CN112680430B - 一种CRISPR SpCas9突变体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种CRISPR SpCas9突变体及其应用，该SpCas9突变体将野生型SpCas9的第497位天冬酰胺残基突变为丙氨酸残基，第510位赖氨酸残基突变为丙氨酸残基，第661位精氨酸残基突变为丙氨酸残基设计得到的。其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。该SpCas9(N497A,K510A,R661A)突变体在保持了与野生型SpCas9的对靶位点剪切效率基本相同的情况下，能够显著降低对脱靶位点的编辑效率，即显著降低脱靶率。

Description

一种CRISPR SpCas9突变体及其应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种CRISPR SpCas9突变体及其应用。

背景技术

SpCas9(SpCas9)在基因编辑中应用广泛。SpCas9基因编辑系统包括SpCas9蛋白和sgRNA。SpCas9蛋白和sgRNA结合形成复合物，该复合物通过SpCas9上的与PAM相互作用结构域和sgRNA上的向导序列(guide sequence)序列特异性识别靶位点，并利用HNH结构域和RuvC结构域对靶标DNA进行双链平端剪切。在活体细胞中，剪切后的基因组DNA可以启动NHEJ进行修复，从而产生插入/缺失突变(Indel)。

但在相关技术中，野生型SpCas9虽然可以高效的对基因进行编辑，却在编辑靶位点的同时也对一些与靶位点类似的非靶位点进行编辑，这严重影响了SpCas9的临床应用。

因此，亟待开发一种新型SpCas9。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种SpCas9突变体或其活性片段，相比于常规的野生型SpCas9，SpCas9(N497A,K510A,R661A)突变体在保持了与野生型SpCas9的对靶位点剪切效率基本相同的情况下，能够显著降低对脱靶位点的编辑效率，即显著降低脱靶率。

本发明还提出一种提供编码上述SpCas9突变体或其活性片段的基因。

本发明还提出一种组合物。

本发明还提出一种多核苷酸。

本发明还提出一种向导多核苷酸/Cas复合物。

本发明还提出含有上述基因的重组载体、重组菌或细胞。

本发明还提出一种修饰细胞基因组中的靶位点的方法。

本发明还提出上述SpCas9突变体或其活性片段或上述基因在基因编辑中的应用。

根据本发明的第一个方面，提供一种SpCas9突变体或其活性片段，该SpCas9突变体或其活性片段包括：与SEQ ID NO.1所示的野生型SpCas9多肽具有至少90％的氨基酸同一性，且野生型SpCas9多肽的REC3结构域的第497位和第510位同时被取代或第510位和第661位氨基酸同时被取代。

其中，该SpCas9突变体具有内切核酸酶活性。

在本发明的一些实施方式中，上述SpCas9突变体或其活性片段为：与SEQ ID NO.1所示的野生型SpCas9多肽具有至少90％的氨基酸同一性，且野生型SpCas9多肽的REC3结构域的第497位天冬酰胺残基突变为丙氨酸残基，第510位赖氨酸残基突变为丙氨酸残基，第661位精氨酸残基突变为丙氨酸残基，其中，该SpCas9突变体具有内切核酸酶活性。

根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：本发明中的SpCas9(N497A,K510A,R661A)突变体，是将野生型SpCas9的第497位天冬酰胺残基突变为丙氨酸残基，第510位赖氨酸残基突变为丙氨酸残基，第661位精氨酸残基突变为丙氨酸残基设计得到的。发明人分析野生型SpCas9 REC3结构域的氨基酸残基与sgRNA/靶DNA杂合双链的相互作用，发现REC3结构中的部分氨基酸残基与sgRNA/靶DNA双链形成了非特异性的氢键相互作用，通过进一步对于相互作用力类型、大小及结构的筛选后，发现将REC3结构中的第497位天冬酰胺残基、第510位赖氨酸残基和第661位精氨酸残基同时取代可有效降低基因编辑过程中降低脱靶率。通过将野生型SpCas9 REC3结构域第497位天冬酰胺残基突变为丙氨酸残基，第510位赖氨酸残基突变为丙氨酸残基，第661位精氨酸残基突变为丙氨酸残基，在反复验证下，证实SpCas9(N497A,K510A,R661A)突变体在保持了与野生型SpCas9的对靶位点剪切效率基本相同的情况下，能够显著降低对脱靶位点的编辑效率，即显著降低脱靶率。

其中，上述SEQ ID NO.1所示的野生型SpCas9的氨基酸序列为：

加粗且标有下划线的部分即为突变前的第497位的天冬酰胺残基，第510位的赖氨酸残基，第661位的精氨酸残基；

仅标有下划线的部分为修饰序列。

表达野生型SpCas9的质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

在本发明的一些实施方式中，上述SpCas9突变体或其活性片段还包括：与SEQIDNO.1所示的野生型SpCas9多肽具有至少89％、88％、87％、86％、85％、84％、83％、82％、81％、80％、79％、78％、77％、76％、75％的氨基酸同一性，且野生型SpCas9多肽的REC3结构域的第497位天冬酰胺残基突变为丙氨酸残基，第510位赖氨酸残基突变为丙氨酸残基，第661位精氨酸残基突变为丙氨酸残基，其中，该SpCas9突变体具有内切核酸酶活性。

在本发明的一些实施方式中，上述SpCas9突变体或其活性片段的氨基酸序列包括：

(1)SEQ ID NO.2所示的SpCas9(N497A,K510A,R661A)突变体的氨基酸序列；或

(2)SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸和/或末端修饰后且具内切核酸酶活性的序列。

其中，SpCas9(N497A,K510A,R661A)突变体的氨基酸序列为：

其中，加粗且标有下划线的部分即为突变后的丙氨酸残基；

仅标有下划线的部分为修饰序列。

在本发明的一些优选的实施方式中，上述SpCas9突变体或其活性片段的氨基酸序列还包括：在SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的基础上加入核信号肽、3×flag或his6标签等修饰得到的序列。

根据本发明的第二个方面，提供编码本发明第一个方面所述的SpCas9突变体或其活性片段的基因。

根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：上述编码本发明第一个方面所述的SpCas9突变体或其活性片段的基因可用于表达本发明第一个方面所述的SpCas9突变体或其活性片段，表达得到的SpCas9(N497A,K510A,R661A)突变体在保持了与野生型SpCas9的对靶位点剪切效率基本相同的情况下，能够显著降低对脱靶位点的编辑效率，即显著降低脱靶率。

根据本发明的第三个方面，提供一种组合物，该组合物含有本发明第一个方面所述的SpCas9突变体或其活性片段。

根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：上述组合物含有本发明第一个方面所述的SpCas9突变体或其活性片段，通过利用该组合物，可以使基因编辑过程中的脱靶率显著降低。

根据本发明的第四个方面，提供一种多核苷酸，该多核苷酸含有本发明的第二个方面所述的基因。

在本发明的一些优选的实施方式中，上述多核苷酸为向导多核苷酸。

在本发明的一些更优选的实施方式中，上述向导多核苷酸为sgRNA。

在本发明的一些更优选的实施方式中，上述sgRNA的向导序列(guide sequence)为：

5’-gagtccgagcagaagaagaa-3’(SEQ ID NO.3)。

Cas9的靶向特异性取决于20nt的sgRNA向导序列以及基因组中与目标序列相邻的PAM的存在，因此，设计合理且有效的sgRNA向导序列可有效的提高Cas9的可用性。

使用上述sgRNA的向导序列构建的sgRNA质粒载体还可以插入抗生素抗性基因和报告基团(GFP)序列。

在本发明的一些更优选的实施方式中，上述抗生素抗性基因包括真核puromycin(嘌呤霉素)抗性基因或潮霉素抗性基因。

在本发明的一些更优选的实施方式中，上述抗生素抗性基因为真核puromycin抗性基因。

在本发明的一些更优选的实施方式中，上述报告基团包括EGFP基团。

当然，本领域技术人员也可以根据实际需求，插入其他功能性基因，如强力霉素(doxycycline)的诱导启动子，以增强Cas9的瞬时表达。

根据本发明的第五个方面，提供一种向导多核苷酸/Cas复合物，该向导多核苷酸/Cas复合物包含至少一种向导多核苷酸和至少一种本发明第一个方面所述的SpCas9突变体或其活性片段；

其中，该向导多核苷酸是嵌合的非天然存在的向导多核苷酸；

该向导多核苷酸/Cas复合物能完全或部分识别、结合靶序列并使靶序列产生切口或解旋、切割靶序列。

在本发明的一些优选的实施方式中，上述多核苷酸为向导多核苷酸。

在本发明的一些更优选的实施方式中，上述向导多核苷酸为sgRNA。

在本发明的一些更优选的实施方式中，上述sgRNA的向导序列(guide sequence)如SEQ ID NO.3所示。

将CRISPR/Cas9组分导入细胞通常是利用DNA导入系统来实现的，比如将编码Cas9和sgRNA的质粒转染到细胞内。但当质粒导入存在问题时，可以直接导入Cas9/sgRNA核糖核蛋白(RNP)复合物或者使用病毒载体(如慢病毒载体)来实现基因编辑。与导入质粒的方法相比，采用导入Cas9/sgRNA核糖核蛋白(RNP)复合物的方法进行编辑，在导入细胞后可以快速开始切割。Cas9/sgRNA核糖核蛋白(RNP)复合物具有较少的脱靶率和较低的免疫原性，使用病毒载体转染时，转染效率更高，且持续时间长。

根据本发明的第六个方面，提供含有本发明第二个方面所述基因的重组载体、重组菌或细胞。

在本发明的一些实施方式中，上述细胞包括原核细胞或真核细胞。

在本发明的一些优选的实施方式中，上述细胞包括：动物、细菌、真菌、昆虫、酵母和植物来源的细胞。

在本发明的一些更优选的实施方式中，上述细胞包括：体内、离体或体外的人细胞、动物细胞、植物细胞和单细胞生物；其中，所述人细胞、动物细胞优选为人和动物的血细胞。

根据本发明的第七个方面，提供一种修饰细胞基因组中的靶位点的方法，包括：将本发明的第五个方面所述的向导多核苷酸/Cas复合物导入细胞中，使所述细胞中的靶位点具有如下修饰：

至少一个核苷酸的替代；和/或

至少一个核苷酸的缺失；和/或

至少一个核苷酸的插入。

根据本发明的第八个方面，提供本发明第一个方面所述SpCas9突变体或其活性片段或本发明第二个方面所述基因在基因编辑中的应用。

根据本发明的一种优选的实施方式，至少具有以下有益效果：本发明中的SpCas9(N497A,K510A,R661A)突变体，是将野生型SpCas9的第497位天冬酰胺残基突变为丙氨酸残基，第510位赖氨酸残基突变为丙氨酸残基，第661位精氨酸残基突变为丙氨酸残基设计得到的。发明人分析野生型SpCas9 REC3结构域的氨基酸残基与sgRNA/靶DNA杂合双链的相互作用，发现REC3结构中的部分氨基酸残基与sgRNA/靶DNA双链形成了非特异性的氢键相互作用，通过进一步对于相互作用力类型、大小及结构的筛选后，发现将REC3结构中的第497位天冬酰胺残基、第510位赖氨酸残基和第661位精氨酸残基同时取代可有效降低基因编辑过程中降低脱靶率。通过将将野生型SpCas9 REC3结构域第497位天冬酰胺残基突变为丙氨酸残基，第510位赖氨酸残基突变为丙氨酸残基，第661位精氨酸残基突变为丙氨酸残基，在反复验证下证实SpCas9(N497A,K510A,R661A)突变体在保持了与野生型SpCas9的对靶位点剪切效率基本相同的情况下，能够显著降低对脱靶位点的编辑效率，即显著降低脱靶率。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例中的SpCas9的质粒图谱；

图2为本发明实施例中的sgRNA质粒图谱；

图3为野生型SpCas9在EMX1-1(A)、EMX1-1-OT1(B)、EMX1-1-OT2(C)三个位点的编辑效率结果二维图；其中，蓝色点：单FAM阳性，绿色点：单VIC阳性，灰色点：FAM/VIC双阴性，棕色点：FAM/VIC双阳性；

图4为突变型SpCas9(N497A，K510A，R661A)在EMX1-1(A)、EMX1-1-OT1(B)、EMX1-1-OT2(C)三个位点的编辑效率结果二维图；其中，蓝色点：单FAM阳性，绿色点：单VIC阳性，灰色点：FAM/VIC双阴性，棕色点：FAM/VIC双阳性。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

关于本发明说明书中的术语：spCas9是指酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)Cas9，Cas是指成簇的规律的间隔回文序列(CRISPR(clustered regularly interspacedshort palindromic repeats)associated)。

术语“Cas蛋白”或“Cas多肽”是指由Cas(CRISPR-相关的)基因编码的多肽。Cas蛋白包括Cas内切核酸酶。

术语“Cas内切核酸酶”是指当与适合的多核苷酸组分复合时能够识别、结合特定DNA靶序列的全部或部分、并任选地使特定多核苷酸靶序列的全部或部分产生切口或切割特定多核苷酸靶序列的全部或部分的Cas多肽(Cas蛋白)。Cas内切核酸酶由所述向导多核苷酸指导以识别、结合双链DNA中的特定靶位点的全部或部分并任选地使双链DNA中的特定靶位点的全部或部分产生切口或切割双链DNA中的特定靶位点的全部或部分(例如，在细胞基因组中的靶位点处)。本文描述的Cas内切核酸酶包含一个或多个核酸酶结构域。在本文所述的供体DNA插入方法中采用的Cas内切核酸酶是在靶位点处向DNA中引入单链或双链断裂的内切核酸酶。可替代地，本文中的Cas内切核酸酶可能缺乏DNA切割或切口活性，但是当与合适的RNA组分复合时，仍然可以特异性结合DNA靶序列。

质粒的设计与构建

下述实施例中以BPK4410质粒(Addgene plasmid#101178)作为示例，但需要注意的是，本发明不限于BPK4410质粒，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，可以合理选择具有替代性的质粒作为实验载体。

(1)SpCas9突变体质粒载体构建：

发明人根据sgRNA/靶DNA杂合双链压缩可以引起双链的疏水性增强，从而引起sgRNA/靶DNA杂合双链与REC3结构域之间的疏水作用增强，而增强的疏水作用导致REC3结构域向sgRNA/靶DNA杂合双链移动，进而启动剪切这一假定。从而进一步设想上述发现的最佳情况应为REC3结构域与sgRNA/靶DNA杂合双链之间的作用力只有疏水相互作用而没有氢键等非特异性相互作用，且只有当sgRNA与靶DNA链100％匹配时才能启动REC3结构域向sgRNA/靶DNA杂合双链的移动。根据设想，发明人通过分析REC3结构域的氨基酸残基与sgRNA/靶DNA杂合双链的相互作用，发现部分氨基酸残基与sgRNA/靶DNA双链形成了非特异性的氢键相互作用，进一步通过考虑相互作用力类型、大小及结构等因素，筛选得到通过将野生型SpCas9 REC3结构域第497位天冬酰胺残基突变为丙氨酸残基，第510位赖氨酸残基突变为丙氨酸残基，第661位精氨酸残基突变为丙氨酸残基，可以获得最佳的突变体SpCas9(N497A,K510A,R661A)。

具体构建步骤为：

以质粒BPK4410(HyperCas9,Addgene plasmid#101178)为模板，首先将HyperCas9的692位的丙氨酸残基突变为天冬酰胺残基，第694位的丙氨酸残基突变为蛋氨酸残基，将第695位的丙氨酸残基突变为谷氨酰胺残基，将第698位的丙氨酸残基突变为组氨酸残基，得到野生型SpCas9。

其中，突变前的野生型SpCas9氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，突变后得到的SpCas9(N497A，K510A，R661A)突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

表达野生型SpCas9的质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

表达SpCas9(N497A，K510A，R661A)的质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

构建完成的SpCas9突变体的质粒图谱如图1所示。

(2)构建sgRNA质粒载体(sgRNA-EMX1-1-puro)：

设计sgRNA，经过筛选后，选择SEQ ID NO.3所示序列为向导序列。

SEQ ID NO.3所示序列为：

5’-gagtccgagcagaagaagaa-3’(SEQ ID NO.3)。

构建完成的sgRNA质粒载体还包括启动子、真核puromycin抗性基因序列和EGFP报告基团序列，转染后可以表达绿色荧光蛋白，且可以使用puromycin进行药筛以筛选出转染成功的阳性细胞。

为了验证SpCas9突变体实际效果，以EMX1基因的EMX1-1位点为靶位点，使sgRNA质粒载体靶向靶位点，该sgRNA质粒载体被命名为sgRNA-EMX1-1-puro。

构建完成的sgRNA质粒载体(sgRNA-EMX1-1-puro)的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示，质粒图谱如图2所示。

sgRNA-EMX1-1-puro质粒的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

其中，加粗且标有下划线的部分为表达sgRNA-EMX1-1的向导序列(guidesequence)的碱基序列。

细胞培养

以HEK293T细胞-为转染对象。

用DMEM培养基(含10％FBS、2mM的谷氨酰胺和两种抗生素(青霉素和链霉素))培养HEK293T细胞，培养环境为37℃、5％CO₂。

构建转染细胞

将上述实施例中培养好的HEK293T细胞移种至24孔板(2×10⁵个细胞/孔)中，每孔加入0.5mL的完全培养基，培养过夜。直至次日细胞融合度约为70-80％时进行转染。转染共使用1μg质粒(750ng的SpCas9/SpCas9(N497A，K510A，R661A)质粒和250ngsgRNA-EMX1-1-puro质粒)，采用Lipofectamine 3000(Invitrogen，1.5μL lipo3000，2μLp3000)作为转染试剂，参照试剂使用说明书或本领域常规操作转染细胞。

转染后的细胞使用2μg/mL的Puromycin在转染后第2-4天进行药筛，药筛结束后的第二天提取基因组DNA，备用。

在靶位点和脱靶位点的编辑效率检测

选取野生型SpCas9在剪切EMX1-1位点时,已报到具有较高脱靶率的脱靶位点EMX1-1-OT1和EMX1-1-OT2，用以检测本发明实施例中的SpCas9(N497A,K510A,R661A)突变体的脱靶情况。其中，靶位点EMX1-1、脱靶位点EMX1-1-OT1和EMX1-1-OT2的序列和PAM序列如表1所示。

表1靶位点和脱靶位点的靶序列和PAM序列

其中，加粗部分为脱靶位点与靶位点不一致的脱靶碱基。

采用ddPCR(Droplet Digital PCR，微滴式数字PCR)验证在靶位点和脱靶位点的编辑效率。

针对表1所示的靶位点EMX1-1、脱靶位点EMX1-1-OT1和EMX1-1-OT2的序列，分别设计引物组，以用于扩增出一段包含靶位点或脱靶位点的长约60-200bp的片段，同时，设计Reference探针(含有FAM荧光修饰基团)，用于靶向剪切靶位点两端的序列，设计NHEJ探针(含有VIC荧光修饰基团)，用于靶向剪切靶位点。当靶位点没有被编辑时NHEJ探针可以与靶位点序列结合，当靶位点被编辑时，NHEJ探针将不能够再与靶位点相结合，因此，可以通过识别靶序列上的VIC的荧光即可判断脱靶情况。

其中，靶位点EMX1-1、脱靶位点EMX1-1-OT1和EMX1-1-OT2的引物组、Reference探针和NHEJ探针序列分别为：

(1)靶位点EMX1-1：

引物组序列：

上游引物F：5’-cggaggacaaagtacaaacgg-3’(SEQ ID NO.10)；

下游引物R：5’-gtcattggaggtgacatcgatg-3’(SEQ ID NO.11)。

Reference探针序列为：5’-FAM-ccattggcctgcttcgtggcaatgcg-BHQ1-3’(SEQ IDNO.12)。

NHEJ探针序列为：5’-VIC-cgagcagaagaagaag-MGB-3’(SEQ ID NO.13)。

(2)脱靶位点EMX1-1-OT1：

引物组序列：

上游引物F：5’-gctacctgtacatctgcacaag-3’(SEQ ID NO.14)；

下游引物R：5’-aagaaatgcccaatcattgatgc-3’(SEQ ID NO.15)。

Reference探针序列为：5’-FAM-ctgtcttgccatgccataagcccctatt-BHQ1-3’(SEQID NO.16)。

NHEJ探针序列为：5’-VIC-atgcctttcttcttc-MGB-3’(SEQ ID NO.17)。

(3)脱靶位点EMX1-1-OT2：

引物组序列：

上游引物F：5’-agcctctttctcaatgtgcttc-3’(SEQ ID NO.18)；

下游引物R：5’-agagtagatggttgggtagtgg-3’(SEQ ID NO.19)。

Reference探针序列为：5’-FAM-ccatcacggcctttgcaaatagagccct-BHQ1-3’(SEQIDNO.20)。

NHEJ探针序列为：5’-VIC-ctaagcagaagaagaagag-MGB-3’(SEQ ID NO.21)。

ddPCR中的微滴的制备参照QX200^TM微滴式数字PCR系统的说明书或使用其他本领域常规操作进行。

ddPCR反应体系为：

表2.ddPCR反应体系

反应程序为：95℃预变性10min；94℃变形30s，-50-65℃退火1min，循环40次；98℃10min；4℃维持。

使用QX200^TM微滴式数字PCR系统检测：微滴通过微滴分析仪依次分开，逐个进行荧光信号的检测，分别检测各个微滴在FAM通道和VIC通道的荧光信号值。有荧光信号的微滴为阳性，无荧光信号的微滴为阴性。记录每个样品里阳性微滴的数量和占比情况。根据比例关系计算编辑效率。

其中，编辑效率用NHEJ突变率来计算，公式如下：

结果如图3-4和表3所示。

图2-3分别为野生型SpCas9和突变型SpCas9(N497A，K510A，R661A)在EMX1-1、EMX1-1-OT1、EMX1-1-OT2三个位点的编辑效率结果二维图。图2中的蓝色点为单FAM阳性，绿色点为单VIC阳性，灰色点为FAM/VIC双阴性，棕色点为FAM/VIC双阳性。进一步分析发现，野生型SpCas9对靶位点EMX1-1的编辑率为53.31％，对脱靶位点EMX1-1-OT1的编辑率为2.51％，对脱靶位点EMX1-1-OT2的编辑率为1.76％。SpCas9(N497A,K510A,R661A)突变体对靶位点EMX1-1的编辑率为42.40％，对脱靶位点EMX1-1-OT1的编辑率为0.03％，对脱靶位点EMX1-1-OT2的编辑率为0.21％。与野生型SpCas9相比，突变体SpCas9(N497A，K510A，R661A)对靶位点的编辑效率基本与野生型SpCas9基本持平(75％以上)，而且，对脱靶位点的编辑率有了大幅度的显著降低。

表3野生型SpCas9和突变型SpCas9(N497A，K510A，R661A)在EMX1-1靶位点和脱靶位点的编辑效率

vs.野生型，**P<0.01，***P<0.001。

SpCas9(N497A,K510A,R661A)突变体在靶位点EMX1-1的编辑效率验证

采用T7E1酶切法检测SpCas9(N497A,K510A,R661A)突变体的编辑效率。

设计针对EMX1-1位点的引物(扩增产物长度为720bp)：

上游引物F：5’-CTTCCAGAGCCTGCACTCCT-3’(SEQ ID NO.22)；

下游引物R：5’-AGGCTCTCCGAGGAGAAGGC-3’(SEQ ID NO.23)。

使用该引物和

Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix预混液(M0494，NEB)对EMX1-1基因序列进行扩增。扩增产物进行T7E1酶切(E3321，NEB)。结果如表4所示。

表4 T7E1酶切法检测结果

vs.野生型，***P<0.001。

结果显示SpCas9突变体(N497A，K510A，R661A)对靶位点EMX1-1的剪切率为野生型剪切率的78.0％(表4)，与ddPCR检测的结果一致。

综上所述，本发明实施例中的SpCas9(N497A,K510A,R661A)突变体，是将野生型SpCas9的第497位天冬酰胺残基突变为丙氨酸残基，第510位赖氨酸残基突变为丙氨酸残基，第661位精氨酸残基突变为丙氨酸残基设计得到的。通过T7E1实验对靶序列的编辑情况进行了分析，并通过ddPCR证实SpCas9(N497A,K510A,R661A)突变体在保持了与野生型SpCas9的对靶位点剪切效率基本相同的情况下，能够显著降低对脱靶位点的编辑效率，即显著降低脱靶率。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学

<120> 一种CRISPR SpCas9突变体及其应用

<130>

<160> 23

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1404

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Met Asp Lys Lys Tyr Ser Ile Gly Leu Asp Ile Gly Thr Asn Ser Val

1 5 10 15

Gly Trp Ala Val Ile Thr Asp Glu Tyr Lys Val Pro Ser Lys Lys Phe

20 25 30

Lys Val Leu Gly Asn Thr Asp Arg His Ser Ile Lys Lys Asn Leu Ile

35 40 45

Gly Ala Leu Leu Phe Asp Ser Gly Glu Thr Ala Glu Ala Thr Arg Leu

50 55 60

Lys Arg Thr Ala Arg Arg Arg Tyr Thr Arg Arg Lys Asn Arg Ile Cys

65 70 75 80

Tyr Leu Gln Glu Ile Phe Ser Asn Glu Met Ala Lys Val Asp Asp Ser

85 90 95

Phe Phe His Arg Leu Glu Glu Ser Phe Leu Val Glu Glu Asp Lys Lys

100 105 110

His Glu Arg His Pro Ile Phe Gly Asn Ile Val Asp Glu Val Ala Tyr

115 120 125

His Glu Lys Tyr Pro Thr Ile Tyr His Leu Arg Lys Lys Leu Val Asp

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Asp Asp Leu Asp Asn Leu Leu Ala Gln Ile Gly Asp Gln Tyr Ala Asp

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<212> DNA

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cggatcggga gatcgatctc ccgatcccct agggtcgact ctcagtacaa tctgctctga 60

tgccgcatag ttaagccagt atctgctccc tgcttgtgtg ttggaggtcg ctgagtagtg 120

cgcgagcaaa atttaagcta caacaaggca aggcttgacc gacaattgca tgaagaatct 180

gcttagggtt aggcgttttg cgctgcttcg cgatgtacgg gccagatata cgcgttgaca 240

ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc atagcccata 300

tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga 360

cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt 420

ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt 480

gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca 540

ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct acgtattagt 600

catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt 660

tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca 720

ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga cgcaaatggg 780

cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct ggtttagtga accgtcagat 840

ccgctagaga tccgcggccg ctaatacgac tcactatagg gagagccgcc accatggata 900

aaaagtattc tattggttta gacatcggca ctaattccgt tggatgggct gtcataaccg 960

atgaatacaa agtaccttca aagaaattta aggtgttggg gaacacagac cgtcattcga 1020

ttaaaaagaa tcttatcggt gccctcctat tcgatagtgg cgaaacggca gaggcgactc 1080

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aagaaatttt tagcaatgag atggccaaag ttgacgattc tttctttcac cgtttggaag 1200

agtccttcct tgtcgaagag gacaagaaac atgaacggca ccccatcttt ggaaacatag 1260

tagatgaggt ggcatatcat gaaaagtacc caacgattta tcacctcaga aaaaagctag 1320

ttgactcaac tgataaagcg gacctgaggt taatctactt ggctcttgcc catatgataa 1380

agttccgtgg gcactttctc attgagggtg atctaaatcc ggacaactcg gatgtcgaca 1440

aactgttcat ccagttagta caaacctata atcagttgtt tgaagagaac cctataaatg 1500

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gagatcagta tgcggactta tttttggctg ccaaaaacct tagcgatgca atcctcctat 1800

ctgacatact gagagttaat actgagatta ccaaggcgcc gttatccgct tcaatgatca 1860

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ttgacggcgg agcgagtcaa gaggaattct acaagtttat caaacccata ttagagaaga 2040

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ttagaaggca ggaggatttt tatccgttcc tcaaagacaa tcgtgaaaag attgagaaaa 2220

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cgaacgaaaa agtattgcct aagcacagtt tactttacga gtatttcaca gtgtacaatg 2460

aactcacgaa agttaagtat gtcactgagg gcatgcgtaa acccgccttt ctaagcggag 2520

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aattgaaaga ggactacttt aagaaaattg aatgcttcga ttctgtcgag atctccgggg 2640

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ttaccctctt tgaagatcgg gaaatgattg aggaaagact aaaaacatac gctcacctgt 2820

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cgaaaagcga acaggagata ggcaaggcta cagccaaata cttcttttat tctaacatta 4020

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gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc 3000

accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg 3060

cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg 3120

cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc 3180

cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc 3240

gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac 3300

aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc 3360

cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc 3420

ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc 3480

aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg 3540

atcactctcg gcatggacga gctgtacaag ggctccggag agggcagggg aagtcttcta 3600

acatgcgggg acgtggagga aaatcccggc cccatgaccg agtacaagcc cacggtgcgc 3660

ctcgccaccc gcgacgacgt ccccagggcc gtacgcaccc tcgccgccgc gttcgccgac 3720

taccccgcca cgcgccacac cgtcgatccg gaccgccaca tcgagcgggt caccgagctg 3780

caagaactct tcctcacgcg cgtcgggctc gacatcggca aggtgtgggt cgcggacgac 3840

ggcgccgcgg tggcggtctg gaccacgccg gagagcgtcg aagcgggggc ggtgttcgcc 3900

gagatcggcc cgcgcatggc cgagttgagc ggttcccggc tggccgcgca gcaacagatg 3960

gaaggcctcc tggcgccgca ccggcccaag gagcccgcgt ggttcctggc caccgtcggc 4020

gtctcgcccg accaccaggg caagggtctg ggcagcgccg tcgtgctccc cggagtggag 4080

gcggccgagc gcgccggggt gcccgccttc ctggagacct ccgcgccccg caacctcccc 4140

ttctacgagc ggctcggctt caccgtcacc gccgacgtcg aggtgcccga aggaccgcgc 4200

acctggtgca tgacccgcaa gcccggtgcc tgaacccagc tttcttgtac aaagtggtgg 4260

tacccgataa tcaacctctg gattacaaaa tttgtgaaag attgactggt attcttaact 4320

atgttgctcc ttttacgcta tgtggatacg ctgctttaat gcctttgtat catgctattg 4380

cttcccgtat ggctttcatt ttctcctcct tgtataaatc ctggttgctg tctctttatg 4440

aggagttgtg gcccgttgtc aggcaacgtg gcgtggtgtg cactgtgttt gctgacgcaa 4500

cccccactgg ttggggcatt gccaccacct gtcagctcct ttccgggact ttcgctttcc 4560

ccctccctat tgccacggcg gaactcatcg ccgcctgcct tgcccgctgc tggacagggg 4620

ctcggctgtt gggcactgac aattccgtgg tgttgtcggg gaagctgacg tcctttccat 4680

ggctgctcgc ctgtgttgcc acctggattc tgcgcgggac gtccttctgc tacgtccctt 4740

cggccctcaa tccagcggac cttccttccc gcggcctgct gccggctctg cggcctcttc 4800

cgcgtcttcg ccttcgccct cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgcatc 4860

ggctttaaga ccaatgactt acaaggcagc tgtagatctt agccactttt taaaagaaaa 4920

ggggggactg gaagggctaa ttcactccca acgaagacaa gatctgcttt ttgcttgtac 4980

tgggtctctc tggttagacc agatctgagc ctgggagctc tctggctaac tagggaaccc 5040

actgcttaag cctcaataaa gcttgccttg agtgcttcaa gtagtgtgtg cccgtctgtt 5100

gtgtgactct ggtaactaga gatccctcag acccttttag tcagtgtgga aaatctctag 5160

cagtagtagt tcatgtcatc ttattattca gtatttataa cttgcaaaga aatgaatatc 5220

agagagtgag aggaacttgt ttattgcagc ttataatggt tacaaataaa gcaatagcat 5280

cacaaatttc acaaataaag catttttttc actgcattct agttgtggtt tgtccaaact 5340

catcaatgta tcttatcatg tctggctcta gctatcccgc ccctaactcc gcccatcccg 5400

cccctaactc cgcccagttc cgcccattct ccgccccatg gctgactaat tttttttatt 5460

tatgcagagg ccgaggccgc ctcggcctct gagctattcc agaagtagtg aggaggcttt 5520

tttggaggcc tagggacgta cccaattcgc cctatagtga gtcgtattac gcgcgctcac 5580

tggccgtcgt tttacaacgt cgtgactggg aaaaccctgg cgttacccaa cttaatcgcc 5640

ttgcagcaca tccccctttc gccagctggc gtaatagcga agaggcccgc accgatcgcc 5700

cttcccaaca gttgcgcagc ctgaatggcg aatgggacgc gccctgtagc ggcgcattaa 5760

gcgcggcggg tgtggtggtt acgcgcagcg tgaccgctac acttgccagc gccctagcgc 5820

ccgctccttt cgctttcttc ccttcctttc tcgccacgtt cgccggcttt ccccgtcaag 5880

ctctaaatcg ggggctccct ttagggttcc gatttagtgc tttacggcac ctcgacccca 5940

aaaaacttga ttagggtgat ggttcacgta gtgggccatc gccctgatag acggtttttc 6000

gccctttgac gttggagtcc acgttcttta atagtggact cttgttccaa actggaacaa 6060

cactcaaccc tatctcggtc tattcttttg atttataagg gattttgccg atttcggcct 6120

attggttaaa aaatgagctg atttaacaaa aatttaacgc gaattttaac aaaatattaa 6180

cgcttacaat ttaggtggca cttttcgggg aaatgtgcgc ggaaccccta tttgtttatt 6240

tttctaaata cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca 6300

ataatattga aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt 6360

ttttgcggca ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga 6420

tgctgaagat cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa 6480

gatccttgag agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct 6540

gctatgtggc gcggtattat cccgtattga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat 6600

acactattct cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga 6660

tggcatgaca gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc 6720

caacttactt ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat 6780

gggggatcat gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa 6840

cgacgagcgt gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac 6900

tggcgaacta cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa 6960

agttgcagga ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc 7020

tggagccggt gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc 7080

ctcccgtatc gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag 7140

acagatcgct gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta 7200

ctcatatata ctttagattg atttaaaact tcatttttaa tttaaaagga tctaggtgaa 7260

gatccttttt gataatctca tgaccaaaat cccttaacgt gagttttcgt tccactgagc 7320

gtcagacccc gtagaaaaga tcaaaggatc ttcttgagat cctttttttc tgcgcgtaat 7380

ctgctgcttg caaacaaaaa aaccaccgct accagcggtg gtttgtttgc cggatcaaga 7440

gctaccaact ctttttccga aggtaactgg cttcagcaga gcgcagatac caaatactgt 7500

tcttctagtg tagccgtagt taggccacca cttcaagaac tctgtagcac cgcctacata 7560

cctcgctctg ctaatcctgt taccagtggc tgctgccagt ggcgataagt cgtgtcttac 7620

cgggttggac tcaagacgat agttaccgga taaggcgcag cggtcgggct gaacgggggg 7680

ttcgtgcaca cagcccagct tggagcgaac gacctacacc gaactgagat acctacagcg 7740

tgagctatga gaaagcgcca cgcttcccga agagagaaag gcggacaggt atccggtaag 7800

cggcagggtc ggaacaggag agcgcacgag ggagcttcca gggggaaacg cctggtatct 7860

ttatagtcct gtcgggtttc gccacctctg acttgagcgt cgatttttgt gatgctcgtc 7920

aggggggcgg agcctatgga aaaacgccag caacgcggcc tttttacggt tcctggcctt 7980

ttgctggcct tttgctcaca tgttctttcc tgcgttatcc cctgattctg tggataaccg 8040

tattaccgcc tttgagtgag ctgataccgc tcgccgcagc cgaacgaccg agcgcagcga 8100

gtcagtgagc gaggaagcgg aagagcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc ccgcgcgttg 8160

gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg gcagtgagcg 8220

caacgcaatt aatgtgagtt agctcactca ttaggcaccc caggctttac actttatgct 8280

tccggctcgt atgttgtgtg gaattgtgag cggataacaa tttcacacag gaaacagcta 8340

tgaccatgat tacgccaagc gcgcaattaa ccctcactaa agggaacaaa agctggagct 8400

gcaagctt 8408

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

gagtccgagc agaagaagaa 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

gagttagagc agaagaagaa 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

gagtctaagc agaagaagaa 20

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cggaggacaa agtacaaacg g 21

<210> 11

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 11

gtcattggag gtgacatcga tg 22

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 12

ccattggcct gcttcgtggc aatgcg 26

<210> 13

<211> 16

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 13

cgagcagaag aagaag 16

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 14

gctacctgta catctgcaca ag 22

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 15

aagaaatgcc caatcattga tgc 23

<210> 16

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 16

ctgtcttgcc atgccataag cccctatt 28

<210> 17

<211> 15

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 17

atgcctttct tcttc 15

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 18

agcctctttc tcaatgtgct tc 22

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 19

agagtagatg gttgggtagt gg 22

<210> 20

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 20

ccatcacggc ctttgcaaat agagccct 28

<210> 21

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 21

ctaagcagaa gaagaagag 19

<210> 22

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 22

cttccagagc ctgcactcct 20

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 23

aggctctccg aggagaaggc 20

Claims (6)

1.SpCas9突变体在体外基因编辑中的应用，其特征在于，所述SpCas9突变体为：在如SEQ ID NO .1所示的野生型SpCas9多肽的REC3结构域的第497位天冬酰胺残基突变为丙氨酸残基，第510位赖氨酸残基突变为丙氨酸残基，第661位精氨酸残基突变为丙氨酸残基，其中，所述SpCas9突变体具有内切核酸酶活性；

所述SpCas9突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO .2所示。

2.一种组合物，其特征在于，所述组合物含有权利要求1中所述的SpCas9突变体。

3.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1中所述的SpCas9突变体。

4.一种向导多核苷酸/Cas复合物，其特征在于，所述向导多核苷酸/Cas复合物包含向导多核苷酸和权利要求1所述的SpCas9突变体；所述向导多核苷酸的核苷酸序列如SEQ IDNO .3所示。

5.含有权利要求3中所述多核苷酸的重组载体或重组菌。

6.一种体外修饰细胞基因组中的靶位点的方法，包括：将权利要求4所述的向导多核苷酸/Cas复合物导入细胞中，即得。

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