CN112680477A - 一种基于无缝克隆技术的h9n2亚型禽流感病毒的拯救方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物领域，公开了一种基于无缝克隆技术的H9N2亚型禽流感病毒的拯救方法，包括如下步骤：步骤1：提取H9N2亚型禽流感病毒的RNA，并根据RNA获得病毒的cDNA；步骤2：以cDNA为模板采用8对引物扩增得到H9N2亚型禽流感病毒8个片段的PCR产物；步骤3：将PHW2000质粒进行酶切得到线性化片段；步骤4：将H9N2亚型禽流感病毒8个片段的PCR产物分别与线性化的PHW2000载体进行同源重组得到8种重组质粒；步骤5：将8种重组质粒共同转染293T及MDCK混合培养细胞，得到重组的H9N2病毒；其中，8对引物的序列分别为如序列表SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：17所示。该方法的优势在于：操作简单、重组精确、拯救效率高。

Description

一种基于无缝克隆技术的H9N2亚型禽流感病毒的拯救方法

技术领域

本发明涉及生物领域，具体涉及一种基于无缝克隆技术的H9N2亚型禽流感病毒的拯救方法。

背景技术

禽流感病毒(Avian influenza virus，AIV)属于正粘病毒科，流感病毒属中A型流感病毒，其基因组为单股负链RNA，宿主广泛。根据血凝素HA，A型流感病毒可划分为18个亚型，根据神经氨酸酶NA可划分为11个亚型。在众多亚型中，H9N2亚型禽流感病毒尽管为中低致病力毒株，但其传播和造成的破坏却最为广泛。首先，该病毒可通过直接感染、共同感染以及免疫抑制感染禽类，给家禽养殖业造成严重的损失；其次，该病毒不仅可以感染哺乳动物，同时可以为新兴的高致病性流感病毒H5N1、H7N9等提供内部基因，从而对公共卫生安全构成重大威胁。

反向遗传技术是指从生物基因组及其所含生物信息的角度出发，采用从基因到性状的研究方式，对生物体的遗传和变异规律进行研究。RNA病毒反向遗传操作的核心是构建感染性cDNA分子克隆，通过体外或体内转录，拯救出与亲本毒株具有相似生物学特性的活病毒，从而实现对病毒基因组结构与功能、致病机制以及分子免疫机理等进行研究的目的。

目前，对H9N2亚型禽流感感染力和致病力的分子机制的研究还不够深入，因此，建立起H9N2亚型流感病毒的反向遗传操作系统对于进一步从分子水平研究流感病毒致病性、种间传播能力、病毒变异机制，更好的防控该疾病具有十分重要的意义。

流感病毒的反向遗传操作技术虽然已经广泛应用于探讨流感病毒基因结构与功能、揭示病毒的致病、传播和免疫机理、构建疫苗候选株等方面的研究，但目前流感病毒的反向遗传操作主要采用的是传统的克隆方式，过程比较繁琐，主要体现在以下方面：

(1)采用传统的酶切连接方式进行重组质粒构建；

(2)PCR引物设计需引入载体上的酶切位点，PCR产物再经过酶切、胶回收、连接后定向克隆到目的载体上，过程耗时费力；

(3)需要查找合适的酶切位点，如载体或基因组中无合适的酶切位点，还需进行突变，降低了基因的保真性，降低了病毒拯救成功的概率，并且需要购买各种内切酶；

(4)阳性率低。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于无缝克隆技术的H9N2亚型禽流感病毒的拯救方法，该方法的优势在于：操作简单、重组精确、拯救效率高，具体来说，其优势如下：(1)只需要一次反应即可完成定向克隆，省略pcr产物酶切、酶连等过程；(2)对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点；(3)连接片段之间不会引入任何其他序列，不附加任何多余序列，精确定向连接；(4)重组连接体系反应时间仅需15min，快速反应。(5)共转染293T和MDCK细胞，并添加胰酶，拯救效率高。

本发明的具体方案如下：一种基于无缝克隆技术的H9N2亚型禽流感病毒的拯救方法，包括如下步骤：

步骤1：提取H9N2亚型禽流感病毒的RNA，并根据RNA获得病毒的cDNA；

步骤2：以cDNA为模板采用8对引物扩增得到H9N2亚型禽流感病毒8个片段的PCR产物；

步骤3：将PHW2000质粒进行酶切得到线性化片段；

步骤4：将H9N2亚型禽流感病毒8个片段的PCR产物分别与线性化的PHW2000载体进行同源重组得到8种重组质粒；

步骤5：将8种重组质粒共同转染293T及MDCK混合培养细胞，得到重组的H9N2病毒；其中，8对引物的序列分别为如序列表SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：17所示。

在上述的基于无缝克隆技术的H9N2亚型禽流感病毒的拯救方法中，步骤1中，根据RNA获得病毒的cDNA的引物为U12引物，U12引物的序列如序列表SEQ ID NO：1所示。

在上述的基于无缝克隆技术的H9N2亚型禽流感病毒的拯救方法中，所示步骤4中，病毒各片段PCR产物和线性化的PHW2000载体的物质的量比例为2:1。

在上述的基于无缝克隆技术的H9N2亚型禽流感病毒的拯救方法中，所示步骤5中，293T及MDCK混合细胞的培养通过以下方法制备得到：

将293T细胞及MDCK细胞按1:1的比例传至35mm培养皿中，待细胞长至80％-90％左右汇合度时，弃去旧培养基，换入1.5ml opti-mem培养基。

在上述的基于无缝克隆技术的H9N2亚型禽流感病毒的拯救方法中，转染方法具体为：按照LipofectamineLTX Reagent with PLUS Reagent说明书，取禽流感病毒的8种重组质粒各1μg的量混合均匀后转染293T及MDCK混合培养细胞，转染6-8h后，将小皿中的液体弃去，换入2ml新鲜的opti-mem培养基，30h后补加1ml opti-mem，同时补加TPCK胰酶至终浓度为1μg/mL，48h后将细胞反复冻融3次，回收冻融液，接种spf鸡胚，拯救出病毒命名为H9N2-rDA株。

在上述的基于无缝克隆技术的H9N2亚型禽流感病毒的拯救方法中，步骤1中，提取H9N2亚型禽流感病毒的RNA的方法为：参照Axygen AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNAMiniprep Kit使用说明书进行病毒RNA抽提；

步骤1中，根据RNA获得病毒的cDNA的具体方法为：

(1)取病毒RNA 20.5μL，加入2μL U12引物混合均匀，置于70℃水浴锅中10min；

(2)取出RNA和U12引物混合物，置于冰上放置2-3min后，5000-8000rpm离心30s；

(3)按如下体系加入试剂：

RNA和U12引物混合物22.5μL；

5×Reverse Transcriptase M-MLV Buffer 8μL；

dNTP Mixture 8μL；

RNase Inhibitor 0.5μL；

Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)1μL；

将上述体系混合均匀后，置于37℃水浴锅中反应1.5h，得到病毒cDNA模板，保存于-20℃备用。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)只需要一次反应即可完成定向克隆，省略pcr产物酶切、酶连等过程；

(2)对酶切位点无要求，可以把目的片段插入到任意载体的任意位点；

(3)连接片段之间不会引入任何其他序列，不附加任何多余序列，精确定向连接；

(4)重组连接体系反应时间仅需15min，快速反应。

(5)共转染293T和MDCK细胞，并添加胰酶，拯救效率高。

附图说明

图1为A/chicken/Guangdong/DA/2014(H9N2)株全基因组RT-PCR及线性化质粒凝胶电泳图；其中M：5K DNA Marker；1：HA；2：NA；3：NP；4：PB1；5：PB2；6：PA；7：M；8：NS；10：PHW2000。

图2为拯救病毒H9N2-rDA株血凝效价测定结果。

图3为H9N2-rDA病毒株拯救细胞病变图；

图4为禽流感反向遗传病毒拯救流程图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步的描述，但不构成对本发明的任何限制，任何在本发明权利要求范围所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求范围内。

实施例1

1.毒株和主要试验材料

H9N2亚型禽流感病毒A/chicken/Guangdong/DA/2014(H9N2)株(简称DA株)，由肇庆大华农生物药品有限公司鉴定、保管和供应，反向遗传PHW2000载体由本公司保存，SPF鸡胚购自温氏大华农生物科技有限公司。

2.主要试剂

AxygenAxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit购自康宁生命科学有限公司；Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)、Recombinant RNase Inhibitor购自宝日医生物技术(北京)有限公司；TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase、pEASY-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit、Trans10 Chemically Competent Cell购自北京全式金生物技术有限公司；质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司；Lipofectamine LTX Reagent with PLUS Reagent，Opti-MEM I Reduced Serum Medium购自赛默飞世尔科技公司；DNA凝胶回收试剂盒购自omega生物科技有限公司；Bsmb I限制性内切酶购自NEB公司。

3.引物设计与合成

反转录(RT)为U12引物，根据无缝克隆试剂盒说明，设计了8对带有PHW2000同源序列的禽流感全基因组PCR引物用于扩增禽流感病毒8个基因组(HA、NA、NP、PB1、PB2、PA、M、NS)序列，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成，具体信息见表1。

表1 U12引物以及PCR引物序列表

4.重组方法

4.1.病毒RNA的抽提以及反转录

参照Axygen AxyPrep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit使用说明书进行病毒RNA抽提，获得病毒RNA之后，按照Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)、Recombinant RNase Inhibitor试剂盒说明书进行cDNA的合成，具体步骤如下：

(1)取病毒RNA 20.5μL，加入2μL U12引物混合均匀，置于70℃水浴锅中10min；

(2)取出RNA/U12引物混合物，置于冰上放置2-3min后，5000-8000rpm离心30s；

(3)按如下体系加入试剂：

将上述体系混合均匀后，置于37℃水浴锅中反应1.5h，得到病毒cDNA模板，保存于-20℃备用。

4.2.病毒基因组片段扩增及线性化载体获得

(1)以上述获得的cDNA为模板，对禽流感的8个片段进行扩增，按照TransStartFastPfu Fly DNA Polymerase试剂盒说明，体系如下：

试剂名称	使用量(μL)
		cDNA模板	Variable(5-30ng)
上游引物F(10μM)	1
		下游引物R(10μM)	1
5×TransStart FastPfu Fly Buffer	10
		2.5mM dNTPs	4
TransStart FastPfu Fly DNA Polymerase	1
		Nuclease-free Water	Variable
Total volume	50

PCR反应条件为：98℃变性2min，1个循环；98℃变性20s,55-60℃退火20s，72℃延伸1-2min，34个循环；最后72℃延伸5min。PCR结束后，PCR产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，并进行特异性片段的回收。

(2)将本实验保存的PHW2000质粒进行酶切线性化，按照Bsmb I限制性内切酶说明书，体系如下：

试剂名称	使用量
		PHW2000质粒	Variable(1μg)
10×NEBuffer 3.1	5μL
		Bsmb I Enzyme	1μL
Nuclease-free Water	Variable
		Total volume	50μL

将上述体系混合均匀后，置于55℃水浴锅反应1h，酶切产物在1％的琼脂糖凝胶中进行电泳，并进行线性化片段的回收。

4.3.重组质粒的构建及转化

(1)重组质粒构建

采用pEASY-Basic Seamless Cloning and Assembly Kit，将回收的禽流感病毒基因各pcr片段分别和线性化的PHW2000进行同源重组，各基因组片段和线性化载体用量摩尔比为2:1，体系如下：

试剂名称	使用量
		线性化PHW2000载体	0.1-0.2pmol
禽流感各基因组pcr产物	0.05-0.1pmol
		2×Basic Assembly Mix	5μL
Nuclease-free Water	Variable
		Total volume	10μL

将上述体系混合均匀后，50℃反应15min。反应结束后，将重组产物置于冰上冷却数秒，进行转化。

(2)转化

在冰上融化Trans10感受态细胞，取50μL感受态细胞，向其中加入2μL重组产物，轻轻弹动离心管壁混匀，置于冰上30min；42℃水浴热激30s后，立马置于冰上冷却2-3min；加入500μL SOC培养基，置于37℃摇床中220rpm培养1h；取适量细胞均匀地涂在氨苄抗性的LB平板中，置于37℃培养箱中过夜培养。

4.4.阳性质粒鉴定及质粒提取

从过夜培养的LB平板中各挑取5-10个单菌落，用鉴定引物初步挑取阳性克隆，将挑取的阳性克隆菌液送生工生物(上海)有限公司测序，测序正确的菌株进行扩大培养并按质粒小提试剂盒提取质粒进行备用。

4.5.质粒转染及病毒拯救

转染之前，先将293T细胞及MDCK细胞按1:1的比例传至35mm小皿中，待细胞长至80％-90％左右汇合度时，弃去旧培养基，换入1.5ml opti-mem培养基；按照LipofectamineLTX Reagent with PLUS Reagent说明书，取禽流感病毒的8个重组质粒HA、NA、NP、PB1、PB2、PA、M、NS各1μg的量混合均匀后转染至上述细胞，转染6-8h后，将小皿中的液体弃去，换入2ml新鲜的opti-mem培养基，30h后补加1ml opti-mem，同时补加TPCK胰酶至终浓度为1μg/mL，48h后将细胞反复冻融3次，回收冻融液，一部分用于测HA，一部分用于接种spf鸡胚，拯救出病毒命名为H9N2-rDA株。

参考图2，结果显示，回收的冻融液HA可达9log₂以上，说明转染后的第一代即有大量病毒粒子的形成，拯救效率高。

4.6.H9N2-rDA株与亲本毒H9N2-DA株EID50的测定

按照中华人民共和国兽药典三部附录3402病毒半数致死量、感染量测定法，测定拯救毒株H9N2-rDA株与亲本毒株H9N2-DA株的鸡胚半数感染量EID50。结果显示，两者的EID50差异不显著，H9N2-rDA株EID50为10^8.5/0.1ml，H9N2-DA株EID50为10^8.8/0.1ml，说明拯救出的病毒具有与亲本毒相似的鸡胚感染性及增殖特性。

参考图3，图3为H9N2-rDA病毒株感染细胞后48h病变图。

5.各相关载体以及片段序列

(1)PHW2000序列(SEQ ID NO：18)：

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(2)H9N2-DA株HA基因序列(SEQ ID NO：19)：

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(3)H9N2-DA株NA基因序列(SEQ ID NO：20)：

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(4)H9N2-DA株NP基因序列(SEQ ID NO：21)：

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(5)H9N2-DA株PB1基因序列(SEQ ID NO：22)：

agcgaaagcaggcaaaccatttgaatggatgtcaatccgactttacttttcttaaaagtgccagtgcaaaatgctataagtaccactttcccttatactggagaccctccatacagccatggaacaggaacaggatacaccatggacacagtcaacagaacacataaatactcagaaaaaggaaagtggacaacgaacacagagactggagcaccccaactcaatccaattgatggaccattacctgaggacaacgagccgagtgggtatgcacaaacggattgtgtattggaagcaatggctttccttgaagaatctcacccagggatctttgaaaactcgtgtctcgaaacgatggaaattgttcagcaaacaagagtggataaactgacccaaggccgccagacctatgactggacgttgaatagaaatcagccggctgctaccgcattggccaacactatagaggtattcagatcgaatggcctgacagccaatgaatcaggaaggttgatcgatttcctcaaggacgtgatggattcaatggataaggaagaaatggagattacaacacatttccagaggaagaggagagtgagggacaacatgaccaagaaaatggtcacacagagaacaatagggaagaaaaaacaaagactgaacaaaaggagctacctaataagagcactgacattgaacacaatgacaaaggatgctgaaagaggcaagttgaaaaggagggcaatagcaacacccgggatgcaaatcagaggattcgtgtattttgtagaagcactagcgaggagcatctgtgagaaacttgagcaatctggcctccctgtcggagggaatgagaagaaggctaaattggcaaatgttgtgaggaagatgatgactaattcacaagatacagagctctccttcacaattactggggacaacaccaaatggaatgagaatcaaaacccccggatgtttctagcaatgataacatacatcacaagaaaccagccagaatggtttagaaatgtcttaagcattgctcctataatgttctcaaacaagatggcgagattaggaaaagggtacatgttcgaaagtaagagtatgaagttacggacacaagtaccagcggaaatactcgcaaatattgacctgaaatacttcaacaaatcaacaagagagaaaatcgagaaaataagacctctactggtagatggcacagcctcattgagtcctggaatgatgatgggcatgttcaacatgttgagtacagtcttaggagtttcaattctgaatctcgggcagaagaagtacaccaaaaccacatattggtgggacggactccaatcctcagatgacttcgccctcatagtgaatgcaccgaatcatgagggaatacaggcaggagtagataggttctatagaacctgcaaattagttgggataaacatgagcaagaagaaatcctacataaatcggacaggaacattcgaattcacaagctttttctaccgctatgggttcgtagctaacttcagtatggagttgcccagttttggagtgtccgggattaatgagtcagctgacatgagcgttggtgttacagtaataaaaaacaatatgataaacaacgatcttggaccagcaacagcccaaatggcccttcagctatttatcaaagactacagatacacataccgatgtcacaggggtgatacgcaaattcaaacgaggagagcattcgagctgaagaagctgtgggagcagacccgttcgaaggcaggactgttggtttcagatggagggccaaacctgtacaatatccggaacctccacattccagaggtctgtttgaaatgggaattgatggatgaagactaccaaggcaggttgtgtaatcctatgaatccgtttgtcagtcataaggaaattgattcagtcaacaatgctgtggtgatgccagctcatggcccagccaaaagcatggagtatgatgccgttgcaaccacacattcatggattcctaagaggaatcgctccattctcaacaccagccaaagggggattcttgaggacgaacagatgtaccagaagtgctgcaacctattcgaaaagttcttccccagcagttcgtacaggaggccagttggaatttccagtatggtggaggccatggtgtctagggcccgaattgatgcacgaattgacttcgaatctggaaggattaagaaagaagagtttgctgagatcatgaagatctgttccaccattgaagagctcagacggcaaaaatagtgaatttagcttgtccttcatgaaaaaatgccttgtttctact

(6)H9N2-DA株PB2基因序列(SEQ ID NO：23)：

agcgaaagcaggtcaaatatattcaatatggaaagaataaaagaactaagagatttgatgtcacagtctcgcactcgcgagatactgacaaaaacaactgtggaccatatggccataatcaagaaatacacatcgggaagacaggagaagaatcctgcccttaggatgaagtggatgatggcgatgaagtatccaattacagcagacaaaaggataatggagatgatcccggaaaggaatgagcaaggtcagaccctttggagcaagacaaatgatgctggatcagacagagtgatggtgtcacctctggctgtgacgtggtggaacagaaatggaccaacgacaagcacagtccattatccaaaggtctataaaacctattttgaaaaggtcgaaagactaaaacatgggaccttcggccccgttcacttccgaaaccaggttaaaatacgacgcagggtcgacataaacccaggccacgcagatcttagtgctaaggaagcacaagatgtcatcatggaggtcgtattcccaaacgaagttggagccagaatattgacatcagagtcacagttaacgataaccaaggaaaagaaggaggagcttcaagactgcaaaatagcccctttaatggtggcttacatgttggagagggaactggttcgcaaaacaagatttctaccagtagctggagggacaagcagcgtgtatatcgaagtattacatttgacccaagggacctgctgggagcaaatgtacacaccaggaggggaagtgagaaatgatgatgttgatcagagtttaattattgctgctagaaatattgttagaagagcaacagtgtcagcagacccgttggcttcgcttttggagatgtgccatagtacacagattggcggggttaggatggttgacatccttagacaaaacccaacagaagaacaggctgtggatatatgtaaggcagcaatgggcctaaggatcagttcatccttcagctttggaggtttcactttcaaaaggacaagtgggtcatctgtcaaaaaggaagaagaagtgctcacaggcaacctccaaacattgaaaataagagtacatgagggatatgaggaattcacaatggttgggcgaagagcaacagccattctaaggaaagcaaccagaagactgatccaattgatagtgagtgggaaagacgagcaatcaattgccgaggcaatcatagtggcaatggtattctcacaagaggattgtatgataaaggcagtgagaggtgatttgaactttgtcaacagagcaaatcagaggctaaatcccatgcatcaactcctgaggcatttccaaaaggatgcaaaggtcctgtttcaaaactggggaattgaacccattgacaatgtaatggggatgatcggaatattgcctgacatgacccccagcacagagatgtcattgagaggagtgagagttagtaaaatgggagtagatgaatattccagtactgagagagtggtcgtgagtattgatcgtttcttgagggtccgagaccagaggggaaacgtactcctgtctcctgaagaggttagtgaaacacagggaacagaaaagctgactataacatattcatcgtccatgatgtgggagatcaatggtccggaatcagtgctagttaacacatatcaatggatcattagaaactgggaaactgtaaagattcaatggtcccaagatcctacaatgctatacaataagatggaatttgaaccctttcaatccctagtgcctaaagctgtcagaggccaatatagtgggttcgtaagggttctattccaacagatgcgtgacgtactggggacatttgacactgtccaaataataaagctattaccatttgcagcagccccgccggagcagagtaggatgcagttctcttctctaactgtgaatgtgaggggttcaggaatgagaatagttgtgagaggcaattctcctgtgttcaactacaacaaggcaaccaaaaggcttacggtgcttgggaaggatgcaggtgcattggtggaagacccagatgagggaacagcaggagtggaatctgcagtattgaggggatttctgattctgggcaaagaagacaagagatatgggccagcattgagcatcaatgaattgagcaatcttgcgaaaggagagaaggctaatgtgttgatagggcaaggagacgtggtgttggtaatgaaacggaaacgggactctagcatacttactgacagtcagacagcgaccaaaaggattcggatggccatcaattaatgtcgaattgtttaaaaacgaccttgtttctac

(7)H9N2-DA株PA基因序列(SEQ ID NO：24)：

agcaaaagcaggtactgatccaaaatggaagactttgtgcgacaatgcttcaatccaatgatcgtcgagcttgcggaaaaggcaatgaaagaatatggggaagatccgaaaatcgaaacaaacaaattcgcatcaatatgcacacacttagaagtctgcttcatgtattctgatttccacttcatcgacgaacggggcgaatcaactattatagaatctggcgatccaaatgtgttgttgaaacatcggtttgaaataatcgaagggagagaccgaacaatggcctggacagtggtgaatagtatctgcaacaccacgggagtcgaaaaacccaaatttctcccggatctgtatgactacaaggaaaaccgattcattgaaattggagtgacgaggagggaagtccacatatattacctagagaaagccaataaaataaaatccgagaagacacacatacacattttctcattcactggagaagagatggccaccaaagcagattacactcttgatgaagaaagcagggcaagaatcaaaaccaggctgttcaccataaggcaggaaatggccagcaggggtctatgggattcctttcgtcagtccgaaagaggcgaagaaacaattgaagaaagatttgaaatcacaggaaccatgcgcaggcttgccgaccaaagtctcccaccgaacttctccagccttgaaaactttagagcctatgtggatggattcgaaccgaacggctgcattgagggcaagctttctcaaatgtcaaaagaagtgaacgccagaatcgagccatttctaaggacaacaccacgaccgctcagattgcctaatgggcctccctgttctcagcggtcgaaattcttgctgatggatgctctgaaattaagcattgaagacccgagccacgaaggggaggggataccgctatatgatgcgatcaaatgcatgaaaacgttcttcgggtggaaagagcccaacattatcaaaccacatgagaagggcataaaccccaactatctcctgacttggaagcaggtgctatcagaacttcaggacattgaaaatgaagagaagattccaaggacaaaaaacatgaagaaaacaagccaattaaagtgggcactcggtgagaacatggcaccagagaaggtggactttgaggattgtaaagatgtcaacgacctgaaacagtatgacagtgatgagccagagcccagatcactagcatgttggatccagaatgaattcaacaaggcatgtgaattaactgattcaagctgggtagaacttgatgaaataggggaagatgttgccccaatcgaacacattgcaagcatgagaaggaactattttacagcagaggtgtcccactgcagggctactgaatacataatgaagggagtgtacataaatacagctttgctcaatgcatcttgtgcagccatggatgactttcaactgattccaatgataagtaaatgcagaaccaaagaaggaagacggaaaacaaacctatatggattcattataaaaggaagatctcatttgaggaatgataccgatgtggtgaactttgtaagtatggaattttcccttaccgacccaaggttggaaccacataaatgggaaaagtattgtgttctcgaaataggggatatgctcctgcgaactgcagtaggccaagtgtcaagacccatgtttctgtatgtgagaaccaatgggacctccaagatcaagatgaaatggggtatggaaatgagacgctgccttctccaatctctccaacagattgagagcatgattgaagctgaatcctccgtcaaagagaaagacctgaccaaagaattctttgaaaacaaatcagaaacatggccaattggagaatcacctaagggagtggaggaaggttccattgggaaggtgtgcagaaccttactagcaaaatctgtattcaatagcctatatgcatctccgcaactcgaggggttctcagctgaatcgagaaaactgctactcattgttcaggcacttagggataacctggaacctggaaccttcgatcttgaggggctatatgaagcaatcgaggagtgcctgattaatgatccctgggttttgcttaatgcatcttggttcaactccttcctcacacatgcactaagatagttgtggcaatgctactatttgctatccatactgtccaaaaaagtaccttgtttctact

(8)H9N2-DA株M基因序列(SEQ ID NO：25)：

agcgaaagcaggtagatgtttaaagatgagtcttctaaccgaggtcgaaacgtacgttctctctatcattccatcaggccccctcaaagccgagatcgcgcagagacttgaggatgtttttgcagggaagaacgcagatctcgaggctctcatggagtggataaagacaagaccaatcctgtcacctctgactaaggggattttagggtttgtgttcacgctcaccgtgcccagtgagcgaggactgcagcgtagacggtttgtccaaaacgccctaaatgggaatggagacccaaacaacatggacaaggcagttaaactatacaagaaactgaagagggaaatgacatttcatggagcaaaggaagttgcactcagttactcaactggtgcgcttgccagctgcatgggtctcatatacaacaggatggggacagtaactgcagaaggggctcttggattggtatgtgccacttgtgagcagattgctgacgcacaacatcggtcccacaggcagatggcaactactaccaacccactaattaggcatgagaatagaatggtactagccagtactacggctaaggctatggagcagatggctggatcaagtgaacaggcagcggaagccatggaagtcgcaagccaggctaggcaaatggtgcaggctatgagaacagtcgggactcaccctaactccagtacaggtctaaaggatgatcttattgaaaatttgcaggcctaccagaaccggatgggagtgcaactgcagcggttcaagtgacccactcgttgttgcagctaacattattgggatattgcacctgatattgtggattcttgatcgtcttttcttcaaatgcatttatcgtcgctttaaatacggtttgaaaagagggccttctacggaaggaatgcctgagtctatgagggaagaatatcggcaggaacagcagaatgctgtggatgttgacgatggtcattttgtcaacatagagctgaagtaaaaaactaccttgtttctact

(9)H9N2-DA株NS基因序列(SEQ ID NO：26)：

agcaaaagcagggtgacaaaaacataatggattccaatactgtgtcaagcttccaggtagactgctttctttggcatgtccgcaaacgatttgcagaccaagaaatgggtgatgccccatttctagaccggcttcgccgagatcagaagtccctgagaggaagaagcagcactcttggtctggacatcagaactgccacacgtgaaggaaagcatatagtggagcggattttagaggaagagtcagatgaagcatttaaaatgagtattgcttcagtgccagctccacgctatctaactgacatgactcttgaagaaatgtcaagagattggttaatgctcattcccaaacagaaaataacagggtccctatgcattagaatggaccaagcaatagtggacaaaaccatcacattgaaatcaaatttcagtgtgattttcaatcggcttgaagccctgatactacttagagcttttacggaagaaggagcaatagtaggcgaaatctcaccattaccttctcttccaggacatactgacaaggatgtcaaaaatgcaattgagatcctcatcggaggatttgaatggaatgataacacagttcgagtctctgaaactctacagagattcgcttggagaagcagcgatgaggatgggagatctccactctctacaaagtagaaacgggaaatggagagaacagttaagccagaagttcgaagagataagatggttgattgaagaagtacgacatagattaaaaattacggagaatagctttgagcaaataacttttatgcaagccttacaactattgcttgaagtggagcaagagataagaactttctcgtttcagcttatttaatgataaaaaacacccttgtttctact

序列表

<110> 华农（肇庆）生物产业技术研究院有限公司

<120> 一种基于无缝克隆技术的H9N2亚型禽流感病毒的拯救方法

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> DNA

<213> U12(人工序列)

<400> 1

agcaaaagca gg 12

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> HA-F(人工序列)

<400> 2

gaagttgggg gggaagcaaa agcaggggaa 30

<210> 3

<211> 38

<212> DNA

<213> HA-R(人工序列)

<400> 3

ttgggccgcc gggttattag tagaaacaag ggtgtttt 38

<210> 4

<211> 29

<212> DNA

<213> NA-F(人工序列)

<400> 4

gaagttgggg gggaagcaaa agcaggagt 29

<210> 5

<211> 40

<212> DNA

<213> NA-R(人工序列)

<400> 5

ttgggccgcc gggttattag tagaaacaag gagttttttc 40

<210> 6

<211> 36

<212> DNA

<213> NP-F(人工序列)

<400> 6

gaagttgggg gggaagcaaa agcagggtag ataatc 36

<210> 7

<211> 40

<212> DNA

<213> NP-R(人工序列)

<400> 7

ttgggccgcc gggttattag tagaaacaag ggtatttttc 40

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> PB1-F(人工序列)

<400> 8

gaagttgggg gggaagcgaa agcaggcaaa cc 32

<210> 9

<211> 40

<212> DNA

<213> PB1-R(人工序列)

<400> 9

ttgggccgcc gggttattag tagaaacaag gcattttttc 40

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> PB2-F(人工序列)

<400> 10

gaagttgggg gggaagcgaa agcaggtcaa 30

<210> 11

<211> 36

<212> DNA

<213> PB2-R(人工序列)

<400> 11

ttgggccgcc gggttattag tagaaacaag gtcgtt 36

<210> 12

<211> 31

<212> DNA

<213> PA-F(人工序列)

<400> 12

gaagttgggg gggaagcaaa agcaggtact g 31

<210> 13

<211> 34

<212> DNA

<213> PA-R(人工序列)

<400> 13

ttgggccgcc gggttattag tagaaacaag gtac 34

<210> 14

<211> 32

<212> DNA

<213> M-F(人工序列)

<400> 14

gaagttgggg gggaagcgaa agcaggtaga tg 32

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> M-R(人工序列)

<400> 15

ttgggccgcc gggttattag tagaaacaag gtag 34

<210> 16

<211> 31

<212> DNA

<213> NS-F(人工序列)

<400> 16

gaagttgggg gggaagcaaa agcagggtga c 31

<210> 17

<211> 38

<212> DNA

<213> NS-R(人工序列)

<400> 17

ttgggccgcc gggttattag tagaaacaag ggtgtttt 38

<210> 18

<211> 2980

<212> DNA

<213> PHW2000序列(人工序列)

<400> 18

ctagcagtta accggagtac tggtcgacct ccgaagttgg gggggaggag acggtaccgt 60

ctccaataac ccggcggccc aaaatgccga ctcggagcga aagatatacc tcccccgggg 120

ccgggaggtc gcgtcaccga ccacgccgcc ggcccaggcg acgcgcgaca cggacacctg 180

tccccaaaaa cgccaccatc gcagccacac acggagcgcc cggggccctc tggtcaaccc 240

caggacacac gcgggagcag cgccgggccg gggacgccct cccggcggtc acctaaatgc 300

tagagctcgc tgatcagcct cgactgtgcc ttctagttgc cagccatctg ttgtttgccc 360

ctcccccgtg ccttccttga ccctggaagg tgccactccc actgtccttt cctaataaaa 420

tgaggaaatt gcatcgcatt gtctgagtag gtgtcattct attctggggg gtggggtggg 480

gcaggacagc aagggggagg attgggaaga caatagcagg catgctgggg atgcggtggg 540

ctctatggct tctgaggcgg aaagaaccag ctgcattaat gaatcggcca acgcgcgggg 600

agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg 660

gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca 720

gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac 780

cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac 840

aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg 900

tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac 960

ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc aatgctcacg ctgtaggtat 1020

ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag 1080

cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac 1140

ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt 1200

gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca ctagaaggac agtatttggt 1260

atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc 1320

aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga 1380

aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac 1440

gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc 1500

cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct 1560

gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag cgatctgtct atttcgttca 1620

tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga tacgggaggg cttaccatct 1680

ggccccagtg ctgcaatgat accgcgagac ccacgctcac cggctccaga tttatcagca 1740

ataaaccagc cagccggaag ggccgagcgc agaagtggtc ctgcaacttt atccgcctcc 1800

atccagtcta ttaattgttg ccgggaagct agagtaagta gttcgccagt taatagtttg 1860

cgcaacgttg ttgccattgc tacaggcatc gtggtgtcac gctcgtcgtt tggtatggct 1920

tcattcagct ccggttccca acgatcaagg cgagttacat gatcccccat gttgtgcaaa 1980

aaagcggtta gctccttcgg tcctccgatc gttgtcagaa gtaagttggc cgcagtgtta 2040

tcactcatgg ttatggcagc actgcataat tctcttactg tcatgccatc cgtaagatgc 2100

ttttctgtga ctggtgagta ctcaaccaag tcattctgag aatagtgtat gcggcgaccg 2160

agttgctctt gcccggcgtc aatacgggat aataccgcgc cacatagcag aactttaaaa 2220

gtgctcatca ttggaaaacg ttcttcgggg cgaaaactct caaggatctt accgctgttg 2280

agatccagtt cgatgtaacc cactcgtgca cccaactgat cttcagcatc ttttactttc 2340

accagcgttt ctgggtgagc aaaaacagga aggcaaaatg ccgcaaaaaa gggaataagg 2400

gcgacacgga aatgttgaat actcatactc ttcctttttc aatattattg aagcatttat 2460

cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttagaaaaa taaacaaata 2520

ggggttccgc gcacatttcc ccgaaaagtg ccacctgacg tcgatatgcc aagtacgccc 2580

cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta catgacctta 2640

tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac catggtgatg 2700

cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg atttccaagt 2760

ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg ggactttcca 2820

aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt acggtgggag 2880

gtctatataa gcagagctct ctggctaact agagaaccca ctgcttactg gcttatcgaa 2940

attaatacga ctcactatag ggagacccaa gctgttaacg 2980

<210> 19

<211> 1742

<212> DNA

<213> H9N2-DA株 HA基因序列(人工序列)

<400> 19

agcaaaagca ggggaatttc acaaccactc aagatggaga cagtatcact aataactata 60

ctactagtag caacagtaag caatgcagat aaaatctgca tcggctatca atcaacaaac 120

tccacagaaa ctgtggacac actaacagaa aacaatgtcc ctgtgacaca tgccaaagaa 180

ctgctccaca cagagcataa tgggatgctg tgtgcaacaa gcttgggaca acctcttatt 240

ttagacacct gcaccattga agggctaatc tatggcaatc cttcttgtga tctatcgctg 300

gaaggaagag aatggtccta tatcgtcgag agaccatcag ctgtcaacgg attgtgttac 360

cccgggaatg tagaaaatct agaagagcta aggtcacttt ttagttctgc taggtcttat 420

caaagaatcc agattttccc agacacaatc tggaatgtgt cttacgatgg gacaagcaca 480

gcatgctcag gttcattcta cagaagcatg agatggttga ctcgaaagaa cggcgattac 540

cctgtccaag acgcccaata cacaaataat caagggaaga acattctttt catgtggggc 600

atacatcacc cacccaccga tactacgcag agaaatctgt acacgagaaa cgacacaaca 660

acgagtgtgg caacagaaga aataaatagg atcttcaaac cattgatagg accaaggcct 720

cttgtcaacg gtttgatggg aagaattgat tattattggt ctgtattgaa accgagtcaa 780

acactgcgaa taaaatctga tgggaatcta atagctccat ggtatggaca cattctttca 840

ggagagagcc acggaagaat tctgaagact gatttaaaaa ggggtagctg cacagtgcaa 900

tgtcagacag agaaaggtgg cttaaacaca acactgccat tccaaaatgt aagtaagtat 960

gcatttggaa actgctcaaa atacattggc ataaagagtc tcaaacttgc agttggtctg 1020

aggaatgtgc cttctagatc tagtagagga ctattcgggg ccatagcagg gtttatagag 1080

ggaggttggt cagggctagt tgctggttgg tatgggttcc agcattcaaa tgaccaaggg 1140

gttggtatgg cagcagatag agactcaacc caaaaggcaa ttgataaaat aacatccaaa 1200

gtgaataata tagtcgacaa aatgaacaag cagtatgaaa tcattgatca tgaattcagt 1260

gaggtagaaa ctagacttaa catgatcaat aataagattg atgatcaaat ccaggatata 1320

tgggcatata atgcagaatt gctagttctg cttgaaaacc agaaaacact cgatgagcat 1380

gacgcaaatg taaacaatct atataataaa gtaaagaggg cgttgggttc caatgcggtg 1440

gaagatggga aaggatgttt cgagctatac cacaaatgtg atgaccaatg catggagaca 1500

attcgaaacg ggacctacaa cagaaggaag tatcaagagg agtcaaaatt agaaagacag 1560

aaaatagagg gggtcaagct ggaatctgaa ggaacttaca aaatcctcac catttattcg 1620

actgttgcct catctcttgt gattgcaatg gggtttgctg ccttcttgtt ctgggccatg 1680

tccaatgggt cttgcagatg caacatttgt atataattgg caaaaacacc cttgtttcta 1740

ct 1742

<210> 20

<211> 1458

<212> DNA

<213> H9N2-DA株 NA基因序列(人工序列)

<400> 20

agcaaaagca ggagtgaaaa tgaatccaaa tcagaagata acagcaattg gctctgtttc 60

tctgatcatt gcgataatat gtctcctcat gcaaattgcc atcttaacaa cgactatgac 120

attacatttc aggcagaaag aatgcagtaa cccatcgaat aatcaagtga tgccatgtga 180

accgatcata atagaaagga acacagtgca tttgaatagt actaccatag agagggaaat 240

ttgtcctaaa gtagcagaat ataagaattg gtcaaaacca caatgtctaa ttacagggtt 300

cgctcctttc tcaaaggaca actcaattag gctttctgca ggtggggata tctgggtaac 360

aagagaacct tatgtctcat gcagtcccga caaatgttat caatttgcac ttgggcaggg 420

aaccaccctg aaaagcaagc actcaaatgg cactacacat gatagaaccc ctcacagaac 480

tcttttaatg aatgagttag gtgtcccatt tcatttggga accaaacaag tgtgtatagc 540

atggtctagt tcaagctgct atgatggaaa agcatggtta catatatgtg ttactgggga 600

tgataaaaat gctactgcta gtatcatcta tgatgggatg cttgttgaca gtattggctc 660

atggtccaaa aacatcctca gaactcagga gtcagaatgc gtttgcatca atggaacttg 720

tgcagtggta atgactgatg gaagtgcatc aggagtggcc gacactagag tattattcat 780

aagagaagga aaaattataa atattagacc attgtcagga agtgctcagc acgttgagga 840

atgctcctgt tatccccggt atcctgaaat taggtgtgtt tgcagagaca attggaaggg 900

ctccaatagg cccattatat atataaatat ggctgattat agcattgagt ccagttatgt 960

gtgctcagga cttgttggcg acacaccaag aaatgatgat agctccagca gcagcaactg 1020

cagagaccct aataacgaaa gaggggcccc aggagtgaaa gggtgggctt ttgacgacgg 1080

gaatgatgtt tggatgggac ggacaatcaa aaatggttca cgctcaggtt atgagacttt 1140

tagggtcata aatggttgga ccatggctaa ttcaaagtca cagataaata ggcaagtcat 1200

agttgacagt gacgactggt ctgggtattc cggcatcttc tctgttgaag gcaaaaaatg 1260

catcaacagg tgcttttatg tggagttgat aagagggaga ccacaggaac ccagagtgtg 1320

gtggacatca aatagcatca ttgtattctg tgggacctca ggtacatatg ggacaggctc 1380

atggcctgat ggagcgaata tcaacttcat gcctatataa gctttcgcaa ttttagaaaa 1440

aaactccttg tttctact 1458

<210> 21

<211> 1565

<212> DNA

<213> H9N2-DA株 NP基因序列(人工序列)

<400> 21

agcaaaagca gggtagataa tcactcactg agtgacatca acatcatggc gtctcaaggc 60

accaaacgat cctatgaaca gatggaaact ggtggggaac gccagaatgc tactgagatc 120

agggcatctg ttggaagaat ggttagcggc attgggagat tctacataca gatgtgtaca 180

gaactcaaac tcagtgacaa tgaagggagg ctgattcaga acagtataac aatagagaga 240

atggtactct ctgcatttga tgaaagaagg aacagatact tggaagagca ccccagtgca 300

ggaaaggacc ctaagaaaac tggaggtcca atttacagga gaagagacgg aaaatgggtg 360

agagagctga tcctgtatga taaagaggaa atcaggagaa tttggcgaca agcgaacaat 420

ggagaggatg caactgctgg tcttacccat ctgatgatat ggcattccaa cctgaatgat 480

gctacctatc agagaacgag agctctcgtg cgtactggaa tggatccccg gatgtgctct 540

ctgatgcaag gatcaactct cccaaggaga tctggagctg caggtgcagc agtgaagggg 600

atagggacaa tggtgatgga actgattcgg atgataaaac gagggatcaa cgaccggaat 660

ttctggagag gcgaaaatgg aagaaggaca agaattgcat atgagagaat gtgcaacatc 720

ctcaaaggga aattccaaac agcagcacaa agggcaatga tggatcaagt gcgagagagc 780

agaaatcctg ggaatgctga aatagaagat ctcatttttc tggcaaggtc tgcactcatc 840

ctgagaggat cagtggctca taaatcctgc ttgcctgctt gtgtgtacgg acttgcagtg 900

gctagtggat atgactttga gagagaaggg tactccttgg ttggaataga tcctttccgt 960

ctgcttcaaa acagccaggt ctttagtctc attagaccaa atgagaaccc agcacataag 1020

agccaactag tgtggatggc atgccactct gcagcgtttg aggaccttag ggtctcaagt 1080

ttcattagag ggacaagaat ggtcccaaga ggacagctat ccactagagg ggttcaaatt 1140

gcttcaaatg agaacatgga agcaatggac tccaatactc ttgaactgag aagtagatat 1200

tgggctataa gaaccagaag cggagggaac accaaccaac agagggcatc tgcaggacag 1260

gtcagcgttc aacccacttt ctcagtacag agaaaccttc ctttcgaaag agcaaccatt 1320

atggcagcat ttacaggaaa tactgagggt agaacgtctg acatgaggac tgaaatcata 1380

agaatgatgg aaagtgccag accagaagat gtgtcattcc aggggcgggg agtcttcgag 1440

ctctcggacg aaaaggcaac gaacccgatc gtgccttcct ttgacatgaa taatgaagga 1500

tcttatttct tcggagacaa tgcagaggag tatgacaatt gaagaaaaat acccttgttt 1560

ctact 1565

<210> 22

<211> 2341

<212> DNA

<213> H9N2-DA株 PB1基因序列(人工序列)

<400> 22

agcgaaagca ggcaaaccat ttgaatggat gtcaatccga ctttactttt cttaaaagtg 60

ccagtgcaaa atgctataag taccactttc ccttatactg gagaccctcc atacagccat 120

ggaacaggaa caggatacac catggacaca gtcaacagaa cacataaata ctcagaaaaa 180

ggaaagtgga caacgaacac agagactgga gcaccccaac tcaatccaat tgatggacca 240

ttacctgagg acaacgagcc gagtgggtat gcacaaacgg attgtgtatt ggaagcaatg 300

gctttccttg aagaatctca cccagggatc tttgaaaact cgtgtctcga aacgatggaa 360

attgttcagc aaacaagagt ggataaactg acccaaggcc gccagaccta tgactggacg 420

ttgaatagaa atcagccggc tgctaccgca ttggccaaca ctatagaggt attcagatcg 480

aatggcctga cagccaatga atcaggaagg ttgatcgatt tcctcaagga cgtgatggat 540

tcaatggata aggaagaaat ggagattaca acacatttcc agaggaagag gagagtgagg 600

gacaacatga ccaagaaaat ggtcacacag agaacaatag ggaagaaaaa acaaagactg 660

aacaaaagga gctacctaat aagagcactg acattgaaca caatgacaaa ggatgctgaa 720

agaggcaagt tgaaaaggag ggcaatagca acacccggga tgcaaatcag aggattcgtg 780

tattttgtag aagcactagc gaggagcatc tgtgagaaac ttgagcaatc tggcctccct 840

gtcggaggga atgagaagaa ggctaaattg gcaaatgttg tgaggaagat gatgactaat 900

tcacaagata cagagctctc cttcacaatt actggggaca acaccaaatg gaatgagaat 960

caaaaccccc ggatgtttct agcaatgata acatacatca caagaaacca gccagaatgg 1020

tttagaaatg tcttaagcat tgctcctata atgttctcaa acaagatggc gagattagga 1080

aaagggtaca tgttcgaaag taagagtatg aagttacgga cacaagtacc agcggaaata 1140

ctcgcaaata ttgacctgaa atacttcaac aaatcaacaa gagagaaaat cgagaaaata 1200

agacctctac tggtagatgg cacagcctca ttgagtcctg gaatgatgat gggcatgttc 1260

aacatgttga gtacagtctt aggagtttca attctgaatc tcgggcagaa gaagtacacc 1320

aaaaccacat attggtggga cggactccaa tcctcagatg acttcgccct catagtgaat 1380

gcaccgaatc atgagggaat acaggcagga gtagataggt tctatagaac ctgcaaatta 1440

gttgggataa acatgagcaa gaagaaatcc tacataaatc ggacaggaac attcgaattc 1500

acaagctttt tctaccgcta tgggttcgta gctaacttca gtatggagtt gcccagtttt 1560

ggagtgtccg ggattaatga gtcagctgac atgagcgttg gtgttacagt aataaaaaac 1620

aatatgataa acaacgatct tggaccagca acagcccaaa tggcccttca gctatttatc 1680

aaagactaca gatacacata ccgatgtcac aggggtgata cgcaaattca aacgaggaga 1740

gcattcgagc tgaagaagct gtgggagcag acccgttcga aggcaggact gttggtttca 1800

gatggagggc caaacctgta caatatccgg aacctccaca ttccagaggt ctgtttgaaa 1860

tgggaattga tggatgaaga ctaccaaggc aggttgtgta atcctatgaa tccgtttgtc 1920

agtcataagg aaattgattc agtcaacaat gctgtggtga tgccagctca tggcccagcc 1980

aaaagcatgg agtatgatgc cgttgcaacc acacattcat ggattcctaa gaggaatcgc 2040

tccattctca acaccagcca aagggggatt cttgaggacg aacagatgta ccagaagtgc 2100

tgcaacctat tcgaaaagtt cttccccagc agttcgtaca ggaggccagt tggaatttcc 2160

agtatggtgg aggccatggt gtctagggcc cgaattgatg cacgaattga cttcgaatct 2220

ggaaggatta agaaagaaga gtttgctgag atcatgaaga tctgttccac cattgaagag 2280

ctcagacggc aaaaatagtg aatttagctt gtccttcatg aaaaaatgcc ttgtttctac 2340

t 2341

<210> 23

<211> 2340

<212> DNA

<213> H9N2-DA株 PB2基因序列(人工序列)

<400> 23

agcgaaagca ggtcaaatat attcaatatg gaaagaataa aagaactaag agatttgatg 60

tcacagtctc gcactcgcga gatactgaca aaaacaactg tggaccatat ggccataatc 120

aagaaataca catcgggaag acaggagaag aatcctgccc ttaggatgaa gtggatgatg 180

gcgatgaagt atccaattac agcagacaaa aggataatgg agatgatccc ggaaaggaat 240

gagcaaggtc agaccctttg gagcaagaca aatgatgctg gatcagacag agtgatggtg 300

tcacctctgg ctgtgacgtg gtggaacaga aatggaccaa cgacaagcac agtccattat 360

ccaaaggtct ataaaaccta ttttgaaaag gtcgaaagac taaaacatgg gaccttcggc 420

cccgttcact tccgaaacca ggttaaaata cgacgcaggg tcgacataaa cccaggccac 480

gcagatctta gtgctaagga agcacaagat gtcatcatgg aggtcgtatt cccaaacgaa 540

gttggagcca gaatattgac atcagagtca cagttaacga taaccaagga aaagaaggag 600

gagcttcaag actgcaaaat agccccttta atggtggctt acatgttgga gagggaactg 660

gttcgcaaaa caagatttct accagtagct ggagggacaa gcagcgtgta tatcgaagta 720

ttacatttga cccaagggac ctgctgggag caaatgtaca caccaggagg ggaagtgaga 780

aatgatgatg ttgatcagag tttaattatt gctgctagaa atattgttag aagagcaaca 840

gtgtcagcag acccgttggc ttcgcttttg gagatgtgcc atagtacaca gattggcggg 900

gttaggatgg ttgacatcct tagacaaaac ccaacagaag aacaggctgt ggatatatgt 960

aaggcagcaa tgggcctaag gatcagttca tccttcagct ttggaggttt cactttcaaa 1020

aggacaagtg ggtcatctgt caaaaaggaa gaagaagtgc tcacaggcaa cctccaaaca 1080

ttgaaaataa gagtacatga gggatatgag gaattcacaa tggttgggcg aagagcaaca 1140

gccattctaa ggaaagcaac cagaagactg atccaattga tagtgagtgg gaaagacgag 1200

caatcaattg ccgaggcaat catagtggca atggtattct cacaagagga ttgtatgata 1260

aaggcagtga gaggtgattt gaactttgtc aacagagcaa atcagaggct aaatcccatg 1320

catcaactcc tgaggcattt ccaaaaggat gcaaaggtcc tgtttcaaaa ctggggaatt 1380

gaacccattg acaatgtaat ggggatgatc ggaatattgc ctgacatgac ccccagcaca 1440

gagatgtcat tgagaggagt gagagttagt aaaatgggag tagatgaata ttccagtact 1500

gagagagtgg tcgtgagtat tgatcgtttc ttgagggtcc gagaccagag gggaaacgta 1560

ctcctgtctc ctgaagaggt tagtgaaaca cagggaacag aaaagctgac tataacatat 1620

tcatcgtcca tgatgtggga gatcaatggt ccggaatcag tgctagttaa cacatatcaa 1680

tggatcatta gaaactggga aactgtaaag attcaatggt cccaagatcc tacaatgcta 1740

tacaataaga tggaatttga accctttcaa tccctagtgc ctaaagctgt cagaggccaa 1800

tatagtgggt tcgtaagggt tctattccaa cagatgcgtg acgtactggg gacatttgac 1860

actgtccaaa taataaagct attaccattt gcagcagccc cgccggagca gagtaggatg 1920

cagttctctt ctctaactgt gaatgtgagg ggttcaggaa tgagaatagt tgtgagaggc 1980

aattctcctg tgttcaacta caacaaggca accaaaaggc ttacggtgct tgggaaggat 2040

gcaggtgcat tggtggaaga cccagatgag ggaacagcag gagtggaatc tgcagtattg 2100

aggggatttc tgattctggg caaagaagac aagagatatg ggccagcatt gagcatcaat 2160

gaattgagca atcttgcgaa aggagagaag gctaatgtgt tgatagggca aggagacgtg 2220

gtgttggtaa tgaaacggaa acgggactct agcatactta ctgacagtca gacagcgacc 2280

aaaaggattc ggatggccat caattaatgt cgaattgttt aaaaacgacc ttgtttctac 2340

<210> 24

<211> 2233

<212> DNA

<213> H9N2-DA株 PA基因序列(人工序列)

<400> 24

agcaaaagca ggtactgatc caaaatggaa gactttgtgc gacaatgctt caatccaatg 60

atcgtcgagc ttgcggaaaa ggcaatgaaa gaatatgggg aagatccgaa aatcgaaaca 120

aacaaattcg catcaatatg cacacactta gaagtctgct tcatgtattc tgatttccac 180

ttcatcgacg aacggggcga atcaactatt atagaatctg gcgatccaaa tgtgttgttg 240

aaacatcggt ttgaaataat cgaagggaga gaccgaacaa tggcctggac agtggtgaat 300

agtatctgca acaccacggg agtcgaaaaa cccaaatttc tcccggatct gtatgactac 360

aaggaaaacc gattcattga aattggagtg acgaggaggg aagtccacat atattaccta 420

gagaaagcca ataaaataaa atccgagaag acacacatac acattttctc attcactgga 480

gaagagatgg ccaccaaagc agattacact cttgatgaag aaagcagggc aagaatcaaa 540

accaggctgt tcaccataag gcaggaaatg gccagcaggg gtctatggga ttcctttcgt 600

cagtccgaaa gaggcgaaga aacaattgaa gaaagatttg aaatcacagg aaccatgcgc 660

aggcttgccg accaaagtct cccaccgaac ttctccagcc ttgaaaactt tagagcctat 720

gtggatggat tcgaaccgaa cggctgcatt gagggcaagc tttctcaaat gtcaaaagaa 780

gtgaacgcca gaatcgagcc atttctaagg acaacaccac gaccgctcag attgcctaat 840

gggcctccct gttctcagcg gtcgaaattc ttgctgatgg atgctctgaa attaagcatt 900

gaagacccga gccacgaagg ggaggggata ccgctatatg atgcgatcaa atgcatgaaa 960

acgttcttcg ggtggaaaga gcccaacatt atcaaaccac atgagaaggg cataaacccc 1020

aactatctcc tgacttggaa gcaggtgcta tcagaacttc aggacattga aaatgaagag 1080

aagattccaa ggacaaaaaa catgaagaaa acaagccaat taaagtgggc actcggtgag 1140

aacatggcac cagagaaggt ggactttgag gattgtaaag atgtcaacga cctgaaacag 1200

tatgacagtg atgagccaga gcccagatca ctagcatgtt ggatccagaa tgaattcaac 1260

aaggcatgtg aattaactga ttcaagctgg gtagaacttg atgaaatagg ggaagatgtt 1320

gccccaatcg aacacattgc aagcatgaga aggaactatt ttacagcaga ggtgtcccac 1380

tgcagggcta ctgaatacat aatgaaggga gtgtacataa atacagcttt gctcaatgca 1440

tcttgtgcag ccatggatga ctttcaactg attccaatga taagtaaatg cagaaccaaa 1500

gaaggaagac ggaaaacaaa cctatatgga ttcattataa aaggaagatc tcatttgagg 1560

aatgataccg atgtggtgaa ctttgtaagt atggaatttt cccttaccga cccaaggttg 1620

gaaccacata aatgggaaaa gtattgtgtt ctcgaaatag gggatatgct cctgcgaact 1680

gcagtaggcc aagtgtcaag acccatgttt ctgtatgtga gaaccaatgg gacctccaag 1740

atcaagatga aatggggtat ggaaatgaga cgctgccttc tccaatctct ccaacagatt 1800

gagagcatga ttgaagctga atcctccgtc aaagagaaag acctgaccaa agaattcttt 1860

gaaaacaaat cagaaacatg gccaattgga gaatcaccta agggagtgga ggaaggttcc 1920

attgggaagg tgtgcagaac cttactagca aaatctgtat tcaatagcct atatgcatct 1980

ccgcaactcg aggggttctc agctgaatcg agaaaactgc tactcattgt tcaggcactt 2040

agggataacc tggaacctgg aaccttcgat cttgaggggc tatatgaagc aatcgaggag 2100

tgcctgatta atgatccctg ggttttgctt aatgcatctt ggttcaactc cttcctcaca 2160

catgcactaa gatagttgtg gcaatgctac tatttgctat ccatactgtc caaaaaagta 2220

ccttgtttct act 2233

<210> 25

<211> 1027

<212> DNA

<213> H9N2-DA株 M基因序列(人工序列)

<400> 25

agcgaaagca ggtagatgtt taaagatgag tcttctaacc gaggtcgaaa cgtacgttct 60

ctctatcatt ccatcaggcc ccctcaaagc cgagatcgcg cagagacttg aggatgtttt 120

tgcagggaag aacgcagatc tcgaggctct catggagtgg ataaagacaa gaccaatcct 180

gtcacctctg actaagggga ttttagggtt tgtgttcacg ctcaccgtgc ccagtgagcg 240

aggactgcag cgtagacggt ttgtccaaaa cgccctaaat gggaatggag acccaaacaa 300

catggacaag gcagttaaac tatacaagaa actgaagagg gaaatgacat ttcatggagc 360

aaaggaagtt gcactcagtt actcaactgg tgcgcttgcc agctgcatgg gtctcatata 420

caacaggatg gggacagtaa ctgcagaagg ggctcttgga ttggtatgtg ccacttgtga 480

gcagattgct gacgcacaac atcggtccca caggcagatg gcaactacta ccaacccact 540

aattaggcat gagaatagaa tggtactagc cagtactacg gctaaggcta tggagcagat 600

ggctggatca agtgaacagg cagcggaagc catggaagtc gcaagccagg ctaggcaaat 660

ggtgcaggct atgagaacag tcgggactca ccctaactcc agtacaggtc taaaggatga 720

tcttattgaa aatttgcagg cctaccagaa ccggatggga gtgcaactgc agcggttcaa 780

gtgacccact cgttgttgca gctaacatta ttgggatatt gcacctgata ttgtggattc 840

ttgatcgtct tttcttcaaa tgcatttatc gtcgctttaa atacggtttg aaaagagggc 900

cttctacgga aggaatgcct gagtctatga gggaagaata tcggcaggaa cagcagaatg 960

ctgtggatgt tgacgatggt cattttgtca acatagagct gaagtaaaaa actaccttgt 1020

ttctact 1027

<210> 26

<211> 890

<212> DNA

<213> H9N2-DA株 NS基因序列(人工序列)

<400> 26

agcaaaagca gggtgacaaa aacataatgg attccaatac tgtgtcaagc ttccaggtag 60

actgctttct ttggcatgtc cgcaaacgat ttgcagacca agaaatgggt gatgccccat 120

ttctagaccg gcttcgccga gatcagaagt ccctgagagg aagaagcagc actcttggtc 180

tggacatcag aactgccaca cgtgaaggaa agcatatagt ggagcggatt ttagaggaag 240

agtcagatga agcatttaaa atgagtattg cttcagtgcc agctccacgc tatctaactg 300

acatgactct tgaagaaatg tcaagagatt ggttaatgct cattcccaaa cagaaaataa 360

cagggtccct atgcattaga atggaccaag caatagtgga caaaaccatc acattgaaat 420

caaatttcag tgtgattttc aatcggcttg aagccctgat actacttaga gcttttacgg 480

aagaaggagc aatagtaggc gaaatctcac cattaccttc tcttccagga catactgaca 540

aggatgtcaa aaatgcaatt gagatcctca tcggaggatt tgaatggaat gataacacag 600

ttcgagtctc tgaaactcta cagagattcg cttggagaag cagcgatgag gatgggagat 660

ctccactctc tacaaagtag aaacgggaaa tggagagaac agttaagcca gaagttcgaa 720

gagataagat ggttgattga agaagtacga catagattaa aaattacgga gaatagcttt 780

gagcaaataa cttttatgca agccttacaa ctattgcttg aagtggagca agagataaga 840

actttctcgt ttcagcttat ttaatgataa aaaacaccct tgtttctact 890

Claims (6)

1.一种基于无缝克隆技术的H9N2亚型禽流感病毒的拯救方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤1：提取H9N2亚型禽流感病毒的RNA，并根据RNA获得病毒的cDNA；

步骤2：以cDNA为模板采用8对引物扩增得到H9N2亚型禽流感病毒8个片段的PCR产物；

步骤3：将PHW2000质粒进行酶切得到线性化片段；

步骤4：将H9N2亚型禽流感病毒8个片段的PCR产物分别与线性化的PHW2000载体进行同源重组得到8种重组质粒；

步骤5：将8种重组质粒共同转染293T及MDCK混合培养细胞，得到重组的H9N2病毒；

其中，8对引物的序列分别为如序列表SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：17所示。

2.根据权利要求1所述的基于无缝克隆技术的H9N2亚型禽流感病毒的拯救方法，其特征在于，步骤1中，根据RNA获得病毒的cDNA的引物为U12引物，U12引物的序列如序列表SEQID NO：1所示。

3.根据权利要求1所述的基于无缝克隆技术的H9N2亚型禽流感病毒的拯救方法，其特征在于，所示步骤4中，病毒各片段PCR产物和线性化的PHW2000载体的物质的量比例为2:1。

4.根据权利要求1所述的基于无缝克隆技术的H9N2亚型禽流感病毒的拯救方法，其特征在于，所示步骤5中，293T及MDCK混合细胞的培养通过以下方法制备得到：

将293T细胞及MDCK细胞按1:1的比例传至35mm培养皿中，待细胞长至80％-90％左右汇合度时，弃去旧培养基，换入1.5ml opti-mem培养基。

5.根据权利要求4所述的基于无缝克隆技术的H9N2亚型禽流感病毒的拯救方法，其特征在于，转染方法具体为：按照Lipofectamine LTX Reagent with PLUS Reagent说明书，取禽流感病毒的8种重组质粒各1μg的量混合均匀后转染293T及MDCK混合培养细胞，转染6-8h后，将小皿中的液体弃去，换入2ml新鲜的opti-mem培养基，30h后补加1ml opti-mem，同时补加TPCK胰酶至终浓度为1μg/mL，48h后将细胞反复冻融3次，回收冻融液，接种spf鸡胚，拯救出病毒命名为H9N2-rDA株。

6.根据权利要求1所述的基于无缝克隆技术的H9N2亚型禽流感病毒的拯救方法，其特征在于，步骤1中，提取H9N2亚型禽流感病毒的RNA的方法为：参照Axygen AxyPrep BodyFluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit使用说明书进行病毒RNA抽提；

步骤1中，根据RNA获得病毒的cDNA的具体方法为：

(1)取病毒RNA 20.5μL，加入2μL U12引物混合均匀，置于70℃水浴锅中10min；

(2)取出RNA和U12引物混合物，置于冰上放置2-3min后，5000-8000rpm离心30s；

(3)按如下体系加入试剂：

RNA和U12引物混合物22.5μL；

5×Reverse Transcriptase M-MLV Buffer 8μL；

dNTP Mixture 8μL；

RNase Inhibitor 0.5μL；

Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-)1μL；

将上述体系混合均匀后，置于37℃水浴锅中反应1.5h，得到病毒cDNA模板，保存于-20℃备用。

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