CN113943751A - 一种用于h7n9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种用于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法，其包括如下步骤：PCR扩增目标基因片段、目的基因包装到载体中、转染、慢病毒分离和检测、测定HA蛋白表达情况、测定血清杀伤活性。本发明有着如下有益效果：本发明构建的细胞株高效均一地表达HA蛋白，在普通二级实验室即可操作，为测定H7N9血清杀伤效应提供稳定、可靠的靶细胞来源；本发明提供的细胞系带有ZSgreen荧光报告基因，无需额外的标记，且能区分靶细胞与效应细胞；本发明建立的检测H7N9禽流感免疫血清Fc效应的方法，为全面认识H7N9疫苗的免疫保护机理提供有力工具；除了针对特定的病菌外，本发明还可以对其他家禽疫苗抗体Fc免疫效应的测定提供了技术参考。

Description

一种用于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定 方法

技术领域

本发明涉及生物技术技术领域，特别是涉及一种用于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法。

背景技术

H7N9亚型禽流感是2013年新发的人兽共患传染病，给家禽养殖与公共卫生安全带来了重大威胁。目前，研究者已经研制了众多的H7N9亚型禽流感候选疫苗株。除了传统的血清学指标，包括血凝抑制(HI)与病毒中和(VN)抗体外，抗体介导的Fc免疫效应对于疫苗保护力也具有重要贡献。

IgG抗体的Fab区负责识别并结合抗原，主要负责介导HI与VN活性。IgG Fc区结合免疫效应细胞表面的Fc受体，激活抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)及抗体依赖的补体介导的杀伤作用(ADCML)免疫杀伤效应，诱导对病原的杀伤作用。但是，对于流感疫苗，尤其是禽流感疫苗，仍缺少特异、准确、标准的免疫效应检测方法。

抗体免疫杀伤效应的检测方法主要包括靶细胞、效应细胞与待测抗体三个组分。其中，靶细胞是影响检测方法灵敏度与特异性的关键因素。对于流感疫苗而言，现有的大多数检测技术使用流感病毒感染的细胞作为靶细胞。但是，这种方法存在以下缺陷：1)病毒感染的剂量与时间等实验参数难以标准化；2)对于H5、H7亚型等高致病性禽流感病毒，需要在生物安全三级实验室进行感染，限制了大多数低级别实验室从事相关研究；3)病毒感染细胞造成的细胞死亡，与抗体杀伤造成的细胞死亡混淆，导致实验噪音过高，特异性降低；4)荧光染料标记靶细胞的效果不均一；2)死亡的靶细胞及操作过程中死亡的效应细胞均会干扰对靶细胞杀伤水平的测定。因此，开发新的靶细胞对于建立高效的抗体Fc效应测定方法具有重要意义。

为了解决流感疫苗抗体Fc免疫效应测定的靶细胞来源问题，本发明利用慢病毒包装技术，构建了一株稳定表达H7N9亚型禽流感病毒HA基因的293T细胞，同时表达ZSgreen荧光报告基因。该细胞系一方面保证细胞中靶抗原的均一、稳定表达，另一方面以ZSgreen的表达区分靶细胞与效应细胞，提高检测特异性。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明其中一个目的是，克服现有用于测定H7N9亚型禽流感病毒杀伤效应测定的靶细胞的鉴定能力的不足，提供一种用于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：一种用于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法，其特征在于：包括如下步骤：

PCR扩增目标基因片段：使用PCR技术对于目的基因进行扩增；

目的基因包装到载体中：将目标基因包装到载体中；

转染：将质粒和细胞混合，然后加入转染试剂，混合物滴加到293T细胞培养液中，培养；

慢病毒分离和检测：将转染中得到的含病毒颗粒的培养基过滤、离心、弃上清、重悬，然后进行慢病毒质量检测；

测定HA蛋白表达情况：将目的细胞接种待其贴壁后，进行空细胞致死最低浓度筛选，空白组对照检测慢病毒感染后的细胞存活比例和药物抗性；

测定血清杀伤活性：将慢病毒转导的细胞与鸡免疫效应细胞混合，设置空白对照组测定疫苗免疫鸡血清的杀伤效应。

作为本发明所述对于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法的一种优选方案，其中：PCR扩增目标片段中，所述PCR扩增目标毒株为GD15，目标基因为HA基因。

作为本发明所述对于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法的一种优选方案，其中：目的基因包装到载体中，使用的技术手段为无缝克隆。

作为本发明所述对于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法的一种优选方案，其中：目的基因包装到载体中，使用HA基因上下游加入的同源臂。

作为本发明所述对于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法的一种优选方案，其中：目的基因包装到载体中，使用的内切酶为Xba I与Not I。

作为本发明所述对于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法的一种优选方案，其中：转染中，使用的载体包括装载有目标基因的载体、pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体。

作为本发明所述对于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法的一种优选方案，其中：转染中，使用的细胞为293T细胞。

作为本发明所述对于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法的一种优选方案，其中：慢病毒分离和检测中包括物理检测、无菌检测、病毒滴度测定。

作为本发明所述对于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法的一种优选方案，其中：目的基因包装到载体中，使用的载体为FV115。

作为本发明所述对于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法的一种优选方案，其中：测定HA蛋白表达情况中，过滤的滤膜孔径为0.22μm，离心转速为80000g，离心4h，弃去上清后重悬，重悬液需在经过0.22微米过滤除菌。

本发明提供了一种对于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法，属于生物技术领域，具体涉及一种基于人胚胎肾细胞系(293T)构建的稳定表达H7N9亚型禽流感病毒(AIV)血凝素蛋白(HA)的细胞，可作为测定H7N9亚型禽流感疫苗阳性血清杀伤效应的靶细胞。

本发明利用慢病毒包装技术构建一株同时稳定表达H7N9 HA蛋白与ZSgreen荧光报告基因的293T细胞系(293T-HA)，中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCCNo.C2021132；本发明还提供一种以293T-HA细胞为靶细胞的鸡H7N9免疫血清杀伤效应的测定方法。该细胞系能够高水平、稳定表达H7N9 HA蛋白，且表达ZSgreen绿色荧光蛋白作为报告基因，能够作为靶细胞用于检测H7N9亚型AIV阳性血清的特异性杀伤活性，在评价H7N9亚型禽流感抗体介导的免疫效应方面具有潜在的应用价值。

本发明有着如下有益效果：

(1)现有技术使用禽流感病毒感染细胞制备靶细胞，缺点在于背景噪声高、表达效率低、均一性差，且需要高级别生物安全实验条件；本发明构建的细胞株高效均一地表达HA蛋白，在普通二级实验室即可操作，为测定H7N9血清杀伤效应提供稳定、可靠的靶细胞来源。

(2)现有技术通过对靶细胞的染料标记或测定LDH衡量靶细胞被杀伤水平，难以实现靶细胞的均一化标记以及死亡靶细胞与效应细胞的区分；本发明提供的细胞系带有ZSgreen荧光报告基因，无需额外的标记，且能区分靶细胞与效应细胞。

(3)传统的血清学方法，如HI与VN试验，不能真实反映H7N9亚型禽流感疫苗的免疫效力；本发明建立的检测H7N9禽流感免疫血清Fc效应的方法，为全面认识H7N9疫苗的免疫保护机理提供有力工具。

(4)对其他家禽疫苗抗体Fc免疫效应的测定提供了技术参考。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1表达H7N9 HA基因的慢病毒包装载体构建示意图；

图2慢病毒包装转染结果图；

图3慢病毒滴定结果图；

图4稳转细胞株ZSgreen报告基因表达鉴定图；

图5细胞株HA蛋白表达鉴定图；

图6H7N9亚型禽流感疫苗阳性血清杀伤效应测定图；

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。以本领域技术人员能够实施为准，制定了以下实施例。

实施例1

因为H7N9亚型禽流感(A/chicken/Guangdong/GD15/2016,GD15株)与目前流行的H7N9病毒遗传距离较近，且与不同的H7N9病毒有较好的交叉反应性。对于供体毒株的选择在本技术领域中仍然属于需要技术人员经过一定程度的选择和研究才可以进行的程度，本发明和本实施例优选GD15作为构建细胞系HA基因的供体毒株。以含有GD15株HA基因的质粒pHW2000-GDHA为模板，用PCR方法扩增H7N9亚型禽流感病毒(A/chicken/Guangdong/GD15/2016,GD15株)的HA基因，所用引物为：上游引物5’-tcctcgagactagttgccaccatgaacactcaaatcctggtattcg-3’(SEQ ID NO.1)；下游引物5’-taggcgtagtcaggcacgtcgtaaggatatatacaaatagtgcaccgcatgtttccattc-3’(SEQ ID NO.2)。引物两端已添加了与载体互补的同源臂序列(下划线标注)。PCR反应体系如下：

表1 H7N9亚型禽流感病毒HA基因的PCR体系

PCR反应条件为：98℃,30s；98℃,10s,60℃,20s,72℃,2min，共30个循环；72℃,5min；4℃保持。PCR产物凝胶电泳后回收目的条带。

实施例2

用Xba I与Not I对FV115载体进行线性化处理，酶切产物凝胶电泳后回收目的条带，然后用无缝克隆法将HA基因克隆至慢病毒包装载体FV115之中，包装的流程如图1所示，反应体系如表2所示：

表2 HA基因连接至FV115载体的反应体系

37℃孵育30min，转化TOP10感受态，过夜培养后挑取单克隆于液体LB中培养16-24h，用质粒抽提试剂盒提取质粒，用Xba I与Not I进行双酶切鉴定，阳性质粒用基因插入位置两侧的CMV与Ubi引物进行测序。测序正确的质粒用于慢病毒的包装实验。

常规的双酶切手段常常对目的基因和载体进行双酶切，回收目的片段后在使用T4DNA连接酶进行末端的连接，这种克隆方法相对而言繁琐、耗时较长、克隆效率相对较低，本实施例采用的无缝克隆法将H7N9 HA基因与线性化的FV115载体相连，使用的酶为ExnaseII，最终将HA基因克隆至病毒包装载体FV115之中。

实施例3

①转染前24h，使用1mL 0.25％的胰蛋白酶消化对数生长期的293T细胞(6×10⁶个)，用移液管吹至单细胞悬液，细胞计数后，取2×10⁶个细胞接种于10cm细胞培养皿，37℃、5％CO₂培养箱内培养，待细胞密度达70％～80％时即可用于转染；

②转染前2h更换为Opti-MEM培养基；

③向一灭菌离心管中加入所制备的质粒(载体质粒10μg、pHelper 1.0载体5μg、pHelper 2.0载体5μg)，与0.2mL的Opti-MEM混合均匀，补加Opti-MEM培养基约0.25mL至总体积为0.5ml，室温孵育5min；

④取50μl Polyfect 3000转染试剂与450μl Opti-MEM混合，室温孵育5min；

⑤把稀释后的质粒与稀释后的转染试剂混合，轻轻地颠倒混匀，不要振荡，室温下孵育10min；

⑥将上述转染混合物滴加到293T细胞Opti-MEM培养液中，摇匀，于37℃,5％CO₂细胞培养箱中培养；

⑦培养8h后倒去含有转染混和物的培养基，每盘细胞更换10ml含10％FBS的完全培养基，37℃、5％CO2培养箱内继续培养；

⑧转染24h后，用显微镜观察表达绿色荧光细胞的数量，观察到的图像图2所示，判定转染效率；

⑨确定转染成功后(荧光细胞比例≥70％)，进行第一次病毒收获。收集细胞培养基于一个无菌50ml离心管中，4℃保存。更换新鲜的10％FBS培养基10ml，继续培养24h；

⑩转染48h后，进行二次病毒收获。收获上清于无菌50ml离心管，4℃保存。

实施例4

①将收获的含病毒颗粒的培养基，经过0.22μm滤膜过滤并收集于无菌超速离心管中，配平、密封；

②超速离心80,000g，离心4h；

③弃去上清，用Virus store buffer重悬沉淀；

④收集重悬液，再次经过0.22μm滤膜过滤除菌，分装于无菌病毒管中，-80℃保存；

慢病毒质量检测如下：

①物理检测：检测内容为病毒颜色、是否存在可见不溶性物质。

②无菌检测：将病毒加入293T细胞，正常培养24h后镜检，观察是否存在任何细菌及真菌污染情况；

病毒滴度测定方法如下：

①实验前24h，接种293T细胞于96孔板中，约1x10⁴个/孔，50μl/孔，于37℃，5％CO2条件下培养；

②实验前，在显微镜下对细胞进行观察，确定细胞饱满、分部均匀、无污染后再进行后续实验；

③病毒梯度稀释：

a)准备1个新的96孔板，向每孔加入90μl的2％FBS的DMEM培养基；

b)取病毒原液10μl加入到第一个孔中，吹打混匀；

c)从第一个孔中吸取10μl稀释液加入到第二个孔中，吹打混匀，继续相同的操作，直到稀释至10⁴；

④稀释病毒加样：依次从高稀释度到低稀释度，吸取90μl病毒液缓慢加入含到293T细胞的96孔培养板中，培养72h；

⑤在显微镜下观察细胞ZSgreen表达情况，计算病毒滴度；

实验结果显示，成功构建了表达H7N9 HA基因的慢病毒包装载体，与辅助质粒共转染293T细胞，可成功包装慢病毒。病毒滴度高达1×10⁸TU/ml，说明病毒包装与浓缩效率较高。

实施例5

①将目的细胞接种于6孔板中，至70-80％融合度；

②待细胞贴壁后，加入puromycin药物进行空细胞致死最低浓度筛选，药物浓度梯度设置为1μg/ml、2.5μg/ml、5μg/ml、10μg/ml进行筛选；

③药物处理24h后细胞全部死亡的最低药物浓度即后续稳定株筛选的药物工作浓度；

④将目的细胞接种于6孔板中，待细胞贴壁后进行慢病毒感染，感染48h后，加入最低浓度的puromycin药物进行筛选，同时做一个空细胞对照。显微镜下观察存活细胞中报告基因的表达，继续维持培养；

⑤待细胞密度生长至90％时，消化后接种于10cm细胞培养皿，稳定培养三代后冻存；

⑥冻存1周后，细胞复苏检测，观察细胞存活比例和药物抗性及荧光表型；

⑦细胞接种于6孔板中，用H7N9 GD15株免疫鸡血清检测细胞中HA蛋白，激光共聚焦方法观察HA蛋白与报告基因的表达；

实验结果显示，用包装的慢病毒转导293T细胞，细胞在药物的筛选下保持较高活率，且能够高效表达ZSgreen报告基因，说明稳定细胞株构建成功；用激光共聚焦可检测到高水平的HA蛋白表达，且蛋白定位于细胞表面，符合HA蛋白的跨膜定位特性。

实施例6

①将293T-HA细胞接种于圆底96孔板中，1×10⁵个/孔；

②用试剂盒分离鸡外周血单个核细胞(PBMC)，与293T-HA细胞按1:40的比例进行混合；

③将H7N9疫苗(新城疫病毒载体疫苗与全病毒灭活疫苗)免疫鸡血清做不同处理，包括56℃热灭活30min(灭活补体)及不进行热灭活，50倍稀释后加入细胞混合物中，37℃孵育24h；另外设置一组热灭活血清补加正常鸡血清(提供补体)，作为对照；

④细胞对照设置：设置仅有靶细胞、效应细胞的对照；靶细胞在56℃加热30min，作为死细胞对照；

⑤24h后，收集细胞，用细胞坏死染料碘化丙啶(PI)进行染色，流式细胞术检测靶细胞报告基因ZSgreen与PI的信号，计算死细胞比例；

实验结果显示，用构建的293T-HA细胞为靶细胞，鸡PBMC细胞为效应细胞，未处理的NDV-H7N9载体疫苗血清介导的细胞杀伤比例为21％，H7N9灭活疫苗血清介导的细胞死亡比例为9.46％。但是，当免疫血清经过加热处理后，即血清中的补体被灭活后，两种免疫血清诱导的杀伤效应均明显降低；在补充新鲜血清后(含有补体成分)，免疫血清的杀伤活性得到了恢复。结果说明，用建立的检测方法可检测出H7N9疫苗免疫血清的杀伤效应，且主要是由血清补体介导的，不同疫苗免疫血清诱导的杀伤活性不同。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

序列表

<110> 扬州大学

<120> 一种用于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

tcctcgagac tagttgccac catgaacact caaatcctgg tattcg 46

<210> 2

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

taggcgtagt caggcacgtc gtaaggatat atacaaatag tgcaccgcat gtttccattc 60

Claims (10)

1.一种用于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法，其特征在于：包括如下步骤：

PCR扩增目标基因片段：使用PCR技术对于目的基因进行扩增；

目的基因包装到载体中：将目标基因包装到载体中；

转染：将质粒和细胞混合，然后加入转染试剂，混合物滴加到293T细胞培养液中，培养；

慢病毒分离和检测：将转染中得到的含慢病毒颗粒的培养基过滤、离心、弃上清、重悬，然后进行慢病毒质量检测；

测定HA蛋白表达情况：将目的细胞接种待其贴壁后，进行空细胞致死最低浓度筛选，空白组对照检测慢病毒感染后的细胞存活比例和药物抗性；

测定血清杀伤活性：将慢病毒转导的细胞、免疫血清与鸡免疫效应细胞混合，设置空白对照组测定疫苗免疫鸡血清的杀伤效应。

2.根据权利要求1中所述的用于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法，其特征在于：所述PCR扩增目标基因片段中，所述PCR扩增目标毒株为GD15，目标基因为HA基因。

3.根据权利要求1中所述的用于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法，其特征在于：所述目的基因包装到载体中，使用的技术手段为无缝克隆。

4.根据权利要求1或3中所述的用于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法，其特征在于：所述目的基因包装到载体中，使用HA基因上下游加入的同源臂。

5.根据权利要求1中所述的用于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法，其特征在于：所述目的基因包装到载体中，使用的内切酶为Xba I与Not I。

6.根据权利要求1中所述的用于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法，其特征在于：所述转染中，使用的载体包括装载有目标基因的载体、pHelper 1.0载体、pHelper 2.0载体。

7.根据权利要求1中所述的用于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法，其特征在于：所述转染中，使用的细胞为293T细胞。

8.根据权利要求1中所述的用于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法，其特征在于：所述慢病毒分离和检测中包括物理检测、无菌检测、病毒滴度测定。

9.根据权利要求1中所述的用于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法，其特征在于：所述目的基因包装到载体中，使用的载体为FV115。

10.根据权利要求1中所述的对于H7N9亚型禽流感血清杀伤效应测定的靶细胞及鉴定方法，其特征在于：所述测定HA蛋白表达情况中，过滤的滤膜孔径为0.22μm，离心转速为80000g，离心4h，弃去上清后重悬，重悬液需在经过0.22微米过滤除菌。

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