CN110320352A - 基于抗体依赖的细胞介导细胞毒性的抗体效价检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了基于抗体依赖的细胞介导细胞毒性的抗体效价检测方法,包括以下内容:制备靶细胞、制备效应细胞和抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的抗体效价测定。本发明通过反应靶细胞被杀伤的情况反应抗体结合靶细胞的情况,具有更广泛的应用性,可以通过修改靶细胞检测不同种类的抗体的效价。
Description
技术领域
本发明涉及抗体效价检测领域,具体为基于抗体依赖的细胞介导细胞毒性的抗体效价检测方法。
背景技术
抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用又称ADCC,ADCC实验是一种检测抗体效价的有效手段,抗体对靶细胞的结合是选择性的,NK细胞攻击所有被抗体识别的细胞,这个过程是非特异性的。现有技术主要是使用试剂盒进行定量的检测抗体的效价,但试剂盒的普适性较低,只针对少数固定种类的抗体。
发明内容
本发明所解决的技术问题在于提供基于抗体依赖的细胞介导细胞毒性的抗体效价检测方法,以解决上述背景技术中的问题。
本发明所解决的技术问题采用以下技术方案来实现:基于抗体依赖的细胞介导细胞毒性的抗体效价检测方法,包括以下内容:
步骤一、制备靶细胞,所述制备靶细胞具体内容为:在BSL-3实验设施内进行实验,实验开始前48h使用A/California/04/2009(H1N1)型流感病毒感染raji细胞,MOI为2,细胞会合度为80-95%;感染后48h收集靶细胞,通过其与火鸡红细胞产生血液凝集以及与多克隆抗体结合的能力来评估其感染细胞的能力;能力评估合格后,计数2*106个靶细胞,并用PBS清洗两次;
步骤二、制备效应细胞,所述制备效应细胞具体内容为:从志愿者体内采集全血,然后使用密度梯度离心法获得单个核细胞(PBMC);
步骤三、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的抗体效价测定,所述抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的抗体效价测定具体内容为:将步骤一中获取的靶细胞接种到培养板中,每孔50ul 1640培养基、5.0×104个标记的靶细胞;向每个孔中加入50ul抗体;在37℃的CO2培养箱中孵育15分钟;将步骤二中获取的未标记的正常PBMC效应细胞悬浮为浓度2.5x107cells/ml,每个孔中加入100ul细胞悬液;在37℃的CO2培养箱中孵育2小时;再加入1ul荧光染料7-氨基-放线菌素-D;在4℃下避光孵育20分钟;使用流式细胞仪上机分析,共获取5000个细胞;分析靶细胞中死亡细胞的百分比即可反应出该抗体的效价。
优选的,所述PBS即磷酸盐缓冲液,能够提供相对稳定的离子环境和pH缓冲能力,是生物学中经常使用的缓冲盐溶液,用于分子克隆及细胞培养等,pH为7.2-7.4,与人体血液等渗,主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠以及氯化钾。
优选的,所述MOI为感染复数,即感染时病毒与细胞数量的比值。
优选的,所述步骤三中的培养板为96孔圆底培养板。
与已公开技术相比,本发明通过反应靶细胞被杀伤的情况反应抗体结合靶细胞的情况,具有更广泛的应用性,可以通过修改靶细胞检测不同种类的抗体的效价。
具体实施方式
为了使本发明的技术手段、创作特征、工作流程、使用方法达成目的与功效易于明白了解,下面将结合本发明实施例,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例1
基于抗体依赖的细胞介导细胞毒性的抗体效价检测方法,包括以下内容:
步骤一、制备靶细胞,所述制备靶细胞具体内容为:在BSL-3实验设施内进行实验,实验开始前48h使用A/California/04/2009(H1N1)型流感病毒感染raji细胞,MOI为2,细胞会合度为80-95%;感染后48h收集靶细胞,通过其与火鸡红细胞产生血液凝集以及与多克隆抗体结合的能力来评估其感染细胞的能力;能力评估合格后,计数2*106个靶细胞,并用PBS清洗两次;
步骤二、制备效应细胞,所述制备效应细胞具体内容为:从志愿者体内采集全血,然后使用密度梯度离心法获得单个核细胞(PBMC);
步骤三、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的抗体效价测定,所述抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的抗体效价测定具体内容为:将步骤一中获取的靶细胞接种到培养板中,每孔50ul 1640培养基、5.0×104个标记的靶细胞;向每个孔中加入50ul抗体;在37℃的CO2培养箱中孵育15分钟;将步骤二中获取的未标记的正常PBMC效应细胞悬浮为浓度2.5x107cells/ml,每个孔中加入100ul细胞悬液;在37℃的CO2培养箱中孵育2小时;再加入1ul荧光染料7-氨基-放线菌素-D;在4℃下避光孵育20分钟;使用流式细胞仪上机分析,共获取5000个细胞;分析靶细胞中死亡细胞的百分比即可反应出该抗体的效价。
实施例2
基于抗体依赖的细胞介导细胞毒性的抗体效价检测方法,包括以下内容:
步骤一、制备靶细胞,所述制备靶细胞具体内容为:在BSL-3实验设施内进行实验,实验开始前48h使用A/California/04/2009(H1N1)型流感病毒感染raji细胞,MOI为2,细胞会合度为80-95%;感染后48h收集靶细胞,通过其与火鸡红细胞产生血液凝集以及与多克隆抗体结合的能力来评估其感染细胞的能力;能力评估合格后,计数2*106个靶细胞,并用PBS清洗两次;
步骤二、制备效应细胞,所述制备效应细胞具体内容为:从志愿者体内采集全血,然后使用密度梯度离心法获得单个核细胞(PBMC);
步骤三、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的抗体效价测定,所述抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的抗体效价测定具体内容为:将步骤一中获取的靶细胞接种到培养板中,每孔50ul 1640培养基、5.0×104个标记的靶细胞;向每个孔中加入50ul抗体;在37℃的CO2培养箱中孵育15分钟;将步骤二中获取的未标记的正常PBMC效应细胞悬浮为浓度2.5x107cells/ml,每个孔中加入100ul细胞悬液;在37℃的CO2培养箱中孵育2小时;再加入1ul荧光染料7-氨基-放线菌素-D;在4℃下避光孵育20分钟;使用流式细胞仪上机分析,共获取5000个细胞;分析靶细胞中死亡细胞的百分比即可反应出该抗体的效价。
优选的,所述PBS即磷酸盐缓冲液,能够提供相对稳定的离子环境和pH缓冲能力,是生物学中经常使用的缓冲盐溶液,用于分子克隆及细胞培养等,pH为7.2-7.4,与人体血液等渗,主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠以及氯化钾。
优选的,所述MOI为感染复数,即感染时病毒与细胞数量的比值。
优选的,所述步骤三中的培养板为96孔圆底培养板。
与已公开技术相比,本发明通过反应靶细胞被杀伤的情况反应抗体结合靶细胞的情况,具有更广泛的应用性,可以通过修改靶细胞检测不同种类的抗体的效价。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及本发明的优点。本行业的技术人员应该了解,本发明不受上述实施例的限制,上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理,在不脱离本发明精神和范围的前提下,本发明还会有各种变化和改进,这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明的要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (4)
1.基于抗体依赖的细胞介导细胞毒性的抗体效价检测方法,其特征在于,包括以下内容:
步骤一、制备靶细胞,所述制备靶细胞具体内容为:在BSL-3实验设施内进行实验,实验开始前48h使用A/California/04/2009(H1N1)型流感病毒感染raji细胞,MOI为2,细胞会合度为80-95%;感染后48h收集靶细胞,通过其与火鸡红细胞产生血液凝集以及与多克隆抗体结合的能力来评估其感染细胞的能力;能力评估合格后,计数2*106个靶细胞,并用PBS清洗两次;
步骤二、制备效应细胞,所述制备效应细胞具体内容为:从志愿者体内采集全血,然后使用密度梯度离心法获得单个核细胞(PBMC);
步骤三、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的抗体效价测定,所述抗体依赖性细胞介导的细胞毒性的抗体效价测定具体内容为:将步骤一中获取的靶细胞接种到培养板中,每孔50ul 1640培养基、5.0×104个标记的靶细胞;向每个孔中加入50ul抗体;在37℃的CO2培养箱中孵育15分钟;将步骤二中获取的未标记的正常PBMC效应细胞悬浮为浓度2.5x107cells/ml,每个孔中加入100ul细胞悬液;在37℃的CO2培养箱中孵育2小时;再加入1ul荧光染料7-氨基-放线菌素-D;在4℃下避光孵育20分钟;使用流式细胞仪上机分析,共获取5000个细胞;分析靶细胞中死亡细胞的百分比即可反应出该抗体的效价。
2.根据权利要求1所述的基于抗体依赖的细胞介导细胞毒性的抗体效价检测方法,其特征在于:所述PBS即磷酸盐缓冲液,能够提供相对稳定的离子环境和pH缓冲能力,是生物学中经常使用的缓冲盐溶液,用于分子克隆及细胞培养等,pH为7.2-7.4,与人体血液等渗,主要成分为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠以及氯化钾。
3.根据权利要求1所述的基于抗体依赖的细胞介导细胞毒性的抗体效价检测方法,其特征在于:所述MOI为感染复数,即感染时病毒与细胞数量的比值。
4.根据权利要求1所述的基于抗体依赖的细胞介导细胞毒性的抗体效价检测方法,其特征在于:所述步骤三中的培养板为96孔圆底培养板。
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