EA023596B1

EA023596B1 - Способы обработки композиции эритроцитов для инактивации патогена

Info

Publication number: EA023596B1
Application number: EA201071178A
Authority: EA
Inventors: Нахид Муфти; Анна Эриксон; Энн Норт
Original assignee: Сирус Корпорейшн
Priority date: 2008-04-09
Filing date: 2009-04-09
Publication date: 2016-06-30
Also published as: HK1157140A1; CA2720824C; US20150157665A1; EA201071178A1; SG189745A1; JP2011516570A; EP2285210B1; US20180008639A1; WO2009126786A3; BRPI0911176B8; SG10201605663UA; US9713627B2; ES2636563T3; BRPI0911176B1; KR101742533B1; JP2014231528A; JP5916383B2; CN102046006A; AU2009233807A1; MX2010011018A

Abstract

Настоящее изобретение предлагает усовершенствованные способы обработки композиций эритроцитов с помощью патоген-инактивирующего соединения при условиях, которые обеспечивают соответствующую инактивацию патогена при сохранении жизнеспособности клеток. Кроме того, предлагаются способы снижения степени дегидратации эритроцитов, а также подвергнутые обработке композиции эритроцитов.

Description

Это изобретение относится к усовершенствованным способам гашения реакционноспособных электрофильных соединений, используемых при обработке препаратов крови с целью инактивации возможных патогенов. В частности, нуклеофильные соединения, такие как тиолы, используют при повышенной концентрации для гашения реакционноспособных электрофильных соединений в композициях эритроцитов с последующим понижением их концентрации для уменьшения степени дегидратации эритроцитов (ВВС).

Уровень техники

Перенос заболевания продуктами крови и другими биологическими материалами остается серьезной проблемой здравоохранения. Несмотря на то что были достигнуты значительные успехи при массовом контроле донорской крови и в исследовании крови, тем не менее, в продуктах крови во время ее исследования могут быть не обнаружены такие вирусы, как гепатит В (НВУ), гепатит С (НСУ), и вирус иммунодефицита человека (Н1У) вследствие низких уровней содержания вируса или вирусных антител. Кроме вирусной опасности в настоящее время существует проблема отсутствия соответствующих сертификационных испытаний для проведения скрининга крови, предназначенной для использования при трансфузии, на присутствие невирусных микробов, таких как бактерии или представители простейших организмов. Существует также риск, что неизвестный до настоящего времени патоген может стать преобладающим в предназначенных для трансфузии продуктах крови, и возникнет опасность переноса заболевания, как это, например, происходило до выявления риска передачи ВИЧ в результате переливания крови. Для инактивации патогенов перед клиническим применением продукта крови в кровь или в плазму крови вводят химические реагенты. Обычно для продуктов крови, содержащих небольшое количество эритроцитов или не содержащих эритроциты, таких как тромбоциты и плазма, используют фотохимически активируемые соединения, такие как псоралены. Для продуктов крови, содержащих эритроциты, были разработаны соединения для патогенной инактивации, которые не требуют фотоактивации. Эти соединения обычно имеют электрофильные группы, которые реагируют с патогенами, и более конкретно, с нуклеиновой кислотой патогена. Например, в патентном документе И8 5055485 описана инактивация вирусов в клеточных и содержащих белок композициях с помощью эпоксидов арилдиолов. Могут быть использованы и другие соединения, которые генерируют электрофилы ίη δίΐιι. В публикации ЬоОпрро с1 а1., РгосссФпдх οί Юс δίχίΗ Сопдгсзз οί Юс 1п1сгпа0опа1 8ойс1у οί В1оой ТтапвГизюп, В1Ы10Фсса Наста1о1ощса (Но11апйсг, ей.), 1958, р. 225-230 приведены результаты исследований по применению для вирусной инактивации азотистого иприта, СН₃-Ы(СН₂СН₂С1)₂. Еще более важными являются патентные документы И8 5691132, 6177441, 6410219, 6143490 и 6093725, содержание которых приводится здесь путем ссылки на них, в которых описано применение соединений, имеющих компонент, обеспечивающий направленность действия только по нуклеиновой кислоте, так же как и электрофильный компонент, который реагирует с нуклеиновой кислотой с целью инактивации патогена. В патентных документах И8 6093725 и 6514987, содержание которых приводится здесь путем ссылки на них, описаны аналогичные соединения, в которых компонент соединения, обеспечивающий направленность действия только по нуклеиновой кислоте, соединен с реакционноспособным электрофильным компонентом через гидролизуемое звено. В патентных документах И8 6136586 и 6617157, содержание которых приводится здесь путем ссылки на них, описано использование этилениминных олигомеров и родственных соединений для патогенной инактивации. Эти соединения этилениминных производных обычно имеют азиридиновую группу, которая обеспечивает наличие реакционноспособного электрофильного компонента, и полиаминный компонент, который обеспечивает направленное воздействие соединения по нуклеиновой кислоте. Общий класс соединений с направленным воздействием по нуклеиновой кислоте, имеющих электрофильную или аналогичную группу, реагирующую с нуклеиновой кислотой, используют для инактивации патогенов в крови, продуктах крови и в различных образцах биологического происхождения.

Существует некоторая опасность, что хотя эти соединения и специально предназначены для направленного воздействия по нуклеиновой кислоте, тем не менее, они могут реагировать с другими компонентами крови, такими как белки или клеточные мембраны. Эти побочные реакции являются неблагоприятными и могут вызывать побочные нежелательные эффекты, такие как изменения белков и клеточных мембран, которые могут распознаваться иммунной системой. Когда такие подвернутые обработке продукты крови используют повторно, они могут вызывать иммунную реакцию реципиента на обработанный продукт крови. В патентных документах И8 6270952, 6709810 и 7293985, содержание которых приводится здесь путем ссылки на них, описаны способы гашения таких патоген-инактивирующих соединений для снижения степени протекания любых таких нежелательных побочных реакций. В патент- 1 023596 ной публикации И8 № 2006/0115466, содержание которой приводится здесь путем ссылки на нее, описаны усовершенствования для этих условий гашения, которые направлены на иммунную реакцию, развивающуюся в ответ на присутствие патоген-инактивирующего соединения. Однако, несмотря на повышение эффективности гашения, было обнаружено, что в некоторых случаях подвергнутые обработке эритроциты имели пониженный срок использования вследствие повышенной степени дегидратации клеток, измеряемой по пониженной величине осмотической резистентности эритроцитов и пониженной величине гематокрита.

Таким образом, существует потребность в способах снижения нежелательных электрофильных побочных реакций патоген-инактивирующих соединений при сохранении способности патогенинактивирующего соединения инактивировать опасные патогены без вредного воздействия на жизнеспособность и срок использования обработанного продукта крови. В частности, существует потребность в усовершенствованных способах гашения патоген-инактивирующих соединений в эритроцитах.

Сущность изобретения

Настоящее изобретение предлагает способы обработки композиций эритроцитов с помощью патоген-инактивирующего соединения и гасителя при условиях, которые обеспечивают соответствующую патогенную инактивацию и снижение степени протекания нежелательных побочных реакций (таких как изменение эритроцитов) при снижении или минимизации неблагоприятных эффектов, таких как дегидратация клеток. В некоторых вариантах осуществления гасителем является глутатион, который нейтрализован с помощью соответствующего количества основания. В некоторых вариантах осуществления способ включает понижение концентрации глутатиона сразу после патогенной инактивации.

В одном аспекте настоящее изобретение предлагает способ обработки композиции эритроцитов, включающий а) наличие ί) эффективного количества патоген-инактивирующего соединения для инактивации патогена, в случае, если он присутствует, где патоген-инактивирующее соединение включает функциональную группу, которая является или которая образует реакционноспособную электрофильную группу, ίί) эффективного количества гасителя, включающего тиольную группу, где тиол способен реагировать с реакционноспособной электрофильной группой патоген-инактивирующего соединения и ш) композиции, включающей эритроциты; Ь) смешение патоген-инактивирующего соединения и гасителя с композицией, включающей эритроциты; и с) соответствующее понижение концентрации гасителя в смеси до количества, которое снижает степень дегидратации эритроцитов, происходящей при хранении смеси, относительно степени дегидратации эритроцитов, происходящей при хранении смеси при исходной концентрации гасителя. В некоторых из этих вариантов осуществления понижение концентрации гасителя включает удаление раствора, используемого во время инактивации, и добавление конечного дополнительного раствора (например, любого описанного здесь раствора, такого как 8ЛС-М, А8-5, или любого раствора из табл. 2, 3 или 4).

В некоторых вариантах осуществления стадия (а) дополнительно включает наличие подходящего основания, стадия (Ь) дополнительно включает смешение основания с композицией, включающей эритроциты, где основание присутствует в достаточном количестве для снижения степени протекания нежелательной реакции патоген-инактивирующего соединения с эритроцитами в смеси, относительно смеси без основания. В некоторых вариантах осуществления нежелательной реакцией патогенинактивирующего соединения с эритроцитами является изменение поверхности эритроцитов патогенинактивирующим соединением. В некоторых вариантах осуществления стадия (а) дополнительно включает наличие соответствующего основания, стадия (Ь) дополнительно включает смешение основания с композицией, включающей эритроциты, где основание присутствует в достаточном количестве для снижения уровня связывания антитела с анти-патоген-инактивирующим соединением подвергнутой обработке композиции эритроцитов в полученной смеси по меньшей мере приблизительно на 5% (или по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 75%, или по меньшей мере приблизительно на 90%) относительно смеси, не содержащей основания. В некоторых вариантах осуществления основание и гаситель смешивают с композицией эритроцитов перед смешением патоген-инактивирующего соединения с композицией эритроцитов, в то же самое время, или не позже чем через 30 мин после смешения патоген-инактивирующего соединения с композицией эритроцитов. В некоторых вариантах осуществления основание и гаситель смешивают вместе перед смешением либо основания, либо гасителя, с композицией эритроцитов. В некоторых вариантах осуществления основанием является ΝαΟΗ. В некоторых вариантах осуществления основанием является щелочной буфер. В некоторых вариантах осуществления основание включает приблизительно от 0,5 до 1,5 экв. основания, где эквивалент означает мольное количество, которое эквивалентно мольному количеству гасителя в смеси. В некоторых вариантах осуществления основание включает приблизительно от 0,75 до 1,25 экв. основания. В некоторых вариантах осуществления основание включает около 1 экв. основания. В некоторых вариантах осуществления полученная смесь на стадии (Ь) имеет величину рН при 37°С приблизительно от 6,0 до 7,5. В некоторых вариантах осуществления величина рН составляет приблизительно от 6,5 до 7,1. В некоторых вариантах осуществления величина рН составляет около 6,8 или 6,9.

В некоторых вариантах осуществления гаситель включает цистеин или производное цистеина. В

- 2 023596 некоторых вариантах осуществления гасителем является глутатион или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления концентрация гасителя в полученной смеси на стадии (b) является большей, чем 2 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация гасителя составляет приблизительно от 5 до 30 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация гасителя составляет приблизительно от 15 до 25 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация гасителя составляет около 20 мМ.

В некоторых вариантах осуществления понижение концентрации гасителя на стадии (с) включает центрифугирование смеси с последующим удалением надосадочной жидкости. В некоторых вариантах осуществления стадия (с) включает эксклюзионное разделение. В некоторых вариантах осуществления гаситель в полученной смеси на стадии (с) присутствует при концентрации меньшей, чем приблизительно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация гасителя составляет меньше, чем приблизительно 8 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация гасителя составляет меньше, чем приблизительно 6 мМ (или меньше, чем приблизительно 4 мМ, или меньше, чем приблизительно 2 мМ). В некоторых вариантах осуществления хранением смеси является хранение смеси в течение более чем 10 дней при 4°С. В некоторых вариантах осуществления хранением смеси является хранение смеси в течение более чем 42 дней (или 28 дней) при 4°С. В некоторых вариантах осуществления способ включает добавление дополнительного раствора (например, любого дополнительного раствора, описанного в табл. 2, и/или дополнительного раствора, включающего хлорид натрия, аденин, глюкозу, фосфат, гуанозин, цитрат и/или маннит). В некоторых вариантах осуществления смесь хранят в дополнительном растворе (например, любом дополнительном растворе, описанном в табл. 2, и/или дополнительном растворе, включающем хлорид натрия, аденин, глюкозу, фосфат, гуанозин, цитрат и/или маннит). В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает замену раствора для обработки (например, любого раствора, описанного в табл. 2, 3 или 4, и/или раствора, включающего хлорид натрия, аденин, глюкозу, фосфат, гуанозин, цитрат, и/или маннит) на дополнительный раствор (например, любой дополнительный раствор, описанный в табл. 2, и/или дополнительный раствор, включающий хлорид натрия, аденин, глюкозу, фосфат, гуанозин, цитрат и/или маннит). В некоторых вариантах осуществления концентрация хлорида в композиции перед понижением концентрации гасителя составляет меньше, чем приблизительно 100 мМ (или около 75 мМ). В некоторых вариантах осуществления концентрация хлорида в композиции после понижения концентрации гасителя и/или добавления дополнительного раствора составляет больше, чем 100 мМ (или около 125 мМ).

В некоторых вариантах осуществления каждого из упомянутых выше способов, так же как и других описанных здесь способов, функциональной группой является иприт, промежуточное соединение иприта или эквивалент иприта. В некоторых вариантах осуществления функциональная группа является, или она способна к образованию иона азиридиния. В некоторых вариантах осуществления реакционноспособная электрофильная группа способна реагировать с нуклеиновыми кислотами. В некоторых вариантах осуществления патоген-инактивирующее соединение дополнительно включает лиганд, связывающий нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления лигандом, связывающим нуклеиновую кислоту, является интеркалятор. В некоторых вариантах осуществления интеркалятором является акридин. В некоторых вариантах осуществления патоген-инактивирующее соединение включает непрочное звено, соединяющее функциональную группу и лиганд, связывающий нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления патоген-инактивирующим соединением является β-аланин, Ы-(акридин-9ил), 2-[бис(2-хлорэтил)амино]этиловый эфир. В некоторых вариантах осуществления концентрация патоген-инактивирующего соединения в полученной смеси на стадии (Ь) составляет приблизительно от 0,1 мкМ до 5 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация должна быть достаточной для инактивации, по меньшей мере 1 1од патогена в композиции эритроцитов, в случае, если он присутствует. В некоторых вариантах осуществления концентрация должна быть достаточной для инактивации, по меньшей мере 3 1од патогена. В некоторых вариантах осуществления время между стадией (Ь) и стадией (c) составляет приблизительно от 1 до 48 ч. В некоторых вариантах осуществления время составляет приблизительно от 10 до 30 ч. В некоторых вариантах осуществления время составляет приблизительно от 15 до 25 ч. В некоторых вариантах осуществления обработка приводит к инактивации, по меньшей мере 1 1од патогенной контаминации композиции эритроцитов, в случае, если она присутствует. В некоторых вариантах осуществления обработка приводит к инактивации, по меньшей мере 3 1од8. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает стадию понижения концентрации патоген-инактивирующего соединения в смеси. В некоторых вариантах осуществления стадии понижения концентрации гасителя в смеси и понижения концентрации патоген-инактивирующего соединения в смеси происходят в одно и то же время.

В некоторых вариантах осуществления каждого из упомянутых выше способов, так же как и других описанных здесь способов, эритроциты (КВСк) полученной смеси через 20 ч после стадии (Ь) имеют величину связывающей способности анти-патоген-инактивирующего соединения с антителом (АВС) менее чем 65%, по сравнению с величиной АВС эритроцитов для того же самого способа и при тех же самых условиях, но без использования основания. В некоторых вариантах осуществления эритроциты имеют среднее значение АВС меньшее, чем приблизительно 50000. В некоторых вариантах осуществления

- 3 023596 эритроциты имеют среднее значение АВС меньшее, чем приблизительно 40000. В некоторых вариантах осуществления эритроциты имеют среднее значение АВС приблизительно от 25000 до 70000. В некоторых вариантах осуществления эритроциты имеют среднее значение АВС приблизительно от 35000 до 45000. В некоторых вариантах осуществления эритроциты полученной смеси имеют после стадии (с) менее чем 1% гемолиза. В некоторых вариантах осуществления эритроциты имеют после стадии (с) менее чем 1% гемолиза через 42 дня (или 28 дней) при 4°С. В некоторых вариантах осуществления эритроциты полученной смеси имеют после стадии (с) гематокритное число (РСУ) больше чем 50%. В некоторых вариантах осуществления эритроциты имеют после стадии (с) РСУ больше чем 50 % через 42 дня (или 28 дней) при 4°С. В некоторых вариантах осуществления эритроциты полученной смеси имеют после стадии (с) величину средней осмотической ломкости эритроцитов больше чем 140 (или 150) через 42 дня (или 28 дней) при 4°С. В некоторых вариантах осуществления количество патоген-инактивирующего соединения не понижают, и/или патоген-инактивирующее соединение не контактируют с устройством для адсорбции соединения (САЭ).

В дополнительном аспекте, изобретение предлагает способ снижения степени дегидратации эритроцитов, включающий а) наличие композиции эритроцитов, включающей смесь ί) гасителя, где гаситель способен реагировать с патоген-инактивирующим соединением, и и) эритроцитов; и Ь) соответствующее понижение концентрации гасителя (и, необязательно, концентрации патоген-инактивирующего соединения и/или его побочных продуктов) в смеси до количества, которое снижает степень дегидратации эритроцитов, возникающей вследствие хранения смеси, относительно степени дегидратации эритроцитов, возникающей вследствие хранения смеси при исходной концентрации гасителя. В некоторых вариантах осуществления гаситель включает цистеин или производное цистеина. В некоторых вариантах осуществления гасителем является глутатион или его фармацевтически приемлемая соль. В некоторых вариантах осуществления гаситель в полученной на стадии (Ь) смеси присутствует в концентрации меньше чем приблизительно 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация гасителя составляет меньше чем приблизительно 8 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация гасителя составляет меньше чем приблизительно 6 мМ, или меньше чем приблизительно 2 мМ. В некоторых вариантах осуществления эритроциты (КВСк) в полученной смеси после стадии (Ь) имеют меньше чем 1% гемолиза. В некоторых вариантах осуществления эритроциты после стадии (Ь) имеют меньше чем 1% гемолиза через 42 дня (или 28 дней) при 4°С. В некоторых вариантах осуществления эритроциты полученной смеси после стадии (Ь) имеют гематокритное число (РСУ) большее, чем 50%. В некоторых вариантах осуществления эритроциты полученной смеси после стадии (Ь) имеют РСУ большее, чем 50% через 42 дня (или 28 дней) при 4°С. В некоторых вариантах осуществления эритроциты полученной смеси имеют после стадии (Ь) величину средней осмотической ломкости эритроцитов большую, чем 140 (или 150) через 42 дня (или 28 дней) при 4°С. В некоторых вариантах осуществления хранением смеси является хранение смеси в течение более чем 10 дней при 4°С. В некоторых вариантах осуществления хранением смеси является хранение смеси в течение более чем 42 дней (или 28 дней) при 4°С.

В некоторых вариантах осуществления количество патоген-инактивирующего соединения не понижают и/или патоген-инактивирующеее соединение не контактируют с устройством адсорбции соединения (САЭ).

Предлагаются композиции эритроцитов, полученные с помощью каждого из упомянутых выше способов. Также предлагаются композиции эритроцитов, которые могут быть получены с помощью каждого из упомянутых выше способов.

В дополнительном аспекте, изобретение предлагает композицию, включающую а) эритроциты, где эритроциты ковалентно прореагировали с электрофильной группой патоген-инактивирующего соединения; и Ь) гаситель, включающий тиольную группу, которая способна реагировать с патогенинактивирующим соединением; где композиция используется для инфузии людям после хранения до 42 дней (или 28 дней) при 4°С. В некоторых вариантах осуществления инактивируется по меньшей мере 1 1од патогена, в случае, если он присутствует. В некоторых вариантах осуществления инактивируются по меньшей мере 3 1одк. В некоторых вариантах осуществления электрофильной группой является иприт, промежуточное соединение иприта или эквивалент иприта. В некоторых вариантах осуществления электрофильная группа является ионом азиридиния, или она способна образовывать ион азиридиния. В некоторых вариантах осуществления электрофильная группа способна реагировать с нуклеиновыми кислотами. В некоторых вариантах осуществления электрофильная группа ковалентно реагирует с клеточной поверхностью эритроцитов. В некоторых вариантах осуществления патоген-инактивирующее соединение дополнительно включает лиганд, связывающий нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления лигандом, связывающим нуклеиновую кислоту, является интеркалятор. В некоторых вариантах осуществления интеркалятором является акридин. В некоторых вариантах осуществления патогенинактивирующее соединение включает непрочное звено, соединяющее электрофильную группу и лиганд, связывающий нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах осуществления патогенинактивирующим соединением является β-аланин, Ы-(акридин-9-ил), 2-[бис(2-хлорэтил)амино]этиловый эфир. В некоторых вариантах осуществления гаситель включает цистеин или производное цистеина. В некоторых вариантах осуществления гасителем является глутатион или его фармацевтически приемле- 4 023596 мая соль. В некоторых вариантах осуществления гаситель присутствует при концентрации, которая является достаточно низкой, для того чтобы исключить или минимизировать дегидратацию эритроцитов во время хранения. В некоторых вариантах осуществления концентрация гасителя составляет приблизительно менее чем 10 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация гасителя составляет приблизительно менее чем 8 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация гасителя составляет приблизительно менее чем 6 мМ, или приблизительно менее чем 2 мМ. В некоторых вариантах осуществления эритроциты (КВСк) имеют гематокритное число (РСУ) большее, чем 55%. В некоторых вариантах осуществления эритроциты имеют значение РСУ большее, чем 60%. В некоторых вариантах осуществления эритроциты имеют среднюю величину связывающей способности с антителами (АВС) приблизительно меньшую, чем 50000. В некоторых вариантах осуществления эритроциты имеют среднюю величину АВС приблизительно меньшую, чем 40000. В некоторых вариантах осуществления эритроциты имеют среднюю величину АВС приблизительно от 25000 до 60000. В некоторых вариантах осуществления эритроциты имеют среднюю величину АВС приблизительно от 25000 до 70000. В некоторых вариантах осуществления эритроциты имеют среднюю величину АВС приблизительно от 35000 до 45000. В некоторых вариантах осуществления композиция дополнительно включает дополнительный раствор (например, любой дополнительный раствор, описанный в табл. 2, и/или дополнительный раствор, включающий хлорид натрия, аденин, глюкозу, фосфат, гуанозин, цитрат и/или маннит). В некоторых вариантах осуществления концентрация хлорида в дополнительном растворе и/или в композиции составляет приблизительно больше чем 100 мМ (или около 125 мМ).

В дополнительном аспекте, изобретение предлагает способы инфузии эритроцитов человеку, включающие: а) наличие любой одной из упомянутых выше композиций эритроцитов или композиции эритроцитов, полученной любым одним из описанных здесь способов, и Ь) инфузию композиции эритроцитов человеку.

В одном аспекте изобретение предлагает способ обработки композиции эритроцитов, включающий (а) смешение (ί) патоген-инактивирующего соединения, включающего функциональную группу, которая является реакционноспособной электрофильной группой, или которая образует реакционноспособную электрофильную группу (например, эффективное количество патоген-инактивирующего соединения для инактивации патогена в случае, если он присутствует); (ίί) гасителя (например, эффективного количества гасителя), включающего тиольную группу, где тиол способен реагировать с реакционноспособной электрофильной группой патоген-инактивирующего соединения; и (ίίί) композиции, включающей эритроциты; и (Ь) соответствующее понижение концентрации гасителя в смеси до количества, которое снижает степень дегидратации эритроцитов, возникающий вследствие хранения смеси, относительно степени дегидратации эритроцитов, возникающий вследствие хранения смеси при исходной концентрации гасителя. В некоторых из этих вариантов осуществления понижение концентрации гасителя включает удаление раствора, используемого во время инактивации, и добавление конечного дополнительного раствора (например, любого описанного здесь раствора, такого как 8АС-М, А§-5 или любого раствора из таблиц 2, 3 или 4). Способ может включать любой один или более из вариантов осуществлений, перечисленных здесь или выше.

В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает смешение подходящего основания с композицией, включающей эритроциты, где основание присутствует в достаточном количестве, чтобы снизить степень протекания нежелательной реакции патоген-инактивирующего соединения с эритроцитами в смеси, относительно смеси, не содержащей основания. В некоторых вариантах осуществления нежелательной реакцией патоген-инактивирующего соединения с эритроцитами является изменение поверхности эритроцитов патоген-инактивирующим соединением. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает смешение подходящего основания с композицией, включающей эритроциты, где основание присутствует в достаточном количестве, чтобы снизить величину связывания анти-патоген-инактивирующего соединения с антителом для подвергнутой обработке композиции эритроцитов в полученной смеси по меньшей мере приблизительно на 5% (или по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 75%, или по меньшей мере приблизительно на 90%) относительно смеси без основания.

В одном аспекте изобретение предлагает способ снижения степени дегидратации в композиции эритроцитов, где композиция является смесью, включающей гаситель, способный реагировать с патогенинактивирующим соединением, и эритроциты; где способ включает достаточное понижение концентрации гасителя в смеси до количества, которое снижает степень дегидратации эритроцитов, возникающей вследствие хранения смеси, относительно уровня дегидратации эритроцитов, возникающей вследствие хранения смеси при исходной концентрации гасителя.

В другом аспекте, изобретение предлагает способ инфузии эритроцитов, включающий инфузию описанной здесь композиции эритроцитов человеку.

- 5 023596

Краткое описание фигур

На фиг. 1 приведена осмотическая резистентность эритроцитов при различных содержаниях основания после начального введения гасителя, как это описано в примере 6.

На фиг. 2 приведена плотность эритроцитов при различных содержаниях основания при инкубации в течение 20 ч.

На фиг. 3 приведена плотность эритроцитов при различных содержаниях основания после инкубации и хранения в течение 36 дней.

На фиг. 4 приведена осмотическая резистентность эритроцитов после инкубации и хранения в течение 36 дней при понижении и без понижения концентрации гасителя (то есть с проведением и без проведения стадии замены).

На фиг. 5 приведена осмотическая резистентность эритроцитов после инкубации и хранения в течение 42 дней с изменением исходной концентрации гасителя (со стадией замены) в сравнении со средней исходной концентрацией гасителя (без стадии замены).

На фиг. 6 приведена осмотическая резистентность эритроцитов после инкубации и хранения в течение 36 дней в присутствии и отсутствии патоген-инактивирующего соединения.

На фиг. 7 приведены значения связывающей способности с антителами (АВС) для различных препаратов эритроцитов, полученных с помощью способов настоящего изобретения.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение предлагает способы обработки композиций эритроцитов для инактивации возможно присутствующих в них патогенов, обеспечивающие при этом снижение или минимизацию протекания нежелательных побочных реакций (таких как изменение эритроцитов, приводящее к нежелательной ответной иммунной реакции) и снижение или минимизацию неблагоприятных воздействий на жизнеспособность клеток (например, пониженной осмотической резистентности и/или повышенной степени дегидратации) и/или на срок использования во время обработки и после обработки. Авторы обнаружили, что соответствующий контроль величины рН в сочетании с использованием подходящих количеств гасителя во время процесса патогенной инактивации позволяет понизить исходную степень дегидратации эритроцитов, подвергнутых обработке патоген-инактивирующим соединением. За этим процессом может следовать понижение исходной концентрации гасителя для получения здоровых патогенинактивированных эритроцитов, что позволяет осуществлять хранение клеток без значительных изменений осмотической резистентности. Эти способы особенно подходят для получения композиций эритроцитов, в которых патогены уже были инактивированы для клинического применения, особенно, когда композиции планируется хранить в течение некоторого периода времени перед их клиническим применением.

Соответственно, настоящее изобретение в одном аспекте предлагает способ обработки композиции эритроцитов, включающей патоген-инактивирующее соединение и гаситель, путем (1) смешения патоген-инактивирующего соединения и гасителя с композицией, включающей эритроциты; и (2) соответствующего понижения концентрации гасителя для снижения степени дегидратации эритроцитов, возникающее вследствие хранения смеси, относительно степени дегидратации эритроцитов, возникающее вследствие хранения смеси при исходной концентрации гасителя.

В других аспектах, настоящее изобретение предлагает способы снижения степени дегидратации и/или повышения осмотической резистентности эритроцитов, так же как и способы инфузии эритроцитов людям. Кроме того, предлагаются подвергнутые обработке композиции эритроцитов.

Эритроциты.

Композиции эритроцитов изобретения включают, но этим не ограничивая, любой продукт крови, включающий эритроциты (например, человеческую кровь), где продукт крови обеспечивает или способен обеспечить эритроциты, подходящие для применения у людей, млекопитающих и/или позвоночных, например, для инфузии. Композиции эритроцитов включают, например, цельную кровь и концентраты эритроцитов, такие как эритроцитарная масса (например, эритроциты с повышенным гемакритом и/или не содержащие дополнительный раствор). Композиции эритроцитов могут быть охарактеризованы с помощью их гематокрита или гематокритного числа (РСУ), величины концентрации эритроцитов в композиции. Композиции эритроцитов могут иметь гематокрит в интервале приблизительно от 1 до 100%, более вероятно, приблизительно от 10 до 90%, а также приблизительно от 35 до 80%, или приблизительно от 40 до 70%. Такие композиции эритроцитов могут включать химические реагенты, такие как патогенинактивирующие соединения и гасители. Они могут также включать буферы и другие растворы, такие как дополнительные растворы эритроцитов (например, любой описанный здесь раствор, такой как §АОМ, А§-5 или любой раствор из табл. 2, 3 или 4), включающие соли или буферные растворы. В некоторых вариантах осуществления описанные здесь композиции эритроцитов перед применением в описанных здесь способах обработки являются эритроцитарными массами, имеющими гематокрит в интервале приблизительно от 70 до 90%, или приблизительно от 75 до 85%, или около 80%. В некоторых вариантах осуществления композиции эритроцитов перед использованием и/или во время использования в описанных здесь способах обработки не являются эритроцитарными массами, имеющими гематокрит в интервале приблизительно от 50 до 70%, или приблизительно от 55 до 65%, или около 60%. В некоторых вари- 6 023596 антах осуществления композиции эритроцитов перед использованием и/или во время использования в описанных здесь способах обработки разбавляют с помощью раствора для разбавления, и они имеют гематокрит в интервале приблизительно от 30 до 50%, или приблизительно от 35 до 45%, или около 40%. В некоторых вариантах осуществления описанные здесь композиции эритроцитов подвергали лейкоцитредуцированию перед применением в описанных здесь способах обработки. В некоторых вариантах осуществления композиции эритроцитов не подвергали лейкоцитредуцированию. Любая композиция эритроцитов, которая будет приведена в контакт или будет введена живому человеку, млекопитающему или позвоночному, когда такой контакт несет риск переноса заболевания вследствие заражения патогенами, может быть подвергнута описанной здесь обработке.

Патогены крови.

Патогенное контаминирование, если оно присутствует, которое инактивируют способами изобретения, включает любой содержащий нуклеиновую кислоту возбудитель, способный вызвать заболевание у человека, других млекопитающих или позвоночных. Патогенный возбудитель может являться одноклеточным или многоклеточным. Примерами патогенов являются бактерии, вирусы, простейшие, грибки, дрожжевые грибки, плесени и микоплазмы, которые вызывают заболевания у людей, других млекопитающих или позвоночных. Г енетическим материалом патогена может являться ДНК или РНК, и генетический материал может присутствовать в виде односпиральной или двухспиральной нуклеиновой кислоты. В табл. 1 приведен список примеров вирусов, который, как предполагается, ни в коей мере не является ограничением для изобретения.

Таблица 1

Неограничивающие примеры вирусов

Семейство:	Вирус:
Абепо	Абепоуьгиз 2 (Аденовирус 2)
Сапьпе ЬераСгСгз (Собачий гепатит)
Агепа	РίοΗίηάε (Пичинде)
Ъазза (Ласа)
Випуа	Тиг1оск (Турлок)
СаИГогпга епсерЬаНСгз (Калифорнийский энцефалит)
Не гре £	Негрез з1тр1ех 1 (Простой герпес 1)
Негрез з1тр1ех 2 (Простой герпес 2)
Сукотеда1оу£гиз (Цитомегаловирус)
РзепбогаЫез (Инфекционный бульбарный паралич)
ОгобЬотухо	1п£1иепга (Грипп)
Ρ3ρον3	ЗУ-4 0
Рагатухо	Меаз1ез (Корь)
Мпшрз (Инфекционный паротит)
Рага1п£1пепга 2 апб 3 (Парагрипп 2 и 3)
Р1согпа	Ρο1ίονίπΐ3 1 апб 2 (Вирус полиомиелита 1 и 2)
Сохзаскте А-9 (Вирус коксаки А-9)
Есйо 11
Рох	\/асс1п1а (Коровья оспа)
Ром1 Рох (Оспа птиц)
Кео	В1ие копдпе (Африканская катаральная лихорадка)
Со1огабо бхск £еуег (Колорадская клещевая лихорадка)
Кек го	Ηΐν (Вирус иммунодефицита человека)
Ανίθη загсота (Саркома птиц)
Миггпе загсота (Саркома мышей)
Мпгьпе 1еикетФа (Лейкемия мышей)
КЬаЬбо	УездсиХаг зЪотаЫЫз νϊτυδ (Вирус везикулярного стоматита)

- 7 023596

Тода	Иезкегп ецитпе епсерЬаЫШз (Западный энцефалит лошадей)
Оепдие 2 (Лихорадка Денге 2)
Эепдие 4 (Лихорадка Денге 4)
ЗЬ. ЬоиФз епсерЬаНбФз (Энцефалит Сент-Луис)
Нерайпа	ЬеракткФз В (Гепатит В)
Вас^егдорЬаде	ЬашЬЛа (Лямбда-фаг)
К17
Т2
(КтскеССзта)	К+ акаг! (г 1скекк51а1рох) (Осповидный риккетсиоз)

В добавление к инактивации возможных контаминирующих патогенов, способы настоящего изобретения могут также инактивировать лейкоциты, которые могут присутствовать в композиции эритроцитов. Предпочтительно, чтобы способы снижения содержания лейкоцитов использовали для удаления основной массы лейкоцитов из композиций эритроцитов, предназначенных для инфузии, так как они могут вызывать нежелательные ответные иммунные реакции у реципиента. Однако не всю кровь подвергают обработке для снижения содержания лейкоцитов, или при помощи способов снижения содержания лейкоцитов могут удалять не все лейкоциты. Поэтому инактивация любых остаточных лейкоцитов описанными здесь способами изобретения может дополнительно снижать риск проявления таких ответных иммунных реакций.

Патоген-инактивирующие соединения.

Инактивацию патогена в композиции эритроцитов осуществляют путем контактирования патогена в композиции эритроцитов с патоген-инактивирующим соединением. В любом из описанных здесь вариантов осуществления патоген-инактивирующее соединение (например, описанное здесь 8-303) может присутствовать в эффективном количестве (например, эффективном количестве для инактивации патогена, например, в количестве, достаточном для инактивации, например, по меньшей мере 1 1од, 2 1од, или 3 1од патогена в композиции эритроцитов, в случае, если он присутствует). Патоген-инактивирующие соединения, которые могут быть использованы в способах изобретения, включают соединения, содержащие функциональную группу, которая является, или которая способна образовывать, и образовала, например, ίη вки, реакционноспособную группу, такую как электрофильная группа. В ряде случаев, патоген-инактивирующие соединения настоящего изобретения не требуют фотоактивации, для того чтобы становиться реакционноспособными. Например, функциональной группой может являться ипритная группа, группа из промежуточного соединения иприта, группа из экв. иприта, эпоксид, формальдегид или синтон, получаемый из формальдегида. Такие функциональные группы способны образовывать ίη δίΐιι реакционноспособную группу, такую как электрофильные азиридин, ион азиридиния, тииран или ион тиирания. Ипритная группа может являться моно- или бис(галогенэтил)аминной группой или моно (галогенэтил)сульфидной группой. Эквивалентом иприта является группа, которая реагирует по такому же механизму, как иприты, например, путем образования реакционноспособных промежуточных соединений, таких как группы азиридиния и азиридина или группы тиирана и тиирания. Примеры включают производные азиридина, моно или бис(мезилэтил)аминные группы, моно(мезилэтил)сульфидные группы, моно- или бис(тозилэтил)аминные группы и моно(тозилэтил)сульфидные группы. Синтон, получаемый из формальдегида, является любым соединением, которое распадается до формальдегида, и который включает гидроксиламин, такой как гидроксиметилглицин. Реакционноспособная группа патогенинактивирующего соединения способна реагировать с нуклеиновыми кислотами патогенов, например с нуклеофильными группами нуклеиновой кислоты. Реакционноспособная группа также способна реагировать с нуклеофильной группой гасителя. Патоген-инактивирующие соединения могут также включать компонент, который нацеливает соединение на нуклеиновые кислоты, такой как якорный участок. Якорный участок включает фрагмент, который способен нековалентно связываться с биополимером нуклеиновой кислоты, таким как ДНК или РНК, и его также называют лигандом, связывающим нуклеиновую кислоту, группой, связывающей нуклеиновую кислоту, или фрагментом, связывающим нуклеиновую кислоту. Примеры таких соединений описаны в патентных документах И8 5691132, 6410219, 6136586, 6617157 и 6709810, содержание каждого из которых приводится здесь путем ссылки на него. Другой класс патоген-инактивирующих соединений, которые могут быть погашены с помощью способов изобретения, включает упомянутые выше реакционноспособные группы, соединенные с группой, связывающей нуклеиновую кислоту, с помощью гидролизуемого звена, описан в патентном документе и8 6514987, содержание которого приводится здесь путем ссылки на него. Якорный участок патогенинактивирующих соединений имеет сродство к нуклеиновым кислотам. Это сродство может быть обусловлено любым из нескольких способов нековалентного связывания с нуклеиновой кислотой, включая, но этим не ограничивая, интеркаляцию, связывание с малой бороздкой, связывание с большой борозд- 8 023596 кой, и электростатическое связывание (например, связывание с фосфатным остовом). Сродство может быть также обусловлено смешанными способами связывания (например, интеркаляцией и связыванием с малой бороздкой). Связывание может быть последовательно-специфическим (то есть, повышенное сродство к связыванию для одной или более конкретных последовательностей нуклеиновых кислот по сравнению с другими последовательностями нуклеиновых кислот) или не является последовательноспецифическим. Подробные примеры таких фрагментов, связывающих нуклеиновую кислоту, могут быть найдены в упомянутых выше патентных документах.

В некоторых вариантах осуществления каждого из описанных здесь способов композиций и наборов патоген-инактивирующие соединения могут включать функциональную группу, которая является или которая образует реакционноспособную электрофильную группу, которая может реагировать с нуклеофилом выбранного гасителя. В некоторых вариантах осуществления патоген-инактивирующая группа включает лиганд, связывающий нуклеиновую кислоту, и функциональную группу, которая является или которая образует электрофильную группу.

Конкретным примером подходящего патоген-инактивирующего соединения для использования в настоящем изобретении является β-аланин, Ы-(акридин-9-ил), 2-[бис(2-хлорэтил)амино]этиловый эфир (который также здесь иначе называют как 8-303), структура которого приведена ниже, включая его соли.

В некоторых вариантах осуществления концентрация патоген-инактивирующего соединения, такого как 8-303, в смеси с композицией эритроцитов и гасителем находится в интервале приблизительно от 0,05 до 4 мМ, приблизительно от 0,05 до 2 мМ, приблизительно от 0,05 до 0,5 мМ, приблизительно от 0,1 до 0,3 мМ или около 0,2 мМ. В некоторых вариантах осуществления мольное отношение гасителя к патоген-инактивирующему соединению в случае смешения обоих компонентов с композицией эритроцитов составляет приблизительно от 10:1 до 400:1, также приблизительно от 10:1 до 200:1, также приблизительно от 20:1 до 200:1, также приблизительно от 50:1 до 200:1, также около 100:1.

Г асители.

Гасители для использования в способах настоящего изобретения предназначены для снижения степени протекания нежелательных побочных реакций реакционноспособных электрофильных соединений, используемых для инактивации патогенов (например, связывания патоген-инактивирующего соединения с поверхностью эритроцитов, которое может приводить к нежелаемой ответной иммунной реакции). В любом из описанных здесь вариантов осуществления гаситель (например, описанный здесь глутатион) может присутствовать в эффективном количестве (например, эффективном количестве для снижения степени протекания нежелательных побочных реакций, таком как описанные здесь количества). Подходящие гасители включают нуклеофильную группу, которая способна реагировать с электрофильной группой патоген-инактивирующего соединения. Неограничивающие примеры подробно описаны в патентном документе И8 6709810, содержание которого приводится здесь путем ссылки на него. В некоторых вариантах осуществления гасители способны значительно снижать степень протекания нежелательных побочных реакций в композиции эритроцитов, позволяя при этом патоген-инактивирующему соединению в достаточной степени инактивировать патоген, которым может быть контаминирована композиция эритроцитов. В некоторых вариантах осуществления в усовершенствованных способах настоящего изобретения используют эффективное количество гасителя в комбинации с эффективным количеством патоген-инактивирующего соединения при условиях, которые обеспечивают оптимальное снижение степени протекания нежелательных побочных реакций (например, связывание патоген-инактивирующего соединения) в сочетании с достаточной инактивацией патогенов без значительного изменения (например, без понижения) осмотической резистентности клетки и без значительного изменения (например, без повышения) степени дегидратации. Может быть снижена степень протекания целого ряда нежелательных побочных реакций, таких как реакция патоген-инактивирующего соединения с белками и/или компонентами эритроцитов. В некоторых вариантах осуществления гаситель обеспечивает оптимальное снижение степени изменения эритроцитов, такого как связывание 1§О с эритроцитами или связывание патоген-инактивирующего соединения с эритроцитами. Несмотря на то что способы изобретения включают обработку композиции эритроцитов ех νίνο, некоторые гасители могут оставаться в композиции при введении человеку. В этой связи, в некоторых вариантах осуществления, гасители изобретения подходят для инфузии. Подходящие гасители включают, но этим не ограничивая, соединения, включающие тиольную группу, такие как гасители, включающие аминокислоту цистеин или подходящее производное цистеина, такое как Ν-ацетилцистеин. Примеры таких гасителей включают цистеин и пептиды, вклю- 9 023596 чающие по меньшей мере один цистеин, такой как глутатион. В некоторых вариантах осуществления подходящие гасители включают производное цистеина, которое может образовывать тиольную группу ίη 8ίΙι.ι с использованием или без использования дополнительных химических реагентов или добавляемых ферментов, таких как δ-ацетилцистеин или другие подходящие полученные из тиола пролекарства цистеина, или пептидов, включающих δ-ацетилцистеин или другие подходящие полученные из тиола пролекарства цистеина. Подходящими производными цистеина являются те производные, которые любо включают, либо способны образовывать ίη δίΐιι. цистеинилтиол, который способен реагировать с электрофильной группой патоген-инактивирующего соединения.

В некоторых вариантах осуществления гасителем является пептид, содержащий от 2 до 10 аминокислот, где по меньшей мере одной из аминокислот является цистеин, Ν-ацетилцистеин, δ-ацетилцистеин, или другое подходящее производное цистеина. В некоторых вариантах осуществления гасителем является пептид, содержащий по меньшей мере 3 аминокислоты, например приблизительно 310 аминокислот, например приблизительно 3-6 аминокислот, где по меньшей мере одной из аминокислот является цистеин, Ν-ацетилцистеин, δ-ацетилцистеин или другое подходящее производное цистеина. В некоторых вариантах осуществления гасителем является пептид, содержащий по меньшей мере 3 аминокислоты, например приблизительно 3-10 аминокислот, например приблизительно 3-6 аминокислот, где по меньшей мере одной из аминокислот является цистеин, Ν-ацетилцистеин, δ-ацетилцистеин или другое подходящее производное цистеина, и также где по меньшей мере 2 или по меньшей мере 3 из аминокислот являются цистеином, Ν-ацетилцистеином, δ-ацетилцистеином или другим подходящим производным цистеина.

В предпочтительном варианте осуществления, гасителем является нейтрализованный глутатион (также известный как Ь-глутатион и γ-Ь-глутамил-Ь-цистеинил-глицин). Глутатион обладает многими свойствами, которые делают его особенно подходящим в качестве гасителя. Он обычно присутствует во всех типах клеток. По-видимому, он не способен пассивно проникать в патоген, например путем прохождения через клеточные мембраны или липидные пленки бактерий и вирусов в липидной оболочке, или путем прохождения через вирусную капсулу вирусов без липидной оболочки. При приблизительно нейтральном значении рН, глутатион несет на себе заряд и в отсутствии активного транспорта не проникает через липидные бислои в какой-либо заметной степени. Это подтверждается в случае инактивации вирусов в липидной оболочке, таких как ВИЧ и вирус везикулярного стоматита, на которые глутатион не оказывает существенного действия, включая использование концентраций нейтрализованного глутатиона большие, чем 2 мМ. Применение глутатиона действительно дает некоторый эффект при инактивации, например, Уешша ейегосоййса (иерсинии энтероколитики), δίαρίινίοοοοοιίδ ер1бегт1б18 (эпидермальных стафилококков) и δе^^аΐ^а тагсексепз (серратии). Однако это может достигаться только путем использования эффективных количеств нейтрализованного глутатиона и патоген-инактивирующего соединения. В силу этого, предлагаются предпочтительные способы гашения, при которых контаминация композиции эритроцитов вирусным или бактериальным патогеном инактивируется по меньшей мере на 2 1од, предпочтительно по меньшей мере на 3 1од. В некоторых вариантах осуществления δΐαρ^ίο^^υδ ер1бегт1б18 (эпидермальные стафилококки) могут быть инактивированы по меньшей мере на 3 1од, также приблизительно на 4 1од, или приблизительно на 5 1од, и вирус везикулярного стоматита может быть инактивирован по меньшей мере на 4 1од, также приблизительно на 5 1од, или приблизительно на 6 1од. В некоторых вариантах осуществления инактивация 81арЬу1ососси8 ерШегтШз (эпидермальных стафилококков) с помощью δ-303 составляет около 3 1од, также около 2 1од, или около 1 1од, что аналогично композиции, инактивированной с помощью 2 мМ кислого глутатиона и 0,2 мМ δ-303. В некоторых вариантах осуществления инактивация везикулярного стоматита с помощью δ-303 составляет около 2 1од, или около 1 1од, или является практически идентичной инактивации аналогичной композиции, инактивированной с помощью 2 мМ кислого глутатиона и 0,2 мМ δ-303. При соответствующих условиях, описанных в настоящем изобретении, глутатион также подходит для хранения эритроцитов ίη уйго, и полученная композиция эритроцитов является подходящей для введения ίη у1уо.

В некоторых вариантах осуществления гасителем является глутатион в его восстановленной форме. Может также быть использован глутатиондисульфид, окисленная форма глутатиона, при условии, что в достаточной степени происходит восстановление глутатиондисульфида в растворе перед добавлением раствора в смесь, включающую композицию эритроцитов, или в достаточной степени происходит восстановление глутатиондисульфида после добавления к смеси, включающей композицию эритроцитов.

В некоторых вариантах осуществления гасителем является производное глутатиона, такое как моноалкиловый эфир или диалкиловый эфир глутатиона, где алкильной группой является линейная или разветвленная группа, имеющая от 1 до 10 углеродных атомов. Конкретные примеры алкильных групп включают, но этим не ограничивая, метильную группу, этильную группу, пропильную группу, изопропильную группу, бутильную группу, изобутильную группу, третбутильную группу, пентильную группу, изопентильную группу, неопентильную группу, третпентильную группу, 1-метилбутильную группу, гексильную группу, изогексильную группу, 2-метилпентильную группу, 1-этилбутильную группу, гептильную группу, октильную группу, нонильную группу, идецильную группу. Например, неограничивающие примеры производных глутатиона включают метиловый эфир глутатиона, моноэтиловый эфир глутатио- 10 023596 на, и моноизопропиловый эфир глутатиона. В некоторых вариантах осуществления используют окисленный диэтиловый эфир глутатиона (О88О-(глицил)-диэтил-эфир). В некоторых вариантах осуществления тиоэфир глутатиона после добавления к композиции эритроцитов подвергают гидролизу с образованием тиола.

Следует иметь в виду, что в некоторых вариантах осуществления, гаситель может применяться в форме свободной кислоты или основания, в то время как в других вариантах осуществления, гаситель может применяться в форме соли. Если гаситель находится в форме соли, предпочтительно, чтобы солью являлась фармацевтически приемлемая соль. Фармацевтически приемлемые соли соединений (в форме водорастворимых, маслорастворимых или диспергируемых продуктов) включают обычные нетоксичные соли или соли четвертичного аммония, которые образуются, например, из неорганических или органических кислот или оснований. Примеры таких солей присоединения кислоты включают ацетат, адипат, альгинат, аспартат, бензоат, бензолсульфонат, бисульфат, бутират, цитрат, камфорат, камфорсульфонат, циклопентанпропионат, диглюконат, додецилсульфат, этансульфонат, фумарат, глюкогептаноат, глицерофосфат, гемисульфат, гептаноат, гексаноат, гидрохлорид, гидробромид, гидройодид, 2-гидроксиэтансульфонат, лактат, малеат, метансульфонат, 2-нафталинсульфонат, никотинат, оксалат, памоат, пектинат, персульфат, 3-фенилпропионат, фосфат, пикрат, пивалат, пропионат, сукцинат, тартрат, тиоцианат, тозилат и ундеканоат. Соли основания включают соли аммония, соли щелочных металлов, такие как соли натрия и калия, соли щелочноземельных металлов, такие как соли кальция и магния, соли с органическими основаниями, такие как соли дициклогексиламина, Ν-метил-Э-глюкамина, и соли с аминокислотами, такими как аргинин, лизин и так далее. Кроме того, основные азотсодержащие группы могут кватернизированы с помощью таких реагентов как низшие алкилгалогениды, такие как метил-, этил-, пропил- и бутилхлорид; бромиды и йодиды; диалкилсульфаты, такие как диметил, диэтил, дибутил и диамилсульфаты, длинноцепочечные галогениды, такие как децил-, лаурил-, миристил- и стеарилхлориды, бромиды и йодиды, аралкилгалогениды, такие как бензил- и фенетилбромиды и другие. Другие фармацевтически приемлемые соли включают сульфатную соль этанолата и сульфатные соли.

Например, в некоторых вариантах осуществления, гаситель находится в форме фармацевтически приемлемой соли, образованной из глутатиона. В некоторых вариантах осуществления гаситель находится в форме фармацевтически приемлемой соли, образованной из глутатиона и одного или более катионов, таких как натрий, алюминий, кальций, литий, магний, цинк или тетраметиламмоний. В некоторых вариантах осуществления гасителем является глутатион (восстановленный), и его вводят в форме мононатриевой соли глутатиона (выпускаемой, например, фирмой Вютебюа Роксата, Иа1у). В некоторых других вариантах осуществления, глутатион (восстановленный) вводят в форме гидрохлоридной соли глутатиона. В некоторых других вариантах осуществления, глутатион вводят в форме динатриевой соли глутатиона (восстановленного). В дополнительных вариантах осуществления, используют сульфат моноалкилового эфира глутатиона. В некоторых вариантах осуществления глутатион вводят в форме динатриевой соли окисленного глутатиона.

Способы инактивации и гашения.

Способы настоящего изобретения включают комбинацию композиции эритроцитов с патогенинактивирующим соединением и гасителем при условиях, когда при смешении композиции с патогенинактивирующим соединением и гасителем величина рН полученной композиции находится в подходящей области для обеспечения соответствующей патогенной инактивации и уменьшения степени протекания нежелательных побочных реакций (таких как изменение эритроцитов) при ограниченном воздействии или при отсутствии воздействия на жизнеспособность (например, на осмотическую резистентность и дегидратацию) и/или на срок использования продукта крови, подвергнутого обработке. Кроме того, настоящее изобретение описывает понижение концентрации гасителя в композиции эритроцитов после проведения патогенной инактивации для сохранения жизнеспособности и срока использования эритроцитов во время их хранения. Описанный здесь дополнительный раствор также может быть применен к эритроцитам во время их хранения, и он может быть использован для замены растворов для обработки и/или растворов для разбавления, применяемых во время патогенной инактивации.

Усовершенствованные способы включают несколько характерных черт, которые могут являться важными при гашении. Первой характерной чертой является тиольная группа или другая подходящая нуклеофильная группа. Второй характерной чертой является корректировка величины рН раствора. Можно обеспечить определенный уровень гашения просто путем корректировки величины рН раствора. В силу этого, гасители изобретения обеспечивают композиции, включающей эритроциты, некоторую буферную емкость, где буферная емкость сама по себе обеспечивает улучшенное гашение. Например, использование аналога цистеина, такого как метионин, в качестве гасителя, при его соответствующей модификации для обеспечения подходящего изменения величины рН в композиции эритроцитов, может приводить к определенному уровню гашения связывания патоген-инактивирующего соединения с эритроцитами. Так как атом серы в метионине не является нуклеофильным, метионин не обеспечивает никакого гашения, кроме как обеспечения необходимой величины рН раствора. Таким образом, комбинация корректировки рН и тиольной группы обеспечивает улучшенное гашение. Тщательная корректировка величины рН и эквивалентное количество основания может также понизить степень дегидратации эрит- 11 023596 роцитов в процессе инактивации. Третьей характерной чертой, которая может быть важной для достижения улучшенного гашения в некоторых вариантах осуществления, является выбор предпочтительных гасителей, которые практически не проникают внутрь патогенов, таких как вирусы и бактерии. Такие гасители обеспечивают достаточное гашение во внеклеточной среде, где происходят оказывающие вредные воздействия реакции, такие как связывание с поверхностями эритроцитов, но без дополнительного гашения патоген-инактивирующего соединения, после того как оно проникло внутрь патогена. И наконец, усовершенствованные способы гашения настоящего изобретения включают понижение концентрации гасителя после инактивации и, в ряде случаев, добавление дополнительного раствора для хранения. Было показано, что эритроциты имеют повышенный срок использования и пониженные степени дегидратации во время хранения при снижении общей концентрации гасителя до соответствующих пределов.

В одном аспекте настоящее изобретение предлагает способ обработки композиции эритроцитов, включающий а) наличие ί) патоген-инактивирующего соединения, включающего функциональную группу, которая является реакционноспособной электрофильной группой, или которая образует реакционноспособную электрофильную группу (например, эффективного количества патоген-инактивирующего соединения для инактивации патогена, в случае, если он присутствует), ίί) гасителя (например, эффективного количества описанного здесь гасителя), включающего тиольную группу, где тиол способен реагировать с реакционноспособной электрофильной группой патоген-инактивирующего соединения, и ίίί) композиции, включающей эритроциты; Ь) смешение патоген-инактивирующего соединения и гасителя с композицией, включающей эритроциты; и с) соответствующее понижение концентрации гасителя в смеси до количества, которое снижает степень дегидратации эритроцитов, возникающей вследствие хранения смеси, относительно степени дегидратации эритроцитов, возникающей вследствие хранения смеси при исходной концентрации гасителя. В некоторых вариантах осуществления стадия (а) дополнительно включает введение подходящего основания, стадия (Ь) дополнительно включает смешение основания с композицией, включающей эритроциты, и основание присутствует в достаточном количестве для снижения степени протекания нежелательной реакции патоген-инактивирующего соединения с эритроцитами в смеси, относительно смеси, не содержащей основания. В некоторых вариантах осуществления нежелательной реакцией патоген-инактивирующего соединения с эритроцитами является изменение поверхности эритроцитов в результате воздействия патоген-инактивирующего соединения. В некоторых вариантах осуществления стадия (а) дополнительно включает введение подходящего основания, стадия (Ь) дополнительно включает смешение основания с композицией, включающей эритроциты, и основание присутствует в достаточном количестве для снижения уровня связывания анти-патоген-инактивирующего соединения с антителом для подвергнутой обработке композиции эритроцитов в полученной смеси по меньшей мере приблизительно на 5% (или по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 75%, или по меньшей мере приблизительно на 90%) относительно смеси, не содержащей основания. В некоторых вариантах осуществления сроки хранения смеси составляют величину большую чем, равную или меньшую чем 7, 10, 14, 21, 28, 35 или 42 дня хранения при 4°С или при комнатной температуре. В некоторых вариантах осуществления смесь хранят в дополнительном растворе (например, в любом дополнительном растворе, описанном в табл. 2, и/или в дополнительном растворе, включающем хлорид натрия, аденин, глюкозу, фосфат, гуанозин, цитрат и/или маннит). В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает замену раствора, используемого в процессе обработки, на дополнительный раствор (например, любой дополнительный раствор, описанный в табл. 2, и/или дополнительный раствор, включающий хлорид натрия, аденин, глюкозу, фосфат, гуанозин, цитрат и/или маннит).

В дополнительном аспекте, изобретение предлагает способ снижения дегидратации эритроцитов, включающий а) получение композиции эритроцитов, включающей ί) гаситель, где гаситель способен реагировать с патоген-инактивирующим соединением, и ίί) эритроциты; и Ь) соответствующее понижение концентрации гасителя в смеси до количества, которое снижает степень дегидратации эритроцитов, возникающей вследствие хранения смеси, относительно степени дегидратации эритроцитов, возникающей вследствие хранение смеси при исходной концентрации гасителя. В некоторых вариантах осуществления сроки хранения смеси составляют величину большую чем, равную или меньшую чем 7, 10, 14, 21, 28, 35 или 42 дня хранения при 4°С или при комнатной температуре. В некоторых вариантах осуществления способ дополнительно включает добавление дополнительного раствора (например, любого дополнительного раствора, описанного в табл. 2, и/или дополнительного раствора, включающего хлорид натрия, аденин, глюкозу, фосфат, гуанозин, цитрат и/или маннит), например перед хранением.

Гаситель и/или добавляемое основание (или нейтрализованный гаситель), используемый в описанных здесь способах, может быть смешан с композицией эритроцитов перед добавлением патогенинактивирующего соединения к композиции эритроцитов, в то же самое время, или после добавления патоген-инактивирующего соединения к композиции эритроцитов. Если гаситель и основание (или нейтрализованный гаситель) смешивают с композицией эритроцитов после того, как патогенинактивирующий раствор смешивают с композицией эритроцитов, то предпочтительно, чтобы гаситель и/или основание (или нейтрализованный гаситель) добавляли к композиции эритроцитов перед тем, как произойдет большая часть побочной реакции патоген-инактивирующего соединения с эритроцитами,

- 12 023596 вследствие чего может быть достигнуто соответствующее гашение нежелательной побочной реакции. В некоторых вариантах осуществления гаситель и/или основание (или нейтрализованный гаситель) смешивают с композицией эритроцитов приблизительно через один час, приблизительно через 30 мин, приблизительно через 20 мин, приблизительно через 10 мин, приблизительно через 5 мин, приблизительно через 2 мины, или приблизительно через 1 мину после смешения патоген-инактивирующего соединения с композицией эритроцитов. В некоторых вариантах осуществления гаситель и основание смешивают с композицией эритроцитов одновременно с патоген-инактивирующим соединением.

В некоторых вариантах осуществления каждого из описанных здесь способов гаситель и добавляемое основание (или нейтрализованный гаситель) предварительно обрабатывают с помощью композиции эритроцитов в течение подходящего времени перед добавлением патоген-инактивирующего соединения (например, 8-303), например, приблизительно меньше чем один час, приблизительно меньше чем 30 мин, приблизительно меньше чем 20 мин, приблизительно меньше чем 10 мин, приблизительно меньше чем 5 мин, приблизительно меньше чем 2 мины, или приблизительно меньше чем 1 мина, до смешения патоген-инактивирующего соединения с композицией эритроцитов. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, предварительную обработку проводят при температуре приблизительно от 1 до 30°С, также приблизительно от 18 до 25°С, или около 37°С, или около комнатной температуры.

В некоторых вариантах осуществления каждого из описанных здесь способов патогенинактивирующее соединение (например, 8-303) инкубируют с композицией эритроцитов в присутствии гасителя и добавляемого основания (или нейтрализованного гасителя) в течение подходящего времени, например в течение приблизительно от 30 мин до 48 ч, также приблизительно от 2 до 36 ч, также приблизительно от 8 до 24 ч, также около 20 ч. В некоторых дополнительных вариантах осуществления, инкубирование проводят в интервале температур приблизительно от 1 до 30°С, также приблизительно от 18 до 25°С, или около 37°С, или около комнатной температуры.

Что касается характерной черты, связанной с корректировкой величины рН композиции эритроцитов, то в ранее известных способах гашения таких патоген-инактивирующих соединений не придавали значения важности соответствующей величины рН полученной смеси, как с точки зрения эффективности гашения, так и с точки зрения жизнеспособности клеток в процессе инактивации. Несмотря на то что в ранее известных способах была показана необходимость в достаточном количестве основания и подходящем значении рН для соответствующего гашения нежелательных побочных реакций патогенинактивирующего соединения (например, путем повышения содержаний непротонированного глутатиона для снижения связывания патоген-инактивирующего соединения с поверхностью эритроцитов), в этих способах не было выявлено и не было описано воздействие повышенного количества основания на дегидратацию клеток в процессе инактивации. Таким образом, один аспект настоящего изобретения включает корректировку величины рН композиции эритроцитов до подходящего значения для инкубирования патоген-инактивирующего соединения и гасителя (например, подходящего значения, при котором исключается вредное воздействие на дегидратацию).

В некоторых вариантах осуществления при смешении патоген-инактивирующих соединений и гасителя с композицией эритроцитов устанавливают до соответствующего значения рН смеси, при котором снижается степень протекания нежелательных побочных реакций патоген-инактивирующего соединения (например, связывания патоген-инактивирующего соединения с поверхностью эритроцитов, которое может приводить к нежелательной ответной иммунной реакции) и достаточно снижается степень дегидратации клеток в процессе инактивации. В некоторых вариантах осуществления нежелательной побочной реакцией является изменение поверхности эритроцитов в результате воздействия патогенинактивирующего соединения. В некоторых вариантах осуществления изменением является ковалентное связывание патоген-инактивирующего соединения с поверхностью эритроцитов. В других вариантах осуществления, изменением является нековалентное связывание патоген-инактивирующего соединения с поверхностью эритроцитов.

Как уже здесь было описано, в некоторых вариантах осуществления каждого из способов, снижается степень протекания нежелательной (называемой также здесь неблагоприятной) побочной реакции патоген-инактивирующего соединения с эритроцитами. В некоторых вариантах осуществления нежелательной побочной реакцией, степень протекания которой снижают, является изменение поверхности эритроцитов в результате воздействия патоген-инактивирующего соединения. В некоторых вариантах осуществления степень протекания побочной реакции снижают по меньшей мере приблизительно на 5%, по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 75%, или по меньшей мере приблизительно на 90%. Снижение степени протекания побочной реакции может быть подтверждено, например, путем измерения количества связывания антител с подвергнутыми обработке эритроцитами, которые являются специфичными к патоген-инактивирующему соединению, и/или путем определения срока использования подвергнутых обработке эритроцитов ίη νίνο, и сравнения этих данных с данными для эритроцитов, подвергнутых обработке вторым, отличающимся способом (например, способом без достаточного количества гасителя и/или основания, добавляемых к реакционной смеси, способом, в котором не добавляется гаситель и/или основание к реакционной смеси, и/или обработке при более низком значении

- 13 023596 рН). Например, в некоторых вариантах осуществления описанных здесь способов, степень связывания анти-патоген-инактивирующего соединения с антителом для подвергнутых обработке эритроцитов снижается по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 75%, или по меньшей мере приблизительно на 90%, относительно второго способа (например, способа без достаточного количества гасителя и/или основания, добавляемых к реакционной смеси, способа, в котором не добавляется гаситель и/или основание к реакционной смеси, и/или обработки при более низком значении рН).

В некоторых вариантах осуществления при смешении патоген-инактивирующего соединения и гасителя с композицией эритроцитов, величина рН смеси находится в интервале приблизительно от 6,0 до 8,5, приблизительно от 6,0 до 7,5, приблизительно от 6,5 до 7,1, приблизительно от 6,5 до 7,0, приблизительно от 6,6 до 6,8 или около 6,6, 6,7, 6,8 или 6,9. Хотя величина рН композиции эритроцитов может и изменяться во времени, желательно, чтобы величина рН находилась в требуемом интервале при добавлении гасителя к композиции эритроцитов, независимо от того, содержит она уже или не содержит патоген-инактивирующее соединение. Способы настоящего изобретения включают добавление патогенинактивирующего соединения и гасителя к композиции эритроцитов. Поддержание требуемого интервала значений рН является необходимым при добавлении как патоген-инактивирующего соединения, так и гасителя, независимо от порядка добавления патоген-инактивирующего соединения и/или гасителя к композиции эритроцитов. Иными словами, как только все три компонента смешаны, значение рН должно находиться в требуемом интервале. В некоторых вариантах осуществления гаситель добавляют раньше, чем патоген-инактивирующее соединение. В некоторых вариантах осуществления патогенинактивирующее соединение добавляют раньше, чем гаситель. В некоторых вариантах осуществления гаситель и патоген-инактивирующее соединение добавляют практически одновременно. Таким образом, после добавления патоген-инактивирующего соединения и гасителя достигается момент, когда и гаситель, и патоген-инактивирующее соединение смешаны с композицией эритроцитов. Требуемое значение рН может быть получено различными способами, и нет ограничений на то, каким способом осуществляется корректировка величины рН композиции эритроцитов, или в некоторых вариантах осуществления, величину рН существенно не изменяют от естественного значения рН продукта крови. Например, требуемое значение рН композиции эритроцитов может быть достигнуто путем корректировки величины рН. Корректировка величины рН может быть осуществлена, например, путем добавления подходящего дополнительного раствора, такого как буферный раствор, перед добавлением патоген-инактивирующего соединения и гасителя. В некоторых вариантах осуществления композиция эритроцитов может быть промыта один или более раз с помощью подходящего буфера перед суспендированием в нем или другом подходящем буфере. В качестве варианта, величина рН композиции эритроцитов может быть скорректирована одновременно с добавлением либо патоген-инактивирующего соединения, либо гасителя, либо их обоих. В некоторых вариантах осуществления величину рН корректируют одновременно с добавлением гасителя. В некоторых вариантах осуществления гаситель нейтрализуют, так что добавление нейтрализованного гасителя обеспечивает требуемый интервал значений рН в композиции эритроцитов. В качестве примера, нейтрализация глутатиона может быть использована для осуществления необходимых корректировок величины рН. В некоторых вариантах осуществления может быть использована соответствующая степень нейтрализации глутатиона, например путем добавления 1 экв. основания, для получения гасителя, который при добавлении к композиции эритроцитов будет обеспечивать необходимую корректировку величины рН композиции. Соответствующая нейтрализация будет зависеть от используемого гасителя. Например, когда используют пептид, она может зависеть от компонентов аминокислот пептида. В некоторых вариантах осуществления может быть использован гаситель, который практически не влияет на величину рН композиции эритроцитов. Например, использование пептида, включающего цистеин, который может дополнительно включать одну или более аминокислот, дает в результате более нейтральное значение рН для раствора выделенного природного пептида. В некоторых вариантах осуществления пептид дополнительно включает по меньшей мере одну основную аминокислоту, такую как аргинин или лизин.

В некоторых вариантах осуществления описанных здесь способов, где основание смешивают с композицией эритроцитов вместе с патоген-инактивирующим соединением и гасителем для увеличения рН смеси до желаемого значения и/или для улучшения гашения нежелательных побочных реакций, основанием является основная соль. Основная соль может сначала быть растворена в водном растворе перед смешением с композицией эритроцитов. В других вариантах осуществления, соль может быть добавлена непосредственно в композицию эритроцитов в твердом виде. В некоторых вариантах осуществления основная соль включает гаситель и в результате обеспечивает действие, как гасителя, так и основания для смеси. В некоторых вариантах осуществления используемым в способе основанием является сильное основание, такое как ΝαΟΗ. Обычно, сильное основание, такое как ΝαΟΗ, сначала растворяют в водном растворе перед смешением с композицией эритроцитов. В некоторых вариантах осуществления сильное основание (например, в растворе или в твердом виде) смешивают с гасителем перед смешением с композицией эритроцитов. В некоторых вариантах осуществления основанием является щелочной буфер (добавляемый в достаточных количествах и имеющий приемлемое значение рКа, для того чтобы

- 14 023596 установить в смеси требуемый интервал значений рН). Если используют щелочной буфер, в некоторых вариантах осуществления, буфером будет являться фармацевтически приемлемый буфер. В некоторых вариантах осуществления буфер будет иметь титруемый протон со значением рКа в интервале приблизительно от 7 до 8. Примеры буферов, которые могут быть использованы в качестве щелочных буферов, включают, но этим не ограничивая, М-(2-гидроксиэтил)пиперазин-№-2-этансульфоновую кислоту (ΗΕΡΕ8), забуференный фосфатом физиологический раствор (РВ8), и буфер из фосфата натрия. Другие подходящие щелочные буферы могут быть легко выбраны любым специалистом в этой области.

В некоторых вариантах осуществления каждого из описанных здесь способов и каждой из описанных здесь композиций, величина рН смеси эритроцитов, гасителя, патоген-инактивирующего соединения, и любого добавленного основания составляет величину приблизительно большую, чем 5,5, приблизительно большую, чем 5,7, приблизительно большую, чем 6,0, приблизительно большую, чем 6,3, приблизительно большую, чем 6,5, приблизительно большую, чем 6,7, приблизительно большую, чем 7,0, или приблизительно большую чем 7,2. В некоторых вариантах осуществления каждого из описанных здесь способов и каждой из описанных здесь композиций, величина рН смеси эритроцитов, гасителя, патоген-инактивирующего соединения, и основания (если его добавляют) находится в интервале приблизительно от 6,0 до 8,5, приблизительно от 6,0 до 7,5, приблизительно от 6,5 до 7,1, приблизительно от 6,5 до 7,0 или приблизительно от 6,6 до 6,8, или около 6,6, 6,7, 6,8 или 6,9. В некоторых вариантах осуществления указанное значение рН является значением рН при комнатной температуре. В некоторых вариантах осуществления указанное значение рН является значением рН при 37°С. Например, в некоторых вариантах осуществления, включающую эритроциты композицию подвергают обработке с помощью патоген-инактивирующего соединения в присутствии гасителя и любого добавляемого основания, где величина рН смеси находится в интервале приблизительно от 6,5 до 7,0 (или 7,1) при 37°С.

В некоторых вариантах осуществления величина рН смеси эритроцитов, гасителя и основания (если добавление основания является частью способа) находится в интервале приблизительно от 6,0 до 8,5, приблизительно от 6,0 до 7,5, приблизительно от 6,5 до 7,1, приблизительно от 6,5 до 7,0 или приблизительно от 6.6 до 6,8, или около 6,5, 6,7, 6,8 или 6,9, перед смешением патоген-инактивирующего соединения с композицией эритроцитов. В некоторых других вариантах осуществления, величину рН корректируют во время смешения патоген-инактивирующего соединения с содержащей эритроциты композицией, или приблизительно через 1 час, приблизительно через 30 мин, приблизительно через 20 мин, приблизительно через 10 мин, приблизительно через 5 мин, или приблизительно через 2 мины после смешения патоген-инактивирующего соединения с содержащей эритроциты композицией. В некоторых вариантах осуществления этих способов, в которых корректируют величину рН, величину рН корректируют до желаемого интервала значений перед смешением патоген-инактивирующего соединения с содержащей эритроциты композицией, одновременно со смешением патоген-инактивирующего соединения с содержащей эритроциты композицией, приблизительно через 1 час, приблизительно через 30 мин, приблизительно через 20 мин, приблизительно через 10 мин, приблизительно через 5 мин, или приблизительно через 2 мины после смешения патоген-инактивирующего соединения с содержащей эритроциты композицией. В тех вариантах осуществления, в которых гасителем является глутатион, патогенинактивирующим соединением является 8-303, предпочтительно, чтобы величина рН смеси, включающей композицию эритроцитов и гаситель, корректировали до требуемого интервала рН (например, от рН

6,5 до 7,0) перед смешением 8-303 с композицией эритроцитов.

В некоторых вариантах осуществления полученная после смешения эритроцитов, гасителя и основания величина рН композиции не нуждается в корректировке величины рН исходной композиции эритроцитов. Например, композиция эритроцитов может иметь величину рН в требуемом интервале 6,0-7,5, и величина рН композиции существенно не изменяется при добавлении гасителя и затем патогенинактивирующего соединения. В таких вариантах осуществления, гаситель либо естественным образом обеспечивает требуемое значение рН, либо его нейтрализуют для обеспечения требуемого значения рН. Это является комбинацией добавления высоких исходных количеств гасителя, таких как, приблизительно от 5 до 40 мМ, с полученной величиной рН в требуемом интервале, которая является важной. В известных способах, не применяли таких концентраций глутатиона, например с требуемым интервалом значения рН в сочетании с другими аспектами настоящего изобретения. Таким образом, в случае пептидов, независимо от пептидного гасителя, при необходимости он может быть эффективно нейтрализован для обеспечения подходящего интервала значений рН при добавлении к композиции эритроцитов, и кроме того он может быть выбран для обеспечения подходящего количества буферного действия в требуемом интервале значений рН. В силу этого, нейтрализованный гаситель означает, что при необходимости гаситель соответствующим образом был оттитрован с помощью кислоты или основания, так что при добавлении к композиции эритроцитов, полученная смесь имеет величину рН, при котором обеспечивается более эффективное гашение протекания нежелательных побочных реакций (например, связывание патоген-инактивирующего соединения с поверхностью эритроцитов, которое может приводить к нежелательной ответной иммунной реакции) при предотвращении дегидратации клеток в процессе инактивации, например, величину рН в интервале приблизительно от 6,0 до 8,5, приблизительно от 6,0 до 7,5, приблизительно от 6,5 до 7,0, приблизительно от 6,5 до 7,1, приблизительно от 6,6 до 6,8 или около 6,6,

- 15 023596

6,7, 6,8 или 6,9. В некоторых вариантах осуществления выделенный естественным образом пептид является в соответствующей степени нейтрализованным, то есть он не требует добавления кислоты или основания для обеспечения требуемого значения рН в конечной смеси. Кроме того, предпочтительные гасители будут обеспечивать буферную емкость для поддержания значения рН в требуемом интервале в течение времени, необходимого для гашения протекания нежелательных побочных реакций.

В некоторых вариантах осуществления каждого из описанных здесь способов и каждой из описанных здесь композиций, гаситель является нейтрализованным. Гаситель называют нейтрализованным с помощью основания, если достаточное количество основания было объединено с гасителем, в результате чего в смеси, включающей композицию, содержащую эритроциты, патоген-инактивирующее соединение и гаситель, улучшается гашение протекания нежелательной побочной реакции между патогенинактивирующим соединением и эритроцитами. Нейтрализованный гаситель не должен обязательно иметь нейтральное значение рН, и не должен быть обязательно незаряженным. В некоторых вариантах осуществления нейтрализованный гаситель находится ни в его наиболее протонированной форме, ни в его наиболее депротонированной форме. В некоторых вариантах осуществления когда гаситель является очень кислым, величина рН нейтрализованного гасителя может быть все же ниже, чем 7,0 (например, около 6,6, 6,7, 6,8 или 6,9). В некоторых вариантах осуществления величина рН раствора нейтрализованного гасителя может быть больше чем 7,0. В некоторых вариантах осуществления величина рН раствора нейтрализованного гасителя будет заметно выше, чем величина рН гасителя перед добавлением основания. В некоторых вариантах осуществления гаситель нейтрализуют с помощью по меньшей мере приблизительно 0,25 экв., по меньшей мере приблизительно 0,5 экв., по меньшей мере приблизительно 0,75 экв., по меньшей мере приблизительно 1 экв., по меньшей мере приблизительно 1,25 экв., по меньшей мере приблизительно 1,5 экв., или по меньшей мере приблизительно 2 экв. основания. В некоторых вариантах осуществления гаситель нейтрализуют с помощью приблизительно меньше чем 2 экв., приблизительно меньше чем 1,5 экв., приблизительно меньше чем 1,25 экв., приблизительно меньше чем 1 экв., или приблизительно меньше чем 0,75 экв. основания. В некоторых вариантах осуществления гаситель нейтрализуют с помощью приблизительно от 0,25 до 2 экв., приблизительно от 0,5 до 1,5 экв., или приблизительно от 0,75 до 1,25 экв. основания. В некоторых вариантах осуществления гаситель нейтрализуют с помощью около 0,75 экв. основания. В других вариантах осуществления, гаситель нейтрализуют с помощью около 1 экв. основания. В других вариантах осуществления, гаситель нейтрализуют с помощью около 1,25 экв. основания. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения, глутатион нейтрализуют с помощью около 1 экв. подходящего основания, такого как гидроксид натрия. В этом случае, раствор протонированного глутатиона имеет величину рН около 3, нейтрализованный раствор с помощью 1 экв. гидроксида натрия имеет величину рН около 4,5 и раствор, нейтрализованный с помощью 2 экв. гидроксида натрия, имеет величину рН около 9,5. Любой соответствующий пептидный гаситель, включающий по меньшей мере один цистеин, может быть подвергнут соответствующей корректировке для обеспечения требуемого значения рН при добавлении к композиции эритроцитов.

Соответствующие способы нейтрализации глутатиона и других гасителей являются очевидными для обычных специалистов в этой области. В некоторых вариантах осуществления для нейтрализации или частичной нейтрализации гасителя используют гидроксид натрия. В некоторых вариантах осуществления твердые гранулы ΝαΟΗ сначала растворяют в воде для получения концентрированного раствора основания, например 1Ν, 5Ν, 10Ν или 20Ν раствора ΝαΟΗ. В некоторых вариантах осуществления соответствующее количество такого раствора ΝαΟΗ затем добавляют к гасителю либо перед добавлением гасителя к смеси, либо в то же самое время, либо после добавления гасителя к смеси. В качестве варианта, ΝαΟΗ добавляют к композиции эритроцитов или патоген-инактивирующему соединению, или к их комбинации, перед добавлением гасителя к смеси.

В дополнение к получению гасителя, величина рН которого соответственно скорректирована или который является нейтрализованным, в некоторых вариантах осуществления, предпочтительные гасители не способны значительно проникать в патогены, так что они оптимально гасят нежелательные реакции во внеклеточной среде, но не препятствуют патогенной инактивации, как только патогенинактивирующее соединение проникло внутрь патогена.

В некоторых вариантах осуществления каждого из описанных здесь способов гасителем является кислое соединение. В некоторых вариантах осуществления гаситель получают в форме свободной кислоты. В некоторых вариантах осуществления гаситель является кислым, и для нейтрализации гасителя добавляют по меньшей мере около 1 экв. основания. Раствор, включающий такой нейтрализованный гаситель, может являться, в ряде случаев, щелочным, нейтральным или даже кислым. В некоторых вариантах осуществления для нейтрализации или частичной нейтрализации гасителя добавляют около 1 экв. основания. В некоторых вариантах осуществления добавляют около 2 экв. основания. В некоторых вариантах осуществления гаситель является кислым и для нейтрализации гасителя используют приблизительно от 0,5 до 1,5 экв. основания. В некоторых вариантах осуществления используют приблизительно от 0,75 до 1,25 экв. основания. В некоторых вариантах осуществления используют около 1 экв. основания.

В некоторых вариантах осуществления гаситель нейтрализуют перед добавлением к композиции эритроцитов и/или к патоген-инактивирующему соединению. В других вариантах осуществления, гаси- 16 023596 тель нейтрализуют после объединения гасителя с композицией эритроцитов и/или патогенинактивирующим соединением. В некоторых вариантах осуществления величина рН нейтрализованного гасителя перед добавлением к композиции эритроцитов и/или патоген-инактивирующему соединению находится в интервале приблизительно от 2,5 до 7,5, приблизительно от 3,0 до 6,5, приблизительно от 3,5 до 5,5, приблизительно от 4,0 до 5,0 или приблизительно от 4,3 до 4,5 или около 4,4.

В некоторых вариантах осуществления гасителем является глутатион, и его получают в форме мононатриевой соли глутатиона, и его нейтрализуют с помощью около 1 экв. основания или не нейтрализуют с помощью основания. В некоторых других вариантах осуществления, гасителем является глутатион, и его получают в форме гидрохлоридной соли глутатиона и нейтрализуют с помощью приблизительно 1 экв. основания.

В некоторых вариантах осуществления каждого из описанных здесь способов исходная концентрация гасителя в смеси, включающей композицию эритроцитов, гаситель, патоген-инактивирующее соединение, и любое добавленное основание, является повышенной во время процесса инактивации, и затем понижается до пониженной концентрации после процесса инактивации. В некоторых вариантах осуществления исходная концентрация гасителя является достаточной для понижения степени протекания нежелательных побочных реакций патоген-инактивирующего соединения (например, связывания патогенинактивирующего соединения с поверхностью эритроцитов), и затем ее снижают до пониженной концентрации, достаточной для снижения отрицательного воздействия на жизнеспособность (например, осмотическую резистентность и дегидратацию) и/или на срок использования во время хранения клеток.

Изобретение охватывает любое количество способов, используемых для понижения концентрации гасителя после процесса патогенной инактивации. В некоторых вариантах осуществления концентрацию гасителя (например, глутатиона) снижают путем центрифугирования смеси, включающей композицию эритроцитов, гаситель и патоген-инактивирующее соединение, с последующим удалением надосадочной жидкости смеси и затем добавления свежего раствора, такого как дополнительный раствор (например, любой дополнительный раствор, описанный в табл. 2, и/или дополнительный раствор, включающий хлорид натрия, аденин, глюкозу, фосфат, гуанозин, цитрат и/или маннит), для ресуспендирования клеток (например, с помощью промывки клеток). Процесс центрифугирования, удаления надосадочной жидкости и добавления свежего раствора (например, любого дополнительного раствора, описанного в табл. 2, и/или дополнительного раствора, включающего хлорид натрия, аденин, глюкозу, фосфат, гуанозин, цитрат и/или маннит) может быть повторен, в некоторых вариантах осуществления, еще 1, 2, 3, 4 или 5 или более раз. В некоторых вариантах осуществления способ, используемый для понижения концентрации гасителя, является автоматизированным. В некоторых вариантах осуществления свежий раствор не включает гаситель или включает пониженную концентрацию гасителя. В некоторых вариантах осуществления концентрацию гасителя (например, глутатиона) понижают путем химической деактивации гасителя. В некоторых вариантах осуществления концентрацию гасителя (например, глутатиона) понижают путем адсорбции в периодическом или непрерывном процессе удаления или путем эксклюзионного разделения по размеру в непрерывном процессе с помощью мембран (например, мембран из полых волокон или мембран для диализа), или гранул для эксклюзионного разделения по размеру. В некоторых вариантах осуществления количество гасителя не уменьшают и/или его не контактируют с устройством для адсорбции соединений (СЛИ).

В некоторых вариантах осуществления каждого из описанных здесь способов и каждой из описанных здесь композиций, исходная концентрация гасителя (например, глутатиона) в смеси, включающей композицию эритроцитов, гаситель, патоген-инактивирующее соединение и любое добавляемое основание, составляет приблизительно больше чем 2 мМ, приблизительно больше чем 4 мМ, приблизительно больше чем 6 мМ, приблизительно больше чем 8 мМ, приблизительно больше чем 10 мМ, приблизительно больше чем 15 мМ или приблизительно больше чем 20 мМ. В некоторых вариантах осуществления исходная концентрация гасителя в смеси находится в интервале приблизительно от 2 до 100 мМ, приблизительно от 2 до 40 мМ, приблизительно от 4 до 40 мМ, приблизительно от 5 до 40 мМ, приблизительно от 5 до 30 мМ, или приблизительно от 10 до 30 мМ, или до 2 мМ, 5 мМ, 10 мМ, 15 мМ, 20 мМ, 25 мМ, 30 мМ, 35 мМ, 40 мМ, 45 мМ, 50 мМ или 100 мМ. В некоторых вариантах осуществления исходная концентрация гасителя в смеси составляет около 20 мМ.

В некоторых вариантах осуществления каждого из описанных здесь способов и каждой из описанных здесь композиций, исходная концентрация гасителя (например, глутатиона) в смеси эритроцитов, гасителя и патоген-инактивирующего соединения составляет приблизительно больше чем 2 мМ, приблизительно больше чем 4 мМ, приблизительно больше чем 6 мМ, приблизительно больше чем 8 мМ или приблизительно больше чем 10 мМ, и величина рН смеси составляет приблизительно больше чем 5,5, приблизительно больше чем 5,7, приблизительно больше чем 6,0, приблизительно больше чем 6,3, приблизительно больше чем 6,5, приблизительно больше чем 6,7, приблизительно больше чем 7,0 или приблизительно больше чем 7,2. В некоторых вариантах осуществления каждого из описанных здесь способов и каждой из описанных здесь композиций, исходная концентрация гасителя в смеси находится в интервале приблизительно от 2 до 40 мМ, приблизительно от 4 до 40 мМ, приблизительно от 5 до 40 мМ, приблизительно от 5 до 30 мМ или приблизительно от 10 до 30 мМ или около 20 мМ, и величина рН сме- 17 023596 си находится в интервале приблизительно от 6,0 до 8,5, приблизительно от 6,0 до 7,5, приблизительно от

6,5 до 7,1, приблизительно от 6,5 до 7,0 или приблизительно от 6,6 до 6,8 или около 6,6, 6,7, 6,8 или 6,9. В некоторых вариантах осуществления исходная концентрация гасителя в смеси составляет приблизительно больше чем 2 мМ, приблизительно больше чем 4 мМ, приблизительно больше чем 6 мМ, приблизительно больше чем 8 мМ или приблизительно больше чем 10 мМ, и величина рН смеси находится в интервале приблизительно от 6,0 до 8,5, приблизительно от 6,0 до 7,5, приблизительно от 6,5 до 7,1, приблизительно от 6,5 до 7,0 или приблизительно от 6,6 до 6,8 или около 6,6, 6,7, 6,8 или 6,9. В некоторых вариантах осуществления концентрация гасителя (например, глутатиона) в смеси находится в интервале приблизительно от 10 до 30 мМ, и величина рН смеси находится в интервале приблизительно от 6,0 до 7,5. В некоторых вариантах осуществления концентрация гасителя (например, глутатиона) в смеси находится в интервале около 20 мМ, и величина рН смеси находится в интервале приблизительно от 6,5 до 7,0 (или 7,1).

В некоторых вариантах осуществления каждого из описанных здесь способов и каждой из описанных здесь композиций, исходную концентрацию гасителя (например, глутатиона) в смеси, включающей композицию эритроцитов, гаситель, патоген-инактивирующее соединение и любое добавляемое основание после процесса инактивации понижают более чем в 2 раза или 3 раза, или 4 раза, или 5 раз, или 6 раз, или 7 раз, или 8 раз, или 9 раз, или 10 раз, или 15 раз, или 20 раз, или 25 раз, или 30 раз, или 35 раз, или 40 раз, или 50 раз, или 100 раз, или 500 раз, или 1000 раз относительно исходной концентрации гасителя (например, глутатиона) в смеси.

В некоторых вариантах осуществления каждого из описанных здесь способов и каждой из описанных здесь композиций, пониженная концентрация гасителя (например, глутатиона) в смеси, включающей композицию эритроцитов, гаситель, патоген-инактивирующее соединение и любое добавляемое основание, после процесса инактивации составляет приблизительно меньше чем 15 мМ, приблизительно меньше чем 10 мМ, приблизительно меньше чем 8 мМ, приблизительно меньше чем 6 мМ, приблизительно меньше чем 5 мМ, приблизительно меньше чем 4 мМ, приблизительно меньше чем 3 мМ, приблизительно меньше чем 2 мМ, приблизительно меньше чем 1 мМ, приблизительно меньше чем 0,75 мМ, приблизительно меньше чем 0,5 мМ или приблизительно меньше чем 0,25 мМ. В некоторых вариантах осуществления пониженная концентрация гасителя в смеси после периода инактивации находится в интервале приблизительно от 1 до 20 мМ, приблизительно от 2 до 15 мМ, приблизительно от 3 до 10 мМ, приблизительно от 4 до 8 мМ, или приблизительно от 5 до 6 мМ. В некоторых вариантах осуществления пониженная концентрация гасителя в смеси после периода инактивация составляет приблизительно до 0,25 мМ или 0,5 мМ, или 0,75 мМ, или 1 мМ, или 1,5 мМ, или 2 мМ, или 3 мМ, или 4 мМ, или 5 мМ, или 6 мМ, или 7 мМ, или 8 мМ, или 9 мМ, или 10 мМ, или 12,5 мМ, или 15 мМ, или 20 мМ.

В некоторых вариантах осуществления каждого из описанных здесь способов и каждой из описанных здесь композиций, исходная концентрация гасителя (например, глутатиона) в смеси, включающей композицию эритроцитов, гаситель, патоген-инактивирующее соединение и любое добавляемое основание, составляет приблизительно больше чем 2 мМ, приблизительно больше чем 4 мМ, приблизительно больше чем 6 мМ, приблизительно больше чем 8 мМ или приблизительно больше чем 10 мМ, и пониженная концентрация гасителя в смеси после процесса инактивации составляет приблизительно меньше чем 15 мМ, приблизительно меньше чем 10 мМ, приблизительно меньше чем 8 мМ, приблизительно меньше чем 6 мМ, приблизительно меньше чем 5 мМ, приблизительно меньше чем 4 мМ, приблизительно меньше чем 3 мМ, приблизительно меньше чем 2 мМ, приблизительно меньше чем 1,5 мМ, приблизительно меньше чем 1 мМ, приблизительно меньше чем 0,75 мМ, приблизительно меньше чем 0,5 мМ или приблизительно меньше чем 0,25 мМ. В некоторых вариантах осуществления исходная концентрация гасителя находится в интервале приблизительно от 2 до 100 мМ, приблизительно от 2 мМ до 40 мМ, приблизительно от 4 до 40 мМ, приблизительно от 5 до 40 мМ, приблизительно от 5 до 30 мМ, или приблизительно от 10 мМ до 30 мМ или около 20 мМ, и пониженная концентрация гасителя в смеси после процесса инактивации находится в интервале приблизительно от 1 мМ до 20 мМ, приблизительно от 2 до 15 мМ, приблизительно от 3 до 10 мМ, приблизительно от 4 до 8 мМ или приблизительно от 5 до 6 мМ. В некоторых вариантах осуществления исходная концентрация гасителя (например, глутатиона) находится в интервале приблизительно от 10 до 30 мМ, и пониженная концентрация гасителя в смеси после процесса инактивации находится в интервале приблизительно от 2 до 15 мМ. В некоторых вариантах осуществления исходная концентрация гасителя (например, глутатиона) составляет около 20 мМ, и пониженная концентрация гасителя в смеси после периода инактивации находится в интервале приблизительно от 4 до 8 мМ.

В некоторых вариантах осуществления исходная концентрация гасителя (например, глутатиона) в смеси, включающей композицию эритроцитов, гаситель (например, глутатион), патогенинактивирующее соединение и любое добавляемое основание, составляет больше чем 2 мМ, больше чем приблизительно 4 мМ, больше чем приблизительно 6 мМ, больше чем приблизительно 8 мМ или больше чем приблизительно 10 мМ; величина рН смеси составляет больше чем приблизительно 5,5, больше чем приблизительно 5,7, больше чем приблизительно 6,0, больше чем приблизительно 6,3, больше чем приблизительно 6,5, больше чем приблизительно 6,7, больше чем приблизительно 7,0 или больше чем при- 18 023596 близительно 7,2; и пониженная концентрация гасителя в смеси после процесса инактивации составляет меньше чем приблизительно 15 мМ, меньше чем приблизительно 10 мМ, меньше чем приблизительно 8 мМ, меньше чем приблизительно 6 мМ, меньше чем приблизительно 5 мМ, меньше чем приблизительно 4 мМ, меньше чем приблизительно 3 мМ, меньше чем приблизительно 2 мМ, меньше чем приблизительно 1,5 мМ, меньше чем приблизительно 1 мМ, меньше чем приблизительно 0,75 мМ, меньше чем приблизительно 0,5 мМ или меньше чем приблизительно 0,25 мМ. В некоторых вариантах осуществления исходная концентрация гасителя находится в интервале приблизительно от 2 до 100 мМ, приблизительно от 2 до 40 мМ, приблизительно от 4 до 40 мМ, приблизительно от 5 до 40 мМ, приблизительно от 5 до 3 0 мМ, или приблизительно от 10 до 30 мМ или около 20 мМ; величина рН смеси находится в интервале приблизительно от 6,0 до 8,5, приблизительно от 6,0 до 7,5, приблизительно от 6,5 до 7,0, приблизительно от 6,5 до 7,1 или приблизительно от 6,6 до 6,8, или около 6,6, 6,7, 6,8 или 6,9; и пониженная концентрация гасителя в смеси после процесса инактивации находится в интервале приблизительно от 1 до 20 мМ, приблизительно от 2 до 15 мМ, приблизительно от 3 до 10 мМ, приблизительно от 4 до 8 мМ или приблизительно от 5 до 6 мМ. В некоторых вариантах осуществления исходная концентрация гасителя (например, глутатиона) находится в интервале приблизительно от 10 до 30 мМ; величина рН смеси находится в интервале приблизительно от 6,0 до 7,5; и пониженная концентрация гасителя в смеси после процесса инактивации находится в интервале приблизительно от 2 до 15 мМ. В некоторых вариантах осуществления исходная концентрация гасителя (например, глутатиона) составляет около 20 мМ; величина рН смеси находится в интервале приблизительно от 6,5 до 7,0 (или 7,1); и пониженная концентрация гасителя в смеси после периода инактивации находится в интервале приблизительно от 4 до 8 мМ.

В некоторых вариантах осуществления каждого из описанных здесь способов и каждой из описанных здесь композиций, период времени между моментом начала добавления гасителя при исходной концентрации и моментом понижения концентрации гасителя до пониженной концентрации в смеси, включающей композицию эритроцитов, гаситель, патоген-инактивирующее соединение и любое добавляемое основание, является достаточным для снижения протекания нежелательных побочных реакций патогенинактивирующего соединения (например, связывания патоген-инактивирующего соединения с поверхностью эритроцитов, которое может приводить к нежелательной ответной иммунной реакции). В некоторых вариантах осуществления период времени является достаточным для снижения протекания нежелательных побочных реакций патоген-инактивирующего соединения и для предотвращения дегидратации или снижения степени дегидратации клеток в процессе инактивации.

В некоторых вариантах осуществления период времени между моментом начала добавления гасителя при исходной концентрации и моментом понижения концентрации гасителя до пониженной концентрации в смеси, включающей композицию эритроцитов, гаситель, патоген-инактивирующее соединение и любое добавляемое основание, составляет больше чем, приблизительно равен или составляет меньше чем 5 ч, 10 ч, 15 ч, 20 ч, 25 ч, 30 ч, 35 ч, 40 ч или 50 ч. В некоторых вариантах осуществления период времени составляет приблизительно от 1 до 96 ч или приблизительно от 1 до 72 ч, или приблизительно от 1 до 48 ч, или приблизительно от 10 до 30 ч, или приблизительно от 15 до 25 ч, или около 20 ч.

В некоторых вариантах осуществления каждого из описанных здесь способов и каждой из описанных здесь композиций, исходная концентрация гасителя (например, глутатиона) в смеси, включающей композицию эритроцитов, гаситель, патоген-инактивирующее соединение и любое добавляемое основание, составляет больше чем 2 мМ, больше чем приблизительно 4 мМ, больше чем приблизительно 6 мМ, больше чем приблизительно 8 мМ, больше чем приблизительно 10 мМ, или больше чем приблизительно 15 мМ; пониженная концентрация гасителя в смеси после периода инактивации составляет меньше чем приблизительно 25 мМ, меньше чем приблизительно 20 мМ, меньше чем приблизительно 15 мМ, меньше чем приблизительно 10 мМ, меньше чем приблизительно 8 мМ, меньше чем приблизительно 6 мМ, меньше чем приблизительно 5 мМ, меньше чем приблизительно 4 мМ, меньше чем приблизительно 3 мМ, меньше чем приблизительно 2 мМ, меньше чем приблизительно 1,5 мМ, меньше чем приблизительно 1 мМ, меньше чем приблизительно 0,75 мМ, меньше чем приблизительно 0,5 мМ или меньше чем приблизительно 0,25 мМ; и период времени между моментом добавления гасителя при исходной концентрации и моментом снижения концентрации гасителя до пониженной концентрации составляет больше чем, приблизительно равен или составляет меньше чем 5 ч, 10 ч, 15 ч, 20 ч, 25 ч, 30 ч, 35 ч, 40 ч, или 50 ч.

В некоторых вариантах осуществления исходная концентрация гасителя находится в интервале приблизительно от 2 до 100 мМ, приблизительно от 2 до 40 мМ, приблизительно от 4 до 40 мМ, приблизительно от 5 до 40 мМ, приблизительно от 5 до 30 мМ, или приблизительно от 10 до 30 мМ или около 20 мМ; пониженная концентрация гасителя в смеси после процесса инактивации находится в интервале приблизительно от 1 до 20 мМ, приблизительно от 2 до 15 мМ, приблизительно от 3 до 10 мМ, приблизительно от 4 до 8 мМ или приблизительно от 5 до 6 мМ; и период времени между моментом добавления гасителя при исходной концентрации и моментом понижения концентрации гасителя до пониженной концентрации составляет приблизительно от 1 до 96 ч или приблизительно от 1 до 72 ч, или приблизительно от 1 до 48 ч, или приблизительно от 10 до 30 ч, или приблизительно от 4 до 30 ч, или приблизительно от 10 до 25 ч, или приблизительно от 15 до 25 ч, или около 20 ч.

- 19 023596

В некоторых вариантах осуществления исходная концентрация гасителя (например, глутатиона) находится в интервале приблизительно от 10 до 30 мМ; пониженная концентрация гасителя в смеси после процесса инактивации находится в интервале приблизительно от 2 до 15 мМ; и период времени между моментом добавления гасителя при исходной концентрации и моментом снижения концентрации гасителя до пониженной концентрации составляет приблизительно от 10 до 30 ч. В некоторых вариантах осуществления исходная концентрация гасителя (например, глутатиона) составляет приблизительно 20 мМ; и пониженная концентрация гасителя в смеси после процесса инактивации находится в интервале приблизительно от 4 до 8 мМ; и период времени между моментом добавления гасителя при исходной концентрации и моментом снижения концентрации гасителя до пониженной концентрации составляет приблизительно от 15 до 25 ч. В некоторых из этих вариантах осуществления, величина рН смеси находится в интервале приблизительно от 6,5 до 7,0 (или 7,1). В других вариантах этих осуществлений, величина рН смеси находится в интервале приблизительно от 6,0 до 7,5.

В любом из этих вариантов осуществлений, температура смеси, включающей композицию эритроцитов и гаситель в период времени между моментом добавления гасителя при исходной концентрации и моментом понижения концентрации гасителя до пониженной концентрации находится в интервале температур приблизительно от 1 до 30°С, также приблизительно от 18 до 25°С или около 37°С, или около комнатной температуры.

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает способ обработки композиции эритроцитов, включающий а) наличие ί) патоген-инактивирующего соединения (например, эффективного количества патоген-инактивирующего соединения для инактивации патогена, в случае, если он присутствует), включающего непрочное звено, соединяющее ипритную группу с лигандом, связывающим нуклеиновую кислоту (например, 8-303), ίί) гасителя (например, эффективного количества гасителя), включающего тиольную группу, где тиол способен реагировать с реакционноспособной электрофильной группой патоген-инактивирующего соединения (например, глутатиона), ίίί) композиции, включающей эритроциты, и ίν) подходящего основания (например, ЫаОН); Ь) смешение патогенинактивирующего соединения, гасителя и подходящего основания с композицией, включающей эритроциты; и с) достаточное понижение концентрации гасителя в смеси до количества, которое снижает степень дегидратации эритроцитов, возникающей вследствие хранения смеси (например, после 10, 28 или 42 дней при 4°С), относительно степени дегидратации эритроцитов, возникающей вследствие хранения смеси при исходной концентрации гасителя. В некоторых вариантах осуществления смесь включает приблизительно от 0,5 до 1,5 экв. основания (или приблизительно от 0,75 до 1,25 экв.), где эквивалент означает мольное количество, которое эквивалентно мольному количеству гасителя в смеси, и/или полученная смесь на стадии (Ь) имеет величину рН при 37°С приблизительно от 6,0 до 7,5 (или приблизительно от 6,5 до 7,0, или 7,1). В некоторых вариантах осуществления основание на стадии (а) присутствует в достаточном количестве, чтобы снизить степень связывания анти-патоген-инактивирующего соединения с антителом для подвергнутой обработке композиции эритроцитов в полученной смеси по меньшей мере приблизительно на 5% (или по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 75% или по меньшей мере приблизительно на 90%) относительно смеси, не содержащей основания. В некоторых вариантах осуществления концентрация гасителя составляет приблизительно от 5 до 30 мМ (или приблизительно от 15 до 25 мМ), и/или гаситель в полученной смеси на стадии (с) присутствует при концентрации меньше чем приблизительно 10 мМ (или меньше чем приблизительно 6 мМ, или меньше чем приблизительно 2 мМ). В некоторых вариантах осуществления концентрация патогенинактивирующего соединения в полученной смеси на стадии (Ь) составляет приблизительно от 0,1 мкМ до 5 мМ и/или является достаточной для инактивации по меньшей мере 1 1од (или 3 1од) патогена в композиции эритроцитов, в случае, если он присутствует. В некоторых вариантах осуществления время между стадией (Ь) и стадией (с) составляет приблизительно от 1 до 48 ч (или от 15 до 25 ч). В некоторых вариантах осуществления через 20 ч после стадии (Ь), эритроциты (КВСк) полученной смеси имеют величину связывающей способности с антителами (АВС) меньшую, чем 65%, по сравнению с величиной АВС для эритроцитов, подвергнутых обработке этим же способом и при таких же условиях, но без использования основания, и/или имеют среднее значение АВС меньшее, чем приблизительно 50000 (или приблизительно от 25000 до 70000), и/или имеют меньше чем 1% гемолиза после стадии (с) (или после хранения в течение 28 или 42 дней при 4°С), и/или имеют гематокритное число (РСУ) больше чем 50% после стадии (с) (или после хранения в течение 28 или 42 дней при 4°С), и/или имеют величину средней осмотической ломкости эритроцитов меньше чем 140 (или 150) через 28 (или 42) дней при 4°С после стадии (с). В некоторых из этих вариантах осуществления, понижение концентрации гасителя на стадии (с) включает удаление раствора, используемого в процессе инактивации, л добавление конечного дополнительного раствора (например, любого описанного здесь раствора, такого как 8АС-М, А8-5, любого раствора из табл. 2, 3 или 4, или дополнительного раствора, включающего хлорид натрия, аденин, глюкозу, фосфат, гуанозин, цитрат и/или маннит).

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает способ обработки композиции эритроцитов, включающий (а) смешение (ί) патоген-инактивирующего соединения (например,

- 20 023596 эффективного количества патоген-инактивирующего соединения для инактивации патогена, в случае, если он присутствует), включающего функциональную группу, которая является или которая образует реакционноспособную электрофильную группу (например, 8-303); (ίί) гасителя (например, эффективного количества гасителя), включающего тиольную группу (например, глутатион), где тиол способен реагировать с реакционноспособной электрофильной группой патоген-инактивирующего соединения; (ίίί) композиции, включающей эритроциты; и (ίν) подходящего основания (например, ΝαΟΗ); и (Ь) достаточное понижение концентрации гасителя в смеси до количества, которое снижает степень дегидратации эритроцитов, возникающей вследствие хранения смеси, относительно степени дегидратации эритроцитов, возникающей вследствие хранения смеси (например, через 10, 28, или 42 дня при 4°С) при исходной концентрации гасителя. В некоторых вариантах осуществления смесь включает приблизительно от 0,5 до

1,5 экв. основания (или приблизительно от 0,75 до 1,25 экв.), где эквивалент означает мольное количество основания, которое эквивалентно мольному количеству гасителя в смеси, и/или полученная смесь на стадии (а) имеет величину рН при 37°С приблизительно от 6,0 до 7,5 (или приблизительно от 6,5 до 7,0 или 7,1). В некоторых вариантах осуществления основание на стадии (а) присутствует в достаточном количестве для снижения степени связывания анти-патоген-инактивирующего соединения с антителом для подвергнутой обработке композиции эритроцитов в полученной смеси по меньшей мере приблизительно на 5% (или по меньшей мере приблизительно на 10%, по меньшей мере приблизительно на 25%, по меньшей мере приблизительно на 50%, по меньшей мере приблизительно на 75% или по меньшей мере приблизительно на 90%) относительно смеси без основания. В некоторых вариантах осуществления концентрация гасителя составляет приблизительно от 5 до 30 мМ (или приблизительно от 15 до 25 мМ), и/или гаситель в полученной смеси на стадии (Ь) имеет концентрацию меньше чем приблизительно 10 мМ (или меньше чем приблизительно 6 мМ, или меньше чем приблизительно 2 мМ). В некоторых вариантах осуществления концентрация патоген-инактивирующего соединения в полученной смеси на стадии (а) составляет приблизительно от 0,1 мкМ до 5 мМ и/или является достаточной для инактивации по меньшей мере 1 1од (или 3 1од) патогена в композиции эритроцитов, в случае, если он присутствует. В некоторых вариантах осуществления время между стадией (а) и стадией (Ь) составляет приблизительно от 1 до 48 ч (или от 15 до 25 ч). В некоторых вариантах осуществления через 20 ч после стадии (а) эритроциты (РВСк) полученной смеси имеют связывающую способность с антителами (АВС) меньшую, чем 65%, по сравнению со значением АВС для эритроцитов из этого же самого способа и при этих же самых условиях, но без использования основания, и/или имеет среднее значение АВС меньшее, чем приблизительно 50000 (или приблизительно от 25000 и 70000), и/или имеет меньше чем 1% гемолиза после стадии (Ь) (или после хранения в течение 28 или 42 дней при 4°С) и/или имеют гематокритное число (РСУ) больше чем 50% после стадии (Ь) (или после хранения в течение 28 или 42 дней при 4°С), и/или имеют величину средней осмотической ломкости эритроцитов большую, чем 140 (или 150), через 28 (или 42) дней при 4°С после стадии (Ь). В некоторых из этих вариантах осуществления, понижение концентрации гасителя на стадии (Ь) включает удаление раствора, используемого в процессе инактивации, и добавление конечного дополнительного раствора (например, любого описанного здесь раствора, такого как 8АО-М, А8-5, любого раствора из табл. 2, 3 или 4, или дополнительного раствора, включающего хлорид натрия, аденин, глюкозу, фосфат, гуанозин, цитрат и/или маннит).

В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает способ снижения дегидратации эритроцитов, включающий а) получение композиции эритроцитов, включающей ί) гаситель (например, глутатион), где гаситель способен реагировать с патоген-инактивирующим соединением, и ίί) эритроциты; и Ь) достаточное снижение концентрации гасителя в смеси до количества, которое снижает степень дегидратации эритроцитов, возникающей вследствие хранения смеси, относительно степени дегидратации эритроцитов, возникающей вследствие хранения смеси при исходной концентрации гасителя (например, через 10, 28 или 42 дней при 4°С). В некоторых вариантах осуществления гаситель в полученной смеси на стадии (Ь) присутствует при концентрации меньшей, чем приблизительно 10 мМ (или меньшей чем приблизительно 6 мМ, или меньшей чем приблизительно 2 мМ). В некоторых вариантах осуществления эритроциты (РВСк) полученной смеси имеют меньше чем 1% гемолиза после стадии (Ь) (или после хранения в течение 28 или 42 дней при 4°С), и/или имеет гематокритное число (РСУ) большее, чем 50% после стадии (Ь) (или после хранения в течение 28 или 42 дней при 4°С), и/или имеют величину средней осмотической ломкости эритроцитов больше чем 140 (или 150) через 28 (или 42) дней при 4°С после стадии (Ь).

Способы изобретения включают использование патоген-инактивирующего соединения и гасителя ех νί\Ό. Применение ех νί\Ό включает использование соединений для обработки композиции эритроцитов вне организма живого человека, млекопитающего или позвоночного, где подвергнутый обработке биологический материал предназначается для использования внутри живого человека, млекопитающего или позвоночного. Например, отбор крови из человека и введение соединения в кровь для инактивации патогенов определяют как применение соединения ех νί\Ό. если кровь предназначена для повторного введения этому человеку или другому человеку. Повторное введение человеческой крови этому человеку или другому человеку могло бы являться применением крови ίη νί\Ό, в противоположность применению соединения ех νί\Ό. Если соединение все еще присутствует в крови, когда ее повторно вводят человеку,

- 21 023596 тогда соединение в дополнение к его применению ех νίνο также вводят ίη νίνο. Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения включают применение гасителя ех νίνο, где композиция эритроцитов предназначается для использования ίη νίνο. В некоторых случаях, определенное содержание гасителя остается в композиции эритроцитов, так что гаситель также вводится ίη νίνο. Применение материала или соединения ίη νίΐτο включает использование материала или соединения вне организма живого человека, млекопитающего или позвоночного, где материал или соединение не предназначено для повторного введения в организм живого человека, млекопитающего или позвоночного. Примером применения ίη νίΐτο может являться диагностический анализ компонентов препарата эритроцитов. Способы изобретения могут применяться при использовании композиции эритроцитов ίη νίΐτο, так как изменение эритроцитов или других составляющих может воздействовать на анализ компонентов препарата крови ίη νίΐτο. Таким образом, способы изобретения могут обеспечивать безопасность при работе с такими препаратами ίη νίΐτο с соответствующим гашением изменений препарата, которые могут, в противном случае, мешать диагностическому испытанию препарата.

С описанными здесь способами и композициями эритроцитов могут быть использованы дополнительные растворы, включающие соли и/или буферные растворы. Например, выбранный буфер (например, 8ЛС-М, А8-5 или любой раствор, описанный в табл. 2, 3 и/или 4) может быть добавлен к композиции эритроцитов перед инактивацией, во время инактивации и/или после процесса инактивации и/или во время понижения концентрации гасителя.

Способы инактивации при использовании эритроцитарной массы В некоторых вариантах осуществления эритроцитарную массу (эритроцитарные массы) (например, эритроциты без дополнительного раствора и/или имеющие гематокрит в интервале приблизительно от 70 до 90%, или приблизительно от 75 до 85%, или около 80%) подвергают описанному здесь способу инактивации (например, способу, в котором композиция включает содержание около 20 мМ глутатиона с приблизительно 1 экв. основания и около 0,2 мМ 8-303), затем подвергают обработке (в ряде случаев, сохраняют с помощью) с помощью дополнительного раствора (например, 8АС-М, А8-5 или любого описанного здесь или в табл. 2 раствора). Примеры дополнительных растворов описаны здесь и приведены в табл. 2. В некоторых из этих вариантов осуществления дополнительный раствор (например, любой описанный здесь или в табл. 2 раствор) добавляют к композиции эритроцитов, включающей гаситель, патоген-инактивирующее соединение, и любое добавляемое основание, через приблизительно от 5 мин до 20 ч после добавления патогенинактивирующего соединения (например, 8-303) и/или гасителя (например, глутамина). В некоторых вариантах осуществления дополнительный раствор добавляют к композиции эритроцитов через приблизительно от 5 мин до 10 ч, или через приблизительно от 5 мин до 5 ч, или через приблизительно от 5 мин до 60 мин, или через приблизительно от 5 мин до 30 мин, или через приблизительно от 10 мин до 20 мин, или через приблизительно 15 мин после добавления патоген-инактивирующего соединения (например, 8303) и/или гасителя (например, глутамина). В некоторых вариантах осуществления концентрацию гасителя понижают, как здесь описано, после добавления дополнительного раствора (например, 8АС-М, А8-5 или любого описанного здесь или в табл. 2 раствора). Например, эритроцитарная масса может быть подвергнута описанному здесь способу инактивации (например, обработке, где композиция включает около 20 мМ глутамина, около 1 экв. основания, и около 0,2 мМ 8-303), затем обработке с помощью дополнительного раствора (например, 8АС-М, А8-5 или любым описанным здесь или в табл. 2 раствором) в конкретный момент времени после добавления патоген-инактивирующего соединения и/или гасителя (например, через приблизительно от 5 мин до 5 ч или через приблизительно от 10 мин до 20 мин, или через приблизительно 15 мин), с последующим снижением концентрации гасителя, как это здесь описано (например, до концентрации меньше чем приблизительно 10 мМ, или меньше чем приблизительно 5 мМ). В некоторых из этих вариантов осуществления понижение концентрации гасителя включает удаление раствора для обработки и/или дополнительного раствора с последующим добавлением конечного дополнительного раствора (например, 8АС-М, А8-5 или любого описанного здесь или в табл. 2 раствора) с получением композиции эритроцитов, имеющей, например, гематокрит в интервале приблизительно от 50 до 70% или приблизительно от 55 до 65%, или около 60%. В некоторых вариантах осуществления концентрация хлорид-иона в композиции эритроцитов перед и/или в процессе инактивации составляет меньше чем или больше чем приблизительно 150 мМ, или приблизительно 120 мМ, или приблизительно 100 мМ, или приблизительно 90 мМ, или приблизительно 80 мМ, или приблизительно 70 мМ, или приблизительно 60 мМ, или приблизительно 50 мМ, или приблизительно 40 мМ, или приблизительно 30 мМ, или приблизительно 20 мМ, или приблизительно 10 мМ, или приблизительно от 25 до 250 мМ, или приблизительно от 40 до 100 мМ, или приблизительно от 50 до 75 мМ, или около 70 мМ, или около 65 мМ.

В некоторых вариантах осуществления называемый здесь как дополнительный раствор (например, дополнительный раствор, вводимый перед понижением и/или после понижения концентрации гасителя) включает один или более из следующих компонентов: декстрозу, аденин, гуанозин, маннит, цитрат (например, цитрат натрия), лимонную кислоту, фосфат (например, №-ьНРО₄ и/или Ν;·ιΗ₂ΡΟ₄) и хлорид (например, в виде хлорида натрия). В некоторых вариантах осуществления концентрация декстрозы в дополнительном растворе и/или конечная концентрация декстрозы в композиции эритроцитов после заме- 22 023596 ны растворов (например, перед трансфузией) составляет приблизительно от 10 до 150 мМ, или приблизительно от 20 до 120 мМ, или приблизительно от 25 до 100 мМ, или приблизительно от 30 до 75 мМ, или приблизительно от 40 до 50 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация аденина в дополнительном растворе и/или конечная концентрация аденина в композиции эритроцитов после замены растворов (например, перед трансфузией) составляет приблизительно от 0,5 мМ до 5 мМ, или приблизительно от 0,75 до 3 мМ, или приблизительно от 1 до 2,5 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация гуанозина в дополнительном растворе и/или конечная концентрация гуанозина в композиции эритроцитов после замены растворов (например, перед трансфузией) составляет приблизительно от 0,5 до 5 мМ, или приблизительно от 0,75 до 3 мМ, или приблизительно от 1 до 2,5 мМ, или приблизительно от 1,5 до 2 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация маннита в дополнительном растворе и/или конечная концентрация маннита в композиции эритроцитов после замены растворов (например, перед трансфузией) составляет приблизительно от 10 до 150 мМ, или приблизительно от 20 до 120 мМ, или приблизительно от 25 до 100 мМ, или приблизительно от 30 до 75 мМ, или приблизительно от 40 до 50 мМ, или приблизительно от 35 до 45 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация цитрата (например, цитрата натрия) в дополнительном растворе и/или конечная концентрация цитрата в композиции эритроцитов после замены растворов (например, перед трансфузией) составляет приблизительно от 5 до 100 мМ, или приблизительно от 10 до 75 мМ, или приблизительно от 15 до 50 мМ, или приблизительно от 15 до 35 мМ, или приблизительно от 20 до 30 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация фосфата (например, Ыа₂НРО₄ и/или ΝαΗ₂ΡΟ₄) в дополнительном растворе и/или конечная концентрация фосфата в композиции эритроцитов после замены растворов (например, перед трансфузией) составляет приблизительно от 1 до 150 мМ, или приблизительно от 2 до 100 мМ, или приблизительно от 3 до 75 мМ, или приблизительно от 4 до 50 мМ, или приблизительно от 5 до 25 мМ, или приблизительно от 10 до 20 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация хлорида в дополнительном растворе и/или конечная концентрация хлорида в композиции эритроцитов после замены растворов (например, перед трансфузией) составляет меньше чем или больше чем приблизительно 500 мМ, или приблизительно 250 мМ, или приблизительно 200 мМ, или приблизительно 150 мМ, или приблизительно 100 мМ, или приблизительно 75 мМ, или приблизительно 50 мМ, или приблизительно 25 мМ, или приблизительно от 25 до 250 мМ, или приблизительно от 40 до 100 мМ, или приблизительно от 50 до 75 мМ, или приблизительно от 60 до 70 мМ, или приблизительно от 100 до 200 мМ, или приблизительно от 125 до 175 мМ, или около 150 мМ.

В некоторых вариантах осуществления называемый здесь как дополнительный раствор (например, дополнительный раствор, вводимый перед понижением и/или после понижения концентрации гасителя), и/или конечная композиция эритроцитов после замены растворов (например, перед трансфузией) включает приблизительно от 10 до 150 мМ (или приблизительно от 50 до 90 мМ) декстрозы, приблизительно от 0,5 до 5 мМ (приблизительно от 0,75 до 3 мМ) аденина, приблизительно от 10 до 150 мМ (или приблизительно от 25 до 100 мМ) маннита, приблизительно от 10 до 75 мМ (или приблизительно от 15 до 50 мМ) цитрата (например, цитрата натрия), приблизительно от 3 мМ до 75 мМ (или приблизительно от 5 до 25 мМ) фосфата (например, Να₂ΗΡΟ₄ и/или Ν;·ιΗ₂ΡΟ₄). и приблизительно от 50 до 250 мМ (или приблизительно от 100 до 175 мМ) хлорида.

Таблица 2

Примеры дополнительных растворов

	АЗ-1	АЗ-З	5АС- М	ЕгуДЬго- зо1	АЗ-5	рдеез- м	МАР
Декстроза (мМ)	111,0	55, 5	45,4	81, 1	45, 4	47,5	36, 4
Аденин (мМ)	2, 0	2,2	1,3	1,6	2,2	1,4	1
Гуанозин (мМ)						1,44
Маннит (мМ)	41,2		28, 8	42,5	28, 8	55	80
Дигидрат цитрата натрия (мМ)		20		26, 6			5, 1
ЦагНРСД (мМ)				17		8
ЦаН₂РО₄ (мМ)		20		4,7		8	6
ЫаС1 (мМ)	154,0	70	150		150	72	85
Лимонная кислота (мМ)		2					1
Осмоляльность (тОзш)		276	35Э	175	351	2Э6

- 23 023596

Способы инактивации при использовании разбавленных эритроцитов.

Описанные здесь композиции эритроцитов могут быть разбавлены перед инактивацией. Подвергая эритроциты разбавлению, можно понизить концентрацию растворенных веществ (например, солей, таких как С1^-) до уровня, который подходит для инактивации с помощью описанных здесь способов. Примеры разбавленных растворов описаны здесь и приведены в табл. 3. В некоторых вариантах осуществления неэритроцитарную массу (например, эритроциты, имеющие гематокрит в интервале приблизительно от 50 до 70% или приблизительно от 55 до 65%, или около 60% и необязательно включающие 8АО-М или оптизол) подвергают разбавлению с помощью раствора (например, любого описанного здесь или в табл. 3 раствора) перед описанным здесь способом инактивации (например, способом, в котором композиция включает около 20 мМ глутамина с приблизительно 1 экв. основания и около 0,2 мМ 8-303), с последующим понижением концентрации гасителя, как это здесь описано (например, до меньше чем приблизительно 10 мМ или меньше чем приблизительно 5 мМ). В некоторых из этих вариантах осуществления, понижение концентрации гасителя включает удаления раствора для обработки (например, разбавленного раствора для обработки) с последующим добавлением конечного дополнительного раствора (например, 8АО-М, А8-5 или любого описанного здесь или в табл. 2 раствора) с получением, например, композиции эритроцитов, имеющих гематокрит в интервале приблизительно от 50 до 70% или приблизительно от 55 до 65%, или около 60%). В некоторых вариантах осуществления концентрацию хлорид-иона в композиции эритроцитов разбавляют перед инактивацией до величины меньшей чем или большей чем приблизительно 150 мМ, или приблизительно 120 мМ, или приблизительно 100 мМ, или приблизительно 90 мМ, или приблизительно 80 мМ, или приблизительно 70 мМ, или приблизительно 60 мМ, или приблизительно 50 мМ, или приблизительно 40 мМ, или приблизительно 30 мМ, или приблизительно 20 мМ, приблизительно 10 мМ, или приблизительно от 25 до 250 мМ, или приблизительно от 40 до 100 мМ, или приблизительно от 50 до 75 мМ, или приблизительно от 60 до 70 мМ, или около 65 мМ. В некоторых вариантах осуществления количество (по объему) раствора для разбавления, добавляемого к раствору эритроцитов, составляет приблизительно от 0,2 до 2 раз, или приблизительно от 0,3 до 1,5 раз, или приблизительно от 0,4 до 1 раза, или приблизительно от 0,5 до 0,75 раза от объема раствора эритроцитов. В некоторых из этих вариантов осуществления композицию эритроцитов разбавляют с помощью раствора для разбавления (например, любого описанного здесь или в табл. 3 раствора) до величины гематокрита в интервале приблизительно от 30 до 50%, или приблизительно от 35 до 45%, или около 40%.

В некоторых вариантах осуществления называемый здесь как раствор для разбавления включает один или более из следующих компонентов: декстрозу, аденин, маннит, цитрат (например, цитрат натрия), лимонную кислоту, фосфат (например, Ыа₂НРО₄ и/или ЫаН₂РО₄) и хлорид (например, в виде хлорида натрия). В некоторых вариантах осуществления концентрация декстрозы в растворе для разбавления и/или конечная концентрация декстрозы в композиции эритроцитов после разбавления с помощью раствора для разбавления составляет приблизительно от 10 до 150 мМ, или приблизительно от 20 до 120 мМ, или приблизительно от 25 до 100 мМ, или приблизительно от 30 до 75 мМ, или приблизительно от 40 до 50 мМ, или приблизительно от 50 до 60 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация аденина в растворе для разбавления и/или конечная концентрация аденина в композиции эритроцитов после разбавления с помощью раствора для разбавления составляет приблизительно от 0,5 до 5 мМ, или приблизительно от 0,75 до 3 мМ, или приблизительно от 1 до 2,5 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация маннита в растворе для разбавления и/или конечная концентрация маннита в композиции эритроцитов после разбавления с помощью раствора для разбавления составляет приблизительно от 10 до 150 мМ, или приблизительно от 20 до 120 мМ, или приблизительно от 25 до 100 мМ, или приблизительно от 30 до 75 мМ, или приблизительно от 40 до 60 мМ, или приблизительно от 25 до 35 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация цитрата (например, цитрата натрия) в растворе для разбавления и/или конечная концентрация цитрата в композиции эритроцитов после разбавления с помощью раствора для разбавления составляет приблизительно от 5 до 100 мМ, или приблизительно от 10 до 75 мМ, или приблизительно от 15 до 50 мМ, или приблизительно от 15 до 35 мМ, или приблизительно от 20 до 30 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация фосфата (например, Ыа₂НРО₄ и/или ЫаН₂РО₄) в растворе для разбавления и/или конечная концентрация фосфата в композиции эритроцитов после разбавления с помощью раствора для разбавления составляет приблизительно от 1 до 150 мМ, или приблизительно от 2 до 100 мМ, или приблизительно от 3 до 75 мМ, или приблизительно от 4 до 50 мМ, или приблизительно от 5 до 25 мМ, или приблизительно от 10 до 20 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация хлорида в растворе для разбавления и/или после разбавления с помощью раствора для разбавления составляет меньше чем или больше чем приблизительно 500 мМ, или приблизительно 250 мМ, или приблизительно 200 мМ, или приблизительно 150 мМ, или приблизительно 120 мМ, или приблизительно 100 мМ, или приблизительно 90 мМ, или приблизительно 80 мМ, или приблизительно 70 мМ, или приблизительно 60 мМ, или приблизительно 50 мМ, или приблизительно 40 мМ, или приблизительно 30 мМ, или приблизительно 20 мМ, или приблизительно 10 мМ, или приблизительно от 25 до 250 мМ, или приблизительно от 40 до 100 мМ, или приблизительно от 50 до 75 мМ, или приблизительно от 60 до 70 мМ, или приблизительно от 100 до 200 мМ, или приблизительно от 125 до 175 мМ.

- 24 023596

В некоторых вариантах осуществления называемый здесь как раствор для разбавления и/или композиция эритроцитов после разбавления с помощью раствора для разбавления включает приблизительно от 10 до 150 мМ (или приблизительно от 35 до 65 мМ) декстрозы, приблизительно от 0,5 5 мМ (или приблизительно от 0,75 до 3 мМ) аденина, приблизительно от 10 до 150 мМ (или приблизительно от 25 до 75 мМ) маннита, приблизительно от 10 до 75 мМ (или приблизительно от 15 до 50 мМ) цитрата (например, цитрат натрия), приблизительно от 3 до 75 мМ (или приблизительно от 5 до 25 мМ) фосфата (например, Ν;·ι₂ΗΡΘ.·| и/или ΝαΗ₂ΡΘ.₁). и приблизительно от 5 до 50 мМ (или приблизительно от 10 до 25 мМ) хлорида.

В некоторых вариантах осуществления неэритроцитарную массу подвергают разбавлению с помощью раствора для разбавления (например, любого описанного выше или в табл. 3 раствора) перед применением описанного здесь способа инактивации, с последующим понижением концентрации описанного здесь гасителя, затем обрабатывают с помощью конечного дополнительного раствора (например, 8ЛС-М, А8-5 или любого описанного выше или в табл. 2 раствора) с получением композиции эритроцитов, подходящей для использования (например, подходящей для трансфузии). В некоторых вариантах осуществления конечным дополнительным раствором может являться любой описанный здесь дополнительный раствор, например, дополнительный раствор, в котором концентрация хлорида (и/или конечная концентрация хлорида в композиции эритроцитов после замены растворов, например, перед трансфузией) составляет меньше чем приблизительно 500 мМ, или приблизительно 250 мМ, или приблизительно 200 мМ, или приблизительно 150 мМ, или приблизительно 100 мМ, или приблизительно 75 мМ, или приблизительно 50 мМ, или приблизительно 25 мМ, или приблизительно от 25 до 250 мМ, или приблизительно от 40 до 100 мМ, или приблизительно от 50 до 75 мМ, или приблизительно от 60 до 70 мМ, или приблизительно от 100 до 200 мМ, или приблизительно от 125 до 175 мМ, или около 150 мМ.

Таблица 3

Примеры растворов для разбавления

	Э5 1	Р5 2	Э5 3	4	ϋδ 5	ϋδ 6	Р5 7	ϋδ 8	Э5 9	ϋδ 10	ϋδ 11	ϋδ 12	ϋδ 13
Декстроза (мМ)	55	55	55	55	55	45, 4	45, 4	45, 4	45, 4	45, 4	45, 4	45, 4
Аденин/ Аденин НС1 (мМ)	1, з	1, 3	1, 3	1, з	1, з	1, з	1, 3	1, 3	1, з	1, 3	1, з	1, з	1, з
Маннит (мМ)	55	55	55	55	55	28,8			28,8	28,8	28,8	28, 3	23, 3
Цитрат натрия ди гидрат или безводный	20	20				33, 5	33, 5	33, 5	20	20	20	20	20
Ыа₂НРО₄ (мМ)				20	15			33, 5	12,7	3, 5	16, 2	20
МаН₂РО₄ (мМ)						33, 5	33, 5		3, 5	12, 7			16,2
МаС1 (мМ)				15	20
Осмоляльнос ть (тОзт)	180	178	128	177	179	287	243	215	227	179	174	181
рН	6, 9	7, 68,0		8,61	8,38	6, 28	6,29	8,77	7, 48	6, 63	8, 62	8,7	7,5

Способы инактивации при использовании ресуспендированной эритроцитарной массы.

В некоторых вариантах осуществления эритроцитарную массу (эритроцитарные массы) (например, эритроциты, имеющие гематокрит в интервале приблизительно от 70 до 90% или приблизительно от 75 до 85%, или около 80%) подвергают обработке раствором перед проведением описанного здесь способа инактивации (например, способа, в котором композиция включает около 20 мМ глутатиона приблизительно с 1 экв. основания и около 0,2 мМ 8-303). Примеры растворов для обработки приведены в табл. 4. В некоторых вариантов осуществления раствор для обработки (например, любой описанный в табл. 4 раствор) добавляют к эритроцитарной массе перед добавлением гасителя, патоген-инактивирующего соединения, и любого добавляемого основания. В некоторых из этих вариантах осуществления, композицию эритроцитарной массы обрабатывают с помощью раствора для обработки, что приводит к получению не-эритроцитарной массы (например, эритроцитов, имеющих гематокрит в интервале приблизительно от 50 до 70% или приблизительно от 55 до 65%, или около 60%). В некоторых вариантах осуществления (а) добавляют к эритроцитарной массе раствор для обработки, (Ь) проводят описанный здесь способ инактивации (например, способ, в котором композиция включает около 20 мМ глутатиона с приблизительно 1 экв. основания и около 0,2 мМ 8-303), и (с) понижают, как это здесь описано, концентра- 25 023596 цию гасителя, (например, до меньше чем приблизительно 10 мМ, или меньше чем приблизительно 5 мМ). В некоторых из этих вариантов осуществления стадия (с) включает удаление раствора для обработки и добавление конечного дополнительного раствора (например, любого описанного здесь раствора, такого как 8АС-М, А8-5 или любого раствора из табл. 2, 3 или 4) с получением, например, композиции эритроцитов, имеющих гематокрит в интервале приблизительно от 50 до 70%, или приблизительно от 55 до 65%, или около 60%. В некоторых из этих вариантов осуществления концентрация хлорид-иона в композиции эритроцитов перед и/или в процессе инактивации составляет меньше чем или больше чем приблизительно 150 мМ, или приблизительно 120 мМ, или приблизительно 100 мМ, или приблизительно 90 мМ, или приблизительно 80 мМ, или приблизительно 70 мМ, или приблизительно 60 мМ, или приблизительно 50 мМ, или приблизительно 40 мМ, или приблизительно 30 мМ, или приблизительно 20 мМ, приблизительно 10 мМ, или от приблизительно 25 до 250 мМ, или от приблизительно 40 до 100 мМ, или от приблизительно 50 до 75 мМ, или от приблизительно 60 до 70 мМ, или около 65 мМ.

В некоторых вариантах осуществления называемый здесь как раствор для обработки включает один или более из следующих компонентов: декстрозу, аденин, маннит, цитрат (например, цитрат натрия), лимонную кислоту, фосфат (например, Να₂ΗΡΟ₄ и/или ЫаН₂РО₄) и хлорид (например, в виде хлорида натрия). В некоторых вариантах осуществления концентрация декстрозы в растворе для обработки и/или концентрация декстрозы в дополнительном растворе после удаления раствора для обработки в композиции эритроцитов составляет приблизительно от 10 до 150 мМ, или приблизительно от 20 до 120 мМ, или приблизительно от 25 до 100 мМ, или приблизительно от 30 до 75 мМ, или приблизительно от 40 до 50 мМ, или приблизительно от 50 до 60 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация аденина в растворе для обработки и/или концентрация аденина в дополнительном растворе после удаления раствора для обработки в композиции эритроцитов составляет приблизительно от 0,5 до 5 мМ, или приблизительно от 0,75 до 3 мМ, приблизительно от 1 до 2,5 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация маннита в растворе для обработки и/или концентрация маннита в дополнительном растворе после удаления раствора для обработки в композиции эритроцитов составляет приблизительно от 10 до 150 мМ, или приблизительно от 20 до 120 мМ, или приблизительно от 25 до 100 мМ, или приблизительно от 30 до 75 мМ, или приблизительно от 40 до 60 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация цитрата (например, цитрата натрия) в растворе для обработки и/или концентрация цитрата в дополнительном растворе после удаления раствора для обработки в композиции эритроцитов составляет приблизительно от 1 до 100 мМ, или приблизительно от 2 до 75 мМ, или приблизительно от 5 до 50 мМ, или приблизительно от 7,5 до 25 мМ, или приблизительно от 10 до 15 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация фосфата (например, Να₂ΗΡΟ₄ и/или ΝαΗ₂ΡΟ₄) в растворе для обработки и/или концентрация фосфата в дополнительном растворе после удаления раствора для обработки в композиции эритроцитов составляет приблизительно от 1 до 150 мМ, или приблизительно от 2 до 100 мМ, или приблизительно от 3 до 75 мМ, или приблизительно от 4 до 50 мМ, или приблизительно от 5 до 25 мМ, или приблизительно от 10 до 20 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация хлорида в растворе для обработки и/или концентрация хлорида в дополнительном растворе после удаления раствора для обработки в композиции эритроцитов составляет приблизительно 250 мМ, или приблизительно 200 мМ, или приблизительно 150 мМ, или приблизительно 120 мМ, или приблизительно 100 мМ, или приблизительно 90 мМ, или приблизительно 80 мМ, или приблизительно 70 мМ, или приблизительно 60 мМ, или приблизительно 50 мМ, или приблизительно 40 мМ, или приблизительно 30 мМ, или приблизительно 20 мМ, приблизительно 10 мМ, или приблизительно от 25 до 250 мМ, или приблизительно от 40 до 100 мМ, или приблизительно от 50 до 75 мМ, или приблизительно от 60 до 70 мМ, или приблизительно от 100 до 200 мМ, или приблизительно от 125 до 175 мМ.

В некоторых вариантах осуществления раствор для обработки и/или дополнительный раствор после удаления раствора для обработки в композиции эритроцитов включает приблизительно от 10 до 150 мМ (или приблизительно от 35 до 65 мМ) декстрозы, приблизительно от 0,5 до 5 мМ (или приблизительно от 0,75 мМ до 3 мМ) аденина, приблизительно от 10 до 150 мМ (или приблизительно от 25 до 75 мМ) маннита, приблизительно от 5 до 75 мМ (или приблизительно от 10 до 20 мМ) цитрата (например, цитрат натрия), приблизительно от 3 до 75 мМ (приблизительно от 5 до 25 мМ) фосфата (например, Να₂ΗΡΟ₄и/или ΝαΗ₂ΡΟ₄), и приблизительно от 5 до 100 мМ (или приблизительно от 25 до 75 мМ) хлорида.

- 26 023596

Таблица 4

Примеры растворов для обработки

	Раствор 1	Раствор 2	Раствор 3	Раствор 4	Раствор 5
Декстроза (мМ)	45,4	45,4	45,4	45,4	45, 4
Аденин/Аденин НС1(мМ)	1,з	1,3	1,3	1,3	1,3
Маннит (мМ)	55	44,5	44,5	44,5	30
Цитрат натрия дигидрат или безводный (мМ)		12	12	12
Ыа₂НРС>4 (мМ)					15
ЫаН₂Ж (мМ)
^С1 (мМ)	70	60	60	60	70
Осмоляльность (тОзт)
рН (скорректированное с помощью лимонной кислоты)			7	6, 5	6, 5

Оценка эффективности способа.

Кроме обсужденного выше показателя эффективности инактивации, выражаемого через 1од, эффективность усовершенствованных способов гашения может быть оценена рядом других методов, описанных в патентной публикации И8 № 2006/0115466, содержание которой приводится здесь путем ссылки на нее. Например, способы гашения могут быть оценены путем исследования изменения композиции эритроцитов с точки зрения функции, морфологии и состояния гидратации эритроцитов, и с точки зрения реакционной способности подвергнутых обработке эритроцитов по отношению к иммунной системе, например, к антителам. Если подвергнутая обработке композиция эритроцитов предназначается для применения в организме человека, например, для инфузии, способы гашения практически не должны нарушать функцию эритроцитов (например, в результате дегидратации). Практическое отсутствие нарушающего воздействия на функцию эритроцитов может быть определено с помощью известных в технике методов исследования функции эритроцитов. В частности, степень дегидратации может быть определена, например, по гематокриту (гематокритному числу, РСУ), осмотической резистентности, средней концентрации клеточного гемоглобина в эритроцитах (МСНС), проценту гемолиза, и с помощью эктацитометрии. Могут быть определены значения других индикаторов функции эритроцитов, такие как общий АТФ (аденозин-5'-трифосфат), общий 2,3-ДФГ (2,3-дифосфоглицерол) или внеклеточный калий, и сравнены с этими индикаторами для контрольной группы эритроцитов, не подвергавшихся обработке. Кроме того, могут быть определены величина внутриклеточного и внеклеточного рН, гемоглобин, потребление глюкозы и продуцирование лактата. Усовершенствованные способы настоящего изобретения могут быть сопоставлены с условиями обработки, ранее описанными в патентной публикации И8 № 2006/0115466 (например, полностью погашенные (2 экв. основания) 20 мМ глутатиона в комбинации с δ-303/смесь эритроцитов без описанного здесь понижения концентрации гасителя после инкубирования).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, эритроциты описанных здесь способов и композиций имеют минимальные повреждения или не имеют повреждений после обработки (например, дегидратацию, гемолиз и так далее). В некоторых вариантах осуществления эритроциты в полученной смеси, включающей композицию эритроцитов, гаситель, патоген-инактивирующее соединение и любое добавляемое основание (перед снижением или после снижения концентрации гасителя) имеют меньше чем 4%, или меньше чем 3%, или меньше чем 2%, меньше чем 1% гемолиза, или меньше чем 0,5% гемолиза. В некоторых вариантах осуществления эритроциты в полученной смеси имеют меньше чем 4%, или меньше чем 3%, или меньше чем 2%, или меньше чем 1%, или меньше чем 0,5% гемолиза приблизительно через 10 дней при 4°С, или приблизительно через 28 или 42 дня при 4°С, или приблизительно через 42 дня при 4°С после понижения концентрации гасителя (например, глутатиона).

В некоторых вариантах осуществления эритроциты в полученной смеси, включающей композицию эритроцитов, гаситель, патоген-инактивирующее соединение и любое добавляемое основание (перед понижением или после понижения концентрации гасителя) имеют большее чем 50%, или большее чем 55%, или большее чем 60%, или большее чем 65% гематокритное число (РСУ). В некоторых вариантах осуществления эритроциты в полученной смеси имеют большее чем 50%, или большее чем 55%, или большее чем 60%, или большее чем 65% гематокритное число (РСУ) приблизительно через 10 дней при 4°С, или приблизительно через 28 или 42 дня при 4°С, или приблизительно через 42 дня при 4°С после понижения концентрации гасителя (например, глутатиона).

- 27 023596

В некоторых вариантах осуществления эритроциты в полученной смеси, включающей композицию эритроцитов, гаситель, патоген-инактивирующее соединение и любое добавляемое основание (перед понижением или после понижения концентрации гасителя) имеют среднюю осмотическую ломкость эритроцитов (МСР; осмолярность, при которой происходит 50% гемолиз) больше чем 130, или больше чем 135, или больше чем 140, или больше чем 145, или больше чем 150, или больше чем 155. В некоторых вариантах осуществления эритроциты в полученной смеси имеют среднюю осмотическую ломкость эритроцитов (МСР) больше чем 130, или больше чем 135, больше чем 140, или больше чем 145, или больше чем 150, или больше чем 155 приблизительно через 10 дней при 4°С, или приблизительно через 28 или 42 дня при 4°С, или приблизительно через 42 дня при 4°С после понижения концентрации гасителя (например, глутатиона).

Способы определения АТФ, 2,3-дифосфоглицерата, глюкозы, гемоглобина, гемолиза и калия являются известными в технике, и они здесь описаны в экспериментальном разделе. См., например, публикацию Оатеу с1 а1., ТгапкГиыоп. 32:525-528 (1992), содержание которой приводится здесь путем ссылки на нее. Способы определения функции эритроцитов также описаны в публикациях ОгеентаЙ с1 а1., Уох 8апд, 58:94-99 (1990); Нодтап е1 а1., Уох 8апд, 65:271-278 (1993); и ВеиЙег е1 а1., В1оой Уо1. 59 (1982), содержание которых приводится здесь путем ссылки на них. Например, общий АТФ и общий 2,3-дифосфоглицерат могут быть определены с помощью набора 81дта АТР или набора 2,3-ОРС (фирмы 81дта, 8ΐ. Ьошк, Мо.). Набор АТР может быть использован в соответствии с методикой фирмы 81дта № 366-ИУ, содержание которой приводится здесь путем ссылки на нее. Общий АТФ может также быть определен с помощью ферментного анализа на основе люциферазы или протокола, описанного Беутлером (ВеиЙег) в 1984 году. Содержания внеклеточного калия могут быть определены с помощью анализатора для Κ'/Ν;·ι' (СаЬа Согпшд Мобе1 614 (фирмы Ска Согпшд ИхадпокБск Согр., МебГогб, МА). Величина внеклеточного рН может быть измерена путем центрифугирования клеток при 4°С в течение 15 мин при 12000 х д и удаления надосадочной жидкости, величина рН которой может быть измерена с помощью стандартного рН-метра при комнатной температуре (например, фирмы Весктап, с каломельным электродом сравнения из эпоксидной смолы). Для определения величины внутриклеточного рН, оставшийся после центрифугирования, осадок может быть закрыт пробкой в пробирке для центрифугирования и подвергнут хранению при температуре около -80°С в течение по меньшей мере 2 ч. Затем осадок может быть подвергнут лизированию путем добавления деионизированной воды. Лизируемый образец может быть тщательно смешан с водой, и величина рН раствора может быть измерена или при комнатной температуре с помощью стандартного рН-метра, или при комнатной температуре с помощью анализатора кислотно-основного баланса крови Ска Согпшд Мобе1 238 (фирмы Ска Согтпд ИхадпокБск Согр., МебГогб, МА). Измерения могут быть сделаны сразу после проведения обработки и в зависимости от прошедшего после обработки времени хранения, например, после хранения в течение до 42 дней. Способы настоящего изобретения позволяют получать композицию эритроцитов, в которой гемолиз подвергнутых обработке эритроцитов составляет величину меньшую чем 3% после 28 дней хранения, более предпочтительно меньшую чем 2% поле 42 дней хранения, и наиболее предпочтительно меньшую, чем или равную приблизительно 1% после 42 дней хранения при 4°С. В некоторых вариантах осуществления предлагается композиция эритроцитов (например, композиция эритроцитов, полученных любым из описанных здесь способов), в которой величина общего АТФ может быть выше в сравнении с величиной общего АТФ для композиции эритроцитов, подвергнутых обработке с помощью 2 мМ кислого глутатиона и 0,2 мМ 8-303. В некоторых вариантах осуществления описанные здесь способы гашения позволяют получить композиции эритроцитов, имеющие значения АТФ, которые приблизительно на 20%, также 30%, также 40% или приблизительно на 50% выше по сравнению с композициями, подвергнутых обработке способами с использованием 2 мМ кислого глутатиона и 0,2 мМ 8-303. В некоторых вариантах осуществления более высокое значение АТФ сохраняется через 7, 14, 21, 28, 35 или 42 дня хранения. В некоторых вариантах осуществления более высокое значение АТФ снижается в процессе хранения.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, описанные здесь способы и композиции включают композиции эритроцитов, в которых эритроциты характеризуются пониженной степенью воздействия нежелательных побочных реакций вследствие действия патоген-инактивирующего соединения (например, связыванием патоген-инактивирующего соединения с поверхностью эритроцитов). В некоторых вариантах осуществления побочной реакцией является изменение поверхности эритроцитов в результате воздействия патоген-инактивирующего соединения. Снижение степени изменения эритроцитов в способах настоящего изобретения может быть оценено при помощи различных известных в технике анализов, например таких, как описанные в патентной публикации И8 № 2006/0115466, содержание которой приводится здесь путем ссылки на нее. Может также быть определено количество акридина, связанного с поверхностью эритроцитов, с помощью описанного здесь чувствительного активированного флюоресценцией иммунного проточного цитометрического анализа (1РС).

Исходя из данных, полученных методами обнаружения с помощью флуоресценции, способы гашения настоящего изобретения по сравнению с аналогичными способами обработки без использования основания (например, способы с использованием нейтрализации глутатиона по сравнению с аналогичными способами с использованием не подвергнутого нейтрализации глутатиона), могут приводить к снижению

- 28 023596 среднего значения флуоресценции по меньшей мере на 10%, также по меньшей мере на 25%, также по меньшей мере на 50%, также по меньшей мере на 75%, или по меньшей мере на 90%. Например, способы гашения настоящего изобретения с помощью любой из описанных композиций с использованием основания (например, композиция эритроцитов, включающая приблизительно 15-25 мМ глутатиона, приблизительно от 0,5 до 1,5 экв. основания, и приблизительно 0,2 мМ 8-303) могут приводить к более низкому значению средней величины флуоресценции по сравнению с аналогичной композицией, но без использования основания (например, композиция эритроцитов, включающая приблизительно 15-25 мМ глутатиона и приблизительно 0,2 мМ 8-303 без основания).

Для способов гашения и композиций настоящего изобретения может быть также измерено количество патоген-инактивирующего соединения, связанного с поверхностью эритроцитов, через связывающую способность с антителами (АВС; число молекул патоген-инактивирующего соединения или его производного на один эритроцит, определяемое с помощью калиброванных гранул фирмы Вапдк ЬаЬога1опс5. 1пс; Р18йег8, ΙΝ; см. примеры 5 и 9) которые включают мышиное моноклональное антиакридиновое антитело, конъюгированное с аллофикоцианином (АРС), и с помощью проточного цитометра-сортировщика РАС8-СаНЬег (фирмы ВО Вюкиепсек). В некоторых вариантах осуществления любого из способов и любой из композиций настоящего изобретения, эритроциты имеют среднюю величину АВС меньшую чем приблизительно 75000, или меньшую чем приблизительно 70000, или меньшую чем приблизительно 60000, или меньшую чем приблизительно 55000, или меньшую чем приблизительно 52500, или меньшую чем приблизительно 50000, или меньшую чем приблизительно 47500, или меньшую чем приблизительно 45000, или меньшую чем приблизительно 42500, или меньшую чем приблизительно 40000, или меньшую чем приблизительно 37500, или меньшую чем приблизительно 35000, или меньшую чем приблизительно 32500, или меньшую чем приблизительно 30000, или меньшую чем приблизительно 27500, или меньшую чем приблизительно 25000. В некоторых вариантах осуществления эритроциты имеют среднюю величину АВС приблизительно от 10000 до 80000, или приблизительно от 20000 до 70000, или приблизительно от 25000 до 70000, или приблизительно от 25000 до 60000, или приблизительно от 30000 до 50000, или приблизительно от 35000 до 45000. В некоторых описанных здесь вариантах осуществления способов, сравнение с такой аналогичной обработкой с помощью гасителя и основания (например, с помощью нейтрализованного глутатиона) может давать значение АВС меньшее чем 90%, также меньшее чем 75%, также меньшее чем 65%, также меньшее чем 55%, также меньшее чем 45%, также меньшее чем 35%, также меньшее чем 25% или меньшее чем 10%, по сравнению с аналогичными способами использования композиции эритроцитов, которая не подвергается обработке с помощью основания (например, глутатион, который не был подвергнут нейтрализации).

Способы гашения изобретения могут также быть сопоставлены с существующими способами путем определения степени изменения нуклеиновых кислот в образце. Обычно, композиция эритроцитов может содержать лейкоциты, и из лейкоцитов может быть выделена нуклеиновая кислота. Меченое радиоактивным изотопом патоген-инактивирующее соединение в случае взаимодействия с нуклеиновой кислотой будет оставаться связанным с нуклеиновой кислотой. Это может быть использовано для оценки количества прореагировавшего соединения для различных способов гашения, и позволяет получить величину, которая может быть непосредственно связана с предполагаемой инактивацией лейкоцитов. Число 8-303 аддуктов, образованных на 1000 комплементарных пар оснований нуклеиновых кислот, может быть использовано в качестве модели для оценки предполагаемого воздействия различных способов на инактивацию патогенов. В качестве варианта, к композиции эритроцитов может быть добавлено соответствующее количество патогена, и после обработки нуклеиновая кислота патогена может быть выделена. Однако в этом случае в образце необходимо снизить содержание лейкоцитов, для того чтобы количество любых оставшихся лейкоцитов не мешало при определении нуклеиновой кислоты патогена.

Кроме обеспечения соответствующей патогенной инактивации при снижении степени протекания нежелательных побочных реакций (например, связывания патоген-инактивирующего соединения с поверхностью эритроцитов, которое может приводить к нежелательной ответной иммунной реакции) и степени дегидратации, способы гашения настоящего изобретения также обеспечивают по меньшей мере в некоторых вариантах осуществления, снижение концентрации реакционноспособных электрофильных соединений после патогенной инактивации. Если композиции эритроцитов предназначены для инфузии, то в этом случае важно, чтобы содержание реакционноспособных электрофильных соединений было как можно более низким, предпочтительно, практически уже необнаруживаемым. Присутствие реакционноспособных электрофильных соединений может быть определено при помощи известных в технике методов, таких как хроматографические методы, включая жидкостную хромато-масс-спектрометрию (ЬСМ8-М8). Кроме того, остаточная активность образца может быть оценена путем исследования его способности реагировать с гуаниновым остатком нуклеиновой кислоты, например путем общего анализа с помощью алкилятора, описанного в публикации Майек (Майек, \УР, Апа1. ВюсНет. 1992 Ос1; 206(1): 161-7). При этом анализе эритроциты экстрагируют после соответствующего времени инкубирования с патоген-инактивирующим соединением и гасителем. Любое остаточное патоген-инактивирующее соединение, так же как гаситель и другие соединения небольшого размера, отделяют от белков. Эти соединения затем инкубируют с двухспиральной ДНК, синтезированной с 8-³Н гуаниновыми остатками. Оста- 29 023596 точное патоген-инактивирующее соединение реагирует с двухспиральной ДНК в положении N7 гуанина, в результате чего происходит подкисление 8-Н остатка и высвобождение Н в раствор, где он может быть выделен и измерен. Количество высвобождающегося трития может быть определено количественно, и оно прямо связано 1:1 с количеством остаточного алкилятора, присутствовавшего в испытываемых экстрагированных образцах. Содержание электрофильных соединений, определенное этими методами, может являться критерием оценки при применении усовершенствованных способов изобретения и их сравнении с известными способами.

В некоторых вариантах осуществления каждого из описанных здесь способов способ дополнительно включает стадию понижения концентрации соединения в смеси, где соединение выбирают из группы, состоящей из патоген-инактивирующего соединения и продукта разложения патоген-инактивирующего соединения. В некоторых вариантах осуществления способ включает стадию понижения концентрации патоген-инактивирующего соединения в смеси. В некоторых вариантах осуществления способ включает стадию понижения концентрации электрофильных соединений в смеси. Концентрация патогенинактивирующего соединения в биологическом материале, таком как продукт крови, может быть понижена после обработки, например, путем адсорбции в периодическом или непрерывном процессе. Методы и устройства, которые могут быть использованы, описаны в патентных документах υδ 6544727; 6331387; 6951713 и 7037642; и заявках на патент υδ 2002/0192632 (абандонированная) и 2001/0009756 (абандонированная), содержание каждого из которых приводится здесь путем ссылки на них. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления, концентрацию патоген-инактивирующего соединения понижают путем контактирования смеси с адсорбционной средой, включающей частицы адсорбента, имеющие сродство к патоген-инактивирующему соединению. В некоторых вариантах осуществления адсорбционная система может быть предназначена для удаления патоген-инактивирующего соединение в периодическом процессе. В некоторых вариантах осуществления содержание патоген-инактивирующего соединения не понижают с помощью устройства для адсорбции соединения. В некоторых вариантах осуществления концентрацию патоген-инактивирующего соединения в смеси понижают путем промывки эритроцитов с помощью известных в технике методов. В некоторых вариантах осуществления концентрацию патоген-инактивирующего соединения в смеси понижают путем удаления части или всего раствора для обработки (например, δΆΟ-Μ, Αδ-5 или любого описанного в табл. 2,3 и/или 4 раствора) с помощью описанных здесь и/или известных в технике методов (например, с помощью центрифуг и устройств для выдавливания или путем объединения центрифуги и устройств для выдавливания, например, таких как установка ΤΑСδI, выпускаемая фирмой Тегито). В некоторых вариантах осуществления концентрацию патоген-инактивирующего соединения в смеси понижают путем удаления части или всего раствора для обработки (например, δΑΟ-Μ, Αδ-5 или любого описанного в табл. 2, 3 и/или 4 раствора) после введения в смесь дополнительного раствора (например, δΑΟ-Μ, Αδ-5 или любого описанного в табл. 2 раствора). В некоторых вариантах осуществления концентрацию патоген-инактивирующего соединения понижают одновременно с понижением концентрации гасителя.

Подвергнутые обработке композиции крови.

В некоторых вариантах осуществления изобретение также предлагает композиции эритроцитов, получаемые вследствие применения каждого из описанных здесь способов обработки. В некоторых вариантах осуществления изобретение также предлагает композиции эритроцитов, которые можно получить путем применения каждого из описанных здесь способов обработки. В одном аспекте изобретение предлагает композицию, включающую а) эритроциты, где эритроциты ковалентно прореагировали с электрофильной группой патоген-инактивирующего соединения; и Ь) гаситель, включающий тиольную группу, которая способна реагировать с патоген-инактивирующим соединением; где композиция является подходящей для инфузии людям после хранения от 28 до 42 дней при 4°С.

В некоторых вариантах осуществления каждого из описанных здесь способов и каждой из описанных здесь композиций, эритроциты в композиции эритроцитов являются клетками крови млекопитающего. Например, эритроцитами могут являться эритроциты грызунов (например, мыши или крысы), собак, зайцеобразных (например, кролика), низших приматов (например, шимпанзе) или эритроциты человека. Например, в некоторых вариантах осуществления, эритроцитами являются эритроциты человека. В некоторых вариантах осуществления эритроциты были подвергнуты лейкоцитредуцированию. В некоторых других вариантах осуществления, эритроциты не были подвергнуты лейкоцитредуцированию. В некоторых вариантах осуществления существует возможность, что композиция, включающая эритроциты, контаминирована патогеном. В некоторых вариантах осуществления композиция эритроцитов контаминирована патогеном. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 1 1од или по меньшей мере 2 1од8, или по меньшей мере 3 1од8, или по меньшей мере 4 1од8 патогена в композиции являются инактивированными, в случае, если патоген присутствует.

В некоторых вариантах осуществления изобретение охватывает композиции эритроцитов, в которых эритроциты подверглись изменению под действием описанного здесь патоген-инактивирующего соединения (например, δ-303). В некоторых вариантах осуществления композиции эритроцитов, полученные в результате применения способов обработки, включают продукты разложения патогенинактивирующего соединения (например, продукт реакции гасителя с патоген-инактивирующим соеди- 30 023596 нением). В некоторых вариантах осуществления изменением является реакция электрофильной группы патоген-инактивирующего соединения с поверхностью эритроцитов. В некоторых вариантах осуществления патоген-инактивирующее соединение ковалентно связано с поверхностью эритроцитов. В некоторых вариантах осуществления патоген-инактивирующее соединение ковалентно связано с одним или более белками на поверхности эритроцитов. В некоторых вариантах осуществления изменением является нуклеофильная группа эритроцита, прореагировавшая с электрофильной группой патогенинактивирующего соединения, где электрофильной группой является ипритная группа, и нуклеофильная группа была заменена одним или более атомами хлора ипритной группы. В некоторых вариантах осуществления патоген-инактивирующее соединение нековалентно связано с поверхностью эритроцитов. В некоторых вариантах осуществления композиции эритроцитов имеют среднее значение АВС менее чем 75000, или менее чем 70000, или менее чем 60000, или менее чем 55000, или менее чем 52500, или менее чем 50000, или менее чем 47500, или менее чем 45000, или менее чем 42500, или менее чем 40000, или менее чем 37500, или менее чем 35000, или менее чем 32500, или менее чем 30000, или менее чем 27500, или менее чем 25000. В некоторых вариантах осуществления эритроциты имеют среднее значение АВС приблизительно от 10000 до 80000, или приблизительно от 20000 до 70000, или приблизительно от 25000 до 70000, или приблизительно от 25000 до 60000, или приблизительно от 30000 до 50000, или приблизительно от 35000 до 45000.

В некоторых вариантах осуществления композиции эритроцитов характеризуются пониженной степенью изменения поверхности эритроцитов в результате воздействия патоген-инактивирующего соединения относительно эритроцитов, полученных при помощи других способов, включающих обработку патоген-инактивирующим соединением. В некоторых вариантах осуществления композиции эритроцитов, полученные в результате применения описанных здесь способов обработки, включают пониженное количество патоген-инактивирующего соединения, содержащего реакционноспособную электрофильную группу после завершения обработки, относительно композиции эритроцитов, полученной другим способом, включающим обработку патоген-инактивирующим соединением (например, способом без достаточного количества добавляемых в реакционную смесь гасителя и/или основания, способом, в котором к реакционной смеси не добавляют гаситель и/или основание, и/или обработкой при более низком значении рН). В некоторых вариантах осуществления количество патоген-инактивирующего соединения, содержащего реакционноспособную электрофильную группу, в композиции было понижено приблизительно на 10%, приблизительно на 25%, приблизительно на 50%, приблизительно на 75%, приблизительно на 90%, приблизительно на 95%, или приблизительно на 99%, относительно композиции, подвергнутой обработке другим способом, включающим патоген-инактивирующее соединение (например, способом без достаточного количества добавляемых в реакционную смесь гасителя и/или основания, способом, в котором к реакционной смеси не добавляют гаситель и/или основание, и/или обработкой при более низком значении рН).

В некоторых из этих вариантов осуществления композиция эритроцитов включает остаточное количество соединения гасителя (например, глутатиона). В некоторых вариантах осуществления композиция включает достаточно низкую концентрацию гасителя, для того чтобы поддерживать жизнеспособность эритроцитов и длительный срок применения и предотвращать дегидратацию эритроцитов и/или пониженную осмотическую резистентность в процессе хранения. В некоторых вариантах осуществления композиция включает концентрацию гасителя, которая является достаточно более низкой, чем ранее использовавшаяся концентрация гасителя в композиции. В некоторых вариантах осуществления ранее использовавшаяся более высокая концентрация гасителя понижает жизнеспособность эритроцитов и срок применения и/или повышает степень дегидратации эритроцитов и снижает осмотическую резистентность в процессе хранения, тогда как более низкая концентрация является достаточно более низкой, чем ранее использовавшаяся концентрация гасителя в композиции. В некоторых вариантах осуществления концентрация гасителя в композиции составляет меньше чем приблизительно 25 мМ, меньше чем приблизительно 20 мМ, меньше чем приблизительно 15 мМ, меньше чем приблизительно 10 мМ, меньше чем приблизительно 8 мМ, меньше чем приблизительно 6 мМ, меньше чем приблизительно 5 мМ, меньше чем приблизительно 4 мМ, меньше чем приблизительно 3 мМ, меньше чем приблизительно 2 мМ, или меньше чем приблизительно 1 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация гасителя в композиции находится в интервале приблизительно от 1 до 20 мМ, приблизительно от 2 до 15 мМ, приблизительно от 3 до 10 мМ, приблизительно от 4 до 8 мМ, или приблизительно от 5 до 6 мМ.

В некоторых вариантах осуществления композиция включает дополнительный раствор (например, раствор, описанный в табл. 2 или раствор, включающий любую комбинацию компонентов, описанных в табл. 2). В некоторых вариантах осуществления композиция включает хлорид натрия, аденин, глюкозу, фосфат и/или маннит. В некоторых вариантах осуществления конечная концентрация хлорид-иона в композиции эритроцитов (например, перед трансфузией) составляет меньше чем приблизительно 500 мМ или приблизительно 250 мМ, или приблизительно 200 мМ, или приблизительно 150 мМ, или приблизительно 100 мМ, или приблизительно 75 мМ, или приблизительно 50 мМ, или приблизительно 25 мМ, или приблизительно от 25 до 250 мМ, или приблизительно от 40 до 100 мМ, или приблизительно от 50 до 75 мМ, или приблизительно от 60 до 70 мМ, или приблизительно от 100 до 200 мМ, или приблизительно

- 31 023596 от 125 до 175 мМ, или около 150 мМ.

В некоторых вариантах осуществления композицию применяют для инфузии пациенту (например, человеку) после приблизительно 2 дней или приблизительно 5 дней, или приблизительно 10 дней, или приблизительно 15 дней, или приблизительно 20 дней, или приблизительно 28 дней, или приблизительно 35 дней, или приблизительно 42 дней хранения при 4°С.

В некоторых из этих вариантов осуществления композиция включает а) эритроциты, которые ковалентно взаимодействуют с электрофильной группой патоген-инактивирующего соединения (например, 8-303) на поверхности клетки и ί) имеют гематокритное число (РСУ) большее, чем 60%, и/или ίί) имеют среднюю связывающую способность с антителами (АВС) приблизительно от 25000 до 70000 (или приблизительно от 35000 до 45000) и Ь) глутатион в качестве гасителя при концентрации меньшей, чем приблизительно 8 мМ (или меньшей, чем 6 мМ, или меньшей, чем приблизительно 2 мМ). В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере 3 1од (или по меньшей мере 1 1од) патогена является инактивированным, в случае, если он присутствует. В некоторых вариантах осуществления композицию применяют для инфузии людям после хранения в течение 28 или 42 дней при 4°С.

Наборы.

В дополнение к усовершенствованным способам гашения, настоящее изобретение предлагает наборы для одноразового использования для обработки композиции эритроцитов, где обработка может быть осуществлена вручную или автоматически. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение предлагает наборы, включающие патоген-инактивирующее соединение, гаситель и/или основание, используемые в каждом из описанных здесь способов. В некоторых вариантах осуществления в наборе имеется свежий раствор (например, буфер для ресуспендирования клеток) для использования после описанного здесь понижения концентрации гасителя.

В некоторых вариантах осуществления набор включает 8-303, включая любые его соли, и нейтрализованный глутатион, включая любые его соли. 8-303 может находиться в твердой форме или в форме раствора. Аналогично, нейтрализованный глутатион может находиться в твердой форме или в форме раствора. Эти твердые формы или растворы могут дополнительно включать приемлемые наполнители, вспомогательные средства, разбавители или стабилизаторы. В некоторых вариантах осуществления 8303 является гидрохлоридной солью, и нейтрализованный глутатион нейтрализован с помощью приблизительно 1 экв. гидроксида натрия. В некоторых вариантах осуществления 8-303 и нейтрализованный глутатион находятся в твердой форме, и набор дополнительно включает подходящий растворитель для растворения 8-303 и подходящий растворитель для растворения нейтрализованного глутатиона. В некоторых вариантах осуществления изобретение предлагает набор, включающий патоген-инактивирующее соединение, гаситель и раствор для растворения гасителя, где раствор нейтрализует или частично нейтрализует гаситель. Обсуждаемые здесь способы и наборы охватывают любой подходящий фармацевтический состав патоген-инактивирующего соединения и гасителя, который может быть приготовлен в виде смеси или раздельно. Фармацевтически приемлемые составы являются известными для специалистов в этой области, и примеры подходящих наполнителей, вспомогательных средств, разбавителей или стабилизаторов могут быть найдены, например, в монографии Оеииаго, ей., йепипдЮп'х Тйе 8с1епсе апй Ргасйсе о£ Рйагтасу, 20Й1 еййюп, Ырршсой УППатх & УШйпх. Изобретение также включает полученные с помощью описанных выше способов описанные выше композиции, включающие эритроциты, патогенинактивирующее соединение и гаситель, где композиция имеет подходящий интервал значений рН для осуществления усовершенствованного гашения патоген-инактивирующего соединения.

В другом аспекте, изобретение предлагает набор, применяемый, например, для обработки композиции эритроцитов с целью инактивирования патогенов, включающий патоген-инактивирующее соединение, содержащее лиганд, связывающий нуклеиновую кислоту, и функциональную группу, которая является электрофильной группой, или которая образует электрофильную группу (включая любую его соль), гаситель, включающий тиольную группу (включая любую его соль), и приблизительно от 0,75 до 1,25 экв. основания, где эквивалент означает мольное количество, которое эквивалентно мольному количеству гасителя в наборе. В некоторых вариантах осуществления набор включает около 1 экв. подходящего основания.

В еще одном аспекте, изобретение предлагает набор для обработки композиции эритроцитов с целью инактивации патогенов, включающий лиганд, связывающий нуклеиновую кислоту, и функциональную группу, которая является электрофильной группой, или которая образует электрофильную группу (например, 8-303), включая его любую соль, нейтрализованный гаситель, включающий тиольную группу (например, нейтрализованный глутатион), включая его любую соль, и, необязательно, свежий раствор (такой как буфер для ресуспендирования клеток), для использования после описанного здесь понижения концентрации гасителя. В некоторых вариантах осуществления раствором является дополнительный раствор, раствор для разбавления и/или описанный здесь раствор для обработки (например, 8АО-М, А8-5 или любой описанный выше или в табл. 2, 3 и/или 4 раствор).

- 32 023596

Примеры, материалы и методы

Далее изобретение иллюстрируется с помощью следующих неограничивающих примеров.

Пример 1. Приготовление организма.

Примеры, материалы и методы.

Бактериальные и вирусные штаммы, используемые для этих исследований, являлись клиническими штаммами, полученными либо из Управления по вопросам медицинского обслуживания штата Калифорния, либо из Американской коллекции типовых культур.

Бактерии. Замороженные исходные рабочие штаммы бактерий инокулировали в колбе емкостью 500 мл, содержащей смесь 50% среды из дрожжевого экстракта без добавленной глюкозы и 50% фетальной бычьей сыворотки. Колбы инкубировали в течение ночи в водяной бане-шейкере с установленной температурой 37°С. Грамположительные бактерии вводили путем инъекции непосредственно из культуры, полученной в течение ночи. Полученные в течение ночи грамотрицательные бактерии были дополнительно пересеяны путем 1:1000 разбавления в свежей культуральной среде и инкубированы, как показано выше, до тех пор, пока они не достигали логарифмической фазы роста, определяемой по оптической плотности. При проведении экспериментов по патогенной инактивации (ΡΙ) эти бактерии в логарифмической фазе роста вводили путем инъекции в продукт крови.

Вирусы. Бесклеточные исходные вирусные штаммы получали при помощи соответствующих клеточных линий для каждого вируса. Эти исходные штаммы замораживали при -80°С и сохраняли при этой температуре до тех пор, пока их не размораживали и вводили путем инъекции в продукт крови для проведения экспериментов по патогенной инактивации.

Пример 2. Приготовление доз эритроцитарной массы.

Получали кровь в фирме Сегик в виде доз цельной крови по 450 мл или 500 мл, либо в день взятия крови у доноров, либо в течение 3 дней после взятия крови. В большинстве случаев цельную кровь подвергали лейкофильтрации, перед тем как ее перерабатывали в дозы эритроцитарной массы. В редких случаях дозы не удавалось подвергнуть результативной лейкофильтрации (например, кровь от доноров с признаком серповидности), и эти дозы эритроцитарной массы использовали без лейкофильтрации для исследований по патогенной инактивации организмов, для которых отсутствует информация относительно их выживаемости внутри лейкоцитов.

После лейкофильтрации кровь центрифугировали и плазму удаляли. Затем добавляли требуемый дополнительный раствор эритроцитов, такой как А8-3 (№.Нпсе1). и полученную дозу эритроцитарной массы либо сразу же использовали, либо хранили до момента использования при 4°С.

Пример 3. Патогенная инактивация (ΡΙ).

Процесс патогенной инактивации включает инокуляцию доз эритроцитарной массы с помощью исследуемой культуры организма. Обычно вводимый в дозы эритроцитарной массы заданный титр организмов составлял приблизительно 10⁶ с£и (колониеобразующих единиц) или р£и (бляшкообразующих единиц)/мл эритроцитов. В большинстве случаев объем культуры организма (включая любую культуральную среду) составлял приблизительно 1% от объема дозы эритроцитарной массы и обычно не превышал больше чем 10%. Для оценки инактивации при более низких, более физиологичных содержаниях бактерий использовали введения от 10 до 10⁵ с£и/доза. Для проведения исследований при введении низких содержаний организмов, две дозы эритроцитарной массы объединяли вместе, перемешивали, затем разделяли на исследуемую дозу, которую подвергали описанной здесь обработке, и на контрольную дозу, к которой добавляли только гаситель (например, глутатион) (инактиватор патогенов, например, 8-303 отсутствовал) и которую выдерживали при таких же температурных условиях, как и в случае исследуемой дозы.

После введения культуры организма в дозу эритроцитарной массы, дозу подвергали перемешиванию в контейнере путем его быстрого перемещения вручную по траектории в виде восьмерки или по траектории движения педали велосипеда.

Контаминированные эритроциты затем переносили в смесительный контейнер комплекта для процесса инактивации патогенов в эритроцитах одноразового использования. Комплект состоит из ряда пластмассовых контейнеров и штуцеров, соединенных пластмассовыми трубками. Смесительный контейнер представлял собой пластмассовый контейнер РБ1813 объемом 600 мл с двумя штуцерами. К каждому из штуцеров подсоединяли Υ-образную трубочку, снабженную с помощью разъемов Льюэра педиатрическими фильтрами, прикрепленными к одному концу трубочки. Неиспользуемый конец трубочки на одном штуцере соединяют с другим пластмассовым контейнером РБ1813 объемом 600 мл (контейнером для инкубирования). Оставшийся неиспользуемый конец трубочки выполнял роль линии, используемой для соединения с исходной дозой эритроцитарной массы.

Растворы для введения готовили и добавляли к дозам следующим образом: раствор 600 мМ глутатиона с 1 экв. ΝαΟΗ получали путем растворения 2,8 г глутатиона в ~12 мл 0,9% физиологического раствора и 0,9 мл 10 Ν ΝαΟΗ. Соответствующий объем раствора глутатиона набирали в шприц объемом 20 мл. Для получения 20 мМ глутатиона после его введения в дозу эритроцитарной массы, используемый объем обычно составлял 10 мл раствора глутатиона на 280 мл эритроцитов плюс 2 мл на потери в линии. Шприц, содержащий глутатион, подсоединяли к смесительному контейнеру с помощью фильтрующего

- 33 023596 конца трубочки, который разделяется при помощи тройника от конца трубочки, присоединенного к контейнеру для инкубирования. Во время добавления вводимых растворов дозу эритроцитарной массы помещали на шейкер для лучшего перемешивания в вертикальном направлении. Глутатион добавляли к дозе эритроцитарной массы во время ее перемешивания на шейкере. Дозу затем перемешивали вручную с помощью описанного выше метода смешения с движением по траектории с фигурой восьмерки. После добавления глутатиона дозы эритроцитарной массы выдерживали при комнатной температуре в течение 5 мин.

После периода выдерживания, отбирали небольшое количество эритроцитов и культивировали их для определения титра перед обработкой. Для бактериальных образцов использовали стандартные биологические испытания в чашке Петри, а исследования путем культивирования клеток использовали для вирусов.

Раствор 6 мМ гидрохлорида амусталина (8-303) готовили путем растворения 46 мг 8-303 в ~15 мл 0,9% физиологического раствора. Соответствующую дозу раствора 8-303 набирали в шприц объемом 20 мл. Для получения 0,2 мМ 8-303 после его введения в дозу эритроцитарной массы, используемый объем обычно составлял 10 мл раствора 8-303 на 280 мл эритроцитов плюс 2 мл на потери в линии. Дозу затем перемешивали вручную с помощью описанного выше метода смешения с движением по траектории с фигурой восьмерки. После добавления 8-303, подвергнутую обработке дозу эритроцитарной массы инкубировали при комнатной температуре минимум в течение 3 ч для осуществления патогенной инактивации перед отбором пробы для определения титра после обработки.

Через 3 ч после инактивации патогенов, отбирали образцы и культивировали их, как было описано выше, для определения титра после обработки. Для исследований, в которых оценивали инактивацию бактерий, вводимых при их низких содержаниях, после обработки проводили инкубирование как испытуемых, так и контрольных доз эритроцитарной массы, при комнатной температуре в течение ~20 ч, и затем инкубировали при 37°С в течение ночи. После инкубирования при 37°С, отбирали образцы из каждой подвергнутой обработке испытуемой дозы эритроцитарной массы и из аналогичной не подвергавшейся обработке дозы эритроцитарной массы и культивировали их для получения качественной оценки бактериального титра. Не подвергавшаяся обработке доза эритроцитарной массы демонстрировала рост бактерий.

Ьод снижение для каждой дозы определяли путем вычисления 1од отношения титра до обработки к титру после обработки, где титры выражали как 10 х с£и или р£и/мл.

Пример 4. Эксперименты по функции эритроцитов ίη νίίτο.

Дозы эритроцитарной массы человека готовили в дополнительных растворах, таких как А8-3 (Νυ1псе1), в соответствии с инструкциями производителя. Дозы эритроцитарной массы обрабатывали глутатионом с различными концентрациями для достижения конечных концентраций в интервале от 2 мМ до 30 мМ. В ряде случаев перед обработкой корректировали величину рН глутатиона с помощью или 1 или 2 экв. основания, или бикарбоната натрия или гидроксида натрия. После обработки глутатионом, эритроциты обрабатывали с помощью 8-303, растворенного в 0,9% хлориде натрия, для достижения концентрации 0,2 мМ 8-303 в эритроцитах, или имитировали обработку с помощью 0,9% хлорида натрия. После обработки, дозы эритроцитарной массы инкубировали в течение 20 ч при 20-25°С. После инкубирования, несколько доз эритроцитарной массы центрифугировали в течение 6 мин при 21°С и при 4100 х д надосадочную жидкость удаляли и добавляли к эритроцитам 100 мл свежего дополнительного раствора. Все дозы помещали на хранение при 4°С. Не подвергавшиеся обработке контрольные дозы помещали на хранение при 4°С, после того как они были приготовлены в дополнительном растворе.

Функции ίη νίίτο исследовали в различные моменты времени на протяжении всего срока хранения. Величину внеклеточного рН при 37°С определяли путем измерения величины рН эритроцитов из каждой дозы на анализаторе кислотно-основного баланса крови Сйгоп ΟίαβηοδίΚδ. Общий АТФ определяли с помощью ферментного анализа на основе люциферазы по протоколу, описанному Беутлером (ВеиНег, 1984). Для определения внеклеточного калия, глюкозы и лактата приготавливали несодержащие клеток надосадочные жидкости. Внеклеточный калий определяли путем измерения содержания К+ в несодержащей клеток надосадочной жидкости с помощью анализатора Να/Κ модели #614 фирмы СЫгоп Όία^ηοδЦс8 или аналогичного анализатора. Внеклеточную глюкозу и лактат определяли на анализаторе ЫехСТ. Показатели эритроцитов регистрировали с помощью гематологического анализатора Αάνία (фирмы 81етепк).

Перед анализом на осмотическую резистентность и распределение плотностей эритроциты три раза промывали в 0,9% хлорида натрия и инкубировали в течение минимум 1 ч при комнатной температуре. Способ, использованный для измерения осмотической резистентности, описан в публикации ВеиЙег еί а1., 1982, Βίοοά ίουτηαΐ 59:1141-1147, и он был модифицирован для 96-луночного планшета (Бете еί а1., 2003, Β1οοά 101:4189-4194). Кривые распределения плотности получали в соответствии с публикацией Багюп апй ΜαπΗογδΗν, 1964, ί ЬаЬ С1ш Мей 6:668-674, используя фталатные эфиры в микрогематокритных трубках.

- 34 023596

Пример 5. Количественная оценка связывания патоген-инактивирующего соединения с поверхностью эритроцитов.

Уровень акридина, связанного с поверхностью эритроцитов, определяли с помощью чувствительного активированного флюоресценцией иммунного проточного цитометрического анализа (1РС) с использованием мышиного моноклонального антиакридинового антитела, конъюгированного с аллофикоцианином (АРС), и с помощью проточного цитометра-сортировщика РАС8-СаПЬит (фирмы ВО ВюксК епсек) (ВО Вюкиепсек). Вкратце, эритроциты промывали три раза в 0,9% физиологическом растворе и ресуспендировали до 4% гематокрита в проточном буфере для инкубирования (НВ88, 1% В8А, 0,1% Ν;·ιΝ_3ι. 1 мМ ЕЭТА, 3% В8А). Затем добавляли мышиное моноклональное анти-акридиновое антитело, конъюгированное с аллофикоцианином, и инкубировали в течение 30 мин при 4°С; клетки промывали в проточном буфере для промывки (НВ88 1% В8А, 0,1% ΝαΝ₃,, 1 мМ ЕЭТА), ресуспендировали в этом же буфере, и оценивали суммарно 30000 событий в проточном цитометре-сортировщике ЕАС8СайЬиг при соответствующей установке дискриминационного окна. Определение числа молекул 8-303, связанных с клеточной поверхностью эритроцитов человека (АВС), осуществляли с помощью наборов гранул ОиаШит 81тр1у Се11и1аг (фирмы Вапд ЬаЬогаФпек, 1пс; Икйегк, ΙΝ).

Пример 6. Влияния величины рН глутатиона на непосредственную и связанную с хранением гидратацию эритроцитов и функцию эритроцитов.

Дозы эритроцитарной массы обрабатывали с помощью 8-303 (0,2 мМ) и глутатиона (20 мМ), величину рН которого корректировали с помощью №ОН (меняя количество экв. основания (Ь.е.)) для усиления гасящего действия глутатиона. Величина рН испытуемых вводимых растворов составляла 2,9, 4,5, и 8,9 для 0 Ь.е., 1 Ь.е. и 2 Ь.е., соответственно. После обработки эритроциты хранили при 4°С и периодически подвергали анализу на величину внеклеточного рН, содержание глюкозы, лактатов, калия, общий АТФ и гемолиз. Физические параметры эритроцитов (МСУ, МСН, МСНС, ΗΌΑ и так далее) измеряли с помощью оптической проточной цитометрии, измерения осмотической резистентности осуществляли в соответствии с методикой Беутлера с соавторами (ВеиДет е1 а1., 1982), модифицированной Лью с соавторами (Безт е1 а1., 2003).

Воздействие на эритроциты щелочного глутатиона приводило к пониженному значению Нс1 с мгновенной и устойчиво пониженной осмотической резистентностью и повышенной плотностью эритроцитов (например, см. фиг. 1). Эту мгновенную дегидратацию корректировали путем понижения количества экв. основания, приводящего к более низкой величине рН растворов глутатиона (см. табл. 5). В то время как мгновенная дегидратация улучшалась, осмотическая резистентность эритроцитов продолжала изменяться (табл. 6; дополнительно примеры на фиг. 2 и 3), в зависимости от концентрации присутствующего глутатиона. Результаты измерения МСНС и распределения МСН с помощью оптической проточной цитометрии (гематологический анализатор АДАа, фирмы 81етепк) были взаимосвязаны с изменениями осмотической резистентности и плотности. Дегидратация не зависела от 8-303, так как влияние рН и глутатиона было также продемонстрировано в отсутствии 8-303.

Таблица 5

Влияние уровней щелочности глутатиона, скорректированных гидроксидом натрия, на гидратацию эритроцитов сразу после обработки

Уровень щелочности	МСТ* (тОзш)	НсЕ <%)	МСНС (г/л)	Величина рН крови
Без обработки	160	62	31	6, 743
Имитация обработки	Не определяли	56	33	6,759
Обработан (0 Ь.е.)	173	53	31	6, 206
Обработан (1 Ь.е.)	156	52	36	6,713
Обработан (2 Ь.е,)	142	47	42	7,180

*МСР (Средняя осмотическая ломкость эритроцитов) = осмолярность, при которой происходит 50% гемолиз.

- 35 023596

Таблица 6

Влияние количества эквивалентов основания, добавленных к глутатиону, на гидратацию и функцию эритроцитов в процессе хранения

Время**	Уровень щелочности	МСР* (тОзш)	Нс1: ί*)	мене (г/дцл)	Величина рН крови	АТФ (мкмоль/ г НЬ)	Глюкоза (ММ)	Лактат (мМ)
20 часов	Вез обработки	158	61±1	30±1	6,749± 0,011	5,35+ 0,41	11,6+ 0,1	0,9+0,7
	Обработан (1 Ь.е.)	156	52 + 1	32±1	6,644± 0,034	б,45± 0,37	14,5+ 0,7	0,2+0,0
	Обработан (2 Ь.е.)	145	46±1	35±1	7,173± 0,020	8,17± 0,50	12,8+ 0,3	0,1+0, 1
дней	Без обработки	158	60 + 1	31 + 0	6,617+ 0,020	4,78+ 0,62	9,8+1,3	3,7±0,3
	Обработан (1 Ь,е.)	152	51±1	34±1	6,4&6± 0,019	4,47± 0,70	9,4±0,4	2,4+0,6
	Обработан {2 ъ.е.)	146	47 + 1	36±1	6,651± 0,035	5,58± 0,36	6,2 + 0,9	5,7+0,5
35 дней	Без обработки	159	61±3	31 + 1	6,477± 0,039	3,52+ 0,37	11,6+ 0,3	10,б± 2,0
	Обработан (1 Ъ.е.)	148	52 + 1	34 + 1	6,423+ 0,033	2,77+ 0,49	14,5± 0,9	20,б± 1,6
	Обработан {2 Ь.еА	147	49±1	35±1	6,489+ 0,030	3,937+ 0,51	12,8± 0,5	10,1± 1,0

**Дней после обработки. Кровь, обработанная на 5 дней позже.

Изменение гидратации эритроцитов зависело от глутатиона, рН и концентрации, но не зависело от 8-303 или данных биохимического анализа (АТФ, лактат, глюкоза), обычно используемых для оценки функции эритроцитов. Ограничение воздействия высоких значений рН глутатиона предотвращало эффект возникновения дегидратации. Ограничение непрерывного воздействия высоких уровней глутатиона предотвращало дегидратацию при хранении. Эти исследования показывают, что оценка состояния гидратации при хранении эритроцитов должна быть включена в качестве прогностического фактора качества эритроцитов, так как существенные изменения в гидратации не влияли на традиционно используемые критерии, но могли приводить к умеренному изменению срока использования эритроцитов.

Пример 7. Усовершенствованный способ гашения с последующим понижением содержания гасителя дает в результате пониженную дегидратацию эритроцитов после хранения.

Дозы эритроцитарной массы обрабатывали с помощью 8-303 (0,2 мМ) и глутатиона (20 мМ), величина рН которого была скорректирована 1 экв. ЫаОН для усиления свойств гашения глутатиона. После обработки глутатионом, эритроциты обрабатывали с помощью 8-303, растворенного в 0,9% хлорида натрия, для достижения концентрации 0,2 мМ 8-303 в эритроцитах, или осуществляли имитацию обработки с помощью 0,9% хлорида натрия. После обработки, дозы эритроцитарной массы инкубировали в течение 20 ч при 20-25°С. После инкубирования, несколько доз центрифугировали в течение 6 мин при 21°С и при 4100 х д, надосадочную жидкость отбрасывали и к эритроцитам добавляли 100 мл свежего дополнительного раствора. Все дозы эритроцитарной массы помещали на хранение при 4°С. Не подвергавшиеся обработке контрольные дозы помещали на хранение при 4°С после их приготовления в дополнительном растворе. Измерения осмотической резистентности эритроцитов проводили в соответствии с методикой Беутлера с соавторами (ВсиЙст с1 а1., 1982), модифицированной Лью с соавторами (Ьсте с1 а1., 2003).

Продолжительное воздействие на эритроциты высоких концентраций глутатиона приводило к повышенной плотности и пониженной осмотической резистентности эритроцитов (например, см. табл. 5, фиг. 3 и 4). Эту связанную с хранением дегидратацию корректировали путем удаления глутатиона перед хранением эритроцитов (например, см. фиг. 4 и 5). Зависящая от времени и концентрации глутатиона дегидратация не зависела от 8-303, так как действие глутатиона также обнаруживалось и при отсутствии 8-303 (например, см. фиг. 6).

Гидратация эритроцитов изменяется в зависимости от концентрации глутатиона. Ограничение воздействия высоких концентраций глутатиона путем замены раствора для обработки на свежий дополнительный раствор предотвращало эффект дегидратации, вызванный хранением.

Пример 8. Патогенная инактивация при применении усовершенствованных способов гашения.

Дозы эритроцитарной массы с уменьшенным содержанием лейкоцитов и с гематокритом около 60% готовили в среде для хранения А8-3. Дозы эритроцитарной массы инокулировали с помощью приблизительно 6 1од§/мл жизнеспособного организма, и отбирали аликвоту, которая служила в качестве не подвергнутой обработке контрольной исходной дозы. К инокулированным дозам добавляли глутатион в рас- 36 023596 творе 1 экв. ΝαΟΗ до конечной концентрации 20 мМ и тщательно перемешивали. Добавляли 8-303 до конечной концентрации 0,2 мМ, и дозы снова тщательно перемешивали и инкубировали при температуре от 20 до 25°С в течение трех ч. После инкубирования отбирали образцы и анализировали их на обнаружение остаточных жизнеспособных организмов. Определяли титр контрольных образцов сразу после приготовления и еще раз после инкубирования в течение 3 ч. Для каждого организма проводили эксперимент по меньшей мере два раза.

За исключением РкеиДотопак, грамотрицательные, грамположительные бактерии и один пример вируса были эффективно инактивированы в результате обработки глутатионом, нейтрализованным с помощью 1 экв. ΝαΟΗ, в сравнении с нейтрализацией с помощью 2 экв. ΝαΟΗ (см. табл.7).

Патогенная инактивация РкеиДотопак аегидтока при использовании суммарного титра инокуляции до 4,4 1одк на дозу эритроцитарной массы давала в результате полную инактивацию.

Таблица 7

Данные по патогенной инактивации при применении усовершенствованных способов гашения в сравнении с применяемыми ранее условиями

	Ьод снижения глутатион (20 мМ), 1 Ь.е*	Ьод снижения глутатион (20 мМ)_г 2 Ь.е.
3. аигеиз	6,0 ± 0,3 (п=4)	6,4
3. тагсезсепз	3,7 ±0,4 (п=3)	4,8
Υ.	5,0 ±0,4	4, 6
еп±егосоИ±1са	(п=4)
Е, соП	5,9 ± 0,8 (п=4)	6,5
Р. аегидтпоза*	1,2 ± 0,4 (п=3)	1,8
νδν	>5, 9	4,2

Пример 9. Содержания связанного с поверхностью акридина при применении усовершенствованных способов гашения с использованием стадии замены.

Способ, описанный в примере 5, был использован для определения связывающей способности анти-акридина с антителами для эритроцитов, обработанных с помощью 20 мМ глутатиона, нейтрализованного 1 экв. NаΟΗ, и 0,2 мМ 8-303. Связывающая способность с антителами, измеренная для различных препаратов эритроцитов, составляла приблизительно 39000 на эритроцит (см. фиг. 7). Этот уровень связывания сравнивают с уровнем 18407±1195 АВС, когда эритроциты обрабатывают с помощью 20 мМ глутатиона, нейтрализованного 2 экв. NаΟΗ, и уровнем 123714±5123 АВС, когда эритроциты обрабатывают с помощью 2 мМ кислого глутатиона.

Пример 10. Патогенная инактивация при обработке с помощью 8-303 при различных значениях гематокрита (Нс1).

Дозы эритроцитарной массы от 450 до 500 мл из собранной цельной крови готовили без использования дополнительного раствора (значение гематокрита 80%, измеренное на гематокритной центрифуге, (Нс1)) или в дополнительном растворе (60% Нс1). Перед обработкой эритроциты подвергали лейкофильтрации, если не указано иначе. Испытуемые дозы эритроцитарной массы при 40% Нс1 разбавляли с помощью раствора для разбавления. Дозы эритроцитарной массы инокулировали путем либо ввода высокого содержания ~10⁶ организмов/мл, либо ввода низкого содержания от 10 до 10⁵ организмов на дозу. Для ввода высокого содержания организмов, отбирали 28 мл контрольного образца перед обработкой с помощью 8-303. Для ввода низкого содержания бактерий, испытуемые и контрольные дозы эритроцитарной массы готовили путем объединения и деления целых доз эритроцитарной массы, и контрольную дозу инокулировали с помощью ~10 организмов на дозу. Испытуемые дозы эритроцитарной массы со значениями 80% и 60% Нс1 обрабатывали с помощью 200 мкМ 8-303 и 20 мМ глутатиона, нейтрализованного одним эквивалентом основания гидроксида натрия (1 Ь.е.). Испытуемые дозы со значением 40% Нс1 обрабатывали с помощью 130 мкМ 8-303 и 13 мМ глутатиона (1 Ь.е.). Контрольные образцы или дозы обрабатывали с помощью или 20 мМ глутатиона, или 13 мМ глутатиона (1 Ь.е.) в зависимости от значения Нс1. Для доз эритроцитарной массы с высоким содержанием вводимых организмов, контрольные образцы анализировали на жизнеспособные организмы во время обработки испытуемой дозы. После 3 ч инкубирования при комнатной температуре, и испытуемые дозы, и контрольные образцы, анализировали на жизнеспособные организмы, которые количественно определяли по росту в чашках на питательном агаре (бактерии) или с помощью анализа бляшкообразования на клетках Уего (У8У). Для доз эритроцитарной массы с низким содержанием вводимых организмов, контрольные и испытуемые дозы инкубиро- 37 023596 вали при комнатной температуре в течение 20 ч и затем при 37°С в течение ~20 ч. Затем образцы высевали в чашках для обнаружения бактериального роста. Результаты приведены в табл. 8.

Таблица 8

Данные по патогенной инактивации для образцов эритроцитарной массы с различными значениями гематокрита

Организм	80% Гематокрит	60% Гематокрит	40% Гематокрит
Высокое содержание вводимых организмов	Среднее Ьод^1и снижение* (N=2)
Уегзтпта епОегосо11д1са	3, 4^е	4, 9	6,1
ЕзсНегтсЫа οοΐΐ	3, 8^е	6, 1^е	6,6
5еггаД1а тагсезсепз	4, 4^е	4,5	3, 1
5ТарЬу1ососсиз аигеиз	>5,8^Ь	6, 7	>7
7ез1?1си1аг з^ста^зЛдз νίΓΏ5 (νεν)	>6,2^Ь	>5, 9	5, 9
Низкое содержание вводимых организмов	Полная (1од^1и) инактивация⁰ дозы
РзеиЦотопаз аегидепоеа	>2,1	>2,5	>2, 5

'Άοβ снижения рассчитывают как Ρο§ (Титр без обработки/Титр после обработки), при выражении титра 10^х/мл;

^ь-снижение патогенов без лейкофильтрации;

^с-п=3;

^,|-во всех случаях, контрольные дозы при самом низком уровне вводимых организмов давали положительный результат бактериального роста.

Пример 11. Гидратация эритроцитов после обработки с помощью 8-303 при различных значениях гематокрита (Нс^.

Эритроциты готовили из цельной крови, подвергнутой операции лейкоцитредуцирования, при значениях 40% или 60% Нс1. измеренных на гематокритной центрифуге, в дополнительном растворе, и при 80% НФ в виде эритроцитарной массы. Дозы эритроцитарной массы обрабатывали с помощью глутатиона (натриевой соли, фирмы ВюМеФса Рο8сата, Иа1у) и 8-303 при конечной концентрации 20 мМ и 0,2 мМ, соответственно. Все обработанные дозы эритроцитарной массы инкубировали в течение до 20 ч при комнатной температуре. Раствор для обработки заменяли на 8АС-М, и дозы корректировали до 60% НФ в течение хранения при 4°С. Контрольные дозы эритроцитарной массы готовили в 8АС-М и хранили при 4°С. Все дозы периодически анализировали на физические параметры; МСНС измеряли вручную, измерения осмотической резистентности проводили с помощью стандартных методов (ВеиЙег еΐ а1., и Ье\у еΐ а1., 2003). Среднюю осмотическую ломкость эритроцитов (МСР) определяли как концентрацию ЫаС1, при которой 50% эритроцитов были гемолизированы. Изменение величины МСР является показателем отношения поверхности к объему (8/ν) и гидратации эритроцитов в процессе хранения. После приблизительно 6 недель хранения все обработанные дозы эритроцитарной массы имели значения МСР, сопоставимые с необработанными контрольными дозами вне зависимости от величины НФ во время обработки. МСНС, еще один показатель гидратации эритроцитов, был одинаковым для испытуемых и контрольных доз в конце хранения. Результаты приведены в табл. 9. Хранение обработанных эритроцитов в течение до 6 недель значительно не изменяло гидратацию эритроцитов и 8/ν для всего широкого интервала значений НФ, используемых в обычной практике приготовления концентратов эритроцитов.

Таблица 9

Данные по гидратации для образцов с различными значениями гематокрита

	МСР (тОзт) (п=2)	МСНС (г/л) (п=2)
	20 часов после введения	После хранения	20 часов после введения	После хранения
40% НСТ	156	152	33	31
80% НСТ	158	156	32	30
5АС-М контроль	156	158	32	30

60% НСТ	151	148	33	33
5АС-М контроль	150	154	32	32

- 38 023596

Пример 12. Качество подвергаемых хранению эритроцитов ίη νίίτο после обработки с помощью 8-303 при различных значениях гематокрита (Нс1).

Эритроциты готовили из цельной крови, подвергнутой операции лейкоцитредуцирования, при 40% или 60% Нс!, измеренных на гематокритной центрифуге, в дополнительном растворе, и при 80% Нс! в виде эритроцитарной массы. Дозы эритроцитарной массы обрабатывали с помощью глутатиона (натриевой соли) и 8-303 при конечной концентрации 20 мМ и 0,2 мМ, соответственно. Все обработанные дозы эритроцитарной массы инкубировали в течение до 20 ч при комнатной температуре. Раствор для обработки заменяли на 8АО-М, и дозы эритроцитарной массы корректировали до значения 60% Нс! в течение хранения при 4°С. Контрольные дозы эритроцитарной массы готовили в 8АО-М и хранили при 4°С. Функцию ίη νίΐΓο оценивали перед обработкой и после обработки и через регулярные интервалы в течение до 6 недель хранения. Оцениваемые параметры для функции эритроцитов ίη νίΐΓο включали рН, общий АТФ, гемолиз и внеклеточный калий, глюкозу и лактат. После приблизительно 6 недель (на 38 день или на 44 день) хранения, все испытуемые дозы эритроцитарной массы имели величины общего АТФ более чем 2 мкмоль АТФ/г НЬ и гемолиз и МСНС были сопоставимы с контрольными дозами эритроцитарной массы, независимо от величины Нс! при обработке. На протяжении всего времени хранения внеклеточная глюкоза в испытуемой дозе эритроцитарной массы была выше, чем глюкоза в контрольных дозах, для 40% и 60% Нс!, в то время как дозы с 80% Нс! были более похожи на контрольные дозы. Внеклеточный лактат был ниже во всех испытуемых дозах вне зависимости от Нс! по сравнению с контрольными дозами. В конце хранения внеклеточный К+ был слегка ниже, чем в контрольных дозах эритроцитарной массы для доз с 40% и 60% Нс!, в то время как дозы с 80% Нс! были сопоставимы с контрольными дозами. Величина рН всех испытуемых доз эритроцитарной массы была аналогична величине рН контрольных доз на всем протяжении хранения. Концентрация гемоглобина после проведения процесса обработки, независимо от величины Нс! при обработке, удовлетворяла требованиям Американской ассоциации банков крови (ААВВ). Активность всех метаболических параметров была аналогична параметрам контрольных доз после обработки с помощью 8-303 для широкого интервала значений Нс! на протяжении всех 6 недель хранения. Результаты представлены в табл. 10.

Таблица 10

Метаболические параметры при патогенной инактивации эритроцитов при различных значениях гематокрита

	АТФ (мкмоль/дНЪ) (п-2)	% гемолиза (п-2)	МСНС (г/дцл) (п=2)	Глюкоза (ммоль/л) (п-2)
Испытание 40%НСТ	3,28 (ϋ38)	0,2% (Ώ44)	31 (Ц44)	11,8 (Ц44)
Испытание 80%НСТ	3,42 (Ц38)	0,3% (Э44)	30 (Ц44)	7,7 (Э44)
5ΑΘ-Μ контроль	3,35 (Ц38)	0,3% (Э44)	30 (Э44)	6,3 (Э44)

Испытание 60%НСТ	2,96 (Ц42)	0,2% (Э42)	30 (Э42)	9,1 (Э42)
5АС-М контроль	3,19 (Ц42)	0,3% (Э42)	30 (Ц42)	5,1 (Э42)

Пример 13. Функция ίη νίΐΓο и патогенная инактивация разведенных эритроцитов.

8АО-М дозы эритроцитарной массы готовили из подвергнутых операции лейкоцитредуцирования доз цельной крови из 500 мл собранной крови. Для исследования функции эритроцитов, 8АО-М дозы эритроцитарной массы объединяли вместе по типу ΑΒΟ (В1ооб Огоиршд 8у§!ет) и разделяли для сдвоенных испытуемых и контрольных доз. Перед обработкой, 150 мл раствора для разбавления, включающего 28,8 мМ маннита, 1,3 мМ аденина, 16,2 мМ фосфат натрия, 20 мМ цитрат натрия, с рН 7,5 добавляли к испытуемым дозам эритроцитарной массы. Испытуемые дозы обрабатывали с помощью натриевой соли глутатиона и 8-303 при конечной концентрации 20 мМ и 0,2 мМ, соответственно. Испытуемые дозы инкубировали в течение до 20 ч при комнатной температуре. После инкубирования при комнатной температуре, дозы центрифугировали, и заменяли надосадочную жидкость на 100 мл 8АО-М, который добавляли перед хранением при 4°С. Контрольные дозы эритроцитарной массы готовили в 8АО-М и хранили при 4°С. Все дозы оценивали в течение приблизительно 6 недель хранения при 4°С путем отбора проб в различные моменты времени. Для исследований патогенной инактивации эритроцитов, 8АО-М дозы эритроцитарной массы разделяли пополам, и дозы эритроцитарной массы инокулировали с помощью патогенов перед добавлением раствора для обработки и глутатиона. После добавления раствора для обработки и глутатиона, отбирали контрольной образец (от 5 до 7 мл) из дозы для определения введенного титра патогена, а оставшуюся дозу обрабатывали с помощью 8-303. Отбирали образцы обработанных доз для титра остаточных жизнеспособных патогенов после 3 ч статического инкубирования при температуре окружающей среды.

Метаболические и физические показатели ίη νίΙΐΌ оценивали в различные моменты времени на протяжении всего хранения с помощью анализов ίη νίΐΐΌ. Величину внеклеточного рН при 37°С измеряли на

- 39 023596 анализаторе кислотно-основного баланса крови 81етепк ЭхадпокИск. Общий АТФ измеряли с помощью ферментного анализа на основе люциферазы. Для определения внеклеточного калия (К+), глюкозы и лактата готовили несодержащие клеток надосадочные жидкости. Внеклеточный калий определяли путем измерения содержания К+ в несодержащей клеток надосадочной жидкости с помощью анализатора Να/Κ ЕакуЬу1е®. Внеклеточную глюкозу и лактат определяли на анализаторе №хСТ™. Среднюю концентрацию гемоглобина в эритроцитах (МСНС) и гематокрит, измеренный на гематокритной центрифуге, определяли вручную. Измерения осмотической резистентности осуществляли стандартными методами (ВеиИег е1 а1., и Ьете е1 а1., 2003). Среднюю осмотическую ломкость эритроцитов (МСР) определяли в виде концентрации №С1, при которой 50% эритроцитов были гемолизованы.

Для исследований бактериальной инактивации, эритроциты инокулировали с помощью приблизительно 6,5 1од с&/мл Е.соН, 8. тагсексепк, 8. аигеик, Υ. еп1егосоННса или Р. аегидшока.

Для исследований вирусной инактивации, эритроциты инокулировали с помощью приблизительно от 4,1 до 6,4 1од ρίπ/мл, в зависимости от вируса. Глутатион, растворенный в физиологическом растворе, добавляли к дозе эритроцитарной массы до конечной концентрации 20 мМ. Бактериальные титры определяли путем подсчета колониеобразующих единиц (сГи) на агаре в чашках, а вирусные титры определяли путем подсчета бляшкообразующих единиц (р£и) на соответствующих клеточных линиях. Необработанные образцы последовательно разбавляли перед подсчетом. Обработанные образцы не разбавляли перед подсчетом титров.

Результаты, приведенные в табл. 11 и 12 ниже, демонстрируют приемлемую метаболическую функцию эритроцитов и физиологические параметры на протяжении всего срока хранения и приемлемую инактивацию патогенов.

Таблица 11

Гидратация и метаболические параметры для патогенной инактивация разбавленных доз эритроцитарной массы

Дни после сдачи крови	Обработка	МОГ (тОзт)	Нс+ (¾)	МСНС (г/дпл)	Кровь рН	АТФ (мкмоль/ дНЬ)	Глюко- за (мМ)	Лактат (мМ)
1	Необрабо- танная	Νϋ	54+2	32 + 0	6,932 10,015	4,50 10, 87	34,2 ±1,3	3, 6 10, 2
1, з	Необрабо- танная	153+3	54+3	33 + 1	6, 944 ±0,015	4,39 ±0,41	33,1 ±1,9	4,3 ±0, 1
	Обработан- ная	15212	57+1	3211	6,837 ±0,016	7,05 ±0, 91	29,4 + 1,1	3, 9 +0,2
7-8	Необрабо- танная	154±2	54±3	3211	6, 823 ±0,021	4, 87 ±0, 45	30,4 +1,0	10, 3 +0,6
	Обработан- ная	15012	56 + 1	3211	б, 701 +0,024	6, 23 ±0, 69	26,3 +1,1	7,9 + 0,5
21-23	Необрабо- танная	15313	5513	3111	6, 623 10,022	4, 30 10, 83	24,5 11,8	18, 5 ±1, 4
	Обработан- ная	148 + 2	56 + 1	32 + 1	6,526 10,028	4,53 10, 99	22,2 +0,6	14,1 ±1, 3
35	Необрабо- танная	155+2	54+3	32 + 1	6,532 ±0,014	3,31 ±0,28	21,6 ±1,3	25, 2 ±0, 7
	Обработан- ная	152+2	55 + 1	33+1	6,429 ±0,016	3,90 ±0,49	19, 7 ±0,6	18,9 ±1, 1

N=4

Таблица 12

Данные по патогенной инактивации для образцов разбавленных доз эритроцитарной массы

Бактерии	Средний Ьод уничтожения (п=4)
5 .	шагсезсепе	4,20
Е.	соН	= 6, 69
5 .	аигеиз	4,15
Υ.	епДегосоИ-Ыса	-6, 57
Р.	аегидхпога	3,35

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Способ обработки композиции эритроцитов для инактивации патогена, если он присутствует, включающий:

(a) смешивание в растворе, включающем один или более из следующих компонентов: декстрозу, аденин, маннит, цитрат и лимонную кислоту, (ί) эффективного количества патоген-инактивирующего соединения, включающего функциональную группу, которая является реакционноспособной электрофильной группой или которая образует реакционноспособную электрофильную группу;

(ίί) эффективного количества гасителя, включающего тиольную группу, где тиол способен реагировать с реакционноспособной электрофильной группой патоген-инактивирующего соединения; и (ш) композиции, включающей эритроциты;

(ίν) приблизительно от 0,5 до 1,5 экв. основания, где эквивалент означает мольное количество, которое является эквивалентным мольному количеству гасителя в смеси;

где конечная смесь на стадии (а) включает приблизительно от 40 до 100 мМ иона хлорида; и (b) замена раствора, указанного на стадии (а), конечным раствором таким образом, чтобы концентрация гасителя в смеси снизилась до по меньшей мере приблизительно 10 мМ, где конечный раствор включает один или более из следующих компонентов: декстрозу, натрия хлорид, аденин, гуанозин, глюкозу, цитрат, лимонную кислоту, фосфат и маннит.
2. Способ по п.1, где раствор на стадии (а) дополнительно включает фосфат.
3. Способ по п.2, где раствор на стадии (а) включает аденин, маннит, цитрат и фосфат.
4. Способ по п.1, где композиция, содержащая эритроциты (ίίί), также содержит дополнительный раствор, который включает один или более из следующих компонентов: декстрозу, натрия хлорид, аденин, гуанозин, глюкозу, цитрат, лимонную кислоту, фосфат и маннит.
5. Способ по любому из пп.1-4, где основание и гаситель смешивают с композицией эритроцитов перед смешением, во время смешения или не более чем через приблизительно 30 мин после смешения патоген-инактивирующего соединения с композицией эритроцитов.
6. Способ по любому из пп.1-4, где основание и гаситель смешивают вместе перед их смешением с композицией эритроцитов.
7. Способ по п.6, где смешение основания и гасителя приводит к солевой форме гасителя.
8. Способ по п.7, где гасителем является глутатион и его солевой формой является калиевая соль глутатиона или натриевая соль глутатиона.
9. Способ по любому из пп.1-6, где основанием является Ν;·ιΟΗ.
10. Способ по любому из пп.1-9, где основание включает приблизительно от 0,75 до 1,25 экв. основания, где эквивалент означает мольное количество, которое является эквивалентным мольному количеству гасителя в смеси на стадии (а).
11. Способ по любому из пп.1-9, где основание включает около 1 экв. основания, где эквивалент означает мольное количество, которое является эквивалентным мольному количеству гасителя в смеси на стадии (а).
12. Способ по любому из предшествующих пунктов, где полученная на стадии (а) смесь имеет величину рН при 37°С приблизительно от 6,5 до 7,1.
13. Способ по любому из предшествующих пунктов, где гаситель включает цистеин или производное цистеина.
14. Способ по п.13, где гасителем является глутатион или его фармацевтически приемлемая соль.
15. Способ по п.14, где гасителем является мононатриевая соль глутатиона.
16. Способ по любому из предшествующих пунктов, где концентрация гасителя в полученной на стадии (а) смеси составляет больше чем 2 мМ.
17. Способ по п.16, где гаситель в полученной на стадии (а) смеси присутствует в концентрации приблизительно от 5 до 30 мМ.
18. Способ по п.16, где гаситель в полученной на стадии (а) смеси присутствует в концентрации приблизительно от 15 до 25 мМ.
19. Способ по п.16, где гаситель в полученной на стадии (а) смеси присутствует в концентрации около 20 мМ.
20. Способ по любому из пп.1-19, где стадия (Ь) включает центрифугирование смеси с последующим удалением надосадочной жидкости из смеси.
21. Способ по любому из пп.1-19, где стадия (Ь) включает эксклюзионное разделение по размеру частиц.
22. Способ по любому из пп.1-19, где стадия (Ь) предусматривает использование устройств для выдавливания.
23. Способ по любому из предшествующих пунктов, где гаситель в полученной на стадии (Ь) смеси присутствует в концентрации меньше чем приблизительно 8 мМ.
24. Способ по любому из предшествующих пунктов, где гаситель в полученной на стадии (Ь) смеси

- 41 023596 присутствует в концентрации меньше чем приблизительно 6 мМ.
25. Способ по любому из предшествующих пунктов, где функциональную группу выбирают из группы, состоящей из иприта, промежуточного соединения иприта, и эквивалента иприта.
26. Способ по любому из предшествующих пунктов, где функциональная группа является ионом азиридиния или способна образовывать ион азиридиния.
27. Способ по любому из предшествующих пунктов, где реакционноспособная электрофильная группа способна реагировать с нуклеиновыми кислотами.
28. Способ по любому из предшествующих пунктов, где патоген-инактивирующее соединение дополнительно включает лиганд, связывающий нуклеиновую кислоту.
29. Способ по п.28, где лигандом, связывающим нуклеиновую кислоту, является интеркалятор.
30. Способ по п.29, где интеркалятором является акридин.
31. Способ по любому из пп.28-30, где патоген-инактивирующее соединение включает непрочный линкер, связывающий функциональную группу и лиганд, связывающий нуклеиновую кислоту.
32. Способ по п.31, где патоген-инактивирующим соединением является β-аланин, ^(акридин-9ил), 2-[бис(2-хлорэтил)амино]этиловый эфир.
33. Способ по любому из предшествующих пунктов, где концентрация патоген-инактивирующего соединения в полученной на стадии (а) смеси составляет приблизительно от 0,1 мкМ до 5 мМ.
34. Способ по п.33, где концентрация патоген-инактивирующего соединения в полученной на стадии (а) смеси является достаточной для инактивации по меньшей мере 3 1од патогена в композиции эритроцитов, в случае, если он присутствует.
35. Способ по любому из предшествующих пунктов, где время между стадией (а) и стадией (Ь) составляет приблизительно от 1 до 48 ч.
36. Способ по п.35, где время между стадией (а) и стадией (Ь) составляет приблизительно от 4 до

30 ч.
37. Способ по любому из предшествующих пунктов, где обработка инактивирует по меньшей мере 3 1од патогенного контаминанта в композиции эритроцитов, если он присутствует.
38. Способ по любому из предшествующих пунктов, дополнительно включающий стадию понижения концентрации патоген-инактивирующего соединения в смеси.
39. Способ по п.38, где стадии понижения концентрации гасителя в смеси и понижения концентрации патоген-инактивирующего соединения в смеси происходят в одно и то же время.
40. Способ по любому из пп.1-39, где концентрация иона хлорида после стадии (а) и перед стадией (Ь) составляет менее чем приблизительно 100 мМ.
41. Способ по п.40, где концентрация иона хлорида после стадии (а) и перед стадией (Ь) составляет менее чем приблизительно 75 мМ.
42. Способ по любому из пп.1-41, где композиция, включающая эритроциты, на стадии (а) имеет гематокритное число приблизительно от 70 до 90%.
43. Способ по п.42, где композиция, включающая эритроциты, на стадии (а) имеет гематокритное число приблизительно от 75 до 85%.
44. Способ по любому из пп.1-41, где композиция, включающая эритроциты, на стадии (а) имеет гематокритное число приблизительно от 50 до 70%.
45. Способ по п.44, где композиция, включающая эритроциты, на стадии (а) имеет гематокритное число приблизительно от 55 до 70%.
46. Способ по любому из пп.1-41, где композиция, включающая эритроциты, на стадии (а) имеет гематокритное число приблизительно от 30 до 50%.
47. Способ по п.46, где композиция, включающая эритроциты, на стадии (а) имеет гематокритное число приблизительно от 35 до 45%.
48. Способ по любому из пп.1-47, где композиция, содержащая эритроциты на стадии (а), подвергнута лейкоцитредуцированию.
49. Способ по любому из пп.1-47, где композиция, содержащая эритроциты на стадии (а), не подвергнута лейкоцитредуцированию.
50. Способ введения эритроцитов пациенту, включающий инфузию пациенту композиции эритроцитов, полученной с помощью способов по любому из пп.1-49.
51. Композиция, включающая эритроциты, которая получена способом по любому из пп.1-49.