BRPI0911176B1

BRPI0911176B1 - Método de tratar uma composição de célula vermelha sanguínea, composição de célula vermelha sanguínea, e método de reduzir a desidratação em uma composição de célula vermelha sanguínea

Info

Publication number: BRPI0911176B1
Application number: BRPI0911176-0A
Authority: BR
Inventors: Naheed Mufti; Anna Erickson; Anne North
Original assignee: Cerus Corporation
Priority date: 2008-04-09
Filing date: 2009-04-09
Publication date: 2019-10-15
Also published as: HK1157140A1; CA2720824C; US20150157665A1; EA201071178A1; SG189745A1; JP2011516570A; EP2285210B1; US20180008639A1; WO2009126786A3; BRPI0911176B8; SG10201605663UA; US9713627B2; ES2636563T3; KR101742533B1; JP2014231528A; JP5916383B2; CN102046006A; AU2009233807A1; MX2010011018A; EA023596B1

Abstract

método de tratar uma composição de célula vermelha sanguínea, composição de célula verme- lha sanguínea, e método de reduzir a desidratação em uma composição de célula vermelha sanguínea a presente invenção refere-se a métodos melhorados para tratar composições de célula sanguínea vermelha com um composto de inativação de patógeno sob condições que forneçam inativação de patógeno adequada ao mesmo tempo em que mantendo a vitalidade da célula. também forneci- dos são métodos de reduzir a desidratação em células vermelhas sanguí- neas, bem como composições de célula sanguínea vermelha tratadas.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO DE TRATAR UMA COMPOSIÇÃO DE CÉLULA VERMELHA SANGUÍNEA, COMPOSIÇÃO DE CÉLULA VERMELHA SANGUÍNEA, E MÉTODO DE REDUZIR A DESIDRATAÇÃO EM UMA COMPOSIÇÃO DE CÉLULA VERMELHA SANGUÍNEA.

REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS RELACIONADOS [001] Este pedido reivindica benefício de prioridade do Pedido

Provisional US N° 61/043.666, intitulado Quenching Methods For Red Blood Cell Pathogen Inactivation, depositado em 09 de abril, de 2008, e Pedido Provisional US N° 61/087.034, intitulado Quenching Methods For Red Blood Cell Pathogen Inactivation depositado em 07 de agosto de 2008. O teor de ambos destes pedidos está desse modo incorporado por referência em sua totalidade como se fosse apresentado na íntegra abaixo.

CAMPO DA INVENÇÃO [002] O campo desta invenção refere-se aos métodos melhorados de extinção de compostos eletrofílicos reativos usados no tratamento de produtos sanguíneos para inativar possíveis contaminantes de patógeno. Em particular, os compostos nucleofílicos, tais como tióis, são usados em uma concentração elevada para extinguir os compostos eletrofílicos reativos em composições de célula sanguínea vermelha, em seguida diminuídos em concentração para reduzir a desidratação de célula vermelha sanguínea (RBC).

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [003] A transmissão de doença de produtos sanguíneos e outros materiais biológicos continua sendo um problema de saúde sério. Ao mesmo tempo em que ocorreram avanços significantes na avaliação de doador de sangue e teste de sangue, os vírus tais como hepatite B (HBV), hepatite C (HCV), e vírus da imunodeficiência humana (HIV) podem escapar da detecção em produtos sanguíneos durante o teste

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2/108 devido a níveis baixos de vírus ou anticorpos virais. Além do perigo viral, não há atualmente nenhum teste licenciado adequado para avaliar quanto à presença de micróbios não virais, tais como bactérias ou protozoários, no sangue pretendido para uso em transfusões. O risco também existe que um patógeno até agora desconhecido pode se tornar predominante no fornecimento de sangue e apresenta uma ameaça de transmissão de doença, como no fato ocorrido antes do reconhecimento do risco de transmissão de HIV através de transfusões de sangue.

[004] Os agentes químicos foram introduzidos no sangue ou plasma sanguíneo para inativar os patógenos antes do uso clínico do produto de sangue. Tipicamente, para produtos de sangue tendo pouco ou nenhum teor de célula vermelha sanguínea, tais como plaquetas e plasma, os compostos fotoquimicamente ativados tais como psoralenos são usados. Para produtos de sangue contendo célula vermelha sanguínea, os compostos foram desenvolvidos para inativação de patógeno, os quais não requerem fotoativação. Estes compostos tipicamente têm grupos eletrofílicos que reagem com os patógenos, mais especificamente com ácido nucleico de patógeno. Por exemplo, a Patente US 5.055.485 descreve a inativação de vírus em composições contendo proteína e célula usando epóxidos de diol arila. Outros compostos que geram eletrófilos in situ podem ser usados. LoGrippo et al avaliaram o uso de mostarda de nitrogênio, CH3-N(CH2CH2Cl)2, para inativação viral. LoGrippo et al, Proceedings of the Sixth Congress of the International Society of Blood Transfusion, Bibliotheca Haematologica (Hollander, ed.), 1958, pp. 225-230. Mais significantemente, as Patentes dos Estados Unidos 5.691.132; 6.177.441; 6.410.219;

6.143.490; e 6.093.725, as descrições das quais estão desse modo incorporadas por referência, descrevem o uso de compostos que têm um componente de direcionamento de ácido nucleico bem como um

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3/108 componente eletrofílico que reage com o ácido nucleico para inativar o patógeno. As Patentes dos Estados Unidos 6.093.725 e 6.514.987, as descrições das quais estão desse modo incorporadas por referência, descrevem compostos similares, onde o componente de direcionamento de ácido nucleico do composto está ligado ao componente eletrofílico reativo através de um ligador hidrolisável. As Patentes dos Estados Unidos 6.136.586 e 6.617.157, as descrições das quais estão desse modo incorporadas por referência, descrevem o uso de oligômeros de etilenoimina e compostos relacionados para inativação de patógeno. Estes compostos derivados de etilenoimina tipicamente têm um grupo aziridina, que fornece o componente eletrofílico, e um componente de poliamina, que fornece ácido nucleico direcionando o composto. A classe geral de compostos alvejados por ácido nucleico tendo um grupo eletrofílico ou similar reativo com o ácido nucleico é usada para inativar os patógenos no sangue, produtos de sangue, e uma variedade de amostras de origem biológica.

[005] Há alguma preocupação de que, ao mesmo tempo em que estes compostos são designados para especificamente direcionar ácidos nucleicos, eles podem reagir com outros componentes do sangue, tais como proteínas ou membranas celulares. Estas reações colaterais são desfavoráveis e podem causar efeitos adversos, tais como modificações de proteínas e membranas celulares que possam ser reconhecidas pelo sistema imune. Quando tais produtos de sangue tratados são usados repetidamente, eles podem resultar em uma resposta imune do recipiente ao produto de sangue tratado. As Patentes dos Estados Unidos 6.270.952; 6.709.810; e 7.293.985, as descrições das quais estão desse modo incorporadas por referência, descrevem métodos de extinguir tais compostos de inativação de patógeno para reduzir o nível de qualquer reação colateral adversa. A Publicação de Patente US No. 2006/0115466, a descrição da qual está desse modo

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4/108 incorporada por referência, descreve melhoras para estas condições de extinção que se voltam para uma resposta imune desenvolvida contra o composto de inativação de patógeno. Entretanto, a despeito da melhora na eficácia da extinção, em alguns casos as células vermelhas sanguíneas tratadas terem sido constatadas a ter período de vida diminuído atribuído a desidratação celular aumentada quando medida por fragilidade osmótica diminuída e hematócrito de giro diminuído. [006] Desse modo, há uma necessidade de métodos para reduzir reações colaterais eletrofílicas indesejadas de composto de inativação de patógenos ao mesmo tempo em que preservando a capacidade do composto de inativação de patógeno de inativar patógenos nocivos sem adversamente afetar a vitalidade e período de vida do produto de sangue tratado. Especificamente, há uma necessidade de métodos melhorados de extinguir os compostos de inativação de patógeno em células vermelhas sanguíneas.

BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO [007] A presente invenção fornece uma variedade de métodos para tratar composições de célula sanguínea vermelha com um composto de inativação de patógeno e um extintor sob condições que forneçam inativação de patógeno adequada e redução de reações colaterais indesejáveis (tais como modificação das células vermelhas sanguíneas), ao mesmo tempo em que reduzindo ou minimizando os efeitos adversos tal como a desidratação aumentada das células. Em algumas modalidades, o extintor é glutationa que é neutralizado com uma quantidade apropriada de base. Em algumas modalidades, o método envolve reduzir a concentração da glutationa em seguida a inativação de patógeno.

[008] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de tratar uma composição de célula vermelha sanguínea compreendendo: a) fornecer i) uma quantidade eficaz de um composto de inati

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5/108 vação de patógeno para inativar um patógeno, se presente, onde o composto de inativação de patógeno compreende um grupo funcional que é, ou que forma, um grupo eletrofílico reativo, ii) uma quantidade eficaz de um extintor compreendendo um grupo tiol, o tiol é capaz de reagir com o grupo eletrofílico reativo do composto de inativação de patógeno, e iii) uma composição compreendendo células vermelhas sanguíneas; b) misturar o composto de inativação de patógeno e extintor com a composição compreendendo células vermelhas sanguíneas; e c) suficientemente diminuir a concentração do extintor na mistura a uma quantidade que reduz o nível de desidratação de célula vermelha sanguínea resultante do armazenamento da mistura, relativo ao nível de desidratação de célula vermelha sanguínea resultante do armazenamento da mistura na concentração original do extintor. Em algumas destas modalidades, a diminuição da concentração do extintor compreende a remoção da solução usada durante a inativação e adição de uma solução aditiva final (por exemplo, qualquer solução descrita aqui, tal como SAG-M, AS-5 ou qualquer solução das Tabelas 2, 3, ou 4).

[009] Em algumas modalidades, a etapa (a) também compreende fornecer uma base adequada, a etapa (b) também compreende misturar a base com a composição compreendendo células vermelhas sanguíneas, e a base é de quantidade suficiente para reduzir o nível de uma reação indesejada do composto de inativação de patógeno com as células vermelhas sanguíneas na mistura, relativo à mistura sem a base. Em algumas modalidades, a reação indesejada do composto de inativação de patógeno com células vermelhas sanguíneas é a modificação da superfície das células vermelhas sanguíneas pelo composto de inativação de patógeno. Em algumas modalidades, a etapa (a) também compreende fornecer uma base adequada, etapa (b) também compreende misturar a base com a composição compreendendo as células vermelhas sanguíneas, e a base é de quantidade suficiente

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6/108 para reduzir o nível de ligação de anticorpo de composto de inativação antipatógeno à composição de célula vermelha sanguínea tratada na mistura resultante em pelo menos cerca de 5% (ou em pelo menos 10%, em pelo menos 25%, em pelo menos 50%, em pelo menos 75%, ou em pelo menos 90%) relativo à mistura sem a base. Em algumas modalidades, a base e o extintor são misturados com a composição de célula vermelha sanguínea antes, ao mesmo tempo, ou não mais do que 30 minutos após a mistura do composto de inativação de patógeno com a composição de célula vermelha sanguínea. Em algumas modalidades, a base e o extintor são misturados um ao outro antes de misturar a base ou o extintor com a composição de célula vermelha sanguínea. Em algumas modalidades, a base é NaOH. Em algumas modalidades, a base é um tampão básico. Em algumas modalidades, a base compreende cerca de 0,5 a 1,5 equivalentes de base, onde um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente a quantidade molar do extintor na mistura. Em algumas modalidades, a base compreende cerca de 0,75 a 1,25 equivalentes de base. Em algumas modalidades, a base compreende cerca de 1 equivalente de base. Em algumas modalidades, a mistura resultante da etapa (b) tem um pH a 37 oC de cerca de 6,0 a 7,5. Em algumas modalidades, o pH é cerca de 6,5 a 7,1. Em algumas modalidades, o pH é cerca de 6,8 ou 6,9.

[0010] Em algumas modalidades, o extintor compreende cisteína ou um derivado de cisteína. Em algumas modalidades, o extintor é glutationa ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em algumas modalidades, a concentração do extintor na mistura resultante da etapa (b) é maior do que 2 mM. Em algumas modalidades, a concentração de extintor é cerca de 5 mM a cerca de 30 mM. Em algumas modalidades, a concentração de extintor é cerca de 15 mM a cerca de 25 mM. Em algumas modalidades, a concentração de extintor é cerca de 20 mM.

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7/108 [0011] Em algumas modalidades, a diminuição da concentração de extintor na etapa (c) compreende centrifugação da mistura seguida por remoção do sobrenadante. Em algumas modalidades, a etapa (c) compreende separação por exclusão de tamanho. Em algumas modalidades, o extintor na mistura resultante da etapa (c) está em uma concentração menor do que cerca de 10 mM. Em algumas modalidades, a concentração de extintor é menor do que cerca de 8 mM. Em algumas modalidades, a concentração de extintor é menor do que cerca de 6 mM (ou menor do que cerca de 4 mM, ou menor do que cerca de 2 mM). Em algumas modalidades, o armazenamento da mistura é o armazenamento da mistura durante mais do que 10 dias a 4 oC. Em algumas modalidades, o armazenamento da mistura é o armazenamento da mistura durante mais do que 42 dias (ou 28 dias) a 4 oC. Em algumas modalidades, o método compreende a adição de uma solução aditiva (por exemplo, qualquer solução aditiva descrita na Tabela 2, e/ou uma solução aditiva compreendendo cloreto de sódio, adenina, glicose, fosfato, guanosina, citrato e/ou manitol). Em algumas modalidades, a mistura é armazenada em uma solução aditiva (por exemplo, qualquer solução aditiva descrita na Tabela 2, e/ou uma solução aditiva compreendendo cloreto de sódio, adenina, glicose, fosfato, guanosina, citrato e/ou manitol). Em algumas modalidades, o método também compreende a substituição de uma solução de tratamento (por exemplo, qualquer solução descrita nas Tabelas 2, 3, ou 4 e/ou uma solução compreendendo cloreto de sódio, adenina, glicose, fosfato, guanosina, citrato, e/ou manitol) com uma solução aditiva (por exemplo, qualquer solução aditiva descrita na Tabela 2, e/ou uma solução aditiva compreendendo cloreto de sódio, adenina, glicose, fosfato, guanosina, citrato e/ou manitol). Em algumas modalidades, a concentração de cloreto da composição antes da diminuição da concentração do extintor é menor do que cerca de 100 mM (ou cerca de 75 mM). Em

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8/108 algumas modalidades, a concentração de cloreto da composição em seguida a diminuição da concentração do extintor e/ou adição da solução aditiva é maior do que cerca de 100 mM (ou cerca de 125 mM).

[0012] Em algumas modalidades de cada dos métodos acima mencionados, bem como outros métodos descritos aqui, o grupo funcional é uma mostarda, um intermediário de mostarda, ou um equivalente de mostarda. Em algumas modalidades, o grupo funcional é, ou é capaz de formar, um íon de aziridínio. Em algumas modalidades, o grupo eletrofílico reativo é capaz de reagir com ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, o composto de inativação de patógeno também compreende um ligante de ligação de ácido nucleico. Em algumas modalidades, o ligante de ligação de ácido nucleico é um intercalador. Em algumas modalidades, o intercalador é uma acridina. Em algumas modalidades, o composto de inativação de patógeno compreende um ligador frangível ligando o grupo funcional e o ligante de ligação de ácido nucleico. Em algumas modalidades, o composto de inativação de patógeno é β-alanina, N-(acridin-9-il), éster de 2-[bis(2cloroetil)amino]etila. Em algumas modalidades, a concentração do composto de inativação de patógeno na mistura resultante da etapa (b) é cerca de 0,1 μΜ a cerca de 5 mM. Em algumas modalidades, a concentração é suficiente para inativar pelo menos 1 log de um patógeno na composição de célula vermelha sanguínea, se presente. Em algumas modalidades, a concentração é suficiente para inativar pelo menos 3 logs de um patógeno. Em algumas modalidades, o tempo entre a etapa (b) e a etapa (c) é cerca de 1 a 48 horas. Em algumas modalidades, o tempo é cerca de 10 a 30 horas. Em algumas modalidades, o tempo é cerca de 15 a 25 horas. Em algumas modalidades, o tratamento inativa pelo menos 1 log de um contaminante de patógeno na composição de célula vermelha sanguínea, se presente. Em algumas modalidades, o tratamento inativa pelo menos 3 logs. Em algu

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9/108 mas modalidades, o método também compreende a etapa de diminuir a concentração do composto de inativação de patógeno na mistura. Em algumas modalidades, as etapas de diminuição da concentração do extintor na mistura e diminuição da concentração do composto de inativação de patógeno na mistura, ocorrem ao mesmo tempo.

[0013] Em algumas modalidades de cada dos métodos acima mencionados, bem como outros métodos descritos aqui, em 20 horas em seguida a etapa (b), as células vermelhas sanguíneas (RBCs) da mistura resultante têm uma capacidade de ligação de anticorpo de composto de inativação antipatógeno (ABC) de menos do que 65% comparado com o valor de ABC de células vermelhas sanguíneas do mesmo método sob as mesmas condições, porém sem o uso de base. Em algumas modalidades, os RBCs têm um ABC médio menor do que cerca de 50.000. Em algumas modalidades, os RBCs têm um ABC médio menor do que cerca de 40.000. Em algumas modalidades, os RBCs têm um ABC médio dentre cerca de 25.000 e 70.000. Em algumas modalidades, os RBCs têm um ABC médio dentre cerca de 35.000 e 45.000. Em algumas modalidades, os RBCs da mistura resultante têm menos do que 1% de hemólise em seguida a etapa (c). Em algumas modalidades, os RBCs têm menos do que 1% de hemólise em um tempo de 42 dias (ou 28 dias) a 4 oC em seguida a etapa (c). Em algumas modalidades, os RBCs da mistura resultante têm um Volume de Célula Embalada (PCV) maior do que 50% em seguida a etapa (c). Em algumas modalidades, os RBCs têm um PCV maior do que 50% em um tempo de 42 dias (ou 28 dias) a 4oC em seguida a etapa (c). Em algumas modalidades, os RBCs da mistura resultante têm um valor de Fragilidade Corpuscular Média maior do que 140 (ou 150) após 42 dias (ou 28 dias) a 4oC em seguida a etapa (c). Em algumas modalidades, a quantidade do composto de inativação de patógeno não é reduzida e/ou o composto de inativação de patógeno não é con-

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10/108 tatada com um dispositivo de absorção de composto (CAD).

[0014] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método de redução da desidratação de células vermelhas sanguíneas, compreendendo: a) fornecer uma composição de célula vermelha sanguínea compreendendo a mistura de i) um extintor, onde o extintor é capaz de reagir com um composto de inativação de patógeno, e ii) células vermelhas sanguíneas; e b) suficientemente diminuir a concentração do extintor (e opcionalmente a concentração do composto de inativação de patógeno e/ou subprodutos do mesmo) na mistura para uma quantidade que reduza o nível de desidratação de célula vermelha sanguínea resultante do armazenamento da mistura relativo ao nível de desidratação de célula vermelha sanguínea resultante do armazenamento da mistura na concentração original do extintor. Em algumas modalidades, o extintor compreende cisteína ou um derivado de cisteína. Em algumas modalidades, o extintor é glutationa ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em algumas modalidades, o extintor na mistura resultante da etapa (b) está em uma concentração menor do que cerca de 10 mM. Em algumas modalidades, a concentração de extintor é menor do que cerca de 8 mM. Em algumas modalidades, a concentração de extintor é menor do que cerca de 6 mM, ou menor do que cerca de 2 mM. Em algumas modalidades, as células vermelhas sanguíneas (RBCs) da mistura resultante têm menos do que 1% de hemólise em seguida a etapa (b). Em algumas modalidades, os RBCs têm menos do que 1% hemólise em um tempo de 42 dias (ou 28 dias) a 4 oC em seguida a etapa (b). Em algumas modalidades, os RBCs da mistura resultante têm um Volume de Célula Embalada (PCV) maior do que 50% em seguida a etapa (b). Em algumas modalidades, os RBCs da mistura resultante têm um PCV maior do que 50% em um tempo de 42 dias (ou 28 dias) a 4 oC em seguida a etapa (b). Em algumas modalidades, os RBCs da mistura resultante

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11/108 têm um Valor de Fragilidade Corpuscular Médio maior do que 140 (ou 150) após 42 dias (ou 28 dias) a 4 oC em seguida a etapa (b). Em algumas modalidades, o armazenamento da mistura é o armazenamento da mistura durante mais do que 10 dias a 4 oC. Em algumas modalidades, o armazenamento da mistura é o armazenamento da mistura durante mais do que 42 dias (ou 28 dias) a 4 oC. Em algumas modalidades, a quantidade do composto de inativação de patógeno não é reduzida e/ou o composto de inativação de patógeno não é contatado com um dispositivo de absorção de composto (CAD).

[0015] As composições de célula vermelha sanguínea (RBC) produzidas por cada dos métodos mencionados acima são fornecidas. As composições de RBC preparáveis por cada dos métodos acima mencionados são também fornecidas.

[0016] Em um outro aspecto, a invenção fornece uma composição compreendendo a) células vermelhas sanguíneas, onde as células vermelhas sanguíneas covalentemente reagiram com um grupo eletrofílico de um composto de inativação de patógeno; e b) um extintor compreendendo um grupo tiol que seja capaz de reagir com o composto de inativação de patógeno; onde a composição é adequada para infusão em humanos após armazenamento até 42 dias (ou 28 dias) a 4 oC. Em algumas modalidades, pelo menos 1 log de um patógeno é inativado, se presente. Em algumas modalidades, pelo menos 3 logs são inativados. Em algumas modalidades, o grupo eletrofílico é uma mostarda, um intermediário de mostarda, ou um equivalente de mostarda. Em algumas modalidades, o grupo eletrofílico é, ou é capaz de formar, um íon de aziridínio. Em algumas modalidades, o grupo eletrofílico é capaz de reagir com ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, o grupo eletrofílico é covalentemente reagido com a superfície celular das células vermelhas sanguíneas. Em algumas modalidades, o composto de inativação de patógeno também compreende um ligan

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12/108 te de ligação de ácido nucleico. Em algumas modalidades, o ligante de ligação de ácido nucleico é um intercalador. Em algumas modalidades, o intercalador é uma acridina. Em algumas modalidades, o composto de inativação de patógeno compreende um ligador frangível ligando o grupo eletrofílico e o ligante de ligação de ácido nucleico. Em algumas modalidades, o composto de inativação de patógeno é β-alanina, N(acridin-9-il), éster de 2-[bis(2-cloroeti)amino]etil. Em algumas modalidades, o extintor compreende cisteína ou um derivado de cisteína. Em algumas modalidades, o extintor é glutationa ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo. Em algumas modalidades, o extintor está em uma concentração que é suficientemente baixa para evitar ou minimizar a desidratação de célula vermelha sanguínea durante o armazenamento. Em algumas modalidades, a concentração de extintor é menor do que cerca de 10 mM. Em algumas modalidades, a concentração de extintor é menor do que cerca de 8 mM. Em algumas modalidades, a concentração de extintor é menor do que cerca de 6 mM, ou menor do que cerca de 2 mM. Em algumas modalidades, as células vermelhas sanguíneas (RBCs) têm um Volume de Célula Embalada (PCV) maior do que 55%. Em algumas modalidades, os RBCs têm um PCV maior do que 60%. Em algumas modalidades, os RBCs têm uma capacidade de ligação de anticorpo média (ABC) menor do que cerca de 50.000. Em algumas modalidades, RBCs têm um ABC médio menor do que cerca de 40.000. Em algumas modalidades, os RBCs têm um ABC médio dentre cerca de 25.000 e 60.000. Em algumas modalidades, os RBCs têm um ABC médio dentre cerca de 25.000 e 70.000. Em algumas modalidades, os RBCs têm um ABC médio dentre cerca de 35.000 e 45.000. Em algumas modalidades, a composição também compreende uma solução aditiva (por exemplo, qualquer solução aditiva descrita na Tabela 2, e/ou uma solução aditiva compreendendo cloreto de sódio, adenina, glicose, fosfato, guanosina, citrato e/ou mani

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13/108 tol). Em algumas modalidades, a concentração de cloreto da solução aditiva e/ou da composição é maior do que cerca de 100 mM (ou cerca de 125 mM).

[0017] Em um aspecto adicional, a invenção fornece métodos de infundir células vermelhas sanguíneas em um indivíduo, compreendendo: a) fornecer qualquer uma das composições de célula sanguínea vermelha acima mencionadas ou uma composição de célula vermelha sanguínea produzida por qualquer um dos métodos descritos aqui e, b) infundir a composição de célula vermelha sanguínea no indivíduo.

[0018] Em um aspecto, a invenção fornece um método de tratar uma composição de célula vermelha sanguínea compreendendo: (a) misturar (i) um composto de inativação de patógeno compreendendo um grupo funcional que é, ou que forma, um grupo eletrofílico reativo (por exemplo, uma quantidade eficaz de um composto de inativação de patógeno para inativar um patógeno, se presente); (ii) um extintor (por exemplo, uma quantidade eficaz de um extintor) compreendendo um grupo tiol, onde o tiol é capaz de reagir com o grupo eletrofílico reativo do composto de inativação de patógeno; e (iii) uma composição compreendendo células vermelhas sanguíneas; e (b) suficientemente diminuir a concentração do extintor na mistura para uma quantidade que reduza o nível de desidratação de célula vermelha sanguínea resultante do armazenamento da mistura relativo ao nível de desidratação de célula vermelha sanguínea resultante do armazenamento da mistura na concentração original de extintor. Em algumas destas modalidades, a diminuição da concentração do extintor compreende a remoção da solução usada durante a inativação e adição de uma solução aditiva final (por exemplo, qualquer solução descrita aqui, tal como SAG-M, AS-5 ou qualquer solução das Tabelas 2, 3, ou 4). O método pode compreender qualquer uma ou mais das modalidades listadas

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14/108 acima e/ou aqui.

[0019] Em algumas modalidades, o método também compreende misturar uma base adequada com a composição compreendendo as células vermelhas sanguíneas, e a base é de quantidade suficiente para reduzir o nível de uma reação indesejada do composto de inativação de patógeno com as células vermelhas sanguíneas na mistura, relativo à mistura sem a base. Em algumas modalidades, a reação indesejada do composto de inativação de patógeno com as células vermelhas sanguíneas é a modificação da superfície das células vermelhas sanguíneas pelo composto de inativação de patógeno. Em algumas modalidades, o método também compreende misturar uma base adequada com a composição compreendendo as células vermelhas sanguíneas, e a base sendo de quantidade suficiente para reduzir o nível de ligação de anticorpo de composto de inativação antipatógeno a composição de célula vermelha sanguínea tratada na mistura resultante em pelo menos 5% (ou em pelo menos 10%, em pelo menos 25%, em pelo menos 50%, em pelo menos 75%, ou em pelo menos 90%) relativo à mistura sem a base.

[0020] Em um aspecto, a invenção fornece um método de reduzir a desidratação em uma composição de célula vermelha sanguínea onde a composição é uma mistura compreendendo um extintor capaz de reagir com um composto de inativação de patógeno, e as células vermelhas sanguíneas; o método compreendendo, suficientemente diminuir a concentração do extintor na mistura para uma quantidade que reduza o nível de desidratação de célula vermelha sanguínea resultante do armazenamento da mistura relativa ao nível de desidratação de célula vermelha sanguínea resultante do armazenamento da mistura na concentração original do extintor.

[0021] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de infusão de células vermelhas sanguíneas, compreendendo infundir uma

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15/108 composição de célula vermelha sanguínea descrita aqui em um paciente.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0022] Figura 1 mostra a fragilidade osmótica de células vermelhas sanguíneas em vários níveis de base após a dosagem do extintor inicial como descrito no exemplo 6.

[0023] Figura 2 mostra a densidade de célula vermelha sanguínea em vários níveis de base em 20 horas de incubação.

[0024] Figura 3 mostra a densidade de célula vermelha sanguínea em vários níveis de base após incubação e 36 dias de armazenamento.

[0025] Figura 4 mostra a fragilidade osmótica de células vermelhas sanguíneas após incubação e 36 dias de armazenamento com e sem diminuição da concentração de extintor (isto é, com/sem etapa de permuta).

[0026] Figura 5 mostra a fragilidade osmótica de células vermelhas sanguíneas após incubação e 42 dias de armazenamento com variação da concentração de extintor inicial (com etapa de permuta) comparado com a concentração de extintor moderada inicial (sem a etapa de permuta).

[0027] Figura 6 mostra a fragilidade osmótica de células vermelhas sanguíneas após incubação e 36 dias de armazenamento com e sem o composto de inativação de patógeno.

[0028] Figura 7 mostra os valores de capacidade de ligação de anticorpo (ABC) para várias preparações de célula vermelha sanguínea usando os métodos da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0029] A presente invenção fornece métodos para tratar as composições de célula sanguínea vermelha para inativar os patógenos que possam estar presentes, ao mesmo tempo em que reduzindo ou mini

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16/108 mizando as reações colaterais indesejadas (tal como modificação das células vermelhas sanguíneas levando a uma resposta imune indesejada) e ao mesmo tempo em que reduzindo ou minimizando os efeitos adversos na vitalidade celular (por exemplo, fragilidade osmótica diminuída e/ou desidratação aumentada) e/ou período de vida durante e após o tratamento. Descobriu-se que o controle apropriado de pH em conjunto com quantidades adequadas de extintor durante o processo de inativação de patógeno pode reduzir a desidratação inicial de células vermelhas sanguíneas tratadas com um composto de inativação de patógeno. O processo pode então ser seguido pela redução da concentração de extintor inicial para fornecer células vermelhas sanguíneas inativadas por patógeno saudáveis capazes de armazenamento celular, sem mudanças significantes em fragilidade osmótica. Estes métodos são particularmente adequados para a preparação de composições de célula sanguínea vermelha nas quais os patógenos foram inativados para uso clínico, especialmente quando as composições têm que ser armazenadas durante um período de tempo antes do uso clínico.

[0030] Consequentemente, a presente invenção em um aspecto fornece um método de tratar uma composição de célula vermelha sanguínea compreendendo um composto de inativação de patógeno e um extintor, (1) misturando-se o composto de inativação de patógeno e o extintor com a composição compreendendo células vermelhas sanguíneas; e (2) suficientemente diminuindo-se a concentração do extintor para reduzir o nível de desidratação de célula vermelha sanguínea resultante do armazenamento da mistura relativo ao nível de desidratação de célula vermelha sanguínea resultante do armazenamento da mistura na concentração original.

[0031] Em outros aspectos, a presente invenção fornece métodos de redução da desidratação e/ou aumento da fragilidade osmótica em

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17/108 células vermelhas sanguíneas, bem como métodos de infusão das células vermelhas sanguíneas em humanos. Também fornecidas são composições de célula sanguínea vermelha tratadas.

Células Vermelhas Sanguíneas [0032] As composições de célula sanguínea vermelha da invenção incluem, porém não estão limitadas a, qualquer produto de sangue compreendendo células vermelhas sanguíneas (por exemplo, sangue humano), onde o produto de sangue fornece, ou é processado para fornecer, células vermelhas sanguíneas adequadas para uso em seres humanos, mamíferos, e/ou vertebrados, tal como para infusão. As composições de célula sanguínea vermelha incluem, por exemplo, concentrados de sangue total e de célula vermelha sanguínea, tais como células vermelhas sanguíneas embaladas (pRBCs; por exemplo, células vermelhas sanguíneas com hematócrito aumentado e/ou não contendo solução aditiva). As composições de célula sanguínea vermelha podem ser descritas por seu hematócrito ou Volume de Célula Embalada (PCV), uma medida da concentração de células vermelhas sanguíneas na composição. As composições de célula sanguínea vermelha podem ter um hematócrito na faixa de cerca de 1 a 100%, mais provavelmente cerca de 10 a 90%, também cerca de 35 a 80%, ou cerca de 40 a 70%. Tais composições de célula sanguínea vermelha podem incluir substâncias químicas, tais como composto de inativação de patógenos e extintores. Elas podem também incluir tampões e outras soluções, tais como soluções aditivas de célula vermelha sanguínea (por exemplo, qualquer solução descrita aqui, tal como SAG-M, AS-5 ou qualquer solução das Tabelas 2, 3, ou 4), incluindo sais e soluções tamponadas. Em algumas modalidades, as composições de célula sanguínea vermelha descritas aqui são células vermelhas sanguíneas embaladas tendo um hematócrito na faixa de cerca de 70 a 90%, ou cerca de 75 a 85%, ou cerca de 80%, antes do uso

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18/108 nos métodos de tratamento descritos aqui. Em algumas modalidades, as composições de célula sanguínea vermelha são células vermelhas sanguíneas não embaladas tendo um hematócrito na faixa de cerca de 50 a 70%, ou cerca de 55 a 65%, ou cerca de 60%, antes e/ou durante o uso nos métodos de tratamento descritos aqui. Em algumas modalidades, as composições de célula sanguínea vermelha são diluídas com uma solução diluente e têm um hematócrito na faixa de cerca de 30 a 50%, ou cerca de 35 a 45%, ou cerca de 40%, antes de e/ou durante o uso nos métodos de tratamento descritos aqui. Em algumas modalidades, as composições de célula sanguínea vermelha descritas aqui foram leucorreduzidas antes do uso nos métodos de tratamento descritos aqui. Em algumas modalidades, a composições de célula sanguínea vermelha não foi leucorreduzida. Qualquer composição de célula vermelha sanguínea que entre em contato com, ou seja introduzida em, um ser humano, mamífero, ou vertebrado vivo, onde tal contato carregue um risco de transmitir doença devido à contaminação de patógenos, pode ser tratada como descrito aqui.

Patógenos Sanguíneos [0033] Um contaminante de patógeno, se presente, a ser inativado nos métodos da invenção inclui qualquer agente contendo ácido nucleico capaz de causar doença em um ser humano, outros mamíferos, ou vertebrados. O agente patogênico pode ser unicelular ou multicelular. Os exemplos de patógenos são bactérias, vírus, protozoários, fungos, leveduras, mofos, e micoplasmas que causam doença em seres humanos, outros mamíferos, ou vertebrados. O material genético do patógeno pode ser DNA ou RNA, e o material genético pode estar presente como ácido nucleico de filamento único ou filamento duplo. A Tabela 1 lista os exemplos de vírus, e não é pretendido limitar a invenção de qualquer modo.

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Tabela 1. Exemplos Não Limitantes de Vírus

Família:	Vírus:
Adeno	Adenovírus 2
Hepatite canina
Arena	Pichinde
Lassa
Bunya	Turlock
Encefalite da Califórnia
Herpes	Herpes simples 1
Herpes simples 2
Citomegalovírus
Pseudorraivas
Orothomyxo	Influenza
Papova	SV-40
Paramyxo	Sarampo
Caxumba
Parainfluenza 2 e 3
Picorna	Poliovírus 1 e 2
Coxsackie A-9
Echo 11
Pox	Varíola
Epitelioma contagioso
Reo	Língua Azul
Febre do Carrapato do Colorado
Retro	HIV
Sarcoma Aviário
Sarcoma de Murino
Leucemia de Murino
Rhabdo	Vírus de estomatite vesicular

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Família:	Vírus:
Toga	Encefalite eqüina do oeste
Dengue 2
Dengue 4
Encefalite de St. Louis
Hepadna	hepatite B
Bacteriófago	Lambda
R17
T2
(Rickettsia)	R. akari (rickettsialpox)

[0034] Além de inativar possíveis contaminantes patógeno, os métodos da presente invenção podem também inativar leucócitos que possam estar presente na composição de célula vermelha sanguínea. Os métodos de leucorredução são usados para preferivelmente remover a maioria dos leucócitos de composições de célula sanguínea vermelha pretendidas para infusão, uma vez que eles podem resultar em respostas imune indesejadas no recipiente. Entretanto, nem todo o sangue é leucorreduzido, ou os métodos de leucorredução podem não remover todos os leucócitos. Portanto, a inativação de qualquer leucócito residual pelos métodos da invenção como descritos aqui pode também reduzir o risco de tais respostas imunes.

Compostos de Inativação de Patógeno [0035] A inativação de um patógeno nas composições de célula sanguínea vermelha é afetada contatando-se o patógeno na composição de célula vermelha sanguínea com um composto de inativação de patógeno. Em quaisquer das modalidades descritas aqui, o composto de inativação de patógeno (por exemplo, S-303 descritos aqui) pode estar presente em uma quantidade eficaz (por exemplo, uma quantidade eficaz para inativar um patógeno, tal como uma quantidade suficiente para inativar, por exemplo, pelo menos 1 log, 2 logs, ou 3 logs

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21/108 de um patógeno na composição de célula vermelha sanguínea, se presente). O composto de inativação de patógenos que pode ser usado pelos métodos da invenção incluem os compostos que compreendem um grupo funcional que é, ou que seja capaz de formar e ter formado, por exemplo in situ, um grupo reativo, tal como um grupo eletrofílico. Em alguns casos, o composto de inativação de patógenos da presente invenção não requer a fotoativação para ser reativo. Por exemplo, o grupo funcional pode ser um grupo mostarda, um intermediário de grupo mostarda, um equivalente de grupo mostarda, um epóxido, um formaldeído ou um sinton de formaldeído. Tais grupos funcionais são capazes de formar in situ um grupo reativo, tal como uma aziridina eletrofílica, aziridínio, tiirano ou íon de tiirânio. Um grupo mostarda pode ser um grupo mono- ou bis-(haloetil)amina ou um grupo mono (haloetil)sulfeto. Um equivalente de mostarda é um grupo que reage por um mecanismo similar às mostardas, por exemplo, formando-se intermediários reativos tais como grupos aziridínio e aziridina ou grupos tiirano e tiirânio. Os exemplos incluem derivados de aziridina, grupos mono ou bis-(mesiletil)amina, grupos mono-(mesiletil)sulfeto, grupos mono ou bis-(tosiletil)amina e grupos mono-(tosiletil)sulfeto. Um Sinton de formaldeído é qualquer composto que se decompõem para um formaldeído, que inclui uma hidroxilamina tal como hidroximetilglicina. O grupo reativo do composto de inativação de patógeno é capaz de reagir com os ácidos nucleicos de patógenos, por exemplo, com grupos nucleofílicos no ácido nucleico. O grupo reativo é também capaz de reagir com um grupo nucleofílico de um extintor. O composto de inativação de patógenos pode também incluir um componente que direciona o composto para ácidos nucleicos, tal como uma porção de âncoras. A fração de âncoras compreende uma fração que é capaz de se ligar não covalentemente a um bipolímero de ácido nucleico, tal como DNA ou RNA, e é também referida como um ligante de ligação

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22/108 de ácido nucleico, grupo de ligação de ácido nucleico, ou fração de ligação de ácido nucleico. Os exemplos de tais compostos são descritos nas Patentes dos Estados Unidos 5.691.132, 6.410.219,

6.136.586, 6.617.157, e 6.709.810, cada das quais está incorporada por referência aqui. Outra classe de compostos de inativação de patógeno que pode ser extinta pelos métodos da invenção compreende os grupos reativos acima mencionados ligados a um grupo de ligação de ácido nucleico através de um ligador hidrolisável, como descrito na Patente US 6.514.987, incorporada por referência. A porção de âncoras dos compostos de inativação de patógeno tem uma afinidade com os ácidos nucleicos. Esta afinidade pode ser devido a quaisquer dos vários modos de ligação ao ácido nucleico não covalentemente, incluindo, porém não limitado a, intercalação, ligação de ranhura menor, ligação de ranhura maior, e ligação eletrostática (por exemplo, ligação de esqueleto de fosfato). A afinidade pode ser devido aos modos misturados de ligação (por exemplo, intercalação de ligação de ranhura menor). A ligação pode ser específica de sequência (isto é, afinidade de ligação aumentada para uma ou mais sequências de ácido nucleico particular sobre outras sequências de ácido nucleico) ou não específica de sequência. Os exemplos detalhados de tais frações de ligação de ácido nucleico podem ser encontrados nas patentes acima mencionadas.

[0036] Em algumas modalidades de cada dos métodos, composições, e kits descritos aqui, o composto de inativação de patógeno pode compreender um grupo funcional que é, ou que forma, um grupo eletrofílico reativo com o nucleófilo do extintor escolhido. Em algumas modalidades, o grupo de inativação de patógeno compreende um ligante de ligação de ácido nucleico e um grupo funcional que é, ou que forma um grupo eletrofílico.

[0037] Um exemplo específico de um composto de inativação de

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23/108 patógeno adequado para uso na presente invenção é β-alanina, N(acridin-9-il), éster de 2-[bis(2-cloroetil)amino]etil (também alternativamente referido aqui como S-303), a estrutura do qual é como segue, incluindo os sais do mesmo.

ci

NH

Ξ-303 [0038] Em algumas modalidades, a concentração do composto de inativação de patógeno, tal como S-303, na mistura com a composição de célula vermelha sanguínea e o extintor está na faixa de cerca de 0,05 mM a 4 mM, cerca de 0,05 mM a 2 mM, cerca de 0,05 mM a 0,5 mM, cerca de 0,1 mM a 0,3 mM, ou cerca de 0,2 mM. Em algumas modalidades, a relação molar do extintor para o composto de inativação de patógeno uma vez que ambos componentes foram misturados com a composição de célula vermelha sanguínea é cerca de 10:1 a cerca de 400:1, também cerca de 10:1 a cerca de 200:1, também cerca de 20:1 a cerca de 200:1, também cerca de 50:1 a cerca de 200:1, também cerca de 100:1.

Extintores [0039] Os extintores para uso em métodos da presente invenção são pretendidos reduzir as reações colaterais indesejadas das espécies eletrofílicas reativas usadas para inativar os patógenos (por exemplo, ligação do composto de inativação de patógeno à superfície de RBC que pode levar a uma resposta imune indesejada). Em quaisquer das modalidades descritas aqui, o extintor (por exemplo, glutationa descrita aqui) pode estar presente em uma quantidade eficaz (por exemplo, uma quantidade eficaz para reduzir as reações colaterais

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24/108 indesejadas, tal como as quantidades descritas aqui). Os extintores adequados compreendem um grupo nucleofílico que é capaz de reagir com o grupo eletrofílico do composto de inativação de patógeno. Os exemplos não limitantes são descritos em detalhes na Patente US 6.709.810, incorporada por referência aqui em sua totalidade. Em algumas modalidades, os extintores são capazes de significantemente reduzir as reações colaterais indesejadas em uma composição de célula vermelha sanguínea ao mesmo tempo em que permitindo que o composto de inativação de patógeno suficientemente inative um patógeno que pode estar contaminando a composição de célula vermelha sanguínea. Em algumas modalidades, os métodos melhorados da presente invenção fornecem uma quantidade eficaz de extintor em combinação com uma quantidade eficaz de composto de inativação de patógeno sob condições que fornecem redução ideal em reações colaterais indesejadas combinadas (por exemplo, ligação do composto de inativação de patógeno) com inativação suficiente de patógenos, sem significantemente alterar (por exemplo, sem diminuir) a fragilidade osmótica celular e sem significantemente alterar (por exemplo, sem aumentar) a desidratação. Uma variedade de reações colaterais indesejadas pode ser reduzida, tal como reação do composto de inativação de patógeno com proteínas e/ou componentes de célula vermelha sanguínea. Em algumas modalidades, o extintor fornece redução ideal na modificação das células vermelhas sanguíneas, tal como a ligação de IgG às células vermelhas sanguíneas ou ligação do composto de inativação de patógeno às células vermelhas sanguíneas. Ao mesmo tempo em que os métodos da invenção envolvem o tratamento ex vivo de composições de célula sanguínea vermelha, alguns extintores podem permanecer na composição sob introdução em um paciente. Como tal, em algumas modalidades, os extintores da invenção, são adequados para infusão. Os extintores adequados incluem, porém não

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25/108 estão limitados a, compostos compreendendo um grupo tiol, tal como extintores compreendendo a cisteína de aminoácido ou um derivado adequado de cisteína, tal como cisteína de N-acetila. Os exemplos de tais extintores incluem cisteína e peptídeos compreendendo pelo menos uma cisteína, tal como glutationa. Em algumas modalidades, os extintores adequados compreendem um derivado de cisteína que pode formar um grupo tiol in situ, com ou sem o uso de substâncias químicas adicionais ou enzimas adicionadas, tal como cisteína de S-acetila ou outros pró-fármacos derivados de tiol adequados de cisteína, ou peptídeos compreendendo cisteína de S-acetila ou outros prófármacos derivados de tiol adequados de cisteína. Os derivados adequados de cisteína são aqueles que ou compreendem, ou são capazes de formar in situ, um cisteinil tiol que é capaz de reagir com o grupo eletrofílico do composto de inativação de patógeno.

[0040] Em algumas modalidades, o extintor é um peptídeo de 2 a aminoácidos, onde pelo menos um dos aminoácidos é cisteína, cisteína de N-acetila, cisteína de S-acetila, ou outro derivado adequado de cisteína. Em algumas modalidades, o extintor é um peptídeo de pelo menos 3 aminoácidos, tal como cerca de 3-10 aminoácidos, também cerca de 3-6 aminoácidos, onde pelo menos um dos aminoácidos é cisteína, cisteína de N-acetila, cisteína de S-acetila, ou outro derivado adequado de cisteína. Em algumas modalidades, o extintor é um peptídeo de pelo menos 3 aminoácidos, tal como cerca de 3-10 aminoácidos, também cerca de 3-6 aminoácidos, onde pelo menos um dos aminoácidos é cisteína, cisteína de N-acetila, cisteína de S-acetila, ou outro derivado adequado de cisteína, também onde pelo menos 2 ou pelo menos 3 dos aminoácidos é cisteína, cisteína de N-acetila, cisteína de S-acetila, ou outro derivado adequado de cisteína.

[0041] Em uma modalidade preferida, o extintor é glutationa neutralizada (também conhecida como L-glutationa e γ-L-glutamil-L

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26/108 cisteinil-glicina). A glutationa tem muitas propriedades que a torna particularmente útil como um extintor. Está normalmente presente em todos os tipos de célula. Não se acredita ser capaz de passivamente penetrar em um patógeno, tal como se passando através de membranas celulares ou revestimentos de lipídeo, de vírus envelopados por lipídeo e bactérias, ou passando-se através do capsídeo viral de vírus não envelopados. Em pH aproximadamente neutro a glutationa é carregada e na ausência de transporte ativo, não penetra as bicamadas de lipídeo em qualquer nível significante. Isto é compatível com a inativação de vírus envelopados por lipídeo tais como HIV e VSV sendo substancialmente não afetado por glutationa, incluindo usando concentrações de glutationa neutralizada maiores do que 2 mM. O uso de glutationa tem algum efeito sobre a inativação de, por exemplo, Yersinia enterocolitica, Staphylococcus epidermidis e Serratia marcescens. Entretanto, isto pode ser administrado utilizando-se quantidades eficazes de glutationa neutralizada e composto de inativação de patógeno. Como tal, os métodos preferidos de extinção são fornecidos onde a contaminação de uma composição de célula vermelha sanguínea por um patógeno viral ou bacteriano é inativada em pelo menos 2 logs, preferivelmente pelo menos 3 logs. Em algumas modalidades, Staphylococcus epidermidis pode ser inativado em até pelo menos 3 logs, também cerca de 4 logs, ou cerca de 5 logs e VSV pode ser inativado em até pelo menos 4 logs, também cerca de 5 logs, ou cerca de 6 log. Em algumas modalidades, a inativação de Staphylococcus epidermidis com S-303 está em cerca de 3 logs, também cerca de 2 logs, ou cerca de 1 log que é de uma composição similar inativada com glutationa ácida a 2 mM e S-303 a 0,2 mM. Em algumas modalidades, a inativação de VSV com S-303 está em cerca de 2 logs, ou cerca de 1 log, ou essencialmente igual àquela de uma composição inativada similar com glutationa ácida a 2 mM e S-303 a 0,2 mM. Nas condições apropriadas,

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27/108 como descrito pela presente invenção, a glutationa é também compatível com o armazenamento in vitro de células vermelhas sanguíneas e a composição de célula vermelha sanguínea resultante é adequada para introdução in vivo.

[0042] Em algumas modalidades, o extintor é glutationa em sua forma reduzida. O dissulfeto de glutationa, a forma oxidada de glutationa, pode também ser usada, contanto que o dissulfeto de glutationa seja suficientemente reduzido na solução antes da adição da solução à mistura compreendendo a composição de célula vermelha sanguínea ou suficientemente reduzido após a adição à mistura compreendendo a composição de célula vermelha sanguínea.

[0043] Em algumas modalidades, o extintor é um derivado de glutationa, tal como um éster de monoalquila ou éster de dialquila de glutationa, onde o grupo alquila é um grupo linear ou ramificado tendo 1 a 10 átomos de carbono. Os exemplos específicos de grupos alquila incluem, porém não estão limitados a grupo metila, grupo etila, grupo propila, grupo isopropila, grupo butila, grupo isobutila, grupo terc-butila, grupo pentila, grupo isopentila, grupo neopentila, grupo terc-pentila, grupo 1-metulbutila, grupo hexila, grupo isoexila, grupo 2-metilpentila, grupo 1-etilbutila, grupo heptila, grupo octila, grupo nonila, e grupo decila. Por exemplo, os exemplos não limitantes de derivados de glutationa incluem éster de metila de glutationa, éster de monoetila de glutationa, e éster de monoisopropila de glutationa. Em algumas modalidades, o ester de dietila oxidado de glutationa (GSSG-(glicil)-dietil-éster) é usado. Em algumas modalidades, um tioéster de glutationa é hidrolisado após a adição às composições de célula sanguínea vermelha para formar o tiol.

[0044] É entendido que em algumas modalidades, o extintor será fornecido na forma de uma base ou ácido livre, ao passo que, em outras modalidades, o extintor será fornecido na forma de um sal. Se o

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28/108 extintor estiver na forma de um sal, o sal será preferivelmente um sal farmaceuticamente aceitável. Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos (na forma de produtos dispersíveis ou solúveis em óleo ou em água) incluem os sais não tóxicos convencionais ou os sais de amônio quaternário que são formados, por exemplo, de bases ou ácidos inorgânicos ou orgânicos. Os exemplos de tais sais de adição de ácido incluem acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, benzenssulfonato, bissulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digliconato, dodecilsulfato, etanossulfonato, fumarato, glicoeptanoato, glicerofosfato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, cloridrato, bromidrato, iodidrato, 2-hidroxietanossulfonato, lactato, maleato, metanossulfonato, 2-naftalenossulfonato, nicotinato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, sucinato, tartrato, tiocianato, tosilato, e undecanoato. Os sais de base incluem sais de amônio, sais de metal de álcali tais como sais de sódio e potássio, sais de metal alcalino-terroso tais como sais de cálcio e magnésio, sais com bases orgânicas tais como sais de dicicloexilamina, N-metil-D-glucamina, e sais com aminoácidos tal como arginina, lisina, e assim por diante. Além disso, os grupos contendo nitrogênio básico podem ser quaternizados com tais agentes como haletos de alquila inferior, tais como cloreto, brometos e iodetos de metila, etila, propila, e butila; sulfatos de dialquila como sulfatos de dimetila, dietila, dibutila; e diamila, haletos de cadeia longa tais como cloretos, brometos e iodetos de decila, laurila, miristila e estearila, haletos de aralquila como brometos de benzila e fenetila e outros. Outros sais farmaceuticamente aceitáveis incluem o etanolato de sal de sulfato e sais de sulfato.

[0045] Por exemplo, em algumas modalidades, o extintor está na forma de um sal farmaceuticamente aceitável formado de glutationa. Em algumas modalidades, o extintor está na forma de um sal farma

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29/108 ceuticamente aceitável formado de glutationa e um ou mais cátions tais como sódio, alumínio, cálcio, lítio, magnésio, zinco, ou tetrametilamônio. Em algumas modalidades, o extintor é glutationa (reduzida) e é fornecido na forma de sal de monossódio de glutationa (disponibilizado, por exemplo, por Biomedica Foscama, Itália). Em algumas outras modalidades, a glutationa (reduzida) é fornecida na forma de sal de cloridrato de glutationa. Em algumas outras modalidades, a glutationa é fornecida na forma de um sal de sódio de glutationa (reduzido). Em outras modalidades, um sulfato de éster de monoalquila de glutationa é usado. Em algumas modalidades, a glutationa é fornecida na forma de sal de dissódio oxidado de glutationa.

Métodos de Inativação e Extinção [0046] Os métodos da presente invenção envolvem a combinação de uma composição de célula vermelha sanguínea com um composto de inativação de patógeno e um extintor sob condições onde, ao misturar a composição com o composto de inativação de patógeno e extintor, o pH da composição resultante fica em uma faixa adequada para fornecer inativação de patógeno adequada e redução de reações colaterais indesejadas (tal como modificação das células vermelhas sanguíneas) com limitado ou nenhum efeito na vitalidade (por exemplo, fragilidade osmótica e desidratação) e/ou período de vida do produto de sangue tratado. Além disso, a presente invenção descreve a diminuição da concentração do extintor na composição de célula vermelha sanguínea em seguida a um período de inativação de patógeno para ajudar na conservação da vitalidade e período de vida das células vermelhas sanguíneas durante o armazenamento. Uma solução aditiva, como descrita aqui, também pode ser utilizada para as células vermelhas sanguíneas durante o armazenamento e pode ser usada para substituir as soluções de tratamento e/ou soluções diluentes usadas durante a inativação de patógeno.

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30/108 [0047] Os métodos melhorados incluem várias carcaterísticas que podem ser importantes para extinção. A primeira característica é o grupo tiol, ou outro grupo nucleofílico adequado. A segunda é o ajuste do pH da solução. É possível fornecer algum nível de extinção adequadamente ajustando-se o pH da solução. Como tais, os extintores da invenção fornecem alguma capacidade de tamponamento à composição compreendendo as células vermelhas sanguíneas, onde a capacidade de tamponamento propriamente dita fornece extinção melhorada. Por exemplo, usando um análogo de cisteína tal como metionina como um extintor, quando apropriadamente modificado para fornecer uma alteração de pH adequada na composição de célula vermelha sanguínea, resultará em algum nível de extinção de ligação do composto de inativação de patógeno às células vermelhas sanguíneas. Quando o átomo de enxofre em metionina não é nucleofílico, a metionina não fornece qualquer extinção exceto ao fornecer o pH necessário da solução. Desse modo, uma combinação de ajuste de pH e um grupo tiol fornece extinção melhorada. O ajuste apropriado do pH e equivalentes de base pode também diminuir o nível de desidratação de célula vermelha sanguínea durante o período de inativação. Uma terceira característica que pode ser importante para fornecer extinção melhorada em algumas modalidades, é a seleção de extintores preferidos que não substancialmente penetre dentro de patógenos tais como vírus e bactérias. Tais extintores fornecem extinção adequada no ambiente extracelular, onde as reações detrimentais tais como ligação às superfícies de célula vermelha, ocorrem, sem extinção adicional de composto de inativação de patógeno uma vez que tenha penetrado dentro do patógeno. Finalmente, os métodos de extinção melhorados da presente invenção incluem a diminuição da concentração de extintor em seguida à inativação e, em alguns casos, adição de uma solução aditiva durante o armazenamento. As células vermelhas sanguí

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31/108 neas mostradas tiveram período de vida melhorado e níveis diminuídos de desidratação durante o armazenamento quando a concentração total do extintor é diminuída para níveis adequados.

[0048] Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de tratar uma composição de célula vermelha sanguínea compreendendo: a) fornecer i) um composto de inativação de patógeno compreendendo um grupo funcional que é, ou que forme, um grupo eletrofílico reativo (por exemplo, uma quantidade eficaz de um composto de inativação de patógeno para inativar um patógeno, se presente), ii) um extintor (por exemplo, uma quantidade eficaz de um extintor como descrito aqui) compreendendo um grupo tiol, onde o tiol é capaz de reagir com o grupo eletrofílico reativo do composto de inativação de patógeno, e iii) uma composição compreendendo células vermelhas sanguíneas; b) misturar o composto de inativação de patógeno e extintor com a composição compreendendo células vermelhas sanguíneas; e c) suficientemente diminuir a concentração do extintor na mistura para uma quantidade que reduza o nível de desidratação de célula vermelha sanguínea resultante do armazenamento da mistura, relativo ao nível de desidratação de célula vermelha sanguínea resultante do armazenamento da mistura na concentração original do extintor. Em algumas modalidades, a etapa (a) também compreende fornecer uma base adequada, a etapa (b) também compreende misturar a base com a composição compreendendo células vermelhas sanguíneas, e a base é de quantidade suficiente para reduzir o nível de uma reação indesejada do composto de inativação de patógeno com células vermelhas sanguíneas na mistura, relativo à mistura sem a base. Em algumas modalidades, a reação indesejada do composto de inativação de patógeno com células vermelhas sanguíneas é a modificação da superfície das células vermelhas sanguíneas pelo composto de inativação de patógeno. Em algumas modalidades, a etapa (a) também compreende

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32/108 fornecer uma base adequada, a etapa (b) também compreende misturar a base com a composição compreendendo células vermelhas sanguíneas, e a base é de quantidade suficiente para reduzir o nível de ligação de anticorpo de composto de inativação antipatógeno à composição de célula vermelha sanguínea tratada na mistura resultante em pelo menos 5% (ou em pelo menos 10%, em pelo menos 25%, em pelo menos 50%, em pelo menos 75%, ou em pelo menos 90%) relativo à mistura sem a base. Em algumas modalidades, o armazenamento da mistura é maior do que, igual a, ou menor do que 7, 10, 14, 21, 28, 35, ou 42 dias de armazenamento a 4oC ou temperatura ambiente. Em algumas modalidades, a mistura é armazenada em uma solução aditiva (por exemplo, qualquer solução aditiva descrita na Tabela 2, e/ou uma solução aditiva compreendendo cloreto de sódio, adenina, glicose, fosfato, guanosina, citrato e/ou manitol). Em algumas modalidades, o método também compreende substituir a solução usada durante o tratamento com uma solução aditiva (por exemplo, qualquer solução aditiva descrita na Tabela 2, e/ou uma solução aditiva compreendendo cloreto de sódio, adenina, glicose, fosfato, guanosina, citrato e/ou manitol).

[0049] Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método de reduzir a desidratação em células vermelhas sanguíneas, compreendendo: a) fornecer uma composição de célula vermelha sanguínea compreendendo i) um extintor, onde o extintor é capaz de reagir com um composto de inativação de patógeno, e ii) células vermelhas sanguíneas; e b) suficientemente diminuir a concentração do extintor na mistura para uma quantidade que reduza o nível de desidratação de célula vermelha sanguínea resultante do armazenamento da mistura relativa ao nível de desidratação de célula vermelha sanguínea resultante do armazenamento da mistura na concentração original de extintor. Em algumas modalidades, o armazenamento da mistura é maior

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33/108 do que, igual a, ou menor do que 7, 10, 14, 21, 28, 35, ou 42 dias de armazenamento a 4 oC ou temperatura ambiente. Em algumas modalidades, o método também compreende a adição de uma solução aditiva (por exemplo, qualquer solução aditiva descrita na Tabela 2, e/ou uma solução aditiva compreendendo cloreto de sódio, adenina, glicose, fosfato, guanosina, citrato e/ou manitol), por exemplo, antes do armazenamento.

[0050] O extintor e/ou base adicionada (ou o extintor neutralizado) usados nos métodos descritos aqui podem ser misturados com a composição de célula vermelha sanguínea antes de, ao mesmo tempo em que, ou após a adição do composto de inativação de patógeno à composição de célula vermelha sanguínea. Se o extintor e base (ou extintor neutralizado) são misturados com a composição de célula vermelha sanguínea após a solução de inativação de patógeno ser misturada com a composição de célula vermelha sanguínea, o extintor e/ou base (ou extintor neutralizado) são preferivelmente adicionados à composição de célula vermelha sanguínea antes que uma quantidade significante de reação colateral do composto de inativação de patógeno com as células vermelhas sanguíneas tenha ocorrido, de modo que extinção adequada da reação colateral indesejada possa ser obtida. Em algumas modalidades, o extintor e/ou base (ou extintor neutralizado) são misturados com a composição de célula vermelha sanguínea em cerca de uma hora, em cerca de 30 minutos, em cerca de 20 minutos, em cerca de 10 minutos, em cerca de 5 minutos, em cerca de 2 minutos, ou em cerca de 1 minuto após misturar o composto de inativação de patógeno com a composição de célula vermelha sanguínea. Em algumas modalidades, o extintor e a base são misturados com a composição de célula vermelha sanguínea ao mesmo tempo em que o composto de inativação de patógeno.

[0051] Em algumas modalidades de cada dos métodos descritos

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34/108 aqui, o extintor e a base adicionada (ou o extintor neutralizado) são pré-tratados com a composição de célula vermelha sanguínea durante um intervalo de tempo adequado antes da adição do composto de inativação de patógeno (por exemplo, S-303), tal como menor do que cerca de uma hora, menor do que cerca de 30 minutos, menor do que cerca de 20 minutos, menor do que cerca de 10 minutos, menor do que cerca de 5 minutos, menor do que cerca de 2 minutos, ou menor do que cerca de 1 minuto antes de misturar o composto de inativação de patógeno com a composição de célula vermelha sanguínea. Em algumas outras modalidades, o pré-tratamento está em uma temperatura de cerca de 1oC a 30oC, também cerca de 18oC a 25oC, ou cerca de 37oC, ou cerca de temperatura ambiente.

[0052] Em algumas modalidades de cada dos métodos descritos aqui, o composto de inativação de patógeno (por exemplo, S-303) é incubado com a composição de célula vermelha sanguínea na presença do extintor e da base adicionada (ou o extintor neutralizado) durante um intervalo de tempo adequado, tal como durante cerca de 30 minutos a 48 horas, também cerca de 2 a 36 horas, também cerca de 8 a 24 horas, também cerca de 20 horas. Em algumas outras modalidades, a incubação está em uma faixa de temperatura de cerca de 1oC a 30oC, também cerca de 18oC a 25oC, ou cerca de 37oC, ou cerca de temperatura ambiente.

[0053] Com respeito à característica de ajustar o pH da composição de célula vermelha sanguínea, os métodos anteriores de extinguir tais compostos de inativação de patógenos falham ao reconhecer a importância do pH da mistura resultante com respeito tanto à eficácia da extinção quanto à vitalidade da célula durante a inativação. Ao mesmo tempo em que os métodos anteriores demonstraram a necessidade de nível de pH adequado e base suficiente para adequadamente extinguir as reações colaterais indesejadas do composto de inativa

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35/108 ção de patógeno (por exemplo, aumentando-se os níveis de glutationa não protonada para reduzir a ligação do composto de inativação de patógeno para a superfície de RBC), estes métodos não realizam e descrevem os efeitos da base aumentada na desidratação de célula durante o processo de inativação. Desse modo, um aspecto da presente invenção envolve ajustar o pH da composição de célula vermelha sanguínea para um nível adequado para a incubação do composto de inativação de patógeno e extintor (por exemplo, um nível adequado para evitar adversamente afetar a desidratação).

[0054] Em algumas modalidades, ao misturar o composto de inativação de patógeno e extintor com a composição de célula vermelha sanguínea, o pH da mistura está em um nível adequado para reduzir as reações colaterais indesejadas do composto de inativação de patógeno (por exemplo, ligação do composto de inativação de patógeno à superfície de RBC que pode levar a uma resposta imune indesejada) e suficientemente reduzir a desidratação de célula durante a inativação. Em algumas modalidades, a reação colateral indesejada é a modificação da superfície das células vermelhas sanguíneas pelo composto de inativação de patógeno. Em algumas modalidades, a modificação é ligação covalente do composto de inativação de patógeno à superfície das células vermelhas sanguíneas. Em outras modalidades, a modificação é ligação não covalente do composto de inativação de patógeno à superfície das células vermelhas sanguíneas.

[0055] Como descrito aqui, em algumas modalidades de cada dos métodos, uma reação colateral indesejada (também referida como desnecessária) do composto de inativação de patógeno com as células vermelhas sanguíneas, é reduzida. Em algumas modalidades, a reação colateral indesejada que é reduzida é a modificação da superfície de célula vermelha sanguínea pelo composto de inativação de patógeno. Em algumas modalidades, o nível de reação colateral é re

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36/108 duzido em pelo menos 5%, em pelo menos 10%, em pelo menos 25%, em pelo menos 50%, em pelo menos 75%, ou em pelo menos 90%. A diminuição na reação colateral pode ser evidenciada, por exemplo, medindo-se a quantidade de ligação às células vermelhas sanguíneas tratadas de anticorpos específicos para o composto de inativação de patógeno e/ou medindo-se o período de vida das células vermelhas sanguíneas tratadas in vivo, e comparando-se estas medições com as células vermelhas sanguíneas tratadas por um segundo método diferente (por exemplo, um método sem extintor e/ou base suficiente adicionados à mistura de reação, um método no qual nenhum extintor e/ou base é adicionado à mistura de reação, e/ou um tratamento em um pH reduzido). Por exemplo, em algumas modalidades dos métodos descritos aqui, o nível de ligação de anticorpo de composto de inativação antipatógeno às células de sangue tratadas é diminuído em pelo menos 10%, em pelo menos 25%, em pelo menos 50%, em pelo menos 75%, ou em pelo menos 90%, relativo a um segundo método (por exemplo, um método sem extintor e/ou base suficiente adicionado à mistura de reação, um método no qual nenhum extintor e/ou base é adicionado à mistura de reação, e/ou tratamento em um pH mais baixo).

[0056] Em algumas modalidades, ao misturar o composto de inativação de patógeno e extintor com a composição de célula vermelha sanguínea, o pH da mistura fica na faixa de cerca de 6,0 a 8,5, cerca de 6,0 a 7,5, cerca de 6,5 a 7,1, cerca de 6,5 a 7,0, cerca de 6,6 a 6,8, ou cerca de 6,6, 6,7, 6,8, ou 6,9. Ao mesmo tempo em que o pH em uma composição de célula vermelha sanguínea pode mudar com o tempo, é desejável que o pH esteja em uma faixa desejada quando o extintor for adicionado à composição de célula vermelha sanguínea, se ou não ele já contém o composto de inativação de patógeno. Os métodos da presente invenção envolvem adicionar o composto de inati

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37/108 vação de patógeno e extintor a uma composição de célula vermelha sanguínea. A faixa de pH desejada é necessária sob a adição tanto do composto de inativação de patógeno quanto do extintor, independente da ordem de adição do composto de inativação de patógeno e/ou extintor à composição de célula vermelha sanguínea. Em outras palavras, uma vez que todos os três componentes foram misturados, o pH fica dentro da faixa desejada. Em algumas modalidades, o extintor é adicionado antes do composto de inativação de patógeno. Em algumas modalidades, o composto de inativação de patógeno é adicionado antes do extintor. Em algumas modalidades, o extintor e o composto de inativação de patógeno são adicionados essencialmente simultaneamente. Desse modo, sob adição do composto de inativação de patógeno e extintor significa no ponto quando tanto o extintor quanto o composto de inativação de patógeno foram misturados com a composição de célula vermelha sanguínea. O pH desejado pode ser obtido por vários modos, e não está limitado a quando o pH da composição de célula vermelha sanguínea é ajustado, ou em algumas modalidades, não é significantemente ajustado a partir do pH natural do produto de sangue. Por exemplo, o pH desejado da composição de célula vermelha sanguínea pode ser obtido ajustando-se o pH. O ajuste do pH pode ser feito, por exemplo, por adição de uma solução aditiva adequada, tal como uma solução de tamponamento, antes da adição do composto de inativação de patógeno e extintor. Em algumas modalidades, a composição de célula vermelha sanguínea pode ser lavada uma ou mais vezes com um tampão adequado antes da suspensão no mesmo ou outro tampão adequado. Alternativamente, o pH da composição de célula vermelha sanguínea pode ser ajustado simultaneamente com a adição do composto de inativação de patógeno, do extintor, ou ambos. Em algumas modalidades, o pH é ajustado simultaneamente com a adição do extintor. Em algumas modalidades, o extintor é

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38/108 neutralizado, tal que a adição do extintor neutralizado forneça a faixa de pH desejada na composição de célula vermelha sanguínea. Como um exemplo, a neutralização de glutationa pode ser usada para efetuar os ajuste de pH necessários. Em algumas modalidades, um nível apropriado de neutralização da glutationa pode ser usado, por exemplo, por adição de 1 equivalente de base, para fornecer um extintor que, sob adição a uma composição de célula vermelha sanguínea, fornecerá o ajuste de pH necessário da composição. A neutralização apropriada dependerá do extintor usado. Por exemplo, quando um peptídeo será usado pode depender dos componentes de aminoácido do peptídeo. Em algumas modalidades, um extintor pode ser usado o qual não significantemente afete o pH da composição de célula vermelha sanguínea. Por exemplo, o uso de um peptídeo compreendendo uma cisteína que pode também compreender um ou mais aminoácidos que resultem em um pH mais neutro para uma solução do peptídeo naturalmente isolado. Em algumas modalidades, o peptídeo também compreende pelo menos um aminoácido básico, tal como arginina ou lisina.

[0057] Em algumas modalidades dos métodos descritos aqui, onde uma base é misturada com a composição de célula vermelha sanguínea junto com o composto de inativação de patógeno e extintor para aumentar o pH da mistura para um nível desejado e/ou melhorar a extinção das reações colaterais indesejadas, a base é um sal básico. O sal básico pode primeiro ser dissolvido em uma solução aquosa antes de misturar com a composição de célula vermelha sanguínea. Em outras modalidades, o sal pode ser adicionado diretamente à composição de célula vermelha sanguínea na forma sólida. Em algumas modalidades, o sal básico compreende o extintor e fornece tanto o extintor quanto a base para a mistura. Em algumas modalidades, a base usada no método é uma base forte, tal como NaOH. Tipicamente, uma

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39/108 base forte como NaOH será dissolvida primeiro em solução aquosa antes de misturar com a composição de célula vermelha sanguínea. Em algumas modalidades, a base forte (por exemplo, na forma de solução ou sólida) é misturada com o extintor antes de misturar o extintor com a composição de célula vermelha sanguínea. Em algumas modalidades, a base é um tampão básico (adicionado em quantidades suficientes e tendo um pKa apropriado para trazer a mistura para a faixa de pH desejada). Se um tampão básico é usado, o tampão, em algumas modalidades, será um tampão farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o tampão terá um próton titulável com um pKa na faixa de cerca de 7 a 8. Os exemplos de tampões que podem ser usados como tampões básicos incluem, porém não estão limitados a, ácido N-(2- hidroxietil)-piperazina-N'-2-etanossulfônico (HEPES), salina tamponada por fosfato (PBS), e tampão de fosfato de sódio. Outros tampões básicos adequados serão facilmente identificáveis por alguém versado na técnica ordinariamente.

[0058] Em algumas modalidades de cada dos métodos e composições descritos aqui, o pH da mistura de células vermelhas sanguíneas, extintor, composto de inativação de patógeno, e qualquer base adicionada é maior do que cerca de 5,5, maior do que cerca de 5,7, maior do que cerca de 6,0, maior do que cerca de 6,3, maior do que cerca de

6,5, maior do que cerca de 6,7, maior do que cerca de 7,0, ou maior do que cerca de 7,2. Em algumas modalidades de cada dos métodos e composições descritos aqui, o pH da mistura de células vermelhas sanguíneas, extintor, composto de inativação de patógeno, e base (se alguma for adicionada) está na faixa de cerca de 6,0 a 8,5, cerca de 6,0 a 7,5, cerca de 6,5 a 7,1, cerca de 6,5 a 7,0, ou cerca de 6,6 a 6,8, ou cerca de 6,6, 6,7, 6,8, ou 6,9. Em algumas modalidades, o pH indicado é o pH em temperatura ambiente. Em algumas modalidades, o pH indicado é o pH a 37oC. Por exemplo, em algumas modalidades, a

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40/108 composição compreendendo as células vermelhas sanguíneas é tratada com o composto de inativação de patógeno na presença do extintor e qualquer base adicionada, onde o pH da mistura está na faixa de cerca de 6,5 a cerca de 7,0 (ou 7,1) a 37 oC.

[0059] Em algumas modalidades, o pH da mistura de células vermelhas sanguíneas, extintor, e a base (se a base for adicionada como parte do método) está na faixa de cerca de 6,0 a 8,5, cerca de 6,0 a

7,5, cerca de 6,5 a 7,1, cerca de 6,5 a 7,0, ou cerca de 6,6 a 6,8, ou cerca de 6,5, 6,7, 6,8, ou 6,9, antes de misturar o composto de inativação de patógeno com a composição de célula vermelha sanguínea. Em algumas outras modalidades, o pH é obtido ao mesmo tempo quando ou em cerca de 1 hora, em cerca de 30 minutos, em cerca de 20 minutos, em cerca de 10 minutos, em cerca de 5 minutos, ou em cerca de 2 minutos de mistura do composto de inativação de patógeno com a composição compreendendo as células vermelhas sanguíneas. Em algumas modalidades destes métodos onde o pH é ajustado, o pH é ajustado para a faixa de pH desejada antes, ao mesmo tempo em que, em cerca de 1 hora, em cerca de 30 minutos, em cerca de 20 minutos, em cerca de 10 minutos, em cerca de 5 minutos, ou em cerca de 2 minutos de mistura do composto de inativação de patógeno com a composição compreendendo as células vermelhas sanguíneas. Nestas modalidades, onde o extintor é glutationa e o composto de inativação de patógeno é S-303, o pH da mistura compreendendo a composição de célula vermelha sanguínea e o extintor é preferivelmente ajustado para a faixa de pH desejada (por exemplo, pH 6,5 a 7,0) antes de misturar o S-303 com a composição de célula vermelha sanguínea.

[0060] Em algumas modalidades, o pH resultante da composição após misturar as células vermelhas sanguíneas, extintor, e a base, não é necessariamente um ajuste do pH da composição de célula verme

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41/108 lha sanguínea inicial. Por exemplo, uma composição de célula vermelha sanguínea pode ter um pH na faixa desejada de 6,0-7,5, e o pH da composição não muda significantemente na adição do extintor, e subsequentemente do composto de inativação de patógeno. Em tais modalidades, o extintor ou naturalmente fornece o pH desejado, ou é neutralizado consequentemente para fornecer o pH desejado. É a combinação de adicionar quantidades iniciais elevadas do extintor, tal como cerca de 5 mM a cerca de 40 mM, com um pH resultante na faixa desejada que é importante. Os métodos conhecidos usando tais concentrações de glutationa, por exemplo, não foram usados com a faixa de pH desejada em conjunto com outros aspectos da presente invenção. Desse modo, para os peptídeos, independente do extintor de peptídeo, ele pode ser eficazmente neutralizado quando necessário para fornecer uma faixa de pH adequada quando adicionado a uma composição de célula vermelha sanguínea, e também pode ser selecionado para fornecer uma quantidade adequada de tamponamento na faixa de pH desejada. Como tal, um extintor neutralizado significa que o extintor é adequadamente titulado com ácido ou base quando necessário tal que na adição a uma composição de célula vermelha sanguínea, a mistura resultante tenha um pH que forneça melhor extinção de reações colaterais indesejadas (por exemplo, ligação do composto de inativação de patógeno à superfície de RBC que pode levar a uma resposta imune indesejada) ao mesmo tempo em que evitando a desidratação de célula durante inativação, tal como um pH na faixa de cerca de 6,0 a 8,5, cerca de 6,0 to 7,5, cerca de 6,5 to 7,0, cerca de 6,5 to 7,1, ou cerca de 6,6 to 6,8, ou cerca de 6,6, 6,7, 6,8, ou 6,9. Em algumas modalidades, o peptídeo quando isolado naturalmente, é adequadamente neutralizado, isto é requer nenhuma adição de ácido ou base para fornecer o pH desejado na mistura final. Além disso, os extintores preferidos fornecerão capacidade de tamponamento para manter o pH na faixa

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42/108 desejada durante um tempo necessário para extinguir as reações colaterais indesejadas.

[0061] Em algumas modalidades de cada dos métodos e composições descritos aqui, o extintor é neutralizado. Um extintor é dito ser neutralizado por uma base, de uma quantidade suficiente da base foi combinada com o extintor, tal que a extinção de uma reação colateral indesejada entre o composto de inativação de patógeno e as células vermelhas sanguíneas seja melhorada em uma mistura compreendendo a composição compreendendo as células vermelhas sanguíneas, o composto de inativação de patógeno, e o extintor. Um extintor neutralizado não necessariamente tem um pH neutro, nem é necessariamente não carregado. Em algumas modalidades, o extintor neutralizado não está nem em sua forma mais protonada nem em sua forma mais desprotonada. Em algumas modalidades, onde o extintor é muito ácido, o pH do extintor neutralizado pode ainda ser menor do que 7,0 (por exemplo, cerca de 6,6, 6,7, 6,8, ou 6,9). Em algumas modalidades, o pH da solução do extintor neutralizado pode ser maior do que 7,0. Em algumas modalidades, o pH da solução do extintor neutralizado será detectavelmente maior do que aquele do extintor antes da adição da base. Em algumas modalidades, o extintor é neutralizado em pelo menos 0,25 equivalentes, em pelo menos 0,5 equivalentes, em pelo menos 0,75 equivalentes, em pelo menos 1 equivalente, em pelo menos 1,25 equivalentes, em pelo menos 1,5 equivalentes, ou em pelo menos 2 equivalentes de uma base. Em algumas modalidades, o extintor é neutralizado com menos do que cerca de 2 equivalentes, menos do que cerca de 1,5 equivalentes, menos do que cerca de 1,25 equivalentes, menos do que cerca de 1 equivalente, ou menos do que cerca de 0,75 equivalentes de uma base. Em algumas modalidades, o extintor é neutralizado com cerca de 0,25 a cerca de 2 equivalentes, cerca de 0,5 a cerca de 1,5 equivalentes, ou cerca de 0,75 a cerca de

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1,25 equivalentes de base. Em algumas modalidades, o extintor é neutralizado com cerca de 0,75 equivalente de base. Em outras modalidades, o extintor é neutralizado com cerca de 1 equivalente de base. Em outras modalidades, o extintor é neutralizado com cerca de 1,25 equivalente de base. Por exemplo, em algumas modalidades da invenção, a glutationa é neutralizada com cerca de 1 equivalente de uma base adequada, tal como hidróxido de sódio. Neste caso, uma solução da glutationa protonada tem um pH de aproximadamente 3, uma solução neutralizada com 1 equivalente de hidróxido de sódio tem um pH de aproximadamente 4,5, e uma solução neutralizada com 2 equivalentes de hidróxido de sódio tem um pH de aproximadamente 9,5. Qualquer extintor de peptídeo apropriado compreendendo pelo menos uma cisteína pode ser adequadamente ajustado para fornecer o pH desejado sob adição à composição de célula vermelha sanguínea.

[0062] Os métodos apropriados para neutralizar a glutationa e outros extintores estarão facilmente evidentes para aqueles versados na técnica ordinariamente. Em algumas modalidades, o hidróxido de sódio é usado para neutralizar ou parcialmente neutralizar o extintor. Em algumas modalidades, os péletes sólidos de NaOH são primeiro dissolvidos em água para gerar uma solução concentrada da base, tal como uma solução de NaOH a 1 N, 5 N, 10 N, ou 20 N. Em algumas modalidades, uma quantidade apropriada desta solução de NaOH é então adicionada ao extintor ou antes, ao mesmo tempo em que, ou em seguida a adição do extintor à mistura. Alternativamente, o NaOH é adicionado à composição de célula vermelha sanguínea ou ao composto de inativação de patógeno, ou a combinação dos dois, antes da adição do extintor à mistura.

[0063] Além de fornecer um extintor que é adequadamente ajustado ao pH ou neutralizado, em algumas modalidades, os extintores preferidos não são capazes de significantemente entrar nos patógenos,

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44/108 tal que eles idealmente satisfaçam as reação indesejadas no ambiente extracelular, porém não interferem com a inativação de patógeno uma vez que o composto de inativação de patógeno tenha penetrado dentro do patógeno.

[0064] Em algumas modalidades de cada dos métodos descritos aqui, o extintor é um composto ácido. Em algumas modalidades, o extintor é fornecido na forma de ácido livre. Em algumas modalidades, o extintor é ácido e em pelo menos 1 equivalente de base é adicionado para neutralizar o extintor. Uma solução compreendendo um tal extintor neutralizado pode ser, em alguns casos, básico, neutro, ou mesmo ácido. Em algumas modalidades, cerca de 1 equivalente de base é adicionado para neutralizar ou parcialmente neutralizar o extintor. Em algumas modalidades, cerca de 2 equivalentes de base são adicionados. Em algumas modalidades, o extintor é ácido e cerca de 0,5 a cerca de 1,5 equivalentes de base é usado para neutralizar o extintor. Em algumas modalidades, cerca de 0,75 a cerca de 1,25 equivalentes de base são usados. Em algumas modalidades, cerca de 1 equivalente de base é usado.

[0065] Em algumas modalidades, o extintor é neutralizado antes da adição à composição de célula vermelha sanguínea e/ou composto de inativação de patógeno. Em outras modalidades, o extintor é neutralizado após combinar o extintor com a composição de célula vermelha sanguínea e/ou composto de inativação de patógeno. Em algumas modalidades, o pH do extintor neutralizado antes da adição à composição de célula vermelha sanguínea e/ou composto de inativação de patógeno está na faixa de cerca de 2,5 a 7,5, cerca de 3,0 a 6,5, cerca de 3,5 a 5,5, cerca de 4,0 a 5,0, ou cerca de 4,3 a 4,5, ou cerca de 4,4. [0066] Em algumas modalidades, o extintor é glutationa e é fornecido na forma de sal de monossódio de glutationa e é neutralizado com cerca de 1 equivalente de base, ou não é neutralizado com base.

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Em algumas outras modalidades, o extintor é glutationa e é fornecido na forma de sal de cloridrato de glutationa e é neutralizado com cerca de 1 equivalente de base.

[0067] Em algumas modalidades de cada dos métodos descritos aqui, a concentração inicial do extintor na mistura compreendendo a composição de célula vermelha sanguínea, extintor, composto de inativação de patógeno, e qualquer base adicionada, é elevada durante um período para a inativação, e em seguida reduzida para uma concentração diminuída em seguida ao período de inativação. Em algumas modalidades, a concentração inicial do extintor é adequada para suficientemente reduzir as reações colaterais indesejadas do composto de inativação de patógeno (por exemplo, ligação do composto de inativação de patógeno à superfície de RBC), em seguida reduzida para uma concentração diminuída para suficientemente reduzir adversamente afetando a vitalidade (por exemplo, fragilidade osmótica e desidratação) e/ou período de vida durante o armazenamento de célula.

[0068] A invenção abrange qualquer quantidade de métodos usados para reduzir a concentração de extintor em seguida ao período de inativação de patógeno. Em algumas modalidades, a concentração de extintor (por exemplo, glutationa) é reduzida por centrifugação da mistura compreendendo a composição de célula vermelha sanguínea, extintor, e composto de inativação de patógeno, seguido por remoção do sobrenadante da mistura, em seguida a adição de solução fresca, tal como uma solução aditiva (por exemplo, qualquer solução aditiva descrita na Tabela 2, e/ou uma solução aditiva compreendendo cloreto de sódio, adenina, glicose, fosfato, guanosina, citrato e/ou manitol), para ressuspensão das células (por exemplo, através da lavagem das células). O processo de centrifugação, remoção de sobrenadante, e adição de solução fresca (por exemplo, qualquer solução aditiva descrita na

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Tabela 2, e/ou uma solução aditiva compreendendo cloreto de sódio, adenina, glicose, fosfato, guanosina, citrato e/ou manitol), pode ser, em algumas modalidades, repetido para um adicional de 1, 2, 3, 4, ou 5 ou mais vezes. Em algumas modalidades, o método usado para reduzir a concentração do extintor é automatizado. Em algumas modalidades, a solução fresca não compreende o extintor ou compreende uma concentração menor do extintor. Em algumas modalidades, a concentração de extintor (por exemplo, glutationa) é reduzida quimicamente desativando-se o extintor. Em algumas modalidades, a concentração de extintor (por exemplo, glutationa) é reduzida por absorção em um processo de remoção de fluxo ou batelada ou exclusão de tamanho em processo de fluxo usando membranas (por exemplo, membranas de fibra oca ou membranas de diálise), ou contas de exclusão de tamanho. Em algumas modalidades, o extintor não é reduzido e/ou não é contatado com um dispositivo de absorção de composto (CAD).

[0069] Em algumas modalidades de cada dos métodos e composições descritos aqui, a concentração inicial do extintor (por exemplo, glutationa) na mistura compreendendo a composição de célula vermelha sanguínea, extintor, composto de inativação de patógeno, e qualquer base adicionada é maior do que cerca de 2 mM, maior do que cerca de 4 mM, maior do que cerca de 6 mM, maior do que cerca de 8 mM, maior do que cerca de 10 mM, maior do que cerca de 15 mM, ou maior do que cerca de 20 mM. Em algumas modalidades, a concentração inicial de extintor na mistura é na faixa de cerca de 2 mM a 100 mM, cerca de 2 mM a 40 mM, cerca de 4 mM a 40 mM, cerca de 5 mM a 40 mM, cerca de 5 mM a 30 mM, ou cerca de 10 mM a 30 mM, ou até 2 mM, 5 mM, 10 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, 45 mM, 50 mM, ou 100 mM. Em algumas modalidades, a concentração inicial de extintor na mistura é cerca de 20 mM.

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47/108 [0070] Em algumas modalidades de cada dos métodos e composições descritos aqui, uma concentração inicial de extintor (por exemplo, glutationa) na mistura de células vermelhas sanguíneas, extintor, e o composto de inativação de patógeno é maior do que cerca de 2 mM, maior do que cerca de 4 mM, maior do que cerca de 6 mM, maior do que cerca de 8 mM ou maior do que cerca de 10 mM, e o pH da mistura é maior do que cerca de 5,5, maior do que cerca de 5,7, maior do que cerca de 6,0, maior do que cerca de 6,3, maior do que cerca de

6.5, maior do que cerca de 6,7, maior do que cerca de 7,0, ou maior do que cerca de 7,2. Em algumas modalidades de cada dos métodos e composições descritos aqui, a concentração inicial do extintor na mistura é na faixa de cerca de 2 mM a 40 mM, cerca de 4 mM a 40 mM, cerca de 5 mM a 40 mM, cerca de 5 mM a 30 mM, ou cerca de 10 mM a 30 mM, ou cerca de 20 mM, e o pH da mistura é na faixa de cerca de 6,0 a 8,5, cerca de 6,0 a 7,5, cerca de 6,5 a 7,1, cerca de 6,5 a 7,0, ou cerca de 6,6 a 6,8, ou cerca de 6,6, 6,7, 6,8, ou 6,9. Em algumas modalidades, a concentração inicial de extintor na mistura é maior do que cerca de 2 mM, maior do que cerca de 4 mM, maior do que cerca de 6 mM, maior do que cerca de 8 mM ou maior do que cerca de 10 mM, e o pH da mistura é na faixa de cerca de 6,0 a 8,5, cerca de 6,0 a 7,5, cerca de 6,5 a 7,1, cerca de 6,5 a 7,0, ou cerca de 6,6 a 6,8, ou cerca de 6,6, 6,7, 6,8, ou 6,9. Em algumas modalidades, a concentração de extintor (por exemplo, glutationa) na mistura é na faixa de cerca de 10 mM a cerca de 30 mM, e o pH da mistura é na faixa de cerca de 6,0 a

7.5. Em algumas modalidades, a concentração de extintor (por exemplo, glutationa) na mistura é na faixa de cerca de 20 mM, e o pH da mistura é na faixa de cerca de 6,5 a 7,0 (ou 7,1).

[0071] Em algumas modalidades de cada dos métodos e composições descritos aqui, a concentração inicial do extintor (por exemplo, glutationa) na mistura compreendendo a composição de célula verme

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48/108 lha sanguínea, extintor, composto de inativação de patógeno e qualquer base adicionada em seguida ao período de inativação, é reduzida em mais do que 2 vezes, ou 3 vezes, ou 4 vezes, ou 5 vezes, ou 6 vezes, ou 7 vezes, ou 8 vezes, ou 9 vezes, ou 10 vezes, ou 15 vezes, ou 20 vezes, ou 25 vezes, ou 30 vezes, ou 35 vezes, ou 40 vezes, ou 50 vezes, ou 100 vezes, ou 500 vezes, ou 1000 vezes relativo à concentração inicial do extintor (por exemplo, glutationa) na mistura.

[0072] Em algumas modalidades de cada dos métodos e composições descritos aqui, a concentração do extintor reduzida (por exemplo, glutationa) na mistura compreendendo a composição de célula vermelha sanguínea, extintor, composto de inativação de patógeno e qualquer base adicionada em seguida ao período de inativação, é menor do que cerca de 15 mM, menor do que cerca de 10 mM, menor do que cerca de 8 mM, menor do que cerca de 6 mM, menor do que cerca de 5 mM, menor do que cerca de 4 mM, menor do que cerca de 3 mM, menor do que cerca de 2 mM, menor do que cerca de 1 mM, menor do que cerca de 0,75 mM, menor do que cerca de 0,5 mM, ou menor do que cerca de 0,25 mM. Em algumas modalidades, a concentração do extintor reduzida na mistura em seguida ao período de inativação é na faixa de cerca de 1 mM a 20 mM, cerca de 2 mM a 15 mM, cerca de 3 mM a 10 mM, cerca de 4 mM a 8 mM, ou cerca de 5 mM a 6 mM. Em algumas modalidades, a concentração do extintor reduzida na mistura em seguida ao período de inativação está em uma concentração de até cerca de 0,25 mM, ou 0,5 mM, ou 0,75 mM, ou 1 mM, ou 1,5 mM, ou 2 mM, ou 3 mM, ou 4 mM, ou 5 mM, ou 6 mM, ou 7 mM, ou 8 mM, ou 9 mM, ou 10 mM, ou 12,5 mM, ou 15 mM, ou 20 mM.

[0073] Em algumas modalidades de cada dos métodos e composições descritos aqui, a concentração inicial do extintor (por exemplo, glutationa) na mistura compreendendo a composição de célula vermelha sanguínea, extintor, composto de inativação de patógeno e qual

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49/108 quer base adicionada é maior do que 2 mM, maior do que cerca de 4 mM, maior do que cerca de 6 mM, maior do que cerca de 8 mM ou maior do que cerca de 10 mM, e a concentração do extintor reduzida na mistura em seguida ao período de inativação é menor do que cerca de 15 mM, menor do que cerca de 10 mM, menor do que cerca de 8 mM, menor do que cerca de 6 mM, menor do que cerca de 5 mM, menor do que cerca de 4 mM, menor do que cerca de 3 mM, menor do que cerca de 2 mM, menor do que cerca de 1,5 mM, menor do que cerca de 1 mM, menor do que cerca de 0,75 mM, menor do que cerca de 0,5 mM, ou menor do que cerca de 0,25 mM. Em algumas modalidades, a concentração inicial do extintor é na faixa de cerca de 2 mM a 100 mM, cerca de 2 mM a 40 mM, cerca de 4 mM a 40 mM, cerca de 5 mM a 40 mM, cerca de 5 mM a 30 mM, ou cerca de 10 mM a 30 mM, ou cerca de 20 mM, e a concentração do extintor reduzida na mistura em seguida ao período de inativação é na faixa de cerca de 1 mM a 20 mM, cerca de 2 mM a 15 mM, cerca de 3 mM a 10 mM, cerca de 4 mM a 8 mM, ou cerca de 5 mM a 6 mM. Em algumas modalidades, a concentração inicial do extintor (por exemplo, glutationa) é na faixa de cerca de 10 mM a 30 mM, e a concentração do extintor reduzida na mistura em seguida ao período de inativação é na faixa de cerca de 2 mM a 15 mM. Em algumas modalidades, a concentração inicial do extintor (por exemplo, glutationa) é cerca de 20 mM, e a concentração do extintor reduzida na mistura em seguida ao período de inativação é na faixa de cerca de 4 mM a 8 mM.

[0074] Em algumas modalidades, a concentração inicial do extintor (por exemplo, glutationa) na mistura compreendendo a composição de célula vermelha sanguínea, extintor (por exemplo, glutationa), composto de inativação de patógeno e qualquer base adicionada é maior do que 2 mM, maior do que cerca de 4 mM, maior do que cerca de 6 mM, maior do que cerca de 8 mM ou maior do que cerca de 10 mM; o pH

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50/108 da mistura é maior do que cerca de 5,5, maior do que cerca de 5,7, maior do que cerca de 6,0, maior do que cerca de 6,3, maior do que cerca de 6,5, maior do que cerca de 6,7, maior do que cerca de 7,0, ou maior do que cerca de 7,2; e a concentração do extintor reduzida na mistura em seguida ao período de inativação é menor do que cerca de 15 mM, menor do que cerca de 10 mM, menor do que cerca de 8 mM, menor do que cerca de 6 mM, menor do que cerca de 5 mM, menor do que cerca de 4 mM, menor do que cerca de 3 mM, menor do que cerca de 2 mM, menor do que cerca de 1,5 mM, menor do que cerca de 1 mM, menor do que cerca de 0,75 mM, menor do que cerca de 0,5 mM, ou menor do que cerca de 0,25 mM . Em algumas modalidades, a concentração inicial do extintor é na faixa de cerca de 2 mM a 100 mM, cerca de 2 mM a 40 mM, cerca de 4 mM a 40 mM, cerca de 5 mM a 40 mM, cerca de 5 mM a 30 mM, ou cerca de 10 mM a 30 mM, ou cerca de 20 mM; o pH da mistura é na faixa de cerca de 6,0 a 8,5, cerca de 6,0 a 7,5, cerca de 6,5 a 7,0, cerca de 6,5 to 7,1, ou cerca de 6,6 a 6,8, ou cerca de 6,6, 6,7, 6,8, ou 6,9; e a concentração do extintor reduzida na mistura em seguida ao período de inativação é na faixa de cerca de 1 mM a 20 mM, cerca de 2 mM a 15 mM, cerca de 3 mM a 10 mM, cerca de 4 mM a 8 mM, ou cerca de 5 mM a 6 mM. Em algumas modalidades, a concentração inicial do extintor (por exemplo, glutationa) é na faixa de cerca de 10 mM a 30 mM; o pH da mistura é na faixa de cerca de 6,0 a 7,5; e a concentração do extintor reduzida na mistura em seguida ao período de inativação é na faixa de cerca de 2 mM a 15 mM. Em algumas modalidades, a concentração inicial do extintor (por exemplo, glutationa) é cerca de 20 mM; o pH da mistura é na faixa de cerca de 6,5 a 7,0 (ou 7,1); e a concentração do extintor reduzida na mistura em seguida ao período de inativação é na faixa de cerca de 4 mM a 8 mM.

[0075] Em algumas modalidades de cada dos métodos e composi

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51/108 ções descritos aqui, o período de tempo entre o ponto de adição do extintor na concentração inicial e o ponto de redução da concentração do extintor para uma concentração reduzida na mistura compreendendo a composição de célula vermelha sanguínea, extintor, composto de inativação de patógeno, e qualquer base adicionada é suficiente para reduzir as reações colaterais indesejadas do composto de inativação de patógeno (por exemplo, ligação do composto de inativação de patógeno à superfície de RBC que pode levar a uma resposta imune indesejada). Em algumas modalidades, o período de tempo é suficiente para reduzir as reações colaterais indesejadas do composto de inativação de patógeno e para evitar ou reduzir a desidratação de célula durante o processo de inativação.

[0076] Em algumas modalidades, o período de tempo entre o ponto de adição do extintor na concentração inicial e o ponto de redução da concentração do extintor a uma concentração reduzida na mistura compreendendo a composição de célula vermelha sanguínea, extintor, composto de inativação de patógeno, e qualquer base adicionada é maior do que, cerca de igual ao, ou menos do que 5 horas, 10 horas, 15 horas, 20 horas, 25 horas, 30 horas, 35 horas, 40 horas, ou 50 horas. Em algumas modalidades, o período de tempo é cerca de 1 a 96 horas, ou cerca de 1 a 72 horas, ou cerca de 1 a 48 horas, ou cerca de 10 a 30 horas, ou cerca de 15 a 25 horas, ou cerca de 20 horas.

[0077] Em algumas modalidades de cada dos métodos e composições descritos aqui, a concentração inicial do extintor (por exemplo, glutationa) na mistura compreendendo a composição de célula vermelha sanguínea, extintor, composto de inativação de patógeno e qualquer base adicionada é maior do que 2 mM, maior do que cerca de 4 mM, maior do que cerca de 6 mM, maior do que cerca de 8 mM, maior do que cerca de 10 mM, ou maior do que cerca de 15 mM; a concentração do extintor reduzida na mistura em seguida ao período de inati

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52/108 vação é menor do que cerca de 25 mM, menor do que cerca de 20 mM, menor do que cerca de 15 mM, menor do que cerca de 10 mM, menor do que cerca de 8 mM, menor do que cerca de 6 mM, menor do que cerca de 5 mM, menor do que cerca de 4 mM, menor do que cerca de 3 mM, menor do que cerca de 2 mM, menor do que cerca de 1,5 mM, menor do que cerca de 1 mM, menor do que cerca de 0,75 mM, menor do que cerca de 0,5 mM, ou menor do que cerca de 0,25 mM ; e o período de tempo entre o ponto de adição do extintor na concentração inicial e o ponto de redução da concentração do extintor a uma concentração reduzida é maior do que, cerca de igual a, ou menor do que 5 horas, 10 horas, 15 horas, 20 horas, 25 horas, 30 horas, 35 horas, 40 horas, ou 50 horas.

[0078] Em algumas modalidades, a concentração inicial do extintor é na faixa de cerca de 2 mM a 100 mM, cerca de 2 mM a 40 mM, cerca de 4 mM a 40 mM, cerca de 5 mM a 40 mM, cerca de 5 mM a 30 mM, ou cerca de 10 mM a 30 mM, ou cerca de 20 mM; a concentração do extintor reduzida na mistura em seguida ao período de inativação é na faixa de cerca de 1 mM a 20 mM, cerca de 2 mM a 15 mM, cerca de 3 mM a 10 mM, cerca de 4 mM a 8 mM, ou cerca de 5 mM a 6 mM; e o período de tempo entre o ponto de adição do extintor na concentração inicial e o ponto de redução da concentração do extintor a uma concentração reduzida é cerca de 1 a 96 horas, ou cerca de 1 a 72 horas, ou cerca de 1 a 48 horas, ou cerca de 10 a 30 horas, ou cerca de 4 a 30 horas, ou cerca de 10 a 25 horas, ou cerca de 15 a 25 horas, ou cerca de 20 horas.

[0079] Em algumas modalidades, a concentração inicial do extintor (por exemplo, glutationa) é na faixa de cerca de 10 mM a 30 mM; a concentração do extintor reduzida na mistura em seguida ao período de inativação é na faixa de cerca de 2 mM a 15 mM; e o período de tempo entre o ponto de adição do extintor na concentração inicial e o

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53/108 ponto de redução da concentração do extintor a uma concentração reduzida é cerca de 10 a 30 horas. Em algumas modalidades, a concentração inicial do extintor (por exemplo, glutationa) é cerca de 20 mM; e a concentração do extintor reduzida na mistura em seguida ao período de inativação é na faixa de cerca de 4 mM a 8 mM; e o período de tempo entre o ponto de adição do extintor na concentração inicial e o ponto de redução da concentração do extintor a uma concentração reduzida é cerca de 15 a 25 horas. Em algumas destas modalidades, o pH da mistura é na faixa de cerca de 6,5 a 7,0 (ou 7,1). Em outras destas modalidades, o pH da mistura é na faixa de cerca de 6,0 a

7,5.

[0080] Em quaisquer destas modalidades, a temperatura da mistura compreendendo a composição de célula vermelha sanguínea e extintor durante o período de tempo entre o ponto de adição do extintor na concentração inicial e o ponto de redução da concentração do extintor a uma concentração reduzida está em uma faixa de temperatura de cerca de 1oC a 30oC, também cerca de 18oC a 25oC, ou cerca de 37oC, ou cerca de temperatura ambiente.

[0081] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratar uma composição de célula vermelha sanguínea compreendendo: a) fornecer i) um composto de inativação de patógeno (por exemplo, uma quantidade eficaz de um composto de inativação de patógeno para inativar um patógeno, se presente) compreendendo um ligador frangível ligando um grupo mostarda e um ligante de ligação de ácido nucleico (por exemplo, S-303), ii) um extintor (por exemplo, uma quantidade eficaz de um extintor) compreendendo um grupo tiol, onde o tiol é capaz de reagir com o grupo eletrofílico reativo do composto de inativação de patógeno (por exemplo, glutationa), iii) uma composição compreendendo células vermelhas sanguíneas, e iv) uma base adequada (por exemplo, NaOH); b) misturar o composto de inati

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54/108 vação de patógeno, extintor, e base adequada com a composição compreendendo células vermelhas sanguíneas; e c) suficientemente diminuir a concentração do extintor na mistura para uma quantidade que reduza o nível de desidratação de célula vermelha sanguínea resultante do armazenamento da mistura (por exemplo, após 10, 28, ou 42 dias a 4 oC), relativo ao nível de desidratação de célula vermelha sanguínea resultante do armazenamento da mistura na concentração original do extintor. Em algumas modalidades, a mistura compreende cerca de 0,5 a 1,5 equivalentes de base (ou cerca de 0,75 a 1,25 equivalentes), onde um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente a quantidade molar do extintor na mistura, e/ou a mistura resultante da etapa (b) tem um pH a 37oC de cerca de 6,0 a 7,5 (ou cerca de 6,5 a 7,0, ou 7,1). Em algumas modalidades, a base da etapa (a) é de quantidade suficiente para reduzir o nível de ligação de anticorpo de composto de inativação antipatógeno à composição de célula vermelha sanguínea tratada na mistura resultante em pelo menos 5% (ou em pelo menos 10%, em pelo menos 25%, em pelo menos 50%, em pelo menos 75%, ou em pelo menos 90%) relativo à mistura sem a base. Em algumas modalidades, a concentração de extintor é cerca de 5 mM a cerca de 30 mM (ou cerca de 15 mM a cerca de 25 mM) e/ou o extintor na mistura resultante da etapa (c) está em uma concentração menor do que cerca de 10 mM (ou menor do que cerca de 6 mM, ou menor do que cerca de 2 mM). Em algumas modalidades, a concentração do composto de inativação de patógeno na mistura resultante da etapa (b) é cerca de 0,1 pM a cerca de 5 mM e/ou é suficiente para inativar pelo menos 1 log (ou 3 logs) de um patógeno na composição de célula vermelha sanguínea, se presente. Em algumas modalidades, o tempo entre a etapa (b) e a etapa (c) é cerca de 1 a 48 horas (ou 15 a 25 horas). Em algumas modalidades, em 20 horas em seguida a etapa (b), as células vermelhas sanguíneas (RBCs) da mistura

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55/108 resultante têm uma capacidade de ligação de anticorpo (ABC) de menos do que 65% comparado com o valor de ABC de células vermelhas sanguíneas do mesmo método sob as mesmas condições, porém sem o uso de base e/ou têm um ABC médio menor do que cerca de 50,000 (ou entre cerca de 25,000 e 70,000), e/ou têm menos do que 1% de hemólise em seguida a etapa (c) (ou em seguida ao armazenamento durante 28 ou 42 dias a 4oC) e/ou têm um Volume de Célula Embalada (PCV) maior do que 50% em seguida a etapa (c) (ou em seguida ao armazenamento durante 28 ou 42 dias a 4oC) e/ou têm um Valor de Fragilidade Corpuscular Médio maior do que 140 (ou 150) após 28 (ou 42) dias a 4oC em seguida a etapa (c). Em algumas destas modalidades, a diminuição da concentração do extintor na etapa (c) compreende remoção da solução usada durante inativação e adição de uma solução aditiva final (por exemplo, qualquer solução descrita aqui, tal como SAG-M, AS-5, qualquer solução das Tabelas 2, 3, ou 4, ou uma solução aditiva compreendendo cloreto de sódio, adenina, glicose, fosfato, guanosina, citrato, e/ou manitol).

[0082] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de tratar uma composição de célula vermelha sanguínea compreendendo (a) misturar (i) um composto de inativação de patógeno (por exemplo, uma quantidade eficaz de um composto de inativação de patógeno para inativar um patógeno, se presente) compreendendo um grupo funcional que é, ou que forma, um grupo eletrofílico reativo (por exemplo, S-303); (ii) um extintor (por exemplo, uma quantidade eficaz de um extintor) compreendendo um grupo tiol (por exemplo, glutationa), onde o tiol é capaz de reagir com o grupo eletrofílico reativo do composto de inativação de patógeno; (iii) uma composição compreendendo células vermelhas sanguíneas; e (iv) uma base adequada (por exemplo, NaOH), e; (b) suficientemente diminuir a concentração do extintor na mistura para uma quantidade que reduza o nível de de

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56/108 sidratação de célula vermelha sanguínea resultante do armazenamento da mistura relativo ao nível de desidratação de célula vermelha sanguínea resultante do armazenamento da mistura (por exemplo, após 10, 28, ou 42 dias a 4oC) na concentração original do extintor. Em algumas modalidades, a mistura compreende cerca de 0,5 a 1,5 equivalentes de base (ou cerca de 0,75 a 1,25 equivalentes), onde um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar do extintor na mistura, e/ou a mistura resultante da etapa (a) tem um pH a 37 oC de cerca de 6,0 a 7,5 (ou cerca de 6,5 a 7,0, ou 7,1). Em algumas modalidades, a base da etapa (a) é de quantidade suficiente para reduzir o nível de ligação de anticorpo de composto de inativação antipatógeno à composição de célula vermelha sanguínea tratada na mistura resultante em pelo menos 5% (ou em pelo menos 10%, em pelo menos 25%, em pelo menos 50%, em pelo menos 75%, ou em pelo menos 90%) relativo à mistura sem a base. Em algumas modalidades, a concentração de extintor é cerca de 5 mM a cerca de 30 mM (ou cerca de 15 mM a cerca de 25 mM) e/ou o extintor na mistura resultante da etapa (b) está em uma concentração menor do que cerca de 10 mM (ou menor do que cerca de 6 mM, ou menor do que cerca de 2 mM). Em algumas modalidades, a concentração do composto de inativação de patógeno na mistura resultante da etapa (a) é cerca de 0,1 μΜ a cerca de 5 mM e/ou é suficiente para inativar pelo menos 1 log (ou 3 logs) de um patógeno na composição de célula vermelha sanguínea, se presente. Em algumas modalidades, o tempo entre a etapa (a) e etapa (b) é cerca de 1 a 48 horas (ou 15 a 25 horas). Em algumas modalidades, em 20 horas em seguida a etapa (a), as células vermelhas sanguíneas (RBCs) da mistura resultante têm uma capacidade de ligação de anticorpo (ABC) menor do que 65% comparada com o valor de ABC de células vermelhas sanguíneas do mesmo método sob as mesmas condições, porém sem o uso de base

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57/108 e/ou têm um ABC médio menor do que cerca de 50,000 (ou entre cerca de 25,000 e 70,000), e/ou têm menos do que 1% de hemólise em seguida a etapa (b) (ou em seguida ao armazenamento durante 28 ou 42 dias a 4 oC) e/ou têm um Volume de Célula Embalada (PCV) maior do que 50% em seguida a etapa (b) (ou em seguida ao armazenamento durante 28 ou 42 dias a 4 oC) e/ou têm um Valor de Fragilidade Corpuscular Médio maior do que 140 (ou 150) após 28 (ou 42) dias a 4 oC em seguida a etapa (b). Em algumas destas modalidades, a diminuição da concentração do extintor na etapa (b) compreende a remoção da solução usada durante inativação e adição de uma solução aditiva final (por exemplo, qualquer solução descrita aqui, tal como SAGM, AS-5, qualquer solução das Tabelas 2, 3, ou 4, ou uma solução aditiva compreendendo cloreto de sódio, adenina, glicose, fosfato, guanosina, citrato, e/ou manitol).

[0083] Em algumas modalidades, a presente invenção fornece um método de redução da desidratação em células vermelhas sanguíneas, compreendendo: a) fornecer uma composição de célula vermelha sanguínea compreendendo i) um extintor (por exemplo, glutationa), onde o extintor é capaz de reagir com um composto de inativação de patógeno, e ii) células vermelhas sanguíneas; e b) suficientemente diminuir a concentração do extintor na mistura para uma quantidade que reduza o nível de desidratação de célula vermelha sanguínea resultante do armazenamento da mistura relativo ao nível de desidratação de célula vermelha sanguínea resultante do armazenamento da mistura na concentração original do extintor (por exemplo, após 10, 28, ou 42 dias a 4 oC). Em algumas modalidades, o extintor na mistura resultante da etapa (b) está em uma concentração menor do que cerca de 10 mM (ou menor do que cerca de 6 mM, ou menor do que cerca de 2 mM). Em algumas modalidades, as células vermelhas sanguíneas (RBCs) da mistura resultante têm menos do que 1% de hemólise em

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58/108 seguida a etapa (b) (ou em seguida ao armazenamento durante 28 ou 42 dias a 4 oC) e/ou têm um Volume de Célula Embalada (PCV) maior do que 50% em seguida a etapa (b) (ou em seguida ao armazenamento durante 28 ou 42 dias a 4 oC) e/ou têm um Valor de Fragilidade Corpuscular Médio maior do que 140 (ou 150) após 28 (ou 42) dias a 4 oC em seguida a etapa (b).

[0084] Os métodos da invenção incluem o uso ex vivo de um composto de inativação de patógeno e um extintor. O uso ex vivo envolve usar os compostos para tratamento de uma composição de célula vermelha sanguínea, fora de um ser humano, mamífero, ou vertebrado vivo, onde o material biológico tratado é pretendido para uso no interior de um ser humano, mamífero, ou vertebrado vivo. Por exemplo, a remoção de sangue de um ser humano, e introdução de um composto neste sangue para inativar os patógenos, é definida como um uso ex vivo do composto se o sangue é pretendido para reintrodução neste ser humano ou outro ser humano. A reintrodução do sangue humano neste ser humano ou outro ser humano seria uso in vivo do sangue, quando oposto ao uso ex vivo do composto. Se o composto está ainda presente no sangue quando ele é reintroduzido no ser humano, então o composto, além de seu uso ex vivo, é também introduzido in vivo. Algumas modalidades da presente invenção envolvem o uso ex vivo de um extintor, onde a composição de célula vermelha sanguínea é pretendida para uso in vivo. Em alguns casos, algum nível de extintor permanece na composição de célula vermelha sanguínea tal que o extintor seja também introduzido in vivo. O uso in vitro de um material ou composto envolve um uso do material ou composto fora de um ser humano, mamífero, ou vertebrado vivo, onde o material ou composto não é pretendido para reintrodução em um ser humano, mamífero, ou vertebrado vivo. Um exemplo de um uso in vitro seria a análise de diagnóstico de componentes de uma amostra de célula vermelha san

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59/108 guínea. Os métodos da invenção podem ser aplicados ao uso in vitro das composições de célula sanguínea vermelha, como modificação das células vermelhas sanguíneas ou outros constituintes podem afetar a análise in vitro dos componentes da amostra de sangue. Desse modo, os métodos da invenção podem fornecer segurança no manuseio de tais amostras in vitro com extinção adequada de modificações da amostra que podem de outro modo interferir com o teste de diagnóstico da amostra.

[0085] As soluções aditivas, incluindo os sais e/ou soluções tamponadas, podem ser usadas com os métodos e composições de célula sanguínea vermelha descritos aqui. Por exemplo, um tampão selecionado (por exemplo, SAG-M, AS-5, ou qualquer solução descrita nas Tabelas 2, 3, e/ou 4) pode ser adicionado à composição de célula vermelha sanguínea antes, durante, e/ou em seguida ao período de inativação e/ou no momento em que a concentração de extintor é diminuída.

[0086] Métodos de Inativação Usando Células Vermelhas Sanguíneas Embaladas [0087] Em algumas modalidades, as células vermelhas sanguíneas embaladas (pRBCs) (por exemplo, células vermelhas sanguíneas necessitadas de solução aditiva e/ou tendo um hematócrito na faixa de cerca de 70 a 90%, ou cerca de 75 a 85%, ou cerca de 80%) são submetidas a um método de inativação descrito aqui (por exemplo, um método onde a composição compreende cerca de 20 mM GSH com cerca de 1 equivalentes de base de cerca de S-303 a 0,2 mM), em seguida submetidas a (em alguns casos, preservadas com) uma solução aditiva (por exemplo, SAG-M, AS-5, ou qualquer solução descrita aqui ou na Tabela 2). Os exemplos de soluções aditivas são mostrados na Tabela 2 e descritos aqui. Em algumas destas modalidades, a solução aditiva (por exemplo, qualquer solução descrita aqui ou na Tabela 2) é

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60/108 adicionada à composição de célula vermelha sanguínea compreendendo extintor, composto de inativação de patógeno, e qualquer base adicionada, de cerca de 5 minutos a 20 horas em seguida a adição do composto de inativação de patógeno (por exemplo, S-303) e/ou do extintor (por exemplo, GSH). Em algumas modalidades, a solução aditiva é adicionada à composição de RBC de cerca de 5 minutos a 10 horas, ou cerca de 5 minutos a 5 horas, ou cerca de 5 minutos a 60 minutos, ou cerca de 5 minutos a 30 minutos, ou cerca de 10 minutos a 20 minutos, ou cerca de 15 minutos em seguida a adição do composto de inativação de patógeno (por exemplo, S-303) e/ou do extintor (por exemplo, GSH). Em algumas modalidades, a concentração do extintor é diminuída como descrito aqui em seguida à adição da solução aditiva (por exemplo, SAG-M, AS-5, ou qualquer solução descrita aqui ou na Tabela 2). Por exemplo, pRBCs podem ser tratados com um método de inativação descrito aqui (por exemplo, tratamento onde a composição compreende cerca de 20 mM de GSH, cerca de 1 equivalentes de base, e cerca de S-303 a 0,2 mM), em seguida tratados com uma solução aditiva (por exemplo, SAG-M, AS-5, ou qualquer solução descrita aqui ou na Tabela 2) em um tempo especificado após a adição do composto de inativação de patógeno e/ou do extintor (tal como em cerca de 5 minutos a 5 horas, ou cerca de 10 minutos a 20 minutos, ou cerca de 15 minutos), seguido pela diminuição da concentração de extintor como descrito aqui (por exemplo, para menos do que cerca de 10 mM, ou menor do que cerca de 5 mM). Em algumas destas modalidades, a diminuição da concentração de extintor compreende remoção da solução de tratamento e/ou solução aditiva, seguido pela adição de uma solução aditiva final (por exemplo, SAG-M, AS-5, ou qualquer solução descrita aqui ou na Tabela 2) para fornecer uma composição de célula vermelha sanguínea tendo, por exemplo, um hematócrito na faixa de cerca de 50 a 70%, ou cerca de 55 a 65%, ou

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61/108 cerca de 60%. Em algumas modalidades, a concentração de íon de cloreto na composição de célula vermelha sanguínea antes e/ou durante inativação é menor do que ou maior do que cerca de 150 mM, ou cerca de 120 mM, ou cerca de 100 mM, ou cerca de 90 mM, cerca de 80 mM, ou cerca de 70 mM, ou cerca de 60 mM, ou cerca de 50 mM, cerca de 40 mM, cerca de 30 mM, ou cerca de 20 mM, cerca de 10 mM, ou entre cerca de 25 e 250 mM, ou cerca de 40 e 100 mM, ou cerca de 50 e 75 mM, ou cerca de 60 e 70 mM, ou cerca de 65 mM.

[0088] Em algumas modalidades, a solução aditiva referida aqui (por exemplo, a solução aditiva administrada antes e/ou em seguida a diminuição da concentração de extintor) compreende um ou mais dos seguintes componentes: dextrose, adenina, guanosina, manitol, citrato (por exemplo, citrato de sódio), ácido cítrico, fosfato (por exemplo, Na2HPO4 e/ou NaH2PO4) e cloreto (por exemplo, de cloreto de sódio). Em algumas modalidades, a concentração de dextrose da solução aditiva e/ou a concentração final de dextrose na composição de RBC em seguida a permuta (por exemplo, antes da transfusão) está em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 150 mM, ou cerca de 20 mM a cerca de 120 mM, ou cerca de 25 mM a cerca de 100 mM, ou cerca de 30 mM a cerca de 75 mM, ou cerca de 40 mM a cerca de 50 mM. Em algumas modalidades, a concentração de adenina da solução aditiva e/ou a concentração final de adenina na composição de RBC em seguida a permuta (por exemplo, antes da transfusão) está em uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 5 mM, ou cerca de 0,75 mM a cerca de 3 mM, ou cerca de 1 mM a cerca de 2,5 mM. Em algumas modalidades, a concentração de guanosina da solução aditiva e/ou a concentração final de guanosina na composição de RBC em seguida a permuta (por exemplo, antes da transfusão) está em uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 5 mM, ou cerca de 0,75 mM a cerca de 3 mM, ou cerca de 1 mM a cerca de 2,5 mM,

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62/108 ou cerca de 1,5 mM a cerca de 2 mM. Em algumas modalidades, a concentração de manitol da solução aditiva e/ou a concentração final de manitol na composição de RBC em seguida a permuta (por exemplo, antes da transfusão) está em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 150 mM, ou cerca de 20 mM a cerca de 120 mM, ou cerca de 25 mM a cerca de 100 mM, ou cerca de 30 mM a cerca de 75 mM, ou cerca de 40 mM a cerca de 50 mM, ou cerca de 35 mM a cerca de 45 mM. Em algumas modalidades, a concentração de citrato (por exemplo, citrato de sódio) da solução aditiva e/ou a concentração final de citrato na composição de RBC em seguida a permuta (por exemplo, antes da transfusão) está em uma concentração de cerca de 5 mM a cerca de 100 mM, ou cerca de 10 mM a cerca de 75 mM, ou cerca de 15 mM a cerca de 50 mM, ou cerca de 15 mM a cerca de 35 mM, ou cerca de 20 mM a cerca de 30 mM. Em algumas modalidades, a concentração de fosfato (por exemplo, Na2HPO4 e/ou NaH2PO4) da solução aditiva e/ou a concentração final de fosfato na composição de RBC em seguida a permuta (por exemplo, antes da transfusão) está em uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 150 mM, ou cerca de 2 mM a cerca de 100 mM, ou cerca de 3 mM a cerca de 75 mM, ou cerca de 4 mM a cerca de 50 mM, ou cerca de 5 mM a cerca de 25 mM, ou cerca de 10 mM a cerca de 20 mM. Em algumas modalidades, a concentração de cloreto da solução aditiva e/ou a concentração final de cloreto na composição de RBC em seguida a permuta (por exemplo, antes da transfusão) é menor do que ou maior do que cerca de 500 mM, ou cerca de 250 mM, ou cerca de 200 mM, ou cerca de 150 mM, ou cerca de 100 mM, cerca de 75 mM, ou cerca de 50 mM, ou cerca de 25 mM, ou cerca de 25 a cerca de 250 mM, ou cerca de 40 a cerca de 100 mM, ou cerca de 50 a cerca de 75 mM, ou cerca de 60 a cerca de 70 mM, ou cerca de 100 a cerca de 200 mM, ou cerca de 125 mM a cerca de 175 mM, ou cerca de 150 mM.

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63/108 [0089] Em algumas modalidades, a solução aditiva referida aqui (por exemplo, a solução aditiva administrada antes e/ou em seguida a diminuição da concentração de extintor) e/ou a composição de RBC final em seguida a permuta (por exemplo, antes da transfusão) compreende dextrose a 10 mM a cerca de 150 mM (ou cerca de 50 mM a cerca de 90 mM), adenina a 0,5 mM a cerca de 5 mM (ou cerca de 0,75 mM a cerca de 3 mM), manitol a cerca de 10 mM a cerca de 150 mM (ou cerca de 25 mM a cerca de 100 mM), citrato a cerca de 10 mM a cerca de 75 mM (ou cerca de 15 mM a cerca de 50 mM) (por exemplo, citrato de sódio), fosfato a cerca de 3 mM a cerca de 75 mM (ou cerca de 5 mM a cerca de 25 mM) (por exemplo, Na2HPO4 e/ou NaH2PO4), e cloreto a cerca de 50 a cerca de 250 mM, ou (cerca de 100 a cerca de 175 mM).

Tabela 2: Soluções Aditivas Exemplares

	AS-1	AS-3	SAG -M	Eritro- sol	AS-5	PAGGS -M	MA P
Dextrose (mM)	111,0	55,5	45,4	81,1	45,4	47,5	36, 4
Adenina (mM)	2,0	2,2	1,3	1,6	2,2	1,4	1
Guanosina (mM)						1,44
Manitol (mM)	41,2		28,8	42,5	28,8	55	80
Diidrato de Citrato de sódio (mM)		20		26,6			5,1
Na2HPO4 (mM)				17		8
NaH2PO4 (mM)		20		4,7		8	6

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	AS-1	AS-3	SAG -M	Eritro- sol	AS-5	PAGGS -M	MA P
NaCl (mM)	154,0	70	150		150	72	85
Ácido cítrico (mM)		2					1
Osmolalidade (mOsm)		276	359	175	351	296

Métodos de Inativação Usando Células Vermelhas Sanguíneas Diluídas [0090] As composições de célula sanguínea vermelha descritas aqui podem ser diluídas antes da inativação. A sujeição das células vermelhas sanguíneas a um diluente pode diminuir a concentração de espécies dissolvidas (por exemplo, sais tal como Cl-) para um nível que é adequado para a inativação com os métodos descritos aqui. Os exemplos de soluções diluentes são descritos aqui e mostrados na Tabela 3. Em algumas modalidades, as células vermelhas sanguíneas não embaladas (por exemplo, células vermelhas sanguíneas tendo um hematócrito na faixa de cerca de 50 a 70%, ou cerca de 55 a 65%, ou cerca de 60% e opcionalmente compreendendo SAG-M ou Optisol) são submetidas a uma solução diluente (por exemplo, qualquer solução descrita aqui ou na Tabela 3) antes de um método de inativação descrito aqui (por exemplo, um método onde a composição compreende GSH a cerca de 20 mM com cerca de 1 equivalentes de base e cerca de S-303 a 0,2 mM), seguido pela diminuição da concentração de extintor como descrito aqui (por exemplo, para menos do que cerca de 10 mM, ou menos do que cerca de 5 mM). Em algumas destas modalidades, a diminuição da concentração de extintor compreende a remoção da solução de tratamento (por exemplo, uma solução de tratamento diluída) seguido pela adição de uma solução aditiva final (por exemplo, SAG-M, AS-5, ou qualquer solução descrita acima ou na Ta

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65/108 bela 2) para fornecer, por exemplo, uma composição de célula vermelha sanguínea tendo um hematócrito na faixa de cerca de 50 a 70%, ou cerca de 55 a 65%, ou cerca de 60%). Em algumas modalidades, a concentração de íon de cloreto na composição de célula vermelha sanguínea é diluída para menos do que ou mais do que cerca de 150 mM, ou cerca de 120 mM, ou cerca de 100 mM, ou cerca de 90 mM, cerca de 80 mM, ou cerca de 70 mM, ou cerca de 60 mM, ou cerca de 50 mM, cerca de 40 mM, cerca de 30 mM, ou cerca de 20 mM, cerca de 10 mM, ou entre cerca de 25 e 250 mM, ou cerca de 40 e 100 mM, ou cerca de 50 e 75 mM, ou cerca de 60 e 70 mM, ou cerca de 65 mM antes da inativação. Em algumas modalidades, a quantidade (em volume) da solução diluente adicionada à solução de RBC é entre cerca de 0,2 e 2 vezes, ou cerca de 0,3 e 1,5 veze, ou cerca de 0,4 e 1 vez, ou cerca de 0,5 e 0,75 vez a quantidade da solução de RBC. Em algumas destas modalidades, a composição de célula vermelha sanguínea é diluída com uma solução diluente (por exemplo, qualquer solução descrita aqui ou na Tabela 3) para um nível de hematócrito na faixa de cerca de 30 a 50%, ou cerca de 35 a 45%, ou cerca de 40%.

[0091] Em algumas modalidades, a solução diluente referida aqui compreende um ou mais dos seguintes componentes: dextrose, adenina, manitol, citrato (por exemplo, citrato de sódio), ácido cítrico, fosfato (por exemplo, Na2HPO4 e/ou NaH2PO4) e cloreto (por exemplo, de cloreto de sódio). Em algumas modalidades, a concentração de dextrose da solução diluente e/ou a concentração final de dextrose na composição de RBC em seguida a diluição com a solução diluente está em uma concentração de cerca de 10 mM a cerca de 150 mM, ou cerca de 20 mM a cerca de 120 mM, ou cerca de 25 mM a cerca de 100 mM, ou cerca de 30 mM a cerca de 75 mM, ou cerca de 40 mM a cerca de 50 mM, ou cerca de 50 mM a cerca de 60 mM. Em algumas modalidades, a concentração de adenina da solução diluente e/ou a

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66/108 concentração final de adenina na composição de RBC em seguida a diluição com a solução diluente é de cerca de 0,5 mM a cerca de 5 mM, ou cerca de 0,75 mM a cerca de 3 mM, ou cerca de 1 mM a cerca de 2,5 mM. Em algumas modalidades, a concentração de manitol da solução diluente e/ou a concentração final de manitol na composição de RBC em seguida a diluição é de cerca de 10 mM a cerca de 150 mM, ou cerca de 20 mM a cerca de 120 mM, ou cerca de 25 mM a cerca de 100 mM, ou cerca de 30 mM a cerca de 75 mM, ou cerca de 40 mM a cerca de 60 mM, ou cerca de 25 mM a cerca de 35 mM. Em algumas modalidades, a concentração de citrato (por exemplo, citrato de sódio) da solução diluente e/ou a concentração final de citrato na composição de RBC em seguida a diluição com a solução diluente é de cerca de 5 mM a cerca de 100 mM, ou cerca de 10 mM a cerca de 75 mM, ou cerca de 15 mM a cerca de 50 mM, ou cerca de 15 mM a cerca de 35 mM, ou cerca de 20 mM a cerca de 30 mM. Em algumas modalidades, a concentração de fosfato (por exemplo, Na2HPO4 e/ou NaH2PO4) da solução diluente e/ou a concentração final de fosfato na composição de RBC em seguida a diluição com a solução diluente é de cerca de 1 mM a cerca de 150 mM, ou cerca de 2 mM a cerca de 100 mM, ou cerca de 3 mM a cerca de 75 mM, ou cerca de 4 mM a cerca de 50 mM, ou cerca de 5 mM a cerca de 25 mM, ou cerca de 10 mM a cerca de 20 mM. Em algumas modalidades, a concentração de cloreto da solução diluente e/ou em seguida a diluição com uma solução diluente, é menor do que ou maior do que cerca de 500 mM, ou cerca de 250 mM, ou cerca de 200 mM, ou cerca de 150 mM, ou cerca de 120 mM, ou cerca de 100 mM, ou cerca de 90 mM, ou cerca de 80 mM, ou cerca de 70 mM, ou cerca de 60 mM, ou cerca de 50 mM, ou cerca de 40 mM, ou cerca de 30 mM, ou cerca de 20 mM, cerca de 10 mM ou cerca de 25 a cerca de 250 mM, ou cerca de 40 a cerca de 100 mM, ou cerca de 50 a cerca de 75 mM, ou cerca de 60 a cerca de 70

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67/108 mM, ou cerca de 100 a cerca de 200 mM, ou cerca de 125 mM a cerca de 175 mM.

[0092] Em algumas modalidades, a solução diluente referida aqui e/ou a composição de RBC em seguida a diluição com uma solução diluente compreende dextrose a 10 mM a cerca de 150 mM (ou cerca de 35 mM a cerca de 65 mM), adenina a 0,5 mM a cerca de 5 mM (ou cerca de 0,75 mM a cerca de 3 mM), manitol a cerca de 10 mM a cerca de 150 mM (ou cerca de 25 mM a cerca de 75 mM), citrato a cerca de 10 mM a cerca de 75 mM (ou cerca de 15 mM a cerca de 50 mM) (por exemplo, citrato de sódio), fosfato a cerca de 3 mM a cerca de 75 mM (ou cerca de 5 mM a cerca de 25 mM) (por exemplo, Na2HPO4 e/ou NaH2PO4), e cloreto a cerca de 5 a cerca de 50 mM, ou (cerca de 10 a cerca de 25 mM).

[0093] Em algumas modalidades, as células vermelhas sanguíneas não embaladas são submetidas a uma solução diluente (por exemplo, qualquer solução descrita acima ou na Tabela 3) antes de um método de inativação descrito aqui, seguido pela diminuição da concentração de extintor como descrito aqui, em seguida tratadas com uma solução aditiva final (por exemplo, SAG-M, AS-5, ou qualquer solução descrita acima ou na Tabela 2) para fornecer uma composição de RBC adequada para uso (por exemplo, adequado para transfusão). Em algumas modalidades, a solução aditiva final pode ser qualquer solução aditiva descrita aqui, por exemplo, uma solução aditiva onde a concentração de cloreto (e/ou a concentração final de cloreto na composição de RBC em seguida a permuta , tal como antes da transfusão) é menor do que cerca de 500 mM, ou cerca de 250 mM, ou cerca de 200 mM, ou cerca de 150 mM, ou cerca de 100 mM, cerca de 75 mM, ou cerca de 50 mM, ou cerca de 25 mM, ou entre cerca de 25 e 250 mM, ou cerca de 40 e 100 mM, ou cerca de 50 e 75 mM, ou cerca de 60 e 70 mM, ou cerca de 100 e 200 mM, ou cerca de 125 mM e 175 mM, ou cerca de 150 mM.

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Tabela 3: Soluções Diluentes Exemplares

	DS 1	DS 2	DS 3	DS 4	DS 5	DS 6	DS 7	DS 8	DS 9	DS 10	DS 11	DS 12	DS 13
Dextrose (mM)	55	55	55	55	55	45,4	45,4	45,4	45,4	45,4	45,4	45,4
Adenina/Adenina HCl (mM)	1,3	1,3	1,3	1,3	1,3	1,3	1,3	1,3	1,3	1,3	1,3	1,3	1,3
Manitol (mM)	55	55	55	55	55	28,8			28,8	28,8	28,8	28,8	28,8
Diidrato de citrato de sódio ou anidroso (mM)	20	20				33,5	33,5	33,5	20	20	20	20	20
Na2HPO4 (mM)				20	15			33,5	12,7	3,5	16,2	20
NaH2PO4 (mM)						33,5	33,5		3,5	12,7			16,2
NaCl (mM)				15	20
Osmolalidade (mOsm)	180	178	128	177	179	287	243	215	227	179	174	181
pH	6,9	7,6- 8,0		8,61	8,38	6,28	6,29	8,77	7,48	6,63	8,62	8,7	7,5

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Métodos de Inativação Usando Células Vermelhas Sanguíneas Embaladas Reconstituídas [0094] Em algumas modalidades, células vermelhas sanguíneas embaladas (pRBCs) (por exemplo, células vermelhas sanguíneas tendo um hematócrito na faixa de cerca de 70 a 90%, ou cerca de 75 to 85%, ou cerca de 80%) são submetidas a uma solução de tratamento antes de conduzir o método de inativação descrito aqui (por exemplo, um método onde a composição compreende GSH a cerca de 20 mM com cerca de 1 equivalente de base e cerca de S-303 a 0,2 mM). Os exemplos de soluções de tratamento são mostrados na Tabela 4. Em algumas modalidades, a solução de tratamento (por exemplo, qualquer solução descrita na Tabela 4) é adicionada aos pRBCs antes da adição do extintor, o composto de inativação de patógeno, e qualquer base adicionada. Em algumas destas modalidades, a composição de pRBC é tratada com uma solução de tratamento resultando em células vermelhas sanguíneas não embaladas (por exemplo, células vermelhas sanguíneas tendo um hematócrito na faixa de cerca de 50 a 70%, ou cerca de 55 a 65%, ou cerca de 60%). Em algumas modalidades, (a) uma solução de tratamento é adicionada aos pRBCs, (b) um método de inativação descrito aqui (por exemplo, um método onde a composição compreende GSH a cerca de 20 mM com cerca de 1 equivalente de base e S-303 a cerca de 0,2 mM) é conduzido, e (c) a concentração do extintor é diminuída como descrito aqui (por exemplo, para menos do que cerca de 10 mM, ou menos do que cerca de 5 mM). Em algumas destas modalidades, a etapa (c) compreende a remoção da solução de tratamento e adição de uma solução aditiva final (por exemplo, qualquer solução descrita aqui, tal como SAG-M, AS-5 ou qualquer solução das Tabelas 2, 3, ou 4) para fornecer, por exemplo, uma composição de célula vermelha sanguínea tendo um hematócrito na faixa de cerca de 50 a 70%, ou cerca de 55 a 65%, ou cerca de

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60%. Em algumas destas modalidades, a concentração de íon de cloreto na composição de célula vermelha sanguínea antes e/ou durante a inativação é menor do que ou maior do que cerca de 150 mM, ou cerca de 120 mM, ou cerca de 100 mM, ou cerca de 90 mM, cerca de 80 mM, ou cerca de 70 mM, ou cerca de 60 mM, ou cerca de 50 mM, cerca de 40 mM, cerca de 30 mM, ou cerca de 20 mM, cerca de 10 mM, ou entre cerca de 25 e 250 mM, ou cerca de 40 e 100 mM, ou cerca de 50 e 75 mM, ou cerca de 60 e 70 mM, ou cerca de 65 mM.

[0095] Em algumas modalidades, a solução de tratamento referida aqui compreende um ou mais dos seguintes componentes: dextrose, adenina, manitol, citrato (por exemplo, citrato de sódio), ácido cítrico, fosfato (por exemplo, Na2HPO4 e/ou NaH2PO4) e cloreto (por exemplo, de cloreto de sódio). Em algumas modalidades, a concentração de dextrose da solução de tratamento e/ou a concentração de dextrose na solução aditiva em seguida a remoção da solução de tratamento na composição de RBC é de cerca de 10 mM a cerca de 150 mM, ou cerca de 20 mM a cerca de 120 mM, ou cerca de 25 mM a cerca de 100 mM, ou cerca de 30 mM a cerca de 75 mM, ou cerca de 40 mM a cerca de 50 mM, ou cerca de 50 mM a cerca de 60 mM. Em algumas modalidades, a concentração de adenina da solução de tratamento e/ou a concentração de adenina na solução aditiva em seguida a remoção da solução de tratamento na composição de RBC é de cerca de 0,5 mM a cerca de 5 mM, ou cerca de 0,75 mM a cerca de 3 mM, ou cerca de 1 mM a cerca de 2,5 mM. Em algumas modalidades, a concentração de manitol na solução de tratamento e/ou a concentração de manitol na solução aditiva em seguida a remoção da solução de tratamento na composição de RBC é de cerca de 10 mM a cerca de 150 mM, ou cerca de 20 mM a cerca de 120 mM, ou cerca de 25 mM a cerca de 100 mM, ou cerca de 30 mM a cerca de 75 mM, ou cerca de 40 mM a cerca de 60 mM. Em algumas modalidades, a concentração de citrato

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71/108 (por exemplo, citrato de sódio) na solução de tratamento e/ou a concentração de citrato na solução aditiva em seguida a remoção da solução de tratamento na composição de RBC é de cerca de 1 mM a cerca de 100 mM, ou cerca de 2 mM a cerca de 75 mM, ou cerca de 5 mM a cerca de 50 mM, ou cerca de 7,5 mM a cerca de 25 mM, ou cerca de 10 mM a cerca de 15 mM. Em algumas modalidades, a concentração de fosfato (por exemplo, Na2HPO4 e/ou NaH2PO4) na solução de tratamento e/ou a concentração de fosfato na solução aditiva em seguida a remoção da solução de tratamento na composição de RBC é de cerca de 1 mM a cerca de 150 mM, ou cerca de 2 mM a cerca de 100 mM, ou cerca de 3 mM a cerca de 75 mM, ou cerca de 4 mM a cerca de 50 mM, ou cerca de 5 mM a cerca de 25 mM, ou cerca de 10 mM a cerca de 20 mM. Em algumas modalidades, a concentração de cloreto na solução de tratamento e/ou a concentração de cloreto na solução aditiva em seguida a remoção da solução de tratamento na composição de RBC é de cerca de 250 mM, ou cerca de 200 mM, ou cerca de 150 mM, ou cerca de 120 mM, ou cerca de 100 mM, ou cerca de 90 mM, ou cerca de 80 mM, ou cerca de 70 mM, ou cerca de 60 mM, ou cerca de 50 mM, ou cerca de 40 mM, ou cerca de 30 mM, ou cerca de 20 mM, cerca de 10 mM, ou cerca de 25 a cerca de 250 mM, ou cerca de 40 a cerca de 100 mM, ou cerca de 50 a cerca de 75 mM, ou cerca de 60 a cerca de 70 mM, ou cerca de 100 a cerca de 200 mM, ou cerca de 125 mM a cerca de 175 mM.

[0096] Em algumas modalidades, a solução de tratamento e/ou a solução aditiva em seguida a remoção da solução de tratamento na composição de RBC compreende dextrose a 10 mM a cerca de 150 mM (ou cerca de 35 mM a cerca de 65 mM), adenina a 0,5 mM a cerca de 5 mM (ou cerca de 0,75 mM a cerca de 3 mM), manitol de cerca de 10 mM a cerca de 150 mM (ou cerca de 25 mM a cerca de 75 mM), citrato a cerca de 5 mM a cerca de 75 mM (ou cerca de 10 mM a cerca

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72/108 de 20 mM) (por exemplo, citrato de sódio), fosfato de cerca de 3 mM a cerca de 75 mM (ou cerca de 5 mM a cerca de 25 mM) (por exemplo, Na2HPO4 e/ou NaH2PO4), e cloreto a cerca de 5 a cerca de 100 mM, ou (cerca de 25 a cerca de 75 mM).

Tabela 4: Soluções e Tratamento Exemplares.

	Sol 1	Sol 2	Sol 3	Sol 4	Sol 5
Dextrose (mM)	45,4	45,4	45,4	45,4	45,4
Adenina/HCl de Adenina (mM)	1,3	1,3	1,3	1,3	1,3
Manitol (mM)	55	44,5	44,5	44,5	30
Diidrato de Citrato de Sódio ou anidroso (mM)		12	12	12
Na2HPO4 (mM)					15
NaH2PO4 (mM)
NaCl (mM)	70	60	60	60	70
Osmolalidade (mOsm)
pH (ajustado com ácido cítrico)			7	6,5	6,5

Avaliação da Eficácia do Método [0097] Além de comparar a inativação de log como descrito acima, a eficácia dos métodos de extinção melhorados pode ser avaliada por vários outros métodos, como descrito na Publicação de Patente US No. 2006/0115466, o teor da qual está desse modo incorporado por referência em sua totalidade. Por exemplo, os métodos de extinção podem ser avaliados avaliando-se a modificação da composição de célula vermelha sanguínea, em termos da função, morfologia, e o estado de hidratação das células vermelhas sanguíneas, e em termos da reatividade das células vermelhas sanguíneas tratadas com o sistema

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73/108 imune, tal como com anticorpos. Se a composição de célula vermelha sanguínea tratada é pretendida para uso humano, tal como infusão, os métodos de extinção substancialmente não deveriam danificar a função da célula vermelha sanguínea (por exemplo, através da desidratação). A falta de um efeito substancialmente danificante na função de célula vermelha sanguínea pode ser medida por métodos conhecidos na técnica para testar a função da célula vermelha sanguínea. Em particular, os níveis de desidratação podem ser medidos, por exemplo, por hematócrito (Volume de Célula Embalada, PCV), fragilidade osmótica, concentração de hemoglobina corpuscular média (MCHC), percentual de hemólise, e ectacitometria. Os níveis de outros indicadores de função, tal como ATP total (5'-trifosfato de adenosina), 2,3-DPG total (2,3-difosfoglicerol) ou potássio extracelular podem ser medidos, e comparados com um controle não tratado. Adicionalmente, o pH intracelular e extracelular, hemoglobina, consumo de glicose e produção de lactato podem ser medidos. Os métodos melhorados da presente invenção podem ser comparados com as condiçoes previamente descritas de tratamento na Publicação de Patente US No. 2006/0115466 (por exemplo, glutationa a 20 mM completamente extinta (2 equivalentes de base) em combinação com a mistura de S-303/célula vermelha sanguínea sem redução na concentração de extintor em seguida a incubação descrita aqui).

[0098] Em algumas modalidades da presente invenção, as células vermelhas sanguíneas dos métodos e composições descritos aqui têm mínimo ou nenhum dano em seguida ao tratamento (por exemplo, desidratação, hemólise, etc.). Em algumas modalidades, as células vermelhas sanguíneas da mistura resultante compreendendo a composição de célula vermelha sanguínea, extintor, composto de inativação de patógeno e qualquer base adicionada (antes ou após a redução na concentração de extintor) têm menos do que 4%, ou menos do que

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3%, ou menos do que 2%, menos do que 1% de hemólise, ou menos do que 0,5% de hemólise. Em algumas modalidades, as células vermelhas sanguíneas da mistura resultante têm menos do que 4%, ou menos do que 3%, ou menos do que 2%, ou menos do que 1%, ou menos do que 0,5% de hemólise em um tempo de cerca de 10 dias a 4oC, ou cerca de 28 ou 42 dias a 4oC, ou cerca de 42 dias a 4oC em seguida a redução na concentração do extintor (por exemplo, glutationa).

[0099] Em algumas modalidades, as células vermelhas sanguíneas da mistura resultante compreendendo a composição de célula vermelha sanguínea, extintor, composto de inativação de patógeno e qualquer base adicionada (antes ou após a redução na concentração de extintor) têm mais do que 50%, ou mais do que 55%, ou mais do que 60%, ou mais do que 65% de Volume de Célula Embalada (PCV). Em algumas modalidades, as células vermelhas sanguíneas da mistura resultante têm mais do que 50%, ou mais do que 55%, ou mais do que 60%, ou mais do que 65% de Volume de Célula Embalada (PCV) em um tempo de cerca de 10 dias a 4oC, ou cerca de 28 ou 42 dias a 4oC, ou cerca de 42 dias a 4 oC em seguida a redução na concentração do extintor (por exemplo, glutationa).

[00100] Em algumas modalidades, as células vermelhas sanguíneas da mistura resultante compreendendo a composição de célula vermelha sanguínea, extintor, composto de inativação de patógeno e qualquer base adicionada (antes ou após a redução na concentração de extintor) têm uma Fragilidade Corpuscular Média (MCF; osmolaridade na qual 50% de hemólise ocorrem) maior do que 130, ou maior do que 135, ou maior do que 140, ou maior do que 145, ou maior do que 150, ou maior do que 155. Em algumas modalidades, as células vermelhas sanguíneas da mistura resultante têm uma Fragilidade Corpuscular Média (MCF) maior do que 130, ou maior do que 135, maior

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75/108 do que 140, ou maior do que 145, ou maior do que 150, ou maior do que 155 em um tempo de cerca de 10 dias a 4 oC, ou cerca de 28 ou 42 dias a 4 oC, ou cerca de 42 dias a 4 oC em seguida a redução na concentração do extintor (por exemplo, glutationa).

[00101] Os métodos para determinar ATP, 2,3-DPG, glicose, hemoglobina, hemólise, e potássio estão disponíveis na técnica e descritos aqui na seção experimental. Vide, por exemplo, Davey et al., Transfusion, 32:525-528 (1992), a descrição do qual está incorporada aqui. Os métodos para determiner a função da célula vermelha sanguínea estão também descritos em Greenwalt et al., Vox Sang, 58:94-99 (1990); Hogman et al., Vox Sang, 65:271-278 (1993); e Beutler et al., Blood, Vol. 59 (1982) as descrições dos quais estão incorporadas aqui por referência. Por exemplo, ATP total e 2,3-DPG total podem ser medidos usando um kit Sigma ATP ou kit 2,3-DPG (Sigma, St. Louis, Mo.). O kit ATP pode ser usado em seguida ao procedimento de Sigma No. 366UV, a descrição do qual está desse modo incorporada por referência. ATP total pode também ser medido usando um ensaio enzimático com base em luciferase ou um protocolo descrito por Beutler (1984). Os níveis de potássio extracelular podem ser medidos usando um Analisador de K+/Na+ Ciba Corning Modelo 614 (Ciba Corning Diagnostics Corp., Medford, MA). O pH extracelular pode ser medido por centrifugação das células a 4 oC durante 15 minutos em 12.000 x g e removendo o sobrenadante, para que o pH possa ser medido usando um medidor de pH padrão em temperatura ambiente (por exemplo, Beckman, Epoxy Calomel electrode). Para o pH intracelular, o pélete restante pode ser tamponado no tubo centrífugo e armazenado em cerca de -80 oC durante pelo menos 2 horas. Isto então pode ser lisado pela adição de água deionizada. A amostra lisada pode ser bem misturada e o pH da solução pode ser medido ou em temperatura ambiente usando um medidor de pH padrão ou em temperatura ambiente usan

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76/108 do um Analisador de Gás Sanguíneo Ciba Corning Model 238 (Ciba Corning Diagnostics Corp., Medford, MA). As medições podem ser feitas um pouco após o tratamento e como uma função de armazenamento pós-tratamento, por exemplo, armazenamento durante até 42 dias. Os métodos da presente invenção fornecem uma composição de célula vermelha sanguínea onde a hemólise das células vermelhas sanguíneas tratadas é menor do que 3% após 28 dias de armazenamento, mais preferivelmente menor do que 2% após 42 dias de armazenamento, e mais preferivelmente menor do que ou igual a cerca de 1% após 42 dias de armazenamento a 4 °C. Em algumas modalidades é fornecida uma composição de célula vermelha sanguínea (por exemplo, uma composição de célula vermelha sanguínea usando quaisquer dos métodos descritos aqui) onde o nível de ATP total pode ser mais elevado quando comparado com uma composição de célula vermelha sanguínea tratada usando glutationa ácida a 2 mM e S-303 a 0,2 mM. Em algumas modalidades, os métodos de extinção descritos aqui fornecem composições de célula sanguínea vermelha tendo níveis de ATP que são cerca de 20%, também 30%, também 40% ou cerca de 50% mais elevados quando comparados com as composições de métodos usando glutationa ácida a 2 mM e S-303 a 0,2 mM. Em algumas modalidades, o nível mais elevado de ATP é mantido após 7, 14, 21, 28, 35, ou 42 dias de armazenamento. Em algumas modalidades, o nível mais elevado de ATP diminui durante o armazenamento.

[00102] Em algumas modalidades da presente invenção, os métodos e composições descritos aqui incluem as composições de célula sanguínea vermelha onde as células vermelhas sanguíneas têm um número reduzido de reações colaterais indesejadas do composto de inativação de patógeno (por exemplo, ligação do composto de inativação de patógeno à superfície de RBC). Em algumas modalidades, a

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77/108 reação colateral é a modificação da superfície das células vermelhas sanguíneas pelo composto de inativação de patógeno. A redução na modificação de células vermelhas sanguíneas nos métodos da presente invenção pode ser avaliada por vários ensaios conhecidos na técnica, tais como aqueles descritos na Publicação de Patente US No. 2006/0115466, o teor da qual está desse modo incorporado por referência. A quantificação de acridina ligada à superfície de RBC pode também ser determinada usando um ensaio citométrico de fluxo imune ativado por fluorescência sensível (IFC) descrito aqui.

[00103] Com respeito aos ensaios de detecção por fluorescência, os métodos de extinção da presente invenção, quando comparados com o mesmo tratamento sem o uso de base (por exemplo, métodos usando neutralização de glutationa comparado com os mesmos métodos usando glutationa não neutralizada), podem resultar na redução da fluorescência média em pelo menos 10%, também pelo menos 25%, também pelo menos 50%, também pelo menos 75%, ou pelo menos 90%. Por exemplo, os métodos de extinção da presente invenção usando quaisquer das composições descritas com o uso de base (por exemplo, uma composição de célula vermelha sanguínea compreendendo glutationa a cerca de 15-25 mM, cerca de 0,5 a 1,5 equivalente de base, e cerca de S-303 a 0,2 mM) podem resultar em um nível mais baixo de fluorescência média quando comparado com uma composição idêntica, porém sem o uso de base (por exemplo, uma composição de célula vermelha sanguínea compreendendo glutationa a cerca de 15-25 mM e cerca de S-303 a 0,2 mM sem base).

[00104] O nível de composto de inativação de patógeno ligado à superfície de RBC para os métodos de extinção e composições da presente invenção também podem ser medidos em termos de capacidade de ligação de anticorpo (ABC; o número de moléculas do composto de inativação de patógeno ou derivado do mesmo per célula

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78/108 vermelha, como determinado pelo uso de contas de calibração de Bangs Laboratories, Inc; Fishers, IN; vide os Exemplos 5 e 9) que envolve um anticorpo antiacridina monoclonal de camundongo conjugado para aloficocianina (APC) e um citômetro de fluxo FACS-Caliber (BD Biosciences). Em algumas modalidades de quaisquer dos métodos e composições da presente invenção, os RBCs têm um valor de ABC menor do que cerca de 75.000,ou menor do que cerca de 60.000,ou menor do que cerca de 52.500,ou menor do que cerca de 47.500,ou menor do que cerca de 42.500,ou menor do que cerca de 37.500,ou menor do que cerca de 32.500,ou menor do que cerca de 27.500, ou menor do que cerca de 70.000,ou menor do que cerca de 55.000,ou menor do que cerca de 50.000,ou menor do que cerca de 45.000,ou menor do que cerca de 40.000,ou menor do que cerca de 35.000,ou menor do que cerca de 30.000,ou menor do que cerca de 25.000. Em algumas modalidades, os RBCs têm um valor de ABC médio dentre cerca de 10.000 e 80.000, ou entre cerca de 20.000 e 70.000, ou entre cerca de 25.000 e 70.000, ou entre cerca de 25.000 e 60.000, ou entre cerca de 30.000 e 50.000, ou entre cerca de 35.000 e 45.000. Em al gumas modalidades dos métodos descritos aqui, quando comparados com tal tratamento similar com o extintor e base (por exemplo, glutationa neutralizada), pode resultar em um valor de ABC menor do que 90%, também menor do que 75%, também menor do que 65%, também menor do que 55%, também menor do que 45%, também menor do que 35%, também menor do que 25%, ou menor do que 10% quando comparado com os métodos idênticos usando uma composição de RBC que não é tratada com base (por exemplo, glutationa que não está neutralizada).

[00105] Os métodos de extinção da invenção podem também ser comparados com os métodos existentes determinando-se o nível de modificação de ácidos nucleicos em uma amostra. Tipicamente, uma

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79/108 composição de célula vermelha sanguínea pode conter leucócitos, e o ácido nucleico dos leucócitos pode ser isolado. Um composto de inativação de patógeno tendo um isótopo radioativo que, sob reação do composto com ácido nucleico, permanecerá ligado ao ácido nucleico. Isto pode ser usado para avaliar a quantidade de composto reagido com ácido nucleico para uma variedade de métodos de extinção, e fornece uma medição que pode estar diretamente correlacionada com a inativação de leucócito esperada. O número de aduções de S-303 formadas por 1.000 pares de base de ácido nucleico pode ser usado como um modelo para avaliar o impacto esperado dos vários métodos na inativação de patógeno. Alternativamente, uma quantidade adequada de um patógeno pode ser adicionada a uma composição de célula vermelha sanguínea e o ácido nucleico do patógeno pode ser isolado após o tratamento. Entretanto, neste caso a amostra precisa ser leucorreduzida tal que os níveis de quaisquer leucócitos residuais não interfira com a medição do ácido nucleico de patógeno.

[00106] Além de fornecer inativação de patógeno adequada ao mesmo tempo em que reduzindo os níveis de reações colaterais indesejadas (por exemplo, ligação do composto de inativação de patógeno à superfície de RBC que pode levar a uma resposta imune indesejada) e desidratação, os métodos de extinção da presente invenção também fornecem, em pelo menos algumas modalidades, uma redução na concentração de espécies eletrofílicas reativas após inativação de patógeno. Se as composições de célula sanguínea vermelha são pretendidas para infusão, é importante que o nível de espécies eletrofílicas reativas seja tão baixo quanto possível, preferivelmente essencialmente não mais detectável. A presença das espécies eletrofílicas reativas pode ser determinada usando os métodos disponíveis na técnica, tal como métodos cromatográficos incluindo cromatografia líquida / espectrometria de massa (LC-MS-MS). Além disso, a atividade residual

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80/108 de uma amostra pode ser avaliada avaliando-se sua capacidade de reagir com um resíduo de guanina de um ácido nucleico, tal como usando o ensaio de alquilador geral descrito por Mattes (Mattes, WR, Anal. Biochem. 1992 Oct; 206(1):161-7). Neste ensaio, os RBCs são extraídos após um tempo de incubação adequado com o composto de inativação de patógeno e extintor. Qualquer composto de inativação de patógeno residual, bem como o extintor e outras espécies pequenas, são separados das proteínas. Estas espécies são em seguida incubadas com DNA de filamento duplo (ds) sintetizado com resíduos de guanina 8-3H. O composto de inativação de patógeno residual reage com ds DNA na posição N7 de guanina, que acidifica o resíduo de 8-H e libera o 3H na solução, onde pode ser isolado e medido. A quantidade de trítio liberado pode ser quantificada, e tem uma correlação de 1:1 com a quantidade de alquilador residual presente nas amostras extraídas testadas. O nível de espécies eletrofílicas como determinado por estes métodos pode ser avaliado usando os métodos melhorados da invenção e comparando com métodos conhecidos.

[00107] Em algumas modalidades de cada dos métodos descritos aqui, o método também compreende a etapa de reduzir a concentração de um composto na mistura, onde o composto é selecionado do grupo consistindo no composto de inativação de patógeno e um produto de degradação do composto de inativação de patógeno. Em algumas modalidades, o método compreende a etapa de reduzir a concentração do composto de inativação de patógeno na mistura. Em algumas modalidades, o método compreende a etapa de reduzir a concentração das espécies eletrofílicas na mistura. A concentração do composto de inativação de patógeno em um material biológico, tal como um produto de sangue, pode ser reduzida após o tratamento, por exemplo, por absorção em um processo de remoção por fluxo ou batelada. Os métodos e dispositivos que podem ser usados são descritos

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81/108 nas Patentes dos Estados Unidos 6.544.727; 6.331.387; 6.951.713; e 7.037.642; e Pedidos de Patente US 2002/0192632 (abandonado) e 2001/0009756 (abandonado), as descrições de cada dos estão incorporadas aqui por referência em sua totalidade. Consequentemente, em algumas modalidades, a concentração do composto de inativação de patógeno é reduzida contatando-se a mistura com um meio de absorção compreendendo partículas absorventes tendo uma afinidade com o composto de inativação de patógeno. Em algumas modalidades, o sistema de absorção seria configurado para remover o composto de inativação de patógeno em um processo de batelada. Em algumas modalidades, o composto de inativação de patógeno não é reduzido utilizando-se um dispositivo de absorção de composto. Em algumas modalidades, a concentração do composto de inativação de patógeno na mistura é reduzida lavando-se as células vermelhas sanguíneas usando técnicas conhecidas na técnica. Em algumas modalidades, a concentração do composto de inativação de patógeno na mistura é reduzida removendo-se um pouco ou toda a solução de tratamento (por exemplo, SAG-M, AS-5, ou qualquer solução descrita nas Tabelas 2, 3, e/ou 4) por métodos descritos aqui e/ou conhecidos na técnica (por exemplo, usando centrífugas e dispositivos de expressão ou centrífuga e expressores combinados tal como TACSI feito por Terumo®). Em algumas modalidades, a concentração do composto de inativação de patógeno na mistura é reduzida removendo-se um pouco ou toda a solução de tratamento (por exemplo, SAG-M, AS-5, ou qualquer solução descrita nas Tabelas 2, 3, e/ou 4), seguido por adição de uma solução aditiva (por exemplo, SAG-M, AS-5, ou qualquer solução descrita na Tabela 2) à mistura. Em algumas modalidades, a concentração do composto de inativação de patógeno é reduzida simultaneamente com uma redução na concentração do extintor.

Composições de Sangue Tratado

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82/108 [00108] Em algumas modalidades, a invenção também fornece composições de célula sanguínea vermelha resultante de cada dos métodos de tratamento descrito aqui. Em algumas modalidades, a invenção também fornece composições de célula sanguínea vermelha preparáveis por cada dos métodos de tratamento descritos aqui. Em um aspecto, a invenção fornece uma composição compreendendo a) células vermelhas sanguíneas, onde as células vermelhas sanguíneas covalentemente reagiram com um grupo eletrofílico de um composto de inativação de patógeno; e b) um extintor compreendendo um grupo tiol que é capaz de reagir com o composto de inativação de patógeno; onde a composição é adequada para infusão em seres humanos após armazenamento de 28 ou 42 dias a 4 oC.

[00109] Em algumas modalidades de cada dos métodos e composições descritos aqui, as células vermelhas sanguíneas na composição de célula vermelha sanguínea são células sanguíneas de mamífero. Por exemplo, as células vermelhas sanguíneas podem ser de roedores (por exemplo, camundongos ou rato), canina, lagomorfo (por exemplo, coelho), primata não humano (por exemplo, chimpanzé), ou células vermelhas sanguíneas humanas. Por exemplo, em algumas modalidades, as células vermelhas sanguíneas são humanas. Em algumas modalidades, as células vermelhas sanguíneas foram leucorreduzidas. Em algumas outras modalidades, as células vermelhas sanguíneas não foram leucorreduzidas. Em algumas modalidades, há uma possibilidade que a composição compreendendo células vermelhas sanguíneas esteja contaminada com um patógeno. Em algumas modalidades, a composição de célula vermelha sanguínea está contaminada com um patógeno. Em algumas modalidades, pelo menos 1 log, ou pelo menos 2 logs, ou pelo menos 3 logs, ou pelo menos 4 logs de patógeno na composição são inativados, se presentes.

[00110] Em algumas modalidades, a invenção abrange composi

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83/108 ções de célula sanguínea vermelha onde as células vermelhas sanguíneas foram modificadas com um composto de inativação de patógeno (por exemplo, S-303), como descritos aqui. Em algumas modalidades, as composições de célula sanguínea vermelha produzidas pelo tratamento dos métodos compreendem os produtos de degradação do composto de inativação de patógeno (por exemplo, o produto de reação do extintor com o composto de inativação de patógeno). Em algumas modalidades, a modificação é a reação do grupo eletrofílico de um composto de inativação de patógeno com a superfície da célula vermelha sanguínea. Em algumas modalidades, o composto de inativação de patógeno está covalentemente ligado à superfície de célula vermelha sanguínea. Em algumas modalidades, o composto de inativação de patógeno está covalentemente ligado a uma ou mais proteínas na superfície da célula vermelha sanguínea. Em algumas modalidades, a modificação é um grupo nucleofílico da célula vermelha sanguínea reagida com o grupo eletrofílico do composto de inativação de patógeno, onde o grupo eletrofílico é um grupo mostarda e o grupo nucleofílico substituiu um ou mais dos átomos de cloro do grupo mostarda. Em algumas modalidades, o composto de inativação de patógeno é não covalentemente ligado a superfície da célula vermelha sanguínea. Em algumas modalidades as composições de RBC têm um valor de ABC médio menor do que 75.000, ou menor do que 70.000, ou menor do que 60.000, ou menor do que 55.000, ou menor do que

52.500, ou menor do que 50.000, ou menor do que 47.500, ou menor do que 45.000, ou menor do que 42.500, ou menor do que 40.000, ou menor do que 37.500, ou menor do que 35.000, ou menor do que

32.500, ou menor do que 30.000, ou menor do que 27.500, ou menor do que 25.000. Em algumas modalidades, os RBCs têm um valor de ABC médio dentre cerca de 10.000 e 80.000, ou entre cerca de 20.000 e 70.000, ou entre cerca de 25.000 e 70.000, ou entre cerca de 25.000

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84/108 e 60.000, ou entre cerca de 30.000 e 50.000, ou entre cerca de 35.000 e 45.000.

[00111] Em algumas modalidades, as composições de célula sanguínea vermelha compreendem níveis reduzidos de modificação da superfície das células vermelhas sanguíneas pelo composto de inativação de patógeno, relativo às células vermelhas sanguíneas produzidas por outros métodos envolvendo o tratamento com o composto de inativação de patógeno. Em algumas modalidades, as composições de célula sanguínea vermelha produzidas pelos tratamentos dos métodos descritos aqui compreendem uma quantidade reduzida de composto de inativação de patógeno compreendendo o grupo eletrofílico reativo após a conclusão do tratamento, relativo a uma composição de células vermelhas sanguíneas produzida por outro método envolvendo o tratamento com o composto de inativação de patógeno (por exemplo, um método sem extintor e/ou base suficiente adicionados à mistura de reação, um método no qual nenhum extintor e/ou base é adicionado à mistura de reação, e/ou um tratamento em um pH mais baixo). Em algumas modalidades, a quantidade de composto de inativação de patógeno compreendendo o grupo eletrofílico reativo na composição foi reduzida em cerca de 10%, cerca de 25%, cerca de 50%, cerca de 75%, cerca de 90%, cerca de 95%, ou cerca de 99%, relativo a uma composição tratada por outro método envolvendo o composto de inativação de patógeno (por exemplo, um método sem extintor e/ou base suficientes adicionados à mistura de reação, um método no qual nenhum extintor e/ou base é adicionado à mistura de reação, e/ou tratamento em um pH mais baixo).

[00112] Em algumas destas modalidades, a composição de célula vermelha sanguínea compreende composto extintor residual (por exemplo, glutationa). Em algumas modalidades, a composição compreende uma concentração de extintor suficientemente baixa para

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85/108 manter a vitalidade de RBC e período de vida e evita a desidratação de célula vermelha sanguínea e/ou fragilidade osmótica reduzida durante o armazenamento. Em algumas modalidades, a composição compreende uma concentração de extintor que é suficientemente mais baixa do que uma concentração de extintor previamente usada na composição. Em algumas modalidades, a concentração mais elevada de extintor previamente usado diminui a vitalidade de RBC e período de vida e/ou aumenta a desidratação de célula vermelha sanguínea e diminui a fragilidade osmótica durante o armazenamento, ao mesmo tempo em que a concentração mais baixa é suficientemente menor do que uma concentração de extintor previamente usada na composição. Em algumas modalidades, a concentração do extintor na composição é menor do que cerca de 25 mM, menor do que cerca de 20 mM, menor do que cerca de 15 mM, menor do que cerca de 10 mM, menor do que cerca de 8 mM, menor do que cerca de 6 mM, menor do que cerca de 5 mM, menor do que cerca de 4 mM, menor do que cerca de 3 mM, menor do que cerca de 2 mM, ou do que cerca de 1 mM. Em algumas modalidades, a concentração do extintor na composição é na faixa de cerca de 1 mM a 20 mM, cerca de 2 mM a 15 mM, cerca de 3 mM a 10 mM, cerca de 4 mM a 8 mM, ou cerca de 5 mM a 6 mM.

[00113] Em algumas modalidades, a composição compreende uma solução aditiva (por exemplo, uma solução descrita na Tabela 2, ou uma solução compreendendo qualquer combinação dos componentes descritos na Tabela 2). Em algumas modalidades, a composição compreende cloreto de sódio, adenina, glicose, fosfato, e/ou manitol. Em algumas modalidades, a concentração final de íon de cloreto na composição de RBC (por exemplo, antes da transfusão) é menor do que cerca de 500 mM, ou cerca de 250 mM, ou cerca de 200 mM, ou cerca de 150 mM, ou cerca de 100 mM, cerca de 75 mM, ou cerca de 50 mM, ou cerca de 25 mM, ou entre cerca de 25 e 250 mM, ou cerca de

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86/108 e 100 mM, ou cerca de 50 e 75 mM, ou cerca de 60 e 70 mM, ou cerca de 100 e 200 mM, ou cerca de 125 mM e 175 mM, ou cerca de 150 mM.

[00114] Em algumas modalidades, a composição é adequada para infusão em um paciente (por exemplo, um ser humano) após cerca de 2 dias, ou cerca de 5 dias, ou cerca de 10 dias, ou cerca de 15 dias, ou cerca de 20 dias, ou cerca de 28 dias, ou cerca de 35 dias, ou cerca de 42 dias de armazenamento a 4 oC.

[00115] Em algumas destas modalidades, a composição compreende a) células vermelhas sanguíneas que são covalentemente reagidas com um grupo eletrofílico de um composto de inativação de patógeno (por exemplo, S-303) na superfície celular e i) tem um Volume de Célula Embalada (PCV) maior do que 60%, e/ou ii) tem uma capacidade de ligação de anticorpo média (ABC) dentre cerca de 25.000 e 70.000 (ou cerca de 35.000 e 45.000) e b) um extintor de glutationa em uma concentração de menor do que cerca de 8 mM (ou menor do que 6 mM, ou menor do que cerca de 2 mM). Em algumas modalidades, pelo menos 3 logs (ou pelo menos 1 log) de um patógeno é inativado, se presente. Em algumas modalidades, a composição é adequada para infusão em seres humanos até 28 ou 42 dias de armazenamento a 4°C.

Kits [00116] Além dos métodos melhorados de extinção, a presente invenção fornece kits descartáveis para o processamento de uma composição de célula vermelha sanguínea, onde o processamento pode ser feito manualmente ou automaticamente. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece kits compreendendo o composto de inativação de patógeno, extintor, e/ou base usados em cada dos métodos descritos aqui. Em algumas modalidades, o kit fornece solução fresca (tal como tampão para ressuspensão das células) para uso em segui

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87/108 da a diminuição da concentração de extintor descrito aqui.

[00117] Em algumas modalidades, o kit compreende S-303, incluindo qualquer sal do mesmo e glutationa neutralizada, incluindo qualquer sal do mesmo. S-303 pode estar na forma sólida ou em solução. Similarmente, a glutationa neutralizada pode estar na forma sólida ou em solução. Estes sólidos ou soluções podem também compreender excipientes, adjuvantes, diluentes, ou estabilizadores aceitáveis. Em algumas modalidades, S-303 é o sal de cloridrato e a glutationa neutralizada é neutralizada com cerca de 1 equivalente de hidróxido de sódio. Em algumas modalidades, S-303 e glutationa neutralizada estão na forma sólida e o kit também compreende uma solução adequada para dissolver o S-303 e uma solução adequada para dissolver a glutationa neutralizada. Em algumas modalidades, a invenção fornece um kit compreendendo um composto de inativação de patógeno, um extintor e uma solução para dissolver o extintor, onde a solução neutraliza ou parcialmente neutraliza o extintor. Os métodos e kits descritos aqui abrangem qualquer formulação farmacêutica adequada do composto de inativação de patógeno e extintor, que pode ser formulada como uma mistura ou separadamente. As formulações farmaceuticamente aceitáveis são conhecidas por aqueles versados na técnica, e os exemplos de excipientes, adjuvantes, diluentes ou estabilizadores adequados podem ser encontrados, por exemplo, em Gennaro, ed., Remington’s The Science e Practice of Pharmacy, 20a edição, Lippincott Williams &Wilkins. A invenção também inclui as composições resultantes dos métodos descritos acima, compreendendo as células vermelhas sanguíneas, um composto de inativação de patógeno e extintor como descrito acima, onde a composição está em uma faixa de pH adequada para efetuar a extinção melhorada do composto de inativação de patógeno.

[00118] Em outro aspecto, a invenção fornece um kit útil, por exem

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88/108 plo, para tratar composições de célula sanguínea vermelha para inativar patógenos, compreendendo um composto de inativação de patógeno compreendendo um ligante de ligação de ácido nucleico e um grupo funcional que é, ou que forme, um grupo eletrofílico (incluindo qualquer sal do mesmo) um extintor compreendendo um grupo tiol (incluindo qualquer sal do mesmo), e cerca de 0,75 a cerca de 1,25 equivalente de base, onde um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar do extintor no kit. Em algumas modalidades, o kit compreende cerca de 1 equivalente de uma base adequada.

[00119] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um kit para tratar composições de célula sanguínea vermelha para inativar patógenos, compreendendo um ligante de ligação de ácido nucleico e um grupo funcional que é, ou que forme, um grupo eletrofílico (por exemplo, S-303), incluindo qualquer sal do mesmo, um extintor neutralizado compreendendo um grupo tiol (por exemplo, glutationa neutralizada), incluindo qualquer sal do mesmo, e opcionalmente solução fresca (tal como tampão para ressuspensão das células) para uso em seguida à diminuição da concentração de extintor descrita aqui. Em algumas modalidades, a solução é uma solução aditiva, solução diluente, e/ou a solução de tratamento descrita aqui (por exemplo, SAG-M, AS-5, ou qualquer solução descrita acima ou nas Tabelas 2, 3, e/ou 4).

Exemplos, Materiais, & Métodos [00120] A invenção é também ilustrada pelos seguintes exemplos não limitantes.

Exemplo 1: Preparação do Organismo

Exemplos, Materiais, & Métodos [00121] As cepas bacterianas e virais usadas para estes estudos foram isolados clínicos obtidos de California Department of Health Services ou de American Type Culture Collection.

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89/108 [00122] Bactérias: As matérias-primas de trabalho congeladas de bactérias foram inoculadas em um frasco de 500 mL contendo uma mistura de 50% de meios de extrato de levedura sem glicose adicionada e 50% de soro bovino fetal. Os frascos foram incubados durante a noite em um banho de água com agitação ajustado a 37 ^oC. As bactérias gram positivas foram cravadas no produto de sangue diretamente da cultura durante a noite. As culturas durante a noite de bactérias gram negativas foram também subcultivadas por uma diluição de 1:1000 em meio de cultura fresco e incubadas como acima até que elas alcançassem a fase de log como determinado por densidade óptica. Este crescimento da fase de log foi reforçado no produto de sangue para experimentos de PI.

[00123] Vírus: As matérias-primas virais livres de células foram preparadas usando as linhas celulares apropriadas para cada vírus. Estas matérias-primas foram congeladas a -80 ^oC até que elas fossem descongeladas e reforçadas diretamente no produto de sangue para experimentos de PI.

Exemplo 2: Preparação de Unidades de RBC [00124] O sangue foi recebido em Cerus como unidades de 450 mL ou 500 mL de sangue total ou no dia de coleta ou até 3 dias após a coleta. Na maioria dos casos o sangue total foi leucofiltrado antes de ser processado em unidades de RBC. As unidades ocasionais não podem ser sucessivamente leucofiltradas (por exemplo, o sangue de doadores com características de foice) e estas unidades foram usadas sem a leucofiltração para estudos de PI de organismos que não são conhecidos por sobreviver dentro de células brancas do sangue.

[00125] Após a leucofiltração, o sangue foi centrifugado e o plasma foi expresso. A solução de RBC aditiva desejada, tal como AS-3 (Nutricel), foi em seguida adicionada e a unidade de RBC resultante foi usada imediatamente ou armazenada a 4 ^oC até o uso.

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Exemplo 3: Inativação de Patógeno (PI) [00126] Os processos de PI envolvem a inoculação de unidades de RBC com uma cultura do organismo a ser testado. O título de entrada alvo típico de organismos nas unidades de RBC foi aproximadamente 106 cfu ou pfu/mL de RBC. Na maioria dos casos o volume do organismo (incluindo qualquer meio de cultura) foi aproximadamente 1% do volume da unidade de RBC e não foi tipicamente maior do que 10%. Para avaliar a inativação de níveis menores, mais fisiologicamente relevantes, os níveis de bactérias, consumos de 10 a 105 cfu/unidade foram usados. Para estudos de consumo de nível baixo duas unidades de RBC foram misturadas, reforçadas, então divididas em uma unidade de Teste que foi tratada como descrito aqui e uma unidade de Controle a qual somente o extintor (por exemplo, GSH) foi adicionado (nenhum patógeno inativador, por exemplo, S-303) e que foi mantida sob as mesmas condições de temperatura como a unidade de Teste.

[00127] Após adição do organismo na unidade de RBC, a unidade foi misturada agarrando-se as terminações do recipiente e movimentando-se as extremidades 10 vezes em um movimento de figura oito, ou de pedal de bicicleta.

[00128] Os RBCs contaminados foram em seguida transferidos para o recipiente de mistura do aparelho descartável do processo de PI de RBC. O aparelho consiste em uma série de recipientes plásticos e orifícios conectados por tubagem plástica. O recipiente de mistura foi um recipiente plástico PL1813 de capacidade de 600-mL de orifício dual. Conectado a cada dos orifícios estava um aparelho de tubagem Y com filtros pediátricos Luer-adaptados presos a uma sonda. A sonda inutilizada em um orifício se conecta ao outro recipiente plástico PL1813 de capacidade de 600 mL (Recipiente de Incubação). A sonda inutilizada restante foi a linha usada para conectar a unidade de RBC original.

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91/108 [00129] As soluções de dosagem foram preparadas e adicionadas às unidades como segue: uma solução de Glutationa a 600 mM (GSH) com 1 equivalente de NaOH foi preparada dissolvendo-se 2,8 g de GSH em ~12 mL de 0,9% de salina e 0,9 mL de NaOH a 10 N. O volume apropriado de solução de GSH foi extraído em uma seringa de capacidade de 20 mL. O volume usado foi tipicamente 10 mL de solução de GSH por 280 mL de RBC, mais 2 mL de perda de cepa para gerar GSH a 20 mM na unidade de RBC dosada. A seringa contendo GSH foi presa ao recipiente de mistura usando a sonda filtrada que compartilha um ajuste de Y com a sonda conectada ao recipiente de incubação. A unidade foi colocada em um oscilador para facilitar a mistura do topo para a base durante a adição de soluções de dosagem. O GSH foi adicionado à unidade ao mesmo tempo em que a unidade está misturando no oscilador. A unidade foi em seguida misturada manualmente usando o método de mistura da figura oito descrito acima. Após adição de GSH as unidades foram permitidas descansar em temperatura ambiente durante 5 minutos.

[00130] Após o período de descanso, uma pequena amostra de RBCs Foi removida e cultivada para determinar o título de prétratamento. Os ensaios de placa padrões foram usados para amostras bacterianas e ensaios de cultura de célula foram usados para vírus.

[00131] Uma solução de cloridrato de amustalina a 6 mM (S-303) foi preparada dissolvendo-se 46 mg S-303 em ~15 mL de 0,9% de salina. A dose apropriada de solução de S-303 foi extraída em uma seringa de 20 mL. O volume usado foi tipicamente 10 mL de solução de S-303 por 280 mL de RBC, mais 2 mL de perda de cepa para gerar S-303 a 0,2 mM na unidade de RBC dosada. A unidade foi então misturada manualmente usando o método de mistura da figura oito como descrito acima. A unidade de RBC tratada foi incubada em temperatura ambiente durante um mínimo de 3 horas após adição de S-303 para garan

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92/108 tir a conclusão da inativação de patógeno antes da amostragem para título de pós-tratamento.

[00132] Em 3 horas pós-PI, as amostras foram removidas e cultivadas, como descrito acima, para determinar o título de pós-tratamento. Para estudos de avaliação da inativação de consumo de bactérias de baixo nível, tanto as unidades de Teste quanto de Controle foram incubadas em TA durante ~20 horas pós-tratamento e em seguida incubadas a 37 oC durante a noite. Em seguida a 37 oC de incubação, as amostras foram removidas de cada unidade de Teste tratada e da unidade de Controle não tratada idêntica e cultivadas para obter uma avaliação qualitativa de título bacteriano. A unidade de Controle não tratado exibiu crescimento.

[00133] A redução de log para cada unidade foi determinada tomando-se o log da relação de título de pré-tratamento para título de pós-tratamento, onde os títulos foram expressos como 10x cfu ou pfu/mL.

Exemplo 4: Experimentos de Função In Vitro de RBC [00134] As unidades de RBC humano foram preparadas em soluções aditivas, tal como AS-3 (Nutricel), de acordo com as instruções do fabricante. As unidades de RBC foram tratadas com várias concentrações de GSH para obter as concentrações finais variando de 2 mM a 30mM. Em alguns casos o GSH teve o pH ajustado com 1 ou 2 equivalentes de base com bicarbonato de sódio ou hidróxido de sódio antes do tratamento. Em seguida ao tratamento com GSH os RBC foram tratados com S-303, dissolvidos com 0,9% de cloreto de sódio, para obter uma concentração de S-303 a 0,2 mM no RBC, ou dosado simulado com 0,9% de cloreto de sódio. Após tratamento, as unidades foram incubadas durante 20h a 20-25°C. Após a incubação algumas unidades foram centrifugadas em 6 min, 21°C, 4100 x g, sobrenadante expresso e 100mL de solução fresca aditiva foram adicionados ao

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RBC. Todas as unidades foram colocadas a 4 °C durante o armazenamento. Os controles não tratados foram colocados a 4 °C após serem preparados em solução aditiva.

[00135] A função in vitro foi ensaiada em vários pontos de tempo durante todo o curso de armazenamento. O pH extracelular a 37 °C foi determinado medindo-se o pH de RBC de cada unidade em um analisador de Gás de Sangue de Chiron Diagnostics. O ATP total foi medido usando um ensaio enzimático com base em luciferase ou um protocolo descrito por Beutler (1984). Os sobrenadantes livres de célula foram preparados para avaliar o potássio, glicose, e lactato extracelular. O potássio extracelular foi determinado medindo-se o teor de K+ do sobrenadante livre de célula usando um analisador de Na/K Chiron Diagnostics (modelo No. 614) ou analisador similar. A glicose e lactato extracelular foram avaliados em um analisador NexCT. Os índices de célula vermelha foram coletados usando o analisador de hematologia Advia (Siemens).

[00136] Os RBCs foram lavados três vezes em 0,9% de cloreto de sódio e incubados um mínimo de 1h em TA antes da análise quanto aos perfis de fragilidade osmótica e densidade. O método usado para fragilidade osmótica é descrito por Beutler et al., 1982, (Blood Journal 59:1141-1147) e foi modificado para um formato de 96 cavidades (Lew et al., 2003, Blood 101:4189-4194). As curvas de distribuição de densidade foram obtidas de acordo com Danon e Marikovsky, 1964 (J Lab Clin Med 6:668-674), usando ésteres de ftalato em tubos de microematócrito.

Exemplo 5: Quantificação de Ligação de Composto de Inativação de Patógeno à Superfície de RBC [00137] O nível de acridina ligada à superfície de RBC foi detectado com um ensaio citométrico de fluxo imune ativado por fluorescência sensível (IFC) usando um anticorpo monoclonal anti-acridina de ca

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94/108 mundongo conjugado para aloficocianina (APC) e um citômetro de fluxo de FACS-Caliber (BD Biosciences). Resumidamente, os RBCs foram lavados três vezes em 0,9% de salina e ressuspensos para um hematócrito a 4% em tampão de incubação por fluxo (HBSS, 1% de BSA, 0,1% de NaN3, EDTA a 1mM, 3% de BSA). Em seguida, o anticorpo anti-acridina monoclonal de camundongo conjugado para APC foi adicionado e incubado durante 30 minutos a 4°C; as células foram lavadas em tampão de lavagem de fluxo (HBSS 1% de BSA, 0,1% de NaN3, EDTA a 1mM) ressuspensas no mesmo tampão e um total de 30.000 eventos foi avaliado no FACS-Caliber em uma passagem apropriada. A quantificação dos números de moléculas S-303 ligadas à superfície celular de RBC humano (ABC) foi realizada usando kits de conta Quantum Simply Cellular (Bang Laboratories, Inc; Fishers, IN).

Exemplo 6: Efeitos de pH de Glutationa sobre Função e Hidratação de RBC imediatos e relacionadas com Armazenamento [00138] As unidades de RBC foram tratadas com S-303 (0,2 mM) e GSH (20 mM), pH ajustado com NaOH (variando os equivalentes de base (b.e.)) Para potencializar a extinção de GSH. O pH das soluções de dosagem testadas foi 2,9, 4,5, e 8,9 para 0 b.e., 1 b.e., e 2 b.e., respectivamente. Em seguida ao tratamento, os RBCs foram armazenados a 4 oC e ensaiados periodicamente quanto ao pH extracelular, glicose, lactato, potássio, ATP total e hemólise. Os parâmetros físicos de RBC (MCV, MCH, MCHC, HDW etc) foram medidos por citmometria de fluxo óptico, as medições de fragilidade osmótica foram realizadas como por Beutler et al., (1982) com modificação por Lew et al., (2003).

[00139] A exposição de RBC a GSH alcalino resultou em Hct diminuído com fragilidade osmótica diminuída imediata e prolongada e densidade de RBC aumentada (por exemplo, vide Figura 1). Esta desidratação imediata foi corrigida diminuindo-se os equivalentes de ba

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95/108 se, resultando em um pH menor das soluções de GSH (vide, a Tabela 5). Embora a desidratação imediata tenha sido melhorada, a fragilidade osmótica de RBCs continuou a ser mudada (Tabela 6; outros Exemplos nas Figuras 2 e 3) pela presença de GSH de um modo dependente da concentração. A medição de MCHC e a distribuição de MCH usando citometria de fluxo óptico (Adiva hematology analyzer, Siemens) se correlacionaram com as mudanças na fragilidade osmótica e densidade. A desidratação foi independente de S-303 uma vez que o efeito também foi demonstrado por pH e GSH na ausência de S303.

Tabela 5: Efeito de níveis ajustados de base de hidróxido de sódio de

GSH em hidratação de RBC imediatamente pós-tratamento

Nível de Base	MCF* (mOsm)	Hct (%)	MCHC (g/dL)	pH do Sangue
Não tratado	160	62	31	6,743
Dosagem simulada	Não feita	56	33	6,759
Dosado (0 b.e.)	173	59	31	6,206
Dosado (1 b.e.)	156	52	36	6,713
Dosado (2 b.e.)	142	47	42	7,180

* MCF (Fragilidade Corpuscular Média) = osmolaridade na qual 50% de hemólise ocorre

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Tabela 6: Efeito de equivalentes de base de GSH em hidratação de RBC e função durante o armazenamento

Tem- ** po	Nível de Base	MCF* (mOsm)	Hct (%)	MCHC (g/dL)	pH do Sangue	ATP (pmoles/gHb)	Glicose (mM)	Lactato (mM)
20 hr	Não tratado	158	61±1	30±1	6,749±0,011	5,35±0,41	11,6±0,1	0,9±0,7
Dosado (1 b.e.)	156	52±1	32±1	6,644±0,034	6,45±0,37	14,5±0,7	0,2±0,0
Dosado (2 b.e.)	145	46±1	35±1	7,173±0,020	8,17±0,50	12,8±0,3	0,1±0,1
14 Di- as	Não tratado	158	60±1	31±0	6,617±0,020	4,78±0,62	9,8±1,3	3,7±0,3
Dosado (1 b.e.)	152	51±1	34±1	6,486±0,019	4,47±0,70	9,4±0,4	2,4±0,6
Dosado (2 b.e.)	146	47±1	36±1	6,651±0,035	5,58±0,36	6,2±0,9	5,7±0,5
35 Dias	Não tratado	159	61±3	31±1	6,477±0,039	3,52±0,37	11,6±0,3	10,6±2,0
Dosado (1 b.e.)	148	52±1	34±1	6,423±0,033	2,77±0,49	14,5±0,9	20,6±1,6
Dosado (2 b.e.)	147	49±1	35±1	6,489±0,030	3,937±0,51	12,8±0,5	10,1±1,0

96/108 * MCF (Fragilidade Corpuscular Média) = osmolaridade na qual 50% de hemólise ocorre ** Dias pós-dosagem. Sangue dosado em 5 dias de idade.

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97/108 [00140] As mudanças de hidratação de RBC se correlacionaram com GSH, pH e concentração, porém não se correlacionaram com S303 ou ensaios bioquímicos (ATP, lactato, glicose) rotineiramente usados para avaliar a função de RBC. A exposição limitante ao pH elevado de GSH preveniu o efeito de desidratação inicial. A exposição continuada limitante de níveis elevados de GSH preveniu o efeito de desidratação no armazenamento. Estes estudos mostram que a avaliação do estado de hidratação de RBCs armazenados deve ser incluída como um preditor de qualidade de RBC uma vez que mudanças substanciais na hidratação não tiveram nenhum efeito em critérios convencionais porém podem ter contribuído com a mudança moderada no período de vida de célula vermelha.

Exemplo 7: Método de extinção melhorado com diminuição subsequente em resultados de extintor em desidratação de RBC diminuída em seguida ao armazenamento [00141] As unidades de RBC foram tratadas com S-303 (0,2 mM) e GSH (20 mM), pH ajustado com 1 equivalente de NaOH para potencializar a extinção de GSH. Em seguida ao tratamento com GSH os RBC foram tratados com S-303, dissolvidos com 0,9% de cloreto de sódio, para obter uma concentração de S-303 a 0,2 mM no RBC, ou dosado simulado com 0,9% de cloreto de sódio. Após o tratamento, as unidades foram incubadas durante 20h a 20-25°C. Após a incubação algumas unidades foram centrifugadas em 6 min, 21 °C, 4100 x g, sobrenadante expresso e 100 mL de solução fresca aditiva foram adicionados ao RBC. Todas as unidades foram colocadas a 4°C durante o armazenamento. Os controles não tratados foram colocados a 4 °C após serem preparados na solução aditiva. As medições de fragilidade osmótica de RBC foram realizadas como por Beutler et al., (1982) com modificação por Lew et al., (2003).

[00142] A exposição prolongada de RBC a concentrações elevadas

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98/108 de GSH resultou em densidade de RBC aumentada e fragilidade osmótica diminuída (por exemplo, vide Tabela 5, Figuras 3 e 4). Esta desidratação relacionada com o armazenamento foi corrigida removendo-se o GSH antes do armazenamento de RBC (por exemplo, vide, as Figuras 4 e 5). A desidratação dependente do tempo e concentração de GSH foi independente de S-303 uma vez que o efeito foi também demonstrado por GSH na ausência de S-303 (por exemplo, vide Figura 6).

[00143] As mudanças de hidratação de RBC se correlacionaram com GSH. A exposição limitante às concentrações elevadas de GSH permutando-se a solução de tratamento para solução fresca aditiva preveniu o efeito de desidratação induzido pelo armazenamento.

Exemplo 8: Inativação de patógeno para métodos de extinção melhorados [00144] As unidades de RBC leucorreduzidas com um hematócrito de aproximadamente 60% foram preparadas em meio de armazenamento AS-3. As unidades de RBC foram inoculadas com aproximadamente 6 logs/mL de organismo viável, e uma alíquota foi removida para servir como o controle de consumo não tratado. GSH em uma solução de 1 equivalente de NaOH foi adicionado às unidades inoculadas para uma concentração final de 20 mM e misturado bem. S-303 foi adicionado a uma concentração final de 0,2 mM e as unidades foram novamente bem misturadas e incubadas de 20 a 25 ^oC durante três horas. Em seguida à incubação, as amostras foram removidas e ensaiadas para detectar organismos viáveis residuais. As amostras de controle foram tituladas imediatamente após a preparação e novamente após o período de incubação de 3 horas. Pelo menos duas replicações foram realizadas para cada organismo.

[00145] Com a excessão de Pseudomonas, o Gram negativo, Gram positivo e um vírus de exemplo foram eficazmente inativados pelo tra

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99/108 tamento com GSH neutralizado com 1 equivalente de NaOH comparado com a neutralização com 2 equivalentes de NaOH (vide, Tabela 7). [00146] A inativação de patógeno de Pseudomonas aeruginosa usando um título de inoculação total de até 4,4 logs por unidade de RBC resultou em inativação completa.

Tabela 7: Dados de inativação de patógeno para condições de extinção melhoradas vs. Condições anteriores.

	Redução de Log GSH (20 mM), 1 b.e.	Redução de Log GSH (20 mM), 2 b.e.
S. aureus	6,0 ± 0,3 (n=4)	6,4
S. marcescens	3,7 ± 0,4 (n=3)	4,8
Y enterocolitica	5,0 ± 0,4 (n=4)	4,6
E. coli	5,9 ± 0,8 (n=4)	6,5
P. aeruginosa*	1,2 ± 0,4 (n=3)	1,8
VSV	>5,9	4,2

Exemplo 9: Níveis de acridina ligada à superfície para Métodos de extinção melhorados com etapa de permuta [00147] O método descrito no exemplo 5 foi usado para determinar a capacidade de ligação de anticorpo antiacridina às células vermelhas sanguíneas tratadas com GSH a 20 mM neutralizado com 1 equivalente de NaOH e S-303 a 0,2 mM. A capacidade de ligação de anticorpo medida através de várias preparações de RBC foi aproximadamente 39.000 por célula vermelha (vide Figura 7). Este nível de ligação se compara com 18,407±1195 ABC quando RBC é tratado com GSH a 20 mM neutralizado com 2 equivalentes de NaOH e 123,714±5123ABC quando RBC é tratado com GSH ácido a 2 mM.

Exemplo 10: Inativação de patógeno com Tratamento de S-303 em Hematócrito Variável (Hct) [00148] As unidades de RBC, de 450 a 500 mL de coleções de WB, foram preparadas sem solução aditiva (80% de hematócrito centrifu

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100/108 gado (Hct)) ou em solução aditiva (60% de Hct). Os RBC foram leucofiltrados antes do tratamento a menos que de outro modo indicado. As unidades de teste em 40% de Hct foram diluídas com uma solução diluente. As unidades de RBC foram inoculadas com um consumo de nível elevado de ~10⁶ organismos/mL ou um consumo de nível baixo de 10 a 105 organismos por unidade. Para consumo de nível elevado, uma amostra de controle de 28 mL foi removida antes do tratamento com S-303. Para consumo bacteriano de nível baixo, as unidades de Teste e Controle foram preparadas misturando-se e dividindo-se todas as unidades de RBC e a unidade de Controle foi inoculada com ~10 de organismos por unidade. As unidades de teste com 80% e 60% de Hct foram tratadas com 200 μΜ de S-303 e GSH a 20 mM, neutralizadas com um equivalente de base de hidróxido de sódio (1 b.e.). As unidades de teste com 40% de Hct foram tratadas com 130 μΜ S-303 e GSH a 13 mM (1 b.e.). As unidades ou amostras de Controle foram tratadas com GSH a 20 mM ou GSH a 13 mM (1 b.e.) com base em Hct. Para unidades com consumo de nível elevado, as amostras de Controle foram ensaiadas para organismos viáveis no momento em que a unidade de Teste foi tratada. Após 3 horas de incubação em TA tanto as unidades de Teste quanto as amostras de controle foram ensaiadas para organismos vivos, que foram quantificados por crescimento em placas Agar ricas (bactérias) ou por ensaio de placa em células Vero (VSV). Para unidades com consumo de nível baixo, as unidades de Controle e Teste foram incubadas em TA durante 20 horas e em seguida a 37^oC durante ~20 horas. As amostras foram em seguida semeadas para detectar o crescimento bacteriano. Os resultados são mostrados na Tabela 8.

Tabela 8: Dados de inativação de patógeno para amostras de valores de hematócrito variantes.

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Organismo	80% de Hematócrito	60% de Hematócrito	40% de He- matócrito
Consumo de Nível Elevado	Redução de Log 10 Médio ^a (N=2)
Yersinia enterocolitica	3,4 ^b	4,9	6,1
Escherichia coli	3,8 ^b	6,1^c	6,6
Serratia marcescens	4,4 ^b	4,5	3,1
Staphylococcus aureus	>5,8^b	6,7	>7
Vírus da estomatite Vesticular (VSV)	>6,2^b	>5,9	5,9
Consumo de Nível Baixo	Inativação de Unidade Completa ^d (log 10)
Pseudomonas aerugenosa	>2,7	>2,5	>2,5

^a Redução de log é calculada como Log (título não tratado/título após o tratamento), com o título expresso como 10^x/mL ^b Redução de patógeno sem leucofiltração ^cn=3 ^d Em todos os casos, as unidades de controle no nível de consumo baixo foram positivas para crescimento bacteriano

Exemplo 11: Hidratação de RBC em seguida ao Tratamento com S303 em Hematócrito Variante (Hct) [00149] RBCs foram preparados de sangue total leucorreduzido em 40% ou 60% de Hct, medido por hematócrito centrifugado, em solução aditiva e em 80% de Hct como células vermelhas embaladas. As unidades foram tratadas com GSH (sal de sódio, BioMedica Foscama, Itália) e S-303 em uma concentração final de 20mM e 0,2mM respectivamente. Todas as unidades tratadas foram incubadas até 20 horas em TA. A solução de tratamento foi substituída com SAG-M e as uni

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102/108 dades foram ajustadas para 60% de Hct durante o armazenamento a 4°C. As unidades de RBC de Controle foram preparadas em SAG-M e armazenadas a 4°C. Todas as unidades foram avaliadas periodicamente quanto aos parâmetros físicos; MCHC foi medido manualmente, as medições de fragilidade osmótica foram realizadas por métodos padrões (Beutler et al., e Lew et al., 2003). A Fragilidade Corpuscular Média (MCF) foi definida como a concentração de NaCl na qual 50% de RBCs foram hemolisados. A alteração em MCF é um índice de relação de superfície para volume (S/V) e hidratação de RBC durante o armazenamento. Após aproximadamente 6 semanas de armazenamento todas as unidades tratadas tiveram valores de MCF comparáveis com os controles não tratados, independente de Hct no momento do tratamento. MCHC, outro índice de hidratação de RBC, foi similar entre as unidades de Teste e Controle no final do armazenamento. Os resultados são mostrados na Tabela 9. O armazenamento de RBC tratado durante até 6 semanas não significantemente alterou a hidratação de RBC e S/V em uma ampla faixa de Hct usada na prática de rotina para a preparação de concentrados de RBC.

Tabela 9: Dados de hidratação para amostras de valores de hematócrito variantes.

	MCF (mOsm) (n=2)	MCHC (g/dL) (n=2)
	20h pós dosagem	Pós armazenamento	20h pós do- sagem	Pós armazenamento
40% de HCT	156	152	33	31
80% de HCT	158	156	32	30
Controle de SAG-M	156	158	32	30

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103/108

60% de HCT	151	148	33	33
Controle de SAG-M	150	154	32	32

Exemplo 12: Qualidade In Vitro de RBCs Armazenados em seguida ao

Tratamento de S-303 em Hematócrito Variável (Hct) [00150] Os RBCs foram preparados de sangue total leucorreduzido em 40% ou 60% de Hct, medidos por hematócrito centrifugado, em solução aditiva e em 80% de Hct como células vermelhas embaladas. As unidades foram tratadas com GSH (sal de sódio) e S-303 em uma concentração final de 20mM e 0,2mM respectivamente. Todas as unidades tratadas foram incubadas até 20 horas a TA. A solução de tratamento foi substituída com SAG-M e as unidades foram ajustadas para 60% de Hct durante o armazenamento a 4°C. As unidades de RBC de Controle foram preparadas em SAG-M e armazenadas em 4°C. A função in vitro foi ensaiada pré- e pós-tratamento e em intervalos regulares durante até 6 semanas de armazenamento. Os parâmetros avaliados para função de RBC in vitro incluíram pH, ATP total, hemólise, e potássio extracelular, glicose e lactato. Após aproximadamente 6 semanas (Dias 38 ao Dia 44) de armazenamento, todas as unidades de Teste tiveram níveis de ATP total maiores do que 2 pmols de ATP/g de Hb e a hemólise e MCHC foram comparáveis com as unidades de controle, independente do tratamento com Hct. Durante todo o armazenamento a glicose extracelular de unidade de Teste foi mais elevada do que das unidades de controle para 40% e 60% de Hct, ao passo que as unidades com 80% de Hct foram mais similares ao controle. O lactato extracelular foi menor em todas as unidades de Teste, independente de Hct, comparado com o Controle. No final do armazenamento, K⁺ extracelular foi ligeiramente menor em unidades de Teste do que em Controle para 40% e 60% de unidades de Hct ao passo que as

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104/108 unidades de Hct a 80% foram comparáveis dom o Controle. O pH de todas as unidades de teste foi similar ao Controle em todo o armazenamento. A produção de hemoglobina do processo, independente do tratamento com Hct, atendeu aos requerimentos de AABB. A atividade de todos os parâmetros metabólicos foi similar ao Controle após tratamento com S-303 em uma ampla faixa de Hct durante todas as 6 semanas de armazenamento. Os resultados são mostrados na Tabela

10.

Tabela 10: Parâmetros metabólicos para inativação de patógeno de

RBC em valores de hematócrito variantes.

	ATP (pmol/gHb) (n=2)	% de Hemó- lise (n=2)	MCHC (g/dL) (n=2)	Glicose (mmol/L) (n=2)
T este 40% de HCT	3,28 (D38)	0,2% (D44)	31 (D44)	11,8 (D44)
T este 80% de HCT	3,42 (D38)	0,3% (D44)	30 (D44)	7,7 (D44)
Controle de SAG-M	3,35 (D38)	0,3% (D44)	30 (D44)	6,3 (D44)

T este 60% de HCT	2,96 (D42)	0,2% (D42)	30 (D42)	9,1 (D42)
Controle de SAG-M	3,19 (D42)	0,3% (D42)	30 (D42)	5,1 (D42)

Exemplo 13: Função In Vitro e Inativação de Patógeno de RBCs Diluídos [00151] As unidades de RBC de SAG-M foram preparadas de unidades de sangue total leucorreduzidas de 500 mL de coleções. Para estudos de função de RBC, as unidades de RBC de SAG-M foram misturadas por tipo de ABO, e divididas para unidades de Teste e

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Controle compartilhadas. Antes do tratamento, 150 mL de solução diluente compreendendo manitol a 28,8 mM, adenina a 1,3 mM, fosfato de sódio a 16,2 mM, citrato de sódio a 20 mM, pH 7,5 foi adicionado às unidades de Teste. As unidades de teste foram tratadas com um sal de sódio de GSH e S-303 em uma concentração final de 20 mM e 0,2 mM respectivamente. As unidades de teste foram incubadas até 20 horas em temperatura ambiente (TA). Após incubação em TA, as unidades foram centrifugadas e o sobrenadante foi permutado com 100 mL de SAG-M que foi adicionado antes do armazenamento a 4°C. As unidades de RBC de controle foram preparadas em SAG-M e armazenadas a 4°C. Todas as unidades foram avaliadas em aproximadamente 6 semanas de armazenamento a 4°C amostrando-se em vários pontos de tempo. Para estudos de inativação de patógeno de RBC, as unidades de RBC de SAG-M foram divididas na metade e as unidades de RBC foram inoculadas com patógenos antes da adição da solução de tratamento e GSH. Após a adição da solução de tratamento e GSH, uma amostra de controle (5 mL a 7 mL) foi removida da unidade para determinar o título de patógeno de consumo e a unidade restante foi tratada com S-303. As unidades tratadas foram amostradas para título de patógeno viável residual após uma incubação estática de 3 horas em temperatura ambiente.

[00152] Os índices metabólicos e físicos in vitro foram avaliados em vários pontos de tempo durante todo o armazenamento com ensaios in vitro. O pH extracelular a 37°C foi medido e, um analisador de Gás de Sangue Siemens Diagnostics. ATP total foi medido usando um ensaio enzimático com base em luciferase. Os sobrenadantes livres de célula foram preparados para avaliar o potássio (K+), glicose, e lactato extracelulares. O potássio extracelular foi determinado medindo-se o teor de K+ de sobrenadante livre de célula usando um analisador de Na/K EasyLyte®. A glicose e lactato extracelulares foram avaliados em um

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106/108 analisador NexCT®. A concentração de hemoglobina corpuscular média (MCHC) e hematócrito centrifugado foram medidos manualmente. As medições de fragilidade osmótica foram realizadas por métodos padrões (Beutler et al., e Lew et al., 2003). A Fragilidade Corpuscular Média (MCF) foi definida como a concentração de NaCl na qual 50% de RBCs foram hemolisados.

[00153] Para estudos de inativação bacteriana, RBC foi inoculado com aproximadamente 6,5 logs de cfu/mL de E.coli, S. marcescens, S. aureus, Y. enterocolitica, ou P. aeruginosa. Para estudos de inativação viral, RBC foi inoculado com aproximadamente 4,1 logs de pfu/mL a 6,4 logs de pfu/mL, dependendo do vírus. GSH dissolvido em salina foi adicionado à unidade a uma concentração final de 20 mM. Os títulos bacterianos foram determinados por enumeração de unidades de formação de colônia (cfu) em placas agar e títulos virais foram determinados por enumeração de unidades de formação de placa (pfu) em linhagens de célula apropriadas. As amostras não tratadas foram serialmente diluídas antes da enumeração. As amostras tratadas não foram diluídas antes da enumeração dos títulos.

[00154] Os resultados mostrados nas Tabelas 11 e 12 abaixo demonstram função metabólica de RBC aceitável e parâmetros fisiológicos durante o curso da duração do armazenamento e inativação de patógeno aceitável.

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Tabela 11: Hidratação e parâmetros metabólicos para inativação de patógeno de unidades de RBC diluídas.

Dias após a Doação	Tratamento	MCF (mOsm)	Hct (%)	MCHC (g/dL)	Sangue pH	ATP (pmol/ gHb)	Glicose (mM)	Lactato (mM)
1	Não tratado	ND	54 ±2	32 ±0	6,982±0,015	4,50 ±0,87	34,2 ±1,3	3,6 ±0,2
1,8	Não tratado	153 ±3	54 ±3	33 ±1	6,944±0,015	4,39 ±0,41	33,1 ±1,9	4,8 ±0,1
T ratado	152 ±2	57 ±1	32 ±1	6,837±0,016	7,05 ±0,91	29,4 ±1,1	3,9 ±0,2
7-8	Não tratado	154 ±2	54 ±3	32 ±1	6,823±0,021	4,87 ±0,45	30,4 ±1,0	10,3 ±0,6
T ratado	150 ±2	56 ±1	32 ±1	6,701±0,024	6,23 ±0,69	26,3 ±1,1	7,9 ±0,5
21-23	Não tratado	153 ±3	55 ±3	31 ±1	6,623±0,022	4,30 ±0,83	24,5 ±1,8	18,5 ±1,4
T ratado	148 ±2	56 ±1	32 ±1	6,526±0,028	4,53 ±0,99	22,2 ±0,6	14,1 ±1,3
35	Não tratado	155 ±2	54 ±3	32 ±1	6,532±0,014	3,31 ±0,28	21,6 ±1,3	25,2 ±0,7
T ratado	152 ±2	55 ±1	33 ±1	6,429±0,016	3,90 ±0,49	19,7 ±0,6	18,9 ±1,1

N=4

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Tabela 12: Dados de inativação de patógeno para amostras de unidades de RBC diluídas.

Bactérias	Log de Morte média (n=4)
S. marcescens	4,20
E. coli	>6,69
S. aureus	4,15
Y. enterocolitica	>6,57
P. aeruginosa	3,35

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método de tratar uma composição de célula vermelha sanguínea, caracterizado pelo fato de que compreende:

(a) misturar (i) uma quantidade eficaz de um composto de inativação de patógeno que é β-alanina, N-(acridin-9-il), éster de 2-[bis(2cloroetil)amino]etil;

(ii) uma quantidade eficaz de um extintor compreendendo um grupo tiol, onde o tiol é capaz de reagir com o grupo eletrofílico reativo do composto de inativação de patógeno;

(iii) uma composição compreendendo células vermelhas sanguíneas; e (iv) 0,5 a 1,5 equivalentes de base, em que um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar de extintor na mistura;

em uma solução de tratamento ou diluente;

em que a solução de tratamento ou diluente compreende um ou mais de dextrose, adenina, manitol, citrato e ácido cítrico; e em que a mistura da etapa (a) depois da adição da solução de tratamento ou diluente compreende entre 40 mM e 100 mM de íon cloreto; e (b) substituir a solução utilizada durante o tratamento da composição de célula vermelha sanguínea na etapa (a) com uma solução de aditivo final, de tal modo que composição de célula vermelha tenha hematócrito na faixa de cerca de 35 a 80%, e de tal modo que a concentração do extintor na mistura seja reduzida para uma quantidade que reduza o nível de desidratação de célula vermelha sanguínea resultante do armazenamento da mistura relativo ao nível de desidratação de célula vermelha sanguínea resultante do armazenamento da mistura na concentração original do extintor.

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2/5

2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução de tratamento compreende ainda, um ou mais de fosfato, e cloreto.
3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a solução diluente compreende fosfato.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que a composição compreendendo células vermelhas do sangue (iii) compreende ainda uma solução de aditivo.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a base compreende 0,75 a 1,25 equivalente de base, em que um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar do extintor na etapa (a) de mistura.
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a base compreende 1 equivalente de base, em que um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar do extintor na etapa (a) de mistura.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a mistura resultante da etapa (a) tem um pH a 37°C de 6,0 a 7,5.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o extintor compreende cisteína ou um derivado de cisteína.
9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o extintor é glutationa ou um sal farmaceuticamente aceitável da mesma.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o extintor é sal de monossódio de glutationa.
11. Método de acordo com qualquer uma das reivindica

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3/5 ções 1 a 10, caracterizado pelo fato de que o extintor na mistura resultante da etapa (a) está em uma concentração de 20 mM.
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o tempo entre a etapa (a) e etapa (b) é 1 a 48 horas.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o tempo entre a etapa (a) e etapa (b) é 4 a 30 horas.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a etapa (b) compreende centrifugação da mistura seguido por remoção do sobrenadante da mistura.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a (b) compreende separação por exclusão de tamanho.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizado pelo fato de que a (b) compreende dispositivos de expressão.
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a concentração do composto inativante de patógeno na mistura resultante da etapa (a) é 0,1 μΜ a 5 mM.
18. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que a base é NaOH.
19. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18, caracterizado pelo fato de que a concentração do composto de inativação de patógeno na mistura resultante da etapa (a) é suficiente para inativar pelo menos 3 logs de um patógeno na composição de célula vermelha sanguínea, se presente.
20. Método de acordo com qualquer uma das reivindica

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4/5 ções 1 a 19, caracterizado pelo fato de que as células vermelhas sanguíneas da mistura resultante têm menos do que 1% de hemólise em um tempo de 42 dias a 4°C em seguida a etapa (b).
21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 20, caracterizado pelo fato de que seguindo a etapa (a), as células vermelhas sanguíneas da mistura resultante têm uma capacidade de ligação de anticorpo (ABC) menor do que 55% comparado com o valor de ABC de células vermelhas sanguíneas do mesmo método sob as mesmas condições, porém sem o uso da base.
22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que as células vermelhas sanguíneas da mistura resultante têm um Volume de Célula Embalada maior do que 50% em um tempo de 42 dias a 4°C em seguida a etapa (b).
23. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 22, caracterizado pelo fato de que as células vermelhas sanguíneas da mistura resultante têm um Valor de Fragilidade Corpuscular Médio maior do que 140 após 42 dias a 4°C em seguida a etapa (b).
24. Método de reduzir a desidratação em uma composição de célula vermelha sanguínea em que a composição é uma mistura compreendendo um extintor capaz de reagir com um composto de inativação de patógeno, que é β-alanina, N-(acridin-9-il), éster de 2-[bis(2cloroetil)amino]etil, 0,5 a 1,5 equivalentes de base, em que um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar de extintor na mistura, células vermelhas sanguíneas, e a solução de tratamento ou diluente; em que a solução de tratamento ou diluente compreende um ou mais de dextrose, adenina, manitol, citrato e ácido cítrico; e em que a composição de célula vermelha sanguínea compreende entre 40 mM e 100 mM de íon de cloreto; o método ca

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5/5 racterizado pelo fato de que compreende substituir a solução na mistura com uma solução de aditivo final, de tal modo que composição de célula vermelha tenha hematócrito na faixa de cerca de 35 a 80%, de tal modo que a concentração do extintor na mistura é reduzida para uma quantidade que reduz o nível de desidratação de célula vermelha sanguínea resultante do armazenamento da mistura relativo ao nível de desidratação de célula vermelha sanguínea resultante do armazenamento da mistura na concentração original do extintor.
25. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende:

a) células vermelhas sanguíneas, em que as células vermelhas sanguíneas covalentemente reagiram com um grupo eletrofílico de um composto de inativação de patógeno que é que é β-alanina, N(acridin-9-il), éster de 2-[bis(2-cloroetil)amino]etil; e

b) um extintor compreendendo um grupo tiol, que é capaz de reagir com um composto de inativação de patógeno;

em que as células vermelhas sanguíneas têm um valor de Fragilidade Corpuscular Média maior do que 150 mOsm após 28 dias a 4 °C.
26. Composição de célula vermelha sanguínea como definida na reivindicação 25, caracterizada por ser no preparo de um medicamento para infusão de células vermelhas sanguíneas em um indivíduo.
27. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de que a solução final de aditivo compreende um ou mais de dextrose, cloreto de sódio, adenina, guanosina, glicose, citrato, ácido cítrico, fosfato, e manitol.