KR20170037682A

KR20170037682A - 적혈구 병원체 불활성화를 위한 개선된 퀀칭 방법

Info

Publication number: KR20170037682A
Application number: KR1020177008174A
Authority: KR
Inventors: 나히드 무프티; 안나 에릭슨; 앤 노스
Original assignee: 세루스 코포레이션
Priority date: 2008-04-09
Filing date: 2009-04-09
Publication date: 2017-04-04
Also published as: US8900805B2; EA201071178A1; AU2009233807A1; KR101896430B1; AU2009233807B2; CA2720824C; US20180008639A1; BRPI0911176A2; CN102046006B; BRPI0911176B8; US20150157665A1; US10357516B2; WO2009126786A2; JP5916383B2; BRPI0911176B1; EP2285210A2; JP2011516570A; IL208431A0; ES2636563T3; WO2009126786A3

Abstract

본 발명은 세포 생육력을 유지하면서 적합한 병원체 불활성화를 제공하는 조건에서 병원체-불활성화 화합물로 적혈구 조성물을 처리하는 개선된 방법을 제공한다. 또한, 적혈구의 탈수를 감소시키는 방법, 및 처리된 적혈구 조성물이 제공된다.

Description

적혈구 병원체 불활성화를 위한 개선된 퀀칭 방법{IMPROVED QUENCHING METHODS FOR RED BLOOD CELL PATHOGEN INACTIVATION}

관련 출원의 참조

본 출원은 2008년 4월 9일 제출된, 발명의 명칭 "적혈구 병원체 불활성화를 위한 퀀칭 방법", 미국 가출원 No. 61/043,666, 및 2008년 8월 7일 제출된, 발명의 명칭 "적혈구 병원체 불활성화를 위한 퀀칭 방법", 미국 가출원 No. 61/087,034의 우선권을 주장한다. 이들 두 출원의 내용은 이하 전문에 제시된 것처럼 그 전문이 본원에 참고자료로 포함된다.

기술분야

본 발명의 분야는 가능한 병원체 오염물들을 불활성화하기 위한 혈액 제품의 처리에 사용된 퀀칭 반응성 친전자성 화합물의 개선된 방법에 관한 것이다. 특히, 티올과 같은 친핵성 화합물을 상승된 농도로 사용하여 적혈구 조성물 중의 반응성 친전자성 화합물을 퀀칭한 다음, 적혈구(RBC) 탈수를 줄일 수 있는 농도로 낮출 수 있다.

혈액 제품 및 다른 생물학적 물질들에 의한 질환의 전파는 여전히 심각한 보건문제이다. 혈액 제공자 선별 및 혈액 테스트에 있어서 상당한 진전이 있었지만, B형 간염(HBV), C형 간염(HCV), 및 인간 면역결핍 바이러스(HIV)와 같은 바이러스들은 바이러스나 바이러스 항체의 수준이 낮기 때문에 테스트 중에 혈액 산물에서 검출될 수 없다. 바이러스 위험에 더하여, 수혈용 혈액에서 박테리아나 원충과 같은 비바이러스성 병원균의 존재를 선별할 수 있는 허가된 시험이 현재 충분하지 않다. 또한, 수혈을 통한 HIV 전파의 위험을 인식하기 전에 그랬었던 것처럼, 지금까지 불명인 병원체가 혈액 조달 중에 유행하게 되어 위협적으로 전파되는 질환으로 부상하게 될 수 있는 위험이 존재한다.

혈액 제품의 임상 사용 전에 병원체를 불활성화하기 위하여 혈액이나 혈장에 화학적 제제가 도입되었다. 전형적으로, 혈소판 및 혈장과 같은 적혈구 함량이 거의 없거나 전혀 없는 혈액 제품에서는 솔라렌 같은 광화학적으로 활성화된 화합물이 사용된다. 적혈구-함유 혈액 제품에서는 광활성화가 필요치 않은 병원체 불활성화용 화합물이 개발되었다. 이들 화합물은 전형적으로 병원체, 더 구체적으로는 병원체 핵산과 반응하는 친전자성 기들을 가진다. 예를 들어, U. S. 특허 No. 5,055,485는 아릴디올 에폭시드를 사용한 세포 및 단백질-함유 조성물 중의 바이러스의 불활성화를 설명한다. 친전자체가 원위치 발생되는 다른 화합물들도 사용될 수 있다. LoGrippo 등은 바이러스 불활성화에서 질소 머스터드 CH3-N(CH2CH2Cl)2의 사용을 평가했다. LoGrippo et al., Proceedings of the Sixth Congress of the International Society of Blood Transfusion, Bibliotheca Haematologica (Hollander, ed.), 1958, pp. 225-230. 더 중요하게는 U.S. 특허 Nos. 5,691,132; 6,177,441; 6,410,219; 6,143,490; 및 6,093,725에서 병원체를 불활성화할 수 있는 핵산 표적화 성분 및 핵산과 반응하는 친전자 성분을 갖는 화합물의 사용이 설명되며, 이들의 내용은 모두 참고자료로 본원에 포함된다. U.S. 특허 Nos. 6,093,725 및 6,514,987에는 유사한 화합물이 설명되는데, 여기서는 화합물의 핵산 표적화 성분이 가수분해 가능한 링커에 의해 반응성 친전자 성분과 연결되며, 이들의 내용도 본원에 참고자료로 포함된다. U.S. 특허 Nos. 6,136,586 및 6,617,157에는 병원체 불활성화를 위한 에틸렌이민 올리고머와 관련된 화합물들의 사용이 설명되고, 이들의 내용도 본원에 참고자료로 포함된다. 이들 에틸렌이민-유도 화합물들은 전형적으로 반응성 친전자 성분을 제공하는 아지리딘 기, 및 화합물의 핵산 표적화를 제공하는 폴리아민 성분을 가진다. 일반적인 부류의 핵산 반응성 친전자성 기 또는 유사한 기를 가진 핵산 표적화된 화합물을 사용하여 혈액, 혈액 제품, 및 생물학적 기원의 각종 샘플 중의 병원체를 불활성화할 수 있다.

이들 화합물은 핵산을 특이적으로 표적화하도록 설계되지만, 단백질이나 세포막과 같은 혈액의 다른 성분들과도 반응할 수 있다는 것이 다소 우려된다. 이러한 부반응은 바람직하지 않으며, 면역 시스템에 의해서 인식될 수 있는 단백질 및 세포막의 변형과 같은 불리한 효과를 일으킬 수 있다. 이러한 처리된 혈액 제품이 반복하여 사용될 경우, 이들은 처리된 혈액 제품에 대한 수여자의 면역반응을 초래할 수 있다. U.S. 특허 Nos. 6,270,952; 6,709,810; 및 7,293,985에는 어떤 이러한 불리한 부반응의 수준을 낮추기 위해 이러한 병원체-불활성화 화합물을 퀀칭하는 방법이 설명되며, 이들의 내용은 모두 본원에 참고자료로 포함된다. U.S. 특허 공개 No. 2006/0115466은 이러한 퀀칭 조건의 개선사항을 설명하면서, 병원체-불활성화 화합물에 대해 발생된 면역반응을 다루고 있으며, 이것의 내용도 본원에 참고자료로 포함된다. 그러나, 퀀칭 효능의 개선에도 불구하고, 일부 경우 처리된 적혈구는, 감소된 삼투 취약성 및 감소된 회전 적혈구용적율에 의해 측정되는 증가된 세포 탈수로 인하여 감소된 수명을 가진다는 것이 판명되었다.

따라서, 처리된 혈액 제품의 활력과 수명에는 불리한 영향을 미치지 않고 유해 병원체를 불활성화하는 병원체-불활성화 화합물의 능력은 보존하면서 병원체-불활성화 화합물의 원치않는 친전자성 부반응을 감소시킬 수 있는 방법이 필요하다. 구체적으로, 적혈구 중의 병원체-불활성화 화합물을 퀀칭하는 개선된 방법이 필요하다.

본 발명은 세포 탈수의 증가와 같은 불리한 효과를 줄이거나 최소화하면서, 적합한 병원체 불활성화 및 원치않는 부반응(적혈구의 변형 같은)의 감소를 제공하는 조건에서 병원체-불활성화 화합물로 적혈구 조성물을 처리하기 위한 다양한 방법 및 퀀처를 제공한다. 어떤 구체예에서, 퀀처는 적합한 양의 염기로 중화된 글루타티온이다. 어떤 구체예에서, 방법은 병원체 불활성화 후에 글루타티온의 농도를 감소시키는 것을 수반한다.

한 양태에서, 본 발명은, i) 병원체가 존재할 경우 병원체를 불활성화할 수 있는 유효량의 병원체-불활성화 화합물, 여기서 병원체-불활성화 화합물은 반응성 친전자성 기인 작용기, 또는 반응성 친전자성 기를 형성하는 작용기를 포함한다, ii) 티올기를 포함하는 유효량의 퀀처, 여기서 티올은 병원체-불활성화 화합물의 반응성 친전자성 기와 반응할 수 있다, 및 iii) 적혈구를 포함하는 조성물을 제공하는 단계; b) 병원체-불활성화 화합물 및 퀀처와 적혈구를 포함하는 조성물을 혼합하는 단계; 및 c) 원래 퀀처 농도에서 혼합물의 저장으로 인해 생기는 적혈구 탈수 수준에 비하여, 혼합물의 저장으로 인해 생기는 적혈구 탈수 수준을 감소시키는 양까지 혼합물 중의 퀀처 농도를 충분히 감소시키는 단계를 포함하는, 적혈구 조성물을 처리하는 방법을 제공한다. 이들 구체예들 중 일부에서, 퀀처 농도를 감소시키는 것은 불활성화 동안 사용된 용액을 제거하고, 최종 첨가제 용액(예를 들어, SAG-M, AS-5 또는 표 2, 3 또는 4의 어떤 용액과 같은 본원에 설명된 어떤 용액)을 첨가하는 것을 포함한다.

어떤 구체예에서, 단계 (a)는 적합한 염기를 제공하는 단계를 더 포함하고, 단계 (b)는 이 염기와 적혈구를 포함하는 조성물을 혼합하는 단계를 더 포함하며, 염기는 염기가 없는 혼합물에 비하여, 혼합물 중에서 병원체-불활성화 화합물과 적혈구의 원치않는 반응의 수준을 감소시킬 수 있는 충분한 양이다. 어떤 구체예에서, 병원체-불활성화 화합물과 적혈구의 원치않는 반응은 병원체-불활성화 화합물에 의한 적혈구의 표면 변형이다. 어떤 구체예에서, 단계 (a)는 적합한 염기를 제공하는 단계를 더 포함하고, 단계 (b)는 이 염기와 적혈구를 포함하는 조성물을 혼합하는 단계를 더 포함하며, 염기는 염기가 없는 혼합물에 비하여 적어도 약 5%(또는 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 90%)까지 얻어진 혼합물 중에서 처리된 적혈구 조성물과 결합한 항-병원체 불활성화 화합물의 수준을 감소시킬 수 있는 충분한 양이다. 어떤 구체예에서, 염기 및 퀀처는 병원체-불활성화 화합물과 적혈구 조성물의 혼합 전에, 동시에, 또는 약 30분 이내에 적혈구 조성물과 혼합된다. 어떤 구체예에서, 염기 또는 퀀처와 적혈구 조성물을 혼합하기 전에 염기와 퀀처가 함께 혼합된다. 어떤 구체예에서, 염기는 NaOH이다. 어떤 구체예에서, 염기는 염기성 버퍼이다. 어떤 구체예에서, 염기는 약 0.5 내지 1.5 당량의 염기를 포함하며, 여기서 당량은 혼합물 중의 퀀처의 몰량과 동등한 몰량을 의미한다. 어떤 구체예에서, 염기는 약 0.75 내지 1.25 당량의 염기를 포함한다. 어떤 구체예에서, 염기는 약 1 당량의 염기를 포함한다. 어떤 구체예에서, 단계 (b)에서 얻어진 혼합물은 37℃에서 약 6.0 내지 7.5의 pH를 가진다. 어떤 구체예에서, pH는 약 6.5 내지 7.1이다. 어떤 구체예에서, pH는 약 6.8 또는 6.9이다.

어떤 구체예에서, 퀀처는 시스테인 또는 시스테인 유도체를 포함한다. 어떤 구체예에서, 퀀처는 글루타티온 또는 제약학적으로 허용되는 그것의 염이다. 어떤 구체예에서, 단계 (b)에서 얻어진 혼합물 중 퀀처의 농도는 2mM를 초과한다. 어떤 구체예에서, 퀀처 농도는 약 5mM 내지 약 30mM이다. 어떤 구체예에서, 퀀처 농도는 약 15mM 내지 약 25mM이다. 어떤 구체예에서, 퀀처 농도는 약 20mM이다.

어떤 구체예에서, 단계 (c)에서 퀀처의 농도를 감소시키는 것은 혼합물의 원심분리 후 상청액의 제거를 포함한다. 어떤 구체예에서, 단계 (c)는 크기-배제 분리를 포함한다. 어떤 구체예에서, 단계 (c)에서 얻어진 혼합물 중 퀀처는 약 10mM 미만의 농도이다. 어떤 구체예에서, 퀀처 농도는 약 8mM 미만이다. 어떤 구체예에서, 퀀처 농도는 약 6mM 미만이다(또는 약 4mM 미만, 또는 약 2mM 미만). 어떤 구체예에서, 혼합물의 저장은 4℃에서 10일을 초과하는 동안의 혼합물의 저장이다. 어떤 구체예에서, 혼합물의 저장은 4℃에서 42일(또는 28일)을 초과하는 동안의 혼합물의 저장이다. 어떤 구체예에서, 방법은 첨가제 용액의 첨가를 포함한다(예를 들어, 표 2에 설명된 어떤 첨가제 용액, 및/또는 염화나트륨, 아데닌, 글루코오스, 포스페이트, 구아노신, 시트레이트 및/또는 만니톨을 포함하는 첨가제 용액). 어떤 구체예에서, 혼합물은 첨가제 용액 중에 저장된다(예를 들어, 표 2에 설명된 어떤 첨가제 용액, 및/또는 염화나트륨, 아데닌, 글루코오스, 포스페이트, 구아노신, 시트레이트 및/또는 만니톨을 포함하는 첨가제 용액). 어떤 구체예에서, 방법은 처리 용액(예를 들어, 표 2, 3 또는 4에 설명된 어떤 용액, 및/또는 염화나트륨, 아데닌, 글루코오스, 포스페이트, 구아노신, 시트레이트 및/또는 만니톨을 포함하는 용액)을 첨가제 용액(예를 들어, 표 2에 설명된 어떤 첨가제 용액, 및/또는 염화나트륨, 아데닌, 글루코오스, 포스페이트, 구아노신, 시트레이트 및/또는 만니톨을 포함하는 첨가제 용액)으로 대체하는 것을 더 포함한다. 어떤 구체예에서, 퀀처의 농도를 감소시키기 전에 조성물의 염화물 농도는 약 100mM(또는 약 75mM) 미만이다. 어떤 구체예에서, 퀀처 농도의 감소 및/또는 첨가제 용액의 첨가 후 조성물의 염화물 농도는 약 100mM(또는 약 125mM)를 초과한다.

전술한 방법들과 본원에 설명된 다른 방법들 각각의 어떤 구체예에서, 작용기는 머스타드, 머스타드 중간체, 또는 머스타드 등가물이다. 어떤 구체예에서, 작용기는 아지리디늄 이온이거나, 아지리디늄 이온을 형성할 수 있다. 어떤 구체예에서, 반응성 친전자성 기는 핵산과 반응할 수 있다. 어떤 구체예에서, 병원체-불활성화 화합물은 핵산 결합 리간드를 더 포함한다. 어떤 구체예에서, 핵산 결합 리간드는 인터칼레이터이다. 어떤 구체예에서, 인터칼레이터는 아크리딘이다. 어떤 구체예에서, 병원체-불활성화 화합물은 작용기와 핵산-결합 리간드를 연결하는 취약성 링커를 포함한다. 어떤 구체예에서, 병원체-불활성화 화합물은 β-알라닌, N-(아크리딘-9-일), 2-[비스(2-클로로에틸)아미노]에틸에스테르이다. 어떤 구체예에서, 단계 (b)에서 얻어진 혼합물 중 병원체-불활성화 화합물의 농도는 약 0.1μM 내지 약 5mM이다. 어떤 구체예에서, 이 농도는 병원체가 존재할 경우 적혈구 조성물 중의 적어도 1 log의 병원체를 불활성화하기에 충분하다. 어떤 구체예에서, 이 농도는 적어도 3 log의 병원체를 불활성화하기에 충분하다. 어떤 구체예에서, 단계 (b)와 단계 (c) 사이의 시간은 약 1 내지 48시간이다. 어떤 구체예에서, 이 시간은 약 10 내지 30 시간이다. 어떤 구체예에서, 이 시간은 약 15 내지 25시간이다. 어떤 구체예에서, 처리는 병원체가 존재할 경우 적혈구 조성물 중의 적어도 1 log의 병원체 오염물을 불활성화한다. 어떤 구체예에서, 처리는 적어도 3 log를 불활성화한다. 어떤 구체예에서, 방법은 혼합물 중 병원체-불활성화 화합물의 농도를 감소시키는 단계를 더 포함한다. 어떤 구체예에서, 혼합물 중의 퀀처 농도를 감소시키는 단계와 혼합물 중의 병원체-불활성화 화합물의 농도를 감소시키는 단계는 동시에 일어난다.

전술한 방법들과 본원에 설명된 다른 방법들 각각의 어떤 구체예에서, 단계 (b) 이후 20시간째에, 얻어진 혼합물의 적혈구(RBC)는 염기를 사용하지 않은 것을 제외하고는 동일한 조건에서 동일한 방법으로부터 얻어진 적혈구의 ABC 값과 비교하여, 65% 미만의 항-병원체 불활성화 화합물 항체 결합 능력(ABC)을 가진다. 어떤 구체예에서, RBC는 약 50,000 미만의 평균 ABC를 가진다. 어떤 구체예에서, RBC는 약 40,000 미만의 평균 ABC를 가진다. 어떤 구체예에서, RBC는 약 25,000 내지 70,000의 평균 ABC를 가진다. 어떤 구체예에서, RBC는 약 35,000 내지 45,000의 평균 ABC를 가진다. 어떤 구체예에서, 얻어진 혼합물의 RBC는 단계 (c) 이후 1% 미만의 용혈반응을 가진다. 어떤 구체예에서, RBC는 단계 (c) 이후 4℃에서 42일(또는 28일)째에 1% 미만의 용혈반응을 가진다. 어떤 구체예에서, 얻어진 혼합물의 RBC는 단계 (c) 이후 50%를 초과하는 충전세포용적(PCV)을 가진다. 어떤 구체예에서, RBC는 단계 (c) 이후 4℃에서 42일(또는 28)일 후에 140(또는 150)을 초과하는 중간 혈구 취약성(Median Corpuscular Fragility) 값을 가진다. 어떤 구체예에서, 병원체 불활성화 화합물의 양은 감소되지 않고 및/또는 병원체 불활성화 화합물은 화합물 흡착 장치(CAD)와 접촉되지 않는다.

추가의 양태에서, 본 발명은, a) i) 병원체-불활성화 화합물과 반응할 수 있는 퀀처와 ii) 적혈구의 혼합물을 포함하는 적혈구 조성물을 제공하는 단계; 및 b) 원래 퀀처 농도에서 혼합물의 저장으로 인해 생기는 적혈구 탈수 수준에 비하여, 혼합물의 저장으로 인해 생기는 적혈구 탈수 수준을 감소시키는 양까지 혼합물 중의 퀀처의 농도(및 선택적으로 병원체-불활성화 화합물 및/또는 그것의 부산물의 농도)를 충분히 감소시키는 단계를 포함하는, 적혈구의 탈수를 감소시키는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 퀀처는 시스테인 또는 시스테인 유도체를 포함한다. 어떤 구체예에서, 퀀처는 글루타티온 또는 제약학적으로 허용되는 그것의 염이다. 어떤 구체예에서, 단계 (b)에서 얻어진 혼합물 중 퀀처는 약 10mM 미만의 농도이다. 어떤 구체예에서, 퀀처 농도는 약 8mM 미만이다. 어떤 구체예에서, 퀀처 농도는 약 6mM 미만, 또는 약 2mM 미만이다. 어떤 구체예에서, 얻어진 혼합물의 적혈구(RBC)는 단계 (b) 이후 1% 미만의 용혈반응을 가진다. 어떤 구체예에서, RBC는 단계 (b) 이후 4℃에서 42일(또는 28일)째에 1% 미만의 용혈반응을 가진다. 어떤 구체예에서, 얻어진 혼합물의 RBC는 단계 (b) 이후 50%를 초과하는 충전세포용적(PCV)을 가진다. 어떤 구체예에서, 얻어진 혼합물의 RBC는 단계 (b) 이후 4℃에서 42일(또는 28일)째에 50%를 초과하는 PCV를 가진다. 어떤 구체예에서, 얻어진 혼합물의 RBC는 단계 (b) 이후 4℃에서 42일(또는 28일) 후에 140(또는 150)을 초과하는 중간 혈구 취약성 값을 가진다. 어떤 구체예에서, 혼합물의 저장은 4℃에서 10일을 초과하는 동안의 혼합물의 저장이다. 어떤 구체예에서, 혼합물의 저장은 4℃에서 42일(또는 28일)을 초과하는 동안의 혼합물의 저장이다. 어떤 구체예에서, 병원체 불활성화 화합물의 양은 감소되지 않고 및/또는 병원체 불활성화 화합물은 화합물 흡착 장치(CAD)와 접촉되지 않는다.

전술한 방법들 각각에 의해 제조된 적혈구(RBC) 조성물이 제공된다. 전술한 방법들 각각에 의해 제조할 수 있는 RBC 조성물이 또한 제공된다.

추가의 양태에서, 본 발명은 a) 병원체-불활성화 화합물의 친전자성 기와 공유 반응한 적혈구; 및 b) 병원체-불활성화 화합물과 반응할 수 있는 티올기를 포함하는 퀀처를 포함하는 조성물을 제공하며, 이 조성물은 4℃에서 42일(또는 28일)까지 저장 후 인체에 주입하기에 적합하다. 어떤 구체예에서, 병원체가 존재할 경우 적어도 1 log의 병원체가 불활성화된다. 어떤 구체예에서, 적어도 3 log가 불활성화된다. 어떤 구체예에서, 친전자성 기는 머스터드, 머스터드 중간체, 또는 머스터드 등가물이다. 어떤 구체예에서, 친전자성 기는 아지리디늄 이온이거나, 또는 아지리디늄 이온을 형성할 수 있다. 어떤 구체예에서, 친전자성 기는 핵산과 반응할 수 있다. 어떤 구체예에서, 친전자성 기는 적혈구의 세포 표면과 공유 반응된다. 어떤 구체예에서, 병원체-불활성화 화합물은 핵산 결합 리간드를 더 포함한다. 어떤 구체예에서, 핵산 결합 리간드는 인터칼레이터이다. 어떤 구체예에서, 인터칼레이터는 아크리딘이다. 어떤 구체예에서, 병원체-불활성화 화합물은 친전자성 기와 핵산 결합 리간드를 연결하는 취약성 링커를 포함한다. 어떤 구체예에서, 병원체-불활성화 화합물은 β-알라닌, N-(아크리딘-9-일), 2-[비스(2-클로로에틸)아미노]에틸에스테르이다. 어떤 구체예에서, 퀀처는 시스테인 또는 시스테인 유도체를 포함한다. 어떤 구체예에서, 퀀처는 글루타티온 또는 제약학적으로 허용되는 그것의 염이다. 어떤 구체예에서, 퀀처는 저장 동안 적혈구 탈수를 피하거나 최소화할 만큼 충분히 낮은 농도이다. 어떤 구체예에서, 퀀처 농도는 약 10mM 미만이다. 어떤 구체예에서, 퀀처 농도는 약 8mM 미만이다. 어떤 구체예에서, 퀀처 농도는 약 6mM 미만, 또는 약 2mM 미만이다. 어떤 구체예에서, 적혈구(RBC)는 55%를 초과하는 충전세포용적(PCV)을 가진다. 어떤 구체예에서, RBC는 60%를 초과하는 PCV를 가진다. 어떤 구체예에서, RBC는 약 50,000 미만의 평균 항체 결합 능력(ABC)을 가진다. 어떤 구체예에서, RBC는 약 40,000 미만의 평균 ABC를 가진다. 어떤 구체예에서, RBC는 약 25,000 내지 60,000의 평균 ABC를 가진다. 어떤 구체예에서, RBC는 약 25,000 내지 70,000의 평균 ABC를 가진다. 어떤 구체예에서, RBC는 35,000 내지 45,000의 평균 ABC를 가진다. 어떤 구체예에서, 조성물은 첨가제 용액(예를 들어, 표 2에 설명된 어떤 첨가제 용액, 및/또는 염화나트륨, 아데닌, 글루코오스, 포스페이트, 구아노신, 시트레이트 및/또는 만니톨을 포함하는 첨가제 용액)을 더 포함한다. 어떤 구체예에서, 첨가제 용액 및/또는 조성물의 염화물 농도는 약 100mM(또는 약 125mM)을 초과한다.

추가의 양태에서, 본 발명은, a) 전술한 적혈구 조성물 또는 본원에 설명된 방법들 중 어느 하나에 의해서 제조된 적혈구 조성물 중 어느 하나를 제공하는 단계; 및 b) 개체에 적혈구 조성물을 주입하는 단계를 포함하는, 개체에 적혈구를 주입하는 방법을 제공한다.

한 양태에서, 본 발명은, (i) 반응성 친전자성 기인 작용기, 또는 반응성 친전자성 기를 형성하는 작용기를 포함하는 병원체-불활성화 화합물(예를 들어, 병원체가 존재할 경우 병원체를 불활성화할 수 있는 유효량의 병원체-불활성화 화합물); (ii) 병원체-불활성화 화합물의 반응성 친전자성 기와 반응할 수 있는 티올기를 포함하는 퀀처(예를 들어, 유효량의 퀀처); 및 (iii) 적혈구를 포함하는 조성물을 혼합하는 단계; 및 (b)원래 퀀처 농도에서 혼합물의 저장으로 인해 생기는 적혈구 탈수 수준에 비하여, 혼합물의 저장으로 인해 생기는 적혈구 탈수 수준을 감소시키는 양까지 혼합물 중의 퀀처 농도를 충분히 감소시키는 단계를 포함하는, 적혈구 조성물을 처리하는 방법을 제공한다. 이들 구체예 중 일부에서, 퀀처의 농도를 감소시키는 것은 불활성화 동안 사용된 용액을 제거하고, 최종 첨가제 용액(예를 들어, SAG-M, AS-5 또는 표 2, 3 또는 4의 어떤 용액과 같은 본원에 설명된 어떤 용액)을 첨가하는 것을 포함한다. 상기 방법은 상기 열거된 또는 본원에 열거된 구체예들 중 어느 하나 이상을 포함할 수 있다.

어떤 구체예에서, 방법은 적합한 염기와 적혈구를 포함하는 조성물을 혼합하는 단계를 더 포함하고, 염기는 염기가 없는 혼합물에 비하여, 혼합물 중에서 병원체-불활성화 화합물과 적혈구의 원치않는 반응의 수준을 감소시킬 수 있는 충분한 양이다. 어떤 구체예에서, 병원체-불활성화 화합물과 적혈구의 원치않는 반응은 병원체-불활성화 화합물에 의한 적혈구 표면의 변형이다. 어떤 구체예에서, 방법은 적합한 염기와 적혈구를 포함하는 조성물을 혼합하는 단계를 더 포함하고, 염기는 염기가 없는 혼합물에 비하여, 적어도 약 5%(또는 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 90%)까지 얻어진 혼합물 중에서 처리된 적혈구 조성물과 결합한 항-병원체-불활성화 화합물 항체의 수준을 감소시킬 수 있는 충분한 양이다.

한 양태에서, 본 발명은 적혈구 조성물 중에서 탈수를 감소시키는 방법을 제공하며, 여기서 조성물은 병원체-불활성화 화합물과 반응할 수 있는 퀀처와 적혈구를 포함하는 혼합물이고, 방법은 원래 퀀처 농도에서 혼합물의 저장으로 인해 생기는 적혈구 탈수 수준에 비하여, 혼합물의 저장으로 인해 생기는 적혈구 탈수 수준을 감소시키는 양까지 혼합물 중의 퀀처 농도를 충분히 감소시키는 단계를 포함한다.

다른 양태에서, 본 발명은 본원에 설명된 적혈구 조성물을 개체에 주입하는 단계를 포함하는, 적혈구 주입 방법을 제공한다.

도 1은 실시예 6에 설명된 대로 초기 퀀처 첨가한 후에 다양한 염기 수준에서 적혈구의 삼투 취약성을 나타낸다.
도 2는 20시간 인큐베이션했을 때 다양한 염기 수준에서 적혈구 밀도를 나타낸다.
도 3은 인큐베이션 후와 36일 저장 후에 다양한 염기 수준에서 적혈구 밀도를 나타낸다.
도 4는 퀀처 농도를 감소시켰을 때와 그렇지 않았을 때(즉, 교환 단계의 유/무)의 인큐베이션 후와 36일 저장 후에 적혈구의 삼투 취약성을 나타낸다.
도 5는 중간 정도의 초기 퀀처 농도(교환 단계 무)와 비교하여 초기 퀀처 농도를 변경했을 때(교환 단계 유)의 인큐베이션 후와 42일 저장 후에 적혈구의 삼투 취약성을 나타낸다.
도 6은 병원체-활성화 화합물이 있을 때와 없을 때의 인큐베이션 후와 36일 저장 후에 적혈구의 삼투 취약성을 나타낸다.
도 7은 본 발명의 방법을 사용한 몇 개의 적혈구 제제에 대한 항체 결합 능력(ABC) 값을 나타낸다.

본 발명은 원치않는 부반응(바람직하지 않은 면역반응을 유도하는 적혈구의 변형 같은)을 감소시키거나 최소화하면서 그리고 처리 도중과 처리 후에 세포 생육력 및/또는 수명에 대한 불리한 효과(예를 들어, 감소된 삼투 취약성 및/또는 증가된 탈수)를 감소시키거나 최소화하면서, 병원체가 존재할 경우 병원체를 불활성화하기 위해 적혈구 조성물을 처리하는 방법을 제공한다. 본 출원자는 병원균 불활성화 과정 동안에 적합한 양의 퀀처와 함께 pH의 적합한 조절이 병원체-불활성화 화합물로 처리된 적혈구의 초기 탈수를 감소시킬 수 있다는 것을 알았다. 다음에, 상기 과정에 이어서 초기 퀀처 농도를 감소시킴으로써 삼투 취약성에 유의한 변화 없이 세포 저장이 가능한 건강한 병원체-불활성화된 적혈구가 얻어진다. 이들 방법은 병원체가 임상 사용 동안 불활성화되는 적혈구 조성물의 제조에, 특히 조성물이 임상 사용 전에 일정 시간 기간 동안 저장되어야 할 때 특히 적합하다.

따라서, 한 양태에서, 본 발명은 (1) 병원체-불활성화 화합물 및 퀀처와 적혈구를 포함하는 조성물을 혼합하는 단계; 및 (2) 원래 농도에서 혼합물의 저장으로 인해 생기는 적혈구 탈수 수준에 비하여, 혼합물의 저장으로 인해 생기는 적혈구 탈수 수준을 감소시킬 수 있을 만큼 퀀처 농도를 충분히 감소시키는 단계에 의한, 병원체-불활성화 화합물 및 퀀처를 포함하는 적혈구 조성물을 처리하는 방법을 제공한다.

다른 양태에서, 본 발명은 적혈구에서 탈수를 감소시키고 및/또는 삼투 취약성을 증가시키는 방법 및 적혈구를 인체에 주입하는 방법을 제공한다. 또한, 처리된 적혈구 조성물이 제공된다.

적혈구

본 발명의 적혈구 조성물은, 제한은 아니지만, 적혈구를 포함하는 어떤 혈액 제품(예를 들어, 사람 혈액)을 포함하며, 여기서 혈액 제품은 사람, 포유류 및/또는 척추동물에서 사용하기에, 예를 들어 주입하기에 적합한 적혈구를 제공하거나, 또는 그것을 제공하도록 가공된다. 적혈구 조성물은, 예를 들어 전혈 및 적혈구 농축물, 예를 들어 충전 적혈구(pRBC; 예를 들어, 적혈구용적율은 증가되고 및/또는 첨가제 용액은 함유하지 않는 적혈구)를 포함한다. 적혈구 조성물은 조성물 중 적혈구 농도의 측정값인 적혈구용적율 또는 충전세포용적(PCV)에 의해서 설명될 수 있다. 적혈구 조성물은 약 1 내지 100%, 더 가능성 있게는 약 10 내지 90%, 또한 약 35 내지 80%, 또는 약 40 내지 70% 범위의 적혈구용적율을 가질 수 있다. 이러한 적혈구 조성물은 화학물질, 예를 들어 병원체-불활성화 화합물 및 퀀처를 포함할 수 있다. 또한, 이들은 버퍼 및 다른 용액, 예를 들어 염이나 완충 용액을 포함하는 적혈구 첨가제 용액(예를 들어, SAG-M, AS-5 또는 표 2, 3 또는 4의 어떤 용액과 같은 본원에 설명된 어떤 용액)을 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서, 본원에 설명된 적혈구 조성물은 본원에 설명된 처리 방법에 사용하기 전에 약 70 내지 90%, 또는 약 75 내지 85%, 또는 약 80% 범위의 적혈구용적율을 갖는 충전 적혈구이다. 어떤 구체예에서, 적혈구 조성물은 본원에 설명된 처리 방법에 사용하기 전에 및/또는 사용하는 동안에 약 50 내지 70%, 또는 약 55 내지 65%, 또는 약 60% 범위의 적혈구용적율을 갖는 비충전 적혈구이다. 어떤 구체예에서, 적혈구 조성물은 희석제 용액으로 희석되며, 본원에 설명된 처리 방법에 사용하기 전에 및/또는 사용하는 동안에 약 30 내지 50%, 또는 약 35 내지 45%, 또는 약 40% 범위의 적혈구용적율을 가진다. 어떤 구체예에서, 본원에 설명된 적혈구 조성물은 본원에 설명된 처리 방법에 사용하기 전에 백혈구 감소된다. 어떤 구체예에서, 적혈구 조성물은 백혈구 감소되지 않는다. 살아 있는 사람, 포유류 또는 척추동물과 접촉되거나 그것에 도입될 예정인 어떤 적혈구 조성물에서, 이러한 접촉이 병원체 오염으로 인해 질환을 전파할 위험을 지닌 경우에, 적혈구 조성물이 본원에 개시된 대로 처리될 수 있다.

혈액 병원체

본 발명의 방법에서 불활성화될 수 있는 병원체 오염물은, 그것이 존재할 경우, 사람, 다른 포유류, 또는 척추동물에서 질환을 일으킬 수 있는 어떤 핵산-함유 인자를 포함한다. 병원체성 인자는 단세포성 또는 다세포성일 수 있다. 병원체의 예들은 사람, 다른 포유류, 또는 척추동물에서 질환을 일으키는 박테리아, 바이러스, 원충, 진균, 효모, 곰팡이 및 미코플라스마이다. 병원체의 유전자 물질은 DNA 또는 RNA일 수 있으며, 유전자 물질은 단일-가닥 또는 이중-가닥 핵산으로서 존재할 수 있다. 표 1에 바이러스의 예들이 나열되며, 이것은 어떤 식으로도 본 발명을 제한하지는 않는다.

가능한 병원체 오염물을 불활성화하는 것에 더하여, 본 발명의 방법은 또한 적혈구 조성물에 존재할 수 있는 백혈구를 불활성화할 수 있다. 백혈구가 수여자에서 원치않는 면역반응을 초래할 수 있기 때문에 백혈구 감소 방법이 주입용의 적혈구 조성물에서 백혈구의 대부분을 바람직하게 제거하는데 사용되곤 한다. 그러나, 모든 혈액이 백혈구 감소되는 것은 아니며, 또는 백혈구 감소 방법이 모든 백혈구를 제거할 수 있는 것은 아니다. 따라서, 본원에 설명된 본 발명의 방법에 의한 어떤 잔류 백혈구의 불활성화가 이러한 면역반응의 위험을 더욱 감소시킬 수 있다.

병원체-불활성화 화합물

적혈구 조성물에 존재하는 병원체의 불활성화는 적혈구 조성물 중의 병원체와 병원체-불활성화 화합물을 접촉시킴으로써 행해진다. 본원에 설명된 구체예들 중 어느 것에서, 병원체-불활성화 화합물(예를 들어, 본원에 설명된 S-303)은 유효량으로 존재할 수 있다(예를 들어, 병원체를 불활성화할 수 있는 유효량, 예를 들어 병원체가 존재할 경우 적혈구 조성물 중의, 예를 들어 적어도 1 log, 2 log, 또는 3 log의 병원체를 불활성화하기에 충분한 양). 본 발명의 방법에 의해 사용될 수 있는 병원체-불활성화 화합물은, 친전자성 기와 같은 반응성 기이거나, 또는 이러한 반응성 기를, 예를 들어 원위치 형성할 수 있고, 형성하고 있는 작용기를 포함하는 화합물을 포함한다. 어떤 경우, 본 발명의 병원체-불활성화 화합물은 반응성이 되도록 광활성화활 필요가 없다. 예를 들어, 작용기는 머스터드 기, 머스터드 기 중간체, 머스터드 기 등가물, 에폭시드, 포름알데히드, 또는 포름알데히드 신톤일 수 있다. 이러한 작용기는 친전자성 아지리딘, 아지리디늄, 티이란 또는 티이라늄 이온과 같은 반응성 기를 원위치 형성할 수 있다. 머스터드 기는 모노- 또는 비스-(할로에틸)아민기 또는 모노-(할로에틸)술피드 기일 수 있다. 머스터드 등가물은 머스터드와 유사한 기전에 의해 반응하는, 예를 들어 아지리디늄 및 아지리딘 기 또는 티이란 및 티이라늄 기와 같은 반응성 중간체를 형성함으로써 반응하는 기이다. 예들은 아지리딘 유도체, 모노- 또는 비스-(메실에틸)아민 기, 모노-(메실에틸)술피드 기, 모노- 또는 비스-(토실에틸)아민 기 및 모노-(토실에틸)술피드 기를 포함한다. 포름알데히드 신톤은 포름알데히드로 화학변화를 일으키는 어떤 화합물이며, 히드록실아민, 예를 들어 히드록시메틸글리신을 포함한다. 병원체-불활성화 화합물의 반응성 기는 병원체의 핵산과, 예를 들어 핵산 상의 친핵성 기와 반응할 수 있다. 또한, 반응성 기는 퀀처의 친핵성 기와 반응할 수 있다. 또한, 병원체-불활성화 화합물은 화합물을 핵산, 예를 들어 앵커 부분에 표적화하는 성분을 포함할 수 있다. 앵커 부분은 핵산 생체중합체, 예를 들어 DNA 또는 RNA와 비공유 결합할 수 있는 부분을 포함하며, 핵산 결합 리간드, 핵산 결합기, 또는 핵산 결합 부분이라고도 한다. 이러한 화합물의 예들은 U.S. 특허 Nos. 5,691,132, 6,410,219, 6,136,586, 6,617,157 및 6,709,810에 설명되며, 이들 각각은 참고자료로 본원에 포함된다. 본 발명의 방법에 의해 퀀칭될 수 있는 병원체-불활성화 화합물의 다른 부류는 가수분해 가능한 링커를 통해서 핵산 결합기에 연결된 상기 언급된 반응성 기들을 포함하며, 이들은 본원에 참고자료로 포함되는 U.S. 특허 No. 6,514,987에 설명된다. 병원체-불활성화 화합물의 앵커 부분은 핵산에 대해 친화성을 가진다. 이 친화성은, 제한은 아니지만, 인터칼레이션, 마이너 그루브 결합, 메이저 그루브 결합, 및 정전기적 결합(예를 들어, 포스페이트 백본 결합)을 포함하는 비공유적으로 핵산과 결합하는 몇 가지 방식 중 어느 것으로 인한 것일 수 있다. 또한, 친화성은 혼합된 결합 방식(예를 들어, 인터칼레이션과 마이너 그루브 결합)으로 인한 것일 수 있다. 결합은 서열-특이적(즉, 다른 핵산 서열에 비해서 하나 이상의 특정 핵산 서열에 대한 증가된 결합 친화성)일 수도 있고, 서열-특이적이 아닐 수도 있다. 이러한 핵산 결합 부분에 대한 상세한 예들은 상기 언급된 특허들에서 찾을 수 있다.

본원에 설명된 방법, 조성물 및 키트들 각각의 어떤 구체예에서, 병원체-불활성화 화합물은 선택된 퀀처의 친핵체와 반응하는 반응성 친전자성 기이거나, 또는 이러한 기를 형성하는 작용기를 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서, 병원체-불활성화 기는 핵산 결합 리간드와 친전자성 기이거나, 또는 친전자성 기를 형성하는 작용기를 포함한다.

본 발명에서 사용하기 위한 적합한 병원체-불활성화 화합물의 특정 예는 β-알라닌, N-(아크리딘-9-일), 2-[비스(2-클로로에틸)아미노]에틸에스테르(본원에서는 "S-303"이라고 하기도 한다)이며, 이것의 구조는 그것의 염을 포함해서 다음과 같다.

어떤 구체예에서, 적혈구 조성물 및 퀀처와의 혼합물 중 S-303과 같은 병원체-불활성화 화합물의 농도는 약 0.05mM 내지 4mM, 약 0.05mM 내지 2mM, 약 0.05mM 내지 0.5mM, 약 0.1mM 내지 0.3mM, 또는 약 0.2mM의 범위이다. 어떤 구체예에서, 퀀처 대 병원체 불활성화 화합물의 몰비는, 일단 두 성분이 모두 적혈구 조성물과 혼합된 후에, 약 10:1 내지 약 400:1, 또한 약 10:1 내지 약 200:1, 또한 약 20:1 내지 약 200:1, 또한 약 50:1 내지 약 200:1, 또한 약 100:1이다.

퀀처

본 발명의 방법에서 사용하기 위한 퀀처는 병원체를 불활성화하는데 사용된 반응성 친전자성 종들의 원치않는 부반응을 감소시키려는 목적을 가진다(예를 들어, 바람직하지 않은 면역반응을 유도할 수 있는 병원체-불활성화 화합물과 RBC 표면의 결합). 본원에 설명된 구체예들 중 어느 것에서, 퀀처(예를 들어, 본원에 설명된 글루타티온)는 유효량으로 존재할 수 있다(예를 들어, 본원에 설명된 양과 같은 원치않는 부반응을 감소시킬 수 있는 유효량). 적합한 퀀처는 병원체-불활성화 화합물의 친전자성 기와 반응할 수 있는 친핵성 기를 포함한다. 비제한적인 예들이 본원에 그 전문이 참고자료로 포함되는 U.S. 특허 No. 6,709,810에 상세히 설명된다. 어떤 구체예에서, 퀀처는 병원체-불활성화 화합물이 적혈구 조성물을 오염시킬 수 있는 병원체를 충분히 불활성화할 수 있도록 하면서 적혈구 조성물 중에서 원치않는 부반응을 유의하게 감소시킬 수 있다. 어떤 구체예에서, 본 발명의 개선된 방법은 세포 삼투 취약성의 유의한 변경 없이(예를 들어, 감소 없이) 그리고 탈수의 유의한 변경 없이(예를 들어, 증가 없이) 충분한 병원체 불활성화와 조합된 원치않는 부반응(예를 들어, 병원체-불활성화 화합물의 결합)의 최적 감소를 제공하는 조건에서 유효량의 병원체-불활성화 화합물과 조합된 유효량의 퀀처를 제공한다. 병원체-불활성화 화합물과 단백질 및/또는 적혈구 성분의 반응과 같은 다양한 원치않는 부반응이 감소될 수 있다. 어떤 구체예에서, 퀀처는 IgG와 적혈구의 결합 또는 병원체-불활성화 화합물과 적혈구의 결합과 같은 적혈구 변형의 최적 감소를 제공한다. 본 발명의 방법은 적혈구 조성물의 생체외 처리를 수반하지만, 일부 퀀처가 개체에 도입시 조성물에 남아 있을 수 있다. 이와 같이, 어떤 구체예에서, 본 발명의 퀀처는 주입하기에 적합하다. 적합한 퀀처는, 제한은 아니지만, 아미노산 시스테인 또는 N-아세틸 시스테인 같은 적합한 시스테인 유도체를 포함하는 퀀처와 같은, 티올기를 포함하는 화합물을 포함한다. 이러한 퀀처의 예들은 시스테인 및 적어도 하나의 시스테인을 포함하는 펩티드, 예를 들어 글루타티온을 포함한다. 어떤 구체예에서, 적합한 퀀처는 추가 화학물질의 사용이나 효소의 첨가와 무관하게 티올기를 원위치 형성할 수 있는 시스테인 유도체, 예를 들어 S-아세틸 시스테인 또는 다른 적합한 티올 유래 시스테인 프로드러그, 또는 S-아세틸 시스테인 또는 다른 적합한 티올 유래 시스테인 프로드러그를 포함한다. 적합한 시스테인 유도체는 병원체-불활성화 화합물의 친전자성 기와 반응할 수 있는 시스테이닐 티올을 포함하거나, 또는 그것을 원위치 형성할 수 있는 것들이다.

어떤 구체예에서, 퀀처는 2-10개 아미노산의 펩티드이며, 아미노산 중 적어도 하나는 시스테인, N-아세틸 시스테인, S-아세틸 시스테인, 또는 다른 적합한 시스테인 유도체이다. 어떤 구체예에서, 퀀처는 적어도 3개 아미노산, 예를 들어 약 3-10개 아미노산, 또한 약 3-6개 아미노산의 펩티드이며, 아미노산 중 적어도 하나는 시스테인, N-아세틸 시스테인, S-아세틸 시스테인, 또는 다른 적합한 시스테인 유도체이다. 어떤 구체예에서, 퀀처는 적어도 3개 아미노산, 예를 들어 약 3-10개 아미노산, 또한 약 3-6개 아미노산의 펩티드이며, 아미노산 중 적어도 하나는 시스테인, N-아세틸 시스테인, S-아세틸 시스테인, 또는 다른 적합한 시스테인 유도체이고, 또한 아미노산 중 적어도 2개 또는 적어도 3개는 시스테인, N-아세틸 시스테인, S-아세틸 시스테인, 또는 다른 적합한 시스테인 유도체이다.

바람직한 구체예에서, 퀀처는 중화된 글루타티온이다(L-글루타티온 및 γ-L-글루타밀-L-시스테이닐-글리신이라고도 알려져 있다). 글루타티온은 퀀처로서 특히 유용하게 하는 많은 특성들을 가진다. 이것은 모든 세포 타입에 정상적으로 존재한다. 그것은 박테리아 및 지질-외피보유 바이러스의 세포막 또는 지질 코팅을 통과하거나, 또는 비-외피보유 바이러스의 바이러스 캡시드를 통과하는 것에 의해서와 같이, 병원체에 수동적으로 침투할 수 있다고 생각되지 않는다. 대략 중성의 pH에서 글루타티온은 하전되며, 능동 수송의 부재시에는 어떤 유의한 정도로 지질 이중층을 침투하지 못한다. 이것은 2mM를 초과하는 농도의 중화된 글루타티온의 사용을 포함하여, 글루타티온에 의해 실질적으로 영향받지 않는 HIV 및 VSV와 같은 지질-외피보유 바이러스의 불활성화와 부합된다. 글루타티온의 사용은, 예를 들어 Yersinia enterocolitica, Staphylococcus epidermidis 및 Serratia marcescens의 불활성화에 대해 어떤 효과를 가진다. 그러나, 이것은 유효량의 중화된 글루타티온과 병원체-불활성화 화합물을 사용함으로써 관리될 수 있다. 이와 같이, 바이러스 또는 박테리아 병원체에 의한 적혈구 조성물의 오염이 적어도 2 log, 바람직하게는 적어도 3 log까지 불활성화되는 바람직한 퀀칭 방법이 제공된다. 어떤 구체예에서, Staphylococcus epidermidis는 적어도 3 log, 또한 약 4 log, 또는 약 5 log까지 불활성화될 수 있고, VSV는 적어도 4 log, 또한 약 5 log, 또는 약 6 log까지 불활성화될 수 있다. 어떤 구체예에서, Staphylococcus epidermidis의 S-303에 의한 불활성화는 약 3 log, 또한 약 2 log, 또는 약 1 log, 또는 2mM 산성 글루타티온과 0.2mM S-303을 사용하여 불활성화된 유사한 조성물의 값과 본질적으로 동등한 범위 내이다. 어떤 구체예에서, VSV의 S-303에 의한 불활성화는 약 2 log, 또는 약 1 log, 또는 2mM 산성 글루타티온과 0.2mM S-303을 사용하여 불활성화된 유사한 조성물의 값과 본질적으로 동등한 범위 내이다. 본 발명에 의해 설명된 대로, 적합한 조건에서, 글루타티온은 또한 적혈구의 시험관내 저장과 양립될 수 있으며, 얻어진 적혈구 조성물은 생체내 도입하기에 적합하다.

어떤 구체예에서, 퀀처는 환원된 형태의 글루타티온이다. 글루타티온 이황화물이 적혈구 조성물을 포함하는 혼합물에 그 용액을 첨가하기 전에 용액 중에서 충분히 환원되거나, 또는 적혈구 조성물을 포함하는 혼합물에 첨가한 후에 충분히 환원되기만 한다면, 글루타티온의 산화된 형태인 글루타티온 이황화물도 사용될 수 있다.

어떤 구체예에서, 퀀처는 글루타티온 유도체, 예를 들어 글루타티온 모노알킬에스테르 또는 디알킬에스테르이며, 여기서 알킬기는 1-10개 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 기이다. 알킬기의 특정 예들은, 제한은 아니지만, 메틸기, 에틸기, 프로필기, 이소프로필기, 부틸기, 이소부틸기, tert-부틸기, 펜틸기, 이소펜틸기, 네오펜틸기, tert-펜틸기, 1-메틸부틸기, 헥실기, 이소헥실기, 2-메틸펜틸기, 1-에틸부틸기, 헵틸기, 옥틸기, 논일기, 및 데실기를 포함한다. 예를 들어, 글루타티온 유도체의 비제한적 예들은 글루타티온 메틸에스테르, 글루타티온 모노에틸에스테르, 및 글루타티온 모노이소프로필에스테르를 포함한다. 어떤 구체예에서, 글루타티온 산화 디에틸에스테르(GSSG-(글리실)-디에틸에스테르)가 사용된다. 어떤 구체예에서, 글루타티온의 티오에스테르가 적혈구 조성물에 첨가된 후 가수분해되어 티올을 형성한다.

어떤 구체예에서는 퀀처가 자유 산 또는 염기의 형태로 제공되고, 다른 구체예에서는 퀀처가 염의 형태로 제공된다는 것이 이해된다. 퀀처가 염의 형태일 경우, 바람직하게 염은 제약학적으로 허용되는 염이다. 화합물의 제약학적으로 허용되는 염(수용성 또는 지용성 또는 분산성 산물)은, 예를 들어 무기 또는 유기 산 또는 염기로부터 형성되는 종래의 비독성 염들 또는 4차 암모늄 염들을 포함한다. 이러한 산 부가 염들의 예는 아세테이트, 아디페이트, 알기네이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 벤젠술포네이트, 바이술페이트, 부티레이트, 시트레이트, 캄포레이트, 캄포술포네이트, 시클로펜탄프로피오네이트, 디글루코네이트, 도데실술페이트, 에탄술포네이트, 푸마레이트, 글루코헵타노에이트, 글리세로포스페이트, 헤미술페이트, 헵타노에이트, 헥사노에이트, 염산염, 브롬화수소산염, 요오드화수소산염, 2-히드록시에탄술포네이트, 락테이트, 말레에이트, 메탄술포네이트, 2-나프탈렌술포네이트, 니코티네이트, 옥살레이트, 파모에이트, 펙티네이트, 퍼술페이트, 3-페닐프로피오네이트, 포스페이트, 피크레이트, 피발레이트, 프로피오네이트, 숙시네이트, 타르트레이트, 티오시아네이트, 토실레이트, 및 운데카노에이트를 포함한다. 염기 염들은 암모늄염, 알칼리 금속염, 예를 들어 나트륨 및 칼륨 염, 알칼리 토금속염, 예를 들어 칼슘 및 마그네슘 염, 유기 염기와의 염, 예를 들어 디시클로헥실아민 염, N-메틸-D-글루카민, 및 아르기닌, 리신 등과 같은 아미노산과의 염들을 포함한다. 또한, 염기성 질소-함유 기들이 저급 알킬 할로겐화물, 예를 들어 메틸, 에틸, 프로필, 및 부틸 염화물, 브롬화물 및 요오드화물; 디알킬 술페이트, 예를 들어 디메틸, 디에틸, 디부틸; 및 디아밀 술페이트, 장쇄 할로겐화물, 예를 들어 데실, 라우릴, 미리스틸 및 스테아릴 염화물, 브롬화물 및 요오스화물, 아랄킬 할로겐화물, 예를 들어 벤질 및 페네틸 브롬화물 및 기타 등등의 제제와 4차화될 수 있다. 다른 제약학적으로 허용되는 염은 술페이트 염 에탄올레이트 및 술페이트 염을 포함한다.

예를 들어, 어떤 구체예에서, 퀀처는 글루타티온으로부터 형성된 제약학적으로 허용되는 염의 형태이다. 어떤 구체예에서, 퀀처는 글루타티온과 하나 이상의 양이온, 예를 들어 나트륨, 알루미늄, 칼슘, 리튬, 마그네슘, 아연, 또는 테트라메틸암모늄으로부터 형성된 제약학적으로 허용되는 염의 형태이다. 어떤 구체예에서, 퀀처는 글루타티온(환원된)이고, 글루타티온 일나트륨염의 형태로 제공된다(예를 들어, 이탈리아의 Biomedica Foscama로부터 입수가능함). 어떤 다른 구체예에서, 글루타티온(환원된)은 글루타티온 염산염의 형태로 제공된다. 어떤 다른 구체예에서, 글루타티온은 글루타티온(환원된) 이나트륨염의 형태로 제공된다. 추가의 구체예에서, 글루타티온 모노알킬에스테르 술페이트가 사용된다. 어떤 구체예에서, 글루타티온은 글루타티온 산화 이나트륨염의 형태로 제공된다.

불활성화 및 퀀칭 방법

본 발명의 방법은 적혈구 조성물과 병원체-불활성화 화합물 및 퀀처의 혼합시 얻어진 조성물의 pH가 처리된 혈액 제품의 생육력(예를 들어, 삼투 취약성 및 탈수)에 대해 제한된 영향을 미치거나 영향을 미치지 않으면서 충분한 병원체 불활성화 및 원치않는 부반응(예를 들어, 적혈구의 변형)의 감소를 제공할 수 있는 적합한 범위가 되는 조건에서 적혈구 조성물과 병원체-불활성화 화합물 및 퀀처의 조합을 수반한다. 또한, 본 발명은 저장 동안 적혈구의 생육력 및 수명을 유지하는데 도움이 되도록 병원체 불활성화 기간 후 적혈구 조성물 중 퀀처 농도를 감소시키는 것을 설명한다. 또한, 본원에 설명된 첨가제 용액이 저장 동안 적혈구에 이용될 수 있으며, 병원체 불활성화 동안 사용된 처리 용액 및/또는 희석제 용액을 대체하는데 사용될 수 있다.

개선된 방법은 퀀칭에 중요할 수 있는 몇 가지 특징을 포함한다. 첫 번째 특징은 티올기, 또는 다른 적합한 친핵성 기이다. 두 번째는 용액의 pH의 조정이다. 용액의 pH를 적합하게 조정함으로써 어떤 퀀칭 수준을 제공하는 것이 가능하다. 이와 같이, 본 발명의 퀀처는 적혈구를 포함하는 조성물에 어떤 완충 능력을 제공하고, 완충 능력 자체는 개선된 퀀칭을 제공한다. 예를 들어, 퀀처로서 메티오닌과 같은 시스테인 유사체를 사용하면, 적혈구 조성물의 적합한 pH 변화가 제공되도록 적합하게 변형되었을 때, 병원체-불활성화 화합물과 적혈구의 결합에 대해 어떤 수준의 퀀칭이 얻어질 것이다. 메티오닌의 황 원자는 친핵성이 아니므로 메티오닌은 용액의 필요한 pH를 제공하는 것 이외의 다른 어떤 퀀칭을 제공하지는 않는다. 따라서, pH 조정과 티올기의 조합은 개선된 퀀칭을 제공한다. 또한, pH의 적절한 조정과 염기 등가물이 불활성화 기간 동안 적혈구 탈수 수준을 감소시킬 수 있다. 어떤 구체예에서 개선된 퀀칭을 제공하는데 중요할 수 있는 세 번째 특징은 바이러스 및 박테리아 같은 병원체의 내부로는 실질적으로 침투하지 않는 바람직한 퀀처의 선택이다. 이러한 퀀처는 일단 병원체 내부로 침투된 후에는 병원체-불활성화 화합물의 추가의 퀀칭 없이 적혈구 표면과의 결합 같은 유해한 반응이 일어나는 세포외 환경에서 충분한 퀀칭을 제공한다. 마지막으로, 본 발명의 개선된 퀀칭 방법은 불활성화 이후 퀀처 농도를 감소시키는 것과 일부 경우 저장용 첨가제 용액을 첨가하는 것을 포함한다. 전체적 퀀처 농도가 적합한 수준까지 감소되었을 때 적혈구는 저장 동안 개선된 수명 및 감소된 탈수 수준을 갖는 것으로 나타났다.

한 양태에서, 본 발명은, a) i) 반응성 친전자성 기인 작용기, 또는 반응성 친전자성 기를 형성하는 작용기를 포함하는 병원체-불활성화 화합물(예를 들어, 병원체가 존재할 경우 병원체를 불활성화할 수 있는 유효량의 병원체-불활성화 화합물), ii) 병원체-불활성화 화합물의 반응성 친전자성 기와 반응할 수 있는 티올기를 포함하는 퀀처(예를 들어, 본원에 설명된 퀀처의 유효량), 및 iii) 적혈구를 포함하는 조성물을 제공하는 단계; b) 병원체-불활성화 화합물 및 퀀처와 적혈구를 포함하는 조성물을 혼합하는 단계; 및 c) 원래 퀀처 농도에서 혼합물의 저장으로 인해 생기는 적혈구 탈수 수준에 비하여, 혼합물의 저장으로 인해 생기는 적혈구 탈수 수준을 감소시키는 양까지 혼합물 중의 퀀처 농도를 충분히 감소시키는 단계를 포함하는, 적혈구 조성물을 처리하는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 단계 (a)는 적합한 염기를 제공하는 단계를 더 포함하고, 단계 (b)는 이 염기와 적혈구를 포함하는 조성물을 혼합하는 단계를 더 포함하며, 염기는 염기가 없는 혼합물에 비하여, 혼합물 중에서 병원체-불활성화 화합물과 적혈구의 원치않는 반응의 수준을 감소시킬 수 있는 충분한 양이다. 어떤 구체예에서, 병원체-불활성화 화합물과 적혈구의 원치않는 반응은 병원체-불활성화 화합물에 의한 적혈구 표면의 변형이다. 어떤 구체예에서, 단계 (a)는 적합한 염기를 제공하는 단계를 더 포함하고, 단계 (b)는 이 염기와 적혈구를 포함하는 조성물을 혼합하는 단계를 더 포함하며, 염기는 염기가 없는 혼합물에 비하여, 적어도 약 5%(또는 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 90%)까지 얻어진 혼합물 중에서 처리된 적혈구 조성물과 결합한 항-병원체-불활성화 화합물 항체의 수준을 감소시킬 수 있는 충분한 양이다. 어떤 구체예에서, 혼합물의 저장은 4℃ 또는 실온에서 7, 10, 14, 21, 28, 35, 또는 42일을 초과하거나, 동등하거나, 또는 미만이다. 어떤 구체예에서, 혼합물은 첨가제 용액(예를 들어, 표 2에 설명된 어떤 첨가제 용액, 및/또는 염화나트륨, 아데닌, 글루코오스, 포스페이트, 구아노신, 시트레이트 및/또는 만니톨을 포함하는 첨가제 용액)에 저장된다. 어떤 구체예에서, 방법은 처리 동안 사용된 용액을 첨가제 용액(예를 들어, 표 2에 설명된 어떤 첨가제 용액, 및/또는 염화나트륨, 아데닌, 글루코오스, 포스페이트, 구아노신, 시트레이트 및/또는 만니톨을 포함하는 첨가제 용액)으로 대체하는 단계를 더 포함한다.

추가의 양태로서, 본 발명은, a) i) 병원체-불활성화 화합물과 반응할 수 있는 퀀처, 및 ii) 적혈구를 포함하는 적혈구 조성물을 제공하는 단계; 및 b) 원래 퀀처 농도에서 혼합물의 저장으로 인해 생기는 적혈구 탈수 수준에 비하여, 혼합물의 저장으로 인해 생기는 적혈구 탈수 수준을 감소시키는 양까지 혼합물 중의 퀀처 농도를 충분히 감소시키는 단계를 포함하는, 적혈구의 탈수를 감소시키는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 혼합물의 저장은 4℃ 또는 실온에서 7, 10, 14, 21, 28, 35, 또는 42일을 초과하거나, 동등하거나, 또는 미만이다. 어떤 구체예에서, 방법은, 예를 들어 저장 전에 첨가제 용액(예를 들어, 표 2에 설명된 어떤 첨가제 용액, 및/또는 염화나트륨, 아데닌, 글루코오스, 포스페이트, 구아노신, 시트레이트 및/또는 만니톨을 포함하는 첨가제 용액)을 첨가하는 단계를 더 포함한다.

본원에 설명된 방법에서 사용된 퀀처 및/또는 첨가된 염기(또는 중화된 퀀처)는 적혈구 조성물에 병원체-불활성화 화합물을 첨가하기 전에, 동시에, 또는 후에 적혈구 조성물과 혼합될 수 있다. 병원체-불활성화 용액이 적혈구 조성물과 혼합된 후에 퀀처와 염기(또는 중화된 퀀처)가 적혈구 조성물과 혼합되는 경우, 퀀처 및/또는 염기(또는 중화된 퀀처)는 병원체-불활성화 화합물과 적혈구의 부반응이 유의한 양으로 발생하기 전에 적혈구 조성물에 첨가되는 것이 바람직하며, 이로써 바람직하지 않은 부반응의 충분한 퀀칭이 달성될 수 있다. 어떤 구체예에서, 퀀처 및/또는 염기(또는 중화된 퀀처)는 병원체-불활성화 화합물과 적혈구 조성물을 혼합한 후 약 1시간 이내에, 약 30분 이내에, 약 20분 이내에, 약 10분 이내에, 약 5분 이내에, 약 2분 이내에, 또는 약 1분 이내에 적혈구 조성물과 혼합된다. 어떤 구체예에서, 퀀처와 염기는 병원체-불활성화 화합물과 동시에 적혈구 조성물과 혼합된다.

본원에 설명된 방법들 각각의 어떤 구체예에서, 퀀처 및 첨가된 염기(또는 중화된 퀀처)는 병원체-불활성화 화합물(예를 들어, S-303)의 첨가 전에 적합한 시간 간격 동안, 예를 들어 병원체-불활성화 화합물과 적혈구 조성물을 혼합하기 전에 약 1시간 미만, 약 30분 미만, 약 20분 미만, 약 10분 미만, 약 5분 미만, 약 2분 미만, 또는 약 1분 미만 동안 적혈구 조성물로 전처리된다. 어떤 추가의 구체예에서, 전처리는 약 1℃ 내지 30℃, 또한 약 18℃ 내지 25℃, 또는 약 37℃, 또는 약 실온의 온도에서 이루어진다.

본원에 설명된 방법들 각각의 어떤 구체예에서, 병원체-불활성화 화합물(예를 들어, S-303)은 퀀처 및 첨가된 염기(또는 중화된 퀀처)의 존재하에 적합한 시간 간격 동안, 예를 들어 약 30분 내지 48시간, 또한 약 2 내지 36시간, 또한 약 8 내지 24시간, 또한 약 20시간 동안 적혈구 조성물과 함께 인큐베이션된다. 어떤 추가의 구체예에서, 인큐베이션은 약 1℃ 내지 30℃, 또한 약 18℃ 내지 25℃, 또는 약 37℃, 또는 약 실온의 온도 범위에서 이루어진다.

적혈구 조성물의 pH 조정 특징과 관련하여, 이러한 병원체-불활성화 화합물을 퀀칭하는 이전의 방법은 불활성화 동안 퀀칭 효능과 세포 생육력 모두와 관련하여 얻어진 혼합물의 pH에 대한 중요성을 인식하지 않는다. 이전 방법은 병원체-불활성화 화합물의 원치않는 부반응을 충분히 퀀칭하기 위한 충분한 염기 및 적합한 pH 수준에 대한 필요성을 증명하였지만(예를 들어, 병원체-불활성화 화합물과 RBC 표면의 결합이 감소되도록 비-양자화된 글루타티온의 수준을 증가시킴으로써), 이들 방법은 불활성화 과정 동안 세포 탈수에 대한 증가된 염기의 효과를 깨달아 설명하지는 않는다. 따라서, 본 발명의 한 양태는 병원체-불활성화 화합물과 퀀처의 인큐베이션 동안 적합한 수준(예를 들어, 탈수에 대한 불리한 영향을 피할 수 있는 적합한 수준)까지 적혈구 조성물의 pH를 조정하는 것을 수반한다.

어떤 구체예에서, 병원체-불활성화 화합물 및 퀀처와 적혈구 조성물을 혼합했을 때, 이 혼합물의 pH는 불활성화 동안 병원체-불활성화 화합물의 원치않는 부반응(예를 들어, 바람직하지 않은 면역반응을 유도할 수 있는 병원체-불활성화 화합물과 RBC 표면의 결합)을 감소시키고, 세포 탈수를 충분히 감소시킬 수 있는 적합한 수준이다. 어떤 구체예에서, 원치않는 부반응은 병원체-불활성화 화합물에 의한 적혈구 표면의 변형이다. 어떤 구체예에서, 변형은 병원체-불활성화 화합물과 적혈구 표면의 공유 결합이다. 다른 구체예에서, 변형은 병원체-불활성화 화합물과 적혈구 표면의 비-공유 결합이다.

본원에 설명된 대로, 방법들 각각의 어떤 구체예에서, 병원체-불활성화 화합물과 적혈구의 바람직하지 않은(본원에서는 "원치않는"이라고 하기도 한다) 부반응이 감소된다. 어떤 구체예에서, 감소되는 바람직하지 않은 부반응은 병원체-불활성화 화합물에 의한 적혈구 표면의 변형이다. 어떤 구체예에서, 부반응의 수준은 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 90%까지 감소된다. 부반응의 감소는, 예를 들어 병원체-불활성화 화합물에 특이적인 항체의 처리된 적혈구와의 결합량을 측정하고 및/또는 처리된 적혈구의 생체내 수명을 측정하고, 이들 측정값을 제 2의 상이한 방법(예를 들어, 반응 혼합물에 충분한 퀀처 및/또는 염기를 첨가하지 않는 방법, 반응 혼합물에 퀀처 및/또는 염기를 전혀 첨가하지 않는 방법, 및/또는 낮은 pH에서의 처리)에 의해 처리된 적혈구와 비교함으로써 증명될 수 있다. 예를 들어, 본원에 설명된 방법들의 어떤 구체예에서, 처리된 적혈구와 결합한 항-병원체 불활성화 화합물 항체의 수준이 제 2의 방법(예를 들어, 반응 혼합물에 충분한 퀀처 및/또는 염기를 첨가하지 않는 방법, 반응 혼합물에 퀀처 및/또는 염기를 전혀 첨가하지 않는 방법, 및/또는 낮은 pH에서의 처리)에 비하여, 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 90%까지 감소된다.

어떤 구체예에서, 병원체-불활성화 화합물 및 퀀처와 적혈구 조성물을 혼합했을 때, 이 혼합물의 pH는 약 6.0 내지 8.5, 약 6.0 내지 7.5, 약 6.5 내지 7.1, 약 6.5 내지 7.0, 약 6.6 내지 6.8, 또는 약 6.6, 6.7, 6.8, 또는 6.9의 범위이다. 적혈구 조성물의 pH는 시간에 따라 변할 수 있지만, 퀀처가 적혈구 조성물에 첨가될 때는 적혈구 조성물이 병원체-불활성화 화합물을 이미 함유하고 있는지 아닌지에 상관없이 pH가 바람직한 범위인 것이 바람직하다. 본 발명의 방법은 적혈구 조성물에 병원체-불활성화 화합물 및 퀀처를 첨가하는 것을 수반한다. 바람직한 pH 범위는 적혈구 조성물에 병원체-불활성화 화합물 및/또는 퀀처를 첨가하는 순서와 상관없이 병원체-불활성화 화합물 및 퀀처 모두의 첨가시에 필요하다. 다시 말해서, 일단 세 성분이 모두 혼합된 후에 pH는 바람직한 범위 내에 있다. 어떤 구체예에서, 퀀처는 병원체-불활성화 화합물에 앞서 첨가된다. 어떤 구체예에서, 병원체-불활성화 화합물은 퀀처에 앞서 첨가된다. 어떤 구체예에서, 퀀처와 병원체-불활성화 화합물은 본질적으로 동시에 첨가된다. 따라서, 병원체-불활성화 화합물과 퀀처의 첨가시란 퀀처와 병원체-불활성화 화합물 모두 적혈구 조성물과 혼합된 때의 시점을 의미한다. 바람직한 pH는 몇 가지 수단에 의해서 달성될 수 있으며, 적혈구 조성물의 pH가 조정되는 때에 관해서 제한이 없거나, 또는 어떤 구체예에서는 혈액 제품의 자연적인 pH로부터 현저히 조정되지 않는다. 예를 들어, 적혈구 조성물의 바람직한 pH는 pH를 조정함으로써 달성될 수 있다. pH 조정은, 예를 들어 병원체-불활성화 화합물과 퀀처를 첨가하기 전에 완충 용액 같은 적합한 첨가제 용액을 첨가함으로써 행해질 수 있다. 어떤 구체예에서, 적혈구 조성물은 동일한 또는 다른 적합한 버퍼 중에 현탁되기 전에 적합한 버퍼로 1회 이상 세척될 수 있다. 또는 달리, 적혈구 조성물의 pH는 병원체-불활성화 화합물, 퀀처, 또는 이 둘 모두의 첨가와 동시에 조정될 수 있다. 어떤 구체예에서, pH는 퀀처의 첨가와 동시에 조정된다. 어떤 구체예에서, 퀀처는 중화되며, 이 경우 중화된 퀀처의 첨가가 적혈구 조성물의 바람직한 pH 범위를 제공한다. 예로서, 글루타티온의 중화를 사용하여 필요한 pH 조정을 행할 수 있다. 어떤 구체예에서, 예를 들어 1 당량의 염기를 첨가함으로써 적합한 수준의 글루타티온 중화가 사용될 수 있으며, 이로써 적혈구 조성물에 첨가했을 때 조성물의 필요한 pH 조정을 제공하는 퀀처가 제공된다. 적합한 중화는 사용된 퀀처에 따를 것이다. 예를 들어, 펩티드가 사용될 때, 그것은 펩티드의 아미노산 성분에 따를 수 있다. 어떤 구체예에서, 적혈구 조성물의 pH에 유의한 영향을 미치지 않는 퀀처가 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산을 더 포함할 수 있는 시스테인을 포함하는 펩티드의 사용은 자연적으로 분리된 펩티드의 용액의 pH를 더욱 중성으로 만든다. 어떤 구체예에서, 펩티드는 아르기닌 또는 리신과 같은 적어도 하나의 염기성 아미노산을 더 포함한다.

본원에 설명된 방법들의 어떤 구체예에서, 원하는 수준까지 혼합물의 pH를 증가시키고 및/또는 바람직하지 않은 부반응의 퀀칭을 개선하기 위해 병원체-불활성화 화합물 및 퀀처와 함께 염기가 적혈구 조성물과 혼합되는 경우, 이 염기는 염기성 염이다. 염기성 염은 적혈구 조성물과 혼합되기 전에 먼저 수성 용액에 용해될 수 있다. 다른 구체예에서, 염은 고체 형태로 적혈구 조성물에 직접 첨가될 수 있다. 어떤 구체예에서, 염기성 염은 퀀처를 포함하며, 혼합물에 퀀처와 염기를 모두 제공한다. 어떤 구체예에서, 본 방법에서 사용되는 염은 NaOH 같은 강염기이다. 전형적으로, NaOH 같은 강염기는 적혈구 조성물과 혼합되기 전에 먼저 수성 용액에 용해될 것이다. 어떤 구체예에서, 강염기(예를 들어, 용액 또는 고체 형태)는 퀀처와 적혈구 조성물을 혼합하기 전에 퀀처와 혼합된다. 어떤 구체예에서, 염기는 염기성 버퍼이다(혼합물을 바람직한 pH 범위로 만들 수 있는 적합한 pKa를 가지면 충분한 양으로 첨가된다). 염기성 버퍼가 사용되는 경우, 어떤 구체예에서 버퍼는 제약학적으로 허용되는 버퍼이다. 어떤 구체예에서, 버퍼는 약 7-8 범위의 pKa를 갖는 적정가능한 양자를 가질 것이다. 염기성 버퍼로서 사용가능한 버퍼의 예들은, 제한은 아니지만, N-(2-히드록시에틸)-피페라진-N'-2-에탄술폰산(HEPES), 포스페이트 완충 식염수(PBS), 및 나트륨 포스페이트 버퍼를 포함한다. 다른 적합한 염기성 버퍼들도 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있다.

본원에 설명된 방법 및 조성물들 각각의 어떤 구체예에서, 적혈구, 퀀처, 병원체-불활성화 화합물, 및 어떤 첨가된 염기의 혼합물의 pH는 약 5.5 초과, 약 5.7 초과, 약 6.0 초과, 약 6.3 초과, 약 6.5 초과, 약 6.7 초과, 약 7.0 초과, 또는 약 7.2 초과이다. 본원에 설명된 방법 및 조성물들 각각의 어떤 구체예에서, 적혈구, 퀀처, 병원체-불활성화 화합물, 및 염기(어느 것이 첨가될 경우)의 혼합물의 pH는 약 6.0 내지 8.5, 약 6.0 내지 7.5, 약 6.5 내지 7.1, 약 6.5 내지 7.0, 또는 약 6.6 내지 6.8, 또는 약 6.6, 6.7, 6.8, 또는 6.9의 범위이다. 어떤 구체예에서, 나타낸 pH는 실온에서의 pH이다. 어떤 구체예에서, 나타낸 pH는 37℃에서의 pH이다. 예를 들어, 어떤 구체예에서, 적혈구를 포함하는 조성물이 퀀처와 어떤 첨가된 염기의 존재하에 병원체-불활성화 화합물로 처리되며, 여기서 혼합물의 pH는 37℃에서 약 6.5 내지 약 7.0(또는 7.1)의 범위이다.

어떤 구체예에서, 적혈구, 퀀처, 병원체-불활성화 화합물, 및 염기(방법의 일부로서 염기가 첨가될 경우)의 혼합물의 pH는 병원체-불활성화 화합물과 적혈구 조성물을 혼합하기 전에 약 6.0 내지 8.5, 약 6.0 내지 7.5, 약 6.5 내지 7.1, 약 6.5 내지 7.0, 또는 약 6.6 내지 6.8, 또는 약 6.5, 6.7, 6.8, 또는 6.9의 범위이다. 어떤 다른 구체예에서, pH는 병원체-불활성화 화합물과 적혈구를 포함하는 조성물을 혼합하는 것과 동시에 또는 1시간 이내에, 약 30분 이내에, 약 20분 이내에, 약 10분 이내에, 약 5분 이내에, 또는 약 2분 이내에 달성된다. pH가 조정되는 방법들의 어떤 구체예에서, pH는 병원체-불활성화 화합물과 적혈구를 포함하는 조성물을 혼합하기 전에, 동시에, 약 1시간 이내에, 약 30분 이내에, 약 20분 이내에, 약 10분 이내에, 약 5분 이내에, 또는 약 2분 이내에 바람직한 pH 범위로 조정된다. 이들 구체예에서, 퀀처가 글루타티온이고 병원체-불활성화 화합물이 S-303인 경우, 적혈구 조성물과 퀀처를 포함하는 혼합물의 pH는 바람직하게 S-303과 적혈구 조성물을 혼합하기 전에 바람직한 pH 범위(예를 들어, pH 6.5 내지 7.0)로 조정된다.

어떤 구체예에서, 적혈구, 퀀처, 및 염기를 혼합한 후 조성물의 결과의 pH가 반드시 출발 적혈구 조성물의 pH의 조정일 필요는 없다. 예를 들어, 적혈구 조성물은 6.0-7.5의 바람직한 범위의 pH를 가질 수 있고, 조성물의 pH는 퀀처의 첨가와 이어진 병원체-불활성화 화합물의 첨가시 유의하게 변하지 않는다. 이러한 구체예에서, 퀀처는 자연적으로 바람직한 pH를 제공하거나, 또는 그에 따라서 중화되어 바람직한 pH를 제공할 수 있다. 그것은 약 5mM 내지 약 40mM과 같은 퀀처의 높은 초기 양의 첨가와 중요한 바람직한 범위의 결과의 pH의 조합이다. 이러한 글루타티온 농도를 사용하는 공지된 방법은, 예를 들어 본 발명의 다른 양태와 함께 바람직한 pH 범위와 함께 사용되지 않았다. 따라서, 펩티드에 대해서, 펩티드 퀀처와 무관하게, 그것이 필요에 따라 효과적으로 중화되어 적혈구 조성물에 첨가되었을 때 적합한 pH 범위를 제공할 수 있으며, 또한 원하는 pH 범위에서 적합한 완충량을 제공하도록 선택될 수 있다. 이와 같이, 중화된 퀀처는 퀀처가 필요에 따라 산이나 염기로 적합하게 적정됨으로써 적혈구 조성물에 첨가시 얻어진 혼합물이 불활성화 동안 세포 탈수를 피하면서 원치않는 부반응(예를 들어, 바람직하지 않은 면역반응을 가져올 수 있는 병원체-불활성화 화합물과 RBC 표면의 결합)의 보다 나은 퀀칭을 제공하는 pH, 예를 들어 약 6.0 내지 8.5, 약 6.0 내지 7.5, 약 6.5 내지 7.0, 약 6.5 내지 7.1, 또는 약 6.6 내지 6.8, 또는 약 6.6, 6.7, 6.8, 또는 6.9 범위의 pH를 갖게 된다는 의미이다. 어떤 구체예에서, 펩티드는 자연적으로 분리되며, 적합하게 중화되는데, 즉 최종 혼합물에 바람직한 pH를 제공하기 위해 산이나 염기를 첨가할 필요가 없다. 또한, 바람직한 퀀처는 원치않는 부반응을 퀀칭하기 위해 필요한 시간 동안 바람직한 범위로 pH를 유지할 수 있는 완충 능력을 제공한다.

본원에 설명된 방법 및 조성물들 각각의 어떤 구체예에서, 퀀처는 중화된다. 충분한 양의 염기가 퀀처와 조합된 경우, 퀀처는 염기에 의해 '중화된다"고 하며, 이로써 병원체-불활성화 화합물과 적혈구 간의 바람직하지 않은 부반응의 퀀칭이 적혈구를 포함하는 조성물, 병원체-불활성화 화합물 및 퀀처를 포함하는 혼합물 중에서 개선된다. "중화된 퀀처"가 반드시 중성 pH를 가지거나, 반드시 하전되지 않을 필요는 없다. 어떤 구체예에서, 중화된 퀀처는 그것의 가장 양자화된 형태나 아니고 가장 탈양자화된 형태는 아니다. 어떤 구체예에서, 퀀처가 매우 산성인 경우, 중화된 퀀처의 pH는 여전히 7.0 이하일 수 있다(예를 들어, 약 6.6, 6.7, 6.8, 또는 6.9). 어떤 구체예에서, 중화된 퀀처 용액의 pH는 7.0을 초과할 수 있다. 어떤 구체예에서, 중화된 퀀처 용액의 pH는 염기의 첨가 전 퀀처의 pH보다 검출 가능할 만큼 높을 것이다. 어떤 구체예에서, 퀀처는 적어도 약 0.25 당량, 적어도 약 0.5 당량, 적어도 약 0.75 당량, 적어도 약 1 당량, 적어도 약 1.25 당량, 적어도 약 1.5 당량, 또는 적어도 약 2 당량의 염기로 중화된다. 어떤 구체예에서, 퀀처는 약 2 당량 미만, 약 1.5 당량 미만, 약 1.25 당량 미만, 약 1 당량 미만, 또는 약 0.75 당량 미만의 염기로 중화된다. 어떤 구체예에서, 퀀처는 약 0.25 내지 약 2 당량, 약 0.5 내지 약 1.5 당량, 또는 약 0.75 내지 약 1.25 당량의 염기로 중화된다. 어떤 구체예에서, 퀀처는 약 0.75 당량의 염기로 중화된다. 다른 구체예에서, 퀀처는 약 1 당량의 염기로 중화된다. 다른 구체예에서, 퀀처는 약 1.25 당량의 염기로 중화된다. 예를 들어, 본 발명의 어떤 구체예에서, 글루타티온은 약 1 당량의 적합한 염기, 예를 들어 수산화나트륨으로 중화된다. 이 예에서, 양자화된 글루타티온의 용액은 약 3의 pH를 가지며, 1 당량의 수산화나트륨으로 중화된 용액은 약 4.5의 pH를 가지고, 2 당량의 수산화나트륨으로 중화된 용액은 약 9.5의 pH를 가진다. 적어도 하나의 시스테인을 포함하는 어떤 적합한 펩티드 퀀처가 적혈구 조성물에 첨가시 바람직한 pH를 제공할 수 있도록 적합하게 조정될 수 있다.

글루타티온 및 다른 퀀처를 중화하는 적합한 방법은 당업자에게 아주 자명하다. 어떤 구체예에서, 수산화나트륨을 사용하여 퀀처를 중화하거나 부분적으로 중화할 수 있다. 어떤 구체예에서, NaOH의 고체 펠릿이 먼저 물에 용해되어 1N, 5N, 10N, 또는 20N NaOH 용액과 같은 농축 염기 용액이 만들어진다. 어떤 구체예에서, 다음에, 적합한 양의 NaOH 용액이 혼합물에 퀀처를 첨가하기 전에, 동시에 또는 이후에 퀀처에 첨가된다. 또는 달리, NaOH는 혼합물에 퀀처의 첨가 전에 적혈구 조성물 또는 병원체-불활성화 화합물, 또는 이 둘의 조합에 첨가된다.

적합하게 pH 조정된 또는 중화된 퀀처를 제공하는 것에 더하여, 어떤 구체예에서, 바람직한 퀀처는 병원체에 유의하게 진입할 수 없으며, 이로써 이들은 세포외 환경에서 원치않는 반응을 최적으로 퀀칭하지만, 일단 병원체-불활성화 화합물이 병원체 내부로 침투된 후에는 병원체 불활성화를 방해하지 않는다.

본원에 설명된 방법들 각각의 어떤 구체예에서, 퀀처는 산성 화합물이다. 어떤 구체예에서, 퀀처는 자유 산 형태로 제공된다. 어떤 구체예에서, 퀀처는 산성이고, 적어도 약 1 당량의 염기가 첨가되어 퀀처를 중화한다. 어떤 예에서, 이러한 중화된 퀀처를 포함하는 용액은 염기성, 중성, 또는 심지어 산성일 수 있다. 어떤 구체예에서, 약 1 당량의 염기가 첨가되어 퀀처를 중화하거나 부분적으로 중화할 수 있다. 어떤 구체예에서, 약 2 당량의 염기가 첨가된다. 어떤 구체예에서, 퀀처는 산성이며, 약 0.5 내지 약 1.5 당량의 염기가 사용되어 퀀처를 중화한다. 어떤 구체예에서, 약 0.75 내지 약 1.25 당량의 염기가 사용된다. 어떤 구체예에서, 약 1 당량의 염기가 사용된다.

어떤 구체예에서, 퀀처는 적혈구 조성물 및/또는 병원체-불활성화 화합물에 첨가하기 전에 중화된다. 다른 구체예에서, 퀀처는 적혈구 조성물 및/또는 병원체-불활성화 화합물과 퀀처를 조합한 후에 중화된다. 어떤 구체예에서, 적혈구 조성물 및/또는 병원체-불활성화 화합물에 첨가하기 전에 중화된 퀀처의 pH는 약 2.5 내지 7.5, 약 3.0 내지 6.5, 약 3.5 내지 5.5, 약 4.0 내지 5.0, 또는 약 4.3 내지 4.5, 또는 약 4.4의 범위이다.

어떤 구체예에서, 퀀처는 글루타티온이고, 글루타티온 일나트륨염의 형태로 제공되며, 약 1 당량의 염기로 중화되거나, 또는 염기로 중화되지 않는다. 어떤 다른 구체예에서, 퀀처는 글루타티온이고, 글루타티온 염산염의 형태로 제공되며, 약 1 당량의 염기로 중화된다.

본원에 설명된 방법들 각각의 어떤 구체예에서, 적혈구 조성물, 퀀처, 병원체-불활성화 화합물, 및 어떤 첨가된 염기를 포함하는 혼합물 중 퀀처의 초기 농도는 불활성화 기간 도중에는 상승하고, 그 다음 불활성화 기간 이후에는 낮은 농도까지 감소된다. 어떤 구체예에서, 초기 퀀처 농도는 병원체-불활성화 화합물의 원치않는 부반응(예를 들어, 병원체-불활성화 화합물과 RBC 표면의 결합)을 충분히 감소시킬 수 있을 만큼 충분하며, 그 다음 세포 저장 동안 생육력(예를 들어, 삼투 취약성 및 탈수) 및/또는 수명에 대한 불리한 영향을 충분히 감소시킬 수 있을 만큼 낮은 농도까지 감소된다.

본 발명은 병원체 불활성화 기간 이후 퀀처의 농도를 감소시키는데 사용되는 다수의 방법을 포함한다. 어떤 구체예에서, 퀀처(예를 들어, 글루타티온)의 농도는 적혈구 조성물, 퀀처, 및 병원체-불활성화 화합물을 포함하는 혼합물의 원심분리 후, 혼합물의 상청액을 제거하고, 그 다음 첨가제 용액(예를 들어, 표 2에 설명된 어떤 첨가제 용액, 및/또는 염화나트륨, 아데닌, 글루코오스, 포스페이트, 구아노신, 시트레이트 및/또는 만니톨을 포함하는 첨가제 용액) 같은 신선한 용액을 첨가하여 세포를 재현탁함으로써 감소된다(예를 들어, 세포의 세척을 통해). 어떤 구체예에서, 원심분리, 상청액 제거, 및 신선한 용액(예를 들어, 표 2에 설명된 어떤 첨가제 용액, 및/또는 염화나트륨, 아데닌, 글루코오스, 포스페이트, 구아노신, 시트레이트 및/또는 만니톨을 포함하는 첨가제 용액) 첨가의 과정은 추가로 1, 2, 3, 4, 또는 5회 이상 반복될 수 있다. 어떤 구체예에서, 퀀처의 농도를 감소시키는데 사용되는 방법은 자동화된다. 어떤 구체예에서, 신선한 용액은 퀀터를 포함하지 않거나, 또는 낮은 농도의 퀀처를 포함한다. 어떤 구체예에서, 퀀처(예를 들어, 글루타티온)의 농도는 퀀처를 화학적으로 탈활성화함으로써 감소된다. 어떤 구체예에서, 퀀처(예를 들어, 글루타티온)의 농도는 뱃치 과정이나 유동 제거 과정에서 흡착에 의해, 또는 멤브레인(예를 들어, 중공 섬유 멤브레인 또는 투석 멤브레인)을 이용한 유동 과정에서 크기 배제에 의해, 또는 크기 배제 비드에 의해서 감소된다. 어떤 구체예에서, 퀀처는 화합물 흡착 장치(CAD)에서 감소되지 않고 및/또는 이 장치와 접촉되지 않는다.

본원에 설명된 방법 및 조성물들 각각의 어떤 구체예에서, 적혈구, 퀀처, 병원체-불활성화 화합물, 및 어떤 첨가된 염기의 혼합물 중 퀀처(예를 들어, 글루타티온)의 초기 농도는 약 2mM 초과, 약 4mM 초과, 약 6mM 초과, 약 8mM 초과, 약 10mM 초과, 약 15mM 초과, 또는 약 20mM 초과이다. 어떤 구체예에서, 혼합물 중 초기 퀀처 농도는 약 2mM 내지 100mM, 약 2mM 내지 40mM, 약 4mM 내지 40mM, 약 5mM 내지 40mM, 약 5mM 내지 30mM, 또는 약 10mM 내지 30mM, 또는 2mM, 5mM, 10mM, 15mM, 20mM, 25mM, 30mM, 35mM, 40mM, 45mM, 50mM, 또는 100mM 이하의 범위이다. 어떤 구체예에서, 혼합물 중 초기 퀀처 농도는 약 20mM이다.

본원에 설명된 방법 및 조성물들 각각의 어떤 구체예에서, 적혈구, 퀀처, 및 병원체-불활성화 화합물의 혼합물 중 퀀처(예를 들어, 글루타티온)의 초기 농도는 약 2mM 초과, 약 4mM 초과, 약 6mM 초과, 약 8mM 초과 또는 약 10mM 초과이고, 혼합물의 pH는 약 5.5 초과, 약 5.7 초과, 약 6.0 초과, 약 6.3 초과, 약 6.5 초과, 약 6.7 초과, 약 7.0 초과, 또는 약 7.2 초과이다. 본원에 설명된 방법 및 조성물들 각각의 어떤 구체예에서, 혼합물 중 퀀처의 초기 농도는 약 2mM 내지 40mM, 약 4mM 내지 40mM, 약 5mM 내지 40mM, 약 5mM 내지 30mM, 또는 약 10mM 내지 30mM, 또는 약 20mM 범위이고, 혼합물의 pH는 약 6.0 내지 8.5, 약 6.0 내지 7.5, 약 6.5 내지 7.1, 약 6.5 내지 7.0, 또는 약 6.6 내지 6.8, 또는 약 6.6, 6.7, 6.8, 또는 6.9 범위이다. 어떤 구체예에서, 혼합물 중 퀀처의 초기 농도는 약 2mM 초과, 약 4mM 초과, 약 6mM 초과, 약 8mM 초과 또는 약 10mM 초과이고, 혼합물의 pH는 약 6.0 내지 8.5, 약 6.0 내지 7.5, 약 6.5 내지 7.1, 약 6.5 내지 7.0, 또는 약 6.6 내지 6.8, 또는 약 6.6, 6.7, 6.8, 또는 6.9 범위이다. 어떤 구체예에서, 혼합물 중 퀀처(예를 들어, 글루타티온)의 농도는 약 10mM 내지 약 30mM 범위이고, 혼합물의 pH는 약 6.0 내지 7.5 범위이다. 어떤 구체예에서, 혼합물 중 퀀처(예를 들어, 글루타티온)의 농도는 약 20mM의 범위이고, 혼합물의 pH는 약 6.5 내지 7.0(또는 7.1) 범위이다.

본원에 설명된 방법 및 조성물들 각각의 어떤 구체예에서, 불활성화 기간 이후 적혈구 조성물, 퀀처, 병원체-불활성화 화합물 및 어떤 첨가된 염기를 포함하는 혼합물 중 퀀처(예를 들어, 글루타티온)의 초기 농도는 혼합물 중 퀀처(예를 들어, 글루타티온)의 초기 농도에 비하여 2배, 또는 3배, 또는 4배, 또는 5배, 또는 6배, 또는 7배, 또는 8배, 또는 9배, 또는 10배, 또는 15배, 또는 20배, 또는 25배, 또는 30배, 또는 35배, 또는 40배, 또는 50배, 또는 100배, 또는 500배, 또는 1,000배를 초과하여 감소된다.

본원에 설명된 방법 및 조성물들 각각의 어떤 구체예에서, 불활성화 기간 이후 적혈구 조성물, 퀀처, 병원체-불활성화 화합물 및 어떤 첨가된 염기를 포함하는 혼합물 중 퀀처(예를 들어, 글루타티온)의 저하된 농도는 약 15mM 미만, 약 10mM 미만, 약 8mM 미만, 약 6mM 미만, 약 5mM 미만, 약 4mM 미만, 약 3mM 미만, 약 2mM 미만, 약 1mM 미만, 약 0.75mM 미만, 약 0.5mM 미만, 또는 약 0.25mM 미만이다. 어떤 구체예에서, 불활성화 기간 이후 혼합물 중 퀀처의 저하된 농도는 약 1mM 내지 20mM, 약 2mM 내지 15mM, 약 3mM 내지 10mM, 약 4mM 내지 8mM, 또는 약 5mM 내지 약 6mM 범위이다. 어떤 구체예에서, 불활성화 기간 이후 혼합물 중 퀀처의 저하된 농도는 약 0.25mM, 또는 0.5mM, 또는 0.75mM, 또는 1mM, 또는 1.5mM, 또는 2mM, 또는 3mM, 또는 4mM, 또는 5mM, 또는 6mM, 또는 7mM, 또는 8mM, 또는 9mM, 또는 10mM, 또는 12.5mM, 또는 15mM, 또는 20mM 이하의 농도이다.

본원에 설명된 방법 및 조성물들 각각의 어떤 구체예에서, 적혈구 조성물, 퀀처, 병원체-불활성화 화합물 및 어떤 첨가된 염기를 포함하는 혼합물 중 퀀처(예를 들어, 글루타티온)의 초기 농도는 2mM 초과, 약 4mM 초과, 약 6mM 초과, 약 8mM 초과, 또는 약 10mM 초과이고, 불활성화 기간 이후 혼합물 중 퀀처의 저하된 농도는 약 15mM 미만, 약 10mM 미만, 약 8mM 미만, 약 6mM 미만, 약 5mM 미만, 약 4mM 미만, 약 3mM 미만, 약 2mM 미만, 약 1.5mM 미만, 약 1mM 미만, 약 0.75mM 미만, 약 0.5mM 미만, 또는 약 0.25mM 미만이다. 어떤 구체예에서, 초기 퀀처 농도는 약 2mM 내지 100mM, 약 2mM 내지 40mM, 약 4mM 내지 40mM, 약 5mM 내지 40mM, 약 5mM 내지 30mM, 또는 약 10mM 내지 30mM, 또는 약 20mM 범위이고, 불활성화 기간 이후 혼합물 중 저하된 퀀처 농도는 약 1mM 내지 20mM, 약 2mM 내지 15mM, 약 3mM 내지 10mM, 약 4mM 내지 8mM, 또는 약 5mM 내지 6mM 범위이다. 어떤 구체예에서, 초기 퀀처(예를 들어, 글루타티온) 농도는 약 10mM 내지 30mM 범위이고, 불활성화 기간 이후 혼합물 중 저하된 퀀처 농도는 약 2mM 내지 15mM 범위이다. 어떤 구체예에서, 초기 퀀처(예를 들어, 글루타티온) 농도는 약 20mM이고, 불활성화 기간 이후 혼합물 중 저하된 퀀처 농도는 약 4mM 내지 8mM 범위이다.

어떤 구체예에서, 적혈구 조성물, 퀀처(예를 들어, 글루타티온), 병원체-불활성화 화합물 및 어떤 첨가된 염기를 포함하는 혼합물 중 퀀처(예를 들어, 글루타티온)의 초기 농도는 2mM 초과, 약 4mM 초과, 약 6mM 초과, 약 8mM 초과 또는 약 10mM 초과이고, 혼합물의 pH는 약 5.5 초과, 약 5.7 초과, 약 6.0 초과, 약 6.3 초과, 약 6.5 초과, 약 6.7 초과, 약 7.0 초과, 또는 약 7.2 초과이고, 불활성화 기간 이후 혼합물 중 퀀처의 저하된 농도는 약 15mM 미만, 약 10mM 미만, 약 8mM 미만, 약 6mM 미만, 약 5mM 미만, 약 4mM 미만, 약 3mM 미만, 약 2mM 미만, 약 1.5mM 미만, 약 1mM 미만, 약 0.75mM 미만, 약 0.5mM 미만, 또는 약 0.25mM 미만이다. 어떤 구체예에서, 초기 퀀처 농도는 약 2mM 내지 100mM, 약 2mM 내지 40mM, 약 4mM 내지 40mM, 약 5mM 내지 40mM, 약 5mM 내지 30mM, 또는 약 10mM 내지 30mM, 또는 약 20mM 범위이고; 혼합물의 pH는 약 6.0 내지 8.5, 약 6.0 내지 7.5, 약 6.5 내지 7.0, 약 6.5 내지 7.1, 또는 약 6.6 내지 6.8, 또는 약 6.6, 6.7, 6.8, 또는 6.9 범위이고; 불활성화 기간 이후 혼합물 중 퀀처의 저하된 농도는 약 1mM 내지 20mM, 약 2mM 내지 15mM, 약 3mM 내지 10mM, 약 4mM 내지 8mM, 또는 약 5mM 내지 6mM 범위이다. 어떤 구체예에서, 초기 퀀처(예를 들어, 글루타티온) 농도는 약 10mM 내지 30mM 범위이고; 혼합물의 pH는 약 6.0 내지 7.5 범위이고; 불활성화 기간 이후 혼합물 중 퀀처의 저하된 농도는 약 2mM 내지 15mM 범위이다. 어떤 구체예에서, 초기 퀀처(예를 들어, 글루타티온) 농도는 약 20mM이고; 혼합물의 pH는 약 6.5 내지 7.0(또는 7.1) 범위이고; 불활성화 기간 이후 혼합물 중 퀀처의 저하된 농도는 약 4mM 내지 8mM 범위이다.

본원에 설명된 방법 및 조성물들 각각의 어떤 구체예에서, 적혈구 조성물, 퀀처, 병원체-불활성화 화합물 및 어떤 첨가된 염기를 포함하는 혼합물 중에 초기 농도의 퀀처를 첨가하는 시점과 저하된 농도까지 퀀처의 농도를 감소시키는 시점 사이의 시간 기간은 병원체-불활성화 화합물의 원치않는 부반응(예를 들어, 바람직하지 않은 면역반응을 유도할 수 있는 병원체-불활성화 화합물과 RBC 표면의 결합)을 감소시키기에 충분하다. 어떤 구체예에서, 시간 기간은 병원체-불활성화 화합물의 원치않는 부반응을 감소시키고, 불활성화 과정 동안 세포 탈수를 피하거나 감소시키기에 충분하다.

어떤 구체예에서, 적혈구 조성물, 퀀처, 병원체-불활성화 화합물 및 어떤 첨가된 염기를 포함하는 혼합물 중에 초기 농도의 퀀처를 첨가하는 시점과 저하된 농도까지 퀀처의 농도를 감소시키는 시점 사이의 시간 기간은 5시간, 10시간, 15시간, 20시간, 25시간, 30시간, 35시간, 40시간, 또는 50시간을 초과하거나, 대략 동등하거나, 또는 미만이다. 어떤 구체예에서, 시간 기간은 약 1 내지 96시간, 또는 약 1 내지 72시간, 또는 약 1 내지 48시간, 또는 약 10 내지 30시간, 또는 약 15 내지 25시간, 또는 약 20시간이다.

본원에 설명된 방법 및 조성물들 각각의 어떤 구체예에서, 적혈구 조성물, 퀀처, 병원체-불활성화 화합물 및 어떤 첨가된 염기를 포함하는 혼합물 중 퀀처(예를 들어, 글루타티온)의 초기 농도는 2mM 초과, 약 4mM 초과, 약 6mM 초과, 약 8mM 초과, 약 10mM 초과, 또는 약 15mM 초과이고, 불활성화 기간 이후 혼합물 중 퀀처의 저하된 농도는 약 25mM 미만, 약 20mM 미만, 약 15mM 미만, 약 10mM 미만, 약 8mM 미만, 약 6mM 미만, 약 5mM 미만, 약 4mM 미만, 약 3mM 미만, 약 2mM 미만, 약 1.5mM 미만, 약 1mM 미만, 약 0.75mM 미만, 약 0.5mM 미만, 또는 약 0.25mM 미만이고, 초기 농도의 퀀처를 첨가하는 시점과 저하된 농도까지 퀀처의 농도를 감소시키는 시점 사이의 기간은 5시간, 10시간, 15시간, 20시간, 25시간, 30시간, 35시간, 40시간, 또는 50시간을 초과하거나, 대략 동일하거나, 또는 미만이다.

어떤 구체예에서, 초기 퀀처 농도는 약 2mM 내지 100mM, 약 2mM 내지 40mM, 약 4mM 내지 40mM, 약 5mM 내지 40mM, 약 5mM 내지 30mM, 또는 약 10mM 내지 30mM, 또는 약 20mM 범위이고; 불활성화 기간 이후 혼합물 중 퀀처의 저하된 농도는 약 1mM 내지 20mM, 약 2mM 내지 15mM, 약 3mM 내지 10mM, 약 4mM 내지 8mM, 또는 약 5mM 내지 6mM 범위이고; 초기 농도로 퀀처를 첨가하는 시점과 저하된 농도까지 퀀처의 농도를 감소시키는 시점 사이의 시간 기간은 약 1 내지 96시간, 또는 약 1 내지 72시간, 또는 약 1 내지 48시간, 또는 약 10 내지 30시간, 또는 약 4 내지 30시간, 또는 약 10 내지 25시간, 또는 약 15 내지 25시간, 또는 약 20시간이다.

어떤 구체예에서, 초기 퀀처(예를 들어, 글루타티온) 농도는 약 10mM 내지 30mM 범위이고, 불활성화 기간 이후 혼합물 중 퀀처의 저하된 농도는 약 2mM 내지 15mM 범위이고, 초기 농도로 퀀처를 첨가하는 시점과 저하된 농도까지 퀀처의 농도를 감소시키는 시점 사이의 시간 기간은 약 10 내지 30시간이다. 어떤 구체예에서, 초기 퀀처(예를 들어, 글루타티온) 농도는 약 20mM이고, 불활성화 기간 이후 혼합물 중 퀀처의 저하된 농도는 약 4mM 내지 8mM 범위이고, 초기 농도로 퀀처를 첨가하는 시점과 저하된 농도까지 퀀처의 농도를 감소시키는 시점 사이의 시간 기간은 약 15 내지 25시간이다. 이들 구체예들 중 일부에서, 혼합물의 pH는 약 6.5 내지 7.0(또는 7.1) 범위이다. 이들 구체예들 중 다른 일부에서, 혼합물의 pH는 약 6.0 내지 7.5 범위이다.

이들 구체예들 중 어느 것에서, 초기 농도로 퀀처를 첨가하는 시점과 저하된 농도까지 퀀처의 농도를 감소시키는 시점 사이의 시간 기간 동안 적혈구 조성물과 퀀처를 포함하는 혼합물의 온도는 약 1℃ 내지 30℃, 또한 약 18℃ 내지 25℃, 또는 약 37℃, 또는 약 실온의 온도 범위이다.

어떤 구체예에서, 본 발명은, a) i) 머스터드 기와 핵산 결합 리간드를 연결하는 취약성 링커를 포함하는 병원체-불활성화 화합물(예를 들어, 병원체가 존재할 경우 병원체를 불활성화할 수 있는 유효량의 병원체-불활성화 화합물)(예를 들어, S-303), ii) 병원체-불활성화 화합물의 반응성 친전자성 기와 반응할 수 있는 티올기를 포함하는 퀀처(예를 들어, 유효량의 퀀처)(예를 들어, 글루타티온), iii) 적혈구를 포함하는 조성물, 및 iv) 적합한 염기(예를 들어, NaOH)를 제공하는 단계; b) 병원체-불활성화 화합물, 퀀처, 및 적합한 염기와 적혈구를 포함하는 조성물을 혼합하는 단계; 및 c) 원래 퀀처 농도에서 혼합물의 저장으로 인해 생기는 적혈구 탈수 수준에 비하여, 혼합물의 저장(예를 들어, 4℃에서 10, 28일 또는 42일 후)으로 인해 생기는 적혈구 탈수 수준을 감소시키는 양까지 혼합물 중 퀀처 농도를 충분히 감소시키는 단계를 포함하는, 적혈구 조성물을 처리하는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 혼합물은 약 0.5 내지 1.5 당량의 염기(또는 약 0.75 내지 1.25 당량)를 포함하며, 여기서 당량은 혼합물 중 퀀처의 몰량과 동등한 몰량을 의미하고, 및/또는 단계 (b)에서 얻어진 혼합물은 37℃에서 약 6.0 내지 7.5(또는 약 6.5 내지 7.0, 또는 7.1)의 pH를 가진다. 어떤 구체예에서, 단계 (b)의 염기는 염기가 없는 혼합물에 비하여, 적어도 약 5%(또는 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 90%)까지 얻어진 혼합물 중에서 처리된 적혈구 조성물과 결합한 항-병원체 불활성화 화합물 항체의 수준을 감소시킬 수 있는 충분한 양이다. 어떤 구체예에서, 퀀처 농도는 약 5mM 내지 약 30mM(또는 약 15mM 내지 약 25mM)이고, 및/또는 단계 (c)에서 얻어진 혼합물 중의 퀀처는 약 10mM 미만의 농도이다(또는 약 6mM 미만, 또는 약 2mM 미만). 어떤 구체예에서, 단계 (b)에서 얻어진 혼합물 중 병원체 불활성화 화합물의 농도는 약 0.1μM 내지 약 5mM 이고, 및/또는 병원체가 존재할 경우 적혈구 조성물에 존재하는 적어도 1 log(또는 3 log)의 병원체를 불활성화하기에 충분하다. 어떤 구체예에서, 단계 (b)와 단계 (c) 사이의 시간은 약 1 내지 48시간(또는 15 내지 25시간)이다. 어떤 구체예에서, 단계 (b) 이후 20시간째에, 얻어진 혼합물의 적혈구(RBC)는 동일한 조건에서 염기를 사용하지 않은 동일한 방법으로부터 얻어진 적혈구의 ABC 값과 비교하여 65% 미만의 항체 결합 능력(ABC)을 가지고, 및/또는 약 50,000(또는 약 25,000 내지 70,000) 미만의 평균 ABC를 가지고, 및/또는 단계 (c) 이후(또는 4℃에서 28 또는 42일 저장 후) 1% 미만의 용혈반응을 가지고, 및/또는 단계 (c) 이후(또는 4℃에서 28 또는 42일 저장 후) 50%를 초과하는 충전세포용적(PCV)을 가지고, 및/또는 단계 (c) 이후 4℃에서 28(또는 42)일 후에 140(또는 150)을 초과하는 중간 혈구 취약성 값을 가진다. 이들 구체예들 중 일부에서, 단계 (c)에서 퀀처의 농도를 감소시키는 것은 불활성화 동안 사용된 용액을 제거하고, 최종 첨가제 용액(예를 들어, SAG-M, AS-5, 또는 표 2, 3 또는 4의 어떤 용액과 같은 본원에 설명된 어떤 용액, 또는 염화나트륨, 아데닌, 글루코오스, 포스페이트, 구아노신, 시트레이트, 및/또는 만니톨을 포함하는 첨가제 용액)을 첨가하는 것을 포함한다.

어떤 구체예에서, 본 발명은, (a) (i) 반응성 친전자성 기인 작용기, 또는 반응성 친전자성 기를 형성하는 작용기를 포함하는 병원체-불활성화 화합물(예를 들어, 병원체가 존재할 경우 병원체를 불활성화할 수 있는 유효량의 병원체-불활성화 화합물)(예를 들어, S-303); (ii) 병원체-불활성화 화합물의 반응성 친전자성 기와 반응할 수 있는 티올기(예를 들어, 글루타티온)를 포함하는 퀀처(예를 들어, 유효량의 퀀처); 및 (iii) 적혈구를 포함하는 조성물; 및 (iv) 적합한 염기(예를 들어, NaOH)를 혼합하는 단계, 및 (b) 원래 퀀처 농도에서 혼합물의 저장(예를 들어, 4℃에서 10, 28, 또는 42일 후)으로 인해 생기는 적혈구 탈수 수준에 비하여, 혼합물의 저장으로 인해 생기는 적혈구 탈수 수준을 감소시키는 양까지 혼합물 중 퀀처의 농도를 충분히 감소시키는 단계를 포함하는, 적혈구 조성물을 처리하는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 혼합물은 약 0.5 내지 1.5 당량의 염기(또는 약 0.75 내지 1.25 당량)를 포함하며, 여기서 당량은 혼합물 중의 퀀처의 몰량과 동등한 몰량을 의미하고, 및/또는 단계 (a)에서 얻어진 결과의 혼합물은 37℃에서 약 6.0 내지 7.5(또는 약 6.5 내지 7.0, 또는 7.1)의 pH를 가진다. 어떤 구체예에서, 단계 (a)의 염기는 염기가 없는 혼합물에 비하여, 적어도 약 5%(또는 적어도 약 10%, 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 90%)까지 얻어진 혼합물 중에서 처리된 적혈구 조성물과 결합한 항-병원체 불활성화 화합물 항체의 수준을 감소시킬 수 있는 충분한 양이다. 어떤 구체예에서, 퀀처 농도는 약 5mM 내지 약 30mM(또는 약 15mM 내지 약 25mM)이고, 및/또는 단계 (b)에서 얻어진 혼합물 중의 퀀처는 약 10mM 미만의 농도이다(또는 약 6mM 미만, 또는 약 2mM 미만). 어떤 구체예에서, 단계 (a)에서 얻어진 혼합물 중 병원체 불활성화 화합물의 농도는 약 0.1μM 내지 약 5mM 이고, 및/또는 병원체가 존재할 경우 적혈구 조성물에 존재하는 적어도 1 log(또는 3 log)의 병원체를 불활성화하기에 충분하다. 어떤 구체예에서, 단계 (a)와 단계 (b) 사이의 시간은 약 1 내지 48시간(또는 15 내지 25시간)이다. 어떤 구체예에서, 단계 (a) 이후 20시간째에, 얻어진 혼합물의 적혈구(RBC)는 동일한 조건에서 염기를 사용하지 않은 동일한 방법으로부터 얻어진 적혈구의 ABC 값과 비교하여 65% 미만의 항체 결합 능력(ABC)을 가지고, 및/또는 약 50,000(또는 약 25,000 내지 70,000) 미만의 평균 ABC를 가지고, 및/또는 단계 (b) 이후(또는 4℃에서 28 또는 42일 저장 후) 1% 미만의 용혈반응을 가지고, 및/또는 단계 (b) 이후(또는 4℃에서 28 또는 42일 저장 후) 50%를 초과하는 충전세포용적(PCV)을 가지고, 및/또는 단계 (b) 이후 4℃에서 28(또는 42)일 후에 140(또는 150)을 초과하는 중간 혈구 취약성 값을 가진다. 이들 구체예들 중 일부에서, 단계 (b)에서 퀀처의 농도를 감소시키는 것은 불활성화 동안 사용된 용액을 제거하고, 최종 첨가제 용액(예를 들어, SAG-M, AS-5, 또는 표 2, 3 또는 4의 어떤 용액과 같은 본원에 설명된 어떤 용액, 또는 염화나트륨, 아데닌, 글루코오스, 포스페이트, 구아노신, 시트레이트, 및/또는 만니톨을 포함하는 첨가제 용액)을 첨가하는 것을 포함한다.

어떤 구체예에서, 본 발명은, a) i) 병원체-불활성화 화합물과 반응할 수 있는 퀀처(예를 들어, 글루타티온), 및 ii) 적혈구를 포함하는 적혈구 조성물을 제공하는 단계; 및 b) 원래 퀀처 농도에서 혼합물의 저장(예를 들어, 4℃에서 10, 28 또는 42일 후)으로 인해 생기는 적혈구 탈수 수준에 비하여, 혼합물의 저장으로 인해 생기는 적혈구 탈수 수준을 감소시키는 양까지 혼합물 중의 퀀처 농도를 충분히 감소시키는 단계를 포함하는, 적혈구의 탈수를 감소시키는 방법을 제공한다. 어떤 구체예에서, 단계 (b)에서 얻어진 혼합물 중의 퀀처는 약 10mM 미만(또는 약 6mM 미만, 또는 약 2mM 미만)의 농도이다. 어떤 구체예에서, 얻어진 혼합물의 적혈구(RBC)는 단계 (b) 이후(또는 4℃에서 28 또는 42일 저장 후) 1% 미만의 용혈반응을 가지고, 및/또는 단계 (b) 이후(또는 4℃에서 28 또는 42일 저장 후) 50%를 초과하는 충전세포용적(PCV)을 가지고, 및/또는 단계 (b) 이후 4℃에서 28(또는 42)일 후 140(또는 150)을 초과하는 중간 혈구 취약성 값을 가진다.

본 발명의 방법은 병원체-불활성화 화합물과 퀀처의 생체외 사용을 포함한다. 생체외 사용은 살아 있는 사람, 포유류, 또는 척추동물의 외부에서 화합물을 사용하여 적혈구 조성물을 처리하는 것을 수반하며, 처리된 생물학적 물질은 살아 있는 사람, 포유류, 또는 척추동물의 내부에의 사용을 목적으로 한다. 예를 들어, 혈액을 해당 사람 또는 다른 사람에게 재도입하는 것이 목적이라면, 사람으로부터 혈액을 채혈하고, 그 혈액에 화합물을 도입하여 병원체를 불활성화하는 것이 화합물의 생체외 사용으로서 정의된다. 해당 사람 또는 다른 사람에게 사람 혈액의 재도입은 화합물의 생체외 사용과는 반대로 혈액의 생체내 사용이라고 한다. 사람에게 재도입될 때 화합물이 혈액에 여전히 존재한다면, 화합물은 그것의 생체외 사용에 더하여 또한 생체내 도입되는 것이다. 본 발명의 어떤 구체예는 퀀처의 생체외 사용을 수반하며, 여기서 적혈구 조성물은 생체외 사용을 목적으로 한다. 어떤 예에서, 어떤 수준의 퀀처가 적혈구 조성물에 잔류하며, 이로써 퀀처는 또한 생체내 도입된다. 물질 또는 화합물의 시험관내 사용은 살이 있는 사람, 포유류, 또는 척추동물의 외부에서 물질 또는 화합물을 사용하는 것을 수반하며, 이 경우에는 물질 또는 화합물을 살아 있는 사람, 포유류, 또는 척추동물에 재도입하는 것이 목적이 아니다. 시험관내 사용의 예는 적혈구 샘플 성분들의 진단 분석이다. 적혈구 또는 다른 구성성분들의 변형은 혈액 샘플 성분들의 시험관내 분석에 영향을 미칠 수 있기 때문에, 본 발명의 방법이 적혈구 조성물의 시험관내 사용에 적용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 샘플의 진단 시험을 방해할 수 있는 샘플의 변형에 대한 충분한 퀀칭에 의하여 이러한 시험관내 샘플의 취급에 있어서 안전성을 제공할 수 있다.

염 및/또는 완충 용액을 포함하는 첨가제 용액이 본원에 설명된 방법 및 적혈구 조성물과 함께 사용될 수 있다. 예를 들어, 선택된 버퍼(예를 들어, SAG-M, SA-5, 또는 표 2, 3, 및/또는 4에 설명된 어떤 용액)가 불활성화 기간 전에, 도중에, 및/또는 이후에 및/또는 퀀처 농도 감소와 동시에 적혈구 조성물에 첨가될 수 있다.

충전 적혈구를 이용한 불활성화 방법

어떤 구체예에서, 충전 적혈구(pRBC)(예를 들어, 첨가제 용액을 결여한 및/또는 약 70 내지 90%, 또는 약 75 내지 85%, 또는 약 80% 범위의 적혈구용적율을 갖는 적혈구)에 본원에 설명된 불활성화 방법이 수행되고(예를 들어, 조성물이 약 1 당량의 염기 및 약 0.2mM S-303과 함께 약 20mM GSH를 포함하는 방법), 다음에 첨가제 용액(예를 들어, SGA-M, SA-5, 또는 본원 또는 표 2에 설명된 어떤 용액)에 노출된다(어떤 경우, 첨가제 용액으로 보존된다). 첨가제 용액의 예들은 표 2에 제시되며 본원에 설명된다. 이들 구체예들 중 일부에서, 첨가제 용액(예를 들어, 본원 또는 표 2에 설명된 어떤 용액)은 병원체-불활성화 화합물(예를 들어, S-303) 및/또는 퀀처(예를 들어, GSH)의 첨가 후 약 5분 내지 20시간 이내에 퀀처, 병원체-불활성화 화합물, 및 어떤 첨가된 염기를 포함하는 적혈구 조성물에 첨가된다. 어떤 구체예에서, 첨가제 용액은 병원체-불활성화 화합물(예를 들어, S-303) 및/또는 퀀처(예를 들어, GSH)의 첨가 후에 약 5분 내지 10시간, 또는 약 5분 내지 5시간, 또는 약 5분 내지 60분, 또는 약 5분 내지 30분, 또는 약 10분 내지 20분, 또는 약 15분 이내에 RBC 조성물에 첨가된다. 어떤 구체예에서, 퀀처 농도는 첨가제 용액(예를 들어, SAG-M, AS-5, 또는 본원 또는 표 2에 설명된 어떤 용액)의 첨가 이후 본원에 설명된 대로 감소된다. 예를 들어, pRBC는 본원에 설명된 불활성화 방법으로 처리된 다음(예를 들어, 조성물이 약 20mM GSH, 약 1 당량의 염기, 및 약 0.2mM S-303), 병원체-불활성화 화합물 및/또는 퀀처의 첨가 후 특정 시간에(예를 들어, 약 5분 내지 약 5시간, 또는 약 10분 내지 20분, 또는 약 15분에) 첨가제 용액(예를 들어, SAG-M, AS-5, 또는 본원 또는 표 2에 설명된 어떤 용액)으로 처리되고, 이어서 본원에 설명된 대로 퀀처 농도가 감소된다(예를 들어, 약 10mM 미만, 또는 약 5mM 미만까지). 이들 구체예들 중 일부에서, 퀀처 농도를 감소시키는 것은 처리 용액 및/또는 첨가제 용액을 제거한 다음, 최종 첨가제 용액(예를 들어, SAG-M, AS-5, 또는 본원 또는 표 2에 설명된 어떤 용액)을 첨가하는 것을 포함하며, 이로써 예를 들어, 약 50 내지 70%, 또는 약 55 내지 65%, 또는 약 60% 범위의 적혈구용적율을 갖는 적혈구 조성물이 제공된다. 어떤 구체예에서, 불활성화 전에 및/또는 도중에 적혈구 조성물 중 염화물 이온의 농도는 약 150mM, 또는 약 120mM, 또는 약 100mM, 또는 약 90mM, 약 80mM, 또는 약 70mM, 또는 약 60mM, 또는 약 50mM, 약 40mM, 약 30mM, 또는 약 20mM, 약 10mM, 또는 약 25 내지 250mM, 또는 약 40 내지 100mM, 또는 약 50 내지 75mM, 또는 약 60 내지 70mM, 또는 약 65mM 미만이거나 초과한다.

어떤 구체예에서, 본원에 언급된 첨가제 용액(예를 들어, 퀀처 농도 감소 전에 및/또는 후에 투여된 첨가제 용액)은 다음 성분들 중 하나 이상을 포함한다: 덱스트로스, 아데닌, 구아노신, 만니톨, 시트레이트(예를 들어, 나트륨 시트레이트), 시트르산, 포스페이트(예를 들어, Na2HPO4 및/또는 NaH2PO4) 및 염화물(예를 들어, 염화나트륨의). 어떤 구체예에서, 첨가제 용액의 덱스트로스 농도 및/또는 교환 후 RBC 조성물 중 최종 덱스트로스 농도(예를 들어, 수혈 전)는 약 10mM 내지 약 150mM, 또는 약 20mM 내지 약 120mM, 또는 약 25mM 내지 약 100mM, 또는 약 30mM 내지 약 75mM, 또는 약 40mM 내지 약 50mM의 농도이다. 어떤 구체예에서, 첨가제 용액의 아데닌 농도 및/또는 교환 후 RBC 조성물 중 최종 아데닌 농도(예를 들어, 수혈 전)는 약 0.5mM 내지 약 5mM, 또는 약 0.75mM 내지 약 3mM, 또는 약 1mM 내지 약 2.5mM의 농도이다. 어떤 구체예에서, 첨가제 용액의 구아노신 농도 및/또는 교환 후 RBC 조성물 중 최종 구아노신 농도(예를 들어, 수혈 전)는 약 0.5mM 내지 약 5mM, 또는 약 0.75mM 내지 약 3mM, 또는 약 1mM 내지 약 2.5mM, 또는 약 1.5mM 내지 약 2mM의 농도이다. 어떤 구체예에서, 첨가제 용액의 만니톨 농도 및/또는 교환 후 RBC 조성물 중 최종 만니톨 농도(예를 들어, 수혈 전)는 약 10mM 내지 약 150mM, 또는 약 20mM 내지 약 120mM, 또는 약 25mM 내지 약 100mM, 또는 약 30mM 내지 약 75mM, 또는 약 40mM 내지 약 50mM, 또는 약 35mM 내지 약 45mM의 농도이다. 어떤 구체예에서, 첨가제 용액의 시트레이트(예를 들어, 나트륨 시트레이트) 농도 및/또는 교환 후 RBC 조성물 중 최종 시트레이트 농도(예를 들어, 수혈 전)는 약 5mM 내지 약 100mM, 또는 약 10mM 내지 약 75mM, 또는 약 15mM 내지 약 50mM, 또는 약 15mM 내지 약 35mM, 또는 약 20mM 내지 약 30mM의 농도이다. 어떤 구체예에서, 첨가제 용액의 포스페이트(예를 들어, Na2HPO4 및/또는 NaH2PO4) 농도 및/또는 교환 후 RBC 조성물 중 최종 포스페이트 농도(예를 들어, 수혈 전)는 약 1mM 내지 약 150mM, 또는 약 2mM 내지 약 100mM, 또는 약 3mM 내지 약 75mM, 또는 약 4mM 내지 약 50mM, 또는 약 5mM 내지 약 25mM, 또는 약 10mM 내지 약 20mM의 농도이다. 어떤 구체예에서, 첨가제 용액의 염화물 농도 및/또는 교환 후 RBC 조성물 중 최종 염화물 농도(예를 들어, 수혈 전)는 약 500mM, 또는 약 250mM, 또는 약 200mM, 또는 약 150mM, 또는 약 100mM, 약 75mM, 또는 약 50mM, 또는 약 25mM, 또는 약 25 내지 약 250mM, 또는 약 40 내지 약 100mM, 또는 약 50 내지 약 75mM, 또는 약 60 내지 약 70mM, 또는 약 100 내지 약 200mM, 또는 약 125mM 내지 약 175mM, 또는 약 150mM 미만이거나 초과한다.

어떤 구체예에서, 본원에 언급된 첨가제 용액(예를 들어, 퀀처 농도 감소 전에 및/또는 후에 투여된 첨가제 용액) 및/또는 교환 후 최종 RBC 조성물(예를 들어, 수혈 전)은 10mM 내지 약 150mM(또는 약 50mM 내지 약 90mM) 덱스트로스, 0.5mM 내지 약 5mM(또는 약 0.75mM 내지 약 3mM) 아데닌, 약 10mM 내지 약 150mM (또는 약 25mM 내지 약 100mM) 만니톨, 약 10mM 내지 약 75mM(또는 약 15mM 내지 약 50mM) 시트레이트(예를 들어, 나트륨 시트레이트), 약 3mM 내지 약 75mM(또는 약 5mM 내지 약 25mM) 포스페이트(예를 들어, Na2HPO4 및/또는 NaH2PO4), 및 약 50 내지 약 250mM, 또는 (약 100 내지 약 175mM) 염화물을 포함한다.

희석된 적혈구를 이용한 불활성화 방법

본원에 설명된 적혈구 조성물은 불활성화 전에 희석될 수 있다. 희석제에 적혈구를 노출하면 본원에 설명된 방법에 의한 불활성화에 적합한 수준까지 용해된 종들(예를 들어, Cl- 같은 염들)의 농도를 감소시킬 수 있다. 희석제 용액의 예들은 본원에 설명되며 표 3에 제시된다. 어떤 구체예에서, 비-충전 적혈구(예를 들어, 약 50 내지 70%, 또는 약 55 내지 65%, 또는 약 60% 범위의 적혈구용적율을 가지며, 선택적으로 SAG-M 또는 Optisol을 포함하는 적혈구)는 본원에 설명된 불활성화 방법(예를 들어, 조성물이 약 1 당량의 염기 및 약 0.2mM S-303과 함께 약 20mM GSH를 포함하는 방법) 전에 희석제 용액(예를 들어, 본원 또는 표 3에 설명된 어떤 용액)에 노출되고, 이어서 본원에 설명된 대로 퀀처 농도가 감소된다(예를 들어, 약 10mM 미만, 또는 약 5mM 미만까지). 이들 구체예들 중 일부에서, 퀀처 농도를 감소시키는 것은 처리 용액(예를 들어, 희석된 처리 용액)을 제거한 다음, 최종 첨가제 용액(예를 들어, SAG-M, AS-5, 또는 상기 설명되거나 표 2에 설명된 어떤 용액)을 첨가하는 것을 포함하며, 이로써 예를 들어, 50 내지 70%, 또는 약 55 내지 65%, 또는 약 60% 범위의 적혈구용적율을 갖는 적혈구 조성물이 제공된다. 어떤 구체예에서, 적혈구 조성물 중 염화물 이온의 농도는 불활성화 전에 약 150mM, 또는 약 120mM, 또는 약 100mM, 또는 약 90mM, 약 80mM, 또는 약 70mM, 또는 약 60mM, 또는 약 50mM, 약 40mM, 약 30mM, 또는 약 20mM, 약 10mM, 또는 약 25 내지 250mM, 또는 약 40 내지 100mM, 또는 약 50 내지 75mM, 또는 약 60 내지 70mM, 또는 약 65mM 미만 또는 초과까지 희석된다. 어떤 구체예에서, RBC 용액에 첨가되는 희석제 용액의 양(부피 기준)은 RBC 용액의 약 0.2 내지 2배, 또는 약 0.3 내지 1.5배, 또는 약 0.4 내지 1배, 또는 약 0.5 내지 0.75배이다. 이들 구체예들 중 일부에서, 적혈구 조성물은 약 30 내지 50%, 또는 약 35 내지 45%, 또는 약 40% 범위의 적혈구용적율 수준까지 희석제 용액(예를 들어, 본원 또는 표 3에 설명된 어떤 용액)으로 희석된다.

어떤 구체예에서, 본원에 언급된 희석제 용액은 다음 성분들 중 하나 이상을 포함한다: 덱스트로스, 아데닌, 만니톨, 시트레이트(예를 들어, 나트륨 시트레이트), 시트르산, 포스페이트(예를 들어, Na2HPO4 및/또는 NaH2PO4) 및 염화물(예를 들어, 염화나트륨의). 어떤 구체예에서, 희석제 용액의 덱스트로스 농도 및/또는 희석제 용액으로 희석 후 RBC 조성물 중 최종 덱스트로스 농도는 약 10mM 내지 약 150mM, 또는 약 20mM 내지 약 120mM, 또는 약 25mM 내지 약 100mM, 또는 약 30mM 내지 약 75mM, 또는 약 40mM 내지 약 50mM, 또는 약 50mM 내지 약 60mM이다. 어떤 구체예에서, 희석제 용액의 아데닌 농도 및/또는 희석제 용액으로 희석 후 RBC 조성물 중 최종 아데닌 농도는 약 0.5mM 내지 약 5mM, 또는 약 0.75mM 내지 약 3mM, 또는 약 1mM 내지 약 2.5mM이다. 어떤 구체예에서, 희석제 용액의 만니톨 농도 및/또는 희석제 용액으로 희석 후 RBC 조성물 중 최종 만니톨 농도는 약 10mM 내지 약 150mM, 또는 약 20mM 내지 약 120mM, 또는 약 25mM 내지 약 100mM, 또는 약 30mM 내지 약 75mM, 또는 약 40mM 내지 약 60mM, 또는 약 25mM 내지 약 35mM이다. 어떤 구체예에서, 희석제 용액의 시트레이트(예를 들어, 나트륨 시트레이트) 농도 및/또는 희석제 용액으로 희석 후 RBC 조성물 중 최종 시트레이트 농도는 약 5mM 내지 약 100mM, 또는 약 10mM 내지 약 75mM, 또는 약 15mM 내지 약 50mM, 또는 약 15mM 내지 약 35mM, 또는 약 20mM 내지 약 30mM이다. 어떤 구체예에서, 희석제 용액의 포스페이트(예를 들어, Na2HPO4 및/또는 NaH2PO4) 농도 및/또는 희석제 용액으로 희석 후 RBC 조성물 중 최종 포스페이트 농도는 약 1mM 내지 약 150mM, 또는 약 2mM 내지 약 100mM, 또는 약 3mM 내지 약 75mM, 또는 약 4mM 내지 약 50mM, 또는 약 5mM 내지 약 25mM, 또는 약 10mM 내지 약 20mM이다. 어떤 구체예에서, 희석제 용액의 염화물 농도 및/또는 희석제 용액으로 희석 후 RBC 조성물 중 최종 염화물 농도는 약 500mM, 또는 약 250mM, 또는 약 200mM, 또는 약 150mM, 또는 약 120mM, 또는 약 100mM, 또는 약 90mM, 또는 약 80mM, 또는 약 70mM, 또는 약 60mM, 또는 약 50mM, 또는 약 40mM, 또는 약 30mM, 또는 약 20mM, 약 10mM 또는 약 25 내지 약 250mM, 또는 약 40 내지 약 100mM, 또는 약 50 내지 약 75mM, 또는 약 60 내지 약 70mM, 또는 약 100 내지 200mM, 또는 약 125mM 내지 약 175mM 미만이거나 초과한다.

어떤 구체예에서, 본원에 언급된 희석제 용액 및/또는 희석제 용액으로 희석한 후 RBC 조성물은 10mM 내지 약 150mM(또는 약 35mM 내지 약 65mM) 덱스트로스, 0.5mM 내지 약 5mM(또는 약 0.75mM 내지 약 3mM) 아데닌, 약 10mM 내지 약 150mM (또는 약 25mM 내지 약 75mM) 만니톨, 약 10mM 내지 약 75mM(또는 약 15mM 내지 약 50mM) 시트레이트(예를 들어, 나트륨 시트레이트), 약 3mM 내지 약 75mM(또는 약 5mM 내지 약 25mM) 포스페이트(예를 들어, Na2HPO4 및/또는 NaH2PO4), 및 약 5 내지 약 50mM, 또는 (약 10 내지 약 25mM) 염화물을 포함한다.

어떤 구체예에서, 비-충전 적혈구는 본원에 설명된 불활성화 방법 전에 희석제 용액(예를 들어, 상기 설명되거나 표 3에 설명된 어떤 용액)에 노출되고, 이어서 본원에 설명된 대로 퀀처 농도가 감소된 다음, 최종 첨가제 용액(예를 들어, SAG-M, AS-5, 또는 상기 설명되거나 표 2에 설명된 어떤 용액)으로 처리되며, 이로써 사용에 적합한(예를 들어, 수혈에 적합한) RBC 조성물이 제공된다. 어떤 구체예에서, 최종 첨가제 용액은 본원에 설명된 어떤 첨가제 용액일 수 있으며, 예를 들어 염화물의 농도(및/또는 교환 후, 예를 들어 수혈 전 RBC 조성물 중의 최종 염화물 농도)가 약 500mM, 또는 약 250mM, 또는 약 200mM, 또는 약 150mM, 또는 약 100mM, 약 75mM, 또는 약 50mM, 또는 약 25mM, 또는 약 25 내지 250mM, 또는 약 40 내지 100mM, 또는 약 50 내지 75mM, 또는 약 60 내지 70mM, 또는 약 100 내지 200mM, 또는 약 125mM 내지 175mM, 또는 약 150mM 미만인 첨가제 용액이다.

복원된 충전 적혈구를 이용한 불활성화 방법

어떤 구체예에서, 충전 적혈구(pRBC)(예를 들어, 약 70 내지 90%, 또는 약 75 내지 85%, 또는 약 80% 범위의 적혈구용적율을 갖는 적혈구)는 본원에 설명된 불활성화 방법(예를 들어, 조성물이 1 당량의 염기 및 약 0.2mM S-303과 함께 20mM GSH를 포함하는 방법)을 수행하기 전에 처리 용액에 노출된다. 처리 용액의 예들은 표 4에 제시된다. 어떤 구체예에서, 처리 용액(예를 들어, 표 4에 설명된 어떤 용액)은 퀀처, 병원체-불활성화 화합물 및 어떤 첨가된 염기의 첨가 전에 pRBC에 첨가된다. 이들 구체예들 중 일부에서, pRBC 조성물이 처리 용액으로 처리되고, 그 결과로서 비-충전 적혈구(예를 들어, 약 50 내지 70%, 또는 약 55 내지 65%, 또는 약 60% 범위의 적혈구용적율을 갖는 적혈구)가 얻어진다. 어떤 구체예에서, (a) 처리 용액이 pRBC에 첨가되고, (b) 본원에 설명된 불활성화 방법(예를 들어, 조성물이 1 당량의 염기 및 약 0.2mM S-303과 함께 20mM GSH를 포함하는 방법)이 수행되고, (c) 퀀처의 농도가 본원에 설명된 대로 감소된다(예를 들어, 약 10mM 미만, 또는 약 5mM 미만까지). 이들 구체예들 중 일부에서, 단계 (c)는 처리 용액을 제거하고, 최종 첨가제 용액(예를 들어, SAG-M, AS-5 또는 표 2, 3 또는 4의 어떤 용액과 같은, 본원에 설명된 어떤 용액)을 첨가하는 것을 포함하며, 이로써 예를 들어, 약 50 내지 70%, 또는 약 55 내지 65%, 또는 약 60% 범위의 적혈구용적율을 갖는 적혈구 조성물이 제공된다. 이들 구체예들 중 일부에서, 불활성화 전에 및/또는 도중에 적혈구 조성물 중의 염화물 이온 농도는 약 150mM, 또는 약 120mM, 또는 약 100mM, 또는 약 90mM, 약 80mM, 또는 약 70mM, 또는 약 60mM, 또는 약 50mM, 약 40mM, 약 30mM, 또는 약 20mM, 약 10mM, 또는 약 25 내지 250mM, 또는 약 40 내지 100mM, 또는 약 50 내지 75mM, 또는 약 60 내지 70mM, 또는 약 65mM 미만이거나 초과한다.

어떤 구체예에서, 본원에 언급된 처리 용액은 다음 성분들 중 하나 이상을 포함한다: 덱스트로스, 아데닌, 만니톨, 시트레이트(예를 들어, 나트륨 시트레이트), 시트르산, 포스페이트(예를 들어, Na2HPO4 및/또는 NaH2PO4) 및 염화물(예를 들어, 염화나트륨의). 어떤 구체예에서, 처리 용액의 덱스트로스 농도 및/또는 RBC 조성물 중에서 처리 용액 제거 후 첨가제 용액 중 덱스트로스 농도는 약 10mM 내지 약 150mM, 또는 약 20mM 내지 약 120mM, 또는 약 25mM 내지 약 100mM, 또는 약 30mM 내지 약 75mM, 또는 약 40mM 내지 약 50mM, 또는 약 50mM 내지 60mM이다. 어떤 구체예에서, 처리 용액의 아데닌 농도 및/또는 RBC 조성물 중에서 처리 용액 제거 후 첨가제 용액 중 아데닌 농도는 약 0.5mM 내지 약 5mM, 또는 약 0.75mM 내지 약 3mM, 또는 약 1mM 내지 약 2.5mM이다. 어떤 구체예에서, 처리 용액의 만니톨 농도 및/또는 RBC 조성물 중에서 처리 용액 제거 후 첨가제 용액 중 만니톨 농도는 약 10mM 내지 약 150mM, 또는 약 20mM 내지 약 120mM, 또는 약 25mM 내지 약 100mM, 또는 약 30mM 내지 약 75mM, 또는 약 40mM 내지 약 60mM이다. 어떤 구체예에서, 처리 용액의 시트레이트(예를 들어, 나트륨 시트레이트) 농도 및/또는 RBC 조성물 중에서 처리 용액 제거 후 첨가제 용액 중 시트레이트 농도는 약 1mM 내지 약 100mM, 또는 약 2mM 내지 약 75mM, 또는 약 5mM 내지 약 50mM, 또는 약 7.5mM 내지 약 25mM, 또는 약 10mM 내지 약 15mM이다. 어떤 구체예에서, 처리 용액의 포스페이트(예를 들어, Na2HPO4 및/또는 NaH2PO4) 농도 및/또는 RBC 조성물 중에서 처리 용액 제거 후 첨가제 용액 중 포스페이트 농도는 약 1mM 내지 약 150mM, 또는 약 2mM 내지 약 100mM, 또는 약 3mM 내지 약 75mM, 또는 약 4mM 내지 약 50mM, 또는 약 5mM 내지 약 25mM, 또는 약 10mM 내지 약 20mM이다. 어떤 구체예에서, 처리 용액의 염화물 농도 및/또는 RBC 조성물 중에서 처리 용액 제거 후 첨가제 용액 중 염화물 농도는 약 250mM, 또는 약 200mM, 또는 약 150mM, 또는 약 120mM, 또는 약 100mM, 또는 약 90mM, 약 80mM, 또는 약 70mM, 또는 약 60mM, 또는 약 50mM, 또는 약 40mM, 또는 약 30mM, 또는 약 20mM, 약 10mM, 또는 약 25 내지 약 250mM, 또는 약 40 내지 약 100mM, 또는 약 50 내지 약 75mM, 또는 약 60 내지 약 70mM, 또는 약 100 내지 약 200mM, 또는 약 125mM 내지 약 175mM이다.

어떤 구체예에서, 처리 용액 및/또는 RBC 조성물 중에서 처리 용액 제거 후 첨가제 용액은 10mM 내지 약 150mM(또는 약 35mM 내지 약 65mM) 덱스트로스, 0.5mM 내지 약 5mM(또는 약 0.75mM 내지 약 3mM) 아데닌, 약 10mM 내지 약 150mM(또는 약 25mM 내지 약 75mM) 만니톨, 약 5mM 내지 약 75mM(또는 약 10mM 내지 약 20mM) 시트레이트(예를 들어, 나트륨 시트레이트), 약 3mM 내지 약 75mM(또는 약 5mM 내지 약 25mM) 포스페이트(예를 들어, Na2HPO4 및/또는 NaH2PO4), 및 약 5 내지 약 100 mM, 또는 (약 25 내지 약 75mM) 염화물을 포함한다.

방법 효능의 평가

상기 논의된 log 불활성화의 비교에 더하여, 개선된 퀀칭 방법의 효능이 그 내용 전문이 본원에 참고자료로서 포함되는 U.S. 특허 공개 No. 2006/0115466에 설명된 몇 가지 다른 방법들에 의해 평가될 수 있다. 예를 들어, 적혈구의 기능, 형태 및 수화 상태의 항목으로, 그리고 항체와 같은 면역 시스템과 처리된 적혈구의 반응성의 항목으로, 적혈구 조성물의 변형을 평가함으로써 퀀칭 방법이 평가될 수 있다. 처리된 적혈구 조성물이 주입 같은 인체용일 경우, 퀀칭 방법은 적혈구 기능을 실질적으로 손상하지 않아야 한다(예를 들어, 탈수에 의해). 적혈구 기능에 대한 실질적인 손상 효과의 결여는 적혈구 기능을 시험하는 본 분야에 공지된 방법들에 의해 측정될 수 있다. 특히, 탈수 수준은, 예를 들어 적혈구용적율(충전세포용적, PCV), 삼투 취약성, 평균 혈구 헤모글로빈 농도(MCHC), 용혈반응 %, 및 엑타시토메트리(ektacytometry)에 의해서 측정될 수 있다. 총 ATP(아데노신 5'-트리포스페이트), 총 2,3-DPG(2,3-디포스포글리세롤) 또는 세포외 칼륨과 같은 다른 기능 표시인자들의 수준도 측정될 수 있으며, 미처리 대조군과 비교될 수 있다. 추가로, 세포내 및 세포외 pH, 헤모글로빈, 글루코오스 소비 및 락테이트 생산이 측정될 수 있다. 본 발명의 개선된 방법은 U.S. 특허 공개 No. 2006/0115466에 이전에 설명된 처리 조건(예를 들어, 거기 설명된 인큐베이션 후 퀀처 농도의 감소 없이 S-303/적혈구 혼합물과 조합된 완전 퀀칭된(2 염기 당량) 20mM 글루타티온)과 비교될 수 있다.

본 발명의 어떤 구체예에서, 본원에 설명된 방법 및 조성물의 적혈구는 처리 후 최소한 손상되거나, 또는 전혀 손상되지 않는다(예를 들어, 탈수, 용혈반응 등). 어떤 구체예에서, 적혈구 조성물, 퀀처, 병원체-불활성화 화합물 및 어떤 첨가된 염기를 포함하는 얻어진 혼합물의 적혈구(퀀처 농도 감소 전 또는 후)는 4% 미만, 또는 3% 미만, 또는 2% 미만, 1% 미만의 용혈반응, 또는 0.5% 미만의 용혈반응을 가진다. 어떤 구체예에서, 얻어진 혼합물의 적혈구는 퀀처(예를 들어, 글루타티온) 농도 감소 후 4℃에서 약 10일째에, 또는 4℃에서 약 28 또는 42일째에, 또는 4℃에서 약 42일째에 4% 미만, 또는 3% 미만, 또는 2% 미만, 또는 1% 미만, 또는 0.5% 미만의 용혈반응을 가진다.

어떤 구체예에서, 적혈구 조성물, 퀀처, 병원체-불활성화 화합물 및 어떤 첨가된 염기를 포함하는 얻어진 혼합물의 적혈구(퀀처 농도 감소 전 또는 후)는 50% 초과, 또는 55% 초과, 또는 60% 초과, 또는 65% 초과의 충전세포용적(PCV)을 가진다. 어떤 구체예에서, 얻어진 혼합물의 적혈구는 퀀처(예를 들어, 글루타티온) 농도 감소 후 4℃에서 약 10일째에, 또는 4℃에서 약 28 또는 42일째에, 또는 4℃에서 약 42일째에 50% 초과, 또는 55% 초과, 또는 60% 초과, 또는 65% 초과의 충전세포용적(PCV)을 가진다.

어떤 구체예에서, 적혈구 조성물, 퀀처, 병원체-불활성화 화합물 및 어떤 첨가된 염기를 포함하는 얻어진 혼합물의 적혈구(퀀처 농도 감소 전 또는 후)는 130 초과, 또는 135 초과, 또는 140 초과, 또는 145 초과, 또는 150 초과, 또는 155 초과의 중간 혈구 취약성(MCF; 50%의 용혈반응이 일어나는 삼투농도)을 가진다. 어떤 구체예에서, 얻어진 혼합물의 적혈구는 퀀처(예를 들어, 글루타티온) 농도 감소 후 4℃에서 약 10일째에, 또는 4℃에서 약 28 또는 42일째에, 또는 4℃에서 약 42일째에 130 초과, 또는 135 초과, 140 초과, 또는 145 초과, 또는 150 초과, 또는 155 초과의 중간 혈구 취약성(MCF)을 가진다.

ATP, 2,3-DPG, 글루코오스, 헤모글로빈, 용혈반응, 및 칼륨을 측정하는 방법들은 본 분야에서 이용할 수 있고, 본원 실험 부문에 설명된다. 예를 들어, 그 내용이 본원에 포함되는 Davey et al, Transfusion, 32:525-528 (1992)를 참조한다. 또한, 적혈구 기능의 측정 방법이 Greenwalt et al, Vox Sang, 58:94-99 (1990); Hogman et al, Vox Sang, 65:271-278 (1993); 및 Beutler et al, Blood, Vol. 59 (1982)에 설명되며, 이들의 내용도 본원에 참고자료로서 포함된다. 예를 들어, 총 ATP 및 총 2,3-DPG가 Sigma ATP 키트 또는 2,3-DPG 키트(Sigma, St. Louis, Mo.)를 사용하여 측정될 수 있다. ATP 키트는 Sigma 과정 No. 366-UV에 따라서 사용될 수 있으며, 이것의 내용이 본원에 참고자료로서 포함된다. 또한, 총 ATP는 루시페라제 기반 효소 분석법 또는 Beutler(1984)에 의해서 설명된 프로토콜을 이용하여 측정될 수 있다. 세포외 칼륨 수준은 Ciba Corning 모델 614 K+/Na+ 분석기(Ciba Corning Diagnostics Corp., Medford, MA)를 사용하여 측정될 수 있다. 세포외 pH는 12,000x g에서 15분간 4℃에서 세포를 원심분리하고 상청액을 제거함으로써 측정될 수 있으며, 상청액의 pH가 실온에서 표준 pH 미터에 의해 측정될 수 있다(예를 들어, Beckman, 에폭시 칼로멜 전극). 세포내 pH에 대해서, 나머지 펠릿을 원심분리 튜브에 넣고 봉한 다음, 적어도 2시간 동안 -80℃에 보관할 수 있다. 다음에, 탈이온수를 첨가하여 이것을 용해시킬 수 있다. 용해된 샘플을 잘 혼합하고, 용액의 pH가 표준 pH 미터를 사용하여 실온에서 측정되거나, 또는 Ciba Corning 모델 238 혈중 기체 분석기(Ciba Corning Diagnostics Corp., Medford, MA)를 사용하여 실온에서 측정될 수 있다. 측정은 처리 직후 처리-후 저장일의 함수로서, 예를 들어 42일까지 동안의 저장일의 함수로서 수행될 수 있다. 본 발명의 방법은 처리된 적혈구의 용혈반응이 28일 저장 후 3% 미만, 더 바람직하게는 42일 저장 후 2% 미만, 가장 바람직하게는 4℃에서 42일 저장 후 약 1% 이하인 적혈구 조성물을 제공한다. 어떤 구체예에서, 2mM 산성 글루타티온과 0.2mM S-303을 사용하여 처리된 적혈구 조성물과 비교하여 총 ATP 수준이 더 높을 수 있는 적혈구 조성물(예를 들어, 본원에 설명된 방법들 중 어느 것을 사용한 적혈구 조성물)이 제공된다. 어떤 구체예에서, 본원에 설명된 퀀칭 방법은 2mM 산성 글루타티온과 0.2mM S-303을 사용한 방법에서 얻어진 조성물과 비교하여 약 20%, 또한 30%, 또한 40% 또는 약 50% 더 높은 ATP 수준을 갖는 적혈구 조성물을 제공한다. 어떤 구체예에서, 더 높은 ATP 수준은 저장 후 7, 14, 21, 28, 35, 또는 42일까지 유지된다. 어떤 구체예에서, 더 높은 ATP 수준은 저장 동안 감소된다.

본 발명의 어떤 구체예에서, 본원에 설명된 방법 및 조성물은 적혈구가 병원체-불활성화 화합물로 인한 원치않는 부반응(예를 들어, 병원체-불활성화 화합물과 RBC 표면의 결합)을 감소된 수로 갖는 적혈구 조성물을 포함한다. 어떤 구체예에서, 부반응은 병원체-불활성화 화합물에 의한 적혈구 표면의 변형이다. 본 발명의 방법에서 적혈구 변형의 감소는 그 내용이 본원에 참고자료로 포함되는 U.S. 특허 공개 No. 2006/0115466에 설명된 것들과 같은, 본 분야에 공지된 몇 가지 분석법에 의해서 평가될 수 있다. 또한, RBC 표면에 결합된 아크리딘의 정량이 본원에 설명된 감응성 형광-활성화 면역 유세포계수 분석법(IFC)을 이용하여 결정될 수 있다.

형광 검출 분석과 관련하여, 본 발명의 퀀칭 방법은, 염기를 사용하지 않은 동일한 처리와 비교했을 때(예를 들어, 중화된 글루타티온을 사용한 방법과 중화되지 않은 글루타티온을 사용한 동일한 방법의 비교), 적어도 10%, 또한 적어도 25%, 또한 적어도 50%, 또한 적어도 75%, 또는 적어도 90%까지 중간 형광의 감소를 가져올 수 있다. 예를 들어, 염기를 사용한 조성물(예를 들어, 약 15-25mM 글루타티온, 약 0.5 내지 1.5 당량의 염기, 및 약 0.2mM S-303을 포함하는 적혈구 조성물) 중 어느 것을 사용한 본 발명의 퀀칭 방법은 염기를 사용하지 않은 동일한 조성물(예를 들어, 염기 없이 약 15-25mM 글루타티온 및 약 0.2mM S-303을 포함하는 적혈구 조성물)과 비교했을 때 중간 형광 수준의 저하를 가져올 수 있다.

또한, 본 발명의 퀀칭 방법 및 조성물에서 RBC 표면에 결합된 병원체-불활성화 화합물의 수준은 항체 결합 능력(ABC; 적혈구 당 병원체-불활성화 화합물 또는 그것의 유도체의 분자 수, Bangs Laboratories, Inc.(인디애나 피셔)의 캘리브레이션 비드를 사용하여 측정; 실시예 5 및 9 참조)의 항목으로 측정될 수 있고, 이것은 알로피코시아닌(APC)와 콘쥬게이션된 마우스 단클론 항-아크리딘 항체와 FACS-Caliber 유세포계수기(BD Biosciences)를 수반한다. 본 발명의 방법 및 조성물 중 어느 것의 어떤 구체예에서, RBC는 약 75,000 미만, 또는 약 70,000 미만, 또는 약 60,000 미만, 또는 약 55,000 미만, 또는 약 52,500 미만, 또는 약 50,000 미만, 또는 약 47,500 미만, 또는 약 45,000 미만, 또는 약 42,500 미만, 또는 약 40,000 미만, 또는 약 37,500 미만, 또는 약 35,000 미만, 또는 약 32,500 미만, 또는 약 30,000 미만, 또는 약 27,500 미만, 또는 약 25,000 미만의 평균 ABC 값을 가진다. 어떤 구체예에서, RBC는 약 10,000 내지 80,000, 또는 약 20,000 내지 70,000, 또는 약 25,000 내지 70,000, 또는 약 25,000 내지 60,000, 또는 약 30,000 내지 50,000, 또는 약 35,000 내지 45,000의 평균 ABC 값을 가진다. 본원에 설명된 방법들의 어떤 구체예에서, 퀀처 및 염기에 의한 이러한 유사한 처리(예를 들어, 중화된 글루타티온)와 비교했을 때, 염기로 처리되지 않은(예를 들어, 중화되지 않은 글루타티온) RBC 조성물을 사용한 동일한 방법과 비교하여 90% 미만, 또한 75% 미만, 또한 65% 미만, 또한 55% 미만, 또한 45% 미만, 또한 35% 미만, 또한 25% 미만, 또는 10% 미만의 ABC 값을 가져올 수 있다.

또한, 본 발명의 퀀칭 방법은 샘플 중에서 핵산의 변형 수준을 측정함으로써 기존 방법들과 비교될 수 있다. 전형적으로, 적혈구 조성물은 백혈구를 함유할 수 있고, 백혈구로부터 핵산이 분리될 수 있다. 방사선 활성 동위원소를 갖는 병원체-불활성화 화합물은 이 화합물과 핵산의 반응시 핵산에 결합된 채로 있을 것이다. 이것을 사용하여 다양한 퀀칭 방법에 대해 핵산과 반응된 화합물의 양을 평가할 수 있고, 예상된 백혈구 불활성화와 직접 상관될 수 있는 측정값이 제공된다. 1,000개 핵산 염기쌍 당 형성된 S-303 애덕트의 수가 병원체 불활성화에 대한 다양한 방법들의 예상된 영향을 평가하기 위한 모델로서 사용될 수 있다. 또는 달리, 적합한 양의 병원체가 적혈구 조성물에 첨가될 수 있고, 처리 후 병원체의 핵산이 분리될 수 있다. 그러나, 이 경우에는 어떤 잔류 백혈구의 수준이 병원체 핵산의 측정값에 영향을 미치지 않도록 샘플이 백혈구 감소될 필요가 있다.

원치않는 부반응(예를 들어, 바람직하지 않은 면역반응을 유도할 수 있는 병원체-불활성화 화합물과 RBC 표면의 결합) 및 탈수의 수준을 감소시키면서 충분한 병원체 불활성화를 제공하는 것에 더하여, 적어도 일부 구체예에서, 본 발명의 퀀칭 방법은 또한 병원체 불활성화 후 반응성 친전자성 종들의 농도의 감소를 제공한다. 적혈구 조성물이 주입을 목적으로 하는 경우, 반응성 친전자성 종들의 수준은 가능한 낮은 것이 중요하며, 본질적으로 더 이상 검출되지 않는 것이 바람직하다. 반응성 친전자성 종들의 존재는 액체 크로마토그래피-질량분광법(LC-MS-MS)을 포함하는 크로마토그래피 방법 같은, 본 분야에서 이용할 수 있는 방법을 사용하여 결정될 수 있다. 이에 더하여, Mattes(Mattes, WR, Anal. Biochem. 1992 Oct; 206 (1): 161-7)에 의해 설명된 일반적인 알킬레이터 분석을 이용하는 것 등에 의해서, 핵산의 구아닌 잔기와 반응하는 능력을 평가함으로써 샘플의 잔류 활성이 평가될 수 있다. 이 분석에서는 병원체-불활성화 화합물 및 퀀처와 함께 적합한 시간 동안 인큐베이션한 후 RBC가 추출된다. 어떤 잔류한 병원체-불활성화 화합물과 퀀처 그리고 다른 작은 종들이 단백질로부터 분리된다. 다음에, 이들 종들이 8-3H 구아닌 잔기로 합성된 이중-가닥(ds) DNA와 함께 인큐베이션된다. 잔류한 병원체-불활성화 화합물은 구아닌의 N7 위치에서 ds DNA와 반응하며, 이것은 8-H 잔기를 산성화하여 용액으로 3H를 방출하는데, 이것이 분리되고 측정될 수 있다. 방출된 트리튬의 양이 정량될 수 있으며, 추출된 시험 샘플에 존재하는 잔류 알킬레이터의 양과 1:1의 상관성을 가진다. 이러한 방법들에 의해서 측정된 친전자성 종들의 수준이 본 발명의 개선된 방법을 사용하여 평가될 수 있으며, 공지된 방법과 비교된다.

본원에 설명된 방법들 각각의 어떤 구체예에서, 방법은 혼합물 중의 화합물 농도를 감소시키는 단계를 더 포함하며, 여기서 화합물은 병원체-불활성화 화합물 및 병원체-불활성화 화합물의 변성 산물로 구성되는 군으로부터 선택된다. 어떤 구체예에서, 방법은 혼합물 중의 병원체-불활성화 화합물 농도를 감소시키는 단계를 포함한다. 어떤 구체예에서, 방법은 혼합물 중의 친전자성 종들의 농도를 감소시키는 단계를 포함한다. 혈액 제품과 같은 생물학적 물질 중의 병원체-불활성화 화합물의 농도는, 예를 들어 뱃치 과정 또는 유동 제거 과정에서 흡착에 의해서 처리 후 감소될 수 있다. 사용가능한 방법 및 장치들이 U.S. 특허 Nos. 6,544,727; 6,331,387; 6,951,713; 및 7,037,642; 및 U.S. 특허출원 Nos. 2002/0192632(포기) 및 2001/0009756(포기)에 설명되며, 이들 각각의 내용은 그 전문이 참고자료로서 본원에 포함된다. 따라서, 어떤 구체예에서, 병원체-불활성화 화합물의 농도는 이 화합물을 병원체-불활성화 화합물에 대해 친화성을 갖는 흡착제 입자를 포함하는 흡착 매질과 접촉시킴으로써 감소된다. 어떤 구체예에서, 흡착 시스템은 뱃치 과정에서 병원체-불활성화 화합물을 제거하도록 구성된다. 어떤 구체예에서, 병원체-불활성화 화합물은 화합물 흡착 장치를 사용해서는 감소되지 않는다. 어떤 구체예에서, 혼합물 중 병원체-불활성화 화합물의 농도는 본 분야에 공지된 기술을 이용하여 적혈구를 세척함으로써 감소된다. 어떤 구체예에서, 혼합물 중 병원체-불활성화 화합물의 농도는 본원에 설명된 및/또는 본 분야에 공지된 방법들에 의해서 처리 용액(예를 들어, SAG-M, AS-5, 또는 표 2, 3 및/또는 4에 설명된 어떤 용액)의 일부 또는 전부를 제거함으로써 감소된다(예를 들어, 원심분리 및 압착 장치 또는 원심분리와 압착기의 조합, 예를 들어 Terumo?에 의해 제조된 TACSI를 사용한다). 어떤 구체예에서, 혼합물 중 병원체-불활성화 화합물의 농도는 처리 용액(예를 들어, SAG-M, AS-5, 또는 표 2, 3 및/또는 4에 설명된 어떤 용액)의 일부 또는 전부를 제거한 다음, 혼합물에 첨가제 용액(예를 들어, SAG-M, AS-5, 또는 표 2에 설명된 어떤 용액)을 첨가함으로써 감소된다. 어떤 구체예에서, 병원체-불활성화 화합물의 농도는 퀀처 농도의 감소와 동시에 감소된다.

처리된 혈액 조성물

어떤 구체예에서, 본 발명은 또한 본원에 설명된 처리 방법들 각각으로부터 얻어진 적혈구 조성물을 제공한다. 어떤 구체예에서, 본 발명은 또한 본원에 설명된 처리 방법들 각각에 의해서 제조할 수 있는 적혈구 조성물을 제공한다. 한 양태로서, 본 발명은 a) 병원체-불활성화 화합물의 친전자성 기와 공유 반응한 적혈구; 및 b) 병원체-불활성화 화합물과 반응할 수 있는 티올기를 포함하는 퀀처를 포함하는 조성물을 제공하며, 여기서 조성물은 4℃에서 28 또는 42일 저장 후 인체에 주입하기에 적합하다.

본원에 설명된 방법 및 조성물들 각각의 어떤 구체예에서, 적혈구 조성물 중의 적혈구는 포유류 혈액 세포이다. 예를 들어, 적혈구는 설치류(예를 들어, 마우스 또는 래트), 개과, 토끼목(예를 들어, 토끼), 비-사람 영장류(예를 들어, 침팬지), 또는 사람의 적혈구일 수 있다. 예를 들어, 어떤 구체예에서, 적혈구는 사람 적혈구이다. 어떤 구체예에서, 적혈구는 백혈구 감소된다. 어떤 다른 구체예에서, 적혈구는 백혈구 감소되지 않는다. 어떤 구체예에서, 적혈구를 포함하는 조성물은 병원체로 오염될 가능성이 있다. 어떤 구체예에서, 적혈구 조성물은 병원체로 오염된다. 어떤 구체예에서, 병원체가 존재할 경우, 조성물 중 적어도 1 log, 또는 적어도 2 logs, 또는 적어도 3 logs, 또는 적어도 4 logs의 병원체가 불활성화된다.

어떤 구체예에서, 본 발명은 적혈구가 본원에 설명된 대로 병원체-불활성화 화합물(예를 들어, S-303)로 변형된 적혈구 조성물을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 방법의 처리에 의해 생산된 적혈구 조성물은 병원체-불활성화 화합물의 변성 산물(예를 들어, 퀀처와 병원체-불활성화 화합물의 반응 산물)을 포함한다. 어떤 구체예에서, 변형은 병원체-불활성화 화합물의 친전자성 기와 적혈구 표면의 반응이다. 어떤 구체예에서, 병원체-불활성화 화합물이 적혈구 표면에 공유 결합된다. 어떤 구체예에서, 병원체-불활성화 화합물이 적혈구 표면의 하나 이상의 단백질에 공유 결합된다. 어떤 구체예에서, 변형은 병원체-불활성화 화합물의 친전자성 기와 반응된 적혈구의 친핵성 기이며, 여기서 친전자성 기는 머스터드 기이고, 친핵성 기는 머스터드 기의 염소 원자들 중 하나 이상이 치환된 것이다. 어떤 구체예에서, 병원체-불활성화 화합물은 적혈구 표면과 비-공유 결합된다. 어떤 구체예에서, RBC 조성물은 75,000 미만, 또는 70,000 미만, 또는 60,000 미만, 또는 55,000 미만, 또는 52,500 미만, 또는 50,000 미만, 또는 47,500 미만, 또는 45,000 미만, 또는 42,500 미만, 또는 40,000 미만, 또는 37,500 미만, 또는 35,000 미만, 또는 32,500 미만, 또는 30,000 미만, 또는 27,500 미만, 또는 25,000 미만의 평균 ABC 값을 가진다. 어떤 구체예에서, RBC는 약 10,000 내지 80,000, 또는 약 20,000 내지 70,000, 또는 약 25,000 내지 70,000, 또는 약 25,000 내지 60,000, 또는 약 30,000 내지 50,000, 또는 약 35,000 내지 45,000의 평균 ABC 값을 가진다.

어떤 구체예에서, 적혈구 조성물은 병원체-불활성화 화합물에 의한 처리를 수반하는 다른 방법에 의해 생산된 적혈구에 비하여, 병원체-불활성화 화합물에 의한 적혈구의 표면 변형의 감소된 수준을 포함한다. 어떤 구체예에서, 본원에 설명된 방법의 처리에 의해 생산된 적혈구 조성물은 병원체-불활성화 화합물에 의한 처리를 수반하는 다른 방법(예를 들어, 반응 혼합물에 충분한 퀀처 및/또는 염기가 첨가되지 않는 방법, 반응 혼합물에 퀀처 및/또는 염기가 전혀 첨가되지 않는 방법, 및/또는 낮은 pH에서의 처리)에 의해 생산된 적혈구 조성물에 비하여, 처리 완료 후 반응성 친전자성 기를 포함하는 병원체-불활성화 화합물의 감소된 양을 포함한다. 어떤 구체예에서, 조성물 중 반응성 친전자성 기를 포함하는 병원체-불활성화 화합물의 양은 병원체-불활성화 화합물을 수반하는 다른 방법(예를 들어, 반응 혼합물에 충분한 퀀처 및/또는 염기가 첨가되지 않는 방법, 반응 혼합물에 퀀처 및/또는 염기가 전혀 첨가되지 않는 방법, 및/또는 낮은 pH에서의 처리)에 의해 처리된 조성물에 비하여, 약 10%, 약 25%, 약 50%, 약 75%, 약 90%, 약 95%, 또는 약 99%까지 감소된다.

이들 구체예들 중 일부에서, 적혈구 조성물은 잔류 퀀처 화합물(예를 들어, 글루타티온)을 포함한다. 어떤 구체예에서, 조성물은 저장 동안 RBC 생육력 및 수명을 유지하고, 적혈구 탈수 및/또는 감소된 삼투 취약성을 피할 수 있는 충분히 낮은 농도의 퀀처를 포함한다. 어떤 구체예에서, 조성물은 이전에 조성물에 사용된 퀀처 농도보다 충분히 낮은 농도의 퀀처를 포함한다. 어떤 구체예에서, 이전에 사용된 높은 퀀처 농도는 저장 동안 RBC 생육력 및 수명을 감소시키고 및/또는 적혈구 탈수를 증가시키고 삼투 취약성을 감소시키며, 낮은 농도는 이전에 조성물에 사용된 퀀처 농도보다 충분히 낮다. 어떤 구체예에서, 조성물 중 퀀처 농도는 약 25mM 미만, 약 20mM 미만, 약 15mM 미만, 약 10mM 미만, 약 8mM 미만, 약 6mM 미만, 약 5mM 미만, 약 4mM 미만, 약 3mM 미만, 약 2mM 미만, 또는 약 1mM 미만이다. 어떤 구체예에서, 조성물 중 퀀처 농도는 약 1mM 내지 20mM, 약 2mM 내지 15mM, 약 3mM 내지 10mM, 약 4mM 내지 8mM, 또는 약 5mM 내지 6mM 범위이다.

어떤 구체예에서, 조성물은 첨가제 용액(예를 들어, 표 2에 설명된 용액, 또는 표 2에 설명된 성분들의 어떤 조합을 포함하는 용액)을 포함한다. 어떤 구체예에서, 조성물은 염화나트륨, 아데닌, 글루코오스, 포스페이트, 및/또는 만니톨을 포함한다. 어떤 구체예에서, RBC 조성물 중 염화물 이온의 최종 농도(예를 들어, 수혈 전)는 약 500mM, 또는 약 250mM, 또는 약 200mM, 또는 약 150mM, 또는 약 100 mM, 약 75mM, 또는 약 50mM, 또는 약 25mM, 또는 약 25 내지 250mM, 또는 약 40 내지 100mM, 또는 약 50 내지 75mM, 또는 약 60 내지 70mM, 또는 약 100 내지 200mM, 또는 약 125mM 내지 175mM, 또는 약 150mM 미만이다.

어떤 구체예에서, 조성물은 4℃에서 약 2일, 또는 약 5일, 또는 약 10일, 또는 약 15일, 또는 약 20일, 또는 약 28일, 또는 약 35일, 또는 약 42일 저장 후 개체(예를 들어, 사람)에 주입하기에 적합하다.

이들 구체예들 중 일부에서, 조성물은 a) 병원체-불활성화 화합물(예를 들어 S-303)의 친전자성 기와 공유 반응되고, i) 60%를 초과하는 충전세포용적(PCV), 및/또는 ii) 약 25,000 내지 70,000(또는 약 35,000 내지 45,000)의 평균 항체 결합 능력(ABC)을 갖는 적혈구; 및 b) 약 8mM 미만(또는 6mM 미만, 또는 약 2mM 미만)의 농도의 글루타티온 퀀처를 포함한다. 어떤 구체예에서, 병원체가 존재할 경우, 적어도 3 log(또는 적어도 1 log)의 병원체가 불활성화된다. 어떤 구체예에서, 조성물은 4℃에서 28 또는 42일까지 저장 후 인체에 주입하기에 적합하다.

키트

개선된 퀀칭 방법에 더하여, 본 발명은 적혈구 조성물의 가공을 위한 일회용 키트를 제공하며, 여기서 가공은 수동 또는 자동으로 행해질 수 있다. 어떤 구체예에서, 본 발명은 병원체-불활성화 화합물, 퀀처, 및/또는 본원에 설명된 방법들 각각에서 사용된 염기를 포함하는 키트를 제공한다. 어떤 구체예에서, 키트는 본원에 설명된 퀀처 농도의 감소 후 사용하기 위한 신선한 용액(세포 현탁용 버퍼 같은)을 제공한다.

어떤 구체예에서, 키트는 어떤 염을 포함하는 S-303 및 어떤 염을 포함하는 중화된 글루타티온을 포함한다. S-303은 고체 형태일 수도 있고 용액일 수도 있다. 유사하게, 중화된 글루타티온도 고체 형태일 수도 있고 용액일 수도 있다. 이들 고체 또는 용액은 허용되는 부형제, 애쥬번트, 희석제, 또는 안정제를 더 포함할 수 있다. 어떤 구체예에서, S-303은 염산염이고, 중화된 글루타티온은 약 1 당량의 수산화나트륨으로 중화된다. 어떤 구체예에서, S-303과 중화된 글루타티온은 고체 형태이고, 키트는 S-303을 용해하기 위한 적합한 용액 및 중화된 글루타티온을 용해하기 위한 적합한 용액을 더 포함한다. 어떤 구체예에서, 본 발명은 병원체-불활성화 화합물, 퀀처 및 퀀처를 용해하기 위한 용액을 포함하는 키트를 제공하며, 여기서 용액은 퀀처를 중화하거나 부분적으로 중화한다. 본원에 논의된 방법 및 키트는 병원체-불활성화 화합물 및 퀀처의 어떤 적합한 제약 제형을 포함하며, 이들은 혼합물로 또는 개별적으로 조제될 수 있다. 제약학적으로 허용되는 제형은 당업자에게 공지되어 있으며, 적합한 부형제, 애쥬번트, 희석제 또는 안정제의 예들은, 예를 들어 Gennaro, ed., Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 20th edition, Lippincott Williams &Wilkins에서 찾을 수 있다. 또한, 본 발명은 상기 설명된 대로 적혈구, 병원체-불활성화 화합물 및 퀀처를 포함하는, 상기 설명된 방법에서 얻어진 조성물을 포함하며, 여기서 조성물은 병원체-불활성화 화합물의 개선된 퀀칭을 행하기 위한 적합한 pH 범위를 가진다.

다른 양태로서, 본 발명은 핵산 결합 리간드와 친전자성 기이거나, 또는 친전자성 기를 형성하는 작용기를 포함하는 병원체-불활성화 화합물(그것의 어떤 염을 포함한다), 티올기를 포함하는 퀀처(그것의 어떤 염을 포함한다), 및 약 0.75 내지 약 1.25 당량의 염기를 포함하는, 예를 들어 병원체를 불활성화하기 위해 적혈구 조성물을 처리하기 위한 유용한 키트를 제공하며, 여기서 당량은 키트 중 퀀처의 몰량과 동등한 몰량을 의미한다. 어떤 구체예에서, 키트는 약 1 당량의 적합한 염기를 포함한다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 어떤 염을 포함해서 핵산 결합 리간드 및 친전자성 기이거나, 또는 친전자성 기를 형성하는 작용기를 포함하는 병원체-불활성화 화합물(예를 들어, S-303), 어떤 염을 포함해서 티올기를 포함하는 중화된 퀀처(예를 들어, 중화된 글루타티온), 및 선택적으로 본원에 설명된 퀀처 농도 감소 후 사용하기 위한 신선한 용액(세포 현탁용 버퍼 같은)을 포함하는, 병원체를 불활성화하기 위해서 적혈구 조성물을 처리하기 위한 키트를 제공한다. 어떤 구체예에서, 용액은 본원에 설명된 첨가제 용액, 희석제 용액, 및/또는 처리 용액이다(예를 들어, SAG-M, AS-5, 또는 상기 설명되거나 표 2, 3 및/또는 4에 설명된 어떤 용액).

실시예 , 재료 및 방법

본 발명은 하기 비제한적 예들에 의해 더 예시된다.

실시예 1: 유기체 제조

실시예 , 재료 및 방법

이들 연구에 사용된 박테리아 및 바이러스 균주는 California Department of Health Services 또는 American Type Culture Collection로부터 얻은 임상 분리주였다.

박테리아: 냉동된 박테리아 작업 스톡을 글루코오스를 첨가하지 않은 50% 효모 추출물 배지와 50% 태아 소 혈청의 혼합물을 함유하는 500mL 플라스크에 접종했다. 플라스크를 37℃로 설정된 쉐이킹 수조에서 하룻밤 인큐베이션했다. 그람 양성 박테리아를 오버나잇 배양물로부터 직접 혈액 제품에 스파이크했다. 그람 음성 박테리아의 오버나잇 배양물을 신선한 배양 배지로 1:1000 희석하여 추가로 하위-배양한 다음, 광학 밀도에 의해 측정했을 때 이들이 log 상에 도달할 때까지 상기와 같이 인큐베이션했다. 이 log 상 성장물을 PI 실험용 혈액 제품에 스파이크했다.

바이러스: 세포 무함유 바이러스 스톡을 각 바이러스별로 적합한 셀라인을 사용하여 제조했다. 이들 스톡을 -80℃에 냉동시켰고, 해동하여 PI 실험용 혈액 제품에 직접 스파이크했다.

실시예 2: RBC 유닛 제조

채혈일에 또는 채혈 후 3일 이내에 전혈 450mL 또는 500mL 단위로서 Cerus에 혈액을 받았다. 대부분의 경우 전혈은 RBC 유닛으로 가공되기 전에 백혈구 필터링하였다. 때때로 유닛이 성공적으로 백혈구 필터링되지 않았을 수도 있으며(예를 들어, 겸상 적혈구를 가진 공여자의 혈액), 이들 유닛은 백혈구 내에서 생존하지 않는다고 알려진 유기체의 PI 연구를 위해 백혈구 필터링 없이 사용하였다.

백혈구 필터링 후, 혈액을 원심분리하고 혈장을 압착했다. 다음에, 바람직한 RBC 첨가제 용액, 예를 들어 AS-3(Nutricel)를 첨가하고, 얻어진 RBC 유닛은 즉시 사용하거나, 또는 사용시까지 4℃에 저장했다.

실시예 3: 병원체 불활성화(PI)

PI 과정은 시험될 유기체의 배양물을 RBC 유닛에 접종하는 것을 포함한다. RBC 유닛에서 유기체의 전형적인 표적 유입 역가는 대략 10⁶ cfu 또는 pfu/mL RBC였다. 대부분의 경우, 유기체 부피(어떤 배양 배지를 포함해서)는 RBC 유닛 부피의 약 1%였고, 전형적으로 10%를 초과하지 않았다. 더 낮은, 더 생리학적으로 관련 있는 수준의 박테리아의 불활성화를 평가하기 위해서, 10 내지 10⁵ cfu/유닛의 유입을 사용하였다. 저 수준 유입 연구에서, 두 RBC 유닛을 모아서 스파이크한 다음, 테스트 유닛과 대조군 유닛으로 분할했으며, 테스트 유닛은 본원에 설명된 대로 처리했고, 대조군 유닛은 테스트 유닛과 동일한 온도 조건에서 유지되면서 단지 퀀처(예를 들어, GSH)만을 첨가했다(병원체 불활성화제, 예를 들어 S-303 없이).

RBC 유닛에 유기체의 첨가 후, 용기의 끝을 쥐고 8자 모양이나 자전거 페달의 움직임처럼 끝을 10번 움직여 유닛을 혼합했다.

다음에, 오염된 RBC를 RBC PI 과정 일회용 세트의 혼합 용기로 옮겼다. 이 세트는 일련의 플라스틱 용기와 플라스틱 튜빙에 의해 연결된 포트로 구성된다. 혼합 용기는 듀얼-포트 600mL 용량 PL1813 플라스틱 용기였다. Y-튜빙 세트를 각 포트에 연결하고, Luer-개조된 소아과용 필터를 한쪽 도입선에 부착했다. 한쪽 포트의 사용하지 않는 도입선은 다른 600mL 용량 PL1813 플라스틱 용기(Incubation Container)에 연결한다. 나머지 미사용 도입선은 원래 RBC 유닛을 연결하는데 사용된 라인이었다.

다음과 같이 첨가 용액을 제조하여 유닛에 첨가했다: 1 당량의 NaOH를 함유한 600mM 글루타티온(GSH) 용액을 0.9% 식염수 약 12mL와 10N NaOH 0.9mL 중에 GSH 2.8g을 용해하여 제조했다. 적합한 부피의 GSH 용액을 20mL 용량 주사기로 인출했다. 사용된 부피는 전형적으로 RBC 280mL 당 GSH 용액 10mL였으며, 2mL의 라인 로스를 더하여 첨가된 RBC 유닛 중 20mM GSH를 만들었다. GSH를 함유한 주사기를 인큐베이션 용기에 도입선이 연결된 Y 피팅을 공유하는 필터링 도입선을 사용하여 혼합 용기에 부착했다. 유닛을 첨가 용액의 첨가 동안 상하 혼합을 용이하게 하는 락커에 배치했다. 유닛을 락커에서 혼합하면서 GSH를 유닛에 첨가했다. 다음에, 상기 설명된 8자형 혼합 방법을 사용하여 유닛을 손으로 혼합했다. GSH 첨가 후, 유닛을 실온에서 5분간 방치했다.

방치 기간 후, 소량의 RBC 샘플을 취해서 배양하여 전처리 역가를 결정했다. 박테리아 샘플에는 표준 평판 분석을 사용했고, 바이러스에는 세포 배양 분석을 사용했다.

6mM 아뮤스탈린 염산염(S-303) 용액을 0.9% 식염수 약 15mL에 46mg S-303을 용해하여 제조했다. 적합한 용량의 S-303 용액을 20mL 주사기로 인출했다. 사용된 부피는 전형적으로 RBC 280mL 당 S-303 용액 10mL였으며, 2mL의 라인 로스를 더하여 첨가된 RBC 유닛 중 0.2mM S-303을 만들었다. 다음에, 상기 설명된 8자형 혼합 방법을 사용하여 유닛을 손으로 혼합했다. 처리-후 역가에 대한 샘플링 전에, S-303의 첨가가 병원체 불활성화를 확실히 완료한 후, 처리된 RBC 유닛을 최소 3시간 동안 실온에서 인큐베이션했다.

PI-후 3시간째에 상기 설명된 대로 샘플을 취해서 배양하여 처리-후 역가를 결정했다. 저 수준 박테리아 유입의 불활성화를 평가하는 연구에서, 시험 유닛과 대조군 유닛을 모두 처리-후 약 20시간 동안 실온에서 인큐베이션한 다음, 37℃에서 하룻밤 인큐베이션했다. 37℃ 인큐베이션 후, 처리된 시험 유닛과 동일한 처리되지 않은 대조군 유닛으로부터 각각 샘플을 취해서 배양하여 박테리아 역가를 정성 평가했다. 처리되지 않은 대조군 유닛은 성장을 나타냈다.

처리-전 역가 대 처리-후 역가의 비의 log를 취해서 각 유닛에 대해 log 감소를 측정했으며, 역가는 1Ox cfu 또는 pfu/mL로서 표시하였다.

실시예 4: RBC 시험관내 기능 실험

사람 RBC 유닛을 제조자의 지시에 따라서 AS-3(Nutricel) 같은 첨가제 용액 중에 제조했다. RBC 유닛을 다양한 농도의 GSH로 처리하여 2mM 내지 3OmM 범위의 최종 농도를 만들었다. 어떤 경우, 처리 전에 1 또는 2 염기 당량의 중탄산나트륨 또는 수산화나트륨으로 GSH의 pH를 조정했다. GSH 처리 후, RBC를 0.9% 염화나트륨과 함께 용해된 S-303로 처리하여, RBC 중 0.2mM S-303의 농도를 만들거나, 또는 0.9% 염화나트륨을 위 첨가했다. 처리 후, 유닛을 20-25℃에서 20시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 일부 유닛을 21℃, 4100x g에서 6분간 원심분리하고, 상청액을 압착하고, 신선한 첨가제 용액 100mL를 RBC에 첨가했다. 모든 유닛을 4℃에 저장했다. 처리되지 않은 대조군은 첨가제 용액 중에 제조한 후 4℃에 저장했다.

저장 과정 내내 다양한 시점에서 시험관내 기능을 분석했다. 37℃에서 세포외 pH는 Chiron Diagnostics 혈중 기체 분석기에서 각 유닛으로부터 RBC의 pH를 측정하여 결정했다. 총 ATP는 루시페라제 기반 효소 분석 또는 Beutler(1984)에 의해 설명된 프로토콜을 사용하여 측정했다. 세포 무함유 상청액을 제조하여 세포외 칼륨, 글루코오스, 및 락테이트를 평가했다. 세포외 칼륨은 Chiron Diagnostics Na/K 분석기(모델 #614) 또는 유사한 분석기를 사용하여 세포 무함유 상청액의 K+ 함량을 측정함으로써 결정했다. 세포외 글루코오스 및 락테이트는 NexCT 분석기에서 평가했다. 적혈구 지수는 Advia 혈액학 분석기(Siemens)를 사용하여 수집했다.

RBC를 0.9% 염화나트륨으로 3번 세척하고, RT에서 최소 1시간 동안 인큐베이션한 후에, 삼투 취약성 및 밀도 프로파일에 대해 분석했다. 삼투 취약성에 사용된 방법은 Beutler et al., 1982, (Blood Journal 59:1141-1147)에 개략되어 있고, 96-웰 포맷에 맞게 변형되었다(Lew et al., 2003, Blood 101:4189-4194). Danon and Marikovsky, 1964(J Lab Clin Med 6:668-674)에 따라서 마이크로헤마토크릿 튜브에서 프탈레이트 에스테르를 사용하여 밀도 분포 곡선을 얻었다.

실시예 5: RBC 표면에 결합한 병원체-불활성화 화합물의 정량

RBC 표면에 결합된 아크리딘의 수준을 알로피코시아닌(APC)와 콘쥬게이트된 마우스 항-아크리딘 단클론 항체를 사용하는 감응성 형광-활성화 면역 유세포계수 분석법(IFC) 및 FACS-Caliber 유세포계수기(BD Biosciences)를 사용하여 검출했다. 간단히 말해서, RBC를 0.9% 식염수로 3번 세척하고, 유동 인큐베이션 버퍼(HBSS, 1% BSA, 0.1% NaN3, 1mM EDTA, 3% BSA) 중에 4% 적혈구용적율까지 재현탁했다. 다음에, APC와 콘쥬게이션된 마우스 단클론 항-아크리딘 항체를 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션했다. 세포를 유동 세척 버퍼(HBSS 1% BSA, 0.1% NaN3, 1mM EDTA)로 세척하고, 동일한 버퍼에 재현탁하여, FACS-Caliber에서 적합한 게이팅으로 총 30,000 사건을 평가했다. 사람 RBC(ABC)의 세포 표면에 결합된 S-303 분자의 수의 정량을 Quantum Simply 세포 비드 키트(Bang Laboratories, Inc; 인디애나 피셔)를 사용하여 수행했다.

실시예 6: 즉시 및 저장-관련 RBC 수화 및 기능에 대한 글루타티온 pH 효과

RBC 유닛을 S-303(0.2mM) 및 NaOH(염기 당량(b.e.)을 다양하게 하여)로 pH 조정된 GSH(20mM)로 처리하여 GSH 퀀칭을 강화하였다. 시험된 첨가 용액의 pH는 0 b.e., 1 b.e., 및 2 b.e.에 대해 각각 2.9, 4.5, 및 8.9였다. 처리 후, RBC를 4℃에 저장하고, 세포외 pH, 글루코오스, 락테이트, 칼륨, 총 ATP 및 용혈반응에 대해 주기적으로 분석했다. RBC 물리적 변수들(MCV, MCH, MCHC, HDW 등)은 광학 유세분석법에 의해 측정했고, 삼투 취약성 측정은 Lew et al.(2003)에 의한 변형을 가하여 Beutler et al.(1982)에 제시된 대로 수행하였다.

알칼리성 GSH에 RBC의 노출은 즉시 및 지속 감소된 삼투 취약성 및 증가된 RBC 밀도와 함께 감소된 Hct를 가져왔다(예를 들어, 도 1 참조). 이런 즉각적인 탈수는 염기 당량을 감소시킴으로써 보정되었으며, 그 결과 GSH 용액의 pH가 저하되었다(표 5 참조). 즉각적인 탈수는 완화되었지만, RBC의 삼투 취약성은 농도 의존적 방식으로 GSH의 존재에 의해 계속 변하였다(표 6; 도 2 및 3의 추가의 실시예들). 광학 유세포분석법(Adiva 혈액학 분석기, Siemens)를 사용한 MCHC 및 MCH 분포의 측정값이 삼투 취약성 및 밀도의 변화와 상관되었다. 탈수는 그 효과가 S-303의 부재시에도 pH 및 GSH에 의해 증명되었기 때문에 S-303 독립적이었다.

RBC 수화 변화는 GSH, pH 및 농도와 상관되었지만, S-303 또는 RBC 기능 평가에 관례적으로 사용되는 생화학적 분석(ATP, 락테이트, 글루코오스)와는 상관되지 않았다. 높은 pH의 GSH에의 제한적인 노출이 초기 탈수 효과를 방지했다. 높은 수준의 GSH의 제한적인 연속 노출은 저장 탈수 효과를 방지했다. 이들 연구는 저장된 RBC의 수화 상태에 대한 평가가 RBC 품질의 예측인자로서 포함되어야 한다는 것을 나타내며, 실질적인 수화 변화는 종래의 기준에는 영향을 미치지 않지만, 적혈구 수명의 중간 정도의 변화에는 기여할 수 있다.

실시예 7: 저장 후 감소된 RBC 탈수를 가져오는 퀀처의 연속 감소를 행하는 개선된 퀀칭 방법

RBC 유닛을 S-303(0.2mM) 및 1 당량의 NaOH로 pH 조정된 GSH(20mM)로 처리하여 GSH 퀀칭을 강화하였다. GSH 처리 후, RBC를 0.9% 염화나트륨과 함께 용해된 S-303으로 처리하여, RBC 중 0.2mM S-303의 농도를 달성하거나, 또는 0.9% 염화나트륨을 위 첨가했다. 처리 후, 유닛을 20-25℃에서 20시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후 일부 유닛을 21℃, 4100x g에서 6분간 원심분리하고, 상청액을 압착하고, 신선한 첨가제 용액 100mL를 RBC에 첨가했다. 모든 유닛을 4℃에 저장했다. 처리되지 않은 대조군은 첨가제 용액 중에 제조한 후 4℃에 저장했다. RBC 삼투 취약성 측정은 Lew et al.(2003)에 의한 변형을 가하여 Beutler et al. (1982)에 제시된 대로 수행하였다.

고 농도의 GSH에 RBC의 연장된 노출은 RBC 밀도를 증가시켰고, 삼투 취약성을 감소시켰다(예를 들어, 표 5, 도 3 및 4 참조). 이런 저장-관련 탈수는 RBC 저장 전에 GSH를 제거함으로써 보정되었다(예를 들어, 도 4 및 5 참조). 시간 및 GSH 농도 의존적 탈수는 그 효과가 S-303의 부재시에도 GSH에 의해 증명되었기 때문에 S-303 독립적이었다(예를 들어, 도 6 참조).

RBC 수화 변화는 GSH와 상관되었다. 처리 용액의 신선한 첨가제 용액으로의 교체에 의한 고 농도의 GSH에의 제한된 노출이 저장 유도 탈수 효과를 방지하였다.

실시예 8: 개선된 퀀칭 방법을 위한 병원체 불활성화

약 60%의 적혈구용적율을 갖는 백혈구 감소된 RBC 유닛을 AS-3 저장 매질 중에 제조했다. RBC 유닛을 생육성 유기체 약 6 log/mL로 접종하고, 알리쿼트를 취하여 미처리 유입 대조군으로 사용했다. 1 당량 NaOH 용액 중의 GSH를 접종된 유닛에 최종 농도 20mM으로 첨가하고 잘 혼합했다. S-303을 최종 농도 0.2mM로 첨가하고, 유닛을 다시 잘 혼합한 후 20-25℃에서 3시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, 샘플을 취해서 분석하여 잔류한 생육성 유기체를 검출했다. 대조군 샘플은 제조 직후와 3시간 인큐베이션 기간 후에 적정했다. 적어도 2번의 중복 실험을 각 유기체에 대해 수행했다.

Pseudomonas를 제외하고, 그람 음성, 그람 양성 및 일례의 바이러스가 2 당량의 NaOH로 중화한 것과 비교하여 1 당량의 NaOH로 중화된 GSH로 처리했을 때 효과적으로 불활성화되었다(표 7 참조).

RBC 유닛 당 4.4 log 이하의 총 접종 역가를 사용한 Pseudomonas aeruginosa의 병원체 불활성화는 완전한 불활성화를 가져왔다.

실시예 9: 교환 단계가 있는 개선된 퀀칭 방법에서 표면- 결합된 아크리딘 수준

실시예 5에 설명된 방법을 사용하여 1 당량 NaOH로 중화된 20mM GSH와 0.2mM S-303으로 처리된 적혈구에 대한 항-아크리딘 항체 결합 능력을 측정했다. 몇 가지 RBC 제제에 대해 측정된 항체 결합 능력은 적혈구 당 약 39,000였다(도 7 참조). 이런 결합 수준은 RBC가 2 당량 NaOH로 중화된 20mM GSH로 처리되었을 때의 18,407±1195 ABC 및 RBC가 2mM 산성 GSH로 처리되었을 때의 123,714±5123 ABC와 비교된다.

실시예 10: 다양한 적혈구용적율(Hct)에서 S-303 처리에 의한 병원체 불활성화

450 내지 500 mL WB 채혈로부터 RBC 유닛을 첨가제 용액 없이(80% 회전 적혈구용적율(Hct)) 또는 첨가제 용액 중에(60% Hct) 제조했다. 다른 지시가 없다면 처리 전에 RBC를 백혈구 필터링했다. 40% Hct의 시험 유닛을 희석제 용액으로 희석했다. 약 10⁶ 유기체/mL의 고 수준 유입 또는 유닛 당 10 내지 10⁵ 유기체의 저 수준 유입으로 RBC 유닛에 접종했다. 고 수준 유입에서, 28mL의 대조군 샘플을 S-303 처리 전에 취하였다. 저 수준 박테리아 유입에서는, 전체 RBC 유닛을 모은 다음 분할하여 시험 유닛과 대조군 유닛을 제조했고, 대조군 유닛에는 유닛 당 약 10 유기체를 접종했다. 80% 및 60% Hct를 가진 시험 유닛은 200μM S-303 및 1 염기 당량의 수산화나트륨(1 b.e.)으로 중화된 20mM GSH로 처리했다. 40% Hct를 가진 시험 유닛은 130μM S-303 및 13mM GSH(1 b.e.)로 처리했다. 대조군 샘플 및 유닛은 Hct에 기초하여 20mM GSH 또는 13mM GSH(1 b.e.)로 처리했다. 고 수준 유입을 가진 유닛에서, 대조군 샘플은 시험 유닛이 처리된 시점에서 생육성 유기체에 대해 분석했다. 실온에서 3시간 인큐베이션 후, 시험 유닛과 대조군 샘플을 모두 생육성 유기체에 대해 분석했고, 이것을 부화 아가 평판 상에서의 성장(박테리아) 또는 Vero 세포에 대한 플라크 분석(VSV)에 의해 정량했다. 저 수준 유입을 가진 유닛에서는, 대조군 유닛과 시험 유닛을 실온에서 20시간 인큐베이션한 다음, 37℃에서 약 20시간 인큐베이션했다. 다음에, 샘플을 평판하여 박테리아 성장을 검출했다. 결과를 표 8에 나타낸다.

실시예 11: 다양한 적혈구용적율(Hct)에서 S-303 처리 후 RBC 수화

첨가제 용액 중에 회전 적혈구용적율에 의해 측정했을 때 40% 또는 60% Hct로 그리고 충전 적혈구로서 80% Hct로 백혈구 감소된 전혈로부터 RBC를 제조했다. 유닛을 각각 최종 농도 20mM 및 0.2mM로 GSH(나트륨 염, BioMedica Foscama, 이탈리아) 및 S-303으로 처리했다. 모든 처리된 유닛을 실온에서 20시간까지 인큐베이션했다. 처리 용액을 SAG-M으로 교체하고, 유닛을 60% Hct로 조정하여 4℃에 저장했다. 대조군 RBC 유닛을 SAG-M 중에 제조하여 4℃에 저장했다. 모든 유닛을 물리적 변수들에 대해 주기적으로 분석했다; MCHC는 손으로 측정했고, 삼투 취약성 측정은 표준 방법에 의해 수행했다(Beutler et al., 및 Lew et al., 2003). 중간 혈구 취약성(MCF)은 RBC의 50%가 용혈반응되는 NaCl 농도로서 정의하였다. MCF의 변화는 저장 동안 RBC의 표면 대 부피 비(S/V) 및 수화에 대한 지수이다. 약 6주 저장 후, 모든 처리된 유닛은 처리시의 Hct와 무관하게 미처리 대조군과 비슷한 MCF 값을 가졌다. RBC 수화의 또 다른 지수인 MCHC는 저장 종료 시점에서 시험 유닛과 대조군 유닛이 유사했다. 결과를 표 9에 나타낸다. 6주까지 처리된 RBC의 저장은 RBC 농축물의 제조를 위해 통례적으로 사용되는 광범한 Hct에 걸쳐 RBC 수화 및 S/V를 유의하게 변경하지 않았다.

실시예 12: 다양한 적혈구용적율(Hct)에서 S-303 처리 후 저장된 RBC의 시험관내 품질

첨가제 용액 중에 회전 적혈구용적율에 의해 측정했을 때 40% 또는 60% Hct로 그리고 충전 적혈구로서 80% Hct로 백혈구 감소된 전혈로부터 RBC를 제조했다. 유닛을 각각 최종 농도 20mM 및 0.2mM로 GSH(나트륨 염) 및 S-303으로 처리했다. 모든 처리된 유닛을 실온에서 20시간까지 인큐베이션했다. 처리 용액을 SAG-M으로 교체하고, 유닛을 60% Hct로 조정하여 4℃에 저장했다. 대조군 RBC 유닛을 SAG-M 중에 제조하여 4℃에 저장했다. 시험관내 기능을 처리 전후와 6주간 저장하는 동안 규칙적인 간격으로 분석했다. 시험관내 RBC 기능에서 분석된 변수들은 pH, 총 ATP, 용혈반응, 및 세포외 칼륨, 글루코오스 및 락테이트를 포함했다. 약 6주(38일 내지 44일) 저장 후, 모든 시험 유닛은 처리 Hct와 무관하게 2μmol ATP/g Hb을 초과하는 총 ATP 수준을 가졌고, 용혈반응과 MCHC는 대조군 유닛과 비슷했다. 저장 기간 내내 시험 유닛의 세포외 글루코오스는 40% 및 60% Hct에서 대조군 유닛보다 높았지만, 80% Hct를 가진 유닛은 대조군과 보다 유사했다. 세포외 락테이트는 대조군과 비교하여 Hct와 무관하게 모든 시험 유닛에서 더 낮았다. 저장 종료 시점에서, 세포외 K+는 40% 및 60% Hct 유닛에서는 대조군보다 시험 유닛에서 약간 낮았지만, 80% Hct 유닛은 대조군과 비슷했다. 모든 시험 유닛의 pH는 저장 기간 내내 대조군과 유사했다. 이 과정에서 헤모글로빈 수율은 처리 Hct와 무관하게 AABB 요건을 만족했다. 모든 대사 변수들의 활성은 6주의 저장 기간 내내 광범한 Hct에 걸쳐서 S-303 처리 후 대조군과 유사했다. 결과를 표 10에 나타낸다.

실시예 13: 희석된 RBC의 시험관내 기능 및 병원체 불활성화

SAG-M RBC 유닛을 500mL 채혈의 백혈구 감소된 전혈 유닛으로부터 제조했다. RBC 기능 연구에서는 SAG-M RBC 단위들을 ABO 타입별로 모은 다음, 매칭되는 시험 유닛과 대조군 유닛으로 분할했다. 처리 전 28.8mM 만니톨, 1.3mM 아데닌, 16.2mM 인산나트륨, 20mM 나트륨 시트레이트를 포함하는 희석제 용액(pH 7.5) 150mL를 시험 유닛에 첨가했다. 시험 유닛을 각각 최종 농도 20mM 및 0.2mM로 GSH 나트륨 염 및 S-303로 처리했다. 시험 유닛을 실온(RT)에서 20시간까지 인큐베이션했다. RT 인큐베이션 후, 유닛을 원심분리하고, 4℃에 저장 전에 첨가된 SAG-M 100mM로 상청액을 교환했다. 대조군 RBC 유닛을 SAG-M 중에 제조하여 4℃에 저장했다. 모든 유닛을 4℃에서 약 6주에 걸쳐 저장하면서 다양한 시점에서 샘플링하여 평가하였다. RBC 병원체 불활성화 연구를 위해, SAG-M RBC 유닛을 반으로 분할하고, RBC 유닛에 병원체를 접종한 후, 처리 용액과 GSH를 첨가했다. 처리 용액과 GSH 첨가 후, 유닛으로부터 대조군 샘플(5mL 내지 7mL)을 취하여 유입 병원체 역가를 결정하고, 나머지 유닛은 S-303으로 처리했다. 처리된 유닛을 주위 온도에서 3시간 정류 인큐베이션한 후 잔류 생육성 병원체 역가를 위해 샘플링했다.

시험관내 대사 및 물리적 지수를 시험관내 분석에 의해 저장 기간 내내 다양한 시점에서 평가했다. 37℃에서 세포외 pH는 Siemens Diagnostics 혈중 기체 분석기에서 측정했다. 총 ATP는 루시페라제 기반 효소 분석을 사용하여 측정했다. 세포 무함유 상청액을 제조하여 세포외 칼륨(K+), 글루코오스 및 락테이트를 평가했다. 세포외 칼륨은 EasyLyte? Na/K 분석기를 사용하여 세포 무함유 상청액의 K+ 함량을 측정함으로써 결정했다. 세포외 글루코오스 및 락테이트는 NexCT™ 분석기에서 평가했다. 평균 혈구 헤모글로빈 농도(MCHC) 및 회전 적혈구용적율은 손으로 측정했다. 삼투 취약성 측정은 표준 방법에 의해 수행하였다(Beutler et al. 및 Lew et al., 2003). 중간 혈구 취약성(MCF)는 RBC의 50%가 용혈반응한 NaCl 농도로서 정의하였다.

박테리아 불활성화 연구를 위해서, RBC에 약 6.5 log cfu/mL의 E. coli , S. marcescens, S. aureus, Y. enterocolitica, 또는 P. aeruginosa를 접종했다. 바이러스 불활성화 연구를 위해서, 바이러스에 따라서 약 4.1 log pfu/mL 내지 6.4 log pfu/mL를 RBC에 접종했다. 식염수에 용해된 GSH를 유닛에 최종 농도 20mM로 첨가했다. 아가 평판 상의 콜로니-형성 유닛(cfu)을 세어서 박테리아 역가를 결정했고, 적합한 셀라인 상의 플라크-형성 유닛(pfu)을 세어서 바이러스 역가를 결정했다. 미처리 샘플은 계산 전에 연속 희석했다. 처리된 샘플은 역가 계산 전에 희석하지 않았다.

아래 표 11 및 12에 나타낸 결과는 저장 기간에 걸쳐 허용되는 RBC 대사 기능 및 생리학적 변수들과 허용되는 병원체 불활성화를 증명한다.

Claims

(a) 병원체-불활성화 화합물의 친전자성 기와 공유 결합된 적혈구; 및
(b) 병원체-불활성화 화합물과 반응할 수 있는 티올기를 포함하는 퀀처
를 포함하는 조성물로서, 상기 적혈구가 4℃에서 28일 후에 150 mOsm을 초과하는 중간 혈구 취약성 값을 갖는 조성물.
제 1 항에 있어서, 병원체가 존재할 경우, 적어도 3 log의 병원체가 불활성화된 조성물.
제 1 항에 있어서, 작용기는 머스타드, 머스타드 중간체, 또는 머스타드 등가물이고, 병원체-불활성화 화합물은 인터칼레이터인 핵산 결합 리간드를 더 포함하며, 병원체-불활성화 화합물은 작용기와 핵산 결합 리간드를 연결하는 취약성 링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 3 항에 있어서, 인터칼레이터는 아크리딘인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 4 항에 있어서, 병원체-불활성화 화합물이 β-알라닌, N-(아크리딘-9-일), 2-[비스(2-클로로에틸)아미노]에틸 에스테르인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 퀀처는 시스테인 또는 시스테인 유도체인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 6 항에 있어서, 퀀처는 글루타티온 또는 제약학적으로 허용되는 그것의 염인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 7 항에 있어서, 퀀처는 글루타티온 일나트륨염인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 퀀처 농도는 10mM 미만인 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 적혈구가 55%를 초과하는 충전 세포 용적을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 적혈구가 50,000 미만의 평균 항체 결합 능력(ABC)을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 적혈구가 25,000 내지 70,000의 평균 항체 결합 능력(ABC)을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항에 있어서, 조성물의 적혈구는 4℃에서 42일 후에 150 mOsm을 초과하는 중간 혈구 취약성 값을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 개체에게 적혈구를 주입하는 방법에서 사용하기 위한 것을 특징으로 하는 적혈구 조성물.