ES2337852T3 - Metodos y dispositivos para la eliminacion de psoralenos de productos sanguineos. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN METODOS Y DISPOSITIVOS PARA LA ELIMINACION DE PSORALENO Y PRODUCTOS DE PSORALENO DE PRODUCTOS SANGUINEOS. LOS METODOS INCLUYEN PONER EN CONTACTO UN PRODUCTO SANGUINEO TRATADO CON PSORALENO Y RADIACION CON UNA RESINA CAPAZ DE ABSORBER PSORALENOS Y FOTOPRODUCTOS DE PSORALENO. EL PROCESO DE ELIMINACION ES PARTICULARMENTE ADECUADO PARA SU UTILIZACION CON CONCENTRADOS DE PLAQUETAS Y DE PLASMA PUESTO QUE EL PROCESO NO EJERCE UN EFECTO ADVERSO SIGNIFICATIVO SOBRE LA FUNCION DE LOS FACTORES DE COAGULACION. LOS METODOS Y DISPOSITIVOS PUEDEN SER INCORPORADOS CON SISTEMAS DE AFERESIS Y OTROS DISPOSITIVOS Y PROCEDIMIENTOS UTILIZADOS HABITUALMENTE PARA PROCESAR PRODUCTOS SANGUINEOS PARA TRANSFUSION.

Description

Métodos y dispositivos para la eliminación de psoralenos de productos sanguíneos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos y dispositivos para la eliminación de sustancias de productos sanguíneos y particularmente a métodos y dispositivos para la eliminación de psoralenos y fotoproductos de psoralenos de plasma que contiene plaquetas sin afectar considerablemente la función plaquetaria.

Antecedentes

La contaminación por agentes patógenos dentro del suministro de sangre sigue siendo un problema médico importante en todo el mundo. Aunque los métodos de ensayo mejorados para la hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) y HIV han reducido notablemente la incidencia de enfermedades asociadas a las transfusiones, el público está perdiendo confianza en la seguridad del suministro de sangre debido a la publicidad de casos de transmisión de estos virus relacionada con las transfusiones.

Por ejemplo, la reciente introducción de una prueba sanguínea para HCV reducirá la transmisión de este virus; sin embargo, solamente posee una sensibilidad de 67% para la detección de unidades sanguíneas infecciosas probables. El HCV es responsable del 90% de la hepatitis asociada a transfusiones. Melnick, J.L., Abstracts of Virological Safety Aspects of Plasma, Cannes, 3-6 de noviembre (1992) (página 9). Se estima que, con la prueba implementada, el riesgo de infección es de 1 en 3300 unidades transfundidas.

Similarmente, si bien se implementan ensayos serológicos más sensibles para HIV-1 y HBV, a pesar de ello estos agentes pueden ser transmitidos por donantes de sangre seronegativos. International Forum: Vox Sang 32:346 (1977). Ward, J.W., et al., N. Engl. J. Med., 318:473 (1988). Hasta un 10% del total de hepatitis relacionada con transfusiones y el 25% de los casos de ictericia severos se deben al HBV transmitido por donantes negativos del antígeno de superficie de la hepatitis B (HBasAg). Hasta ahora, el Centro de Control de Enfermedades (CDC) ha informado sobre quince casos de infecciones con HIV asociadas a transfusión entre receptores de sangre previamente ensayada como negativa para el anticuerpo contra el HIV-1.

Además, otros virus, bacterias y agentes no se ensayan rutinariamente, y siguen siendo una potencial amenaza para la seguridad de las transfusiones. Schmunis, G.A., Transfusion 31:547-557 (1992). Además, los ensayos no asegurarán la seguridad del suministro de sangre contra futuros agentes patógenos desconocidos que puedan ingresar a la población donante dando como resultado la transmisión asociada a la transfusión antes de que se puedan implementar pruebas sensibles.

Aún si las pruebas de seroconversión fueran un control suficiente, pueden no ser prácticas en la aplicación. Por ejemplo, el CMV (un virus del herpes) y el parvovirus B19 en seres humanos, son comunes. Cuando aparecen en adultos sanos e inmunocompetentes, casi siempre resultan en seroconversión asintomática. Debido a que una proporción tan grande de la población es seropositiva, la exclusión de unidades positivas produciría una limitación considerable del suministro de sangre.

Un abordaje alternativo para eliminar la transmisión de enfermedades virales a través de los productos sanguíneos es desarrollar un medio para inactivar agentes patógenos en productos de transfusión. El desarrollo de una tecnología efectiva para inactivar agentes patógenos infecciosos en productos sanguíneos ofrece el potencial de mejorar la seguridad del suministro de sangre, y tal vez hacer más lenta la introducción de nuevas pruebas, tal como la recientemente introducida prueba del HIV-2, para agentes patógenos de baja frecuencia. En última instancia, la tecnología de descontaminación podría reducir considerablemente el costo de los productos sanguíneos e incrementar la disponibilidad de productos sanguíneos escasos.

Para que sea útil, semejante método de inactivación i) no debe afectar negativamente la función para la que el producto sanguíneo es transfundido, ii) debe inactivar completamente los agentes patógenos existentes en el producto sanguíneo y iii) no debe afectar negativamente a los receptores del producto sanguíneo. Se han informado varios métodos para la inactivación o eliminación de agentes virales en productos sanguíneos libres de eritrocitos. Sin embargo, la mayoría de estas técnicas son completamente incompatibles con el mantenimiento de la función de las plaquetas, un producto sanguíneo importante. Los ejemplos de estas técnicas son: calor (Hilfenhous, J., et al., J. Biol. Std. 70:589 (1987)), tratamiento con disolventes/detergentes (Horowitz. B., et al., Transfusion 25:516 (1985)), irradiación gamma (Moroff. G.. et al.. Transfusion 26:453 (1986)), radiación UV combinada con beta propriolactona (Prince A.M., et al., Reviews of Infect. Diseases 5:92-107 (1983)), luz láser visible en combinación con hematoporfirinas (Matthews J.L., et al., Transfusion 28:81-83 (1988); North J., et al., Transfusion 32:121-128 (1992)), uso de los colorantes fotoactivos ftalocianina de aluminio y merocianina 540 (Sieber F., et al., Blood 73:345-350 (1989); Rywkin S., et al., Blood 78(Suppl I):352a (Abstract) (1991)) o radiación UV sola (Proudouz, K.N., et al., Blood 70:589 (1987)).

Otros métodos inactivan agentes virales por tratamiento con furocumarinas tales como psoralenos en presencia de luz ultravioleta. Los psoralenos son compuestos tricíclicos formados por condensación lineal de un anillo de furano con una cumarina. Los psoralenos se pueden intercalar entre los pares de bases de ácidos nucleicos de doble hebra formando aductos covalentes con bases pirimidínicas por absorción de luz ultravioleta de onda larga (UVA). G. D. Cimino et al., Ann. Rev. Biochem. 54:1151 (1985); Hearst et al., Quart. Rev. Biophys. 17:1 (1984). Si hay una segunda pirimidina adyacente a un monoaducto de psoraleno-pirimidina y en la cadena opuesta, la absorción de un segundo fotón puede conducir a la formación de un diaducto que actúa como un entrecruzamiento entre cadenas. Se incorporan a la presente memoria como referencia S. T. Isaacs et al., Biochemistry 16:1058 (1977); S. T. Isaacs et al., Trends in Photobiology (Plenum) páginas 279-294 (1982), J. Tessman et al., Biochem. 24:1669 (1985), Hearst et al., Patentes Estadounidenses Nos. 4.124.598, 4.169.204 y 4.196.281.

Los psoralenos unidos covalentemente actúan como inhibidores de la replicación de ADN y tienen así el potencial de interrumpir el proceso de replicación. Debido a esta capacidad de unirse al ADN, los psoralenos son de particular interés con relación a la resolución de los problemas inherentes a la creación y mantenimiento de un suministro de sangre libre de patógenos. Se ha demostrado que algunos psoralenos conocidos inactivan virus en algunos productos sanguíneos. H. J. Alter et al., The Lancet, (ii:1446) (1988); L. Lin et al., Blood 74:517 (1989) (concentrados descontaminantes de plaquetas); G. P. Wisehahn et al., Patentes Estadounidenses Nos. 4.727.027 y 4.748.120, incorporadas a la presente memoria como referencia, describen el uso de una combinación de 8-metoxipsoraleno (8-MOP) e irradiación. P. Morel et al., Blood Cells 18:27 (1992), demuestran que 300 \mug/ml de 8-MOP junto con 10 horas de irradiación con luz ultravioleta pueden inactivar eficazmente virus en suero humano. Otros investigadores han presentado estudios similares que utilizan 8-MOP y aminometiltrimetil psoraleno (AMT). Dodd RY et al., Transfusion 31:483-490 (1991); Margols-Nunno, H. et al., Thromb Haemostas 65:1162 (Abstract) (1991). En efecto, se ha establecido la fotoinactivación de un amplio espectro de microorganismos, incluidos HBV, HCV y HIV, en condiciones diferentes de las usadas en la presente invención y usando derivados de psoraleno previamente conocidos. [Hanson, C. V., Blood Cells, 18:7-24 (1992); Alter, H. Et al., The Lancet ii: 1446 (1989); Margolis-Nunno, H et al., Thromb Haemostas 65:1162 (Abstract) (1991)].

La fotoinactivación por psoralenos es sólo factible si la capacidad del psoraleno de inactivar virus es suficiente para asegurar un margen de seguridad en el que se producirá la inactivación completa. Por otra parte, el psoraleno no debe ser tal que pueda causar un daño a los productos sanguíneos. Los métodos recién descritos, cuando se aplican utilizando psoralenos conocidos, requieren el uso de procedimientos difíciles y caros para evitar ocasionar daños a los productos sanguíneos. Por ejemplo, algunos compuestos y protocolos han requerido la eliminación de oxígeno molecular de la reacción antes de la exposición a la luz para evitar el daño a los productos sanguíneos provocado por los radicales oxígeno producidos durante la irradiación. Véase Lin et al., Blood 74:517 (1989); Patente Estadounidense No. 4.727.027, concedida a Wiesehahn. Este es un procedimiento costoso y que requiere tiempo.

Finalmente, algunos compuestos comúnmente conocidos usados en la descontaminación fotoquímica (PCD) exhiben una mutagenicidad indeseable que parece aumentar con el incremento de la capacidad para matar virus. En otras palabras, cuanto más eficaces son los compuestos conocidos en la inactivación de los virus, más perjudiciales son los compuestos para el receptor y, por tanto, son menos útiles en cualquier punto de un sistema de inactivación de productos para uso in vivo.

Se necesita un nuevo compuesto del grupo de los psoralenos que exhiba una mejor capacidad para inactivar agentes patógenos y una mutagenicidad baja, sin causar un daño significativo a los productos sanguíneos para los que se usa, y sin necesidad de eliminar el oxígeno, que asegure así una inactivación segura y completa de los agentes patógenos en los métodos de descontaminación de sangre. Además, se necesita un dispositivo que sea capaz de eliminar de los productos sanguíneos los niveles residuales y los fotoproductos creados por un psoraleno apropiado, permitiendo así el uso extendido eficaz y económico del tratamiento de PCD de dichos productos sanguíneos.

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Compendio de la invención

Describimos un método para inactivar agentes patógenos que contienen ácidos nucleicos en productos sanguíneos, que comprende proporcionar, en cualquier orden, un psoraleno, un medio de fotoactivación, un producto sanguíneo destinado al uso in vivo sospechado de estar contaminado con al menos un agente patógeno, añadir psoraleno al producto sanguíneo para crear una solución de psoraleno a una dada concentración, tratar la solución con un medio de fotoactivación para crear un producto sanguíneo tratado, en el que los patógenos están inactivados, y en el que al menos una porción de la concentración de psoraleno está libre en solución; y eliminar sustancialmente toda la porción de concentración de psoraleno libre en solución en el producto sanguíneo tratado. La etapa de eliminación comprende poner en contacto el producto sanguíneo tratado con una resina.

De este modo, la presente invención proporciona un recipiente para su uso en la eliminación de al menos una sustancia seleccionada de psoraleno y su fotoproducto de un producto sanguíneo, que comprende: a) una envoltura biocompatible; b) una resina capaz de eliminar el psoraleno o su fotoproducto de un producto sanguíneo, estando dicha resina contenida dentro de dicha envoltura biocompatible; y c) un medio para retener dicha resina dentro de dicha envoltura biocompatible, en el que la resina comprende una resina adsorbente de poliestireno hiper-reticulado que se produce por entrecruzamiento de cadenas de poliestireno lineal en solución o en un estado hinchado con un agente bifuncional para producir puentes reticulantes conformacionalmente restringidos, y que no requiere prehumectación para la adsorción; y de manera tal que el producto sanguíneo, tras la eliminación de la sustancia, es apropiado para el uso in vivo, y en el que el recipiente es un dispositivo de eliminación por lotes.

La presente invención también proporciona un método para utilizar el recipiente en el que el método comprende añadir un producto sanguíneo que contiene el psoraleno o su fotoproducto al recipiente para poner en contacto la resina, y adsorber al menos una porción de dicho psoraleno o su fotoproducto del producto sanguíneo sobre la resina.

También describimos el pasaje del producto sanguíneo a través de un adaptador de flujo en contacto fluido con una columna en línea después que el producto ha pasado a través de la columna en línea. En una realización el contacto sucede dentro de una bolsa que contiene resina. En una realización particularmente preferida, la resina está contenida dentro de un recinto de malla en la bolsa, en donde el recinto de malla se adapta para permitir que el producto sanguíneo entre en contacto con la resina.

También describimos el método que además comprende una división montada externa a, y en contacto con, la bolsa, en donde la división está adaptada para separar el producto sanguíneo del recinto de malla y está adaptada para ser retirada de la bolsa en un momento predeterminado. También describimos el método que además comprende mezclar la bolsa que contiene resina con un dispositivo agitador. Se contempla que varios compuestos de psoraleno serán útiles en la presente invención, incluyendo, sin limitación, al 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno. También se contempla que el producto sanguíneo comprende cualquier componente sanguíneo, incluyendo, sin limitación plaquetas, plasma, glóbulos rojos y glóbulos blancos, así como sangre entera.

También describimos un método para inactivar agentes patógenos que contienen ácidos nucleicos en productos sanguíneos, que comprende las etapas de: proporcionar en cualquier orden 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno, un medio de fotoactivación, una mezcla de plaquetas destinada al uso in vivo sospechada de estar contaminada con agentes patógenos, añadir 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno a la mezcla de plaquetas para crear una solución de 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno a una dada concentración; tratar la solución con un medio de fotoactivación para crear una mezcla de plaquetas tratada en la que los agentes patógenos son inactivados y en la que al menos una porción de la concentración de 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno está libre en solución; y eliminar sustancialmente toda la porción de la concentración de 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno libre en solución en la mezcla de plaquetas tratada.

En este método, la etapa de eliminación comprende poner en contacto la mezcla de plaquetas tratada con una resina. La presente invención contempla una eliminación de 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno mayor que el 99% a las dos horas de producido el contacto con una resina.

En una realización preferida de la invención, el recipiente comprende una bolsa de sangre. En una realización, la bolsa de sangre además comprende un recinto de malla dispuesto dentro del compartimiento y que contiene resina, en donde el recinto de malla está adaptado para permitir que un producto sanguíneo se ponga en contacto con la resina. Se contempla que el recinto de malla esté fijo en la ubicación dentro del compartimiento.

En una realización alternativa, la bolsa de sangre además comprende una división montada externa a, y en contacto con, la envoltura biocompatible, en donde la división está adaptada para separar el producto sanguíneo del recinto de malla y para ser retirada de la bolsa en un momento predeterminado para permitir que el producto sanguíneo se ponga en contacto con la resina. Aún en otra realización, la bolsa de sangre además comprende un adaptador de flujo en contacto fluido con la envoltura biocompatible y que posee un filtro de malla de 50-100 \mum.

Se contempla que se utilicen diversas bolsas de sangre. No se pretende que la bolsa de sangre esté limitada a un tipo o fuente particular. En efecto, se considera que las bolsas de sangre obtenidas de cualquier fuente comercial serán útiles en la presente invención. También, se contempla que el dispositivo de fotoactivación descrito en la presente memoria puede obtenerse a partir de cualquier fuente comercial. De este modo, no se pretende que la presente invención se limite a ninguna fuente de bolsa de sangre.

En algunas realizaciones, el medio de retención del recipiente o la bolsa de sangre comprende un recinto de malla dispuesto dentro de la envoltura biocompatible, conteniendo el recinto de malla la resina y adaptado para permitir que un producto sanguíneo se ponga en contacto con la resina. En otras realizaciones, el recinto de malla comprende poros de 30 \mum. En realizaciones particulares, el recinto de malla comprende poliéster.

En realizaciones adicionales, el recipiente o la bolsa de sangre además comprende una línea de entrada/salida. Inclusive en otras realizaciones, el medio de retención comprende un filtro de malla colocado en la línea de entrada/salida y en comunicación fluida con el alojamiento biocompatible. El filtro de malla comprende poros de 30 \mum en realizaciones particulares, mientras que la malla del filtro de malla comprende poliéster inclusive en otras realizaciones.

En ciertas realizaciones, el aminopsoraleno es 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno.

También describimos un método para inactivar agentes patógenos que contienen ácidos nucleicos en productos sanguíneos, que comprende: a) proporcionar, en cualquier orden: i) un psoraleno, ii) un medio de fotoactivación, iii) un primer recipiente que contiene un producto sanguíneo destinado al uso in vivo sospechado de estar contaminado con los agentes patógenos; b) añadir el psoraleno al producto sanguíneo en el primer recipiente para crear una solución de psoraleno a una dada concentración; c) tratar la solución con el medio de fotoactivación para crear un producto sanguíneo tratado en el que los agentes patógenos son inactivados y en el que al menos una porción de la concentración de psoraleno está libre en solución; y d) eliminar algo de la porción del psoraleno libre en solución en el producto sanguíneo tratado. Se debe recalcar que el método no se limita a la eliminación de una cantidad particular de psoraleno libre en solución. En efecto, la presente invención contempla la eliminación de cualquier porción de psoraleno libre en solución.

En realizaciones particulares, el psoraleno es 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno. En otras realizaciones, el psoraleno es bromado. Cuando se utiliza un psoraleno bromado, el psoraleno bromado puede ser 5-bromo-8-metoxipsoraleno o 5-bromo-8-(dietilaminopropiloxi)-psoraleno. Además, el psoraleno es una amina cuaternaria en algunas realizaciones, y el psoraleno amina cuaternaria es 4'-(trietilamino)metil-4,5',8-trimetilpsoraleno en aun otras realizaciones.

En algunos casos, la etapa de eliminación comprende transferir el producto sanguíneo tratado a un segundo recipiente, que comprende: i) una envoltura biocompatible; ii) una resina capaz de eliminar psoraleno del producto sanguíneo, estando la resina contenida dentro de la envoltura biocompatible; y iii) un medio de retención para retener la resina dentro de la envoltura biocompatible en condiciones tales que algo de la porción de la concentración de psoraleno libre en solución se elimina en el producto sanguíneo tratado.

También describimos un método para inactivar agentes patógenos que contienen ácidos nucleicos en productos sanguíneos, que comprende: a) proporcionar, en cualquier orden: i) un donante, siendo el donante capaz de proporcionar sangre sospechada de estar contaminada con los agentes patógenos, ii) un medio de separación de sangre para separar la sangre en productos sanguíneos, iii) un psoraleno, iv) un medio de fotoactivación, y v) un medio de eliminación del psoraleno; b) extraer la sangre del donante e introducir la sangre en dicho medio de separación de sangre; c) aislar un producto sanguíneo de la sangre con el medio de separación de sangre; d) añadir el psoraleno al producto sanguíneo para crear una solución de psoraleno a una dada concentración; e) tratar la solución con el medio de fotoactivación para crear un producto sanguíneo tratado en el que los agentes patógenos son inactivados y en el que al menos una porción de la concentración de psoraleno está libre en solución; y f) eliminar sustancialmente todas las porciones del psoraleno libre en solución en el producto sanguíneo tratado con el medio de eliminación del psoraleno.

En realizaciones particulares, el medio de separación de sangre es un sistema de aféresis. El producto sanguíneo es plaquetas en ciertas realizaciones, y plasma en otras realizaciones.

En algunas realizaciones, el medio de eliminación del psoraleno comprende un recinto de malla que contiene una resina, estando el recinto de malla adaptado para permitir que un producto sanguíneo se ponga en contacto con la resina.

El psoraleno puede ser un aminopsoraleno en algunas realizaciones, y un psoraleno bromado en otras.

Definiciones

El término "producto sanguíneo" se refiere a todas las formulaciones del fluido y/o elementos celulares asociados y similares (tales como eritrocitos, leucocitos, plaquetas, etc.) que pasan a través del sistema circulatorio del cuerpo; los productos sanguíneos incluyen, sin limitación, mezclas de plaquetas, suero y plasma. El término "mezcla de plaquetas" se refiere a un tipo de producto sanguíneo en donde el elemento celular es fundamentalmente o solamente plaquetas. Un concentrado de plaquetas (PC) es un tipo de mezcla de plaquetas en la que las plaquetas están asociadas a una porción de plasma más pequeña que la normal. Un medio sintético puede conformar ese volumen normalmente ocupado por el plasma; por ejemplo, un concentrado de plaquetas puede constar de plaquetas suspendidas en 35% de plasma/65% de medio sintético. Frecuentemente, los medios sintéticos comprenden fosfato.

El término "fotoproducto" se refiere a productos que resultan de la reacción fotoquímica que sufre un psoraleno por exposición a radiación ultravioleta.

El término "resina" se refiere a un soporte sólido (tal como cuentas/partículas, etc.) capaz de interactuar y adherirse a diversos elementos, incluyendo psoralenos, en una solución o fluido (por ejemplo, un producto sanguíneo), eliminando de ese modo esos elementos. El proceso de eliminación no se limita a ningún mecanismo particular. Por ejemplo, un psoraleno puede ser eliminado por un adsorbente o por carga (es decir, interacción por afinidad). El término "resina adsorbente" se refiere en líneas generales a sustancias orgánicas naturales y sustancias sintéticas. Varias resinas adsorbentes difieren en la superficie, tamaño de poros, naturaleza química (por ejemplo, poliestireno, divinilbenceno y éster acrílico), polaridad, etc., para permitir el desempeño óptimo para aplicaciones particulares (por ejemplo, adsorción de productos farmacéuticos). Las resinas adsorbentes pueden cargarse en una cantidad de disposiciones, incluyendo una columna a través de la que una sustancia como sangre puede perfundirse, y una malla que posee aberturas de dimensiones adecuadas para permitir el contacto del adsorbente con la sustancia mientras retiene la resina adsorbente dentro del área definida por la malla.

El término "medio de eliminación de psoraleno" se refiere a una sustancia o dispositivo que es capaz de eliminar un psoraleno de, por ejemplo, un producto sanguíneo. Un medio de eliminación de psoraleno también puede eliminar otros componentes del producto sanguíneo, tales como fotoproductos de psoralenos. Un medio de eliminación de psoraleno preferido es una resina adsorbente.

El término "columna en línea" se refiere a un recipiente, usualmente de forma cilíndrica, que posee un extremo de entrada y un extremo de salida y que contiene una sustancia dispuesta en el mismo para eliminar sustancias de un producto sanguíneo. Describimos el uso de una columna que posee una capacidad de al menos 1 ml, y preferiblemente 5-10 ml, que se carga con una resina adsorbente para eliminar psoralenos y fotoproductos de psoralenos del producto sanguíneo. Un producto sanguíneo ingresa en el extremo de entrada, se pone en contacto con la resina adsorbente, y después sale por el extremo de salida.

El término "división" se refiere a cualquier tipo de dispositivo o elemento que puede separar o dividir un todo en secciones o partes. Por ejemplo, la presente invención contempla el uso de una división para dividir una bolsa de sangre adaptada para contener un producto sanguíneo en dos partes. El producto sanguíneo ocupa una parte de la bolsa antes de y durante el tratamiento, mientras la resina adsorbente ocupa la otra parte. En una realización, después del tratamiento del producto sanguíneo, se retira la división (por ejemplo, la integridad de la división se altera), permitiendo de ese modo que el producto sanguíneo tratado entre en contacto con la resina adsorbente. La división puede colocarse en el interior o en el exterior de la bolsa. Cuando se utiliza con el término "división", el término "eliminado" significa que el aislamiento de las dos partes de la bolsa de sangre ya no existe; no significa necesariamente que la división ya no está asociada a la bolsa de alguna manera.

El término "adaptador de flujo" se refiere a un dispositivo que es capaz de controlar el flujo de una sustancia particular como un producto sanguíneo. El adaptador de flujo puede realizar funciones adicionales, tal como evitar el paso de trozos del material de resina adsorbente.

El término "medio de retención de resina" se refiere a cualquier mecanismo que confina la resina en un área definida, como una envoltura biocompatible. Por ejemplo, puede utilizarse un recinto de malla, alojado dentro de un recipiente de almacenamiento de plaquetas, para mantener la resina dentro del recipiente. Similarmente, puede colocarse un filtro (por ejemplo, un filtro de malla) en la línea de entrada/salida de una bolsa de almacenamiento de producto sanguíneo. El término "línea de entrada/salida" se refiere al tubo que está conectado a y en comunicación fluida con una bolsa de almacenamiento de producto sanguíneo. Puede haber una única línea de entrada/salida o dos o más líneas conectadas a una bolsa.

Los términos "recinto de malla", "saco de malla" y similares se refieren a un recinto, saco, bolsa o similares fabricado para contener múltiples poros. Por ejemplo, la presente invención contempla un saco, que contiene la resina adsorbente, con poros de un tamaño que permite que un producto sanguíneo entre en contacto con la resina adsorbente, pero retienen la resina dentro del saco. A los efectos de la presente invención, se denomina RD al recinto de malla que contiene el adsorbente. En una realización preferida, el RD está alojado en un recipiente de almacenamiento de producto sanguíneo (por ejemplo, recipiente de almacenamiento de plaquetas). La presente invención contempla que los recintos de malla estarán hechos de una malla tejida de poliéster apta para uso médico u otro material apropiado como nylon. El intervalo preferido de tamaño de poros del material de malla es aproximadamente 10 \mum a 50 \mum, mientras que la realización preferida de la presente invención utiliza malla con poros de aproximadamente 30 \mum.

Los términos "contacto fluido", "conexión fluida" y similares se refieren a la capacidad de un componente fluido (por ejemplo, un producto sanguíneo) de fluir desde un elemento a otro. Por ejemplo, un componente sanguíneo puede fluir desde una bolsa de plaquetas a través de una tubería hasta un adaptador de flujo; de este modo, el adaptador de flujo no tiene que estar en contacto directo con la bolsa de plaquetas. Similarmente, la tubería de cada uno de dos o más recipientes de producto sanguíneo puede estar conectada (por ejemplo, por soldadura estéril) utilizando un dispositivo de conexión estéril para permitir que el fluido sea transferido de un recipiente a otro.

La frase "adaptado para permitir que un producto sanguíneo se ponga en contacto con dicha resina" se refiere a la capacidad de un producto sanguíneo de ponerse en contacto e interactuar con una resina de manera tal que la resina sea capaz de adsorber los componentes (por ejemplo, psoraleno y fotoproductos de psoraleno) del producto sanguíneo. La frase frecuentemente se utiliza para describir la capacidad de un producto sanguíneo tratado con psoraleno e irradiación (por ejemplo, plaquetas), contenido dentro de un recipiente de almacenamiento de producto sanguíneo, para pasar a través de los poros de un recinto de malla alojado dentro de ese contenedor; al realizar esto, la resina es capaz de adsorber el psoraleno y los fotoproductos de psoraleno.

El término "dispositivo agitador" se refiere a cualquier tipo de dispositivo capaz de mezclar completamente un producto sanguíneo tal como un concentrado de plaquetas. El dispositivo puede tener un temporizador para permitir que el mezclado se restrinja a una duración particular.

El término "envoltura biocompatible" se refiere en líneas generales a envolturas, contenedores, bolsas, recipientes, receptáculos y similares que son apropiados para contener un material biológico, tal como sangre entera, concentrados de plaquetas y plasma. Los recipientes apropiados son biocompatibles si poseen un mínimo o ningún efecto sobre el material biológico a ser contenido dentro del mismo. Por "mínimo" efecto se entiende que no se observa ninguna diferencia importante en comparación con el control. De este modo, los productos sanguíneos pueden almacenarse en envolturas biocompatibles antes de la transfusión a un receptor. En una realización preferida, una envoltura biocompatible es un recipiente de almacenamiento de plaquetas.

El término "medio de separación de sangre" se refiere en líneas generales a un dispositivo, máquina o similar que sea capaz de separar sangre en productos sanguíneos (por ejemplo, plaquetas y plasma). Un sistema de aféresis es un tipo de medio de separación de sangre. Los sistemas de aféresis generalmente comprenden un dispositivo de separación de sangre, una red intrincada de tubería y filtros, bolsas de recolección, un anticoagulante y un medio computarizado para controlar todos los componentes. El dispositivo de separación de sangre por lo común es una centrífuga. Se utiliza al menos una bomba para movilizar la sangre, los componentes sanguíneos separados y los aditivos fluidos a través del sistema de aféresis y finalmente de regreso al donante o a la(s) bolsa(s) de recolección. Aunque no se limita a ningún tipo particular de sistema de aféresis, la presente invención específicamente contempla el uso de sistemas automáticos que son capaces de recolectar una cantidad particular de una mezcla de producto sanguíneo deseado.

El término "aislar" se refiere a separar una sustancia de una mezcla que contiene más de un componente. Por ejemplo, las plaquetas pueden separarse de la sangre entera. El producto que se aísla (por ejemplo, plaquetas) no necesariamente se refiere a la reparto completa de ese producto de otros componentes. Por ejemplo, las plaquetas aisladas mediante un sistema de aféresis frecuentemente están asociadas a un pequeño volumen de plasma; en este ejemplo, se consideraría inclusive que las plaquetas se han separado de la sangre entera.

El término "filtro" se refiere en líneas generales a dispositivos, materiales y similares que son capaces de permitir que ciertos componentes de una mezcla los atraviesen al mismo tiempo que se retienen otros componentes. Por ejemplo, un filtro puede comprender una malla con poros de dimensiones adecuadas para permitir que un producto sanguíneo (por ejemplo, plasma) pase, al mismo tiempo que se retienen otros componentes tales como partículas de resina. El término "filtro" no se limita al medio por el que se retienen ciertos componentes.

El término "poliéster" se refiere en líneas generales a materiales que comprenden [poli(tereftalato de etileno)]. El material de poliéster puede estar en forma de material de malla con poros de un tamaño definido.

El término "polímero" se refiere en líneas generales a un material constituido por una cadena de "unidades básicas" repetidas e idénticas. El término abarca materiales que contienen monómeros de estireno (C_{6}H_{5}CH = CH_{2}), que se pueden denominar "redes de poliestireno".

El término "reticulado" se refiere en líneas generales a moléculas lineales que están unidas una con otra para formar una red bi- o tridimensional. Por ejemplo, el divinilbenceno (DVB) sirve como agente reticulante en la formación de copolímeros de estireno-divinilbenceno. El término también abarca la "hiper-reticulación", en la que se producen redes hiper-reticuladas por entrecruzamiento de cadenas de poliestireno lineal en solución o en un estado hinchado con agentes bifuncionales (descritos más abajo).

Los términos "aminopsoraleno", "psoraleno aminado" y similares se refieren a compuestos de psoraleno que contienen un grupo NH_{2} unido a la posición 4' (psoralenos sustituidos con grupos amino primarios en posición 4') o a la posición 5' (psoralenos sustituidos con grupos amino primarios en posición 5') del psoraleno por una cadena hidrocarbonada. En los psoralenos sustituidos con amina primaria en 4', la longitud total de la cadena hidrocarbonada es 2-20 carbonos, donde 0 a 6 de esos carbonos están reemplazados independientemente por NH u O, y cada punto de reemplazo está separado de otro punto de reemplazo por al menos dos carbonos, y está separado del psoraleno por al menos un carbono. Los psoralenos sustituidos con grupos amino primarios en posición 4' pueden tener sustituciones adicionales en las posiciones 4, 5' y 8 del psoraleno, incluyendo dichas sustituciones, sin limitación, los siguientes grupos: H y (CH_{2})_{n}CH_{3}, donde n = 0-6. En comparación, en los psoralenos sustituidos con grupos amino primarios en posición 5', la longitud total de la cadena hidrocarbonada es 1-20 carbonos, donde 0 a 6 de esos carbonos están reemplazados independientemente por NH u O, y cada punto de reemplazo está separado de otro punto de reemplazo por al menos dos carbonos, y está separado del psoraleno por al menos un carbono. Los psoralenos sustituidos con grupos amino primarios en posición 5' pueden tener sustituciones adicionales en las posiciones 4, 4' y 8 del psoraleno, incluyendo dichas sustituciones, sin limitación, los siguientes grupos: H y (CH_{2})_{n}CH_{3}, donde n = 0-6.

El término "psoraleno bromado" se refiere a compuestos de psoraleno que contienen un átomo de bromo (Br) unido al mismo. Los psoralenos bromados preferidos contienen un bromo unido a la posición 5. Los ejemplos de psoraleno bromados incluyen 5-bromo-8-metoxipsoraleno y 5-bromo-8-(dietilaminopropiloxi)-psoraleno.

Descripción de los dibujos

La Fig. 1 es una vista en perspectiva de una realización del dispositivo descrito en la presente memoria.

La Fig. 2 es una vista en sección transversal del dispositivo que se muestra en la Fig. 1 por las líneas 2-2.

La Fig. 3 es una vista en sección transversal del dispositivo que se muestra en la Fig. 1 por las líneas 3-3.

La Fig. 4 es una vista en sección transversal del dispositivo que se muestra en la Fig. 1 por las líneas 4-4.

La Fig. 5A es un diagrama de vías de síntesis y estructuras químicas de los compuestos 8, 13 y 14.

La Fig. 5B es un diagrama de vías de síntesis y estructuras químicas de los compuestos 2, 4 y 7.

La Fig. 5C es un diagrama de vías de síntesis y estructuras químicas de los compuestos 1, 5, 6, 9 y 10.

La Fig. 5D es un diagrama de vías de síntesis y estructuras químicas de los compuestos 12 y 15.

La Fig. 5E es un diagrama de una vía de síntesis y la estructura química del compuesto 3.

La Fig. 5F es un diagrama de vías de síntesis y la estructura química de los compuestos 16 y 17.

La Fig. 6 muestra la influencia de la concentración sobre la destrucción logarítmica de R17 cuando los Compuestos 1-3 son fotoactivados.

La Fig. 7 muestra la influencia de la concentración sobre la destrucción logarítmica de R17 cuando los Compuestos 3-6 son fotoactivados.

La Fig. 8 muestra la influencia de la concentración sobre la destrucción logarítmica de R17 cuando los Compuestos 2 y 6 son fotoactivados.

La Fig. 9 muestra la influencia de la concentración sobre la destrucción logarítmica de R17 cuando los Compuestos 6 y 18 son fotoactivados.

La Fig. 10 muestra la influencia de la concentración sobre la destrucción logarítmica de R17 cuando el Compuesto 16 es fotoactivado.

La Fig. 11 muestra la influencia de cantidades variables de Joules/cm^{2} (Watt segundo/cm^{2}) de irradiación sobre el log del título de R17 para el Compuesto 6.

La Fig. 12 muestra la influencia de cantidades variables de Joules/cm^{2} de irradiación sobre el log del título de R17 para los Compuestos 7, 9 y 10.

La Fig. 13 muestra la influencia de cantidades variables de Joules/cm^{2} de irradiación sobre el log del título de R17 para los Compuestos 7 y 12.

La Fig. 14 muestra la influencia de cantidades variables de Joules/cm^{2} de irradiación sobre el log del título de R17 para el Compuesto 15.

La Fig. 15 muestra la influencia de cantidades variables de Joules/cm^{2} de irradiación sobre el log del título de R17 para el Compuesto 17.

La Fig. 16 muestra la influencia de cantidades variables de Joules/cm^{2} de irradiación sobre el log del título de R17 para los Compuestos 6 y 17.

La Fig. 17 muestra la influencia de cantidades variables de Joules/cm^{2} de irradiación sobre el log del título de R17 para los Compuestos 6 y 15.

La Fig. 18 muestra el efecto de variar la concentración de los Compuestos 2 y 6 en plasma.

La Fig. 19 muestra el efecto de variar la concentración de los Compuestos 2 y 6 en medio sintético.

La Fig. 20A muestra esquemáticamente el abordaje estándar de separación de productos sanguíneos utilizado en la actualidad en los bancos de sangre.

La Fig. 20B muestra esquemáticamente una realización por la que se introduce un medio sintético al concentrado de plaquetas preparado como en la Fig. 20A.

La Fig. 20C muestra esquemáticamente una realización del abordaje de descontaminación aplicado específicamente al concentrado de plaquetas diluido con medio sintético como en la Fig. 20B.

La Fig. 21A es un gráfico que compara los efectos de un almacenamiento de 5 días (D5), luz ultravioleta (uv) y tratamiento con el Compuesto 2 a 100 \muM (PCD) sobre la función plaquetaria medidos por recuento de plaquetas. "n" representa el número de experimentos representado por el punto de medición.

Fig. 21B es un gráfico que compara los efectos de un almacenamiento de 5 días (D5), luz ultravioleta (uv) y tratamiento con el Compuesto 2 a 100 \muM (PCD) sobre la función plaquetaria medidos por agregación plaquetaria. "n" representa el número de experimentos representado por el punto de medición.

La Fig. 21C es un gráfico que compara los efectos de un almacenamiento de 5 días (D5), luz ultravioleta (uv) y tratamiento con el Compuesto 2 a 100 \muM (PCD) sobre la función plaquetaria medidos por la expresión de GMP-140. "n" representa el número de experimentos representado por el punto de medición.

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La Fig. 21D es un gráfico que compara los efectos de un almacenamiento de 5 días (D5), luz ultravioleta (uv) y tratamiento con el Compuesto 2 a 100 \muM (PCD) sobre la función plaquetaria medidos por el pH. "n" representa el número de experimentos representado por el punto de medición.

La Fig. 22A es un gráfico que compara los efectos de un almacenamiento de 5 días (D5), luz ultravioleta (uv) y tratamiento con el Compuesto 6 a 100 \muM (PCD) sobre la función plaquetaria medidos por el recuento de plaquetas. "n" representa el número de experimentos representado por el punto de medición.

La Fig. 22B es un gráfico que compara los efectos de un almacenamiento de 5 días (D5), luz ultravioleta (uv) y tratamiento con el Compuesto 6 a 100 \muM (PCD) sobre la función plaquetaria medidos por la agregación plaquetaria. "n" representa el número de experimentos representado por el punto de medición.

La Fig. 22C es un gráfico que compara los efectos de un almacenamiento de 5 días (D5), luz ultravioleta (uv) y tratamiento con el Compuesto 6 a 100 \muM (PCD) sobre la función plaquetaria medidos por la expresión de GMP-140. "n" representa el número de experimentos representado por el punto de medición.

La Fig. 22D es un gráfico que compara los efectos de un almacenamiento de 5 días (D5), luz ultravioleta (uv) y tratamiento con el Compuesto 6 a 100 \muM (PCD) sobre la función plaquetaria medidos por el pH. "n" representa el número de experimentos representado por el punto de medición.

La Fig. 23A es un gráfico que compara los efectos de un almacenamiento de 5 días (D5), luz ultravioleta (uv) y tratamiento con el Compuesto 17 a 100 \muM (PCD) sobre la función plaquetaria medidos por el recuento de plaquetas. "n" representa el número de experimentos representado por el punto de medición.

La Fig. 23B es un gráfico que compara los efectos de un almacenamiento de 5 días (D5), luz ultravioleta (uv) y tratamiento con el Compuesto 17 a 100 \muM (PCD) sobre la función plaquetaria medidos por la agregación plaquetaria. "n" representa el número de experimentos representado por el punto de medición.

La Fig. 23C es un gráfico que compara los efectos de un almacenamiento de 5 días (D5), luz ultravioleta (uv) y tratamiento con el Compuesto 17 a 100 \muM (PCD) sobre la función plaquetaria medidos por la expresión de GMP-140. "n" representa el número de experimentos representado por el punto de medición.

La Fig. 23D es un gráfico que compara los efectos de un almacenamiento de 5 días (D5), luz ultravioleta (uv) y tratamiento con el Compuesto 17 a 100 \muM (PCD) sobre la función plaquetaria medidos por el pH. "n" representa el número de experimentos representado por el punto de medición.

La Fig. 24A es un gráfico que compara los efectos de un almacenamiento de 5 días (D5), luz ultravioleta (uv) y tratamiento con el Compuesto 18 a 100 \muM (PCD) sobre la función plaquetaria medidos por el recuento de plaquetas. "n" representa el número de experimentos representado por el punto de medición.

La Fig. 24B es un gráfico que compara los efectos de un almacenamiento de 5 días (D5), luz ultravioleta (uv) y tratamiento con el Compuesto 18 a 100 \muM (PCD) sobre la función plaquetaria medidos por la agregación plaquetaria. "n" representa el número de experimentos representado por el punto de medición.

La Fig. 24C es un gráfico que compara los efectos de un almacenamiento de 5 días (D5), luz ultravioleta (uv) y tratamiento con el Compuesto 18 a 100 \muM (PCD) sobre la función plaquetaria medidos por la expresión de GMP-140. "n" representa el número de experimentos representado por el punto de medición.

La Fig. 24D es un gráfico que compara los efectos de un almacenamiento de 5 días (D5), luz ultravioleta (uv) y tratamiento con el Compuesto 18 a 100 \muM (PCD) sobre la función plaquetaria medidos por el pH. "n" representa el número de experimentos representado por el punto de medición.

La Fig. 25A representa gráficamente la captación de S-59 (C_{0} = 50 \muM) por las plaquetas en el tiempo (parte superior) y la liberación de S-59 por las plaquetas en el tiempo (parte inferior).

La Fig. 25B es un gráfico que muestra la cinética para la adsorción de S-59 no iluminado (C_{0} = 150 \muM) de 35% de plasma/65% de PAS III por Amberlite XAD-4^{TM} (0,1 g/3,0 ml) con y sin un período de preincubación de 24 horas con S-59 antes de la adición del adsorbente.

La Fig. 26 es un gráfico que ilustra el efecto del caudal sobre la adsorción de S-59 con Amberlite XAD-16^{TM}
(10 g/300 ml) en una columna de 1 cm de diámetro. Los datos para las plaquetas en 35% de plasma/65% de PAS III están indicados por cuadrados, mientras que los datos para 35% de plasma/65% de PAS III están indicados por círculos; los triángulos abiertos indican niveles residuales de adsorción de S-59 con Amberchrom cg-161^{TM} (poliestireno de diámetro120, 5 g/300 ml).

La Fig. 27 ilustra gráficamente la cinética de adsorción para el contacto por lotes de Amberlite XAD-4^{TM}
(10 g/300 ml) con plaquetas iluminadas en 35% de plasma/65% de PAS III. Los porcentajes son relativos a una mezcla de plaquetas no iluminadas.

La Fig. 28A representa cromatogramas de HPLC de 35% de plasma/65% de PAS III iluminado después de ningún tratamiento (parte superior), adsorción con Amberlite XAD-16^{TM} (parte media), y adsorción con Hemosorba CH-350^{T}''' (parte inferior).

La Fig. 28B representa cromatogramas de HPLC de 35% de plasma/65% de PAS III que contiene S-59 no iluminado (parte superior), S-59 iluminado (parte media), y S-59 iluminado tratado con Amberlite XAD-4^{TM} (parte inferior); el adsorbente estaba contenido en un recinto/saco de malla de nylon de 30 \mum, y el tiempo de contacto fue de tres horas.

La Fig. 29 es un gráfico que representa el porcentaje de S-59 que escapa a la adsorción (indicado como Ruptura) como función del volumen de plasma inoculado con S-59 que es perfundido a través del cartucho; se muestra S-59 no iluminado (150 \muM) en plasma al 100% a dos caudales diferentes (2,5 ml/minuto y 5,0 ml/minuto).

La Fig. 30A representa gráficamente niveles de fibrinógeno después de la PCD con S-59 y de la eliminación de S-59 con Hemosorba CH-350^{TM} y sílice; se analizaron tanto muestras no iluminadas como iluminadas.

La Fig. 30B representa gráficamente niveles de fibrinógeno después de la PCD con S-59 y de la eliminación de S-59 con Amberlite XAD-4^{TM}, Amberlite XAD-16^{TM} y t-butil HIC^{TM} de Bio-Rad; se analizaron tanto muestras no iluminadas como iluminadas.

La Fig. 30C representa gráficamente la función de coagulación de PT, aPTT y TT después de la PCD con S-59 y de la eliminación de S-59 con Amberlite XAD-4^{TM}, Amberlite XAD-16^{TM} y t-butil HIC^{TM} de Bio-Rad; se analizaron tanto muestras no iluminadas como iluminadas.

La Fig. 30D representa gráficamente la actividad del Factor V, Factor VIII y Factor IX después de la PCD con S-59 y de la eliminación de S-59 con Amberlite XAD-4^{TM}, Amberlite XAD-16^{TM} y t-butil HIC^{TM} de Bio-Rad; se analizaron tanto muestras no iluminadas como iluminadas.

La Fig. 31 representa gráficamente la relación entre el contenido de etanol de la solución humectante y la capacidad de adsorción del adsorbente resultante durante un proceso de humectación por lotes de 10 minutos con los adsorbentes Amberlite^{TM} XAD-4 (círculos) y XAD-16 (cuadrados).

La Fig. 32 representa gráficamente que la eliminación de S-59 de 35% de plasma/65% de PAS III disminuye con la reducción del contenido de agua para Amberlite^{TM} XAD-16.

La Fig. 33 representa gráficamente la pérdida de agua por Amberlite^{TM} XAD-16 (cuadrados) y Amberlite^{TM} XAD-4 (círculos) durante una incubación de 27 horas a temperatura ambiente y humedad estándar.

Las Figuras 34A y 34B representan gráficamente el efecto de esterilización mediante irradiación \gamma (cuadrados = 0 MRad; círculos = 5 MRad; triángulos = 10 MRad) sobre la cinética de adsorción para la eliminación de S-59 del concentrado de plaquetas al 35% por dos lotes diferentes de Amberlite^{TM} XAD-4.

Las Figuras 35A y 35B representan gráficamente el efecto de esterilización mediante irradiación \gamma (cuadrados = 0 MRad; círculos = 5 MRad; triángulos = 10 MRad) sobre la cinética de adsorción para la eliminación de S-59 del concentrado de plaquetas al 35% por dos lotes diferentes de Amberlite^{TM} XAD-16.

La Fig. 36 es un gráfico de barras que indica las constantes de adsorción de S-59 para los adsorbentes en ambos estados, mojado (sombreado oscuro) y seco (sombreado claro), refiriéndose los porcentajes a la cantidad de agua en cada muestra.

La Fig. 37 representa un dispositivo de eliminación que ilustra cómo el dispositivo de eliminación puede estar contenido dentro de un recipiente de almacenamiento de plaquetas.

La Fig. 38 representa un diagrama de flujo de producción de muchas de las etapas utilizadas en la fabricación de un dispositivo de eliminación por lotes.

La Fig. 39 es un cromatograma de HPLC representativo de S-59 y fotoproductos de S-59 formado en una PC (35% de plasma/65% de PAS III, S-59 150 \muM [15,2 mg/ 300 ml]) después de la iluminación con 3,0 J/cm^{2} de UVA.

La Fig. 40 representa la estructura química de los principales picos de fotoproductos de S-59: i) S-59 (pico F de HPLC), ii) el heterodímero de S-59 (pico D de HPLC) y iii) el homodímero de S-59 (pico E de HPLC).

La Fig. 41 representa cromatogramas de PC, que contienen S-59 150 \muM (15,2 mg/300 ml), que muestran niveles de S-59 y fotoproductos libres antes de la iluminación con UVA (parte superior), después de la iluminación con UVA (parte media) y después de la iluminación con UVA y una incubación de 8 horas con un RD que contiene Dowex® XUS-43493 (parte inferior) y alojado dentro de un recipiente de plástico PL 2410 (Baxter).

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La Fig. 42 representa la cinética para la eliminación de fotoproductos D, E y S-59 no unidos del PC completo (es decir, un PC que contiene plaquetas).

La Fig. 43 representa la cinética para la eliminación de fotoproductos D, E y S-59 no unidos del PC centrifugado para eliminar las plaquetas para permitir el análisis separado de fotoproductos no unidos en el plasma/PAS III.

La Fig. 44 representa las estructuras químicas de tres psoralenos diferentes utilizados en algunos de los experimentos: Psoraleno A [4'-(trietilamino)metil-4,5',8-trimetilpsoraleno]; Psoraleno B [5-bromo-8-metoxi-psoraleno); y Psoraleno C (5-bromo-8-(dietilaminopropiloxi)-psoraleno].

El Esquema A representa diagramáticamente la distribución de S-59 en plaquetas suspendidas en 35% de plasma/65% de PAS III después de la iluminación con UVA.

El Esquema B es un gráfico que muestra el efecto de la concentración final de S-59 sobre la cantidad de adsorbente requerido (concentración inicial, C_{o} = 30 \muM y un volumen, V = 300 ml). Los "valores de K" para cada curva se enumeran en la leyenda.

El Esquema C representa dos posibles configuraciones para un RD por lotes. La configuración A ilustra un diseño de dos bolsas, mientras que la configuración B ilustra un diseño de bolsa única.

El Esquema D representa diagramáticamente el proceso de reducción de S-59. Después de la iluminación del PC que contiene S-59, el PC se transfiere a un recipiente que aloja el RD, se incuba con agitación para permitir una reducción dependiente del tiempo en la cantidad de S-59 residual y fotoproductos no unidos y después se transfiere a un recipiente de almacenamiento.

El Esquema E representa un diagrama de flujo que resume la operación de un hipotético sistema de aféresis en el que puede emplearse una realización del RD.

El Esquema F representa una realización alternativa en la que se añade PAS III durante procedimiento de recolección de plaquetas.

El Esquema G representa una realización alternativa en la que PAS III se combina con S-59 y después se añade durante el procedimiento de recolección de plaquetas.

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Descripción de la invención

Describimos psoralenos y métodos de síntesis de nuevos psoralenos que poseen capacidad potenciada para inactivar agentes patógenos en presencia de luz ultravioleta. Los nuevos psoralenos son eficaces contra una amplia variedad de agentes patógenos. También describimos métodos para utilizar compuestos nuevos y conocidos para inactivar agentes patógenos en productos relacionados con la salud a ser utilizados in vivo e in vitro y, en particular, productos sanguíneos, sin afectar considerablemente la función del producto sanguíneo o exhibir mutagenicidad.

Los métodos de inactivación descritos en la presente memoria proporcionan métodos para inactivar agentes patógenos, y en particular virus, en productos sanguíneos antes del uso in vitro o in vivo. En contraposición a abordajes anteriores, el método requiere solamente tiempos cortos de irradiación y no hay necesidad de limitar la concentración de oxígeno molecular.

La descripción se divide en las siguientes secciones:

I) Dispositivos de Fotoactivación, II) Síntesis de Compuestos, III) Unión de Compuestos a Ácidos Nucleicos, IV) Inactivación de Contaminantes, V) Conservación de las Propiedades Bioquímicas del Material Tratado, VI) Dispositivos y Métodos para Eliminar Psoralenos y Fotoproductos de Psoralenos; VII) Efecto de las Características Estructurales de los Psoralenos sobre la Adsorción; y VIII) Fabricación de un Dispositivo de Eliminación de Psoralenos por Lotes.

I. Dispositivos de fotoactivación

Describimos dispositivos y métodos para la fotoactivación y, específicamente, para la fotoactivación de compuestos fotorreactivos de unión a ácidos nucleicos. Describimos dispositivos que poseen una fuente económica de radiación electromagnética que está integrada a una unidad. En general, un dispositivo de fotoactivación para tratar compuestos fotorreactivos, que comprende: a) un medio para proporcionar longitudes de onda de radiación electromagnética apropiadas para ocasionar la fotoactivación de al menos un compuesto fotorreactivo; b) un medio para soportar una pluralidad de muestras en una relación fija con el medio que proporciona radiación durante la fotoactivación; y c) un medio para mantener la temperatura de las muestras dentro de un intervalo de temperatura deseada durante la fotoactivación. También describimos métodos que comprenden: a) soportar una pluralidad de recipientes de muestra, que contienen uno o más compuestos fotorreactivos, en una relación fija con una fuente fluorescente de radiación electromagnética; b) irradiar la pluralidad de recipientes de muestra simultáneamente con radiación electromagnética para ocasionar la fotoactivación de al menos un compuesto fotorreactivo; y c) mantener la temperatura de la muestra dentro de un intervalo de temperatura deseado durante la fotoactivación.

Las características principales del dispositivo descrito incluyen: A) una fuente económica de radiación ultravioleta en una relación fija con el medio para soportar los recipientes de muestra, B) fotoactivación rápida, C) procesamiento de grandes muestras, D) control de temperatura de las muestras irradiadas, y E) seguridad inherente.

A. Fuente de Radiación Electromagnética

Se pueden utilizar exitosamente muchas fuentes de radiación ultravioleta en protocolos de descontaminación con psoralenos. Por ejemplo, algunos grupos han irradiado una muestra desde arriba y abajo mediante lámparas UVA fluorescentes General Electric de tipo F20T12-BLB con un ventilador eléctrico que proyecta aire suavemente a través de las luces para enfriar el área. Alter. H. J., et al., The Lancet. 24:1446 (1988). Otro grupo utilizó una lámpara ultravioleta de longitud de onda larga de tipo A405-TLGW/05 fabricada por P. W. Allen Co. de Londres colocada por encima de las muestras de virus en contacto directo con las tapas de las placas de Petri que contenían las muestras, y se hizo funcionar a temperatura ambiente. La intensidad total suministrada a las muestras en estas condiciones fue 1,3 x 10^{15} fotones/segundo cm^{2} (o 0,7 mW/cm^{2} o 0,0007 J/cm^{2} segundo) en la placa de Petri. Hearst, J. E., y Thiry, L., Nucleic Acids Research, 4:1339 (1977). Sin embargo, sin pretender limitarnos a ningún tipo de dispositivo de fotoactivación, a continuación describimos varias disposiciones preferidas para el dispositivo de fotoactivación.

Un dispositivo de fotoactivación preferido posee una fuente económica de radiación ultravioleta en una relación fija con el medio para soportar los recipientes de muestra. La radiación ultravioleta es una forma de energía que ocupa una porción del espectro de radiación electromagnética (el espectro de radiación electromagnética abarca desde los rayos cósmicos hasta las ondas de radio). La radiación ultravioleta puede provenir de muchas fuentes artificiales y naturales. Dependiendo de la fuente de radiación ultravioleta, la misma puede estar acompañada de otros tipos (no ultravioletas) de radiación electromagnética (por ejemplo, luz visible).

En la presente memoria se describen tipos particulares de radiación ultravioleta en términos de longitud de onda. En la presente memoria se describe la longitud de onda en términos de nanómetros ("nm"; 10^{-9} metros). A los fines de la presente memoria, la radiación ultravioleta se extiende aproximadamente desde 180 nm a 400 nm. Cuando una fuente de radiación, en virtud de los filtros u otro medio, no permite una radiación por debajo de una longitud de onda particular (por ejemplo, 320 nm), se dice que tiene un corte de extremo bajo en esa longitud de onda (por ejemplo, "un corte de longitud de onda a 300 nanómetros"). Similarmente, cuando una fuente de radiación permite solamente radiación por debajo de una longitud de onda particular (por ejemplo, 360 nm), se dice que tiene un "corte" de extremo alto en esa longitud de onda (por ejemplo, "un corte de longitud de onda a 360 nanómetros").

Para cualquier reacción fotoquímica es deseable eliminar o al menos minimizar cualquier reacción colateral perjudicial. Algunas de estas reacciones colaterales pueden ser causadas por la excitación de cromóforos endógenos que pueden estar presentes durante el procedimiento de fotoactivación. En un sistema en el que sólo están presentes un ácido nucleico y el psoraleno, los cromóforos endógenos son las propias bases del ácido nucleico. Restringir el proceso de fotoactivación a longitudes de onda mayores que 320 nm minimiza el daño directo al ácido nucleico debido a que hay muy poca absorción por parte de los ácidos nucleicos por encima de 313 nm.

En el suero o plasma humano, por ejemplo, el ácido nucleico está típicamente presente junto con constituyentes biológicos adicionales. Si el fluido biológico es solo proteína, el corte de 320 nm será adecuado para minimizar las reacciones colaterales (los aminoácidos aromáticos no absorben por encima de 320 nm). Si el fluido biológico incluye otros analitos, puede haber constituyentes que sean sensibles a longitudes de onda de luz particulares. En vista de la presencia de estos constituyentes endógenos, se prevé que el dispositivo esté diseñado para permitir la irradiación dentro de un intervalo pequeño de longitudes de onda específicas y deseables, y evitar de este modo el daño a los componentes sanguíneos. El intervalo preferido de longitudes de onda deseables está entre 320 y 350 nm.

Se puede lograr alguna selectividad mediante la elección de fuentes de irradiación comerciales. Por ejemplo, mientras los tubos fluorescentes típicos emiten longitudes de onda que varían de 300 nm hasta por encima de 400 nm (con un amplio pico centrado alrededor de 360 nm), las lámparas fluorescentes del tipo BLB están diseñadas para eliminar longitudes de onda por encima de los 400 nm. Esto, sin embargo, sólo proporciona un corte de extremo superior.

El dispositivo puede comprender un medio de filtrado adicional. En una realización, el medio de filtrado comprende un filtro de corte de vidrio, tal como un trozo de vidrio de Cobalto. En otra realización, el medio de filtrado comprende una solución de filtro líquida que sólo transmite una región específica del espectro electromagnético, tal como una solución acuosa de Co(NO_{3})_{2}. Esta solución salina produce una ventana de transmisión de 320-400 nm. En una realización preferida, la solución acuosa de Co(NO_{3})_{2} se utiliza en combinación con NiSO_{4} para eliminar el componente de 365 nm del espectro de emisión de la fuente fluorescente o de arco empleada. La solución de Co-Ni conserva su transmisión inicial notablemente bien aun después de decenas de horas de exposición a la luz directa de fuentes de alta energía.

No se pretende que el dispositivo esté limitado por el filtro particular empleado. Diversas sales inorgánicas y vidrios satisfacen los requerimientos necesarios. Por ejemplo, el sulfato cúprico es el filtro general más útil para eliminar el infrarrojo, cuando se debe aislar sólo el ultravioleta. Su estabilidad en fuentes intensas es bastante buena. Otras sales son conocidas por los expertos en la técnica. Las lámparas de apertura o reflectoras también pueden utilizarse para lograr longitudes de onda e intensidades específicas.

Cuando la radiación ultravioleta se describe en la presente memoria en términos de irradiación, la misma se expresa en términos de flujo de intensidad (miliwatts por centímetro cuadrado o "mW cm^{-2}" o J/cm^{2} segundo). La "potencia de salida" se describe en la presente memoria para abarcar tanto la emisión de radiación (sí o no; encendido o apagado) así como el nivel de irradiación. En una realización preferida, la intensidad se monitorea en 4 ubicaciones: 2 por cada lado del plano de irradiación.

Una fuente preferida de radiación ultravioleta es una fuente fluorescente. La fluorescencia es un caso especial de luminiscencia. La luminiscencia implica la absorción de radiación electromagnética por una sustancia y la conversión de la energía en radiación de una longitud de onda diferente. Con la fluorescencia, la sustancia que es excitada por la radiación electromagnética vuelve a su estado fundamental emitiendo un cuanto de radiación electromagnética. Si bien hasta este momento se ha considerado que las fuentes fluorescentes son de intensidad demasiado baja para ser útiles para la fotoactivación, un dispositivo descrito emplea fuentes fluorescentes para lograr resultados hasta aquí obtenibles sólo en un equipo costoso.

Tal como se utiliza en la presente, la relación fija se define como que comprende una distancia y geometría fijas entre la muestra y la fuente de luz durante la irradiación de la muestra. Distancia se refiere a la distancia entre la fuente y la muestra tal como está soportada. Se sabe que la intensidad de luz desde una fuente puntual está inversamente relacionada con el cuadrado de la distancia desde la fuente puntual. De este modo, pequeños cambios en la distancia desde la fuente pueden tener una influencia dramática sobre la intensidad. Debido a que los cambios en la intensidad pueden influir sobre los resultados de la fotoactivación, en los dispositivos de la presente invención se evitan los cambios en la distancia. Esto proporciona reproducibilidad y repetibilidad.

Geometría se refiere al posicionamiento de la fuente de luz. Por ejemplo, se puede imaginar que las fuentes de luz podrían ubicarse alrededor del soporte de la muestra de muchas maneras (a los costados, en la parte inferior, en un círculo, etc.). La geometría utilizada en nuestro dispositivo permite la exposición de luz uniforme de intensidad apropiada para la rápida fotoactivación. La geometría de un dispositivo preferido incluye múltiples fuentes de lámparas lineales en oposición a fuentes puntuales únicas. Además, existen varias superficies reflectantes y varias superficies absorbentes. Debido a esta geometría complicada, se deben evitar los cambios en la ubicación de las lámparas con relación a la posición de las muestras a ser irradiadas ya que dichos cambios producirán cambios de intensidad.

B. Fotoactivación Rápida

La fuente de luz descrita permite la fotoactivación rápida. Las características de intensidad del dispositivo de irradiación se han seleccionado para que sean convenientes con la previsión de que puede ser necesario procesar muchos conjuntos de múltiples muestras. Con esta previsión, un tiempo de exposición de quince minutos o menor es un objetivo práctico.

En el diseño de los dispositivos descritos en la presente memoria, la posición relativa de los elementos del dispositivo preferido se ha optimizado para permitir aproximadamente quince minutos de tiempo de irradiación, de manera que, cuando se mide para las longitudes de onda entre 320 y 350 nanómetros, se suministra a los recipientes de muestra un flujo de intensidad mayor que aproximadamente 1 mW cm^{-2} (0,001 J/cm^{2} segundo).

C. Procesamiento de Gran Cantidad de Muestras

Según lo observado, otra importante característica de los dispositivos de fotoactivación descritos es que estos proporcionan el procesamiento de gran cantidad de muestras. A este respecto, un elemento de los dispositivos descritos es un medio para soportar una pluralidad de bolsas de sangre. El medio de soporte puede comprender un soporte de bolsas de sangre colocado entre dos bancos de luces. Al aceptar las bolsas comercialmente disponibles comúnmente utilizadas, el dispositivo permite el procesamiento conveniente de gran cantidad de muestras.

D. Control de temperatura

Según lo observado, una de las características importantes de los dispositivos de fotoactivación descritos es el control de temperatura. El control de temperatura es importante debido a que la temperatura de la muestra en el momento de la exposición a la luz puede influir dramáticamente en los resultados. Por ejemplo, las condiciones que promueven la estructura secundaria en los ácidos nucleicos también potencian las constantes de afinidad de muchos derivados de psoraleno por los ácidos nucleicos. Hyde y Hearst, Biochemistry, 17, 1251 (1978). Estas condiciones son una combinación de composición del disolvente y temperatura. Con un ARN ribosomal 5S monocatenario, la irradiación a bajas temperaturas potencia la adición covalente de HMT al ARNr 5S en un factor dos a 4ºC en comparación con los 20ºC. Thompson et al., J. Mol. Biol. 147:417 (1981). Incluso se han informado otros aumentos de unión al psoraleno inducidos por la temperatura con polinucleótidos sintéticos. Thompson et al., Biochemistry 21:1363 (1982).

E. Seguridad Inherente

La radiación ultravioleta puede ocasionar quemaduras severas. Dependiendo de la naturaleza de la exposición, ésta también puede ser carcinogénica. El usuario puede protegerse de la fuente de luz descrita en la presente memoria. Esto contrasta con las fuentes ultravioletas comerciales manuales así como las fuentes grandes y de alta intensidad. La fuente de irradiación puede estar contenida dentro de una envoltura hecha de un material que obstruya la transmisión de energía radiante (es decir, una envoltura opaca). No se permite que ninguna irradiación pase al usuario. Esto permite la seguridad inherente para el usuario.

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II. Síntesis de compuestos A. Compuestos de Fotoactivación en General

La frase "Compuestos de fotoactivación" (o "compuestos fotorreactivos") define una familia de compuestos que sufren un cambio químico en respuesta a la radiación electromagnética. La Tabla 1 es una lista parcial de compuestos de fotoactivación.

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TABLA 1

1

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Comúnmente la especie preferida de compuestos fotorreactivos descritos en la presente memoria se denomina furocumarinas. En particular, el método descrito en la presente memoria contempla aquellos compuestos descritos como psoralenos: (7H-furo(3,2-g)-(1)-benzopiran-7-ona o \beta-lactona del ácido 6-hidroxi-5-benzofuranacrílico], que son lineales:

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2

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y en los que los dos residuos de oxígeno unidos al resto aromático central poseen una orientación 1, 3, y además en los que el resto del anillo furano está unido a la posición 6 del sistema de cumarina bianular. Los derivados de psoraleno derivan de la sustitución de la furocumarina lineal en las posiciones 3, 4, 5, 8, 4' o 5'.

El 8-metoxipsoraleno (conocido en la literatura por varios nombres, por ejemplo xantotoxina, metoxsaleno, 8-MOP) es un psoraleno natural con unión fotoactivada relativamente baja a los ácidos nucleicos y baja mutagenicidad en el ensayo de Ames, que se describe en la siguiente sección experimental. El 4'-aminometil-4,5',8-trimetilpsoraleno (AMT) es uno de los derivados de psoraleno de unión a ácidos nucleicos más reactivos, proporcionando hasta 1 aducto de AMT por cada 3,5 pares de bases de ADN. S.T. Isaacs, G. Wiesehahn y L.M. Hallick, NCI Monograph 66:21 (1984). Sin embargo, el AMT también exhibe niveles considerables de mutagenicidad. Se deseaba obtener un nuevo grupo de psoralenos que tuviera las mejores características de ambos 8-MOP y AMT: baja mutagenicidad y alta afinidad de unión a ácidos nucleicos, para garantizar la seguridad y la inactivación completa de los agentes patógenos. Los compuestos descritos en la presente memoria fueron diseñados para ser dichos compuestos.

Los "psoralenos sustituidos con grupos amino primarios en posición 4'" se definen como compuestos de psoraleno que poseen un grupo NH_{2} unido a la posición 4' del psoraleno por una cadena hidrocarbonada que posee una longitud total de 2 a 20 carbonos, donde 0 a 6 de esos carbonos están reemplazados independientemente por NH u O, y cada punto de reemplazo está separado de otro punto de reemplazo por al menos dos carbonos, y está separado del psoraleno por al menos un carbono. Los psoralenos sustituidos con grupos amino primarios en posición 4' pueden tener sustituciones adicionales en las posiciones 4, 5' y 8 del psoraleno, incluyendo dichas sustituciones, sin limitación, a los siguientes grupos: H y (CH_{2})_{n}CH_{3}, donde n = 0-6.

Los "psoralenos sustituidos con grupos amino primarios en posición 5'" se definen como compuestos de psoraleno que poseen un grupo NH_{2} unido a la posición 5' del psoraleno por una cadena hidrocarbonada que posee una longitud total de 1 a 20 carbonos, donde 0 a 6 de esos carbonos están reemplazados independientemente por NH u O, y cada punto de reemplazo está separado de otro punto de reemplazo por al menos dos carbonos, y está separado del psoraleno por al menos un carbono. Los psoralenos sustituidos con grupos amino primarios en posición 5' pueden tener sustituciones adicionales en las posiciones 4, 4' y 8 del psoraleno, incluyendo dichas sustituciones, sin limitación, a los siguientes grupos: H y (CH_{2})_{n}CH_{3}, donde n = 0-6.

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B. Síntesis de los Psoralenos

Describimos métodos de síntesis para los compuestos nuevos descritos en la presente memoria así como nuevos métodos de síntesis para intermediarios conocidos. Específicamente, los nuevos compuestos son psoralenos sustituidos con grupos amino primarios en posición 4' o 5' mono-, di- o trialquilados. En las Figuras 5A-5F se muestran varios ejemplos de los esquemas desarrollados en esta sección. Para una fácil referencia, la Tabla 2 expone la nomenclatura utilizada para los derivados de psoraleno tratados en la presente memoria. Las estructuras de los compuestos 1-18 también se ilustran en las Figuras 5A-5F. Obsérvese que en esta sección (titulada "B. Síntesis de los Psoralenos") los números romanos utilizados para identificar los compuestos se correlacionan solamente con los Esquemas 1-6, y no se correlacionan con los números de compuestos enumerados en la Tabla 2 o las Figuras 5A-5F.

Es más lógico describir primero la síntesis de intermediarios útiles en la síntesis de muchos de los compuestos descritos en la presente memoria. Si bien la invención no se limita a 4,5',8-trimetil-psoralenos sustituidos con grupos amino primarios en posición 4' o 4,4',8-trimetil-psoralenos sustituidos con grupos amino primarios en 5', algunos intermediarios importantes incluyen tri- y tetrametil psoralenos, 4'-halometil-4,5',8-trimetilpsoralenos y 5'-halometil-4,4',8-trimetilpsoralenos. La preparación de estos intermedios críticos presenta difíciles desafíos.

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3

4

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Síntesis de Intermediarios

Las síntesis previas del 4'-clorometil-4,5',8-trimetilpsoraleno (4'-CMT) y 4'-bromometil-4,5',8-trimetilpsoraleno (4'-BrMT) comienzan a partir del 4,5',8-trimetilpsoraleno (5'-TMP), que está comercialmente disponible (Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) o puede prepararse en cuatro etapas según lo descrito más abajo para otros psoralenos alquilados. El 5'-TMP se convierte en 4'-CMT utilizando un gran exceso (20-50 equivalentes) de éter clorometilmetílico altamente carcinogénico y volátil. La halometilación de 4,5',8-trialquilpsoralenos con éter clorometilmetílico o éter bromometilmetílico se describe en la Patente Estadounidense Núm. 4.124.598 concedida a Hearst. El compuesto bromado 4'-BrMT, se prepara de la misma manera utilizando éter bromometilmetílico, que es algo menos volátil. Se obtienen rendimientos de sólo 30-60% del intermediario deseado. El 5'-clorometil-4,4',8-trimetilpsoraleno (5'-CMT) y 5'-bromometil-4,4',5-trimetilpsoraleno (5'-BrMT) se preparan similarmente, utilizando el compuesto de partida isómero, 4,4',8-trimetilpsoraleno (4'-TMP) [Patente Estadounidense No. 4.294.822 concedida a Kaufman; McLeod, et al., "Synthesis of Benzofuranoid Systems. I. Furocoumarins, Benzofurans and Dibenzofurans", Tetrahedron Letters 237 (1972)].

En la presente memoria se describe un procedimiento mucho más mejorado que permite la síntesis de cualquier isómero de bromometil-trialquilpsoralenos a partir del mismo psoraleno precursor mediante el cuidadoso control de las condiciones de reacción. Véase el Esquema 1.

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Esquema 1

5

La reacción de la 4,8-dialquil-7-hidroxicumarina con 2-cloro-3-butanona en condiciones básicas típicas, da la 4,8-dialquil-7-(1-metil-2-oxo)propiloxi-cumarina (I). Este material se cicla calentando en NaOH acuoso para dar 4,8-dialquil-4',5'-dimetilpsoraleno (II). El tratamiento del psoraleno tetrasustituido y N-bromosuccinimida en un disolvente a una temperatura entre ambiente y 150ºC lleva a la bromación en la posición 4' o 5', dependiendo de las condiciones utilizadas. Puede añadirse un catalizador tal como peróxido de dibenzoílo, pero no es necesario. Si el disolvente utilizado es tetracloruro de carbono a reflujo, se obtiene 4,8-dialquil-5'-bromometil-4'-metilpsoraleno (IV) con rendimientos del 50% o mayores. Si se utiliza cloruro de metileno a temperatura ambiente, sólo se obtiene 4,8-dialquil-4'-bromometil-5'-metil-psoraleno (III) con un rendimiento \geq80%. También puede realizarse la bromación bencílica en otros disolventes, generando uno de los productos isómeros solo o en una mezcla. Estos disolventes incluyen, sin limitación, 1,2-dicloroetano, cloroformo, bromotriclorometano y benceno.

Esquema General de la Síntesis de Psoralenos Sustituidos en Posición 4'

Yendo ahora a la síntesis de una subclase de psoralenos lineales, pueden fabricarse 4,5',8-trialquilpsoralenos de la siguiente manera. Las 4,8-dialquilcumarinas se preparan a partir de 2-alquilresorcinoles y un éster de 3-oxoalcanoato por reacción de Pechmann (Organic Reactions vol. VII, capítulo 1, ed. Adams et al., Wiley, NY (1953)). El grupo hidroxi se trata con un agente de alilación, CH_{2} = CHX-CH(R)-Y, en el que X es un haluro o hidrógeno, Y es un haluro o sulfonato, y R es H o (CH_{2})_{v}CH_{3}, en el que v es un número entero de 0 a 4. El reordenamiento de Claisen del alil éter resultante da 4,8-dialquil-6-alil-7-hidroxicumarina. Las cumarinas se convierten en 4,5',8-trialquilpsoralenos usando procedimientos similares a uno de los varios procedimientos descritos previamente (es decir, véase Bender et al., J. Org. Chem. 44:2176 (1979); Kaufman, Patente Estadounidense No. 4.235.781 y 4.216.154. El 4,5',8-trimetilpsoraleno es un producto natural y está comercialmente disponible (Aldrich Chemical Co., Milwakee, WI).

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Esquema general de síntesis de psoralenos sustituidos en posición 5'

Los 4,4',trialquipsoralenos pueden prepararse en dos etapas también comenzando a partir de las 4,8-dialquil-7-hidroxicumarinas citadas más arriba. La cumarina se trata con una alfa-cloro cetona en condiciones básicas para dar la 4,8-dialquil-7-(2-oxoalcoxi)cumarina). La ciclación de este intermediario a la 4,4',8-trialquilcumarina se produce calentando en base acuosa.

Los 4'-(\omega-haloalquil)trialquilpsoralenos de cadena más larga (denominados en esta memoria 4'-HATP de cadena más larga), en los que los grupos alquilo se seleccionan desde el grupo (CH_{2})_{2} hasta (CH_{2})_{10}, se pueden preparar en condiciones de Friedel-Crafts según lo descrito en otro lugar (Olah y Kuhn, J. Org. Chem., 1964, 29, 2317; Friedel-Crafts and Related Reactions, vol. II, Parte 2, Olah, ed. Interscience, NY, 1964, pág. 749). Si bien se han descrito reacciones de los intermediarios halometilados con aminas (por ejemplo, Hearst et al., Patente Estadounidense No. 4.124.598) y alcoholes (por ejemplo, Kaufman, Patente estadounidense No. 4.269.852), sólo hay dos informes originales sobre la formación de aminas primarias de cadena extendida. Estos describen la reacción del 4'-clorometil-4,5',8-psoraleno con H_{2}N-(CH_{2})_{n}-NH_{2} (donde n = 2, 4, 6) (Véase Lee, B. et al., Interaction of Psolaren Derivatized Oligodeoxyribonucleoside Methylphosphonates with Single-Stranded DNA, Biochemistry 27:3197 (1988) y con H_{2}NCH_{2}CH_{2}SSCH_{2}CH_{2}CH_{2}NH_{2} (Goldenberg, M. et al., Synthesis and Properties of Novel Psolaren Derivatives, Biochemistry 27:6971 (1988)). No se ha informado anteriormente de la utilidad de los compuestos resultantes para fotorreacción con ácidos nucleicos. Las propiedades de estos materiales, tales como una mutagenicidad reducida, están basadas inesperadamente en lo que se conoce sobre los compuestos previamente preparados, tales como
el AMT.

En el Esquema 2 se presentan varias vías de síntesis. Partiendo del 4'-HATP, la reacción con un exceso de un compuesto bis-hidroxilado, HO-(B)-OH, donde B es o bien una cadena alquílica (por ejemplo, HO-B-OH es 1,3-propanodiol), un monoéter (por ejemplo, dietilenglicol) o un poliéter (por ejemplo, tetraetilenglicol), puro o con un disolvente tal como acetona a 20-80ºC, y una base para cadenas carbonadas más largas que halometilo, da un (\omega-hidroxialcoxi)alquil psoraleno.

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Esquema 2

6

El grupo hidroxi terminal se puede transformar en un grupo amino en una variedad de condiciones (por ejemplo, véase Larock, Comprehensive Organic Transformations, VCH Publishers, NY, 1989). En particular, el grupo hidroxi se puede convertir en el éster del ácido metanosulfónico (estructura VI). Éste se puede convertir seguidamente en la azida en etanol a reflujo y la azida reducirse en la amina final, estructura VII (son ejemplos los compuestos 2, 4 y 7). El método descrito en la presente memoria utiliza trifenilfosfina y agua en THF para la reducción, pero se contemplan otros métodos.

Un método preferido para la preparación de la estructura VII usa la reacción del 4'-HATP con un alcohol lineal primario que contiene una amina protegida (por ejemplo un grupo ftalimido) en la posición terminal, en un disolvente adecuado tal como DMF a 25-150ºC para dar I. La amina después se desprotege en condiciones estándar (por ejemplo, hidrazina o MeNH_{2} acuosa para desproteger un grupo ftalimido [también se contemplan alquilhidrazinas superiores, tales como bencilhidrazinas]) para dar VII.

A la inversa, se puede hacer reaccionar la estructura VI con diaminas H_{2}N-(B')-NH_{2} (estructura IX) en las que B' es una cadena alquílica (por ejemplo, 1,4-butandiamina), un monoéter (por ejemplo, 3-oxa-1,5-pentandiamina) o un poliéter (por ejemplo, 3,6-dioxa-1,8-octandiamina) para dar el producto final, el compuesto VIII (son ejemplos los compuestos 8, 13 y 14). Esta reacción se realiza con un exceso de diamina en acetonitrilo a reflujo, pero son igualmente posibles otros disolventes y temperaturas.

Se desean algunos compuestos finales en los que la cadena carbonada está unida a la posición 4' del anillo de psoraleno por un grupo aminoalquilo [NH(CH_{2})_{w}] y no por un grupo oxialquilo [O(CH_{2})_{w}]. Las vías de síntesis para estos compuestos se muestran en el Esquema 3. Cuando la unión entre este nitrógeno y el nitrógeno terminal contiene sólo subunidades CH_{2} y oxígeno pero no otros nitrógenos (estructura X) (son ejemplos los compuestos 1, 5, 6, 9, 10 y 11), el producto puede prepararse convenientemente a partir de 4'-HATP y la diamina apropiada de estructura IX. Este método es también aplicable a productos finales que contienen más de dos nitrógenos en la cadena (estructura XIII) (son ejemplos los compuestos 12 y 15) a partir de poliaminas de estructura XII (por ejemplo, norespermidina o espermina [disponibles comercialmente de Aldrich, Milwaukee, WI]); sin embargo, en este caso también se forman estructuras isómeras en cantidades considerables. El método preferido para la preparación de la estructura XIII es la aminación reductiva del psolaren-4'-alcanal (XI) con una poliamina de estructura XII y un agente reductor tal como cianoborohidruro sódico. Esta aminación reductiva es aplicable también a la síntesis de los compuestos X. Los carboxaldehídos (estructura XI, w = 0) se han preparado previamente por hidrólisis de los 4'-halometil compuestos y posterior oxidación del 4'-hidroximetil compuesto resultante. (Isaacs et al., J. Labelled Cmpds Radiopharm., 1982, 19, 345). Estos compuestos también se pueden preparar convenientemente mediante la formulación de los 4'-hidrido compuestos con una formamida y POCl_{3} o con hexametilentetraamina en ácido. Los alcanales de cadena larga se pueden preparar a partir de los compuestos de tipo 4'-HATP por conversión del grupo halo terminal a función aldehído (por ejemplo, Durst, Adv. Org. Chem. 6:285 (1969)).

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Esquema 3

7

Otros productos finales tienen una amina terminal unida al psoraleno por una cadena alquílica. Según se muestra en el Esquema 4 siguiente, estos compuestos (estructuras XIV) (un ejemplo es el Compuesto 3) se preparan por reacción del 4'-HATP con ftalimida o azida potásica y posterior liberación de la amina deseada como antes, o por conversión del 4'-HATP en el ciano-compuesto, seguida de reducción, por ejemplo con NaBH_{4}-CF_{3}CO_{2}H.

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Esquema 4

8

La descripción de la conversión de 4,5',8-trialquilpsoralenos en 4,5',8-trialquilpsoralenos con función amina en 4' se aplica igualmente bien cuando la posición 4 y/u 8 está sustituida con sólo un hidrógeno, obteniéndose así 5' (4 u 8)-dialquilpsoralenos sustituidos con grupos amino primarios en posición 4' y 5'-alquilpsoralenos sustituidos con grupos amino primarios en posición 4'.

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Síntesis de Derivados en Posición 5'

En condiciones idénticas a las descritas más arriba, los 4,4',8-trialquilpsoralenos o los 4,4',8-trialquil-5'-metilpsoralenos pueden convertirse en 5'-(\omega-haloalquil))-4,4',8-trialquilpsoralenos (denominados en la presente memoria 5'-HATP), según se detalla en el Esquema 5, más abajo. (Véase Kaufman, Patente Estadounidense No. 4.294.522 y 4.298.614 para la versión modificada).

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Esquema 5

9

La descripción de la conversión de 4,4',8-trialquilpsoralenos en 4,4',8- trialquilpsoralenos sustituidos por grupos amino primarios en posición 5' se aplica igualmente bien cuando la posiciones 4, 4'y/u 8 están sustituidas sólo con un hidrógeno, obteniéndose de este modo dialquilpsoralenos sustituidos por grupos amino primarios en posición 5' y alquilpsoralenos sustituidos por grupos amino primarios en posición 5', con el/los grupo(s) alquilo en las posiciones 4, 4' y/u 8.

La discusión anterior acerca de las síntesis de psoralenos con grupos amino primarios en posición 4' y 5' puede extenderse a las cumarinas no lineales, específicamente los isopsoralenos o angelicinas. De este modo, las halometilangelicinas en posición 4' (XIX) y las 5'-halometilangelicinas (XX) pueden prepararse de manera similar a sus contrapartes lineales. (Véase el Esquema 6). Por analogía con los mecanismos de síntesis presentados más arriba se puede anticipar la síntesis de 4'-(\omega-amino)alquilangelicinas y 5'-(\omegaamino)alquilangelicinas donde la unión alquilo puede contener uno o más átomos de oxígeno o nitrógeno.

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Esquema 6

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10

III. Unión de compuestos a un ácido nucleico

Describimos la unión de compuestos nuevos y conocidos a un ácido nucleico, incluyendo (sin limitación) un ácido nucleico viral y un ácido nucleico bacteriano. Un abordaje para unir compuestos de fotoactivación a un ácido nucleico es la fotounión. La fotounión se define como la unión de compuestos de fotounión en presencia de longitudes de onda de luz fotoactivantes. Los compuestos de fotounión son compuestos que se unen a ácidos nucleicos en presencia de longitudes de onda de luz fotoactivantes. Describimos métodos de fotounión con compuestos de fotounión descritos en la presente memoria.

Un método de fotounión incluye las etapas de: a) proporcionar un compuesto de fotounión descrito en la presente memoria y b) mezclar el compuesto de fotounión con un ácido nucleico en presencia de longitudes de onda de fotoactivación de radiación electromagnética.

También describimos un método para modificar un ácido nucleico, que comprende las etapas de: a) proporcionar un compuesto de fotounión descrito en la presente memoria y un ácido nucleico y b) fotounir el compuesto de fotounión al ácido nucleico, de manera que se forme un complejo compuesto:ácido nucleico. Sin pretender limitarse a ningún método por el que los compuestos descritos en la presente memoria previenen la replicación, se cree que la estructura de dicho complejo compuesto:ácido nucleico sirve para prevenir la replicación del ácido nucleico evitando que la polimerasa necesaria actúe en la región donde se ha unido el compuesto.

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IV. Inactivación de agentes patógenos

Describimos el tratamiento de un producto sanguíneo con un compuesto fotoactivante y la irradiación para inactivar secuencias de ácidos nucleicos contaminantes de agentes patógenos antes de usar el producto sanguíneo.

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A. Inactivación en General

El término "inactivación" se define aquí como la alteración del ácido nucleico de una unidad de agente patógeno para hacer que la unidad del agente patógeno sea incapaz de replicación. Esto se diferencia de la "inactivación total", en la que se hace que todas las unidades del agente patógeno presentes en una muestra dada resulten incapaces de replicación, o "inactivación sustancial", donde se hace que la mayoría de las unidades del agente patógeno presentes resulten incapaces de replicación. La "eficiencia de inactivación" de un compuesto se define como el nivel de inactivación que el compuesto puede alcanzar a una dada concentración del compuesto o dosis de irradiación. Por ejemplo, si 100 \muM de un hipotético compuesto X inactivaron 5 destrucciones logarítmicas de virus HIV mientras que, en las mismas condiciones experimentales, la misma concentración del compuesto Y inactivó sólo 1 destrucción logarítmica de virus, entonces el compuesto X tendría una "eficiencia de inactivación" mejor que el compuesto Y.

Para apreciar si un método de "inactivación" puede lograr o no la "inactivación total", es útil considerar un ejemplo específico. Se dice que un cultivo bacteriano está inactivado si una alícuota del cultivo, cuando se transfiere a una placa de cultivo fresca y se permite que crezca, es indetectable después de un cierto período de tiempo. Para que una señal sea detectable, se debe aplicar a la placa un número mínimo de bacterias viables. Con el método de detección óptimo, este número mínimo es 1 célula bacteriana. Con un método de detección subóptimo, el número mínimo de células bacterianas aplicadas de manera que se observe una señal puede ser mucho mayor que 1. El método de detección determina un "umbral" por debajo del que el "método de inactivación" parece ser completamente eficaz (y por encima del que la "inactivación" es, de hecho, sólo parcialmente eficaz).

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B. Inactivación de Agentes Patógenos Potenciales

Las mismas consideraciones del método de detección y umbral existen cuando se determina el límite de sensibilidad de un método de inactivación para un ácido nucleico. Nuevamente, "inactivación" significa que se hace que una unidad de agente patógeno resulte incapaz de replicación.

En el caso de los métodos de inactivación para material a ser utilizado por seres humanos, sea in vitro o in vivo, teóricamente, el método de detección a seguir puede ser la medición del nivel de infección con una enfermedad como resultado de la exposición al material. El umbral por debajo del cual el método de inactivación es completo se considera entonces que es el nivel de inactivación que es suficiente para prevenir que se produzca enfermedad debido al contacto con el material. Se reconoce que en este escenario práctico no es esencial que los métodos descritos en la presente memoria produzcan la "inactivación total". Es decir, la "inactivación sustancial" será adecuada en tanto que la porción viable sea insuficiente para causar la enfermedad. Así, "sustancialmente la totalidad" de un agente patógeno está inactivada cuando cualquier porción viable del agente patógeno que permanece es insuficiente para causar enfermedad. El método de inactivación descrito en la presente memoria convierte al ácido nucleico de los agentes patógenos en sustancialmente inactivado.

Sin pretender limitarse a ningún método por el que los compuestos descritos en la presente memoria inactivan agentes patógenos, se cree que la inactivación resulta de la unión inducida por la luz de los psoralenos al ácido nucleico de los patógenos. Además, si bien no se pretende que el método de inactivación descrito en la presente memoria esté limitado por la naturaleza del ácido nucleico, se contempla que el método de inactivación convierta a todas las formas de ácido nucleico (sea ADN, ARNm, etc.) en sustancialmente inactivadas.

Cuando los compuestos de fotoactivación se usan para modificar un ácido nucleico, la interacción del ácido nucleico del agente patógeno (sea ADN, ARNm, etc.) con el compuesto de fotoactivación preferentemente previene la replicación del agente patógeno de manera que, si un ser humano se expone al agente patógeno tratado, no se producirá una infección.

"Medio sintético" se define en la presente memoria como un medio acuoso de almacenamiento sintético de sangre o de un producto sanguíneo. En una realización, describimos la inactivación de productos sanguíneos en un medio sintético que comprende una solución salina tamponada. Este método reduce el daño causado a productos sanguíneos y permite el uso de concentraciones mucho más bajas de compuestos de fotoactivación.

El método de fotoinactivación con psoralenos inactiva agentes patógenos basados en ácidos nucleicos presentes en la sangre a través de un único procedimiento. De este modo, éste tiene potencial para eliminar bacterias, protozoos y también virus. Si se hubiera dispuesto de un método de descontaminación eficaz antes de la llegada del SIDA pandémico, no se habría producido la transmisión de HIV asociada a transfusiones. La descontaminación basada en psoralenos tiene el potencial de eliminar todos los agentes infecciosos del suministro de sangre, independientemente del agente patógeno involucrado. Además, la descontaminación basada en psoralenos tiene la capacidad de esterilizar productos sanguíneos después de su recolección y procesamiento, lo que en el caso de concentrados de plaquetas podría resolver el problema de la contaminación bacteriana de bajo nivel y dar como resultado una vida de almacenamiento extendida. Morrow, J. F. et al., JAMA 266:555-558 (1991); Bertolini, F. et al., Transfusion 32:152-156
(1992).

En la Tabla 3 aparece una lista de virus que han sido inactivados fotoquímicamente por uno o más derivados de psoralenos. (De la Tabla 1 de Hanson, C.V., Blood Cells, 18:7 (1992)). Esta lista no es exhaustiva y es meramente representativa de la gran variedad de agentes patógenos que pueden inactivar los psoralenos. Describimos la inactivación de estos y otros virus por compuestos que se describen en la presente memoria. Los compuestos descritos en la presente memoria son particularmente adecuados para inactivar virus de envoltura tales como el virus
HIV.

TABLA 3 Virus Fotoquímicamente Inactivados por Psoralenos

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C. Selección de Compuestos de Fotoinactivación Para la Inactivación de Agentes Patógenos

Con el fin de evaluar un compuesto para decidir si sería útil en los métodos de descontaminación fotoquímica (PCD) descritos en la presente memoria, se deben considerar dos propiedades importantes: 1) la capacidad del compuesto para inactivar agentes patógenos y 2) su mutagenicidad. La capacidad de un compuesto para inactivar agentes patógenos se puede determinar mediante varios métodos. Una técnica es realizar una detección de bacteriófagos; un ensayo que determina la unión de un ácido nucleico con los compuestos de ensayo. Una detección de este tipo, una detección r-17, se describe en detalle en el Ejemplo 12, más abajo. Si la detección r-17 revela actividad de inactivación, es útil ensayar directamente la capacidad del compuesto para inactivar un virus. Un método para realizar una detección directa de inactivación viral se describe en detalle en el Ejemplo 13 para HIV libre de células.

Se cree que el análisis con el bacteriófago R17 predice la eficiencia de inactivación del HIV, así como la eficiencia de los compuestos contra muchos otros virus. Se escogió el R17 porque se esperaba que fuera un agente patógeno muy difícil de inactivar. Es un fago de ARN pequeño, monocatenario. Sin que eso signifique una limitación a cualquier medio por el que actúan los métodos descritos en la presente memoria, se espera que los trozos más cortos de ácido nucleico sean más difíciles de inactivar debido a que requieren una frecuencia más alta de formación de aductos de psoraleno que los trozos más largos de ácido nucleico. Además, los agentes patógenos de ARN monocatenarios son más difíciles de inactivar porque los psoralenos ni se pueden intercalar entre pares de bases, como con ácidos nucleicos bicatenarios, ni forman diaductos que funcionan como entrecruzamientos entre cadenas. De este modo se espera que cuando se logra la inactivación de R17, estas mismas condiciones provocarán la inactivación de muchos virus y bacterias.

El análisis de HIV libre de células complementa el análisis con r-17 afirmando que un compuesto dado que ha probado ser positivo en r-17 realmente actuará eficazmente para inactivar virus. De este modo, si un compuesto exhibe actividad en el análisis con r-17, seguidamente se ensaya en el análisis de inactivación viral.

La segunda propiedad que es importante al ensayar un compuesto para utilizar en los métodos descritos en la presente memoria es la mutagenicidad. El ensayo de detección de mutágeno/carcinógeno más extendido es el ensayo de Ames. Este ensayo lo describen D.M. Maron y B.N. Ames en Mutation Research 113:173 (1983) y se describe detalladamente un análisis específico en el Ejemplo 17 más abajo. El ensayo de Ames utiliza varias cepas únicas de Salmonella typhimurium que son dependientes de la histidina para el crecimiento y que carecen de las enzimas usuales de reparación de ADN. La frecuencia de mutaciones normales que hacen que las bacterias resulten independientes de la histidina (es decir, la frecuencia de revertantes espontáneos) es baja. El ensayo permite evaluar la influencia de un compuesto sobre esta frecuencia de revertantes.

Debido a que algunas sustancias no son mutagénicas por sí mismas pero se convierten en mutágenas por acción metabólica, el compuesto a ensayar se mezcla con las bacterias en placas de agar junto con extracto de hígado. El extracto de hígado sirve para imitar la acción metabólica en un animal. Las placas de control sólo tienen las bacterias y el extracto.

Se dejan incubar las mezclas. El crecimiento de bacterias (si lo hay) se controla contando colonias. Un ensayo de Ames positivo es uno en el que el número de colonias en las placas con mezclas que contienen el compuesto excede considerablemente el número de las correspondientes placas de control.

Cuando se analizan de esta manera carcinógenos conocidos con el ensayo de Ames, aproximadamente el 90% de ellos son positivos. Cuando se ensayan similarmente no carcinógenos conocidos, aproximadamente el 90% de ellos son negativos.

Se puede evaluar un nuevo compuesto (X) como potencial compuesto de descontaminación de sangre, tal como se muestra en la Tabla 4, más abajo. X se evalúa inicialmente en la Etapa 1. X se analiza con el ensayo de r-17 a varias concentraciones diferentes entre 4 y 320 \muM, según se explica en el Ejemplo 12. Si el compuesto exhibe una actividad de inactivación mayor que 1 log de inactivación de r-17 (destrucción logarítmica) en el ensayo de r-17 a cualquier concentración, el compuesto después se prueba en el ensayo de HIV libre de células, según se explica en el Ejemplo 13. Si el compuesto exhibe una actividad de inactivación mayor que 1 log de inactivación de HIV (destrucción logarítmica) en el ensayo de HIV libre de células, el compuesto y AMT se prueban después en el ensayo de Ames. Finalmente, si el compuesto exhibe una mutagenicidad inferior en el ensayo de Ames a la de AMT, el nuevo compuesto se identifica como agente útil para la inactivación de agentes patógenos.

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TABLA 4

12

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Siguiendo estas instrucciones, una persona puede determinar rápidamente qué compuestos serían apropiados para su uso en los métodos descritos en la presente memoria.

D. Suministro de Compuestos Para Fotoinactivación

Describimos varias formulaciones y vías diferentes por las que se pueden suministrar en un procedimiento de inactivación los compuestos descritos en la presente memoria. Esta sección es meramente ilustrativa y no tiene la finalidad de limitarse a ninguna forma o método de introducción del compuesto.

Los compuestos descritos en la presente memoria se pueden introducir en un método de inactivación en varias formas. Los compuestos se pueden introducir como solución acuosa en agua, solución salina o en un medio sintético tal como "Sterilyte^{TM} 3,0" (contenido expuesto al comienzo de la sección Experimental más abajo) o una variedad de otros disolventes. Los compuestos además se pueden proporcionar como formulaciones secas, con o sin adyu-
vantes.

Los nuevos compuestos también se pueden suministrar por muchas vías diferentes. Por ejemplo, el compuesto se puede introducir en el recipiente de reacción, tal como una bolsa de sangre, en el momento de la fabricación. Alternativamente, el compuesto se puede añadir al material a esterilizar después de haber puesto el material en el recipiente de reacción. Además, los compuestos se pueden introducir solos o en un "cóctel" o mezcla de varios compuestos diferentes.

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V. Conservación de propiedades bioquímicas del material tratado

Cuando se tratan productos sanguíneos a ser utilizados in vivo, dos factores tienen una importancia primordial en cuanto a los métodos de desarrollo y compuestos a ser utilizados. En primer lugar, uno se debe preguntar si el proceso o los compuestos usados alteran la actividad in vivo del material tratado. Por ejemplo, la transfusión de plaquetas es un tratamiento eficaz bien establecido para pacientes con hemorragia trombocitopénica. Sin embargo, si el tratamiento de descontaminación usado reduce considerablemente la actividad coagulante de las plaquetas, entonces el tratamiento no tiene valor práctico alguno. Los psoralenos son útiles en procedimientos de inactivación, porque la reacción se puede realizar a temperaturas compatibles con la retención de las propiedades bioquímicas de la sangre y los productos sanguíneos. Hanson, C.V., Blood Cells 18:7 (1992). Pero no todos los psoralenos o procedimientos descontaminarán sin reducir considerablemente la actividad biológica del material descontaminado. Los compuestos y protocolos anteriores han necesitado la eliminación de oxígeno molecular de la reacción antes de la exposición a la luz para prevenir que los radicales oxígeno formados durante la irradiación dañen los productos sanguíneos. Véase L. Lin et al., Blood 74:517 (1989); Patente Estadounidense No. 4.727.027 concedida a Wiesenhanh. El método descrito en la presente memoria puede usarse para descontaminar los productos sanguíneos en presencia de oxígeno sin destruir la actividad in vivo para la que se preparan los productos sanguíneos. Los métodos descritos contemplan que no se destruya o se reduzca considerablemente la actividad in vivo de un producto sanguíneo si una muestra de un producto sanguíneo que está descontaminada por métodos descritos en la presente memoria da resultados de ensayo como daría una muestra de un producto sanguíneo que funcionara normalmente en ensayos conocidos para la función de un producto sanguíneo. Por ejemplo, en lo concerniente a plaquetas, la actividad in vivo no se destruye ni se reduce considerablemente si la agregación y el pH de las plaquetas son básicamente los mismos para plaquetas tratadas por los métodos de la presente invención y almacenadas durante 5 días que para muestras de plaquetas no tratadas almacenadas durante 5 días. "Básicamente los mismos" pH y agregación significa que los valores están dentro del intervalo de error en torno a ese punto particular de
medición.

El segundo factor es si los compuestos son tóxicos o mutagénicos para el paciente tratado. Un "compuesto que desarrolla una baja mutagenicidad" se define como un compuesto que es menos mutagénico que el AMT cuando se ensaya en concentraciones por debajo de 250 \muM en el ensayo de Ames, descrito en la sección Experimental más abajo. Los compuestos y métodos de inactivación de la presente invención son especialmente útiles porque muestran la desconexión entre la eficiencia de la inactivación del agente patógeno y la mutagenicidad. Los compuestos exhiben una potente inactivación del agente patógeno sin un aumento concomitante de la mutagenicidad. Los compuestos comúnmente conocidos ensayados según protocolos de fotoinactivación, tales como AMT, parecen exhibir una conexión entre la eficiencia de la inactivación del patógeno y la acción mutagénica que hasta ahora parecía
indivisible.

Si bien no se pretende que los métodos descritos en la presente memoria estén limitados por ninguna teoría según la cual la eficiencia de la inactivación del agente patógeno no está vinculada a la mutagenicidad, se postula que la desconexión se produce como resultado de la longitud de los grupos sustituidos en el psoraleno y la ubicación de las cargas en los compuestos. Se postula que las cargas positivas en uno o ambos extremos de los compuestos mutagénicos tienen interacciones no covalentes con el esqueleto de fosfato del ADN. Se presume que esas interacciones se producen independientemente de la presencia de luz (llamada "unión oscura"). En teoría, de esta manera, el psoraleno bloquea estéricamente a la polimerasa impidiéndole la apertura del ADN, causando mutagenicidad. En contraste, los compuestos de la presente invención tienen una carga positiva o neutra en un grupo sustituyente largo. Estos grupos sustituidos forman una barrera estérica durante la unión oscura que es mucho más fácil de liberar del ADN, lo que permite el paso de la polimerasa. Por lo tanto, no se produce mutagenicidad.

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VI. Dispositivos y métodos para eliminar psoralenos y fotoproductos de psoralenos

Después de la descontaminación fotoquímica (PCD), los fotoproductos de psoralenos formados, así como los psoralenos residuales, pueden eliminarse del producto sanguíneo tratado. En esencia, la eliminación es una precaución de seguridad. Si los psoralenos y fotoproductos de psoralenos no se eliminan del producto sanguíneo tratado antes de la infusión en un receptor, existe la remota posibilidad de que puedan formar conjugados con los ácidos nucleicos del receptor.

Existe un importante cuerpo de investigación referido a la eliminación de sustancias de productos sanguíneos. La mayor parte de esta investigación está dirigida a la reducción de glóbulos blancos. [Véase, por ejemplo, M.N. Boomgaard et al., Transfusion 34:311 (1994); F. Bertolini et al., Vox Sang 62:82 (1992); y A.M. Joustra-Dijkhuis et al., Vox Sang 67:22 (1994)]. La reducción de glóbulos blancos es importante porque los pacientes que reciben transfusiones de componentes sanguíneos con un gran número de glóbulos blancos pueden experimentar varias reacciones adversas, incluyendo reacciones febriles no hemolíticas a la transfusión, aloinmunización por antígenos de leucocitos humanos (HLA), reacciones injerto versus huésped, y refractividad a las transfusiones de plaquetas de donante aleatorio. [T. Shimizu et al., Transfusion 33:730 (I993); y H. Wadenvik, supra]. La filtración de plaquetas es el método más común utilizado en la reducción de glóbulos blancos de PCs. Se han empleado exitosamente numerosos filtros para reducir el número de WBCs en PCs a un nivel que no ocasione las reacciones adversas antes mencionadas. [Véase, por ejemplo, K.I. Kao, supra (PL-100 filters, Pall Corp., Glen Cove, NY); M. Back et al., Transfusion 31:333 (1991) (Sepacell PL-5A, Asahi, Tokio, Japón); J.D. Sweeney et al., Transfusion 35:131 (1995) (Leukotrap PL, Miles Inc., Covina, CA); y M. van Marwijk et al., Transfusion 30:34 (1990) (Cellselect, NPBI, Emmer-Compascuum, The Netherlands; Immugard Ig-500, Terumo, Tokio, Japón)]. Desafortunadamente, estos filtros son incapaces de eliminar los productos de fotoadición de psoralenos o los propios psoralenos, ya que estos compuestos de peso molecular relativamente bajo no se pueden eliminar mediante los mecanismos de filtración actuales.

La adsorción es también un método viable para eliminar productos no deseados de los PCs. Los PCs almacenados durante varios días pueden generar anafilotoxinas que pueden causar efectos adversos, como lesión endotelial vascular e insuficiencia circulatoria periférica, tras la infusión plaquetaria. [T. Shimizu et al., Vox Sang 66:161 (1994)]. Las anafilotoxinas tales como C3a están cargadas positivamente y se cree que se adsorben sobre las membranas filtrantes cargadas negativamente mediante fuerzas electrostáticas; la mayoría de las proteínas plasmáticas están cargadas negativamente y de este modo no son adsorbidas, permitiendo el aislamiento y retención de las anafilotoxinas. T. Shimizu et al. descubrió que ciertos filtros disponibles comercialmente para PCs hechos de fibra de poliéster redujeron los niveles de anafilotoxina C3a hasta aproximadamente un 12% en sus niveles de prefiltración. En teoría, podrían desarrollarse psoralenos que sean moléculas cargadas capaces de unirse a filtros tal como lo hacen ciertas anafilotoxinas. Sin embargo, tomando como base el porcentaje de anafilotoxinas que se escapan de la adsorción del filtro, los fotoproductos de psoralenos y los psoralenos residuales posiblemente permanecerían en los PCs con dicho método debido la superficie/capacidad absortiva limitada de dichos filtros.

El proceso de adsorción también se ha utilizado para asilar componentes sanguíneos selectivos sobre polímeros de fosfolípidos. Por ejemplo, se han evaluado varios copolímeros con diversas cargas eléctricas para determinar sus interacciones con componentes sanguíneos, incluyendo adhesión plaquetaria y adsorción de proteínas. [K. Ishihara et al., J. Biomed. Mat. Res. 28:1347 (1994)]. Sin embargo, dichos polímeros no están diseñados para la adsorción de compuestos de bajo peso molecular como los psoralenos y los fotoproductos de psoralenos.

Varios medios de diálisis son capaces de eliminar compuestos de bajo peso molecular del plasma y sangre entera. Por ejemplo, la diálisis puede eliminar exitosamente toxinas y compuestos farmacéuticos de bajo peso molecular. De este modo, la diálisis se puede utilizar para eliminar psoralenos y fotoproductos de psoralenos de productos sanguíneos. Desafortunadamente, los procedimientos actuales de diálisis incluyen dispositivos muy complicados y costosos. Como tal, el uso de máquinas de diálisis no sería práctico para la descontaminación de un gran volumen de productos sanguí-
neos. Se necesita desarrollar medios más económicos y más simples para ser utilizados en conjunción con PCD.

Según lo presentado más arriba, los métodos y dispositivos actuales para aislar productos no deseados de los PCs no son apropiados para utilizar con tecnología de PCD y psoralenos; de este modo, se debe descubrir otro abordaje. Una importante consideración en el desarrollo de un dispositivo apropiado es la necesidad de evitar alteraciones perjudiciales en el propio producto sanguíneo cuando está siendo procesado por el dispositivo. [J.M. Courtney et al., Artificial Organs 17(4):260 (1993)] Cuando hay involucradas plaquetas, es de particular importancia la retención de la función plaquetaria y la integridad plaquetaria. Para este fin, el recuento plaquetario e indicadores de la función plaquetaria tales como el pH, el contenido de ATP y la activación por GMP-140 no deben ser alterados desfavorablemente por el dispositivo. Además, un dispositivo aceptable no debe afectar considerablemente la cascada de coagulación. Finalmente, el psoraleno debe ser compatible con el dispositivo utilizado para eliminar los psoralenos y debe tener una capacidad adsortiva suficiente para lograr que el psoraleno deseado sea eliminable con un dispositivo de tamaño razonable.

Este aspecto de la presente invención se refiere a dispositivos utilizados para eliminar sustancias de productos sanguíneos y particularmente a dispositivos utilizados para adsorber psoralenos y fotoproductos de psoralenos de mezclas de plaquetas sin afectar desfavorablemente a las plaquetas. De aquí en adelante, tales dispositivos pueden denominarse indistintamente "dispositivos para extracción de impurezas" o "dispositivos de captura", mientras que el proceso de eliminación puede denominarse "proceso para extracción de impurezas" o "proceso de captura".

La descripción de los dispositivos que sigue está dividida en las siguientes partes: A) Reparto de Psoraleno en el Concentrado de Plaquetas; B) Descripción y Selección de Adsorbentes; C) Estudios de Adsorción; D) Dispositivos de Eliminación de Psoralenos; y E) Adsorción de Psoraleno del Plasma.

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A. Reparto de Psoraleno en el Concentrado de Plaquetas

El nuevo psoraleno S-59 es un buen candidato para utilizar en el proceso de tratamiento fotoquímico (PCT). El S-59, 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno, posee la siguiente estructura química:

13

El proceso expuesto en la descripción que sigue incluye la adición de S-59 (concentración final, 150 \muM) a plaquetas suspendidas en 35% de plasma/65% de medio sintético (PAS III) seguida por iluminación con UVA. De aquí en adelante, la referencia a PC al 35% se refiere a plaquetas suspendidas en 35% de plasma/65% de PAS III. Un reparto análogo puede resultar con psoralenos estructuralmente similares y diferentes formulaciones de plaquetas. Al diseñar un dispositivo de "captura" o "extracción de impurezas" para la eliminación de psoralenos, una importante consideración es la identificación y cuantificación de los niveles residuales de fotoproductos de bajo peso molecular. Varias propiedades de la mezcla de plaquetas (por ejemplo, contenido de lípidos, contenido de plaquetas, contenido de hemoglobina/RBC) pueden afectar el reparto final del psoraleno y la cantidad de cada fotoproducto que debe ser eliminada durante el proceso de captura o extracción de impurezas.

"Fotoproducto" se define como un producto de la reacción de un compuesto y longitudes de onda activantes de radiación electromagnética. El "fotoproducto" se entiende mejor considerando las posibles reacciones de un compuesto fotorreactivo cuando se expone a longitudes de onda activantes de radiación electromagnética. Si bien no está limitada a ningún mecanismo preciso, se cree que la reacción del compuesto fotorreactivo en su estado fundamental ("C") con longitudes de onda activantes de radiación electromagnética crea una especie excitada de corta vida ("C*"):

C \rightarrow C*

Lo que sucede después es mayormente función de qué reactivos potenciales están disponibles para las especies excitadas. Debido a que tiene corta vida, se cree que una reacción de esta especie con un ácido nucleico ("NA") sólo es posible si el ácido nucleico está presente en el momento en el que se genera la especie excitada. La reacción se puede describir de la siguiente manera:

C* + NA \rightarrow NA:C

Con esta reacción descrita, ahora se puede considerar la situación en la que el ácido nucleico no está disponible para unirse en el momento que el compuesto se expone a las longitudes de onda activantes de radiación electromagnética. Debido a que la especie excitada tiene corta vida y no posee ningún ácido nucleico con el que reaccionar, la especie excitada puede simplemente volver a su estado fundamental:

C* \rightarrow C

Por otra parte, la especie excitada puede reaccionar consigo misma (es decir, un estado fundamental o especie excitada) para crear un complejo de estado fundamental ("C:C"). El producto de estas autorreacciones en las que dos compuestos reaccionan se denomina "fotodímero" o simplemente "dímero". Las autoreacciones, sin embargo, no se limitan a dos compuestos; se puede formar una variedad de multímeros (trímeros, etc.).

La especie excitada no se limita a reaccionar consigo misma. Esta puede reaccionar con su medio ambiente, tal como elementos del disolvente ("E") (por ejemplo iones, gases, etc.) para producir otros productos:

C* + E \rightarrow E:C

Además, simplemente puede reordenarse ("isomerizarse")a un derivado de estado fundamental ("I"):

C* \rightarrow I

Finalmente, la especie excitada puede sufrir otras reacciones además de las descritas aquí.

La presente invención y el entendimiento de "fotoproducto" no depende de cuál de estas reacciones (si las hay) realmente sucede. La presente invención simplemente describe métodos y dispositivos para la eliminación de fotoproductos después de la fotoactivación de productos sanguíneos.

Tras la adición de S-59 a la plaquetas, el S-59 se reparte rápidamente, estableciéndose un equilibrio entre el S-59 en plasma y S-59 dentro de las plaquetas. Aproximadamente el 25% del S-59 inicial se reparte en las plaquetas, dependiendo el porcentaje del recuento de plaquetas y de la viabilidad de las plaquetas (es decir, las plaquetas muertas no captan el psoraleno). Además, se repartirán porcentajes más altos de S-59 en las plaquetas si se producen largos períodos de incubación (por ejemplo, mayores que 60 minutos) entre la adición de S-59 y la iluminación con UVA. La cantidad de S-59 que se reparte en las plaquetas finalmente determina cuánto S-59 queda asociado a las plaquetas, cuánto está asociado a las macromoléculas plasmáticas, y cuánto permanece como fotoproducto libre.

Durante el proceso de iluminación con UVA, el S-59 sufre una reacción fotoquímica para formar varios fotoproductos de bajo peso molecular además de asociarse a las macromoléculas tanto en la fracción de plaquetas como en la plasmática. Aproximadamente el 20% de la concentración 150 \muM original de S-59 se asocia a las plaquetas: 8-9% como S-59 y fotoproductos de bajo peso molecular y 11-12% como S-59 asociado a macromoléculas. El restante aproximadamente 80% de S-59 permanece en el plasma, aproximadamente el 65% como S-59 y fotoproductos de bajo peso molecular y aproximadamente el 15% asociado a macromoléculas plasmáticas. Los fotoproductos de bajo peso molecular que permanecen en las plaquetas y plasma totalizan aproximadamente el 73% de la concentración 150 \muM original de S-59. Esta fracción de fotoproductos de bajo peso molecular se elimina durante el proceso de extracción de impurezas, y su eliminación puede monitorearse tanto por HPLC como por medición de radioactividad utilizando S-59 marcado con ^{3}H. El esquema A representa diagramáticamente la distribución de S-59 en las plaquetas suspendidas en 35% de plasma/65% de PAS III después de la iluminación con UVA.

El S-59 que no se puede eliminar mediante el proceso de captura/extracción de impurezas también puede monitorearse utilizando S-59 marcado con ^{3}H. Esta fracción no eliminable, que representa el 27% de la concentración 150 \muM original de S-59, se asocia covalentemente a las macromoléculas (por ejemplo, lípidos) en las fracciones de plaquetas y plasma.

B. Descripción y selección de adsorbentes

La eliminación de psoralenos y sus fotoproductos de bajo peso molecular asociados de las mezclas de plaquetas puede visualizarse como una situación que es similar al tratamiento de pacientes que sufren de sobredosis con fármacos. Los pacientes que sufren de intoxicación con fármacos han sido tratados exitosamente utilizando columnas que contienen adsorbentes sólidos para eliminar fármacos de bajo peso molecular de la sangre. El tratamiento se logra extrayendo la sangre del paciente a través de un circuito extracorpóreo y pasando el plasma (perfusión de plasma) o sangre entera (hemoperfusión) a través de una columna adsorbente antes de devolver la sangre al paciente. La mayor parte de la literatura relacionada con la hemoperfusión se ha focalizado en dos grupos de resinas de adsorción: (i) las amberlitas, que son resinas poliméricas [J. L. Rosenbaum et al., Archives of Internal Medicine 136:263-66 (1976); R.. Hughes et al., Artificial Organs 3(1):23-26 (1979)] y (ii) el carbón activado, que usualmente está recubierto con un polímero hemocompatible [D. Webb, British J. of Hospital Medicine 49(7):493-96 (1993)].

Las resinas adsorbentes apropiadas para la eliminación de fotoproductos de psoralenos de las mezclas de plaquetas deben poseer varias propiedades importantes. El adsorbente debe tener calidad apropiada para aplicaciones farmacéuticas, incluyendo la caracterización completa de estabilidad química y física, lixiviables, tamaño de partícula y superficie. El adsorbente también debe ser esterilizable por autoclave o irradiación gamma. Finalmente, el adsorbente debe ser hemocompatible con respecto a la función plaquetaria y/o factores de coagulación plasmática. También debe observarse que las resinas adsorbentes contempladas para su uso en la presente invención pueden ser efectivas en la eliminación de colesterol, lípidos y ácidos grasos, citoquinas y endotoxinas.

La Tabla A resume algunas de las resinas elegidas para el proceso de selección inicial. Además de la descripción de la resina según se presenta en la Tabla A, se eligieron específicamente resinas de bajo costo. Esta lista no es completa, también otras resinas pueden ser eficaces. Para destacar: se han examinado recientemente resinas de cromatografía tradicionales como potenciales adsorbentes de hemoperfusión para varias indicaciones médicas diferentes. Los adsorbentes C-4, C-8, y C-18 se incluyeron en la selección debido a su utilidad previa. [DJ. Hei et aL, "Removal of Cytokines from HSA-Containing Solutions by Adsorption onto Silica", Biotechnology and Bioengineering 44:1023-30 (1994); S. Murugavel, "In Vitro Studies of the Efficacy of Reversed Phase Silica Gel as a Sorbent for Hemo- and Plasmaperfusion", Clinical Toxicology 30(1)69-82 (1992)].

TABLA A

14

Tal como se discutirá en detalle más abajo, las siguientes resinas dieron resultados superiores sobre la base del procedimiento de selección inicial: Amberlite XAD-4^{TM}, Amberlite XAD-16^{TM}, Amberchrom CG-161cd^{TM}, Hemosorba CH-350^{TM} y Bio-Beads SM-4 (300-1180 \mum de diámetro).

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Resinas amberlite

Los adsorbentes amberlite se han utilizado para tratar a pacientes con intoxicación aguda con fármacos [J.L. Rosenbaum et al., Archives of Internal Medicine 136:263-66 (1976)] e insuficiencia hepática [R. Hughes et al., Artificial Organs 3(1):23-26 (I979)]. Además, los adsorbentes amberlite actualmente se utilizan en una variedad de aplicaciones en la industria farmacéutica. Supelco, Inc. (Bellefonte, PA) actualmente procesa resinas Amberlite XAD-4^{TM} y XAD-16^{TM} fabricadas por Rohm and Haas (Chauny, Francia) específicamente para aplicaciones farmacéuticas. Supelco, Inc. trata los adsorbentes para eliminar potenciales compuestos lixiviables (por ejemplo, divinilbenceno, DVB) y para restringir las partículas hasta un diámetro mínimo. El adsorbente final se certifica estéril (USP XXI), libre de pirógenos (LAL) y libre de compuestos lixiviables detectables (DVB y componentes orgánicos totales).

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Resinas de carbón

Los dispositivos de hemoperfusión que utilizan resinas de carbón actualmente son fabricados por varias compañías japonesas y se comercializan en los Estados Unidos y Europa. Dos dispositivos de hemoperfusión fabricados por Asahi Medical Co. (Tokio, Japón) que contienen carbón activado actualmente poseen una presentación de 510(k) ante la FDA para el tratamiento de sobredosis de fármacos y coma hepático. El adsorbente del dispositivo de hemoperfusión Hemosorba CH-350 es una partícula grande, muy durable, que está diseñada específicamente para la eliminación de fármacos y toxinas de bajo peso molecular de fluidos que contienen células tales como PCs. Los adsorbentes de carbón para hemoperfusión típicamente se fabrican a partir de brea de petróleo y se recubren con un polímero hemocompatible tal como poli(HEMA) (metacrilato de hidroxietilo); el recubrimiento con polímero aumenta la hemocompatibilidad y reduce el riesgo de generación de pequeñas partículas debido a la rotura mecánica.

Los dispositivos de hemoperfusión que utilizan resinas de carbón no se utilizan muy frecuentemente en Estados Unidos por varias razones. En primer lugar, en muchas circunstancias existen mejores métodos de tratamiento alternativos tales como la hemodiálisis. En segundo lugar, algunas formas de intoxicación y envenenamiento con fármacos no pueden someterse a hemoperfusión debido a un fuerte reparto de las toxinas en compartimentos particulares del cuerpo (por ejemplo, tejido, pulmones, etc.). Sin embargo, la hemoperfusión aún se recomendada en ciertas situaciones clínicas tales como sobredosis de teofilina. [D. Webb, British J. of Hospital Medicine 49(7):493-96 (1993)].

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C. Estudios de adsorción Adsorción en equilibrio

El método más fácil para evaluar los potenciales adsorbentes para la eliminación de S-59 implica examinar la adsorción en equilibrio de S-59 del PC. El uso de S-59 radiomarcado en los experimentos de adsorción permitió que se utilicen las mediciones de la radioactividad residual como indicador del S-59 remanente después de la adsorción. Para comparar los diversos adsorbentes candidatos, se añadió aproximadamente 0,1 g de cada adsorbente a 3,0 ml de PC que contenía ^{3}H-S-59 150 \muM (no iluminado). Las muestras se incubaron en tubos sellados sobre un agitador de plaquetas rotativo durante 24 horas a temperatura ambiente. Las mediciones cinéticas indicaron que el equilibrio completo se había logrado después de aproximadamente 6 horas de incubación por lotes. Después de la incubación, se sacó una muestra de PC de cada tubo y se determinó el nivel de radioactividad remanente para cada adsorbente.

La Tabla B muestra, entre otras cosas, los niveles residuales de S-59 y de este modo proporciona un buen indicador de la eficacia relativa de cada adsorbente. A fin de asegurar que el equilibrio se había alcanzado, estos niveles residuales se determinaron después de un período de incubación de 24 horas.

Se construyeron isotermas de adsorción para cada adsorbente, y se determinaron las constantes de adsorción en equilibrio (K) a partir de la pendiente de la isoterma (las constantes de adsorción se detallan en la tercera columna de la Tabla B). En la cuarta columna de la Tabla B, se determinó el costo total de la resina (\textdollar/dispositivo) para la reducción de los niveles de S-59 de 30 \muM (20% de 150 \muM) a 5 \muM. En la quinta (última) columna de la Tabla B, se determinó el costo total de ciertas resinas (\textdollar/dispositivo) para la reducción de los niveles de S-59 de 30 \muM a 1 \muM. Se debe observar que la iluminación de la mezcla de plaquetas reducirá el nivel de S-59 de 150 \muM a 30 \muM debido a la fotodegradación. El costo para Hemosorba CH-350 se estimó (\textdollar350 para un dispositivo de adsorción único que contenía 140 g de adsorbente). Finalmente, El "ND" indica que esos valores no se determinaron.

TABLA B

16

Los ensayos realizados incluyeron el análisis de varias resinas de fase reversa (es decir, C-18 de varios fabricantes y C-4 y C-5 de Baker) que se utilizan típicamente en Extracción en Fase Sólida (SPE) de fármacos de la sangre. Aunque varias resinas de fase reversa mostraron buena adsorción, estas resinas sufren problemas relacionados con la humectación de las resinas con soluciones acuosas. Los adsorbentes de fase reversa deben prehumectarse con etanol suspendiéndolos en etanol, centrifugando y decantando el etanol, antes de añadir soluciones acuosas. Los adsorbentes de fase reversa que no se prehumectaron en etanol tendieron a agrumarse y adherirse en los laterales de los tubos, dando como resultado una distribución y contacto desigual. Además de los problemas con la humectación, los medios de fase reversa tienden a ser más costosos que otros medios y usualmente sólo son suministrados en tamaños pequeños de partícula (es decir, diámetros menores que 50 \mum). Como resultado, no se prefieren ni las resinas de fase reversa que incluyen C-4, C-8 y C-18 ni otras resinas que no se humedecen fácilmente con soluciones acuosas, tales como las resinas Amberchrom (Tabla B) y Waters Porapak RDX^{TM} (Waters, Milford, MA) (no enumeradas en la Tabla B).

El examen de los datos relacionados con las amberlites en la Tabla B revela que se prefieren Amberlite XAD-4^{TM} y Amberlite XAD-16^{TM}. En particular, los niveles residuales de S-59 son mucho menores (una diferencia de más de tres veces) para esas dos amberlites que para otras amberlites (es decir, Amberlite XAD-2^{TM} y Amberlite XAD-7^{TM}).

También se ensayaron varios carbones activados (no detallados en la Tabla B). Los carbones activados estándar no eran mecánicamente estables y tendieron a romperse en partículas muy finas. Las muestras tomadas durante los estudios de adsorción a menudo contenían altos niveles de partículas finas de carbón (finas partículas de adsorbente) que eran imposibles de separar de las plaquetas. Los carbones activados producidos específicamente para la hemoperfusión (por ejemplo, Hemosorba CH-350; Asahi; incluido en la Tabla B) están hechos de brea de petróleo que produce cuentas de carbón muy duras y durables. Además, tal como se observó previamente, los carbones activados que se desarrollan para la hemoperfusión típicamente se recubren con un polímero que aumenta la hemocompatibilidad y reduce el riesgo de generación de pequeñas partículas debido a la ruptura mecánica.

La Tabla B resume otros datos de adsorción en equilibrio además de los datos relacionados con los niveles residuales de S-59 para cada una de las resinas. Estos datos pueden utilizarse para estimar la capacidad de equilibrio de la resina a la concentración final deseada del S-59 residual. Si la concentración inicial de S-59 es 150 \muM y se establece un objetivo de eliminación mayor que 99% del S-59 inicial, la concentración final de S-59 es aproximadamente 1 \muM. La capacidad de cada resina puede estimarse suponiendo una isoterma lineal (Langmuir, baja concentración) y utilizando la siguiente ecuación:

(Ecuación 1)q = KC_{f0}

en la que q (\mumol de S-59/g de resina) es la capacidad de la resina, C_{f} (\muM) es la concentración de la solución de equilibrio final de S-59, y K (L/g) es la constante de adsorción, que es una propiedad de la resina. Pueden utilizarse datos similares a los que se muestran en la segunda columna de la Tabla B para estimar un valor para K. La capacidad de la resina (q) puede entonces estimarse utilizando el valor calculado para K y el objetivo de concentración final de 1 \muM S-59 para C_{f}.

Después del cálculo de la capacidad de una resina, puede estimarse la cantidad de resina requerida para tratar un volumen dado de PC a partir de la siguiente ecuación:

(Ecuación 2)M = V(C_{0}-C_{f})/q

en la que M (g) es la masa de adsorbente, V (L) es el volumen de la solución, C_{0} es la concentración inicial de S-59, C_{f} (\muM) es la concentración final de S-59 (1 \muM a los fines de este cálculo), y q (\mumol de S-59/g de resina) es la capacidad de la resina definida por la Ecuación 1.

Para una PC típica de 35% (es decir, 35% de plasma/65% de PAS III), aproximadamente 20% de la concentración 150 \muM original de S-59 permanece después de la iluminación; por ello, C_{0} puede estimarse en aproximadamente 30 \muM. El volumen de PC (V) que se trata es 300 ml. Por ello, se puede calcular la masa de adsorbente, M, que se requiere para reducir la concentración de S-59 de C_{0} a C_{f} para cada resina que posee una capacidad q.

La concentración final de solución en equilibrio, C_{f}, es un importante parámetro ya que determina tanto la capacidad de la resina, q, como la cantidad total de S-59 que debe eliminarse. La combinación de la Ecuación 1 y la Ecuación 2 produce la siguiente relación:

(Ecuación 3)M = (V/K)[(C_{0}/C_{f})-1)

Obsérvese que, para valores bajos de C_{f}, la masa requerida de resina, M, es inversamente proporcional a C_{f}. El comportamiento asintótico de la masa de adsorbente con respecto a C_{f} se expone en el Esquema B. La Ecuación 3 se utilizó para derivar las curvas presentadas en el Esquema B, y los cálculos se basaron en una concentración inicial, C_{0}, de 30 \muM y un volumen, V, de 300 ml.

Cinética de adsorción

Tal como se discutirá en detalle más abajo, dos métodos potenciales para poner en contacto el adsorbente seleccionado con el PC incluyen el uso de un dispositivo de flujo y el uso de un dispositivo por lotes. La cinética para la adsorción del psoraleno del PC o plasma es potencialmente uno de los factores más importantes para determinar la eficacia de un dispositivo para extracción de impurezas de flujo (discutido en detalle más abajo). El equilibrio incompleto entre el psoraleno libre y el adsorbente sólido durante el uso de un dispositivo de flujo podría resultar en incrementos considerables en la cantidad de adsorbente requerida para lograr un nivel dado de psoraleno residual.

Las velocidades de los procesos de adsorción a menudo están limitadas por los procesos de transferencia de masa que involucran difusión del adsorbato a la superficie del adsorbente. La adsorción de un compuesto de bajo peso molecular tal como S-59 es típicamente un proceso rápido debido a la difusividad relativamente alta de las moléculas pequeñas. Sin embargo, la interacción de S-59 con células y/o moléculas plasmáticas podría dar lugar a una cinética de adsorción más lenta si las velocidades de adsorción están limitadas por un proceso diferente a la difusión.

D. Dispositivos de eliminación de psoralenos Generalidades

Se describen dos tipos netamente diferentes de dispositivos para la eliminación de psoralenos: dispositivos de flujo y dispositivos por lotes. Los dispositivos de flujo implican la eliminación de psoralenos perfundiendo el PC a través de una columna adsorbente posterior a la iluminación o previo a la transfusión en métodos clínicos. A la inversa, los dispositivos por lotes suponen o bien añadir un adsorbente directamente a la bolsa de plaquetas después de la iluminación o transferir las plaquetas a una bolsa que contiene el adsorbente después de la iluminación; las plaquetas después se agitan durante un período de tiempo especificado. La presente invención proporciona un dispositivo por lotes.

Según lo expuesto más arriba, aproximadamente el 73% de la concentración 150 \muM original de S-59 está presente como S-59 y fotoproductos de bajo peso molecular. Aproximadamente el 20-30% del S-59 original permanece mientras que el otro 40-50% representa los productos de la fotorreacción de S-59. Los estudios que utilizan dispositivos por lotes han indicado que puede adsorberse más del 99% del S-59 y fotoproductos de bajo peso molecular de los PCs utilizando adsorbentes apropiados. La selección de un dispositivo de eliminación de flujo o por lotes debe permitir alcanzar niveles similares de eliminación.

Dispositivos de flujo

Según lo expuesto más arriba, describimos que una preparación de plaquetas puede perfundirse a través del dispositivo de flujo después de la iluminación de las plaquetas con UVA o antes de la transfusión de la preparación al receptor. Típicamente, el dispositivo de flujo supone una columna en línea de 5-10 ml de capacidad que se carga con adsorbente. El cuerpo del dispositivo debe fabricarse con un plástico hemocompatible (policarbonato, polipropileno) que sea lo suficientemente durable para proteger a la resina contra la ruptura durante el manipuleo. El dispositivo posee un adaptador de flujo, preferentemente un filtro de malla de nylon de 50-100 \mum, que debe evitar que las partículas finas (partículas finas del adsorbente) lo atraviesen permitiendo al mismo tiempo que las células pasen con una mínima caída de presión. En la mayoría de las realizaciones, el dispositivo también supone una bolsa adicional para almacenar la preparación plaquetaria después que ha perfundido a través de la columna y un filtro en línea para proteger contra la transfusión de diminutas partículas del adsorbente.

En términos de operación, el dispositivo de flujo debe funcionar bajo flujo por gravedad; el proceso de eliminación debe completarse dentro de una ventana de tiempo definida por la cantidad mínima de tiempo permitida para tratar una preparación plaquetaria, 30 minutos a 3 horas y preferentemente 1 a 2 horas, y la cantidad mínima de tiempo requerida para el análisis de virus de la preparación plaquetaria, aproximadamente 12 horas. La pérdida de plaquetas y la pérdida de volumen deben ser despreciables.

Varias consideraciones son relevantes para el proceso de fabricación. Primero, el volumen del lecho debe considerarse en vista de la cantidad de fármaco que se espera eliminar. Se requiere un volumen de lecho mayor para la eliminación de cantidades más grandes de fármaco. Segundo, el diámetro del lecho está establecido por la caída de presión para un volumen de lecho dado; el diámetro también puede tener un efecto sobre la eliminación de psoraleno a volumen de lecho constante. Tercero, los dispositivos deben cargarse con una columna de adsorbente húmedo y deben cebarse en una solución aceptable (por ejemplo, un medio sintético tal como PAS III) antes del ensamblaje y esterilización. Cuarto, el dispositivo debe estar conectado a bolsas para la recolección/tratamiento y almacenamiento de plaquetas, y este último ensamblaje debe esterilizase y envasarse con posterioridad. El cebado del dispositivo entre la bolsa de plaquetas y la columna debe realizarse con cuidado; la introducción de una gran burbuja de aire podría causar la canalización en el dispositivo y la eliminación incompleta del psoraleno.

Supelco, Inc., actualmente fabrica dispositivos para gran escala (250-1500 ml, Porozorb Cartridges^{TM}) y pequeña escala (5 ml, Rezorian Cartridges^{TM}) que contienen resinas Amberlite^{TM} y Amberchrom^{TM}. Estos dispositivos se comercializan para la eliminación de pequeñas moléculas tales como bromuro de etidio, detergentes, antibióticos, etc., de las soluciones de proteínas. Además, Waters (Milford, MA) actualmente fabrica dispositivos de adsorción para pequeña escala (1 ml) que se clasifican como Dispositivos Médicos de Tipo I.

En este punto, los experimentos y consideraciones de diseño que se han tratado se basan en datos de adsorción en equilibro (por lotes). En un dispositivo de adsorción de flujo, varios factores pueden influir sobre la cantidad de adsorbente requerida, y de este modo sobre el diseño general del dispositivo. Primero, tal como se mencionó previamente, las limitaciones cinéticas en la adsorción pueden dar como resultado requerimientos aumentados para el adsorbente debido al equilibrio incompleto entre el fluido y el adsorbente. Sin embargo, las limitaciones cinéticas típicamente pueden contrarrestarse disminuyendo el caudal a través del dispositivo de adsorción para permitir el tiempo de contacto suficiente. Segundo, las dispersiones que resultan de imperfecciones en el flujo a través del dispositivo también pueden dar como resultado un requerimiento de mayor masa de adsorbente en los dispositivos de flujo. El diseño y fabricación apropiados del dispositivo minimizará los efectos de dispersión.

Se ha examinado el efecto del adsorbente y la geometría de la columna sobre los niveles residuales de psoraleno en los dispositivos de flujo. Los resultados para varias configuraciones de flujo, resumidas en la Tabla C, indican varios puntos claves. Primero, el incremento del diámetro del dispositivo de flujo a masa constante de resina dio como resultado un incremento en el nivel de S-59 residual en la unidad plaquetaria tratada. Segundo, columnas más largas con un diámetro estrecho darán como resultado niveles más bajos de S-59 residual, pero también puede dar como resultado caídas de presión inaceptablemente elevadas para el flujo por gravedad. Tercero, Amberlite XAD-4^{TM} no resultó tan efectiva como Amberlite XAD-16^{TM} en la eliminación de S-59; el diámetro de poros más pequeño en Amberlite XAD-4^{TM} puede producir una cinética de adsorción sustancialmente más lenta.

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TABLA C

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La Tabla C indica que duplicar la masa de Amberlite XAD-4^{TM} dio como resultado una ganancia desproporcionadamente pequeña en la eliminación de S-59 en un dispositivo de flujo. Es más, los datos sugieren que el factor limitante en la eliminación de S-59 de las soluciones que contienen plaquetas es el transporte de S-59 desde el interior de las plaquetas. Las posibles soluciones para las limitaciones cinéticas de los dispositivos de flujo incluyen incrementar el tiempo de residencia de las plaquetas utilizando un dispositivo de flujo más grande y disminuir el caudal.

Dispositivos por lotes

Según lo citado más arriba, una alternativa al dispositivo de flujo es la adsorción por lotes. La adsorción por lotes implica colocar el adsorbente directamente en la bolsa de plaquetas después de la iluminación o transferir las plaquetas a una bolsa que contiene el adsorbente después de la iluminación. Las plaquetas después se agitan durante un período de tiempo especificado. A partir de ese momento, como precaución de seguridad adicional, las plaquetas pueden transferirse a otra bolsa a través de un filtro/tamiz en línea para eliminar cualquier partícula de resina sólida.

En ciertas realizaciones, las plaquetas se tratan directamente con el adsorbente (es decir, el adsorbente no está contenido dentro de ningún tipo de envase). En dichas realizaciones, el dispositivo por lotes contiene un dispositivo de eliminación, tal como un adaptador de flujo u otro dispositivo de filtración, con un filtro de malla de nylon de 50-100 \mum para eliminar el adsorbente de las plaquetas después del tratamiento. En otras realizaciones, el adsorbente está contenido dentro de un recinto/saco de malla que está dispuesto dentro de la propia bolsa de plaquetas. A los fines experimentales, el recinto de malla se colocó dentro de la bolsa de plaquetas cortando una ranura a lo largo del lateral de la bolsa de plaquetas, insertando el recinto de malla a través de la ranura, sellando después con calor la bolsa de plaquetas. Sin embargo, en la fabricación a gran escala el recinto de malla puede o no fijarse a la bolsa de plaquetas. Este ensamblaje completo puede esterilizarse por calor o irradiación gamma.

Tal como fue el caso con los dispositivos de flujo, en la mayoría de las realizaciones el dispositivo por lotes también supone un filtro en línea para proteger contra la transfusión de partículas finas de adsorbente y una bolsa adicional para almacenar las plaquetas tratadas. En otra realización, el adsorbente se carga en un compartimiento externo que ofrece protección de la resina durante el manipuleo. Este compartimento externo podría servir como envase para el adsorbente estéril y un dispositivo para eliminar el adsorbente después del tratamiento. El compartimento externo podría parecerse a una cámara de goteo con un cerramiento frágil entre la bolsa y el compartimento y una malla de filtro apropiada para retener el adsorbente en la salida. Después de la iluminación, los materiales frágiles se romperían y el adsorbente se transportaría a la bolsa que contiene las plaquetas tratadas. Después de finalizada la eliminación, el producto sanguíneo se pasa a través de la cámara externa donde se elimina el adsorbente. Existen varios fabricantes de materiales de malla apropiados para utilizar con la presente invención. Por ejemplo, Saati Corp. (Stamford, CT) y Tetko, Inc. (Buffalo, NY) fabrican una variedad de materiales de malla aptos para uso médico.

El Esquema C representa dos posibles configuraciones para un RD por lotes. En la configuración A (es decir, un diseño de dos bolsas), las plaquetas se transfieren a una segunda bolsa después de la iluminación, conteniendo la segunda bolsa el adsorbente en un recinto/saco de malla. Las plaquetas podrían transferirse de vuelta a la bolsa original si se desea un tiempo de contacto limitado. En la configuración B (es decir, un diseño de bolsa única), la división externa se separa después de la iluminación, permitiendo de ese modo que las plaquetas se mezclen libremente con la bolsa/saco del adsorbente. Por supuesto, son posibles otras configuraciones para un RD por lotes.

Se deben considerar varios factores al elegir un RD por lotes. Primero, el tiempo extendido de contacto con el adsorbente podría incrementar los niveles de compuestos lixiviables del adsorbente presente en la PC final. Segundo, los RDs por lotes generalmente poseen un mayor tiempo de contacto con el producto sanguíneo que los dispositivos de flujo. Como resultado, es especialmente importante monitorear la hemocompatibilidad (es decir, la función plaquetaria y la pérdida excesiva de factores de coagulación). Tercero, los RDs por lotes incluyen un dispositivo adicional para la agitación (es decir, un agitador) de las plaquetas/plasma durante le proceso de adsorción. El dispositivo utilizado debe tener dispositivos de seguridad para asegurar que el tiempo de adsorción no se acorte por el mal funcionamiento del dispositivo.

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Estudios de hemocompatibilidad

Se realizaron estudios de la función plaquetaria tanto con dispositivos de flujo como dispositivos por lotes (Ejemplo 25 y Ejemplo 29, respectivamente). Los resultados indicaron buena retención de la función plaquetaria para varios adsorbentes particulares. Los problemas asociados a los dispositivos de flujo principalmente suponen la eliminación de grumos de plaquetas que pueden formarse en el dispositivo; sin embargo, la eliminación de grumos posiblemente no cree un problema significativo debido a que los grumos típicamente se eliminarían mediante filtros para agregados antes de la transfusión. Los estudios de la función plaquetaria que involucran dispositivos por lotes sugirieron que Amberlite XAD-4^{TM} y Amberlite XAD-16^{TM} poseen características de hemocompatibilidad satisfactorias.

Debe observarse que utilizar un dispositivo de flujo no necesariamente producirá resultados análogos a los obtenidos utilizando un dispositivo por lotes aun cuando se utilice el mismo adsorbente. Aunque los tiempos de contacto entre plaquetas y adsorbente serían menores en un dispositivo de flujo, otros factores tales como estrés mecánico y contacto con otros componentes de columna podrían afectar negativamente las plaquetas.

Se realizaron estudios de coagulación sobre plasma al 100%. Los mejores resultados (Ejemplo 30, más abajo) se obtuvieron con Amberlite XAD-4^{TM} y Hemosorba CH-350^{TM}, donde ambos tuvieron poco efecto sobre cualquiera de los parámetros ensayados. Los experimentos relacionados con los ensayos del factor de coagulación se realizaron en una modalidad por lotes con una mayor relación de adsorbente a plasma que la que se utiliza típicamente en los experimentos de adsorción. Además, un dispositivo de flujo debe dar lugar a tiempos de contacto más cortos con recuperación concomitantemente más alta de las proteínas involucradas en la formación de coágulos sanguíneos.

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Comparación de los diseños de flujo y por lotes

Los formatos de flujo y por lotes discutidos más arriba son similares en el sentido que el contacto directo entre el producto sanguíneo y el adsorbente ocurre durante la eliminación del psoraleno. Sin embargo, los dos tipos de dispositivos poseen varias diferencias importantes. Primero, mientras que la adsorción por lotes es capaz de reducir los niveles residuales de psoraleno y fotoproductos hasta < 1%, son más probables niveles de aproximadamente 5% con la adsorción de flujo. Según lo observado previamente, las limitaciones cinéticas debidas al tiempo de contacto reducido para el transporte del psoraleno desde las plaquetas puede impedir la completa eliminación del psoraleno residual utilizando un formato de flujo; a la inversa, el tiempo extendido de contacto de adsorción por lotes es más efectivo en la eliminación.

Segundo, el tiempo extendido de contacto de los formatos por lotes podría incrementar los niveles de compuestos lixiviables presentes en la mezcla final de plaquetas. Sin embargo, Supelco, Inc., actualmente procesa adsorbentes Amberlite^{TM} que efectivamente reducen los niveles de compuestos lixiviables a niveles no detectables. Tercero, con ambos tipos de dispositivos existe la posibilidad de que partículas finas de adsorbente podrían finalmente transfundirse al recipiente del producto sanguíneo. Aunque un dispositivo de flujo proporciona una configuración más estable para la resina, los adaptadores de flujo para un formato de flujo requerirían un tamaño mínimo de malla de aproximadamente 60 \mum para impedir la coagulación por grumos de plaquetas. Sin embargo, un dispositivo por lotes podría utilizar un tamaño de malla más pequeño (por ejemplo, aproximadamente 10 \mum) debido a que las plaquetas no necesitan fluir a través de la propia malla. La capacidad de utilizar una malla más pequeña de este modo puede reducir la posibilidad de transfundir partículas finas en un formato por lotes.

Sobre la base de todos los factores discutidos más arriba, un abordaje por lotes es preferible a un diseño de flujo. En los estudios realizados relativos a la adsorción por lotes, Amberlite XAD-4^{TM},Amberlite XAD-16 y Hemosorba CH-350^{TM} fueron los adsorbentes que exhibieron altas capacidades de adsorción de S-59 y buenas características de hemocompatibilidad.

E. Adsorción de psoraleno del plasma Generalidades

En este punto, la discusión sobre las RDs se ha centrado en la eliminación de psoraleno de los PCs, específicamente plaquetas en 35% de plasma/65% de PAS III. Sin embargo, la presente invención también contempla la eliminación de psoraleno de otros productos sanguíneos, tales como plasma y suero. Esta sección tratará la eliminación de psoraleno del plasma.

En general, se aplican los mismos principios a la eliminación de psoraleno del plasma que se aplican para eliminar el psoraleno de los PCs. De este modo, pueden utilizarse tanto los formatos de flujo como los formatos por lotes para eliminar psoraleno del plasma fototratado. El tiempo de residencia no es un factor importante con el plasma (o suero) debido a que no existen plaquetas de las que se deba eliminar el psoraleno. La principal limitación en la eliminación de S-59 del plasma es la competencia por parte de las proteínas plasmáticas, principalmente la albúmina sérica, por la unión del S-59 libre y el fotoproducto.

Tal como ocurrió anteriormente para los PCs, se investigaron los potenciales adsorbentes para determinar su efectividad. La Tabla D enumera el costo y la capacidad de S-59 para varios adsorbentes. No se determinó el costo de Amberlite XAD-1600 (cuarta columna).

TABLA D

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Además, también se generaron y se presentan en el Ejemplo 30 datos de adsorción utilizando un dispositivo de flujo a dos caudales diferentes.

Valoraciones de factores de coagulación

El adsorbente utilizado para productos plasmáticos debe ser capaz de eliminar S-59 sin reducir considerablemente los niveles de proteínas importantes en la cascada de coagulación. Se analizó la selectividad de varias resinas para S-59 llevando a cabo experimentos de adsorción por lotes (Véase EL Ejemplo 31, abajo) y sometiendo el plasma tratado a ensayos de tiempo de coagulación y niveles de factores. Los adsorbentes utilizados fueron Amberlite XAD-4^{TM}, Amberlite XAD-16^{TM}, Hemosorba CH-350^{TM}, BioRad t-butil HIC^{TM} (Macro-Prep) y Sílice Davision (Grado 15).

Los experimentos relacionados con las valoraciones de los factores de coagulación se llevaron a cabo en una modalidad por lotes en una relación mayor de adsorbente a plasma que la típicamente utilizada en los experimentos de adsorción. Un dispositivo de adsorción de flujo debe dar como resultado tiempos de contacto más cortos con recuperación concomitantemente más elevada de las proteínas involucradas en la formación de coágulos sanguíneos.

VII. Desempeño y fabricación de un dispositivo de eliminación por lotes

Una de las realizaciones preferidas de la presente invención supone un dispositivo de eliminación por lotes. Un dispositivo de eliminación por lotes es preferible a un dispositivo de flujo para ciertos productos sanguíneos. Por ejemplo, el uso de un dispositivo por lotes con concentrados de plaquetas supera las limitaciones cinéticas de eliminar fotoproductos de psoralenos de las plaquetas. Similarmente, el plasma congelado fresco (FFP) también posee limitaciones cinéticas, por ejemplo la competencia por parte de la albúmina sérica y otras proteínas plasmáticas por la unión de S-59 libre y fotoproductos, que son superadas con un dispositivo por lotes.

Los términos "dispositivo de eliminación" y "RD" se refieren a una masa conocida de adsorbente apto para uso médico/farmacéutico (por ejemplo, cuentas de adsorbente polimérico) retenida en un saco/bolsa de malla (por ejemplo, malla de poliéster), un saco fabricado con una membrana permeable, un cartucho (por ejemplo, una columna en línea), u otro medio apropiado; la presente invención contempla el uso de un RD para la eliminación de psoralenos y fotoproductos de psoralenos. En términos generales, cuanto más largo es el tiempo de contacto con el RD, mayor es la eliminación del psoraleno y fotoproductos del psoraleno; sin embargo, limitaciones prácticas impuestas por los procedimientos de almacenamiento de sangre limitan el tiempo de contacto disponible.

En una realización preferida, el RD (es decir, el saco que contiene adsorbente) está contenido en un recipiente de almacenamiento de producto sanguíneo (por ejemplo, una bolsa de almacenamiento de plaquetas). La presente invención también contempla otras realizaciones, descritas en detalle más abajo, que utilizan adsorbente para la eliminación de S-59 y fotoproductos. Esta sección describe los requerimientos de desempeño para el RD por lotes, los adsorbentes particularmente apropiados para dicho RD, y el proceso global de fabricación de RD.

A. Requerimientos para un Dispositivo de Eliminación por Lotes

En una realización de la presente invención, el producto sanguíneo primero se trata con psoraleno y UVA en un recipiente de iluminación. Por ejemplo, puede añadirse S-59 (15,2 mg) a aproximadamente 4,0 x 10^{11} plaquetas suspendidas en 300 ml de 35% de plasma/65% de PAS III e iluminarse con UVA de longitud de onda larga de 3 J/cm^{2} (320-400 nm). Después de la iluminación hay S-59 residual; además, se cree que existen fotoproductos de bajo peso molecular. A partir de ese momento, el producto sanguíneo es transferido, por ejemplo, a un recipiente plástico PL 2410 modificado (Baxter) que contiene el RD y se incuba durante un período de tiempo especificado (por ejemplo, > 8 horas en un agitador de plaquetas); esta incubación permite que el psoraleno residual y los fotoproductos del psoraleno sean eliminados (es decir, reducción de S-59) hasta niveles suficientemente bajos de manera que el producto sanguíneo puede ser liberado para la transfusión a seres humanos. Después del período de incubación, el producto sanguíneo puede transferirse a otro recipiente de almacenamiento (por ejemplo, un recipiente plástico PL 2410; Baxter) durante, por ejemplo, hasta 5 días para plaquetas, en espera de transfusión. El Esquema D representa diagramáticamente el proceso de reducción de S-59 descrito más arriba.

En una realización alternativa, la iluminación con UVA y el tratamiento con RD ocurren en una única bolsa de producto sanguíneo. En esta realización, una división externa removible divide la bolsa de producto sanguíneo en dos compartimentos (véase el Esquema C, configuración B). Con referencia al Esquema C, configuración B, el producto sanguíneo es iluminado en el compartimiento inferior. Después de la iluminación, la división se retira y el producto sanguíneo iluminado se pone en contacto con el RD que está fijo dentro del compartimento superior. Después de la incubación, la bolsa de producto sanguíneo puede colgarse y la división puede reponerse, aislando de esta manera el producto sanguíneo del RD. Alternativamente, la bolsa puede soldarse (por ejemplo, sellarse con calor o soldarse por impulso) para aislar el producto sanguíneo del RD. La bolsa entera de producto sanguíneo (es decir, la bolsa incluyendo el producto sanguíneo tratado por RD e iluminado y el propio RD) después puede almacenarse en espera de transfusión.

Además de eliminar eficazmente S-59 y fotoproductos, el RD no debe afectar negativamente el desempeño in vivo del producto sanguíneo transfundido. Para los PCs, se ha informado que varios ensayos de función plaquetaria in vitro se correlacionan con la recuperación y supervivencia posterior a la transfusión in vivo, incluyendo pH, puntaje de morfología, cambio de forma de las plaquetas y respuesta al shock hipotónico. [S. Murphy et al., "In Vitro Assessment of the Quality of Stored Platelet Concentrates", Transfusion Med. Rev. VIII(I):29-36 (1994)]. Es preferible que el RD no posea un efecto adverso importante sobre la función plaquetaria.

En la Tabla AA que sigue, se enumeran ciertos requerimientos mínimos sugeridos para un RD por lotes. Se debe recalcar que estos requerimientos son simplemente preferidos; como tales, se debe entender que las modificaciones a los requerimientos están dentro del ámbito de la presente invención. Aunque estos requerimientos están específicamente dirigidos a un RD para la eliminación de S-59, muchos de los requerimientos son aplicables independientemente del psoraleno que se utilice.

TABLA AA

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B. Adsorbentes Particularmente apropiados para un dispositivo de eliminación

La presente invención utiliza una resina según lo definido en la Reivindicación 1.

Las secciones anteriores han presentado una perspectiva general de ciertos adsorbentes contemplados para su uso en la eliminación de fotoproductos de psoralenos de productos sanguíneos (véase, por ejemplo, la Tabla A). Existe una cantidad de adsorbentes poliméricos apropiados para el uso en un RD por lotes, incluyendo los fabricados por Dow Chemical Company (por ejemplo, Dowex® XUS-40323, XUS-43493 y XUS-40285), Mitsubishi Chemical (por ejemplo. Dialon® HP20), Purolite (por ejemplo, Hypersol-Macronet® Sorbent Resins MN-150 y MN-400) y Rohm and Haas (por ejemplo, Amberlite® XAD-2, XAD-4 y XAD-16). El adsorbente más preferido es Dowex® XUS-43493, un polímero inerte fabricado por Dow Chemical Company; Dowex XUS®-43493 es comercialmente conocido como Optipore® L493.

Los adsorbentes poliméricos más utilizados en la presente invención son resinas macroporosas no iónicas y macrorreticulares. El término "macroporosa" generalmente significa que el 20% o más de la resina está reticulada (el reticulado se trata en detalle más abajo). El término "macroporosa" se diferencia del término "macroporos"que significa que el diámetro de los poros es mayor que 500 \ring{A}. Finalmente, el término "macrorreticular" es un término relativo que significa que la estructura posee una alta porosidad física (es decir, está presente un gran número de poros).

Las resinas macroporosas y macrorreticulares no iónicas son especialmente aptas para la eliminación de fotoproductos de psoralenos de concentrados de plaquetas. La razón fundamental de por qué se prefiere Dowex® XUS-43493 macrorreticular y macroporosa no iónica es que además de la alta afinidad por S-59, posee propiedades humectantes superiores; tal como se discute con mayor detalle más abajo, la frase "propiedades humectantes superiores" significa que el adsorbente seco (es decir, esencialmente anhidro) no necesita ser humectado con un agente humectante (por ejemplo, etanol) antes de entrar en contacto con el PC iluminado para que el adsorbente elimine eficazmente el S-59 residual y los fotoproductos. Las cuentas de adsorbente de ese copolímero de estireno y divinilbenceno con puente metilénico tienen forma de partículas esféricas con un diámetro en el intervalo de aproximadamente 300 a 850 \mum. Dowex® XUS-43493 posee una superficie interna extremadamente alta (1100 m^{2}/g) y poros relativamente pequeños (46 \ring{A}) lo que la hace muy efectiva al eliminar moléculas hidrófobas pequeñas como S-59 y sus fotoproductos; si bien no se pretende que la presente invención se vea limitada por el mecanismo por el que se produce la eliminación, se cree que la interacción hidrófoba es el mecanismo fundamental de adsorción. Dowex® XUS-43493 es insoluble en ácidos y bases fuertes y en disolventes orgánicos. Su naturaleza porosa le confiere selectividad al proceso de adsorción permitiendo que las moléculas pequeñas accedan a una mayor proporción dla superficie con relación a las grandes moléculas (es decir, proteínas) y células. Purolite® MN-150 tiene muchas características similares a Dowex® XUS-43493, tales como alta afinidad por S-59 y propiedades humectantes superiores, y es un adsorbente preferido.

Las series de adsorbentes Amberlite® XAD, que contienen cuentas de resina macrorreticular hidrófoba, también son efectivas. Además, también son apropiadas para su uso en un RD diferentes variantes de Amberlites, tales como las series de adsorbentes Amberchrom® CG (la versión de pequeñas partículas de las Amberlites). Los adsorbentes Amberchrom® han mostrado buenos resultados para la eliminación de psoralenos en conjunción con FFP (Plasma Congelado Fresco) (datos no representados). Además, Rohm and Haas también fabrica absorbentes carbonáceos (es decir ricos en carbono) Ambersorb, cada uno de los cuales posee un amplio intervalo de tamaños de poros.

Algunas de las características estructuralmente relacionadas de los adsorbentes descritos más arriba se resumen en la Tabla BB. Además de sus propiedades estructuralmente relacionadas, los adsorbentes detallados en la Tabla BB poseen otras características que los hacen apropiados para su uso en un RD por lotes. Esas características, muchas de las que se han mencionado previamente, incluyen alta afinidad por los psoralenos (particularmente S-59), buena selectividad por los psoralenos, buena hemocompatabilidad y bajo costo. Debido a que los adsorbentes suministrados por los fabricantes generalmente no son aceptables para aplicaciones farmacéuticas y médicas, los adsorbentes deben tratarse (se describe más abajo) para producir un estado de pureza elevado aceptable para aquellas aplicaciones. La capacidad del adsorbente de lograr dicho estado de pureza elevado representa otra característica deseable.

Con referencia a la Tabla BB, los poliaromáticos son todos copolímeros de poliestireno-divinilbenceno. En términos de efectividad en un RD, se debe destacar que, en términos generales, los polimetacrilatos no fueron igualmente útiles; esto puede ser consecuencia del hecho de que estos no son igualmente hidrófobos o debido a que no existen interacciones aromáticas de apilamiento entre la resina y el psoraleno. Finalmente, es digno de destacar que el adsorbente utilizado en Dowex® XUS-43493 está comercialmente disponible en ambas formas, húmeda y seca (Dowex® XUS-43493.00 y Dowex XUS-43493.01, respectivamente).

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TABLA BB

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Los adsorbentes de la presente invención son redes de poliestireno. El término "red de poliestireno" se refiere en líneas generales a polímeros que contienen monómeros de estireno (C_{6}H_{5}CH = CH_{2}); los polímeros pueden ser lineales, consistiendo en una cadena de alcano covalente única con sustituyentes fenilo, o reticulados, generalmente con residuos de m- o p-fenileno, para formar un esqueleto polimérico bidimensional. Las redes de poliestireno además pueden clasificarse, en base al mecanismo de síntesis y características físicas y funcionales, como i) redes convencionales y ii) redes hiperreticuladas; cada una de estas clases se describe adicionalmente más abajo. Los adsorbentes de la presente invención están dentro de la clase de las redes hiperreticuladas.

Las redes convencionales son básicamente copolímeros de estireno-divinilbenceno en los que el divinilbenceno (DVB) sirve como agente reticulante (es decir, el agente que une las cadenas de poliestireno lineales). Estas redes poliméricas incluyen los polímeros de "tipo gel". Los polímeros de tipo gel son copolímeros homogéneos de estireno-DVB no porosos obtenidos por copolimerización de monómeros; dichos polímeros frecuentemente se utilizan en la preparación de resinas de intercambio iónico. Los adsorbentes macroporosos representan una segunda clase de redes convencionales. Se obtienen por copolimerización de monómeros en presencia de diluyentes que precipitan las cadenas de poliestireno en crecimiento. La red de poliestireno formada por este procedimiento posee una superficie interna relativamente grande (hasta cientos de metros cuadrados por gramo de polímero); Amberlite® XAD-4 se produce mediante dicho procedimiento. [Véase, por ejemplo, Davankov y Tsyurupa, "Structure And Properties Of Hypercrosslinked Polystyrene - The First Representative Of A New Class of Polymer Networks", Reactive Polymers 13:27-42 (1990); Tsyurupa et al., ``Sorption of organic compounds from aqueous media by hypercrosslinked polystyrene sorbents "Styrosorb", Reactive Polymers 25:69-78 (1995)].

En contraste con las redes convencionales descritas más arriba, los adsorbentes de la presente invención (por ejemplo, Dowex® XUS-43493) son redes hiperreticuladas. Estas redes se producen por reticulación de cadenas de poliestireno lineales en solución o en un estado hinchado con agentes bifuncionales; los agentes bifuncionales preferidos producen puentes reticulantes conformacionalmente restringidos, discutidos más abajo, que se cree impiden que los poros colapsen cuando el adsorbente está en un estado esencialmente anhidro (es decir, "seco").

Se cree que las redes hiperreticuladas poseen tres características fundamentales que las diferencian de las redes convencionales. Primero, existe una baja densidad de las cadenas de polímero debido a los puentes que mantienen las cadenas de poliestireno apartadas. Como resultado, los adsorbentes generalmente poseen una superficie porosa y un diámetro de poro relativamente grandes. Segundo, las redes son capaces de hincharse; es decir, el volumen de la fase de polímero aumenta cuando entra en contacto con moléculas orgánicas. Finalmente, los polímeros hiperreticulados están "tensionados" cuando están en estado seco; es decir, la rigidez de la red en el estado seco impide las atracciones intercatenarias. Sin embargo, las tensiones se relajan cuando el adsorbente se humecta, lo que aumenta la capacidad de la red de hincharse en medio líquido. [Davankov y Tsyurupa, "Structure And Properties Of Hypercrosslinked Polystyrene - The First Representative Of A New Class of Polymer Networks", Reactive Polymers 13:27-42 (1990); Tsyurupa et al., ``Sorption of organic compounds from aqueous media by hypercrosslinked polystyrene sorbents "Styrosorb", Reactive Polymers 25:69-78 (1995)].

Varios agentes reticulantes se han empleado exitosamente para producir los puentes entre las cadenas de poliestireno, incluyendo dicloruro de p-xileno (XDC), éter monoclorodimetílico (MCDE), 1,4-bis-clorometildifenilo (CMDP), 4,4'-bis-(clorometil)bifenilo (CMS), dimetilformal (DMF), p,p'-bis-clorometil-1,4-difenilbutano (DPB) y tris-(clorometil)-mesitileno (CMM). Los puentes se forman entre las cadenas de poliestireno haciendo reaccionar uno de estos agentes reticulantes con los anillos fenilo del estireno por medio de una reacción de Friedel-Crafts. De este modo, los puentes resultantes unen los anillos de fenilo del estireno presentes en dos cadenas de poliestireno diferentes. [Véase. por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 3.729.457].

Tal como se introdujo previamente, los puentes son especialmente importantes cuando el adsorbente se va a utilizar en un RD debido a que los puentes generalmente eliminan la necesidad de un agente "humectante". Es decir, los puentes impiden que los poros colapsen cuando el adsorbente está en un estado esencialmente anhidro (es decir, "seco"), y de este modo no tienen que "reabrirse" con un agente humectante antes de que el adsorbente entre en contacto con el PC iluminado. Para impedir que los poros colapsen, deben formarse puentes conformacionalmente restringidos. Algunos agentes bifuncionales como el DPB no dan como resultado una conformación generalmente limitada; por ejemplo, el DPB contiene cuatro unidades metileno sucesivas que son susceptibles a reordenamientos conformacionales. De este modo, el DPB no es un agente bifuncional preferido para su uso con la presente invención.

C. Proceso de Fabricación del Dispositivo de Eliminación Procesamiento del adsorbente

Los adsorbentes que se describen más arriba típicamente están disponibles en grandes cantidades y son relativamente económicos. Según se observó más arriba, los adsorbentes no son aceptables para las aplicaciones médicas/farmacéuticas. Además de tener que ser esterilizados, los adsorbentes típicamente deben procesarse adicionalmente para eliminar partículas finas, sales, potenciales componentes extraíbles y endotoxinas. La eliminación de estos componentes extraíbles típicamente se realiza por tratamiento con disolventes orgánicos, vapor o fluidos supercríticos.

Varias compañías actualmente venden versiones "limpias" (es decir, procesadas) de adsorbentes poliméricos. Además de procesar las resinas, estas compañías ensayan los adsorbentes y el adsorbente final se certifica estéril (USP XXI), libre de pirógenos (LAL) y libre de compuestos extraíbles detectables (DVB y productos orgánicos totales). Según lo descrito con mayor detalle más abajo, Dowex® XUS-43493 puede procesarse térmicamente; similarmente, las resinas Amberlite pueden procesarse térmicamente o procesarse con disolventes orgánicos. La limpieza con fluidos supercriticos no se utiliza rutinariamente debido a su costo.

Con respecto al uso de disolventes orgánicos, una de las desventajas fundamentales se refiere a potenciales problemas asociados con niveles residuales de disolvente orgánico. El disolvente residual puede interferir con la adsorción y puede filtrarse en el producto sanguíneo durante el proceso de adsorción, ocasionando potencialmente efectos adversos al receptor de la transfusión; esto es especialmente cierto con el metanol, el disolvente más comúnmente utilizado. Además, los disolventes orgánicos generalmente inciden más en el costo que el vapor, en gran parte debido al costo de eliminación del disolvente.

El procesamiento térmico (por ejemplo, vapor) es un método efectivo para procesar resinas adsorbentes. En efecto, las referencias estándar sobre el procesamiento de polímeros indican que la extracción con vapor es un proceso típico para limpiar el poliestireno. [F. Rodriguez, Principles Of Polymer Systems, (Hemisphere Publishing Corp.), páginas 449-53 (3º Edición, 1989)). Supelco, Inc. (Bellefonte, PA) utiliza un proceso patentado térmico, sin disolvente, para limpiar los adsorbentes Dowex® XUS-43493 y Amberlite. La principal ventaja de utilizar vapor es que el mismo no añade ningún potencial compuesto extraíble al adsorbente. Una gran desventaja, sin embargo, es que este proceso puede extraer agua de los poros de las cuentas de resina; el desempeño eficaz de algunos adsorbentes requiere que las cuentas sean rehumectadas antes de ponerlas en contacto con el producto sanguíneo iluminado. En efecto, según se describe en detalle en la sección Experimental, algunos adsorbentes pierden la mayor parte de la capacidad de adsorción si están secos.

Es importante destacar que los diferentes adsorbentes poseen requerimientos de humectación especiales. En oposición a la resina Amberlite no limpia, las Amberlites limpias tienen dificultad para humectarse y tienden a flotar sobre la superficie de las soluciones acuosas. Se descubrió que rehumectar el adsorbente con etanol (15-30%) en agua destilada durante un mínimo de 10 minutos da como resultado la liberación del gas atrapado de los poros internos de las cuentas. Las cuentas recuperan nuevamente su capacidad de adsorción una vez que se han enjuagado con agua destilada para eliminar el etanol residual. En realidad, una exposición de 10 minutos a etanol 15% como mínimo en agua destilada restituyó las capacidades de adsorción hasta niveles casi máximos para Amberlite® XAD-4 y XAD-16 (véase el Ejemplo 32, abajo). Las capacidades de adsorción demostraron depender fuertemente del contenido de agua, con capacidades óptimas de adsorción que se producen con 50-65% de agua para Amberlite® XAD-4 y con 40-55% de agua para Amberlite XAD-4; las capacidades de adsorción disminuyeron con la reducción del contenido de agua.

Por el contrario, se descubrió que Dowex® XUS-43493 eliminó muchos de los problemas de humectación asociados con los adsorbentes Amberlite debido a que no necesita ser rehumectado antes de entrar en contacto con el producto sanguíneo para un eficaz desempeño. En efecto, la "humectabilidad" de Dowex® XUS-43493 (y otros adsorbentes "con puentes" que poseen estructuras altamente reticuladas y de este modo no colapsan cuando se secan) es una de sus características mas favorables.

Finalmente, una de las características claves del adsorbente limpio/procesado es un nivel extremadamente bajo de partículas con diámetros menores que 30 \mum. Se realizó el ensayo preliminar sobre los adsorbentes (Dowex® XUS-43493 y Amberlite® XAD-16) procesados por Supelco para determinar los recuentos de partículas. Los resultados de estos ensayos indicaron que las partículas extrañas (por ejemplo, polvo, fibras, partículas no adsorbentes y partículas no identificadas) estaban ausentes y que las partículas finas (< 30 \mum) estaban esencialmente ausentes. Después del procesamiento, el adsorbente puede envasarse en grandes cantidades y, si es necesario, puede enviarse a un sitio de ensamblaje para ser introducido en el saco de malla.

Construcción del Saco de Malla

La presente invención contempla un RD por lotes (es decir, adsorbente retenido en una bolsa/saco de malla) alojado en un recipiente de almacenamiento de producto sanguíneo (por ejemplo, un recipiente de almacenamiento de plaquetas). La presente invención contempla que los sacos de malla se construyan con una malla tejida de poliéster apto para uso médico. La malla de poliéster es un material estándar utilizado en la fabricación de dispositivos de filtración de sangre; de este modo, es particularmente bien apropiado para utilizar en un RD por lotes. Aunque no se limitan a materiales de malla fabricados por ninguna compañía particular, Tetko, Inc. (Depew, NY) y Saati (Stamford, CT) actualmente fabrican materiales de malla apropiados para la presente invención.

Por supuesto, también pueden utilizarse otros materiales apropiados (por ejemplo, nylon) y están dentro del ámbito de la presente invención. En efecto, los estudios realizados por el inventor indicaron que tanto el poliéster como el nylon funcionaron igualmente bien para utilizar en un RD (no se muestran datos). Sin embargo, la realización preferida utiliza poliéster debido a que éste puede poseer propiedades superiores de hemocompatabilidad que el nylon. Además, la presente invención contempla el uso de un saco construido con una membrana, por ejemplo Supor 200, 800, 1200 (Gelman Sciences. Ann Arbor, MI) y difloruro de polivinilideno modificado hidrofílico Durapore (Millipore, Milford, MA).

En una realización preferible, los sacos de malla se ensamblan como recipientes en forma de bolsillos con cuatro bordes y dos superficies. Estos recipientes pueden fabricarse en una de varias maneras. Por ejemplo, el saco puede crearse soldando (es decir, uniendo para crear un sellado) dos trozos de material (de dimensiones aproximadamente iguales) entre sí en tres bordes. El cuarto borde se deja abierto para permitir el llenado del saco con el adsorbente; según se discute más abajo, el cuarto borde también se sella con posterioridad al llenado. Alternativamente, el saco puede fabricarse de un trozo de material doblando primero ese trozo de material sobre sí mismo. La región donde el material se superpone puede entonces soldarse (se describe más abajo), dando como resultado la formación de un tubo cilíndrico. A partir de ese momento, se puede formar un bolsillo soldando uno de los extremos abiertos del cilindro, dejando el otro extremo abierto para el llenado con el adsorbente; este diseño de saco tiene la ventaja de requerir una soldadura menos. La presente invención no se limita a sacos ensamblados como bolsillos de cuatro bordes ni la invención está limitada a las técnicas de construcción de saco de malla que se discuten más arriba. Por ejemplo, en la presente invención también pueden utilizarse sacos circulares. Aunque los sacos circulares generalmente son más difíciles de fabricar, tienen la ventaja de ser más fuertes debido a que la soldadura no está paralela a la trama de la malla.

Para el ensamblaje de los sacos, se prefieren las soldaduras ultrasónicas a las soldaduras con calor debido a la superior resistencia de las soldaduras ultrasónicas. La técnica de soldadura ultrasónica es bien conocida en la técnica de fabricación de dispositivos de filtración para la industria médica. [Véase, por ejemplo, las Patentes Estadounidenses Nos. 4.576.715 y 5.269.917]. La presente invención no se limita a una técnica de soldadura/sellado particular; en efecto, con la presente invención puede utilizarse cualquier técnica de sellado apropiada, incluyendo, sin limitación, sellado ultrasónico, por radiofrecuencia (RF), por calor y por impulso. Sin importar la técnica de sellado utilizada, los bordes de los materiales de malla, tales como en el extremo abierto del saco (es decir, la ranura), se sellan por calor para impedir el desprendimiento de las fibras de poliéster durante la fabricación y el manipuleo. La presente invención también contempla lavar el material de malla con un disolvente o solución de detergente para eliminar endotoxinas, una técnica que es estándar en la fabricación de dispositivos médicos.

La presente invención contempla utilizar un material de malla con aberturas de aproximadamente 30 \mum cundo están involucradas unidades de plaquetas. Se eligió este tamaño, en parte, debido a los límites de transfusión de las partículas. No había una diferencia considerable en el número de partículas transfundidas entre la malla con aberturas de 10 \mum y 30 \mum (no se muestran datos). Debe observarse que los Lineamientos de la Asociación para el Avance de Instrumentos Médicos (AAMI) estipulan que sean transfundidas menos de 3000 partículas con 10-25 \mum de diámetro. Aunque se cree que un material de malla con aberturas de 30 \mum impedirá el escape de las partículas finas en la unidad plaquetaria, los materiales con aberturas de otros tamaños están dentro del ámbito de la presente invención. Sin embargo, un material con aberturas sumamente pequeñas (por ejemplo, 5 \mum) puede inhibir el movimiento del fluido dentro y fuera del RD (es decir, el saco que contiene adsorbente), que de este modo posee un efecto perjudicial sobre el proceso de adsorción. El intervalo preferido está por ello entre aproximadamente 10 \mum y 50 \mum.

Ensamblaje del Dispositivo de Eliminación

Después de la construcción del saco de malla, en el saco se dispersa una cantidad definida de adsorbente para formar el RD. Los sacos de malla pueden llenarse con adsorbente en el mismo sitio donde se construyó el saco o pueden enviarse a otro sitio para la adición del adsorbente y el ulterior procesamiento por parte de un ensamblador de dispositivos médicos (por ejemplo, Baxter Healthcare Corp., Round Lake, IL).

Después del llenado del saco con el adsorbente, se utiliza una soldadura ultrasónica para sellar el extremo abierto (es decir, la ranura). Si se desea, el adsorbente contenido en el saco sellado después puede rehumectarse. Aunque Dowex® MS-43493 no requiere rehumectación para un desempeño eficaz, puede rehumectarse en esta etapa, si se desea, para impedir o minimizar el "desprendimiento de gases" (tratado más abajo) cuando las plaquetas entran primero en contacto con el adsorbente. La etapa de humectación se realiza en esta etapa de la fabricación por varias razones. Primero, el llenado automático de las bolsas de malla con el adsorbente requiere que el adsorbente fluya libremente. Si bien el adsorbente limpio está relativamente seco y fluye libremente, algunos adsorbentes tienden a agrumarse como la arena húmeda cuando han sido rehumectados. De ese modo, es preferible la rehumectación del adsorbente posterior al llenado. Segundo, una etapa de lavado después del llenado de la bolsa de malla permite que las partículas finas se arrastren desde la superficie externa de la bolsa, ayudando a reducir la contaminación de partículas finas en el RD final. Finalmente, el proceso de lavado sirve para eliminar el etanol residual del adsorbente. Por supuesto, la presente invención no se limita a la rehumectación del adsorbente en esta etapa. Nuevamente, si bien se ha descubierto que la rehumectación del adsorbente procesado es necesaria para el desempeño satisfactorio de muchos adsorbentes, algunos adsorbentes (por ejemplo, Dowex® XUS-43493) no necesitan ser humectados para desempeñarse eficazmente.

El RD después puede insertarse en un recipiente de almacenamiento de producto sanguíneo (este proceso se describe en detalle en la sección Experimental). El RD contenido en un recipiente de almacenamiento de producto sanguíneo después puede envasarse dentro de una barrera a prueba de humedad para impedir el secado durante el almacenamiento. Según se utiliza en la presente memoria, la expresión "barrera a prueba de humedad" está destinada a abarcar cualquier recipiente, envase, recubrimiento o similar que sea capaz de mantener el contenido de humedad del RD durante el almacenamiento. Por ejemplo, el producto sanguíneo que contiene el RD puede sellarse en un recubrimiento con película. A partir de ese momento, los sacos deben esterilizarse en fase terminal (por ejemplo, irradiación \gamma, haz de electrones, es decir haz E, o autoclave) para impedir el crecimiento microbiano durante el almacenamiento. Debe observarse que el recipiente de almacenamiento preferido para plaquetas, el recipiente plástico PL 2410 (Baxter), no es autoclavable. De este modo, cuando se utiliza el recipiente plástico PL 2410 para alojar el RD, debe esterilizare mediante irradiación \gamma o haz E.

Finalmente, según se describe en detalle en la sección Experimental, se determinaron las "cinéticas de secado" tanto de Amberlite® XAD-4 como de Amberlite XAD-16 en condiciones estándar de laboratorio a temperatura ambiente. La esterilización gamma a las dosis de 5 y 10 MRad no tuvieron efecto sobre la cinética de adsorción para Amberlite® XAD-16 y sólo tuvieron un mínimo efecto para Amberlite® XAD-4. La esterilización gamma tuvo pequeños efectos sobre las capacidades de adsorción para ambos adsorbentes, pero las capacidades de adsorción siguieron siendo aceptables. Los datos para esterilización con haz E a 5 MRad también indican la función aceptable para ambos adsorbentes después de la esterilización. Finalmente, se han ensayado dispositivos esterilizados con gamma que contienen Dowex® XUS-43493 y demostraron ser efectivos.

D. Modificaciones al Dispositivo de Eliminación para Mejorar el Desempeño

Si bien Dowex® XUS-43493 representa la realización preferida, su uso en un RD está asociado a varias desventajas. Debe observarse que estos problemas no son específicos de Dowex® XUS-43493 y también pueden estar asociados a otros adsorbentes. Esta sección describe la naturaleza de dichas desventajas y expone las potenciales soluciones.

Desprendimiento de Gases/Espumado

El aire que está contenido en los poros del adsorbente seco es liberado durante la humectación inicial del adsorbente. Este proceso de "desprendimiento de gases" da como resultado un espumado en el concentrado de plaquetas durante las primeras aproximadamente 4 horas de almacenamiento. Aunque la aparición de la espuma durante el tratamiento no es deseable, su efecto sobre la cinética de eliminación de S-59, rendimiento de plaquetas y función plaquetaria in-vitro no es significativo.

El problema del desprendimiento de gases puede paliarse mediante una de las varias soluciones potenciales. Primero, el RD puede humectarse con solución salina o PAS. Los resultados con Dowex® XUS-43493 han mostrado sólo un incremento mínimo en el rendimiento y función plaquetaria cuando los RDs se prehumectaron en una solución isotónica. Las principales desventajas de este abordaje son el incremento en la complejidad del proceso de fabricación, problemas de esterilidad, y una reducción potencial en la vida útil del RD debido a los componentes extraíbles.

Segundo, el RD puede almacenarse en un gas inerte con una alta solubilidad en soluciones acuosas. Estudios previos con CO_{2} (solubilidad = 170 ml/ml) han demostrado que el almacenamiento del RD en un gas con alta solubilidad en soluciones acuosas también puede minimizar el espumado (no se muestran datos). Sin embargo, utilizar CO_{2} da como resultado una gran caída en el pH durante el contacto inicial con las plaquetas (pH<6,5). El único otro gas comúnmente utilizado con elevada solubilidad en soluciones acuosas es el óxido nitroso (solubilidad = 130 ml/ml).

Finalmente, el RD puede almacenarse al vacío. Por ejemplo, puede utilizarse una jeringa para hacer vacío en un recipiente de plástico PL 2410 (Baxter) que contiene el RD, minimizando de ese modo el desprendimiento de gases durante el contacto inicial con las plaquetas. El almacenamiento al vacío requiere que el recipiente de plástico PL 2410 que contiene el RD sea envasado en un recubrimiento de folia sellado al vacío ya que el recipiente de plástico PL 2410 es permeable a los gases.

Rendimiento de plaquetas y función plaquetaria

Según lo expuesto en la Tabla AA, es deseable lograr una pérdida de plaquetas menor que 10%. Los estudios con transferencia de plaquetas a un recipiente de plástico PL 2410 vacío (Baxter) después de 8 horas de contacto han demostrado una pérdida de plaquetas <10%. Los estudios actuales han indicado una amplia variabilidad entre las unidades plaquetarias con una pérdida de 10-30% en las plaquetas después de 5 días de contacto con el RD. Aunque no se ha establecido firmemente, la adhesión de plaquetas al adsorbente y/o malla es probablemente la principal fuente de pérdida de plaquetas.

Los estudios han indicado que el cambio de forma es el ensayo más sensible para monitorear los efectos del RD de la presente invención sobre la función plaquetaria, aunque la importancia del ensayo de cambio de forma no se entiende claramente. Las plaquetas son capaces de recuperar su capacidad para cambiar la forma después de la transferencia desde el RD y la incubación en un recipiente de plástico PL 2410 (Baxter) en un volumen igual de plasma autólogo. Otros ensayos (pH, respuesta al shock hipotónico, puntaje de morfología, expresión de p-selectina (GMP-140), ATP secretable y agregación) no parecen verse afectados negativamente por el RD, mientras que las determinaciones para lactato, glucosa y pO_{2}/pCO_{2} sugieren que el metabolismo de las plaquetas puede suprimirse levemente durante el contacto con el RD de la presente invención.

Existen varias soluciones potenciales para superar los efectos adversos sobre el rendimiento plaquetario y la función plaquetaria. Primero, el material de malla de poliéster utilizado en el saco podría reemplazarse por un material de membrana. Un RD que utiliza un material de membrana con un corte de 5 \mum o menor puede excluir eficazmente las plaquetas del contacto con el adsorbente: la cinética de eliminación para S-59 y los fotoproductos puede verse afectada negativamente ya que el transporte al adsorbente sería por difusión en vez de flujo a granel. Las membranas potenciales disponibles comercialmente que pueden demostrar ser efectivas en satisfacer los requerimientos para la eliminación de S-59 incluyen Supor® 200, 800, 1200 (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI) y difluoruro de polivinilideno modificado hidrofílico Durapore® (Millipore, Milford, MA). Estas membranas poseen características de baja unión a proteínas.

Segundo, el adsorbente puede recubrirse con un polímero hemocompatible tal como poli-(metacrilato de 2-hidroxietilo) (pHEMA) y polímeros basados en celulosa para mejorar la hemocompatibilidad. Estos polímeros son hidrogeles que impiden que las células interactúen con la superficie del adsorbente a la vez que permiten que compuestos de bajo peso molecular tales como S-59 pasen al adsorbente. Los estudios con Dowex® XUS-43493 recubierto con pHEMA demostraron un incremento en el rendimiento de plaquetas así como un efecto dramático sobre el cambio de forma de las plaquetas; sólo hubo una leve reducción en la cinética de adsorción de S-59 (no se muestran datos). Pueden generarse muestras con recubrimientos crecientes de pHEMA (0-15%) utilizando un proceso de recubrimiento de Wurster (realizado por International Processing Corp., Winchester, KY). Cualquier hidrogel que reduzca la unión a proteínas también puede tenerse en cuenta para recubrir los adsorbentes de la presente invención.

Tercero, la superficie del adsorbente puede modificarse con heparina inmovilizada. Además, los adsorbentes de poliestireno-divinilbenceno de fuerte intercambio aniónico pueden modificarse a través de la adsorción de heparina. La heparina, un polianión, se adsorberá muy fuertemente a las superficies de adsorbentes que posean características de intercambio aniónico fuerte. Una variedad de adsorbentes de poliestireno-divinilbenceno modificados con amonio cuaternario está comercialmente disponible. El principal problema con este abordaje es que las resinas de fuerte intercambio aniónico poseen una carga positiva que también dará como resultado una baja afinidad por S-59. Sin embargo, XUS-40285 (Dow) y MN-400 (Purolite) tienen una densidad de carga aproximadamente 10 veces inferior a las resinas de intercambio iónico estándar. Estos adsorbentes tienen aproximadamente la mitad de la capacidad para S-59
que sus homólogos no modificados (XU5-43493 y MN-150, respectivamente), que tienen altas afinidades por S-59.

VIII. Efecto de las características estructurales de los psoralenos sobre la adsorción

La sección anterior estuvo dirigida a la eliminación del psoraleno S-59 (4'-(4-amino-2-oxa)-butil-4,5',8-trimetilpsoraleno) y los fotoproductos de S-59 de los productos sanguíneos. Sin embargo, la presente invención no se limita al uso y eliminación de S-59 o psoralenos estructuralmente relacionados. En efecto, la eliminación de psoralenos con diferentes características estructurales esta contemplada por la presente invención.

Esta sección supone un examen de la eliminación de varios psoralenos estructuralmente diferentes de los productos sanguíneos. Los psoralenos ensayados se eligieron para reflejar una variedad de variaciones estructurales que podrían utilizarse en un proceso de foto-descontaminación. Se esperaría que los psoralenos sin carga o con carga positiva sean las principales variaciones que serían efectivas ya que el ácido nucleico tiene carga negativa; de acuerdo a eso se eligieron las estructuras químicas de los psoralenos ensayados. Específicamente, se ensayó un psoraleno fuertemente básico (amonio cuaternario) psoraleno, así como dos psoralenos bromados con diferentes grupos laterales, uno con carga positiva y uno sin carga. Para los estudios de adsorción, estos psoralenos se combinaron con adsorbentes iónicos y no iónicos Amberlite. Los procedimientos experimentales se discuten en detalle en el Ejemplo 39.

Aunque la presente invención no se limita a ningún mecanismo particular, se cree que el mecanismo fundamental de eliminación de psoraleno supone interacciones hidrófobas entre el anillo aromático del psoraleno y las cadenas laterales (por ejemplo, poliestireno) del adsorbente. De este modo, los psoralenos que son muy polares pueden ser difíciles de eliminar ya que tienen una afinidad reducida por los adsorbentes hidrófobos. Según se describe en detalle en la sección Experimental, el tiempo de retención por HPLC puede utilizarse como una estimación aproximada de la hidrofobicidad. Además, otros factores además de la hidrofobicidad afectan la adsorción de los psoralenos. Por ejemplo, los psoralenos pueden interactuar con células o proteínas plasmáticas (por ejemplo, albúmina sérica) que están presentes en el producto sanguíneo; estas interacciones competitivas pueden interferir en teoría con la unión a la resina y la eliminación del psoraleno.

Según se demuestra en la sección Experimental, psoralenos que poseen un amplio intervalo de características estructurales son capaces de ser eliminados de los productos sanguíneos.

IX. Incorporación de un dispositivo de eliminación por lotes en un proceso de recolección de plaquetas

La separación de la sangre entera en dos o más componentes específicos (por ejemplo, glóbulos rojos y plaquetas) es de rutina en la medicina moderna. Los componentes separados pueden utilizarse solos o en combinación con aditivos en aplicaciones terapéuticas, de investigación u otras aplicaciones relacionadas. Algunos procedimientos de separación de sangre incluyen extraer sangre entera de un individuo, someter la sangre entera a un procedimiento de separación, y reinfundir uno o más componentes de vuelta al individuo. El componente o los componentes que no son reinfundidos pueden utilizarse para preparar productos sanguíneos, tales como fracciones que contienen Factor VIII; a la inversa, aquellos componentes pueden someterse a tratamientos farmacológicos, radiológicos o similares y posteriormente pueden retornarse al donante u otro individuo.

A. Aféresis

El término "aféresis" se refiere en líneas generales a procedimientos en los que la sangre se extrae de un donante y se separa en varios componentes, recolectándose y reteniéndose el/los componente(s) de interés y devolviéndose los otros componentes al donante. El donante recibe fluidos de reemplazo durante el proceso de reinfusión para ayudar a compensar el volumen y pérdida de presión causada por la eliminación de componentes. La aféresis puede realizarse en la mayoría de los escenarios de pacientes hospitalizados y externos, incluyendo centros de diálisis y bancos de sangre.

Existen varios tipos específicos de aféresis, incluyendo leucoféresis (siendo los leucocitos el componente de interés recolectado), plaquetoféresis o trombocitoféresis (siendo las plaquetas el componente de interés recolectado), o plasmaféresis (siendo el plasma el componente de interés recolectado). Otros tipos de aféresis incluyen intercambio terapéutico de plasma, en el que se reemplaza parte del plasma del donante, y procesamiento de plasma terapéutico, en el que el componente sanguíneo recolectado se somete a algún tipo de procesamiento (por ejemplo, la eliminación de una toxina) y después se regresa al donante. [Véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5.112.298 concedida a Prince et al.].

Uno de los usos más comunes de la aféresis es la recolección de un componente sanguíneo de uno o más donantes para la transfusión a uno o más receptores. La aféresis es ventajosa en el sentido que requiere menos donantes que el procedimiento de donante aleatorio para obtener una dosis terapéutica de un componente. Por ejemplo, la recolección de una unidad de plaquetas generalmente requiere aproximadamente seis personas con el método de donante aleatorio, pero solamente una persona utilizando aféresis.

Antes del advenimiento de las máquinas de aféresis automatizadas, la aféresis se realizaba manualmente; es decir, la sangre extraída se separaba manualmente (por ejemplo, a través de centrifugación) y los componentes que no se iban a retener eran reinfundidos manualmente al donante. En contraposición, los métodos automatizados modernos permiten la recolección rápida y exacta del(de los) componente(s) deseado(s) sin ser casi tan intensivos en mano de obra como los métodos manuales. La aféresis automatizada utiliza dispositivos típicamente denominados unidades de aféresis o sistemas de aféresis, pero también se conocen como unidades de hemaféresis o plasmaféresis, separadores de células, o procesadores de células sanguíneas; de aquí en adelante, estas máquinas se denominarán "sistemas de aféresis".

B. La Operación de los Sistemas de Aféresis

El método de operación de los sistemas de aféresis es conocido en la técnica. Por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 5.112,298 concedida a Prince et al. inicialmente describe los principales componentes de los sistemas de aféresis y su método de uso, después describe un sistema para separación simplificada de fluidos. Similarmente, la Patente Estadounidense No. 5.147.290 concedida a Jonsson, incorporada a la presente memoria como referencia, está dirigida a un método y equipo para citaféresis, por ejemplo plaquetoféresis, y expone los principios generales de la aféresis. Una breve perspectiva general de la operación de los sistemas de aféresis ayudará a entender ciertos aspectos y se proporciona a continuación.

Los sistemas de aféresis automatizados generalmente comprenden un dispositivo de separación de sangre, una red complicada de tubos y filtros, bolsas de recolección, un anticoagulante y un medio computarizado para controlar todos los componentes. El dispositivo de separación de sangre es por lo común una centrífuga que separa la sangre en diferentes componentes en base a la densidad. Al menos se utiliza una bomba para movilizar la sangre, los componentes sanguíneos separados y los aditivos fluidos a través del sistema de aféresis y finalmente para devolverlos al donante o a (una) bolsa(s) de recolección. Un conjunto de tubos estériles (conjunto de aféresis) es conectado por el operador (generalmente un enfermero o un técnico capacitado) al sistema de aféresis y al donante o persona a ser tratada.

Mientras la sangre se bombea desde el donante al sistema de aféresis, se añade automáticamente a la sangre un anticoagulante, tal como ácido-citrato-dextrosa (ACD) o heparina. La sangre después ingresa a la cámara de la centrífuga, donde es separada en sus diversos componentes. Tras la separación, la(s) capa(s) que contiene(n) el/los componente(s) deseado(s) después se sifona a una o más bolsas de recolección, mientras que los restantes componentes se regresan al donante. Durante ese proceso, al donante se le administran fluidos de reemplazo para ayudar a compensar la reducción en la presión y el volumen que resulta del circuito extracorpóreo; los fluidos de reemplazo, cuya naturaleza difiere dependiendo del tipo y objetivo de la aféresis, incluyen solución salina, albúmina sérica normal, y fracción de proteínas plasmáticas.

Los sistemas de aféresis poseen sensores que son capaces de monitorear y controlar varios parámetros importantes. Por ejemplo, algunos sensores son capaces de detectar contaminantes y ayudan a minimizar la contaminación. Además, los sensores son capaces de detectar cuándo son inminentes o están presentes condiciones peligrosas, por ejemplo la presencia de burbujas de aire, y emiten una señal que avisa al operador de las condiciones. Finalmente, muchos sistemas utilizan sensores y otros mecanismos que determinan, controlan o establecen la cantidad requerida de un componente como el anticoagulante (véase la Patente Estadounidense No. 5.421.812 concedida a Langley et al., incorporada a la presente memoria como referencia). Similarmente, dichos mecanismos pueden utilizarse para calcular el volumen de los fluidos de reemplazo a ser reinfundidos para compensar el componente removido. Los sistemas de aféresis más sofisticados son programables; de este modo, el operador es capaz de ingresar variables específicas del paciente, como peso y volumen a ser reinfundido, el sistema realiza después automáticamente la separación deseada.

Describimos el uso de sistemas de aféresis para plaquetoféresis; las plaquetas recolectadas se someten posteriormente al tratamiento fotoquímico, seguido del tratamiento con un RD. Vale la pena destacar que ciertos sistemas de aféresis son capaces de proporcionar la cantidad de plaquetas en la(s) bolsa(s) de recolección de plaquetas a través del monitoreo de la concentración de plaquetas en los tubos de la línea de recolección con un sensor óptico. Además, describimos el uso de técnicas recientemente descritas para incrementar la pureza y rendimiento de las plaquetas (véase la Patente Estadounidense No. 5.494.592 concedida a Latham, Jr. et al.

Los sistemas de aféresis pueden realizar centrifugación intermitente o continua. En síntesis, la configuración intermitente implica llevar a cabo todas las etapas descritas más arriba (extraer sangre, separarla en componentes y recolectar el/los componente(s) deseado(s) y reinfundir los componentes remanentes) utilizando una única línea intravenosa. En contraste, la centrifugación continua lleva a cabo continuamente todas las etapas antes mencionadas con pequeñas alícuotas de sangre, regresando la sangre al donante a través de una línea separada. De este modo, la centrifugación continua requiere dos venipunturas, mientras que la centrifugación intermitente sólo requiere una.

Según se indicó más arriba, la red de tubos y otros componentes forman un conjunto de féresis. Existen dos tipos principales de conjuntos de féresis, cerrados y abiertos. Los conjuntos de féresis cerrados son autocontenidos. Es decir, el conjunto se compra con todos los componentes del conjunto (bolsas de recolección, agujas y bolsas que contienen solución salina y anticoagulante) ya unidos entre sí. Los conjuntos de féresis abiertos usualmente incluyen todos o la mayoría de los componentes antes mencionados, pero los componentes no están conectados. Aunque los conjuntos de féresis abiertos con menos costosos que los conjuntos cerrados, los conjuntos de féresis cerrados tienen la ventaja de una mayor duración de almacenamiento del producto sanguíneo, ya que existe una posibilidad reducida de contaminación debido a que los conjuntos cerrados son autocontenidos. A modo de ilustración, los productos sanguíneos transfundibles como las plaquetas generalmente pueden almacenarse durante cinco días con un sistema cerrado, mientras que sólo pueden almacenarse hasta 24 horas con un conjunto abierto.

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C. El Uso de la Descontaminación con Psoralenos y un Dispositivo de Eliminación de Psoralenos en Combinación con Sistemas de Aféresis

Describimos el uso de una descontaminación con psoralenos y un RD por lotes con un sistema de aféresis. Aunque se resumen varios procedimientos más abajo, la presente invención no se limita a ningún medio particular de incorporar el RD por lotes en la operación de un sistema de aféresis. A fin de ayudar a entender la siguiente discusión, en el Esquema E se describe un diagrama de flujo que resume la operación de un sistema de aféresis hipotético. Se debe recalcar que el diagrama del Esquema E tiene como objetivo representar el posible flujo de fluidos a través de un diseño ilustrativo para un sistema de aféresis y no está destinado a representar ningún procedimiento de aféresis real. Los expertos en la técnica entenderán que los procedimientos de aféresis podrían incluir diferentes vías de flujo de fluidos y diferentes componentes u ordenamiento de componentes que los que se muestran en el Esquema E.

Con referencia al Esquema E, se extrae sangre entera de un donante 500 y se ingresa a una línea de entrada 502. Una bomba de anticoagulante 506 bombea un anticoagulante desde un recipiente de anticoagulante 508 a través de una línea de anticoagulante 509 que sale a la línea de entrada 502. La sangre entera que contiene anticoagulante es bombeada posteriormente por una bomba de entrada 516 a una centrífuga 520. Debe observarse que algunas máquinas de aféresis utilizan una única bomba en lugar de bombas separadas de anticoagulante y entrada. La centrífuga 520 separa la sangre en sus diversos componentes, tales como glóbulos blancos, glóbulos rojos, plaquetas y plasma.

A continuación, un componente celular a ser recolectado (por ejemplo, plaquetas) puede extraerse de la centrífuga mediante una bomba de células 536 a través de una línea de recolección de células 532 y a un recipiente de recolección 538 (por ejemplo, un recipiente de almacenamiento de plaquetas). En forma análoga, puede extraerse el plasma de la centrífuga mediante una bomba de plasma 526 a través de una línea de recolección de plasma 522 y a un recipiente de recolección de plasma 528. Los componentes remanentes se regresan al donante a través de una línea de retorno 542. Los fluidos de reemplazo pueden extraerse desde un recipiente de fluidos de reemplazo 558 a través de una línea de fluidos de reemplazo 552 que está en contacto fluido con la línea de retorno 542 a través de una bomba de fluidos de reemplazo 556. Un controlador computarizado 550 monitorea y controla las bombas y también puede estar conectado a varios sensores que monitorean el volumen de fluidos, contaminantes y similares.

Aunque no está limitada al uso de ningún sistema de aféresis particular, la realización descrita utiliza un Baxter Biotech CS-3000^{TM} disponible comercialmente (Baxter Healthcare Corp., Fenwal Division). Los expertos en la técnica están familiarizados con las características específicas de este sistema y su mecanismo de operación (resumido más abajo); debe notarse, sin embargo, que el mecanismo básico y los componentes descritos más arriba para el diseño ilustrativo para un sistema de aféresis también son aplicables con este sistema.

En síntesis, el Baxter Biotech CS-3000^{TM} puede utilizarse en combinación con el Closed System Apheresis Kit^{TM}, que tiene bolsas preconectadas de solución salina normal para inyección y ACD. El Kit se ceba automáticamente con la solución salina normal. Se añade anticoagulante, en una proporción indicada por el operador, a la sangre entera extraída del donante mediante una bomba combinada de sangre entera-ACD. A partir de ese momento, la sangre que contiene ACD es bombeada a través de un lumen de múltiples tubos de lumen a un recipiente de separación, uno de dos recipientes dentro de la cámara de la centrífuga. La sangre que avanza a través del recipiente de separación se separa en plasma rico en plaquetas y glóbulos rojos. El término "múltiples tubos de lumen" se refiere a tubos que contienen más de un pasaje de fluidos separados y diferentes.

Después de la separación, los glóbulos rojos son regresados al donante a través de un lumen separado de los múltiples tubos de lumen, y el plasma rico en plaquetas es bombeado al recipiente de recolección (el segundo de los dos recipientes dentro de la cámara de la centrífuga). Cuando el plasma rico en plaquetas avanza a través del recipiente de recolección, las plaquetas se concentran y retienen mientras que el plasma puede devolverse al donante; sin embargo, generalmente hay una recolección simultánea de una porción de plasma del donante para la resuspensión y almacenamiento de plaquetas. Finalmente, las plaquetas se transfieren a un recipiente de almacenamiento preconectado, a partir del que pueden ser procesadas adicionalmente antes de ser infundidas a un donante.

Las plaquetas primero se recolectan (es decir, en el recipiente de almacenamiento preconectado) y después se procesan en preparación para la iluminación. Más específicamente, primero puede añadirse una cantidad apropiada de plasma autólogo a las plaquetas concentradas, seguido de la adición de PAS en una cantidad que dará como resultado la composición deseada (por ejemplo, 4,0 x 10^{11} plaquetas/300 ml en 35% de plasma autólogo y 65% de PAS III). De ahí en adelante, la solución de PC/PAS III puede mezclarse con S-59 e iluminarse en un recipiente apropiado. Después de la iluminación, el PC se añade al recipiente que envuelve el RD, se incuba durante el período de tiempo necesario para la eliminación de S-59 y fotoproductos, y después se transfiere a un recipiente de almacenamiento de plaquetas; el PC resultante después puede administrarse a un receptor desde el recipiente de almacenamiento de plaquetas.

Según se detalla en la sección Experimental, el método descrito anteriormente implica la adición de PAS III sólo después de la recolección de la mezcla de plasma-plaquetas y requiere varias transferencias de recipientes antes que el producto de plaquetas final esté listo para la transfusión a un receptor. Sin embargo, el método no se limita a esa realización particular. En efecto, el método puede utilizar procedimientos alternativos para reducir el número de etapas totales, por ejemplo transferencias de solución, cuando se utiliza un RD por lotes en combinación con aféresis.

Por ejemplo, en una realización alternativa, las plaquetas finalmente recolectadas en el recipiente de recolección de plaquetas ya contienen la cantidad apropiada de plaquetas y cantidades de PAS y plasma. El Esquema F es una versión modificada del Esquema E que representa el procedimiento de recolección de plaquetas en esta realización alternativa. Además de tener el recipiente de almacenamiento de plaquetas 538 y el recipiente de plasma autólogo 528, esta realización contiene una bolsa 539 que contiene una cantidad predeterminada de PAS III (u otro medio sintético apropiado). Después de o en forma simultánea con la recolección de plaquetas, se añaden automáticamente a las plaquetas una cantidad apropiada de plasma autólogo recolectado (por ejemplo, 105 ml) y una cantidad apropiada de PAS III (por ejemplo, 180 ml); esto puede realizarse añadiendo el PAS III y el plasma a través de los tubos 562 que puentean a la centrífuga 520 e ingresan al recipiente de almacenamiento de plaquetas 538. De este modo, debido a que la adición de PAS III se integra al procedimiento de recolección de plaquetas, esta realización elimina el procedimiento de acoplamiento estéril (véase la sección Experimental) requerido en cambio para añadir la solución de PAS III.

El volumen apropiado de PAS III puede añadirse al recipiente de almacenamiento de plaquetas 538 por gravedad, mediante una bomba (no representada), o por cualquier otros medio apropiado. En una realización, la bolsa 539 de PAS III contiene un volumen predeterminado de manera que la cantidad completa puede añadirse a una cantidad definida de plaquetas a ser recolectadas en el recipiente de almacenamiento de plaquetas 538. Además, se puede utilizar un microprocesador para añadir la cantidad apropiada de PAS III desde un reservorio sobre la base de la cantidad de plaquetas recolectadas. Si se añade en forma simultánea, es preferible que se mantenga una relación constante de PAS III a plasma.

Se pueden aplicar procedimientos similares en la recolección y adición de plasma autólogo. Es decir, puede recolectarse simultáneamente un volumen predeterminado de plasma del donante y ese volumen completo posteriormente puede utilizarse en la resuspensión de las plaquetas. Esto elimina la necesidad de determinar cuánto plasma está asociado a las plaquetas antes de añadir plasma adicional para alcanzar el volumen deseado. A modo de ilustración, después de la centrifugación, las plaquetas en el recipiente de recolección generalmente están asociadas a una pequeña cantidad de plasma residual (por ejemplo, aproximadamente 30 ml); además, usualmente hay plasma residual en los tubos del sistema de aféresis que debe tenerse en cuenta (por ejemplo, aproximadamente 18-20 ml). De este modo, si se desea un volumen total de plasma de, por ejemplo, 105 ml, después puede recolectarse simultáneamente aproximadamente 55-57 ml de plasma del donante y posteriormente se pueden añadir para la resuspensión de las plaquetas.

Después de la recolección, la solución de PC/PAS III se mezcla con S-59, se incuba para permitir el equilibrio, y se ilumina. A partir de ese momento. la preparación plaquetaria iluminada se transfiere al recipiente de almacenamiento de plaquetas que envuelve al RD durante un período de tiempo definido para permitir la eliminación de S-59 y los fotoproductos. Finalmente, la preparación plaquetaria tratada se transfiere a una bolsa de almacenamiento de plaquetas desde la que pueden ser transfundidas a un receptor.

También son posibles otras realizaciones del método. Sin embargo, debe señalarse que las realizaciones alternativas están limitadas por ciertas consideraciones prácticas. Por ejemplo, no se considera que S-59 y el medio sintético PAS III en solución sean particularmente compatibles en forma conjunta para la esterilización (por ejemplo, autoclavado) y para almacenamiento. Similarmente, S-59 generalmente no debe colocarse directamente en el recipiente de almacenamiento de plaquetas debido a que, durante períodos de tiempo prolongados, la captación de S-59 por las plaquetas podría influir sobre la inactivación microbiana ya que la cantidad de fármaco disponible se reduce por la captación de las plaquetas.

Otra realización contemplada implica el uso de un recipiente 560 que contiene S-59 colocado entre una bolsa 539 que contiene PAS III y el recipiente de recolección de plaquetas 538 (Véase el Esquema G). Como el PAS III se está añadiendo al PC, el mismo se mezcla con S-59 y después ingresa inmediatamente al recipiente de recolección de plaquetas. De este modo, con esta realización se sortea un procedimiento adicional de acoplamiento estéril.

Experimental

Los ejemplos siguientes no son todos parte de la presente invención.

En la descripción experimental que sigue, se aplican las siguientes abreviaturas: eq (equivalentes); M (molar); \muM (micromolar); N (normal); mol (moles); mmol (milimoles); \mumol (micromoles); nmol (nanomoles); g (gramos); mg (miligramos); \mug (microgramos); kg (kilogramos); l (litros); ml (mililitros); \mul (microlitros); cm (centímetros); mm (milímetros); \mum (micrómetros); nm (nanómetros); min. (minutos); s y seg. (segundos); J (joules, también watt segundo; nótese que en las Figs. 6, 8-17 Joules o J se refiere a Joules/cm^{2}); ºC (grados centígrados); TLC (Cromatografía en Capa Delgada); HPLC (Cromatografía Líquida de Alta Presión); HEMA (polimetacrilato de hidroxietilo); PC(s) (concentrado(s) de plaquetas); PT (tiempo de protrombina); aPTT (tiempo de tromboplastina parcial activada); TT (tiempo de trombina); HSR (respuesta al shock hipotónico); FDA (Administración de Alimentos y Fármacos de Estados Unidos); GMP (buenas prácticas de fabricación); DMF (Archivos Maestros de Fármacos); SPE (Extracción en Fase Sólida); Asahi (Asahi Medical Co., Ltd., Tokio, Japón). Baker (J.T. Baker Inc., Phillipsburg, NJ); Barnstead (Barnstead/Thermolyne Corp., Dubuque, IA); Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA); Eppendorf (Eppendorf North America Inc., Madison, WI); Grace Davison (W.R. Grace & Co., Baltimore, MD); NIS (Nicolet, a Thermo Spectra Co., San Diego, CA); Rohm and Haas (Chauny, Francia); Sigma (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO); TosoHaas (TosoHass, Montgomeryville, PA); Wallac (Wallac Inc., Gaithersburg, MD); YMC (YMC Inc.; Wilmington, NC); DVB (divinilbenceno); LAL (Lisado de Amebocitos del Limulus); USP (Farmacopea de Estados Unidos); EAA (acetoacetato de etilo); EtOH (etanol); HOAC (ácido acético); W (watts); mW (miliwatts); RMN (Resonancia Magnética Nuclear; espectros obtenidos a temperatura ambiente en un Espectrómetro por Transformadas de Fourier Varian Gemini de 200 MHZ); p.f. (punto de fusión); UV (luz ultravioleta); THF (tetrahidrofurano); DMEM (Medio Eagles Modificado de Dulbecco); FBS (suero fetal bovino); LB (Caldo de Luria); EDTA (ácido etilendiaminotetraacético); Miristato Acetato de Forbol (PMA); solución salina tamponada con fosfato (PBS); AAMI (Asociación para el Avance de los Instrumentos Médicos); ISO (Organización Intenacional de Normas); EU (unidades de endotoxina); LVI (inyectables de gran volumen); GC (cromatografía gaseosa); M (mega-); kGy (1000 Gray = 0,1 MRad); Mn (Mohm); PAS III (solución aditivos para plaquetas III); RD (dispositivo de eliminación); SCD (dispositivo de conexión estéril).

Para facilidad de referencia, a algunos compuestos descritos en la presente memoria se les ha asignado un número de 1 a 18. Los números de referencia se asignan en la Tabla 2. Sus estructuras aparecen en las Figs. 5A-5F. Los números de referencia se usan a la largo de la sección experimental.

Cuando se aíslan los compuestos descritos en la presente memoria en forma de sal de adición de ácido, el ácido se selecciona preferentemente de manera que contenga un anión que sea no tóxico y farmacéuticamente aceptable, al menos en las dosis terapéuticas usuales. Las sales representativas que se incluyen en este grupo preferido son los hidrocloruros, hidrobromuros, sulfatos, acetatos, fosfatos, nitratos, metansulfonatos, etansulfonatos, lactatos, citratos, tartratos o bitartratos y maleatos. Otros ácidos son igualmente adecuados y se pueden usar según se desee. Por ejemplo, también pueden usarse como ácidos que forman sales de adición de ácidos los ácidos fumárico, benzoico, ascórbico, succínico, salicílico, bismetilensalicílico, propiónico, glucónico, málico, malónico, mandélico, cinámico, citracónico, esteárico, palmítico, itacónico, glicólico, bencensulfónico y sulfámico.

Uno de los ejemplos siguientes se refiere al tampón HEPES. Este tampón contiene 8,0 g de NaCl 137 mM, 0,2 g de KCl 2,7 mM, 0,203 g de MgCl_{2}(6H_{2}O) 1 mM, 1,0 g de glucosa 5,6 mM, 1,0 g de Albúmina de Suero Bovino (ABS) de 1 mg/ml (disponible de Sigma St. Louis, MO) y 4,8 g de HEPES 20 mM (disponible de Sigma, St. Louis, MO).

En uno de los siguientes ejemplos, para el tratamiento de plaquetas se formula un medio sintético tamponado con fosfato. Este puede formularse en una etapa, dando como resultado una solución de pH equilibrado (por ejemplo, pH 7,2) combinando los siguientes reactivos en 2 litros de agua destilada:

Preparación de Sterilyte^{TM} 3.0

24

La solución después se mezcla, se filtra en forma estéril (filtro de 0,2 \mum) y se refrigera.

La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) se usa en uno de los ejemplos para medir si la inactivación viral por algunos compuestos fue completa. La PCR es un método para aumentar la concentración de un segmento de una secuencia blanco en una mezcla de ADN genómico sin clonación ni purificación. Véase K.B. Mullis et al., Patentes Estadounidenses Nos. 4.683.195 y 4.683.202. Este proceso para amplificar la secuencia blanco consiste en introducir un gran exceso de dos cebadores oligonucleotídicos en la mezcla de ADN que contiene la secuencia blanco deseada, seguido de una secuencia precisa de ciclos térmicos en presencia de una ADN polimerasa. Los dos cebadores son complementarios a sus respectivas hebras de la secuencia blanco de doble hebra. Para efectuar la amplificación, se desnaturaliza la mezcla y los cebadores después se alinean a sus secuencias complementarias dentro de la molécula blanco. Después del alineamiento, los cebadores se extienden con una polimerasa para formar un nuevo par de hebras complementarias. Las etapas de desnaturalización, alineamiento de cebadores y extensión con polimerasa se pueden repetir muchas veces (es decir, desnaturalización, alineamiento y extensión constituyen un "ciclo"; puede haber numerosos ciclos) para obtener una concentración elevada de un segmento amplificado de la secuencia blanco deseada. La longitud del segmento amplificado de la secuencia blanco deseada está determinada por las posiciones relativas entre sí de los cebadores y, por lo tanto, esta longitud es un parámetro controlable. A causa del aspecto repetitivo del proceso, los inventores denominan al método "Reacción en Cadena de la Polimerasa". Debido a que los segmentos amplificados deseados de la secuencia blanco llegan a ser las secuencias predominantes (en términos de concentración) en la mezcla, se dice que son "amplificados por PCR".

Con la PCR, es posible amplificar una única copia de una secuencia blanco específica del ADN genómico hasta un nivel detectable por varias metodologías diferentes (por ejemplo, hibridación con una sonda marcada; incorporación de cebadores biotinilados seguida de detección de conjugado avidina-enzima; incorporación de desoxinucleótido trifosfatos marcados con ^{32}P, por ejemplo dCTP o dATP, en el segmento amplificado). Además del ADN genómico, se puede amplificar cualquier secuencia de oligonucleótido con el conjunto apropiado de moléculas de cebador.

Se sabe que el proceso de amplificación por PCR alcanza una concentración meseta de secuencias blanco específicas de aproximadamente 10^{-8} M. Un volumen de reacción típico es 100 \mul, que corresponde a un rendimiento de 6 x 10^{11} moléculas de producto bicatenario.

La PCR es un protocolo de amplificación de polinucleótidos. El factor de amplificación que se observa está relacionado con el número (n) de ciclos de PCR que ha habido y la eficacia de replicación de cada ciclo (E) que, a su vez, es función de las eficacias de cebado y extensión durante cada ciclo. Se ha observado que la amplificación sigue la forma E^{n} hasta que se logran concentraciones elevadas del producto de PCR. A estas concentraciones elevadas (aproximadamente 10^{-8} M/l) la eficacia de replicación disminuye drásticamente. Probablemente esto se debe al desplazamiento de los cebadores oligonucleotídicos cortos por las hebras complementarias más largas del producto de PCR. A concentraciones por encima de 10^{-8} M, la velocidad de encuentro mutuo entre las dos hebras de producto complementarias amplificadas por PCR durante las reacciones de cebado llega a ser suficientemente rápida al punto que se produce antes de, o simultáneamente con, la etapa de extensión del procedimiento de PCR. Esto conduce finalmente a una eficacia reducida de cebado y, por lo tanto, a una eficacia reducida del ciclo. Los ciclos continuados de PCR conducen a aumentos declinantes de moléculas de producto de PCR. En definitiva, el producto de PCR alcanza una concentración meseta.

Las secuencias de los cebadores polinucleotídicos usados en esta sección experimental son las siguientes:

DCD03: 5' ACT AGA AAA CCT CGT GGA CT 3'

DCD05: 5' GGG AGA GGG GAG CCC GCA CG 3'

DCD06: 5' CAA TTT CGG GAA GGG CAC TC 3'

DCD07: 5' GCT AGT ATT CCC CCG AAG GT 3'

Con DCD03 como cebador delantero común, los pares generan amplicones de longitudes de 127, 327 y 1072 pb. Estos oligonucleótidos se seleccionaron de regiones que se conservan absolutamente entre 5 aislados dHBV diferentes (DHBV1, DHBV3, DHBV16, DHBV22 y DHBV26), así como de HBV de garza (HHBV4).

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Ejemplo 1

Como se ha señalado más arriba, describimos dispositivos y métodos para la fotoactivación de compuestos fotorreactivos que se unen a ácidos nucleicos. En este ejemplo, se describe un dispositivo de fotoactivación para descontaminar productos sanguíneos. Este dispositivo comprende: (a) un medio para proporcionar longitudes de onda apropiadas de radiación electromagnética para causar la fotoactivación de al menos un compuesto fotorreactivo; (b) un medio para soportar una pluralidad de productos sanguíneos en una relación fija con el medio que proporciona radiación durante la fotoactivación, y (c) un medio para mantener la temperatura del producto sanguíneo dentro de un intervalo deseado de temperatura durante la fotoactivación.

La Fig. 1 es una vista en perspectiva de una realización del dispositivo que integra las características antes mencionadas. La figura muestra una envoltura opaca (100) de la que se ha eliminado una porción, que contiene un arreglo de lámparas (101) por encima y por debajo de una pluralidad de medios (102) que contienen productos sanguíneos representativos situados entre ensamblajes de placas (103, 104). Los ensamblajes de placas (103, 104) se describen posteriormente en forma más completa.

Las lámparas (100), que se pueden conectar a una fuente de energía (no representada), sirven como fuente de radiación electromagnética. Si bien no está limitada al tipo particular de lámpara, la realización está configurada para aceptar una lámpara bipin dual estándar industrial.

La envoltura (100) se puede abrir con un pasador (105) de manera que el producto sanguíneo se pueda colocar adecuadamente. Como se muestra en la Fig. 6, la envoltura (100), cuando está cerrada, contiene completamente la irradiación de las lámparas (101). Durante la irradiación, el usuario puede confirmar que el dispositivo está funcionando mirando a través de un visor de seguridad (106) que no permite que se transmita luz ultravioleta al usuario.

La envoltura (100) sirve también como soporte para varios componentes electrónicos en un tablero de control (107) que incluye, a modo de ejemplo, una llave conectora de energía principal, un temporizador de cuenta regresiva y un reloj. Por conveniencia, la llave conectora de energía puede estar conectada al temporizador de cuenta regresiva, que a su vez está conectado en paralelo con un reloj y a la fuente de radiación electromagnética. El temporizador de cuenta regresiva permite al usuario prefijar el tiempo de irradiación al nivel de exposición deseado. El reloj mantiene un registro del número total de horas de radiación provistas por la fuente de radiación electromagnética. Esta característica permite monitorear las lámparas (101) y cambiarlas antes de que su rendimiento disminuya por debajo del nivel mínimo necesario para una rápida fotoactivación.

La Fig. 2 es una vista en corte transversal del dispositivo que se muestra en la Fig. 1 a lo largo de las líneas 2-2. La Fig. 2 muestra la disposición de las lámparas (101) con la envoltura (100) abierta. Un reflector (108A, 108B) rodea completamente cada arreglo de lámparas (101). El medio (102) que contiene el producto sanguíneo está colocado entre los ensamblajes superior (103) e inferior (104) de placas. Cada ensamblaje de placas comprende una placa superior (103A, 104A) y una placa inferior (103B, 104B). Los ensamblajes de placas (103, 104) están conectados mediante una bisagra (109) diseñada para acomodarse al espacio creado por el medio (102) que contiene el producto sanguíneo. El ensamblaje superior de placas (103) se sitúa para que descanse encima de la parte superior del medio (102) que contiene el producto sanguíneo soportado por la placa inferior (104B) del ensamblaje inferior de placas
(104).

Los detectores (110A, 110B, 110C, 110D) se pueden situar convenientemente entre las placas (103A, 103B, 104A, 104B) de los ensamblajes de placas (103, 104). Se pueden conectar a un tablero de circuito impreso (111) que, a su vez, está conectado a un tablero de control (107).

La Fig. 3 es una vista en corte transversal del dispositivo representado en la Fig. 1 a lo largo de las líneas 3-3. Seis medios (102) que contienen productos sanguíneos (por ejemplo, bolsas de unidades de plaquetas de Teflon^{TM}) están colocados en una relación fija encima de un arreglo de lámparas (101). La temperatura del producto sanguíneo se puede controlar con un ventilador (112) solo o, con mayor preferencia, empleando un intercambiador de calor (113) que tiene puertos de enfriamiento de entrada (114) y de salida (115) conectados a una fuente de enfriamiento (no se muestra).

La Fig. 4 es una vista en corte transversal del dispositivo representado en la Fig. 1 a lo largo de las líneas 4-4. La Fig. 4 representa más claramente el abordaje de control de temperatura de una realización preferida del dispositivo. Las placas del ensamblaje superior de placas (103A, 103B) y las placas del ensamblaje inferior de placas (104A, 104B) crean, cada una, una cámara de control de temperatura (103C, 104C), respectivamente. El ventilador (112) puede hacer circular aire dentro de y entre las cámaras (103C, 104C). Cuando se emplea el intercambiador de calor (113), se enfría el aire circulante y se hace pasar entre las placas (103A, 103B, 104A, 104B).

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Ejemplo 2 Síntesis de 4'-bromometil-4,5',8-trimetilpsoraleno

En este ejemplo se describe la síntesis en tres etapas del 4'-bromometil-4,5',8-trimetilpsoraleno. La síntesis se realiza sin una etapa de bromometilación, haciéndola más segura que los métodos de síntesis conocidos.

Etapa 1

Se añadió 3-cloro-2-butanona (29,2 ml, 0,289 mol) a una suspensión agitada mecánicamente de 7-hidroxi-4,8-dimetilcumarina (50,00 g, 0,263 mol) y K_{2}CO_{3} en polvo (54 g, 0,391 mol) en acetona (500 ml). La suspensión se mantuvo a reflujo durante toda la noche, después de lo que se destiló el disolvente. Para eliminar la sal, el sólido se agitó en 1,2 l de agua, se filtró y se lavó con agua hasta que el pH de las aguas madres fue neutro (pH 5-7). El filtrado marrón se disolvió en metanol en ebullición (150 ml), se dejó enfriar a temperatura ambiente para formar una pasta espesa y se lavó con metanol helado para eliminar la mayor parte de la impureza marrón, dando 4,8-dimetil-7-(1-metil-2-oxo)propiloxi-cumarina (67,7 g, rendimiento de 99,9%) como un sólido blancuzco. p.f. 95-96ºC. RMN: d 1,57
(d, J = 6,7 Hz, 3H), 2,19 (s, 3H), 2,39 (s, 6H), 4,73 (q, J = 6,9 Hz, 1H), 6,17 (s, 1H), 6,63 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,38 (d, J = 8,9 Hz, 1H).

Etapa 2

Se calentó durante 2-4 horas a 70-85ºC una suspensión de 4,8-dimetil-7-(1-metil-2-oxo)propiloxi-cumarina (67,5 g, 0,260 mol), NaOH acuoso al 10% (114 ml, 0,286 mol) y agua (900 ml). Después se dejó enfriar la mezcla a temperatura ambiente. Se filtró el sólido y después se lavó con agua fría (1,5 l) hasta que las aguas madres fueron incoloras y el pH fue neutro (pH 5-7). El producto se secó al aire y al vacío para dar 4,4',5',8-tetrametilpsoraleno (56,3 g, 89,5%) como un sólido blanco. p.f. 197-199ºC. RMN: d 2,19 (s, 3H), 2,42 (s, 3H), 2,51 (s, 3H), 2,56 (s, 3H), 6,23 (s, 1H), 7,40 (s, 1H).

Etapa 3

Se disolvió 4,4',5',8-tetrametilpsoraleno seco (10,00 g, 41,3 mmol) en cloruro de metileno (180 ml) a temperatura ambiente. Se añadió N-bromosuccinimida (8,09 g, 45,3 mmol) y la mezcla de reacción se agitó durante 4,5 horas. Se eliminó completamente el disolvente y el sólido resultante se agitó con agua (200 ml) durante 0,5-1 h, se filtró y se trituró en frío con agua adicional (aproximadamente 500 ml) para eliminar completamente el subproducto succinimida. El producto en bruto (es decir, 4'-bromometil-4,5',8-trimetilpsoraleno) se secó en un desecador al vacío con P_{2}O_{5} y después se recristalizó de una mínima cantidad de tolueno en ebullición (200-300 ml) para dar 4'-bromometil-4,5',8-trimetilpsoraleno (10,2 g), un sólido amarillo pálido. Se separaron las aguas madres y se recristalizó nuevamente con tolueno (60 ml), para dar una segunda cosecha de producto (1,08 g, rendimiento combinado 85,1%, pureza > 99% por RMN). p.f. 206-207ºC. RMN: d 2,50 (s, 3H), 2,54 (d, J = 1,2 Hz, 3H), 2,58 (s, 3H), 4,63 (s, 2H), 6,28, (q aparente,
J = 1,3 Hz, 1H), 7,59 (s, 1H).

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Ejemplo 3 Síntesis de 5'-bromometil-4, 4',8-trimetilpsoraleno

En este ejemplo, se describe una síntesis en tres etapas de 5'-bromometil-4, 4',8-trimetilpsoraleno. Como la síntesis descrita en el Ejemplo 2, este método representa una mejora con respecto a los esquemas de síntesis previamente conocidos debido a que no requiere bromometilación.

Se sometió 4,4',5',8-tetrametilpsoraleno (2,33 g, 9,59 mmol), (síntesis descrita en el Ejemplo 2, Etapas 1 y 2) a reflujo en tetracloruro de carbono (100 ml) hasta que se disolvió. Después se añadieron N-bromosuccinimida (1,88 g, 10,5 mmol) y peróxido de benzoílo (80 mg) y la mezcla se sometió a reflujo durante 15 horas. Con enfriamiento hasta temperatura ambiente se añadió cloruro de metileno (100 ml) para disolver el sólido y la solución se lavó con agua (4 x 150 ml), después salmuera y se secó con Na_{2}SO_{4} anhidro. El disolvente se destiló para dar una mezcla de 5'-bromometil-4,4',8-trimetilpsoraleno, 4'-bromometil-3,5',8-trimetilpsoraleno, y 4',5'-bis(bromometil)-4,8-dimetilpsoraleno en una relación 55/25/20 respectivamente según se determinó por ^{1}H RMN (3,0 g, producto bruto). ^{1}H RMN del compuesto 5'-bromometilado: d 2,29 (s, 3H), 2,52 (d, J = 1,2 Hz, 3H), 2,60 (s, 3H), 4,64 (s, 2H), 6,27 (d aparente, J = 1,2 Hz, 1 H), 7,51 (s, 1H), ^{1}H RMN del compuesto 4',5'-bis(bromometilado): d 2,54 (d, J = 1,1 Hz, 3H), 2,60 (s, 3H), 4,65 (s, 4H), 6,30 (q aparente, J = 1,1 Hz, 1H), 7,67 (s, 1H).

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Ejemplo 4 Síntesis de Hidrocloruro de 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno (Compuesto 2) y Compuestos Relacionados (Compuesto 4)

En este ejemplo se describen dos métodos de síntesis del Compuesto 2. El Compuesto 2 también se conoce como S-59 y posee la estructura química descrita más abajo y en la Fig. 40. El primer método se realizó de la siguiente manera:

Etapa 1

Se agitaron en dimetiformamida seca (65 ml) 4'-bromometil-4,5',8-trimetilpsoraleno (3,09 g, 9,61 mmol) (síntesis descrita en el Ejemplo 2) y N-(2-hidroxietil)ftalimida (4,05 g, 21,2 mmol. Se hizo burbujear N_{2} gaseoso seco suavemente en la mezcla de reacción. La mezcla de reacción se calentó a 100ºC durante 4,5 horas y después se dejó que enfriara a temperatura ambiente y se colocó en el congelador durante varias horas. Se filtró el producto cristalino y se lavó con MeOH (100 ml) seguido de H_{2}O. El sólido se trituró posteriormente con MeOH (100 ml) para eliminar las impurezas. El producto bruto se secó al aire y se disolvió en CHCl_{3} (150 ml). Se añadió carbón activado y gel de sílice para decolorar y se eliminó completamente el CHCl_{3}. El producto blanco resultante, 4'-[4-(N-ftalimido)-2-oxa]butil-4,5',8-trimetilpsoraleno (1,56 g, rendimiento 37,5%) tenía una pureza >99% determinada tanto por RMN como por HPLC. p.f. 224-225ºC. RMN (CDCl_{3}): d 2,37 (s, 3H), 2,47 (s, 3H), 2,48 (s, 3H), 3,78 (s, 4H), 4,59 (s, 2H), 6,22 (s, 1H), 7,42 (s, 1H), 7,50 (m, 4H).

Etapa 2

Se suspendió 4'-[4-(N-ftalimido)-2-oxa]butil-4,5',8-trimetil-psoraleno (1,56 g, 3,61 mmol) en tetrahidrofurano (75 ml) a temperatura ambiente. A la suspensión se añadió metilamina (solución acuosa al 40%, 25 ml, 290 mmol) y se agitó durante toda la noche. Se eliminaron completamente el disolvente y la metilamina. El sólido resultante se tomó en solución acuosa de HCl 0,3 N (25 ml). La suspensión ácida se enjuagó tres veces con 40 ml de CHCl_{3} y después se llevó a pH 11 con NaOH acuoso al 20%. Se usó CHCl_{3} (3x60 ml) para extraer el producto (es decir, 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno) de la capa alcalinizada. Las capas combinadas de CHCl_{3} se lavaron con H_{2}O (100 ml) seguida de salmuera (100 ml), después se secaron sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentraron para dar 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno. p.f. 139-141ºC. La pureza fue mayor que 99% determinada por RMN. RMN (CDCl_{3}): d 2,50 (s, 6H), 2,58 (s, 3H), 2,90 (t, J = 5,27 Hz, 2H) 3,53 (t, J = 5,17 Hz, 2H), 4,66 (s, 2H), 6,25 (s, 1H), 7,61 (s, 1H). El 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno se disolvió en etanol absoluto (150 ml), se añadió una solución 1,0 M de HCl en éter (10 ml) y la suspensión se enfrió durante toda la noche en el congelador. Después de la filtración y lavado con éter, el sólido se secó al vacío para dar cristales de color amarillo pálido (0,76 g, rendimiento de 62%). p.f. 235-236ºC.

Este método proporciona alto rendimiento y pureza.

El segundo método se inicia con la preparación de 4'-clorometil-4,5',8-trimetilpsoraleno a partir de 4,5',8-trimetilpsoraleno disponible comercialmente, según lo descrito más arriba. La síntesis de hidrocloruro de 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno se logra en cuatro (4) etapas.

Etapa 1

Se calentaron 4'-clorometil-4,5',8-trimetilpsoraleno (550 mg, 1,99 mmol) y etilenglicol (6,8 ml, 121,9 mmol) en acetona (6 ml) a 50-60ºC durante 3,5 h. Después de calentar durante 2 h, la suspensión blanca se había convertido en una solución ligeramente amarilla. Se eliminaron la acetona y el etilenglicol en un evaporador rotativo y al residuo se añadió agua (50 ml). La suspensión resultante se filtró, se lavó con agua fría y después se secó en estufa de vacío para dar 574 mg (96%) de 4'-(4-hidroxi-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno. RMN (CDCl_{3}) d: 2,51 (s, 6H), 2,58 (s, 3H), 3,62 (t, J = 4,5 Hz, 2H), 3,78 (t, J = 4,9 Hz, 2H), 4,70 (s, 2H), 6,26 (d, J = 1,1 Hz, 1H), 7,61 (s, 1H).

Etapa 2

Se disolvió 4'-(4-hidroxi-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno (574 mg, 1,9 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (6 ml) bajo N_{2} a \leq10ºC. Se añadió trietilamna (359 mg, 3,55 mmol). Se añadió lentamente gota a gota cloruro de metansulfonilo (305 mg, 266 mmol) manteniendo la temperatura por debajo de 10ºC. Finalizada la adición, la mezcla se agitó durante 15 minutos más y después se agitó a temperatura ambiente durante 10 horas. A la suspensión que había reaccionado se añadió CH_{2}Cl_{2} (45 ml) y la mezcla se lavó con agua (3x20 ml), después se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro. La concentración a \leq 30ºC seguida de secado al vacío dio 4'-[(4-metansulfoniloxi-2-oxa)butil-4,5',8-trimetil-psoraleno como un sólido amarillo (706 mg, 98%). p.f 138-140ºC. RMN d 2,51 (s, 3H), 2,52 (d, 3H), 2,58 (s, 3H), 2,99 (s, 3H), 3,77 (m, 2H), 4,39 (m, 2H), 4,71 (s, 2H), 6,26 (s, 1H), 7,62 (s, 1H).

Etapa 3

Se mantuvieron a reflujo durante 8 horas en alcohol etílico al 95% (5 ml) 4'-[(4-metansulfoniloxi-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno (706 mg, 1,86 mmol) y azida sódica (241 mg, 3,71 mmol). La solución de reacción se enfrió y se añadió agua fría (55 ml). El sólido blancuzco se filtró y se lavó con agua fría. Con el secado al vacío, se obtuvo la azida (es decir, 4'-(4-azido-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno) como un sólido amarillento claro (575 mg, 95%). p.f. 105-106ºC. RMN: d 2,51 (s, 6H), 2,58 (s, 3H), 3,41 (t, J = 4,9 Hz, 2H), 3,67 (t aparente, J = 4,9 Hz, 2H), 4,70 (s, 2H), 6,26 (s, 1H), 7,66 (s, 1H).

Etapa 4

El 4'-(4-azido-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno (1,65 g, 5,03 mol) se disolvió en tetrahidrofurano (10 ml). A la solución anterior se añadieron trifenilfosfina (1,59 g, 6,08 mmol) y seis gotas de agua. Después de agitar a temperatura ambiente durante toda la noche, se concentró la solución de color amarillo claro. El residuo se disolvió en CHCl_{3} (90 ml). E residuo se disolvió en CHCl_{3} (90 ml) y se extrajo con HCl acuoso 0,3N (30 ml, después 2x5 ml). Las capas combinadas de HCl se trataron cuidadosamente con K_{2}CO_{3} hasta saturación. La solución básica se extrajo con CHCl_{3} (3x60 ml). Las capas de CHCl_{3} combinadas se lavaron con 60 ml de agua, 60 ml de salmuera y se secaron sobre Na_{2}SO_{4} anhidro. Después de la concentración y secado al vacío, se obtuvo la amina como un sólido amarillo (1,25 g, 82%). p.f. 139-141ºC. RMN d 2,48 (s, 6H), 2,55 (s, 3H), 2,89 (t, J = 6 Hz, 2H), 3,52 t, J = 6 Hz, 2H), 4,64 s, 2H), 6,22 (s, 1H), 7,59 (s, 1H).

La amina se disolvió en etanol absoluto (40 ml) y se añadieron 20 ml de HCl 1N en éter etílico. Después de dejar en reposo durante la noche a 5ºC, se filtró el precipitado y se enjuagó con éter para dar 1,25 g del compuesto 2. p.f. 236ºC (descomp.). ^{13}C RMN: 8,54, 12,39, 19,18, 38,75, 62,26, 65,80, 108,01, 112,04, 112,42, 112,97, 116,12, 125,01, 148,76, 153,97, 154,37, 155,76, 160,34.

Análisis calculado para C_{17}H_{20}ClNO_{4}: C, 60,45; H, 5,97; N, 4,15. Experimental: C, 60,27; H, 5,88; N, 4,10.

Se preparó de manera similar, haciendo reaccionar 4'-CMT con 1,3-propanodiol en forma comparable con la Etapa 1 y procediendo análogamente a lo largo de la Etapa 4,4'-(5-amino-2-oxa)pentil-4,5',8-trimetilpsoraleno (compuesto 4). p.f. 212-214ºC (descomp.). RMN de la base libre: d 1,73 (pent, J = 6,4 Hz, 2H), 2,45 (s, 3H), 2,51 (s, 3H), 2,78 (t, J = 6,8 Hz, 2H), 3,54 (t, J = 6,3 Hz, 2H), 4,59 (s, 2H), 6,18 (s, 1H), 7,54 (s, 1H).

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Ejemplo 5 Síntesis de 5'-(4-amino-2-oxa)butil-4,4',8-trimetilpsoraleno (Compuesto 18)

Este ejemplo describe la síntesis del Compuesto 18. A una solución agitada de N-metilformanilida (16,0 ml, 0,134 mol) en acetonitrilo (130 ml) se añadió oxicloruro de fósforo (12,5 ml. 0,134 mol), después 4,4',8-trimetilpsoraleno (5,0 g. 21,9 mmol) (descrito en McLeod. et al., Tetrahedron Letters No. 3:237 (1972)). La temperatura se mantuvo entre 0-10ºC durante la adición del psoraleno mediante el uso de un baño de agua/hielo. La suspensión se agitó a 50ºC durante 2 días protegida de la humedad con un tubo de secado con drierite. Se dejó enfriar la mezcla de reacción hasta temperatura ambiente, después se enfrió en un baño con agua helada. El acetonitrilo se decantó, después se añadió agua helada (150 ml) a la suspensión naranja y se agitó durante 1 hora. El sólido naranja se filtró y se enjuagó con agua fría, después con acetonitrilo frío. El producto bruto se recristalizó y se decoloró con carbón en dicloroetano (600 ml) para dar 4,4',8-trimetil-5'-psoralencarboxaldehído (3,59 g, 64,0%) como un sólido amarillo-naranja, que sublima \geq 250ºC, descomp. > 300ºC. ^{1}H RMN (CDCl_{3}); 2,54 (d, J = 1 Hz, 3H), 2,64 (s, 3H), 2,68 (s, 3H), 632 (d aparente,
J = 1 Hz, 1H), 7,75 (s, 1H), 10,07 (s, 1H).

Se agitó 4,4',8-trimetil-5-psoralencarboxaldehído (7,50 g, 29,3 mmol) en EtOH absoluto (250 ml). Se añadió borohidruro de sodio y la suspensión se agitó durante toda la noche. Se añadieron agua helada (150 ml) y NaCO_{3} acuoso al 10% (50 ml) para desactivar la reacción. Después de agitar durante 45 minutos, el precipitado se filtró y se enjuagó con agua hasta que el filtrado fuera neutro (pH 5-7). El producto se secó en un desecador al vacío con P_{2}O_{5} para dar 5'-hidroximetil-4,4',8-trimetilpsoraleno (7,46 g, 98,5%) como un sólido amarillo pálido, p.f. 244-245ºC. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 1,97 (t, J = 6 Hz, 1H), 2,31 (s, 3H), 2,51 (d, J = 1 Hz, 3H), 2,58 (s, 3H), 4,79 (d, J = 6 Hz, 2H), 6,25 (d aparente, J = 1 Hz, 1H), 7,49 (s, 1H).

A una suspensión enfriada con agua hielo y agitada de 5'-hidroximetil-4,4',8-trimetilpsoraleno (15,42 g, 59,7 mmol) en dicloroetano (500 ml) se añadió tribromuro de fósforo (6,17 ml, 65,7 mmol) gota a gota. La reacción se protegió de la humedad y se dejó agitar durante toda la noche a temperatura ambiente. La mezcla después se agitó con 300 ml de agua/hielo durante 1 hora. El sólido se filtró, se secó, se disolvió en tolueno caliente, se filtró a través de un papel de filtro y se destiló para dar 5'-bromometil-4,4',8-trimetilpsoraleno (3,43 g). Los disolventes de la reacción (dicloroetano y agua) se separaron y la capa acuosa se extrajo tres veces con dicloroetano. Se combinaron las capas orgánicas, se enjuagaron con salmuera, después se secaron (Na_{2}SO_{4} anhidro) y se destilaron al vacío para dar la mayor parte del producto, 5'-bromometil-4,4',8-trirnetilpsoraleno (13,13 g, rendimiento combinado de 86,4%), como un sólido amarillo pálido, p.f. 201^{-}202ºC. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 2,29 (s, 3H), 2,52 (d, J = 1 Hz, 3H), 2,60 (s, 2H), 4,64 (s, 2H), 6,27(d aparente, J = 1 Hz, 1H), 7,51 (s, 1H).

Se disolvió N-hidroxietilftalimida (3,00 g, 15,5 mmol) en DMF (5 ml) a 60-64ºC mientras se hacía burbujear N_{2} gaseoso en la solución. Se añadieron yoduro de sodio (0,01 g, 0,007 mmol) y 5'-bromometil-4,4',8-trimetilpsoraleno (1,00 g, 3,11 mmol) y la suspensión se agitó en estas condiciones durante toda la noche. Se dejó enfriar la mezcla de reacción espesa amarilla hasta temperatura ambiente, se enfrió en un baño de agua/hielo, se filtró y se enjuagó con MeOH helado para dar el producto bruto (1 g). El sólido se recristalizó de dicloroetano (100 ml) para dar 4,4',8-trimetil-5'-[2-(N-ftalimido)-2-oxa)butilpsoraleno (0,68 g, 50,8%), como un sólido blancuzco, p.f. 225-228ºC. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): 2,26 (s, 3H), 2,46 (s, 3H), 2,51 (d, J = 1 Hz, 3H), 3,87 (m, 4H), 4,64 (s, 2H), 6,26 (d aparente, J = 1 Hz, 1H), 7,42 (s, 1H), 7,64 (multiplete, 4H).

Se agitó el 4,4',8-trimetil-5'-[4'-(N-ftalimido)-2-oxa]butilpsoraleno (1,61 g, 3,73 mmol) con THF (40 ml) y metilamina acuosa 40% en peso (20 ml, 257 mmoI) durante toda la noche. El disolvente se destiló y el residuo se repartió entre HCl acuoso diluido y diclorometano. La capa acuosa se enjuagó varias veces más con diclorometano, después se alcalinizó con K_{2}CO_{3}. La capa básica se extrajo tres veces con diclorometano. Los extractos orgánicos combinados de la base se agitaron con salmuera y después se secaron (Na_{2}SO_{4} anhidro) y se destilaron para dar 5'-(4-amino-2-oxa)butil-4,4',8-trimetilpsoraleno (0,71 g, 63,4%), p.f. 126-129ºC.H RMN (CDCl_{3}): 2,30 (s, 3H), 2,51 (s, 3H), 2,58 (s, 3H), 2,91 (t, J = 5 Hz, 2H), 3,59 (t, J = 5Hz, 2H), 4,64 (s, 2H), 6,25 (s, 1H), 7,50 (s, 1H).

La amina anterior (0,71 g, 2,36 mmol) se disolvió en etanol caliente, se convirtió en ácido con HCl 1M en éter dietílico (3 ml, 3 mmol), se decoloró con carbón, se enfrió y se recolectó. El sólido se decoloró nuevamente con carbón y se destiló para dar hidrocloruro de 5'-(4-amino-2-oxa)butil-4,4',8-trimetil-psoraleno (0,39 g, rendimiento del 49,3%) como un sólido blanco, p.f. 235-236ºC. (Nota: Otras preparaciones de este material han dado un producto con un punto de fusión considerablemente más bajo, pero idénticos espectros RMN). ^{1}H RMN (d6-DMSO): 2,32 (s, 3H), 2,45 (s, 3H), 2,50 (s, 3H), 3,00 (m, 2H), 3,71 (t, J = 5 Hz, 2H), 4,71 (s, 2H), 6,33 (s, 1H), 7,79 (s, 1H), 8,15 (br), ^{13}C RMN (d6-DMSO): 7,93, 8,57, 19,01, 38,74, 62,66, 66,28, 108,22, 112,42, 113,69, 115,34, 116,06, 125,60, 149,38, 150,95, 154,26 (tentativamente 2 carbonos), 160,26

Ejemplo 6 Síntesis de hidrocloruro de 4'-(7-amino-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno (Compuesto 7)

En este ejemplo se describe la síntesis del compuesto 7. La síntesis del hidrocloruro de 4'-(7-amino-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno se realiza en 4 etapas:

Etapa 1

Se sometió a reflujo durante 11,5 horas 4'-clorometil-4,5',8-trimetilpsoraleno (589 mg, 2,13 mmol), dietilenglicol (15,4 g, 145 mmol) y acetona (13 ml). La solución de reacción se concentró para eliminar la acetona y parte del dietilenglicol. A la solución de color marrón claro resultante se añadió CHCl_{3} (40 ml), después se lavó con agua varias veces. La capa de CHCl_{3} se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentró para dar 781 mg de producto, 4'-(7-hidroxi-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno (\sim100%). RMN d 2,46 (d, 3H), 2,47 (s, 3H), 2,51 (s, 3H), 3,58-3,67 (m, 8H), 4,67 (s, 2H), 6,18 (s, 1H), 7,57 (s, 1H).

Etapa 2

Se disolvió 4'-(7-hidroxi-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno (781 mg, 2,25 mmol) en CH_{2}Cl_{2} (2,5 ml) bajo corriente de N_{2} a <10ºC. Se añadió trietilamina (363 mg, 3,59 mmol). Se añadió por goteo lentamente cloruro de metansulfonilo (362 mg, 3,16 mmol) para mantener la temperatura por debajo de 10ºC. Terminada la adición, la mezcla se mantuvo por debajo de 10ºC durante 15 minutos más. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche y después se añadió CH_{2}Cl_{2} (50 ml). La solución se lavó con agua (3x60 ml), se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro y se concentró a \leq 30ºC. Con el secado al vacío, se obtuvo un jarabe de color marrón claro [4'-(7-metansulfoniloxi-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno]; 437 mg (76%). RMN d 2,50 (s, 3H), 2,51 (s, 3H), 2,58 (s, 3H), 3,01 (s, 3H), 3,66 (m, 4H), 3,77 (t, J = 4,6 Hz, 2H), 4,37 (t, J = 6 Hz, 2H), 4,69 (s, 2H), 6,25 (s, 1H), 7,61 (s, 1H).

Etapa 3

Se sometieron a reflujo en 3 ml de alcohol etílico al 95% durante 8 horas [4'-(7-metanosulfoniloxi-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno] (288 mg, 0,678 mmol) y azida sódica (88,2 mg, 1,36 mmol). Se dejó enfriar la solución de reacción y se añadió agua fría (50 ml). Se desechó la capa acuosa. El material en bruto se purificó por cromatografía (gel de sílice con cloroformo como eluyente) en un Chromatotron (Harrison Research, Inc., Palo Alto, CA) y se secó al vacío para obtener un jarabe ligeramente amarillo, 4'-(7-azido-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno (123 mg, 49%). RMN d 2,50 (s, 6H), 2,57 (s, 3H), 3,39 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 3,68 (m, 6H), 4,70 (s, 2H), 6,24 (s, 1H), 7,62 (s, 1H).

Etapa 4

Se disolvieron 4'-(7-azido-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetil-psoraleno (122 mg, 0,33 mmol), trifenilfosfina (129 mg, 0,49 mmol) y varias gotas de agua en tetrahidrofurano (2 ml). La solución transparente de color ligeramente amarillo se agitó a temperatura ambiente durante el fin de semana; no se detectó por TLC material de partida. Se concentró la solución de reacción y el residuo se disolvió eN CHCl_{3} (20 ml). La solución se extrajo con solución acuosa de HCl 0,15 N (10 ml, después 2x5 ml) y las capas de HCl se llevaron a pH 13 mediante la adición de solución acuosa de NaOH al 20%. La solución básica se extrajo con CHCl_{3} (3x15 ml). Las capas combinadas de CHCl_{3} se lavaron con agua, se secaron sobre Na_{2}SO_{4} anhidro, se concentraron y se secaron al vacío para dar 63,9 mg de producto, 4'-(7-amino-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno (56%). La TLC reveló sólo una mancha. RMN d 2,50 (s, 3H), 2,50 (s, 3H), 2,50 (s, 3H), 2,57 (s, 3H), 2,86 (t, J = 5,3 Hz, 2H), 3,50 (t, J = 5,3 Hz, 2H), 3,63 (s, 4H), 4,70 (s, 2H), 6,24 (s, 1H), 7,62 (s, 1H). p.f. 170-173ºC.

El sólido se disolvió en etanol absoluto, después se añadió HCl 1M en éter etílico, se filtró la suspensión y se enjuagó el producto con éter y se secó.

Ejemplo 7 Síntesis de dihidrocloruro de 4'-(12-amino-8-aza-2,5-dioxa)dodecil-4,5',8-trimetilpsoraleno (compuesto 8)

La síntesis del dihidrocloruro de 4'-(12-amino-8-aza-2,5-dioxa)dodecil-4,5'.8-trimetilpsoraleno ocurre en una etapa (1) a partir del producto del Ejemplo 5, método 2, etapa 2: Una solución de 4'-(7-metanosulfoniloxi-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno (108 mg, 0,253 mmol) en 8 ml de acetonitrilo se añadió lentamente a una solución de 1,4-diaminobutano (132 mg, 1,49 mmol) en 2,8 ml de acetonitrilo. Después de someter a reflujo durante 8 horas, no quedaba material de partida según TLC. La mezcla de reacción se enfrió hasta temperatura ambiente y se añadió CHCl_{3} (25 ml) y solución acuosa de NaOH 1 N (25 ml). Se separaron las capas y se usó CHCl_{3} (2x10 ml) para lavar la capa acuosa. Para extraer el producto de las capas orgánicas combinadas se usó HCl acuoso (0,3N, 3x10 ml). Las capas de HCl se trataron con solución acuosa de NaOH al 20% hasta pH 13. Las capas básicas combinadas después se extrajeron con CHCl_{3} (3x20 ml). La capa de CHCl_{3} se lavó con solución acuosa saturada de NaCl (10 ml) y después se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro. Después de la concentración y el secado al vacío, se obtuvieron 63 mg de producto, dihidrocloruro de 4'-(12-amino-8-aza-2,5-dioxa)dodecil-4,5'.8-trimetilpsoraleno (60%). RMN d 1,45 (m, 2H), 2,49 (s, 6H), 2,55 (s, 3H), 2,58 (t, 2H), 2,66 (t, J = 5,6 Hz, 2H), 2,76 (m, 4H), 3,55-3,61 (m, 6H), 4,68 (s, 2H), 6,22 (s, 1H), 7,61 (s, 1H).

Ejemplo 8 Síntesis de hidrocloruro de 4'-(2-aminoetil)-4,5',8-trimetilpsoraleno (Compuesto 3)

La síntesis del 4'-(2-aminoetil)-4,5',8-trimetilpsoraleno ocurre en una etapa: se preparó trifluoroacetoxiborohidruro sódico añadiendo ácido trifluoroacético (296 mg, 2,60 mmol) en 2 ml de THF a una suspensión en agitación de borohidruro sódico (175 mg, 4,63 mmol) en 2 ml de THF a lo largo de un período de 10 minutos a temperatura ambiente. La suspensión resultante se añadió a una suspensión de 4'-cianometil-4,5',8-trimetilpsoraleno (Kaufman et al., J. Heterocyclic Chem. 19:1051 (1982)) (188 mg, 0,703 mmol) en 2 ml de THF. La mezcla se agitó durante la noche a temperatura ambiente. A la solución de la reacción transparente de color amarillo claro resultante se añadieron varias gotas de agua por debajo de 10ºC para descomponer el reactivo en exceso. La mezcla resultante se concentró y se añadió solución acuosa de NaOH 1N (30 ml). Se usó cloroformo (30 ml, después 10 ml, 5 ml) para extraer la amina resultante. Las capas combinadas de CHCl_{3} se lavaron con solución saturada de NaCl. La amina después se extrajo en HCl acuoso 0,3 N (10, 5, 5 ml) y las capas ácidas se llevaron a pH 13 con solución acuosa de NaOH al 20%. Se usó CHCl_{3} (3x10 ml) para extraer la amina de las capas básicas combinadas, después se lavó con agua (2 ml) y se secó sobre Na_{2}SO_{4} anhidro. Con la concentración y el secado al vacío se obtuvo la amina como un sólido; pureza >95% según RMN. RMN d 2,45 (s, 3H), 2,47 (s, 3H), 2,53 (s, 3H), 2,78 (t, J = 6,6 Hz, 2H), 3,00 (t, J = 6,5 Hz, 2H), 6,20 (s, 1H), 7,44 (s, 1H). El sólido se disolvió en etanol absoluto. Se añadió una solución de cloruro de hidrógeno en éter dietílico (1N, 1 ml). La suspensión se filtró para obtener el compuesto 3, un sólido morado claro (32,7 mg, rendimiento 15%). p.f. > 237ºC (descomp.)

Ejemplo 9 Dihidrocloruro de 4'-(6-amino-2-aza)hexil-4,5',8-trimetilpsoraleno (Compuesto 6)

La síntesis del 4'-(6-amino-2-aza)hexil-4,5',8-trimetilpsoraleno ocurre en una (1) etapa de la siguiente manera: se añadió una solución de 4'-clorometil-4,5',8-trimetilpsoraleno (188 mg, 0,68 mmol) en 30 ml de acetonitrilo a una solución de 1,4-diaminobutano (120 mg, 1,4 mmol) en 7 ml de acetonitrilo. Después de agitar durante la noche, se eliminó el disolvente a presión reducida. Al residuo se añadió cloroformo (10 ml) y NaOH 1N (10 ml) y la mezcla se sacudió y separó. La solución acuosa se extrajo con otros 2x10 ml de CHCl_{3} y los extractos combinados se enjuagaron con agua. El producto se extrajo después de la solución de CHCl_{3} con HCl acuoso 0,3N y la capa ácida es llevó a pH 12 con solución concentrada de NaOH. La suspensión básica se extrajo con CHCl_{3}, que después se enjuagó con agua, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró a presión reducida para dar la amina como base libre. RMN (CDCl_{3}): d 1,33 (m, 3H), 1,52 (m, 4H), 2,47 (s, 3H), 2,49 (d, J = 1,1 Hz, 3H), 2,54 (s, 3H), 2,68 (q, J = 6,5 Hz, 4H), 3,86 (s, 2H), 6,21 (d aparente, J = 1,1 Hz, 1H), 7,60 (s, 1H).

La base libre, disuelta en aproximadamente 6 ml de EtOH absoluto, se trató con una solución de HCl en éter (1,0M, 3 ml). La sal HCl resultante se filtró, se enjuagó con EtOH absoluto y se secó al vacío para producir 150 mg del compuesto 6 (55%). p.f. 290ºC (descomp.). Análisis calculado para C_{19}H_{26}C_{12}N_{2}O_{3}\cdotH_{2}O: C, 54,42; H, 6,73; N, 6,68. Experimental: C, 54,08; H, 6,45; N, 6,65.

De manera similar se prepararon los siguientes compuestos, indicándose las diferencias en la síntesis:

(a) dihidrocloruro de 4'-(4-amino-2-aza)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno (compuesto 1). p.f. 320-322ºC (descomp.). En esta síntesis se usó etilendiamina como diamina.

(b) dihidrocloruro de 4'-(5-amino-2-aza)pentil-4,5',8-trimetilpsoraleno (compuesto 5). p.f. 288ºC (descomp.). RMN de la base libre: d 1,33 (s ancho, 3H), 1,66 (pent, J = 6,8 Hz, 2H), 2,47 (s, 3H), 2,50 (d, J = 1 Hz, 3H), 2,55 (s, 3H), 2,6-2,85 (m, 4H), 3,89 (s, 2H), 6,22 (d aparente, J = 1 Hz, 1H), 7,62 (s, 1H). Para esta síntesis se usó 1,3-diaminopropano como diamina.

(c) dihidrocloruro de 4'-(7-amino-2-aza)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno (compuesto 10). p.f. 300ºC (descomp.). RMN de la base libre: d 1,22 (s ancho), 1,3-1,6 (m, total 9H), 2,44 (s), 2,50 (s, total 9H), 2,63 (m, 4H), 6,17 (s, 1H), 7,56,(s, 1H). Aquí se uso 1,5-diaminopentano como diamina.

Ejemplo 10 Dicloruro de 5'-(6-amino-2-aza)hexil-4,4'.8-trimetilpsoraleno (Compuesto 17)

La síntesis del dicloruro de 5'-(6-amino-2-aza)hexil-4,4',8-trimetilpsoraleno ocurre en una (1) etapa, de la siguiente manera: una suspensión de 5'-clorometil-4,4',8-trimetilpsoraleno (190 mg, 0,68 mmol) en 30 ml de acetonitrilo se añadió a una solución de 1,4-diaminobutano (120 mg, 1,4 mmol) en 7 ml de acetonitrilo. Después de agitar a temperatura ambiente durante toda la noche, el disolvente se eliminó a presión reducida. Se añadieron cloroformo (10 ml) y NaOH 1N (10 ml) al residuo y la mezcla se agitó y se separó. La capa acuosa se extrajo con 2 x 10 ml adicionales de CHCl_{3} y los extractos combinados se enjuagaron con agua. El producto después se extrajo de la solución de CHCl_{3} con HCl acuoso 0,3 N y la capa ácida después se llevó a aproximadamente pH 12 con solución de NaOH concentrado. La suspensión básica se extrajo con CHCl_{3} que después se lavó con agua, se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se concentró a presión reducida.

El residuo se purificó mediante cromatografía en columna en gel de sílice con CHCl_{3} : EtOH : Et_{3}N (9:1:0,25). Las fracciones que contenían el producto se combinaron y se separaron del disolvente para dar la amina libre. RMN (CDCl_{3}): d 1,35 (m, 314); 1,49 (m, 4H); 2,22 (s, 3H); 2,46 (d, J = 1,1 Hz, 3H); 2,51 (S, 3H); 2,65 (m, 4H); 3,88 (s, 2H); 6,17 (d aparente, 1 Hz); 7,40 (s, 1H),

La base libre, disuelta en EtOH absoluto (\sim6 ml) se trató con una solución de HCl en éter (1,0 M, \sim3 ml). La sal de HCl resultante se filtró, se enjuagó con EtOH absoluto y se secó al vacío para producir 100 mg (36,3%) de producto, dicloruro de 5'-(6-amino-2-aza)hexil-4,4',8-trimetilpsoraleno, p.f. 288ºC (con descomposición).

Se preparó dihidrocloruro de 5'-(4-amino-2-aza)butil-4,4',8-trimetil-psoraleno (Compuesto 16) de la misma manera, excepto que se utilizó etilendiamina como diamina. RMN de la base libre: d 1,83 (s ancho, 3H), 2,27 (s, 3H), 2,51 (s, 3H), 2,58 (s, 3H), 2,74 (m, 2H), 2, 87 (m, 2H), 3,95 (s, 2H), 6,24 (s, 1H), 7,46 (s, 1H).

Ejemplo 11 Tetrahidrocloruro de 4'-(14-amino-2,6,11-triaza)tetradecil-4,5'-8-trimetil-psoraleno (compuesto 15)

La síntesis de 4'-(14-amino-2,6,11-triaza)tetradecil-4,5'-8-trimetil-psoraleno ocurre en una (1) etapa de la siguiente manera: A una solución de 0,5 g (2,5 mmol) de espermina (Aldrich, Milwakee, WI) en 10 ml de metanol se añadió una solución metanólica de HCl 5N (HCl concentrado diluido con HCl hasta 5N) para ajustar el pH a 5-6 y seguido de 0,128 g (0,5 mmol) de 4,5',8-trimetlpsolaren-4'-carboxaldehído, 20 mg (0,3 mmol) de NaBH_{3}CN y 3 ml de MeOH. La mezcla de reacción se agitó a temperatura ambiente durante toda la noche. Se añadió una solución metanólica 5N de HCl hasta pH<2 y se eliminó el metanol a presión reducida. El residuo se recogió en aproximadamente 100 ml de agua y se enjuagó con tres porciones de 25 ml de CHCl_{3}. La solución acuosa se llevó hasta pH>10 con NaOH concentrado y se extrajo con tres porciones de 25 ml de CHCl_{3}. Se combinaron estos extractos finales y se lavó con agua, se secó (Na_{2}SO_{4}) y se evaporó para dar la base libre de la amina. Pureza \geq95 por RMN. RMN (CDCl_{3}): d 1,31 (m, 5H), 1,45 (pent, J = 3,41 Hz, 4H), 1,65 (m, 4H), 2,46 (s, 3H), 2,49 (d, J = 1,14 Hz, 3H), 2,66 (m, 15H), 3,85 (s, 2H), 6,21 (s, 1H), 7,60 (s, 1H).

La amina libre es disolvió en etanol absoluto y se añadió HCl (anhidro, 1N en éter etílico). Se filtró la sal hidrocloruro y se lavó con etanol absoluto y se secó al vacío a temperatura ambiente dando 80,2 mg de producto, tetrahidrocloruro de 4'-(14-amino-2,6,11-triaza)tetradecil-4,5'-8-trimetil-psoraleno, como un sólido de color amarillo pálido.

Ejemplo 12

Se usó en este ejemplo un ensayo con el bacteriófago r-17 para predecir la eficiencia de inactivación de agentes patógenos y determinar la unión a ácidos nucleicos de los compuestos de unión fotorreactivos de la presente invención. En el ensayo con r-17, el bacteriófago se colocó en solución con cada compuesto ensayado y después se irradió. Se midió la capacidad del fago para infectar seguidamente bacterias e inhibir su crecimiento. El bacteriófago se seleccionó por su ácido nucleico relativamente accesible de manera que la inhibición del crecimiento del cultivo reflejaría con precisión el daño causado al ácido nucleico por los compuestos de prueba. El ensayo con bacteriófago para determinar la unión de ácidos nucleicos a compuestos de prueba ofrece un procedimiento seguro y económico para identificar compuestos que probablemente exhiben una inactivación eficaz de agentes patógenos. Experimentos anteriores sustentan el hecho de que el ensayo con r-17 mide con precisión la sensibilidad del HIV-1 a compuestos similares.

Se hizo crecer r-17 en bacterias Hfr 3000, de título aproximadamente 5x10^{11} (R17 y Hfr 3000 se obtuvieron de la American Tissue Culture Collection (ATCC), Washington, DC). El acopio de fago R17 se añadió a una solución de suero fetal bovino al 15% en medio Eagles modificado de Dulbecco (DMEM) a una concentración final de fagos de 10^{9}/ml. Se pasó una alícuota (0,5 ml) a un tubo de polietileno de 1,5 ml con cierre a presión. Se añadió al tubo una alícuota (0,004-0,040 ml) de la solución madre del compuesto de prueba preparada en agua, etanol o dimetilsulfóxido a la concentración 0,80-8,0 mM. Los compuestos se ensayaron a concentraciones entre 4 \muM y 320 \muM. (AMT está comercialmente disponible de HRI Inc., Concord, CA; 8-MOP está comercialmente disponible de Sigma, St. Louis, MO). Los tubos se colocaron en un dispositivo de luz como se describe en el Ejemplo 1 y se irradiaron entre 1 y 10 minutos. Se prepararon tubos de dilución de 13 ml estériles; cada compuesto de prueba requirió un tubo con 0,4 ml de caldo de Luria (LB) y 5 tubos que contenían 0,5 ml de caldo LB. Para hacer las diluciones, se añadió una alícuota de 0,100 ml de la solución irradiada de fagos y compuesto de prueba al primer tubo de dilución de 0,4 ml de medio y después se añadieron 0,020 ml de esta solución al segundo tubo de 0,05 ml de medio (1:25). Después se diluyó en forma seriada (1:25) la segunda solución en los tubos restantes. A cada muestra diluida se añadieron 0,050 ml de bacterias Hfr 3000 cultivadas durante toda la noche y 3 ml de agar superior con LB fundido, y los materiales mezclados es vertieron en placas de caldo LB. Una vez endurecido el agar superior, se incubaron las placas a 37ºC durante toda la noche. Se contaron a la mañana siguiente las unidades formadoras de láminas y se calculó el título de los fagos remanentes después del fototratamiento basándose en los factores de dilución.

Se realizaron los siguientes controles: el "sólo fago", en el que no se trató el fago con el compuesto de prueba y no se irradió (designado "título de partida" en las siguientes tablas); el "sólo UV", en el que el fago se irradió en ausencia del compuesto de prueba; y el control "oscuro", en el que la solución de fago/compuesto de prueba no se irradió antes de que se diluyera y colocara en placas.

La Tabla 5 que sigue presenta tres experimentos diferentes en los que se ensayó el Compuesto 1 de acuerdo con el protocolo de R17 recién descrito. Una comparación de los valores para las muestras de control en las corridas 1-3 (valores en negrita) revela que ni los controles "sólo UV" ni "oscuro" dan por resultado una mortalidad significativa de bacterias (como máximo, 0,3 destrucciones logarítmicas en el control "sólo UV" y 0,1 destrucciones logarítmicas en el control "oscuro").

El control "sólo UV sola" se repitió en muchos experimentos similares con otros compuestos de la presente invención y coherentemente no evidenció mortalidad significativa. (Datos no presentados). Así, el control "sólo UV" no se muestra en las siguientes tablas y figuras, aunque se realizó en cada experimento de este ejemplo. En lo que respecta al control "oscuro", después de muchos intentos con varios compuestos descritos en la presente memoria, se hizo evidente que sin importar el tipo de sustitución en la posición 4' del psoraleno, no se observó inactivación bacteriana significativa experimentalmente en la oscuridad. (Datos no representados). Por ejemplo, en la Tabla 5, el experimento 1 muestra 0,1 destrucciones logarítmicas con el compuesto 1 en la oscuridad. En cambio, cuando el Compuesto 1 se irradia durante sólo 1 minuto, la caída del título resultante es >6,7 destrucciones logarítmicas. Por lo tanto, los controles "oscuros" no se realizaron para compuestos ensayados más tarde y cuando se realizaron, no se presentan en las siguientes tablas y figuras.

TABLA 5

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Las siguientes Tablas 6-9 y Figs. 6-8 muestran los resultados del ensayo con R17 para varios compuestos de psoraleno sustituidos por grupos amino primarios en posición 4' de la presente invención. Los datos de las Tablas 7 y 8 aparecen en las Figs. 6 y 7, respectivamente. Los compuestos de psoraleno sustituidos por grupos amino primarios en posición 5' descritos en la presente memoria, que tienen sustituciones en la posición 5' similares a los compuestos de psoraleno sustituidos con grupos amino primarios en posición 4', se ensayaron también a concentraciones variables, como se ha descrito anteriormente en este ejemplo, y se demuestra que exhiben una eficiencia de inactivación comparable. Los resultados para estos compuestos se presentan en las Figs. 9 y 10 más adelante.

TABLA 6 Título inicial de R17: aproximadamente 7,5 Destrucciones logarítmicas - 1 minuto de Irradiación

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TABLA 7 Título inicial de aproximadamente 7,2 Destrucciones logarítmicas de R17 - 1 minuto de Irradiación

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TABLA 8 Título inicial de aproximadamente 7,1 Destrucciones logarítmicas - 1 minuto de Irradiación = 1,2 J/cm^{2}

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TABLA 9 Título inicial de aproximadamente 7,1 Destrucciones logarítmicas de R17 - 1 minuto de Irradiación

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Los compuestos descritos en la presente memoria que poseen sustituciones en la posición 4' del anillo de psoraleno demostraron ser activos para destruir al R17, según se muestra en las tablas anteriores. En la Tabla 7, es evidente que el compuesto 1 de la presente invención exhibe una eficiencia de inactivación de R17 mucho más alta que 8-MOP. Según se muestra en la Tabla 7 y la Fig. 6, el compuesto 1 es uno de los compuestos menos activos de la presente invención. Ambos compuestos, 2 y 3, presentan un log de inactivación más alto que el compuesto 1 en cada punto de concentración. Estos resultados respaldan que generalmente los compuestos son mucho más activos que el 8-MOP.

Los compuestos descritos en la presente memoria tienen también una eficiencia de inactivación de R17 similar o mejor que AMT. En las Tablas 7 y 8 y las Figs. 6-10, todos los compuestos de la presente invención alcanzan un log de inactivación de R17 a niveles comparables a los de AMT. Los compuestos 2 y 3 (Tabla 6, Fig. 6), los compuestos 5 y 6 (Tabla 8, Fig. 7) y el compuesto 16 (Fig. 10) exhiben una eficiencia de inactivación significativamente más alta que AMT.

Los compuestos descritos en la presente memoria también se ensayaron a una concentración constante para dosis variables de luz UV. Se prepararon tres conjuntos de tubos de 1,5 ml que contenían alícuotas de 0,6 ml de R17 en DMEM (preparado como se ha descrito antes). El compuesto ensayado se añadió a la concentración deseada y las muestras se agitaron con vórtex. Las muestras se irradiaron después a intervalos de 1,0 J/cm^{2} hasta alcanzar 3,0 J/ cm^{2}. Entre cada intervalo de 1,0 J/ cm^{2} se extrajeron de cada muestra 100 \mul y se colocaron en el primer tubo de dilución correspondiente, después se realizaron 5 diluciones secuenciales para cada compuesto ensayado, a las 3 dosis de irradiación, como se ha descrito antes en este ejemplo.

Después se añadieron a cada tubo 50 \mul de bacterias Hfr 3000, 3 ml de agar superior y se volvió a agitar con vórtex el contenido de los tubos. El contenido de cada tubo se vertió en su propia placa de LB y las placas se incubaron durante toda la noche a 37ºC. Se hizo el recuento de las placas por inspección visual a la mañana siguiente.

En las Figs. 11-17 se presentan los resultados del ensayo para varios compuestos de psoraleno sustituidos con grupos amino primarios en posiciones 4' y 5'. Estos datos confirman además que los compuestos descritos en la presente memoria son comparables con AMT en cuanto a su capacidad para inactivar R17. Además, los compuestos 6 (Fig. 11), 10 (Fig. 12), 12 (Fig. 13), 15 (Fig. 14 y 17) y el Compuesto 17 (Fig. 15) fueron todos más eficientes en la inactivación de R17 que AMT.

Ejemplo 13

Se evaluó la eficiencia de inactivación de agentes patógenos de varios compuestos descritos en la presente memoria examinando la capacidad de los compuestos para inactivar virus exentos de células (HIV). La inactivación de HIV exento de células se realizó de la siguiente manera:

Como en el ensayo con R17, se añadieron pequeñas alícuotas de los compuestos enumerados en las TABLAS 10 y 11, más abajo, a las concentraciones enumeradas en las tablas, a solución patrón de HIV-1 hasta un total de 0,5 ml. El patrón de HIV (10^{5}-10^{7} unidades formadoras de placas/ml) se encontraba en DMEM/FBS al 15%. Las alícuotas de 0,5 ml se colocaron en placas de cultivo tisular de poliestireno de 24 pocillos y se irradiaron con 320-400 nm (20 mW/cm^{2}) durante 1 min. en un dispositivo similar al dispositivo del Ejemplo 1. El dispositivo de fotoactivación usado aquí se ensayó previamente y se descubrió que daba resultados de exposición a la luz comparables con los del dispositivo del Ejemplo 1. (Datos no representados). Los controles incluyeron sólo patrón de HIV-1, sólo HIV-1 más UVA y HIV-1 más la máxima concentración de cada psoraleno ensayado, sin UVA. Después de la irradiación, todas las muestras se almacenaron congeladas a -70ºC hasta que se ensayaron en cuanto a su infectividad por el ensayo en placa de microtitulación. Se separaron alícuotas para la medición de la infectividad residual del HIV en las muestras tratadas con un compuesto de la presente invención y se cultivaron.

La infectividad residual del HIV se ensayó usando un ensayo de infectividad MT-2. (Descrito previamente por Hanson, C.V., Crowford-Miksza, L y Sheppard, H.W., J. Clin. Micro 28:2030 (1990)). El medio de prueba fue DMEM al 85% (con una concentración elevada de glucosa) que contenía 100 \mug de estreptomicina, 100 U de penicilina, 50 \mug de gentamicina y 1 \mug de anfotericina B por ml, FBS al 15% y 2 \mug de Polybrene (Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo) por ml. Las muestras de prueba y de control del procedimiento de inactivación se diluyeron en medio de prueba al 50% y plasma normal humano combinado al 50%. Las muestras se diluyeron en forma seriada directamente en placas de 96 pocillos (Corning Glass Works, Corning, N.Y.). Las placas se mezclaron en un agitador oscilante durante 30 segundos y se incubaron a 37ºC en una atmósfera de CO_{2} al 5% durante 1 a 18 horas. A cada pozo se añadieron células MT-2 (0,025 ml) [clon alfa-4, disponibles (número de catálogo 237) de National Institutes of Health AIDS Research and Reference Reagent Program, Rockville, Md.] para dar una concentración de 80.000 células por pocillo. Después de 1 hora adicional de incubación a 37ºC en atmósfera de CO_{2} al 5%, se añadieron a cada pocillo 0,075 ml de medio de prueba que contenía 1,6% de agarosa SeaPlaque (FMC Bioproducts, Rockland, Maine), y se precalentaron hasta 38,5ºC. Las placas se mantuvieron a 37ºC durante unos pocos minutos hasta que se habían acumulado varias placas y después se centrifugaron en soportes de placas a 600 x g durante 20 min. en una centrífuga preenfriada a 10ºC. En la centrífuga se formaron monocapas de células antes de que gelificara la capa de agarosa. Las placas se incubaron a 37ºC durante 5 días en CO_{2} al 5% y se tiñeron añadiendo a cada pocillo 0,05 \mug/ml de yoduro de propidio (Sigma Chemical Co.) en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4). Después de 24 a 48 horas, se examinaron visualmente las microplacas teñidas de fluorescencia roja colocando las placas en una caja de luz ultravioleta de 304 nm de 8.000 \muW/cm^{2} (Fotodyne, Inc., New Berlin, Wis.). Las placas se contaron con un aumento de x20 a x25 con un estereomicroscopio. Los resultados se muestran en las siguientes Tablas 10 y 11. "n" representa el número de corridas para las que el punto de medición es un promedio.

Los resultados sustentan el hacho de que los compuestos descritos en la presente memoria son eficaces para inactivar el HIV. De hecho, los datos para concentraciones de compuestos 64 \muM o mayores sugieren que los compuestos 2 y 3 son significativamente más activos que AMT, que previamente se había pensado que era uno de los psoralenos antivirales más activos. A concentraciones más bajas, el Compuesto 6 es capaz de destruir un mayor log de HIV (3,1 destrucciones logarítmicas a 32 \muM) que el AMT (2,5 destrucciones logarítmicas a 32 \muM). Los otros compuestos enumerados en la Tabla 9 presentan una eficiencia de inactivación del mismo orden que AMT.

TABLA 10 Título de Partida de HIV con 1 Minuto de Irradiación: Aproximadamente 5 Destrucciones logarítmicas

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TABLA 11 Título de Partida de HIV: Aproximadamente 5,4 Destrucciones logarítmicas - 1 Minuto de Irradiación

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Ejemplo 14

Este ejemplo describe el protocolo de inactivación del Virus de la Hepatitis B del Pato (DHBV), un modelo para el Virus de la Hepatitis B, usando compuestos descritos en la presente memoria.

Se añadió DHBV en yema de huevo de pato a un concentrado de plaquetas (PC) a una concentración final de 2 x 10^{7} partículas por ml y se mezcló sacudiendo suavemente durante \geq15 min. Se añadieron los psoralenos S-70, S-59 y AMT a alícuotas de 3 ml de PC en mini-bolsa de Teflon^{TM} a las concentraciones 35, 70 y 100 mM. Se irradiaron muestras, incluidos los controles sin psoraleno añadido, con 5 J/cm^{2} de UVA, con agitación, con incrementos de 1 J/cm^{2}. Después de la irradiación, los leucocitos y las plaquetas se separaron del virus por centrifugación. El material sobrenadante que contenía DHBV es digirió durante la noche con 50 \mug/ml de proteinasa K en un tampón que contenía dodecilsulfato sódico al 0,5%, tampón Tris 20 mM, pH 8,0, y EDTA 5 mM a 55ºC. Las muestras se extrajeron con fenol-cloroformo y cloroformo, seguido de precipitación con etanol. Después se usó ADN purificado en reacciones de amplificación por PCR con una entrada inicial de 10^{6} genomas DHVD de cada muestra. Los amplicones de PCR se generaron usando pares de cebadores DCD03/DCD05 (127 pb), DCD03/DCD06 (327 pb) y DCD03/DCD07 (1072 pb). La PCR se realizó en tampón estándar de PCR que contenía 0,2 mM de cada uno de los desoxinucleósido 5'-trifosfatos (dATP, dGTP, dCTP y dTTP), 0,05 mM de cada cebador y 0,5 unidades de Taq polimerasa por 100 ml de reacción. Se realizaron 30 ciclos de amplificación con el siguiente perfil térmico: 95ºC 30 segundos, 60ºC 30 segundos, 72ºC 1 minuto. A la amplificación siguió una incubación durante 7 min. a 72ºC para que resultaran productos de longitud completa. Se añadió [lambda -32P] dcTP en una proporción de 10 mCi por 100 ml con el fin de detectar y cuantificar los productos resultantes. Los productos se separaron por electroforesis en geles desnaturalizantes de poliacrilamida y se contaron. La ausencia de señal en una reacción dada se tomó como indicación de inactivación eficaz de DHBV.

Los resultados revelaron que los amplicones menores evidenciaron una inactivación creciente en función de la concentración de psoraleno para todos los psoralenos ensayados. A las mismas concentraciones, S-59 y S-70 inhibieron la PCR de los amplicones menores mejor que el AMT. Para el amplicón de 1072 pb, se observó inhibición completa de PCR a todas las concentraciones de S-59 y S-70, mientras que la muestra sin psoraleno dio una señal fuerte. AMT inhibió la amplificación por PCR del amplicón de 1072 pb en los niveles de 70 y 100 mM, pero se pudo detectar una señal cuando se usó AMT a la concentración final 35 mM.

Ejemplo 15

En el Ejemplo 13, se ensayaron los compuestos descritos en la presente memoria en cuanto a su capacidad para inactivar virus en DMEM/FBS al 15%. En este ejemplo, los compuestos se ensayan en plasma al 100% y medio predominantemente sintético para demostrar que los métodos descritos en la presente memoria no están restringidos a ningún tipo particular de medio.

Para las muestras en medio sintético, se centrifugaron concentrados de plaquetas humanas estándar para separar el plasma. Después se exprimió el ochenta y cinco por ciento del plasma y se reemplazó por un medio sintético (denominado "Sterilyte^{TM} 3.0") que contenía acetato sódico 2 mM, glucosa 2 mM; KCl 4 mM, NaCl 100 mM, Na_{3} citrato 10 mM, NaH_{2}PO_{4}/Na_{2}HPO_{4} 20 mM y MgCl_{2} 2 mM. Se añadieron células H9 infectadas con HIV a concentrados de plaquetas en Starilyte^{TM} 3,0 al 85% o a concentrados de plaquetas humanas estándar (2,5x10^{7} células por concentrado), concentración final de 5x10^{5} células/ml. Los concentrados de plaquetas se colocaron en FL20 modificado de Teflon^{TM} o Minibolsas de Teflon^{TM} (American Fluoroseal Co., Silver Springs, MD), se trataron con uno de los compuestos de las Figs. 18 y 19, a las concentraciones indicadas y después se irradiaron con 320-400 nm (20 mW/cm^{2}) para 5 J/ cm^{2} (para muestras de plasma) o 2 J/cm^{2} (para muestras con Sterilyte^{TM} al 85%) en un dispositivo similar al del Ejemplo 1. El dispositivo de fotoactivación usado aquí había sido ensayado previamente y se encontró que daba por resultado una exposición a la luz comparable a la del Dispositivo del Ejemplo 1. (Datos no presentados). Se separaron y cultivaron alícuotas para medir la infectividad residual del HIV en las muestras tratadas con un compuesto según se describe en la presente memoria.

Para muestras corridas en plasma: células H9 infectadas con HIV se añadieron a concentrados de plaquetas humanas estándar (2,5 x 10^{7} células por concentrado), concentración final 5 x 10^{5} células/ml. Se colocaron en cámaras Pyrex con camisa de agua alícuotas de concentrados de plaquetas contaminadas con HIV (5 ml). Las cámaras habían sido revestidas previamente en el interior con silicio. Los concentrados de plaquetas se trataron con uno de los compuestos detallados en las TABLAS 10 y 11, más abajo, a las concentraciones dadas en las tablas, y después se irradiaron con 320-400 nm (20 mW/cm^{2}) durante 1 min. en un dispositivo similar al del Ejemplo 1. El dispositivo de fotoactivación usado en este ejemplo había sido previamente ensayado y se encontró que daba una exposición a la luz comparable a la del dispositivo del Ejemplo 1. (Datos no representados). Se extrajeron y cultivaron alícuotas para medir la infectividad residual del HIV en las muestras tratadas con un compuesto descrito en la presente memoria. La infectividad residual del HIV se ensayó para las muestras de plasma y Sterilyte^{TM} al 85% usando un ensayo de infectividad MT-2 (detallado en el Ejemplo 13, más arriba, y descrito anteriormente por Hanson, C.V et al., J. Clin. Micro 28:2030 (1990)). Los resultados se muestran en las Figs. 18 y 19.

Los resultados sustentan el hecho de que los compuestos descritos en la presente memoria son eficaces para inactivar HIV en plasma y en medio sintético. Comparando las Figs. 18 y 19, las curvas de inactivación parecen iguales, logrando ambas aproximadamente 5 destrucciones logarítmicas de inactivación a concentraciones 64 \muM de compuesto. Sin embargo, la inactivación en medio sintético se realizó con sólo 2 J/cm^{2} de irradiación, 3 J/cm^{2} menos que la requerida para alcanzar la misma inactivación en plasma. Así, de los datos se desprende que el medio sintético facilita los métodos de inactivación descritos en la presente memoria.

Ejemplo 16

En este ejemplo se midió, la inactivación bacteriana por parte de los compuestos fotorreactivos que se unen a ácidos nucleicos como función de la capacidad de las bacterias de replicarse posteriormente. Se escogió una bacteria gram negativa como representativa de las cepas de bacterias más difíciles de inactivar.

La bacteria, una cepa de Pseudomonas, se inoculó en LB con un asa de siembra estéril y se hizo crecer durante la noche en un agitador a 37ºC. Basándose en la aproximación de que una DO a 610 nm es equivalente a 5 x 10^{6} unidades formadoras de colonias (ufc)/ml, se midió una dilución 1:10 del cultivo en un espectrómetro (fabricado por Shimatsu). El cultivo de bacterias se añadió a una solución de suero fetal bovino al 15% en DMEM a una concentración final de bacterias de aproximadamente 10^{6}/ml. Se transfirió una alícuota (0,8 ml) a un tubo de polietileno de 1,5 ml con cierre a presión. Se añadió al tubo una alícuota (0,004-0,040 ml) de la solución patrón del compuesto de prueba preparada en agua, etanol o dimetilsulfóxido a la concentración 0,80-8,0 mM. Los compuestos se ensayaron a una concentración 16 \muM. Los tubos se colocaron en un dispositivo lumínico como se ha descrito en el Ejemplo 1 y se irradiaron con 1,3 J/cm^{2}, 1,2 J/cm^{2} y finalmente 2,5 J/cm^{2}, para un total de 5 J/cm^{2}. Se tomaron 150 \mul para ensayo después de cada período de pulsación. Se prepararon tubos de dilución estériles de 13 ml; cada compuesto de prueba requería un tubo con 0,4 ml de caldo LB y 4 tubos que contenían 0,5 ml de caldo LB. Para hacer las diluciones, se añadió al primer tubo de dilución de 0,5 ml de medio, una alícuota de 0,050 ml de la solución irradiada de fagos y compuesto de prueba, después 0,050 ml de esta solución se añadieron al segundo tubo de 0,5 ml de medio (1:10). La segunda solución después se diluyó en forma seriada (1:10) en los tubos restantes. 100 \mul de la muestra original y cada dilución se cultivan separadamente sobre placas de agar con LB y se incuban durante toda la noche a 37ºC. Después a la mañana siguiente, se hizo el recuento de las unidades formadoras de colonias y, basándose en los factores de dilución, se calculó el título de los fagos remanentes después del fototratamiento.

Se hicieron los siguientes controles: "sólo bacterias", en el que la bacteria no se trató con el compuesto de prueba y no se irradió (citado como "título de partida" en las tablas); "sólo UV", en el que la bacteria se irradió en ausencia del compuesto de prueba. No se hicieron aquí controles oscuros por las razones expuestas en el anterior Ejemplo 12.

Los resultados fueron los siguientes. El título de partida de la bacteria fue de 6,5 destrucciones logarítmicas. Después de 5 J/cm^{2} de irradiación, los destrucción logarítmica para los diversos compuestos ensayados fueron los siguientes: 8-MOP - 1,9 destrucciones logarítmicas; AMT - 5,2 destrucciones logarítmicas, Compuesto 2 - >5,5, Compuesto 6 - >5,5. Es evidente según estos resultados que los compuestos descritos en la presente memoria son más eficaces que AMT y 8-MOP para inactivar una bacteria gram negativa.

Ejemplo 17

En los ejemplos anteriores, los psoralenos descritos en la presente memoria han demostrado ser eficaces para inactivar agentes patógenos, tales como bacterias (Pseudomonas), bacteriófagos (R17) y virus (HIV y DHBV). Sin que ello suponga limitarse a ningún método por el que los compuestos descritos en la presente memoria inactivan agentes patógenos, se cree que la inactivación es el resultado de la unión inducida por la luz de los psoralenos al ácido nucleico de los agentes patógenos. Según se discutió más arriba, el AMT es conocido por su eficiencia de inactivación de agentes patógenos y su acción mutagénica acompañante en la oscuridad a concentraciones bajas. En cambio, los psoralenos menos activos, tales como 8-MOP, que se han examinado antes, presentan una mutagenicidad significativamente menor. Este ejemplo establece que la fotounión y la mutagenicidad no son fenómenos vinculados en los compuestos descritos en la presente memoria. Los psoralenos descritos en la presente memoria tienen una eficiencia excepcional de inactivación de agentes patógenos mientras que presentan sólo una mínima mutagenicidad.

En este ejemplo, los compuestos descritos en la presente memoria se ensayan en cuanto a su mutagenicidad en la oscuridad usando el ensayo de Ames. Se siguieron exactamente los procedimientos usados para el ensayo de mutagenicidad de Salmonella descrito detalladamente por Maron y Ames. Maron, D.M. y B.N. Ames, Mutation Research 113:173 (1983). Se describe aquí brevemente cada procedimiento. Las cepas para ensayo TA97a, TA98, TA100, TA102, TA1537 y TA1538 se obtuvieron del Dr. Ames. TA97a, TA98, TA1537 y TA1538 son cepas de prueba de desplazamiento de marco. TA100 y TA102 son cepas de prueba de sustitución de bases. Después de recibirlas, cada cepa se cultivó en una variedad de condiciones para confirmar los genotipos específicos para las cepas.

Las cepas de prueba de Salmonella estándar usadas en este estudio requieren histidina para crecer dado que cada cepa de prueba contiene un tipo de mutación diferente en el operón de histidina. Además de la mutación de la histidina, estas cepas de prueba contienen otras mutaciones, que se describen más abajo, que aumentan mucho su capacidad para detectar mutágenos.

Dependencia de la histidina. El requerimiento de histidina se ensayó extendiendo primeramente cada cepa en una placa mínima de glucosa suplementada sólo con biotina y después en una placa mínima de glucosa suplementada con biotina e histidina. Todas las cepas crecieron revelando la falta de crecimiento de las cepas en ausencia de histidina.

Mutación de rfa: Se confirmó una mutación que causa pérdida parcial de la barrera de lipopolisacárido que recubre la superficie de la bacteria aumentando así la permeabilidad para moléculas grandes, exponiendo al violeta cristal una placa de agar surcada con nutrientes recubierta con la cepa de prueba. Primero, se añadieron 100 \mul de cada cultivo a 2 ml de agar superior mínimo fundido y se vertió sobre una placa de agar con nutriente. Después se colocó un disco de papel de filtro estéril saturado con violeta cristal en el centro de cada placa. Después de 16 horas de incubación a 37ºC, se marcaron las placas y se encontró en torno al disco una zona clara sin crecimiento bacteriano, lo que confirmó la mutación de rfa.

Mutación de uvrB: Tres cepas usadas en este estudio contienen un sistema de reparación de UV deficiente (TA97a, TA98, TA100, TA1537 y TA1538). Este rasgo se ensayó extendiendo las cepas sobre una placa de agar con nutriente que cubría la mitad de la placa e irradiando la cara expuesta de la placa con lámparas germicidas. Después de la incubación, se vio crecimiento sólo en la cara de la placa protegida contra la irradiación UV.

Factor R: Las cepas de prueba (TA97a, TA98, TA100 y TA102) contienen el plásmido pKM101 que aumenta su sensibilidad a mutágenos. El plásmido confiere también a las bacterias resistencia a la ampicilina. Esto fue confirmado por el crecimiento de cepas en presencia de ampicilina.

PAQ1: La cepa TA 102 contiene también el plásmido pAQ1 que potencia más su sensibilidad a mutágenos. Este plásmido también codifica la resistencia a la tetraciclina. Para probar la presencia de este plásmido, se extendió TA102 sobre una placa de glucosa mínima que contenía histidina, biotina y tetraciclina. La placa se incubó durante 16 h a 37ºC. La cepa presentó un crecimiento normal que revelaba la presencia del plásmido pAQ1.

Los mismos cultivos usados para el ensayo de genotipos se cultivaron nuevamente y se congelaron alícuotas en condiciones controladas. Los cultivos se ensayaron de nuevo en cuanto al genotipo para confirmar la fidelidad del genotipo después de la manipulación en la preparación de muestras permanentes congeladas.

Los primeros ensayos hechos con las cepas eran para determinar el intervalo de reversión espontánea para cada una de las cepas. Con cada experimento de mutagenicidad se midió la reversión espontánea de las cepas de prueba a la independencia de la histidina y se expresó como el número de agentes de reversión espontánea por placa. Estos sirvieron como controles de fondo. En cada cepa de prueba se incluyó un control positivo de mutagénesis usando un mutágeno diagnóstico adecuado para esa cepa (2-aminofluoreno a razón de 5 mg/placa para TA98 y azida sódica a razón de 1,5 mg/placa para TA 100).

Para todos los experimentos se usó el procedimiento de preincubación. En este procedimiento se descongeló un vial de cada cepa de prueba y se añadieron 20 \mul de este cultivo a 6 ml de Caldo Oxoid Nutrient # 2. Esta solución se sacudió durante 10 horas a 37ºC. En el procedimiento de preincubación, se añadió 0,1 ml de este cultivo nocturno a cada uno de un número requerido de tubos de prueba estériles. A la mitad de los tubos, se añadieron 0,5 ml de una solución de S-9 al 10% que contenía extracto de hígado de rata inducido por Aroclor 1254 (Molecular Toxicology Inc, Annapolis, MD) y MgCl_{2}, KCl, glucosa 6-fosfato, NADP y tampón de fosfato sódico (Sigma, St. Luis, Missouri). Para la otra mitad de los tubos se usaron 0,5 ml de tampón de fosfato sódico 0,2M, pH 7,4, en vez de la mezcla de S-9 (las muestras -S9). Finalmente, se añadió 0,1 ml de la solución de prueba que contenía 0, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 50, 100, 250 o 500 \mug/ml del compuesto de prueba. La mezcla de 0,7 ml se agitó con vórtex y después se preincubó mientras se sacudía durante 20 min. a 37ºC. Después de la agitación, a la mezcla de 0,7 ml se añadieron 2 ml de agar superior fundido suplementado con histidina y biotina e inmediatamente se vertió en una placa de agar con glucosa mínima (el volumen de agar de base era de 20 ml). El agar superior se dejó solidificar durante 30 min. y después se invirtieron las placas y se incubaron a 37ºC durante 44 horas. Después de la incubación, se contó el número de colonias que revirtieron en cada placa. Los resultados aparecen en las Tablas 12(A)-18 (B) más abajo ("n" representa el número de réplicas realizadas para cada punto de medición).

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TABLA 12(A) AMT

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TABLA 12 (B) AMT

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TABLA 13 (A) 8-MOP

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TABLA 13 (B) 8-MOP

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TABLA 14 Compuesto 1

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TABLA 15 (A) Compuesto 2

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TABLA 15 (B) Compuesto 2

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TABLA 16 Compuesto 3

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TABLA 17 Compuesto 4

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TABLA 18 (A) Compuesto 6

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TABLA 18 (B) Compuesto 6

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TABLA 19 (A) Compuesto 18

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TABLA 19 (B) Compuesto 18

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Maron y Ames (1983) describen los puntos de vista conflictivos en cuanto al tratamiento estadístico de datos generados en el ensayo. A la luz de ello, este ejemplo adopta el modelo simple de mutagenicidad que se caracteriza por un aumento de dos veces o más en el número de revertantes por encima del fondo (en negrita en las tablas), así como la respuesta mutagénica dependiente de la dosis al fármaco.

En cuanto a 8-MOP, la única respuesta mutagénica detectada fue un mutágeno débil de sustitución de base en TA102 a la dosis de 500 \mug/placa (Tabla 13 (B)).

En contraste marcado, el AMT (Tabla 12 (A) y 12 (B)) evidenció una mutagenicidad de desplazamiento de marco entre 5 y 10 \mug/placa en TA97a y TA98, a la dosis de 5 \mug/placa en TA1537 y a 1 \mug/placa en TA1538. El AMT no evidenció mutaciones significativas de sustitución de base.

Observando el compuesto 1, la única respuesta mutagénica detectada fue un mutágeno débil de desplazamiento de marco en TA1538 a la dosis de 5 \mug/placa en presencia de S9. El compuesto 1 presentó también mutación en la cepa TA100, pero sólo en ausencia de S9. El compuesto 2 también evidenció mutagenicidad de desplazamiento de marco débil en presencia de S9 en TA98 y TA1537. Los compuestos 3 y 4 no evidenciaron mutagenicidad. El compuesto 6 no tuvo mutagenicidad de sustitución de base pero evidenció una respuesta de desplazamiento de marco en TA98 en presencia de S9 a concentraciones de 250 \mug/placa y mayores. También evidenció una respuesta a la dosis de 50 \mug/placa en TA1537 en presencia de S9. El compuesto 18 evidenció sólo una respuesta débil a concentraciones altas en presencia de S9 en las cepas TA 90 y TA 1537. La respuesta fue más alta en ausencia de S9, pero aún seguía siendo significativamente inferior a la de AMT, que evidenció mutagenicidad a concentraciones mucho menores (5 \mug/placa).

Se deduce claramente de estos datos que los compuestos descritos en a presente memoria son menos mutagénicos que el AMT, según lo definido por el ensayo de Ames. Al mismo tiempo, estos compuestos presentan una eficiencia de inactivación mucho más alta que el 8-MOP, según se muestra en los Ejemplos 12 y 16. Estos dos factores demuestran que los compuestos de la presente invención combinan las mejores características de AMT y 8-MOP: alta eficiencia de inactivación y baja mutagenicidad.

Ejemplo 18

En el Ejemplo 15, los compuestos descritos en la presente memoria exhibieron la capacidad de inactivar agentes patógenos en medios sintéticos. Este ejemplo describe métodos por los que se pueden introducir y usar medios sintéticos y compuestos descritos en la presente memoria para inactivar agentes patógenos en sangre. La Fig. 20A presenta esquemáticamente el abordaje de separación de productos sanguíneos estándar usado actualmente en bancos de sangre. Se integran tres bolsas con una tubos flexibles para crear un conjunto de transferencia de sangre (200) (por ejemplo, disponible comercialmente de Baxter, Deerfield, III.). Después que la sangre se lleva a la primera bolsa (201), el conjunto completo se procesa por centrifugación (por ejemplo, la centrífuga de bolsa oscilante Sorvall^{TM}, Dupont), lo que da por resultado un concentrado de glóbulos rojos y plasma rico en plaquetas en la primera bolsa (201). El plasma se exprime de la primera bolsa (201) (por ejemplo, usando un dispositivo Fenwall^{TM} para expresión de plasma) a través de los tubos y a la segunda bolsa (202). Se separa después la primera bolsa (201) y el conjunto de dos bolsas se centrífuga para crear un concentrado de plaquetas y plasma pobre en plaquetas; éste último se exprime de la segunda bolsa (202) a la tercera bolsa (203).

La Fig. 20B representa esquemáticamente un dispositivo por el que el medio sintético y el compuesto de fotoactivación se introducen en el concentrado de plaquetas preparado según se indica en la Fig. 20A. Un conjunto de dos bolsas (300) se acopla en forma estéril con la bolsa de concentrado de plaquetas (202) (indicada como "P.C."). El acoplamiento estéril es bien conocido en la técnica. Véase, por ejemplo, la Patente Estadounidense No. 4.412.835, concedida a D.W.C. Spencer. Véanse también las Patentes Estadounidenses No. 4.157.723 y No. 4.265.280. Los dispositivos de acoplamiento estéril están comercialmente disponibles (por ejemplo, Terumo, Japón).

Una de las bolsas (301) del conjunto de dos bolsas (300) contiene una formulación de medio sintético descrita en la presente memoria (indicada como "STERILYTE"). En la segunda etapa que se muestra en la Fig. 20B, el concentrado de plaquetas se mezcla con el medio sintético pasando el concentrado de plaquetas a la bolsa de medio sintético (301) exprimiendo el concentrado de plaquetas desde la primera bolsa de sangre a la segunda bolsa de sangre a través de un medio de conexión estéril. El compuesto de fotoactivación puede estar en la bolsa que contiene medio sintético (301), añadido en el punto de fabricación. Alternativamente, el compuesto se puede mezclar con la sangre en el punto de recolección, si el compuesto se añade a la bolsa de recolección de sangre (Fig. 20A, 201) en el punto de fabricación. El compuesto puede estar en forma seca o en una solución compatible con la conservación de la sangre.

La Fig. 20C muestra esquemáticamente una realización del abordaje de descontaminación de la presente invención aplicado específicamente a un concentrado de plaquetas diluido con medio sintético según la Fig. 20B. En esta realización, las plaquetas se han pasado a una bolsa de medio sintético (301). El compuesto de fotoactivación o bien ya ha sido introducido en la bolsa de recolección de sangre (201) o está presente en la bolsa de medio sintético (301). Después las plaquetas o bien se exprimen a la bolsa de medio sintético a través del medio estéril de conexión (según lo mostrado) o el medio sintético se exprime a la bolsa de plaquetas. Después, la bolsa que contiene la mezcla de concentrado de plaquetas y medio sintético (301), que tiene unas propiedades de transmisión de luz UV y otras características adecuadas para el método descrito en la presente memoria, se coloca en un dispositivo (tal como el descrito en el Ejemplo 1, más arriba) y se ilumina.

Seguidamente al fototratamiento, las plaquetas descontaminadas se transfieren desde la bolsa de medio sintético (301) a la bolsa de almacenamiento (302) del conjunto de dos bolsas (300). La bolsa de almacenamiento puede ser una bolsa de almacenamiento comercialmente disponible (por ejemplo, la bolsa CLX de Cutter).

Ejemplo 19

Este ejemplo incluye una estimación del impacto de los compuestos y métodos descritos en la presente memoria sobre la función de las plaquetas. Se emplearon cuatro indicadores de la viabilidad y función de las plaquetas: 1) expresión de GMP-140, 2) mantenimiento del pH; 3) agregación plaquetaria y 4) recuento de plaquetas.

Para medir los efectos de los presentes compuestos y métodos de descontaminación sobre la función de las plaquetas usando estos cuatro indicadores, se prepararon cuatro muestras para cada compuesto ensayado: dos muestras de control y dos que contenían compuesto. Se obtuvieron tres unidades de plaquetas humanas de Sacramento Blood Centre, Sacramento, CA. Cada una de éstas se transfirió en condiciones estériles a tubos de 50 ml de centrífuga y después se transfirieron alícuotas de cada unidad a un segundo conjunto de tubos estériles de 50 ml de centrífuga. A cada tubo de centrífuga que contenía concentrado de plaquetas (PC) se añadió una alícuota de patrón de compuesto para tener una concentración final 100 \muM de compuesto. Los compuestos ensayados en este experimento fueron el compuesto 2 (36 \mul de solución patrón 10 mM añadidos a 4 ml de PC), el compuesto 6 (173,5 \mul de solución patrón 9,8 mM añadidos a 16,8 ml de PC), el compuesto 17 (2,0 ml de solución patrón 1 mM añadidos a 18 ml de PC), y el compuesto 18 (0,842 ml de solución patrón 2,0 mM añadidos a 16 ml de PC). Las muestras se pipetearon suavemente hacia arriba y abajo para mezclar. Después se transfirieron alícuotas (de 3 ml u 8 ml) de cada muestra a dos Medi-bags^{TM} de Teflon^{TM} estériles (American Fluoroseal Co., Silver Springs, DM) (actualmente propiedad de The West Company, Lionville, PA). Las muestras se trataron en una de dos bolsas de diferente tamaño que tenían 3 ml u 8 ml de capacidad. Las bolsas tenían aproximadamente las mismas relaciones de superficie a volumen, y experimentos previos han demostrado que las dos bolsas tienen aproximadamente propiedades equivalentes durante la irradiación de las muestras. (Datos no representados). Para cada compuesto ensayado, se prepararon dos muestras de control sin compuesto extrayendo nuevamente alícuotas de concentrado de plaquetas (17 ml si se usaba una bolsa de 8 ml, 4 ml si se usaba una bolsa de 3 ml) del mismo tubo del primer conjunto de tubos de centrífuga de 50 ml de la que se extrajo la muestra de compuesto, y dividiéndola, como antes, entre las Medibags. Una de cada par de Medibags que contenían un compuesto y una de cada par de Medibags de control se iluminaron con 5 Joules/cm^{2} en el dispositivo descrito antes en el Ejemplo 1. Después, todas las Medibags experimentales y de control se colocaron en un agitador de plaquetas para almacenarlas durante 5 días. Los mismos experimentos se repitieron varias veces para obtener más datos estadísticamente significativos, indicados como "n", el número de puntos de medición representados, en los gráficos de las Figs. 21-24 discutidos más abajo.

Para obtener datos para muestras de control el día 1, se extrajeron aproximadamente 3 ml del volumen remanente de cada una de las tres unidades y se dividieron en dos tubos de 1,5 ml. Estas muestras se ensayaron para medir el pH según se describe más abajo. También se hizo un recuento de plaquetas a una dilución 1:3 como se describe más abajo. El concentrado residual de plaquetas de cada unidad se centrifugó durante 10 minutos a 3800 r.p.m. (3000 g) en Sorval RC3B (DuPont Company,Wilmington, Delaware) para paletizar las plaquetas. Después se decantó el plasma en 2 tubos estériles de 50 ml (uno el día 1 y el otro se almacenó a 4ºC para el día 5) para utilizar en el ensayo de agregación.

1) Expresión de GMP-140

Cuando se activan las plaquetas, una glicoproteína de membrana de gránulos alfa, denominada p-selectina
(GMP140), queda expuesta sobre la superficie de la plaqueta. Menos del 5% de las plaquetas normales no estimuladas, frescas, expresan por citometría de flujo niveles detectables de GMP140. Véase en general M.J. Metzelaar, Studies on the Expression of Activation-Markers on Human Platelets (Tesis 1991).

Para medir la GMP140, una pequeña alícuota de plasma rico en plaquetas se coloca en tampón HEPES que contiene un anticuerpo que se une a GMP 140 o a un isotipo de IgG de ratón control. CD62 es un anticuerpo moclonal disponible comercialmente que se une a GMP140 (disponible de Sanbio, Uden, Países Bajos; Caltag Labs, So. San Francisco, CA, y Becton Dickinson, Mountain View, CA). Después de una incubación de 15 min. a temperatura ambiente, se añade al tubo, en cantidades de saturación, IgG anti-ratón F(ab')2 de cabra conjugada a FITC (Caltag Laboratories, So. San Francisco, CA) y se deja que incube a temperatura ambiente (RT) durante 15 min. Finalmente, las células se diluyen en paraformaldehído al 1% en solución salina tamponada con fosfato y se analizan en un FACSCAN^{TM} (Becton Dickinson, Mountain View, CA). El control positivo se hace añadiendo miristato acetato de forbol (PMA) al sistema, a una concentración final de 2 x 10^{-7} M.

En este ejemplo se empleó CD62 para medir el impacto, si lo hubiera, de la irradiación en presencia de varios compuestos de la presente invención sobre la activación de plaquetas. El anticuerpo se mezcló con tampón HEPES (10 \mul de anticuerpo [0,1 mg/ml]:2,49 ml de tampón) y se almacenó en alícuotas de 50 \mul a -40ºC antes del uso. Un control positivo estaba constituido por: 10 \mul de CD62, 8 \mul de PMA y 2,482 ml de tampón HEPES. También se empleó un control de IgG1 de ratón (0,05 mg/ml) concentrado 5x (Becton Dickinson, Mountain View, CA #9040). El anticuerpo se diluyó en tampón HEPES (20 \mul de anticuerpo:2,48 ml de tampón) y se almacenó a -40ºC. Se almacenó miristato acetato de forbol (PMA) (Sigma, St. Louis, MO) -40ºC. Al momento de usarlo, éste se disolvió en DMSO (la concentración de trabajo fue de 10 \mug/ml).

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Se preparó paraformaldehído al 1% (PFA) (Sigma, St. Louis, MO) añadiendo 10 g de paraformaldehído a 1 litro de PBS. Esto se calentó hasta 70ºC y después se añadió gota a gota NaOH 3M hasta que la solución se tornó transparente. Se enfrió la solución y el pH se ajustó a 7,4 con HCl 1N. La solución se filtró y se guardó.

El procesamiento de cada una de las muestras de concentrados de plaquetas después del tratamiento incluyó añadir 5 microlitros de concentrado de plaquetas, diluido 1:3 en tampón HEPES, a cada tubo de microcentrífuga que contenía el anticuerpo CD62 y los reactivos apropiados y mezclar muy suavemente con vórtex. Las muestras se incubaron después durante 15 min. a temperatura ambiente.

A cada tubo se añadió (5 microlitros) el IgG-FITC anti-ratón de cabra (diluido 1:10 en tampón HEPES) y la solución se mezcló suavemente con vórtex. Las muestras se incubaron durante 15 min. más a temperatura ambiente. Seguidamente, a cada tubo se añadió 1 ml de PFA al 1% en PBS y se mezcló suavemente. Se analizaron las plaquetas en el FACSCAN^{TM}. Los resultados se muestran en las Figs. 21C, 22C, 23C y 24C (las Figs. 21 corresponden al compuesto 2, las Figs. 22 corresponden al compuesto 6, las Figs. 23 corresponden al compuesto 17 y las Figs. 24 corresponden al compuesto 18). Claramente, tres de los cuatro compuestos ensayados, 2, 6 y 17, exhibieron una diferencia pequeña o ninguna diferencia entre el control no tratado el día 5 (D5) y la muestra tratada con luz y compuesto psoraleno (PCD). Sólo el compuesto 18 exhibió un aumento notable por encima del control. Pero el valor seguía siendo inferior al valor de control positivo.

2) Mantenimiento del pH

Los cambios del pH de plaquetas en el concentrado pueden alterar sus características morfológicas y su supervivencia después de una transfusión. Moroff, G. et al., Factors Influencing Changes in pH during Storage of Platelet Concentrates at 20-24ºC, Vox Sang, 42:33 (1982). El intervalo de pH en el que funcionan normalmente las plaquetas es de aproximadamente 6,0-6,5 a 7,6. Stack, G. y E.L. Snyder, "Storage of Platelet Concentrate", Blood Separation and Platelet Fractionation 99, at 107 (1991). Para medir el pH de las muestras se usó un analizador de pH/gases en sangre CIBA-CORNING 238 (CIBA-CORNING, Norwood, MA). Se introdujo en el analizador de pH/gases en sangre una pequeña cantidad de concentrado de plaquetas de cada muestra.

Las mediciones de pH se hicieron para todas las muestras al tiempo cero y después de 5 días de almacenamiento. Las Figs. 21D, 22D, 23D y 24D son gráficos de barras que indican los resultados del pH para un control oscuro, un control con luz y un compuesto experimental de luz más compuesto. Estos gráficos indican que el pH de las muestras de concentrado de plaquetas después de la iluminación en presencia de cualquiera de los compuestos permanece por encima de pH 6,5. Así, las plaquetas permanecen a un pH aceptable para las plaquetas almacenadas después del tratamiento de fotoinactivación usando compuestos descritos en la presente memoria.

3) Agregación

La agregación plaquetaria se mide por el cambio de la transmisión óptica que una muestra de plaquetas exhibe después de estimular la agregación. La agregación plaquetaria se midió usando un Whole Blood Aggregometer (Chrono-Log Corp., Havertown, PA, modelo 560 VS). Se controló el número de plaquetas de cada muestra para que fuera constante para cada medición. Se usó un contador de células Sysmex modelo F800 (Toa Medical Electronics, Kobe, Japón) para medir el recuento de plaquetas en las muestras de plaquetas y se usó plasma autólogo para ajustar a 300.000/ml los recuentos de plaquetas del concentrado de plaquetas.

Para el procedimiento, todas las muestras se incubaron en un tubo de plástico con tapón durante 30 min. a 37ºC para la activación. El agregómetro se calentó hasta 37ºC. Para medir la agregación plaquetaria se usó el canal óptico. La velocidad magnética del agregómetro se fijó en 600 r.p.m. El concentrado de plaquetas remanente de las unidades obtenidas que no se extrajo como muestra para tratamiento, se centrífugo a alta velocidad (14.000 g) con una microcentrífuga durante 5 min. para obtener recipientes de plasma pobre en plaquetas autólogo a las muestras experimentales.

Para comenzar, se añadieron 0,45 ml del plasma autólogo pobre en plaquetas junto con 0,5 ml de solución salina a una cubeta de vidrio y se colocó en el canal de PPP. Después se añadieron a una cubeta de vidrio (que contenía un imán pequeño) 0,45 ml del concentrado de plaquetas de muestra y 0,50 ml de solución salina. Después de un minuto, se añadieron a la cubeta de muestra los reactivos ADP y colágeno (10 \mul). La concentración final de ADP fue 10 \muM y la concentración final de colágeno fue de 5 \mug/ml. La agregación plaquetaria se registró durante aproximadamente 8-10 min. o hasta que se alcanzó la lectura máxima.

Los resultados aparecen en las Figs. 21B, 22B, 23B y 24B. La línea de 100% de agregación es el nivel en el que el registrador se fijó en cero. La línea de 0% de agregación es el nivel en el que transmitían las plaquetas antes de añadir ADP y colágeno. El valor de agregación para la muestra se determina tomando el valor máximo de agregación como porcentaje del intervalo total. Tres de los cuatro compuestos ensayados evidenciaron una diferencia pequeña o ninguna diferencia en los niveles de agregación entre las muestras tratadas con compuesto y las muestras no tratadas que se almacenaron durante 5 días. El Compuesto 2 exhibió una pequeña reducción en la agregación, de aproximadamente 8% respecto del control del día 1. La agregación para la muestra tratada con compuesto y uv fue la misma que la de la muestra tratada sólo con uv. Esto es evidencia que respalda el hecho de que los compuestos descontaminantes ensayados no tienen efecto significativo sobre la agregación plaquetaria cuando se usan en los métodos descritos en la presente memoria.

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4) Recuento

Para medir el recuento en las muestras de plaquetas se usó un contador de células Sysmex. Las muestras se diluyeron 1:3 en solución salina de banco de sangre.

Los resultados de las mediciones del recuento de plaquetas aparecen en las Figs. 21A, 22A, 23A y 24A. Para cada uno de los compuestos, las muestras no muestran ninguna caída o una caída pequeña en el recuento de plaquetas entre el control del Día 5 y la muestra tratada el Día 5. Resulta interesante que las muestras tratadas con los Compuestos 6, 17 y 18 presentan un recuento de plaquetas más alto que las muestras tratadas sólo con luz. Por ejemplo, las muestras tratadas con el Compuesto 6 tuvieron recuentos equivalentes al del control del día 5, pero las muestras tratadas sólo con luz ultravioleta evidenciaron una reducción de aproximadamente 33% en el recuento de plaquetas. Así, el tratamiento con los compuestos descritos en la presente memoria no sólo es compatible con el mantenimiento del recuento de plaquetas, sino que realmente parece impedir la caída en el recuento de plaquetas causada por la exposición a la luz ultravioleta.

Ejemplo 20

Un compuesto preferido para descontaminar sangre para utilizar posteriormente in vivo no debe ser mutagénico para el receptor de la sangre. En la primera parte de este experimento, se analizaron algunos compuestos para determinar su nivel de genotoxicidad en comparación con el aminometiltrimetilpsoraleno. En la segunda parte, se midió la clastogenicidad in vivo de algunos compuestos descritos en la presente memoria observando la formación de micronúcleos en reticulocitos de ratón.

1) Genotoxicidad

Los cultivos de células de mamíferos son herramientas valiosas para evaluar el potencial clastogénico de sustancias químicas. En tales estudios, las células se exponen a las sustancias químicas con y/o sin sistema de activación metabólica de rata S-9 (S-9) y después se examinan para determinar la supervivencia celular (para una evaluación de la genotoxicidad) o cambios en la estructura cromosómica (para un ensayo de aberración cromosómica).

Se usaron células de ovario de hámster chino (CHO; ATCC CCL 61 CHO-K1 que requieren prolina) para los ensayos de genotoxicidad y aberración cromosómica in vitro. Las células CHO se usan extensamente para los ensayos citogénicos porque tienen un número relativamente bajo de cromosomas (2n = 20) y una velocidad de multiplicación rápida (\sim12 a 14 horas, dependiendo de las condiciones de cultivo). Las células crecieron en una atmósfera con CO_{2} al 5% a aproximadamente 37ºC en medio 5a de McCoy con suero fetal bovino al 15% (FBS), L-glutamina 2 mM y solución de penicilina-estreptomicina al 1% para mantener un crecimiento exponencial. Este medio se usó también durante la exposición de las células al compuesto de ensayo cuando no se usó S-9. Se mantuvieron los cultivos celulares y las exposiciones de células se realizaron en matraces T-75 o T-25.

Cada uno de los compuestos de muestra se ensayó a siete diluciones: 1, 3, 10, 33, 100, 333 y 1000 \mug/ml. El compuesto se añadió en medio 5a de McCoy completo. Después de haber añadido el compuesto, se hicieron crecer las células en la oscuridad a aproximadamente 37ºC durante aproximadamente 3 horas. Después se aspiró el medio que contenía el compuesto de ensayo, se lavaron las células tres veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS) a aproximadamente 37ºC y se añadió medio 5a de McCoy completo fresco. El control positivo era metansulfonato de metilo. El disolvente control era dimetilsulfóxido (DMSO) diluido en medio de cultivo. Para los ensayos en que se usó activación metabólica (véase más abajo) la mezcla de activación se añadió también al disolvente control. Los cultivos se incubaron después durante un tiempo adicional de aproximadamente 12 horas antes de la cosecha. Se añadió colchicina (concentración final, 0,4 \mug/ml) aproximadamente 2,5 horas antes de la cosecha.

Después de aproximadamente 2,5 horas en colchicina, las células se cosecharon. Las células se quitaron de la superficie de los matraces usando un raspador de células. La suspensión de células resultante se centrifugó, se aspiró el material sobrenadante y se añadieron 4 ml de una solución hipotónica de KCl 0,075M a las células durante 15 min. a aproximadamente 37ºC. Después se centrifugaron las células, se aspiró el material sobrenadante y las células se suspendieron en un fijador de metanol:ácido acético (3:1). Después de cambiar tres veces el fijador, se prepararon portaobjetos secados al aire utilizando células de todos los matraces. La densidad celular y la calidad de la metafase en el portaobjetos inicial de cada matraz se controlaron usando un microscopio de contraste de fase; de cada matraz se prepararon al menos dos portaobjetos de densidad celular apropiada. Los portaobjetos se tiñeron en Giemsa al 3% durante 20 min., se enjuagaron en agua desionizada y se pasaron por xileno. Se montaron cubreobjetos con Permount. Las muestras se examinaron después para determinar qué concentración de cada compuesto de ensayo representaba una dosis tóxica.

Un análisis de los resultados reveló que el AMT era genotóxico a la concentración de 30 \mug/ml. En cambio, los compuestos 2 y 6 eran genotóxicos sólo a la concentración de 100 \mug/ml, más de tres veces la dosis tóxica de AMT.

En este experimento se ensayó también un compuesto psoraleno con una estructura distinta de la de los compuestos descritos en la presente memoria, el 8-aminometil-4,4',5'-trimetilpsoraleno, y reveló ser tóxico a 10 \mug/ml. Si bien el aminometil compuesto sustituido en posición 8 y estructuras similares pueden no ser adecuados para los métodos descritos en la presente memoria, pueden ser útiles para fines alternativos. A la luz de la capacidad de los compuestos de prevenir la replicación de los ácidos nucleicos, en combinación con su extrema toxicidad, los compuestos podrían usarse, por ejemplo, para tratar enfermedades caracterizadas por un crecimiento celular descontrolado, tales como el cáncer.

2) Protocolo del Ensayo de Micronúcleos

Se prepararon soluciones salinas para los Compuestos 2, 6, 17 y 18 a varias concentraciones. Se inyectaron ratones Balb/c macho con 0,1 ml de una solución de compuesto a través de la vena caudal. Al menos se inyectaron 3 ratones por nivel de dosis. Se usó solución salina sola como control negativo. Para control positivo se administró ciclofosfamida (cicloPP) a la dosis de 30 mg/kg. En el grupo experimental, las inyecciones se repitieron una vez al día durante cuatro días. En el grupo de control positivo, la muestra se administró sólo una vez, el día 3. El día 5 se extrajeron varios microlitros de sangre de cada individuo y se esparcieron sobre un portaobjetos de vidrio. Las células se fijaron en etanol absoluto y se almacenaron en un estante de portaobjetos.

Para el análisis, las células se tiñeron con naranja de acridina y se examinaron con un microscopio de fluorescencia por recuento de: (i) el número de reticulocitos por cada 5000 eritrocitos, y (ii) el número de reticulocitos micronucleados por cada 1000 reticulocitos. Los reticulocitos se distinguían por su fluorescencia roja debido a la presencia de ARN. Se distinguían micronúcleos por su fluorescencia verde debido a la presencia de ADN. Se calculó después el porcentaje de reticulocitos (%PCE). Una disminución de la frecuencia de eritrocitos, representada por un aumento del porcentaje de reticulocitos, es indicativa de toxicidad en la médula ósea. Se calculó también el porcentaje de reticulocitos con micronúcleos (%PCE con MN). Un aumento del %PCE con MN es una medida de la clastogenicidad.

TABLA 20

48

Después de haber determinado los resultados iniciales, se repitió el experimento usando niveles de dosis aumentados, hasta que: (i) se observó formación de micronúcleos, (ii) se observó toxicidad en médula ósea, o (iii) se alcanzó la dosis letal, o (iv) se administró una dosis de 5 g/kg. Para los ensayos con cada uno de los compuestos 2, 6, 17 y 18, se alcanzó plenamente la dosis letal antes de que hubiera señales de toxicidad en médula ósea o formación de micronúcleos. Los resultados del experimento se presentan en la Tabla 20, más arriba. Según lo que se deduce de la tabla, no se observó toxicidad en la médula ósea para ninguno de los compuestos en las dosis ensayadas. El valor porcentual de reticulocitos para el tratamiento con cada compuesto permaneció próximo al valor del control negativo. Esto contrasta con una caída de aproximadamente 2-2,5% PCE/RBC observada en el control positivo, lo que representa un empobrecimiento de los eritrocitos debido a la toxicidad en médula ósea. Ninguno de los compuestos presentó tampoco acción clastogénica.

Ejemplo 21

En el Ejemplo 13 se muestra la inactivación del virus HIV exento de células usando los compuestos y métodos descritos en la presente memoria. Este ejemplo muestra la inactivación de HIV asociado a células usando también compuestos descritos en la presente memoria.

Se usaron células H9 infectadas crónicamente con HIV_{IIIB}. (H9/HTLV-III-B-NIH 1983, No. de catálogo 400). Se mantuvieron los cultivos de estas células en medio Eagle Modificado de Dulbecco de elevado contenido en glucosa, suplementado con L-glutamina 2 mM, 200 u/ml de penicilina, 200 \mug/ml de estreptomicina y suero fetal bovino al 9% (Intergen Company, Purchase, NY). Para el mantenimiento, el cultivo se dividió una vez a la semana a una densidad de 3 x 10^{5} a 4 x 10^{5} células/ml y aproximadamente cuatro días después de la división, se añadió bicarbonato de sodio al 3,3% según necesidad. Para el procedimiento de inactivación, las células se usaron tres días después de que fueran divididas. Se peletizaron de su medio de cultivo a 400 g x 10 min., el material sobrenadante se descartó y las células se resuspendieron en un concentrado de plaquetas humanas (PC) de 1-5 días de antigüedad (pH 7,5-7,6) a una concentración de 2 x 10^{6} células/ml. Se prepararon alícuotas de la suspensión de células infectadas con PC para controles oscuros libres de psoraleno, para controles sólo con UVA libres de psoraleno, para controles oscuros con psoraleno y para la muestra experimental de psoraleno más UVA. Se diluyeron en agua soluciones patrón concentradas esterilizadas por filtración de cada psoraleno para dar alícuotas adecuadas para producir una concentración final 150 \muM. (Una solución patrón 10 mM del compuesto 18 se diluyó aproximadamente 67 veces y un patrón 2 mM del compuesto 2 se diluyó aproximadamente 13 veces). Después de un período de equilibración de aproximadamente 30 min. a temperatura ambiente, 0,5 ml de cada uno de los controles oscuros se colocó en un criovial y se guardó en la oscuridad a -80ºC. Para la iluminación con UVA, 8 ml de la alícuota libre de psoraleno y 8 ml de cada alícuota que contenía psoraleno se introdujeron en una bolsa de Teflon^{TM} Fl 20 modificada (modificada para que tuviera una superficie total de 92 cm^{2}, The West Co., Phoenixvill, PA) a través de una jeringa de plástico descartable de 10 ml conectada a uno de los puertos de polipropileno de la bolsa. Esto dio una longitud media de paso de 0,17 cm. Las bolsas se iluminaron después a una exposición total de 3 Joules/cm^{2} en el dispositivo descrito en el Ejemplo 1, más arriba, conectado a un baño de agua de refrigeración circulante fijado a 4ºC que mantiene la temperatura en la bolsa a aproximadamente 22-25ºC. Durante la exposición, el dispositivo se sacudió en un agitador de plaquetas (Helmer Labs, Noblesville, IN). Después de la exposición, los contenidos de las bolsas se extrajeron con una jeringa fresca a través del puerto restante no usado de la bolsa y se colocaron en crioviales para almacenamiento a -80ºC en la oscuridad hasta su análisis.

Las muestras almacenadas se descongelaron a 37ºC, después se titularon en un ensayo de microplaca de HIV, según se describe en Hanson, C.V., Crawford-Miksza, L. y Sheppard, H.W., J. Clin. Micro 28:2030 (1990), y según se describe en el Ejemplo 13 anterior, con las siguientes modificaciones. La eliminación de coágulos de cada muestra se realizó antes del cultivo. A causa de que se deseaba el cultivo de un volumen programado de 4 ml después de eliminar el coágulo, se transfirió un exceso de muestra (6 ml) a un tubo de polipropileno y se diluyó hasta un volumen total de 60 ml con. Muestras de ensayo y control del procedimiento de inactivación se diluyeron en medio de ensayo al 50% y plasma humano normal combinado al 50%. Las muestras se diluyeron en forma seriada directamente en placas de 96 pocillos (Corning Glass Works, Corning, NY). Las placas se mezclaron en un agitador oscilante durante 30 segundos y se incubaron a 37ºC en atmósfera de CO_{2} al 5% durante 1-18 horas. A cada pocillo se añadieron células MT-2 (0,025 ml) [clon alfa-4, disponibles (número de catálogo 237) de National Institutes of Health AIDS Research and Reference Reagent Program, Rockville, Md.] para obtener una concentración de 80.000 células por pocillo. Después de 1 hora más de incubación a 37ºC en CO_{2} al 5%, se añadieron a cada pocillo 0,075 ml de medio de ensayo que contenía 1,6% de agarosa SeaPlaque (FMC Bioproducts, Rockland, Maine) y precalentada a 38,5ºC. Las placas se mantuvieron a 37ºC durante unos pocos minutos hasta que se habían acumulado varias placas y después se centrifugaron en soportes de placas a 600 x g durante 20 minutos en una centrífuga preenfriada a 10ºC. En la centrífuga se formaron monocapas antes de que gelificara la capa de agarosa. Las placas se incubaron a 37ºC durante 5 días en atmósfera en CO_{2} al 5% y se tiñeron mediante la adición a cada pocillo de 0,05 ml de yoduro de propidio de 50 \mug/ml (Sigma Chemical Co.) en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4). Después de 24-48 horas, se examinaron visualmente las microplacas teñidas con fluorescencia roja colocando las placas en una caja de luz UV de 304 nm con 8.000 \muW/cm^{2}
(Fotodyne, Inc., New Berlin, Wis.). El recuento de las placas se hizo con un aumento de 20x a 25x con un estereomicroscopio.

Los resultados fueron los siguientes: el Compuesto 2 (150 \muM) inactivó >6,7 destrucciones logarítmicas de HIV después de una irradiación de 3 joules/cm^{2} (en comparación con controles oscuro y con luz de 0 destrucción logarítmica de inactivación, a partir de log del título de 6,1 unidades/ml que forman placa). A la misma concentración e igual tiempo de irradiación, el Compuesto 18 inactivó >7,2 destrucciones logarítmicas de HIV (en comparación con un control oscuro de 0 destrucciones logarítmicas y un control de luz de 0,1 destrucciones logarítmicas, a partir del título de 6,6). Este ejemplo respalda el hecho de que los compuestos descritos en la presente memoria son eficaces para inactivar virus asociados a células.

Ejemplo 22

Este ejemplo incluye una estimación de formulaciones de medios sintéticos medidos mediante los siguientes ensayos de la función plaquetaria in vitro: 1) mantenimiento del pH; 2) agregación plaquetaria ("Agg") y 3) expresión de GMP-40. Los ensayos para cada una de estas pruebas han sido descritos más arriba.

Se prepararon cuatro formulaciones: S 2.19, S 2.22, S 3.0 y S 4.0. La composición de estas formulaciones de medios sintéticos se muestra en la Tabla 21, más abajo:

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TABLA 21*

49

* Cantidades en mM

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Una unidad de plasma humano rico en plaquetas (PRP) se obtuvo del banco de sangre de Sacramento. La unidad se centrífugó a temperatura ambiente durante 6 minutos a 4000 r.p.m. y después se transfirió a una unidad de prensado. Usando una línea de transferencia conectada, se exprimió el plasma de la unidad dejando aproximadamente 9,4 ml de plasma residual.

Se dejó la unidad en reposo durante 1 hora y después se amasó suavemente para resuspender las plaquetas. A
0,6 ml de la suspensión se añadieron 2,4 ml de plasma y el contenido total se transfirió a una minibolsa de Teflon^{TM}. Se determinó el pH de la unidad reconstituida y se hicieron otros ensayos el día siguiente, con los siguientes resultados:

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50

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El resto de la unidad se usó después para evaluar el medio sintético en cuanto al almacenamiento de plaquetas con y sin fotodescontaminación. A cada formulación (3,2 ml) se añadieron alícuotas (0,8 ml) de la unidad en tubos. 3 ml de cada mezcla se transfirieron a una minibolsa de Teflon^{TM} (concentración final de plasma 20%).

Cinco días después, se evaluó la función de plaquetaria usando la batería de ensayos descrita anteriormente. En la siguiente Tabla 22 se muestran los resultados para cada una de las formulaciones de medios sintéticos.

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TABLA 22

51

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Aparentemente, el medio sintético que contenía glucosa 2 mM (es decir, S 2.22) mantuvo la función plaquetaria, medida por GMP140 y la agregación, mejor que el medio sintético que no contenía glucosa (es decir, S 2.19).

Para confirmar el hallazgo anterior, se repitieron los experimentos (siendo "n" el número de experimentos repetidos) con estas formulaciones así como con formulaciones adicionales exentas de glucosa (3.0 y 4.0). La función plaquetaria se evaluó antes y después del almacenamiento y junto con la fotodescontaminación. En las siguientes Tablas 4, 5 y 6 se proporciona un resumen de los resultados.

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TABLA 23*

52

* Sin UVA; Día 1 de Almacenamiento.

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TABLA 24*

53

* Sin UVA; Día 5 de Almacenamiento.

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TABLA 25*

54

* UVA a 3 Joules; Día 5 de Almacenamiento.

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Ejemplo 23 Efecto Sobre la Cinética de Adsorción del Reparto de S-59 en Plaquetas

Según se discutió previamente, la captación de S-59 por las plaquetas puede suceder durante un período de varias horas antes de que suceda la saturación. La Fig. 25A representa gráficamente la captación de S-59 (C_{0} = 50 \muM) por las plaquetas con el paso del tiempo (parte superior) y la liberación de S-59 por las plaquetas con el paso del tiempo (parte inferior). Según se muestra en el gráfico superior, el equilibrio de S-59 se logra en aproximadamente
dos horas.

Este ejemplo está dirigido a la cuestión de si el reparto de S-59 en plaquetas tiene un efecto considerable sobre la cinética de adsorción. La cinética de adsorción de un PC preincubado con S-59 durante 24 horas antes de la adsorción se comparó con la cinética de adsorción en el PC sin un período de preincubación. Las cinéticas de adsorción en ambos casos (con o sin un período de preincubación de 24 horas) se determinaron poniendo en contacto PC al 35% (es decir, 35% de plasma/65% de PAS III) inoculado con una concentración 150 \muM (C_{0}) de S-59 con adsorbente sólido (Amberlite XAD-4^{TM}; 0,1 g/3,0 ml). Se extrajeron muestras de PC en varios puntos de medición y se analizaron para determinar niveles de S-59 residual.

La Fig. 25B representa gráficamente los resultados; los datos representados por cuadrados llenos/línea llena son los datos de adsorción sin preincubación, y los círculos abiertos/línea punteada representan los datos de adsorción con incubación. Los resultados indican que la preincubación de plaquetas con S-59 no dio como resultado una adsorción por lotes considerablemente menor. La cinética de adsorción por lotes no parece verse afectada desfavorablemente por la captación plaquetaria de los psoralenos. Los dispositivos de adsorción de flujo, sin embargo, poseen un tiempo de contacto mucho más corto. Los datos presentados en la Fig. 25A sugieren que el transporte de S-59 desde el interior de las plaquetas podría ser una limitación fundamental para la eliminación de S-59 en dispositivos con corto tiempo de residencia.

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Ejemplo 24 Eliminación del S-59 Residual y Fotoproductos de S-59 del PC Iluminado y del Plasma Iluminado por Adsorción de Flujo

Se realizaron experimentos de flujo con columnas Pharmacia C (vidrio de borosilicato) (Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) ajustadas con adaptadores de flujo de malla de nylon especial de 80 \muM. Las columnas se prepararon con resina estéril y se enjuagaron con PAS III estéril antes de cada experimento. Las plaquetas se prepararon en 35% de plasma/65% de PAS III con S-59 150 \muM y se iluminaron a 3,0 J/cm^{2} en grandes bolsas de almacenamiento de plaquetas PL-2410. Después de la iluminación, se permitió que las plaquetas se agitaran durante al menos una horas antes de pasarlas a través del dispositivo de adsorción de S-59. Las mezclas de plaquetas se bombearon a través de la columna con una bomba peristáltica de manera que el caudal pudiera controlarse con precisión. Se utilizaron conexiones estériles de manera que las unidades plaquetarias pudieran transferirse desde una bolsa PL2410, a través de la columna de adsorción estéril, a otra bolsa PL2410 sin contaminación. Se analizó una muestra de mezcla de plaquetas extraída para determinar S-59 residual y fotoproductos utilizando HPLC. Además, las unidades se almacenaron en bolsas PL2410 y se monitorearon para determinar la función plaquetaria a lo largo del almacena-
miento.

Los datos que se muestran en la Fig. 26 resumen el efecto del caudal en una columna de 1 cm de diámetro, del tamaño de partículas y de las plaquetas sobre los niveles residuales de S-59 en unidades plaquetarias iluminadas. La reducción del caudal dio como resultado un incremento en la eliminación de S-59 para la adsorción de flujo con Amberlite XAD-16^{TM} (10 g/300 ml). Resulta interesante que no se observó dependencia del caudal para Amberchrom cg-161^{TM}, una versión de partículas pequeñas (120 \mum de diámetro) de Amberlite XAD-16^{TM} (250-850 \mum de diámetro). El efecto de las plaquetas sobre la eliminación de S-59 se demostró examinando la adsorción de S-59 del 35% de plasma/65% de PAS III iluminado. Los niveles de S-59 residual fueron mucho menores en las muestras de 35% de plasma/65% de PAS III, sugiriendo que el transporte de S-59 y los fotoproductos desde las plaquetas es la principal resistencia cinética a la adsorción de S-59. En la Fig. 26, los datos para las plaquetas en 35% de plasma/65% de PAS III están indicados por cuadrados, mientras que los datos para 35% de plasma/65% de PAS III están indicado por círculos; los triángulos abiertos indican niveles residuales de la adsorción de S-59 con Amberchrom cg-161 (poliestireno de 120 de diámetro, 5 g/300 ml).

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Ejemplo 25 Función Plaquetaria Después de la Adsorción de Flujo

Este ejemplo incluyó estudios de la función plaquetaria y estudios sobre factores de coagulación; los estudios sobre factores de coagulación fueron realizados por UCSF Hematology Laboratory (San Francisco, CA). Las plaquetas se recolectaron en bolsas de almacenamiento de plaquetas PL2410 después del pasaje a través del dispositivo de adsorción de flujo (columna Pharmacia C; Pharmacia Biotech. Inc., Piscataway, NJ). Las unidades plaquetarias se almacenaron en condiciones estándar (plaquetas agitadas a 22ºC) y se analizaron para determinar la función plaquetaria después de tres días de almacenamiento. Los datos de la función plaquetaria para las plaquetas tratadas con adsorbente
(10 g/300 ml) y almacenadas durante dos días en bolsas PL2410 se resumen en la Tabla E.

TABLA E

55

Además de los datos resumidos en la Tabla E, se tomaron mediciones de pH, pO_{2}, y pCO_{2} durante un período de cinco días de almacenamiento. No se observó ninguna diferencia significativa entre las unidades tratadas y las de control. Finalmente, debe destacarse que estos experimentos se realizaron con resinas Amberlite^{TM} estándar (es decir, resinas que no fueron tratadas por Supelco, Inc.). Los compuestos lixiviables que son eliminados por el proceso de limpieza de Supelco, Inc., no parecen tener un impacto sustancial sobre la función plaquetaria según indican los ensayos in vitro.

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Ejemplo 26 Eliminación de S-59 Residual y Fotoproductos de S-59 del PC Iluminado por Adsorción por Lotes

Se investigó la eliminación de S-59 residual y fotoproductos de S-59 del PC iluminado por adsorción por lotes. Se inoculó una unidad de plaquetas frescas (es decir, 35% de plasma/65% de PAS III) con ^{3}H-S-59 150 \muM y se transfirió a una bolsa PL2410 (Baxter). La bolsa se iluminó a 3,0 J/cm^{2} y se transfirieron alícuotas de 20 ml de PC iluminado a bolsas PL2410 que contenían 0,67 g de adsorbente (10 g/300 ml), Amberlite XAD-4^{TM} o Amberlite XAD-16^{TM}. Las bolsas se colocaron en un incubador de plaquetas. Dos unidades plaquetarias separadas se trataron para cada adsorbente; una unidad se agitó durante 3 horas antes de que las plaquetas se separaran del adsorbente y se transfirió a otra bolsa, y la otra unidad plaquetaria se dejó en contacto con el adsorbente durante 4 días. Se retiraron muestras de las unidades antes del tratamiento, después de 3 horas de contacto con el adsorbente y en el día 4.

Se analizaron las muestras para determinar S-59 residual y la función plaquetaria. Los resultados de la eliminación de S-59 se resumen en la Tabla F.

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TABLA F

57

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Los datos de la Tabla F sugieren que la adsorción de los fotoproductos de S-59 está cercana a completarse después de 3 horas de contacto. El 36-37% de la radioactividad no adsorbida representa recuentos asociados con macromoléculas plasmáticas (aproximadamente 18%), macromoléculas plaquetarias (aproximadamente 15%), y agua que ha intercambiado ^{3}H (aproximadamente 10%). La radioactividad residual que típicamente está asociada a macromoléculas o agua (43%) concuerda muy bien con los recuentos residuales de las muestras que se trataron durante 4 días (36-37%). Los niveles más bajos de radioactividad residual que se observaron en el PC después de la adsorción pueden deberse a la alta estimación de los recuentos asociados al agua o a la eliminación real de macromoléculas plasmáticas covalentemente asociadas a S-59.

Ejemplo 27 Eliminación de S-59 Residual y Fotoproductos de S-59 del PC Iluminado por Adsorción por Lotes

Este ejemplo, que examinó la eliminación de S-59 residual y de los fotoproductos de S-59 de las mezclas de plaquetas iluminadas por adsorción por lotes, fue una continuación del Ejemplo 26. Se inoculó una unidad de plaquetas frescas suspendidas en 35% de pasma/65% de PAS III con S-59 150 \muM y se iluminó a 3,0 J/cm^{2} en una bolsa de almacenamiento de plaquetas PL2410 grande. La mezcla de plaquetas iluminada se puso en contacto con Amberlite XAD-4^{TM} (10 g/300 ml). Se retiraron muestras de la mezcla de plaquetas a diversos intervalos de tiempo y se analizaron para determinar el S-59 residual y sus fotoproductos utilizando HPLC.

Los perfiles de HPLC (no representados) indicaron una eliminación de S-59 mayor que 99% a las 2 horas con niveles no detectables de S-59. Los resultados se exponen gráficamente en la Fig. 27. En la Fig. 27, los cuadrados representan niveles residuales de S-59 en una unidad de plaquetas que contiene Amberlite XAD-4^{TM} "libre" (es decir, que no abarca recinto/saco de malla). Los niveles de S-59 residual en unidades que contenían Amberlite XAD-4^{TM} contenidas en un recinto/saco de malla de 30 \mum (Spectra/Mesh de 30 \mum de nylon, área abierta = 21%) y recinto/saco de malla de 60 \mum (Spectra/Mesh de 60 \mum de nylon, área abierta = 45%) están representados por círculos y triángulos, respectivamente. Los porcentajes se refieren a una mezcla de plaquetas no iluminada (S-59 de 150 \mum).

Ejemplo 28 Análisis por HPLC de PC Iluminado

Se realizó un estudio en el que muestras de 20 ml de 35% de plasma/65% de PAS III iluminado se pusieron en contacto con Amberlite XAD-16^{TM} y Hemosorba CH-350^{TM} durante 4 días, después se sometieron a análisis por HPLC. La Fig. 28A representa cromatogramas de HPLC de 35% de plasma/65% de PAS III iluminado después de ningún tratamiento (es decir, sin adsorbente) (parte superior), adsorción con 0,033 g/ml de Amberlite XAD-16^{TM} (parte media), y adsorción con 0,033 g/ml de Hemosorba CH-350^{TM} (parte inferior).

El S-59 original se elimina casi completamente en el caso de ambos adsorbentes con vestigios de los fotoproductos B, D y E. El Fotoproducto B parece ser el más difícil de eliminar, pero probablemente representa menos del 1% del S-59 original en base molar. El análisis de la Fig. 28A revela que Hemosorba CH-350 parece eliminar los compuestos además de los fotoproductos, según lo indicado por la reducción en el pico de inyección (tiempo de retención = 3 minutos); de este modo, la Hemosorba CH-350 podría tener potencialmente un efecto adverso sobre la función plaquetaria eliminando compuestos necesarios tales como nutrientes.

La Fig. 28B representa cromatogramas de HPLC de PC al 35% (es decir, 35% de plasma/65% de PAS III) que contenía S-59 no iluminado 150 \muM (parte superior), S-59 iluminado 150 \muM (parte media), y S-59 iluminado 150 \muM tratado con 10,0 g de Amberlite XAD-4^{TM} por 300 ml (parte inferior); el adsorbente estaba contenido en un recinto/saco de malla de nylon de 30 \mum y el tiempo de contacto fue de tres horas. El pico correspondiente a S-59 está presente en los cromatogramas representando S-59 no iluminado (parte superior) y S-59 iluminado (parte media) a un tiempo de retención de aproximadamente 12 minutos. Los otros picos del cromatograma que representan S-59 iluminado (parte media) (además del pico de inyección a aproximadamente 3 minutos) corresponde a los fotoproductos de S-59 formados durante la iluminación. Obsérvese que los picos que aparecen a tiempo (t) = 18 minutos y t = 20 minutos son especies plasmáticas y están relacionadas con S-59. Los picos que permanecen en el panel inferior no son fotoproductos de S-59, por lo tanto la eliminación de S-59 y los fotoproductos se completó esencialmente en este caso según lo indicado por la HPLC (es decir, no detectable por HPLC). El análisis del cromatograma tratado con Amberlite XAD-4^{TM} revela que se ha adsorbido la mayor parte de S-59 y los fotoproductos de S-59.

Ejemplo 29 Función Plaquetaria Tras la Adsorción por Lotes

Una unidad de plaquetas frescas (es decir, 35% de plasma/65% de PAS III) se inoculó con 5-59 150 \muM y se transfirió a una bolsa PL2410. La bolsa se iluminó a 3,0 J/cm^{2} y alícuotas de 20 ml del PC iluminado se transfirieron a pequeñas bolsas PL2410 que contenían 0,67 g de adsorbente (10 g/300 ml): Amberlite XAD-4^{TM}, Amberlite XAD-16^{TM}, Amberlite 200, y carbón activado estándar fueron los adsorbentes utilizados. Las pequeñas bolsas PL2410 de polietileno se almacenaron en un agitador de plaquetas a 22ºC. Se trataron dos unidades plaquetarias separadas para cada adsorbente. Una unidad de cada par se puso en contacto con adsorbente durante 3 horas antes de transferir a una bolsa de plaquetas sin adsorbente. La otra unidad plaquetaria permaneció en contacto con el adsorbente a lo largo del período de almacenamiento de 4 días.

Se tomaron muestras de las unidades después de 24 horas y se analizaron para determinar el recuento de plaquetas y el pH. Después de 5 días, se tomaron muestras y también se analizaron para determinar el recuento de plaquetas y el pH, así como el contenido de ATP y la activación por GMP-140. Los controles incluyeron una muestra de PC tratado con PCD sin adsorbente (control sin adsorbente) y una muestra de PC que no fue tratada. Los resultados para cada uno de los ensayos de la función plaquetaria están presentes en la Tabla G (el símbolo "*" en la Tabla G indica un tiempo de contacto de sólo tres horas).

TABLA G

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Las mediciones de pH y recuentos de plaquetas resumidos en la Tabla G indican que el contacto con las resinas Amberlite no afectó drásticamente el pH o el recuento de plaquetas del PC. El PC que fue tratado con carbón activado tuvo un pH elevado, lo que sugiere que el carbón puede tener un efecto de tamponado sobre el PC. Además, los recuentos de plaquetas fueron considerablemente menores para el PC tratado con carbón activado. El ensayo más sensible, el de GMP-140, indica que tanto Amberlite XAD-4 como Amberlite XAD-16 tienen buenas características de hemocompatibilidad. El PC tratado con Amberlite XAD-4 y Amberlite XAD-16 tuvo niveles más bajos de activación que el control sin adsorbente tratado con PCD. Además, ambas muestras de Amberlite XAD-4 y Amberlite XAD-16 que permanecieron en contacto con el adsorbente durante 5 días tuvieron niveles más bajos de activación que las muestras correspondientes que estuvieron en contacto durante sólo 3 horas. Esta observación sugiere que el contacto del PC con Amberlite XAD-4 y Amberlite XAD-16 durante períodos de tiempo prolongados no afecta desfavorablemente la función plaquetaria. A la inversa, la Amberlite 200 activó las plaquetas considerablemente con respecto al control sin adsorbente. Los estudios de la función plaquetaria sugirieron que Amberlite XAD-4 y Amberlite XAD-16 tuvieron características satisfactorias de hemocompatibilidad.

La Tabla H presenta datos para ensayos in vitro adicionales obtenidos a partir de un experimento similar de adsorción por lotes con Amberlite XAD-4. Una vez más, no se observó ningún efecto adverso sobre la función plaquetaria.

TABLA H

59

Una vez más, debe observarse que estos experimentos se realizaron con resinas Amberlite estándar que no fueron tratadas por Supelco, Inc. Según lo indicado por los ensayos in vitro, los compuestos lixiviables que son eliminados por el proceso de limpieza de Supelco, Inc., no parecen tener un impacto sustancial sobre la función plaquetaria.

Ejemplo 30 Adsorción de Plasma por Flujo

Este ejemplo describe la eliminación de psoraleno de una muestra de plasma utilizando un dispositivo de flujo. En el plasma, el tiempo de residencia no es tan importante como lo es con otros productos sanguíneos (por ejemplo, PCs) debido a que la adsorción no depende del transporte de S-59 desde las plaquetas.

Según se señaló más arriba, Supelco, Inc. (Bellefonte, PA) vende cartuchos que contienen un adsorbente hidrófobo que puede utilizarse para una cantidad de propósitos, incluyendo adsorción de ciertos fármacos y pequeñas proteínas. El Cartucho Rezorian^{TM} A161 (5 ml de volumen de lecho) comercializado por Supelco, Inc., es un cartucho en línea (es decir, un tipo de dispositivo de flujo) apropiado para el uso en la eliminación de S-59 del plasma. Las cuentas de adsorbente polimérico poseen un diámetro de poro medio de 120 \ring{A} y una superficie de aproximadamente
800-900 m^{2}/g.

Se efectuaron estudios con plasma humano al 100% a dos caudales diferentes: 2,5 ml/min y 5,0 ml/min. Los resultados se representan gráficamente en la Fig. 29, que muestra el porcentaje de S-59 que escapa a la adsorción (indicado como Penetración) en función del volumen de plasma inoculado con S-59 que es perfundido a través del cartucho; los estudios se realizaron con S-59 no iluminado en plasma al 100% (150 \muM). Como era de esperar, hay menor adsorción de S-59 cuanto mayor es la velocidad de flujo a través del cartucho.

Debe destacarse que si se realiza la eliminación de mezclas de plaquetas, los adaptadores de flujo de plástico sinterizado de los cartuchos Rezorian^{TM} deben reemplazarse por adaptadores de flujo apropiados (por ejemplo, malla de nylon de 80 \mum), ya que los adaptadores de flujo pueden dañar las plaquetas.

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Ejemplo 31 Análisis de Factores de Coagulación Tras la Adsorción por Lotes de Plasma

El adsorbente utilizado para productos plasmáticos también debe ser capaz de eliminar psoraleno sin reducir considerablemente los niveles de proteínas importantes en la cascada de la coagulación. En este ejemplo, se analizó la selectividad de varias resinas para S-59 llevando a cabo experimentos de adsorción por lotes y analizando el plasma para determinar los niveles de los factores de coagulación y los tiempos de coagulación.

Se añadió una alícuota de 1,0 ml de plasma al 100% a 0,1 g de adsorbente y se selló en tubos de polipropileno. Los tubos se agitaron suavemente a temperatura ambiente durante 3 horas. Las muestras de plasma se obtuvieron o bien permitiendo que el adsorbente se depositara o filtrando la muestra a través de un filtro de 0,2 \mum para eliminar el adsorbente. Las muestras de plasma se entregaron al UCSF Hematology Laboratory (San Francisco, CA) para ensayos de coagulación estándar. Los ensayos que se realizaron incluyeron nivel de fibrinógeno, nivel de Factor V, nivel de Factor VIII, nivel de Factor IX, tiempo de tromboplastina parcial activada, tiempo de protrombina, tiempo de trombina y nivel de ristoceitina. La Tabla I resume los datos de los análisis de plasma, mientras que las Figuras 30A-30D representan gráficamente el efecto de la PCD con S-59 y la eliminación de S-59 sobre ciertos indicadores de la función de coagulación. En la Tabla I, la designación "+S-59/+UVA" se refiere a los datos obtenidos de las muestras de plasma que contenían S-59 150 \muM expuesto a 3 J/cm^{2} de radiación ultravioleta; además, "PT" representa el tiempo de protrombina, "aPTT" representa el tiempo de tromboplastina parcial activada y "TT" representa el tiempo de trombina.

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TABLA I

60

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Las muestras se entregaron al UCSF Hematology Laboratory en dos grupos separados (según lo indicado por la separación de los resultados en la Tabla I). Las muestras plasmáticas de control para cada grupo fueron tratadas con S-59 y UVA pero no se pusieron en contacto con el adsorbente. Los niveles de actividad del Factor V y el Factor VIII fueron suprimidos en la muestra plasmática antes del tratamiento con S-59, indicando que el tratamiento con S-59 no era la causa. Amberlite XAD-4 y Hemosorba CH-350 evidenciaron los mejores resultados con poco efecto sobre cualquiera de los parámetros ensayados. Los niveles del Factor IX se redujeron levemente en ambos
casos.

Amberlite XAD-16 evidenció una reducción en el nivel de fibrinógeno, pero sólo leves reducciones en los niveles del Factor V y IX, y leves incrementos en el tiempo de tromboplastina parcial activada y el tiempo de trombina. El incremento en el tamaño de poros de Amberlite XAD-16 (160 \ring{A}) puede ser la causa del incremento en la adsorción del factor de coagulación con respecto a Amberlite XAD-4, que tiene poros mucho más pequeños (40 \ring{A}). El tamaño reducido de poros por ello puede ofrecer especificidad para la adsorción de pequeñas moléculas tales como S-59 y prevenir la adsorción de moléculas más grandes tales como proteínas. Finalmente, el BioRad t-butil HIC (Macro-Prep) dio resultados muy pobres, con la casi completa eliminación del Factor V y el Factor VIII y significativos incrementos en el tiempo de protrombina y el tiempo de tromboplastina parcial activada.

Los experimentos relacionados con los análisis de los factores de coagulación se llevaron a cabo en una modalidad por lotes con una mayor relación de adsorbente a plasma que la que se utiliza típicamente en experimentos de adsorción. Además, un dispositivo de flujo debe dar como resultado tiempos de contacto mas cortos con recuperación simultáneamente más alta de las proteínas involucradas en la formación de coágulos de sangre.

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Ejemplo 32 Efecto del Contenido de Agua Sobre la Función de los Adsorbentes Amberlite

Tal como se introdujo previamente, los adsorbentes Amberlite® XAD-4 y XAD-16 (Rohm and Haas) poseen propiedades que los hacen apropiados para su uso en la eliminación de compuestos de productos sanguíneos transfundibles (por ejemplo, concentrados de plaquetas [PC] y plasma congelado fresco [FFP]) después de la descontaminación fotoquímica. En efecto, los adsorbentes Amberlite® XAD-4 and Amberlite XAD-16 de poliestireno-divinil benceno, macroporosos, no iónicos, han mostrado una elevada capacidad para S-59. En las primeras etapas del desarrollo del RD para PC, los inventores descubrieron que el tratamiento con vapor o secado de los adsorbentes Amberlite eliminaba algo de agua de los poros del adsorbente; como resultado, el adsorbente limpio tenía una capacidad de adsorción considerablemente más baja para S-59 que el adsorbente humectado. Este ejemplo está dirigido al efecto de agua sobre la capacidad de adsorción del Amberlite y sobre las condiciones para la humectación del adsorbente y la restauración de la función del adsorbente después del tratamiento.

Los estudios iniciales realizados por el inventor en el desarrollo del RD para plaquetas utilizaron adsorbentes Amberlite adquiridos directamente de Rohm & Haas. Estos adsorbentes se obtuvieron en forma altamente hidratada, teniendo Amberlite® XAD-16 típicamente un contenido de agua de 50-65% en peso y Amberlite® XAD-4 típicamente un contenido de aproximadamente 40-55% en peso. Sin embargo, el proceso térmico de limpieza actualmente realizado por Supelco (Bellefonte, PA) da como resultado un contenido de agua reducido (5%) y una reducción simultánea importante en la capacidad de adsorción. Además, las partículas de adsorbente seco contienen aire en los poros de las cuentas, lo que hace que las cuentas floten en solución acuosa a diferencia de las partículas de adsorbente hidratadas, reduciendo también la capacidad adsortiva.

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A. Procedimiento de Humectación en la Fabricación de un RD

La humectación de adsorbentes poliméricos tales como Amberlite® XAD-4 y XAD-16 puede lograrse utilizando disolventes orgánicos que reducen la tensión superficial de la solución humectante e incrementan la humectabilidad del adsorbente. Se eligió etanol como disolvente orgánico para este proceso. Las dos variables que pueden ajustarse para el proceso de humectación incluyen (i) concentración de etanol y (ii) tiempo de contacto con la solución humectante. Se eligió un tiempo de contacto de 10 minutos sobre la base del tiempo de procesamiento deseado para la humectación del adsorbente.

Se realizó un estudio para determinar la concentración de etanol requerida para la humectación en un procedimiento por lotes de 10 minutos. Se suspendieron muestras limpias de Amberlite® XAD-4 (lote SC-27 de Supelco) y Amberlite XAD-16 (lote SC-30 de Supelco) en soluciones etanol/agua que contenían niveles de etanol de 0-50% en volumen. El adsorbente se puso en contacto con la solución en una relación de 1 g de adsorbente a 5 ml de solución humectante. Las muestras de adsorbente se agitaron periódicamente durante la incubación de 10 minutos. La solución de etanol se eliminó al finalizar los 10 minutos y se reemplazó por agua destilada. Se realizó una serie de tres etapas de enjuague por lotes (10 min. cada una) en agua destilada en una relación de 1 g de adsorbente por cada 5 ml de agua. El agua después se eliminó y se permitió que las partículas de adsorbente se escurrieran hasta secarse.

El contenido de agua de cada muestra de adsorbente se determinó pesando con precisión una muestra de adsorbente en un recipiente previamente secado y pre-pesado (un vial para centelleo). Las muestras se colocaron en una estufa de secado a 120ºC y se dejaron secar durante 24 horas. Las muestras secas se pesaron y se calculó el contenido de agua % en masa. Es notable que el secado de las muestras durante más de 24 horas no resultó en pérdida adicional de
agua.

También se ensayaron muestras de cada adsorbente para determinar la capacidad de adsorción en equilibrio. Se pesó aproximadamente 0,1 g de adsorbente y se transfirió a un tubo de polipropileno de 5 ml. Se añadió a cada tubo una alícuota de 3,0 ml de 35% de plasma, 65% de PAS III que contenía ^{3}H-S-59 150 \muM. Los tubos se colocaron en rotadores y se incubaron durante 24 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, se sacó una muestra de cada tubo y se transfirió a un tubo Eppendorf. Se sacó una muestra de 200 \mul de 35% de plasma de cada tubo Eppendorf y se diluyó en 5,0 ml de cóctel HiSafe LSC (Wallac). Se hizo el recuento de las muestras en un Wallac LSC para determinar los niveles residuales de S-59 en cada muestra. Se calcularon las capacidades determinando los \mumoles totales de S-59 que se eliminaron de cada muestra por unidad de masa de adsorbente seco. La Fig. 31 representa la relación entre el contenido de etanol de la solución humectante y la capacidad de adsorción del adsorbente resultante durante un proceso de humectación por lotes de 10 minutos. Las capacidades de adsorción son para la eliminación de S-59 del 35% de plasma, 65% de PAS III. Se estimaron las capacidades a partir de las mediciones únicas de adsorción con C_{o} = 150 \muM.

Los resultados resumidos en la Fig. 31 sugieren que la humectación de los adsorbentes Amberlite con soluciones acuosas de etanol que poseen concentraciones de etanol por encima de 15% (v/v) da como resultado una recuperación casi máxima de las capacidades del adsorbente. Debe aclararse que estos datos se recolectaron durante un proceso por lotes de 10 minutos. Es posible que pudieran utilizarse niveles más bajos de etanol si se utilizaran tiempos de contacto más largos. Además, se debe recalcar que puede requerirse un mínimo de etanol al 20% para impedir el crecimiento microbiano en la solución humectante. Los niveles excesivamente altos de etanol obviamente deben evitarse para reducir tanto los costos de etanol como los niveles de etanol que deben eliminarse en el posterior enjuague con agua.

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B. Capacidad del Adsorbente en Función del Contenido de Agua

Las muestras que se prepararon en el estudio de humectación descrito más arriba también pueden analizarse para determinar la relación entre contenido de agua y capacidad de adsorción. Los resultados para Amberlite® XAD-16 se resumen en la Fig. 32. La Fig. 32 indica que la capacidad de adsorción (es decir, \mumoles de S-59 adsorbidos/g de adsorbente seco) de Amberlite® XAD-16 para la eliminación de S-59 del 35% de plasma, 65% de PAS III se reduce con la disminución del contenido de agua. Los datos presentados en la Fig. 32 se tomaron después de la humectación del adsorbente con diversas concentraciones de soluciones de etanol acuoso. Debe señalarse que la relación entre capacidad de adsorción y contenido de agua puede ser diferente para el mismo adsorbente dependiendo de la historia del procesamiento (es decir, contenido de agua logrado por humectación o secado).

Con referencia a la Fig. 32, la capacidad de adsorción se aproxima a niveles extremadamente bajos a medida que los niveles de contenido de agua disminuyen hasta por debajo de 50% de agua en masa. A la inversa, la capacidad de adsorción aumenta continuamente hasta un valor máximo en contenidos de agua entre 70-75% agua. Las capacidades de adsorción se han recorregido en base a masa seca para el adsorbente de manera que la capacidad creciente refleja los cambios reales en la función del adsorbente.

Aunque la correlación presentada en la Fig. 32 es notable, es importante enfatizar que las muestras que poseen contenidos de agua variables se obtuvieron humectando el adsorbente en diferentes condiciones. Aunque no está confirmado, los datos más relevantes puede obtenerse produciendo muestras de adsorbente que poseen contenidos de agua variables secando una muestra de adsorbente completamente hidratado. Se cree que las muestras obtenidas humectando el adsorbente pueden contener un porcentaje más alto de agua en la superficie externa de la cuenta del adsorbente. A la inversa, se cree que el adsorbente preparado por secado probablemente pierda primero agua que cubre la superficie externa de la cuenta; esto daría como resultado un cambio en el aspecto del adsorbente pero puede no afectar la capacidad de adsorción si no se ha eliminado una cantidad significativa de agua de los poros del adsorbente. Se presentan en la próxima sección datos preliminares que indican el índice aproximado de pérdida de agua de los adsorbentes Amberlite a temperatura ambiente.

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C. Secado Durante el Manipuleo de Adsorbentes Amberlite

Según lo discutido previamente, el saco de malla de poliéster puede llenarse con adsorbente Amberlite seco y sellarse por soldadura ultrasónica o por impulso durante la fabricación del RD de la presente invención. Los sacos sellados después se someterán al proceso de humectación en etanol acuoso seguido por un enjuague final con agua destilada. El RD final se incorporará en recipientes de plástico PL 2410 (Baxter) que serán sellados en un recubrimiento de lámina metálica. El recubrimiento de lámina metálica servirá como barrera líquida e impedirá el secado del adsorbente durante el almacenamiento. El tiempo más vulnerable para el potencial secado de los adsorbentes Amberlite durante el proceso de fabricación es el tiempo entre la finalización de la etapa de enjuague final y la envoltura del RD en el recubrimiento de lámina metálica. A fin de entender mejor el potencial para el secado del adsorbente durante la fabricación, se realizó un estudio para evaluar el índice de secado de los adsorbentes Amberlite a temperatura ambiente.

En este estudio, se prepararon muestras de Amberlite® XAD-16 (Supelco Lote SC-30) y Amberlite® XAD-4 (Supelco Lote SC-27) humectando el adsorbente en una solución acuosa de etanol al 30%. Después de una incubación de 10 minutos en etanol acuoso, el adsorbente se enjuagó completamente con agua destilada. Se permitió que aproximadamente 50 g de cada adsorbente se escurrieran hasta secarse y después se colocaron en un recipiente plástico. El recipiente de dejó a temperatura ambiente y no se sometió a una corriente de aire aumentada (por ejemplo, campana de flujo laminar). Se tomaron muestras a ciertos intervalos de tiempo y se colocaron en viales de polipropileno herméticos. El contenido de agua de cada muestra se determinó según se describe más abajo.

Los datos que indican la cinética para la pérdida de agua de Amberlite® XAD-4 y Amberlite® XAD-16 se presentan en la Fig. 33. Más específicamente, la Fig. 33 representa la pérdida de agua por Amberlite® XAD-16 (cuadrados) y Amberlite® XAD-4 (círculos) durante una incubación de 27 horas a temperatura ambiente y humedad estándar. Los resultados de la Fig. 33 indican que la pérdida de agua es un problema potencial que debe tenerse en cuenta en la fabricación y almacenamiento de los RDs que contienen Amberlite.

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Ejemplo 33 Esterilización de Adsorbentes Amberlite Húmedos por Irradiación Gamma

Según se indicó previamente, el recipiente de almacenamiento que contiene el RD ensamblado de la presente invención se sella en un recubrimiento de lámina metálica y se esteriliza en fase terminal. En términos generales, los adsorbentes de poliestireno-divinil benceno son estables a los ciclos repetidos de autoclave. Sin embargo, algunos recipientes de almacenamiento (por ejemplo, recipiente plástico PL2410 (Baxter)) no son esterilizables en autoclave debido a los materiales utilizados en los mismos, y deben esterilizarse por \gamma-irradiación, la técnica preferida, o E-beam.

Este ejemplo describe los métodos y resultados de estudios realizados para determinar la adecuación de la \gamma-irradiación o E-beam para esterilizar adsorbentes Amberlite húmedos. Los datos de los efectos de esterilización sobre una variedad de características del adsorbente, incluyendo cinética de adsorción y capacidad de adsorción, se presentan más abajo.

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A. Efecto de la \gamma-Irradiación Sobre la Cinética de Adsorción

El adsorbente bruto (es decir, no procesado) fue procesado por Supelco y después se sometió a \gamma-irradiación. Se procesaron dos lotes separados de adsorbente bruto en Supelco conforme al siguiente procedimiento. Primero, se colocaron lotes de adsorbente bruto (por ejemplo, 18 litros) en un recipiente de limpieza con tamices retenedores de 74 \mum y se enjuagaron con agua desionizada; durante el enjuague, la conductividad del efluente se monitorea continuamente. El enjuague se completó cuando la resistividad del efluente de enjuague aumentó hasta 18 M\Omega. Segundo, los compuestos extraíbles residuales se eliminaron de los lotes de adsorbente (por ejemplo, 6 litros, 1,6 kg.) mediante un proceso patentado de limpieza térmica libre de disolvente (Supelco, Inc.). A partir de ese momento, el adsorbente se cargó (recipientes de vidrio marrón de 2 l) y se esterilizó con vapor en un ciclo líquido (20 minutos, 121ºC).

Después de este procedimiento, las cuentas de adsorbente contenían <10% agua. Los adsorbentes se humectaron suspendiéndolos en una solución acuosa de etanol al 30% durante 10 minutos. El adsorbente se enjuagó completamente con agua destilada para eliminar el etanol residual. A partir de ese momento, las muestras de adsorbente se colocaron en recipientes de vidrio y se sometieron a dos dosis diferentes de \gamma-irradiación (Isomedix; Morton Grove, IL): única dosis (49,9-50,7 kGy) y dosis doble (112,4-114,8 kGy).

Las muestras irradiadas se ensayaron para evaluar la función del adsorbente. El primer estudio comparó la cinética de adsorción de adsorbente no esterilizado (es decir, procesado pero no sometido a \gamma-irradiación) y esterilizado. Una unidad fresca de concentrado de plaquetas (4,0 x 10^{11} plaquetas/300 ml) preparada en 35% de plasma autólogo, 65% de PAS III se inoculó con ^{3}H-S-59 150 \muM. Las muestras de adsorbente (aproximadamente 0,1 g) se pesaron con precisión en tubos de polipropileno de 5 ml. Se añadió a cada tubo un alícuota de 3,0 ml de la mezcla de plaquetas y los tubos se colocaron en un rotador (Barnstead, Thermolyne Model 400110) a temperatura ambiente. Se tomaron muestras de PC de los tubos en diversos puntos de medición. Se determinaron los niveles de radioactividad contando 200 \mul de cada muestra en 5,0 ml de cóctel HiSafe LSC (Wallac). Se midieron las concentraciones de S-59 residual y se determinó la cantidad de S-59 que había sido absorbida por unidad de masa (\mumoles/g) de adsorbente mediante equilibrio de radioactividad. En este estudio, la masa de adsorbente se basó en el peso húmedo de las muestras de adsorbente.

Los datos de cinética de adsorción para la eliminación de S-59 del PC se presentan en las Figuras 34A y B y 35A y B. Más específicamente, los datos de las Figuras 34 y 35 representan el efecto de esterilización mediante \gamma-irradiación sobre la cinética de adsorción para la eliminación de S-59 del concentrado de plaquetas al 35% por Amberlite® XAD-4 (dos lotes, Figuras 34A y 34B) y Amberlite® XAD-16 (dos lotes, Figuras 35A y 35B), respectivamente. Según lo indicado más arriba, las capacidades (es decir, la cantidad de S-59 adsorbido por unidad de masa de adsorbente; \mumoles/g) se determinaron sobre la base del peso húmedo de los adsorbentes.

En términos globales, la esterilización con \gamma-irradiación no parece tener un efecto importante sobre la cinética de adsorción. La esterilización tuvo un efecto adverso leve sobre la cinética de adsorción de Amberlite® XAD-4. A la inversa, Amberlite® XAD-16 esterilizado pareció tener una cinética de adsorción tan buena como o mejor que muestras de Amberlite® XAD-16 no esterilizadas. La comparación de los dos adsorbentes reveló que el Amberlite® XAD-16 esterilizado evidenció considerablemente mejor cinética de adsorción y capacidades que el Amberlite® XAD-4 esterilizado. A modo de ilustración, Amberlite® XAD-16 pareció alcanzar condiciones de equilibrio cerca de los 120 minutos de incubación, mientras que Amberlite® XAD-4 requirió más de 180 minutos para alcanzar condiciones de equilibrio. Es importante enfatizar que los cálculos se basaron en el peso húmedo de adsorbente. Debido a que típicamente contiene más agua que XAD-4, las capacidades de adsorción basadas en el peso seco serían significativamente superiores para XAD-16 (véase la Fig. 32).

Se cree que Amberlite® XAD-16 es el adsorbente Amberlite preferido debido a su rápida cinética de adsorción y relativamente alta capacidad. Es importante destacar, según lo indicado más arriba y lo expuesto más abajo, que Dowex® XUS-43493 se considera actualmente el adsorbente globalmente preferido.

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B. Efecto de la \gamma-Irradiación sobre la Capacidad de Adsorción

También se ensayaron muestras de cada adsorbente para determinar la capacidad de adsorción en equilibrio después de la esterilización. Se pesó con precisión aproximadamente 0,1 g de adsorbente en un tubo de polipropileno de 5 ml. Se preparó una serie de diluciones de S-59 en 35% de plasma, 65% de PAS III que contenían concentraciones de ^{3}H-S-59 desde 500 \muM hasta 15 \muM. Se añadió una alícuota de 3,0 ml de cada dilución a tubos separados. Los tubos se colocaron en rotadores (Barnstead, Thermolyne Model 400110) y se incubaron durante 24 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, se sacó una muestra de cada tubo y se transfirió a un tubo Eppendorf. Se sacó una muestra de 200 \muL de 35% de plasma de cada tubo Eppendorf y se diluyó en 5,0 ml de cóctel HiSafe LSC (Wallac). Las muestras se contaron en un Wallac LSC para determinar los niveles residuales de S-59 en cada muestra. Las capacidades se calcularon determinando los \mumoles totales de S-59 que se eliminaron de cada muestra por unidad de masa de adsorbente húmedo. Las capacidades de adsorción para Amberlite® XAD-4 y Amberlite® XAD-16 tratados con dosis de 5 y 10 MRad de \gamma-irradiación se resumen en la Tabla J.

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TABLA J

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* Las capacidades se basan en la masa húmeda de las muestras de adsorbente.

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Como lo indican los datos de la Tabla J, el efecto de \gamma-irradiación sobre la capacidad de adsorción de Amberlite® XAD-4 fue muy pequeño aun en dosis de hasta 10 MRad. Las variaciones en la capacidad de adsorción para Amberlite® XAD-16 probablemente no son significativas. Los efectos de esterilización sobre la capacidad de adsorción son lo suficientemente pequeños de manera que no influirán considerablemente sobre el adsorbente en un RD que sea esterilizado por \gamma-irradiación.

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C. Esterilización de Adsorbentes Amberlite por E-Beam

Como se discutió anteriormente, la \gamma-irradiación se visualiza actualmente como el método de esterilización preferido. El efecto de E-beam sobre la función de los adsorbentes Amberlite se examinó en un estudio similar al realizado para la esterilización gamma. La metodología y resultados de este estudio se informan a continuación.

Para este estudio, se humectaron muestras de Amberlite® XAD-4 y XAD-16 con etanol acuoso (30%) y se colocaron en viales de centelleo de 25 ml. Además, se prepararon dispositivos de prueba colocando 10 g de adsorbente húmedo en sacos de malla de poliéster (poliéster Saati 29/16, 10 cm x 10 cm) y sellando con calor el extremo abierto. El dispositivo de eliminación simulado resultante se introdujo en recipientes de plástico PL 2410 (Baxter) a través de una pequeña ranura; posteriormente, la ranura se cerró a través de termosellado.

Las muestras de adsorbente y los dispositivos de simulación se entregaron a NIS (San Diego, CA), donde se sometieron a dosis de 5 MRad de E-beam. Las muestras que se esterilizaron en viales no requirieron humectación. Sin embargo, las muestras de adsorbente de los dispositivos de simulación se secaron durante el almacenamiento debido a que no se utilizó ninguna barrera de agua; estas muestras se recuperaron de los dispositivos de simulación y se humectaron con etanol acuoso antes de realizar los experimentos de función. La capacidad de adsorción para la eliminación de S-59 del 35% de plasma/65% de PAS III se examinó según se describió más arriba. Los resultados del estudio se resumen en la Tabla K.

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TABLA K

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* Las capacidades se basan en la masa húmeda de las muestras de adsorbente. ND = no {}\hskip0,3cmdeterminado.

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Según indican los datos presentados en la Tabla K, la esterilización por E-beam a 5 MRad no tuvo un efecto significativo sobre la función del adsorbente cuando se realizó la esterilización sobre el adsorbente solo ("Adsorbente con 5 MRad") o sobre el adsorbente retenido dentro de un saco de malla de poliéster envuelto en un recipiente de plástico PL 2410 (Baxter) ("Dispositivo de simulación con 5 MRad").

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Ejemplo 34 Constantes de Adsorción de S-59 y el Efecto del Contenido de Agua Sobre la Función del Adsorbente

Un ejemplo anterior estuvo específicamente dirigido al efecto del contenido de agua sobre la función de Amberlite® XAD-4 y XAD-16. Este ejemplo compara las constantes de adsorción de S-59 para varios adsorbentes adicionales en sus estados húmedo y seco.

Se enjuagaron muestras de adsorbente exhaustivamente con agua destilada. Una porción de cada muestra después se colocó en una estufa de secado a 120ºC durante 4 horas para producir muestras de adsorbente seco. El contenido de agua de cada adsorbente, en ambos estados húmedo y seco, se determinó pesando con precisión una muestra de adsorbente en un recipiente previamente secado y pre-pesado (un vial para centelleo). Las muestras se secaron a 120ºC durante 24 horas y se volvieron a pesar para determinar la masa de agua perdida. Después se calculó el contenido de agua en % en masa.

También se ensayaron muestras de cada adsorbente para determinar la capacidad de adsorción en equilibrio. Según se citó más arriba, la capacidad de adsorción en equilibrio se refiere a la cantidad de psoraleno que una resina particular es capaz de adsorber; es decir, después de alcanzado el equilibrio, la cantidad de psoraleno adsorbido con respecto a la cantidad de psoraleno residual esencialmente no cambia. Se indicó previamente un período de incubación de 24 horas para producir condiciones de equilibrio.

Se pesó el adsorbente (aproximadamente 0,1 g) y se transfirió a un tubo de polipropileno de 5 ml. Se añadió a cada tubo una alícuota de 3,0 ml de 35% de plasma, 65% de PAS III que contenía ^{3}H-S-59 150 \muM. Los tubos se colocaron en rotadores y se incubaron durante 24 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, se tomó una muestra de cada tubo y se transfirió a un tubo Eppendorf. Se retiró una muestra de 200 \mul de plasma 35% de cada tubo Eppendorf y se diluyó en 5,0 ml de cóctel HiSafe LSC (Wallac). Las muestras se contaron en un Wallac LSC para determinar los niveles residuales de S-59 en cada muestra. Las capacidades se calcularon determinando los \mumoles totales de S-59 que se eliminaron de cada muestra por unidad de masa de adsorbente seco. Los resultados se representan en la Fig. 36, indicando un gráfico de barras las constantes de adsorción de S-59 para adsorbentes en ambos estados húmedo (sombreado oscuro) y seco (sombreado claro) (los porcentajes se refieren a la cantidad de agua en cada muestra), y se resumen en la Tabla L (150 \muM S-59 = 61754,725 DPM; Fondo 30 DPM; Cf = concentración final de la solución de S-59 en el equilibrio).

TABLA L

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Ejemplo 35 Características de un Dispositivo de Eliminación que Contiene Dowex® XUS-43493

La sección Descripción de la Invención describió las características generales del proceso de fabricación del RD y su incorporación a un recipiente de almacenamiento. Este ejemplo ilustra las características específicas del RD por lotes preferido y el proceso de fabricación preferido para un RD por lotes y su incorporación a un recipiente de almacenamiento.

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Adsorbente Dowex® XUS-43493

Según se indicó previamente, Dowex® XUS-43493 (Dow Chemical Co.) es el adsorbente preferido. Después que Supelco, Inc. identifica el adsorbente no limpio con espectroscopía infrarroja, procesa adicionalmente el adsorbente para asegurar bajos niveles de sustancias extraíbles y partículas finas. En la primera etapa del proceso, las partículas finas y sales se eliminan mediante enjuague exhaustivo del adsorbente con agua destilada. Se colocan lotes de adsorbente (por ejemplo, 2,0 kg.) en un recipiente con tamices retenedores de 74 \muM (es decir, el proceso es capaz de retener partículas de aproximadamente 74 \muM de diámetro o mayores) durante el proceso de enjuague. La segunda etapa del proceso implica la eliminación de sustancias extraíbles residuales mediante un proceso de limpieza térmico libre de disolventes, patentado. Si se desea, el adsorbente limpio después puede envasarse en bolsas grandes y esterilizarse con vapor antes del envío al sitio de fabricación del RD.

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El adsorbente Dowex® XUS-43493 de Dow Chemical Co. está acompañado por un Certificado de Análisis que especifica el contenido de agua (50-60%), esfericidad (> 90%), y límites de tamaño de partículas mediante análisis granulométrico (< 2% retenido en malla 16; < 3% pasa a través de la malla 50). El adsorbente que ha sido sometido al proceso de limpieza de Supelco, Inc. se monitorea para determinar sustancias extraíbles potenciales, tales como divinil benceno (por ejemplo, < 50 ppb; isopropanol:adsorbente 1:1; 2 horas de extracción a 22ºC) y etilvinilbenceno. Además, se utiliza un análisis por CG de extractos de cloruro de metileno para evaluar los Compuestos Orgánicos Cromatográficos Totales (por ejemplo, < 20 \mug/ml de sustancias extraíbles totales).

También se realizan ensayos adicionales sobre el adsorbente limpio. Por ejemplo, se determinan niveles de endotoxinas utilizando un ensayo de Lisado de Amebocitos del Limulus (LAL). Se mide la distribución de tamaño de partículas (por ejemplo, <0,01% por debajo de 90 \muM de diámetro; <2,0% por encima de 1400 \muM de diámetro) para cada lote de adsorbente, así como el contenido de agua (por ejemplo, pérdida de masa por secado = 10% máximo, 5% mínimo). Finalmente, se evalúan las características funcionales de cada lote de adsorbente mediante un ensayo de adsorción de S-59 realizado con S-59 marcado con ^{3}H en solución salina tamponada que contiene albúmina sérica.

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El Saco de Malla y el Filtro de Puerto

La Fig. 37 ilustra esquemáticamente el RD por lotes preferido contenido en el recipiente de almacenamiento de plaquetas (por ejemplo, un recipiente plástico PL 2410, de Baxter). Además, en la Fig. 38 se presenta un diagrama de flujo que representa las etapas fundamentales del proceso de fabricación preferido para el RD por lotes contenido dentro de un recipiente de almacenamiento de plaquetas, incluyendo las etapas de incorporar el RD ensamblado y un puerto de filtro en el recipiente de almacenamiento de plaquetas. La referencia a esas figuras ayudará a comprender la siguiente discusión.

El saco de malla de poliéster y el filtro de puerto se fabrican utilizando la misma técnica (descrita más abajo). El saco de malla se utiliza para confinar el adsorbente, impidiendo de este modo que el adsorbente sea posteriormente transfundido al recipiente. El filtro de puerto sirve como mecanismo de soporte para proteger contra la transfusión de pequeñas partículas; las soluciones que ingresan o salen del recipiente de almacenamiento de plaquetas deben pasar por el filtro de puerto. Tanto el saco de malla de poliéster como el filtro de puerto utilizan el mismo poliéster tejido apto para uso médico con aberturas de poros de 30 \mum (por ejemplo, Tetko Medifab 07-30/21, denominado plástico PL1144 por Baxter). El tamaño de poros de malla de 30 \muM proporciona un gran margen de seguridad para prevenir la transfusión de pequeñas partículas mientras se permite que la mezcla plasma/PAS entre en contacto libremente con el adsorbente. Las plaquetas no tienen que ponerse realmente en contacto con el adsorbente, pero permitir que la solución pase libremente por el adsorbente contribuye a la eliminación del psoraleno residual y de los fotoproductos de psoraleno.

Para la fabricación del saco de malla y el filtro de puerto, se dobla longitudinalmente una tira de malla de un rollo y se sella transversalmente con un sellador por impulso. Al sellar, el sellador por impulso simultáneamente corta la malla en la parte media del sello. Esto da como resultado un bolsillo rectangular que contiene i) un extremo inferior que está doblado, ii) dos extremos que están termosellados y iii) un extremo superior que está abierto. Dependiendo del ancho del bolsillo y de la distancia entre los dos termosellos, el bolsillo se convierte en el filtro de puerto o en el saco de malla que contiene el adsorbente (es decir, el RD). Por ejemplo, una realización de la presente invención utiliza la ranura del material de malla en anchos de aproximadamente 76 mm para el filtro de puerto y aproximadamente 154 mm para el saco del RD.

Los bolsillos de malla más pequeños se convierten en el filtro de puerto 401. El filtro de puerto se sella a un buje 402 (es decir, el buje del puerto) que se utilizará para fijar la línea de entrada/salida 403 al recipiente plástico. El recipiente plástico está formado por dos pliegues de soldadura por rediofrecuencia (es decir, capas) de plástico PL 2410 (Baxter) sobre el filtro de puerto 401. El reverso del recipiente plástico PL 2410 (Baxter) se deja abierto para la inserción del RD. A partir de ese momento, la línea de entrada/salida (es decir, el paso dador) 403 se une al buje del puerto 402 utilizando un disolvente (por ejemplo, ciclohexanona) y se sella en el extremo para impedir cualquier contaminación por partículas en posteriores etapas.

Se utilizan bolsillos de malla más grandes para producir el RD. En síntesis, el saco de malla de poliéster 404 (por ejemplo, cuadrado con lados de 5 cm o circular) producido más arriba se llena con las cuentas de adsorbente 405 (por ejemplo, 2,5 \pm 0,1 g secos) a través del cuarto borde no sellado. El saco de malla para llenar se sostiene mediante un fijador y se mueve a un sistema de llenado (no representado). La presente invención contempla el uso de cualquier sistema de llenado apropiado, por ejemplo un sistema de llenado vibratorio. Los sistemas de llenado que utilizan una sonda para dispensar el adsorbente también están disponibles, pero no se prefieren porque pueden causar degradación mecánica del adsorbente. El sistema de llenado típicamente consiste en una balanza, una unidad de alimentación vibratoria y un controlador. El borde abierto del saco de malla después se sella con un termosellador. A partir de ese momento, el saco de malla se somete a una "lluvia de aire ionizado" o vacío para eliminar las partículas libres de las superficies externas del RD, se pesa y se inspecciona para determinar partículas sueltas y fallas. Desde luego, puede utilizarse cualquier medio preciso de llenado del saco de malla en combinación con la realización preferida.

El RD por Lotes Totalmente Ensamblado Contenido Dentro de un Recipiente de Almacenamiento de Plaquetas

El RD después se coloca dentro de un recipiente plástico PL 2410 (Baxter) 406 equipado con un único paso dador 403 (Fig. 37). El sellado final de la parte inferior se realiza para crear un área rectangular 407 que posteriormente proporcionará una solapa para fijar una etiqueta identificatoria 408. El recipiente completamente ensamblado que envuelve el RD, que es desechable en una realización preferida, se inspecciona visualmente y se somete a un ensayo de filtración con aire comprimido a través del paso dador.

A partir de ese momento, el recipiente de almacenamiento de plaquetas 406 se evacua para eliminar aire residual dentro del recipiente, el paso dador se termosella y el recipiente se coloca en un saco de lámina metálica que está sellado al vacío. La conservación del recipiente en condiciones de vacío ayuda a eliminar la formación de burbujas (es decir, desprendimiento de gases/espumado) durante el contacto inicial de la mezcla de plaquetas iluminada y el RD. Finalmente, el ensamblaje contenido en el saco de lámina metálica se coloca en cajas de cartón para envío. Las cajas de cartón cerradas después se esterilizan mediante \gamma-irradiación a una dosis suficiente para lograr un Nivel de Garantía de Esterilización (SAL) de 10^{-6} (es decir, que estén presentes menos de 10^{-6} microorganismos después de la \gamma-irradiación).

Los componentes principales de la realización preferida se presentan en la Tabla M.

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TABLA M

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* Propiedades físicas y químicas típicas para Dowex® XUS-43493 (Boletín Técnico 3.03).

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Mientras que la realización preferida de la presente invención incluye la colocación del RD dentro del recipiente de almacenamiento de plaquetas (u otro recipiente o bolsa), la presente invención también contempla una realización en la que el adsorbente se libera dentro del recipiente de almacenamiento de plaquetas. El mismo tipo de diseño global puede utilizarse en dicha realización alternativa tal como se utilizó en el diseño descrito más arriba, sólo que sin el saco de malla. Más específicamente, el adsorbente libre es retenido en el recipiente de almacenamiento de plaquetas 406 por el filtro de puerto 401. De este modo, mientras que el filtro de puerto 401 sirve como medio de protección secundaria (es decir, impide el escape de las partículas de adsorbente) en la realización expuesta en la Fig. 37, sirve como medio de protección primaria en esta realización alternativa debido a la ausencia del saco de malla que contiene el adsorbente. Si se desea, se puede incorporar un filtro de macroagregados (o filtro similar) 409 en la línea de entrada/salida 403; dicho filtro serviría como medio secundario de protección reteniendo las partículas en caso de que el filtro de puerto 401 falle.

La realización alternativa tiene varias ventajas con respecto a la realización que utiliza una bolsa de malla que contiene adsorbente. Por ejemplo, se evita la adhesión de plaquetas a la bolsa de malla, aumentando de este modo el rendimiento de plaquetas. Similarmente, debería haber menos pérdida de volumen debido a que hay menos superficies para la adhesión de fluidos. Además, esta realización también elimina los problemas con el atrapamiento de gas dentro del saco de malla. A la inversa, con la falta del saco de malla, esta realización alternativa carece de un mecanismo importante para impedir la infusión inadvertida posterior de las partículas de adsorbente u otros contaminantes.

La presente invención también contempla el uso de otros medios para asegurar las partículas/cuentas de adsorbente dentro de un recipiente de almacenamiento de producto sanguíneo. Por ejemplo, las partículas de Dowex® XUS-43493 pueden incorporarse en una red de fibras para producir un sistema de filtración que comprende una red tridimensional de fibras con partículas ordenadas en forma equidistante dentro de la estructura de la fibra. La red de fibras después se coloca dentro de un recipiente de almacenamiento de plaquetas. Las fibras preferidas están compuestas por poliéster debido a sus antecedentes positivos de uso en dispositivos de contacto con sangre. Puede utilizarse un proceso con adhesivo o libre de adhesivo para asegurar el adsorbente a la red de fibras. (Hoechst Celanese, Charlotte, NC). Se contempla que puede producirse una red homogénea de fibras con cantidades conocidas de adsorbente por superficie; debido a esta homogeneidad, la cantidad apropiada de adsorbente puede medirse simplemente cortando un área predeterminada de red de fibras (es decir, no hay pesada del adsorbente). De este modo, esta realización también evita la necesidad de un RD.

Ejemplo 36 Análisis por HPLC de S-59 Residual y de Fotoproductos de S-59 Después de la Reducción con un RD que Contiene Dowex® XUS-43493

Según se indicó previamente, los fotoproductos generados por iluminación con UVA de los PCs que contienen S-59 puede monitorearse utilizando un ensayo por HPLC. Este ejemplo primero proporciona una perspectiva general de los fotoproductos formados durante la iluminación. De allí en adelante, este ejemplo ilustra las características de reducción de un RD que contiene Dowex® XUS-43493.

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A. Caracterización de S-59 Residual y Fotoproductos de S-59

El proceso de tratamiento fotoquímico incluye la adición de S-59 (por ejemplo, 15,2 mg) a plaquetas (aproximadamente 4,0 x 10^{11}) suspendidas en aproximadamente 300 ml de 35% de plasma/65% de PAS III. Durante la iluminación posterior con luz UVA, S-59 se convierte en fotoproductos en el PC. Los fotoproductos pueden clasificarse como no unidos o unidos sobre la base de los experimentos de diálisis (véase el Esquema A). Los fotoproductos no unidos pueden monitorearse y cuantificarse utilizando un ensayo estándar por HPLC.

Se prepararon muestras para análisis por HPLC conforme al procedimiento general descrito en el Ejemplo 39, abajo. En síntesis, el ensayo incluyó una preparación de muestra inicial que lisa las plaquetas y solubiliza el S-59 y los fotoproductos. El material sobrenadante de la preparación de la muestra después se analizó en columna C-18 de fase reversa con un gradiente de metanol en concentración creciente en tampón de KH_{2}PO_{4}. Los principales picos se detectaron mediante absorbancia óptica.

La Fig. 39 es un cromatograma representativo de HPLC de S-5-59 y de los fotoproductos de S-59 formados en un PC (35% de plasma/65% de PAS III, S-59 150 \muM [15,2 mg/ 300 ml)) después de la iluminación con UVA a 3,0 J/cm^{2} (320-400 nm). Con referencia a la Fig. 39, la ordenada es la densidad óptica a 300 nm mientras que la abscisa representa el tiempo; los picos rotulados "PPs" son picos plasmáticos que están presentes en los cromatogramas de HPLC del plasma sin S-59, y el pico rotulado "TMP" se refiere a 4,5',8-trimetilpsoraleno utilizado como estándar interno. La Fig. 39 revela siete picos principales, que se denominan picos A-G. El S-59 residual está representado por el pico F, y los otros fotoproductos están representados por los picos A-E y G. La cantidad de S-59 residual en la mezcla de plaquetas tratada con UVA es reproducible y puede utilizarse como dosímetro interno para monitorear la aplicación de UVA. Cada uno de los fotoproductos de S-59 también se forma en cantidades reproducibles.

Si bien no es necesario que el mecanismo preciso y los fotoproductos sean conocidos para el uso exitoso de la invención, se cree que la dimerización de S-59 es el principal modo de ruptura fotoquímica. Los dos fotoproductos principales (picos D y E en el cromatograma por HPLC de la Fig. 39) se han aislado de soluciones iluminadas y sus estructuras se han determinado por análisis de GC/MS y RMN y están representados en la Fig. 40. Tal como se expone en la Fig. 40, el pico D es el heterodímero de S-59 y el pico E es el homodímero de S-59 (de aquí en adelante "fotoproductos D y E"); las estructuras de los fotoproductos restantes son desconocidas.

Según se indicó previamente, aproximadamente el 25% del S-59 añadido a los PC se reparte en las plaquetas (dependiendo la cantidad real del recuento de plaquetas). La captación de S-59 por las plaquetas da como resultado una concentración considerablemente más alta de S-59 dentro de las plaquetas. Además, debido a que la dimerización es una reacción biomolecular, el rendimiento de los dímeros (representados por los picos D y E) formados durante el tratamiento fotoquímico también se incrementa dentro de las plaquetas. De este modo, debe diseñarse un RD efectivo para eliminar S-59 y los fotoproductos D y E del interior de las plaquetas.

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B. Características de Reducción de un RD que Contiene Dowex® XUS-43493

Según se describió más arriba, aproximadamente el 74% de los 15,2 mg originales de S-59 está presente como fotoproductos de S-59 residuales y no unidos después de la iluminación. Los estudios de adsorción han demostrado que más del 99% de los 15,2 mg iniciales de S-59 se elimina de los PCs después de la iluminación e incubación con el RD. Esta sección trata la cinética de eliminación de S-59 y los fotoproductos no unidos y los niveles finales de S-59 después del tratamiento con un RD que contiene Dowex® XUS-43493.

Después de la iluminación con UVA de 3,0 J/cm^{2} de un PC al que se le habían añadido 15,2 mg de S-59, el PC tratado se incubó con el RD (contenido dentro de un recipiente plástico PL2410, Baxter) durante 8 horas. Después se tomaron muestras del PC y se sometieron a HPLC para la detección del S-59 residual y de los fotoproductos de S-59. Los niveles de fotoproductos D, E, y F (S-59) posteriores a la incubación están representados en la Tabla N; los fotoproductos A, B, C y G no fueron detectables por HPLC. Los niveles de los fotoproductos residuales son valores promedio tomados de seis unidades plaquetarias independientes tratadas fotoquímicamente y con RD. El Límite de Cuantificación (LOQ) para el ensayo de HPLC fue S-59 0,3 \muM.

TABLA N

67

* Dos mediciones estuvieron por debajo del LOQ para el ensayo, mientras que las otras cuatro {}\hskip0,3cmmediciones estuvieron en el LOQ.

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Están representados en la Fig. 41 cromatogramas representativos de HPLC del PC que muestra los niveles de S-59 y fotoproductos libres antes y después de la incubación de 8 horas con el RD. Los cromatogramas de la Fig. 41 son del PC que contiene S-59 150 \muM (15,2 mg/300 ml) antes de la iluminación con UVA (parte superior), después de la iluminación con UVA (parte media), y después de la iluminación con UVA e incubación con el RD (parte inferior). La ordenada es la densidad óptica a 300 nm medida por el detector de HPLC y la abscisa es el tiempo en minutos.

Los datos descritos más arriba indican que los niveles de los fotoproductos residuales D y E son más altos que los niveles de S-59 residual aunque los niveles iniciales de D y E en el PC iluminado fueron mucho más bajos que S-59. La observación puede entenderse más fácilmente examinando la cinética para la eliminación de S-59 y los fotoproductos D y E de los PCs iluminados. Para este estudio, se tomaron muestras del PC del recipiente plástico PL 2410 que envuelve el RD en diversos puntos de medición antes de la finalización del tratamiento de 8 horas. El PC se analizó para determinar fotoproductos no unidos utilizando el ensayo de HPLC descrito más arriba, que cuantifica los fotoproductos presentes dentro de las plaquetas y en la mezcla de plasma/PAS III. Los resultados representados en la Fig. 42 exponen la cinética para la eliminación de los fotoproductos D, E y S-59 del PC completo. Los fotoproductos D y E parecen alcanzar niveles de equilibrio mientras que S-59 es eliminado casi completamente.

Además de analizar el PC completo, se centrifugaron muestras para eliminar las plaquetas de manera que los fotoproductos no unidos en el plasma/PAS III pudieran analizarse separadamente. Los resultados representados en la Fig. 43 demuestran que todos los fotoproductos son eliminados del compartimiento de plasma/PAS III en forma relativamente rápida. Aunque no es necesario que se entiendan precisamente los factores que influyen sobre la eliminación de los fotoproductos a fin de llevar a la práctica la presente invención, los resultados sugieren que la eliminación de los fotoproductos D y E está cinéticamente limitada por la migración desde el interior de las plaquetas al compartimento de plasma/PAS III. Que sea más difícil eliminar los fotoproductos D y E que S-59 puede deberse al hecho de que los fotoproductos D y E poseen dos grupos amino cargados que deben neutralizarse al cruzar la membrana plaquetaria, mientras que S-59 posee sólo un único grupo amino cargado.

La limitación cinética para eliminar los fotoproductos D y E del interior de las plaquetas indica que la realización preferida incluye un proceso de contacto por lotes en vez de un proceso de flujo. Es decir, el uso de un RD por lotes proporciona suficiente tiempo para permitir que los fotoproductos D y E sean eliminados del interior de las plaquetas hasta niveles factibles en vista de las limitaciones prácticas impuestas por los procedimientos de almacenamiento de sangre que limitan el tiempo de incubación disponible con la resina.

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Ejemplo 37 Ensayos In Vitro de la Función Plaquetaria Después del Tratamiento de RD por Lotes con Dowex® XUS-43493

Este ejemplo describe los ensayos in vitro de la función plaquetaria del PC sometido a tratamiento fotoquímico, tratamiento con RD de 8 horas (Dowex® XUS-43493) y almacenamiento (recipiente plástico PL 2410, Baxter). Los resultados de los ensayos para las mezclas de plaquetas sometidas a tratamiento fotoquímico y con RD se compararon con mezclas idénticas de plaquetas sometidas sólo a tratamiento fotoquímico. Según se describe en detalle más abajo, se evaluó cada uno de los parámetros los días 1, 5 y 7; después de cinco días de almacenamiento de las plaquetas, los productos tratados y no tratados demostraron una función in vitro comparable.

Dos PCs de donante único ABO-compatible que contenían 2-5 x 10^{11} plaquetas en aproximadamente 300 ml de 35% de plasma y 65% de PAS III se combinaron y se redividieron en dos unidades idénticas en recipientes plásticos PL 2410 (Baxter). Una unidad (el control) se colocó inmediatamente en un agitador de plaquetas y se conservó a aproximadamente 22ºC. La otra unidad (la prueba) se trató con S-59 150 \muM y UVA de 3 Joules/cm^{2}. Después del tratamiento, la suspensión de plaquetas se transfirió a un segundo recipiente plástico PL 2410 que contenía un RD. El contacto entre las plaquetas y el RD se produjo durante un período de aproximadamente 8 horas, después la suspensión plaquetaria se transfirió a un nuevo recipiente plástico PL 2410 para almacenamiento. El momento de donación de la sangre se definió como el día 0. El tratamiento con S-59, UVA (320-400 nm) y el RD se realizó en el día 1. Se realizaron seis experimentos replicados, cada uno con una combinación diferente de dos concentrados de plaquetas de donante único ABO-compatible.

Para la evaluación de la función plaquetaria in vitro, se extrajeron muestras de plaquetas de las unidades de control y de prueba antes del tratamiento y después del tratamiento los días 2, 5 y 7. Se analizaron los siguientes parámetros: pH, pO_{2}, pCO_{2}, concentración de bicarbonato, recuento plaquetario, morfología, agregación, cambio de forma de las plaquetas, respuesta al shock hipotónico, producción de lactato, consumo de glucosa, secreción de ATP, expresión de p-selectina y formación de microvesículas. Se ha informado en la literatura que varios de estos ensayos, incluyendo pH, puntaje de morfología, cambio de forma de las plaquetas, y respuesta al shock hipotónico, se correlacionan con la recuperación y supervivencia posterior a la transfusión in vivo. Se utilizó la prueba T apareada de Student para el análisis estadístico.

Para evaluar la eficacia del RD para reducir la concentración de S-59, se analizaron muestras de plaquetas de la unidad de prueba para determinar el contenido de S-59 por HPLC. Se analizaron las muestras antes de la iluminación, después de 3 Joules/cm2 de iluminación e inmediatamente después de tratamiento con RD de 8 horas.

Los resultados se exponen en la Tabla O y la Tabla P. Con referencia a las Tablas O y P, "ID" se refiere a si la muestra era una unidad de prueba (es decir, "T") o una unidad de control (es decir, "C"), el símbolo "*" indica p\leq0,05 entre las plaquetas de prueba y las plaquetas de control, y "n.d." indica que las mediciones no se realizaron. Para la medición de recuento de plaquetas, el volumen de la unidad de control es aproximadamente 5% menor que el volumen de la unidad de prueba apareada; de este modo, para el análisis estadístico el recuento de plaquetas por \mul para la unidad de prueba se ajustó por un factor de 1,05. El pH de las plaquetas tratadas se mantuvo en 6,91\pm0,05 después de siete días de almacenamiento después del tratamiento.

Los resultados demuestran que las plaquetas no fueron afectadas desfavorablemente por el tratamiento fotoquímico seguido por tratamiento con el RD de la presente invención. No hubo diferencia estadísticamente significativa (p>0,05) entre las plaquetas de prueba y las plaquetas de control para el recuento de plaquetas, agregación plaquetaria, trifosfato de adenosina secretor (ATP) y formación de microvesículas evaluados durante siete días de almacenamiento. Las mediciones en la morfología de plaquetas y cambio de forma de las plaquetas demostraron mejoras estadísticamente significativas (p\leq0,05) con el paso del tiempo para las plaquetas de prueba. Las diferencias estadísticamente significativas (p\leq0,05) en pCO_{2}, pO_{2}, HCO_{3}-, glucosa plasmática y producción de lactato sugirieron una disminución en la velocidad metabólica para las plaquetas tratadas que no parecieron ser perjudiciales para la propiedad plaquetaria. Se detectaron diferencias estadísticamente significativas para la respuesta al shock hipotónico (HSR) en el día 2 y para la expresión de p-selectina en los días 2 y 5.

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TABLA O

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TABLA P

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Se midieron la concentración de S-59 antes y después de la iluminación con UVA y la reducción en la concentración de S-59 residual después del tratamiento con RD mediante análisis por HPLC. A 0 Joule/cm^{2}, la concentración inicial de S-59 en un concentrado de plaquetas fue aproximadamente 145 \pm 10 \muM. Después de 3 Joule/cm^{2} de iluminación, quedó sin reaccionar el 20,5% \pm 2,3% del S-59 inicial (Tabla Q). Con referencia a la Tabla Q, "n.a." significa no aplicable y "n.d." significa "no realizado". La concentración del S-59 remanente se redujo a 0,27 \pm 0,05 \muM por tratamiento con un RD durante 8 horas. Este nivel de reducción en S-59 fue de aproximadamente 100 veces.

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TABLA Q

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Los resultados indicaron que la función plaquetaria in vitro después del tratamiento fotoquímico con S-59 150 \muM y UVA 3 Joules/cm^{2} y eliminación de S-59 mediante tratamiento con un RD durante 8 horas se mantuvieron adecuadamente durante siete días de almacenamiento.

Los valores medidos de la función plaquetaria in vitro para la plaquetas de prueba obtenidas en este estudio fueron comparables a los obtenidos para las plaquetas tratadas fotoquímicamente sin exposición al RD en un estudio anterior (resultados no representados). Se han evaluado las plaquetas tratadas fotoquímicamente en voluntarios humanos normales y han demostrado tener recuperación in vivo y período de vida normales. Sobre la base de estos estudios in vitro, no se espera que el tratamiento con un RD tenga un efecto adiciona sobre la función plaquetaria in vivo.

Después de un tratamiento con RD de 8 horas, se alcanzó una reducción de 100 veces en la concentración de S-59. La concentración de S-59 residual se redujo hasta \leq 0,3 \muM. Estos resultados demuestran que la incorporación de un RD en un proceso de tratamiento fotoquímico para concentrados de plaquetas proporciona un medio viable para reducir efectivamente la exposición del paciente a S-59 y de este modo incrementar el margen de seguridad de la transfusión plaquetaria.

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Ejemplo 38 Eliminación de Psoraleno de Plasma Congelado Fresco Utilizando un Dispositivo de Eliminación por Lotes

Algunos de los ejemplos anteriores tratan la eliminación de psoraleno de los concentrados de plaquetas utilizando RDs por lotes que contienen adsorbentes Dowex®. Este ejemplo describe los experimentos con plasma congelado fresco (FFP) utilizando RDs que contienen Dowex® XUS 43493 (también conocido comercialmente como Optipore® L493). Los experimentos evaluaron i) la cantidad de adsorbente requerido para eliminar S-59 hasta niveles preferidos y ii) el efecto de la masa del adsorbente determinada en i) sobre la actividad del factor de coagulación.

Según se describe en detalle más abajo, el protocolo básico para los experimentos de este ejemplo es similar al de los experimentos con plaquetas. Sin embargo, se utilizaron cantidades mayores de adsorbente (y sacos de malla más grandes para acomodar el adsorbente) debido a que se deseaba un tiempo de tratamiento muy corto, por ejemplo 1 hora. El plasma congelado fresco preferentemente se procesa rápidamente debido a que los factores de coagulación pueden degradarse con el tiempo cuando se encuentran a temperatura ambiente.

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A. Efecto de la Masa de Adsorbente Sobre la Cinética de Eliminación de S-59 y Retención de la Actividad de los Factores de Coagulación

Sobre la base de los resultados de los estudios toxicológicos (no representados), el nivel residual preferido de S-59 después del tratamiento con el dispositivo de eliminación (RD) y tratamiento fotoquímico es menor que 5 \muM, preferentemente menor que 1 \muM, y mucho más preferentemente menor que o igual a 0,75 \muM. Además, es preferible lograr el nivel deseado de \leq 0,75 \muM en menos de 2 horas y con preferencia aproximadamente una hora debido a las restricciones actuales de la FDA que tratan acerca del manipuleo de plasma a temperatura ambiente. Con esos objetivos en mente, se realizaron los siguientes experimentos.

Se combinaron siete unidades frescas de plasma, cada una con 250-325 ml, y se dividieron en porciones de plasma de 250 ml. Se añadió cada porción de 250 ml a un recipiente plástico PL 2410 (Baxter), y después se añadió un volumen de solución de S-59 a cada recipiente para alcanzar una concentración final de S-59 150 \muM. Los recipientes después se colocaron en un Sistema de Iluminación Ultravioleta (Steritech,. Inc. y Baxter Healthcare Corp., Fenwal Division) para el tratamiento fotoquímico y se iluminaron (UVA de longitud de onda larga de 3 J/cm^{2} [320-400 nm]).

A partir de ese momento, la solución de plasma/S-59 de cada recipiente se transfirió a un recipiente plástico PL 2410 (Baxter) separado que envolvía un RD que contenía 5, 10, 15 o 20 g de Dowex® XUS 43493 seco dentro de un saco de malla de 12 cm x 12 cm (malla de poliéster de 30 \mum). Los recipientes después se incubaron con0 agitación a temperatura ambiente. Se extrajeron muestras de cada uno de los recipientes antes de la iluminación y después de la iluminación a 1 hora y 8 horas. Se almacenaron estas muestras a -80ºC para el análisis posterior.

Las muestras tomadas de cada bolsa después de una incubación de 1 hora se analizaron para determinar S-59 y la eliminación de fotoproductos. Los resultados (n = 7) para S-59 residual y los fotoproductos D y E (dos de los fotoproductos primarios formados durante la iluminación, según se describió más arriba) están representados en la Tabla R (ND = no detectable; 1 hora de incubación).

TABLA R

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Se analizaron muestras tomadas de cada bolsa después de una incubación de 8 horas con el RD para determinar la actividad de los factores de coagulación. Los resultados (n = 7) utilizando RDs que contenían masas diferentes de adsorbente están representados en la Tabla S (incubación de 8 horas).

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TABLA S

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B. Cinética de Eliminación de S-59 y Retención de la Actividad de los Factores de Coagulación con un RD que Contiene 12,5 g de Adsorbente

Sobre la base de los resultados de los experimentos descritos más arriba, se determinó que 12,5 g de Dowex® XUS-43493 es una cantidad preferida para la eliminación de S-59 residual y los fotoproductos y la retención de la actividad de los factores de coagulación dado el tamaño de la bolsa, el volumen de plasma, la concentración seleccionada de S-59 y el límite deseado de 1 hora. Esta sección describe los experimentos para evaluar la cinética de eliminación y retención de la actividad de los factores de coagulación utilizando un RD que contiene 12,5 g de adsorbente.

Los experimentos se realizaron de la manera descrita más arriba. Las muestras extraídas de cada uno de los recipientes previo a la iluminación y con posterioridad a la iluminación para el análisis de S-59 residual y los fotoproductos y la actividad de los factores de coagulación se almacenaron a -80ºC.

Los resultados (n = 7) para S-59 residual y los fotoproductos D y E obtenidos de las muestras tomadas después de una incubación de 1 hora se exponen en la Tabla T. Según lo indicado en la Tabla T, el RD alcanzó el nivel de eliminación deseado (S-59 residual \leq0,75 \muM en aproximadamente una hora) (ND = no detectable; 1 hora de incubación).

TABLA T

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Los resultados (n = 7) de actividad de los factores de coagulación después de una incubación de 2 horas con el RD se representan en la Tabla U.

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TABLA U

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Según indican los resultados, hubo poco, si lo hubo, efecto sobre el tiempo de protrombina, tiempo parcial de tromboplastina y Factor V. Es más, las reducciones en la actividad para los otros factores de coagulación fueron aceptables. Estos resultados indican que un RD que contiene Dowex® XUS 43493 puede emplearse exitosamente con FFP. En las condiciones ensayadas, es conveniente usar más de 10 g, y más preferentemente 12,5 g.

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Ejemplo 39 Efecto de las Características Estructurales del Psoraleno Sobre la Adsorción

Varios de los ejemplos anteriores trataron la eliminación de 5-59 de los concentrados de plaquetas mediante dispositivos de flujo y por lotes. Este ejemplo supone una determinación de cómo las características estructurales de los psoralenos pueden afectar su eliminación por los adsorbentes Amberlite durante la adsorción por lotes.

En los experimentos de este ejemplo se utilizaron los siguientes tres psoralenos estructuralmente diferentes: Psoraleno A, un psoraleno con una amina cuaternaria (4'-(trietilamino)metil-4,5',8-trimetilpsoraleno]; Psoraleno B, un psoraleno bromado que no tiene carga (5-bromo-8-metoxipsoraleno]; y Psoraleno C, un psoraleno bromado que tiene carga positiva (5-bromo-8-(dietilaminopropiloxi)-psoraleno]. Las estructuras químicas de estos psoralenos se exponen en la Fig. 44; debe observarse que mientras el Br^{-} se describe como el contraión en la Fig. 44, generalmente el CI^{-} es el contraión. Para los estudios de adsorción, estos psoralenos se combinaron con adsorbentes Amberlite iónicos y no iónicos. Más específicamente, se utilizaron tres adsorbentes de poliestireno no iónicos (Amberlite® XAD-2, XAD-4 y XAD-16), un adsorbente de éster poliacrílico no iónico (Amberlite® XAD-7) y dos adsorbentes de poliestireno derivatizados con grupos intercambiadores de iones (Amberlite® 200 [ácido sulfónico) y Amberlite® DP-1 (ácido carboxílico)). Algunas de las propiedades de estos adsorbentes se exponen en la Tabla A, arriba.

Para este ejemplo, los concentrados de plaquetas contenían aproximadamente 4,0 x 10^{11} plaquetas/300 ml en una mezcla de 35% de plasma/65% de PAS III. Las soluciones patrón (15 mM) de cada psoraleno (es decir, Psoralenos A, B y C) se prepararon en DMSO. Las diluciones seriadas de cada psoraleno después se prepararon en el PC en concentraciones que variaban de 300 \muM a 10 \muM; a los efectos de los cálculos que siguen, estas concentraciones iniciales se designaron C. A partir de ese momento, se prepararon muestras de control y muestras de ensayo para análisis por HPLC. Se prepararon las muestras de ensayo añadiendo una alícuota de 3,0 ml de cada dilución a un tubo de polipropileno de 5 ml que contenía 0,1 g de adsorbente; se prepararon las muestras de control en forma análoga con la excepción de que se omitió el adsorbente. Las muestras de control y de ensayo después se incubaron durante 6 horas a 22ºC haciéndolas rotar suavemente en una mezcladora (Barinstead, Thermolyne Model 400110). Esta incubación dio como resultado un completo equilibrio entre el psoraleno adsorbido y el psoraleno libre sobre la base de estudios previos de equilibrio con S-59.

Después se obtuvieron los datos de adsorción mediante análisis por HPLC sobre las muestras de control y de ensayo. Específicamente, se sacó de cada tubo un volumen de muestra de 200 \mul de PC después del período de incubación (teniendo especial cuidado para asegurar que no se extrajera ninguna partícula de adsorbente con las muestras de ensayo). Cada muestra de PC se diluyó 5 veces con diluyente de muestra (concentración final: 35% de metanol, KH_{2}PO_{4} 25 mM, pH = 3,5) que contenía trimetilpsoraleno (TMP) como estándar interno. La adición de metanol lisa las plaquetas y precipita las proteínas plasmáticas de manera que el psoraleno contenido dentro de las plaquetas no es excluido por el ensayo. Esta técnica de preparación de muestra dio como resultado una recuperación mayor del 90% de cada uno de los psoralenos que se utilizaron en el estudio. Las muestras se centrifugaron y el material sobrenadante se filtró con filtros de 0,2 \mum. Las muestras después de analizaron en una columna de fase reversa C-18 (YMC, modelo ODSAM, 4,6 x 250 mm) haciendo pasar un gradiente lineal de 65% de disolvente A (KH_{2}PO_{4} 25 mM, pH = 3,5), B al 35% (Metanol) hasta B al 80% en 20 minutos.

Los resultados de HPLC de las muestras de control se utilizaron para construir las curvas de calibración (no representadas) para los Psoralenos A, B y C. Las curvas de calibración graficaron el área de HPLC (eje y) versus la concentración (eje x) para cada psoraleno. Las pendientes de las curvas de calibración se determinaron por un método de cuadrados mínimos lineales (ordenada al origen forzada a cero). Las pendientes después se utilizaron para calcular la concentración de psoraleno remanente después de 6 horas de tiempo de contacto entre el PC que contenía psoraleno y uno de los adsorbentes Amberlite (véase más abajo).

Los resultados de HPLC de las muestras de ensayo se utilizaron en combinación con las pendientes de las curvas de calibración para determinar las concentraciones de psoraleno residual (es decir, no adsorbido, libre), C_{f} (\mumoles/l), después de la incubación del PC con el adsorbente. Específicamente, el área de HPLC se dividió por la pendiente de la curva de calibración para ese adsorbente particular, produciendo la C_{f}. Se calculó la cantidad (\mumoles) de psoraleno que el adsorbente había eliminado del PC [V(C_{0}-C_{f})]. Después se construyeron isotermas de adsorción que graficaron la capacidad del adsorbente, q (\mumoles/g), versus la concentración final de psoraleno (\muM) en el PC. Se obtuvieron isotermas lineales (descritas por[q = KC_{f}) (Ecuación 1, previamente presentada)). Según se discutió previamente, la pendiente de la isoterma del adsorbente, K (L/g), se denomina constante de adsorción y puede determinarse por una regresión lineal de los datos de adsorción. La Ecuación 1 después puede utilizarse para estimar la capacidad de un adsorbente (q) para un psoraleno dado a una concentración final prevista, C_{f}. En la Tabla V se informan las capacidades de adsorción (\mumoles/g) de varios adsorbentes Amberlite en psoraleno residual 1 \muM (C_{f}).

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TABLA V

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Con posterioridad al cálculo de la capacidad de un adsorbente, se puede determinar la cantidad de adsorbente requerida para lograr un objetivo de eliminación particular (es decir, para eliminar una cantidad dada de un psoraleno particular). Esa cantidad puede calcularse utilizando la siguiente ecuación: [M = V(C_{0}-C_{f})/q] (Ecuación 2, previamente presentada). A los fines de la Ecuación 2, M es la masa de adsorbente (g) y V es el volumen de la muestra a ser
tratado (L).

En una situación típica en donde se desea lograr una inactivación viral en un PC, el psoraleno se añade al PC hasta una concentración de aproximadamente 150 \muM. Sin embargo, durante la iluminación, el psoraleno sufre una fotodegradación; el proceso de fotodegradación da como resultado una concentración inferior para una C_{o} de aproximadamente 30-50 \muM. De este modo, se puede determinar la cantidad de adsorbente requerida para reducir la concentración de psoraleno de C_{o} = 50 \muM hasta un valor deseado C_{f}. La Tabla W enumera la cantidad (g) de adsorbente requerido para lograr una C_{f} 1 \muM utilizando la Ecuación 2. Las cantidades de la Tabla W se calcularon utilizando las capacidades de adsorción (q) enumeradas en la Tabla V, C_{o} = 50 \muM, y V = 0,3 l (una dosis terapéutica típica de PC).

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TABLA W

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* Cantidad (g) de adsorbente requerida para lograr C_{f} = 1 \muM.

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De los datos presentados en la Tabla W, se pueden extraer varias conclusiones con respecto a (i) las características de los mismos adsorbentes y (ii) cómo la estructura del psoraleno afecta la capacidad de eliminación de los psoralenos. Primero, los adsorbentes de poliestireno Amberlite® XAD-2, XAD-4 y XAD-16, parecen ser capaces de eliminar cualquiera de los psoralenos hasta niveles satisfactorios. El desempeño de Amberlite® XAD-7, un adsorbente poliacrílico que es más polar que el poliestireno, no fue tan efectivo como los adsorbentes de poliestireno más hidrófobos. Similarmente, la adsorción con las resinas de intercambio iónico (Amberlite® 200 y Amberlite® DP-1) no dieron como resultado una eliminación de psoraleno comparable con los adsorbentes de poliestireno hidrófobos. Aunque la presente invención no se limita a ningún mecanismo particular, el mecanismo fundamental de eliminación de psoraleno es probablemente la interacción hidrófoba que incluye el apilamiento aromático del psoraleno y las cadenas laterales de poliestireno del adsorbente. Esto explica, en parte, la efectividad de los adsorbentes de poliestireno hidrófobos.

El examen de las propiedades de los psoralenos revela que el tiempo de retención por HPLC puede utilizarse como una estimación aproximada de la hidrofobicidad. Debido a que se analizó cada uno de los psoralenos utilizando el mismo tipo de ensayo por HPLC, se pueden utilizar los tiempos de retención relativos de los psoralenos para clasificarlos conforme a la hidrofobicidad creciente. Los tiempos de retención por HPLC en orden creciente de hidrofobicidad fueron los siguientes: Psoraleno A - 7,8 min, Psoraleno C - 12,0 min; y Psoraleno B - 20,0 min. Si la hidrofobicidad fuera el principal factor en determinar la capacidad de eliminación de un psoraleno del PC, se esperaría que el Psoraleno B se elimine más fácilmente ya que es el más hidrófobo. Sin embargo, a pesar de ser intermediario en hidrofobicidad, el Psoraleno C fue el más fácilmente eliminado del PC. Una explicación posible para este resultado es que el Psoraleno C no interactúa tan fuertemente como el Psoraleno B con las células o proteínas plasmáticas (por ejemplo, la albúmina sérica) que están presentes en el PC. Las fuertes interacciones con las células o proteínas plasmáticas podrían competir con la adsorción, interfiriendo de este modo con la unión a la resina.

Además, los psoralenos que son muy polares, tales como el Psoraleno A, pueden ser más difíciles de eliminar ya que poseen una reducción en la afinidad por los adsorbentes hidrófobos. Además, las resinas de intercambio catiónico ensayadas (Amberlite® DP-1 y Amberlite® 200) también dieron pobre eliminación para todos los psoralenos ensayados. Los resultados de este ejemplo demuestran que los psoralenos que poseen una amplia variedad de características estructurales son capaces de ser eliminados del PC.

Ejemplo 40 Uso de un RD en Combinación con un Sistema de Aféresis

Según se indicó previamente, describimos el uso de un RD en combinación con un sistema de aféresis. Este ejemplo primero describe la recolección simultánea de plaquetas y plasma de un donante único a través de aféresis. Posteriormente, se describe la adición de PAS III y S-59 a la preparación plaquetaria, seguida de una discusión de los procesos de iluminación y tratamiento con RD.

Metodología

Los experimentos de este ejemplo utilizaron un Separador de Células Sanguíneas Baxter Biotech CS-3000^{TM} Plus con Access Management System^{TM} (Baxter Healthcare Corp., Fenwal Division) en combinación con un Kit de Aféresis de sistema cerrado (Baxter Healthcare Corp., Fenwal Division). Los componentes incluyeron dos bolsas vacías de recolección de plaquetas de 1000 ml (plástico PL 3014, Baxter), un recipiente plástico PL 2410 (Baxter) y una bolsa (PL 2411, Baxter) que contenía PAS III. Los componentes adicionales del sistema de aféresis incluyeron una Cámara de Separación TNX-6^{TM}, una Cámara de Recolección PLT-30^{TM}, una Balanza Accesoria de Peso (todos de Baxter Healthcare Corp., Fenwal Division), y un Soldador de tTuberías Estéril Terumo SCD 312. Los parámetros de operación del sistema de aféresis fueron los siguientes: caudal de sangre entera de 50-55 ml/min; offset detector de interfaz fijado en 6; factor de calibración de rendimiento de 1,13; volumen de recolección de plasma de 155 ml, y un rendimiento de plaquetas de 3,7 x 10^{11} plaquetas. El equipamiento se armó y se operó conforme a las instrucciones del fabricante, a menos que se indique lo contrario.

Después de la calibración, se utilizó la Balanza Accesoria de Peso para tarar el primer recipiente de almacenamiento de plaquetas; según se utiliza en este ejemplo, el término "tarar" significa determinar el peso del recipiente de almacenamiento y restar ese peso del peso bruto del recipiente de almacenamiento y la solución para permitir la medición precisa del peso de la solución. Después se cerró la grampa de rodillo. El segundo recipiente de almacenamiento de plaquetas y el conjunto de transferencia se colocaron en ganchos separados frente a las bolsas de solución salina y ACD, respectivamente; se cerró la grampa de rodillo del segundo recipiente de almacenamiento de plaquetas, mientras se abrió la del conjunto de transferencia. El conjunto de transferencia de plasma se utilizó para recolectar la solución salina de cebadura. Después se cebaron las líneas de entrada y retorno con la solución salina, y se ajustó la relación de ACD para administrar una relación anticoagulante de aproximadamente 10:1.

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Recolección de Plaquetas y Plasma

Después de la venipunctura, se extrajo sangre entera del donante y se bombeó a través de la línea de entrada de la tubería múltiple de lumen al recipiente de separación de la centrífuga. El recipiente de separación separó la sangre entera en dos fases diferentes, una que contenía plasma y plaquetas (es decir, plasma rico en plaquetas) y otra que contenía glóbulos rojos; los glóbulos rojos se regresaron al donante. El plasma rico en plaquetas después se bombeó desde el recipiente de separación al recipiente de recolección de la centrífuga. Mientras el plasma rico en plaquetas pasaba a través del recipiente de recolección, las plaquetas se concentraron a medida que el plasma se extraía. Las plaquetas concentradas en el recipiente de recolección estaban asociadas a aproximadamente 30 ml de plasma residual. Por supuesto, diferentes parámetros de operación y diferentes sistemas de aféresis pueden dar como resultado otras cantidades de plasma residual asociado a las plaquetas.

Al utilizar la Cámara de Recolección PLT-30^{TM}, se debe recolectar una cantidad adicional de plasma durante el procedimiento para la posterior resuspensión y almacenamiento de las plaquetas. De este modo, después que se habían procesado 400 ml de plasma por la bomba de plasma y el sistema de aféresis no estaba en una situación de desborde, se seleccionó la opción de plasma y el sistema se programó para recolectar 155 ml de plasma. Después de abrir las grampas apropiadas, se recolectaron 55 g de plasma (pesado en la balanza accesoria) en el primer recipiente de almacenamiento de plaquetas para la posterior resuspensión de plaquetas, y posteriormente se recolectaron 100 ml en el segundo recipiente de almacenamiento de plaquetas. Después de la recolección del plasma, se inició el Modo de Reinfusión del Separador de Células Sanguíneas Baxter Biotech CS-3000^{TM}. La aguja de la línea de retorno se retiró del brazo del donante.

Después de retirar los recipientes de separación y recolección de sus respectivos ensamblajes de grampas, las plaquetas concentradas en el recipiente de recolección se resuspendieron hasta que no era visible ningún agregado plaquetario. Esto se realizó añadiendo los 55 g de plasma de la primera bolsa de recolección de plaquetas al recipiente de recolección. El recipiente de almacenamiento de plaquetas y ensamblaje del conjunto de transferencia de plasma después se colocaron en la parte inferior del compartimiento de la centrífuga y las plaquetas concentradas se transfirieron a la primera bolsa de recolección de plaquetas. Finalmente, este ensamblaje de almacenamiento de plaquetas se separó del kit de aféresis haciendo tres sellados herméticos aproximadamente 30,5 centímetros por debajo del colector, dando como resultado una longitud de 30,5 centímetros de tubería que se utilizó más tarde para conectar el ensamblaje a través del acoplamiento estéril a la solución PAS III. La tubería se cortó entre los sellos de manera tal que se dejaron dos sellos en el ensamblaje del recipiente de almacenamiento de plaquetas.

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Transferencia de la Solución PAS III al PC Seguida de Transferencia al Recipiente de Almacenamiento

La solución PAS III después se añadió al PC a través de un procedimiento de acoplamiento estéril. La Patente Estadounidense No. 4.412.835 concedida a Spencer, incorporada a la presente memoria como referencia, describe un aparato de acoplamiento estéril. Primero, la longitud de 30,5 cm de los tubos del ensamblaje del recipiente de almacenamiento de plaquetas se colocaron en la ranura posterior del dispositivo de conexión estéril (SCD). Los dos recipientes de almacenamiento de plaquetas y el conjunto de transferencia de plasma se colgaron a la derecha del SCD, y sus grampas de rodillo se controlaron para asegurar que estuvieran cerradas. La línea del recipiente plástico PL 2411 (Baxter) con la solución PAS III se colocó en la ranura frontal del SCD de manera que el recipiente plástico PL 2411 (Baxter) se dejó del lado izquierdo del SCD. Después se realizó la operación de soldadura estéril (Soldador de Tuberías Estéril Terumo SCD 312), y la conexión fluida se controló para detectar posibles fugas. Después de abrir la grampa de rodillo para el recipiente del PC, la solución PAS III se pasó al PC, y el aire residual del PC se condujo en forma forzada al recipiente vacío de PAS III. Finalmente, los tubos de conexión se termosellaron y el recipiente de PAS III se desechó.

A continuación, el recipiente de almacenamiento de plaquetas que contenía solución de PC/PAS III se conectó al recipiente plástico PL 2410 (Baxter). Después de pesar el recipiente plástico PL 2410 (Baxter) vacío, ese recipiente se acopló en forma estéril (utilizando el procedimiento descrito más arriba) al conjunto de transferencia de plasma (que comprendía el recipiente de almacenamiento de plaquetas que contenía solución de PC/PAS III). Después de finalizar la operación de soldadura estéril (Soldador de Tubo Estéril Terumo SCD 312), se desechó el conjunto de transferencia de plasma. Después se transfirió la solución de PC/PAS III del primer recipiente de plaquetas al recipiente plástico PL 2410 (Baxter), conduciendo el aire en forma forzada al primer recipiente de almacenamiento de plaquetas ahora
vacío.

Después se pesó la solución de PC/PAS III. El volumen total (excluyendo la tara del recipiente plástico PL 2410 (Baxter)) debe ser 300 \pm 10 ml. Si el volumen total (medido en peso) es menor que 290 ml, se puede añadir una cantidad de plasma del segundo recipiente de almacenamiento de plaquetas (utilizado para recolectar plasma concurrente) para alcanzar el volumen deseado. Esto da como resultado un concentrado final de plaquetas de aproximadamente 35% de plasma/65% de solución de PAS III. Finalmente, la línea proveniente del recipiente plástico PL 2410 (Baxter) se selló herméticamente tan lejos del recipiente como fuera posible, y se almacenó solución de PC/PAS III en un agitador de lecho plano a 22 \pm 2ºC.

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Conexión Estéril de Solución de PC/PAS III a la Solución de S-59

Se añadió la solución de PC/PAS III a la solución de S-59 e inmediatamente se transfirió a un recipiente vacío para la posterior iluminación. Primero, se realizó el procedimiento de soldadura/acoplamiento estéril descrito más arriba para crear una conexión fluida entre la línea del recipiente de PC/PAS III y una línea del recipiente plástico (recipiente plástico PL 2411, Baxter) con el S-59 (15 ml; 3 mM). Se realizó la operación de soldadura estéril y se controló la línea para detectar posibles fugas. Después, se utilizó el procedimiento de soldadura estéril para conectar la línea desconectada del recipiente de S-59 al tubo más corto de un recipiente plástico PL 2410 (Baxter) vacío. Nuevamente, se realizó la operación de soldadura estéril, y se controló la línea para detectar posibles fugas. Después de retirar la grampa apropiada, la solución de PC/PAS III se pasó a través del recipiente de S-59 y al recipiente plástico PL 2410 (Baxter) vacío. Los tubos entre el recipiente d S-59 y el recipiente plástico PL 2410 (Baxter) se termosellaron tan cerca del recipiente de S-59 como fuera posible, y se descartaron los dos recipientes vacíos. El recipiente de S-59/PC/solución de PAS III después se colocó en un agitador de lecho plano durante un mínimo de 5 minutos y un máximo de 1 hora.

Según se describió más arriba, este ejemplo incluyó la transferencia de la solución de PC/PAS III a través del recipiente de S-59, permitiendo que las dos soluciones se mezclen, y a un recipiente plástico PL 2410 (Baxter) separado. Sin embargo, si el PC/solución de PAS III está en un recipiente plástico PL 2410 (Baxter) antes de mezclar con la solución de S-59, no es necesario transferir las soluciones a un recipiente separado para la iluminación. Antes bien, el recipiente plástico PL 2410 (Baxter) que contiene la solución de PC/PAS III puede acoplarse en forma estéril al recipiente con la solución de S-59, las dos soluciones pueden mezclarse completamente, y el volumen completo puede recolectarse en el recipiente plástico PL 2410 (Baxter) para la posterior iluminación.

Si se desea, se pueden evaluar muestras de la solución resultante (por ejemplo, concentración de S-59 antes de la iluminación por HPLC). El procedimiento de muestreo supone desmontar (sellador/separador modelo 1301; Sebra) la línea al producto de plaquetas para despachar una muestra de plaquetas al trozo largo de tubo remanente en el recipiente de solución de S-59/PC/PAS III. De ahí en adelante, los tubos se termosellan al menos a 30,5 cm del recipiente de la solución, y las muestras pueden prepararse y procesarse. Por ejemplo, los extremos de los tubos pueden cortarse sobre un tubo de centrífuga estéril de 15 ml, permitiendo que la solución drene en el tubo, y las alícuotas pueden colocarse en los tubos de microcentrífuga de 5 ml (Vacutainer, Becton-Dickinson). Las muestras de la solución (por ejemplo, alícuotas de 200 \mul) después pueden transferirse a tubos de polipropileno de microcentrífuga y almacenarse a -20ºC previo al análisis por HPLC.

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Tratamiento Fotoquímico

Después se colocó el recipiente de la solución de S-59/PC/PAS III en un Sistema de Iluminación Ultravioleta (Steritech, Inc. and Baxter Healthcare Corp.. Fenwal Division) para el tratamiento fotoquímico. El recipiente se iluminó (UVA de longitud de onda larga de 3 J/cm^{2} [320-400 nm]), registrando la temperatura (antes y después) y la duración del tratamiento. La solución iluminada después se almacenó en la oscuridad en un agitador de lecho plano a aproximadamente 22ºC (22 \pm 2ºC) hasta que se añadió al recipiente que envolvía el RD.

Reducción de S-59 con un RD

Antes de su uso, se inspeccionó el recipiente que envolvía el RD para evaluar la materia particulada, la integridad del RD y la integridad del filtro de puerto. Además, se tuvo cuidado de no manipular o aplastar las cuentas del RD. La Fig. 37 ilustra el tipo de recipiente que envuelve el dispositivo de eliminación (RD) por lotes utilizado en este ejemplo.

El procedimiento de soldadura/acoplamiento estéril descrito más arriba se realizó entre la línea proveniente del recipiente de la solución tratada de S-59/PC/PAS III y la línea proveniente del recipiente que envolvía el RD. Se realizó la operación de soldadura estéril, y se controló la línea para detectar posibles fugas. La solución tratada de S-59/PC/PAS III se transfirió al recipiente que envolvía el RD, y el aire residual se condujo en forma forzada al ahora vacío recipiente de solución de S-59/PC/PAS III. Si el recipiente que envolvía el RD se envasó al vacío, usualmente no existe aire residual. La línea que conecta las dos bolsas se termoselló y se descartó el recipiente vacío de la solución de S-59/PC/PAS III. El recipiente que ahora contenía la solución de S-59/PC/PAS III después se agitó continuamente durante 8 horas a 22ºC (agitador de plaquetas de lecho plano modelo #PF48; Helmer Lab Co.).

Después de un período de agitación de 8 horas, la línea del recipiente que envolvía el RD se soldó/acopló en forma estéril (utilizando el procedimiento descrito más arriba) a la línea de un recipiente plástico PL 2410 (Baxter) vacío. Después de controlar la línea para detectar posibles fugas, el PC tratado con RD se transfirió al recipiente de almacenamiento. El tubo de conexión se termoselló y se descartó el recipiente ahora vacío que envolvía el RD. El recipiente de almacenamiento que contenía el PC final después se almacenó en un agitador de lecho plano a 22ºC. La solución final tratada puede almacenarse (hasta cinco días a partir del momento de extracción de la sangre entera del donante) para la posterior infusión a un receptor.

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Ejemplo 41 Uso de un RD en Combinación con un Sistema de Aféresis

Aunque es similar en muchos aspectos, este ejemplo incluye una variación del procedimiento de aféresis presentado en el ejemplo anterior. A modo de ilustración, el protocolo de este ejemplo utilizó sólo una de las dos bolsas de almacenamiento de plaquetas para la recolección de plasma, mientras que se utilizaron ambas bolsas de recolección de plaquetas en el ejemplo anterior. Además, mientras que las bolsas de almacenamiento de plaquetas en el ejemplo anterior eran recipientes plásticos PL 2410 (Baxter), el protocolo de este ejemplo utiliza recipientes plásticos PL 3014 (Baxter) que no son apropiados para el tratamiento fotoquímico. Estas diferencias y otras relacionadas con el procedimiento y equipo utilizados en la recolección de productos sanguíneos del donante y el procedimiento para añadir los diversos agentes a esos productos se describen en detalle más abajo.

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Metodología

Los experimentos de este ejemplo utilizaron un Separador de Células Sanguíneas Baxter Biotech CS-3000^{TM} Plus con Sistema de Administración de Acceso (Baxter Healthcare Corp., Fenwal Division) en combinación con un Kit de Aféresis de Sistema Cerrado (Baxter Healthcare Corp., Fenwal Division). Los componentes incluyeron dos bolsas de recolección de plaquetas vacías de 1000 ml (recipiente plástico PL 3014, Baxter), un recipiente plástico PL 2410 (Baxter) y una bolsa que contenía PAS III (recipiente plástico PL-2411, Baxter). Los componentes adicionales del sistema de aféresis incluyeron una Cámara de Separación TNX-6^{TM} (Baxter Healthcare Corp., Fenwal Division), una Cámara de Recolección PLT-30^{TM} (Baxter Healthcare Corp., Fenwal Division), una Balanza Accesoria de Peso (Baxter Healthcare Corp.), un dispositivo de conexión estéril (modelo SCD 312; Terumo) y un sellador de tubos (modelo #1090; Sebra Engineering and Research Associates). Estos componentes se utilizaron en combinación con un Kit de Aféresis de Sistema Cerrado (modelo 4R2295; Baxter Healthcare Corp.. Fenwal Division). Los parámetros de operación del sistema de aféresis fueron los siguientes: caudal de sangre entera de 50-55 ml/min; offset detector de interfaz fijado en 6; factor de calibración de rendimiento de 1,13; volumen de recolección de plasma de 155 ml, y un rendimiento de plaquetas de 3,7 x 10^{11} plaquetas. El equipo se armó y se operó conforme a las instrucciones del fabricante, a menos que se indique lo contrario.

Después de la calibración, se utilizó la Balanza Accesoria de Peso para tarar el primer recipiente de almacenamiento de plaquetas; según se utiliza en este ejemplo, el término "tarar" significa determinar el peso del recipiente de almacenamiento y restar ese peso del peso bruto del recipiente de almacenamiento y la solución para permitir la medición precisa del peso de la solución. Después se cerró la grampa de rodillo. El segundo recipiente de almacenamiento de plaquetas y el conjunto de transferencia se colocaron en ganchos separados frente a las bolsas de solución salina y ACD, respectivamente; se abrió la grampa de rodillo del segundo recipiente de almacenamiento de plaquetas, mientras que la del conjunto de transferencia se cerró. El segundo recipiente de almacenamiento de plaquetas se utilizó para "desbordes" a lo largo del procedimiento, incluyendo la solución salina utilizada para cebar las líneas de entrada y retorno. Después se cebaron las líneas de entrada y retorno con la solución salina, y la relación de ACD se ajustó para aplicar una relación de anticoagulante de aproximadamente 10:1-11:1.

Recolección de Plaquetas y Plasma

Después de la venipunctura, se extrajo sangre entera del donante y se bombeó a través de la línea de entrada del tubo múltiple de lumen al recipiente de separación de la centrífuga. El recipiente de separación separó la sangre entera en plasma rico en plaquetas y glóbulos rojos, regresando estos últimos al donante. El plasma rico en plaquetas después se bombeó desde el recipiente de separación al recipiente de recolección de la centrífuga. Mientras el plasma rico en plaquetas pasaba a través del recipiente de recolección, las plaquetas se concentraban a medida que se extraía el plasma.

Cuando el sistema de aféresis estuvo listo para recolectar plasma (es decir, después que 400 ml de plasma habían sido procesados en la bomba de plasma), se seleccionó la opción de plasma y se ingresó un volumen de plasma de aproximadamente 200 ml. Después de cerrar la bolsa de desborde y abrir la primer bolsa de recolección de plaquetas que se apoyaba sobre la balanza accesoria de peso, se recolectaron 54 g de plasma para la posterior resuspensión de plaquetas; después se cerró la grampa en esa bolsa. Inmediatamente después, la grampa del conjunto de transferencia se abrió y se recolectó el plasma concurrente remanente. Tras la recolección del plasma concurrente, se cerró la grampa y la grampa de la bolsa de recolección de desborde se abrió nuevamente. Al finalizar la recolección, se cerraron todas las grampas y el donante se desconectó del sistema de aféresis.

Después que se retiró el recipiente de recolección del ensamblaje de grampas, las plaquetas concentradas en el mismo se mezclaron manualmente hasta que se suspendieron homogéneamente en el plasma residual presente en el recipiente de recolección. Después, se abrió la grampa de la primera bolsa de recolección de plaquetas que contenía los 54 g de plasma y se hizo drenar el plasma al recipiente de recolección. Después de mezclar bien las plaquetas y el plasma, se transfirieron de regreso al primer recipiente de almacenamiento de plaquetas. Después se añadió el plasma adicional recolectado en el conjunto de transferencia para alcanzar un total de 105 ml de plasma. La bolsa de recolección de desborde se termoselló, se desconectó y se descartó. Después de aflojar las grampas de las líneas de plasma que iban a la cámara de recolección, se selló el tubo que iba a cada bolsa (dejando suficiente tubo para poder acoplar en forma estéril las bolsas entre sí). El recipiente plástico PL 3014 (Baxter) y el conjunto de transferencia de plasma concurrente se mantuvieron conectados entre sí y las cámaras de recolección y separación se retiraron y se descartaron de esas bolsas. Finalmente, se midió el peso en la bolsa que contenía el PC para la determinación del volumen de plasma.

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Transferencia de la Solución PAS III y de S-59 al PC

En este ejemplo, a fin de conservar el plasma y facilitar la descontaminación eficaz, las plaquetas se concentraron en 105 ml de plasma autólogo y 180 ml de PAS III (la preparación también contenía 15 ml de ACD). Se utilizó un sistema de tratamiento fotoquímico que comprendía un recipiente plástico PL 2410 (Baxter), una bolsa con 180 ml de solución PAS III, y una bolsa con 15 ml (3 mM) de solución de S-59. Después de pesar la bolsa de almacenamiento de plaquetas vacía, se utilizó un SCD para conectar el conjunto de transferencia que contenía los 180 ml de PAS III a la unidad de plaquetoféresis de donante único en el recipiente plástico PL 3014 (Baxter). La solución PAS III después se añadió al PC y el tubo entre la bolsa vacía de PAS III y el PC se termoselló, dejando suficiente tubo para el PL 3014 (Baxter) como para acoplarlo en forma estéril posteriormente a la bolsa de S-59. La bolsa vacía de PAS III se descartó, y se permitió que las plaquetas reposaran durante menos de 2 horas en un agitador de lecho plano (modelo #PF48; Helmer Lab Co.) hasta que se desagregaran lo suficiente.

Es preferible que el S-59 no se una a la bolsa de manera que esté disponible la cantidad deseada de S-59 en la bolsa de S-59 para mezclarse con la solución de producto sanguíneo. De este modo, en las realizaciones preferidas de la presente invención, se utilizan polímeros que no se unen a ningún psoraleno en la construcción de la bolsa de S-59 (y en las bolsas utilizadas para alojar otros psoralenos).

La bolsa de S-59 después se acopló en forma estéril con un dispositivo de conexión estéril (SCD) (utilizando el procedimiento previamente descrito) al recipiente plástico PL 3014 (Baxter) que contenía la solución de PC/PAS III. Es preferible que S-59 no se una a la bolsa de manera que esté disponible la cantidad deseada de S-59 en la bolsa de S-59 para mezclarse con la solución de producto sanguíneo. De este modo, en las realizaciones preferidas de la presente invención, se utilizan polímeros que no se unen a ningún psoraleno en la construcción de la bolsa de S-59 (y en la bolsas utilizadas para alojar otros psoralenos). Para el procedimiento de acoplamiento estéril, se utilizó el SCD para conectar el tubo más corto en el recipiente plástico PL 2410 (Baxter) (el tubo más largo puede utilizarse más tarde para muestreo, si se desea) a la línea libre de la bolsa de S-59. La solución de PC/PAS III del recipiente plástico PL 3014 (Baxter) después se transfirió a través de la bolsa de S-59 al recipiente plástico PL 2410 (Baxter). Esta transferencia fue necesaria debido a que el recipiente plástico PL 3014 no es apropiado para la iluminación. La línea entre la bolsa de S-59 y el recipiente plástico PL 2410 (Baxter) que ahora contenía S-59/PC/PAS III después se termoselló tan cerca de la bolsa de S-59 como fuera posible, mientras que la bolsa de almacenamiento y la bolsa de S-59 vacías se descartaron. La bolsa de S-59/PC/PAS III después se colocó en un agitador de plaquetas (mínimo de 5 min., máximo de 1 hora).

Si se desea, pueden extraerse muestras de la solución resultante para análisis (por ejemplo, concentración de S-59 previo a la iluminación por HPLC). El procedimiento de muestreo supone desmontar (separador/sellador modelo 1301: Sebra) la línea del producto de plaquetas para despachar una muestra de plaquetas al trozo largo de tubo remanente en el recipiente de solución de S-59/PC/PAS III. De allí en adelante, el tubo se sella con calor al menos a 30,5 cm del recipiente de la solución y las muestras pueden prepararse y procesarse. Por ejemplo, los extremos de los tubos pueden cortarse sobre un tubo estéril de centrífuga de 15 ml, permitiendo que la solución drene en el tubo, y pueden colocarse alícuotas en tubos de microcentrífuga de 5 ml (Vacutainer, Becton-Dickinson). Las muestras de solución (por ejemplo, alícuotas de 200 \mul) después pueden transferirse a tubos de polipropileno de microcentrífuga y almacenarse a -20ºC antes del análisis por HPLC.

El recipiente de solución de S-59/PC/PAS III después se colocó en un Sistema de Iluminación Ultravioleta (Steritech, Inc. y Baxter Healthcare Corp., Fenwal Division). El recipiente se iluminó (3 J/cm^{2}) y la solución iluminada después se almacenó en la oscuridad en un agitador de lecho plano a 20-24ºC.

En este punto, el plasma autólogo puede ensayarse in vitro para evaluar la función plaquetaria. Para esto, el plasma autólogo concurrente previamente recolectado se sometió a centrifugación. Específicamente, el SCD se utilizó para conectar el tubo del conjunto de transferencia que contenía plasma a un recipiente de conjunto de transferencia de 150 ml. El plasma autólogo/nuevo conjunto de transferencia se centrifugaron (modelo #RC-3B con rotor HA 6000; Sorvall Instruments) a 3000 g (3800 rpm) durante 10 minutos a temperatura ambiente. El plasma centrifugado después se colocó en el extractor de plasma, y aproximadamente la mitad del plasma pobre en plaquetas se exprimió al nuevo conjunto de transferencia. El tubo se termoselló y el nuevo conjunto de transferencia se desconectó del conjunto de transferencia original. Finalmente, el extremo de inoculación (es decir, el extremo de un trozo de tubo adaptado para ser insertado en el puerto receptor de otro elemento, por ejemplo un recipiente de almacenamiento de sangre, para crear una conexión fluida entre el tubo y el elemento) de un conjunto de transferencia de plasma (4C2240, Baxter Healthcare Corp., Fenwal Division) se insertó en el puerto de la bolsa de transferencia de plasma. Se exprimió un mínimo de 20 ml de plasma pobre en plaquetas a un tubo de centrífuga estéril, se cubrió y se almacenó a aproximadamente 4ºC preparándolo para los ensayos de la función plaquetaria.

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Reducción de S-59 con un RD

Según se indicó previamente, se almacena un recipiente que envuelve el RD en un recubrimiento de lámina metálica sellado al vacío en una realización preferida. Previo a su uso, el recipiente que envolvía el RD se retiró de su recubrimiento y se inspeccionó proa determinar la materia particulada, la integridad del RD y la integridad del filtro de puerto. Además, se tuvo cuidado de no manipular o aplastar las cuentas en el RD. La Fig. 37 ilustra el tipo de recipiente que envuelve el dispositivo de eliminación por lotes (RD) utilizado en este ejemplo.

El procedimiento de soldadura/acoplamiento estéril descrito más arriba se realizó entre la línea del recipiente de solución de S-59/PC/PAS III tratada y la única línea de entrada/salida del recipiente que envuelve el RD. Antes de la soldadura, la línea de entrada/salida del recipiente que envolvía el RD se hizo girar entre dos dedos para asegurar que no estuviera excesivamente colapsada antes de colocarse en el SCD. Se realizó la operación de soldadura estéril, la línea se controló para detectar posibles fugas y la conexión entre los dos recipientes se hizo girar entre dos dedos para abrir la línea. La solución tratada de S-59/PC/PAS III después se transfirió al recipiente que envolvía el RD, y la solución residual después se exprimió a mano a ese recipiente. La línea que conectaba las dos bolsas se termoselló (dejando suficiente tubo conectado al recipiente que envolvía el RD para permitir la transferencia al recipiente final de almacenamiento de plaquetas) y el recipiente vacío de la solución de S-59/PC/PAS III se descartó. El recipiente que contenía la solución de S-59/PC/PAS III después se agitó continuamente durante 8 horas a 22ºC (agitador de lecho plano de plaquetas modelo #PF48; Helmer Lab Co.).

Después de un período de agitación de 8 horas, la única línea del recipiente que envolvía el RD se soldó/acopló en forma estéril (utilizando el procedimiento previamente descrito) a la línea de un recipiente plástico PL 2410 (Baxter) vacío. Después de controlar la línea para detectar posibles fugas, el PC tratado con RD se transfirió al recipiente de almacenamiento, exprimiendo a mano la solución residual al recipiente de almacenamiento. El tubo de conexión se termoselló con calor y se descartó el recipiente ahora vacío que envolvía el RD. El recipiente de almacenamiento que contenía el PC final después se almacenó en un agitador de lecho plano a 22ºC (para ser utilizado en menos de 4 días y no más de 5 días después de la extracción de la sangre entera del donante). Si se desea, se puede despachar una muestra de plaquetas al trozo de tubo remanente en el recipiente de almacenamiento utilizando el procedimiento de muestreo descrito más arriba.

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Ejemplo 42 Adición de PAS III a un PC Durante la Recolección de Plaquetas en un Sistema de Aféresis

Según se indicó previamente, el medio sintético PAS III (u otro apropiado) puede añadirse a las plaquetas recolectadas después de la aféresis para producir una preparación apropiada para la iluminación. Sin embargo, dichos procedimientos requieren esperar hasta que las plaquetas hayan sido recolectadas antes de utilizar un procedimiento de acoplamiento estéril para añadir el PAS III a las plaquetas recolectadas. Este ejemplo describe una realización alternativa en la que el PAS III se añade durante el proceso de recolección de plaquetas durante la aféresis de manera que las plaquetas finalmente recolectadas ya contengan la cantidad apropiada de PAS III.

Excepto por las desviaciones a ser discutidas, todo el equipo y procedimientos del Ejemplo 41 son igualmente aplicables aquí. El proceso de este ejemplo utiliza un ordenamiento de tres bolsas como el descrito más arriba y representado en el Esquema E. La primera bolsa contiene 180 ml de PAS III; la segunda bolsa se utiliza para recolectar plasma autólogo en una cantidad predeterminada; la tercera bolsa es la bolsa de recolección de plaquetas en la que se combinan todos los aditivos.

El sistema de aféresis está programado para recolectar un volumen predeterminado de plasma a ser utilizado para la resuspensión de plaquetas. Sin embargo, el volumen necesario debe tener en consideración el plasma residual asociado a las plaquetas en el recipiente de recolección después de la centrifugación y en el tubo del sistema de aféresis. Por ejemplo, si se desea que las plaquetas recolectadas finalmente estén suspendidas en 105 ml de plasma, deben restarse los aproximadamente 30 ml de plasma residual asociado a las plaquetas en el recipiente de recolección y los aproximadamente 18-20 ml de plasma residual en el tubo del sistema de aféresis. De este modo, el sistema de aféresis debe programarse para recolectar simultáneamente alrededor de 55-57 ml de plasma del donante para la posterior resuspensión de las plaquetas.

Tras la recolección del plasma, las plaquetas concentradas (aproximadamente 4,0 x 10^{11}) en la cámara de recolección de la centrífuga se resuspenden en los 105 ml (total) de plasma y se transfieren al recipiente de almacenamiento de plaquetas. Mientras esa mezcla está siendo transferida, se añade la cantidad requerida de PAS III desde el recipiente de PAS III para proporcionar la concentración final deseada de plasma a PAS III. La bolsa de plaquetas recolectadas finales contiene aproximadamente 300 ml y está compuesta por lo siguiente (en aproximadamente las cantidades indicadas): 35% de plasma autólogo, 60% de PAS III, 5% de ACD y 4,0 x 10^{11} plaquetas.

De allí en adelante, la solución de PC/PAS III puede procesarse utilizando los procedimientos descritos en el Ejemplo 41. En síntesis, la solución de PC/PAS III resultante se combina con S-59, se agita y se ilumina. La preparación plaquetaria iluminada después se transfiere al recipiente que envuelve el RD durante aproximadamente 8 horas para permitir la eliminación de S-59 y los fotoproductos. Finalmente, la preparación de plaquetas tratada se transfiere a una bolsa de almacenamiento de plaquetas desde la que puede infudirse a un receptor.

Claims (20)

1. Un recipiente para utilizar en la eliminación de al menos una sustancia seleccionada de psoraleno y su fotoproducto de un producto sanguíneo, que comprende:

a) una envoltura biocompatible;

b) una resina capaz de eliminar el psoraleno o su fotoproducto de un producto sanguíneo, estando dicha resina contenida dentro de dicha envoltura biocompatible; y

c) un medio para retener dicha resina dentro de dicha envoltura biocompatible,

donde la resina comprende una resina adsorbente de poliestireno hiper-reticulado que se produce entrecruzando cadenas de poliestireno lineales en solución o en un estado hinchado con un agente bifuncional para producir puentes reticulantes conformacionalmente restringidos, y que no requiere prehumectación para la adsorción; y tal que el producto sanguíneo tras la eliminación de la sustancia es apropiado para el uso in vivo, y donde el recipiente es un dispositivo de eliminación por lotes.

2. El recipiente de la reivindicación 1, en el que dicho medio de retención comprende un recinto de malla dispuesto dentro de dicha envoltura biocompatible, conteniendo dicho recinto de malla dicha resina y adaptado para permitir que el producto sanguíneo se ponga en contacto con dicha resina.

3. El recipiente de la reivindicación 1, en el que dicho medio de retención comprende un filtro de malla colocado en una línea de entrada/salida y en comunicación fluida con dicha envoltura biocompatible.

4. El recipiente de la reivindicación 1, en el que la resina es no iónica, macroporosa y macrorreticular.

5. El recipiente de la reivindicación 1, en el que la resina comprende una red de poliestireno reticulada con dicloruro de p-xileno, éter monoclorodimetílico, 1,4-bisclorometildifenilo, 4,4'-bis-(clorometil)bifenilo, dimetilformal,
p,p'-bisclorometil-1,4-difenilbutano o tris-(clorometil)-mesitileno.

6. El recipiente de la reivindicación 1, en el que el medio para retener la resina es una red de fibras.

7. El recipiente de la reivindicación 6, en el que la resina se adhiere a fibras de la red de fibras.

8. El recipiente de la reivindicación 1, en el que la envoltura biocompatible comprende una bolsa de sangre.

9. El recipiente de la reivindicación 4, en el que la resina es: un copolímero poliaromático con puente metilénico de estireno y divinilbenceno que posee una superficie media de 1100 m^{2}/g y un diámetro de poro medio de 46 \ring{A} y un diámetro de tamaño de partículas en el intervalo de 300 a 850 \mum.

10. Un método para utilizar un recipiente de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, donde el método comprende añadir un producto sanguíneo que contiene el psoraleno o su fotoproducto al recipiente para ponerse en contacto con la resina, y adsorber al menos una porción de dicho psoraleno o su fotoproducto del producto sanguíneo en la resina.

11. El método de la reivindicación 10, en el que el psoraleno es un aminopsoraleno.

12. El método de la reivindicación 11, en el que el aminopsoraleno es 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno.

13. El método de la reivindicación 10, en el que el psoraleno es un psoraleno bromado.

14. El método de la reivindicación 10, en el que el psoraleno es una amina cuaternaria.

15. El método de la reivindicación 14, en el que el psoraleno con función amina cuaternaria es 4'-(trietilamino)metil-4,5',8-trimetilpsoraleno.

16. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en el que el producto sanguíneo es un producto sanguíneo plaquetario y en el que el recipiente es además para utilizar en la eliminación por lotes de dicho psoraleno o su fotoproducto del producto sanguíneo plaquetario.

17. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, en el que el producto sanguíneo es un producto sanguíneo plasmático y en el que el recipiente es para utilizar en la eliminación por lotes de dicho psoraleno o su fotoproducto del producto sanguíneo plasmático.

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18. El método de la reivindicación 10, en el que el adsorbente posee una capacidad suficiente de adsorción tal que el contacto de dicho producto sanguíneo con dicho aparato elimina dicho psoraleno a un nivel tal que menos del 1% de la cantidad original del psoraleno añadido al producto sanguíneo permanece como sustancia libre.

19. El método de la reivindicación 10 a 15, en el que el producto sanguíneo es un producto sanguíneo con glóbulos rojos.

20. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 10 a 19 para formar un producto sanguíneo.