ES2434319T3 - Sistema y método para la reducción de los compuestos orgánicos pequeños de los hemoderivados - Google Patents

Abstract

Un sistema para usar en el tratamiento de un hemoderivado que contiene un agente inactivante de patógenosque comprende una carcasa biocompatible y un medio adsorbente que tiene(1) partículas de resina adsorbente muy porosas capaces de adsorber el agente inactivante de patógenos;(2) una matriz inerte en la que las partículas de resina adsorbente están inmovilizadas;en donde el sistema está configurado como un aparato de flujo continuo y las partículas adsorbentes inmovilizadastienen un diámetro entre aproximadamente 10μm y aproximadamente 20μm; en donde el compuesto inactivante de patógenos es compuesto orgánico pequeño seleccionado de un psoraleno, underivado de psoraleno, un colorante de tiazina, una acridina, un derivado de acridina, un colorante de xanteno, uncolorante de tiazina, tioglicolato de metilo, ácido tioláctico, tiofenol, 2-mercaptopiridina, 3-mercapto-2-butanol, 2-mercaptobenzotiazol, ácido tiosalicílico, ácido tióctico, o productos de fotoactivación; y en donde dicho hemoderivado mantiene sustancialmente una actividad biológica deseada después de tratamientocon dicho sistema.

Description

Sistema y método para la reducción de los compuestos orgánicos pequeños de los hemoderivados

Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos y dispositivos para reducir los compuestos orgánicos pequeños de los hemoderivados.

Antecedentes de la invención

Existe un amplio campo de investigación en relación con la eliminación de sustancias de los hemoderivados. La mayor parte de esta investigación se dirige a la reducción de glóbulos blancos. Véase, p. ej., M.N. Boomgaard et al., Transfusion 34:311 (1994); F. Bertolini et al., Vox Sang 62:82 (1992); y A.M. Joustra-Dijkhuis et al., Vox Sang 67:22 (1994). La filtración de las plaquetas es el método más común usado en la reducción de glóbulos blancos de concentrados de plaquetas. Véase, p. ej., M. Böck et al., Transfusion 31:333 (1991) (Sepacell PL-5A, Asahi, Tokyo, Japan); J.D. Sweeney et al., Transfusion 35:131 (1995) (Leukotrap PL, Miles Inc., Covina, CA); y M. van Marwijk et al., Transfusion 30:34 (1990) (Cellselect, NPBI, Emmer-Compascuum, The Netherlands; Immugard Ig-500, Terumo, Tokyo, Japan). Sin embargo, estos mecanismos de filtración actuales no se pueden llevar a la eliminación de compuestos de peso molecular relativamente bajo que incluyen, por ejemplo, psoralenos, productos de fotoadición y otros compuestos usados habitualmente para tratar fluidos biológicos.

El procedimiento de adsorción se ha usado para aislar componentes selectivos de la sangre sobre polímeros de fosfolípidos. Por ejemplo, se han evaluado las interacciones de varios copolímeros con diferentes cargas eléctricas con componentes de la sangre, incluyendo la adhesión de plaquetas y la adsorción de proteínas. K. Ishihara et al., J. Biomed. Mat. Res. 28:1347 (1994). Sin embargo, estos polímeros no están diseñados para la adsorción de compuestos de bajo peso molecular.

Diferentes medios de diálisis pueden separar compuestos de bajo peso molecular del plasma y la sangre entera. Por ejemplo, la diálisis puede separar con éxito toxinas de bajo peso molecular y compuestos farmacéuticos. Por lo tanto, se puede usar la diálisis para separar, por ejemplo, psoralenos, y fotoproductos de psoralenos de los hemoderivados. Desgraciadamente, los procedimientos de diálisis actuales implican dispositivos muy complicados y caros. Como tales, el uso de las máquinas de diálisis no sería práctica para la descontaminación de un volumen grande de hemoderivados.

El uso de poliestireno-divinilbenceno, gel de sílice y polímeros de éster acrílico para la adsorción de azul de metileno se ha descrito previamente. Por ejemplo, la publicación PCT nº WO 91/03933 describe estudios discontinuos con resina adsorbente libre (p. ej., Amberlites (Rohm and Haas (Frankfurt, Alemania) y Bio Beads (Bio-Rad Laboratories (Munich, Alemania)). Sin embargo, sin la separación muy cuidadosa de la resina adsorbente después de exposición a los hemoderivados, estos métodos tienen el riesgo de transfusión de las partículas de resina.

Además, también se han descrito dispositivos y procedimientos para separar leucocitos y agentes de inactivación víricos (p. ej., psoralenos, hipericina, y colorantes tales como azul de metileno, azul de toluidina y cristal violeta). Específicamente, la publicación PCT nº WO 95/18665 describe un filtro que comprende una banda textil colocada que incluye un sustrato polimérico mecánicamente estable. La propia banda comprende fibras textiles entrelazadas formando una matriz con espacios y partículas fibriladas dispuestas dentro de los espacios. Sin embargo, este dispositivo produce una disminución significativa en la actividad del factor XI.

Por lo tanto, se necesitan medios más sencillos, más seguros y más económicos para reducir la concentración de compuestos orgánicos pequeños en un fluido biológico mientras que se mantiene sustancialmente la actividad biológica del fluido purificado.

Descripción de la invención

La presente invención contempla un dispositivo para reducir la concentración de compuestos orgánicos pequeños en hemoderivados mientras que se mantiene sustancialmente una actividad biológica deseada del hemoderivado, comprendiendo el dispositivo partículas adsorbentes muy porosas, y en donde las partículas adsorbentes están inmovilizadas por una matriz inerte. Por lo tanto, de acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un sistema para usar en el tratamiento de un hemoderivado que contiene un agente inactivante de patógenos, que comprende una carcasa biocompatible y un medio adsorbente, de acuerdo con la reivindicación 1.

En una realización, la matriz inerte puede sr una red de fibras o un medio sinterizado.

La inmovilización de partículas adsorbentes en una matriz para reducir la concentración de compuestos orgánicos pequeños en hemoderivados, tiene varios beneficios y ventajas frente a sistemas existentes. Una ventaja es la reducción en el escape de partículas adsorbentes sueltas en los hemoderivados, lo que a su vez produce un hemoderivado más seguro. Otra ventaja es la capacidad potenciada de las partículas adsorbentes de adsorber compuestos orgánicos pequeños debido en parte a la eliminación de problemas de aglutinación asociados con

partículas no inmovilizadas cuando se usan con hemoderivados, por ejemplo, materiales que comprenden glóbulos rojos. Una ventaja adicional es la reducción en los problemas asociados con el manejo de las partículas de adsorbente sueltas; simplificando, de esta forma, la fabricación. Un beneficio sorprendente de usar partículas adsorbentes inmovilizadas por una matriz inerte es la reducción del daño a los hemoderivados que contienen membranas almacenados, por ejemplo, plaquetas, glóbulos rojos y glóbulos blancos.

En otra realización, las partículas adsorbentes tienen una superficie específica mayor que aproximadamente 750 m2/g. En otra realización, las partículas adsorbentes pueden tener una superficie específica mayor de aproximadamente 1000 m2/g.

Los autores de la invención también describen un dispositivo discontinuo en el que las partículas adsorbentes son menores de aproximadamente 1200 !m de diámetro y mayores que 300 !m de diámetro.

Los autores de la invención describen que las partículas adsorbentes comprenden compuestos poliaromáticos o carbón activado. En una realización, los compuestos poliaromáticos están incluidos en redes de copolímero de poliestireno-divinilbenceno hiperreticulado.

Los autores de la invención también describen un dispositivo que reduce la concentración de acridinas, derivados de acridina, azul de metileno o tioles en un hemoderivado. También está contemplado un dispositivo que reduce la concentración de psoralenos, derivados de psoralenos, incluyendo, por ejemplo, 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8trimetilpsoraleno, isopsoralenos o aminopsoralenos. El hemoderivado se puede seleccionar del grupo que consiste en plaquetas, glóbulos rojos o plasma.

Como un componente adicional, los autores de la invención describen que el dispositivo comprende además una bolsa de sangre.

De acuerdo con otro aspecto de la invención, los autores de la invención proporcionan un método para reducir un compuesto inactivante de patógenos con el sistema de la invención, como se define en la reivindicación 15.

En una realización, las partículas adsorbentes tienen una superficie específica mayor que aproximadamente 750 m2/g. En otra realización, las partículas adsorbentes pueden tener una superficie específica mayor de aproximadamente 1000 m2/g.

Los autores de la invención describen que las partículas adsorbentes comprenden compuestos poliaromáticos o carbón activado. En una realización, los compuestos poliaromáticos están incluidos en redes de copolímero de poliestireno-divinilbenceno hiperreticulado.

La presente descripción también contempla un método para inactivar patógenos en disolución, en donde el método comprende: a) proporcionar, en cualquier orden: i) un compuesto cíclico, ii) una disolución que se sospecha que está contaminada con los patógenos, y iii) resina fibrizada; b) tratar la disolución con el compuesto cíclico para así crear un producto de disolución tratada en donde los patógenos están inactivados; y c) poner en contacto el producto de disolución tratada con la resina fibrizada, comprendiendo la mejora un dispositivo para reducir la concentración de compuestos orgánicos pequeños en un hemoderivado, mientras que se mantiene sustancialmente la actividad biológica deseada del hemoderivado, comprendiendo el dispositivo partículas adsorbentes muy porosas, y en donde las partículas adsorbentes están inmovilizadas por una matriz inerte.

La presente descripción también contempla un método para reducir la concentración de compuestos cíclicos en disolución, que comprende: a) proporcionar i) compuestos cíclicos en disolución en una concentración, seleccionados los compuestos cíclicos del grupo que consiste en compuestos monocíclicos, compuestos policíclicos y compuestos heterocíclicos, y ii) resina fibrizada; y b) poner en contacto los compuestos cíclicos con la resina fibrizada, reduciendo así la concentración de los compuestos cíclicos.

La presente descripción contempla una bolsa de sangre, que comprende: a) una carcasa biocompatible; y b) resina inmovilizada en una red de fibras, con la resina inmovilizada contenida dentro de la carcasa biocompatible.

Breve descripción de los dibujos

La figura 1 representa mediante diagrama una vista en perspectiva de una realización de una fibra, indicando su núcleo interior y una vaina exterior, que forma las redes de la resina fibrizada.

La figura 2 representa esquemáticamente una parte de una realización de la resina fibrizada de la presente invención.

La figura 3 representa mediante diagrama una vista en sección transversal de una realización de la resina fibrizada en la que las perlas adsorbentes se aseguran a las fibras que componen la resina fibrizada.

La figura 4 representa mediante diagrama una vista en sección transversal de una realización de la resina fibrizada en la que las perlas adsorbentes están inmovilizadas dentro de las fibras de la resina fibrizada y las juntas térmicas que abarcan muestras de resina fibrizada.

La figura 5 es una gráfica que muestra una comparación de las cinéticas de adsorción para la separación de aminopsoralenos de plaquetas con perlas adsorbentes sueltas Dowex® XUS-43493 y Amberlite® XAD-16 HP y resina fibrizada que contiene Amberlite® XAD-16.

La figura 6 es una gráfica que muestra una comparación de las cinéticas de adsorción para la separación de aminopsoralenos de plaquetas con resina fibrizada que contiene Amberlite® XAD-16 y resina fibrizada con las dos cargas diferentes de carbón activado.

La figura 7 es una gráfica que muestra una comparación de las cinéticas de adsorción para la separación de aminopsoralenos de plaquetas con perlas Dowex® XUS-43493 no recubiertas y recubiertas con p(HEMA).

La figura 8 es una gráfica que muestra una comparación del efecto del contenido de glicerol de la disolución de pretratamiento en la capacidad de adsorción relativa de aminopsoralenos para Amberlite® XAD-16 y Dowex® XUS43493.

La figura 9 es una gráfica que muestra una comparación del efecto de la disolución de mojado en las capacidades de adsorción de 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno para adsorbente seco en plasma al 100% para Amberlite® XAD-16 (superior) y Dowex® XUS-43493 (inferior); las muestras que no se mojaron en una disolución de etanol están marcadas "No Tx". Las capacidades adsorbentes se dan como porcentajes relativos respecto a la capacidad del adsorbente mojado de forma óptima.

La figura 10 es una gráfica que muestra una comparación de la adsorción de aminopsoralenos del plasma a los largo de un periodo de 3 h, usando Amberlite® XAD-16 mojada en diferentes disoluciones.

La figura 11 es una gráfica que muestra una comparación de las cinéticas de adsorción del azul de metileno del plasma a lo largo de un periodo de 2 h.

La figura 12 representa las estructuras químicas de la acridina, naranja de acridina, 9-aminoacridina y 5-[(∀carboxietil)amino]acridina.

La figura 13 es una gráfica que muestra las representaciones gráficas de datos para la capacidad de la adenina (eje y) y la capacidad de la 5-[(∀-carboxietil)amino]acridina (eje x) para diferentes resinas.

Las figuras 14A y 14B son gráficas que muestran una comparación de las cinéticas de adsorción para la separación de 5-[(∀-carboxietil)amino]acridina con Dowex® XUS-43493 y Purolite® MN-200 y Amberlite® XAD-16 HP.

La figura 15 es una gráfica que muestra una comparación de las cinéticas de adsorción para la separación de 9amino-acridina y naranja de acridina con Dowex® XUS-43493.

La figura 16 es una ilustración de configuraciones de flujo y discontinua para el dispositivo de adsorción inmovilizado (DAI).

La figura 17 es una gráfica que muestra una comparación de las isotermas de adsorción para diferentes Ambersorbs comparados con Purolite MN-200.

La figura 18 es una gráfica que muestra una comparación de los niveles de 5-[(∀-carboxietil)amino]acridina y GSH en el líquido sobrenadante de 300 ml de unidades de GRE con exposición continuada o terminada durante 24 h a un DAI Pica G277 fibrizado (500 g/m2) a lo largo de 4 semanas de almacenamiento a 4ºC.

La figura 19 es una gráfica que muestra el efecto del material de cerramiento en la 5-[(∀-carboxietil)amino]acridina en GRE expuestos a DAI.

La figura 20 es una gráfica que muestra una comparación del porcentaje de hemolisis para la partícula adsorbente Purolite MN-200 inmovilizada y no inmovilizada.

La figura 21 es una gráfica que muestra una comparación del porcentaje de hemolisis para la partícula adsorbente Pica G-277 activada, inmovilizada y no inmovilizada.

La figura 22 es una gráfica que muestra la cinética para la separación del 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8trimetilpsoraleno de concentrados de plaquetas.

Mejor modo de llevar a cabo la invención

La presente invención proporciona métodos y dispositivos para reducir la concentración de compuestos orgánicos pequeños de un hemoderivado tratado, como se define en las reivindicaciones. Se proporcionan dispositivos que comprenden una red tridimensional de partículas adsorbentes inmovilizadas por una matriz inerte. Esta inmovilización reduce el riesgo de escape de partículas adsorbentes sueltas en el hemoderivado. Además, la inmovilización de las partículas adsorbentes por una matriz inerte simplifica la fabricación al reducir los problemas asociados con el manejo de las partículas adsorbentes sueltas. La inmovilización de las partículas adsorbentes

también potencia la capacidad de las partículas adsorbentes de adsorber compuestos orgánicos pequeños en composiciones que comprenden glóbulos rojos y/o plaquetas y/o plasma. Finalmente, usando partículas adsorbentes inmovilizadas por una matriz inerte se reduce el daño de las composiciones que comprenden hemoderivados que contienen membranas celulares, por ejemplo, plaquetas, glóbulos rojos y glóbulos blancos.

Definiciones

La expresión "derivados de acridina" se refiere a un compuesto químico que contiene la estructura tricíclica de la acridina (dibenzo[b,e]piridina; 10-azantraceno). Los compuestos tienen una afinidad (y se pueden unir) a ácidos nucleicos de forma no covalente mediante intercalación. El término "aminoacridina" se refiere a aquellos compuestos de acridina con uno o más grupos funcionales que contienen nitrógeno. Los ejemplos de aminoacridinas incluyen 9aminoacridina y naranja de acridina (representado en la figura 12).

La expresión "partícula adsorbente" se refiere de forma amplia a cualquier material natural o sintético que es capaz de interaccionar con moléculas en un líquido permitiendo así separar la molécula del líquido. Los ejemplos de adsorbentes naturales incluyen, pero sin limitar, carbón activado, sílice, tierra de diatomeas y celulosa. Los ejemplos de adsorbentes sintéticos incluyen, pero sin limitar, poliestireno, adsorbentes poliacrílicos y carbonosos. Las partículas adsorbentes a menudo son porosas, a menudo tienen superficies específicas altas, y se pueden modificar con una variedad de grupos funcionales (p. ej., iónico, hidrófobo, ácido, básico) que pueden afectar a cómo interacciona el adsorbente con moléculas.

Las expresiones "aromático", "compuestos aromáticos" y similares, se refieren de forma amplia a compuestos con anillos de átomos que tienen electrones deslocalizados. El compuestos monocíclico benceno (C6H6) es un compuesto aromático común. Sin embargo, la deslocalización de electrones se puede producir con más de un anillo adyacente (p. ej., naftaleno (dos anillos) y antraceno (tres anillos)). Las diferentes clases de compuestos aromáticos incluyen, pero sin limitar, haluros aromáticos (haluros de arilo, compuestos heterocíclicos aromáticos, hidrocarburos aromáticos (arenos) y nitrocompuestos aromáticos (nitrocompuestos arílicos).

La expresión "recubrimiento biocompatible" se refiere de forma amplia al recubrimiento de una superficie (p. ej., la superficie de una perla de poliestireno) con un polímero hidrófilo que cuando se pone en contacto con un hemoderivado no produce una respuesta perjudicial, tóxica o inmunológica y hace a la superficie más biocompatible disminuyendo la adhesión celular, adsorción de proteínas o mejora la función celular. Los recubrimientos adecuados son biocompatibles si tienen un efecto mínimo, si tienen alguno, en el material biológico que va a estar expuesto a los mismos. Por efecto "mínimo" se entiende que no se ven diferencias significativas comparado con el control. En realizaciones preferidas, los recubrimientos biocompatibles mejoran la hemocompatibilidad de la superficie de las estructuras poliméricas. Por ejemplo, se usa con frecuencia el poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (pHEMA) para el recubrimiento de materiales usados en dispositivos médicos (p. ej., filtros de sangre).

La expresión "carcasa biocompatible" se refiere de forma amplia a carcasas de filtros, envases, bolsas, vasos, recipientes, y similares que son adecuados para contener un material biológico tal como sangre entera, concentrados de plaquetas y plasma. Los envases adecuados son biocompatibles si tienen un efecto mínimo, si tienen alguno, en el material biológico que va a estar contenido en los mismos. Por efecto "mínimo" se entiende que no se ven diferencias significativas en la función del hemoderivado comparado con el control como se describe en la presente memoria, para los glóbulos rojos, plaquetas y plasma. Por lo tanto, los hemoderivados se pueden almacenar en carcasas biocompatibles antes de la transfusión a un receptor. En realizaciones preferidas, carcasas biocompatibles son bolsas de sangre, incluyendo un envase de almacenamiento de plaquetas.

La expresión "fluidos biológicos" incluye sangre entera, plasma, plaquetas, glóbulos rojos, leucocitos, suero, linfa, saliva, leche, orina o productos de o que contienen cualquiera de los anteriores, humanos o no humanos, solos o mezclados, con o sin una disolución de aditivos químicos. Preferiblemente, el fluido es sangre o un hemoderivado con o sin una disolución de aditivos químicos, más preferiblemente plasma, plaquetas y glóbulos rojos, lo más preferiblemente plasma y glóbulos rojos de aféresis.

La expresión "bolsa de sangre" se refiere a un envase de hemoderivado.

El término "hemoderivado" se refiere al fluido y/o elementos celulares asociados y similares (tal como eritrocitos, leucocitos, plaquetas, etc.) que pasan a través del sistema circulatorio del cuerpo; los hemoderivados incluyen, pero sin limitar, células sanguíneas, mezclas de plaquetas, suero y plasma. La expresión "mezcla de plaquetas" se refiere a un tipo de hemoderivado en donde el elemento celular es principalmente o solo plaquetas. Un concentrado de plaquetas (CP) es un tipo de mezcla de plaquetas donde las plaquetas están asociadas con una porción de plasma menor de la normal. En los hemoderivados el medio sintético puede completar este volumen ocupado normalmente por el plasma; por ejemplo, un concentrado de plaquetas puede conllevar plaquetas suspendidas en 35% de plasma/65% de medio sintético. Con frecuencia, el medio sintético comprende fosfato.

La expresión "medios de separación de sangre" se refiere de forma amplia a un dispositivo, máquina o similar, que es capaz de separar la sangre en hemoderivados (p. ej., plaquetas y plasma). Un sistema de aféresis es un tipo de medio de separación de sangre. Los sistemas de aféresis en general comprenden un dispositivo de separación de sangre, una red intrincada de tubos y filtros, bolsas colectoras, un anticoagulante y medios computerizados para

controlar todos los componentes.

El término "reticulado" se refiere de forma amplia a moléculas lineales que están unidas entre sí para formar una red bi- o tri-dimensional. Por ejemplo, el divinilbenceno (DVB) sirve como el agente de reticulación en la formación de copolímeros de estireno-divinilbenceno. El término también abarca la "hiperreticulación" en donde las redes hiperreticuladas se producen por reticulación de cadenas de poliestireno lineales en disolución o en un estado hinchado con agentes bifuncionales. Se puede usar una variedad de agentes bifuncionales para la reticulación (por ejemplo, véase, Davankov y Tsyurupa, Reactive Polymers 13:24-42 (1990); Tsyurupa et al., Reactive Polymers 25:69-78 (1995).

La expresión "compuestos cíclicos" se refiere a compuestos que tienen un (es decir, compuestos monocíclicos) o más de un (es decir, compuestos policíclicos) anillo de átomos. La expresión no se limita a compuestos con anillos que contienen un número particular de anillos. Aunque la mayoría de los compuestos cíclicos contienen anillos con 5 ó 6 átomos, también están contemplados en la presente invención los anillos con otros números de átomos diferentes (p. ej., 3 ó 4 átomos). La identidad de los átomos en los anillos no está limitada, aunque los átomos son normalmente de forma predominante átomos de carbono. Hablando en términos generales, los compuestos policíclicos son adyacentes entre sí; sin embargo, el término compuesto "policíclico" incluye aquellos compuestos que contienen múltiples anillos que no son adyacentes entre sí.

El término "colorante" se refiere de forma amplia a compuestos que imparten color. Los colorantes comprenden en general grupos cromóforos y auxocromos unidos a uno o más compuestos cíclicos. El color se debe al cromóforo, mientras que las afinidades colorantes se deben al auxocromo. Los colorantes se han agrupado en muchas categorías, incluyendo colorantes azina (p. ej., rojo neutro, safranina y azocarmina B); los colorantes azo; los colorantes azocarmina; los colorantes difenilmetano, los colorantes de fluoresceína, los colorantes de cetonimina, los colorantes de rosanilina y los colorantes de trifenilmetano. Está contemplado que los métodos y dispositivos de la presente invención se pueden poner en práctica junto con cualquier colorante que sea un compuesto cíclico.

La expresión "resina fibrizada" en general se refiere a la inmovilización de material adsorbente, incluyendo por ejemplo, resinas en, sobre o atrapadas en una red de fibras. En una realización, la red de fibras está compuesta de fibras de polímero. En otra realización, las fibras consisten en un núcleo polimérico (p. ej., poli(tereftalato de etileno [PET]) con un punto de fusión alto, rodeado de una vaina de polímero (p. ej., nailon o PET modificado) con una temperatura de fusión relativamente baja. La resina fibrizada se puede producir calentando la red de fibras en condiciones que no afecten de forma adversa a la capacidad adsorbente de la resina en un grado significativo. Cuando las resina comprende perlas, el calentamiento se realiza de modo que las perlas adsorbentes quedan unidas a la vaina de polímero externa para crear las "perlas fibrizadas". Mediante la producción de resina fibrizada que contiene una cantidad conocida de perlas adsorbentes por área definida, se pueden obtener muestras de resina fibrizada para usar en la separación de compuestos cíclicos (p. ej., psoralenos, y en particular, aminopsoralenos) y otros productos, cortando un área definida de la resina fibrizada, en lugar de pesar las perlas adsorbentes.

El término "filtro" se refiere de forma amplia a dispositivos, materiales y similares, que pueden dejar que determinados componentes de una mezcla pasen a través de ellos mientras que retienen otros componentes. Por ejemplo, un filtro puede comprender una malla con poros de tamaño para permiten que pase a través un hemoderivado (p. ej., plasma), mientras que retienen otros componentes tales como partículas de resina. El término "filtro" no se limita a los medios por el cual determinados componentes son retenidos.

El término "adaptador de flujo" se refiere a un dispositivo que es capaz de controlar el flujo de una sustancia particular como un hemoderivado. El adaptador de flujo puede realizar funciones adicionales tales como prevenir el paso de trozos de material de resina adsorbente.

La expresión "compuestos heterocíclicos" se refiere de forma amplia a compuestos cíclicos en donde uno o más de los anillos contienen más de un tipo de átomo. En general, el carbono representa el átomo predominante, mientras que los otros átomos incluyen, por ejemplo, nitrógeno, azufre y oxígeno. Los ejemplos de compuestos heterocíclicos incluyen furano, pirrol, tiofeno y piridina.

La frase "procedimiento de activación a alta temperatura" se refiere a un procedimiento a alta temperatura que normalmente da como resultado cambios en la superficie específica, porosidad y química superficial del material tratado debido a la pirólisis y/u oxidación del material de partida.

La expresión "dispositivo de adsorción de inmovilización (DAI)" se refiere a material adsorbente inmovilizado en, sobre o atrapado en una matriz inerte. Cuando la matriz inerte es una red de fibras el término DAI se puede usar de forma intercambiable con la expresión resina fibrizada.

La expresión "matriz inerte" se refiere a cualquier fibra sintética o natural o material polimérico que se puede usar para inmovilizar partículas adsorbentes sin afectar sustancialmente a la actividad biológica deseada de los hemoderivados. La matriz puede contribuir a la reducción de la concentración de los compuestos orgánicos pequeños aunque típicamente no contribuye sustancialmente al proceso de adsorción o separación. Además, la matriz inerte puede interaccionar con los componentes celulares o de proteína que resultan en la separación celular

(p. ej., disminución del número de leucocitos) o separación de proteínas u otras moléculas.

La expresión "columna en línea" se refiere a un envase, normalmente de forma cilíndrica, que tiene un extremo de entrada y un extremo de salida y que contiene una sustancia dispuesta en el mismo para reducir la concentración de compuestos orgánicos pequeños de un hemoderivado.

El término "aislar" se refiere a separar una sustancia de una muestra que contiene más de un componente. Por ejemplo, se pueden separar las plaquetas de la sangre entera. El producto que está aislado no se refiere necesariamente a la separación completa de este producto de los otros componentes.

El término "macroporos" en general significa que el diámetro de los poros es mayor de aproximadamente 500 Å. El término microporos se refiere a poros con diámetros menores de aproximadamente 20 Å. El término mesoporos se refiere a poros con diámetros mayores de aproximadamente 20 Å y menores de aproximadamente 500 Å.

El término "macroporoso" se usa para describir una estructura porosa que tiene un número sustancial de poros condiámetros mayores de aproximadamente 500 Å.

El término "macrorreticular" es un término relativo que significa que la estructura tiene una porosidad física alta (es decir, están presentes un número grande de poros), una estructura adsorbente porosa que tiene tanto macroporos como microporos.

La expresión "cerramiento de malla", "bolsa de malla" y similares, se refiere a un cerramiento, bolsa,saco o similar fabricado para contener múltiples poros. Por ejemplo, la presente invención contempla una bolsa que contiene la partícula adsorbente inmovilizada, con poros de un tamaño que permiten que un hemoderivado se ponga en contacto con la partícula adsorbente inmovilizada, pero retiene la partícula adsorbente inmovilizada dentro de la bolsa.

El término "partición" se refiere a cualquier tipo de dispositivo o elemento que puede separar o dividir un conjunto en secciones o partes. Por ejemplo, la presente invención contempla el uso de una partición para dividir en dos partes una bolsa de sangre, adaptada para contener un hemoderivado. El hemoderivado ocupa una parte de la bolsa antes y durante el tratamiento, mientras que la resina adsorbente ocupa la otra parte. En una realización, después de tratamiento del hemoderivado, se elimina la partición (p. ej., se altera la integridad de la partición), permitiendo así que el hemoderivado tratado se ponga en contacto con la resina adsorbente. La partición puede estar situada en el interior de la bolsa o en su exterior. Cuando se usa con el término "partición", el término "eliminado" significa que ya no existe el aislamiento de las dos partes de la bolsa de sangre; no significa necesariamente que la partición ya no está asociada con la bolsa de alguna forma.

El término "fotoproducto" se refiere a productos que resultan de la reacción fotoquímica que sufre un psoraleno tras exposición a radiación ultravioleta.

La expresión "compuestos poliaromáticos" se refiere a compuestos poliméricos que contienen grupos aromáticos en la cadena principal, tal como poli(tereftalato de etileno), o como grupos colgantes, tal como poliestireno, o ambos.

La expresión "red de poliestireno" se refiere de forma amplia a polímeros que contienen monómeros de estireno (C6H5CH=CH2); los polímeros pueden ser lineales, que consisten en una sola cadena de alcano covalente con sustituyentes fenilo, o reticulada, en general, con restos m-o p-fenileno u otra estructura bifuncional o hiperreticulada, para formar una cadena principal de polímero bidimensional.

La expresión "medio para separar psoraleno" se refiere a una sustancia o dispositivo que puede separar más de aproximadamente 70% del psoraleno de, p. ej., un hemoderivado; preferiblemente, más de aproximadamente 90%; lo más preferiblemente más de aproximadamente 99%. Un medio para separar el psoraleno también puede separar otros componentes del hemoderivado, tal como fotoproductos del psoraleno.

La frase "reducir la concentración" se refiere a la separación de parte del compuesto aromático de la disolución acuosa. Aunque la reducción de la concentración preferiblemente es del orden de más de aproximadamente 70%, más preferiblemente del orden de aproximadamente 90%, y lo más preferiblemente del orden de aproximadamente 99%.

La frase "reducir sustancialmente toda dicha parte de un compuesto orgánico pequeño (p. ej., un psoraleno, derivado de psoraleno, isopsoraleno, acridina, derivado de acridina o colorante) libre en disolución" se refiere preferiblemente a la separación de más de aproximadamente 80% del compuesto libre en disolución, más preferiblemente a la separación de más de aproximadamente 85%, incluso más preferiblemente más de aproximadamente 90%, y lo más preferiblemente a la separación de más de aproximadamente 99%.

El término "resina" se refiere a un soporte sólido (tal como partículas o perlas, etc.) capaz de interaccionar y unirse a diferentes compuestos orgánicos pequeños, incluyendo psoralenos, en una disolución o fluido (p. ej., un hemoderivado), disminuyendo de esta forma la concentración de esos elementos en disolución. El procedimiento de separación no está limitado a ningún mecanismo particular. Por ejemplo, un psoraleno se puede separar por interacción hidrófoba o iónica (es decir, interacción de afinidad). La expresión "resina adsorbente" se refiere de forma amplia tanto a sustancias orgánicas naturales como sustancias sintéticas y a mezclas de las mismas.

La expresión "dispositivo agitador" se refiere a cualquier tipo de dispositivo capaz de mezclar completamente un hemoderivado tal como un concentrado de plaquetas. El dispositivo puede tener un mecanismo temporizador para permitir restringir la mezcla a una duración particular.

La expresión "medio sinterizado" se refiere a una estructura que se forma aplicando calor y presión a un plástico poroso, incluyendo, por ejemplo, un polímero termoplástico en polvo. Los plásticos porosos se pueden preparar mezclando polvos de polímeros de punto de fusión relativamente bajo y calentándolos de modo que las partículas plásticas fundan parcialmente pero permitan todavía un paso para que penetren fluidos en la masa porosa. El medio adsorbente sinterizado se puede preparar de forma similar incorporando carbón u otras partículas adsorbentes de alto punto de fusión o que no funden, al polvo de bajo punto de fusión y calentando. Los métodos para producir materiales plásticos porosos se describen en las patentes de EE.UU. 3.975.481, 4.110.391, 4.460.530, 4.880.843 y

4.925.880. El procedimiento produce la fusión de las partículas en polvo dando como resultado la formación de una estructura sólida porosa. El medio sinterizado se puede formar en una variedad de formas poniendo el polvo polimérico en una herramienta de conformado durante el procedimiento de sinterizado. Las partículas adsorbentes se pueden introducir en el medio sinterizado mezclando partículas adsorbentes con el polímero termoplástico en polvo antes de someterlo al procedimiento de sinterizado.

La expresión "agente estabilizante" se refiere a un compuesto o composición capaz de optimizar la capacidad de adsorción de determinadas resinas. Hablando en términos generales, los agentes estabilizantes aceptables deben ser solubles en agua y etanol (u otros agentes humectantes), relativamente no volátiles en agua y etanol, y seguros para la transfusión en pequeñas cantidades. Los ejemplos de agentes estabilizantes incluyen, pero sin limitar, glicerol y PEG de bajo peso molecular. Un "agente humectante" se distingue de un "agente estabilizante" en que el primero se cree de reabre los poros adsorbentes de aquellas resinas que no están hiperreticuladas (es decir, resinas que no son macrorredes). En general, los agentes humectantes no evitarán que los poros colapsen en las condiciones de secado, mientras que los agentes estabilizantes si lo evitarán. Se expone una discusión general de humectantes y agentes humectantes en la patente de EE.UU. 5.501.795 de Pall et al.

La frase "mantener sustancialmente una actividad biológica del hemoderivado" se refiere a mantener sustancialmente las propiedades de un hemoderivado que se cree que son indicativas del potencial comportamiento del producto en un marco terapéutico. Por ejemplo, con respecto a los glóbulos rojos, la actividad in vivo no se destruye o disminuye significativamente si los niveles de ATP, escape de potasio extracelular, % de hemolisis, se mantienen sustancialmente en los glóbulos rojos tratados por los métodos descritos en la presente memoria comparado con muestras no tratadas. Por ejemplo, el cambio en el nivel de ATP entre los glóbulos rojos tratados y los glóbulos rojos no tratados puede ser menor de aproximadamente 10%. El cambio en la hemolisis entre los glóbulos rojos tratados y los glóbulos rojos no tratados después de almacenamiento puede ser menor de aproximadamente 1%, preferiblemente menor de aproximadamente 0,8%. El cambio en el escape de potasio extracelular entre los glóbulos rojos tratados y los glóbulos rojos no tratados puede ser menor de aproximadamente 15%. En el caso del plasma, la actividad in vivo no se destruye o disminuye significativamente si el nivel de factores de coagulación, tales como los factores I, II, V, VII, X, XI, o el cambio en el tiempo TP y TTP se mantienen sustancialmente en el plasma cuando se trata por los métodos descritos en la presente memoria, comparado con muestras no tratadas. Por ejemplo, el nivel de cambio en los factores de coagulación, tales como los factores I, II, V, VII, X, XI, entre el plasma tratado y el plasma no tratado puede ser menor de aproximadamente 20%; preferiblemente menor de aproximadamente 10%. El cambio en el tiempo TP y TTP para el plasma tratado comparado con el plasma no tratado puede ser, por ejemplo, menos de aproximadamente 3 segundos y mayor de 1 segundo; preferiblemente 1,5 segundos. Con respecto a las plaquetas, la actividad in vivo no se destruye o disminuye significativamente si, por ejemplo, el rendimiento de plaquetas, pH, respuesta de agregación, cambio de forma, GMP-140, morfología o respuesta de choque hipotónico, se mantienen sustancialmente en los glóbulos rojos tratados por los métodos descritos en la presente memoria comparado con muestras no tratadas. Se contempla además que la frase sustancialmente mantenido para cada una de las propiedades asociadas con un hemoderivado descrito, también puede incluir valores aceptables para los expertos en la técnica, como se describen en la bibliografía, incluyendo, por ejemplo, en Klein H.G., ed. Standards for Blood Banks and Transfusion Services, 17th Ed., Bethesda, MD: American Association of Blood Banks, 1996.

La expresión "colorantes de tiazina" incluye colorantes que contienen un átomo de azufre en uno o más anillos. El colorante de tiazina más común es el azul de metileno (cloruro de 3,7-bis(dimetilamino)fenotiazin-5-onio). Otros colorantes de tiazina incluyen, pero sin limitar, azur A, azur C y tionina, como se describen, p. ej., en la patente de EE.UU. nº 5.571.666 de Schinazi.

La expresión "colorantes de xanteno" se refiere a colorantes que son derivados del compuesto xanteno. Los colorantes de xanteno se pueden poner en una de tres categorías principales: i) fluorenos o aminoxantenos, ii) rodoles o aminohidroxixantenos, y iii) las fluoronas o hidroxixantenos. Los ejemplos de colorantes de xanteno contemplados para usar con la presente invención incluyen rosa de Bengala y eosina Y; estos colorantes se pueden obtener en el comercio de una serie de fuentes (p. ej., Sigma Chemical Co., St. Louis, MI), y como se describe, p. ej., en la patente de EE.UU. nº 5.571.666 de Schinazi.

Partículas adsorbentes

Se proporcionan partículas adsorbentes que son útiles en un dispositivo para reducir la concentración de compuestos orgánicos pequeños en un hemoderivado, mientras que se mantiene sustancialmente una actividad biológica deseada del hemoderivado.

Las partículas adsorbentes pueden ser de cualquier forma regular o irregular que permita que se incorporen en la matriz inerte, pero preferiblemente son más o menos esféricas. Cuando el DAI se usa con un dispositivo de flujo, las partículas tienen entre 10 !m y 200 !m de diámetro; más preferiblemente, las partículas tienen entre 10 !m y 100 !m de diámetro; lo más preferiblemente, las partículas tienen entre 10 !m y 50 !m de diámetro.

Una característica de las partículas es una superficie específica alta. Preferiblemente, las partículas tienen una superficie específica entre aproximadamente 750 m2/g y aproximadamente 3000 m2/g. Más preferiblemente, las partículas tienen una superficie específica entre aproximadamente 1000 m2/g y aproximadamente 3000 m2/g. Lo más preferiblemente, las partículas tienen una superficie específica entre aproximadamente 1750 m2/g y aproximadamente 3000 m2/g.

Las partículas adsorbentes adecuadas para usar en el dispositivo de la presente invención pueden ser de cualquier material sobre el que se adsorban moléculas orgánicas pequeñas, con la limitación de que el material no afecte sustancialmente de forma adversa a la actividad biológica de un fluido tras el contacto. La partícula adsorbente puede estar hecha, por ejemplo, de materiales tales como carbón activado, resinas hidrófobas o resinas de intercambio iónico.

En una realización preferida, las partículas adsorbentes son carbón activado derivado de fuentes naturales o sintéticas. Preferiblemente los carbones activados derivan de fuentes sintéticas. Los ejemplos no limitantes de carbón activado incluyen: Picatiff Medicinal, que está disponible en PICA USA Inc. (Columbus, OH), Norit ROX 0.8, que está disponible en Norit Americas, Inc. (Atlanta, GA), Ambersorb 572, que está disponible en Rohm & Haas (Philadelphia, PA), y G-277, que está disponible en PICA (Columbus, OH).

En una realización preferida, las partículas son Norit A Supra, que está disponible en Norit Americas, Inc. (Atlanta, GA). Norit A Supra es un carbón activado de calidad USP que se forma por activación de lignito con vapor de agua. Este carbón activado tiene una superficie específica total muy alta (2000 m2/g) y es de naturaleza muy microporosa.

En otra realización preferida, las partículas pueden ser resinas hidrófobas. Los ejemplos no limitantes de resinas hidrófobas incluyen los siguientes adsorbentes poliaromáticos: adsorbentes Amberlite® (p. ej., Amberlite® XAD-2, XAD-4 y XAD-16), disponible en Rohm and Haas (Philadelphia, PA); adsorbentes Amberchrom® disponibles en Toso Haas (TosoHass, Montgomeryville, PA); Adsorbentes Diaion®//Sepabeads® (p. ej., Diaion® HP20), disponibles en Mitsubishi Chemical America, Inc. (White Plains, NY); resinas Hypersol-Macronet® Sorbent (p. ej., resinas Hypersol-Macronet® Sorbent MN-200, MN-150 y MN-400) disponibles en Purolite (Bala Cynwyd, PA); y adsorbentes Dowex® (p. ej., Dowex® XUS-40323, XUS-43493, y XUS-40285), disponibles en Dow Chemical Company (Midland, MI).

Las partículas preferidas son resinas hidrófobas que son adsorbentes poliaromáticos que comprenden una red de poliestireno hiperreticulado, tal como Dowex® XUS-43493 (conocida en el comercio como Optipore® L493 o V493) y Purolite MN-200.

Las redes de poliestireno hiperreticulado, tales como Dowex® XUS-43493 y Purolite MN-200 son resinas macroporosas y macrorreticulares no iónicas. La Dowex® XUS-43493 macrorreticular y macroporosa no iónica tiene una alta afinidad por los psoralenos, incluyendo, por ejemplo, el 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno, y tiene propiedades humectantes superiores. La frase "propiedades humectantes superiores" significa que el adsorbente seco (es decir, esencialmente anhidro), no necesita ser mojado con un agente humectante (p. ej., etanol) antes de ponerlo en contacto con el hemoderivado con el fin de que el adsorbente reduzca eficazmente la concentración de los compuestos orgánicos pequeños del hemoderivado.

Las redes de poliestireno hiperreticuladas, tales como Dowex® XUS-43493 y Purolite MN-200 preferiblemente tienen forma de partículas esféricas con un intervalo de diámetros de aproximadamente 100 μm a aproximadamente 1200 μm. Para dispositivos de flujo, las partículas tienen un intervalo de diámetro de aproximadamente 10 a aproximadamente 100 μm. Para dispositivos discontinuos, las partículas tienen un intervalo de diámetro de aproximadamente 100 a aproximadamente 1200 μm. Las partículas adsorbentes, incluyendo por ejemplo, Dowex® XUS-43493, preferiblemente tienen superficies específicas internas extremadamente altas y poros relativamente pequeños (p. ej., 46 Å). La superficie específica interna de las partículas puede ser de aproximadamente 300 a aproximadamente 1100 m2/g; preferiblemente 1100 m2/g. El tamaño de poros de las partículas puede ser mayor de25 Å y menor de 800 Å; preferiblemente de aproximadamente 25 Å a aproximadamente 150 Å; lo más preferiblemente de aproximadamente 25 Å a aproximadamente 50 Å. Aunque no se pretende que la presente invención está limitada al mecanismo por el cual se produce la reducción de los compuestos orgánicos pequeños, se cree que la interacción hidrófoba es el mecanismo principal de adsorción. Su naturaleza porosa confiere selectividad al proceso de adsorción permitiendo que moléculas pequeñas accedan a una proporción mayor de la superficie específica con respecto a moléculas grandes (es decir, proteínas) y células. Purolite# tiene características similares a Dowex® XUS-43493, tal como alta afinidad por los psoralenos y propiedades humectantes superiores, y también

es una partícula adsorbente preferida.

Las partículas de poliestireno se pueden clasificar, basándose en su mecanismo de síntesis y características físicas y funcionales, como i) redes convencionales y ii) redes hiperreticuladas. Los adsorbentes preferidos tienen una superficie específica grande, tienen poros que no colapsan, no requieren mojado y para los materiales que comprenden glóbulos rojos o plaquetas, también tienen niveles extremadamente bajos de partículas pequeñas y partículas extrañas (p. ej., polvo, fibras, partículas no adsorbentes y partículas no identificadas). Para un dispositivo discontinuo, las partículas pequeñas preferiblemente tienen un diámetro menor de 30 !m. Para un dispositivo de flujo, las partículas pequeñas preferiblemente tienen un diámetro menor de 5 !m. Además, los adsorbentes preferidos tienen niveles bajos de monómero residual extraíble, reticuladores y otros compuestos orgánicos extraíbles.

Las redes convencionales son principalmente copolímeros de estireno-divinilbenceno en las que el divinilbenceno (DVB) sirve como agente de reticulación (es decir, el agente que une las cadenas de poliestireno lineales entre sí). Estas redes poliméricas incluyen los polímeros de "tipo gel". Los polímeros de tipo gel son copolímeros de estireno-DVB no porosos, homogéneos, obtenidos por copolimerización de monómeros. Los adsorbentes macroporosos representan una segunda clase de redes convencionales. Se obtienen por copolimerización de monómeros en presencia de diluyentes que precipitan las cadenas de poliestireno en crecimiento. La red de poliestireno formada por este procedimiento tiene una superficie específica relativamente grande (hasta cientos de m2/g de polímero); Amberlite® XAD-4 se produce por dicho procedimiento.

A diferencia de las redes convencionales descritas antes, los adsorbentes preferidos de la presente invención (p. ej., Dowex® XUS-43493) son redes hiperreticuladas. Estas redes se producen por reticulación de cadenas de poliestireno lineales en disolución o en un estado hinchado con agentes bifuncionales; los agentes bifuncionales preferidos producen puentes de reticulación conformacionalmente restringidos, que se cree que evitan que los poros colapsen cuando el adsorbente está en un estado esencialmente anhidro (es decir, "seco").

Las redes hiperreticuladas se cree que tienen tres características principales que las distinguen de las redes convencionales. Primero, hay una baja densidad de cadenas de polímero debido a los puentes que mantienen separadas las cadenas de poliestireno. Como resultado, los adsorbentes en general tienen una superficie específica porosa y diámetro de poros relativamente grande. Segundo, las redes se pueden hinchar; es decir, el volumen de la fase de polímero aumenta cuando se pone en contacto con moléculas orgánicas. Finalmente, los polímeros hiperreticulados están "tensos" cuando están en estado seco; es decir, la rigidez de la red en el estado seco evita las atracciones de cadena a cadena. Sin embargo, las tensiones se relajan cuando el adsorbente se moja, lo cual aumenta la capacidad de la red para hincharse en el medio líquido. Davankov and Tsyurupa, Reactive Polymers 13:27-42 (1990); Tsyurupa et al., Reactive Polymers 25:69-78 (1995).

Se han usado con éxito varios agentes de reticulación para producir puentes entre cadenas de poliestireno, que incluyen dicloruro de p-xileno (XDC), éter monoclorodimetílico (MCDE), 1,4-bis-clorometildifenilo (CMDP), 4,4'-bis(clorometil)bifenilo (CMB), dimetilformal (DMF), p,p'-bis-clorometil-1,4-difenilbutano (DPB), y tris-(clorometil)mesitileno (CMM). Los puentes se forman entre las cadenas de poliestireno por reacción de uno de estos agentes de reticulación con los anillos de fenilo del estireno, mediante una reacción de Friedel-Crafts. Por lo tanto, los puentes resultantes unen anillos de fenol del estireno presentes en dos cadenas de poliestireno diferentes. Véase, p. ej., patente de EE.UU. nº 3.729.457.

Los puentes son especialmente importantes porque eliminan en general la necesidad de un agente "humectante". Es decir, los puentes evitan que los poros colapsen cuando el adsorbente está en un estado esencialmente anhidro (es decir, "seco"), y por lo tanto no tienen que "reabrirse" con un agente humectante antes de que el adsorbente se ponga en contacto con un hemoderivado. Con el fin de prevenir que los poros colapsen, deben formarse los puentes conformacionalmente restringidos. Algunos agentes bifuncionales, como el DPB no producen una conformación generalmente limitada; por ejemplo, el DPB contiene cuatro unidades de metileno sucesivas que son susceptibles de reordenaciones conformacionales. Por lo tanto, el DPB no es un agente bifuncional preferido para usar con la presente invención.

Algunas de las características estructuralmente relacionadas de las partículas adsorbentes descritas antes se resumen en la tabla A.

Tabla A

Tamaño de malla (!m)

Adsorbentes Amberlite® - Rohm and Haas

XAD-2

poliaromático 90 20-60

XAD-4

poliaromático 40 20-60

Tamaño de malla (!m)

Adsorbentes Amberlite® - Rohm and Haas

XAD-7

polimetacrilato 90 20-60

XAD-16

poliaromático 100 20-60

-

20-60

XAD-2000

poliaromático 42 20-60

XAD-2010

poliaromático 280 20-60

Adsorbentes Amberchrom® - Toso Haas

CG-71m

polimetacrilato 200-300 50-100

-

80-160

CG-161m

poliaromático 110-175 50-100

CG-161c

poliaromático 110-175 80-160

Adsorbentes Diaion®//Sepabeads® - Mitsubishi Chemical

HP20

poliaromático 300-600 20-60

20-60

SP207

estirénico bromado 100-300 20-60

SP850

poliaromático 50-100 20-60

HP2MG

polimetacrilato 200-800 25-50

HP20SS

poliaromático 300-600 75-150

50-100

Adsorbentes Dowex# - Dow Chemical Company

XUS-40285

funcionalizado 25 20-50

XUS-40323

poliaromático 100 16-50

XUS-43493

poliaromático 46 20-50

Procesamiento de las partículas adsorbentes

Las partículas adsorbentes se pueden procesar más para separar partículas finales, sales, potenciales productos extraíbles y endotoxinas. La separación de estos componentes extraíbles se lleva a cabo típicamente por tratamiento con disolventes orgánicos, vapor de agua, o fluidos supercríticos. Preferiblemente, las partículas se

5 esterilizan.

Actualmente varias compañías venden versiones "limpias" (es decir, procesadas) de partículas adsorbentes disponibles en el comercio. Además de procesar las partículas adsorbentes (p. ej., resinas), estas compañías ensayan los adsorbentes, y el adsorbente final se certifica estéril (USP XXI), exento de pirógenos (LAL), y exento de productos detectables extraíbles (DVB y productos orgánicos totales).

10 El procesamiento término (p. ej., vapor de agua) es un método eficaz para procesar partículas adsorbentes. F. Rodriguez, Principles Of Polymer Systems, (Hemisphere Publishing Corp.), pp. 449-53 (3rd. Ed., 1989). Supelco, Inc. (Bellefonte, PA) usa un procedimiento patentado térmico sin disolvente para limpiar adsorbentes Dowex® XUS43493 y Amberlite. La ventaja principal de usar vapor de agua es que no añade ningún potencial producto extraíble al adsorbente. Sin embargo, una gran desventaja es que este procedimiento puede sacar agua de los poros de las

15 perlas de resina; el rendimiento eficaz de algunos adsorbentes requiere que las perlas se vuelvan a mojar antes de ponerlas en contacto con el hemoderivado destacado.

Una ventaja del adsorbente limpio/procesado es un nivel extremadamente bajo de partículas con diámetros menores de 30 !m. Se llevó a cabo un ensayo preliminar de adsorbentes (Dowex® XUS-43493 y Amberlite® XAD-16) procesados por Supelco, para determinar el recuento de partículas. Los resultados de estos ensayos indicaban que

20 estaban ausentes partículas extrañas (p. ej., polvo, fibras, partículas no adsorbentes y partículas no identificadas) y que las partículas finas (< 30 !m) estaban esencialmente ausentes.

Uso de agentes humectantes y agentes estabilizantes con resinas adsorbentes

Se pueden usar métodos para prevenir el secado y la pérdida de capacidad de adsorción de partículas, tales como Amberlite# que pierde algo de su capacidad de adsorción en determinadas condiciones (p. ej., secado).

En un método, se pueden fabricar partículas, materiales o dispositivos en un estado mojado que está sellado y no es capaz de secar. Este método está asociado con varios inconvenientes importantes. La semivida de los productos se podría reducir puesto que los niveles de productos extraíbles de los materiales podrían aumentar con el tiempo. La esterilización puede estar limitada a un procedimiento con vapor de agua porque la irradiación ∃ de los polímeros mojados típicamente no se realiza. La fabricación de un dispositivo que requiere que un componente se mantenga en un estado mojado, en general es más difícil que la fabricación de un dispositivo en seco; por ejemplo, la biocarga y las endotoxinas pueden ser un problema si hay un tiempo de retraso grande entre el montaje del dispositivo y la esterilización terminal.

Un segundo método para prevenir la pérdida de la capacidad de adsorción implica el uso de un adsorbente que no se afecte de forma adversa por el secado. Como se ha expuesto previamente, en general los adsorbentes macrorreticulares que tienen estructuras porosas altamente reticuladas (p. ej., Dowex® XUS-43493 y Purolite® MN200) en general no requieren un agente humectante porque la reticulación previene que los poros colapsen. A diferencia de Amberlite® XAD-16, estos adsorbentes macrorreticulares retienen una proporción muy grande de su actividad inicial cuando están secos.

En un tercer método, la pérdida de la capacidad de adsorción tras el secado se puede prevenir hidratando los adsorbentes Amberlite® XAD-16 y relacionados (p. ej., Amberlite® XAD-4) en presencia de un agente humectante no volátil. Por ejemplo, cuando se usa Amberlite® XAD-16 como el adsorbente, las perlas de adsorbente se pueden secar parcialmente antes de usarlas durante el manejo, esterilización y almacenamiento. Cuando el contenido de agua de estos adsorbentes baja por debajo de un nivel crítico, se produce una pérdida rápida de la capacidad de adsorción (probablemente debido al "colapso" de los poros); por lo tanto, para una eficacia óptima, los poros deben "reabrirse" con un agente humectante antes de usar.

Los agentes estabilizantes son eficaces para mantener la capacidad de adsorción cerca de su máximo cuando determinadas resinas adsorbentes se someten a condiciones de secado. Se cree que el uso de agentes estabilizantes sirve para prevenir que los poros del adsorbente colapsen.

Un agente estabilizante aceptable debe ser soluble en agua y etanol, relativamente no volátil respecto al etanol y agua, y seguro para la transfusión en pequeñas cantidades. El glicerol y el polietilenglicol de bajo peso molecular (p. ej., PEG-200 y PEG-400) son ejemplos de agentes estabilizantes que tienen estas características. El glicerol tiene una historia de hemocompatibilidad positiva. Se añade con frecuencia a la sangre como un agente crioprotector en el almacenamiento congelado de preparaciones de glóbulos rojos. Véase, p. ej., Chaplin et al., Transfusion 26:34145 (1986); Valeri et al., Am. J. Vet. Res. 42(9)1590-94 (1981). Las disoluciones que contienen hasta 1% de glicerol se transfunden rutinariamente, y están disponibles en el comercio disoluciones de glicerol (p. ej., Glyerolite 57 Solution, Fenwal Laboratories, Deerfield, IL). Las perlas de adsorbente tales como Amberlite® XAD-16 se pueden estabilizar en etanol y glicerol.

Los polietilenglicoles de bajo peso molecular, usados habitualmente como bases farmacéuticas, también se pueden usar como agentes estabilizantes. Los PEG son polímeros líquidos y sólidos de fórmula química general H(OCH2CH2)nOH, donde n es mayor o igual que 4. Las formulaciones de PEG normalmente van seguidas de un número que corresponde al peso molecular medio; por ejemplo, PEG-200 tiene un peso molecular de 200 y un intervalo de peso molecular de 190-210. Los PEG están disponibles en el comercio en una serie de formulaciones

(p. ej., Carbowax, Poly-G y Solbase).

Matrices inertes para inmovilización de partículas

Las partículas adsorbentes se inmovilizan por una matriz inerte. La matriz inerte puede estar hecha de un polímero sintético o natural. Por ejemplo, la matriz inerte puede ser una fibra polimérica sintética o natural, por ejemplo, una red de fibras. La matriz inerte pueden ser polímeros sinterizados. La matriz inerte, como con los otros componentes del dispositivo, preferiblemente es biocompatible y no afecta sustancialmente de forma adversa la actividad biológica de un material tras el contacto.

Lo más preferiblemente, las fibras sintéticas son fibras de polietileno (Air Quality Filtration (AQF), una sección de Hoechst Celanese (Charlotte, N.C.)). Otros ejemplos preferidos de fibras sintéticas son fibras de poliolefina, poliéster

o poliamida. Otras fibras sintéticas de ejemplo incluyen fibras de polipropileno, poli(alcohol vinílico) y polisulfona.

En una realización preferida, la fibra de polímero sintético incluye un primer núcleo polimérico con un punto de fusión alto rodeado de una vaina con una temperatura de fusión menor. El núcleo polimérico puede ser un núcleo de (polietileno-poliéster de tereftalato). La vaina puede ser una vaina de nailon, o una vaina de poliéster modificado. Las fibras están disponibles en el comercio en Unitika (Osaka, Japón) y Hoechst Trevira GmbH & Co. (Augsberg, Alemania).

Las fibras de polímero natural de ejemplo incluyen fibras de celulosa derivadas de una variedad de fuentes, tales como yute, kozu, kraft y cáñamo de Manila. Se han usado redes de fibras de polímero sintético o natural para hacer filtros como se describe en las patentes de EE.UU. nº 4.559.145 y 5.639.376.

Los polímeros sintéticos adecuados para la construcción de partículas sinterizadas son polietileno de alta densidad, polietileno de peso molecular ultraalto, polipropileno, poli(fluoruro de vinilo), politetrafluoroetileno, nailon 6. Más preferiblemente, las partículas sinterizadas son poliolefinas tales como polietileno.

La presente invención contempla las partículas adsorbentes sin fibras; dichas fibras preferiblemente contienen una superficie de adsorción porosa grande u otros medios de adsorción para facilitar la reducción de la concentración de compuestos orgánicos pequeños.

Inmovilización de partículas

En una realización, las partículas adsorbentes están inmovilizadas por una matriz inerte para producir un medio de adsorción para reducir la concentración de los compuestos orgánicos pequeños en un material. La matriz inerte puede ser una red tridimensional que incluye una red de fibras poliméricas sintéticas o naturales con partículas adsorbentes inmovilizadas en la misma.

Preferiblemente, el medio de adsorción comprende partículas adsorbentes porosas pequeñas con estructuras muy porosas y superficies específicas internas muy grandes, como se ha descrito antes, inmovilizadas por la matriz inerte. Preferiblemente, cuando un material biológico se pone en contacto con el medio de adsorción, el medio de adsorción no afecta sustancialmente de forma adversa a la actividad biológica u otras propiedades del material.

La tecnología para la inmovilización de perlas adsorbentes en una red de fibras para construir filtros de aire, se ha descrito en la patente de EE.UU. nº 5.486.410 y la patente de EE.UU. nº 5.605.746. Como se representa en la figura 1, las fibras de polímero 600 de la red de fibras consiste en un núcleo de polímero 602 (p. ej., poli(tereftalatos de etileno) (PET)) con un punto de fusión alto, rodeado de una vaina de polímero 604 (p. ej., nailon) con una temperatura de fusión relativamente baja. Véase, la patente de EE.UU. nº 5.190.657 de Heagle et al. La resina fibrizada se prepara distribuyendo primero uniformemente las perlas adsorbentes en la red de fibras. Después, la red se calienta rápidamente (p. ej., 180ºC x 1 min) haciendo que la vaina de polímero de las fibras 600 funda y se una a las perlas adsorbentes 606 y otras fibras, formando una red de fibras reticuladas, representada en la figura 2. Como se representa en la figura 3 y figura 4 (no están a escala), hablando en términos generales, las redes de fibra contienen tres capas; dos capas exteriores 607 que están densamente empaquetadas con fibras 600 y una capa interior 609 menos densa que contiene las perlas adsorbentes 606 y menos fibras 600. En una realización preferida, los bordes de la resina fibrizada se pueden sellar con un poliuretano y otros polímeros. Alternativamente, como se representa en la figura 3 y figura 4, se pueden hacer juntas térmicas 608 en la resina fibrizada resultante a intervalos predeterminados; por ejemplo, se pueden hacer juntas térmicas en la resina fibrizada con un patrón de cuadrados. Después, la resina fibrizada se puede cortar por las juntas térmicas para formar muestras de resina que contienen una masa deseada (p. ej., preferiblemente menos de 5,0 g y más preferiblemente menos de 3,0 g) de perlas adsorbentes y de un tamaño adecuado para ponerlas dentro de un envase de hemoderivado. Las juntas térmicas sirven para prevenir que la resina fibrizada cortada se deshilache y ayudan a inmovilizar las perlas adsorbentes. Sin embargo, el uso de dichas juntas térmicas no es necesario con el fin de practicar la presente invención. En una realización alternativa, representada en la figura 4, las perlas adsorbentes 606 no están aseguradas a las propias fibras, sino que están inmovilizadas entre las capas exteriores de fibras 607 más densas y las juntas térmicas 608; esta realización también puede producir muestras de medios fibrizados que contienen una cantidad definida de adsorbente después de ser cortadas por las juntas térmicas.

La presente invención también contempla el uso de un adhesivo (p. ej., un agente de unión) para asegurar la resina adsorbente a las fibras. Además, aunque se prefiere que las perlas adsorbentes estén químicamente unidas a la red de fibras, las perlas también pueden estar físicamente atrapadas dentro de la red de fibras; esto se puede llevar a cabo, por ejemplo, rodeando las perlas con fibras suficientes para así mantener las perlas en la posición.

También están contempladas otras formas en las que pueden estar inmovilizadas partículas adsorbentes en una red de fibras. Las partículas se pueden inmovilizar usando un procedimiento de colocado en seco, como se describe en las patentes de EE.UU. 5.605.746 y 5.486.410 (patentes AQF). Las partículas se pueden inmovilizar usando un procedimiento de colocado en mojado, como se describe en las patentes de EE.UU. nº 4.559.145 y 4.309.247. Las partículas se pueden inmovilizar usando un procedimiento de soplado de fundido, como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.616.254. Cuando se usa un procedimiento de colocado en mojado para construir una matriz de fibras de polímero naturales, la matriz inerte preferiblemente incluye un agente aglutinante para unir las partículas adsorbentes a las fibras. Los ejemplos no limitantes de agentes aglutinantes incluyen melamina, poliaminas y poliamidas. La matriz típicamente contiene 1% o menos de dichos agentes aglutinantes.

Cuando la matriz inerte se construye a partir de partículas de polímeros sintéticos que están sinterizadas con partículas adsorbentes, es importante que la partícula adsorbente tenga una temperatura de fusión más alta que la matriz.

Preferiblemente, el medio de adsorción resultante comprende cantidades conocidas de adsorbente por área. Para

dispositivos discontinuos, el adsorbente por área es de aproximadamente 100 g/m2 a aproximadamente 500 g/m2, preferiblemente de aproximadamente 250 g/m2 a aproximadamente 350 g/m2. Para los dispositivos de flujo el adsorbente por área es de aproximadamente 300 g/m2 a aproximadamente 1100 g/m2, preferiblemente de aproximadamente 500 g/m2 a aproximadamente 700 g/m2. Por lo tanto, la cantidad adecuada de adsorbente contemplada para un propósito específico se puede medir simplemente cortando un área predeterminada de la resina fibrizada (es decir, no se pesa la resina fibrizada).

El medio de adsorción preferiblemente es biocompatible (es decir, no produce una respuesta tóxica, perjudicial o inmunológica); tiene un impacto mínimo en las propiedades del material tal como el hemoderivado (p. ej., plaquetas y factores de coagulación); y no está asociado con productos extraíbles tóxicos. Las partículas adsorbentes inmovilizadas del medio de adsorción preferiblemente tienen una alta estabilidad mecánica (es decir, no hay generación de partículas finas). El medio de adsorción para un dispositivo discontinuo contiene aproximadamente 25-85% en peso de adsorbente, preferiblemente aproximadamente 50-80% de adsorbente con una carga de aproximadamente 100-500 g/m2, más preferiblemente aproximadamente 50-80% de adsorbente con una carga de aproximadamente 250-350 g/m2.

El medio de adsorción para un dispositivo de flujo contiene aproximadamente 20-70% en peso de adsorbente, preferiblemente 30-50% en peso. Preferiblemente el medio de adsorción contiene aproximadamente 30% en peso de la partícula adsorbente cuando se usa una matriz fibrosa. Cuando se usa una matriz de partículas sinterizadas con una partícula de adsorbente polimérica molida, el medio de adsorción preferiblemente contiene aproximadamente 50% en peso de la partícula adsorbente

Recubrimiento de las partículas adsorbentes

La hemocompatibilidad superficial de las partículas, matrices o medios de adsorción se puede mejorar recubrimiento sus superficies con un polímero hidrófilo. Los polímeros hidrófilos de ejemplo incluyen poli(metacrilato de 2hidroxietilo) (pHEMA), que se puede obtener de, p. ej., Scientific Polymer Products, Inc. (Ontario, NY) y polímeros basados en celulosa, p. ej. etilcelulosa, que se puede obtener de Dow Chemical (Midland, MI). Véase, p. ej.,

Andrade et al., Trans. Amer. Soc. Artif. Int. Organs XVII:222-28 (1971). Otros ejemplos de recubrimientos incluyen polietilenglicol y poli(óxido de etileno), también disponible en Scientific Polymer Products, Inc. El recubrimiento de polímero puede aumentar la hemocompatibilidad y reducir el riesgo de generación de partículas pequeñas debido a la rotura mecánica.

La superficie del adsorbente también se puede modificar con heparina inmovilizada. Además, se pueden modificar adsorbentes de poliestireno-divinilbenceno de intercambio aniónico fuerte por adsorción de heparina. La heparina, un polianión, se adsorberá muy fuertemente sobre las superficies de adsorbentes que tengan características de intercambio aniónico fuerte. Están disponibles en el comercio una variedad de adsorbentes de poliestirenodivinilbenceno modificados con amina cuaternaria.

El recubrimiento se puede aplicar con una serie de métodos diferentes, incluyendo la polimerización por descarga luminiscente de radiofrecuencia, como se describe en la patente de EE.UU. nº 5.455.040, y el procedimiento de recubrimiento de Wurster (realizado por International Processing Corp. (Winchester, KY)).

En una realización, el procedimiento de recubrimiento de Wurster se puede aplicar suspendiendo las partículas adsorbentes (en general por presión de aire) en una cámara de modo que el polímero hidrófilo, tal como pHEMA, se pueda pulverizar uniformemente sobre todas las superficies de las partículas adsorbentes. Como se ilustra en el ejemplo 3, Dowex® XUS-43493 pulverizado uniformemente con pHEMA demostró un aumento del rendimiento de plaquetas, así como un efecto notable en el cambio de forma de las plaquetas con cantidades crecientes de recubrimiento. Se encontró que el procedimiento de recubrimiento de Wurster recubría selectivamente la superficie exterior de la superficie adsorbente, dejando la superficie porosa dentro prácticamente inafectada.

En una realización preferida, el recubrimiento se puede aplicar sumergiendo el medio de adsorción inmovilizado en el polímero hidrófilo (véase el ejemplo 3). Este procedimiento es más sencillo y más barato que la pulverización de las partículas adsorbentes con el polímero hidrófilo.

El procedimiento no se limita a un procedimiento que aplica el recubrimiento del medio de adsorción en cualquier momento particular. Por ejemplo, en una realización, el recubrimiento de pHEMA se aplica después de la producción del medio de adsorción, pero antes de sellado térmico del medio de adsorción. En otra realización, el medio de adsorción primero se sella térmicamente, y después se aplica el recubrimiento de pHEMA. Además de recubrir el medio de adsorción, el procedimiento de lavado asociado con la aplicación de pHEMA sirve para eliminar partículas sueltas y fibras.

Al aumentar la cantidad de recubrimiento, se hace más difícil para algunos compuestos orgánicos pequeños cruzar el recubrimiento para alcanzar la superficie de la partícula, produciendo una disminución de la cinética de adsorción. Por lo tanto, al aumentar la cantidad de recubrimiento, en general se debe usar una mayor masa de adsorbente para lograr la misma cinética de separación que el adsorbente con recubrimiento. En una realización, el nivel óptimo de recubrimiento de pHEMA es el recubrimiento mínimo al que se observa un efecto protector sobre el rendimiento de las plaquetas y la función de las plaquetas in vitro (0,1%-0,5%).

Los recubrimientos deben ser sensibles a la esterilización. Por ejemplo, la esterilización gamma puede producir la reticulación y/o corte del recubrimiento. Por lo tanto, el tipo (haz de electrones frente a irradiación gamma) y la dosis de esterilización pueden influir en las propiedades del adsorbente recubierto. En general, se prefiere la esterilización por haz de electrones.

Dispositivos

Se proporcionan dispositivos para reducir la concentración de compuestos orgánicos pequeños de materiales tales como hemoderivados. El dispositivo es un dispositivo flujo continuo. Los ejemplos de dispositivos de flujo se muestran en la figura 16. Los dispositivos de flujo se conocen en la bibliografía y se describen, por ejemplo, en la publicación PCT WO 96/40857.

Los dispositivos discontinuos de la descripción comprenden un envase, tal como una bolsa de sangre, que incluye un medio de adsorción que contiene partículas inmovilizadas. En una realización, el hemoderivado se añade a una bolsa de sangre que contiene medio adsorbente y la bolsa se agita durante un periodo de tiempo específico.

Por ejemplo, en una realización, un medio de adsorción, p. ej. Dowex® XUS-43493 inmovilizado, se coloca dentro de un envase de un hemoderivado (p. ej., un envase de plástico PL 146 (BaxterHealthcare Corp. (Deerfield, IL)) se mantiene en un agitador (Helmer Laboratories (Novesvill, IN)) o rotador (Helmer Laboratories (Novesvill, IN)) de plaquetas durante aproximadamente 24 h a temperatura ambiente, y se almacena en diferentes condiciones de temperatura. El tamaño del envase del hemoderivado puede ser de aproximadamente 600 a aproximadamente 1000 ml. La temperatura de almacenamiento puede ser de aproximadamente 4ºC a aproximadamente 22ºC.

Se pueden usar métodos para reducir la presencia de partículas de adsorbente que se pueden soltar del medio adsorbente.

La presente descripción contempla un dispositivo discontinuo que incluye el medio adsorbente inmovilizado retenido en un envase tal como una bolsa/saco. La malla/bolsa puede estar construida de un cerramiento tejido, no tejido o membranoso. En una realización, la bolsa de malla tejida puede estar construida de poliéster o nailon de calidad médica. La realización preferida es poliéter. Las membranas disponibles en el comercio incluyen, pero sin limitar, membranas de de poli(sulfonato de etileno) (PES) hidrófilo Supor® 200, 800, 1200 (Gelman Sciences (Ann Arbor, MI)); poli(difluoruro de vinilideno) (PVDF) modificado hidrófilo Durapore® (Mantee America Corp. (San Diego, CA)) y membranas de polisulfona modificadas hidrófilas con conductos de ventilación hidrófobos integrados, p. ej., membranas Gemini, (Millipore (Marlborough, MA)); y membranas que comprenden policarbonato con un recubrimiento de polivinilideno (Poretics (Livermore, CA)). Los envases se pueden esterilizar después de la adición del medio de adsorción.

Los dispositivos de flujo permiten reducir la concentración de compuestos orgánicos pequeños de materiales tales como hemoderivados por perfusión del hemoderivado a través del dispositivo de flujo.

Cuando el dispositivo es un dispositivo de flujo, el medio de adsorción preferiblemente es de aproximadamente 3 a 30 mm de grosor para promover un flujo uniforme de fluido biológico sin una caída de presión sustancial. Preferiblemente el medio es de 3 a 15 mm de grosor. Más preferiblemente, el medio es de aproximadamente 5 a 8 mm de grosor. Cuando el dispositivo es un dispositivo discontinuo, el medio de adsorción puede ser de aproximadamente 2 a 30 mm de grosor. Preferiblemente el medio es aproximadamente de 2 a 10 mm de grosor.

Realización preferida para plaquetas

Preferiblemente, se proporciona un dispositivo de flujo para reducir la concentración de compuestos orgánicos pequeños en un material que comprende plaquetas, mientras que se mantiene sustancialmente la actividad biológica de las plaquetas. Se prefiere un dispositivo discontinuo. El medio de adsorción comprende partículas adsorbentes inmovilizadas por una matriz inerte. Las partículas preferidas son altamente porosas y tienen una superficie específica mayor que aproximadamente 750 m2/g.

Las partículas particularmente preferidas son adsorbentes poliaromáticos que comprenden una red de poliestireno hiperreticulada, tal como Dowex® XUS-43493 o Purolite MN-200. La matriz inerte preferida incluye una fibra polimérica sintética o natural que incluye un primer núcleo de polímero con un punto de fusión alto rodeado de una vaina con una temperatura de fusión inferior. El núcleo de polímero puede ser un núcleo de poli(tereftalato de etileno). La vaina puede ser una vaina de nailon o una vaina de poliéster modificado. Las fibras Staple están disponibles en el comercio en Unitika (Osaka, Japón) y Hoechst Trevira.

El dispositivo discontinuo puede comprender un medio de adsorción, un dispositivo de retención de partículas (p. ej., malla tejida, material no tejido o membrana) y una carcasa (p. ej., envase de almacenamiento de sangre).

Los compuestos orgánicos pequeños de ejemplo que son reducidos por los dispositivos, materiales y métodos de la presente invención son psoralenos y derivados psoralenos, isopsoralenos, productos de fotoactivación de psoralenos, acridinas y derivados de acridinas.

Las plaquetas típicamente se usan en los siguientes 3 días de la donación, pero se pueden almacenar durante hasta 5 días a temperatura ambiente, por lo tanto, sería ventajoso permitir que las plaquetas permanecieran en contacto con el medio de adsorción durante todo el periodo de almacenamiento. Preferiblemente, el procedimiento daría como resultado un rendimiento de plaquetas aceptable (p. ej., menos de 10% de pérdida). Un método contemplado por la presente invención permite el almacenamiento prolongado mejorando la hemocompatibilidad de la superficie adsorbente.

El uso de un medio de adsorción que comprende partículas adsorbentes inmovilizadas por una matriz inerte permite reducir la concentración de los compuestos orgánicos pequeños sin una pérdida sustancial en el recuento de plaquetas. La frase "sin una pérdida sustancial" se refiere a una pérdida del recuento de plaquetas menor de aproximadamente 10%, preferiblemente menor de aproximadamente 5% a lo largo de un periodo de tiempo de 1 día, más preferiblemente 5 días. Además, el tiempo que las plaquetas pueden estar en contacto con el medio de adsorción sin pérdida sustancial en el recuento de plaquetas es mayor que la cantidad de tiempo que las plaquetas pueden estar en contacto con las partículas adsorbentes solas. La inmovilización de las partículas permite de forma inesperada tanto un tiempo de contacto mayor como una reducción en la pérdida del recuento de plaquetas. Las plaquetas típicamente no pueden estar en contacto con partículas adsorbentes no inmovilizadas durante más de aproximadamente 20 h sin una pérdida significativa del recuento de plaquetas, p. ej., aproximadamente 80% de rendimiento. En cambio, las plaquetas pueden estar en contacto con el medio de adsorción que comprende partículas adsorbentes inmovilizadas por una matriz inerte durante más de 20 h, p. ej., de aproximadamente 1 a 5 días, sin una pérdida sustancial en el recuento de plaquetas.

Además, la función de las plaquetas in vitro (p. ej., cambio de forma, GNP-140, pH) mejora para las plaquetas almacenadas en presencia del medio de adsorción en comparación con el almacenamiento de las plaquetas sin el medio de adsorción a lo largo del tiempo. Las plaquetas almacenadas en presencia del medio de adsorción pueden tener un pH desde más de aproximadamente 6 a menos de aproximadamente 7,5.

Realización preferida para el plasma

Preferiblemente, se proporciona un dispositivo de flujo para reducir la concentración de compuestos orgánicos pequeños en un material que comprende plasma, mientras que mantiene sustancialmente la actividad biológica del plasma. El medio de adsorción comprende partículas adsorbentes inmovilizadas por una matriz inerte. Las partículas preferidas son muy porosas y tienen una superficie específica mayor de aproximadamente 750 m2/g.

Las partículas particularmente preferidas son Norit A Supra, que está disponible en Norit Americas, Inc, (Atlanta, GA). Norit a Supra es un carbón activado de calidad USP que se forma por activación de lignito con vapor de agua. El carbón activado tiene una superficie específica total muy alta (2000 m2/g) y es de naturaleza muy microporosa.

Además, las partículas se pueden seleccionar de cualquiera de las siguientes partículas en donde las partículas preferiblemente tienen un intervalo de tamaños de 10 !m a 100 !m de diámetro, sea por síntesis directa por molienda, o por algún otro medio, y son carbones activados, tales como Picactif Medicinal (Pica USA, Columbus, OH), adsorbentes carbonosos sintéticos, tales como Ambersorb 572 (Rohm and Haas, Philadelphia, PA), resinas hidrófobas, tales como adsorbentes Amberlite (p. ej., Amberlite® XAD-2, XAD-4, y XAD-16), disponibles en Rohm and Haas (Philadelphia, PA); adsorbentes Amberchrom® disponibles en Toso Haas (TosoHass, Montgomeryville, PA); adsorbentes Diaion®//Sepabeads® (p. ej., Diaion® HP20), disponibles en Mitsubishi Chemical America, Inc. (White Plains, NY); resinas Hypersol-Macronet® Sorbent (p. ej., resinas Hypersol-Macronet® Sorbent MN-150 y MN400) disponibles en Purolite (Bala Cynwyd, PA) y adsorbentes Dowex® (p. ej., Dowex® XUS-40323, XUS-43493, y XUS-40285), disponibles en Dow Chemical Company (Midland, MI).

La matriz inerte puede ser una fibra polimérica sintética o natural. En una realización preferida, la matriz inerte son partículas sinterizadas o celulosa.

Los compuestos orgánicos pequeños de ejemplo que se reducen mediante los dispositivos, materiales y métodos de la presente invención son psoralenos y derivados psoralenos, isopsoralenos, productos de fotoactivación de psoralenos, azul de metileno, fenotiazina, acridina.

Cuando el fluido biológico que contiene moléculas pequeñas cuya concentración se va a reducir es plasma, el dispositivo preferiblemente es un dispositivo de flujo que mantiene niveles adecuados de actividad de coagulación. Las medidas de la actividad de coagulación incluyen el tiempo de protrombina, tiempo de tromboplastina parcial activada y medidas funcionales de los factores de coagulación I, II, V, VII, VIII, IX, X, XI y XII. Una medida funcional adecuada de la actividad del factor de coagulación es más de 80% del nivel previo al paso por el dispositivo, o en el caso de tiempos de coagulación, uno que permanezca en el intervalo normal establecido por cada laboratorio que hace este tipo de ensayo. Las medidas preferidas para la actividad de coagulación incluyen PT y PTT, ya que son medidas de la capacidad total del plasma para coagular, y los factores I, II, V, VII, X, XI, y XII, ya que estos factores normalmente no son sustituidos por proteínas recombinantes. Se prefiere que se retenga más de 90% de la actividad de coagulación de estos factores respecto al nivel previo al paso por el dispositivo y tenga cambios en PT y PTT de menos de aproximadamente 1,5 segundos.

En una realización el dispositivo de flujo puede comprender un medio de adsorción y una carcasa. La carcasa debe

promover el flujo uniforme del plasma para promover un buen uso del medio y cuando se ceba, permite que el plasma empuje el aire por delante de él, eliminando así burbujas que reducirían el área de contacto entre el plasma y el medio de adsorción, reduciendo así el uso del medio. La carcasa puede ser plana o tener profundidad sustancial para acomodar el medio de adsorción o el medio de retención de partículas que no es plano, por ejemplo medio de adsorción conformado de forma cilíndrica. En una realización preferida, la carcasa es plana. La carcasa puede tener entradas y salidas en diferentes orientaciones, por ejemplo, entrada superior/salida superior o entrada inferior/salida inferior. En una realización preferida, la salida está en la parte inferior para promover un buen drenaje y la entrada está en la parte superior para promover el uso del medio.

En otra realización, el dispositivo de flujo que comprende un medio de adsorción y una carcasa también puede incluir un medio de retención de partículas. En una realización preferida, el dispositivo incluye un medio de retención de partículas corriente abajo del medio de adsorción para retener las partículas que son echadas del medio de adsorción mientras se mantiene un caudal del fluido alto y una recuperación de proteínas alta. El medio de retención de partículas puede ser una membrana, una matriz extendida de fibras seca o mojada, una matriz de polímero sinterizado, un material tejido, un material no tejido (poliéster no tejido), o una combinación de los mismos.

La carcasa del dispositivo mantiene el medio de retención de partículas en una orientación aproximadamente paralela corriente abajo del medio de adsorción (la patente de EE.UU. nº 5.660.731 describe ejemplos de carcasas de filtros). La carcasa puede estar construida de cualquier material impermeable rígido adecuado, que no afecte sustancialmente de forma adversa a la actividad biológica del fluido. Preferiblemente, la carcasa está construida de un polímero sintético. Los ejemplos no limitantes de dichos polímeros incluyen plásticos poliacrílicos, de polietileno, polipropileno, poliestireno y policarbonato.

Cuando el dispositivo es un dispositivo de flujo, el medio de adsorción que contiene partículas inmovilizadas por una matriz inerte debe ser de entre 3 y 30 mm de grosor para promover un flujo uniforme del fluido biológico sin una caída sustancial de presión. Preferiblemente, el medio debe tener entre 3 y 15 mm de grosor. Más preferiblemente, el medio debe tener entre 5 y 8 mm de grosor.

Cuando el dispositivo es un dispositivo de flujo, se prefiere el flujo por gravedad. Más preferiblemente, el dispositivo es un dispositivo de flujo por gravedad que está construido para permitir caudales de 10-80 ml/min con presiones diferenciales de 30,5-190,5 cm (12-72 pulgadas) de agua. Más preferiblemente, el dispositivo permite caudales de 30-60 ml/min con presiones diferenciales de 61-121,9 cm (24-48 pulgadas) de agua.

Realización preferida para los glóbulos rojos

Preferiblemente, se proporciona un dispositivo discontinuo o de flujo para reducir la concentración de compuestos orgánicos pequeños en un material que comprende glóbulos rojos, mientras que mantiene sustancialmente la actividad biológica de los glóbulos rojos. El medio de adsorción comprende partículas adsorbentes inmovilizadas por una matriz inerte. Las partículas preferidas son muy porosas y tienen una superficie específica mayor de aproximadamente 750 m2/g.

Preferiblemente, el dispositivo es un dispositivo de flujo o discontinuo que mantiene sustancialmente la actividad biológica de los glóbulos rojos después de reducir la concentración de compuestos orgánicos pequeños. La realización del dispositivo de flujo comprende dos componentes: un medio de adsorción y una carcasa, y opcionalmente un medio de retención. Las realizaciones para el medio de retención de partículas y la carcasa son como se han descrito antes para la realización del dispositivo para plasma. En otra realización, el dispositivo para glóbulos rojos es un dispositivo discontinuo que no afecta sustancialmente de forma adversa a la actividad biológica de un fluido tras el contacto. La realización del dispositivo discontinuo comprende un medio de adsorción que contiene partículas inmovilizadas por una matriz inerte y opcionalmente un dispositivo de retención de partículas.

En una realización, las partículas son carbón activado. Preferiblemente, los carbones activados se obtienen de fuentes sintéticas. Los ejemplos no limitantes de carbones activados incluyen Picactif Medicinal, que está disponible en Pica U.S.A. (Columbus, OH); Norit ROX 0.8, que está disponible en Norit Americas Inc. (Atlanta, GA); y G-277, que está disponible en Pica U.S.A. (Columbus, OH).

Cuando el dispositivo para glóbulos rojos es un dispositivo discontinuo, el adsorbente preferiblemente es un carbón activado obtenido de una fuente sintética, tal como Ambersorb 572. Los Ambersorbs son adsorbentes carbonosos

(p. ej., ricos en carbón) activados sintéticos fabricados por Rohm & Haas (Philadelphia, PA). Los Ambersorbs en general son partículas esféricas grandes (300 - 900 !m) que son más duraderas que los carbones activados típicos. Los Ambersorbs se fabrican de forma sintética tratando perlas de poliestireno poroso altamente sulfonado con un procedimiento de activación de alta temperatura patentado. Estos adsorbentes no requieren el hinchado previo para lograr la actividad de adsorción óptima.

En otra realización preferida, las partículas pueden ser resinas hidrófobas. Los ejemplos no limitantes de resinas hidrófobas incluyen los siguientes adsorbentes poliaromáticos: adsorbentes Amberlite® (p. ej., Amberlite® XAD-2, XAD-4 y XAD- 16), disponibles en Rohm and Haas (Philadelphia, PA); adsorbentes Amberchrom® disponibles en Toso Haas (TosoHass, Montgomeryville, PA); y adsorbentes Diaion®//Sepabeads® (p. ej., Diaion® HP20), disponibles en Mitsubishi Chemical America, Inc. (White Plains, NY). En una realización particularmente preferida,

las partículas son resinas Hypersol-Macronet® Sorbent (p. ej., resinas Hypersol-Macronet® Sorbent MN-200, MN150 y MN-400) disponibles en Purolite (BaJa Cynwyd, PA) o adsorbentes Dowex® (p. ej., Dowex® XUS-43493 y XUS-40285), disponibles en Dow Chemical Company (Midland, MI).

La matriz inerte preferida incluye una fibra polimérica sintética o natural. En una realización preferida, la matriz inerte incluye una fibra polimérica sintética que incluye un primer núcleo de polímero con un punto de fusión alto rodeado de una vaina con una temperatura de fusión inferior. El núcleo de polímero puede ser un núcleo de poli(tereftalato de etileno) o de poliéster. La vaina puede ser una vaina de nailon o una vaina de poliéster modificado. Las fibras están disponibles en el comercio en Unitika (Osaka, Japón) y Hoechst Trevira (Augsberg, Alemania).

En algunas realizaciones, el medio de adsorción está en un cerramiento. En una realización, el dispositivo discontinuo comprende un medio de adsorción y una carcasa. En otra realización, el dispositivo discontinuo que comprende un medio de adsorción y una carcasa también puede incluir un medio de retención de partículas. En una realización preferida, la carcasa comprende una bosa de sangre de un volumen entre 600 ml y 1 litro. El medio de retención de partículas puede comprender un cerramiento de poliéster tejido, poliéster no tejido o membranoso. Se prefiere que el dispositivo discontinuo ponga en contacto los glóbulos rojos a 4ºC o 22ºC, en presencia de agitación, a lo largo de un periodo de tiempo de 1 a 35 días.

El uso del medio de adsorción que comprende partículas adsorbentes inmovilizadas por una matriz inerte permite reducir la concentración de compuestos orgánicos pequeños sin una pérdida sustancial en la función de los glóbulos rojos. La frase "sin una pérdida sustancial" se refiere a menos de aproximadamente 1% de cambio en la hemolisis; preferiblemente menos de aproximadamente 0,8% de cambio en la hemolisis, más de aproximadamente 90% de recuperación de los glóbulos rojos; preferiblemente más de 80% de recuperación de los glóbulos rojos, menos de aproximadamente 10% de diferencia con los glóbulos rojos de control sin dispositivo en el cambio de la concentración de ATP, y menos de aproximadamente 15% de diferencia con los glóbulos rojos de control sin dispositivo en el cambio de concentración de potasio extracelular. A los 35 días, el cambio en la hemolisis es al menos 10% mayor para el DAI comparado con las partículas no inmovilizadas, preferiblemente 20% mayor y más preferiblemente 50%.

La función de los glóbulos rojos se puede ensayar usando kits convencionales. En particular, la hemolisis se puede determinar midiendo la absorbancia a 540 nm de una muestra de líquido sobrenadante de glóbulos rojos en un reactivo Drabkin ((Sigma Chemical Company), St Louis, MO). El escape de potasio se puede ensayar usando un analizador de Na+/K+ (Ciba-Corning Diagnostics, Medfield, MA). La determinación enzimática cuantitativa del ATP en las muestras de glóbulos rojos es posible usando un kit convencional (Sigma Diagnostics, St. Louis, MO) y midiendo la absorbancia a 340 nm comparado con un fondo de agua.

Cuando el fluido biológico que se va a purificar son glóbulos rojos, el dispositivo puede reducir la concentración de moléculas orgánicas pequeñas tanto cíclicas como acíclicas en una muestra de glóbulos rojos. Preferiblemente, el dispositivo puede reducir la concentración tanto de derivados de acridina como de tioles en una muestra de glóbulos rojos. Más preferiblemente, el dispositivo puede reducir la concentración tanto de 5-[(∀-carboxietil)amino]acridina como de glutatión en una muestra de glóbulos rojos. Se pueden usar ensayos convencionales de HPLC para determinar las concentraciones de 5-[(∀-carboxietil)amino]acridina y de glutatión en glóbulos rojos puestos en contacto con el dispositivo. Las fases móviles de ensayo son H3PO4 10 mM en agua para HPLC y H3PO4 10 mM en acetonitrilo. Las columnas Zorbax SB-CN y YMC ODSAM-303 están disponibles en MacMod Analytical, Inc. (Chadds Ford, PA) y YMC, Inc. (Wilmington, NC).

Aplicaciones

La presente invención contempla reducir la concentración de compuestos orgánicos pequeños. Los compuestos orgánicos pequeños incluyen agentes inactivantes de patógenos tales como productos de fotoactivación, aminoacridinas, colorantes orgánicos y fenotiazinas. Los ejemplos de agentes inactivantes de patógenos incluyen furocumarinas, tales como psoralenos y acridinas. Después del tratamiento de un hemoderivado con un compuesto inactivante de patógenos como se describe, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. nº 5.459.030 y 5.559.250, la concentración de compuestos inactivantes de patógenos en el hemoderivado se puede reducir poniendo en contacto el hemoderivado tratado con un dispositivo de la invención.

La descripción ilustra un método para inactivar patógenos en disolución, en donde el método comprende: a) proporcionar, en cualquier orden: i) un compuesto cíclico, ii) una disolución que se sospecha que está contaminada con dichos patógenos, y iii) resina fibrizada; b) tratar dicha disolución con dicho compuesto cíclico para así crear un producto de disolución tratada en donde dichos patógenos están inactivados; y c) poner en contacto dicho producto de disolución tratada con dicha resina fibrizada, y que además comprende un dispositivo para reducir la concentración de compuestos orgánicos pequeños en un hemoderivado, mientras que se mantiene sustancialmente la actividad biológica deseada del hemoderivado, comprendiendo el dispositivo partículas adsorbentes muy porosas, en donde las partículas adsorbentes están inmovilizadas por una matriz inerte.

Además del compuesto inactivante de patógenos, también se pueden reducir los productos de degradación reactivos del mismo del material tal como un hemoderivado, por ejemplo, antes de la transfusión.

Los materiales y dispositivos descritos en la presente memoria se pueden usar en métodos de aféresis. La sangre entera se puede separar en dos o más componentes específicos (p. ej., glóbulos rojos, plasma y plaquetas). El término "aféresis" se refiere de forma amplia a procedimientos en los que se saca sangre de un donante y se separa en diferentes componentes, recogiéndose y reteniéndose el o los componentes de interés y devolviendo al donante los otros componentes. El donante recibe sustitución de fluidos durante el procedimiento de reinfusión para ayudar a compensar la pérdida de volumen y presión causada por la separación de componentes. Los sistemas de aféresis se describen en la publicación PCT WO96/40857.

Compuestos orgánicos pequeños

Un conjunto diverso de compuestos orgánicos pequeños puede ser adsorbidos por el dispositivo de la presente invención. Las moléculas pueden ser cíclicas o acíclicas. En una realización, los compuestos son psoralenos, acridinas o colorantes.

Los ejemplos no limitantes de compuestos cíclicos incluyen actinomicinas, antraciclinonas, mitomiacina, antramicina, y colorantes orgánicos y compuestos fotorreactivos tales como benzodipironas, fluorenos, fluorenonas, furocumarinas, porfirinas, protoporfirinas, purpurinas, ftalocianinas, azul Monostral Fast, norfilina A, fenantridinas, sales de fenazationio, fenazinas, fenotaiazinas, fenilazidas, quinolinas y tiaxantenonas. Preferiblemente, los compuestos son furocumarinas o colorantes orgánicos. Más preferiblemente, los compuestos son furocumarinas.

Los ejemplos no limitantes de furocumarinas, incluyen psoralenos y derivados de psoralenos. Están contemplados específicamente 4'-aminometil-4,5',8- trimetilpsoraleno, 8-metoxipsoraleno, psoralenos halogenados, isopsoralenos y psoralenos unidos a aminas cuaternarias, azúcares u otros grupos que se unen a ácidos nucleicos. También están contemplados los siguientes psoralenos: 5'-bromometil-4,4',8-trimetilpsoraleno, 4'-bromometil-4,5',8trimetilpsoraleno, 4'-(4-amino-2-aza)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'(2-aminoetil)-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(5-amino-2-oxa)pentil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(5-amino-2-aza)pentil-4,5',8trimetilpsoraleno, 4'-(6-amino-2-aza)hexil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(7-amino-2,5-oxa)heptil-4,5',8-trimetiIpsoraleno, 4'-(12-amino-8-aza-2,5-dioxa)dodecil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(13-amino-2-aza-6,11-dioxa)tridecil-4,5',8trimetilpsoraleno, 4'-(7-amino-2-aza)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(7-amino-2-aza-5-oxa)heptil-4,5',8trimetilpsoraleno, 4'-(9-amino-2,6-diaza)nonil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(8-amino-5-aza-2-oxa)octil-4,5',8trimetilpsoraleno, 4'-(9-amino-5-aza-2-oxa)nonil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(14-amino-2,6,11-triaza)tetradecil-4,5',8trimetilpsoraleno, 5,-(4-amino-2-aza)butil-4,4',8-trimetilpsoraleno, 5'-(6-amino-2-aza)hexil-4,4',8- trimetilpsoraleno y 5'-(4-amino-2-oxa)butil-4,4',8-trimetilpsoraleno. Preferiblemente, el psoraleno es el 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8trimetilpsoraleno.

Acridinas

Los ejemplos no limitantes de acridinas incluyen naranja de acridina, acriflavina, quinacrina, N1,N1-bis(2-hidroxietil)N4-(6-cloro-2-metoxi-9-acridinil)-1,4-pentanodiamina, 9-(3-hidroxipropil)aminoacridina, N-(9-acridinil)glicina, S-(9acridinil)-glutatión. En una realización preferida la acridina es la N-(9-acridinil)-β-alanina, alternativamente denominada 5-[(β-carboxietil)amino]acridina.

Colorantes

Los ejemplos no limitantes de colorantes incluyen fenotiazinas tales como azul de metileno, rojo neutro, azul toluidina, cristal violeta y azur A y fenotiazonas tales como violeta de metileno Bernthsen. Preferiblemente, el colorante es azul de metileno o azul de toluidina. Más preferiblemente, el colorante es azul de metileno.

Otros compuestos orgánicos

Se puede reducir la concentración de una variedad de compuestos orgánicos. Otros compuestos de ejemplo incluyen compuestos inactivadores. Los métodos para inactivar reacciones secundarias indeseables de compuestos inactivantes de patógenos que incluyen un grupo funcional que es, o que es capaz de formar, un grupo electrófilo, se describen en la solicitud de patente copresentada de EE.UU. "Methods for Quenching Pathogen Inactivators in Biological Systems", número de expediente 282173000600, presentada el 6 de enero de 1998. En este método, un material, tal como un hemoderivado, se trata con el compuesto inactivante de patógenos y un inactivador, en donde el inactivador comprende un grupo funcional nucleófilo que es capaz de reaccionar de forma covalente con un grupo electrófilo. En una realización, el compuesto inactivante de patógenos incluye un ligando de unión a ácido nucleico y un grupo funcional, tal como un grupo mostaza, que es capaz de reaccionar in situ para formar el grupo electrófilo. Los ejemplos de inactivadores incluyen, pero sin limitar, compuestos que incluyen grupos nucleófilos. Los grupos nucleófilos de ejemplo incluyen grupos tiol, tioácido, ácido ditioico, tiocarbamato, ditiocarbamato, amina, fosfato y tiofosfato. El inactivador puede ser, o contener, un heterociclo con nitrógeno tal como piridina. El inactivador puede ser un compuesto que contiene fosfato tal como glucosa-6-fosfato. El inactivador también puede ser un compuesto que contiene tiol, incluyendo, pero sin limitar, glutatión, cisteína, N-acetilcisteína, mercaptoetanol, dimercaprol, mercaptano, ácido mercaptoetanosuflónico y sales de los mismos, p. ej., MESNA, homocisteína, aminoetanotiol, dimetilaminoetanotiol, ditiotreitol y otros compuestos que contienen tiol. Los compuestos tioles aromáticos de ejemplo incluyen ácido 2-mercaptobencimidazolsulfónico, ácido 2-mercapto-nicotínico, naftalenotiol, quinolinatiol, 4nitrotiofenol y tiofenol. Otros inactivadores incluyen nitrobencilpiridina y nucleófilos inorgánicos tales como sales

selénidas u organoselénidos, tiosulfato, sulfito, sulfuro, tiofosfato, pirofosfato, hidrosulfuro y ditionitrito. El inactivador puede ser un compuesto peptídico que contiene un grupo nucleófilo. Por ejemplo, el inactivador puede ser un compuesto que contiene cisteína, por ejemplo un dipéptido tal como GlyCys , o un tripéptido, tal como glutatión.

Otros compuestos orgánicos incluyen tioglicolato de metilo, ácido tioláctico, tiofenol, 2-mercaptopiridina, 3-mercapto2-butanol, 2-mercaptobenzotiazol, ácido tiosalicíclico y ácido tioctico.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar algunas realizaciones preferidas y aspectos de la presente invención y no deben considerarse limitantes del alcance de la misma.

En la siguiente descripción experimental, se aplican las siguientes abreviaturas: eq (equivalentes); M (Molar); μM (micromolar); N (Normal); mol (moles); mmol (milimoles); μmol (micromoles); nmol (nanomoles); g (gramos); mg (miligramos); μg (microgramos); Kg (kilogramos); l (litros); ml (mililitros); μl(microlitros); cm (centímetros); mm (milímetros); μm (micrómetros); nm (nanómetros); min (minutos); s (segundos); J (Julios, también vatios por segundo); °C (grados centígrados); TLC (cromatografía de capa fina); HPLC (cromatografía de líquidos de alta presión); pHEMA y p(HEMA) (poli[metacrilato de 2-hidroxietilo]); CP (concentrado(s) de plaquetas); TP (tiempo de protrombina); TTPa (tiempo de tromboplastina parcial activada); TT (tiempo de trombina); HSR (respuesta de choque hipotónico); FDA (Administración de alimentos y medicamentos de Estados Unidos); BPF (buenas prácticas de fabricación); DMF (archivos maestros de medicamentos); SPE (extracción en fase sólida); Aldrich (Milwaukee, WI); Asahi (Asahi Medical Co., Ltd., Tokyo, Japón); Baker (J.T. Baker, Inc., Phillipsburg, NJ); Barnstead (Barnstead/Thermolyne Corp., Dubuque, IA); Becton Dickinson (Becton Dickinson Microbiology Systems; Cockeysville, MD); Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA); Cerus (Cerus Corporation; Concord, CA); Chrono-Log (Chrono-Log Corp.; Havertown, PA); Ciba-Corning (Ciba-Corning Diagnostics Corp.; Oberlin, OH); Consolidated Plastics (Consolidated Plastics Co., Twinsburg, OH); Dow (Dow Chemical Co.; Midland, MI); Eppendorf (Eppendorf North America Inc., Madison, WI); Gelman (Gelman Sciences, Ann Arbor, MI); Grace Davison (W.R. Grace & Co., Baltimore, MD); Helmer (Helmer Labs, Noblesville, IN); Hoechst Celanese (Hoechst Celanese Corp., Charlotte, NC); International Processing Corp. (Winchester, KY); Millipore (Milford, MA); NIS (Nicolet, a Thermo Spectra Co., San Diego, CA); Poretics (Livermore, CA); Purolite (Bala Cynwyd, PA) Rohm and Haas (Chauny, Francia); Saati (Stamford, CT); Scientific Polymer Products (Ontario, NY); Sigma (Sigma Chemical Company, St. Louis, MO); Spectrum (Spectrum Chemical Mfg. Corp., Gardenia, CA); Sterigenics (Corona, CA); Tetko, Inc. (Depew, NY); TosoHaas (TosoHass, Montgomeryville, PA); Wallac (Wallac Inc., Gaithersburg, MD); West Vacco (Covington, VA); YMC (YMC Inc., Wilmington, NC); DVB (divinilbenceno); LAL (lisado de amebocitos de Limulus); USP (Farmacopea de Estados Unidos); EAA (acetoacetato de etilo); EtOH (etanol); HOAc (ácido acético); W (vatios); mW (milivatios); RMN (Resonancia magnética nuclear; espectros obtenidos a temperatura ambiente en un espectrómetro de transformada de Fourier Varian Gemini 200 MHz); ft3/min (pies cúbicos por minuto); p.f. (punto de fusión); g/min y gpm (galones por minuto); UV (luz ultravioleta); THF (tetrahidrofurano); DMEM (medio Eagle modificado por Dulbecco); FBS (suero bovino fetal); LB (caldo de Luria); EDTA (ácido etilendiaminotetraacético); miristato-acetato de forbol (PMA); disolución salina tamponada con fosfato (PBS); AAMI (Asociación para el avance de la instrumentación médica); ISO (Organización internacional de normalización); UE (unidades de endotoxinas); IGV (inyectables de gran volumen); GC (cromatografía de gases); M (mega-); kGy (1000 Gray = 0,1 MRad); MΩ (Mohm); PAS III (disolución de aditivos de plaquetas III); dH2O (agua destilada); DAI (dispositivo de adsorción de inmovilización); SCD (dispositivo de conexión estéril).

Uno de los siguientes ejemplos hace referencia al tampón HEPES. Este tampón contiene 8,0 g de NaCl 137 mM, 0,2 g de KCl 2,7 mM, 0,203 g de MgCl2(6H2O) 1 mM, 1,0 g de glucosa 5,6 mM, 1,0 g de albúmina de suero bovino (BSA) 1 mg/ml (disponible en Sigma, St. Louis, MO), y 4,8 g de HEPES 20 mM (disponible en Sigma, St. Louis, MO).

Ejemplo 1

Resina fibrizada con Amberlite® XAD-16

Este ejemplo compara tanto las cinéticas de separación de aminopsoralenos de plaquetas como la función y morfología de las plaquetas usando resina fibrizada y dispositivos que contienen perlas adsorbentes no inmovilizadas. Más específicamente, se comparó la resina fibrizada que comprendía Amberlite® XAD-16 inmovilizada con dispositivos que contienen Amberlite® XAD-16 HP y Dowex® XUS-43493 libres (es decir, no inmovilizadas).

Preparación de la resina fibrizada y las perlas adsorbentes

Hoechst Celanese prepararon resina fibrizada que contenía Amberlite® XAD-16 obtenida de Rohm and Haas en un estado limpio e hidratado. Las fibras de la red de fibras de Hoechst Celanese consisten en un núcleo de poli(tereftalato de etileno) y una vaina de nailon, teniendo la vaina una temperatura de fusión menor que el núcleo. La resina fibrizada se preparó distribuyendo primero uniformemente las perlas adsorbentes en la red de fibras. Después, la red de fibras se calentó rápidamente haciendo que la vaina de polímero de las fibras se fundiera y se uniera a las perlas adsorbentes y otras fibras, formando una red de fibras reticuladas. La resina fibrizada formada contenía Amberlite® XAD-16 con una carga de 130 g/m2 (es decir, cada metro cuadrado de fibra contenía 130 g de

perlas adsorbentes).

La resina fibrizada se cortó en cuadrados (14 cm x 14 cm), y las secciones resultantes contenían aproximadamente 2,5 g de Amberlite® XAD-16 seca. Después las perlas de Amberlite® XAD-16 se mojaron previamente sumergiendo la resina fibrizada en etanol al 30% durante aproximadamente 10 min. El etanol residual después se separó lavando dos veces en disolución salina durante 10 min. Los métodos alternativos para mojar la Amberlite® XAD-16 y otros adsorbentes también son eficaces y están contemplados por la presente invención. Debe indicarse que la resina fibrizada que contiene otros tipos de perlas (p. ej., resinas con puentes o hiperreticuladas como Dowex® XUS43493) no requieren una etapa de mojado para la separación eficaz de psoralenos.

Las perlas de Amberlite® XAD-16 (alta pureza) también se obtuvieron directamente de Rohm and Haas en un estado limpio e hidratado. No fue necesario el mojado previo para las perlas de Amberlite® XAD-16 sueltas (es decir, no inmovilizadas) antes de la incorporación en una bolsa de malla; sin embargo, la masa de adsorbente se corrigió para tener en cuenta el contenido de agua de las perlas (2,5 g secas = 6,8 g con 62,8% de humedad). Las perlas Dowex® XUS-43493 se obtuvieron de Dow, y las perlas secas no requerían el mojado ni la masa de las perlas requería la corrección para el agua. Después se llenaron bolsas de malla de poliéster (7 cm x 7 cm cuadrado; aberturas de 30 μm) con 2,5 g (peso seco) de perlas sueltas de Amberlite® XAD-16 HP o Dowex® XUS-43493.

La resina fibrizada y las bolsas que contenían adsorbente se esterilizaron por tratamiento en autoclave en un ciclo "húmedo" durante 45 min a 121ºC. Después, la resina fibrizada y las bolsas que contenían adsorbente se insertaron en recipientes de plástico PL 2410 (Baxter) de 1 litro, estériles, separados. Después de la inserción, los recipientes de plástico PL 2410 se cerraron por calor en una campana de flujo laminar, usando tijeras estériles, hemostatos y un sellador por impulsos.

Contacto de la resina fibrizada y las perlas adsorbentes con concentrado de plaquetas (CP) que contiene psoraleno

Se prepararon mezclas de concentrado de plaquetas combinando 2-3 unidades de plaquetas de aféresis de un único donante en 35% de plasma autólogo/65% de disolución de aditivos de plaquetas (es decir, medio sintético). A esta disolución se le añadió 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno en una cantidad para lograr una concentración final de 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno 150 !M. El CP resultante se dividió en unidades de 300 ml, y las unidades después se pusieron en recipientes de plástico PL 2410 (Baxter) y se iluminaron con UVA 3 J/cm2. Después de la iluminación, los CP tratados se transfirieron a los recipientes de plástico PL 2410 que contenían resina fibrizada con Amberlite® XAD-16 inmovilizada, Amberlite® XAD-16 suelta o Dowex® XUS-43493 suelta, o en un recipiente de plástico PL 2410 vacío como control. Los recipientes de plástico PL 2410 (Baxter) después se pusieron en un incubador de plaquetas Helmer a 22ºC y se agitaron a aproximadamente 70 ciclos/min.

Se retiraron muestras de CP a intervalos de 1 h durante las primeras 8 h de almacenamiento para el análisis por HPLC del 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno residual. Cada muestra de CP se diluyó 5 veces con diluyente de muestra (concentración final: metanol al 35%, KH2PO4 25 mM, pH = 3,5) que contenía trimetilpsoraleno (TMP) como referencia interna. Se hicieron precipitar las proteínas y otras macromoléculas por incubación de las muestras a 4ºC durante 30 min. Después, las muestras se centrifugaron y los líquidos sobrenadantes se filtraron (0,2 !m) y se analizaron en una columna de fase inversa C-18 (YMC ODS-AM 4,6 mm x 250 mm) llevando a cabo un gradiente lineal de 65% de disolvente A (KH2PO4 25 mM, pH = 3,5), 35% de B (metanol) a 80% de B en 20 min.

Se controló diariamente el rendimiento de las plaquetas durante un periodo de almacenamiento de 5 días con la resina fibrizada o una de las perlas sueltas, mediante recuento de las plaquetas en un Baker System 9118 CP (Baker Instrument Co.; Allentown, PA). Los gases en sangre y el pH se evaluaron usando un Analizador de gases en sangre Ciba-Coming 238 pH. Se evaluó la función de las plaquetas in vitro después de 5 días de contacto con la resina fibrizada o el dispositivo que contenía adsorbentes libres, usando ensayos de la morfología, cambio de forma, respuesta de choque hipotónico, agregación y expresión de GMP-140 (p-selectina). El cambio de forma, agregación y respuesta de choque hipotónico se evaluaron usando un Lumi-agregómetro (Chrono-Log ), mientras que GMP-140 se determinó por citometría de flujo usando un analizador de fluorescencia Becton-Dickinson FACScan (Becton Dickinson).

Separación de psoraleno y rendimiento y función de plaquetas

La figura 5 compara las cinéticas de adsorción para la separación de 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno de plaquetas en 35% de plasma/65% de medio sintético (PAS III) con XUS-43493, XAD-16 HP, y resina fibrizada que contiene XAD-16. Específicamente, los datos indicados por los círculos conectados por la línea negra representan el dispositivo que contiene adsorbente XUS-43493 no inmovilizado (2,5 g de perlas; <5% de humedad); los datos indicados por triángulos conectados por la línea de trazos indican el dispositivo que contiene XAD-16 HP no inmovilizado (6,8 g de perlas; 62,8% de humedad); y los datos indicados por cuadrados conectados por la línea de trazos representan la resina fibrizada (fibras Hoechst con perlas de XAD-16 mojadas en etanol al 30%; 14 cm x 14 cm). Como indican los datos de la figura 5, las cinéticas de adsorción del 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8trimetilpsoraleno son muy comparables tanto para el dispositivo que contiene adsorbentes no inmovilizados como para el dispositivo que contiene resina fibrizada. Por lo tanto, el procedimiento de fibrización no parece que tenga un impacto significativo en las cinéticas de separación.

Además, se estudiaron el rendimiento y función de las plaquetas de la resina fibrizada comparada con las perlas sueltas. Específicamente, los experimentos de este estudio usaron 6,8 g de XAD-16 HP (62,8% de humedad); ii) 14 cm x 14 cm de XAD-16 fibrizado (130 g resina/cm2) mojado en etanol al 30%; y iii) 2,5 g de XUS-43493 (< 5% de humedad). Se prepararon unidades de plaquetas por duplicado para las muestras de XAD-16 HP y la resina fibrizada, pero solo se preparó una unidad de plaquetas individual para la muestra de XUS-43493. Los resultados se exponen en la tabla 1.

Como se indica en la tabla 1, los valores de pH y pO2 el día 5 eran ligeramente elevados con respecto al día 5 del control, para las muestras que contenían perlas no inmovilizadas (XAD-16 HP y XUS-43493). El experimento con la resina fibrizada tenía valores de pH y pO2 que eran más comparables con el control. Los recuentos de plaquetas indicaban una pérdida de plaquetas de 9-22% después de 5 días de contacto con el medio fibrizado y el dispositivo que contenía adsorbentes no inmovilizados. Como se expone en la tabla 1, la resina fibrizada dio mejores rendimientos (9% de pérdida el día 5) y se comportó mejor en todos los ensayos in vitro comparada con el dispositivo que contenía partículas de adsorbente XAD-16 o XUS-43493 no inmovilizadas.

Tabla 1

Recuento de plaquetas (1011/300 ml)

GMP-140 (%)

6,98

56 4,40 ± 0,18

6,89

80 4,21 ± 0,16 83 ± 3 297 60,6

-

6,98 110 3,65 ± 0,09 (-13,3%) 70 ± 6 278 53,8

-

-

55,8

-

6,98 115 3,27 ± 0,05 (-22,3%) 51 ± 2 271 67,0

Aunque no es necesaria una comprensión del mecanismo que subyace en los valores más altos de pH y pO2 observados para el dispositivo que contiene XUS-43493 y XAD-16 HP no inmovilizadas, para poner en práctica la invención, se cree que los valores más altos son producidos por una ligera disminución en el metabolismo de las plaquetas en presencia del dispositivo que contiene adsorbente no inmovilizado. Por comparación, el medio fibrizado dio de forma sistemática valores de pH y pO2 el día 5 que eran más comparables al control que las perlas de XUS43493 y XAD-16.

Los rendimientos de plaquetas el día 5 también eran mejores para los medios fibrizados con respecto a las perlas adsorbentes de XUS-43493 y XAD-16 HP. La pérdida de 22-28% que se observó para los medios de XUS-43493 se observó en varias ocasiones. Sin embargo, debe indicarse que la realización preferida actual para un dispositivo que contiene adsorbente no inmovilizado con XUS-43493 implica la transferencia de las plaquetas de este dispositivo después de 8 h de exposición; este procedimiento produce <5% de pérdida de plaquetas.

Los datos presentados en la tabla 1 indican que los medios fibrizados dan un rendimiento de plaquetas mayor respecto a los dispositivos que contienen adsorbentes no inmovilizados. Sorprendentemente, los medios fibrizados también dan como resultado una mejor función de las plaquetas el día 5, indicado por pH/pO2, cambio de forma, agregación, morfología y GMP-140. Aunque no es necesaria la comprensión del fundamento del comportamiento potenciado de los medios fibrizados para poner en práctica la invención, se han propuesto varias hipótesis. Primero, las fibras que están unidas a la superficie de las perlas adsorbentes pueden impedir la interacción entre las plaquetas y la superficie de las perlas. Segundo, la inmovilización de las perlas puede prevenir que las perlas interaccionen y elimina efectos mecánicos que son perjudiciales para las plaquetas. Tercero, la inmovilización de las perlas puede potenciar la cizalladura del fluido en la superficie de las perlas; por comparación, las perlas no inmovilizadas son libres para fluir con el fluido produciendo un flujo bajo de fluido con respecto a la superficie de la perla.

Pérdida de plaquetas

Cuando se revisan los datos anteriores, parece que hay cierta variabilidad en la pérdida de plaquetas de un estudio al siguiente. Sin embargo, la pérdida de plaquetas expresada como un porcentaje de los recuentos del control del día 5, es menor para los estudios en donde el recuento de plaquetas inicial es mayor. Se llevó a cabo un estudio con el fin de confirmar si el número de plaquetas que se pierde es constante para un área de material dada disponible para la adhesión de plaquetas. Para este estudio, se mezclaron dos unidades de plaquetas y la mezcla se dividió en dos muestras. Una muestra se diluyó a la mitad con 35% de plasma autólogo/65% de medio sintético (PAS) de modo que el recuento de plaquetas era la mitad de la otra unidad. Las mezclas de plaquetas se trataron con 4'-(4amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno + UVA y se pusieron en contacto con un dispositivo que contenía adsorbente no inmovilizado (2,5 g de XUS-43493) durante 5 días en las condiciones convencionales de almacenamiento de plaquetas discutidas antes.

El número total de plaquetas que se perdía era casi idéntico para las dos unidades, mientras que las pérdidas calculadas como un porcentaje diferían mucho. Por lo tanto, los resultados indican que la pérdida total de plaquetas parce que es esencialmente contante después de un periodo de tiempo; es decir, mientras que el porcentaje de pérdida de plaquetas varía con el recuento inicial de plaquetas, el número total de pérdida de plaquetas será aproximadamente constante cuando se alcanza el equilibrio. Basándose en los resultados expuestos en este ejemplo, la resina fibrizada no tiene un efecto negativo en la función de plaquetas in vivo.

Ejemplo 2

Resina fibrizada con carbón activado

Este ejemplo compara las cinéticas de separación del 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno de las plaquetas y la función y morfología de las plaquetas para resina fibrizada que comprende Amberlite® XAD-16 y para resina fibrizada que comprende carbón activado inmovilizado.

Preparación de resina fibrizada

Hoechst Celanese preparó resina fibrizada que contenía Amberlite® XAD-16 HP (Rohm and Haas). La resina fibrizada que contenía Amberlite® XAD-16 se preparó como se describe en el ejemplo precedente, incluyendo la etapa de mojado con etanol al 30%. Hoechst Celanese también preparó resina fibrizada que contenía carbón activado inmovilizado (WestVaco [(Luke, W. Va.)] con una carga de 375 g/m2 (AQF-375-B) y 500 g/m2 (AQF-500-B). En una realización preferida, las partículas adsorbentes son un carbón activado sintético, incluyendo, por ejemplo, Ambersorb y A-Supra. Se prefieren carbones activados sintéticos debido a su capacidad para eliminar la cantidad de material en partículas vertido desde el medio de adsorción inmovilizado. Esta resina fibrizada se preparó en un método análogo al de la resina fibrizada que contenía Amberlite® XAD-16. La composición de las fibras para cada resina fibrizada era la misma.

La resina fibrizada se cortó en cuadrados (14 cm x 14 cm); las secciones resultantes contenían aproximadamente 2,5 g de Amberlite® XAD-16 seco. Después, la resina fibrizada se esterilizó por tratamiento en autoclave en un ciclo "en mojado" durante 45 min a 121ºC. Después, la resina fibrizada se insertó en recipientes de plástico PL 2410 (Baxter) de 1 litro, estériles, separados, y los recipientes se cerraron por calor en una campana de flujo laminar, usando tijeras estériles, hemostatos y un sellador por impulsos.

Contacto de la resina fibrizada y con CP que contiene psoraleno

Se prepararon mezclas de concentrado de plaquetas combinando 2-3 unidades de plaquetas de aféresis de un único donante en 35% de plasma autólogo/65% de medio sintético PAS III). Se añadió 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8trimetilpsoraleno en una cantidad para lograr una concentración final de 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8trimetilpsoraleno 150 !M. El CP resultante se dividió en unidades de 300 ml, y las unidades se pusieron en recipientes de plástico PL 2410 (Baxter) y se iluminaron con UVA 3 J/cm2. Después de la iluminación, los CP tratados se transfirieron a los recipientes de plástico PL 2410 que contenían resina fibrizada con XAD-16, AQF-375-B, AQF-500-B, o en un recipiente de plástico PL 2410 vacío como control. Los recipientes de plástico PL 2410 después se pusieron en un incubador de plaquetas Helmer a 22ºC y se agitaron a aproximadamente 70 ciclos/min.

Como se hizo en el ejemplo precedente, se retiraron muestras de CP a intervalos de 1 h durante las primeras 8 h de almacenamiento para el análisis por HPLC del 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno residual. Cada muestra de CP se diluyó 5 veces con diluyente de muestra (concentración final: metanol al 35%, KH2PO4 25 mM, pH = 3,5) que contenía trimetilpsoraleno (TMP) como referencia interna. Se hicieron precipitar las proteínas y otras macromoléculas por incubación de las muestras a 4ºC durante 30 min. Después, las muestras se centrifugaron y los líquidos sobrenadantes se filtraron (0,2 !m) y se analizaron en una columna de fase inversa C-18 (YMC ODS-AM 4,6 mm x 250 mm) llevando a cabo un gradiente lineal de 65% de disolvente A (KH2PO4 25 mM, pH = 3,5), 35% de B (metanol) a 80% de B en 20 min.

Se controló diariamente el rendimiento de las plaquetas durante un periodo de almacenamiento de 5 días con la resina fibrizada o el dispositivo que contenía adsorbente no inmovilizado, mediante recuento de las plaquetas en un Baker System 9118 CP . Los gases en sangre y el pH se evaluaron usando un Analizador de gases en sangre Ciba-Coming 238 pH. Se evaluó la función de las plaquetas in vitro después de 5 días de contacto con la resina fibrizada

o el dispositivo que contenía adsorbente no inmovilizado, usando ensayos de la morfología, cambio de forma, respuesta de choque hipotónico, agregación y expresión de GMP-140 (p-selectina). El cambio de forma, agregación y respuesta de choque hipotónico se evaluaron usando un Lumi-agregómetro Chrono-Log, mientras que la GMP-140 se determinó por citometría de flujo usando un analizador de fluorescencia Becton-Dickinson FACScan.

Separación de psoraleno y rendimiento y función de las plaquetas

La figura 6 compara las cinéticas de adsorción para la separación de 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno de plaquetas en 35% de plasma/65% de medio sintético (PAS III) con resina fibrizada que contiene XAD-16, y resina fibrizada con las dos cargas diferentes de carbón activado. Específicamente, los datos indicados por los círculos representan la separación de 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno con perlas de XAD-16 fibrizada; los

datos indicados por cuadrados representan la separación con AQF-500-B fibrizada; y los datos indicados por los triángulos representan la separación con AQF-375-B fibrizada. Como indican los datos de la figura 6, las cinéticas de adsorción del 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno son muy comparables tanto para las diferentes resinas fibrizadas, y las resinas fibrizadas muestran todas cinéticas de separación muy buenas (4'-(4-amino-2-oxa)butil4,5',8-trimetilpsoraleno residual % 0,5 !M, después de 4 h).

El rendimiento de las plaquetas y la función de las plaquetas in vitro para cada una de las resinas fibrizadas también se evaluaron y los datos se resumen en la tabla 2.

Tabla 2

Agregación

59

23 90 ± 5

112

21 72 ± 8

-

117 20 - 69 ± 6

-

100 20 - 61 ± 0

-

107 20 - 65 ± 2

En relación con la tabla 2, la resina fibrizada basada en carbón dio rendimientos de plaquetas buenos con pérdidas menores de 10%; como en los estudios del ejemplo precedente, la resina fibrizada que contenía XAD-16 tenía una pérdida de plaquetas ligeramente mayor (aproximadamente 17%). En relación con el pO2, los valores el día 5 para la resina fibrizada con carbón son comparables al control. Aunque no es necesaria la comprensión de por qué la resina fibrizada con carbón tenía valores de pH ligeramente elevados, para la práctica de la presente invención, puede ser un artefacto causado por los productos extraíbles residuales (p. ej., fosfato) del proceso de activación; la subida rápida de pH (pH = 7,3-7,4) observada después de 8 h de almacenamiento del CP con la resina fibrizada basada en carbón apoya esta idea. Los experimentos con carbones USP, que se asocian con menos productos extraíbles, pueden eliminar la subida inicial observada de pH.

La resina fibrizada basada en carbón proporcionó buenos resultados en los ensayos tanto de cambio de forma como de agregación. Aunque el resultado del cambio de forma para la resina fibrizada AQF-500-B es mejor que el del control, las plaquetas asociadas con AQF-500-B se comportaron ligeramente peor en el ensayo de agregación.

Ejemplo 3

Efecto del recubrimiento de pHEMA en la hemocompatibilidad del adsorbente

Este ejemplo compara las cinéticas de separación del 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno de plaquetas y la función y morfología de las plaquetas tanto para Dowex® XUS-43493 como para resina fibrizada que contiene Amberlite® XAD-16 recubierto con pHEMA.

Preparación de perlas adsorbentes recubiertas con pHEMA y resina fibrizada

Se obtuvo Dowex® XUS-43493 (conocido en el comercio como Optipore® L493) que contenía aproximadamente 50% en peso de agua de Dow, y el HEMA polimerizado con un peso molecular promedio viscoso de 300 kD, de Scientific Polymer Products. Antes del recubrimiento, las perlas adsorbentes se secaron hasta un contenido de agua <5%. Se preparó una disolución madre de pHEMA disolviendo el polímero en 95% de etanol desnaturalizado/5% de agua para lograr una concentración de pHEMA de 50 mg/ml.

El procedimiento de recubrimiento lo realizó International Processing Corp. en una máquina recubridora de lecho fluidizado Wurster de 22,9 cm (9 inch) con una carga de aproximadamente 4 kg (secos) de adsorbente. El procedimiento de recubrimiento implicaba un caudal de pHEMA de 227,12-264,98 l/min (60-70 g/min), una temperatura de entrada de 50°C, y un caudal de aire de aproximadamente 5,66 m3/min (200 ft3/min). Se retiraron muestras (50 g) de adsorbente recubierto durante el procedimiento de recubrimiento de modo que se obtuvieran niveles de recubrimiento en el intervalo de 3-18% (p/p) de pHEMA; se usaron perlas adsorbentes recubiertas con 3,7%, 7,3%, y 10,9% de pHEMA (p/p) en los estudios descritos a continuación.

Se preparó un dispositivo que contenía Dowex® XUS-43493 (2,5 g) seco, no inmovilizado (no recubierto) y Dowex® XUS-43493 (3,0 g o 5,0 g) recubierto con pHEMA, poniendo la masa deseada del adsorbente en una bolsa cuadrada de malla de poliéter de 30 !m (7 cm x 7 cm). Las bolsas cargadas de adsorbente se insertaron en recipientes separados de plástico PL 2410 de 1 litro (Baxter), estériles, y se cerraron por calor con un sellador por impulsos. Después, los recipientes de plástico PL 2410 que contenían las bolsas cargadas de adsorbente se esterilizaron por haz de electrones (NIS) o irradiación gamma (SteriGenics) a 2,5 MRad; como se ha aludido previamente, se prefiere en general la esterilización por haz de electrones.

Hoechst Celanese preparó resina fibrizada que contenía Amberlite® XAD-16 de acuerdo con el método descrito en el ejemplo 1. La resina fibrizada se cortó en cuadrados (14 cm x 14 cm); las secciones resultantes contenían aproximadamente 2,5 g de Amberlite® XAD-16 seco. La Amberlite® XAD-16 de la resina fibrizada se mojó y recubrió con pHEMA simultáneamente mediante inmersión en una disolución que contenía pHEMA 50 mg/ml en etanol al 95%/agua destilada al 5%. El etanol residual se separó por lavado dos veces en disolución salina durante 10 min. Este procedimiento dio como resultado el recubrimiento con aproximadamente 6% (p/p) pHEMA. Después la resina fibrizada se esterilizó por tratamiento en autoclave en un ciclo "en mojado" durante 45 min a 121ºC. Después, la resina fibrizada se insertó en recipientes separados de plástico PL 2410 (Baxter) de 1 litro, estériles, y se cerraron por calor en una campana de flujo laminar, usando tijeras estériles, hemostatos y un sellador por impulsos.

Contacto de perlas adsorbentes recubiertas de pHEMA y resina fibrizada con CP que contiene psoraleno

Se prepararon mezclas de concentrado de plaquetas combinando unidades de plaquetas de aféresis de un único donante en 35% de plasma autólogo/65% de medio sintético (PAS III). Se añadió 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8trimetilpsoraleno en una cantidad para lograr una concentración final de 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8trimetilpsoraleno 150 !M. El CP resultante se dividió en unidades de 300 ml, y las unidades después se pusieron en recipientes de plástico PL 2410 (Baxter) y se iluminaron con UVA 3 J/cm2. Después de la iluminación, los CP tratados se transfirieron a los recipientes de plástico PL 2410 que contenían el dispositivo que contenía Dowex® XUS-43493 recubierto con pHEMA no inmovilizado, la resina fibrizada recubierta con pHEMA con Amberlite® XAD16, o en un recipiente de plástico PL 2410 vacío como control. Los recipientes de plástico PL 2410 (Baxter) después se pusieron en un incubador de plaquetas Helmer a 22ºC y se agitaron a aproximadamente 70 ciclos/min.

Se retiraron muestras de CP a intervalos de 1 h durante las primeras 8 h de almacenamiento para el análisis por HPLC del 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno residual. Cada muestra de CP se diluyó 5 veces con diluyente de muestra (concentración final: metanol al 35%, KH2PO4 25 mM, pH = 3,5) que contenía trimetilpsoraleno (TMP) como referencia interna. Se hicieron precipitar las proteínas y otras macromoléculas por incubación de las muestras a 4ºC durante 30 min. Después, las muestras se centrifugaron y los líquidos sobrenadantes se filtraron (0,2 !m) y se analizaron en una columna de fase inversa C-18 (YMC ODS-AM 4,6 mm x 250 mm) llevando a cabo un gradiente lineal de 65% de disolvente A (KH2PO4 25 mM, pH = 3,5), 35% de B (metanol) a 80% de B en 20 min.

Se determinó el rendimiento de las plaquetas después de un periodo de almacenamiento de 5 días con la resina fibrizada o el dispositivo que contenía adsorbente no inmovilizado, mediante recuento de las plaquetas en un Baker System 9118 CP. Los gases en sangre y el pH se evaluaron usando un Analizador de gases en sangre Ciba-Coming 238 pH. Se evaluó la función de las plaquetas in vitro después de 5 días de contacto con la resina fibrizada o el dispositivo que contenía adsorbente no inmovilizado, usando ensayos de la morfología, cambio de forma, respuesta de choque hipotónico, agregación y expresión de GMP-140 (p-selectina). El cambio de forma, agregación y respuesta de choque hipotónico se evaluaron usando un Lumi-agregómetro Chrono-Log, mientras que la GMP-140 se determinó por citometría de flujo usando un analizador de fluorescencia Becton-Dickinson FACScan.

Efecto del recubrimiento de pHEMA en la separación de psoraleno

La figura 7 compara las cinéticas de adsorción para la separación de 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno de plaquetas en 35% de plasma/65% de medio sintético (PAS III) con perlas Dowex# XUS-43493 recubiertas con pHEMA y no recubiertas. Específicamente, la separación de 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno con 3,0 g de Dowex# XUS-43493 recubierto con 3,7% (p/p) de pHEMA se representa por los círculos, con 7,3% (p/p) de pHEMA se representa por los triángulos y con 10,9% (p/p) de pHEMA se representa por los rombos; los cuadrados representan la separación de 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno con 2,5 g (secos) de Dowex# XUS43493 no recubierto. Como indican los datos de la figura 7, las cinéticas de adsorción del 4'-(4-amino-2-oxa)butil4,5',8-trimetilpsoraleno disminuían a medida que aumentaba el nivel de recubrimiento de pHEMA. Aunque no es necesario entender el mecanismo con el fin de poner en práctica la invención, se cree que esta disminución se debe a un aumento en la resistencia de la difusión del 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno al interior de las partículas adsorbentes.

Las cinéticas de adsorción de la separación de 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno también se determinaron con 5,0 g de Dowex# XUS-43493 recubierto con 3,7%, 7,3% y 10,9 % (p/p) de pHEMA. Los resultados (no se muestran) indican que las cinéticas de separación para las perlas recubiertas con 10,9% de pHEMA eran comparables a las de las perlas no recubiertas (control).

Efecto de recubrimiento con pHEMA en el rendimiento de plaquetas

El efecto del pHEMA en el rendimiento de las plaquetas se determinó en dos estudios usando diferentes cantidades de adsorbente (3,0 g y 5,0 g) pero los mismos niveles de recubrimiento de pHEMA (3,7%, 7,3% y 10 % (p/p)) en cada uno. Los rendimientos de las plaquetas se calcularon con respecto al recuento de plaquetas el día 5 para los CP tratados que no se pusieron en contacto con un dispositivo que contenía adsorbentes no inmovilizados. Como indican los resultados en la tabla 3, cuando se ensayaron 3,0 g de XUS-43493, había una respuesta a la dosis nominal en el rendimiento de plaquetas el día 5 con niveles de recubrimiento de pHEMA crecientes; esos resultados sugerían que un nivel bajo de recubrimiento de pHEMA puede ser lo más eficaz puesto que tiene un efecto menor

en las cinéticas de separación del 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno a la vez que todavía inhibe la adhesión de plaquetas a la superficie adsorbente. A diferencia del efecto nominal visto con 3,0 g de XUS-43493, se observó una respuesta a la dosis cuando se trataron 5,0 g; los niveles crecientes de recubrimiento con pHEMA no aumentaron el rendimiento de las plaquetas el día 5. Sin embargo, los rendimientos todavía eran menores que los observados cuando se usaron 3,0 g de perlas absorbentes.

Tabla 3

Recubrimiento polimérico

Nivel de recubrimiento (%) Masa de adsorbente (g) Rendimiento de plaquetas, día 5 (%)*

ninguno

0 2,5 73,1

pHEMA

3,7 3,0 91,4

pHEMA

7,3 3,0 87,7

pHEMA

10,9 3,0 89,0

pHEMA

3,7 5,0 71,8

pHEMA

7,3 5,0 80,2

pHEMA

10,9 5,0 86,6

Los resultados presentados en la tabla 3 sugieren que el uso de una masa menor de adsorbente (p. ej., 2,5 -3,0 g) junto con un nivel bajo de recubrimiento de pHEMA (p. ej., %3,0% p/p) proporcionará el mejor rendimiento de plaquetas. Como se ha indicado previamente, el nivel óptimo de recubrimiento de pHEMA es el mínimo

10 recubrimiento con el que se observa un efecto protector en el rendimiento de las plaquetas y la función de las plaquetas in vitro.

Efecto del recubrimiento de pHEMA y esterilización en la función de las plaquetas

Se ha indicado previamente, que los métodos de esterilización pueden tener un efecto sustancial en la función adsorbente puesto que el recubrimiento de pHEMA se puede reticular o escindir por la radiación. Con el fin de

15 evaluar este efecto, se llevó a cabo un estudio con dispositivos que contenían XUS-43493 no inmovilizado, recubierto con pHEMA (3,7% p/p) y no recubierto, esterilizado con haz de electrones de 2,5 MRad o irradiación gamma de 2,5 MRad. Cada dispositivo contenía 2,5 g (secos) de XUS-43493 no inmovilizado, recubierto o no recubierto, alojados en una bolsa de malla de poliéster de 30 !m (7 cm x 7 cm); el control comprendía CP tratado almacenado en un recipiente de plástico PL 2410 solo. Los resultados se resumen en la tabla 4.

20 Tabla 4

Activación de GMP-140 (%)

Control Día 0

- - - - -

70,0

XUS-43493 no recubierta

- 58,3

XUS-43493 3,7% de pHEMA Gamma

- 58,5

XUS-43493 3,7% de pHEMA haz de electrones

- 54,8

En relación con la tabla 4, parecía que los valores de pH el día 5 eran muy estables comparados con el control. El valor de pO2 medido con el dispositivo que contenía adsorbente no recubierto no inmovilizado es ligeramente elevado, sugiriendo una disminución suave en el metabolismo; el recubrimiento con pHEMA parecía reducir este efecto, con los resultados para el dispositivo esterilizado por haz de electrones que contenía adsorbente no

25 inmovilizado, más cercanos a los del control que los del dispositivo esterilizado por irradiación gamma.

Los rendimientos de plaquetas eran muy buenos para ambas muestras recubiertas con pHEMA, comportándose ligeramente mejor la muestra esterilizada por haz de electrones. El cambio de forma y la agregación presentaron un patrón similar al del rendimiento, dando el dispositivo que contenía adsorbente no recubierto no inmovilizado los valores más bajos y proporcionando la muestra esterilizada por haz de electrones/recubierta con pHEMA valores más altos similares a los del control. Las muestras tratadas con un dispositivo que contenía adsorbentes no inmovilizados se comportó tan bien o mejor que el control en el ensayo de respuesta de choque hipotónico (HSR). Las muestras que se trataron con los dispositivos que contenían adsorbentes no inmovilizados dieron menores puntuaciones en morfología que el control, pero mostraron niveles menores de activación como indica el ensayo de GMP-140.

Se llevó a cabo otro estudio de hemocompatibilidad que comparaba un dispositivo que contenía XUS-43493 no recubierta, no inmovilizada (2,5 g de perlas; bolsa de malla de poliéster de 30 !m; 7 cm x 7 cm), resina fibrizada no recubierta (14 cm x 14 cm) que contenía Amberlite® XAD-16 y resina fibrizada que contenía Amberlite® XAD-16 recubierta con pHEMA. El efecto favorable de pHEMA en la resina fibrizada se indica por los resultados presentados en la tabla 5.

Tabla 5

Activación de GMP-140 (%)

Control Día 0

- - - - -

Control Día 5

- 0,60 ± 0,09 72,5

XUS-43493 no recubierta

- 68,7

Resina con XAD-16 fibrizada no recubierta

- 65,3

Resina con XAD-16 fibrizada recubierta con pHEMA

- 63,0

Como indican los datos relacionados con la función de las plaquetas in vitro y el rendimiento de las plaquetas en la tabla 5, el recubrimiento con pHEMA llevó los valores de pO2 para la resina fibrizada más cerca de los observados para el control. La resina fibrizada recubierta con pHEMA también presentaba rendimiento de plaquetas mayor que la resina fibrizada no recubierta. Los resultados indican que la resina fibrizada recubierta con pHEMA se comportaba mejor que las perlas de XUS-43493 no recubiertas en todos los ensayos de función de las plaquetas in vitro. Además, la resina fibrizada no recubierta se comportaba mejor que las perlas de XUS-43493 no recubiertas en la mayoría de los ensayos de función de las plaquetas in vitro.

Ejemplo 4

Efecto del glicerol y polietilenglicol en la capacidad adsorbente

Este ejemplo examina el efecto del glicerol y polietilenglicol como agentes estabilizantes en la capacidad adsorbente y en las cinéticas de separación de aminopsoralenos del plasma. Se usaron perlas adsorbentes de Amberlite® XAD16 y Dowex# XUS-43493 libres (es decir no fibrizadas) en los experimentos de este ejemplo.

Metodología

Se secaron Amberlite® XAD-16 HP (Rohm & Haas (Philadelphia, PA)) y Dowex® XUS-43493 (Supelco, Bellefonte, PA) hasta < 5% de agua en un horno a 80°C. Masas conocidas de adsorbente se sumergieron en disoluciones de etanol que contenían 0-50% de glicerol, 50% de PEG-200 o 50% de PEG-400 (glicerol, PEG-200, y PEG-400 de Sigma). Después de un periodo de incubación de 15 min a temperatura ambiente, se separó el exceso de disolvente y las muestras se secaron durante la noche en un horno a 80ºC; se evitó el secado del adsorbente a temperaturas >120ºC ya que se habían observado previamente cambios en las propiedades adsorbentes (p. ej., fusión de poros) a temperaturas mayores. Después de secado, las muestras adsorbentes se pesaron para determinar la masa de agente estabilizante por masa de adsorbente.

Se llevaron a cabo varios estudios individuales. Se incluyeron en estos estudios muestras de control de adsorbente "no mojado" y de adsorbente "mojado de forma optima" como se describe a continuación. Las muestras de adsorbente no mojado eran adsorbente seco que no se había sometido a ningún tratamiento previo, mientras que las muestras de adsorbente mojado de forma óptima se prepararon mojando el adsorbente con 30% de etanol/70%

de dH2O. El adsorbente mojado de forma óptima se lavó con dH2O para separar el etanol residual. El adsorbente se preparó justo antes del estudio de adsorción para asegurar que no se producía secado.

Cada uno de los estudios de adsorción se llevó a cabo usando 100% de plasma humano que contenía 4'-(4-amino2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno con trazas añadidas de 3H-4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno. Se añadió plasma a los viales (6,0 ml) que contenían adsorbente tratado con diferentes agentes estabilizantes. Se corrigieron las masas de adsorbentes para el contenido de glicerol o PEG para dar 0,2 g de adsorbente. Los viales se pusieron en un rotador y se agitaron a temperatura ambiente. Se retiraron muestras de plasma a diferentes tiempos y se determinaron los niveles de 3H-4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno residual. Las muestras se diluyeron (200 !l) en cóctel de centelleo de líquido Optiphase HiSafe (Wallac) y se hizo el recuento en un contador de centelleo de líquidos Wallac 1409 (Wallac).

Capacidades de adsorción de Amberlite® XAD-16 y Dowex# XUS-43493 tratados con glicerol

La figura 8 compara el efecto del tratamiento previo con disoluciones de etanol que contienen diferentes niveles de glicerol con respecto a la capacidad de adsorción del 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno en plasma al 100% para Amberlite® XAD-16 y Dowex® XUS-43493. Las muestras de adsorbentes se mojaron en las disoluciones de etanol/glicerol durante 15 min antes de secado durante 48 h a 80ºC. Se hicieron mediciones individuales de la capacidad de adsorción después de 4 h. En relación con la figura 8, el contenido de glicerol mostrado en el eje x es el porcentaje de glicerol en etanol en peso/volumen. Las capacidades de adsorción mostradas en el eje y son porcentajes con respecto a la capacidad de adsorción de la muestra de adsorbente mojada de forma óptima. La capacidad de adsorción de XUS-43493 se representa por cuadrados, mientras que la de XAD-16 se representa por círculos.

Como indican los datos en la figura 8, la capacidad de XAD-16 aumentaba desde aproximadamente 30% en la muestra seca hasta más de 90% en la muestra mojada en una disolución de glicerol al 20%. Estos resultados indican que son necesarios niveles muy bajos de glicerol para mantener la alta capacidad adsorbente después de secado. Las muestras de control que se habían mojado en 50% de etanol/50% de dH2O (sin glicerol) antes de secado, demostraron capacidades de adsorción que eran similares a las muestras no tratadas que se secaron. En cambio, las muestras de XUS-43493 no mostraron ningún efecto del glicerol en la capacidad de adsorción; la capacidad de adsorción se acercaba a 100% en todos los niveles de glicerol. Aunque no es crítico para la práctica de la presente invención, esta observación apoya la hipótesis de que el glicerol actúa para prevenir que los poros de adsorbente colapsen durante el secado; debido a que XUS-43493 tiene una estructura muy reticulada, no está sometido a colapso de poros durante el secado.

Las muestras que se trataron con glicerol parecían ser muy estables al secado. No se observaron cambios en la capacidad de absorción para las muestras que se almacenaron durante 7 días en una campana de flujo laminar (no se muestran los datos).

En una realización preferida de la presente invención, se usan 2,5 g secos de adsorbente par la separación del psoraleno y fotoproductos del psoraleno de cada unidad de plaquetas. La inmersión del adsorbente en 30% de glicerol/70% de etanol, seguido de secado, produjo un adsorbente que contiene aproximadamente 50% de glicerol. Por lo tanto, una muestra de 5,0 g de adsorbente contendría 2,5 g de adsorbente seco y 2,5 g de glicerol. Por lo tanto, una unidad de 300 ml de plaquetas típica contendría 0,8% de glicerol, un nivel que se cree que es aceptable para la transfusión.

Capacidades de adsorción de Amberlite® XAD-16 y Dowex# XUS-43493 tratados con glicerol o PEG

Se llevaron a cabo estudios adicionales con los polietilenglicoles de bajo peso molecular PEG-200 y PEG-400, agentes de toxicidad baja que no son volátiles y son solubles en etanol y agua. Se trataron muestras de adsorbente durante 15 min en disoluciones de PEG-200, PEG-400 o glicerol al 50% en etanol. La figura 9 compara el efecto de los agentes estabilizantes en las capacidades de adsorción del 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno con adsorbentes secos en plasma al 100% para Amberlite® XAD-16 (inferior) y Dowex# XUS-43493 (superior); las muestras que no estaban mojadas se marcaron "No Tx". Las capacidades adsorbentes se dan como porcentajes con respecto a la capacidad del adsorbente mojado de forma óptima.

Como se indica por los datos de la figura 9 y como es predecible basándose en su estructura de "macrorred", la capacidad del Dowex# XUS-43493 no se afectaba por el secado (muestra "No Tx"). A la inversa, la Amberlite® XAD-16 tenía aproximadamente 35% de la capacidad máxima cuando está seco. El tratamiento de XAD-16 con glicerol, PEG-200 y PEG-400 mejoraron todos la capacidad del adsorbente seco; las capacidades adsorbentes con cada uno eran todas mayores de 90%, con glicerol>PEG-200>PEG-400. Aunque no es necesaria la comprensión del mecanismo de acción preciso para la práctica de la presente invención, las diferencias de capacidades entre el glicerol y las dos disoluciones de PEG pueden estar causadas por disminución de la penetración del agente estabilizante con el peso molecular creciente. Es decir, durante el procedimiento de aplicación de 15 min, el glicerol (PM = 92,1) puede ser capaz de penetrar los poros del adsorbente de forma más completa que el PEG-200 (PM = 190-210) o PEG-400 (PM = 380-420), que se difunden más lentamente debido a su tamaño mayor.

Cinéticas de adsorción de Amberlite® XAD-16 tratado con glicerol o PEG

Se llevó a cabo un estudio para determinar si el llenado de los poros del adsorbente con glicerol o PEG produce cinéticas de adsorción reducidas. La figura 10 compara la adsorción del 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8trimetilpsoraleno a lo largo de un periodo de 3 h de plasma al 100% usando Amberlite® XAD-16 en varias disoluciones diferentes. Específicamente, los datos en la figura 10 representan XAD-16 i) mojada antes de secar con una disolución de glicerol al 50% (cuadrados blancos conectados por líneas negras), ii) mojada antes de secar con una disolución de PEG-400 al 50% (círculos sombreados conectados con líneas de trazos), iii) previamente mojada, es decir, justo antes de iniciar el estudio con 50% de etanol/50% de dH2O (triángulos sombreados conectados por líneas de trazos), y iv) no sometida a ningún tratamiento (cuadrados sombreados conectados por líneas negras; "No Tx"). Los datos en la figura 10 demuestran que las muestras de Amberlite® XAD-16 que se habían mojado en disoluciones de 50% de glicerol/50% de etanol o 50% de PEG-400/50% de etanol, tenían cinéticas de adsorción que eran muy cercanas a la muestra que se había mojado de forma óptima en etanol (es decir, la muestra mojada previamente con etanol). La muestra de XAD-16 que se había secado pero no tratado (No Tx) logró solo aproximadamente 30% de separación en 3 h. Los datos presentados en este ejemplo indican que el tratamiento de Amberlite® XAD-16 con agentes estabilizantes en forma de disoluciones que contienen 50% de etanol y 50% de glicerol, PEG-200 o PEG-400 pueden prevenir la pérdida de capacidad de adsorción asociada con el secado. Los resultados obtenidos con estos agentes estabilizantes sugieren que los agentes humectantes de bajo peso molecular representan métodos viables para potenciar la función adsorbente.

Ejemplo 5

Separación del azul de metileno de PFC

Este ejemplo se dirige a la capacidad de una variedad de materiales adsorbentes poliméricos distintos para separar el azul de metileno del plasma fresco congelado.

Los experimentos de este ejemplo evaluaban la resina adsorbente "libre" (es decir, no incorporada en el dispositivo que contiene adsorbentes no inmovilizados) y resina fibrizada. Las resinas adsorbentes libres ensayadas eran Amberlite® XAD-16 HP (Rohm and Haas), MN-200 (Purolite), y Dowex® XUS-43493 (Dow Chemical Co.). La XAD16 HP venía en un estado hidratado de modo que no era necesario tratamiento previo (es decir, no mojado), y la MN-200 también se suministraba en un estado completamente hidratado; la XUS-43493 estaba seca.

La resina fibrizada que contenía XAD-16 se preparó como se describe en general en el ejemplo 1. Brevemente, primero se mojó una tira de de 2 cm x 7 cm (es decir, 14 cm2) de resina fibrizada que contenía 130 g/m2 de XAD-16, en etanol al 70% y después se lavó exhaustivamente en agua destilada.

Se preparó una disolución madre de azul de metileno (10 mM) disolviendo azul de metileno USP (Spectrum) en agua destilada. La disolución madre de azul de metileno se añadió a una muestra de plasma al 100% para dar una concentración final 10 !M. Se pesaron muestran de la resina adsorbente "libre" (es decir, XAD-16 HP, MN-200, y XUS-43493) en tubos de polipropileno de 50 ml para estudios de adsorción. El contenido de agua de cada adsorbente se determinó midiendo la pérdida de masa después de secado. La masa de cada adsorbente se corrigió para el contenido de agua de modo que se usó el equivalente de 0,25 g de adsorbente seco para cada uno.

Se añadió a cada vial una muestra de 30 ml de plasma al 100% que contenía azul de metileno 10 !M. Los viales se pusieron en un rotador a temperatura ambiente. Se retiraron muestras (200 !l) de cada vial a intervalos de 15 min y se ensayó por HPLC el azul de metileno residual. Cada muestra de plasma se diluyó 5 veces con diluyente de muestra (concentración final: metanol al 35%, KH2PO4 25 mM, pH = 3,5). Se hicieron precipitar las proteínas y otras macromoléculas por incubación de las muestras a 4ºC durante 30 min. Después, las muestras se centrifugaron y los líquidos sobrenadantes se filtraron (0,2 !m) y se analizaron en una columna de fase inversa C-18 (YMC ODS-AM 4,6 mm x 250 mm) llevando a cabo un gradiente lineal de 65% de disolvente A (KH2PO4 25 mM, pH = 3,5), 35% de B (metanol) a 80% de B en 20 min. El límite de detección para el ensayo por HPLC era aproximadamente azul de metileno 0,5 !M.

La figura 11 compara las cinéticas de adsorción de azul de metileno a lo largo de un periodo de 2 h de plasma al 100%. En relación con la figura 11, los datos de XAD-16 HP se representan por rombos blancos conectados por líneas de trazos, los datos de MN-200 se representan por triángulos sombreados conectados por líneas negras, los datos de XUS-43493 se representan por círculos blancos conectados por líneas de trazos, y la resina fibrizada que contiene XAD-16 se representa por cuadrados sombreados conectados por líneas negras. Como indican los datos, XAD-16 HP y MN-200 dieron las cinéticas de adsorción más rápidas, seguido de XUS-43493. La cinética ligeramente más lenta de XUS-43493 puede ser resultado del mojado más lento, ya que se usa en el estado seco. Finalmente, la resina fibrizada que contiene XAD-16 HP tenía la cinética de adsorción más lenta. Esto puede ser resultado del contacto peor entre la resina fibrizada y el plasma durante la incubación del lote, ya que una parte de la tira de 14 cm2 de resina fibrizada no se sumergió completamente en el plasma a lo largo de todo el estudio de adsorción, reduciendo asó el área de contacto efectiva entre el adsorbente y el plasma.

Los datos indican que compuestos que no son inactivantes de patógenos de tipo psoraleno como los colorantes de

fenotiazina se pueden separar de los hemoderivados usando las resinas y resina fibrizada contempladas para usar con la presente invención.

Ejemplo 6

Separación de compuestos de acridina de glóbulos rojos empaquetados

Este ejemplo se dirige a la capacidad de una variedad de materiales de resina diferentes para separar los compuestos de acridina de glóbulos rojos empaquetados (GRE). Más específicamente, los experimentos de este ejemplo evalúan la separación del compuesto de acridina 5-[(β-carboxietil)amino]acridina, de GRE.

En la figura 12 se representan las estructuras químicas de varias acridinas. Como se indica en la figura 12, la 12,9aminoacridina y la 5-[(β-carboxietil)amino]acridina son aminoacridinas.

Selectividad de la resina

Se estudió la adsorción en el equilibrio del compuesto 5-[(β-carboxietil)amino]acridina con varios tipos de resinas. Las resinas adsorbentes poliméricas evaluadas eran Amberlite® XAD-2, XAD-4, XAD-7 y XAD-16 HP (Rohm and Haas); Purolite® MN-150, MN-170, MN-200, MN-300, MN-400, MN-500 y MN-600; y Dowex® XUS-43493 y XUS40285 (Dow Chemical Co.). Además, se ensayaron varias resinas de intercambio aniónico Amberlite® (IRA-958, IRA-900, IRA-35, IRA-410 y IRA-120; Rohm and Haas) y una resina de intercambio catiónico débil Amberlite® (DP1; Rohm and Haas). Además, se evaluaron varios carbones, que incluían Hemosorba® AC (Asahi), PICA G277 y Norit A Supra (ambos disponibles en el comercio en American Norit). Finalmente, también se ensayó un copolímero de estireno y vinilpirrolidona, Porapak® RDx (Waters), que tenía afinidad por compuestos nitroaromáticos.

Inicialmente, se llevó a cabo un estudio de adsorción en el equilibrio con muestras de cada resina para evaluar la capacidad para la 5-[(β-carboxietil)amino]acridina y la adenina (6-aminopurina). Se pesaron aproximadamente 0,1 g de resina y se transfirieron a un tubo de polipropileno de 6 ml. Después, se añadió a cada tubo una parte alícuota de 5,0 ml de 25% de plasma/75% de Adsol# (Baxter) que contenía 5-[(β-carboxietil)amino]acridina 100 !M en agua destilada. Los productos celulares tales como los glóbulos rojos normalmente se almacenan en un medio que contiene un porcentaje de plasma bajo (10-35%) siendo el resto medio sintético; Adsol# es un ejemplo de un medio sintético que consiste en adenina, dextrosa y manitol en una disolución salina. Por supuesto, la presente invención contempla el uso de concentraciones de acridinas distintas de 100 !M en mezclas de plasma y otros medios sintéticos. Después, los tubos se pusieron en un agitador de tambor y se incubaron durante 3 h a temperatura ambiente. Después de incubación, se retiraron partes alícuotas de cada muestra para el análisis por HPLC de la 5[(β-carboxietil)amino]acridina residual.

Para el procedimiento por HPLC, cada muestra se diluyó 2 veces con diluyente de muestra (metanol al 50%, KH2PO4 25 mM, pH = 3,5) y se hicieron precipitar las proteínas y otras macromoléculas por incubación de las muestras a 4ºC durante 30 min. Después, las muestras se centrifugaron y los líquidos sobrenadantes se filtraron (0,2 !m) y se analizaron en una columna de fase inversa C-18 (YMC ODS-AM 4,6 mm x 250 mm) llevando a cabo un gradiente lineal de 75% de disolvente A (KH2PO4 25 mM, pH = 3,5), 25% de B (metanol) a 80% de B en 20 min. Para la separación de la 5-[(β-carboxietil)amino]acridina se determinaron las capacidades calculadas (!mol/g) a Cf = 1 !M a partir de mediciones de adsorción individuales con C0 = 100 !M; los resultados se presentan en la segunda columna de la tabla 6 (ND = no detectable). Para la separación de la adenina, las capacidades calucladas (!mol/g) a Cf = 1 !M se calcularon a partir de mediciones de adsorción individuales con C0 = 1,5 mM. Los resultados se presentan en la tercera columna de la tabla 6 (ND = no detectable).

Tabla 6 5

Resina

Capacidad calculada de 5-[(β-carboxietil)amino]acridina (μmol/g) a Cf = 1μM Capacidad de adenina (mmol/g) a Cf = 1 mM

XAD-2

0,1 0,00

XAD-4

3,2 0,02

XAD-7

0,1 0,01

XAD-16HP

4,3 0,03

XUS-43493

17,5 0,46

XUS-40285

6,8 0,27

MN-150

1,6 0,24

MN-170

4,2 0,43

MN-200

8,9 0,46

Resina

Capacidad calculada de 5-[(β-carboxietil)amino]acridina (μmol/g) a Cf = 1μM Capacidad de adenina (mmol/g) a Cf = 1 mM

MN-300

5,1 0,33

MN-400

4,4 0,22

MN-500

8,0 1,17

MN-600

5,8 0,36

IRA-958

0,0 0,00

IRA-900

0,0 0,01

DP-1

0,0 0,00

IRA-35

0,0 0,01

IRA-120

4,7 0,41

Hemosorba AC

ND ND

PICA G277

5,0 ND

Norit A Supra

ND ND

Porapak RDx

0,1 0,01

IRA-410-D

0,0 0,00

Aunque es contempla el uso de cualquier resina que sea capaz de adsorber compuestos de acridina, las resinas preferidas adsorben selectivamente la 5-[(β-carboxietil)amino]acridina frente a la adenina y presentan hemolisis baja. La figura 13 representa gráficamente los datos para la capacidad de la adenina (eje y) y la capacidad de la 5-[(βcarboxietil)amino]acridina (eje x) para diferentes resinas. Como indican los datos en la tabla 6 y la figura 13, las resinas Dowex® XUS-43493 y Purolite® MN-200 tenían la mayor capacidad para la 5-[(β-carboxietil)amino]acridina; además, cuando se consideraron tanto la alta capacidad para la 5-[(β-carboxietil)amino]acridina como la baja capacidad para la adenina, Amberlite® XAD-16 HP se comportó bien.

Los resultados de los experimentos in vitro descritos en este ejemplo sugieren que Dowex® XUS-43493 y la resina relacionada Purolite® MN-200 son resinas preferidas para separar compuestos de acridina de los GRE.

Ejemplo 7

Separación de compuestos de acridina de glóbulos rojos empaquetados con adsorbentes de estireno-divinilbenceno

Este ejemplo se dirige a la capacidad de una variedad de diferentes adsorbentes de estireno-divinilbenceno (estireno-DVB) para separar compuestos de aminoacridina de preparaciones de sangre. Más específicamente, los experimentos de este ejemplo evalúan la separación de naranja de acridina y 9-aminoacridina (representado en la figura 12) de una disolución de plasma/Adsol#.

A. Procedimientos experimentales

Para los experimentos de este ejemplo, se prepararon disoluciones madre (10 mM) de 5-[(βcarboxietil)amino]acridina (Cerus) y naranja de acridina (Aldrich) en agua destilada, y una disolución madre (10 mM) de 9-aminoacridina (Aldrich) en etanol. Se añadió la 5-[(β-carboxietil)amino]acridina a una disolución que contenía 25% de plasma/75% de disolución salina para lograr una concentración final 100 !M, mientras que los compuestos naranja de acridina y 9-aminoacridina se añadieron a disoluciones que contenían 25% de plasma/75% de disolución de conservación de glóbulos rojos Adsol# (Baxter) para lograr una concentración final de acridina 100 !M.

Los adsorbentes usados eran Amberlite® XAD-16 HP (Rohm and Haas); Purolite® MN-200, y Dowex® XUS-43493 (Supelco). El contenido de agua de cada absorbente se determinó midiendo la pérdida de masa tras el secado; el contenido de agua se corrigió de modo que se usó el equivalente de 0,25 g secos de cada absorbente. Los adsorbentes se pesaron con precisión en tubos Falcon de 50 ml. Se añadieron 30 ml de disolución de 25% de plasma/75% de Adsol# que contenía acridina 100 !M a cada tubo que contenía adsorbente. Los tubos después se pusieron en un rotador a temperatura ambiente, y se retiraron muestras de disolución de 500 !l en diferentes tiempos y se almacenaron para el análisis posterior.

Se analizaron en las muestras por HPLC los niveles de acridina residual. Cada muestra se diluyó 2 veces con diluyente de muestra (metanol al 50%, KH2PO4 25 mM, pH = 3,5) y se hicieron precipitar las proteínas y otras macromoléculas por incubación de las muestras a 4ºC durante 30 min. Después, las muestras se centrifugaron y los

líquidos sobrenadantes se filtraron (0,2 !m) y se analizaron en una columna de fase inversa C-18 (YMC ODS-AM 4,6 mm x 250 mm) llevando a cabo un gradiente lineal de 75% de disolvente A (KH2PO4 25 mM, pH = 3,5), 25% de B (metanol) a 80% de B en 20 min. La detección se hizo por absorbancia de luz visible usando un detector de matriz de diodos ajustado a 400 nm para la 9-aminoacridina, 490 nm para el naranja de acridina y 410 nm para la 5-[(βcarboxietil)amino]acridina.

B. Cinéticas de adsorción

Se compararon cinéticas de adsorción de la 5-[(β-carboxietil)amino]acridina a lo largo de un periodo de 3 h de 25% de plasma/75% de disolución salina para Dowex® XUS-43493, Purolite® MN-200, y Amberlite® XAD-16 HP. La figura 14A y figura 14B representan ambas la 5-[(β-carboxietil)amino]acridina residual en función del tiempo. La figura 14B presenta los datos en una escala logarítmica. En la figura 14A y la figura 14B los datos de XAD-16 HP se representan por círculos sombreados conectados por líneas de trazos, los datos de MN-200 se representan por cuadrados sombreados conectados por líneas de trazos, y los datos de XUS-43493 se representan por triángulos sombreados conectados por líneas negras. Como indican los datos, XUS-43493 y MN-200 dieron las cinéticas de adsorción más rápidas y eran casi equivalentes. La XAD-16 HP parece tener la menor capacidad para la 5-[(βcarboxietil)amino]acridina.

La figura 15 compara las cinéticas de adsorción para la separación de 9-aminoacridina y naranja de acridina de 25% de plasma/75% de Adsol# con Dowex® XUS-43493. En relación con la figura 15, los cuadrados sombreados con las líneas de trazos representan la 9-aminoacridina, y los círculos sombreados con las líneas negras representan el naranja de acridina. Como indican los datos, los niveles de 9-aminoacridina eran indetectables más allá de 3 h. En comparación, la capacidad de Dowex® XUS-43493 para el naranja de acridina era menor, lo cual puede estar relacionado con la presencia de grupos amino terciaro en el naranja de acridina.

Los resultados de este estudio demuestran la capacidad general de los adsorbentes de poliestireno-DVB para separar las acridinas de hemoderivados. Debe indicarse que las interacciones entre el agente químico (p. ej., la acridina) y la preparación de sangre que contiene células determinarán si será más eficaz un dispositivo de separación por adsorción discontinua o adsorción de flujo. Igualmente, las propiedades de hemocompatibilidad de los adsorbentes individuales influirán en la determinación de que adsorbentes son más eficaces.

Debe entenderse que la invención no está limitada a los detalles exactos de operación o compuestos, composiciones, métodos exactos, o procedimientos mostrados y descritos, ya que las modificaciones y los equivalentes serán evidentes para el experto en la técnica. A partir de lo anterior, debe quedar claro que los métodos y dispositivos se pueden incorporar con sistemas de aféresis y otros dispositivos y procedimientos usados actualmente para procesar hemoderivados para transfusión.

Ejemplo 8

Este ejemplo compara el uso diferentes tipos de carbones en polvo como el componente activo en el medio y demuestra que es necesaria una elección cuidadosa del constituyente activo para reducir la concentración de un compuesto orgánico pequeño y conservar la función biológica del fluido. Los cinco carbones activados ilustrados en el ejemplo 8 reducen la concentración del psoraleno, 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno, en plasma en aproximadamente la misma cantidad. Sin embargo, cuando se usa "A Supra" como partícula absorbente, hay una retención sustancialmente mejor de los factores de coagulación con respecto a los otros adsorbentes.

Se añadió 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno al plasma para una concentración 150 !M, y el plasma se iluminó en lotes de 325 ml con UVA 3,0 J/cm2 para inactivar los patógenos. La concentración de 4'-(4-amino-2oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno residual era aproximadamente 90 !M en la mezcla de plasma resultante. Se bombearon 325 ml de plasma iluminado a 20 ml/min a través de 5 tipos diferentes de almohadillas de carbón de 90 mm Cuno ZetaPlus. Se ensayaron los niveles de los factores de coagulación en el plasma, tiempos de coagulación y concentración de 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno antes y después del flujo a través de las almohadillas de carbón.

Calidad Cuno

% de 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8trimetilpsoraleno separado Aumento del TTP (s) I % Rendimiento VIII % Rendimiento IX % Rendimiento

R11S

99,3 4,8 91 89 80

R12S

99,4 4,9 93 89 48

R13S

99,4 6,4 88 90 42

R14S

99,3 3,4 96 85 50

A Supra

99,4 1,6 96 81 82

Especificaciones del carbón activado

Carbón activado

Carbón activado

Contenido de cenizas Activación Tratamiento especial

R11S

Mineral 14% Vapor de agua No

R12S

Lignito no determinado Vapor de agua No

R13S

Turba 8% Vapor de agua Lavado ácido

R14S

Turba 8% Ácido (H2SO4) No

A Supra

Lignito 3% Vapor de agua No

El caudal de agua para el medio R10S es 81,4 litros de agua/min/m2 (2 galones de agua/min/ft2) con una presión diferencial de 0,105 kg/cm2 (1,5 p.s.i.).

Notas: La calidad de A Supra se preparó con las mismas especificaciones que la serie R1xS; solo se cambió el carbón. TTP significa el tiempo de la tromboplastina parcial y un aumento indica la separación de factores de coagulación. I, VIII y IX se refiere a factores de coagulación particulares. Todos los valores son con respecto al tratamiento fotoquímico posterior. El 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno se ensayó por HPLC y los factores de coagulación y los tiempos se ensayaron por un analizador de coagulación automático.

Ejemplo 9

Este ejemplo compara el uso de dos tamaños de partículas y demuestra la superioridad de las partículas más pequeñas en la reducción de la concentración de compuestos orgánicos pequeños y el equilibrio con la función biológica del fluido. Un tamaño de partícula menor de 50 !m produce un aumento significativo del porcentaje de psoraleno separado del plasma con respecto al uso de un tamaño de partícula entre 100 y 50 !m: 99,2% frente a 96,1%.

El plasma con tratamiento fotoquímico se preparó de forma similar al ejemplo 8. Se prepararon filtros de tipo ZetaPlus que contenían dos tamaños de partículas diferentes de Dowex Optipore L493 molido en lugar de carbón activado en polvo de acuerdo con las especificaciones de Cuno R1xS. Se bombearon 325 ml de plasma con tratamiento fotoquímico a través de cada almohadilla a 20 ml/min. Se analizaron el 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8trimetilpsoraleno y los factores de coagulación como en el ejemplo 8.

Tamaño de partículas (μm)

% de 4'-(4-amino-2-oxa)butil4,5',8-trimetilpsoraleno separado Aumento de TTP (s) I % Rendimiento VIII % Rendimiento IX % Rendimiento

100>> 50

96,1 0,9 97 94 86

< 50

99,2 2,2 83 91 76

Ejemplo 10

Este ejemplo compara el efecto de cambiar la fracción en masa del componente activo en la reducción de la concentración de un compuesto orgánico pequeño y el equilibrio con la función biológica del fluido.

El plasma con tratamiento fotoquímico se preparó de forma similar al ejemplo 8. Se prepararon almohadillas de Supra con la carga estándar R1xS de aproximadamente 60% de carbón y un nivel de carga inferior de 30%. Se bombearon aproximadamente 230 ml de plasma a través de cada disco de 90 mm. Se analizaron el 4'-(4-amino-2oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno y los factores de coagulación como en el ejemplo 8.

Carga de A Supra (%)

% de 4'-(4-amino-2-oxa)butil4,5',8-trimetilpsoraleno separado Aumento de TTP (s) I % Retenido VIII % Retenido IX % Retenido

61,5

99,4 1,3 93 93 77

30,8

99,4 0,9 99 90 91

Ejemplo 11

Este ejemplo demuestra que en algunos casos, el tratamiento del medio con un polímero hidrófilo puede tener beneficios para la función biológica.

El plasma con tratamiento fotoquímico se preparó de forma similar al ejemplo 8. Una almohadilla R14S de 90 mm se lavó por barrido durante la noche con una disolución de poli(metacrilato de hidroxietilo) (pHEMA) 50 mg/ml en etanol al 95% y se secó en un horno a 70ºC hasta que no hubo cambio de peso adicional. La segunda almohadilla se lavó por barrido de forma similar con etanol al 95% sin pHEMA y se secó. Se bombearon 325 ml de plasma con a través

de los discos a 5 ml/min. Se analizaron el 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno y los factores de coagulación como en el ejemplo 8.

Recubrimiento

% de 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno separado Aumento de TTP (s) I % Rendimiento

Nada

99,6 4,1 98

pHEMA

99,1 2,5 103

Ejemplo 12

Este ejemplo demuestra que el caudal puede tener un efecto en la reducción de la concentración del compuesto orgánico pequeño.

El plasma con tratamiento fotoquímico se preparó de forma similar al ejemplo 8. Se prepararon almohadillas de Supra con la carga estándar R1xS de aproximadamente 60% de carbón y se bombearon 325 ml de plasma a través de cada uno de los discos de 47 mm de diámetro con tres caudales diferentes. Se analizaron el 4'-(4-amino-2oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno y los factores de coagulación como en el ejemplo 8.

Caudal (ml/min)

% de 4'-(4-amino-2-oxa)butil4,5',8-trimetilpsoraleno separado Aumento de TTP (s) I % Rendimiento VIII % Rendimiento IX % Rendimiento

10

99,0 1,3 98 83 80

15

98,8 1,5 99 85 86

20

98,7 1,4 97 89 86

Ejemplo 13

Este ejemplo demuestra cómo el volumen de fluido puede tener un efecto tanto en la reducción de la concentración del compuesto orgánico pequeño como en la actividad biológica del fluido. Se ilustra la naturaleza crítica del modo de contacto entre el fluido biológico y el dispositivo de reducción de moléculas orgánicas. Se muestra el efecto que tiene el volumen de fluido tanto en la reducción de la concentración del compuesto orgánico pequeño como en la actividad biológica del fluido. Cuando se aumenta el volumen de plasma bombeado a través del dispositivo (p. ej., se duplica), se reduce aproximadamente la misma concentración de compuestos orgánicos pequeños, por ejemplo psoralenos, de la disolución y hay un aumento significativo de la retención de factores de coagulación.

El plasma con tratamiento fotoquímico se preparó de forma similar al ejemplo 8. Se prepararon filtros de tipo ZetaPlus con Dowex Optipore L493 molido con partículas menores de 50 !m en lugar de carbón activado en polvo de acuerdo con las especificaciones de Cuno R1xS. Se bombeó el plasma a través del filtro a 20 ml/min y se cogieron muestras a los 180 ml y 325 ml. Se analizaron el 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno y los factores de coagulación como en el ejemplo 8.

Volumen de plasma (ml)

% de 4'-(4-amino-2-oxa)butil4,5',8-trimetilpsoraleno separado Aumento de TTP (s) I % Rendimiento VIII % Rendimiento IX % Rendimiento

180

99,3 4,1 74 89 66

325

99,2 2,2 83 91 76

Ejemplo 14

Este ejemplo describe el uso de un medio sinterizado

Se fabricaron discos de 90 mm de diámetro de 6,35 mm (1/4") de grosor, por Porex. Los discos contenían diferentes fracciones en peso de Dowex Optipore L493 finamente molido con tamaños de partículas entre 20 !m y 100 !m, y partículas pequeñas de polietileno de peso molecular ultraalto (calidad UF220), que después se sinterizaron juntas. El plasma con tratamiento fotoquímico se preparó de forma similar al ejemplo 8 y se bombearon 200 ml de plasma a través de cada disco a 16-18 ml/min. Se analizaron el 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno y los factores de coagulación como en el ejemplo 8.

Porcentaje en peso de adsorbente

% de 4'-(4-amino-2-oxa)butil4,5',8-trimetilpsoraleno separado Aumento de TTP (s) I % Retenido VIII % Retenido IX % Retenido

25

97,8 0,5 93 95 78

35

99,0 1,2 90 94 74

Porcentaje en peso de adsorbente

% de 4'-(4-amino-2-oxa)butil4,5',8-trimetilpsoraleno separado Aumento de TTP (s) I % Retenido VIII % Retenido IX % Retenido

50

99,3 1,2 91 80 76

Ejemplo 15

Este ejemplo describe el efecto de aumentar la masa de adsorbente aumentando el diámetro del filtro con un grosor constante.

El plasma con tratamiento fotoquímico se preparó de forma similar al ejemplo 8. Se bombearon aproximadamente 325 ml de plasma tratado a través de discos de 90 y 47 mm de diámetro de calidad R03S. Se analizaron el 4'-(4amino-2-oxa)butil-4,5',8 trimetilpsoraleno y los factores de coagulación como en el ejemplo 8.

Diámetro del disco (mm)

% de 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno separado Aumento de TTP (s) I % Retenido

47

99,4 2,1 96

90

99,6 3,5 77

Ejemplo 16

Preparación de GRE tratados con un derivado de 5-[(β-carboxietil)amino]acridina y glutatión. Se prepararon mezclas de GRE a partir de sangre entera correspondiente a ABO- reciente. Las unidades de sangre entera se centrifugaron a 3800 rpm durante 5 min usando una centrífuga Beckman Sorvall RC3B. El plasma se exprimió en otra bolsa limpia usando una prensa de exprimir. Las unidades de GRE se mezclaron en una bolsa Clintec Viaflex de 3 litros de tamaño si era necesaria más de una unidad. Para cada unidad de GRE se añadieron 94 ml de Erythrosol. El porcentaje de hematocrito (HCT) se midió llenando un tubo capilar con la muestra de sangre y centrifugándola durante 5 min. El hematocrito se determinó para asegurarse de que no disminuía por debajo de 55%. Por cada 100 ml de GRE se añadieron 3,3 ml de glucosa al 12%. Se determinó el porcentaje de hematocrito final. Los GRE (300 ml) se volvieron a cargar en recipientes de plástico PL 146 (Baxter Healthcare). Se añadieron a las bolsas de sangre 6,0 ml de glutatión 150 mM para alcanzar una concentración final 3,0 mM y 3,0 ml de un derivado de 5-[(βcarboxietil)amino]acridina 30 mM para una concentración final 300 !M. La mezcla de GRE se agitó durante 1 min usando un agitador de movimiento circular (fabricante). Los GRE tratados con derivado de 5-[(βcarboxietil)amino]acridina y glutatión se dejaron incubar a temperatura ambiente durante la noche para permitir que se rompiera el derivado de 5-[(β-carboxietil)amino]acridina en el 5-[(β-carboxietil)amino]acridina.

Ejemplo 17

Ensayo de HPLC de la 5-[(β-carboxietil)amino]acridina en los GRE y el líquido sobrenadante de los GRE. La muestra (100 !l) se diluyó con 100 !l de disolución salina y la mezcla resultante se mezcló con vórtice. Se añadieron a la disolución 300 !l de H3PO4 20 mM en CH3CN, y la mezcla se mezcló con vórtice durante 15 s. La muestra se centrifugó a 13.200 rpm durante 5 min. El líquido sobrenadante (200 !l) se diluyó en 800 !l de HCl 0,1 M frío y se mezcló con vórtice. La muestra se filtró en un vial autoinyector usando un filtro de 0,2 !m Gelman Acrodisc. Las condiciones de HPLC eran las siguientes: (Fabricante y nº de pieza para la columna y columna general) Columna = Zorbax SB-CN, 4,6 mm x 150 mm, partículas de 3,5 μm; precolumna = (4,6 mm x 12,5 mm, partículas de 5 μm (Mac Mod Analytical, Inc. (Chadds Ford, PA)); la fase móvil para A era H3PO4 10 mM en agua para HPLC; la fase móvil para C era H3PO4 10 mM en acetonitrilo; la temperatura era 20ºC; el volumen de muestra era 100 !l; las condiciones del gradiente eran las siguientes:

Tiempo

A (%) C (%) Caudal (ml/min)

0,00

90,0 10,0 1,0

5,28

77,0 23,0 1,0

10,00

40,0 60,0 1,0

11,00

90,0 10,0 1,0

16,00

Parada Parada Parada

Los ajustes del DAD eran los siguientes:

Señal

Longitud de onda de detección Ancho de banda de detección Longitud de onda de referencia Ancho de banda de referencia

A

410 5 580 20

B

260 5 580 20

Ejemplo 18

Ensayo por HPLC del glutatión en los GRE y el líquido sobrenadante de los GRE. La muestra se preparó como para el ensayo de HPLC descrito antes. Las condiciones de HPLC eran las siguientes: columna analítica YMC ODS-AM303, 250 mm x 4,6 mm, partículas de 5 μm; precolumna = Brownlee, 15 x 3,2 mm, partículas de 7 μm; la fase móvil para A era H3PO4 10 mM en agua para HPLC; la fase móvil para C era H3PO4 10 mM en acetonitrilo; la temperatura era 15ºC; el volumen de muestra era 75 !l; las condiciones del gradiente eran las siguientes:

Tiempo

A (%) C (%) Caudal (ml/min)

0,00

95,0 5,0 0,5

6,00

95,0 5,0 0,5

8,00

10,0 90,0 1,0

9,00

95,0 5,0 1,0

20,00

Parada Parada Parada

Los ajustes del DAD eran los siguientes:

Señal

Longitud de onda de detección Ancho de banda de detección Longitud de onda de referencia Ancho de banda de referencia

A

205 10 600 100

Ejemplo 19

10 Método de selección de adsorbentes. Se usó una disolución de ensayo que contenía 25% de plasma/75% de Erythrosol para representar el líquido sobrenadante de los GRE. El Erythrosol se preparó como dos partes de disolución madre separadas (disolución C y disolución D) que se esterilizaron por separado. Las disoluciones finales se prepararon mezclando volúmenes iguales de disolución C y disolución D.

Disolución C

Disolución D

Adenina 3,2 mM

Citrato Na 2 H2O 53,2 mM

Manitol 85 mM

NaH2PO4 2 H2O 5,4 mM

Glucosa 100 mM

Na2HPO4 2 H2O 38 mM

HCl 6,2 mM

Se añadió 5-[(β-carboxietil)amino]acridina a la disolución de plasma-Erythrosol a una concentración final 300 !M. Se

15 añadió glutatión (forma reducida, Sigma Chemical Co.) a la mezcla para obtener una concentración final 3 mM. Se pesaron con precisión (&0,001 g) muestras de adsorbente (0,2-0,8 g) en viales de polipropileno de 7 ml tarados con tapones de rosca. Las muestras de adsorbentes que requerían el mojado previo se suspendieron en etanol al 70%. Se dejó que el adsorbente se depositaria y se separó el líquido sobrenadante. El etanol residual se separó volviendo a suspender el adsorbente en agua destilada, dejando que se depositara el adsorbente y decantando el líquido

20 sobrenadante. Las masas de adsorbentes se corrigieron para el contenido de agua cuando se calcularon las capacidades de adsorción. Se añadieron a cada tubo partes alícuotas de 5 ml de plasma/Erythrosol. Los tubos se pusieron en un rotador y se voltearon a temperatura ambiente durante 24 h. Los viales se retiraron del rotador y se dejó que se depositara el adsorbente. Se separó una muestra de líquido sobrenadante de cada tubo. Las muestras se centrifugaron para separar el adsorbente residual. Las muestras se analizaron por HPLC para determinar los

25 niveles residuales de 5-[(β-carboxietil)amino]acridina. El ensayo de fase inversa descrito antes se usó para determinar los niveles residuales de glutatión. Los resultados de la selección de adsorbente se muestran en las tablas 7 y 8.

Tabla 7 Selección de adsorbente - Separación de 5-[(β-carboxietil)amino]acridina de 25% de plasma/75% de Erythrosol

Adsorbente

Química Masa corregida (g) ¿Requiere mojado? Acridina final Cf (!M) Capacidad (!mol/g) K calculado (l/g)

Purolite MN-150

PS-DVB base débil 0,108 No 1,4 13,5 9,7

Purolite MN-I70

PS-DVB base débil 0,105 No 0,4 14,0 38,4

Purolite MN-200

PS-DVB No funcional. 0,077 No 0,9 19,1 21,5

Purolite MN-300

PS-DVB base débil 0,111 No 1,0 13,2 13,4

Purolite MN-400

PS-DVB base fuerte 0,102 No 1,1 14,3 13,0

Purolite MN-500

PS-DVB ácido fuerte 0,098 No 0,6 15,0 24,2

Purolite MN-600

PS-DVB ácido débil 0,112 No 0,8 13,1 16,7

Dowex Optipore L-493

PS-DVB No funcional. 46 A, 1100 m2/g 0,189 No 0,3 7,8 22,5

Dowex Optipore L- 2S5

PS-DVB base débil, 25 A, 800 m2/g 0,245 No 0,5 6,0 11,2

Amberlite XAD-2

PS-DVB No funcional. 90 A, 300 m2/g 0,190 Si 117,5 4,7 0,0

Amberlite XAD-4

PS-DVB No funcional. 40 A, 725 m2/g 0,118 Si 1,6 12,4 7,7

Amberlite XAD-7

Poli(éster acrílico) 90 A, 450 m2/g 0,097 Si 117,4 9,1 0,1

Amberlite XAD-16

Poliestireno No funcional. 100 A, 800 m2/g 0,101 Si 44,1 12,4 0,3

Hemosorba AC

Carbón activado recubierto con pHEMA 0,149 No LD > 9,8 > I96,8

Duolite GT-73

Macrorreticular que contiene tiol 0,144 No 1,0 10,2 10,2

Kieselguhr

Tierra de diatomeas 0,131 No 317,7 -0,9 0,0

Graver GL-711

XUS-43493 molido unido a fibra 0,134 No 1,9 10,9 5,8

Amberlite IRA 900

PS macroreticular am. cuat., forma Cl 0,067 No 239,1 4,1 0,0

Amberlite IRA 35

PS modificado con base débil 0,076 No 223,7 4,6 0,0

Amberlite IRA 410 D

PS gel base fuerte forma CI 0,086 No 127,2 9,7 0,1

Amberlite IRA 958

Poliestireno macroreticular Quat. Am. forma Cl 0,084 No 304,9 -0,6 0,0

Amberlite DP-1

PS macrorreticular carboxílico 0,066 No 292,8 0,1 0,0

Amberlite IR-120

PS gel de ácido sulfónico forma H 0,079 No 1,4 18,6 13,1

Adsorbente

Química Masa corregida (g) ¿Requiere mojado? Acridina final Cf (!M) Capacidad (!mol/g) K calculado (l/g)

Diaion HPA 75

PS muy poroso alquilamina cuat. 0 091 No 97,2 10,8 0,1

Duolite S-761

PS modificado con fenolformaldehído 0,093 No 1,8 15,8 8,6

Duolite A-7

PS macrorreticular poliamina, base libre 0,079 Mo 189,0 6,6 0,0

Amberlite IRA-68

PS gel poliamina 0,083 No 203,4 5,5 0,0

Amberlite IRA-458

PS gel amina cuat. forma Cl 0,148 No 292,8 0,0 0,0

Amberlite IRA-958

PS macrorreticular amina cuat., forma Cl 0,139 No 296, 3 -0,1 0,0

Ambersorb 563

CA sintético, 550 m2/g, hidrofobicidad alta 0,228 No 0,4 6,4 17,5

Ambersorb 572

CA sintético, 1100 m2/g, hidrofobicidad baja 0,267 No LD > 5,5 > 55,0

Ambersorb 575

CA sintético, 800 m2/g, hidrofobicidad media 0,258 No LD > 5,7 > 56,9

PICA G277 AC

Carbón activado 0,283 No LD >5,2 >51,9

PICA NC506 AC

Carbón activado 0,266 No LD > 5,5 > 55,3

PICAtif Med. AC

Carbón activado 0,280 No LD > 5,3 > 52,5

West VACO CX-S

Carbón activado 0,228 No LD >6,4 > 64,4

Norit ASupra

Carbón activado 0,268 No LD > 5,5 > 54,8

Norti B Supra

Carbón activado 0,258 No LD > 5,7 > 56,9

Norit Supra E

Carbón activado 0,266 No LD > 5,5 > 55,2

Norit S5 1 AC

Carbón activado 0,237 No LD > 6,2 >61,9

Norit SX Ultra

Carbón activado 0,203 No LD > 7,2 > 72,2

Chemviron

Carbón activado 0,233 No LD >6,3 > 63,1

Norit CN1

Carbón activado 0,261 No LD > 5,6 > 56,4

Norit G60

Carbón activado 0,230 No LD >6,4 > 64,0

Norit ROX,0.8

Carbón activado 0,246 No LD >6,0 > 59,8

Norti Darco (20x50)

Carbón activado 0,219 No LD >6,7 >67,3

PICAtif Medicinal

Carbón activado 0,129 No LD > 11,4 > 113,8

Davison Silica Grade 15

Sílice no modificada 0,245 No 77,0 4,4 0,1

Davison Silica Grade 636

Sílice no modificada 0,255 No 140,1 3 0 0,0

BioRad AG501- X3(D)

Intercambio iónico lecho mixto 0,083 No 119,4 10,5 0,1

Amberlite 200

PS macrorret. ácido sulfónico, forma Na 0,080 No 46,5 15,5 0,3

MP-3 (C-18) SPE media

Resina C-18 sulfonada 0,230 Si 1,7 6,1 3,7

Adsorbente

Química Masa corregida (g) ¿Requiere mojado? Acridina final Cf (!M) Capacidad (!mol/g) K calculado (l/g)

Alltech C-18 SPE

Sílice modificada C-18 0 234 Si 64,4 4,9 0,1

BioRad 1-Butyl H1C

Polimetacrilato modificado C-4 0,213 Si 163,9 3,1 0,0

Baker C-18 SPE

Sílice modificada C-18 0263 Si 94,9 3,8 0,0

Waters Sep Pak C-13

Sílice modificada C-18 0,190 Si 81,3 5,6 0,1

Baker C-4 SPE

Sílice modificada C-4 0,232 Si 178,3 2,5 0,0

Waters Bondapak C-8

Sílice modificada C-8 0,213 Si 156,9 3,2 0,0

Waters Bondapak C-4

Sílice modificada C-4 0,228 Si 251,0 0,9 0,0

Amberchrom cg-161 xcd

Poliestireno 150 A, 900 m2/g 0,192 Si 79,3 5,6 0,1

Amberchrom cg-1000 sd

Poliestireno 1000 A, 250 m2/g 0,176 Si 243,7 1,4 0,0

Amberchrom cg-300 md

Poliestireno 300 A, 700 m2/g 0,135 Si 172,1 4,5 0,0

Amberchrom cg-71 md

Polimetacrilato 250 A, 500 m2/g 0,189 Si 156,4 3,6 0,0

Waters Porapak RDx

PS-vinilpirrolidona adsorbente poroso 0,125 Si 307,8 -0,6 0,0

CUNO Delipid Media

Resina -modificada con celulosa 0,663 No 245,8 0,4 0,0

CUNO DEAE media

Celulosa modificada con base débil 0,361 No 280,8 0,2 0,0

Sigma DE

Tierra de diatomeas 0,179 No 317,6 -0,7 0,0

Diaion SP-850

Poliestireno 38 A, 1000 m2/g 0,236 Si 1,4 6,2 4,4

Diaion SP-207

PS bromado 105 A, 650 m2/g 0,191 No 211,1 2,2 0,0

Diaion HP-2MG

Polimetacrilato 170 A, 500 m2/g 0,258 Si 182,6 2,2 0,0

Diaion HP-20

Poliestireno 260 A, 500 m2/g 0,175 Si 107,4 5,3 0,0

Amberlite 1180

Poliestireno-DVB 300 A, 600 m2/g 0,094 Si 9,9 15,1 1,5

Amberlite 1600

Poliestireno-DVB 0,208 Si 73,0 5,3 0,1

Amberlite XAD- 2000

Poliestireno-DVB 42 A, 580 m2/g 0,172 Si 61,0 6,8 0,1

Amberlite XAD- 2010

Poliestireno-DVB 280 A, 660 m2/g 0,203 Si 173,0 3,0 0,0

Dowex XUS- 40323

Poliestireno-DVB 100 A, 650 m2/g 0,213 Si 102,6 4,5 0,0

Whatman DE-52

Celulosa modificada con base débil 0,284 No 177,5 2,0 0,0

Whatman CM-32

Celulosa modificada con ácido débil 0,294 No 268,7 0,4 0,0

Adsorbente

Química Masa corregida (g) ¿Requiere mojado? Acridina final Cf (!M) Capacidad (!mol/g) K calculado (l/g)

Whatman QA-52

Celulosa modificada con base fuerte 0,264 No 285,2 0,2 0,0

Whatman SE-S3

Celulosa modificada con ácido fuerte 0,238 No 294,3 0,0 0,0

Pharmacia Q Seph FF

Agarosa modificada con base fuerte 0,111 No 267,8 1,2 0,0

Pharmacia S Seph FF

Agarosa modificada con ácido fuerte 0,112 No 267,0 1,2 0,0

Toyopearl QAE-550 C

Agarosa modificada con base débil 0,118 No 266,8 1,2 0,0

Toyopearl Butyl 650-M

Metacrilato modoficado (C-4) hidrófobo 0,112 Si 232,8 2,7 0,0

Toyopearl SP-550C

Metacrilato modificado con ácido fuerte 0,111 No 230,2 2,9 0,0

Toyopearl CM-650M

Metacrilato modificado con ácido débil 0,118 No 249,0 1,9 0,0

Toyopearl DEAE-650M

Metacrilato modificado con base débil 0,112 No 260,4 1,5 0,0

Toyopearl Super Q 650C

Metacrilato modificado con base fuerte 1,111 No 263,2 1,4 3,0

Tabla 8 Selección de adsorbente - Separación de glutatión de 25% de plasma/75% de Erythrosol

Capacidad calculada en Cf = 30 !M (!mol/g)

-

0,4

-

2732 0,1

-

3147 -0,1

-

2520 0,3

-

2099 0,6

-

0,1

-

2773 0,1

3027

0,0

1778

0,4

-

2973 0,0

-

3172 -0,1

-

3165 -0,1

-

2912 0,0

56

53,3

2680

0,1

3330

- -0,1

Capacidad calculada en Cf = 30 !M (!mol/g)

3294

- -0,1

3116

-0,1

3069

0,0

2918

0,0

3152

-0,1

-

3061 0,0

2745

0,2

3160

-0,1

-

2211 06

-

3024 0,0

-

2906 0,0

-

3138 -0,1

-

3133 -0,1

-

3254 -0,1

-

3012 0,0

3075

0,0

LD

>167,9

LD

>173,8

LD

>158,4

LD

>168,7

LD

>160,4

LD

>196,5

LD

>167,2

LD

>173,7

LD

>168,5

LD

>189,0

>220,5

LD

>192,6

LD

>172,1

LD

>195,4

LD

>182,4

>205,3

LD

>347,4

3171

0,0

3133

0,0

0,0

3148

-0,1

Capacidad calculada en Cf = 30 !M (!mol/g)

3237

- -0,1

-

3419 -0,I

-

3022 0,0

-

2983 0,0

-

3036 0,0

-

2865 0,0

-

2761 0,1

-

2931 0,0

-

2639 0,1

-

2799 0,1

-

2800 0,1

3179

-0,1

3197

0,0

1510

0,4

3348

-0,1

-

2996 0,0

-

3332 -0,1

-

3036 0,0

-

2984 0,0

3120

-0,1

3014

0,0

-

2879 0,0

-

2988 0,0

2633

0,1

-

2718 0,1

-

3637 - -0,1

0,0

-

3236 0,0

2668

0,2

2759

0,1

2792

0,1

0,2

-

2856 0,1

-

2784 0,1

-

2772 0 1

2717

0,1

Ejemplo 20

Capacidades de adsorción de los adsorbentes. Se llevaron a cabo experimentos de isotermas de adsorción para determinar las capacidades de adsorción (!mol de 5-[(β-carboxietil)amino]acridina/g de adsorbente) de los diferentes tipos de adsorbentes. La figura 17 muestra las isotermas de adsorción obtenidas para Ambersorbs comparado con la isoterma de adsorción para Purolite MN-200. Los estudios de adsorción se llevaron a cabo en disoluciones de 25% de plasma/75% de Erythrosol que contenían 5-[(β-carboxietil)amino]acridina 0,2-3 mM y GSH 0,6-10 mM. Las muestras se agitaron durante 24 h a temperatura ambiente. Los cálculos usando la capacidad de adsorción de la tabla 7 (22 !mol/g) determinaron que serían necesarios aproximadamente 4 g de Purolite MN-200 para reducir el nivel de 5-[(β-carboxietil)amino]acridina en una unidad de 300 ml de GRE de 300 !M a un nivel final de 1 !M. Sería necesario menos de 1 g de Ambersorb 572 (130 !mol/g) para lograr una separación comparable. Un calculó similar estimó que sería necesario menos de 1 g de Ambersorb 572 para reducir el nivel de GSH en una unidad de 300 ml de GRE de 6 mM a un nivel final de 500 !M en 150 ml de líquido sobrenadante (HCT 50%).

Ejemplo 21

Estudios de flujo usando varias formas de medios de carbón activado

Se llevaron a cabo experimentos para investigar la separación de 5-[(β-carboxietil)amino]acridina y GSH de GRE usando un dispositivo de flujo. Se dosificó en los GRE (Erythrosol, glucosa, HCT 63%) un derivado de 5-[(βcarboxietil)amino]acridina degradable 300 !M y GSH 3 mM, y se mantuvo a temperatura ambiente sin agitación durante 20 h antes de fluir a través de los dispositivos. El medio del dispositivo de flujo de adsorción de compuestos consistía en diferentes formas de carbón activado, como un disco de carbón/celulosa compuesto, o un fieltro de fibra de carbón. El medio se cerró en una carcasa de policarbonato de 90 mm de diámetro (Cuno, Meridien, CT). Los GRE dosificados se bombearon (Gilson Minipuls, Middleton, WI) a través de los medios con un caudal de 5 ml/min, y se recogieron en un envase de plástico PL146 (Baxter Healthcare). Los resultados de este estudio se muestran en la tabla 9.

Tabla 9. Resultados del estudio de flujo usando diferentes medios de carbón activado

% de hemolisis

4,83

-

7,56

-

5,15

5,19

5,27

7,17

--

1,27

1,78

1,06

-

1,37

1,18

-

-

1,11

Ejemplo 22

Dispositivos de flujo de adsorción de compuestos (medio CUNO) frente a dispositivos discontinuos de adsorción de compuestos (medio AQF). Se llevaron a cabo estudios que comparaban la separación de 5-[(βcarboxietil)amino]acridina y GSH en dispositivos de adsorción de compuestos de flujo frente a discontinuos. El dispositivo de flujo consistía en un disco de celulosa/carbón Norit A Supra (Norit Americas, Inc. (Atlanta, GA)) encerrado en una carcasa de 90 mm. Había dos dispositivos discontinuos separados: uno consistía en carbón activado Pica G277 fibrizado (AQF 500 g/m2); el otro consistía en Purolite MN-200 fibrizada (AQF 312 g/m2). Después de dosificar un derivado de 5-[(β-carboxietil)amino]acridina degradable 300 !M y GSH 3 mM, los GRE se bombearon a través del medio de celulosa/carbón con un caudal de 2 ml/min, después de lo cual los niveles de 5[(β-carboxietil)amino]acridina y GSH cayeron 75 y 88%, respectivamente, a 24 !M y 0,71 mM en el líquido sobrenadante de los GRE. Después los GRE expuestos al dispositivo de flujo se transfirieron al dispositivo discontinuo de 6 g de MN-200, que disminuyó los niveles de 5-[(β-carboxietil)amino]acridina y GSH un 5 y 1%

adicionales, llegando a 20 !M y 0,67 mM a lo largo de 24 h. La exposición de los GRE solo a un dispositivo discontinuo con 7 g de Pica G277 dio una caída de los niveles de 5-[(β-carboxietil)amino]acridina y GSH de 92 y 54% a concentraciones 8 !M y 3 mM. Por lo tanto, un paso por el dispositivo de flujo era más eficaz para separar el GSH que la exposición al dispositivo discontinuo durante 24 h. Sin embargo, el dispositivo discontinuo solo, era más eficaz para separar la 5-[(β-carboxietil)amino]acridina que los dispositivo de flujo y MN-200 combinados. No parecía que el flujo a través del dispositivo tuviera un efecto adverso en la concentración de ATP de los GRE. Los niveles de K+ de los GRE eran inferiores después de la exposición al dispositivo de flujo comparado con una exposición al dispositivo discontinuo con carbón de 24 h.

Ejemplo 23

Separación a largo plazo de productos de rotura

Este experimentó examinaba los niveles de 5-[(β-carboxietil)amino]acridina y GSH en GRE de los cuales se había retirado un dispositivo de carbón activado PICA G-277 fibrizado (AQF, 7,3 g, 500 m2/g) después de 24 h de exposición. Este estudio se llevó a cabo en paralelo con estudios en donde los GRE se expusieron de forma continua al dispositivo. La figura 18 muestra que las concentraciones de 5-[(β-carboxietil)amino]acridina y GSH en las muestras de líquido sobrenadante eran considerablemente más altas en ausencia de un dispositivo a lo largo de tiempos de almacenamiento de 1 a 4 semanas.

La concentración de 5-[(β-carboxietil)amino]acridina se redujo a 5 !M en los GRE agitados inicialmente después de 35 días de almacenamiento en presencia de un dispositivo de separación (MN-200). Esto indica que la separación de la 5-[(β-carboxietil)amino]acridina no se produce en condiciones de almacenamiento estáticas de 4ºC.

Ejemplo 24

Efecto del material del cerramiento (membrana, tejido, no tejido) en un DAI

Se investigó el uso de un material de cerramiento que rodea el medio adsorbente con el propósito principal de retención de las partículas. El propósito principal es la retención de las partículas. Sin embargo, las membranas pueden potenciar la hemocompatibilidad de los dispositivos previniendo el contacto entre los GRE y las membranas. Las membranas se pueden modificar fácilmente con polímeros hidrófilos (PEO, PEG, HPL) para potenciar la hemocompatibilidad sin alterar la función. Se rodearon aproximadamente 10 g de medio de carbón activado PICA G277 fibrizado (AQF, 500 m2/g) por un material de membrana, poliéster tejido o poliéster no tejido cerrada por calor. Se dosificó en las unidades de GRE (300 ml) un derivado de 5-[(β-carboxietil)amino]acridina degradable 300 !M y GSH 3 mM, se mantuvieron a temperatura ambiente durante 20 h en un oscilador de plaquetas y después se transfirieron a los DAI. La concentración de 5-[(β-carboxietil)amino]acridina se siguió durante 24 h. La figura 19 muestra los niveles de 5-[(β-carboxietil)amino]acridina en el líquido sobrenadante de unidades de GRE de 300 ml expuestas a los DAI que consistían en carbón activado PICA G-277 fibrizado (500 m2/g) y encerrado por un material de membrana, tejido o no tejido. Se dosificó en los GRE (Erythrosol, glucosa HCT 62%) un derivado de 5-[(βcarboxietil)amino]acridina degradable 300 !M y GSH 3 mM, y se agitó en un oscilador de plaquetas a temperatura ambiente antes de la transferencia a los DAI. Los DAI que contenían GRE se agitaron a temperatura ambiente durante 24 h.

Estos estudios indican que el cerramiento con tejido Tetko muestra la cinética de separación más rápida para la 5[(β-carboxietil)amino]acridina a lo largo de 24 h. Los niveles finales logrados para todos los materiales de cerramiento después de 2 semanas eran similares, con concentraciones de 5-[(β-carboxietil)amino]acridina que disminuían a aproximadamente 2 !M después de 1 día, pero volviendo a subir a 10 !M cerca del día 8.

Ejemplo 25

Efecto del dispositivo de adsorción de compuestos en la función de los glóbulos rojos

Se controlaron los indicadores de la función de los glóbulos rojos a lo largo de los experimentos de separación de 5[(β-carboxietil)amino]acridina y GSH para diferentes configuraciones de dispositivos. Los parámetros medidos incluían porcentaje de lisis, ATP y concentraciones de K+. La tabla 10 muestra que las concentraciones de ATP en general no se afectaron por la presencia de un dispositivo de adsorción de compuestos: La disminución de las concentraciones de ATP era aproximadamente igual para el control (sin DAI) que para los dispositivos de MN-200 o Pica G277. Se encontró que los niveles de K+ en los GRE aumentaban con el tiempo. La temperatura a la que se producía la separación no influía en los niveles de K+ en las unidades de GRE expuestas a dispositivos de separación de compuestos a lo largo de 20 días. Sin embargo, cuando el periodo de tiempo de exposición se prolongó a 35 días, la tasa de aumento de K+ en los GRE variaba con el tipo de adsorbente, con niveles finales alcanzados de 40 y 45 mmol/l para los dispositivos de MN-200 y Pica G277, respectivamente, comparado con el control sin dispositivo de 39 mmol/l. Se encontró que el porcentaje de glóbulos rojos lisados en las unidades de GRE expuestas a dispositivos y de control sin dispositivo, en general era entre 0,1 y 1% después de 24 h. Como se muestra en la tabla 11 y tabla 12 y se representa gráficamente en las figuras 20 y 21, el % de lisis variaba significativamente con el tipo de adsorbente usado. La tabla 11 muestra los valores de lisis obtenidos para los GRE

expuestos a dos tipos de dispositivos de adsorción inmovilizados a lo largo de 35 días. La tabla 12 muestra los

valores de lisis obtenidos para los GRE expuestos a partículas adsorbentes sueltas encerradas en una malla de

poliéster tejido a lo largo de 42 días. Se usó un agitador de movimiento circular en la dosificación de todas las

unidades de GRE durante 1 min, después de lo cual los GRE estuvieron en condiciones estáticas durante 4 h a

5 temperatura ambiente. Los dispositivos se mantuvieron a temperatura ambiente durante 24 h en un oscilador de

plaquetas, después de lo cual estuvieron en condiciones estáticas a 4ºC durante la duración del estudio. MN-200

inmovilizada mostró menores niveles de hemolisis que PICA G-277 inmovilizado, mientras que el adsorbente

carbonoso sintético Ambersorb mostró uno de los niveles de hemolisis más bajos tras la comparación de los

adsorbentes de partículas sueltas. El DAI de MN-200 mostró menor hemolisis que el mismo adsorbente no 10 inmovilizado. Se hicieron observaciones similares para otros DAI comparados con el mismo adsorbente no

inmovilizado.

Tabla 10. Concentración de ATP (!mol/dl) en GRE a lo largo del tiempo

Tiempo

- DAI PICA G277

0 h

79

4 h

82

8 h

81

24 h

86

8 días

78

22 días

50

35 días

28

Tabla 11. Porcentaje de lisis en GRE (HCT 56%) expuestos a diferentes DAI a lo largo del tiempo

Tiempo

- DAI PICA G277

0 h

0,13

4 h

0,37

8 h

0,53

24 h

0,62

8 días

0,67

22 días

0,77

35 días

0,89

Tabla 12: Porcentaje de lisis en GRE (HCT 56%) expuestos a diferentes adsorbentes de partículas sueltas encerradas en malla tejida

Purolite MN-200

- Pica G277

0,07 0,09 0,17 0,39 0,48 0,59 0,60 0,78 1,08

0,07 0,13 0,18 0,92 0,40 0,57 0,74 1,05 1,60

Se ilustra la naturaleza crítica de la partícula de adsorbente con respecto al mantenimiento de la función de los glóbulos rojos. Se presenta un estudio comparativo de los efectos de 5 adsorbentes diferentes en la hemolisis de glóbulos rojos. Ambesorb 572 produjo solo 0,16% de lisis en los GRE (55%) después de 24 h de exposición, mientras que Darco AC (Norit Americas, Inc. (Atlanta. GA) produjo 0,13% de lisis. Estos adsorbentes eran

significativamente mejores en la minimización de la hemolisis de los glóbulos rojos que los adsorbentes Purolite MN

200. Hemosorba CH-350 y Pica G277.

La tabla 13 muestra un estudio comparativo donde líquidos sobrenadantes de muestras de glóbulos rojos que contenían glutatión y 5-[(β-carboxietil)amino]acridina se pusieron en contacto con una serie de adsorbentes diferentes. Los adsorbentes de carbón activado eran el único tipo de adsorbente capaz de reducir sustancialmente la concentración tanto de 5-[(β-carboxietil)amino]acridina como de glutatión. Tanto los carbones activados naturales (Norit y PICA) como los carbones activados sintéticos (Ambesorb) probaron ser eficaces en la reducción de compuesto.

Tabla 13. Propiedades de diferentes adsorbentes

Cap.^ acridina (!mol/g) Cf = 1 !M

-

-

17+

22*

10*

560+

-

>53*

-

> 60*

-

134+

-

> 52*

@ PS-DVB = poliestireno-divinilbenceno, CA = carbón activado ^Valores listados como ">" eran mediciones individuales con niveles residuales inferiores al límite de detección del ensayo *Calculado a partir de estudios de adsorción de un solo punto en 25% de plasma, 75% de Erythrosol +Calculado a partir de isotermas de adsorción de múltiples puntos en 25% de plasma, 75% de Erythrosol

10 Ejemplo 26

Este ejemplo describe el comportamiento típico de un dispositivo adsorbente inmovilizado en un modo de flujo en plasma, usando medios adsorbentes compuestos de 30% de carbón Norit A Supra (Norit Americas, Atlanta, GA) y fabricado por Cuno (Meriden, CT) previamente descrito en un ejemplo anterior.

Los DAI se montaron usando medio R10SP impregnado con 30% de Norit A Supra Cuno de 90 mm en serie con 15 membrana de polisulfona recubierta de hidroxipropilcelulosa Memtec de 90 mm de diámetro con poros de 5 !m.

Para completar la fabricación desechable, se acopló una bolsa LPL2410 a un tubo de 3,18 mm (1/8") de DO y después el tubo se unió a la salida del DAI de modo que la distancia de la línea media del DAI a la bolsa fuera 40 cm. Se unió un tubo del mismo tamaño a la entrada del SRD de modo que cuando la bolsa de iluminación se acopla al mismo, la distancia de la línea media a la bolsa sería 30 cm.

20 Se añadió 5-[(β-carboxietil)amino]acridina a 500 ml de plasma a una concentración final de aproximadamente 150 !M, y el plasma se iluminó con UVA 6,3 J/cm2 para inactivar patógenos. La concentración de 5-[(βcarboxietil)amino]acridina después de iluminación era 82 !M.

La tabla 14 muestra mediciones de la actividad del factor de coagulación y los niveles de 5-[(βcarboxietil)amino]acridina después de haber sido tratados por el DAI con respecto a los valores antes de pasar por el

DAI. El experimento se repitió 3 veces. Se dan las medias y las desviaciones típicas. El tiempo de tratamiento promediado era 14 min. Es evidente que casi no han cambio en los factores I, II, V, VII, X o las mediciones de actividad de coagulación de agregados, el tiempo de la protrombina (TP) y tiempo de tromboplastina parcial activada (TTPa) y cambios muy pequeños en los factores XI y XII. Los factores VIII y IX muestran cambios algo mayores, pero estos son aceptables, en especial a la luz de la prescripción de proteínas recombinantes por su deficiencia. La naturaleza muy selectiva del dispositivo debería notarse en que retiene prácticamente toda la actividad coagulante mientras que permite que pase a su través 0,9% de 5-[(β-carboxietil)amino]acridina.

Tabla 14

PT(s)

0,0 ± 0,1

aPTT(s)

0,7 ± 0,1

I (%)

98 ± 2

II (%)

99 ± 1

V(%)

101 ± 2

VII(%)

99 ± 2

VIII (%)

86 ± 1

IX(%)

82 ± 3

X(%)

103 ± 4

XI (%)

94 ± 4

XII(%)

95 ± 5

S-59(%)

0,9 ± 0,1

Ejemplo 27

El medio fibrizado que consistía en Dowex Optipore L-493 unido a una matriz de fibra de poliéster no tejida (Hoechst-L493) fue fabricado por AQF sección de Hoechst Celanese (Charlotte, NC). Se evaluó el comportamiento de este medio adsorbente en un dispositivo de separación discontinuo para plaquetas.

Preparación de plaquetas

Se obtuvieron unidades de plaquetas de aféresis de donantes individuales que contenía 3,5 - 4,5 x 1011 plaquetas en 300 ml de 35% de plasma autólogo, 65% de PAS III, del Centro del Banco de Sangre de Sacramento. Se añadió 4'(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno (Baxter Healthcare) a cada unidad de plaquetas para lograr una concentración final 150 !M. Se mezclaron las unidades de plaquetas (4-5) en un solo envase de plástico PL-2410 y se mezclaron bien. La mezcla de plaquetas se dividió uniformemente en 4-5 envases de plástico PL2410 de 1 litro conteniendo cada uno aproximadamente 300 ml de mezcla de plaquetas. Las unidades recibieron tratamiento fotoquímico con UV-A 3,0 J/cm2 y se transfirieron al dispositivo de separación adecuado para el estudio. Todos los experimentos incluían una unidad de plaquetas de control que había recibido tratamiento fotoquímico (psoraleno 150 !M, UVA 3,0 J/cm2) pero no se había puesto en contacto con un dispositivo de separación.

Preparación del dispositivo

Los dispositivos de separación convencionales que contenía 2,5 g de Dowex XUS 43493 fueron preparados por Baxter Healthcare Corporation (Lote FX1032 D96F20042R). Se prepararon DAI experimentales con medio Hoechst-L493 (Hoechst Celanese Corp.) que fue suministrado en rollo. El medio se midió y se cortó para dar la masa de adsorbente adecuada para cada DAI (5,0 g y 7,5 g). El medio cortado se puso en bolsas construidas con malla de poliéster de 30 !m soldadas por impulsos (Tetko). Las bolsas de malla que contenían medio se trataron en el autoclave (121ºC, 20 min) y se pusieron en envases de plástico PL 2410 estériles. Alternativamente, se pusieron bolsas de malla en envases PL2410, los envases se cerraron, y el conjunto entero se esterilizó por irradiación gamma a 2,5 MRad (SteriGenics, Corona, CA). El exceso de aire se evacuó de forma manual de los dispositivos usando una jeringa antes de la transferencia de las plaquetas con tratamiento fotoquímico.

Cinéticas de adsorción

Después de tratamiento fotoquímico con 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno + UVA, las mezclas de plaquetas se transfirieron a envases de plástico PL 2410 con dispositivos de separación. Los dispositivos se pusieron en un incubador de plaquetas estándar (Helmer) y se agitaron a 70 ciclos/min a 22ºC. Se retiraron muestras de la mezcla de plaquetas a intervalos de 1 h durante las primeras 8 h de almacenamiento. Estas muestras se almacenaron a 4ºC y después se analizó el 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno residual por

análisis de HPLC. En ensayo implica una preparación de muestra inicial que lisa las plaquetas y solubiliza el 4'-(4amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno y los fotoproductos libres. El líquido sobrenadante de la preparación de muestra se analiza en una columna de fase inversa C-18 con un gradiente de metanol creciente en tampón de KH2PO4.

Función de las plaquetas in vitro

Las mezclas de plaquetas se agitaron en contacto con los dispositivos de separación durante 7 días. En un estudio, la mezcla de plaquetas se puso en contacto con el DAI durante 24 h y se transfirió a envases de plástico PL 2410 de 1 litro estériles usando un soldador de tubería estéril (Terumo SCD 312). Las plaquetas se volvieron a poner en el incubador de plaquetas y se almacenaron para el resto del periodo de almacenamiento de 7 días.

Después de 5 ó 7 días de almacenamiento, se determinaron el recuento de plaquetas y el pH para cada unidad de plaquetas. Se midieron el pH y pO2/pCO2 usando un analizador de gases en sangre de CIBA-Corning modelo 238. El recuento de plaquetas de cada muestra se determinó usando un analizador de hematología Baker 9118+.

Se llevaron a cabo varios ensayos para evaluar la función de las plaquetas in vitro. El cambio de forma de las muestras de plaquetas se controló usando un agregómetro de sangre entera Chrono-Log modelo 500 VS. El cambio de forma se cuantificó como la relación del cambio máximo en la transmisión de luz después de adición de ADP con respecto al cambio en la transmisión de la luz después de adición de EDTA.

La respuesta de las plaquetas al estrés hipotónico se evaluó por el ensayo de respuesta de choque hipotónico (HSR). El cambio en la transmisión de la luz después de la adición de una disolución hipotónica se midió usando un agregómetro de sangre entera Chrono-Log modelo 500 VS. Los datos se dan como porcentaje de recuperación del estrés hipotónico 2 minutos después de que la absorbancia alcance su valor mínimo.

La capacidad de las plaquetas para agregarse en respuesta a ADP/agonista de colágeno se indicaba por el cambio en la transmisión óptica medida con un agregómetro de sangre entera Chrono-Log modelo 500 VS.

Es estado de las plaquetas se evaluó por puntuación de las plaquetas. Las muestras se enmascararon y se sumaron las puntuaciones de morfología de 100 plaquetas para cada muestra. La puntuación más alta posible es 400 (Disco = 4, intermedio = 3, esfera = 2, dendrita = 1, balón = 0).

Se midió la activación de las plaquetas indicada por la expresión de la p-selectina (proteína de membrana granular, GMP-140). Se usó el anticuerpo CD62 para la muestra de ensayo, se usó IgG1 de ratón de control para el control negativo y el anticuerpo CD62 con miristato-acetato de forbol (PMA) se usó para el control positivo. Las muestras se analizaron en un FACScan (Becton Dickinson). El porcentaje de activación que se da es con respecto al control positivo y es la diferencia entre el valor de ensayo y el valor del control negativo.

Cinéticas de adsorción

Se investigó el impacto de incorporar perlas adsorbentes en una matriz de fibras. Unidades de plaquetas que contenían 4,0 x 1011 plaquetas en 300 ml de 35% de plasma, 65% de PAS III se trataron con 4'-(4-amino-2-oxa)butil4,5',8-trimetilpsoraleno 150 !M + UVA 3,0 J/cm2. Los DAI se prepararon a partir de Hoechst-L493 con una carga de adsorbente de 450 g/m2. Los DAI se esterilizaron por irradiación gamma. Después del tratamiento con psoraleno + UVA, las plaquetas se transfirieron a los dispositivos de separación. Se retiraron muestras a intervalos de 1 h y se analizó el 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno residual por HPLC. La figura 22 compara las cinéticas para la separación del 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno para DAI que contienen 5,0 g y 7,5 g de medio Hoechst-L493 con los de un dispositivo de separación convencional que contiene 2,5 g de perlas sueltas. Los DAI contenían 5,0 g de Hoechst-L493 (triángulos), 7,5 g de medio Hoechst-L493 (cuadrados) o 2,5 g de perlas adsorbentes Dowex L493 sueltas (círculos). El medio Hoechst-L493 contenía perlas adsorbentes con una carga de 450 g/m2.

La cinética de adsorción del 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno era más lenta para los medios Hoechst cuando se comparaba con una masa igual de perlas adsorbentes sueltas. El dispositivo de separación que contenía 2,5 g de perlas sueltas alcanzó los niveles más bajos de 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno residual en tiempos cortos (1 h). Sin embargo, con tiempos más largos, los DAI que contenían 7,5 g y 5,0 g de medio Hoechst-L493 se comportaron mejor. En este estudio las cinéticas de adsorción eran relativamente rápidas con los tres dispositivos de separación alcanzando el objetivo de 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno residual <0,5 !M en menos de 4 h de contacto.

Obsérvese que con tiempos más largos (6-8 h) los DAI de Hoechst-L493 que contenían una masa mayor de adsorbente lograron niveles menores de 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno residual. Esta observación sugiere que la cinética de adsorción más lenta para los DAI de Hoechst-L493 es un resultado de las limitaciones del transporte de masa (flujo de fluido frente a difusión) y no es el resultado de una pérdida de área de adsorción funcional debido a la unión de fibras. Estudios adicionales indican que el medio Hoechst-L493 con niveles menores de carga de adsorbente (200-300 g/m2) permite que el fluido penetre el medio más fácilmente dando como resultado cinéticas de adsorción más rápidas. Estudios previos (no se muestran los datos) con medio Hoechst que contenía

adsorbente Amberlite XAD-16 con una carga de 160 g/m2 indicaba que a las cinéticas de adsorción no les afectaba la incorporación en una matriz de fibras con un nivel bajo de carga.

Rendimiento de plaquetas y función de plaquetas in vitro

En esta sección se presentan los datos de los dos estudios separados. Las unidades de plaquetas en cada estudio 5 se obtuvieron de una sola mezcla de modo que se pudiera evaluar claramente el efecto del formato del medio del DAI, masa de adsorbente, y tiempo de contacto.

El primer estudio evaluaba el efecto de fibrización (medio Hoechst) en el rendimiento y la función de las plaquetas después de contacto prolongado (5 y 7 días). Se usaron un total de 4 unidades de plaquetas que se obtuvieron de una sola mezcla en este estudio. La unidad de control sin DAI se trató con psoraleno + UVA. Dos de las unidades de 10 plaquetas se pusieron en contacto con 5,0 g de Hoechst-L493. Una unidad se puso en contacto con el DAI durante 24 h antes de ser transferida a un envase de almacenamiento PL 2410 vacío. La otra unidad permaneció en contacto con el DAI durante la duración del estudio. Los DAI de Hoechst-L493 se esterilizaron con vapor de agua (120ºC, 20 min). El dispositivo de separación convencional (2,5 g de Dowex XUS-43493 suelto), que se obtuvo de Baxter, se esterilizó por irradiación gamma. Obsérvese que las plaquetas no se transfirieron fuera del dispositivo de

15 separación convencional después de 8-16 h de contacto como es típico en la práctica con el dispositivo que usa partículas de adsorbente sueltas.

Los resultados de los recuentos de plaquetas y la función in vitro después de 5 y 7 días de almacenamiento se resumen en la tabla 15A y tabla 15B, respectivamente.

Tabla 15A (Día 5)

20 Comparación del medio fibrizado Hoechst-L493 con el dispositivo de separación convencional, rendimiento de las plaquetas y función in vitro después de 5 días de almacenamiento

Muestra

Recuento de plaquetas (x1011/300 ml) Rendimiento (%) pH pCO2 pO2

Control (+ PCT - RD)

3,50 ±0,11 100 6,91 18 120

5,0 g de Hoechst/L-493 Transferencia a las 24 h

3,41 ± 0,06 97 ± 4 6,95 21 95

5,0 g de Hoechst/L-493 Sin transferencia

3,33 ± 0,08 95 ± 4 6,93 24 87

2,5 g de Dowex Optipore L493 Baxter Lote FX1032 D96F20042R Sin transferencia

2,60 ± 0,07 74 ± 3 7,04 13 146

Agregación

GMP-140

-

69 ± 4 67,2

-

61,5

-

58,9

71,3

Tabla 15B (Día 7)

Comparación del medio fibrizado Hoechst-L493 con el dispositivo de separación convencional, rendimiento de las plaquetas y función in vitro después de 7 días de almacenamiento

Muestra

Recuento de plaquetas (x1011/300 ml) Rendimiento (%) pH pCO2 pO2

Control (+ PCT - DAI)

3,45 ± 0,06 100 6,97 13 126

5,0 g de Hoechst/L-493 Transferencia a las 24 h

3,28 ± 0,22 95 ± 7 6,90 18 105

5,0 g de Hoechst/L-493 Sin transferencia

3,11 ± 0,15 90 ± 5 6,88 21 100

2,5 g de Dowex Optipore L-493 Baxter Lote FX1032 D96F20042R Sin transferencia

2,29 ± 0,07 66 ± 2 7,04 9 161

Cambio de forma

GMP-140

-

0,54 ± 0,05 80,1

-

72,7

-

66,1

-

77,1

5 Los rendimientos de las plaquetas para los DAI de Hoechst-L493 (5,0 g) eran sustancialmente mejores que el rendimiento para el dispositivo de separación convencional (2,5 g). Se alcanzaron pérdidas <10% para 7 días de almacenamiento en contacto continuo con el DAI de Hoechst-L493 (5,0 g). Ambas unidades de plaquetas que se trataron con los DAI de Hoechst-L493 presentaron un mejor comportamiento en los ensayos de cambio de forma, agregación y GMP-140 que el control sin DAI. Las plaquetas que permanecían en contacto con el DAI de Hoechst

10 L493 (5,0 g) durante los 5 días enteros mostraron función in vitro comparable respecto a las plaquetas que se transfirieron después de 24 h de contacto. Es interesante que las plaquetas que permanecieron en contacto con el DAI Hoechst-L493 se comportaron mejor en el ensayo de GMP-140. La diferencia de comportamiento entre los dos era incluso mayor después de 7 días. Esta observación sugiere que el contacto con el DAI disminuye la tasa de expresión de p-selectina por las plaquetas durante el almacenamiento.

15 El segundo estudio miraba los DAI que contenían 5,0 g y 7,5 g de medio Hoechst-L493 para determinar si había una disminución significativa en el rendimiento de plaquetas o en la función in vitro con una masa de medio mayor. En este estudio, los DAI de Hoechst-L493 se esterilizaron por irradiación gamma. Se incluyó un dispositivo de separación convencional (2,5 g Dowex XUS-43493) en este estudio. Las plaquetas permanecieron en contacto con los dispositivos de separación durante toda la duración del estudio. Los resultados de los recuentos de plaquetas y

20 la función in vitro después de 5 y 7 días de almacenamiento se resumen en la tabla 16A y tabla 16B, respectivamente.

Tabla 16A (Día 5)

Evaluación del medio fibrizado Hoechst-L493 esterilizado por irradiación gamma, rendimiento de las plaquetas y función in vitro después de 5 días de almacenamiento (Sin transferencia)

Muestra

Recuento de plaquetas (x1011/300 ml) Rendimiento (%) pH pCO2 pO2

Control (+ PCT - DAI)

3,96 ± 0,19 100 6,89 25 88

5,0 g de Hoechst/L-493

3,68 ± 0,16 93 ± 6 6,89 27 70

7,5 g de Hoechst/L-493

3,44 ± 0,11 87 ± 5 6,87 26 84

2,5 g de Dowex Optipore L-493 Baxter Lote FX1032 D96F20042R

2,85 ± 0,13 72 ± 5 7,04 13 145

HSR

Morfología GMP-140

-

0,26 ± 0,04 289 65,1

-

0,40 ± 0,00 278 54,5

-

0,25 ± 0,01 290 55,4

62,8

Tabla 16 (Día 7)

Evaluación del medio fibrizado Hoechst-L493 esterilizado por irradiación gamma, rendimiento de las plaquetas y función in vitro después de 7 días de almacenamiento (Sin transferencia)

Muestra

Recuento de plaquetas (x1011/300 ml) Rendimiento (%) pH pCO2 pO2

Control (+ PCT - DAI)

3,88 ± 0,18 100 6,99 18 93

5,0 g de Hoechst/L-493

3,67± 0,08 95 ± 5 6,92 22 81

7,5 g de Hoechst/L-493

3,48 ± 0,07 90 ± 4 6,91 20 91

2,5 g de Dowex Optipore L-493 Baxter Lote FX1032 D96F20042R

2,65 ± 0,22 68 ± 6 7,04 9 159

Morfología

0,23 ± 0,02

260

-

0,30 ± 0,01 266

-

0,29 ± 0,01 280

228

Los resultados que se resumen en las tablas 16A y 16B son similares a los resultados observados en el primer estudio. Las plaquetas que estuvieron en contacto con el DAI de Hoechst-L493 tenían rendimientos significativamente mayores que las plaquetas que estuvieron en contacto con el dispositivo de separación convencional. El rendimiento de plaquetas era ligeramente menor para el DAI de Hoechst-L493 de 7,5 g con

10 respecto al DAI de 5 g. Las plaquetas que se trataron con el DAI de Hoechst-L493 se comportaron de forma comparable a las plaquetas de control en todos los ensayos in vitro. Las plaquetas que se pusieron en contacto con los DAI de Hoechst-L493 mostraron un comportamiento mejorado en el ensayo de agregación comparado con el control sin DAI el día 7. El ensayo de GMP-140 no se llevó a cabo el día 7.

Los DAI que se prepararon con medio Hoechst-L493 (5,0, 7,5 g) dieron como resultado mejor función in vitro cuando

15 se compararon con los dispositivos de separación convencionales (2,5 g de XUS-43493 suelto) almacenado en contacto con plaquetas durante 5 días. Además, las plaquetas que se habían tratado con 4'-(4-amino-2-oxa)butil4,5',8-trimetilpsoraleno 150 !M + UVA 3,0 J/cm2 mostraron una mejor función in vitro indicado por los ensayos de cambio de forma, agregación y GMP-140 cuando se pusieron en contacto con DAI de Hoechst-L493 (5,0 g) durante 5 y 7 días. Un estudio adicional que comparaba el almacenamiento 5-7 días para las plaquetas (sin psoraleno/UVA)

con y sin DAI (50 g Hoechst-L493) demostró que el almacenamiento con un DAI puede mejorar el comportamiento de las plaquetas como se indica por los ensayos de la función in vitro.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES

   1.- Un sistema para usar en el tratamiento de un hemoderivado que contiene un agente inactivante de patógenos que comprende una carcasa biocompatible y un medio adsorbente que tiene

   (1)

   partículas de resina adsorbente muy porosas capaces de adsorber el agente inactivante de patógenos;

   (2)

   una matriz inerte en la que las partículas de resina adsorbente están inmovilizadas;

   en donde el sistema está configurado como un aparato de flujo continuo y las partículas adsorbentes inmovilizadas tienen un diámetro entre aproximadamente 10 !m y aproximadamente 20 !m;

   en donde el compuesto inactivante de patógenos es compuesto orgánico pequeño seleccionado de un psoraleno, un derivado de psoraleno, un colorante de tiazina, una acridina, un derivado de acridina, un colorante de xanteno, un colorante de tiazina, tioglicolato de metilo, ácido tioláctico, tiofenol, 2-mercaptopiridina, 3-mercapto-2-butanol, 2mercaptobenzotiazol, ácido tiosalicílico, ácido tióctico, o productos de fotoactivación;

   y en donde dicho hemoderivado mantiene sustancialmente una actividad biológica deseada después de tratamiento con dicho sistema.
2. 2.- Un sistema según la reivindicación 1, en donde la matriz inerte comprende una red de fibras.
3. 3.- Un sistema según la reivindicación 1, en donde el sistema comprende además un medio de retención de partículas.
4. 4.- Un sistema según la reivindicación 3, en donde el medio de retención de partículas está colocado dentro de dicha carcasa.
5. 5.- Un sistema según la reivindicación 1, en donde el tamaño de poros de las partículas de resina adsorbentes esentre 25 y 800 Å.
6. 6.- Un sistema según la reivindicación 1 o reivindicación 5, en donde las partículas de resina adsorbentes tienen una superficie específica entre 300 y 1100 m2/g.
7. 7.- Un sistema según la reivindicación 1, en donde el medio adsorbente contiene 20-70% en peso de dichas partículas de resina adsorbentes.
8. 8.-Un sistema según la reivindicación 7, en donde el medio adsorbente contiene 30-50% en peso de dichas partículas de resina adsorbentes.
9. 9.- Un sistema según la reivindicación 1, en donde la cantidad de dichas partículas de resina adsorbentes por área de dicho medio adsorbente es de 300 a 1100 g/m2.
10. 10.- Un sistema según la reivindicación 9, en donde la cantidad de dichas partículas de resina adsorbentes por área de dicho medio adsorbente es de 500 a 700 g/m2.
11. 11.- Un sistema según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde dicho agente inactivante de patógenos se selecciona del grupo que consiste en 4'-aminometil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(4-amino-2-oxa)butil4,5',8-trimetilpsoraleno, 8-metoxipsoraleno, psoralenos halogenados, isopsoralenos y psoralenos unidos a aminas cuaternarias, 5'-bromometil-4,4',8-trimetilpsoraleno, 4'-bromometil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(4-amino-2-aza)butil4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(2-aminoetil)-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(5-amino-2-oxa)pentil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'(5-amino-2-aza)pentil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(6-amino-2-aza)hexil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(7-amino-2,5oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(12-amino-8-aza-2,5-dioxa)dodecil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(13-amino-2-aza6,11-dioxa)tridecil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(7-amino-2-aza)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(7-amino-2-aza-5oxa)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(9-amino-2,6-diaza)nonil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(8-amino-5-aza-2-oxa)octil4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(9-amino-5-aza-2-oxa)nonil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4 '-(14-amino-2,6,11-triaza)tetradeciI4,5',8-trimetilpsoraleno, 5'-(4-amino-2-aza)butil-4,4',8-trimetilpsoraleno, 5'-(6-amino-2-aza)hexiI-4,4',8trimetilpsoraleno, 5'-(4-amino-2-oxa)butil-4,4',8-trimetilpsoraleno, y N-(9- acridinil)-∀-alanina.
12. 12.-Un sistema según la reivindicación 1, en donde las partículas de resina adsorbentes comprenden redes de polímeros de poliestireno.
13. 13.- Un sistema según cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde las partículas de resina adsorbentes están hiperreticuladas.
14. 14.-Un sistema según la reivindicación 13, en donde las partículas de resina adsorbentes hiperreticuladas comprenden poliestireno reticulado con dicloruro de p-xileno, éter monoclorodimetílico, 1,4-bis-clorometildifenilo, 4,4'-bis-(clorometil)bifenilo, dimetilformal, p,p'-bis-clorometil-1,4-difenilbutano, o tris-(clorometil)-mesitileno.
15. 15.- Un método para reducir un compuesto inactivante de patógenos de un hemoderivados que contiene dicho compuesto inactivante de patógenos con el sistema según una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el agente inactivante de patógenos comprende un psoraleno, un derivado de psoraleno, un colorante de tiazina, una acridina, un derivado de acridina, un colorante de xanteno, un colorante de tiazina, tioglicolato de metilo,

    5 ácido tioláctico, tiofenol, 2-mercaptopiridina, 3-mercapto-2-butanol, 2-mercaptobenzotiazol, ácido tiosalicílico, ácido tióctico, o productos de fotoactivación.
16. 16.- Un método según la reivindicación 15, en donde dicho agente inactivante de patógenos se selecciona del grupo que consiste en 4'-aminometil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 8metoxipsoraleno, psoralenos halogenados, isopsoralenos y psoralenos unidos a aminas cuaternarias, 5'-bromometil10 4,4',8-trimetilpsoraleno, 4'-bromometil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(4-amino-2-aza)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(2aminoetil)-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(5-amino-2-oxa)pentil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(5-amino-2-aza)pentil-4,5',8trimetilpsoraleno, 4'-(6-amino-2-aza)hexil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(7-amino-2,5-oxa)heptil-4,5',8- trimetilpsoraleno, 4'-(12-amino-8-aza-2,5-dioxa)dodecil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(13-amino-2-aza-6,11-dioxa)tridecil-4,5',8trimetilpsoraleno, 4'-(7-amino-2-aza)heptil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(7-amino-2-aza-5-oxa)heptil-4,5',8

    15 trimetilpsoraleno, 4'-(9-amino-2,6-diaza)nonil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(8-amino-5-aza-2-oxa)octil-4,5',8trimetilpsoraleno, 4'-(9-amino-5-aza-2-oxa)nonil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 4'-(14-amino-2,6,11-triaza)tetradecil-4,5',8trimetilpsoraleno, 5'-(4-amino-2-aza)butil-4,4',8-trimetilpsoraleno, 5'-(6-amino-2-aza)hexil-4,4',8-trimetilpsoraleno, 5'(4-amino-2-oxa)butil-4,4',8-trimetilpsoraleno, y N-(9-acridinil)-∀-alanina.