JP2012067126A - 血液製剤からソラレンを除去するための方法およびデバイス - Google Patents

血液製剤からソラレンを除去するための方法およびデバイス Download PDF

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Abstract

【課題】血液製剤からソラレンを除去するための方法およびデバイスを提供すること。
【解決手段】．以下の工程を含む血液製剤中の核酸含有病原菌を不活性化させる方法：
ａ）任意の順序で、ｉ）ソラレン、ｉｉ）光活性化手段、ｉｉｉ）該病原菌に汚染されていることが疑われるインビボでの使用の為の血液製剤、を提供する工程；
ｂ）該ソラレンを該血液製剤に添加して、ある濃度のソラレン溶液を調製する工程；
ｃ）該溶液を光活性化手段で処理し、処理血液製剤を調製する工程であって、該病原菌が
不活性化され、かつ該溶液中の該ソラレン濃度の少なくとも一部がフリーである、工程；および
ｄ）該処理血液製剤中の溶液でフリーである該ソラレン濃度の部分の実質的にすべてを除
去する工程。
【選択図】なし

Description

発明の分野
本発明は、血液製剤から物質を除去するための方法および装置、さらに詳しくは、血小板機能に有意に影響することなく、血小板を含有する血漿からソラレンおよびソラレン光化学反応生成物を除去するための方法および装置に関する。
背景
血液供給内の病原体汚染は世界中で重要な医学的問題のままである。Ｂ型肝炎（ＨＢＶ）、Ｃ型肝炎（ＨＣＶ）、およびＨＩＶについての改良された試験方法は輸血関連病の発生を顕著に減少させたが、公衆はこれらのウイルスの輸血関連伝播の場合の公表性のため血液供給の安全性に信頼性を失いつつある。
例えば、ＨＣＶについての血液試験の最近の導入は、このウイルスの伝播を低下させるであろうが、恐らく感染性である血液ユニットの検出の６７％に過ぎない感度を有する。ＨＣＶは輸血関連肝炎の９０％の原因である。Ｍｅｌｎｉｃｋ，Ｊ．Ｌ．，Ａｂｓｔｒａｃｔ ｏｆ Ｖｉｒｏｌｏｇｉｃａｌ Ｓａｆｅｔｙ Ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ Ｐｌａｓｍａ，Ｃａｎｎｅｓ，１１月３〜６日（１９９２）（９頁）。適した試験では、感染の危険は輸血された３３００ユニットのうち１であると見積もられる。
同様に、より感度の良い血清学的アッセイはＨＩＶ−１およびＨＢＶに適するが、これらの病原体はそれにも拘わらず血清反応陰性血液ドナーによって伝播され得る。国際フォーラム：Ｖｏｘ Ｓａｎｇ ３２：３４６（１９７７）。Ｗａｒｄ，Ｊ．Ｗ．ら，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．，３１８：４７３（１９８８）。全輸血関連肝炎の多くとも１０％、およびひどい黄疸ケースの２５％が、Ｂ型肝炎表面抗原（ＨＢａｓＡｇ）陰性ドナーによって伝播されたＨＢＶに起因する。現在、輸血関連ＨＩＶ感染の１５例が、ＨＩＶ−１に対する抗体について陰性と予備試験された血液の受容者の間で、Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｃｏｎｔｒｏｌ（ＣＤＣ）によって報告されている。
さらに、他のウイルス、細菌、および薬剤は輸血の安全性について規定通りには試験されず、輸血の安全性に対する潜在的脅威は残っている。Ｓｃｈｍｕｎｉｓ，Ｇ．Ａ．，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３１：５４７−５５７（１９９２）。加えて、試験は、ドナー集団に侵入し得る将来の未知病原体に対する血液提供の安全性を保証せず、この結果、感度良好な試験が実施できるようになる前に輸血関連伝播が起こることとなる。
血清変換試験が十分なスクリーニングであったとしても、それらは、利用する際現実的ではないであろう。例えば、ヒトにおけるＣＭＶ（ヘルペスウイルス）およびパルボＢ１９ウイルスは一般的である。それらが健康で免疫能の正常な成人で発生した場合、それらはほとんど常に無徴候血清変換をもたらす。集団のかかる大部分は血清反応陽性であるので、陽性ユニットの排除の結果、血液供給の実質的制限をもたらす。
血液製剤を介するウイルス病の伝播を排除するためのもう１つのアプローチは、輸血製品中の病原体を不活性化する手段を開発することである。血液製剤中の感染性病原体を不活性化するための効果的技術の開発は、血液供給の安全性を改良し、恐らくは、低頻度病原体については、最近導入されたＨＩＶ−２試験のごとき新しい試験の導入を遅らせる可能性を供する。結局は、除染技術は血液製剤のコストをおおいに下げ、稀な血液製剤の利用性を増大させる。
有用であるためには、かかる不活性化方法は、ｉ）血液製剤が輸血される機能に悪影響を与えてはならず、ｉｉ）血液製剤中の存在する病原体を徹底的に不活性化しなければならず、そしてｉｉｉ）血液製剤の受容者に悪影響を与えてはならない。無赤血球血液製剤中のウイルス病原体の不活性化または排除につきいくつかの方法が報告されている。しかしながら、これらの技術のほとんどが、血小板（重要な血液製剤）の機能の維持に完全には適合しない。これらの技術の例は加熱（Ｈｉｌｆｅｎｈｏｕｓ，Ｊ．ら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｓｔｄ．７０：５８９（１９８７））、溶媒／界面活性剤処理（Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，Ｂ．ら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２５：５１６（１９８５））、ガンマ線照射（Ｍｏｒｏｆｆ，Ｇ．ら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２６：４５３（１９８６））、ベータプロプリオラクトンと組み合わせた紫外線照射（Ｐｒｉｎｃｅ Ａ．Ｍ．ら，Ｒｅｖｉｅｗｓ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓｅａｓｅｓ ５：９２−１０７（１９８３））、ヘマトポルフィリンと組み合わせた可視レーザー光（Ｍａｔｔｈｅｗｓ Ｊ．Ｌ．ら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ２８：８１−８３（１９８８）；Ｎｏｒｔｈ Ｊ．ら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３２：１２１−１２８（１９９２））、光活性色素アルミニウムフタロシアニンおよびメロシアニン５４０の使用（Ｓｉｅｂｅｒ Ｆ．ら，Ｂｌｏｏｄ ７３：３４５−３５０（１９８９）；Ｒｙｗｋｉｎ Ｓ．ら，Ｂｌｏｏｄ ７８（補遺１）：３５２ａ（アブストラクト）（１９９１）または紫外線単独（Ｐｒｏｕｄｏｕｚ，Ｋ．Ｎ．ら，Ｂｌｏｏｄ ７０：５８９（１９８７））である。
他の方法は、紫外線の存在下でソラレンのごときフロクマリンで処理することによってウイルス病原体を不活性化する。ソラレンは、フラン環とクマリンとの直線状縮合によって形成される三環性化合物である。ソラレンは二本鎖核酸の塩基対の間にインターカレートでき、長波長紫外線（ＵＶＡ）の吸収に際して、ピリミジン塩基への共有結合付加生成物を形成する。Ｇ．Ｄ．Ｃｉｍｉｎｏら，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．５４：１１５１（１９８５）；Ｈｅａｒｓｔら，Ｑｕａｒｔ Ｒｅｃ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．１７：１（１９８４）。対向ストランドにソラレン−ピリミジン一付加生成物（モノアダクト）に隣接して第２のピリミジンがある場合、第２のフォトンの吸収によりストランド間架橋として機能する二付加生成物（ダイアダクト）の形成に至る。Ｓ．Ｔ．Ｉｓａａｃｓら，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ １６：１０５８（１９７７）；Ｓ．Ｔ．Ｉｓａａｃｓら，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｐｈｏｔｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｐｌｅｎｕｍ） ２７９−２９４頁（１９８２）；Ｊ．Ｔｅｓｓｍａｎら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．２４：１６６９（１９８５）；Ｈｅａｒｓｔら，米国特許第４，１２４，５９８号、同第４，１６９，２０４号および同第４，１９６，２８１号。出典明示してこれらを本明細書の一部とみなす。
共有結合したソラレンはＤＮＡ複製の阻害剤として作用し、かくして、複製プロセスを停止させる能力を有する。このＤＮＡ結合能力のため、ソラレンは無病原体血液供給を生産し維持することにおける固有の問題を解決することに関して特別に興味深い対象である。いくつかの公知のソラレンはいくつかの血液製剤でウイルスを不活性化することが示されてきた。出典明示して本明細書の一部とみなすＨ．Ｊ．Ａｌｔｅｒら，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ（ｉｉ：１４４６）（１９８８）；Ｌ．Ｌｉｎら，Ｂｌｏｏｄ ７４：５１７（１９８９）（除染血小板濃縮液）；Ｇ．Ｐ．Ｗｉｅｓｅｈａｈｎら，米国特許第４，７２７，０２７号および同第４，７４８，１２０号は、８−メトキシソラレン（８−ＭＯＰ）および照射の組合せの使用を記載している。Ｐ．Ｍｏｒｅｌら，Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ １８：２７（１９９２）は、３００μｇ／ｍＬの８−ＭＯＰと紫外線の１０時間の照射は、ヒト血清中のウイルスを効果的に不活性化できることを示す。８−ＭＯＰおよびアミノメチルトリメチルソラレン（ＡＭＴ）を用いる同様の研究が他の研究者によって報告されてきた。Ｄｏｄｄ Ｒ Ｙら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３１：４８３−４９０（１９９１）；Ｍａｒｇｏｌｉｓ−Ｎｕｎｎｏ，Ｈ．ら，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔａｓ ６５：１１６２（アブストラクト）（１９９１）。事実、本発明で用いるものと異なる条件下にて、かつ従前に知られたソラレン誘導体を用いて、ＨＢＶ、ＨＣＶおよびＨＩＶを含めた広範囲スペクトルの微生物の光不活性化が確立されてきた［Ｈａｎｓｏｎ，Ｃ．Ｖ．，Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ，１８：７−２４（１９９２）；Ａｌｔｅｒ，Ｈ．Ｊ．ら，Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ ｉｉ：１４４６（１９８８）；Ｍａｒｇｏｌｉｓ−Ｎｕｎｎｏ，Ｈ．ら，Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔａｓ ６５：１１６２（アブストラクト）（１９９１）］。
ソラレン光不活性化は、ウイルスを不活性化するソラレンの能力が、完全に不活性化が起こる安全域を保証するのに十分である場合のみ可能である。他方、ソラレンは、血液製剤に損傷を引き起こすようであってはならない。丁度述べた方法は、公知のソラレンを用いて利用されると、血液製剤に対する損傷を回避するためには困難で費用のかかる手法の使用が必要である。例えば、いくつかの化合物およびプロトコルは、照射の間に生じる酸素ラジカルから血液製剤に対する損傷を防止するために、光に曝露する前に反応物から分子酸素を除去することを必要とする。Ｌ．Ｌｉｎら，Ｂｌｏｏｄ ７４：５１７（１９８９）；Ｗｉｅｓｅｈａｈｎに対する米国特許第４，７２７，０２７号参照。これは費用がかかり、時間を消費する手法である。
最後に、光化学除染（ＰＣＤ）で使用されるいくつかの通常に知られた化合物は、ウイルスを殺す能力が増大するにつれ増大するように見える望ましくない変異原性を示す。換言すれば、公知の化合物がより効果的にウイルスを不活性化すれば、該化合物は受容者に対してより有害であり、かくして、それらはインビボ使用では製品の不活性化系においていずれの時点でも有用性が低い。
新しいソラレン化合物が要望されており、新しいソラレン化合物は、それが使用される血液製剤に対して有意な損傷を引き起こすことなく、かつ酸素を除去する必要なくして、それにより血液除染方法において病原体の安全で完全な不活性化を確実とする、病原体を不活性化する改良された能力および低い変異原性を示す。加えて、適当なソラレンによって生じた光化学反応生成物および残存レベルのソラレンの両方を血液製剤から除去することができ、それにより、かかる血液製剤のＰＣＤ処理の効果的で経済的な広く行き渡る使用を可能とする装置が要望される。
発明の要旨
本発明は、新しいソラレン、ならびに変異原性には関連せず、紫外線の存在下で病原体を不活性化する能力が増強された新しいソラレンの合成方法を提供する。また、本発明は、インビボおよびインビトロにて、特に、血液製剤および合成培地中の血液製剤で使用される健康関連製品において病原体を不活性化する新しい化合物および公知の化合物を使用する方法を提供する。
本発明は、以下の順序で、ａ）任意の順序で、ｉ）４’−第一級アミノ置換ソラレンおよび５’−第一級アミノ置換ソラレンよりなる群から選択される化合物を含む合成培地；ｉｉ）該化合物を光活性化するための光活性化手段；およびｉｉｉ）核酸を有する病原体で汚染されたことが疑われる血小板調製物を供する工程、ｂ）該合成培地を該血小板調製物に添加する工程、次いで、ｃ）該化合物を光活性化して、該血小板調製物の生物学的活性を有意に変化させることなく、該病原体核酸の実質的に全ての複製を妨げる工程を包含する血小板調製物中の病原体を不活性化する方法を企図する。該病原体はウイルスまたは細菌であってよい。その核酸は一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。光活性化手段は、１８０ｎｍおよび４００ｎｍの間の波長を含む所与の強度の電磁放射線のスペクトルを放射できる光活性化装置を含む。該強度は１〜３０ｍＷ／ｃｍ２の間であってよく、血小板調製物は１秒および３０分間の間、該強度に曝露される。電磁放射線のスペクトルは３２０ｎｍおよび３８０ｎｍの間の波長であってよい。
１つの具体例において、該化合物は低変異原性を示す。該化合物は０．１μＭ〜２５０μＭの間の濃度で血小板調製物に添加される。該方法は分子酸素の濃度を制限することなく行うことができる。
４’−第一級アミノ置換ソラレンは、ａ）
［式中、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、ＯおよびＮＨよりなる群から選択され、ここに、ｕは１ないし１０の整数であり、ｗは１ないし５の整数であり、ｘは２ないし５の整数であり、ｙは２ないし５の整数であり、ｚは２ないし６の整数である］よりなる群から選択される４’位炭素原子上の置換基Ｒ１；およびｂ）各々、独立して、Ｈおよび（ＣＨ２）ｖＣＨ３［ここに、ｖは０ないし５の整数である］よりなる群から選択される、４、５’および８位炭素原子上の置換基Ｒ５、Ｒ６およびＲ７；あるいはその塩を含むことができる。
また、５’−第一級アミノ置換ソラレンは、ａ）
［式中、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、ＯおよびＮＨよりなる群から選択され、ここに、ｕは１ないし１０の整数であり、ｗは１ないし５の整数であり、ｘは２ないし５の整数であり、ｙは２ないし５の整数であり、ｚは２ないし６の整数である］よりなる群から選択される５’位炭素原子上の置換基Ｒ１；およびｂ）各々、独立して、Ｈおよび（ＣＨ２）ｖＣＨ３［ここに、ｖは０ないし５の整数である］よりなる群から選択される、４、４’および８位炭素原子上の置換基Ｒ５、Ｒ６およびＲ７；あるいはその塩を含むことができ、ここに、Ｒ１が−（ＣＨ２）ｕ−ＮＨ２から選択される場合、Ｒ６はＨである。
最後に、５’−第一級アミノ置換ソラレンは、ａ）
［式中、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、ＯおよびＮＨよりなる群から選択され、ここに、ｕは３ないし１０の整数であり、ｗは１ないし５の整数であり、ｘは２ないし５の整数であり、ｙは２ないし５の整数であり、ｚは２ないし６の整数である］よりなる群から選択される５’位炭素原子上の置換基Ｒ１；およびｂ）各々、独立して、Ｈおよび（ＣＨ２）ｖＣＨ３［ここに、ｖは０ないし５の整数である］よりなる群から選択される、４、４’および８位炭素原子上の置換基Ｒ５、Ｒ６およびＲ７；あるいはその塩を含むことができる。
１つの具体例において、少なくとも２つの化合物が存在する。もう１つの具体例において、合成培地は、さらに、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよび塩化マグネシウムを含み、また、マンニトールおよび／またはグルコースを含むことができる。
１つの具体例において、合成培地は、第１の血液バッグに含まれ、該血小板調製物は第２のバッグに含まれ、合成培地は、滅菌連結を介して、第１の血液バッグからの合成培地を第２の血液バッグに絞り出すことによって、工程（ｂ）において血小板調製物に添加される。
好ましい具体例において、該化合物は５’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，４’，８−トリメチルソラレンまたは４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである。
１つの具体例において、前記した方法は、静脈内注入によって該血小板調製物を哺乳動物に投与することを含む。
本発明は、以下の順序で、ａ）任意の順序で、ｉ）第１の血液バッグに含まれた、緩衝化生理食塩水ならびに４’−第一級アミノ置換ソラレンおよび５’−第一級アミノ置換ソラレンよりなる群から選択される低変異原性を示す化合物を含む合成培地：ｉｉ）該化合物を光活性化するための光活性化手段；およびｉｉｉ）第２の血液バッグに含まれた、核酸を有する病原体で汚染されたことが疑われる血小板調製物を供する工程；ｂ）滅菌連結手段を介して該合成培地を該第１の血液バッグから該第２の血液バッグに絞り出すことによって、該合成培地を該血小板調製物に添加する工程；次いで、ｃ）該化合物を光活性化させて、該血小板調製物の生物学的活性を有意に変化させることなく、該病原体核酸の実質的に全ての複製を妨げる工程を包含する、血小板調製物中の病原体を不活性化する方法を企図する。該病原体はウイルスまたは細菌であってよい。その核酸は一本鎖または二本鎖のＤＮＡまたはＲＮＡであってよい。光活性化手段は、１８０ｎｍおよび４００ｎｍの間の波長を含む所与の強度の電磁放射線のスペクトルを放射できる光活性化装置を含む。該強度は１および３０ｍＷ／ｃｍ２の間であってよく、血小板調製物は１秒〜３０分の間、該強度に曝露される。電磁放射線のスペクトルは３２０ｎｍ〜３８０ｎｍの間の波長であってよい。
１つの具体例において、該化合物は低変異原性を示す。該化合物は０．１μＭ〜２５０μＭの間の濃度で血小板調製物に添加することができる。該方法は分子酸素の濃度を制限することなく行うことができる。
４’−第一級アミノ置換ソラレンは：ａ）
［式中、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、ＯおよびＮＨよりなる群から選択され、ここに、ｕは１ないし１０の整数であり、ｗは１ないし５の整数であり、ｘは２ないし５の整数であり、ｙは２ないし５の整数であり、ｚは２ないし６の整数である］
よりなる群から選択される４’位炭素原子上の置換基Ｒ１；およびｂ）各々、独立して、Ｈおよび（ＣＨ２）ｖＣＨ３［ここに、ｖは０ないし５の整数である］よりなる群から選択される、４、５’および８位炭素原子上の置換基Ｒ５、Ｒ６およびＲ７；あるいはその塩を含むことができる。
また、５’−第一級アミノ置換ソラレンは、ａ）
［式中、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、ＯおよびＮＨよりなる群から選択され、ここに、ｕは１ないし１０の整数であり、ｗは１ないし５の整数であり、ｘは２ないし５の整数であり、ｙは２ないし５の整数であり、ｚは２ないし６の整数である］
よりなる群から選択される５’位炭素原子上の置換基Ｒ１；およびｂ）各々、独立して、Ｈおよび（ＣＨ２）ｖＣＨ３［ここに、ｖは０ないし５の整数である］よりなる群から選択される、４、４’および８位炭素原子上の置換基Ｒ５、Ｒ６およびＲ７；あるいはその塩を含むことができ、ここに、Ｒ１が−（ＣＨ２）ｕ−ＮＨ２を含む群から選択される場合、Ｒ６はＨである。
最後に、５’−第一級アミノ置換ソラレンは、ａ）
［式中、Ｒ２、Ｒ３およびＲ４は、独立して、ＯおよびＮＨよりなる群から選択され、ここに、ｕは３ないし１０の整数であり、ｗは１ないし５の整数であり、ｘは２ないし５の整数であり、ｙは２ないし５の整数であり、ｚは２ないし６の整数である］
よりなる群から選択される５’位炭素原子上の置換基Ｒ１；およびｂ）各々、独立して、Ｈおよび（ＣＨ２）ｖＣＨ３［ここに、ｖは０ないし５の整数である］よりなる群から選択される、４、４’および８位炭素原子上の置換基Ｒ５、Ｒ６およびＲ７；あるいはその塩を含むことができる。
１つの具体例において、少なくとも２つの化合物が存在する。もう１つの具体例において、合成培地は、さらに、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよび塩化マグネシウムを含み、また、マンニトールおよび／またはグルコースを含むことができる。
１つの具体例において、合成培地は、第１の血液バッグに含まれ、血小板調製物は第２のバッグに含まれ、合成培地は、滅菌連結を介して、第１の血液バッグから合成培地を第２の血液バッグに絞り出すことによって、工程（ｂ）において血小板調製物に添加される。
好ましい具体例において、該化合物は５’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，４’，８−トリメチルソラレンまたは４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである。
１つの具体例において、前記した方法は、静脈内注入によって該血小板調製物を哺乳動物に投与することを含む。
また、本発明は、ａ）４，８−ジアルキル−７−（１−メチル−２−オキソプロピルオキシ）ソラレンを供する工程；ｄ）４，８−ジアルキル−４’，５’−ジメチルソラレンを四塩化炭素中で撹拌して、４，８−ジアルキル−５’−ブロモメチル−４’−メチルソラレンを得る工程を包含する、クロロメチル化を行うことなく、４，８−ジアルキル−５’−ブロモメチル−４’−メチルソラレンを合成する方法を企図する。ａ）４，８−ジアルキル−７−（１−メチル−２−オキソプロピルオキシ）ソラレンを供する工程；ｄ）４，８−ジアルキル−４’，５’−ジメチルソラレンを塩化メチレン中で撹拌して４，８−ジアルキル−４’−ブロモメチル−５’−メチルソラレンを得る工程を包含する、クロロメチル化を行うことなく、４，８−ジアルキル−４’−ブロモメチル−５’−メチルソラレンを合成する方法も企図される。
式：
を有する新規化合物またはその塩も企図される。
最後に、本発明は、抗ウイルス特性を有する組成物を企図する。最初のものは、４’−第一級アミノ置換ソラレンおよびインビボ使用に適した血小板の水溶液を含む。１つの具体例は、さらに合成培地を含み、この合成培地は、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよび塩化マグネシウムを含み、所望によりマンニトールまたはグルコースを含んでもよい。４’−第一級アミノ置換ソラレンよりもむしろ５’−第一級アミノ置換ソラレンを含むこれらの同組成物が企図される。
また、４５〜１００ｍＭ塩化ナトリウム；
４〜５ｍＭ塩化カリウム；
１０〜１５ｍＭクエン酸ナトリウム；
２０〜２７ｍＭ酢酸ナトリウム；
０〜２ｍＭグルコース；
０〜３０ｍＭマンニトール；
ほぼ２０ｍＭのリン酸ナトリウム；
２〜３ｍＭ塩化マグネシウム；および
４’−第一級アミノソラレンおよび５’−第一級アミノソラレンよりなる群から選択されるほぼ０．１〜ほぼ２５０μＭの間の濃度のソラレン
の水溶液を含む新規合成血小板貯蔵培地も企図される。
本発明は、任意の順序で、ソラレン、光活性化手段、少なくとも１種の病原体で汚染されたことが疑われるインビボ使用を意図した血液製剤を供する工程、ソラレンを血液製剤に添加して特定の濃度のソラレンの溶液を生成する工程、該溶液を光活性化手段で処理して処理後血液製剤を生成する工程であって、ここに病原体は不活性化され、ここに、ソラレン濃縮物の少なくとも一部は溶液中で遊離している、工程；および、処理後血液製剤において溶液中に遊離しているソラレン濃縮物の一部の実質的に全てを除去する工程を包含する、血液製剤中の核酸含有病原体を不活性化する方法を提供する。
１つの具体例おいて、除去工程は、処理後血液製剤を樹脂と接触させる工程を包含する。限定されるものではないが、吸着剤、ポリスチレン、ポリアクリルエステル、シリカ、活性炭、およびポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）で被覆した活性炭を含めた、種々の樹脂が本発明で使用されると考えられる。別の具体例において、接触工程は、樹脂を含有するインラインカラムに血液製剤を灌流させる工程を包含する。
もう１つの具体例において、本発明の方法は、血液製剤をインラインカラムに通した後に、血液製剤をインラインカラムに流体接触したフローアダプターに通す工程を包含する。もう１つの具体例において、接触は、樹脂を含有するバッグ中で起こる。特に好ましい具体例において、樹脂をバッグ中のメッシュエンクロージャー（ｍｅｓｈ ｅｎｃｌｏｓｕｒｅ）内に含有させ、ここに、該メッシュエンクロージャーは、血液製剤が樹脂と接触するように適合させられる。
もう１つの具体例において、本発明の方法は、さらに、パーティションがバッグの外部にバッグと接触して設けられる工程を包含し、ここに、該パーティションは、血液製剤をメッシュエンクロージャーから分離するように適合させられ、また所定の時間にバッグから除去されるように適合させられる。別の具体例において、該方法は、さらに、樹脂含有バッグを振盪装置で混合する工程を包含する。限定されるものではないが、４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンを含めた種々のソラレン化合物が本発明で有用であることが企図される。また、限定されるものではないが、血小板、血漿、赤血球、および白血球、ならびに全血を含めた、任意の血液成分を血液製剤が含むことが企図される。
もう１つの具体例において、本発明は、任意の順序で、４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン、光活性化手段、病原体に汚染されたことが疑われるインビボ使用を意図した血小板混合物を供する工程、４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンを血小板混合物に添加して特定の濃度の４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンの溶液を生成する工程；該溶液を光活性化手段で処理して処理後血小板混合物を生成する工程であって、ここに病原体は不活性化され、４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン濃縮物の少なくとも一部は溶液中で遊離している、工程；および、処理後血小板混合物において溶液中に遊離した４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン濃縮物の一部の実質的に全てを除去する工程を包含する、血液製剤中の核酸含有病原体を不活性化する方法を提供する。
この方法の１つの具体例において、除去工程は、処理後血小板混合物を樹脂と接触させる工程を包含する。本発明は、樹脂と接触させることで、２時間で４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンの９９％超を除去することを企図する。限定されるものではないが、吸着剤、ポリスチレン、ポリアクリルエステル、シリカ、活性炭、およびポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）で被覆した活性炭を含めた、種々の樹脂が本発明で使用されることが企図される。別の具体例において、接触工程は、樹脂を含有するインラインカラムに血液製剤を灌流させることを包含する。さらにもう１つの具体例において、この方法は、さらに、血液製剤をインラインカラムに通した後に、血液製剤をインラインカラムと流体接触したフローアダプターに通す工程を包含する。
この方法のもう１つの具体例において、接触工程は、樹脂を含有するバッグ内で起こる。好ましい具体例において、樹脂をバッグ中のメッシュエンクロージャー内に含有させ、ここに、該メッシュエンクロージャーは、血液製剤を樹脂と接触させるように適合させられる。もう１つの好ましい具体例において、該方法は、さらに、パーティションがバッグの外部でバッグと接触して設けられる工程を包含し、ここに、該パーティションは、血液製剤をメッシュエンクロージャーから分離するように適合させられ、また該パーティションが所定の時間にバッグから除去されるように該パーティションが適合させられる。この方法は、さらに、樹脂含有バッグを振盪装置で混合する工程を包含することが企図される。
また、本発明は、血液除染システムを提供し、この血液除染システムは、第１の血液バッグおよびソラレンを除去できる樹脂を除去できるインラインカラムを含み、ここに、該インラインカラムは第１血液バッグと流体連絡した入力端部、出力端部、およびキャパシティーを有する。１つの具体例において、出力端部は、第２血液バッグと流体接触している。好ましい具体例において、インラインカラムのキャパシティーはほぼ５〜１０ｍＬである。もう１つの具体例において、該方法は、さらに、インラインカラムと流体接触して位置付けされ、かつインラインカラムの出力端部の後であって第２のバッグの前に位置付けされたフローアダプターを含む。
この方法の１つの具体例において、除去工程は、処理後血小板混合物を樹脂と接触させる工程を包含する。限定されるものではないが、吸着剤、ポリスチレン、ポリアクリルエステル、シリカ、活性炭、およびポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）で被覆した活性炭を含めた、種々の樹脂が本発明で使用されることが企図される。別の具体例において、接触工程は、樹脂を含有するインラインカラムに血液製剤を灌流させる工程を包含する。さらにもう１つの具体例において、この方法は、さらに、血液製剤をインラインカラムに通した後に、血液製剤をインラインカラムと流体接触したフローアダプターに通す工程を包含する。
また、本発明は、生体適合性ハウジング、およびソラレンを除去できる樹脂を含有する該ハウジング内の区画を含む血液バッグを提供する。１つの具体例において、血液バッグは、さらに、該区画内に配され、かつ樹脂を含有するメッシュエンクロージャーを含み、ここに、該メッシュエンクロージャーは、血液製剤を樹脂と接触させるように適合させられる。メッシュエンクロージャーは該区画内の位置に指定することが企図される。
別の具体例において、該血液バッグは、さらに、該生体適合性ハウジングの外部に該生体適合性ハウジングと接触して設けられたパーティションを含み、ここに、該パーティションが血液製剤をメッシュエンクロージャーから分離し、所定の時間にバッグから該パーティションが取り出されて、血液製剤を樹脂と接触させるように該パーティションが適合させられる。さらにもう１つの具体例において、該血液バッグは、さらに、該生体適合性ハウジングと流体接触し、かつ５０〜１００μｍメッシュフィルターを有するフローアダプターを含む。本発明の樹脂は、限定されるものではないが、吸着剤、ポリスチレン、ポリアクリルエステル、シリカ、活性炭、およびポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート）で被覆した活性炭を含めた種々の物質を含むことが企図される。
種々の血液バッグが使用されることが企図される。血液バッグが特定タイプまたは入手源に限定する意図はない。事実、いずれの商業的入手源から得られた血液バッグも本発明で有用であることが企図される。また、本発明の光活性化装置はいずれの商業的入手源から得られるものであってもよいことが企図される。かくして、本発明はいずれか１つの入手源の血液バッグまたは光活性化装置に限定する意図はない。
本発明は、ａ）生体適合性ハウジング；ｂ）血液製剤からソラレンを除去できる樹脂であって、該樹脂は該生体適合性ハウジング内に含有される、樹脂；およびｃ）該生体適合性ハウジング内の樹脂を保持するための手段を含む、血液製剤のための容器を企図する。
また、本発明は、ａ）生体適合性ハウジング；ｂ）血液製剤からアミノソラレンを除去できる樹脂であって、該樹脂は該生体適合性ハウジング内に含有される、樹脂；およびｃ）該生体適合性ハウジング内の樹脂を保持するための手段を含む、血液バッグを企図する。
いくつかの具体例において、容器または血液バッグの保持手段は、生体適合性ハウジング内に配されたメッシュエンクロージャーを含み、該メッシュエンクロージャーは樹脂を含有し、該メッシュエンクロージャーは、血液製剤を樹脂と接触させるように適合させられる。さらなる具体例において、該メッシュエンクロージャーは３０μｍ孔を含む。特別の具体例において、該メッシュエンクロージャーはポリエステルを含む。
さらなる具体例において、容器または血液バッグは、さらに、流入口／流出口ラインを含む。なおさらなる具体例において、該保持手段は、流入口／流出口ライン中に位置付けされ、生体適合性ハウジングと流体連絡しているメッシュフィルターを含む。メッシュフィルターは特別の具体例では３０μｍ孔を含み、他方、メッシュフィルターのメッシュはさらにもう１つの具体例ではポリエステルを含む。
本発明の特別の具体例において、樹脂は吸着剤である。樹脂が吸着剤である場合、樹脂はある具体例ではポリマーを含む。該ポリマーはさらなる具体例においてポリスチレンであり得、該ポリスチレンはなおさらなる具体例において架橋されている。
ある具体例では、アミノソラレンは４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである。
また、本発明は、ａ）任意の順序で、ｉ）ソラレン、ｉｉ）光活性化手段、ｉｉｉ）病原体で汚染されたことが疑われるインビボ使用を意図した血液製剤を含有する第１の容器を供する工程、ｂ）ソラレンを第１の容器中の血液製剤に添加して特定の濃度のソラレンの溶液を生成する工程、ｃ）該溶液を光活性化手段で処理して処理後血液製剤を生成する工程であって、ここに病原体は不活性化され、ここに、ソラレン濃縮物の少なくとも一部は溶液中で遊離している、工程；および、ｄ）処理後血液製剤において溶液中に遊離しているソラレンの一部のいくらかを除去する工程を包含する、血液製剤中の核酸含有病原体を不活性化する方法も企図する。本発明は、溶液中の遊離しているソラレンの特定量の除去に限定されないことを強調しなければならない。事実、本発明は、溶液中の遊離しているソラレンの任意の部分の除去を企図する。
特別の具体例において、ソラレンは４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである。他の具体例において、ソラレンは臭素化される。臭素化ソラレンを用いる場合、臭素化ソラレンは５−ブロモ−８−メトキシソラレンまたは５−ブロモ−８−（ジエチルアミノプロピルオキシ）−ソラレンであり得る。さらに、ソラレンはいくつかの具体例では第四級アミンであり、該第四級アミンソラレンはなおさらなる具体例において４’−（トリエチルアミノ）メチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである。
本発明のいくつかの具体例では、該除去工程は、ｉ）生体適合性ハウジング、ｉｉ）血液製剤からソラレンを除去できる樹脂であって、該樹脂は該生体適合性ハウジングに含有される、樹脂；およびｉｉｉ）溶液中の遊離しているソラレン濃縮物の一部のうちのいくらかが処理後血液製剤において除去されるような条件下で、樹脂を生体適合性ハウジング内に保持する保持手段を含む第２の容器に、処理後血液製剤を移行させる工程を含む。
いくつかの具体例において、容器または血液バッグの保持手段は生体適合性ハウジング内に配されたメッシュエンクロージャーを含み、該メッシュエンクロージャーは樹脂を含有し、血液製剤を樹脂と接触させるように該メッシュエンクロージャーを適合させる。さらなる具体例において、メッシュエンクロージャーは３０μｍ孔を含む。特別の具体例において、該メッシュエンクロージャーはポリエステルを含む。
さらなる具体例において、容器または血液バッグは、さらに、流入口／流出口ラインを含む。なおさらなる具体例なおいて、保持手段は、流入口／流出口ライン中に位置付けされ、かつ生体適合性ハウジングと流体連絡したメッシュフィルターを含む。該メッシュフィルターは特別の具体例では３０μｍ孔を含む、メッシュフィルターのメッシュはなおさらなる具体例ではポリエステルを含む。
また、本発明は、ａ）任意の順序で、ｉ）病原体で汚染されていることが疑われる血液を供することができる、ドナー、ｉｉ）血液を血液製剤中に分離するための血液分離手段、ｉｉｉ）ソラレン、ｉｖ）光活性化手段、およびｖ）ソラレン除去手段を供する工程；ｂ）血液をドナーから採血し、血液を該血液分離手段に導入する工程；ｃ）アフェレーシスシステムで血液から血小板を単離する工程；ｄ）ソラレンを血液製剤に添加して特定の濃度のソラレンの溶液を生成する工程；ｅ）該溶液を光活性化手段で処理して処理後血液製剤を生成する工程であって、ここに病原体は不活性化され、ここに、ソラレン濃縮物の少なくとも一部は溶液中で遊離している、工程；および、ｆ）処理後血液製剤において溶液中に遊離しているソラレンの一部の実質的に全てを該ソラレン除去手段で除去する工程を包含する、血液製剤中の核酸含有病原体を不活性化する方法も企図する。
特別の具体例において、血液分離手段は、アフェレーシスシステムである。血液製剤は、ある具体例では血小板であり、他の具体例では血漿である。
いくつかの具体例では、ソラレン除去手段は、樹脂を含有するメッシュエンクロージャーを含み、血液製剤を樹脂と接触させるように該メッシュエンクロージャーを適合させる。該樹脂はいくつかの具体例では吸着剤である。樹脂が吸着剤である場合、それはさらなる具体例ではポリマーであってよい。特別の具体例では、該ポリマーはポリスチレンを含み、他方、なおさらなる具体例ではポリスチレンは架橋されている。
ソラレンはいくつかの具体例ではアミノソラレンであってよく、他の具体例では臭素化ソラレンであってよい。
加えて、本発明は、ａ）任意の順序で、ｉ）病原体で汚染されていることが疑われる血液を供することができる、ドナー、ｉｉ）血液から血小板を分離するためのアフェレーシスシステム、ｉｉｉ）アミノソラレン、ｉｖ）光活性化手段、およびｖ）ソラレン除去手段を供する工程；ｂ）血液をドナーから採血し、血液を該アフェレーシスシステムに導入する工程；ｃ）アフェレーシスシステムで血液から血小板を単離する工程；ｄ）血小板を含む血小板混合物を生成する工程；ｅ）アミノソラレンを血小板混合物に添加して特定の濃度のアミノソラレンの溶液を生成する工程；ｆ）該溶液を光活性化手段で処理して処理後血小板混合物を生成する工程であって、ここに病原体は不活性化され、ここに、アミノソラレン濃縮物の少なくとも一部は溶液中で遊離している、工程；および、ｇ）処理後血小板混合物において溶液中に遊離しているアミノソラレンの一部の実質的に全てをソラレン除去手段で除去する工程を包含する、血液製剤中の核酸含有病原体を不活性化する方法を企図する。
いくつかの具体例では、ソラレン除去手段は、樹脂を含有するメッシュエンクロージャーを含み、該メッシュエンクロージャーは、血小板混合物を樹脂と接触させるように適合させられる。該樹脂はいくつかの具体例では吸着剤である。樹脂が吸着剤である場合、それはさらなる具体例ではポリマーであってよい。特別の具体例では、該ポリマーはポリスチレンを含み、他方、なおさらなる具体例ではポリスチレンは架橋されている。最後に、該樹脂はなおさらなる具体例では湿潤プロセスに付される。
なおさらなる具体例では、アミノソラレンは４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである。
また、本発明は、ａ）任意の順序で、ｉ）病原体で汚染されていることが疑われる血液を供することができる、ドナー、ｉｉ）血液から血小板を分離するためのアフェレーシスシステム、ｉｉｉ）合成培地、ｉｖ）血小板収集容器、ｖ）４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン、ｖｉ）光活性化手段、およびｖｉｉ）ソラレン除去手段を供する工程；ｂ）血液をドナーから採血し、血液を該アフェレーシスシステムに導入する工程；ｃ）アフェレーシスシステムで血液から血小板を単離する工程；ｄ）一定の時間にわたって血小板容器中の血小板を収集する工程；ｅ）合成培地を血小板容器中の血小板に添加し、それにより、血小板および合成培地を含む血小板混合物を生成する工程；ｆ）４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンを血小板混合物に添加して、特定の濃度の４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン溶液を生成する工程；ｇ）該溶液を光活性化手段で処理して処理後血小板混合物を生成する工程であって、ここに病原体は不活性化され、ここに、４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン濃縮物の少なくとも一部は溶液中で遊離している、工程；および、ｈ）処理後血小板混合物において溶液中に遊離している４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンの一部の実質的に全てをソラレン除去手段で除去する工程を包含する、血液製剤中の核酸含有病原体を不活性化する方法を企図する。
いくつかの具体例において、合成培地はホスフェートを含む。なおさらなる具体例において、合成培地を一定の時間にわたって血小板に添加し、血小板は収集される。
いくつかの具体例において、ソラレン除去手段は、樹脂を含有するメッシュエンクロージャーを含み、該メッシュエンクロージャーは、血小板混合物を樹脂と接触させるように適合させられる。該樹脂はいくつかの具体例では吸着剤である。樹脂が吸着剤である場合、それはさらなる具体例ではポリマーであってよい。特別の具体例では、該ポリマーはポリスチレンを含み、他方、なおさらなる具体例ではポリスチレンは架橋されている。最後に、該樹脂はなおさらなる具体例では湿潤プロセスに付される。
定義
「血液製剤」なる用語は、身体の循環系を通る（赤血球、白血球、血小板等のごとき）流体および／または関連細胞要素等の全ての処方物をいい；血液製剤は、限定されるものではないが、血小板混合物、血清、および血漿を含む。「血小板混合物」なる用語は、細胞要素が主として血小板または血小板のみである血液製剤の１つのタイプをいう。血小板濃縮液（ＰＣ）は血小板が血漿の正常な一部よりも少ない血小板混合物の１つのタイプである。合成培地は血漿によって通常占められる容量を補ってよい；例えば、血漿濃縮物は３５％血漿／６５％合成培地中に懸濁した血小板を含意し得る。しばしば、合成培地はホスフェートを含む。
「光化学反応生成物」なる用語は、ソラレンが紫外線照射への曝露に際して受ける光化学反応から得られる生成物をいう。
「樹脂」なる用語は、溶液または流体（例えば、血液製剤）中のソラレンを含めた種々の要素と相互作用し、それに付着することができ、それにより、それらの要素を除去できる（ビーズ／粒子等のごとき）固体支持体をいう。除去プロセスは特定のメカニズムに限定されない。例えば、ソラレンは、吸着剤によって、または電荷（例えば、アフィニティー相互作用）によって除去することができる。「吸着剤樹脂」なる用語は、広く、天然有機物質および合成物質を共にいう。
種々の吸着剤樹脂は表面積、孔サイズ、化学的性質（例えば、ポリスチレンジビニルベンゼンおよびアクリルエステル）、極性等の点で異なって、特定の用途（例えば、医薬の吸着）で最適性能を可能とする。吸着剤樹脂は、カラム（このカラムを通して血液のような物質が灌流され得る）、およびメッシュによって規定される領域内に吸着剤樹脂を保持しつつ、吸着剤と物質との接触を可能とするサイズの開口を有するメッシュを含めた、多数の装備の中に充填することができる。
「ソラレン除去手段」なる用語は、ソラレンを例えば血液製剤から除去できる物質または装置をいう。ソラレン除去手段はソラレン光化学反応生成物のごとき血液製剤の他の成分を除去することもできる。好ましいソラレン除去手段は吸着剤樹脂である。
「インラインカラム」なる用語は、入力端部および出力端部を有し、その中に配された、血液製剤から物質類を除去するための物質を含有する、通常は円筒形状の容器をいう。本発明は、血液製剤からソラレンおよびソラレン光化学反応生成物を除去するための吸着剤樹脂が充填された少なくとも１ｍＬ、好ましくは５〜１０ｍＬの容量を有するカラムの使用を企図する。血液製剤は入力端部に入り、吸着剤樹脂と接触し、次いで、出力端部から出る。
「パーティション」なる用語は、全体をセクションまたは部分に分離または分割できる装置または要素のいずれのタイプもいう。例えば、本発明は、血液製剤を含有するのに適合した血液バッグを２つの部分に分割するパーティションの使用を企図する。血液製剤は処理に先立っておよび処理の間にバッグの１つの部分を占め、他方、吸着剤樹脂はもう１つの部分を占める。１つの具体例において、血液製剤の処理の後、パーティションを除去し（すなわち、区画の一体性を変え）、それにより、処理後血液製剤を吸着剤樹脂と接触させる。該パーティションはバッグの内部またはその外部上に位置させることができる。「パーティション」なる用語と共に使用する場合、「除去」なる用語は、血液バッグの２つの部分の隔離がもはや存在しないことを意味する；それは、パーティションが何らかの方法でバッグともはや結合しないことを必ずしも意味しない。
「フローアダプター」なる用語は、血液製剤のような特定の物質の流れを制御できる装置をいう。該フローアダプターは吸着剤樹脂材料片の通過を防ぐごとき、さらなる機能を行うことができる。
「樹脂保持手段」なる用語は、生体適合性ハウジングのような規定された領域に樹脂を拘束するいずれのメカニズムもいう。例えば、血小板貯蔵容器内に収容されたメッシュエンクロージャーを用いて、樹脂を容器内に保持することができる。同様に、フィルター（例えば、メッシュフィルター）は血液製剤貯蔵バッグの流入口／流出口ラインに位置させることができる。「流入口／流出口ライン」なる用語は、血液製剤貯蔵バッグに結合し、それと流体連絡したチューブをいう。バッグに結合された単一の流入口／流出口ラインまたは２つ以上のラインであってよい。
「メッシュエンクロージャー」、「メッシュポーチ」等の用語は、多数の孔を含有させるために製造したエンクロージャー、ポーチ、バッグ等をいう。例えば、本発明は、血液製剤を吸着剤樹脂に接触させるが、樹脂をポーチ内に保持するサイズの孔を持つ、吸着剤樹脂を含有するポーチを企図する。本発明の目的では、吸着剤含有メッシュエンクロージャーをＲＤという。好ましい具体例において、ＲＤは血液製剤貯蔵容器（例えば、血小板貯蔵容器）に収容される。本発明は、メッシュエンクロージャーが織られた、医療用グレードのポリエステルメッシュまたはナイロンのような他の適当な材料から構成されることを企図する。メッシュ材料の孔サイズの好ましい範囲はほぼ１０μｍないし５０μｍであり、他方、本発明の好ましい具体例はほぼ３０μｍの孔を持つメッシュを利用する。
「流体接触」、「流体結合」等の用語は、１の要素から他の要素に流動する流体成分（例えば、血液製剤）の能力をいう。例えば、血液成分は血小板バッグからチューブを通ってフローアダプターまで流動することができ、フローアダプターは血小板バッグと直接接触する必要はない。同様に、２つ以上の血液製剤容器の各々からのチューブは滅菌結合装置を用いて結合して（例えば、滅菌溶接）、流体が１の容器から他の容器に移動するのを可能とする。
「血液製剤を該樹脂と接触させるように適合させられる」なる語句は、樹脂が血液製剤からの成分（例えば、ソラレンおよびソラレン光化学反応生成物）を吸着できるように、血液製剤を樹脂と接触させ相互作用させる能力をいう。該語句はしばしば使用され、血液製剤貯蔵容器内に収容されたメッシュエンクロージャーの孔を通過する、血液製剤貯蔵容器内に含有された、ソラレン−および照射−処理された血液製剤の能力を記載し、そうする場合において、樹脂はソラレンおよびソラレン光化学反応生成物を吸着できる。
「振盪装置」なる用語は、血小板濃縮液のような血液成分を完全に混合できるいずれのタイプの装置もいう。該装置は、混合を特定の継続時間に制限するための計時メカニズムを有することもできる。
「生体適合性ハウジング」なる用語は、広く、全血、血小板濃縮液および血漿のごとき生物学的物質を含有するのに適したハウジング、容器、バッグ、収容器、収納具等をいう。適当な容器がその中に含有されるべき生物学的物質に対して、仮に有するとして、最小の効果を有する場合には、その適当な容器は生体適合性である。「最小」効果とは、有意な差異が対照実験と比較して観察されないことを意味する。かくして、血液製剤は受容者への輸液に先立って生体適合性ハウジングに貯蔵することができる。好ましい具体例において、生体適合性ハウジングは血小板貯蔵容器である。
「血液分離手段」なる用語は、広く、血液を血液製剤（例えば、血小板および血漿）に分離できる装置、機械等をいう。アフェレーシスシステムは血液分離手段の１つのタイプである。アフェレーシスシステムは、一般に、血液分離装置、チューブおよびフィルターの複雑なネットワーク、収集バッグ、抗凝集剤、および全ての成分を制御するコンピュータ化手段よりなる。血液分離装置は、最も一般的には、遠心機である。少なくとも１つのポンプを用いて、血液、分離された血液成分、および流体添加物を動かし、アフェレーシスシステムを通して、最後にはドナーまたは収集バッグに返す。いずれかの特定のタイプのアフェレーシスシステムに限定されるものではないが、本発明は、特に、特定量の所望の血液製剤混合物を収集できる自動システムの使用を企図する。
「単離する」なる用語は、１を超える成分を含有する混合物からある物質を分離することをいう。例えば、血小板は全血から分離することができる。単離された製品（例えば、血小板）は他の成分からのその製品の完全な分離を必ずしもいわない。例えば、アフェレーシスシステムによって単離された血小板は、しばしば、小容量の血漿と共にある。この例では、血小板は全血から分離されたとみなされるであろう。
「フィルター」なる用語は、広く、他の成分を保持しつつ、混合物に対する特定の成分を通すことができる装置、材料等をいう。例えば、フィルターは、樹脂粒子のごとき他の成分を保持しつつ、血液成分（例えば、血漿）を通すことができる孔サイズを持つメッシュを含むことができる。「フィルター」なる用語は、特定の成分が保持される手段に限定されない。
「ポリエステル」なる用語は、広く、［ポリ（エチレンテレフタレート）］を含む物質をいう。ポリエステル物質は限定的サイズの孔を持つメッシュ材料の形態であってよい。
「ポリマー」なる用語は、広く、繰り返される同一の「ベースユニット」の鎖から構成される物質をいう。該用語は「ポリスチレン網状組織」ということができる、スチレン（Ｃ６Ｈ５ＣＨ＝ＣＨ２）モノマーを含有する物質を含む。
「架橋した」なる用語は、広く、相互に結合して二次元または三次元ネットワークを形成する線状分子をいう。例えば、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）はスチレン−ジビニルベンゼンコポリマーの形成において架橋剤として働く。該用語は、超架橋ネットワークが、二官能性剤（後記）で、溶液または膨潤状態で線状ポリスチレン鎖を架橋することによって生じる「超架橋」も含む。
「アミノソラレン」「アミノ化ソラレン」などの用語は、炭化水素鎖によってソラレンの４’位（４’−第一級アミノ置換ソラレン）又は５’位（５−第一級アミノ置換ソラレン）に結合したＮＨ２基を含有するソラレン化合物を意味する。４’−第一級アミノ置換ソラレンでは、その炭化水素鎖の全長が２〜２０個の炭素であり、それら炭素の０〜６個は独立にＮＨ又は０で置換されていて、各置換点は他の各置換点から少なくとも２個の炭素によって隔てられており、ソラレンとは少なくとも１個の炭素によって隔てられている。４’−第一級アミノ置換ソラレンは、ソラレンの４、５’及び８位にさらに置換基を持ってもよく、その置換基としては次の基が挙げられる（ただしこれらに限らない）：Ｈおよび（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ここにｎ＝０〜６）。これに対して、５’−第一級アミノ置換ソラレンでは、炭化水素鎖の全長が１〜２０個の炭素であり、それらの炭素のうち０〜６個は独立にＮＨ又は０で置換されていて、各置換点は他の各置換点から少なくとも２個の炭素によって隔てられており、ソラレンとは少なくとも１個の炭素によって隔てられている。５’−第一級アミノ置換ソラレンは、ソラレンの４、４’および８位にさらに置換基を持ってもよく、その置換基としては次の基が挙げられる（ただしこれらに限らない）：Ｈおよび（ＣＨ２）ｎＣＨ３（ここにｎ＝０〜６）。
「臭素化ソラレン」という用語は、臭素（Ｂｒ）原子が結合しているソラレン化合物を意味する。好ましい臭素化ソラレンは５位に結合した臭素を含有する。臭素化ソラレンの例としては、５−ブロモ−８−メトキシソラレン及び５−ブロモ−８−（ジエチルアミノプロピルオキシ）−ソラレンが挙げられる。
本発明は、例えば以下の項目を提供する。
１．以下の工程を含む血液製剤中の核酸含有病原菌を不活性化させる方法：
ａ）任意の順序で、ｉ）ソラレン、ｉｉ）光活性化手段、ｉｉｉ）該病原菌に汚染されているこ
とが疑われるインビボでの使用の為の血液製剤、を提供する工程；
ｂ）該ソラレンを該血液製剤に添加して、ある濃度のソラレン溶液を調製する工程；
ｃ）該溶液を光活性化手段で処理し、処理血液製剤を調製する工程であって、該病原菌が
不活性化され、かつ該溶液中の該ソラレン濃度の少なくとも一部がフリーである、工程；および
ｄ）該処理血液製剤中の溶液でフリーである該ソラレン濃度の部分の実質的にすべてを除
去する工程。
２．前記除去工程が、前記処理血液製剤を樹脂に接触させる過程を含む、項目１に記載の
方法。
３．前記樹脂が吸着剤である、項目２に記載の方法。
４．前記樹脂がポリスチレンを含む、項目３に記載の方法。
５．前記樹脂がポリアクリルエステルを含む、項目３に記載の方法。
６．前記樹脂が活性炭を含む、項目３に記載の方法。
７．前記接触させる過程が、前記血液製剤を前記樹脂を含むインラインカラムに通して注
ぐことを含む、項目２に記載の方法。
８．前記接触させる過程が、前記樹脂を含むバッグ内で行われる、項目２に記載の方法。
９．前記樹脂が、前記バッグ中のメッシュエンクロージャーに含まれ、該メッシュエンク
ロージャーが前記血液製剤を該樹脂に接触させるように適合している、項目８に記載の方法。
１０．項目９に記載の方法であって、さらに、前記バッグの外側に接触するように備えら
れるパーティションを含み、該パーティションが、前記血液製剤を前記メッシュエンクロージャーから隔てるように適合しており、かつ該バッグから所定の時間に取り除かれるように適合している、方法。
１１．前記ソラレンが、４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである、項目１に記載の方法。
１２．前記血液製剤が、血小板を含む、項目１に記載の方法。
１３．前記血液製剤が、血漿を含む、項目１に記載の方法。
１４．血液の汚染除去システムであって、第一の血液バッグおよびソラレンを除去し得る
樹脂を含むインラインカラムを含み、該インラインカラムは、該第一の血液バッグとの流体的に連結するインプットエンド、アウトプットエンド、およびキャパシティを含む、血液の汚染除去システム。
１５．前記アウトプットエンドが、第二の血液バッグと流体的に接触している、項目１４
に記載のシステム。
１６．項目１５に記載のシステムであって、さらに、前記インラインカラムと流体的に接
触するよう配置され、かつ該インラインカラムの前記アウトプットエンドの後で、前記第二のバッグの前に配置されたフローアダプターを含む、システム。
１７．前記樹脂が吸着剤である、項目１４に記載のシステム。
１８．以下を含む血液バッグ：
ａ）生物学的適合性のハウジング；および
ｂ）ソラレンを除去し得る樹脂を含む、該ハウジング内のコンパートメント。
１９．さらに合成媒体を含む、項目１８に記載の血液バッグ。
２０．項目１８に記載の血液バッグであって、さらに、前記コンパートメント内に配置さ
れた、樹脂を含むメッシュエンクロージャーを含み、該メッシュエンクロージャーが血液製剤を該樹脂に接触させるように適合している、血液バッグ。
２１．項目２０に記載の血液バッグであって、さらに、前記生物学的適合性のハウジング
の外側に接触するように備えられたパーティションを含み、該パーティションが、前記血液製剤を前記メッシュエンクロージャーから隔てるように適合しており、かつ該バッグから所定の時間に取り除かれ、該血液製剤が該樹脂に接触するように適合している、方法。２２．前記樹脂が吸着剤である、項目１８に記載の血液バッグ。
２３．以下の工程を含む血液製剤中の核酸含有病原菌を不活性化させる方法：
ａ）任意の順序で、ｉ）該病原菌に汚染されていることが疑われる血液を提供しうるドナー、ｉｉ）該血液を血液製剤に分離する分離手段、ｉｉｉ）ソラレン、ｉｖ）光活性化手段、およ
びｖ）ソラレン除去手段、を提供する工程；
ｂ）該血液を該ドナーから取り、そして、該血液を該血液分離手段に導入する工程；
ｃ）該血液分離手段で、該血液から血液製剤を単離する工程；
ｄ）該ソラレンを該血液製剤に添加して、ある濃度のソラレン溶液を調製する工程；
ｅ）該溶液を光活性化手段で処理し、処理血液製剤を調製する工程であって、該病原菌が
不活性化され、かつ該溶液中の該ソラレン濃度の少なくとも一部がフリーである、工程；および
ｆ）該ソラレン除去手段で、該処理血液製剤中の溶液でフリーである該ソラレン濃度の部
分の実質的にすべてを除去する工程。
２４．前記血液分離手段が、アフェレーシスシステムである、項目２３に記載の方法。
２５．前記血液製剤が、血小板である、項目２３に記載の方法。
２６．前記血液製剤が、血漿である、項目２３に記載の方法。
２７．項目２３に記載の方法であって、前記ソラレン除去手段が、樹脂を含むメッシュエ
ンクロージャーを含み、該メッシュエンクロージャーが血液製剤を該樹脂に接触させるように適合している、方法。
２８．前記樹脂が吸着剤である、項目２７に記載の方法。
２９．前記樹脂がポリマーを含む、項目２８に記載の方法。
３０．前記ソラレンがアミノソラレンである、項目２３に記載の方法。
３１．前記アミノソラレンが、４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである、項目３０に記載の方法。
３２．前記ソラレンが、臭素化ソラレンである、項目２３に記載の方法。
３３．以下の工程を含む血液製剤中の核酸含有病原菌を不活性化させる方法：
ａ）任意の順序で、ｉ）該病原菌に汚染されていることが疑われる血液を提供しうるドナー、ｉｉ）血小板を該血液から分離するアフェレーシスシステム、ｉｉｉ）合成媒体、ｉｖ）血小
板回収コンテナ、ｖ）４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン、ｖｉ）光活性化手段、およびｖｉｉ）ソラレン除去手段、を提供する工程；
ｂ）該血液を該ドナーから取り、そして、該血液を該アフェレーションシステムに導入す
る工程；
ｃ）該アフェレーションシステムで、該血液から血小板を単離する工程；
ｄ）該血小板を血小板コンテナに所定の時間に回収する工程；
ｅ）該合成媒体を該血小板コンテナ中の血小板に加える工程であって、これによって、血
小板および合成媒体を含む血小板混合物をつくる、工程；
ｆ）４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンを該血小板混合物に添加して、ある濃度の４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチル
ソラレン溶液を調製する工程；
ｇ）該溶液を該光活性化手段で処理し、処理血小板混合物を調製する工程であって、該病
原菌が不活性化され、かつ該溶液中の４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−
トリメチルソラレン濃度の少なくとも一部がフリーである、工程；および
ｈ）該ソラレン除去手段で、該処理血小板混合物中の溶液でフリーである該４’−（４−ア
ミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン濃度の部分の実質的にすべてを
除去する工程。
３４．前記合成媒体がリン酸塩を含む、項目３３に記載の方法。
３５．項目３３に記載の方法であって、前記ソラレン除去手段が、樹脂を含むメッシュエ
ンクロージャーを含み、該メッシュエンクロージャーが、血小板混合物を該樹脂に接触させるように適合している、方法。
３６．前記樹脂が吸着剤である、項目３５に記載の方法。
３７．前記樹脂がポリマーを含む、項目３６に記載の方法。
３８．前記ポリマーがポリスチレンを含む、項目３７に記載の方法。
３９．以下を含む血液製剤用のコンテナ：
ａ）生物学的適合性のハウジング；
ｂ）該血液製剤からソラレンを除去し得る樹脂であって、該生物学的適合性のハウジング
内に含まれる、樹脂；および
ｃ）該樹脂を該生物学的適合性のハウジング内に保持する手段。
４０．項目３９に記載のコンテナであって、前記保持する手段が、前記生物学的適合性の
ハウジング内に配置されたメッシュエンクロージャーを含み、該メッシュエンクロージャーが、前記樹脂を含みかつ血液製剤を該樹脂に接触させるように適合している、コンテナ。
４１．さらに入口／出口ラインを含む、項目４０に記載のコンテナ。
４２．項目４１に記載のコンテナであって、前記保持する手段が、前記入口／出口ライン
中に、前記生物学的適合性のハウジングに流体的に連結するよう配置されたメッシュフィルターを含む、コンテナ。
４３．前記樹脂が、吸着剤である、項目３９に記載のコンテナ。
４４．前記ソラレンが、アミノソラレンである、項目３９に記載のコンテナ。
４５．前記アミノソラレンが、４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである、項目４４に記載のコンテナ。
４６．以下の工程を含む血液製剤中の核酸含有病原菌を不活性化させる方法：
ａ）任意の順序で、ｉ）ソラレン、ｉｉ）光活性化手段、ｉｉｉ）該病原菌に汚染されているこ
とが疑われるインビボでの使用の為の血液製剤を含む第一のコンテナ、を提供する工程；ｂ）該ソラレンを該第一のコンテナ中の該血液製剤に添加して、ある濃度のソラレン溶液
を調製する工程；
ｃ）該溶液を光活性化手段で処理し、処理血液製剤を調製する工程であって、該病原菌が
不活性化され、かつ該溶液中の該ソラレン濃度の少なくとも一部がフリーである、工程；および
ｄ）該処理血液製剤中の溶液でフリーである該ソラレン濃度の部分のいくらかを除去する
工程。
４７．前記ソラレンが、４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンである、項目４６に記載の方法。
４８．前記ソラレンが、臭素化されている、項目４６に記載の方法。
４９．前記臭素化ソラレンが、５−ブロモ−８−メトキシソラレンである、項目４８に記載の方法。
５０．前記臭素化ソラレンが、５−ブロモ−８−（ジエチルアミノプロピルオキシ）−ソラレンである、項目４８に記載の方法。
５１．前記ソラレンが、第四級アミンである、項目４６に記載の方法。
５２．前記第四級アミンソラレンが、４’−（トリエチルアミノ）メチル−４，５’，８−トリ
メチルソラレンである、項目５１に記載の方法。
５３．項目４６に記載の方法であって、前記除去工程が、前記処理血液製剤を第二のコン
テナに移す過程を包み、該第二のコンテナが、
ｉ）生物学的適合性のハウジング；
ｉｉ）該血液製剤からソラレンを除去し得る樹脂であって、該生物学的適合性のハウジング内に含まれる、樹脂；および
ｉｉｉ）該処理血液製剤から、溶液でフリーである前記ソラレン濃度の部分のいくらかが除
去されるような条件下で、該樹脂を該生物学的適合性のハウジング内に保持する手段。
５４．項目５３に記載の方法であって、前記保持する手段が、前記生物学的適合性のハウ
ジング内に配置されたメッシュエンクロージャーを含み、該メッシュエンクロージャーが、前記樹脂を含み、血液製剤を該樹脂に接触させるように適合している、方法。
５５．前記第二のコンテナが、さらに、入口／出口ラインを含む、項目５４に記載の方法
。
５６．項目５５に記載の方法であって、前記保持する手段が、前記入口／出口ライン中に、前記生物学的適合性のハウジングと流体的に連結するように配置されたメッシュフィルターを含む、方法。
図１は、本発明装置の一態様の透視図である。 図２は、図１に示す装置の線２−２に沿った断面図である。 図３は、図１に示す装置の線３−３に沿った断面図である。 図４は、図１に示す装置の線４−４に沿った断面図である。 図５Ａは、本発明の化合物８、１３および１４の合成経路および化学構造のダイヤグラムである。 図５Ｂは、本発明の化合物２、４および７の合成経路および化学構造のダイヤグラムである。 図５Ｃは、本発明の化合物１、５、６、９および１０の合成経路および化学構造のダイヤグラムである。 図５Ｄは、本発明の化合物１２および１５の合成経路および化学構造のダイヤグラムである。 図５Ｅは、本発明の化合物３の合成経路および化学構造のダイヤグラムである。 図５Ｆは、本発明の化合物１６および１７の合成経路および化学構造のダイヤグラムである。 図６は、本発明の化合物１〜３を光活性化した場合の対数Ｒ１７の死滅に対する濃度のインパクトを示す。 図７は、本発明の化合物３〜６を光活性化した場合の対数Ｒ１７の死滅に対する濃度のインパクトを示す。 図８は、本発明の化合物２および６を光活性化した場合の対数Ｒ１７の死滅に対する濃度のインパクトを示す。 図９は、本発明の化合物６および１８を光活性化した場合の対数Ｒ１７の死滅に対する濃度のインパクトを示す。 図１０は、本発明の化合物１６を光活性化した場合の対数Ｒ１７の死滅に対する濃度のインパクトを示す。 図１１は、本発明の化合物６についての対数Ｒ１７滴定値に対する変化するジュール／ｃｍ２（ワット秒／ｃｍ２）の照射のインパクトを示す。 図１２は、本発明の化合物７、９および１０についての対数Ｒ１７滴定値に対する変化するジュール／ｃｍ２の照射のインパクトを示す。 図１３は、本発明の化合物７および１２についての対数Ｒ１７滴定値に対する変化するジュール／ｃｍ２の照射のインパクトを示す。 図１４は、本発明の化合物１５についての対数Ｒ１７滴定値に対する変化するジュール／ｃｍ２の照射のインパクトを示す。 図１５は、本発明の化合物１７についての対数Ｒ１７滴定値に対する変化するジュール／ｃｍ２の照射のインパクトを示す。 図１６は、本発明の化合物６および１７についての対数Ｒ１７滴定値に対する変化するジュール／ｃｍ２の照射のインパクトを示す。 図１７は、本発明の化合物６および１５についての対数Ｒ１７滴定値に対する変化するジュール／ｃｍ２の照射のインパクトを示す。 図１８は、血漿における、本発明の化合物２および６の変化させる濃度の効果を示す。 図１９は、合成培地における、本発明の化合物２および６の変化させる濃度の効果を示す。 図２０Ａは、血液バングで現在使用される標準的血液製剤分離アプローチを模式的に示す。 図２０Ｂは、本発明の具体例を模式的に示し、それにより、合成培地を図２０Ａにおけるごとく調製した血小板濃縮液に導入する。 図２０Ｃは、図２０Ｂにおけるごとき合成培地で希釈した血小板濃縮液に特異的に適用した本発明の除染アプローチの１の具体例を模式的に示す。 図２１Ａは、血小板カウントによって測定した血小板機能に対する５日貯蔵（Ｄ５）、紫外線（ｕｖ）および１００μＭでの化合物２での処理（ＰＣＤ）の影響を比較するグラフである。「ｎ」はデータポイントによって表される実験の番号を表す。図２１Ｂは、血小板凝集によって測定した血小板機能に対する５日貯蔵（Ｄ５）、紫外線（ｕｖ）および１００μＭでの化合物２での処理（ＰＣＤ）の影響を比較するグラフである。「ｎ」はデータポイントによって表される実験の番号を表す。 図２１Ｃは、ＧＭＰ−１４０によって測定した血小板機能に対する５日貯蔵（Ｄ５）、紫外線（ｕｖ）および１００μＭでの化合物２での処理（ＰＣＤ）の影響を比較するグラフである。「ｎ」はデータポイントによって表される実験の番号を表す。図２１Ｄは、ｐＨによって測定した血小板機能に対する５日貯蔵（Ｄ５）、紫外線（ｕｖ）および１００μＭでの化合物２での処理（ＰＣＤ）の影響を比較するグラフである。「ｎ」はデータポイントによって表される実験の番号を表す。 図２２Ａは、血小板カウントによって測定した血小板機能に対する５日貯蔵（Ｄ５）、紫外線（ｕｖ）および１００μＭでの化合物６での処理（ＰＣＤ）の影響を比較するグラフである。「ｎ」はデータポイントによって表される実験の番号を表す。図２２Ｂは、血小板凝集によって測定した血小板機能に対する５日貯蔵（Ｄ５）、紫外線（ｕｖ）および１００μＭでの化合物６での処理（ＰＣＤ）の影響を比較するグラフである。「ｎ」はデータポイントによって表される実験の番号を表す。 図２２Ｃは、ＧＭＰ−１４０によって測定した血小板機能に対する５日貯蔵（Ｄ５）、紫外線（ｕｖ）および１００μＭでの化合物６での処理（ＰＣＤ）の影響を比較するグラフである。「ｎ」はデータポイントによって表される実験の番号を表す。図２２Ｄは、ｐＨによって測定した血小板機能に対する５日貯蔵（Ｄ５）、紫外線（ｕｖ）および１００μＭでの化合物６での処理（ＰＣＤ）の影響を比較するグラフである。「ｎ」はデータポイントによって表される実験の番号を表す。 図２３Ａは、血小板カウントによって測定した血小板機能に対する５日貯蔵（Ｄ５）、紫外線（ｕｖ）および１００μＭでの化合物１７での処理（ＰＣＤ）の影響を比較するグラフである。「ｎ」はデータポイントによって表される実験の番号を表す。図２３Ｂは、血小板凝集によって測定した血小板機能に対する５日貯蔵（Ｄ５）、紫外線（ｕｖ）および１００μＭでの化合物１７での処理（ＰＣＤ）の影響を比較するグラフである。「ｎ」はデータポイントによって表される実験の番号を表す。 図２３Ｃは、ＧＭＰ−１４０によって測定した血小板機能に対する５日貯蔵（Ｄ５）、紫外線（ｕｖ）および１００μＭでの化合物１７での処理（ＰＣＤ）の影響を比較するグラフである。「ｎ」はデータポイントによって表される実験の番号を表す。図２３Ｄは、ｐＨによって測定した血小板機能に対する５日貯蔵（Ｄ５）、紫外線（ｕｖ）および１００μＭでの化合物１７での処理（ＰＣＤ）の影響を比較するグラフである。「ｎ」はデータポイントによって表される実験の番号を表す。 図２４Ａは、血小板カウントよって測定した血小板機能に対する５日貯蔵（Ｄ５）、紫外線（ｕｖ）および１００μＭでの化合物１８での処理（ＰＣＤ）の影響を比較するグラフである。「ｎ」はデータポイントによって表される実験の番号を表す。図２４Ｂは、血小板凝集よって測定した血小板機能に対する５日貯蔵（Ｄ５）、紫外線（ｕｖ）および１００μＭでの化合物１８での処理（ＰＣＤ）の影響を比較するグラフである。「ｎ」はデータポイントによって表される実験の番号を表す。 図２４Ｃは、ＧＭＰ−１４０よって測定した血小板機能に対する５日貯蔵（Ｄ５）、紫外線（ｕｖ）および１００μＭでの化合物１８での処理（ＰＣＤ）の影響を比較するグラフである。「ｎ」はデータポイントによって表される実験の番号を表す。図２４Ｄは、ｐＨよって測定した血小板機能に対する５日貯蔵（Ｄ５）、紫外線（ｕｖ）および１００μＭでの化合物１８での処理（ＰＣＤ）の影響を比較するグラフである。「ｎ」はデータポイントによって表される実験の番号を表す。 図２５Ａは、経時的な血小板によるＳ−５９（Ｃ０＝５０μＭ）摂取（頂部）および経時的な血小板によってＳ−５９放出（底部）をグラフ表示する。 図２５Ｂは、吸着剤の添加の前における、Ｓ−５９と共に２４時間プレインキュベートするまたはしない、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭ（０．１ｇ／３．０ｍＬ）による３５％血漿／６５％ＰＡＳ ＩＩＩからの光照射Ｓ−５９（Ｃ０＝１５０μＭ）の吸着の動態をグラフ表示する。 図２６は、１ｃｍ直径のカラムにおけるＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６ＴＭ（１０ｇ／３００ｍＬ）でのＳ−５９吸着に対する流速の効果を示すグラフである。３５％血漿／６５％ＰＡＳ ＩＩＩにおける血小板に対するデータを四角で示す一方、３５％血漿／６５％ＰＡＳ ＩＩＩに対するデータを丸で示す；塗りつぶしていない三角はＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ｃｇ−１６１ＴＭ（１２０直径ポリスチレン、５ｇ／３００ｍＬ）でのＳ−５９吸着の残存レベルを示す。 図２７は、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭ（１０ｇ／３００ｍＬ）を３５％血漿／６５％ＰＡＳ ＩＩＩにおける照射血小板と接触させるバッチ式についての吸着の動態をグラフ表示する。パーセントは非照射血小板混合物に対するものである。 図２８Ａは、処理無し（頂部）、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６ＴＭでの吸着（中央）、およびＨｅｒｍｏｓｏｒｂａ ＣＨ−３５０ＴＭ（底部）後における、照射３５％血漿／６５％ＰＡＳ ＩＩＩのＨＰＬＣクロマトグラムを示す。 図２８Ｂは、非照射Ｓ−５９（頂部）、照射Ｓ−５９（中央）、およびＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭで処理した照射Ｓ−５９（底部）を含有する３５％血漿／６５％ＰＡＳ ＩＩＩのＨＰＬＣクロマトグラムを示す；吸着剤は３０μｍナイロンメッシュエンクロージャー／ポーチに含有され、接触時間は３時間であった。 図２９は、カートリッジを通して灌流されるＳ−５９でスパイクした血漿の容量の関数としての吸着から逃げる（破過として示す）Ｓ−５９のパーセントを示す；２つの異なる流速（２．５ｍＬ／分および５．０ｍＬ／分）における１００％血漿中の非照射Ｓ−５９（１５０μＭ）を示す。 図３０Ａは、Ｈｅｒｍｏｓｏｒｂａ ＣＨ−３５０ＴＭおよびシリカでのＳ−５９ ＰＣＤおよびＳ−５９除去後のフィブリノーゲンレベルをグラフ表示する；非照射および照射試料を共に分析した。 図３０Ｂは、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭ、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６ＴＭ、およびＢｉｏ−Ｒａｄ ｔ−ブチルＨＩＣＴＭでのＳ−５９ ＰＣＤおよびＳ−５９除去後のおけるフィブリノーゲンレベルをグラフ表示する；非照射および照射試料を共に分析した。 図３０Ｃは、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭ、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６ＴＭ、およびＢｉｏ−Ｒａｄ ｔ−ブチルＨＩＣＴＭでのＳ−５９ ＰＣＤおよびＳ−５９除去後のおけるＰＴ、ａＰＴＴ、およびＴＴ凝集機能をグラフ表示する；非照射および照射試料を共に分析した。 図３０Ｄは、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭ、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６ＴＭ、およびＢｉｏ−Ｒａｄ ｔ−ブチルＨＩＣＴＭでのＳ−５９ ＰＣＤおよびＳ−５９除去後のおける第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子、および第ＩＸ因子活性をグラフ表示する；非照射および照射試料を共に分析した。 湿潤溶液のエタノール含有量および１０分間の得られた吸着剤の吸着容量の間の関係をグラフ表示する。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４（丸）およびＸＡＤ−１６（四角）吸着剤でのバッチ式湿潤プロセス。 図３２は、３５％血漿、６５％ＰＡＳ ＩＩＩからのＳ−５９の除去が、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６についての水含有量の低下と共に減少することをグラフ表示する。 図３３は、室温および標準的湿度における２７時間のインキュベーションの間の室温および標準的湿度における２７時間のインキュベーションの間のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６（四角）およびＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４（丸）による水の減少をグラフ表示する。 図３４Ａおよび３４Ｂは、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４の２つの異なるロットによる３５％血小板濃縮液からのＳ−５９の除去についての吸着動態に対するγ線照射（四角＝０Ｍｒａｄ；丸＝５Ｍｒａｄ；三角＝１０Ｍｒａｄ）による滅菌の効果をグラフ表示する。 図３４Ａおよび３４Ｂは、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４の２つの異なるロットによる３５％血小板濃縮液からのＳ−５９の除去についての吸着動態に対するγ線照射（四角＝０Ｍｒａｄ；丸＝５Ｍｒａｄ；三角＝１０Ｍｒａｄ）による滅菌の効果をグラフ表示する。 図３５Ａおよび３５Ｂは、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６の２つの異なるロットによる３５％血小板濃縮液からのＳ−５９の除去についての吸着動態に対するγ線照射（四角＝０Ｍｒａｄ；丸＝５Ｍｒａｄ；三角＝１０Ｍｒａｄ）による滅菌の効果をグラフ表示する。 図３５Ａおよび３５Ｂは、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６の２つの異なるロットによる３５％血小板濃縮液からのＳ−５９の除去についての吸着動態に対するγ線照射（四角＝０Ｍｒａｄ；丸＝５Ｍｒａｄ；三角＝１０Ｍｒａｄ）による滅菌の効果をグラフ表示する。 図３６は、湿潤（暗い陰影）および乾燥（明るい陰影）状態双方における吸着剤についてのＳ−５９吸着定数をグラフ表示し、パーセントは各試料における水の量をいう。 図３７は、除去装置を血小板貯蔵容器内に含ませる方法を示す本発明の除去装置を示す。 図３８は、バッチ式除去装置の製造で使用される工程の多くの生産フローチャートを示す。 図３９は、Ｓ−５９ならびに３．０Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡでの照射に続く、ＰＣ（３５％血漿／６５％ＰＡＳ ＩＩＩ、１５０μＭのＳ−５９［１５．２ｍｇ／３００ｍＬ］）において形成されたＳ−５９光化学反応生成物のＨＰＬＣクロマトグラムを表す。 図４０は、主要Ｓ−５９光化学反応生成物ピーク：ｉ）Ｓ−５９（ＨＰＬＣピークＦ）、ｉｉ）Ｓ−５９のヘテロダイマー（ＨＰＬＣピークＤ）、およｉｉｉ）Ｓ−５９のホモダイマー（ＨＰＬＣピークＥ）の化学構造を示す。 図４１は、ＵＶＡでの照射前における（頂部）、ＵＶＡの照射後における（中央）、およびＵＶＡの照射およびＤｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３を含有するＲＤとの８時間インキュベーション後における（底部）Ｓ−５９および遊離光化学反応生成物のレベルを示す、１５０μＭのＳ−５９（１５．２ｍｇ／３００ｍＬ）を含有し、ＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）内に収容されたＰＣのクロマトグラムを示す。 図４２は、完全なＰＣ（すなわち、血小板を含有するＰＣ）からの未結合光化学反応生成物Ｄ、ＥおよびＳ−５９の除去の動態を示す。 図４３は、血漿／ＰＡＳ ＩＩＩ中の未結合光化学反応生成物の別の分析を可能するための血小板を除去するのに遠心機にかけたＰＣからの未結合光化学反応生成物Ｄ、ＥおよびＳ−５９の除去の動態を示す。 図４４は、本発明の実験のいくつかで使用する３つの異なるソラレンの化学構造を示す：ソラレンＡ［４’−（トリエチルアミノ）−メチル−４，５’，８−トリメチルソラレン］；ソラレンＢ［５−ブロモ−８−メトキシソラレン；およびソラレンＣ［５−ブロモ−８−（ジエチルアミノプロピル）−ソラレン］
スキームＡは、ＵＶＡの照射後における３５％血漿／６５％ＰＡＳ ＩＩＩに懸濁させた、血小板中のＳ−５９の分布をダイヤグラム表示する。
スキームＢは、必要な吸着剤の量に対する最終Ｓ−５９濃度の効果を示すグラフである（初期濃度、Ｃ０＝３０μＭおよび容量、Ｖ＝３００ｍＬ）。各曲線についての「Ｋ値」は凡例にリストする。
スキームＣは、バッチ式ＲＤについての２つの可能な構成を示す。構成Ａは２バッグ設計を示し、他方、構成Ｂは単一バッグ設計を示す。
スキームＤはＳ−５９還元プロセスをダイヤグラム表示する。Ｓ−５９を含有するＰＣを照射した後、ＲＤを収容する容器にＰＣを移し、撹拌しつつインキュベートして、残存Ｓ−５９および未結合光化学反応生成物の量の時間依存性還元を行い、次いで、貯蔵容器に移す。
スキームＥは、本発明のＲＤの一の具体例を使用できる仮想アフェレーシスシステムの操作をまとめるフローダイアグラムを示す。
スキームＦは、ＰＡＳ ＩＩＩを血小板収集手法の間に添加する、本発明の別の具体例を示す。
スキームＧは、ＰＡＳ ＩＩＩをＳ−５９と組合せ、次いで、血小板収集手法の間に添加する本発明の別の具体例を示す。
発明の説明
本発明は紫外線存在下で病原体を不活性化する能力を高める新しいソラレンと新しいソラレン合成方法を示している。新しいソラレンは幅広い種類の病原体に対して効果的である。本発明はまた、インビボおよびインビトロで使用する健康関連の製品、特に血液製剤において、血液製剤の機能に著しく影響を及ぼすことも変異原性を示すこともなしに、病原体を不活性化するための新しいおよび既知の試薬を使った方法を示している。
本発明に記した、不活性化法は病原体、特にインビトロまたはインビボで使用される前に血液製剤中のウイルスを不活性化する方法である。これまでのアプローチに対して、この方法は短い照射時間のみを要求し、分子酸素濃度を制限することを必要としない。
本発明の記述は次に示すセクションに分けられる：Ｉ）光活性化装置、ＩＩ）化合物合成、ＩＩＩ）核酸への化合物の結合、ＩＶ）夾雑物の不活性化、Ｖ）処理された物質の生化学的特性の保存、ＶＩ）ソラレンおよびソラレン光化学反応生成物を除去する装置および方法、ＶＩＩ）吸着におけるソラレン構造特性の効果、およびＶＩＩＩ）バッチ式ソラレン除去装置の製造。
Ｉ．光活性化装置
本発明は、光活性化のための、装置と方法、特に光反応性の核酸結合化合物の光活性化の装置と方法を企図する。本発明はユニット中に組み込まれた電磁放射線の安価な供給源をもつ装置企図する。一般に、本発明はａ）少なくとも一つの光反応性化合物の光活性化を引き起こす電磁放射線の適した波長を提供する手段、ｂ）光活性化の間、上記放射提供手段と一定の関係で、複数の試料を支持する手段、およびｃ）光活性化の間、希望する温度範囲の中で試料の温度を維持する手段、を含む光反応性化合物を処理するための光活性化装置を企図する。本発明はまた、ａ）電磁放射線の蛍光供給源と一定の関係で、一つあるいは複数の光反応性化合物を含んだ複数の試料容器を支持する工程、ｂ）少なくとも一つの光反応性化合物の光活性化を引き起こす電磁放射線と同時に複数の試料容器を照射する工程、およびｃ）光活性化の間に希望の温度範囲の中で試料の温度を維持する工程を包含する方法を企図する。
本発明における装置の一具体例の大きな特徴は、Ａ）試料容器を支持する手段と一定の関係で紫外線放射の安価な供給源、Ｂ）素早い光活性化、Ｃ）大量の試料の処理、Ｄ）照射された試料の温度制御、Ｅ）固有の安全性を含んでいる。
Ａ．電磁放射線の供給源
多くの紫外線照射の供給源は、ソラレンを使った除染プロトコルで使用することができる。例えば、あるグループは、冷却のためにその領域をゆっくりと電気扇風機で風を送りながら、Ｇｅｎｅｒａｌ ＥｌｅｃｔｒｉｃのタイプＦ２０Ｔ１２−ＢＬＢ蛍光ＵＶＡ電球によって上および下から試料に照射している。Ａｌｔｅｒ，Ｈ．Ｊ．，ら．Ｔｈｅ Ｌａｎｃｅｔ．２４：１４４６（１９８８）．他のグループは、ウイルスの試料の上で、試料を含むペトリ皿のふたに直接接触するようにＰ．Ｗ．Ａｌｌｅｎ Ｃｏ．，Ｌｏｎｄｏｎ社製のＴｙｐｅ Ａ４０５−ＴＬＧＷ／０５長波長紫外線ランプを使用し、室温で作動させた。
これらの条件下での試料へ送達される全強度はペトリ皿中で１．３×１０１５ フォトン／秒 ｃｍ２（または０．７ｍＷ／ｃｍ２または０．０００７Ｊ／ｃｍ２ ｓｅｃ）であった。Ｈｅａｒｓｔ，Ｊ．Ｅ．，およびＴｈｉｒｙ，Ｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，４：１３３９（１９７７）．しかしながら、任意のタイプの光活性化装置に制限されることを意図することなく、本発明は以下に示すように、光活性化装置への適した改良を企図する。
本発明の好ましい光活性化装置は、試料容器を支持する手段と一定の関係で紫外線放射の安価な供給源をもっている。紫外線放射は電磁放射線スペクトル（宇宙線から電波までの電磁放射線スペクトル）の一部を占めるエネルギー形態である。紫外線放射は多くの自然および人工の供給源に由来する。
紫外線照射の供給源によっては、他（非紫外線）の型の電磁放射線（例えば、可視光線）を伴うかもしれない。
紫外線放射の特別な種類については、波長の点から本明細書中で述べられる。波長はナノメートル（「ｎｍ」；１０−９メートル）として本明細書中で述べられている。本明細書中における目的に対して、紫外線放射は、およそ１８０ｎｍから４００ｎｍまで及ぶ。フィルターまたは他の手段によって、放射源が特有の波長（例えば、３２０ｎｍ）より下での放射を許容しない場合、その波長において下限「カットオフ（遮断）」をもっているという（例えば、「３００ナノメートルで波長をカットオフ」）。同様に、放射源が特有の波長（例えば、３６０ｎｍ）より下での放射を許容する場合、その波長（例えば、３６０ナノメートルで波長をカットオフ）において上限「カットオフ（遮断）」をもっているという。
任意の光化学反応について、いずれの害のある副反応を排除または極力最小限にしたいと考える。これらの副反応の一部は光活性化行程の間に存在できる内在性の発色団の励起によって引き起こされる。核酸とソラレンだけが存在する系において、内在性の発色団は核酸の塩基それ自身である。核酸による３１３ｎｍより長波長側の吸収はほとんど無いため、光活性化プロセスを３２０ｎｍより長波長側の波長に制限することが、直接的な核酸のダメージを最小限にする。
ヒトの血清または血漿においては、例えば、核酸は典型的には、さらなる生物構成要素とともに存在する。
もし、生物学的流体が全くのタンパク質なら、３２０ｎｍでの遮断は副反応を最小限にするには適切である（芳香族アミノ酸は３２０ｎｍより大きい光は吸収しない）。
もし、生物学的流体が他の分析物を含むならば、光の特別な波長に対して敏感な構成要素があるかもしれない。それらの内在的構成要素の存在を考慮して、特異的かつ望ましい波長の狭い範囲内での照射を可能にし、このように血液構成成分へのダメージを防ぐように本発明の装置は設計されていることが意図される。その望ましい波長の範囲は３２０ｎｍと３５０ｎｍの間である。
ある選択性は、市販の照射源から選ぶことによっても可能である。例えば、典型的な蛍光チューブが３００ｎｍから４００ｎｍよりさらに長波長側にわたる波長の光を放つ一方（３６０ｎｍ付近を中心に幅広いピークがある）、ＢＬＢタイプの蛍光ランプは４００ｎｍより大きい波長を取り除くように設計されている。しかし、これは単に上端の遮断を行っているだけである。
よりよい実施態様においては、本発明の装置は付加的なフィルター手段を含む。１つの実施様態では、フィルター手段は一片のコバルトガラスのようなガラス遮断フィルターを含む。もう一つの実施様態では、フィルター手段はＣｏ（ＮＯ３）２水溶液のように特定領域の電磁スペクトルのみを通す液体フィルター溶液を含む。この塩溶液により３２０〜４００ｎｍの透過領域が生じる。よりよい実施態様において、Ｃｏ（ＮＯ３）２水溶液は、使用される蛍光またはアーク源の発光スペクトルの３６５ｎｍ成分を取り除くためにＮｉＳＯ４と組み合わせて用いられる。そのＣｏ−Ｎｉ溶液は何十時間も高エネルギー源の直接光にさらした後でさえ、初期の透過能を非常によく保つ。
本発明を、使用される特別なフィルターにより制限するつもりはない。いくつかの無機塩およびガラスは必要とされる条件を満たす。例えば、紫外線のみを分離しなくてはならないとき、硫酸銅（ＩＩ）は赤外線を取り除くのに最も有用な一般的フィルターである。その強烈な光源における安定性はかなり良い。他の塩についても専門家に知られている。レンズの口径または反射ランプもまた、特異的な波長および強度を達成するのに用いられ得る。
本明細書中において、紫外線放射が照射の点で記されるとき、それは強度束によって表現される（センチ四方あたりミリワット、または「ｍＷ ｃｍ−２」または「Ｊ／ｃｍ２ｓｅｃ」）。本明細中において「出力」とは照射レベルならびに、放射線の発光（はいまたはいいえ、オンまたはオフ）の両方を含むものと定義される。
よりよい実施態様において、強度は照射平面の各側に対して２カ所の計４カ所でモニターされる。
紫外線放射のよりよい供給源は蛍光源である。蛍光とは発光の特別な事例である。
発光は、物質による電磁放射線の吸収、及び異なる波長の放射へのエネルギー変換を伴う。蛍光の場合、電磁放射によって励起された物質は、電磁放射の量子を放射することによって基底状態にもどる。従来から蛍光源は強度が低すぎて光活性に有用でないと考えられているが、本発明では実施態様の一つとして、今までは高価な装置でしか達成できなかった結果を達成する蛍光源を採用している。
ここで言う、一定の関係とは、試料照射の間、試料と光源の間の一定の距離と幾何状態を含むものと定義される。距離は、それが支持されているため光源と試料との間の距離に関係する。点源からの光強度は、点源からの距離の２乗に反比例していることが知られている。このように、光源からの距離における小さな変化が、強度について大きな影響を与え得る。強度の変化は光活性化の結果に影響をもたらし得るため、本発明の装置において、そうした距離の変化を回避するように工夫されている。これにより、再現性と反復可能性が得られる。
幾何状態とは光源のポジショニングに関係する。例えば、光源は試料ホルダーの周りで多くの様式（側面に、底部に、環状に、など）で配置し得ると想定できる。本発明のよりよい実施態様に用いられた幾何状態は、迅速な光活性化のための適切な強度の一様な露光を可能にする。本発明のよりよい装置の幾何状態は、単一の点源とは対照的に、直線状のランプの複数の供給源を含む。加えて、いくつかの反射面と吸収面がある。この複雑な幾何状態によって、照射される試料の位置に対するランプの位置または数の違いによる強度変化は、そのような変化が強度変化をもたらすという点で回避されるべきである。
Ｂ．迅速な光活性化
本発明のよりよい実施態様における光源は、迅速な光活性化を可能にする。照射装置の強度特性は、複数の試料の多くのセットを処理する必要があり得るという予想のもと、都合の良いものが選ばれている。この予想のもと、１５分の露光時間またはそれ以内が実際上の目標である。
本発明の装置を設計するにあたり、よりよい装置の構成要素の相対的な位置は、およそ１５分という照射時間を可能にするよう最適化されている。その結果、３２０ｎｍと３５０ｎｍの間の波長を測定するとき、およそ１ｍＷｃｍ−２（０．００１Ｊ／ｃｍ２ｓｅｃ）以上の強度束が試料容器に与えられる。
Ｃ．多数の試料の処理
既に述べたように、本発明の光活性装置におけるもうひとつの重要な特徴は、多数の試料の処理を提供するということである。この点で、本発明の装置における一つの構成要素は、複数の血液バッグを支持する手段である。本発明におけるよりよい実施態様において、支持手段は光源の両側に位置した血液バッグサポートを含む。一般的に使用されている市販のバッグを受容することにより、本発明の装置は多数の試料を都合の良い処理を可能にする。
Ｄ．温度コントロール
既に述べたように、本発明の光活性化装置の重要な特徴の１つは温度コントロールである。温度コントロールは重要である、というのも、露光する時の試料の温度はその結果に劇的に影響を及ぼし得るからである。例えば、核酸での二次構造を促進する条件もまた、核酸に対する多くのソラレン誘導体の親和定数を高める。ＨｙｄｅおよびＨｅａｒｓｔ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１７，１２５１（１９７８）．これらの条件は溶媒の組成と温度の両方の混ざったものである。一本鎖５ＳリボゾームＲＮＡに関しては、低温での照射は２０℃と比較して４℃ではＨＭＴの５ＳｒＲＮＡへの共有結合的付加が２倍に増す。Ｔｈｏｍｐｓｏｎら，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１４７：４１７（１９８１）．温度により引き起こされるソラレンの結合のさらなる増進さえも合成ポリヌクレオチドに関して報告されている。Ｔｈｏｍｐｓｏｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２１：１３６３（１９８２）。
Ｅ．固有の安全性
紫外線の放射は深刻なやけどを引き起こし得る。露光の性質次第では発ガン性となり得る。本発明のよりよい実施態様の光源は使用者から遮蔽されている。これは、大規模な高強度の光源、ならびに、市販のハンディータイプの紫外線源とも対照的である。よりよい実施態様において、照射源はその放射エネルギーの伝達を妨げる物質でできた覆い（すなわち、不伝導性の覆い）内に収容されている。
使用者に伝わる照射はない。これは、使用者に対する独自の安全性を念頭に入れているからである。
ＩＩ．化合物の合成
Ａ．一般の光活性化合物
「光活性化合物」（または「光反応性化合物」）は、電磁放射への応答において化学変化を受ける化合物ファミリーと定義する。表１は光活性化合物の一部分を記した表である。
本明細書中において述べられている、先取権のある光化学反応化合物は、通常フロクマリンと呼ばれる。特に、本発明では、ソラレンつまり、［７Ｈ−フロ（３，２−ｇ）−（１）−ベンゾピラン−７−オンまたは６−ヒドロキシ−５−ベンゾフランアクリル酸のβ−ラクトン］といわれるこれらの化合物を企図する。
これらの化合物は直線状で、中心の芳香環に付いた２つの酸素残基は、１、３に配向している。さらに、フラン環部分は、２環から成るクマリン系の６位に結合している。
ソラレン誘導体は、３、４、５、８、４’、または５’位で直線状フロクマリンを置換することにより誘導される。
８−メトキシソラレン（文献では、キサントトキシン，メトキサレン、８−ＭＯＰなど様々な名前で記されている）は、天然由来のソラレンであり、核酸に比較的弱く光活性化結合し、エイムスアッセイにおいては弱い変異原性をもつ。これについては以下の実験セクションで記述する。４’−アミノメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（ＡＭＴ）は、３．５ＤＮＡ塩基対当たり１ＡＭＴ付加生成物までという条件においては、最も反応性に富む核酸結合ソラレン誘導体の一つである。Ｓ．Ｔ．Ｉｓａａｃｓ，Ｇ．ＷｉｅｓｅｈａｈｎおよびＬ．Ｍ．Ｈａｌｌｉｃｋ，ＮＣＩ Ｍｏｎｏｇｒａｐｈ ６６：２１（１９８４）しかしながら、ＡＭＴはかなりのレベルの変異原性も示す。８−ＭＯＰおよびＡＭＴ双方の最良の特徴、つまり、病原体の完全な不活性化と安全を確保するための低い変異原性と高い核酸結合性をもつ、新しいソラレンのグループが求められた。本発明においては、このような特徴をもつ化合物の設計を行った。
「４’−第一級アミノ置換ソラレン」は以下のように定義されるソラレン化合物である。ソラレンの４’位に、２から２０個の炭素の全長を有する炭化水素鎖によってＮＨ２基がつながっており、これらの炭素のうち０から６個は独立にＮＨまたは０に置換される。さらに、各置換部位は、他の置換部位から少なくとも炭素二つ分離れており、また、ソラレンから少なくとも炭素一つ分離れている。４’−第一級アミノ置換ソラレンは、ソラレンの４、５’および８位にさらなる置換があり得、この置換基としては、限定はされないが、Ｈおよび（ＣＨ２）ｎＣＨ３（式中ｎ＝０〜６）の群が挙げられる。
「５’−第一級アミノ置換ソラレン」は以下のように定義されるソラレン化合物である。ソラレンの５’位に、１から２０個の炭素の全長を有する炭化水素鎖によってＮＨ２基がつながっており、これらの炭素のうち０から６個は独立にＮＨまたは０に置換される。さらに、各置換部位は、他の置換部位から少なくとも炭素二つ分離れており、また、ソラレンから少なくとも炭素一つ分離れている。５’−第一級アミノ置換ソラレンは、ソラレンの４、４’および８位にさらなる置換があり得、この置換基としては、限定はされないが、Ｈおよび（ＣＨ２）ｎＣＨ３（式中ｎ＝０〜６）の群が挙げられる。
Ｂ．ソラレンの合成
本発明は、本発明の新しい化合物の合成法と、これまでに知られている中間体の新しい合成法を企図する。特に、その新しい化合物とは、モノ、ジ、もしくはトリアルキル化４’−第一級アミノ置換ソラレン、またはモノ、ジ、もしくはトリアルキル化５’−第一級アミノ置換ソラレンである。このセクションで議論されるスキームのいくつかの例が図５Ａ〜５Ｆに示してある。参考のため、本明細書で議論されるソラレン誘導体に対して用いられている学名を、表２に示す。化合物１〜１８についてはまた、その構造を図５Ａ〜５Ｆに描いてある。このセクション（「Ｂ．ソラレンの合成」と題する）では、化合物を同定するために使用されるローマ数字はスキーム１〜６のみに該当しており、表２および図５Ａ〜５Ｆの化合物番号には該当しないことに注意すること。
最初に、本発明で述べる化合物の多くを合成するのに有用な種々の中間体の合成について述べるのが最も論理的である。この本発明は４，５’，８−トリメチル−４’−第一級アミノ置換ソラレンまたは４，４’，８−トリメチル−５’−第一級アミノ置換ソラレンに限ったものではないが、トリメチルソラレンおよびテトラメチルソラレン、４’−ハロメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン、および５’−ハロメチル−４，４’，８−トリメチルソラレンを含む重要な中間体もある。これらの不安定な中間体の調製はなかなかの難題である。
中間体の合成
４’−クロロメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（４’−ＣＭＴ）および４’−ブロモメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（４’−ＢｒＭＴ）の前合成は、市販されている４，５’，８−トリメチルソラレン（５’−ＴＭＰ）（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から始めるか、または、他のアルキル化ソラレンについては、以下に述べる４つのステップで調製することができる。高発癌性で揮発性のクロロメチルメチルエーテルを大量に（２０〜５０当量）用いることによって、５’−ＴＭＰは、４’−ＣＭＴに転換される。クロロメチルメチルエーテルまたはブロモメチルメチルエーテルを用いた４，５’，８−トリアルキルソラレンのハロメチル化については、Ｈｅａｒｓｔに対する米国特許第４１２４５９８号で記述されている。臭素化合物である４’−ＢｒＭＴは同様に、幾分か揮発性のより低いブロモメチルメチルエーテルを用いて調製される。必要とする中間体はわずか３０〜６０％の収率で得られる。５’−クロロメチル−４，４’，８−トリメチルソラレン（５’−ＣＭＴ）および５’−ブロモメチル−４，４’，８−トリメチルソラレン（５’−ＢｒＭＴ）は、異性体の出発化合物である、４，４’，８−トリメチルソラレン（４’−ＴＭＰ）を用いて同様に調製した［Ｋａｕｆｍａｎに対する米国特許第４，２９４，８２２号；ＭｃＬｅｏｄら「ベンゾフラノイド系の合成。Ｉ．フロクマリン、ベンゾフランおよびジベンゾフラン」、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２３７（１９７２）］。
本明細書中においては、より改良した生産方法を記載する。注意深く反応条件を調節しながら、同じソラレン前駆体から、ブロモメチルトリアルキルソラレンの異性体のどちらかを合成する。スキーム１を見よ。
４，８−ジアルキル−７−ヒドロキシクマリンと２−クロロ−３−ブタノンを典型的な塩基性条件下で反応させると、４，８−ジアルキル−７−（１−メチル−２−オキソ）プロピルオキシクマリン（Ｉ）を生ずる。この物質は、水酸化ナトリウムの水溶液中で加熱することにより環化し、４，８−ジアルキル−４’，５’−ジメチルソラレン（ＩＩ）となる。４個置換されたソラレンとＮ−ブロモスクシンイミドを室温から１５０℃までで溶媒中で処理すると、使用された条件に応じて４’または５’位が臭素化する。ジベンゾイルペルオキシドのような触媒が加えられる場合もあるが、それは必ずしも必要ではない。もしその溶媒として、四塩化炭素を還流させて用いたら、４，８−ジアルキル−５’−ブロモメチル−４’−メチルソラレン（ＩＶ）が５０％またはそれ以上生産される。もし塩化メチレンを室温で用いたら、４，８−ジアルキル−４’−ブロモメチル−５’−メチルソラレン（ＩＩＩ）のみが８０％以上生ずる。その他の溶媒でもベンゾイルの臭素化は起こりえる。その場合、異性体の一つを純品または混合物として生産する。これらの溶媒には１，２−ジクロロエタン、クロロホルム、ブロモトリクロロメタン、およびベンゼンが挙げられるが、これらに限定した訳ではない。
４’−置換ソラレンの合成の一般的手法
現在では、線状ソラレンのサブクラスである４，５’，８−トリアルキルソラレンは以下のように合成できる。４，８−ジアルキルクマリンは、２−アルキルレゾルシノールと３−オキソアルカノエートエステルからＰｅｃｈｍａｎｎ反応（Ｏｒｇａｎｉｃ Ｒｅａｃｔｌｉｏｎｓ ＶＯＬ ＶＩＩ，Ｃｈａｐ １，Ａｄａｍｓら編，Ｗｉｌｅｙ，ＮＹ（１９５３））によって調製される。水酸基は、アリル化試薬であるＣＨ２＝ＣＨＸ−ＣＨ（Ｒ）−Ｙで処理される（式中、Ｘは、ハロゲン化物または水素であり、Ｙはハロゲン化物またはスルホネートであり、Ｒは水素または（ＣＨ２）ＶＣＨ３であり、ここでＶは、０〜４の整数である）。その結果として生ずるアリルエーテルのクライゼン転移によって、４，８−ジアルキル−６−アリル−７−ヒドロキシクマリンができる。クマリンは、いくつかの以前に書かれた方法の一つに類似した方法を用いると、４，５’，８−トリアルキルソラレンに変換される（すなわち、Ｂｅｎｄｅｒら，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．４４：２１７６（１９７９）；Ｋａｕｆｍａｎｎ，米国特許第４，２３５，７８１号および同４，２１６，１５４号を参照のこと。また、これらは本明細書で参考として援用される。）。
４，５’，８−トリメチルソラレンは天然の産物で市販品として入手できる（Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｍｉｗａｕｋｅｅ ＷＩ）。
５’−置換ソラレンの合成の一般的スキーム
４，４’，８−トリアルキルソラレンも、これまでに論じた４，８−ジアルキル−７−ヒドロキシクマリンから始めて２段階で調製できる。クマリンを塩基性の条件下でα−クロロケトンで処理すると、４，８−ジアルキル−７−（２−オキソアルコキシ）クマリンを生ずる。この中間物から４，４’，８−トリアルキルクマリンへの環化は、水性塩基中で加熱することにより起こる。
長鎖４’−（ω−ハロアルキル）トリアルキルソラレン（本明細書においては長鎖４’−ＨＡＴＰと呼ぶ）は、アルキル基は（ＣＨ２）２基から（ＣＨ２）１０基までのものから選ばれ、別に論じているフリーデル−クラフツ条件（ＯｌｈａおよびＫａｈｎ，Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，１９６４，２９，２３１７；フリーデル−クラフツ反応およびそれに関係する反応，ＶＯＬ．ＩＩ，ｐａｒｔ ２，Ｏｌａｈ編，Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ，１９６４，ｐ７４９）下で調製できる。ハロメチル中間体とアミンの反応（例えば、Ｈｅａｒｓｔら．，米国特許第４，１２４，５９８号）、およびアルコールとの反応（例えば、Ｋａｕｆｍａｎｎ，米国特許第４，２６９，８５２号）はすでに書かれているが、第一級アミンの伸長鎖形成についてはたった２報の原案報告書のみしか存在しない。それらは、４’−クロロメチル−４，５’，８−トリメチルソラレンとＨ２Ｎ−（ＣＨ２）ｎ−ＮＨ２（ｎ＝２，４，６）の反応（Ｌｅｅ，Ｂ．ら、「ソラレン由来のオリゴデオキシリボヌクレオシドメチルホスフェートと一本鎖ＤＮＡとの相互作用（Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｐｓｏｒａｌｅｎ−Ｄｅｒｉｖａｔｉｚｅｄ Ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅ Ｍｅｔｈｙｌｐｈｏｓｐｈｏｎａｔｅｓ ｗｉｔｈ Ｓｉｎｇｌｅ−Ｓｔｒａｎｄｅｄ ＤＮＡ）」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７；３１９７（１９８８））、ならびに、４’−クロロメチル−４，５’，８−トリメチルソラレンとＨ２ＮＣＨ２ＣＨ２ＳＳＣＨ２ＣＨ２ＮＨ２との反応（Ｇｏｌｄｅｎｂｅｒｇ，Ｍ．，ら．，「新規ソラレン誘導体の合成と特性（Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｏｆ Ｎｏｖｅｌ Ｐｓｏｒａｌｅｎ Ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｓ）」、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７；６９７１（１９８８））を記載する。核酸光反応の結果生じる化合物の有用性は、今まで報告されていない。これらの物質の特性（例えば、減少した変異原性）は、ＡＭＴのような以前に調製された化合物について公知であることに基づいて予期できないものである。
いくつかの合成経路を以下のスキーム２に示す。まず４’−ＨＡＴＰから始め、過剰のビスヒドロキシ化合物ＨＯ−（Ｂ）−ＯＨと、ハロメチルより長い炭素鎖としての塩基と、ニートかアセトンのような溶媒中かのどちらかで２０〜８０℃で反応させると（ω−ヒドロキシアルコキシ）アルキルソラレンが生ずる（式中、Ｂは、アルキル鎖（例えば、ＨＯ−（Ｂ）−ＯＨは１，３−プロパンジオール）もしくはモノエーテル（例えば、ジエチレングリコール）もしくはポリエーテル（例えば、テトラエチレングリコール）のどれかである）。
末端の水酸基は、いろいろな条件下（例えば、Ｌａｒｏｃｋ，「分かりやすい有機置換（Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎｓ）」，ＶＣＨ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，ＮＹ，１９８９を参照）でアミノ基に変換できる。とりわけ、水酸基は、メタンスルホン酸エステルに転換し得る（構造ＶＩ）。これは、その後エタノールが還流しているときアジドに転換し構造ＶＩＩのように、アジドは最終的にアミンに還元される（例えば２、４、７の化合物）。本明細書中に記載の方法は、還元のためにＴＨＦ中でトリフェニルホスフィンと水を利用するが、他の方法が企図される。
構造ＶＩＩの調製に適した方法によると、４’−ＨＡＴＰと、末端位に保護したアミノ基を含む（例えば、フタルイミド基）第一級直鎖アルコールを、ＤＭＦのような適した溶媒中で、２５〜１５０℃で反応させるとＩが生ずる。アミンは、標準的な条件で脱保護されてＶＩＩを生成する（例えば、ヒドラジンまたは水性ＭｅＮＨ２はフタルイミド基を脱保護する［ベンジルヒドラジンのような高級アルキルヒドラジンもまた企図される。］）
逆にいうと、構造ＶＩはジアミンＮＨ２−（Ｂ’）−ＮＨ２（構造ＶＩ）と反応できて、最終生産物として化合物ＶＩＩＩを生ずる（例えば、化合物８、１３および１４）（Ｂ’は、アルキル鎖（例えば、１，４−ブタンジアミン）、モノエーテル（例えば、３−オキサ−１，５−ペンタンジアミン）またはポリエーテル（例えば、３，６−ジオキサ−１，８−オクタンジアミン）を示す）。この反応は、ジアミンを過剰に加え、アセトニトリル中で還流することで起こるが、他の溶媒や温度でも同様に起こりえる。
最終反応物のうち、炭素鎖がソラレン環の４’位にオキシアルキル基［Ｏ（ＣＨ２）Ｗ］で結合したものよりもむしろアミノアシル基［ＮＨ（ＣＨ２）Ｗ］で結合したものが望まれる場合もある。これらの化合物の合成経路を以下の図３に示す。この窒素と末端の窒素の間の結合が、他に全く窒素が存在せずに（ＣＨ２）サブユニットと酸素のみを含む場合（構造Ｘ）（例えば化合物１、５、６、９、１０および１１）には、その生成物は４’−ＨＡＴＰ及び構造ＩＸの適当なジアミンから都合よく調製され得る。この方法は、構造ＸＩＩのポリアミン（例えば、ノルスペルミジンあるいはスペルミン［Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）から市販されている］）から始まる、窒素を鎖中に２個より多く含む最終生産物（構造ＸＩＩＩ）（例は化合物１２および１５である。）にも適用可能である。けれども、この場合は異性体構造物もかなりの量で形成される。構造ＸＩＩＩの調製のための好ましい方法は、構造ＸＩＩのポリアミンとシアノ水素化ホウ素ナトリウムのような還元試薬でのソラレン−４’−アルカナール（ＸＩ）の還元的アミノ化である。この還元的アミノ化は、化合物Ｘの合成にも適用できる。カルボキシアルデヒド（構造ＸＩ、ｗ＝０）は４’−ハロメチル化合物の加水分解、及び、得られた４’−ヒドロキシメチル化合物のその後の酸化によって、以前に調製されている（Ｉｓａａｃｓら，Ｊ．Ｌａｂｅｌｌｅｄ Ｃｍｐｄｓ，Ｒａｄｉｏｐｈａｒｍ，１９８２，１９，３４５）。これらの化合物も、ホルムアミドおよびＰＯＣｌ３と、または、酸中でのヘキサメチレンテトラアミンと、４’−ヒドリド化合物との配合によって都合よく調製できる。長鎖アルカナールは４’−ＨＡＴＰ化合物から、末端のハロ基をアルデヒド官能基に転換することによって調製できる（例えば、Ｄｕｒｓｔ，Ａｄｖ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．６：２８５（１９６９））。
その他の最終生産物は末端のアミンがアルキル鎖によってソラレンに結合している。以下のスキーム４に示すように、４’−ＨＡＴＰとフタルイミドカリウムまたはアジドとの反応、及び以前に示した通りの所望のアミンのその後の遊離か、あるいは４’−ＨＡＴＰのシアニド化合物への転換、および、例えばＮａＢＨ４−ＣＦ３ＣＯ２Ｈでの還元のいずれかによって、これらの化合物（構造ＸＩＶ）（一つの例として化合物３）が調製される。
４，５’，８−トリアルキルソラレンから４’−アミノ官能基化−４，５’，８−トリアルキルソラレンへの転換についての議論は、４位及び／もしくは８位が水素だけで置換される場合に同じように十分当てはまり、したがって、４’−第一級アミノ置換−５’，（４または８）−ジアルキルソラレンおよび４’−第一級アミノ置換−５’−アルキルソラレンが得られる。
５’誘導体の合成
これまでに示した条件で、４，４’，８−トリアルキルソラレンまたは４，４’，８−トリアルキル−５’−メチルソラレンは５’−（ω−ハロアルキル）−４，４’，８−トリアルキルソラレン（本明細書においては５’−ＨＡＴＰと呼ぶ）に転換される。以下のスキーム５に詳しく示す（Ｋａｕｆｍａｎ，米国特許第４，２９４，８２２号および同４，２９８，６１４号を参照）。
４，４’，８−トリアルキルソラレンから５’−第一級アミノ置換−４，４’，８−トリアルキルソラレンへの変換についての議論は、４位、４’位および／または８位が単に水素で置換される場合に同じように十分当てはまり、したがって、４位、４’位および／または８位にアルキル基を有する、５’−第一級アミノ置換−ジアルキルソラレンおよび５’−第一級アミノ置換−アルキルソラレンが得られる。
４’−第一級アミノソラレンおよび５’−第一級アミノソラレンの合成についての上記の考察は、直鎖でないクマリン、具体的には、イソソラレンまたはアンゲリシンにも拡張できる。このように４’−ハロメチルアンゲリシン（ＸＩＸ）および５’−ハロメチルアンゲリシン（ＸＸ）は、それに似た直鎖の物質と似た手法で調製され得る（スキーム６を見よ）。上記に示した合成経路と同様にして、アルキル鎖が一つ以上の酸素原子および窒素原子を含有し得る４’−（ω−アミノ）アルキルアンゲリシンおよび５’−（ω−アミノ）アルキルアンゲリシンの合成法が予想できる。
ＩＩＩ．化合物の核酸への結合
本明細書は、新規の化合物および既知の化合物と、ウイルス及び細菌の核酸（それに限った訳ではない）などの核酸との結合を企図する。光活性化合物と核酸の結合に対する一つのアプローチとして光結合がある。光結合とは、光活性化する波長の光の存在下での光結合化合物の結合として定義される。
光結合化合物とは、光活性化する波長の光の存在下で核酸と結合する化合物である。本発明は、本発明の光結合化合物と光結合する方法を企図する。
光結合についての本発明の一具体例は、以下の工程を含む、ａ）本発明の光結合化合物を供給する工程と、ｂ）その光結合化合物と核酸を、光活性化する波長の電磁放射線の存在下で混合する工程を包含する。
本発明はさらに核酸を修飾する方法を企図しており、この方法は、ａ）本発明の光結合化合物と核酸を供給する工程と、ｂ）化合物：核酸複合体が形成されるように光結合化合物を核酸に光結合させる工程を包含する。本発明の化合物が複製を妨げるいずれかの方法に制限されることを意図することなく、化合物：核酸複合体の構造が、化合物が結合した領域で必要なポリメラーゼが作用するのを妨げることによって、核酸の複製を妨げると考えられる。
ＩＶ．病原体の不活性化
本発明は、血液製剤を光活性化合物で処理すること、および血液製剤を使う前に汚染した病原体の核酸配列を不活性化するために照射することを企図する。
Ａ．一般的な不活性化
「不活性化」という言葉はここでは、病原体の一個体の複製を不可能にするために、その個体の核酸を変化させることと定義される。これは、与えられた試料中に存在するすべての病原体の個体が複製を不可能にされる「完全な不活性化」や、存在する病原体の個体のほとんどが複製を不可能にされる「実質的な不活性化」とは区別される。化合物の「不活性化効率」は、その化合物が、所与の濃度で達成しうるまたは照射の線量で達成しうる、不活性化のレベルと定義される。例えば、１００μＭの仮想の化合物ＸがＨＩＶウイルスを５対数不活性化させるのに対して同濃度の化合物Ｙが同じ実験条件でウイルスを１対数しか不活性化しない場合、化合物Ｘは化合物Ｙよりも「不活性化効率」が良いことになる。
「不活性化」の方法が「完全な不活性化」を達成し得るかし得ないかを評価する為には、特定の例を考えることは有用である。細菌の培養では、その細菌の培養のアリコットを新鮮なプレート培地に移し成長させたとき、一定時間後に検出可能でない場合、不活性化しているといわれる。生存可能な細菌の最小の数が、検出できるシグナルとしてプレートに用いられなければならない。最適な検出方法では、これの最小数は１つの細菌細胞である。準最適な検出方法では、シグナルが観察されるように利用された細菌細胞の最小数は、１よりはるかに大であり得る。検出方法は、「限界（閾）」を決定し、限界（閾）未満では「不活性化法」が完全に効果的であるように思われる（限界（閾）より上での「不活性化」は、実際には、部分的にだけ効果がある。
Ｂ．潜在する病原体の不活性化
核酸への不活性化法における感度の限界を決定する際に、検出方法とその限界に対する同様の配慮が要求される。再度繰り返すが、「不活性化」とは１個体の病原体が複製を不可能にされることを意味する。
人によって物質が使われる不活性化法の場合、インビトロであろうとインビボであろうと、その検出方法は、その物質への曝露の結果としての、病気の感染レベルの測定であると理論的に考えられうる。次いで、その限界未満では不活性化法が完全である限界は、物質と接触することに起因して病気が起きるのを防ぐのに十分な不活性化レベルであると考えられる。この実用的なシナリオでは、本発明の方法が「完全な不活性化」をもたらすことが必須ではないことが認識される。つまり、いわゆる「実質的な不活性化」は、生存可能な部分が、病気を引き起こすには不十分である限りは適切である。
したがって、残存している病原体の生存可能ないずれかの部分が病気を引き起こすのに不十分である場合、病原体の「実質的に全て」が不活性化される。本発明の不活性化方法は、病原体の核酸を実質的に不活性化する。一つの具体例として、血液製剤中の病原体の核酸を実質的に不活性化する。
本発明の化合物が病原体を不活性化するいずれの方法にも限定されることを意図することなく、不活性化は、病原体の核酸へのソラレンの、光に誘発された結合に起因すると考えられる。更に、本発明の不活性化法は核酸の性質によって限定されるものではないことが意図される一方で、不活性化法はすべての形態の核酸（ＤＮＡ，ｍＲＮＡなど）を実質的に不活性化することが企図される。
光活性化合物を核酸修飾に用いる際、病原体の核酸（ＤＮＡ，ｍＲＮＡなど）と光活性化合物との相互作用は、好ましくは病原体の複製を防止し、その結果、人が処置後の病原体にさらされても感染は起きない。
「合成培地」は本明細書中において合成血液、または血液製剤貯蔵培地と定義される。一実施態様として、本発明は緩衝化生理食塩水を含む合成培地中で血液製剤の不活性化を企図する。この方法は血液製剤への損害を減少させ、大変低濃度での光活性化合物の使用を可能にする。
ソラレン光不活性化法は血液中に存在する病原体に基づく核酸を単一の手順によって不活性化する。それ故に、細菌、原生生物、およびウイルスを同様に除外する潜在能力を有する。効果的な除染法がＡＩＤＳの世界的流行の出現以前から利用可能であったのであれば、輸血に連同したＨＩＶの伝達が起こっていなかったであろう。ソラレンに基づく除染は、含有される病原体に関係なく、血液供給からすべての感染因子を除去する潜在能力を有する。加えて、ソラレンに基づく除染は収集および処理後の血液製剤を滅菌する能力を有し、血小板濃縮液においては低いレベルの細菌汚染の問題を解決し、貯蔵寿命を引き延ばす結果となり得た。Ｍｏｒｒｏｗ Ｊ．Ｆ．らＪＡＭＡ ２６６：５５５−５５８（１９９１）；Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉ Ｆ．らＴｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３２：１５２−１５６（１９９２）
１つまたは複数のソラレン誘導体によって光化学的に不活性化されるウイルスのリストを表３に示す（Ｈａｎｓｏｎ，Ｃ．Ｖ．Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ １８：７（１９９２）の表１から）。このリストは網羅的ではなく、単にソラレンが不活性化できる多種多様な病原体のうちの代表的なものだけを示している。本発明は本明細書中に述べられている化合物による、これら、およびその他のウイルスの不活性化を企図する。本発明の化合物は特にＨＩＶウイルスのようなエンベロープウイルスを不活性化することにとても適している。
Ｃ．病原体不活性化のための光不活性化合物の選択
本発明の光化学除染（ＰＣＤ）法において有用である化合物を評価するために２つの重要な特性が考慮された。すなわち１）病原体を不活性化する化合物の能力、および２）その変異原性である。病原体を不活性化する化合物の能力はいくつかの方法によって決定し得る。１つの技術はバクテリオファージスクリーンを行うことである。すなわち試験化合物の核酸結合を決定するアッセイである。このタイプのスクリーン、すなわちｒ−１７スクリーンは下記実施例１２の項目で詳細に述べる。もしｒ−１７スクリーンで不活性化活性を示すならば、ウイルスを不活性化する化合物の能力を直接試験するのに有用である。直接的なウイルス不活性化スクリーンを行う１つの方法を、細胞を含まないＨＩＶについての下記実施例１３の項目において詳細に述べる。
Ｒ１７バクテリオファージスクリーンは、ＨＩＶ不活性化効率と同様にその他多くのウイルスに対する化合物の効率についても予測可能であると考えられている。Ｒ１７が選ばれ、それは、不活性化することが大変難しい病原体であると予想されていたからである。それは小さく、一本鎖ＲＮＡウイルスである。本発明が実行するいずれかの手段に限定されることを意図するものではなく、短い核酸断片を不活性化することは、長い核酸断片を不活性化するよりもソラレン付加物を形成する高い頻度を要求するために難しいと予想されている。さらに一本鎖ＲＮＡ病原体を不活性化することはより困難である。なぜならソラレンが二本鎖核酸の場合と同じように塩基対の間に挿入され得もせず、鎖内架橋として機能する二付加物を形成し得もしないからである。それ故にＲ１７の不活性化が達成されれば、同条件において多くのウイルスおよび細菌の不活性化がもたらされると予想される。
セルフリーＨＩＶスクリーンは、ｒ−１７にポジテイブな化合物が実際にウイルス不活性化に効果的であることを肯定することによって、ｒ−１７スクリーンを相補する。それ故に、もし化合物がｒ−１７スクリーンにおいて活性を示せば、次にウイルス不活性化スクリーンで試験される。
本発明の方法に用いられる化合物の試験において重要な２つめの特性は変異原性である。最も広く用いられる変異原／発ガン物質スクリーニングアッセイはエイムス試験である。このアッセイはＤ．Ｍ．ＭａｒｏｎおよびＢ．Ｎ．ＡｍｅｓによってＭｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１３：１７３（１９８３）に述べられており、具体的なスクリーンは下記実施例１７の項目に述べる。エイムス試験は、成長についてヒスチジン要求性であり、かつ通常のＤＮＡ修復酵素を欠損させたＳａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍのいくつかの特異的な株を利用する。細菌をヒスチジン非要求性にする変異の頻度（自発的復帰変異の頻度）は低い。つまり、この試験は化合物の影響を復帰変異の頻度で評価するのである。
いくつかの物質はそれら自身では突然変異誘発性を示さず、代謝作用によって変異原に転換されるため、試験される化合物は、肝臓抽出物に加えて寒天培地上の細菌と混合される。肝臓抽出物は動物の代謝作用を模倣するのに役立つ。対照実験プレートは細菌と抽出物のみである。
混合物は保温され、（もしあれば）細菌の成長はコロニー計数によってチェックされる。エイムス試験におけるポジテイブとは化合物を含むプレート上のコロニー数が、対照実験プレート上のコロニー数を大幅に上回ったときを指す。
既知の発ガン物質をエイムス試験によってスクリーンすると約９０％がポジテイブになる。既知の非発ガン物質に同様の試験を行うと約９０％がネガテイブになる。
表４に示す通り、新しい化合物（Ｘ）は潜在的な血液の光除染化合物として評価され得る。Ｘは最初に工程Ｉで評価される。Ｘは実施例１２に説明するように４〜３２０μＭの間のいくつかの異なる濃度においてｒ−１７アッセイでスクリーンされる。もし化合物が任意の濃度でのｒ−１７スクリーンにおいて、ｒ−１７の１対数の不活性化（対数 死滅）よりも大きな不活性化活性を示すならば、その化合物は実施例１３に説明するセルフリーＨＩＶアッセイでスクリーンされる。もし化合物がセルフリーＨＩＶアッセイにおいてＨＩＶの１対数不活性化（対数 死滅）よりも大きな不活性化活性を示すならば、その化合物およびＡＭＴはエイムスアッセイでスクリーンされる。最後に、もし化合物がエイムスアッセイにおいてＡＭＴよりも低い変異原性を示すならば、新しい化合物は病原体の不活性化に対する有用な薬剤として認定される。
これらの指示に従うことにより、いずれの化合物が本発明の方法における使用に適しているかを迅速に決定することができる。
Ｄ．光不活性化のための化合物の配送
本発明は、本明細書中において述べられる化合物が不活性化法で配送され得るための、いくつかの異なった処方物および経路を企図する。この欄は単に実例であり、化合物を導入するいずれの方法、または形状も発明を制限することは意図されない。
本発明の化合物はいくつかの形状において不活性化法に導入し得る。化合物は、水溶液、食塩水、「ＳｔｅｒｉｌｙｔｅＴＭ ３．０」（下記の実施例セクションの最初に示される内容）のような合成培地、またはその他の溶媒状態において導入し得る。化合物はさらに、アジュバントの有無に関わらず乾燥処方物として供給し得る。
新しい化合物はまた多くの異なった経路によって供給され得る。例えば、化合物は製造時において血液バッグのような反応器に導入され得る。他方、化合物は反応器に移された後の滅菌された材料に加えられ得る。さらに化合物は単一、または「カクテル」、またはいくつかの異なった化合物の混合物として導入し得る。
Ｖ．処理された原料の生物学的特性の保存
インビボで使用するための血液製剤を扱う場合、２つの要因が、使用する化合物および方法を開発する際に最も重要である。まず使用されるプロセスまたは化合物が、処理された材料のインビボにおける活性を変えるかどうかを問わねばならない。例えば、血小板輸血は血小板減少症の患者の出血に対する有効な治療として十分確立されている。しかしながら、用いられる除染処理が血小板の凝固活性を著しく減少させるのであれば、その処理に実用的な意義はないことになる。ソラレンは不活性化手順において有用であり、それはその反応が血液および血液製剤の生物学的特性の保持できる温度範囲内で実施可能であるからである（Ｈａｎｓｏｎ．Ｃ．Ｖ．，Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌｓ １８：７（１９９２））。しかし、すべてのソラレンまたは方法が、除染された物質の生物学的活性を著しく低下させずに除染するわけではない。これまでの化合物やプロトコルでは、照射中に生じる酸素ラジカルに由来する血液製剤の損傷を防ぐために、光に当てる前に反応物からの分子酸素の除去が必要であった（Ｌ．Ｌｉｎら，Ｂｌｏｏｄ ７４：５１７（１９８９）；Ｗｉｅｓｅｈａｈｎに対する米国特許第４，７２７，０２７を参照）。本発明は、酸素存在下で、血液製剤が調製される目的であるインビボ活性を破壊せずに、血液製剤を除染するために使用され得る。本発明は、本発明の方法で除染される血液製剤試料を、通常に機能する血液製剤試料を血液製剤の機能についての公知のアッセイにおいて試験したのと同様に試験した場合、血液製剤のインビボ活性は破壊もされず、著しい減少もないことを企図する。例えば血小板に関しては、血小板が本発明による方法で処理され、かつ未処理試料中に５日間保存されるのと同様に５日間保存された血小板と、血小板の凝集及びｐＨが実質的に同じである場合、そのインビボ活性は破壊もされず、著しい減少もない。「実質的に同じ」ｐＨ及び凝集性とは、特定のデータポイントが示す周辺の誤差の範囲内であることを意味している。
２つ目の要因は、使用される化合物が治療を行う患者に対して毒性があるか、あるいは変異原性があるかどうかである。「低い変異原性を示す」化合物とは、下記の実験のセクションに叙述したエイムス試験において２５０μＭ未満の濃度で試験した場合、ＡＭＴよりも低い変異原性を呈する化合物と定義される。本発明の不活性化合物および方法は特に有用であり、それは、それらが病原体の不活性化効率と変異原性とが無関係であることを示すからである。これらの化合物は、変異原性の付随的上昇なしに強力な病原体不活性化を呈する。ＡＭＴのような一般的に知られている化合物が光不活性化プロトコルで試験され、これまでは分割できないと思われた病原体不活性効率と変異誘発作用の間に、ある関係があるように見える。
本発明は、は病原体不活性化効率が変異原性と無関係であるための任意の理論に限定されることは意図されないが、その無関係さはソラレン上に置換された基の長さおよび化合物上の電荷の位置の結果起こると仮定している。変異原性の化合物の一端または両端上の正電荷は、ＤＮＡのリン酸エステル主鎖と非共有結合性の相互作用をすると仮定している。これらの相互作用は、光の存在下にかかわらず起こると推認している（「暗結合」と呼ぶ）。理論上、ソラレンは立体的にポリメラーゼによるＤＮＡの開裂をブロックし、変異原性を引き起こす。逆に、本発明の化合物は、長鎖置換基上に正あるいは中性電荷を持っている。これらの置換された基は暗結合の間中、立体的なバリアを形成しており、それがＤＮＡから相当たやすく自由にはずれ、ポリメラーゼの通過が可能となる。よって、変異原性は結果的にない事になる。
ＶＩ．ソラレンおよびソラレン光化学反応生成物の除去に対する装置および方法
光化学的除染（ＰＣＤ）の次には、形成されるソラレン光生成物、そして残存ソラレンが処理された血液製剤から除去されなければならない。本質的には、除去は安全面での予防策である。もし、ソラレンおよびソラレン光生成物が受容者に注入される前に血液製剤から除去されないと、受容者の核酸とコンジュゲートを形成する間接的な可能性がある。
血液製剤から物質を除去することに関しては、非常に多くの研究例が存在している。この研究の多くは白血球の減少に関する（Ｍ．Ｎ．Ｂｏｏｍｇａａｒｄら、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３４：３１１（１９９４）；Ｆ．Ｂｅｒｔｏｌｉｎｉら、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ ６２：８２（１９９２）；Ａ．Ｍ．Ｊｏｕｓｔｒａ−Ｄｉｊｋｈｕｉｓら、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ ６７：２２（１９９４））。白血球細胞の減少は重要である。なぜならば、多くの白血球細胞を含む血液成分の輸血を受けた患者は、非溶血性熱性（ｎｏｎｈｅｍｏｌｙｔｉｃ ｆｅｂｒｉｌｅ）輸血反応やヒト白血球抗原（ＨＬＡ）同種免疫、移植片対宿主反応、そして無作為のドナーからの血小板の輸血に対する不応状態（ｒｅｆｒａｃｔｏｒｉｎｅｓｓ ｔｏ ｒａｎｄｏｍ−ｄｏｎｏｒ ｐｌａｔｅｌｅｔ ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ）といった、いくつかの有害反応を経験し得るからである（Ｔ．Ｓｈｉｍｉｚｕら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３３：７３０（１９９３）；Ｈ．Ｗａｄｅｎｖｉｋ，上記）。血小板のろ過はＰＣの白血球細胞の減少に使われる一般的な方法である。数多くのフィルターがＰＣ中のＷＢＣの量を上述した有害反応を生じないレベルにまで減少させるのに首尾よく用いられた。（Ｋ．Ｊ．Ｋａｏ，上記（ＰＬ−１００フィルター，Ｐａｌｌ Ｃｏｒｐ．，Ｇｌｅｎ Ｃｏｖｅ，ＮＹ）；Ｍ．Ｂｏｅｃｋら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３１：３３３（１９９１）（Ｓｅｐａｃｅｌｌ ＰＬ−５Ａ，Ａｓａｈｉ，東京，日本）；Ｊ．Ｄ．Ｓｗｅｅｎｅｙら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３５：１３１（１９９５）（Ｌｅｕｋｏｔｒａｐ，Ｍｉｌｅｓ Ｉｎｃ．，Ｃｏｖｉｎａ，ＣＡ）；およびＭ．ｖａｎ Ｍａｒｗｉｊｋら，Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ ３０：３４（１９９０）（Ｃｅｌｌｓｅｌｅｃｔ，ＮＰＢＩ，Ｅｍｍｅｒ−Ｃｏｍｐａｓｃｕｕｍ，Ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；Ｉｍｍｕｇａｒｄ Ｉｇ−５００，Ｔｅｒｕｍｏ，東京，日本））。不運にも、これらのフィルターは、これら比較的低分子量の化合物が現在のろ過メカニズムで容易に除去されないのと同様に、ソラレン光付加生成物もソラレン自身も除去できない。
ＰＣから不要生成物を除去する方法として、吸着法も実行可能な方法である。数日貯蔵されたＰＣはアナフィラトキシンを発生させ得、アナフィラトキシンが血小板輸血時に血管内皮損傷や末梢循環不全といった悪影響を引き起こし得る（Ｔ．Ｓｈｉｍｉｚｕら，Ｖｏｘ Ｓａｎｇ ６６：１６１（１９９４））。Ｃ３ａといったアナフィラトキシンは正に帯電しており、静電力によって負に帯電したフィルター膜に吸着すると考えられている。というのは、多くの血漿タンパクは負に帯電しており、これらが吸着しないため、アナフィラトキシンの単離および保持を可能にする。Ｔ．ＳｈｉｍｉｚｕらはＰＣに対しある市販品のポリエステル繊維製フィルターが、Ｃ３ａアナフィラトキシンレベルを以前のろ過レベルの約１２％にまで減少させることを発見した。理論上、ある種のアナフィラトキシンと同様に、フィルターに結合可能な荷電分子であるソラレンが開発され得る。しかしながら、フィルターへ吸着しないアナフィラトキシンの割合に基づいて考えると、フィルターの限られた表面積と吸着容量が原因で、その方法ではソラレン光化学反応生成物、及び残存ソラレンはＰＣ中におそらく残存すると考えられる。
吸着のプロセスはまた、リン脂質ポリマー上に選択された血液成分を単離するために用いられてきた。例えば、様々な電荷を持ついくつかのポリマーは血小板の付着やタンパクの吸着を含めた血液成分とのそれらの相互作用について評価されてきた。［Ｋ．Ｉｓｈｉｈａｒａら、Ｊ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ｍａｔ．Ｒｅｓ．２８：１３４７（１９９４）］しかし、これらのポリマーは、ソラレンやソラレン光化学反応生成物といった低分子量化合物の吸着のために設計されてはいない。
様々な透析手段により、血漿および血液全体から低分子量化合物をうまく除くことができる。例えば、透析は、低分子量毒素および薬学的化合物を首尾よく除去し得る。よって、透析は血液製剤からソラレン及びソラレン光化学反応生成物を除去するのに用いられ得る。不運なことに、現在の透析手順は大変複雑かつ高価な装置を必要とする。そのために、透析機械の使用は、大量の血液製剤の除染において実用的ではない。ＰＣＤと組み合わせた、より簡単でさらに経済的な手段を開発する必要がある。
上記の通り、ＰＣから望ましくない生成物を単離するための現在の方法及び装置は、ＰＣＤとソラレンの技術の使用に適さない。このように、他のアプローチをみつけなくてはならない。適当な装置の開発に際して重要な考えは、装置を用いてプロセスを進めたとき、血液製剤それ自体への有害な変化を避ける必要性があることである（Ｊ．Ｍ．Ｃｏｕｔｎｅｙら，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｏｒｇａｎｓ １７（４）：２６０（１９９３））。血小板が含まれている場合特に重要なのは、血小板の機能及び完全さの維持である。その目的を達するために、血小板の数、ならびにＧＭＰ−１４０による活性化、ｐＨ、およびＡＴＰの含有量といった血小板機能の指標となる値は、装置の使用によって悪い方向に変化すべきでない。さらに、満足できる装置は凝固カスケードに対して著しい影響を与えるべきではない。そして最後に、ソラレンはソラレンを除去するために使用される装置と共存可能でなければならないし、適当なサイズの装置を用いて所望されるソラレンの除去を達成するのに十分な吸着容量を持たねばならない。
本発明のこの局面に関係があるのは、血液製剤から物質を除去するために用いられる装置、特に血小板に有害な影響を及ぼさずに血小板混合物からソラレン及びソラレン光化学反応生成物を吸着させるために用いられる装置である。今後、このような装置は「スクラブ装置（ｓｃｒｕｂ ｄｅｖｉｃｅ）」または「捕獲装置」と互換性を持って呼ばれ得る。一方で、除去のプロセスは、「スクラブプロセス」または「捕獲プロセス」と言われ得る。
以下に続く装置の記述は、下記の各部分に分かれている。
（Ａ）血小板濃縮液中でのソラレンの分離（Ｂ）吸着物の説明及び選択（Ｃ）吸着法の研究（Ｄ）ソラレン除去装置（Ｅ）血漿からのソラレンの吸着
Ａ．血小板濃縮液中のソラレンの分離
新しいソラレンＳ−５９は、光化学的処理（ＰＣＴ）のプロセス内で使用する物質の有力候補である。Ｓ−５９即ち４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンの化学構造は以下の通りである。
以下に続く記述中に示されるプロセスは、３５％血漿／６５％合成培地（ＰＡＳ ＩＩＩ）中に懸濁させた血小板へのＳ−５９の添加（最終濃度は１５０μＭ）、その後のＵＶＡ照射が含まれている。本明細書中今後、３５％ＰＣと言うのは３５％血漿／６５％ＰＡＳ ＩＩＩ中に懸濁した血小板の事を意味する。構造的に類似のソラレンおよび異なる血小板処方物についても同様の分離が結果として生じ得る。ソラレンの除去を目的とする「捕獲」または「スクラブ」装置の設計の際重要な考えとなるのは、低分子量光化学反応生成物の同定およびその残存レベルの定量化である。血小板混合物のいくつかの特性（脂質含量、血小板量、ヘモグロビン／ＲＢＣ含量）が最終的なソラレンの分離、及び捕獲またはスクラブのプロセスの間に除去されなくてはならない各光化学反応生成物の量に影響する。
「光化学反応生成物」は、化合物と活性化波長の電磁放射線との反応の生成物と定義される。活性化波長の電磁放射線にさらされたとき、光反応性化合物のとりうる反応を考えることで「光化学反応生成物」はよく理解できる。いずれの正確なメカニズムにも限定されることはないが、基底状態（「Ｃ」）にある光反応性化合物と活性化波長の電磁放射線との反応は、短命の励起状態種（「Ｃ＊」）を生成する：
次に起こる現象は主として、どんな潜在的な反応物が遷移状態種に利用可能であるかということの結果である。それは短命であるから、この種と核酸（「ＮＡ」）の反応は、遷移状態種が生じた時に核酸が存在すれば唯一可能であると信じられている。その反応は以下のように示される。
この反応を記述すると、化合物が活性化波長の電磁放射線にさらされたときに、核酸は結合に利用されない状況を考える人もいるだろう。励起状態種は短命で、反応する核酸がないと、励起状態種は単に基底状態に戻る。
他方、励起状態種はそれ自身と（基底状態種または励起状態種と）反応し、基底状態での複合体（「Ｃ：Ｃ」）を形成し得る。２つの化合物が反応してできるこれらの自己反応の生成物は、「光二量体」または単なる「二量体」と呼ばれる。しかしながら、自己反応とは２つの化合物に限られるわけでなく、多量体（三量体など）も形成され得る。
励起状態種は自己反応のみに限られない。それは、溶媒（「Ｅ」）の要素といった周辺環境（イオンや気体など）と反応し、他の生成物を生じ得る。
さらに、それは、単なる基底状態の誘導体（「
」）への内的な再編成（「異性化」）も起こし得る。
最後に、遷移状態種はここで述べたもの以外の他の反応に進み得る。
本発明および「光化学反応生成物」の理解は、（もしあるのなら）これらの１つの反応が実際におこるかどうかとは無関係である。本発明は血液製剤の光活性化を伴う光化学反応生成物の除去のための方法及び装置についてのみ記述する。
Ｓ−５９を血小板に添加するとＳ−５９は迅速に分配され、血漿中のＳ−５９と血小板中のＳ−５９との間に平衡状態を形成する。おおよそ初めのＳ−５９のうち２５％が血小板へ分配されるが、その割合は血小板の数及び血小板の生存性に依存する（すなわち、死んだ血小板はソラレンを取り込まない）。さらに、Ｓ−５９の添加とＵＶＡ照射の間に長い培養期間（例えば、６０分より長く）をもうければ、高い割合のＳ−５９が血小板に分配される。血小板に分配されるＳ−５９の量は最終的に、どのくらいの量のＳ−５９が血小板と会合したままであるか、血漿巨大分子とどれくらい会合するのか、遊離光化学反応生成物としてどれくらいが残るのかで決まるのである。
ＵＶＡの照射プロセスの間、Ｓ−５９は光化学反応を経て、いくつかの低分子量の光化学反応生成物を形成し、その上、血小板および血漿画分中の巨大分子と会合する。初期濃度１５０μＭのＳ−５９のうちおよそ２０％が血小板と会合する。つまりは８〜９％がＳ−５９と低分子量光化学反応生成物であり、１１〜１２％が巨大分子と会合したＳ−５９である。残る８０％のＳ−５９は血漿中に残る。つまり、６５％はＳ−５９と低分子量光化学反応生成物であり、約１５％が血漿巨大分子と会合したＳ−５９である。低分子量光化学反応生成物が血小板および血漿中に残っており、総じて、１５０μＭのＳ−５９のおよそ７３％である。この画分の低分子光化学反応生成物は、スクラブプロセスの間に除去され、それらの除去はＨＰＬＣおよび３Ｈ標識したＳ−５９を使った放射能測定により追跡した。スキームＡは、ＵＶＡの照射後、３５％血漿／６５％ＰＡＳ ＩＩＩのなかに懸濁した血小板の中のＳ−５９の分布を図表で描いている。
スクラブ／捕獲プロセスで除去されないＳ−５９もまた３Ｈ標識したＳ−５９を使ってモニターできる。初期の１５０μＭのＳ−５９の２７％に当たる除去出来ない画分は血小板および血漿のなかの巨大分子と共有結合的に会合している。
Ｂ．吸着剤の評価および選択
血小板混合物からのソラレンおよびそれに関係した低分子光化学反応生成物の除去は、薬物の過剰摂取によって苦しんでいる患者を治療する情況に似ている。
薬物中毒で苦しんでいる患者は、血液中の低分子の薬物を除去する固体の吸着剤の入ったカラムを使うことで、うまく治療される。治療は患者から血液を取り除き、生体外循環系経由で、吸着剤の入ったカラムに血漿（血漿灌流）または、全血（血液灌流）を通して患者に血液を戻すことで行われる。血液灌流に関係する論文の大部分は、２つのグループの吸着樹脂に焦点をあてている：（ｉ）アンバーライト、これは重合性の樹脂である〔Ｊ．Ｌ．Ｒｏｓｅｎｂａｕｍら，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １３６：２６３−６６（１９７６）；Ｒ．Ｈｕｇｈｅｓら，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｏｒｇａｎｓ ３（１）：２３−２６（１９７９）〕および（ｉｉ）活性炭、これは、血液適合性のポリマーで覆われている〔Ｄ．Ｗｅｂｂ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｏｆ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４９（７）：４９３−９６（１９９３）〕。
血小板混合物からソラレン光化学反応生成物を除くのに適した樹脂は幾つかの重要な特性を持っていなければならない。吸着剤は、化学的・物理的安定性、浸出性、粒子サイズ、表面積などの完全な特徴をふくめて、薬学的な利用に適した品質でなければならない。樹脂はオートクレーブまたはガンマ線照射で滅菌できなければならない。最後に、樹脂は血小板の機能および／または血漿凝固因子を重視するような血液適合性でなければならない。この樹脂は、コレステロール、脂質、脂肪酸、サイトカイン、エンドトキシンの除去に有効であると思われる本発明に使用されることを予期していることも明記しておくべきである。
表Ａは最初のスクリーニング手順で選んだ幾つかの樹脂について要約している。表Ａに記載されている樹脂に加えて、特に安価な樹脂も選んだ。このリストに記載されていない、他の有効な樹脂も効果的であり得る。伝統的にクロマトグラフィーに使われてきた樹脂も最近、血液灌流の潜在的吸着剤として別の医学的指標で調査されている。このような利用があるので、Ｃ−４、Ｃ−８およびＣ−１８樹脂を選択範囲の中に加えた〔Ｄ．Ｊ．Ｈｅｉら、「シリカへの吸着によるＨＳＡを含む溶液からのサイトカインの除去（Ｒｅｍｏｖａｌ ｏｆ Ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｆｒｏｍ ＨＳＡ−Ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ ｂｙ Ａｄｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｎｔｏ Ｓｉｌｉｃａ）」、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ４４：１０２３−３０（１９９４）；Ｓ．Ｍｕｒｕｇａｖｅｌ、「逆相シリカゲルの全血および血漿灌流の吸着剤としての効果に関する試験管内での研究（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ｓｔｕｄｉｅｓ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｆｆｉｃａｃｙ ｏｆ Ｒｅｖｅｒｓｅｄ Ｐｈａｓｅ Ｓｉｌｉｃａ Ｇｅｌ ａｓ ａ Ｓｏｒｂｅｎｔ ｆｏｒ Ｈｅｍｏ− ａｎｄ Ｐｌａｓｍａｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）」、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ３０（１） ６９−８２（１９９２）〕。
後に詳細に述べるように以下の樹脂は最初のスクリーニング手順ですぐれた結果を示した：Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭ，Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６ＴＭ，Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ＣＧ−１６１ｃｄＴＭ，Ｈｅｍｏｓｏｒｂａ ＣＨ−３５０ＴＭ，およびＢｉｏ−Ｂｅａｄｓ ＳＭ−４ＴＭ（３００〜１１８０μｍ直径）
アンバーライト樹脂
アンバーライト樹脂は急性の薬物中毒〔Ｊ．Ｌ．Ｒｏｓｅｎｂａｕｍら，Ａｒｃｈｉｖｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ １３６：２６３−６６（１９７６）〕および肝機能不全〔Ｒ．Ｈｕｇｈｅｓら，Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ Ｏｒｇａｎｓ ３（１）：２３−２６（１９７９）〕の患者を治療するために使用されてきた。他にも、アンバーライト吸着剤は医薬品工業において最近様々な用途に使われている。Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）はＲｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ（Ｃｈａｕｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）が製造したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭおよびＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６ＴＭ樹脂を特に薬学的応用のために加工処理した。Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｉｎｃ．は、浸出物（例えば、ジビニルベンゼン、ＤＶＢ）を除去し、粒子を最小の直径に制限するために、吸着剤を処理した。最終的な吸着剤は、滅菌された（ＵＳＰ ＸＸＩ）、発熱物質のない（ＬＡＬ）、検出しうる浸出物（ＤＶＢおよびすべての有機物）の含まれていないことが証明されている。
チャーコール樹脂
チャーコール樹脂を使った血液灌流装置は最近、幾つかの日本の会社で製造され、米国およびヨーロッパで市販されている。Ａｓａｈｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏ．（東京，日本）が製造している活性炭を含んだ二種の血液灌流装置は、薬物過量摂取および肝性昏睡の治療のためのＦＤＡに提出する５１０（ｋ）書類に記載されている。血液灌流装置Ｈｅｍｏｓｏｒｂａ ＣＨ−３５０の吸着剤はとても耐久性がある、大きな直径の粒子であり、この粒子は、低分子量の薬物および毒素を、ＰＣのような細胞が含まれている流体から除去することを特に目的として設計されている。チャーコール吸着剤は普通は石油のピッチから作られ、ポリ（ＨＥＭＡ）（メタクリル酸ヒドロキシエチル）のような血液適合性のポリマーでおおわれている；ポリマーで覆われることによって血液適合性が増加し、機械の故障の原因となる微小粒子の発生の危険を減らしている。
チャーコール樹脂を使った血液灌流装置は、いくつかの理由により米国ではあまり使われていない。理由の第一に、多くの情況において、血液透析のようなより良い二者択一的な治療法があること。理由の第二に、ある型の薬物中毒（ｄｒｕｇ ｉｎｔｏｘｃａｔｉｏｎ）や薬物中毒（ｄｒｕｇ ｐｏｉｓｏｎｉｎｇ）では、毒素が体の区画（例えば、組織、肺など）に強く分配されているので血液灌流が容易に出来ないということがあげられる。しかしながら、まだ血液灌流はセオフィリン過量摂取などの特定の臨床的な情況において推薦される〔Ｄ．Ｗｅｂｂ，Ｂｒｉｔｉｓｈ Ｊ．ｏｆ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ４９（７）：４９３−９６（１９９３）〕。
Ｃ．吸着に関する研究
吸着平衡
Ｓ−５９を除去する能力のある吸着剤をスクリーニングする最も簡単な方法に、ＰＣからのＳ−５９の平衡吸着を調査する方法がある。吸着実験において放射能標識されたＳ−５９を使用することで、残留放射能の測定が、吸着後に残っているＳ−５９の指標として使用されることを可能にする。様々な吸着剤の候補を比べるために、各々の吸着剤を約０．１ｇずつ１５０μＭの３Ｈ−Ｓ−５９（照射していない）を含む３．０ｍｌのＰＣに加えた。試料は密閉したチューブで血小板回転機の上で、２４時間室温でインキュベートした。速度論的測定は、完全な平衡はバッチ式インキュベーションの約６時間後に達せられたことを示した。インキュベーション後に、各チューブからＰＣ試料を除去し、それぞれの吸着剤に残っている放射能レベルを各吸着剤について決定した。
表Ｂには、Ｓ−５９の残存レベルを、その他の事項と一緒に記載している。それゆえ、表Ｂは、各々の吸着剤の相対的な効果の良い指標を提供する。平衡に達したことを保証するために、２４時間のインキュベーション後にこれらの残存レベルを決定した。
各々の吸着剤について吸着等温線が描かれ、この吸着等温線の傾きから平衡吸着定数（Ｋ）が決定された（吸着定数は表Ｂの３番目の欄に記載した）。表Ｂの４番目の欄では、Ｓ−５９のレベルを３０μＭ（１５０μＭの２０％）から５μＭにまで減らすのにかかる樹脂の全コスト（＄／装置）が決定された。表Ｂの５番目の欄では、Ｓ−５９のレベルを３０μＭから１μＭにまで減らすのにかかる樹脂の全コスト（＄／装置）が決定された。書き加えておくと、血小板の混合物への照射は光分解反応によりＳ−５９のレベルを１５０μＭから３０μＭにまで減らす。Ｈｅｍｏｓｏｒｂａ ＣＨ−３５０のコストが見積られた（１４０ｇの吸着剤を含んでいる一つの吸着装置当たり＄３５０）。最後に、「ＮＤ」はその値が決められていないことを示している。
実行した試験には、血液から薬剤を固相抽出（ＳＰＥ）するときに普通使われている、幾つかの逆相樹脂（すなわち、いくつかの製造業者からのＣ−１８、ならびにＢａｋｅｒ製のＣ−４およびＣ−８）の解析も含まれている。
幾つかの逆相樹脂は良い吸着性を示したが、これらの樹脂は水性の溶液で樹脂を湿らせることに関係する問題点を抱えている。逆相吸着剤は、エタノール中に懸濁し、遠心分離し、エタノールをデカントした後、水性の溶液を加えることによって、エタノールで前もって湿らせておかなくてはならない。エタノールで前もって湿らせなかった逆相吸着剤は互いに凝集し、チューブの側面にくっつく傾向があり、不均一な分布および接触をもたらした。樹脂を湿らせる事の他にも問題点を付け加えると、逆相媒体は他の媒体と比べて、値段が高い傾向がある。さらに、逆相媒体は普通小さな粒子サイズでのみ供給される（５０μｍ未満の直径）。その結果、Ｃ−４、Ｃ−８、およびＣ−１８を含む逆相樹脂やＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ樹脂（表Ｂ）やＷａｔｅｒｓ Ｐｏｒａｐａｋ ＲＤＸＴＭ（Ｗａｔｅｒｓ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）（表Ｂには記載されていない）などの水性の溶液で容易に湿潤しない他の樹脂は好まれないことになる。
表Ｂに示された、アンバーライトに関するデータについての考察によって、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭおよびＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６ＴＭが好ましいということが明らかになった。特にこれら二つのアンバーライトのＳ−５９の残存レベルは、他のアンバーライト（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−２ＴＭ、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−７ＴＭ）に比べて十分低い（３倍以上の違いがみられる）。
幾つかの、活性炭（表Ｂには記載されていない）も試験された。標準的な、活性炭は物理的に安定ではなく、こわれて、とても細かい粒子になる傾向があった。
吸着性の研究中に採られた試料は高いレベルの炭の微粒子（吸着剤の細かい粒子）をしばしば含み、この炭の微粒子は血小板から分離することが出来なかった。血液灌流のために、特別に生産された活性炭（例えば、Ｈｅｍｏｓｏｒｂａ ＣＨ−３５０；Ａｓａｈｉ；表Ｂに記載）は石油のピッチから作られ、この石油ピッチは、とても固い、耐久性のある炭ビーズを与える。前述のように、血液灌流のために開発された活性炭はさらに、ポリマーで覆われている。このポリマーは、血液適合性を増加させ、機械の故障の原因となる微小粒子の発生の危険を減らしている。
表Ｂには樹脂のそれぞれについてＳ−５９の残存レベルに関連したデータに加えて、他の平衡吸着のデータも要約されている。このデータを使って、残存Ｓ−５９の希望の終濃度における、各樹脂の平衡容量を見積もることができる。Ｓ−５９の初期濃度は１５０μＭであり、かつ初期のＳ−５９の９９％超を除去する目標を設定した場合に、Ｓ−５９の最終濃度は約１μＭになる。線形の等温線（Ｌａｎｇｍｕｉｒ，低濃度）を仮定すると同時に下記の方程式を用いれば、各樹脂の容量を見積ることができる。
ここで、ｑ（μｍｏｌ Ｓ−５９／ｇ樹脂）は樹脂容量、Ｃｆ（μＭ）はＳ−５９の最終の平衡溶液濃度、Ｋ（Ｌ／ｇ）は樹脂の特性である吸着定数である。表Ｂの二列目に示すデータと同様なデータを用いて、Ｋの値を見積り得る。次に、Ｋについて算出された値と、１μＭのＳ−５９での最終濃度目標としてのＣｆとを用いて樹脂容量（ｑ）を見積り得る。
樹脂の容量を計算した後、下記の方程式を用いて、所与の量のＰＣを処理するのに必要とする樹脂量を見積り得る。
ここでＭ（ｇ）は吸着剤の質量、Ｖ（Ｌ）は溶液の体積、ＣｏはＳ−５９の初期濃度、Ｃｆ（μＭ）はＳ−５９の最終濃度（この計算のために１μＭ）、ｑ（μｍｏｌ Ｓ−５９／ｇ樹脂）は式１により定義された樹脂容量である。
代表的な３５％ＰＣ（つまり３５％血漿／６５％ＰＡＳ ＩＩＩ）の場合に、原液１５０μＭのＳ−５９の約２０％が光照射後も残存し、それゆえに、Ｃｏは約３０μＭであると見積ることができる。処理されたＰＣの体積（Ｖ）は３００ｍＬである。従って、容量ｑを持つ各樹脂について、Ｓ−５９の濃度をＣｏからＣｆまで下げるのに必要とされる吸着剤の質量Ｍを計算し得る。
最終の平衡溶液濃度Ｃｆは、樹脂容量ｑと除かれるべきＳ−５９の全量の両方を決定するので、最終の平衡濃度は重要なパラメーターである。式１と式２を組み合わせて下記の関係が得られる。
Ｃｆが低い値の場合に、必要とされる樹脂の質量ＭはＣｆと反比例にする。Ｃｆに対する、吸着剤の質量の漸近的性質をスキームＢに示す。スキームＢに示される曲線を導き出すのに方程式３を用いた。その時の計算は、初期濃度Ｃｏは３０μＭ、体積Ｖは３００ｍＬに基づいた。
吸着動態
以下に述べるように、選択される吸着剤とＰＣとを接触させる２つの可能な方法は、流動装置の使用とバッチ式（ｂａｔｃｈ）装置の使用を含む。ＰＣまたは血漿からのソラレンの吸着についての動力学は、潜在的には、流動スクラブ装置の有効性を決定する際に最も重要な因子の一つである（下で詳しく議論する）。流動装置を使用中の遊離のソラレンと固体吸着剤との不完全な平衡によって、所与のレベルの残存ソラレンに達するのに必要な吸着剤の量が実質的に増加する結果になり得る。
吸着速度はしばしば、吸着剤表面への吸着質の拡散を含む、物質移動プロセスに制限される。小分子の拡散性は相対的に高いので、低分子量の化合物（例えばＳ−５９）の吸着は一つ代表的な速いプロセスである。しかし、吸着速度が拡散以外のプロセスによって制限される場合、Ｓ−５９と細胞および／または血漿分子との相互作用はより遅い吸着動態を示す。
Ｄ．ソラレンの除去装置
概要
本発明はソラレンの除去のための、二種類の明確に異なる型式の装置の使用を企図する：流動装置とバッチ式装置。流動装置においては、枕元でＰＣを、照射後かまたは注入前かどちらかにおいて吸着剤カラムに通して灌流させることによってソラレンを除去する。
逆に、バッチ式装置は、照射の後、直接吸着剤を血小板バッグに加えるかまたは血小板を、照射の後、吸着剤を含むバッグに移すかどちらかをし、その次に血小板を特定の時間かき回すことを伴う。
前にも述べたような、１５０μＭのＳ−５９原液の約７３％はＳ−５９と低分子量の光化学反応生成物として存在する。Ｓ−５９原液の約２０〜３０％は残っており、他の４０〜５０％はＳ−５９の光化学反応生成物を表す。バッチ式装置を用いた研究の結果、適当な吸着剤を用いて、Ｓ−５９の９９％超と低分子量の光化学反応生成物をＰＣから吸着することができることが示された。適当な流動装置またはバッチ式除去装置を選択することにより、同様な除去レベルを達成することを可能にすべきである。
流動装置
前にも述べた通り、本発明はＵＶＡで血小板を照射した後かまたは調製物を受容者に注入する前のいずれかに、流動装置を用いて血小板の調製物が灌流され得ることを企図する。代表的には、流動装置は、吸着剤が充填された５〜１０ｍＬの容量のインラインカラムを伴う。
この装置の本体としては、取り扱っている間に樹脂が粉砕されるのを防ぐために十分に丈夫である血液適合性プラスチック（ポリカーボネート、ポリプロピレン）で製造しなければならない。この装置はフローアダプター、特に５０〜１００μｍのナイロンメッシュフィルターを持ち、このフローアダプターは細胞の通過を最小の圧力低下で可能にする一方で、細粒（吸着剤の微粒子）の通過を防げるに違いない。多くの実施態様では、この装置は、血小板調製物がカラムを通過して灌流した後血小板調製物を貯蔵するための追加のバッグ、ならびに、吸着剤微粒子の注入を防ぐためのインラインフィルターを伴う。
操作の点から、重力流によりこの装置は作動するべきである。この除去プロセスは、ある時間枠内で完結されるべきであり、この時間枠は、血小板調製物の処理では、３０分から３時間まで、好ましくは、１から２時間の最小時間により定義され、そして、血小板調製物のウイルス試験に必須の、約１２時間の最少時間により定義される。血小板及び液量のいずれについても、それらの減少は無視できる程度でならなければいけない。
製造プロセスと関連して幾つかの考慮がされている。第一に、カラム床体積は除去される薬物の予想量を考慮して考えるべきである。より多量の薬物を除去するには、より大きなカラム床体積が必要とされる。第二に、所与のカラム床体積に対して、カラム床直径は圧力によって決まる。この直径は、一定のカラム床体積でのソラレンの除去に影響を与えるかもしれない。第三に、組立と滅菌の前に、この装置は、湿潤したカラムで充填され、受容可能な溶液（例えば、合成培地ＰＡＳ ＩＩＩ）を注入されるべきである。第四に、この装置は血小板の収集／処理や貯蔵用のバッグに連結されるべきである。また、その後、最後のアセンブリは、滅菌され封入されるべきである。血小板バッグとカラムとの間に装置を詰めるとき、注意して行う必要がある。大きな空気泡が導入されると、装置中の偏流、および不完全なソラレンの除去を引き起こす。
現在、Ｓｕｐｅｌｃｏ株式会社は大容量（２５０〜１５００ｍＬ，Ｐｏｒｏｚｏｒｂ ＣａｒｔｒｉｄｇｅｓＴＭ）と小容量（５ｍＬ，Ｒｅｚｏｒｉａｎ ＣａｒｔｒｉｄｇｅｓＴＭ）の両方を製造しており、それらは、ＡｍｂｅｒｌｉｔｅＴＭ樹脂およびＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍＴＭ樹脂を含む。これらの装置は臭化エチジウム、洗剤や抗生物質などのような小分子を蛋白質溶液から除去するために市販されている。さらに、Ｗａｔｅｒｓ（Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）は現在小容量（１ｍＬ）のＴｙｐｅ Ｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｄｅｖｉｃｅｓに分類される吸着装置を製造している。
ここまでで、議論されてきた実験と設計への考慮は、平衡（バッチ式）吸着データに基づく。流動吸着装置において、吸着剤の必要量へ影響を与え得る因子は幾つかあり、それゆえ装置の全体的な設計にも影響を与え得る。第一に、この前に少し述べたように、吸着時における動力学な限界が、流体と吸着剤との間に不完全な平衡状態が生じ、必要な吸着剤の量の増加をもたらし得る。しかし、吸着装置を通過する流速を下げて、十分な接触時間を与えることによって、動力学的限界を打ち消し得る。第二に、装置を通過する不完全な流動によって引き起こされる分散が、流動装置中の大量の吸着剤の必要性もまた、もたらし得る。装置の適切な設計や製造は分散効果を最小限に抑える。
吸着剤とカラムの位置関係が流動装置内でのソラレンの残存レベルに及ぼす影響について考察した。表Ｃにまとめた幾つかの流動の設定で得られた結果から幾つかの重要なポイントが明らかになった。第一に、一定の樹脂量で流動装置の直径が大きくなると、処理される血小板ユニット中のＳ−５９の残存レベルも増加する。第二に、長くて細いカラムを使えば、Ｓ−５９の残存レベルが低くなるが、許容できない重力流に対して大きな圧力低下をもたらすかもしれない。第三に、Ｓ−５９の除去時にＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭはＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６ＴＭほど効果が良くない。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭのより小さな直径の孔によって、実質的により遅い吸着動態がもたらされ得る。
表Ｃは、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭの量を二倍にすることは、流動装置内のＳ−５９の除去の不釣り合いなわずかな増加という結果をもたらすということを示した。また、このデータから、血小板含有溶液からＳ−５９を除去する際の制限因子は、Ｓ−５９を血小板の内部から運び出すことであることが示唆された。流動装置内の動力学的限界に対する可能な解決法は、より大きな流動装置を使って流速を下げることによって、血小板の滞留時間を長くにすることを包含する。
バッチ式装置
前に示唆したように、流動装置に代わって選べるのはバッチ式吸着である。
バッチ式吸着では、照射後に吸着剤を直接血小板バッグに入れるか、または照射後に血小板を、吸着剤を含むバッグまで移動させるかのどちらかを含む。その次に血小板を特定の時間かき回す。その後、一つ加えられた安全な予防策として、あらゆる固体樹脂粒子を除去するために、インラインフィルター／ふるいを通して血小板を別のバッグに移してもよい。
ある実施態様において、血小板は、吸着剤を用いて直接処理される（つまり、どの型の包装（ｐａｃｋａｇｉｎｇ）の内部にも吸着剤は含まれない）。このような実施態様において、バッチ式装置中に、処理後に血小板から吸着剤を除去するために５０〜１００μｍのナイロンメッシュフィルターを付けたフローアダプターまたは他の濾過装置のような除去装置が含まれる。他の実施態様において、吸着剤はメッシュエンクロージャー／ポーチの内側に入れられ、このメッシュエンクロージャー／ポーチは血小板バッグそれ自体の内側に入れられる。実験的目的で、血小板バッグの側面に沿ってスリットを切って作り、メッシュエンクロージャーをこのスリットを通して挿入した後、血小板バッグをヒートシールすることによって、メッシュエンクロージャーを血小板バッグの中に入れる。しかし、大規模製造では、メッシュエンクロージャーは血小板バッグに固定されていても固定されていなくともよい。この完全なアセンブリを熱またはγ線照射により滅菌し得る。
流動装置の場合と同様に、多くの実施態様においてバッチ式装置もまた、微小な吸着剤粒子の注入を防ぐためのインラインフィルター、ならびに処理された血小板を貯蔵するための追加のバッグを伴う。別の実施態様において、取り扱っている間、樹脂を保護する外部区画に吸着剤は包まれる。この外部区画は滅菌吸着剤のための包装として、および処理後に吸着剤を除去するための装置として働き得る。この外部区画は、バッグと区画の間に壊れやすいクロージャー、および流出口で吸着剤を保持するのに適したフィルターメッシュを備える滴下チャンバーと似ている。照射後、壊れやすい物は壊れ、吸着剤は、処理された血小板を含むバッグの中に移される。除去が完了した後、血液製剤が外部チャンバーを通過し、そこで吸着剤が除去される。本発明と共に使用するのに適したメッシュ材料の製造者が幾つか存在する。例えば、Ｓａａｔｉ Ｃｏｒｐ．（Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ）とＴｅｔｋｏ，Ｉｎｃ．（Ｂｕｆｆａｌｏ，ＮＹ）らは様々な医療用グレードのメッシュ材料を製造する。
スキームＣにバッチ式ＲＤの２つの可能な構成を示す。構成Ａ（いわゆる二つバッグ設計）では、照射した後、血小板が第２のバッグに移され、この第２のバッグは、メッシュエンクロージャー／ポーチ中の吸着剤を含む。限られた接触時間が望ましい場合、血小板は元のバッグに戻され得る。構成Ｂ（いわゆるただ一個のバッグ設計）では、照射後、外部パーティションがはがされ、それにより血小板が自由に吸着剤バッグ／ポーチと混ざることを可能にする。もちろん、バッチ式ＲＤに対して、他の構成も可能である。
バッチ式ＲＤを選ぶ時に、幾つかの因子を考慮しないといけない。第一に、吸着剤との接触時間が延びると、最終のＰＣ中に存在する吸着剤からの浸出物のレベルが上がる。第二に、一般的にバッチ式ＲＤは、流動装置より血液製剤との接触時間が長い。従って、血液適合性（いわゆる血小板機能と凝固因子の過度の減少）を監視することが非常に重要である。第三に、バッチ式ＲＤは、吸着プロセス中に血小板／血漿を撹拌するための追加装置（つまり振とう機）を含む。使用された装置は、装置の不調により吸着時間が短くならないことを保証するための安全装置を有するべきである。
血液適合性の検討
血小板機能についての検討はバッチ式装置と流動装置両方を用いて行った（実施例２５と実施例−２９）。それらの結果から、幾つかの特殊な吸着剤は血小板機能を良好に維持することが示された。流動装置に関する問題は主に、装置内で形成し得る血小板凝集塊の除去を伴っている。しかし、凝集塊は一般的には、注入前に集合体フィルター（ａｇｇｒｅｇａｔｅ ｆｉｌｔｅｒ）により除去されるので、凝集塊の除去は大きな問題を生み出さないようである。バッチ式装置での血小板機能についての検討結果から、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭとＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６ＴＭは満足な血液適合性特性が持つことが示唆された。
特に注意するのは、たとえ同じ吸着剤を使っても、流動装置が必ずしも、バッチ式装置を用いて得られる結果と類似の結果をもたらすわけではないことである。流動装置の場合に血小板と吸着剤との接触時間が短いが、機械的応力や他のカラム成分との接触のような他の因子が血小板に有害な影響を与えるという可能性がある。
凝塊に関する検討を１００％の血漿で実施した。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭおよびＨｅｍｏｓｏｒｂａ ＣＨ−３５０ＴＭを使うと、一番良い結果（後掲の実施例３０）が得られた。このＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭおよびＨｅｍｏｓｏｒｂａ ＣＨ−３５０ＴＭは両方とも、試験されたパラメーターのいずれに対しても影響はほとんど無かった。凝固因子アッセイに関する実験を、バッチ式で、吸着実験で典型的に用いられる吸着剤対血漿の割合より高い吸着剤対血漿の割合で行った。また、流動装置は、より短い接触時間と共に、付随して血ぺい形成に関与するタンパク質の高い回収率をもたらす。
バッチ式装置と流動装置の比較
以上議論した流動式とバッチ式は、ソラレンの除去を行う際に起きる、血液製剤と吸着剤の間の直接接触という点が似ている。しかし、この二種類の装置の間に著しい差異が幾つもある。第一に、バッチ式吸着はソラレンと光化学反応生成物の残存レベルを＜１％まで低下させることが可能であるのに対して、流動吸着での場合にはその残存レベルが約５％でありやすい。前にも指摘したように、血小板からソラレンを移すための接触時間の減少に起因する動力学的制限によって、流動式を用いての残存ソラレンの完全な除去が妨げられる可能性がある。逆に、バッチ式吸着での延びた接触時間は除去時により効果的である。
第二に、バッチ式での延びた接触時間により、最終血小板混合物中に存在する浸出物のレベルが増加し得る。しかし、現在Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｉｎｃ．は、ＡｍｂｅｒｌｉｔｅＴＭの吸着剤を加工処理しており、この吸着剤は、浸出物のレベルを検出できないレベルまで効果的に減少させる。第三に、どちらの種類の装置を用いても、吸着剤の微粒子が最終的に血液製剤の受容者に注入され得るという可能性がある。流動装置は樹脂にとって、より安定な構成を提供しているが、流動式のためのフローアダプターは血小板凝集塊による流路の詰まりを防ぐために、約６０μｍの最小メッシュサイズを必要とする。
しかし、バッチ式装置は、血小板がメッシュそのものを通過して流れる必要はないので、より小さいメッシュサイズ（例えば約１０μｍ）を使用し得る。したがって、バッチ式には、より小さいメッシュを使用する能力は、バッチ式において微粒子を注入する可能性を減少させ得る。
以上議論したすべての因子に基づいて、バッチ式アプローチは流動設計より好ましい。バッチ式吸着に関して行われた検討において、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭやＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６ＴＭやＨｅｍｏｓｏｒｂａ ＣＨ−３５０ＴＭは高いＳ−５９の吸着容量、かつ良い血液適合性特性を呈する吸着剤であった。これらの樹脂のうち、Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｉｎｃ．により加工されたＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭとＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６ＴＭが好ましく、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭは凝固因子に有害な影響が少ないので、最も好ましい。
Ｅ．血漿からのソラレンの吸着
概要
ここで、ＲＤに関する議論はＰＣ、特に、血小板は３５％血漿／６５％ＰＡＳ ＩＩＩ中の血小板からのソラレンの除去に集中していった。しかし、本発明は、血漿や血清のような他の血液製剤からのソラレンの除去も企図する。このセクションでは血漿からのソラレンの除去について議論する。
一般的に、ＰＣからのソラレンの除去に適用されるのと同じ原理が、血漿からのソラレンの除去に適用される。従って、バッチ式と流動式の両方が、光処理した血漿からソラレンを除去するのに使用され得る。血漿（または血清）の場合、ソラレンを除去しなければならない血小板は存在しないので、滞留時間は重要な因子ではない。
血漿からＳ−５９の除去に関する主な制限は血漿蛋白質、主に血清アルブミンによる、遊離Ｓ−５９と光化学反応生成物との結合をめぐる競合である。
上記に述べたＰＣの場合と同様に、潜在的な吸着剤は、それらの有効性を決定するためにスクリーニングされた。表Ｄに幾つかの吸着剤についてコストとＳ−５９容量を示す。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６００のコスト（四列目）は決定しなかった。
また、二つ異なる流速で流動装置を用いた吸着データも得られた。その吸着データは実施例３０に示す。
凝固因子のアッセイ
血漿製剤に使用される吸着剤は、凝固カスケードにおいて重要なタンパク質のレベルを著しく激減させることなくＳ−５９を除去することが可能でなければならない。Ｓ−５９に対する様々な樹脂の選択性については、バッチ式吸着実験（下記の実施例３１参照）を行い、凝固時間および凝固因子レベルについてのアッセイに処理後の血漿を供することによって解析した。使用した吸着剤はＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭ、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６ＴＭ、Ｈｅｍｏｓｏｒｂａ ＣＨ−３５０ＴＭ、ＢｉｏＲａｄ ｔ−ブチル ＨＩＣＴＭ（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ）、およびＤａｖｉｓｉｏｎ Ｓｉｌｉｃａ（Ｇｒａｄｅ １５）である。
凝固因子のアッセイに関する実験は、吸着実験で典型的に使用される吸着剤対血漿の割合よりも高い吸着剤対血漿の割合で、バッチ式でおこなった。流動吸着装置は、より短い接触時間と共に、付随して血ぺい形成に関与するタンパク質の高い回収率をもたらすべきである。
ＶＩＩ．バッチ式除去装置の性能と製造
本発明の望ましい実施態様は、バッチ式除去装置を伴う。バッチ式除去装置はある種の血液製剤に対しては流動装置よりも望ましい。例えば血小板濃縮液とバッチ式装置を使用することにより、血小板からのソラレンの光化学反応生成物の除去の動力学的限界を超える。同様に新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）も動力学的限界（例えば、血清アルブミンや他の血漿タンパク質による、遊離Ｓ−５９と光化学反応生成物との結合をめぐる競合）を有しており、この動力学的限界はバッチ式装置を用いて克服される。
「除去装置」および「ＲＤ」といった用語は、メッシュポーチ／バッグ（例：ポリエステルメッシュ）、透過膜から構築されるポーチ、カートリッジ（例：インラインカラム）、または他の適した手段に保持された、公知の多くの医療用／製薬用グレードの吸着剤（例：ポリマー性吸着剤ビーズ）を意味する。本発明は、ソラレンおよびソラレンの光化学反応生成物を除去するためのＲＤの使用を企図している。一般的にいうと、ＲＤとの接触時間が長いほどソラレンおよびソラレンの光化学反応生成物は多く除去される。しかしながら血液貯蔵の手順により課される実施上の限界が、利用可能な接触時間を制限する。
好ましい実施態様ではＲＤ（例：吸着剤を含んだポーチ）は血液製剤貯蔵容器（例：血小板貯蔵バッグの中に含まれている。本発明品はまた、詳細は後述するが、他の実施態様を企図しており、この他の実施態様は、Ｓ−５９と光化学反応生成物の除去に吸着剤を利用するものである。
このセクションではバッチ式ＲＤの性能の必要条件、そのようなＲＤに特に適した吸着剤、ならびにＲＤ製造プロセス全体について記述する。
Ａ．バッチ式除去装置の条件
本発明品の一実施態様では血液製剤はまず照射容器中でソラレンとＵＶＡによる処理がおこなわれる。例えばＳ−５９（１５．２ｍｇ）が、３００ｍｌ（３５％血漿／６５％ＰＡＳ ＩＩＩ）中に懸濁したおよそ４．０×１０１１個の血小板に加えられ、３Ｊ／ｃｍ２の長波長のＵＶＡ（３２０〜４００ｎｍ）で照射され得る。照射後、残存Ｓ−５９が存在する。さらに低分子量の光化学反応生成物が存在すると考えられる。その後、血液製剤は例えば、ＲＤを含んだ改良型のＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）に移され、特定された時間（例：血小板振盪機で８時間より長い時間）インキュベートされる。このインキュベートにより、血液製剤がヒトへの注入のために放出され得るような十分に低いレベルまで残存ソラレンおよびソラレン光化学反応生成物を除去する（すなわち、Ｓ−５９の減少）ことが可能となる。インキュベートした後、血液製剤は、注入を延期する（例えば、血小板については最長で５日）ために、他の貯蔵容器（例：ＰＬ２４１０プラスチック容器；Ｂａｘｔｅｒ）に移される。スキームＤは上述したＳ−５９の減少プロセスを図で示す。
代替の実施態様ではＵＶＡの照射とＲＤ処理が１つの血液製剤バッグ中でおこなわれる。この実施態様では、血液製剤のバッグが除去可能な外部パーティションによって２つの区画に分けられる（スキームＣ、構成Ｂ参照）。スキームＣ、構成Ｂによると、血液製剤が下の区画で照射されている。照射後、パーティションは除去され、照射された血液製剤は上の区画内に固定されたＲＤと接触する。インキュベーションののち、血液製剤バッグはつりさげられ、パーティションが元の所に戻され得、その結果、ＲＤから血液製剤が隔離され得る。あるいは、ＲＤから血液製剤を隔離するために、バッグを溶接（例：ヒートシールまたはインパルス溶接）してもよい。次いで、血液製剤バッグ全体（すなわち、照射されかつＲＤ処理された血液製剤とＲＤ自体を含んでいる）は貯蔵され得、注入を延期し得る。
さらにＳ−５９と光化学反応生成物の効果的な除去のために、インビボでの条件でＲＤは注入された血液製剤の性能に有害な影響を及ぼしてはならない。ＰＣについては、ｐＨ、形態スコア（ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ ｓｃｏｒｅ）、血小板の形状変化、および低浸透圧ショック応答を含む、幾つかのインビトロでの血小板機能試験が、インビボでの注入後の回収率と残存物と相関があることが報告されている［Ｓ．Ｍｕｒｐｈｙら、「インビトロでの貯蔵された血小板濃縮液の質の評価（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏ Ａｓｓｅｓｓｍｅｎｔ ｏｆ ｔｈｅ Ｑｕａｌｉｔｙ ｏｆ Ｓｔｏｒｅｄ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ）」、Ｔｒａｎｓｆｕｓｉｏｎ Ｍｅｄ．Ｒｅｖ．ＶＩＩＩ（１）：２９−３６（１９９４）］。ＲＤは血小板の機能に悪影響を及ぼす物質を有しないことが望ましい。
下記の表ＡＡには、バッチ式ＲＤに対する、特定の示唆された最小限の必要条件が列挙される。
これらの必要条件は単に好ましいだけであることが強調されるべきである。したがって、必要条件の改変は本発明の範囲内であると理解されるべきである。これらの必要条件はＳ−５９の除去のためのバッチ式除去装置に具体的に適合するが、使用されるソラレンにかかわらず多くの必要条件が応用可能である。
Ｂ．除去装置に特に適した吸着剤
前のセクションにおいて、血液製剤からソラレンの光化学反応生成物を除去する際の使用について企図された特定の吸着剤の概要について説明した（例えば、表Ａを参照）。バッチ式除去装置での使用に適した多くのポリマー吸着剤があり、例えば、Ｄｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ（例：Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４０３２３，ＸＵＳ−４３４９３，およびＸＵＳ−４０２８５）、Ｍｉｔｓｕｂｉｓｈｉ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（例：Ｄｉａｉｏｎ（登録商標）ＨＰ２０）、Ｐｕｒｏｌｉｔｅ（例：Ｈｙｐｅｒｓｏｌ−Ｍａｃｒｏｎｅｔ（登録商標）Ｓｏｒｂｅｎｔ Ｒｅｓｉｎｓ ＭＮ−１５０およびＭＮ−４００）、およびＲｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ（例：Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−２，ＸＡＤ−４，およびＸＡＤ−１６）により製造されるものが挙げられる。最も好ましい吸着剤はＤｏｗ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙにより製造された不活性ポリマーのＤｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３である。Ｄｏｗｅｘ ＸＵＳ−４３４９３はＯｐｔｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｌ４９３として商業的に知られている。
本発明の中で最も有用なポリマー吸着剤は非イオン性のマクロ多孔性かつマクロ網状の樹脂である。「マクロ多孔性」という用語は、一般に樹脂の２０％以上が架橋しているものをいう（架橋については後述）。「マクロ多孔性」は「マクロ孔」とは区別可能であり、孔の直径が５００Åより大きいことをいう。最後に「マクロ網状」という用語は、その構造が高い物理的多孔性を有している（すなわち多数の孔が存在する）ことを意味する関連用語である 。
非イオン性のマクロ多孔性樹脂かつマクロ網状の樹脂は特に血小板濃縮液からのソラレン光化学反応生成物の除去に有効である。非イオン性のマクロ多孔性かつマクロ網状のＤｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３が望ましい第一の理由は、Ｓ−５９への高い親和性に加えて、優れた湿潤特性も有しているためである。以下で詳細に論議する通り、「優れた湿潤特性」とは、乾燥した（すなわち本質的に無水の）吸着剤は、残存Ｓ−５９および光化学反応生成物を吸着剤が効果的に除去する目的で、照射されたＰＣと接触する前に湿潤剤（例えば、エタノール等）で湿らせる必要がないことを意味する。メチレン架橋された、スチレンとジビニルベンゼンのコポリマーである吸着剤ビーズは、直径およそ３００〜８５０μｍの範囲の球状粒子の形態である。Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３は極めて大きい内部表面積（１１００ｍ２／ｇ）および比較的小さい孔（４６Å）を有し、この内部表面積および小さい孔が、Ｓ−５９や光化学反応生成物のような小さい疎水性分子を除去する際にＤｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３をとても効果的なものにする。本発明が、除去が行われる機構に制限されることを意図しないが、疎水性相互作用は吸着の主要な機構であると考えられる。Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３は強酸、強塩基および有機溶媒には不溶である。その多孔性の性質は、大分子（すなわちタンパク質）および細胞と比較して表面領域のより多くの部分に小分子が接近することを可能にすることにより、吸着プロセスに対し選択性を与える。Ｐｕｒｏｌｉｔｅ（登録商標）ＭＮ−１５０はＳ−５９への高い親和性および優れた湿潤特性といった、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３に似た特徴を多く有しており、好ましい吸着剤である。
疎水性のマクロ網状樹脂のビーズを含んだ、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤシリーズの吸着剤もまた効果的である。さらにＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ（登録商標）ＣＧシリーズの吸着剤（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅの小粒子のもの）のような様々な種類のＡｍｂｅｒｌｉｔｅもＲＤでの使用に適している。Ａｍｂｅｒｃｈｒｏｍ吸着剤はＦＦＰ（新鮮凍結血漿）に関連するソラレン除去についてのよい結果が示されている（データは示さず）。さらにＲｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓも炭素質の（すなわち炭素の豊富な）Ａｍｂｅｒｓｏｒｂ吸着剤を製造しており、このＡｍｂｅｒｓｏｒｂ吸着剤の各々が広範な範囲の孔サイズを有している。
上述の吸着剤の構造関連の特徴の一部を表ＢＢにまとめた。それらの構造関連特性に加えて、表ＢＢ中に列挙された吸着剤は、吸着剤をバッチ式除去装置での使用に適切にする他の特徴を有する。その多くを前に述べた、それらの特徴としてはソラレン（特にＳ−５９）への高い親和性、ソラレンに対する良好な選択性、良好な血液適合性、および安価であることが挙げられる。製造者により供給される吸着剤は一般的には製薬的および医学的な応用に対して受容可能ではないので、そういった応用に対して受容可能な高純度状態を作り出すために、吸着剤を処理しなければならない（後述）。そのような高純度状態を達成する吸着剤の能力は他の望ましい特徴を表す。
表ＢＢによればポリ芳香族は全てポリスチレン−ジビニルベンゼンのコポリマーである。ＲＤでの効果の点からみると、一般的にいって、ポリメタクリレートは有用でないことに注意しなければならない。このことは、ポリメタクリレートは疎水性ではないという事実の結果であるか、樹脂とソラレンの間に芳香族スタッキング相互作用がないからであり得る。最後に、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３で使用されている吸着剤は乾燥型と湿潤型の両方が商業的に入手可能である（それぞれ、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３．００およびＤｏｗｅｘ ＸＵＳ−４３４９３．０１）。
任意の特定の組成を有する吸着剤または任意の特定の手順で得られる吸着剤の使用に限定はされていないが、本発明の好ましい吸着剤はポリスチレン網状組織である。「ポリスチレン網状組織」という用語は、スチレン（Ｃ６Ｈ５ＣＨ＝ＣＨ２）モノマーを含むポリマーのことを幅広く意味する。
このポリマーは、フェニル置換基を有する単一の共有結合性アルカン鎖からなる直鎖であっても、二次元ポリマー主鎖を形成するために一般にｍ−またはｐ−フェニレン残基と架橋してもよい。ポリスチレン網状組織は、それらの合成機構ならびに物理的特徴および機能的特徴に基づいて、ｉ）在来網状組織とｉｉ）超架橋網状組織としてさらに分類し得る。これらの各分類については後述する。本発明の最も望ましい吸着剤は超架橋網状組織に分類される。
在来網状組織は主に、ジビニルベンゼン（ＤＶＢ）が架橋剤（すなわち、直線状ポリスチレン鎖を一つに結合する剤）の役割を果たす、スチレンジビニルベンゼンのコポリマーである。これらのポリマーの網状組織は「ゲルタイプ」のポリマーを含む。ゲルタイプポリマーは、モノマーのコポリマー化で得られる、均質で非多孔性のスチレン−ＤＶＢコポリマーである。このようなポリマーはイオン交換樹脂の調製において頻繁に使用される。マクロ多孔性の吸着剤は在来網状組織の２つめの分類を表す。マクロ多孔性の吸着剤は成長中のポリスチレン鎖を沈殿させる希釈剤の存在下でのモノマーのコポリマー化で得られる。この手順で形成されるポリスチレン網状組織は比較的大きな内部表面積を有する（ポリマー１ｇあたり数百ｍ２まで）。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４はこのような手順で生産されている［ＤａｖａｎｋｏｖおよびＴｓｙｕｒｕｐａら、「超架橋されたポリスチレンの構造と特性−ポリマー網状組織の新たな種の第一報（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ｈｙｐｅｒｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ − Ｔｈｅ Ｆｉｒｓｔ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ Ｏｆ Ａ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ）」、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ １３：２７−４２（１９９０）；Ｔｓｙｕｒｕｐａら、「超架橋ポリスチレン吸着剤’Ｓｔｙｒｏｓｏｒｂ’による水相からの有機化合物の吸着（Ｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ ｏｒｇａｎｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｒｏｍ ａｑｕｅｏｕｓ ｍｅｄｉａ ｂｙ ｈｙｐｅｒｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ｓｏｒｂｅｎｔｓ ’Ｓｔｙｒｏｓｏｒｂ’）」、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ２５：６９−７８（１９９５）］。
上述した在来網状組織とは対照的に本発明の好ましい吸着剤（例：Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９４）は超架橋網状組織である。これらの網状組織は溶液中または膨張した状態のいずれかで二価性剤を用いて直鎖のポリスチレン鎖を架橋することで生産される。好ましい二価性剤は配座が限定された架橋を形成し、この架橋は、吸着剤が本質的に無水状態（すなわち乾燥）のときに孔がつぶれるのを防ぐと考えられている。
超架橋網状組織は３つの主な特徴を有しており、これらの特徴により在来網状組織から区別されると考えられる。第一にポリスチレン鎖を離して固定する架橋に起因する低密度のポリマー鎖が存在する。その結果、吸着剤は一般的に比較的大きな多孔性表面の面積および孔径を有する。第二にこの網状組織は膨張しうる。つまりポリマー相の体積が有機分子に接触したときに増加する。最後に超架橋ポリマーは乾燥状態で「変形」する。つまり、乾燥状態の網状組織の堅さが、鎖同士が引き合うのを防ぐ。しかし、吸着剤が湿潤したとき変形が和らぎ、このことが液状媒体中で膨張する網状組織の能力を増加させる［ＤａｖａｎｋｏｖおよびＴｓｙｕｒｕｐａ、「超架橋されたポリスチレンの構造と特性−ポリマー網状組織の新たな種の第一報（Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｏｆ Ｈｙｐｅｒｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ Ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ - Ｔｈｅ ｆｉｒｓｔ Ｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｖｅ Ｏｆ Ａ Ｎｅｗ Ｃｌａｓｓ ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋｓ）」、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ １３：２７−４２（１９９０）；Ｔｓｙｕｒｕｐａら、「超架橋ポリスチレン吸着剤’Ｓｔｙｒｏｓｏｒｂ’による水相からの有機化合物の吸着（Ｓｏｒｐｔｉｏｎ ｏｆ Ｏｒｇａｎｉｃ ｃｏｍｐｏｕｎｄｓ ｆｒｏｍ ａｑｕｅｏｕｓ ｍｅｄｉａ ｂｙ ｈｙｐｅｒｃｒｏｓｓｌｉｎｋｅｄ ｐｏｌｙｓｔｙｒｅｎｅ ｓｏｒｂｅｎｔｓ‘Ｓｔｙｒｏｓｏｒｂ’）」、Ｒｅａｃｔｉｖｅ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ ２５：６９−７８（１９９５）］。
ｐ−キシレンジクロライド（ＸＤＣ）、モノクロロジメチルエーテル（ＭＣＤＥ）、１，４−ビス−クロロメチルジフェニル（ＣＭＤＰ）、４，４’−ビス−（クロロメチル）ビフェニル（ＣＭＢ）、ジメチルホルマール（ＤＭＦ）、ｐ，ｐ’−ビス−クロロメチル−１，４−ジフェニルブタン（ＤＰＢ）、およびトリス−（クロロメチル）−メシチレン（ＣＭＭ）のようないくつかの架橋剤がポリスチレン鎖間の架橋を形成するために首尾よく使用されている。この架橋は、これらの架橋剤の一つとスチレンのフェニル環とをＦｒｉｅｄｅｌ−Ｃｒａｆｔｓ反応によって反応させることにより、ポリスチレン鎖間で形成される。このようにして得られる架橋は、異なる２つのポリスチレン鎖に存在するスチレンのフェニル環をつなげる［例えば、本明細書中で参考として援用される米国特許第３，７２９，４５７号を参照のこと］。
前述したとおり架橋は吸着剤がＲＤで使用されるとき特に重要である。なぜなら架橋は一般的に「湿潤」剤の必要性を排除するからである。つまり、架橋は、吸着剤が本質的に無水（すなわち「乾燥」）状態の時に孔がつぶれるのを防ぎ、その結果照射された血小板濃縮液に吸着剤が接触する前に湿潤剤による「再開孔」の必要がなくなる。孔がつぶれるのを防ぐために配座が限定された架橋が形成されるべきである。ＤＰＢのようないくつかの二価性剤は一般的に限定された配座はもたらさない。例えばＤＰＢは配座転移を受けやすい４つの連続したメチレン単位を有する。このようなことからＤＰＢは本発明と使用するのに好ましい二価性剤ではない。
Ｃ．除去装置の製造プロセス
吸着剤の加工
上述した吸着剤は代表的な大量に入手可能なものであり、比較的安価である。上述したように吸着剤は医学的／製薬的応用に対して受容可能ではない。滅菌されなければいけないことに加えて、吸着剤は代表的には、微粒子、塩、潜在的抽出可能物、およびエンドトキシンを除去するためにさらに加工されなければならない。これらの抽出可能成分の除去は代表的には、有機溶媒、蒸気または超臨界流体のいずれかを用いて処理することによってなされる。
いくつかの企業が目下、ポリマー吸着剤の「きれいな」（すなわち加工された）バージョンを販売している。
この樹脂を加工することに加えて、これらの企業が吸着剤を試験し、最終の吸着剤は、保証された滅菌済（ＵＳＰ ＸＸＩ）の、発熱物質を含まない（ＬＡＬ）、検出可能な抽出可能物（ＤＶＢおよび全有機物）を含まない。さらに詳細を述べるとＤｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３は熱加工され得る。同様に、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ樹脂は熱加工されてもよく、有機溶媒で加工されてもよい。超臨界流体によるクリーニングは費用がかかるため、決まって使用されない。
有機溶媒の使用に関しては、有機溶媒の残存レベルと関連づけられる潜在的な問題が不利な点の１つである。残存溶媒は吸着に干渉し得、また吸着のプロセスにおいて血液製剤中に浸出し得、もしかすると注入受容者への悪影響を引き起こすかもしれない。これは特に最も一般的に使用される溶媒であるメタノールで起こる。加えて溶媒処分のコストに大きく起因して、有機溶媒は一般的に蒸気を使うよりもコストがかかる。
熱加工（たとえば蒸気）は吸着剤樹脂を加工するための効果的な方法である。確かに、ポリマー加工の標準的な参考書では蒸気による抽出はポリスチレンをクリーニングするための典型的な処理であると記載されている。［Ｆ．Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ，Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ Ｏｆ Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ，（Ｈｅｍｉｓｐｈｅｒｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｒｐ．），ｐｐ．４４９−５３（３ｒｄ．Ｅｄ．，１９８９）］。Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）は、溶媒を使わない独占的な熱処理法を使って、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３とＡｍｂｅｒｌｉｔｅ吸着剤をクリーニングする。蒸気を使う主な利点は、それが吸着剤に任意の可能性のある抽出可能物を加えないことである。しかしながら１つの大きな欠点は、この処理は樹脂のビーズの孔から水を取り除き得ることである。つまり、いくつかの吸着剤の効果的な性能は、照射後の血液製剤と接触させる前にビーズを再び湿らせることを必要とする。確かに、実験セクションのところで細かく述べるが、もしいくつかの吸着剤が乾いていたなら、吸着剤はそれらの吸着容量の大部分を失うのである。
重要なことに、異なる吸着剤はそれぞれ独特の湿潤必要条件を有する。汚れているＡｍｂｅｒｌｉｔｅ樹脂とは対照的に、きれいなＡｍｂｅｒｌｉｔｅは湿らすのが難しく、水溶液の表面に浮く傾向がある。蒸留水中の（１５〜３０％）エタノールで１０分間吸着剤を再湿潤させることはビーズの内部の細孔から、閉じ込められたガスを放出するという結果をもたらすことが発見された。一度、残存エタノールを除くために蒸留水でリンスすると、ビーズはそれらの吸着容量を回復する。実際、蒸留水中の１５％のエタノールの最小量に１０分さらすとＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４およびＸＡＤ−１６（後掲の実施例３２を参照のこと）の両方でほぼ最大レベルの吸着容量にまで戻る。吸着容量は水含有量の緊密な関数であることを示し、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６は５０〜６５％の水分で、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４は４０〜５５％の水分で最適吸着容量を持つ。つまり吸着容量は水含有量の減少により減少する。
それとは反対に、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３はＡｍｂｅｒｌｉｔｅ吸着剤と関連付けられる多くの湿潤問題の多くを排除することがわかった。なぜなら効果的性能のために血液製剤を接触させる前に再び湿らせる必要がないからである。確かにＤｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３（および別の「架橋」吸着剤（この架橋吸着剤は高度架橋構造を有し、それゆえ、乾いたときにも崩壊しない））の「湿潤性」はそのもっとも好ましい特徴の１つです。
最後に、きれいな／加工された吸着剤の鍵となる特徴の１つは直径３０μｍ未満の直径を有する、非常に低いレベルの粒子である。Ｓｕｐｅｌｃｏによって処理された吸着剤（Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３およびＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６）の予備試験は分子の数を決定するために行われた。これらの試験の結果は外来粒子（たとえば、ほこり、繊維、非吸着剤粒子および同定されていない粒子）は存在せず、微粒子（＜３０μｍ）は本質的に存在しないことを示す。加工後、吸着剤は大量に詰め込まれ、もし必要であれば、メッシュポーチに導入されるようにアセンブリ場所に輸送される。
メッシュポーチの組立
本発明は血液製剤貯蔵容器（例えば血小板貯蔵容器）中に収納されるバッチ式ＲＤ（メッシュバック／ポーチ中に保持される吸着剤。）を企図する。本発明は、メッシュポーチが織られた、医療用グレードのポリエステルメッシュから構成される事を企図する。ポリエステルメッシュは血液濾過装置を製造する際に使われる標準的な材料であり、したがって、ポリエステルメッシュはバッチ式ＲＤで使うのには特に十分に適合する。任意の会社で製造されているメッシュ材料に限定されないが、Ｔｅｔｋｏ，Ｉｎｃ．（Ｄｅｐｅｗ，ＮＹ）およびＳａａｔｉ（Ｓｔａｍｆｏｒｄ，ＣＴ）は現在、本発明と共に使用するのに適しているメッシュ材料を製造する。
もちろん別の適した材料（例えばナイロン）もまた使用され、本発明の範囲内にある。実際、発明者によって以前為された研究において、ポリエステルとナイロンの両方がＲＤに使うのに同程度に良く機能したことが示されていた（データは載せていない）。しかしながらポリエステルが血液適合性特性でナイロンよりも勝っているので、好ましい実施態様はポリエステルを使う。加えて本発明は膜（例えばＳｕｐｏｒ（登録商標）２００，８００，１２００（Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｒ，ＭＩ）およびＤｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）親水性改質ポリビニリデンジフルオリド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）から構築されたポーチの使用を企図する。
より望ましい実施態様において、メッシュポーチは４つの端と２つの表面を持ったポケットのような容器として組み立てられる。これらの容器はいくつかの方法の１つで製造されうる。例えば、ポーチは（ほぼ同じ寸法の）２片の材料を、３つの端で一緒にして溶接する（つまりシールを作るためにいっしょにする）ことによって作製され得る。４つの端は吸着剤でポーチを一杯にすることを可能にする目的で開いたままにしておく。つまり下で述べるが、４つの端も満たしてから密封する。あるいは、ポーチは、最初に一片の材料自身上にその材料の１部を折り返すことによって、一片の材料から作られうる。次いで、材料がそれ自身と重なっている領域が溶接（下で述べられる）され得、その結果、円筒チューブの形成をもたらし得る。その後、ポケットはシリンダーのオープンエンドの１つを溶接して閉じることによって形成され得、吸着剤で満たすために他のエンドを開いたままにし得た。つまりこのポーチのデザインは、より溶接されないものを要求する利点がある。本発明は４つの端のポケットとして組み立てられたポーチに限定されず、上で議論しているメッシュポーチを構築する技術にも限定されない。例えば、環状ポーチはまた本発明で使われるかもしれない。環状ポーチは一般に製造しにくく、環状ポーチは、溶接がメッシュの織りと平行ではないのでより強いという利点がある。
ポーチの組み立てについては、超音波溶接は、超音波溶接の優れた強度に起因して、熱溶接より好ましい。超音波溶接の技術は医薬工業のための濾過装置を製造する分野で良く知られている。［例えば、米国特許第４，５７６，７１５号および同５，２６９，９１７号参照。］本発明は特定の溶接／密封技術に限定されない。つまり実際に本発明と共に、任意の適した密封技術（この技術は超音波密封および無線周波数（ＲＦ）密封、ヒートシール、およびインパルス密封を含むが限定されない）が使われ得る。使用される密封技術に関係なく、例えば、ポーチのオープンエンド（つまりスリット）のメッシュ材料の端は、製造中および取扱い中にポリエステル繊維がこぼれるのを妨げるようにヒートシールされる。本発明はまた、医療用装置の製造において標準である技術である、溶媒または洗浄剤溶液でメッシュ材料をリンスしエンドトキシンを除去することを企図する。
本発明は、血小板ユニットが含まれる場合、約３０μｍの開口部を有するメッシュ材料を使うことを企図している。このサイズは、部分的に、粒子注入限界のため選択された。１０μｍの開口部を有するメッシュと３０μｍの開口部を有するメッシュの間で、注入された粒子の数に重要な違いはない（データは載せてない。）。医療器具開発協会（ＡＡＭＩ）ガイドラインは直径１０μｍ−２５μｍを有する３０００個未満の粒子が注入されるべきであることを規定していることに注目すべきである。３０μｍの開口部を有するメッシュ材料は血小板ユニットへの微粒子の流出を妨げると考えられるが、別のサイズの開口部を有する材料は本発明の範囲内にある。しかしながら、極めて小さな開口部（例えば５μｍ）を有する材料はＲＤ（つまり吸着剤を含むポーチ）内または外への流動体の動きを妨げ得、それによって吸着プロセスに対して決定的な影響を及ぼし得る。そのため約１０μｍから５０μｍの間が好ましい範囲である。
除去装置の組立
メッシュポーチの構築後、吸着剤の明記された量がＲＤを形成するためにポーチに分配される。メッシュポーチは、吸着剤の添加、および医療用装置組立業者（例えば、Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｒｏｕｎｄ Ｌａｋｅ，ＩＬ）によるさらなる加工のためにポーチを別の場所に構築したり輸送したりする同じ場所で、吸着剤で満たされうる。
ポーチを吸着剤で満たした後、超音波溶接はオープンエンド（つまりスリット）を密封するのに使われる。もし望むなら密封されたポーチ中の吸着剤は次いで再湿潤され得る。Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３は効果的性能のために再湿潤を必要としないけれども、それはこの段階で再湿潤させてもよく、望むなら、血小板が吸着剤と最初に接触したとき「ガスの発生」を妨げるかまたは最小限にするために再湿潤させてもよい。
いくつかの理由で製造するこの段階で、湿潤工程が行われる。第１に、吸着剤でのメッシュバックの自動充填は、吸着剤が自由に流動することを必要とする。きれいな吸着剤は比較的乾燥しており、かつ自由に流動する一方、吸着剤を再湿潤したとき、湿った砂のように一部の吸着剤が凝集する傾向がある。このように吸着剤を充填後に再湿潤することが好ましい。第２にメッシュバッグを充填した後のリンス工程は、微粒子がバッグの外側表面から洗われることを可能にし、最後のＲＤにおいて微粒子の汚染を減らす助けとなる。最後に、リンスプロセスは吸着剤から残存エタノールを除く働きをする。もちろん本発明は、このステージで吸着剤の再湿潤に限定されるものではない。もう一度、加工された吸着剤の再湿潤は多くの吸着剤の充分な性能に必要であることが見出されてきた一方で、いくつかの吸着剤（例えば、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３）は効果的に作動させるのに湿潤させる必要はない。
ＲＤはそれから血液製剤貯蔵容器に挿入されうる（このプロセスは実験セクションで詳細に述べる。）。血液製剤貯蔵容器中に含まれるＲＤは、貯蔵している間、乾燥を妨げるように耐湿バリアー内に包まれうる。本明細書中で使用されているように「耐湿バリアー」という用語は、貯蔵中にＲＤの水分含有量を維持することが可能な任意の容器、パッケージ、またはオーバーラップなどを取り囲むことを意味している。例えばＲＤを含んでいる血液製剤はホイルオーバーラップで密封されうる。その後、ポーチは貯蔵中に微生物の成長を妨げるように（例えばγ線照射、電子ビーム（つまりＥビーム）、またはオートクレーブにより）最終的には滅菌すべきである。好ましい血小板貯蔵容器であるＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）はオートクレーブできないことに注目すべきである。
このように、ＰＬ２４１０プラッチック容器がＲＤを収容するのに使用されるとき、γ線照射かＥビームのいずれかによって滅菌されなければならない。
最後に、実験セクションで細かく述べるが、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４およびＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６の両方の「乾燥動態」は室温の標準的な研究室条件下で決められた。５Ｍｒａｄおよび１０Ｍｒａｄの線量でのガンマ線滅菌はＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６の吸着動態には影響がなく、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４にはほんのわずかだけ影響があった。ガンマ線滅菌は、両方の吸着剤について吸着剤に対してわずかな影響を及ぼしたが、吸着容量は受容可能なままであった。５ＭｒａｄまでのＥビーム滅菌についてのデータはまた滅菌後に両吸着剤について受容可能な機能を示している。最後にＤｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３を含むガンマ線滅菌された装置は試験され効果的だと分かった。
Ｄ．性能を高めるための除去装置への改変
Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３は好ましい実施態様を表す一方で、ＲＤでのその使用はいくつかの欠点と結びついている。これらの問題はＤｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３に特異的でなく、同様にその他の吸着剤と結びつけられ得ることに注目すべきである。このセクションはそのような欠点の性質について述べ、潜在的な溶液を示す。
ガス発生／泡立ち
乾燥した吸着剤の孔に含まれる空気は最初に吸着剤を湿らせる間に放出される。
この「ガス発生」プロセスは、貯蔵の最初の約４時間の間、血小板濃縮液中での泡立ちをもたらす。処理中の泡の出現は好ましくないけれども、Ｓ−５９除去動態、血小板収量およびインビトロ血小板機能に対するその影響は有意ではない。
ガス発生の問題は、いくつかの潜在的な解決策によって緩和され得る。第一に、ＲＤは食塩水またはＰＡＳで湿潤され得る。Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３の結果はＲＤが等張液中で前もって湿潤されるとき、最小限の収量および血小板機能の増加しか示さなかった。このアプローチの主な欠点は製造プロセスでの複雑さの増加、滅菌関係、および抽出可能物によるＲＤの貯蔵寿命の潜在的減少である。
第二に、ＲＤは、水溶液中の溶解度が高い不活性ガス中に貯蔵され得る。ＣＯ２（溶解度＝１７０ｍＬ／ｍＬ）を用いた前の実験は、水溶液中の溶解度が高いガス中でのＲＤの貯蔵はまた泡立ちを最小限にし得る（データ示さず）。しかしながら、ＣＯ２の使用は、最初に血小板と接触している間にｐＨの大きな低下をもたらす（ｐＨ＜６．５）。共通して使用され、水溶液中の溶解度が高い唯一他のガスは一酸化二窒素（溶解度＝１３０ｍＬ／ｍＬ）である。
最後にＲＤは真空中で貯蔵されうる。例えば、ＲＤを含んでいるＰＬ２４１０プラッチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）を真空にするのにシリンジが使われ得、それゆえ最初に血小板と接触する間のガス発生を最小化する。真空下での貯蔵は、ＰＬ２４１０プラスチック容器がガス透過性であるので、ＲＤを含んでいるＰＬ２４１０プラスチック容器が真空密封されたホイルオーバーラップで包まれることを必要とする。実際にこれは本発明の好ましい実施態様に対する解決策である。
血小板収量と血小板機能
表ＡＡに示されるように、血小板の１０％未満の減少を達成することがこう望ましい。８時間の接触後、空のＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）に血小板を移す研究は血小板の１０％未満の減少を証明してきた。最近の研究は、ＲＤとの５日間の接触後の血小板の１０〜３０％の減少を伴う血小板ユニットの中での広範な可変性を示している。完全に確立されていないけれども、吸着剤および／またはメッシュに血小板が粘着することが、おそらく血小板減少の主な原因である。
研究は、形状変化アッセイの重要さは明確に理解されていないけれども、形状変化は血小板機能に対する本発明のＲＤの効果を監視するためのもっとも敏感なアッセイであることを示してきた。ＲＤから移し、ＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）中で同量の自己由来の血漿をインキュベートした後、血小板は形を変化させる能力を再び得ることができる。別のアッセイ（ｐＨ、低浸透圧ショック応答、形態スコア、Ｐ−セレクチン発現（ＧＭＰ−１４０）、分泌されたＡＴＰや集合体）はＲＤによって悪影響を及ぼされるようには思われない一方で、ラクテート、グルコースおよびｐＯ２／ｐＣＯ２のアッセイは、血小板代謝は、本発明のＲＤと接触中はわずかに抑制され得ることを示唆する。
血小板収量および血小板機能に対する悪影響を克服するためのいくつかの潜在的な解決策が存在する。第一に、ポーチ内で使用されるポリエステルメッシュ材料は膜材料で置き換えられうる。５μｍ以下のカットオフを有する膜材料を利用するＲＤは、吸着剤との接触から効果的に血小板を排除しうる。つまり吸着剤への輸送はバルクな流れよりもむしろ拡散によって行われているので、Ｓ−５９と光化学反応生成物の除去動態は悪影響を受けうる。Ｓ−５９除去のための必要条件を満たす際に効果的であることが証明されうる、潜在的な商業的に入手可能な膜としてはＳｕｐｏｒ（登録商標）２００，８００，１２００（Ｇｅｌｍａｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，ＭＩ）およびＤｕｒａｐｏｒｅ（登録商標）親水性改質ポリビニリデンジフルオリド（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｍｉｌｆｏｒｄ，ＭＡ）が挙げられる。これらの膜は特徴と結びついた低分子量タンパク質を持つ。
第二に、吸着剤は、血液適合性を改良するために、ポリ（２−ヒドロキシエチルメタクリレート（ｐＨＥＭＡ）およびセルロースベースのポリマーのような血液適合性ポリマーでコーティングされうる。これらのポリマーは、Ｓ−５９のような低分子化合物が吸着剤へ通り抜けられるようにする一方で、細胞が、吸着剤の表面と相互作用するのを妨げるヒドロゲルである。ｐＨＥＭＡでコーティングされたＤｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３の研究は、血小板の形状変化に対する劇的な影響と同じくらい血小板収量の増加を実証した。つまりＳ−５９吸着動態においてほんのわずかな減少がある（データは示していない）。ｐＨＥＭＡのコーティングを増加（０〜１５％）させた試料はＷｕｒｓｔｅｒコーティングプロセス（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ Ｃｏｒｐ．，Ｗｉｎｃｈｅｓｔｅｒ，ＫＹで実行されている）を使い生み出される。タンパク質結合を減少させるヒドロゲルはまた、本発明の吸着剤のコーティングについて考慮され得る。
第三に、吸着剤表面は固定されたヘパリンで修飾されうる。加えて強陰イオン交換ポリスチレンジビニルベンゼン吸着剤はヘパリン吸着によって修飾されうる。ヘパリン（ポリアニオン）は強陰イオン交換の特徴を持つ吸着剤の表面に非常に強く吸着する。四級アミンで修飾されたポリスチレンジビニルベンゼン吸着剤の種々のものが商業的に入手可能である。このアプローチの主な問題は、強陰イオン交換樹脂が正電荷を有することであり、この正電荷はまたＳ−５９と低親和力をもたらす。しかしながらＸＵＳ−４０２８５（Ｄｏｗ）およびＭＮ−４００（Ｐｕｒｏｌｉｔｅ）は標準的なイオン交換樹脂よりも電荷密度が約１０倍低い。これらの吸着剤は、その修飾されていない対照物（それぞれＸＵＳ−４３４９３およびＭＮ−１５０）と比べてＳ−５９に対する約半分の容量を有し、修飾されていない対照物はＳ−５９に対する高い親和性を有する。
ＶＩＩＩ．吸着に対するソラレンの構造的特徴の効果
前のセクションで、血液製剤からソラレンＳ−５９［４’−（４−アミノ−２−オキサ）−ブチル−４，５’８−トリメチルソラレン］およびＳ−５９光化学反応生成物の除去を示した。しかしながら本発明は、Ｓ−５９または構造的に関連するソラレンの使用および除去に限定されない。実際に、はっきりした構造特徴を持つソラレン除去は本発明により企図される。
このセクションは、血液製剤からのいくつかの構造の異なるソラレンの除去の実験を伴う。光除染プロセスで使われうる多様な構造変異体を反映するように、試験されたソラレンは選択された。無電荷ソラレン、および正に帯電したソラレンは、核酸が負に帯電しているので効果的である主な変異体であると期待される。つまり試験されたソラレンの化学構造はそれに応じて選択された。特に強力な塩基性（４級アミン）ソラレン、ならびに、異なる側鎖基を持つ２つの臭素化ソラレン（１つは正に帯電し、１つは負に帯電している）が試験された。
吸着の研究で、これらのソラレンはアンバーライトイオン性吸着剤とアンバーライト非イオン性吸着剤と組み合わされた。実験の手順は実施例３９で詳しく述べる。
本発明は特定のメカニズムに限定されることはないけれどもソラレン除去の最初のメカニズムはソラレンの芳香環と吸着剤の側鎖（例えばポリスチレン）の間の親油性相互作用を伴うと考えられる。このように、非常に極性の高いソラレンは、親油性吸着剤との親和性が減少するので、除去しにくくなりうる。実験のセクションで詳しく述べるがＨＰＬＣ保持時間は親油性のおおよその目安として使われ得る。さらに親油性に加えて別のファクターがソラレン吸着に影響を与える。例えば、ソラレンは血液製剤中にある細胞または血漿タンパク（例えば血清アルブミン）と相互作用しうる、つまり、これらの競合相互作用は理論的に樹脂結合とソラレン除去に干渉することができる。
実験のセクションで論証するが、広範な構造特徴を有するソラレンは血液製剤から除去される能力がある。本発明は、具体的に試験されたソラレンにも、実験で使われた吸着剤樹脂にも限定されないことが理解されるべきである。
ＩＸ．血小板収集プロセスへのバッチ式除去装置の組み込み
２つ以上の特定の成分（例えば赤血球や血小板）への全血の分離は最近の薬における日常業務である。分離された成分を単独でまたは添加物と組み合わせて、治療用途、研究用途および別の関連用途で利用されうる。いくつかの血液分離手順は被験体から全血を取り出すこと、全血を分離手順に供すること、および１つ以上の成分を被験体に再注入することを含む。再注入されない成分（単数または複数）は、第ＶＩＩＩ因子を含むフラクションといった血液製剤を調製するために使用され得る。つまり逆に、これらの成分は薬理学的処理、放射線学的処理または同様の処理に供され得、その後ドナーまたは別の被験体に戻され得る。
Ａ．アフェレーシス
用語「アフェレーシス」は、ドナーから血液を除き、様々な成分に分離する手順を広範に意味し、ここで、関心のある成分は収集されて保持され、他の成分はドナーに戻される。ドナーは、成分除去により引き起こされる体積や圧力の減少を補うのをたすけるために、再注入プロセスの間に置換流体を受け取る。透析センターや血液バンクを含め、アフェレーシスは多くの入院患者および外来患者の設定で実行され得る。
アフェレーシスには白血球アフェレーシス（白血球が、収集される、関心のある成分である）、血小板アフェレーシス（ｐｌａｔｅｌｅｔｐｈｅｒｅｓｉｓ）または血小板アフェレーシス（ｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔａｐｈｅｒｅｓｉｓ）（血小板が、収集される、関心のある成分である）または血漿アフェレーシス（血漿が、収集される、関心のある成分である）を含む、いくつかの特定のタイプのアフェレーシスがある。
別のタイプのアフェレーシスは、ドナーの血漿の一部が置き換えられる治療的血漿交換、および、収集された血液成分がいくつかの種類のプロセス（例えば、トキシンの除去）に供され、その後ドナーに戻される、治療的血漿プロセスを含んでいる。
［本明細書中で参考として援用される、Ｐｒｉｎｃｅらに対する米国特許第５，１１２，２９８号を参照のこと。］
通常最もよく使われるアフェレーシスの一つは、一人または複数の受容者へ注入するために一人または複数のドナーからの血液成分の収集である。アフェレーシスは、成分の治療用量を得るためにランダムなドナーでの手順よりも少数のドナーを必要とするという点で有利である。例えば、血小板の１ユニットの収集には一般的にランダムドナー法を用いると約６人必要であるが、アフェレーシスを用いるとたった一人しか必要としない。
自動アフェレーシス機の出現よりも前に、アフェレーシスは手動で行われていた；つまり、取り出された血液は手動で分離され（例えば、遠心分離を行い）、維持される予定ではなかった成分が手動で再びドナーへ注入された。反対に、近代的な自動的な方法は手動方法とほぼ同じように大きな労力を強いることなしに、希望の成分の素早く正確な収集を可能にした。自動アフェレーシスはアフェレーシスユニットまたはアフェレーシスシステムとして典型的には言及されるが、ヘムフェレーシスまたはプラズマフェレーシスユニット、細胞分離機、または血球のプロセッサとしても知られる装置を利用している；以下、これらの機械は「アフェレーシスシステム」と呼ばれる。
Ｂ．アフェレーシスシステムの操作
アフェレーシスシステムの操作法は当該分野で知られている。例えば、Ｐｒｉｎｃｅらに対する米国特許第５，１１２，２９８号では、はじめにアフェレーシスシステムの主たる構成部品およびそれらの使用方法を記述し、そして流体の単純化された分離についてのシステムを記述している。同様に、Ｊｏｎｓｓｏｎに対する米国特許第５，１４７，２９０号（この米国特許は本明細書中で参考として援用される）では、溶血性フェレーシス、例えば血小板フェレーシスのための方法および装置について述べ、そしてアフェレーシスの一般的な原理を示している。アフェレーシスシステムの操作の簡単な概観は本発明のある側面を理解するのを助け、以下に提供する。
自動化したアフェレーシスシステムは一般的に血液分離装置、チューブおよびフィルターの入り組んだネットワーク、収集バッグ、抗凝血剤、ならびにすべての構成部品を制御するコンピュータ化された手段を備える。血液分離装置は密度に基づいて血液を異なる成分に血液を分離する通常最もよく使われる遠心分離機である。少なくとも一つのポンプがアフェレーシスシステムを通して血液、分離した血液成分、および流体添加物を移動させ、最後にドナーへ戻されるか、または収集バッグへ移動させるかのどちらかである。滅菌されたチューブのセット（フェレーシスセット）は操作者（通常看護婦か訓練された技術者）によってアフェレーシスシステムおよび処置をされるドナーまたはヒトへつながれる。
血液がドナーからアフェレーシスシステムへポンプで輸送される間、酸性クエン酸デキストロース（ＡＣＤ）またはヘパリンのような抗凝血剤は、自動的に血液に加えられる。
そして血液が遠心分離チャンバーへ入り、そこで血液は様々な成分に分離される。分離に続いて、希望の成分が含まれる相は一つまたは複数の収集バッグへサイホンで移され、残りの成分はドナーへ戻される。このプロセスの間、血液の体外循環によって生じる、圧力および体積の減少を補うのを助けるために、ドナーは置換流体を投与されている；置換流体の性質は、アフェレーシスの型および目標に依存して異なっており、この置換流体は、生理食塩水、通常の血清アルブミンおよび血漿タンパク質画分を含む。
アフェレーシスシステムはいくつかの重要なパラメーターを監視および制御することができるセンサーをもっている。例えば、いくつかのセンサーは汚染物質を検出することおよび汚染を最少にするのを容易にすることができる。加えて、センサーは危険な条件、例えば、空気の泡の存在、が、顕著あるいは存在するとき検出でき、そして条件の操作者を刺激する信号を放つことができる。最後に、多くのシステムが、抗凝血剤のような成分の要求量を決定するか、制御するか、または確立するセンサーおよび他の機構を利用している（本明細書中で参考として援用される、Ｌａｎｇｌｅｙらに対する米国特許第５，４２１，８１２号を参照してください）。同様にそのような機構は除去された成分を補うために再び注入される置換流体の量の計算するために使うことができる。より洗練されたアフェレーシスシステムがプログラムできる；このようにして、操作者は再び注入されるために、重さおよび体積のように患者に特異的なパラメーターを入力することができ、そしてシステムが自動的に希望する分離を行う。
本発明は特に血小板フェレーシスのためのアフェレーシスシステムの使用を企図している；次いで、収集した血小板は光化学的処理、つづいてＲＤでの処理に供される。あるアフェレーシスシステムは光学的なセンサーを用いて収集ラインチューブ中の血小板の濃度を監視することによって、血小板収集バッグ中の血小板の量を得ることができることは注目すべきである。さらに、本発明は、血小板の純度と収量を増加させるための新しく記述された技術の使用を想像している（本明細書中で参考として援用される、Ｌａｔｈａｍ，Ｊｒ．らに対する米国特許第５，４９４，５９２号を参照）。
アフェレーシスシステムは間欠的なまたは連続的な遠心分離を行い得る。簡単に言うと、間欠的な遠心分離は、一本の静脈ラインを使用することによって、上で示した全ての工程（血液を引き出すこと、血液をその成分に分離し希望の成分を収集すること、および残りの成分を再注入すること）を行うことを含んでいる。一方、連続的な遠心分離は連続的に、すべての上記の工程を、少量のアリコットの血液で行い、別個のラインを通じてドナーに血液を戻す。したがって、連続的な遠心分離は、２つの静脈穿刺を必要とするが、間欠的な遠心分離は１つだけ必要とする。
上記のように、チュービングおよび他の成分のネットワークは、フェレーシスセットを構成する。２つの主なタイプのフェレーシスセットがあり、閉鎖型と開放型とがある。閉鎖型フェレーシスセットは、自己充足式である。すなわち、このセットは、セットの構成部品（収集バッグ、針および抗凝固剤含有バッグおよび生理食塩水含有バッグ）のすべてが、すべてすでに互いに接続された状態で購入される。開放型フェレーシスセットは、通常、上記の構成部品のすべてまたはほとんどを含むが、其の構成部品は接続されていない。開放型フェレーシスセットは、閉鎖型セットに比べて安いが、閉鎖型アフェレーシスセットは、自己充足式なので汚染の機会が減ることから、血液製剤の貯蔵期間が増大するという利点がある。例示すると、血小板のような輸血可能血液製剤は、通常、閉鎖系では５日間保存されうるが、これらは、開放型では２４時間までしか保存され得ない。
Ｃ．アフェレーシスシステムと連結するソラレン除染とソラレン除去装置
本発明はソラレン除染およびアフェレーシスシステムを用いたバッチ式ＲＤの使用を企図している。いくつかの手順を下にまとめているが、本発明はアフェレーシスシステムの操作へバッチ式ＲＤを組み込むどんな特定の手段にも制限されていない。以下につづく考察を理解することを助けるために仮想のアフェレーシスシステムの操作をまとめた流れ図をスキームＥに描いている。スキームＥにおける流れ図はアフェレーシスシステムの実例となるデザインを通じて、流体の起こり得る流れを描くことが意図されており、任意の実際のアフェレーシスの手順を描くつもりはないことが強調されるべきである。当業者は、アフェレーシスの手順が、スキームＥで示したものよりも、異なる流体の流れ道および異なる構成部品または構成部品の異なる配置を含んでいるかもしれないことを理解している。
スキームＥによると、全血はドナー５００から取り出され、流入口ライン５０２へと運ばれる。抗凝血用ポンプ５０６は抗凝血剤を抗凝血剤容器５０８から、流入口５０２へ出る抗凝血剤ライン５０９を通して運ぶ。次いで、抗凝血剤を含んだ全血は流入口ポンプ５１６によって遠心分離器５２０へ運ばれる。いくつかのアフェレーシス機は分離された抗凝血剤ポンプおよび流入口ポンプの代わりに、一つのポンプを利用していることを留意するべきである。遠心分離器５２０は血液を白血球、赤血球、血小板および血漿のような、さまざまな成分に分離する。
次に、収集される細胞成分（例えば、血小板）は、細胞ポンプ５３６によって遠心分離器から、細胞収集ライン５３２を通して、収集容器５３８（例えば、血小板貯蔵容器）へ取り出され得る。類似の方法で、血漿は血漿ポンプ５２６によって遠心分離器から、血漿収集ライン５２２を通して、血漿収集容器５２８へ取り出される。残りの成分は返還ライン５４２を通してドナーへ返還される。置換流体は、置換流体容器５５８から置換流体ポンプ５５６を経由して返還ライン５４２に流体接触している置換流体ライン５５２へ取り出される。コンピュータ制御機５５０はポンプを監視および制御し、流体体積、汚染物質、および同類のものを監視するさまざまなセンサーにつながれ得る。
任意の特別なアフェレーシス システムの使用に制限されないが、本発明の好ましい実施態様は、商業的に入手可能なＢａｘｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＣＳ−３０００ＴＭ（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｆｅｎｗａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を利用する。当業者はこのシステムの特異的な特徴およびその操作の機構（下にまとめてある）に精通している；しかしながら、アフェレーシスシステムの実例となるデザインについて上で記述した基本的な機構および構成部品は、このシステムと一緒に同様に適用できることを留意するべきである。
簡単に言えば、Ｂａｘｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＣＳ−３０００ＴＭはＢａｘｔｅｒ’ｓ Ｃｌｏｓｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ ＫｉｔＴＭと共同して使われ得このＢａｘｔｅｒ’ｓ Ｃｌｏｓｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ ＫｉｔＴＭは注入用の通常の生理食塩水およびＡＣＤの、あらかじめ取り付けられたバッグを有する。このキットは通常の生理食塩水で自動的に満たされる。操作者が示した速度で、全血−ＡＣＤポンプの複合ポンプによってドナーから取り出された全血に、抗凝血剤は加えられる。その後、ＡＣＤを含む血液は遠心分離チャンバー内にある２つの容器のうちの１つである、分離用容器への多数の管腔チューブのうち一つの管腔を通してポンプにより輸送される。分離用容器を通って加工血液は血小板を多く含む血漿および赤血球に分離される。「多数の管腔チューブ」という言葉は、一を超える別個でありかつ異なる流体通路を含んでいるチューブを意味する。
分離のあと、赤血球は多数の管腔チューブの別個の管腔を通してドナーに戻され、血小板を多く含む血漿は収集容器（遠心分離チャンバー内の２つの容器の２番目のもの）へポンプにより移される。血小板を多く含む血漿は収集容器を通って進み、血小板は濃縮されて保有される一方で、血漿がドナーへ戻されてもよい；しかしながら、一般的に血小板の再懸濁および貯蔵のためにドナーからの血漿の一部を同時収集する。
最後に、血小板は先に取り付けた貯蔵容器に移され、この貯蔵容器からの血小板がドナーへ注入される前にさらに加工され得る。
本発明の一つの実施態様において、血小板は最初に収集され（すなわち、先に取り付けた貯蔵バッグの中に）、そして照射するための準備において加工される。
より具体的には、自己由来の血漿の適した量が濃縮した血小板へ最初に加えられ、その後、希望の組成（例えば、３５％自己由来の血漿、６５％ＰＡＳ ＩＩＩ中、４．０×１０１１個の血小板／３００ｍＬ）になるような量でＰＡＳを加えられ得る。その後、ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液はＳ−５９と混ぜられ、適した容器中で照射される。照射後、ＰＣはＲＤを収容する容器に加えられ、Ｓ−５９と光化学反応生成物の除去に必要な時間インキュベートされ、そして血小板貯蔵容器へ移される；生じたＰＣは次いで、血小板貯蔵容器から受容者へ投与され得る。
実験のセクションで詳しく述べられるように、先に記述した実施態様は血漿−血小板混合物の収集の後にのみＰＡＳ ＩＩＩの添加を含み、そして最終血小板生産物が容器へ注入するための準備ができる前にいくつかの容器を輸送することを要求している。しかしながら、本発明は特定の実施態様に制限されない。実際は、本発明は、バッチ式ＲＤがアフェレーシスと共同で使われるときに、全体の工程の数、例えば、溶液の輸送の数を減らすための代替の手順の使用を企図している。
例えば、一つの代替の実施態様として、血小板収集容器に最後に収集された血小板は、すでに適した量の血小板および適した量のＰＡＳおよび血漿を含んでいる。スキームＦはこの代替の実施態様の中で、血小板収集手順を描いているスキームＥの改変版である。血漿貯蔵容器５３８および自己由来の血漿容器５２８を有することに加え、この実施態様は先に決定した量のＰＡＳ ＩＩＩ（または他の適した合成培地）を含むバッグ５３９を含んでいる。血漿収集の後またはそれと同時に、収集された自己由来の血漿（例えば、１０５ｍＬ）の適した量、およびＰＡＳ ＩＩＩの適した量（例えば、１８０ｍＬ）が自動的に血小板に加えられる；これは遠心分離機５２０を迂回し、血小板貯蔵容器５３８に入るチューブ５６２を通って、ＰＡＳ ＩＩＩおよび血漿を加えることによって行われ得る。このようにして、ＰＡＳ ＩＩＩの添加は血小板収集手順に組み込まれるので、この実施態様は、滅菌結合手順（実験セクションを参照のこと）を排除し、別の方法でＰＡＳ ＩＩＩ溶液を加えることを必要とされた。
ＰＡＳ ＩＩＩの適した量は、重力によって、ポンプによって（示さない）、または他の適した手段によって、血小板貯蔵容器５３８へ加えられ得る。一つの実施態様において、ＰＡＳ ＩＩＩバッグ５３９は先に決められた量を含んでおり、その結果、その全量が血小板貯蔵容器５３８の中に収集される規定量の血小板に加えられ得る。加えて、本発明は収集された血小板の量に基づいてリザーバーから適した量のＰＡＳ ＩＩＩを加えるためのマイクロプロセッサの使用を企図している。もし同時に加えられる場合、ＰＡＳ ＩＩＩ対血漿の一定の比が維持されることが好ましい。
同様な手順が自己由来の血漿の収集および添加に利用され得る。すなわち、先に決定した量の血漿は同時にドナーから収集され得、続いて全量が血小板の再懸濁に用いられる。このことは、希望の量に達するためにさらに血漿を加える前に、どれくらい血漿が血小板と会合するかを決定する必要性を排除する。説明すると、遠心分離に続いて、収集容器中の血小板は一般に少量の残存血漿（例えば、およそ３０ｍＬ）と会合する；さらに、通常、属すると考えられなければならないアフェレーシスシステムのチューブの中に残存血漿がある（例えば、およそ１８〜２０ｍＬ）。したがって、もし例えば１０５ｍＬの全血漿量が所望される場合、およそ約５５〜５７ｍＬの血漿が同時にドナーから収集され、続いて血小板の再懸濁のために添加される。
収集に続いて、ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液はＳ−５９と混合され、平衡に達するまでインキュベートされ、照射される。その後、照射された血小板調製物は、Ｓ−５９および光化学反応生成物の除去を可能にする規定された時間でＲＤを収容する血小板貯蔵容器へ移される。最後に、処理された血小板調製物は容器へ輸送できるものから血小板貯蔵バッグへ移され、この血小板貯蔵バッグから上記処理された血小板調製物は、受容者に注入され得る。
本発明の他の実施態様もまた可能である。しかしながら、代替の実施態様は特定の実際の考えによって制限されることが指摘されるべきである。
例えば、Ｓ−５９および合成培地溶液ＰＡＳ ＩＩＩは特に滅菌（例えば、オートクレーブ）および貯蔵についてともに両立可能であると考えられていない。同様に、Ｓ−５９は通常血小板貯蔵容器中に直接入れるべきではない。なぜならば、入手できる薬の量は血小板の取り込みによって減るので、長い時間にわたって、血小板によるＳ−５９の取り込みが微生物の不活性化に影響を与え得るからである。
本発明により企図された他の実施態様はＰＡＳ ＩＩＩを含むバッグ５３９および血小板収集容器５３８の間にあるＳ−５９を含む容器５６０の使用を含んでいる（スキームＧ参照）。ＰＡＳ ＩＩＩがＰＣに加えられているように、ＰＡＳ ＩＩＩはＳ−５９と混ぜられ、そして迅速に血小板収集容器に入れられる。したがって、追加的滅菌結合手順はこの実施態様によって回避される。
実験
以下に示す実施例は本発明の特定の好ましい実施態様および局面を示すのに役立っており、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
以下に示す実験の開示の中で、以下に示す略号を当てている：ｅｑ（当量）；Ｍ（モル濃度）；μＭ（マイクロモル濃度）；Ｎ（規定）；ｍｏｌ（モル）；ｍｍｏｌ（ミリモル）；μｍｏｌ（マイクロモル）；ｎｍｏｌ（ナノモル）；ｇ（グラム）；ｍｇ（ミリグラム）；μｇ（マイクログラム）；Ｋｇ（キログラム）；Ｌ（リットル）；ｍＬ（ミリリットル）；μＬ（マイクロリットル）；ｃｍ（センチメートル）；ｍｍ（ミリメートル）；μｍ（マイクロメートル）；ｎｍ（ナノメートル）；ｍｉｎ．（分）；ｓおよびｓｅｃ．（秒）；Ｊ（ジュール、ワット秒、図６，８〜１７では、ジュール／ｃｍ２をジュールまたはＪとしていることに注意）；℃（摂氏度）；ＴＬＣ（薄膜クロマトグラフィー）；ＨＰＬＣ（高圧液体クロマトグラフィー）；ＨＥＭＡ（ポリヒドロキシエチルメタクリレート）；ＰＣ（血小板濃縮液）；ＰＴ（プロトロンビン時間）；ａＰＴＴ（活性化部分トロンボプラスチン時間）；ＴＴ（トロンビン時間）；ＨＳＲ（低浸透圧ショック応答）；ＦＤＡ（米国食品医薬品局）；ＧＭＰ（医薬品の製造および品質管理に関する基準）；ＤＭＦ（薬物マスターファイル）；ＳＰＥ（固相抽出）；Ａｓａｈｉ（Ａｓａｈｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｌｔｄ．，東京，日本）；Ｂａｋｅｒ（Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ．Ｉｎｃ．，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪ）；Ｂａｒｎｓｔｅａｄ（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ／Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ Ｃｏｒｐ．，Ｄｕｂｕｑｕｅ，ＩＡ）；Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）；エッペンドルフ（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ Ｉｎｃ．，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；Ｇｒａｃｅ Ｄａｖｉｓｏｎ（Ｗ．Ｒ．Ｇｒａｃｅ ＆ Ｃｏ．，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ）；ＮＩＳ（Ｎｉｃｏｌｅｔ，ａ Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｐｅｃｔｒａ Ｃｏ．，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）；Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ（Ｃｈａｕｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）；ＴｏｓｏＨａａｓ（ＴｏｓｏＨａａｓ，Ｍｏｎｔｇｏｍｅｒｙｖｉｌｌｅ，ＰＡ）；Ｗａｌｌａｃ（Ｗａｌｌａｃ Ｉｎｃ．，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）；ＹＭＣ（ＹＭＣ Ｉｎｃ．，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，ＮＣ）；ＤＶＢ（ジビニルベンゼン）；ＬＡＬ（Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍｏｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓｔａｔｅ）；ＵＳＰ（米国薬局方）；ＥＡＡ（エチルアセトアセテート）；ＥｔＯＨ（エタノール）；ＨＯＡｃ（酢酸）；Ｗ（ワット）；ｍＷ（ミリワット）；ＮＭＲ（核磁気共鳴；Ｖａｒｉａｎ Ｇｅｒｍｉｎｉ ２００ＭＨｚフーリエ変換分光器で、室温で得られたスペクトル）；ｍ．ｐ．（融点）；ＵＶ（紫外線）；ＴＨＦ（テトラヒドロフラン）；ＤＭＥＭ（ダルベッコ変法イーグル培地）；ＦＢＳ（胎児のウシ血清）；ＬＢ（ルリア培養液（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ））；ＥＤＴＡ（エチレンジアミン四酢酸）；酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）；リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）；ＡＡＭＩ（医療器具開発協会（Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｆｏｒ ｔｈｅ Ａｄｖａｎｃｅｍｅｎｔ ｏｆ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ））；ＩＳＯ（国際標準化機構）；ＥＵ（エンドトキシンユニット）；ＬＶＩ（大容量注射可能物質）；ＧＣ（ガスクロマトグラフィー）；Ｍ（メガ）；ｋＧｙ（１０００グレイ＝０．１ Ｍｒａｄ）；ＭΩ（メガオーム）；ＰＡＳ ＩＩＩ（血小板を加えた溶液ＩＩＩ）；ＲＤ（除去装置）；ＳＣＤ（滅菌連結装置）。
参照を容易にする目的で、本発明のいくつかの化合物に１〜１８の数字を割り当てた。参照番号は表２で割り当てられている。それらの構造は図５Ａ〜５Ｆに示す。参照番号は実験のセクション全体にわたって使われている。
酸付加塩の形態で本発明の化合物を単離するとき、好ましくは、酸は、少なくとも通常の治療薬量で無毒および薬理学的に許容できる陰イオンを含むように選択される。この好ましい群に含まれる代表的な塩は塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、酢酸塩、リン酸塩、硝酸塩、メタンスルホン酸塩、エタンスルホン酸塩、乳酸塩、クエン酸塩、酒石酸塩または酒石酸水素塩、およびマレイン酸塩である。他の酸も同様に適していて、所望されるように使用され得る。例えば、フマル酸、安息香酸、アスコルビン酸、こはく酸、サリチル酸、ビスメチルエチレンサリチル酸、プロピオン酸、グルコン酸、リンゴ酸、マロン酸、マンデル酸、ケイ皮酸、シトラコン酸、ステアリン酸、パルミチン酸、イタコン酸、グリコン酸、ベンゼンスルホン酸、およびスルファミン酸もまた酸付加塩形成酸として使用され得る。
下に示した実施例のうちの一つはＨＥＰＥＳ緩衝液に言及する。この緩衝液は１３７ｍＭのＮａＣｌを８．０ｇ、２．７ｍＭのＫＣｌを０．２ｇ、１ｍＭのＭｇＣｌ２（６Ｈ２Ｏ）を０．２０３ｇ、５．６ｍＭのグルコースを１．０ｇ、１ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より入手）を１．０ｇ、および２０ｍＭのＨＥＰＥＳ（Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）より入手）を４．８ｇ含んでいる。
下に示した実施例のうちの一つにおいて、リン酸緩衝合成培地は血小板処理のために配合される。これは一段階で配合され得、蒸留水２リットル中に以下に示す試薬を合わせることによって、ｐＨが平衡化した溶液（例えば、ｐＨ７．２）をもたらし得る。
次いで、溶液は混ぜられ、（０．２ミクロンフィルターで）滅菌濾過され、冷蔵される。
ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）はいくつかの化合物によるウイルスの不活性化が完全であるかどうかを測定するために実施例の一つにおいて使われる。ＰＣＲはクローニングまたは精製することなしにゲノムＤＮＡの混合物中の標的配列のセグメントの濃度を増加させる方法である。本明細書中で参考として援用される、Ｋ．Ｂ．Ｍｕｌｌｉｓら米国特許第４，６８３，１９５および同第４，６８３，２０２号を参照してください。標的配列を増幅するこのプロセスは、希望する標的配列を含むＤＮＡ混合物へ大過剰の２つのオリゴヌクレオチドプライマーの導入、その後の、ＤＮＡポリメラーゼ存在下での正確な順序の熱サイクルからなる。
二本のプライマーは、二本鎖の標的配列の各々の鎖に相補的である。効果の増大のために、混合物は変性され、次いで、プライマーは標的分子内のプライマーの相補的な配列にアニールされる。アニーリングに続き、プライマーはポリメラーゼによって伸長され、新しい相補鎖の対が形成される。変性、プライマーのアニーリング、およびポリメラーゼの伸長の工程は何度も繰り返され（すなわち、変性、アニーリング、伸長は一つの「サイクル」を構成しており、多数の「サイクル」が存在し得る）、高濃度の、希望する標的配列の増幅セグメントが得られる。希望する標的配列の増幅セグメントの長さはプライマー同士の相対的な位置によって確定され、したがって、この長さは制御可能なパラメーターである。プロセスの繰り返す局面に起因して、この方法は発明者から「ポリメラーゼ連鎖反応」と呼ばれる。標的配列の希望する増幅セグメントが混合物中で優位な配列（濃度に換算して）になるため、それは「ＰＣＲ増幅された」と呼ばれる。
ＰＣＲによって、いくつかの異なった方法（例えば、標識されたプローブとのハイブリダイゼーション；ビオチン化させたプライマーとの結合後の、アビジン−酵素コンジュゲートの検知；３２Ｐで標識された、ｄＣＴＰやｄＡＴＰといったデオキシヌクレオチド三リン酸との結合）で探知できる程度にまで、ゲノムＤＮＡの特異的な標的配列の単一コピーを増幅させることができる。ゲノムＤＮＡに加え、どんなオリゴヌクレオチド配列も適切なプライマー分子の組によって増幅させることができる。
ＰＣＲ増幅プロセスでは特異的な標的配列が約１０−８Ｍのプラトー濃度に達することがしられている。一般的な反応体積は１００μｌであり、６×１０１１個の二本鎖産物分子の収量に対応する。
ＰＣＲはポリヌクレオチドの増幅プロトコルである。観察されている増幅要因は、行われる際のＰＣＲのサイクルの数（ｎ）、および各々のサイクル（Ｅ）での複製の効率に関連しており、これは同様に、各々のサイクル中のプライミングと伸長の効率の関数である。増幅は高濃度のＰＣＲ産物が作製されるまではＥｎの形に従うことが観察されている。
これらの高濃度（約１０−８Ｍ／ｌ）では複製の効率は劇的に低下する。これはおそらく、短いオリゴヌクレオチドプライマーがより長鎖のＰＣＲ産物の相補鎖と置換するためである。１０−８Ｍを超える濃度ではプライミング反応中に二本の相補的なＰＣＲ増幅産物の鎖がお互いを認識する速さは十分速くなり、このことはＰＣＲ手順の伸長工程以前か、あるいは同時におこる。このことは、ついにはプライミングの効率の低下、そしてそれ故、サイクルの効率の低下を引き起こす。連続したＰＣＲのサイクルはＰＣＲ産物分子の増加の減退を引き起こす。ＰＣＲ産物分子はついにはプラトー濃度に達する。
この実験セクションで用いられたポリヌクレオチドプライマーの配列は次の通りである：
共通の前進プライマーとしてのＤＣＤ０３を用いる場合、その組み合わせは、１２７，３２７と１０７２ｂｐの長さのアンプリコンを生み出す。これらのオリゴはサギＨＢＶ（ＨＨＢＶ４）に由来する単離物と同様に５つの異なるｄＨＢＶ単離物（ＤＨＢＶ１，ＤＨＢＶ３，ＤＨＢＶ１６，ＤＨＢＶ２２，およびＤＨＢＶ２６）の間で完全に保存されている領域から選択されている。
次に示す実施例は本発明の特定の好ましい実施態様と局面を示すのに役立っており、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。
実施例 １
前述のように、本発明では光反応性の核酸結合化合物の光活性化のための装置と方法を企図している。この実施例では、光活性化装置は、本発明の方法による血液製剤の除染に関して記述されている。この装置はａ）少なくとも一つの光反応性化合物を光活性化させるのに適切な波長の電磁放射線を供給する手段、ｂ）光活性化の間、放射線を供給する手段との固定された関係の中で複数の血液製剤を支持するための手段、およびｃ）血液製剤を光活性化中に望ましい温度範囲内の温度に維持するための手段を含む。
図１は上に示した特徴を組み込んでいる一実施態様の一つの透視画である。この図には不透明な外被（１００）が、それの一部が取り去られて示されており、この外被は、プレートのアセンブリ（１０３，１０４）の間に置かれた複数の代表的な血液製剤を含んでいる手段（１０２）の上や下に位置するバルブ（１０１）の列を含んでいる。プレートのアセンブリ（１０３，１０４）は後にさらに詳しく描かれている。
電源（示さず）に接続可能なバルブ（１０１）は電磁放射線源としての役目をはたしている。しかし、特定のバルブのタイプに限定されず、実施態様は、業界標準のデュアル二ピンランプ（ｄｕａｌ ｂｉｐｉｎ ｌａｍｐ）を受容するように構成されている。
外被（１００）は血液製剤が適切に位置することが可能であるように掛け金（１０５）によって開けることができる。図１に示されているように、外被（１００）が閉じられているときは完全にバルブ（１０１）からの照射を抑えている。照射の間、使用者は、使用者に紫外線が届かない安全な観測点（１０６）から装置が動いていることを確認することができる。
外被（１００）はまた、例えば主電源スイッチ、カウントダウンタイマー、および時間メーターといったものを含むコントロールボード（１０７）上の幾つかの電子部品のための台としての役割をもっている。簡単のために、電源スイッチはカウントダウンタイマーにつなぐことができ、このカウントダウンタイマーは同様に時間メーターや電磁放射線源を並列につなぐことができる。カウントダウンタイマーは、使用者が希望のレベルの曝露になるように照射時間を先にセットすることを可能にする。
時間メーターは電磁放射線源によって供給される放射時間の合計を記録し続ける。この特徴はバルブ（１０１）をモニターされた状態にし、それらの出力が迅速な光活性化に必要な最小レベルを下回る前にバルブ（１０１）を変更することを可能にする。
図２は図１で示された装置の２−２線に沿った断面図である。図２は外被（１００）が解放された際のバルブ（１０１）の配置を示している。反射物（１０８Ａ，１０８Ｂ）は完全に各々のバルブ（１０１）の列を取り巻いている。血液製剤を含む手段（１０２）はプレートアセンブリの上部（１０３）と下部（１０４）の間に位置する。各々のプレートアセンブリは上部（１０３Ａ，１０４Ａ）や下部（１０３Ｂ，１０４Ｂ）のプレートから構成される。プレートアセンブリ（１０３，１０４）は、血液製剤を含む手段（１０２）によって作られる空間に対応するように設計されたヒンジ（１０９）によって接続されている。上部のプレートアセンブリ（１０３）は下部プレートアセンブリ（１０４）の下部プレート（１０４Ｂ）によって支えられている血液製剤を含む手段（１０２）の上部のちょうど上に置くように持ってくる。
検出器（１１０Ａ，１１０Ｂ，１１０Ｃ，１１０Ｄ）はプレートアセンブリ（１０３，１０４）のプレート（１０３Ａ，１０３Ｂ，１０４Ａ，１０４Ｂ）の間に便利よく設置されている。それらは、プリント基板（１１１）につながれており、このプリント回路基板はさらにコントロール盤（１０７）につながっている。
図３は図１に示された装置の３−３線に沿って描かれた断面図である。６つの血液製剤が入った手段（１０２）（例えば、ＴｅｆｌｏｎＴＭ血小板ユニットバッグ）はバルブ（１０１）の列の上に、固定された関係で置かれる。血液製剤の温度はファン（１１２）のみ、あるいはより好ましくは冷却源（示さず）に接続された冷却用流入力口ポート（１１４）および出力口ポート（１１５）をもった熱交換器（１１３）を使用することによってコントロールできる。
図４は図１に示された装置の４−４線に沿って描かれた断面図である。図４には、装置の望ましい実施態様の温度コントロールへのアプローチをよりはっきり示している。上部のプレートアセンブリのプレート（１０３Ａ，１０３Ｂ）と、下部のプレートアセンブリ（１０４Ａ，１０４Ｂ）は各々温度コントロールチャンバー（１０３Ｃ，１０４Ｃ）を作っている。ファン（１１２）はチャンバー（１０３Ｃ、１０４Ｃ）の中や間に空気を循環させることができる。
熱交換器（１１３）が使用されると、循環している空気は冷やされ、プレートの間を通り抜ける（１０３Ａ，１０３Ｂ，１０４Ａ，１０４Ｂ）。
実施例 ２
４’−ブロモメチル−４，５’，８−トリメチルソラレンの合成
この例では４’−ブロモメチル−４，５’，８−トリメチルソラレンの３段階の合成について書かれている。この合成はブロモメチル化のステップなしで行われていて、このことがこの合成を既知の合成法よりも安全にしている。
ステップ１：アセトン（５００ｍＬ）中の、機械的にかき混ぜられた７−ヒドロキシ−４，８−ジメチルクマリン（５０．００ｇ，０．２６３ｍｏｌ）とパウダー状のＫ２ＣＯ３（５４ｇ，０．３９１ｍｏｌ）の縣濁物に３−クロロ−２−ブタノン（２９．２ｍＬ，０．２８９ｍｏｌ）が加えられた。スラリーは一晩還流され、その後溶媒は取り去られた。塩を取り除くため、固体は１．２Ｌの水中でかき混ぜられ、ろ過され、母液のｐＨが中性（ｐＨ５〜７）になるまで水でリンスされた。褐色のろ過物は沸騰したメタノール（１５０ｍＬ）に溶かされ、濃いペースト状になるまで冷やされ、氷冷したメタノールで、大半の褐色の不純物を取り去るためにリンスされ、オフホワイトの固体である４，８−ジメチル−７−（１−メチル−２−オキソ）プロピルオキシ−クマリン（６７．７ｇ，収率９９．０％）が得られた。融点９５〜９６℃。
ステップ２：４，８−ジメチル−７−（１−メチル−２−オキソ）プロピルオキシ−クマリン（６７．５ｇ，０．２６０ｍｏｌ）と１０％ＮａＯＨ水溶液（１１４ｍＬ，０．２８６ｍｏｌ）と水（９００ｍＬ）の縣濁物が７０〜８５℃で２〜４時間熱せられた。混合物は室温まで冷やされた。固体はろ過され、母液が無色でｐＨが中性（ｐＨ５〜７）になるまで冷水（１．５Ｌ）でリンスされた。生成物は、空気乾燥および真空乾燥され４，４’，５’，８−テトラメチルソラレン（５６．３ｇ，８９．５％）の白色固体が得られた。
ステップ３：乾燥した４，４’，５’，８−テトラメチルソラレン（１０．００ｇ，４１．３ｍｍｏｌ）は室温でメチレンクロライド（１８０ｍＬ）に溶かされた。Ｎ−ブロモスクシンイミド（８．０９ｇ，４５．３ｍｍｏｌ）が加えられ反応混合物は４．５時間撹拌された。溶媒は完全に取り除かれ、生じた固体は０．５〜１時間水（２００ｍＬ）と撹拌され、ろ過され、スクシンイミドの副生成物を取り除くために低温で水（約５００ｍＬ）を加えてすり潰された。粗生成物（すなわち４’−ブロモメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン）はＰ２０５を用いて真空デシケーター中で乾燥され、最小限の量の沸騰トルエン（２００〜３００ｍＬ）によって再結晶化され４’−ブロモメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（１０．２ｇ）の淡黄色の固体を得た。母液は取り除かれ、再びトルエン（６０ｍＬ）で再結晶化され２次的な生成物（１．０８ｇ、合わせた収率＝８５．１％、ＮＭＲによると＞９９％純度）が得られた。
実施例 ３
５’−ブロモメチル−４，４’，８−トリメチルソラレンの合成
この例では５’−ブロモメチル−４，４’，８−トリメチルソラレンの３段階の合成について書かれている。実施例２に書かれた合成と同様、この方法はブロモメチル化を必要としないため、既知の合成スキームから改良された。
４，４’，５’，８−トリメチルソラレン（２．３３ｇ，９．５９ｍｍｏｌ）（合成法は実施例２、ステップ１と２に書かれている）は溶けるまでカーボンテトラクロライド（１００ｍＬ）中で還流した。Ｎ−ブロモスクシンイミド（１．８８ｇ，１０．５ｍｍｏｌ）とベンゾイルペルオキシド（８０ｍｇ）が添加され、この混合物を１５時間還流した。室温まで冷やした後、固体を溶かすためにメチレンクロライド（１００ｍＬ）が加えられ、溶液は水（４×１５０ｍＬ）、次いで食塩水で洗浄され、無水のＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒は取り去られ、５’−ブロモメチル−４，４’，８−トリメチルソラレン、４’−ブロモメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン、および４’，５’−ビス（ブロモメチル）−４，８−ジメチルソラレンの混合物（３．０ｇ、粗生成物）が得られ、それぞれの比は１Ｈ ＮＭＲにより５５／２５／２０と決定された。
実施例 ４
４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンヒドロクロリド（化合物２）と関連化合物（化合物４）の合成
この例では化合物２の２つの合成方法が書かれている。化合物２はまたＳ−５９として知られており、下および図４０で描かれている化学構造をもっている。第一の方法は次に示した通りである：
ステップ１：４’−ブロモメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（３．０９ｇ，９．６１ｍｍｏｌ）、（合成法は実施例２で書かれている）とＮ−（２−ヒドロキシエチル）フタルイミド（４．０５ｇ，２１．２ｍｍｏｌ）は乾燥ジメチルホルムアミド（６５ｍＬ）中でかき混ぜられた。反応混合物に乾燥したＮ２ガスが穏やかに通気された。反応混合物は１００℃で４．５時間熱せられ、室温まで冷やされ、数時間冷凍庫に入れられた。結晶状の生成物はろ過され、ＭｅＯＨ、その後に水で洗浄された。不純物を取り除くために、固体はさらにＭｅＯＨ（１００ｍＬ）で摩砕された。粗生成物は風乾され、ＣＨＣｌ３（１５０ｍＬ）中で溶かされた。活性化炭素とシリカゲルが脱色するために加えられ、そしてＣＨＣｌ３を完全に除いた。得られた白色生成物である４’−［４−（Ｎ−フタルイミド）−２−オキサ］ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（１．５６ｇ，収率３７．５％）は、ＮＭＲおよびＨＰＬＣの両方で≧９９％の純度であった。
ステップ２：４’−［４−（Ｎ−フタルイミド）−２−オキサ］ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（１．５６ｇ，３．６１ｍｍｏｌ）は室温でテトラヒドロフラン（７５ｍＬ）に懸濁させた。メチルアミン（４０％水溶液，２５ｍＬ，２９０ｍｍｏｌ）が懸濁液に加えられ、一晩撹拌された。溶媒とメチルアミンは完全に取り除かれた。生成した固体は０．３Ｎ ＨＣｌ水溶液（２５ｍＬ）に溶かされた。酸性の懸濁液は４０ｍＬのＣＨＣｌ３で３回リンスされ、２０％ＮａＯＨ水溶液でｐＨ１１にした。ＣＨＣｌ３（３×６０ｍＬ）が生成物（すなわち４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン）を塩基性の層から抽出するために用いられた。合わせたＣＨＣｌ３の層はＨ２Ｏ（１００ｍＬ）、続いて食塩水（１００ｍＬ）で洗浄され、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥し、濃縮され、４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（ｍｐ１３９〜１４１℃）が得られた。純度はＮＭＲで９９％より高かった。
４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンは無水エタノール（１５０ｍＬ）に溶かされ、エーテル中のＨＣｌの１．０Ｍ溶液（１０ｍＬ）が加えられ、懸濁液は冷蔵庫で一晩冷やされた。ろ過とエーテルでの洗浄の後、固体は真空乾燥され、淡黄色の結晶（０．７６ｇ，収率６２％）（ｍｐ２３５〜２３６℃）が得られた。
最初の方法は収率と純度が高いので本発明の好ましい実施態様である。
２つめの方法は、上に示した通り、商業的に手に入る４，５’，８−トリメチルソラレンから４’−クロロメチル−４，５’，８−トリメチルソラレンを調製することから始まる。４’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンヒドロクロリドの合成は４つのステップで達成される。
ステップ１：４’−クロロメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（５５０ｍｇ，１．９９ｍｍｏｌ）とエチレングリコール（６．８ｍＬ，１２１．９ｍｍｏｌ）はアセトン（６ｍＬ）中で５０〜６０℃に３．５時間熱せられた。２時間の加熱後、白色の懸濁液ははっきりしたライトイエローの溶液に変化していた。アセトンとエチレングリコールはロータリーエバポレーターで取り去られ、残留物には水（５０ｍＬ）が加えられた。生じた懸濁液はろ過され、冷水で洗浄され、真空オーブンで乾燥させられて５７４ｍｇ（９６％）の４’−（４−ヒドロキシ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンが得られた。
ステップ２：４’−（４−ヒドロキシ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（５７４ｍｇ，１．９ｍｍｏｌ）はＮ２の下で≦１０℃でＣＨ２Ｃｌ２（６ｍＬ）に溶かされた。トリエチルアミン（３５９ｍｇ，３．５５ｍｍｏｌ）が加えられた。メタンスルホニルクロライド（３０５ｍｇ，２６６ｍｍｏｌ）が、温度が１０℃未満に保たれるようにゆっくり滴下された。添加が完了した後、混合物はさらに１５分撹拌され、室温で１０時間撹拌された。反応後の懸濁液にＣＨ２Ｃｌ２（４５ｍＬ）が添加され、混合物は水（３×２０ｍＬ）で洗浄され、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。≦３０℃で濃縮し、その後の真空乾燥によって、４’−［（４−メタンスルホニルオキシ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンが黄色の固体（７０６ｍｇ，９８％）として得られた。
ステップ３：４’−［（４−メタンスルホニルオキシ−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（７０６ｍｇ，１．８６ｍｍｏｌ）とアジ化ナトリウム（２４１ｍｇ，３．７１ｍｍｏｌ）は９５％エタノール（５ｍＬ）中で８時間還流させた。反応溶液は冷やされ、冷水（５５ｍＬ）が加えられた。オフホワイトの固体はろ過され冷水で洗浄された。真空乾燥によりアジド（すなわち、４’−（４−アジド−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン）は明るい黄色がかった固体（５７５ｍｇ，９５％）として得られた。ｍｐ １０５〜１０６℃。
ステップ４：４’−（４−アジド−２−オキサ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（１．６５ｇ，５．０５ｍｍｏｌ）はテトラヒドロフラン（１０ｍＬ）中に溶かされた。トリフェニルホスフィン（１．５９ｇ，６．０８ｍｍｏｌ）と６滴の水が前述の溶液に添加された。室温で一晩かき混ぜられた後、ライトイエローの溶液は濃縮された。残留物はＣＨＣｌ３（９０ｍＬ）に溶かされ、０．３Ｎ ＨＣｌ水溶液（３０ｍＬ，その後２×５ｍＬ）によって抽出された。
合わせたＨＣｌの層は飽和するまで慎重にＫ２ＣＯ３で処理された。塩基性の溶液をＣＨＣｌ３（３×６０ｍＬ）で抽出した。合わせたＣＨＣｌ３層は６０ｍＬの水と６０ｍＬの食塩水で洗浄され、無水Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させた。濃縮と真空乾燥の後、アミンが黄色の固体（１．２５ｇ，８２％）として得られた。
アミンは無水エタノール（４０ｍＬ）中に溶かされ、エチルエーテル中の１Ｎ ＨＣｌの２０ｍＬが加えられた。５℃で一晩静置した後沈殿物はろ過され、エーテルでリンスされ、１．２５ｇの化合物２が得られた。ｍｐ ２３６℃（ｄｅｃｏｍｐ）。１３Ｃ ＮＭＲ：
ステップ１と同様に４’−ＣＭＴを１，３−プロパンジオールと反応させ、そしてステップ４まで同様に行われると４’−（５−アミノ−２−オキサ）ペンチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（化合物４）が得られた。ｍ．ｐ．２１２〜２１４℃（ｄｅｃｏｍｐｏｓｅｄ）。遊離塩基のＮＭＲ：
実施例 ５
５’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，４’，８−トリメチルソラレン（化合物１８）の合成
この例では化合物１８の合成について書かれている。アセトニトリル（１３０ｍＬ）中でかき混ぜられているＮ−メチルホルムアニリド（１６．０ｍＬ，０．１３４ｍｏｌ）の溶液にオキシ塩化リン（１２．５ｍＬ，０．１３４ｍｏｌ）そして４，４’，８−トリメチルソラレン（５．０ｇ，２１．９ｍｏｌ）（ＭｃＬｅｏｄら，Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ Ｎｏ．３：２３７（１９７２）に記載される）が加えられた。ソラレンの添加中は、氷水浴を使用して温度は０〜１０℃に保たれた。スラリーはドライエライト乾燥管によって湿気から守られながら５０℃で２日間かき混ぜられた。反応混合物は室温まで冷やされ、そして氷水浴で冷やされた。
アセトニトリルはデカンテーションで除かれ、次いで氷水（１５０ｍＬ）が橙色のスラリーに加えられ、１時間撹拌した。橙色の固体を濾過して取り除き、冷水および冷やしたアセトニトリルでリンスした。粗生成物は再結晶化し、ジクロロエタン（６００ｍＬ）中で炭を用いて脱色し、淡黄橙色の固体として４，４’，８−トリメチル−５’−ソラレンカルボキシアルデヒド（３．５９ｇ，６４．０％）を得た。
４，４’，８−トリメチル−５−ソラレンカルボキシアルデヒド（７．５０ｇ，２９．３ｍｍｏｌ）を２００強度のエタノール（２５０ｍＬ）中で撹拌した。水素化ホウ素ナトリウムを加え、スラリーを一晩撹拌した。氷水（１５０ｍＬ）と１０％炭酸ナトリウム水溶液（５０ｍＬ）を反応停止のために加えた。４５分間撹拌した後に沈澱物を濾過により除去し、濾液が中性（ｐＨ５〜７）になるまで水でリンスした。生成物は五酸化二リンで真空デシケーター中で乾燥させ、淡黄色の固体として５’−ヒドロキシメチル−４，４’，８−トリメチルソラレン（７．４６ｇ，９８．５％）を得た。
氷水中で冷却した、ジクロロエタン（５００ｍＬ）中の５’−ヒドロキシメチル−４，４’，８−トリメチルソラレン（１５．４２ｇ，５９．７ｍｍｏｌ）のスラリーに、一滴ずつ三臭化リン（６．１７ｍＬ，６５．７ｍｍｏｌ）を加えた。反応は湿気から保護され、室温で一晩撹拌した。その後、混合物を３００ｍＬの氷水と共に一時間撹拌した。固体を濾過により除去し、乾燥させた後、温めたトルエンに溶解させ、縦に溝を付けた濾紙で濾過し、蒸発させて揮発成分を取り除くと５’−ブロモメチル−４，４’，８−トリメチルソラレン（３．４３ｇ）が得られた。反応溶媒（ジクロロエタン及び水）は分離させ、水層を三回ジクロロエタンで抽出した。有機層を合わせ、食塩水でリンスした後、乾燥させ（無水硫酸ナトリウム）減圧下で蒸発させて揮発成分を取り除くと、淡黄色の固体として５’−ブロモメチル−４，４’，８−トリメチルソラレン（１３．１３ｇ、合わせた収率８６．４％）の大部分が得られた。融点
Ｎ−ヒドロキシエチルフタルイミド（３．００ｇ，１５．５ｍｍｏｌ）を６０〜６４℃でＤＭＦ（５ｍＬ）に溶解させる一方、窒素を溶液に通した。ヨウ化ナトリウム（０．０１ｇ，０．０６７ｍｍｏｌ）と５’−ブロモメチル−４，４’，８−トリメチルソラレン（１．００ｇ，３．１１ｍｍｏｌ）を加え、スラリーを、これらの条件下で、一晩撹拌した。濃い黄色の反応混合物を室温まで冷却し、更に氷水浴により冷却した後濾過し、氷冷メタノールでリンスすることにより、粗生成物（１ｇ）を得た。固体を、ジクロロエタン（１００ｍＬ）中で再結晶化させると、オフホワイトの固体として４，４’，８−トリメチル−５’−［２−（Ｎ−フタルイミド）−２−オキサ］ブチルソラレン（０．６８ｇ，５０．８％）が得られた。
４，４’，８−トリメチル−５’−［４’−（Ｎ−フタルイミド）−２−オキサ］ブチルソラレン（１．６１ｇ，３．７３ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（４０ｍＬ）と４０重量％のメチルアミン水溶液（２０ｍＬ，２５７ｍｍｏｌ）と共に一晩撹拌した。溶媒を取り除き、残留物は水性希塩酸とジクロロメタンに分配された。
水層はジクロロメタンで数回さらにリンスした後、炭酸カリウムで塩基性にした。塩基性層はジクロロメタンで三回抽出した。合わせた、塩基からの有機抽出物は食塩水と共に振とうし、乾燥させ（無水硫酸ナトリウム）た後、蒸発させて揮発成分を取り除くと、５’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，４’，８−トリメチルソラレン（０．７１ｇ，６３．４％）が得られる。融点１２６〜１２９℃。
上記のアミン（０．７１ｇ，２．３６ｍｍｏｌ）を温めたエタノールに溶かし、ジエチルエーテル中の１Ｍ ＨＣｌ（３ｍＬ，３ｍｍｏｌ）を加えて酸性にし、炭で脱色し、冷却した後収集した。固体を再度炭で脱色し、蒸発させて揮発成分を取り除き、白い固体として５’−（４−アミノ−２−オキサ）ブチル−４，４’，８−トリメチルソラレンヒドロクロリド（０．３９ｇ，収率４９．３％）を得た。融点２３５〜２３６℃。（注：この物質を他の方法で調製すると、ＮＭＲスペクトルは一致するが、明らかに融点が低い生成物がもたらされる）。
実施例 ６
４’−（７−アミノ−２，５−オキサ）ヘプチル−４，５’，８−トリメチルソラレンヒドロクロリドの合成（化合物７）
この例においては、化合物７の合成について詳述する。４’−（７−アミノ−２，５−オキサ）ヘプチル−４，５’，８−トリメチルソラレンヒドロクロリドは四ステップで進行する。
ステップ１：４’−クロロメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（５８９ｍｇ，２．１３ｍｍｏｌ）と、ジエチレングリコール（１５．４ｇ，１４５ｍｍｏｌ）とアセトン（１３ｍＬ）を１１．５時間還流させた。
反応溶液からアセトンとジエチレングリコールの一部を除去するために濃縮した。得られた薄茶色の溶液にＣＨＣｌ３（４０ｍＬ）を加えた後、水で数回洗浄した。ＣＨＣｌ３層を無水硫酸ナトリウムで乾燥させ、濃縮し、７８１ｍｇの４’−（７−ヒドロキシ−２，５−オキサ）ヘプチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（約１００％）を得た。
ステップ２：４’−（７−ヒドロキシ−２，５−オキサ）ヘプチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（７８１ｍｇ，２．２５ｍｍｏｌ）を＜１０℃で窒素気流下にて、ＣＨ２Ｃｌ２（２．５ｍＬ）に溶かした。トリエチルアミン（３６３ｍｇ，３．５９ｍｍｏｌ）を加えた。メタンスルホニルクロリド（３６２ｍｇ，３．１６ｍｍｏｌ）を、１０℃未満に温度を保つためにゆっくりと滴下した。添加が終了した後、混合物をさらに１５分間１０℃未満に保った。混合物を室温で一晩撹拌し、その後ジクロロメタン（５０ｍＬ）を加えた。溶液を水（３×６０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させ３０℃以下で濃縮した。減圧乾燥して、残った薄茶色のシロップ状の液体［４’−（７−メタンスルホニルオキシ−２，５−オキサ）ヘプチル−４，５’，８−トリメチルソラレン］；４３７ｍｇ（７６％）を得た。
ステップ３：４’−（７−メタンスルホニルオキシ−２，５−オキサ）ヘプチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（２８８ｍｇ，０．６７８ｍｍｏｌ）とアジ化ナトリウム（８８．２ｍｇ，１．３６ｍｍｏｌ）を３ｍＬの９５％エチルアルコールで８時間還流した。
反応液を冷却し、冷水（５０ｍＬ）を加えた。水層は流して捨てられた。粗生成物質は（クロロホルム溶出によるシリカゲル）クロマトグラフィーＣｈｒｏｍａｔｏｔｒｏｎ（Ｈａｒｒｉｓｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）により精製し、減圧乾燥して、明るい黄色いシロップ状の液体として４’−（７−アジド−２，５−オキサ）ヘプチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（１２３ｍｇ，４９％）を得た。
ステップ４：４’−（７−アジド−２，５−オキサ）ヘプチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（１２２ｍｇ，０．３３ｍｍｏｌ）と、トリフェニルホスフィン（１２９ｍｇ，０．４９ｍｍｏｌ）と数滴の水を、テトラヒドロフラン（２ｍＬ）に溶かした。明るい黄色の透明な溶液を、室温で週末の間撹拌した。出発物質はＴＬＣで確認されなかった。反応溶液を濃縮し、残留物をトリクロロメタン（２０ｍＬ）に溶かした。溶液を０．１５Ｎ塩酸（１０ｍＬ、その後２×５ｍＬ）で抽出し、塩酸層は２０％水酸化ナトリウム水溶液を加え、ｐＨ１３にした。塩基性溶液をトリクロロメタンで抽出した（３×１５ｍＬ）。合わせたトリクロロメタン層を水で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥後、濃縮、減圧乾燥し６３．９ｍｇの生成物、４’−（７−アミノ−２，５−オキサ）ヘプチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（５６％）を得た。ＴＬＣでは単一スポットのみが確認された。
固体を無水エタノールに溶かし、エチルエーテル中の１Ｍ塩酸を加え、懸濁液を濾過し生成物をエーテルでリンスし、乾燥させた。
実施例 ７
４’−（１２−アミノ−８−アザ−２，５−ジオキサ）ドデシル−４，５’，８−トリメチルソラレンジヒドロクロリド（化合物８）の合成
４’−（１２−アミノ−８−アザ−２，５−ジオキサ）ドデシル−４，５’，８−トリメチルソラレンジヒドロクロリドは、実施例５、方法２、ステップ２の生成物から、一段階で合成される。８ｍＬのアセトニトリル中の４’−（７−メタンスルホニルオキシ−２，５−オキサ）ヘプチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（１０８ｍｇ，０．２５３ｍｍｏｌ）の溶液を、２．８ｍＬのアセトニトリル中の１，４−ジアミノブタン（１３２ｍｇ，１．４９ｍｍｏｌ）の溶液にゆっくりと加えた。８時間還流した後、出発物質はＴＬＣで確認されなかった。反応混合物を室温までさまし、トリクロロメタン（２５ｍＬ）と１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（２５ｍＬ）を加えた。層を分離し、トリクロロメタン（２×１０ｍＬ）を用いて水層を洗浄した。塩酸（０．３Ｎ，３×１０ｍＬ）を用いて、合わせた有機層から生成物を抽出した。塩酸層をｐＨ１３になるまで２０％水酸化ナトリウム水溶液で処理した。その後、合わせた塩基性層を、トリクロロメタン（３×２０ｍＬ）で抽出した。トリクロロメタン層は、飽和塩化ナトリウム水溶液（１０ｍＬ）で洗浄し、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。濃縮後、減圧乾燥させると、６３ｍｇの生成物、４’−（１２−アミノ−８−アザ−２，５−ジオキサ）ドデシル−４，５’，８−トリメチルソラレンジヒドロクロリドが得られた（６０％）。
実施例 ８
４’−（２−アミノエチル−４，５’，８−トリメチルソラレンヒドロクロリド（化合物３）の合成
４’−（２−アミノエチル）−４，５’，８−トリメチルソラレンヒドロクロリドの合成は一段階で行われる：水素化トリフルオロアセトキシホウ素ナトリウムは、２ｍＬのＴＨＦ中のトリフルオロ酢酸（２９６ｍｇ，２．６０ｍｍｏｌ）を、２ｍＬのＴＨＦ中の水素化ホウ素ナトリウム（１７５ｍｇ，４．６３ｍｍｏｌ）の懸濁液を撹拌した物に、室温で１０分かけて加えることにより生成した。得られた懸濁液を、２ｍＬのＴＨＦ中の４’−シアノメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（Ｋａｕｆｍａｎら、Ｊ．Ｈｅｔｅｒｏｃｙｃｌｉｃ Ｃｈｅｍ．１９：１０５１（１９８２））（１８８ｍｇ，０．７０３ｍｍｏｌ）の懸濁液に加えた。
混合物を室温で一晩撹拌した。１０℃未満で、余分な試薬を分解するために、数滴の水を明るい黄色の透明な溶液に加えた。その結果得られた混合物を濃縮し、１Ｎ水酸化ナトリウム水溶液（３０ｍＬ）を加えた。クロロホルム（３０ｍＬ、続いて１０ｍＬ、５ｍＬ）を用いて、生じたアミンを抽出した。合わせたトリクロロメタン層を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄した。アミンは０．３Ｎの塩酸（１０ｍＬ，５ｍＬ，５ｍＬ）で抽出し、酸性層を２０％水酸化ナトリウム水溶液でｐＨ１３にした。トリクロロメタン（３×１０ｍＬ）を用いて、合わせた塩基性層からアミンを抽出し、水（２ｍＬ）で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。濃縮し減圧乾燥させた後、アミンは、９５％より高い純度（ＮＭＲによる）で固体として得られた。
上記固体を無水エタノールに溶かした。ジエチルエーテル中の塩化水素溶液（１Ｎ，１ｍＬ）を加えた。懸濁液を濾過し、明るい紫色の固体として化合物３（３２．７ｍｇ，収率１５％）を得た。
実施例 ９
４’−（６−アミノ−２−アザ）ヘキシル−４，５’，８−トリメチルソラレンジヒドロクロリド（化合物６）
４’−（６−アミノ−２−アザ）ヘキシル−４，５’，８−トリメチルソラレンジヒドロクロリドの合成は次に示すように１段階で行われた：３０ｍＬのアセトニトリル中の４’−クロロメチル−４，５’，８−トリメチルソラレン（１８８ｍｇ，０．６８ｍｍｏｌ）を、７ｍＬのアセトニトリル中の１，４−ジアミノブタン（１２０ｍｇ，１．４ｍｍｏｌ）の溶液に加えた。一晩撹拌した後、減圧下で、溶媒を除去した。クロロホルム（１０ｍＬ）と１Ｎ水酸化ナトリウム（１０ｍＬ）を残留物に加え、混合物を振とうし、分離した。水溶液をさらに２×１０ｍＬのトリクロロメタンで抽出し、合わせた抽出物を水でリンスした。生成物をトリクロロメタン溶液から０．３Ｎ塩酸で抽出し、酸性層に濃い水酸化ナトリウム溶液でｐＨ１２にした。塩基性の懸濁液をトリクロロメタンで抽出し、その後水でリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮すると遊離塩基であるアミンが得られた。
約６ｍＬの無水エタノールに溶かした遊離塩基を、エーテル中のＨＣｌの溶液（１．０Ｍ，３ｍＬ）で処理した。生じた塩酸塩を濾過し、無水エタノールでリンスした後減圧乾燥させると、１５０ｍｇの化合物６が得られた（５５％）、融点２９０℃（分解）。Ａｎａｌｙｓｉｓ ｃａｌｃｕｌａｔｅｄ ｆｏｒ Ｃ１９Ｈ２６Ｃ１２Ｎ２Ｏ３・Ｈ２Ｏ：Ｃ，５４．４２；Ｈ，６．７３；Ｎ，６．６８。Ｆｏｕｎｄ： Ｃ，５４．０８；Ｈ，６．４５；Ｎ，６．６５。
次に示す化合物は同様な方法で調製した。合成する上での相違点を示す：
ａ）４’−（４−アミノ−２−アザ）ブチル−４，５’，８−トリメチルソラレンジヒドロクロリド（化合物１）、融点３２０〜３２２℃（分解）。この合成においてエチレンジアミンはジアミンとして用いられた。
ｂ）４’−（５−アミノ−２−アザ）ペンチル−４，５’，８−トリメチルソラレンジヒドロクロリド（化合物５）、融点２８８℃（分解）。遊離塩基のＮＭＲ：ｄ１．３３（ｂｒｓ，３Ｈ），１．６６（ｐｅｎｔ，Ｊ＝６．８Ｈｚ，２Ｈ），２．４７（ｓ，３Ｈ），２．５０（ｄ，Ｊ＝１Ｈｚ，３Ｈ），２．５５（ｓ，３Ｈ），２．６−２．８５（ｍ，４Ｈ），３．８９（ｓ，２Ｈ），６．２２（ａｐｐａｒｅｎｔ ｄ，Ｊ＝１Ｈｚ，１Ｈ），７．６２（ｓ，１Ｈ）。この合成において、１，３−ジアミノプロパンをジアミンとして用いた。
ｃ）４’−（７−アミノ−２−アザ）ヘプチル−４，５’，８−トリメチルソラレンジヒドロクロリド（化合物１０）、融点３００℃（分解）。遊離塩基のＮＭＲ：
ここでは、１，５−ジアミノペンタンをジアミンとして用いた。
実施例１０
５’−（６−アミノ−２−アザ）ヘキシル−４，４’，８−トリメチルソラレンジヒドロクロリド（化合物１７）
５’−（６−アミノ−２−アザ）ヘキシル−４，４’，８−トリメチルソラレンジヒドロクロリドは次に示す一段階で合成された：３０ｍＬのアセトニトリル中の５’−クロロメチル−４，４’，８−トリメチルソラレン（１９０ｍｇ，０．６８ｍｍｏｌ）の懸濁液を、７ｍＬのアセトニトリル中の１，４−ジアミノブタン（１２０ｍｇ，１．４ｍｍｏｌ）の溶液にくわえた。
室温で一晩撹拌した後、減圧下で溶媒を除去した。クロロホルム（１０ｍＬ）と１Ｎ水酸化ナトリウム（１０ｍＬ）を残留物に加え、混合物を振とうし分離した。水層を、さらに２×１０ｍＬのトリクロロメタンで抽出し、合わせた抽出物を水でリンスした。生成物はトリクロロメタン溶液から０．３Ｎ塩酸で抽出し、酸性層は、濃い水酸化ナトリウム溶液でｐＨ約１２にした。塩基性の懸濁液をトリクロロメタンで抽出し、その後水でリンスし、硫酸ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。
残留物を、トリクロロメタン：エタノール：Ｅｔ３Ｎ（９：１：０．２５）を用いるシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより精製した。生成物を含む画分を合わせ、溶媒から取り除き、遊離アミンを得た。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：
無水エタノール（約６ｍＬ）に溶かした遊離塩基をエーテル中のＨＣｌの溶液（１．０Ｍ，約３ｍＬ）で処理した。生じた塩酸塩を濾過し、無水エタノールでリンスした後減圧乾燥させると１００ｍｇ（３６．３％）の生成物、５’−（６−アミノ−２−アザ）ヘキシル−４，４’，８−トリメチルソラレンジヒロドクロリドが得られた。融点２８８℃（分解）。
５’−（４−アミノ−２−アザ）ブチル−４，４’，８−トリメチルソラレンジヒドロクロリド（化合物１６）は、エチレンジアミンをジアミンとして用いたことを除いては、同様な方法で調製された。遊離の塩基のＮＭＲ：
実施例 １１
４’−（１４−アミノ−２，６，１１−トリアザ）テトラデシル−４，５’，８−トリメチルソラレンテトラヒドロクロリド（化合物１５）
４’−（１４−アミノ−２，６，１１−トリアザ）テトラデシル−４，５’，８−トリメチルソラレンテトラヒドロクロリドの合成は次に示すように一段階で行われる。１０ｍＬのメタノール中の０．５ｇ（２．５ｍｍｏｌ）のスペルミン（Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｍｉｌｗａｕｋｅｅ，ＷＩ）の溶液に、ＨＣｌのメタノール溶液（５Ｎ）（濃塩酸を５Ｎになるようにメタノールで希釈した）をｐＨ５〜６になるように添加し、続いて０．１２８ｇ（０．５ｍｍｏｌ）の４，５’，８−トリメチルソラレン−４’カルボキシアルデヒド、２０ｍｇ（０．３ｍｍｏｌ）のＮａＢＨ３ＣＮを、及び３ｍＬのメタノールを添加した。反応混合物を室温で一晩撹拌した。ＨＣｌのメタノール溶液（５Ｎ）をｐＨが２未満になるまで加えたのち、減圧下でメタノールを除去した。残留物を約１００ｍＬの水に溶かし、２５ｍＬのトリクロロメタンで３回リンスした。水溶液は濃水酸化ナトリウムでｐＨが１０より高くなるようにし、２５ｍＬのトリクロロメタンで３回抽出した。これら最終抽出物を合わせ、水で洗浄し、乾燥させ（硫酸ナトリウム）、留去するとアミンの有機塩基が９５％以上の純度（ＮＭＲによる）で得られた。ＮＭＲ（ＣＤＣｌ３）：
遊離アミンを無水エタノールに溶かし、ＨＣｌ（無水、エチルエーテル中に１Ｎ）を加えた。塩酸塩を濾過し、無水エタノールで洗浄し、室温で減圧乾燥させ、８０．２ｍｇの生成物、４’−（１４−アミノ−２，６，１１−トリアザ）テトラデシル−４，５’，８−トリメチルソラレンテトラヒドロクロライドを明るい黄色の固体として得た。
実施例 １２
ここでは、ｒ−１７バクテリオファージアッセイを病原体の不活性化効率を予測するため及び、本発明の光活性結合化合物の核酸への結合を測定するためにこの実施例中で用いた。ｒ−１７アッセイでは、各試験化合物を含む溶液中にバクテリオファージを加え、光を照射した。ファージの、その後の細菌への感染能力および成長阻害能力を測定した。試験化合物による核酸の損傷を培養成長阻害が正確に反映するように、相対的に影響を受けやすい核酸に対してバクテリオファージが選択された。試験化合物への核酸の結合についてのバクテリオファージアッセイは、効果的な病原体の不活性化を示しそうな化合物を特定する、安全で安価な方法を提供する。これまでの実験では、ｒ−１７アッセイは、同様な化合物に対するＨＩＶ−１の感受性を正確に測定することを支持している。
Ｒｌ７はＨｆｒ ３００の細菌内で、力価約５×１０１１に増殖した。（Ｒ１７及びＨｆｒ ３０００は国際細菌命名規約（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）（ＡＴＣＣ）（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）より得た）Ｒ１７ファージ保存液を、ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）中の１５％ウシ胎児血清溶液に、最終ファージ濃度が１０９／ｍＬになるように加えた。アリコット（０．５ｍＬ）を、１．５ｍＬスナップトップポリエチレンチューブに移した。水、エタノール、もしくは、ジメチルスルホキシド中に０．８０〜８．０ｍＭになるように調製された試験化合物保存溶液のアリコット（０．００４〜０．０４０ｍＬ）をチューブに加えた。化合物は４μＭから３２０μＭの間の濃度で試験した。（ＡＭＴはＨＲＩ，Ｉｎｃ．（Ｃｏｎｃｏｒｄ，ＣＡ）から商品として入手可能；８−ＭＯＰはＳｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から商品として入手可能。）チューブを実施例１に詳述したような光照射装置中におき、１分から１０分間光を照射した。滅菌した１３ｍＬの希釈用チューブを用意した；各々の試験化合物は０．４ｍＬのルリア培養液（ＬＢ）を含む１本のチューブと、０．５ｍＬのＬＢ培地を含む５本のチューブを必要とした。希釈物を作製するために、ファージと試験化合物の光照射した溶液の０．１００ｍＬアリコットを、０．４ｍＬの培地の第一の希釈用チューブに加え、次いで、この溶液の０．０２０ｍＬを０．５ｍＬの培地の別のチューブに加えた（１：２５）。次いで、第二の溶液を残りのチューブに連続的に希釈した（１：２５）。
希釈したそれぞれの試料に、一晩培養したＨｆｒ ３０００細菌を０．０５０ｍＬ及び溶解したＬＢトップアガーを３ｍＬ加え、その混合物質をＬＢ培地プレートに注いだ。トップアガーが固まった後、プレートを３７℃で一晩インキュベートした。その後、プラーク形成単位を翌朝カウントし、光処理後に残ったファージの力価を、希釈比をもとに算出した。
次に示すような対照実験を行った：ファージは試験化合物で処理されず、光照射もされなかった、「ファージのみ」（下表では「開始力価」として列挙した）；試験化合物無しでファージを光照射した、「ＵＶのみ（紫外線のみ）」；ファージ／試験化合物溶液を、希釈及び平板培養する前に光照射しなかった「暗」対照実験。
下記の表５は、ちょうど記載したＲ１７実験計画に従って化合物１について試験した、３種類の異なる実験について示している。１〜３の実験（値を太字で表記）について、対照実験試料の値と比較すると、「ＵＶのみ」対照実験も「暗」対照実験のどちらも、細菌の有意な死滅をもたらさないことが示される（多くとも、「ＵＶのみ」対照実験で０．３対数が死滅し、「暗」対照実験で０．１対数が死滅した）。
「ＵＶのみ」対照実験については、本発明の他の化合物を用いて多くの同様の実験を繰り返したところ、一貫して有意な死滅を示さなかった。（データ不記載）。「ＵＶのみ」対照実験は、この実施例でどの実験においても行っているが、以下の表及び図には示していない。「暗」対照実験に関しては、本発明の種々の化合物について何度も実験を試みた結果、ソラレンの４’位の置換基の種類に関わらず、暗所では実験的に有意な細菌の不活性化は認められないことが明らかになった。（データ不記載）。例えば、表５において、実験１では暗所において化合物１を用いた場合、０．１対数の死滅を示した。これとは対照的に、化合物１に丁度１分間光を照射すると、その結果生じる力価の下落は６．７対数より大きい。それゆえに、その他の試験化合物については「暗」対照実験を行わず、また、行った場合でも以下に示す表および図に結果は記載していない。
下の表６〜９および図６〜８は、本発明の４’−第一級アミノ置換ソラレン化合物のそれぞれに対するＲ１７アッセイの結果を表す。表７および８でのデータは、それぞれ図６および７に対応する。本発明の化合物の５’−第一級アミノ置換ソラレン化合物は、４’−第一級アミノ置換ソラレン化合物と同様に５’位に置換基を有し、この実施例で先に述べたように、さまざまな濃度で試験した。そして、その結果、匹敵する不活性化効率を現すことが示されている。
これらの化合物に対する結果を、下の図９および１０に示す。
ソラレンの４’位に置換基を有する本発明の化合物は上記の表で示されるようにＲ１７の死滅において活性があると証明された。表７では、本発明の化合物１が８−ＭＯＰよりもずっと高いＲ１７不活性化効率を表すことが明らかである。表７および図６で示されるように、化合物１は、本発明のより活性でない化合物のうちの１つである。化合物２および３はどちらもそれぞれの濃度において化合物１よりも高い対数不活性化を示す。これらの結果は、本発明の化合物が、一般に８−ＭＯＰよりもずっと高い活性があることを支持する。
本発明の化合物はまた、ＡＭＴと同等、あるいはより強いＲ１７不活性化効率を有する。
表７および８、図６〜１０で、本発明の化合物はすべてＡＭＴに匹敵するレベルでＲ１７対数不活性化を達成している。化合物２および化合物３（表６，図６）、化合物５および化合物６（表８，図７）、および化合物１６（図１０）は、ＡＭＴよりも顕著に高い不活性化効率を示している。
本発明の化合物をまた、一定の濃度で、紫外線の様々な線量について試験した。ＤＭＥＭ中のＲ１７のアリコット０．６ｍＬを含む３本の１．５ｍＬチューブを用意した（上で述べたように用意された）。試験化合物を所望される濃度で加え、試料を激しく撹拌した。その後、試料に１．０Ｊ／ｃｍ２の間隔で、３．０Ｊ／ｃｍ２に達するまで照射した。各１．０Ｊ／ｃｍ２の間隔の間に、それぞれの試料から１００μＬを取り、第一の対応する希釈チューブに入れ、その後この実施例の前に述べたようにそれぞれの試験化合物に対し、３つの照射線量すべてで５つの連続した希釈を行った。
その後、５０μＬのＨｆｒ ３０００細菌をそれぞれのチューブに加え、３ｍＬのトップアガーを加え、そのチューブの内容物を激しく撹拌した。それぞれのチューブの内容物をＬＢプレートにまき、そのプレートを３７℃で一晩インキュベートした。
明朝、プラークを目で数えた。
４’−第一級アミノ置換ソラレン化合物および５’−第一級アミノ置換ソラレン化合物のそれぞれに対するアッセイの結果は、図１１〜１７に示している。このデータはさらに、本発明の化合物は、Ｒ１７を不活性化する能力において、ＡＭＴに匹敵することを支持している。さらに、化合物６（図１１）、化合物１０（図１２）、化合物１２（図１３）、化合物１５（図１４および１７）、および化合物１７（図１５）はすべて、Ｒ１７の不活性化においてＡＭＴよりも効率的である。
実施例 １３
本発明の化合物それぞれの、病原体不活性化効果は、無細胞ウイルス（ＨＩＶ）を不活性化するという化合物の能力を試験することで評価した。無細胞ＨＩＶの不活性化は、次のように行った。
Ｒ１７アッセイでのように、下の表１０および１１に列挙された化合物の小アリコットを、表で列挙された濃度で、総量が０．５ｍＬになるようにＨＩＶ−１株に加えた。ＨＩＶ株（１０５〜１０７プラーク形成単位／ｍＬ）は、ＤＭＥＭ／１５％ＦＢＳ中にあった。０．５ｍＬの試験アリコットを２４穴のポリスチレン組織培養プレート中に置き、３２０〜４００ｎｍ（２０ｍＷ／ｃｍ２）で、実施例１の装置に類似する装置にて１分間照射した。ここで用いられた光活性化装置は、あらかじめ試験され、実施例１の装置に匹敵する光への曝露をもたらすことが分かった。（データは示していない。）対照実験としては、ＨＩＶ−１株のみ、ＨＩＶ−１にＵＶＡのみ加えたもの、ならびに、ＨＩＶ−１に、ＵＶＡなしで、試験する各ソラレンを最も高濃度で加えたものが挙げられた。照射後、試料はすべて、マイクロタイタープラークアッセイにより感染力を分析するまで、−７０℃で凍結保存した。
本発明の化合物で処理された試料での残存ＨＩＶ感染力を測定するためのアリコットを回収し、培養した。
残存ＨＩＶ感染力は、ＭＴ−２感染力アッセイを用いて分析した。（以前、Ｈａｎｓｏｎ，Ｃ．Ｖ．，Ｃｒｏｗｆｏｒｄ−Ｍｉｋｓｚａ，Ｌ．ａｎｄ Ｓｈｅｐｐａｒｄ，Ｈ．Ｗ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ ２８；２０３０（１９９０）で述べられていた。）アッセイ培地は、１ｍＬにつき１００μｇのストレプトマイシン、１００Ｕのペニシリン、５０μｇのゲンタマイシン、１μｇのアンフォテリシンＢを含む８５％ ＤＭＥＭ（高濃度のグルコースを含む）、１５％ ＦＢＳ、および１ｍＬにつき２μｇのポリブレン（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｏ．）であった。不活性化処置からの試験試料、および対照実験試料を、５０％アッセイ培地、および５０％正常ヒトプール血漿で希釈した。続いて、試料を９６穴プレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｌａｓｓ Ｗｏｒｋｓ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．）で直接希釈した。プレートを振動撹拌器で３０秒混合し、５％ ＣＯ２の雰囲気にて３７℃で１から１８時間インキュベートした。ＭＴ−２細胞（０．０２５ｍＬ）［Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄ．）より手に入れられる（カタログ番号２３７）クローンアルファ−４］を一つの穴につき８０，０００細胞の濃度になるようにそれぞれの穴に加えた。さらに１時間５％ ＣＯ２中３７℃でインキュベートした後１．６％ Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅアガロース（ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，ｒｏｃｋｌａｎｄ，Ｍａｉｎｅ）を含み、あらかじめ３８．５℃に温められたアッセイ培地の０．０７５ｍＬをそれぞれの穴に加えた。それぞれのプレートにたまるまで、プレートを数分間３７℃で保ち、その後、１０℃に冷やされた遠心機においてプレートキャリア中にて６００×ｇで２０分間遠心機にかけた。遠心の際、細胞の単層は、アガロース層のゲル化よりも先に形成された。プレートを５％ ＣＯ２中３７℃で５日間インキュベートし、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＨ７．４）中の５０μｇ／ｍＬのヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）を０．０５ｍＬ加えることで染色した。２４から４８時間後、プレートを８，０００μＷ／ｃｍ２の３０４ｎｍ紫外線箱（Ｆｏｔｏｄｙｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｂｅｒｌｉｎ，Ｗｉｓ．）に置くことで赤色蛍光染色されたマイクロプラークが目に見えるようになった。立体顕微鏡により、×２０から×２５の倍率で、プラークを数えた。結果を下の表１０および１１に示す。数値「ｎ」は、試験の回数を表しており、データポイントはそれらの試験の平均値である。
結果より、本発明の化合物は、ＨＩＶの不活性化において効果的であることが証拠づけられる。事実、６４μＭ、あるいはもっと高濃度の化合物に対するデータでは、化合物２および３は、以前最も活性のある抗ウイルス性のソラレンであると考えられていたＡＭＴよりも有意に高い活性があることを支持している。より低い濃度では、化合物６は、ＡＭＴ（３２μＭで２．５対数）よりも高い対数のＨＩＶ（３２μＭで３．１対数）を死滅させ得る。表９に列挙された他の化合物は、ＡＭＴと同じ範囲での不活性化効率を示す。
実施例 １４
この実施例は、本発明の化合物を用い、Ｂ型肝炎ウイルスのモデルとしてアヒルのＢ型肝炎ウイルス（ＤＨＢＶ）を不活性化する手法を記述している。
アヒルの卵黄中のＤＨＢＶを、血小板濃縮液（ＰＣ）へ最終濃度が１ｍＬにつき２×１０７個の粒子になるよう加え、１５分以上穏やかに振盪した。ソラレンＳ−７０，Ｓ−５９およびＡＭＴをＴｅｆｌｏｎＴＭミニバッグ中のＰＣのアリコット３ｍＬに、３５，７０，および１００ｍＭの濃度で加えた。ソラレンを加えていない対照実験を含む試料に５Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡを照射し、１Ｊ／ｃｍ２ずつ増分を加えた。照射後、白血球と血小板を、遠心によりウイルスと分離した。ＤＨＢＶを含む上清を、０．５％ドデシル硫酸ナトリウム、２０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．０）、５ｍＭ ＥＤＴＡを含む緩衝液中で、５０μｇ／ｍＬのプロテイナーゼＫで、５５℃で一晩消化した。試料を、フェノール−クロロホルム、およびクロロホルムで抽出し、続いてエタノールで沈殿させた。その後、それぞれの試料から１０６個のＤＨＢＶゲノムを最初に投入したＰＣＲ増幅反応に、精製されたＤＮＡを用いた。ＰＣＲアンプリコンは、ＤＣＤ０３／ＤＣＤ０５（１２７ｂｐ）、ＤＣＤＯ３／ＤＣＤ０６（３２７ｂｐ）およびＤＣＤ０３／ＤＣＤ０７（１０７２ｂｐ）のプライマーの組を用いて生じた。ＰＣＲは、０．２ｍＭの各デオキシリボヌクレオチド５’−三リン酸（ｄＡＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＣＴＰ、およびｄＴＴＰ）、０．５ｍＭの各プライマー、および１００ｍＬの反応液につき０．５単位のＴａｑポリメラーゼを含む標準ＰＣＲ緩衝液中で行った。３０サイクルの増幅を、以下の温度プロフィール、すなわち、９５℃３０秒、６０℃３０秒、７２℃１分で行った。十分な長さの生成物を生じさせるために、増幅の後、７２℃で７分間インキュベートした。生成物を検出し、その量を測るために、［ラムダ−３２Ｐ］ｄＣＴＰを、１００ｍＬにつき１０ｍＣｉの量で加えた。生成物を、変性しているポリアクリルアミド平板ゲル上で、電気泳動により分離し、数えた。所定の反応でのシグナルの消失は、ＤＨＢＶを効果的に不活性化していることを指し示すと理解された。
この結果は、より小さいアンプリコンほど、試験した全てのソラレンについてソラレン濃度の関数として、高い不活性化を呈したことを示した。等濃度では、Ｓ−５９およびＳ−７０は、より小さいアンプリコンのＰＣＲを、ＡＭＴよりも阻害した。１０７２ｂｐのアンプリコンについては、Ｓ−５９およびＳ−７０のすべての濃度で、完全なＰＣＲの阻害が観察された。ところが、ソラレンなしの試料は、強いシグナルを与えた。ＡＭＴは、７０および１００ｍＭのレベルで、１０７２ｂｐのアンプリコンのＰＣＲ増幅を阻害した。しかし、ＡＭＴを最終濃度３５ｍＭで用いた際には、シグナルを検出し得た。
実施例 １５
実施例１３では、本発明の化合物を、ＤＭＥＭ／１５％ ＦＢＳ中においてウイルスを不活性化するそれらの能力について試験した。この実施例では、本発明の方法が、どんな特別なタイプの培地にも限定されないことを示すために、１００％の血漿および大部分が合成培地の両方で、化合物を試験した。
合成培地中の試料について：標準ヒト血小板濃縮液を、血漿を分離するために遠心機にかけた。その後、８５％の血漿を絞り出し、２０ｍＭの酢酸ナトリウム、２ｍＭのグルコース、４ｍＭのＫＣｌ、１００ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのクエン酸三ナトリウム、２０ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４／Ｎａ２ＨＰＯ４、および２ｍＭのＭｇＣｌ２を含む合成培地（「ＳｔｅｒｉｌｙｔｅＴＭ３．０」と呼ばれる）と取り替えた。ＨＩＶに感染したＨ９細胞を、８５％のＳｔｅｒｉｌｙｔｅＴＭ３．０血小板濃縮液、または標準ヒト血小板濃縮液（１濃縮液につき２．５×１０７細胞）のどちらかに、最終濃度が５×１０５細胞／ｍＬの濃度となるよう加えた。血小板濃縮液は、ＴｅｆｌｏｎＴＭで改良されたＦＬ２０、あるいはＴｅｆｌｏｎＴＭミニバッグ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ Ｃｏ．，Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＭＤ）に入れ、図１８および１９で示す化合物のうちの１つで、示す濃度で処理し、その後、実施例１の装置と類似の装置で、３２０〜４００ｎｍ（２０ｍＷ／ｃｍ２）で、５Ｊ／ｃｍ２（血小板試料に対し）または２Ｊ／ｃｍ２（８５％のＳｔｅｒｉｌｙｔｅＴＭ３．０に対し）照射した。ここで用いられた光活性化装置は、あらかじめ分析され、実施例１の装置と比較できる光照射内であると分かった（データは示していない）。本発明の化合物で処理された試料における残存ＨＩＶ感染力の測定のためのアリコットを回収し、培養した。
血漿中の試料について：ＨＩＶに感染したＨ９細胞を、標準ヒト血小板濃縮液（１濃縮液につき２．５×１０７細胞）に、最終濃度が５×１０５細胞／ｍＬとなるよう加えた。ＨＩＶで汚染された血小板濃縮液のアリコット（５ｍＬ）を水で覆われたＰｙｒｅｘ（登録商標）チャンバー中に入れた。そのチャンバーは、あらかじめ、内側をシリコンで覆ってあった。血小板濃縮液を、下の表１０および１１で列挙された化合物のうちの１つで、表に列挙された濃度で処理し、実施例１の装置と類似の装置で、３２０〜４００ｎｍ（２０ｍＷ／ｃｍ２）で１分間照射した。ここで用いられた光活性化装置は、あらかじめ試験され、実施例１の装置に匹敵する光への曝露をもたらすと分かった（データは示していない）。本発明の化合物で処理された試料における残存ＨＩＶ感染力の測定のためのアリコットを回収し、培養した。残存ＨＩＶ感染力は、血漿と、８５％のＳｔｅｒｉｌｙｔｅＴＭ試料との両方について、ＭＴ−２感染力アッセイを用いて分析した（先の実施例１３にて詳述、および以前Ｈａｎｓｏｎ，Ｃ．Ｖ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ ２８；２０３０（１９９０）で述べられている）。その結果を、図１８、および１９に示す。
その結果は、本発明の化合物が、血漿中、および合成培地中のどちらともでＨＩＶの不活性化において効果的であることを支持している。図１８、および１９を比べると、不活性化曲線は、同じ様であり、６４μＭの化合物濃度で、およそ５対数の不活性化を達成している。しかしながら、合成培地中での不活性化は、血漿中で同じ不活性化を達成するために必要とされる値よりも低い、ほんの２Ｊ／ｃｍ２、３Ｊ／ｃｍ２の照射で行った。従って、そのデータから、合成培地は、本発明の不活性化方法を促進することが明らかである。
実施例 １６
この実施例では、核酸と結合している光反応性の本発明の化合物による細菌の不活性化を、後で自己複製する細菌の能力の関数として測定した。グラム陰性菌を、不活性化することがもっと困難である細菌株の代表として選んだ。
細菌としてＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓの菌株を、滅菌ループでＬＢ中に植菌し、３７℃にて振盪器で一晩増殖させた。６１０ｎｍで１ＯＤが、５×１０８コロニー形成単位（ｃｆｕ）／ｍＬに等しい。１：１０の培地の希釈物を、分光光度計（Ｓｈｉｍａｔｓｕにより製造された）で測定した。細菌培養物を、ＤＭＥＭ中１５％のウシ胎児血清の溶液に、最終細菌濃度がおよそ１０６／ｍＬになるように加えた。アリコット（０．８ｍＬ）を１．５ｍＬスナップトップ（ｓｎａｐ−ｔｏｐ）ポリエチレンチューブに移した。水、エタノールまたはジメチルスルホキシドで０．８０〜８．０ｍＭに調製された試験化合物保存溶液のアリコット（０．００４〜０．０４０ｍＬ）を、チューブに加えた。化合物は、１６μＭの濃度で試験した。チューブを、実施例１で述べたような光装置の中に置き、１．３Ｊ／ｃｍ２、１．２Ｊ／ｃｍ２、そして最後に２．５Ｊ／ｃｍ２で、総量が５Ｊ／ｃｍ２となるように照射した。それぞれのパルス期間の後に、試験するために１５０μＬ取り除いた。滅菌した１３ｍＬの希釈チューブを用意した。それぞれの試験化合物に、０．４ｍＬのＬＢ培地の入った１本のチューブと、０．５ｍＬのＬＢ培地を含む４本のチューブが必要である。希釈物を作るために、ファージと試験化合物の照射された溶液のアリコット０．０５０ｍＬを０．５ｍＬの培地の第１の希釈チューブに加えた。その後、この溶液の０．０５０ｍＬを、０．５ｍＬの培地の第２のチューブに加えた（１：１０）。その後、第２の溶液を、続けて残りのチューブ内で希釈した（１：１０）。１００μＬの元の試料とそれぞれの希釈物を別々にＬＢアガープレート上にまき、３７℃で一晩インキュベートした。コロニー形成単位を明朝数え、光処理後に残っているファージの力価を希釈比にもとづいて計算した。
次の対照実験を行った。試験化合物で処理せず、照射しない「細菌のみ」（下の表中では、「開始力価」として列挙した。）、試験化合物なしで細菌を照射した「紫外線のみ」である。暗対照実験は、実施例１２に示された理由で、ここでは行わなかった。
結果は以下の通りである。細菌の開始力価は、６．５対数であった。５Ｊ／ｃｍ２での照射後、さまざまな試験化合物についての死滅の対数は以下の通りであった。８−ＭＯＰは１．９対数、ＡＭＴは５．２対数、化合物２は＞５．５、化合物６は＞５．５であった。これらの結果から、本発明の化合物が、ＡＭＴおよび８−ＭＯＰのどちらよりも、グラム陰性菌の不活性化においてより効率的であることが明らかである。
実施例 １７
上述の実施例において、本発明のソラレンは細菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ）、バクテリオファージ（Ｒ１７）およびウイルス（ＨＩＶおよびＤＨＢＶ）のような病原体を不活性化するのに効果的であることが実証された。本発明の化合物が病原体を不活性化するどんな方法にも限定されることを意図しないが、不活性化は光に誘導されたソラレンの病原体の核酸への結合に起因するということが考えられている。すでに論議されたように、ＡＭＴはその病原体を不活性化する効率と、低濃度で暗下にて付随して起きる変異原性作用の両方で知られている。対照的に、前に調査された８−ＭＯＰのような活性の低いソラレンほど、有意に変異原性が低い。この実施例では、光結合と変異原性が、本発明の化合物において関連のある現象ではないということを確立する。本発明のソラレンは、最小の変異原性のみを呈する一方で、例外的な病原体不活性化効率を持つ。
この実施例において、本発明の化合物は、暗下での変異原性についてエイムスアッセイを用い試験される。ＭａｒｏｎおよびＡｍｅｓにより詳細に述べられているように、Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ変異原性試験に対して使われた手順は、Ｍａｒｏｎ，Ｄ．Ｍ．およびＢ．Ｎ．Ａｍｅｓ，Ｍｕｔａｔｉｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １１３：１７３（１９８３）に正確に従った。各手順の簡単な説明をここに紹介する。試験菌株ＴＡ９７ａ，ＴＡ９８，ＴＡ１００，ＴＡ１０２，ＴＡ１５３７およびＴＡ１５３８はＤｒ．Ａｍｅｓより頂いた。ＴＡ９７ａ，ＴＡ９８，ＴＡ１５３７およびＴＡ１５３８は、フレームシフトの試験菌株である。ＴＡ１００およびＴＡ１０２は、塩基置換の試験菌株である。受け取り次第、各菌株は、菌株に特異的な遺伝子型を確かにするため、様々な条件下で培養した。
この研究で使われた標準のＳａｌｍｏｎｅｌｌａ試験菌株は、各試験菌株がヒスチジンオペロンに異なるタイプの変異を含んでいるので、その成長にヒスチジンを必要とする。ヒスチジンの変異に加え、これらの試験菌株は以下に述べる他の変異を含んでおり、これらの変異はそれらの変異原の検出能力を大いに増加させる。
ヒスチジン依存性：ヒスチジン要求性は、まずビオチンのみ補った最小グルコースプレートに、各菌株を筋状に撒き、それからビオチンとヒスチジンを補った最小グルコースプレートに筋状に撒くことにより試験した。
すべての菌株は、ヒスチジンがない状態で、その成長が減少した。
ｒｆａ変異：細菌の表面を覆い、大分子に対する浸透性を増しているリポ多糖類壁の部分的な損失を引き起こす変異を、試験菌株で覆われ、筋状に撒かれた栄養寒天プレートをクリスタルバイオレットにさらすことにより確かめた。まず、各培養菌１００μＬを２ｍＬの溶解した最小トップアガーに加え、栄養寒天プレート上に注いだ。それから、クリスタルバイオレットで飽和させた滅菌フィルターペーパーディスクを各プレートの中央に置いた。３７℃で１６時間インキュベートした後、プレートを評価し、細菌の成長が見られない明瞭な領域がディスクのまわりに見られ、ｒｆａ変異を確認した。
ｕｖｒＢ変異：この研究で使われた３つの菌株は、ＵＶ修復システムに欠陥を含んでいる（ＴＡ９７ａ，ＴＡ９８，ＴＡ１００，ＴＡ１５３７およびＴＡ１５３８）。この特性を、菌株を栄養寒天プレート上に筋状に撒き、プレートの半分を覆い、プレートのさらされた側に滅菌ランプを照射することにより試験した。培養後、プレートの、ＵＶ照射から保護された側にのみ成長が見られた。
Ｒファクター：試験菌株（ＴＡ９７ａ，ＴＡ９８，ＴＡ１００およびＴＡ１０２）は、変異原に対する感受性を増加させるｐＫＭ１０１プラスミドを含んでいる。このプラスミドは、細菌にアンピシリン耐性も与える。これはアンピシリンの存在するところでの菌株の成長により確かめられた。
ｐＡＱ１：菌株ＴＡ１０２も、変異原に対するその感受性をより増強させるｐＡＱ１プラスミドを含んでいる。このプラスミドも、テトラサイクリン耐性をコードしている。このプラスミドの存在を試験するため、ＴＡ１０２をヒスチジン、ビオチンおよびテトラサイクリンを含む最小グルコースプレート上に筋状に撒いた。プレートを、３７℃で１６時間インキュベートした。この菌株は普通の増殖を示し、このことはｐＡＱ１プラスミドの存在を示した。
遺伝子型試験に使った同じ培養菌を再度培養し、制御された条件下でアリコットを凍結した。凍結された永久不変のものを調製するときの操作の際の遺伝子型の忠実度を確認するために、再度、培養菌を遺伝子型について試験した。
この菌株で行った最初の試験は、各菌株の自発的復帰変異の範囲を決定することだった。
各変異原性実験で、ヒスチジン非依存性への試験菌株の自発的復帰変異が測定され、それはプレートごとの自発的復帰変異体の数として表された。これはバックグラウンド対照実験として役立った。変異原性の陽性対照実験は、その菌株に適する、診断用変異原を使うことにより、各試験菌株に設けられた（ＴＡ９８に対しては５ｍｇ／プレートの２−アミノフルオレンおよびＴＡ１００に対しては１．５ｍｇ／プレートのアジ化ナトリウム）。
すべての実験に対して、前培養の手順が用いられた。この手順においては、各試験菌株の１つのバイアルを解凍し、この培養菌２０μＬを６ｍＬのＯｘｏｉｄ Ｎｕｔｒｉｅｎｔ Ｂｒｏｔｈ ＃２に加えた。この溶液を、その後３７℃で１０時間振とうした。前培養の手順で、この一晩置いた培養菌の０．１ｍＬを必要な数の滅菌試験管にそれぞれ加えた。
試験管の半分に、Ａｒｏｃｌｏｒ １２５４に誘導されたラットの肺抽出物（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．，Ａｎｎａｐｏｌｉｓ，ＭＤ）を含む０．５ｍＬの１０％ Ｓ−９溶液、ＭｇＣｌ２、ＫＣｌ、グルコース−６−リン酸、ＮＡＤＰおよびリン酸ナトリウムバッファー（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）を加えた。試験管のもう半分には、Ｓ−９混合物（Ｓ９試料）の代わりに、０．５ｍＬの０．２Ｍリン酸ナトリウムバッファー（ｐＨ７．４）を使用した。最後に、０，０．１，０．５，ｌ，５，１０，５０，１００，２５０または５００μｇ／ｍＬのいずれかの試験化合物を含む試験溶液０．１ｍＬを加えた。その０．７ｍＬの混合物を撹拌し、それから３７℃で２０分間振とうしながらプリインキュベートした。振とう後、ヒスチジンとビオチンを補った２ｍＬの溶解したトップアガーを、その０．７ｍＬの混合物に加え、即刻最小グルコース寒天プレートに注いだ（基本培地の量は２０ｍＬだった）。そのトップアガーを固まらせるため３０分間放置し、それからプレートを逆さにして、３７℃で４４時間インキュベートした。インキュベート後、各プレートの復帰変異体のコロニーの数を数えた。結果は、以下の表１２（Ａ）−１８（Ｂ）に示してある（ｎは各データポイントで行われた反復回数を表す。）。
ＭａｒｏｎとＡｍｅｓ（１９８３）は、この試験から生まれたデータの統計的な扱いに関して、相対する見解を述べている。この点を考慮して、この実施例は、薬物に対する用量依存性変異原性応答と同様、復帰変異体の数における、バックグラウンドを越えての２倍または２倍超の増加により特徴づけられている変異原性の簡単なモデルを採用している。
８−ＭＯＰに関しては、検出された唯一の変異原性応答は、ＴＡ１０２において５００μｇ／プレートで弱い塩基置換変異原だった（表１３（Ｂ））。
はっきりとした対比では、ＡＭＴ（表１２（Ａ）および１２（Ｂ））は、ＴＡ９７ａおよびＴＡ９８において５μｇ／プレートと１０μｇ／プレートの間、ＴＡ１５３７において５μｇ／プレート、およびＴＡ１５３８において１μｇ／プレートでフレームシフト変異原性を示した。ＡＭＴは意味ある塩基置換変異を示さなかった。
化合物１を見ると、検出された唯一の変異原性の応答は、Ｓ９の存在下、５μｇ／プレートでＴＡ１５３８における弱いフレームシフト変異原であった。化合物１はＴＡ１００株においても変異を示したが、Ｓ９の非存在下でのみであった。化合物２も、ＴＡ９８およびＴＡ１５３７においてＳ９の存在下、弱いフレームシフト変異原性を示した。化合物３および４は変異原性を示さなかった。化合物６は塩基置換変異原性を持たなかったが、２５０μｇ／プレート以上の濃度で、Ｓ９の存在下、ＴＡ９８においてフレームシフト応答を示した。化合物６はＴＡ１５３７においても、Ｓ９の存在下、５０μｇ／プレートで応答を示した。化合物１８はＴＡ９ｏ株とＴＡ１５３７株において、Ｓ９の存在下、高い濃度で弱い応答を示しただけだった。その応答はＳ９の非存在下ではより高かったが、それでもなお、はるかに低い濃度（５μｇ／プレート）で変異原性を示すＡＭＴの応答より充分下であった。
このデータから、本発明の化合物はエイムス試験により定義されたように、ＡＭＴより変異原性が低い。同時に、これらの化合物は実施例１２と１６で示されたように、８−ＭＯＰよりはるかに高い不活性化効率を示す。これら２つのファクターは、本発明の化合物がＡＭＴと８−ＭＯＰ両方の一番良い特徴、すなわち高い不活性化効率と低い変異原性を兼ね合わせているということを支持している。
実施例１８
実施例１５において、本発明の化合物が、合成培地中で病原体を不活性化する能力を示した。この実施例は、合成培地および本発明の化合物が、血液中で病原体を不活性化するために導入され、使用されるかもしれない方法を述べている。図２０Ａは、現在、血液銀行で使用されている標準的な血液製剤分離アプローチを概略的に示している。血液輸送セット（２００）（例えば、商業的にＢａｘｔｅｒ（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ，Ｉｌｌ）から入手可能）を作製するために、三つのバッグを曲げやすいチューブで統合している。
血液が第１のバッグ（２０１）に送り込まれた後、全セットを遠心分離（例えば、ＳｏｒｖａｌｌＴＭ回転バケット遠心機、Ｄｕｐｏｎｔ）により処理し、その結果、第１のバッグ（２０１）に赤血球および血小板が豊富な血漿が詰められる。血漿は第１のバッグ（２０１）からチューブを通って第２のバッグ（２０２）に絞り出される（例えば、血漿圧搾用のＦｅｎｗａｌｌＴＭ装置を使用）。それから第１のバッグ（２０１）は取り外され、二つのバッグのセットを遠心機にかけ、血小板濃縮液と血小板が少ない血漿を作製する。後者は第２のバッグ（２０２）から第３のバッグ（２０３）に絞り出される。
図２０Ｂは、合成培地および光活性化合物が、図２０Ａと同様に調製された血小板濃縮液に導入される本発明の実施態様を、概略的に示している。二つのバッグのセット（３００）は、血小板濃縮液のバッグ（２０２）（「Ｐ．Ｃ．」と記す）と滅菌連結される。滅菌連結は、当該分野でよく知られている。例えば、Ｄ．Ｗ．Ｃ．Ｓｐｅｎｃｅｒに対する米国特許第４，４１２，８３５号を参照のこと。この米国特許は本明細書により参考として援用される。また、米国特許第４，１５７，７２３号及び第４，２６５，２８０号を参照のこと。これらの米国特許は本明細書により参考として援用される。滅菌連結装置は、商業的に入手可能である（例えば、Ｔｅｒｕｍｏ，日本）。
二つのバッグのセット（３００）のバッグのうち一つ（３０１）は、本発明の合成培地の処方物を含んでいる（「ＳＴＥＲＩＬＹＴＥ」と記す）。図２０Ｂに示されている第二段階で、滅菌接続手段で第１の血液バッグから第２の血液バッグに血小板濃縮液を絞り出すことにより血小板濃縮液を合成培地バッグ（３０１）に移すことによって、血小板濃縮液を合成培地と混合する。光活性化合物は合成培地を含むバッグ（３０１）に存在し得、製造の間際に加えられる。あるいは、製造の間際に化合物が血液収集バッグ（図２０Ａ，２０１）に加えられる場合、化合物は収集の間際に血液と混合され得る。化合物は、血液の維持と両立可能な、乾燥した状態で存在しても、溶液中に存在してもどちらであっても良い。
図２０Ｃは、図２０Ｂと同様に、特に合成培地で希釈された血小板濃縮液に適用した本発明の除染アプローチの一実施態様を概略的に示している。この実施態様で、血小板は合成培地バッグ（３０１）に移された。光活性化合物は、すでに血液収集バッグ（２０１）に導入されたか、または合成培地バッグ（３０１）中に存在するかのいずれかである。次いで、血小板は滅菌接続手段によって（示されているように）合成培地バッグに絞り出されるか、または合成培地が血小板バッグに絞り出されるかのいずれかである。血小板濃縮液と合成培地（３０１）の混合物を含んだバッグは、ＵＶ光透過特性と本発明に適した他の特徴を有し、それから、（上述の実施例１で述べられたような）装置の中に置き、照射される。
光処理に続いて、除染した血小板は二つのバッグのセット（３００）の合成培地バッグ（３０１）から貯蔵バッグ（３０２）に移される。貯蔵バッグは、商業的に入手可能な貯蔵バッグであり得る（例えば、Ｃｕｔｔｅｒ製のＣＬＸバッグ）。
実施例 １９
この例は、血小板機能に対する本発明の化合物および方法の影響の評価を含んでいる。血小板生存能力および機能の四つの指標が使用されている。つまり、１）ＧＭＰ−１４０の発現、２）ｐＨの維持、３）血小板の凝集、４）血小板の数。
これらの四つの指標を用いて、血小板機能に対する本化合物および除染の方法の効果を測定するため、それぞれの試験化合物のために四つの試料を調製した。つまり、二つは対照実験試料および二つは化合物を含んでいる試料である。３ユニットのヒト血小板はＳａｃｒａｍｅｎｔｏ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｎｔｅｒ（Ｓａｃｒａｍｅｎｔｏ，ＣＡ）から入手した。これらは、滅菌条件下でそれぞれ５０ｍｌ遠心チューブに移し、それから、各ユニットのアリコットを、５０ｍｌ滅菌遠心チューブの第２のセットに移した。血小板濃縮液（ＰＣ）を含んだそれぞれの遠心チューブに、貯蔵された化合物のアリコットを化合物の最終濃度が１００μＭに達するように加えた。この実験で試験される化合物は、化合物２（３６μＬの１０ｍＭストックを４ｍｌのＰＣに添加）、化合物６（１７３．５μＬの９．８ｍＭストックを１６．８ｍｌのＰＣに添加）、化合物１７（２．０ｍｌの１ｍＭストックを１８ｍｌのＰＣに添加）、および化合物１８（０．８４２ｍｌの２．０ｍＭストックを１６ｍｌのＰＣに添加）であった。試料は穏やかにピペッティングし、混合した。それから、それぞれの試料のアリコット（３ｍｌか、または８ｍｌ）を、二本の滅菌ＴｅｆｌｏｎＴＭ Ｍｅｄｉ−ｂａｇｓＴＭ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｆｌｕｏｒｏｓｅａｌ Ｃｏ．，Ｓｉｌｖｅｒ Ｓｐｒｉｎｇｓ，ＭＤ）（現在、Ｔｈｅ Ｗｅｓｔ Ｃｏｍｐａｎｙ（Ｌｉｏｎｖｉｌｌｅ，ＰＡ）により所有される）に移した。試料は、３ｍｌまたは８ｍｌの容量の二つの異なったサイズのバッグのうち一つの中で扱った。バッグは共に、大体同じ、表面積対体積の比を持っており、前の実験は二つのバッグが試料を照射している間、大体等しい特性を表していることを示している（データ示さず）。それぞれの試験化合物について、化合物を含まない二つの対照実験試料を、以前と同様に、化合物試料が抜かれた５０ｍｌ遠心チューブの第１のセットのうち同じチューブから血小板濃縮液のアリコット（８ｍｌのバッグを使用するならば１７ｍｌ、３ｍｌのバッグを使用するならば４ｍｌ）再び取り除き、Ｍｅｄｉｂａｇに分配することによって調製した。化合物を含んだそれぞれの組のＭｅｄｉｂａｇのうち一つと、対照実験のそれぞれの組のＭｅｄｉｂａｇのうち一つを、上述の実施例１で述べられた装置上で、５ジュール／ｃｍ２で照射した。それから、全ての実験のＭｅｄｉｂａｇと対照実験のＭｅｄｉｂａｇを五日間貯蔵のため血小板振とう器に置いた。同じ実験を統計上、より意味があるデータを得るために数回繰り返した。以下に議論されている図２１〜２４のグラフに「ｎ」と表されているのは、データポイントの数を表している。
第一日目に対照実験試料のデータを得るために、３ユニットのそれぞれの残量から約３ｍｌを取り除き、二本の１．５ｍｌチューブに分配した。これらの試料を以下に述べられているようにｐＨについて試験した。血小板の数に関してもまた以下に述べられているように１：３希釈で行った。それぞれのユニットから残存血小板濃縮液を、Ｓｏｒｖａｌ ＲＣ３Ｂ（Ｄｕｐｏｎｔ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｗｉｌｍｉｎｇｔｏｎ，Ｄｅｌａｗａｒｅ）で１０分間、３８００ｒｐｍ（３０００ｇ）で遠心機にかけ、ペレット状濃縮物にした。それから、血漿は凝集アッセイで使用するために、二本の滅菌した５０ｍｌチューブ（一本を第一日目に、他を第五日目のために４℃で保存）にデカントして移した。
１）ＧＭＰ−１４０の発現
血小板が活性化すると、ｐ−セレクチン（ＧＭＰ−１４０）と呼ばれるα顆粒膜糖タンパク質が、血小板表面に露出される。（５％）未満の新鮮で正常な刺激されていない血小板しか、フローサイメトリーで検出可能なＧＭＰ−１４０レベルを発現していない。Ｍ．Ｊ．Ｍｅｔｚｅｌａａｒによる、Ｓｔｕｄｉｅｓ Ｏｎ Ｔｈｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｆ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ−Ｍａｋｅｒｓ Ｏｎ Ｈｕｍａｎ Ｐｌａｔｅｌｅｔｓ（ヒト血小板の活性化マーカーの発現における研究）（Ｔｈｅｓｉｓ １９９１）に概要参照。
ＧＭＰ−１４０を測定するために、血小板が多い血漿の小アリコットを、ＧＭＰ−１４０結合抗体またはアイソタイプのコントロールマウスＩｇＧを含むＨＥＰＥＳ緩衝液に加える。
ＣＤ６２はＧＭＰ−１４０に結合する商業的に入手可能なモノクローナル抗体である（Ｓａｎｂｉｏ，Ｕｄｅｎ，ｔｈｅ Ｎｅｔｈｅｒｌａｎｄｓ；Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｓ，Ｓｏ．Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡおよびＢｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡから入手可能）。室温で１５分間インキュベート後、ＦＩＴＣ（Ｃａｌｔａｇ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｓｏ，Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）に結合したヤギＦ（ａｂ’）２抗マウスＩｇＧを飽和量で、チューブに加え、１５分間、室温（ＲＴ）でインキュベートを行った。最終的に、細胞をリン酸塩緩衝液中１％のパラホルムアルデヒドで希釈し、ＦＡＣＳＣＡＮＴＭ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）で分析した。陽性対照実験を、酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）を最終濃度が２×１０−７Ｍになるように試験系に加えることによって作製した。
この実施例では、もしあれば、血小板活性化に対する本発明のいくつかの化合物存在下で照射の影響を測定するために、ＣＤ６２を使用した。抗体をＨＥＰＥＳ緩衝液（１０μＬの抗体［０．１ｍｇ／ｍｌ］：２．４９ｍＬの緩衝液）と混合し、使用前に−４０℃で５０μＬのアリコットで保存した。陽性対照実験は１０μＬのＣＤ６２、８μＬのＰＭＡ、および２．４８２ｍＬのＨＥＰＥＳ緩衝液からなった。５倍に濃縮されたマウスＩｇＧ１対照実験（０．０５ｍｇ／ｍｌ）（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ，Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ ＃９０４０）もまた使用した。抗体をＨＥＰＥＳ緩衝液（２０μＬの抗体：２．４８ｍｌの緩衝液）で希釈し、−４０℃で保存した。酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）は−４０℃で保存した。使用時には、これをＤＭＳＯ（作用濃度は１０μｇ／ｍＬ）に溶解させた。
１％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）（Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）を、１０ｇのパラホルムアルデヒドを１ＬのＰＢＳに加えて調製した。これを７０℃に熱し、その後、溶液が透明になるまで３Ｍ ＮａＯＨを滴下して添加した。この溶液を冷まし、ｐＨを１Ｎ ＨＣｌで７．４に調節した。これを濾過し、保存した。
処理後、血小板濃縮液のそれぞれの試料の処理は、ＨＥＰＥＳ緩衝液で１：３に希釈した５μＬの血小板濃縮液を、抗体ＣＤ６２および適当な試薬を含んだそれぞれの微量遠心チューブへ添加すること、および、ボルテックスによって大変穏やかに混合することを含んでいた。それから、試料を１５分間、室温でインキュベートした。
ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ（ＨＥＰＥＳ緩衝液で１：１０に希釈）を（５μＬ）それぞれのチューブに加え、溶液を穏やかにボルテックスで混合した。試料をさらに１５分間、室温でインキュベートした。次に、ＰＢＳ中１％のＰＦＡの１ｍＬをそれぞれのチューブに加え、穏やかに混合した。血小板はＦＡＣＳＣＡＮＴＭで分析した。その結果を、図２１Ｃ、２２Ｃ、２３Ｃ、および２４Ｃに示している。（図２１は化合物２に、図２２は化合物６に、図２３は化合物１７に、図２４は化合物１８にそれぞれ対応している。）明らかに、四つの試験化合物のうち三つ、すなわち２，６、および１７は第五日目の非処理対照実験（Ｄ５）および光とソラレン化合物（ＰＣＤ）の両方で処理した試料間で、わずかあるいは全く違いが見られなかった。化合物１８だけが対照実験以上に顕著な上昇が見られた。しかしながら、値は、依然として陽性対照実験の値に比べてずっと低かった。
２）ｐＨの維持
濃縮液中の血小板のｐＨの変化は、形態的な特徴および輸血後の生存を変化させ得る。Ｍｏｒｏｆｆ，Ｇ．ら、「２０〜２４℃で血小板濃縮液の貯蔵の間、ｐＨの変化に影響を与える因子（Ｆａｃｔｏｒｓ Ｉｎｆｌｕｅｎｃｉｎｇ Ｃｈａｎｇｅｓ ｉｎ ｐＨ ｄｕｒｉｎｇ Ｓｔｏｒａｇｅ ｏｆ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｓ ａｔ ２０−２４℃）」、Ｖｏｘ Ｓａｎｇ．４２：３３（１９８２）。血小板が正常に作用するｐＨの範囲は、約６．０〜６．５から７．６である。Ｓｔａｃｋ，Ｇ．およびＥ．Ｌ．Ｓｎｙｄｅｒ、「血小板濃縮液の貯蔵」、Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｐｌａｔｅｌｅｔ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ ９９，ａｔ １０７（１９９１）。ｐＨを測定するため、ＣＩＢＡ−ＣＯＲＮＩＮＧ ２３８ ｐＨ／血液ガス分析器（ＣＩＢＡ−ＣＯＲＮＩＮＧ，Ｎｏｒｗｏｏｄ，ＭＡ）を用いた。
それぞれの試料から少量の血小板濃縮液をｐＨ／血液ガス分析器に注入した。
ｐＨの測定は全ての試料について時間０と五日間の貯蔵後に行った。図２１Ｄ、２２Ｄ、２３Ｄ、および２４Ｄは、光を照射しない（暗）対照実験、光を照射した対照実験、および光に化合物を加えた実験についてのｐＨの結果を示す棒グラフである。これらのグラフは、化合物のうちいずれか一つの存在下で照射後の血小板濃縮液試料のｐＨは６．５を超えたままであることを示している。このようにして、血小板は本発明の化合物を用いた光活性化処理後の貯蔵血小板が許容できるｐＨを維持している。
３）凝集
血小板の凝集は、凝集を刺激する際に呈する血小板試料の光透過の変化により測定した。血小板の凝集は、Ｗｈｏｌｅ Ｂｌｏｏｄ Ａｇｇｒｅｇｏｍａｔｏｒ（Ｃｈｏｒｏｎｏ−Ｌｏｇ Ｃｏｒｐ．，Ｈａｖｅｒｔｏｗｍ，ＰＡ，モデル５６０ＶＳ）により測定した。各試料における血小板の数は各測定において一定になるように調節した。モデルＦ８００ Ｓｙｓｍｅｘ細胞カウンター（Ｔｏａ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ，神戸，日本）は、血小板試料の血小板数測定に用い、同一血漿は血小板数を３０００００血小板凝集物／ｍｌに調節することに用いた。
手順中で、すべての試料は活性化のために３７℃で３０分間密栓したプラスチックチューブでインキュベートした。凝集計は３７℃まで加温した。光学チャンネルは血小板凝集測定に用いた。凝集計の磁気速度は６００／ｍｉｎに設定した。得られたユニットから処理用の試料として寄せ集めた残存血小板凝集物は、実験試料と同一の血小板に乏しい血漿から含有物を得るために微量遠心機で高速（１４０００ｇ）で５分間遠心機にかけた。
開始するにあたり、０．４５ｍｌの同一の血小板に乏しい血漿を０．５ｍｌの食塩水とともにガラスキュベット内に添加し、ＰＰＰチャンネルに置いた。それから、０．４５ｍｌの血小板凝集物試料および０．５０ｍｌの食塩水は試料チャンネルの方へガラスキュベット（小さい磁石を含む）に添加した。１分後、ＡＤＰおよびコラーゲン試薬（１０μｌ）それぞれは試料キュベットに添加した。ＡＤＰの最終濃度は１０μＭ、そしてコラーゲンの最終濃度は５μｇ／ｍｌであった。血小板の凝集は約８から１０分間、あるいは最大示度に到達するまで記録された。
その結果は図２１Ｂ，２２Ｂ，２３Ｂおよび２４Ｂに表している。１００％凝集ラインは、記録計がゼロに設定される値である。０％凝集ラインはＡＤＰおよびコラーゲンが添加される以前に血小板が透過されるところである。試料に対する凝集値は最大凝集値を全範囲の百分率としてとることにより決定した。化合物処理された試料と５日間保持された化合物処理していない試料との間で、凝集度における相違は、試験された４つの化合物のうちの３つにおいては非常にわずかであるか、または全く見られなかった。化合物２は、１日目の対照実験から約８％の僅かな凝集の減少を呈した。化合物ならびにＵＶで処理した試料に対する凝集はＵＶ単独で処理したものと同様であった。このことは本発明の方法において用いられる場合の、試験された除染化合物は、血小板の凝集に対して有意な効果をもたないことを支持する証拠である。
４）計数
Ｓｙｓｍｅｘ細胞カウンターは血小板試料中の血小板数を測定するために用いた。試料は血液銀行の食塩水で１：３に希釈した。
図２１Ａ，２２Ａ，２３Ａおよび２４Ａに血小板数測定の結果が現している。それぞれの化合物に対して、５日目の対照実験と５日目の処理された試料との間で血小板数においてほとんどあるいは全く減少が見られない。興味深いことに、化合物６，１７及び１８で処理した試料は全て、光単独で処理した試料より高い血小板数を表している。例として、化合物６で処理した試料は５日目の対照実験と等しい数であったが、紫外線単独で処理した試料は血小板数において、約３３％の減少を示した。ゆえに、本発明の化合物での処理は血小板数の維持と両立可能であるだけでなく、紫外線への曝露に起因する、数の減少を実際に防ぐようである。
実施例 ２０
血液を除染するための好ましい化合物であって、除染後にインビボで使われる化合物は、受容者の血液に対し変異原性であるべきではない。この実験の第一部において、アミノメチルトリメチルソラレンと比較して遺伝毒性レベルを決定するために幾つかの化合物を検査した。第二部では本発明のいくつかの化合物のインビボの染色体異常誘発能が、マウスの網状赤血球における微小核形成を検索することによって測定した。
１）遺伝毒性
哺乳類細胞培養は化学薬品の染色体異常誘発能評価のために有用な手段である。このような研究では、細胞は、ラットＳ−９代謝活性化システム（Ｓ−９）を用いて、そして／または、用いずに化学試薬に供し、後に細胞の生存性（遺伝毒性での検査のため）あるいは染色体構造の変化（染色体異常のアッセイのため）を試験する。
チャイニーズハムスター子宮細胞（ＣＨＯ；ＡＴＣＣ ＣＣＬ ６１ ＣＨＯ−Ｋ１，プロリン要求性）はインビトロで遺伝毒性および染色体異常の試験に用いた。ＣＨＯ細胞は、細胞発生試験に広く使用される。なぜなら、ＣＨＯ細胞は相対的に少数の染色体数を有し（２ｎ＝２０）、ならびに増殖速度が高い（約１２から１４時間以内、培養状態に依存する）からである。細胞は、指数関数的増殖を維持する目的で、１５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン酸、および１％ペニシリン−ストレプトマイシン溶液を含有するＭｃＣｏｙの５ａ培地中で、５％，ＣＯ２雰囲気下にて約３７℃で培養した。この培地はまた、Ｓ−９を用いなかった際に試験化合物へ細胞をさらす間に用いられた。Ｔ−７５またはＴ−２５フラスコにおいて、細胞培養を維持し、細胞への曝露を実行した。
それぞれの試料化合物は７段階の希釈物、１，３，１０，３３，１００，３３３および１０００μｇ／ｍｌで試験した。化合物は不完全ＭｃＣｏｙの５ａ培地に添加した。
化合物が添加された後、暗中で、約３７℃で３時間細胞を増殖させた。次いで、試験化合物を含む培地は、吸引し、細胞は３７℃で、リン酸緩衝化食塩水（ＰＢＳ）で３度洗浄し、新鮮な完全ＭｃＣｏｙの５ａ培地が添加された。陽性の対照実験はメチルメタンスルホン酸であった。溶媒の対照実験は、培養培地で希釈したジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）であった。代謝活性化（以下に示す）を用いたアッセイのために、活性化混合物もまた溶媒対照実験に添加した。次いで、培養液は、細胞を回収する前に約１２時間追加してインキュベートした。コルヒチンは（最終濃度０．４μｇ／ｍｌ）を、回収より約２．５時間先立って添加した。
コルヒチンで約２．５時間後、上記細胞を収穫した。細胞を、セルスクレイパーを用いてフラスコ表面から除去した。得られた細胞縣濁液を遠心機にかけ、上清を吸引し、４ｍｌの０．０７５Ｍ ＫＣｌ低張液を３７℃で１５分間細胞に添加した。それから細胞は遠心機にかけられ、上清は吸引し、細胞はメタノール：酢酸（３：１）の固定液に懸濁した。固定液の三度の交換ののち、すべてのフラスコ由来の細胞を用いて、風乾させたスライドを調製した。それぞれのフラスコ由来の初期のスライド上での細胞密度と中期の品質を、位相差顕微鏡を用いて観察し、少なくとも２つの適切な細胞密度のスライドを各フラスコから調製した。スライドは３％Ｇｉｅｍｓａで２０分間染色し、脱イオン水中でリンスし、キシレン中に通した。カバーガラスはパーマウントで取り付けた。スライドはそれぞれの試験化合物のどれだけの濃度が中毒量を表すかを決定するために検査された。
結果の分析により、ＡＭＴは３０μｇ／ｍｌで遺伝毒性であることがわかった。対比して、化合物２および化合物６はＡＭＴの中毒量の３倍超の１００μｇ／ｍｌで遺伝毒性のみを呈した。
本発明の化合物と構造的に異なるソラレン化合物である８−アミノメチル−４，４’，５’−トリメチルソラレンもまたこの実験で試験し、１０μｇ／ｍｌで毒性を持つことを証明した。８−置換アミノメチル化合物および類似の構造物は本発明の方法に適し得えないが、代替の目的に有用であり得る。核酸複製を妨害する化合物の能力を考慮して、例えば、それらの非常に強い毒性と組み合わせて、ガンのような細胞増殖が制御不能であることで特徴づけられる病気を処置するために使用しうる。
２）微小核評価プロトコル
食塩水を化合物２，６，１７および１８に対して様々な濃度で調製した。次いで、雄Ｂａｌｂ／ｃマウスに０．１ｍｌの化合物溶液を、尾静脈を経由して注入した。少なくとも３匹のマウスは用量レベルごとに注入された。塩類のみは陰性対照実験として用いた。陽性対照実験としてシクロホスファミド（ｃｙｃｌｏＰＰ）を３０ｍｇ／ｋｇの用量で投与した。実験集団には、注入を１日につき一度を４日間繰り返した。陽性対照実験の集団には３日目に一度だけ投与した。５日目にそれぞれの被験体から数μｌの血液を抜き取り、ガラススライド上に塗布した。細胞は無水メタノールで固定し、スライドラックに貯蔵した。
分析には、アクリジンオレンジで細胞を染色し、（１）５０００個の赤血球当たりの網状赤血球数（２）１０００個の網状赤血球当たりの微小核赤血球数を計数することによって蛍光顕微鏡のもとで可視化した。網状赤血球をＲＮＡの存在に起因する赤色蛍光で判別した。微小核はＤＮＡの存在に起因する緑色蛍光で判別した。次いで、網状赤血球の割合（ＰＣＥ％）を計算した。網状赤血球細胞の割合の増加によって説明される赤血球の頻度の低下は骨髄毒性を示唆している。微小核を伴う網状赤血球の割合（ＭＮを伴うＰＣＥ％）も計算した。ＭＮを伴うＰＣＥ％の増加が染色体異常誘発能の尺度である。
初期の結果を決定した後、（１）微小核形成を観察するか、（２）骨髄毒性を観察するか、（３）致死量に至るか、あるいは、（４）用量が５ｇ／ｋｇが投与されるまで用量レベルを増加させて、実験を繰り返した。化合物２，６，１７および１８のそれぞれを用いたアッセイにおいては、骨髄毒性あるいは微小核形成の兆候のいずれかが見られる前に急性致死量に到達した。その実験結果を上の表２０に表した。表から明らかなように、試験した用量でのどの化合物でも骨髄毒性は観察されなかった。それぞれの化合物で処理した網状赤血球の割合の値は陰性対照実験の値に近いままであった。
陽性対照実験に観察される約２〜２．５％ＰＣＥ／ＲＢＣの減少と比べて、骨髄毒性に起因する赤血球の枯渇を表している。どの化合物も染色体異常誘発作用を現さなかった。
実施例 ２１
実施例１３で、本発明の化合物および手法を用いる、無細胞ＨＩＶウイルスの不活性化を示している。この実施例は、本発明の化合物を用いてもまた細胞親和性ＨＩＶの不活性化を示している。
長期間ＨＩＶＩＩＩＢ感染されたＨ９細胞を用いた（Ｈ９／ＨＴＬＶ−ＩＩＩ−Ｂ ＮＩＨ １９８３ Ｃａｔ．＃４００）。
これらの細胞の培養は、２ｍＭのＬ−グルタミン、２００ｕ／ｍｌのペニシリン、２００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび９％ウシ胎児血清（Ｉｎｔｅｒｇｅｎ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｐｕｒｃｈａｓｅ，Ｎ．Ｙ．）を追加した高グルコースダルベッコ変法イーグル培地で継代した。継代は、週に一度３×１０５〜４×１０５細胞／ｍｌの密度へ分割し、分割の約４日後、３．３％の炭酸水素ナトリウムを適宜添加し、培養液を交換した。不活性化の手順で、培地を分割した後３日の細胞を用いた。４００ｇ×１０分で培養培地を小球形にし、上清を捨て、細胞を１から５日令のヒト血小板濃縮液（ＰＣ）（ＰＨ７．５〜６．５）へ２×１０６細胞／ｍｌの濃度になるように再懸濁した。ＰＣ感染細胞懸濁物のアリコットは、ソラレン非存在下での暗対照実験、ソラレン非存在下でのＵＶＡのみの対照実験、ソラレン存在下での暗対照実験、および、ソラレン存在下およびＵＶＡ実験試料のために調製した。それぞれの水中のソラレンの濃縮フィルター滅菌保存液を最終濃度が１５０μＭになるように適当なアリコットに希釈した（１０ｍＭの化合物１８の保存液は６７倍に希釈し、２ｍＭの化合物２の保存液は１３倍に希釈した）。室温で３０分平衡化させたのち、０．５ｍｌのそれぞれの暗対照実験を凍結バイアル中に置き−８０℃で暗中に貯蔵した。バッグのポリプロピレンポートの１つに連結されたプラスチック製の使い捨て１０ｍｌシリンジを経由して、ＵＶＡ照射のために、８ｍｌのソラレンが非存在のアリコットと８ｍｌのそれぞれのソラレン含むアリコットを、改良Ｆｌ２０ ＴｅｆｌｏｎＴＭバッグ（総表面積が９２ｃｍ２に改良されたもの、Ｔｈｅ Ｗｅｓｔ Ｃｏ．，Ｐｈｏｅｎｉｘｖｉｌｌ，ＰＡ）に導入した。これは０．１７ｃｍの平均経路長であった。バッグは、４℃に設定された循環冷却水槽（バッグ内をおおよそ２２〜２５℃に維持する）に連結した、上記実施例１に記述されている装置で、総曝露が３ジュール／ｃｍ２になるように照射した。曝露中、この装置を血小板振盪機（Ｈｅｌｍｅｒ Ｌａｂｓ，Ｎｏｂｌｅｓｖｉｌｌｅ，ＩＮ）で振盪した。曝露後、バッグの内容物はバッグ上の残りの未使用のポートから新しいシリンジで回収し、分析するまで凍結バイアル中に置き−８０℃で暗中に貯蔵した。
貯蔵した試料は３７℃で解凍し、以下の改変を伴いつつ、Ｈａｎｓｏｎ，Ｃ．Ｖ．，Ｃｒａｗｆｏｒｄ−Ｍｉｋｓｚａ，Ｌ．、およびＳｈｅｐｐｒｄ，Ｈ．Ｗ．，Ｊ Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏ ２８：２０３０（１９９０）および上の実施例１３に記述されるように、ＨＩＶマイクロプラークアッセイで滴定される。各試料からの血ぺいの除去を、塗布の前に実行した。血ぺいの除去後に目標体積の４ｍｌの塗布が望まれるから、過剰の試料（６ｍｌ）をポリプロピレンチューブに移し、最終体積が６０ｍｌになるようにＴｅｓｔで希釈し、不活性化の手順に由来する対照実験の試料は、５０％アッセイ培地と５０％の正常ヒトプール血漿で希釈した。試料は直接９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ Ｇｌａｓｓ Ｗｏｒｋｓ，Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ｎ．Ｙ．）にて段階的に希釈した。プレートは振動振盪器で３０秒間混合し、１から１８時間５％ ＣＯ２雰囲気下３７℃でインキュベートした。ＭＴ−２細胞（０．０２５ｍｌ）［クローンα−４，これはＮａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ ＡＩＤＳ Ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｐｒｏｇｒａｍ，Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ，Ｍｄから入手可能（カタログ番号２３７）］は１ウェル当たり８００００細胞の濃度になるように、各ウェルに添加した。３７℃で５％ ＣＯ２下でさらに１時間のインキュベーションののち、１．６％ Ｓｅａ Ｐｌａｑｕｅアガロース（ＦＭＣ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ｍａｉｎｅ）を含み３８．５℃に前もって温められた０．０７５ｍｌのアッセイ培地をそれぞれのウェルに添加した。プレートは、いくつかのプレートが蓄えられるまで３７℃に２、３分間保たれ、あらかじめ１０℃に冷却した遠心器で６００×ｇで，２０分間プレート台で遠心機にかけた。遠心器内で、アガロース層のゲル化に先立って細胞単層が形成した。プレートは５日間３７℃で５％ ＣＯ２下でインキュベートし、リン酸緩衝化食塩水（ｐＨ７．４）中の５０μｇ／ｍｌのヨウ化プロピジウム（Ｓｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）０．０５ｍｌをそれぞれのウェルへの添加することで染色した。２４から４８時間後、８０００μＷ／ｃｍ２の３０４ｎｍ紫外線箱（ＵＶ ｌｉｇｈｔ ｂｏｘ）（Ｆｏｔｏｄｙｎｅ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｂｅｒｌｉｎ，Ｗｉｓ．）にプレートを置くことで赤色蛍光染色されたマイクロプラークは可視化された。プラークは立体顕微鏡で２０倍から２５倍の倍率で計数した。
結果は以下の通りであった。化合物２（１５０μＭ）は、３ジュール／ｃｍ２の照射後に、６．７対数を超えるＨＩＶ（０対数不活性化の暗対照実験および明対照実験と比較して、対数滴定を６．１プラーク形成単位／ｍｌで開始する）を不活性化した。同一濃度と同一照射時間で化合物１８は７．２対数を超えるＨＩＶ（０対数の暗対照実験および０．１対数の明対照実験と比較して、開始滴定は６．６）を不活性化した。この実施例は、本発明の化合物が細胞親和性ウイルスの不活性化に効果的であることを支持するものである。
実施例 ２２
この実施例には、以下のインビトロの血小板機能アッセイ：１）ｐＨの維持、２）血小板凝集（「Ａｇｇ」）および、３）ＧＭＰ１４０発現により測定される通り、新しい合成培地の評価が含まれている。
Ｓ２．１９，Ｓ２．２２，Ｓ３．０およびＳ４．０の４種の処方物を調製した。合成培地処方物の組成は以下の表２に示した。
ヒトの血小板に富む血漿（ＰＲＰ）の一ユニットをＳａｃｒａｍｅｎｔｏ Ｂｌｏｏｄ Ｂａｎｋより得た。そのユニットは室温で、６分間４０００回転で遠心機にかけ、ユニットプレスに移した。接合した輸送経路を用いて血漿は上記ユニットから圧搾され、残存血漿の約９．４ｍｌを残した。
そのユニットを一時間放置し、その後、血小板を再懸濁するために穏やかに練った。０．６ｍｌの懸濁液へ２．４ｍｌの血漿を添加しその全内容物をＴｅｆｌｏｎＴＭミニバッグへ移した。再構成されたユニットには翌日ｐＨや他の試験を施し、以下の結果を得た。
残りのユニットは、光除染して、または光除染せずに血小板を貯蔵するための合成培地を評価するために用いた。上記ユニットからのアリコット（０．８ｍｌ）はチューブ中のそれぞれの処方物（３．２ｍｌ）へ加えた。３ｍｌのそれぞれの混合物をＴｅｆｌｏｎＴＭミニバッグへ移した（最終血漿濃度２０％）。
５日後、上述された試験のバッテリーを用いて血小板の機能を評価した。それぞれの合成培地処方物の結果は以下の表３に示した。
ＧＭＰ１４０または凝集によって測定する場合、２ｍＭグルコースを含有する合成培地（即ちＳ２．２２）はグルコースを含まない合成培地（即ちＳ２．１９）より良く血小板の機能が保持されていることが明らかとなった。
上の知見を確認するため、これらの処方物と同様に、追加のグルコースの存在しない処方物（３．０および４．０）で実験を繰り返した（「ｎ」は繰り返された実験の回数である）。血小板の機能は貯蔵の前後の両方で試験し、光除染と連結した。結果の要約は以下の表４，５および６に示した。
実施例 ２３
Ｓ−５９の血小板への分配の吸着動態に対する効果
先に述べたように、血小板によるＳ−５９の取り込みは、飽和が起こる前に数時間にかけて起こりうる。図２５Ａは、経時的な血小板によるＳ−５９（Ｃ０＝５０μＭ）の取り込み（上）、および経時的な血小板によるＳ−５９の放出（下）を図的に描写している。上のグラフに示したようにＳ−５９の平衡はおおよそ２時間で到達される。
この実施例は、血小板へのＳ−５９の分配が、吸着動態に対して有意な効果を有するかどうかという問いに向けられている。Ｓ−５９と共に、吸着に先立って２４時間プレインキュベートしたＰＣの吸着動態はプレインキュベートしないＰＣの吸着動態と比較された。両方の場合（２４時間のプレインキュベートする期間の有無）の吸着の動態は固体吸着剤（Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭ；０．１ｇ／３．０ｍｌ）を伴う１５０μＭ（Ｃ０）のＳ−５９を打ち込んだ３５％のＰＣ（即ち３５％が血漿で６５％がＰＡＳ ＩＩＩ）との接触によって決定した。ＰＣの試料は様々な時点で除去し、残りのＳ−５９のレベルを分析した。
図２５Ｂは図的に結果を表現しており、そのデータは四角と実線でプレインキュベートしない吸着データを表し、円と破線でプレインキュベートした吸着データを表している。その結果は、Ｓ−５９を含む血小板のプレインキュベーションが著しく緩やかなバッチ式吸着を導かないことが示唆された。バッチ式吸着の動態は血小板のソラレンの取り込みによって逆に影響されるように見えない。しかし、流動吸着器は、もっと短い接触時間をしている。図２５Ａに示されたデータは、血小板の内部からのＳ−５９の輸送は、短い所在時間での機器内でのＳ−５９の除去の主要な限界となり得るということが示唆された。
実施例 ２４
流動吸着による、照射されたＰＣおよび照射された血漿に由来する残存Ｓ−５９及びＳ−５９光化学反応生成物の除去
流動実験は、特別な８０μｍナイロンメッシュフローアダプターと適合するＰｈａｒｍａｃｉａ Ｃカラム（ホウケイ酸ガラス）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪ）で行われた。それぞれの実験の前にカラムは滅菌した樹脂で調製し、滅菌したＰＡＳ ＩＩＩでリンスした。血小板は３５％の血漿と６５％のＰＡＳ ＩＩＩ中で１５０μＭのＳ−５９と共に調製し、大きなＰＬ−２４１０血小板貯蔵バッグ中で３．０Ｊ／ｃｍ２で照射した。照射の次に血小板は、Ｓ−５９吸着器を通過する前に少なくとも１時間撹拌した。血小板混合物は、流速が正確に制御されうるようにぜん動ポンプでカラムを通して押し出された。血小板ユニットが１つのＰＬ２４１０バッグから滅菌吸着カラムを通じて別のＰＬ２４１０バッグに汚染せずに移すことができるように滅菌連結部位を使用した。スクラブされた血小板混合物の試料を、残存Ｓ−５９および光生成物についてＨＰＬＣを用いて分析した。加えて、ユニットはＰＬ２４１０バッグ中で貯蔵され、貯蔵する間血小板機能を監視した。
図２６に示されているデータは、照射した血小板ユニット内の残存レベルのＳ−５９に対する、直径１ｃｍのカラムの流速、粒子経および血小板の効果について要約する。流速の低下はＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６ＴＭ（１０ｇ／３００ｍｌ）での流動吸着のためのＳ−５９の除去量の増加につながった。興味深いことに、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６ＴＭ（直径２５０〜８５０μｍ）の小さな粒子径型である（１２０μｍ）のＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ｃｇ−１６１ＴＭについて流速依存性は観察されなかった。照射した３５％血漿／６５％ＰＡＳ ＩＩＩからのＳ−５９の吸着を試験することにより、Ｓ−５９の除去における血小板の効果を示した。残存Ｓ−５９のレベルは３５％血漿／６５％ＰＡＳ ＩＩＩ試料よりずっと小さかった。このことは血小板からのＳ−５９および光化学反応生成物の輸送はＳ−５９吸着に対し主に動力学的に抵抗性であることを示している。図２６で、３５％血漿、６５％ＰＡＳ ＩＩＩ中の血小板には四角で、一方で３５％血漿、６５％ＰＡＳ ＩＩＩに対するデータは円で示している。三角はＡｍｂｅｒｃｈｒｏｍ ｃｇ−１６１（直径１２０、ポリスチレン５ｇ／３００ｍｌ）によるＳ−５９吸着の残存レベルを示唆する。
実施例 ２５
流動吸着後の血小板の機能
この実施例は血小板の機能の研究及び凝固因子の研究が含まれている。凝固因子の研究は、ｔｈｅ ＵＣＳＦ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）により実施された。血小板は流動吸着器（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｃカラム：Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．，ＮＪ）を通過してＰＬ２４１０血小板貯蔵バッグに収集された。血小板ユニットは標準的な条件下（血小板が２２℃で振盪される）で貯蔵され、３日間の貯蔵後に血小板機能について分析された。吸着剤（１０ｇ／３００ｍＬ）で処置されて２日間ＰＬ２４１０バッグ中で貯蔵された血小板についての血小板機能のデータは、表Ｅに要約される。
表Ｅに要約されたデータに加えて、５日間の貯蔵期間を通してｐＨやｐＯ２、ｐＣＯ２の測定が行われた。処理されたユニットと、対照実験のユニットとの差において、重要な違いは観察されなかった。最後に、特筆すべきことは、これらの実験は標準的なＡｍｂｅｒｌｉｔｅＴＭ樹脂（すなわちＳｕｐｅｌｃｏ，Ｉｎｃ．によって処理されなかった樹脂）で行われた。Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｉｎｃ．の洗浄プロセスによって除かれる浸出物は、インビトロアッセイで示される通り、血小板機能に対して実質的な影響を与えないように思われる。
実施例 ２６
バッチ式吸着による、照射されたＰＣに由来する残存Ｓ−５９及びＳ−５９光化学反応生成物の除去
バッチ式吸着による、照射されたＰＣに由来する残存Ｓ−５９及びＳ−５９光化学反応生成物の除去が調査された。１ユニットの新鮮な血小板（すなわち３５％血漿／６５％ＰＡＳ ＩＩＩ）は、１５０μＭの３Ｈ−Ｓ−５９を注入され、ＰＬ２４１０バッグ（Ｂａｘｔｅｒ）に移された。そのバッグは３．０Ｊ／ｃｍ２で照射され、照射されたＰＣの２０ｍＬのアリコットは０．６７ｇの吸着剤Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭまたはＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６ＴＭが入っているＰＬ２４１０バッグに移された（１０ｇ／３００ｍＬ）。それらのバッグは、血小板インキュベーターに移された。２つの別個の血小板がそれぞれの吸着剤に対して処理された。一方のユニットは、３時間撹拌され、その後血小板が吸着剤から分離されて別のバッグに移された。もう一方の血小板ユニットは吸着剤と接触してから４日間そのままにされた。試料は、処理前のユニット、吸着剤と接触してから３時間のユニット、４日間おかれたユニットから除去された。
試料は、残存Ｓ−５９と血小板機能が分析された。Ｓ−５９除去の結果は、表Ｆに要約されている。
表Ｆのデータは、接触してから３時間後であればＳ−５９の光化学反応生成物の吸着はほぼ完了していることを示唆している。３６〜３７％の吸着されなかった放射能は、血漿高分子（約１８％）、血小板高分子（約１５％）及び３Ｈが入れ替わった水（約１０％）に関するカウントに相当する。高分子または水に関する残存放射能（４３％）は、４日間処理されていた試料の残存カウントによく一致する。吸着後のＰＣに見られる、低いレベルの残存放射能は、水に関するカウントに対する高い概算、もしくはＳ−５９と共有結合で会合する血漿高分子の実際の除去のどちらかに起因し得る。
実施例 ２７
バッチ式吸着による、照射されたＰＣに由来する残存Ｓ−５９およびＳ−５９光化学反応生成物の除去
バッチ式吸着による、照射された血小板混合物に由来する残存Ｓ−５９及びＳ−５９光化学反応生成物の除去の実験がなされているこの実施例は、実施例２６から継続している。３５％血漿／６５％ＰＡＳ ＩＩＩ中に懸濁している１ユニットの新鮮な血小板は、１５０μＭのＳ−５９を注入され、大きなＰＬ２４１０血小板貯蔵バッグで３．０Ｊ／ｃｍ２で照射した。照射された血小板混合物は、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭ（１０ｇ／３００ｍＬ）と接触させた。
血小板混合物の試料は、様々な時間間隔で除去され、ＨＰＬＣを用いての残存Ｓ−５９及び光化学反応生成物についての解析がなされた。
ＨＰＬＣのプロフィールは、２時間でＳ−５９が検出できないレベルにあり、９９％超のＳ−５９が除去されたことを示している。その結果は、図２７に図示されている。図２７において、四角は「フリー」（すなわちメッシュのエンクロージャー／ポーチを包んでいない）のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭを含んだ、１ユニットの血小板中のＳ−５９残存レベルを示している。３０μｍのメッシュのエンクロージャー／ポーチ（スペクトル／メッシュ３０μｍナイロン，開口部面積＝２１％）及び６０μｍのメッシュのエンクロージャー／ポーチ（スペクトル／メッシュ６０μｍナイロン，開口部面積＝４５％）によって包まれたＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭを含んだ、ユニット中のＳ−５９の残存レベルは丸と三角でそれぞれ示されている。パーセンテージは照射されていない血小板混合物（１５０μＭ Ｓ−５９）に対しての値で示されている。
実施例 ２８
照射されたＰＣのＨＰＬＣ解析
照射された３５％血漿／６５％ＰＡＳ ＩＩＩの２０ｍＬの試料を、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６ＴＭ及びＨｅｍｏｓｏｒｂａ ＣＨ−３５０ＴＭと４日間接触させた後、ＨＰＬＣ解析に供する研究を実行した。図２８Ａは、照射された３５％血漿／６５％ＰＡＳ ＩＩＩの処理されていないもの（すなわち吸着剤なし）（図上）、０．０３３ｇ／ｍＬのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６ＴＭで吸着処理後のもの（図中央）、および０．０３３ｇ／ｍＬのＨｅｍｏｓｏｒｂａ ＣＨ−３５０ＴＭで吸着処理後のもの（図下）のＨＰＬＣクロマトグラムの図である。
元のＳ−５９は、どちらの吸着剤のケースもほとんど完全に除去されており、光化学反応生成物はＢ，Ｄ，及びＥは微量である。光化学反応生成物Ｂは、もっとも除去するのが困難なように見えるが、おそらくモル基準で１％未満のもとのＳ−５９を表している。図２８．Ａの解析によると、注入ピーク（保持時間＝３分）の減少が示しているように、Ｈｅｍｏｓｏｒｂａ ＣＨ−３５０は、光化学反応生成物に加えて化合物も除去するらしいことを示している。故にＨｅｍｏｓｏｒｂａ ＣＨ−３５０は、栄養分などの必要な化合物の除去により血小板機能に対する悪影響を潜在的に及ぼし得る。
図２８Ｂは、１５０μＭの照射されていないＳ−５９を含む３５％ＰＣ（すなわち３５％血漿／６５％ＰＡＳ ＩＩＩ）（図上）、１５０μＭの照射されたＳ−５９を含むもの（図中央）、３００ｍＬあたり１０．０ｇのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭで処理されたＳ−５９であって、１５０μＭの照射されたＳ−５９を含むもの（図下）のＨＰＬＣのクロマトグラムの図である。吸着剤は、３０μｍナイロンメッシュのエンクロージャー／ポーチの中に含まれていて、接触させる時間は３時間であった。Ｓ−５９に相当するピークは、照射されていないＳ−５９（図上）および照射されたＳ−５９（図中央）を表すクロマトグラム中で保持時間が約１２分の地点に存在する。照射されたＳ−５９（図中央）を表すクロマトグラム中の他のピーク（約３分地点の注入ピークは除く）は、照射中に形成されたＳ−５９の光化学反応生成物に相当する。特筆すべき事は、時間（ｔ）＝１８分およびｔ＝２０分において現れるピークは血漿種であり、Ｓ−５９とは関係がないことである。下のパネルにおいて残っているピークはＳ−５９の光化学反応生成物ではないことから、Ｓ−５９及び光化学反応生成物の除去は、ＨＰＬＣにより示された通り、今回の場合は本質的に完全であった（すなわちＨＰＬＣでは検出できなかった）。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭによって処理されたもののクロマトグラムの解析では、ほとんどのＳ−５９およびＳ−５９光化学反応生成物が吸着されたことを示している。
実施例 ２９
バッチ式吸着後の血小板の機能
１ユニットの新鮮な血小板（３５％血漿／６５％ＰＡＳ ＩＩＩ）は、１５０μＭのＳ−５９を注入され、ＰＬ２４１０バッグに移された。バッグが３．０Ｊ／ｃｍ２で照射され、照射されたＰＣの２０ｍＬのアリコットを、０．６７ｇの吸着剤を含んだ小さなＰＬ２４１０バッグに移された（１０ｇ／３００ｍＬ）。吸着剤としては、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４ＴＭ、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６ＴＭ、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ２００及び標準的な活性炭が使われた。小さなポリＰＬ２４１０バッグは血小板振盪機中にて２２℃で貯蔵された。それぞれの吸着剤に対して、２つの別個の血小板ユニットが処理された。それぞれの組の１ユニットは、吸着剤と３時間接触させた後、吸着剤のない血小板バッグに移された。もう一方の血小板ユニットは４日間の保存期間を通して吸着剤と接触させ続けた。
２４時間後に試料はユニットから除去され、血小板の数とｐＨについて分析された。さらに５日後、試料を採り、血小板の数とｐＨ、ならびに、ＡＴＰ含有量及びＧＭＰ−１４０による活性化についても分析された。対照実験には、ＰＣＤ処理されていて吸着剤が含まれていないＰＣの試料（吸着剤の無い対照実験）と処理されなかったＰＣの試料が含まれた。それぞれの血小板機能アッセイの結果は表Ｇにある（表Ｇの「＊」は反応時間が３時間であることを示す。）。
表Ｇに要約されたｐＨの測定値と血小板の数は、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ樹脂との接触がＰＣのｐＨ及び血小板の数ともにそれほどの影響を及ぼしていなかったことを示している。活性炭によって処理されたＰＣは高いｐＨであったが、炭はＰＣに対して緩衝効果を及ぼしていた可能性があることを示している。加えて、血小板の数は、活性炭によって処理されたＰＣについては有意により低い。もっとも敏感なアッセイであるＧＭＰ−１４０は、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４とＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６はともによい血液適合性の特徴を持っていることを示している。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４及びＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６に処理されたＰＣは、ＰＣＤ処理された吸着剤のない対照実験に比べて低いレベルの活性化であった。そのうえ、５日間吸着剤と接触させ続けたＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４及びＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６の両試料は、３時間だけ接触させた対応する試料に比べ低いレベルの活性であった。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４及びＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６とＰＣとの接触時間が延びることが、血小板機能に悪影響を及ぼすことはないことをこの観察は示唆している。
逆に、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ２００は、吸着剤のない対照実験と比較して血小板を有意に活性化した。血小板機能の研究は、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４およびＡｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６は十分な血液適合性の特徴を持っていることを示唆した。
表Ｈでは、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４での同じバッチ式吸着実験から得られる追加のインビトロアッセイについてのデータが示されている。血小板機能に対する悪影響はないことが再度示された。
再度特筆すべき事は、これらの実験は標準的なＡｍｂｅｒｌｉｔｅ樹脂を使用して行われ、このＡｍｂｅｒｌｉｔｅ樹脂はＳｕｐｅｌｃｏ，Ｉｎｃ．によって処理されていないということです。インビトロアッセイで示されているように、Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｉｎｃ．の洗浄プロセスによって除かれる浸出物は、血小板機能に対して実質的な影響を及ぼすようではない。
実施例 ３０
血漿の流動吸着
この実施例では、流動装置を用いた血漿試料からのソラーレンの除去について述べている。血漿中では、吸着というのは血小板からのＳ−５９の輸送に依存しないので、滞留時間は他の血液製剤（例えばＰＣ）ほど重要ではない。
先に特記したように、Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）はある種の薬剤や低分子の蛋白質の吸着など多くの目的で使用することができる疎水性の吸着剤を含むカートリッジを販売している。Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｉｎｃ．が販売するＲｅｚｏｒｉａｎＴＭ Ａ１６１ Ｃａｒｔｒｉｄｇｅ（５ｍｌベッド体積）は、インラインカートリッジ（すなわち流動装置タイプ）で、血漿からのＳ−５９の除去に適している。ポリマー吸着ビーズは平均孔径が１２０Åで、表面積はおよそ８００〜９００ｍ２／ｇである。
１００％ヒト血漿を用いて２種類の異なった流速２．５ｍＬ／ｍｉｎ．および５．０ｍＬ／ｍｉｎ．で研究が行われた。結果を図２９にグラフで表している。図２９では、Ｓ−５９を注入した血漿であって、カートリッジの中に注がれた血漿の量の関数として吸着から逃れる（漏出として示している）Ｓ−５９の割合を示している。この研究は１００％血漿中の未照射のＳ−５９（１５０μＭ）で行われた。予想どおりに、Ｓ−５９の吸着が少ないほどカートリッジを流れる流速は高い。
もし、血小板混合物からの除去を行う場合は、フローアダプターが血小板に害を及ぼすので、ＲｅｚｏｒｉａｎＴＭカートリッジの焼結したプラスチックフローアダプターを適切なフローアダプター（例えば８０μｍのナイロンメッシュ）に交換しなければならない。
実施例 ３１
血漿のバッチ式吸着後の凝固因子アッセイ
血漿製剤に使用した吸着剤は、凝固カスケードで重要な蛋白質のレベルを有意に下げることなくソラーレンを除くこともできなければならない。この実施例ではバッチ式吸着実験を行うことによって、および処理した血漿の凝固因子及び凝固時間のレベルを分析することによって、Ｓ−５９に対する様々な樹脂の選択性を分析した。
１００％血漿の１．０ｍｌのアリコットを０．１ｇの吸着剤に加え、ポリプロピレンチューブに密封した。チューブは室温で３時間穏やかに撹拌した。血漿試料は吸着剤を静置させたままにしておくことによって、または試料を０．２μｍのフィルターで濾過して吸着剤を除くことによって得られた。血漿試料の標準凝固アッセイをＵＣＳＦ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ，ＣＡ）に委託した。行われたアッセイとしてはフィブリノーゲンレベル、第Ｖ因子レベル、第ＶＩＩＩ因子レベル、第ＩＸ因子レベル、活性化部分トロンボプラスチン時間、プロトロンビン時間、トロンビン時間、およびリストセチンレベルが挙げられた。表Ｉでは血漿アッセイのデータを要約している。図３０Ａ〜３０Ｄにおいて、凝固機能のある指標に対するＳ−５９ ＰＣＤおよびＳ−５９の除去の影響をグラフで表している。表Ｉにおいて、「＋Ｓ−５９／＋ＵＶＡ」と表示しているのは、３Ｊ／ｃｍ２の紫外線照射に曝露された１５０μＭのＳ−５９を含む血漿試料から得られたデータを意味し、さらに「ＰＴ」はプロトロンビン時間、「ａＰＴＴ」は活性化部分トロンボプラスチン時間、「ＴＴ」はトロンビン時間を示している。
試料は２つのグループに分けて（表Ｉに分離して結果を示しているように）ＵＣＳＦ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙに委託した。各グループの対照実験の血漿試料はＳ−５９およびＵＶＡで処理したが、吸着剤とは接触していない。第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子の活性のレベルはＳ−５９での処理前の血漿試料中では抑制された。このことはＳ−５９での処理は原因ではなかったことを示している。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４およびＨｅｍｏｓｏｒｄａ ＣＨ−３５０は試験されたどのパラメーターにもほとんど影響を及ぼさず、最良の結果を示した。第ＩＸ因子のレベルは両方の場合で少しだけ減少した。
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６はフィブリノーゲンレベルの減少を示したが、第Ｖ因子および第ＩＸ因子のレベルはほんの少しだけ減少しただけで、活性化部分トロンボプラスチン時間およびトロンビン時間は少し増加した。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−１６（１６０Å）における孔サイズの増加が、孔サイズがかなり小さい（４０Å）Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ ＸＡＤ−４と比較して凝固因子の吸着が増加した原因でありうる。孔サイズの減少はそれゆえ、Ｓ−５９のような低分子の吸着に対して特異性を示し、蛋白質のような高分子の吸着を妨げ得る。最後に、ＢｉｏＲａｄのｔ−ブチル ＨＩＣ（Ｍａｃｒｏ−Ｐｒｅｐ）はほとんど完全に第Ｖ因子、第ＶＩＩＩ因子を除去し、プロトロンビン時間および活性化部分トロンボプラスチン時間が大幅に増加するというとても残念な結果となった。
凝固因子アッセイに関する実験は、一般的に吸着実験で使用されているよりも血漿に対する吸着剤の割合が高いバッチ式で行われた。さらに、流動装置は、より短い接触時間をもたらし、付随して、凝血形成に関与する蛋白質のより高い回収率を伴うはずである。
実施例 ３２
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ吸着剤の機能に対する水含有量の影響
先に紹介したように、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４およびＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６吸着剤（Ｒｏｈｍ ａｎｄ Ｈａａｓ）は光化学的除染後に輸血用血液製剤（例えば血小板濃縮液［ＰＣ］および新鮮凍結血漿［ＦＦＰ］）から化合物を除去し、それらを輸血用血漿製剤として使用しようするのにふさわしくさせる役割がある。実際に、非イオン性マクロ孔質ポリスチレンジビニルベンゼン吸着剤であるＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４およびＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６はＳ−５９に対して高い容量を示した。ＰＣ除去装置の開発の初期に、創案者らはＡｍｂｅｒｌｉｔｅ吸着剤の蒸気処理または乾燥はその吸着剤の孔から水分を除去することを発見した。その結果、洗浄した吸着剤は湿潤した吸着剤よりもＳ−５９に対する吸着容量が大幅に低下した。この実施例では、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ吸着剤の吸着容量に対する水分の影響、および吸着剤を湿らせて、処置後に吸着剤の機能を回復させるための条件に対する水分の影響について述べている。
血小板のＲＤの開発において創案者によって行われた初期の研究では、Ｒｏｈｍ ＆ Ｈａａｓから直接購入したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ吸着剤を使用した。これらの吸着剤は一般的に５０〜６５％の重量の水分を含んでいるＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６および約４０〜５５％の重量の水分を含んでいるＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４の高水和物の状態で入手した。しかしながら、最近Ｓｕｐｅｌｃｏ（Ｂｅｌｌｅｆｏｎｔｅ，ＰＡ）で行われた熱による洗浄プロセスでは、水含有量の減少（５％）およびそれに付随して大幅な吸着容量の低下という結果になった。さらに水和した吸着粒子とは異なり、乾燥吸着粒子はビーズ孔に空気を含み、これは水溶液にビーズが浮く原因となり、これもまた吸着容量の低下という結果をもたらした。
Ａ．ＲＤ製造における湿潤手順
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４およびＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６のようなポリマー吸着剤の湿潤は、湿潤している溶液の表面張力を減少させ、吸着剤の湿潤性を高める有機溶媒を使用することによって達成される。このプロセスのための有機溶媒としてエタノールを選択した。湿潤プロセスにおいて調節することができる２つの変数としては、（ｉ）エタノール濃度、および（ｉｉ）湿潤溶液との接触時間が挙げられる。吸着剤の湿潤のための望ましい処理時間に基づいて、接触時間は１０分間とした。
１０分のバッチ手順で湿潤させるために必要とされるエタノール濃度を決定する研究を行った。洗浄したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４（Ｓｕｐｅｌｃｏ ロットＳＣ−２７）およびＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６（Ｓｕｐｅｌｃｏ ロットＳＣ−３０）の試料を、０〜５０％体積のエタノールを含んだエタノール／水溶液に懸濁した。５ｍｌの湿潤溶液に対して１ｇの吸着剤の割合で、吸着剤を溶液に接触させた。１０分間インキュベートする間に定期的に吸着剤試料を撹拌した。１０分後にエタノール溶液を除去し、蒸留水に交換した。蒸留水によるバッチリンス工程を、５ｍｌの水に対して１ｇの吸着剤の割合で３回連続して（各１０分間）行った。次に水を除去し、吸着剤粒子を乾燥させた。
各吸着剤試料の水含有量は、前もって乾燥させ重量を測定しておいた容器（シンチレーションバイアル）内で吸着剤試料の重量を正確に測定することにより決定した。試料を１２０℃の乾燥したオーブン中に放置し、２４時間乾燥させた。乾燥させた試料の重量を測定し、水含有量（ｍａｓｓ％）を算出した。注意点としては、２４時間以上乾燥させてもそれ以上水分は減少しなかった。
各吸着剤の試料を、平衡吸着容量についても試験を行った。およそ０．１ｇの吸着剤を量りとり、５ｍｌのポリプロピレンチューブに移した。１５０μＭの３Ｈ−Ｓ−５９を含んだ３５％血漿，６５％ＰＡＳ ＩＩＩの３．０ｍｌのアリコットを各チューブに加えた。チューブを回転機上に放置し、２４時間室温でインキュベートした。インキュベートした後、試料をチューブから除去し、エッペンドルフチューブに移した。各エッペンドルフチューブから３５％血漿のうちの２００μｌの試料を除去し、５．０ｍＬのＨｉＳａｆｅ ＬＳＣカクテル（Ｗａｌｌａｃ）で希釈した。各試料中のＳ−５９の残存レベルを決定するために、Ｗａｌｌａｃ ＬＳＣで試料を計測した。乾燥した吸着剤の質量あたりの、各試料から除去されたＳ−５９の全μｍｏｌ数を決定することによって、容量を算出した。図３１には、１０分間のバッチ湿潤プロセスでの、湿潤溶液中のエタノール含有量と、得られる吸着剤の吸着容量との関係を示している。吸着容量は３５％血漿，６５％ＰＡＳ ＩＩＩ溶液からのＳ−５９の除去ついてのものである。容量はＣ０＝１５０μＭでの単独吸着測定から見積もられた。
図３１に要約している結果から、エタノール濃度が１５％（ｖ／ｖ）超のエタノール水溶液でＡｍｂｅｒｌｉｔｅ吸着剤を湿潤させると、ほぼ最大限に吸着容量が回復することが示唆されている。このデータは１０分間のバッチプロセスについて集められたことを注意しておかなければならない。接触時間をもっと長くすれば、さらに低レベルのエタノールを使用することも可能である。さらに、湿潤溶液中での微生物の成長を防止するためには最低２０％エタノールが必要であることを強調しておかなければならない。エタノールのコスト、およびその後の水によるリンスによって除去しなければならないエタノールのレベルを減少させるために、極端に高レベルの工タノールは避けなければならないことは明白である。
Ｂ．水含有量の関数としての吸着容量
先に述べた湿潤研究で用意された試料はまた、水含有量と吸着容量との関係を決定するために解析することができる。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６についての結果は図３２に要約している。図３２では、水含有量が減少するにつれて、３５％血漿，６５％ＰＡＳ ＩＩＩ溶液からＳ−５９を除去するためのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６の吸着容量（すなわち吸着したＳ−５９のμｍｏｌ数／乾燥吸着剤１ｇ）は減少することを示している。図３２に示しているデータは様々な濃度のエタノール水溶液で吸着剤を湿潤させた後に得られたものである。吸着容量と水含有量の関係は、同じ吸着剤であってもそれに事前に施された処理によって異なることを指摘しておかなければならない（すなわち湿潤または乾燥によって達した水含有量）。
図３２で参照しているように、水含有量が質量の５０％未満に減少すると、吸着容量は非常に低レベルになる。反対に、水含有量が７０〜７５％の間では、吸着容量は安定して最大値へと増加する。吸着容量は吸着剤の乾燥質量を基準にして補正されたものであるから、容量の増加は吸着剤の作用の真の変化を反映している。
図３２に示している相関関係は注目すべきものであるけれども、水含有量の異なった試料は、吸着剤を異なった条件下で湿潤させることによって得られたものであることを強調することは重要なことである。確証はないが、十分に水和した吸着剤試料を乾燥させることにより水含有量の異なる吸着剤試料を生産すれば、さらに適切なデータが得られうる。吸着剤を湿潤させることによって得られた試料は、吸着ビーズの外表面に高い率の水分を含み得ると思われる。反対に、乾燥させることによって調製された吸着剤はおそらく、最初にビーズの外表面を覆っていた水分が失われていると思われる。すなわち、吸着剤の孔から多くの水分が除去されなくとも、吸着剤の外観の変化をもたらすが吸着容量に影響を及ぼし得ない。室温でのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ吸着剤からの水分減少のおよその割合を示している予備実験のデータは次のセクションで示している。
Ｃ．Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ吸着剤の使用中の乾燥
先に述べたように、ポリエステルのメッシュポーチは本発明のＲＤの製造中に、乾燥Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ吸着剤で満たされ、超音波またはインパルス溶接によって密封され得る。密封されたポーチは次に、エタノール水溶液中での湿潤プロセス、続いての蒸留水での最終的なリンスに供される。最終的なＲＤはホイル包装で密封されたＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）中に組み入れられる。ホイル包装は液体バリアとして役に立ち、貯蔵中の吸着剤の乾燥を妨げる。製造プロセス中のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ吸着剤の潜在的な乾燥を最も受けやすい期間は、最終的なリンス工程完了からホイル包装でＲＤを包装するまでの期間である。製造中の吸着剤の乾燥についての可能性をさらに理解するために、室温でのＡｍｂｅｒｌｉｔｅ吸着剤の乾燥の速度を評価する研究が行われた。
本研究において、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６（Ｓｕｐｅｌｃｏ ロットＳＣ−３０）およびＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４（Ｓｕｐｅｌｃｏ ロットＳＣ−２７）の試料を、３０％エタノール水溶液中で吸着剤を湿潤させることによって調製した。吸着剤をエタノール水溶液中で１０分間のインキュベーション後、蒸留水で完全にリンスした。およそ５０ｇの各吸着剤を、乾燥させ、次にプラスチック容器に入れた。その容器をそのまま室温に放置し、空気流が増加する状態には晒さなかった（例えば、ラミナーフローフード（ｌａｍｉｎａｒ ｆｌｏｗ ｈｏｏｄ））。ある時間間隔で容器から試料を除去し、気密性のポリプロピレンバイアルに入れた。各試料の水含有量は先に述べたように決定した。
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４およびＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６の両方からの水分減少の動態を示しているデータは、図３３に表している。特に図３３では、室温および標準湿度で２７時間インキュベーション中のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６（■）およびＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４（●）からの水分減少を表している。図３３の結果から、水分減少はＡｍｂｅｒｌｉｔｅを含むＲＤの製造および貯蔵の両方において考慮されなければならない潜在的な問題であることが示唆される。
実施例 ３３
ガンマ線による湿潤Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ吸着剤の滅菌
先に示したように、本発明における組立後のＲＤを含む貯蔵容器は、ホイル包装で密封されており、最後に滅菌される。一般的に、ポリスチレンジビニルベンゼン吸着剤は繰り返しのオートクレーブに安定である。しかしながら、ある貯蔵容器（例えばＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ））はその中に使われている素材のためにオートクレーブすることができないため、望ましくはガンマ線またはＥビームによって滅菌されなければならない。
この実施例では湿潤Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ吸着剤の滅菌において、ガンマ線またはＥビームのどちらが適しているかを決定するために行われた研究の方法と結果を述べている。吸着動態および吸着容量を含む、様々な吸着特性に対する滅菌の効果についてのデータは、以下に示される。
Ａ．吸着動態に対するガンマ線の影響
原料としての（すなわち加工していない）吸着剤はＳｕｐｅｌｃｏによって加工され、次にガンマ線に曝露された。２つに分けられたたくさんの原料としての吸着剤は次に述べる手順に従って、Ｓｕｐｅｌｃｏによって加工された。まず、１回分の原料としての吸着剤（例えば１８リットル）を７４μｍのふるいのある洗浄容器に入れ、蒸留水でリンスした。リンス中の水流の伝導率は継続的に監視された。リンスは、リンス水流の抵抗が１８ＭΩまで上昇したときに完了させた。次に、１回分の吸着剤（例えば６リットル、１．６ｋｇ）から、残留抽出可能物を、専有（Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｉｎｃ．）の溶媒を使用しない熱洗浄プロセスによって除去した。その後、吸着剤は梱包され（２Ｌの褐色ガラス容器）、液体循環式で蒸気滅菌された（２０分、１２１℃）。
この手順の後、吸着剤のビーズは、１０％未満の水分を含んだ。３０％のエタノール水溶液に１０分間懸濁することによって吸着剤を湿潤させた。残留エタノールを除去するために、吸着剤を蒸留水で完全にリンスした。その後、吸着剤試料をガラス容器に入れ、２種類の異なった線量のガンマ線（Ｉｓｏｍｅｄｉｘ；Ｍｏｒｔｏｎ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ）、すなわち、単回線量（４９．９〜５０．７ｋＧｙ）、倍加線量（１１２．４〜１１４．８ｋＧｙ）に晒した。
照射した試料を、吸着作用について試験した。最初の研究では、未滅菌（すなわちガンマ線に晒していないが加工した）の吸着剤と滅菌済みの吸着剤の吸着動態を比較した。３５％同一の血漿，６５％ＰＳＡ ＩＩＩ中で調製された、１ユニットの新鮮な血小板濃縮液（４．０×１０１１血小板／３００ｍＬ）は、１５０μＭの３Ｈ−Ｓ−５９を注入された。吸着剤試料（およそ０．１ｇ）を５ｍｌのポロプロピレンチューブに正確に量り取った。各チューブに、血小板混合物の３．０ｍｌのアリコットを加え、室温で回転機（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ，Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ Ｍｏｄｅｌ ４００１１０）上に置いた。様々な時点でチューブからＰＣ試料を除去した。放射能レベルは、５．０ｍｌのＨｉＳａｆｅ ＬＳＣカクテル（Ｗａｌｌａｃ）中の各試料の２００μｌを計数することによって決定した。残存Ｓ−５９濃度を測定し、吸着剤の質量あたりの吸着したＳ−５９の量（μｍｏｌ／ｇ）を、放射能の残りによって測定した。本研究において、吸着剤の質量は吸着剤試料の湿重量に基づいている。
ＰＣからのＳ−５９の除去における吸着動態データは図３４Ａ，Ｂおよび３５Ａ，Ｂに示している。特に、図３４、３５のデータは、それぞれＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４（２つのロット、図３４ＡおよびＢ）およびＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６（２つのロット、図３５ＡおよびＢ）による３５％血小板濃縮液からのＳ−５９の除去における吸着動態に対するガンマ線による滅菌の影響を表している。先に述べたように、容量（すなわち吸着剤の質量あたりの吸着したＳ−５９の量；μｍｏｌ／ｇ）は吸着剤の湿重量に基づいて決定された。
全体的に、ガンマ線による滅菌は吸着動態に有意の影響を及ぼさなかった。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４の吸着動態に対して、滅菌はほんの少し悪影響を及ぼした。反対に、滅菌したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６はＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６の未滅菌試料と同じぐらい、またはよりよい吸着動態を有するようであった。２種類の吸着剤の比較から、滅菌したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６は滅菌したＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４よりも実質的によりよい吸着動態および吸着容量を示したことが分かった。図に示しているように、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６は約１２０分間のインキュベーションで平衡状態に達したようであったが、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４は平衡状態に達するまでに１８０分超必要であった。計算は吸着剤の湿重量に基づいていることを強調することが重要である。ＸＡＤ−１６は一般的にＸＡＤ−４よりも多くの水分を含んでいるので、乾燥重量に基づいた吸着容量は、ＸＡＤ−１６が有意により高い（図３２参照）。
Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６は迅速な吸着動態および比較的高い吸着容量のためにより好ましいＡｍｂｅｒｌｉｔｅ吸着剤と考えられる。特に、先に述べたように、またこれから述べるように、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３は総合的に見ると好ましい吸着剤と現在考えられる。
Ｂ．吸着容量に対するガンマ線の影響
各吸着剤の試料はまた、滅菌後の平衡吸着容量についても試験された。およそ０．１ｇの吸着剤を５ｍＬのポリプロピレンチューブに正確に量り取った。５００μＭから１５μＭまでの濃度の３Ｈ−Ｓ−５９を含む、３５％血漿，６５％ＰＳＡ ＩＩＩ中のＳ−５９の希釈系列が調製された。各希釈液の３ｍｌのアリコットを別個のチューブに加えた。チューブを回転機（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ，Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ Ｍｏｄｅｌ ４００１１０）上に置き、室温で２４時間インキュベートした。インキュベートした後、試料を各チューブから除去し、エッペンドルフチューブに移した。３５％血漿の２００μｌの試料を各エッペンドルフチューブから除去し、５．０ｍｌのＨｉＳａｆｅ ＬＳＣカクテル（Ｗａｌｌａｃ）で希釈した。各試料のＳ−５９の残存レベルを決定するために、Ｗａｌｌａｃ ＬＳＣで計数した。湿潤吸着剤の質量あたりの、各試料から除去されたＳ−５９の全μｍｏｌ数を決定することによって容量を計算した。５および１０Ｍｒａｄの線量のガンマ線で処理されたＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４およびＡｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６の吸着容量を表Ｊに要約している。
表Ｊのデータに示されているように、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４の吸着容量に対するガンマ線の影響は、１０Ｍｒａｄまでの線量でさえとても小さい。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−１６の吸着容量にばらつきがあるのは、おそらくあまり重要なことではない。ガンマ線で滅菌したＲＤ中のどちらの吸着剤にも有意な影響を及ぼさないので、吸着容量に対する滅菌の影響は十分に少ない。
Ｃ．ＥビームによるＡｍｂｅｒｌｉｔｅ吸着剤の滅菌
上記のように、γ線は一般的に好ましい滅菌法として見られている。Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ吸着剤の機能に対するＥビームの影響は、γ線滅菌について実行された研究と類似した研究で調べられた。その研究の方法と結果は以下に報告している。
この研究では、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４、及びＸＡＤ−１６の試料はエタノール水溶液（３０％）で湿潤させ、２５ｍＬシンチレーションバイヤルに入れた。さらに、ポリエステルのメッシュポーチ（Ｓａａｔｉ ｐｏｌｙｅｓｔｅｒ ２９／１６，１０ｃｍ×１０ｃｍ）に湿らせた吸着剤を１０ｇ入れ、開封口を熱で密封することで、模型装置を用意した。この得られた模型除去装置を、小さな切り口からＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）の中に導入した。その後、その切り口は、熱で密封することで再び閉じた。
これらの吸着剤試料と模型装置はＮＩＳ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）に提出し、そこで５Ｍｒａｄの線量のＥビームに晒された。バイアル中で滅菌した試料は湿潤している必要はなかった。しかし、水分バリアが使用されなかったので、模型装置からの吸着剤試料が貯蔵中に乾燥した。そこで、これらの試料は、模型装置から回収され、機能実験を行う前にエタノール水溶液で湿らせた。３５％血漿、６５％ＰＡＳ ＩＩＩからＳ−５９を除去するための吸着剤の容量を、前述した通りに調べた。この研究結果を、表Ｋにまとめた。
表Ｋに示したデータから示唆されるように、吸着剤単独（「５Ｍラド−吸着剤」）に対して、またはＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）（「５Ｍラド−模型装置」）に収容されたポリエステルのメッシュポーチの中に保たれた吸着剤に対して滅菌を行った場合、５ＭｒａｄのＥビーム照射による滅菌吸着剤の機能に対して有意な影響を及ぼさなかった。
実施例 ３４
Ｓ−５９吸着定数、及び、吸着剤の機能に対する水含有量の影響
以前の実施例では、Ａｍｂｅｒｌｉｔｅ（登録商標）ＸＡＤ−４、及び、ＸＡＤ−１６の機能に対する水含有量の影響に特に視点が向けられていた。この実施例では、湿潤状態、及び、乾燥状態の両方について、数種の追加の吸着剤についてのＳ−５９吸着定数を比較する。
吸着剤の試料は、蒸留水で徹底的にリンスした。次いで、それぞれの試料の一部は、１２０℃で４時間、乾燥オーブンに置き、乾燥した吸着剤試料を得た。それぞれの吸着剤の水含有量は、湿潤状態、および、乾燥状態の両方で、前もって乾燥させて重量のはかってある容器（シンチレーションバイアル）中に吸着剤試料を入れ、正確に吸着剤試料の重量を量ることによって決定した。試料は、１２０℃２４時間で乾燥させ、再び減少した水の質量を決定するために、重量を測定した。次いで、質量％で水含有量を算出した。
それぞれの吸着剤の試料は平衡吸着容量についても試験した。前述したように、平衡吸着容量は、特定の樹脂が吸着することのできるソラレンの量を意味する。つまり、平衡に達した後は、残存したソラレンの量に対する吸着されたソラレンの量は、本質的に変化しない。２４時間インキュベーションで、平衡状態ができることが以前に示された。
吸着剤（約０．１ｇ）を量りとり、５ｍｌのポリプロピレンのチューブに移した。１５０μＭの３Ｈ−Ｓ−５９を含む３５％の血漿、６５％ＰＡＳ ＩＩＩの３．０ｍＬのアリコットをそれぞれのチューブに加えた。そのチューブを回転機に置き、２４時間室温でインキュベートした。インキュベートした後、試料をそれぞれのチューブから除去し、エッペンドルフチューブに移した。３５％の血漿の試料２００μＬをエッペンドルフチューブから取り除き、５．０ｍＬのＨｉＳａｆｅ ＬＳＣカクテル（Ｗａｌｌａｃ）で希釈した。試料をＷａｌｌａｃ ＬＳＣで計数することによって、それぞれの試料中のＳ−５９の残存レベルを決定した。容量は、乾燥吸着剤の質量あたりの、それぞれの試料から除去されたＳ−５９の全μｍｏｌ数を決定することによって、算出した。その結果を図３６に示し、湿潤状態（深い陰）と乾燥状態（明るい陰）（各試料中の水の量をパーセンテージで示した）における吸着剤のＳ−５９吸着定数を棒グラフが示し、表Ｌにまとめた。（１５０μＭのＳ−５９＝６１７５４．７２５ ＤＰＭ；バックグラウンド３０ ＤＰＭ；Ｃｆ＝Ｓ−５９の最終平衡溶液濃度）
実施例 ３５
発明の説明のセクションではＲＤの製造プロセスや貯蔵容器への取り込みの一般的な特徴を述べた。この実施例では、好ましいバッチ式ＲＤの明確な特性、及び、バッチ式ＲＤのための好ましい製造プロセス、そして、貯蔵容器への取り込み法を説明する。
ある。Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｉｎｃ．は、赤外線分光器を用いて、洗浄されていない吸着剤を同定した後、低レベルの抽出可能物や微粒子を確保するために、その吸着剤をさらに加工した。そのプロセスの第一工程として、微粒子や塩を蒸留水で吸着剤を徹底的にリンスすることで除去する。一回分の吸着剤（例えば、２．０ｋｇ）は、このリンスプロセスの間に孔径７４μｍのふるい保持器に入れた（すなわち、このプロセスは、直径約７４μｍ以上の粒子を保持することができる）。そのプロセスの第二工程は、専有の溶媒を使用しない熱洗浄プロセスによって残存抽出可能物を除去することを包含する。もし必要なら、洗浄した吸着剤は、ＲＤ製造部に発送する前に、大きなバッグに包装し、蒸気滅菌することもできる。
（＞９０％）、及び、ふるい分析による粒子サイズ制限（＜２％が１６メッシュで保持されるもの；＜３％が５０メッシュで通過するもの）の詳細を記した分析証明書を伴っている。Ｓｕｐｅｌｃｏ，Ｉｎｃ．洗浄プロセスに供された吸着剤は、ジビニルベンゼン（例えば、＜５０ｐｐｂ、１：１＝イソプロパノール：吸着剤；２２℃で２時間抽出）やエチルビニルベンゼンのような潜在的な抽出可能物を監視している。加えて、塩化メチレン抽出物のＧＣ分析は全クロマトグラフ的有機物（Ｔｏｔａｌ Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ Ｏｒｇａｎｉｃｓ）（例えば、＜２０μｇ／ｍＬ全抽出可能物）を評価するために用いられている。
洗浄した吸着剤についても、追加的に試験が行われた。例えば、エンドトキシンのレベルを、Ｌｉｍｕｌｕｓ Ａｍａｅｂｏｃｙｔｅ Ｌｙｓｉｓ（ＬＡＬ）試験を用いて決定した。水含有量（例えば、乾燥による質量の減少度＝最高１０％、最低５％）と同様に粒子のサイズ分布（例えば、直径９０μｍ未満が＜０．０１％；直径１４００μｍ超が＜２．０％）も、吸着剤の各バッチについて測定した。最後に、吸着剤の各バッチの機能特性を、血清アルブミンを含む緩衝食塩液中の３ＨでラベルしたＳ−５９を用いて、Ｓ−５９吸着アッセイを行うことによって評価した。
メッシュポーチとポートフィルター
図３７は血小板貯蔵容器（例えば、ＰＬ２４１０プラスチック容器，Ｂａｘｔｅｒ）内に備えられる好ましいバッチ式ＲＤを図式化したものである。加えて、図３８のフローチャートでは、組み立てたＲＤとフィルターポートを血小板貯蔵容器内に組み込む工程を含む、血小板貯蔵容器内に備えられるバッチ式ＲＤの好ましい製造プロセスの初期工程を図に表した。それらの図を参照することが後に続く論述を理解する助けになる。
ポリエステルのメッシュポーチとポートフィルターは、同じ技術を用いて製造された（下記のように）。メッシュポーチは吸着剤を密封するために用いられ、それによって、後に受容者に吸着剤が移入するのを妨げている。ポートフィルターは小さな粒子が移入することから守る予備の仕組みとして働いている；血小板貯蔵容器を出入りする溶液はポートフィルターを通過しなければならない。ポリエステルのメッシュポーチ、及び、ポートフィルターは共に、孔径３０μｍの穴のある医療用の織られたポリエステル（例えば、Ｂａｘｔｅｒ製の、ＰＬ１１４４プラスチックと呼ばれるＴｅｔｋｏ Ｍｅｄｉｆａｂ ０７−３０／２１）を利用している。３０μｍのメッシュ孔径は、血漿／ＰＡＳ混合物は自由に吸着剤と接触することができるが、小さな粒子が移入することを妨げるのに大きな安全域を提供する。血小板は実際には吸着剤と接触する必要はないが、残存ソラレンとソラレン光化学反応生成物を除去する目的で、吸着剤に沿って溶液が自由に通過するようにしている。
メッシュポーチとポートフィルターの製造のために、ロールから一片のメッシュを縦に折り畳み、インパルスシーラーで横を密封する。インパルスシーラーは、密封する一方で同時に、そのシールの中央でメッシュを切り取る。その結果、長方形のポケットになり、この長方形のポケットは、ｉ）折り畳まれた下方末端、ｉｉ）ヒートシールされた２つの縁部、およびｉｉｉ）開口している上側縁部を備えている。
そのポケットの幅、および二つのヒートシール間の距離に依存して、ポケットはポートフィルター、または、吸着剤を含むメッシュポーチ（すなわち、ＲＤ）のいずれかになる。例えば、本発明の一実施態様ではメッシュ材料の切り口を約７６ｍｍの幅にしてポートフィルターとして、また約１５４ｍｍの幅にしてＲＤポーチとして利用する。
メッシュの小さなポケットはポートフィルター４０１になる。ポートフィルターは流入口／流出口ライン４０３をプラスチック容器に付けるために用いられるブッシング４０２（すなわち、ポートブッシング）に接続された。プラスチック容器は、ポートフィルター４０１上でＰＬ２４１０プラスチック（Ｂａｘｔｅｒ）の２個の積み重ね（すなわち、２つの層）を高周波溶接することにより形成される。ＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）の後ろは、ＲＤを挿入するために、開いたままになっている。その後、流入口／流出口ライン（すなわち、ドナーリード線（ｄｏｎｅｒ ｌｅａｄ））４０３はポートブッシング４０２に、溶剤（例えば、シクロヘキサン）を用いて結合させ、後の工程で粒子が混入しないように、端を密封した。
メッシュの大きなポケットは、ＲＤを作製するのに用いられる。簡潔には、上記のように作製したポリエステルのメッシュポーチ４０４（例えば、一辺の長さが５ｃｍの正方形、または円形）を、まだ密封していない４番目の縁部を通して、吸着剤のビーズ４０５（例えば、２．５±０．１ｇ乾燥重量）で、満たした。満たされるメッシュポーチを、固定具で保持し、充填システムの方に動かした（示さず）。本発明は如何なる適切な充填システム（例えば、振動性充填システム）の使用を企図する。吸着剤を分配するためにオーガーを用いる充填システムもまた利用できるが、充填システムが機械的な劣化を引き起こし得るので好ましくない。充填システムは典型的に釣り合いを取るものと、振動供給装置とコントローラーから成る。次いで、メッシュポーチの開口縁部はヒートシーラーで密封される。その後、メッシュポーチは、「イオン化した空気シャワー」に晒されるか、ＲＤの外側表面から自由な粒子を除去するために減圧状態に晒され、重量が量られ、そして、固定されていない粒子や欠陥が調べられる。もちろん、メッシュポーチを充填する任意の精密な手段を好ましい実施態様と合わせて、用いることができる。
血小板貯蔵容器内に備えられたバッチ式ＲＤ
ＲＤは単一ドナーリード線４０３を装備したＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）４０６の中に置く（図３７）。同定ラベル４０８を取り付けるためのフラップ（ｆｌａｐ）を後に提供する長方形の部分４０７を作り出すために最後に底面を密封した。ＲＤを収容する完全に組み立てられた容器は、好ましい実施態様では使い捨てであり、視覚的に検査され、ドナーリード線を通して圧縮した空気を送り込むことで漏出試験を行った。
その後、血小板貯蔵容器４０６は容器内の残存空気を除去するために空気を抜かれ、ドナーリード線がヒートシールされ、真空密封されたホイルポーチのなかに入れた。
真空状態での容器の貯蔵は、血小板の混合物とＲＤが最初に接触する際の泡の形成（すなわち、ガス発生／発泡）を排除するのに役立つ。最後に、ホイルポーチの中に入れられたアセンブリを、輸送箱に入れる。次いで、包装した箱は滅菌保証水準（Ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ Ａｓｓｕｒａｎｃｅ Ｌｅｖｅｌ）（ＳＡＬ）の１０−６（すなわち、１０−６未満の微生物が、γ線照射の後に存在する）を達成するのに十分な線量でのγ線照射によって滅菌する。
好ましい実施態様の主な部品は、表Ｍに表した。
本発明における好ましい実施態様において、血小板貯蔵容器（または、他の容器、もしくはバッグ）内にＲＤを配置することも含まれる一方、本発明はまた、吸着剤が血小板貯蔵容器内で固定されていないという実施態様も企図している。前述した設計図と全体的に同じ型の設計図であるが、ただメッシュポーチのない設計図が、代用の実施様態で用いられうる。特に、固定されていない吸着剤は血小板貯蔵容器４０６内で、ポートフィルター４０１によって保持されている。このように、ポートフィルター４０１は、図３７に描いた実施態様においては第二の防御法として（すなわち、吸着剤粒子の漏出を防ぐように）働いているが、代用の実施様態においては、吸着剤を含むメッシュポーチがないので、第一の防御法として働いている。必要ならば、大集塊用フィルター（もしくは類似したフィルター）４０９は流入口／流出口ライン４０３に組み入れることもできる；そのようなフィルターは、ポートフィルター４０１が保持し損なうに違いない場合、粒子を保持することで、第二の防御手段として働くであろう。
代用の実施態様には吸着剤を含むメッシュバッグを利用する実施態様よりもいくつかの利点がある。例えば、メッシュバッグへの血小板の付着が避けられ、それゆえ、もたらされる血小板が増加する。類似して、流体付着のための表面が少ないので、体積減少も少なくなるに違いない。加えて、この実施態様はメッシュポーチ内にガスが詰まる問題も除かれる。逆に、メッシュポーチがないと、代用の実施態様は吸着剤粒子や他の汚染物質の後の不慮の注入をさける主な機構が全くない。
本発明は、血液製剤貯蔵容器内の吸着剤粒子／ビーズを固定するための他
離に並んだ粒子と共に繊維の３次元網を含む濾過システムを作製するために、繊維網中に組み込まれ得る。繊維網はそれから、血小板貯蔵容器内に入れる。繊維は血液と接触する装置での使用において建設的な歴史を持っていることから、ポリエステルから構成されることが好ましい。付着性プロセス、もしくは付着性のないプロセスは、繊維網に吸着剤を固定するのに利用され得る（Ｈｏｅｃｈｓｔ Ｃｅｌａｎｅｓｅ，Ｃｈａｒｌｏｔｔｅ，ＮＣ）。均一な繊維網は表面積あたりの吸着剤の公知の量で作製され得ることが企図されている；この均一性に起因して、適当な量の吸着剤を、単に繊維網の所定の領域を切り取ることで測定し得る（すなわち、吸着剤の重さを量っていない）。このように、この実施態様は、ＲＤの必要性もない。
実施例 ３６
Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３を含むＲＤを用いた還元後の残存Ｓ−５９およびＳ−５９光化学反応生成物のＨＰＬＣ解析
先に示したように、Ｓ−５９を含むＰＣへのＵＶＡ照射により生じた光化学反応生成物はＨＰＬＣアッセイを用いることにより監視し得る。本実施例では最初に、光照射中に形成される光化学反応生成物のあらましを提供する。その後、この実施例は、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３を含むＲＤの還元特性を例証する。
Ａ．残存Ｓ−５９およびＳ−５９光化学反応生成物の特性
光化学的処理のプロセスは、Ｓ−５９（例えば１５．２ｍｇ）を約３００ｍｌの３５％血漿／６５％ＰＡＳ ＩＩＩ中に懸濁した血小板（約４．０×１０１１）へ添加することが含まれる。その後、ＵＶＡ光により光照射を行う間に、Ｓ−５９はＰＣ中で光化学反応生成物に変換される。その光化学反応生成物は透析実験（スキームＡ参照）に基づいて、結合するか、結合しないかで分類され得る。結合していない光化学反応生成物は標準的なＨＰＬＣアッセイにより監視、定量され得る。
下記の実施例３９に示される一般的手順に従ってＨＰＬＣ解析のために、試料を調製した。簡単にまとめると、解析を行うために、血小板を溶解させ、Ｓ−５９および光化学反応生成物を溶解させた、初期試料の調製を行った。次いで、試料調製物の上清は、Ｃ−１８逆相カラムにより、ＫＨ２ＰＯ４緩衝液中のメタノール濃度を増加させる濃度勾配を用いて解析した。主要なピークは光学吸光度で検出した。
図３９は、ＰＣ（３５％血漿／６５％ＰＡＳ ＩＩＩ，１５０μＭのＳ−５９［１５．２ｍｇ／３００ｍＬ］中で３．０Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡ（３２０〜４００ｎｍ）照射後に形成された、Ｓ−５−５９およびＳ−５９光化学反応生成物の代表的なＨＰＬＣクロマトグラムを示したものである。図３９については、縦座標は３００ｎｍの光学密度（ＯＤ）であり、一方横座標は時間を示している；「ＰＰｓ」で示されるピークはＳ−５９を含まない血漿のＨＰＬＣクロマトグラムにおける血漿ピークであり、「ＴＭＰ」で示されるピークは、内部標準として使用した４，５’，８−トリメチルソラレンのピークを意味する。
図３９には７本の主要ピークが観察され、それぞれピークＡ〜Ｇと名付けた。残存Ｓ−５９はピークＦであり、ピークＡ〜ＥおよびＧは、他の光化学反応生成物を表している。ＵＶＡで処理した血小板混合物において、残存Ｓ−５９の量は再現性があり、このことからＵＶＡの送達を監視するための線量計として使用し得る。Ｓ−５９光化学反応生成物のそれぞれはまた、再現性のある量で形成される。
本発明をうまく利用するには、正確なメカニズムや光化学反応生成物が公知である必要はないが、Ｓ−５９の二量体化が光化学的崩壊の基本様式であると言われている。光照射した溶液から２つの主要な光化学反応生成物（図３９のＨＰＬＣクロマトグラムではピークＤおよびＥ）を単離し、それらの構造をＧＣ／ＭＳおよびＮＭＲ解析により決定し、その結果を図４０に示す。図４０に示されるように、ピークＤはＳ−５９のヘテロ二量体で、ピークＥはＳ−５９のホモ二量体である（本明細中、今後「光化学反応生成物Ｄ及びＥ」とする）；残りの光化学反応生成物の構造は不明である。
先に示したように、ＰＣへ加えられたＳ−５９のおよそ２５％を、血小板へ分配する（実際の量は、血小板数による）。血小板によるＳ−５９の取り込みは、血小板内の、かなり高い濃度のＳ−５９をもたらす。さらに、二量体化は生体分子反応であるため、光化学的処理の間に形成される二量体（ピークＤおよびピークＥで示される）の収量は、血小板に取り込まれるのと同様に増加する。このように、効果的なＲＤは、Ｓ−５９および光化学反応生成物ＤおよびＥを血小板内部から取り除けるように設計を行う必要がある。
Ｂ．Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３含むＲＤの還元特性
上記に示したように、光照射後、Ｓ−５９の最初の１５．２ｍｇの約７４％は残存および非結合Ｓ−５９光化学反応生成物として存在する。吸着の研究により、ＲＤとともに光照射およびインキュベートしたＰＣから、Ｓ−５９の初期の１５．２ｍｇの９９％超を除去されることが示された。このセクションでは、Ｓ−５９および結合していない光化学反応生成物の除去動態と、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３を用いたＲＤ処理後のＳ−５９の最終レベルを示す。
１５．２ｍｇのＳ−５９を加えたＰＣを３．０Ｊ／ｃｍ２のＵＶＡを照射し、処理したＰＣをＲＤ（ＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）内に備えられている）とともに８時間インキュベートした。次いで、残存Ｓ−５９およびＳ−５９光化学反応生成物を検出するために、処理したＰＣの試料を取り、ＨＰＬＣに供した。インキュベーション後の光化学反応生成物Ｄ，ＥおよびＦ（Ｓ−５９）のレベルを表Ｎに示した；光化学反応生成物Ａ，Ｂ，ＣおよびＧはＨＰＬＣでは検出されなかった。残存光化学反応生成物のレベルは、６つの独立した、光化学的処理およびＲＤ処理した血小板ユニットから得られた平均値である。ＨＰＬＣアッセイでの定量限界値（ＬＯＱ）は、Ｓ−５９で０．３μＭであった。
図４１には、ＲＤで８時間インキュベートする前およびした後の、Ｓ−５９および結合していない光化学反応生成物のレベルを示すＰＣの代表的ＨＰＬＣクロマトグラフを示した。図４１のクロマトグラフに、１５０μＭのＳ−５９（１５．２ｍｇ／３００ｍＬ）を含むＰＣについて、ＵＶＡを照射する前のもの（上）、ＵＶＡでの照射後のもの（中）、およびＵＶＡを照射した後、ＲＤでインキュベートしたもの（下）を示した。縦座標はＨＰＬＣ検出器により測定された、３００ｎｍでの光学密度であり、横座標は分で示した時間である。
上記で示したデータにより、光照射後のＰＣにおいて、ＤおよびＥの初期のレベルがＳ−５９よりかなり少なくても、光化学反応生成物ＤおよびＥは残存Ｓ−５９のレベルよりも高いということが示された。光照射したＰＣから、残存Ｓ−５９および光化学反応生成物ＤおよびＥの除去について動態を調べることで、この観察結果をより簡単に理解し得る。本研究では、ＰＣの試料を、８時間処理が完了する前にさまざまな時点でＲＤを収容しているＰＬ２４１０プラスチック容器からＰＣの試料を取り除いた。結合していない光化学反応生成物について、上記のＨＰＬＣアッセイを用いて、ＰＣを評価し、このＨＰＬＣアッセイは、血小板内部に存在する光化学反応生成物および血漿／ＰＡＳ ＩＩＩ混合物に存在する光化学反応生成物の両方を定量する。図４２で示される結果では、完全なＰＣから光化学反応生成物Ｄ，ＥおよびＳ−５９の除去動態を示した。光化学反応生成物ＤおよびＥは平衡レベルに達したように見えるが、Ｓ−５９はほとんど完全に取り除かれる。
完全なＰＣを評価することに加え、血漿／ＰＡＳ ＩＩＩ中の、結合していない光化学反応生成物を分離して解析し得るように、試料を遠心分離機にかけることで血小板を除いた。図４３に示した結果では、全ての光化学反応生成物は比較的迅速に血漿／ＰＡＳ ＩＩＩ区画から取り除かれることが示されている。本発明を実施するために、光化学反応生成物の除去に影響を与える因子を正確に理解することは必要ではないが、結果より、光化学反応生成物ＤおよびＥの除去は、血小板内部から血漿／ＰＡＳ ＩＩＩ区画への輸送により、動力学的に限定されることが示唆される。Ｓ−５９よりも光化学反応生成物ＤおよびＥを取り除くことは困難である原因は、光化学反応生成物ＤおよびＥは電荷を持つアミノ基を２個持ち、これらのアミノ基は血小板膜を通過するときに中和される必要があるが、Ｓ−５９は電荷を持つアミノ基を１つしか持たないためであり得る。
血小板内部から光化学反応生成物ＤおよびＥを取り除くことに対する動力学的限界は、好ましい実施態様は流動プロセスよりむしろバッチ式接触プロセスを含むことを示唆する。
すなわち、樹脂との利用可能なインキュベーション時間を制限する血液保存手順により課される実用限界から考えれば、バッチ式ＲＤを使用することにより、実現可能なレベルまで光化学反応生成物ＤおよびＥが血小板内部から激減することを可能にするのに充分な時間が提供される。
実施例 ３７
Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３を用いたバッチ式ＲＤ処理後のインビトロでの血小板機能試験
本実施例ではインビトロにおいて、光化学的処理、８時間のＲＤ処理（Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ−４３４９３）および貯蔵（ＰＬ２４１０プラスチック容器，Ｂａｘｔｅｒ社）に供したＰＣの血小板機能試験を示している。光化学的処理およびＲＤ処理に供した血小板混合物の試験結果と、光化学的処理のみに供した同一の血小板混合物のものを比較した。以下に詳細に示すように、パラメーターそれぞれを１、５および７日について評価した；血小板を５日間貯蔵後、処理した血小板製剤と、処理しなかった血小板製剤は、類似のインビトロでの機能を実証した。
ＡＢＯが一致している単一のドナーからの２つのＰＣであって、約３００ｍＬの３５％血漿および６５％ＰＡＳ ＩＩＩ中に２×１０１１〜５×１０１１の血小板を含むＰＣを集め、これをＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）の２つの同一のユニットに再分配した。１ユニット（対照実験）は、直ちに血小板振盪機に置き、およそ２２℃で貯蔵した。もう一方のユニット（試験）は１５０μＭのＳ−５９および３ジュール／ｃｍ２のＵＶＡで処理した。処理後、血小板懸濁液を、ＲＤを含む第２のＰＬ２４１０プラスチック容器に移した。血小板とＲＤをおよそ８時間接触させ、その後血小板懸濁液を新しいＰＬ２４１０プラスチック容器に貯蔵のために移した。献血して頂いた時を第０日とした。Ｓ−５９、ＵＶＡ（３２０〜４００ｎｍ）およびＲＤでの処理を第１日に行った。６回実験を繰り返し、いずれの場合でも、ＡＢＯが一致している単一のドナーからの２つの血小板濃縮液の異なる貯蔵液を使用した。
インビトロにおける血小板機能を評価するために、第２、５および７日において処理前、および処理後に分けて、対照実験および試験ユニットの両方から血小板試料を取り出した。以下のパラメーターつまり；ｐＨ、ｐＯ２、ｐＣＯ２、重炭酸塩濃度、血小板数、形態、凝集、血小板の形状変化、低浸透圧ショック応答、ラクテートの形成、グルコースの消費、ＡＴＰの分泌、Ｐ−セレクチンの発現、および微小胞の形成について解析を行った。ｐＨ、形態スコア、血小板の形状変化および低浸透圧ショック応答などを含む、これらのアッセイのいくらかは、インビボにおける輸血後の回復および生存と相関するという文献報告がある。統計的な解析には、スチューデント対応ｔ検定を利用した。
Ｓ−５９の濃度を減少させるＲＤの効果を評価するために、試験ユニットの血小板試料をＳ−５９含有量についてＨＰＬＣにより解析した。３ジュール／ｃｍ２での照射前の試料、照射後の試料および８時間のＲＤ処理をした直後の試料を解析した。
結果を表Ｏおよび表Ｐに示す。表Ｏおよび表Ｐでの「ＩＤ」は、試料が試験ユニット（例「Ｔ」）あるいは対照実験（例「Ｃ」）かどうかを意味し、「＊」は試験の血小板と対照実験の血小板の間でｐ≦０．０５であることを示し、「ｎ．ｄ．」は測定が行われなかったことを示している。血小板数を測定するため、対照実験ユニットの体積は、対となる試験ユニットに対しておよそ５％少なくしてある；したがって、統計的に解析するために、試験ユニットのμＬ当たりの血小板数を、１．０５のファクターにより調節した。処理後に７日間貯蔵する間、処理した血小板のｐＨを６．９１±０．０５に維持した。
この結果は、光化学的処理後に本発明のＲＤで処理することにより、血小板は悪影響を受けなかったということを示している。貯蔵した７日間にわたって、試験した血小板および対照実験の血小板の間で、血小板数、血小板の凝集、分泌性アデノシン３リン酸（ＡＴＰ）および微小胞の形成について、統計的に有意な差はなかった（ｐ＞０．０５）。血小板の形態および血小板の形状変化の測定では、試験した血小板において、経時的に統計的に有意な（ｐ≦０．０５）改善が示された。処理後の血小板について、ｐＯ２、ｐＣＯ２、ＨＣＯ３ −、血漿グルコースおよびラクテートの生産における統計的に有意な差（ｐ≦０．０５）は、代謝の緩徐化を示唆しており、この処理後の血小板は血小板の性質に悪影響を及ぼさなかったようである。第２日における低浸透圧ショック応答（ＨＳＲ）、および第２および５日のＰ−セレクチン発現において、統計的に有意な差が検出された。
ＵＶＡ照射前および後のＳ−５９濃度、およびＲＤ処理後の残存Ｓ−５９濃度の減少をＨＰＬＣ解析により測定した。０ジュール／ｃｍ２での照射の血小板濃縮液中の初期のＳ−５９濃度は、およそ１４５±１０μＭであった。３ジュール／ｃｍ２での照射後では、初期のＳ−５９の２０．５％±２．３％が反応せず残った（表Ｑ）。表Ｑの「ｎ．ａ．」は、「適用外」および「ｎ．ｄ．」は「行っていない」を示している。残存Ｓ−５９濃度は、ＲＤで８時間処理することにより０．２７±０．０５μＭまで減少した。このＳ−５９における減少レベルは、およそ１００倍であった。
これらの結果より、１５０μＭのＳ−５９および３ジュール／ｃｍ２でのＵＶＡの照射、およびＲＤで８時間処理することによるＳ−５９の消耗後の、インビトロにおける血小板機能は、貯蔵した７日間、十分に維持されていた。
本研究で得た試験血小板についてのインビトロで測定した血小板機能の値は、初期の研究においてＲＤへ曝露することなく光化学的に処理した血小板について得られた値と同等である（結果は示さない）。一般ボランティアの人達について、光化学的に処理した血小板を評価すると、通常のインビボにおける回復と寿命を示してきた。これらのインビトロの研究に基づけば、ＲＤによる処理は、インビボでの血小板の機能に対して付加的な効果を有するとは予想されない。
ＲＤによる８時間の処理後、Ｓ−５９濃度の１００倍の減少が達成された。残存Ｓ−５９の濃度は≦０．３μＭに減少した。これらの結果は、血小板濃縮液に対する光化学的処理プロセスにＲＤを組み込むことで、患者がＳ−５９に晒されることを効果的に減少させる実行可能な手段、ならびにこうして血小板輸血の安全域の向上が提供されることを示唆する。
実施例 ３８
バッチ式除去装置を用いた、新鮮凍結血漿からのソラレンの除去
Ｄｏｗｅｘ（登録商標）吸着剤を含むバッチ式ＲＤを用いた、血小板濃縮液からのソラレン除去を、前出のいくつかの例で示した。本実施例では、Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ４３４９３（商品名Ｏｐｔｉｐｏｒｅ（登録商標）Ｌ４９３としても知られる）を含むＲＤを用いた、新鮮凍結血漿（ＦＦＰ）の実験について示す。本実験では、ｉ）Ｓ−５９を好ましいレベルまで除くために必要な吸着剤の量、ならびに、ｉｉ）凝固因子活性に対する、ｉ）で決定された吸着剤の質量の影響について評価する。
以下に、詳細に示されるように、本実施例の実験の基本プロトコルは、血小板で行った実験と似ている。しかしながら、大変短い処理時間、例えば１時間が望ましいため、多量の吸着剤（および吸着剤を収容するためのより大きなメッシュポーチ）が使用された。凝固因子は室温にある場合継時的に分解し得るため、新鮮凍結血漿はすばやく加工されるのが好ましい。
Ａ．Ｓ−５９の除去動態と凝固因子活性の保持に対する吸着剤の質量の影響
毒物学的試験の結果（示していない）に基づけば、光化学的処理および除去装置（ＲＤ）による処理後の、Ｓ−５９の好ましい残存レベルは５μＭ未満であり、好ましいのは１μＭ未満であり、最も好ましいのは０．７５μＭ以下である。加えて、室温での血漿の取り扱いについて書かれている現在のＦＤＡによる制限により、２時間より少なく、好ましくはおよそ１時間で≦０．７５μＭの望ましいレベルを達成することが好ましい。
これらを達成するために、以下の実験を行った。
それぞれが２５０〜３２５ｍＬを含む、７つの新鮮な血漿ユニットを集め、２５０ｍＬの血漿に分けた。それぞれの２５０ｍＬの血漿をＰＬ２４１０プラスチック溶液（Ｂａｘｔｅｒ）に加え、さらにある量のＳ−５９溶液を、Ｓ−５９の最終濃度が１５０μＭになるように各容器に加えた。続いて、光化学的処理を行うために、容器をＵｌｔｒａｖｉｏｌｅｔ Ｉｌｌｕｍｉｎａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｓｔｅｒｉｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．およびＢａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｆｅｎｗａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）の中に置き、光照射（３Ｊ／ｃｍ２の長波長ＵＶＡ（３２０〜４００ｎｍ））した。
その後、各容器の血漿／Ｓ−５９溶液を、ＲＤと５，１０，１５あるいは２０ｇの乾燥Ｄｏｗｅｘ（登録商標）ＸＵＳ ４３４９３を３０μｍポリエステルメッシュの１２ｃｍ×１２ｃｍポーチ内に含むＲＤを収容する別個のＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）に移した。
そして、容器を室温で振とうしながらインキュベートした。光照射前および１時間および８時間の光照射後に、それぞれの容器より試料を取り出した。これらの試料を−８０℃で次の解析のために貯蔵した。
１時間インキュベートした後の各バッグから得た試料を、Ｓ−５９および光化学反応生成物の除去について解析した。残存Ｓ−５９および、光化学反応生成物ＤおよびＥ（上述したように、光照射を行う間に形成される２つの初期光化学反応生成物）に対する結果（ｎ＝７）を表Ｒに示した（ＮＤ＝検出できない；１時間インキュベーション）。
ＲＤと共に８時間インキュベートした後の、それぞれのバッグより得た試料を、凝固因子活性について解析した。異なった質量の吸着剤を含むＲＤを用いた結果（ｎ＝７）を表Ｓに示した（８時間インキュベーション）。
Ｂ．Ｓ−５９の除去動態及び１２．５ｇの吸着剤を含むＲＤを用いる血液凝固因子活性の維持
９及び光化学反応生成物を除去し、かつ血液凝固因子活性を維持するのに好ましい量であるように、バッグの大きさ、血漿の量、選択されたＳ−５９の濃度、および所望される１時間の制限を考慮して決定した。このセクションでは、除去動態および１２．５ｇの吸着剤を含むＲＤを用いる血液凝固因子活性の維持を評価するための実験について述べる。
実験は上述した方法で行った。残存Ｓ−５９および光化学反応生成物ならびに血液凝固因子活性の解析を行うために照射前および照射後に各容器から取り出された試料は−８０℃で貯蔵された。
一時間インキュベーション後に採取された試料から得られた残存Ｓ−５９と光化学反応生成物Ｄ及びＥの結果（ｎ＝７）は表Ｔに示している。表Ｔが示唆するようにＲＤは望む除去レベルに達していた（約一時間で残存Ｓ−５９≦０．７５μＭ）（ＮＤ＝検出不能；一時間インキュベーション）。
ＲＤと共に２時間インキュベートした後の血液凝固因子活性の結果（ｎ＝７）は表Ｕに示している。
結果から示唆されるように、プロトロンビン時間、部分トロンボプラスチン時間および第Ｖ因子に対する影響は、例えあるとしても少なかった。そのうえ、他の血液凝固因子に対する活性の低下は許容できるものであった。これらの結果
る。試験された条件下では、１０ｇを超えることが望まれ、１２．５ｇがより好ましい。
実施例 ３９
吸着作用に対するソラレンの構造的特徴の影響
これまでの実験のいくつかは、バッチ式装置および流動装置の両方による血小板濃縮液からのＳ−５９の除去について論議した。この実施例では、ソラレンのどのような構造的特徴が、バッチ式吸着の間のアンバーライト吸着剤によるソラレンの除去に影響を与えて得るかについての決定を伴う。
つぎに示す３種類の構造の異なるソラレンをこの実施例での実験に用いた：ソラレンＡ、第４級アミンを有するソラレン［４’−（トリエチルアミノ）メチル−４，５’，８−トリメチルソラレン］；ソラレンＢ、荷電していない臭素化ソラレン［５−ブロモ−８−メトキシソラレン］；ソラレンＣ、正に荷電した臭素化ソラレン［５−ブロモ−８−（ジエチルアミノプロピルオキシ）−ソラレン］。これらソラレンの化学構造式は図４４に示している；図４４ではＢｒ−が対イオンとして描かれているが、一般的にはＣｌ−が対イオンである。吸着作用に関する研究のために、これらのソラレンをＡｍｂｅｒｌｉｔｅのイオン性および非イオン性吸着剤と組み合わせた。より明確に述べると、３種類の非イオン性ポリスチレン吸着
を使用した。
これらの吸着剤の特徴の一部は、前に表Ａとして示した。
この実施例で、血小板濃縮液は、３５％血漿／６５％ＰＡＳ ＩＩＩの混合物中に３００ｍＬあたり４．０×１０１１個の血小板を含んだ。それぞれのソラレン（つまり、ソラレンＡ、ＢおよびＣ）の保存液（１５ｍＭ）をＤＭＳＯで調製した。それから、３００μＭから１０μＭの範囲の濃度で、ＰＣで各ソラレンの段階希釈物を調製した；つぎに行う計算の目的のために、初期濃度をＣ０とする。その後、対照実験試料と試験試料はＨＰＬＣ分析用に調製された。それぞれの希釈物の３．０ｍＬのアリコットを、０．１ｇの吸着剤を含む５ｍＬポリプロピレンチューブに加えることにより、試験試料を調製した；対照実験試料は、吸着剤が省かれことを除いて、類似の方法で調製した。試験試料および対照実験試料をミキサー（Ｂａｒｎｓｔｅａｄ，Ｔｈｅｒｍｏｌｙｎｅ Ｍｏｄｅｌ ４００１１０）上で、２２℃で６時間、穏やかに回転させてインキュベーションを行った。
このインキュベーションは、先に行ったＳ−５９を用いた平衡の研究に基づく、吸着したソラレンと遊離のソラレンとの間の完全な平衡をもたらした。
吸着に関するデータは試験試料と対照実験試料についてのＨＰＬＣ解析から得られた。具体的には、試料体積２００μｌのＰＣをインキュベーション期間後に各チューブから取り除いた（吸着剤粒子が試験試料と共に除去されることがないことを保証するために特別な注意が払われた）。各々のＰＣ試料を、内部標準としてトリメチルソラレン（ＴＭＰ）を含む試料希釈液（終濃度：３５％メタノール、２５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝３．５）を用いて５倍に希釈した。血小板内に含まれるソラレンがアッセイによって除外されないように、メタノール添加により血小板を溶解させ、血漿を沈殿させる。この試料調製技術により、研究に使用された各ソラレンの９０％を超える回収率がもたらされた。試料を遠心分離し、上清を０．２μｍのフィルターで濾過した。その後、Ｃ−１８逆相カラム（ＹＭＣ，ＯＤＳ−ＡＭ型、４．６×２５０ｍｍ）で、溶媒Ａ（２５ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ＝３．５）６５％と溶媒Ｂ（メタノール）３５％から、２０分間で溶液Ｂが８０％に達する線形濃度勾配をかけて使用し、試料を分析した。
対照実験試料のＨＰＬＣの結果は、ソラレンＡ、Ｂ及びＣの検量線を引くのに利用した（測定値不記載）。検量線は各々のソラレンについて、ＨＰＬＣの面積（ｙ軸）と濃度（ｘ軸）に関して引いた。
検量線の傾きは線形最小二乗法により決定した（ｙ切片を０とした）。傾きは、ソラレンを含むＰＣとＡｍｂｅｒｌｉｔｅ吸着剤の１つが接触してから６時間後に残っているソラレンの濃度を算出するのに用いた（以下参照）。
試験試料のＨＰＬＣの結果は、吸着剤と共にＰＣをインキュベートした後の、残存（すなわち遊離し、吸着していない）ソラレンの濃度、Ｃｆ（μｍｏｌ／Ｌ）を決定するために、検量線と合わせて用いた。特に、ＨＰＬＣの面積を、特定の吸着剤の検量線の傾きで除すると、Ｃｆが得られる。吸着剤がＰＣから除去されたソラレンの量（μｍｏｌ）を算出した［Ｖ（Ｃ０−Ｃｆ）］。吸着等温線は、吸着容量、ｑ（μｍｏｌ／ｇ）をＰＣ中のソラレンの最終濃度（μＭ）に対して値をプロットすることにより構築された。線形の等温線が得られた（ｑ＝ＫＣｆで表記される（式１、すでに表記））。これまでに議論してきたように、吸着等温線の傾き、Ｋ（Ｌ／ｇ）は吸着定数と呼ばれ、吸着データの線形回帰により決定され得る。式１は、目的終濃度、Ｃｆにおける所与のソラレンに対する吸着剤の容量（ｑ）の評価に用いられる。残存ソラレン濃度（Ｃｆ）が１μＭ時の、種々のＡｍｂｅｒｌｉｔｅ吸着剤の吸着容量（μｍｏｌ／ｇ）は表Ｖで報告している。
吸着剤の容量を算出した結果として、特定の除去目標に到達する（つまり、所与の量のソラレンを除去する）のに必要な吸着剤の量を決定できる。その量は次に示す方程式から算出可能である：［Ｍ＝Ｖ（Ｃ０−Ｃｆ）／ｑ］（式２、すでに表記）。式２の目的のために、Ｍは吸着剤の質量（ｇ）、Ｖは処理する試料の体積（Ｌ）を意味している。
ＰＣ中で、ウイルスが不活性化にいたる典型的な状況では、ＰＣにソラレンを約１５０μＭの濃度になるように加える。しかしながら、光照射中に、ソラレンは光分解を受ける；光分解プロセスは約３０〜５０μＭというＣ０濃度の低下をもたらす。このように、ソラレン濃度をＣ０＝５０μＭから望ましいＣｆ値に減少させるのに必要な吸着剤の量を決定できる。表Ｗに、式２を用いて、１μＭのＣｆに至るのに必要な吸着剤の量（ｇ）を列挙した。表Ｗにおける量は、表Ｖに挙げた吸着容量（ｑ）、Ｃ０＝５０μＭ、Ｖ＝０．３Ｌ（ＰＣの典型的な治療時の投薬量）を用いて算出した。
表Ｗに示したデータから、（ｉ）吸着剤自体の特性および、（ｉｉ）ソラレンの構造が、ソラレンの除去能力にどのように影響を与えているか、に関していくつかの結論
びＸＡＤ−１６は十分なレベルでどのようなソラレンも除去できるように思われる。
は、疎水性の高いポリスチレン吸着剤ほど効果的ではない。同様に、イオン交換
ン吸着剤に匹敵するソラレン除去を引き起こさなかった。
本発明は、特定の機構に制限されるものではないが、ソラレン除去の初期反応機構は、おそらく、ソラレンと吸着剤のポリスチレン側鎖との芳香族のスタッキングを含む、疎水性相互作用である。このことは、疎水性ポリスチレン吸着剤の効果を、部分的に説明する。
ソラレン特性の考察は、ＨＰＬＣの保持時間は、疎水性のおおよその評価として利用できることを明らかにする。各々のソラレンは同様な形式のＨＰＬＣアッセイによって解析されたので、ソラレンの相対的保持時間を疎水性の増加に応じてそれらを分類するのに利用することが可能である。疎水性が増加していく順番でのＨＰＬＣの保持時間は次のようになる；ソラレンＡは７．８分、ソラレンＣは１２．０分、そしてソラレンＢは２０．０分であった。もし、疎水性がＰＣからのソラレンの除去可能性の主な決定要因だとしたら、ソラレンＢが最も疎水性が高いので、最も容易に除去されると予想された。しかしながら、疎水性は中間を示しているにも関わらず、ソラレンＣは最も容易にＰＣから除去された。このような結果に対する１つの可能性のある説明としては、ソラレンＣはソラレンＢほど強力に、ＰＣ中に存在する細胞または血漿タンパク質（つまり、血清アルブミン）と相互作用しないことが挙げられる。細胞または血漿タンパク質との強力な相互作用は吸着作用と競合し、結果的に樹脂との結合を阻害し得る。
加えて、ソラレンＡのような非常に極性の高いソラレンは、疎水性の吸着剤に対する親和性が減少するので、除去はより困難であり得る。さらに、試験に
使用したすべてのソラレンに対してわずかな除去を呈した。この実施例の結果は、広範で多様な構造特性を示すソラレンがＰＣから除去可能であることを実証している。
実施例 ４０
アフェレーシスシステムと連結したＲＤの使用
以前に示したように、本発明により、アフェレーシスシステムと連結したＲＤの使用が企図される。この実施例では最初にアフェレーシスを介した単一ドナーの血小板や血漿の同時収集が記述されている。その後、血小板調製物へのＰＡＳ ＩＩＩおよびＳ−５９の添加が述べられ、続いて、照射およびＲＤ処理プロセスの議論が述べられる。
方法論
この実施例の実験はＡｃｃｅｓｓ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ ＳｙｓｔｅｍＴＭを伴うＢａｘｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＣＳ−３０００ＴＭ Ｐｌｕｓ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｆｅｎｗａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）を、Ｃｌｏｓｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｆｅｎｗａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）と共に利用した。構成要素には、二つの空の１０００ｍｌ血小板収集バッグ（ＰＬ３０１４プラスチック，Ｂａｘｔｅｒ），ＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）およびＰＡＳ ＩＩＩ含有バッグ（ＰＬ２４１１，Ｂａｘｔｅｒ）が挙げられた。上記アフェレーシスシステムの追加構成要素には、ＴＮＸ−６ＴＭ分離チャンバー（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒ）、ＰＬＴ−３０ＴＭ回収チャンバー（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒ）、Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｃａｌｅ（すべてＢａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｆｅｎｗａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）およびＴｅｒｕｍｏ ＳＣＤ ３１２−Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｔｕｂｉｎｇ Ｗｅｌｄｅｒが挙げられた。
アフェレーシスシステムの操作パラメーターは以下の通りであった。全血液の流速は５０〜５５ｍｌ／ｍｉｎ、内部検出器オフセット設定は６、収量較正ファクターは１．１３、血漿収集体積は１５５ｍｌ、および血小板の収量は３．７×１０１１血小板である。別の方法が記されていない場合は製造者の指図によって装置は設定及び操作を行った。
校正後、Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｃａｌｅは最初の血小板貯蔵容器の風袋控除をするために用いた。
この例で使われているように、「風袋控除（ｔａｒｅ）」という語は貯蔵容器重量を決定し、貯蔵容器と溶液の総重量からその重さを差し引いて溶液重量の正確な測定を可能にすることを意味する。ローラークランプを閉じた。第２の貯蔵容器及び輸送パックはそれぞれ食塩水とＡＣＤバッグの正面の分離フックの上に置かれた。第２の血小板貯蔵容器のローラークランプを閉じ、一方で輸送パックのローラークランプは開けた。血漿輸送パックは最初の食塩水を収集するのに用いた。
食塩水を流入口ラインと戻り口ラインに注入し、ＡＣＤ比をおおよそ１０：１の抗凝固用の比で送達するように調節した。
血小板と血漿の収集
静脈穿刺に続いて、全血をドナーから取り出し、多重内腔管（ｍｕｌｔｉｐｌｅ ｌｕｍｅｎ ｔｕｂｉｎｇ）の流入口ラインを通じて遠心分離機の分離容器へポンプで送った。分離容器は全血を、一方は血漿及び血小板（即ち血小板に富む血漿）を含み、他方は赤血球を含む、二つの区別しうる相に分離させた。赤血球はドナーに戻した。次いで、血小板に富む血漿は分離容器から遠心分離機の収集容器へポンプで送られた。血小板に富む血漿は収集容器を通過しながら、血漿が取り出されるので血小板は濃縮された。収集容器内の濃縮された血小板は約３０ｍｌの残存血漿と会合した。もちろん、異なる操作パラメーターや異なるアフェレーシスシステムによって血小板と会合する残存血漿の異なる量がもたらされうる。
ＰＬＴ−３０ＴＭ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒを使用するとき、次の血小板再懸濁および貯蔵のための手順の間血漿の追加分が収集されなければならない。故に、４００ｍｌの血漿は血漿ポンプで加工されたあとでアフェレーシスシステムはあふれ出さず、血漿のオプションが選択され、システムは１５５ｍｌの血漿を収集するようにプログラムした。適切なクランプを開けた後、５５ｇの血漿（付属の量りで計量された）は、後の血小板の再懸濁のために第１の血小板貯蔵容器に収集し、１００ｍｌを次に第２の血小板貯蔵容器に収集した。
血漿の収集に続き、Ｂａｘｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＣＳ−３０００ＴＭ Ｐｌｕｓ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｏｒの再注入モデルを初期化した。戻り口ラインの注射針をドナーの腕から外した。
分離及び収集の後、容器はそれぞれのクランプアセンブリから外し、収集容器中で濃縮された血小板は、血小板の凝集物が見えなくなるまで再懸濁した。これにより第１の血小板収集バッグから収集容器へ５５ｇの血漿の添加が行われた。次いで、血小板貯蔵容器および血漿輸送パックアセンブリは遠心分離区画の底部に置かれ、濃縮した血小板は第１の血小板収集バッグへ移した。最後に、この血小板貯蔵アセンブリは多岐管の下方約１２インチで３つの密封シールを作り、後にＰＡＳ ＩＩＩ溶液へ滅菌接合を経由して上記アセンブリを連結するために用いられる１２インチの長さのチューブをもたらすことでアフェレーシスキットから分離される。二つのシールが血小板貯蔵容器アセンブリ上に残されるようそのチューブをシール間で切断した。
ＰＡＳ ＩＩＩ溶液のＰＣへの輸送後の貯蔵容器への輸送
ＰＡＳ ＩＩＩ溶液は次いで、滅菌接合手順によってＰＣへ添加された。Ｓｐｅｎｃｅｒに対する米国特許第４４１２８３５号（これは本明細書中で参考として援用される）滅菌接合装置を記述している。はじめに、血小板貯蔵容器アセンブリから１２インチの長さのチューブを滅菌連結装置（ＳＣＤ）の背面スロットに置いた。二つの血小板貯蔵容器および血漿輸送パックはＳＣＤの右に吊るし、ローラークランプが確実に閉じていることを確かめた。ＰＡＳ ＩＩＩ溶液のはいったＰＬ２４１１プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）からのラインは、ＰＬ２４１１プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）がＳＣＤの左側になるように、ＳＣＤの正面のスロットに置いた。次いで、滅菌溶接操作を行い（Ｔｅｒｕｍｏ ＳＣＤ ３１２ Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｔｕｂｉｎｇ Ｗｅｌｄｅｒ）、流動連結は漏れを検査した。ＰＣ容器のためにローラークランプを開けた後、ＰＡＳ ＩＩＩ溶液はＰＣ中に送られ、ＰＣ由来の残存空気は空のＰＡＳ ＩＩＩ容器に戻した。最後に、連結チューブをヒートシールし、ＰＡＳ ＩＩＩ容器を捨てた。
次に、ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液を含む血小板貯蔵容器をＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）に連結した。空のＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）を計量した後、容器は、血漿輸送パック（ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液を含む血小板貯蔵容器を備える）へ滅菌接合した（上述の手法を用いて）。滅菌溶接操作（Ｔｅｒｕｍｏ ＳＣＤ ３１２ Ｓｔｅｒｉｌｅ Ｔｕｂｉｎｇ Ｗｅｌｄｅｒ）の完了後、血漿輸送パックを捨てた。次いで、第１の血小板容器内のＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液は、ＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）中へ移され、ここで空の第１の血小板貯蔵容器に空気を戻した。
ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液をその後計量した。全体積（ＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）の風袋重量を除いて）は３００±１０ｍｌとなるべきである。もし全体積（重量を測定することによる）が２９０ｍｌ未満なら、求まれる体積を得るために、第２の血小板貯蔵容器（同時に血漿を収集するのに使われた）から一定量の血漿は添加し得る。
おおよそ３５％血漿／６５％ＰＡＳ ＩＩＩ溶液の最終血小板濃縮液をもたらす。最終的に、ＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）からのラインは容器からできるだけ離して完全密封し、ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液を２２±２℃で、平板型撹拌器で貯蔵した。
Ｓ−５９溶液へのＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液の滅菌連結
ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液はＳ−５９溶液に添加し、直ちに、次の照射のために空の容器に移した。はじめに、上述した滅菌接合／溶接手順は、ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ容器からのラインと、Ｓ−５９（１５ｍｌ；３ｍＭ）を伴うプラスチック容器のラインの一つ（ＰＬ２４１１プラスチック容器，Ｂａｘｔｅｒ）との間で流体連結を作ることを行った。滅菌溶接操作を行い、ラインは漏れを検査した。次に、滅菌溶接手順はＳ−５９容器から空のＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）のより短いチューブへ接続されていないラインを連結するのに用いた。再び、滅菌溶接操作を行い、ラインは漏れを検査した。
適当なクランプの除去の後で、ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液はＳ−５９容器を通って、空のＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）へと送られた。Ｓ−５９容器と、ＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）の間のチューブは、できるだけＳ−５９容器に近いところでヒートシールされ、２つの空の容器は廃棄された。Ｓ−５９／ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液容器はそれから、平板型撹拌器上に置かれた（最低５分間および最大１時間）。
先に示したように、この例は、Ｓ−５９容器を通過して、ＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）へＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液を輸送することを含んでおり、そして、Ｓ−５９容器を通過して輸送することで、このとき二つの溶液は混合される。しかしながら、もし、Ｓ−５９溶液との混合に先立ち、ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液がＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）にあるならば、照射のための分離容器への溶液の輸送は必要ない。むしろ、ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液を含むＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）は、Ｓ−５９溶液を伴った容器へ滅菌接合がなされ得、二つの溶液は完全に混合され、後の照射のためにＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）に全量が集められる。
もし望むのなら、得られた溶液試料は評価され得る（例えば、ＨＰＬＣによって照射前Ｓ−５９濃縮液の解析）。サンプリング手順はＳ−５９／ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液容器の残された長いチューブの部分に血小板試料を吸い上げるために、血小板製剤へのラインを除去（除去器／密閉シーラーモデル１３０１；Ｓｅｂｒａ）することが必要となる。それから後は、チューブは溶液容器から最低１２インチ離れた点でヒートシールされ、試料が準備され、処理され得る。例えば、滅菌１５ｍＬ遠心管の上でチューブの端が切断され得、溶液は遠心管へ排出され、アリコットを５ｍＬ微小遠心管（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に置く。溶液の試料（例えば、２００μｌのアリコット）はそれからポリプロピレンの微小遠心管に移すことができ、ＨＰＬＣでの解析に先立ち−２０℃にて貯蔵することができる。
光化学的処理
Ｓ−５９／ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液の容器はその後、光化学処理のために、紫外線照射システム（Ｓｔｅｒｉｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．およびＢａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｆｅｎｗａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）に移された。容器は温度（処理前と後）と処理時間を記録しながら、照射（３Ｊ／ｃｍ２で長波長ＵＶＡ［３２０〜４００ｎｍ］）された。照射された溶液はそれから暗所で平板型撹拌器上に約２２℃（２２±２℃）にて、溶液がＲＤを収容している容器に加えられるまで貯蔵された。
ＲＤによるＳ−５９の減少
その使用に先立ち、ＲＤを収容する容器は詳細なことが調べられた、それはＲＤの完全性、およびポートフィルターの完全性である。加えて、ＲＤのなかのビーズを手で扱うことのないように、または壊すことはしないように注意しなければならない。図３７はこの例で用いられたバッチ式除去装置（ＲＤ）を収容する容器の型を表している。
これまでに示した滅菌接合／溶接の手順が、処理されたＳ−５９／ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液容器からのラインと、ＲＤを収容する容器からのラインとの間で行われた。滅菌溶接操作が行われ、それからラインは漏れが検査された。処理されたＳ−５９／ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液はＲＤを収容する容器へと移され、残存空気はもはや空となったＳ−５９／ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液の容器へ戻された。ＲＤを収容する容器が真空状態で封入されたのであれば、たいてい残存空気は存在しない。二つのバッグをつなぐラインはヒートシールされ、空となったＳ−５９／ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液容器は廃棄された。新たにＳ−５９／ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液を含む容器はそれから連続的に２２℃で８時間撹拌された（平板型血小板撹拌器モデル＃ＰＦ４８；Ｈｅｌｍｅｒ Ｌａｂ Ｃｏ．）。
８時間の撹拌につづいて、ＲＤを収容する容器からのラインが、空のＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）からのラインへと（上記手順を使用いて）滅接合／溶接された。ラインの漏れが検査された後、ＲＤ処理されたＰＣが貯蔵容器へと移された。連結しているチューブは、ヒートシールされ、空となったＲＤを収容する容器は廃棄された。それから、最終的なＰＣを含む貯蔵容器は平板型撹拌機上に２２℃にて貯蔵された。最終処理溶液は受容者へのその後の注入のために貯蔵可能である（ドナーから全血が抜き取られたときから５日間まで）。
実施例 ４１
アフェレーシスシステムと連結させたＲＤの利用
多くの点で類似しているが、この実施例は、先の例で与えられたアフェレーシス手順のある変形を含んでいる。説明すると、この例のプロトコルは血漿収集のために２つの血小板貯蔵バッグの内ひとつだけを利用した。一方、先の実施例では血小板収集バッグが二つとも使われた。加えて、先の実施例では血小板貯蔵バッグはＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）であったのに対し、この実施例のプロトコルでは光化学的処理に対しては適さないＰＬ３０１４プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）が利用された。これらの相違、およびドナーから血液製剤を収集する際に利用された手順や装備に関連する他の点、ならびに、いろいろな試薬をこれらの製剤に対して加える手順の詳細は以下に記される。
方法
この実施例の実験はＣｌｏｓｅｄ Ｓｙｓｔｅｍ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ Ｋｉｔ（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｆｅｎｗａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）と連結したＡｃｃｅｓｓ Ｍａｎａｇｅｍｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｆｅｎｗａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）とともにＢａｘｔｅｒ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＣＳ−３０００ＴＭ Ｐｌｕｓ Ｂｌｏｏｄ Ｃｅｌｌ Ｓｅｐａｒａｔｏｒを利用した。構成要素としては２つの空の１０００ｍＬ血小板収集バッグ（ＰＬ３０１４プラスチック容器、Ｂａｘｔｅｒ）とひとつのＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）および、ＰＡＳ ＩＩＩを含むバッグ（ＰＬ−２４１１プラスチック容器、Ｂａｘｔｅｒ）を挙げられた。アフェレーシスシステムのさらなる構成要素としては、ＴＮＸ−６ＴＭ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒ（ＢａｘｔｅｒＨｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｆｅｎｗａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、ＰＬＴ−３０ＴＭ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ Ｃｈａｍｂｅｒ（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｆｅｎｗａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）、Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｃａｌｅ（Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．）滅菌連結装置（モデルＳＣＤ ３１２；Ｔｅｒｕｍｏ）、およびチューブシーラー（モデル♯１０９０；Ｓｅｂｒａ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ およびＲｅｓｅａｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を含んでいた。これらの構成要素はＡｃｃｅｓｓ Ｓｙｓｔｅｍ Ａｐｈｅｒｅｓｉｓ Ｋｉｔ（モデル４Ｒ２２９５；Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｆｅｎｗａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）と連結して使われた。アフェレーシスシステムの操作パラメーターは以下に示す：血液流速５０〜５５ｍＬ／ｍｉｎ；インターフェース検知器オフセット設定６；収量較正ファクター１．１３；血漿収集体積１５５ｍＬ、および血小板収量３．７×１０１１血小板。装置の設置および操作は、もし他に記述のないときは、製造業者の使用説明書に従った。
較正の後、Ａｃｃｅｓｓｏｒｙ Ｗｅｉｇｈｔ Ｓｃａｌｅは第１の血小板貯蔵容器を風袋控除した。
この実施例で使用される場合の用語、「風袋控除」とは、貯蔵容器の重量を決定し、溶液重量の正確な測定をするために、その貯蔵容器重量を貯蔵容器および溶液の総重量から差し引くことを意味する。ローラークランプはそれから閉じられた。第２の血小板貯蔵容器および輸送パックはそれぞれ生理食塩水バッグおよびＡＣＤバッグの前の別個のホックに置かれた。第２の血小板貯蔵容器の回転クランプは開けられ、一方で、輸送パックの回転クランプは閉じられた。第２の血小板貯蔵容器はこの手順の間、流入口ラインと戻り口ラインに注入するために使用された生理食塩水を含めた、「あふれ出たもの」のために使われた。それから、流入口ラインと戻り口ラインは生理食塩水を注入され、ＡＣＤの比率は抗凝血剤を１０：１〜１１：１の比で送達するように調節された。
血小板と血漿の収集
静脈穿刺につづいて、全血がドナーから取り出され、多重内腔管の流入口ラインを通して遠心分離機の分離容器に送出された。分離容器は全血を、血小板に富む血漿と赤血球に分離し、後者はドナーへと返された。その後、血小板に富む血漿は分離容器から遠心分離機の収集容器へと送出された。血小板に富む血漿が収集容器を通過する間に、血漿が取り出されるので血小板が濃縮された。
アフェレーシスシステムが血漿を集める準備が出来ているときに（すなわち、血漿ポンプで４００ｍＬの血漿が加工された後）、血漿オプションが選択され、約２００ｍＬの血漿が入れられる。過剰バッグが閉じられた後、付属の重量計につるされた第１の血小板収集バッグが開けられ、５４ｇの血漿が後の血小板再懸濁液用に収集された。そのバッグのクランプはそれから閉じられた。その後即座に、輸送用パックへのクランプが開けられ、そのまま残っている同時に血漿が収集された。血漿の同時収集につづいて、そのクランプは閉じられ、過剰収集バッグのクランプが再び開かれた。収集の完了に際に、全てのクランプが閉じられ、ドナーはアフェレーシスシステムから解放される。
クランプアセンブリから収集容器が取り除かれた後、濃縮された血小板が収集容器中に存在する残存血漿中に均一に懸濁するまで、濃縮された血小板は収集容器中で、人の手で混合された。
次に、５４ｇの血漿が含まれる第１の血小板収集バッグへのクランプが開けられ、血漿が収集容器に排出された。血小板と血漿が良く混合された後、それらは第１の血小板貯蔵容器に移された。輸送パック中に収集されたさらなる血漿は、血漿が総計１０５ｍＬに達するまで加えられた。あふれた収集バッグはヒートシールされ、取り除かれ、そして廃棄された。収集チャンバーへと向かう血漿ラインをクランプから外した後、それぞれのバッグへと向かうチューブは密閉された（お互いのバッグを、滅菌接合させることを可能にするのに充分なチューブが残されるように）。
ＰＬ３０１４プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）および、同時に発生する血漿輸送パックはお互いに付着したままで、収集チャンバーおよび分離チャンバーはこれらのバッグから取り除かれ、廃棄された。最終的に、血漿の体積を決定するためにＰＣを含むバッグの中の重量が量られた。
ＰＡＳ ＩＩＩ溶液およびＳ−５９のＰＣへの輸送
この実施例において、血漿を保存するため、および、効果的な除染を促進するために、血小板は１０５ｍＬの自己由来の血漿、および１８０ｍＬのＰＡＳ ＩＩＩ（調製品はＡＣＤも１５ｍＬ含む）へ濃縮された。光化学的処理システムはひとつのＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）、１８０ｍＬのＰＡＳ ＩＩＩ溶液を伴うバッグ、および、１５ｍＬ（３ｍＭ）Ｓ−５９溶液のバッグを含むものが使われた。空の血小板貯蔵バッグの重さを量った後、ＳＣＤが使われて、１８０ｍＬのＰＡＳ ＩＩＩを含んでいる輸送パックは、ＰＬ３０１４プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）に、ある一人のドナーからのアフェレーシスユニットへ付着させられた。ＰＡＳ ＩＩＩ溶液はそれからＰＣに加えられた。それから、空のＰＡＳ ＩＩＩバッグとＰＣの間のチューブが、この後にＳ−５９へ滅菌接合するのに充分なだけのＰＬ３０１４（Ｂａｘｔｅｒ）へのチューブを残して、ヒートシールされた。空のＰＡＳ ＩＩＩバッグは廃棄され、それから血小板は２時間未満の間、平板型血小板撹拌器（モデル♯ＰＦ４８；Ｈｅｌｍｅｒ Ｌａｂ Ｃｏ．）上で、充分分離するまで静置された。
Ｓ−５９バッグ中の望まれる量のＳ−５９が血液製剤溶液と混合するのに利用可能であるように、Ｓ−５９はバッグに結合しないことが好ましい。それゆえ、本発明の好まれる実施態様として、非ソラレン結合ポリマーがＳ−５９バッグの構築の際用いられる（そして、このポリマーはそのバッグ中では、他のソラレンを収容するために用いられる）。
それから、Ｓ−５９バッグは滅菌連結装置（ＳＣＤ）によって（すでに述べられた手順を用いて）、ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液を含むＰＬ３０１４プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）に滅菌接合された。Ｓ−５９バッグ中の望まれる量のＳ−５９が血液製剤溶液と混合するのに利用可能であるように、Ｓ−５９はバッグに結合しないことが好ましい。それゆえ、本発明の好まれる実施態様として、非ソラレン結合ポリマーがＳ−５９バッグの構築の際用いられる（そして、このポリマーはそのバッグ中では、他のソラレンを収容するために用いられる）。滅菌接合手順のために、ＳＣＤを用いて、ＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）の短い方のチューブを（もし望むなら、長い方のチューブは後で、サンプリングのために用いることができる）、Ｓ−５９バッグの自由な管に付着させた。それから、ＰＬ３０１４プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）中のＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液は、Ｓ−５９バッグを通って、ＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）へと移された。この輸送は、ＰＬ３０１４プラスチック容器は光照射に適さないという理由で必要であった。Ｓ−５９バッグと、Ｓ−５９／ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩを含んでいるＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）の間のラインは、その後、できるだけＳ−５９バッグに近いところでヒートシールされた。一方で、空の貯蔵バッグおよびＳ−５９バッグは廃棄された。Ｓ−５９／ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩバッグはそれから、平板型撹拌器上に置かれた（最低５分間、最大１時間）。
もし望むのなら、得られた溶液試料は解析のために取り除かれ得る（例えば、ＨＰＬＣによって照射前Ｓ−５９濃縮液の解析）。サンプリング手順は、Ｓ−５９／ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液容器の残された長いチューブの部分に、血小板試料を吸い上げるために、血小板製剤へのラインを除去（除去器／密閉シーラーモデル１３０１；Ｓｅｂｒａ）することが必要となる。それから先は、チューブは溶液容器から最低１２インチ離れた点でヒートシールされ、試料が準備され、処理され得る。例えば、滅菌１５ｍＬ遠心管の上でチューブの端が切断され得、溶液は遠心管へ排出され、アリコットを５ｍＬ微小遠心管（Ｖａｃｕｔａｉｎｅｒ，Ｂｅｃｔｏｎ−Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）に置く。溶液の試料（例えば、２００μｌのアリコット）はそれからポリプロピレンの微小遠心管に移すことができ、ＨＰＬＣでの解析に先立ち−２０℃にて貯蔵することができる。
Ｓ−５９／ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液容器は紫外線照射システム（Ｓｔｅｒｉｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．およびＢａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｆｅｎｗａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）へ移された。容器は照射され（３Ｊ／ｃｍ２）、照射された溶液はそれから暗所の２０〜２４℃にて、平板型撹拌器上に置かれた。
ここで、自己由来血漿はインビトロで血小板機能について検査される。このため、前もって収集された同時に発生する自己由来血漿は遠心分離に供された。特に、ＳＣＤは血漿含有輸送パックのチューブを、空のｌ５０ｍＬ輸送パック容器に付着させるのに使われた。自己由来血漿／新しい輸送パックは室温にて１０分間、３０００ｇ（３８００ｒｐｍ）で遠心分離された（ＨＡ ６０００ローターを伴うモデル♯ＲＣ−３Ｂ；Ｓｏｒｖａｌｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）。遠心分離された血漿は血漿抽出装置に移され、血小板に乏しい血漿の約半分が、新しい輸送パック中に搾り出された。チューブはヒートシールされ、新しい輸送パックはもとの血漿輸送パックから取り外された。最終的に、血漿輸送セット（４Ｃ２２４０，Ｂａｘｔｅｒ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｆｅｎｗａｌ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ）の突起末端（すなわち、他の構成要素（例えば、血液貯蔵容器）の受容口へ挿入され、チューブと構成要素の間で流体連結を形成するように適合した、一本のチューブの末端）は血漿輸送バッグのポートに挿入された。血小板が乏しい血漿の最小２０ｍＬが滅菌遠心管へ搾り出され、蓋をされ、血小板機能試験の準備のため約４℃で貯蔵された。
ＲＤによるＳ−５９の減少
すでに示したように、ＲＤを収容する容器は好まれる実施態様において、真空密封されたホイルオーバーラップ中で貯蔵される。その使用に先立ち、ＲＤを収容する容器はそのオーバーラップを取り除かれ、細かいことまで調べられる、つまり、ＲＤの完全性、ポートフィルターの完全性である。加えて、ＲＤのなかのビーズを手で扱うことのないように、または壊すことはしないように注意しなければならない。
図３７はこの例で用いられたバッチ式除去装置（ＲＤ）を収容する容器の型を表している。
すでに述べられた、滅菌接合／溶接手順は、処理されたＳ−５９／ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液容器からのラインと、ＲＤを収容する容器の単一の流入口／流出口ラインとの間でなされた。溶接に先立ち、ＲＤを収容する容器の流入口／流出口ラインは２本の指の間で回転させ、ＳＣＤに置かれる前に、過大な崩壊がないことを確認した。滅菌溶接操作がなされ、ラインは漏れが検査され、ラインを開くために、二つの容器の間の連結部分が二本の指の間で回転させた。それから、処理されたＳ−５９／ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液はＲＤを収容する容器へと移され、残存溶液はその容器に手で搾り出された。二つのバッグを連結しているラインはヒートシールされた（最終血小板貯蔵容器へ移すことが十分に出来るようにＲＤを収容する容器へチューブを連結したままにする）。そして、空のＳ−５９／ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液容器は廃棄された。Ｓ−５９／ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液を含む容器はそれから連続的に、２２℃で８時間撹拌された（平板型血小板撹拌器モデル＃ＰＦ４８；Ｈｅｌｍｅｒ Ｌａｂ Ｃｏ．）。
８時間の撹拌につづいて、ＲＤを収容する容器からの単一のラインが、空のＰＬ２４１０プラスチック容器（Ｂａｘｔｅｒ）からのラインへ滅菌接合／溶接された。
ラインの漏れが検査された後、ＲＤ処理されたＰＣが貯蔵容器へと移され、残存溶液は貯蔵容器に手で搾り出された。連結しているチューブは、ヒートシールされ、空となったＲＤを収容する容器は廃棄された。それから、最終的なＰＣを含む貯蔵容器は平板型撹拌機上に２２℃にて貯蔵された（ドナーから全血が抜き取られたときから４日間未満で、そして５日間以下で使用される）。もし望むのなら、血小板試料はこれまでに記したサンプリング手順を利用して、貯蔵容器の残っているチューブまで吸い上げることができる。
実施例 ４２
アフェレーシスシステムでの血小板収集の間のＰＡＳ ＩＩＩのＰＣへの添加
前に示したとおり、ＰＡＳ ＩＩＩ（または他の適した）合成培地は、アフェレーシスに続いて収集された血小板に加えられ、照射に適した調製物を作製することができる。しかしながら、ＰＡＳ ＩＩＩを、収集された血小板に加えるために、滅菌接合手順を利用する前に、血小板が収集されるまでずっと、そのような手法は待つことが必要である。この実施例は代替えの実施態様を述べているが、その中で、アフェレーシスの間の血小板収集プロセスの間にＰＡＳ ＩＩＩが加えられ、その結果、最終的に収集された血小板はすでに適当量のＰＡＳ ＩＩＩを含んでいる。
論じられるべき逸脱を除けば、実施例４１にある全ての装備および手順はここに於いて同等に適用できる。この実施例のプロセスは、上述され、かつスキームＥに描写されたように３つのバッグの変化を利用する。第１のバッグは１８０ｍＬのＰＡＳ ＩＩＩを含む。第２のバッグは所定の量で自己由来血漿を収集するために使われる。第３のバッグは、全ての添加剤が組み合わされる血小板収集バッグである。
アフェレーシスシステムは、血小板を再懸濁するのに用いられる血漿の、所定の量を収集するようにプログラムされている。しかしながら、遠心分離後の収集容器中の血小板、ならびに、アフェレーシスシステムのチューブ中の血小板と会合する残存血漿の必要な量を考慮に入れなければならない。例えば、収集された血小板を最終的に１０５ｍＬの血漿に懸濁することが望ましいのならば、収集容器中の血小板と会合する約３０ｍＬの残存血漿、および、アフェレーシスシステムのチューブ中にある約１８〜２０ｍＬの残存血漿が差し引かれなければならない。それゆえ、アフェレーシスシステムは後で血小板を再懸濁するためにドナーから約５５〜５７ｍＬの血漿を同時に収集するようにプログラムされるべきである。
血漿の収集につづいて、遠心分離機の収集チャンバー内で濃縮された血小板（約４．０×１０１１）は血漿１０５ｍＬ（総量）に再懸濁され、血小板貯蔵容器に移される。その混合物が移される間に、望まれるＰＡＳ ＩＩＩに対する血漿の最終濃度を与えるために、必要量のＰＡＳ ＩＩＩがＰＡＳ ＩＩＩ容器から加えられる。最終的に集められた血小板バッグは約３００ｍＬを含み、以下のものから構成される（おおよその量で示される）：３５％自己由来血漿、６０％ＰＡＳ ＩＩＩ、５％ＡＣＤ、および４．０×１０１１血小板。
その後で、ＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液は実施例４１に記載された手順を使って、加工され得る。簡単には、得られたＰＣ／ＰＡＳ ＩＩＩ溶液はＳ−５９と組み合わされ、撹拌され、そして照射される。照射された血小板調製物はそれから約８時間かけてＲＤを収容する容器へと移され、Ｓ−５９および光化学反応生成物を取り除く。最終的に、処理された血小板調製物は、血小板貯蔵バッグへ移され、この血小板貯蔵バッグから、受容者へと注入され得る。
当該分野の技術者にとって、その改変および均等物が明らかであるように、本発明は、操作の正確な詳細にも、正確な化合物にも、組成にも、方法にも、示された手順にも、描かれた手順にも限定されるものでないということが理解される。

Claims (1)

  1. 明細書に記載の発明。
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