JP2009132728A - 血液製剤からソラレンを除去するための方法およびデバイス - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明の方法は、ソラレン処理および放射線処理した血液製剤をソラレンおよびソラレン光産物を吸収し得る樹脂に接触させる工程を含む。この除去プロセスは、特に、濃縮血小板および血漿に用いるのに特に適している。なぜならば、このプロセスは、凝血因子の機能に、悪影響を及ぼさないからである。この方法およびデバイスは、アフェレーシスシステム、および現在輸血の為の血液製剤の処理に用いられている他のデバイスおよび手法に組み込まれ得る。
【選択図】なし
Description
本発明は、血液製剤から物質を除去するための方法およびデバイス、さらに詳しくは、血小板機能に有意に影響することなく、血小板を含有する血漿からソラレンおよびソラレン光生成物を除去するための方法およびデバイスに関する。
血液供給内の病原体汚染は世界中で重要な医学的問題のままである。B型肝炎(HBV)
、C型肝炎(HCV)、およびHIVについての改良されたテスト方法は輸血関連病の発生を顕著に減少させたが、公衆はこれらのウイルスの輸血関連伝播の場合の公表性のため血液供給の安全性に信頼性を失いつつある。
であろうが、恐らく感染性血液ユニットの検出の67%に過ぎない感度を有する。HCVは輸
血関連肝炎の90%の原因である。Melnick,J. L., Abstract of Virological Safety Aspects ofPlasma, Cannes, 11月3-6 (1992)(2頁)。所定のテストに関して、感染の危険は輸血された3300ユニットのうち1であると見積もられる。
る抗体につき陰性と予備テストされた血液の受容者の間で、Centerfor Disease Control (CDC)によって報告されている。
の安全性を保証せず、この結果、感度良好なテストが実施できるようになる前に輸血関連伝播が起こることとなる。
製品中の病原体を不活化する手段を開発することである。血液製剤中の感染性病原体を不活化するための効果的技術の開発は、血液供給の安全性を改良し、恐らくは、低頻度病原体については、最近導入されたHIV−2テストのごとき新しいテストの導入を遅らせる可能性を供する。結局は、脱汚染技術は血液製剤のコストをおおいに下げ、稀な血液製剤の利用性を増大させる。
悪影響を与えてはならず、ii)血液製剤中の存在する病原体を徹底的に不活化しなければ
ならず、およびiii)血液製剤の受容者に悪影響を与えてはならない。無赤血球血液製剤中のウイルス病原体の不活化または除去につきいくつかの方法が報告されている。しかしながら、これらの技術のほとんどが、血小板(重要な血液製剤)の機能の維持に完全には適合しない。これらの技術の例は加熱(Hilfenhous,J.ら,J. Biol. Std. 70:589 (1987))
、溶媒/界面活性剤処理(Horowitz, B.ら, Transfusion 25:516(1985))、ガンマ線照射
(Moroff, G.ら, Transfusion 26:453 (1986))、ベータプロプリオラクトンと組み合わせた紫外線照射(PrinceA. M.ら,Reviews of Infect. Diseases 5:92-107 (1983))、ヘマ
トポルフィリンと組み合わせた可視レーザー光(MattewsJ. L.ら, Transfusion 28:81-83
(1988); North J.ら, Transfusion 32:121-128 (1992))、光活性色素アルミニウムフタ
ロシアニンおよびメロシアニン540の使用(SieberF.ら, Blood 73:345-350 (1989);Rywkin S.ら, Blood 78(補選1):352a(アブストラクト)(1991)または紫外線単独(Proudouz,K.N.ら, Blood 70:589(1987))である。
ダクトを形成する。G.D. Ciminoら, Ann. Rev.Biochem. 54:1151 (1985); Hearstら, Quart Rec.Biophys. 171:1 (1984)。もし対向ストランドにソラレン−ピリミジンモノアダ
クトに隣接して第2のピリミジンがあれぎ、第2のフォトンの吸収によりストランド間架橋として機能するジアヂクトの形成に至る。S.T. Issacsら,Biochemistry 16:1058 (1977); S. T. Issacsら, Trends in Photobiology(Plenum)279-294頁 (1982); J. Tessmanら,
Biochem, 24:1669 (1985); Hearstら,米国特許第4,124,598号、第34,169,204号および
第4,196,281号。出典明示してこれらを本明細書の一部とみなす。
止させる能力を有する。このDNA結合能力のため、ソラレンは無病原体血液供給を生産し
維持するにおける固有の問題に関して特に興味深い。いくつかの公知のソラレンはいくつかの血液製剤でウイルスを不活化することが知られている。出典明示して本明細書の一部とみなすH.J.Alterら, The Lancet (ii:1446) (1988); L. Linら, Blood 74:517 (1989)
(脱汚染血小板濃縮物);G.P. Wiesehalnら, 米国特許第4,727,027号および第4,748,120号は、8−メトキシソラレン(8−MOP)および照射の組合せの使用を記載している。P.Morelら,Blood Cells 18:27 (1992)は、300μg/mLの8−MOPは紫外線光の10時間の照射と共に
、ヒト血清中のウイルスを効果的に不活化できることを示す。8−MOPおよびアミノメチルトリメチルソラレン(AMT)を用いる同様の研究が他の研究者によって報告されている。DoddRYら,Transfusion 31:483-490 (1991); Margolis-Nunno, H.ら, Thromb Haemostas65:1162 (アブストラクト)(1991)。事実、本発明で用いるものと異なる条件下にて、かつ従前に知られたソラレン誘導体を用いて、HBV、HCVおよびHIVを含めた広範囲スペクトルの
微生物の光不活化が確立されている[Hanson,C. V., Blood Cells, 18:7-24 (1992); Alter, H. J.ら, TheLancet ii:1446 (1988);Margolis-Nunnuo, H.ら, Thromb haemostas 65:1162 (アブストラクト)(1991)]。
国特許第4,727,027号参照。これは費用がかかり、時間を消費する手法である。
ルスを殺す能力を増大させるに見える望ましくない突然変異誘発性を呈する。換言すれば、公知の化合物がより効果的にウイルスを不活化すれば、該化合物は受容者に対してより有害であり、かくして、それらはイン・ビボ使用では製品の不活化系においていずれの時点でも有用性が低い。
的で経済的な広い使用を可能とするデバイスが要望される。
本発明は、新しいソラレン、ならびに突然変異誘発には関連せず、紫外線光の存在下で病原体を不活化する増強された能力を有する新しいソラレンの合成方法を提供する。また、本発明は、イン・ビボおよびイン・ビトロにて、特に、血液製剤および合成媒体中の血液製剤で使用される健康関連製品において病原体を不活化する新しいおよび公知の化合物を使用する方法を提供する。
1.以下の工程を含む血液製剤中の核酸含有病原菌を不活性化させる方法:
a)任意の順序で、i)ソラレン、ii)光活性化手段、iii)該病原菌に汚染されているこ
とが疑われるインビボでの使用の為の血液製剤、を提供する工程;
b)該ソラレンを該血液製剤に添加して、ある濃度のソラレン溶液を調製する工程;
c)該溶液を光活性化手段で処理し、処理血液製剤を調製する工程であって、該病原菌が
不活性化され、かつ該溶液中の該ソラレン濃度の少なくとも一部がフリーである、工程;および
d)該処理血液製剤中の溶液でフリーである該ソラレン濃度の部分の実質的にすべてを除
去する工程。
2.前記除去工程が、前記処理血液製剤を樹脂に接触させる過程を含む、項目1に記載の
方法。
3.前記樹脂が吸着剤である、項目2に記載の方法。
4.前記樹脂がポリスチレンを含む、項目3に記載の方法。
5.前記樹脂がポリアクリルエステルを含む、項目3に記載の方法。
6.前記樹脂が活性炭を含む、項目3に記載の方法。
7.前記接触させる過程が、前記血液製剤を前記樹脂を含むインラインカラムに通して注
ぐことを含む、項目2に記載の方法。
8.前記接触させる過程が、前記樹脂を含むバッグ内で行われる、項目2に記載の方法。
9.前記樹脂が、前記バッグ中のメッシュエンクロージャーに含まれ、該メッシュエンク
ロージャーが前記血液製剤を該樹脂に接触させるように適合している、項目8に記載の方法。
10.項目9に記載の方法であって、さらに、前記バッグの外側に接触するように備えら
れるパーティションを含み、該パーティションが、前記血液製剤を前記メッシュエンクロージャーから隔てるように適合しており、かつ該バッグから所定の時間に取り除かれるように適合している、方法。
11.前記ソラレンが、4’-(4-アミノ-2-オキサ)ブチル-4,5’,8-トリメチルソ
ラレンである、項目1に記載の方法。
12.前記血液製剤が、血小板を含む、項目1に記載の方法。
13.前記血液製剤が、血漿を含む、項目1に記載の方法。
14.血液の汚染除去システムであって、第一の血液バッグおよびソラレンを除去し得る
樹脂を含むインラインカラムを含み、該インラインカラムは、該第一の血液バッグとの流体的に連結するインプットエンド、アウトプットエンド、およびキャパシティを含む、血液の汚染除去システム。
15.前記アウトプットエンドが、第二の血液バッグと流体的に接触している、項目14
に記載のシステム。
16.項目15に記載のシステムであって、さらに、前記インラインカラムと流体的に接
触するよう配置され、かつ該インラインカラムの前記アウトプットエンドの後で、前記第二のバッグの前に配置されたフローアダプターを含む、システム。
17.前記樹脂が吸着剤である、項目14に記載のシステム。
18.以下を含む血液バッグ:
a)生物学的適合性のハウジング;および
b)ソラレンを除去し得る樹脂を含む、該ハウジング内のコンパートメント。
19.さらに合成媒体を含む、項目18に記載の血液バッグ。
20.項目18に記載の血液バッグであって、さらに、前記コンパートメント内に配置さ
れた、樹脂を含むメッシュエンクロージャーを含み、該メッシュエンクロージャーが血液製剤を該樹脂に接触させるように適合している、血液バッグ。
21.項目20に記載の血液バッグであって、さらに、前記生物学的適合性のハウジング
の外側に接触するように備えられたパーティションを含み、該パーティションが、前記血液製剤を前記メッシュエンクロージャーから隔てるように適合しており、かつ該バッグから所定の時間に取り除かれ、該血液製剤が該樹脂に接触するように適合している、方法。22.前記樹脂が吸着剤である、項目18に記載の血液バッグ。
23.以下の工程を含む血液製剤中の核酸含有病原菌を不活性化させる方法:
a)任意の順序で、i)該病原菌に汚染されていることが疑われる血液を提供しうるドナー、ii)該血液を血液製剤に分離する分離手段、iii)ソラレン、iv)光活性化手段、およ
びv)ソラレン除去手段、を提供する工程;
b)該血液を該ドナーから取り、そして、該血液を該血液分離手段に導入する工程;
c)該血液分離手段で、該血液から血液製剤を単離する工程;
d)該ソラレンを該血液製剤に添加して、ある濃度のソラレン溶液を調製する工程;
e)該溶液を光活性化手段で処理し、処理血液製剤を調製する工程であって、該病原菌が
不活性化され、かつ該溶液中の該ソラレン濃度の少なくとも一部がフリーである、工程;および
f)該ソラレン除去手段で、該処理血液製剤中の溶液でフリーである該ソラレン濃度の部
分の実質的にすべてを除去する工程。
24.前記血液分離手段が、アフェレーシスシステムである、項目23に記載の方法。
25.前記血液製剤が、血小板である、項目23に記載の方法。
26.前記血液製剤が、血漿である、項目23に記載の方法。
27.項目23に記載の方法であって、前記ソラレン除去手段が、樹脂を含むメッシュエ
ンクロージャーを含み、該メッシュエンクロージャーが血液製剤を該樹脂に接触させるように適合している、方法。
28.前記樹脂が吸着剤である、項目27に記載の方法。
29.前記樹脂がポリマーを含む、項目28に記載の方法。
30.前記ソラレンがアミノソラレンである、項目23に記載の方法。
31.前記アミノソラレンが、4’-(4-アミノ-2-オキサ)ブチル-4,5',8-トリメチルソラレンである、項目30に記載の方法。
32.前記ソラレンが、臭素化ソラレンである、項目23に記載の方法。
33.以下の工程を含む血液製剤中の核酸含有病原菌を不活性化させる方法:
a)任意の順序で、i)該病原菌に汚染されていることが疑われる血液を提供しうるドナー、ii)血小板を該血液から分離するアフェレーシスシステム、iii)合成媒体、iv)血小
板回収コンテナ、v)4’-(4-アミノ-2-オキサ)ブチル-4,5',8-トリメチルソラレン、vi)光活性化手段、およびvii)ソラレン除去手段、を提供する工程;
b)該血液を該ドナーから取り、そして、該血液を該アフェレーションシステムに導入す
る工程;
c)該アフェレーションシステムで、該血液から血小板を単離する工程;
d)該血小板を血小板コンテナに所定の時間に回収する工程;
e)該合成媒体を該血小板コンテナ中の血小板に加える工程であって、これによって、血
小板および合成媒体を含む血小板混合物をつくる、工程;
f)4’-(4-アミノ-2-オキサ)ブチル-4,5',8-トリメチルソラレンを該血小板混合物に添加して、ある濃度の4’-(4-アミノ-2-オキサ)ブチル-4,5',8-トリメチル
ソラレン溶液を調製する工程;
g)該溶液を該光活性化手段で処理し、処理血小板混合物を調製する工程であって、該病
原菌が不活性化され、かつ該溶液中の4’-(4-アミノ-2-オキサ)ブチル-4,5',8-
トリメチルソラレン濃度の少なくとも一部がフリーである、工程;および
h)該ソラレン除去手段で、該処理血小板混合物中の溶液でフリーである該4’-(4-ア
ミノ-2-オキサ)ブチル-4,5',8-トリメチルソラレン濃度の部分の実質的にすべてを
除去する工程。
34.前記合成媒体がリン酸塩を含む、項目33に記載の方法。
35.項目33に記載の方法であって、前記ソラレン除去手段が、樹脂を含むメッシュエ
ンクロージャーを含み、該メッシュエンクロージャーが、血小板混合物を該樹脂に接触させるように適合している、方法。
36.前記樹脂が吸着剤である、項目35に記載の方法。
37.前記樹脂がポリマーを含む、項目36に記載の方法。
38.前記ポリマーがポリスチレンを含む、項目37に記載の方法。
39.以下を含む血液製剤用のコンテナ:
a)生物学的適合性のハウジング;
b)該血液製剤からソラレンを除去し得る樹脂であって、該生物学的適合性のハウジング
内に含まれる、樹脂;および
c)該樹脂を該生物学的適合性のハウジング内に保持する手段。
40.項目39に記載のコンテナであって、前記保持する手段が、前記生物学的適合性の
ハウジング内に配置されたメッシュエンクロージャーを含み、該メッシュエンクロージャーが、前記樹脂を含みかつ血液製剤を該樹脂に接触させるように適合している、コンテナ。
41.さらに入口/出口ラインを含む、項目40に記載のコンテナ。
42.項目41に記載のコンテナであって、前記保持する手段が、前記入口/出口ライン
中に、前記生物学的適合性のハウジングに流体的に連結するよう配置されたメッシュフィルターを含む、コンテナ。
43.前記樹脂が、吸着剤である、項目39に記載のコンテナ。
44.前記ソラレンが、アミノソラレンである、項目39に記載のコンテナ。
45.前記アミノソラレンが、4’-(4-アミノ-2-オキサ)ブチル-4,5',8-トリメチルソラレンである、項目44に記載のコンテナ。
46.以下の工程を含む血液製剤中の核酸含有病原菌を不活性化させる方法:
a)任意の順序で、i)ソラレン、ii)光活性化手段、iii)該病原菌に汚染されているこ
とが疑われるインビボでの使用の為の血液製剤を含む第一のコンテナ、を提供する工程;b)該ソラレンを該第一のコンテナ中の該血液製剤に添加して、ある濃度のソラレン溶液
を調製する工程;
c)該溶液を光活性化手段で処理し、処理血液製剤を調製する工程であって、該病原菌が
不活性化され、かつ該溶液中の該ソラレン濃度の少なくとも一部がフリーである、工程;
および
d)該処理血液製剤中の溶液でフリーである該ソラレン濃度の部分のいくらかを除去する
工程。
47.前記ソラレンが、4’-(4-アミノ-2-オキサ)ブチル-4,5',8-トリメチルソラレンである、項目46に記載の方法。
48.前記ソラレンが、臭素化されている、項目46に記載の方法。
49.前記臭素化ソラレンが、5-ブロモ-8-メトキシソラレンである、項目48に記載の方法。
50.前記臭素化ソラレンが、5-ブロモ-8-(ジエチルアミノプロピルオキシ)−ソラレンである、項目48に記載の方法。
51.前記ソラレンが、第四級アミンである、項目46に記載の方法。
52.前記第四級アミンソラレンが、4’-(トリエチルアミノ)メチル-4,5',8-トリ
メチルソラレンである、項目51に記載の方法。
53.項目46に記載の方法であって、前記除去工程が、前記処理血液製剤を第二のコン
テナに移す過程を包み、該第二のコンテナが、
i)生物学的適合性のハウジング;
ii)該血液製剤からソラレンを除去し得る樹脂であって、該生物学的適合性のハウジング内に含まれる、樹脂;および
iii)該処理血液製剤から、溶液でフリーである前記ソラレン濃度の部分のいくらかが除
去されるような条件下で、該樹脂を該生物学的適合性のハウジング内に保持する手段。
54.項目53に記載の方法であって、前記保持する手段が、前記生物学的適合性のハウ
ジング内に配置されたメッシュエンクロージャーを含み、該メッシュエンクロージャーが、前記樹脂を含み、血液製剤を該樹脂に接触させるように適合している、方法。
55.前記第二のコンテナが、さらに、入口/出口ラインを含む、項目54に記載の方法
。
56.項目55に記載の方法であって、前記保持する手段が、前記入口/出口ライン中に
、前記生物学的適合性のハウジングと流体的に連結するように配置されたメッシュフィルターを含む、方法。
ンおよび5’−第一級アミノ置換−ソラレンよりなる群から選択される化合物を含む合成
媒体:ii)該化合物を光活性化するための光活性化手段;およびiii)核酸を有する病原体
で汚染されたことが疑われる血小板調製物を供し:b)該合成媒体を該血小板調製物に添加し;次いで、c)該化合物を光活性化させて、該血小板調製物の生物学的活性を有意に変化させることなく、該病原体核酸の実質的に全ての複製を妨げることを特徴とする血小板調製物中の病原体を不活化する方法を含む。該病原体はウイルスまたは細菌であってよい。その核酸は一本鎖または二本鎖のDNAまたはRNAであってよい。光活性化手段は、180
および400nmの間の波長よりなる所与の強度の電磁波照射のスペクトルを放射できる光活
性化デバイスを含む。該強度は1および30mW/cm2の間であってよく、血小板調製物は1秒および30分間の間、該強度に暴露される。電磁波照射のスペクトルは320nmおよび380nmの間の波長であってよい。
1つの具体例において、該化合物は低突然変異様発性を呈する。それは1および250μM
の間の濃度で血小板調製物に添加される。該方法は分子酸素の濃度を制限することなく行うことができる。
4’−第一級アミノ−置換ソラレンは:a)
、uは1ないし10の全数であり、wは1ないし5の全数であり、xは2ないし5の全数であり、yは2ないし5の全数であり、zは2ないし6の全数であり]
よりなる群から選択される4’炭素原子上の置換基R1;およびb)各々、独立して、Hおよび(CH2)vCH3[ここに、vは0ないし5の全数である]よりなる群から選択される、4、5’および8炭素原子上の置換基R5、R6およびR7、あるいはその塩を含むことができる
。
また、5’−第一級アミノ置換ソラレンは、a)
に、uは1ないし10の全数であり、wは1ないし5の全数であり、xは2ないし5の全数であり、yは2ないし5の全数であり、zは2ないし6の全数であり]
よりなる群から選択される5’炭素原子上の置換基R1;およびb)各々、独立して、Hおよび(CH2)vCH3[ここに、vは0ないし5の全数である]よりなる群から選択される、4、4’および8炭素原子上の置換基R5、R6およびR7、あるいはその塩を含むことができ、
ここに、R1が-(CH2)u-NH2から選択される場合、R6はHである。
最後に、5’−第一級アミノ置換ソラレンは、a)
、uは3ないし10の全数であり、wは1ないし5の全数であり、xは2ないし5の全数であり、yは2ないし5の全数であり、zは2ないし6の全数であり]
よりなる群から選択される5’炭素原子上の置換基R1;およびb)各々、独立して、Hおよび(CH2)vCH3[ここに、vは0ないし5の全数である]よりなる群から選択される、4、4’および8炭素原子上の置換基R5、R6およびR7、あるいはその塩を含むことがでる。
1つの具体例において、少なくとも2つの化合物が存在する。もう1つの具体例において、合成媒体は、さらに、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよび塩化マグネシウムを含み、また、マンニトールおよび/またはグルコースを含むことができる。
1つの具体例において、合成媒体は、第1の血液バッグに含まれ、該血小板調製物は第2のバッグに含まれ、合成媒体は、滅菌連結を介して、第1の血液バッグからの合成媒体を第2の血液バッグに絞り出すことによって、工程(b)において血小板調製物に添加される。
好ましい具体例において、該化合物は5’−(4−アミノ−オキサ)ブチル−4,4’−8−
−トリメチルソラレンまたは4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’−8−トリメチルソラレンである。
もう1つの具体例において、前記した方法は、静脈内注入によって該血小板調製物を哺乳動物に投与することを含む。
本発明は、以下の順序で、a)いずれかの順序で、i)第1の血液バッグに含まれた、緩衝化生理食塩水ならびに4’−第一級アミノ−置換ソラレンおよび5’−第一級アミノ置換−ソラレンよりなる群から選択される低突然変異誘発性を呈する化合物を含む合成媒体:ii)該化合物を光活性化するための光活性化手段;およびiii)第2の血液バッグに含まれた
、核酸を有する病原体で汚染されたことが疑われる血小板調製物を供し:b)滅菌連結手段を介して該合成媒体を該第1の血液バッグから該第2の血液バッグに絞り出すことによって、該合成媒体を該血小板調製物に添加し;次いで、c)該化合物を光活性化させて、該血小板調製物の生物学的活性を有意に変化させることなく、該病原体核酸の実質的に全ての複製を妨げることを特徴とする血小板調製物中の病原体を不活化する方法を含む。
該病原体はウイルスまたは細菌であってよい。その核酸は一本鎖または二本鎖のDNAまた
はRNAであってよい。光活性化手段は、180および400nmの間の波長よりなる所与の強度の
電磁波照射のスペクトルを放射できる光活性化デバイスを含む。該強度は1および30mW/cm2の間であってよく、血小板調製物は1秒および30分間の間、該強度に暴露される。電磁波照射のスペクトルは320nmおよび380nmの間の波長であってよい。
1つの具体例において、該化合物は低突然変異様発性を呈する。それは1および250μM
の間の濃度で血小板調製物に添加することができる。該方法は分子酸素の濃度を制限することなく行うことができる。
4’−第一級アミノ−置換ソラレンは:a)
、uは1ないし10の全数であり、wは1ないし5の全数であり、xは2ないし5の全数であり、yは2ないし5の全数であり、zは2ないし6の全数であり]
よりなる群から選択される4’炭素原子上の置換基R1;およびb)各々、独立して、Hおよび(CH2)vCH3[ここに、vは0ないし5の全数である]よりなる群から選択される、4、5’および8炭素原子上の置換基R5、R6およびR7、あるいはその塩を含むことができる
。
また、5’−第一級アミノ置換ソラレンは、a)
、uは1ないし10の全数であり、wは1ないし5の全数であり、xは2ないし5の全数であり、yは2ないし5の全数であり、zは2ないし6の全数であり]
よりなる群から選択される5’炭素原子上の置換基R1;およびb)各々、独立して、Hおよび(CH2)vCH3[ここに、vは0ないし5の全数である]よりなる群から選択される、4、4’および8炭素原子上の置換基R5、R6およびR7、あるいはその塩を含むことができ、
ここに、R1が-(CH2)u-NH2から選択される場合、R6はHである。
最後に、5’−第一級アミノ−置換ソラレンは、a)
、uは3ないし10の全数であり、wは1ないし5の全数であり、xは2ないし5の全数であり、yは2ないし5の全数であり、zは2ないし6の全数であり]
よりなる群から選択される5’炭素原子上の置換基R1;およびb)各々、独立して、Hおよび(CH2)vCH3[ここに、vは0ないし5の全数である]よりなる群から選択される、4、4’および8炭素原子上の置換基R5、R6およびR7、あるいはその塩を含むことがでる。
1つの具体例において、少なくとも2つの化合物が存在する。もう1つの具体例において、合成媒体は、さらに、酢酸ナトリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよび塩化マグネシウムを含み、また、マンニトールおよび/またはグルコースを含むことができる。
1つの具体例において、合成媒体は、第1の血液バッグに含まれ、該血小板調製物は第2のバッグに含まれ、合成媒体は、滅菌連結を介して、第1の血液バッグからの合成媒体を第2の血液バッグに絞り出すことによって、工程(b)において血小板調製物に添加される。
好ましい具体例において、該化合物は5’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,4’−8−−トリメチルソラレンまたは4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’−8−トリメチルソラレンである。
1つの具体例において、前記した方法は、静脈内注入によって該血小板調製物を哺乳動物に投与することを含む。
また、本発明は、a)4,8−ジアルキル−7−(1−メチル−2−オキソプロピル)ソラレ
ンを供し;d)4,8−ジアルキル−4’,5’−ジメチルソラレンを四塩化炭素中で撹拌して、4,8−ジアルキル−5’−ブロモメチル−4’−メチルソラレンを得ることよりなる、クロロメチル化を行うことなく、4,8−ジアルキル−5’−ブロモメチル−4’−メチルソラレンを合成する方法を含む。a)4,8−ジアルキル−7−(1−メチル−2−オキソプロ
ピルオキシソラレンを供し;d)4,8−ジアルキル−4’,5’−ジメチルソラレンを四塩化炭素中で撹拌して4,8−ジアルキル−4’−ブロモメチル−5’−メチルソラレンを得ることよりなる、クロロメチル化を行うことなく、4,8−ジアルキル−4’−ブロモメチル
−5’−メチルソラレンを合成する方法も含まれる。
式:
最後に、本発明は、抗−ウイルス特性を有する組成物を含む。最初のものは、4’−第一
級アミノ−置換ソラレンおよびイン・ビボ使用に適した血小板の水溶液を含む。1の具体例は、さらに、酢酸ナチリウム、塩化カリウム、塩化ナトリウム、クエン酸ナトリウム、リン酸ナトリウムおよび塩化ノグネシウムを含む、所望によりマンニトールまたはグルコースを含んでもよい合成媒体をむ。4’−第一級アミノ−置換ソラレンよりもむしろ5’−第一級アミノ−置換ソラレンを含むこれらの同組成物が含まれる。
また、45−100mM塩化ナトリウム;
4−5mM塩化カリウム;
10−15mMクエン酸ナトリウム;
20−27mM酢酸ナトリウム;
0−2mMグルコース;
0−30mMマンニトール;
ほぼ20mMのリン酸ナトリウム;
2−3mM塩化ナチリウム;および 4’−第一級アミノソラレンおよび5’−第一級アミノソ
ラレンよりなる群から選択されるほぼ0.1および250μMの間の濃度のソラレン;
の水溶液を含む新規合成血小板貯蔵媒体も含まれる。
本発明は、いずれかの順序で、ソラレン、光活性化手段、少なくとも1種の病原体で汚染されたことが疑われるイン・ビボ使用を意図した血液製剤を供し、ソラレンを血液製剤に添加して一定濃度のソラレンの溶液を生じさせ、該溶液を光活性化手段で処理して処理血液製剤を生じさせ、ここに病原体は不活化され、ここに、少なくとも一部のソラレン濃度は溶液中で遊離しており;次いで、処理血液製剤において溶液中に遊離しているソラレン濃度の一部の実質的に全てを除去することよりなる、血液製剤中の核酸含有病原体を不活化する方法を提供する。
めた、種々の樹脂を本発明で使用できると考えられる。
別の具体例において、接触工程は、樹脂を含有するイン−ラインカラムに血液製剤を灌流させることよりなる。
該メッシュエンクロージャーを血液製剤に適用して樹脂と接触させる。
もう1つの具体例において、本発明の方法は、さらに、バッグの外部でそれと接触した区画よりなり、ここに、該区画を適用して血液製剤をメッシュエンクロージャーから分離し、また所定の時間にバッグから取り出す。別の具体例において、該方法は、さらに、樹脂含有バッグを振盪デバイスと混合することよりなる。限定されるものではないが、4’−
(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレンを含めた種々のソラ
レン化合物が本発明で有用であると考えられる。また、限定されるものではないが、血小板、血漿、赤血球、および白血球、ならびに全血を含めた、いずれの血液成分も血液製剤に含まれると考えられる。
キサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレン、光活性化手段、病原体に汚染されたこ
とが疑われるイン・ビボ使用を意図した血小板混合物を供し、4’−(4−アミノ−2−オ
キサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレンを血小板混合物に添加して一定濃度の4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレンの溶液を生成させ
;該溶液を光活性化手段で処理して処理血小板混合物を生成させ、ここに病原体は不活化され、4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレン濃度の少なくとも一部は溶液中で遊離しており;処理血小板混合物において溶液中に遊離した4’
−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレンの一部の実質的に
全てを除去する工程よりなる、血液製剤中の核酸含有病原体を不活化する方法を提供する。
を含めた、種々の樹脂を本発明で使用できると考えられる。別の具体例において、接触工程は、樹脂を含有するイン−ラインカラムに血液製剤を灌流させることよりなる。さらにもう1つの具体例において、この方法は、さらに、血液製剤をイン−ラインカラムに通した後に、血液製剤をイン−ラインカラムと流体接触したフローアダプターに通すことよりなる。
好ましい具体例において、樹脂をバッグ中のメッシュエンクロージャー内に含有させ、ここに、該メッシュエンクロージャーを血液製剤に適用して樹脂と接触させる。もう1つの具体例において、該方法は、さらに、バッグの外部でそれと接触して設けた区画よりなり、ここに、該区画を適用して血液製剤をメッシュエンクロージャーから分離し、また所定の時間にバッグから取り出す。この方法は、さらに、樹脂含有バッグを振盪デバイスと混合することを含むと考えられる。
もう1つの具体例において、該方法は、さらに、イン−ラインカラムと流体接触して位置した、かつイン−ラインカラムの出力端部の後であって第2のバッグの前に位置したフローアダプターを含む。
ことよりなる。限定されるものではないが、吸着剤、ポリスチレン、ポリアクリルエステル、シリカ、活性炭、およびポリ−(2−ヒドロキシエチルメチルメタクリレート)で被
覆した活性炭を含めた、種々の樹脂を本発明で使用できると考えられる。別の具体例において、接触工程は、樹脂を含有するイン−ラインカラムに血液製剤を灌流させることよりなる。さらにもう1つの具体例において、この方法は、さらに、血液製剤をイン−ラインカラムに通した後に、血液製剤をイン−ラインカラムと流体接触したフローアダプターに通すことよりなる。
別の具体例において、該血液バッグは、さらに、該生体適合性ハウジング外部でそれと接触して設けられた区画よりなり、ここに、該区画を適用して血液製剤をメッシュエンクロージャーから分離し、また所定の時間にバッグから取り出して血液製剤を樹脂と接触させる。さらにもう1つの具体例において、該血液バッグは、さらに、該生体適合性ハウジングと流体接触し、50−100μmメッシュフィルターを有するフローアダプターを含む。本
発明の樹脂は、限定されるものではないが、吸着剤、ポリスチレン、ポリアクリルエステル、シリカ、活性炭、およびポリ−(2−ヒドロキシエチルメトクリレート)で被覆した
活性炭を含めた種々の物質を含むと考えられる。
本発明は、a)生体適合性ハウジング;b)血液製剤からソラレンを除去できる樹脂、該樹脂は該生体適合性ハウジング内に含有され;およびc)該生体適合性ハウジング内の樹脂を保持するための手段よりなる血液製剤のための容器を含む。
また、本発明は、a)生体適合性ハウジング;b)血液製剤からアミノソラレンを除去できる樹脂、該樹脂は該生体適合性ハウジング内に含有され;およびc)該生体適合性ハウジング内の樹脂を保持するための手段よりなる血液バッグを含む。
いくつかの具体例において、容器または血液バッグの保持手段は、生体適合性ハウジング内に配されたメッシュエンクロージャーよりなり、該メッシュエンクロージャーは樹脂を含有し、適用されて血液製剤を樹脂と接触させる。さらなる具体例において、該メッシュエンクロージャーは30μポアよりなる。特別の具体例において、該メッシュエンクロージャーはポリエステルよりなる。
本発明の特別の具体例において、樹脂は吸着剤である。樹脂が吸着剤である場合、それはある具体例ではポリマーよりなる。該ポリマーはさらなる具体例においてポリスチレンであり、該ポリスチレンはなおさらなる具体例において架橋されている。
ある具体例では、アミノソラレンは4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレンである。
で汚染されたことが疑われるイン・ビボ使用を意図した血液製剤を含有する第1の容器を供し、b)ソラレンを第1の容器中の血液製剤に添加して一定濃度のソラレンの溶液を生じさせ、c)該溶液を光活性化手段で処理して処理血液製剤を生じさせ、ここに病原体は不活化され、ここに、少なくとも一部のソラレン濃度は溶液中で遊離しており;次いで、d)処理血液製剤において溶液中に遊離しているソラレンの一部のいくらかを除去することよりなる、血液製剤中の核酸含有病原体を不活化する方法を含む。本発明は、溶液中に遊離するソラレンの特定量の除去に限定されないことを強調する。事実、本発明は、溶液中の遊離するいずれのソラレンの除去も含む。
特別の具体例において、ソラレンは4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルソラレンである。他の具体例において、ソラレンは臭素化される。臭素化ソラレンを用いる場合、臭素化ソラレンは5−ブロモ−8−メトキシソラレンまたは5−ブロモ
−8−(ジエチルアミノプロピルオキシ)−ソラレンであり得る。さらに、ソラレンはい
くつかの具体例では第四級アミンであり、該第四級アミンはなおさらなる具体例において4’−(トリエチルアミノ)メチル−4,5’,8−トリメチルプロラレンである。
剤からソラレンを除去できる樹脂、該樹脂は該生体適合性ハウジングに含有され;およびiii)溶液中で遊離するソラレン濃度の一部のいちいくらかが処理血液製剤において除去されるような条件下で樹脂を生体適合性ハウジング内の保持する保持手段よりなる第2の容器に、処理血液製剤を移行させることよりなる。
いくつかの具体例において、容器または血液バッグの保持手段は生体適合性ハウジング内に配されたメッシュエンクロージャーであり、該メッシュエンクロージャーは樹脂を含有し、適用されて血液製剤を樹脂と接触させる。さらなる具体例において、メッシュエンクロージャーは30αmポアよりなる。特別の具体例において、該メッシュエンクロージャーはポリエステルよりなる。
分離手段、iii)ソラレン、iv)光活性化手段、およびv)ソラレン除去手段を供し、b)血
液をドナーから採血し、血液を該血液分離手段に導入し;c)アフェレーシスシステムで血液から血小板を単離し;d)ソラレンを血液製剤に添加して一定濃度のソラレンの溶液を生じさせ、e)該溶液を光活性化手段で処理して処理血液製剤を生じさせ、ここに病原体は不活化され、ここに、少なくとも一部のソラレン濃度は溶液中で遊離しており;次いで、f)処理血液製剤において溶液中に遊離しているソラレンの一部の実質的に全てを該ソラレン除去手段で除去することよりなる、血液製剤中の核酸含有病原体を不活化する方法を含む。
ソラレンはいくつかの具体例ではアミノソラレンであってよく、他の具体例では臭素化ソラレンであってよい。
ェレーシスシステム、iii)アミノソラレン、iv)光活性化手段、およびv)ソラレン除去手
段を供し、b)血液をドナーから採血し、血液を該アフェレーシスシステムに導入し;d)血小板を含む血小板混合物を生じさせ;e)アミノソラレンを血小板混合物に添加して一定濃度のアミノソラレンの溶液を生じさせ、f)該溶液を光活性化手段で処理して処理血小板混合物を生じさせ、ここに病原体は不活化され、ここに、少なくとも一部のソラレン濃度は溶液中で遊離しており;次いで、g)処理血小板混合物において溶液中に遊離しているソラレンの一部の実質的に全てを該ソラレン除去手段で除去することよりなる、血液製剤中の核酸含有病原体を不活化する方法を含む。
いくつかの具体例では、ソラレン除去手段は、樹脂を含有するメッシュエンクロージャーよりなり、該メッシュエンクロージャーは適用されて血小板混合物を樹脂と接触させる。該樹脂はいくつかの具体例では吸着剤である。樹脂が吸着剤である場合、それはさらなる具体例ではポリマーであってよい。特別の具体例では、該ポリマーはポリスチレンであり、他方、なおさらなる具体例ではポリスチレンは架橋されている。最後に、該樹脂はなおさらなる具体例では湿潤プロセスに付される。
レーシスシステム、iii)合成媒体、iv)血小板収集容器、v)4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’,8−トリメチルプロラレン、vi)光活性化手段、およびvii)ソラレン除去手段を供し、b)血液をドナーから採血し、血液を該アフェレーシスシステムに導入し;c)アフェレーシスシステムで血液から血小板を単離し;d)一定の時間にわたって血小板容器から血小板を収集し;e)合成媒体を血小板容器中の血小板に添加し、それにより、血小板および合成媒体よりなる血小板混合物を生じさせ;f)4’−(4−アミノ−2
−オキサ)ブチル−4,5’−8−トリメチルソラレンを血小板混合物に添加して、一定濃
度の4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’−8−トリメチルソラレン溶液を生じさせ;g)該溶液を光活性化手段で処理して処理血小板混合物を生じさせ、ここに病原体は不活化され、ここに、少なくとも一部の4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5
’−8−トリメチルソラレン濃度は溶液中で遊離しており;次いで、h)処理血小板混合
物において溶液中に遊離している4’−(4−アミノ−2−オキサ)ブチル−4,5’−8−トリメチルソラレンの一部の実質的に全てを該ソラレン除去手段で除去することよりなる、血液製剤中の核酸含有病原体を不活化する方法を含む。
いくつかの具体例において、ソラレン除去手段は、樹脂を含有するメッシュエンクロージャーよりなり、該メッシュエンクロージャーは適用されて血小板混合物を樹脂と接触させる。該樹脂はいくつかの具体例では吸着剤である。樹脂が吸着剤である場合、それはさらなる具体例ではポリマーであってよい。特別の具体例では、該ポリマーはポリスチレンであり、他方、なおさらなる具体例ではポリスチレンは架橋されている。最後に、該樹脂はなおさらなる具体例では湿潤プロセスに付される。
定義 「血液製剤」なる用語は、身体の循環系を通る(赤血球、白血球、血小板等のごと
き)流体および/または関連細胞要素等の全ての処方をいい;血液製剤は、限定されるものではないが、血小板混合物、血清、および血漿を含む。「血小板混合物」なる用語は、細胞要素が一義的には血小板または血小板のみである血液製剤の1つのタイプをいう。血小板濃縮物(PC)は血小板が血漿の正常一部よりも少ない血小板混合物の1つのタイプである。合成媒体は血漿によって通常冷められる容量よりなるものであってよい;例えば、血漿濃縮物は35%血漿/65%合成媒体中に懸濁した血小板を含むことができる。
拘束するいずれのメカニズムもいう。例えば、血小板貯蔵容器内に収容されたメッシュエンクロージャーを用いて、樹脂を容器内の保持することができる。同様に、フィルター(例えば、メッシュフィルター)は血液製剤貯蔵バッグの流入口/流出口ラインに位置させることができる。「流入口/流出口ライン」
なる用語は、血液製剤貯蔵バッグに結合し、それと流体連絡したチューブをいう。バッグに結合された単一の流入口/流出口ラインまたは2以上ラインであってよい。
、流体が1の容器から他の容器に移動するのを可能とする。
特定のタイプのアフェレーシスシステムに限定されるものではないが、本発明は、特に、特定量の所望の血液製剤混合物を収集できる自動システムの使用を含む。
ポリマーの形成において架橋剤として働く。該用語は、過剰架橋ネツトワークが、二官能性剤(後記)で、溶液または膨潤状態で線状ポリスチレン鎖を架橋することによって生じる「過剰架橋」も含む。
水素鎖の全長が2〜20炭素であり、それら炭素の0〜6個は独立にNH又は0で置換されてい
て、各置換点は他の各置換点から少なくとも2炭素によって隔てられており、ソラレンとは少なくとも1炭素によって隔てられている。4-一級アミノ置換ソラレンは、ソラレンの4、5及び8位にさらに置換基を持ってもよく、その置換基としては次の基が挙げられる(
ただしこれらに限らない):Hおよび(CH2)nCH3(ここにn=0〜6)。これに対して、5-一級
アミノ置換ソラレンでは、炭化水素鎖の全長が1〜20炭素であり、それら炭素のうち0〜6
個は独立にNH又は0で置換されていて、各置換点は他の各置換点から少なくとも2炭素によって隔てられており、ソラレンとは少なくとも1炭素によって隔てられている。5-一級アミノ置換ソラレンは、ソラレンの4、4および8位にさらに置換基を持ってもよく、その
置換基としては次の基が挙げられる(ただしこれらに限らない):Hおよび(CH2)nCH3(こ
こにn=0〜6)。
をダイアグラム表示する。
グ設計を示し、他方、立体配置Bは単一−バッグ設計を示す。
ンと新しいソラレン合成方法を示している。新しいソラレンは幅広い種類の病原体に対して効果的である。本発明はまた、in vivoおよびin vitroで使用する保健関連の製品、特
に血液製剤において、血液製剤の機能に著しく影響を及ぼしたりまたは変異原性を与えたりすることなしに、病原体を不活性化するための新しいおよび既知の試薬を使った方法を示している。
製剤中のウィルスを不活性化する方法である。これまでのアプローチに対して、この方法は短い照射時間を要求し、酸素分子濃度を制限することを必要としない。
合物質の光活性化の装置と方法について述べる。本発明は装置中に組み込まれた安価な電磁波照射源をもつ装置を考えている。一般に、本発明はa)少なくとも一つの光反応性物質の光活性化を引き起こす電磁波照射に適した波長を出す方法、b)光活性化の間、整列した複数のサンプルを保持する方法、およびc)光活性化の間、希望する温度範囲の中でサンプルの温度を維持する方法、からなる光反応性試薬を処理するための光活性化装置と考えている。本発明はまた、a)電磁波の照射の蛍光源に対して、一つあるいは多くの光反応性試薬を含んだ複数のサンプルコンテナを保持できる、b)同時に少なくとも一つの光反応性試薬の光活性化を引き起こす電磁波照射を用いた複数のサンプルコンテナへの照射、およびc)光活性化の間に希望の温度範囲の中でサンプルの温度の維持、からなる方法を考えている。
を支える事のできる状態で紫外線照射ができるの安価な供給源、B)素早い光活性化、C)大量のサンプルの処理、D)照射されたサンプルの温度制御、E)固有の安全性、を含んでいる。
トコールで使用することができる。例えば、あるグループは冷却のために、ゆっくりと電気扇風機で風を送りながら、GeneralElectric typeF20T12-BLB fluorescent UVA bulbs
によって上および下からサンプルに照射している。Alter,H.J.,ら.TheLancel.24:1446(1988).他のグループはサンプルを含むペトリ皿のふたにウィルスのサンプルを入れ
て、直接接触するようにP.W.Allen Co.London社製のTypeA405-TLOW/05長波長紫外線ランプを、室温で使用している。
ないときに、その波長(例えば、300ナノメートルで波長をカットオフ)において下限「
カットオフ(遮断)」をもっているという。同様に、照射源が特有の波長(例えば、360nm)より下で照射されているとき、その波長(例えば、360ナノメートルで波長をカットオフ)において上限「カットオフ(遮断)」をもっているという。
活性の進行を波長が320nmより長波長側になるよう制限することが、直接的な核酸のダメ
ージを最小限にする。ヒトの血清または血漿においては、例えば、核酸は典型的な生物構成要素とともに存在する。
切である(芳香族アミノ酸は320nmより大きい波は吸収しない)。
極大がある)、BLBタイプの蛍光ランプは400nmより大きい波長を取り除くように設計されている。しかし、これは単に上端の遮断を行っているだけである。
液は何十時間も高エネルギー源の直接光にさらした後でさえ、初期の伝達能を非常によく保つ。
数の違いによる強度変化が結果として起こるのを回避することになる。
の重要な特徴は、多数のサンプルの処理が可能であるということである。この点で、本発明の装置におけるある構成部品は、多数の血液バッグを保持する役目をする。本発明におけるよりよい実施態様において、サンプルの保持方法は光源の両側に位置した血液バッグサポートを構成する。一般的に使用されている市販のバッグを使用することにより、本発明の装置は多数のサンプルを処理するのに都合よくなっている。
ントロールである。温度コントロールは重要である、というのも、露光する時のサンプルの温度はその結果に劇的に影響を及ぼすからである。例えば、核酸での二次構造を促進する条件もまた、核酸に対する多くのソラレン誘導体の親和性定数を高める。HydeおよびHearst,Biochemistry,17,1251(1978).これらの条件は溶媒構成成分と温度の両方の混ざったものである。一本鎖5SリボゾームRNAに関しては、低温での照射は20℃と比較して4
℃では2倍HMTの5S rRNAへの共有結合的付加が増す。Thompsonら,J.Mol.Biol.147:417(1981).温度による結合促進が報告されているソラレンの結合の増進を引き起こすさら
にそれ以上の温度でも合成ポリヌクレオチドに関して、結合が報告されている。
化合物について熟慮する。
、Amesアッセイにおいては弱い突然変異誘発力をもつ。これについては以下の実験節で記述する。4’-Aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen(AMT)は、3.5DNA塩基対当たり1AMT付加生成物までという条件においては、最も反応性に富む核酸結合psoralen誘導体の一つである。S.T.Isaacs,G.WiesehahnおよびL.M.Hallick,NClMonograph66:21(1984)
しかしながら、AMTはかなりのレベルの突然変異誘発力も示す。8-MOPおよびAMT双方の
最良の特徴、つまり、病原体の完全な不活性化と安全を確保するための低い突然変異誘発力と高い核酸結合性をもつと考えられる、新しいpsoralenのグループが求められた。本発明においては、このような特徴をもつ化合物の設計を行った。
は(CH2)nCH3 n=0〜6のグループに限られたものではない。
物である。ソラーレンの5’位に、1から20個の炭素鎖長からなる炭化水素鎖によってNH2グループがつながっており、これらの炭素のうち0から6個は独立にNHまたは0に置き換わっている。さらに、各置換部位は、他の置換部位から少なくとも炭素二つ分離れており、また、ソラーレンから少なくとも炭素一つ分離れている。5'-Primaryamino-substitutedpsoralensは、ソラーレンの4、4’および8位にさらなる置換があることがあるが
、Hまたは(CH2)nCH3 n=0〜6のグループに限られたものではない。
知られている中間体の新しい合成法とともに考慮している。特に、その新しい化合物とは、mono、di、trialkylated4'-5'-Primaryaminosubstitutedpsoralenを指す。この節で議論されるいくつかの合成過程がFIG.5A-5Fに示してある。参考のため、本明細書で議論さ
れるpsoralen誘導体に対して用いられている学名を、TABLE2に示す。化合物1-18についてはまた、その構造をFIGS.5A-5Fに描いてある。この節(''B.Synthesisofthe Psoralen''
と題する)では、化合物を同定するために使用されるローマ数字はSchematics 1-6のみに
該当しており、Table2およびFIGS5A-5Fの化合物番号には該当しないことに注意すること
。
ったものではないが、tri-およびtetramethyl psoralen、4'-halomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen、および5'-halomethyl-4,4',8-trimethylpsoralenを含む重要な中間体もある。これらの不安定な中間体の調製はなかなかの難題である。
ル化psoralenについて以下に述べる4つのステップで調製することができる。高発癌性で揮発性のクロロエチルメチルエーテルを大量に(20-50当量)用いることによって、5'-TMPは、4'-CMTに転化する。クロロエチルメチルエーテルまたはブロモメチルエチルエーテ
ルを用いた4,5',8-trialkylpsoralenのハロメチル化についてはU.S.PatentNo 4124598,to Hearstで記述されている。臭素化合物である4'-BrMTは同様に、より揮発性の低いブロ
モメチルメチルエーテルを用いて調製される。必要とする中間体はわずか30〜60%の収率で生産できた。5'-chloromethyl-4,4',8-trimethylpsoralen(5'-CMT)および5'-bromomethyl-4,4',8-trimethylpsoralen(5'-BrMT)は、その異性体の4,4',8-trimethylpsoralen(4'-TMP)から生産するという類似した方法で調製した[U.S.patentNo.4,294,822,toKaufman;Mcleodら“ベンゾフラノイドの合成系。I.Furocoumarins、ベンゾフランおよびジベンゾフラン”TetrahedronLetters237(1972)]。
が加えられる場合もあるが、それは必ずしも必要ではない。もしその溶媒として、カーボンアルカライドを還流させて用いたら、4,8-dialkyl-5'-bromometyl-4'-methylpsoralen
(IV)が50%またはそれ以上生産される。もしメチレンクロライドを室温で用いたら、4,8-dialkyl-4'-bromometyl-5'-methylpsoralen(III)のみが80%以上生ずる。その他の溶媒でもベンゾイルの臭素化は起こりえる。その場合、異性体の一つを純品または混合物として生産する。これらの溶媒には1,2-ジクロロエタン、クロロホルム、ブロモクロロメタン、ベンゼンに限定した訳ではない。
示す。その結果として生ずるアリルエステルのクライゼン転移によつて、4,8-dialkyl-6-allyl-7-hydroxycoumarinができる。coumarinはいくつかの以前に書いた方法の一つに類
似した方法をもちいると、4,5',8-trialkylpsoralenに変換される(l,e.,see,Benderら,J.Org.Chem.44:2176(1979);Kaufmann,U.S.PatentNos,4,235,781および4,216,154本明細書で参考として援用)。
じた4,8-dialkyl-7-hydroxycoumarinから2段階のステップで調製できる。coumarinを塩基性の条件下でα-クロロケトンで処理すると、4,8-dialkyl-7-(2-oxoalkoxy)coumarinを生ずる。この中間物から4,4'-8-trialkylcoumarinへの環状化は、アルカリ性に水溶液中で
加熱することにより起こる。
,and withH2NCH2CH2SSCH2CH2NH2(Goldenberg,M.,ら.,“一般的なpsoralen誘導物の
合成と特性”Biochemistry27;6971(1988))核酸光化学反応の原因となる物質は、今ま
で報告されていない。これらの物質の特性は、突然変異によって起こる病気のような、AMTのような以前に調製していた化合物では予期できないものである。
かアセトンのような溶媒中かどちらかで20〜80℃で反応させると(ω-haloalkyl)alkylpsoralenが生ずる。Bは、アルキル鎖(e,g.,HO-(B)-OHは1,3-プロパンジオール)もしくはモノエステル(e,g.,ジエチレングリコール)もしくはポリエステル(e,g.,テトラエチレングリコール)どれかである。
て書いたが、他の方法を考えている。
℃で反応させるとIが生ずる。アミンは、一般的な条件では保護されずにVIIを生成する
(e,g.,hydrazinまたはMeNH2水溶液はphthalimide基を保護しない[benzylhydrazineの
ような高alkyl hydrazineも考えている。])
逆にいうと、構造VIはジアミンNH2-(B')-NH2(構造□)と反応できて、最終生産物として化合物VIIIを生ずる(例えば、化合物8、13および14)。B'は、アルキル鎖(e,g.,1,4,-butanediamine)、モノエステル(e,g.,3-oxa-1,5-pentanediamine)またはポリエ
ステル(e,g.,3,6-dioxa-1,8-octanediamine)を示す。この反応は、アセトニトリル還
流中でジアミンを過剰に加えることで起こるが、他の溶媒や温度でも同様に起こりえる。
のよりもむしろアミノアシル基[NH(CH2)W]で結合したものが望まれる場合もある。このような化合物の合成経路を図3と以下の文に示す。この窒素と末端の窒素の間の結合が、他
に全く窒素が存在せずに(CH2)サブユニットと酸素を含む場合(構造X)(例えば化合物1、5、6、9、10および11)には、その生産物には4'-HATP及び構造IXの適当なジアミンから都合よく調製される。この方法は、構造□のポリアミンから合成される(e,g.,norspermidineあるいはspermine[商業的に有用なものfromAldrich,Milwaukee,WI])窒素を鎖中
に2個以上もつ最終生産物(構造□)にもあてはまる。けれども、この場合は異性体もか
なりの量形成される。構造□の調製のために提案した方法は、構造□のポリアミンとsodiumcyanoborohydrideのような還元試薬でpsoralen-47-alkanal(□)を還元的アミノ化する
。この還元的アミノ化は、化合物Xの合成にも充分適用できる。carboxyaldehyde(構造
□、w=0)は4'-halomethyl化合物の加水分解及び合成された4'-hydroxymethyl化合物のその後の酸化によって、以前に調製されている(Isaacsら,J.LabeledCmpds,Radiopharm,1982,19,345)。これらの化合物も、4'-hydrodo化合物とホルムアミドおよびPOCl3でまたは、ヘキサメチレンテトラアミンを酸中で処理することによって都合よく調製できる。長鎖alkanalは4'-HATP化合物から、末端のhalo基をアルデヒド官能基に置換することによって調製できる(例えば、Durst,Adv.Org.Chem.6:285(1969))。
に示したような誘引されたアミンのその後の放出物、または4'-HATPの例えばNaBH4-CF3CO2Hのようなcyanide化合物への置換のような還元のいずれかによって、これらの化合物(
構造□)(一つの例として化合物3)が調製される。
級アミン基が置換した5'(4または8)-dialkylpsoralenおよび4'に第一級アミン基が置換した5'-alkylpsoralenが得られるかどうかは、議論の余地がある。
5'誘導体の合成これまでに示した条件で、4,4',8-trialkylpsoralenまたは4,4',8-trialkyl-5'-methylpsoralenは5'-(ω-haloalkyl)-4,4',8-trialkylpsoralen(本明細書におい
ては5'-HATFと呼ぶ)に変換される。図式5と以下の文に詳しく示す(SeeKaufman,U.S.PatentNo.4,294,822およびNo.4,298,614)。
への変換が4、4'および/または8位が単に水素で置換された場合におこり、4、4'および/
または8位がアルキル基で置換された場合は5'に第一級アミノ基が置換したdialkylpsoralenおよび第一級アミノ基が置換した-alkylpsoralenへの変換が起こるかは、議論の余地がある。
の物質と似た手法で調製される(図式6を見よ)。上記に示した合成経路と同様にして、alkyl鎖に一つ以上の酸素および窒素が存在する4'-(ω-amino)alkylangelisinおよび5'-(
ω-amin)alkylangelisinの合成法が予想できる。
たら、化合物Xは化合物Yよりも「不活性化効率」が良いことになる。
れる。検査法は、それ以下では「不活性化」が完全に効果的であるとうことを示す、明白
な「限界(閾)」を決定する。測定限界以上では、その方法は、部分的に効果があるとしか言えないであろう。
、検査法とその限界に対する同様の配慮が要求される。再度繰り返すが、「不活性化とは1個体の病原体が複製を不可能にすることを意味する。
との相互作用は特に病原体の複製を防止する。すなわち人が病原体にさらされても感染しない。
流行の出現以前から有用であった。ソラレンに基づく汚染除去は病原体の含有に関係なく、血液供給からすべての伝染性要因を除去する潜在能力を有する。加えて、ソラレンに基づく汚染除去は収集および処理後の血液産物を滅菌する能力を有し、血小板濃縮物においては低いレベルの細菌汚染の問題を解決し、貯蔵期間を引き延ばす結果となった。MorrowJ.F.らJAMA266:555-558(1991);Bertolini F.らTransfusion 32:152-156(1992)
いくつかのソラレン誘導体によって光化学不活性化されるウイルスのリストを表3に示す(Hanson,C.V.Blood Cells 18:7(1992)の表1から)。このリストは包括的ではなく、単にソラレンが不活性化できる病原体の主な種類を示している。本発案は本明細書中に述べられている化合物による、これら、およびその他のウイルスの不活性化を意図する。本
発案の化合物は特にHIVウイルスのようなエンベロープウイルスを不活性化することに特
に適している。
において有用である化合物を評価するために2つの重要な特性が考慮された。すなわち1)病原体を不活性化させる化合物の能力、および2)その突然変異誘発性である。病原体を
不活性化させる化合物の能力はいくつかの方法によって決定し得る。1つの技術はバクテリオファージスクリーンを行うことである。すなわち試験化合物の核酸結合を決定するアッセイである。このタイプのスクリーン、すなわちr-17スクリーンは下記実施例12の項目で詳細に述べる。もしr-17スクリーンで不活性化活性を示すならば、ウイルスを不活性化する化合物の能力の直接試験に有用である。直接的なウイルス不活性化スクリーンを行う1つの方法を細胞を含まないHIVのための下記実施例13の項目において詳細に述べる。
は、不活性化することが大変難しい病原体であると予想されていたからである。それは小さく、一本鎖RNAウイルスである。本発案の作用を決して限定するものではないが、短い
核酸断片を不活性化することは、長い核酸断片を不活性化するよりもソラレン付加物を形成する高い頻度を要求するために難しいと予想されている。さらに一本鎖RNA病原体を不
活性化することはより困難である。なぜならソラレンが二本鎖核酸に対するように塩基対を挿入することができず、また鎖内架橋を行う機能による付加物を形成することができないからである。それ故にR17の不活性化が達成されれば、同条件において多くのウイルス
および細菌の不活性化がもたらされると予想される。
効果的であることを肯定することによって、r-17スクリーンを相補する。それ故に、もし化合物がr-17スクリーンにおいて活性を示せば、次にウイルス不活性化スクリーンで試験される。
イムス試験である。このアッセイはD.M.MaronおよびB.N.AmesによってMutationResearch 113:173(1983)に述べられており、明確なスクリーンは下記実施例17の項目に述べる
。エイムス試験はヒスチジン要求性、および主なDNA修復酵素を欠損させたSalmonellatyphimuriumのいくつかの特異的な株を利用する。細菌をヒスチジン非要求性にする変異の頻度(自発的復帰変異の頻度)は低い。つまり、この試験は化合物の影響を復帰変異の頻度で評価するのである。
物がエイムスアッセイにおいてAMTよりも低い突然変異誘発性を示すならば、新しい化合物は病原体の不活性化に対する有用な薬剤として認定される。
ような合成培地、またはその他の溶媒状態において導入し得る。化合物はさらに、アジュバントの有無に関わらず乾燥形状として供給し得る。
物質とは、下記の実験の項に叙述したエイムス試験において250μM濃度で試験した場合、AMTよりも低い変異誘発原性を呈する化合物と定義される。不活性物質および本件新案の方法が特に有用であるのは、それらが病原体の不活性化効率と突然変異原性とが無関係であることを示唆するからである。その化合物は、突然変異原性の上昇なしに強力な病原体不活性化を呈する。AMTのようなよく知られている化合物が光不活性化プロトコルで試験されたが、これまでは分割できないと思われた病原体不活性効率と突然変異反応の間に、ある関係が認められるようになった。
である。数多くのフィルターがPCs中のWBCsの量を上記で述べた逆反応を生じないレベルにまで減少させるのに首尾よく用いられた。(K.J.Kao,supra(PL-100filters,PallCorp.,Glen Cove,NY)M.Bockら,Transfusion31:333(1991)(SepacellPL-5A,Asahi,Tokyo,Japan);J.Dsweeneyら,Transfusion30:34(1990)(Cellselect,NPBI,Emmer-Compascuum.TheNetherlands;ImmugardIg-500,Terumo,Tokyo,Japan)。不運にも、これらのフィルターはこれら比較的低分子量の化合物が現在のフィルターろ過方法で除去されないのと同様に、ソラレンの光反応産物またはソラレン自身を除去できない。
研究(D)ソラーレン除去装置(E)血漿中のソラーレンの吸着A.血小板濃縮液中のソラーレンの分離 新しいソラレンS-59は、光化学的処理(PCT)の過程内で使用する物質の有力候補である。S-59即ち4-(4-amino-2-oxa)butyl-4,5',8-trimethylpsoralenの化学構造は以下の通りである。
”)を生じる:
反応し、基底状態での複合体(“C:C”)を形成し得る。2つの化合物が反応してできる
これらの自己反応産物は、「光反応二量体」か単なる「二量体」かに言及される。しかしながら、自己反応とは2つの化合物に限られるわけでなく、多量体(三量体など)も形成され得る。
励起状態物質は自己反応のみに限られない。それは、溶媒(“E”)の成分(イオンや気
体など)といった周辺環境と反応し、他の産物を生じ得る。
本件新案および「光反応産物」の理解は、(もしあるのなら)これらの1つの反応が実際におこるかどうかとは無関係である。本件新案は血液成分の光活性化を伴う光反応産物の除去のための方法及び装置についてのみ記述する。μS-59を血小板に添加するとS-59は
迅速に分配され、血漿中のS-59と血小板中のS-59との間に平衡状態を形成する。おおよそ初めのS-59のうち25%が血小板へ分配されるが、その割合は血小板の数及び血小板の生残
性に依存する(死んだ血小板はソラーレンを取り込まない)。さらに、S-59の添加とUVA
照射の間に長い培養時間をもうければ、S-59のおおくが血小板に分配される。血小板に分配されるS-59の量は最終的に、どのくらいの量のS-59が血小板と相互作用し、未反応の光反応物質として残留するかで決まるのである。
内での研究"ClinicalTexicology 30(1)69-82(1992)〕。
アンバーライト樹脂 アンバーライト樹脂は急性の薬物中毒〔J.L.Rosenbaumら,Archives of Internal Medicine136:263-66(1976)〕および肝機能不全〔R.Hughesら,ArtificalOrgans 3(1):23-26(1979)〕の治療に使用されてきた。他にも、アンバーライト吸着剤は最近様々な薬事的応用に使われている。Supelco,Inc.(Bellefonte,PA)はRohnおよびHaas(Chauny,France)が製造したXAD-4TMおよびAmberliteXAD-16TM樹脂を特に薬事的応用のために加工処理した。Supelco,Inc.は、浸出物(e.g.,ジビニルベンゼン、DVB)を除去し
、粒子を最小の直径に制限するために、この樹脂を処理した。最終的にこの樹脂は、遠心機にかけられ、滅菌された(USPXXI)、発熱源のない(LAL)、検出しうる浸出物(DVBおよび
すべての有機物)の含まれていないものとなっている。
社で製造され、米国およびヨーロッパで市販されている。Asahi Medical Co.(Tokyo,Japan)が製造している活性炭を含んだ二種の血液灌流装置は、薬物中毒および肝臓障害の治療のためのFDA,510(k)書類に記載されている。血液灌流装置HemosorbaCH-350の樹脂はとても耐久性があり、低分子の薬物およびPCのような細胞が含まれてる溶液から毒素を除去することを目的として大きな直径の粒子に設計されている。チャーコール吸着剤は普通は石油のピッチから作られ、poly(HEMA)(ヒドロキシエチルメタクリル酸)のような血液融和性の重合体でおおわれている;重合体で覆われることによって血液融和性が増加し、機械の故障の原因となる微小粒子の発生の危険を減らしている。
い)を含む3.0mlのPCに加えた。試料は密閉したチューブで血小板回転機の上で約24時間室温で定温放置した。速度論的測定の結果からは、完全な吸着の平衡は約6時間で得られることがわかっている。定温放置した後に、各チューブ中のPC試料を除去し、それぞれの吸着剤に残っている放射活性を測定した。
スト($/装置)が記載されている。表Bの5番目の欄には、残留のS-59のレベルを30μMから1μMにまで減らすのにかかる樹脂の全コスト($/装置)が記載されている。書き加えておくと、血小板の混合液への照射は光分解反応によりS-59のレベルを150μMから30μMにまでへらすのである。HemosorbaCH-350のコストが計算されている(S350は一つの装置当たり140gの吸着剤を含んでいる)。最後に、NDはその値が決められていないことを示している。
相樹脂の解析も含まれている。
)などの水性の溶液であらかじめ湿らせていない樹脂は好まれないことになる。
バーライト樹脂のS-59の残存レベルは、他のアンバーライト樹脂(AmberliteXAD-2TM、Amberlite XAD-7TM)に比べて十分低い(3倍以上の違いがみられる)。
い、耐久性のある粒子が得られる。前述のように、血液灌流のために開発された活性炭はさらに、重合体で覆われている。そのため血液融和性が増加し、機械の故障の原因となる微小粒子の発生の危険を減らしている。
目標を設定した場合に、S-59の最終濃度は約1mMになる。直線性(Langmuir,低濃度)を仮定すると同時に下記の方程式を用いれば、各樹脂の処理量を試算することができる。
続いて樹脂の処理量を計算する時に、下記の方程式を用いて一定のPC量を処理するのに対して必要とする樹脂量を計算し得る。
ない。
。
装置中に処理後に血小板から吸着剤を除去するため50-100μmのナイロン網フィルターを
付けた調節器または他の濾過装置のような除去装置が含まれる。または、吸着剤を網封入物/小袋に入れ、血小板袋中に入れる方法であろう。実験的に、血小板袋のサイドを細長く切り、網封入物をこの細長い切り口から血小板袋に挿入した後、熱密閉する。このようにして網封入物を血小板袋の中に入れる。しかし、網封入物の大量製造では、血小板袋を固定するかまたは固定しないかどちらかにする。全部の組立品を熱またはγ−照射により滅菌する。
血製品と吸着剤の直接接触といった点が似ている。しかし、この二種類の装置の間に著しい区別が幾つもある。第一、バッチ吸着よりソラレンと光産物の残留レベルが<1%まで下げれるのに対して、流動吸着での場合にはその残留レベルが約5%である。前にも指摘したように、流動型式の場合に、血小板から除去際に接触時間を減少されたため、動力学制限によって、完全な残留ソラレンの除去を妨げる可能性がある。逆に、バッチ吸着で延びた接触時間は除去時にもっと有効な利点である。
少し得る。
パク質を極端に奪うことなくS-59を除去しなければならない。S-59に対する様々な樹脂の選択については、回分での吸着試験(以下の例31参照)及び、凝固時間および凝固因子レベルを処理後の血漿について解析して決定した。使用した吸着剤はAmberliteXAD-4TM、AmberliteXAD-16TM、Hemosorba CH-350TM、BioRad t-butyl HICTM(Macro-Prep)、およびDavisionSilica(Grade15)である。
有し、例えば血清アルブミンや他の血漿タンパク質とS-59や光化学的反応生成物との結合での競合において、回分装置は勝っている。
チック容器(Baxter)に移され、指定された時間(例:血小板シェイカーで8時間以上)保温される。この保温が残存のソラレンおよびソラレン光化学的反応生成物を、血液製剤のヒトへの輸液が可能な十分に低い量まで除去する(S-59の減少)。インキュベートに続いて血液製剤は他の貯蔵容器(例:PL2410プラスチック容器;Baxter)に移され、5日以上かけて輸液をおこなう。略図Dは上述したS-59の減少過程を示す。
剤とRD自体を含んでいる)は輸液のままで保存されうる。
で製造された不活性のポリマーのDowex XUS-43493である。Dowex XUS-43493はOptipore L493として商業的に知られている。
橋されたポリスチレンの構造と特性−ポリマー網状組織の新たな種の第一報"ReactivePolymers13:27-42(1990);Tsyurupaら"超架橋ポリスチレン吸着剤'Styrosorb'による水相からの有機化合物の吸着"ReactivePolymers25:69-78(1995)]。
ら水を取り除いてしまうことである。つまり効果的な吸着のためには照射後の血液産物と接触させる前に細孔を再び湿らせる必要がある。確かに、実験セクションのところで細かく述べるが、もし吸着樹脂が乾いていたなら、吸着樹脂は吸着能力の大部分を失うのである。
一群のRD(メッシュバックおよび小袋で吸着性を保持している。)を想定している。本発明はメッシュ小袋が医薬的等級のポリエステル小袋の織物で組み立てる事を想定している。ポリエステル小袋は製品化された血液濾過装置として使われる標準的な原料です、つまりこのように1群のRDで使うのには特別に良く適合するのもである。いくつかの会社で製品化されているメッシュ原料に限らずTetko,Inc.(Depew,NY)およびSaati(Stamford,CT)は一般に本発明に適しているメッシュ小袋を製品化されている。
ると信じられてきたが、別のサイズの穴を持つ原料は現在の発明の範囲にある。しかしながら小さな穴(例えば5μm)を上回る原料はRDの出入流動性の動きを禁止する。(つまり吸着性小袋を含んでいる。)またそれらによって吸着性処理において決定的効果がある。そのため約10μmから50μmが優先的な範囲である。
小袋を吸着剤で満たした後、超音波溶接はオープンした端をシールするのに使われる。(つまり長い切れ込み)もし望むならシールされた小袋の吸着剤はその時湿気いるかもしれない。DowexXUS-43493は効率的な実行には再湿気を要求しないけれども、望むなら最初に血小板が吸着剤と結合したときガスを止めるのを阻害したりまたは最小限にしたこのステージでは再び湿気ているかも知れない。
させる必要はない。
きです。
の親油性相互作用の実行であると考えられる。このように非常に極性のソラレンは親油性吸着剤と親和性が減少するので、除去しにくくなりうる。実験のセクションで詳しく述べるがHPLC保持時間は親油性の粗い目安として使われる。さらに親油性に加えて別のファクターがソラレン吸着に影響を与える。例えば、ソラレンは血液産物にある細胞または血漿タンパク(例えば精子のアルブミン)と相互作用しうる、つまりこれらの競争相互作用は理論的に樹脂結合とソラレン除去に干渉することができる。
クションに含まれるFactorVIII、つまり逆にこれらの化合物は薬理学、放射線学または同様の処置を行われ、およびその後ドナーまたは別の物に戻される。
ある化合物およびドナーから戻された別の化合物など多様な化合物から分離の手続を広く参照する。ドナーは化合物の除去による量や圧力のロスのために補償をたすけるための再流入過程の間、代替液体を受け取る。透析センターや血液バンクに含まれている間、採血は多くの出入の忍耐を実行する。
集められた化合物の血漿)のいくつかの特定のタイプがある。
回収された血液は手動で分離され(例えば、遠心分離を行い)、保持されないであろう成分を手動で再び提供者へ戻された。反対に、近代的な自動的な方法は手動方法のように労力を強いることなしに、希望の成分の素早く正確になった。自動アフェレシスはアフェレシス単位またはアフェレシスシステムとして典型的に引用されただけでなく、ヘムフェレシスまたはプラズマフェレシス単位、細胞分離機、または血球のプロセッサとして知られる装置を利用している;将来、これらの機械は「アフェレシスシステム」と呼ばれることになるだろう。
ている。例えば、米国特許第5,112,298 Princeらでは、はじめにアフェレシス システム
の主たる構成およびそれらの操作方法を記述し、そして流体の単純化された分離についてのシステムを記述している。同様に、本明細書中で参考として援用する米国特許第5,147,290Jonssonでは、溶血性フェレシス、例えば血小板フェレシス、に対する方法および装置について述べ、そしてアフェレシスの一般的な原理へおかれた。アフェレシスシステムの操作の簡単な概観は本発明のある側面を理解するのを助け、以下に規定する。
および処置をするために提供者またはヒトへつながれる。
上記のように、チュービングおよび他の成分のネットワークは、フェレーシスセットを作成する。2つの主なタイプのフェレーシスセットがあり、閉鎖型と開放型とがある。閉鎖型フェレーシスは、自己拘束形である。すなわち、このセットは、セットの構成要素(収集バッグ、針および抗凝固剤含有バッグおよび生理食塩水含有バッグ)のすべてがすべて互いに接続されて購入される。開放フェレーシスは、通常、上記の構成要素のすべてまたはほとんどを含むが、其の構成要素は結合していない。開放フェレーシスセットは、閉鎖セットに比べて安いが、閉鎖型アフェレーシスは、閉鎖型の自己拘束ではないので、汚染の機会が減ることから、血液製品の貯蔵期間が増大するという利点がある。例示すると、血小板のような輸血血液製品は、通常、閉鎖系では5日間保存されうるが、これらは、開放型では24時間までしか保存され得ない。
C.アフェレシスシステムと連結するソラレン汚染除去とソラレン除去装置本発明はソラレン汚染除去およびソラレンシステムを用いたバッチRDの使用を考えている。いくつかの工程を下にまとめているが、本発明はアフェレシスシステムの操作へバッチRDを一体化した多くの独特の方法に制限されていない。以下につづく考察を理解することを助けるために仮想のアフェレシスシ
ステムの操作をまとめた流れ図をSchematicEに描いている。Schematic Eにおける流れ図はアフェレシスシステムの実例となるデザインを通じて、流体の流れを描いていて、実際のアフェレシスの工程を描くつもりはない。当業者は、アフェレシスの工程が、 SchematicEで示したものよりも、異なる流体の流れ道および異なる構成部品または構成部品の配置換えを含んでいるかもしれないことを評価している。
赤血球、血小板および血漿のような、さまざまな成分に分離する。
から、細胞収集線532を通して、収集コンテナ538(例えば、血小板保存コンテナ)へ回収される。類似の方法で、血漿は血漿ポンプ526によって遠心分離器から、血漿収集線522を通して、血漿収集コンテナ528へ回収される。残りの成分は返還線542を通して提供者へ返還される。流体の置換は置換流体コンテナ558から置換流体ポンプ556を経由して返還線542に流体接触している置換流体線552へ回収される。コンピュータ制御機550はポンプを監
視および制御し、流体体積、汚染物質、および同類のものを監視するさまざまな素子をつながれているであろう。
)として商業的に入手可能である。当業者はこのシステムの特異的な特徴およびその操作の機構(下にまとめてある)で有名で;しかしながら、アフェレシスシステムの実例となるデザインに対して上で記述した基本的な機構および構成部品は、このシステムと同様適用できることを留意するべきである。
うにPASを加えられる。PC/PASIII溶液はS-59で混ぜられ、適したコンテナで照らされる。PCはRDをもったコンテナに加えられ、S-59と光生産物の除去に必要な時間反応させ、そして血小板保存コンテナへ輸送される;生じたPCは血小板保存コンテナから容器へ送られる。
れ、視野の制限として説明されない。
ドロキシエチルメタクリル酸塩);PC(血小板濃縮物);PT(プロトロンビン時間);aPTT(活性化部分トロンボプラスチン時間);
TT(トロンビン時間);HSR(低張性のショック応答);FDA(UnitedS tates Food and
Drug Administration);GMP(;DMF(Frug Masterfiles);SPE(SolidPhase Extraction);Asahi(AsahiMedical Co.,Ltd.,Tokyo,Japan);Baker(J.T.Baker.Inc.,Phillipsburg,NJ);Barnstead(Barnstead/ThermolyneCorp.,Dubuque,IA);Bio-Rad(Bio-RadLaboratories,Hercules,CA) ;Eppendorf(EppendorfNorth America Inc.,Madison,WI);GraceDavison(W.R.Grace & Co.,Baltimore,MD);NIS(Nicolet,aThermo Spectra Co.,SanDiego,CA);Rohn and Haas(Chauny,France);Sigma(SigmeChemical Company,St.Louis,MO);TosoHaas(TosoHaas,Montgomeryville,PA);Wallac(WallacInc.,Gaithersburg,MD);YMC(YMCInc.,Wilmington,NC);DVB(ジビニル ベンゼン);LAL(LimulusAmoebocyte Lystate);USP(UnitedStates Pharmacopeia);EAA(エチルアセトアセテート);EtOH(エタノール);HOAc(酢酸);W(ワット);mW(ミリワット);NMR(NuclearMagneticResonance;Varian Germini 200MHz Fourier Transform Spectrometerで室温で得られたスペクトル);m.p.(融点);UV(紫外線);THF(テトラヒドロフラン);DMEN(Dulbecco'sModifiedEagles Medium);FBS(胎児の牛血清);LB(Luria Broth);EDTA(エチレン ジアミン 4酢酸);PhorbolMyristateAcetate(PMA);リン酸緩衝食塩水(PBS);AAMI(Association for the Advancement ofMedicalInstruments);ISO(International Standards Organization);EU(エンドトキシン単位);LVI(大容量注射できる);GC(ガスクロマトグラフィ);M(メガ-);kGy(1000Gray=0.1MRad);Mohm(Mohm); PASIII(血小板を加えた溶液III);RD(除去装置);SCD(滅菌接続装置)。
る。
KCl 0.2g、1mM MgCl2(6H2O)0.203g、5.6mMグルコース1.0g、1mg/ml牛血清アルブミン
(BSA)(Sigma,St.Louis,MOより入手)1.0g、および20mMHEPES(Sigma,St.Louis,MOより入手)4.8gを含んでいる。
るかどうか測定するための一つの例として使われる。PCRはクローニングまたは精製する
ことなしに染色体DNAの混合物中の目的配列のセグメントの濃度を増加させる方法である
。本明細書中で参考として援用するK.B.Mullisら米国特許第4,683,195および4,683,202を参照してください。目的配列を増幅するこのプロセスは希望する目的配列を含むDNA混
合物へ大過剰の2つのオリゴヌクレオチドプライマーの導入からなり、続けて、DNAポリ
メラーゼ存在下での正確な作用順序の熱サイクルを行わせる。
、高濃度の必要な標的配列の増幅断片が得られる。必要な標的配列の増幅断片の長さはプライマー同士の相対的な位置によって確定され、この長さは調節できる要素である。プロセスが繰り返されるという理由で、この方法は発明者から”PolymeraseChain Reaction”と呼ばれている。標的配列の必要な増幅断片が混合液中で優位な配列(濃度に換算し
て)になるため、それは”PCRamplified”と呼ばれた。
ダイゼーション、ビオチン化させたプライマーとの結合のアビジン-酵素との結合に依る
探知、32PでラベルされたdCTPやdATPといったデオキシヌクレオチド3リン酸との結合)
で探知できる程度にまで、ゲノムDNAの特異的な標的配列の単一コピーを増幅させること
ができる。ゲノムDNAに加え、どんなオリゴヌクレオチド配列も適切なプライマー分子の
組によって増幅させることができる。
のPCRのサイクルの数(n)と複製の効率、それは各々のサイクルのプライミングと伸長の効率である、に関係がある。増幅は高濃度のPCR産物が得られるまではEnの形に従うことが観察されている。
ヌクレオチドプライマーがより長鎖のPCR産物の相補鎖と転置するためである。10-8を超
える濃度ではプライミングの反応中に二本の相補的なPCR増幅産物がお互いを認識する確
率は十分速くなり、このことはPCR法の伸長のステップ以前か、あるいは同時におこる。
このことは、ついにはプライミングの減少、そしてサイクルの効率の低下を引き起こす。連続したPCRのサイクルはPCR産物分子の増加を減退させる。PCR産物はついには一定の濃
度になる。
前述のように、すでにある発明では光反応性の核酸結合複合体の光活性化のための装置と方法を熟慮している。この例では、すでにある発明の方法による血液製剤の除染に関して記述されている。この装置はa)少なくとも一つの光反応性複合体を活性化
させるのに適切な波長の電磁気の放射を供給する装置、b)光活性化の間、放射を供給す
る装置との固定された関係の中で血液製剤の複数性を維持するための装置、そして(c血
液製剤を光活性化に望ましい温度範囲内の温度に維持するための装置からなる。
間で多数表示された血液製剤を含んでいる装置(102)の上や下に位置するバルブの整列
を含んでいる。プレートの集合(103,104)は後にさらに詳しく描かれている。
(101)からの放射を抑えている。放射の間、使用者は紫外線が届かない安全な観測点(106)から装置が動いていることを確認することができる。
ものを含むコントロールボード(107)上の幾つかの電子部品のための台としての役割をもっている。簡単のために、電源スイッチはカウントダウンタイマーつなぐことができ、それは同様に時間メーターや電磁気放射源を並列に結ぶことができる。カウントダウンタイマーは使用者が希望の露光になるように照射時間を先にセットすることを可能にする。
な最小レベルよりも下回る前に変更する。
のバルブの配列を取り巻いている。血液製剤を含む装置(102)はプレートの集合の上(103)や下(104)に位置する。各々のプレートの集合は上部(103A,104A)や下部(103B
,104B)のプレートの集合からなる。プレートの集合(103,104)は、血液製剤を含む装置によって適応するように設計されたヒンジ(109)によって接続されている。上部のプ
レートの集合(103)は下部プレートの集合(104)の下部プレート(104B)によって支えられている血液製剤を含む装置の上部のちょうど上に残りをもってくる。
た装置(102)(例えば、TefronTMプレートretunit bags)はバルブ(101)の上の固定された位置にある。血液製剤の温度はファンのみ、あるいはできれば冷却源(notshown)
に冷却入力(114)出力(115)孔をもった熱交換器によってコントロールできる。
望ましい装置の温度コントロールの方法をよりはっきり示している。上部のプレートの集合のプレート(103A,103B)と、下部のプレートの集合(104A,104B)は各々temperaturecontrolchamber(103C,104C)につながっている。ファン(112)はchambers(103C、104C)の中や間に空気を循環させることができる。
り抜ける(103A,103B,104A,104B)。
4'-Bromomethyl-4,5',8-trimethylpsoralenの合成この例では4'-Bromomethyl-4,5',8-trimethylpsoralenの3段階の合成について書かれている。この合成はbromomethylationのステップなしで行われていて、既知の合成ステップよりも安全である。
を取り除くため、固体は1.2Lの水でかき混ぜられ、ろ過され、母液のpHが中性(pH5-7)
になるまで洗浄された。褐色のろ過物は沸騰したメタノール(150mL)に溶かされ、濃い
ペースト状になるまで冷やされ、大半の褐色の不純物が取り去られるまで氷冷したメタノールが洗浄され、黄白色の固体である4,8-dimethyl-7-(1-methyl-2-oxo)propyloxy-coumarin(産物67.7g,99.0%)を生じる。
混合物は室温で冷やされた。固体はろ過され、母液が無色でpHが中性(pH5-7)になるま
で冷水(1.5L)で洗浄された。生成物は、空気と真空で乾燥され4,4',5',8-tetramethylpsorarlen(56.3g,89.5%)の白色固体が生じた。
は室温でメチレンクロライド(180mL)に溶かされた。N-Bromosuccinimide(8.09g,45.3mmol)が加えられ反応混合物は4.5時間撹拌された。溶媒は完全に取り除かれ、生じた固体は0.5-1時間水(200mL)と混合され、ろ過され、副生成物のsuccinimideを取り除くために低温で水(約500mL)を加えてすり潰された。粗生成物(すなわち4'-Bromomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen)はP205と共に真空デシケーターで乾燥され、最小限のトルエン(200〜300mL)によって再結晶化され4'-Bromomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen(10.2g)の淡黄色の固体が生じた。母液は取り除かれ、再びトルエンで再結晶化され2次的な生成物(1.08g)を生じた。
5'-bromomethyl-4,4',8-trimethylpsoralenの合成この例では5'-bromomethyl-4,4',8-trimethylpsoralenの3段階の合成について書かれている。例2に書かれた合成と同様、この方法はブロモメチル化を必要としないため、既知の合成から改良された。
4'-(4-amino-2-oxa)butyl-4,5',8-trimethylpsoralenHydrochloride(化合
物2)と関連化合物(化合物4)の合成この例では化合物2の2つの合成方法が書かれている。化合物2はまたS-59として知られており、下およびFIG.40で描かれている化学構
造をもっている。第一の方法は次に示したとうりである:ステップ1:4'-Bromomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen(3.09g,9.61mmol) 、(合成法は例2で書かれている)とN-(2-hydroxyethyl)phthalimide(4.05g,21.2mmol)は無水のジメチルホルムアミド(65mL)中でかき混ぜられた。反応混合物に乾燥したN2ガスが穏やかに通気された。反応混合物は100℃で4.5時間熱せられ、室温まで冷やされ、数時間冷凍庫に入れられた。結晶状の生成物はろ過され、MeOHと水で洗浄された。不純物を取り除くために、固体はさらにMeOH(100mL)で滴定された。粗生成物は風乾され、CHCl3(150mL)中で溶かされた。活性化炭素とシリカゲルが、脱色するため、そしてCHCl3を完全に除くために加えられた。生成物は白色でステップ2:4'-[4-(N-phthalimido)-2-oxa]butyl-4,5',8-trimethylpsoralen(1.56g,3.61mmol)は室温でテトラヒドロフラン(75mL)に懸濁された。
された。酸性の懸濁液は40mL CHCl3で3回洗浄され、20% NaOH水溶液でpH11にされた。CHCl3(3×60mL)が生成物(すなわち4'-(4-amino-2-oxa)butyl-4,5',8-trimethylpsoralen)を塩基性の層から抽出するために用いられた。CHCl3の層はH2O(100mL)で洗浄され、無水Na2SO4と凝縮によって濃縮され、4'-(4-amino-2-oxa)butyl-4,5',8-trimethylpsoralen、mp139-141℃が生じた。純度はNMRで99%以上であった。
溶かされ、1.0MHClのエタノール溶液(10mL)が加えられ、懸濁液は冷蔵庫で一晩冷やさ
れた。ろ過とエタノールに依る洗浄の後、固体は淡黄色の結晶(生成物0.76g,62%)mp235-236℃が生じるまで真空乾燥された。
。2時間の加熱後は白色の懸濁液ははっきりしたライトイエローの溶液に変化していた。アセトンとエチレングリコールはローターエバポレーターで取り去られ、残留物には水(50mL)が加えられた。生じた懸濁液はろ過され、冷水で洗浄され、真空オーブンで乾燥させられて574mg(96%)の4'-(4hydroxy-2-oxa)butyl-4,5',8-trimethylpsoralenが生じた。
)はテトラヒドロフラン(10mL)によって溶かされた。トリフェニルフォスフィン(1.59g,6.08mmol)と6滴の水が前述の溶液に添加された。室温で一晩かき混ぜられた後、ラ
イトイエローの溶液は濃縮された。残留物はCHCl3(90mL)に溶かされ、0.3NHCl水溶液(30mL,then 2×5mL)によって抽出された。
5'-(4-Amino-2-oxa)butyl-4,4',8-trimethylpsoralen(化合物18)
この例では化合物18の合成について書かれている。アセトニトリル(130mL)
中でかき混ぜられているN-methylformanilide(16.0mL,0.134mol)溶液にphosphorusoxychloride(12.5mL,0.134mol)そして4,4',8-trimethylpsoralen(5.0g,21.9mol)が加えられた(describedinMeLeod,et al.,Teirahedron Letters No.3:237(1972))。psoralenの添加中は、アイスウォーターバスを使用して温度は0-10℃に保たれた。懸濁液
はdrieritedrying tubeによって湿度から守られながら50℃で2日かき混ぜられた。反応
混合物は室温まで冷やされ、そしてアイスウォーターバスで冷やされた。
撹拌した。橙色の固体を濾過して取り除き、冷水および氷冷したアセトニトリルで洗浄した。粗生成物は再結晶化し、ジクロロエタン(600mL)を用いて炭色を脱色し、黄色から橙
色の4,4',8-トリメチル-5-ソラーレンカルボキシルオキサイド(3.59g,64.0%)を得た。
度のエタノール中で撹拌した。sodiumborohydrideを加え、スラリーを一晩撹拌した。氷
冷水(150mL)と10%炭酸ナトリウム水溶液(50mL)を反応停止のために加えた。45分間撹拌
した後に沈澱物を濾過除去し、濾過液が中性(pH5-7)になるまで水で洗浄した。生成物は
五酸化二リンで減圧乾燥され、薄黄色の5'-ヒドロキシメチル-4,4',8-トリメチルソラレ
ン(7.46g,98.5%)、融点244-245℃、を得た。1HNMR(CDCl3);
氷水中で冷却した、ジクロロエタン(500mL)に5-ヒドロキシメチル-4,4,8-トリメチルソラレン(15.42g,59.7mmol)を溶解したスラリーを、一滴ずつ三臭化リン(6.17mL,65.7mmol)に加えた。
中で、一時間撹拌した。固形物を濾過により除去し、乾燥させた後、温めたトルエンに溶解させ、縦に溝を付けた濾紙で濾過した後に蒸留して、揮発成分を取り除くと5'-ブロモ
メチル-4,4',8-トリメチルソラレン(3.43g)が得られた。反応溶媒(ジクロロエタン及び水)は分離し、水層を三倍量のジクロロエタンで抽出した。有機層を混合し塩類溶液で洗浄
した後、乾燥させ(無水硫酸ナトリウム)減圧下で蒸留すると、薄黄色の固形物、5'-ブロ
モメチル-4,4',8-トリメチルソラレン(13.13g、複合収率86.4%)の大部分を得た。融点
に通しながら溶解させた。ヨウ化ナトリウム(0.01g,0..067mmol)と5'-ブロモメチル-4,4',8-トリメチルソラレン(1.00g,3.11mmol)を加え、スラリーを、同様の条件下で、一晩撹拌した。濃い黄色の反応混合液を室温にまで冷却し、更に氷水浴により冷却した後濾過し、氷冷メタノールで洗浄することにより、粗生成物(1g)を得た。固体を、ジクロロエタン(100mL)中で再結晶化させると、生成り色(オフホワイト)の固体、4,4,8-トリメチル-5-[2-(N-フタルイミド)-2-オキサ]ブチルソラレン(0.68g,50.8%)が得られた。
を蒸留し、残留物は希塩酸とジクロロメタンに分配された。
ブチル-4,4',8-トリメチルソラレン(0.71g,63.4%)、融点126-129℃が得られる。
を再度活性炭で脱色し、蒸留し、白い固体、5'-(4-アミノ-2-オキサ)ブチル-4,4',8-トリメチルソラレン塩酸塩(0.39g,49.3%収率)、融点235-236℃、を得た。(注:この物質の
他の方法で調製すると、固有のNMR値の他に、明らかに融点が低い生成物をもたらす)。1HNMR(d6-DMSO):
実施例 6
4'-(7-アミノ-2,5-オキサ)ヘプチル-4,5,8-トリメチルソラレン塩酸塩の合成(化合物7) この例においては、化合物7の合成について詳述する。4-(7-アミノ-2,5-オキサ)ヘプチル-4,5,8-トリメチルソラレン塩酸塩は四段階からなる。
乾燥して、残った薄い茶色のシロップ状の液体[4-(7-メタンスルホニルオキシ-2,5-オキ
サ)ヘプチル-4,5,8-トリメチルソラレン];437mg(76%)を得た。
s
ルコールで8時間環流した。
たトリクロロエタン層を水で洗浄し、無水流酸ナトリウムで乾燥後、濃縮、減圧乾燥し63.9mgの生成物、4-(7-アミノ-2,5-オキサ)ヘプチル-4,5,8-トリメチルソラレン(56%)を得た。TLCでは単一スポットのみが確認された。
4-(12-アミノ-8-アザ-2,5-ジオキサ)ドデシル-4,5,8-トリメチルソラレンジヒロドクロリド(化合物8)の合成 4-(12-アミノ-8-アザ-2,5-ジオキサ)ドデシル-4,5,8-トリメチルソラレンジヒロドクロリドは、例5、方法2、ステップ2からの、一つの(1)段階から合成される。8mLのアセトニトリルに溶かした4-(7-メタンスルホニルオキシ-2,5-オキサ)ヘプチル-4,5,8-トリメチルソラレン(108mg,0.253mmol)を、2.8mLのアセトニトリルに溶かした1,4-ジアミノブタン(132mg,1.49mmol)溶液にゆっくりと加えた。8時間環流した後では、初発物質はTLCで確認されなかった。反応混合液を室温にまでさまし、トリクロロメタン(25mL)と1N水酸化ナトリウム水溶液(25mL)を加えた。反応液はいく層かに分離しており、トリクロロメタン(2×10mL)を用いて水層を洗浄した。塩酸水溶液(0.3N,3×10mL)を用いて、混合した有機層から生成物を抽出した。塩酸層をpH13になるまで20%水酸化ナトリウム水溶液で処理した。その後、混合した塩基性層を、トリクロロメタン(3×20mL)で抽出した。トリクロロエタン層は、飽和水酸化ナトリウム水溶液(10mL)で洗浄し、
無水流酸ナトリウムで乾燥させた。濃縮後、減圧乾燥させると、63mgの4-(12-アミノ-8-
アザ-2,5-ジオキサ)ドデシル-4,5,8-トリメチルソラレンジヒロドクロリドが得られた(60%)。
4'-(2-アミノエチル-4,5,8-トリメチルソラレン塩酸塩(化合物3)の合成4'-(2-アミノエチル)-4,5,8-トリメチルソラレン塩酸塩の合成は一段階(1)からなる:sodiumtrifluoroacetoxyborohydrideは、2mLのTHFに溶かしたトリフルオロ酢酸(296mg,2.60mmol)を、2mLのTHFにsodiumborohydride(175mg,4.63mmol)を懸濁した物に加え、室温で10分以上撹拌することにより生成した。合成懸濁液を、2mLのTHFに4'-シアノメチル-4,5',8-トリメチルソラレン(Kaufmanetal.,J.Heterocyclic Chem.19:1051(1982))(188mg,0.703mmol)を溶かした懸濁液に加えた。
、生じたアミンを抽出した。混合したトリクロロメタン層を飽和塩化ナトリウム溶液で洗浄した。アミンは0.3Nの塩酸(10mL,5mL,5mL)で抽出し、酸性層に20%水酸化ナトリウムを加え、pH13にした。トリクロロメタン(3×10mL)で、混合した塩基性層からアミンを抽出
し、水(2mL)で洗浄後、無水硫酸ナトリウムで乾燥させた。濃縮し減圧乾燥させたアミン
は、NMRで95%以上の純度で固体として得られた。
4'-(6-アミノ-2-アザ)ヘキシル-4,5',8-トリメチルソラレンDihydrochloride
(化合物6) 4'-(6-アミノ-2-アザ)ヘキシル-4,5',8-トリメチルソラレンDihydrochlorideの合成は次に示すように1段階からなる:30mLのアセトニトリルに溶かした4'-クロロメチル-4,5',8-トリメチルソラレン(188mg,0.68mmol)を、7mLのアセトニトリルにとかした1、-ジアミノブタン(120mg,1.4mmol)に加えた。一晩撹拌した後、減圧下で、溶媒を除去した。4-クロロホルム(10mL)と1N水酸化ナトリウムを残留物に加え、混合物を振とうし、分離した。水溶液は2×10mL以上のトリクロロメタンで抽出し、混合した抽出物を水で洗浄
した。生成物をトリクロロメタン溶液から0.3N塩酸水溶液で抽出し、酸性層に濃い水酸化ナトリウム溶液を加えpH12にした。塩基性の懸濁液を水で洗浄したトリクロロメタンで抽出し、硫化ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮すると遊離塩基であるアミンが得られた。
合物6が得られた(55%)、融点290℃(分解)。分析結果より、C19H26C12N2O3・H2O:C,54.42;H,6.73;N.6.68。Found:C,54.08;H,6.45;N.6.65。
(分解)。この合成においてエチレンジアミンはジアミンとして用いられた。
ここでは、1,5-ジアミノペンタンをジアミンとして用いた。
5'-(6-アミノ-2-アザ)ヘキシル-4,4',8-トリメチルソラレンジヒロドクロリド(化合物17)
5-(6-アミノ-2-アザ)ヘキシル-4,4,8-トリメチルソラレンジヒロドクロリドは次に示
す一段階で合成された:30mLのアセトニトリルに5-クロロメチル-4,4,8-トリメチルソラ
レン(190mg,0.68mmol)を溶かしたものを、7mLのアセトニトリルに溶かした1,4-ジアミノブタン(120mg,1.4mmol)溶液にくわえた。
のトリクロロメタンで抽出し、混合した抽出物を水で洗浄した。生成物はトリクロロメタン溶液から0.3N塩酸水溶液で抽出し、酸性層は、濃い水酸化ナトリウム溶液でpH12にした。塩基性の懸濁液を水で洗浄したトリクロロメタンで抽出し、硫化ナトリウムで乾燥させ、減圧下で濃縮した。
無水エタノール(〜6mL)に溶かした遊離塩基を塩酸エーテル溶液(1.0M,3mL)で処理した。生じた塩酸塩を濾過し、無水エタノールで洗浄した後減圧乾燥させると100mg(36.3%)の生成物、5-(6-アミノ-2-アザ)ヘキシル-4,4,8-トリメチルソラレンジヒロドクロリド、融点288℃(分解)を生じた。
実施例 11
4-(14-アミノ-2,6,11-トリアザ)テトラデシル-4,5,8-トリ
メチルソラレンテトラヒドロクロリド(化合物15) 4-(14-アミノ-2,6,11-トリアザ)テトラデシル-4,5,8-トリメチルソラレンテトラヒドロクロリドの合成は次に示すように一段階
からなる。10mLのメタノールにスペルミン(Aldrich,Milwaukee,WI)、0.5g(2.5mmol)を
溶かした溶液を、4,5',8-トリメチルソラレン-4カルボキシアルデヒドを0.128g(0.5mmol)、NaBH3CNを20mg(0.3mmol)及び3mLのメタノールを含む5N塩酸メタン溶液(濃塩酸をメタ
ノールで5Nになるように希釈した)がpH5-6になるように添加した。反応混合物を室温で
撹拌した。5N塩酸メタン溶液をpHが2未満になるまで加えたのち、減圧下でメタノールを除去した。残留物を約100mLの水に溶かし、トリクロロメタンで25mLで3回洗浄した。水溶液は濃水酸化ナトリウムでpHが10より高くなるように加え、トリクロロメタンで25mLで3回洗浄した。これら最終抽出物を回収し、水で洗浄し乾燥させ(硫酸ナトリウム)、吸引するとのアミンがNMRで95%以上の純度で得られた。NMR(CDCL3):
遊離アミンを無水エタノールに溶かし、塩酸(無水エチルエーテルに1Nになるように加えたもの)を加えた。塩酸塩を濾過し、無水エタノールで洗浄し、室温で減圧乾燥し80.2mgの生成物4-(14-アミノ-2,6,11-トリアザ)テトラデシル-4,5,8-トリメチルソラレンテトラヒドロクロライドを明るい黄色の固体として得た。
ここでは、r-17バクテリオファージ検定を病原体の不活性化効率を予測する目的及び、本発明における化合物への光回復時の核酸の結合を測定するために用いた。r-17バクテリオファージ検定では、バクテリオファージを検定物質を含む溶液中に加え、光を照射した。バクテリアへの感染力および生育阻害能を測定した。検定物質によって受けた核酸の損傷を正確に反映する培養液生育阻害ような、相対的に影響を受けやすい核酸のために、バクテリオファージを集めた。核酸の検定物質への結合調べるバクテリオファージ検定法は、効果的に病原体を不活化するような化合物を特定する、安全で安価な方法である。これまでの実験では、r-17検定法は、同様な化合物に対するHIV-1の感受性正確に
測定できることを示している。
入手可能;8-MOPはSigma,St.Louis,MOから商品として入手可能)試験管を実施例1に詳述したような光照射装置中におき、1分から10分間光を照射した。滅菌した13mLの希釈用試
験管を用意した;各々の化合物は1本の0.4mLのLuria液体培地(LB)と0.5mLのLBを含む5本
の試験管が必要とした。希釈するために光り照射したファージ溶液0.100mLずつと試験化
合物を、最初の0.4mL培地の入った希釈用試験管に加え、この溶液0.020mLを次の0.5mLの
培地の入った試験管に加えた(1:25)。引き続き、2番目の溶液を1:25の希釈率で希釈した
。
前に光照射しなかった“dark”コントロール。
実験について示している。1-3の実験(値を太字で表記)について、対照実験の値と比較す
ると、“UVonly”も“dark”対照実験どちらとも、バクテリアの有意な死滅を示すにはいたらなかった(多くとも、“UV only”で.3死滅対数、“dark”で.1死滅対数)。
たところ、一貫して有意な死滅数を示さなかった。(データ不記載)。
“UV only”は、この実施例ですべての実験を行ってはいるが、続く表及び図には示していない。“dark”対照実験に関しては、ここに示した種々の化合物について何度か実験を試みた結果、4位の基質の種類に関わらず、暗所では実験的に有意なバクテリアの不活化
は認められないことが明らかになった。(データ不記載)。例えば、表5において、実験1では化合物1は暗所において.1死滅対数を示した。これとは対照的に、化合物1に1分間光を
照射すると、力価は6.7対数より大きく下落している。それゆえに、その他の化合物につ
いては“dark”対照実験を行わず、また、行った場合でも以下に示す表および図に結果は記載していない。
において活性があると証明された。Table7では、本発見化合物1が8-MOPよりもずっと高いR17不活性化効果を表すことが明らかである。Table7およびFIG.6で示されるように、化合物1は、本発見化合物のうち、劣活性である化合物の1つである。化合物2および3はどち
らもそれぞれの濃度において化合物1よりも高い対数不活性を示す。これらの結果は、本発見化合物が、一般に8-MOPよりもずっと高い活性があることを支持する。
ている。
化合物を任意の濃度で加え、サンプルを激しく懸濁した。その後、サンプルに1.0J/cm2の間隔で、3.0J/cm2に達するまで照射した。その間、それぞれ間隔は1.0J/cm2である。それぞれのサンプルから100μLを取り、初めの対応する希釈チューブに入れ、その後この実施例の前に述べたようにそれぞれの分析する化合物に対し、3照射線量すべてで5つの連続した希釈を行った。
おいて、AMTと比較できることを示している。さらに、化合物6(FIG.11),10(FIG.12),12(FIG.13),15(FIG.14および17),および化合物17(FIG.15)は、すべてR17の不活性化
においてAMTよりも効果的である。
本発見化合物それぞれの、病原体不活性化効果は、cell-freevirus(HIV)
を不活性化するという化合物の能力を試験することで評価した。cell-free HIVの不活性
化は、次のように行った。
挙された濃度で、総量が0.5mLになるようにHIV-1株に加えた。HIV株(105-107plaqueformingunits/mL)は、DMEM/15%FBS中にあった。0.5mLの分析分割液を24穴のポリスチレン組織培地プレート中に置き、320-400nm(20mW/cm2)で、実施例1の装置に類似する装置にて1分間照射した。ここで用いられた光活性化装置は、あらかじめ分析され、実施例1の装置と比較できる光照射であると分かった。(データは示していない。)コントロールは、HIV-1株のみ、HIV-1にA紫外線のみ加えたもの、HIV-1に、A紫外線なしで、分析されるそ
れぞれのソラレンの、最も高濃度のもののみを加えたものである。照射後、サンプルはすべて、微力価プラーク分析により、感染力を分析するまで、-70℃で凍結保存した。
し、培養した。
で述べられていた。)分析培地は、1mLにつき100μgのストレプトマイシン、100Uのペ
ニシリン、50μgのゲンタマイシン、1μgのアンフォテリシンBを含む85%DMEM(高濃度の
グルコースを含む)、15% FBS、および1mLにつき2μ□のポリブレン(Sigma Chemical Co.,St Louiw,Mo.)であった。不活性化処置からの分析サンプル、およびコントロール
サンプルを、50%分析培地、および50%標準凝集血漿で希釈した。続いて、サンプルを96穴プレート(CorningGlass Works,Corning,N.Y)で直接希釈した。プレートを振動撹拌器
で30分混合し、5%CO2の大気中において37℃で1から18時間インキュベートした。MT-2細胞[NationalInstitutesof Health AIDS Research and Reference Reagent Program,Rockville,Md.より手に入れられる(カタログ番号237)クローンアルファ-4]を一つの穴につき80,000細胞の濃度になるようにそれぞれの穴に加えた。さらに1時間5%CO2中37℃で
インキュベートした後1.6%Sea Plaqueアガロース(FMC Bioproducts,rockland,Maine)を含み、あらかじめ38.5℃に暖められた分析培地をそれぞれの穴に加えた。それぞれのプレートにたまるまで、プレートを数分間37℃で保ち、その後、10℃に冷やされた遠心機においてプレート上で600xgで20分間遠心した。遠心において、細胞層は、アガロース層の
ゲルよりも上に形成した。プレートを5% CO2中37℃で5日間インキュベートし、リン酸緩
衝液塩類(PH7.4)中の50μg/mLのプロピディウムイオダイド(SigmaChemical Co.)を0.05mL加えることで染色した。24から48時間後、プレートを8,000μW/cm2304nm紫外線光
機器(Fotodyne,Inc.,NewBerlin,Wis.)に置くことで赤く蛍光染色された微プラークが目に見えるようになった。立体顕微鏡により、x20からx25の倍率で、プラークを数えた。結果を下のTABLES10および11に示す。数値“n”は、分析の平均の数を表している。
る。事実、64μM、あるいはもっと高濃度の化合物に対するデータでは、化合物2および3
は、以前最も活性のある抗ウィルス性のソラレンであると考えられていたAMTよりもずっ
と活性があることを支持している。より低い濃度では、化合物6は、AMT(32μMで2.5対数)よりもずっと高いHIV対数(32μMで3.1対数)を殺し得る。TABLES9に列挙された他の化合物は、AMTと等しい範囲での不活性化効果を示す。
この例は、本発見化合物を用い、B型肝炎ウィルスのモデルとしてアヒルのB型肝炎ウィルス(DHBV)を不活性化する手法を記述している。
遠心によりウィルスと分離した。DHBVを含む上清を、0.5%ドデシル硫酸ナトリウム、20mMトリス緩衝液(PH8.0)、5mMEDTAを含む緩衝液中において、50μg/mLのプロテイナーゼKで、55℃で一晩消化した。サンプルを、フェノールクロロホルム、およびクロロホルム、続いてエタノール沈殿により抽出した。その後、精製されたDNAを、それぞれのサンプル
から、106のDHBVゲノムを最初に投入したPCR増幅反応にて用いた。PCR増幅断片は、DCD03/DCD05(127bp)、DCDO3/DCD06(327bp)およびDCD03/DCD07(1072bp)のプライマーの組を用いて生じた。PCRは、0.2mMの各デオキシリボヌクレオチド5三リン酸、0.5mMの各プライマーおよび100mLの反応液につき、0.5unitsのTaqポリメラーゼを含む標準PCR緩衝液
中で行った。30サイクルの増幅を、次の温度特性、すなわち、95℃30秒、60℃30秒、72℃1分で行った。十分な長さの生成物を生じさせるために、増幅の後、72℃で7分間インキュベートした。生成物を検出し、その量を測るために、[ラムダ-32P]dCTPを、100mLにつ
き10mCiの量で加えた。生成物を、変性しているポリアクリルアミド平板ゲル上で、電気
泳動により分離し、数えた。与えられた反応でのシグナルの消失は、DHBVを実際に不活性
化していることを指し示すと受け取った。
。ところが、ソラレンなしのサンプルは、強いシグナルを与えた。AMTは、70,および100mMのレベルで、1072bpの断片のPCR増幅を阻害する。しかし、AMTを最終濃度35mMで用いた
際には、シグナルは検出し得た。
例13では、本発見化合物の、DMEM/15%FBS中において、ウィルスを不活性化
する能力について分析した。この例では、本発見化合物の方法が、どんな特別なタイプの培地にも限定されないことを見るために、100%の血漿、およびよりすぐれた合成培地の両方の中で、化合物を分析した。
は、FL20を修正したTeflonTM、あるいはTeflonTMMinibags(AmericanFluoroseal Co.,Silver Springs,MD)に入れ、FIGS.18および19で示す化合物のうちの1つで、示す濃度で処理し、その後、例1の装置と類似の装置で、320-420nm(20mW/cm2)で、5J/cm2(血小板サンプルに対し)または2J/cm2(85%のSterilyteTM3.0に対し)照射した。ここで用いら
れた光活性化装置は、あらかじめ分析され、例1の装置と比較できる光照射内であると分
かった(データは示していない)。本発見化合物で処理されたサンプルにおける残存HIV
感染力の測定のための分割液を回収し、培養した。
ーは、あらかじめ、内側をシリコンで覆ってあった。血小板濃縮液を、下のTABLES10および11で列挙された化合物のうちの1つで、表に列挙された濃度で処理し、例1の装置と類
似の装置で、320-420nm(20mW/cm2)で、1分間照射した。ここで用いられた光活性化装
置は、あらかじめ分析され、例1の装置と比較できる光照射内であると分かった(データ
は示していない)
。本発見化合物で処理されたサンプル中での、残存HIV感染力の測定のための分割液を
回収し、培養した。残存HIV感染力は、血漿と、85%のSterilyteTM3.0のサンプルに対し、MT-2感染力分析を用いて分析した(先の例13にて詳述、および以前Hanson,C.V.,etal.,J.Clin.Micro28;2030(1990)で述べられている)。その結果を、FIG.18、および19に示す。
化において効果的であることを支持している。FIG.18、および19を比べると、不活性化曲線は、同じ様であり、64μMの化合物濃度で、およそ5対数の不活性化を達成している。
しかしながら、合成培地中では、血漿中で同じ不活性化を達成するために要求されるよりも弱い2J/cm2,3J/cm2,の照射でのみ不活性化が起こった。従って、そのデータから、合成培地は、本発見の不活性手法を促進することが明らかである。
この例では、本発見化合物を縛っている光活性化核酸による細菌の不活性化を続いて複製するという細菌の能力の作用として測定した。グラム陰性菌を、不活性化することがもっと困難である細菌種の代わりとして選んだ。
養した。610nmで10Dが、5x10colony forming units(cfu)/mLに相当する。1:10の培地の希釈液を、分光光度計(Shimatsuにより製造された)で測定した。細菌培地を、DMEM中15%の牛胎児血清の溶液に、最終細菌濃度がおよそ106/mLになるように加えた。分析化合
物の保存溶液の分割液(0.004-0.040mL)を水の中に用意し、エタノールとジメチルスル
ホキシドを0.80-8.0mMでチューブに加えた。化合物は、16mMの濃度で分析した。チューブを、例1で述べたような光機器の中に置き、1.3J/cm2,1.2J/cm2,および最後に2.5J/cm2で、総量が5J/cm2となるように照射した。それぞれのパルス期間の後に、分析するために150μL取り除いた。無菌の13mLの希釈チューブを用意した。それぞれの分析化合物に、0.4mLのLB培地の入った1本のチューブと、0.5mLのLB培地を含む4本のチューブが必要である。希釈液を作るために、照射されたファージと分析化合物の溶液の分割液0.050mLを0.5mLの培地の最初の希釈チューブに加えた。その後、この溶液の0.050mLを、0.5mLの培地の2番
目の希釈チューブに加えた(1:10)。その後、2番目の溶液を、続けて残りのチューブ内で(1:10)で希釈した。100μLの元のサンプルとそれぞれの希釈液を別々にLBアガープ
レート上にまき、37℃で一晩インキュベートした。colonyforming unitsを明朝数え、光
処理後残っているファージの力価を希釈率にもとづいて計算した。
は行わなかった。
析する化合物に対する殺対数は次のようであった。8-MOP-1.9対数、AMT-5.2対数、化合物2->5.5、化合物6->5.5。これらの結果から、本発見化合物が、AMTおよび8-MOPのどちらよりも、グラム陰性菌の不活性化においてより効果的であることが明らかである。
上述の例において、本発明のpsoralenは細菌(Pseudomonas)、バクテリオ
ファージ(R17)およびウイルス(HIVおよびDHBV)のような病原体を不活性化するのに効果的であることが示された。本発明の化合物が病原体を不活性化するどんな方法に対しても制限はなく、不活性化は光に誘導されたpsoralenの病原体の核酸への結合に起因するということが信じられている。すでに論議されたように、AMTはその病原体を不活性化する
効果と、暗下、低濃度で伴っている突然変異誘発性の働きの両方で知られている。比べて前に調査された8-MOPのような活性の低いpsoralenは、意義深いことに突然変異性が低い
。この例では、光結合と突然変異原性が、本発明の化合物において関連のある現象ではないということを確立する。本発明のpsoralenは、最小の突然変異原性のみを発揮するのだが、例外的な病原体不活性化効率を持つ。
異原性試験に対して使われた手順は、Maron,D.M.B.N.Ames,MutationResearch 113:173(1983)に正確に従われた。各手順の簡単な説明をここに紹介する。試験菌株TA97a,TA98,TA100,TA102,TA1537およびTA1538はDr.Amesより頂いた。TA97a,TA98,TA1537およびTA1538
は、フレームシフトの試験菌株である。TA100およびTA102は、塩基置換の試験菌株である。受け取り次第、各菌株は、菌株に特異的な遺伝子型を確かにするため、様々な条件下で培養された。
異なるタイプの変異を含んでいるので、その生育にヒスチジンを要求する。ヒスチジンの変異に加え、これらの試験菌株は以下に述べる他の変異を含んでおり、これらの変異はそれらの突然変異原の検出能を大いに増加する。
ースプレートに筋状に撒き、それからビオチンとヒスチジンを補った最小グルコースプレートに筋状に撒くことにより試験した。
オレットで浸した滅菌フィルターペーパーディスクを各プレートの中央に置いた。37℃で16時間培養した後、プレートが得られ、rfamutationを確かにする、細菌の生育が見られ
ない明瞭な領域がディスクのまわりに見られた。
トのさらされた側に殺菌ランプを照射して菌株を栄養寒天培地上に筋状に撒くことにより試験した。培養後、プレートの、UV照射から保護された側にのみ生育が見られた。
ースプレート上に筋状に撒いた。プレートを、37℃で16時間培養した。この菌株はpAQ1プラスミドを持っているようで、普通の増殖を示した。
ートのアジ化ナトリウム)。
ルチャーを必要な数の滅菌試験管にそれぞれ加えた。
よびリン酸ナトリウムバッファー(Sigma,St.Louis,Missouri)
を加えた。試験管のもう半分には、S-9混合物(the S9 samples)の代わりに、0.5mLの0.2Mリン酸ナトリウムバッファー(pH7.4)を使用した。最後に、0,0.1,0.5,l.5,10,50,100,250または500μg/mLの各試験化合物を含む試験溶液0.1mLを加えた。その0.7mLの混合
物を混合し、それから37℃で20分間振とうし、前培養した。振とう後、ヒスチジンとビオチンを補った2mLのmoltentop agarを、その0.7mLの混合物に加え、即刻最小グルコース
寒天プレートに注いだ(基本培地の量は20mLだった)。そのtop agarを固まらせるため30分間放置し、それからプレートを逆さにして、37℃で44時間培養した。培養後、各プレートの復帰突然変異体のコロニーの数を数えた。結果は、以下のTABLE12(A)-18(B)に示してある(nは各データポイントで行われた実験の回数を表す。)。
示すAMTの応答より、充分下であった。
実施例15において、本発明の化合物が、合成培地中で病原体を不活性化させる能力を示した。この例は、合成培地および本発明の化合物が、血液中で病原体を不活性化するため採用され、使用されるかもしれない方法を述べている。図20Aは、現在、血液銀行で使用されている標準的な血液産物分離アプローチを概略的に示している。血液移動セット(200)(例えば、商業的にBaxter、Deerfieldから入手可能)を作製するため、三つの袋を曲げやすいチューブで統合している。
、CLX bag from Cutter)。
この例は、血小板作用における本発明の化合物および方法の影響の評価を含んでいる。血小板生存能力および作用の四つの指標が使用されている。つまり、1)GMP−140の発現、2)pHの維持、3)血小板の凝集、4)血小板の数。
結合抗体またはアイソタイプのコントロールマウスIgGを含むHEPES緩衝液に加える。
変化させ得る。Moroff,G.ら、“20−24℃で血小板濃縮液の貯蔵の間、pHの変化に影響を与える因子”Vox Sang.42:33(1982)。血小板が正常に作用するpHの範囲は、約6.0−6.5から7.6である。Stack,G.およびE.L.Snyder、“血小板濃縮液の貯蔵”Blood Separation andプレートlet Fractionation 99,at 107(1991)。pHを測定するため、CIBA−CORNING 238 pH/血液ガス分析器(CIBA−CORNING,Norwood,MA)を用いた。
することに用いた。試料は血液銀行の塩類溶液で1:3に希釈した。
血液の除染の次にin vivoに使われた優先化合物は、レシピエントの血液に変異原性であるべきではない。この実験の第一部において、アミノメチルトリメチルソラレンとの比較して遺伝毒性レベル決定するために幾つかの化合物審査した。第二部では本発明のいくつかの化合物のin vivoのclastogenicityが、マウスの網状赤血球における微小核形成を検索することによって測定した。
定着液に懸濁した。定着液の三度の交換ののち、すべてのフラスコ由来の細胞を用いて、風乾させたスライドを調製した。それぞれのフラスコ由来の初期のスライド上での細胞密度と中期の品質を位相差顕微鏡を用いて観察し、少なくとも2つの適切な細胞密度のスライドを各フラスコから調製した。スライドは3%Giemsaで20分間染色し、脱イオン水中で洗浄し、キシレン中に通した。カバーガラスはパーマウントに取り付けた。スライドはそれぞれの試験化合物の濃度が毒性量を表す濃度を決定することに使用した。
)致死投与量に至る(4)投与量が5g/kgが投与される、まで投与量レベルを増加して、実験
を繰り返した。化合物2,6,17および18のそれぞれを用いた評価においては、骨髄毒性あるいは微小核形成のいかなる兆候も見られる前に実際の致死投与量に到達した。その実験結果を上の表20に表した。表から明らかなように、試験した投与量でどの化合物も骨髄毒性は観察されなかった。それぞれの化合物で処理した網状赤血球の割合の値は陰性対照の値に近いままであった。
減少を表している。どの化合物もclastogenic作用を現さなかった。
実施例13内で、本発明の化合物および手法を用いて、無細胞系HIVウィルス
の不活性化を示している。この実施例は、本発明の化合物を用いてもまた細胞に随伴したHIVの不活性化を示している。
レプトマイシンおよび9%ウシ胎児血清(IntergenCompany,Purchase,,N.Y.)を追加した
高グルコースDulbecco Modified Eagle Mediumで継代した。継代は、3×105から4×105細胞/mlの密度への交換し、その約4日後、3.3%の炭酸水素ナトリウムを適宜添加し、週に一度培養液を交換した。不活性化の手順で、培地交換後3日の細胞を用いた。400g×10分で
培養液を固化し、培養上清を捨て、細胞を1から5日令のヒト血小板濃縮液(PC)(PH7.5-6.5)へ2×106細胞/mlの濃度になるように再懸濁した。等量のPC感染細胞懸濁液は、ソラレンの非存在の暗対照、ソラレン非存在のA紫外線のみの対照、ソラレン存在の暗対照、およ
び、ソラレン存在およびA紫外線実験試料のために調製した。それぞれの水中のソラレン
濃縮フィルター滅菌保存液を最終濃度が150μMになるように適当に希釈した(10mMの化合
物18の保存液は67倍に希釈し、2mMの化合物2の保存液は13倍に希釈した)。室温で30分平
衡化させたのち、0.5mlそれぞれの暗対照を凍結バイアル中に置き80℃で暗中に保持した
。一方がバッグのポリプロピレン部分に連結されたプラスチック製の使い捨て10mlシリンジを経由して、紫外線A照射のために、8mlのソラレン非存在の分割量と8mlのそれぞれの
ソラレン含む分割量を、改良Fl20 TeflonTMバッグ(総表面積が92cm2に改良された、The West Co.,Phenixvill,PA)に導入した。これは0.17cmの平均経路長であった。バッグは実施例1に記述されている装置で、バッグ内をおおよそ22から25℃に維持するために、4℃に設定された循環冷却水槽に連結し、総照射が3joles/cm2になるように照射した。照射中、バッグの内容物はバッグ上の残りの使われない部分から新しいシリンジで吸引し、分析するまで凍結バイアル-中に置き80℃で暗中に保持した。
に、HIV微小溶菌斑評価で滴定した。血ぺいの除去の後、目標体積の4mlの塗布が望まれるから、過剰の試料(6ml)はポリプロピレンチューブに移し、最終体積が60mlになるよう
に試行して希釈し、不活性化の手順から対照の試料は、50%評価培地と50%の通常のヒト貯血漿に希釈した。試料は直接96ウェルプレート(CorningGlassWorks,Corning,N.Y.
)に段階的に希釈した。プレートは発振振動器で30秒間混合し、1から18時間5%CO2存在下でインキュベートした。MT-2細胞(0.025ml)[clonealpha-4,(Catalognumber 237)Natinal Institutes of Health AIDS Research andReference ReagentProgram,Rockvills,Md
から入手可能]は1ウェル当たり80000細胞の濃度になるように添加した。追加の37℃で5%CO2下でのインキュベーションののち、1.6%SeaPlaqueagarose(FMC Bioproducts,Rockland,maine)を含み38.5℃にプレインキュベートされた0.075mlの評価培地をそれぞれの
ウェルに添加した。プレートは、いくつかのプレートが蓄えられるまで37℃に2、3分間保
たれ、あらかじめ10℃に冷却した遠心器で600g,20分間プレート台で遠心した。遠心器内で、アガロース層のゲル化に先立って細胞単層が形成した。プレートは5日間37℃で5%CO2下でインキュベートし、リン酸緩衝塩類液(pH7.4)中の50μg/mlのpropidiumiodide(SigmaChemical Co.)0.05mlをそれぞれのウェルへの添加することで染色した。24から48時間後、800μW/cm2304nm UV light box(Fotodyne,Inc.,NewBerlin Wis.)上でプレ
ートを置くことで赤色蛍光微小溶菌班は可視化された。プラークは立体顕微鏡で20倍から25倍の倍率で計数した。結果は以下に示した。化合物2(150μM)
は6.7log以上のHIV(log滴定を6.1plaqueforming units/mlで開始して0logの暗および
明対照の不活性化と比較した)3joles/cm2の照射後不活性化した。同一濃度と同一照射時
間で化合物18は7.2log以上のHIV(0logの暗対照、0.1logの明対照、開始滴定は6.6)
を不活性化した。この実施例は本発明の化合物が細胞に随伴したウィルスの不活性化に効果的であることを支持するものである。
この実施例には以下のinvitroの血小板機能評価1)pHの維持、2)血小板凝集
(“Agg”)および、GMP140発現、により測定される、新しい合成培地の調合が含まれている。
経路を用いて約9.4mlの残りの血漿から出発して、血漿はユニットから圧搾された。
血小板を再懸濁するために穏やかに混合した後、そのユニットを一時間放置にあてた。0.6mlの懸濁液へ2.4mlの血漿を添加しその全内容物をTeflonTMminibagへ移した。再構成されたユニットには翌日pHや他の試験を施し、以下の結果を得た。
5日後、以上に書かれた試験のバッテリーを用いて血小板の機能を評価した。
それぞれの合成培地の調合結果は以下の表3に示した。
グルコースを含まない合成培地(即ちS2.19)よりよく血小板の機能が保持されているこ
とが明らかとなった。
上の知見を確認するため、これらの調合と同様にグルコースの存在しない調合(3.0およ
び4.0)で試験を繰り返した(「n」試行回数)。血小板の機能は貯蔵の前後の両方で試験し、光除染と連結した。結果の要約は以下の表4,5および6に示した。
S-59の血小板への分配の吸着速度上の効果先に述べたように、血小板によるS-59の捕捉は、飽和が起こる前に数時間以上起こりうる。図25Aは、(C0=50μM)時間内の血小板への捕捉(上)または時間内の血小板による放出(下)されるS-59を図的に描写している。上のグラフに示したようにS-59の平衡はおおよそ2時間で到達される。
ない吸着データを表し、円と破線でプレインキュベートした吸着データを表している。その結果は血小板のS-59のプレインキュベーションが認識しうる緩やかなバッチ吸着を導かないことが示唆された。バッチ吸着速度は血小板のソラレン捕捉によって逆に影響されるように見えない。しかし、流動吸着器は、もっと短い接触時間をしている。図25Aに示さ
れたデータは、血小板の内部からのからのS-59の短い所在時間での機器内でのS-59の除去の主要な限界となり得るということをが示唆された。
残余S-59及び、S-59流動吸着により照射されたPCおよび照射された血漿由来の光産物の除去流動実験は、特別な80μmナイロンメッシュフローアダプターと適合するPharmacia C colum(borosilicate glass)(Pharmaciabiotech,Inc.,NJ)で行われた。それぞれの実験の前にカラムは滅菌したレジンで調製し、滅菌したPASIIIで洗浄した。血小板は35%血漿65%PASIII中で150μMのS-59と共に調製し、大きなPL-2410血小板保持バッグ中で3.0J/cm2照射した。照射の次に血小板は、S-59吸着器を通過する前に少なくとも1時間撹拌した。血小板混合液は、流速が実際に制御しうるようにぜん動ポンプで流した。血小板ユニットが1つのPL2410バッグから滅菌吸着カラムを通じて別のPL2410カラムに汚染せずに移るように滅菌連結部位は使用した。洗浄した血小板混合物の試料を残余のS-59および光産物をHPLCを用いて分析した。加えて、ユニットはPL241バッグで保持され、保存をして血小板機能を観測した。
とは血小板からS-59および光産物の輸送はS-59吸着に主に動力学的に抵抗性であるとを示している。図26で、35%血漿、65%PASIII中の血小板には四角で、一方で35%血漿、65%PASIIIに対するデータは円で示している。三角はAmberchromcg・161(直径120、ポリスチレン5g/300ml)によるS-59吸着の残余レベルを示唆する。
流動吸着に続く血小板の機能この実験は血小板の機能の研究及び凝固因子の研究が含まれている。血小板は流動吸着器を通過してPL2410血小板維持バッグ(Pharmacia
C colum:Pharmaciabiotech,Inc.,NJ)に回収された。
が行われた。処理されたものと、コントロールとの差において、重要な違いは観察されなかった。最後に、特筆すべきことは、これらの実験は標準的なAmberliteレジン(レジン
はSupelco,Inc.によって処理されていない)で行われた。Supelco,Inc.によって除かれた浸出物の洗浄過程では、血小板機能に対する実質的な影響は、試験管での測定では現れていない。
回分での吸着作用による、照射されたPCからの残存しているS-59及びS-59光化学反応生成物の除去 回分での吸着作用による、照射されたPCからの残存しているS-59及びS-59光化学反応生成物の除去の実験がなされた。1ユニットの新鮮な血小板(35%血漿/65%PASIII)が150uM3H-S-59を注入され、PL2410バッグ(Baxter)に移された。そのバッグは3.0J/cm2で照射され、照射されたPCは0.67gの吸着剤AmberliteXAD-4またはAmberliteXAD-16が入っているPL2410バッグに20mL等量ずつ移された(10g/300mL)。それらのバッグは、血小板インキュベーターに移された。それぞれの吸着剤によって処理される血小板ユニットは、2つの処理方法によって処理された。一方のユニットは、血小板が吸着剤
と3時間よく接触され、その後分離されて別のバッグに移された。もう一方の血小板ユニ
ットは吸着剤と接触されてから4日間そのままにされた。各サンプルは、処理前のユニッ
ト、吸着剤と接触されてから3時間のユニット、4日間おかれたユニットから除去された。サンプルは、S-59残存率と血小板機能が分析された。S-59残存率の結果は、TableFに要約されている。
(約18%)、血小板高分子(約15%)及び水と入れ替わった3H(約10%)に相当する。高分子と水に関する残存放射能(43%)は、4日間処理されていたサンプルの残存量によく
一致する。水によるものに対する高い概算、もしくは実際のS-59と電子対を共有する血漿高分子の除去のどちらかによって、吸着後のPCに見られる残存放射能レベルが低いと思われる。
回分での吸着作用による、照射されたPCからの残存しているS-59およびS-59光化学反応生成物の除去 回分での吸着作用による照射された血小板混合物からの残存しているS-59及びS-59光化学反応生成物の除去の実験がなされているこのエキザンプルは、エキザンプル26から継続している。35%血漿/65%PASIIIに解けている1ユニットの新鮮な血小板にS-59を150uM注入し、PL2410血小板貯蔵バッグで3.0J/cm2で照射した。照射された血小板混合物は、AmberliteXAD-4と接触された(10g/300mL)。
照射されたPCのHPLC解析20mLの35%血漿/65%PASIIIに、AmberliteXAD-16及びHemosorbaCH-350をそれぞれ接触させ、4日間反応させ、HPLC解析を受けた。FIG28Aは、照射された35%血漿/65%PASIIIの処理されていないもの(吸着剤なし)(図上)、0.033g/mLのAmberliteXAD-16で吸着処理後のもの(図中央)、および0.033g/mLのHemosorbaCH-350で吸着処理後のもの(図下)のHPLCクロマトグラムの図である。
も除去するのが困難なようにあらわれているが、おそらくモル基準で1%以下のもとのS-59を表している。FIG28.Aの解析によると、大きなピーク(保持時間=3分)の減少が示しているように、HemosorbaCH-350は、光化学反応生成物と同時に混合物も除去することを示
している。故にHemosorbaCH-350は、栄養分などの必要な混合物の除去により血小板機能
に対する影響がより大きくなる可能性がある。
る。クロマトグラム中で、S-59に相当するピークは、照射されていないS-59(図上)およ
び照射されたS-59(図中央)における、保持時間が約12分の地点に存在する。クロマトグ
ラム中で、照射されたS-59(図中央)の他のピーク(約3分地点のピークは除く)は、照
射中に形成されたS-59の光化学反応生成物に相当する。特筆すべき事は、(t)=18分および(t)=20分におけるピークは血漿関係のものでS-59とは関係がないことである。下のパネルにおけるS-59の光化学反応生成物のピークが残っていないことからS-59及びその光化学反応生成物は、完全に除去されたことがHPLCによる解析では示された(HPLCでは検出できなかった)。AmberliteXAD-4によって処理されたもののクロマトグラムの解析では、ほとんどのS-59およびS-59光化学反応生成物が吸着されたことを示している。
回分での吸着作用後の血小板の機能1ユニットの新鮮な血小板(35%血漿/65%PASIII)に150uM S-59が注入され、PL2410バッグに移された。バッグが3.0J/cm2で照射され、照射されたPCを20mL等量ずつ、0.67gの吸着剤を含んだ小さなPL2410バッグに移された。吸着剤としては、AmberliteXAD-4、AmberliteXAD-16、Amberlite 200及び標準的な活性炭が使われた。小さなポリPL2410バッグは血小板シェーカーで22℃で保存された。それぞれの吸着剤において、血小板ユニットを2つに分けて処理された。それぞれの組において、一方は吸着剤と3時間接触させた後、吸着剤のない血小板バッグに移された。も
う一方は4日間を通して吸着剤と接触され続けた。
コントロールには、PCD処理されていて吸着剤が含まれていないPC(no-adsorbentcontrol)と処理されていないPCが含まれた。それぞれの血小板機能測定の結果はTableGにある
(Table Gの“*”は反応時間が3時間であることを示す。)。
よい血液融和性の特徴を持っていることを示している。Amberlite XAD-4及びAmberliteXAD-16に処理されたPCは、PCD処理された吸着剤のないコントロールに比べて低いレベルの
活性であった。そのうえ、5日間吸着剤と接触させ続けたAmberliteXAD-4及びAmberlite XAD-16両サンプルは、同じサンプルで3時間接触させ続けたものに比べ低いレベルの活性であった。AmberliteXAD-4及びAmberliteXAD-16とpcとの接触時間が延びることが、血小板機能に悪影響を及ぼすことはないことをこの観察は示している。
Table Hでは、AmberliteXAD-4での吸着実験と同じバッチからのものを使用しての試験管
測定の付加的データが示されている。血小板機能に対する悪影響はないことが再度示された。
れはSupelco,Inc.によって処理されていないということです。試験管での測定で示されているように、Supelco,Inc.によって除かれた浸出物の洗浄過程では、血小板機能に対する
実質的な影響は現れていない。
血漿のフロー吸着この用例では、流動除去装置を用いた血漿サンプルからのプソラーレンの除去について述べている。血漿中では、吸着というのは血小板からのS-59の輸送に依存しないので、滞留時間は他の血液製剤(例えばPC)ほど重要ではない。
れた。結果をFIG.29にグラフで表している。FIG.29では、カートリッジに注がれたS-59を注入した血漿の量の機能として吸着しない(ブレイクスルーとして示している)S-59の割合を示している。この研究は100%血漿中の未照射のS-59で行われた(150μM)。予想どおりに、S-59の吸着が少ないほどカートリッジを流れる流速は高い。
血漿の回分吸着後の凝血因子分析血漿製剤に使用した吸着剤は、凝血カスケードで重要な蛋白質のレベルを下げることなくプソラーレンをのぞくこともできなければならない。この実施例ではバッチ吸着実験を行うことによって、および処理した血漿の凝血因子及び凝血時間のレベルを分析することによって、S-59に対する様々なレジンの選択性を分析した。
ブは室温で3時間穏やかに撹拌した。血漿サンプルは吸着剤を固定したままにしておくことによって、またはサンプルを0.2μmのフィルターで濾過して吸着剤を除くことによって得られた。血漿サンプルの標準凝血分析をUCSFHematologyLaboratory(San Francisco,CA)に委託した。分析はフィブリノーゲンレベル、因子Vレベル、因子VIIIレベル、因子IXレベル、activatedpartialthromboplastin time,prothrombin time,thrombin time
,およびrestoceutin levelについて行われた。TableIでは血漿分析のデータを要約して
いる。すべてのFIG.30A-30Dにおいて、ある凝血機能の反応を指標としてのS-59 PCDおよ
びS-59の除去の影響をグラフで表している。TableIにおいて、+S-59/+UVAと表示しているのは、3J/□の紫外線照射をした150μMのS-59を含む血漿サンプルから得られたデータで
あり、さらにPTはprothrombintime、aPTTはactivated partial thromboplastin time、TTはthrombintimeを示している。
およびUVAで処理したものであるが、吸着剤とは接触していない。因子V、因子VIIIの活
性はS-59での処理前の血漿サンプル中では抑制された。このことはS-59での処理は原因ではなかったことを示している。AmberliteXAD-4およびHemosordaCH-350は検査されたどのパラメータにもほとんど影響を及ぼさず、最良の結果を示した。因子IXのレベルは両方の場合で少しだけ減少した。
レベルはほんの少しだけ減少しただけで、activated partialthromboplastin timeおよびthrombin timeは少し増加した。おそらくAmberliteXAD-16(160Å)における孔サイズの増加が、孔サイズがかなり小さい(40Å)AmberliteXAD-4と比較して凝血因子の吸着が増加した原因であろう。孔サイズの減少はそれゆえ、S-59のような低分子の吸着に対して特徴を示し、蛋白質のような高分子の吸着は妨げるのだろう。最後に、BioRadのt-butylHIC(Macro-Prep)はほとんど完全に因子V、因子VIIIを除去し、prothrombintimeおよびactivated partialthromboplastin timeが大幅に増加するというとても残念な結果となった。
Amberlite吸着剤の作用における水分含量の影響先に紹介したように、Amberlite XAD-4およびAmberlite XAD-16吸着剤(RohnandHass)は光化学洗浄後に輸血用血液製剤(例えば血小板濃縮物[PC]および新鮮凍結血漿[FFP])から混合物を除去し、それらを輸血用血漿製剤として使用しようするのにふさわしくさせる役割がある。実際に、非イオンmacroporouspolystyrenedivil genzen吸着剤であるAmberlite XAD-4およびAmberlite XAD-16は高いS-59吸着能力を示した。PC除去装置の開発の初期に、創案者らはAmberlite吸着剤の蒸気処理または乾燥はその吸着剤の孔から水分を除去することを発見した。そ
の結果、洗浄した吸着剤は湿潤した吸着剤よりもS-59に対する吸着能力が大幅に低下した。この実施例では、Amberlite吸着剤の吸着能力における水分の影響および、湿潤状態の吸着剤および処置後の回復した状態の吸着剤における水分の影響について述べている。
の高水和物の状態で入手した。しかしながら、最近Supelco(Bellefonte,PA)で行われ
た熱による洗浄過程では、水分含量の減少(5%)およびそれに付随して大幅な吸着能力
の低下という結果になった。さらに含水吸着粒子とは異なり、ビーズ孔に空気を含んでいる乾燥吸着粒子は水溶液中にビーズが浮く原因となり、これもまた吸着能力の低下という結果になった。
AmberliteXAD-4およびAmberlite XAD-16のような重合体の吸着剤は、湿潤している溶液の表面張力を減少させ、吸着剤の湿潤性を高めるような有機溶媒を使用することによって湿潤性をもたせることができる。この工程における有機溶媒としてエタノールを選択した。湿潤工程においては、(□)エタノール濃度、および(□)湿潤溶液との接触時間の2
つの変数を調節することができる。要求された吸着剤の湿潤時間に基づいて、接触時間は10分間とした。
間のインキュベート間に定期的に吸着サンプルを撹拌した。10分後にエタノール溶液を除去し、蒸留水に交換した。蒸留水によるバッチリンス工程を、5mlの水に対して1gの吸着
剤の割合で3回連続して(各10分間)行った。次に水を除去し、吸着粒子を完全に乾燥させた。
ルの重量を測定し、水分含量を算出した。注意点としては、24時間以上乾燥させてもそれ以上水分は減少しなかった。
時間室温でインキュベートした。インキュベート後、各サンプルをチューブからエッペンドルフチューブに移した。各エッペンドルフチューブから35%plasma,65%PAS III溶液のうちの200μlのサンプルを取り出し、5.0mLのHiSafe LSC cocktail(Wallac)で希釈した。各サンプル中のS-59の残留レベルをWallacLSCで測定した。各サンプルから除去された
、乾燥した吸着剤サンプルの体積あたりのS-59の全μmole数を決定することによって、能力を算出した。FIG.31には、湿潤溶液中の含エタノール量および10分間のバッチ湿潤工
程による吸着剤の能力との関係を示している。吸着能力とは35%plasma,65% PAS III溶液からのS-59の除去のことである。能力はC0=150μMでの単位吸着量から見積もられた。
液で吸着剤を湿潤させると、ほぼ最大限に吸着能力が回復することが示唆されている。このデータは10分間のバッチ処理から集められたことを注意しておかなければならない。接触時間をもっと長くすれば、さらに低レベルのエタノールを使用することも可能なはずで
ある。さらに、湿潤溶液中での微生物の繁殖を防止するためには最低20%エタノールが必
要であることを強調しておかなければならない。エタノールのコストおよびその後の水によるリンスによって除去しなければならないエタノールのレベルを減少させるために、極端に高レベルの工タノールは避けなければならないことは明白である。
水分含量および吸着能力との関係についても解析することができる。Amberlite XAD-16についての結果はFIG.32に要約している。FIG.32では、水分含量が減少するにつれて、35%plasma,65%PAS III溶液からS-59を除去するためのAmberlite XAD-16の吸着能力(すなわち吸着したS-59のμmole数/乾燥吸着剤1g)は減少することを示している。FIG.
32に示しているデータは様々な濃度のエタノール水溶液で吸着剤を湿潤させた後に得られたものである。吸着能力と水分含量の関係は、同じ吸着剤であっても加工工程によって異なることを指摘しておかなければならない(すなわち湿潤または乾燥によって達した水分含量)。
サンプルは、吸着剤を異なった条件下で湿潤させることによって得られたものであることを強調することは重要なことである。確証はないが、十分に水分を含んだ吸着剤サンプルを乾燥させることにより水分含量の異なる吸着剤サンプルを生産すれば、さらに適切なデータが得られると思われた。吸着剤を湿潤させることによって得られたサンプルは、吸着ビーズの外表面に高い率の水分を含んでいると思われる。反対に、乾燥させることによって用意された吸着剤はおそらく、最初にビーズの外表面を覆っていた水分が失われていると思われる。すなわちこのことが吸着剤の孔から多くの水分が除去されても吸着能力に影響を及ぼさずに吸着剤の状態を変化させる結果となっているのだろう。室温でのAmberlite吸着剤からの水分減少のおよその割合を示している予備実験のデータは次のセクション
で示している。
着によって密封される。密封されたポーチは次に、最終的な蒸留水でのリンスに続いくエタノール中での湿潤工程を受ける。最終的なRDはホイル包装で密封されたPL2410Plastic
container(Baxter)に包装される。ホイル包装はリキッドバリアーとして役に立ち、保管時の吸着剤の乾燥を妨げる。製造過程中のAmberlite吸着剤が最も乾燥しやすい期間は
、最終的なリンスエ程完了からホイル包装でRDを包装するまでの期間である。製造中の吸着剤の乾燥についてさらに理解するために、室温でのAmberlite吸着剤の乾燥の割合を評
価する研究が行われた。
って用意した。吸着剤をエタノール水溶液中で10分間のインキュベート後、蒸留水で完全にリンスした。およそ50gの各吸着剤を、完全に乾燥させ、次にプラスチック容器に入れ
た。その容器をそのまま室温に放置し、それ以上気流(例えばlaminarflow hood)を与えなかった。まもなく容器からサンプルを除去し、気密性のポリプロピレンバイアルに入れた。各サンプルの水分含量は先に述べたように決定した。
両方の吸着剤AmberliteXAD-4およびAmberlite XAD-16からの水分減少の動態を示している
データは、FIG.33に表している。特にFIG.33では、室温および標準湿度で27時間インキュベート中のAmberliteXAD-4(■)およびAmberliteXAD-16(●)からの水分減少を表している。FIG.33の結果から、水分減少はRDを含んでいるAmberliteの製造および保管の両方において考慮されなければならない根本的な問題であることが示唆される。
ガンマ線による湿潤Amberlite吸着剤の殺菌先に示したように、本発明にお
ける組立後のRDに含まれる保管容器は、ホイル包装で密封されており、最後に殺菌される。一般的に、ポリプロピレンジビニルベンゼン吸着剤は繰り返しのオートクレーブに安定である。しかしながら、ある保管容器(例えばPL2410Plastic container(Baxter))はその中に使われている素材のためにオートクレーブすることができないため、望ましくはガンマ線またはE光線によって殺菌されなければならない。この実施例では湿潤Amberlite吸着剤の殺菌において、ガンマ線またはE光線のどちらが適しているかを決定するために行われた研究の方法と結果を述べている。
A.吸着動態におけるガンマ線の影響 原料としての(すなわち加工していない)吸着剤はSupelcoによって加工され、次にガンマ線を照射された。2つに分けられたたくさんの天然吸着剤は次に述べる工程に従って、Supelcoによって加工された。まず、1回分の天然吸着剤(例えば18□)を74μmのふるいのある洗浄した容器に入れ、蒸留水でリンスした。リンス中の水流の伝導率は継続的に監視された。リンスは、リンス水流の抵抗が18MΩまで上昇したときに完了させた。次に、1回分の吸着剤(例えば6□、1.6kg)から抽出することができる残留物を熱溶媒の入らない洗浄工程の特許売薬(Supelco)によって除去した。その後、吸着剤は梱包され(2□の褐色ガラス容器)、液体循環式の蒸気殺菌された(20分、121℃)。
ンマ線(Isomedix;MortonGrove,IL)、1線量(49.9-50.7kGy)、2線量(112.4-114.8kGy)を照射した。
3H-S-59を注入した35% autologous plasma,65% PSA III溶液に溶解させた1ユニットの
新鮮な血小板濃縮物(4.0×1011プレートlets/300mL)
を用意した。吸着剤サンプル(およそ0.1g)を5mlのポロプロピレンチューブに正確に
量り取った。各チューブに3.0mlの血小板混合物を加え、室温でローター(Barnstead,ThermolyneModel 400110)上に放置した。様々な時間にチューブからPCサンプルを取り出した。放射活性レベルは、5.0mlのHiSafeLSC cocktall(Wallac)中の各サンプルの200μlを測定することによって決定した。放射活性平均値によって、残留S-59濃度を測定、および体積あたりの吸着剤に吸着したS-59の量を測定した。本研究において、吸着剤の体積は吸着剤サンプルの湿重量に基づいている。
。特に、FIG.34、35のデータは、それぞれAmberliteXAD-4(2つFIG.
34AおよびB)およびAmberliteXAD-16(2つFIG.35AおよびB)による35%血小板濃縮物からのS-59の除去による吸着動態におけるガンマ線による殺菌の影響を表している。先に述べたように、能力(すなわち体積あたりの吸着剤に吸着したS-59の量;μmoles/g)は吸着剤の湿重量に基づいて決定された。
は未殺菌のAmberliteXAD-16サンプルと同じぐらい、またはよりよい吸着動態が観察され
た。2種類の吸着剤の比較から、殺菌したAmberlite XAD-16は殺菌したAmberliteXAD-4よ
りも連続的によりよい吸着動態および吸着能力を示したことが分かった。図に示しているように、Amberlite XAD-16は約120分間のインキュベートで平衡状態に達したが、AmberliteXAD-4は平衡状態に達するまでに180分以上必要であった。測定は吸着剤の湿重量に基づいていることを強調しておかなければならない。XAD-16は一般的にXAD-4よりも多くの水
分を含んでいるので、乾燥重量に基づいた吸着能力は、かなり高いであろう(FIG.32参
照)。
いても検査された。およそ0.1gの吸着剤を5mLのポリプロピレンチューブに正確に量り取
った。3H-S-59を含んでいる35%plasma,65% PSA III溶液で500μMから15μMまでのS-59の希釈系列が用意された。各希釈液3mlずつチューブに分注した。チューブをローター(Barmsted,ThemolyneModel400110)上に放置し、室温で24時間インキュベートした。インキュベート後、サンプルを各チューブからエッペンドルフチューブに移した。35%plasma溶
液のうちの200μlを各エッペンドルフチューブから取り出し、5.0mlのHiSafe LSC cocktail(Wallac)に希釈した。各サンプルの残留S-59のレベルをWallacLSCで測定した。各サ
ンプルから除去された湿潤吸着剤の体積あたりのS-59の全μmole数を決定することによって吸着能力を測定した。5および10Mradのガンマ線で処理されたAmberliteXAD-4およびAmberliteXAD-16の吸着能力をTable Jに要約している。
ガンマ線の影響はとても少ない。Amberlite XAD-16の吸着能力にばらつきがあるのは、おそらくあまり重要なことではない。ガンマ線で殺菌したRDの中でなくても悪影響を及ぼさないので、吸着能力における殺菌の影響は十分に少ない。
C.EビームによるAmberlite吸着剤の滅菌上記のように、γ線滅菌は一般的に優れた滅菌
法である。Amberlite吸着剤の機能に与えるE-ビームの影響は、γ線滅菌の研究と類似し
た方法で調べられた。
その研究の方法と結果は本明細書後に報告している。
この研究では、AmberliteXAD-4、及びXAD-16のサンプルはエタノール溶液(30%)で湿ら
せ、25mLシンチレーションバイヤルに入れた。さらに、ポリエステルのメッシュポーチ(Saatipolyester 29/16,10cm×10cm)に湿らせた吸着剤を10g入れ、開封口を熱でシー
ルすることで、模型装置を作製した。この模型除去装置を、小さな切り口からPL2410 Plastic容器(Baxter)に移した。その後、その切り口は、熱でシールすることで再び閉じた。
-ビームを照射した。バイアル中で滅菌したサンプルは湿潤している必要はなかった。し
かし、水の保護がなかったので、保存中に模型装置中の吸着剤サンプルが乾燥した。そこで、これらのサンプルは、機能実験を行う前にエタノール溶液で湿らせた。35%血漿、65%PASIIIから、S-59を除去する吸着剤の能力を、前述した方法で調べた。この研究
結果を、Table Kにまとめた。
ク容器(Baxter)に入れたポリエステルのメッシュポーチの中に入れた吸着剤に対して行った5MRadのE-ビーム照射による滅菌操作(それぞれ“5MRad-吸着剤”、“5MRad-模型装置”)によって、吸着剤の機能はほとんど影響を受けなかった。
S-59吸着定数、及び、吸着剤の機能に対する水含有量の影響以前の実施例では、AmberliteXAD-4、及び、XAD-16の機能に対する水含有量の影響に特に視点が向けられていた。この実施例では、湿潤状態、及び、乾燥状態の両方について、数種の他の吸着剤についてもS-59吸着定数を比較した。
、重量を測定した。重量%水含有量をそれから算出した。
ブを回転装置に置き、24時間室温でインキュベートした。インキュベートの後、サンプルをそれぞれのチューブからEppendorfチューブに移した。35%の血漿のサンプル200μL
をEppendorfチューブから取り、5.0mLのHiSafeLSC調製液(Wallac)に希釈した。サンプ
ルをWallac LSCで算出することによって、それぞれのサンプル中の残留S-59の残留量を決定した。吸着能は、乾燥吸着剤の重量に対してそれぞれのサンプルから除去されたS-59の全μモル数を決定することによって、算出した。その結果をFIG.36に湿潤状態(深い陰
)と乾燥状態(明るい陰)(各サンプル中の水の量をパーセンテージで示した)における吸着剤のS-59吸着定数を示す棒グラフとして示し、TableLにまとめた。(150μMS-59=61754.725 DPM;バックグラウンド30DPM;Cf=S-59の最終平衡溶液濃度)
直径約74μm以上の粒子を保持することができる)。その過程の第二段階として、専売の
熱や溶媒のいらない洗浄過程によって残存抽出物を除去する。もし必要なら、洗浄した吸着剤は、RD製造部に発送する前に、大きな袋に包装し、蒸気滅菌することもできる。
の;<3%−50meshで通過するもの)の詳細を記した分析証明書を伴っている。Supelco,Inc.洗浄過程を受けた吸着剤は、ジビニルベンゼン(e.g.<50ppb:1:1イソプロパノール
:吸着剤;22度で2時間抽出)やエチルビニルベンゼンのような潜在的な抽出物を監視し
ている。加えて、塩化メチレン抽出物のGC分析はTotalChromatographic Organics(e.g.,<20μg/mL全抽出物)を評価するために用いられている。
による重量の減少度=最高10%、最低5%)と同様に粒子のサイズ分布(e.g.,<0.01%直径90μm以下;<2.0%直径1400μm以上)も、それぞれの回の吸着剤について測定した。最後に、それぞれの回の吸着剤の機能的な特性を、血清アルブミンを含む塩化ナトリウム緩衝液に溶かした3HでラベルしたS-59を用いて、S-59吸着アッセイを行うことによって評価した。
階、そして、組み立てたRDとフィルターポート血小板保存容器に入れる段階を図に表した。それらの図を参照することで後に続く論述を理解できるでしよう。
μmのメッシュの開孔サイズで、血漿/PAS混合物は自由に吸着剤と接触することができる
が、小さな粒子が移入することを妨げるのには十分である。血小板は実際には吸着剤と接触する必要はないが、残留psoralenとpsoralen光産物を除去する目的で、吸着剤中を溶液が自由に通過するようにしている。
出力線403をプラスチック容器に付けるために用いられるブッシング402(i.e.,ポートブッシング)に、取り付けた。プラスチック容器はポートフィルター401上のradiofrequenc
y溶接した2層(i.e.,Layer)のPL2410 Plastic(Baxter)から形成されている。PL 2410 Plastic(Baxter)の後ろは、RDを挿入するために、左に開いている。それゆえ、入力/出
力線(i.e.,donerlead)403はポートブッシング402に、溶剤(e.g.,シクロヘキサン)
を用いて結合させ、後の段階で微粒子が混入しないように、端をシールした。
器は、好ましい実施態様では、使い捨てであるので、外見を検査し、ドナーリード線を通して圧縮した空気を送り込むことで漏出テストを行った。
リード線を熱でシールし、容器を密封したフォイル袋のなかに入れた。
.10-6以下では、γ線照射の後も微生物は存在する)を越えるに十分な量で、γ線照射によって滅菌する。
み入れることもできうる;そのようなフィルターは、ポートフィルター401がせき止める
ことのできなかった粒子を阻止することで、第二の防御法として働くであろう。
製することを意図している;この均一性により、適当な量の吸着剤を単に前もって算定した繊維網の領域を切り取ることで測定した(i.e.吸着剤の重さを量ることはできない)
。このように、この実施態様は、RDの必要性もない。
DowexXUS-43493を用いたRDによる除去を行った未反応S-59およびS-59光反応産物のHPLC解析 先に示したように、S-59を含むPCsのUVA照射により生じた光反応産物はHPLC解析を用いることにより検出し得る。本実施例では最初に、光照射中に形成される光
反応産物のあらましについて記述する。その後、DowexXUS-43493を用いたRDの除去特性を例証する。
その後、UVAライトにより光照射を行う間に、S-59はPC中で光反応産物に変化する。その
光反応産物は透析実験(スキームA)に基づいて、結合するか、結合しないかで同定し得る
。結合しなかった光反応産物は標準的なHPLC解析により検出、定量し得る。
を示したものである。FIG.39の縦座標は300nmの光学密度(OD)であり、一方横座表は時間
を示している;"PPs"で示されるピークはS-59を含まない血漿のHPLCクロマトグラムにお
ける血漿ピークで、"TMP"で示されるピークは4,5'-trimethylpsoralenのピークであり、
これらを内部標準として使用した。
照射検出に対する内部の計測計として使用し得る。いずれのS-59光反応産物もまた、再現性のある量が形成される。
つの主要な光産物ピーク(FIG.39のHPLCクロマトグラムではピークEおよびF)を単離し、それらの構造をGC/MSあるいはNMR解析により決定した結果をFIG.40に示す。FIG.40に示されるように、ピークDはS-59のヘテロ二量体で、ピークEはS-59のホモ二量体である(本明細
中、今後"光反応産物D及びE"とする);残りの光反応産物の構造は不明である。
血小板のカウントに従っている)。血小板によるS-59の取り込みでは、かなり高い濃度のS-59が血小板に取り込まれる。さらに、二量体化は生物分子反応であるため、光化学的処
理の間に形成される二量体(ピークDおよびピークEで示される)の収量は、血小板に取り込まれるのと同様に増加する。このように、効果的なRDは、S-59および光反応産物DおよびEを血小板内部から取り除けるように設計を行う必要がある。
光化学的処理およびRD処理した血小板をユニットとした実験を6回行い、その平均値によ
り残った光反応産物のレベルを定めた。HPLC解析による定量限界値(LOQ)は、S-59で0.3μMであった。
物のレベルの代表的HPLCクロマトグラフを示した。FIG.41のクロマトグラフに、S-59を150μM(15.2mg/mL)含むPCについて、UVAで照射する前(上)、UVAでの照射後(中)、およびUVAで照射した後、RDで保温したもの(下)を示した。縦座標はHPLC検出器により測定された
、300nmでの光学密度であり、横座標は分で示した時間である。
性を調べることで、この観察結果をより簡単に理解し得る。本実験では、PCのサンプル8
時間処理が完了する前のさまざまなポイントでRDの入っているPL2410プラスチック容器からサンプルを取り除いた。PC中の結合していない光反応産物を、上記に示したHPLC解析により検出した。この場合、血小板内部および血漿/PASIII混合液両方における光反応産物
の量を決定し得る。FIG.42で示される結果では、完全なPCから光反応産物D,EおよびS-59
除去特性を示した。光反応産物DおよびEは平衡状態に達したが、S-59はほとんど完全に取り除かれた。
ように、サンプルを遠心することで血小板を除いた。結果、FIG.43では、全ての光反応産
物は比較的迅速に血漿/PASIII区画から取り除かれることが示されている。本新案を実施
するために、光反応産物の除去に影響を与える因子を理解することは必要ではないが、結果より光反応産物DおよびEの除去は、血小板内部から血漿/PASIII区画への移動における
、動力学的な限界が存在するのではないかと推測し得る。S-59よりも光反応産物DおよびEを取り除くことは困難である原因として、光反応産物DおよびEは2つの電荷を持つアミノ
基を持ち、血小板膜を通過するときに中和される必要があるが、S-59には1つしか電荷を
持つアミノ基が存在しないためではないだろうか。
In vitroにおける血小板機能性試験DowexXUS-43493を用いた回分RD処理 本実施例ではin vitroにおいて、光化学的処理、8時間のRD処理(Dowex XUS-43493)および保存(PL2410プラスチック容器,Baxer社)によるPCの血小板機能性試験を示している。光化学的およびRD処理による血小板混合液の試験結果と、別に光化学反応のみ行った血小板混合液を比較した。以下に詳細に示すように、パラメーターそれぞれについて1、5および7日について評価した;血小板産物について、処理したものと、処理しないを5日間保存した後では、invitroでの機能に違いが認められた。
器に移した。血小板とRDをおよそ8時間接触させ、その後血小板懸濁液を新しいPL2410プ
ラスチック容器に保存のために移した。献血して頂いた時間を第0日とした。S-59、UVA(320-400nm)およびRDでの処理を第1日に行った。6回実験を繰り返し、いずれの場合でも、2つのABO-適性を示す一人の供給者の血小板濃縮液の異なる保存液を使用した。
の分泌、p-selectinの発現、および微少小胞の生産について解析を行った。pH、形態スコア、血小板の形態変化および低浸透圧性ショックの反応などを含む、これらの試験のいくらかは、invivoにおける輸血後の回復および生存に関係しているという文献報告がある。統計的な解析には、Student'spairedt-testを利用した。
ストユニット(例"T")あるいはコントロール(例"C")かどうか、"*"はテストとコントロー
ルの血小板においてp≦0.05かどうかを示し、"n.d."は測定が行われなかったことを示し
ている。血小板を数えるため、コントロールユニットの体積はテストユニットに対してお
よそ5%少なくしてある;そのことでテストユニットのμL当たりの血小板数を統計的に解
析するため、1.05倍することで調節した。処理後、7日間保存する間、処理した血小板のpHを6.91±0.05に維持した。
、血小板数、血小板の凝集、アデノシン3リン酸(ATP)の分泌および微少小胞の形成には、統計的に大きな違いはなかった(p>0.05)。血小板の形態および血小板の形態変化では、テストした血小板において、観察時間内において統計的に大きな(p≦0.05)改善が示された
。処理後の血小板において、pO2、pCO2、HCO3-、血漿グルコースおよび乳酸の生産が、統計的に大きく異なる(p≦0.05)のは、代謝の減少が血小板の性質に悪影響及ぼしているた
めである。第2日における低浸透圧ショック応答(HSR)、および第2および5日のp-selecion発現において、統計的に重要な違いが検出された。
析により測定した。0JouIe/cm2照射の血小板濃縮物における初期のS-59濃度は、およそ145±10μMであった。3Joule/cm2照射後では、初期の20.5%±2.3%のS-59が反応せず残った(TableQ)。TableQの"n.a."は、"適用外"および"n.d."は"行っていない"を示している。
未反応のS-59濃度は、RDで8時間処理することにより0.27±0.05μMまで減少した。このS-59における減少レベルは、およそ100倍であった。
処理することによるS-59の削減においては、invitroにおける血小板機能は7日間の保存で十分に維持されていた。
おいてRDで処理を行なわず、光化学的に処理した血小板とは、明らかに異なる(結果は示
さない)。一般ボランティアの人達について、光化学的に処理した血小板を評価すると、
通常のinvivoにおける回復と寿命を示してきた。これらのin vitroの研究に基づけば、RDによる処理で、in vivoの血小板の機能に付加的な効果を加えることはないと考えられる
。
込むことで、患者がS-59にさらされることを効果的に減少し得、こうして血小板輸血の安全性の向上を成し得る。
回分除去装置を用いた、新鮮凍結血漿からのpsoralenの除去Dowex吸着薬を含む回分RDsを用いた、血小板濃縮物からのpsoralen除去を、以前のいくつかの例で示した。本実施例では、Dowex42493(商品名OptiporeL43としても知られる)を含むRDsを用いた、新鮮凍結血漿(FFP)の実験について示す。本実験では、)S-59を好ましいレベルまで除くために必要な吸着薬の量、)大量な吸着剤の影響を )の凝血因子活性において決定、について評価する。
析した。未反応のS-59および、光反応産物DおよびE(上述したように、光照射を行う間に
形成される2つの初期光反応産物)に対する結果(n=7)をTableRに示した(ND=検出できない
;1時間反応)。
間培養)。
グの大きさ、血漿の量、選択されたS-59の濃度で、制限時間1時間以内での血液凝固因子
活性の保持能力を決定した。ここでは、S-59の除去速度および12.5gの吸収剤を含むRDに
おける血液凝固因子活性の保持能を数値化するための実験について述べる。
実験は上述した方法で行った。サンプルは、未反応のS-59の解析を行うために照射の前後に容器からそれぞれ採取し、光化学反応による生成物及び血液凝固因子活性は-80℃で保
持されていた。
一時間培養後のサンプルから得られた未反応のS-59と光化学反応による生成物D及びEの結果(n=7)は表Tに示している。表Tが示唆するようにRDは望むレベルに達していた(約一
時間以内で未反応S-59≦.75mM)(ND=検出不能;一時間培養)。
吸着作用に与えるソラレンの構造的特徴の影響これまでの実験のいくつかは、回分および流加装置による血小板濃縮液からのS-95の除去について論議した。この実施例では、ソラレンのどのような構造的特徴が、回分吸着の間のアンバーライト吸着剤からの除去に影響を与えているかについての決定に関して述べている。
つぎに示す3種類の構造の異なるソラレンをここでの実験に用いた:ソラレンA、4級アミンソラレン[4-(トリエチルアミン)メチル-4,5,8-トリメチルソラレン];ソラレンB、荷電していない臭素化ソラレン[5-ブロモ-8-メトキシソラレン];ソラレンC、正に荷電した臭素化ソラレン[5-ブロモ-8-(ジエチルアミノプロピルオキシ)-ソラレン]。これらソラレンの化学構造式はは図44に示している;図44ではBr-で描かれているが、一般的にはCl-が対イオンで示される。吸着作用に関する研究のために、これらのソラレンをアンバーライトのイオンおよび非イオン性吸着剤に結合させた。より明確に述べると、3種類の非イオン性吸着
)DMSO溶液として準備した。それから、300mMから10mMの濃度範囲のPCで段階希釈を行っ
た;つぎに行う計算で、最初の濃度をC0とする。その後、対照資料と試験資料はHPLC分析用に準備した。それぞれの希釈溶液を3mLずつを、0.1gの吸着剤を含む5mLポリエチレン試験管に加え、準備した;対照資料としては吸着能を欠く類似物で調製した。試験資料および対照資料をミキサー(Barnstead,ThermolyneModel400110)上で、22℃で6時間、回転
振とう培養した。
ように特別な処理を施している)。各々のPC試料を、内部標準としてトリメチルソラレン(TMP)を含む希釈溶液(終濃度:35%エタノール、25mMKH2PO4、pH=3.5)5倍で希釈した。血小板内に含まれるソラレンが検定によって除外されないように、メタノール添加により血小板を溶解し、血漿を沈殿させた。この試料調製法により、実験に使用されたソラレンの派90%以上回復した。試料を遠心分離し、上清を0.2mmのフィルターで濾過した。そ
の後、C-18逆相カラム(YMC,ODS-AM型、4.6×250mm)で、溶液A(25mMKH2PO4、pH=3.5)65%、溶液B(メタノール)35%から、20分間で溶液Bが80%に達する濃度勾配をかけて使
用し、試料を分析した。
不記載)。検定曲線は各々のソラレンについて、HPLCの面積(y軸)と濃度(x軸)に関して曲線を引いた。
ラレンを含むPCとAmberlite吸着剤の接触後の残存ソラレン濃度の算出に用いた(以下参
照)。
容量(q)の評価に用いられる。残存ソラレン濃度1mM時の、種々のAmberlite吸着剤の吸着
容量(mmoles/g)、(Cf)は表Vで報告している。
程式2において、Mは吸着剤の質量(g)、Vは処理する試料の体積(L)を意味している。
ように加える。しかしながら、光照射中に、ソラレンは光分解を生じる;光分解過程は約30-50mMというC0濃度の低下をもたらす。このように、ソラレン濃度をC0=50mMから目的のCfに減少するのに必要な吸着剤の量を決定できる。
表Wに、方程式2を用いて、1mMのCfいたるのに必要な吸着剤の量(g)を列挙した。表Wに
おける量は、表Vに挙げた、C0=50mM、V=0.3L(PCの典型的な治療時の投薬量)という吸着許容能(q)をから算出した。
ラレンC-12.0分そしてソラレンBは-20.0分であった。もし、疎水性がPCからのソラレン除去能力の主な決定要因だとしたら、ソラレンBが最も疎水性が高いので、最も容易に除去
されると思われる。しかしながら、疎水性は中間を示しているにも関わらず、ソラレンC
は最も容易にPCから除去された。このような結果を示した可能性の説明としては、ソラレンCはソラレンBほど強力に、PC中に含まれる細胞や血漿タンパク質(つまり、血清アルブミン)と相互作用しないことが挙げられる。強力な細胞や血漿タンパク質との相互作用は吸着作用と競合し、結果的に樹脂への吸着を阻害するのであろう。
和性が減少しているので、除去はより困難と思われる。さらに、実験に
機械的有害物除去(apherisis)システムと連結したRDの使用以前に示唆したように、本発明により、apheresisシステムと連結したRDの使用が塾考された。この実験では最初にapheresisを介した単一ドナーの血小板や血漿の同一回収が記述されている。その後、RD処理過程の議論に続いて、血小板調製へのPASIIIおよびS-59の添加が述べられている。
スチック容器−(Baxter)およびPASIII含有バッグ(PL 2411,Baxter)を含んだ。追加構成要素にTNX-6TM分離チャンバーを含んだapheresisシステム、PLT-30TM回収チャンバー、AccessoryWeightScale(すべてBaxter Healthcare Corp.,Fenwal Division)およびTerumo SCD312-SterileTubing Welder.を含んだ。
指図によって装置は設定及び操作を行った。
とACDバッグの正面の分離フックの上に置かれた。2番目の血小板保持容器のローラークランプを閉じ、一方でトランスファーパックのそれは開けた。血漿トランスファーパックは最初の塩類液を回収するのに用いた。
うに補正した。
重管を通じて分離容器の遠心へ送った。分離容器は全血液を、一方は血漿及び血小板(即ち血小板に富む血漿)を含み、他方は赤血球を含む、二つの区別しうる相に、分離容器で全血液は分割した。赤血球細胞はドナーに戻した。血小板に富む血漿は分離容器から遠心回収容器へ送られた。血小板に富む血漿はコレクション容器を通過するが、血小板は血漿が吸引されるにつれて濃縮された。回収容器内の濃縮された血小板は約30mlの残余血漿と混合した。もちろん、異なる操作パラメータや異なるaphereslsシステムによって血小板
と混合される残余血漿量が異なる結果が導かれうる。
の追加分が回収されなければならない。故に、400mlの血漿は血漿ポンプで処理されたあ
とでapheresisシステムはあふれ出さず、血漿の追加が選択され、システムは155mlの血漿を回収用にプログラムした。適切なクランプを開けた後、55gの血漿(補助の規模で評価
された)は、後の血小板の再懸濁ために最初の血小板保持容器に回収し、100mlを次に第
二の血小板保持容器に回収した。
Cell Separatorを初期化した。戻り口経路注射針をドナーの腕から外した。
心画分の底部に置かれ、濃縮した血小板は最初の血小板回収バッグへ移した。最後に、この血小板保持集約物はapheresisキットと多岐管の下方12インチで3つの密封シールを作ることで分離され、後にPASIII溶液への滅菌接合を経由して連結されることに用いられる12インチの長さのチューブとなった。二つのシールが血小板保持容器集約物から離れるようそのチューブをシール間で切断した。
、滅菌ドッキング装置を記述している。はじめに、血小板保持容器集約物から12インチの長さのチューブを滅菌接合器(SCD)の背面スロットに置いた。二つの血小板保持容器お
よび血漿移動パックはSCDの右に吊るし、ローラークランプが閉じていることを確かめた
。PASIII溶液のはいったPL2411Plastic container(Baxter)からの経路は、PL2411 Plas
tic container(Baxter)はSCDの左側になるように、SCDの正面のスロットに置いた。滅
菌溶接操作を行い(TerumoSCD 312 Sterile Tubing Welder)、流動連結は漏れを検査し
た。PC容器のためにローラークランプを開けた後、PASIII溶液はPC中に流れ、PC由来の残余空気は空のPASIII容器に戻した。最後に、連結チューブを熱封し、PASIII容器を捨てた。
いて)。滅菌溶接操作(TerumoSCD 312 Sterlle Tubing Welder)の完成に続いて、血漿
移動パックを捨てた。最初の血小板の容器内のPC/PASIII溶液は、最初の血小板容器に空
気を戻しながら、PL2411Plastic container(Baxter)移した。
よる)が290ml以下なら、求まれる体積を得るために、二番目の血小板保持容器(同一の
血漿を集めるのに使われた)から一定量の血漿は添加し得る。
を22±2℃で平底撹拌器で保持した。
じめに、上述した滅菌ドッキング/溶接手順は、PC/PASIII容器からの経路と、S-59(15ml;3mM)と共にプラスチック容器の経路の一つ(PL2411Plasticcontainer,Baxter)との間で流動的な接続を作ることを行った。滅菌溶接操作を行い、経路は漏れを検査した。次に、滅菌溶接方法はS-59容器から空のPL2410Plasticcontainer(Baxter)の短くなったチュ
ーブへ接続されていない経路を接続するのに用いた。再び、滅菌溶接操作を行い、経路の漏れを検査した。
ク容器(Baxter)にあるならば、照射のための分離容器への溶液の輸送は必要ない。むしろ、PC/PAS III溶液を含むPL2410プラスチック容器(Baxter)S-59溶液を伴った容器へ無菌的連結がなされ、二つの溶液は完全に混合され、後の照射のためにPL2410プラスチック容器(Baxter)に全量が集められる。
された長い管の部分に血小板サンプルを吸い上げるために、血小板産物側への管を除去(除去器/密閉シーラーmodel1301;Sebra)することが必要となる。それから後は、管は溶
液容器から最低12インチ離れた点で加熱密閉シールされると、サンプルが準備され、処理されることとなる。例えば、滅菌15mL遠心管の上で管の先端が切断されれば、溶液は遠心
管へ排出され、一部を5mL微小遠心管(Vacutainer,Becton-Dickinson)に置く。溶液のサンプルはそれからポリプロピレンの微小遠心管に移すことができ、HPLCでの解析に先立ち-20℃にて保管することができる。
システム(Steritech.Inc.およびBaxter HealthcareCorp.,Fenwal Division)に移された
。容器は温度(処理前と後)と処理時間を記録しながら、照射(3J/cm2で長波長UVA[320-400nm])された。照射された溶液はそれから暗所で平板撹拌器上に約22℃(22±2℃)にて、溶液がRDを収容している容器に加えられるまで保存された。
法が、処理されたS-59/PC/PASIII溶液の容器からの管、およびRDを収容する容器からの管との間で行われた。無菌的溶接操作が行われ、それから配管の漏れが検査された。処理されたS-59/PC/PASIII溶液はRDを収容する容器へと移され、残余空気はもはや空となったS-59/PC/PASIII溶液の容器へ押し戻された。RDを収容する容器が真空状態で封入されたの
であれば、たいてい残余空気は存在しない。二つのバッグをつなぐ管は熱密閉シールされ、空となったS-59/PC/PASIII溶液容器は廃棄された。新たにS-59/PC/PASIII溶液を含む
容器はそれから連続的に22℃で8時間撹拌された(平板型血小板撹拌器model#pf48;HelmerLab Co)。
れたPCが保存容器へと移された。結合された管は、熱密閉シールされ、空となったRDを収容する容器は廃棄された。それから、最終的にPCを含む保存容器は平板撹拌機上に22℃にて保管された。最終処理溶液は受容器へのその後の注入のために保存可能である(ドナーから全成分を含む血液が抜き取られたときから5日間まで)。
血漿分離交換システムによる連結でのRDの利用 多くの点で類似しているが、この実施例は、先の例で与えられた血漿分離交換手法の変化を含んでいる。説明すると、この例のプロトコールは血漿集積のために2つの血小板保存バッグの内ひとつだけを利用した。一方、先の実施例では血小板集積バッグが二つとも使われた。加えて、先の実施例では血小板保存容器はPL2410プラスチック容器(Baxter)であったのに対し、この実施例のプロトコールでは光化学的処理に対しては適さないPL3014プラスチック容器(Baxter)が利用された。これらの相違およびドナーからの血液産物の集積に利用された手法や装備に関連する他の点、そして、いろいろな試薬をこれらの生産物に対して加える手法の詳細は以下に記される。
Division)とともにBaxter BlotechCS-3000TM PlusBlood Cell SepaRatorを利用した。構成備品は2つの空の1000mL血小板集積バッグ(PL3014プラスチック容器、Baxter)とひとつのPL2410プラスチック容器(Baxter)および、PASIIIを含むバッグ(PL-2411プラスチ
ック容器、Baxter)を含んでいた。加えて、血漿分離交換システムはTNX-6TMSeparation Chamber(BaxterHealthcare Corp.,Fenwal Division)、PLT-30TMCollection Chamber(BaxterHealthcare Corp.,Fenwal Division)、Accessory WeightScale(Baxter Healthcare Corp.)無菌結合装置(modelSCD 312;Terumo)、および管シーラー(model ♯1090;SebraEngineeringおよびReseach Associates)を含んでいた。これらの構成備品はAccessSystem Apheresis Kit(model4R2295;Baxter Healthcare Corp.,Fenwal Division)に連結
されて使われた。血漿分離交換システムの操作パラメーターは以下に示す:血液流速50-55mL/min;インターフェース検知器オフセット値6;収率較正係数1.13;血漿集積量155mL、および血小板収率3.7×1011血小板。装置の設置および操作は、もし他に記述のないと
きは、製造業者の指導に従った。
目の血小板保管容器の回転クランプは開けられ、一方で、輸送パックのそれは閉じられた。二番目の血小板保管容器はこの手順の間、「過剰にあふたもの」のために使われ、入路と復路は生理食塩水につながれた。それから、ACDの比率は加えられる抗凝血試薬に対し
て10:1-11:1に調節された。
、複合内腔管の入路を通して遠心分離の分離容器に送出された。分離容器は全成分を含む血液を、血小板を多く含んだ血漿と赤血球に分離し、後者はドナーへと返される。その後、血小板を多く含んだ血漿は分離容器から遠心集積容器へと送出された。血小板を多く含んだ血漿が集積容器を通過する間に、血小板が濃縮され、そのとき血漿が集積される。
られた。その後即座に、輸送用パックへのクランプが開けられ、そのまま残っている伴生血漿が集められた。伴生血漿の集積につづいて、そのクランプは閉じられ、過剰集積バッグのクランプが再び開かれた。集積の完了に際に、全てのクランプが閉じられ、ドナーは血漿分離交換システムから解放される。
集積容器に排出された。血小板と血漿が良く混合された後、それらは一番目の血小板保管容器に移される。輸送パック中の集められた血漿は、血漿が総計105mLに達するまで加え
られた。あふれた集積バッグは加熱密閉シールされ、取り除かれ、そして廃棄された。集積区域へとつながる血漿の管のクランプが閉じられるのにつづいて、それぞれのバッグへの管は密閉シールされた(お互いのバッグを、無菌的結合させるのに充分な管が残されるように)。
び、汚染をさける効果を促進するために、血小板は105mLの自己由来の血漿、および180mLのPAS III(調製品はACDも15mL含む)へ濃縮された。光化学的処理システムはひとつのPL2410プラスチック容器(Baxter)、180mLのPASIII溶液のバッグ、および、15mL(3mM)S-59溶液のバッグを含むものが使われた。空の血小板保管バッグの重さを量った後、SCDが使われて、180mLのPASIIIを含んでいる輸送パックは、PL3014プラスチック容器(Baxter)にある一人のドナーの血小板分離交換ユニットへ付着させられた。PASIII溶液はそれからPCに加えられた。それから、空のPASIIIバッグとPCの間が、この後にS-59へ無菌的結合するのに充分なだけのPL3014(Baxter)への管を残して、加熱密閉シールされた。空のPASIIIバッグは廃棄され、それから血小板は2時間以下の間、平板型血小板撹拌器(model♯pf48;HelmerLab Co)上で、充分分離するまで静置された。
いて)、PC/PASIII溶液を含むPL3014プラスチック容器(Baxter)に無菌的に連結された
。S-59はバッグに結合しないことが好まれるので、S-59バッグ中の望まれるS-59の総量は血液産物溶液で混合できる。それゆえ、現在の発見の好まれる具体化として、非ソラレン結合性繊維がS-59バッグの構造で用いられる(そして、バッグの中によく他のソラレンが含まれていた)。無菌的連結手法のために、SCDが用いられ、PL2410プラスチック容器(Baxter)の短い方の管を(もし望むなら、長い方の管は後で、サンプリングのために用い
ることができる)
、S-59バッグの自由な管に付着させられた。それから、PC/PASIII溶液を含むPL3014プ
ラスチック容器(Baxter)は、S-59バッグを通って、PL2410プラスチック容器(Baxter)へと移された。この輸送は、PL3014プラスチック容器は光照射に適さないという理由で必要である。S-59/PC/PASIIIを含むようになったS-59バッグと、PL2410プラスチック容器(Baxter)の間の管は、その後、できるだけS-59バッグに近いところで加熱密封シールされた。一方で、空の保管バッグおよびS-59バッグは廃棄された。S-59/PC/PASIIIバッグはそれから、平板型撹拌器上に置かれた(最低値5分間、最大値1時間)。
側へ管を除去(除去器/密閉シーラーmodel1301;Sebra)することが必要となる。それから先は、管は溶液容器から最低12インチ離れた点で加熱密閉シールされると、サンプルが準備され、処理されることとなる。例えば、滅菌15mL遠心管の上で管の先端が切断されれば、溶液は遠心管へ排出され、一部を5mL微小遠心管(Vacutainer,Becton-Dickinson)に置く。溶液のサンプルはそれからポリプロピレンの微小遠心管に移すことができ、HPLCでの解析に先立ち-20℃にて保管することができる。
、照射された溶液はそれから暗所の20-24℃にて、平板型撹拌器上に置かれた。
て集められた自己由来伴生血漿は遠心分離によって分けられた。特に、SCDは血漿含有輸
送パックの管を、空のl50mL輸送パック容器に付着させるのに使われた。新しい輸送パッ
ク中の自己由来血漿は室温にて10分間、3000g(3800rpm)で遠心分離された(model♯RC-3b HA 6000ローターにて;SorvallINstrumenrs)。遠心分離された血漿は血漿抽出装置
に移され、約半分の血小板に乏しい血漿が、新しい輸送パックに移された。管は加熱密閉シールされ新しい輸送パックはもとの血漿輸送パックから取り外された。最終的に、血漿
輸送セット(4C2240,BaxterHealthcare Corp.,Fenwal Division)の突起末端(すなわち、ひとつの管の末端は他の構成要素の受容口へ挿入できるように適合していた。例えば、血液保管容器は管と構成要素の間で流動的な結合を形成するために)は血漿輸送バッグの入口に差し込まれた。血小板が乏しい血漿の最小20mLが滅菌遠心管へ送り込まれ、蓋をされ、血小板機能検査の準備のため約4℃で保管された。
る容器の入口、出口の管は2本の指の間で回転させられ、SCDに置かれる前に、過大な崩
壊がないことを確認した。無菌的溶接作業がなされ、管の漏れがないか確かめられると、管を開くために、二つの容器の間の結合が二本の指の間で回転させられた。それから、処理されたS-59/PC/PASIII溶液はRDを収容する容器へと移され、余った溶液はその容器に手で送り込まれた。二つのバッグを結合している管は加熱密閉シールされた(最終血小板保管容器へ移せるようにRDを収容する容器へ結合している管を充分に残すように)。そして、空のS-59/PC/PASIII溶液容器は廃棄された。S-59/PC/PASIII溶液を含む容器はそれか
ら連続的に、22℃で8時間撹拌された(平板型血小板撹拌器model#pf48;Helmer Lab Co)。8時間の撹拌につづいて、RDを収容する容器からの一本の管が、空のPL2410プラスチック容器(Baxter)からの管へと無菌的結合/溶接された。
血漿分離交換システムでの血小板集積の間のPAS IIIの添加 前に示したとおり、照射に適した準備を行うための血漿分離交換システムにつづいて、PAS III(または他の適した)合成培地は集められた血小板に加えることができる。しかしながら、PASIIIを集められた血小板に加えるために無菌的結合手法を利用する前に、血小板が集められるまではそのような手法は待つことが必要である。この実施例は代替えの具体化を述べているが、その中で、血小板分離交換の間の血小板集積過程においてPASIIIが加えられる。よって、最終的に、集められた血小板はすでに適当量のPASIIIを含んでいる。論じられ
るはずの違いを除けば、実施例41にある全ての装置および手法はここに於いて正しく適用できる。この実施例の過程は概要Eに描写されたように3つのバッグの変化を利用する。一番目のバッグは180mLのPASIIIを含む。二番目のバッグは総量を決定する前の自己由来血漿を集めるのに使われる。三番目のバッグはその中で全ての混合物が組み合わさった血小板集積バッグである。
を集めるようにプログラムされるべきだ。
Claims (1)
- 明細書に記載の発明。
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