ES2210846T3

ES2210846T3 - Nuevos psoralenos para inactivar agentes patogenos.

Info

Publication number: ES2210846T3
Application number: ES98960295T
Authority: ES
Inventors: Susan Wollowitz; Aileen Nerio
Original assignee: Cerus Corp
Current assignee: Cerus Corp
Priority date: 1997-11-20
Filing date: 1998-11-20
Publication date: 2004-07-01
Anticipated expiration: 2018-11-20
Also published as: CA2300382A1; ATE252830T1; EP1032265A4; EP1032265A1; CA2300382C; DE69819360T2; WO1999026476A1; JP2003525848A; DE69819360D1; EP1032265B1; US6133460A; US6455286B1; AU1592999A; AU747842B2; US20030082510A1

Abstract

Un compuesto de psoraleno de la fórmula seleccionada entre el grupo constituido por: a) un sustituyente A sobre el anillo de pirona, seleccionado entre el grupo constituido por: - (CH2)u-NH2,-(CH2)w-J-(CH2)z-NH2,-(CH2)w-J-(CH2)x-K-(CH2)z-NH2, y - (CH2)w-J-(CH2)x-K-(CH2)y-L-(CH2)z-NH2; en los que J, K, y L se seleccionan independientemente entre el grupo constituido por O y NH, en los que u es un número entero entre 1 y 10, w es un número entero entre 1 y 5, x es un número entero entre 2 y 5, y es un número entero entre 2 y 5, y z es un número entero entre 2 y 6; y b) los sustituyentes B, R3, R4, R5 y R6 sobre el anillo de pirona, átomos de carbono 5-, 4¿-, 5¿ y 8 respectivamente, independientemente seleccionados entre el grupo constituido por -H y -(CH2)vCH3, en el que v es un número entero entre 0 y 5; o una sal del mismo.

Description

Nuevos psoralenos para inactivar agentes patógenos.

La presente invención proporciona nuevos psoralenos que tienen capacidad potenciada para inactivar patógenos en presencia de la luz ultravioleta. La presente invención también proporciona procedimientos de uso de nuevos psoralenos para inactivar patógenos en productos relacionados con la salud para usarse in vivo e in vitro, y en particular, productos sanguíneos.

Los psoralenos son compuestos tricíclicos formados por la fusión lineal de un anillo furano con una cumarina. Los psoralenos se pueden intercalar entre los pares de bases de ácidos nucleicos de doble cadena (o regiones de pares de bases de ácidos nucleicos de cadena sencilla), que forman aductos covalentes a bases de pirimidina tras absorción de luz ultravioleta de onda larga (UVA). G. D. Cimino y col., Ann. Rev. Biochem. 54: 1151 (1985); Hearst y col., Quart. Rev. Biophys. 17: 1 (1984). Si hay una segunda piridina adyacente a un monoaducto psoraleno-pirimidina y sobre la cadena opuesta, la absorción de un segundo fotón puede conducir a la formación de un diaducto que funciona como un entrecruzamiento intercadena [S. T. Isaacs y col., Biochemistry 16: 1058 (1977); S. T. Isaacs y col., Trends in Photobiology (Plenum) pp. 279-294 (1982); J. Tessman y col., Biochem. 24: 1669 (1985); patentes de Estados Unidos números 4.124.598, 4.169.204 y 4.196.281 de Hearst y col.].

La fotorreacción de los psoralenos con ácido nucleico ha sido útil en el estudio de plegamiento de ácido nucleicos, la unión de sondas diagnósticas a ácidos nucleicos, la unión de ácidos nucleicos a superficies y materiales, el bloqueo de reacciones de polimerasa y la inactivación de organismos y células que requieren replicación de ácidos nucleicos para que proliferen, por ejemplo, bacterias, virus, leucocitos y células sobreproliferantes, tales como las que se producen en psoriasis, reestenosis, o cáncer. La inactivación de un virus también se puede aplicar a la preparación de vacunas. El nivel de reacción con ácido nucleico celular se puede modular para detener la proliferación de las funciones celulares que todavía mantienen las funciones celulares tales como la síntesis de proteínas. Esto se puede aplicar al tratamiento de linfocitos de células T como medio para prevenir a los injertos frente a una enfermedad de hospedador en, por ejemplo, transplantes de médula ósea.

El uso de los psoralenos para inactivación de patógenos en productos sanguíneos es de particular interés ya que la seguridad del suministro de sangre es una cuestión de interés universal. Mientras que la transfusión asociada a infecciones virales se han reducido considerablemente ensayando la transmisión del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), virus de hepatitis B (VHB) y virus de la hepatitis C (VHC) continúa produciéndose en 1/450.000 a 600.000 unidades, 1/200.000 unidades y 1/3000 unidades respectivamente [R. Dodd, Blood Suply: Risks, Perceptions and Prospects for the Future, ed. S. J. Nance, p 1 (1994); E. Lackritz y col., New Eng. J. Med. 333: 1721 (1995)]. El ensayo no es una opción para algunos virus. El citomegalovirus que se encuentra comúnmente en el suministro de sangre todavía es de importancia clínica solamente para inmunizar pacientes comprometidos para los que la infección puede ser fatal. [R. Bowden, Blood Safety: Current Challenges, ed. S. J. Nance, p 201 (1992)]. La evaluación universal para CMV conduciría a una reducción grave en donantes aceptables y de esta manera una reducción en el suministro de sangre nacional. Actualmente los bancos de donantes especiales se deben usar para estos pacientes. También se reconoce que otros virus desconocidos o nuevas cepas de virus conocidos pueden encontrar su vía en el suministro de sangre y no se identificará hasta que se aprecie la morbilidad o mortalidad, ni serán capaces de evaluarse hasta que los ensayos se hagan disponibles. La identificación de la hepatitis G en unidades de sangre es el ejemplo más reciente de dicha existencia [H. Alter, Transfusion 37: 569 (1997)]. Cada vez más la contaminación bacteriana, especialmente de concentrados de plaquetas (PC) se ha reconocido también como un problema. Se estima que entre 1/1.000 y 2.000 unidades de PC muestran niveles de contaminación que da como resultado una respuesta séptica [J. Morrow y col., JAMA 266: 555 (1991); M. Blajchman, Blood Safety: Current Challenges, ed. S. J. Nance, p 213 (1992); E. Chiu y col., Transfusion 34: 950 (1994)]. Actualmente no existen ensayos de evaluación disponibles para unidades de sangre para cualquiera de las aproximadamente diez bacterias que se han asociado con la sepsis asociada a transfusiones fatales en los Estados Unidos. Aunque existen procedimientos potenciales para almacenamiento de plaquetas a temperaturas bajas que alivian este problema [las patentes de Estados Unidos números 5.827.640 y 5.827.741] la inactivación de las bacterias mediante psoraleno tendría menos impacto en el almacenamiento habitual de plaquetas.

Los psoralenos son candidatos ideales para descontaminación fotosensibilizada de concentrados de plaquetas. [H. Alter y col., Lancet ii: 1446 (1988); L. Lin y col., Blood 4: 517 (1989); C. Hanson, Blood Cells18: 7 (1992)]. Por ejemplo, el 8-metoxipsoraleno (8-MOP) es totalmente eficaz en la desactivación de numerosas bacterias encontradas en concentrados de plaquetas.Sin embargo, no es suficientemente activo para inactivar patógenos con genomas pequeños (es decir, virus) sin usar concentraciones y tiempos de radiación que dañan las plaquetas. El psoraleno altamente activo, 4'aminometil-4,5,'8-trimetilpsoraleno (AMT), muestra excelentes propiedades de inactivación fotoquímicas pero es altamente mutagénico en ausencia de luz en algunos ensayos bacterianos [S. Wagner y col., Photochem. Photobio. Meeting Abstract, 55: 113S (1992)]. Otros psoralenos 4'- y 5' aminometil sustituidos que se han desarrollado muestran excelentes propiedades de inactivación fotoquímica con una reducción considerable en mutagenicidad.

Diversas patentes se refieren a la inactivación por psoralenos de patógenos de productos sanguíneos [patentes de Estados Unidos números 4.727.027 y 4.748.120 de G. Wiesehahn y col., patentes de Estados Unidos números 5.288.605, 5.482.828 y 5.709.991 de L. Lin y col., y patente se Estados Unidos Nº 5.593.823 de S. Wollowitz y col.]. P. Morel y col., Bood Cells 18:27 (1992) muestran que 300 \mug/ml del 8-MOP junto con diez horas de radiación con luz ultravioleta puede inactivar eficazmente los virus en suero humano. Otros investigadores han descrito en estudios similares el uso del 8-MOP y del AMT [Dodd RY, y col., Transfusion 31: 483-490 (1991); Margolis-Nunno, H., y col., Thromb Haemostas 65: 1162 (Resumen) (1991)]. De hecho, se ha establecido la fotoinactivación de un amplio espectro de microorganismos, incluyendo VHB, VHC y VIH. [Hanson C. V., Blood Cells: 18: 7-24 (1992); Alter, H. J. y col., The Lancet ii: 1446 (1988); Margolis Nunno H. y col., Thromb Haemostas 65: 1162 (Resumen) (1991); Lin y col., Transfusion 37: 423 (1997)]. Claramente existen una amplia clase de compuestos de psoralenos eficaces en la inactivación de patógenos en general y particularmente en productos sanguíneos.

Los compuestos de psoralenos más altamente activos útiles para la inactivación tienen derivados amino en las posiciones 4' y 5' [patentes de Estados Unidos números 5.578.736 y 5.654.443 de Wollowitz y col., patente de Estados Unidos Nº 4.294.822 de Kanfman]. Se conocen 5-alcoxi y 8-alcoxipsoralenos con sustituyentes amino en la posición 8 ó 5 respectivamente, así como el 8- aminometilpsoraleno y el 8-aminometil-4-metilpsoraleno [J. Hansen y col., J. Med. Chem. 28: 1001-1010 (1985); patentes de Estados Unidos números 4.269.851 y 4.328.239 de Kaufman]. Los datos limitados proporcionados por estos últimos compuestos sugieren que incluso los alcoxipsoralenos amino sustituidos tienen una fotoactividad relativamente escasa y que la sustitución amino en el anillo furano es importante para la alta fotoactividad. También, estos compuestos se forman mediante procedimientos que ofrecen poca flexibilidad en la modificación de la funcionalidad del anillo. El documento WO-A 88/10272 describe el uso de 4'-aminometiltrioxaleno (4'-aminometil-4,5',8-trimetilpsoraleno o AMT) para tratar sangre en presencia de luz ultravioleta.

Sumario de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones y proporciona nuevos psoralenos con una fotorreactividad no predicha con ácidos nucleicos que se pueden usar para preparaciones inútiles de ácidos nucleicos, preparaciones de conjugados, inhibición de proliferación celular, inactivación de virus para preparación de vacunas y en particular, para la inactivación de patógenos en productos sanguíneos. Además se describen nuevas vías para la síntesis de aminopsoralenos e intermedios que pueden ser útiles para proporcionar psoralenos conjugados a una diversidad de otros grupos funcionales.

Con respecto a los nuevos compuestos, alguno de los nuevos psoralenos son psoralenos unidos a amino primario-pirona que comprenden un grupo amino primario (es decir, grupo -NH_{2}) unido al anillo pirona del psoraleno (átomos de carbono 3- y 4-) mediante una cadena alquilo que contiene opcionalmente átomos de oxígeno y de nitrógeno, y en los que el anillo psoraleno puede tener uno o más grupos alquilo en otras posiciones. La presente invención además contempla compuestos de psoraleno con un sustituyente amino primario sobre el anillo pirona, que comprende: a) un sustituyente A sobre el anillo pirona, seleccionado entre el grupo constituido por: -(CH_{2})_{u}-NH_{2}, -(CH_{2})_{w}-J-(CH_{2})_{z}-NH_{2}, -(CH_{2})_{w}-J-(CH_{2})_{x}-K-(CH_{2})_{z}-NH_{2} y -(CH_{2})_{w}-J-(CH_{2})_{x}-K-(CH_{2})_{y}-L-(CH_{2})_{z}-NH_{2}; en los que J, K y L se seleccionan independientemente entre el grupo constituido por O y NH, en que u es un número entero entre 1 y 10, w es un número entero entre 1 y 5, x es un número entero entre 2 y 5, y es un número entero entre 2 y 5, y z es un número entero entre 2 y 6; y b) sustituyentes B, R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} sobre el anillo pirona (el átomo de carbono 3- ó 4- que no tiene el sustituyente amino primario), átomos de carbono 5-, 4'-, 5'- y 8- respectivamente, seleccionados independientemente entre el grupo constituido por -H y -(CH_{2})_{v}-CH_{3}, en el que v es un número entero entre 0 y 5; o una sal del mismo. Donde un elemento se "selecciona independientemente" entre un grupo, significa que el elemento no necesita ser el mismo que otros elementos elegidos del mismo grupo. La estructura de estos compuestos es como sigue.

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La presente invención contempla además los compuestos de la estructura anterior con un sustituyente amino primario sobre el anillo pirona, en los que A está en el carbono 3- y B está en el átomo de carbono 4-, preferiblemente en el que A se selecciona entre el grupo constituido por -CH_{2}-NH_{2} y -CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-NH_{2}. Más específicamente, la invención contempla compuestos en los que A es -CH_{2}-NH_{2}, y en los que B, R_{3}, R_{5} y R_{6} son -H, y en los que R_{4} es -CH_{3}; en el los A es -CH_{2}-NH_{2}, y en los que R_{3} y R_{5} son -H, y en los que B, R_{4}, y R_{6} son -CH_{3}; en los que A es -CH_{2}-NH_{2}, y en los que R_{3} y R_{4} son -H, y en los que B, R_{5} y R_{6} son -CH_{3}; en los que A es -CH_{2}-NH_{2}, y en los que R_{3} es H, y en el que B, R_{4}, R_{5}y R_{6} son -CH_{3}; en los que A es -CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-NH_{2} y en los que R_{3} y R_{5} son -H, y en los que B, R_{4}, y R_{6} son -CH_{3}. La estructura de estos compuestos es como sigue.

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La presente invención además contempla compuestos de la anterior estructura con un sustituyente amino primario sobre el anillo pirona, en los que A está en el átomo de carbono 4- y B está en el átomo de carbono 3, preferiblemente en los que A se selecciona entre el grupo constituido por CH_{2}-NH_{2}, y -CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-NH_{2}. Más específicamente, la invención contempla compuestos en los que A es -CH_{2}-NH_{2}, y en los que B, R_{3}, R_{5}y R_{6} son -H, y en los que R_{4}, es -CH_{3}; en los que A es -CH_{2}-NH_{2}, y en los que B y R_{3}son -H, y en los que R_{4}, R_{5}y R_{6} son -CH_{3}; en los que A es -CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-NH_{2}, y en los que B y R_{3} son -H, y en los que R_{4}, R_{5}y R_{6} son -CH_{3}. La estructura de estos compuestos es como sigue.

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Adicionalmente algunos de los nuevos psoralenos son psoralenos unidos a aminoprimario y benceno que comprenden un grupo amino primario unido al anillo benceno del psoraleno (átomos de carbono 5- y 8-) mediante una cadena alquilo que contiene opcionalmente átomos de nitrógeno, y en los que el anillo psoraleno puede tener uno o más grupos alquilo en otras posiciones. La presente invención además contempla compuestos de psoraleno con un sustituyente amino primario sobre el anillo benceno, que comprende: a) un sustituyente A en el átomo de carbono 5 del anillo benceno, seleccionado entre el grupo constituido por: -(CH_{2})_{u}-NH_{2}, -(CH_{2})_{w}-J-(CH_{2})_{z}-NH_{2}, -(CH_{2})_{w}-J-(CH_{2})_{x}-K-(CH_{2})_{z}-NH_{2} y -(CH_{2})_{w}-J-(CH_{2})_{x}-K-(CH_{2})_{y}-L-(CH_{2})_{z}-NH_{2}; en los que J, K y L se seleccionan independientemente entre el grupo constituido por O y NH, en los que u es un número entero entre 1 y 10, w es un número entero entre 1 y 5, x es un número entero entre 2 y 5, y es un número entero entre 2 y 5, y z es un número entero entre 2 y 6; y b) los sustituyentes B, R_{1}, R_{2}, R_{4} y R_{5} sobre el anillo benceno (el átomo de carbono 8- que no tiene el sustituyente amino primario), los átomos de carbono 3-, 4-, 4'- y 5'- respectivamente, seleccionados independientemente entre el grupo constituido por -H y -(CH_{2})_{v}-CH_{3}, en el que v es un número entero entre 0 y 5; o una sal del mismo. Donde un elemento se "selecciona independientemente" entre un grupo, significa que el elemento no necesita ser el mismo que otros elementos elegidos del mismo grupo. La estructura de estos compuestos es como sigue.

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Preferiblemente A se selecciona entre el grupo constituido por -(CH_{2})-NH_{2} y -CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-NH_{2}. Más específicamente, la invención contempla los compuestos en los que A es -(CH_{2})-NH_{2} y B, R_{1}, R_{2}, R_{4} y R_{5} son -H; en los que A es -CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-NH_{2} y en el que B, R_{1} y R_{2} son -H; en el que R_{4} y R_{5} son CH_{3}.

La presente invención además contempla un procedimiento de inactivación de patógenos in vitro o ex vivo en una composición biológica mediante el uso de compuestos de psoraleno de estructura V (más adelante) con un sustituyente amino primario en el anillo benceno, en los que A está en el átomo 88 y B está en el átomo de carbono 5-, en los que A se selecciona entre el grupo constituido por: -(CH_{2})_{u}-NH_{2}, -(CH_{2})_{w}-J-(CH_{2})_{z}-NH_{2}, -(CH_{2})_{w}-J-(CH_{2})_{x}-K-(CH_{2})_{z}-NH_{2} y -(CH_{2})_{w}-J-(CH_{2})_{x}-K-(CH_{2})_{y}-L-(CH_{2})_{z}-NH_{2}; en los que J, K y L se seleccionan independientemente entre el grupo constituido por O y NH, en los que u es un número entero entre 1 y 10, w es un número entero entre 1 y 5, x es un número entero entre 2 y 5, y es un número entero entre 2 y 5, y z es un número entero entre 2 y 6; y sustituyentes B, R_{1}, R_{2}, R_{4} y R_{5} sobre los átomos de carbono 5-, 3-, 4-, 4'- y 5'- respectivamente, se seleccionan independientemente entre en grupo constituido por -H y -(CH_{2})_{v}CH_{3}, en el que v es un número entero entre 0 y 5; y cuando A es -CH_{2}-NH_{2}, al menos uno de B, R_{1}, R_{4} y R_{5} es -(CH_{2})_{v}CH_{3}, o una sal del mismo. Preferiblemente, A se selecciona entre el grupo constituido por -CH_{2}-NH_{2} y -CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-NH_{2}, y en los que cuando A es -CH_{2}-NH_{2}, al menos uno de B, R_{1}, R_{4} y R_{5} es -(CH_{2})_{v}CH_{3}. Más específicamente, la invención contempla los compuestos en los que A es -CH_{2}-NH_{2}, y en los que B, R_{1} y R_{4} son -H, y en los que R_{2}y R_{5} son -CH_{3}; en los que A es -CH_{2}-NH_{2}, y en los que B y R_{1} son -H, y en los que R_{2},R_{4} y R_{5} son -CH_{3}. En los que A es -CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-NH_{2}, y en los que B y R_{1} son -H, y en los que R_{2},R_{4} y R_{5} son -CH_{3}. La estructura de estos compuestos es como sigue.

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La presente invención también proporciona nuevas vías para la síntesis de los aminopsoralenos e intermedios que pueden ser útiles para proporcionar los psoralenos conjugados a una diversidad de otros grupos funcionales.

Sin tener la intención de estar limitado por ningún procedimiento de síntesis, los compuestos de la presente invención se pueden preparar mediante la inducción de la funcionalidad amino (o de un bloque de construcción para dicho grupo amino primario) en una forma temprana protegida en la síntesis antes de que se construya totalmente el anillo de psoraleno. Este procedimiento proporciona nuevas vías para la síntesis de psoralenos unidos a amino primario y pirona y unidos a benceno que permiten más flexibilidad en los sustituyentes en el anillo que los procedimientos existentes. Esto se ejemplifica en la síntesis de 3-aminometil-4'-metilpsoraleno, 3-aminometil-4,4',8-trimetilpsoraleno, 3-aminometil-4,5',8-trimetilpsoraleno, 3-aminometil-4,4',5',8-tetrametilpsoraleno, 3-(amino-2-oxa)butil-4,4',8-trimetilpsoraleno, 4-aminometil-4'-metilpsoraleno, 4-aminometil-4',5',8-trimetilpsoraleno, 4-(4-amino-2-oxa)butil-4',5',8-trimetilpsoraleno, 5-aminometilpsoraleno, 5-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',dimetilpsoraleno, 8-aminometil-4,4',5'-trimetilpsoraleno, 8-aminometil-4,5'-dimetilpsoraleno y 8-(4-amino-2-oxa)butil-4,4',5'-trimetilpsoraleno (descritos en los ejemplos más adelante).

La presente invención contempla procedimientos de inactivación de patógenos in vitro o ex vivo en una composición biológica, que comprende, en el siguiente orden: a) proporcionar, en cualquier orden, i) un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 ii) medios de fotoactivación para foto activar de dichos compuestos; y iii) una composición biológica que se origina de un organismo biológico de cualquier tipo y se sospecha que está contaminada con un patógeno que contiene ácido nucleico; b) añadir dicho compuesto a dicha composición biológica; y c) fotoactivar dicho compuesto, de manera que inactive dicho patógeno. En una realización, la composición biológica es un producto sanguíneo. En una realización preferida, el producto sanguíneo es bien plaquetas o plasma. Un procedimiento preferido de la presente invención se realiza en un banco de sangre o escenario similar, en el que dicho compuesto se formula en solución y dicha solución está contenida en una bolsa de sangre compatible, y en el que dicho compuesto se añade a dicha composición biológica haciendo fluir dicha composición biológica a través de dicha bolsa. Después del tratamiento con el procedimiento, el producto sanguíneo es adecuado para su uso propuesto.

Una composición biológica se define como una composición que se origina a partir de un organismo biológico de cualquier tipo. Los ejemplos de composiciones biológicas incluyen, pero no se limitan a, sangre, productos sanguíneos (tales como plasma, preparaciones de plaquetas, glóbulos rojos, glóbulos rojos envasados y suero), fluido cerebroespinal, saliva, orina, heces, semen, sudor, leche, tejido, muestras de tejidos, muestras de tejidos homogeneizadas, y cualquier otra sustancia que tenga su origen en un organismo biológico. Las composiciones biológicas también incluyen material sintético que incorpora una sustancia que tiene su origen en un organismo biológico, tal como una preparación de vacuna que comprende alumbre y un patógeno (el patógeno siendo la sustancia que tiene su origen en un organismo biológico), medio de cultivo celular, cultivos celulares, cultivos virales, y otros cultivos derivados de un organismo biológico.

Un patógeno se define como cualquier agente que contiene ácido nucleico y es capaz de ocasionar una enfermedad en un ser humano, otros mamíferos, o vertebrados. Los ejemplos incluyen microorganismos tales como microorganismos unicelulares o multicelulares que incluyen pero no se limitan a bacterias, virus, protozoos, hongos, levaduras, mohos y micoplasmas. El patógeno puede comprender bien DNA o RNA y este ácido nucleico puede ser de cadena sencilla o de doble cadena.

La presente invención contempla que el medio de fotoactivación comprende un dispositivo de fotoactivación capaz de emitir una intensidad dada de un espectro de radiación electromagnética que comprende longitudes de onda entre 180 nm y 400 nm, preferiblemente entre 300 nm y 400 nm, y en particular entre 320 nm y 380 nm. Es preferible que la intensidad esté entre 1 y 30 mW/cm^{2} y que la mezcla se exponga a esta intensidad durante entre un segundo y treinta minutos [patente de Estados Unidos Nº 5.593.823].

La presente invención contempla realizaciones en las que dicha preparación de sangre es un medio sintético. En una realización, la concentración de compuesto está entre 1 \muM y 1000 \muM, preferiblemente entre 1 \muM y 500 \muM. En una realización preferida, el compuesto se añade a dicha preparación de sangre a una concentración entre 10 \muM y 250 \muM.

La presente invención contempla realizaciones de los procedimientos donde la inactivación se realiza sin limitación (por ejemplo, reducción) de la concentración de oxígeno molecular. Preferiblemente, la inactivación se realiza sin limitación de la concentración de oxígeno singulete que se puede formar durante la etapa de fotorreacción. Además, no existe necesidad de usar codisolventes (por ejemplo, dimetilsulfóxido (DMSO)) para incrementar la solubilidad del compuesto.

En una realización del procedimiento de la invención, al menos dos de los compuestos están presentes. La presente invención contempla realizaciones en las que el compuesto se introduce bien en soluciones acuosas tales como agua, solución salina, o un medio sintético, preferiblemente un medio tamponado con fosfato, soluciones no acuosas tales como alcoholes, polietilenglicoles, o mezclas de disolventes con agua, o en una formulación seca en la que pueden estar presentes aditivos. En una realización, la presente invención contempla un medio sintético de almacenamiento de plaquetas, que comprende una solución acuosa exenta de glucosa y magnesio de: cloruro sódico 45-120 mM; citrato sódico 5-15 mM; acetato sódico 20-40 mM, y fosfato sódico 20-30 mM. En una realización preferida, la solución acuosa comprende: cloruro sódico aproximadamente 86 mM; citrato sódico aproximadamente 10 mM; acetato sódico aproximadamente 30 mM, y fosfato sódico aproximadamente 26 mM. La solución tiene un pH de aproximadamente 300 miliosmolar / Kg. Como no contiene glucosa o magnesio, el medio se autoclava fácilmente.

La presente invención contempla realizaciones en las que el compuesto se puede introducir en el recipiente de reacción en el momento de la fabricación. Alternativamente, el compuesto se puede añadir al recipiente de reacción en algún momento después de la fabricación, por ejemplo, un producto sanguíneo. En una realización, se proporciona una solución de psoraleno en un recipiente biocompatible que está unido a un conjunto de plástico desechable que contiene una unidad de plaquetas o plasma. La solución se psoraleno se mezcla con el producto sanguíneo pasando dicho producto sanguíneo a través del recipiente de psoraleno y la mezcla resultante se fotoactiva con un dispositivo de iluminación adecuado para la irradiación uniforme de bolsas de sangre [patente se Estados Unidos Nº 5.593.823]. En una realización adicional, el psoraleno residual y cualquier fotoproducto de psoraleno de bajo peso molecular se retira de la solución [publicación PCT WO / 98 / 30327, incorporada en esta memoria descriptiva como referencia].

En una realización, el producto sanguíneo, se mezcla con el psoraleno y la mezcla se pasa a través de un sistema de flujo en el que éste se pasa sobre una fuente de luz estática dando como resultado la fotoactivación de dicho psoraleno. El medio de paso a través de dicho sistema de flujo incluye pero no se limita a flujo de gravedad o flujo calibrado usando un sistema de bomba.

Descripción de la invención

La presente invención proporciona nuevos psoralenos que tienen capacidad potenciada para inactivar patógenos en presencia de luz ultravioleta. Los nuevos psoralenos son potencialmente eficaces contra una amplia diversidad de patógenos. La presente invención también proporciona procedimientos de uso de compuestos nuevos y conocidos para inactivar patógenos en productos biológicos para usarse in vivo o in vitro, y en particular, productos sanguíneos.

Los procedimientos de inactivación de la presente invención proporcionan procedimientos ex vivo de inactivación de patógenos, y en particular, virus, en productos sanguíneos antes de usarse in vitro o in vivo, en contraposición con los enfoques anteriores, el procedimiento requiere solamente tiempos de irradiación cortos y no hay necesidad de limitar (por ejemplo, reducir) la concentración de oxígeno molecular o de oxígeno en estado singulete presente o generado en el sistema.

El uso in vivo de un material se define como la introducción del material o compuesto en un ser humano mamífero o vertebrado vivo. El uso in vitro de material o compuesto se define como un uso del material o compuesto fuera de un ser humano mamífero o vertebrado vivo un en el que ni el material ni el compuesto se propone para la reintroducción en un ser humano, mamífero o vertebrado vivo. Un ejemplo de un uso in vitro sería el análisis de un componente de una muestra de sangre usando equipo de laboratorio. El uso ex vivo se define como el uso de un compuesto para el tratamiento de un material biológico tal como un producto sanguíneo en el exterior de un ser humano, mamífero o vertebrado vivo, en el que el material biológico tratado se propone para el uso en el interior de un ser humano, mamífero o vertebrado vivo. Por ejemplo, la extracción de sangre de un ser humano y la introducción de un compuesto en esa sangre para inactivar patógenos se define como un uso ex vivo de ese compuesto si la sangre se propone para la introducción en ese ser humano u otro ser humano. La reintroducción de la sangre humana en ese ser humano u otro ser humano sería uso in vivo de la sangre, en oposición al uso ex vivo del compuesto.

La descripción de la invención se divide las siguientes secciones: I) síntesis de compuestos, II) dispositivos de fotoactivación, III) unión de compuestos a ácido nucleico, IV) inactivación de materiales que contienen ácido nucleico V) conservación de propiedades bioquímicas de materiales tratados, VI) conjugados de psoralenos y otros usos de psoralenos.

I. Síntesis de compuestos A. Psoralenos como compuestos de fotoactivación

La presente invención contempla los compuestos descritos como psoralenos [7H-furo(3,2-g)-(1)-benzopiran-7-ona, o b-lactona de ácido 6-hidroxi-5-benzofuranacrílico], que son lineales

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y en la que los dos residuos de oxígeno anexos al resto aromático central tienen una orientación 1,3, y además en la que el resto de anillo furano está unido a la posición 6- del sistema de anillo de cumarina. Los derivados de psoraleno se derivan de sustitución de la fucocumarina lineal en los átomos de carbono 3-, 4-, 5-, 8-, 4'-, ó 5'- indicados en la estructura anterior. Para el propósito de esta invención, los sustituyentes sobre el anillo de psoraleno se designarán mediante la estructura de tres anillos constituida por los sustituyentes en el anillo furano (sustituyentes unidos a los átomos de carbono 4'- y 5'-), los sustituyentes del anillo central de benceno (sustituyentes unidos a los átomos de carbono 5- y 8-) y los sustituyentes del anillo pirona (sustituyentes unidos a los átomos 3- y 4-). Más específicamente, la presente invención contempla compuestos con un sustituyente amino primario sobre los átomos de carbono 3- ó 4- denominados en esta memoria descriptiva como psoralenos unidos a amino primario y pirona y compuestos con un sustituyente amino primario sobre el átomo de carbono 5- u 8- denominados en esta memoria descriptiva como psoralenos unidos a amino primario y benceno. Además, el otro átomo de carbono 3- ó 4- de un psoraleno unido a amino primario y pirona puede contener un sustituyente alquilo. De manera similar, el otro átomo de carbono 5- u 8- de un psoraleno unido a amino primario y pirona puede contener un sustituyente alquilo.

El 8-metoxipsoraleno (conocido en la bibliografía con diversos nombres, por ejemplo, xantotoxina, metoxsaleno, 8-MOP) es un psoraleno de origen natural con una unión fotoactivada relativamente baja a los ácidos nucleicos y baja mutagenicidad en un ensayo Ames. El 4'aminometil-4,5',8-trimetilpsoraleno (AMT) es uno de los derivados de psoraleno de unión a ácidos nucleicos más reactivos, proporcionando hasta 1 aducto del AMT por 3,5 pares de bases de DNA [S. T. Isaacs, G. Wiesehahn y L. M. Hallick, NCl Monograph 66: 21 (1984)]. Sin embargo, el AMT también exhibe niveles significativos de mutagenicidad. Se desea un nuevo grupo de psoralenos que tenga las mejores características tanto del 8-MOP como del AMT: baja mutagenicidad y alta afinidad de unión a ácidos nucleicos, para asegurar inactivación segura y completa de patógenos. Un grupo de psoralenos que se ha sintetizado y estudiado son psoralenos unidos a amino primario y furano, los cuales se describen en detalle en la patente de Estados Unidos Nº 5.593.823. Los compuestos de la presente invención son análogos unidos a amino primario y pirona y unidos a amino primario y benceno y se muestra que son eficaces en la activación de R17, sugiriendo una afinidad de unión a ácido nucleico muy alta.

Los psoralenos unidos a amino primario y pirona se definen como compuestos de psoraleno que tienen un grupo -NH_{2} unido a los átomos de carbono 3- ó 4- del psoraleno mediante una cadena de hidrocarburo que tiene una longitud total de 1 a 24 carbonos, donde 0 a 3 de los carbonos se reemplazan independientemente con NH u O, y cada punto de reemplazo se separa de cada otro punto mediante al menos dos carbonos y se separa del psoraleno mediante al menos un carbono. Los psoralenos unidos a amino primario y pirona pueden tener sustituyentes adicionales sobre el otro átomo de carbono 3- ó 4- y sobre los átomos de carbono 5-, 8-, 4'- y 5'. Dichos sustituyentes incluyen pero no se limitan a -H y -(CH_{2})_{v}CH_{3}, donde v es un número entero entre 0 y 5. El compuesto I anterior proporciona la estructura de psoralenos unidos a amino primario y pirona.

Los psoralenos unidos a amino primario y benceno se definen como compuestos de psoraleno que tienen un grupo -NH_{2} unido al átomo de carbono 5- u 8 del psoraleno mediante una cadena de hidrocarburos que tiene una longitud total de 1 a 24 carbonos, donde o 0 a 3 de aquellos carbonos se reemplazan independientemente por NH u O, y cada punto de reemplazo se separa de cada otro punto de reemplazo mediante al menos dos carbonos y se separa del psoraleno mediante al menos un carbono. Los psoralenos unidos a amino primario y benceno pueden tener sustituyentes adicionales sobre el otro átomo de carbono 5- u 8- y sobre los átomos de carbono 3-, 4-, 4'- y 5'-. Dichos sustituyentes incluyen pero no se limitan a -H y -(CH_{2})_{v}CH_{3}, donde v es un número entero entre 0 y 5. Cuando el sustituyente amino primario está sobre el átomo de carbono 8-, la presente invención está limitada ya que al menos uno de los sustituyentes 3-, 5-, 4'- ó 5'- es -(CH_{2})_{v}CH_{3}. El compuesto IV anterior proporciona la estructura de psoralenos unidos a amino primario y benceno.

B. Síntesis de los psoralenos unidos a amino primario y pirona

El esquema 1 muestra un procedimiento de síntesis de 3-halometilcumarinas (1) y 4-halometilcumarinas (4) útiles para la preparación de los compuestos unidos a amino primario y pirona de la presente invención. Los compuestos se pueden preparar a partir de materiales comercialmente disponibles y convertir en ftalimidometilcumarinas (2 y 5) y a psoralenos unidos a aminometil y pirona (3 y 6) aplicando los procedimientos descritos previamente [McLeod y col. Tetrahedron Lett. (1972) p. 237; 237; Isaacs y col., Biochem. 16: 1058 (1977) p. 237; Isaac y col., Biochem. 16: 1058 (1977)] y detallados además en los ejemplos.

Esquema 1

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Los psoralenos de cadena larga unidos a aminoalquilo y pirona se pueden preparar a partir de los análogos de haloalquilcumarinas (7 y 9 como se muestra en el esquema 2). Aunque hay muchas formas de elaborar las cumarinas deseadas, muchas de ellas se pueden preparar más convenientemente mediante la reacción de Pechman [Organic Reactions, Vol VII, capítulo 1, ed. Adams y col., Wiley, N. Y., (1953)] de resorcinoles con los betacetoésteres funcionarizados. Los betacetoésteres funcionalizados teniendo un haluro o haluro sintón se pueden preparar mediante procedimientos conocidos [por ejemplo, J. March, Advance Organic Chemistry, tercera edición, Wiley, (1985) pp 437-440 y 824]. Por ejemplo, Lambert y col., J. Org. Chem., 1985, 50, 5352; Gupta y col., J. Organomet. Chem. 1993, 444,1; Crombie y col., J. Chem. Soc Perk trans I, 1987, 333; patente española 549788 AI de Tremul Lozano describe la preparación de los betacetoésteres deseables. La síntesis de dichos haloalquilo e hidroxialquilcumarinas se han descrito previamente [Pat. Pol. PL 144435 B1 de Zaniuk y col., Fall y col., Heterocycles, (1995) 41, 647].

Esquema 2

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Alternativamente se puede llevar la alquilcumarina protegida (por ejemplo, 7 donde Y = halo, OH, OMe) a través de un psoraleno unido a haloalquilo y pirona y preparar los compuestos de la presente invención aplicando algunos procedimientos conocidos en la técnica para funcionalizar los haloalquilpsoralenos. Los ejemplos de tales funcionalizaciones incluyen la reacción de 4'-bromometil o clorometilpsoralenos (4'-BMT y 4'-CMT respectivamente) sin amoníaco, o ftalimida de potasio (KPhth) seguido de hidrazina para proporcionar el AMT, así como la reacción de la 4'-BMT y 4'-CMT con una diversidad de otras aminas. Se conoce la reacción idéntica de 5'-bromometil o clorometilpsoraleno con KPhth [patente de Estados Unidos Nº 4.294.822 de Kaufman]. Se conoce la reacción de 5-clorometil-8-metoxipsoraleno y 8-clorometil-5-metoxipsoraleno con aminas.

Para la preparación de los compuestos de la presente invención en los que el engarce entre la amina primaria y el psoraleno contiene uno o más átomos de oxígeno, uno o más de nitrógeno o de ambos oxígeno y nitrógeno, anteriormente la preparación de dichos sistemas funcionarizados de haloalquilpsoralenos se ha descrito completamente para psoralenos 4'- y 5'-amino primario sustituidos [patente de Estados Unidos Nº 5.654.443]. Los mismos procedimientos sintéticos se pueden aplicar a los psoralenos 3- y 4-amino primario sustituidos como se muestra en los ejemplos. Finalmente, el uso de de pseudohaluros tal como el grupo metanosulfonilo se ha descrito de manera que en la reacción de 4'-(4-metanosulfoniloxi-2-oxa)butil-4,5',8.trimetilpsoraleno con azida sódica y posteriormente convertida en 4'-(4-amino-2-oxa)butil-4,5',8'-trimetilpsoraleno. Los mismos procedimientos sintéticos se pueden aplicar a los psoralenos 3- y 4-amino primario sustituidos como se muestra en los ejemplos y se tipifica en el esquema 3 para la síntesis de 13 y 16, que tienen un átomo de oxígeno en la cadena amino primario sustituyente. La síntesis comienza a partir de metoxialquilcumarinas 7 y 9 anteriores (en las que Y = OMe) que se puede preparar a partir de 7 y 9 (Y = halo, OH) o mediante síntesis directa de cumarina. La conversión en psoralenos 11a y 14a sigue los mismos procedimientos descritos en esta memoria descriptiva en el esquema 1 y en alguna otra parte. Después los psoralenos se desmetilan en un procedimiento que proporciona bien el haloalquilpsoraleno directamente, o un hidroxialquilpsoraleno que se convierte a un pseudohaloalquilpsoraleno (11b y 14b más adelante). Mediante procedimientos conocidos, indicados en los ejemplos y en alguna otra parte [patente de Estados Unidos Nº 5.654.443] los haloalquilpsoralenos se convierten en los psoralenos sustituidos unidos a amino primario y pirona 13 y 16.

Esquema 3

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C. Síntesis de psoralenos unidos a amino primario y benceno

Como se ha descrito anteriormente para los compuestos unidos a amino primario y pirona, los compuestos unidos a amino primario y benceno se pueden preparar mediante la funcionalización inicial antes de la formación del sistema de anillo de psoraleno. Las halometilcumarinas (17 y 19 más adelante) se pueden preparar mediante la brotación de la cumarina adecuada como se muestra en el esquema 4 y después convertirse mediante procedimientos descritos en los ejemplos y en alguna otra parte en los aminometilpsoralenos deseados (18 y 20 más adelante) de la presente invención. Para los compuestos amino primarios unidos al átomo de carbono 8, los 8-aminoalquilinferiorpsoralenos y 8-aminoalquilinferior-4-alquilinferiorpsoralenos se describen en las patentes de Estados Unidos números 4.328.239 y 4.269.851.

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Esquema 4

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Los compuestos anteriores unidos a aminometilbenceno y psoralenos unidos a aminoalquilbenceno de cadena larga (23 y 26 más adelante) se pueden preparar preformando los análogos de haloalquilcumarinas (22 y 25 como se muestra en el esquema 5). Aunque hay muchas formas de elaborar las cumarinas deseadas, muchas de ellas se pueden preparar más convenientemente mediante la reacción de Pechman [Organic Reactions, Vol VII, capítulo 1, ed. Adams y col., Wiley, N. Y., (1953)] de resorcinoles funcionalizados con los betacetoésteres. Los resorcinoles deseados teniendo un haluro o haluro sintón (21 y 24 más adelante) se pueden preparar mediante procedimientos conocidos [véase por ejemplo, patente de Estados Unidos 5.440.052 de Makriyannis y col.; Seebach y col., Helv. Chim. Acta (1994) 77, 1673; Charalambous y col., J. Med. Chem (1992) 35, 3076; Elix y col., Aust. J. Chem. (1987) 40, 1841]. Las haloalquilcumarinas también se pueden convertir a aminoalquilcumarinas protegidas y tomadas sobre los psoralenos mediante procedimientos descritos en los ejemplos.

Esquema 5

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Alternativamente se puede llevar la alquilcumarina protegida (por ejemplo, 22 y 25 donde Y = halo, OH, OMe) directamente a un psoraleno unido a haloalquilpirona y preparar los compuestos de la presente invención mediante procedimientos conocidos en la técnica para funcionalizar los haloalquilpsoralenos como se muestra en el esquema 6 para la síntesis de 28 y 30 más adelante, que tiene un átomo de oxígeno en la cadena sustituyente amino primario. La síntesis comienza a partir de metoxialquilcumarinas 22 y 25 anteriores (en las que Y = OMe) que se puede preparar a partir de 22 y 25 (Y = halo, OH) o mediante síntesis directa de cumarina. La conversión en psoralenos 27 y 29 sigue los mismos procedimientos descritos en esta memoria descriptiva en el esquema 3 y en alguna otra parte. Mediante procedimientos conocidos, indicados en los ejemplos los haloalquilpsoralenos se convierten en 28 y 30.

Para la preparación de los psoralenos unidos a amino primario y benceno en los que el engarce entre la amina primaria y el psoraleno contiene uno o más átomos de oxígeno, uno o más de nitrógeno o de ambos oxígeno y nitrógeno, se pueden usar los procedimientos descritos en anteriormente para los psoralenos unidos a amino primario y pirona.

Esquema 6

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D. Síntesis de conjugados de psoraleno

La preparación de conjugados de psoraleno en los que el psoraleno está unido a nucleótidos, biotina, otros intercaladores, etc., se ha descrito para los psoralenos unidos en 4', para el 8-metilpsoraleno unido a 5-metilo y para el 5-metilpsoraleno unido a 8-metilo. Aunque no estando limitado a ningún procedimiento de síntesis para conjugar el psoraleno en otra pequeña molécula, proteína, ácido nucleico o superficie de material, los procedimientos típicos para unir psoralenos a menudo conllevan uno de los tres procedimientos: 1) el bromometilpsoraleno se hace reaccionar con una función amino o hidroxi sobre el resto conjugado; 2) el aminometilpsoraleno se hace reaccionar con un precursor de amida, urea o carbamato (por ejemplo, un grupo succinamido, o un isocianato) sobre el resto de conjugación; y 3) el hidroximetilpsoraleno se hace reaccionar con un precursor de éster, o de carbamato sobre el resto de conjugación.

Mediante el uso de dichos procedimientos de conjugación conocidos o procedimientos alternativos que pueden proporcionar mayor facilidad de preparación, se pueden preparar composiciones que comprenden un psoraleno unido a través del anillo pirona a otros restos de unión de ácidos nucleicos, a proteínas, a ácidos nucleicos, a sondas fluorescentes u otras moléculas pequeñas útiles en diagnósticos y superficies de materiales.

Del mismo modo, mediante el uso de dichos procedimientos conocidos de conjugación o procedimientos alternativos que pueden proporcionar mayor facilidad de preparación, se pueden preparar composiciones que comprenden un psoraleno unido a través del anillo benceno a otros restos de unión de ácidos nucleicos, a proteínas, a ácidos nucleicos, a sondas fluorescentes u otras moléculas pequeñas útiles en diagnósticos y superficies de materiales.

II. Dispositivos de fotoactivación

Una diversidad de dispositivos luminosos puede ser útil para la fotoactivación de compuestos de la presente invención y puede ser útil en la metodología actual. Las características de los posibles dispositivos se pueden encontrar en las patentes de Estados Unidos números 5.593.823 y 5.683.661. Las características adicionales para posibles usos de los compuestos de esta invención incluirían un medio para pasar una solución para inactivación a través de un dispositivo luminoso de manera que la solución se ilumine suficientemente como para inactivar patógenos en el interior de la solución. Dichos medios pueden incluir flujo por gravedad o flujo calibrado, tal como mediante una bomba peristáltica o aparatos de flujo similares.

III. Unión de compuestos a ácido nucleico

La presente invención contempla los compuestos nuevos y conocidos de unión a ácido nucleico, incluyendo (pero no limitado a) ácido nucleico viral, ácido nucleico bacteriano, ácido nucleico de linfocitos y ácido nucleico de células de tejidos tales como células de músculo liso. Un planteamiento de la presente invención para unir compuestos de fotoactivación a ácido nucleico es la fotounión. La fotounión se define como la unión de compuestos de fotounión en presencia de longitudes de onda de fotoactivación de luz. Los compuestos de fotounión son compuestos que se unen a ácido nucleico en presencia de longitudes de onda fotoactiivadoras de luz. La presente invención contempla procedimientos de fotounión con compuestos de la presente invención.

Una realización del procedimiento de la presente invención para la fotounión implica las etapas: a) proporcionar un compuesto de fotounión de la presente invención; y b) mezclar el compuesto de fotounión con ácido nucleico en presencia de longitudes de onda de fotoactivación de radiación electromagnética.

La invención además contempla un procedimiento para modificar ácido nucleico que comprende las etapas: a) proporcionar un compuesto de fotounión de la presente invención y ácido nucleico; y b) fotounir el compuesto de el compuesto de fotounión al ácido nucleico de manera que se forma un complejo compuesto:ácido nucleico.

IV. Inactivación de materiales que contienen ácido nucleico

La presente invención contempla tratar un producto sanguíneo con un compuesto de fotoactivación e irradiar para inactivar las secuencias de ácido nucleico de patógeno contaminante antes de usar el producto sanguíneo. La presente invención también se puede aplicar a la inactivación de otros materiales que contienen ácidos nucleicos, tales como linfocitos, células de tejidos, y soluciones que contienen ácidos nucleicos, por ejemplo soluciones que se han amplificado mediante la reacción en cadena de la polimerasa o una técnica similar de amplificación de ácido nucleico.

A. Inactivación en general

El término "inactivación" se define en esta memoria descriptiva como la alteración del ácido nucleico en un material de manera que el ácido nucleico se vuelva incapaz de replicarse. Cuando el ácido nucleico es el de un patógeno, la inactivación del ácido nucleico hace que el patógeno sea incapaz de replicarse. La inactivación de patógenos se detalla en la patente de Estados Unidos Nº 5.593.823. Además, la inactivación se puede producir en cualquier célula y el nivel de inactivación en el interior de una célula se puede controlar mediante el nivel de de fotounión del psoraleno al ácido nucleico. El nivel de fotounión se puede controlar variando bien la dosis de luz usada o la dosis del psoraleno. El nivel de inactivación se puede controlar variando entre la detención completa de todas las funciones celulares (altos niveles de fotounión) y la detención de la proliferación de la célula mientras se mantienen las funciones celulares (bajos niveles de fotounión), es decir, la célula todavía es capaz de de transcribir el ácido nucleico para la producción de proteínas. Por ejemplo, un linfocito o célula de tejido se puede inactivar de manera que no puede replicarse aunque puede todavía producir proteínas y mantener la función biológica. Esto también se puede denominar como inhibición de proliferación celular en lugar de inactivación.

B. Inactivación de patógenos potenciales

En el caso de procedimientos de inactivación para los materiales que van a usar los seres humanos, bien in vivo o in vitro, el procedimiento de detección se puede tomar teóricamente para que sea la medición del nivel de infección con una enfermedad como un resultado de la exposición al material. El umbral debajo del cual el procedimiento de inactivación se completa se toma entonces como el nivel de inactivación que es suficiente para evitar que la enfermedad se produzca debido al contacto con el material. Se reconoce que en este escenario práctico, no es esencial que los procedimientos de la presente invención den como resultado "inactivación total". Es decir, la "inactivación sustancial" será adecuada mientras la parte viable sea insuficiente para producir la enfermedad. El procedimiento de inactivación de la presente invención hace que el ácido nucleico en los patógenos se inactive sustancialmente. En otra realización, el procedimiento de inactivación hace que el ácido nucleico del patógeno en las preparaciones sanguíneas se inactive sustancialmente.

Sin intentar estar limitado por ningún procedimiento mediante el que los compuestos de la presente invención inactivan patógenos, se cree que la inactivación se produce de la unión inducida por la luz de los psoralenos al ácido nucleico del patógeno. Además, aunque que no se intenta que el procedimiento de inactivación de la presente invención esté limitado por la naturaleza del ácido nucleico; se contempla que el procedimiento de inactivación hace que todas las formas de ácido nucleico (bien DNA, mRNA, etc.) se inactiven sustancialmente.

En el caso de los compuestos de fotoactivación que modifican ácido nucleico, se prefiere que la interacción del ácido nucleico del patógeno (bien DNA, mRNA, etc.)con el compuesto de fotoactivación haga que el patógeno sea incapaz de replicarse, de manera que si un humano se expone al patógeno tratado, no se producirá la infección.

"Medios sintéticos" en esta memoria descriptiva se define como un medio de almacenamiento acuoso de sangre sintética o producto sanguíneo. En una realización, la presente invención contempla la inactivación de productos sanguíneos en medios sintéticos. Este procedimiento puede reducir la degradación del producto durante el almacenamiento y permite el uso de concentraciones inferiores de compuestos de fotoactivación.

El procedimiento de fotoinactivación por psoralenos inactiva el ácido nucleico base de los patógenos presentes en la sangre mediante un procedimiento sencillo. De este modo, tiene el potencial de eliminar también bacterias, protozoos, y virus. Si hubiera habido un procedimiento de descontaminación eficaz disponible antes del advenimiento de la pandemia de SIDA, no se hubiera producido ninguna transfusión asociada a la transmisión de VIH. La descontaminación basada en psoralenos tiene el potencial de eliminar todos los agentes infecciosos del suministro de sangre, independientemente del patógeno implicado. Adicionalmente, la descontaminación basada en psoralenos tiene la capacidad de esterilizar productos sanguíneos después de la recogida y elaboración, que en el caso de concentrados de plaquetas podría solucionar el problema de contaminación bacteriana de bajo nivel y da como resultado una ampliación de la vida de almacenamiento. [J. Morrow y col., JAMA 266: 555-558 (1991); F. Bertolini y col., Transfusion 32: 152-156 (1992)].

Una lista de virus que se han inactivado fotoquímicamente mediante uno o más psoralenos aparece en la tabla 2 [A partir de la tabla 1 de Hanson, C. V., Blood Cells 18: 7 (1992)]. Esta lista no es exhaustiva y es meramente representativa de la gran diversidad de patógenos que los psoralenos pueden inactivar. La presente invención contempla la inactivación de estos y otros virus mediante los compuestos descritos en esta memoria descriptiva. Los compuestos de la presente invención son particularmente muy adecuados para inactivar virus de envoltura, tal como el virus de VIH.

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(Tabla pasa a página siguiente)

TABLA 2

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C. Selección de los compuestos de fotoactivación para inactivación de patógenos

Con el fin de evaluar un compuesto para decidir si sería útil en los procedimientos de la presente invención, se deben considerar dos propiedades importantes: la capacidad de los compuestos para inactivar patógenos y el efecto de los compuestos sobre la idoneidad del producto tratado para su uso propuesto. Una descripción de la inactivación de patógenos distinta del modelo R17 descrito más adelante se puede encontrar en la patente de Estados Unidos Nº 5.593.823. Esta referencia permite el criterio de selección para uso en inactivación de patógenos de productos sanguíneos para los compuestos de la presente invención. La técnica de evaluación usada para valorar los compuestos de la presente invención es realizar una evaluación de bacteriófagos; un ensayo que determina la unión de los compuestos de ensayo al ácido nucleico. Una evaluación de este tipo, una evaluación de R17, se describe en detalle en el ejemplo 13 más adelante.

La evaluación de bacteriófago R17 se cree que es predictiva de la eficacia de inactivación de VIH, así como de la eficacia de los compuestos contra otros muchos virus. Es un fago pequeño de cadena sencilla de RNA. Sin pretender estar sujeto a las limitaciones de ningún medio mediante el que la presente invención trabaja, se espera que piezas más cortas de ácido nucleico sean más difíciles de inactivar debido a que requieren una mayor frecuencia de formación de aductos de psoralenos que lo hacen piezas más largas de ácido nucleico. Además, los patógenos de RNA de cadena sencilla son más difíciles de inactivar debido a que los psoralenos ni se pueden intercalar entre las pares de bases, como con los ácidos nucleicos de cadena doble, ni formar diaductos que funcionan como entrecruzamientos intercadena. De este modo se espera que cuando se logra la inactivación de R17, estas mismas condiciones producirán la inactivación de muchos virus y bacterias. Más específicamente, los compuestos que muestran un logaritmo de inactivación > 1 de R17 (es decir, muerte > 90%) a una concentración de compuesto en un medio de ensayo de 320 \muM o menos se espera que sean candidatos razonables para la inactivación de patógenos en productos sanguíneos.

V. Conservación de las propiedades bioquímicas del material tratado

Los psoralenos son útiles en los procedimientos de inactivación debido a que la reacción se puede llevar a cabo a temperaturas compatibles con el mantenimiento de las propiedades bioquímicas de la sangre y productos sanguíneos [Hanson, C. V., Blood Cells 18: 7 (1992)]. Los compuestos y procedimientos de inactivación de la presente invención son especialmente útiles porque proporcionan un medio para inactivar patógenos mientras potencialmente mantienen la aptitud del producto para su uso propuesto. La aptitud del plasma se puede medir mediante la funcionalidad de sus componentes proteicos, bien en el plasma entero o después de la separación en fracciones de plasma. La aptitud de las plaquetas se puede determinar mediante procedimientos y criterios similares a los usados para establecer la aptitud de protocolos y de almacenamiento y manejo.

VI. Conjugados de psoraleno y otros usos de psoralenos

Debido a su afinidad por los ácidos nucleicos y capacidad de unirse covalentemente a ácidos nucleicos, los compuestos de la presente invención pueden ser muy útiles cuando se conjugan a otras moléculas. Los conjugados se pueden formar bien mediante unión química o fotoquímica de los psoralenos a otra molécula, fragmento molecular o ligando. Los materiales a los que el psoraleno se puede conjugar, incluyen, pero no se limitan a, otros restos de unión a ácidos nucleicos tales como acridinas o lexitropsinas, proteínas tales como anticuerpos o ligandos de receptores, ácidos nucleicos, moléculas pequeñas útiles en diagnósticos tales como sondas fluorescentes y superficies de materiales.

La cadena terminada en amino de los psoralenos de la presente invención, o los intermedios sustituidos con halógeno indicados en los ejemplos 6-9, son particularmente adecuados para la unión química a otras moléculas. Dichos compuestos terminados en amino se pueden sustituir con el AMT en los siguientes ejemplos. En Wang Z, y col., J. Am. Chem. Soc 117 (20): 5438-5444 (1995), el AMT se conjuga a un aminoácido protegido y posteriormente se usa para preparar un conjugado psoraleno:péptido. Dichos conjugados se pueden usar para sondear las interacciones específicas de secuencias entre proteínas y ácidos nucleicos, o quizás para controlar selectivamente la expresión génica. De manera similar, el psoraleno se puede conjugar a un oligonucleótido de ácido nucleico que se dirige a una secuencia específica de ácido nucleico (Vaghefi y col., publicación PCT WO 92/02641. Dichos conjugados se pueden usar como control de la expresión génica o como una sonda específica del lugar de la secuencia de ácidos nucleicos. La conjugación del psoraleno permite una unión fotoquímica covalente del oligonucleótido a la secuencia diana. Otras moléculas conjugadas a un psoraleno comenzando en una cadena de aminoácido terminal del psoraleno incluyen, pero no se limitan a, biotina, tintes fluorescentes, insulina y lexitropsina, los usos de los cuales se describen en las referencias [patentes de Estados Unidos números 4.737.454 y 4.599.303, Biochem. Y Biophys. Res. Comm. 141 (2): 502-509 (1986), Anti-cancer Drug Design 9: 221-237 (1994)].

Cualquier psoraleno se puede conjugar potencialmente a un ácido nucleico fotoquímicamente. Dichos conjugados fotoquímicos se pueden usar como sondas a dianas específicas de ácidos nucleicos. El psoraleno conjugado fotoquímicamente se puede preparar de manera que cuando los pares de oligonucleótidos modificados con el ácido nucleico diana complementario, el psoraleno puede entrecruzar la sonda a la hebra diana con una dosis adicional de luz UV. La preparación y usos de dichos conjugados fotoquímicos psoraleno-oligonucleótido se describen en las patentes de Estados Unidos números 4.737.454, 4.599.303 y 5.532.146. De manera similar, cualquier material con el que el psoraleno puede interactuar y fotounirse se puede conjugar fotoquímicamente al psoraleno. Por ejemplo, Bioconjugate Chem. 5 (5): 463-467 (1994) proporciona un procedimiento de fotorreacción de un compuesto de psoraleno con una superficie de poliestireno tal como una placa de microtitulación. Después el psoraleno se puede conjugar a otra molécula tal como un oligonucleótido, péptido, o biotina. Aunque esta referencia usa psoralenos que contienen una amina secundaria, los compuestos de amino primario de la presente invención también serían útiles usando los esquemas de conjugación descritos en las referencias anteriores.

Otros posibles usos de los compuestos de la presente invención incluyen la inactivación de virus para el propósito de preparar una vacuna, la inhibición de leucocitos para controlar la proliferación todavía mantiene alguna función como medio de prevenir injerto frente a una enfermedad de hospedador en transplantes de médula ósea, y la inhibición de células de músculo liso para controlar la proliferación después de la lesión, por ejemplo, para prevenir la reestenosis después de la angioplastia de globo. Una descripción del uso de psoralenos en la preparación de vacunas se puede encontrar en la patente se Estados Unidos Nº 5.106.619. Una descripción del uso del 8-metoxipsoraleno para la prevención de reestenosis se puede encontrar en la patente de Estados Unidos Nº 5354774.

Parte experimental

Los ejemplos siguientes sirven para ilustrar ciertas realizaciones y aspectos preferidos de la presente invención y no se construyen como limitación del alcance de la misma.

En la descripción experimental que sigue, se aplican las siguientes abreviaturas: J (julios); TLC (cromatografía en capa fina); RMN (resonancia magnética nuclear; espectros obtenidos a temperatura ambiente en un espectrómetro Varian Gemini 200 MHz Fourier Transform); THF (tetrahidrofurano); DMF (N,N-dimetilformamida); DMEM (medio de Eagle modificado por Dulbeccos); FBS (suero fetal bovino); LB (caldo Luria); EDTA (ácido etilendiaminotetraacético). Los materiales de partida para los ejemplos de síntesis se obtienen a partir de proveedores comunes tales como Aldrich Chemical, Milwaukee, Wisconsin.

Cuando se aíslan compuestos de la presente invención en forma de una sal de adición de ácido, el ácido se selecciona preferiblemente de manera que contenga un anión que no sea tóxico y farmacéuticamente aceptable, al menos en dosis terapéuticas usuales. Las sales representativas que se incluyen en este grupo preferido son los clorhidratos, bromhidratos, sulfatos, acetatos, fosfatos, nitratos, metanosulfonatos, etanosulfonatos, lactatos, citratos, tartratos o bitartratos, y maleatos. Otros ácidos son igualmente adecuados y se pueden emplear como se desee. Por ejemplo, ácidos fumárico, benzoico, ascórbico, succínico, salicílico, bimetilensalicílico, propiónico, glucónico, málico, malónico, mandélico, cinámico, citracónico, esteárico, palmítico, itacónico, glicólico, bencenosulfónico y sulfámico también se pueden emplear como ácidos formadores de sales de adición.

Los siguientes ejemplos sirven para ilustrar ciertas realizaciones y aspectos preferidos de la presente invención y no se construyen como limitación del alcance de la misma.

Ejemplo 1 Síntesis de clorhidrato de 3-aminometil-4,4',8-trimetilpsoraleno (compuesto 31)

Etapa 1

Una solución de 7-hidroxi-3,4,8-trimetilcumarina (5,19 g, 25,4 mmoles) se calentó a reflujo en anhídrido acético (10 ml) durante 1,5 horas. Se vierte la solución se vertió lentamente en agua con hielo (200 ml) y se filtra el sólido resultante, después se enjuagó con agua para producir 7-acetoxi-3,4,8-trimetilcumarina, un sólido beige (6,22 g, 99,5%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,47 (d, J = 8,6 Hz, 1H), 7,00 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 2,40 (s, 3H), 2,37 (s, 3H), 2,29 (s, 3H), 2,22 (s, 3H).

Etapa 2

Una mezcla de 7-acetoxi-3,4,8-trimetilcumarina (6,22 g, 25,3 mmoles), N-bromosuccinimida (4,61 g, 25,9 mmoles) y peróxido de benzoílo (30 mg) se calentaron a reflujo en tetracloruro de carbono durante 3,5 horas. Se enfrió la mezcla hasta temperatura ambiente y se repartió entre CH_{2}Cl_{2} y agua. Se separó la fase orgánica y se lavó con agua varias veces, después se lavó con salmuera. Después la fase orgánica se secó con sulfato sódico anhidro y se evaporó para proporcionar el producto bruto (11,8 g) que se recristalizó dos veces en tolueno para proporcionar 7-acetoxi-3-bromometil-4,8-dimetilcumarina, un sólido cristalino blanco (4,86 g, 59%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,54 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,05 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 4,57 (s, 2H), 2,50 (s, 3H), 2,37 (s, 3H), 2,28 (s, 3H).

Etapa 3

Una mezcla de 7-acetoxi-3-bromometil-4,8-dimetilcumarina (200 mg, 0,617 mmoles) y ftalimida potásica (126 mg, 0,680 mmoles) se agitó durante una noche a temperatura ambiente en DMF (3 ml). La suspensión se vertió en agua con hielo, se filtró y se lavó con una cantidad copiosa de agua para retirar trazas de DMF con el fin de proporcionar 7-acetoxi-4,8-dimetil-3-ftalimidometilcumarina, un sólido cremoso blanco después de secar (221 mg, 91,7%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,84-7,67 (m, 4H), 7,55 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,02 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 4,92 (s, 2H), 2,62 (s, 3H), 2,36 (s, 3H), 2,25 (s, 3H).

Etapa 4

Una solución de 7-acetoxi-4,8-dimetil-3-ftalimidometilcumarina (15,9 g, 40,6 mmoles) se agitó en metanol (2000 ml) mientras se añadió gota agota H_{2}SO_{4} concentrado (75 ml). La mezcla resultante se calentó a reflujo durante 3 horas, se dejó enfriar hasta temperatura ambiente, después se enfrió en baño de agua con hielo. Se recogió el precipitado en un embudo Buchner y se enjuagó con metanol enfriado con hielo para proporcionar 7-hidroxi-4,8-dimetil-3-ftalimidometilcumarina, un sólido blanco (12,1 g, 85,6%). ^{1}H RMN (CD_{3}OD): \delta 7,87-7,78 (m, 4H), 7,55 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 6,84 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 2,61 (s, 3H), 2,23 (s, 3H), el pico de metileno está presumiblemente oscurecido por el pico de hidroxi del metileno a 4,88.

Etapa 5

Una suspensión de 7-hidroxi-4,8-dimetil-3-ftalimidometilcumarina (4,00 g, 11,5 mmoles), carbonato potásico (4,5 g, 36,9 mmoles), cloroacetona (1 ml, 11,5 mmoles) y acetona (200 ml) se calentó a reflujo durante una noche. Después se dejó que la solución se enfriara hasta temperatura ambiente, se añadió CH_{2}Cl_{2} (200 ml) y el sólido resultante se retiró por filtración. La solución restante se decoloró en frío con carbón y se evaporó el disolvente. El sólido resultante se agitó con agua, se filtró a vacío y se lavó con agua. Después de secar al aire se obtuvo 4,8-dimetil-7-(2-oxo)propiloxi-3-(ftalimidometil)cumarina (4,06 g, 87,1%) en forma de un sólido blanquecino. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,66-7,83 (m, 4H), 7,48 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,65 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 4,91 (s, 2H), 4,62 (s, 2H), 2,59 (s, 3H), 2,35 (s, 3H), 2,32 (s, 3H).

Etapa 6

El compuesto 4,8-dimetil-7-(2-oxo)propiloxi-3-(ftalimidometil)cumarina (655 mg, 1,62 mmoles) se agitó en NaOH concentrado (30 ml) durante una noche. La solución marrón obtenida se vertió en agua con hielo (150 ml) y se acidificó con H_{2}SO_{4} hasta pH 1. El sólido blanco obtenido se dejó en agitación durante varias horas, se filtró y se enjuagó con agua. Después de secar en un desecador a vacío con pentóxido de fósforo, se obtuvo 3-(o-carboxibenzamido)metil-4,4'8-trimetilpsoraleno (68,3 mg, 102%) en forma de un sólido blanco. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 8,54 (m, 1H), 7,41-7,93 (m, 6H), 4,45 (d, J = 4,8 Hz, 2H), 2,65 (s, 3H), 2,30 (s, 3H).

Etapa 7

Una suspensión del ácido carboxílico de 3-(o-carboxibenzamido)metil-4,4'8-trimetilpsoraleno (304 mg, 0,751 mmoles) en HCl 6 N (50 ml) se calentó a reflujo durante una noche. Se extrajo la reacción con CH_{2}Cl_{2}. La fase ácida acuosa se basificó con K_{2}CO_{3} básico y se extrajo con CH_{2}Cl_{2}. La fase orgánica se secó y se evaporó para proporcionar 3-aminometil-4,4',8-trimetilpsoraleno (129 mg, 66,8%) en forma de un sólido amarillo. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,58 (s, 1H), 7,48 (cuartete ap., J = 1,3 Hz, 1H), 3,91 (s, 2H), 2,59 (s, 6H), 2,29 (d, J = 1,2 Hz, 3H).

^{13}C RMN (CD_{3}OD) 8,35, 8,89, 15,57, 39,47, 109,72, 112,54, 116,35, 117,04, 124,85, 125,78, 143,18, 147,91, 148,80, 155,86, 162,55.

Etapa 8

La amina libre de 3-aminometil-4,4',8-trimetilpsoraleno (129 mg, 0,502 mmoles) se disolvió en una cantidad mínima de etanol caliente y se acidificó con HCl 1 M en éter (0,7 ml). Después de calentar a reflujo durante unos pocos minutos para expeler el éter, la solución se dejó que se enfriara hasta temperatura ambiente y se enfrió en un baño de hielo. El sólido formado se filtró y se enjuagó con etanol enfriado con hielo para proporcionar clorhidrato de 3-aminometil-4,4',8-trimetilpsoraleno (28,9 mg, 19,7%), un sólido amarillo.

Ejemplo 2 Síntesis de 8-aminometil-4,4',5'-trimetilpsoraleno (compuesto 32)

Etapa 1

Hidroximetilftalimida (1,59 g, 8,98 mmoles) se añadió por partes aproximadamente cada 10 minutos a una solución de 7-hidroxi-4-metilcumarina (1,50 g, 8,55 mmoles) disuelto en H_{2}SO_{4} concentrado (18 ml). Se añadió más H_{2}SO_{4} (4 ml) y se agitó la suspensión durante 1 hora a temperatura ambiente. La solución transparente se vertió en 50 ml de agua con hielo y se agitó hasta que se fundió el hielo. El precipitado blanco resultante se retiró por filtración, se enjuagó con agua y se dejó secar al aire. Después el sólido bruto se trituró (2 x 100 ml) con cloroformo para retirar las impurezas solubles, se obtuvo 7-hidroxi-4-metil-8-ftalimidometilcumarina, un sólido blanco (1,96 g, 68,5%).

^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,70-7,96 (m, 4H), 7,50 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,97 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,17 (s, 1H), 5,13 (s, 2H), 2,38 (s, 3H).

Etapa 2

De la misma manera que en la etapa 5 del ejemplo 1 anterior usando 3-cloro-2-butanona en lugar de cloroacetona, se hizo reaccionar 7-hidroxi-4-metil-8-ftalimidometilcumarina para formar 4-metil-7-(1-metil-2-oxo)propiloxi-8-(ftalimidometil)cumarina, un sólido amarillo claro.

^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,64-7,88 (m, 4H), 7,46 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,58 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 6,19 (s, 1H), 5,21 (s, 2H), 4,67 (q, J = 6,9 Hz, 1H), 2,37 (s, 3H), 2,02 (s, 3H), 1,42 (d, J = 6,8 Hz, 3H).

Etapa 3

4-metil-7-(1-metil-2-oxo)propiloxi-8-ftalimidometilcumarina (2,99 g, 8,92 mmoles) se calentó a reflujo en NaOH al 10% (135 ml) durante 30 minutos. La solución verde oliva se dejó enfriar hasta temperatura ambiente, se enfrió en un baño de hielo y se acidificó con HCl hasta pH 1. El precipitado obtenido se retiró por filtración, se lavó con agua y se secó para proporcionar 8-(o-carboxibenzamido)metil-4,4',5'-trimetilpsoraleno, un sólido blanquecino (3,15 g, 87,3%). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 8,73-8,86 (m, 1H), 7,83 (s, 1H), 7,40-7,79 (m, 4H), 6,38 (s, 1H), 4,82 (d, J = 4,5 Hz, 2H), 2,45 (s, 3H), 2,23 (s, 3H), el tercer grupo metilo presumiblemente oscurecido por el pico de DMSO.

Etapa 4

De la misma manera que en la etapa 7 del ejemplo 1, 8-(o-carboxibenzamido)metil-4,4',5'-trimetilpsoraleno se hizo reaccionar para formar 8-aminometil-4,4',5'-trimetilpsoraleno, un sólido amarillo claro. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,47 (s, 1H), 6,25 (s, 1H), 4,32 (s, 2H), 2,51 (s, 3H), 2,43 (s, 3H), 2,19 (s, 3H).

Etapa 5

De la misma manera que en la etapa 8 del ejemplo 1,8-aminometil-4,4',5'-trimetilpsoraleno se convirtió en clorhidrato de 8-aminometil-4,4',5'-trimetilpsoraleno, un sólido blanquecino. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 8,46 (s, 3H), 7,97 (s, 1H), 6,44 (s, 1H), 4,38 (s, 2H), 2,57 (s, 3H), 2,47 (s, 3H), 2,24 (s, 3H).

^{13}C RMN (CD_{3}OD): 7,96, 12,10, 19,53, 19,61, 33,48, 104,92, 112,18, 113,64, 117,22, 117,66, 129,50, 155,30, 156,62, 162,64.

Mediante el mismo procedimiento pero usando cloroacetona en la etapa 2, se puede preparar clorhidrato de 8-aminometil-4,5'-dimetilpsoraleno (compuesto 33).

Ejemplo 3 Síntesis de 3-aminometil-4,4',5',8-tetrametilpsoraleno (compuesto 34)

Etapa 1

De la misma manera que en la etapa 5 del ejemplo 1 pero usando 3-cloro-2-butanona en lugar de cloroacetona, se hizo reaccionar 7-hidroxi-4,8-dimetil-3-ftalimidometilcumarina para formar 4,8-dimetil-7-(1-metil-2-oxo)propiloxi-3-ftalimidometilcumarina, un sólido amarillo.

^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,67-7,83 (m, 4H), 7,45 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,63 (d, J = 9,0 Hz, 1H), 4,91 (s, 2H), 4,72 (q, J = 6,8 Hz, 1H), 2,58 (s, 3H), 2,35 (s, 3H), 2,17 (s, 3H), 1,55 (d, J = 6,8 Hz, 3H).

Etapa 2

De la misma manera que en la etapa 3 del ejemplo 2, se hizo reaccionar 4,8-dimetil-7-(1-metil-2-oxo)propiloxi-3-ftalimidometilcumarina para formar 3-(o-carboxibenzamido)metil-4,4',5',8-tetrametilpsoraleno, un sólido blanquecino. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 8,53 (t, J = 1,2 Hz, 1H), 7,80 (s, 1H), 7,37-7,79 (m, 4H), 4,45 (d, J = 4,6 Hz, 2H), 2,64 (s, 3H), 2,44 (s, 3H), 2,22 (s, 3H), el cuarto grupo metilo presumiblemente oscurecido por el pico de DMSO.

Etapa 3

De la misma manera que en la etapa 7 del ejemplo 1, se hizo reaccionar 3-(o-carboxibenzamido)metil-4,4',5',8-tetrametilpsoraleno para formar 3-aminometil-4,4',5',8-tetrametilpsoraleno, un sólido amarillo claro. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,44 (s, 1H), 3,90 (s, 2H), 2,57 (s, 6H), 2,42 (s, 3H), 2,19 (s, 3H).

Etapa 4

De la misma manera que en la etapa 8 del ejemplo 1, se convirtió 3-aminometil-4,4',5',8-tetrametilpsoraleno en clorhidrato de 3-aminometil-4,4',5',8-tetrametilpsoraleno, un sólido amarillo. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 8,00-8,22 (m, 3H), 7,90 (s, 1H), 4,09 (s, 2H), 2,67 (s, 3H), 2,45 (s, 3H), 2,23 (s, 3H), el cuarto grupo metilo presumiblemente oscurecido por el pico de DMSO.

^{13}C RMN (DMSO): 7,82, 8,46, 12,01, 16,18, 35,38, 107,71, 110,38, 113,40, 115,62, 115,79, 126,98, 147,78, 152,83, 153,78, 154,06, 160,85.

Ejemplo 4 Síntesis de 3-aminometil-4,5',8-trimetilpsoraleno (compuesto 35)

Etapa 1

Una suspensión 7-hidroxi-4,8-dimetil-3-ftalimidometilcumarina (649 mg, 1,86 mmoles), carbonato potásico (320 mg, 2,60 mmoles), yoduro potásico (15 mg, 0,093 mmoles) y 2,3-dicloro-1-propeno (0,20 ml, 2,23 mmoles) en DMF (15 ml) se agitó a 55-65ºC durante 8 horas, seguido de enfriamiento hasta temperatura ambiente, después se enfrió en baño de agua con hielo. Se retiró el sólido por filtración para obtener una primera cosecha de producto bruto (1,09 g). Se retiró la mitad del disolvente del filtrado y después de enfriamiento se obtuvo una segunda cosecha de cristales (33 mg). Se combinaron los sólidos, se disolvieron en CH_{2}Cl_{2} y se lavaron con agua varias veces. Se secó la fase orgánica y se evaporó para proporcionar 7-(beta-cloroaliloxi)-4,8-dimetil-3-ftalimidometilcumarina, un sólido blanco (690 mg, 87%). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,66 -7,83 (m, 4H), 7,49 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 6,79 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 5,56 (s, 1H), 5,47 (s, 1H), 4,91 (s, 2H), 4,67 (s, 2H), 2,59 (s, 3H), 2,32 (s, 3H).

Etapa 2

Se calentó a reflujo 7-(beta-cloroaliloxi)-4,8-dimetil-3-ftalimidometilcumarina (487 mg, 1,15 mmoles) en 1,4-disiopropilbenceno (20 ml) durante 17 horas. Después de enfriar hasta temperatura ambiente, el precipitado beige (347 mg) constituido por el intermedio 6-(beta-cloroalil)-4,8-dimetil-7-hidroxi-3-ftalimidometilcumarina y el producto de descomposición 4,8- dimetil-7-hidroxi-3-ftalimidometilcumarina y el disolvente residual se recogió y se enjuagó con hexano. Se añadió gota a gota H_{2}SO_{4} concentrado (2,5 ml) a una suspensión enfriada con hielo de producto bruto (296 mg) en H_{2}SO_{4}al 70% y se agitó durante 25 minutos. La solución transparente resultante se vertió en agua con hielo (100 ml). El precipitado blanco se recogió mediante filtración a vacío, se enjuagó con agua y se repartió entre CH_{2}Cl_{2} (200 ml) y NaOH al 10% (50 ml). La fase acuosa básica se lavó con CH_{2}Cl_{2} (2 x 50 ml) y las fases orgánicas se combinaron, se lavaron con agua (3 x 100 ml), se secaron con salmuera, después son sulfato sódico anhidro y se evaporaron. Después de la trituración con éter para retirar 1,4-diisopropilbenceno residual, se obtuvo 3-ftalimidometil-4,5',8-trimetilpsoraleno, un sólido blanco (114 mg, 27,3%) con 93% de pureza. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,65-7,86 (m, 4H), 7,60 (s, 1H), 6,41 (s, 1H), 4,96 (s, 2H), 2,68 (s, 3H), 2,55 (s, 3H), 2,49 (s, 3H).

Etapa 3

El 3-ftalimidometil-4,5',8-trimetilpsoraleno (29,8 mg, 0,0704 mmoles) se agitó en THF (2 ml), después se añadió metilamina acuosa al 40% (1 ml). Después de 20 minutos, la solución amarilla transparente resultante se evaporó y se repartió entre cloroformo y HCl 0,3 N. La fase ácida acuosa se basificó con K_{2}CO_{3} sólido y se extrajo con CH_{2}Cl_{2}, que después se secó y se evaporó para proporcionar 3-aminometil-4,5',8-trimetilpsoraleno (17 mg, 94%), un sólido amarillo claro. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,54 (s, 1H), 6,40 (s, 1H), 3,87 (s, 2H), 2,57 (s, 3H), 2,53 (s, 3H), 2,48 (s, 3H).

^{13}C RMN (CDCl_{3}): 8,97, 14,65, 15,55, 39,45, 103,12, 109,18, 103,04, 117,02, 125,92, 148,07, 148,18, 155,45, 157,73, 162,72.

Etapa 4

De la misma manera que en la etapa 8 del ejemplo 1, se convirtió 3-aminometil-4,5',8-tetrametilpsoraleno en clorhidrato de 3-aminometil-4,5',8-tetrametilpsoraleno, un sólido amarillo. ^{1}H RMN (CD_{3}OD): \delta 7,90 (s, 1H), 6,61 (s, 1H), 4,22 (s, 2H), 2,68 (s, 3H), 2,58 (s, 3H), 2,51 (s, 3H).

Ejemplo 5 Síntesis de 4-aminometil-4',5',8-trimetilpsoraleno (compuesto 36)

Etapa 1

De la misma manera que en la etapa 3 del ejemplo 1, 7-acetoxi-4-clorometil-8-metilcumarina (preparada a partir 7-hidroxi-4-clorometil-8-metilcumarina (obtenida como Zagotto y col., Photechem. Photobio, 58: 486 (1993)) de manera similar a la etapa 1 del ejemplo 1) se hace reaccionar para formar 7-acetoxi-4-ftalimidometil-8-metilcumarina, se obtiene un sólido beige. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,76-7,99 (m, 4H), 7,67 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 7,08 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,23 (s, 1H), 5,00 (s, 2H), 2,38 (s, 3H), 2,29 (s, 3H).

Etapa 2

De la misma manera que en la etapa 4 del ejemplo 7, se hizo reaccionar 7-acetoxi-4-ftalimidometil-8-metilcumarina para formar 7-hidroxi-4-ftalimidometil-8-metilcumarina, un sólido amarillo claro. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 10,58 (s, 1H), 7,87-8,06 (m, 4H), 7,66 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 6,93 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,08 (s, 1H), 4,97 (s, 2H), 2,19 (s, 3H).

Etapa 3

De la misma manera que en la etapa 5 del ejemplo 1, usando 3-cloro-2-butanona en lugar de cloroacetona, se hizo reaccionar 7-hidroxi-4-ftalimidometil-8-metilcumarina para formar 8-metil-7-(1-metil-2-oxo)propiloxi-4-ftalimidometil-8-metilcumarina, un sólido blanco. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,73-7,97 (m, 4H), 7,56 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,68 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,09 (s, 1H), 4,96 (s, 2H), 4,75 (d, J = 6,9 Hz, 1H), 2,38 (s, 3H), 2,19 (s, 3H), 1,59 (s, 3H).

Etapa 4

Se calentó una solución de 8-metil-7-(1-metil-2-oxo)propiloxi-4-ftalimidometilcumarina (500 mg, 1,23 mmoles), NaOH al 10% (1,09 ml, 2,46 mmoles) y agua (25 ml) a 50-60ºC durante 4 horas. La suspensión se disolvió en agua (200 ml) y se lavó con cloroformo. La fase ácida acuosa se acidificó con HCl 6 N, se enfrió y se filtró para proporcionar 4-(o-carboxibenzamido)metil- 4',5',8-trimetilpsoraleno, un precipitado amarillo bruto (470 mg, 93,9% de rendimiento de > de 90% de pureza). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 9,02 (t aparente, J = 4,7 Hz, 1H), 7,45-7,98 (m, 5H), 6,56 (s, 1H), 4,78 (s, 2H), 2,45 (s, 3H), 2,22 (s, 3H), el tercer grupo metilo oscurecido por el pico de DMSO.

Etapa 5

Una mezcla de 4-(o-carboxibenzamido)metil-4',5'8-trimetilpsoraleno (251 mg, 0,620 mmoles), HCl 6 N (30 ml) y agua (20 ml) se calentó a reflujo durante varias horas, se enfrió hasta temperatura ambiente y se filtró. El precipitado obtenido era una mezcla (88 mg) de 4-ftalimidometil-4',5',8-trimetilpsoraleno y de clorhidrato de 4-aminometil-4',5',8-trimetilpsoraleno. Se formó un segundo precipitado en el licor madre y se recogió para proporcionar clorhidrato de 4-aminometil-4',5',8-trimetilpsoraleno, un sólido amarillo (41 mg). ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 8,73 (s ancho, 3H), 7,82 (s, 1H), 6,52 (s, 1H), 4,50 (s, 2H), 2,52 (s, 3H), 2,45 (s, 3H), 2,22 (s, 3H).

Ejemplo 6 Síntesis de 3-(4-amino-2-oxa)butil-4,4',8-trimetilpsoraleno (compuesto 37)

Etapa 1

7-acetoxi-3-bromometil-4,8-dimetilcumarina (2,50 g, 8,90 mmoles) se calentó a reflujo en metanol (300 ml) durante una noche, se enfrió hasta temperatura ambiente y se concentró a vacío para proporcionar 4,8-dimetil-7-hidroxi-3-metoximetilcumarina bruta. ^{1}H RMN (CD_{3}OD): \delta 7,52 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 4,50 (s, 2H), 3,41 (s, 3H), 2,49 (s, 3H), 2,25 (s, 3H).

Etapa 2

De la misma manera que en la etapa 5 del ejemplo 1, se hizo reaccionar 4,8-dimetil-7-hidroxi-3-metoximetilcumarina para formar 4,8-dimetil-3- metoximetil-7-(2-oxo)propiloxicumarina, un sólido amarillo claro. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,47 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,66 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 4,63 (s, 2H), 4,53 (s, 2H), 3,43 (s, 3H), 2,48 (s, 3H), 2,39 (s, 3H), 2,34 (s, 3H).

Etapa 3

4,8-Dimetil-3-metoximetil-7-(2-oxo)propiloxicumarina bruta se calentó a reflujo con agua (200 ml) y NaOH al 10% (3,5 ml) durante una noche. Se enfrió la suspensión básica, se acidificó con unas pocas gotas de HCl concentrado hasta pH 1, se filtró y se enjuagó con agua. El sólido marrón claro bruto se purificó mediante TLC preparativa sobre gel de sílice con 1% de acetonitrilo en CH_{2}Cl_{2} para proporcionar 3-metoximetil-4,4'8-trimetilpsoraleno, un sólido amarillo claro (172,1 mg, 6% de rendimiento a partir de 7-acetoxi-3-bromometil-4,8-dimetilcumarina). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,60 (s, 1H), 7,47 (s, 1H), 4,58 (s, 2H), 3,45 (s, 3H), 2,61 (s, 3H), 2,58 (s, 3H), 2,28 (s, 3H).

Etapa 4

Se añadió yoduro sódico (275 mg, 1,84 mmoles) a una suspensión de 3-metoximetil-4,4',8-trimetilpsoraleno (250 mg, 0,919 mmoles) en acetonitrilo. Se añadió en atmósfera de nitrógeno cloruro de terimetilsililo (0,23 ml, 1,84 mmoles) y la solución se calentó a reflujo durante 3 horas. Se evaporó el disolvente de reacción y la reacción se repartió entre CH_{2}Cl_{2} y tiosulfato sódico acuoso. Se secó la fase orgánica con salmuera, después con sulfato sódico anhidro y el disolvente se retiró a vacío para proporcionar 3-yodometil-4,4',8-trimetilpsoraleno (283 mg, 83,7% de rendimiento bruto, > 90% de pureza), un sólido beige. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,61 (s, 1H), 7,49 (s, 1H), 4,54 (s, 2H), 2,59 (s, 3H), 2,48 (s, 3H), 2,29 (s, 3H).

Etapa 5

Una solución de 3-yodometil-4,4',8-trimetilpsoraleno bruto (843 mg) se calentó a reflujo con etilenglicol (35 ml, 650 mmoles) en acetona (90 ml) durante una noche. Después de evaporar el disolvente, el líquido viscoso se repartió entre CH_{2}Cl_{2} y agua para retirar el exceso de diol. Después de varios lavados con agua, la fase orgánica se secó y se evaporó. El producto bruto se purificó sobre dos placas de TLC preparativa en gel de sílice, primero se eluyó con CH_{2}Cl_{2}, después se eluyó con 2% de 2-propanol en CH_{2}Cl_{2}, para proporcionar 3-(4-hidroxi-2-oxa)butil -4,4',8-trimetilpsoraleno, un sólido amarillo (224 mg). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,60 (s, 1H), 7,47 (s, 1H), 4,69 (s, 2H), 3,63-3,90 (m, 4H), 2,63 (s, 3H), 2,57 (s, 3H), 2,29 (s, 3H).

Etapa 6

Una mezcla de 3-(4-hidroxi-2-oxa)butil-4,4',8-trimetilpsoraleno (214 mg, 0,709 mmoles), TEA (0,37 ml, 2,65 mmoles) y cloruro de metanosulfonilo (0,150 ml, 1,94 mmoles) en CH_{2}Cl_{2} (5 ml) se agitó durante una noche en atmósfera de nitrógeno. Después la mezcla de reacción se repartió entre CH_{2}Cl_{2} y agua. La fase orgánica se lavó con agua, se secó y se destiló para proporcionar 3-(4-metanosulfoniloxi-2-oxa)butil-4,4',8-trimetilpsoraleno, un sólido amarillo (220 mg, > 90% de pureza). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,63 (s, 1H), 7,49 (q, ap., J = 1,2 Hz, 1H), 4,71 (s, 2H), 4,34-4,47 (m, 2H), 3,79-3,94 (m, 2H), 3,05 (s, 3H), 2,64 (s, 3H), 2,59 (s, 3H), 2,30 (d, J = 1,2 Hz, 3H).

Etapa 7

Una mezcla de 3-(4-metanosulfoniloxi-2-oxa)butil-4,4',8-trimetilpsoraleno bruto (220 mg) y azida sódica (75,3 mg) en etanol (10 ml) y agua (1 ml) se calentó a reflujo durante una noche, se evaporó y se destiló azeotrópicamente con tolueno. Se trituró el residuo con CH_{2}Cl_{2} y se filtró para retirar los sólidos insolubles. Se destiló el licor madre para proporcionar 3-(4-azido-2-oxa)butil-4,4',8-trimetilpsoraleno, un sólido amarillo (171 mg, > 90% de pureza). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,61 (s, 1H), 7,47 (s, 1H), 4,70 (s, 2H), 3,72-3,82 (m, 2H), 3,35-3,46 (m, 2H), 2,64 (s, 3H), 2,58 (s, 3H), 2,29 (s, 3H).

^{13}C RMN (CDCl_{3}): 8,32, 8,85, 16,00, 51,27, 65,24, 69,72, 109,66, 112,71, 116,40, 116,80, 119,63, 125,81, 143,29. 149,18, 153,34, 156,26, 162,46.

Etapa 8

Una mezcla de 3-(4-azido-2-oxa)butil-4,4',8-trimetilpsoraleno bruto (171 mg), trifenilfosfina (205 mg), y agua (10 gotas) se agitó en THF (9 ml) durante una noche, se evaporó y se repartió entre CH_{2}Cl_{2} y HCl 1 M. La fase ácida acuosa de basificó con K_{2}CO_{3} y se extrajo con CH_{2}Cl_{2}. La fase orgánica se secó y se evaporó para proporcionar 3-(4-amino-2-oxa)butil-4,4',8-trimetilpsoraleno, un sólido naranja (114 mg). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,60 (s, 1H), 7,47 (s, 1H), 4,65 (s, 2H), 3,60 (d, J = 5,1 Hz, 2H), 2,84-2,97 (m, 2H), 2,62 (s, 3H), 2,57 (s, 3H), 2,28 (s, 3H).

Etapa 9

3-(4-Amino-2-oxa)butil-4,4',8-trimetilpsoraleno bruto se acidificó con HCl 5-6 N en isopropoanol y se evaporó. La sal se recristalizó en isopropanol y el precipitado resultante se lavó con hexano para proporcionar clorhidrato de 3-(4-amino-2-oxa)butil-4,4',8-trimetilpsoraleno, un sólido blanquecino (64,5 mg). ^{1}H RMN (CD_{3}OD): \delta 7,89 (s, 1H), 7,67 (q ap., J = 1,1 Hz, 1H), 4,70 (s, 2H), 3,74-3,88 (m, 2H), 3,13-3,26 (m, 2H), 2,70 (s, 3H), 2,57 (s, 3H), 2,32 (d, J = 1,2 Hz, 3H).

^{13}C RMN (CD_{3}OD): 8,11, 8,63, 16,22, 40,98, 66,07, 67,60, 110,02, 114,52, 117,59, 117,75, 119,88, 127,20, 145,00, 149,82, 155,43, 157,24, 164,14.

Ejemplo 7 4-(4-Amino-2-oxa)butil-4',5',8-trimetilpsoraleno (compuesto 38)

Etapa 1

Una mezcla de 4-clorometil-7-hidroxi-8-metilcumarina (2,00 g, 8,90 mmoles) y metóxido de sodio (12,0 g, 222 mmoles) en metanol (400 ml) se calentó a reflujo durante una noche. Se dejó que la solución se calentara hasta temperatura ambiente, se acidificó hasta pH 0-1 con HCl 5-6 N en isoporopanol y se evaporó. El residuo se destiló azeotrópicamente con tolueno durante varios minutos para proporcionar el producto bruto 7-hidroxi-4-metoximetil-8-metilcumarina, un aceite amarillo. ^{1}H RMN (CD_{3}OD): \delta 7,38 (d, J = 8,5 Hz, 1H), 6,82 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,29 (s, 1H), 4,66 (s, 2H), 3,51 (s, 3H), 2,26 (s, 3H).

Etapa 2

De la misma manera que en la etapa 5 del ejemplo 1 pero usando 3-cloro-2-butanona en lugar de cloroacetona, 7-hidroxi-4-metoximetil-8-metilcumarina se hizo reaccionar para formar 8-metil-4-metoximetil-7-(1-metil-2-oxo)propiloxicumarina, un sólido blanquecino. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,34 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,61 (d, J = 8,9 Hz, 1H), 6,40 (s, 1H), 4,72 (d, J = 6,8 Hz, 1H), 4,57 (d, J = 1,3 Hz, 2H), 3,49 (s, 3H), 2,39 (s, 3H), 2,19 (s, 3H), 1,56 (d, J = 6,8 Hz, 2H).

Etapa 3

8-metil-4-metoximetil-7-(1-metil-2-oxo)propiloxicumarina bruta se calentó a reflujo en agua (200 ml) y NaOH al 10% durante una noche. La suspensión básica se enfrió, se acidificó con unas pocas gotas de HCl concentrado hasta pH 1, se filtró y se enjuagó con agua para proporcionar 4-metoximetil-4',5',8-trimetilpsoraleno (1,58 g), un sólido blanquecino. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,35 (s, 1H), 6,49 (s, 1H), 4,72 (s, 2H), 3,54 (s, 3H), 2,58 (s, 3H), 2,42 (s, 3H), 2,18 (s, 3H).

^{13}C RMN (CDCl_{3}): d 8,38, 8,94, 12,43, 59,48, 71,21, 109,62, 110,07, 110,26, 111,13, 113,67, 127,39, 149,73, 152,61, 152,96, 155,00, 162,07.

Etapa 4

Una mezcla de 4-metoximetil-4',5',8-trimetilpsoraleno (500 mg, 1,84 mmoles) en cloruro de metileno (20 ml) se enfrió hasta -78ºC. Después se añadió gota a gota una solución 1 M de tribromuro de boro en cloruro de metileno (2,6 ml, 2,58 mmoles). La mezcla de reacción se dejó en agitación durante toda una noche bajo una capa de suero, y se repartió entre cloruro de metileno y agua. La fase orgánica se secó con salmuera, después con sulfato sódico anhidro y se evaporó para proporcionar 4-hidroximetil-4',5',8-trimetilpsoraleno (500 mg, 105%), un sólido verde oliva. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,30 (s, 1H), 6,57 (s, 1H), 5,00 (s, 2H), 2,53 (s, 3H), 2,42 (s, 3H), 2,17 (s, 3H).

Etapa 5

De la misma manera que en la etapa 6 del ejemplo 6, 4-hidroximetil-4',5',8-trimetilpsoraleno se hizo reaccionar para formar 4-metanosulfoniloximetil-4',5',8-trimetilpsoraleno. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,31 (s, 1H), 6,51 (s, 1H), 5,49 (d, J = 1,1 Hz, 2H), 3,16 (s, 3H), 2,58 (s, 3H), 2,43 (s, 3H), 2,19 (s, 3H).

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Etapa 6

De la misma manera que en la etapa 5 del ejemplo 6, 4- metanosulfoniloximetil-4',5',8-trimetilpsoraleno se hizo reaccionar para formar 4-(4-hidroxi-2-oxa)butil-4',5',8-trimetilpsoraleno. El producto se eluyó con acetato de etilo al 80%, hexano al 20% en lugar de 2-propanol al 2% en CH_{2}Cl_{2}. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,32 (s, 1H), 6,52 (s, 1H), 4,83 (s, 2H), 3,72-3,93 (m, 4H), 2,55 (s, 3H), 2,41 (s, 3H), 2,17 (s, 3H).

Etapa 7

De la misma manera que en la etapa 7 del ejemplo 6, 4-(4-hidroxi-2-oxa)butil-4',5',8-trimetilpsoraleno se hizo reaccionar para formar 4-(4-metanosulfoniloxi-2-oxa)butil-4',5',8-trimetilpsoraleno. Este mesilato bruto (105 mg, aprox. 70% puro) se calentó a reflujo 1-2 días con azida sódica (90 mg, 1,38 mmoles) en etanol (5 ml) y agua (0,5 ml), después se evaporó. El residuo se trituró con CH_{2}Cl_{2} y los sólidos insolubles se retiraron por filtración para proporcionar 4-(4-azido-2-oxa)butil-4',5,8-trimetilpsoraleno (71,6 mg). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,38 (s, 1H), 6,50 (s, 1H), 4,83 (s, 2H), 3,80 (t, J = 4,9, 2H), 3,49 (t, J = 4,9, 2H), 2,57 (s, 3H), 2,41 (s, 3H), 2,17 (s, 3H).

Etapa 8

De la misma manera que en la etapa 8 del ejemplo 6, 4-(4-azido-2-oxa)butil-4',5,8-trimetilpsoraleno se hizo reaccionar para formar 4-(4-amino-2-oxa)butil-4',5,8-trimetilpsoraleno.

^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,34 (s, 1H), 6,52 (s, 1H), 4,80 (s, 2H), 3,64-3,75 (m, 3H), 2,92-3,08 (m, 2H), 2,57 (s, 3H), 2,42 (s, 3H), 2,17 (s, 3H).

Etapa 9

4-(4-Amino-2-oxa)butil-4',5',8-trimetilpsoraleno bruto se disolvió en isopropanol en ebullición y se filtró en caliente a través de un papel de filtro corrugado. El licor madre caliente se acidificó con HCl 5-6 N en isopropanol hasta pH 1 y se dejó que se enfriara primero hasta temperatura ambiente, después en un baño de agua con hielo. El producto sólido se retiró por filtración, se enjuagó con isopropanol enfriado con hielo, después con hexano para proporcionar clorhidrato de 4-(4-amino-2-oxa)butil-4',5,8-trimetilpsoralen. ^{1}H RMN (CD_{3}OD): \delta 7,55 (s, 1H), 6,61 (s, 1H), 5,00 (s, 2H), 3,93 (m, 2H), 2,55 (s, 3H), 2,44 (s, 3H), 2,22 (s, 3H). Los picos de CH2NH2 se sitúan en los picos del disolvente a 3,3 ppm.

Ejemplo 8 Síntesis de 5-(4-amino-2-oxa)butil-4',5'-dimetilpsoraleno (compuesto 39)

Etapa 1

De la misma manera que en la etapa 1 del ejemplo 1, 7-hidroxi-5-metilcumarina se hizo reaccionar para formar 7-acetoxi-5-metilcumarina. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,88 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 6,96 (s, 1H), 6,89 (s, 1H), 6,40 (d, J = 9,8 Hz, 1H), 2,52 (s, 3H), 2,33 (s, 3H).

Etapa 2

De la misma manera que en la etapa 2 del ejemplo 1, 7-acetoxi-5-metilcumarina se hizo reaccionar para formar 7-acetoxi-5-bromoetilcumarina sin recristalización (75-85% de pureza). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 8,00 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 7,11 (s, 1H), 7,09 (s, 1H), 6,51 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 4,62 (s, 2H), 2,34 (s, 3H).

^{13}C RMN (CDCl_{3}): 21,56, 28,44, 111,68, 115,50, 116,78, 120,05, 136,61, 139,29, 153,05, 156,01, 160,25, 168,92.

Etapa 3

De la misma manera que en la etapa 1 del ejemplo 6, 7-acetoxi-5-bromoetilcumarina se hizo reaccionar para formar 7-hidroxi-5-metoximetilcumarina bruta. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 8,10 (d, J = 9,5 Hz, 1H), 6,82 (s, 1H), 6,68 (s, 1H), 6,22 (d, J = 9,7 Hz, 1H), 4,64 (s, 2H), 3,40 (s, 3H).

Etapa 4

De la misma manera que en la etapa 5 del ejemplo 1, usando 3-cloro-2-butanona en lugar de cloroacetona, 7-hidroxi-5-metoximetilcumarina se hizo reaccionar para formar 5-metoximetil-7-(1-metil-2-oxo)propiloxicumarina. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,92 (d, J = 9,8 Hz, 1H), 6,84 (s, 1H), 6,66 (s, 1H), 6,29 (d, J = 9,8 Hz, 1H), 4,71 (q, J = 6,8 Hz, 1H), 4,60 (s, 2H), 3,41 (s, 3H), 2,20 (s, 3H), 1,54 (d, J = 6,9 Hz, 3H).

Etapa 5

5-Metoximetil-4',5'-dimetilpsoraleno. 5-metoximetil-7-(1-metil-2-oxo)propiloxicumarina bruta (12,2 g, aprox. 90% de pureza) se calentó a reflujo en agua (500 ml) y NaOH al 10% (17 ml) durante 6 horas. La solución acuosa se repartió entre CH_{2}Cl_{2} y agua. La fase orgánica se lavó con agua, se secó con salmuera, después con sulfato sódico anhidro y se evaporó para proporcionar 5-metoximetil-4',5'-dimetilpsoraleno, un sólido beige (6,87 g, > 95% de pureza). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 8,17 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 7,33 (s, 1H), 6,40 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 4,92 (s, 2H), 3,46 (s, 3H), 2,40 (s, 3H), 2,36 (s, 3H).

Etapa 6

Una mezcla de 5-metoximetil-4',5'-dimetilpsoraleno (6,87 g, 26,6 mmoles) en cloruro de metileno (300 ml) se enfrió hasta -78ºC, después se añadió gota a gota una solución de tribromuro de boro 1 M en cloruro de metileno (37,2 ml, 37,2 mmoles) en atmósfera de nitrógeno. La mezcla de reacción se dejó en agitación durante una noche en atmósfera de nitrógeno y se repartió entre cloruro de metileno y agua. La fase orgánica se secó con salmuera, después con sulfato sódico anhidro y se evaporó para proporcionar 5-bromometil-4',5'-dimetilpsoraleno (5,89 g, 72,1% de rendimiento), un sólido negro. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 8,11 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 7,33 (s, 1H), 6,49 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 5,02 (s, 2H), 2,46 (s, 3H), 2,43 (s, 3H).

Etapa 7

De la misma manera que en la etapa 5 del ejemplo 6, 5-bromometil-4',5'-dimetilpsoraleno se hizo reaccionar para formar 5-(4-hidroxi-2-oxa)butil-4',5'-dimetilpsoraleno sin purificación cromatográfica (> 80% de pureza). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 8,17 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 7,33 (s, 1H), 6,40 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 5,04 (s, 2H), 3,63-3,85 (m, 4H), 2,41 (s, 3H), 2,36 (s, 3H). ^{13}C RMN (CDCl_{3}): 11,17, 12,30, 62,37, 65,16, 72,10, 99,83, 109,97, 114,58, 114,71, 126,75, 127,49, 141,31, 152,31, 154,08, 156,04, 161,47.

Etapa 8

De la misma manera que en la etapa 6 del ejemplo 6, 5-(4-hidroxi-2-oxa)butil-4',5'-dimetilpsoraleno se hizo reaccionar para formar 5-(4-metanosulfoniloxi-2-oxa)butil-4',5'-dimetilpsoraleno ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 8,18 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 7,35 (s, 1H), 6,42 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 5,07 (s, 2H), 4,34-4,43 (m, 2H), 3,81-3,90 (m, 2H), 2,97 (s, 3H), 2,41 (s, 3H), 2,36 (s, 3H).

Etapa 9

De la misma manera que en la etapa 7 del ejemplo 6, 5-(4-metanosulfoniloxi-2-oxa)butil-4',5'-dimetilpsoraleno se hizo reaccionar para formar 5-(4-azido-2-oxa)butil-4',5'-dimetilpsoraleno, un sólido beige. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 8,19 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 7,34 (s, 1H), 6,41 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 5,06 (s, 2H), 3,72 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 3,42 (t, J = 4,9 Hz, 2H), 2,41 (s, 3H), 2,37 (s, 3H).

Etapa 10

De la misma manera que en la etapa 8 del ejemplo 6, 5-(4-azido-2-oxa)butil-4',5'-dimetilpsoraleno se hizo reaccionar para formar 5-(4-amino-2-oxa)butil-4',5'-dimetilpsoraleno, un sólido amarillo claro. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 8,18 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 7,32 (s, 1H), 6,39 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 5,00 (s, 2H), 3,61 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 2,90 (t, J = 5,2 Hz, 2H), 2,40 (s, 3H), 2,35 (s, 3H).

Etapa 11

5-(4-Amino-2-oxa)butil-4',5'-dimetilpsoraleno (232 mg, 0,956 mmoles) se disolvió en isopropanol caliente y se añadió HCl 5-6 N en isopropanol hasta que se alcanzó pH 1. Precipitó un sólido y la suspensión se dejó que se enfriara hasta temperatura ambiente, después se enfrió en un baño de hielo. El filtrado se retiró por filtración con un embudo Buchner y se lavó primero con isopropanoil enfriado con hielo después con hexano para proporcionar clorhidrato de 5-(4-amino-2-oxa)butil -4',5'-dimetilpsoraleno (194 mg, 72,6% de rendimiento), un sólido beige. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 8,40 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 7,40 (s, 1H), 6,41 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 5,16 (s, 2H), 3,80 (t, J = 4,9 Hz, 2H), 3,16 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 2,42 (s, 3H), 2,40 (s, 3H).

^{13}C RMN: 11,05, 11,90, 41,05, 65,81, 67,27, 100,48, 111,29, 114,85, 116,01, 128,12, 128,81, 143,44, 153,35, 155,47, 157,27, 163,19.

Ejemplo 9 Síntesis de 8-(4-amino-2-oxa)butil-4,4',5'-trimetilpsoraleno (compuesto 40)

Etapa 1

De la misma manera que en la etapa 2 del ejemplo 1, 7-acetoxi-4,8-dimetilcumarina se hizo reaccionar para formar 7-acetoxi-8-bromometil-4-metilcumarina. El sólido amarillo bruto no se recristalizó (75-85% de pureza). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,61 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,15 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,31 (s, 1H), 4,68 (s, 2H), 2,43 (s, 6H).

Etapa 2

De la misma manera que en la etapa 2 del ejemplo 6, 7-acetoxi-8-bromometil-4-metilcumarina se hace reaccionar para formar 7-hidroxi-8-metoximetil-4-metilcumarina en forma de un sólido amarillo. ^{1}H RMN (CD_{3}OD: \delta 7,44 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,84 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,11 (q ap., J = 1,1 Hz, 1H), 5,05 (s, 2H), 3,55 (s, 3H), 2,40 (d, J = 1,1 Hz, 3H).

Etapa 3

De la misma manera que en la etapa 5 del ejemplo 1, usando 3-cloro-2-butanona en lugar de cloroacetona, 7-hidroxi-8-metoximetil-4-metilcumarina se hizo reaccionar para formar 8-metoximetil-7-(1-metil-2-oxo)propiloxi-4-metilcumarina en forma de un sólido amarillo (> 90% de pureza). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,51 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,73 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,18 (s, 1H), 4,65-4,88 (m, 3H), 3,47 (s, 3H), 2,39 (s, 3H), 2,36 (s, 3H), 2,22 (s, 3H), 1,58 (d, J = 6,8 Hz, 3H).

Etapa 4

De la misma manera que en la etapa 5 del ejemplo 8, 8-metoximetil-7-(1-metil-2-oxo)propiloxi-4-metilcumarina se hizo reaccionar para formar 8-metoximetil-4,4',5'-trimetilpsoraleno en forma de un sólido amarillo claro (> 93% de pureza). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,55 (s, 1H), 6,26 (s, 1H), 4,98 (s, 2H), 3,50 (s, 3H), 2,52 (s, 3H), 2,44 (s, 3H), 2,20 (s, 3H).

Etapa 5

De la misma manera que en la etapa 6 del ejemplo 8, 8-metoximetil-4,4',5'-trimetilpsoraleno se hizo reaccionar para formar 8-bromometil-4,4',5'-trimetilpsoraleno en forma de un sólido amarillo claro (> 93% de pureza). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,54 (s, 1H), 6,28 (s, 1H), 4,97 (s, 2H), 2,52 (s, 3H), 2,46 (s, 3H), 2,20 (s, 3H).

^{13}C RMN (CDCl_{3}): 8,32, 12,50, 19,76, 20,18, 109,57, 110,57, 113,47, 114,35, 116,44, 127,93, 148,95, 153,43, 153,64, 153,96, 161,04.

Etapa 6

De la misma manera que en la etapa 5 del ejemplo 6, 8-bromometil-4,4',5'-trimetilpsoraleno se hizo reaccionar para formar 8-(4-hidroxi-2-oxa)butil-4,4',5'-trimetilpsoraleno sin purificación cromatográfica. El producto bruto (> 85% de pureza) se preparó en forma de un sólido amarillo mostaza. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,55 (s, 1H), 6,26 (s, 1H), 5,09 (s, 2H), 3,76 (s, 4H), 2,52 (s, 3H), 2,43 (s, 3H), 2,20 (s, 3H).

Etapa 7

De la misma manera que en la etapa 6 del ejemplo 6, 8-(4-hidroxi-2-oxa)butil-4,4',5'-trimetilpsoraleno se hizo reaccionar para formar 8-(4-metanosulfoniloxi-2-oxa)butil-4,4',5'-trimetilpsoraleno (> 85% de pureza) en forma de un sólido amarillo marrón. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,55 (s, 1H), 6,25 (s, 1H), 5,06 (s, 2H), 4,40 (t, J = 4,4 Hz, 2H), 3,87 (t, J = 4,4 Hz, 2H), 3,03 (s, 3H), 2,52 (s, 3H), 2,43 (s, 3H), 2,20 (s, 3H).

Etapa 8

De la misma manera que en la etapa 7 del ejemplo 6, 8-(4-metanosulfoniloxi-2-oxa)butil-4,4',5'-trimetilpsoraleno se hizo reaccionar para formar 8-(4-azido-2-oxa)butil-4,4',5'-trimetilpsoraleno, un sólido beige (> 85% de pureza). ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,55 (s, 1H), 6,26 (s, 1H), 5,08 (s, 2H), 3,81 (t, J = 5,1 Hz, 2H), 3,41 (t, J = 5,1 Hz, 2H), 2,52 (s, 3H), 2,43 (s, 3H), 2,20 (s, 3H).

Etapa 9

De la misma manera que en la etapa 8 del ejemplo 6, 8-(4-azido-2-oxa)butil-4,4',5'-trimetilpsoraleno se hizo reaccionar para formar 8-(4-amino-2-oxa)butil-4,4',5'-trimetilpsoraleno, un sólido amarillo claro.

^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,53 (s, 1H), 6,25 (s, 1H), 5,04 (s, 2H), 3,66 (t, J = 5,1 Hz, 2H), 2,89 (t, J = 5,1 Hz, 2H), 2,51 (s, 3H), 2,43 (s, 3H), 2,19 (s, 3H).

Etapa 10

De la misma manera que en la etapa 9 del ejemplo 7, 8-(4-amino-2-oxa)butil-4,4',5'-trimetilpsoraleno (784 mg) se hizo reaccionar para formar clorhidrato de 8-(4-amino-2-oxa)butil-4,4',5'-trimetilpsoraleno (483 mg, 54,9% de rendimiento), un sólido blanquecino.

^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,85 (s, 1H), 6,33 (s, 1H), 5,09 (s, 2H), 3,83 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 3,16 (t, J = 5,0 Hz, 2H), 2,59 (s, 3H), 2,45 (s, 3H), 2,25 (s, 3H).

^{13}C RMN (CD_{3}OD): 8,03, 12,14, 19,68, 40,95, 62,58, 67,76, 109,12, 111,74, 113,19, 115,87, 117,22, 129,15, 150,61, 154,70, 155,90, 156,54, 163,30.

Ejemplo 10 Síntesis de 3-aminometil-4'-metilpsoraleno (compuesto 41)

Etapa 1

De la misma manera que en la etapa 1 el ejemplo 1, 7-hidroxi-3-metilcumarina se hizo reaccionar para formar 7-acetoxi-3-metilcumarina, un sólido beige. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,51 (s, 1H), 7,42 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 6,99-7,14 (m, 2H), 2,34 (s, 3H), 2,22 (d, J = 1,2 Hz, 3H).

Etapa 2

De una manera similar a la de la etapa 2 el ejemplo 1, 7-acetoxi-3-metilcumarina, se hizo reaccionar para formar 7-acetoxi-3-bromometilcumarina (70% de pureza), un sólido beige. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,84 (s, 1H), 7,51 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 7,03-7,20 (m, 2H), 4,42 (s, 2H), 2,34 (s, 3H).

Etapa 3

7-Acetoxi-3-bromometilcumarina (630 mg) se agitó durante una noche con ftalimida potásica (432, 2,33 mmoles) en DMF (100 ml). El disolvente de reacción se evaporó y la reacción se repartió entre CH_{2}Cl_{2} y agua, después se lavó varias veces con agua, después con NaHCO_{3}acuoso. La fase orgánica se secó con salmuera, después con sulfato sódico anhidro y se evaporó. El producto bruto se recristalizó en ácido acético para proporcionar 7-acetoxi-3-ftalimidometilcumarina (375 mg, > 95% de pureza), un sólido blanquecino. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,73-7,97 (m, 4H), 7,53 (s, 1H), 7,43 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,13 (s, 1H), 7,03 (dd, J = 7,5, 2,1 Hz, 1H), 4,82 (s, 2H), 2,33 (s, 3H).

Etapa 4

De una manera similar a la de la etapa 4 el ejemplo 1, 7-acetoxi-3-ftalimidometilcumarina, se hizo reaccionar para formar 7-hidroxi-3-ftalimidometilcumarina, un sólido beige. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 7,85-7,98 (m, 5H), 7,51 (d, J = 8,3 Hz, 1H), 6,72-6,83 (m, 2H), 4,58 (s, 2H).

Etapa 5

De una manera similar a la de la etapa 5 el ejemplo 1, 7-hidroxi-3-ftalimidometilcumarina, se hizo reaccionar para formar 7-(2-oxo)propiloxi-3-ftalimidometilcumarina, un sólido blanquecino. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 7,83-8,04 (m, 5H), 7,60 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 7,05 (s, 1H), 6,95 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 4,99 (s, 2H), 4,61 (s, 2H), 2,18 (s, 3H).

Etapa 6

De una manera similar a la de la etapa 3 el ejemplo 2, 7-(2-oxo)propiloxi-3-ftalimidometilcumarina, se hizo reaccionar para formar 3-(o-carboxibenzamido)metil-4'-metilpsoraleno, un sólido beige. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 8,89 (m, 1H), 8,15 (s, 1H), 7,45-8,04 (m, 7H), 4,28 (d, J = 5,3 Hz, 2H), 2,29 (s, 3H).

Etapa 7

De una manera similar a la de la etapa 7 el ejemplo 1, 3-(o-carboxibenzamido)metil-4'-metilpsoraleno, se hizo reaccionar para formar 3-aminometil-4'-metilpsoraleno, un sólido amarillo claro. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,80 (s, 1H), 7,57 (s, 1H), 7,47 (q ap., J = 1,3 Hz, 1H), 7,42 (s, 1H), 3,81 (s, 2H), 2,28 (d, J = 1,3 Hz, 3H).

Etapa 8

Clorhidrato de 3-aminometil-4'-metilpsoraleno

De una manera similar a la de la etapa 8 el ejemplo 1, 3-aminometil-4'-metilpsoraleno, se convirtió en clorhidrato de 3-aminometil-4'-metilpsoraleno, un sólido blanquecino. ^{1}H RMN (CD_{3}OD): \delta 8,27 (s, 1H), 7,92 (s, 1H), 7,69 (q ap., J = 1,3 Hz, 1H), 7,54 (s, 1H), 4,10 (s, 2H), 2,31 (d, J = 1,4 Hz, 3H).

Ejemplo 11 Síntesis de 4-aminometil-4'-metilpsoraleno (compuesto 42)

Etapa 1

De la misma manera que la etapa 1 el ejemplo 1, 7-hidroxi-4-metilcumarina, se hizo reaccionar para formar 7-acetoxi-4-metilcumarina, un sólido blanco. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,61 (d, J = 8,4 Hz, 1H), 7,03-7,16 (m, 2H), 6,27 (s, 1H), 2,43 (s, 3H), 2,35 (s, 3H).

Etapa 2

De una manera similar a la de la etapa 2 el ejemplo 1, 7-acetoxi-4-metilcumarina, se hizo reaccionar para formar 7-acetoxi-4-bromometilcumarina bruta (60% de pureza), un sólido beige.

Etapa 3

De una manera similar a la de la etapa 3 el ejemplo 10, 7-acetoxi-4-bromometilcumarina se hizo reaccionar para formar 7-acetoxi-4-ftalimidometilcumarina (> 93% de pureza), un sólido amarillo. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,74-8,00 (m, 5H), 7,10-7,22 (m, 2H), 6,25 (s, 1H), 5,00 (s, 2H), 2,35 (s, 3H).

Etapa 4

De una manera similar a la de la etapa 4 el ejemplo 1, 7-acetoxi-4-ftalimidometilcumarina se hizo reaccionar para formar 7-hidroxi-4-ftalimidometilcumarina, un sólido amarillo. ^{1}H RMN (DMSO-d_{6}): \delta 7,83-8,05 (m, 4H), 7,80 (d, J = 8,8 Hz, 1H), 6,87 (dd, J = 8,7, 2,1 Hz, 1H), 6,78 (s, 1H), 6,09 (s, 1H), 4,97 (s, 2H).

Etapa 5

De una manera similar a la de la etapa 5 el ejemplo 1, 7-hidroxi-4-ftalimidometilcumarina, se hizo reaccionar para formar 7-(2-oxo)propiloxi-4-ftalimidometilcumarina, un sólido amarillo claro.

^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,76-7,98 (m, 4H), 7,73 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 6,94 (dd, J = 8,9, 2,5 Hz, 1H), 6,80 (d, J = 2,5 Hz, 1H), 6,12 (s, 1H), 4,98 (s, 2H), 4,65 (s, 2H), 2,31 (s, 3H).

Etapa 6

De una manera similar a la de la etapa 4 el ejemplo 5, 7-(2-oxo)propiloxi-4-ftalimidometilcumarina, se hizo reaccionar para formar 4-(o-carboxibenzamido)metil-4'-metilpsoraleno, un sólido beige.

Etapa 7

De una manera similar a la de la etapa 7 el ejemplo 1, 4-(o-carboxibenzamido)metil-4'-metilpsoraleno se hizo reaccionar para formar 4-aminometil-4'-metilpsoraleno, un sólido amarillo claro.

^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 7,70 (s, 1H), 7,48 (s, 1H), 7,45 (s, 1H), 6,57 (s, 1H), 4,21 (s, 2H), 2,29 (s, 3H).

Etapa 8

Clorhidrato de 4-aminometil-4'-metilpsoraleno

De una manera similar a la de la etapa 9 el ejemplo 6, 4-aminometil-4'-metilpsoraleno se convirtió en clorhidrato de 4-aminometil-4'-metilpsoraleno, un sólido blanquecino. ^{1}H RMN (CD_{3}OD): \delta 8,00 (s, 1H), 7,71 (s, 1H), 7,56 (s, 1H), 6,45 (s, 1H), 4,61 (s, 2H), 2,35 (s, 3H).

Ejemplo 12 Síntesis de 5-aminometilpsoraleno (compuesto 43)

Etapa 1

De una manera similar a la de la etapa 3 el ejemplo 1, 5-bromometilpsoraleno se hace reaccionar para formar 5-ftalimidometilpsoraleno, un sólido blanco. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 8,73 (d, J = 10,0 Hz, 1H), 7,67-7,89 (m, 5H), 7,47 (s, 1H), 7,38 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 6,50 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 5,27 (s, 2H).

Etapa 2

Una suspensión de 5-ftalimidometilpsoraleno (300 mg, 0,879 mmoles) y acetato de hidrazina (648 mg, 7,03 mmoles) en etanol (15 ml) se calentó a reflujo durante 2 horas. Se evaporó la solución negra y el residuo se repartió entre cloruro de metileno y HCl acuoso diluido. La fase ácida acuosa se lavó con cloruro de metileno, después se basificó con K_{2}CO_{3} sólido y se extrajo con cloruro de metileno. La fase orgánica final se secó y se evaporó para proporcionar 5-aminometilpsoraleno. ^{1}H RMN (CDCl_{3}): \delta 8,25 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 7,71 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,42 (s, 1H), 6,95 (d, J = 1,4 Hz, 1H), 6,45 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 4,32 (s, 2H).

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Etapa 3

De una manera similar a la de la etapa 9 el ejemplo 6, 5-aminometilpsoraleno se convirtió en clorhidrato de 5-aminometilpsoraleno, un sólido blanquecino. ^{1}H RMN (CD_{3}OD): \delta 8,40 (d, J = 9,9 Hz, 1H), 8,02 (d, J = 2,2 Hz, 1H), 7,69 (s, 1H), 7,26 (d, 1,5 Hz, 1H), 6,54 (d, J = 10 Hz, 1H), 4,74 (s, 2H).

Ejemplo 13

El R17 se desarrolló en bacterias Hfr 3000, título aproximado 5 x 10^{11}. (R17 y Hfr 3000 se obtuvieron de la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), Washington, D. C.). Las existencias del fago R17 se añadieron a una solución de suero fetal bovino al 15% en DMEM hasta una concentración final de fagos de 10^{8}/ml. Se transfirió una alícuota (0,5 ml) a un tubo de polietileno de cierre superior rápido de 1,5 ml. Se añadió al tubo una alícuota (0,004-0,040 ml) de la solución madre del compuesto de ensayo preparada en agua, etanol o dimetilsulfóxido a 0,5 mM. Los compuestos se ensayaron a concentraciones entre 4 \muM y 32 \muM. (el AMT está comercialmente disponible de HRI, Inc., Concord, CA; el 8-MOP está comercialmente disponible de Sigma, San Luis, MO). Los tubos se situaron en un dispositivo luminoso similar al descrito en la patente de Estados Unidos 5.593.823 (sistema de irradiación ultravioleta Baxter, modificado nº 4R4440) y se irradió a una dosis establecida de 1J/cm^{2}. Se prepararon tubos de dilución estériles de 13 ml; cada compuesto de ensayo requería un tubo con 0,4 ml de caldo LB y cinco tubos que contenían 0,5 ml de caldo LB. Para preparar las diluciones, una alícuota de 0,100 ml de la solución irradiada del fago y compuesto de ensayo se añadió al primer tubo de dilución de 0,4 ml de medio después 0,020 ml de esta solución se añadió al segundo tubo de 0,5 ml de medio (1:25). Después la segunda solución se diluyó en serie (1:25) en los tubos restantes. A cada muestra diluida se añadió 0,050 ml de bacterias Hfr 3000 cultivadas durante una noche y 3 ml de agar superior LB fundido y los materiales mezclados se vertieron en las placas de caldo LB. Después de que el agar superior se endureció, las placas se incubaron a 37ºC durante una noche. Después las unidades formadoras de placa se contaron a la siguiente mañana y el título del fago restante después del fototratamiento se calculó basándose en los factores de dilución.

Se realizaron los siguientes controles: el "fago solamente" en el que el fago no se trató con el compuesto de ensayo y no se irradió (denominado "título de partida" en las tablas más adelante); y el control "oscuro", en el que el la solución de fago/compuesto de ensayo no se irradió antes, se diluyó y se sembró. Un control "solamente UV" en el que el fago se iluminó sin tratamiento con el compuesto de ensayo no se utilizó en estos experimentos. Este control ha mostrado no tener inactivación significativa de R17 en otros diversos estudios (datos no mostrados). El control oscuro no se realizó sobre todos los compuestos ensayados pero no se observó inactivación significativa de R17 en los compuestos ensayados. Controles similares se han realizado sobre otros psoralenos, con la mayoría de los psoralenos amino sustituidos en 4' y 5' con inactivación no significativa de R17 también (datos no mostrados).

La tabla 3, más adelante, muestra los resultados de diversos experimentos que ensayaron un número de compuestos de la presente invención según el protocolo de R17 recién descrito. También se realizó con el AMT para comparación. Se indica el número de experimentos replicados hechos para cada compuesto. Los resultados indican que todos los compuestos seleccionados reúnen probablemente los criterios de selección de logaritmo de inactivación > 1 a 320 \muM. La mayoría de los compuestos ensayados eran al menos tan eficaces como el AMT mientras el 3-(amino-2-oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno era al menos dos veces tan eficaz como el AMT (es decir, se lograron niveles similares de inactivación a una concentración dada de AMT a menos de la mitad de concentración, los datos no mostrados). La estructura de 3-(amino-2. oxa)butil-4,5',8-trimetilpsoraleno se muestra más adelante.

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TABLA 3 Logaritmo de inactivación de R17 con el compuesto a 4 \muM y 32 \muM

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Ejemplo 14

La eficacia de inactivación del patógeno de los tres compuestos ensayados en el ejemplo anterior se evaluó examinando la capacidad de los compuestos para inactivar nº de virus (VIH) libres de célula. La inactivación de VIH libre de célula se realizó como sigue.

Se añadieron alícuotas pequeñas de los compuestos a VIH-1 de partida a una concentración de compuesto de 32 \muM en un total de 0,5 ml. El VIH de partida (10^{5}-10^{7} unidades formadoras de placas/ml) estaba en DMEM/FBS al 15%. Las alícuotas de ensayo de 0,5 ml se situaron en placas de poliestireno de cultivo de tejido de 24 pocillos y se irradiaron con 320-400 nm (20 mW/cm^{2}) durante 1 minuto sobre un dispositivo similar al dispositivo del ejemplo 13. Los controles incluían solamente existencias de VIH-1, VIH-1 más UVA solamente, y VIH-1 más la concentración más alta de cada psoraleno ensayado, sin UVA. Después de la irradiación, todas las muestras se congelaron a -70ºC hasta que se ensayaron para infectividad mediante un ensayo de placa de microtitulación. Las alícuotas para la medición de infectividad de VIH residual en las muestras se retiraron y se cultivaron.

La infectividad residual de VIH se ensayó usando un ensayo de infectividad de MT-2. (Previamente descrito en Hanson, C. V., Crowford-Miksza, L. y Sheppard, H. W., J. Clin. Micro 28: 2030 (1990)). El medio de ensayo era DMEM al 85% (con una concentración de glucosa alta) que contenía 100 \mug de estreptomicina, 100 U de penicilina, 50 \mug de gentamicina y 1 \mug de anfotericina B por ml, FBS al 15% y 2 \mug de Polibreno (Sigma Chemical Co., San Luis, MO) por ml. Las muestras de control y de ensayo del procedimiento de inactivación se diluyeron en una mezcla de medio de ensayo al 50% y suero normal humano al 50%. Las muestras se diluyeron en serie directamente en placas de 96 pocillos (Corning Glass Works, de N. Y.). Las placas se mezclaron en un agitador oscilatorio durante 30 segundos y se incubaron a 37ºC en una atmósfera de 5% de CO_{2} durante 1 a 18 horas. Células MT-2 (0,025 ml) [clon alfa-4, disponible (número de catálogo 237) de los institutos nacionales de salud de investigación se SIDA y programa de reactivos de referencia, Rockville, Md.] se añadieron a cada pocillo para conseguir una concentración de 80.000 células por minuto. Después de 1 hora adicional de incubación a 37ºC en 5% de CO_{2}, se añadió a cada pocillo 0,075 ml de medio de ensayo que contenía 1,6% de agarosa SeaPlaque (FMC Bioproducts, Rockland, Maine) y se precalentaron hasta 38,5ºC. Las placas se mantuvieron a 37ºC durante unos pocos minutos hasta que se habían acumulado varias placas y después se centrifugaron en portadores de placa a 600 x g durante 20 minutos. En la centrífuga, las monocapas de células formadas antes de la gelificación de la capa de agarosa. Las placas se incubaron durante 5 días a 37ºC en 5% de CO_{2} y se tiñeron mediante la adición de 0,05 ml de 50 \mug/ml de yoduro de propidio (Sigma Chemical Co.) en solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4) a cada pocillo. Después de 24 a 48 horas, las microplacas teñidas fluorescentes se visualizaron colocando las placas sobre una caja de luz UV de 8000 \muW/cm^{2} de 304 nm (Fotodyne, Inc., New Berlin, Wis.). Las placas se contaron a un aumento de entre x 20 y x 25 a través de un microscopio estéreo. Los resultados se muestran en la tabla 4, más adelante.

Los resultados respaldan que los compuestos de la presente invención son eficaces inactivando VIH. De hecho, los datos de estos compuestos son comparables a los niveles de inactivación observados para el AMT (datos no mostrados).

TABLA 4

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Se entenderá que la invención no se limita a los detalles exactos de los compuestos, composición, procedimientos, o procedimientos de la operación o exactos, mostrados y descritos, ya que las modificaciones y equivalentes serán evidentes para los expertos en la técnica.

Claims

1. Un compuesto de psoraleno de la fórmula seleccionada entre el grupo constituido por:

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que comprende:

a) un sustituyente A sobre el anillo de pirona, seleccionado entre el grupo constituido por:

-: (CH_{2})_{u}-NH_{2},

-: (CH_{2})_{w}-J-(CH_{2})_{z}-NH_{2},

-: (CH_{2})_{w}-J-(CH_{2})_{x}-K-(CH_{2})_{z}-NH_{2}, y

-: (CH_{2})_{w}-J-(CH_{2})_{x}-K-(CH_{2})_{y}-L-(CH_{2})_{z}-NH_{2};

en los que J, K, y L se seleccionan independientemente entre el grupo constituido por O y NH, en los que u es un número entero entre 1 y 10, w es un número entero entre 1 y 5, x es un número entero entre 2 y 5, y es un número entero entre 2 y 5, y z es un número entero entre 2 y 6; y

b) los sustituyentes B, R_{3}, R_{4}, R_{5} y R_{6} sobre el anillo de pirona, átomos de carbono 5-, 4'-, 5' y 8 respectivamente, independientemente seleccionados entre el grupo constituido por -H y -(CH_{2})_{v}CH_{3}, en el que v es un número entero entre 0 y 5; o una sal del mismo.

2. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que dicho sustituyente A está en el átomo de carbono 3, y en el que dicho sustituyente B está en el átomo de carbono 4 de dicho anillo de pirona.

3. Un compuesto de la reivindicación 2, en el que dicho sustituyente A se selecciona entre el grupo constituido por -CH_{2}-NH_{2}, -CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-NH_{2}.

4. Un compuesto de la reivindicación 3, en el que dichos sustituyentes R_{3} y R_{5} son -H, y en los que dichos sustituyentes B, R_{4} y R_{6} son -CH_{3}.

5. Un compuesto de la reivindicación 4, en el que dicho compuesto es 3-(4-amino-2-oxa)butil-4,4'-8-trimetilpsoraleno.

6. Un compuesto de la reivindicación 1, en el que dicho sustituyente A está en el átomo de carbono 4, y en el que dicho sustituyente B está en el átomo de carbono 3 de dicho anillo de pirona.

7. Un compuesto de la reivindicación 6, en el que dicho sustituyente A se selecciona entre el grupo constituido por -CH_{2}-NH_{2}, -CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-NH_{2}.

8. Un compuesto de la reivindicación 7, en el que dicho sustituyente B y R_{3} son -H, y en el que dichos sustituyentes R_{4}, R_{5} y R_{6} son todos -CH_{3}.

9. Un compuesto de psoraleno de fórmula:

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que comprende:

a) un sustituyente A sobre el átomo de carbono 5, seleccionado entre el grupo constituido por:

-: (CH_{2})_{u}-NH_{2},

-: (CH_{2})_{w}-J-(CH_{2})_{z}-NH_{2},

-: (CH_{2})_{w}-J-(CH_{2})_{x}-K-(CH_{2})_{z}-NH_{2}, y

-: (CH_{2})_{w}-J-(CH_{2})_{x}-K-(CH_{2})_{y}-L-(CH_{2})_{z}-NH_{2};

b) los sustituyentes B, R_{1}, R_{2}, R_{4} y R_{5} de los átomos de carbono 8-, 3-, 4-, 4'- y 5'- respectivamente, independientemente seleccionados entre el grupo constituido por -H y -(CH_{2})_{v}CH_{3}, en el que v es un número entero entre 0 y 5; o una sal del mismo.

10. Un compuesto de la reivindicación 9, en el que dicho sustituyente A se selecciona entre el grupo constituido por -CH_{2}-NH_{2}, -CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-NH_{2}.

11. Un procedimiento de inactivación de patógenos in vitro o ex vivo en una composición biológica; que comprende, en el siguiente orden:

a) proporcionar, en cualquier orden, i) un compuesto según cualquiera de las reivindicaciones precedentes; ii) medios de fotoactivación de dichos compuestos; y iii) una composición biológica que se origina de un organismo biológico de cualquier tipo y se sospecha que está contaminado con un patógeno que contiene ácido nucleico;

b) añadir dicho compuesto a dicha composición biológica; y

c) fotoactivar dicho compuesto, de manera que inactive dicho patógeno.

12. Un procedimiento de inactivación de patógenos in vitro o ex vivo en una composición biológica; que comprende, en el siguiente orden:

a) proporcionar, en cualquier orden, i) un compuesto de psoraleno de fórmula:

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que comprende:

aa) un sustituyente A sobre el átomo de carbono 8, seleccionado entre el grupo constituido por:

-: (CH_{2})_{u}-NH_{2},

-: (CH_{2})_{w}-J-(CH_{2})_{z}-NH_{2},

-: (CH_{2})_{w}-J-(CH_{2})_{x}-K-(CH_{2})_{z}-NH_{2}, y

-: (CH_{2})_{w}-J-(CH_{2})_{x}-K-(CH_{2})_{y}-L-(CH_{2})_{z}-NH_{2};

bb) los sustituyentes B, R_{1}, R_{2}, R_{4} y R_{5} sobre los átomos de carbono 5-, 3-, 4-, 4' y 5'- respectivamente, independientemente seleccionados entre el grupo constituido por -H y -(CH_{2})_{v}CH_{3}, en el que v es un número entero entre 0 y 5; o una sal del mismo; y

cc) en el que A es -CH_{2}-NH_{2}, al menos uno de B, R_{1}, R_{4} y R_{5} es -(CH_{2})_{v}CH_{3};

ii) medios de fotoactivación para fotoactivar dichos compuestos; y iii) una composición biológica que se origina a partir de un organismo biológico de cualquier tipo y que se sospecha que está contaminado con un patógeno que contiene ácido nucleico;

b) añadir dicho compuesto, a dicha composición biológica; y

c) fotoactivar dicho compuesto, de manera que inactive dicho patógeno.

13. El procedimiento de la reivindicación 12, en el que dicho sustituyente a se selecciona entre el grupo constituido por -CH_{2}-NH_{2}, -CH_{2}-O-(CH_{2})_{2}-NH_{2}.

14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13, en el que la composición biológica se selecciona entre el grupo constituido por sangre, productos sanguíneos, fluido cerebroespinal, saliva, orina, heces, semen, sudor, leche, tejido, muestras de tejido, muestras de tejido homogeneizadas, vacunas, medio de cultivo celular, cultivos celular y cultivos virales.

15. El procedimiento de la reivindicación 14, en el que la composición biológica es un producto sanguíneo.

16. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15, en el que el patógeno se selecciona del grupo constituido por virus y bacterias.