JP5346468B2 - 赤血球不活性化プロセスのための改善されたクエンチング方法 - Google Patents
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Description
本出願は、米国仮特許出願第60/623,177号(2004年10月29日出願)の優先権を主張し、この仮特許出願は、本明細書中でその全体が参考として援用される。
本発明の分野は、存在し得る病原体汚染物質を不活化するための血液製剤の処理に用いられる反応性求電子性化合物をクエンチング(quenching)する方法に関する。特に、チオールなどの求核性化合物を用いて、赤血球組成物中の反応性求電子性化合物をクエンチングする。
血液製剤および他の生物学的材料による疾患の感染は、依然として深刻な健康上の問題である。血液ドナーのスクリーニングおよび血液試験は、相当進歩しているが、B型肝炎ウイルス(HBV)、C型肝炎ウイルス(HCV)およびヒト免疫不全ウイルス(HIV)などのウイルスは、ウイルスまたはウイルス抗体のレベルが低いため、試験の際、血液製剤中での検出が見逃されることがある。ウイルスの有害性(hazard)に加え、現在、輸血における使用が意図される血液中の非ウイルス微生物(例えば、細菌または原虫など)の存在についてスクリーニングするための適格な認可試験はない。また、これまで未知の病原体が、輸血用血液中に蔓延(prevalent)した状態となり、疾患の感染の脅威を提示し得るというリスクも存在する(これは、実際、輸血によるHIV感染のリスクの認識以前に起こった)。
本発明は、赤血球組成物を病原体不活化化合物で、赤血球との病原体不活化化合物の望ましくない副作用をクエンチングするための改善された条件下で処理する種々の方法を提供する。一部の実施形態では、クエンチングは、クエンチャー(quencher)のpHおよび/または濃度の増大の調整によって改善される。
赤血球組成物中の反応性求電子性種のクエンチングのための既存の方法は、例えば、米国特許第6,709,810号に示されている。このような方法の非限定的な例として、グルタチオンが、β−アラニン、N−(アクリジン−9−イル)、2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステル(本明細書において以下、択一的に、「病原体不活化化合物I」、「PIC−1」または「S−303」という)と組み合わせて使用される。グルタチオンは、典型的には、酸性形態で単離され(すなわち、プロトン化されている)、これは、これらの公知の方法において使用されている形態である。したがって、公知のクエンチング方法に言及する場合、グルタチオンは、酸性またはプロトン化されたグルタチオンをいう。本明細書で用いる場合、赤血球(組成物)中の病原体の不活化のための標準的な条件は、赤血球組成物を、2mMのプロトン化されたグルタチオンおよび0.2mMのPIC−1で処理することを伴う。プロトン化されたグルタチオン濃度は、望ましくない副作用のより良好なクエンチングを提供する試みにおいて、増大することがあり得、病原体不活化化合物に対するクエンチャーの比率が高くなる。しかしながら、プロトン化されたグルタチオン濃度が増大すると、赤血球組成物全体としてのpHは、グルタチオンの酸性度のため減少する。このpHの低下により、病原体不活化化合物と赤血球(特に赤血球の表面)との反応のクエンチングが不充分になることが測定されている。また、この標準的な条件では、赤血球表面の改変の充分なクエンチングがもたらされないことが測定された。したがって、本発明は、病原体不活化化合物およびクエンチャーを含む赤血球組成物のpHを、改善されたクエンチングがもたらされる適当な範囲に調整し、使用するクエンチャーの濃度が2mMより高い(例えば、約5〜40mM、同様に約10〜30mM、または約20mM)、改善されたクエンチング方法を提供する。例えば、赤血球含有組成物を病原体不活化化合物およびクエンチャーと混合すると、pHが適当な範囲内(例えば、約6.8〜8.5、同様に約7.0〜8.5、同様に約7.2〜8.5、または約7.2〜8.0のpH)であり、クエンチャー濃度が約5〜40mMの範囲であるような方法が提供される。
えば、一部の実施形態では、得られる混合物中のクエンチャーの濃度が約10mM〜30mMの範囲である。一部の実施形態では、クエンチャーが酸性である。一部の実施形態では、クエンチャーが、システインまたはシステイン誘導体、例えばグルタチオンなどを含むものである。一部の実施形態では、該官能基が、マスタード、マスタード中間体およびマスタード同等物からなる群より選択される。例えば、一部の実施形態では、病原体不活化化合物が、β−アラニン、N−(アクリジン−9−イル)、2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステルである。一部の実施形態では、該処理により、赤血球組成物において少なくとも1logの病原体汚染物質の不活化がもたらされる。
標準的な条件とのSerratia marcescens、Staphylococcus epidermidisおよびYersinia enterocoliticaの不活化の比較
細菌S.marcescensを、マスタープレート由来の単一のコロニーを37℃で500mLのLB培地に添加することにより一晩成長させた。一夜培養物を新たな培地中で1:1000に希釈した。37℃での成長を、600nmでの懸濁液のODによってモニターした。懸濁液が0.5ODに達した調製物を使用した。全血液(Blood Source,Sacramento,CA)を用い、遠心分離して充填RBC(およそ90%のヘマトクリットの34mL)を得、次いで、17mLのErythrosolをおよそ60%のヘマトクリットまで添加することにより、赤血球(RBC)組成物を調製した。Erythrosolは、赤血球添加剤(Baxter Healthcare Corp.,Deerfield,IL)であり、これは、クエン酸ナトリウム二水和物(7.82g);過リン酸ナトリウム二水和物(0.73g);リン酸ナトリウム二水和物(3.03g);アデニン(0.22g);マンニトール(7.74g);およびグルコース(9g)を1リットルの蒸留水中で合わせることにより調製されたものであり得る。次いで、該細菌調製物(全容量の1/100)をRBC/Erythrosolに添加し、汚染RBCを得た。この汚染RBCをいくつかの試料に分割し、表2に従って処理した。ここで、PIC−1は、β−アラニン、N−(アクリジン−9−イル)、2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステルである。PIC−1およびグルタチオン(Aldrich,St.Louis,Mo)を8%デキストロース一水和物の溶液に、一緒に添加する場合は最終赤血球組成物に所望される濃度の約15倍で、または別々に添加する場合は30倍で溶解した。また、グルタチオンは、表示した当量の水酸化ナトリウムで中和し、適当な量の5N NaOHをグルタチオンに添加することにより調製した。各試料について、4.67mLのRBCを、330μLのPIC−1/グルタチオンまたは165μLの別々の各PIC−1およびグルタチオンのいずれかと混合した。例えば、2mMのグルタチオンおよび0.2mMのPIC−1の標準処理物は、7.6mgのPIC−1および46mgのグルタチオンを5mLの8%デキストロースに溶解し、このうち330μLを4.67mLのRBCに添加することにより調製した。20mMの中和グルタチオンおよび0.2mMのPIC−1の試料を、7.6mgのPIC−1および460mgのグルタチオンを4.4mLの8%デキストロースに溶解し、0.6mLの5N NaOHと混合し、次いで、このうち330μLを4.67mLのRBCに添加することにより調製した。20mMの中和グルタチオンを用いて別々に添加する場合、PIC−1は、7.6mgを2.5mLの8%デキストロースに溶解することにより調製し、グルタチオンは、460mgを1.9mLの8%デキストロースに溶解し、0.6mLの5N NaOHと混合することにより調製し、次いで、165μLの各溶液を4.67mLのRBCに適切な順序で添加する。種々の成分の容量は、表に示した適切な試料が提供されるように、しかるべく調整する。処理後、試料を2時間インキュベートし、各々100μLを連続希釈し、LBプレート上にプレーティングした。細菌の成長を評価するため、これらを一晩37℃でインキュベートした。細菌力価は、プレート上のコロニーを計測することにより測定し、プレートの希釈度に対してその力価を測定した。例えば、10倍連続希釈では、最初の溶液の5番目の希釈物(この場合、0.1mLがプレーティングされる)で30個のコロニーが計測されることは、(30×105)/0.1=3×107あるいは7.47logの初期力価を示し得る。未処理の対照試料(すなわち、PIC−1またはグルタチオンの添加なし)を、処理後の力価のlog低減を評価するためのベースラインとして用いる。表2Aおよび2Bは、種々の試料に関するlog力価およびlog低減の両方を示す。表2Aのほとんどの試料では、PIC−1およびグルタチオンを一緒に製剤化したことに留意されたい。グルタチオンを種々の量の水酸化ナトリウムで中和した試料4〜6では、PIC−1が溶液から析出し、塩基の添加量が増加するにつれて、沈殿は増加した。したがって、これらの結果は、溶液中のPIC−1実際の濃度がわからないので、不活化レベルの充分な表示を提供しない。表2Bに示すような、この2つの成分の逐次添加によって試験を繰返した(時間遅延0は、これらを同じ溶液中に添加したことを示す)。表2Aにおける標準的な条件との比較では(試料1および10)、該成分を別々に添加した試料7のみが、妥当な比較を提供する。この場合、表2Bでも示されるように、20mMの2当量の塩基で中和したグルタチオンによるクエンチングでは、標準的な条件(2mMの酸性グルタチオンおよび0.2mMのPIC−1)と比べ、約1〜1.5log少ないlog低減がもたらされる。
標準的な条件との水疱性口内炎ウイルス(VSV)の不活化の比較
VSVの100倍原液(およそ1.78×108力価)を用い、実施例1のようにして調製した赤血球組成物を汚染する。汚染RBCを、表5A〜Bに示すようにして処理し、2時間インキュベートした。成分は、上記の同様の実験で示したようにして添加した。各試料に対して、5mL容量の汚染RBCを処理した。インキュベーションの終了後、RBCを液体N2中で凍結し、後のある時点で解析した。残留VSVの力価を、10%ウシ胎仔血清および他の必須成分を加えたEMEM中で成長させたアフリカミドリザル細胞Vero 76において、プラークアッセイによって測定した。力価は、既報(Hsiung GD and Melnick JL,Journal of Immunology 78,128−136.1957)のコンフルエント細胞調製物に対して希釈試料を適用したときに得られたプラークの数の測定によって計算した。結果を表6Aに示す。これは、該クエンチング方法はすべて、高力価のVSVの本質的に完全な不活化をもたらすことを示す。2当量の水酸化ナトリウムで中和した、または中和していないシステインをクエンチャーとして用い、さらなる試験を行なった。結果を、比較のための標準的な条件および20mMの中和グルタチオンとともに表6Bに示す。酸性、または中和されたいずれかの20mMのシステインは、不活化レベルを約2〜3log低下させ、中和された試料が最も低い不活化レベルを示す。また、20mMのグルタチオン試料も不活化レベルを約2log低下させる。結果はすべて、細胞外ウイルスVSVの不活化がクエンチング条件に対してあまり感受性でないことを示す。
PIC−1およびグルタチオンまたはシステインでのRBCの処理後のヒト白血球ゲノムDNAにおけるPIC−1付加物頻度(adduct frequency)の測定
白血球低減処理されていない全血を用い、実施例1に記載のようにして、Erythrosolを加えたRBCを調製した。各々20mLのアリコートを、0.2mMのPIC−1、0.2mMのPIC−1および2mMの酸性グルタチオン、20mMの中和グルタチオン(2当量の塩基)および10分後に0.2mMまで添加するPIC−1、または各々20mMの中和グルタチオン(2当量のNaOH)および中和システイン(1当量のNaOH)ならびに10分後に0.2mMまで添加するPIC−1のいずれかで処理した。使用したPIC−1は放射能標識PIC−1を含むものであり、その反応性基は、14C標識を含むものであった(ViTrax,Inc.,Placentia,CA)。使用したPIC−1の比活性は、1.08μCi/μモルであった。すべての試料を室温で20時間インキュベートした。インキュベーション後、20mLのRBCを、20mL容量のPBSで希釈し、20mLの混合物を10mLのFicollを入れた2つのチューブの各々に添加した。次いで、この懸濁液を400×gで30分間遠心分離した。白血球部分を分離し、さらに20mLのPBSを添加後、遠心分離機工程を繰返した。得られたペレットを合わせ、合わせたペレットを5mLの溶解バッファー(100mM NaCl,10mM Tris HCl,25mM EDTA,5%SDS,0.1mg/mLプロテイナーゼK,Sigma,St.Louis,Mo)中に再懸濁し、50℃で少なくとも2時間インキュベートした。次いで、得られた溶液を5mLのフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール24:25:1、続いて5mLのクロロホルム、次いで5mLのエーテルで抽出した。ゲノムDNAが水層中に単離され、0.5mLの3M NaOAc、10mLの100%エタノールの添加後、ドライアイス/エタノール浴中での最終混合物のインキュベーションによって沈殿させた。DNAは、6,000×gで10分間の遠心分離によって単離した。上清みを除去し、ペレットを風乾し、1mLのTEバッファー(100mM Tris HCl,1mM EDTA,pH=7.4)中に再懸濁した。単離されたDNAの量は、260nmでのUV吸収によって定量し、PIC−1付加物の量は、DNA塩基対に対するPIC−1モル比を評価するためのPIC−1の比活性を用い、該DNA溶液の液体シンチレーション計測(Perkin Elmer−Wallac,Winspectral 1414 Liquid Scintillation Counter,Shelton,CT)によって定量した。1000bp(kbp)あたりの付加物の数を以下の表7に示す。これは、標準的な条件または非クエンチング試料と比べ、20mMの中和グルタチオンを用いてクエンチングした試料において、白血球核酸の改変が同等であることを示す。表中ならびに本明細書の他の部分において、グルタチオンを「GSH」で、システインを「Cys」で示す。付加物頻度の測定は、白血球の不活化の代替的(surrogate)測定として用いた。標準的な病原体の不活化条件では、白血球は、限界希釈アッセイの検出レベルまで不活化されることが知られており、これは、5.3logの不活化に相当する。不活化の機構は、ゲノム核酸上への付加物の形成によるものである。したがって、結果は、該改善されたクエンチング方法は、白血球の不活化に有意に影響を与えないはずであることを示す。種々の条件下での病原体核酸に対する結合を評価するため、白血球低減処理された赤血球を用いて、適当な病原体で同様の試験を行ない得る。
**2当量で中和
実施例4
赤血球への抗アクリジン抗体結合によって評価されるクエンチングに対するRBCのpH調整の効果
グルタチオンの添加前に、この実施例に示すようにして、異なるpHの種々の溶液を用いてRBCを洗浄することにより、RBC組成物のpHを調整することが可能である。白血球低減処理された全血(Blood Source,Sacramento,CA)の20mLの試料を、4本の50mL容遠心チューブの各々において、室温にて、4,100×gで5分間、遠心分離した。上清みを各チューブから取り出し、赤血球濃縮物(RCC)を得た。試料1には、5mLのErythrosol(pH7.3)を10mLのRCCに添加した。試料2〜4は、RCCを、表示した溶液10mLで3回洗浄し、上記のようにして遠心分離し、各洗浄後の上清みを取り出した。各洗浄RCCについて、細胞を、洗浄に用いた溶液5mL中に再懸濁した。これを、以下、RBC試験試料という。試料2〜4に用いた溶液は、それぞれ、Erythrosol(pH7.3)、PBS pH8(50mMリン酸塩,100mM NaCl,pH8.0)、およびCHES pH9(50mM CHES(Aldrich),100mM NaCl,pH9.0)であった。各RBC試験試料について、1.5mLを、100μLのPIC−1+グルタチオン(2mMの酸性のもの、または20mMの0.9、1.5もしくは2当量の水酸化ナトリウムで中和されたもの)と混合し、最終濃度が0.2mMのPIC−1および2mMまたは20mMのグルタチオンを得た。これらの試料を20時間、室温でインキュベートした。インキュベーション後、RBCをBBS(Blood Bank Saline、0.9%生理食塩水、非緩衝、Fisher Scientific)中で洗浄し、最終ヘマトクリット4%まで希釈した。25μLの各アリコートを、BBS中で1:100に希釈したウサギポリクローナル抗アクリジン血清15μLと混合し、混合物を37℃で30分間インキュベートした。続いて、細胞を1.5mLのBBSで洗浄した。洗浄を終了した後、細胞を、50μLのFITC標識ヤギ抗ウサギFab’2断片(BBS中、1:64希釈度)と混合し、37℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を、3×1.5mLのBBSで再度洗浄した。次いで、赤血球をFACScanによって解析した。各試料で観察された平均蛍光を表8に示す。この値は赤血球表面に対するPIC−1アクリジンの結合と、値が小さいほど、PIC−1とRBCとの副作用のクエンチングの改善を示すように相関する。RBCに対するPIC−1の結合は、単に、細胞を高pHバッファー中で洗浄することによって有意に低減され、中和グルタチオンは、さらにより良好なクエンチングを提供した。グルタチオンを中和する水酸化ナトリウムの量を増加させると、クエンチングが改善されることに留意されたい。この実施例は、改善されたクエンチングを提供するために赤血球組成物のpHを調整することの重要性を示す。CHES(pH9)での洗浄と1.5または2当量の水酸化ナトリウムで中和されたグルタチオンとの組み合わせにより、PIC−1の結合がほぼバックグラウンドレベルまで低下される。
赤血球への抗アクリジン抗体結合の結合に関する種々のクエンチング条件の比較
処理済み赤血球に対するウサギ抗アクリジン血清の結合のFACScan解析を用い、種々のクエンチング条件を評価した。RBC試料は、実施例1に記載のようにして調製し、クエンチャーは、上記の実施例に記載のようにして調製した。RBCとの混合時の成分の添加順および最終化合物濃度を表9Aおよび9Bに示す。これらの表は、各々、試料を標準的な条件下または20mMの中和グルタチオンで処理した2つの異なる実験のデータを示す。PIC−1は、すべての試料で0.2mMである。実験のデータは、種々の処理の相対的な有効性を提供する。アッセイは、用いる赤血球のロット(lot)に依存し得るため、平均蛍光の絶対値は、ある試験と次のものとで異なり得、そのため、相対値は、所与の実験内のみで比較するのがよい。例えば、標準的な条件では、表9Aでは114で、表9Bでは151〜182の平均蛍光が得られていることに留意されたい。中和システインは、15または20mMで、本質的にバックグラウンドシグナル(すなわち、本質的に結合なし)まで効果的にクエンチングする。20mMの中和グルタチオンでは、バックグラウンドレベルに近くなる。表9Bから、システインに関する結果は、クエンチャー濃度を増加させると、RBCとの反応のより良好なクエンチングが提供されるが、システイン濃度が増加したとき、システインを中和すると、望ましくない副作用の最適なクエンチングが提供されることを示す。2.5mMシステインでは、中和システインと酸性システインとでほとんど差はないが、5mM以上では、同じ濃度の酸性システイン試料と比べ、1当量のNaOHにより、シグナルがさらに低減されることに留意されたい。
PIC−1および種々のクエンチャーの添加時の赤血球組成物のpHの評価
赤血球組成物のpHに対する種々のクエンチング条件の効果を、種々の処理条件で調べた。クエンチャー溶液は、8%デキストロース一水和物中600mMの濃度に調製した。システインでは、溶液の一部を1または2当量いずれかの水酸化ナトリウムと混合した。グルタチオンは、2mM(酸性)または20mM(2当量の塩基)で評価した。N−アセチルシステイン、メチオニンおよびペプチドダイマーであるシステイン−グリシン(CysGly)もまた評価し、ここで、N−アセチルシステインは、1当量の水酸化ナトリウムで中和し、メチオニンは、1または2当量の水酸化ナトリウムで中和し、CysGlyは、2当量の水酸化ナトリウムで中和した。クエンチャー溶液(非改変または中和のいずれか)のpHは、室温で、標準的なEpoxy Calomel電極(Beckman Instruments)を用いて測定した。PIC−1の溶液は、8%デキストロース一水和物中、6mMに調製した。赤血球組成物を実施例1のようにして調製した。各試料に対し、167μLのクエンチャーおよび167μLのPIC−1を4.67mLのRBCに逐次添加し、クエンチャーの添加後、室温で10分間インキュベートし、次いでPIC−1を添加した。試料を混合し、pHを室温で、上記のものと同じ電極を用いて測定した。種々の試験の結果を表10に示す。
グルタチオン濃度と中和の関数としてのクエンチング;抗アクリジン抗体結合およびS.epidermidisの不活化の評価
これらにおいて、適当な量の600mMの原液を添加し、適切な容量の8%デキストロースと混合し、各RBC試料に対して同じ容量添加を提供した。ここで、試験の1つでは、グルタチオン濃度を変化させ、pHを、グルタチオンの添加後およびPIC−1の添加後に測定した。PIC−1の添加によって、クエンチャーの添加後、高pH値を有する一部の溶液のpHが低下するが、最終pHは依然として、改善されたクエンチングに好ましい範囲内にあり、中和していない同じ濃度のグルタチオンのpH値の充分上であることに留意されたい。種々の濃度のグルタチオン(表11A)を用いて実施例6と同様にして調製した試料を、抗アクリジンウサギ血清に対する結合について、ゲルカードまたはFACScan解析のいずれかによって評価した。また、同様の試料を、S.epidermidisの不活化について評価した。各RBC試料をグルタチオンで、続いて10分後にPIC−1で処理し、次いで、PIC−1の混合後に室温で20時間インキュベートした。ゲルカード解析では、インキュベーション後、RBCをBBS中で洗浄し、BBS中で最終ヘマトクリット4%まで希釈した。25μLの各アリコートを、BBS中で1:4または1:100のいずれかに希釈した15μLのウサギポリクローナル抗アクリジン血清と混合し、混合物を37℃で30分間インキュベートした。続いて、細胞を1.5mLのBBSで洗浄した。洗浄を終了した後、細胞をヤギ抗ウサギFab’2断片の抗H+L鎖(PBS中、1:4希釈度)と混合し、37℃で30分間インキュベートした。インキュベーション後、細胞を3×1.5mLのBBSで再度洗浄し、ゲルカード上に負荷し、該カードを、MTS Centrifuge(登録商標)(Ortho System,Pompano Beach,Fl)において、製造業者の設定に従って10分間900×gで遠心分離した。カードを、凝集の相対量を等級分けする0、1+、2+、3+、4+の段階でスコア付けする。ここで、0は、凝集なし(すべての細胞がゲルを通過する)を示し、4+は、完全な凝集(すべての細胞がゲル上部にある)を示す。これらの結果は、グルタチオン濃度が増加するにつれて、中和グルタチオンを用いることなどで、RBC組成物のpHを調整することが必要であることを示す。5mMであっても、2当量の塩基で中和したグルタチオンは、1または0当量の塩基で中和した5mMのものより良好なクエンチングするを提供する。中和グルタチオンは、濃度が増加するにつれて抗体結合の低減を示すが、酸性グルタチオンは、2mMの標準的な条件と比べ、より高い濃度では改善は、あったとしても、ほんのわずかである。このアッセイの感度は、この試験において、1:4希釈度では、すべての試料で完全な凝集を示す(未処理の対照は、凝集を示さない)ため、クエンチング方法における差を調べるには、1:100希釈度のウサギ血清が必要であるようなものである。したがって、1:100に希釈した試料のみを表11Bに示す。試験間の結果は、用いる血液試料によって異なる。例えば、この試験では、1:4に希釈した抗アクリジンウサギ血清では、すべての試料で4+スコアがもたらされたが、別の試験は、10、15および20mMの中和グルタチオン(2当量の塩基)を用いて行ない、この場合、1:4に希釈した試料において差が観察されたが、1:100に希釈した試料はすべて、スコア0を示した。1:4希釈度のウサギ血清を用いて試験したこれらの試料は、標準的な条件、10mM、15mMおよび20mMの中和(2当量または塩基)グルタチオンで、それぞれ、4+、4+、3+および1+のスコアを示した。また、中和グルタチオン(2当量の塩基)と中和システイン(1当量の塩基)の組合せも使用し、この場合、全クエンチャー濃度を20mMとし、すべてのかかる試料で、1+または0のスコアがもたらされた(すなわち、これらは、20mMの中和グルタチオンと少なくとも同程度に有効であった)。
種々のクエンチャーでクエンチングした試料におけるゲルカード解析による抗アクリジン抗体結合の評価
ゲルカードアッセイを用いた同様の試験を、他のクエンチング条件で、例えば、システイン、システイン−グリシンジペプチドまたはシステインとグルタチオンの組合せなどを用いて行なった。また、試料を、1:4または1:100いずれかの希釈度のウサギ血清を用いて、および二次抗体なしで試験し、この場合、2mMのグルタチオンおよび0.2mMのPIC−1の標準的な条件で処理した試料、またはクエンチャーなしでPIC−1で処理した試料で、一部凝集がもたらされた。濃縮した1:4希釈度のウサギ血清を二次抗ウサギ抗体(表12および13)と用いたほとんどすべての試料で観察された凝集は、一部、異好性(heterophile)反応によるものと考えられる。異好性抗体は、天然に存在する抗体であり、RBCを別の種から非特異的様式で認識する。表12〜13は、1:4または1:100いずれかの希釈度のウサギ血清および1:4希釈度の抗ウサギ抗体に関する種々の実験の結果を示す。未処理の対照のデータは、すべての試料でスコア0であったため、示していない。試料はすべて、まずクエンチャーと、次いで0.2mMのPIC−1と混合した。クエンチャーの具体名、濃度、および当量の塩基を表に示す。これらの結果は、グルタチオンおよびシステインまたはシステイン単独の組合せにより、いくぶんより良好なRBCに対するPIC−1の結合のクエンチングが提供され得ることを示唆する。
本発明の方法の処理による標準処理済み赤血球で見られた交差反応性の排除
2mMのグルタチオンおよび0.2mMのPIC−1で処理されているRBCと交差反応する抗体を発現した患者由来の血清を用い、改善された方法との交差反応性を評価した。O陰性血液(Blood Source,Sacramento,CA)を用いた試料を実施例1に記載のようにして調製し、2mMのグルタチオンおよび0.2mMのPIC−1、0.2mMのPIC−1に続いて1分後に20mMの中和グルタチオン(2当量の塩基)、または20mMの中和グルタチオンに続いて10分後に0.2mMのPIC−1のいずれかで処理した。また、未処理の対照RBC試料も調製した。各試料をBBSで3回洗浄し、次いで、低イオン強度の生理食塩水(AABBマニュアル,第14版)中にヘマトクリット8%まで懸濁した。50μLの各アリコートをゲルカードに、25μLの患者血清とともに添加し、混合物を37℃で15分間インキュベートした。ゲルカードは、患者血清由来の抗体が結合したRBCを凝集させるウサギ抗ヒトIgGを含有するものである。カードを実施例7のように遠心分離した。カードは、実施例7記載のものと同じ目盛りで読む。3種類の異なる血清を用いて試験した試料は、標準処理したRBCで3+、および対照未処理または20mM(2当量)の中和グルタチオン処理試料で0のスコアを示した。
チオールのクエンチングと独立したpH調整によるクエンチングを評価するためのモデルとしてのメチオニンの使用
メチオニン(Met)は、イオウ原子上にメチル置換基を有するが、それ以外は、非常にシステインと類似するため、これを、クエンチングに対するpH調整単独の効果を評価するためのモデルアミノ酸として使用した。メチル基の存在はイオウ原子の求核特性を排除するため、クエンチングは、溶液のpHの増加によるものであり得る(例えば、高濃度の水酸化物は、ある程度のクエンチングをもたらし得る)。メチオニン(Aldrich)を、1または2当量の塩基の添加を伴って20mMで用い、システイン(1または2当量)およびグルタチオン(2当量)(すべて、クエンチャーの10分後に0.2mMのPIC−1の添加を伴う)と比較する。標準的な条件、すなわち、0.2mMのPIC−1および2mMの酸性グルタチオンの同時添加を含めた。試料は、ゲルカード解析用の試料を37℃または室温でインキュベートした以外は実施例7のようにして、抗アクリジンウサギ血清結合のゲルカード解析によって評価する。結果を表15に示す。結果は、2当量の塩基で中和されたメチオニンは、標準的な条件と比べて改善されたクエンチングを提供することを示す。
20mMの中和グルタチオンおよび0.2mMのPIC−1で処理した完全体単位(whole unit)に関するインビトロ機能試験
赤血球濃縮物(Interstate Blood Bank,Inc.,Memphis,TN)の完全体単位を白血球低減処理した。200mL容量のこのRCC(80%ヘマトクリット)を94mLのErythrosolまたは100mLのAdsol(Baxter Healthcare Corp.,Deerfield,IL)(対照として)(単位1)と混合した。20mL容量の8%デキストロースを用いてPIC−1(mg)および酸性グルタチオン(mg)を溶解し、1単位にに添加して0.2mMのPIC−1および2mMのグルタチオン(単位2)を得た。単位3および4では、PIC−1(mg)およびグルタチオン(mg)を、それぞれ、10mLまたは8.8mLの8%デキストロースに別々に溶解した。グルタチオンには、1.2mLの10N NaOHを添加した(2当量)。PIC−1をこの単位と、続いて1分後(単位3)または5分後(単位4)にグルタチオンと混合した。単位5では、まず中和グルタチオンを、続いて10分後にPIC−1を混合した。単位6では、グルタチオンを18.8mLの8%デキストロースに溶解し、1.2mLの10N NaOHと混合し、次いでRBC(PIC−1なし)と混合した。すべての単位は、血液バッグの両端をつかみ、8の字の動きを30回で混合することにより混合した。次いで、これらを室温で合計20時間インキュベートした。対照試料以外はすべて、メッシュポーチ内に入れたポリマー樹脂で構成された化合物吸着デバイス(CAD)を使用した。このデバイスは、残留PIC−1、PIC−1分解生成物および試料由来のグルタチオンを除去することを目的とするものである。試料を8時間インキュベートし、次いで、CADを入れた第2の血液バッグに移した。さらに12時間インキュベートした。室温でインキュベーション後、試料を冷蔵庫(4℃)に移し、43日間まで保存した。アリコートを各単位から、混合の12時間および20時間後に、その後は1週間毎に取り出した。アリコートを、全ヘモグロビン、pH、細胞内ATP、血漿ヘモグロビン、カリウム、細胞外グルコースおよび細胞外乳酸について解析した。また、抗ウサギ血清結合を、実施例4に記載のようにして、FACScan解析によって評価した。CADで処理した、または処理していないPIC−1処理単位を用いて、試験を繰り返した。ATP、溶血および抗ウサギ血清結合の結果を表16A〜Cおよび17A〜Cに示す。
表16A〜C 試料の具体名:
1:未処理対照
2:標準処理 0.2mM PIC 1+2mMのGSH
3:0.2mMのPIC−1、1分間遅延、20mMのGSH+2当量の塩基
4:0.2mMのPIC−1、5分間遅延、20mMのGSH+2当量の塩基
5:20mMのGSH+2当量の塩基、10分間遅延、0.2mMのPIC−1
6:0.2mMのGSH+2当量の塩基
(表16A 42日間にわたる保存のATPデータ)
1:標準処理、0.2mMのPIC−1、2mMのGSH+CAD
2:標準処理、0.2mMのPIC−1、2mMのGSH
3:0.2mMのPIC−1、1分間遅延、20mMの中和GSH+CAD
4:0.2mMのPIC−1、1分間遅延、20mMの中和GSH
5:20mMの中和GSH、10分間遅延、0.2mMのPIC−1+CAD
6:20mM nGSH、10分間遅延、0.2mMのPIC−1
7:20mMの中和GSH
8:未処理対照
(表17A 42日間にわたる保存の細胞内ATP値)
ウサギモデルにおける処理済み赤血球の免疫反応性のインビボ評価
非限定的な一例の改善されたクエンチング方法を用いてS−303で処理している赤血球(RBC)(この実施例では、「改変S−303 RBC」という)の免疫反応性のインビボ評価を、同種(allogeneic)輸血モデルを用いて行なった。(改変S−303 RBCのプロトコルの記載については下記参照。)使用した同種輸血モデルは、遅延型溶血性輸血反応の機構を調べるためのNessらによって記載されたウサギモデル(Trans Med Rev,2001,15:305−17)に基づくものであった。該モデルにおいて、HgD−陽性赤血球を用いて、HgD−陰性レシピエント動物を免疫処置した。しかしながら、HgD−ミスマッチRBCのみが稀に(infrequently)抗体形成を引き起こすという文献と一致して、Nessらは、検出可能な力価の抗HgD抗体を生成させるために、アジュバントと組み合わせたHgD−陽性RBCの皮下投与を報告した。
動物飼育(husbandry):New Zealand Whiteウサギの雄および雌は、試験の開始時、およそ5〜7月齢であり、体重は3.5〜4.5kgであった。ドナー動物は、HgD−陽性;レシピエントはHgD−陰性であった。
第1段階において、S−303 RBCに対する応答が検出され得るか否かを調べるため、動物に、HgD遺伝子座がミスマッチの同種RBCを10mL/kgで、隔週で24週間輸血した。動物のコホートを表19に記載する。
S−303またはS−220で処理した抗原−ミスマッチRBC調製物の反復輸液では、抗アクリジン免疫応答が生じなかったため、第2段階では、よりストリンジェントなアプローチを採用して抗アクリジン抗体を惹起した。アジュバントを含めた慣用的な初回免疫刺激/追加免疫レジメンを用いて、動物をKLH−アクリジンで免疫処置し、次いで、ウサギにおける種々の処理済みRBC調製物のインビボ寿命または高力価抗体を測定した。第1段階の結果は、KLH−アクリジンでの皮下免疫処置によりウサギを免疫処置し、高い抗体力価を得ることは実現可能であることを示した。
オリジナルプロセスによって調製されたRBCの寿命:対照RBCの生存を、非免疫ウサギおよびアクリジン免疫ウサギ(それぞれ、亜群IAおよびIB、表21)において測定した。これらの亜群間でRBCの寿命に差が無かったため、データを、以下にグラフにより、4匹すべての動物を合わせて平均回収パーセントとして示す。対照RBCを与えた動物を、その他のすべての群に対する比較対象として使用した。
S−303処理RBCのさらなるFACScan解析
RBCをS−303(PIC−1)結合について試験するフローサイトメトリーのため、50μLの血液を1.2mLの0.9%生理食塩水中で3回洗浄し、次いで、0.75mL生理食塩水中におよそ4%ヘマトクリットまで再懸濁した。25μLのRBCを、1:100に希釈した抗アクリジンウサギ血清15μLと合わせた。30分間37℃でインキュベーション後、試料を上記のようにして3回洗浄した。次いで、RBCペレットを、0.1%ウシ血清アルブミン中1:64の希釈度で調製したFITC標識ヤギ抗ウサギ抗体(Caltag)50μL容量中に再懸濁した。試料を暗所で30分間37℃にてインキュベートした。さらに3回洗浄後、RBCを1mLのHaemaLine−2(Serono Diagnostics)中に再懸濁した。0.01%ヘマトクリットに希釈後、20,000事象を収集し、600nmでの蛍光について解析した。
Claims (29)
- 赤血球組成物を、病原体が存在する場合に該病原体を不活化するように処理するインビトロの方法であって、赤血球組成物と以下のもの:
(a)β−アラニン,N−(アクリジン−9−イル),2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステルである、病原体不活化化合物;
(b)グルタチオンであるクエンチャーであって、クエンチャー:病原体不活化化合物の比が20:1〜200:1である、クエンチャー;および
(c)適当な塩基であって、該赤血球組成物、該病原体不活化化合物、該クエンチャーおよび該塩基を含む得られる混合物において、該塩基を有しない混合物と比べて少なくとも25%、処理された赤血球組成物に対する抗病原体不活化化合物の抗体の結合のレベルを低下させるのに充分な量の適当な塩基であって、該塩基の量が、1〜2当量の塩基を含み、ここで、1当量が、該赤血球組成物、該病原体不活化化合物、該クエンチャーおよび該塩基を含む得られる混合物中のクエンチャーのモル量に相当するモル量を意味し、該グルタチオンが、該塩基で中和される、塩基
を混合することを含む、方法。 - 前記工程(c)における塩基の量が、前記赤血球組成物、前記病原体不活化化合物、前記クエンチャーおよび該塩基を含む得られる混合物のpHを、室温において6.7より高く増大させるのに充分である、請求項1に記載の方法。
- 前記赤血球組成物、前記病原体不活化化合物、前記クエンチャーおよび前記塩基を含む得られる混合物のpHが、該病原体不活化化合物と該赤血球組成物との混合の1時間以内に室温で達成される、請求項2に記載の方法。
- 前記塩基および前記クエンチャーの両方が前記赤血球組成物と、前記病原体不活化化合物と該赤血球組成物との混合前、該混合と同時、または該混合後30分以内に混合される、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記塩基および前記クエンチャーを、該塩基または該クエンチャーのいずれかと前記赤血球組成物と混合する前に互いに混合する、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 前記クエンチャーおよび前記塩基がともに、該クエンチャーを構成する塩基性の塩によって提供される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記塩基がNaOHである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記塩基が塩基性バッファーである、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記赤血球組成物、前記病原体不活化化合物、前記クエンチャーおよび前記塩基を含む得られる混合物中の該クエンチャーの濃度が2mMより高い、請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。
- 前記赤血球組成物、前記病原体不活化化合物、前記クエンチャーおよび前記塩基を含む得られる混合物中の該クエンチャーの濃度が2mMより高く、そして
得られる混合物の室温でのpHが7.0〜8.5の範囲内にある、
請求項1〜8のいずれか1項に記載の方法。 - (c)赤血球含有組成物のpHを、前記赤血球組成物、前記病原体不活化化合物、前記クエンチャーおよび前記塩基を含む得られる混合物の室温でのpHが7.0〜8.5の範囲内となるように調整する工程をさらに含む、請求項10に記載の方法。
- 前記赤血球含有組成物のpHが、該赤血球組成物への少なくとも1当量の塩基の添加によって調整され、ここで、1当量は、前記赤血球組成物、前記病原体不活化化合物、前記クエンチャーおよび前記塩基を含む得られる混合物中のクエンチャーのモル量に相当するモル量を意味する、請求項10に記載の方法。
- 前記クエンチャーが、前記赤血球組成物への該クエンチャーの添加前に少なくとも1当量の適当な塩基で中和され、該赤血球含有組成物のpHが、該中和されたクエンチャーの添加によって調整される、請求項10に記載の方法。
- 前記赤血球組成物、前記病原体不活化化合物、前記クエンチャーおよび前記塩基を含む得られる混合物中の該クエンチャーの濃度が4mM〜40mMの範囲内にある、請求項1〜13のいずれか1項に記載の方法。
- 前記クエンチャーがグルタチオン一ナトリウム塩である、請求項1に記載の方法。
- 前記得られる混合物中のグルタチオンの濃度が、5mM〜30mMであり、β−アラニン,N−(アクリジン−9−イル),2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステルの濃度が、0.05mM〜0.5mMである、請求項1に記載の方法。
- 前記得られる混合物中のグルタチオンの濃度が、5mM〜30mMであり、β−アラニン,N−(アクリジン−9−イル),2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステルの濃度が、0.1mM〜0.3mMである、請求項1に記載の方法。
- 前記クエンチャー:病原体不活化化合物のモル比が50:1〜200:1である、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記クエンチャーの濃度が、4mM〜40mMである、請求項1〜15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記クエンチャーの濃度が、5mM〜30mMであり、前記病原体不活化化合物の濃度が、0.05mM〜0.5mMである、請求項1に記載の方法。
- 前記クエンチャーの濃度が、5mM〜30mMであり、前記病原体不活化化合物の濃度が、0.1mM〜0.3mMである、請求項1に記載の方法。
- 前記処理が、前記赤血球組成物中の病原体汚染物質の少なくとも1logの不活化をもたらす、請求項1〜21のいずれか1項に記載の方法。
- 前記赤血球組成物、前記病原体不活化化合物、前記クエンチャーおよび前記塩基を含む、得られる混合物中の該病原体不活化化合物の濃度を低下させる最終工程をさらに含む、請求項1〜22のいずれか1項に記載の方法。
- 以下の順に、
(a)i)β−アラニン,N−(アクリジン−9−イル),2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステル、ii)中和グルタチオン、およびiii)赤血球含有組成物であって、病原体で汚染されている可能性がある赤血球組成物を提供すること;
(b)該中和グルタチオンを該赤血球含有組成物と混合すること;
(c)該中和グルタチオンと赤血球含有組成物との混合物を適切な時間枠インキュベートすること;および
(d)該β−アラニン,N−(アクリジン−9−イル),2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステルを、中和グルタチオンと赤血球含有組成物との混合物と混合すること
を含み、ここで、病原体は、該赤血球含有組成物中に存在する場合には、少なくとも1log不活化される、請求項1に記載の方法。 - (a)赤血球;
(b)β−アラニン,N−(アクリジン−9−イル),2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステルである、病原体不活化化合物;
(c)グルタチオンであるクエンチャーであって、該クエンチャーが2mMより高い濃度であり、クエンチャー:病原体不活化化合物の比が20:1〜200:1である、クエンチャー;および
(d)塩基であって、塩基の量が、1〜2当量の塩基を含み、ここで、1当量が、該組成物中のクエンチャーのモル量に相当するモル量を意味する、塩基
を含む組成物。 - β−アラニン,N−(アクリジン−9−イル),2−[ビス(2−クロロエチル)アミノ]エチルエステルである病原体不活化化合物、グルタチオンであるクエンチャー、および1〜2当量の塩基を含むキットであって、1当量は、該キット内のクエンチャーのモル量に相当するモル量を意味し、該グルタチオンが、該塩基で中和される、キット。
- 前記塩基が2当量の塩基を含み、ここで1当量とは、前記赤血球組成物、前記病原体不活化化合物、前記クエンチャーおよび前記塩基を含む得られる混合物中のクエンチャーのモル量に相当するモル量を意味する、請求項1〜5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記赤血球組成物、前記病原体不活化化合物、前記クエンチャーおよび前記塩基を含む得られる混合物における、処理された赤血球組成物に対する抗病原体不活化化合物抗体結合のレベルが、該塩基を有しない混合物と比べて少なくとも50%低下される、請求項1に記載の方法。
- 前記赤血球組成物、前記病原体不活化化合物、前記クエンチャーおよび前記塩基を含む得られる混合物における、処理された赤血球組成物に対する抗病原体不活化化合物抗体結合のレベルが、該塩基を有しない混合物と比べて少なくとも75%低下される、請求項1に記載の方法。
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