CN103961731A - 用于红细胞灭活过程的改进的猝灭方法 - Google Patents

用于红细胞灭活过程的改进的猝灭方法 Download PDF

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Abstract

提供了在用灭活病原体的化合物处理红细胞组合物时对不需要的副反应进行改进的猝灭的方法，所述的灭活病原体的化合物包含核酸结合配体和为或能够形成亲电子基团的官能团。在某些实施方案中，这种改进的方法使用了适当高浓度的猝灭剂，该猝灭剂包含能够与亲电子基团共价反应的亲核官能团，其中所述的处理在所需pH范围内进行以便提供充分猝灭。用于这些方法中的某些的优选的猝灭剂包括巯基，诸如谷胱甘肽，它们已经被适当中和，以便加入到红细胞组合物中在6.8-8.5的理想pH范围产生所需的猝灭剂浓度。

Description

用于红细胞灭活过程的改进的猝灭方法
本申请是申请号为200580045313.8、申请日为2005年10月31日、发明名称为“用于红细胞灭活过程的改进的猝灭方法”的中国发明专利申请的分案申请。
相关申请的交叉参考
本申请要求2004年10月29日提交的美国临时申请顺序号60／623，177的优先权利益，将该文献完整地引入本文作为参考。
发明领域
本发明的领域涉及使用于处理血液制品的反应性亲电子化合物猝灭以使可能的病原体污染物灭活的方法。特别地，将亲核化合物，诸如硫醇类，用于使红细胞组合物中的反应性亲电子化合物猝灭。
发明背景
通过血液制品和其它生物材料传播疾病仍然是严重的健康问题。尽管在供血者筛选和血液检测方面已经取得了显著进展，但是诸如乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)和人免疫缺陷病毒(HIV)这类病毒在检测过程中因病毒或病毒抗体低水平而仍然可能逃脱血液制品中的检测。除病毒的危害外，目前还没有在指定用于输血的血液中用于检测非病毒微生物，诸如细菌或原生动物存在的足够的经许可的试验。迄今未知病原体可能在供血中很普遍并且呈现疾病传播的威胁的风险仍然存在，正如在识别HIV通过输血传播的风险前实际发生的。
已经将化学物质导入血液或血浆以便使病原体灭活，此后临床应用该血液制品。一般，对几乎没有或无红细胞内含物的血液制品而言，诸如血小板和血浆，使用光化学活化的化合物诸如补骨脂素。就含有红细胞的血液制品而言，已经研发了无需光活化的用于病原体灭活的化合物。这些化合物一般具有与病原体，更具体地说是与病原体核酸反应的亲电子基团。例如，美国专利US5,055,485中描述了使用芳基二醇环氧化物使细胞中的病毒和含有蛋白质的组合物失活。可以使用原位产生亲电子试剂的其它化合物。LoGrippo等评价了芥子CH3-N(CH2CH2Cl)2在病毒灭活中的应用。LoGrippo等，Proceedings ofthe Sixth Congress of the International Society of BloodTransfusion，Biblio theca Haema to logica(Hollander，ed.)，1958，pp.225-230。更有意义的是，美国专利US6,410,219和US5,691,132中描述了具有核酸靶向成分以及与该核酸反应的亲电子成分的化合物在使病原体灭活中的应用，将这些文献披露的内容引入本文作为参考。美国专利US6,514,987中描述了类似的化合物，其中该化合物中核酸靶向成分通过可水解连接基与反应性亲电子成分连接，将该文献披露的内容引入本文作为参考。美国专利US6,136,586和US6,617,157中描述了使用乙烯亚胺寡聚体和相关化合物使病原体灭活，将这些文献披露的内容引入本文作为参考。这些乙烯亚胺衍生的化合物一般具有提供反应性亲电子成分的氮丙啶基团和提供化合物的核酸靶向的多胺成分。一般类别的带有与核酸反应的亲电子或类似基团的靶向核酸的化合物用于使血液、血液制品和各种生物来源样品中的病原体灭活。
在一定程度上关注的是，尽管设计这些化合物与核酸特异性地反应，但是它们仍然可能与血液中的其它成分反应，诸如蛋白质或细胞膜。这些副反应是不利的，并且可能导致不良作用，诸如可以由免疫系统识别的蛋白质修饰和细胞膜改变。当反复使用这类经处理的血液制品时，它们可能使受血者对经处理的血液制品产生免疫反应。美国专利US6,709,810中描述了使这类灭活病原体的化合物猝灭以便降低任何这类不良副反应的水平的方法，将该文献披露的内容引入本文作为参考。然而，尽管这类方法显著地减少了不需要的副反应，但是进一步减少不需要的免疫反应是需要的。使用这类化合物处理红细胞的近期临床试验已经显示出了这类不良事件的可能性。在V.I.Techno logies，Inc.于2003年11月17日发表的新闻稿中，介绍了他们的用于红细胞的I NACTINETM病原体减少系统(Pathogen Reduct ionSystem)的III期长期试验因涉及对INACTINETM处理的红细胞的抗体反应而被停止。在Cerus Corporation于2003年9月4日发表的新闻稿中，指出了在两位研究患者对用S-303处理的红细胞产生抗体后，他们自愿停止其病原体灭活的红细胞程序的III期试验，所述S-303是用于其红细胞病原体灭活系统的化合物。一般使用间接抗球蛋白试验检测这类抗体，所述的间接抗球蛋白试验可以在没有对实际抗体性质或同质性的详细了解的情况下进行。这类测定法本领域技术人员众所周知的且非常灵敏，从而能够检测低至每个RBC中500个分子。检测这些抗体的最常用方法是通过将患者血清与为输注用候选物的RBC制品混合并且检测凝集反应是否发生来进行的。这称作RBC单位与患者血清的交叉配血。通过包含与抗体交叉反应的抗-人免疫球蛋白提供更高的灵敏度。这提高了RBC表面上IgG或其它抗体之间的反应性。最终，可以通过在反应介质中包含增强抗体彼此之间的on-rate的增效剂而获得甚至更高的检测灵敏度(AABB手册第13版)。例如，这类测定法比例如流式细胞计量测定法更为灵敏并且甚至可以在其它方法显示不存在任何潜在抗体时观察到。这类现象发生在临床试验中并且常常与可能具有较高的产生这些抗体的趋势的特殊患者群体相关。
因此，对进一步减少通过亲电子基团与病原体反应的灭活病原体的化合物的不需要的亲电子副反应，同时保持灭活病原体的化合物灭活有害病原体的能力的方法存在需求。具体地，对使红细胞中灭活病原体的化合物猝灭的改进方法存在需求。需要这种新方法显著降低因用灭活病原体的化合物处理而对红细胞产生不良免疫反应的风险。
发明概述
本发明提供了在使灭活病原体的化合物与红细胞的不需要的副反应猝灭的改善条件下用灭活病原体的化合物处理红细胞组合物的各种方法。在某些实施方案中，通过调节pH和／或增加猝灭剂浓度来改善猝灭。
本发明在一个方面中提供了处理红细胞组合物的方法，包括：a)提供：i)包含反应性亲电子基团的灭活病原体的化合物；ii)包含巯基的猝灭剂；和iii)包含红细胞的组合物，其中存在红细胞组合物被病原体污染的可能性；和b)混合灭活病原体的化合物和猝灭剂与包含红细胞的组合物，其中所得混合物在适合于使灭活病原体的化合物与红细胞结合充分猝灭的pH范围内。在另一个实施方案中，该方法包括步骤c)调节包含红细胞的组合物的pH。在某些实施方案中，该处理导致至少1log，也可以至少2log或至少3log的病原体污染物灭活。在某些实施方案中，红细胞组合物含有白细胞，并且所述的处理导致至少1log，也可以至少2log或至少3log的白细胞灭活。在某些实施方案中，将猝灭剂与包含红细胞的组合物混合，此后添加灭活病原体的化合物。在某些实施方案中，调节包含红细胞的组合物的pH，此后与灭活病原体的化合物和猝灭剂混合。在某些实施方案中，在添加灭活病原体的化合物后调节包含红细胞的组合物的pH。在某些实施方案中，通过添加猝灭剂调节包含红细胞的组合物的pH。在某些实施方案中，一旦混合了所有三种成分，猝灭剂、灭活病原体的化合物和包含红细胞的组合物的混合物在室温下就具有约6.8-8.5的pH，也可具有约7.0-8.5，也可具有约7.2-8.5或约7.2-8.0的pH。在某些实施方案中，将猝灭剂、灭活病原体的化合物和包含红细胞的组合物的混合物孵育适当的时间间隔，诸如约30分钟-48小时，也可以约2-24小时，也可以约8-24小时。在另一个实施方案中，所述的孵育在约1℃-30℃，也可以在约18℃-25℃的温度范围内或在约室温下。在某些实施方案中，一旦混合了所有三种成分，则猝灭剂的浓度在约2mM-约40mM，也可以在约4mM-约40mM，也可以在约4mM-约30mM，也可以在约5mM-约30mM，也可以约10mM-约30mM的范围内，也可以为约20mM。在某些实施方案中，一旦混合了所有三种成分，则一旦混合了三种成分，则猝灭剂在所得混合物中的浓度大于约2mM，至少约4mM，至少约5mM，至少约10mM或至少约15mM。在某些实施方案中，一旦混合了三种成分，则猝灭剂与灭活病原体的化合物的摩尔比为约10∶1-约400∶1，也可以为约10∶1-约200∶1，也可以为约20∶1-约200∶1，也可以为约50∶1-约200∶1，也可以为约100∶1。在某些实施方案中，猝灭剂包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。在某些实施方案中，猝灭剂为包含至少一种半胱氨酸或半胱氨酸衍生物的肽。在一个优选的实施方案中，猝灭剂为谷胱甘肽。在某些实施方案中，中和猝灭剂并且添加中和的猝灭剂以调节红细胞组合物的pH。在某些实施方案中，中和的猝灭剂包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。在某些实施方案中，中和的猝灭剂为包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物的肽。在某些实施方案中，灭活病原体的化合物包含核酸结合基团。在某些实施方案中，核酸结合基团为嵌入剂，诸如吖啶基。在某些实施方案中，核酸结合基团为多胺。在某些实施方案中，灭活病原体的化合物包含通过可水解键与反应性亲电子基团连接的核酸结合基团。在某些实施方案中，核酸结合基团为嵌入剂且反应性亲电子基团选自芥子、芥子中间体和芥子等效物。在一个优选的实施方案中，猝灭剂为中和的谷胱甘肽，其中用约2当量的合适的碱中和质子化的谷胱甘肽，并且灭活病原体的化合物为β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯。
本发明在一个另外的方面中提供了处理红细胞组合物的方法，包括：a)提供：i)包含核酸结合基团和反应性亲电子基团的灭活病原体的化合物；ii)包含半胱氨酸或合适的半胱氨酸衍生物的猝灭剂；和iii)包含红细胞的组合物，其中存在红细胞组合物被病原体污染的可能性；b)混合猝灭剂与包含红细胞的组合物，其中添加猝灭剂将该混合物的pH调节至合适的pH；和c)混合灭活病原体的化合物与包含红细胞的组合物，其中病原体如果存在于包含红细胞的组合物中，那么它被灭活至少1log，也可以至少2log，也可以至少3log。在某些实施方案中，所述的红细胞组合物含有白细胞，并且所述的处理导致至少1log，也可以至少2log或至少3log的白细胞被灭活。在某些实施方案中，将猝灭剂在与灭活病原体的化合物混合前与包含红细胞的组合物混合。在某些实施方案中，将猝灭剂在与灭活病原体的化合物混合后与包含红细胞的组合物混合。在某些实施方案中，将猝灭剂和灭活病原体的化合物与包含红细胞的组合物同时或基本上同时，诸如彼此在约1分钟内混合。在某些实施方案中，将猝灭剂和包含红细胞的组合物的混合物孵育约1-30分钟，此后与灭活病原体的化合物混合。在某些实施方案中，所述的孵育在约1℃-30℃，也可以在约18℃-25℃温度范围内或在约室温下。在某些实施方案中，将猝灭剂、灭活病原体的化合物和包含红细胞的组合物的混合物孵育适当的时间间隔，诸如约30分钟-48小时，也可以约2-24小时，也可以约8-24小时。在另一个实施方案中，所述的孵育在约1℃-30℃，也可以在约18℃-25℃的温度范围内或在约室温下。在某些实施方案中，在将猝灭剂与包含红细胞的组合物混合时适当的pH在约6.8-8.5，也可以在约7.0-8.5，也可以在约7.2-8.5或约7.2-8.0的范围内，如在室温下测定的。在某些实施方案中，一旦混合了所有三种成分，那么该混合物的pH在约6.8-8.5，也可以在约7.0-8.5，也可以在约7.2-8.5或约7.2-8.0的范围内，如在室温下测定的。在某些实施方案中，一旦混合了所有三种成分，那么猝灭剂的浓度在约2mM-约40mM，也可以在约4mM-约40mM，也可以在约4mM-约30mM，也可以在约5mM-约30mM，也可以在约10mM-约30mM的范围内，也可以为约20mM。在某些实施方案中，一旦混合了所有三种成分，那么猝灭剂与灭活病原体的化合物的摩尔比为约10∶1-约400∶1，也可以为约10∶1-约200∶1，也可以为约20∶1-约200∶1，也可以为约50∶1-约200∶1，也可以为约100∶1。在某些实施方案中，猝灭剂为包含至少一种半胱氨酸或半胱氨酸衍生物的肽。在一个优选的实施方案中，猝灭剂为谷胱甘肽。在某些实施方案中，猝灭剂被中和或呈对组合物的pH进行所需调节的形式。在某些实施方案中，通过向猝灭剂中添加1当量，也可以约为2当量的碱中和猝灭剂。在某些实施方案中，猝灭剂呈中和的形式，诸如合适的盐。在某些实施方案中，猝灭剂被中和。在某些实施方案中，中和的猝灭剂为包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物的中和的肽。在一个优选的实施方案中，
中和的肽为中和的谷胱甘肽。在某些实施方案中，灭活病原体的化合物的核酸结合基团为嵌入剂，诸如吖啶基。在某些实施方案中，核酸结合基团为多胺。在某些实施方案中，核酸结合基团通过可水解的键与反应性亲电子基团连接。在某些实施方案中，核酸结合基团为嵌入剂并且反应性亲电子基团选自芥子、芥子中间体和芥子等效物。在某些实施方案中，核酸结合基团为多胺并且亲电子基团为吖啶基或吖丙啶基。在一个优选的实施方案中，猝灭剂为中和的谷胱甘肽并且灭活病原体的化合物为β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯。
本发明在另一个方面中提供了处理红细胞组合物的方法，包括下列顺序的步骤：a)提供：i)β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯；ii)中和的谷胱甘肽；和iii)包含红细胞的组合物，其中存在红细胞组合物被病原体污染的可能性；b)将中和的谷胱甘肽与包含红细胞的组合物混合；c)将该混合物孵育合适的时间间隔；和d)将β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯与中和的谷胱甘肽和包含红细胞的组合物的混合物混合，其中如果病原体存在于包含红细胞的组合物中，那么它被灭活至少1log，也可以至少2log，也可以至少3log。在某些实施方案中，所述的红细胞组合物包含白细胞，并且所述的处理导致至少1log，也可以至少2log或至少3log的白细胞被灭活。在某些实施方案中，将中和的谷胱甘肽作为合适的盐提供。在某些实施方案中，通过用约1当量的碱，也可以约2当量的碱中和质子化的谷胱甘肽提供中和的谷胱甘肽。在某些实施方案中，中和的谷胱甘肽在溶解状态中。在某些实施方案中，中和的谷胱甘肽为固体，诸如冻干粉和合适的盐。在某些实施方案中，用于孵育与谷胱甘肽混合的红细胞的时间间隔为约1-30分钟，也可以为约5-20分钟，其中孵育在约1℃-30℃，也可以在约18℃-25℃范围内的温度下或在约室温下进行。在某些实施方案中，在与β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯混合后，将该混合物孵育合适的时间间隔，诸如约30分钟-48小时，也可以约2-24小时，也可以约8-24小时。在另一个实施方案中，孵育在约1℃-30℃，也可以在约18℃-25℃的温度范围内或在约室温下进行。在某些实施方案中，在混合β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯时，谷胱甘肽在混合物中的浓度在约5mM-约30mM的范围内，并且β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯的浓度在约0.05mM-约0.5mM的范围内。在某些实施方案中，在混合β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯时，谷胱甘肽在混合物中的浓度在约10mM-约30mM的范围内，并且β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯的浓度在约0.05mM-约0.3mM的范围内。在某些实施方案中，在混合β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯时，谷胱甘肽在混合物中的浓度为约20mM，并且β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯的浓度为约0.2mM。
本发明在另一个方面中提供了处理红细胞组合物的方法，包括：(a)提供：i)包含为或形成反应性亲电子基团的官能团的灭活病原体的化合物；ii)包含巯基的猝灭剂，其中巯基能够与灭活病原体的化合物的反应性亲电子基团反应；和iii)包含红细胞的组网，其中存在红细胞组合物被病原体污染的可能性；和(b)将灭活病原体的化合物和猝灭剂与包含红细胞的组合物混合，其中猝灭剂在所得混合物中的浓度大于2mM，其中所得混合物在室温下的pH在约6.7或6.7以上的范围内。在某些实施方案中，所得混合物在室温下的pH在约7.0-8.5的范围内。
本发明在另一个方面中提供了处理红细胞组合物的方法，包括：将下列成分与红细胞组合物混合：(a)灭活病原体的化合物，其中灭活病原体的化合物包含核酸结合配体和为或形成能够与核酸反应的亲电子基团的官能团；(b)包含巯基的猝灭剂，其中巯基能够与亲电子基团反应；和(c)与不含碱的混合物相比，降低包含红细胞组合物、灭活病原体的化合物、猝灭剂和碱的混合物中灭活病原体的化合物与红细胞的不需要的反应水平的足量的合适的碱。在某些实施方案中，灭活病原体的化合物与红细胞的不需要的反应是灭活病原体的化合物对红细胞表面的修饰。
本发明在另一个实施方案中提供了处理红细胞组合物的方法，包括将下列成分与红细胞组合物混合：(a)灭活病原体的化合物，其中灭活病原体的化合物包含核酸结合配体和为或形成能够与核酸反应的亲电子基团的官能团；(b)包含巯基的猝灭剂，其中巯基能够与亲电子基团反应；和(c)与不含碱的混合物相比，增加包含红细胞组合物、灭活病原体的化合物、猝灭剂和碱的混合物的pH的足量的合适的碱。在某些实施方案中(例如在某些实施方案中，其中猝灭剂为酸性化合物)，加入足量的合适的碱以便将混合物的pH增加到至少约为不含碱或猝灭剂的混合物的pH。
本发明在一个另外的方面中提供了在有猝灭剂存在下在用灭活病原体的化合物处理包含红细胞的组合物的过程中改善灭活病原体的化合物与红细胞不需要的副反应的猝灭的方法，其中猝灭剂包含巯基，并且其中灭活病原体的化合物包含为或形成与猝灭剂的巯基反应的亲电子试剂的官能团，其中该方法包括增加包含红细胞组合物、灭活病原体的化合物和猝灭剂的反应混合物的pH。在某些实施方案中，该方法进一步包括增加猝灭剂在反应混合物中的浓度的步骤。在某些实施方案中，灭活病原体的化合物与红细胞的不需要的反应为灭活病原体的化合物对红细胞表面的修饰。
在上述方法各自的某些实施方案以及本文所述的其它方法中，该方法进一步包括降低灭活病原体的化合物在混合物中的浓度的步骤。
在上述方法各自的某些实施方案以及本文所述的其它方法中，在离体条件下处理所述的红细胞组合物。在上述方法各自的某些实施方案以及本文所述的其它方法中，在体外处理所述的红细胞组合物。
还提供了通过上述各方法以及本文所述的其它方法生产的红细胞组合物。
本发明在另一个方面中提供了试剂盒，诸如用于处理红细胞组合物的一次性试剂盒。这些试剂盒可以用于人工操作、自动化操作或人工和自动化操作。在某些实施方案中，该试剂盒包括：包含反应性亲电子基团的灭活病原体的化合物，包括其任何盐；包含巯基的猝灭剂，包括其任何盐；和1或2当量的合适的碱，其中当量意指与试剂盒中猝灭剂的摩尔量相当的摩尔量。在一个优选的实施方案中，该试剂盒包含：β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯，包括其任何盐；谷胱甘肽，包括其任何盐；和1或2当量的合适的碱，其中当量意指与试剂盒中谷胱甘肽的摩尔量相当的摩尔量。在某些实施方案中，β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯或其任何盐为固体形式。在某些实施方案中，β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯或其任何盐为溶液形式。在某些实施方案中，谷胱甘肽或任何盐为固体形式。在某些实施方案中，谷胱甘肽或任何盐为溶液形式。在某些实施方案中，1或2当量的碱为固体形式。在某些实施方案中，1或2当量的碱为溶液形式。在某些实施方案中，谷胱甘肽或其任何盐和1或2当量的碱作为混合物存在。在某些实施方案中，谷胱甘肽或其任何盐与1或2当量的碱的混合物为均匀性混合物。在某些实施方案中，该均匀性混合物为固体形式。在某些实施方案中，该均匀性混合物为溶液形式。在某些实施方案中，所述的试剂盒包含用于溶解为固体形式的β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯或其任何盐的溶液。在某些实施方案中，所述的试剂盒包含用于溶解为固体形式的谷胱甘肽或其任何盐的溶液。在某些实施方案中，所述的试剂盒包含用于溶解为固体形式的1或2当量的碱的溶液。在某些实施方案中，所述的试剂盒包含用于溶解为固体形式的猝灭剂或其任何盐和1或2当量的碱的溶液。在某些实施方案中，所述的试剂盒包含用于溶解猝灭剂和1或2当量的碱的混合物的溶液。在某些实施方案中，试剂盒中的固体或溶液进一步包括可接受的赋形剂、辅助剂、稀释剂或稳定剂。
本发明在一个方面中提供了例如用于处理红细胞组合物以灭活病原体的试剂盒，包含：包含核酸结合配体和为或形成亲电子基团的官能团的灭活病原体的化合物(包括其任何盐)；包含巯基的猝灭剂(包括其任何盐)；和至少约1当量的碱，其中当量意指与试剂盒中猝灭剂的摩尔量相等的摩尔量。在某些实施方案中，该试剂盒包含约1或约2当量的合适的碱。
本发明在一个方面中提供了用于处理红细胞组合物以灭活病原体的试剂盒，包含：核酸结合配体和为或形成亲电子基团(例如(PIC-1)的官能团，包括其任何盐；和包含巯基的中和的猝灭剂(例如中和的谷胱甘肽)，包括其任何盐。
本发明在另一个方面中包括一种组合物，其包含：红细胞；包含反应性亲电子基团的灭活病原体的化合物；和包含能够与亲电子基团反应的亲核基团的猝灭剂，其中猝灭剂的浓度在约2mM-40mM，也可以在约4mM-40mM，也可以在约5mM-30mM，或在约10mM-30mM的范围内，并且该组合物的pH在约6.8-8.5，也可以在约7.0-8.5，也可以在约7.2-8.5或约7.2-8.0的范围内。在某些实施方案中，灭活病原体的化合物包含核酸结合配体和包含巯基的猝灭剂。优选的实施方案包括一种组合物，其包含红细胞。β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯和浓度范围在约2mM-40mM的谷胱甘肽，其中该组合物的pH在约6.8-8.5，也可以在约7.0-8.5，也可以在约7.2-8.5，或约7.2-8.0的范围内。在某些实施方案中，该组合物的红细胞比容在约1-100％，也可以在约10-90％，也可以在约35-80％，或在约40-70％的范围内。在某些实施方案中，β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯的浓度在约0.05mM-4mM，也可以在约0.05mM-2mM，也可以在约0.05mM-0.5mM，或在约0.1mM-0.3mM的范围内，并且谷胱甘肽的浓度在约5mM-40mM，也可以在约5mM-30mM，或在约10mM-30mM的范围内。
本发明在一个另外的方面中提供了一种组合物，其包含：红细胞；包含核酸结合配体和反应性亲电子基团的灭活病原体的化合物；和包含能够与亲电子基团反应的巯基的猝灭剂，其中猝灭剂的浓度大于2mM，并且该组合物的pH为约6.7或6.7以上。在某些实施方案中，该组合物具有的pH在约6.8-8.5，约7.0-8.5，约7.2-8.5和约7.2-8.0的范围内。例如，在某些实施方案中，该组合物的pH在约7.0-8.5的范围内。在某些实施方案中，该组合物包含至少约4mM的猝灭剂或至少约10mM的猝灭剂。例如，在某些实施方案中，猝灭剂的浓度在约4-40mM或约10-30mM的范围内。例如，在某些实施方案中，猝灭剂的浓度在约4mM-40mM的范围内，并且该组合物的pH在约6.8-8.5的范围内。在某些实施方案中，猝灭剂的浓度为至少约4mM，并且该组合物的pH在约6.8-8.5的范围内。
本发明还提供了另外的方面。
附图简述
附图1表示在实施例121期反复输血过程中血清抗体滴度。为清楚起见，仅对KLH-吖啶免疫接种显示了误差棒。RBC输注组的误差棒约为±1。
附图2表示实施例122期的4A、4B和6组中原始S-220RBC的寿命。通过将早期时间点外推至在第0天时的100％确定寿命。1组动物接受生物素化对照RBC。为清楚起见，仅对4A、4B和6组显示了误差棒。
附图3表示实施例122期的2A、2B和5组中原始S-303(PIC-1)RBC的寿命。通过将早期时间点外推至在第0天时的100％确定寿命。1组动物接受生物素化对照RBC。为清楚起见，仅对2B和5组显示了误差棒。
附图4表示实施例122期的4A、4B和6组中修饰的S-220RBC的寿命。通过将早期时间点外推至在第0天时的100％确定寿命。1组动物接受生物素化对照RBC。为清楚起见，仅对1、4B和6组显示了误差棒。
附图5表示实施例122期的2A、2B和5组中修饰的S-303RBC的寿命。通过将早期时间点外推至在第0天时的100％确定寿命。1组动物接受生物素化对照RBC。为清楚起见，仅对2B和5组显示了误差棒。
附图6表示S-303处理的RBC的FACScan分析结果。
发明详述
例如，美国专利US6,709,810中提供了使红细胞组合物中反应性亲电子种类猝灭的现存方法。作为这些方法的非限制性实例，将谷胱甘肽与β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯组合使用(下文也可以称作″灭活病原体的化合物I″、″PIC-1″或″S-303″)。一般将谷胱甘肽以酸性形式分离(即质子化)，并且这种形式被用于这些已知的方法。因而，当提及已知的猝灭方法时，谷胱甘肽被称作酸性或质子化的谷胱甘肽。本文所用的用于灭活红细胞中的病原体的标准条件包括用2mM质子化的谷胱甘肽和0.2mM PIC-1处理红细胞组合物。可以增加质子化谷胱甘肽的浓度，在对不需要的副反应提供较好猝灭的尝试中，使猝灭剂与灭活病原体的化合物之比较高。然而，在质子化谷胱甘肽浓度增加时，红细胞组合物的总体pH因谷胱甘肽的酸性而下降。已经确定这种较低的pH导致不足以猝灭灭活病原体的化合物与红细胞，特别是红细胞表面的反应。还已确定所述的标准条件无法对红细胞表面的修饰提供足够的猝灭。因而，本发明提供了改进的猝灭方法，其中将包含灭活病原体的化合物和猝灭剂的红细胞组合物的pH调节至适当范围以便提供改善的猝灭，其中所用猝灭剂的浓度为大于2mM，诸如为约5-40mM，也可以为约10-30mM，或为约20mM。例如，提供了这样的方法，使得在将包含红细胞的组合物与灭活病原体的化合物和猝灭剂混合时，pH在适当的范围内，诸如pH在约6.8-8.5，也可以在约7.0-8.5，也可以在约7.2-8.5，或在约7.2-8.0的范围内，其中猝灭剂的浓度在约5-40mM的范围内。
在本文所述方法各自的某些实施方案中，减少灭活病原体的化合物与红细胞的不理想的(本文也称作″不需要的″)副反应。在某些实施方案中，减少的不理想的副反应为灭活病原体的化合物对红细胞表面的修饰。在某些实施方案中，将副反应的水平降低至少约5％，至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％或至少约90％。例如，可以通过下列步骤验证副反应的减少(与第二种方法相比)：测定对灭活病原体的化合物具有特异性的抗体与处理的红细胞结合的量和／或测定处理的红细胞在体内的寿命，并且将这些测定值与通过第二种不同方法处理的红细胞进行比较。例如，在改进方法的某些实施方案中，与未改进的方法相比，将抗-灭活病原体的化合物的抗体与处理的红细胞结合的水平降低至少约10％，至少约25％，至少约50％，至少约75％或至少约90％。
在本文所述本发明各方面各自的某些实施方案中，适合于对灭活病原体的化合物与红细胞结合提供足够猝灭的pH范围为与用2mM质子化谷胱甘肽和0.2mM PIC-1对红细胞组合物进行的标准处理相比对灭活病原体的化合物与红细胞结合提供改善的猝灭的pH范围。在某些实施方案中，根据处理的红细胞与通过标准方法处理的那些红细胞相比的免疫原性降低验证猝灭的改善。在某些实施方案中，根据对灭活病原体的化合物具有特异性的抗体与与处理的红细胞在体外结合的量的减少和／或根据处理的红细胞在体内的寿命增加验证指定方法与标准方法相比提供的猝灭的改善。
本发明在一个方面中提供了处理红细胞组合物的方法，包括：a)提供：i)包含反应性亲电子基团的灭活病原体的化合物；ii)包含巯基的猝灭剂；和iii)包含红细胞的组合物，其中存在红细胞组合物被病原体污染的可能性；和b)将灭活病原体的化合物和猝灭剂与包含红细胞的组合物混合，其中所得混合物在适合于使灭活病原体的化合物与红细胞结合充分猝灭的pH范围。在某些实施方案中，该方法进一步包括调节包含红细胞的组合物的pH的步骤。在某些实施方案中，在与灭活病原体的化合物和猝灭剂混合前调节包含红细胞的组合物的pH。在某些实施方案中，通过添加猝灭剂调节包含红细胞的组合物的pH。在某些实施方案中，在向红细胞组合物中添加猝灭剂前用至少约1当量的合适的碱中和猝灭剂。在某些实施方案中，在添加灭活病原体的化合物前将猝灭剂与包含红细胞的组合物混合。在所述方法的某些实施方案中，在室温下合适的pH范围为约6.8-8.5，约7.0-8.5，约7.2-8.5，或约7.2-8.0。在某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度在约2mM-约40mM的范围内。在某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度在约4mM-约40mM，约10-约30mM的范围内。在所述方法的某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度为至少约4mM或至少约10mM。在某些实施方案中，用于所述方法的猝灭剂包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。例如，在某些实施方案中，猝灭剂为谷胱甘肽。在某些实施方案中，反应性亲电子基团选自芥子、芥子中间体和芥子等效物。在某些实施方案中，灭活病原体的化合物为β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯。在某些实施方案中，所述的处理导致红细胞组合物中至少1log的病原体污染物的灭活。
本发明在另一个方面中提供了处理红细胞组合物的方法，包括：(a)提供：i)包含为或形成反应性亲电子基团的官能团的灭活病原体的化合物；ii)包含巯基的猝灭剂，其中巯基能够与灭活病原体的化合物的反应性亲电子基团反应；和iii)包含红细胞的组合物，其中存在红细胞组合物被病原体污染的可能性；和(b)将灭活病原体的化合物和猝灭剂与包含红细胞的组合物混合，其中猝灭剂在所得混合物中的浓度大于2mM，其中所得混合物在室温下的pH在约6.7或6.7以上的范围内。在某些实施方案中，所得混合物在室温下具有的pH为约7.0或7.0以上，或为7.2或7.2以上。在某些实施方案中，所得混合物的pH在约6.8-8.5，约7.0-8.5，约7.2-8.5或约7.2-8.0的范围内。例如，在某些实施方案中，所得混合物在室温下的pH在约7.0-8.5的范围内。在某些实施方案中，该方法进一步包括下列步骤：(c)调节包含红细胞的组合物的pH，使得所得混合物在室温下的pH在指定的范围内(例如在约7.0-8.5的范围内)。在某些实施方案中，通过将至少约0.5当量，至少约1当量或至少约2当量的碱添加到红细胞组合物中调节包含红细胞的组合物的pH，其中当量意指与混合物中猝灭剂的摩尔量相等的摩尔量。在某些实施方案中，在向红细胞组合物中添加猝灭剂前用至少约1当量的合适的碱中和猝灭剂并且通过添加中和的猝灭剂调节包含红细胞的组合物的pH。在某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度为至少约4mM或至少约10mM。在某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度为约4-40mM或约10-30mM。例如，在某些实施方案中，猝灭剂的浓度为至少约4mM，其中所述混合物在室温下具有的pH在约6.8-8.5的范围内。在某些实施方案中，猝灭剂的浓度在约4-40mM内并且在室温下的pH在约7.2-8.5的范围内。在某些实施方案中，在向红细胞组合物中添加猝灭剂前用至少约1当量的合适的碱中和猝灭剂。在某些实施方案中，在添加灭活病原体的化合物前将猝灭剂与包含红细胞的组合物混合。在某些实施方案中，猝灭剂化合物为酸性。在某些实施方案中，猝灭剂包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。例如，在某些实施方案中，猝灭剂为谷胱甘肽。在某些实施方案中，官能团选自芥子、芥子中间体和芥子等效物。在某些实施方案中，灭活病原体的化合物为β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯。在某些实施方案中，所述的处理导致红细胞组合物中至少1log的病原体污染物的灭活。在某些实施方案中，所述的处理导致红细胞组合物中至少1log，至少约2log或至少约3log的病原体污染物的灭活。
本发明在另一个方面中提供了处理红细胞组合物的方法，包括将下列成分与红细胞组合物混合：(a)灭活病原体的化合物，其中灭活病原体的化合物包含核酸结合配体和为或形成能够与核酸反应的亲电子基团的官能团；(b)包含巯基的猝灭剂，其中巯基能够与亲电子基团反应；和(c)与不含碱的混合物(即除未加入(c)的碱外包含与第一种混合物相同成分的第二种混合物)相比，降低包含红细胞组合物、灭活病原体的化合物、猝灭剂和碱的混合物中灭活病原体的化合物与红细胞的不需要的副反应水平的足量合适的碱。在某些实施方案中，灭活病原体的化合物与红细胞的不需要的反应为灭活病原体的化合物对红细胞表面的修饰。在某些实施方案中，在将灭活病原体的化合物与红细胞组合物合并之前，同时或之后不超过约1小时，约30分钟，约20分钟，约10分钟，约5分钟，约2分钟或约1分钟将碱和猝灭剂与红细胞组合物合并。在某些实施方案中，在将灭活病原体的化合物与红细胞组合物混合前将碱和猝灭剂与红细胞组合物混合。在某些实施方案中，在将碱或猝灭剂与红细胞组合物混合前将碱和猝灭剂彼此混合。在某些实施方案中，包含猝灭剂的碱式盐不但提供猝灭剂而且提供碱。在某些实施方案中，碱为NaOH。在某些实施方案中，碱为碱性缓冲剂。在某些实施方案中，加入至少约0.5当量，至少约1.0或至少约2当量的碱，其中当量意指与混合物中猝灭剂的摩尔量相等的摩尔量。在某些实施方案中，碱包含至少约1当量的碱。在所述方法的某些实施方案中，在室温下合适的pH范围为约6.8-8.5，约7.0-8.5，约7.2-8.5或约7.2-8.0。在某些实施方案中，所得混合物在室温下具有的pH为约7.0-8.5。在某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度为大于2mM，大于约4mM或大于约10mM。在某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度在约2mM-约40mM的范围内。在某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度在约4mM-约40mM，约10-约30mM的范围内。例如，在某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度在约10mM-30mM的范围内。在某些实施方案中，猝灭剂为酸性的。在某些实施方案中，猝灭剂包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物，诸如谷胱甘肽。在某些实施方案中，官能团选自芥子、芥子中间体和芥子等效物。例如，在某些实施方案中，权利要求14所述的方法中灭活病原体的化合物为β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯。在某些实施方案中，所述的处理导致红细胞组合物中至少1log的病原体污染物的灭活。
本发明在另一个实施方案中提供了处理红细胞组合物的方法，包括将下列成分与红细胞组合物混合：(a)灭活病原体的化合物，其中灭活病原体的化合物包含核酸结合配体和为或形成能够与核酸反应的亲电子基团的官能团；(b)包含巯基的猝灭剂，其中巯基能够与亲电子基团反应；和(c)与不含碱的混合物(即除未向混合物中加入(c)的碱外包含与第一种混合物相同成分的第二种混合物)相比，增加包含红细胞组合物、灭活病原体的化合物、猝灭剂和碱的混合物的pH的足量合适的碱。在某些实施方案(例如在某些实施方案中，其中猝灭剂为酸性化合物)中，加入足量的合适的碱以便将混合物的pH增加到至少约为不含碱或猝灭剂的混合物的pH。在某些实施方案中，在将灭活病原体的化合物与红细胞组合物合并之前，同时或之后不超过约1小时，约30分钟，约20分钟，约10分钟，约5分钟，约2分钟或约1分钟将碱和猝灭剂与红细胞组合物合并。在某些实施方案中，在将灭活病原体的化合物与红细胞组合物混合前将碱和猝灭剂与红细胞组合物混合。在某些实施方案中，在将碱或猝灭剂与红细胞组合物混合前将碱和猝灭剂彼此混合。在某些实施方案中，包含猝灭剂的碱式盐不但提供猝灭剂而且提供碱。在某些实施方案中，碱为NaOH。在某些实施方案中，碱为碱性缓冲剂。在某些实施方案中，加入至少约0.5当量，至少约1.0或至少约2当量的碱，其中当量意指与混合物中猝灭剂的摩尔量相等的摩尔量。在某些实施方案中，碱包含至少约1当量的碱。在所述方法的某些实施方案中，在室温下合适的pH范围为约6.8-8.5，约7.0-8.5，约7.2-8.5或约7.2-8.0。在某些实施方案中，所得混合物在室温下具有的pH为约7.0-8.5。在某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度为大于2mM，大于约4mM或大于约10mM。在某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度在约2mM-约40mM的范围内。在某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度在约4mM-约40mM，约10-约30mM的范围内。例如，在某些实施方案中，猝灭剂在所得混合物中的浓度在约10mM-30mM的范围内。在某些实施方案中，猝灭剂为酸性的。在某些实施方案中，猝灭剂包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物，诸如谷胱甘肽。在某些实施方案中，官能团选自芥子、芥子中间体和芥子等效物。例如，在某些实施方案中，权利要求14所述的方法中灭活病原体的化合物为β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯。在某些实施方案中，所述的处理导致红细胞组合物中至少1log的病原体污染物的灭活。
本发明在一个另外的方面中提供了在有猝灭剂存在下在用灭活病原体的化合物处理包含红细胞的组合物过程中改善灭活病原体的化合物与红细胞的不需要的副反应的猝灭的方法，其中猝灭剂包含巯基，并且其中灭活病原体的化合物包含为或形成与猝灭剂的巯基反应的亲电子试剂的官能团，其中该方法包括增加包含红细胞组合物、灭活病原体的化合物和猝灭剂的反应混合物的pH。在某些实施方案中，该方法进一步包括增加猝灭剂在反应混合物中的浓度的步骤。在某些实施方案中，猝灭剂为酸性的。在某些实施方案中，灭活病原体的化合物与红细胞的不需要的反应为灭活病原体的化合物对红细胞表面的修饰。
本发明在另一个方面中提供了处理红细胞组合物的方法，包括按照下列次序的步骤：a)提供：i)β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯；ii)中和的谷胱甘肽；和iii)包含红细胞的组合物，其中存在红细胞组合物被病原体污染的可能性；b)将中和的谷胱甘肽与包含红细胞的组合物混合；c)将该混合物孵育适当的时间间隔；和d)将β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯与中和的谷胱甘肽和包含红细胞的组合物的混合物混合，其中病原体如果存在于包含红细胞的组合物中，那么被灭活至少1log。在某些实施方案中，中和的谷胱甘肽包含加入了至少约1当量的碱的谷胱甘肽，其中当量意指与猝灭剂的摩尔量相等的摩尔量。在某些实施方案中，中和的谷胱甘肽包含加入了约2当量的碱的谷胱甘肽(例如谷胱甘肽的游离酸)。
还提供了通过本文所述方法各自生产的红细胞组合物。在某些实施方案中，与通过包括用灭活病原体的化合物处理的其它方法生产的红细胞相比，红细胞组合物包含灭活病原体的化合物对红细胞表面的降低水平的修饰。在某些实施方案中，通过所述方法的处理生产的红细胞组合物包含灭活病原体的化合物的降解产物(例如猝灭剂与灭活病原体的化合物的反应产物)。在某些实施方案中，与通过包括用灭活病原体的化合物处理的另一种方法生产的红细胞组合物相比，通过本文所述方法的处理生产的红细胞组合物包含处理完成后减少量的包含反应性亲电子基团的灭活病原体的化合物。在某些实施方案中，包含反应性亲电子基团的灭活病原体的化合物在组合物中的量与通过包括灭活病原体的化合物的另一种方法(例如不向反应混合物中加入猝灭剂和／或碱的方法或在较低pH下处理)处理的组合物相比已经减少了约10％，约25％，约50％，约75％，约90％，约95％或约99％。
本发明在一个另外的方面中提供了包含红细胞的组合物、包含核酸结合配体和反应性亲电子基团的灭活病原体的化合物和包含能够与亲电子基团反应的巯基的猝灭剂，其中猝灭剂的浓度为大于2mM，并且组合物的pH在约6.7或6.7以上。在某些实施方案中，组合物具有的pH范围在约6.8-8.5，约7.0-8.5和约7.2-8.0的范围内。在某些实施方案中，组合物包含至少约4mM的猝灭剂或至少约10mM的猝灭剂。在某些实施方案中，猝灭剂的浓度在约4-40mM或约10-30mM的范围内。例如，在某些实施方案中，猝灭剂的浓度在约4mM-40mM的范围内，并且组合物的pH在约6.8-8.5的范围内。在某些实施方案中，猝灭剂的浓度为至少约4mM，并且组合物的pH在约6.8-8.5的范围内。
就包含氨基酸取代基的本文的序列而言，正如本领域技术人员显而易见的，每个氨基酸取代基都可以独立地选择。本发明还提供了包含氨基酸取代基的序列，其中一个或多个氨基酸取代基被消除。
本发明方法中待灭活的病原体污染物包括能够使人、其它哺乳动物或脊椎动物产生疾病的任何含核酸的病原体。病原体可以为单细胞的或多细胞的。病原体的实例为使人、其它哺乳动物或脊椎动物产生疾病的细菌、病毒、原生动物、真菌、酵母、霉菌和支原体。病原体的遗传物质可以为DNA或RNA并且该遗传物质可以为单链或双链核酸形式。表1中列举了病毒的实例，但它们并不以任何方式来限定本发明。
表1.病毒的非限制性实例
除灭活可能的病原体污染物外，本发明的方法还可以灭活可能存在于红细胞组合物中的白细胞。白细胞减少(Leukoreduction)法优选用于从打算用于输注的红细胞组合物中将大部分白细胞除去，因为它们可以在受血者中导致不需要的免疫反应。然而，并非所有的血液均需要进行白细胞减少或白细胞减少法无法除去所有的白细胞。因此，通过本发明的方法使任何残留的白细胞灭活可以进一步降低这类免疫反应的风险。
本发明的方法包括灭活病原体的化合物和猝灭剂的离体应用。离体应用包括在活的人、哺乳动物或脊椎动物体外使用所述化合物处理红细胞组合物，其中处理的生物材料打算用于活的人体、哺乳动物或脊椎动物体内。例如，从人体内取血和将化合物导入该血液中以便灭活病原体被定义为化合物的离体应用，只要该血液打算用于再导入该人体或另一人体中。将人体血液再导入该人体或另一人体中就是血液的体内应用，这与化合物的离体应用相反。如果化合物在被重新导入人体内时仍然存在于血液中，那么它除了离体应用外，还可以将该化合物导入体内。本发明的某些实施方案包括猝灭剂的离体应用，其中红细胞组合物打算用于体内应用。在某些情况中，一定水平的猝灭剂仍然存在于红细胞组合物中，使得也可以将该猝灭剂导入体内。物质或化合物的体外应用包括该物质或化合物在活的人体、哺乳动物或脊椎动物体外的应用，其中不打算将该物质或化合物再导入活的人体、哺乳动物或脊椎动物体内。体外应用的实例可以为对红细胞样品中的成分的诊断分析。本发明的方法可以应用于红细胞组合物的体外应用，因为对红细胞或其它成分的修饰可能实现对血液样品中的成分的体外分析。因此，本发明的方法可以为这类体外样品的操作安全性提供对可能在其他方面干扰样品的诊断性测试的样品修饰的足够的猝灭。
本发明的红细胞组合物包括，但不限于任何包含红细胞的血液制品，其中该血液制品可提供或经加工可提供适合于人体应用，诸如输血用的红细胞。红细胞组合物包括：例如全血和红细胞浓缩物，诸如压紧的红细胞。可以将红细胞组合物描述为血细胞比容，即红细胞在组合物中浓度的测量值。红细胞组合物可以具有的血细胞比容在约1-100％，更可能的是在约10-90％的范围内，也可以在约35-80％或约40-70％。这类红细胞组合物可以包括化学物质，诸如灭活病原体的化合物和猝灭剂。它们还可以包括缓冲液和其它溶液，诸如红细胞添加剂溶液，包括盐或缓冲溶液。可以如本文披露的处理任何接触或导入活的人体、哺乳动物或脊椎动物体内的红细胞组合物，其中这类接触因污染病原体而携带传播疾病的风险。
病原体的灭活包括使物质中的病原体不能繁殖。将灭活表示为能够繁殖的剩余病原体分数的负对数。因此，如果一定浓度的化合物使物质中90％的病原体不能繁殖，那么10％或十分之一(0.1)的病原体仍然能够繁殖。0.1的负对数为1，并且认为该浓度的化合物已经灭活了现存的为1log的病原体。或者，认为化合物在该浓度下具有1log的灭活作用或减少作用。灭活几乎1％或0.1％的病原体相应于在该化合物浓度下病原体分别减少2log或3log。测定物质，诸如包含红细胞的组合物中特定病原体水平的方法为众所周知的并且实施例中提供了这类方法的实例。
在本文所述的方法和组合物各自的某些实施方案中，处理红细胞组合物会导致红细胞组合物中至少约1log，至少约2log或至少约3log的病原体污染物(如果存在)灭活。在某些实施方案中，病原体为细菌，诸如表皮葡萄球菌(Staphy lococcus epidermidis)、粘质沙雷氏菌(Serra tia marcescens)或小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersiniaenterocolit ica)。在某些其它实施方案中，病原体为病毒，诸如疱疹性口腔炎病毒。在其它实施方案中，处理红细胞组合物确实导致组合物中至少约1log，至少约2log或至少约3log的病原体污染物灭活。
通过使红细胞组合物中的病原体接触灭活病原体的化合物对红细胞组合物中的病原体进行灭活。可以通过本发明的方法猝灭的灭活病原体的化合物包括包含为或能够形成和已经例如在原位形成反应性基团，诸如亲电子基团的官能团的化合物。本发明的灭活病原体的化合物无需光活化而成为反应性的。例如，官能团可以为芥子基、芥子基中间体、芥子基等效物、环氧化物、甲醛或甲醛合成子。这类官能团能够在原位形成反应性基团，诸如亲电子吖丙啶、吖丙啶硫杂环丙烷或硫杂环丙烷(thiiranium)离子。芥子基可以为单-或双-(卤代乙基)胺基团或一(卤代乙基)硫化物基团。芥子等效物为通过与芥子类似的机制，例如，通过形成反应性中间体，诸如吖丙啶和吖丙啶基或硫杂环丙烷和硫杂环丙烷基团反应的基团。实例包括吖丙啶衍生物、单或双-(甲磺酰基乙基)胺基团、一-(甲磺酰基乙基)硫化物基团、单或双-(甲苯磺酰基乙基)胺基团和一-(甲苯磺酰基乙基)硫化物基团。甲醛合成子为分解成甲醛的任何化合物，包括羟基胺，诸如羟甲基甘氨酸。灭活病原体的化合物的反应性基团能够与病原体的核酸，例如与核酸上的亲核基团反应。该反应性基团还能够与猝灭剂的亲核基团反应。灭活病原体的化合物还可以包括使该化合物靶向至核酸，诸如锚定部分的成分。锚定部分包含能够与核酸生物聚合物，诸如DNA或RNA非共价结合的部分，并且也称作核酸结合配体、核酸结合基团或核酸结合部分。这类化合物的实例描述在美国专利US5,691,132、6,410,219、6,136,586、6,617,157和6,709,810中，将这些文献各自引入本文作为参考。如美国专利US6,514,987中所述，可以通过本发明的方法猝灭的另一类灭活病原体的化合物包含通过可水解连接基与核酸结合基团连接的上述反应性基团，将该文献引入本文作为参考。灭活病原体的化合物的锚定部分对核酸具有亲和力。这种亲和力可能是因非共价结合核酸的几种方式中的任一种所致，包括，但不限于嵌入、小沟结合、大沟结合、静电结合(即磷酸骨架结合)和序列特异性结合。这类核酸结合部分的具体实例可以在上述专利文献中找到。
在本文所述方法、组合物和试剂盒各自的某些实施方案中，灭活病原体的化合物包含为或形成与选择的猝灭剂的亲核体反应的反应性亲电子基团的官能团。在某些实施方案中，灭活病原体的基团包含核酸结合配体和为或形成亲电子基团的官能团。
用于本发明的合适的灭活病原体的化合物的具体实例为β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯(或者在本文中也称作″PIC-1″或″S-303″)，其结构如下，包括其盐。
在某些实施方案中，灭活病原体的化合物，诸如PIC-1在与红细胞组合物和猝灭剂的混合物中的浓度在约0.05mM-4mM，约0.05mM-2mM，约0.05mM-0.5mM或约0.1mM-0.3mM的范围内。在某些实施方案中，一旦将猝灭剂和灭活病原体的化合物这两种成分与红细胞组合物混合，则猝灭剂与灭活病原体的化合物的摩尔比为约10∶1-约400∶1，也可以为约10∶1-约200∶1，也可以为约20∶1-约200∶1，也可以为约50∶1-约200∶1的范围，也可以为约100∶1。
打算将用于本发明方法的猝灭剂用来减少用于灭活原体的反应性亲电子种类的不需要的副反应。合适的猝灭剂包含能够与灭活病原体的化合物的亲电子基团反应的亲核基团并且详细描述在美国专利US6,709,810中，将该文献完整地引入本文作为参考。猝灭剂能够显著减少红细胞组合物中不需要的副反应，同时使得灭活病原体的化合物能够充分灭活可能污染红细胞组合物的病原体。本发明的改进方法在最佳减少不需要的副反应以及充分灭活病原体的条件下提供了有效量的猝灭剂以及有效量的灭活病原体的化合物。可以减少各种不需要的副反应，诸如与蛋白质和红细胞成分的反应。在某些实施方案中，猝灭剂提供了最佳减少的红细胞修饰，诸如IgG与红细胞结合或灭活病原体的化合物与红细胞结合。尽管本发明的方法包括离体处理红细胞组合物，但是某些猝灭剂在导入个体时仍然保留在组合物中。因而，本发明的猝灭剂需要适合于输注。合适的猝灭剂包括，但不限于包含巯基的化合物，诸如包含氨基酸半胱氨酸或半胱氨酸的合适的衍生物的猝灭剂，诸如N-乙酰半胱氨酸。这类猝灭剂的实例包括半胱氨酸和包含至少一个半胱氨酸的肽类，诸如谷胱甘肽。在某些实施方案中，合适的猝灭剂包含可以在使用或不使用额外化学物质或添加的酶的情况下在原位形成巯基的半胱氨酸衍生物，诸如S-乙酰半胱氨酸或其它合适的巯基衍生的半胱氨酸前体药物或包含S-乙酰半胱氨酸或其它合适的巯基衍生的半胱氨酸的前体药物的肽类。半胱氨酸的合适的衍生物为那些包含或能够在原位形成能够与灭活病原体的化合物的亲电子基团反应的半胱氨酰巯基的化合物。
一般而言，因灭活病原体的化合物靶向至核酸，所以足量的灭活病原体的化合物能够透入病原体并且与病原体核酸反应，此后被猝灭。然而，仍然保留在胞外环境中的灭活病原体的化合物不足以被猝灭而减少不需要的副反应。因此，本发明方法提供了有效量的猝灭剂与有效量的灭活病原体的化合物的组合。在某些实施方案中，猝灭剂能够猝灭红细胞组合物的胞外环境中不需要的副反应，但无法大量进入细胞，诸如红细胞，病毒和细菌。因而，可以提供有效量的灭活病原体的化合物，使得足够的灭活病原体的化合物透入病原体，此后它在胞外环境中被猝灭。在某些实施方案中，猝灭剂包含半胱氨酸或合适的半胱氨酸衍生物并且无法大量透入病原体，诸如病毒或细菌。这类猝灭剂包括肽类，其中至少一个氨基酸为半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、S-乙酰半胱氨酸或其它合适的半胱氨酸衍生物。在某些实施方案中，猝灭剂包括包含半胱氨酸的肽(例如2-10个氨基酸)。
在某些实施方案中，猝灭剂为2-10个氨基酸的肽，其中氨基酸中至少一个为半胱氨酸，N-乙酰半胱氨酸、S-乙酰半胱氨酸或其它合适的半胱氨酸衍生物。在某些实施方案中，猝灭剂为至少3个氨基酸的肽，诸如约3-10个氨基酸，也可以约为3-6个氨基酸，其中氨基酸中至少一个为半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、S-乙酰半胱氨酸或其它合适的半胱氨酸衍生物。在某些实施方案中，猝灭剂为至少3个氨基酸的肽，诸如约3-10个氨基酸，也可以约为3-6个氨基酸，其中氨基酸中至少一个为半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、S-乙酰半胱氨酸或其它合适的半胱氨酸衍生物，另外，其中氨基酸中的至少2个或至少3个为半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、S-乙酰半胱氨酸或其它合适的半胱氨酸衍生物。优选的猝灭剂为谷胱甘肽(也称作L-谷胱甘肽和γ-L-谷氨酰-L-半胱氨酰-甘氨酸)。
在某些实施方案中，猝灭剂为还原形式的谷胱甘肽。也可以使用谷胱甘肽二硫化物、谷胱甘肽的氧化形式，只要谷胱甘肽二硫化物在溶液添加到包含红细胞组合物的混合物中之前在溶液中被充分还原或在添加到包含红细胞组合物的混合物中之后被充分还原。
在某些实施方案中，猝灭剂为谷胱甘肽的衍生物，诸如谷胱甘肽一烷基酯或二烷基酯，其中烷基为带有1-10个碳原子的直链或支链基团。烷基的具体实例包括，但不限于甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、1-甲基丁基、己基、异己基、2-甲基戊基、1-乙基丁基、庚基、辛基、壬基和癸基。例如，谷胱甘肽衍生物的非限制性实例包括谷胱甘肽甲酯、谷胱甘肽一乙酯和谷胱甘肽一异丙酯。在某些实施方案中，使用谷胱甘肽氧化的二乙酯(GSSG-(甘氨酰)-二乙酯)。在某些实施方案中，在添加到红细胞组合物中之后水解谷胱甘肽的硫酯以形成巯基。
当然在某些实施方案中，提供了游离酸或碱形式的猝灭剂，而在其它实施方案中，提供了盐形式的猝灭剂。如果猝灭剂为盐的形式，那么该盐优选为药学上可接受的盐。化合物的药学上可接受的盐(水-或油-溶性或可分散的产物形式)包括例如由无机或有机酸或碱形成的常规的无毒性盐或季铵盐。这类酸加成盐的实例包括乙酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、盐酸盐、氢溴酸盐、氢碘酸盐、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、扑酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、甲苯磺酸盐和十一酸盐。碱式盐包括：铵盐；碱金属盐，诸如钠和钾盐；碱土金属盐，诸如钙和镁盐；与有机碱形成的盐，诸如二环己基胺盐、N-甲基-D-葡糖胺和与氨基酸，诸如精氨酸、赖氨酸等形成的盐。此外，含碱性氮的基团可以被如下这类试剂季铵化：诸如烷基卤，诸如甲基、乙基、丙基和丁基的氯化物、溴化物和碘化物；二烷基硫酸盐，如二甲基、二乙基、二丁基和二戊基硫酸盐；长链卤化物，诸如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂酰基的氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基卤，如苄基溴和苯乙基溴等。其它药学上可接受的盐包括硫酸盐、乙醇酸盐和硫酸盐。
例如，在某些实施方案中，猝灭剂为由谷胱甘肽形成的药学上可接受的盐的形式。在某些实施方案中，猝灭剂为由谷胱甘肽和一种或多种阳离子，诸如钠、铝、钙、锂、镁、锌或四甲基铵形成的药学上可接受的盐的形式。在某些实施方案中，猝灭剂为谷胱甘肽(还原的)并且以谷胱甘肽一钠盐的形式提供(例如可购自Biomedica Foscama，Italy)。在某些其它实施方案中，提供了谷胱甘肽盐酸盐形式的谷胱甘肽(还原的)。在某些其它实施方案中，提供了谷胱甘肽(还原的)二钠盐形式的谷胱甘肽。在其它实施方案中，使用谷胱甘肽一烷基酯硫酸盐。在某些实施方案中，提供了谷胱甘肽氧化的二钠盐形式的谷胱甘肽。
在某些实施方案中，将纯净形式的猝灭剂与红细胞组合物和／或灭活病原体的化合物混合。在某些实施方案中，与红细胞组合物和／或灭活病原体的化合物混合的猝灭剂为水溶液形式。在某些实施方案中，猝灭剂为在水溶液中的中和的猝灭剂。例如，在某些实施方案中，猝灭剂可以为在加入了至少1当量(例如约1或2当量)碱的水溶液中的酸性化合物。
本发明的猝灭方法包括在一定条件下将红细胞组合物与灭活病原体的化合物和猝灭剂合并，所述的条件为，在将所述组合物与灭活病原体的化合物和猝灭剂混合时，所得组合物的pH在适当的范围以便提供充分的病原体灭活，使不需要的副反应，诸如红细胞的修饰减少得以改善。这种改进的方法包括对猝灭方法而言可能是重要的三个特征。第一个特征在于巯基或其它合适的亲核基团。第二个特征在于调节溶液的pH。仅通过适当调节溶液的pH就可能提供一定水平的猝灭。因而，本发明的猝灭剂给包含红细胞的组合物提供一定的缓冲能力，其中缓冲能力自身提供了改善的猝灭。例如，使用半胱氨酸类似物，诸如甲硫氨酸作为猝灭剂，当适当修饰以便提供红细胞组合物中合适的pH改变时，将导致一定水平的对灭活病原体的化合物与红细胞结合的猝灭。由于甲硫氨酸上的硫原子并非亲核的，所以甲硫氨酸除了提供必要的溶液pH无法提供任何猝灭。因此，pH调节和巯基的组合提供了对本发明的猝灭方法的进一步改善。对某些实施方案中提供改善的猝灭而言可能重要的第三个特征在于基本上不会透入病原体，诸如病毒和细菌内部的优选的猝灭剂。这类猝灭剂提供了在发生有害反应，诸如结合红细胞表面的胞外环境中的充分猝灭，但一旦它透入病原体内部不会额外猝灭灭活病原体的化合物。
就调节红细胞组合物pH的特征而言，猝灭这类灭活病原体的化合物的现存方法不能实现所得混合物pH的重要性。尽管在已知的方法中证实较高量的猝灭剂可提供足够的病原体灭活，但是在使用较高量的猝灭剂，诸如质子化的谷胱甘肽时，这些方法不足以描述对红细胞修饰的作用。作为本文显示的实例，较高量猝灭剂，诸如酸性谷胱甘肽的应用不足以降低红细胞修饰的水平。因为谷胱甘肽为酸性的，所以较高水平使得红细胞组合物的pH达到不可接受的低水平，此时对灭活病原体的化合物的不需要的副反应的猝灭是无效的。因此，本发明的一个方面包括在加入灭活病原体的化合物和猝灭剂时，确保将红细胞组合物的pH维持在适当水平。在某些实施方案中，在将灭活病原体的化合物和猝灭剂与红细胞组合物混合时，该混合物的pH在约6.8-8.5，也可以在约7.0-8.5，也可以在约7.2-8.5或在约7.2-8.0的范围内。尽管红细胞组合物的pH可以随时间改变，但是当将猝灭剂加入到红细胞组合物中时，无论它是否已经含有灭活病原体的化合物，均需要pH在所需的范围内。本发明的方法包括将灭活病原体的化合物和猝灭剂加入到红细胞组合物中。在加入灭活病原体的化合物和猝灭剂时，所需pH范围是必不可少的，与将灭活病原体的化合物和／或猝灭剂加入到红细胞组合物中的顺序无关。换句话说，一旦混合了所有三种成分，则pH在所需的范围内。在某些实施方案中，在加入灭活病原体的化合物之前加入猝灭剂。在某些实施方案中，在加入猝灭剂之前加入灭活病原体的化合物。在某些实施方案中，基本上同时加入猝灭剂和灭活病原体的化合物。因此，加入灭活病原体的化合物和猝灭剂时意味着已经将猝灭剂和灭活病原体的化合物二者与红细胞组合物混合的时间点。可以通过几种方式获得所需的pH并且并不限于调节红细胞组合物的pH时或在某些实施方案中并不根据血液制品的天然pH显著调节所需的pH。例如，可以通过调节pH获得所需的红细胞组合物的pH。例如，可以在添加灭活病原体的化合物和猝灭剂前，通过添加合适的添加剂溶液，诸如缓冲溶液进行pH调节。在某些实施方案中，可以用合适的缓冲液将红细胞组合物洗涤一次或多次，此后将其悬浮于相同或其它合适的缓冲液中。或者，可以与添加灭活病原体的化合物、猝灭剂或它们两者同时调节红细胞组合物的pH。在某些实施方案中，与添加猝灭剂的同时调节pH。在一个优选的实施方案中，猝灭剂为中和的，以便添加中和的猝灭剂提供红细胞组合物中的所需的pH范围。作为实例，可以将中和谷胱甘肽用于进行必要的pH调节。因为谷胱甘肽包含谷氨酸，所以其质子化形式的pH为酸性的。不受理论约束，质子化谷胱甘肽的可能的中和如下列方案中所示：
因而，例如，可以通过添加2当量的碱对谷胱甘肽使用适当水平的中和以便提供猝灭剂，所述的猝灭剂在添加到红细胞组合物中时会提供对组合物必不可少的pH调节。适当的中和将取决于使用的猝灭剂。例如，当使用肽时，将取决于肽的氨基酸成分。在某些实施方案中，可以使用不明显影响红细胞组合物pH的猝灭剂。例如，包含半胱氨酸的肽的应用，该肽可以进一步包含一种或多种氨基酸，其导致天然分离的肽的溶液的pH更趋于中性。在某些实施方案中，这种肽进一步包括至少一种碱性氨基酸，诸如精氨酸或赖氨酸。
在本文所述方法的某些实施方案中，其中将碱与红细胞组合物连同灭活病原体的化合物和猝灭剂一起混合以便将该混合物的pH增加至所需水平和／或改善不需要的副反应的猝灭，所述的碱为碱式盐。可以将这种碱式盐先溶于水溶液，然后与红细胞组合物混合，或可以将其以固体形式直接加入到红细胞组合物中。在某些实施方案中，这种碱式盐包含猝灭剂并且给所述的混合物提供猝灭剂和碱。在某些实施方案中，用于该方法的碱为强碱，诸如NaOH。一般而言，将强碱，如NaOH先溶于水溶液，此后与红细胞组合物混合。在某些实施方案中，将强碱(溶液或固体形式)与猝灭剂混合，此后将猝灭剂与红细胞组合物混合。在某些实施方案中，所述的碱为碱性缓冲液(以足量加入并且具有合适的pKa以便使混合物达到所需的pH范围)。如果使用碱性缓冲液，那么在某些实施方案中，该缓冲液为药学上可接受的缓冲液。在某些实施方案中，该缓冲液具有可滴定的质子，其pKa在约7-8的范围内。可以用作碱性缓冲液的缓冲液实例包括，但不限于N-(2-羟乙基)-哌嗪-N′-2-乙磺酸(HEPES)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)和磷酸钠缓冲液。其它合适的碱性缓冲液易于由本领域普通技术人员确定。
在本文所述的方法和组合物各自的某些实施方案中，红细胞、猝灭剂、灭活病原体的化合物和任何添加的碱的混合物的pH大于约6.7，大于约7.0或大于约7.2。在本文所述的方法和组合物各自的某些实施方案中，红细胞、猝灭剂、灭活病原体的化合物和碱(如果添加的话)的混合物的pH在约6.8-8.5，也可以在约7.0-8.5，也可以在约7.2-8.5或在约7.2-8.0的范围内。在某些优选的实施方案中，所示pH为在室温下的pH。例如，在某些实施方案中，在有猝灭剂和任何添加的碱存在下用灭活病原体的化合物处理包含红细胞的组合物，其中所述混合物的pH在约7.2-约8.0的范围内。
在某些实施方案中，红细胞、猝灭剂和碱(如果将碱作为方法的组成部分加入)的混合物的pH在约6.8-8.5，约7.0-8.5，约7.2-8.5或约7.2-8.0的范围内，此后将灭活病原体的化合物与红细胞组合物混合。在某些其它实施方案中，在混合灭活病原体的化合物与包含红细胞的组合物的同时或约1小时内，约30分钟内，约20分钟内，约10分钟内，约5分钟内或约2分钟内达到所需的pH。在调节pH的那些方法的某些实施方案中，在混合灭活病原体的化合物与包含红细胞的组合物的同时或约1小时内，约30分钟内，约20分钟内，约10分钟内，约5分钟内或约2分钟内将pH调节至所需的pH范围。在猝灭剂为谷胱甘肽且灭活病原体的化合物为PIC-1的那些实施方案中，优选将包含红细胞的组合物和猝灭剂的混合物的pH调节至所需的pH范围(例如pH7.2-8.0)，此后将PI C-1与红细胞组合物混合。
在某些实施方案中，所得最终组合物的pH并不一定是对起始红细胞组合物的pH进行了调节。例如，红细胞组合物可以具有6.8-8.5的所需范围的pH，并且该组合物的pH在添加猝灭剂和随后加入灭活病原体的化合物时不会显著改变。在这类实施方案中，猝灭剂自然提供了所需的pH或被中和而由此提供了所需的pH。添加高量的猝灭剂，诸如约5mM-约40mM与所得pH在所需范围内的组合是重要的。例如，使用这类浓度的谷胱甘肽的已知方法尚未与本发明的所需pH联用。因此，就肽类而言，不考虑肽猝灭剂，可以根据需要将其有效中和以便在加入到红细胞组合物中时提供合适的pH范围，并且可以进一步选择以便在所需pH范围内提供适当量的缓冲。因而，中和的猝灭剂意指根据需要用酸或碱适当滴定猝灭剂，以便在添加到红细胞组合物中时，所得混合物具有对不需要的副反应提供良好猝灭的pH，诸如pH在约6.8-8.5，也可以在约7.0-8.5，也可以在约7.2-8.5或在约7.2-8.0的范围内。在某些实施方案中，将天然分离的肽适当中和，即不需要添加酸或碱而在最终混合物中提供所需的pH。此外，优选的猝灭剂提供将pH维持在所需范围内达猝灭不需要的副反应所必不可少的时间的缓冲能力。
在本文所述的方法和组合物各自的某些实施方案中，猝灭剂为中和的。如果将足量的碱与猝灭剂合并，使得在包括包含红细胞的组合物、灭活病原体的化合物和猝灭剂的混合物中灭活病原体的化合物与红细胞之间不需要的副反应猝灭得以改善，那么认为猝灭剂被碱″中和″。″中和的猝灭剂″不一定具有中性pH。在某些实施方案中，如果猝灭剂酸性极强，那么中和的猝灭剂的pH仍然可以低于7.0。在某些实施方案中，中和的猝灭剂的溶液的pH可以大于7.0。在某些实施方案中，中和的猝灭剂的溶液的pH可检测地高于添加碱之前猝灭剂的pH。在某些实施方案中，使用至少约0.25当量，至少约0.5当量，至少约0.75当量，至少约1当量或至少约2当量的碱中和猝灭剂。在某些实施方案中，使用约1-约2当量的碱中和猝灭剂。在某些实施方案中，使用约1当量的碱中和猝灭剂。在其它实施方案中，使用约2当量的碱中和猝灭剂。例如，在本发明的某些实施方案中，使用约2当量的合适的碱，诸如氢氧化钠中和谷胱甘肽。在这种情况中，质子化谷胱甘肽溶液具有的pH约为3，而使用2当量氢氧化钠中和的溶液具有的pH约为9.5。可以适当调节包含至少一个半胱氨酸的任何合适的肽猝灭剂，以便在添加到红细胞组合物中时提供所需的pH。在某些实施方案中，除提供进行了适当pH调节或中和的猝灭剂外，优选的猝灭剂不能大量进入病原体，使得它们最佳地猝灭胞外环境中的不需要的反应，而一旦灭活病原体的化合物透入病原体的内部，则不会干扰病原体灭活。
在本文所述的方法各自的某些实施方案中，猝灭剂为酸性化合物。在某些实施方案中，提供游离酸形式的猝灭剂。在某些实施方案中，猝灭剂为酸性的并且加入至少约1当量的碱以便中和该猝灭剂。在某些情况中，包含这种中和的猝灭剂的溶液可以为碱性的，中性的乃至仍然是酸性的。在某些实施方案中，加入约1当量的碱以便中和猝灭剂。在某些实施方案中，加入约2当量的碱。在某些实施方案中，猝灭剂为酸性的并且使用约1-约2当量的碱以便中和该猝灭剂。在某些实施方案中，使用约1或约2当量的碱。
在某些实施方案中，在加入到红细胞组合物和／或灭活病原体的化合物之前中和猝灭剂。在其它实施方案中，在将猝灭剂与红细胞组合物和／或灭活病原体的化合物合并后中和猝灭剂。
在某些实施方案中，猝灭剂为谷胱甘肽并且以谷胱甘肽一钠盐的形式提供，且使用约1当量的碱进行中和。在某些其它实施方案中，猝灭剂为谷胱甘肽并且谷胱甘肽盐酸盐的形式提供，且使用约2当量的碱进行中和。
在某些实施方案中，猝灭剂在包含红细胞组合物、猝灭剂、灭活病原体的化合物和任何添加的碱的混合物中的浓度大于2mM，大于约4mM或大于约10mM。在某些实施方案中，猝灭剂在该混合物中的浓度在约2mM-100mM，约2mM-40mM，约4mM-40mM，约5mM-40mM，约5mM-30mM或约10mM-30mM的范围内。在某些实施方案中，猝灭剂在该混合物中的浓度约为20mM。在本文所述的方法和组合物各自的某些实施方案中，猝灭剂在所述混合物中的浓度大于2mM，大于约4mM或大于约10mM，并且红细胞、猝灭剂和灭活病原体的化合物的混合物的pH大于约6.7，大于约7.0或大于约7.2。在某些实施方案中，猝灭剂在所述混合物中的浓度在约2mM-40mM，约4mM-40mM，约5mM-40mM，约5mM-30mM或约10mM-30mM的范围内，并且红细胞、猝灭剂和灭活病原体的化合物的混合物的pH在约6.8-8.5，也可以在约7.0-8.5，也可以在约7.2-8.5或在约7.2-8.0的范围内。在本文所述的方法和组合物各自的某些实施方案中，猝灭剂在所述混合物中的浓度大于2mM，大于约4mM或大于约10mM，并且红细胞、猝灭剂和灭活病原体的化合物的混合物的pH在约6.8-8.5，也可以在约7.0-8.5，也可以在约7.2-8.5或在约7.2-8.0的范围内。在某些实施方案中，猝灭剂(例如谷胱甘肽)在所述混合物中的浓度在约4mM-约40mM的范围内，并且该混合物的pH在约7.2-8.0的范围内。在某些实施方案中，猝灭剂在所述混合物中的浓度在约10mM-约30mM的范围内，并且该混合物的pH在约6.8-8.5的范围内。
在一个优选的实施方案中，猝灭剂为中和的谷胱甘肽。谷胱甘肽具有许多能够使其特别可用作猝灭剂的特性。它通常存在于所有细胞类型中。认为它不能诸如经穿过细菌和有脂包膜病毒的细胞膜或脂外壳或经穿过无包膜病毒的病毒壳体而被动透入病原体。在pH7下，加载谷胱甘肽并且在没有主动转运存在下，它无法穿透脂双层至任何显著的程度。这一结果与灭活有脂包膜的病毒，诸如HIV和VSV基本上不受谷胱甘肽的影响，包括使用大于2mM的中和的谷胱甘肽浓度的结果相一致。谷胱甘肽的应用对灭活小肠结肠炎耶尔森氏菌、表皮葡萄球菌和粘质沙雷氏菌具有一定作用。然而，可以通过使用有效量的中和的谷胱甘肽和灭活病原体的化合物控制这种作用。因而，提供了优选的猝灭方法，其中病毒或细菌病原体对红细胞组合物的污染被灭活至少2log，优选至少3log。在某些实施方案中，表皮葡萄球菌可以被灭活达至少3log，也可以约4log或约5log，并且VSV可以被灭活达至少4log，也可以约5l og或约6l og。此外，灭活为使用2mM酸性谷胱甘肽和0.2mM PIC-1对红细胞组合物进行标准处理的灭活的约3log，也可以约2log，优选约1log以内。在某些实施方案中，使用PIC-1对表皮葡萄球菌的灭活为使用2mM酸性谷胱甘肽和0.2mMPIC-1灭活的类似组合物的表皮葡萄球菌的约3log，也可以在约2log或约1log以内。在某些实施方案中，使用PIC-1灭活VSV为使用2mM酸性谷胱甘肽和0.2mM PIC-1灭活的类似组合物的VSV的约2log或约1log以内或基本上与之相等。谷胱甘肽还与体外红细胞贮存相容并且所得红细胞组合物适合于导入体内。
中和谷胱甘肽和其它猝灭剂的适当方法对本领域普通技术人员而言显而易见。在某些实施方案中，使用氢氧化钠中和猝灭剂。在某些实施方案中，首先将NaOH固体颗粒溶于水以便产生该碱的浓溶液，诸如1N，5N，10N或20N NaOH溶液。在某些实施方案中，在将猝灭剂加入到所述混合物之前，同时或之后将适量的该NaOH溶液加入到猝灭剂中。或者，在将猝灭剂加入到所述混合物前将NaOH加入到红细胞组合物或灭活病原体的化合物或它们两者的组合中。
可以在将灭活病原体的化合物加入到红细胞组合物之前，同时或之后将用于本文所述方法的猝灭剂和／或添加的碱(或中和的猝灭剂)与红细胞组合物混合。如果在将灭活病原体的溶液与红细胞组合物混合后将猝灭剂和碱(或中和的猝灭剂)与红细胞组合物混合，那么优选在灭活病原体的化合物与红细胞发生大量副反应前将猝灭剂和／或碱(或中和的猝灭剂)加入到红细胞组合物中，使得可以实现对不需要的副反应充分猝灭。在某些实施方案中，在将灭活病原体的化合物与红细胞组合物混合后约1小时内，约30分钟内，约20分钟内，约10分钟内，约5分钟内，约2分钟内或约1分钟内将猝灭剂和／或碱(或中和的猝灭剂)与红细胞组合物混合。在某些实施方案中，在将灭活病原体的化合物与红细胞组合物混合前将猝灭剂和／或碱(或中和的猝灭剂)与红细胞组合物混合。例如，在将中和的谷胱甘肽和PIC-1用于该方法的某些实施方案中，在将PIC-1与红细胞组合物混合之前、同时或之后约10分钟内将中和的谷胱甘肽与红细胞混合。
在某些实施方案中，在将灭活病原体的化合物与红细胞组合物混合前将猝灭剂和／或碱(或中和的猝灭剂)与红细胞组合物混合。
在本文所述的方法各自的某些实施方案中，在添加灭活病原体的化合物前将猝灭剂和碱(或中和的猝灭剂)与红细胞组合物一起孵育适当的时间间隔，诸如约30分钟-48小时，也可以约2-24小时，也可以约8-24小时。在某些其它实施方案中，这种孵育在约1℃-30℃，也可以在约18℃-25℃范围内的温度，或在约室温下进行。
在本文所述的方法各自的某些实施方案中，将灭活病原体的化合物与红细胞组合物一起在有猝灭剂和添加的碱(或中和的猝灭剂)存在下孵育适当的时间间隔，诸如约30分钟-48小时，也可以约2-24小时，也可以约8-24小时。在某些其它实施方案中，这种孵育在约1℃-30℃，也可以在约18℃-25℃范围内的温度或在约室温下进行。
除如上所述比较log灭活外，还可以通过几种其它方法评价改进的猝灭方法的功效。可以通过在红细胞的功能和处理的红细胞与免疫系统，诸如与抗体的反应性这两方面评价红细胞组合物的修饰来评估猝灭方法。如果打算将处理的红细胞组合物用于人体应用，诸如输注，那么猝灭方法应该基本上不损害红细胞功能。可以通过本领域已知的用于测试红细胞功能的方法测定基本上对红细胞功能无损害作用。例如，可以测定指示剂，诸如胞内ATP(腺苷5，-三磷酸)、胞内2，3-DPG(2，3-二磷酸甘油)或胞外钾的水平，并且与未处理的对照品比较。另外，可以测定溶血、胞内和胞外pH、血细胞比容、血红蛋白、渗透脆性、葡萄糖消耗和乳酸产生。可以将本发明改进的方法与2mM酸性谷胱甘肽与0.2mM PIC-1组合的标准条件以及使用递增的谷胱甘肽的条件进行比较，其中如美国专利US6,709,810中所述，已知的方法使用酸性谷胱甘肽。尽管在本发明的方法中增加谷胱甘肽浓度可以导致相同病原体的灭活水平稍有降低，但是仍然可以获得足够水平的灭活，并且改善的红细胞修饰的减少，同时维持足够的红细胞功能，导致总体较好的结果。
用于测定ATP、2，3-DPG、葡萄糖、血红蛋白、溶血和钾的方法在本领域中是可以得到的。例如，参见Davey等Trans fus ion，32∶525-528(1992)，将该文献引入本文作为参考。用于确定红细胞功能的方法还描述在下列文献中：Greenwalt等Vox Sang，58：94-99(1990)；Hogman等Vox Sang，65：271-278(1993)；和Beutler等Blood，Vol.59(1982)，将这些文献披露的内容引入本文作为参考。例如，使用Sigma ATP试剂盒或2，3-DPG试剂盒(Sigma，St.Louis，Mo.)测定胞内ATP和胞内2，3-DPG。按照Sigma procedure No.366-UV的操作步骤使用ATP试剂盒，将其披露的内容引入本文作为参考。可以使用Ciba Corning614K+／Na+型分析仪(Ciba Corning DiagnosticsCorp.，Medford，MA)测定胞外钾水平。通过在4℃下将细胞以12,000xg离心15分钟并且除去上清液测定胞外pH，就此而言在室温下使用标准pH计(例如Beckman，环氧甘汞电极)测定其pH。就胞内pH而言，将剩余的沉淀密封在离心管内并且贮存在约-80℃至少2小时。然后通过添加去离子水将其裂解。充分混合裂解的样品并且在室温下使用标准pH计或在室温下使用Ciba Corning238型血液气体分析仪(CibaCorning Diagnostics Corp.，Medford，MA)测定溶液的pH。可以在处理后不久进行测定并且作为处理后贮存，例如贮存长达42天的函数。本发明的方法提供了红细胞组合物，其中在4℃下，在28天贮存后处理的红细胞的溶血低于3％，更优选在42天贮存后低于2％，且最优选在42天贮存后低于或等于约1％。优选的方法提供了红细胞组合物，其中胞内ATP水平高于使用2mM酸性谷胱甘肽和0.2mM PIC-1标准条件处理的类似组合物的胞内ATP水平。在某些实施方案中，本发明的猝灭方法提供了高于使用2mM酸性谷胱甘肽和0.2mM PIC-1处理的组合物约20％，也可以30％，也可以40％或约50％的ATP水平，其中在7，14，21，28，35或42天贮存后维持较高水平的ATP。
可以通过几种测定法评价本发明的方法中红细胞修饰的减少。在一种测定法中，通过给新西兰白兔注射与KLH结合的吖啶化合物产生与吖啶反应的兔多克隆血清。使用吖啶化合物S-197并且其具有如下结构：
通过将10μL的该化合物(在去离子水中10mM)添加到990μL KLH缓冲溶液(在50mM磷酸盐中10mg／mL，150mM NaCl，PBS pH＝7.2，含有专利稳定剂，Pierce Cat#77600)中并且在室温下孵育20小时以上使所述化合物与KLH结合。在此孵育后，通过流经脱盐柱(例如D-盐柱，Pierce)和用PBS缓冲液洗脱从未反应的S-197和S-197副产物中分离结合的KLH。然后合并溶液染色的级分并且KLH结合物的特征在于在210和410nm处的吸光度之比。将吖啶-KLH结合物溶液与弗氏完全佐剂混合以便在多个部位肌内注入兔而使兔免疫。所得兔血清具有高滴度的可与吖啶结构反应的多克隆抗体。可以将兔血清与例如用PIC-1和谷胱甘肽处理的红细胞组合物一起孵育。洗涤掉未结合的兔抗体并且使该溶液与山羊抗-兔抗体反应。可以通过流经BufferGel Card(Micro Typing Systems，Pompano Beach，Florida)检测所得溶液的凝集。设计凝胶卡片以使未凝集的红细胞流过，而通过与兔血清反应并且与抗-兔抗体交叉反应而凝集的细胞仍然在凝胶上部。将凝胶卡片记为0，1+，2+，3+或4+的得分，其中0表示所有细胞均为完整的并且在凝胶下部，而4+表示完全凝集，其中所有细胞均在凝胶上部。当使用1∶100的兔血清稀释液检测时，本发明的猝灭方法导致1+或1+以下，优选0的得分，而用2mM酸性谷胱甘肽和0.2mM PIC-1处理类似的组合物导致2+或2+以上的得分。
此外，当与使用和优选猝灭方法猝灭剂相同浓度的酸性谷胱甘肽和相同浓度的灭活病原体的化合物处理类似的组合物比较时，本发明的猝灭方法导致较低的得分。例如，用10mM中和的谷胱甘肽和0.2mMPIC-1处理的红细胞组合物导致低于用10mM酸性谷胱甘肽和0.2mMPIC-1处理的红细胞组合物的得分，优选得分为1+或0。
在另一种测定法中，兔多克隆血清可以与处理的红细胞反应。在洗涤掉未结合的抗体后，加入FITC标记的山羊抗-兔Fab′2片段(抗H+L链，Caltag)。FITC标记与红细胞结合与结合到红细胞表面上的吖啶的量相关并且通过FACScanTM分析确定(Becton，Dickinson和Co.，NJ)。根据FACScanTM平均荧光值确定红细胞的相对修饰。当与使用2mM酸性谷胱甘肽和0.2mM PIC-1处理比较时，本发明的猝灭方法导致平均荧光降低至少50％，也可以至少75％或至少90％。此外，当与使用和优选猝灭方法猝灭剂相同浓度的酸性谷胱甘肽和相同浓度的灭活病原体的化合物处理类似的组合物比较时，本发明的猝灭方法产生的平均荧光水平较低。例如，用10mM中和的谷胱甘肽和0.2mM PIC-1处理的红细胞组合物导致平均荧光水平低于用10mM酸性谷胱甘肽和0.2mM PIC-1处理的红细胞组合物的平均荧光水平。当与使用酸性谷胱甘肽进行类似处理比较时，本发明的猝灭方法与酸性谷胱甘肽处理相比导致平均荧光降低至少10％，也可以至少25％，也可以至少50％，也可以至少75％或至少90％。
最后，可以使用来自输注了用2mM谷胱甘肽和0.2mM PIC-1处理的红细胞看来已经产生了抗-PIC-1抗体的患者的血清样品，以便评价与本发明的处理的红细胞组合物的交叉反应性。本测定法与使用兔多克隆血清的Gel Card测定法类似。在本测定法中，凝胶含有兔抗-人IgG，使得与患者血清反应的红细胞在凝胶上部凝集。如上所述给凝胶卡片记分。就本测定法而言，本发明的猝灭方法导致1+或1+以下，优选0，的得分而使用2mM酸性谷胱甘肽和0.2mM PIC-1处理的类似组合物导致2+或2+以上的得分。此外，当与使用和优选猝灭方法猝灭剂相同浓度的酸性谷胱甘肽和相同浓度的灭活病原体的化合物处理类似的组合物比较时，本发明的猝灭方法导致较低的得分。例如，用10mM中和的谷胱甘肽和0.2mM PIC-1处理的红细胞组合物导致低于用10mM酸性谷胱甘肽和0.2mM PIC-1处理的红细胞组合物的得分，优选得分为1+或0。
还可以通过确定样品中核酸修饰的水平将本发明的猝灭方法与现存的方法进行比较。一般而言，红细胞组合物可以含有白细胞并且可以从白细胞中分离核酸。具有放射性同位素的灭活病原体的化合物在该化合物与核酸反应时仍然保持与核酸结合。可以使用它确定对各种猝灭方法而言与核酸反应的化合物的量，并且提供可以直接与期望白细胞灭活相关的测定值。可以将每1,000个核酸碱基对形成的加合物数量用作评价各种方法对病原体灭活的预计影响的模型。或者，可以将适量的病原体加入到红细胞组合物中并且可以在处理后分离病原体的核酸。然而，在这种情况中，需要减少样品的白细胞，以便任何残余白细胞的水平不会干扰病原体核酸的测定。
除提供足够的病原体灭活，同时降低不需要的副反应水平外，本发明的猝灭方法在至少某些实施方案中还提供了病原体灭活后反应性亲电子种类浓度的下降。如果打算将红细胞组合物用于输注，那么重要的是反应性亲电子种类的水平尽可能低，优选基本上不再可检测到。可以使用本领域中可利用的方法，诸如色谱法，包括液相色谱法-质谱法(LC-MS)确定反应性亲电子种类的存在。此外，可以通过评价与核酸的鸟嘌呤残基反应的能力，诸如使用Matties所述的一般烷基化剂测定法(Matties，WR，Anal.Biochem.1992Oct；206(1)：161-7)评价样品的剩余活性。在本测定法中，在与灭活病原体的化合物和猝灭剂一起孵育适当的时间后提取RBC。从蛋白质中分离任何残留的灭活病原体的化合物以及猝灭剂和其它小的种类。然后将这些种类与用8-3H鸟嘌呤残基合成的双链DNA一起孵育。残留的灭活病原体的化合物与双链DNA在鸟嘌呤的N7位上反应，该反应使8-H酸化并且将3H释放到溶液中，在所述溶液中可以分离并且测定它。可以对释放的氚定量并且它与存在于测试的提取样品中的残余烷基化剂的量具有1∶1的关系。可以使用本发明的改进的方法并且与已知方法比较评价通过这些方法确定的亲电子种类的水平。
在本文所述的方法各自的某些实施方案中，所述的方法进一步包括降低混合物中化合物浓度的步骤，其中所述的化合物选自灭活病原体的化合物或灭活病原体的化合物的降解产物。在某些实施方案中，该方法包括降低混合物中灭活病原体的化合物浓度的步骤。在某些实施方案中，该方法包括降低混合物中亲电子种类浓度的步骤。在某些实施方案中，该方法包括降低混合物中猝灭剂浓度的步骤。灭活病原体的化合物和／或猝灭剂(和相关产物)在生物材料，诸如血液制品中的浓度在处理后，例如通过在批量或流动除去过程中的吸附而得以降低。可以使用的方法和装置描述在美国专利US6,544,727和6,331,387和美国专利公开号2002／0192632、2005／0142542、2004／0185544和2001／0009756中，将这些文献各自披露的内容完整地引入本文作为参考。因此，在某些实施方案中，通过使所述混合物与包含对灭活病原体的化合物具有亲和力的吸附颗粒的吸附介质接触来降低灭活病原体的化合物的浓度。在某些实施方案中，可以构造吸附系统以便在批量方法中除去灭活病原体的化合物。在某些实施方案中，通过洗涤红细胞降低灭活病原体的化合物在混合物中的浓度。
本发明的方法与已知方法相比导致利用改进的猝灭使红细胞组合物中可能的病原体污染物得到充分灭活。如上所述，在优选的方法中，灭活病原体的化合物包含核酸靶向部分和反应性亲电子基团且猝灭剂包含半胱氨酸，其中猝灭剂在加入到红细胞组合物中时提供了合适的pH。在某些实施方案中，猝灭剂为酸性的并且使用1-2当量的合适的碱，诸如氢氧化钠将其中和。在一个优选的实施方案中，猝灭剂为使用2当量的碱中和的谷胱甘肽。在一个优选的实施方案中，灭活病原体的化合物包含通过酯键与芥子基团连接的吖啶基团。在一个优选的实施方案中，灭活病原体的化合物为β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯及其盐并且猝灭剂为使用2当量的碱中和的谷胱甘肽。可以在加入灭活病原体的化合物之前，之后或同时将猝灭剂加入到红细胞组合物中。在某些实施方案中，在加入灭活病原体的化合物之前约30分钟到加入灭活病原体的化合物之后约10分钟的时间范围内加入猝灭剂。在某些实施方案中，基本上同时，但单独地加入猝灭剂和灭活病原体的化合物。例如，在灭活病原体的化合物为β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯并且猝灭剂为中和的谷胱甘肽的优选实施方案中，易于将它们共同配制成溶液以便加入到红细胞组合物中。由于充分猝灭需要高浓度的谷胱甘肽，所以灭活病原体的化合物在它们以高浓度存在于相同溶液中时沉淀。一旦加入到红细胞组合物中，它们就得到充分稀释和缓冲以便二者都完全溶解。
在本发明的一个优选实施方案中，将红细胞组合物与β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯和用2当量的碱中和的谷胱甘肽混合。在另一个实施方案中，将中和的谷胱甘肽与红细胞组合物混合，并且随后在加入谷胱甘肽约30分钟内，优选在约10分钟内加入β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯。在另一个实施方案中，将β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯和中和的谷胱甘肽与红细胞组合物基本上同时和彼此在约1分钟内混合。在另一个实施方案中，首先将β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯加入到红细胞组合物中，然后在约30分钟内，也可以在约10分钟内，也可以在约5分钟内，也可以在约1分钟内加入中和的谷胱甘肽。在某些实施方案中，在混合所有三种成分时，例如在混合约1-5分钟内，谷胱甘肽的浓度在约5mM-30mM，优选在约10mM-30mM的范围内，优选约20mM，并且β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯的浓度在约0.05mM-0.5mM，优选在约0.1mM-0.3mM的范围内，优选约0.2mM，并且该混合物的pH在约7.2-8.0的范围内。
本发明还提供了由本文所述的处理方法各自产生的红细胞组合物。
在本文所述的方法和组合物各自的某些实施方案中，红细胞组合物中的红细胞为哺乳动物血细胞。例如，红细胞可以为啮齿动物(例如小鼠或大鼠或兔)、猿(例如黑猩猩)或人的红细胞。例如，在某些实施方案中，红细胞为人的红细胞。在某些实施方案中，已经减少了红细胞中的白细胞。在某些其它实施方案中，未减少红细胞中的白细胞。在某些实施方案中，存在包含红细胞的组合物被病原体污染的可能性。在某些实施方案中，红细胞组合物被病原体污染。
除改进的猝灭方法外，本发明还提供了用于处理红细胞组合物的一次性试剂盒，其中所述的处理可以手工或自动进行。在某些实施方案中，本发明提供了包含用于本文所述的各方法的灭活病原体的化合物、猝灭剂和／或碱的试剂盒。
在某些实施方案中，所述的试剂盒包含：β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯，包括其任何盐；和中和的谷胱甘肽，包括其任何盐。β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯可以为固体形式或溶液形式。类似地，中和的谷胱甘肽可以为固体形式或溶液形式。这些固体或溶液可以进一步包括可接受的赋形剂、辅助剂、稀释剂或稳定剂。在某些实施方案中，β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯为盐酸盐并且中和的谷胱甘肽是用约2当量的氢氧化钠中和的。在某些实施方案中，β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯和中和的谷胱甘肽为固体形式并且所述的试剂盒进一步包括适合于溶解β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯的溶液和适合于溶解中和的谷胱甘肽的溶液。在某些实施方案中，本发明提供包含灭活病原体的化合物、猝灭剂和用于溶解猝灭剂的溶液的试剂盒，其中所述的溶液中和猝灭剂。本文所述的方法和试剂盒包括可以作为混合物或单独配制的灭活病原体的化合物和猝灭剂的任何合适的药物制剂。例如，药学上可接受的制剂为本领域技术人员公知的并且合适的赋形剂、辅助剂、稀释剂或稳定剂的实例可以在Gennaro，ed.，Remington′s The Science andPract ice of Pharmacy，20thedition，Lippincott Williams&Wilkins中找到。本发明还包括上述方法获得的组合物，其包含如上所述的红细胞、灭活病原体的化合物和猝灭剂，其中该组合物的pH在适当的范围内以便对灭活病原体的化合物进行改进的猝灭。
本发明在另一个方面中提供了例如用于处理红细胞组合物以便灭活病原体的试剂盒，其包含：包含核酸结合配体和为或形成亲电子基团的官能团的灭活病原体的化合物(包括其任何盐)；包含巯基的猝灭剂(包括其任何盐)；和至少约1当量的碱，其中当量意指与试剂盒中猝灭剂的摩尔量相等的摩尔量。在某些实施方案中，该试剂盒包含约1或约2当量的合适的碱。
本发明在另一个方面中提供了用于处理红细胞组合物以便灭活病原体的试剂盒，其包含：核酸结合配体和为或形成亲电子基团的官能团(例如PIC-1)，包括其任何盐；和包含巯基的中和的猝灭剂(例如中和的谷胱甘肽)，包括其任何盐。
通过下列非限制性实施例进一步解释本发明。在这些实施例中，所有的细菌和病毒均获自美国典型培养物保藏中心(AmericanTypeCulture Collection)(ATCC)，Rockville，MD，或为临床分离物。
实施例1
粘质沙雷氏菌、表皮葡萄球菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌灭活与标准条件的比较
通过在37℃下将来自主平板的单一菌落添加入到500mL LB培养基中使细菌粘质沙雷氏菌生长过夜。用新鲜培养基按照1∶1000稀释过夜培养物。通过在600nm处混悬液的OD监测37℃下的生长。当混悬液达到0.5OD时使用该制备物。将全血(Blood Source，Sacramento，CA)用于通过离心以便提供压紧的RBC(34mL，约90％的血细胞比容)，然后添加17mL Erythrosol至血细胞比容约为60％制备血细胞(RBC)组合物。Erythrosol为红细胞添加剂(Baxter HealthcareCorp.，Deerfield，IL)，它可以通过下列步骤制备：在1升蒸馏水中合并柠檬酸钠二水合物(7.82g)；酸式磷酸钠二水合物(0.73g)；磷酸钠二水合物(3.03g)；腺嘌呤(0.22g)；甘露糖醇(7.74g)；和葡萄糖(9g)。然后向RBC／Erythrosol中加入细菌制备物(总体积的1／100)以便提供污染的RBC。将污染的RBC分成几份样品并且按照表2处理，其中PIC-1为β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯。将PIC-1和谷胱甘肽(Aldrich，St.Loui s，Mo)在同时加入时以在最终红细胞组合物中的所需浓度约15x或在单独加入时30x溶于8％的葡萄糖一水合物溶液。此外，用所示当量的氢氧化钠中和谷胱甘肽，是通过将适量的5N NaOH加入到谷胱甘肽中制备的。就每份样品而言，将4.67mL RBC与330μL PIC-1／谷胱甘肽或分别与各自165μL的PIC-1和谷胱甘肽混合。例如，通过将7.6mg PIC-1和46mg谷胱甘肽溶于5mL8％葡萄糖并且将330μL该溶液加入到4.67mL RBC中制备2mM谷胱甘肽和0.2mM PIC-1的标准处理物。通过将7.6mg PIC-1和460mg谷胱甘肽溶于4.4mL8％葡萄糖并且与0.6mL5N NaOH混合，然后将330μL该溶液加入到4.67mL RBC中制备20mM中和的谷胱甘肽和0.2mM PIC-1的样品。就使用20mM中和的谷胱甘肽单独添加而言，通过将7.6mg溶于2.5mL8％葡萄糖制备PIC-1，通过将460mg溶于1.9mL8％葡萄糖并且与0.6mL5NNaOH混合制备谷胱甘肽，然后将165μL各溶液按照适当顺序加入到4.67mL RBC中。相应地调节各种成分的体积以便提供表中所示的合适的样品。处理后，将样品孵育2小时并且顺序稀释各100μL且涂布在LB平板上。将它们在37℃下孵育过夜以便评价细菌生长。通过对平板上的菌落进行计数确定细菌滴度并且基于平板稀释确定滴度。例如，使用10倍的连续稀释液，对原始溶液的第五次稀释计数30个菌落，其中将0.1mL铺板，显示最初滴度(30x105)／0.1＝3x107或7.47log。将未处理的对照样品(即未添加P1C-I或谷胱甘肽)用作基线以便评价处理后滴度的log减少。表2A和2B表示不同样品的log滴度和log减少。注意就表2A中的大部分样品而言，共同配制PIC-1和谷胱甘肽。就样品4-6而言，其中用不同量的氢氧化钠中和谷胱甘肽，PIC-1从溶液中沉淀出来，其中随着加入碱的量增加沉淀增加。因而，在PIC-1在溶液中的实际浓度未知时，这些结果无法对灭活水平提供良好的指示。如表2B中所示，通过依次添加这两种成分重复本研究(时间延迟为0表示将它们同时加入到溶液中)。为了与表2A中的标准条件(样品1和10)比较，仅分别加入所述成分的样品7提供了合理的比较。在这种情况中，另外如2B中所示，使用应用2当量的碱中和的20mM谷胱甘肽猝灭导致log减少比标准条件(2mM酸性谷胱甘肽和0.2mM PIC-1)低约1-1.5log。
使用表皮葡萄球菌进行了另外的研究，其中使用未经稀释的过夜培养物。在这些研究中，按照表3中所示的顺序加入PIC-1和谷胱甘肽，其中结果如该表中所示。当将20mM中和的谷胱甘肽用作猝灭剂时，对表皮葡萄球菌的灭活未明显减少。在所有样品中PIC-1均为0.2mM。
使用小肠结肠炎耶尔森氏菌进行了类似的研究，其中，除中和的谷胱甘肽外，还将中和的半胱氨酸用作猝灭剂，其中用1或2当量的氢氧化钠中和该半胱氨酸(Aldrich)。在本研究中，将2mM酸性谷胱甘肽与20mM中和的谷胱甘肽或20mM中和的半胱氨酸比较，在所有样品中均含有0.2mM PIC-1。结果如表4中所示。结果显示适当中和的半胱氨酸与中和的谷胱甘肽同样有效，其中与标准条件相比灭活减少约2.5log。
表2A在不同猝灭条件下RBC中粘质沙雷氏菌的灭活
*就该样品而言，首先加入PIC-1，此后不久加入谷胱甘肽。就所有其它样品而言，共同配制PIC-1和谷胱甘肽并且加入到RBC中。
表2B包括顺序添加PIC-1和谷胱甘肽的RBC中粘质沙雷氏菌的灭活(在所有样品中PIC-1均为0.2mM)
表3包括顺序添加PIC-1和谷胱甘肽的RBC中表皮葡萄球菌的灭活(在所有样品中PIC-1均为0.2mM)
表4包括顺序添加PIC-1和谷胱甘肽的RBC中小肠结肠炎耶尔森氏菌的灭活(在所有样品中PIC-1均为0.2mM)
使用半胱氨酸作为猝灭剂进行了另外的研究。如上所述制备并且评价样品，其中使用1或2当量的氢氧化钠中和半胱氨酸(Cys)。就这些样品而言，以10N制备NaOH储备溶液并且按照上述操作步骤使用适当体积的不同成分。进行标准条件和／或20mM中和的谷胱甘肽(GSH)的比较试验。在表5A中所示的研究中，还使用了半胱氨酸和谷胱甘肽的组合。结果如表5A、5B和5C中所示，表示在所有条件下均为至少约3log的灭活。一般而言，半胱氨酸和谷胱甘肽与标准条件相比在病原体灭活方面导致相似的减少，其中灭活在标准条件的约1-1.5log内。两种成分的组合是所关注的，因为半胱氨酸能够进入细胞，而谷胱甘肽在任何大量下均无法进入细胞。这一结果表明在细胞内部和外部适当的猝灭条件下，观察到类似的灭活结果。
表5A使用PIC-1和谷胱甘肽或半胱氨酸或两者的组合对RBC中粘质沙雷氏菌的灭活(在所有样品中PIC-1均为0.2mM)
表5B使用PIC-1和谷胱甘肽或半胱氨酸对RBC中粘质沙雷氏菌的灭活(在所有样品中PIC-1均为0.2mM)
表5C使用PIC-1和谷胱甘肽或半胱氨酸对RBC中表皮葡萄球菌的灭活(在所有样品中PIC-1均为0.2mM)
实施例2
疱疹性口腔炎病毒(VSV)灭活与标准条件的比较
将VSV的100x储备溶液(约1.78x108滴度)用于污染根据实施例1所述制备的红细胞组合物。如表5A-B所示处理污染的RBC，孵育2小时。如对上述类似实验所示加入所述的成分。对每份样品处理5mL体积的污染的RBC。在孵育完成后将RBC冷冻在液N2中并且在稍后时间分析。通过在生长在补充了10％胎牛血清和其它必需元素的EMEM中的非洲绿猴细胞Vero76中的噬菌斑测定法来测定剩余的VSV滴度。通过确定对上述公开的细胞的融合制品施用稀释的样品时获得的噬菌斑数量来计算滴度(Hsiung GD和Melnick JL，Journal of Immunology78，128-136.1957)。结果如表6A中所示，表示所述的猝灭方法对高滴度的VSV均提供了基本上完全的灭活。使用半胱氨酸作为猝灭剂进行了另外的研究，其中使用或未使用2当量的氢氧化钠中和。结果如表6B中所示，其中将标准条件和20mM中和的谷胱甘肽用于比较。20mM的酸性或中和的半胱氨酸将灭活水平降低了约2-3log，其中中和的样品显示最低水平的灭活。20mM的谷胱甘肽样品也将灭活水平降低了约2log。所有结果均表明胞外病毒VSV的灭活对猝灭条件极不敏感。
表6A包括顺序添加PIC-1和谷胱甘肽的RBC中VSV的灭活(在所有样品中PIC-1均为0.2mM)
*与中和的谷胱甘肽共同添加使得PIC-1从溶液中沉淀。
表6B使用PIC-1和谷胱甘肽或半胱氨酸对RBC中VSV的灭活(在所有样品中PIC-1均为0.2mM)
实施例3
用PIC-1和谷胱甘肽或半胱氨酸处理RBC后在人白细胞基因组DNA上PIC-1加合物频度的测定
如实施例1中所述将未减少白细胞的全血用于制备在Erythrosol中的RBC。用0.2mM PIC-1、0.2mM PIC-1和2mM酸性谷胱甘肽、20mM中和的谷胱甘肽(2当量碱)、10分钟后添加PIC-1至0.2mM或各20mM中和的谷胱甘肽(2当量的NaOH)和中和的半胱氨酸(1当量的NaOH)、10分钟后添加PIC-l至0.2mM处理各自20mL等分试样。所用的PIC-1包括放射性标记的PIC-1，其中反应性基团包括14C标记(ViTrax，Inc.，Placentia，CA)。所用PIC-1的比活性为1.08μCi／μmole。将所有样品在室温下孵育20小时。在孵育后，用20mL体积的PBS稀释20mL RBC并且将20mL该混合物加入到各自含有10mL Ficoll的两支试管中。然后以400x g将该混悬液离心30分钟。分离白细胞部分并且在加入另外20mL PBS后重复离心步骤。合并获得的沉淀并且将合并的沉淀重新悬浮于5mL裂解缓冲液(100mM NaCl，10mM Tris HCl，25mM EDTA，5％SDS，0.1mg／mL蛋白酶K，Sigma，St.Louis，Mo)中并且在50℃下孵育至少2小时。然后用5mL苯酚∶氯仿∶异戊醇24∶25∶1，随后用5mL氯仿且然后用5mL乙醚萃取所得溶液。分离水层中的基因组DNA并且通过添加0.5mL3M NaOAc、10mL100％乙醇，随后在干冰／乙醇浴中孵育最终混合物使其沉淀。通过以6，000x g离心10′分离DNA。除去上清液并且风干沉淀且重新悬浮于1mL TE缓冲液(100mM Tris HCl，1mM EDTA，pH＝7.4)中。通过在260nm处的UV吸光度对分离的DNA进行定量并且通过DNA溶液的液体闪烁计数(Perkin Elmer-Wallac，Winspectral1414LiquidScintillation Counter，Shelton，CT)对PIC-1加合物进行定量，使用PIC-I的比活性评价PIC-1与DNA碱基对的摩尔比。每1000bp(kbp)中加合物的数量如下表7中所示，表明用20mM中和的谷胱甘肽猝灭的样品中白细胞核酸的修饰与标准条件或未猝灭样品相比相差无几。表中以及本文的其它部分将谷胱甘肽表示为″GSH″并且将半胱氨酸表示为″Cys″。将加合物频度的测定值用作白细胞灭活的替代测量值。已知在标准病原体灭活条件下，将白细胞灭活至极限稀释测定的检测水平，相当于5.3log的灭活。灭活机制是通过在基因组核酸上形成加合物。因此结果表明改进的猝灭方法不应当显著影响白细胞的灭活。可以使用合适的病原体，应用白细胞减少的红细胞进行类似的研究以便评价在不同条件下与病原体核酸的结合。
表7不同处理条件后在基因组DNA中PIC-1加合物频度
*加合物之间碱基对的平均数。
**使用2当量中和的。
实施例4
如通过结合红细胞的抗-吖啶抗体所评价的RBC的pH调节对猝灭的影响
能够在添加谷胱甘肽前调节RBC组合物的pH，正如在本实施例中通过使用不同pH的各种溶液洗涤RBC所证实的。在室温下将20mL白细胞减少的全血(Blood Source，Sacramento，CA)样品以4，100x g在4支50mL离心管内各自离心5分钟。从每支管中除去上清液以便提供红细胞浓缩物(RCC)。就样品1而言，将5mLErythrosol(pH7.3)加入到10mL RCC中。就样品2-4而言，用10mL所示的溶液将RCC洗涤三次，如上所述离心并且在每次洗涤后除去上清液。就每次洗涤的RCC而言，将细胞重新悬浮于5mL用于洗涤的溶液中。目前将其称作RBC测试样品。用于样品2-4的溶液分别为(pH7.3)，PBS pH8(50mM磷酸盐，100mM NaCl，pH8.0)和CHES pH9(50mM CHES(Aldrich)，100mM NaCl，pH9.0)。就每一RBC测试样品而言，将1.5mL与100μL PIC-1+谷胱甘肽(2mM酸性的或20mM使用0.9，1.5或2当量氢氧化钠中和的)混合以达到终浓度为0.2mMPIC-1和2mM或20mM谷胱甘肽。将这些样品在室温下孵育20小时。在孵育后，用BBS(BloodBank Saline，0.9％盐水，未缓冲，Fisher Scientific)洗涤RBC并且将其稀释至最终血小板比容为4％。将25μl各等分试样与15μL在BBS中按1∶100稀释的兔多克隆抗-吖啶血清混合并且将该混合物在37℃下孵育30分钟。随后用1.5mL BBS洗涤细胞。在洗涤完成后，将细胞与50μL FITC标记的山羊抗-兔Fab′2片段(在BBS中按1∶64稀释)混合并且在37℃下孵育30分钟。在孵育后，用3x1.5mL BBS再次洗涤细胞。然后通过FACScan分析红细胞并且对每一样品观察到的平均荧光如表8中所示。该值与PIC-1吖啶与红细胞表面结合相关，使得较低的值表示PIC-1与RBC的副反应的猝灭改善。仅通过在较高pH缓冲液中洗涤细胞显著减少了PIC-1与RBC的结合，其中中和的谷胱甘肽提供了更好的猝灭。注意随着使用不断增加量的氢氧化钠中和谷胱甘肽，猝灭改善。本实施例表明调节红细胞组合物的pH以便提供改善的猝灭的重要性。使用CHES pH9洗涤与用1.5或2当量的氢氧化钠中和谷胱甘肽相结合将PIC-1结合减少至几乎背景水平。
表8在不同猝灭条件下使用0.2mM PIC-1处理RBC，
抗-吖啶抗体结合的FACScan分析
实施例5
就结合红细胞的抗-吖啶抗体结合而论不同猝灭条件的比较
将对兔抗-吖啶血清与处理的红细胞结合的FACScan分析用于评价不同猝灭条件。如实施例1中所述制备RBC样品，并且如上述实施例中所述制备猝灭剂。在与RBC混合时成分的添加顺序和化合物终浓度如表9A和9B中所示。这些表表示了来自各自使用在标准条件下处理的样品或使用20mM中和的谷胱甘肽的两种不同实验的数据。PIC-1在所有样品中均为0.2mM。实验中的数据提供了不同处理的相对功效。因为本试验可能取决于所用的红细胞批次，所以平均荧光的绝对值可以从一次研究到下一次研究发生改变，使得应当仅在指定实验中比较相对值。例如，注意到标准条件导致表9A中114的平均荧光和表9B中151-182的平均荧光。中和的半胱氨酸在15或20mM下有效猝灭至基本上背景信号(即基本上无结合)。中和的谷胱甘肽在20mM下导致接近于背景水平。从表9B中可以看出，半胱氨酸的结果表明，尽管增加猝灭剂浓度可以提供对与RBC反应更好的猝灭，但是当半胱氨酸浓度增加时，中和半胱氨酸可以提供对不需要的副反应最佳的猝灭。注意到在2.5mM半胱氨酸时，在中和的与酸性的半胱氨酸之间几乎无差异，而在5mM或5mM以上时，与相同浓度下的酸性半胱氨酸样品相比1当量的NaOH进一步降低了信号。
表9A作为FACScan平均荧光测定的抗-吖啶抗体与处理的RBC的相对结合(在所有样品中PIC-1均为0.2mM)
表9B作为FACScan平均荧光测定的抗-吖啶抗体与处理的RBC的相对结合(在所有样品中PIC-1均为0.2mM)
实施例6
添加PIC-1和不同猝灭剂时对红细胞组合物的pH的评价
对不同处理条件测定了不同猝灭条件对红细胞组合物的pH的影响。制备在8％葡萄糖一水合物中的浓度为600mM的猝灭剂溶液。就半胱氨酸而言，将一部分溶液与1或2当量的氢氧化钠混合。在2mM(酸性的)或20mM(2当量碱)下评价谷胱甘肽。还评价了N-乙酰半胱氨酸、甲硫氨酸和肽二聚体半胱氨酸-甘氨酸(CysGly)，其中用1当量的氢氧化钠中和N-乙酰半胱氨酸，用1或2当量氢氧化钠中和甲硫氨酸并且用2当量氢氧化钠中和CysGly。在室温下使用标准环氧甘汞电极(Beckman Instruments)测定未改性的或中和的猝灭剂溶液的pH。制备在8％葡萄糖一水合物中为6mM的PIC-1溶液。如实施例1中所述制备红细胞组合物。就每一样品而言，将167μL猝灭剂和167μLPIC-1依次加入到4.67mL RBC中，在添加猝灭剂后在室温下孵育10分钟，然后加入PIC-1。混合样品并且使用与如上所述相同的电极测定室温下的pH。不同研究的结果如表10中所示。
表10使用不同猝灭剂条件与在RBC中0.2mM PIC-1的pH测定
实施例7
作为谷胱甘肽浓度和中和的函数的猝灭；抗-吖啶抗体结合和表皮葡萄球菌灭活的评价
在它们中加入适量的600mM储备溶液，与适当体积的8％葡萄糖混合以便对每一RBC样品提供相同的添加体积，其中在同一研究中，使用变化的谷胱甘肽浓度，在添加谷胱甘肽后和在添加PIC-1后测定pH。注意到添加PIC-1可降低添加猝灭剂后具有较高pH值的某些溶液的pH，但最终的pH仍然在用于改善猝灭的优选范围内并且适当高于未进行中和的相同浓度的谷胱甘肽的pH值。对按照与实施例6类似的方式，使用不同浓度的谷胱甘肽(表11A)制备的样品，通过凝胶卡片或FACScan分析评价与抗-吖啶兔血清的结合。还评价了类似样品中的表皮葡萄球菌灭活。用谷胱甘肽，在10分钟后再使用PIC-1处理各RBC样品，然后在PIC-1混合后在室温下孵育20小时。就凝胶卡片分析而言，在孵育后，用BBS洗涤RBC并且用BBS稀释至最终血小板比容为4％。将25μL等分试样各自与15μL在BBS中按1∶4或1∶100稀释的兔多克隆抗-吖啶血清混合并且将该混合物在37℃下孵育30分钟。随后用1.5mL BBS洗涤细胞。在洗涤完成后，将细胞与山羊抗-兔Fab′2片段抗H+L链(在PBS中按1∶4稀释)混合并且在37℃下孵育30分钟。在孵育后，用3x1.5mL BBS再次洗涤细胞并且加载到凝胶卡片上且根据制造商的设置在MTS CentrifugeTM(Ortho Sys tem，Pompano Beach，F1)中以900x g将凝胶卡片离心10分钟。将凝胶卡片以0，1+，2+，3+，4+的等级记分，从而对凝集的相对量分级，其中0表示无凝集，所有细胞均通过凝胶，而4+表示完全凝集，所有细胞均位于凝胶上部。这些结果表明当使谷胱甘肽浓度增加时，必需调节RBC组合物的pH，诸如使用中和的谷胱甘肽。甚至在5mM下，使用2当量的碱中和的谷胱甘肽也可以提供优于5mM与1或0当量碱的猝灭。中和的谷胱甘肽在浓度增加时表现出抗体结合的减少，而酸性谷胱甘肽与2mM标准条件相比在较高浓度下几乎未表现出改善(如果有的话)。在本研究中，该测定法的灵敏度是这样的以致于必需按1∶100稀释兔血清才能看出猝灭方法的差异，因为按1∶4稀释在所有样品中均表现出完全凝集(未处理的对照品未表现出凝集)。因而，表11B中仅显示了按照1∶100稀释的样品。研究之间的结果因所用血样的不同而改变。例如，鉴于在本研究中，按照1∶4稀释的抗-吖啶兔血清在所有样品中均导致4+的得分，使用10，15和20mM中和的谷胱甘肽(2当量碱)进行了另外的研究，其中在按照1∶4稀释的样品中观察到了差异，而按照1∶100稀释的样品均表现出0的得分。这些以按照1∶4稀释的兔血清测试的样品对标准条件，10mM，15mM和20mM中和的(2当量碱)谷胱甘肽分别表现出4+，4+，3+和1+的得分。还使用了中和的谷胱甘肽(2当量碱)和中和的半胱氨酸(1当量碱)的组合，其中总猝灭剂浓度为20mM，并且所有这类样品均导致了1+或0的得分(即它们至少与20mM中和的谷胱甘肽同样有效)。
表11A使用不同猝灭剂条件与在RBC中0.2mM PIC-1的pH测定
表11B使用不同浓度的谷胱甘肽和0.2mM PIC-1处理的RBC中的抗-吖啶抗体结合。1∶100稀释的抗-吖啶兔血清和1∶4稀释的二次抗-兔IgG的凝胶卡片得分
*MX＝混合视野
如上所述使用不同单位的RBC制备如表11A中所示的另一组样品并且通过FACScan分析进行评价。在孵育20小时后，如实施例4所述处理这些样品并且通过FACScan进行分析。还评价了未处理的对照样品和标准样品(共同添加2mM酸性谷胱甘肽与0.2mM PIC-1)。结果如表11C中所示。
表11C用不同浓度的谷胱甘肽和0.2mM PIC-1处理的RBC中的抗-吖啶抗体(兔多克隆；按照1∶100稀释)结合。使用FITC标记的抗-兔Fab′2(按照1∶64稀释)，通过FACScan分析评价的
如上所述，使用相同单位的RBC制备如表11A中所示的另一组样品并且搀入了表皮葡萄球菌且根据实施例1评价滴度。结果如表11D中所示。抗体结合与表皮葡萄球菌灭活的综合结果表明使用较高浓度的中和的谷胱甘肽改善了猝灭。
表11D使用不同浓度的谷胱甘肽和0.2mM PIC-1处理的RBC中的表皮葡萄球菌的灭活
实施例8
通过在使用不同猝灭剂猝灭的样品中的凝胶卡片分析评价抗-吖啶抗体结合
使用其它猝灭条件，诸如使用半胱氨酸，半胱氨酸-甘氨酸二肽或半胱氨酸和谷胱甘肽的组合进行使用凝胶卡片测定的类似研究。还用按照1∶4或1∶100稀释的兔血清并且不使用二次抗体测试了样品，对使用2mM谷胱甘肽和0.2mM PIC-1的标准条件或使用PIC-1，但不使用猝灭剂处理的样品而言均导致了一定程度的凝集。认为使用浓的1∶4稀释的兔血清与二次抗-兔抗体在几乎所有样品中观察到的凝集(表12和13)部分地因异嗜白细胞反应所致。异嗜白细胞抗体为以非特异性方式识别来自另一物种的RBC的天然存在的抗体。表12-13显示对按照1∶4或1∶100稀释的兔血清和按照1∶4稀释的抗-兔抗体进行的不同实验的结果。未显示未处理的对照品的数据，因为它们对所有样品而言均得到了0的得分。首先将所有样品与猝灭剂混合，然后与0.2mM的PIC-1混合。猝灭剂的特征、浓度和碱的当量如表中所示。这些结果提示谷胱甘肽和半胱氨酸的组合或单独的半胱氨酸可以对PIC-1与RBC的结合提供在一定程度上更好的猝灭。
表12使用不同浓度的谷胱甘肽和半胱氨酸和0.2mM PIC-1处理的RBC中的抗-吖啶抗体结合
表13使用不同浓度的谷胱甘肽和半胱氨酸和0.2mM PIC-1处理的RBC中的抗-吖啶抗体结合
还将二肽半胱氨酸-甘氨酸(CysGly)用作猝灭剂。将标准条件和20mM中和的半胱氨酸(2当量碱)与不同浓度的CysGly使用和不使用1当量的碱比较。结果如表14中所示。这些结果与那些对谷胱甘肽和半胱氨酸观察到的结果一致，即，当使猝灭剂的量增加时，例如，需要通过中和猝灭剂调节pH以便改善猝灭。
表14使用CysGly进行和不进行中和的猝灭与20mM中和的半胱氨酸或标准条件的比较。抗-吖啶抗体结合的凝胶卡片分析
实施例9
通过本发明方法的处理消除使用标准处理的红细胞观察到的交叉反应性
使用来自产生了与已经用2mM谷胱甘肽和0.2mM PIC-1处理的RBC交叉反应的抗体的患者的血清以便评价使用改进方法的交叉反应性。如实施例1中所述制备使用O阴性血液(Blood Source，Sacramento，CA)的样品并且用2mM谷胱甘肽和0.2mM PIC-1，用0.2mM PIC-1，1分钟后再用20mM中和的谷胱甘肽(2当量碱)或用20mM中和的谷胱甘肽，1分钟后再用0.2mM PIC-1处理。还制备了未处理的对照RBC样品。将每种样品用BBS洗涤三次，然后在低离子强度盐水中悬浮至血小板比容为8％(AABB手册，第14th版)。将50μL等分试样各自与25μL患者血清一起加入到凝胶卡片上，并且将该混合物在37℃下孵育15分钟。凝胶卡片含有兔抗-人IgG，它会使结合来自患者血清的抗体的RBC凝集。如实施例7所述离心凝胶卡片。按照与实施例7所述相同的等级读取凝胶卡片。使用三种不同血清测试的样品显示出使用标准处理的RBC的得分为3+，而使用未处理的对照品或20mM(2当量)中和的谷胱甘肽处理的样品的得分为0。
实施例10
甲硫氨酸作为评价因pH调节所致的猝灭而与巯基猝灭无关的模型的应用
因为甲硫氨酸(Met)在硫原子上带有甲基取代基，而其它部分与半胱氨酸极为相似，所以它可以用作评价单独的pH调节对猝灭的影响的模型氨基酸。甲基的存在消除了硫原子的亲核本性，使得任何猝灭均可以因溶液的pH增加所致(例如较高浓度的氢氧化物可以提供一定的猝灭)。将20mM甲硫氨酸(Aldrich)与1或2当量加入的碱一起使用，并且与半胱氨酸(1或2当量)和谷胱甘肽(2当量)比较，在所有情况中均在加入猝灭剂后10分钟加入0.2mM PIC-1。包括标准条件，即同时加入的0.2mM PIC-1和2mM酸性谷胱甘肽。通过如实施例7所述对抗-吖啶兔血清结合进行凝胶卡片分析来评价样品，不同之处是将用于凝胶卡片分析的样品在37℃或室温下孵育。结果如表15中所示。结果表明用2当量的碱中和的甲硫氨酸与标准条件相比提供了改善的猝灭。
表15如通过抗-吖啶兔血清结合凝胶卡片分析评价的使用甲硫氨酸、半胱氨酸或谷胱甘肽的猝灭
实施例11
对用20mM中和的谷胱甘肽和0.2mM PIC-1处理的全单位的体外功能性研究
减少全单位红细胞浓缩物(Interstate Blood Bank，Inc.，Memphi s，TN)的白细胞。将200mL体积的这种RCC(80％血小板比容)与作为对照品的94mL的Erythrosol或100mL的Adsol(BaxterHealthcare Corp.，Deerfield，IL)混合(单位1)。将20mL体积的8％葡萄糖用于溶解PIC-1(mg)和酸性谷胱甘肽(mg)并且加入到1单位中以便提供0.2mM PIC-1和2mM谷胱甘肽(单位2)。就单位3和4而言，将PIC-1(mg)和谷胱甘肽(mg)分别溶于相应的10mL或8.8mL的8％葡萄糖。就谷胱甘肽而言，加入1.2mL10N NaOH(2当量)。将PIC-1与所述单位混合，1分钟后(单位3)或5分钟后(单位4)加入谷胱甘肽。就单位5而言，首先混合中和的谷胱甘肽，随后在10分钟后加入PIC-1。就单位6而言，将谷胱甘肽溶于18.8mL8％葡萄糖并且与1.2mL10N NaOH混合，然后与RBC混合(无PIC-1)。通过夹紧血袋端口并且以8字形运动混合30次来混合所有单位。然后将它们在室温下孵育总计20小时。将包含在网状袋中含有聚合树脂的化合物吸附装置(CAD)用于除对照样品外的所有样品。该装置指定用于从样品中除去残留的PIC-1、PIC-1分解产物和谷胱甘肽。将样品孵育8小时，然后转入第二个含有CAD的血袋并且再孵育12小时。在室温下孵育后，将样品转入冰箱(4℃)并且贮存长达43天。在混合后12小时和20小时并且此后每周从每个单位中取出等分试样。对等分试样分析总血红蛋白、pH、胞内ATP、血浆血红蛋白、钾、胞外葡萄糖和胞外乳酸。另外如实施例4中所述通过FACScan分析评价抗-兔血清结合。使用PIC-1处理的用或未用CAD处理的单位重复本研究。ATP、溶血和抗-兔血清结合的结果如表16A-C和17A-C中所示。
表16A-C样品特征：
1：未处理的对照品
2：标准处理0.2mM PIC1+2mM GSH
3：0.2mM PIC-1，1′延迟，20mM GSH+2当量的碱
4：0.2mM PIC-1，5′延迟，20mM GSH+2当量的碱
5：20mM GSH+2当量的碱，10′延迟，0.2mM PIC-1
6：0.2mM GSH+2当量的碱
表16A42天贮存期内的ATP数据
表16B42天贮存期内的溶血百分比
表16C通过抗-吖啶抗体结合(FACScan)测定的42天贮存期内的RBC修饰
表17A-C样品特征：
1：标准处理，0.2mM PIC-1，2mM GSH+CAD
2：标准处理，0.2mM PIC-1，2mM GSH
3：0.2mM PIC-1，1′延迟，20mM中和的GSH+CAD
4：0.2mM PIC-1，1′延迟，20mM中和的GSH
5：20mM中和的GSH，10′延迟，0.2mM PIC-1+CAD
6：20mM nGSH，10′延迟，0.2mM PIC-1
7：20mM中和的GSH
8：未处理的对照品
表17A42天贮存期内的胞内ATP值
表17B42天贮存期内的溶血百分比
表17C通过抗-吖啶抗体结合(FACScan)测定的42天贮存期内的RBC修饰
实施例12
兔模型中处理的红细胞的免疫反应性的体内评价
使用同种异体输血模型对已经使用改进的猝灭方法的一个非限制性实例用S-303处理过的红细胞(RBC)，在本实施例中称作″修饰的S-303RBC″的免疫反应性进行体内评价(对改进的S-303RBC方案的描述参见下文)。使用的同种异体输血模型基于Ness等所述的兔模型(Trans Med Rev，2001，15：305-17)以便研究延迟的溶血性输血反应的机制。在该模型中，将HgD-阳性红细胞用于对HgD-阴性受体动物进行免疫接种。然而，与文献中一致的是HgD-错配的RBC仅仅偶尔导致抗体形成，Ness等采用皮下给予合并了佐剂的HgD-阳性RBC以便产生可测量滴度的抗-HgD抗体。
分两期进行评价：在1期中，给兔反复输注同种异体兔RBC，该RBC在HgD座位上错配并且用原始S-303方法处理(参见下文描述)。1期的终点是确定在长期同种异体输血情况下对原始S-303RBC是否会产生抗体反应。在2期中，通常给兔免疫接种在佐剂中的KLH-吖啶结合物以便剂激抗-吖啶抗体的形成。然后该这些免疫接种的动物输注S-303RBC。2期的终点是比较通过原始和改进的S-303RBC方法制备的RBC的回收率和寿命。1期和2期实验中的对照样品包括通过原始和改进方法制备的S-220RBC。S-220为应代表对每种处理方法而言在吖啶对RBC s的结合方面最坏情况的S-303的非-不稳定形式。这些研究的结果表明体内高滴度抗体的存在不会影响修饰的S-303。
A.材料和方法
动物饲养：雄性和雌性的新西兰白兔约5-7个月龄并且在研究开始时称重为3.5-4.5kg。供体动物为HgD-阳性的；受体动物为HgD-阴性的。
试剂：按照表18的配方由Baxter Healthcare生产的不含葡萄糖的Erythrosol。8％葡萄糖一水合物的溶液也由Baxter制备。
表18.Erythrosol的组成(不含葡萄糖)
组分 浓度(mg／100mL)
柠檬酸钠二水合物 782
腺嘌呤 21.5
甘露糖醇 774
磷酸二氢钠二水合物 73.4
无水磷酸氢二钠 242
用于本实施例的灭活病原体的化合物为在本实施例中称作S-303的PIC-1。通过γ照射给S-303·2HCl灭菌。将称作S-220的S-303的非脆弱性类似物用作对照品。S-303(本文中也称作″PIC-1″)和S-220的化学结构如下：
这两种化合物在结构上极为类似，但脆弱性酯键仅存在于S-303中。S-303在本文中有时称作脆弱性锚定连接效应化合物(FrangibleAnchor Linker Effector)(FRALE)且S220称作锚定连接效应化合物(Anchor Linker Effector)(ALE)。
以两种方式之一提供GSH：作为通过γ照射灭菌的预称重的184mg粉末(Baxter Healthcare)或作为在RBC处理时称重和配制的散装物质(Aldrich，St.Louis MO)。
RBC处理：在制备的24-36小时内输注RBC。在ACD-A中以无菌方式从HgD-阳性供体中采血。将约410-500mL全血汇集到塑料容器中并且以4200x g离心6分钟。在除去血浆后，加入94mL不含葡萄糖的Erythrosol以便产生具有约60％血细胞比容的压紧的红细胞制品。如附图2中所示和如下所述的三种方式之一处理压紧的红细胞。
对照RBC：将压紧的红细胞与20mL8％葡萄糖混合且然后在输注前贮存在4℃下(至多2天)。
原始S-303RBC：将GSH(184mg)溶于20mL的8％葡萄糖。然后将这种GSH溶液(pH2.8-3.0)用于溶解S-303·2HCl(33mg)。随后将这种S-303／GSH溶液加入到压紧的红细胞中并且手工混合。将RBC在室温下孵育12小时且然后使其接触化合物吸附装置(CAD)另外8小时，同时混合。S-303和GSH在原始方法中的终浓度分别为0.2mM和2.0mM。然后在输注前将原始S-303RBC贮存在4℃下。使用用于人的临床研究的相同的一次性试剂盒进行用原始方法的处理。
修饰的S-303RBC：称取GSH·HC l(2026mg)放入无菌塑料管中并且溶于9.32mL8％葡萄糖。然后将酸性GSH与代表2当量碱的1.32mL10N NaOH合并。将10mL无菌过滤的在葡萄糖中的碱性GSH(pH9)加入到压紧的红细胞中并且手工混合。在10分钟内，将S-303·2HCl(33mg)单独溶于10mL8％葡萄糖，加入到压紧的红细胞中并且手工混合。将修饰的S-303RBC在室温下孵育并且以与原始方法相同的方式使其接触CAD。S-303和GSH在改进方法中的终浓度分别为0.2mM和20mM。
S-220RBC：S-220为缺乏不稳定酯的S-303的类似物且因此不能在RBC处理过程中通过从分子的其余部分水解来裂解吖啶。使用与对S-303所述的原始或改进方法类似的方法制备S-220RBC并且在一切可能的情况下都使用来自原始方法的一次性物品。就原始S-220RBC而言，S-220和GSH的终浓度分别为0.2mM和2.0mM。就修饰的S-220RBC而言，S-220和GSH的终浓度分别为0.2mM和20mM。
吖啶免疫接种：为了引发高滴度的抗-吖啶抗体产生，在2期中给兔免疫接种KLH-吖啶结合物。通过在室温下使等摩尔量(476μM)的KLH(Pierce Biotechnology，IL)和S-220在磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)中反应48小时制备2-5mL规模的KLH-吖啶。通过流经脱盐柱从KLH-吖啶中分离S-220的小分子降解产物。KLH-吖啶结合物的特征在于其在210和410nm处的吸收，并且使用S-220的消光系数确定吖啶与KLH之比。一般而言，每个分子的KLH中形成200-400个吖啶加合物。在使用之前将KLH-吖啶溶液冷藏。在第1天时给兔在腘、前肩胛和前股淋巴结(每个部位上约0.1mL)上方的10个部位上经皮下免疫接种在弗氏完全佐剂中的KLH-吖啶(0.5mg／mL)。在第8，15，36和64天时，给动物在相同部位上(每个部位上约0.1mL)加强接种在弗氏不完全佐剂中的KLH-吖啶(0.25mg／mL)。每隔两周测试一次兔血清样品中的抗体形成。
吖啶抗体的检测(1期)：使用流式细胞计量测定法检测吖啶抗体。使用原始处理方法将人S-303RBC制备成测试试剂。按照1∶4稀释兔血清并且将25μL稀释的血清与50L血细胞比容为0.8％的人S-303RBC混合。将免疫接种前血清作为阴性对照测试。将样品在37℃下孵育30分钟，然后洗涤并且重新悬浮于50μL的血库盐水中。按照1∶64稀释FITC-标记的山羊抗-兔I gG(供应商)并且将25μL与RBC样品在37℃下孵育30分钟。再次洗涤样品并且通过FACS，使用FL1通道分析以便检测结合的抗体复合物。一旦鉴定了阳性血清，就用兔血清稀释液进行相同的操作步骤以便确定终点滴度。
吖啶抗体的检测(2期)：使用原始处理方法(0.2μMS-303，2mM GSH)将人S-303RBC制备成测试试剂。用血库盐水(BBS，Fi sherScientific)将RBC洗涤三次并且在BBS中稀释至约4％血细胞比容。用BBS连续稀释来自第V和VI组兔的血清。将25μL4％RBC与15μL兔血清合并并且将其在37℃下孵育30分钟。使用BBS代替阴性对照血清。在孵育后，用BBS将RBC洗涤三次且然后重新悬浮于50μL在BBS中按1∶64稀释的FITC结合的山羊F(ab′)2抗-兔IgG(H&L)(Caltag)中。将RBC在37℃下孵育30分钟并且用BBS洗涤三次。然后将样品重新悬浮于1ml HaemaLine-2(HL2，Sereno Diagnostics)中。通过FACS，使用FL1通道分析样品以便检测结合的抗体复合物。
RBC输注和RBC寿命的测定：使用输注泵以1mL／分钟通过耳静脉经静脉给予RBC。在1期中，给予兔的剂量为10mL RBC／kg，而在2期中，给予兔的剂量为4mL RBC／kg。在用于镰状细胞和地中海贫血患者的方案中，10mL／kg剂量相当于近似量的每月输注的血液。
在用S-303或S-220处理后对RBC进行生物素化。用200mL PBSG(12mM磷酸盐，138mM NaCl，2.7mM KCl，5mM葡萄糖，pH7.4)将RBC(300mL)洗涤两次并且重新悬浮于相同介质中。然后将它们与等体积的含有60μMNHS-生物素(Aldrich，St Louis MO)的PBSG混合并且在37℃下孵育1小时。在孵育后，用200mL PBSG将它们洗涤三次并且最终悬浮于血细胞比容为50％的PBSG中且在输注前贮存在冰箱中。
通过FACScan分析评价RBC的寿命。在输注后以定期间隔(1，3，7，15，21和28天)从所有动物中获取兔血液。使样品通过80微米滤器以便除去微凝块，在PBSG中稀释至0.07％HCT并且在室温下和暗处与藻红蛋白-标记的链霉抗生物素(1∶100稀释，Molecular Probes)一起孵育20分钟。对稀释5倍的样品进行FACS分析并且以400个事件／秒的速率收集总计50，000个事件以便能够进行精确的细胞定量。通过在第0天时外推至100％回收率计算生物素化的RBC的寿命。然后将在随后天的值表示为占第0天时的值的百分比。在适当时，使用斯氏t-检验与异方差性(heteroskeda s t ic)分析来分析具有统计学意义的寿命差异。
B.1期：错配的RBC的反复输注
在1期中，每两周给动物输注一次10mL／kg同种异体的在HgD座位上错配的RBC，持续24周，以便确定是否能检测到对S-303RBC的反应。动物分组如表19中所述。
表19.1期中的动物分组
分组 数量 免疫接种方案
第1组 4 对照RBC，静脉内
第2组 6 原始方法S-303RBC，静脉内
第3组 2 KLH-吖啶结合物，皮下
第4组 6 原始方法S-220RBC，静脉内
以每周间隔对血清取样并且用基于流式细胞计量术的测定法测试抗-吖啶抗体的存在。简言之，将通过原始方法(0.2mM S-303和2mMGSH)制备的人S-303RBC与按照1∶4稀释的兔血清一起孵育。在洗涤后，用带有FITC标记的山羊抗-兔IgG检测结合的兔抗体的存在。在以1∶4稀释的第3组中检测到唯一的阳性结果。完成24周输注的结果如附图1中所示。免疫接种了KLH-吖啶的动物表现出强烈的抗-吖啶抗体反应。相反，在反复输注通过原始方法制备的S-303或S-220RBC的动物中没有明显的抗体反应。
通过使用用针对大多数血清样品的原始方法处理的人S-303RBC进行凝集试验证实了附图1中所示的结果。仅来自免疫接种了KLH-吖啶的第3组动物的血清显示使人S-303RBC凝集。此外，我们在任何受体动物中均未观察到抗-HgD反应。
C.2期：免疫接种了KLH-吖啶的兔中RBC寿命的测定
由于反复输注S-303或S-220处理的抗原-错配的RBC制品无法产生抗-吖啶免疫反应，所以在2期中，采取更严格的手段以便引发抗-吖啶抗体产生。使用包括佐剂的常规已接触抗原-加强方案给动物免疫接种KLH-吖啶且然后测定在兔中的各种处理的RBC制品的体内寿命或高滴度抗体。来自1期的结果证实通过皮下免疫接种KLH-吖啶给兔免疫接种和获得高抗体滴度是切实可行的。
在2期中还使用了第1，2和4组中的动物。将这些组再分组并且给一亚组动物免疫接种KLH-吖啶，而对其余的动物维持其现存的输注方案。将首次用于任何类型的RBC输注的两个另外分组的HgD-阴性兔加入到2期中。表20中提供了2期中实验分组的描述。
表20.2期中的动物分组
组 数量 1期免疫接种 2期免疫接种
1A 2 对照RBC 对照RBC
1B 2 对照RBC KLH-吖啶
2A 2 原始S-303RBC 原始S-303RBC
2B 4 原始S-303RBC KLH-吖啶
4A 2 原始S-220RBC 原始S-220RBC
4B 4 原始S-220RBC KLH-吖啶
5 6 无 KLH-吖啶
6 6 无 KLH-吖啶
在2期中的免疫接种过程中，抗体产生后每周进行一次用于1期中的相同的FACS和凝集试验。在约8周后，所有免疫接种了KLH-吖啶的兔都产生了对人S-303RBC具有特异性的强抗体反应，而来自免疫接种不同RBC制品的动物的血清持续为非反应性的。
测定来自第V和VI组的血清中的抗-吖啶抗体滴度。使用流式细胞计量分析滴定来自第V和VI组中的输注1前(原始方法处理的RBC)和输注2前(改进方法处理的RBC)动物的血清样品。第V组动物接受用S-303处理的RBC，而给第VI组动物输注S-220处理的RBC。
将滴度定义为平均荧光高于背景的血清稀释度。所有兔均具有高滴度的抗-吖啶抗体。第V组在取自输注1前(″Pre-T1″)的血清中的滴度稍低于在输注2前(″Pre-T2″)血清中的滴度。第VI组滴度在两种输注前相同。
表21.输注1和输注2前的平均终点滴度／组
一旦通过KLH-吖啶免疫接种建立了血清抗体，就给每只动物输注以便确定不同RBC制品的体内寿命。使用生物素标记以便追踪RBC的体内循环(Suzuki和Dale(1987)Blood70：791-5)。NHS-生物素形成与RBC膜蛋白质的共价连接，并且可以使用荧光标记的链霉抗生物素检测。按照表22中的方案，兔接受约4mL RBC／kg。在第0天输注后，在第1，3，7，15，21和28天抽取血液以便测定相对于第0天而言，生物素标记的细胞在循环中的百分比。测试RBC为如表22中所示的未处理的对照RBC，使用原始或改进的方法制备的S-303RBC或使用原始或改进的方法制备的S-220RBC。
表22.通过动物分组确定RBC寿命的输注
组 吖啶抗体 输注1* 输注2*
1A 无 对照RBC 对照RBC
1B 有 对照RBC 对照RBC
2A 无 原始S-303RBC 原始S-303RBC
2B 有 原始S-303RBC 原始S-303RBC
4A 无 原始S-220RBC 原始S-220RBC
4B 有 原始S-220RBC 原始S-220RBC
5 6 原始S-303RBC 原始S-303RBC
6 6 原始S-220RBC 原始S-220RBC
*在输注前对所有RBC制品进行生物素标记
通过原始方法制备的RBC的寿命：在非免疫的和吖啶免疫的兔(分别为亚组1A和1B，表21)中测定对照RBC的存活期。由于在这些亚组之间RBC的寿命无差异，所以下文以图解方式将数据表示为同时显示的所有4组动物的平均回收百分比。将接受对照RBC的动物用作所有其它组的对比物。
在输注1中第4和6组接受通过原始方法制备的S-220RBC。使用S-220，因为它代表了半抗原形成的″最坏情况″。吖啶在体外处理过程中或随后在体内循环过程中不能被水解。在本研究的1期中第4A和4B组已经输注了原始的S-220RBC，而第6组首次接受S-220RBC(表20)。根据动物免疫接种史的不同，原始S-220RBC的寿命存在显著性差异(附图2)。接受对照RBC的第1组动物具有最长的RBC寿命并且可以在第57天时在循环中检测到生物素化的RBC。对照RBC的清除率随着时间的推移近似为线性的。相反，免疫接种了KLH-吖啶并且从未输注S-220RBC的第6组表现出原始S-220RBC的快速清除。在第20天时基本上检测不到S-220RBC。这表明第4B组中的兔表现出明显较长的RBC存活期，其中这些兔已经通过KLH-吖啶方法进行了免疫接种，但不同于第6组，它们还在1期中反复输注了原始S-220RBC。尽管如此，但是第4B组中原始S-220RBC的寿命比第4A组(未免疫接种过KLH-吖啶)减少。在第1组(接受对照RBC)和第4A组(接受原始S-220RBC)中测定的RBC寿命相差无几，不过，在第1组中对照RBC在循环中的百分比较高的时间超过三周。
通过在第2A，2B和5组中测定S-303RBC的寿命进行了类似的比较(附图3)。在第5组免疫接种了KLH-吖啶并首次接受S-303RBC的兔中观察到S-303RBC的寿命最短。然而，不同于第6组，截止到第20天时原始S-303RBC仍未被清除，并且到第57天时仍可以检测出生物素化的S-303RBC。引人关注的是，具有高水平的循环抗-吖啶抗体的第2B组兔中原始S-303RBC的寿命与接受对照RBC的第1组没有显著不同。在比较第2B组和第5组兔的结果中，看来预先接触原始S-303RBC改善了抗-吖啶抗体对RBC清除率的影响。这一令人意外的结果与使用原始S-220RBC对第4B和6组观察到的结果类似(附图2)。
通过改进的方法制备的RBC的寿命：研发了改进的方法以便通过改变多个参数改善使用GSH的猝灭。首先，将GSH的量增加10-倍。其次，用NaOH滴定GSH，此后加入到RBC中；这一步骤改善了-SH基团的亲核性。这些改变导致与RBC表面结合的S-303明显减少(例如，参见实施例5和实施例13)。使用相同手段制备了修饰的S-220RBC。
在第4A，4B和6组中评价了修饰的S-220RBC的寿命(附图4)。如前面对使用原始方法制备的S-220RBC所观察到的，第6组动物中修饰的S-220RBC的寿命比在第1组动物中输注的对照RBC的寿命明显缩短。然而，修饰的S-220RBC随着时间的推移在循环中的减少明显低于使用原始S-220RBC在相同动物中观察到的情况。例如，在第14天时平均18％修饰的RBC为循环的，而在相同的时间点仅观察到1.4％的原始RBC。此外，在第4A组(无抗体)和第4B组(KLH-吖啶诱导的抗体)中修饰的S-220RBC的寿命等于或长于第1组中对照RBC的寿命。与前面的数据一致(附图3)，看来预先接触原始S-220RBC甚至在有高滴度抗体存在下仍增加了S-220RBC的寿命。
最后，将在第2A，2B和5组中修饰的S-303RBC的寿命呈现在附图5中。在所有情况下，修饰的S-303RBC的寿命都与对照RBC的寿命相差无几。甚至对于已经显示出原始S-303RBC清除率增加的第5组动物来说也是这种情况。这一重要数据证明了这一体外发现，即，通过改进的方法制备的S-303处理的RBC在体外与由几种来源产生的抗-吖啶抗体无免疫反应性。所述抗体包括患者血清、鼠单克隆抗体和兔多克隆抗血清。
实施例13
S-303处理的RBC的另外的FACScan分析
为了对进行S-303(PIC-1)结合的RBC进行细胞计量测试，用1.2mL0.9％盐水将50μL血液洗涤三次且然后重新悬浮于0.75mL盐水中至约4％血细胞比容。将25μL的RBC与15μL的按照1∶100稀释的抗-吖啶兔血清合并。在37℃下孵育30分钟后，如上所述将样品洗涤三次。然后将RBC沉淀重新悬浮于50μL体积的在0.1％牛血清白蛋白中按1∶64稀释制备的FITC-标记的山羊抗-兔抗体(Caltag)中。将样品在37℃下在暗处孵育30分钟。在三次另外的洗涤后，将RBC重新悬浮于1mL HaemaLine-2(Serono Diagnostics)中。在稀释至0.01％血细胞比容后，收集20，000个事件并且在600nm处分析荧光。
正如使用流式细胞计量测定法所检测的，改进的方法导致S-303与RBC表面的结合水平明显较低。使用通过给兔免疫接种在佐剂中的KLH-吖啶结合物制备的多克隆兔抗血清检测与RBC结合的S-303。然后使用FITC-标记的山羊抗-兔IgG检测结合的兔IgG。对于使用原始的和改进的方法制备的9种单独的RBC的汇集物在附图6中显示了FACScan结果。对每一汇集物而言，将FACScan测定法用于检测与C-RBC、O-RBC和M-RBC结合的S-303。相对于原始的方法而言，通过改进的方法使S-303与RBC表面的结合减少了15-至35-倍。
可以理解的是本文所述的实施例和实施方案仅用于解释目的，并且提示本领域技术人员可以依据它们进行各种变型或改变，且这些变型或改变包括在本申请的实质和范围内。
为所有目的而将本文引用的所有出版物、专利、专利申请和登记号(包括多核苷酸和多肽序列)完整地引入本文作为参考，其引用程度与将各个出版物、专利、专利申请或登记号具体和分别引入作为参考的程度相同。

Claims (58)

1.处理红细胞组合物的方法，包括将下列物质与红细胞组合物混合：
(a)灭活病原体的化合物，其中该灭活病原体的化合物包含核酸结合配体和为或形成能够与核酸反应的亲电子基团的官能团；
(b)包含巯基的猝灭剂，其中巯基能够与亲电子基团反应；和
(c)足量的合适的碱以便降低灭活病原体的化合物与混合物中红细胞的不需要的反应的水平，所述的混合物与不含碱的混合物相比包含红细胞组合物、灭活病原体的化合物、猝灭剂和碱。
2.权利要求1所述的方法，其中灭活病原体的化合物与红细胞的不需要的反应为灭活病原体的化合物对红细胞表面的修饰。
3.权利要求1所述的方法，其中在将灭活病原体的化合物与红细胞组合物混合前，混合同时或混合后不超过约30分钟将碱和猝灭剂与红细胞组合物混合。
4.权利要求1所述的方法，其中在将碱或猝灭剂与红细胞组合物混合前将所述的碱和所述的猝灭剂彼此混合。
5.权利要求1所述的方法，其中猝灭剂和碱均由包含猝灭剂的碱式盐提供。
6.权利要求1所述的方法，其中所述的碱为NaOH。
7.权利要求1所述的方法，其中所述的碱为碱性缓冲剂。
8.权利要求1所述的方法，其中所述的碱包含至少约1当量碱，其中当量意指与混合物中猝灭剂的摩尔量相等的摩尔量。
9.权利要求1所述的方法，其中猝灭剂在所得混合物中的浓度大于2mM。
10.权利要求9所述的方法，其中猝灭剂在所得混合物中的浓度在约10mM-30mM的范围。
11.权利要求1所述的方法，其中所得混合物在室温下具有约7.0-8.5的pH。
12.权利要求1所述的方法，其中所述的猝灭剂包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。
13.权利要求12所述的方法，其中所述的猝灭剂为谷胱甘肽。
14.权利要求1所述的方法，其中所述的官能团选自芥子、芥子中间体和芥子等效物。
15.权利要求14所述的方法，其中所述的灭活病原体的化合物为β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯。
16.权利要求1所述的方法，其中所述的处理导致红细胞组合物中至少为1log的病原体污染物灭活。
17.权利要求1所述的方法，进一步包括降低混合物中灭活病原体的化合物的浓度的最终步骤。
18.组合物，包含用权利要求17所述方法生产的红细胞。
19.处理红细胞组合物的方法，包括将下列物质与红细胞组合物混合：
(a)灭活病原体的化合物，其中该灭活病原体的化合物包含核酸结合配体和为或形成能够与核酸反应的亲电子基团的官能团；
(b)包含巯基的猝灭剂，其中巯基能够与亲电子基团反应；和
(c)足量的合适的碱以便增加混合物的pH，所述的混合物与不含碱的混合物相比包含红细胞组合物、灭活病原体的化合物、猝灭剂和碱。
20.权利要求19所述的方法，其中在将灭活病原体的化合物与红细胞组合物混合前，混合同时或混合后不超过约30分钟将碱和猝灭剂与红细胞组合物混合。
21.权利要求19所述的方法，其中在将碱或猝灭剂与红细胞组合物混合前将所述的碱和所述的猝灭剂彼此混合。
22.权利要求19所述的方法，其中猝灭剂和碱均由包含猝灭剂的碱式盐提供。
23.权利要求19所述的方法，其中所述的碱为NaOH。
24.权利要求19所述的方法，其中所述的碱为碱性缓冲剂。
25.权利要求19所述的方法，其中所述的碱包含至少约1当量碱，其中当量意指与混合物中猝灭剂的摩尔量相等的摩尔量。
26.权利要求19所述的方法，其中猝灭剂在所得混合物中的浓度大于2mM。
27.权利要求26所述的方法，其中猝灭剂在所得混合物中的浓度在约10mM-30mM的范围。
28.权利要求19所述的方法，其中所得混合物在室温下具有约7.0-8.5的pH。
29.权利要求19所述的方法，其中所述的猝灭剂包含半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。
30.权利要求29所述的方法，其中所述的猝灭剂为谷胱甘肽。
31.权利要求19所述的方法，其中所述的官能团选自芥子、芥子中间体和芥子等效物。
32.权利要求31所述的方法，其中所述的灭活病原体的化合物为β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯。
33.权利要求19所述的方法，其中所述的处理导致红细胞组合物中至少为1log的病原体污染物灭活。
34.权利要求19所述的方法，进一步包括降低灭活病原体的化合物在混合物中的浓度的最终步骤。
35.组合物，包含用权利要求34所述方法生产的红细胞。
36.处理红细胞组合物的方法，包括：
(a)提供：i)包含为或形成反应性亲电子基团的官能团的灭活病原体的化合物；ii)包含巯基的猝灭剂，其中巯基能够与灭活病原体的化合物的反应性亲电子基团反应；和iii)包含红细胞的组合物，其中存在红细胞组合物被病原体污染的可能性；和
(b)将灭活病原体的化合物和猝灭剂与包含红细胞的组合物混合，其中猝灭剂在所得混合物中的浓度大于2mM，
其中所得混合物在室温下的pH在约7.0-8.5的范围。
37.权利要求36所述的方法，进一步包括下列步骤：
(c)调节包含红细胞的组合物的pH，使得所得混合物在室温下的pH在约7.0-8.5的范围。
38.权利要求36所述的方法，其中通过向红细胞组合物中添加至少约1当量的碱调节包含红细胞的组合物的pH，其中当量意指与猝灭剂在混合物中的摩尔量相等的摩尔量。
39.权利要求36所述的方法，其中在向红细胞组合物中添加猝灭剂前用至少约1当量的合适的碱中和猝灭剂，并且通过添加中和的猝灭剂调节包含红细胞的组合物的pH。
40.权利要求36所述的方法，其中所得混合物在室温下具有约7.2-8.5的pH。
41.权利要求36所述的方法，其中猝灭剂在所得混合物中的浓度在约10mM-30mM的范围。
42.权利要求36所述的方法，其中所述的猝灭剂包含半胱氨酸或合适的半胱氨酸衍生物。
43.权利要求42所述的方法，其中所述的猝灭剂为谷甘胱肽。
44.权利要求36所述的方法，其中所述的反应性亲电子基团选自芥子、芥子中间体和芥子等效物。
45.权利要求44所述的方法，其中所述的灭活病原体的化合物为β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯。
46.权利要求36所述的方法，其中所述的处理导致红细胞组合物中至少为1log的病原体污染物灭活。
47.权利要求36所述的方法，进一步包括降低灭活病原体的化合物在混合物中的浓度的最终步骤。
48.用权利要求47所述方法生产的红细胞组合物。
49.处理红细胞组合物的方法，包括下列顺序的步骤：
(a)提供：i)β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯；ii)中和的谷胱甘肽；和iii)包含红细胞的组合物，其中存在红细胞组合物被病原体污染的可能性；
(b)将中和的谷胱甘肽与包含红细胞的组合物混合；
(c)将该混合物孵育适当的时间间隔；和
(d)将β-丙氨酸、N-(吖啶-9-基)、2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯与中和的谷胱甘肽和包含红细胞的组合物的混合物混合，其中如果病原体存在于包含红细胞的组合物中，那么它被灭活至少1log。
50.在有猝灭剂存在下用灭活病原体的化合物处理包含红细胞的组合物的过程中改进灭活病原体的化合物与红细胞的不需要的副反应猝灭的方法，其中猝灭剂包含巯基，并且其中灭活病原体的化合物包含为或形成亲电子试剂的官能团，所述的亲电子试剂与猝灭剂的巯基反应，该方法包括：增加包含红细胞组合物、灭活病原体的化合物和猝灭剂的反应混合物的pH。
51.权利要求50所述的方法，进一步包括下列步骤：增加反应混合物中猝灭剂的浓度。
52.权利要求50所述的方法，其中灭活病原体的化合物与红细胞的不需要的反应为灭活病原体的化合物对红细胞表面的修饰。
53.组合物，包含：
(a)红细胞；
(b)包含核酸结合配体和反应性亲电子基团的灭活病原体的化合物；和
(c)包含能够与亲电子基团反应的巯基的猝灭剂，
其中猝灭剂的浓度大于2mM，并且组合物的pH在约7.0-8.5的范围。
54.试剂盒，包含：灭活病原体的化合物，该化合物包含核酸结合配体和为或形成亲电子基团的官能团；包含巯基的猝灭剂；和至少约1当量的碱，其中当量意指与试剂盒中猝灭剂的摩尔量相等的摩尔量。
55.用权利要求1所述方法生产的红细胞组合物。
56.用权利要求19所述方法生产的红细胞组合物。
57.用权利要求36所述方法生产的红细胞组合物。
58.用权利要求49所述方法生产的红细胞组合物。
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