BRPI0518198B1

BRPI0518198B1 - método ex vivo para tratar uma composição de células hemácias para inativar um patógeno, se presente, bem como composição e kit

Info

Publication number: BRPI0518198B1
Application number: BRPI0518198A
Authority: BR
Inventors: Stassinopoulos Adonis
Original assignee: Cerus Corp
Priority date: 2004-10-29
Filing date: 2005-10-31
Publication date: 2018-11-21
Also published as: JP5346468B2; EP1838355B1; CN103961731B; BRPI0518198A; JP2012107068A; DK1838355T3; JP5718840B2; ES2429088T3; AU2011201554A1; CN101094692A; BRPI0518198B8; CN103961731A; JP2008518952A; CA2585621A1; EP1838355A1; HK1109594A1; JP2013256537A; CA2585621C; US7655392B2; US20060115466A1

Abstract

métodos de interrupção melhorados para processos de inativação de células hemâcias. a presente invenção refere-se a métodos para a interrupção melhorada de reações secundárias indesejáveis no tratamento de uma composições de células hemácias que são fornecidos com um composto inativador de patógeno compreendendo um ligante que se liga a ácidos nucléícos e um grupo funcional o qual é, ou o qual é capaz de formar um grupo eletrofílíco. em algumas modalidades, os métodos melhorados usam uma concentração adequadamente alta de supressor que compreende um grupo funcional nucleofilico que é capaz de reagir covalentemente com o grupo eletrofilíco, em que o tratamento ocorre em uma faixa de ph desejada para fornecer supressão suficiente. supressores preferidos para uso em alguns dos métodos incluem tióis, tais como glutationa, os quais tenham sido adequadamente neu- tralizados de forma que a adição a uma composição de células hemácias resulte na concentração desejada de supressor em uma faixa de ph desejável de 6,8 a 8,5.

Description

(54) Título: MÉTODO EX VIVO PARA TRATAR UMA COMPOSIÇÃO DE CÉLULAS HEMÁCIAS PARA INATIVAR UM PATÓGENO, SE PRESENTE, BEM COMO COMPOSIÇÃO E KIT (73) Titular: CERUS CORPORATION, Sociedade Norte Americana. Endereço: 2411 Stanwell Drive, Concorc CA 94520, ESTADOS UNIDOS DA AMÉRICA(US) (72) Inventor: ADONIS STASSINOPOULOS.

Prazo de Validade: 10 (dez) anos contados a partir de 21/11/2018, observadas as condições legais

Expedida em: 21/11/2018

Assinado digitalmente por:

Alexandre Gomes Ciancio

Diretor Substituto de Patentes, Programas de Computador e Topografias de Circuitos Integrados

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MÉTODO EX

VIVO PARA TRATAR UMA COMPOSIÇÃO DE CÉLULAS HEMÁCIAS

PARA INATIVAR UM PATÓGENO, SE PRESENTE, BEM COMO COMPOSIÇÃO E KIT.

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Esse pedido reivindica o benefício da prioridade do Pedido Provisório U. S. N° de Série 60/623.177, requerido em 29 de outubro de 2004, o qual é por meio disto incorporado por referência na sua totalidade.

Campo da Invenção

O campo dessa invenção se refere aos métodos de supressão de compostos eletrofílicos reativos usados no tratamento de produtos de sangue para inativar possíveis contaminantes patogênicos. Particularmente, compostos nucleofílicos, tais como tióis, são usados para suprimir os compostos eletrofílicos reativos nas composições de células hemácias.

Antecedentes da Invenção

A transmissão de doenças por produtos de sangue e outros materiais biológicos permanece como um sério problema de saúde. Com os avanços significativos que ocorreram na triagem de doadores sangüíneos e testagem sangüínea, vírus tais como da hepatite B (HBV), hepatite C (HCV) e vírus da imunoeficiência humana (HIV) podem escapar da detecção nos produtos sangüíneos durante o teste devido aos baixos níveis de vírus ou de anticorpos virais. Além dos perigos virais, não existem atualmente testes licenciados adequados para fazer a triagem para a presença de micróbios nãovirais, tais como bactérias ou protozoários, em sangue tencionado para uso em transfusões. O risco também existe de que um patógeno desconhecido até agora possa ficar prevalente no fornecimento de sangue e apresente uma ameaça de transmissão de doença, como de fato ocorreu antes do reconhecimento do fator de risco de transmissão de HIV através de transfusões sangüíneas.

Agentes químicos foram introduzidos no sangue ou no plasma sanPetição 870180029918, de 13/04/2018, pág. 15/27 güíneo para inativar patógenos antes do uso clínico do produto sangüíneo. Tipicamente, para os produtos sanguíneos com pouco ou nenhum conteúdo de células hemácias, tais como plaquetas e plasma, compostos fo-toquimicamente ativados, tais como psoralens são usados. Para produtos sangüíneos contendo células '5 hemácias, compostos foram desenvolvidos para a inativação de patógenos, os quais não requerem a fotoativação. Esses compostos tipicamente têm grupos eletrofílicos que reagem com patógenos, mais especificamente com ácidos nucléicos de patógenos. Por exemplo, a Patente U. S. N- 5.055.485 descreve a inativação de vírus em células e proteínas contendo composições usando epóxidos de aril 10 diol. Outros compostos que geram eletrófilos in situ podem ser usados. LoGrippo et al. Avaliou o uso de mostarda de nitrogênio, CH₃-N(CH2CH2CI)₂ para inativação viral. LoGrippo et al., Proceedings of the Sixth Congress of the International Society of Blood Transfusion, Bibliotheca Haematologica (Hollander, ed.), 1958, pp. 225230. Mais significativamente, as Patentes U. S. N²*⁵ 6.410.219 e 5.691.132, as des15 crições das quais são por meio desta incorporadas por referência, descrevem o uso de compostos que têm um componente objetivo de ácido nucléico assim como um componente eletrofílico que reage com o ácido nucléico para inativar o patógeno. A Patente U. S. N² 6.514.987, a descrição da qual é aqui incorporada por referência, descreve compostos similares, em que o componente objetivo de ácido 20 nucléico do composto está ligado ao componente eletrofílico reativo através de um ligante hidrolisável. Patentes U. S. números 6.136.586 e 6.617.157, as descrições das quais são por meio desta incorporadas por referência, descrevem o uso de oligômeros de etilenoimina e compostos relacionados para inativação de patógeno. Esses compostos derivados de etilenoimina tipicamente têm um grupo aziridi25 na, o qual fornece o componente eletrofílico reativo, e um componente de poliamina, o qual proporciona o alvejamento de ácido nucléico do composto. A classe geral de compostos alvejados de ácido nucléico com um grupo reativo eletrofílico ou similar com o ácido nucléico é usada para inativar patógenos no sangue, produtos de sangue e uma variedade de amostras de origem biológica.

Existe alguma preocupação de que, enquanto esses compostos são projetados para reagir especificamente com ácidos nucléicos, eles podem ainda reagir com outros componentes do sangue, tais como proteínas

ou membranas celulares. Essas reações secundárias são desfavoráveis e podem causar efeitos adversos, tais como modificações das proteínas e membranas celulares que possam ser reconhecidas pelo sistema imune. Quando tais produtos do sangue tratados são usados repetidamente, eles 5 podem resultar em uma resposta imune do receptor ao produto de sangue tratado. Patente U. S. N° 6.709.810, a descrição da qual é por meio disto incorporada por referência, descreve métodos de supressão de tais compostos inativadores de patógenos para reduzir o nível de quaisquer tais reações secundárias adversas. Entretanto, enquanto tais métodos significativamente 10 reduzem reações secundárias indesejáveis, uma outra redução de respostas imunes indesejadas é desejável. Testes clínicos recentes usando tais compostos para o tratamento de células hemácias indicaram a possibilidade de tais eventos adversos. Em uma matéria liberada para publicação da V. I. Technologies, Inc., de 17 de novembro de 2003, foi recomendado que seu tes15 te crônico de fase III do Sistema de Redução de Patógeno INACTINE® para células hemácias fosse interrompido devido a uma preocupação com as respostas dos anticorpos às células de hemácias tratadas com INACTINE®. Em uma matéria liberada para publicação da Cerus Corporation de 4 de setembro de 2003, foi indicado que eles voluntariamente interromperam um teste 20 de fase III para o seu programa de células hemácias inativadas por patógeno depois que dois pacientes de estudo desenvolveram anticorpos para as células hemácias tratadas com S-303, o composto usado no seu sistema de inativação de patógeno para células hemácias. Tais anticorpos são tipicamente detectados com o uso de um teste de antiglobulina indireto que pode ser 25 efetuado sem um conhecimento detalhado da natureza ou homogeneidade do anticorpo efetivo. Tais ensaios são bem conhecidos pelos indivíduos versados na técnica e são muito sensíveis, permitindo a detecção de tão poucas quanto 500 moléculas por RBC. O método mais comum de detectar esses anticorpos é através da mistura de soros de paciente com a preparação 30 de RBC que é um candidato para infusão e detecção se ocorrer uma reação de aglutinação. Isso é chamado de um parelhamento cruzado da unidade RBC com o soro do paciente. Mais sensibilidade é fornecida pela inclusão de

uma reação cruzada de imunoglobulina anti-humana com o anticorpo. Isso aumenta a reatividade entre IgGs ou outros anticorpos na superfície do RBC. Finalmente, mesmo uma maior sensibilidade de detecção pode ser obtida pela inclusão de potenciadores no meio reacional o qual aumenta a taxa dos 5 anticorpos um com o outro (manual AABB 13^a edição). Tais ensaios são mais sensíveis do que, por exemplo, ensaios de citometria de fluxo e podem ser observados mesmo quando outros métodos indicam a ausência de qualquer anticorpo potencial. Tal fenômeno ocorre em testes clínicos e muitas vezes está associado com populações de pacientes específicos que podem 10 ter uma alta tendência a desenvolver esses anticorpos.

Consequentemente, há uma necessidade por métodos para reduzir adicionalmente reações secundárias eletrofilicas indesejáveis de compostos inativadores de patógenos que reagem com patógenos através de um grupo eletrofilico, enquanto é preservada a capacidade do composto ina15 tivador de patógeno de inativar patógenos nocivos. Especificamente, existe uma necessidade por métodos melhorados de suprimir compostos inativadores de patógenos em células hemácias. Tal novo método é necessário para reduzir significativamente o risco de uma resposta imune adversa às células hemácias devido ao tratamento com um composto inativadorde patógeno.

Breve Resumo da Invenção

A presente invenção fornece uma variedade de métodos de tratamento de composições de células hemácias com compostos inativadores de patógenos sob condições melhoradas para suprimir uma reação secundária indesejada do composto inativador de patógeno com as células de 25 hemácias. Em algumas modalidades, a supressão é melhorada pelo ajuste do pH e/ou aumentos na concentração do supressor.

Em um aspecto, a presente invenção fornece um método de tratamento de uma composição de células hemácias compreendendo a) fornecer i) um composto inativador de patógeno compreendendo um grupo eletro30 filico reativo, ii) um supressor compreendendo um grupo tiol, e iii) uma composição compreendendo células hemácias, em que há uma possibilidade de que a composição de células hemácias esteja contaminada com um patóge no, e b) mistura do composto inativador de patógeno e do supressor com a composição compreendendo células de hemácias, em que a mistura resultante está em uma faixa de pH adequada para proporcionar a supressão adequada da ligação do composto inativador de patógeno para as células 5 hemácias. Em uma outra modalidade, o método inclui a etapa c) de ajuste do pH da composição compreendendo as células hemácias. Em algumas modalidades, o tratamento resulta na inativação de pelo menos 1 log, também pelo menos 2 log, ou pelo menos 3 log de um contaminante patógeno. Em algumas modalidades, a composição de células hemácias contém leu10 cócitos, e o tratamento resulta na inativação de pelo menos 1 log, também pelo menos 2 log, ou pelo menos 3 log dos leucócitos. Em algumas modalidades, o supressor é misturado com a composição compreendendo as células hemácias antes de adicionar o composto inativador de patógeno. Em algumas modalidades, o pH da composição compreendendo as células he15 mácias é ajustado antes da mistura com o composto inativador de patógeno e com o supressor. Em algumas modalidades, o pH da composição compreendendo as células hemácias é ajustado depois da adição do composto inativador de patógeno. Em algumas modalidades, o pH da composição compreendendo as células hemácias é ajustado pela adição do supressor. Em 20 algumas modalidades, a mistura do supressor, composto inativador de patógeno e composição compreendendo as células hemácias tem um pH em temperatura ambiente na faixa de cerca de 6,8 a 8,5 também cerca de 7,0 a 8,5, também cerca de 7,2 a 8,5, ou cerca de 7,2 a 8,0, uma vez que todos os três componentes foram misturados. Em algumas modalidades, a mistura do 25 supressor, do composto inativador de patógeno e composição compreendendo as células hemácias é incubada por um intervalo de tempo adequado, tal como por cerca de 30 minutos até 48 horas, também de cerca de 2 a 24 horas, também de cerca de 8 a 24 horas. Em uma outra modalidade, a incubação está em uma faixa de temperatura de cerca de 1°C até 30°C, também 30 de cerca de 18°C até 25°C, ou por volta da temperatura ambiente. Em algumas modalidades, a concentração do supressor, uma vez que todos os três componentes tenham sido misturados, está na faixa de cerca de 2 mM até cerca de 40 mM, também cerca de 4 mM até cerca de 40 mM, também cerca de 4 mM até cerca de 30 mM, também cerca de 5 mM até cerca de 30 mM, também cerca de 10 mM até cerca de 30 mM, também cerca de 20 mM. Em algumas modalidades, a concentração do supressor na mistura resultante é maior do que cerca de 2 mM, peío menos cerca de 4 mM, pelo menos cerca de 5 mM, pelo menos cerca de 10 mM ou pelo menos cerca de 15 mM. Em algumas modalidades, a razão molar do supressor para o composto inativador de patógeno uma vez que todos os três componentes tenham sido misturados é de cerca de 10:1 até cerca de 400:1, também de cerca de 10:1 até 10 cerca de 200:1, também de cerca de 20:1 até cerca de 200:1, também de cerca de 50:1 até cerca de 200:1, também de cerca de 100:1. Em algumas modalidades, o supressor compreende cisteína ou um derivado da cisteína. Em algumas modalidades, o supressor é um peptídeo compreendendo pelo menos uma cisteína ou um derivado da cisteína. Em uma modalidade prefe15 rida, o supressor é glutationa. Em algumas modalidades, o supressor é neutralizado e a adição do supressor neutralizado causa o ajuste do pH da composição de células de hemácias. Em algumas modalidades, o supressor neutralizado compreende cisteína ou um derivado de cisteína. Em algumas modalidades, o supressor neutralizado é um peptídeo compreendendo ciste20 ina ou um derivado da cisteína. Em algumas modalidades, o composto inativador de patógeno compreende um grupo de ligação de ácido nucléico. Em algumas modalidades, o grupo de ligação de ácido nucléico é um intercalador, tal como um grupo acridina. Em algumas modalidades, o grupo de ligação de ácido nucléico é uma poliamina. Em algumas modalidades, o com25 posto inativador de patógeno compreende um grupo de ligação de ácido nucléico ligado ao grupo eletrofílico reativo através de uma ligação hidrolisável. Em algumas modalidades, o grupo de ligação de ácido nucléico é um intercalador e o grupo eletrofílico reativo é selecionado do grupo consistindo em uma mostarda, um intermediário de mostarda e um equivalente de mostarda. 30 Em uma modalidade preferida, o supressor é glutationa neutralizada, em que glutationa protonada é neutralizada com cerca de 2 equivalentes de uma base adequada, e o composto inativador de patógeno é β-alanina, N7 (2$ (acridin-9-ila), éster de 2-[bis(2-cloroetil)amino]etila.

Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para tratar uma composição de células hemácias compreendendo, a) fornecer i) um composto inativador de patógeno compreendendo um grupo de ligação 5 de ácido nucléico, ii) um supressor compreendendo uma cisteína ou um derivado de cisteína e iii) uma composição compreendendo células hemácias, em que há uma possibilidade de que a composição de células hemácias esteja contaminada com um patógeno, b) mistura do supressor com a composição compreendendo as células hemácias, em que a adição do supressor 10 causa o ajuste do pH da mistura para um pH adequado, e c) mistura do composto inativador de patógeno com a composição compreendendo células de hemácias, em que um patógeno, caso presente na composição compreendendo células hemácias, é inativado por pelo menos 1 log, também pelo menos 2 log, também pelo menos 3 log. Em algumas modalidades, a 15 composição de células hemácias contém leucócitos, e o tratamento resulta na inativação de pelo menos 1 log, também pelo menos 2 log, ou pelo menos 3 log dos leucócitos. Em algumas modalidades, o supressor é misturado com a composição compreendendo as células hemácias antes de misturar com o composto inativador de patógeno. Em algumas modalidades, o su20 pressor é misturado com a composição compreendendo células hemácias subseqüentemente à mistura com o composto inativador de patógeno. Em algumas modalidades, o supressor e o composto inativador de patógeno são misturados com a composição compreendendo simultaneamente, ou essencialmente simultaneamente, as células hemácias, tal como cerca de 1 minu25 to um ao outro. Em algumas modalidades, a mistura do supressor e da composição compreendendo células hemácias é incubada por cerca de 1 a 30 minutos antes da mistura com o composto inativador de patógeno. Em algumas modalidades, essa incubação é em uma temperatura na faixa de cerca de 1°C até 30°C, também de cerca de 18°C até 25°C, ou acerca da tem30 peratura ambiente. Em algumas modalidades, a mistura do supressor, composto inativador de patógeno e da composição compreendendo células hemácias por um intervalo de tempo adequado, tal como por cerca de 30 minu8 llh tos a 48 horas, também por cerca de 2 a 24 horas, também por cerca de 8 a horas. Em uma outra modalidade, a incubação está em uma faixa de temperatura de cerca de 1°C até 30°C, também de cerca de 18°C até 25°C, ou acerca da temperatura ambiente. Em algumas modalidades, um pH ade5 quado na mistura do supressor com a composição compreendendo células hemácias está na faixa de cerca de 6,8 até 8,5, também cerca de 7,0 a 8,5, também cerca de 7,2 a 8,5, ou cerca de 7,2 a 8,0, conforme medido em temperatura ambiente. Em algumas modalidades, uma vez que todos os três componentes tenham sido misturados, o pH da mistura está na faixa de cer10 ca de 6,8 até 8,5, também de cerca de 7,0 até 8,5, também de cerca de 7,2 até 8,5 ou cerca de 7,2 até 8,0, conforme medido em temperatura ambiente. Em algumas modalidades, a concentração do supressor uma vez que todos os três componentes tenham sido misturados está na faixa de cerca de 2 mM até cerca de 40 mM, também de cerca de 4 mM até cerca de 40 mM, também de cerca de 4 mM até cerca de 30 mM, também de cerca de 5 mM até cerca de 30 mM, também de cerca de 10 mM até cerca de 30 mM, também de cerca de 20 mM. Em algumas modalidades, a proporção molar do supressor em relação ao composto inativador de patógeno, uma vez que todos os componentes tenham sido misturados, é de cerca de 10:1 para cer20 ca de 400:1, também de cerca de 10:1 até cerca de 200:1, também de cerca de 20:1 até cerca de 200:1, também de cerca de 50:1 até cerca de 200:1, também de cerca de 100:1. Em algumas modalidades, o supressor é um peptídeo compreendendo pelo menos uma cisteína ou um derivado da cisteína. Em uma modalidade preferida, o supressor é a glutationa. Em algumas modalidades, o supressor é neutralizado ou está em uma forma que cause o ajuste desejado no pH da composição. Em algumas modalidades, o supressor é neutralizado pela adição de 1 equivalente, também de cerca de 2 equivalentes de base para o supressor. Em algumas modalidades, o supressor está em uma forma neutralizada, tal como um sal adequado. Em algumas modalidades, o supressor é neutralizado. Em algumas modalidades, o supressor neutralizado é um peptídeo neutralizado compreendendo cisteína ou um derivado da cisteína. Em uma modalidade preferida, o peptídeo neutrali-

zado é glutationa neutralizada. Em algumas modalidades, o grupo de ligação de ácido nucléico do composto inativador de patógeno é um intercalador, tal como um grupo acridina. Em algumas modalidades, o grupo de ligação de ácido nucléico é uma poliamina. Em algumas modalidades, o grupo de ligação de ácido nucléico está ligado ao grupo eletrofílico reativo através de uma ligação hidrolisável. Em algumas modalidades, o grupo de ligação de ácido nucléico é um intercalador e o grupo eletrofílico reativo é selecionado do grupo consistindo em mostarda, um intermediário de mostarda e um equivalente de mostarda. Em algumas modalidades, o grupo de ligação de ácido nucléico é uma poliamina e o grupo eletrofílico é um grupo aziridina ou um grupo aziridínio. Em uma modalidade preferida, o supressor é glutationa neutralizada e o composto inativador de patógeno é β-alanina, N-(acridin-9ila), éster de 2-[bis(2-cloroetil)amino]etila.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método para tratar uma composição de células hemácias compreendendo, na seguinte ordem, a) fornecer i) β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster de 2-[bis(2cloroetil)amino]etila, ii) glutationa neutralizada, e iii) uma composição compreendendo células hemácias, em que existe uma possibilidade de que uma composição de células hemácias esteja contaminada com um patógeno, b) misturar a glutationa neutralizada com a composição compreendendo células hemácias, c) incubar a mistura por um intervalo de tempo apropriado, e d) misturara β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster de 2-[bis(2-cloroetil)amino]etila com a mistura de glutationa neutralizada e a composição compreendendo células hemácias, em que um patógeno, caso presente na composição compreendendo as células hemácias, é inativado por pelo menos 1 log, também pelo menos 2 log, também pelo menos 3 log. Em algumas modalidades, a composição de células hemácias contém leucócitos, e o tratamento resulta na inativação de pelo menos 1 log, também pelo menos 2 log, ou pelo menos 3 log dos leucócitos. Em algumas modalidades, a glutationa neutralizada é fornecida como um sal adequado. Em algumas modalidades, a glutationa neutralizada é fornecida pela neutralização da glutationa protonada com cerca de 1 equivalente de base, também cerca de 2 equivalentes de base. Em

algumas modalidades, a glutationa neutralizada está em solução. Em algumas modalidades, a glutationa neutralizada é um sólido, assim como um pó liofilizado é um sal adequado. Em algumas modalidades, o intervalo de tempo para incubar as células hemácias com glutationa é de cerca de 1 a 30 minutos, também de cerca de 5 a 20 minutos, em que a incubação é em uma temperatura na faixa de cerca de 1 °C até 30°C, também de cerca de 18°C até 25°C, ou de cerca da temperatura ambiente. Em algumas modalidades, depois de misturar com β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster de 2-[bis(2cloroetil)amino]etila, a mistura é incubada por um intervalo de tempo adequado, tal como por cerca de 30 minutos a 48 horas, também por cerca de 2 até 24 horas, também por cerca de 8 a 24 horas. Em uma outra modalidade, a incubação é em uma faixa de temperatura de cerca de 1°C até 30°C, também de cerca de 18°C até 25°C, ou de cerca da temperatura ambiente. Em algumas modalidades, na mistura da β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster de 2[bis(2-cloroetil)amino]etila, a concentração de glutationa na mistura está na faixa de cerca de 5 mM até cerca de 30 mM e a concentração de β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster de 2-[bis(2-cloroetil)amino]etila está na faixa de cerca de 0,05 mM até cerca de 0,5 mM. Em algumas modalidades, na mistura da β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster de 2-[bis(2-cloroetil)amino]etila, a concentração de glutationa na mistura está na faixa de cerca de 10 M até cerca de 30 mM e a concentração de β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster de 2-[bis(2cloroetil)amino]etila está na faixa de cerca de 0,05 mM até cerca de 0,3 mM. Em algumas modalidades, na mistura da β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster de 2-[bis(2-cloroetil)amino]etila, a concentração de glutationa na mistura é de cerca de 20 mM e a concentração de β-alanina, N-(acridí η-9-ila), éster de 2[bis(2-cloroetil)amino]etila é de cerca de 0,2 mM.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método para tratar uma composição de células hemácias compreendendo: (a) fornecer i) um composto inativador de patógeno compreendendo um grupo funcional o qual é, ou o qual forma, um grupo eletrofílico reativo, ii) um supressor compreendendo um grupo tiol, em que o tiol é capaz de reagir com o grupo eletrofílico reativo do composto inativador de patógeno, e iii) uma composição compre-

endendo células hemácias, em que existe a possibilidade de que composição de hemácias seja contaminada com um patógeno; e (b) a mistura do composto inativador de patógeno e do supressor com a composição compreendendo células hemácias, em que a concentração do supressor na mistura resultante é maior do que 2 mM, em que o pH da mistura resultante em temperatura ambiente está na faixa de cerca de 6,7 ou mais. Em algumas modalidades, o pH da mistura resultante em temperatura ambiente está na faixa de cerca de 7,0 a 8,5.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método para tratar uma composição de células hemácias compreendendo a mistura do seguinte com a composição de células hemácias: (a) um composto inativador de patógeno, em que o composto inativador de patógeno compreende um ligante de ligação a ácido nucléico e um grupo funcional o qual é, ou o qual forma, um grupo eletrofílico capaz de reagir com ácidos nucléicos; (b) um supressor compreendendo um tiol, em que o tiol é capaz de reagir com o grupo eletrofílico; e (c) uma quantidade suficiente de uma base adequada para reduzir o nível de uma reação indesejada do composto inativador de patógeno com células hemácias na mistura a qual compreende a composição de células hemácias, o composto inativador de patógeno, o supressor e a base, em relação á mistura sem a base. Em algumas modalidades, a reação indesejada do composto inativador de patógeno com células hemácias é a modificação da superfície das células hemácias pelo composto inativador de patógeno.

Em ainda outra modalidade, a invenção fornece um método para tratar uma composição de células hemácias compreendendo a mistura do seguinte com a composição de células hemácias: (a) um composto inativador de patógeno, em que o composto inativador de patógeno compreende um ligante de ligação a ácido nucléico e um grupo funcional o qual é, ou o qual forma, um grupo eletrofílico capaz de reagir com ácidos nucléicos; (b) um supressor compreendendo um tiol, em que o tiol é capaz de reagir com o grupo eletrofílico; e (c) uma quantidade suficiente de uma base adequada para aumentar o pH da mistura compreendendo a composição de células hemácias, o composto inativador de patógeno, o supressor e a base, em relação à mistura sem a base. Em algumas modalidades, (por exemplo, em algumas modalidades, onde o supressor é um composto ácido), uma quantidade suficiente da base adequada é adicionada para aumentar o pH da mistura até pelo menos aproximadamente o pH da mistura sem ou a base ou o supressor.

Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para melhorar a supressão de uma reação secundária indesejada de um composto inativador de patógeno com as células hemácias durante o tratamento de uma composição compreendendo as células hemácias com o composto inativador de patógeno na presença de um supressor, em que o supressor compreende um tiol, e em que o composto inativador de patógeno compreende um grupo funcional o qual é, ou o qual forma um eletrófilo reativo com o tiol do supressor, em que o método compreende o aumento do pH da mistura reacional compreendendo a composição de células hemácias, o composto inativador de patógeno e o supressor. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a etapa de aumentar a concentração do supressor na mistura reacional. Em algumas modalidades, a reação indesejada do composto inativador de patógeno com as células hemácias é a modificação da superfície das células hemácias pelo composto inativador de patógeno.

Em algumas modalidades de cada um dos métodos acima mencionados, assim como outros métodos aqui descritos, o método ainda compreende a etapa de reduzir a concentração do composto inativador de patógeno na mistura.

Em algumas modalidades de cada um dos métodos acima mencionados, assim como outros métodos aqui descritos, a composição de células hemácias é tratada ex vivo. Em algumas outras modalidades de cada um dos métodos anteriormente mencionados, assim como outros métodos aqui descritos, a composição de células hemácias é tratada in vitro.

Composições de células hemácias produzidas por cada um dos métodos anteriormente mencionados, assim como outros métodos aqui descritos, são aqui fornecidos.

Em outro aspecto, a invenção fornece kits, tais como kits dispo42α níveis para uso no processo de uma composição de células hemácias. Esses kits podem ser usados ou para o processamento manual, processamento automático ou tanto o processamento manual quanto o automático, Em algumas modalidades, o kit compreende um composto inativador de patógeno compreendendo um grupo eletrofílico reativo, incluindo qualquer de seus sais, um supressor compreendendo um grupo tiol, incluindo quaisquer sais seus e 1 ou 2 equivalentes de uma base adequada, onde um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar de supressor no kit. Em uma modalidade preferida, o kit compreende β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster de 2-[bis(2-cloroetil)amino]etila, glutationa, incluindo quaisquer sais seus e 1 ou 2 equivalentes de uma base adequada, onde um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar de glutationa no kit. Em algumas modalidades, a β-alanina, N-(acrídin9-ila), éster de 2-[bis(2-cloroetil)amino]etila ou qualquer seu sal está na forma sólida. Em algumas modalidades, a β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster de 2-[bis(2-cloroetil)amino]etila ou qualquer seu sal está em solução. Em algumas modalidades, a glutationa ou qualquer seu sal está na forma sólida. Em algumas modalidades, a glutationa ou qualquer seu sal está em solução. Em algumas modalidades, 1 ou 2 equivalentes de base está na forma sólida. Em algumas modalidades, o 1 ou 2 equivalentes de base está em solução. Em algumas modalidades, a glutationa ou qualquer seu sal e o 1 ou 2 equivalentes de base está presente como uma mistura. Em algumas modalidades, a mistura de glutationa ou qualquer seu sal e 1 ou 2 equivalentes de base é uma mistura homogênea. Em algumas modalidades, essa mistura homogênea está na forma sólida. Em algumas modalidades, o kit compreende uma solução para dissolver a β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster de 2-[bis(2cloroetil)amino]etila ou qualquer sal seu, o qual está na forma sólida. Em algumas modalidades, o kit compreende uma solução para dissolver a glutationa, ou qualquer sal seu, o qual está na forma sólida. Em algumas modalidades, o kit compreende uma solução para dissolver 1 ou 2 equivalentes de base, a qual está na forma sólida. Em algumas modalidades, o kit compreende uma solução para dissolver tanto o supressor ou qualquer sal seu, e 1 ou 2 equivalentes de base, os quais estão na forma sólida. Em algumas modalidades o kit compreende uma solução para dissolver a mistura do supressor e 1 ou 2 equivalentes de base. Em algumas modalidades, os sólidos ou soluções do kit compreendem ainda excipientes, adjuvantes, diluentes ou estabilizantes aceitáveis.

Em um aspecto, a invenção fornece um kit útil, por exemplo, para tratar composições de células hemácias para inativar patógenos, compreendendo um composto inativador de patógeno, um ligante de ligação a ácido nucléico e um grupo funcional o qual é, ou o qual forma, um grupo eletrofílico (incluindo qualquer sal seu) um supressor compreendendo um grupo tiol (incluindo qualquer sal seu) e pelo menos cerca de 1 equivalente de base, em que um equivalente significa uma quantidade molar que seja equivalente à quantidade molar de supressor no kit. Em algumas modalidades, o kit compreende cerca de 1 ou 2 equivalentes de uma base adequada.

Em um aspecto, a invenção fornece um kit para tratar composições de células hemácias para inativar patógenos, compreendendo um ligante que se ligue a ácido nucléico e um grupo funcional o qual é, ou o qual forma, um grupo eletrofílico (por exemplo, PIC-1), incluindo qualquer sal seu, e um supressor neutralizado compreendendo um grupo tiol (por exemplo, glutationa neutralizada), incluindo qualquer sal seu.

Em ainda outros aspectos, a invenção inclui uma composição compreendendo células hemácias, um composto inativador de patógeno compreendendo um grupo eletrofílico reativo e um supressor compreendendo um grupo nucleofílico que seja capaz de reagir com o grupo eletrofílico, em que o supressor está em uma concentração na faixa de cerca de 2 mM até 40 mM, também de cerca de 4 mM até 40 mM, também cerca de 5 mM até 30 mM ou cerca de 10 mM até 30 mM, e o pH da composição está na faixa de cerca de 6,8 até 8,5, também cerca de 7,0 até 8,5, também cerca de

7,2 até 8,5 ou de cerca de 7,2 até 8,0. Em algumas modalidades, o composto inativador de patógeno compreende um ligante que se ligue a ácido nucléico e o supressor compreende um grupo tiol. Uma modalidade preferida inclui uma composição compreendendo as células hemácias, β-alanina, N- (acridin-9-ila), éster de 2-[bis(2-cloroetil)amino]etila e glutationa em uma concentração na faixa de cerca de 2 mM até 40 mM, em que o pH da composição está na faixa de cerca de 6,8 até 8,5, também de cerca de 7,0 até 8,5, também cerca de 7,2 até 8,5 ou cerca de 7,2 até 8,0. Em algumas modalidades, a composição está no hematócrito das células hemácias na faixa de cerca de 1 até 100%, também de cerca de 10 a 90%, também cerca de 35 até 80% ou cerca de 40 até 70%. Em algumas modalidades, a concentração de β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster de 2-[bis(2-cloroetil)amino]etila está na faixa de cerca de 0,05 mM até 4 mM, também de cerca de 0,05 mM até 2 mM, também cerca de 0,05 mM até 0,5 mM ou cerca de 0,1 mM até 0,3 mM e a glutationa está na faixa de cerca de 5 mM até 40 mM, também de cerca de 5 mM até 30 mM ou de cerca de 10 mM até 30 mM.

Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma composição compreendendo células hemácias, um composto inativador de patógeno compreendendo um ligante que se ligue a ácido nucléico e um grupo eletrofílico reativo, e um supressor compreendendo um grupo tiol que seja capaz de reagir com o grupo eletrofílico, em que o supressor está em uma concentração maior do que 2 mM, e o pH da composição esteja em cerca de 6,7 ou mais. Em algumas modalidades, a composição tem um pH na faixa de cerca de 6,8 a 8,5, cerca de 7,0 a 8,5, cerca de 7,2 a 8,5 e cerca de 7,2 a 8,0. Por exemplo, em algumas modalidades, o pH da composição está na faixa de cerca de 7,0 a 8,5. em algumas modalidades, a composição compreende pelo menos cerca de 4 mM de supressor ou pelo menos cerca de 10 mM de supressor. Em algumas modalidades, o supressor está em uma concentração na faixa de cerca de 4 a 40 mM ou cerca de 10 a 30 mM. Por exemplo, em algumas modalidades, o supressor está em uma concentração na faixa de cerca de 4 mM até 40 mM, e o pH da composição está na faixa de cerca de 6,8 a 8,5. Em algumas modalidades, o supressor está em uma concentração de pelo menos cerca de 4 mM, e o pH da composição está na faixa de cerca de 6,8 a 8,5.

Aspectos adicionais também são fornecidos pela presente invenção.

Breve Descrição dos Desenhos

Figura 1 mostra o título de anticorpos do soro durante a transfusão repetida na Fase 1 do Exemplo 12. Por clareza, as barras de erro são apresentadas somente para as imunizações de KLH-Acridina. Barras de erro para os grupos de infusão RBC foram de aproximadamente ± 1.

Figura 2 mostra o tempo de vida de S-220 RBC original nos grupos 4A, 4B e 6 na Fase 2 do Exemplo 12. O tempo de vida foi determinado pela extrapolação dos pontos de tempo iniciais até 100% no dia 0. Os animais do grupo 1 receberam controle RBC biotinilado. As barras de erro são mostradas para os Grupos 4A, 4B e 6 somente, por clareza.

Figura 3 mostra o tempo de vida de S-303 RBC original (PIC-1) nos Grupos 2A, 2B e 5 na Fase 2 do Exemplo 12. O tempo de vida foi determinado pela extrapolação dos pontos de tempo iniciais até 100% no dia 0. Os animais do grupo 1 receberam controle RBC biotinilado. As barras de erro são mostradas para os Grupos 2B e 5 somente, por clareza.

Figura 4 mostra o tempo de vida de S-220 RBC modificado nos Grupos 4A, 4B e 6 na Fase 2 do Exemplo 12. O tempo de vida foi determinado pela extrapolação dos pontos de tempo iniciais até 100% no dia 0. Os animais do grupo 1 receberam controle RBC biotinilado. As barras de erro são mostradas para os Grupos 1,4B e 6 somente, por clareza.

Figura 5 mostra o tempo de vida de S-303 RBC modificado nos Grupos 2A, 2B e 5 na Fase 2 do Exemplo 12. O tempo de vida foi determinado pela extrapolação dos pontos de tempo iniciais até 100% no dia 0. Os animais do grupo 1 receberam controle RBC biotinilado. As barras de erro são mostradas para os Grupos 2B e 5 somente, por clareza.

Figura 6 mostra os resultados da análise de FACScan do RBC tratado com S-303.

Descrição Detalhada da Invenção

Métodos existentes para a supressão das espécies reativas ele30 trofílicas nas composições de células hemácias são fornecidas, por exemplo, na Patente U. S. número 6.709.810. Como um exemplo não-limitativo desses métodos, glutationa é usada juntamente com β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster de 2-[bis(2-cloroetil)amino]etila (de agora em diante chamado alternativamente como composto inativador de patógeno I, PIC-1 ou S-303). A glutationa é tipicamente isolada na forma ácida (isto é, protonada) e essa é a forma usada nesses métodos conhecidos. Como tal, ao se referir a métodos de supressão conhecidos, glutationa será referida como glutationa ácida ou protonada. Conforme aqui utilizado, a composição padrão para a inativação de patógenos nas células hemácias envolve o tratamento de uma composição de células hemácias com glutationa protonada a 2 mM e PIC-1 a 0,2 mM. A concentração de glutationa protonada pode ser aumentada, proporcionando uma proporção mais alta de supressor para o composto inativador de patógeno, em uma tentativa de proporcionar uma melhor supressão de reações secundárias indesejáveis. Entretanto, conforme a concentração de glutationa protonada é aumentada, o pH total da composição de células vermelhas diminui devido à acidez da glutationa. Foi determinado que esse pH mais baixo resulta na supressão insuficiente da reação do composto inativador de patógeno com as células hemácias, particularmente a superfície das células hemácias. Também foi determinado que a condição padrão não fornece a supressão adequada da modificação da superfície da célula hemácia. Como tal, a presente invenção proporciona métodos de supressão melhorados, em que o pH de uma composição de células hemácias compreendendo um composto inativador de patógeno e um supressor é ajustado para uma faixa adequada para proporcionar uma supressão melhorada, em que a concentração do supressor usada é maior do que 2 mM, tal como cerca de 5 a 40 mM, também cerca de 10 a 30 mM, ou cerca de 20 mM. Por exemplo, métodos são fornecidos de forma que na mistura de uma composição compreendendo as células hemácias com um composto inativador de patógeno e um supressor, o pH está em uma faixa adequada, tal como um pH de cerca de 6,8 a 8,5, também cerca de 7,0 a 8,5, também cerca de 7,2 a

8,5 ou cerca de 7,2 a 8,0, em que a concentração de supressor está na faixa de cerca de 5 a 40 mM.

Em algumas modalidades de cada um dos métodos aqui descritos, uma reação secundária indesejada (também referida aqui como indese18

jada) do composto inativador de patógeno com as células hemácias é reduzida. Em algumas modalidades, a reação secundária indesejada que é reduzida é a modificação da superfície celular das hemácias pelo composto inativador de patógeno. Em algumas modalidades, o nível da reação secundária é reduzido por pelo menos cerca de 5%, pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75% ou pelo menos cerca de 90%. O decréscimo na reação secundária (em relação a um segundo método) pode ser evidenciado, por exemplo, pela medida da quantidade de ligação às células hemácias tratadas de anticorpos específico para o composto inativador de patógeno e/ou pela medida do tempo de vida das células hemácias tratadas in vivo, e comparando essas medidas com as células hemácias tratadas por um segundo método diferente. Por exemplo, em algumas modalidades dos métodos melhorados, o nível de ligação do anticorpo de composto inativador anti-patógeno em relação às células sanguíneas é diminuído por pelo menos cerca de 10%, pelo menos cerca de 25%, pelo menos cerca de 50%, pelo menos cerca de 75% ou pelo menos cerca de 90% em relação a um método sem as melhorias.

Em algumas modalidades de cada um dos aspectos da invenção aqui descritos, a faixa de pH adequada para proporcionar a supressão adequada da ligação do composto inativador de patógeno para as células hemácias está na faixa de pH a qual proporciona a supressão melhorada da ligação do composto inativador de patógeno para as células hemácias para o tratamento padrão de uma composição de células hemácias com glutationa protonada a 2 mM e PIC-1 a 0,2 mM. Em algumas modalidades, a melhoria na supressão é evidenciada por um decréscimo na imunogenicidade das células hemácias tratadas em relação àquelas tratadas pelo método padrão. Em algumas modalidades, a melhoria na supressão proporcionada por um dado método em relação ao método padrão é evidenciada por um decréscimo na quantidade de ligação de anticorpos específicos em relação ao composto inativador de patógeno para as células hemácias tratadas in vitro e/ou pelo tempo de vida aumentado das células hemácias tratadas in vivo.

Em um aspecto, a invenção proporciona um método para tratar uma composição de céiulas hemácias compreendendo: a) o fornecimento de i) um composto inativador de patógeno compreendendo um grupo eletrofílico reativo, ii) um supressor compreendendo um grupo tiol, e iii) uma composição compreendendo células hemácias, em que há uma possibilidade de que a composição de células hemácias esteja contaminada com um patógeno, e

b) mistura do composto inativador de patógeno e do supressor com a composição compreendendo células de hemácias, em que a mistura resultante está em uma faixa de pH adequada para proporcionar a supressão adequada da ligação do composto inativador de patógeno para as células hemácias. Em algumas modalidades, o método compreende ainda uma etapa de ajustar o pH da composição compreendendo células hemácias. Em algumas modalidades, o pH da composição compreendendo células hemácias é ajustado antes da mistura com o composto inativador de patógeno e o supressor. Em algumas modalidades, o pH da composição compreendendo células hemácias é ajustado pela adição do supressor. Em algumas modalidades, o supressor é neutralizado com pelo menos cerca de um equivalente de uma base adequada antes da adição do supressor à composição de células hemácias. Em algumas modalidades, o supressor é misturado com a composição compreendendo células hemácias antes da adição do composto inativador de patógeno. Em algumas modalidades dos métodos, a faixa de pH adequada em temperatura ambiente é de cerca de 6,8 a 8,5, cerca de 7,0 a 8,5, cerca de 7,2 a 8,5 ou cerca de 7,2 a 8,0. Em algumas modalidades, a concentração do supressor na mistura resultante está na faixa de cerca de 2 mM até cerca de 40. Em algumas modalidades, a concentração do supressor na mistura resultante está na faixa de cerca de 4 mM até cerca de 40 mM, cerca de 10 até cerca de 30 mM. Em algumas modalidades do método, a concentração do supressor na mistura resultante é de pelo menos cerca de 4 mM ou pelo menos cerca de 10 mM. Em algumas modalidades, o supressor usado no método compreende cisteína ou um derivado da cisteína. Por exemplo, em algumas modalidades, o supressor é glutationa. O grupo eletrofílico reativo é, em algumas modalidades, selecionado do grupo consistindo em uma mostarda, um intermediário de mostarda e um equivalente de

mostarda. Em algumas modalidades, o composto inativador de patógeno é a β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster de 2-[bis(2-cloroetil)amino]etila. Em algumas modalidades, o tratamento resulta na inativação de pelo menos 1 log de um contaminante patógeno na composição de células hemácias.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método para tratar uma composição de células hemácias compreendendo: (a) fornecer i) um composto inativador de patógeno compreendendo um grupo funcional o qual é, ou o qual forma, um grupo eletrofílico reativo, ii) um supressor compreendendo um grupo tiol, em que o tiol é capaz de reagir com o grupo eletrofílico reativo do composto inativador de patógeno, e iii) uma composição compreendendo células hemácias, em que existe a possibilidade de que a composição de hemácias seja contaminada com um patógeno; e (b) a mistura do composto inativador de patógeno e do supressor com a composição compreendendo células hemácias, em que a concentração do supressor na mistura resultante é maior do que 2 mM, em que o pH da mistura resultante em temperatura ambiente está na faixa de cerca de 6,7 ou mais. Em algumas modalidades, a mistura resultante tem um pH em temperatura ambiente de cerca de 7,0 ou maior, ou cerca de 7,2 ou mais. Em algumas modalidades, o pH da mistura resultante está em uma faixa de cerca de 6,8 a 8,5, de cerca de 7,0 a 8,5, de cerca de 7,2 a 8,5 ou de cerca de 7,2 a 8,0. Por exemplo, em algumas modalidades, o pH da mistura resultante em temperatura ambiente está na faixa de cerca de 7,0 a 8,5. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a etapa de (c) ajustar o pH da composição compreendendo células hemácias de forma que o pH da mistura resultante em temperatura ambiente esteja na faixa indicada (por exemplo, na faixa de cerca de 7,0 a 8,5). Em algumas modalidades, o pH da composição compreendendo células hemácias é ajustado pela adição de pelo menos cerca de 0,5 equivalentes, pelo menos cerca de 1 equivalente ou pelo menos cerca de 2 equivalentes de base em relação à composição de células hemácias, em que um equivalente significa uma quantidade molar que seja equivalente à quantidade molar do supressor na mistura. Em algumas modalidades, o supressor é neutralizado com pelo menos cerca de um equivalente de uma base ade21 quada antes da adição do supressor à composição de células hemácias e o pH da composição compreendendo células hemácias é ajustado pela adição do supressor neutralizado. Em algumas modalidades, a concentração do supressor na mistura resultante é pelo menos cerca de 4 mM ou pelo menos cerca de 10 mM. Em algumas modalidades, a concentração do supressor na mistura resultante é de cerca de 4 a 40 mM ou de cerca de 10 a 30 mM. Por exemplo, em algumas modalidades, a concentração do supressor é de pelo menos cerca de 4 mM, em que a mistura tem um pH em temperatura ambiente na faixa de cerca de 6,8 a 8,5. Em algumas modalidades, a concentração do supressor é de cerca de 4 a 40 mM e o pH em temperatura ambiente está na faixa de cerca de 7,2 a 8,5. Em algumas modalidades, o supressor é neutralizado com pelo menos cerca de 1 equivalente de uma base adequada antes da adição do supressor à composição de células hemácias. Em algumas modalidades, o supressor é misturado com a composição compreendendo células hemácias antes da adição do composto inativador de patógeno. Em algumas modalidades, o supressor compreende cisteína ou um derivado da cisteína. Por exemplo, em algumas modalidades, o supressor é a glutationa. Em algumas modalidades, o grupo funcional é selecionado do grupo consistindo em uma mostarda, um intermediário da mostarda e um equivalente da mostarda. Em algumas modalidades, o composto inativador de patógeno é a β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster de 2-[bis(2cloroetil)amino]etila. Em algumas modalidades, o tratamento resulta na inativação de pelo menos 1 log de um patógeno contaminante na composição de células hemácias. Em algumas modalidades, o tratamento resulta na inativação de pelo menos 1 log, pelo menos cerca de 2 log ou pelo menos cerca de 3 log de um patógeno contaminante na composição de células hemácias.

Em outro aspecto, a invenção fornece um método para tratar uma composição de células hemácias compreendendo a mistura do seguinte com a composição de células hemácias: (a) um composto inativador de patógeno, em que o composto inativador de patógeno compreende um ligante que se ligue a ácido nucléico e um grupo funcional o qual é, ou o qual forma, um grupo eletrofílico capaz de reagir com ácidos nucléicos; (b) um supressor compreendendo um tiol, em que o tiol é capaz de reagir com o grupo eletrofílico; e (c) uma quantidade suficiente de uma base adequada para reduzir o nível de uma reação secundária indesejada do composto inativador de pató'5 geno com as células hemácias na mistura a qual compreende a composição de células hemácias, o composto inativador de patógeno, o supressor e a base em relação à mistura sem a base (isto é, uma segunda mistura compreendendo os mesmos componentes que a primeira, exceto que a base de (c) não foi adicionada). Em algumas modalidades, a reação indesejada do 10 composto inativador de patógeno com células hemácias é a modificação da superfície das células hemácias pelo composto inativador de patógeno. Em algumas modalidades, a base e o supressor são combinados com a composição de células hemácias antes de, ao mesmo tempo de ou não mais do que cerca de uma hora, cerca de 30 minutos, cerca de 20 minutos, cerca de 15 10 minutos, cerca de 5 minutos, cerca de 2 minutos ou cerca de 1 minuto depois da combinação do composto inativador de patógeno com a composição de células hemácias. Em algumas modalidades, a base e o supressor são misturados com a composição de células hemácias antes da mistura do composto inativador de patógeno com a composição de células hemácias.

Em algumas modalidades, a base e o supressor são misturados juntos antes da mistura ou da base ou do supressor com a composição de células hemácias. Em algumas modalidades, um sal básico compreendendo o supressor fornece tanto o supressor e a base quanto são ambos fornecidos por um sal básico compreendendo o supressor. Em algumas modalidades, a base é 25 NaOH. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 0,5 equivalente, pelo menos cerca de 1,0 ou pelo menos cerca de 2 equivalentes de base são adicionados, em que um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar do supressor na mistura. Em algumas modalidades, a base compreende pelo menos cerca de 1 equivalente de base. Em 30 algumas modalidades dos métodos, a faixa de pH adequada em temperatura ambiente é de cerca de 6,8 a 8,5, cerca de 7,0 a 8,5, cerca de 7,2 a 8,5 ou cerca de 7,2 a 8,0. Em algumas modalidades, a mistura resultante tem um pH em temperatura ambiente de cerca de 7,0 a 8,5. em algumas modalidades, a concentração do supressor na mistura resultante é maior do que 2 mM, maior do que cerca de 4 mM ou maior do que cerca de 10 mM. Em algumas modalidades, a concentração do supressor na mistura resultante está na faixa de cerca de 2 mM até cerca de 40 mM. Em algumas modalidades, a concentração do supressor na mistura resultante está na faixa de cerca de 4 mM até cerca de 40 mM, cerca de 10 até cerca de 30 mM. Por exemplo, em algumas modalidades, a concentração do supressor na mistura resultante está na faixa de cerca de 10 mM até 30 mM. Em algumas modalidades, o supressor é ácido. Em algumas modalidades, o supressor compreende cisteína ou um derivado da cisteína, tal como glutationa. Em algumas modalidades, o grupo funcional é selecionado do grupo consistindo em mostarda, um intermediário da mostarda e um equivalente em mostarda. Por exemplo, em algumas modalidades, o composto inativador de patógeno é β-alanina, N(acridin-9-ila), éster de 2-[bis(2-cloroetil)amino]etila. Em algumas modalidades, o tratamento resulta na inativação de pelo menos 1 log de um contaminante de patógeno na composição de células hemácias.

Em ainda outra modalidade, a invenção fornece um método para tratar uma composição de células hemácias, compreendendo a mistura do seguinte com a composição de células hemácias: (a) um composto inativador de patógeno, em que o composto inativador de patógeno compreende um ligante de ligação a ácido nucléico e um grupo funcional o qual é, ou o qual forma, um grupo eletrofílico capaz de reagir com ácidos nucléicos; (b) um supressor compreendendo um tiol, em que o tiol é capaz de reagir com o grupo eletrofílico; e (c) uma quantidade suficiente de uma base adequada para aumentar o pH da mistura compreendendo a composição de células hemácias, o composto inativador de patógeno, o supressor e a base, em relação à mistura sem a base (isto é, uma segunda mistura compreendendo os mesmos componentes que a primeira, exceto que a base de (c) não é adicionada à mistura). Em algumas modalidades, (por exemplo, em algumas modalidades, onde o supressor é um composto ácido), uma quantidade suficiente da base adequada é adicionada para aumentar o pH da mistura até pelo menos aproximadamente o pH da mistura sem ou a base ou o supressor. Em algumas modalidades, a base e o supressor são combinados com a composição de células hemácias antes de, ao mesmo tempo, ou não mais do que cerca de uma hora, cerca de 30 minutos, cerca de 20 minutos, cerca ’5 de 10 minutos, cerca de 5 minutos, cerca de 2 minutos ou cerca de 1 minuto depois da combinação do composto inativador de patógeno com a composição de células hemácias. Em algumas modalidades, a base e o supressor são misturados com a composição de células hemácias antes da mistura do composto inativador de patógeno com a composição de células hemácias.

Em algumas modalidades, a base e o supressor são misturados juntos antes da mistura ou da base ou do supressor com a composição de células hemácias. Em algumas modalidades, um sal básico compreendendo o supressor fornece tanto o supressor e a base quanto são ambos fornecidos por um sal básico compreendendo o supressor. Em algumas modalidades, a base é 15 NaOH. Em aigumas modalidades a base é um tampão básico.Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 0,5 equivalente, pelo menos cerca de 1,0 ou pelo menos cerca de 2 equivalentes de base são adicionados, em que um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar do supressor na mistura. Em algumas modalidades, a base 20 compreende pelo menos cerca de 1 equivalente de base. Em algumas modalidades dos métodos, a faixa de pH adequada em temperatura ambiente é de cerca de 6,8 a 8,5, cerca de 7,0 a 8,5, cerca de 7,2 a 8,5 ou cerca de 7,2 a 8,0. Em algumas modalidades, a mistura resultante tem um pH em temperatura ambiente de cerca de 7,0 a 8,5. em algumas modalidades, a concen25 tração do supressor na mistura resultante é maior do que 2 mM, maior do que cerca de 4 mM ou maior do que cerca de 10 mM. Em algumas modalidades, a concentração do supressor na mistura resultante está na faixa de cerca de 2 mM até cerca de 40 mM. Em algumas modalidades, a concentração do supressor na mistura resultante está na faixa de cerca de 4 mM até 30 cerca de 40 mM, cerca de 10 até cerca de 30 mM. Por exemplo, em algumas modalidades, a concentração do supressor na mistura resultante está na faixa de cerca de 10 mM até 30 mM. Em algumas modalidades, o supressor é ácido. Em algumas modalidades, o supressor compreende cisteína ou um derivado da cisteína, tal como glutationa. Em algumas modalidades, o grupo funcional é selecionado do grupo consistindo em mostarda, um intermediário da mostarda e um equivalente da mostarda. Por exemplo, em algumas modalidades, o composto inativador de patógeno é β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster de 2-[bis(2-cloroetil)amino]etila. Em algumas modalidades, o tratamento resulta na inativação de pelo menos 1 log de um contaminante de patógeno na composição de células hemácias.

Em um aspecto adicional, a invenção fornece um método para melhorar a supressão de uma reação secundária indesejada de um composto inativador de patógeno com células hemácias durante o tratamento de uma composição compreendendo as células hemácias com o composto inativador de patógeno na presença de um supressor, em que o supressor compreende um tiol, e em que o composto inativador de patógeno compreende um grupo funcional o quai é, ou o qual forma, um eletrófilo reativo como tiol do supressor, em que o método compreende o aumento do pH da mistura reacional compreendendo a composição de células hemácias, o composto inativador de patógeno e o supressor. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a etapa de aumentar a concentração do supressor na mistura reacional. Em algumas modalidades, o supressor é ácido. Em algumas modalidades, a reação indesejada do composto inativador de patógeno com as células hemácias é a modificação da superfície das células hemácias pelo composto inativador de patógeno.

Em um outro aspecto, a invenção fornece um método para tratar uma composição de células hemácias compreendendo, na seguinte ordem: a) fornecer i) β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster de 2-[bis(2cloroetil)amino]etila, ii) glutationa neutralizada, e iii) uma composição compreendendo células hemácias, em que existe uma possibilidade de que a composição de células hemácias esteja contaminada com um patógeno, b) misturar a glutationa neutralizada com a composição compreendendo células hemácias, c) incubar a mistura por um intervalo de tempo apropriado, e d) misturar a β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster de 2-[bis(2-cloroetil)amino]etila com a mistura de glutationa neutralizada e a composição compreendendo células hemácias, em que um patógeno, caso presente na composição compreendendo as células hemácias, é inativado por pelo menos 1 log. Em algumas modalidades, a glutationa neutralizada compreende glutationa para a qual foi adicionado pelo menos cerca de um equivalente de base, em que um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar do supressor. Em algumas modalidades, a glutationa neutralizada compreende glutationa (por exemplo, o ácido livre da glutationa) para o qual foi adicionado cerca de dois equivalentes de base.

Composições de células hemácias produzidas por cada um dos métodos aqui descritos também são fornecidas. Em algumas modalidades, as composições de células hemácias compreendem níveis reduzidos de modificação na superfície das células hemácias pelo composto inativador de patógeno, em relação às células hemácias produzidas por outros métodos envolvendo o tratamento com o composto inativador de patógeno. Em algumas modalidades, as composições de células hemácias produzidas pelo tratamento dos métodos compreende os produtos de degradação do composto inativador de patógeno (por exemplo, o produto reacional do supressor com o composto inativador de patógeno). Em algumas modalidades, as composições de células hemácias produzidas pelos tratamentos dos métodos aqui descritos compreendem uma quantidade reduzida de composto inativador de patógeno compreendendo o grupo eletrofílico reativo depois do fim do tratamento, em relação à composição de células hemácias produzidas por outro método envolvendo o tratamento com o composto inativador de patógeno. Em algumas modalidades, a quantidade de composto inativador de patógeno compreendendo o grupo eletrofílico reativo na composição foi reduzido para cerca de 10%, cerca de 25%, cerca de 50%, cerca de 75%, cerca de 90%, cerca de 95% ou cerca de 99% em relação à composição tratada por outro método envolvendo o composto inativador de patógeno (por exemplo, um método no qual nenhum supressor e/ou base é adicionado à mistura reacional ou um tratamento em pH mais baixo).

Em um aspecto adicional, a invenção fornece uma composição

compreendendo as células hemácias, um composto inativador de patógeno compreendendo um ligante que se ligue a ácido nucléico e um grupo eletrofílico reativo, e um supressor compreendendo um grupo tiol que é capaz de reagir com o grupo eletrofílico, em que o supressor está em uma concentração maior do que 2 mM, e o pH da composição é de cerca de 6,7 ou maior. Em algumas modalidades, a composição tem um pH na faixa de cerca de 6,8 a 8,5, cerca de 7,0 a 8,5 e cerca de 7,2 a 8,0. Em algumas modalidades, a composição compreende pelo menos cerca de 4 mM de supressor ou pelo menos cerca de 10 mM de supressor. Em algumas modalidades, o supressor está em uma concentração na faixa de cerca de 4 a 40 mM ou de cerca de 10 a 30 mM. Por exemplo, em algumas modalidades, o supressor está em uma concentração na faixa de cerca de 4 mM até 40 mM, e o pH da composição está na faixa de cerca de 6,8 a 8,5. Em algumas modalidades, o supressor está em uma concentração de pelo menos cerca de 4 mM, e o pH da composição está na faixa de cerca de 6,8 a 8,5.

Em relação às seqüências aqui, as quais compreendem substituintes de aminoácidos, conforme é evidente para um indivíduo versado na técnica, cada substituinte de aminoácido pode ser independentemente selecionado. A invenção também fornece seqüências compreendendo substituintes de aminoácidos nos quais um ou mais dos substituintes de aminoácidos são eliminados.

Um patógeno contaminante a ser inativado nos métodos da invenção inclui qualquer agente contendo ácido nucléico capaz de causar doença em um ser humano, em outros mamíferos ou vertebrados. O agente patogênico pode ser unicelular ou multicelular. Exemplos de patógenos são bactérias, vírus, protozoários, fungos, leveduras, mofos e micoplasmas, os quais causam doenças em seres humanos, outros mamíferos ou vertebrados. O material genético do patógeno pode ser DNA ou RNA, e o material genético pode estar presente como um ácido nucléico de filamento único ou de filamento duplo. Tabela 1 lista exemplos de vírus, e não pretende limitar a invenção de forma alguma.

Tabela 1. Exemplos não-limitantes de vírus

Família:	Vírus:
Adeno	Adenovírus 2
	Hepatite canina
Arena	Pichinde
	Lassa
Bunya	Turlock
	Encefalite da Califórnia
Herpes	Herpes simples 1
	Herpes simples 2
	Citomegalovírus
	Pseudorraivas
Ortomixo	Influenza
Papova	SV-40
Paramixo	Sarampo
	Caxumba
	Parainfluenza 2 e 3
Picorna	Poliovírus 1 e 2
	Coxsackie A-9
	Eco 11
Pox	Vaccinia
	Pox de ave
Reo
	Língua azul
	Febre do carrapato do Colorado
Retro	HIV
	Sarcoma aviário
	Sarcoma de murino
	Leucemia de murino
Rabdo	Vírus da estomative vesicular
Toga	Encefalite eqüina ocidental
	Dengue 2
	Dengue 4
	Encefalite de São Luís
Hepadna	Hepatite B
Bacteriófago	Lambda
	R17
	T2
(Rickettsia)	R. akari (rickettsialpox)

Além da inativação de contaminantes patogênicos possíveis, os métodos da presente invenção também inativam leucócitos que podem estar presentes na composição das células hemácias. Métodos de leucorredução são usados para preferivelmente remover a maioria dos leucócitos das com5 posições de células hemácias pretendidas para infusão, uma vez que elas podem resultar em respostas imunes indesejadas no receptor. Entretanto, nem todo o sangue é leucorreduzido, ou os métodos de leucorredução não removem todos os leucócitos. Consequentemente, a inativação de quaisquer leucócitos residuais pelos métodos da invenção pode ainda reduzir o risco

de tais respostas imunes.

Os métodos da invenção incluem o uso ex vivo de um composto inativador de patógeno e um supressor. O uso ex vivo envolve o uso de

I compostos para o tratamento de uma composição de células hemácias, fora de um organismo vivo, mamífero ou vertebrado, onde o material biológico

Λ tratado é pretendido para o uso dentro de um organismo vivo, mamífero ou vertebrado. Por exemplo, a remoção do corpo de um ser ser humano, a introdução de um composto naquele sangue para inativar patógenos, é definida como o uso ex vivo do composto se o sangue for tencionado para a rein trodução naquele ser humano ou em outro ser humano. A reintrodução do sangue humano naquele ser humano ou em outro ser humano podería ser o

uso in vivo do sangue, em oposição ao uso ex vivo do composto. Se o composto ainda estiver presente no sangue quando ele for reintroduzido no ser humano, então o composto, além de seu uso ex vivo, também é introduzido in vivo. Algumas modalidades da presente invenção envolvem o uso ex vivo 25 de um supressor, onde a composição de células hemácias é pretendida para o uso in vivo. Em alguns exemplos, algum nível de supressor permanece na composição de células hemácias de forma que o supressor também é introduzido in vivo. O uso in vitro de um material ou composto envolve o uso do material ou composto fora de um organismo vivo, mamífero ou vertebrado, 30 onde o material ou composto não é pretendido para a reintrodução em um humano, mamífero ou vertebrado vivo. Um exemplo de um uso in vitro podería ser a análise diagnostica dos componentes de uma amostra de células hemácias. Os métodos da invenção podem ser aplicados ao uso in vitro das composições de células hemácias, uma vez que a modificação das células hemácias ou outros constituintes pode causar a análise in vitro dos componentes da amostra de sangue. Conseqüentemente, os métodos da invenção 5 podem proporcionar segurança no manuseio de tais amostras in vitro com a supressão adequada das modificações da amostra que devem, de um modo diferente, interferir com a testagem diagnostica da amostra.

Composições de células hemácias da invenção incluem, mas não estão limitadas, a qualquer produto sangüíneo compreendendo células 10 hemácias, em que o produto sangüíneo fornece, ou é processado para fornecer células hemácias adequadas para uso humano, tal como por infusão. Composições de células hemácias incluem, por exemplo, sangue inteiro e concentrados de células hemácias, tais como células hemácias empacotadas. As composições de células hemácias podem ser descritas pelo seu 15 hematócrito, uma medida da concentração das células hemácias na composição. Composições de células hemácias podem ter um hematócrito na faixa de 1 a 100%, mais apropriadamente por volta de 10^a 90%, também cerca de 35 a 80%, ou cerca de 40 a 70%. Tais composições de células hemácias podem incluir produtos químicos, tais como compostos inativadores de pató20 genos e supressores. Eles também podem incluir tampões e outras soluções, tais como soluções aditivas de células hemácias incluindo sais ou soluções tamponadas. Qualquer composição de células hemácias que entrará em contato com, ou será produzida em um ser humano, mamífero ou vertebrado vivo, onde tal contato carrega um risco de transmitir doença devido 25 aos patógenos contaminantes pode ser tratada conforme aqui descrito.

A inativação dos patógenos envolve a apresentação dos patógenos em um material incapaz de reproduzir. A inativação é expressa como o logaritmo negativo da fração dos patógenos restantes capazes de se reproduzirem. Conseqüentemente, se um composto em uma certa concentra30 ção conferir 90% dos patógenos em um material incapaz de reprodução, 10% ou um décimo (0,1) dos patógenos permanecem capazes de se reproduzir. O logaritmo negativo de 0,1 é 1, e aquela concentração de composto é

citada por ter inativado os patógenos apresentados por 1 log. Alternativamente, o composto é citado como tendo 1 log de inativação ou redução naquela concentração. A inativação de todos, exceto 1% ou 0,1% dos patógenos podería corresponder a um log de 2 ou a um log de 3, respectivamente, 5 de redução do patógeno naquela concentração do composto. Métodos para determinar o nível de um patógeno particular em um material tal como um composição compreendendo células hemácias são bem conhecidos, e exemplos de tais métodos são fornecidos nos exemplos.

Em algumas modalidades de cada um dos métodos e composi10 ções aqui descritos, o tratamento da composição de células hemácias irá resultar na inativação de pelo menos cerca de 1 log, pelo menos cerca de 2 logs ou pelo menos cerca de 3 logs de um contaminante de patógeno, caso , presente, na composição de células hemácias. Em algumas modalidades, o patógeno é uma bactéria, tal como Staphylococcus epidermidis, Serratia *

marcescens, or Yersinia enterocolitica. Em algumas outras modalidades, o » patógeno é um vírus, tal como o vírus da estomatite vesicular. Em outras modalidades, o tratamento da composição de células hemácias resulta na inativação de pelo menos cerca de 1 log, pelo menos cerca de 2 log ou pelo menos cerca de 3 log de um contaminante de patógeno na composição.

A inativação do patógeno nas composições de células hemácias é causada pelo contato do patógeno na composição de células hemácias com um composto inativador de patógeno. Compostos inativadores de patógenos que podem ser suprimidos pelos métodos da invenção incluem compostos que compreendem um grupo funcional o qual é, ou o qual é capaz de formar e formou, por exemplo, in situ, um grupo reativo, tal como um grupo eletrofílico. Os compostos inativadores de patógeno da presente invenção não necessitam que a fotoativação seja reativa. Por exemplo, o grupo funcional pode ser um grupo mostarda, um intermediário do grupo mostarda, um equivalente do grupo mostarda, um epóxido, um formaldeído ou uma unidade estrutural de formaldeído. Tais grupos funcionais são capazes de formar in situ um grupo reativo, tal como uma aziridina eletrofílica, aziridínio, sulfeto de etileno ou íon de sulfeto de etileno. Um grupo mostarda pode ser

um grupo mono- ou bis-(haloetil)amina ou um grupo mono(haloetil)sulfeto. Um equivalente de mostarda é um grupo que reage por um mecanismo semelhante às mostardas, por exemplo pela formação de intermediários reativos tais como grupos aziridínio ou aziridina ou grupos de sulfeto de etileno ou sulfeto de etileno. Exemplos incluem derivados de aziridina, grupos mono- ou bis-(mesiletil)amina, grupos de mono(mesiletil)sulfeto, grupos de mono- ou bis-(tosiletil)amina e grupos de mono-(tosiletil)sulfeto. Uma unidade estrutural de formaldeído é qualquer composto que se quebra em um formaldeído, o qual inclui uma hidroxilamina, tal como hidroximetiiglicina. O grupo reativo do composto inativador de patógeno é capaz de reagir com os ácidos nucléicos dos patógenos, por exemplo, com grupos nucleofílicos do ácido nucléico. O grupo reativo também é capaz de reagir com um grupo nucleofilico do supressor. Compostos inativadores de patógeno também podem incluir um componente que almeja o composto para os ácidos nucléicos, tal como uma porção de âncora. A porção de âncora compreende uma porção a qual é capaz de se ligar não-covalentemente a um bipolímero de ácido nucléico, tal como DNA ou RNA, e também é referido como um ligante que se liga a ácido nucléico, um grupo de ligação de ácido nucléico ou uma porção de ligação de ácido nucléico. Exemplos de tais compostos estão descritos nas Patentes U. S. 5.691.132, 6.410.219, 6.136.586, 6,617.157 e 6.709.810, cada uma das quais é aqui incorporada aqui por referência. Outra classe de compostos inativadores de patógenos que podem ser suprimidos pelos métodos da invenção compreendem os grupos reativos acima mencionados ligados a um grupo de ligação de ácido nucléico através de um ligante hidrolisável, conforme descrito na Patente U. S. N° 6.514.987, aqui incorporada por referência. A porção de âncora dos compostos inativadores de patógeno tem uma afinidade por ácidos nucléicos. Essa afinidade pode ser devido a qualquer um dos vários modos de ligação ao ácido nucléico não-covalentemente, incluindo, mas sem se limitar, à intercalação, à ligação de encaixe principal, à ligação eletrostática (isto é, ligação da estrutura de fosfato), e ligação especifica da seqüência. Exemplos detalhados de tais porções de ligação de ácidos nucléicos podem ser encontradas nas patentes acima mencionadas.

Em algumas modalidades de cada um dos métodos, composições e kits aqui descritos, o composto inativador de patógeno compreende um grupo funcional o qual é, ou o qual forma, um grupo eletrofílico reativo com o nucleófilo do supressor escolhido. Em algumas modalidades, o grupo inativador de patógeno compreende um ligante que se liga a ácido nucléico e um grupo funcional o qual é, ou o qual forma um grupo eletrofílico.

Um exemplo particular de um composto inativador de patógeno adequado para uso na presente invenção é a β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster de 2-[bis(2-cloroetil)amino]etila (também alternativamente referido aqui como PIC-1 ou S-303), a estrutura do qual é como se segue, incluindo seus sais.

Em algumas modalidades, a concentração do composto inativador de patógeno, tal como PIC-1, na mistura com a composição de células hemácias e o supressor está na faixa de cerca de 0,05 M até 4 mM, cerca de 0,05 mM até 2 mM, cerca de 0,05 mM até 0,5 mM ou cerca de 0,1 mM até 0,3 mM. Em algumas modalidades, a razão molar do supressor para o composto inativador de patógeno uma vez que ambos os componentes tenham sido misturados com a composição de células hemácias é de cerca de 10:1 até 400:1, também de cerca de 10:1 até 2001, também de cerca de 20:1 até cerca de 200:1, também de cerca de 50:1 até cerca de 200:1, também de cerca de 100:1.

Supressores para uso nos métodos da presente invenção são pretendidos para reduzir reações laterais indesejáveis das espécies eletrofílicas reativas usadas para inativar patógenos. Supressores adequados compreendem um grupo nucleofílico que é capaz de reagir com o grupo eletrofí-

lico do composto inativador de patógeno, e estão descritos em detalhes na Patente U. S. N° 6.709.810, aqui incorporada por referência na sua totalidade. Os supressores são capazes de reduzir significativamente as reações secundárias indesejáveis em uma composição de células hemácias enquanto permitem que o composto inativador de patógeno inativo suficientemente um patógeno que pode estar contaminando a composição de células hemácias. Os métodos melhorados da presente invenção fornecem uma quantidade eficaz de supressor juntamente com uma quantidade eficaz de composto inativador de patógeno sob condições as quais proporcionam a redução ótima em reações secundárias indesejáveis com a inatlvação suficiente de patógenos. Uma variedade de reações secundárias indesejáveis pode ser reduzida, tal como a reação com proteínas e com componentes das células hemácias. Em algumas modalidades, o supressor fornece a redução ótima na modificação das células hemácias, tal como a ligação da IgG para as células hemácias ou a ligação do composto inativador de patógeno nas células hemácias. Enquanto os métodos da invenção envolvem o tratamento ex vivo de composições de células hemácias, algum supressor permanece na composição na introdução em um indivíduo. Como tal, os supressores da invenção precisam ser adequados para infusão. Supressores adequados incluem, mas não estão limitados, a compostos compreendendo um grupo tiol, tais como supressores compreendendo o aminoácido cisteína ou um derivado adequado da cisteína, tal como N-acetilcisteína. Exemplos de tais supressores incluem cisteína e peptídeos compreendendo pelo menos uma cisteína, tal como glutationa. Em algumas modalidades, os supressores adequados compreendem um derivado de cisteína que pode formar um grupo tiol in situ, com ou sem o uso de substâncias químicas adicionais ou enzimas adicionadas, tais como S-acetilcisteína ou outras pró-drogas de cisteína derivados de tiol adequados, ou peptídeos compreendendo S-acetilcisteína ou outras pródrogas de cisteína derivados de tiol adequados. Derivados adequados de cisteína são aqueles os quais ou compreendem ou são capazes de formar in situ uma cisteína tiol a qual é capaz de reagir com o grupo eletrofílico do composto inativador de patógeno.

Geralmente, devido ao alvejamento do composto inativador de patógeno para ácidos nucléicos, quantidades suficientes de composto inativador de patógeno são capazes de penetrar no patógeno e reagir com o ácido nucléico do patógeno antes de ser suprimido. O composto inativador de patógeno remanescente no ambiente extracelular, entretanto, é adequadamente suprimido para reduzir reações secundárias indesejáveis. Conseqüentemente, uma quantidade eficaz de supressor juntamente com uma quantidade eficaz de composto inativador de patógeno é fornecida pelos métodos da invenção. Em algumas modalidades, o supressor é capaz de suprimir reações secundárias indesejáveis no ambiente extracelular da composição de células hemácias mas não entra nas células de fora significativa, tal como células hemácias, vírus e bactérias. Como tal, a quantidade eficaz de composto inativador de patógeno pode ser fornecida de forma que composto inativador de patógeno suficiente penetre no patógeno antes dele ser suprimido no ambiente extracelular. Em algumas modalidades, o supressor compreende cisteína ou um derivado adequado de cisteína e não penetra significativamente no patógeno, tal como um vírus ou bactéria. Tais supressores incluem peptídeos em que pelo menos um dos aminoácidos é cisteína, Nacetilcisteína, S-acetilcisteína ou outro derivado de cisteína adequado. Em algumas modalidades, o supressor compreende um peptídeo (por exemplo, 2 - 10 aminoácidos) compreendendo cisteína.

Em algumas modalidades, o supressor é um peptídeo de 2 a 10 aminoácidos, em que pelo menos um dos aminoácidos é cisteína, N- acetilcisteína, S-acetilcisteína ou outro derivado de cisteína adequado. Em algumas modalidades, o supressor é um peptídeo de pelo menos 3 aminoácidos, tal como cerca de 3 - 10 aminoácidos, também cerca de 3 - 6 aminoácidos, em que pelo menos um dos aminoácidos é cisteína, N- acetilcisteína, Sacetilcisteína ou outro derivado de cisteína adequado. Em algumas modalidades, o supressor é um peptídeo de pelo menos 3 aminoácidos, tal como cerca de 3 - 10 aminoácidos, também cerca de 3 - 6 aminoácidos, em que pelo menos um dos aminoácidos é cisteína, N- acetilcisteína, S-acetilcisteína ou outro derivado de cisteína adequado, também em que pelo menos 2 ou pelo menos 3 dos aminoácidos é cisteína, N- acetilcisteína, S-acetilcisteína ou outro derivado de cisteína adequado. Um supressor preferido é a glutationa (também conhecida como L-glutationa ey-L-glutamil-L-cisteinilglicina).

Em algumas modalidades, o supressor é a glutationa na sua forma reduzida. Dissulfeto de glutationa, a forma oxidada da glutationa, também pode ser usada, contanto que o dissulfeto de glutationa é suficientemente reduzido em solução antes da adição da solução à mistura compreendendo a composição de células hemácias ou suficientemente reduzido depois da adição à mistura compreendendo a composição de células hemácias.

Em algumas modalidades, o supressor é um derivado da glutationa, tal como um monoalquiléster ou um dialquiléster da glutationa, em que o grupo alquila é um grupo linear ou ramificado com de 1 a 10 átomos de carbono. Exemplos específicos de grupos alquila incluem, mas não estão limitados, ao grupo metila, ao grupo etila, ao grupo propila, ao grupo isopropila, ao grupo butila, ao grupo isobutila, ao grupo terc-butila, ao grupo pentila, ao grupo isopentila, ao grupo neopentila, ao grupo terc-pentila, ao grupo 1 -metilbutila, ao grupo hexila, ao grupo isoexila, ao grupo 2metilpentila, ao grupo 1 -etilbutila, ao grupo heptila, ao grupo octila, ao grupo nonila e ao grupo decila. Por exemplo, exemplos não-limitativos de derivados da glutationa incluem o éster metílico da glutationa, o éster monoetílico da glutationa e o éster monoisopropílico da glutationa. Em algumas modalidades, éster dietílico oxidado da glutationa (GSSG-(glicil)-dietiléster) é usado. Em algumas modalidades, um tioéster da glutationa é hidrolisado após a adição às composições de células hemácias para formar o tiol.

É entendido que em algumas modalidades, o supressor será fornecido na forma de um ácido ou base livre, enquanto que, em outras modalidades, o supressor será fornecido na forma de um sal. Se o supressor estiver na forma de um sal, o sal é preferivelmente um sal farmaceuticamente aceitável. Os sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos (na forma de produtos aquosos ou oleosos solúveis ou dispersíveis) incluem os sais não-tóxicos convencionais ou os sais quaternários de amônio os quais são

formados, por exemplo, a partir de ácidos ou bases inorgânicas ou orgânicas. Exemplos de tais sais de adição de ácidos incluem acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, benzenossulfonato, bissulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanossulfonato, fumarato, glicoeptanoato, glicerofosfato, hemissulfato, heptanoato, hexanoato, cloridrato, bromidrato, iodidrato, 2hidroxietanossulfonato, lactato, maleato, metanossulfonato, 2naftalenossulfonato, nicotinato, oxalato, pamoato, pectinato, persulfato, 3fenilpropionato, fosfato, picrato, pivalato, propionato, succinato, tartarato, tiocianato, tosilato e undecanoato. Sais de base incluem sais de amônio, sais de metais alcalinos tais como sais de sódio e potássio, sais de metais alcalino-terrosos tais como sais de cálcio e de magnésio, sais com bases orgânicas tais como sais de dicicloexilamina, N-metil-D-glucamina e sais com aminoácidos tais como arginina, lisina e assim por diante. Também os grupos contendo nitrogênio podem ser quatemizados com tais agentes como haletos de alquila inferiores, tais como cloretos, brometos e iodetos de metila, etila, propila e butila; díalquilsulfatos como dimetila, dietila, dibutil; e diamilsulfatos, haletos de cadeia longa tais como cloretos, brometos e iodetos de decila, laurila, miristila e estearila, haletos de aralquila como brometos de benzila e fenetila e outros. Outros sais farmaceuticamente aceitáveis incluem o sal de sulfato do etanolato e sais de sulfato.

Por exemplo, em algumas modalidades, o supressor está na forma de um sal farmaceuticamente aceitável formado a partir da glutationa. Em algumas modalidades, o supressor está na forma de um sal farmaceuticamente aceitável formado a partir da glutationa e um ou mais cátions, tais como sódio, alumínio, cálcio, lítio, magnésio, zinco ou tetrametilamônio. em algumas modalidades, o supressor é a glutationa (reduzida) e é fornecido na forma de sal monossódico de glutationa (disponível, por exemplo, da Biomédica Foscama, Itália). Em algumas outras modalidades, a glutationa (reduzida) é fornecida na forma de sal de cloridrato de glutationa. Em algumas outras modalidades, a glutationa é fornecida na forma de um sal dissódico de glutationa (reduzida). Em outras modalidades, um monoalquilestersulfato de glutationa é usado. Em algumas modalidades, glutationa é fornecida na forma de um sal dissódico oxidado de glutationa.

Em algumas modalidades, o supressor é misturado com a composição de células hemácias e/ou composto inativador de patógeno na forma pura. Em algumas modalidades, o supressor que é misturado com a composição de células hemácias e/ou com o composto inativador de patógeno está em solução aquosa. Em algumas modalidades, o supressor é um supressor neutralizado em solução aquosa. Por exemplo, em algumas modalidades, o supressor pode ser um composto ácido em solução aquosa para o qual pelo menos um equivalente (por exemplo, cerca de um ou dois equivalentes) de base foram adicionados.

Os métodos de supressão da presente invenção envolvem a combinação de uma composição de células hemácias com um composto inativador de patógeno e um supressor sob condições onde, na mistura da composição com o composto inativador de patógeno e o supressor, o pH da composição resultante está em uma faixa adequada para fornecer a inativação de patógeno adequada com a redução melhorada de reações secundárias indesejáveis, tais como a modificação das células hemácias. Os métodos melhorados incluem três características que podem ser importantes para os métodos de supressão. A primeira característica é o grupo tiol, ou outro grupo nucleofílico adequado. A segunda é o ajuste do pH da solução. É possível proporcionar algum nível de supressão somente pelo ajuste adequado do pH da solução. Como tal, os supressores da invenção fornecem alguma capacidade tamponantes para a composição compreendendo as células hemácias, onde a própria capacidade tamponante proporciona uma supressão melhorada. Por exemplo, usando um análogo da cisteína, tal como metionina com um supressor, quando apropriadamente modificado para fornecer uma alteração de pH adequada na composição de células hemácias, irá resultar em algum nível de supressão da ligação do composto inativador de patógeno com as células hemácias. Como o átomo de enxofre na metionina não é nucleofílico, a metionina não fornece qualquer supressão exceto o fornecimento do pH necessário da solução. Conseqüentemente, a combinação do ajuste de pH e do grupo tiol fornece uma melhoria adicional para os métodos de supressão da invenção. Uma terceira característica que pode ser importante para fornecer uma supressão melhorada em algumas modalidades são supressores preferidos que não penetram substancialmente dentro dos patógenos, tais como vírus e bactérias. Tais supressores fornecem uma supressão adequada no ambiente extracelular, onde reações prejudiciais, tais como a ligação às superfícies de células hemácias ocorre, sem a supressão adicional do composto inativador de patógeno uma vez que ele tenha penetrado dentro do patógeno.

Em relação à característica de ajustar o pH da composição de células hemácias, os métodos existentes de suprimir tais compostos inativadores de patógeno falham em compreender a importância do pH da mistura resultante. Enquanto quantidades maiores de supressor são demonstradas em métodos conhecidos como fornecedoras de inativação de patógeno adequada, esses métodos não descrevem adequadamente os efeitos na modificação das células hemácias quando quantidades maiores de supressores, tais como glutationa protonada são usadas. Como os exemplos aqui demonstram, o uso de quantidades maiores de supressores, tais como glutationa ácida, não reduzem adequadamente o nível de modificação das células hemácias. Devido ao fato da glutationa ser ácida, os níveis mais altos levam o pH da composição de células hemácias até níveis inaceitavelmente baixos, nos quais a supressão das reações secundárias indesejáveis do composto inativador de patógeno é ineficaz. Conseqüentemente, um aspecto da presente invenção envolve a garantia de que o pH da composição de células hemácias é mantido em um nível adequado na adição do composto inativador de patógeno e do supressor. Em algumas modalidades, na mistura do composto inativador de patógeno e do supressor com a composição de células hemácias, o pH da mistura está na faixa de cerca de 6,8 até 8,5, também de cerca de 7,0 a 8,5, também de cerca de 7,2 a 8,5 ou de cerca de 7,2 a 8,0. Enquanto o pH em uma composição de células hemácias pode mudar com o tempo, é desejável que o pH esteja em uma faixa desejada quando o supressor for adicionado à composição de células hemácias, quer ou não ele

já contenha o composto inativador de patógeno. Os métodos da presente invenção envolvem a adição do composto inativador de patógeno e do supressor a uma composição de células hemácias. A faixa de pH desejada é necessária na adição tanto do composto inativador de patógeno quanto do supressor, indiferentemente da ordem de adição do composto inativador de patógeno e/ou do supressor para a composição de células hemácias. Em outras palavras, uma vez que todos os três componentes tenham sido misturados, o pH está dentro da faixa desejada. Em algumas modalidades, o supressor é adicionado antes do composto inativador de patógeno. Em algumas modalidades, o composto inativador de patógeno é adicionado antes do supressor. em algumas modalidades, o supressor e o composto inativador de patógeno são adicionados essencialmente simultaneamente. Conseqüentemente, na adição do composto inativador de patógeno e do supressor significa no ponto onde tanto o supressor e o composto inativador de patógeno foram misturados com a composição de células hemácias. O pH desejado pode ser alcançado por várias formas, e não é limitado como para quando o pH da composição de células hemácias é ajustado, ou em algumas modalidades não é significativamente ajustado a partir do pH natural do produto sanguíneo. Por exemplo, o pH desejado da composição de células hemácias pode ser alcançado pelo ajuste do pH. O ajuste do pH pode ser feito, por exemplo, pela adição de uma solução aditiva adequada, tal como uma solução tamponante, antes da adição do composto inativador de patógeno e do supressor. em algumas modalidades, a composição de células hemácias pode ser lavada uma ou mais vezes com um tampão adequado antes de ser suspensa no mesmo ou em outro tampão adequado. Alternativamente, o pH da composição de células hemácias pode ser ajustado simultaneamente com a adição ou do composto inativador de patógeno, ou do supressor ou de ambos. Em algumas modalidades, o pH é ajustado simultaneamente com a adição do supressor. Em uma modalidade preferida, o supressor é neutralizado, de forma que a adição do supressor neutralizado fornece a faixa de pH desejada na composição de células hemácias. Como um exemplo, a neutralização da glutationa pode ser usada para efetuar os ajustes de pH

necessários. Devido ao fato da glutationa compreender ácido glutâmico, o pH da forma protonada é ácido. Sem estar ligado à teoria, a provável neutralização da glutationa protonada é mostrada no seguinte esquema:

glutationa protonada ou ácido livre da glutationa pH aproximadamente 3

0,9 - 1,0 equivalentes de NaOH pH aproximadamente 5 equivalentes de NaOH pH aproximadamente 9,5

Como tal, um nível apropriado de neutralização da glutationa pode ser usado, por exemplo pela adição de 2 equivalentes de base, para fornecer um supressor que, na adição para uma composição de células hemácias, irá fornecer o ajuste de pH necessário da composição. A neutralização apropriada irá depender do supressor usado. Por exemplo, quando um peptídeo é usado, ela irá depender dos componentes do aminoácido do peptídeo. Em algumas modalidades, um supressor pode ser usado que não afete significativamente o pH da composição de células hemácias. Por exemplo, o uso de um peptídeo compreendendo uma cisteína que pode ainda compreender um ou mais aminoácidos que resulte em um pH mais neutro para uma solução do peptídeo naturalmente isolado. Em algumas modalidades, o peptídeo ainda compreende pelo menos um aminoáido básico, tal como ar ginina ou lisina.

Em algumas modalidades dos métodos aqui descritos onde uma base é misturada com a composição de células hemácias juntamente com o composto inativador de patógeno e um supressor para aumentar o pH da mistura até um nível desejado e/ou para melhorar a supressão de reações secundárias indesejáveis, a base é um sal básico. O sal básico pode primeiramente ser dissolvido em uma solução aquosa antes da mistura com a composição de células hemácias, ou pode ser adicionado diretamente para

a composição de células hemácias na forma sólida. Em algumas modalidades, o sal básico compreende o supressor e fornece tanto o supressor quanto a base para a mistura. Em algumas modalidades, a base usada no método é uma base forte, tal como NaOH. Tipicamente, uma base forte como NaOH irá ser dissolvida primeiramente em solução aquosa antes da mistura com a composição de células hemácias. Em algumas modalidades, a base forte (em solução ou na forma sólida) é misturada com o supressor antes de misturar o supressor com a composição de células hemácias. Em algumas modalidades, a base é um tampão básico (adicionado em quantidades suficientes e com um pKa apropriado para levar a mistura até a faixa de pH desejada). Se um tampão básico for usado, o tampão irá, em algumas modalidades, ser um tampão farmaceuticamente aceitável. Em algumas modalidades, o tampão irá ter um próton titulável com um pKa na faixa de cerca de 7 a 8. Exemplos de tampões os quais podem ser usados como tampões básicos incluem, mas não estão limitados, ao ácido N-(2-hidroxietil)-piperazinaΝ’-2-etanossulfônico (HEPES), solução salina tamponada com fosfato (PBS) e tampão de fosfato de sódio. Outros tampões básicos adequados serão prontamente identificáveis por uma pessoa normalmente versada na técnica.

Em algumas modalidades de cada um dos métodos e composições aqui descritos, o pH da mistura das células hemácias, do supressor, do composto inativador de patógeno e de qualquer base adicionada é maior do que cerca de 6,7, maior do que cerca de 7,0 ou maior do que cerca de 7,2. Em algumas modalidades de cada um dos métodos e composições aqui descritos, o pH da mistura de células hemácias, do supressor, do composto inativador de patógeno e da base (se qualquer uma for adicionada) está na faixa de cerca de 6,8 a 8,5, também de cerca de 7,0 a 8,5, também de cerca de 7,2 a 8,5 ou também de cerca de 7,2 a 8,0. em algumas modalidades preferidas, o pH indicado é o pH na temperatura ambiente. Por exemplo, em algumas modalidades, a composição compreendendo as células hemácias são tratadas com o composto inativador de patógeno na presença do supressor e qualquer base adicionada, em que o pH da mistura está na faixa de cerca de 7,2 até cerca de 8,0.

Em algumas modalidades, o pH da mistura das células hemácias, do supressor e da base (se a base for adicionada como parte do método) está na faixa de cerca de 6,8 a 8,5, cerca de 7,0 a 8,5, cerca de 7,2 a 8,5 ou cerca de 7,2 a 8,0, antes da mistura do composto inativador de patógeno com a composição de células hemácias. Em algumas outras modalidades, o pH é alcançado ao mesmo tempo como ou dentro de cerca de 1 hora, dentro de cerca de 30 minutos, dentro de cerca de 20 minutos, dentro de cerca de 10 minutos, dentro de cerca de 5 minutos ou dentro de cerca de 2 minutos de mistura do composto inativador de patógeno com a composição compreendendo as células hemácias. Em algumas modalidades daqueles métodos onde o pH é ajustado, o pH é ajustado até a faixa de pH desejada antes de, ao mesmo tempo em que , dentro de cerca de 1 hora, dentro de cerca de 30 minutos, dentro de cerca de 20 minutos, dentro de cerca de 10 minutos, dentro de cerca de 5 minutos ou dentro de cerca de 2 minutos de mistura do composto inativador de patógeno com a composição compreendendo as células hemácias. Naquelas modalidades, onde o supressor é a glutationa e o composto inativador de patógeno é PIC-1, o pH da mistura compreendendo a composição de células hemácias e o supressor é preferivelmente ajustado até a faixa de pH desejada (por exemplo, pH de 7,2 a 8,0) antes da mistura do PIC-1 com a composição de células hemácias.

Em algumas modalidades, o pH da composição final não é necessariamente um ajuste do pH da composição de células hemácias. Por exemplo, uma composição de células hemácias pode ter um pH na faixa desejada de 6,8 - 8,5, e o pH da composição não muda significativamente na adição do supressor, e subseqüentemente o composto inativador de patógeno. Em tais modalidades, o supressor ou naturalmente fornece o pH desejado ou é neutralizado concordantemente para fornecer o pH desejado. É a combinação de adicionar grandes quantidades de supressor, tal como cerca de 5 mM até cerca de 40 mM, com um pH resultante na faixa desejada que é importante. Métodos conhecidos usando tais concentrações de glutationa, por exemplo, não foram usados com a faixa de pH desejada da presente invenção. Conseqüentemente, para peptídeos, indiferentemente do supres44 sor peptídico, ele pode ser efetivamente neutralizado conforme necessário para fornecer uma faixa de pH adequada quando adicionado a uma composição de células hemácias, e ainda pode ser selecionado para fornecer uma quantidade adequada de tamponante na faixa de pH desejada, como tal, um supressor neutralizado significa que o supressor é adequadamente titulado com ácido ou base conforme necessário de forma que na adição a uma composição de células hemácias, a mistura resultante tem um pH que fornece uma melhor supressão de reações secundárias indesejáveis, tal como um pH na faixa de cerca de 6,8 a 8,5 também cerca de 7,0 a 8,5, também cerca de 7,2 a 8,5, ou cerca de 7,2 a 8,0. Em algumas modalidades, o peptídeo como isolado naturalmente é adequadamente neutralizado, isto é, não requer a adição de ácido ou base para fornecer o pH desejado na mistura final. Além disso, supressores preferidos irão fornecer uma capacidade tamponante para manter o pH na faixa desejada por um tempo necessário para suprimir reações secundárias indesejáveis.

Em algumas modalidades de cada um dos métodos e composições aqui descritos, o supressor é neutralizado. Um supressor é dito como sendo neutralizado por uma base se uma quantidade suficiente da base tiver sido combinada com o supressor, de forma que a supressão de uma reação secundária indesejável entre o composto inativador de patógeno e as células hemácias é melhorada em uma mistura compreendendo as células hemácias, o composto inativador de patógeno e o supressor. Um supressor neutralizado não tem necessariamente um pH neutro. Em algumas modalidades, onde o supressor é muito ácido, o pH do supressor neutralizado pode ainda ser mais baixo do que 7,0. Em algumas modalidades, o pH da solução do supressor neutralizado pode ser maior do que 7,0. Em algumas modalidades, o pH da solução do supressor neutralizado será detectavelmente maior do que aquele do supressor antes da adição de base. Em algumas modalidades, o supressor é neutralizado com pelo menos cerca de 0,25 equivalente, pelo menos cerca de 0,5 equivalente, pelo menos cerca de 0,75 equivalente, pelo menos cerca de 1 equivalente ou pelo menos cerca de 2 equivalentes de base. Em algumas modalidades, o supressor é neutralizado com cerca de 1 até cerca de 2 equivalentes de base. Em algumas modalidades, o supressor é neutralizado com cerca de 1 equivalente de base. Em outras modalidades, o supressor é neutralizado com cerca de 2 equivalentes de base. Por exemplo, em algumas modalidades da invenção, glutationa é neutralizada com cerca de 2 equivalentes de uma base adequada, tal como hidróxido de sódio. Nesse exemplo, uma solução da glutationa protonada tem um pH de aproximadamente 3, enquanto a solução neutralizada com 2 equivalentes de hidróxido de sódio tem um pH de aproximadamente 9,5. Um supressor de peptídeo apropriado compreendendo pelo menos uma cisteína pode ser adequadamente ajustado para fornecer o pH desejado na adição à composição de células hemácias. Além de fornecer um supressor que tem o pH adequadamente ajustado ou neutralizado, em algumas modalidades, supressores preferidos não são capazes de entrar significativamente nos patógenos, de forma que eles suprimem otimamente reações secundárias indesejáveis no ambiente extracelular, mas não interferem com a inativação de patógeno uma vez que o composto inativador de patógeno tenha penetrado dentro do patógeno.

Em algumas modalidades de cada um dos métodos aqui descritos, o supressor é um composto ácido. Em algumas modalidades, o supressor é fornecido na forma de ácido livre. Em algumas modalidades, o supressor é ácido e pelo menos cerca de 1 equivalente de base é adicionado para neutralizar o supressor. Uma solução compreendendo tal supressor neutralizado pode, em alguns exemplos, ser básica, neutra ou mesmo ainda ácida. Em algumas modalidades, cerca de 1 equivalente de base é adicionado para neutralizar o supressor. Em algumas modalidades, cerca de 2 equivalentes de base são adicionados. Em algumas modalidades, o supressor é ácido e cerca de 1 até cerca de 2 equivalentes de base são usados para neutralizar o supressor. Em algumas modalidades, cerca de 1 ou cerca de 2 equivalentes de base são usados.

Em algumas modalidades, o supressor é neutralizado antes da adição á composição de células hemácias e/ou do composto inativador de patógeno. Em outras modalidades, o supressor é neutralizado depois de /Α2 combinar o supressor ou com a composição de células hemácias e/ou com o composto inativador de patógeno.

Em algumas modalidades, o supressor é glutationa e é fornecido na forma de sal monossódico de glutationa e é neutralizado com cerca de 1 equivalente de base. Em algumas outras modalidades, o supressor é glutationa e é fornecido na forma de sal de cloridrato de glutationa e é neutralizado com cerca de 2 equivalentes de base.

Em algumas modalidades, a concentração do supressor na mistura compreendendo composição de células hemácias, supressor, composto inativador de patógeno e qualquer base adicionada é maior do que 2 mM, maior do que cerca de 4 mM ou maior do que cerca de 10 mM. Em algumas modalidades, a concentração de supressor na mistura está na faixa de cerca de 2 mM até 100 mM, cerca de 2 mM até 40 mM, cerca de 4 mM até 40 mM, cerca de 5 mM até 40 mM, cerca de 5 mM até 30 mM ou cerca de 10 mM até 30 mM. Em algumas modalidades, a concentração do supressor na mistura é de cerca de 20 mM. Em algumas modalidades de cada um dos métodos e composições aqui descritas, a concentração do supressor na mistura é maior do que 2 mM, maior do que cerca de 4 mM ou maior do que cerca de 10 mM, e o pH da mistura das células hemácias, supressor e a concentração do composto inativador de patógeno é maior do que cerca de 6,7, maior do que cerca de 7,0 ou maior do que cerca de 7,2. Em algumas modalidades de cada um dos métodos e composições aqui descritos, em algumas modalidades, a concentração do supressor na mistura está na faixa de cerca de 2 mM até 40 mM, cerca de 4 mM até 40 mM, cerca de 5 mM até 40 mM, cerca de 5 mM até 30 mM ou cerca de 10 mM até 30 mM, e o pH da mistura de células hemácias, supressor e composto inativador de patógeno está na faixa de cerca de 6,8 a 8,5, também de cerca de 7,0 a 8,5, também de cerca de 7,2 a

8,5 ou de cerca de 7,2 a 8,0. Em algumas modalidades de cada um dos métodos e composições aqui descritos, a concentração do supressor na mistura é maior do que 2 mM, maior do que cerca de 4 mM ou maior do que cerca de 10 mM, e o pH da mistura de células hemácias, supressor e composto inativador de patógeno está na faixa de cerca de 6,8 a 8,5, também de cerca

de 7,0 a 8,5, também de cerca de 7,2 a 8,5 ou de cerca de 7,2 a 8,0. Em algumas modalidades, a concentração do supressor (por exemplo, glutationa) na mistura está na faixa de cerca de 4 mM até cerca de 40 mM, e o pH da mistura está na faixa de cerca de 7,2 a 8,0. Em algumas modalidades, a concentração do supressor na mistura está na faixa de cerca de 10 mM até cerca de 30 mM, e o pH da mistura está na faixa de cerca de 6,8 a 8,5.

Em uma modalidade preferida, o supressor é a glutationa neutralizada. Glutationa tem muitas propriedades que a tornam particularmente útil como um supressor. Ela está normalmente presente em todos os tipos celulares. Não se acredita que ela seja capaz de penetrar passivamente em um patógeno, tal como pela passagem através das membranas celulares ou revestimentos lipídicos, de bactérias e vírus envelopados com lipídeos, ou pela passagem através do capsídeo viral de vírus não-envelopados. Em pH 7, glutationa é carregada e na ausência de transporte ativo não penetra nas bicamadas lipídicas até qualquer amplitude significativa. Isso é consistente com a inativação dos vírus envelopados com lipídeos, tais como HIV e VSV sendo substancialmente não-afetados pela glutationa, incluindo usando concentrações de glutationa neutralizada maior do que 2 mM. O uso de glutationa não tem algum efeito na inativação de Yersinia enterocolitica, Staphylococcus epidermidis e Serratia marcescens. Entretanto, isso pode ser gerenciado pelo uso de quantidades eficazes de glutationa neutralizada e de composto inativador de patógeno. Como tal, métodos preferidos de supressão são fornecidos, em que a contaminação de uma composição de células hemácias por um patógeno viral ou bacteriano é inativada por pelo menos 2 log, preferivelmente pelo menos 3 log. Em algumas modalidades, Staphylococcus epidermidis pode ser inativado por até pelo menos 3 log, também cerca de 4 log, ou cerca de 5 log e VSV pode ser inativado por até pelo menos 4 log, também cerca de 5 log ou cerca de 6 log. Além disso, a inativação está dentro de cerca de 3 log, também cera de 2 log, preferivelmente cerca de 1 log daquele do tratamento padrão da composição de células hemácias com glutationa ácida 2 mM e PIC-1 0,2 mM. Em algumas modalidades, a inativação de Staphylococcus epidermidis com PIC-1 está dentro de cerca

A Oi de 3 log, também cerca de 2 log ou cerca de 1 iog daquela de uma composição similar inativada com glutationa ácida 2 mM e PIC-1 0,2 mM. Em algumas modalidades, a inativação de VSV com PIC-1 está dentro de cerca de 2 log, ou cerca de 1 log ou e essencialmente igual àquela de uma composição similar inativada com glutationa ácida 2 mM e PIC-1 0,2 mM. glutationa também é compatível com a estocagem in vitro de células hemácias e a composição de células hemácias resultante é adequada para a introdução in vivo.

Métodos apropriados para neutralizar glutationa e outros supressores serão prontamente aparentes para aqueles indivíduos normalmente versados na técnica. Em algumas modalidades, hidróxido de sódio é usado para neutralizar o supressor. Em algumas modalidades, alguns péletes sólidos de NaOH são primeiramente dissolvidos em água para gerar uma solução concentrada da base, tal como uma solução de NaOH 1 N, 5 N, 10 N ou 20 N. Em algumas modalidades, uma quantidade apropriada daquela solução de NaOH é, a seguir, adicionada ao supressor ou antes de, ao mesmo tempo em que ou após a adição do supressor à mistura. Altemativamente, o NaOH é adicionado à composição de células hemácias ou ao composto inativador de patógeno, ou a combinação dos dois, antes da adição do supressor à mistura.

O supressor e/ou a base adicionada (ou o supressor neutralizado) usado nos métodos aqui descritos pode ser misturado com a composição de células hemácias antes de, ao mesmo tempo em que ou depois da adição do composto inativador de patógeno à composição de células hemácias. Se o supressor e a base (ou o supressor neutralizado) são misturados com a composição de células hemácias depois da solução inativada por patógeno ser misturada com a composição de células hemácias, o supressor e/ou base (ou supressor neutralizado) são preferivelmente adicionados à composição de células hemácias antes de uma quantidade significativa de reação secundária do composto inativador de patógeno com as células hemácias tenha ocorrido, de forma que a supressão adequada da reação secundária indesejada possa ser conseguida. Em algumas modalidades, o supressor e/ou a base (ou supressor neutralizado) são misturados com a com49

posição de células hemácias dentro de cerca de uma hora, dentro de cerca de 30 minutos, dentro de cerca de 20 minutos, dentro de cerca de 10 minutos, dentro de cerca de 5 minutos, dentro de cerca de 2 minutos ou dentro de cerca de 1 minutos depois de misturar o composto inativador de patógeno com a composição de células hemácias. Em algumas modalidades, o supressor e/ou a base (ou o supressor neutralizado) são misturados com a composição de células hemácias antes da mistura do composto inativador de patógeno com a composição de células hemácias. Por exemplo, em algumas modalidades onde a glutationa neutralizada e o PIC-1 são usados nos métodos, a glutationa neutralizada é misturada com as células hemácias antes de, ao mesmo tempo em que ou dentro de cerca de 10 minutos depois da mistura do PIC-1 com a composição de células hemácias.

Em algumas modalidades, o supressor e/ou base (ou supressor neutralizado) são misturados com a composição de células hemácias antes da mistura do composto inativador de patógeno com a composição de células hemácias.

Em algumas modalidades de cada um dos métodos aqui descritos, o supressor e a base adicionada (ou o supressor neutralizado) são incubados com a composição de células hemácias por um intervalo de tempo adequado antes da adição do composto inativador de patógeno, tal como por cerca de 30 minutos até 48 horas, também de cerca de 2 até 24 horas, também de cerca de 8 até 24 horas. Em algumas outras modalidades, a incubação está em uma faixa de temperatura de cerca de 1°C até 30°C, também de cerca de 18°C até 25°C ou por volta da temperatura ambiente.

Em algumas modalidades de cada um dos métodos aqui descritos, o composto inativador de patógeno é incubado com a composição de células hemácias na presença do supressor e da base adicionada (ou o supressor neutralizado) por um intervalo de tempo adequado, tal como por cerca de 30 minutos até 48 horas, também de cerca de 2 a 24 horas, também de cerca de 8 até 24 horas. Em algumas outras modalidades, a incubação está em uma faixa de temperatura de cerca de 1°C até 30°C, também de cerca de 18°C até 25°C ou por volta da temperatura ambiente.

Além de comparar o log de inativação conforme discutido acima, a eficácia dos métodos de supressão melhorados pode ser avaliada por vários outros métodos. Os métodos de supressão podem ser avaliados pela avaliação da modificação da composição de células hemácias, tanto em termos da função das células hemácias e em termos da reatividade das células hemácias tratadas com o sistema imune, tal como com anticorpos. Se a composição de células hemácias tratadas for pretendida para uso humano, tal como infusão, os métodos de supressão não devem danificar substancialmente a função das células hemácias. A falta de um efeito substancialmente danoso na função das células hemácias pode ser medida pelos métodos conhecidos na técnica para testar a função das células hemácias. Por exemplo, os níveis de indicadores, tais como ATP intracelular (5’-trifosfato de adenosina), 2,3-DPG intracelular (2,3-difosfoglicerol) ou potássio extracelular podem ser medidos e comparados com um controle não-tratado. Hemólise adicional, pH intracelular e extracelular, hematócrito, hemoglobina, fragilidade osmótica, consumo de glicose e produção de lactato podem ser medidos. Os métodos melhorados da presente invenção podem ser comparados com a condição padrão e glutationa ácida de 2 mM juntamente com PIC-1 0,2 mM, assim como condições co glutationa crescente, onde os métodos conhecidos utilizam glutationa ácida, conforme descrito na Patente U. S. N° 6.709.810. Enquanto o aumento da concentração de glutationa nos métodos da invenção pode resultar em uma leve redução no nível de inativação de alguns patógenos, níveis adequados de inativação são ainda obtidos, e a redução melhorada na modificação das células hemácias, enquanto mantendo a função adequada das células hemácias, resulta em um produto global melhor.

Métodos para determinar ATP, 2,3-DPG, glicose, hemoglobina, hemólise e potássio são disponíveis na técnica. Ver, por exemplo, Davey et al., Transfusion, 32: 525 - 528 (1992), a descrição do qual é aqui incorporada. Métodos para determinar a função das células hemácias também estão descritos em Greenwalt et al. Vox Sang, 58:94-99 (1990); Hogman et al., Vox Sang, 65:271-278 (1993); e Beutler et al, Blood, Vol. 59 (1982), as des51

crições dos quais são aqui incorporadas por referência. Por exemplo, o ATP intracelular e o 2,3-DPG intracelular são medidos usando um kit de ATP ou um kit de 2,3-DPG da Sigma (Sigma, St. Louis, Mo). O kit de ATP é usado seguindo o procedimento da Sigma No. 366-UV, a descrição do qual é por meio deste incorporada por referência. Os níveis de potássio extracelular podem ser medidos usando um analisador de K⁺/Na⁺ Ciba Corning Modelo 614 (Ciba Corning Diagnostics Corp., Medford, MA). O pH extracelular é medido pela centrifugação das células a 4°C por 15 minutos a 12.000 x g e pela remoção do sobrenadante, para o qual o pH é medido usando um me10 didor de pH padrão em temperatura ambiente (por exemplo, Beckman, eletrodo de epóxi calomelano). Para o pH intracelular, o pélete remanescente é tampado no tubo de centrífuga e estocado em or volta de -80°C por pelo menos 2 horas, ele foi, a seguir, lisado pela adição de água deionizada. A amostra lisada é bem misturada e o pH da solução é medido ou em tempe15 ratura ambiente usando um medidor de pH padrão ou em temperatura ambiente, usando um analisador gasoso de sangue Ciba Corning Modelo 238 (Ciba Corning Diagnostics Corp., Medford, MA). As medidas podem ser feitas logo depois do tratamento e como uma função da estocagem póstratamento, por exemplo, pela estocagem por até 42 dias. Os métodos da 20 presente invenção fornecem uma composição de células hemácias em que a hemólise das células hemácias tratadas é menor do que 3% depois de uma estocagem por 28 dias, mais preferivelmente menor do que 2% depois de uma estocagem por 42 dias, e mais preferivelmente menor do que ou igual a cerca de 1% depois de uma estocagem por 42 dias a 4°C. Métodos preferi25 dos fornecem uma composição de células hemácias em que o nível de ATP intracelular é maior do que aquele de uma composição similar tratada com a condição padrão de glutationa ácida 2 mM e PIC-1 0,2 mM. Em algumas modalidades, os métodos de supressão da presente invenção fornecem níveis de ATP que são de cerca de 20%, também 30%, também 40% ou cerca 30 de 50% mais elevado do que uma composição tratada com glutationa ácida mM e PIC-1 0,2 mM, em que o nível mais alto de ATP é mantido depois de 7, 14, 21,28, 35 ou 42 dias de estocagem.

/ bè

A redução na modificação das células hemácias nos métodos da presente invenção pode ser avaliada por vários ensaios Em um ensaio, o soro policlonal de coelho que é reativo com acridina é produzido pela injeção nos coelhos brancos da Nova Zelândia com um composto de acridina conjugado com KLH. O composto de acridina S-197 foi usado e tem a seguinte estrutura:

S-197

Ele é conjugado com o KLH pela adição de 10 μί do composto (10 mM em água deionizada) para 990 μί de uma solução tamponada de KLH (10 mg/mL em fosfato 50 mM, NaCI 150 mM, PBS pH = 7,2 com estabilizante registrado, Pierce Cat #77600) e incubando em temperatura ambiente por mais de 20 horas. Depois dessa incubação, o KLH conjugado é isolado a partir de S-197 não-reagido e subprodutos de S-197 pela passagem através de uma coluna dessalinizadora (por exemplo, colunas de sal-D, Pierce) e eluindo com tampão PBS. As frações coloridas das soluções são, a seguir, combinadas e os conjugados KLH são caracterizados pela proporção da absorvância a 210 e 410 nm. As soluções de acridina-KLH conjugadas são misturadas com o adjuvante completo de Freund para injeção intramuscular nos coelhos em locais múltiplos para imunizar os coelhos. O soro de coelho resultante irá ter um alto título de anticorpo policlonal que é reativo com a estrutura de acridina. O soro de coelho pode ser incubado com composição de células hemácias que foram tratadas com, por exemplo, PIC-1 e glutationa. O anticorpo de coelho não-ligado é removido por lavagem e a solução reage com um anticorpo anticoelho de cabra. A solução resultante pode ser ensaiada para a aglutinação pela passagem através de um cartão de gel de tampão (Micro Typing Systems, Pompano Beach, Flórida). Os cartões de gel são projetados para permitir que as células hemácias não-aglutinadas passem por ele, enquanto que as células aglutinadas pela reação com o soro de coelho e reagindo de forma cruzada com o anticorpo anticoelho permanecerão no topo do gel. Os cartões são pontuados como 0, 1+, 2+, 3+ ou 4+, onde 0 indica que todas as células são intactas e estão no fundo do gel, enquanto que 4+ indica a completa algutinação, com todas as células no topo do gel. Os métodos de supressão da presente invenção irão resultar em uma pontuação de 1+ ou inferior, preferivelmente 0, quando ensaiados usando uma diluição 1:100 de soro de coelho, enquanto que uma composição similar tratada com glutationa ácida 2 mM e PIC-1 0,2 mM resulta em pontuações de 2+ ou maiores.

Além disso, os métodos de supressão da presente invenção irão resultar em pontuações mais baixas quando comparadas com uma composição similar tratada com glutationa ácida na mesma concentração do supressor como o método de supressão preferido e a mesma concentração do composto inativador de patógeno. Por exemplo, uma composição de células hemácias tratada com glutationa neutralizada 10 mM e PIC-1 0,2 mM irá resultar em uma pontuação mais baixa, preferivelmente uma pontuação de 1 + ou 0, do que uma composição de células hemácias tratada com glutationa ácida 10 mM e PIC-1 0,2 mM.

Em outro ensaio, o soro policlonal de coelho pode reagir com células hemácias tratadas. Depois da remoção por lavagem de anticorpos não-ligados, um fragmento de Fab’2 anticoelho de cabra rotulado com FITC (cadeias anti H + L, Caltag) é adicionado. A ligação do rótulo FITC para as células hemácias é correlacionada com a quantidade de acridina ligada na superfície das células hemácias, e é ensaiada por análise de FACScan® (Becton, Dickinson e Co., NJ). A modificação relativa das células hemácias é determinada a partir do valor de fluorescência médio do FACScan®. Os métodos de supressão da presente invenção, quando comparados com o tratamento usando glutationa ácida 2 mM e PIC-1 0,2 mM, irá resultar na redução da fluorescência média por pelo menos 50%, também pelo menos 75% ou pelo menos 90%. Além disso, os métodos de supressão da presente invenção irão resultar em um nível mais baixo de fluorescência média em comparação com uma composição similar tratada com glutationa ácida na

mesma concentração do supressor como o método de supressão preferido e a mesma concentração de composto inativador de patógeno. Por exemplo, uma composição de células hemácias tratada com glutationa neutralizada 10 mM e PIC-1 0,2 mM irá resultar em um nível mais baixo de fluorescência média do que uma composição de células hemácias tratada com glutationa ácida 10 mM e PIC-1 0,2 mM. Os métodos de supressão da presente invenção, quando comparados com tal tratamento similar com glutationa ácida, irá resultar na redução da fluorescência média por pelo menos 10%, também pelo menos 25%, também pelo menos 50%, também pelo menos 75% ou pelo menos 90% em comparação com o tratamento da glutationa ácida.

Finalmente, amostras de soro de pacientes infundidos com células hemácias que foram tratados com glutationa 2 mM e PIC-1 0,2 mM que aparentam ter desenvolvido anticorpo anti-PIC-1 podem ser usadas para avaliar a reatividade cruzada com composições de células hemácias tratadas da presente invenção. Esse ensaio é similar ao ensaio de cartão de gel usando soro policlonal de coelho. Nesse ensaio, o gel contém IgG antihumana de coelho, de forma que as células hemácias reativas com o soro do paciente irá se algutinar no topo do gel. Os cartões são pontuados conforme indicado acima. Os métodos de supressão da presente invenção irão resultar em pontuações de 1+ ou inferiores, preferivelmente 0, para esse ensaio, enquanto que uma composição similar tratada com glutationa ácida 2 mM e PIC-1 0,2 mM resulta em pontuações de 2+ ou superiores. Além disso, os métodos de supressão da presente invenção irão resultar em pontuações mais baixas em comparação com uma composição similar tratada com glutationa ácida na mesma concentração do supressor como o método de supressão preferido e a mesma concentração de composto inativador de patógeno. Por exemplo, uma composição de células hemácias tratada com glutationa neutralizada 10 mM e PIC-1 0,2 mM irá resultar em uma pontuação mais baixa, preferivelmente uma pontuação de 1+ ou 0, do que uma composição de células hemácias tratada com glutationa ácida 10 mM e PIC1 0,2 mM.

Os métodos de supressão da invenção também podem ser

comparados com métodos existentes pela determinação do nível de modificação de ácidos nucléicos em uma amostra. Tipicamente uma composição de células hemácias pode conter leucócitos, e o ácido nucléico dos leucócitos pode ser isolado. Um composto inativador de patógeno com um isótopo radioativo que, na reação do composto com ácido nucléico, permanecerá ligado ao ácido nucléico. Isso pode ser usado para avaliar a quantidade de composto que reagiu com um ácido nucléico para uma variedade de métodos de supressão, e fornece uma medida que pode ser diretamente correlacionada com a inativação de leucócitos esperada. A quantidade de aductos formados por 1.000 pares de base de ácidos nucléicos pode ser usada como um modelo para avaliar o impacto esperado dos vários métodos na inativação do patógeno. Alternativamente, uma quantidade adequada de um patógeno pode ser adicionada a uma composição de células hemácias e o ácido nucléico do patógeno pode ser isolado depois do tratamento. Entretanto, nesse caso a amostra precisa ser leucorreduzida de forma que os níveis de quaisquer leucócitos residuais não irá interferir com a medida do ácido nucléico do patógeno.

Além de fornecer uma inativação de patógeno adequada enquanto os níveis de reações secundárias indesejadas é reduzido, os métodos de supressão da presente invenção também fornecem, em pelo menos algumas modalidades, uma redução na concentração de espécies eletrofílicas reativas depois da inativação do patógeno. Se as composições de células hemácias forem tencionadas para infusão, é importante que o nível de espécies eletrofílicas reativas seja tão baixo quanto possível, preferivelmente essencialmente não mais detectável. A presença de espécies eletrofílicas reativas pode ser determinada usando métodos disponíveis na técnica, tais como métodos cromatográficos incluindo cromatografia líquida - espectroscopia de massa (CL-ΕΜ). Além disso, a atividade residual de uma amostra pode ser avaliada pela avaliação de sua capacidade de reagir com um resíduo de guanina de um ácido nucléico, tal como usando o ensaio alquilador geral descrito por Matties (Matties, WR, Anal. Biochem. 1992 Out; 206(1): 161 - 7). Nesse ensaio, o RBC são extraídos depois de um período de incu56 bação aceitável com o composto inativador de patógeno e o supressor. Qualquer composto inativador de patógeno residual, assim como o supressor e outras espécies pequenas, é separado das proteínas. Essas espécies são, a seguir, incubadas com DNA ds sintetizado com resíduos de guanina 8-³H. O composto inativador de patógeno residual reage com DNA ds na posição N7 da guanina, a qual acidifica o resíduo 8-H e libera o ³H e solução, onde ele pode ser isolado e mensurado. A quantidade de trítio liberada pode ser quantificada, e ter uma correlação 1:1 com a quantidade de alquilador residual presente nas amostras extraídas testadas. O nível de espécies eletrofílicas, conforme determinado por esses métodos, pode ser avaliado usando os métodos melhorados da invenção e pela comparação com métodos conhecidos.

Em algumas modalidades de cada um dos métodos aqui descritos, o método ainda compreende a etapa de reduzir a concentração de um composto na mistura, em que o composto é selecionado do grupo consistindo em um composto inativador de patógeno ou um produto de degradação do composto inativador de patógeno. Em algumas modalidades, o método compreende a etapa de reduzir a concentração do composto inativador de patógeno na mistura. Em algumas modalidades, o método compreende a etapa de reduzir a concentração das espécies eletrofílicas na mistura. Em algumas modalidades, o método compreende a etapa de reduzir a concentração do supressor na mistura. A concentração do composto inativador de patógeno e/ou do supressor (e produtos relacionados) em um material biológico, tal como um produto de sangue, pode ser reduzida depois do tratamento, por exemplo, pela adsorção em um processo de remoção em batelada ou em fluxo. Métodos e dispositivos, os quais podem ser usados, estão descritos nas Patentes U. S. N°^s 6.544.727 e 6.331.387 e nas Publicações de Patentes U. S. N°^s 2002/0192632 , 2005/0142542, 2004/0185544 e 2001/0009756, as descrições das quais são aqui incorporadas por referência na sua totalidade. Concordantemente, em algumas modalidades, a concentração do composto inativador de patógeno é reduzida pelo contato da mistura com um meio de adsorção compreendendo partículas adsorventes com

uma afinidade pelo composto inativador de patógeno. Em algumas modalidades, o sistema de adsorção podería ser configurado para remover o composto inativador de patógeno em um processo em batelada. Em algumas modalidades, a concentração do composto inativador de patógeno na mistura é reduzida pela lavagem das células hemácias.

Os métodos da invenção resultam na inativação adequada de contaminantes de patógenos possíveis em composições de células hemácias com supressão melhorada em comparação com métodos conhecidos. Em métodos preferidos, conforme discutido acima, o composto inativador de patógeno compreende uma porção alvejável de ácido nucléico e um grupo eletrofílico reativo e o supressor compreende cisteína, em que o supressor fornece um pH adequado quando adicionado à composição de células hemácias. Em algumas modalidades, o supressor é ácido e é neutralizado com 1 ou 2 equivalentes de uma base adequada, tal como hidróxido de sódio. Em uma modalidade preferida, o supressor é glutationa neutralizada com 2 equivalentes de base. Em uma modalidade preferida, o composto inativador de patógeno compreende um grupo acridina ligado a um grupo mostarda através de uma ligação éster. Em uma modalidade preferida, o composto inativador de patógeno é a β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster de 2-[bis(2cloroetil)amino/etila, e seus sais e o supressor é a glutationa neutralizada com 2 equivalentes de base. O supressor pode ser adicionado à composição de células hemácias antes, depois ou simultaneamente com o composto inativador de patógeno. Em algumas modalidades, o supressor é adicionado na faixa de tempo de cerca de 30 minutos antes do composto inativador de patógeno até cerca de 10 minutos depois do composto inativador de patógeno. Em algumas modalidades, o supressor e o composto inativador de patógeno podem ser adicionados essencialmente simultaneamente, porém separadamente. Por exemplo, na modalidade preferida onde o composto inativador de patógeno é a β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster 2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico e o supressor é glutationa neutralizada, essas não podem ser facilmente formuladas em solução juntamente para a adição à composição de células hemácias. Devido à alta concentração de glutationa requerida para uma su58

pressão adequada, o composto inativador de patógeno precipita quando esses estão na mesma solução em altas concentrações. Uma vez adicionado à composição de células hemácias, eles são suficientemente diluídos e tamponados como para ambos serem completamente solúveis.

Em uma modalidade preferida da invenção, uma composição de células hemácias é misturada com β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster 2-[bis(2cloroetil)amino]etílico e glutationa neutralizada com 2 equivalentes de base. Em uma outra modalidade, a glutationa neutralizada é misturada com a composição de células hemácias e a β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster 2-[bis(2cloroetil)amino]etílico é subsequentemente adicionada dentro de cerca de 30 minutos da glutationa, preferivelmente dentro de cerca de 10 minutos. Em outra modalidade, a β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster 2-[bis(2cloroetil)amino]etílico e a glutationa neutralizada são misturados com a composição de células hemácias essencialmente simultaneamente, ou dentro de cerca de 1 minuto. Em outra modalidade, a β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster 2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico é adicionado à composição de células hemácias primeiro, com a glutationa neutralizada adicionada em cerca de 30 minutos, também em cerca de 10 minutos, também em cerca de 5 minutos, também em cerca de 1 minuto. Em algumas modalidades, na mistura de todos os três componentes, por exemplo, em cerca de 1 a 5 minutos de mistura, a glutationa está em uma concentração na faixa de cerca de 5 mM a 30 mM, preferivelmente cerca de 10 mM a 30 mM, preferivelmente cerca de 20 mM, e a β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster 2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico está em uma concentração na faixa de cerca de 0,05 mM até 0,5 mM, preferivelmente cerca de 0,1 mM até 0,3 mM, preferivelmente cerca de 0,2 mM, e o pH da mistura está na faixa de cerca de 7,2 a 8,0.

A presente invenção também fornece as composições de células hemácias resultantes dos métodos de tratamento aqui descritos.

Em algumas modalidades de cada um dos métodos e composições aqui descritos, as células hemácias na composição de células hemácias são células hemácias de mamíferos. Por exemplo, as células hemácias podem ser de roedores (por exemplo, camundongo ou rato ou coelho), ma/16 caco (por exemplo, chimpanzé) ou células hemácias humanas. Por exemplo, em algumas modalidades, as células hemácias são humanas. Em algumas modalidades, as células hemácias foram leucorreduzidas. Em algumas outras modalidades, as células hemácias não foram leucorreduzidas. Em algumas modalidades, existe a possibilidade de que a composição compreendendo células hemácias esteja contaminada com um patógeno. Em algumas modalidades, a composição de células hemácias está contaminada com um patógeno.

Além dos métodos melhorados de supressão, a presente invenção fornece listas disponíveis para o processamento de uma composição de células hemácias, onde o processamento pode ser feito manualmente ou automaticamente. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece kits compreendendo o composto inativador de patógeno, supressor e/ou base usada em cada um dos métodos aqui descritos.

Em algumas modalidades, o kit compreende β-alanina, N(acridin-9-ila), éster 2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico, incluindo qualquer de seus sais e glutationa neutralizada, incluindo quaisquer sais seus. A βalanina, N-(acridin-9-ila), éster 2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico pode estar na forma sólida ou em solução. Semelhantemente, a glutationa neutralizada pode estar na forma sólida ou em solução. Esses sólidos ou soluções podem ainda compreender excipientes, adjuvantes, diluentes ou estabilizantes aceitáveis. Em algumas modalidades, a β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster 2[bis(2-cloroetil)amino]etílico é um sal de cloridrato e a glutationa neutralizada é neutralizada com cerca de 2 equivalente de hidróxido de sódio. Em algumas modalidades, a β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster 2-[bis(2cloroetil)amino]etílico e a glutationa neutralizada estão na forma sólida e o kit compreende ainda uma solução adequada para dissolver a β-alanina, N(acridin-9-ila), éster 2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico e uma solução adequada para dissolver a glutationa neutralizada. Em algumas modalidades, a invenção fornece um kit compreendendo um composto inativador de patógeno, um supressor e uma solução para dissolver o supressor, em que a solução neutraliza o supressor. Os métodos e kits aqui discutidos englobam qualquer

formulação farmacêutica adequada do composto inativador de patógeno e do supressor, a qual pode ser formulada como uma mistura ou separadamente. Formulações farmaceuticamente aceitáveis são conhecidas pelos indivíduos versados na técnica, e exemplos de excipientes, adjuvantes, diluentes ou estabilizantes adequados podem ser encontrados, por exemplo, em Gennaro, ed., Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 20^a edição, Lippincott Williams &Wilkins. A invenção também inclui as composições resultantes dos métodos descritos acima, compreendendo células hemácias, um composto inativador de patógeno e supressor conforme descrito acima, em que a composição está em uma faixa de pH adequada para efetuar uma supressão melhorada do composto inativador de patógeno.

em outro aspecto, a invenção fornece um kit útil, por exemplo, para tratar composição de células hemácias para inativar patógenos, compreendendo um composto inativador de patógeno compreendendo um ligante que se ligue a ácido nucléico e um grupo funcional o qual é, ou o qual forma um grupo eletrofílico (incluindo qualquer sal seu), um supressor compreendendo um grupo tiol (incluindo qualquer sal seu) e pelo menos cerca de 1 equivalente de base, em que um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar de supressor no kit. Em algumas modalidades, o kit compreende cerca de 1 ou cerca de 2 equivalentes de uma base adequada.

Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um kit para tratar composição de células hemácias para inativar patógenos, compreendendo um ligante que se ligue a ácido nucléico e um grupo funcional o qual é, ou o qual forma, um grupo eletrofílico (por exemplo, PIC-1), incluindo qualquer sal seu, e um supressor neutralizado compreendendo um grupo tiol (por exemplo, glutationa neutralizada), incluindo qualquer sal seu.

A invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos nãolimitativos. Nesses exemplos, todas as bactérias e vírus foram obtidos da American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, ou são isolados clínicos.

Exemplo 1

Comparação da inativação de Serratia marcescens, Staphylococcus epidermidis e Yersinia enterocolitica para condições padrões

A bactéria S. marcescens cresceu de um dia para o outro pela adição de uma única colônia de uma placa principal para 500 mL de meio LB a 37°C. A cultura de um dia para o outro foi diluída de 1:100 em meio fresco. O crescimento a 37°C foi monitorado pela OD da suspensão a 600 nm. A preparação foi usada quando a suspensão alcançou 0,5 OD. Sangue inteiro (Blood Source, Sacramento, CA) foi usado para preparar uma composição 10 de células hemácias (RBC) ela centrifugação para fornecer RBC empacotado (34 mL de aproximadamente 90% de hematócrito), a seguir adicionando mL de eritrosol a um hematócrito de aproximadamente 60%. Eritrosol é um aditivo de células hemácias (Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL) que pode ser preparado pela combinação de citrato de sódio diidratado (7,82 g);

fosfato ácido de sódio diidratado (0,73 g); fosfato de sódio diidratado (3,03 g); adenina (0,22 g); manitol (7,74 g); e glicose (9 g) em 1 L de água destilada. A preparação bacteriana foi, a seguir, adicionada (1/100° do volume total) ao RBC/eritrosol para fornecer RBC contaminado. O RBC contaminado foi dividido em várias amostras e tratado de acordo com a Tabela 2, onde 20 PIC-1 é β-alanina, N-(acridin-9-ila), éster 2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico. O

PIC-1 e glutationa (Aldrich, St. Louis, Mo) foram dissolvidos em uma solução de dextrose a 8% mo no id ratada em cerca de 15x da concentração desejada na composição de células hemácias final quando adicionada junto, ou 30x quando adicionada separadamente. Também a glutationa foi neutralizada 25 com os equivalentes indicados de hidróxido de sódio, preparada pela adição de uma quantidade apropriada de NaOH 5 N à glutationa. Para cada amostra 4,67 mL de RBC foi misturado ou com 330 μί de PIC-1/glutationa ou 165 uL de cada PIC-1 e glutationa, separadamente. Por exemplo, um tratamento padrão de glutationa 2 mM e PIC-1 0,2 mM foi preparado pela dissolução de 30 7, mg de PIC-1 e 46 mg de glutationa em 5 mL de dextrose 8% e pela adição de 330 pL desse a 4,67 mL de RBC. Uma amostra a 20 mM de glutationa neutralizada e PIC-1 0,2 mM foi preparada pela dissolução de 7,6 mg de

PIC-1 e 460 mg de glutationa em 4,4 mL de dextrose 8% e pela mistura com 0,6 mL de NaOH 5 N, a seguir pela adição de 330 pL desse a 4,67 mL de RBC. Para a adição separada usando glutationa neutralizada 20 mM, PIC-1 é preparado pela dissolução de 7,6 mg em 2,5 mL de dextrose 8%, glutationa é preparada pela dissolução de 460 mg em 1,9 mL de dextrose 8% e pela mistura com 0,6 mL de NaOH 5 N, a seguir pela adição de 165 pL de cada solução a 4,67 mL de RBC na ordem apropriada. Volumes dos vários componentes são ajustados de forma a fornecer as amostras apropriadas indicadas nas tabelas. Seguindo o tratamento, as amostras foram incubadas por 2 horas, e 100 pL de cada uma foi diluída em série e plaqueada em placas de LB. Essas foram incubadas de um dia para o outro a 37°C para avaliar o crescimento bacteriano. O título bacteriano foi determinado pela contagem de colônias nas placas e baseando-se na diluição da placa, o título foi determinado. Por exemplo, com diluições seriadas de 10 vezes, 30 colônias contadas na 5^a diluição da solução original, onde 0,1 mL são plaqueados, poderíam indicar um título inicial de (30 x 10⁵)/0,1 = 3 χ 10⁷, ou 7,47 log. Uma amostra de controle não-tratada (isto é, sem PIC-1 ou glutationa adicionada) é usada como a linha de base para avaliar a redução em log no título depois do tratamento. Tabela 2 A e 2B indicam tanto o log do título quanto à redução no log para as várias amostras. Notar que para a maioria das amostras na Tabela 2^a o PIC-1 e a glutationa foram formulados juntos. Para as amostras 4-6, onde a glutationa foi neutralizada com quantidades variadas de hidróxido de sódio, o PIC-1 precipitou para fora da solução, com precipitado crescente conforme a quantidade de base adicionada aumentou. Como tal, esses resultados não fornecem uma boa indicação do nível de inativação uma vez que a concentração real de PIC-1 em solução não é mostrada. O estudo foi repetido com a adição seqüencial dos dois componentes, conforme indicado na Tabela 2 (atraso de tempo de 0 indica que eles foram adicionados na mesma solução). Para comparação com a condição padrão na Tabela 2^a (amostras 1 e 10), somente a amostra 7, onde os componentes foram adicionados separadamente, fornece uma comparação aceitável. Nesse caso, também mostrado na Tabela 2B, a supressão com

glutationa 20 mM neutralizado com 2 equivalentes de base resulta em menos redução de log por cerca de 1 - 1,5 log em comparação com a condição padrão (glutationa ácida 2 mM e PIC-1 0,2 mM).

Estudos adicionais foram feitos usando S. epidermidis, onde a cultura de um dia para o outro foi usada sem diluição. Nesses estudos, o PIC-1 e a glutationa foram adicionados na seqüência indicada na Tabela 3, com resultados na tabela. A inativação do S. epidermidis não é significativamente reduzida quando glutationa neutralizada 20 mM é usada como um supressor. PIC-1 está em 0,2 mM em todas as amostras.

Um estudo similar foi feito usando Y. enterocolitica onde, além de glutationa neutralizada, cisteína neutralizada foi usada como supressor, onde a cisteína (Aldrich) foi neutralizada ou com 1 ou 2 equivalentes de hidróxido de sódio. Nesse estudo, glutationa ácida 2 mM é comparada com glutationa neutralizada 20 mM, ou cisteína neutralizada 20 mM, com PIC-1 0,2 mM em todas as amostras. Os resultados estão indicados na Tabela 4. Os resultados indicam que cisteína apropriadamente neutralizada é tão eficaz quanto glutationa neutralizada, com uma redução de cerca de 2,5 log de inativação em relação à condição padrão.

Tabela 2A. Inativação de Serratia marcescens em RBC sob várias condições de supressão.

	Glutationa	Log de S. marcescens
Amostra	mM de PIC-1	mM	Eq. de base adicionada	Título	Redução
Controle	0	0	0	7,0	NA
1	0,2	2	0	2,9	4,14
2	0,2	2	0,9	2,8	4,27
3	0,2	20	0	4,6	2,40
4	0,2	20	0,9	4,8	2,26
5	0,2	20	1,5	5,4	1,66
6	0,2	20	2	6,3	0,76
7 (seqüencial)*	0,2	20	2	4,0	3,02
8	0	20	0	7,0	0,02
9	0	20	2	7,4	0,31
10	0,2	2	0	2,5	4,50

* Para essa amostra, PIC-1 foi adicionado primeiro, com glutationa adicionada logo depois. Para todas as outras amostras, o PIC-1 e a glutationa foram formulados juntos e adicionados ao RBC.

Tabela 2B. Inativação de Serratia marcescens em RBC incluindo a adição se5 qüencial de PIC-1 e de glutationa. (PIC-1 está em 0,2 mM em todas as amostras).

		Glutationa	Retardo do tempo (minutos)	Log de S. marces- cens
Amostra	Seqüência de adição	mM	Eq. de base	Título	Redu- ção
Controle	NA	0	0	0	6,76	NA
1	PIC-1/glutationa	0	2	1	3,40	3,36
2	PIC-1/glutationa	20	2	5	2,87	3,89
3	PIC-1/glutatíona	20	2	10	1,80	4,96
4	PIC-1/glutationa	20	2	20	0,00	6,76
5	Glutationa/PIC-1	20	2	1	3,10	3,66
6	Glutationa/PIC-1	20	2	10	3,08	3,68
7	Simultânea	2	0	0	1,51	5,25
8	Simultânea	20	0	0	6,05	0,71

Tabela 3. Inativação de Staphylococcus epidermidis em RBC incluindo a adição sequencial de PIC-1 e glutationa. (PIC-1 está em 0,2 mM em todas as amostras).

		Glutationa	Retardo do tempo (minutos)	Log de S. epidermidis
Amostra	Seqüência de adição	mM	Eq. de base	Titulo	Redução
Controle	NA	0	0	0	6,62	NA
1	PIC-1/glutationa	20	2	1	-0,08	6,70
2	PIC-1/glutationa	20	2	5	-0,08	6,70
3	PIC-1/glutationa	20	2	10	-0,08	6,70
4	PIC-1/glutationa 20	2	20	-0,08	6,70
5	Glutationa/PIC-1 20	2	1	0,52	6,10
6	Glutationa/PIC-1 20	2	10	0,70	5,92
7	Simultânea 2	0	0	-0,08	6,70
8	Simultânea \| 20	0	0	6,40	0,22

Tabela 4. Inativação de Yersinia enterocolitica em RBC incluindo a adição seqüencial de PIC-1 e glutationa. (PIC-1 está em 0,2 mM em todas as amostras).

		Supressor	Retardo do tempo (minutos)	Log de Y. enterocolitica
Amostra	Seqüência de adição	mM	Eq. de base	Título	Redução
Controle	NA	0	0	0	8,49	NA
1	NA	2	0	0	0,00	8,49
2	Glutationa/PIC-1	20	2	10	2,54	5,95
3	Cisteína/PIC-1	20	1	10	4,45	4,04
4	Cisteína/PIC-1	20	2	10	2,70	5,79

Estudos adicionais foram feitos usando cisteína como o supressor. As amostras foram preparadas e avaliadas conforme descrito acima, com cisteína (Cys) neutralizada ou com 1 ou 2 equivalentes de hidróxido de sódio. Para essas amostras, o estoque de NaOH foi preparado a 10 N e volumes apropriados dos vários componentes foram usados seguindo os procedimentos acima. Condições padrões e/ou glutationa neutralizada 20 mM (GSH) correram por comparação. No estudo apresentado na Tabela 5A, uma combinação de cisteína e glutationa também foi usada. Os resultados estão mostrados nas Tabelas 5A, 5B e 5C, mostrando pelo menos cerca de 3 log de inativação sob todas as condições.

Geralmente, cisteína e glutationa resultam em uma redução semelhante na inativação de patógeno em relação à condição padrão, onde a inativação está em cerca de 1 - 1,5 log da condição padrão. A combinação dos dois é de interesse pelo fato de que a cisteína é capaz de entrar nas células enquanto a glutationa não entra nas células em qualquer quantidade substancial. Isso mostra que sob condições apropriadas de supressão tanto dentro quanto fora das células, os resultados similares de inativação são observados.

Tabela 5A. Inativação de Serratia marcescens em RBC com PIC-1 e glutationa ou cisteína ou uma combinação dos dois. (PIC-1 está em 0,2 mM em todas as amostras).

		Supressor	Retardo do tempo (mi- nutos)	Log de S. marcescens
Amostra	Seqüência de adição	mM	Eq. de base	Título	Redução
RBC	Não-tratado	NA	NA	NA	7,5	NA
1	PIC-1/GSH	20	2	1	4,8	2,7
2	GSH/PIC-1	20	2	10	4,1	3,4
3	Cys/PIC-1	20	2	10	4,4	3,1
5	Cys, GSH/PIC-1	10, 10	2, 2	10	4,5	3,0
6	Cys, GSH/PIC-1	15, 5	2, 2	10	3,8	3,7

Tabela 5B. Inativação de Serratia marcescens em RBC co PIC-1 e glutationa ou cisteína (PIC-1 está em 0,2 mM em todas as amostras)._________________

		Supressor	Retardo do tempo (minutos)	Log de S. marces- cens
Amos- tra	Seqüência de adição	mM	Eq. de base	Título	Redu- ção
RBC	Não-tratado	NA	NA	NA	7,6	NA
1	PIC-1 + GSH	2	0	0	3,5	4,1
2	GSH/PIC-1	20	2	10	4,4	3,2
3	Cys/PIC-1	2,5	2	10	3,9	3,7
4	Cys/PIC-1	5	2	5	4,4	3,2
5	Cys/PIC-1	5	2	10	4,4	3,2
6	Cys/PIC-1	5	2	20	4,7	2,9
7	Cys/PIC-1	10	2	10	4,9	2,7
8	Cys/PIC-1	15	2	10	4,5	3.1
9	Cys/PIC-1	20	2	5	4,4	3,2
10	Cys/PIC-1	20	2	10	4,6	3,0
11	Somente Cys	20	2	NA	7,3	0,3

Tabela 5C. Inativação de Staphylococcus epidermidis em RBC com PIC-1 e glutationa ou cisteína (PIC-1 está em 0,2 mM em todas as amostras)._______

		Supressor	Retardo do tempo (minutos)	Log de S. epi- dermidis
Amostra	Seqüência de adição	mM	Eq. de base	Título	Redução
RBC	Não-tratado	NA	NA	NA	7,2	NA
1	PIC-1 + GSH	2	0	0	0	7,2
2	GSH/PIC-1	20	2	10	0	7,2
4	Cys/PlC-1	2,5	1	10	0	7,2
5	Cys/PlC-1	5	1	10	0	7,2
6	Cys/PIC-1	10	1	10	2,3	4,9
3	Cys/PlC-1	20	1	10	3,2	4,0
7	Somente cisteína	20	1	NA	7,1	0,1

Exemplo 2

Comparação da inativação do vírus da estomatite vesicular (VSV) com condições padrões

Um estoque de 100 x de VSV (aproximadamente 1,78 χ 10⁸ de titulo) é usado para contaminar uma composição de células hemácias como por Exemplo 1. Os RBCs contaminados foram tratados conforme indicado na Tabela 5A-B, incubando por duas horas. Os componentes foram adicionados conforme mostrado para experimentos similares descritos acima. Um volume de 5 mL de RBC contaminado foi tratado para cada amostra. Os RBCs foram congelados em N₂ líquido depois do fim da incubação e analisados em um momento posterior. O título do VSV remanescente foi determinado por ensaio em placa em células Vero 76 de macaco verde africano, crescidas em EMEM suplementado com soro de bezerro fetal a 10% e outros elementos essenciais. O título foi calculado pela determinação da quantidade de plaquetas obtida na aplicação de amostras diluídas em preparações confluentes de células conforme anteriormente publicado (Hsiung GD e Melnick JL, Journal of Immunology 78, 128-136. 1957). Os resultados estão apresentados na Tabela 6A, indicando que os métodos de supressão todos proporcionam essencialmente a completa inativação de um alto título de VSV. Um

estudo adicional foi feito usando cisteína como o supressor, com ou sem a neutralização com 2 equivalentes de hidróxido de sódio. Os resultados estão apresentados na Tabela 6B, com condição padrão e glutationa neutralizada 20 mM por comparação. A cisteína a 20 mM, seja ácida ou neutralizada, re5 duz o nível de inativação por cerca de 2 - 3 log, com a amostra neutralizada mostrando o nível mais baixo de inativação. A amostra de glutationa a 20 mM também reduziu o nível de inativação, por cerca de 2 log. Todos os resultados indicam que a inativação do vírus extracelular VSV não é muito sensível às condições de supressão.

Tabela 6A. Inativação de VSV em RBC incluindo a adição seqüencial de PIC-1 e glutationa. (PIC-1 está em 0,2 mM em todas as amostras).

		Glutationa	Retardo do tempo (minutos)	Loq VSV
Amostra	Seqüência de adi- ção	mM	Eq. de base	Título	Redução
RBC	Não-tratado	0	0	NA	7,58	NA
1	PIC-1 + glutationa	2	0	0	<-0,11	>6,32
2	PIC-1 + glutationa	20	2	0	5,68	0,54*
3	PIC-1 + glutationa	20	0	0	< -0,11	>6,32
4	PIC-1/glutationa	20	0	1	<-0,11	>6,32
5	PIC-1/glutationa	20	2	1	-0,11	6,32
6	PIC-1/glutationa	20	2	5	<-0,11	>6,32
7	PIC-1/glutationa	20	2	10	< -0,11	>6,32
8	Glutationa/PIC-1	20	2	10	<-0,11	>6,32
9	Glutationa/PIC-1	20	0	10	< -0,11	> 6,32
10	Somente glutationa	20	2	NA	6,25	-0,04
11	Controle não-tratado	0	0	NA	6,22	NA

* Co-adição com glutationa neutralizada precipita PIC-1 da solução.

Tabela 6B. Inativação do VSV em RBC com PIC-1 e glutationa ou cisteína.

(PIC-1 está em 0,2 mM em todas as amostras)

		Glutationa	Retardo do tempo (minutos)	Log VSV
Amostra	Seqüência de adição	mM	Eq. de base	Título	Redu- ção
RBC	Não-tratado	0	0	NA	6,56	NA
1	PIC-1 + glutationa	2	0	0	-0,3	> 6,86
2	Glutationa/PIC-1	20	2	10	1,41	4,99
3	Cisteína/PIC-1	2	2	10	< -0,3	>6,86
4	Cisteína/PIC-1	2	0	10	< -0,3	>6,86
5	Cisteína/PIC-1	5	2	5	0,7	5,86
6	Cisteína/PIC-1	5	0	5	< -0,3	>6,86
7	Cisteína/PIC-1	5	2	10	<-0,3	>6,86
8	Cisteína/PIC-1	5	0	10	<-0,3	>6,86
9	Cisteína/PIC-1	20	2	10	2,75	3,8
10	Cisteína/PIC-1	20	0	10	1,95	4,61

Exemplo 3

Determinação da freqüência de aducto de PIC-1 no DNA genõmico de leu5 cócito humano depois do tratamento do RBC com PIC-1 e glutationa ou cisteína·

Sangue completo, o qual não tenha sido leucorreduzido, foi usado para preparar RBC em eritrosol conforme descrito no Exemplo 1. Alíquotas de 20 mL cada foram tratadas ou com PIC-1 0,2 mM, PIC-1 0,2 mM e 10 glutationa ácida 2 mM, glutationa neutralizada 20 mM (2 equivalentes de base), com PIC-1 adicionado a 0,2 mM 10 minutos depois, ou 20 mM cada de glutationa neutralizada (2 equivalentes de NaOH) e cisteína neutralizada (1 equivalente de NaOH), com PIC-1 adicionado a 0,2 mM 10 minutos depois. O PIC-1 usado incluiu PIC-1 radiorrotulado, onde o grupo reativo incluiu um 15 rótulo ¹⁴C (ViTrax, Inc., Placentia, CA). A atividade específica do PIC-1 usado foi 1,08 pCi/gmol. Todas as amostras foram incubadas a temperatura ambiente por 20 horas. Depois da incubação, 20 mL de RBC foram diluídos com um volume de 20 mL de PBS e 20 mL da mistura foram adicionados a

Z&ó cada um dos dois tubos contendo 10 mL de Ficoll. A suspensão foi, a seguir, centrifugada a 400 x g por 30 minutos. A porção de células leucócitos foi separada e a etapa de centrífuga foi repetida depois da adição de outros 20 mL de PBS. Os péletes obtidos foram combinados e o pélete combinado foi ressuspenso em 5 mL de tampão de lise (NaCI 100 mM, Tris HCI 10 mM, EDTA 25 mM, SDS 5%, proteinase K 0,1 mg/mL, Sigma, St. Louis, Mo) e foram incubados a 50°C por pelo menos duas horas. A solução resultante foi, a seguir, extraída com 5 mL de fenoLclorofórmio: álccol isoamílico 24:25:1, seguido por 5 mL de clorofórmio, e a seguir 5 mL de éter. O DNA genômico foi isolado na camada aquosa e precipitado pela adição de 0,5 mL de NaOAc 3 M, 10 mL de etanol 100%, seguido pela incubação da mistura final em um banho de gelo seco/etanol. O DNA foi isolado por centrifugação a 6.000 x g por 10’. O sobrenadante foi removido e o pélete foi seco em ar e ressuspenso em 1 mL de tampão TE (Tris HCI 100 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4). A quantidade de DNA isolado foi quantificada por absorção de UV a 260 nm e a quantidade de aductos de PIC-1 foi quantificada por contagem de cintilação líquida (Perkin Elmer-Wallac, Winspectral 1414 Liquid Scintillation Counter, Shelton, CT) da solução de DNA, usando a atividade específica do PIC-1 para avaliar a proporção molar de PIC-1 em relação aos pares de base de DNA. A quantidade de aductos por 1000 pb (Kpb) é mostrada na Tabela 7 abaixo, indicando que a modificação do ácido nucléico de leucócito é comparável nas amostras suprimidas com glutationa neutralizada 20 mM em comparação com a condição padrão ou com a amostra não-suprimida. Glutationa é indicada como GSH e cisteína como ^MCys na tabela, assim como em qualquer lugar aqui. A determinação de frequência de aducto foi usada como uma medida substituta para a inativação de leucócitos. É sabido que sob as condições de inativação de patógeno padrões, os leucócitos são inativados até o nível de anulação de um ensaio de diluição limitante, o qual corresponde a 5,3 log de inativação. O mecanismo de inativação é através da formação de aductos nos ácidos nucléicos genômicos. Os resultados, conseqüentemente, indicam que os métodos de supressão melhorados não devem impactar na inativação dos leucócitos significativamente. Estudos similares poderiam ser feitos com um patógeno adequado usando células hemácias leucorreduzidas para avaliar a ligação ao ácido nucléico de patógeno sob várias condições.

Tabela 7. Freqüência de aducto no DNA genômico depois de várias condições de tratamento.

Amostra	Supressor	CPM	DNA recu- perado (ug)	Aductos por KPb	Freqüência de aducto*
1	Nenhum	39321	487	28	36
2	Nenhum	46293	547,5	28	35
3	GSH ácido 2 mM	46181	502	34	29
4	GSH ácido 2 mM	47204	692,5	23	44
5	GSH neut. ** 20 mM	89836	872	37	27
6	GSH neut. 20 mM	60829	527,5	36	28
7	Cys e GSH neut. 20 mM cada	83392	952,5	30	33

* Número médio de pares de base entre aductos.

** Neutralizado com 2 equivalentes.

Exemplo 4

Efeito do ajuste de pH do RBC na supressão conforme avaliado pela ligação do anticorpo antiacridina ás células hemácias.

É possível ajustar o pH da composição RBC antes da adição da glutationa, conforme é demonstrado nesse exemplo pela lavagem do RBC usando várias soluções de diferentes pHs. Uma amostra de 20 mL de sangue completo leucorreduzido (Blood Source, Sacramento, CA) foi centrifugada a 4.100 x g por 5 minutos em temperatura ambiente em cada um de quatro tubos de centrífuga de 50 mL. O sobrenadante foi removido de cada tubo para fornecer um concentrado de células vermelhas (RCC). Por amostra, 1,5 mL de eritrosol (pH 7,3) foi adicionado a 10 mL do RCC. Para as amostras 2 - 4, o RCC foi lavado três vezes com 10 mL da solução indicada, centrifugando conforme acima e removendo o sobrenadante depois de cada lavagem. Para cada RCC lavado, as células foram ressuspensas em 5 mL da solução usada para lavagem. Essa é agora referido como a amostra de teste

RBC. As soluções usadas nas amostras 2-4 foram eritrosol (pH 7,3), PBS pH 8 (fosfato 50 mM, NaCI 100 mM, pH 8,0_ e CHES pH 9 (CHES 50 mM (Aldrich), NaCI 100 mM, pH 9,0), respectivamente. Para cada amostra de teste de RBC, 1,5 mL foi misturado com 100 pL de PIC-1 mais glutationa (2 mM ácida ou 20 mM neutralizada com 0,9, 1,5 ou 2 equivalentes de hidróxido de sódio) para produzir as concentrações finais de PIC-1 0,2 mM e 2 mM ou 20 mM de glutationa. Essas amostras foram incubadas por 20 horas em temperatura ambiente. Depois da incubação, o RBC foi lavado em BBS (Solução salina de Banco de Sangue, solução salina 0,9%, não-tamponada, Fisher Scientific) e foram diluídos até um hematócrito final de 4%. Uma alíquota de 25 pL de cada foi misturada com 15 pL de soro antiacridina policlonal de coelho diluído 1:100 em BBS e a mistura foi incubada a 37°C por 30 minutos. As células foram subseqüentemente lavadas com BBS 1,5 mL. Depois de completa a lavagem, as células foram misturadas com 50 pL de fragmentos Fab’₂ anticoeiho de cabra rotulado com FITC (diluição 1:64 em BBS) e incubadas a 37°C por 30 minutos. Depois da incubação, as células foram lavadas novamente com 3 x 1,5 mL de BBS. As células hemácias foram, a seguir, analisadas por FACScan, e a fluorescência média observada para cada amostra é dada na Tabela 8. Esse valor se correlaciona com a ligação de PIC-1 acridina na superfície de células hemácias, de forma que um valor menor indica a supressão melhorada da reação secundária de PIC1 com RBC. A ligação de PIC-1 ao RBC foi significativamente reduzida somente pela lavagem das células em tampão de pH superior, com a glutationa neutralizada proporcionando uma supressão ainda melhor. Note que a supressão melhora conforme a glutationa é neutralizada com quantidades crescentes de hidróxido de sódio. Esse exemplo demonstra a importância do ajuste de pH da composição de células hemácias para fornecer uma supressão melhorada. A lavagem com CHES pH 9 em combinação com glutationa neutralizada com 1,5 ou 2 equivalentes de hidróxido de sódio reduz a ligação do PIC-1 a níveis quase de segundo plano.

Tabela 8. Tratamento de RBC com PIC-1 0,2 mM sob várias condições de supressão, análise de FACScan de ligação de anticorpo antiacridina.

			Intensidade de fluorescência média
Amostra	RBC prep	Controle não-tratado	GSH 2 mM	GSH 20 mM + NaOH
0,9 eq.	1,5 eq.	2 eq.
1	RBC prep Eritrosol (pH 7,3) sem lavagem	1,67	108	17,0	8,1	6,0
2	Eritrosol (pH 7,3) lavagem 3 x	1,69	199	26,7	4,9	3,4
3	PBS pH 8 lava- gem 3 x	1,70	25	7,2	5,1	5,1
4	CHES pH 9 lavagem 3 x	1,62	12,1	3,9	1,9	1,9

Exemplo 5

Comparação de várias condições de supressão em relação à ligação de an5 ticorpo antiacridina que se liga ás células hemácias,

A análise de FACScan da ligação de soro antiacridina de coelho para células hemácias tratadas foi usada para avaliar uma variedade de condições de supressão. Amostras de RBC foram preparadas conforme descrito no Exemplo 1, e as supressões foram preparadas conforme descrito 10 nos exemplos acima. A seqüência da adição de componente e as concentrações de composto final na mistura com o RBC estão indicadas nas Tabelas 9A e 9B. As tabelas representam dados de dois experimentos diferentes, cada um com amostras tratadas sob condições padrão ou com glutationa neutralizada 20 mM. PIC-1 está a 0,2 mM em todas as amostras. Os dados 15 em um experimento fornece a eficácia relativa dos vários tratamentos. Devido ao fato do ensaio poder depender do lote de células hemácias usado,os valores absolutos de fluorescência média podem variar de um estudo para o próximo, de forma que valores relativos devem somente ser comparados em um dado experimento. Por exemplo, notar que a condição padrão resulta em 20 uma fluorescência média de 114 na Tabela 9A e 151 - 182 na Tabela 9B.

Cisteína neutralizada suprime efetivamente até essencialmente o sinal de fundo (isto é, essencialmente nenhuma ligação) a 15 ou 20 mM. Glutationa neutralizada a 20 mm resulta em níveis próximos aos de fundo. Da Tabela 9B, os resultados para a cisteína indicam que, enquanto o aumento da con5 centração de supressor fornece uma melhor supressão da reação com RBC, conforme a concentração de cisteína aumenta, a neutralização da cisteína fornece a supressão ótima da reação secundária indesejada. Note que em cisteína 2,5 mM, existe pouca diferença entre cisteína neutralizada e ácida, enquanto a 5 mM ou superiores, 1 equivalente de NaOH ainda reduz o sinal 10 em comparação com a amostra de cisteína ácida na mesma concentração.

Tabela 9A. Ligação de anticorpo antiacridina relativa à RBC tratada medida como fluorescência média FACScan (PIC-1 está a 0,2 mM em todas as amostras).

Amostra	Seqüência de adição	Supressor	Atraso de tempo (minutos)	Fluorescência média
mM	Eq. NaOH
1	PIC-1 + GSH	2	0	0	114
2	GSH/PIC-1	20	2	10	2,6
3	Somente con- trole de Cys	20	2	NA	1,9
4	Cys/PIC-1	2,5	2	10	37
5	Cys/PIC-1	5	2	5	8
6	Cys/PIC-1	5	2	10	10,8
7	Cys/PIC-1	5	2	20	8
8	Cys/PIC-1	10	2	10	2,9
9	Cys/PIC-1	15	2	10	1.9
10	Cys/PIC-1	20	2	5	1,9
11	Cys/PIC-1	20	2	10	1.9
12	Cys/PIC-1	20	2	20	2

Tabela 9B. Ligação de anticorpo antiacridina relativa ao RBC tratado medido como a fluorescência média de FACScan. (PtC-1 está em 0,2 mM em todas as amostras).__________________________________________________________

Amostra	Seqüência de adição	Supressor	Atraso de tem- po (minutos)	Fluorescência média
mM	Eq. NaOH
1a	PIC-1 + GSH	2	0	0	151
1b	PIC-1 + GSH	2	0	0	182
1c	PIC-1 + GSH	2	0	0	160
2a	GSH/PIC-1	20	2	10	6,06
2b	GSH/PIC-1	20	2	10	5,62
2c	GSH/PIC-1	20	2	10	5,6
3	Somente controle Cys	20	2	NA	1,99
4	Cys/PIC-1	2,5	0	10	44
5	Cys/PIC-1	2,5	1	10	49,5
6	Cys/PIC-1	2,5	2	10	49
7	Cys/PIC-1	5	0	10	49
8	Cys/PIC-1	5	1	10	19,28
9	Cys/PIC-1	5	2	10	14,1
10	Cys/PIC-1	10	0	10	11,6
11	Cys/PIC-1	10	1	10	5,1
12	Cys/PIC-1	10	2	10	3,6
13	Cys/PIC-1	20	0	10	4,3
14	Cys/PIC-1	20	1	10	2,5
15	Cys/PIC-1	20	2	10	ND

Exemplo 6

Avaliação do pH de uma composição de células hemácias na adição de PIC1 e vários supressores.

Os efeitos de várias condições de supressão no pH de uma composição de células hemácias foram determinados para várias condições de tratamento. As soluções de supressores foram preparadas em uma concentração de 600 mM em dextrose monoidratada 8%. Para cisteína, uma porção da solução foi misturada ou com 1 ou 2 equivalentes de hidróxido de

sódio. Glutationa foi avaliada a 2 mM (ácida) ou 20 mM (2 eq. de base). Nacetilcisteína, metionina e dímero de peptídeo cisteína-glicina (CysGly) também foram avaliados, onde a N-acetilcisteína foi neutralizada com 1 equivalente de hidróxido de sódio, metionina foi neutralizada com 1 ou 2 equivalen5 tes de hidróxido de sódio e CysGly foi neutralizada com 2 equivalentes de hidróxido de sódio. O pH da solução supressora, seja não-modificada ou neutralizada, foi medido usando um eletrodo de epóxi calomelano padrão (Beckman Instruments) em temperatura ambiente. Uma solução de PIC-1 foi preparada a 6 mM em dextrose monoidratada 8%. Uma composição de célu10 Ias hemácias foi preparada como no Exemplo 1. Para cada amostra, 167 μΙ_ de supressor e 167 μΙ_ de PIC-1 foram adicionados seqüencialmente a 4,67 mL de RBC, incubados em temperatura ambiente por 10 minutos depois da adição do supressor, a seguir adicionado PIC-1. As amostras foram misturadas e o pH em temperatura ambiente foi medido usando o mesmo eletrodo 15 que o descrito acima. Os resultados dos vários estudos estão mostrados na

Tabela 10.

Tabela 10. Medidas de pH usando várias condições de supressor com PIC-1 0,2 mM em RBC.

Amostra	Condições do supressor	pH do supressor estoque	pH da mistura final
1	RBS sem controle de tratamento*	NA	6,96
2	Glutationa ácida 2 mM*	2,82	6,9
3	Glutationa 20 mM + 2 eq. de base*	9,5	7,7
4	Cisteína 20 mM	5	6,5
5	Cisteína 20 mM + 1 eq. de base	9,9	7,4
6	Cisteína 20 mM + 2 eq. de base	11,5	7,8
7	N-acetila cys 20 mM + 1 eq. de base	6	6.7
8	20 mM de CysGly + 2 eq. de base	8,5	ND
9	Metionina 20 mM + 2 eq. de base	13,1	8
10	Metionina 20 mM + 1 eq. de base	11,2	7,5

Exemplo 7

Supressão como uma função da concentração de glutationa e neutralização; avaliação da ligação do anticorpo antiacridina e inativação de S. epidermidis.

Nesses, a quantidade apropriada de estoque 600 mM foi adicionada, misturada com um volume apropriado de dextrose 8% para fornecer o mesmo volume de adição a cada amostra RBC onde em um estudo, com concentrações de glutationa variadas, o pH foi medido depois da adição de glutationa e depois da adição de PIC-1. Notar que a adição de PIC-1 abaixa o pH de algumas das soluções com valores de pH mais elevados depois da adição do supressor, mas o pH final ainda está em uma faixa preferida para a supressão melhorada, e estão bem acima dos valores de pH da mesma concentração de glutationa sem neutralização. As amostras preparadas similarmente ao Exemplo 6 com várias concentrações de glutationa (Tabela 11 A) foram avaliadas para ligação com o soro de coelho antiacridina, seja por cartão de gel ou análise de FACScan. Amostras similares também foram avaliadas para a inativação de S. epidermidis. Cada amostra de RBC foi tratada com glutationa, seguido 10 minutos depois com PIC-1, a seguir incubada em temperatura ambiente por 20 horas depois da mistura do PIC-1. Para análise em cartão de gel, depois da incubação, os RBC foram lavados em BBS e foram diluídos em BBS até um hematócrito final de 4%. Uma alíquota de 25 μΙ_ de cada foi misturado com 15 μί de soro de antiacridina policlonal de coelho diluído ou com 1:4 ou 1:100 em BBS e a mistura foi incubada a 37°C por 30 minutos. As células foram subseqüentemente lavadas com BBS 1,5 mL. Depois de completa a lavagem, as células foram misturadas com cadeias anti H + L de fragmento de Fab’2 anticoelho de cabra (diluição 1:4 em PBS) e incubadas a 37°C por 30 minutos. Depois da incubação, as células foram lavadas novamente com 3 x 1,5 mL de BBS e carregadas em um cartão de gel e os cartões foram centrifugados por 10 minutos a 900 x g conforme os ajustes do fabricante em uma MTS Centrifuge® (Ortho System, Pompano Beach, Fl). Os cartões são pontuados em uma escala de 0, 1+, 2+, 3+, 4+, classificando a quantidade relativa de aglutinação, onde 0 indica ausência de aglutinação, e as células passam através do gel e 4+ indica a completa aglutinação, todas as células no topo do gel. Esses resultados indicam que conforme a concentração de glutationa é aumentada, é necessário ajustar o pH da composição de RBC, tal como usando glutationa neutralizada. Mesmo a 5 mM, a glutationa neutralizada com 2 equivalentes de base fornece uma melhor supressão do que 5 mM com 1 ou 0 equivalentes de base. A glutationa neutralizada mostra a redução na ligação do anticorpo conforme a concentração é aumentada, enquanto que a glutationa ácida mostra pouca, se alguma, melhoria em concentrações mais elevadas em comparação com a condição padrão de 2 mM. A sensibilidade desse ensaio é tal que, nesse estudo, uma diluição 1:100 de soro de coelho é necessária para ver as diferenças nos métodos de supressão, uma vez que a diluição 1:4 mostra a completa aglutinação em todas as amostras (controle nãotratado não apresenta aglutinação). Como tal, somente as amostras diluídas 1:100 são mostradas na Tabela 11B. Os resultados entre os estudos variam dependendo da amostra de sangue usada. Por exemplo, visto que nesse estudo, o soro de coelho antiacridina diluída em 1:4 resultou em pontuações de 4+, outro estudo foi feito com 10, 15 e 20 mM de glutationa neutralizada (2 eq. de base) onde as diferenças foram observadas nas amostras diluídas em 1:4 enquanto que as amostras diluídas em 1:100 todas mostraram uma pontuação de 0. Essas amostras testadas na diluição 1:4 do soro de coelho mostraram pontuações de 4+, 4+, 3+ e 1+ por condição padrão, glutationa neutralizada 10 mM, 15 mM e 20 mM (2 eq. de base), respectivamente. Uma combinação de glutationa neutralizada (2 eq. de base) e cisteína neutralizada (1 eq. de base) também foi usada, onde a concentração de supressor total foi de 20 mM, e todas as tais amostras resultaram em pontuações de 1+ ou 0 (isto é, elas foram pelo menos tão eficazes quanto à glutationa neutralizada 20 mM).

Tabela 11A. Medidas de pH usando várias condições de supressor com PIC1 0,2 mM em RBC.

Amostra	Condições do supressor	pH do supres-	pH da mistura
		sor estoque	Pós-supressor	Final
1	RBC sem controle de tratamento*	NA	ND	6,8
2	Glutationa ácida 20 mM		6,1	6,1
3	Glutationa ácida 10 mM	3,0	6,4	6,4
4	Glutationa ácida 5 mM		6,6	6,6
5	Glutationa ácida 2 mM*		6,7	6,7
6	Glutationa 20 mM + 1 eq. de base		6,7	6,7
7	Glutationa 10 mM + 1 eq. de base	6,1	6,7	6,7
8	Glutationa 5 mM + 1 eq. de base		6,7	6,7
9	Glutationa 2 mM + 1 eq. de base		6,8	6,8
10	Glutationa 20 mM + 2 eq. de base*		7,4	7,2
11	Glutationa 10 mM + 2 eq. de base	9,2	7,2	7,0
12	Glutationa 5 mM + 2 eq. de base		6,9	6,9
13	Glutationa 2 mM + 2 eq. de base		6,8	6,8

Tabela 11B. Ligação de anticorpo antiacridina em RBC tratado com concentrações variadas de glutationa e PIC-1 0,2 mM. Pontuação do cartão de gel 5 para diluição 1:100 de soro de coelho antiacridina e diluição 1:4 de IgG anticoelho secundário.

Pontuação de cartão de gel
Amostra	Nenhuma base adicionada	1 eq. de base	2 eq. de base
GSH 2 mM	3+	4+	3+
GSH 5 mM	3+/MX*	3+	2+
GSH 10 mM	3+/MX*	2+	1 +
GSH 20 mM	3+	1 +	0

*MX = Campo misturado

Outro grupo de exemplos conforme mostrados na Tabela 11A foi preparado conforme acima, usando diferentes unidades de RBC e foi usado 10 por análise de FACScan. Essas amostras, após a incubação de 20 horas, foram tratadas como pelo Exemplo 4 e analisadas por FACScan. Uma amos-

tra de controle não-tratado, assim como uma amostra de padrão (co-adição de glutationa ácida 2 mM com PIC-1 0,2 mM) também foram avaliadas. Os resultados estão mostrados na Tabela 11C.

Tabela 11C. Ligação de anticorpo antiacridina (coelho policlonal, diluição 5 1:100) em RBC tratado com concentrações variadas de glutationa e PIC-1

0,2 mM. Avaliada por análise de FACScan usando Fab’2 anticoelho rotulada com FITC (diluição 1:64).

Fluorescência média
Amostra	Nenhuma base adicionada	1 eq.de base	2 eq. de base
Controle não-tratado	4,62	NA	NA
Padrão de co-adição	144,33	NA	NA
GSH 2 mM	179,17	208,05	160,37
GSH 5 mM	95,57	87,6	67,56
GSH 10 mM	88,21	47,18	27,45
GSH 20 mM	187,74	29,97	13,37

Outro grupo de exemplos, conforme mostrados na Tabela 11 A, foram preparados conforme acima usando a mesma unidade de RBC e fo10 ram adicionados com S. epidermidis e avaliados para o título como para o

Exemplo 1. Os resultados estão mostrados na Tabela 11 D. Os resultados combinados de ligação do anticorpo e inativação de S. epidermidis demonstram a supressão melhorada usando glutationa neutralizada em concentrações mais elevadas.

Tabela 11 D. Inativação de S. epidermidis em RBC tratado com concentrações variadas de glutationa e PIC-1 0,2 mM.

Mudança de log no títu	0 (título de RBC inicial = 6,5)
Amostra	Nenhuma base adicionada	1 eq. de base	2 eq. de base
Controle não-tratado	0	NA	NA
GSH 2 mM	6,5	6,5	6,5
GSH 5 mM	6,5	6,5	6,5
GSH 10 mM	2,9	6,5	6,5
GSH 20 mM	2,5	6,5	6,5

/Ιβ

Exemplo 8

Avaliação da ligação do anticorpo antiacridina or análise de cartão de gel em amostras suprimidas com vários supressores

Estudos similares usando o ensaio de cartão de gel foram feitos com outras condições de supressão, tais como com cisteína, dipeptídeo cisteína-glicina ou uma combinação de cisteína e glutationa. As amostras também foram testadas ou com diluição 1:4 ou 1:100 de soro de coelho e sem anticorpo secundário, o gue resultou em alguma aglutinação por amostras tratadas com a condição padrão de glutationa 2 mM e PIC-1 0,2 mM ou com

PIC-1 sem supressor. Acredita-se gue a aglutinação observada em guase todas as amostras usando a diluição 1:4 concentrada de soro de coelho com um anticorpo anticoelho secundário (Tabelas 12 e 13) seja devido, em parte, às reações heterofílicas. Anticorpos heterofílicos são anticorpos de ocorrência natural que reconhecem RBC a partir de outras espécies de uma forma não-específica. As Tabelas 12-13 mostram os resultados de vários experimentos ou por diluição 1 ;4 ou 1:100 de soro de coelho e diluição 1:4 de anticorpo anticoelho. Dados para controles não-tratados não são apresentados, uma vez que esses deram uma pontuação 0 para todas as amostras. Todas as amostras foram misturados com supressor primeiro, a seguir PIC-1 a 0,2 mM. A identidade, concentração e equivalentes de base do supressor são apresentados nas tabelas. Esses resultados sugerem que uma combinação de glutationa e cisteína, ou somente cisteína, podem proporcionar de alguma forma uma melhor supressão da ligação do PIC-1 para o RBC.

Tabela 12. Ligação do anticorpo antiacridina em RBC tratado com concentrações variadas de glutationa e cisteína e PIC-1 0,2 mM.

		Pontuação de cartão de gel
		Sem Ab secundário	Ab secundário 1:4
Diluição de soro de coelho	1:4	1:100	1:4	1:100
Amostra	Condições de supressor
1	GSH ácido 2 mM	3+	0	4+	4
2	2 eq. de GSH 20 mM	0	0	3+	0
3	1 eq. de Cys 2,5 mM	2+	0	4+	3
4	1 eq. de Cys 5 mM	1 +	0	4+	1*
5	1 eq. de Cys 10 mM	0	0	3+	0
6	1 eq. de Cys 15 mM	0	0	1*	0
7	1 eq. de Cys 20 mM	0	0	0	0

* Cor muito leve no topo do gel.

Tabela 13. Ligação do anticorpo antiacridina no RBC tratado com concentra5 ções variadas de glutationa e cisteína e PIC-1 0,2 mM._____________________

		Pontuação d	e cartão de gel
		Amostra de sangue 1	Amostra de sangue 2
Diluição de soro de coelho	1:4	1:100	1:4	1:100
Amostra	Condições de supressor
1	PIC-1 sem supressor	4+	4+	4+	4+
2	GSH ácido 2 mM	4+	4+	4+	4+
3	2 eq. de GSH 20 mM	4	0	4	0
4	2 eq. de GSH 15 mM/1 eq. de Cys 5 mM	4	0	3	0
5	2 eq. de GSH 10 mM/1 eq. de Cys 10 mM	3	0	3	0
6	2 eq. de GSH 5 mM/1 eq. de Cys 15 mM	2	0	3	0
7	1 eq. de Cys 20 mM	0	0	3	0
8	2 eq. de GSH 15 mM/2 eq. de Cys 5 mM	4	0	3	0
9	2 eq. de GSH 10 mM/2 eq. de Cys 10 mM	2	0	2	0
10	2 eq. de GSH 5 mM/2 eq. de Cys 15 mM	1	0	1	0
11	2 eq. de Cys 20 mM	0	0	1	0

O dipeptídeo cisteína-glicina (CysGly) também foi usado como um supressor. A condição padrão, assim como a cisteína neutralizada 20 mM (2 eq. de base) foram comparadas com concentrações variadas do CysGly com e sem 1 equivalente de base. Os resultados estão apresentados 5 na Tabela 14. Os resultados concordam com aqueles observados tanto para glutationa quanto para cisteína, que conforme a quantidade de supressor é aumentada, o ajuste do pH, por exemplo, pela neutralização do supressor, é necessário para uma supressão melhorada.

Tabela 14. Comparação da supressão com CysGly com e sem neutralização 10 para cisteína neutralizada 20 mM, ou condições padrões. Análise de cartão de gel de ligação de anticorpo antiacridína.

		Pontuação do cartão de gel
Amostra	Condições do supressor	Diluição 1:4 do soro	Diluição 1:100 do soro
1	GSH ácido 2 mM	4	4
2	CysGly 2,5 mM	4	3
3	1 eq. de base CysGly 2,5 mM	4	4
4	CysGly 5 mM	4	0
5	1 eq. de base CysGly 5 mM	4	2
6	CysGly 10 mM	4	0
7	1 eq. de base CysGly 10 mM	4	0
8	CysGly 20 mM	4	0
9	1 eq. de base CysGly 20 mM	4	0
10	2 eq. de base Cys 20 mM	4	0
11	Dextrose somente, sem controle de tratamento	2	0

Exemplo 9

Eliminação da reatividade cruzada vista com células hemácias tratadas padrão pelo tratamento dos métodos da presente invenção.

Os soros dos pacientes que desenvolveram anticorpos que regem de forma cruzada com o RBC que foram tratados com glutationa 2 mM e PIC-1 0,2 mM foram usados para avaliar a reatividade cruzada com métodos melhorados. As amostras usando sangue O negativo (Blood Source,

Sacramento, CA) foram preparadas conforme descrito no Exemplo 1 e tratadas ou com glutationa 2 mM e PIC-1 0,2 mM, PIC-1 0,2 mM seguido 1 minuto depois por glutationa neutralizada 20 mM (2 eq. de base) ou glutationa neutralizada 20 mM seguido 10 minutos depois por PIC-1 0,2 mM. Um controle não-tratado de amostra de RBC também foi preparada. Cada amostra foi lavada com BBS três vezes, a seguir suspensas até um hematócrito de 8% em solução salina de baixa força iônica (manual AABB, 14^a edição). Uma alíquota de 50 μΙ_ de cada foi adicionada a um cartão de gel juntamente com 25 μι de soro do paciente, e a mistura foi incubada a 37°C por 15 minutos. O cartão de gel contém IgG anti-humana, a qual irá aglutinar RBC que se liga aos anticorpos a partir do soro do paciente. Os cartões foram centrifugados como para o Exemplo 7. Os cartões foram lidos pela mesma escala conforme descrito no Exemplo 7. As amostras testadas com três soros diferentes mostraram uma pontuação de 3+ com o RBC tratado padrão e 0 com o controle não-tratado ou com as amostras tratadas com glutationa neutralizada 20 mM (2 equivalentes).

Exemplo 10

Uso da metionina como modelo para avaliar a supressão devido ao ajuste de pH independentemente da supressão com tiol.

Devido ao fato da metionina (Met) ter um substituinte metila no átomo de enxofre mas ser, por outro lado, muito semelhante à cisteína, ele foi usado como um aminoácido modelo para avaliar o efeito do ajuste de pH sozinho na supressão. A presença do grupo metila elimina a natureza nucleofílica do átomo de enxofre, de forma que qualquer supressão pode ser devido ao aumento do pH da solução (por exemplo, a concentração mais elevada de hidróxido pode fornecer alguma supressão). A metionina (Aldrich) é usada a 20 mM com 1 ou 2 equivalentes de base adicionados, e comparada com a cisteína (1 ou 2 eq.) e glutationa (2 eq.) todos com PIC-1 0,2 mM, adicionada 10 minutos depois do supressor. A condição padrão foi incluída, isto é, PIC-1 0,2 mM e glutationa ácida 2 mM adicionadas juntas. As amostras são avaliadas por análise de cartão de gel de ligação de soro de coelho antiacridina como para o Exemplo 7, com a exceção de que as amostras para análise de cartão de gel foram incubadas a 37°C ou em temperatura ambiente. Os resultados estão apresentados na Tabela 15. Os resultados mostram que a metionina neutralizada com 2 equivalentes de base fornece uma supressão melhorada em comparação com a condição padrão.

Tabela 15. Supressão com metionina, cisteína ou glutationa conforme avaliado por aná ise de cartão de gel de ligação de soro de coelho antiacridina.

		Pontuação do cartão de gel
Diluição de soro de coelho:	1:4	1:100	1:4	1:100
Amostra	Tratamento
1	Não-tratado	0	0	0	0
2	PIC-1 0,2 mM/GSH 2 mM	4	3	4	3
3	GSH 20 mM + 2 eq./PIC-1 0,2 mM	3	0	3	0
4	Cys 20 mM + 1 eq./PIC-1 0,2 mM	1	0	2	0
5	Cys 20 mM + 2 eq./PIC-1 0,2 mM	0	0	1	0
6	Met 20 mM + 1 eq./PIC-1 0,2 mM	4	3	4	3
7	Met 20 mM + 2 eq./PIC-1 0,2 mM	3	0	3	0

Exemplo 11

Estudos funcionais in vitro das unidades inteiras tratadas com glutationa neutralizada 20 mM e PIC-1 0,2 mM,

Unidades completas de concentrados de células hemácias (Interstate Blood Bank, Inc., Memphis, TN) foram leucorreduzidas. Um volume de 200 mL de tris RCC (80% de hematócrito) foi misturado com 94 mL de eritrosol ou 100 mL de Adsol (Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL) como controle (unidade 1). Um volume de 20 mL de dextrose 8% foi usado para dissolver PIC-1 (mg) e glutationa ácida (mg) e adicionado a uma unidade para fornecer PIC-1 0,2 mM e glutationa 2 mM (unidade 2). Para as unida-

des 3 e 4, PIC-1 (mg) e glutationa (mg) foram dissolvidos separadamente em 10 mL ou 8,8 mL de dextrose 8%, respectivamente. Para a glutationa, 1,2 mL de NaOH 10 N foi adicionado (2 equivalentes). O PIC-1 foi misturado com a unidade, seguido por 1 minuto depois (unidade 3) ou 5 minutos depois (unidade 4) pela glutationa. Para a unidade 5, a glutationa neutralizada foi misturada primeiro, seguido de 10 minutos depois pelo PIC-1. Para a unidade 6, a glutationa foi dissolvida em 18,8 mL de dextrose 8% e misturada com

1,2 mL de NaOH 10 N, a seguir misturado com o RBC (sem PIC-1). Todas as unidades foram misturadas pelo apertamento das extremidades da bolsa de sangue e pela mistura em um movimento na Figura de 1 a 30 vezes. Essas foram, a seguir, incubadas em temperatura ambiente por um total de 20 horas. Um dispositivo de adsorção de composto (CAD), compreendendo uma resina polimérica contida em uma bolsa de malha, foi usada para todas, à exceção da amostra de controle. Esse dispositivo é pretendido para remover o PIC-1 residual, produtos de quebra do PIC-1 e glutationa das amostras. As amostras foram incubadas por 8 horas, a seguir transferidas para uma segunda bolsa de sangue contendo o CAD e incubadas por 12 horas adicionais. Depois da incubação em temperatura ambiente, as amostras foram transferidas para um refrigerador (4°C) e estocadas até 43 dias. Alíquotas foram removidas de cada unidade 12 horas e 20 horas depois da mistura, e a cada semana daí em diante. As alíquotas foram analisadas para hemoglobina total, pH, ATP intracelular, hemoglobina do plasma, potássio, glicose extracelular e lactato extracelular. A ligação do soro anticoelho também foi avaliada pela análise de FACScan e descrita no Exemplo 4. O estudo foi repetido, com unidades tratadas de PIC-1 tratadas com ou sem o CAD. Os resultados para a ligação de soro de anticoelho, ATP e hemólise estão apresentados nas Tabelas 16A - C e 17A - C.

Tabela 16A - C identidades das amostras:

1: Controle não-tratado

2: Tratamento padrão, PIC 1 0,2 mM + GSH 2 mM

3: PIC-1 0,2 mM, T de prazo, GSH 20 mM + 2 equivalentes de base

4: PIC-1 0,2 mM, 5’ de prazo, GSH 20 mM + 2 equivalentes de base

5: GSH 20 mM + 2 equivalentes de base, prazo de 10’, PIC-1 0,2 mM

6: GSH 0,2 mM + 2 equivalentes de base

Tabela 16A. Dados de ATP nos 42 dias de estocagem.

	Amostra de RBC ATP pmol/g Hb
Dias	1	2	3	4	5	6
0	3,66	3,62	4,20	4,16	4,11	4,30
0,5	3,79	3,85	2,02	5,08	5,17	5,56
0,8	3,77	3,55	5,05	5,38	5,21	5,56
7	3,63	3,59	5,24	5,11	5,58	5,64
14	2,84	2,58	4,20	4,06	4,22	4,93
22	2,69	2,30	3,86	3,66	3,90	4,20
28	2,24	1,61	3,10	2,72	3,27	3,68
35	1,99	1,46	2,71	2,47	2,68	3,30
43	1,65	1,21	2,28	2,06	2,28	2,61
Tabela 16	B. Hemólise porcentual da amostra de RBC.
	Hemólise porcentual da amostra de RBC
Dias	1	2	3	4	5	6
0	0,16	0,22	0,19	0,19	0,19	0,15
0,5	0,18	0,24	0,16	0,25	0,24	0,19
0,8	0,18	0,46	0,40	0,48	0,47	0,51
7	0,27	0,62	0,35	0,52	0,57	0,58
14	0,37	0,69	0,50	0,52	0,55	0,61
22	0,46	0,87	0,59	0,62	0,63	0,60
28	0,62	0,86	0,63	0,64	0,65	0,71
35	0,73	0,99	0,74	0,76	0,71	0,70
43	0,84	1,17	0,82	0,90	0,83	0,75

Tabela 16C. Modificação de RBC medida pela ligaçao do anticorpo antracridina (FACScan) em 42 dias de estocagem._____________________________

	Fluorescência média de unidaC	e RBC
Dias	1	2	3	4	5	6
0,8	1,67	284	20,1	46,0	20,0	2,16
2	1,84	193,5	14,58	34,07	12,31	1,78
7	1,72	142,1	4,96	18,84	5,34	1,58
14	1,56	135,7	4,09	8,41	3,29	1,48
22	1,61	90,8	2,61	4,46	2,12	1,58
28	1,95	128,7	2,6	5,69	2,83	2,02
35	2,71	153,4	2,74	6,71	2,58	1,62
43	1,63	136,1	2,43	4,51	2,46	1,8

Tabela 17A - C identidades da amostra:

1: Tratamento padrão, PIC-1 0,2 mM, GSH 2 mM + CAD

2: Tratamento padrão, PIC-1 0,2 mM, GSH 2 mM

3: PIC-1 0,2 mM, T de prazo, GSH neutralizada 20 mM + CAD

4: PIC-1 0,2 mM, 1’ de prazo, GSH neutralizada 20 mM

5: GHS neutralizado 20 mM, prazo de 10’, PIC-1 0,2 mM + CAD

6: nGSH 20 mM, 10’ de prazo, PIC-1 0,2 mM

7: GSH neutralizado 20 mM

8: Controle não-tratado

Tabela 17A. Valores de ATP intracelular em 42 dias de estocagem.

	Amostra RBC ATP pmol/g Hb
Dias	1	2	3	4	5	6	7	8
0,0	4,02	4,38	5,21	4,86	4,93	4,82	5,17	4,46
0,5	4,63	4,78	6,78	6,60	6,92	6,56	6,54	4,28
0,8	4,58	4,69	6,37	6,31	6,58	6,45	6,41	4,55
7	3,55	3,77	5,21	5,80	6,04	6,12	6,15	3,59
14	2,38	2,54	4,24	4,36	4,44	4,62	4,86	2,74
28	1,51	1,67	3,00	3,11	3,16	3,44	3,21	2,15
35	0,79	0,76	1,37	1,50	1,53	1,65	1,64	1,04
42	1,01	1,12	2,01	2,14	2,13	2,34	2,16	1,58

Tabela 17B. Hemólise porcentual em 42 dias de estocagem.

	Hemólise porcentual de unidades de RBC
Dias	1	2	3	4	5	6	7	8
0,0	0,22	0,22	0,16	0,18	0,21	0,21	0,16	0,17
0,5	0,27	0,22	0,22	0,20	0,28	0,27	0,19	0,17
0,8	0,42	0,25	0,43	0,21	0,48	0,30	0,19	0,20
7	0,54	0,34	0,48	0,31	0,57	0,44	0,29	0,32
14	0,78	0,51	0,56	0,35	0,61	0,42	0,29	0,42
28	1,10	0,78	0,75	0,47	0,78	0,60	0,48	0,74
35	1,31	0,92	0,86	0,53	0,96	0,66	0,61	0,86
42	1,62	1,10	1,09	0,76	1,13	0,81	0,78	1,20

Tabela 17C. Modificação do RBC medida pela ligação do anticorpo antiacridina (FACScan) em 42 dias de estocagem.

	Fluorescência média de unidades de RBC
Dias	1	2	3	4	5	6	7	8
4	148,1	62,6	11,3	5,24	5,33	4,56	1,94	1,55
7	181,6	81,4	9,03	4,12	6,01	4,05	1,47	1,45
14	115,9	46,7	3,73	3,09	2,77	3,74	1,95	1,49
21	133,0	48,6	3,00	3,40	2,65	3,51	1,73	1,65
28	134,4	46,7	4,59	4,94	2,72	5,16	1,96	2,61
35	143,3	44,51	2,8	3,98	2,22	4,51	1,86	1,85
42	132,4	44,1	3,32	5,00	2,66	5,28	2,02	2,04

Exemplo 12

Avaliação in vivo da imunorreatividade de células hemácias tratadas em um modelo de coelho.

A avaliação in vivo da imunorreatividade de células hemácias (RBC) que foram tratadas com S-303 usando um exemplo não-limitativo de um método de supressão melhorado, referido nesse exemplo como o S-303 10 RBC modificado foi conduzida usando um modelo de transfusão alogênico. (Ver abaixo para a descrição do protocolo para S-303 RBC modificado). O modelo de transfusão alogênico foi baseado em um modelo de coelho

descrito por Nesse et al. (Trans Med Ver, 2001, 15: 305 - 17) para investigar os mecanismos para as reações de transfusão hemolítica tardia. Naquele modelo, células hemácias positivas para o HgD foram usadas para imunizar animais receptores HgD negativos. Entretanto, consistente com a literatura de que o RBC mal emparelhado com HgD somente causa a formação de anticorpos de maneira não-freqüente, Nesse t al. recorreram à administração subcutânea de RBC positivo para HgD combinado com adjuvante para gerar títulos apreciáveis de anticorpo anti-HgD.

A avaliação foi conduzida em duas fases: Na fase 1, os coelhos foram repetitiva mente transfundidos com RBC de coelho alogênico, mal emparelhado nos locais HgD e tratados com o processo Original S-303 (ver descrição abaixo). O ponto final da Fase 1 foi determinar se uma resposta de anticorpo podería ser gerada contra o RBC original S-303 no contexto das transfusões alogênicas crônicas. Na fase 2, os coelhos foram convencionalmente imunizados com conjugado KLH-acridina em adjuvante para estimular a formação de anticorpos antiacridina. Esses animais imunizados foram, a seguir, transfundidos com RBC S-303. O ponto final da Fase 2 foi comparar a recuperação e o tempo de vida dos RBCs preparados pelos processos original e modificado de RBC S-303. As amostras de controle nos experimentos de fase 1 e de fase 2 incluiram o RBC S-220 preparados pelos processos original e modificado. S-220 é uma versão não-lábil de S-303 que deve representar o pior caso em termos de acridina se ligando aos RBCs para cada processo de tratamento. Os resultados desses estudos demonstram que os S-303 modificados não são afetados pela presença do alto título de anticorpo in vivo.

A. Materiais e métodos.

Criação de animais: Coelhos brancos da Nova Zelândia, machos e fêmeas, foram aproximadamente de 5 a 7 meses de idade e pesavam entre 3,5 e 4,5 Kg no início do estudo. Os animais doadores foram HgDpositivos; os receptores foram /-/gD-negativos.

Reaqentes: Eritrosol sem dextrose foi produzido pela Baxter Healthcare de acordo com a formulação na Tabela 18. Uma solução de dextro-

se monoidratada a 8% também foi feita pela Baxter. Tabela 18. A composição do eritrosol (sem dextrose).

Ingrediente	Concentração (mg/100 mL)
Citrato de sódio desidratado	782
Adenina	21,5
Manitol	774
Diidrogenofosfato de sódio diidratado	73,4
Fosfato de sódio dibásico, anidro	242

O composto inativador de patógeno usado nesse exemplo foi o

PIC-1, o qual é referido nesse exemplo como S-303. S-303.2HCI foi esterilizado por irradiação gama. Um análogo não-quebradiço de S-303, chamado S-220, foi utilizado como controle. As estruturas químicas de S-303 (também aqui referidas como PIC-1) e S-220 são as seguintes:

ci ci

Os dois compostos têm estruturas similares com a exceção da frágil ligação éster presente somente na S-303. S-303 é algumas vezes referido aqui como um composto efetor ligante de âncora frágil (FRALE) e S220 como um composto efetor ligante de âncora (ALE).

GSH foi fornecido em uma das duas formas: como um pó prépesado de 184 mg esterilizado por radiação gama (Baxter Healthcare) ou como uma substância em bolo (Aldrich, St. Louis, MO) para ser pesado e formulado no momento do tratamento RBC.

Tratamento RBC; RBC foi transfundido em 24 - 36 horas de preparação. Sangue foi coletado assepticamente.de doadores F/gD-positivos em ACD-A. Aproximadamente 410 a 500 mL de sangue completo foram reunidos em um recipiente plástico e centrifugado a 4.200 x g por 6 minutos. Depois da remoção do plasma, 94 mL de eritrosol sem dextrose foram adicionados para produzir uma preparação de células hemácias empacotadas com um hematócrito de aproximadamente 60%. As células hemácias empacotadas foram tratadas de uma das três formas conforme mostrado na Figura 2 e descrito abaixo.

Controle RBC: células hemácias empacotadas foram misturadas 5 com 20 mL de dextrose 8% e, a seguir, estocadas a 4°C antes da infusão (até 2 dias).

S-303 RBC original: GSH (184 mg) foi dissolvido em 20 mL de dextrose 8%. Essa solução de GSH (pH 2,8 - 3,0) foi a seguir usada para dissolver S-303.2HCI (33 mg). A solução de S-303/GSH foi subseqüente-

mente adicionada às células hemácias empacotadas e misturada manualmente. RBC foi incubado por 12 h em temperatura ambiente, e a seguir exposto a um dispositivo de adsorção de composto (CAD) por 8 h adicionais sem misturar. As concentrações finais de S-303 e GSH no processo original foram de 0,2 mM e 2,0 mM, respectivamente. S-303 RBC original foi, a se15 guir, estocado a 4°C antes da infusão. Os tratamentos com o processo original foram efetuados usando o mesmo kit disponível usado em estudos clínicos humanos.

S-303 RBC modificado: GSH.HCI (2026 mg) foi pesado em tubos de plástico estéreis e dissolvido em 9,32 mL de dextrose 8%. O GSH 20 ácido foi, a seguir, combinado com 1,32 mL de NaOH 10 N, o qual representa 2 equivalentes de base. 10 mL de GSH básico, filtrado de forma estéril em dextrose (pH 9) foi adicionado às células hemácias empacotadas e manualmente misturado. Em 10 min, S-303.2HCI (33 mg) foi dissolvido separadamente em 10 mL de dextrose 8%, adicionado às células hemácias empaco25 tadas contendo GSH, e manualmente misturado. S-303 RBC modificado foram incubados em temperatura ambiente e exposto ao CAD de uma forma idêntica ao processo original. As concentrações finais de S-303 e GSH no processo modificado foram de 0,2 mM e 20 mM, respectivamente.

S-220 RBC: S-220 é um análogo do S-303 sem o éster lábil, e dessa forma a acridina pode não ser clivada pela hidrólise do resto da molécula durante o tratamento com RBC. S-220 RBC foram preparados usando métodos análogos ao processo original ou modificado descrito para S-303, e disponíveis a partir do processo original foram usados sempre que possível.

Para o S-220 RBC original, as concentrações finais de S-220 e GSH foram de 0,2 mM e 2,0 mM, respectivamente. Para o S220 RBC modificado, as concentrações finais de S-220 e GSH foram de 0,2 mM e 20 mM, respectivamente.

Imunização de acridina: Para eliciar os anticorpos antiacridina de alto título, os coelhos foram imunizados na fase 2 com um conjugado de KLH-acridina. KLH-acridina foi preparado em uma escala de 2 - 5 mL pela reação de quantidades equimolares (476 pM) de KLH (Pierce Biotechnology, IL) e S-220 em solução salina de tampão fosfato (pH 7,4) por 48 horas em temperatura ambiente. Os produtos de degradação de moléculas pequenas de S-220 foram separados da KLH-acridina pela passagem através de uma coluna de dessalinização. o conjugado de KLH-acridina foi caracterizado pela sua absorção a 210 e 410 nm, e a proporção de acridina para KLH foi determinada usando o coeficiente de extinção de S-220. Tipicamente 200 400 de aductos de acridina foram formados por molécula de KLH. A solução de KLH-acridina foi refrigerada até o uso. Os coelhos foram imunizados no dia 1 com KLH-acridina em adjuvante completo de reund (0,5 mg/mL) subseqüentemente nos 10 sítios acima dos nodos linfáticos popliteal, préescapular e pré-femural (aproximadamente 0,1 mL por sítio). Nos dias 8, 15, 36 e 64, os animais foram encorajados com KLH-acridina em adjuvante incompleto de Freund (0,25 mg/mL) nos mesmos sítios (aproximadamente 0,1 mL por sítio). Amostras de soro de coelho foram testadas bissemanalmente para a formação dos anticorpos.

Detecção de anticorpo à acridina (fase I): Anticorpo para acridina foi detectado usando um ensaio de citrometria de fluxo. S-303 RBC humanos foram preparados como um reagente de teste usando o processo de tratamento original. Soro de coelho foi diluído 1:4 e 25 pL de soro diluído foi misturado com 50 pL de S-303 RBC humano em hematócrito de 0,8%. Os soros de pré-imunização foram testados como controles negativos. As amostras foram incubadas por 30 min a 37°C e, a seguir, lavadas e ressuspensas em 50 pL de solução salina de banco de sangue. IgG anticoelho de cabra

740 rotulado com FITC (fornecedor) foi diluído com 1:64 e 25 pL foram incubados com a amostra de RBC por 30 min a 37°C. As amostras foram novamente lavadas e analisadas por FACS usando o canal FL1 para detectar o complexo de anticorpo ligado. Uma vez que soro positivo tenha sido identificado, o mesmo procedimento foi efetuado com diluições de soro de coelho para determinar o título do ponto final.

Detecção do anticorpo para a acridina (fase 2): S-303 RBC humanas foram preparadas como um reagente de teste usando o processo de tratamento original (S-303 0,2 pm, GSH 2 mM). RBCs foram lavados três vezes em solução salina de banco de sangue (BBS, Fisher Scientific), em BBS, até aproximadamente 4% de hematócrito. Soro dos grupos de coelhos V e VI foram diluídos em série em BBS. 25 pL de RBC 4% foram combinados com 15 pL de soro de coelho e deixados incubar por 30 min a 37°C. BBS foi usado em lugar do soro para o controle negativo. Depois da incubação, os RBC foram lavados três vezes com BBS e, a seguir, ressuspensos em 50 pL de IgG anticoelho F(ab’)2 de cabra conjugada com FITC (H&L) (Caltag) diluído 1:64 em BBS. RBC foram incubados por 30 min a 37°C e lavados três vezes com BBS. As amostras foram, a seguir, ressuspensas em 1 mL de HaemaLine-2 (HLK2, Sereno Diagnostics). As amostras foram analisadas por FACS usando o canal FL1 para detectar o complexo de anticorpo ligado.

Infusões de RBC e medidas de tempo de vida de RBC: RBCs foram administrados intravenosamente através da veia da orelha a 1 mL/min usando bombas de transfusão. Na fase 1, os coelhos foram dosados com 10 mL de RBC/Kg, enquanto que na fase 2 os coelhos foram dosados com 4 mL de RBC;Kg. A dose de 10 mL/Kg corresponde à quantidade aproximada de sangue transfundido mensalmente em regimes para pacientes com célula falciforme e talassemia.

Biotinilação de RBC foi efetuada depois do tratamento ou com S303 ou S-220. RBCs (300 mL) foram lavados duas vezes com 200 mL de PBSG (fosfato 12 mM, NaCl 138 mM, KCI 2,7 mM, glicose 5 mM, pH 7,4) e ressuspensos no mesmo meio. Eles foram, a seguir, misturados com um

volume igual de PBSG contendo NHS-biotina 60 μΜ (Aldrich, St. Louis MO) e incubados por uma hora a 37°C. Depois da incubação, eles foram lavados três vezes com 200 mL de PBSG e foram finalmente ressuspensos em PBSG a 50% de hematócrito e estocados sob refrigeração até a transfusão.

O tempo de vida de RBCs foi avaliado por análise de FACScan.

Sangue de coelho foi obtido em intervalos regulares depois da transfusão (1, 3, 7, 15, 21 e 28 dias) de todos os animais. As amostras foram passadas através de um filtro de 80 mícrons para remover os microcoágulos, diluídas para HCT 0,07% em PBSG e incubadas co estreptavidina rotulada com fico10 eritrina (diluição 1:100, Molecular Probes) no escuro em temperatura ambiente por 20 minutos. A análise de FACS foi efetuada em amostras que foram diluídas 5 vezes, e 50.000 eventos totais foram coletados em uma taxa de 400 eventos/segundo para capacitar a quantificação celular. O tempo de vida de RBC biotinilado foi calculado pela extrapolação para 100% de recupe15 ração no dia 0. Os valores nos dias subseqüentes foram, a seguir, expressos como uma porcentagem do valor do dia 0. Quando apropriado, a significância estatística das diferenças de tempo de vida foi analisada usando o teste t de Student com uma análise heteroesquedástica.

B. Fase T, Infusões repetidas de RBC mal emparelhado

Na fase 1, os animais foram transfundidos bissemanalmente por semanas com 10 mL;Kg de RBC alogênico mal emparelhado nos locais HgD para determinar se uma resposta ao S-303 RBC podería ser detectada. Os grupos de animais estão descritos na Tabela 19.

Tabela 19. Grupos de animais na fase 1

Grupo	Número	Regime de imunização
Grupo 1	4	Controle RBC, intravenoso
Grupo 2	6	Processo original S-303 RBC, intravenoso
Grupo 3	2	Conjugado KLH-acridina, subcutâneo
Grupo 4	6	Processo original S-220 RBC, intravenoso

soro foi amostrado em intervalos de uma semana e testados em um ensaio baseado em citometria de fluxo para a presença de anticorpo antiacridina. Resumidamente, S-303 RBC humano preparado pelo processo

original (S-303 0,2 mM e GSH 2 mM) foram incubados com uma diluição 1:4 de soro de coelho. Depois da lavagem, a presença de anticorpo de coelho ligado foi detectada com uma IgG anticoelho de cabra rotulada com FITC. O único resultado positivo foi detectado no grupo 3 na diluição de 1:4. Os resultados através de 24 semanas de infusão estão mostrados na Figura 1. Os animais imunizados com KLH-acridina demonstraram uma resposta de anticorpo antiacridina robusta. Ao contrário, não houve resposta de anticorpo significativa nos animais repetidamente transfundidos com o S-303 ou S-220 preparado pelo processo original.

Os resultados mostrados na Figura 1 foram confirmados pelos ensaios de aglutinação com S-303 RBC humana tratada com o processo original para a maioria das amostras de soro. Somente soro dos animais do Grupo 3 imunizados com KLH-acridina foram demonstrados para aglutinar S-303 RBC humano. Além disso, não foi observado uma resposta anti-HgD em qualquer animais receptores.

C. Fase 2: Determinação do tempo de vida de RBC em coelhos imunizados com KLH- acridina.

Uma vez que infusões repetidas com S-303 ou S-220 tratadas, preparações de RBC mal emparelhadas com antígenos falharam ao regenerar uma resposta imune antiacridina, na fase 2, uma tentativa mais estringente foi tomada para eliciar um anticorpo antiacridina. Os animais foram imunizados com KLH-acridina usando um regime primário de impulsionamento incluindo adjuvante e o tempo de vida in vivo de várias preparações de RBC tratadas em coelhos ou anticorpo de alto título foi, a seguir, medido. Os resultados da fase 1 demonstraram que foi possível imunizar camundongos através de imunização subcutânea com KLH-acridina e alcançar títulos de anticorpos elevados.

Animais nos Grupos 1, 2 e 4 também foram utilizados na Fase 2. Esses grupos foram subdivididos e um subgrupo de animais foi imunizado com KLH-acridina, enquanto os restantes foram mantidos nos seus regimes de transfusão existentes. Dois grupos adicionais de coelhos /7gD-negativos que foram simples para as infusões de RBC de qualquer tipo foram adicio-

nados à fase 2. Uma descrição dos grupos experimentais na fase 2 é fornecida na Tabela 20.

Tabela 20. Grupos de animais na fase 2.

Grupo	Número	Imunização de fase 1	Imunização de fase 2
1A	2	Controle RBC	Controle RBC
1B	2	Controle RBC	KLH-acridina
2A	2	S-303 RBC original	S-303 RBC original
2B	4	S-303 RBC original	KLH-acridina
4A	2	S-220 RBC original	S-220 RBC original
4B	4	S-220 RBC original	KLH-acridina
5	6	Nenhum	KLH-acridina
6	6	Nenhum	KLH-acridina

Durante as imunizações na fase 2, a produção de anticorpos foi seguida semanalmente pelo mesmo FACS e ensaios de aglutinação na fase 1. Depois de aproximadamente 8 semanas, todos os coelhos imunizados com KLH-acridina desenvolveram uma forte resposta de anticorpo específica para o S-303 RBC humano, enquanto que o soro dos animais imunizados com as várias preparações de RBC continuaram a ser não-reativas.

O título do anticorpo antiacridina no soro dos grupos V e VI foi determinado. A análise de citometria de fluxo foi usada para titular amostras de soro da pré-transfusão 1 (RBCs processados originais) e pré-transfusão 2 (RBCs processados modificados) de animais nos grupos V e VI. Os animais do grupo V receberam RBCs tratados com S-303, enquanto que animais do 15 grupo VI foram transfundidos com RBCs tratados com S-220.

O título foi definido como a diluição do soro no qual a fluorescência média foi acima da de fundo. Todos os coelhos tinham alto título de anticorpos antiacridina. O título para o grupo V foi levemente mais baixo no soro tomado de antes da transfusão 1 (Pré-TI) em comparação com o soro 20 da pré-transfusão 2 ('’Pré-T2''). O título do grupo VI foi o mesmo antes de ambas as transfusões.

Tabela 21. Título do ponto final médio/grupo antes da transfusão 1 e da transfusão 2.

Grupo V

Grupo VI

Pré-T1 Pré-T2

1:2048	1:4096
1:4096	1:4096

Uma vez que o anticorpo do soro foi estabelecido pela imunização KLH-acridina, cada animal foi transfundido para determinar o tempo de vida in vivo de várias preparações de RBC. Um rótulo de biotina foi usado para seguir a circulação in vivo de RBC (Sukuki e Dale (1987) Blood 70: 791 - 5). NHS-biotina forma uma ligação covalente com as proteínas da membrana RBC, e pode ser detectado usando estreptavidina rotulada fluorescen10 temente. Os coelhos receberam aproximadamente 4 mL de RBC/Kg de acordo com o esquema na Tabela 22. Depois da transfusão no dia 0, o san15 gue foi tirado nos dias 1,3, 7, 15, 21 e 28 para medir a porcentagem de células rotuladas com biotina na circulação em relação ao dia 0. RBCs de teste foram ou RBC de controle não-tratado, S-303 RBC preparado usando o procedimento original ou modificado, ou S-220 preparado usando o procedimento original ou modificado conforme mostrado na Tabela 22.

Tabela 22. Transfusões para determinar o tempo de vida do RBC pelos grupos de animais.

Grupo	Anticorpo de acridina	Transfusão 1*	Transfusão 2*
1A	Não	RBC controle	RBC controle
1B	Sim	RBC controle	RBC controle
2A	Não	S-303 RBC original	S-303 RBC modificado
2B	Sim	S-303 RBC original	S-303 RBC modificado
4A	Não	S-220 RBC original	S-220 RBC modificado
4B	Sim	S-220 RBC original	S-220 RBC modificado
5	6	S-303 RBC original	S-303 RBC modificado
6	6	S-220 RBC original	S-220 RBC modificado

* Todas as preparações de RCB foram rotuladas com biotina antes da infusão.

Tempo de vida de RBC preparada pelo processo original: A so-

brevivencia do RBC controle foi medida em coelhos não-imunes e imunes de acridina (subgrupos 1A e 1B, respectivamente, Tabela 21). Uma vez que não houve diferença no tempo de vida do RBC entre esses subgrupos, os dados estão apresentados graficamente abaixo como a recuperação porcentual média para todos os quatro animais combinados. Os animais que receberam o controle RBC foram usados como um comparador para todos os outros grupos.

Os Grupos 4 e 6 receberam S-220 RBC preparado pelo processo original na Transfusão 1. S-220 foi usado porque ele representa o pior caso para a formação de hapteno. A acridina não pode hidrolisar ou durante o tratamento in vitro ou subsequentemente durante a circulação in vivo. Os Grupos 4A e 4B foram transfundidos com S-220 RBC original na fase 1 do estudo, enquanto que o grupo 6 foi simples para o S-220 RBC (Tabela 20). Houve uma notável diferença no tempo de vida de S-220 RBC original dependendo da história de imunização dos animais (Figura 2). Animais do grupo 1, recebendo o controle RBC, tiveram o tempo de vida de RBC mais longo e a RBC biotinilada pode ser detectada na circulação no dia 57. A depuração do RBC de controle foi aproximadamente linear com o tempo. Ao contrário, o Grupo 6, imunizado com KLH-acridina e o qual nunca foi transfundido com S-220 RBC, demonstrou uma rápida depuração do S-220 RBC original. Essencialmente nenhum S-220 RBC foi detectado no dia 20. Isso demonstra que os coelhos no Grupo 4B, os quais foram imunizados pelo procedimento da KLH-acridina, mas diferentemente do grupo 6, também foram repetidamente transfundidos com S-220 RBC original na fase 1, mostraram sobrevivência ao RBC significativamente mais longa. Todavia, o tempo de vida do S-220 original no Grupo 4B foi diminuído em comparação com o Grupo 4A (o qual não foi imunizado com KLH-acridina). O tempo de vida do RBC medido no grupo 1 (recebendo controle RBC) e o Grupo 4A (recebendo S-220 RBC original) foi comparável, embora uma maior porcentagem de RBC de controle foram circulantes no grupo 1 depois de três semanas.

Uma comparação similar foi feita pela medida do tempo de vida do S-303 RBC original nos Grupos 2A, 2B e 5 (Figura 3). O tempo de vida

100 mais curto foi observado para o S-303 RBC nos coelhos do grupo 5, os quais foram imunizados para a KLH-acridina e eram simples para o S-303 RBC. Diferentemente do grupo 6, entretanto, o S-303 RBC original não foi depurado pelo dia 20 e S-303 RBC biotinilado não pode ser detectado além do dia 57. Interessantemente, o tempo de vida do S-303 RBC original nos coelhos do grupo 2B, os quais tinham um alto nível de anticorpo antiacridina circulante, não foi medido diferentemente do grupo 1 recebendo o controle RBC. Na comparação dos resultados para os coelhos dos grupos 2B e 5, aparentemente a exposição anterior ao S-303 RBC original melhorou os efeitos do anticorpo antiacridina na depuração do RBC. Esse resultado não esperado é semelhante ao que foi observado para os grupos 4B e 6 usando S-220 RBC original (Figura 2).

Tempo de vida do RBC preparado pelo processo modificado: O processo modificado foi desenvolvido para melhorar a supressão pelo GSH, pela alteração de múltiplos parâmetros. Primeiramente, a quantidade de GSH foi aumentada 10 vezes. Segundo, o GSH foi titulado com NaOH antes da adição ao RBC; isso aumenta a nucleofilicidade do grupo -SH. Essas alterações levam a uma redução significativa do S-303 ligado à superfície RBC (ver, por exemplo, o Exemplo 5 e o Exemplo 13). S-220 modificados foram preparados usando a mesma tentativa.

O tempo de vida do S-220 RBC modificado foi avaliado nos grupos 4A, 4B e 6 (Figura 4). Conforme observado anteriormente para o S-220 RBC preparado com o processo original, o tempo de vida do S-220 RBC modificado nos animais do grupo 6 foi significativamente reduzido em comparação com o controle RBC transfundido nos animais do grupo 1. Entretanto, o decréscimo na circulação de S-220 RBC modificado no decorrer do tempo foi significativamente menor do que o observado nos mesmos animais com S-220 RBC original.

Por exemplo, uma média de 18 por cento de RBC modificado estava circulante no dia 14, enquanto que somente 1,4% do RBC original foram observados no mesmo ponto de tempo. Além disso, o tempo de vida do S-220 RBC modificado nos grupos 4A (nenhum anticorpo) e 4B (anticor101 po induzido por KLH-acridina) foram equivalentes a ou melhores do que o

RBC controle no Grupo 1. Consistente com os dados anteriores (Figura 3), a exposição anterior ao S-220 RBC original aparenta ter aumentado o tempo de vida do S-220 RBC mesmo na presença de anticorpo de alto título.

Por último, o temo de vida do S-303 RBC modificado nos grupos 2A, 2B e 5 está apresentado na Figura 5. Em todos os casos, o tempo de vida do S-303 RBC modificado foi comparável com o RBC controle. Esse foi o caso mesmo para os animais do grupo 5, os quais demonstraram uma depuração aumentada do S-303 RBC original. Esse dado importante suporta a descrição in vivo de que os RBCs tratados com S-303 preparados pelo Processo Modificado não são imunorreativos in vitro com anticorpo antiacridina derivado de várias fontes. Isso inclui soro de paciente, anticorpo monoclonal de murino e antissoro policlonal de coelho.

Exemplo 13

Análise de FACScan adicional do RBC tratado com S-303

Para a testagem por citometrial de fluxo do RCB para a ligação do S-303 (PIC-1), 50 μ!_ de sangue foi lavado três vezes em 1,2 mL de solução salina 0,9%, e a seguir ressuspenso em 0,75 mL de solução salina para aproximadamente 4% de hematócrito. Vinte e cinco μί de RBC foram combinados com 15 μι de soro de coelho antiacridina que foi diluído de 1:100. Depois da incubação por 30 min a 37°C, a amostra foi lavada três vezes como acima. O pélete de RBC foi, a seguir, ressuspenso em 50 pL de volume de anticorpo anticoelho de cabra rotulado com FITC (Caltag) que tinha sido preparado em uma diluição 1:64 em albumina de soro bovino 0,1%. As amostras foram incubadas no escuro por 30 min a 37°C. Depois de três lavagens adicionais, os RBC foram ressuspensos em 1 mL de HaemaLine-2 (Serono Diagnostics). Depois de diluir para 0,01% de hematócrito, 20.000 eventos foram coletados e analisados para fluorescência a 600 nm.

O processo modificado resulta em níveis significativamente mais baixos de ligação do S-303 à superfície de RBC, conforme detectado usando um ensaio de citometria de fluxo. S-303 ligado ao RBC foi detectado usando um antissoro de coelho policlonal feito pela imunização de coelhos com um

102 conjugado de KLH-acridina no adjuvante. IgG ligada a coelho foi,a seguir, detectada usando uma IgG anticoelho de cabra rotulada com FITC. Resultados do FACScan está mostrados para nove reuniões separadas de RBC preparado usando o processo original e o modificado na Figura 6. Para cada reunião, o ensaio de FACScan foi usado para detectar a ligação do S-303 ao

C-RBC, O-RBC e M-RBC. A ligação do S-303 à superfície do RBC foi reduzida entre 15 a 35 vezes pelo processo modificado em relação ao processo original.

É entendido que os exemplos e modalidades aqui descritos são 10 somente para propósitos ilustrativos e que as várias modificações ou alterações à sua luz serão sugeridas por pessoas versadas na técnica e devem ser incluídas no espirito e campo de ação desse pedido.

Todas as publicações, patentes, pedidos de patentes e números de acesso (incluindo tanto as seqüências de polinucleotídeos quanto de po15 lipeptídeos) aqui citadas são por meio desta incorporadas por referência aqui na sua totalidade para todos os propósitos até a mesma extensão que se cada publicação, patente, pedido de patente ou número de acesso individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado dessa forma por referência.

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Método ex vivo para tratar uma composição de células hemácias para inativar um patógeno, se presente, caracterizado pelo fato de que compreende a mistura do seguinte com a composição de células hemácias:

(a) um composto inativador de patógeno que é β-alanina, N-(acridin-9-il), éster 2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico;

(b) um supressor que é glutationa, em que a razão molar do supressor para o composto inativador de patógeno é de 20:1 a 200:1;

em que o supressor é neutralizado com 0,5 a 2 equivalentes de uma base, em que um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar de supressor na mistura resultante que compreende a composição de células hemácias, o composto inativador de patógeno, o supressor e a base.
2. Método ex vivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que tanto a base quanto o supressor são misturados com a composição de células hemácias antes, ao mesmo tempo, ou não mais do que 30 minutos depois da mistura do composto inativador de patógeno com a composição de células hemácias.
3. Método ex vivo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a base e o supressor são misturados juntos antes de misturar tanto a base ou o supressor com a composição de hemácias.
4. Método ex vivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o supressor e a base são ambos fornecidos por um sal básico compreendendo o supressor.
5. Método ex vivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a base é NaOH.
6. Método ex vivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que a base compreende pelo menos 1 equivalente de base.
7. Método ex vivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a concentração do supressor na mistura resultante compreendendo a composição de células hemácias, o composto

Petição 870180029918, de 13/04/2018, pág. 16/27 inativador de patógeno, o supressor, e a base, é maior do que 2 mM.
8. Método ex vivo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que a concentração do supressor na mistura resultante compreendendo a composição de células hemácias, o composto inativador de patógeno, o supressor, e a base, está na faixa de 4 mM até 40 mM.
9. Método ex vivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a mistura resultante compreendendo a composição de células hemácias, o composto inativador de patógeno, o supressor, e a base, tem um pH em temperatura ambiente de 7,0 até 8,5.
10. Método ex vivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que compreende ainda a etapa:

(c) ajuste do pH da composição compreendendo células hemácias de modo a que o pH da mistura resultante compreendendo a composição de células hemácias, o composto inativador de patógeno, o supressor e a base à temperatura ambiente esteja na faixa de 7,0 a 8,5.
11. Método ex vivo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o pH da composição compreendendo células hemácias é ajustado pela adição de pelo menos 1 equivalente de base.
12. Método ex vivo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o supressor é neutralizado com pelo menos um equivalente de uma base adequada antes da adição do supressor à composição de células hemácias e o pH da composição compreendendo células hemácias é ajustado pela adição do supressor neutralizado.
13. Método ex vivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a concentração do supressor na mistura resultante compreendendo a composição de células hemácias, o composto inativador de patógeno, o supressor e a base está na faixa de 10 mM a 30 mM.
14. Método ex vivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a concentração de glutationa na mistura resultante é de 5 mM a 30 mM e a concentração de β-alanina, NPetição 870180029918, de 13/04/2018, pág. 17/27 (acridin-9-il), éster de 2- [bis(2-cloroetil)amino]etílico é de 0,05 mM a 0,5 mM.
15. Método ex vivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que a concentração de glutationa na mistura resultante é de 5 mM a 30 mM e a concentração de β-alanina, N(acridin-9-il), éster 2- [bis(2-cloroetil)amino]etílico é de 0,1 mM a 0,3 mM.
16. Método ex vivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracterizado pelo fato de que a proporção molar de supressor para composto inativador de patógenos é de 50:1 a 200:1.
17. Método ex vivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que o tratamento resulta em uma inativação de pelo menos 1 log de um contaminante patógeno na composição das células hemácias.
18. Método ex vivo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 17, caracterizado pelo fato de que compreende ainda uma etapa final de redução da concentração do composto inativador de patógeno na mistura resultante compreendendo a composição de células hemácias, o composto inativador de patógeno, o supressor, e a base.
19. Método ex vivo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende, na seguinte ordem:

(a) proporcionar (i) β-alanina, N-(acridin-9-il), éster 2- [bis(2-cloroetil)amino]etílico, (ii) glutationa neutralizada, e (iii) uma composição compreendendo células hemácias, em que existe uma possibilidade de que a composição de células hemácias esteja contaminada com um patógeno;

(b) misturar a glutationa neutralizada com a composição compreendendo células hemácias;

(c) incubar a mistura de glutationa neutralizada e a composição compreendendo células hemácias durante um intervalo de tempo apropriado; e (d) misturar β-alanina, N-(acridin-9-il), éster 2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico com a mistura de glutationa neutralizada e a composição compreendendo células hemácias, em que um patógeno, se presente na composição compreendendo células hemácias, é inativado por pelo menos 1 log.

Petição 870180029918, de 13/04/2018, pág. 18/27
20. Método ex vivo para melhorar a interrupção de uma reação secundária indesejada de um composto inativador de patógeno com células hemácias durante o tratamento de uma composição compreendendo as células hemácias com o composto inativador de patógeno na presença de um supressor, caracterizado pelo fato de que compreende misturar o seguinte com a composição de células hemácias:

(a) composto inativador de patógeno que é β-alanina, N-(acridin9-il), éster 2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico;

(b) um supressor que é glutationa, em que a razão molar do supressor para o composto inativador de patógeno é de 20:1 a 200:1;

em que o supressor é neutralizado com 0,5 a 2 equivalentes de uma base, em que um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar de supressor na mistura resultante que compreende a composição de células hemácias, o composto inativador de patógeno, o supressor e a base.
21. Método ex vivo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a reação indesejada do composto inativador de patógeno com as células hemácias é a modificação da superfície das células hemácias pelo composto inativador de patógeno.
22. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende:

(a) células hemácias;

(b) β-alanina, N-(acridin-9-il), éster 2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico; e (c) glutationa neutralizada como um supressor, em que o supressor está em uma concentração maior do que 2 mM e a proporção do supressor para o composto inativador de patógeno é de 20:1 a 200:1, e em que o supressor é neutralizado com 0,5 a 2 equivalentes de uma base, em que um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar de supressor na mistura resultante que compreende a composição de células hemácias, o composto inativador de patógeno, o supressor e a base, e

Petição 870180029918, de 13/04/2018, pág. 19/27 em que o pH da composição está na faixa de 6,8 até 8,5.
23. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende um composto inativador de patógeno que é β-alanina, N-(acridin-9-il), éster 2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico, um supressor que é glutationa, e pelo menos de 0,5 a 2 equivalentes de base, em que um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar do supressor no kit.
24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que a mistura resultante compreendendo a composição de células hemácias, o composto inativador de patógeno, o supressor, e a base, tem um pH em temperatura ambiente de 6,7 ou maior.
25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a mistura resultante compreendendo a composição de células hemácias, o composto inativador de patógeno, o supressor, e a base, tem um pH em temperatura ambiente de 6,7.
26. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o nível de ligação do anticorpo de composto inativador antipatógeno em relação à composição de células hemácias tratadas na mistura resultante, a qual compreende a composição das células hemácias, o composto inativador de patógeno, o supressor, e a base, é reduzido por pelo menos 50%, em relação à mistura sem a base.
27. Método de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que o nível de ligação do anticorpo de composto inativador anti-patógeno em relação à composição de células hemácias tratadas na mistura resultante, a qual compreende a composição das células hemácias, o composto inativador de patógeno, o supressor, e a base, é reduzido por pelo menos 75%, em relação à mistura sem a base.

Petição 870180029918, de 13/04/2018, pág. 20/27

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