CN116322920A - 使用氧化硅吸附从血浆中纯化fviii - Google Patents
使用氧化硅吸附从血浆中纯化fviii Download PDFInfo
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Abstract
公开了用于从血浆级分尤其是冷沉淀和级分II+III中捕获和去除纤维蛋白原，从而提供高产率的凝血因子VIII的有效方法。根据本公开，提供了一种将包含凝血因子和纤维蛋白原的血浆冷沉淀或级分II+III分离成包含所述凝血因子的第一级分和包含所述纤维蛋白原的第二级分的方法，所述方法包括：(a)使所述血浆冷沉淀与固体SiO2或Al(OH)3接触，从而将所述纤维蛋白原吸附到所述固体SiO2或Al(OH)3上；以及(b)将吸附到所述固体SiO2或Al(OH)3上的所述纤维蛋白原与血液因子分离，从而形成所述第一级分和所述第二级分。
Description
血液、血浆和血清是极其复杂的含蛋白质溶液，其包含除蛋白质以外的多种化合物，所有这些化合物都经过仔细的平衡和调节，以在非常广泛的生化复杂功能诸如氧运输、免疫应答和凝血中发挥作用。当血液从受试者身上抽出并暴露于大气中时，它会变得非常不稳定，纯化或富集血液蛋白质的方法必须考虑到这一事实。虽然添加了化学剂诸如肝素和柠檬酸钠以增加稳定性，并在一定程度上防止通过分离血液获得的血浆凝固，但血浆是非常脆弱、高度浓缩和粘稠的蛋白质溶液，还包含大量的脂质。尽管添加了稳定剂，但对血浆组合物的任何处理或改变都涉及意外失稳的风险，这可能会导致凝血级联的激活、例如脂质组分的沉淀以及蛋白质的变性，从而使血液难以处理。用于从血液或血液来源的溶液中分离蛋白质的任何方法都必须考虑到溶液和蛋白质本身的固有不稳定性。已经证明，这对于由血液大规模生产治疗性产品是一个非常重大的挑战。
血液的复杂性和不稳定性使得血液蛋白质的离析和分离比从其他蛋白质溶液(诸如生物技术行业通常使用的细胞培养上清液和发酵液)中分离蛋白质复杂得多且经济上的要求高得多。此外，生物技术行业通常只从细胞培养上清液中分离出一种特定产品，而出于经济和伦理原因，治疗性血液分级分离行业通常必须从有限量的可用血液中分离出尽可能多的产品。
血液、血清和血浆的成本显著增加，原因之一是预防传染病所需的安全措施成本增加，所述传染病例如从献血者传播至血液产品的接受者的病毒性疾病。血浆的高成本以及病毒消除步骤和处理期间其他安全措施的成本增加，使血液分级分离行业面临着增加单个产品产量的巨大压力，所述单个产品诸如凝血因子，例如因子VIII。血液分级分离行业的长期需求很难用已知技术来满足，尽管已经尝试使用现代吸附技术来替代已确立的沉淀方法，但是迄今为止所描述的吸附方法在经济可行性和处理稳健性方面仍然存在显著问题。人和动物的血液包含许多蛋白质和酶，它们具有治疗和可能挽救生命的特性。这些蛋白质中的一些可能存在于红细胞中，而另一些则存在于血浆或血清的溶液中。自20世纪中叶以来，此类蛋白质一直是大规模和特异性分离的目标，目的是纯化和标准化用作人治疗剂的蛋白质。来自血浆中的一些蛋白质以每年几千公斤的规模生产(白蛋白和IgG)，而其他蛋白质仅以每年克到千克的规模生产。然而，在全球范围内，每年处理数百万升血液以分离这些蛋白质。
美国专利号2,390,074(Cohn等人)中描述了一种常规使用的分级分离血浆或血清蛋白的方法，其公开了一种大规模分级分离血浆或血清蛋白的方法，该方法利用乙醇沉淀并调节温度、pH、离子强度和时间以控制某些蛋白质从人血浆中沉淀。分级分离方法涉及向血浆原料中逐步添加乙醇，以获得若干沉淀物(级分)和包含不同富集蛋白溶液的相应上清液。Cohn等人所公开的乙醇沉淀法的缺点是一些蛋白质易于在过程中变性，导致蛋白质产量降低和聚集体污染，在获得可接受的治疗性产品之前必须去除聚集体。此外，在Cohn分级分离过程中，沉淀的蛋白质必须再溶解以进行进一步处理。此类再溶解的蛋白质溶液可能包含显著水平的不溶性(变性)蛋白质和脂质物质，这使得制备目标产品变得困难且耗时，也显著地导致有价值产物的损失。此外，在该过程中，一种特定的蛋白质可能会分布到在逐步添加乙醇期间获得的若干级分中，从而又导致重组蛋白质级分的制备产量低且耗时。
因子VIII(FVIII)是存在于血浆中的蛋白质，其在导致血液凝固的级联反应中充当辅因子。FVIII活性缺乏会导致称为血友病A的凝血障碍，这是一种主要影响男性的遗传性病症。血友病A目前使用来源于人血浆或利用重组DNA技术制造的FVIII治疗性制备物进行治疗。此类制备物可在出血发作时施用(按需疗法)，或以频繁、规律的时间间隔施用，以防止不受控制的出血(预防)。
已知有几种不同的方法可用于生产用于治疗用途的抗血友病因子(AHF或因子VIII)，例如选择性沉淀、分批吸收和洗脱、在低离子介质中提取以及色谱法。虽然因子VIII的纯化消除了多种其他血浆蛋白，但纤维蛋白原是到目前为止这些蛋白质中最重要和最麻烦的，尤其是当其在处理期间变性时。变性的纤维蛋白原损害FVIII的过滤，导致FVIII在纯化步骤中明显损失，并降低冻干产品在重构流体中的溶解度。一种令人满意的纯化FVIII的方法需要去除相当数量的纤维蛋白原。上述选择性沉淀技术实现了这一目的，但具有使纤维蛋白原和FVIII进一步变性或产生不希望的FVIII损失的缺点。参见美国专利号4,789,733。
涉及在低离子强度缓冲液中从冷沉淀中提取因子VIII的程序虽然会稍微降低最终产品的纤维蛋白原含量，但仍会导致产品中不希望的高蛋白质含量，需要特殊的离心设备和程序，并且在不影响纯化的情况下从冷沉淀中提取的FVIII的总量受到限制。
通常与FVIII的大规模制造相关联的其他问题是最终产品被引起肝炎的致热物质和病毒污染。使用化学沉淀剂实际上可能会增加这些不需要的污染物。
目前使用的分离和纯化过程可以改进，因为从低效纯化过程产生的痕量杂质可能能够刺激患者的免疫应答。此外，无法分离产品的活性部分和非活性部分的纯化方法，如目前使用的方法，可能导致产品具有不可预测的功效和比活性，其在不同批次之间变化。
美国专利号4,387,092描述了一种从纤维蛋白原中纯化FVIII的方法，该方法包括在0至5℃下用6％的多元醇沉淀纤维蛋白原。在美国专利号4,188,318中描述的方法中，FVIII通过用于大规模生产因子VIII浓缩物的特定方法纯化，其使用过量纤维蛋白原、其变性形式和降解产物在低离子强度溶液中的选择性冷沉淀，不添加化学物质，也没有不希望的AHF活性损失。美国专利号8,563,288描述了通过用固定在色谱树脂上的刚性氨基酸进行处理来从粗制凝血制备物中去除纤溶酶原。美国专利申请公开号2015/0158906公开了一种方法，在该方法中，使包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的原料穿过疏水性电荷诱导色谱(HCIC)树脂并回收穿过树脂的包含纤维蛋白原和/或因子VIII和/或VWF的溶液，以降低溶液中纤溶酶原和/或组织纤溶酶原激活剂和/或其他蛋白酶的不稳定水平。
美国专利申请公开号2017/0282095描述了一种在用配体功能化的固体支撑物上使用膨胀床色谱法从添加醇的血液中分离蛋白质的方法。
还有其他生产FVIII浓缩物的方法，即用吸附剂诸如佛罗里凝胶(florigel)、膨润土、离子交换剂处理血浆，和渗透色谱法。此类产品被称为“高度纯化的AHF”或“高纯度AHF”。然而，它们的因子VIII活性也仅比天然血浆高90至100倍，而因子VIII非活性蛋白(纤维蛋白原)的含量仍占总蛋白的35％。参见，例如，美国专利号4,404,131。
示例性的已知方法在图2中阐述。将血浆冷沉淀糊以1(kg):3.5(L)的冷沉淀糊:水的比率悬浮在注射用水中，形成样品A。使样品A与FVIII等电，并进行冷沉淀步骤，以沉淀一些纤维蛋白原和其他蛋白质。该步骤包括添加0.04M的CaCl2，将pH调节到6.5至7.11，将温度调节到8至12℃，并且通过离心使所得的悬浮液澄清。将本体上清液抽出并通过将pH值升高到7.2至7.6并将温度调节到18至26℃使其稳定，形成样品B。向样品B添加NaCl，将NaCl含量调节到0.8M，添加CaCl2至浓度0.05M。通过过滤使所得的溶液澄清，得到澄清的本体。使用溶剂/清洁剂处理使该溶液经受病毒减少步骤。将溶剂(磷酸三(正丁基)酯)和清洁剂(辛苯聚醇9)添加到澄清的本体中，终浓度分别为1.0％(v/v)和0.3％(v/v)，形成样品C。将样品C加载到特异性结合FVIII的免疫亲和柱上。
虽然开发新的工业FVIII纯化方法的尝试已经取得了逐步的进展，并且FVIII产量有所增加，但这些方法复杂、程序繁琐、缺乏稳健性，并具有与冷滴相关的其他困难，这些困难是平衡这些方法的产量和经济性的挑战。消除冷滴将是本领域的重大进展，因为该步骤会产生粘性沉淀物，它们会堵塞管线、难以去除并使因子VIII的回收变得复杂。
如本文所述，本发明解决了现有方法的许多缺点。
发明内容
本发明避免了上文指出的缺点和困难，并提供了一种FVIII制剂，其中非FVIII活性蛋白，特别是纤维蛋白原基本上完全从FVIII中去除。通过消除(特别是)冷滴，本发明方法还克服了当前与沉淀的纤维蛋白原相关的工艺和设备挑战，并提供了从免疫亲和柱上游去除纤维蛋白原的方法。
基于浓缩物中存在的蛋白质，本发明制剂的FVIII活性高。通过消除长期以来被认为对成功分离FVIII至关重要的冷却和pH调节步骤，本发明非常令人惊讶地提供了一种比以前的方法更快、更简单、更经济的FVIII回收方法。本发明方法省去了冷沉淀和离心步骤；冷沉淀步骤严格且耗时，离心机是一项资本密集型投资，维护和维修费用昂贵。本发明的方法更简单，减少了方法循环步骤和循环时间，这是对现有方法的显著改进。
在示例性实施方案中，本发明解决了在不使用离心机的情况下从FVIII中去除纤维蛋白原的问题。在各个实施方案中，本发明解决了在没有冷沉淀步骤的方法中从FVIII中去除纤维蛋白原的问题。在一些实施方案中，本发明解决了从FVIII分离纤维蛋白原的问题，而无需在向下调节混合物的pH值的同时冷却FVIII和纤维蛋白原的混合物的费力过程。本发明的示例性方法解决了在使用本文描述的方法将纤维蛋白原与FVIII分离后收集纤维蛋白原的问题。
以前从血浆来源的富含FVIII的起始材料中富集FVIII的方法涉及用1M乙酸将起始材料(例如冷冻悬浮液)的pH值缓慢改变至6.7，并在持续混合的一段时间内发生沉淀时逐渐将悬浮液冷却至9.5℃。冷却和降低pH值需要约2.5小时，如果操作不当，会带来因子VIII沉淀的风险。在此过程中，形成了主要是纤维蛋白原和纤连蛋白的沉淀物，占总蛋白质的约50％以上。通过在9.5℃下以3000xg离心约120分钟来去除沉淀物。然后在约1.5小时的过程中用1N NaOH将所得的冷上清液的pH值向上调节至7.4。令人惊讶的是，本文公开的方法消除了这些严格且耗时的步骤中的每一个，提供了比现有技术方法更经济的简单、可重复的方法。
在一个示例性实施方案中，本发明方法消除了将纤维蛋白原与FVIII分离的方法中的冷沉淀步骤。将冷沉淀步骤替换为使冷沉淀或级分II+III的水性悬浮液与细碎二氧化硅(SiO2)或氧化铝(Al(OH3))接触，并过滤所得的悬浮液。纤维蛋白原吸附在二氧化硅或氧化铝上，很容易与残留在溶液中的FVIII分离。
因此，在一个示例性实施方案中，提供了一种将包含凝血因子和纤维蛋白原的血浆冷沉淀分离成包含凝血因子的第一级分和包含纤维蛋白原的第二级分的方法，该方法包括：(a)使血浆冷沉淀与固体SiO2或Al(OH)3接触，从而将纤维蛋白原吸附到固体SiO2上；以及(b)将吸附到固体SiO2或Al(OH)3上的纤维蛋白原与血液因子分离，从而形成第一级分和第二级分。
在一个示例性实施方案中，提供了一种将包含凝血因子和纤维蛋白原的Cohn级分II+III分离成包含凝血因子的第一级分和包含纤维蛋白原的第二级分的方法，该方法包括：(a)使血浆冷沉淀与固体SiO2或Al(OH)3接触，从而将纤维蛋白原吸附到固体SiO2上；以及(b)将吸附到固体SiO2或Al(OH)3上的纤维蛋白原与血液因子分离，从而形成第一级分和第二级分。
本发明的一个示例性目的是提供一种生产比活性至少为2.5单位AHF且纤维蛋白原含量低于0.25mg/mg蛋白质的FVIII(AHF)高浓缩物的方法，该方法适用于工业和技术规模，确保高经济性。
在各个实施方案中，本发明提供了含有通过本发明方法富集的FVIII的组合物、含有该组合物的药物制剂(包括单位剂量制剂)以及通过向有需要的受试者施用本发明的药物制剂来治疗或预防受试者的疾病的方法。
附图说明
图1为本发明的示例性实施方案的方法示意图。
图2为将本发明的示例性方法与市售FVIII制剂的生产方法进行比较的流程图。
具体实施方式
I.介绍
鉴于治疗性血浆来源的血液蛋白质组合物诸如凝血因子、凝血因子抑制剂、免疫球蛋白组合物和补体系统蛋白质的广泛使用，确保这些组合物的功效和安全性至关重要。
此外，与通过在宿主细胞系中重组表达DNA载体所生产的其他生物制剂不同，血浆来源的蛋白质是从人血液和血浆捐献者中分级分离的。因此，这些产品的供应不能通过简单地增加生产量来增加。相反，可商购获得的血液产品的水平受到血液和血浆捐献者的可用供应量的限制。这种动态性导致供应链在用于制造血浆来源的血液因子的人血浆原料的可用性方面受到限制。
在某些方面，本发明提供了基于以下惊人发现的制造方法，即细碎二氧化硅(SiO2)可用于从血浆来源的蛋白质溶液中去除显著量的纤维蛋白原。示例性溶液含有纤维蛋白原和一种或多种血液因子，例如FVIII。由本发明方法得到的产物是其中纤维蛋白原比起始血浆来源溶液中存在的纤维蛋白原少的FVIII制备物。
本文提供的方法易于整合到现有的制造程序中，例如，通过冷乙醇对混合血浆样品(优选人血浆样品)进行分级分离(综述于Schultze HE,Heremans J F；MOLECULAR BIOLOGY OFHUMAN PROTEINS.第一卷：NATURE AND METABOLISM OF EXTRACELLULAR PROTEINS 1966,Elsevier PublishingCompany；第236至317页)。然而，本文提供的方法决不限于其用于包括乙醇分级分离的制造方法。用于纯化血浆来源蛋白质的其他方法也与本文提供的方法相容，例如，聚合物(例如，PEG)分级分离和色谱法(例如，阴离子和/或阳离子交换色谱、亲和色谱、免疫亲和色谱、尺寸排阻色谱、疏水相互作用色谱、混合模式色谱等)。
II.定义
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。通常，本文使用的命名法和有机化学、药物制剂和医学成像中的实验室程序是本领域众所周知和常用的那些。
冠词“a”和“an”在本文中用于指冠词的一个或多于一个(即至少一个)语法对象。
除非另有说明，否则本发明的方法和技术通常根据本领域众所周知的常规方法进行，并且如在整个本说明书中引用和讨论的各种一般和更具体的参考文献中所述。参见，例如，Sambrook等人，MOLECU LAR CLONING:A LABORATORY MANUAL，第二版，Cold Spring Harbo rLaboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)和Ausubel等人，CURRENT PROTOCOLS INMOLECULAR BIOLOGY,GREENE PUBLISHING ASSOCIATES(1992)，以及Harlow和Lane，ANTIBODIES:A LABORATO RYMANUAL,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Har bor,N.Y.(1990)，以引用方式并入本文。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行，如本领域中通常所实现或如本文所述。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医药和药物化学相关的命名法以及实验室程序和技术是本领域众所周知和常用的那些。使用标准技术进行化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及患者的治疗。
以下术语，除非另有说明，否则应理解为具有以下含义。
在本文中，术语“因子VIII”或“FVIII”或“rAHF”是指任何FVIII分子，其具有至少一部分完整的B结构域，并且表现出与天然FVIII相关联的生物活性。在本公开的一个实施方案中，FVIII分子是全长FVIII。一般而言，如本文所用，FVIII是指从血浆中获得的天然存在的FVIII。在一个示例性实施方案中，FVIII在基本上不含纤溶酶原的制剂中并且已通过本发明的方法如此提供。
如本文所用，“血浆来源的FVIII”或“血浆的”包括存在于获自哺乳动物的血液中、具有激活凝血途径的特性的所有形式的蛋白质。
术语“分离的蛋白质”或“分离的多肽”是这样一种蛋白质，其起源或衍生来源(1)基本上不含在其天然状态下伴随它的天然相关组分，或(2)基本上不含来自同一物种的其他蛋白质。因此，化学合成或在与其天然来源的细胞不同的细胞系统中合成的多肽将与其天然相关成分“分离”。也可以使用本领域众所周知的或本文公开的蛋白质纯化技术，通过分离或富集使蛋白质基本上不含天然相关组分。
在一个示例性实施方案中，本发明提供了分离的FVIII。在各个实施方案中，本发明提供了一种分离的FVIII制备物，它是本发明方法的产物。示例性制备物中存在的纤维蛋白原比进入本发明方法的起始组合物(例如，血浆、冷沉淀)中存在的纤维蛋白原少。在一些实施方案中，用本发明方法产生的FVIII制备物基本上不含纤维蛋白原。在一些实施方案中，二氧化硅处理下游和免疫亲和柱上游的FVIII制备物基本上不含纤维蛋白原。
如本文所用，“基本上不含纤维蛋白原”是指含有FVIII的制备物具有少于约1％、少于约5％或少于约10％的存在于起始血浆中的纤维蛋白原。在一个示例性实施方案中，含有FVIII的制备物包括少于约1％、少于约5％或少于约10％的存在于冷沉淀起始材料中的纤维蛋白原。
在一个示例性实施方案中，制备物是如本文所讨论的用二氧化硅处理方法中间体的产物。示例性制备物含有FVIII和少于约1％、少于约5％或少于约10％的存在于血浆或冷沉淀起始材料中的纤维蛋白原。
示例性的“分离的”人FVIII是纯度为至少约90％的人FVIII(即，不包含超过10％的蛋白质杂质)。优选地，分离的人FVIII的纯度为至少约95％、98％、99％或至少约99.5％。示例性的分离的人FVIII是通过本文所述的本发明方法制备的。本发明的一个示例性方法提供的FVIII的纯度和活性与目前公认的用于制备这种供人施用的蛋白质的工业制造方法差不多。在一个示例性方法中，最终容器中的FVIII活性范围在约20IU/mL与约200IU/mL之间。
在各个实施方案中，从本发明示例性方法的溶剂/清洁剂处理步骤中产生的FVIII是“分离的人FVIII”。在一个示例性实施方案中，从本发明示例性方法的溶剂/清洁剂处理步骤下游的亲和色谱法步骤中产生的FVIII是“分离的人FVIII”。
如本文所用，术语“大部分”是指组合物中至少10％的特定蛋白质群。例如，当提到从组合物中去除大部分纤维蛋白原时，大部分纤维蛋白原对应于由本发明的方法(或本发明的组成步骤，例如用二氧化硅处理)去除的至少约10％，例如至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、至少约99％或更多的存在于起始组合物(例如，血浆、冷沉淀)中的纤维蛋白原，因此在本发明的产品中不存在。
如本文所用，“Cohn集合”是指用于分级分离血浆样品或血浆样品集合的起始材料。Cohn集合包括全血浆、贫冷沉淀血浆样品和贫冷沉淀血浆样品集合，这些样品可能经过或未经过预处理步骤、分级分离步骤或它们的组合。在某些实施方案中，Cohn集合是贫冷沉淀血浆样品，其中一种或多种血液因子已在预处理步骤中去除，例如，吸附到固相(例如，氢氧化铝、细碎二氧化硅等)上，或色谱步骤(例如，离子交换或肝素亲和色谱)。可从贫冷沉淀血浆样品中分离各种血液因子，包括但不限于因子八抑制剂旁路活性(FEIBA)、因子IX复合物、因子VII浓缩物或抗凝血酶III复合物，以形成Cohn集合。
术语“冷沉淀”，也称为冷沉淀的抗血友病因子(AHF)，是指通过以下方法制备的血液产品：使冷冻血浆(例如，全血来源的新鲜冷冻血浆、单采来源的血浆)受控解冻，以形成包含一种或多种凝血因子的沉淀物，所述凝血因子包括但不限于纤维蛋白原、因子VIII、因子XIII、vWF和/或纤连蛋白。此类冷沉淀通过以下方式制备：缓慢、受控地解冻冷冻血浆(例如，全血来源的新鲜冷冻血浆，或FFP)，例如在1℃与6℃(例如，4±2℃)之间，这会导致形成白色沉淀物，然后在诸如通过冷冻离心从液体血浆部分(本文也称为“上清液”)分离后回收沉淀物。从袋中取出“贫冷沉淀”剩余血浆(在本文中也称为“贫冷沉淀血浆”(CPP)、“冷沉淀减少的血浆”或“冷上清液”)，将分离出的冷不溶性沉淀物重新悬浮在一部分留下的血浆中，通常在1小时内重新冷冻，并冷冻储存直至需要输血时。冷沉淀可在回收后重悬于任何合适体积的血浆中。冷沉淀(也称为“冷沉淀(cryo)”)是一种血液产品，其包含一部分富含凝血因子的血浆。
冷沉淀用作纤维蛋白原、因子VIII、因子XIII、vWF和纤连蛋白的来源。该组分用于控制与纤维蛋白原缺乏相关联的出血，并在容量考虑排除使用冷冻血浆且重组蛋白不可用时治疗因子XIII缺乏症。它也被指定为血管性血友病和A型血友病(因子VIII缺乏症)的二线疗法。当需要用血液组分疗法来治疗血管性血友病和因子VIII缺乏症时，通常首选冷沉淀以外的凝血因子制备物。尽管冷沉淀产品的许多用途已被因子浓缩物或重组因子所取代，但许多医院血库仍常规储存冷沉淀用于替代患者的纤维蛋白原，诸如例如患有获得性低纤维蛋白原血症和出血(例如，大出血)的患者。对于冷沉淀，血型相容性测试不是严格必需的；然而，在可能的情况下，通常优选地输注ABO相容性冷沉淀。制备冷沉淀的方法是本领域众所周知的。
如本文所用，“冷沉淀滤饼”是指在过滤包含细碎SiO2(或Al(OH3))的冷沉淀糊的水性悬浮液后所回收的固体。将冷沉淀悬浮液用吸附材料处理，例如细碎的二氧化硅，以去除杂质诸如纤维蛋白原。在另一个优选的实施方案中，在过滤之前将助滤剂添加到冷沉淀悬浮液中。在一个示例性实施方案中，将冷沉淀悬浮液在离心或过滤之前用吸附材料和助滤剂处理。在分离冷沉淀悬浮液上清液后，回收的固体材料称为“冷沉淀滤饼”。
如本文所用，“级分II+III滤饼”是指在Cohn-Oncley或等效级分II+III糊状悬浮液过滤或离心后所回收的固体。将级分II+III悬浮液用吸附材料处理，例如细碎的二氧化硅，以除去杂质诸如纤维蛋白原。在另一个优选的实施方案中，在过滤之前将助滤剂添加到级分II+III悬浮液中。在一个示例性实施方案中，将级分II+III悬浮液在离心或过滤之前用吸附材料和助滤剂处理。在分离澄清的级分II+III悬浮上清液后，回收的固相材料称为“级分II+III滤饼”。
如本文所用，“贫冷沉淀血浆”是指在去除冷沉淀后形成的上清液，冷沉淀是通过在接近冰点的温度下，例如在低于约10℃，优选地在不高于约6℃的温度下解冻血浆或混合的血浆而形成的。通常例如通过解冻先前冷冻的混合血浆进行冷沉淀，出于安全和质量考虑，已经对混合血浆进行了测定，但也可以使用新鲜血浆。在低温下完全解冻冷冻血浆后，通过离心或过滤在低温(例如≤6℃)下将固体冷沉淀与液体上清液分离。
术语“血浆”是指本领域已知的任何血浆血液产品。在本发明的上下文中，血浆可互换地指回收的血浆(即体外从全血分离的血浆)或源血浆(即通过血浆除去法收集的血浆)。在一些实施方案中，血浆是指全血来源的新鲜冷冻血浆。在一些实施方案中，血浆是指来自全血献血者的一个或多个血浆单元(例如，每个约180mL至250mL体积)。在一些实施方案中，血浆是指来自单采献血者的一个或多个血浆单元(每个可能高达约700mL至800mL)。在一些实施方案中，血浆是指单个单元。在一些实施方案中，血浆是由多个单元混合而成。在一些实施方案中，血浆可含有一种或多种附加组分，包括但不限于一种或多种病原体灭活化合物和/或病原体灭活过程的副产物。
在本文中，术语“上清液”涉及液体级分，其位于沉积物级分或沉淀级分之上。液体级分可以是化合物的组合或纯化合物。在本发明的一个实施方案中，通过该方法使用或产生的级分可以是液体(液体级分)、沉积物(沉积物级分)或沉淀(沉淀级分)的形式。
如本文所用，“二氧化硅”或“细碎二氧化硅”是指具有式SiO2的硅的氧化物，其以允许纤维蛋白原吸附到其表面上的方式制造。适用于本发明方法的二氧化硅的示例性形式包括但不限于气相二氧化硅、热解二氧化硅、AerosilTM、Cab-O-Sil、胶态二氧化硅、硅藻土等。在优选的实施方案中，本文提供的方法使用商业亲水性气相二氧化硅产品。这些产品的非限制性示例包括由Evonik Industries以商品名
销售的那些产品(例如，Aerosil 90、Aerosil 130、Aerosil 150、Aerosil 200、Aerosil 300、Aerosil 380、Aerosil OX 50、Aerosil EG 50、Aerosil TT 600、Aerosil 200SP、Aerosil 300SP、Aerosil 300/30和/>
380)。在示例性实施方案中，SiO2是/>
380。尽管化合物不同，但本发明的方法也可以用Al(OH)3代替二氧化硅或将其与二氧化硅一起使用。当提及这些种类中的一者时，该提及被理解为是指这些助滤剂中的任一者及其组合。
如本文所用，术语“助滤剂”是指在固液分离过程中使用的添加剂，其通过在实际过滤介质上形成多孔预涂层和/或通过合并到滤饼结构中，促进固体的沉积，同时使所得的滤饼具有足够的渗透性。示例性的助滤剂包括硅藻土、珍珠岩、氧化铝、玻璃、植物颗粒、木纤维和/或纤维素或它们的混合物。
硅藻土是一种粉状物质，主要包含具有非常多孔的结构的硅藻化石的二氧化硅壳。在商业上，硅藻土可以例如从Lehmann und Voss(例如
)、Dicelite或PallSeitzSchenk公司获得。珍珠岩助滤剂包含火山黑曜岩，由热膨胀产生；从化学上讲，这些是硅酸铝，几乎与二氧化硅一样惰性。珍珠岩助滤剂的结构对应于不具有相同孔隙率的球形碎片，硅藻的丝状骨架就是这种情况。在商业上，珍珠岩可以例如从Lehmann und Voss
和Dicelite公司获得。
为确保高纯度以及气味和味道中性而部分地专门制备的来自无提取物纤维素的预处理天然纤维同样可用作助滤剂。纤维素助滤剂在机械和化学方面非常稳定，几乎不溶于所有介质，pH几乎为中性。在商业上它们由例如J.Rettenmaier&
分销(例如/>
和/>
型)。
在一个示例性实施方案中，助滤剂是
C300。
如本文所用，术语“过滤”包括各种筛分和膜过滤方法，其中静水压力迫使液体抵靠半渗透过滤器。悬浮固体，而水和溶质通过过滤器。在本发明中使用的示例性过滤技术是切向过滤。本发明上下文中的示例性过滤产生因子II+II滤饼或冷沉淀滤饼。
如本文所用，术语“混合”描述通过任何形式的搅拌使两种或更多种不同的化合物或物质在溶液或悬浮液中基本上均匀分布的行为。当本申请中使用术语“混合”时，可能会由于“混合”导致溶液或悬浮液中所有成分完全均匀分布，但这并不是必需的。
如本文所用，术语“溶剂”包括能够溶解或分散一种或多种其他物质的任何液体物质。溶剂可以是无机性质的，诸如水，或者它可以是有机液体，诸如乙醇、丙酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、己烷、石油醚等。
如本文所用，在本申请中术语“清洁剂”与术语“表面活性剂(surfactant)”或“表面活性剂(surface acting agent)”互换使用。表面活性剂通常为两亲性，即，含有疏水性基团(“尾部”)和亲水性基团(“头部”)的有机化合物，这使得表面活性剂可溶于有机溶剂和水中。表面活性剂可根据其头部中形式上带电荷的基团的存在来分类。非离子表面活性剂在其头部中不具有电荷基团，而离子表面活性剂在其头部中携带净电荷。两性离子表面活性剂包含具有两个带相反电荷的基团的头部。常见表面活性剂的一些示例包括：阴离子(基于硫酸根、磺酸根或羧酸根阴离子)：全氟辛酸盐(PFOA或PFO)、全氟辛烷磺酸盐(PFOS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、十二烷基硫酸铵和其他烷基硫酸盐、月桂基醚硫酸钠(也称为十二烷基醚硫酸钠，或SLES)、烷基苯磺酸盐；阳离子(基于季铵阳离子)：鲸蜡基三甲基溴化铵(CTAB)(又名十六烷基三甲基溴化铵)和其他烷基三甲基铵盐、氯化十六烷基吡啶(CPC)、聚乙氧基化牛脂胺(POEA)、苯扎氯铵(BAC)、苄索氯铵(BZT)；长链脂肪酸及其盐：包括辛酸盐、辛酸、庚酸、己酸、庚酸、纳米酸、癸酸等；两性离子(两性)：十二烷基甜菜碱；椰油酰胺丙基甜菜碱；可可两性甘氨酸盐(coco ampho glycinate)；非离子：烷基聚(环氧乙烷)、烷基酚聚(环氧乙烷)、聚(环氧乙烷)和聚(环氧丙烷)的共聚物(商业上称为泊洛沙姆(Poloxamer)或泊洛沙胺(Poloxamine))、烷基多葡糖苷(包括辛基葡糖苷、癸基麦芽糖苷)、脂肪醇(例如鲸蜡醇和油醇)、椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA、聚山梨醇酯(Tween 20、Tween 80等)、Triton清洁剂和十二烷基二甲基氧化胺。示例性清洁是辛苯聚醇9。
示例性实施方案包括对过滤步骤下游的至少一种产物进行“溶剂/清洁剂处理”，以去除吸附材料，例如二氧化硅。示例性的“溶剂清洁剂处理”使用有机溶剂(例如磷酸三-正丁基酯)，其是用于灭活溶液中脂质包膜病毒的溶剂清洁剂混合物的一部分。在该处理中使用的示例性清洁剂是辛苯聚醇9。
术语“多肽”或“蛋白质”包括天然或人工蛋白质、蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。多肽可以是单体的或聚合的。示例性的多肽或蛋白质包括人FVIII和人纤维蛋白原。
如本文所用，“多肽”是指由通过肽键连接的氨基酸残基、结构变体、相关的天然存在的结构变体和合成的非天然存在的类似物组成的聚合物。例如使用自动多肽合成仪来制备合成多肽。术语“蛋白质”通常是指大的多肽。术语“肽”通常是指短多肽。
“天然存在的”FVIII多肽序列通常来自哺乳动物，包括但不限于灵长类动物，例如人；啮齿动物，例如大鼠、小鼠、仓鼠；牛、猪、马、绵羊或任何哺乳动物。参考多核苷酸和多肽序列包括，例如UniProtKB/Swiss-Prot P00451(FA8_HUMAN)；Gitschier J等人，Characterization of the human Factor VIII gene,Nature,312(5992):326-30(1984)；Vehar G H等人，Structure of human Factor VIII,Nature,312(5992):337-42(1984)；和Thompson A R.Structure and Function of the Factor VIII gene and protein,SeminThromb Hemost,2003:29；11-29(2002)(参考文献全文并入本文)。
如本文所用，“抗体”是指基本上由一种或多种免疫球蛋白基因或其片段编码的多肽，其特异性地结合并识别分析物(抗原)。所识别的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及大量免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，它们继而分别定义免疫球蛋白类别IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元由两对多肽链组成，每对具有一条“轻”链(约25kD)和一条“重”链(约50-70kD)。每条链的N端限定主要负责抗原识别的约100至110或更多个氨基酸的可变区。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别是指这些轻链和重链。示例性的抗体是与FVIII特异性结合的单克隆抗体。在各个实施方案中，抗体与FVIII特异性结合，例如过滤步骤下游制备物中的人FVIII，例如，来自本发明的示例性方法的溶剂/清洁剂处理步骤的FVIII。
在各个实施方案中，使用与FVIII特异性结合的单克隆抗体的亲和色谱法被用于进一步纯化过滤下游的FVIII制备物，例如来自本发明的示例性方法的溶剂/清洁剂处理步骤的FVIII制备物。
如本文所用，术语“在无菌条件下”是指例如通过使用来自血液处理装置的两个或多个容器(例如，袋子)的无菌连接装置保持系统的无菌状态，或指的是一种装置，通过该装置过程中不会引入污染。例如，如在本文所述的方法中所使用，可以通过本领域已知的方法在无菌条件下例如使用无菌连接装置连接血液产品(诸如冷沉淀或血浆)的源单元，源单元包括用于连接到处理装置的管道或包含类似管道的病原体灭活化合物容器，无菌连接装置用于将管道熔化或焊接在一起以在两个容器之间提供无菌流动路径。在各个实施方案中，本发明方法的中间体和产物在各步骤之间的转移是在无菌条件下进行的。
“国际单位”或“IU”是FVIII的凝血活性(效能)的测量单位，如通过标准测定法诸如一步测定法所测量。一步测定法是本领域已知的，诸如N Lee，Martin L等人，An Effectof Predilution on Potency Assays of FVIII Concentrates,Thrombosis Research(Pergamon Press Ltd.)30,511 519(1983)中所述。另一种标准测定法是显色测定法。显色测定法可商购获得，诸如Coatest Factor VIII，可从Chromogeix AB,Molndal,Sweden获得。在一个示例性实施方案中，最终容器中的FVIII活性为约20IU/mL至约200IU/mL。
在一个实施方案中，根据本发明的方法大规模进行。在本文中，术语“大规模”涉及每个吸附循环处理至少约1升的原材料体积，诸如每个吸附循环至少约5升，诸如每个吸附循环至少约10升，诸如每个吸附循环至少约25升，诸如每个吸附循环至少约100升，诸如每个吸附循环至少约1000升，从而将本发明与任何分析和小规模实验区分开来，这些实验不涉及工业大规模生产环境中对稳健性和可重复性的严格要求。本发明的一个示例性方法是将纤维蛋白原与FVIII进行大规模分离。
“疾病”是动物的健康状态，其中动物不能维持稳态，例如止血，并且其中如果疾病没有改善，则动物的健康继续恶化。
“止血”是防止血管损伤(例如破裂)后出血的重要生理过程。存在三种促进止血的基本机制：(i)血管收缩，(ii)血小板在破裂部位聚集；(iii)凝血。在凝血过程中，受损的内皮细胞释放组织因子(因子III)，后者继而在Ca2+的帮助下激活因子VII。活化的血小板所释放的因子XII激活因子XI。活化的因子VII和因子XI促进导致因子X活化的酶促反应级联。活性因子X(因子Xa)与因子m、因子V、Ca2+和血小板凝血因子(PF3)一起激活凝血酶原激活物。凝血酶原激活物将凝血酶原转化为凝血酶，凝血酶将纤维蛋白原(因子I)转化为纤维蛋白，纤维蛋白在损伤部位形成初始网状结构。随后通过因子XIII将初始网状结构转化为致密的纤维蛋白凝块，密封破裂处，直至修复该部位。在凝血级联过程中，凝血酶还将激活因子VIII，这是一种糖蛋白前辅因子，在循环中主要与血管性血友病因子(VWF)复合。在Ca+2和磷脂存在的情况下，因子VIII与因子IXa相互作用以激活因子X。
任何一种或多种参与凝血的蛋白质(包括纤维蛋白原、因子VIII和/或血管性血友病因子(VWF))的水平缺乏，无论是先天性的还是后天性的，都可能导致凝血不充分和出血风险。目前的治疗选择仅限于施用一种或多种治疗性蛋白质的药物制剂，以恢复蛋白质的内源性水平并维持止血。
在各个实施方案中，将通过本发明的方法生产的FVIII或其药物制剂施用于受试者用于预防以防止或治疗需要此类治疗或预防的受试者的疾病。在示例性实施方案中，疾病是止血障碍。在各个实施方案中，疾病是由于血液凝固缺陷导致的过度出血。在一个示例性实施方案中，出血是由于受试者的FVIII缺乏所致。
术语“药理学活性”是指如此描述的物质被确定具有影响医学参数或疾病状态的活性。在示例性实施方案中，本发明提供了通过本发明的方法制备的药学活性FVIII制剂。本发明的示例性FVIII制剂适用于输注。示例性的药理学活性FVIII制剂是病原体灭活的。
术语“适用于输注”是指根据医学判断能够用于输注到受试者(例如，人患者)中的任何血液产品(例如，FVIII)。在一些实施方案中，适用性是指具有足够的生物活性用于其预期用途，即，用于指示输注人凝血因子的情况，包括但不限于控制与因子VIII缺乏相关的出血、维持止血、治疗弥漫性血管内凝血(DIC)和/或大出血。在一些实施方案中，适用性是指具有足够的安全性，例如，产品已经过提高产品安全性的处理(例如，病原体灭活)和/或在一项或多项安全相关测量(诸如病毒或细菌滴度)方面表现出令人满意的性能。如本文所述的使用amotosalen和UVA光对血液产品单元中的病原体进行光化学灭活是公认的，以提供适用于输注到人体内的此类血液产品(例如，冷沉淀)。在一些实施方案中，适用性是指满足由管理输液实践的认证机构或监管机构诸如AABB制定的一项或多项标准(例如，具有生物活性或生物组分的水平、安全准则等)。
如本文所用，“病原体灭活”描述了已经过处理(例如，通过本文描述的方法)以灭活可能存在的病原体的血液产品(例如，冷沉淀或血浆)。应当理解，病原体灭活的冷沉淀或冷沉淀下游的级分可包括冷沉淀或自身已经历病原体灭活的下游级分，或由病原体灭活的血液产品(例如血浆、全血等)制成的冷沉淀。病原体的灭活可通过测量一定体积中感染性病原体(例如病毒或细菌)的数量来测定，灭活水平通常由病原体感染性的log下降或滴度的log下降来表示。测定滴度的对数减少的方法及其对病原体灭活的测量是本领域已知的。测定滴度的对数减少的方法及其对病原体灭活的测量在例如美国专利号7,655,392中有所描述，其公开内容以引用方式并入本文，因为它涉及病原体灭活的测定。因此，对于任何给定的病原体，可以将已知量添加到冷沉淀或血浆的测试单元中，以评估该过程导致多少灭活，其中病原体灭活过程通常导致滴度下降至少约1log，或滴度下降约2log、约3log、约4log或至少约5log。虽然本文所述的方法适用于任何病原体灭活处理，但理想的是病原体灭活处理能够将多种病原体灭活至滴度下降至少1log，包括选自以下的病原体：HIV-1、HBV、HCV、HTLV-1、HTLV-2、西尼罗河病毒、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、小肠结肠炎耶尔森菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、梅毒螺旋体、伯氏疏螺旋体、恶性疟原虫、克氏锥虫和田鼠巴贝虫。在各个实施方案中，本发明提供了一种从FVIII中分离纤维蛋白原并由该方法的产物形成病原体灭活FVIII制剂的方法。
如本文所用，“药学上可接受的载体”包括生理上相容的溶剂、分散介质、包衣、抗菌剂和抗真菌剂、等渗剂和吸收延迟剂等。药学上可接受的载体的一些示例是水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，以及它们的组合。在许多情况下，组合物中优选地包含等渗剂，例如糖、多元醇诸如甘露醇、山梨糖醇、氨基酸(例如甘氨酸、脯氨酸等)或氯化钠。药学上可接受的物质的附加示例是润湿剂或少量辅助物质，诸如润湿剂或乳化剂、防腐剂或缓冲剂，它们可延长FVIII的保质期或有效性。包含此类载体的组合物通过众所周知的常规方法配制。本发明的示例性制剂包括一种、两种或更多种不同的氨基酸。在一个示例性实施方案中，氨基酸的存在提高了抗体的稳定性，即使在高浓度下也是如此，在高浓度下FVIII在不存在氨基酸的制剂中通常不稳定。在各个实施方案中，选择载体以提供“稳定的药物制剂”。
如本文所用，术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成氨基酸。
在一个实施方案中，稳定的药物制剂包含本发明方法的FVIII产物和至少一种根据氨基酸提高FVIII稳定性和/或降低溶液粘度的能力而选择的氨基酸。在一个实施方案中，氨基酸包含带正电荷的侧链，诸如R、H和K。在另一方面，氨基酸包含带负电荷的侧链，诸如D和E。在另一个实施方案中，氨基酸包含疏水性侧链，诸如A、F、I、L、M、V、W和Y。在另一个实施方案中，氨基酸包含极性不带电侧链，诸如S、T、N和Q。在另一个实施方案中，氨基酸没有侧链，即，G。
与本文所述的制剂结合使用的术语“稳定的制剂”诸如“稳定的药物制剂”表示但不限于在制造、储存和应用期间保持其物理稳定性/同一性/完整性和/或化学稳定性/同一性/完整性和/或生物活性/同一性/完整性的制剂。用于评估蛋白质稳定性的各种分析技术在本领域中是可获得的并且在Reubsaet等人，(1998)J Pharm Biomed Anal 17(6-7):955-78和Wang,W.(1999)Int J Pharm 185(2):129-88中有所综述。可通过例如但不限于在选定的气候条件下储存选定的时间段、通过施加机械应力诸如在选定的振动频率下振动选定的时间段、通过用选定的光强度照射选定的时间段或通过在选定的温度下反复冷冻和解冻来评价稳定性。稳定性可通过例如选自以下方法中的至少一者来确定：目视检查、SDS-PAGE、IEF、尺寸排阻液相色谱法(SEC-HPLC)、反相液相色谱法(RP-HPLC)、离子交换HPLC、毛细管电泳、光散射、粒子计数、浊度、RFFIT和κ/λELISA，但不限于此。目视检查所使用的示例性特征包括浊度和聚集体形成。
在一个实施方案中，当制剂中的FVIII(1)基本上保留其全部天然物理稳定性，(2)基本上保留其全部化学稳定性和/或(3)保留其生物活性时，制剂被认为是稳定的。
本发明的示例性FVIII制剂是稳定的制剂，例如稳定的药物制剂。
如果，例如但不限于，FVIII在颜色和/或透明度的视觉检查时或通过UV光散射或尺寸排阻色谱法(SEC)或电泳测量时没有显示出聚集、沉淀和/或变性的迹象，诸如根据浊度或聚集体形成，则可以说它在制剂中“保持其物理稳定性”。可替代的、相容的定义是已获得一个或多个监管机构(例如，FDA、EMA等)的上市许可、满足等效药物产品的一个或多个物理稳定性要求的制剂。
如果，例如但不限于，在给定时间的化学稳定性使得FVIII没有通过键形成或裂解而产生新的化学实体的显著修饰，则可以说FVIII在制剂中“保持其化学稳定性”。在另一个实施方案中，可通过检测和量化FVIII的化学改变形式来评估化学稳定性。化学改变可能涉及，例如但不限于，尺寸修饰(例如剪切)，这可以使用尺寸排阻色谱法、SDS-PAGE和/或基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱法(MALDI/TOF MS)进行评估。其他类型的化学改变包括，例如但不限于，电荷改变(例如由于脱酰胺作用而发生)，其可以例如通过离子交换色谱法进行评估。氧化是另一种常见的化学修饰。可替代的、相容的定义是已获得一个或多个监管机构(例如，FDA、EMA等)的上市许可、满足等效药物产品的一个或多个稳定性要求的FVIII制剂。
在一个实施方案中，如果，例如但不限于，测定时FVIII在给定时间的生物活性为制剂制备时所表现出的生物活性的约50％和约200％之间，或约60％和约170％之间，或约70％和约150％之间，或约80％和约125％之间，或约90％和约110％之间，则可以说FVIII在药物制剂中相对于天然FVIII“保留其生物活性”。在另一个实施方案中，如果，例如但不限于，通过本发明的方法制备的FVIII在给定时间的生物活性为本领域公认的FVIII活性测定中的参考标准品的活性的至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或至少约100％，则可以说FVIII在药物制剂中“保留其生物活性”。可替代的、相容的定义是已获得一个或多个监管机构(例如，FDA、EMA等)的上市许可、满足等效药物产品的一个或多个生物活性要求的FVIII制剂。
通过本发明的方法制备的FVIII的“治疗有效量”是指在剂量、施用间隔和必要的时间段内有效实现所需治疗结果的量。FVIII的治疗有效量可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及FVIII在个体中引起所需反应的能力等因素而变化。在示例性实施方案中，用治疗有效量的包含通过本发明的方法制备的FVIII的药物制剂治疗感染了与止血有关的疾病的受试者降低了死亡风险。在一些实施方案中，用治疗有效量的本发明的药物制剂治疗受感染的受试者加速了受试者的恢复时间。
在一个示例性实施方案中，本发明提供了通过本发明的方法制备的FVIII的单位剂量制剂。单位剂量包含治疗有效量的FVIII。
术语“剂量”和“用量”在本文中可互换使用。剂量是指在每次施用时给予个体的活性成分的量。剂量将根据许多因素而变化，包括施用的频率；个体的大小和耐受性；病症的严重性；副作用的风险；和施用途径。本领域技术人员将认识到剂量可以根据上述因素或根据治疗进展来修改。术语“剂型”是指药物的特定形式，并且取决于施用途径。例如，剂型可以是液体，例如用于输注的盐水溶液。
如本文所用，“施用”是指对受试者进行静脉内、腹膜内、肌内、病灶内或皮下施用、鞘内施用，或滴注到手术形成的袋或手术放置的导管或装置中。
如本文所用，术语“受试者”包括人受试者。
如本文所用，术语“疗法”、“治疗”和“改善”是指由与血液蛋白的缺乏、功能缺乏或功能障碍相关的病症引起的症状严重性的任何降低。如本文所用，术语“治疗”和“预防”不是绝对术语。治疗可以指任何发作延迟、症状改善、患者生存改善、生存时间或生存率增加，例如，(i)减缓、停止或逆转一种或多种症状的进展，(ii)减缓、停止或逆转此类症状背后的疾病的进展，(iii)减少或消除症状复发的可能性，和/或(iv)减缓止血障碍的进展，降低或消除止血障碍。可将治疗效果与未接受该治疗的个体或个体集合进行比较。
如本文所用，术语“预防”是指由与血液蛋白质功能缺乏或功能障碍相关联的病症引起的症状的可能性减小或频率的降低。
如本文所用，“分离的”FVIII是纯度为至少约90％的人FVIII(即，不包含超过10％的蛋白质杂质)。优选地，分离的人FVIII的纯度为至少约95％、98％、99％或至少约99.5％。
在一个示例性实施方案中，通过本发明的方法生产的FVIII至少与在用于制备施用给人的该蛋白质的公认工业方法中获得的一样纯。
在各个实施方案中，本发明提供了分离的FVIII，其通过本发明的方法分离。
如本文所用，术语“约”表示特定值加或减10％的近似范围。例如，语言“约20％”涵盖18％至22％的范围。如本文所用，约也包括精确量。因此，“约20％”表示“约20％”，也表示“20％”。如本文所用，“约”是指等于特定值或特定值加或减至多约10％的范围。
本说明书和权利要求中，词语“包含(comprise)”或变型如“包含(comprises)”或“包含(comprising)”将被理解成意指包括所述的整数或整数的组，但不排除任何其他整数或整数的组。
III.实施方案
现在将详细介绍本公开的示例性实施方案的实现方式。本领域的普通技术人员将会理解，以下详细描述仅是说明性的，并不旨在以任何方式进行限制。受益于本公开的此类技术人员将容易地想到本公开的其他实施方案。
为了清楚起见，并未显示和描述本文所述实现方式的所有常规特征。应当理解，在任何此类实际实现方式的开发中，为了实现开发人员的特定目标，诸如符合应用和商业相关的约束，做出了许多特定于实施的决策，并且这些特定目标在不同的实现方式之间和不同的开发人员之间会有所不同。此外，应理解，此类开发努力可能是复杂的且耗时的，但是仍将是受益于本公开的本领域一般技术人员的常规工程任务。
在不脱离示例性实施方案的精神和范围的情况下，可对本公开中阐述的示例性实施方案进行许多修改和变动，这对本领域技术人员来说是显而易见的。本文所述的具体示例性实施方案仅作为示例提供，并且本公开仅受所附权利要求的条款以及此类权利要求所享有的等同物的全部范围限制。
A.方法
在一个示例性实施方案中，本发明提供了一种将包含凝血因子和纤维蛋白原的血浆冷沉淀分离成包含凝血因子的第一级分和包含纤维蛋白原的第二级分的方法，该方法包括：(a)使血浆冷沉淀与固体SiO2接触，从而将纤维蛋白原吸附到固体SiO2上；以及(b)将吸附到固体SiO2上的纤维蛋白原与血液因子分离，从而形成第一级分和第二级分。
示例性实施方案还包括在(a)之前的(c)：将冷沉淀悬浮在水中，形成冷沉淀悬浮液。悬浮液是本文所述方法的示例性“起始组合物”。
冷沉淀或FVIII的其他来源和水以任何有用的比率组合，例如，在冷沉淀悬浮液中，冷沉淀:水比率为约1:2至约1:7，例如约1.3至约1:6。在各个实施方案中，冷沉淀悬浮液中的冷沉淀:水比率为约1:3.5至约1:5。
在各个实施方案中，在冷沉淀悬浮液中包含盐是有利的。示例性的盐是二价金属离子盐。在示例性实施方案中，盐包括二价阳离子，例如CaCl2。盐以任何有用的量存在。在二价金属盐为CaCl2的示例性实施方案中，CaCl2在冷沉淀悬浮液中以约40μM至约70mM，例如约100μM至约60mM，例如250μM至约50mM存在。
与冷沉淀悬浮液混合的二氧化硅可以是任何可用于从冷沉淀悬浮液中去除纤维蛋白原、降低冷沉淀悬浮液中该蛋白质浓度的目的的二氧化硅。在各个实施方案中，SiO2是气相SiO2，例如气相SiO2是亲水性胶体SiO2。在示例性实施方案中，SiO2是Aerosil产品，例如
380或类似的吸附材料。
在本文提供的方法的某些实施方案中，相对于起始血浆或冷沉淀中纤维蛋白原的量，FVIII制备物中纤维蛋白原的量减少至少约10％。在另一个实施方案中，纤维蛋白原的量从起始血浆或冷沉淀中减少至少约25％。在另一个实施方案中，纤维蛋白原的量比起始血浆或冷沉淀中存在的量减少至少约50％，或至少约60％。在另一个实施方案中，纤维蛋白原的量减少至少75％。在另一个实施方案中，纤维蛋白原的量减少至少90％。在其他实施方案中，纤维蛋白原的量减少至少5％、或至少10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或减少至低于测试系统检测极限的水平。
在示例性实施方案中，在用二氧化硅处理之后，与起始血浆或起始冷沉淀相比，中间组合物中纤维蛋白原的量减少约60％。
在示例性实施方案中，相对于起始血浆或冷沉淀的纤维蛋白原含量，纯化循环结束时最终组合物中纤维蛋白原的量减少至少约99％或低于检测极限。
固体SiO2与冷沉淀以任何有用的比率和量混合。通常，本文所述方法所需的细碎二氧化硅(SiO2)的量将根据若干因素而变化，包括但不限于，起始组合物中存在的蛋白质总量、组合物中FVIII的浓度、起始组合物中纤维蛋白原的量以及溶液条件(例如pH、电导率等)。例如，可将SiO2以约0.01g/g蛋白质和约10g/g蛋白质之间的浓度添加到起始组合物中。在另一个实施方案中，可将SiO2以约1g/g蛋白质和约5g/g蛋白质之间的浓度添加到起始组合物中。在另一个实施方案中，可将SiO2以约2g/g蛋白质和约4g/g蛋白质之间的浓度添加到起始组合物中。在一个实施方案中，以每克总蛋白至少约1g的终浓度添加SiO2。在一个实施方案中，以每克总蛋白至少约2g的浓度添加气相二氧化硅。在一个具体实施方案中，以每克总蛋白至少约2.5g的浓度添加气相二氧化硅。在各个实施方案中，可将SiO2以约0.01g/g蛋白质和约5g/g蛋白质之间的浓度添加到目标组合物中。在一个示例性实施方案中，可将SiO2以约0.02g/g蛋白质和约4g/g蛋白质之间的浓度添加到目标组合物中。在一个实施方案中，以每克总蛋白至少0.1g的终浓度添加SiO2。在另一个具体实施方案中，以每克总蛋白至少0.2g的浓度添加气相二氧化硅。在另一个具体实施方案中，以每克总蛋白至少0.25g的浓度添加气相二氧化硅。在其他具体实施方案中，以至少约0.01g/g总蛋白质或至少0.02g、0.03g、0.04g、0.05g、0.06g、0.07g、0.08g、0.09g、0.1g、0.2g、0.3g、0.4g、0.5g、0.6g、0.7g、0.8g、0.9g、1.0g、1.5g、2.0g、2.5g、3.0g、3.5g、4.0g、4.5g、5.0g、5.5g、6.0g、6.5g、7.0g、7.5g、8.0g、8.5g、9.0g、9.5g或至少约10.0g或更多g/g总蛋白质的浓度添加细碎二氧化硅。
在各个实施方案中，SiO2以每千克冷沉淀悬浮液约5g至约30gSiO2存在于悬浮液中。在示例性实施方案中，SiO2以每千克悬浮液约10g至约20g SiO2存在于悬浮液中。
在本发明的某些实施方案中，将另外的固体材料例如助滤剂与冷沉淀悬浮液组合。
在某些实施方案中，助滤剂，例如Celpure C300(Celpure)或Hyflo-Super-Cel(World Minerals)，用于促进过滤。助滤剂可以约0.01kg/kg起始组合物至约1.0kg/kg起始组合物，或约0.02kg/kg起始组合物至约0.8kg/kg起始组合物，或约0.03kg/kg起始组合物至约0.7kg/kg起始组合物的终浓度添加。在其他实施方案中，助滤剂可以约0.01kg/kg起始组合物至约0.07kg/kg起始组合物，或约0.02kg/kg起始组合物至约0.06kg/kg起始组合物，或约0.03kg/kg沉淀至约0.05kg/kg起始组合物的终浓度添加。在某些实施方案中，助滤剂将以约0.01kg/kg起始组合物或约0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1.0kg/kg起始组合物的终浓度添加。
在示例性实施方案中，助滤剂以每千克冷沉淀悬浮液约2g至约10g助滤剂存在于冷沉淀悬浮液中。在各个实施方案中，助滤剂以每千克冷沉淀悬浮液4g至约8g存在于冷沉淀悬浮液中。在示例性实施方案中，助滤剂以每千克冷沉淀悬浮液约5g至约6.5g，例如约5.2g至约6g/kg，例如约5.4g至约5.8g/kg冷沉淀悬浮液存在于冷沉淀悬浮液中。
在一些实施方案中，助滤剂在二氧化硅处理之后、二氧化硅处理之前或与二氧化硅处理同时添加以促进后续过滤。
一般来讲，方法期间形成的各种悬浮液，例如冷沉淀悬浮液，在方法过程中被搅拌至均匀。
在允许纤维蛋白原吸附到SiO2上的条件下混合固体SiO2和起始组合物，例如冷沉淀悬浮液(或级分II+III悬浮液)。在各个实施方案中，起始组合物/SiO2悬浮液的温度为约15℃至约37℃，例如约20℃至约32℃。
在将起始组合物与二氧化硅和助滤剂中的一者或两者混合的步骤之后，该方法还包括(d)使冷沉淀悬浮液通过过滤装置，从而形成滤饼和滤液。
一般来讲，可使用适用于从冷沉淀悬浮液的混合物中分离基本上所有的二氧化硅吸附的纤维蛋白原的任何过滤装置。在一个示例性实施方案中，过滤装置是网筛。示例性网筛具有直径为约100μm至约400μm的孔。在示例性实施方案中，网筛具有大于约100μm的孔。
过滤方法任选地为切向的、死端的或任何其他有用的过滤方法。设计适合实现本发明过滤步骤的目标的过滤装置和方法在本领域技术人员的能力范围内。
在过滤期间，未吸附到二氧化硅上或未以其他方式与二氧化硅结合的FVIII被收集在第一滤液中。过滤后，将滤饼任选地用液体洗涤，例如一种或多种盐的水溶液。在各个实施方案中，收集该洗涤液从滤饼中回收FVIII级分。在一个示例性实施方案中，相对于夹带在滤饼中的FVIII的量，该级分中回收的FVIII的量基本上是定量的。在一个实施方案中，将含FVIII的洗涤液与溶液中的FVIII组合(未吸附到二氧化硅上或未以其他方式与二氧化硅结合)以形成本体滤液(图1、图2)。示例性液体是含有至少一种金属离子盐例如单电荷金属离子的水性液体。在一个示例性实施方案中，金属离子盐是NaCl。
在一个示例性实施方案中，液体是盐水溶液，例如NaCl水溶液。在一个示例性实施方案中，NaCl以约0.1M至约0.2M，例如约0.13M至约0.16M，例如约0.14M至约0.15M存在。在一个示例性实施方案中，NaCl浓度为约0.145M。发明人发现，洗涤液的离子含量与产品回收率有关—如果离子浓度太高，杂质就会从二氧化硅中浸出，如果离子浓度太低，可回收的FVIII仍然吸附在二氧化硅上。
在各个实施方案中，本发明不使用离心来将吸附到固体SiO2上的纤维蛋白原与血液因子分离，形成第一级分和第二级分。在某些实施方案中，可能有利的是利用离心来改进吸附到固体SiO2上的纤维蛋白原与血液因子的分离，从而形成第一级分和第二级分。
在某些条件下，本体滤液或其组分中的一者，例如第一滤液，包括颗粒物，例如聚集体。通过过滤本体沉淀减少或消除这种颗粒物。示例性的过滤涉及，(e)通过0.2μm过滤器过滤第一滤液，形成收集的FVIII级分和吸附纤维蛋白原的滤饼。
本体滤液或步骤(e)的滤液产物的特征可通过添加盐或其他添加剂来调节。在一个示例性实施方案中，添加金属离子盐。在一个实施方案中，金属离子盐是单电荷金属离子例如Na+的盐，例如NaCl。
在示例性实施方案中，本体滤液或步骤(e)的滤液产物的添加剂以约100mM至约200mM的量存在。在一个示例性实施方案中，添加剂是该量的金属离子盐，例如NaCl。出于示例的目的，添加剂的量为约150mM。
在一个示例性实施方案中，在步骤(e)之前，该方法包括在(e)之前的(g)：将氯化钙添加到第一滤液中至终浓度为约0.045M至约0.055M。在一个示例性实施方案中，将氯化钙添加到第一滤液中至终浓度为约0.050M。
在一个示例性实施方案中，CaCl2是从储备CaCl2溶液例如5MCaCl2溶液中添加的。
在一个示例性实施方案中，对澄清的本体溶液进行均匀溶剂/清洁剂混合物以用于减少病毒。示例性的溶剂/清洁剂混合物是辛苯聚醇和磷酸三(正丁基)酯。在一个示例性实施方案中，溶剂/清洁剂的浓度是管理药品上市许可的国家机构(例如，FDA)所要求的浓度。示例性溶剂/清洁剂混合物包括1.0％±0.1％(v/v)辛苯聚醇和0.3％±0.03％(v/v)磷酸三(正丁基)酯。
在各个实施方案中，该方法还包括使上述病毒减少混合物通过聚集体去除过滤器，形成第二滤液。
在一个示例性实施方案中，该方法包括(k)，将第二滤液加载到用平衡缓冲液预平衡的色谱柱中的亲和色谱填料上，所述亲和色谱填料包含具有特异性结合凝血因子的单克隆抗体的固体支撑物，从而将凝血因子固定在亲和色谱填料上。该步骤之后是(l)，用洗涤缓冲液洗涤亲和色谱填料，去除未结合或与亲和色谱填料弱结合的物质。为了收集纯化的血液因子，该方法包括(m)，用洗脱缓冲液从亲和色谱填料中洗脱凝血因子，并收集含有凝血因子的洗脱缓冲液的至少一个级分。参见，例如，美国专利号5,470,954。
在各个实施方案中，本发明的方法是血液因子的大规模富集和血液因子与纤维蛋白原的分离。
在各个实施方案中，本发明还包括从滤饼中回收纤维蛋白原的步骤。示例性方法包括用合适的洗脱剂从滤饼上洗脱纤维蛋白原并收集如此洗脱的纤维蛋白原。
在示例性实施方案中，根据本文所述，凝血因子是FVIII。
图1示出了用于执行本发明的示例性方法的示例性设备。冷沉淀悬浮液被容纳在SiO2例如Aerosil处理罐中，该处理罐与加盐罐流体连通。在用二氧化硅处理冷沉淀悬浮液之后，将所得的悬浮液经由过滤装置转移至第二个罐，即加盐罐。在加盐罐中，将钠浓度调节至约0.8M，将钙浓度调节至约0.05M。任选地将所得的悬浮液从加盐罐经由澄清过滤装置转移至溶剂/清洁剂罐，并在此处进行病毒减少步骤。示例性的病毒减少步骤包括与磷酸三(正丁基)酯(例如，约1％)和辛苯聚醇9(例如，约0.3％)形成溶液。该过程可在此处完成或可在具有任选的预过滤装置的设备中继续，以在将溶液从溶剂/清洁剂处理罐加载到包含与FVIII特异性结合的固定化MAb的亲和柱上之前去除颗粒。如本领域技术人员所理解的，在该过程期间在设备中产生的溶液和悬浮液通过一个或多个泵例如蠕动泵方便地从一个阶段转移至另一个阶段。
本发明方法的示例性方法方案示于图2中。示例性的已知方法在图2中阐述。将血浆冷沉淀糊以1(kg):3.5(L)的冷沉淀糊:水比率悬浮于注射用水中，形成样品A。用CaCl2将样品A的Ca2+浓度调节至0.04M，并将二氧化硅和助滤剂添加到混合物中，在25℃下将其搅拌约30分钟，然后过滤，产生本体滤液，将其pH值调节至7.2至7.6，形成样品B。将样品B进行加盐和澄清，使用NaCl，将样品B的Na+含量调节至0.8M，并使用CaCl2，将样品B的Ca2+浓度调节至0.05M；通过过滤去除任何聚集体，得到澄清的本体，对该溶液使用溶剂/清洁剂处理进行病毒减少步骤。将溶剂(磷酸三(正丁基)酯)和清洁剂(辛苯聚醇9)添加到澄清的本体中，终浓度分别为1.0％(v/v)和0.3％(v/v)，形成样品C。该过程可在此处完成，或者在一些实施方案中，将样品C加载到特异性结合FVIII的MAb柱上，并通过亲和色谱法进行纯化。
B.组合物
在一个示例性实施方案中，本发明提供了一种凝血因子，例如，根据本文所述方法制备的FVIII制备物。示例性的凝血因子制备物被配制为药物制剂，其中因子与药学上可接受的载体组合。示例性的制备物和/或制剂是病原体灭活的，例如通过溶剂/清洁剂处理。药物制剂通常适用于输注到需要此类输注的受试者体内。示例性的制剂被制成单位剂量制剂并包括治疗有效量的因子。本发明还提供了通过本发明方法生产的因子的稳定药物制剂。
在一个示例性实施方案中，该制备物和/或制剂的特征在于一个或多个参数，这些参数基本上与通过不同于本文所述方法的方法生产的因子的制备物和/或制剂相同。在一个示例性实施方案中，制备物和/或制剂是已获得一个或多个监管机构(例如，FDA、EMA等)的上市许可的药物产品或产品的前体。
示例性的因子为FVIII。美国专利号5,763,401(EP 818 204)描述了不含白蛋白的治疗性FVIII制剂，其包含15mM至60mM的蔗糖、高达50mM的NaCl、高达5mM的氯化钙、65mM至400mM的甘氨酸和高达50mM的组氨酸。
Osterberg(转让给Pharmacia&Upjohn)的美国专利号5,733,873(EP 627 924)公开了包含0.01mg/ml至1mg/ml表面活性剂的制剂。还描述了其他制剂。美国专利号4,877,608(EP 315 968)、美国专利号5,605,884(EP 0 314 095)教导了具有相对高浓度氯化钠的制剂的用途，WO 2010/054238、EP 1 712 223、WO 2000/48635、WO 96/30041、WO 96/22107、WO 2011/027152、EP 2 361 613、EP 0 410 207、EP 0 511 234、美国专利号5,565,427、EP0 638 091、EP 0871 476、EP 0 819 010、美国专利号5,874,408、US 2005/0256038、US2008/0064856、WO 2005/058283、WO 2012/037530、WO 2014/026954和US 2017/0252412。本发明的FVIII制备物可掺入这些或其他参考文献中公开的制剂中。
C.治疗方法
在各个实施方案中，本发明提供了一种治疗与止血功能障碍相关联的疾病的方法。示例性的治疗在不受控制的出血事件期间施用。本发明通过参考FVIII以举例的方式描述，但不限于此。
在一个示例性实施方案中，向需要治疗(或预防)的受试者施用约30IU/kg至50IU/kg剂量的通过本公开的方法生产的FVIII。
治疗本文所述病症的方法中涉及的剂量方案将由主治医师考虑会改变药物作用的各种因素来确定，例如患者的年龄、状况、体重、性别和饮食、任何感染的严重程度、施用时间和其他临床因素。在一个方面，本公开的制剂通过初始推注随后连续输注进行施用，以维持药物产品的治疗循环水平。作为另一个示例，本发明的化合物以一次剂量施用。本领域的普通技术人员将容易地优化有效剂量和施用方案，如根据良好医疗实践和个体患者的临床状况来确定。用药频率取决于剂的药代动力学参数和施用途径。最佳药物制剂由本领域技术人员根据施用途径和所需剂量来确定。参见例如REMINGTON'S PHARMACEUT ICAL SCIENCES，第18版。(1990,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.18042)第1435至1712页，其公开内容以引用方式并入本文。此类制剂影响所施用剂的物理状态、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。根据施用途径，依照体重、体表面积或器官大小计算合适的剂量。可通过使用用于测定血液水平剂量的已确立测定结合适当的剂量-反应数据来确定适当的剂量。最终剂量方案由主治医师考虑会改变药物作用的各种因素来确定，所述因素例如药物的比活性、患者的损伤严重程度和反应性、患者的年龄、状况、体重、性别和饮食、任何感染的严重程度、施用时间和其他临床因素。在进行研究时，将出现关于针对各种疾病和病症的适当剂量水平和治疗持续时间的另外信息。
提供以下实施例来说明本发明的示例性实施方案，并且不限定或限制其范围。
实施例
实施例1
将冷冻的冷沉淀悬浮在20℃至32℃的水中，冷沉淀与水的比率为1:3.5至1:5。添加氯化钙至浓度为40μm。添加每千克悬浮液10g至20g亲水性胶体氧化硅(诸如
380)和每千克悬浮液4g至8g助滤剂(诸如/>
C300)并混合，直至完全均质化。使用孔径为100μm至400μm的网筛过滤均质化悬浮液。在过滤结束时，用盐水溶液对滤饼进行后洗涤，以使回收率最大化。将氯化钠和氯化钙添加到滤液中，使终浓度分别为0.8M和0.05M，然后通过澄清0.2μm过滤器过滤溶液。
上述过程的产物的进一步纯化如下进行。制备均匀的溶剂/清洁剂混合物并将其缓慢添加到溶液中，同时混合。获得混合物中1.0％±0.1％(v/v)辛苯聚醇9和0.3％±0.03％(v/v)磷酸三(正丁基)酯的终浓度。之后，在加载到已用MAb平衡缓冲液平衡的MAb柱之前，通过聚集体去除过滤器过滤悬浮液。之后，用MAb洗涤缓冲液洗涤MAb柱，然后用MAb洗脱缓冲液从柱上洗脱因子VIII。
实施例2
将从人血浆中获得的冷冻冷沉淀悬浮于24±1℃的Mili-Q水中，冷沉淀(Kg)与Mili-Q水(L)的比率为1:3.5。添加足够的氯化钙以获得40μm的最小钙浓度。将17.5g亲水性胶体氧化硅
380和8g助滤剂/>
C300添加到每千克悬浮液中，并在室温下以400rpm混合30分钟。
使用孔径为150μm至250μm的不锈钢网筛作为支撑物过滤均质化悬浮液，然后用盐水溶液洗涤形成的滤饼。将氯化钠和氯化钙添加到滤液中，使终浓度分别为0.8M和0.05M，然后通过澄清0.2μm过滤器过滤溶液。
制备辛苯聚醇9和磷酸三(正丁基)酯的均匀溶剂/清洁剂混合物并将其缓慢添加到溶液中，同时混合。计算添加到蛋白质溶液中的溶剂/清洁剂混合物的量，以获得混合物中1.0％±0.1％(v/v)辛苯聚醇9和0.3％±0.03％(v/v)磷酸三(正丁基)酯的终浓度。将冷沉淀-清洁剂溶液彻底混合60分钟，以确保均匀性和病毒灭活。之后，在加载到已用MAb平衡缓冲液平衡的MAb柱上之前，通过聚集体去除过滤器过滤悬浮液。之后，用最少40个柱体积的MAb洗涤缓冲液洗涤MAb柱，然后用MAb洗脱缓冲液从柱上洗脱因子VIII。
本文使用的术语仅用于描述特定实现方式的目的，并不旨在限制权利要求。如在实现方式和所附权利要求的描述中所使用，单数形式“一个/种”和“该/所述”旨在也包括复数形式，除非上下文清楚地另有说明。已经参考各个示例性实施方案和实施例对本发明进行了说明。正如对本领域技术人员显而易见的，在不偏离本发明的精神和范围的情况下，本发明的其他实施方案和变型可由本领域其他技术人员设计。所附权利要求应被理解为包括所有此类实施方案和等效变型。
本文引用的每个专利、专利申请和公布通过引用整体并入本文。
Claims (38)
1.一种将包含凝血因子和纤维蛋白原的血浆冷沉淀分离成包含凝血因子分离物的第一级分和包含所述纤维蛋白原的第二级分的方法，所述方法包括：
(a)使所述血浆冷沉淀与固体SiO2接触，从而将所述纤维蛋白原吸附到固体SiO2上；以及
(b)将吸附到所述固体SiO2上的所述纤维蛋白原与血液因子分离，从而形成所述第一级分和所述第二级分。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述SiO2为气相SiO2。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述气相SiO2为亲水性胶体SiO2。
4.根据权利要求1所述的方法，其还包括在(a)之前的(c)：将所述冷沉淀悬浮在水中，形成冷沉淀悬浮液。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述水为约15℃至约37℃。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述水为约20℃至约32℃。
7.根据权利要求4所述的方法，其中在所述冷沉淀悬浮液中，所述冷沉淀与水的比率为约1:2至约1:7。
8.根据权利要求7所述的方法，其中在所述冷沉淀悬浮液中，所述冷沉淀与水的比率为约1:3.5至约1:5。
9.根据权利要求4所述的方法，其中所述冷沉淀悬浮液还包含CaCl2。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述CaCl2以约40μM至约50mM存在于所述冷沉淀悬浮液中。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述CaCl2以约0.045M至约0.055M存在于所述冷沉淀悬浮液中。
12.根据权利要求4所述的方法，其中所述SiO2以每千克悬浮液约5g至约30g SiO2存在于所述悬浮液中。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述SiO2以每千克悬浮液约10g至约20g SiO2存在于所述悬浮液中。
14.根据权利要求4所述的方法，其中所述冷沉淀悬浮液还包含每千克冷沉淀悬浮液约2g至约10g助滤剂。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述助滤剂以每千克冷沉淀悬浮液约4g至约8g存在于所述冷沉淀悬浮液中。
16.根据权利要求4所述的方法，其中将所述冷沉淀悬浮液混合至均匀。
17.根据权利要求16所述的方法，其还包括(d)使所述冷沉淀悬浮液通过过滤装置，从而形成滤饼和滤液。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述过滤装置为网筛。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述网筛具有直径为约100μm至约400μm的孔。
20.根据权利要求17所述的方法，其还包括在(d)之后的(e)：用洗涤水溶液洗涤所述滤饼。
21.根据权利要求18所述的方法，其中所述洗涤水溶液是氯化钠溶液。
22.根据权利要求21所述的方法，其还包括(e)通过0.2μm过滤器过滤所述滤液，形成第一滤液。
23.根据权利要求20所述的方法，其还包括在(e)之前的(f)：将氯化钠添加到所述第一滤液中。
24.根据权利要求23所述的方法，其中将所述氯化钠添加到所述第一滤液中至终浓度为约100mM至约200mM。
25.根据权利要求22所述的方法，其中将所述氯化钠添加到所述第一滤液中至终浓度为约150mM。
26.根据权利要求22所述的方法，其还包括在(e)之前的(g)：将氯化钙添加到所述第一滤液中至终浓度为约0.45M至约0.55M。
27.根据权利要求23所述的方法，其中将所述氯化钙添加到所述第一滤液中至终浓度为约0.050M。
28.根据权利要求23所述的方法，其还包括在(e)之前的(h)：将氯化钙添加到所述第一滤液中。
29.根据权利要求1所述的方法，其还包括(i)使(e)的所述第一滤液与均匀的溶剂/清洁剂混合物接触，形成第一滤液悬浮液。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述均匀的溶剂/清洁剂混合物是辛苯聚醇和磷酸三(正丁基)酯。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述均匀的溶剂/清洁剂混合物是1.0％±0.1％(v/v)辛苯聚醇和0.3％±0.03％(v/v)磷酸三(正丁基)酯。
32.根据权利要求29所述的方法，其还包括(j)通过聚集体去除过滤器过滤所述第一滤液悬浮液，形成第二滤液。
33.根据权利要求1所述的方法，其中所述凝血是因子VIII。
34.根据权利要求1所述的方法，其中不使用离心来将吸附到所述固体SiO2或Al(OH)3上的所述纤维蛋白原与所述血液因子分离，形成所述第一级分和所述第二级分。
35.根据权利要求1所述的方法，其中使用离心来将吸附到所述固体SiO2上的所述纤维蛋白原与所述血液因子分离，形成所述第一级分和所述第二级分。
36.一种凝血因子分离物，其通过根据权利要求1所述的方法制备。
37.通过根据权利要求1所述的方法制备的所述凝血因子分离物，其中所述凝血因子分离物包含比所述血浆冷沉淀更少的纤维蛋白原。
38.通过根据权利要求1所述的方法制备的所述凝血因子分离物，其中所述凝血因子是FVIII。
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