ES2221957T3 - Metodo para la eliminacion cromatografica de priones. - Google Patents
Metodo para la eliminacion cromatografica de priones.Info
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Abstract
ESTA INVENCION SE REFIERE A UN PROCEDIMIENTO PARA LA EXTRACCION DE UN PRION DE UNA SOLUCION QUE COMPRENDE EL PRION Y, POR LO MENOS, UNA BIOMOLECULA ADICIONAL, Y QUE COMPRENDE EL CONTROL DE LA SOLUCION A TRAVES DE UNA COLUMNA CROMATOGRAFICA MEDIANTE INTERCAMBIO DE ANIONES EN UNAS CONDICIONES QUE PROVOCAN UNA ELUCION DE GRADIENTE, ESTANDO EL PRION SEPARADO DE, POR LO MENOS, UNA DE LAS BIOMOLECULAS, LO QUE PROVOCA LA RECOGIDA DE DICHA BIOMOLECULA EN UNA FRACCION DE ELUCION, QUE ES DISTINTA DE LA FRACCION DE ELUCION QUE CONTIENE EL PRION. SEGUN UN MODO DE REALIZACION, EL GRADIENTE ES UN GRADIENTE DE PH, POR EJEMPLO, UN GRADIENTE DISCONTINUO. EL PRION PUEDE SER UN AGENTE PATOGENO DE LA ENCEFALOPATIA ESPONGIFORME, COMO POR EJEMPLO EL DE LA ENFERMEDAD DE CREUTZFELD - JACOB, DEL SINDROME GERSTMANN STRAUSSLER - SCHEINKEN, DEL TREMOR DEL CARNERO O DE LA ENCEFALOPATIA ESPONGIFORME BOVINA.
Description
Método para la eliminación cromatográfica de
priones.
Las encefalopatías espongiformes son enfermedades
de los mamíferos del sistema nervioso central que dan por resultado
una demencia presenil y normalmente son fatales. Entre éstas están
las enfermedades humanas de enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob, kuru y el síndrome de
Gerstmann-Straussler-Scheinken, la
enfermedad ovina escrapia, y la encefalopatía espongiforme bovina.
Aunque hay importantes indicios de que estas enfermedades están
provocadas por un agente común o un conjunto de agentes íntimamente
relacionados, la naturaleza de estos agentes está hoy en día
pobremente definida (Prusiner, Science
252:1515-1522 (1991)). Un grupo creciente de
indicios sugiere que una forma modificada de manera
post-traslacional resistente a la proteasa de una
proteína celular anfitriona juega un papel causal, pero no se sabe
si esta proteína alterada sola es el agente causal o si es un
componente necesario del agente causal. Esta proteína se ha llamado
proteína prión (referidas en adelante como "PrP"), y los
agentes infecciosos de las encefalopatías espongiformes se refieren
como priones.
Aunque no son infecciosos generalmente, hay
indicios de que bajo ciertas condiciones, al menos algunas
encefalopatías espongiformes pueden transmitirse de un animal a
otro, y en ciertos casos, pueden cruzar de unas especies a otras.
Por ejemplo, en los 70 se informó de una serie de casos de
enfermedad de Creutzfeldt-Jakob en individuos que
habían recibido tratamiento con la hormona humana del crecimiento
purificada a partir de glándulas de pituitaria juntas (Brown et
al., N. Eng. J. Med. 313:728-731 (1985)).
Se cree que la primera aparición de encefalopatía espongiforme
bovina resultó de la transmisión de la escrapia ovina al ganado por
medio de comida contaminada. Además, se ha desarrollado un modelo
de murino para la escrapia mediante inyección intracraneal de
tejido ovino contaminado en ratones.
La determinación de priones en el tejido u otros
productos biológicos normalmente depende de ensayos que miden la
infección de los ratones o hámsteres con extractos del material
biológico en cuestión. Como el periodo de incubación para estas
enfermedades puede ser un año o más, dichos estudios son largos y
caros de realizar.
La existencia general de la enfermedad
relacionada con un prión y la posibilidad de la transmisión entre
especies tiene graves implicaciones para la industria
biotecnológica, que obtiene muchos de sus productos a partir de
tejido de mamíferos (Di Martino Biologicals
21:61-66 (1993)). Las preocupaciones por la
seguridad de dichos productos han conducido a estudios en la
inactivación de priones. Estos estudios indican que los priones son
más resistentes frente a la inactivación que patógenos más
convencionales tales como virus o bacterias. Así, se requieren
condiciones relativamente severas para descontaminar los materiales
biológicos que contienen priones. Los únicos métodos conocidos
normalmente para desinfectar preparados biológicos que tienen muchos
priones se prolongan tratando en autoclave a 130ºC o por encima y
el tratamiento con disolución concentrada de hidróxido sódico. Se
han recomendado estos métodos para la inactivación rutinaria de
priones (Department of Health and Social Security Circular
84:16 (1989)). También se ha presentado que la ultrafiltración con
corte de 100 kD en combinación con el tratamiento con urea 6M, da
por resultado la descontaminación de los preparados que contienen
priones (Pocchiari et al., Arch. Virol.
98:131-135 (1988)). Otros métodos capaces de
disminuir la actividad de los priones incluye el tratamiento con
disolventes orgánicos, detergentes, agentes desnaturalizantes de
proteínas, sales caotrópicas y fenol (Millson et al., en
Pruniser y Hadlow, editores. Slow Transmissible Diseases of the
Nervous System, volumen II. Nueva York: Academic Press
409-424 (1979); Pruniser et al., PNAS
78:4606-4610 (1981); Kimberlin et al.,
J.Neurol. Sci. 59:390-392 (1983); Walker
et al., Am. J. Public Health
73:661-665 (1983); Brown et al., J.
Infect. Dis. 153:1145-1148
(1986)).
(1986)).
Las condiciones extremas requeridas para eliminar
la capacidad de infección del prión son típicamente incompatibles
con los métodos pensados para preservar las biomoléculas que tienen
actividad útil, dando por resultado la desnaturalización de muchas
biomoléculas y de este modo, destruyendo esencialmente su
actividad. Hay, así, una necesidad de un método para separar los
priones de los materiales biológicos o inactivar los priones en
condiciones que no comprometan la actividad de las biomoléculas
deseables.
El documento
EP-A-0313343 describe un método para
purificar la proteína. Una técnica de cromatografía de intercambio
iónico para purificar proteínas en bruto que contienen impurezas
íntimamente relacionadas; en la que se determinan los puntos
isoeléctricos de la proteína deseada y las impurezas. Se describe la
aplicación de la técnica a la purificación GM-CSF
usando una resina de intercambio iónico.
Protein Science (1992) 1,
1343-1352 (PAN et al.) trata la purificación
y propiedades de la proteína celular prión procedente del Cerebro de
Hámster Sirio. Las proteínas se purificaron a partir de una
fracción microsomal mediante extracción con detergente y se
separaron mediante cromatografía de afinidad con el ión CO^{2+}
inmovilizado y enriquecido para la cromatografía de intercambio de
cationes PrP^{c}-II y
SDS-PAGE.
J. Chromatography B, 680 (1996)
91-96 (Walker et al.), describe la partición
acuosa en dos fases de las alimentaciones del complejo de proteína
derivada de los homogeneizados de tejido cerebral.
El documento
WO-A-9605846 describe un método para
producir preparados farmacéuticos libres de infección y/o
comestibles a partir de material infeccioso, y en particular, de
material que contiene priones, utilizando una serie de membranas de
ultrafiltración.
El presente invento se refiere a un método para
separar un prión de una disolución que incluye el prión y al menos
una biomolécula adicional.
El método incluye la etapa de dirigir la
disolución a través de una columna de cromatografía de intercambio
aniónico en condiciones que provocan un gradiente de elución, por
lo cual se separa el prión de al menos una de las biomoléculas,
provocando así que dicha biomolécula se recoja en una fracción
eluida que es distinta de una fracción eluida que incluye el
prión.
En una realización, la proteína se deriva de un
mamífero tal como un ser humano o un animal bovino, porcino, ovino
o murino.
En otra realización, el presente invento
proporciona un método para separar un prión de una disolución que
incluye el prión y hemoglobina. El método comprende la etapa de
dirigir la disolución a través de una columna de cromatografía de
intercambio aniónico en condiciones que provocan un gradiente de
elución. Esto separa el prión de la hemoglobina, con el prión
fluyendo en una fracción que es distinta de la fracción que incluye
la hemoglobina.
El método del invento puede realizarse en
condiciones suaves, sin el uso de calor, álcalis fuertes o agentes
oxidantes. Así, el presente invento permite la descontaminación de
disoluciones que incluyen priones en presencia de una variedad de
otras biomoléculas, sin afectar significativamente la actividad de
las otras biomoléculas.
Las características y otros detalles del método
del invento se describirán ahora más particularmente y se señalarán
en las reivindicaciones. Se entenderá que las realizaciones
particulares del invento se muestran como medio de ilustración, y
no como limitaciones del invento. Las características principales
del invento pueden emplearse en diversas realizaciones sin apartarse
del alcance del presente invento.
El presente invento se basa en el descubrimiento
de que cromatografiando una disolución de hemoglobina bovina
tratada con priones en una columna de intercambio aniónico elimina
un nivel sorprendentemente alto de capacidad de infección de
priones de la fracción de hemoglobina eluida. El método del
presente invento para separar un prión de una disolución que
comprende un prión y al menos otra biomolécula comprende dirigir la
disolución a través de una columna de cromatografía de intercambio
aniónico en condiciones que provocan una elución por gradiente de
pH. El prión se separa así de al menos una de las biomoléculas,
esto es, al menos una de las biomoléculas eluidas de la columna en
una fracción que es distinta de la fracción que incluye el
prión.
Para los propósitos del presente invento, el
término "prión" se refiere a una proteína que es un agente
causal de una enfermedad del sistema nervioso central. El término
"agente causal" se entiende que se refiere a un agente que o
bien provoca la enfermedad en cuestión, o es un componente necesario
de un sistema productor de la enfermedad. Las enfermedades
asociadas a priones incluyen las diversas encefalopatías
espongiformes, tales como las enfermedades humanas de enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob, kuru, y síndrome de
Gerstmann-traussler-Scheinken, la
enfermedad ovina escrapia, la encefalopatía espongiforme bovina y
la encefalopatía transmisible de visón. El prión puede ser, por
ejemplo, una proteína, tal como una proteína PrP modificada
post-translacionalmente, o puede ser una proteína
complejada con una molécula informativa, tal como un
polinucleótido, por ejemplo, un
polidesoxi-ribonucleótido complejado con una
proteína PrP modificada
post-translacionalmente.
Para los propósitos del presente invento, el
término "biomolécula" se refiere a cualquier molécula de
origen biológico, incluyendo proteínas, tales como enzimas,
anticuerpos, proteínas estructurales y proteínas de transporte,
polipéptidos, hormonas, tales como hormonas de crecimiento, insulina
y hormonas esteroidales, polinucleótidos, azúcares y lípidos. Para
los propósitos del presente invento, las biomoléculas preferidas
son las proteínas, polipéptidos y polinucleótidos que tienen
utilidad realizada o potencial.
Los gradientes de pH adecuados que pueden
emplearse para eluir la columna de cromatografía de intercambio
aniónico incluyen, por ejemplo, un gradiente de pH continuo, en el
que el pH del eluyente se cambia continuamente como una función del
tiempo. Un ejemplo de un gradiente continuo de pH es un gradiente de
pH lineal, en el que el cambio en el pH es una función lineal del
tiempo. Un gradiente continuo de pH puede estabilizarse utilizando
dos o más tampones de diferentes pH que se mezclan juntos para
formar el eluyente. La relación de los tampones dentro del
eluyente, y, así, el pH del eluyente, pueden así variarse
continuamente como una función del tiempo. El control del
procedimiento de mezcla de los tampones se controla típicamente
mediante un controlador de flujo, que está programado para producir
el gradiente deseado de pH.
En otra realización, el gradiente de pH puede ser
un gradiente de pH escalonado, en el que el cambio en el pH es
discontinuo respecto al tiempo, formando una o más etapas, o puntos
en el tiempo en el que el pH sufre un cambio brusco. Esto puede
lograrse fácilmente reemplazando como eluyente un primer tampón con
un segundo tampón de pH diferente. En una realización preferida del
método, el gradiente empleado es un gradiente de pH escalonado.
En un método para realizar una elución con
gradiente de pH escalonado, cada uno de una serie de tampones que
tienen diferentes valores de pH se dirige secuencialmente en la
columna cromatográfica. Se prefiere que los tampones estén
filtrados, tal como a través de una membrana de despirogenización de
10.000 Dalton. Los tampones usados deberían ser tampones
monovalentes con una baja fuerza iónica, así que la elución de los
componentes de la disolución depende generalmente del pH y no
depende significativamente de la fuerza iónica. Típicamente, los
tampones con una fuerza iónica de aproximadamente 50 mM o menos
tienen una fuerza iónica adecuadamente baja.
Ejemplos de medios de intercambio aniónico que
son adecuados para el presente método incluyen sílice, alúmina,
titania, dextrano reticulado, agarosa o un polímero o copolímero
modificado, tal como una poliacrilamida, un
polihidroxietil-metacrilato o un estireno de
divinilbenceno, que se ha derivado con una funcionalidad catiónica,
tal como un grupo dietilaminoetilo o aminoetilo cuaternario.
En una realización preferida, el medio de
intercambio aniónico se basa en gel de sílice. Este medio está
formado por gel de sílice tratado hidrotérmicamente para aumentar
el tamaño de poro, y luego exponiendo el gel a
(\gamma-glicidoxipropil)trimetoxisilano
para formar grupos epóxido de superficie activa. La sílice derivado
se trata luego con una amina terciaria, tal como
HOCH_{2}CH_{2}N(CH_{3})_{2}, para formar
grupos amonio cuaternario de superficie.
La columna de cromatografía de intercambio
aniónico puede ser, por ejemplo, una columna de gravedad, es decir,
una columna a través de la que fluye la fase móvil bajo la fuerza
de gravedad. La fase móvil puede también puede estar sujeta a una
diferencia de presión entre la entrada y la salida de la columna,
tal como dirigiendo un fluido presurizado en la entrada de la
columna posterior a la carga de la muestra en la columna. En una
realización preferida, la columna de cromatografía de intercambio
aniónico es una columna de cromatografía líquida de alta
resolución.
En una realización, la disolución comprende un
prión y hemoglobina, tal como hemoglobina bovina. En esta
realización, el primer tampón transporta la disolución en el medio
en la columna cromatográfica y facilita el enlace de la hemoglobina
al medio. El segundo tampón ajusta luego el pH dentro del medio para
fluir los componentes que no son hemoglobina, tal como el prión. El
tercer tampón eluye después la hemoglobina que está sustancialmente
libre del prión. La primera y última parte del eluyente que
contiene hemoglobina, por ejemplo el primer 3% a 4% y el último 3%
a 4%, puede tirarse para proporcionar seguridad de la pureza de la
hemoglobina.
Preferiblemente, el primer tampón es una
disolución de tris-hidroximetilaminometano
(Tris)(concentración aproximadamente 20 mM, que tiene un pH en el
intervalo de entre aproximadamente 8,4 y aproximadamente 9,4). El
segundo tampón es una mezcla del primer tampón y el tercer tampón,
con el segundo tampón que tiene un pH en el intervalo de
aproximadamente 8,2 a aproximadamente 8,6. El tercer tampón es una
disolución de Tris (concentración aproximadamente 50 mM, que tiene
un pH en el intervalo de aproximadamente 6,5 y aproximadamente
7,5). El cuarto tampón es una disolución de NaCl/Tris
(concentraciones aproximadamente de NaCl 1,0M y aproximadamente de
Tris 20 mM; teniendo un pH en el intervalo de aproximadamente 8,4 y
aproximadamente 9,4, preferiblemente de aproximadamente 8,9 a
aproximadamente 9,1). Se prefiere particularmente que el pH del
segundo tampón esté entre aproximadamente 8,2 y 8,4.
Los tampones empleados están típicamente a una
temperatura en el intervalo de aproximadamente 0ºC a
aproximadamente 50ºC. Preferiblemente, la temperatura del tampón es
aproximadamente 12,4 \pm 1,0ºC durante el uso. Además, los
tampones se almacenan típicamente a una temperatura de
aproximadamente 9ºC a aproximadamente 11ºC.
En otra realización, el método comprende además
dirigir la disolución a través de una membrana de ultrafiltración.
Esta etapa puede realizarse antes o después de la etapa de
cromatografía de intercambio aniónico. En una realización
preferida, la disolución se dirige a presión a través de la membrana
de ultrafiltración, tal como una membrana de 100.000 Dalton, antes
de la cromatografía de intercambio aniónico. Ejemplos de membranas
de ultrafiltración que son adecuadas para este método incluyen
membranas de 100.00 Dalton disponibles por Millipore Corporation
(Bedford, MA, catálogo núm. CDUF 050 H1) y A/G Technology (Needham,
MA, modelo núm. UFP100E55).
En una realización, la disolución comprende un
prión que es un agente causal para la encefalopatía espongiforme
bovina y una segunda proteína bovina. La segunda proteína bovina
puede ser, por ejemplo, hemoglobina bovina, hormona bovina del
crecimiento, inmunoglobulina bovina, insulina bovina, albúmina de
suero bovina, aprotinina bovina, transferrina bovina, suero bovino,
trombina bovina o fibrinógeno bovino. En una realización preferida,
la segunda proteína bovina es hemoglobina bovina.
En otra realización, la disolución comprende un
prión que es un agente causal para una encefalopatía espongiforme,
tal como escrapia, enfermedad de Creutzfeldt-Jakob,
kuru, enfermedad de
Gerstmann-Straussler-Scheinken y una
o más biomoléculas adicionales derivadas del tejido humano o de
otro mamífero, tal como una proteína o una hormona. Ejemplos de
biomoléculas adicionales adecuadas incluyen hemoglobina, insulina,
hormona del crecimiento, gonadotropina, mielina, colágeno,
elastina, suero, albúmina de suero, lactalbúmina, anticuerpos y
antisuero, Factor VIII, Factor IX, protrombina y trombina,
eritropoyetina, activador plasminógeno de tejido, factor de
activación de plaquetas, proteasas, inhibidores de proteasa,
interferonas, interleuquinas y citoquinas.
El invento se describirá ahora adicional y
específicamente en los siguientes ejemplos.
Se preparó una disolución de hemoglobina bovina
según el método descrito en la Solicitud de Patente de EE.UU. núm.
08/473.497. Se recogieron muestras de sangre bovina completa, se
mezclaron con un anticoagulante de citrato sódico para formar una
disolución sanguínea citrada, y luego se analizaron para los
niveles de endotoxina. Las muestras de disolución sanguínea se
mantuvieron después de la recolección a una temperatura de
aproximadamente 2ºC y luego se colaron para separar los grandes
agregados y partículas con una rejilla que tenía aproximadamente
24000 aperturas por metro (rejilla de malla 600).
La disolución sanguínea citrada se pasó entonces
en serie a través de filtros de polipropileno de 800 \mum y 50
\mum para separar grandes escombros de disolución sanguínea.
Los glóbulos rojos se lavaron entonces para
separar las proteínas plasmáticas extracelulares, tales como BSA o
IgG, de los glóbulos rojos. Para lavar los glóbulos rojos, la
disolución sanguínea se situó en un tanque de diafiltración y luego
se diluyó con un volumen igual de una disolución isotónica que se
había filtrado a través de una membrana de ultrafiltración de 10 kD
(disponible comercialmente por Millipore Corporation, cat. Núm. CDUF
050 G1). La disolución isotónica estaba compuesta de 6,0 g/L de
dihidrato de citrato sódico y 8,0 g/L de cloruro sódico en agua
para inyección (WFI).
La disolución sanguínea diluida se concentró
entonces a su volumen original por diafiltración a través de un
diafiltro de fibra hueca de 0,2 \mum (cartucho de microfiltración
Microgon Krosflo II, Spectrum/Microgon, Laguna Hills, CA). Al mismo
tiempo, se añadió de manera continua una disolución isotónica
filtrada, como maquillador, a una velocidad igual a la velocidad de
pérdida de filtrado a través del diafiltro. Durante la
diafiltración, los componentes sanguíneos significativamente
menores que los glóbulos rojos o en disolución, tales como solutos
de plasma, pasaron a través de las paredes del diafiltro con el
filtrado. Los glóbulos rojos, plaquetas y cuerpos mayores de la
disolución sanguínea diluida, tales como glóbulos blancos, se
retuvieron con disolución isotónica añadida continuamente para
formar una disolución sanguínea dializada.
Durante el lavado de los glóbulos rojos, la
disolución sanguínea diluida se mantuvo a una temperatura de entre
aproximadamente 10ºC a 25ºC con una presión de fluido en la entrada
del diafiltro de entre 172369 Pa y 206873 Pa (aproximadamente 25
psi y aproximadamente 30 psi), para mejorar la eficacia del
procedimiento.
El lavado de glóbulos rojos se completó cuando el
volumen del diafiltrado se igualó aproximadamente al 600% del
volumen de disolución sanguínea antes de diluir con la disolución
isotónica.
La disolución sanguínea dializada se bombeó
después continuamente a una velocidad de aproximadamente 4 litros
por minuto a una Centrifugadora Super Sharples (Modelo núm.
AS-16, División Sharples de
Alfa-Laval Separation, Inc.), equipada con un
anillo de núm. 28. La centrifugadora estuvo operando mientras se
alimentaba al mismo tiempo disolución sanguínea dializada para
separar los glóbulos rojos de los glóbulos blancos y plaquetas.
Durante la operación, la centrifugadora rotaba a una velocidad
suficiente para separar la sangre en una fase pesada de glóbulos
rojos y una fase ligera de glóbulos blancos, típicamente a
aproximadamente 15.000 rpm. Las fracciones de la fase de glóbulos
rojos y la fase de glóbulos blancos se descargaron separada y
continuamente de la centrifugadora durante la operación.
Después de la separación, los glóbulos rojos se
lisaron para formar una disolución que contenía hemoglobina. Una
parte importante de los glóbulos rojos se lisaron mecánicamente en
la descarga de la centrifugadora, debido al impacto de las células
en la pared de la línea de descarga de la fase de los glóbulos
rojos a un ángulo respecto al flujo de la fase de glóbulos rojos que
sale de la centrifugadora, liberando de este modo hemoglobina de
los glóbulos rojos en la fase de glóbulos rojos.
La fase lisada de glóbulos rojos fluyó entonces a
través de la línea de descarga de la fase de glóbulos rojos en un
mezclador estático (Kenics 0,0127 m (1/2 pulgada) con 6 elementos,
Chemineer, Inc.). A la vez con la transferencia de la fase de
glóbulos rojos al mezclador estático, se inyectó también un volumen
igual de WFI en el mezclador estático, en el que se mezcló el WFI
con la fase de glóbulos rojos. El caudal de la fase de glóbulos
rojos y el WFI en el mezclador estático es para cada uno de
aproximadamente 0,25 litros por minuto.
Mezclar la fase de glóbulos rojos con WFI en el
mezclador estático produjo un coloide de glóbulos rojos lisados.
Este se transfirió entonces a una Centrifugadora Super Sharples
(Modelo núm. AS-16), que era capaz de separar la
hemoglobina de los componentes de los glóbulos rojos distintos a la
hemoglobina. La centrifugadora se rotó a una velocidad suficiente
para separar el coloide de glóbulos rojos lisados en una fase de
hemoglobina ligera y una fase pesada. La fase ligera estaba
compuesta de hemoglobina y también contenía componentes distintos a
la hemoglobina con una densidad aproximadamente igual a o menor que
la densidad de la hemoglobina.
La fase de hemoglobina se descargó de manera
continua de la centrifugadora, a través de un microfiltro Pellicon
Cassette de 0,45 \mum (Millipore Corporation, cat. Núm. HVLP 000
C5), y en un tanque contenedor en preparación para la purificación
de la hemoglobina. El estroma celular se devolvió entonces con el
retenido del microfiltro al tanque contenedor. Durante la
microfiltración, la temperatura del tanque contenedor se mantuvo a
10ºC o menor. Para mejorar la eficacia, cuando la presión del
fluido a la entrada del microfiltro aumentó de una presión inicial
de 68948 Pa a 172369 Pa (aproximadamente 10 psi a aproximadamente
25 psi), se completó la microfiltración. El microfiltrado de
hemoglobina se transfirió del microfiltro al tanque de
microfiltración. El microfiltrado se dividió en esta etapa en dos
muestras, Muestras A y B. La Muestra A no se purificó adicionalmente
en este punto.
La Muestra B se bombeó posteriormente a través de
un ultrafiltro de 100 kD (Millipore Corporation, cat. Núm. CDUF 050
H1). Una parte importante de la hemoglobina y agua, contenida en el
microfiltrado, permeó el ultrafiltro para formar un ultrafiltrado
de hemoglobina, mientras los componentes grandes del microfiltrado,
tales como proteínas de peso molecular mayor que aproximadamente
100 kD, se retuvieron y recircularon de vuelta al tanque de
microfiltración. Al mismo tiempo, se añadió continuamente WFI al
tanque de microfiltrado como maquillador para la pérdida de agua en
el ultrafiltrado. La ultrafiltración continuó hasta que la
concentración de hemoglobina en el tanque de microfiltrado fue
menor que 8 gramos/litro. Durante la etapa de ultrafiltración, la
temperatura interna del tanque de microfiltrado se mantuvo a
aproximadamente 10ºC.
El ultrafiltrado de hemoglobina se transfirió
luego a un tanque de ultrafiltración, y se recirculó a través de un
ultrafiltro de 30 kD (Millipore Corporation, cat. núm. CDUF 050
T1) para separar los componentes celulares menores, tales como
electrolitos, intermedios metabólicos, agua y proteínas de peso
molecular menor que aproximadamente 30 kD. Esto dio por resultado
una disolución concentrada de hemoglobina que contenía
aproximadamente 100 gramos por litro de hemoglobina. La
purificación inicial de la Muestra B se concluyó en este punto.
Se trató gel de sílice con
(\gamma-glicidoxipropil)trimetoxisilano en
agua a 70ºC, dando una sílice derivada con grupos epóxido de
superficie. Este gel de sílice derivado se trató entonces con
N,N-dimetiletanolamina
(OHCH_{2}CH_{2})N(CH_{3})_{2},
dando un gel de sílice derivado con grupos amonio cuaternario de superficie.
dando un gel de sílice derivado con grupos amonio cuaternario de superficie.
El agente de escrapia usado en los estudios
descritos aquí fue la cepa ME-7 adaptada a la murino
autorizada por el Institute of Animal Health, Edimburgo, Escocia.
La fuente original del agente fue una infección natural de escrapia
de ovejas Suffolk. Un extracto cerebral de estas ovejas sufrió dos
pasajes a través de ratones Moredun reproducidos al azar, nueve
pasajes a través de C57BL/6N, un pasaje a través de ratones
C_{3}H y un pasaje adicional a través de ratones C57BL/6N. El
material de tratamiento usado en este estudio fue al nivel de
pasaje trece.
La Muestra A (180 mL) se trató con un volumen de
20 mL del agente de escrapia para dar la Muestra A'. Se retuvo una
alícuota de la Muestra A' para usar en los ensayos de
"tratamiento de prueba", y el resto se sometió a
ultrafiltración a través de un ultrafiltro de 100 kD, como se
describe anteriormente para la Muestra B. El ultrafiltrado
resultante, designado ahora Muestra A'', se ensayó para la
capacidad de infección de la escrapia como se describe en el
Ejemplo 2.
Una alículota de 20 mL de la Muestra B se trató
con 2 mL de agente de escrapia para la dar Muestra B'. Una alícuota
de la Muestra B' se retuvo para usar en ensayos de control de
"tratamiento de prueba". El resto de la muestra tratada se
sometió a cromatografía de intercambio aniónico. La Muestra B'
tratada se dirigió al medio contenido en la columna de
cromatografía, para purificar la hemoglobina mediante cromatografía
líquida de alta resolución de intercambio aniónico. La columna
tenía 0,2 m (8 pulgadas) de diámetro interno y una longitud de 0,6
m (24 pulgadas). El medio de intercambio aniónico dentro de la
columna era el medio basado en sílice descrito anteriormente.
La columna se pretrató con un tampón que facilita
el enlace de la hemoglobina al medio. Luego se inyectó la Muestra
B' en la columna con un caudal de 1,78 litros por minuto. La
columna se lavó entonces dirigiendo sucesivamente tres tampones
diferentes a través de la columna para producir un eluido de
hemoglobina, produciendo un gradiente de pH dentro de la columna. La
temperatura de cada tampón durante el uso fue aproximadamente
12,4ºC. Los tampones se prefiltraron a través de una membrana de
ultrafiltración de 10 kD (Millipore Corporation, cat. Núm. CDUF 050
G1) antes de la inyección en la columna. El caudal de cada tampón a
través de la columna fue 3,56 litros por minuto.
El primer tampón,
tris-hidroximetilaminometano 20 mM (Tris, pH en el
intervalo de aproximadamente 8,4 a aproximadamente 9,4), transportó
la disolución concentrada de hemoglobina en el medio de intercambio
aniónico dentro de la columna. El segundo tampón, una mezcla del
primer tampón con un tercer tampón y que tenía un pH de
aproximadamente 8,3, ajustó después el pH dentro de la columna para
eluir los componentes contaminantes mientras se retenía la
hemoglobina. El equilibrado con el segundo tampón continuó durante
aproximadamente 30 minutos. El eluyente del segundo tampón se tiró a
la basura. El tercer tampón, Tris 50 mM (pH en el intervalo de
aproximadamente 6,5 a aproximadamente 7,5), eluyó después la
hemoglobina de la columna. El primer y último 3% a 4% del eluyente
de hemoglobina se tiró. El resto del eluyente de hemoglobina, ahora
designado Muestra B'', se ensayó para la capacidad de infección de
la escrapia como se describe en el Ejemplo 2.
El método de validación se realizó a una
instalación registrada, siguiendo procedimientos de acuerdo con las
Regulaciones de la Buena Práctica de Laboratorio de la
Administración de Alimentos y Medicamentos de EE.UU. (21 CFR 58),
el Programa de Conformidad GLP del Reino Unido, el Patrón GLP
Japonés y los Principios OECD de la Buena Práctica de
Laboratorio.
Las disoluciones evaluadas por medio del ensayo
in vivo para la capacidad de infección de la escrapia
fueron: 1. La disolución del agente de escrapia usada para tratar
las disoluciones de hemoglobina, 2. Muestra A', 3. Muestra A'', 4.
Muestra B' y 5. Muestra B''.
El ensayo in vivo para la capacidad de
infección de la escrapia se realizó mediante Microbiological
Associates, Rockville, MD, según un método publicado (Chesebro,
Spongiform Encephalopathies: the Transmissible Agents, en Virology
Fields, Knipe, et al., editores Raven Press LTD.: Nueva York,
Capítulo 81, páginas 2325-2336 (1990)). El método
implica la inoculación intracraneal de ratones con una alícuota de
una disolución de interés, monitorización de los ratones para ver
las señales clínicas de la infección por escrapia y determinación
de los grados de supervivencia durante el curso de un año.
La capacidad de infección de la escrapia se
ensayó para las siguientes disoluciones: el material de tratamiento,
Muestra A' (clarificada y no clarificada), Muestra A'', Muestra B'
y Muestra B''. Se preparó una serie de diluciones de cada una de
estas disoluciones como se indica: material de tratamiento,
factores de dilución 1 (no diluido), 10^{-3}, 10^{-4},
10^{-5}, 10^{-6}, 10^{-7} y 10^{-8}; Muestra A', no
clarificada: factor de dilución 1, clarificada: factores de
dilución 1, 10^{-1}; Muestra A'', factores de dilución 1,
10^{-1}, 10^{-2}, 10^{-3}, 10^{-4} y 10^{-5}; Muestra B',
factores de dilución 1 y 10^{-1}; Muestra B'', factores de
dilución 1, 10^{-1}, 10^{-2}, 10^{-3}, 10^{-4} y
10^{-5}.
Los ratones hembra C57BL/6 se dividieron en
equipos de o bien 10 o 15 ratones. Un equipo de quince ratones de
control no se inoculó, mientras un equipo de quince ratones de
control de vehículo se inoculó cada uno con 0,020 mL sólo de
vehículo. Los ratones en cada uno de los restantes equipos se
inocularon cada uno con una alícuota de 0,02 mL de una sola
dilución de una de las disoluciones en estudio.
Los ratones se monitorizaron para ver las señales
clínicas de infección de escrapia durante 365 días. Las señales de
la etapa terminal de la enfermedad de escrapia incluyen
sensibilidad a ruido bajo, incontinencia urinaria, pelaje áspero,
anormalidad de andares y torpeza de ojos. La infección de escrapia
se confirmó mediante el examen histopatológico del tejido cerebral
de los ratones muertos o sacrificados, en el que la presencia de
vacuolas en el tejido cerebral sostiene un diagnóstico de
escrapia.
El método de purificación total para la
hemoglobina bovina se describe en la Solicitud de Patente de EE.UU.
núm. 08/473.479. Dos disoluciones de hemoglobina bovina se
prepararon según una parte de este procedimiento, como se describe
en el Ejemplo 1, pero en cada caso la purificación se paró en un
punto diferente del procedimiento total. La Muestra A se purificó a
través de la etapa de microfiltración (tamaño de poro de 0,45
\mum), mientras que la Muestra B se purificó a través de la etapa
de diafiltración (corte de peso molecular nominal de 100 kD).
El procedimiento de validación examinó el efecto
de la etapa de ultrafiltración de 100 kD y la etapa de
cromatografía de intercambio aniónico en la capacidad de infección
de las muestras tratadas con el agente de escrapia
ME-7 adaptado a la murino presente en los
homogeneizados cerebrales de los ratones infectados. El agente de
escrapia se usó como un modelo para el agente causal de la
encefalopatía espongiforme bovina. El método empleado fue un ensayo
in vivo en ratones, normalmente el único tipo de ensayo
disponible para la capacidad de infección de priones. La capacidad
de infección de las dos muestras tratadas antes de la etapa de
purificación de interés se ensayó como un control, y en ambos casos
dio por resultado el 100% de mortalidad de los ratones de control
dentro de 365 días, con una mayoría significativa de los ratones que
manifestaron cambios en la morfología cerebral coherente con la
infección de escrapia. En contraste, las muestras tratadas
sometidas posteriormente a purificación por medio de
ultrafiltración de 100 kD o cromatografía de intercambio de
aniones, no mostraron señales de capacidad de infección de escrapia
en el ensayo in vivo.
Los resultados del ensayo in vivo se
resumen en la Tabla, que indica, para cada grupo de prueba de
ratones, el número de ratones que sobrevivieron el estudio de 365
días, el número de ratones que manifestó señales clínicas de
escrapia durante el estudio, el número que murió o se sacrificó
durante el estudio y el número de ratones muertos con escrapia
confirmada histopatológicamente.
Los datos muestran que 19 de 20 ratones
inoculados con material de tratamiento a un factor de dilución de
10^{-4} o mayor manifestaron señales clínicas de escrapia, con
escrapia confirmada por histopatología. Un probable error de
inoculación explica el único ratón superviviente en este grupo.
Todos los ratones tratados con Muestra A' no
diluida, no clarificada, murieron pero sin mostrar señales de
escrapia. Las muertes son atribuibles al efecto tóxico del material
sólido dentro de esta mezcla heterogénea. Cada uno de los diez
ratones tratados con Muestra A' clarificada murieron después de
manifestar señales clínicas de escrapia, en nueve de éstos, la
escrapia se confirmó por histopatología. En un ratón en este grupo,
la importante autolisis previno la confirmación histopatológica de
escrapia. En contraste, de 90 ratones inoculados con una dilución
de Muestra A'', 86 sobrevivieron al estudio, ninguno manifestó
señales clínicas de escrapia, y los cerebros de los 4 ratones que
murieron mostraron histopatología normal.
De los 5 ratones inoculados con Muestra B',
ninguno sobrevivió al estudio, y 4 de éstos mostraron señales tanto
clínicas como histopatológicas de escrapia. Una dilución de Muestra
B'' se administró a 90 ratones. De estos, 84 sobrevivieron al
estudio, con ninguno de los ratones muertos manifestando señales
clínicas o histopatológicas de escrapia.
Los resultados indican claramente que las
disoluciones de hemoglobina tratadas con el agente de escrapia
pueden descontaminarse en condiciones suaves. La purificación por
medio de ultrafiltración de 100 kD o cromatografía de intercambio
aniónico con una elución por gradiente de pH redujeron la capacidad
de infección de la escrapia en las disoluciones resultantes por
debajo de los límites de detección del ensayo in vivo.
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (10)
1. Un método para separar un prión de una
disolución que comprende el prión y una proteína adicional, que
comprende la etapa de dirigir la disolución a través de una columna
de cromatografía de intercambio aniónico en condiciones que
provocan una elución por gradiente de pH, por lo cual se separa el
prión de la proteína adicional, por lo cual se provoca que dicha
proteína se recoja en una fracción eluida que es distinta de la
fracción eluida que incluye el prión.
2. El método según la reivindicación 1, en el que
el gradiente de pH es un gradiente continuo o un gradiente
escalonado.
3. El método según la reivindicación 1 o
reivindicación 2, en el que la proteína se deriva de un ser humano,
animal bovino, ovino, porcino o murino.
4. El método según una cualquiera de las
anteriores reivindicaciones, en el que el medio de cromatografía de
intercambio aniónico comprende al menos un componente seleccionado
a partir de sílice, alúmina, titania, dextrano reticulado,
agarosa, un polímero modificado con grupos catiónicos, una
poliacrilamida, un poli(hidroxietilmetacrilato) o un poli
(estireno-co-divinilbenceno).
5. El método según la reivindicación 1, que
comprende además la etapa de filtrar la disolución a través de una
membrana de ultrafiltración, y opcionalmente en el que la membrana
de ultrafiltración tiene un corte de peso molecular de
aproximadamente 100 kD.
6. El método según una cualquiera de las
anteriores reivindicaciones, en el que la proteína es
hemoglobina.
7. El método según la reivindicación 6, en el que
el prión es un agente causal para la encefalopatía espongiforme,
siendo opcionalmente escrapia, enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob, kuru, síndrome de
Gerstmann-Straussler- Scheinken o encefalopatía
espongiforme bovina.
8. El método según la reivindicación 6, en el que
la hemoglobina es hemoglobina bovina, y opcionalmente el prión es
un agente causal para la encefalopatía espongiforme bovina.
9. El método según la reivindicación 8, en el que
el medio de cromatografía de intercambio aniónico comprende sílice,
y opcionalmente la sílice se funcionaliza con grupos
catiónicos.
10. El método según la reivindicación 4 o la
reivindicación 9, en el que el grupo catiónico es un grupo amonio
cuaternario.
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