EA003235B1 - Способ получения мембранных пузырьков - Google Patents
Способ получения мембранных пузырьков Download PDFInfo
- Publication number
- EA003235B1 EA003235B1 EA200100819A EA200100819A EA003235B1 EA 003235 B1 EA003235 B1 EA 003235B1 EA 200100819 A EA200100819 A EA 200100819A EA 200100819 A EA200100819 A EA 200100819A EA 003235 B1 EA003235 B1 EA 003235B1
- Authority
- EA
- Eurasian Patent Office
- Prior art keywords
- vesicles
- stage
- dendritic cells
- cells
- membrane vesicles
- Prior art date
Links
- 239000012528 membrane Substances 0.000 title claims abstract description 91
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 90
- 210000001808 exosome Anatomy 0.000 claims abstract description 90
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 62
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims abstract description 57
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 claims abstract description 45
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 claims abstract description 44
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 claims abstract description 30
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 claims abstract description 26
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 claims abstract description 24
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims abstract description 24
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 claims abstract description 21
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims abstract description 21
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims abstract description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims abstract description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000005352 clarification Methods 0.000 claims abstract description 8
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims abstract description 7
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 7
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims abstract description 6
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 claims abstract description 5
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 claims abstract description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 16
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 11
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims description 4
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 4
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 claims description 4
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 claims description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 claims 1
- 238000000464 low-speed centrifugation Methods 0.000 claims 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 abstract description 17
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 abstract description 5
- 239000003086 colorant Substances 0.000 abstract 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 67
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 66
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 66
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 35
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 31
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 26
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 18
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 18
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 14
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 12
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 11
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 10
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 10
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 10
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 8
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 7
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N divinylbenzene Substances C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 7
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 7
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 6
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 5
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 4
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 4
- 239000007989 BIS-Tris Propane buffer Substances 0.000 description 4
- 108091006629 SLC13A2 Proteins 0.000 description 4
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N bis-tris propane Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCNC(CO)(CO)CO HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 4
- 238000001085 differential centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 4
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 4
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 4
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N Benzene Chemical compound C1=CC=CC=C1 UHOVQNZJYSORNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 3
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 3
- 108700018351 Major Histocompatibility Complex Proteins 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 206010070834 Sensitisation Diseases 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 description 3
- 230000008313 sensitization Effects 0.000 description 3
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000016557 Acute basophilic leukemia Diseases 0.000 description 2
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 2
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 2
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 2
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 2
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 2
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 2
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 2
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 2
- 230000000711 cancerogenic effect Effects 0.000 description 2
- 231100000357 carcinogen Toxicity 0.000 description 2
- 239000003183 carcinogenic agent Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 2
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 2
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 2
- -1 etc.) Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 2
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N silver(1+) nitrate Chemical compound [Ag+].[O-]N(=O)=O SQGYOTSLMSWVJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000011537 Coomassie blue staining Methods 0.000 description 1
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 1
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 1
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 1
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 239000004696 Poly ether ether ketone Substances 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 1
- 230000030741 antigen processing and presentation Effects 0.000 description 1
- 230000001640 apoptogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- JUPQTSLXMOCDHR-UHFFFAOYSA-N benzene-1,4-diol;bis(4-fluorophenyl)methanone Chemical compound OC1=CC=C(O)C=C1.C1=CC(F)=CC=C1C(=O)C1=CC=C(F)C=C1 JUPQTSLXMOCDHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000003181 biological factor Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 201000008275 breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000011082 depyrogenation Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000011067 equilibration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 description 1
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N ionomycin Natural products O1C(CC(O)C(C)C(O)C(C)C=CCC(C)CC(C)C(O)=CC(=O)C(C)CC(C)CC(CCC(O)=O)C)CCC1(C)C1OC(C)(C(C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N ionomycin Chemical compound O1[C@H](C[C@H](O)[C@H](C)[C@H](O)[C@H](C)/C=C/C[C@@H](C)C[C@@H](C)C(/O)=C/C(=O)[C@@H](C)C[C@@H](C)C[C@@H](CCC(O)=O)C)CC[C@@]1(C)[C@@H]1O[C@](C)([C@@H](C)O)CC1 PGHMRUGBZOYCAA-ADZNBVRBSA-N 0.000 description 1
- 239000002555 ionophore Substances 0.000 description 1
- 230000000236 ionophoric effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000010874 maintenance of protein location Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 description 1
- 150000002994 phenylalanines Chemical class 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920002530 polyetherether ketone Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 210000001995 reticulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000005185 salting out Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 238000007873 sieving Methods 0.000 description 1
- 229910001961 silver nitrate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 238000007447 staining method Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000020382 suppression by virus of host antigen processing and presentation of peptide antigen via MHC class I Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000430 tryptophan group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C2=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C12 0.000 description 1
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 description 1
- 150000003668 tyrosines Chemical class 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000012800 visualization Methods 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/17—Lymphocytes; B-cells; T-cells; Natural killer cells; Interferon-activated or cytokine-activated lymphocytes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
- A61K35/14—Blood; Artificial blood
- A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/0005—Vertebrate antigens
- A61K39/0011—Cancer antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/34—Size selective separation, e.g. size exclusion chromatography, gel filtration, permeation
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
- B01D15/361—Ion-exchange
- B01D15/363—Anion-exchange
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01D—SEPARATION
- B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
- B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
- B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
- B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
- B01D15/3804—Affinity chromatography
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J41/00—Anion exchange; Use of material as anion exchangers; Treatment of material for improving the anion exchange properties
- B01J41/20—Anion exchangers for chromatographic processes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
- A61K2039/515—Animal cells
- A61K2039/5154—Antigen presenting cells [APCs], e.g. dendritic cells or macrophages
Abstract
Способ получения мембранных пузырьков из биологического образца характеризуется тем, что он содержит, по меньшей мере, одну стадию обработки образца путем анионообменной и/или гельпроникающей хроматографии. Изобретение используют для получения пузырьков различного происхождения и различной природы, в частности, из антигенпредставляющих клеток или опухолевых клеток. Изобретение относится также к таким образом полученным пузырькам и их применениям.
Description
Настоящее изобретение относится к новому способу получения (в частности, выделения и/или очистки) мембранных пузырьков. Изобретение относится также к полученным мембранным пузырькам, а также к их применению в области биологии и медицины.
Мембранные пузырьки представляют собой пузырьки обычно диаметром меньше 100 нм, образованные липидным биослоем, включающим цитозольную часть. Особые мембранные пузырьки более специфически происходят из внутриклеточных отделов за счет слияния с цитоплазматической мембраной клетки, приводящего к их высвобождению в биологические жидкости или в супернатант культуральных клеток. Такие пузырьки вообще обозначают термином экзосома. Экзосомы обычно имеют диаметр около 5090 нм, предпочтительно около 60-80 нм и включают преимущественно мембранные протеины, в частности протеины главного комплекса гистосовместимости, которые находятся в той же ориентации, что и в цитоплазматической мембране клеток, из которых они происходят. Кроме того, в зависимости от их происхождения экзосомы включают мембранные протеины, такие как СЭ40, СЭ80, Н8Р70, и лишены эндоплазматического ретикулума и аппарата Гольджи.
Выявлено высвобождение экзосом из различных типов клеток в разных физиологических условиях. Так, показано, что В-лимфоциты высвобождают экзосомы, несущие молекулы главного комплекса гистосовместимости класса II, которые играют роль в антигенной презентации (см., например, Каро ко и др., 1. Ехр. Меб., 183, 1161, 1996). Точно так же показано, что дендритные клетки продуцируют экзосомы, также называемые декзосомами, обладающие особыми структурными и функциональными характеристиками и играющие роль в опосредовании иммунного ответа, в частности в стимуляции цитотоксических Т-лимфоцитов (ΖίΙνο^Ι и др., Να1ите Меб1еше, 4, 594, 1998). Также показано, что опухолевые клетки регулярно выделяют особые экзосомы, также называемые текзосомами, несущие опухолевые антигены и способные представлять эти антигены или переносящие их в антигенпредставляющие клетки (международная заявка № 99/03499). Также известно, что мастоциты аккумулируют в своих везикулярных внутриклеточных отделах молекулы, которые могут быть выделены под воздействием сигналов (8тйй и ^е!5. 1ттипо1оду Тобау, 17, 60, 1996). По-видимому, клетки эмиттируют сигналы и сообщаются между собой через посредство высвобождаемых ими мембранных пузырьков, которые могут быть носителями антигенных мотивов, молекул главного комплекса гистосовместимости (СМН), или любого другого сигнала (цитокин, фактор роста и т.д.), которые обладают специфическими структурными и функциональными характеристиками и продуцируются в различных физиологических ситуа циях. Эти пузырьки, и в частности экзосомы, представляют собой продукт, являющийся особенно интересным для диагностических, вакцинальных, терапевтических применений или для транспортировки представляющих интерес молекул. Следовательно, в особенности представляет интерес располагать эффективным и используемым в промышленном масштабе способом получения мембранных пузырьков, приемлемых для использования в области биологии, в частности для фармакологического применения.
Согласно классическим способам получения мембранных пузырьков (например, экзосом) осуществляют ряд стадий дифференциального центрифугирования, позволяющего отделять пузырьки от клеток или клеточных остатков, находящихся в культуральной среде. Так, в вышецитированных документах описывается получение пузырьков с помощью ряда центрифугирований при ускорениях 300 д, 10000 д и 70000 д или 100000 д, причем полученный осадок после центрифугирования обрабатывают солевым раствором для получения концентрированного раствора экзосом. Этот препарат может быть проанализирован классическими биохимическими методами, позволяющими оценивать протеиновый состав экзосом. Предпочтительный биохимический метод состоит в электрофорезе в денатурирующей среде, ассоциированном с окрашиванием всех протеинов или с детектированием специфических протеинов с помощью антител согласно методу вестерн-блотирования. Детектирование экзосом в конечном препарате может быть реализовано прямо путем электронной микроскопии после фиксации препарата с помощью 4%-ного раствора глутарового альдегида.
Согласно этому способу степени чистоты экзосом являются удовлетворительными в соответствии с тем, что такие препараты позволяют выявлять биологическую активность и противоопухолевые свойства на животных моделях. Тем не менее, известные способы получения путем центрифугирования не позволяют очень тщательно отделять мембранные пузырьки, например экзосомы, от клеточных протеинов, или некоторых макромолекулярных компонентов (ДНК, РНК), или макромолекулярных комплексов. Эти способы, следовательно, не исключают присутствия неидентифицированных загрязняющих биологических факторов, неприемлемых для применения в терапии человека. Кроме того, эти стадии трудноосуществимы в промышленном масштабе, особенно когда должны быть обработаны значительные объемы, или в случае автологичных ех у1уо применений (то есть от пациента к пациенту), где способ обычно нужно осуществлять в закрытой системе.
Задачей настоящего изобретения является решение этой проблемы. Согласно изобретению описываются новые способы, позволяющие получать, то есть выделять и/или очищать мембранные пузырьки в условиях, приемлемых для промышленного использования и фармакологических применений. Способы согласно изобретению могут быть применимы для индивидуальных приготовлений автологичных экзосом и для приготовления экзосом, получаемых из установленных клеточных линий, для экспериментальных, биологических целей или, например, профилактических или терапевтических вакцинаций.
Настоящее изобретение базируется на использовании способов разделения с помощью хроматографии для получения мембранных пузырьков, и в частности для отделения мембранных пузырьков от возможных биологических загрязняющих компонентов.
Первым объектом изобретения является способ получения мембранных пузырьков из биологического образца, характеризующийся тем, что он включает, по меньшей мере, одну стадию обработки образца с помощью анионообменной хроматографии.
Заявитель показал, что мембранные пузырьки, в частности экзосомы, могут быть очищены путем анионообменной хроматографии. Согласно изобретению неожиданно было обнаружено, что экзосомы разрешаются в виде однородного пика после анионообменной хроматографии. Этот результат оказался совершенно неожиданным в соответствии с тем, что экзосомы представляют собой сложные надмолекулярные объекты, состоящие из мембраны, окружающей внутренний объем, в котором находятся растворимые протеины. Более того, экзосомы содержат мембранные протеины.
Более конкретным объектом изобретения является способ получения, точнее очистки, мембранных пузырьков из биологического образца, включающий, по меньшей мере, одну стадию анионообменной хроматографии.
В случае осуществления настоящего изобретения речь может идти о сильном или слабом, предпочтительно сильном, обмене анионов. Кроме того, в случае особого варианта осуществления хроматографию реализуют под давлением. Более конкретно речь может также идти о высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Для осуществления анионообменной хроматографии могут быть использованы различные типы носителей. Более предпочтительно можно назвать целлюлозу, сополимер стирола и дивинилбензола, агарозу, декстран, акриламид, диоксид кремния, сополимер этиленгликоля и метакрилата или смеси, например смеси агарозы с декстраном. В этом отношении в качестве примера можно указать различные материалы для хроматографии, составленные из носителей, таких как указанные выше, и в частности, например гели 8оигсе, Рогоз, сефароза, сефадекс, трисакрил, Т8К-гель δν или Ρν, супердекс, Тоуореаг1 Ην и сефакрил, которые пригодны для осуществления настоящего изобретения.
Согласно особому варианту осуществления объектом изобретения является способ получения мембранных пузырьков из биологического образца, включающий, по меньшей мере, одну стадию, во время которой биологический образец обрабатывают путем анионообменной хроматографии на носителе, который выбран из группы, состоящей из целлюлозы, сополимера стирола и дивинилбензола, диоксида кремния, акриламида, агарозы, декстрана, сополимера этиленгликоля и метакрилата, используемых индивидуально или в виде смесей, в случае необходимости функционализированных.
Кроме того, для улучшения хроматографического разрешения в рамках изобретения предпочтительно используют носители в форме шариков. В идеальном случае речь идет о шариках с однородным и калиброванным диаметром, обладающих достаточно высокой пористостью для возможности проникновения хроматографируемых объектов (то есть экзосом). Так, в расчете на диаметр экзосом, обычно составляющий 50100 нм, для осуществления изобретения предпочтительным является использование гелей повышенной пористости, составляющей в особенности от около 10 нм до около 5 мкм, более предпочтительно от около 20 нм до около 2 мкм, еще более предпочтительно от около 100 нм до около 1 мкм.
В случае анионообменной хроматографии используемый носитель должен быть функционализирован с помощью группы, способной взаимодействовать с анионной молекулой. Обычно эта группа образована амином, который может быть третичным или четвертичным, что определяет соответственно слабый или сильный анионообменник.
В рамках настоящего изобретения особенно предпочтительным является использование сильного анионообменника. Согласно изобретению предпочтительно используют хроматографический носитель, указанный выше, функционализированный четвертичными аминами. Согласно более предпочтительному варианту осуществления изобретения анионообменную хроматографию осуществляют на функционализированном четвертичным амином носителе. Еще более предпочтительно речь идет о функционализированном четвертичным амином носителе, выбранном из группы, состоящей из сополимера стирола и дивинилбензола, акриламида, агарозы, декстрана и диоксида кремния, используемых индивидуально или в виде смесей.
Из функционализированных четвертичным амином носителей в качестве примеров можно назвать гели 8оигсе О. Мопо О. Р-сефарозу, Рогоз НО и Рогоз ОЕ, гели типа Егас1оде1 ТМАЕ и гели Тоуореаг1 8ирег О.
Особенно предпочтительный для осуществления анионообменной хроматографии носитель включает сополимер стирола и дивинилбензола. Примером этого типа геля, используемого в рамках изобретения, является гель 8оигсе О, особенно 8оигсе 15р (РНагташа). Этот носитель обладает тем преимуществом, что имеет встречающиеся внутренние очень широкие и мало резистентные к циркуляции жидкости через гель поры, позволяя осуществляться полностью быстрой диффузии экзосом к функциональным группам, причем особенно важными параметрами в случае экзосом является их размер.
Элюирование биологических соединений в колонке можно осуществлять различным образом, и в частности путем пропускания солевого раствора градиента возрастающей концентрации, например 0-2М. Можно использовать, в частности, раствор хлорида натрия в концентрациях, изменяющихся в пределах 0-2М. Детектирование таким образом очищенных различных фракций осуществляют путем измерения их оптической плотности (ΌΘ) на выходе из колонки с помощью непрерывного спектрофотометрического определения. Для сведения, в используемых в примерах условиях фракции, включающие мембранные пузырьки, элюировали с ионной силой приблизительно 350-700 мМ в зависимости от типов пузырьков.
Для осуществления этой хроматографической стадии могут быть использованы различные типы колонок в зависимости от потребностей и обрабатываемых объемов. В зависимости от препаратов можно использовать колонку объемом от около 100 мкл до около 10 мл или более. Так, имеющиеся в распоряжении носители имеют емкость, способную достигать 25 мг протеинов на мл. В силу этого колонка объемом 100 мкл обладает емкостью порядка 2,5 мг протеинов, что, учитывая рассматриваемые образцы, дает возможность обрабатывать культуральные супернатанты объемом приблизительно 2 л ( которые, после концентрирования, например, в 10-20 раз, дают объемы 100-200 мл на препарат). Само собой разумеется, что также могут быть обработаны гораздо большие объемы, например, за счет увеличения объема колонки.
Кроме того, для осуществления настоящего изобретения также можно сочетать стадию анионообменной хроматографии со стадией гельпроникающей хроматографии. Согласно особому варианту осуществления изобретения стадию гельпроникающей хроматографии добавляют к стадии обмена анионов либо перед, либо после стадии анионообменной хроматографии. В случае этого варианта осуществления стадию гельпроникающей хроматографии осуществляют предпочтительно после стадии обмена анионов. Кроме того, согласно особому варианту осуществления стадию анионообменной хроматографии заменяют стадией гельпроникающей хроматографии. В самом деле, в настоящей заявке показано, что мембранные пузырьки также могут быть очищены при использовании жидкостной гельпроникающей хроматографии, в особенности тогда, когда эту стадию сочетают с анионообменной хроматографией или с другой стадией (другими стадиями) обработки биологического образца, как это будет описано подробно дальше.
Для осуществления стадии гельпроникающей хроматографии предпочтительно используют носитель, выбранный из группы, состоящей из диоксида кремния, акриламида, агарозы, декстрана, сополимера этиленгликоля и метакрилата или смесей, например смесей агарозы с декстраном. В качестве примера в случае гельпроникающей хроматографии преимущественно используют носитель, такой как супердекс 200 НК. (Рйагшаша), Ν8Κ 66000 (Тою Наак) или еще сефакрил 8 (Рйагшаша).
Способ согласно изобретению может быть осуществлен, исходя из различных биологических образцов. В частности, речь может идти о биологической жидкости, происходящей от субъекта (как костный мозг, периферическая кровь и т.д.), культуральном супернатанте, клеточном лизате, предварительно очищенном растворе или о любой другой композиции, включающей мембранные пузырьки.
Согласно особому варианту осуществления изобретения биологическим образцом является супернатант культуры клеток, продуцирующих мембранные пузырьки.
Кроме того, согласно предпочтительному варианту осуществления изобретения биологический образец до стадии хроматографии обрабатывают с целью обогащения мембранными пузырьками (стадия обогащения). Таким образом, согласно особому варианту осуществления настоящее изобретение относится к способу получения мембранных пузырьков из биологического образца, характеризующемуся тем, что он содержит, по меньшей мере,
b) стадию обогащения образца мембранными пузырьками, и
c) стадию обработки образца путем анионообменной хроматографии и/или гельпроникающей хроматографии.
Согласно предпочтительному варианту осуществления биологическим образцом является культуральный супернатант, обработанный таким образом, чтобы было осуществлено обогащение мембранными пузырьками. В частности, биологический образец может представлять собой предварительно очищенный раствор, получаемый из культурального супернатанта популяции продуцирующих мембранные пузырьки клеток или биологической жидкости путем обработок, таких как центрифугирование, осветление, ультрафильтрация, нанофильтрация и/или аффинная хроматография, в особенности осветление, и/или ультрафильтрация, и/или аффинная хроматография.
Предпочтительный способ получения мембранных пузырьков согласно изобретению содержит преимущественно следующие стадии:
а) культивирование популяции клеток, продуцирующих мембранные пузырьки (например, экзосомы), в условиях, позволяющих пузырькам высвобождаться,
b) обогащение образца мембранными пузырьками, и
c) обработка образца путем анионообменной хроматографии и/или гельпроникающей хроматографии.
Как указано выше, стадия обогащения образца (например, супернатанта) может включать одну или несколько стадий центрифугирования, осветления, ультрафильтрации, нанофильтрации и/или аффинной хроматографии супернатанта. Согласно первому варианту осуществления стадия обогащения включает (ί) стадию удаления клеток и/или клеточных остатков (стадия осветления), за которой, в случае необходимости, следует (и) стадия концентрирования и/или аффинной хроматографии. Согласно другому варианту осуществления стадия обогащения включает стадию аффинной хроматографии, которой, в случае необходимости, предшествовала стадия удаления клеток и/или клеточных остатков (стадия осветления). Предпочтительная стадия обогащения согласно изобретению содержит стадию удаления клеток и/или клеточных остатков, концентрирование и аффинную хроматографию.
Удаление клеток и/или клеточных остатков может быть осуществлено, например, путем центрифугирования образца с незначительной скоростью, предпочтительно при ускорении ниже 1000 д, например при 100-700 д. Предпочтительными условиями центрифугирования во время этой стадии являются ускорения около 300 или 600 д, например, в течение периода времени 1-15 мин.
Удаление клеток и/или клеточных остатков также может быть осуществлено путем фильтрации образца в случае необходимости в сочетании с вышеуказанным центрифугированием. Фильтрация может быть осуществлена путем нескольких последовательных фильтраций при использовании фильтров с уменьшающейся пористостью. В этом отношении предпочтительно используют фильтры с пористостью выше 0,2 мкм, например 0,2-10 мкм. Можно использовать последовательность фильтров с пористостью 10, 1, 0,5, затем 0,22 мкм.
Для уменьшения объемов образцов, обрабатываемых во время хроматографических стадий, может быть осуществлено концентрирование. Концентрирования можно достичь путем центрифугирования образца с высокими скоростями, например при ускорениях от 10000 до 100000 д, так, чтобы осадить мембранные пузырьки. В этом отношении речь может идти о ряде дифференциальных центрифугирований, причем последнее центрифугирование осуществляют при ускорении приблизительно 70000 д. Полученные в виде осадка после центрифугирования мембранные пузырьки затем могут быть обработаны более незначительным объемом и соответствующим буферным раствором для последующих стадий способа.
Стадия концентрирования также может быть реализована путем ультрафильтрации. Ультрафильтрация позволяет одновременно концентрировать супернатант и осуществить первую очистку пузырьков. Согласно предпочтительному варианту осуществления биологический образец, например супернатант, подвергают ультрафильтрации, предпочтительно тангенциальной ультрафильтрации. Тангенциальная ультрафильтрация состоит в концентрировании и фракционировании раствора между двумя отделами (фильтрат и ретентат), разделенными мембранами с определенными порогами разрыва. Разделение происходит за счет использования потока в отделе ретентата и трансмембранного давления между этим отделом и отделом фильтрата. Для осуществления ультрафильтрации могут быть использованы различные системы, как, например, спиральные мембраны (Мййроте, Ашкои), плоские мембраны или мембраны из полых волокон (Ашкои, М1Шроте, 8аг1огш5. Ра11, СР, 8ертасот). В рамках изобретения преимущественно используют мембраны с порогом разрыва ниже 1000 кДа, предпочтительно 300-1000 кДа, еще более предпочтительно 300-500 кДа.
Стадия аффинной хроматографии может быть реализована различным образом, на различных хроматографических материалах и носителях. Речь идет преимущественно о неспецифической аффинной хроматографии, предназначенной для удерживания некоторых загрязнителей, присутствующих в растворе, без удерживания представляющих интерес объектов, т. е. экзосом. Следовательно, речь идет об отрицательной селекции. Хроматографию осуществляют с помощью красителя, позволяющего удалять (то есть удерживать) загрязнители, такие как протеины и ферменты, например альбумин, киназы, дегидрогеназы, факторы коагуляции, интерфероны или липопротеины, или еще кофакторы и т.д. Используемым для этой хроматографии носителем предпочтительно является такой носитель, который применяют для ионообменной хроматографии, функционализированный с помощью красителя. В качестве специфического примера краситель может быть выбран среди синего - сефарозы (Рйатшааа), желтого 86 (Уе11о\у 86), зеленого 5 (Стееи 5) и коричневого 10 (Вго\\'п 10) (81дша). Более предпочтительно носителем является агароза. В рамках настоящего изобретения могут быть использованы любой другой носитель и/или краситель или реакционноспособная группа, позволяющая удерживать некоторые загрязнители обрабатываемого биологического образца.
Согласно особому варианту осуществления изобретения биологический образец получают путем обработки супернатанта культуры клеток, продуцирующих мембранные пузырьки, путем, по меньшей мере, одной стадии фильтрации.
Согласно другому особому варианту осуществления изобретения биологический образец получают путем обработки супернатанта культуры клеток, продуцирующих мембранные пузырьки, путем, по меньшей мере, одной стадии центрифугирования.
Согласно еще одному предпочтительному варианту осуществления изобретения биологический образец получают путем обработки супернатанта культуры клеток, продуцирующих мембранные пузырьки, путем, по меньшей мере, одной стадии ультрафильтрации.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления изобретения биологический образец получают путем обработки супернатанта культуры клеток, продуцирующих мембранные пузырьки, путем, по меньшей мере, одной стадии аффинной хроматографии.
Предпочтительный способ получения мембранных пузырьков согласно изобретению заключается в том, что осуществляют культивирование популяции клеток, продуцирующих мембранные пузырьки, например экзосомы, в условиях, позволяющих пузырькам высвобождаться, обрабатывают культуральный супернатант для получения биологического образца, обогащенного мембранными пузырьками, например экзосомами, путем, по меньшей мере, одной стадии ультрафильтрации или аффинной хроматографии, и обрабатывают биологический образец путем анионообменной и/или гельпроникающей хроматографии.
Согласно предпочтительному варианту осуществления вышеуказанная стадия обработки культурального супернатанта включает фильтрацию культурального супернатанта с последующей, предпочтительно тангенциальной, ультрафильтрацией.
Согласно другому предпочтительному варианту осуществления вышеуказанная стадия обработки культурального супернатанта включает осветление с последующей аффинной хроматографией с красителем, особенно на носителе синий-сефароза (В1ие Зерйатоке).
Кроме того, после последней стадии полученный материал может быть подвергнут одной или нескольким дополнительным стадиям обработки и/или фильтрации, в частности, с целью стерилизации. В случае этой стадии обработки путем фильтрации предпочтительно используют фильтры, имеющие диаметр пор меньше или равный 0,3 мкм, еще более предпочтительно меньше или равный 0,25 мкм. Такими фильтрами являются, например, фильтры с диаметром пор 0,22 мкм.
После последней стадии полученный материал распределяют в соответствующие емкости, такие как флаконы, пробирки, резервуары, шприцы и т.д., в соответствующей среде для хранения. Таким образом полученные очищен ные пузырьки можно хранить на холоде замороженными или немедленно использовать.
Особый способ получения согласно изобретению содержит, по меньшей мере, следующие стадии:
стадию обработки биологического образца путем анионообменной хроматографии и/или гельпроникающей хроматографии, и стадию фильтрации, в частности стерилизующей фильтрации, полученного материала.
Согласно первому варианту осуществления изобретения способ содержит стадию обработки биологического образца путем анионообменной хроматографии, и стадию фильтрации, в частности стерилизующей фильтрации, полученного материала.
Согласно другому варианту осуществления изобретения способ содержит стадию обработки биологического образца путем гельпроникающей хроматографии, и стадию фильтрации, в частности стерилизующей фильтрации, полученного после стадии с) материала.
Согласно третьему варианту осуществления изобретения способ содержит стадию обработки биологического образца путем анионообменной хроматографии с последующей или предшествующей гельпроникающей хроматографией, и стадию фильтрации, в частности стерилизующей фильтрации, полученного после стадии с) материала.
Представленные в примерах результаты показывают, что инжекция препарата экзосом в хроматографическую колонку позволяет получать симметричные пики абсорбции, которые вполне разрешены (фиг. 1). Таким образом выделенные различные фракции можно анализировать классическими методами электрофореза протеинов в денатурирующем геле с последующими способами окрашивания с помощью кумасси синего или способами детектирования специфических протеинов с помощью антител. Таким образом, для текзосом можно показать, что элюированный при анионообменной хроматографии с помощью 400 мМ раствора соли пик обладает протеиновым профилем, идентичным таковому препарата экзосом, полученного классическим путем (фиг. 2). Это позволяет бе Гас1о характеризовать пики, элюированные с помощью более слабых или более сильных концентраций соли по отношению к различным биологическим частицам, загрязнителям. Согласно другому эксперименту мембранные пузырьки, полученные из дендритных клеток (декзосомы), или некоторые текзосомы элюируются при ионной силе приблизительно 500-700 мМ, а пузырьки мастоцитов - приблизительно 350 мМ.
Кроме того, представленные в примерах результаты также показывают, что способ согласно изобретению позволяет детектировать возможное загрязнение препарата составляю щими большую долю культуральной среды протеинами, такими как бычий сывороточный альбумин. В самом деле, хроматография эталонного раствора бычьего сывороточного альбумина в вышеуказанных условиях показывает, что он дает пик, элюированный при концентрации соли, отличной от таковой для экзосом (фиг. 3).
Способ согласно изобретению позволяет: 1) очищать мембранные пузырьки в условиях в отношении качества и количества, приемлемых для фармакологического использования, и 2) обнаруживать наличие различных и загрязнителей в обработанном биологическом образце.
Способ согласно изобретению может быть применим для получения мембранных пузырьков различного происхождения. Так, речь может идти, в особенности, об экзосомах, продуцируемых антигенпредставляющими клетками или опухолевыми клетками. Кроме того, речь может идти о первичных клетках, например, в виде культуры, или также об установленных линиях, например иммортализованных линиях клеток, продуцирующих мембранные пузырьки. Речь может идти о клетках, происходящих от млекопитающего, в особенности мыши или человека.
Согласно особому варианту осуществления изобретения мембранные пузырьки представляют собой пузырьки, продуцируемые антигенпредставляющими клетками, в частности дендритными клетками, В-лимфоцитами, макрофагами и мастоцитами, в случае необходимости, после их сенсибилизации с помощью одного или нескольких выбранных антигенов. Особенно предпочтительное применение настоящего изобретения заключается в получении мембранных пузырьков, продуцируемых дендритными клетками. Речь может идти о человеческих или животных дендритных клетках, в частности человеческих или мышиных клетках. Эти клетки могут быть первичными, получаемыми из биологических жидкостей субъекта, или получаемыми ех νίνο из клетокпредшественников клетками, или также клетками установленных линий, например иммортализованных с помощью канцерогена.
Особым объектом настоящего изобретения является способ получения мембранных пузырьков (декзосом), характеризующийся тем, что он содержит получение популяции дендритных клеток, культивирование дендритных клеток в условиях, позволяющих продуцировать мембранные пузырьки-декзосомы, и очистку мембранных пузырьков-декзосом способом, включающим, по меньшей мере, одну стадию анионообменной хроматографии в вышеуказанных условиях.
Более предпочтительным вариантом осуществления является способ получения декзосом, характеризующийся тем, что он содержит получение популяции дендритных клеток, культивирование дендритных клеток в условиях, позволяющих продуцировать декзосомы, и обработку культурального супернатанта для получения обогащенного декзосомами биологического образца путем, по меньшей мере, одной стадии ультрафильтрации или аффинной хроматографии, и очистку декзосом способом, включающим, по меньшей мере, одну стадию анионообменной и/или гельпроникающей хроматографии, в вышеуказанных условиях.
Для осуществления этого варианта изобретения дендритные клетки предпочтительно получают из биологического образца, происходящего от субъекта, например из костного мозга или периферической крови.
В этом отношении способы получения дендритных клеток описаны в уровне техники и могут быть осуществлены специалистом. Дендритные клетки также могут быть получены из клеточных штаммов иммунной системы, из моноцитов-предшественников или еще выделены прямо в дифференцированной форме (Весне раг Най, Βίοοά, 90, 3245, 1997).
Особенно подходящая методика в рамках настоящего изобретения базируется на получении дендритных клеток из моноцитовпредшественников или костного мозга. Более предпочтительным является использование в рамках настоящего изобретения дендритных клеток, получаемых путем обработки моноцитов-предшественников, содержащихся в крови или мозге, в присутствии комбинации СМ-С8Е + 1Ь-4 или СМ-С8Е + 1Б-13.
Кроме того, для осуществления настоящего изобретения особенно предпочтительно использование популяции дендритных клеток, включающей незрелые дендритные клетки. Преимущественно используют популяцию дендритных клеток, образованную, в основном (то есть, по меньшей мере, 60%, предпочтительно 70%), незрелыми дендритными клетками.
Стадия получения дендритных клеток может преимущественно включать получение популяции дендритных клеток, включающей незрелые дендритные клетки, в особенности человека, из моноцитов-предшественников, преимущественно путем обработки с помощью комбинации цитокинов, такой как СМ-С8Е + 1Ь-4 или СМ-С8Е + 1Б-13.
Кроме того, в рамках настоящего изобретения также можно использовать популяции иммортализованных дендритных клеток. Речь может идти о линиях иммортализованных дендритных клеток (как, например, линия Ό1 или любая другая линия, получаемая путем введения канцерогена тус в дендритные клетки). Речь также может идти о полученных, затем иммортализованных ίη νίίτο дендритных клетках. Интерес к иммортализованным дендритным клеткам заключается в составлении банков клеток, сенсибилизированных с помощью данных групп антигенов, используемых в промышленности для получения декзосом, которые могут быть введены целым группам пациентов.
Для продуцирования мембранных пузырьков-декзосом дендритные клетки могут быть просто культивированы в обычных условиях, известных специалисту. Тем не менее, преимущественно эти клетки культивируют в условиях, стимулирующих продуцирование декзосом, в особенности в присутствии факторов, способных стимулировать продуцирование декзосом, в частности цитокина, такого как гаммаинтерферон, интерлейкин-10 или интерлейкин12. Согласно предпочтительному варианту осуществления способа дендритные клетки культивируют в условиях, стимулирующих продуцирование мембранных пузырьков.
С другой стороны, согласно особому варианту осуществления дендритные клетки предварительно сенсибилизируют с помощью антигена для продуцирования мембранных пузырьков. Этот вариант осуществления позволяет нагружать дендритные клетки особым антигеном (особыми антигенами) для продуцирования декзосом иммуногенного характера. Сенсибилизация может быть осуществлена с помощью различных известных способов, включающих введение в контакт клеток с антигенными пептидами, антигенами, протеиновыми комплексами, клетками или клеточными мембранами, экспрессирующими антигены, апоптотическими телами, мембранными пузырьками, липосомами, опухолевыми РНК или любой нуклеиновой кислотой, кодирующей один или несколько антигенов, антигенных детерминант или эпитопов (возможно, переносимыми вирусным или невирусным вектором), и т.д. (см., например, международную заявку 99/03499). Согласно предпочтительному варианту сенсибилизацию осуществляют путем инкубации с пептидами, антигенами, РНК или нуклеиновыми кислотами.
Настоящее изобретение может быть использовано для получения мембранных пузырьков, продуцируемых опухолевыми, особенно человеческими клетками. Речь может идти о любой клетке, происходящей из твердой или жидкой опухоли, а также из трансформированных или иммортализованных ίη νίίτο клеток. Более предпочтительно можно указать солидные, гематопоэтические или асцитные опухоли.
Особым применением настоящего изобретения является также возможность получения мембранных пузырьков, включающих одну или несколько гетерологичных, в частности рекомбинантных, молекул. Можно генетически модифицировать клетки, продуцирующие мембранные пузырьки (например, линии мастоцитов), с целью заставить экспрессировать в или на поверхности пузырьков, которые они продуцируют, представляющие интерес молекулы. Согласно настоящему изобретению можно так же очищать такие модифицированные пузырьки.
Изобретение может быть использовано для получения мембранных пузырьков, продуцируемых любым типом клеток, в особенности пузырьков экзосомного типа предпочтительно с диаметром меньше приблизительно 100 нм. Речь может идти, в частности, о клетках макрофагов, мастоцитов, ретикулоцитов и т.д. В экспериментальной части авторами настоящей заявки были использованы препараты экзосом, происходящие 1) из линий клеток, таких как линии опухолевых клеток (Т8/Л), линии мышиных дендритных клеток (01). линии мастоцитов (КВЬ), и 2) из линий человеческих дендритных клеток, происходящих от моноцитов. Полученные результаты можно прямо переносить на другие первичные культуры, такие как опухолевые клетки, человеческие дендритные клетки, В-лимфоциты и т.д., культивируемые в приемлемых для промышленности условиях. Способ согласно изобретению также может быть использован для очистки экзосом при их использовании в терапии человека.
Таким образом полученные мембранные пузырьки в зависимости от их происхождения представляют собой инструменты для изучения раковых заболеваний или регуляции иммунной системы, переноса молекул, продуцирования антител, введения метки, диагностики, составления банков, действующих начал вакцины или лекарственного средства и т.д.
Кроме того, способ согласно изобретению может быть также использован в качестве метода контролирования качества в отношении возможного присутствия загрязнителей, в частности загрязняющих протеинов в культуральной среде или в препаратах мембранных пузырьков.
Настоящее изобретение может быть также использовано для препаративного способа получения мембранных пузырьков, позволяя в аналитической системе контролировать качество препарата мембранных пузырьков, каков бы ни был способ их получения.
Следовательно, настоящее изобретение также относится к способу контроля присутствия загрязнителей, особенно протеинового или нуклеинового происхождения, в препарате мембранных пузырьков, в частности экзосом, включающему обработку фракции вышеуказанного препарата путем, по меньшей мере, одной стадии анионообменной хроматографии и выявление присутствия загрязнителей.
Изобретение также относится к анионообменной хроматографии, в особенности типа высокоэффективной жидкостной хроматографии, для получения или очистки мембранных пузырьков. Оно также относится к применению аффинной хроматографии для получения или очистки мембранных пузырьков.
Объектом изобретения являются еще мембранные пузырьки, получаемые по способу со гласно изобретению, а также любая композиция, включающая такие пузырьки.
Настоящее изобретение более полно описывается с помощью нижеследующих примеров, которые нужно рассматривать как поясняющие и не ограничивающие патентной охраны изобретения.
В дальнейшем изобретение поясняется описанием предпочтительных вариантов воплощения со ссылками на сопровождающие чертежи, где фиг. 1 изображает диаграммы элюирования после анионообменной хроматографии образца экзосом, полученных путем дифференциального центрифугирования, согласно изобретению;
фиг. 2 - визуализацию протеинового профиля различных элюированных фракций препарата экзосом путем электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (8Ό8 РАСЕ), затем окрашивание с помощью кумасси синего согласно изобретению;
фиг. 3 - диаграммы элюирования после анионообменной хроматографии эталонного раствора бычьего сывороточного альбумина согласно изобретению;
фиг. 4 - схему обработки включающего мембранные пузырьки биологического образца путем тангенциальной ультрафильтрации согласно изобретению;
фиг. 5 - общую диаграмму стадии при использовании быстропроточной колонки с носителем синий-сефароза 6 после центрифугирований при ускорениях 600 и 10000 д супернатанта декзосом согласно изобретению;
фиг. 6 - вестерн-блотирование, направленное против молекул экзосом СМН класса II, в неадсорбированной фракции и в элюате, из стадии при использовании быстропроточной колонки с носителем синий-сефароза 6 согласно изобретению;
фиг. 7 - общую диаграмму стадии с носителем 8оигсе 150 после стадии при использовании быстропроточной колонки с носителем синий-сефароза 6 согласно изобретению;
фиг. 8 - подробную диаграмму градиента элюирования для носителя 8оигсе 150 после стадии при использовании быстропроточной колонки с носителем синий-сефароза 6, увеличенное изображение прямоугольной зоны внизу справа на фиг. 7 согласно изобретению;
фиг. 9 - диаграмму очистки экзосом, получаемых из линии КВЬ ΌΚ+ (эквивалент 53 мкг протеинов) на колонке с носителем 8оигсе 150 после обработки с помощью дезоксирибонуклеазы и рибонуклеазы, согласно изобретению;
фиг. 10 - диаграмму отделения экзосом с помощью дискретного градиента №1С1 на носителе 8оигсе 150 согласно изобретению;
фиг. 11 - вестерн-блотирование, направленное против молекул человеческого СМН класса II, для каждого пика, выделенного путем
ВЭЖХ и подвергнутого ультрацентрифугированию. Положительный контроль: человеческие дендритные клетки, экспрессирующие молекулы СМН II. Отрицательный контроль: подвергнутая ультрацентрифугированию и представляющая собой фон среда. МЭД=молекулярная масса; ХА=неадсорбированная фракция согласно изобретению.
Общие методики культивирования клеток и молекулярной биологии
1. Культивирование клеток.
Линия клеток Т8/А представляет собой установленную линию мышиных клеток из спонтанной грудной карциномы. Эту линию культивировали при температуре 37°С в присутствии 5% СО2 в среде ΚРМI в присутствии 10% фетальной телячьей сыворотки (Поттк.|ие Эи1сйег).
Линии дендритных клеток выдерживали в модифицированной по способу Исков среде Дульбекко ДМИМ), содержащей 10% неактивированной фетальной телячьей сыворотки, 2 мМ Ь-глутамина, 50 мкМ 2-в-МЕ, 100 межд. ед./мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина.
2. Анализ протеинов путем электрофореза в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (8Ό8 РАСЕ).
Образец в количестве 20 мкл разводили в буфере Лэммли (Иа1ше, 227, 680-685, 1970), затем подвергали тепловой денатурации при температуре 95°С в течение 10 мин, после чего помещали на 10% акриламидные гели (Ио^ех 1 мм х 10 лунок). После миграции гели окрашивали кумасси синим.
Примеры
1. Анионообменная хроматография препарата экзосом, продуцируемых опухолевыми клетками (линия Т8/А): анализ путем 8Ό8 РАСЕ протеинового профиля различных элюированных фракций.
В этом примере поясняется, как стадия анионообменной хроматографии может позволять отделить примеси от препарата экзосом.
1.1. Протокол.
В этом эксперименте исходный материал представлял собой концентрат экзосом, полученных путем дифференциального центрифугирования из супернатанта культуры клеток Т8/А, позволяющего отделять экзосомы от клеток или клеточных остатков, присутствующих в культуральной среде. Первое центрифугирование осуществляли при низкой скорости (ускорение 300 д в течение 5 мин), чтобы осадить суспендированные клетки, находящиеся в культуральном супернатанте. Два других центрифугирования (ускорения 1200 д в течение 20 мин, затем 10000 д в течение 30 мин) позволяют осадить клеточные остатки. Таким образом осветленный супернатант подвергали ультрацентрифугированию при высоком ускорении 70000 д в течение 1 ч, позволяющему осадить экзосомы. Этот препарат промывали большим объемом солевого рас твора для повторного центрифугирования в предыдущих условиях. Осадок после центрифугирования затем обрабатывали объемом приблизительно 100 мкл солевого раствора и получали концентрированный раствор экзосом. Количество протеинов определяли по методу Вгабίοτά (Вютай, 1уту, Франция). Содержание всех протеинов в этом концентрате составляет 5001000 мкг/мл.
мкг этого препарата экзосом, разведенные с помощью 500 мкл 50 мМ буфера трис/НС1, рН=8, инжектировали в колонку, содержащую гель 8оигсе 150 (Рйаттас1а), уравновешенный с помощью 50 мМ раствора трис/НС1, рН=8. После промывки адсорбированные вещества элюировали с помощью 30 колоночных объемов линейным градиентом №1С1 от 0 до 500 мМ, затем 2М раствором №101. Элюированные фракции анализировали путем спектрофотометрии при длине волны 260-280 нм. Элюированные фракции объединяли в виде 5 основных фракций (Р1-Р5), чтобы можно было анализировать соответствующую протеиновую диаграмму. Протеины каждой фракции подвергали осаждению с помощью 1/10 объема раствора 100%ной трихлоруксусной кислоты, затем промывали раствором ацетона. Протеиновые осадки после центрифугирования обрабатывали с помощью 20 мкл раствора Лэммли и помещали на акриламидный гель 8Ό8 РАСЕ, который затем окрашивали кумасси синим.
1.2. Результаты.
Диаграммы элюирования при 260-280 нм представлены на фиг. 1. Диаграммы показывают наличие трех различных симметричных пиков, элюированных с помощью концентраций соли, соответствующих 105 мМ, 400 мМ и 2М ΝιΟ1.
Анализ протеиновой диаграммы фракций, соответствующих различным пикам, показывает, что элюированный с помощью 400 мМ раствора ΝιΟ1 пик имеет протеиновую диаграмму, идентичную препарату экзосом, полученному классически путем центрифугирования (фиг. 2). Соотношение между величинами абсорбции при 260 и 280 нм, составляющее 0,8, сравнимо с описанным для протеинов.
Пик (фракция Р2), полученный путем элюирования с помощью 105 мМ раствора ИаС1, взамен имеет другую протеиновую диаграмму, показывающую только две различные полосы. Измерения абсорбции при 260 и 280 нм дают соотношение 1/6, которое может говорить о наличии ассоциации нуклеиновых кислот и протеинов.
Фракция Р5, элюированная с помощью 2 М раствора ИаС1, соответствует биологическим соединениям, в высокой степени ассоциированным с колонкой.
Следовательно, можно отделять экзосомы от примесей путем стадии анионообменной хроматографии.
2. Анионообменная хроматография эталонного раствора бычьего сывороточного альбумина.
Этот способ анионообменной хроматографии также позволяет оценивать степень загрязнения препарата экзосом протеинами, присутствующими в культуральной среде. При хроматографировании 10 мкг раствора бычьего сывороточного альбумина, соответствующего мажоритарному протеину культуральной среды, было показано, что этот протеин элюируется с помощью 205 мМ раствора ΝιΟ1 в виде узкого пика, отличимого от вышеописанных пиков для экзосом.
3. Обработка содержащего экзосомы культурального супернатанта путем ультрафильтрации.
Этот пример показывает, что можно концентрировать экзосомы путем ультрафильтрации. Кроме того, экзосомальный препарат обеднен загрязняющим протеином, таким как бычий сывороточный альбумин (В8А).
3.1. Протокол: (фиг. 4).
150 мл супернатанта культуры клеток, полученного после центрифугирования при 300 д клеток Т8А, подвергали фильтрации через фильтр с пористостью 0,22 мкм (Мййроте). Фильтрат разводили наполовину с помощью забуференного фосфатом физиологического раствора (РВ8). Полученные в результате 300 мл раствора фильтровали тангенциально при использовании кассеты для фильтрации (10 см2 мембраны) с порогом разрыва 300000 Да (8айоПИ8).
3.2. Результаты.
После фильтрации в течение 1 ч получали 7 мл ретентата. Ретентат подвергали ультрацентрифугированию (79000 д) для осаждения и анализа экзосом. Путем анализа с помощью 8Э8РАСЕ с последующим окрашиванием кумасси синим обнаружено, что образец содержал значительно меньше бычьего сывороточного альбумина (В 8А), чем подвергнутый ультрафильтрации раствор. Кроме того, наблюдали специфические протеиновые полосы экзосом, полученных из Т8А.
Ультрафильтрация, следовательно, может быть использована в способе очистки экзосом, чтобы отделить их от загрязняющих протеинов.
4. Очистка с помощью ВЭЖХ человеческих экзосом, продуцируемых происходящими от моноцитов человеческими дендритными клетками (ΜΌΌ0).
4.1. Материалы и методы.
Буферные и маточные растворы
Обычно работают при использовании маточных растворов, профильтрованных через фильтр 0,22 мкм, за исключением воды и раствора гидроксида натрия. Первым буферным раствором является 100 мМ раствор бис-триспропана (81дта; 99% чистоты), забуференный при рН=6; этот буферный раствор использовали на пути А хроматографа (ВюСаб δρτίηΐ, РетктЕ1тег). Вторым буферным раствором является 100 мМ раствор бис-трис-пропана, забуференный при рН=9; этот буферный раствор использовали на пути В хроматографа. Воду получали при пропускании через смолу с помощью системы МШКЦ с сопротивлением 18 МОм-см; воду использовали на пути С. На пути Ό использовали маточный 3М раствор хлорида натрия (ЫаС1, Рго1аЬо, 99,5 % чистоты). На пути Е использовали 0,1М раствор гидроксида натрия (ΝαΟΗ, Рго1аЬо, 98% минимальной чистоты). Путь Е использовали для загрузки культуральных супернатантов в колонки.
Все буферные растворы получали при использовании воды, получаемой с помощью системы Μί11ί-Ο; буферные растворы не дегазировали.
Колонки
Быстропроточная колонка с носителем синий-сефароза (Рйаттас1а)
Первую стадию осуществляли при использовании быстропроточной колонки с носителем синий-сефароза 6 (Рйатташа). Матрицей является агароза, связанная с синим 36 (7%); быстропроточная колонка с носителем синийсефароза 6. Размер частиц составляет 45-165 мкм. Максимальная линейная пропускная способность составляет 750 см/ч. Гель является стабильным при значениях рН в диапазоне 4-12. При предельных значениях рН, составляющих 2 и 14, гель может быть поврежден, что вызывает уменьшение фиксирующей способности (нарушение связи с носителем синий-сефароза 6 быстропроточной колонки) и повышение давления (образование концов).
Носитель быстропроточной колонки синий-сефароза 6 специфичен к таким компонентам, как альбумин, киназы, дегидрогеназы и другие ферменты, содержащие кофакторы, как ΝΑΌ+, факторы коагуляции, интерфероны и липопротеины.
Теоретическая фиксирующая способность носителя синий-сефароза 6 быстропроточной колонки составляет 15-20 мг сывороточного альбумина на мл геля.
Используемый объем колонки составляет приблизительно 5,5 мл геля (С10/10, Рйатташа), или теоретическая фиксирующая способность составляет 80-110 мг сывороточного альбумина. Используемая пропускная способность составляет 2 мл/мин (150 см/ч) на ВюСаб δρτίηΐ и 3,5 мл/мин (260 см/ч) при использовании детектирующей системы Рйаттааа. Давление не превышает 2,5 бар и, по существу, обязано кюветам для измерения оптической плотности (ΌΟ).
Колонка с носителем 8оитсе 15Ц
Вторую стадию осуществляли при использовании колонки с 8оитсе 15Ц (Рйатташа), сильным анионообменником. Матрицей является сшитый с дивинилбензолом полистирол. Размер шариков составляет 15 мкм и является од нородным. Шарики пропускали через сетку с порами размером, изменяющимся от 20 до 1000 нм. Эти гели очень устойчивы к давлению и обладают значительными линейными пропускными способностями (1800 см/ч и более), полностью сохраняя разрешающую способность и удовлетворительную емкость. Это стало возможным благодаря однородности шариков и их пористости, которые увеличивают доступ молекул к функциональным группам.
Гель является стабильным при значениях рН от 2 до 12, за пределами которых гель подвергается опасности значительных повреждений, которые уменьшают его емкости.
Теоретическая фиксирующая способность этого ионообменника составляет приблизительно 25 мг протеинов на мл геля. Используют колонку объемом 0,8 мл (РЕЕК колонка с внутренним диаметром 4,6 мм и длиной 50 мм, Регкт-Е1тет), или максимальная емкость составляет 20 мг протеинов. Реальная емкость, которая позволяет сохранять хорошее разрешение, составляет величину порядка 10% от этой максимальной емкости, или 2 мг протеинов. Используемая пропускная способность составляет 5 мл/мин (1880 см/ч) и позволяет осуществлять быстрое разделение. Колонка заполнена с помощью системы Роток ке1Е Расг со скоростью 15 мл/мин и при давлении 150 бар.
Хроматограф (ВюСаб δρτίηΐ)
ВюСаб представляет собой систему ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография), которая позволяет работать при высоких давлениях (максимально 204 бара) и с высокими пропускными способностями, составляющими от 0,2 до 60 мл/мин. Можно использовать вплоть до 6 буферных растворов (на деле использовали 6 путей), и система может быть обработана с помощью 0,1М раствора гидроксида натрия (рН=12) для депирогенизации фитингов и колонки.
Разделения могут быть реализованы при комнатной температуре или при температуре 4°С. Образцы загружали либо доступными путями, либо через инжекционные петли для маленьких объемов от 100 мкл до 5 мл. В системе для детектирования используется УФ-кювета двойного пути определения: при 190-450 нм для УФ-области и 366-700 нм для видимой области. Обычно проводят детектирование при 254 нм для нуклеиновых кислот и детектирование при 280 нм для протеинов. Ими являются аминокислоты с бензольным циклом, такие как тирозины, триптофаны и фенилаланины, которые поглощают. Систему полностью контролировали (программное обеспечение, разработанное фирмой Реткресбуе Вюкуйет). Для каждого разделения можно контролировать все параметры - давление, расход, удельную электропроводность, оптическую плотность, рН и т.д. Наконец, подвергнутый разделению образец либо улавливали в пробирку Еа1соп емкостью 50 мл, либо соби рали в силиконизированные пробирки Эппендорфа (коллектор АбтаЩес 8Р-2120) для минимизации неспецифических взаимодействий.
Получение экзосом из дендритных клеток
Сначала получали дендритные клетки из моноцитарных предшественников периферической крови. Выделенные моноциты культивировали в присутствии комбинации СМ-С8Р и 1Ь13 или 1Ь-4. Для получения экзосом предпочтительно использовали популяцию незрелых дендритных клеток.
4.2. Стадия при использовании быстропроточной колонки с носителем синий-сефароза 6.
Культуральные супернатанты центрифугировали 2 раза при ускорении 600 д и 1 раз при ускорении 10000 д перед введением в быстропроточную колонку с носителем синийсефароза 6.
Используют колонку объемом 5,5 мл, пропускная способность составляет 2 мл/мин, (линейная пропускная способность составляет 150 см/ч; время контакта 2,7 мин), давление составляет величину порядка 2,5 бар (фиг. 5). Колонку уравновешивали буфером 12 мМ ВТР, 10 мМ №1С1 и рН=7. После уравновешивания в колонку загружали супернатант, затем ее промывали тем же самым буфером для уравновешивания вплоть до снижения снова оптической плотности. Элюирование фиксированных протеинов осуществляли с помощью буфера 12 мМ ВТР, 1,5М ЫаС1 и рН=7 (в количестве 3-4 объемов колонки). Колонку регенерировали путем пропускания воды (в количестве 2-3 объемов колонки), затем пропускали 2 объема 0,1М раствора гидроксида натрия (рН=12), наконец, колонку уравновешивали с помощью буфера 12 мМ ВТР, 150 мМ ЫаС1 и рН=7.
Количественный и качественный аспект стадии при использовании быстропроточной колонки с носителем синий-сефароза 6
Как указано выше, стадия при использовании быстропроточной колонки с носителем синий-сефароза 6 является специфической по отношению к протеинам, как альбумин, который представляет собой основной загрязнитель культурального супернатанта. Определяют концентрацию протеинов в каждой фракции стадии при использовании быстропроточной колонки с носителем синий-сефароза 6 по методике Вютаб (измерение оптической плотности при 600 нм). Результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1 Концентрации протеинов в каждой фракции стадии при использовании быстропроточной колонки
| с носителем синий-се( | ароза 6 | |||
| Супер натант | Не адсорбировано | Пик элюирования | Пик регенерации | |
| Концентрация протеина, мг/мл | 3,69 | 0,18 | 3,32 | 1,48 |
| Объем, мл | 25 | 37,5 | 20 | 20 |
| Общее количество протеинов, мг | 92,2 | 6,7 | 66,4 | 29,6 |
| Выход, % | 100 | 7,3 | 72 | 32,1 |
Основная часть протеинов находится либо в элюате (72%), либо в регенерированной фракции (32%). Неадсорбированная фракция содержит только 7-10% по отношению к общему количеству протеинов, загруженных в быстропроточную колонку с носителем синий-сефароза 6. Стадия является специфичной к основным загрязнителям супернатанта. Для подтверждения этой специфичности носителя синий-сефароза 6 быстропроточной колонки каждую фракцию помещали на гель 8Ό8ΡΑΟΕ при восстановительном условии и окрашивали с помощью нитрата серебра. Перегрузка колонки (50 мл супернатанта, загруженные в быстропроточную колонку с носителем синий-сефароза 6 объемом 5,5 мл) позволила рассчитать максимальное количество протеинов в культуральном супернатанте, которое можно вводить в колонку на мл геля (табл. 2) . В этом случае процент в неадсорбированной фракции составляет от 7 до более 30% по отношению к количеству загруженного протеина. Эта величина составляет 16-18 мг протеинов на мл геля синий-сефароза 6 быстропроточной колонки. В заключение, 1 мл геля синий-сефароза 6 быстропроточной колонки позволяет очищать около 5-6 мл культурального супернатанта (А1МУ 2,5% Н8А). Эта величина важна для изучения увеличения масштаба, так как он определяет размер используемой колонки и, следовательно, стоимость этой стадии.
Таблица 2
Изучение перегрузки носителя синий-сефароза 6 быстропроточной колонки в первой стадии
| Супернатант | Не адсорбировано | Пик элюирования | Пик регенерации | |
| Концентрация протеина, мг/мл | 3,02 | 0,87 | 3 | 1,56 |
| Объем, мл | 50 | 60 | 20 | 20 |
| Общее количество протеинов, мг | 151 | 52,2 | 60 | 31,2 |
| Выход, % | 100 | 34,6 | 39,7 | 20,6 |
Как ожидалось, основным загрязнителем культуральных супернатантов после центрифугирований при 600 и 10000 д является альбумин. Этот загрязнитель после фиксации на носителе синий-сефароза 6 быстропроточной колонки снова обнаруживают во фракциях элюата и регенерации. Кроме этого загрязнителя, снова обнаруживают многочисленные другие загрязнители с низкими и высокими молекулярными массами.
Стадия при использовании быстропроточной колонки с носителем синий-сефароза 6 позволяет удалять около 90-95 % загрязнителей из культурального супернатанта. Экзосомы находятся в не адсорбированной на носителе синийсефароза 6 быстропроточной колонки фракции (фиг. 6).
4.3. Стадия с использованием анионообменника 8оитсе 150 (Рйатташа).
Используют колонку с носителем 8оитсе 150 объемом 0,8 мл с пропускной способно стью 5 мл/мин (линейная пропускная способность 1880 см/ч, время контакта 0,1 мин) при давлении порядка 50 бар. Неадсорбированную на носителе синий-сефароза 6 быстропроточной колонки фракцию загружали прямо в колонку с Зоигсе 150 (фиг. 7) без изменений концентрации соли (ЫаС1) или рН.
После стадии фиксации колонку промывали буферным раствором 12 мМ ВТР, 280 мМ №С1 с рН=7 (35 объемов колонки) вплоть до снижения снова оптической плотности до значений, близких к 0. Осуществляли вторую стадию промывки при использовании концентрации соли 150 мМ ЫаС1 (10 объемов колонки) для усиления взаимодействий экзосом с носителем.
Реализовывали первый градиент от 150 до 420 мМ №1С1 в количестве 7 объемов колонки (фиг. 8), затем градиент прекращали вводить в течение 9 объемов колонки. Второй градиент начинали от 420 мМ ЫаС1 вплоть до 1М ЫаС1 в 25 объемах колонки. Экзосомы элюировали с помощью второго градиента в виде двух пиков при 550 мМ и 700 мМ ЫаС1 (фиг. 8). Колонку регенерировали путем пропускания воды в количестве 10 объемов колонки, затем 0,1М раствора гидроксида натрия (рН=12) в количестве 10 объемов колонки и, наконец, путем пропускания 3М раствора ЫаС1 в количестве 10 объемов колонки. Колонку затем уравновешивали с помощью буфера 12 мМ ВТР, 150 мМ ЫаС1, рН=7.
Количественные и качественные аспекты стадии с 8оитее 150
Как можно видеть на фиг. 6, основная часть протеинов не адсорбированной на носителе синий-сефароза 6 быстропроточной колонки фракции не была удержана колонкой. Концентрации протеинов измеряли путем теста ВютаБ (абсорбция при оптической плотности при 600 нм), и они представлены в табл. 3.
Таблица 3 Количественные аспекты стадии с Зоигсе 15ф после стадии при использовании быстропроточной колонки с носителем синий-сефароза 6
| Начало (не адсорбировано на носителе синий-сефароза 6 быстропроточной колонки) | Не адсорбировано на Зоигсе 150 | Фракции элюата 4-6 | Фракции элюата 19-23 | |
| Протеины, мг/мл | 0,17 | 0,14 | 0,01 | 0,02 |
| Объем, мл | 85 | 98 | 3 | 5 |
| Общие протеины, мг | 14,45 | 13,72 | 0,03 | 0,10 |
| Выход, % | 100 | 94,9 | 0,2 | 0,8 |
95% протеинов, загруженных в колонку с Зоигсе 15Ю, не удержаны. Объединенные фракции 4-6 и объединенные фракции 19-23 составляют около 1,5%. Фракцию регенерации не анализировали. Выход очень близок к 100%. Все количество загруженных протеинов и пузырьков элюировало из колонки. В отношении на грузки протеинами колонки носитель Зоигсе 150 способен фиксировать около 25 мг протеинов (данные изготовителя), или на 0,8 мл 20 мг протеинов. Ясно, что это очень далеко от максимума колонки и с хорошим разрешением согласуются 5-10%, поскольку эти величины находятся между 1 и 2 мг протеинов. В этих условиях с помощью колонки объемом 0,8 мл с носителем Зоигсе 150 можно очищать 200-400 мл культурального супернатанта.
Каждый пик элюирования ультрацентрифугировали (100000 д в течение 1 ч) и объединяли для наблюдения с помощью электронного микроскопа. Первый пик (элюированный между 150 и 420 мМ ЫаС1) содержит, главным образом, протеины, клеточные остатки и несколько пузырьков, маркированных антителом против СМН II.
Второй пик (элюированный с помощью 550 мМ №1С1). обработанный таким же образом, показывает менее значительный фон, намного большее число пузырьков, маркированных антителом против СМН II, имеется также неоднородность по размеру пузырьков.
Третий пик (элюированный с помощью 700 мМ ЫаС1) не имеет больше фона, пузырьки практически все маркированы антителом против СМН II и намного более однородны по размеру.
Эти две фракции (пик 2 и пик 3) сравнивали с тем, что получают путем классического способа очистки с помощью ультрацентрифугирования. В этом случае наблюдают значительный фон и большую неоднородность пузырьков по сравнению с пиками, полученными путем хроматографии. Более того, по-видимому, существует разделение между остатками и очищенными с помощью ВЭЖХ экзосомами, что не происходит в случае ультрацентрифугирования.
4.4. Выводы.
За счет двух стадий хроматографии, причем в первой используют отрицательную селекцию (стадия при использовании быстропроточной колонки с носителем синий-сефароза 6) экзосом, во второй - положительную селекцию и селективное элюирование экзосом (стадия с носителем Зоигсе 150), удаляют около 99-99,5% протеинов из культурального супернатанта, полностью сохраняя экзосомы. Способ сохраняет целостность экзосом, как показывает электронная микроскопия. Этот способ, следовательно, является специфическим для очистки экзосом.
В качестве примера могут быть использованы другие колонки, удерживающие сывороточные протеины. Кроме того, вместо колонки с носителем Зоигсе 150 могут быть использованы колонки с катионными макропористыми носителями.
5. Очистка путем ВЭЖХ экэосом, получаемых из линии ЯВЬ (базофильный лейкоз крысы).
Экзосомы получали из линии ЯВЬ (базофильный лейкоз крысы), стабильно трансфекти рованной для экспрессирования мембраной экзосом молекул человеческого СМН II. После индукции с помощью ионофора (иономицина) клетки подвергают дегрануляции и высаливают экзосомы в среде без протеинов (ΚΡΜΙ). После удаления клеток путем центрифугирования при 600 д в течение 10 мин супернатанты рекуперировали и обрабатывали с помощью дезоксирибонуклеазы (Б1дта) и рибонуклеазы (Б1дта).
Обработанные супернатанты затем центрифугировали при 10000 д при температуре 37°С в течение 30 мин, затем при 100000 д в течение 1 ч.
Осадок после ультрацентрифугирования загружали в ионообменную колонку с носителем Боигсе 150. Рйаттас1а (фиг. 9). Использовали колонку объемом 0,8 мл с пропускной способностью 5 мл/мин (линейная пропускная способность 1880 см/ч, время контакта 0,1 мин).
Колонку уравновешивали буфером 12 мМ бис-трис-пропана (ВТР), 150 мМ ИаС1 и рН=7. После загрузки образца колонку промывали с помощью того же самого буфера для уравновешивания в количестве 15-20 объемов колонки. Элюирование осуществляли с помощью 25 объемов колонки, изменяя концентрацию соли от 150 мМ до 1М №101, значение рН поддерживали постоянным (фиг. 9). Среда очень мало загрязнена протеинами, так как клетки промывали в забуференном фосфатом физиологическом растворе, и индукцию, а также высаливание экзосом осуществляли в одной среде ΚΡΜΙ. Это подтверждено слабой абсорбцией, наблюдаемой (при 280 и 254 нм) в не адсорбированной на Боигсе 150 фракции. Присутствие экзосом подтверждено путем вестерн-блотирования, направленного против молекул СМН II (фиг. 11), после разделения пиков за счет операций с ΝιΟ1 (фиг. 10) и ультрацентрифугирования каждого пика.
Наблюдают три пика плюс неадсорбированную фракцию: первый пик, элюированный с помощью 350 мМ раствора №С1; второй пик, элюированный с помощью 700 мМ раствора №01: и, наконец, третий пик, элюированный с помощью 1,5М раствора ΝιΟ1. Преобладающим является пик, элюированный с помощью 700 мМ раствора ИаС1. В случае вестерн-блотирования, направленного против молекул человеческого СМН II, находят сигнал в пике 1 (350 мМ: ΝιΟ1) и в пике 2 (700 мМ ΝιΟ1).
Нужно заметить, что пик 1, который имеет интенсивность сигнала протеинов в 7-8 раз меньше, чем пик 2, имеет сигнал при вестернблотировании, эквивалентный таковому пика 2. Это может отражать более высокую чистоту пика 1. Для подтверждения этого факта пики ультрацентрифугировали и наблюдали с помощью электронного микроскопа.
Пик 1 очень обогащен экзосомами, маркированными антителом против человеческого СМН II, у него незначительный или вообще от сутствует фон. Экзосомы являются неоднородными по размеру, по-видимому, здесь нет разделения экзосом по их размеру, а имеет место специфический механизм конкуренции между элюентом (ΝιΟ1) и экзосомами.
Фракции, находящиеся между двумя пиками, анализировали с помощью электронной микроскопии. В них находят мало экзосом при более значительном фоне, чем в пике 1.
Пик 2 очень похож на фракции, находящиеся между двумя пиками, находят мало экзосом и более значительный фон.
Выводы
Носитель Боигсе 15р способен удерживать экзосомы и отделять возможные загрязнители (фиг. 9). Преобладающее большинство экзосом элюировали в одном и том же пике с помощью 350 мМ раствора ΝιΟ1. При исследовании с помощью электронной микроскопии экзосомы представляются нормальными со специфической маркировкой молекул человеческого СМН II. Неоднородность размера экзосом (пик 1), повидимому, указывает на то, что разделение основано на ионных обменах, а не на просеивании. Носитель Боигсе 150 может быть использован для стадии очистки экзосом из КВЬ.
Claims (22)
- ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ1. Способ получения мембранных пузырьков из биологического образца, включающий отделение пузырьков от биологических загрязняющих компонентов, отличающийся тем, что отделение пузырьков осуществляют путем анионообменной хроматографии.
- 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что он содержит, по меньшей мере, одну стадию хроматографии, в которой используют сильный анионообменник.
- 3. Способ по любому из пп.1 и 2, отличающийся тем, что он содержит, по меньшей мере, одну стадию анионообменной и гельпроникающей хроматографии.
- 4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что биологическим образцом является образец, выбранный из группы, состоящей из биологической жидкости, культурального супернатанта, клеточного лизата или предварительно очищенного раствора.
- 5. Способ очистки мембранных пузырьков из биологического образца, отличающийся тем, что он содержит, по меньшей мере, одну стадию обогащения образца мембранными пузырьками и одну стадию обработки образца путем анионообменной хроматографии и/или гельпроникающей хроматографии.
- 6. Способ по п.5, отличающийся тем, что он содержит культивирование популяции клеток, продуцирующих мембранные пузырьки (например, экзосомы), в условиях, позволяющих пузырькам высвобождаться, стадию обогащения образца мембранными пузырьками и стадию обработки образца путем анионообменной хроматографии и/или гельпроникающей хроматографии.
- 7. Способ по любому из пп.5 или 6, отличающийся тем, что стадия обогащения включает стадию осветления и последующую стадию концентрирования.
- 8. Способ по любому из пп.5-7, отличающийся тем, что стадия обогащения включает стадию аффинной хроматографии, предпочтительно с красителем.
- 9. Способ по любому из пп.7 или 8, отличающийся тем, что стадия обогащения включает стадию центрифугирования со слабой скоростью и/или фильтрацию.
- 10. Способ по любому из пп.7-9, отличающийся тем, что стадия обогащения включает, по меньшей мере, одну стадию ультрафильтрации, в частности тангенциальной ультрафильтрации.
- 11. Способ получения мембранных пузырьков, отличающийся тем, что он содержит культивирование популяции клеток, продуцирующих мембранные пузырьки экзосомы, в условиях, позволяющих пузырькам высвобождаться, обработку культурального супернатанта для получения биологического образца, обогащенного мембранными пузырьками экзосомами, путем, по меньшей мере, одной стадии ультрафильтрации или аффинной хроматографии, при этом отделение пузырьков от биологических загрязняющих компонентов осуществляют путем анионообменной и/или гельпроникающей хроматографии.
- 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что он включает стадию фильтрации полученного материала.
- 13. Способ по любому из пп.1-12, отличающийся тем, что мембранные пузырьки имеют диаметр приблизительно 60-90 нм.
- 14. Способ по любому из пп.1-13, отличающийся тем, что мембранные пузырьки представляют собой пузырьки, продуцируемые антигенпредставляющими клетками, в частности дендритными клетками, В-лимфоцитами, макрофагами или мастоцитами.
- 15. Способ по п.14, отличающийся тем, что мембранные пузырьки представляют собой пу зырьки, продуцируемые дендритными, в частности человеческими клетками.
- 16. Способ по любому из пп.1-13, отличающийся тем, что мембранные пузырьки представляют собой пузырьки, продуцируемые опухолевыми, особенно человеческими клетками.
- 17. Способ получения мембранных пузырьков из биологического образца, включающий отделение пузырьков от биологических загрязняющих компонентов, отличающийся тем, что осуществляют получение популяции дендритных клеток, культивирование дендритных клеток в условиях, позволяющих продуцировать мембранные пузырьки, при этом отделение пузырьков от биологически загрязняющих компонентов осуществляют путем, по меньшей мере, одной стадии анионообменной хроматографии.
- 18. Способ получения мембранных пузырьков из биологического образца, включающий отделение пузырьков от биологических загрязняющих компонентов, отличающийся тем, что осуществляют получение популяции дендритных клеток, культивирование дендритных клеток в условиях, позволяющих продуцировать мембранные пузырьки, обработку культурального супернатанта для получения биологического образца, обогащенного мембранными пузырьками путем, по меньшей мере, одной стадии ультрафильтрации или аффинной хроматографии, при этом отделение пузырьков от биологически загрязняющих компонентов осуществляют путем, по меньшей мере, одной стадии анионообменной и/или гельпроникающей хроматографии.
- 19. Способ по любому из пп.17 или 18, отличающийся тем, что дендритные клетки получают из биологического образца, происходящего от субъекта - из костного мозга или периферической крови.
- 20. Способ по любому из пп.17-19, отличающийся тем, что дендритные клетки являются незрелыми.
- 21. Способ по любому из пп.17-20, отличающийся тем, что дендритные клетки сенсибилизируют антигеном до продуцирования мембранных пузырьков.
- 22. Способ по любому из пп.17-21, отличающийся тем, что во время культивирования дендритные клетки культивируют в условиях, стимулирующих продуцирование мембранных пузырьков.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR9900886A FR2788780B1 (fr) | 1999-01-27 | 1999-01-27 | Procede de preparation de vesicules membranaires |
| PCT/FR2000/000105 WO2000044389A2 (fr) | 1999-01-27 | 2000-01-19 | Procede de preparation de vesicules membranaires |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| EA200100819A1 EA200100819A1 (ru) | 2001-12-24 |
| EA003235B1 true EA003235B1 (ru) | 2003-02-27 |
Family
ID=9541269
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| EA200100819A EA003235B1 (ru) | 1999-01-27 | 2000-01-19 | Способ получения мембранных пузырьков |
Country Status (11)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US6899863B1 (ru) |
| EP (1) | EP1143982A2 (ru) |
| JP (1) | JP2002535665A (ru) |
| CN (1) | CN1355704A (ru) |
| AU (1) | AU768322B2 (ru) |
| CA (1) | CA2360752A1 (ru) |
| EA (1) | EA003235B1 (ru) |
| FR (1) | FR2788780B1 (ru) |
| HK (1) | HK1042647A1 (ru) |
| IL (1) | IL143692A0 (ru) |
| WO (1) | WO2000044389A2 (ru) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2608509C1 (ru) * | 2016-02-11 | 2017-01-18 | Елена Сергеевна Кастарнова | Способ получения экзосом из крови |
| CN109856259A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-06-07 | 南通大学附属医院 | 一种血清胰腺癌外泌体特异蛋白及其再验证过程 |
Families Citing this family (105)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2002331244B2 (en) | 2001-08-17 | 2007-02-15 | Exothera L.L.C. | Methods and compounds for the targeting of protein to exosomes |
| WO2005121369A2 (en) * | 2004-06-02 | 2005-12-22 | Sourcepharm, Inc. | Rna-containing microvesicles and methods therefor |
| US8021847B2 (en) | 2004-06-02 | 2011-09-20 | Proxy Life Science Holdings, Inc. | Microvesicle-based compositions and methods |
| US8758991B2 (en) * | 2006-04-26 | 2014-06-24 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Isolation of membrane vesicles from biological fluids and methods of using same |
| BRPI0806436A2 (pt) * | 2007-01-26 | 2011-09-06 | Univ Lousville Res Foundation Inc | modificação de componentes exossomais para uso como uma vacina |
| US20100255514A1 (en) | 2007-08-16 | 2010-10-07 | The Royal Institution For The Advancement Of Learning/Mcgill University | Tumor cell-derived microvesicles |
| EP2696203A3 (en) | 2007-08-16 | 2014-05-28 | The Royal Institution for the Advancement of Learning/McGill University | Tumor cell-derived microvesicles |
| EP4219762A1 (en) | 2008-02-01 | 2023-08-02 | The General Hospital Corporation | Use of microvesicles in diagnosis and prognosis of medical diseases and conditions |
| US20220162704A1 (en) * | 2008-02-01 | 2022-05-26 | The General Hospital Corporation | Methods of preparing microvesicle micrornas from bodily fluids |
| WO2014057128A2 (en) | 2012-10-11 | 2014-04-17 | Vin-De-Bona Trading Company Pte Ltd | Method of painting microvesicles |
| US11266736B2 (en) | 2008-04-17 | 2022-03-08 | Vin De Bona Trading Company Pte Ltd | Method of painting micro vesicles |
| CA2742324A1 (en) | 2008-10-30 | 2010-06-03 | Caris Life Sciences Luxembourg Holdings, S.A.R.L. | Methods for assessing rna patterns |
| GB2463401B (en) | 2008-11-12 | 2014-01-29 | Caris Life Sciences Luxembourg Holdings S A R L | Characterizing prostate disorders by analysis of microvesicles |
| EP2454588B1 (en) | 2009-07-16 | 2015-07-15 | The General Hospital Corporation | Nucleic acid analysis |
| EP2475988B1 (en) | 2009-09-09 | 2018-11-14 | The General Hospital Corporation | Use of microvesicles in analyzing nucleic acid profiles |
| US20130029339A1 (en) | 2009-09-09 | 2013-01-31 | The General Hospital Corporation | Use of microvesicles in analyzing kras mutations |
| JP5892939B2 (ja) | 2009-11-02 | 2016-03-23 | エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ | 細胞状態をモニタリングするための方法及び間葉系幹細胞を不死化するための方法 |
| WO2011066589A1 (en) | 2009-11-30 | 2011-06-03 | Caris Life Sciences Luxembourg Holdings | Methods and systems for isolating, storing, and analyzing vesicles |
| WO2011097480A1 (en) * | 2010-02-05 | 2011-08-11 | University Of Louisville Research Foundation, Inc. | Exosomal compositions and methods for the treatment of disease |
| CA2791905A1 (en) | 2010-03-01 | 2011-09-09 | Caris Life Sciences Luxembourg Holdings, S.A.R.L. | Biomarkers for theranostics |
| AU2011237669B2 (en) | 2010-04-06 | 2016-09-08 | Caris Life Sciences Switzerland Holdings Gmbh | Circulating biomarkers for disease |
| ES2624284T3 (es) | 2010-07-07 | 2017-07-13 | Aethlon Medical Inc | Métodos para cuantificar exosomas |
| US20140045915A1 (en) | 2010-08-31 | 2014-02-13 | The General Hospital Corporation | Cancer-related biological materials in microvesicles |
| US20130295574A1 (en) | 2010-11-10 | 2013-11-07 | Exosome Diagnostics, Inc. | Method for Isolation of Nucleic Acid Containing Particles and Extraction of Nucleic Acids Therefrom |
| US20140004601A1 (en) * | 2010-12-20 | 2014-01-02 | Agency For Science, Technology And Research | Method of purifying exosomes |
| AU2012253366A1 (en) | 2011-05-11 | 2014-01-09 | Exosome Diagnostics, Inc. | Nucleic acid extraction from heterogeneous biological materials |
| CA2839896A1 (en) | 2011-06-21 | 2012-12-27 | Alnylam Pharmaceuticals, Inc. | Assays and methods for determining activity of a therapeutic agent in a subject |
| GB201110777D0 (en) * | 2011-06-24 | 2011-08-10 | Aqua Bio Technology Asa | Methods and uses |
| GB201110783D0 (en) | 2011-06-24 | 2011-08-10 | Aqua Bio Technology Asa | Methods and uses |
| ES2395793B1 (es) * | 2011-07-28 | 2013-12-27 | Consejo Superior De Investigaciones Científicas (Csic) | Procedimiento de obtención y usos de vesículas de membrana de un organismo marino para su utilización industrial. |
| EP3492606B1 (en) | 2011-08-22 | 2023-10-04 | Exosome Diagnostics, Inc. | Urine biomarkers |
| US10174361B2 (en) | 2011-11-10 | 2019-01-08 | Exosome Diagnostics, Inc. | Cerebrospinal fluid assay |
| EP2785839A2 (en) | 2011-11-30 | 2014-10-08 | University of Bremen | Expression of mirnas in placental tissue |
| CN103479682B (zh) * | 2012-06-14 | 2015-03-11 | 苏州恒宇生物科技有限公司 | 一种植物来源活性成分-纳米级膜性囊泡的制备方法 |
| US10488403B2 (en) * | 2012-07-19 | 2019-11-26 | Atlantic Cancer Research Institute | Method for the isolation of microvesicles |
| EP2877187B1 (en) * | 2012-07-19 | 2019-06-12 | Reneuron Limited | Stem cell microparticles |
| EP2885414B1 (en) | 2012-08-15 | 2020-09-23 | The University of Chicago | Exosome-based therapeutics against neurodegenerative disorders |
| EP2890783A4 (en) | 2012-08-30 | 2016-03-02 | Exosome Diagnostics Inc | CONTROLS FOR NUCLEIC ACID TESTS |
| CN105025878A (zh) | 2012-10-03 | 2015-11-04 | 外来体诊断公司 | 微泡在医学疾病和病况的诊断、预后和治疗中的用途 |
| US10942184B2 (en) | 2012-10-23 | 2021-03-09 | Caris Science, Inc. | Aptamers and uses thereof |
| CN105026911B (zh) | 2013-01-03 | 2019-01-22 | 外来体诊断公司 | 用于分离微囊泡的方法 |
| WO2014152873A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Pioma Inc. | Microvesicle histone h2ax as a biomarker for genotoxic stress |
| ES2662326T5 (es) * | 2013-04-12 | 2021-08-04 | Evox Therapeutics Ltd | Vesículas de suministro terapéutico |
| RU2668164C2 (ru) | 2013-08-06 | 2018-09-26 | Эксосам Дайэгностикс, Инк. | Когорты биомаркеров мочи, профиль экспрессии генов и способы их применения |
| GB201317887D0 (en) | 2013-10-09 | 2013-11-20 | Reneuron Ltd | Product |
| EP3039174B1 (en) | 2013-08-28 | 2019-10-16 | Caris Science, Inc. | Oligonucleotide probes and uses thereof |
| EP3052616A4 (en) * | 2013-10-02 | 2017-03-29 | Paradigm Biopharmaceuticals Limited | A method of producing exosomes |
| JP6547625B2 (ja) | 2013-10-25 | 2019-07-24 | 凸版印刷株式会社 | 膜小胞回収デバイス、膜小胞回収方法、及び膜小胞分析方法 |
| FR3014198B1 (fr) * | 2013-12-03 | 2017-03-03 | Biomerieux Sa | Procede d'isolement d'exosomes |
| US9982233B2 (en) | 2013-12-12 | 2018-05-29 | Samsung Life Public Welfare Foundation | Method for promoting generation of stem cell-derived exosome by using thrombin |
| US9919011B2 (en) | 2014-03-18 | 2018-03-20 | Samsung Life Public Welfare Foundation | Method for treating an inflammatory brain disease comprising administering a stem cell-derived exosome |
| WO2015153732A2 (en) | 2014-04-01 | 2015-10-08 | Cornell University | Use of double-stranded dna in exosomes: a novel biomarker in cancer detection |
| US11268085B2 (en) | 2014-05-27 | 2022-03-08 | Exosome Diagnostics, Inc. | Methods for isolating microvesicles and extracting nucleic acids from biological samples |
| EP3623792B1 (en) * | 2014-07-09 | 2021-09-01 | Exosome Diagnostics, Inc. | Methods for isolating microvesicles and extracting nucleic acids from biological samples |
| EP3169691B1 (en) | 2014-07-17 | 2020-09-02 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Methods for using exosomes to monitor transplanted organ status |
| EP3173143A4 (en) | 2014-07-24 | 2018-06-27 | Toppan Printing Co., Ltd. | Lipid membrane structure, lipid-membrane-structure-immobilization carrier, and method for fusing cells |
| EP3112474A1 (en) | 2015-06-29 | 2017-01-04 | Evonik Degussa GmbH | Method of detecting avian necrotic enteritis |
| US20180066262A1 (en) | 2015-03-09 | 2018-03-08 | Caris Science, Inc. | Oligonucleotide probes and uses thereof |
| KR20180042217A (ko) * | 2015-06-12 | 2018-04-25 | 허드슨 인스티튜트 오브 메디컬 리서치 | 치료 방법 |
| EP3314027A4 (en) | 2015-06-29 | 2019-07-03 | Caris Science, Inc. | THERAPEUTIC OLIGONUCLEOTIDES |
| AU2016298317B2 (en) | 2015-07-28 | 2021-02-18 | Caris Science, Inc. | Targeted oligonucleotides |
| EP3165926A1 (en) | 2015-11-06 | 2017-05-10 | Humanitas Mirasole S.p.A. | Method for characterization of cell specific microvesicles |
| CN106811428A (zh) * | 2015-11-30 | 2017-06-09 | 复旦大学 | 一种提取细菌外排膜囊泡的方法 |
| IL260988B2 (en) | 2016-03-03 | 2023-03-01 | Roussy Inst Gustave | ptps-based vaccines against cancer |
| EP3443117A1 (en) | 2016-04-15 | 2019-02-20 | Exosome Diagnostics, Inc. | Plasma-based detection of anaplastic lymphoma kinase (alk) nucleic acids and alk fusion transcripts and uses thereof in diagnosis and treatment of cancer |
| WO2018057820A1 (en) | 2016-09-21 | 2018-03-29 | Predicine, Inc. | Systems and methods for combined detection of genetic alterations |
| US11702702B2 (en) | 2016-04-15 | 2023-07-18 | Predicine, Inc. | Systems and methods for detecting genetic alterations |
| DK3452613T3 (da) | 2016-05-05 | 2022-03-21 | Exosome Diagnostics Inc | Profilering af mikrovesikel-nukleinsyrer og anvendelse heraf som signaturer til diagnostisering af nyretransplantatafstødning |
| CN109642229A (zh) | 2016-05-13 | 2019-04-16 | 外来体诊断公司 | 从生物液体分离细胞外囊泡和共分离无细胞dna的自动和手动方法 |
| EP3467059B1 (en) | 2016-05-24 | 2022-02-23 | Japanese Foundation For Cancer Research | Method of recovering extracellular vesicles and container for extracellular vesicles |
| US11299733B2 (en) | 2016-07-15 | 2022-04-12 | University Of Massachusetts | Process of delivering small RNAs to sperm |
| IL247368A0 (en) | 2016-08-18 | 2016-11-30 | Yeda Res & Dev | Diagnostic and therapeutic uses of exosomes |
| EP3529374B1 (en) | 2016-10-21 | 2024-04-03 | Exosome Diagnostics, Inc. | Sequencing and analysis of exosome associated nucleic acids |
| CN110446790B (zh) | 2016-11-30 | 2023-03-31 | 外来体诊断公司 | 使用外来体rna和无细胞dna检测血浆中的突变的方法和组合物 |
| WO2018112557A1 (en) * | 2016-12-23 | 2018-06-28 | Altnia Operations Pty Ltd | Methods and compositions for purification or isolation of microvesicles and exosomes |
| US20200149036A1 (en) | 2017-01-02 | 2020-05-14 | Exosome Diagnostics, Inc. | Methods to distinguish rna and dna in a combined preparation |
| KR101875594B1 (ko) * | 2017-01-13 | 2018-07-06 | ㈜로제타엑소좀 | 금속을 이용한 세포밖 소포체의 분리 방법 |
| CA3063287A1 (en) | 2017-05-12 | 2018-11-15 | Evonik Operations Gmbh | Method for detecting c. perfringens induced diseases in animals |
| JP7225121B2 (ja) | 2017-05-17 | 2023-02-20 | エクソサム ダイアグノスティクス，インコーポレイティド | 微小胞核酸および／またはタンパク質、並びに腎移植拒絶反応マーカーとしてのその使用 |
| EP3652315A4 (en) | 2017-07-12 | 2021-09-01 | Exosome Diagnostics, Inc. | METHOD OF ISOLATION AND ENRICHMENT OF POPULATIONS OF EXTRACELLULAR VESICULES FROM A BIOFLUID AND METHOD OF USING THEREOF |
| US11345957B2 (en) | 2017-07-18 | 2022-05-31 | Exosome Diagnostics, Inc. | Methods of treating glioblastoma in a subject informed by exosomal RNA signatures |
| JP2020528766A (ja) * | 2017-07-26 | 2020-10-01 | ロゼッタ エクソソーム | 陽イオンを利用した細胞外小胞体の分離方法 |
| TR201716062A2 (tr) * | 2017-10-18 | 2019-05-21 | Tuerkiye Bilimsel Ve Teknolojik Arastirma Kurumu Tuebitak | Bi̇r eksozomal terapöti̇k taşiyici üreti̇m yöntemi̇ ve bu yönteme uygun bi̇r şeki̇lde elde edi̇len bi̇r eksozomal terapöti̇k taşiyici |
| GB201717446D0 (en) * | 2017-10-24 | 2017-12-06 | Evox Therapeutics Ltd | Affinity purification of engineering extracellular vesicles |
| WO2019094578A1 (en) | 2017-11-09 | 2019-05-16 | Alnylam Pharmaceuticals Inc. | Assays and methods for determining expression of the lect2 gene |
| US10729156B2 (en) | 2017-11-21 | 2020-08-04 | Purina Animal Nutrition Llc | Methods of purifying exosomes |
| WO2019160519A2 (en) | 2018-02-15 | 2019-08-22 | Yeditepe Universitesi | Exosome isolation method by two phase fluid system |
| WO2019164227A1 (ko) * | 2018-02-20 | 2019-08-29 | 고려대학교 산학협력단 | 엑소좀을 분리하기 위한 다중 컬럼 및 엑소좀 분리 방법 |
| US20210230701A1 (en) | 2018-06-06 | 2021-07-29 | Exosome Diagnostics, Inc. | Methods for developing urine biomarkers and for detecting bladder cancer |
| GB201809622D0 (en) | 2018-06-12 | 2018-07-25 | Evox Therapeutics Ltd | Engineering extracellular vesicles for affinity purification |
| CN108841777A (zh) * | 2018-06-22 | 2018-11-20 | 北京恩泽康泰生物科技有限公司 | 基于静电吸附的胞外囊泡及其内含物的提取方法及装置 |
| US11714068B2 (en) * | 2018-07-31 | 2023-08-01 | Mie University | Exosome production method |
| EP3884045B1 (en) | 2018-11-20 | 2023-01-11 | Exosome Diagnostics, Inc. | Methods for internal controls of microvesicle isolations |
| IT201800021226A1 (it) * | 2018-12-27 | 2020-06-27 | Supsi Scuola Univ Professionale Della Svizzera Italiana | Processo e dispositivo per produrre esosomi |
| KR102212465B1 (ko) * | 2019-01-16 | 2021-02-03 | 서울시립대학교 산학협력단 | 알엔에이 나노입자 전달을 통한 소포체의 제조방법 및 이로부터 제조된 소포체 |
| CN109825472A (zh) * | 2019-03-01 | 2019-05-31 | 易春 | 一种细胞外囊泡的提取方法及试剂盒 |
| CA3177360A1 (en) | 2020-04-13 | 2021-10-21 | Exoprother Medical Ltd. | Cell-derived vesicles comprising wild-type p53 protein for antiviral therapy |
| US20210322483A1 (en) | 2020-04-16 | 2021-10-21 | Ichilov Tech Ltd. | Cell-derived particles presenting heterologous cd24 and use thereof in therapy |
| GB202010278D0 (en) | 2020-07-03 | 2020-08-19 | Evox Therapeutics Ltd | Extracellular vesicles with improved half-life |
| IL277743A (en) | 2020-10-01 | 2022-04-01 | Yeda Res & Dev | A method for diagnosing breast cancer |
| KR20220097337A (ko) * | 2020-12-30 | 2022-07-07 | 한국과학기술원 | 엑소좀 분리용 조성물 및 이를 이용한 엑소좀 분리 방법 |
| GB202105925D0 (en) | 2021-04-26 | 2021-06-09 | Evox Therapeutics Ltd | Modified extracellular vesicles (EVs) with improved half-life |
| JP2023104650A (ja) * | 2022-01-18 | 2023-07-28 | ダイセン・メンブレン・システムズ株式会社 | 細胞外小胞の分離精製方法 |
| WO2024024336A1 (ja) * | 2022-07-28 | 2024-02-01 | 株式会社ダイセル | 微小有用物質を含む液の精製濃縮装置及びそれを用いた微小有用物質の精製濃縮液の製造方法 |
| CN117070450B (zh) * | 2023-10-12 | 2024-01-16 | 哈药集团生物工程有限公司 | 一种外泌体的纯化方法 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE113468T1 (de) * | 1987-07-29 | 1994-11-15 | Liposome Co Inc | Verfahren zur trennung von teilchen nach grösse. |
| EP0841945B1 (en) * | 1995-08-03 | 2006-03-08 | Rijksuniversiteit te Leiden | Cell derived antigen presenting vesicles |
| US6165785A (en) * | 1996-05-24 | 2000-12-26 | University Of Cincinnati | Bone marrow cultures for developing suppressor and stimulator cells for research and therapeutic applications |
| DE69708625T2 (de) * | 1996-05-31 | 2002-08-01 | Whitaker Corp | Steckverbinder für wiederaufladbare batterien |
| FR2766205B1 (fr) * | 1997-07-16 | 2002-08-30 | Inst Nat Sante Rech Med | Nouveau procede de sensibilisation de cellules presentatrices d'antigene et nouveaux moyens pour la mise en oeuvre du procede |
-
1999
- 1999-01-27 FR FR9900886A patent/FR2788780B1/fr not_active Expired - Fee Related
-
2000
- 2000-01-19 CA CA002360752A patent/CA2360752A1/fr not_active Abandoned
- 2000-01-19 WO PCT/FR2000/000105 patent/WO2000044389A2/fr not_active Application Discontinuation
- 2000-01-19 IL IL14369200A patent/IL143692A0/xx unknown
- 2000-01-19 EP EP00900609A patent/EP1143982A2/fr not_active Withdrawn
- 2000-01-19 EA EA200100819A patent/EA003235B1/ru not_active IP Right Cessation
- 2000-01-19 JP JP2000595691A patent/JP2002535665A/ja active Pending
- 2000-01-19 AU AU30561/00A patent/AU768322B2/en not_active Ceased
- 2000-01-19 CN CN00802903A patent/CN1355704A/zh active Pending
- 2000-01-19 US US09/890,319 patent/US6899863B1/en not_active Expired - Fee Related
-
2002
- 2002-04-17 HK HK02102905.8A patent/HK1042647A1/zh unknown
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2608509C1 (ru) * | 2016-02-11 | 2017-01-18 | Елена Сергеевна Кастарнова | Способ получения экзосом из крови |
| CN109856259A (zh) * | 2018-12-29 | 2019-06-07 | 南通大学附属医院 | 一种血清胰腺癌外泌体特异蛋白及其再验证过程 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2000044389A2 (fr) | 2000-08-03 |
| US6899863B1 (en) | 2005-05-31 |
| AU768322B2 (en) | 2003-12-11 |
| IL143692A0 (en) | 2002-04-21 |
| WO2000044389A3 (fr) | 2000-11-16 |
| HK1042647A1 (zh) | 2002-08-23 |
| CA2360752A1 (fr) | 2000-08-03 |
| CN1355704A (zh) | 2002-06-26 |
| AU3056100A (en) | 2000-08-18 |
| EP1143982A2 (fr) | 2001-10-17 |
| FR2788780B1 (fr) | 2001-03-30 |
| JP2002535665A (ja) | 2002-10-22 |
| EA200100819A1 (ru) | 2001-12-24 |
| FR2788780A1 (fr) | 2000-07-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EA003235B1 (ru) | Способ получения мембранных пузырьков | |
| ES2221957T5 (es) | Método para la eliminación cromatográfica de priones. | |
| Staubach et al. | Scaled preparation of extracellular vesicles from conditioned media | |
| US4342828A (en) | Method for producing substance capable of stimulating differentiation and proliferation of human granulopoietic stem cells | |
| CN108473964B (zh) | 用于稳定慢病毒制剂的缓冲液 | |
| JP2000500028A (ja) | 核酸の精製方法 | |
| US20080319163A1 (en) | Method for Isolating and Purifying Immuno-Modulating Polypeptide from Cow Placenta | |
| AU2009214768A1 (en) | Methods using ion exchange and gel filtration chromatography for poxvirus purification | |
| JP6953442B2 (ja) | 循環核酸の不活性化による血液処置 | |
| US8470562B2 (en) | IRX-2 modified manufacturing process | |
| KR100361894B1 (ko) | 치환크로마토그라피방법및정제된헤모글로빈생성물 | |
| JP2002540912A (ja) | 生物学的混入物の除去 | |
| Köck et al. | Purification of human interleukin 1 by high-performance liquid chromatography | |
| KR100900013B1 (ko) | 유체로부터 재조합 인간 에리스로포이에틴을 정제하는 방법 | |
| CA1188243A (en) | Chemorecruitins of leukocytes and inflamed tissues and process for their preparation | |
| US20210128638A1 (en) | Cellular, organ, and whole-body rejuvenation utilizing cord blood plasma and pterostilbene | |
| RU2799637C1 (ru) | Способ получения биологически активного пептидно-аминокислотного препарата на основе плазмы крови человека | |
| van Oss et al. | Separation of blood serum proteins by ultrafiltration | |
| JPS6237605B2 (ru) | ||
| CN115838686A (zh) | 一种规模化纯化人间充质干细胞来源的小细胞外囊泡的方法 | |
| JPH02100697A (ja) | ヒト由来分化誘導物質の製造法 | |
| JPH02109977A (ja) | 新規無血清培地 | |
| Kutsky | GROWTH-STIMULATING EFFECTS BY NUCLEO-PROTEIN AND CELL FRACTIONS ON CHICK HEART FIBROBLASTS IN VITRO | |
| HUARD | LEUKOCYTE DIALYSATE: DETECTION OF A COMPONENT THAT ALTERS RESPONSIVENESS TO T-CELL AND B-CELL MITOGENS | |
| EP0136375A1 (en) | A regulatory glycoprotein for immune response in the production of T-cell growth factor |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s) |
Designated state(s): AM AZ BY KZ KG MD TJ TM RU |