CN105025878A

CN105025878A - 微泡在医学疾病和病况的诊断、预后和治疗中的用途

Info

Publication number: CN105025878A
Application number: CN201380063209.6A
Authority: CN
Inventors: W.坎珀; A.拉马钱德兰; H.颜; L.M.卢梭; J.K.O.斯科格
Original assignee: Exosome Diagnostics Inc
Current assignee: Exosome Diagnostics Inc
Priority date: 2012-10-03
Filing date: 2013-10-03
Publication date: 2015-11-04
Also published as: EP2903597B1; EP2903597A4; EP2903597A1; WO2014055775A1; CA2887058C; CA2887058A1; US20150252428A1; HK1217088A1

Abstract

本发明公开了用于在受试者中诊断或预测疾病或医学病况的方法，即通过在自生物样品的微泡中提取的核酸中检测BRAF突变核酸的存在或不存在。本发明也公开了评价反应性或确定用于有需要的受试者的治疗方案的方法，即通过在自生物样品的微泡中提取的核酸中检测BRAF突变核酸的存在或不存在。也描述了用于分离微泡和自微泡中提取DNA和/或RNA的方法。

Description

微泡在医学疾病和病况的诊断、预后和治疗中的用途

相关申请

本申请要求于2012年10月3日提交的美国申请号61/709,337的优先权和权益；其全部内容通过引用结合到本文中。

发明背景

丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶BRAF，RAS癌基因沿MEK/ERK信号转导途径上的一种下游效应物，已经成为用于人类癌症的诊断、预后和治疗指导的重要生物学标记。突变的BRAF V600E的高度流行意味着该突变在这些癌症亚类的发展中是重要的“驱动剂”或“共驱动剂”。此外，具有BRAF突变的癌症通常比其无突变的相对物而言更具攻击性。因此，突变的BRAF已经成为用于精确癌症治疗的极具吸引力的靶标。因此，用于诊断、预后和治疗指导的BRAF的检测在临床应用上变得越来越重要。

检测癌症突变谱、例如BRAF突变的现有技术，包括活检样品的分析和在体液例如血液中循环的突变肿瘤DNA片段的非侵袭性分析(Diehl等人, 2008)。前一种方法是侵袭性的、复杂的并可能对受试者有害。此外，在侵入性活检程序中，组织样品采自有限的区域，并因此，可能给出假阳性或假阴性，尤其在不均匀的和/或分散在正常组织中的肿瘤中。后一种方法因体液中的突变的癌DNA拷贝数极低而固有地缺乏灵敏度(Gormally等人, 2007)。因此，非常需要用于检测BRAF突变的非侵入性和灵敏的诊断方法。

发明概述

本发明解决了用于检测BRAF突变的非侵入性和高度准确的诊断方法的需求。一般而言，本发明特征在于在分离自生物样品的微泡的DNA和/或RNA中检测BRAF突变的方法。

本发明特征在于在受试者中诊断疾病或其它医学病况的方法，包括自所述受试者的生物样品中分离微泡部分，自微泡中提取DNA和/或RNA，和在提取的DNA和/或RNA中检测BRAF突变的存在或不存在，其中在提取的DNA和/或RNA中的BRAF突变的存在指示所述受试者中的疾病或其它医学病况的存在或所述受试者发展疾病或其它医学病况的更高倾向。

本发明特征在于确定用于治疗患有疾病或其它医学病况的受试者的治疗方案的方法，包括自所述受试者的生物样品中分离微泡部分，自微泡中提取DNA和/或RNA，和在提取的DNA和/或RNA中检测BRAF突变的存在或不存在，其中在提取的DNA和/或RNA中的BRAF突变的存在指示使用包含至少一种激酶抑制剂的治疗方案。在某些实施方案中，所述激酶抑制剂是RAF抑制剂或MEK抑制剂。在某些实施方案中，所述RAF抑制剂是BRAF-特异性抑制剂。在一些优选的实施方案中，所述治疗方案包含靶向突变的BRAF或来自突变的BRAF的下游信号转导的药物。例如，所述治疗方案包含威罗菲尼(vemurafenib)或达拉非尼(dabrafenib)。本发明特征在于这样的方法，其中所述疾病或其它医学病况是癌症。在某些实施方案中，所述癌症是黑素瘤、甲状腺癌、结直肠癌、卵巢癌、乳癌、脑癌、胰腺癌、肺癌、淋巴瘤或白血病。

本发明特征在于这样的方法，其中所述BRAF突变是活化突变。

本发明特征在于这样的方法，其中所述BRAF突变编码突变的BRAF多肽，其中所述突变的BRAF多肽是V600E。

本发明特征在于这样的方法，其中所述BRAF突变是T1799A。

本发明特征在于这样的方法，其中所述生物样品是体液样品。在一些方面，所述体液样品是血浆、血清、脑脊液或腹水液。在其他优选的实施方案中，所述体液样品是支气管肺泡灌洗液(BAL)和囊肿液。在一些方面，所述体液样品在以下范围内：1-25 ml，例如，2-25 ml、2-20 ml、2-15 ml、2-10 ml、4-25 ml、4-20 ml、4-15 ml、4-10 ml、6-25 ml、 6-20 ml、6-15 ml、6-10 ml、8-25 ml、8-20 ml、8-15 ml、10-25 ml、10-20 ml、10-15 ml、15-25 ml或15-20 ml。

现在将详细描述本发明的各方面和实施方案。可以理解，可以对细节进行修改，而不偏离本发明的范围。此外，除非上下文另有需要，否则单数术语将包括复数，复数术语将包括单数。

所确定的所有专利、专利申请和出版物都通过引用明确地结合到本文中，用于描述和公开例如在这些出版物中描述的方法学的目的，所述方法学可用于本发明。提供这些出版物仅为其先于本申请申请日的公开内容。在这一点上不应视为承认本发明人由于在先发明或任何其他原因而无权享有先于这样的公开内容。对日期的所有声明或对这些文件内容的表现都基于申请人可得的信息而不构成对这些文件的日期或内容的准确性的任何承认。

附图简述

图 1是样品081 (深灰色)和055 (浅灰色)的实时PCR数据的图示。扩增曲线代表对自样品081提取的DNA的一式三份的QPCR测定。根据来自肿瘤组织的活检数据，在样品081中检测到BRAF突变(V600E)，但在样品055中未检测到。ΔRn代表归一化到参考荧光信号和基线荧光的报告信号；log (ΔRn)对PCR循环数作图。

图 2是对于自样品MGHSS04提取的RNA的实时PCR数据的图示。根据来自肿瘤组织的活检数据，检测BRAF突变。ΔRn代表归一化到参考荧光信号和基线荧光的报告信号；log (ΔRn)对PCR循环数作图。

图 3 是对于自样品091提取的RNA的实时PCR数据的图示。根据来自肿瘤组织的活检数据，在样品091中检测到无突变。Rn代表归一化到参考荧光信号和基线荧光的报告信号；log (ΔRn)对PCR循环数作图。

发明详述

微泡由真核细胞脱落，或从质膜中出芽，到细胞外面。这些膜囊泡的尺寸是不均匀的，其直径范围为约10nm至约5000nm。由细胞内多泡体胞吐释放的小微泡(直径为约10至1000nm，更经常为约30至200nm)在本领域中称为“外来体(exosome)”。本文描述的方法和组合物同样适用于所有尺寸，优选30至800nm的微泡。

在一些文献中，术语“外来体”也指含有参与mRNA降解和核仁小RNA (snoRNA)、核内小RNA (snRNA)和核糖体RNA (rRNA)加工的核糖核酸外切酶的蛋白质复合体(Liu等人, 2006b；van Dijk等人, 2007)。此类蛋白质复合体没有膜，并且不是本文使用的那些术语，“微泡”或“外来体”。

近来，研究已经揭示出微泡内的核酸具有作为生物标志物的作用。使用自微泡中提取的核酸被认为有可能免除对活检的需求，突出显示出微泡生物学的巨大的诊断潜力(Skog等人, 2008)。本文所述的方法特征在于自微泡中提取的核酸用于检测BRAF突变的用途，用于诊断、预测受试者中的疾病或医学病况的存在，或用于评价或确定患有疾病或医学病况的受试者的治疗方案。

BRAF

RAF激酶是高度保守的丝氨酸/苏氨酸激酶，它们是促分裂原-活化蛋白(MAP)激酶途径的关键组分，该途径是信号转导途径，在基因表达、细胞生长、增殖、分化和程序性细胞死亡的调节中起到根本性作用。MAP激酶途径在真核生物中是保守的，其功能是经由受体和磷酸化级联而转导胞外信号到细胞核，用于活化转录因子；所述胞外信号例如激素、细胞因子和各种生长因子。信号转导途径是通过胞外促分裂原信号所致的受体酪氨酸激酶的活化而启动。受体酪氨酸激酶活化Ras，一种GTP酶，其导致膜募集和RAF蛋白的活化。RAF的活化继而导致磷酸化和随后的蛋白激酶MEK的活化。MEK然后使ERK磷酸化，这可直接和间接活化转录因子，导致参与细胞增殖和生存的多种调节基因的表达。

BRAF，也称为v-raf鼠肉瘤病毒癌基因同源物B1、B-RAF、BRAF1、B-RAF1、NS7和RAFB1，是丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的RAF家族成员。该家族由3种高度保守的激酶组成：ARAF (或A-RAF)、CRAF (RAF-1或C-RAF)和BRAF。如本文使用的，“BRAF”包括所有已知的人类BRAF同源物和变体，以及与BRAF具有70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同源性的其它核酸和多肽。在某些实施方案中，BRAF被鉴定为包含Genbank检索号NM_004333 (SEQ ID NO:1)所示的核酸序列，其中起始密码子和终止密码子以斜体和下划线表示，导致在氨基酸600的突变的共同致癌突变以下划线和黑体表示：

CGCCTCCCTTCCCCCTCCCCGCCCGACAGCGGCCGCTCGGGCCCCGGCTCTCGGTTATAAG ATG GCGGCGCTGAGCGGTGGCGGTGGTGGCGGCGCGGAGCCGGGCCAGGCTCTGTTCAACGGGGACATGGAGCCCGAGGCCGGCGCCGGCGCCGGCGCCGCGGCCTCTTCGGCTGCGGACCCTGCCATTCCGGAGGAGGTGTGGAATATCAAACAAATGATTAAGTTGACACAGGAACATATAGAGGCCCTATTGGACAAATTTGGTGGGGAGCATAATCCACCATCAATATATCTGGAGGCCTATGAAGAATACACCAGCAAGCTAGATGCACTCCAACAAAGAGAACAACAGTTATTGGAATCTCTGGGGAACGGAACTGATTTTTCTGTTTCTAGCTCTGCATCAATGGATACCGTTACATCTTCTTCCTCTTCTAGCCTTTCAGTGCTACCTTCATCTCTTTCAGTTTTTCAAAATCCCACAGATGTGGCACGGAGCAACCCCAAGTCACCACAAAAACCTATCGTTAGAGTCTTCCTGCCCAACAAACAGAGGACAGTGGTACCTGCAAGGTGTGGAGTTACAGTCCGAGACAGTCTAAAGAAAGCACTGATGATGAGAGGTCTAATCCCAGAGTGCTGTGCTGTTTACAGAATTCAGGATGGAGAGAAGAAACCAATTGGTTGGGACACTGATATTTCCTGGCTTACTGGAGAAGAATTGCATGTGGAAGTGTTGGAGAATGTTCCACTTACAACACACAACTTTGTACGAAAAACGTTTTTCACCTTAGCATTTTGTGACTTTTGTCGAAAGCTGCTTTTCCAGGGTTTCCGCTGTCAAACATGTGGTTATAAATTTCACCAGCGTTGTAGTACAGAAGTTCCACTGATGTGTGTTAATTATGACCAACTTGATTTGCTGTTTGTCTCCAAGTTCTTTGAACACCACCCAATACCACAGGAAGAGGCGTCCTTAGCAGAGACTGCCCTAACATCTGGATCATCCCCTTCCGCACCCGCCTCGGACTCTATTGGGCCCCAAATTCTCACCAGTCCGTCTCCTTCAAAATCCATTCCAATTCCACAGCCCTTCCGACCAGCAGATGAAGATCATCGAAATCAATTTGGGCAACGAGACCGATCCTCATCAGCTCCCAATGTGCATATAAACACAATAGAACCTGTCAATATTGATGACTTGATTAGAGACCAAGGATTTCGTGGTGATGGAGGATCAACCACAGGTTTGTCTGCTACCCCCCCTGCCTCATTACCTGGCTCACTAACTAACGTGAAAGCCTTACAGAAATCTCCAGGACCTCAGCGAGAAAGGAAGTCATCTTCATCCTCAGAAGACAGGAATCGAATGAAAACACTTGGTAGACGGGACTCGAGTGATGATTGGGAGATTCCTGATGGGCAGATTACAGTGGGACAAAGAATTGGATCTGGATCATTTGGAACAGTCTACAAGGGAAAGTGGCATGGTGATGTGGCAGTGAAAATGTTGAATGTGACAGCACCTACACCTCAGCAGTTACAAGCCTTCAAAAATGAAGTAGGAGTACTCAGGAAAACACGACATGTGAATATCCTACTCTTCATGGGCTATTCCACAAAGCCACAACTGGCTATTGTTACCCAGTGGTGTGAGGGCTCCAGCTTGTATCACCATCTCCATATCATTGAGACCAAATTTGAGATGATCAAACTTATAGATATTGCACGACAGACTGCACAGGGCATGGATTACTTACACGCCAAGTCAATCATCCACAGAGACCTCAAGAGTAATAATATATTTCTTCATGAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAG T GAAATCTCGATGGAGTGGGTCCCATCAGTTTGAACAGTTGTCTGGATCCATTTTGTGGATGGCACCAGAAGTCATCAGAATGCAAGATAAAAATCCATACAGCTTTCAGTCAGATGTATATGCATTTGGAATTGTTCTGTATGAATTGATGACTGGACAGTTACCTTATTCAAACATCAACAACAGGGACCAGATAATTTTTATGGTGGGACGAGGATACCTGTCTCCAGATCTCAGTAAGGTACGGAGTAACTGTCCAAAAGCCATGAAGAGATTAATGGCAGAGTGCCTCAAAAAGAAAAGAGATGAGAGACCACTCTTTCCCCAAATTCTCGCCTCTATTGAGCTGCTGGCCCGCTCATTGCCAAAAATTCACCGCAGTGCATCAGAACCCTCCTTGAATCGGGCTGGTTTCCAAACAGAGGATTTTAGTCTATATGCTTGTGCTTCTCCAAAAACACCCATCCAGGCAGGGGGATATGGTGCGTTTCCTGTCCAC TGA AACAAATGAGTGAGAGAGTTCAGGAGAGTAGCAACAAAAGGAAAATAAATGAACATATGTTTGCTTATATGTTAAATTGAATAAAATACTCTCTTTTTTTTTAAGGTGAACCAAAGAACACTTGTGTGGTTAAAGACTAGATATAATTTTTCCCCAAACTAAAATTTATACTTAACATTGGATTTTTAACATCCAAGGGTTAAAATACATAGACATTGCTAAAAATTGGCAGAGCCTCTTCTAGAGGCTTTACTTTCTGTTCCGGGTTTGTATCATTCACTTGGTTATTTTAAGTAGTAAACTTCAGTTTCTCATGCAACTTTTGTTGCCAGCTATCACATGTCCACTAGGGACTCCAGAAGAAGACCCTACCTATGCCTGTGTTTGCAGGTGAGAAGTTGGCAGTCGGTTAGCCTGGGTTAGATAAGGCAAACTGAACAGATCTAATTTAGGAAGTCAGTAGAATTTAATAATTCTATTATTATTCTTAATAATTTTTCTATAACTATTTCTTTTTATAACAATTTGGAAAATGTGGATGTCTTTTATTTCCTTGAAGCAATAAACTAAGTTTCTTTTTATAAAAA

在其它实施方案中，BRAF被鉴定为具有Genbank检索号NP_004324 (SEQ ID NO:2)的序列的多肽，其中在氨基酸600的致癌突变以下划线和黑体表示：

MAALSGGGGGGAEPGQALFNGDMEPEAGAGAGAAASSAADPAIPEEVWNIKQMIKLTQEHIEALLDKFGGEHNPPSIYLEAYEEYTSKLDALQQREQQLLESLGNGTDFSVSSSASMDTVTSSSSSSLSVLPSSLSVFQNPTDVARSNPKSPQKPIVRVFLPNKQRTVVPARCGVTVRDSLKKALMMRGLIPECCAVYRIQDGEKKPIGWDTDISWLTGEELHVEVLENVPLTTHNFVRKTFFTLAFCDFCRKLLFQGFRCQTCGYKFHQRCSTEVPLMCVNYDQLDLLFVSKFFEHHPIPQEEASLAETALTSGSSPSAPASDSIGPQILTSPSPSKSIPIPQPFRPADEDHRNQFGQRDRSSSAPNVHINTIEPVNIDDLIRDQGFRGDGGSTTGLSATPPASLPGSLTNVKALQKSPGPQRERKSSSSSEDRNRMKTLGRRDSSDDWEIPDGQITVGQRIGSGSFGTVYKGKWHGDVAVKMLNVTAPTPQQLQAFKNEVGVLRKTRHVNILLFMGYSTKPQLAIVTQWCEGSSLYHHLHIIETKFEMIKLIDIARQTAQGMDYLHAKSIIHRDLKSNNIFLHEDLTVKIGDFGLAT V KSRWSGSHQFEQLSGSILWMAPEVIRMQDKNPYSFQSDVYAFGIVLYELMTGQLPYSNINNRDQIIFMVGRGYLSPDLSKVRSNCPKAMKRLMAECLKKKRDERPLFPQILASIELLARSLPKIHRSASEPSLNRAGFQTEDFSLYACASPKTPIQAGGYGAFPVH

BRAF激酶包含Ras-结合结构域和蛋白激酶结构域。BRAF激酶结构域具有特征性的双叶形构造，N-末端小叶(N-叶)和C-末端大叶(C-叶)被催化性裂缝(catalytic cleft)分隔开。N-叶含有富含甘氨酸的ATP-磷酸结合环(P-环)，其锚定和定向ATP，这对激酶活性是至关重要的。在无活性构象时，催化性裂缝难以接近，然而一旦被Ras活化后，该激酶经过构象变化，使催化性裂缝可接近，BRAF具有活性。活化BRAF通过MEK转导信号以活化ERK，其继而又活化下游转录因子，诱发一系列生化过程，包括细胞分化、增殖、生长和细胞凋亡。

BRAF 突变和癌症

据估计在所有癌症的30%中，MAPK途径中是突变的，且BRAF基因突变存在于所有癌症的约7%中(Garnett等人, 2004, Davies等人, 2002)。重要的是，已经发现BRAF在宽范围的癌症中是突变的，包括40-70%恶性黑素瘤(其是第六最常见的癌症)，45%乳头状甲状腺癌，10%结直肠癌，并且也已经在卵巢癌、乳癌和肺癌、和淋巴瘤和白血病中鉴定。

BRAF的活化突变首先由Sanger研究院于2002年描述(Davies等人, 2002)。目前，在BRAF基因中已经鉴定出与人类癌症相关的约40种不同突变。最常见的BRAF突变是在位置1799 (以前称为1796位置)的从胸腺嘧啶到腺嘌呤的单碱基改变，其突出显示在SEQ ID NO:1中，导致在氨基酸序列的位置600的谷氨酸(E)取代缬氨酸(V)(以前称为599位置)，其突出显示在SEQ ID NO:2中。根据癌症的体细胞突变目录(Catalogue of Somatic Mutations in Cancer，COS-MIC)数据库，该突变目前占所有BRAF突变的多达97%。癌症相关突变已经主要在激酶结构域中鉴定。

本发明公开了用于确定BRAF核酸中的一个或多个突变的存在或不存在的方法。优选地，所述突变是活化突变或致癌突变。优选地，所述突变是取代。所述突变也可以是BRAF核酸的一个或多个取代、插入、缺失或重排或其组合。在某些实施方案中，所述突变是在BRAF核酸的位置1799的取代突变。优选地，所述突变是在BRAF核酸序列的位置1799的单碱基改变或错义突变，其中T突变为A。

在本发明的一些实施方案中，BRAF核酸的突变编码突变的BRAF多肽。优选地，所述突变的BRAF多肽是V600E (也称为V599E)。本发明其它优选的突变的BRAF多肽包括：V600K、V600D和V600R。在其它实施方案中，所述突变的BRAF多肽可以额外地包括以下氨基酸位置上的突变：439、440、443、444、453、456、459、460、462、464、466、467、468、469、471、472、475、485、581、582、583、584、585、586、587、588、589、590、600、601、602、603、604、605、606、607、608、609、610、611、612、614、615、616、617、618、619或其组合。本发明的BRAF突变包括编码本文公开的突变的BRAF多肽的任何核酸。

本发明提供在自生物样品的微泡中提取的核酸中检测BRAF突变核酸的存在或不存在的方法，用于在受试者中诊断或预测疾病或医学病况的存在。本发明也提供在自微泡中提取的核酸中检测BRAF突变核酸的存在或不存在的方法，用于评价或确定患有疾病或医学病况的受试者的治疗方案。

BRAF中的种系突变也与发育性疾病例如LEOPARD、Noonan和心-面-皮肤综合征(cardiofaciocutaenous syndrome)有关。所有这三种综合征都与BRAF的活化突变有关，尽管通常比癌症相关的V600E突变较少活化。

因为在癌症中发现的RAS/BRAF/MEK/ERK途径突变的高流行，靶向该特定途径及其信号转导组分的治疗药已经成为大量研究的主题。激酶抑制剂已被证明在治疗一些癌症中具有一些成功。RAF抑制剂(其包括BRAF-特异性抑制剂)在治疗癌症患者中已经显示出一些功效。BRAF-特异性抑制剂的实例包括：GDC-0879和PLX4720。靶向具有BRAF活化突变的癌症的其它方式包括靶向BRAF的下游效应物，例如MEK，例如通过使用MEK抑制剂。

BRAF，如本文使用的，是指其基因(即编码BRAF蛋白的核苷酸序列)或其蛋白。

作为诊断和 / 或预后工具的微泡

本发明的某些方面是基于以下发现：微泡由肿瘤细胞分泌并在体液中循环。微泡数量随肿瘤生长而增加。体液中的微泡浓度与相应的活性肿瘤载量成比例。肿瘤载量越大，体液中的微泡浓度越高。在这些微泡内发现的核酸，以及微泡的其它内容物例如血管生成蛋白，可用作有价值的生物标志物，用于通过提供遗传谱而进行肿瘤诊断、表征和预后。重要的是，使用本文所述的方法，可以自微泡中提取的核酸中准确检测具有突变(例如编码具有V600E突变的BRAF多肽的突变)的生物标志物。这些微泡中的内容物也可用于监测肿瘤随时间的进展，即通过分析在肿瘤进展期间是否获得其它突变，以及某些突变水平是否随时间或随治疗进程而增加或减少。

本发明涉及在受试者中检测、诊断、监测、治疗或评价疾病或其它医学病况的方法，包括以下步骤：自受试者的体液分离微泡，和分析外来体内含有的一种或多种核酸。定性和/或定量分析核酸，并将结果与患有或未患疾病或其它医学病况的一个或多个其它受试者预期的或获得的结果进行比较。当与一个或多个其它个体相比，所述受试者的微泡核酸含量的差异的存在，可以指示所述受试者中的疾病或其它医学病况的进展(例如肿瘤大小和肿瘤恶性程度的变化)、或易感性或倾向的存在或不存在。在其它实施方案中，自所述受试者分离的微泡内的某些核酸的存在可用于帮助确定可使用的最有效的治疗方案。

本发明特征在于在受试者中诊断疾病或其它医学病况的方法。在一些方面，所述疾病或医学病况是癌症。所述方法包括自所述受试者的生物样品中分离微泡部分，自微泡中提取DNA和/或RNA，和在提取的DNA和/或RNA中检测BRAF突变的存在或不存在。所述BRAF突变可以是本文公开的任何突变；优选地，所述BRAF突变是V600E。BRAF突变的存在指示所述受试者的疾病或医学病况或者发展所述疾病或医学病况的更高倾向的存在。

本发明特征在于确定用于治疗患有疾病或其它医学病况的受试者的治疗方案的方法。在一些方面，所述疾病或医学病况是癌症。所述方法包括自所述受试者的生物样品中分离微泡部分，自微泡中提取DNA和/或RNA，和在提取的DNA和/或RNA中检测BRAF突变的存在或不存在。所述BRAF突变可以是本文公开的任何突变；优选地，所述BRAF突变是V600E。在提取的DNA和/或RNA中的BRAF突变的存在指示肿瘤起始或进展取决于BRAF的致癌或活化突变。因此，BRAF突变的存在指示所述受试者可以获益于包含激酶抑制剂、尤其是RAF或BRAF抑制剂的治疗方案。BRAF突变的不存在指示所述受试者可能不会获益于包含激酶抑制剂、例如RAF或BRAF抑制剂的治疗方案。

治疗由突变的BRAF驱动的癌症的药物已经被开发和现在正在被开发。这些药物中的两种，威罗菲尼和达拉非尼已获美国食品和药品管理局批准用于治疗晚期黑素瘤。威罗菲尼是B-raf抑制剂，其中断由突变的BRAF (即V600E)驱动的B-Raf/MEK/ERK途径。同样，达拉非尼是突变的BRAF (即V600E/K)的强效抑制剂。因此，使用本文所述的方法，已被鉴定具有突变的BRAF的受试者可以获益于包含靶向或抑制突变的BRAF和/或其下游信号转导的药剂的治疗方案。例如，所述受试者可以获益于包含威罗菲尼或达拉非尼的治疗方案，而没有突变的BRAF的受试者可能不会获益于包含威罗菲尼或达拉非尼的治疗方案。

在一些方面，本文公开的方法可用于评价受试者对治疗方案的反应性。例如，通过本文公开的方法可以检测BRAF突变，和BRAF突变的存在指示所述受试者可能对特定治疗方案具有反应性。例如，所述治疗方案包含激酶抑制剂例如RAF或BRAF抑制剂、或靶向突变的BRAF和/或来自突变的BRAF的下游信号转导的药物。受试者对特定治疗方案的反应性的判定可用于选择治疗方案。

的确，本文所述的分离方法和技术提供了以下的迄今为止尚未实现的优势：1)选择性地分析疾病-或肿瘤-特异性核酸的机会，其可通过在液体样品内将疾病-或肿瘤-特异性微泡与其它微泡分离而实现；2)与通过从液体样品中直接提取核酸所得的收率/完整性相比，具有更高序列完整性的核酸种类的明显更高的收率；3)可扩展性(scalability)，例如检测低水平表达的核酸，可通过从更大体积的血清中沉淀更多微泡而增加灵敏度；4)更纯的核酸，其中在核酸提取步骤之前从微泡沉淀物中排除蛋白和脂质、死细胞碎片和其它潜在污染物和PCR抑制剂；和5)在核酸提取方法中的更多选择，因为微泡沉淀物的体积比起始血清的体积小得多，使得可以使用小体积柱滤器从这些微泡沉淀物中提取核酸。

微泡优选地是从采自受试者体液的样品中分离出来。如本文使用的，“体液”是指分离自受试者身体的任何部位的液体样品，优选外周部位，包括但不限于血液、血浆、血清、尿、痰、脊髓液、胸膜液、乳头抽吸液、淋巴液、呼吸道、肠道和泌尿生殖道的液体、泪液、唾液、乳汁、淋巴系统液、精液、脑脊液、器官系统内液体(intra-organ system fluid)、腹水液、支气管肺泡灌洗液(BAL)、囊肿液、肿瘤囊肿液、羊水及其组合。优选地，所述体液是血浆、血清、脑脊液、腹水液、支气管肺泡灌洗液或囊肿液。在某些实施方案中，优选体液样品在2-20 ml的范围内。在一些方面，可以优选使用较大体积的样品，用于在检测稀有遗传突变(例如本文所述的BRAF突变)中增加准确率。在一些方面，所述体液样品在以下范围内：1-25 ml，例如，2-25 ml、2-20 ml、2-15 ml、2-10 ml、4-25 ml、4-20 ml、4-15 ml、4-10 ml、6-25 ml、 6-20 ml、6-15 ml、6-10 ml、8-25 ml、8-20 ml、8-15 ml、10-25 ml、10-20 ml、10-15 ml、15-25 ml或15-20 ml。

术语“受试者”意图包括显示出或预料具有微泡的所有动物。在具体的实施方案中，所述受试者是哺乳动物，人或非人灵长类动物、狗、猫、马、牛，其他农场动物，或啮齿动物(例如，小鼠、大鼠、豚鼠等)。术语“受试者”和“个体”在本文可以互换地使用。

从生物样品中分离微泡的方法是本领域已知的。例如，差速离心方法描述于Raposo等人(Raposo等人, 1996)的论文，类似的方法详述于本文的实施例部分。阴离子交换和/或凝胶渗透色谱的方法描述于美国专利号6,899,863和6,812,023。蔗糖密度梯度或细胞器电泳的方法描述于美国专利号7,198,923。磁性活化细胞分选(MACS)的方法描述于(Taylor和Gercel-Taylor，2008)。纳米膜超滤浓缩器方法描述于(Cheruvanky等人，2007)。优选地，可以通过新开发的使用独特微流体平台以高效和选择性地分离肿瘤来源的微泡的微芯片技术，从受试者的体液中鉴定和分离微泡。该技术，如Nagrath等人(Nagrath等人, 2007)的论文所述，可用于使用该论文教导的类似捕获和分离原理来鉴定和分离微泡。前述参考文献中的每篇都通过引用结合到本文中，用于这些方法的教导。

在一个实施方案中，分离自体液的微泡中，对起源于特定细胞类型，例如，肺、胰腺、胃、肠、膀胱、肾、卵巢、睾丸、皮肤、结直肠、乳房、前列腺、脑、食道、肝、胎盘、胎儿细胞的那些进行富集。因为微泡通常携带来自它们的供体细胞的表面分子如抗原，表面分子可以用于鉴定、分离和/或富集来自特定供体细胞类型的微泡(Al-Nedawi等人，2008；Taylor和Gercel-Taylor，2008)。以这种方式，可以对起源于不同细胞群体的微泡中的核酸含量进行分析。例如，肿瘤(恶性及非恶性)微泡携带肿瘤相关的表面抗原，并可以通过与这些特异性肿瘤关联的表面抗原而检测、分离和/或富集。在一个实例中，该表面抗原是上皮细胞粘附分子(EpCAM)，其对来自肺癌、结直肠癌、乳癌、前列腺癌、头颈部癌、和肝起源的微泡具有特异性，但对血液细胞起源的微泡没有特异性(Balzar等人，1999；Went等人，2004)。在另一个实例中，该表面抗原是CD24，CD24是对尿微泡具有特异性的糖蛋白(Keller等人，2007)。在又一个实例中，该表面抗原选自以下组的分子：CD70、癌胚抗原(CEA)、EGFR、EGFRvIII，和其他变体、Fas配体、TRAIL、铁传递蛋白受体、p38.5、p97和HSP72。另外，肿瘤特异性微泡可以表征为缺少表面标记，如CD80和CD86。

特定细胞类型的微泡的分离可以通过，例如使用对期望表面抗原具有特异性的抗体、适配体、适配体类似物或分子印迹聚合物完成。在一个实施方案中，该表面抗原对癌症类型具有特异性。在另一个实施方案中，该表面抗原对细胞类型具有特异性，该细胞类型不一定是癌性的。基于细胞表面抗原的微泡分离方法的一个实例在美国专利号7,198,923中提供。如美国专利号5,840,867号和5,582,981、WO/2003/050290以及Johnson等人(Johnson等人，2008)的出版物中描述的，适配体及其类似物特异性地结合表面分子，并可以用作重新获得细胞类型特异性的微泡的分离工具。分子印迹聚合物也特异性地识别表面分子，如美国专利号6,525,154、7,332,553和7,384,589以及Bossi等人(Bossi等人，2007)的出版物中描述的，并且是重新获得和分析细胞类型特异性微泡的工具。前述参考文献中的每篇均结合到本文中，用于这些方法的教导。

优选地，使用基于亲和力的过滤柱，从体液样品中分离微泡。例如，所述柱含有特异性地结合肿瘤来源的微泡或来自某种组织(即患病组织、肿瘤组织)或特异性细胞类型的微泡的试剂或部分。例如，所述柱含有特异性地结合微泡表面呈现的肿瘤相关抗原的试剂或部分，使得目标微泡保留在柱上，而其它细胞、碎片和非特异性微泡可被弃去。在使用基于亲和力的过滤柱之前，可通过离心或过滤，预处理体液样品。

或者，微泡可通过离心、过滤和/或浓缩步骤的组合而分离。例如，可以首先通过使用包括至少一个过滤步骤的方法，预处理体液样品。例如，粗滤器(course filter)(0.8微米)用于去除细胞和细胞碎片。该过滤后可接着超滤步骤，以去除溶剂和小分子分析物，同时保留微泡。在最初过滤中使用的滤器可以是足以去除细胞和细胞碎片的任何尺寸，例如，大于0.22微米的任何尺寸。为了分离微泡，预处理的样品再经过过滤浓缩步骤，其中具有分子量截止的滤器用于保留和浓缩直径大于10 nm的微泡。例如，再将样品浓缩至体积小于1 ml，优选100-200 ul。例如，所述分子量截止为至少100 kDa。

在微泡分离和浓缩后，在核酸提取前，样品用RNA酶抑制剂预处理，以防提取的RNA的消化并提高提取品质。任选地，所述样品可以用合适缓冲液洗涤至少一次，以进一步富集或纯化微泡部分。在某些实施方案中，所述样品用合适缓冲液洗涤两次，以进一步富集或纯化微泡部分。任选地，在DNA和/或RNA提取之前，将浓缩的微泡在用于预处理步骤的滤器上裂解。

任选地，在微泡分离或核酸提取之前，可将对照颗粒加入样品中，以起到内部对照的作用，以评价微泡纯化和/或核酸提取的效率或品质。这些对照颗粒包括Q-β噬菌体、病毒粒子或含有对照核酸(例如，至少一个对照靶基因)的任何其它颗粒，其可以是天然发生的或经重组DNA技术而工程化的。在某些实施方案中，对照颗粒的数量在加入样品前是已知的。对照靶基因可以用实时PCR分析来定量。对照靶基因的定量测定可用于确定微泡纯化或核酸提取过程的效率或品质。

本文所述的方法可包括使用对照颗粒以确定或评价微泡分离和/或微泡核酸提取的品质。对照颗粒统指在微泡分离或核酸提取过程期间的某个时间点加入的微泡尺寸范围的颗粒，其中所述颗粒含有对照核酸，例如DNA或RNA。具体地讲，对照核酸包含所测定或测量的至少一个靶基因，用于确定在分离或提取过程期间的对照颗粒的回收量。

优选地，对照颗粒是Q-β噬菌体，在本文中称为“Q-β颗粒”。用于本文所述的方法的Q-β颗粒可以是天然发生的病毒颗粒或可以是重组或工程病毒，其中病毒颗粒的至少一种组分(例如部分基因组或外壳蛋白)是经本领域已知的重组DNA或分子生物学技术合成的。Q-β是光滑病毒科家族成员，特征在于线性单链RNA基因组，其由3个基因组成，编码4种病毒蛋白：外壳蛋白、成熟蛋白、裂解蛋白和RNA复制酶。因其与平均微泡大小相似，所以可用分离微泡的相同纯化方法，从生物样品中容易地纯化Q-β，如本文所述。另外，Q-β病毒单链基因结构的低复杂性对于其在基于扩增的核酸测定中用作对照而言是有利的。Q-β颗粒含有所检测或测定的对照靶基因或对照靶序列，用于定量测定样品中的Q-β颗粒的量。例如，对照靶基因是Q-β外壳蛋白基因。在将Q-β颗粒加入尿样品或分离的尿来源的微泡之后，使用本文所述的提取方法，提取Q-β颗粒的核酸以及微泡和/或尿样品的核酸。通过RT-PCR分析可以确定Q-β对照靶基因的检测，例如与目标生物标志物(即BRAF)同时。对照靶基因的10倍稀释的至少2、3或4个已知浓度的标准曲线可用于确定拷贝数。可以比较检测的拷贝数和加入的Q-β颗粒的量，以确定分离和/或提取过程的品质。

在一个优选的实施方案中，在核酸提取前，将Q-β颗粒加入到尿样品中。例如，在超滤前和/或预过滤步骤后，将Q-β颗粒加入到尿样品中。

在某些实施方案中，将50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、1,000或5,000拷贝的Q-β颗粒加入到体液样品。在一个优选的实施方案中，将100拷贝的Q-β颗粒加入到体液样品。Q-β颗粒的拷贝数可以根据Q-β噬菌体感染靶细胞的能力来计算。因此，Q-β颗粒的拷贝数与Q-β噬菌体的集落形成单位相关。

在自生物样品中分离微泡后，可以自分离的或富集的微泡部分中提取核酸。可使用本领域众所周知的许多程序，自微泡分离核酸分子，对具体的生物样品选择合适的具体分离程序。提取的核酸可以是DNA和/或RNA。在某些实施方案中，提取DNA。在某些实施方案中，提取RNA。在某些实施方案中，同时提取DNA和RNA。RNA可以是信使RNA、转移RNA、核糖体RNA、小RNA、非编码RNA。在某些实施方案中，在核酸提取过程中可以进行额外步骤以改进或提高所提取的核酸的品质。这样的额外步骤描述于WO2011/009104，其全部内容都通过引用结合到本文中。

高品质RNA提取是高度期望的，因为RNA降解可以严重影响提取的RNA的下游评价，例如在基因表达和mRNA分析中，以及非编码RNA例如小RNA和微RNA的分析中。本文所述的新的方法使得能够从生物样品例如微泡中提取高品质核酸，使得可以进行外来体内的基因表达和突变水平的准确分析。在一个实施方案中，例如，当使用增加浓度的蛋白酶(5X, 10X)或RNA酶抑制剂作为提取增强剂时，从尿微泡中分离RNA的量和完整性明显增加。

在一个实施方案中，提取的核酸是RNA。然后优选地将RNA逆转录为互补DNA，然后进一步扩增。这样的逆转录可以单独进行或与扩增步骤组合进行。组合逆转录和扩增步骤的方法的一个实例是逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，其可被进一步修改为定量的例如定量RT-PCR，如美国专利号5,639,606所述，其通过引用结合到本文中，用于该教导。

核酸扩增方法包括但不限于聚合酶链式反应(PCR) (美国专利号5,219,727)及其变体例如原位聚合酶链式反应(美国专利号5,538,871)、定量聚合酶链式反应(美国专利号5,219,727)、巢式聚合酶链式反应(美国专利号5,556,773)、自我维持序列复制及其变体(Guatelli等人, 1990)、转录扩增系统及其变体(Kwoh等人, 1989)、Qb复制酶及其变体(Miele等人, 1983)、冷-PCR (Li等人, 2008)或任何其他核酸扩增方法，接着使用本领域技术人员众所周知的技术来检测扩增的分子。尤其有用的是设计用于检测核酸分子的那些检测方案，如果这样的分子以极少数量存在的话。前述参考文献通过引用结合到本文中，用于这些方法的教导。

对微泡中存在的核酸的分析是定量和/或定性的。对于定量分析，用本领域已知方法(描述于以下)测定微泡内的特定的目标核酸的相对或绝对量(表达水平)。对于定性分析，用本领域已知方法(描述于以下)鉴定微泡内的特定的目标核酸的种类，无论是野生型或是变体。

“遗传畸变”用于本文是指微泡内的核酸量以及核酸变体。具体地讲，遗传畸变包括但不限于，基因(例如，癌基因)或一组基因的过量表达，基因(例如，肿瘤抑制基因例如p53或RB)或一组基因的不足表达，基因或一组基因的剪接变体的选择性产生，基因拷贝数变体(CNV) (例如，DNA双微体) (Hahn, 1993)，核酸修饰(例如，甲基化、乙酰化和磷酸化)，单核苷酸多态性(SNP)，染色体重排(例如，倒位、缺失和重复)，和基因或一组基因的突变(插入、缺失、重复、错义、无义、同义或任何其它核苷酸变化)，在许多情况下所述突变最终影响基因产物的活性和功能，导致选择性转录剪接变体和/或基因表达水平的改变。

对这类遗传畸变的确定可以通过技术人员已知的各种技术来进行。例如，可通过微阵列分析(美国专利号6,913,879、7,364,848、7,378,245、6,893,837和6,004,755)和定量PCR，测定核酸表达水平、选择性剪接变体、染色体重排和基因拷贝数。尤其是，拷贝数变化可用Illumina Infinium II全基因组基因分型测定或Agilent人类基因组CGH微阵列(Steemers等人, 2006)来检测。核酸修饰可通过描述于例如以下文献的方法来测定：美国专利号7,186,512和专利公布WO/2003/023065。尤其是，甲基化谱可通过Illumina DNA甲基化OMA003 Cancer Panel来测定。SNP和突变可通过以下方法检测：与等位基因-特异性探针杂交、酶突变检测、错配异源双链体的化学切割(Cotton等人, 1988)、错配碱基的核糖核酸酶切割(Myers等人, 1985)、质谱(美国专利号6,994,960, 7,074,563和7,198,893)、核酸测序、单链构象多态性(SSCP) (Orita等人, 1989)、变性梯度凝胶电泳(DGGE) (Fischer和Lerman, 1979a；Fischer和Lerman, 1979b)、温度梯度凝胶电泳(TGGE) (Fischer和Lerman, 1979a；Fischer和Lerman, 1979b)、限制性片断长度多态性(RFLP) (Kan和Dozy, 1978a；Kan和Dozy, 1978b)、寡核苷酸连接测定(OLA)、等位基因-特异性PCR (ASPCR) (美国专利号5,639,611)、连接链式反应(LCR)及其变体(Abravaya等人, 1995；Landegren等人, 1988；Nakazawa等人, 1994)、流式细胞异源双链体分析(WO/2006/113590)及其组合/修改。显著地，基因表达水平可以通过基因表达(SAGE)技术的系列分析而测定(Velculescu等人, 1995)。一般而言，分析遗传畸变的方法在大量出版物中都有报告，不限于本文引用的那些，并且可被技术人员利用。合适的分析方法将取决于特定分析目标，患者的病况/病史，和所检测、监测或治疗的具体的癌症、疾病或其它医学病况。前述参考文献结合到本文中，用于这些方法的教导。

在一个实施方案中，疾病例如癌症相关基因的突变(例如，经由核苷酸变体，过量表达或不足表达)通过分析微泡中的核酸而检测，所述核酸来源于起源细胞中的基因组本身或通过病毒引入的外源基因。核酸序列可以是完整的或部分的，因为这两者都预期得到疾病诊断和预后的有用信息。所述序列可以是对实际基因或转录序列而言有义的或反义的。技术人员将能够设计用于自可存在于微泡中的有义或反义核酸的核苷酸变异的检测方法。许多这类方法包括使用探针，其对其直接侧接的核苷酸序列或含有核苷酸变异的核苷酸序列具有特异性。这样的探针可由技术人员考虑到基因序列的知识和基因中的核酸变体的位置而设计。这样的探针可用于分离、扩增和/或实际上杂交，以检测核酸变体，如本领域和本文所述。

确定受试者的微泡内的核酸中的特定核苷酸变体或多个变体的存在或不存在，可以以各种方式进行。对于这样的分析，各种方法是可得的，包括但不限于，PCR、与等位基因-特异性探针杂交、酶突变检测、错配的化学切割、质谱或DNA测序，包括微测序。在具体的实施方案中，与等位基因-特异性探针杂交可以以两种方式进行：1)在溶液中，等位基因特异性寡核苷酸结合到固相(玻璃、硅、尼龙膜)和标记的样品，如同许多DNA芯片应用中，或2)在溶液中，结合的样品(通常是克隆的DNA或经PCR扩增的DNA)和标记的寡核苷酸(或等位基因特异性的或短的，以便允许通过杂交而测序)。诊断测试可以包括一组变异，通常在固体支持物上，其能够同时确定超过一个变异。在另一个实施方案中，确定微泡核酸中的至少一个核酸变异的存在需要单体型分析测试。确定单体型的方法是本领域技术人员已知的，例如在WO 00/04194中。

在一个实施方案中，核酸变体的存在或不存在的确定包括通过例如以下方法确定变体位点的序列(其中出现偏离正常的核酸变异的序列内的准确位置)：聚合酶链式反应(PCR)、链终止DNA测序(美国专利号5547859)、小测序(Fiorentino等人, 2003)、寡核苷酸杂交、焦磷酸测序、Illumina基因组分析仪、深度测序、质谱或其它核酸序列检测方法。检测核酸变体的方法是本领域众所周知的并公开于WO 00/04194，通过引用结合到本文中。在示例性的方法中，诊断测试包括扩增DNA或RNA区段(通常在RNA转化为互补DNA之后)，其在期望的基因序列中跨越一个或多个已知变体。再对该扩增区段测序和/或经过电泳，以鉴定扩增区段中的核苷酸变体。

在一个实施方案中，本发明提供在如本文所述分离的微泡核酸中筛选核苷酸变体的方法。这可以例如通过PCR或在连接链式反应(LCR) (Abravaya等人, 1995；Landegren等人, 1988；Nakazawa等人, 1994)中实现。LCR在目标基因中的点突变检测中可以是特别有用的(Abravaya等人, 1995)。LCR方法包括设计简并引物的步骤，用于扩增靶序列，所述引物对应于对应于目标基因的核酸的一个或多个保守区，用引物扩增PCR产物，使用得自微泡的核酸作为模板，和分析PCR产物。将微泡核酸的PCR产物与对照样品(或具有核苷酸变体或没有)比较，指示微泡核酸中的变体。改变可以是在微泡核酸中不存在或存在核苷酸变体，取决于对照。

可进行扩增产物的分析，使用能够按其尺寸分离扩增产物的任何方法，包括自动和手动的凝胶电泳、质谱等。

或者，使用SSCP、DGGE、TGGE、化学切割、OLA、限制性片断长度多态性以及杂交，例如核酸微阵列，可根据序列差异分析扩增产物。

核酸分离、扩增和分析的方法对于本领域技术人员而言是常规的，方案的实例可以在例如以下文献中找到：Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3-Volume Set) Ed. Joseph Sambrook, David W. Russel,和Joe Sambrook, Cold Spring Harbor Laboratory, 第三版(2001年1月15日), ISBN: 0879695773。用于PCR扩增的方法的一个特别有用的方案来源是PCR Basics: From Background to Bench by Springer Verlag；第一版(2000年10月15日), ISBN: 0387916008。

在肿瘤活检样品上进行诊断的许多方法可用微泡进行，因为肿瘤细胞，以及一些正常细胞，已知会脱落微泡到体液中，并且这些微泡内的遗传畸变反映了肿瘤细胞内的那些，正如本文证明的。此外，使用微泡的诊断方法具有在肿瘤活检样品上直接进行诊断的方法所没有的特征。例如，相比肿瘤/癌症核酸的其它采样形式，微泡核酸分析的一个特别优势就是分析来自个体中存在的所有肿瘤病灶或遗传上不均匀肿瘤的肿瘤/癌症核酸的可用性。活检样品是受限的，因为它们提供仅仅对于肿瘤特定病灶(从中获得活检)的信息。体内发现的、或甚至在单一肿瘤内发现的不同的瘤/癌病灶通常具有不同的遗传谱并且在标准活检中无法分析。然而，对来自个体的微泡核酸的分析有可能提供个体内所有病灶的采样。这为推荐的治疗、治疗有效性、疾病预后和疾病复发的分析，提供了简单活检所无法提供的有价值的信息。

本文所述的方法对特定疾病和/或医学病况相关的遗传畸变的鉴定，也可用于经诊断患有疾病或其它医学病况例如癌症的个体的预后和治疗决策。对疾病和/或医学病况的遗传基础的鉴定提供了有用的信息，指导对疾病和/或医学病况的治疗。例如，许多形式的化学治疗已被证明对具有特定遗传异常/畸变的癌症更有效。一个实例是使用BRAF抑制剂来治疗具有BRAF活化突变的癌症。在某些实施方案中，使用联合治疗可能是有用的，其中所述联合治疗包括BRAF抑制剂和另一化疗药、药物、手术或放疗。

也已发现其它基因中的遗传畸变影响治疗的有效性。正如在Furnari等人(Furnari等人, 2007)中公开的，多个基因中的突变影响了用于治疗脑癌的化学治疗中的特定药物的有效性。对微泡内核酸的这些遗传畸变的鉴定将指导选择适当的治疗计划。

因此，本发明的方面涉及在受试者中监测疾病(例如癌症)进展的方法，并且也涉及在个体中监测疾病复发的方法。这些方法包括以下步骤：如本文讨论，自个体体液中分离微泡，和如本文讨论地分析微泡内的核酸(例如产生微泡的遗传谱)。某种遗传畸变/谱的存在/不存在用于指示受试者中的疾病(例如癌症)的存在/不存在，如本文讨论。随着时间，定期进行该过程并检查结果，以监测疾病进展或消退，或确定疾病的复发。换句话说，遗传谱中的变化指示受试者的疾病状态变化。在受试者的微泡取样以进行微泡分离和分析之间经过的时期，将取决于受试者的情况，并且由技术人员来确定。当分析来自受试者经历的治疗相关基因的核酸时，这样的方法将证明极大的益处。例如，可以监测治疗所靶向基因的突变的发展(使其抵抗治疗)，在这时，可因此改进治疗。监测的基因也可以是指示针对特定治疗的特定反应性的基因。

本发明的方面也涉及以下事实：各种非癌疾病和/或医学病况也具有遗传关联和/或原因，并且所述疾病和/或医学病况可以同样通过本文所述的方法来诊断和/或监测。许多这样的疾病本质上是代谢疾病、感染性疾病或变性疾病。

技术人员根据各种因素的一种或多种的分析，选择从中分离微泡的个体。这些所考虑的因素是受试者是否具有特定疾病(例如癌症)的家族病史，具有所述疾病的遗传倾向，因家族史而具有所述疾病的增加的风险，遗传倾向，指示倾向的其它疾病或体征、或环境原因。环境原因包括生活方式、接触引起或促进疾病的试剂，例如在空气、土壤、水或饮食中。另外，先前患有所述疾病，目前诊断患有所述疾病(在治疗前或治疗后)，目前正在治疗所述疾病(经历治疗)，从所述疾病中缓解或恢复，这些都是选择个体进行所述方法的其它原因。

本文所述的方法任选与额外步骤一起进行，所述额外步骤是在分析步骤前选择基因或核酸用于分析。该选择可基于受试者的任何倾向，或任何先前的暴露或诊断，或受试者所经历的或目前进行的治疗性治疗。

所诊断、监测或另外进行谱分析(profile)的癌症可以是任何类型的癌症。其包括但不限于：上皮细胞癌，例如肺癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜癌、乳癌、脑癌、结肠癌和前列腺癌。也包括的是胃肠癌、头颈部癌、非小细胞肺癌、神经系统的癌症、肾癌、视网膜癌、皮肤癌、肝癌、胰腺癌、生殖泌尿癌和膀胱癌、黑素瘤和白血病。另外，本发明的方法和组合物同样可用于个体的非恶性肿瘤(例如纤维神经瘤、脑膜瘤和许旺氏细胞瘤(schwannoma))的检测、诊断和预后。优选地，所述癌症与BRAF的致癌的或活化的突变有关。

应当理解，本发明不限于本文所述的具体的方法学、方案和试剂，因此可变化。本文所用的术语仅仅用于描述具体实施方案的目的，而无意限制仅由权利要求书限定的本发明范围。

实施例

实施例 1: 自微泡制备核酸

本发明提供自患者样品分离的微泡中提取核酸的方法。具体地讲，DNA和RNA提取自黑素瘤患者的血浆样品。在提取前，样品经过预处理。例如，将2-20 ml范围内的血浆样品在超速离心机中以120,000 x g离心80分钟。任选地，将RNA酶抑制剂、例如RNasin Plus (40 u/μl, Promega)或Superasin (20 u/μl, Ambion)，加入到沉淀物中并在室温下孵育5分钟。含微泡的沉淀物再经处理，使用制造商推荐方案，用Qiagen DNeasy Blood and Tissue Kit (目录号 69504)进行DNA提取，或用Qiagen miRNeasy Kit (目录号 217004)进行RNA提取。

在某些实施方案中，在分析前将提取的RNA逆转录为cDNA可能是优选的。用市售的cDNA合成试剂盒进行RNA逆转录，所述试剂盒含有逆转录酶，例如Superscript ® VILO™ (Invitrogen)。逆转录反应如下进行：

然后在热循环仪例如Veriti PCR机器上进行cDNA合成反应。cDNA反应程序如下：

1.　　25℃ 10 min

2.　　42℃ 70 min

3.　　85℃ 5 min

4.　　4℃

然后将cDNA在-20℃或-80℃冷冻，用于长期贮存。

实施例 2: 用 QPCR 方法检测 BRAF 突变

使用本文公开的方法分析来自黑素瘤患者的血浆样品。原始肿瘤的活检同时在样品081和MGHSS04中显示V600E BRAF突变。样品055和091来自V600E BRAF突变阴性的黑素瘤患者。

首先，微泡部分得自血浆，使用本文公开的方法自微泡中提取DNA或RNA。对于QPCR测定，用以下QPCR引物和探针分析5 μl提取的DNA或2 μl cDNA：

BRAF WT正向: AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACAGT (SEQ ID NO: 3)

BRAF MT ARMS 正向: AAAAATAGGTGATTTTGGTCTAGCTACATA (SEQ ID NO: 4)

BRAF JS E15反向: TGGATCCAGACAACTGTTCAA (SEQ ID NO: 5)

BRAF AZ E15探针(VIC-MGB): GATGGAGTGGGTCCCATCAG (SEQ ID NO: 6)

使用Taqman Gen Expression Master Mix (Applied Biosystems 4369016)准备QPCR反应如下：

BRAF WT正向或MT ARMS正向 (18 µM)	1 µl
		BRAF JS E15反向 (18 µM)	1 µl
BRAF E15 VIC探针(5 µM)	1 µl
		2x Taqman Gene Expression Master Mix	10 µl
提取的DNA或cDNA	5 µl或2 µl
		H₂O	加至20 µl
总计	20 µl

使用的扩增程序如下：

1. 50℃　　2分钟

2. 95℃　　10分钟

3. 95℃　　15秒钟

4. 60℃　　60秒钟

5. 重复步骤3和4，总共50个循环

通过QPCR，一式三份地分析每个样品。对于样品081，Ct值是34.7、34.79和36.89。对于样品MGHSS04，Ct值是35.28、34.69和35.21。扩增阈值经手动设置在基线上。样品055和081的扩增图见图1。样品MGHSS04的扩增图见图2。样品091的扩增图见图3。

如图1、2和3所示，根据来自肿瘤组织的活检数据，BRAF的突变形式在样品081和样品MGHSS04中检出，正如所料。因此，BRAF的突变形式在样品055或样品091中未检出，正如所料。这些结果证明，通过QPCR测定，自生物样品提取的核酸中可以准确和可重复地检测突变的BRAF。

实施例 3: 使用 DNA 和 RNA 分析以提高检测灵敏度

通过QPCR分析一组黑素瘤患者的BRAF突变状态。通过活检分析，所有患者的BRAF突变呈阳性。具体地讲，来自患者051、057、061、074、085、089、090、098、107和109的活检样品含有V600E BRAF突变。来自患者062的活检样品表现出V600K BRAF突变。

通过本文公开的方法，自该组黑素瘤患者的血浆和血清样品中提取DNA和RNA。核酸经过QPCR分析，以检测BRAF突变。QPCR分析的结果概述于表1。对于所有样品，对DNA或RNA的分析得到BRAF突变的存在情况的准确检测。对于一些样品，对这两者的检测允许提高BRAF突变检测的灵敏度，并且显示自微泡提取的核酸中检测BRAF对于癌症的诊断和预后而言可以是有价值的。

表 1. 自一组黑素瘤患者的DNA和RNA样品的QPCR分析的结果概述。

样品 ID	活检 BRAF 突变体	对 DNA 的 QPCR 结果	对 RNA 的 QPCR 结果
				051	V600E	+	-
057	V600E	+	-
				062	V600K	+	-
085	V600E	+	-
				089	V600E	+	-
074	V600E	-	+
				098	V600E	-	+
109	V600E	-	+
				061	V600E	+	+
090	V600E	+	+
				107	V600E	+	+

参考文献

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Claims

1. 在受试者中诊断疾病或其它医学病况的方法，包括：

a) 自所述受试者的生物样品中分离微泡部分；

b) 自微泡中提取DNA和/或RNA；和

c) 在提取的DNA和/或RNA中检测BRAF突变的存在或不存在，

其中在提取的DNA和/或RNA中的BRAF突变的存在指示所述受试者中的疾病或其它医学病况的存在或所述受试者发展疾病或其它医学病况的更高倾向。

2. 确定用于治疗患有疾病或其它医学病况的受试者的治疗方案的方法，包括：

a) 自所述受试者的生物样品中分离微泡部分；

b) 自微泡中提取DNA和/或RNA；和

c) 在提取的DNA和/或RNA中检测BRAF突变的存在或不存在，

其中在提取的DNA和/或RNA中的BRAF突变的存在指示使用包含至少一种激酶抑制剂的治疗方案。

3. 权利要求1或2的方法，其中所述疾病或其它医学病况是癌症。

4. 权利要求3的方法，其中所述癌症是黑素瘤、甲状腺癌、结直肠癌、卵巢癌、乳癌、肺癌、脑癌、胰腺癌、淋巴瘤或白血病。

5. 权利要求1或2的方法，其中所述BRAF突变是活化突变。

6. 权利要求1或2的方法，其中所述BRAF突变编码突变的BRAF多肽，其中所述突变的BRAF多肽是V600E。

7. 权利要求1或2的方法，其中所述BRAF突变是T1799A。

8. 权利要求2的方法，其中所述激酶抑制剂是RAF抑制剂或MEK抑制剂。

9. 权利要求8的方法，其中所述RAF抑制剂是BRAF-特异性抑制剂。

10. 权利要求1或2的方法，其中所述生物样品是体液样品。

11. 权利要求10的方法，其中所述体液样品是血浆、血清、脑脊液、腹水液、支气管肺泡灌洗液和囊肿液。

12. 权利要求10的方法，其中所述体液样品在2-20 ml范围内。

13. 权利要求2的方法，其中所述治疗方案包含威罗菲尼或达拉非尼。