JP2023506768A - 聴覚損失の予防及び治療のための組成物及び方法 - Google Patents

Abstract

聴覚損失の予防又は治療のためにＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤を使用する方法、キット及び医薬組成物が記載されている。

Description

本発明は、アメリカ国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）により認められた認可番号ＤＣ００６４７１ ＤＣ０１５０１０、ＤＣ０１５４４４、ＤＣ０１３８７９、ＤＣ０１３２３２、及びＣＡ０２１７６５、並びにアメリカ海軍研究局（Ｏｆｆｉｃｅ ｎａｖａｌ ｒｅｓｅａｒｃｈ）により認められた認可番号Ｎ０００１４－０９－Ｖ－１０１４、Ｎ０００１４－１２－Ｖ－０１９１、Ｎ０００１４－１２－Ｖ－０７７５、及びＮ０００１４－１６－Ｖ－２３１５の下に政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明において特定の権利を有する。

耳は、聴覚と平衡覚をつかさどる迷路のような構造からなる複雑な器官である。聴覚と平衡覚の両方の知覚は、内耳構造の、機械的刺激を脳によって認識されるインパルスに変換する能力によるものである。聴覚をつかさどる感覚受容器は、液体で満たされたらせん形の管である蝸牛に存在する。蝸牛内にはコルチ器官があり、コルチ器官は基底膜と蓋膜を橋渡しする円柱状の感覚有毛細胞で裏打ちされている。音波がコルチ器官を通過すると、基底膜が振動し、有毛細胞を前後に曲げる。この動きによって有毛細胞が脱分極し、聴神経への神経伝達物質の放出が起こり、聴神経がインパルスを脳へ運ぶ。

内耳蝸牛感覚上皮は生後の有糸分裂後であり、マウスでは生後１週間の間、わずかに限られた自発的再生を示すだけである。成体哺乳動物では有毛細胞は自発的に再生できず、したがって哺乳動物では感覚有毛細胞が損傷すると永続的な聴覚損失に至る。

内耳感覚有毛細胞は、騒音、抗生物質、化学療法中のシスプラチン、又は加齢によって損傷を受けやすい。現在、ＦＤＡにより承認された聴覚損失の予防及び治療のための耳保護剤は存在しない。

本発明は、聴覚損失の治療又は予防を必要としている動物に、上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達阻害剤を投与することによって、聴覚損失を治療又は予防するための方法を提供する。他の実施形態では、方法は、１つ以上の耳保護剤を投与することをさらに含む。特に本発明の主題は、聴覚損失の治療又は予防のための上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達阻害剤の使用であって、ＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤は、ＰＡＮ－ＡＵＲ、ＥｒＢｂ－２、ＭＥＫ、又はＨｅｒ－２、オーロラキナーゼ、Ｂ－Ｒａｆ若しくはＰＤＧＦＲからなる細胞周期関連タンパク質キナーゼの少なくとも１つの発現又は活性を阻害する、使用を含む。

さらなる実施形態においては、ＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤は、ＥＧＦＲ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ＮＣＫ、ＰＡＫ、ＪＮＫ、ＰＬＣ、ＰＫＣ、又は細胞周期関連タンパク質キナーゼ阻害剤（例えば、Ｈｅｒ－２、オーロラキナーゼ、Ｂ－Ｒａｆ若しくはＰＤＧＦＲ）の発現又は活性を阻害する。他の実施形態では、阻害剤は、阻害性ＲＮＡ、抗体、又は小有機分子である。

さらなる実施形態においては、少なくとも２つの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達阻害剤の相乗的組み合わせからなる医薬組成物であって、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤は、ＥＧＦＲ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＮＣＫ、ＰＡＫ、ＪＮＫ、ＰＬＣ、ＰＫＣ、又は細胞周期関連タンパク質キナーゼ阻害剤の発現又は活性を阻害する、医薬組成物が提供される。

本発明の主題の別の態様は、第１の単離されたＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤（ここで、第１のＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤は、ＥＧＦＲ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＮＣＫ、ＰＡＫ、ＪＮＫ、ＰＬＣ、ＰＫＣ、又は細胞周期関連タンパク質キナーゼ阻害剤の発現又は活性を阻害する）、及び第２の単離されたＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤（ここで、ＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤は、ＥＧＦＲ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＮＣＫ、ＰＡＫ、ＪＮＫ、ＰＬＣ、ＰＫＣ、又は細胞周期関連タンパク質キナーゼ阻害剤の発現、活性を阻害する）からなるキットであって、第１の阻害剤は第２の阻害剤と異なる、キットを含む。

図１は、ＥＧＦＲ阻害剤ムブリチニブ（その構造が示されている）が、マウス蝸牛移植片におけるシスプラチン誘発性有毛細胞喪失を防ぐ効果を有することを示しており、ＩＣ_５０は２．５ｎＭ、ＬＤ_５０は＞５００ｎＭ（治療指数 ＞２００）である。移植体数：各投与量で１～４；ＦＶＢマウス蝸牛移植片を１５０μＭのシスプラチンで処理し、蝸牛のミドルターンを分析した；カーブフィッティングのＲ^２は０．８６。全てのアッセイ（ＨＥＩ－ＯＣ１細胞及び移植体）でＭＵＢＲＩＴＩＮＩＢのＩＣ_５０値は一致しており、その特異性及び効力を実証したことに留意されたい。 図２は、ＥＧＦＲ阻害ペリチニブ（その構造が示されている）が、シスプラチン誘発性有毛細胞喪失を防ぐ効果を有することを示している。ペリチニブは、ＨＥＩ－ＯＣ１細胞におけるシスプラチン誘発カスパーゼ－３／７活性に対し保護効果を示すＥＧＦＲの不可逆阻害剤であり、ＩＣ_５０は０．６μＭ（シスプラチン－カスパーゼ－Ｇｌｏ ３／７）、ＬＤ_５０は＞４０μＭ（ＣＥＬＬＴＩＴＥＲ－ＧＬＯ）である。 図３は、シスプラチンで処理した又は処理していないマウス蝸牛移植片におけるダブラフェニブ（Ｄａｂ）の用量反応を示す。Ｄａｂを単独で、又はシスプラチン（１５０μＭ）の１時間前にＤａｂを、Ｐ３ ＦＶＢ蝸牛移植片に添加（２４時間）。Ｄａｂの各用量における移植片数を示した。^＊＊＊：Ｐ＜０．００１；^＊＊：Ｐ＜０．０１；^＊：Ｐ＜０．０５（スチューデントのＴ検定）Ｃｉｓ単独と比較。 図４Ａは、シスプラチン誘発性有毛細胞死におけるＲＴＫ（受容体型チロシンキナーゼ）、ＲＡＳ、ＲＡＦ、ＭＥＫ、及びＥＲＫのシグナル伝達カスケード、並びに耳保護におけるＲＡＦ、ＭＥＫ、及びＥＲＫに対する現在の小分子阻害剤を示している。図４Ｂ－４Ｅは、ダブラフェニブに加えて、３つのＢ－Ｒａｆ阻害剤（ベムラフェニブ、ＰＬＸ－４７２０、及びＲＡＦ－２６５を示す）及び１つのＭＥＫ１／２阻害剤（トラメチニブを示す）が、蝸牛移植片培養アッセイにおいて、シスプラチン誘発性有毛細胞死を防ぐ効果を有したことを示している。シスプラチンで処理した又は処理していないＰ３ ＦＶＢマウス蝸牛移植片におけるこれらの化合物の用量応答性を示す。他の標示の意味については図３を参照されたい。 図５Ａ及び５Ｂは、ダブラフェニブがＨＥＩ－ＯＣ１細胞においてシスプラチン活性化Ｂ－Ｒａｆシグナル伝達カスケードを抑制することを示す。ウェスタンブロットは、特定の用量（５Ｂ）及び時間（５Ａ）でシスプラチン及びＤａｂで処理した際の各シグナル伝達分子の代表的な変化を示す。 図６Ａは、ダブラフェニブ（１００ｍｇ／ｋｇ）及びシスプラチン（３０ｍｇ／ｋｇ）の成体ＦＶＢマウス（雄及び雌）への投与スケジュールを示す。 図６Ｂは、シスプラチン（３０ｍｇ／ｋｇ）とダブラフェニブ（１００ｍｇ／ｋｇ）の同時投与後２１日目に、ＡＢＲ閾値シフト平均が１１．８～１５．０ｄＢの低下を記録したことを示す（平均±ＳＥＭ、^＊：Ｐ＜０．０５ ２元配置分散分析とその後のボンフェローニ比較によりシスプラチン単独と比較）。 図７Ａは、成体ＦＶＢマウス（雄及び雌）へのダブラフェニブ（１００ｍｇ／ｋｇ）の投与及び騒音曝露のスケジュールを示す。 図７Ｂは、ダブラフェニブ（１００ｍｇ／ｋｇ）及び騒音曝露の初日から１４日目に、ＡＢＲ閾値シフトが平均１８．１～２１．９ｄＢの低下を記録したことを示す（平均±ＳＥＭ、^＊＊：Ｐ＜０．０１、^＊＊＊：Ｐ＜０．００１ ２元配置分散分析とその後のボンフェローニ比較により担体と比較）。 図８Ａは、成体ＦＶＢマウス（雄及び雌）へダブラフェニブ（１日に、６０ｍｇ／ｋｇ×２回）の投与及び騒音曝露のスケジュールを示す。 図８Ｂは、ダブラフェニブ（１日に、６０ｍｇ／ｋｇ×２回）及び騒音曝露の初日から１４日目に、ＡＢＲ閾値シフトが平均１３．５～２１．２ｄＢの低下を記録したことを示す（平均±ＳＥＭ、^＊＊：Ｐ＜０．０１、^＊＊＊：Ｐ＜０．００１ ２元配置分散分析とその後のボンフェローニ比較により担体と比較）。 図９は、マウス蝸牛移植片培養におけるＢ－Ｒａｆ／ＭＥＫ１／２阻害剤併用の試験を示す。シスプラチン（１５０μＭ）の前に化合物単独又は化合物の組み合わせをＰ３ＦＶＢ蝸牛移植片に添加し（２４時間）、蝸牛のミドルターン領域の１６０μｍ当たりの外有毛細胞の数を、ファロイジン染色によって計数した（平均±ＳＥＭ、Ｐ＝^＊＜０．０５、Ｐ＝^＊＊＊＜０．００１、対応のない両側スチューデントｔ検定によりシスプラチン単独と比較）。試験した化合物間の最初のモル比は、現在がん患者に与えられている比（ダブラフェニブ（１５０ｍｇを１日２回）＋トラメチニブ（２ｍｇを１日１回））によって決定した。 図１０Ａ及び１０Ｂは、複数の阻害剤（ムブリチニブ、ＳＮＳ－３１４、及びクレノラニブ）についてのマウス蝸牛移植片のデータを示す。 図１１Ａ、１１Ｂ、１１Ｃ及び１１Ｄは、ゼブラフィッシュにおける化合物の保護効果を示す（ダブラフェニブ、ムブリチニブ、クレノラニブ、及びＳＮＳ－３１４）。ゼブラフィッシュの側線感丘を染色し、１感丘当たりの有毛細胞数を計数した。シスプラチン（ＣＰ）：４００μＭ。^＊，^＊＊、及び^＊＊＊：Ｐ＜０．０５、０．０１及び０．００１ ＣＰと比較。 図１２は、化合物ダブラフェニブ（Ｂ－Ｒａｆキナーゼ阻害剤、３０ｎＭ）及びＡＺＤ５４３８（ＣＤＫ２キナーゼ阻害剤、０．３４ｎＭ）が、マウス蝸牛移植片において、個々の阻害剤の場合よりもシスプラチンに対する保護効果がより良好であることを示す。 図１３Ａ～１３Ｄは、阻害剤（ダブラフェニブ １日に６０ｍｇ／ｋｇ×２、ＡＺＤ５４３８ １日に３５ｍｇ／ｋｇ×２）の組み合わせの経口送達によるマウスにおける騒音損傷に対する保護効果を示す。

ＥＧＦＲ及びその下流又はそれに関連するタンパク質の阻害剤が、シスプラチン、抗生物質、騒音、加齢又は他の耳毒性傷害によって損傷した有毛細胞を保護することが見いだされた。したがって、本発明は、ＥＧＦＲ阻害剤を用いて聴覚損失を予防及び治療するための組成物及び方法を提供する。理想的には、本発明の方法は、感覚有毛細胞の喪失又は損傷に関連する少なくとも１つの障害、例えば、感覚有毛細胞の損傷に関連する耳の障害（聴覚損失又は平衡障害など）について、動物、好ましくは哺乳動物（例えば、ヒト）を予防的又は治療的に処置する。本発明の方法はまた、知覚レベルの維持、すなわち、例えば老化過程又は耳毒性剤によって引き起こされる環境刺激の知覚の喪失を制御するのに有用である。ＥＧＦＲ及びその下流又はそれに関連するタンパク質の阻害剤は、表１に要約される治療効果を提供する。

ＥＧＦＲシグナル伝達。上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ、ＥｒｂＢ－１、ヒトにおけるＨＥＲ１）は、上皮成長因子（ＥＧＦ）、トランスフォーミング成長因子α（ＴＧＦα）、ＨＢ－ＥＧＦ、アンフィレグリン、ベタセルリン、エピゲン、及びエピレグリンを含むその特異的リガンドの結合によって活性化される細胞表面受容体である。ＥＧＦＲは、ＥｒｂＢファミリーの受容体のメンバーであり、４つの密接に関連した受容体型チロシンキナーゼ、すなわちＥＧＦＲ、ＨＥＲ２／ｃ－ｎｅｕ（ＥｒｂＢ－２）、Ｈｅｒ３（ＥｒｂＢ３）及びＨｅｒ４（ＥｒｂＢ－４）のサブファミリーである。その成長因子リガンドによる活性化の際に、ＥＧＦＲは、不活性単量体形態から活性ホモ二量体への転移を受ける。リガンド結合後にホモ二量体を形成することに加えて、ＥＧＦＲは、ＥｒｂＢ２／Ｈｅｒ２／ｎｅｕなどのＥｒｂＢ受容体ファミリーの別のメンバーと対合して、活性化ヘテロ二量体を生成することができる。ＥＧＦＲの二量体化は、その内在性の細胞内タンパク質－チロシンキナーゼ活性を刺激する。その結果、ＥＧＥＲのＣ末端ドメインにあるいくつかのチロシン（Ｙ）残基の自己リン酸化が起こる。これらには、Ｙ９９２、Ｙ１０４５、Ｙ１０６８、ＹＩ１４８及びＹ１１７３が含まれる。この自己リン酸化は、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ、ＮＣＫ－ＰＡＫ－ＪＮＫ、ＰＬＣ－ＤＡＧ－ＰＫＣ、及び／又は多数の細胞周期関連タンパク質キナーゼタンパク質／経路の下流の活性化、シグナル伝達、及び／又は発現を誘発する。これらのシグナル伝達イベントは、ＤＮＡ合成、並びに細胞の移動、接着、及び増殖をもたらすいくつかのシグナル伝達カスケードを開始する。したがって、「ＥＧＥＲシグナル伝達」又は「ＥＧＦＲシグナル伝達経路」は、本明細書では、ＥＧＥＲ自体によるシグナル伝達、並びにその下流のＲａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、ＪＡＫ／ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ、ＮＣＫ－ＰＡＫ－ＪＮＫ、ＰＬＣ－ＤＡＧ－ＰＫＣ、細胞周期関連タンパク質キナーゼ経路／タンパク質によるシグナル伝達を指す。

Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ／ＭＡＰＫ経路。Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ／ＭＡＰＫ経路（ＭＡＰＫ／ＥＲＫ経路としても知られる）は当該技術分野でよく知られており、ＥＧＥＲなどのリガンド結合細胞表面チロシンキナーゼ受容体からの細胞外シグナルを中継することによって哺乳動物細胞の増殖を調節する中心的役割を果たす。ＭＡＰＫ／ＥＲＫ（分裂促進因子活性化タンパク質キナーゼ／細胞外シグナル調節キナーゼ）経路の活性化は、Ｒａｓ、例えばＨＲａｓ（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿００１１２３９１４、ＮＰ＿００１３０４９８３若しくはＮＰ＿７８９７６５）、ＫＲａｓ（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿００４９７６若しくはＮＰ＿２０３５２４）、又はＮＲａｓ（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿００２５１５）の活性化から始まるリン酸化イベントのカスケードを介している。Ｒａｓの活性化は、Ｒａｆ、例えばｃ－Ｒａｆ若しくはＲａｆ－１（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿００２８７１）、Ａ－Ｒａｆ（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿００１２４３１２５、ＮＰ＿００１６４５若しくはＮＰ＿００１２４３１２６）、又はＢ－Ｒａｆ（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿００４３２４）の動員及び活性化をもたらす。次いで、活性化されたＲａｆは、ＭＥＫ１／２（すなわち、ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ－１及び－２；それぞれＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿００２７４６及びＮＰ＿１０９５８７）をリン酸化及び活性化し、これは、次いで、ＥＲＫ１／２（すなわち、ＭＡＰ３／ＭＡＰＫ１；それぞれＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ２８４８２及びＰ２７３６１）をリン酸化及び活性化する。この一連のタンパク質のＲａｓからＥＲＫは、細胞表面受容体からＤＮＡにシグナルを伝達する。ＥＲＫは、細胞周期の進行、分化、タンパク質合成、代謝、細胞生存、細胞移動、並びに浸潤及び老化を制御する転写因子によって媒介される遺伝子発現の広範な変化を生成する。

ＪＡＫ／ＳＴＡＴ経路。ヤヌスキナーゼ／シグナル伝達兼転写活性化因子（ＪＡＫ／ＳＴＡＴ）経路は、細胞増殖、分化、細胞移動及びアポトーシスを刺激する。機構的には、ＪＡＫ／ＳＴＡＴシグナル伝達は、いくつかの主要構成要素から構成される。哺乳動物においては、ＪＡＫファミリーは次の４つのメンバーを含む：ＪＡＫ１（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿００１３０７８５２）、ＪＡＫ２（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿００１３０９１２３又はＮＰ＿００１３０９１２７）、ＪＡＫ３（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿０００２０６）及びＴｙｋ２（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿００３３２２）。ＪＡＫの活性化はリガンド媒介受容体の多量体化によって起こり、それによってトランスリン酸化が可能になる。活性化されたＪＡＫは、その後、さらなる標的、特にＳＴＡＴをリン酸化する。ＳＴＡＴは、活性化されるまで細胞質に存在する潜在性転写因子である。哺乳動物ＳＴＡＴ（すなわち、ＳＴＡＴ１、ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿００９３３０又はＮＰ＿６４４６７１；ＳＴＡＴ２、ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿００５４１０又はＮＰ＿９３８１４６；ＳＴＡＴ３、ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿００３１４１、ＮＰ＿６４４８０５又はＮＰ＿９９８８２７；ＳＴＡＴ４、ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿００１２３０７６４又はＮＰ＿００３１４２；ＳＴＡＴ５Ａ、ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿００１２７５６４７、ＮＰ＿００１２７５６４８又はＮＰ＿００１２７５６４９；ＳＴＡＴ５Ｂ、ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿０３６５８０；及びＳＴＡＴ６、ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号。ＮＰ＿００１１７１５４９、ＮＰ＿００１１７１５５０、ＮＰ＿００１１７１５５１又はＮＰ＿００１１７１５５２）は、Ｃ末端付近に保存チロシン残基を有し、これがＪＡＫによってリン酸化される。このホスホチロシンは、保存されたＳＨ２ドメインとの相互作用によってＳＴＡＴの二量体化を可能にする。リン酸化されたＳＴＡＴは核内に入り、特定の調節配列と結合して、標的遺伝子の転写を活性化又は抑制する。このように、ＪＡＫ／ＳＴＡＴカスケードは、細胞外シグナルを転写応答に翻訳する直接的機構を提供する。

ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路。ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ経路は、細胞周期の調節に重要な細胞内シグナル伝達経路である。ＥＧＦＲのリガンド結合活性化は、ＰＩ３Ｋ（ホスファチジルイノシトール－４，５－ビスリン酸３－キナーゼ、例えばＰＩＫ３ＣＡ、ＰＩＫＣＢ、ＰＩＫ３Ｇ、ＰＩＫ３ＣＤ、ＰＩＫ３Ｒ１、ＰＩＫ３Ｒ２、ＰＩＫ３Ｒ３、ＰＩＫ３Ｒ４、ＰＩＫ３Ｒ５及びＰＩＫ３Ｒ６などのクラス１酵素；ＰＩＫ３Ｃ２Ａ、ＰＩＫ３Ｃ２Ｂ及びＰＩＫ３Ｃ２Ｇなどのクラス２酵素；及びクラス３酵素のＰＩＫ３Ｃ３）の活性化をもたらす。ＰＩ３Ｋは、続いてＡｋｔ（すなわち、ＡＫＴ１、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ３１７４９；ＡＫＴ２、ＵｎｉＰｒｏｔアクセッション番号Ｐ３１７５１；及びＡＫＴ３、Ｕｎｉｐｌｏｔアクセッション番号。Ｑ９Ｙ２４３を含むタンパク質キナーゼＢ又はＰＫＢ）をリン酸化する。ＰＩＫ３は、その後、それぞれ細胞増殖に関与するｍＴＯＲ複合体のｍＴＯＲＣ１及びｍＴＯＲＣ２に作用する。ｍＴＯＲ、Ｒａｐｔｏｒ、ＧβＬ（哺乳類致死性ＳＥＣ１３タンパク質８）及びドメイン含有ｍＴＯＲ相互作用タンパク質（ＤＥＰＴＯＲ）から構成されるｍＴＯＲＣ１は、ストレス下の細胞増殖及び異化過程を促進するために、成長因子、栄養素及びエネルギーの利用可能性を示す複数のシグナルを統一する。活性ｍＴＯＲＣ１は、４Ｅ－ＢＰＩ及びｐ７０ Ｓ６キナーゼなどの下流標的をリン酸化することによるｍＲＮＡの翻訳、Ａｔｇｌ３及びＵＬＫ１を介したオートファジーの抑制、リボソームの生合成、並びに脂質生成のミトコンドリア活性の増加につながる転写の活性化を含む、下流にある数多くの生物学的効果を発揮する。ｍＴＯＲ、Ｒｉｃｔｏｒ、ＧβＬ、Ｓｉｎ１、ＰＲＲ５／Ｐｒｏｔｏｒ－１及びＤＥＰＴＯＲから構成されるｍＴＯＲＣ２は、Ａｋｔの活性化により細胞生存を促進する。ｍＴＯＲＣ２は、ＰＫＣαを活性化し、ＳＧＫ１をリン酸化することによって、細胞骨格の動態、イオン輸送及び増殖を調節する。

ＮＣＫ－ＰＡＫ－ＪＮＫ経路。Ｎｃｋ（チロシンキナーゼアダプタータンパク質１の非触媒領域；ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿００１１７７７２５又はＮＰ＿００１２７８９２８）は、そのＳＨ２ドメインを介して活性化ＥＧＦＲに結合することが知られている。Ｎｃｋは、ＰＡＫ１（ｐ２１／ＣＤＣ４２／Ｒａｃ１活性化キナーゼ１；ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿００１１２２０９２又はＮＰ＿００２５６７）と、ＰＡＫ１の第１のＮ末端ポリプロリンドメイン及びＮｃｋのＳＨ３ドメインを介して会合する。ＮｃｋはＰＡＫを活性化し、続いてＰＡＫがＭＥＫＫ１（ＭＡＰ／ＥＲＫキナーゼキナーゼ－１；ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿００５９１２）及びＭＫＫ４／７（ＭＡＰキナーゼキナーゼ－４／７；ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿１２６８３６４、ＮＰ＿００３００１、ＮＰ＿００１２８４４８４、又はＮＰ＿００１２８４４８５）を介してＪＮＫ（ｃ－Ｊｕｎキナーゼ）を活性化する。活性化されたＪＮＫはｎｕに入り、ｃ－Ｆｏｓやｃ－Ｊｕｎなどの転写因子のリン酸化を引き起こす。

ＰＬＣ－ＤＡＧ－ＰＫＣ経路。ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）は、ＥＧＦＲ活性化を二次メッセンジャーの生成とカルシウム代謝に結びつける。ＥＧＥＲはＰＬＣ－γ１（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿００２６５１又はＮＰ＿８７７９６３）を動員及びリン酸化し、これは、次に、ＰｔｄＩｎｓ（４，５）Ｐ２からジアシルグリセロール（ＤＡＧ）及びイノシトール－１，４，５トリスリン酸（ＩＰ３）を生成する。ＤＡＧは、タンパク質キナーゼＣ（ＰＫＣ）の多くのアイソフォーム、例えば、従来のアイソフォームα、β、及びγ、並びにＰＫＣ－ε及びＰＫＣ－θを活性化する。ＰＫＣ－α、ＰＫＣ－β、ＰＫＣ－γ、及びＰＫＣ－εは、ｃ－Ｒａｆ－１をリン酸化して活性化し、それによってＨＲａｓ／ＭＥＫ１及びＭＥＫ２／ＥＲＫ１／２キナーゼカスケードを増幅する。ＰＫＣ－θは、核因子ＮＦ－カッパ－Ｂインヒビターキナーゼベータ（ＩＫＫ－ベータ）を活性化し、その結果、核因子ＮＦ－カッパ－Ｂ（ＮＦ－ｋＢ）が活性化される。

細胞周期関連タンパク質キナーゼ。ＥＧＦＲの下流又はＥＧＦＲと相互作用するタンパク質キナーゼは、真核細胞の細胞周期の調節に中心的な役割を果たしている。より具体的には、これらのタンパク質キナーゼは、シグナル伝達、染色体凝縮、中心体成熟、紡錘体集合、紡錘体配向、減数分裂的成熟、及び細胞質分裂に関与している。したがって、「細胞周期関連タンパク質キナーゼ」は、細胞周期進行、細胞分裂、細胞増殖、及び細胞周期機構の１つ以上を調節する、ＥＧＦＲの下流の、又はＥＧＦＲと相互作用するキナーゼを指す。特定の実施形態では、本発明の細胞周期関連タンパク質キナーゼは、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、オーロラキナーゼ、Ｂ－ｒａｆ（本明細書で説明されている）又は血小板由来増殖因子受容体（ＰＤＧＦＲ）である。

Ｈｅｒ２／ｎｅｕキナーゼ。Ｈｅｒ２／ｎｅｕは、染色体１７ｑ２１－２２に位置するｅｒｂＢ２癌遺伝子によってコードされる１８５ｋＤａの膜貫通タンパク質（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿００１００５８６２、ＮＰ＿００１２７６８６５、ＮＰ＿００１２７６８６６、ＮＰ＿００１２７６８６７、又はＮＰ＿００４４３９）である。Ｈｅｒ２／ｎｅｕの細胞表面での正常な発現は、細胞の増殖及び上皮細胞生存に必須である。Ｈｅｒ２／ｎｅｕの天然リガンドは特定されていないが、Ｈｅｒ２／ｎｅｕは、ＥＧＦＲ及びＨｅｒ３と強力なヘテロ二量体を形成する好ましい二量体化の相手であることが知られている（Ｌｅｎｆｅｒｉｎｋ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：３３８５－９７）。

オーロラキナーゼ。オーロラキナーゼは高度に保存されたセリン／トレオニンキナーゼのファミリーであり、有糸分裂の間の正確な移行に重要である（Ｂｉｓｃｈｏｆｆ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：３０５２－６５；Ｃａｒｍｅｎａ ＆ Ｅａｒｎｓｈａｗ（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４：８４２－５４；Ｇｉｅｔ ＆ Ｐｒｉｇｅｎｔ（１９９９）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１２：３５９１－６０１）。オーロラＡの遺伝子は、種々のヒトの癌で増幅が認められている領域である染色体領域２０ｑ１３．２に位置している。オーロラＡ（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿００１３１０２３２、ＮＰ＿００１３１０２３３、ＮＰ＿００１３１０２３４、ＮＰ＿００３５９１又はＮＰ＿９４０８３５）は、中心体成熟、紡錘体集合、減数分裂的成熟、及び減数第一分裂中期の紡錘体配向に重要な役割を果たしている（Ｇａｒｍｅｎａ ＆ Ｅａｒｎｓｈａｗ（２００３）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．４：８４２－５４）。オーロラＡの機能は、分解、リン酸化及び脱リン酸化によって調節されており、そのキナーゼ活性は活性化ループのトレオニン２８８（Ｔｈｒ２８８）のリン酸化に依存している。オーロラＡの選択的阻害は、Ｔｈｒ２８８でのオーロラＡの自己リン酸化の阻害、単極紡錘体、及びＧ２－Ｍ期停止をもたらす（Ｇｉｒｄｌｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｓｃｉ．１１９：３６６４－７５；Ｃａｒｐｉｎｅｌｌｉ ＆ Ｍｏｌｌ（２００８）Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ．Ｔｈｅｒ．Ｔａｒｇｅｔｓ １２：６９－８０）。オーロラＢ（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿００１２４３７６３、ＮＰ＿００１２７１４５５、ＮＰ＿００１３００８７９、ＮＰ＿００１３００８８０、又はＮＰ＿００１３００８８１）遺伝子は、染色体領域１７ｐ１３．１に位置し、このキナーゼは、３つの非酵素的サブユニット、すなわち内部セントロメアタンパク質（ＩＮＣＥＮＰ）、サバイビン、及びボレアリンとともに染色体パッセンジャー複合体（ＣＰＣ）の一部を形成する（Ｖａｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１７３：８３３－７）。極めて動的なＣＰＣは、染色体凝縮、染色体－微小管結合のエラーの補正による有糸分裂紡錘体上の染色体配向、及び紡錘体形成チェックポイント（ＳＡＣ）、並びに細胞質分裂の最終段階に重要である（Ｓａｍｐａｔｈ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｃｅｌｌ １１８：１８７－２０；Ｔｅｒａｄａ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）ＥＭＢＯ Ｊ．１７：６６７－７６；Ｃａｒｍｅｎａ，ｅｔ ａｌ．（２０１２）Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１３：７８９－８０３；Ｔａｎｅｎｂａｕｍ，ｅｔ ａｌ（２０１１）Ｃｕｒｒ．Ｂｉｏｌ．２１：１３５６－６）。オーロラＣ（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿００１０１５８７８、ＮＰ＿００１０１５８７９、又はＮＰ＿００３１５１）の発現は、精巣、甲状腺、及び胎盤、並びに減数分裂中の配偶子において報告されている（Ｕｌｉｓｓｅ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １１９：２７５－８２；Ｂｅｒｎａｒｄ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５３：４０６－９；Ｋｉｍｕｒａ，ｅｔ ａｌ．（１９９９）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４：７３３４－４０；Ｙａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．Ｃｅｌｌ ２１：２３７１－８３）。さらに、ＳＴＡＴ５に関連する核ＥＧＦＲは、オーロラＡ遺伝子発現に結合し増加させることが示されている（Ｈｕｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．３６（１３）：４３３７－５１）。オーロラＣの過剰発現は、細胞において中心体複製及び多核化をもたらす異常な細胞分裂を誘発することが示唆されている。

ＰＤＧＦＲキナーゼ。ＰＤＧＦＲは、脊椎動物の様々な組織における細胞増殖、分化及び生存の制御に関与する。活性化されたＰＤＧＦＲは自身や他のタンパク質をリン酸化し、それによって移動や増殖などの細胞応答を引き起こす細胞内シグナル伝達経路を働かせる。ＰＤＧＦＲα（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢアクセッション番号Ｐ１６２３４）及びＰＤＧＦＲβ（ＧＥＮＢＡＮＫアクセッション番号ＮＰ＿００２６００）は、胚の１２～１４日目に急速に成長する耳胞において高度に発現し、その後、発現は弱くなる（Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ（２００４）Ａｃｔａ Ｏｔｏ－Ｌａｒｙｎｇ．１２４：５５８－６２）。この分析に基づき、ＰＤＧＦシグナル伝達の完全性が、発生中の蝸牛有毛細胞の増殖に必要であることが示唆された（Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ａｃｔａ Ｏｔｏ－Ｌａｒｙｎｇ．１２４：５５８－６２）。さらに、これまでの研究から、ＰＤＧＦシグナル伝達は、新生仔マウス内耳における血管及び間葉系コンパートメントの栄養に必要であり、間接的には、感覚上皮の生存に必要であることが示唆されている（Ｈａｙａｓｈｉ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｈｅａｒ．Ｒｅｓ．２４５：７３－８１）。特に、ＰＤＧＦＲβとＥＧＦＲの間のヘテロ二量体化及びクロストークは、ＰＤＧＦ刺激細胞移動におけるＥＧＦＲトランス活性化の役割を示している（Ｓａｉｔｏ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｍｂ ｌ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．２１（１９）：６３８７－９４）。

ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤。ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤は、ＥＧＦＲタンパク質、又はＥＧＦＲと相互作用するか若しくはＥＧＦＲの下流経路に存在するタンパク質、例えば、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ（ｍＴＯＲ複合体のタンパク質を含む）、ＮＣＫ、ＰＡＫ、ＪＮＫ、ＰＬＣ、ＰＫＣ又は細胞周期関連タンパク質キナーゼ（例えば、Ｈｅｒ－２、オーロラキナーゼ、Ｂ－Ｒａｆ、又はＰＤＧＦＲ）の発現又は活性を低下、遮断又は減少させる分子を指すものとする。ＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤にはまた、ＥＧＦ、ＴＧＥ－α、ＨＢ－ＥＧＦ、ＡＲ、ＢＴＣ、ＥＰＲ、又はエピゲンなどのＥＧＦＲリガンドの発現又は活性を遮断する阻害剤も含まれる。特定の実施形態では、ＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤は、ＥＧＦＲ、ＰＬＣ、ＳＴＡＴ３、ＪＡＫ２、ＰＩ３Ｋ、ＭＥＫ、Ｈｅｒ－２、オーロラキナーゼ、Ｂ－Ｒａｆ又はＰＤＧＦＲの発現又は活性を阻害又は低下させる。

本発明の阻害剤は、ＥＧＦＲシグナル伝達タンパク質の発現（すなわち、タンパク質の転写又は翻訳）を選択的に減少又は遮断、ＥＧＦＲシグナル伝達タンパク質の活性（すなわち、リガンドへの結合、チロシンキナーゼ活性、リン酸化、タンパク質－タンパク質相互作用、及び／又は下流のシグナル伝達）を減少又は遮断、ＥＧＦＲシグナル伝達タンパク質の生物学的効果を減少又は遮断、並びに／或いはＥＧＦＲシグナル伝達タンパク質の半減期又は細胞内局在（膜対細胞質又は核局在、内在化、及びリサイクリング）を改変しうる。特に、ＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤は、以下、すなわち、転写若しくは翻訳、リガンド結合、リン酸化、多量体化、チロシンキナーゼ活性、内在化、及び／又は核内への移行の１つ以上を選択的に減少又は遮断する活性剤である。

理想的には、ＥＧＦＲシグナル伝達は、ＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤によって、完全に遮断されるか、又は正常な生理学的レベルと比較して、少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９２．５％、少なくとも９５％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９８．５％、少なくとも９９％、少なくとも９９．２５％、少なくとも９９．５％、又は少なくとも９９．７５％減少される。

本発明のＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤は、典型的には１ｐＭ～１００μＭの範囲の半数（５０％）阻害濃度（ＩＣ_５０）を有する。好ましくは、ＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤は、１０μＭ未満、５μＭ未満、１μＭ未満、又は１００ｎＭ未満のＩＣ_５０値を有する。さらに、いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤は、目的のＥＧＦＲシグナル伝達タンパク質の１つ以上に対して特異的／選択的であり、他の非ＥＧＦＲ経路タンパク質を阻害しないか、又は阻害の程度は実質的により少ない。この点において、ＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤は、ＥＧＦＲシグナル伝達の選択的阻害剤であることが好ましい。好ましくは、選択性は１つ、２つ、３つ、又は４つのＥＧＦＲシグナル伝達タンパク質に対するものであり、他の非ＥＧＦＲ経路タンパク質を阻害しないか、又は阻害の程度は実質的により少ない。例として、阻害剤は、いずれもＥＧＦＲシグナル伝達タンパク質であるＥＧＦＲ及びＥＲＢＢ２に対する二重阻害剤であり得る。阻害剤の選択性を評価するための方法は当該技術分野で知られており、任意の従来のアッセイ、例えば、以下に限定されないが、ＩＣ_５０、阻害剤の結合親和性（すなわち、Ｋｉ）、及び／又は別のタンパク質（比較タンパク質）に対するものと比較した、目的のＥＧＦＲシグナル伝達タンパク質に対する阻害剤の半数効果濃度（ＥＣ_５０）の決定に基づくことができる。特定の実施形態では、ＥＧＦＲシグナル伝達の選択的阻害剤は、目的のＥＧＦＲシグナル伝達タンパク質に対するＩＣ_５０値が、比較タンパク質に対する対応するＩＣ_５０値よりも少なくとも２倍、又はより望ましくは少なくとも３倍、４倍、５倍若しくは６倍低い阻害剤である。最も好ましくは、ＥＧＦＲシグナル伝達の選択的阻害剤は、比較タンパク質に対するＩＣ_５０値より少なくとも１桁、又は少なくとも２桁低いＥＧＦＲシグナル伝達タンパク質に対するＩＣ_５０値を有する。

本発明の阻害剤は、核酸ベースの阻害剤（例えば、阻害性ＲＮＡ分子、アンチセンス分子、リボザイム、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡなど）；スプライシング若しくは３’プロセシング（例えば、ポリアデニル化）に影響を及ぼすタンパク質、又は、ｍＲＮＡの蓄積若しくは輸送速度の変化又は転写後調節の変化を媒介するなどにより細胞（すなわち、そこでは遺伝子発現が転写の開始からプロセスタンパク質の産生までの全ての段階を含むと広く考えられている細胞）内の別の遺伝子の発現レベルに影響を及ぼすタンパク質、；抗体（断片又は模倣物を含む）；ペプチド；有機小分子、或いはこれらの組み合わせであり得る。

ｓｉＲＮＡという用語は、標的遺伝子の発現を減少させるために活性である二本鎖ＲＮＡ又はＲＮＡ及びＤＮＡ種を意味する。これらの分子は、「低分子干渉ＲＮＡ」、「短い干渉ＲＮＡ」又は「サイレンシングＲＮＡ」として様々に知られている。ｓｉＲＮＡ鎖は、通常、２０～２５ヌクレオチド長であるが、インビボで切断されて活性種を形成するより大きな前駆体分子は、本明細書で使用される場合、この用語の範囲内である。

本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ分子」又は「ｍｉＲＮＡ」は、動物のゲノムによってコードされるか、又は動物のゲノムによってコードされる配列に対応する配列を用いて合成的に生成される、典型的には約２０～２５ヌクレオチドからなる小ＲＮＡ分子である。本明細書で使用される場合、ｍｉＲＮＡ分子は、一本鎖又は二本鎖であり得る。

阻害剤が、例えば、阻害性ＲＮＡ、ペプチド又はタンパク質である場合、そのような阻害剤をコードする核酸分子は、ＥＧＦＲ阻害剤をコードする同じ核酸分子によって担持されるか、又は同じ発現ベクター上に存在する別個の核酸分子、若しくは異なる発現ベクターの一部であり得る。阻害性ＲＮＡ分子は、本明細書に開示される核酸配列に基づいて容易に調製することができる。或いは、ｓｉＲＮＡなどの阻害性ＲＮＡ分子は、Ｄｈａｒｍａｃｏｎ（例えば、ＯＮ－ＴＡＲＧＥＴ＋ｓｉＲＮＡ ＳＭＡＲＴプールを参照）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ又はＺｙａｇｅｎなどの商業的供給源から得ることができる。タンパク質の発現の減少は、ドットブロット分析、ノーザンブロット分析、ＥＬＩＳＡ分析又はウェスタンブロット分析などの従来の技術を用いて測定することができる。

ＥＧＦＲ阻害剤。ＥＧＦＲ自体の発現を選択的に減少又は遮断するＥＧＦＲ阻害剤としては、ＥＧＦＲアンチセンス、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの分子が挙げられるが、これらに限定されない。ＥＧＦＲの発現を減少させる例示的なアンチセンス及びｓｉＲＮＡは、例えば、米国特許出願公開第２０１１／００４６０６７号明細書及びＫａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｃａｎｃｅｒ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１３（５）：５３０－８に開示されている。ＥＧＦＲの発現を減少させる例示的なｍｉＲＮＡは、例えば、米国特許第８，６７３，８７２号明細書（この全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されている。

ＥＧＦＲ阻害剤はまた、ＥＧＦＲに特異的に結合し、例えば、リガンド結合、活性化、リン酸化又はタンパク質－タンパク質相互作用を遮断することによってその活性に拮抗する、抗体、抗体断片、又は抗体模倣物であり得る。セツキシマブ（ＩｇＧ１）とパニツムマブ（ＩｇＧ２）はＥＧＦＲのモノクローナル抗体阻害剤の例である。他の拮抗するモノクローナル抗体としては、ザルツムマブ、ニモツズマブ、マツズムタブ、ＩＣＲ６２、及びｍＡｂ８０６が挙げられる。米国特許第６，５０６，８８３号明細書、米国特許第６，２３５，８８３号明細書、米国特許第５，８９１，９９６号明細書、米国特許第４，９４３，５３３号明細書、国際公開第２００４／０５６８４７号パンフレット、国際公開第２００２／０９２７７１号パンフレット、国際公開第２００２／６６０５８号パンフレット、及び国際公開第１９９５／２００４５号パンフレットを参照されたい。このような抗体は、細胞外リガンド結合ドメインを遮断し、それによってチロシンキナーゼ活性化を遮断する。

ＥＧＦＲの多量体化及び活性化を調節するＥＧＦＲのペプチド阻害剤もまた、本発明において有用である。ＥＧＦＲの例示的なペプチド阻害剤は、ＥＧＦＲからの以下の傍膜配列（ｊｕｘｔａｍｅｍｂｒａｎｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）：ＬＬＬＷＡＬＧＩＧＬＦＭＲＲＲＨＩＶＲＫＲＴＬＲＲＬＬＱＥＲＥＬＶＥＰＬＴＰＳ（配列番号１）に基づくことができ、細胞への送達を促進するために、タンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）などの細胞浸透成分を任意に含むことができる。米国特許出願公開第２０１６／０３１１８８４号を参照されたい。

さらに、ＥＧＦＲ阻害剤は、ＥＧＦＲのチロシンキナーゼ活性を阻害する小分子であり得る。キナーゼ活性がなければ、ＥＧＦＲは自身を活性化することができず、これは下流のアダプタータンパク質が結合するための必須条件である。ＥＧＦＲの小分子阻害剤の例としては、エルロチニブ（ＣＡＳ １８３３２１－７４－６）、ゲフィチニブ（ＣＡＳ １８４４７５－３５－２）、ラパチニブ（ＣＡＳ２３１２７７－９２－２、ＥＧＦＲ及びＥＲＢＢ２二重阻害剤）、ネラチニブ（ＣＡＳ ６９８３８７－０９－６）、カネルチニブ（ＣＡＳ ２６７２４３－２８－７）、バンデタニブ（ＣＡＳ ４４３９１３－７３－３）、アファチニブ（ＣＡＳ４３９０８１－１８－２）、ＡＧ １４７８（ＣＡＳ １５３４３６－５３－４）、ＴＡＫ－２８５（ＣＡＳ ８７１０２６－４４－７、ＨＥＲ２及びＥＧＦＲ二重阻害剤）、ＡＲＲＹ３３４５４３（ＣＡＳ ８４５２７２－２１－１、二重ＥＧＦＲリン酸化阻害剤）、ダコミチニブ（ＣＡＳ １１１０８１３－３１－４、ＥＧＦＲ及びＥＲＢＢ２阻害剤）、ＡＺＤ３７５９（ＧＡＳ １６２６３８７－８０－１）、ＮＴ１１３（ＣＡＳ １３９８８３３－５６－１、ｐａｎ－ＥＲＥＢ阻害剤）、ＯＳＩ－４２０（デスメチルエルロチニブ、ＣＡＳ １８３３２１－８６－０、ＥＧＦＲ阻害剤）、ＡＺＤ８９３１（ＣＡＳ ８４８９４２－６１－９、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＨＥＲ３阻害剤）、ＡＥＥ７８８（ＣＡＳ ４９７８３９－６２－９、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＶＥＧＦＲ １／２阻害剤）、ペリチニブ（ＥＫＢ－５６９、ＣＡＳ ２５７９３３－８２－７、ｐａｎ－ＥｒｂＢ阻害剤）、ＣＵＤＣ－１０１（ＣＡＳ １０１２０５４－５９－９、ＥＧＦＲ、ＨＥＲ２及びＨＤＡＣ阻害剤）、ＸＬ６４７（ＣＡＳ ６５１０３１－０１－５、ＨＥＲ２及びＥＧＦＲ二重阻害剤）、ＢＭＳ－５９９６２６（ＣＡＳ ７１４９７１－０９－２、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ２二重阻害剤）、ＰＫＣ４１２（ＣＡＳ １２０６８５－１１－２、ＥＧＦＲ、ＰＫＣ、環状ＡＭＰ依存性タンパク質キナーゼ及びＳ６キナーゼ阻害剤）、ＢＩＢＸ１３８２（ＣＡＳ １９６６１２－９３－８、ＥＧＦＲ阻害剤）及びＡＰ２６１１３（ＣＡＳ １１９７９５３－５４－０、ＡＬＫ及びＥＧＦＲ阻害剤）、並びにそれらの誘導体及び組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲ阻害剤はペリチニブではない。

Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ／ＭＡＰＫ阻害剤。Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫの発現を選択的に減少又は遮断するこの経路の阻害剤としては、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの分子が挙げられるが、これらに限定されない。例として、ＭＥＫ１のアンチセンスによる阻害は、米国特許第６，０９６，５４３号明細書に開示されており、この文献はその全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Ｒａｓ阻害剤の例としては、Ｒ１１５７７７（ＣＡＳ １９２１８５－７２－１）、ＢＭＳ－２１４６６２（ＣＡＳ １９５９８７－４１－８）、ＳＣＨ６６３３６（ＣＡＳ１９３２７５－８４－２）、ＦＴＩ－２７７（ＣＡＳ １２１７４４７－０６－７）、マヌマイシンＡ（ＣＡＳ ５２６６５－７４－４）、ＦＴＩ－２７６（ＣＡＳ １７０００６－７２－１）、ＲａｓＣＡＡＸ（ペプチド模倣物）、Ｌ－７４４，８３２（ＣＡＳ １１７７８０６－１１－９）、並びにこれらの誘導体及び組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明において有用なＲａｆ阻害剤としては、Ｂａｙ４３－９００６（ソラフェニブ、ＣＡＳ ２８４４６１－７３－０、Ｂ－Ｒａｆ及びＣ－Ｒａｆに対する選択的阻害剤）、ベムラフェニブ（ＣＡＳ ９１８５０４－６５－１、Ｂ－Ｒａｆ阻害剤）、ダブラフェニブ（ＣＡＳ １１９５７６４－４５－７、Ｂ－Ｒａｆ阻害剤；米国特許第７，９９４，１８５号明細書及び米国特許第８，４１５，３４５号明細書も参照）、ＬＹ３００９１２０（ＣＡＳ １４５４６８２－７２－４、ｐａｎ－Ｒａｆ阻害剤）、ＧＷ ５０７４（ＣＡＳ ２２０９０４－８３－６、Ｃ－Ｒａｆ－１阻害剤）、ＺＭ ３３６３７２（ＣＡＳ ２０８２６０－２９－１、Ｒａｆ－１阻害剤）、２－ブロモアルジシン（ＣＡＳ ９６５６２－９６－８、Ｒａｆ／ＭＥＫ－１／ＭＡＰＫ経路阻害剤）、Ｌ－７７９，４５０（ＣＡＳ ３０３７２７－３１－３）、ＡＺ６２８（ＣＡＳ ８７８７３９－０６－１、Ｒａｆ－１阻害剤）、ＲＡＦ２６５（ＣＡＳ ９２７８８０－９０－８、Ｂ－Ｒａｆ及びＶＥＧＦＲ－２阻害剤）、エンコラフェニブ（ＬＧＸ８１８、ＣＡＳ １２６９４４０－１７－６、Ｂ－Ｒａｆ阻害剤）、並びにこれらの誘導体及び組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

ＭＥＫ阻害剤としては、ＳＬ－３２７（ＣＡＳ ３０５３５０－８７－２、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２の阻害剤）、ＰＤ １８４，３５２（ＣＡＳ ２１２６３１－７９－３）２－ブロモアルジシン（ＣＡＳ ９６５６２－９６－８、Ｒａｆ／ＭＥＫ－１／ＭＡＰＫ経路阻害剤）、ＰＤ １９８３０６（ＣＡＳ ２１２６３１－６１－３、ＭＥＫ１／２の非ＡＴＰ拮抗阻害剤）、ＰＤ ０３２５９０１（ＣＡＳ ３９１２１０－１０－９、ＭＥＫの阻害剤及びＥＲＫのリン酸化抑制剤）、ＭＥＫ阻害剤ＩＩ（ＣＡＳ ６２３１６３－５２－０）、ＰＤ １８４１６１（ＣＡＳ ２１２６３１－６７－９、ＭＥＫ１及びＭＥＫ２に対する選択的阻害剤）、Ｕ－０１２６（ＣＡＳ １０９５１１－５８－２、ＭＥＫ１／２に対する阻害剤）、ＰＤ ９８０５９（ＣＡＳ １６７８６９－２１－８、ＭＥＫ１に対する選択的阻害剤）、ＡＳ７０３０２６（ＣＡＳ １２３６６９９－９２－５、ＭＥＫ１／２に対する阻害剤）、ＢＡＹ ８６９７６６（ＣＡＳ ９２３０３２－３７－５、ＭＥＫ－１及びＭＥＫ－２の非ＡＴＰ拮抗阻害剤）、ＰＤ ３１８０８８（ＣＡＳ ３９１２１０－００７、ＭＥＫ１／２の阻害剤）、セルメチニブ（ＣＡＳ ６０６１４３－５２－６、ＭＥＫ－１非ＡＴＰ拮抗阻害剤）、ＴＡＫ－７３３（ＣＡＳ １０３５５５５－６３－５、ＭＥＫのアロステリック阻害剤）、トラメチニブ（ＣＡＳ ８７１７００－１７－３、ＭＥＫ１／ＭＥＫ２のアロステリック阻害剤）、並びにこれらの誘導体及び組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。さらなるＭＥＫ阻害剤については、国際公開第１９９８／０３７８８１号パンフレット、国際公開第１９９９／９０１４２６号パンフレット、国際公開第２０００／０４１５０５号パンフレット、国際公開第２０００／０４１９９４号パンフレット、国際公開第２０００／０４２００２号パンフレット、国際公開第２０００／０４２００３号パンフレット、国際公開第２０００／０４２０２２号パンフレット、国際公開第２０００／０４２０２９号パンフレット、国際公開第２００１／０６８６１９号パンフレット及び国際公開第２００２／０３６５７０号パンフレットもまた参照されたい。

ＥＲＫ阻害剤としては、例えば、ＳＣＨ７７２９８４（ＣＡＳ ９４２１８３－８００－４、ＥＲＫ１／２阻害剤）、ＤＥＬ－２２３７９（ＣＡＳ １８１２２３－８０－３、ＥＲＫ二量体化阻害剤）、ＶＸ－１１ｅ（ＣＡＳ ８９６７２０－２０－０、ＥＲＫ２阻害剤）、プルリポチン（ＳＣ１、ＣＡＳ ８３９７０７－３７－８、ＥＲＫ１及びＲａｓＧＡＰ二重阻害剤）、ウリクセルチニブ（ＢＶＤ－５２３、ＶＲＴ７５２２７１、ＣＡＳ ８６９８８６－６７－９、ＥＲＫ１／ＥＲＫ２阻害剤）、ＦＲ １８０２０４（ＣＡＳ８６５３６２－７４－９、ＡＴＰ拮抗ＥＲＫ阻害剤）、ＧＤＣ－０９９４（ＣＡＳ １４５３８４８－２６－４、ＥＲＫ１／２阻害剤）、ＫＯ－９４７（Ｋｕｒａ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ、ＥＲＫＩ／２阻害剤）、並びにこれらの誘導体及び組み合わせが挙げられる。さらなるＥＲＫ阻害剤については、特開第２００５－３３０２６５号公報も参照されたい。

ＪＡＫ／ＳＴＡＴ阻害剤。ＪＡＫ又はＳＴＡＴの発現を選択的に減少又は遮断する阻害剤としては、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの分子が挙げられるが、これらに限定されない。例として、ＳＴＡＴ－２、ＳＴＡＴ－３、ＳＴＡＴ－４、ＳＴＡＴ－５及びＳＴＡＴ－６のアンチセンス阻害は、それぞれ、米国特許第２００４／０１０１８５３号明細書、米国特許第６，１５９，６９４号明細書、米国特許第６，４７９，４６５号明細書、米国特許第８，７２２，８７３及び国際公開第１９９８／０４０４７８号パンフレットに開示されている。同様に、ＳＴＡＴ－１及びＳＴＡＴ－２の発現を低下させるｓｉＲＮＡは、米国特許第９，１９８，９１１号明細書に開示されている。ＳＴＡＴ－３ ｓｉＲＮＡは米国特許第２０１０／０２９８４０９号明細書に記載されており、ＳＴＡＴ－５ ｓｉＲＮＡは国際公開第２００９／０３９１９９号パンフレットに記載されており、ＳＴＡＴ－６ ｓｉＲＮＡは米国特許第７，５６６，７００号明細書に記載されている。Ｊａｋｌ及びＪａｋ３の発現の阻害に有用なＳｉＲＮＡ分子は、米国特許第９，１９８，９１１号明細書に開示されており、この文献は参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

ＳＴＡＴ阻害剤の非限定的な例としては、ＷＰ－１０３４（ＣＡＳ ８５７０６４－４２－７、Ｊａｋ－Ｓｔａｔ阻害剤）、フルダラビン（ＣＡＳ ２１６７９－１４－１、ＳＴＡＴ１阻害剤）、Ｓ３Ｉ－２０１（ＣＡＳ ５０１９１９－５９－１、ＳＴＡＴ３ ＤＮＡ結合活性）、Ｓｔａｔｔｉｃ（ＣＡＳ １９９８３－４４－９、ＳＴＡＴ３阻害剤）、ＡＰＴＳＴＡＴ３－９Ｒ（ＳＴＡＴ結合ペプチド）、ＳＴＡ－２１（ＣＡＳ ２８８８２－５３－３、ＳＴＡＴ３阻害剤）、ＳＨ－４－５４（ＣＡＳ １４５６６３２－４０－８）、ナパブカシン（ＣＡＳ ８３２８０－６５－３、ＳＴＡＴ３阻害剤）、クリプトタンシノン（ＣＡＳ ３５８２５－５７－１、ＳＴＡＴ３阻害剤）、ニクロサミド（ＣＡＳ ５０－６５－７、ＳＴＡＴ３阻害剤）、ＮＳＣ ７４８５９（ＣＡＳ ５０１９１９－５９－１、ＳＴＡＴ３阻害剤）、ＨＯ－３８６７（ＣＡＳ １１７２１３３－２８－６、ＳＴＡＴ３阻害剤）、並びにこれらの誘導体及び組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｊａｋ１／Ｊａｋ２阻害剤としては、ＡＧ－４９０（ＣＡＳ １３３５５０－３０－８）、ＣＹＴ３８７（ＣＡＳ １０５６６３４－６８－４）、ＳＢ１５１８（パクリチニブ、ＣＡＳ ９３７２７２－７９－２）、ＬＹ３００９１０４（１ＮＣＢ２８０５０、バリシチニブ、ＣＡＳ １１８７５９４－０９－７）、ＴＧ１０１３４８（ＣＡＳ ９３６０９１－２６－８）、ＢＭＳ－９１１５４３（ＣＡＳ １２７１０２２－９０－２）、ＡＺＤ１４８０（ＣＡＳ ９３５６６６－８８－９）、ルキソリチニブ（ＩＮＣＢ０１８４２４、ＣＡＳ ９４１６７８－４９－５）、ＣＥＰ－７０１（ＣＡＳ １１１３５８－８８－４）、ＴＧ１０１３４８（フェドラチニブ、ＣＡＳ ９３６０９１－２６－８）、ＳＤ １００８（ＣＡＳ ９６０２０１－８１－４）、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３阻害剤、ＷＰ－１０６６（ＣＡＳ ８５７０６４－３８－１、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ３阻害剤）、並びにこれらの誘導体及び組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。ＪＡＫ３阻害剤としては、Ｊａｎｅｘ １（ＷＨＩ－Ｐ１３１、ＣＡＳ ２０２４７５－６０－３）、ＰＦ－９５６９８０（ＣＡＳ １２６２８３２－７４－５）、ＷＨＩ－Ｐ１５４（ＣＡＳ ２１１５５５－０４－３）、ＶＸ－５０９（デセルノチニブ、ＣＡＳ ９４４８４２－５４－０）、ＪＡＫ３阻害剤ＩＶ（ＺＭ－３９９２３、ＣＡＳ １０２１８６８－９２－７）、トファシチニブ（ＣＰ－６９０５５０、ＣＡＳ ５４０７３７－２９－９）、並びにこれらの誘導体及び組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ阻害剤。ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ又はｍＴＯＲの発現を選択的に減少又は遮断する阻害剤としては、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの分子が挙げられるが、これらに限定されない。例として、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ及びｍＴＯＲのｓｉＲＮＡ阻害は、例えば、それぞれ米国特許出願公開第２００５／０２７２６８２号明細書、米国特許出願公開第２００８／０１６１５４７号明細書、及び米国特許第９，０１２，６２２に開示されている。

ＰＩ３Ｋの阻害に有用な小分子としては、ＳＦ１１０１（ＬＹ ２９４００２、ＣＡＳ１５４４４７－３６－６）、ＢＫＭ１２０（ＣＡＳ ９４４３９６－０７－０）、ＢＹＬ７１９（ＣＡＳ １２１７４８６－６１－７）、ＸＬ－１４７（ＣＡＳ ９５６９５８－５３－５）、ＺＳＴＫ－４７４（ＣＡＳ ４７５１１０－９６－４）、ＰＸ－８６６（ＣＡＳ ５０２６３２－６６－８）、ＰＩ－１０３（ＣＡＳ ３７１９３５－７４－９）、並びにこれらの誘導体及び組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

例示的なＡＫＴ阻害剤としては、例えば、ＡＺＤ５３６３（ＣＡＳ １１４３５３２－３９－１）、ＧＤＣ－００６８（ＣＡＳ １００１２６４－８９－６、ＡＴＰ拮抗ｐａｎ－Ａｋｔ阻害剤）、ＭＫ－２２０６（ＣＡＳ １０３２３５０－１３－２）、ペリフォシン（ＣＡＳ １５７７１６－５２－４）、ＰＢＩ－０５２０４（オレアンドリン、ＣＡＳ ４６５－１６－７）、ＧＳＫ２１４１７９５（ＣＡＳ １０４７６３４－６５－０）、及びＳＲ１３６６８（ＣＡＳ ６３７７７４－６１－９）、並びにこれらの誘導体及び組み合わせが挙げられる。さらなるＡＫＴ阻害剤は、米国特許出願公開第２０１０／０００９３９７号明細書、米国特許出願公開第２００７／０１８５１５２号明細書、米国特許第６，９６０，５８４号明細書、米国特許第７，０９８，２０８号明細書、米国特許第７，２２３，７３８号明細書、米国特許第７，３０４，０６３号明細書、米国特許第７，３７８，４０３号明細書、米国特許第７，３９６，８３２号明細書、米国特許第７，３９９、７６４号明細書、米国特許第７，４１４，０５５号明細書、米国特許第７，５４４，６７７号明細書、米国特許第７，５７６，２０９号明細書、米国特許第７，５７９，３５５号明細書、米国特許第７，５８９，０６８号明細書、米国特許第７，６３８，５３０号明細書、米国特許第７，６５５，６４９号明細書、米国特許第７，７０５，０１４号明細書、米国特許第７，７５０，１５１号明細書、米国特許第７、９４３，７３２号明細書、米国特許第８，００３，６４３号明細書、米国特許第８，００３，６５１号明細書、米国特許第８，００８，３１７号明細書、米国特許第８，１６８，６５２号明細書、米国特許第８，２６３，３５７号明細書、米国特許第８，２７３，７８２及び米国特許第８，３２４，２２１号明細書に記載されている。

例示的なｍＴＯＲ／ＰＩ３Ｋ二重阻害剤としては、例えば、ＳＦ１１２６（ＣＡＳ ９３６４８７－６７－１）、ＢＥＺ２３５（ＣＡＳ ９１５０１９－６５－７）、ＢＧＴ－２２６（ＣＡＳ １２４５５３７－６８－１）、ＰＦ－０４６９１５０２（ＣＡＳ １０１３１０１－３６－４）、ＧＮＥ－４７７（ＣＡＳ １０３２７５４－８１－６）、ＸＬ７６５（ＣＡＳ １３４９７９６－３６－６）、ＧＤＣ－０９４１（ＣＡＳ ９５７０５４－３０－７）、ＧＤＣ－０９８０（ＣＡＳ １０３２７５４－９３－０）、ＰＦ－０５２１２３８４（ＣＡＳ １１９７１６０－７８－３）、並びにこれらの誘導体及び組み合わせが挙げられる。

ｍＴＯＲの阻害は、以下の阻害剤、例えば、ＯＳＩ－０２７（ＣＡＳ ９３６８９０－９８－１）、ＩＮＫ－１２８（ＣＡＳ １２２４８４４－３８－５）、ＡＺＤ－８０５５（ＣＡＳ１００９２９８－０９－２）、ＡＺＤ－２０１４（ＣＡＳ １００９２９８－５９－２）、パロミド５２９（ＣＡＳ ９１４９１３－８８－５）、Ｐｐ－２４２（ＣＡＳ １０９２３５１－６７－１）、ＧＳＫ２１２６４５８（ＣＡＳ １０８６０６２－６６－９）、ＰＦ－０４６９１５０２（ＣＡＳ １０３１０１－３６－４）、ウォルトマンニン（ＣＡＳ １９５４５－２６－７）、Ｋｕ－００６３７９４（ＣＡＳ ９３８４４０－６４－３）、ＷＡＹ－６００（ＣＡＳ １０６２１５９－３５－６）、ＷＹＥ－６８７（ＣＡＳ １０６２１６１－９０－３）、ＷＹＥ－３５４（ＣＡＳ １０６２１６９－５６－５）、ラパマイシン（ＣＡＳ ５３１２３－８８－９）、並びにこれらの誘導体及び組み合わせの１つ以上を使用して達成することができる。ラパマイシン誘導体は、例えば、米国特許第５，２５８，３８９号明細書、米国特許第５，１００，８８３号明細書、米国特許第５，１１８，６７８号明細書、米国特許第５，１５１，４１３号明細書、米国特許第５，２５６，７９０号明細書、米国特許第５，１２０，８４２号明細書、米国特許出願公開第２０１１／０１７８０７０号明細書、国際公開第１９９４／０９０１０号パンフレット、国際公開第１９９２／０５１７９号パンフレット、国際公開第１９９３／１１１３０号パンフレット、国際公開第１９９４／０２１３６号パンフレット、国際公開第１９９４／０２４８５号パンフレット、国際公開第１９９４／０２１３６号パンフレット、国際公開第１９９５／１６６９１号パンフレット、国際公開第１９９６／４１８０７号パンフレット、国際公開第１９９６／４１８０７号パンフレット、国際公開第１９９８／０２４４１号パンフレット、国際公開第２００１／１４３８７号パンフレット、及び国際公開第１９９５／１４０２３号パンフレットにさらに記載されている。さらなるＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲ阻害剤については、米国特許出願公開第２０１６／０２４４４２４号明細書もまた参照されたい。

ＮＣＫ－ＰＡＫ－ＪＮＫ阻害剤。ＮＣＫ、ＰＡＫ又はＪＮＫの発現を選択的に減少又は遮断する阻害剤としては、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの分子が挙げられるが、これらに限定されない。例として、Ｐａｋ１のｓｉＲＮＡ阻害は、例えば、国際公開第２０１３／１３５７４５号パンフレットに開示されている。同様に、ＪＮＫ１、ＪＮＫ２及びＪＮＫ３のｓｉＲＮＡ阻害は、例えば、米国特許出願公開第２０１５／０３６１１８４号明細書に開示されている。

ＰＡＫキナーゼの阻害剤は当該技術分野で知られており、国際公開第２００９／０８６２０４号パンフレット、国際公開第２０１０／０７１８４６号パンフレット、国際公開第２０１１／０４４５３５号パンフレット、国際公開第２０１１／１５６６４６号パンフレット、国際公開第２０１１／１５６７８６号パンフレット、国際公開第２０１１／１５６６４０号パンフレット、国際公開第２０１１／１５６７８０号パンフレット、国際公開第２０１１／１５６７７５号パンフレット及び国際公開第２０１１／０４４２６４号パンフレットに開示されているような２－アミノピリド［２，３－ｄ］ピリミジン－７（８Ｈ）－オン；国際公開第２００４／００７５０４号パンフレット、国際公開第２００７／０２３３８２号パンフレット、国際公開第２００７／０７２１５３号パンフレット及び国際公開第２００６／０７２８３１号パンフレットに開示されている１Ｈ－チエノ［３，２－ｃ］ピラゾール、３－アミノ－テトラヒドロピロロ［３，４ｃ］ピラゾール及びＮ４－（１Ｈ－ピラゾール－３－イル）ピリミジン－２，４ジアミン；米国特許第８，６３７，５３７号明細書に開示されているＮ４－（１Ｈ－ピラゾール－３－イル）ピリミジン－２，４－ジアミンの、Ｎ２－二環式インドリル、インダゾリル及びベンズイミダゾリル誘導体；ＰＦ－３７５８３０９（ＣＡＳ ８９８０４４－１５－０）；ＩＰＡ－３（ＣＡＳ ４２５２１－８２－４）；ＦＲＡＸ５９７（ＣＡＳ １２８６７３９－１９－２）；ＦＲＡＸ４８６（ＣＡＳ１２３２０３０－３５－１）；ＦＲＡＸ１０３６（ＣＡＳ １４３２９０８－０５－８）；並びにこれらの誘導体及び組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

ＪＮＫ１、ＪＮＫ２及び／又はＪＮＫ３阻害剤の非限定的な例としては、ＪＮＫ阻害剤Ｖ（ＣＡＳ ３４５９８７－１５－７）、ＪＮＫ阻害剤ＶＩＩ（ＴＡＴ－ＴＩ－ＪＩＰｉ_{５３－１６３}、ＣＡＳ ３０５３５０－８７－２）、ＪＮＫ阻害剤ＶＩＩＩ（ＣＡＳ ８９４８０４－０７－０）、ＪＮＫ－ＩＮ－７（ＣＡＳ １４０８０６４－７１－０）、ＪＮＫ阻害剤ＩＸ（ＣＡＳ ３１２９１７－１４－９）、ＪＮＫ阻害剤ＸＩ（ＣＡＳ ２２０７－４４－５）、ＪＮＫ阻害剤ＸＶＩ（ＣＡＳ １４１０８８０－２２－６）、ＡＥＧ ３４８２（ＣＡＳ ６３７３５－７１－７）、ドラマピモド（ＣＡＳ ２８５９８３－４８－４、ｐ３８α ＭＡＰＫ及びＪＮＫ２阻害剤）、ＣＣ－４０１（ＣＡＳ ３９５１０４－３０－０）、ＳＰ６００１２５（ＣＡＳ １２９－５６－６）、ＡＳ６０１２４５（ＣＡＳ ３４５９８７－１５－７）、並びにそれらの誘導体及び組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、阻害剤はレフルノミドではない。

ＰＬＣ－ＤＡＧ－ＰＫＣ阻害剤。ＰＬＣ又はＰＫＣの発現を選択的に減少又は遮断する阻害剤としては、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの分子が挙げられるが、これらに限定されない。例として、ＰＬＣのｓｉＲＮＡ阻害は、米国特許第９，５４６，３６７号明細書に開示されており、そのｓｉＲＮＡ分子は、参照により本明細書に組み込まれる。

ＰＬＣγの結合及び／又は触媒活性の調節に使用するための抗ＰＬＣγ抗体もまた、当該技術分野において知られている。抗ＰＬＣγ抗体の例は、例えば、Ｌｅｅ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｍｏｌ．Ｖｉｓ．８：１７－２５及びＢｕｃｋｌｅｙ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７９：４１８０７－１４に記載されている。

ＰＬＣの小分子阻害剤の例としては、Ｄ６０９（ＣＡＳ ８３３７３－６０－８）、エデルホシン（ＥＴ－１８－ＯＣＨ３、ＣＡＳ ７７２８６－６６－９、ＰＬＣ／ＰＫＣ阻害剤）、マノアライド（ＣＡＳ ７５０８８－８０－１）、ＮＣＤＣ（ＣＡＳ １０５５６－８８－４）、Ｕ－７３１２２（ＣＡＳ １１２６４８－６８－７）、並びにこれらの誘導体及び組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。

Ｈｅｒ２／ｎｅｕ阻害剤。Ｈｅｒ２／ｎｅｕの発現を選択的に減少又は遮断する阻害剤としては、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの分子が挙げられるが、これらに限定されない。例として、Ｈｅｒ２／ｎｅｕのｓｉＲＮＡ阻害は、例えば、Ｆａｌｔｕｓ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｎｅｏｐｌａｓｉａ６（６）：７８６－９５；Ｃｈｏｕｄｈｕｒｙ，ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ １０８：７１－７７に開示されている。

Ｈｅｒ２／ｎｅｕの活性の調節に使用するための抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体もまた、当該技術分野において知られている。抗Ｈｅｒ２／ｎｅｕ抗体の例としては、トラスツズマブ（ＨＥＲＣＥＰＴＩＮ、ＣＡＳ １８０２８８－６９－１）及びペルツズマブ（ＰＥＲＪＥＴＡ、ＣＡＳ ３８０６１０－２７－５）が挙げられるが、これらに限定されない。概説については、Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ １９：１５１９６－１５２１２を参照されたい。

Ｈｅｒ２／ｎｅｕの小分子阻害剤の例としては、ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＰ、ＣＡＳ ２３１２７７－９２－２、ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ２二重阻害剤）、アファチニブ（ＧＩＯＴＲＩＦ、ＣＡＳ ４３９０８１－１８－２、不可逆ｐａｎ阻害剤）、ＡＺＤ８９３１（ＣＡＳ ８４８９４２－６１－０、ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ２／ＥｒｂＢ３阻害剤）、ＡＳＴ－１３０６（ＣＡＳ ８９７３８３－６２－９、ＥＧＦＲ及びＨｅｒ２不可逆阻害剤）、ＡＥＥ－７８８（ＣＡＳ ４９７８３９－６２－０、ＥＧＦＲ及びＨｅｒ２キナーゼ二重阻害剤）、ＣＩ－１０３３（カネルチニブ、ＣＡＳ ２８９４９９－４５－２、ＥＧＦＲ及びＨｅｒ２阻害剤）、ＴＡＫ－１６５（ムブリチニブ、ＣＡＳ ３６６０１７－０９－６、Ｈｅｒ２阻害剤、米国特許第６，７１６，８６３号明細書及び米国特許第７，００５，５２６号明細書を参照）、ＣＰ－７２４７１４（ＣＡＳ ３８３４３２－３８－０、Ｈｅｒ２阻害剤）、ＣＵＤＣ－１０１（ＣＡＳ １０１２０５４－５９－９、ＨＤＡＣ／ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ２不可逆阻害剤）、ＴＡＫ－２８５（ＣＡＳ ８７１０２６－４４－７、ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ２二重阻害剤）ＡＣ－４８０（ＢＭＳ－５９９６２６、ＣＡＳ ７１４９７１－０９－２、ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ２／ＨＥＲ４可逆的阻害剤）、ＰＦ２９９８０４又はＰＦ２９９（ダコミチニブ、ＣＡＳ １１１０８１３－３１－４、ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ２／Ｈｅｒ４不可逆阻害剤）、及びＥＫＢ－５６９（ペルリチニブ、ＣＡＳ ２５７９３３－８２－７、ＥＧＦＲ／Ｈｅｒ２二重阻害剤）、並びにこれらの誘導体及び組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、阻害剤はＨｅｒ２に対して選択的であり、他のキナーゼに対してほとんど又は全く活性を示さない。

オーロラキナーゼ阻害剤。オーロラキナーゼの発現を選択的に減少又は遮断する阻害剤としては、アンチセンス、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの分子が挙げられるが、これらに限定されない。例として、オーロラキナーゼのｓｉＲＮＡ阻害は、例えば、Ｔａｏ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ ９７（１２）：１６６４－１６７２；Ｕｍｅｎｅ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．４６（４）：１４９８－１５０６に開示されている。

オーロラキナーゼの小分子阻害剤の例としては、ＳＮＳ３１４メシラート（ＣＡＳ １１４６６１８－４１－８、ｐａｎオーロラ阻害剤、米国特許出願公開第２０１６／０２８７６０２号明細書、米国特許出願公開第２０１５／０３２９８２８号明細書及び米国特許出願公開第２０１１／００１４１９１号明細書を参照）、ＰＨＡ－６８０６３２（ＣＡＳ ３９８４９３－７９－３、ｐａｎオーロラ阻害剤）、ＶＥ－４６５（トザセルチブ、ＶＸ－６８０又はＭＫ０４５７、ＣＡＳ ６３９０８９－５４－６）、バラセルチブ（ＡＺＤ１１５２、ＣＡＳ ７２２５４４－５１－６、オーロラＢキナーゼ阻害剤）、アリセルチブ（ＭＬＮ８２３７、ＣＡＳ １０２８４８６－０１－２、オーロラＡキナーゼ阻害剤）、ダヌセルチブ（ＰＨＡ－７３９３５８、ＣＡＳ ８２７３１８－９７－８、ｐａｎオーロラ阻害剤）、ＰＦ－０３８１４７３５（ＣＡＳ ９４２４８７－１６－３、オーロラＡ／Ｂ二重阻害剤）、ＡＭＧ ９００（ＣＡＳ ９４５５９５－８０－２、ｐａｎオーロラ阻害剤）、並びにこれらの誘導体及び組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、阻害剤はオーロラキナーゼに対して選択的であり、他のキナーゼに対してほとんど又は全く活性を示さない。

ＰＤＧＦＲ阻害剤。ＰＤＧＦＲの発現を選択的に減少又は遮断するＥＧＦＲ阻害剤としては、ＥＧＦＲアンチセンス、ｓｉＲＮＡ及びｍｉＲＮＡの分子が挙げられるが、これらに限定されない。例として、ＰＤＧＦＲのｓｉＲＮＡ阻害は、例えば、Ｃｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２００８）Ｌｉｖｅｒ Ｉｎｔ．２８（１０）：１４４６－１４５７；Ｋａｕｌｆｕβ，ｅｔ ａｌ．（２０１３）Ｏｎｃｏｔａｒｇｅｔ４（７）：１０３７－４９；Ｙｅｈ，ｅｔ ａｌ．（２０１１）ＢＭＣ Ｃａｎｃｅｒ １１：１３９に開示されている。

ＰＤＧＦＲの活性の調節に使用するための抗ＰＤＧＦＲ抗体もまた当該技術分野において知られている。抗ＰＤＧＦＲ抗体の例としては、ＩＭＣ－３Ｇ３（抗ＰＤＧＦＲα抗体；ＥＰ ２１００６１８）及びＩＭＣ－２Ｃ５（ＰＤＧＦＲβ抗体；Ｓｈｅｎ，ｅｔ ａｌ．（２００９）Ｎｅｏｐｌａｓｉａ １１（６）：５９４－６０４）が挙げられるが、これらに限定されない。

ＰＤＧＦＲの小分子阻害剤としては、Ｋｉ１１５０２（ＣＡＳ ３４７１５５－７６－４）、イマチニブ（ＧＬＥＥＶＥＣ／ＳＴ５７１、ＣＡＳ２２０１２７－５７－１、ＰＤＧＦＲα／ＢＣＲ－ＡＢＬ／ｃ－Ｋｉｔ阻害剤）、ポナチニブ（ＡＰ２４５３４、ＣＡＳ ９４３３１９－７０－８、Ａｂ１／ＰＤＧＦＲα／ＶＥＧＦＲ２／ＦＧＦＲ１／Ｓｒｃ阻害剤）、テラチニブ（ＣＡＳ ３３２０１２－４０－５、ＶＥＧＦＲ／ｃ－ｋｉｔ／ＰＤＧＦＲα阻害剤）、アムバチニブ（ＭＰ－４７０、ＣＡＳ ８５０８７９－０９－３、ｃ－ｋｉｔ／ＰＤＧＦＲα／Ｆｌｔ３阻害剤）、クレノラニブ（ＣＰ－８６８５９６、ＣＡＳ ６７０２２０－８８－９、ＰＤＧＦＲα／βの選択的阻害剤、米国特許第７，０７１，３３７号明細書、米国特許第７，１８３，４１４号明細書、米国特許出願公開第２０１５／０２３８４７９号明細書、及び米国特許出願公開第２０１０／００１６３５３号明細書を参照）、アキシチニブ（ＣＡＳ ３１９４６０－８５－０、ＶＥＧＦＲ１／ＶＥＧＦＲ２／ＶＥＧＦＲ３／ＰＤＧＦＲβ／ｃ－ｋｉｔ阻害剤）、ＣＰ－６７３４５１（ＣＡＳ ３４３７８７－２９－１、ＰＤＧＦＲα／βの阻害剤）、ニンテダニブ（ＢＩＢＦ １１２０、ＣＡＳ ６５６２４７－１７－５、ＶＥＧＦＲ／ＦＧＦＲ／ＰＤＧＦＲα／β阻害剤）、マシチニブ（ＣＡＳ ７９０２９９－７９－５、ｋｉｔ／ＰＤＧＦＲα／β阻害剤）、スニチニブ（ＳＵＴＥＮＴ／ＳＵ１１２４８、ＣＡＳ ５５７７９５－１９－４、ＶＥＧＦＲ２／ＰＤＧＦＲβ阻害剤）、ＴＳＵ－６８（ＳＵ６６６８又はオランチニブ、ＣＡＳ ２５２９１６－２９－３）、リニファニブ（ＡＢＴ－８６９、ＣＡＳ ７９６９６７－１６－３、ＶＥＧＦＲ／ＰＤＧＦＲ阻害剤）、ＡＣ ７１０（ＣＡＳ １３５１５２２－０４－７、ＰＤＧＦＲファミリー選択的阻害剤）、ＤＭＰＱジヒドロクロリド（ＣＡＳ １３７２０６－９７－４、ＰＤＧＦＲβ阻害剤）、ＧＳＫ１３６３０８９（ＣＡＳ ８４９２１７－６４－７、ＰＤＧＦＲ／ＭＥＴ／ＶＥＧＦＲ２／Ｒｏｎ／ＡＸＬ阻害剤）、ＰＤ １６６２８５（ＣＡＳ ２１２３９１－６３－４、ＰＤＧＦＲβ／ＦＧＦＲ／Ｓｒｃ阻害剤）及びトセラニブ（ＣＡＳ ３５６０６８－９４－５、ＰＤＧＦＲ及びＶＥＧＦＲ阻害剤）、並びにこれらの誘導体及び組み合わせが挙げられるが、これらに限定されない

知覚。本発明は、内耳にＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤、及び任意に耳保護剤をコードする核酸分子を有する発現ベクター（例えば、発現ウイルスベクター）を投与することによる、動物における知覚の調節を提供する。「知覚を調節する」とは、少なくとも部分的に、環境変化を認識し、それに適応する能力を獲得することを意味する。感覚有毛細胞の機能に関して、知覚の調節は、内耳における機械的刺激を神経インパルスに変換する感覚有毛細胞の生成又は保護と関連しており、神経インパルスは、その後、動物が、例えば音、言語、又は身体／頭の位置などの環境変化を認識するように脳内で処理される。感覚有毛細胞は、コルチ器官及び／又は前庭器官において生成されることが好ましい。予防の観点からは、予防しなければ、例えば耳毒性剤により最初に又はさらに損傷するか又は失われるであろう感覚有毛細胞が、ＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤及び任意に耳保護剤を投与することにより、損傷又は損失から保護される。

対象の音を検出する能力の変化は、聴覚専門医によって一般的に行われているトーンテストなどの単純な聴覚テストの実施によって容易に得られる。ほとんどの哺乳動物で、異なる周波数に対する反応は、知覚の変化を示す。ヒトでは、言語の理解も適切である。例えば、対象は、語音を理解することができない一方、聞くことは可能である。知覚の変化は、言語を背景雑音から区別するなど、異なるタイプの音響刺激を区別する能力と、語音を理解することによって示される。このような評価には、語音閾値及び語音弁別試験が有用である。

バランス、運動認識、及び／又は運動刺激に対する応答のタイミングの変化の評価も、様々な技術を用いて達成される。前庭機能はまた、運動刺激に対する応答の大きさ（ゲイン）又は応答開始のタイミング（フェーズ）を比較することによって測定することができる。動物に対し、強膜サーチコイルを用いて前庭動眼反射（ＶＯＲ）のゲイン及びフェーズを試験して、その感覚知覚の改善を評価することができる。電気眼振検査（ＥＮＧ）は、例えば、光の移動又は点滅、身体の再位置決め、半規管内の体液の移動などの刺激に応答した眼球運動を記録する。回転椅子又は移動プラットフォームを用いた移動中のバランスの評価もこの点で有用である。

知覚の変化を検出するために、本発明の方法の前に、任意の適切な感覚試験を用いてベースライン値を記録する。対象は本発明の方法に続く適切な期間（例えば、本発明の方法に続く１時間、６時間、１２時間、１８時間、１日、３日、５日、７日、１４日、２１日、２８日、２か月、３か月又はそれ以上）で再評価され、その結果をベースライン結果と比較して知覚の変化が決定される。

予防又は治療の方法。本発明の方法は、刺激の知覚を可能にする感覚有毛細胞の保護及び／又は生成を促進する。したがって、本発明は、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤及び／又は１つ以上の耳保護／再生剤を、治療を必要としている対象に投与することによる、聴覚の損傷、喪失及び障害の予防、治療、制御、改善、又はリスクの低減のための方法を提供する。理想的には、本発明の方法は、聴覚損失及び平衡障害などの、感覚有毛細胞の喪失、損傷、欠如に関連する少なくとも１つの障害について、動物を予防的又は治療的に処置する。聴覚損失は、細菌又はウイルスの感染、遺伝、物理的損傷、音響外傷、耳毒性薬物（例えば、アミノグリコシド系抗生物質又はシスプラチン）などによるコルチ器官の有毛細胞の損傷によって引き起こされ得る。聴覚損失は容易に特定されるが、平衡障害は他の疾患に容易に起因する多種多様な合併症として発現する。平衡障害の症状としては、見当識障害、目まい、回転性目まい、吐き気、かすみ目、ぎこちない動作、及び頻繁な転倒が挙げられる。本発明の方法によって治療される平衡障害は、好ましくは末梢前庭障害（すなわち、前庭器官における障害）を含み、これは、感覚有毛細胞の損傷又は欠如に起因する、機械的刺激の神経インパルスへの機能不全翻訳を含む。

一態様においては、聴力の喪失又は障害を防御又は予防する方法が提供される。このような方法によれば、処置を必要としている対象に、有効量のＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤を投与する。いくつかの実施形態では、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤は、ＥＧＦＲ、Ｒａｓ／Ｒａｆ／ＭＥＫ／ＥＲＫ／ＭＡＰＫタンパク質、ＪＡＫ／ＳＴＡＴタンパク質、ＰＩ３Ｋ／ＡＫＴ／ｍＴＯＲタンパク質、ＮＣＫ－ＰＡＫ－ＪＮＫタンパク質、ＰＬＣ－ＤＡＧ－ＰＫＣタンパク質、又はＥＧＦＲと関連するか若しくはＥＧＦＲの下流にある細胞周期関連タンパク質キナーゼの発現又は活性を阻害する。他の実施形態では、聴覚損失の予防は、処置を必要としている対象に、ＥＧＦＲに関連するか又はＥＧＦＲの下流にある細胞周期関連タンパク質キナーゼの阻害剤を投与することによって達成される。特定の実施形態では、聴覚損失の予防は、処置を必要としている対象に、Ｈｅｒ－２、オーロラキナーゼ、Ｂ－Ｒａｆ、又はＰＤＧＦＲの発現又は活性の阻害剤を投与することによって達成される。ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤は、単独で、又は１つ以上の耳保護剤と組み合わせて投与され得る。「耳保護剤」という用語は、騒音誘発性聴覚損失、化学誘発性聴覚損失若しくは加齢による聴力障害を低減若しくは予防する薬剤、或いは、聴力障害から保護する薬剤を指す。耳保護剤の例としては、ＰＡＲＰ－１阻害剤；ピレンゼピンＬＳ－７５、オテンゼパッド、ＡＱ－ＲＡ７４１、ビラミューン、ＢＩＢＮ ９９、ＤＩＢＤ、テレンゼピン（米国特許出願公開第２０１１／０２６３５７４号明細書を参照）；メチオニン（米国特許第７，０７１，２３０号明細書を参照）；ＩＧＦ－１、ＦＧＦ－２、アスピリン、還元型グルタチオン、Ｎ－メチル－（Ｄ）－グルカミンジチオカルバメート、並びに酒石酸塩及びマレイン酸塩などの鉄キレート剤が挙げられるが、これらに限定されない。さらなる耳保護剤については、米国特許出願公開第２００５／０１０１５３４号明細書も参照されたい。

聴力の喪失又は障害からの保護、及びその予防又は治療は、耳鳴り（ｔｉｎｎｉｔｕｓ）、耳鳴り（ｒｉｎｇｉｎｇ）、老人性難聴、オーディトリーニューロパチー、音響外傷、音響神経腫、ペンドレッド症候群、アッシャー症候群、ワーデンブルグ症候群、非症候性感音難聴、中耳炎、耳硬化症、メニエール病、耳毒性、迷路炎、並びに、感染（麻疹、流行性耳下腺炎、又は髄膜炎）、抗生物質などの薬物、及び一部の癌治療（すなわち、化学療法及び放射線療法）によって引き起こされる聴力障害を含む病態と関連があり得る。

特定の実施形態では、聴力障害は薬物誘発性である。なおさらなる態様では、薬物は、化学療法剤である。より具体的には、薬物は、カルボプラチン、シスプラチン、トランスプラチン、ネダプラチン、オキサリプラチン、ピコプラチン、サトラプラチン、トランスプラチン、及びトリプラチン、又はその薬学的に許容される塩、などの白金系化学療法剤である。特定の実施形態では、白金系化学療法剤は、シスプラチン、又はその薬学的に許容される塩である。さらに別の実施形態では、薬物は抗生物質であり、それには、ダウノルビシン、ドキソルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アクチノマイシン－Ｄ、ブレオマイシン、マイトマイシン－Ｃ、アミカシン、アプラマイシン、アルベカシン、アストロマイシン、ベカナマイシン、ジベカシン、フラマイセチン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシンＢ、イセパマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルマイシン、パロモマイシン、ロドストレプトマイシン、リボスタマイシン、シソマイシン、スペクチノマイシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、及びベルダマイシン、又はこれらの薬学的に許容される塩が含まれるが、これには限定されない。

さらなる態様では、聴力障害は、加齢に関連した障害、騒音誘発性障害、又は平衡若しくは配向に関連した障害である。平衡障害の例としては、誘発性又は自発性の回転性目まい、平衡障害、乗り物酔いに対する感受性の増加、悪心、嘔吐、運動失調、迷路炎、動揺視、眼振、失神、立ちくらみ、目まい、転倒の増加、夜間の歩行困難、メニエール病、及び視覚追跡及び処理の困難が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、騒音誘発性聴覚損失は、一時的であっても永久的であってもよい。

世界保健機関（Ｗｏｒｌｄ Ｈｅａｌｔｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）によって最近報告されたように、世界中の１０億人以上のティーンズエージャー及び若い成人が、大きな音楽への曝露から聴覚損失のリスクがある。職場環境や消費者操作機器を含む他の多くの騒音曝露もまた、騒音誘発性聴覚損失を引き起こし、これは最も一般的な身体的苦情の１つであり、日常生活において、会話し、コミュニケーションし、且つ参加する能力を著しく損なう（したがって、個人及び家族の一般的な生活の質を低下させる）。急性又は慢性の音響過剰曝露は、４，０００万人を超える米国の労働者を永久的な聴覚損失の危険にさらしている（Ｋｏｐｋｅ，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｈｅａｒ．Ｒｅｓ．２６１１４－１２５）。

外傷性脳損傷（ＴＢＩ）及び爆風関連損傷は、爆風曝露が予測できない軍事的状況において最も頻繁に起こり、外傷強度は、保護装置の効力を超えるか、又は保護装置が利用できない。ＴＢＩはしばしば、爆風損傷に対して非常に脆弱な聴覚系への多様な破壊又は損傷を伴う。爆発による極端な物理的衝撃は、鼓膜（ｔｙｍｐａｎｉｃ ｍｅｍｂｒａｎｅ）（ＴＭ、鼓膜（ｅａｒｄｒｕｍ））の破損、中耳骨の破損、基底膜からの感覚有毛細胞の外れ、有毛細胞を支配するラセン神経節の喪失など、末梢聴覚系に様々なタイプの損傷を引き起こす可能性がある。ヒトにおける爆風損傷の研究では、症例の約１７～２９％が重度のＴＭ破損を伴い、３３～７８％が中等度から重度の感音性の聴覚損失（有毛細胞及び神経節の喪失）を伴う。したがって、ＴＢＩ及び爆風損傷は過激ではあるが、聴覚損失の一般的な原因である。

聴覚の生物学的保護は、現在利用可能な機械的保護装置よりも有望である。補聴器は、コストが高く、技術的な問題が多いため、しばしば問題になっている。理想的には、軍人は高リスク又は高騒音の環境に入る前に防御薬を服用することができ、その結果、能力に影響を及ぼすことなく騒音による損傷から保護される。現在まで、騒音及びＴＢＩに関連した聴覚損失に対する防御のための薬物としてＦＤＡが承認したものはない。

本発明の方法によれば、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤が局所的に、例えば対象の内耳に、投与され得る。或いは、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤が全身的に投与され得る。さらに、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤は、鼓室階、蝸牛管、蝸牛の前庭階１つ又は複数に、内耳道の聴神経幹に、或いは、経鼓膜／鼓膜を横切って中耳洞に、注射により投与することができる。さらに、組み合わせて使用される場合、ＥＧＦＲシグナル伝達は、同じ又は異なる経路を介して投与することができる。

種々の態様においては、開示された分子は、１つ以上の他の薬物と組み合わせて、開示された分子又は他の薬物が有用性を有し得る、聴覚の損傷及び障害の治療、予防、制御、改善、又はリスクの低減に使用され得、薬物の組み合わせはいずれかの薬物が単独で使用されるよりも安全であるか又は有効である。このような他の薬物は、本発明の化合物と同時に又は連続して、一般に使用されている経路及び量で投与することができる。本発明の分子が１つ以上の他の薬物と同時に使用される場合、このような他の薬物と開示の化合物とを含有する単位剤形の医薬組成物が好ましい。しかしながら、この組み合わせ療法にはまた、開示の分子と１つ以上の他の薬物とを別々の重複スケジュールで投与する療法も含まれ得る。１つ以上の他の活性成分と組み合わせて使用される場合、開示の分子と他の活性成分とは、それぞれが単独で使用される場合よりも低い用量で使用し得ることもまた企図される。

本明細書の方法は、機能性感覚有毛細胞の欠如又は損傷に関連する急性及び持続性の両方の進行性障害の予防又は治療に有用である。急性疾患では、本明細書中の薬物は、短期間内に単回投与又は複数回投与により投与され得る。聴覚損失や、感覚有毛細胞の大量の喪失が原因の障害などの持続性の疾患では、本明細書中の薬物の多数回の投与が、治療効果を得るために必要であり得る。

必要に応じて、治療後、対象（例えば、ヒト又は他の動物）に対し、聴覚又は聴覚障害に関連する他の症状の改善を試験することができる。治療の利益を受ける対象には、有毛細胞喪失のリスクがあるものが含まれる。例えば、聴覚損失を有するか、又は聴覚損失を発症するリスクがある対象は、平均的な被験体（例えば、平均的なヒト）よりもよく聞こえないか、又は聴覚損失に罹患する前の対象よりもよく聞こえない可能性がある。例えば、少なくとも５％、１０％、３０％、５０％又はそれ以上、聴力が低い可能性がある。聴力を測定する方法はよく知られており、純音聴力検査、空気伝導検査、及び骨伝導検査が挙げられる。これらの検査は、ヒトが聞くことができるラウドネス（強度）及びピッチ（周波数）の限界を測定する。ヒトの聴力検査としては、聴性行動反応聴力検査（乳児～７か月）、条件詮索反応識聴力検査（７か月～３歳児）、及び３歳超の小児の遊戯聴力検査が挙げられる。耳音響放射検査は蝸牛有毛細胞の機能を検査するのに使用でき、蝸電図法は蝸牛の機能及び脳への神経経路の最初の部分に関する情報を提供する。種々の態様では、処置は、変化の有無にかかわらず継続されるか、又は停止され得る。

発現ベクター。当業者は当該技術分野で知られている多くの発現ベクターのいずれかが、核酸配列を内耳に導入するのに好適であることを知っているであろう。好適な発現ベクターの例としては、例えば、プラスミド、プラスミド－リポソーム複合体、及びウイルスベクター、例えば、パルボウイルスをベースとしたベクター（すなわち、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）をベースとしたベクター）、レトロウイルスベクター、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）をベースとしたベクター、ＡＡＶ－アデノウイルスキメラベクター、及びアデノウイルスをベースとしたベクターが挙げられる。これらの発現ベクターのいずれも、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２^ｎｄＥｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；及びＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹに記載の標準組換えＤＮＡ技術により作製することができる。

遺伝子操作された環状二本鎖ＤＮＡ分子であるプラスミドは、内耳への核酸配列の送達のための発現カセットを含むように設計され得る。プラスミドは治療用核酸の投与について報告された最初のベクターであったが、トランスフェクション効率のレベルは他の技術と比較して不十分である。プラスミドをリポソームと複合体化することにより、一般に遺伝子導入の効率が改善される。プラスミド媒介遺伝子導入戦略に使用されるリポソームは種々の組成を有するが、典型的には合成カチオン性脂質である。プラスミド－リポソーム複合体の利点としては、治療用核酸をコードするＤＮＡの大きな断片を導入する能力、及び、それらの比較的低い免疫原性が挙げられる。プラスミドはまた、米国特許第６，１６５，７５４号明細書に記載されるように、導入遺伝子の発現を長くするように改変され得る。プラスミドを用いた耳における導入遺伝子の発現が報告されている（例えば、Ｊｅｒｏ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．１２：５３９－５４９を参照）。プラスミドは本発明の方法における使用に好適であるが、好ましくは、発現ベクターはウイルスベクターである。

ＡＡＶベクターは、遺伝子治療プロトコルでの使用に特に興味深いウイルスベクターである。ＡＡＶはＤＮＡウイルスであり、ヒトの疾患を引き起こすことは知られていない。ＡＡＶは、効率的な複製を行うために、ヘルパーウイルス（すなわち、アデノウイルス若しくはヘルペスウイルス）との同時感染、又はヘルパー遺伝子の発現を必要とする。治療用核酸の投与に使用されるＡＡＶベクターは、ＤＮＡ複製及びパッケージングのための認識シグナルを含む末端反復（ＩＴＲ）のみが残るように、親ゲノムの約９６％が欠失している。これにより、ウイルス遺伝子の発現による免疫学的又は毒性副作用が排除される。組み込まれたＡＡＶゲノムを含む宿主細胞は細胞増殖又は形態の変化を示さない（例えば、米国特許第４，７９７，３６８号明細書を参照）。効率的ではあるが、ヘルパーウイルス又はヘルパー遺伝子の必要性が、このベクターの広範な使用の障害となりうる。

レトロウイルスは、多種多様な宿主細胞に感染することができるＲＮＡウイルスである。感染すると、レトロウイルスゲノムはその宿主細胞のゲノムに組み込まれ、宿主細胞のＤＮＡと共に複製され、それによってウイルスＲＮＡ及びレトロウイルスゲノムに組み込まれたいかなる核酸配列も常に産生される。病原性レトロウイルス、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）又はヒトＴ細胞リンパ向性ウイルス（ＨＴＬＶ）を使用する場合、毒性を排除するためにウイルスゲノムの改変に注意を払わなければならない。レトロウイルスベクターをさらに操作して、ウイルス複製を不能にすることができる。このため、レトロウイルスベクターは、インビボでの安定した遺伝子導入に特に有用であると考えられている。ＨＩＶベースのベクターなどのレンチウイルスベクターは、遺伝子送達のために使用されるレトロウイルスベクターの例である。他のレトロウイルスと異なり、ＨＩＶベースのベクターはそれらのパッセンジャー遺伝子を非分裂細胞に組み込むことが知られており、したがって、感覚細胞が再生しない内耳の感覚上皮に特に有用である。

ＨＳＶベースのウイルスベクターは、標的細胞の形質導入のために内耳に核酸を導入する発現ベクターとして使用するのに好適である。成熟ＨＳＶビリオンは、１５２ｋｂの線状二本鎖ＤＮＡ分子からなるウイルスゲノムを有するエンベロープをもつ正二十面体カプシドで構成されている。ほとんどの複製欠損ＨＳＶベクターは、複製を妨げるために１つ以上の最初期遺伝子を除去するための欠失を有している。ヘルペスベクターの利点は、長期間のＤＮＡ発現をもたらし得る潜伏期に入る能力、及び２５ｋｂまでの外因性ＤＮＡを収容できるその大きなウイルスＤＮＡゲノムである。当然ながら、この能力は短期治療レジメンにおいては欠点でもある。本発明の方法での使用に適したＨＳＶベースのベクターの記載については、例えば、米国特許第５，８３７，５３２号明細書、米国特許第５，８４６，７８２号明細書、米国特許第５，８４９，５７２号明細書、米国特許第５，８０４，４１３号明細書、国際公開第１９９１／０２７８８号パンフレット、国際公開第１９９６／０４３９４号パンフレット、国際公開第１９９８／１５６３７号パンフレット、及び国際公開第１９９９／０６５８３を参照されたい。

アデノウイルス（Ａｄ）は３６ｋｂの二本鎖ＤＮＡウイルスであり、様々な異なる標的細胞型にインビボで効率的にＤＮＡを導入する。本発明の方法で使用するために、ウイルスは、ウイルス複製に必要な選択遺伝子を欠失させることによって、複製欠損性とすることが好ましい。消耗性の非複製必須Ｅ３領域もまた、より大きなＤＮＡインサートのためのさらなる空間を可能にするために、欠失されることが多い。このベクターは高力価で産生でき、複製細胞及び非複製細胞にＤＮＡを効率的に導入することができる。アデノウイルスベクターを介して細胞に導入された遺伝情報は、エピクロモソームのままであり、したがって、ランダム挿入変異誘発及び標的細胞の遺伝子型の恒久的改変のリスクを排除する。しかしながら、必要に応じて、ＡＡＶの組み込み特性は、ＡＡＶ－Ａｄキメラベクターを構築することによってアデノウイルスに付与することができる。例えば、ＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）及びアデノウイルスベクターに組み込まれたＲｅｐタンパク質をコードする核酸は、アデノウイルスベクターが哺乳動物細胞ゲノムに組み込まれることを可能にする。したがって、ＡＡＶ－Ａｄキメラベクターは、本発明との関連で使用するための興味深い選択肢である。

好ましくは本発明の方法の発現ベクターはウイルスベクターであり、より好ましくは発現ベクターはアデノウイルスベクターである。任意の起源、任意のサブタイプ、サブタイプの混合物、又は任意のキメラアデノウイルス由来のアデノウイルスは、本発明のアデノウイルスベクターのためのウイルスゲノムの供給源として使用され得る。ヒトアデノウイルスは、好ましくは、複製欠損アデノウイルスベクターのためのウイルスゲノムの供給源として使用される。アデノウイルスは、任意のサブグループ又は血清型であり得る。例えば、アデノウイルスは、サブグループＡ（例えば、血清型１２、１８、及び３１）、サブグループＢ（例えば、血清型３、７、１１、１４、１６、２１、３４、３５、及び５０）、サブグループＣ（例えば、血清型１、２、５、及び６）、サブグループＤ（例えば、血清型８、９、１０、１３、１５、１７、１９、２０、２２～３０、３２、３３、３６～３９、及び４２～４８）、サブグループＥ（例えば、血清型４）、サブグループＦ（例えば、血清型４０及び４１）、未分類血清群（例えば、血清型４９及び５１）、又は任意の他のアデノウイルス血清型であり得る。アデノウイルス血清型１～５１は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）から入手可能である。好ましくは、アデノウイルスベクターはサブグループＣであり、特に血清型２であり、又はさらにより望ましくは血清型５である。

しかしながら、非グループＣアデノウイルス、さらには非ヒトのアデノウイルスを用いて、内耳の標的細胞へのＤＮＡの送達のための複製欠損アデノウイルス遺伝子導入ベクターを調製することができる。非グループＣアデノウイルス遺伝子導入ベクターの構築に使用される好ましいアデノウイルスとしては、Ａｄ１２（グループＡ）、Ａｄ７及びＡｄ３５（グループＢ）、Ａｄ３０及びＡｄ３６（グループＤ）、Ａｄ４（グループＥ）、及びＡｄ４１（グループＦ）が挙げられる。非グループＣアデノウイルスベクター、非グループＣアデノウイルスベクターを作製する方法、及び非グループＣアデノウイルスベクターを使用する方法は、例えば、米国特許第５，８０１，０３０号明細書、米国特許第５，８３７，５１１号明細書、米国特許第５，８４９，５６１号明細書、国際公開第１９９７／１２９８６号パンフレット及び国際公開第１９９８／５３０８７号パンフレットに開示されている。好ましい非ヒトアデノウイルスとしては、サルアデノウイルス（例えば、ＳＡＶ ２５）、ウシアデノウイルス、イヌアデノウイルス、ブタアデノウイルスが挙げられる。

アデノウイルスベクターは、複製欠損であることが好ましい。「複製欠損」とは、アデノウイルスベクターが、少なくとも１つの複製に必須の遺伝子機能を欠くアデノウイルスゲノムを含むことを意味する（すなわち、アデノウイルスベクターが典型的な宿主細胞、特に本発明による治療の過程においてアデノウイルスベクターが感染し得るヒト患者における宿主細胞において複製されないように）。遺伝子、遺伝子機能、又は遺伝子若しくはゲノム領域における欠損は、本明細書で使用される場合、その核酸配列が全体又は部分的に欠失した遺伝子の機能を損なうか又は排除するのに十分なウイルスゲノムの遺伝物質の欠失と定義される。遺伝物質の欠失が好ましいが、付加又は置換による遺伝物質の変異もまた、遺伝子機能の破壊に適している。複製必須遺伝子機能は、複製（例えば、増殖）に必要な遺伝子機能であり、例えば、アデノウイルス初期領域（例えば、Ｅ１、Ｅ２、及びＥ４領域）、後期領域（例えば、Ｌ１～Ｌ１５領域）、ウイルスパッケージングに関与する遺伝子（例えば、ＩＶａ２遺伝子）、及びウイルス関連ＲＮＡ（例えば、ＶＡ－ＲＮＡ１及び／又はＶＡ－ＲＮＡ－２）によってコードされる。より好ましくは、複製欠損アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの１つ以上の領域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能を欠損するアデノウイルスゲノムを含む。好ましくは、アデノウイルスベクターは、ウイルス複製に必要なアデノウイルスゲノムのＥ１領域又はＥ４領域の少なくとも１つの遺伝子機能を欠損している（Ｅ１欠損アデノウイルスベクター又はＥ４欠損アデノウイルスベクターと表記）。Ｅ１領域の欠損に加えて、組換えアデノウイルスはまた、国際公開第２０００／００６２８号パンフレットで説明されているように、主要後期プロモーター（ＭＬＰ）に変異を有し得る。最も好ましくは、アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能（望ましくは、全ての複製必須遺伝子機能）及び非必須Ｅ３領域の少なくとも一部（例えば、Ｅ３領域のＸｂａＩ欠失）が欠損している（Ｅ１／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターと表記）。Ｅ１領域に関して、アデノウイルスベクターは、Ｅ１Ａ領域の一部又は全部、及びＥ１Ｂ領域の一部又は全部、例えば、Ｅ１Ａ及びＥ１Ｂ領域のそれぞれの少なくとも１つの複製必須遺伝子機能が欠損し得る。アデノウイルスベクターがアデノウイルスゲノムの１つの領域において少なくとも１つの複製必須遺伝子機能を欠損している場合（例えば、Ｅ１又はＥ１／Ｅ３欠損アデノウイルスベクター）、アデノウイルスベクターは、「単一複製欠損」と呼ばれる。

本発明のアデノウイルスベクターは、アデノウイルスベクターがアデノウイルスゲノムの２つ以上の領域の各々において、１つ以上の複製必須遺伝子機能を欠損していることを意味する「多重複製欠損」であり得る。例えば、前述のＥ１欠損又はＥ１／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ４領域（Ｅ１／Ｅ４又はＥ１／Ｅ３／Ｅ４欠損アデノウイルスベクターと表記）、及び／又はＥ２領域（Ｅ１／Ｅ２又はＥ１／Ｅ２／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターと表記）、好ましくはＥ２Ａ領域（Ｅ１／Ｅ２Ａ又はＥ１／Ｅ２Ａ／Ｅ３欠損アデノウイルスベクターと表記）の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能がさらに欠損し得る。理想的には、アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの初期領域によってコードされる複製必須遺伝子機能のみの複製必須遺伝子機能を欠くが、これは本発明とのあらゆる関係の中で必要とされるわけではない。好ましい多重欠損アデノウイルスベクターは、Ｅ１領域のヌクレオチド４５７～３３３２、Ｅ３領域のヌクレオチド２８５９３～３０４７０、Ｅ４領域のヌクレオチド３２８２６～３５５６１、及び任意に、ＶＡ－ＲＮＡ１をコードする領域のヌクレオチド１０５９４～１０５９５の欠失を有するアデノウイルスゲノムを含む。しかし、他の欠失も適切であり得る。ヌクレオチド３５６－３３２９又は３５６－３５１０を除去して、複製に必須なＥ１遺伝子機能の欠損を作り出すことができる。アデノウイルスゲノムのＥ３領域からヌクレオチド２８５９４～３０４６９を欠失させることができる。上記に列挙した特定のヌクレオチド呼称はアデノウイルス血清型５ゲノムに対応するが、非血清型５アデノウイルスゲノムに対応するヌクレオチドは当業者によって容易に決定され得る。

アデノウイルスベクターは、多重複製欠損、特にＥ１及びＥ４領域の複製必須遺伝子機能の欠損の場合、スペーサーエレメントを含むことが好ましく、単一複製欠損アデノウイルスベクター、特にＥ１欠損アデノウイルスベクターによって達成されるものと同様の相補性細胞株においてウイルス増殖を提供する。スペーサーエレメントは、長さが少なくとも約１５塩基対（例えば、約１５塩基対～約１２，０００塩基対）、好ましくは約１００塩基対～約１０，０００塩基対、より好ましくは約５００塩基対～約８，０００塩基対、さらにより好ましくは約１，５００塩基対～約６，０００塩基対、最も好ましくは約２，０００～約３，０００塩基対など、所望の長さの配列を含むことができる。スペーサーエレメント配列は、コード又は非コードであり得、またアデノウイルスゲノムにとって天然又は非天然であり得るが、欠損領域に対する複製必須機能を回復しない。アデノウイルスベクターにおけるスペーサーの使用は、米国特許第５，８５１，８０６号明細書に記載されている。本発明の方法の一実施形態では、複製機能欠損又は条件付き複製アデノウイルスベクターは、Ｌ５ファイバー領域が保持され、スペーサーがＬ５ファイバー領域と右側ＩＴＲとの間に位置するＥ１／Ｅ４欠損アデノウイルスベクターである。より好ましくは、このようなアデノウイルスベクターにおいては、Ｅ４ポリアデニル化配列は単独で、又は最も好ましくは別の配列と組み合わされて、Ｌ５ファイバー領域と右側ＩＴＲとの間に、保持されたＬ５ファイバー領域が右側ＩＴＲから十分に分離し、その結果、このようなベクターのウイルス産生が、単一複製欠損アデノウイルスベクター、特にＥ１欠損アデノウイルスベクターのウイルス産生に近づくように、存在することが好ましい。

アデノウイルスベクターは、アデノウイルスゲノムの初期領域のみ、アデノウイルスゲノムの後期領域のみ、及びアデノウイルスゲノムの初期領域と後期領域の両方の複製必須遺伝子機能が欠損し得る。アデノウイルスベクターはまた、実質的にアデノウイルスゲノム全体が除去されてもよく、その場合、少なくとも、ウイルスＩＴＲ及び１つ以上のプロモーターか、又はウイルスＩＴＲ及びパッケージングシグナルが無傷である（すなわち、アデノウイルスアンプリコン）ことが好ましい。ＩＴＲ及びパッケージング配列を含むアデノウイルスゲノムの５’又は３’領域は、ウイルスゲノムの残りと同じアデノウイルス血清型由来である必要はない。例えば、アデノウイルス血清型５ゲノムの５’領域（すなわち、前記ゲノムの、アデノウイルスＥ１領域の５’側の領域）を、アデノウイルス血清型２ゲノムの対応する領域に置き換えることができる（例えば、Ａｄ５ゲノムの、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の５’側の領域が、Ａｄ２ゲノムのヌクレオチド１～４５６に置き換えられる）。多重複製欠損アデノウイルスベクターを含む好適な複製欠損アデノウイルスベクターは、米国特許第５，８３７，５１１号明細書、米国特許第５，８５１，８０６号明細書、米国特許第５，９９４，１０６号明細書、米国特許出願公開第２００１／００４３９２２号明細書、米国特許出願公開第２００２／０００４０４０号明細書、米国特許出願公開第２００２／００３１８３１号明細書、米国特許出願公開第２００２／０１１０５４５号明細書、国際公開第１９９５／３４６７１号パンフレット、国際公開第１９９７／１２９８６号パンフレット、及び国際公開第１９９７／２１８２６号パンフレットに開示されている。理想的には、複製欠損アデノウイルスベクターは、自律増殖可能なアデノウイルス（ＲＣＡ）が実質的に混入していない医薬組成物中に存在する（例えば、医薬組成物に含まれるＲＣＡ混入は約１％未満である）。最も望ましくは、医薬組成物はＲＣＡを含まない。ＲＣＡを含まないアデノウイルスベクター組成物及びストックは、米国特許第５，９４４，１０６号明細書、米国特許第６，４８２，６１６号明細書、米国特許出願公開第２００２／０１１０５４５号明細書及び国際公開第１９９５／３４６７１号パンフレットに記載されている。

したがって、好ましい実施形態では、本発明の方法の発現ベクターは、Ｅ１領域の全部又は一部、Ｅ３領域の全部又は一部、Ｅ４領域の全部又は一部、及び任意にＥ２領域の全部又は一部を欠く多重複製欠損アデノウイルスベクターである。多重欠損ベクターは、外因性核酸配列の耳への送達に特に適していると考えられる。Ｅ１領域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能を欠損したアデノウイルスベクターは、インビボでの遺伝子導入に最もよく用いられる。しかし、現在使用されている単一複製欠損アデノウイルスベクターは、内耳の上皮の感受性細胞に有害であり、まさに治療対象の細胞に損傷を引き起こす可能性がある。Ｅ４領域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能を欠損しているアデノウイルスベクター、特にＥ４領域及びＥ１領域の複製必須遺伝子機能を欠損しているアデノウイルスベクターは、Ｅ１欠損アデノウイルスベクターよりも細胞に対する毒性が低い（例えば、Ｗａｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．２（６）：７１４－７１６及び米国特許第６，２２８，６４６号明細書を参照）。したがって、Ｅ１、Ｅ４欠損アデノウイルスベクターを用いてＥＧＦＲ阻害剤をコードする核酸配列を内耳細胞に送達することにより、既存の有毛細胞及び支持細胞に対する損傷を最小限に抑えることができる。

この点に関して、少なくともＥ４が欠損したアデノウイルスベクターは、インビボにおいて限られた時間に高レベルで導入遺伝子を発現し、少なくともＥ４が欠損したアデノウイルスベクターにおける導入遺伝子の発現の持続は、なかでも、トランス作用因子、例えば、ＨＳＶ ＩＣＰＯ、Ａｄ ｐＴＰ、ＣＭＶ－ＩＥ２、ＣＭＶ－ＩＥ８６、ＨＩＶ ｔａｔ、ＨＴＬＶ－ｔａｘ、ＨＢＶ－Ｘ、ＡＡＶ Ｒｅｐ ７８、ＨＳＶ ＩＣＰＯのように機能するＵ２０５骨肉腫細胞株由来の細胞因子、又は神経成長因子によって誘導されるＰＣ１２細胞における細胞因子によって調節され得ることが観察されている。上記の点を考慮すると、多重欠損アデノウイルスベクター（例えば、少なくともＥ４が欠損したアデノウイルスベクター）又は第２の発現ベクターは、ＥＧＦＲ阻害剤をコードする核酸配列の発現の持続を調節するトランス作用性因子をコードする核酸配列を含む。

複製欠損アデノウイルスベクターは、典型的には、複製欠損アデノウイルスベクターには存在しないがウイルス増殖には必要な遺伝子機能を提供する相補性細胞株において、高力価のウイルスベクターストックを生成するために適切なレベルで産生される。好ましい細胞株は、複製欠損アデノウイルスに存在しない少なくとも１つの、好ましくは全ての複製必須遺伝子機能を補完する。相補性細胞株は、（例えば、アデノウイルスアンプリコンの増殖を可能にするために）全てのアデノウイルス機能を含む、初期領域、後期領域、ウイルスパッケージング領域、ウイルス関連ＲＮＡ領域、又はこれらの組み合わせによってコードされる少なくとも１つの複製必須遺伝子機能の欠損を補完することができる。最も好ましくは、相補性細胞株は、アデノウイルスゲノムのＥ１領域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能（例えば、２つ以上の複製必須遺伝子機能）の欠損、特にＥ１Ａ及びＥ１Ｂ領域のそれぞれの複製必須遺伝子機能の欠損を補完する。さらに、相補性細胞株は、アデノウイルスゲノムのＥ２領域（特にアデノウイルスＤＮＡポリメラーゼ及び末端タンパク質に関して）及び／又はＥ４領域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能の欠損を補完することができる。望ましくは、Ｅ４領域欠損を補完する細胞は、Ｅ４－ＯＲＦ６遺伝子配列を含み、Ｅ４－ＯＲＦ６タンパク質を産生する。このような細胞は、少なくともＯＲＦ６を含み、アデノウイルスゲノムのＥ４領域の他のＯＲＦを含まないことが望ましい。細胞株はさらに、アデノウイルスベクターと重複しない様式で相補性遺伝子を含み、それによって、ベクターゲノムが細胞ＤＮＡと組み換えを起こす可能性を最小化し実質的に排除することを特徴としていることが好ましい。したがって、自律増殖可能なアデノウイルス（ＲＣＡ）の存在は、ベクターストックにおいて回避されない場合でも、最小限に抑える。このことは、特定の治療目的、特に、遺伝子治療目的には好適である。ベクターストックにＲＣＡがないことにより、非相補性細胞におけるアデノウイルスベクターの複製が回避される。このような相補性細胞株の構築には、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ；及びＡｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ ａｎｄ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹに記載されているような、標準的な分子生物学及び細胞培養の技術が必要である。

アデノウイルスベクターを産生するための相補性細胞株としては、２９３細胞（例えば、Ｇｒａｈａｍ，ｅｔ ａｌ．（１９７７）Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．３６：５９－７２を参照）、ＰＥＲ．Ｃ６細胞（例えば、国際公開第１９９７／００３２６号パンフレット、米国特許第５，９９４，１２８号明細書及び米国特許第６，０３３，９０８号明細書を参照）、及び２９３－ＯＲＦ６細胞（例えば、国際公開第１９９５／３４６７１号パンフレット及びＢｒｏｕｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７１：９２０６－９２１３を参照）が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの例では、相補性細胞は、必要とされるアデノウイルス遺伝子機能の全てを補完するわけではない。ヘルパーウイルスは、アデノウイルスベクターの複製を可能にするために、細胞ゲノム又はアデノウイルスゲノムによってコードされない遺伝子機能をイントランスで提供するために使用され得る。アデノウイルスベクターは、例えば、米国特許第５，９６５，３５８号明細書、米国特許第５，９９４，１２８号明細書、米国特許第６，０３３，９０８号明細書、米国特許第６，１６８，９４１号明細書、米国特許第６，３２９，２００号明細書、米国特許第６，３８３，７９５号明細書、米国特許第６，４４０，７２８号明細書、米国特許第６，４４７，９９５号明細書、米国特許第６，４７５，７５７号明細書、米国特許出願公開第２００２／００３４７３５号明細書、国際公開第１９９８／５３０８７号パンフレット、国際公開第１９９８／５６９３７号パンフレット、国際公開第１９９９／１５６８６号パンフレット、国際公開第１９９９／５４４４１号パンフレット、国際公開第２０００／１２７６５号パンフレット、国際公開第２００１／７７３０４号パンフレット、及び国際公開第２００２／２９３８８号パンフレット、並びに本明細書中で特定されている他の参考文献に記載される材料及び方法を使用して構築、増殖及び／又は精製することができる。非グループＣアデノウイルスベクター、例えば、アデノウイルス血清型３５ベクターは、例えば、米国特許第５，８３７，５１１号明細書、米国特許第５，８４９，５６１号明細書、国際公開第１９９７／１２９８６号パンフレット、及び国際公開第１９９８／５３０８７号明細書に記載される方法を使用して作製することができる。さらに、多くのアデノウイルスベクターが市販されている。

アデノウイルスベクターの外被タンパク質は、野生型外被タンパク質に対する中和抗体によって認識される能力又は認識されない能力を減少させるように改変され得る。このような改変は、複数回投与のために有用である。同様に、アデノウイルスベクターの外被タンパク質を操作して、潜在的宿主細胞上のウイルス受容体に対するアデノウイルスベクターの結合特異性又は認識を変化させることができる。このような操作には、ファイバー、ペントン、ヘキソン、ｐＩＩＩａ、ｐＶＩ、及び／又はｐＩＸの領域の欠失又は置換、外被タンパク質の部分への種々の天然又は非天然のリガンドの挿入などが含まれ得る。外被タンパク質の操作により、アデノウイルスベクターが感染する細胞の範囲を広げたり、又はアデノウイルスベクターの特定の細胞型へのターゲティングを可能にしたりすることができる。潜在的な宿主細胞を認識するアデノウイルスベクターの能力は、外被タンパク質の遺伝子操作なしに、すなわち二重特異性分子の使用によって調節され得る。例えば、アデノウイルスを、ペントンベース結合ドメイン又はファイバー結合ドメイン、及び特定の細胞表面結合部位に選択的に結合するドメインを含む二重特異性分子と複合体化することにより、アデノウイルスベクターの特定の細胞型へのターゲティングが可能になる。

好ましくは、アデノウイルスカプシドは、非天然アミノ酸配列を示すように改変される。非天然アミノ酸配列は、内部外被タンパク質配列に、若しくはその代わりに（例えば、アデノウイルスファイバータンパク質の露出ループ内に）挿入されるか、又はアデノウイルス外被タンパク質の末端に融合（例えば、任意にリンカー又はスペーサー配列を使用して、アデノウイルスファイバータンパク質のＣ末端に融合）され得る。非天然アミノ酸配列は、アデノウイルス外被タンパク質のいずれかに結合して、キメラ外被タンパク質を形成し得る。したがって、例えば、本発明の非天然アミノ酸配列は、ファイバータンパク質、ペントンベースタンパク質、ヘキソンタンパク質、タンパク質ＩＸ、ＶＩ若しくはＩＩＩａなどに結合されるか、挿入されるか、又は付着され得る。このようなタンパク質の配列、及びそれらを組換えタンパク質に使用する方法は、当該技術分野でよく知られている（例えば、米国特許第５，５４３，３２８号明細書、米国特許第５，５５９，０９９号明細書、米国特許第５，７１２，１３６号明細書、米国特許第５，７３１，１９０号明細書、米国特許第５，７５６，０８６号明細書、米国特許第５，７７０，４４２号明細書、米国特許第５，８４６，７８２号明細書、米国特許第５，９６２，３１１号明細書、米国特許第５，９６５，５４１号明細書、米国特許第５，８４６，７８２号明細書、米国特許第６，０５７，１５５号明細書、米国特許第６，１２７，５２５号明細書、米国特許第６，１５３，４３５号明細書、米国特許第６，３２９，１９０号明細書、米国特許第６，４５５，３１４号明細書、米国特許第６，４６５，２５３号明細書、米国特許第６，５７６，４５６号明細書、米国特許出願公開第２００１／００４７０８１号明細書、米国特許出願公開第２００３／００９９６１９号明細書、国際公開第１９９６／０７７３４号パンフレット、国際公開第１９９６／２６２８１号パンフレット、国際公開第１９９７／２００５１号パンフレット、国際公開第１９９８／０７８７７号パンフレット、国際公開第１９９８／０７８６５号パンフレット、国際公開第１９９８／４０５０９号パンフレット、国際公開第１９９８／５４３４６号パンフレット、国際公開第２０００／１５８２３号パンフレット、国際公開第２００１／５８９４０号パンフレット、及び国際公開第２００１／９２５４９を参照）。キメラ外被タンパク質の外被タンパク質部分は、リガンドドメインが付加されている全長アデノウイルス外被タンパク質であってもよいし、例えば内部又はＣ末端及び／若しくはＮ末端で切断されていてもよい。外被タンパク質部分はそれ自体、アデノウイルスベクターに対し天然である必要はない。

リガンドがファイバータンパク質に結合される場合、ウイルスタンパク質又はファイバーモノマー間の相互作用を妨害しないことが好ましい。したがって、非天然アミノ酸配列は、それ自体はオリゴマー化ドメインではないことが好ましく、オリゴマー化ドメインの場合には、アデノウイルスファイバーの三量体化ドメインと不利に相互作用し得る。好ましくは、リガンドをビリオンタンパク質に添加し、基質に容易に曝露されるように（例えば、タンパク質のＮ末端又はＣ末端に、基質に面する残基に結合して、基質に接触するようにペプチドスペーサー上に位置するなど）組み込んで、非天然アミノ酸配列を基質に最大限に提示させる。理想的には、非天然アミノ酸配列は、ファイバータンパク質のＣ末端でアデノウイルスファイバータンパク質に組み込む（そして、スペーサーを介して結合する）か、又はファイバーの露出ループ（例えば、ＨＩループ）に組み込んで、キメラ外被タンパク質を生成する。非天然アミノ酸配列をペントンベースの一部に結合するか、又は置換する場合、それは基質に確実に接触するように超可変領域内にあることが好ましい。非天然アミノ酸配列をヘキソンに結合する場合、それは超可変領域内にあることが好ましい（Ｍｉｋｓｚａ，ｅｔ ａｌ（１９９６）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７０（３）：１８３６－４４）．非天然アミノ酸配列をアデノウイルス粒子の表面から離れて伸長させるためのスペーサー配列の使用は、非天然アミノ酸配列が受容体への結合により利用可能であり得、非天然アミノ酸配列とアデノウイルスファイバーモノマーとの間の立体的相互作用が低減される点で有利であり得る。

非天然リガンドを含むキメラウイルス外被タンパク質は、望ましくは、前記外被タンパク質を含むウイルスベクター、すなわちアデノウイルスベクター、の細胞への侵入を導くことができ、その侵入は、キメラウイルス外被タンパク質ではなく野生型ウイルス外被タンパク質を含むことを除いて同一であるベクターの細胞への侵入よりも効率的である。好ましくは、キメラウイルス外被タンパク質は、野生型外被タンパク質を含むベクターによって認識されないか、又はほとんど認識されない、細胞表面に存在する新規な内因性結合部位に結合する。

さらに、アデノウイルスカプシドタンパク質を変化させて、天然のアデノウイルス受容体（すなわち、野生型アデノウイルスが結合する受容体）への結合を減少又は除去することができる。特に、コクサッキー及びアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）と相互作用するアデノウイルスファイバータンパク質の部分を、アデノウイルスファイバータンパク質がＣＡＲに結合しないように、ファイバータンパク質内の欠失、置換、再配置などによって変異させることができる。同様に、インテグリンと相互作用するアデノウイルスのペントンタンパク質の部分を変化させて、天然のインテグリン結合を除去することができる。複製欠損又は条件付き複製アデノウイルスベクターの天然の結合及び形質導入を減少させるために、細胞侵入を媒介するアデノウイルス外皮タンパク質上に位置する天然の結合部位、例えばファイバー及び／又はペントンベース、を存在させないか、又は破壊する。２つ以上のアデノウイルス外被タンパク質が、細胞表面への付着を媒介すると考えられる（例えば、ファイバー及びペントンベース）。宿主細胞（例えば、中皮細胞又は肝細胞）への天然の結合を変化させるための任意の好適な技術が使用され得る。例えば、細胞への天然の結合を除去するために異なるファイバー長を利用することは、ペントンベース又はファイバーノブへの結合配列の付加によって達成され得る。この付加は、二重特異性又は多重特異性結合配列によって直接的又は間接的に行うことができる。或いは、アデノウイルスファイバータンパク質をファイバーシャフト中のアミノ酸の数を減少させるように改変し、それによって「短シャフト」ファイバーを作製することができる（例えば、米国特許第５，９６２，３１１号明細書に記載）。いくつかのアデノウイルス血清型のファイバータンパク質は天然に他のものよりも短く、これらのファイバータンパク質を天然のファイバータンパク質の代わりに使用して、アデノウイルスのその天然の受容体への天然の結合を低減し得る。例えば、血清型５アデノウイルス由来のアデノウイルスベクターの天然ファイバータンパク質を、アデノウイルス血清型４０又は４１由来のファイバータンパク質で交換し得る。

この点に関して、アデノウイルスベクターを、異なる血清型のアデノウイルス由来のアデノウイルス外被タンパク質（例えば、ファイバー、ペントン、又はヘキソンタンパク質）を含むように改変することができる。例えば、アデノウイルス血清型５アデノウイルスを、アデノウイルス血清型３５ファイバーを提示するように改変することができ、これは次に、任意に１つ以上の非天然アミノ酸リガンドを含み得る。ベクターを特定の細胞型に標的化するために、内耳の細胞型に自然感染しないアデノウイルスベクターを利用することが可能である。或いは、内耳の細胞に天然に形質導入するアデノウイルスベクターを、標的細胞に対して天然の指向性を有さないアデノウイルス由来のアデノウイルスファイバータンパク質及び／又はアデノウイルスペントンベースを提示するように改変することができ、改変されたアデノウイルスベクターが、標的細胞の形質導入を可能にする非天然アミノ酸配列を提示することができる。

別の実施形態では、天然の基質結合に関連する核酸残基を変異させ（例えば、国際公開第２０００／１５８２３号パンフレット；Ｅｉｎｆｅｌｄ，ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７５（２３）：１１２８４－１１２９１；ｖａｎ Ｂｅｕｓｅｃｈｅｍ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．７６（６）：２７５３－２７６２を参照）、その変異させた核酸残基を組み込んだアデノウイルスベクターの天然基質への結合が少なくなるようにすることができる。例えば、アデノウイルス血清型２及び５は、アデノウイルスファイバータンパク質の、コクサッキーウイルス及びアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）への結合、及びペントンタンパク質の、細胞表面に位置するインテグリンへの結合によって細胞に形質導入する。したがって、本発明の方法の複製欠損又は条件付き複製アデノウイルスベクターは、ＣＡＲへの天然の結合性を欠く、且つ／又は、インテグリンへの天然の結合性の減少を示すことができる。複製欠損又は条件付き複製アデノウイルスベクターの宿主細胞への天然の結合性を低減させるために、天然ＣＡＲ及び／又はインテグリン結合部位（例えば、アデノウイルスペントンベースに位置するＲＧＤ配列）を除去又は破壊する。

タンパク質でのアデノウイルスへの改変は、結果として生じるアデノウイルスベクターの宿主免疫系を回避する能力を増強することができる。一実施形態では、アデノウイルスベクターは、ＣＡＲ及び／又はインテグリンへのアデノウイルスベクターの天然の結合性の除去及びアデノウイルスカプシドへの１つ以上の非天然リガンドの組み込みによって、瘢痕上皮細胞（例えば、内因性の機能的有毛細胞を欠く上皮の領域）を選択的に標的とする。特定のレセプターを介して形質導入を媒介する好適なリガンドは、慣用的なライブラリーディスプレイ技術（例えば、ファージディスプレイ）を使用して決定することができ、例えば、ＥＧＦによって結合されたリガンド及びペプチドのＦＧＦファミリー由来のリガンドが含まれる。非天然アミノ酸配列及びそれらの基質の他の例としては、インテグリンによって認識されるアミノ酸の短い（例えば、６個以下のアミノ酸）直鎖状ストレッチ、並びにポリリシン、ポリアルギニンなどのようなポリアミノ酸配列が挙げられるが、これらに限定されない。キメラアデノウイルス外被タンパク質を生成するための非天然アミノ酸配列は、米国特許第６，４５５，３１４号明細書及び国際公開第２００１／９２５４９号パンフレットにさらに記載されている。

アデノウイルスベクターに対する好適な改変は、米国特許第５，５４３，３２８号明細書、米国特許第５，５５９，０９９号明細書、米国特許第５，７１２，１３６号明細書、第５，７３１，１９０号明細書、米国特許第５，７５６，０８６号明細書、米国特許第５，７７０，４４２号明細書、米国特許第５，８４６，７８２号明細書、米国特許第５，８７１，７２７号明細書、米国特許第５，８８５，８０８号明細書、米国特許第５９２２，３１５号明細書、米国特許第５，９６２，３１１号明細書、米国特許第５，９６５，５４１号明細書、米国特許第６，０５７，１５５号明細書、米国特許第６，１２７，５２５号明細書、米国特許第６，１５３，４３５号明細書、米国特許第６，３２９，１９０号明細書、米国特許第６，４５５，３１４号明細書、米国特許第６，４６５，２５３号明細書、米国特許出願公開第２００１／００４７０８１号明細書、米国特許出願公開第２００２／００９９０２４号明細書、米国特許出願公開第２００２／０１５１０２７号明細書、国際公開第１９９６／０７７３４号パンフレット、国際公開第１９９６／２６２８１号パンフレット、国際公開第１９９７／２０００５１号パンフレット、国際公開第１９９８／０７８６５号パンフレット、国際公開第１９９８／０７８７７号パンフレット、国際公開第１９９８／４０５０９号パンフレット、国際公開第１９９８／５４３４６号パンフレット、国際公開第２０００／１５８２３号パンフレット、国際公開第２００１／５８９４０号パンフレット、及び国際公開第２００１／９２５４９号パンフレットに記載されている。アデノウイルスベクターの構築は、当該技術分野でよく知られている。アデノウイルスベクターは、例えば、米国特許第５，９６５，３５８号、米国特許第６，１６８，９４１号、米国特許第６，３２９，２００号明細書、米国特許第６，３８３，７９５号明細書、米国特許第６，４４０，７２８号明細書、米国特許第６，４４７，９９５号明細書、米国特許第６，４７５，７５７号明細書、国際公開第１９９８／５３０８７号パンフレット、国際公開第１９９８／５６９３７号パンフレット、国際公開第１９９９／１５６８６号パンフレット、国際公開第１９９９／５４４４１号パンフレット、国際公開第２０００／１２７６５号パンフレット、国際公開第２００１／７７３０４号パンフレット及び国際公開第２００２／２９３８８号パンフレット、並びに本明細書中で特定されている他の参考文献に記載される方法を使用して構築及び／又は精製することができる。さらに、アデノウイルスベクターを含む多数の発現ベクターが市販されている。アデノ随伴ウイルスベクターは、例えば、米国特許第４，７９７，３６８号明細書、及びＬａｕｇｈｌｉｎ，ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｇｅｎｅ２３：６５－７３に記載される方法を用いて構築及び／又は精製することができる。

本発明の方法において使用するための発現ベクターの選択は、例えば、宿主、ベクターの免疫原性、タンパク質産生の所望の持続時間、標的細胞などの種々の因子に依存する。発現ベクターの各タイプは特性が異なるため、本発明の方法は特定の状況に合わせることができる。さらに、核酸配列を標的細胞に送達するために、２種以上の発現ベクターを使用することができる。したがって、本発明は、動物における知覚を変化させ、聴覚損失を予防又は治療する方法であって、ＥＧＥＲシグナル伝達の阻害剤をコードする核酸配列を含む少なくとも２つの異なる発現ベクターを内耳に投与することを含む方法を提供する。好ましくは、内耳の標的細胞、例えば支持細胞、をアデノウイルスベクター及びＨＳＶベクターと接触させ、これによって、アデノウイルスベクターが支持細胞に効率的に形質導入し、ＨＳＶベクターがニューロンに効率的に形質導入する。当業者は、内耳の感覚障害を治療又は研究するために、複数の送達システムの有利な特性を利用する能力を理解しているであろう。

核酸分子。本発明の発現ベクターは核酸分子を有する。理想的には、核酸分子はＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤をコードする。当業者は任意の転写因子、例えば、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤が改変又は切断されても活性を保持し得ることを理解できる。したがって、治療用断片（すなわち、例えば転写を活性化するのに十分な生物学的活性を有する断片）もまた、発現ベクターへの組み込みに好適である。同様に、転写因子又はその治療用断片と、例えばペプチド立体配座を安定化する部分とから構成される融合タンパク質もまた、発現ベクターに存在し得る。

核酸分子（すなわち、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤をコードする）は、発現カセット、すなわち、核酸分子のサブクローニング及び回収を促進する機能を有する特定の塩基配列（例えば、１つ以上の制限部位）、又は、核酸分子の発現を促進する機能を有する特定の塩基配列（例えば、ポリアデニル化部位若しくはスプライス部位）、の一部として存在することが望ましい。発現カセットがアデノウイルスベクターである場合、目的の核酸分子（例えば、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤をコードする）は、Ｅ１領域に位置する（例えば、Ｅ１領域の全部又は一部を置換する）か、又はアデノウイルスゲノムのＥ４領域に位置し得る。Ｅ４領域に位置する場合、スペーサー配列は必要とされない。発現カセットは、好ましくは、３’→５’配向で挿入される（例えば、発現カセットの転写方向が周囲のアデノウイルスゲノムの転写方向と反対であるように配向される）。ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤を発現するために、単一の発現カセットをアデノウイルスベクターに挿入することができるが、他の実施形態では、アデノウイルスベクターは、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤をコードする核酸分子を保有する複数の発現カセットを含むことができ、前記カセットはアデノウイルスゲノムの欠失領域のいずれかを置換し得る。アデノウイルスゲノム（例えば、ゲノムのＥ１領域）への発現カセットの挿入は、既知の方法によって、例えば、アデノウイルスゲノムの所与の位置に特有の制限部位を導入することによって容易に行われ得る。上述したように、アデノウイルスベクターのＥ３領域が欠失し、且つＥ４領域がスペーサーエレメントによって置換されることが好ましい。

発現のために、目的の核酸分子は、前記発現に必要な調節配列（例えば、プロモーター）に作動可能に連結される。「プロモーター」はＲＮＡポリメラーゼの結合を指示し、それによってＲＮＡ合成を促進するＤＮＡ配列である。核酸分子は、プロモーターがその核酸分子の転写を指示することができる場合に、プロモーターに「作動可能に連結」されている。プロモーターは、それが作動可能に連結される核酸分子に対して天然であっても非天然であってもよい。任意のプロモーター（すなわち、天然から単離されたか、又は組換えＤＮＡ若しくは合成技術によって生成されたかに関わらない）は、本発明との関連では、核酸分子の転写を生じるために使用され得る。プロモーターは、真核生物（望ましくは、哺乳動物）細胞において転写を指示することができることが好ましい。プロモーターの機能は、１つ以上のエンハンサー（例えば、ＣＭＶ最初期エンハンサー）及び／又はサイレンサーの存在によって改変され得る。

本発明は、ウイルスプロモーターを好適に使用する。好適なウイルスプロモーターは当該技術分野で知られており、例えば、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（ＣＭＶ最初期プロモーターなど）、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）由来のプロモーター（ＨＩＶ長末端反復プロモーターなど）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーター（ＲＳＶ長末端反復など）、マウス乳癌ウイルス（ＭＭＴＶ）プロモーター、ＨＳＶプロモーター（Ｌａｐ２プロモーター又はヘルペスチミジンキナーゼプロモーターなど）（Ｗａｇｎｅｒ，ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ７８：１４４－１４５）、ＳＶ４０又はエプスタイン・バール・ウイルスに由来するプロモーター、アデノ随伴ウイルスプロモーター（ｐ５プロモーターなど）などが挙げられる。ウイルスプロモーターは、好ましくは、アデノウイルスプロモーター（Ａｄ２又はＡｄ５主要後期プロモーター及びトリパータイトリーダー（ｔｒｉｐａｒｔｉｔｅ ｌｅａｄｅｒ）など）、ＣＭＶプロモーター（マウス又はヒト起源）、又はＲＳＶプロモーターである。

プロモーターはウイルスプロモーターである必要はない。例えば、プロモーターは細胞プロモーター、すなわち、細胞タンパク質の発現を駆動するプロモーターであり得る。本発明で使用するための好ましい細胞プロモーターは、治療剤を産生するための所望の発現プロファイルに依存する。一態様では、細胞プロモーターは、種々の細胞型で作用する構成的プロモーターである。好適な構成的プロモーターは、転写因子、ハウスキーピング遺伝子、又は真核細胞に共通の構造遺伝子をコードする遺伝子の発現を駆動することができる。例えば、Ｙｉｎｇ Ｙａｎｇ１（ＹＹ１）転写因子（ＮＭＰ－１、ＮＦ－Ｅ１及びＵＣＲＢＰとも呼ばれる）は、核マトリックスの固有成分である普遍的核転写因子である（Ｇｕｏ，ｅｔ ａｌ（１９９５）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９２：１０５２６－１０５３０）。ＪＥＭ－１（ＨＧＭＷ及びＢＬＺＦ－１としても知られる；Ｔｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｌｅｕｋｅｍｉａ １２（１１）：１７３３－１７４０；Ｔｏｎｇ，ｅｔ ａｌ．（２０００）Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ６９（３）：３８０－３９０）、ユビキチンプロモーター、特にＵｂＣ（Ｍａｒｉｎｏｖｉｃ，ｅｔ ａｌ．（２００２）Ｊ。Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７（１９）：１６６７３－１６６８１）、β－アクチンプロモーター（ニワトリに由来するものなど）などが、本発明の方法での使用に適している。

上記のプロモーターの多くは構成的プロモーターである。プロモーターは、構成的プロモーターの代わりに、誘導性プロモーター、すなわち、適切なシグナルに応答して上方制御及び／又は下方制御されるプロモーターであり得る。例えば、好適な誘導性プロモーター系としては、ＩＬ－８プロモーター、メタロチオニン誘導性プロモーター系、細菌ｌａｃＺＹＡ発現系、テトラサイクリン発現系、及びＴ７ポリメラーゼ系が挙げられるが、これらに限定されない。さらに、異なる発生段階で選択的に活性化されるプロモーター（例えば、グロビン遺伝子は、胚と成体とで異なる様式でグロビン関連プロモーターから転写される）を用いることができる。核酸分子を調節するプロモーター配列は、外因性物質による調節に応答する少なくとも１つの異種調節配列を含み得る。調節配列は、薬物、ホルモン、又は他の遺伝子産物など（これらに限定されない）の外因性物質に応答することが好ましい。例えば、調節配列（例えば、プロモーター）は、グルココルチコイド受容体－ホルモン複合体に応答し、次いで、治療用ペプチド又はその治療用断片の転写レベルを増強することが好ましい。

好ましくは、プロモーターは、組織特異的プロモーター、すなわち、所与の組織において優先的に活性化され、活性化されたその組織において遺伝子産物の発現するプロモーターである。本発明で使用するための組織特異的プロモーターは、標的組織又は細胞型に基づいて、当業者により選択され得る。好適なプロモーターとしては、ＢＲＮ．３Ｃ、ＢＲＮ ３．１、ＰＯＵ ＯＲＦ３因子プロモーター、ＢＲＫ１、ＢＲＫ３、コルディンプロモーター、ノギンプロモーター、ｊａｇｇｅｄ１プロモーター、ｊａｇｇｅｄ２プロモーター、及びｎｏｔｃｈ１プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。本発明で使用するための好ましい組織特異的プロモーターは、有毛細胞において機能するミオシンＶＩＩａプロモーター、又は支持細胞において機能するｈｅｓ－１プロモーターなどのように、支持細胞又は感覚有毛細胞に特異的である。理想的には、瘢痕上皮における導入遺伝子発現を促進するプロモーターが選択される。

プロモーターはまた、本発明で使用するために、その特定の活性パターンを所望のタンパク質の発現の所望のパターン及びレベルと一致させることによって選択され得る。或いは、複数のプロモーターの望ましい特性を組み合わせるハイブリッドプロモーターを構築することができる。例えば、ＣＭＶプロモーターの最初の活性の急増とＲＳＶプロモーターの高い維持レベルの活性とを組み合わせたＣＭＶ－ＲＳＶハイブリッドプロモーターは、本発明の方法の多くの実施形態における使用に特に好ましい。研究者が操作し得る発現プロファイルを有するプロモーターを選択することも可能である。

この線に沿って、タンパク質産生を最適化するために、核酸分子は核酸分子のコード領域に続いてポリアデニル化部位をさらに含むことが好ましい。任意の好適なポリアデニル化配列を使用することができ、これには、合成最適化配列、並びにＢＧＨ（ウシ成長ホルモン）、ポリオーマウイルス、ＴＫ（チミジンキナーゼ）、ＥＢＶ（エプスタイン・バール・ウイルス）、及びヒトパピローマウイルス及びＢＰＶ（ウシパピローマウイルス）を含むパピローマウイルスのポリアデニル化配列が含まれる。好ましいポリアデニル化配列は、ＳＶ４０（ヒト肉腫ウイルス－４０）ポリアデニル化配列である。また、全ての適切な転写シグナル（及び、翻訳シグナル（適切な場合））は、それが導入された細胞で核酸分子が適切に発現されるように正しく配置されることが好ましい。核酸分子はまた、必要に応じて、ｍＲＮＡ産生を促進するために、スプライス部位（すなわち、スプライスアクセプター及びスプライスドナー部位）を組み込むことができる。さらに、核酸分子が、プロセシング若しくは分泌されるタンパク質、又は細胞内で作用する、タンパク質又はペプチドをコードする場合、核酸分子は、プロセシング、分泌、細胞内局在化などのための適切な配列をさらに含むことが好ましい。

特定の実施形態では、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤の発現を調節することが有利であり得る。核酸分子の発現を調節する特に好ましい方法としては、発現ベクター上の部位特異的組換え部位の付加が挙げられる。部位特異的組換え部位を有する発現ベクターを、リコンビナーゼと接触させると、コード配列の転写が上方制御若しくは下方制御されるか、又は同時に、組換え事象を介して、１つのコード配列の転写が上方制御され、別のコード配列の転写が下方制御される。核酸配列の転写を調節するための部位特異的組換えの使用は、例えば、米国特許第５，８０１，０３０号明細書、米国特許第６，０６３，６２７号明細書、及び国際公開第９７／０９４３９号パンフレットに記載されている。

ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤をコードする核酸分子を内耳に送達するために、いくつかの選択肢が利用可能である。複数のコード配列は異なるプロモーター、例えば、異なるレベル及びパターンの活性を有する異なるプロモーターに作動可能に連結され得る。或いは、複数のコード配列は、同じプロモーターに作動可能に連結されて、ポリシストロン性エレメントを形成し得る。本発明はまた、各発現ベクターがＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤をコードする発現ベクターのカクテルを内耳に投与することを企図している。発現ベクターのカクテルは、異なるタイプの発現ベクター、例えばアデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクター、をさらに含み得る。

上記を考慮して、本発明はさらに、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤をコードする核酸分子を有するアデノウイルスベクターであって、核酸分子は、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤の発現に必要な調節配列に作動可能に連結されているアデノウイルスベクターを提供する。アデノウイルスベクターは、少なくともＥ４領域の少なくとも１つの複製必須遺伝子機能を欠損している。核酸分子は、例えば、天然から単離する、合成的に生成する、遺伝子操作された生物から単離するなど、任意の供給源から得ることができる。適切なアデノウイルスベクター及び調節配列は、本明細書中に記載されている。

さらに、本発明は、分化した感覚上皮において有毛細胞をインビボで生成する方法をさらに提供する。この方法は、分化した感覚上皮細胞を、（ａ）Ｅ１領域、Ｅ４領域の１つ以上の複製必須遺伝子機能、及び任意にＥ３領域の１つ以上の遺伝子機能を欠損し、（ｂ）Ｅ４領域にスペーサーを有し、且つ（ｃ）ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤をコードする核酸分子を有するアデノウイルスベクターと接触させる工程を含む。核酸分子は発現されて、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤を産生する。

投与経路。当業者は、内耳に薬物、又はアデノウイルスベクターなどの発現ベクターを投与する好適な方法が利用可能であることを知っている。特定の薬物又は発現ベクターを投与するために２つ以上の経路を使用することができるが、特定の経路は別の経路よりもより迅速且つより有効な反応を提供することができる。したがって、記載された投与経路は単に例示的なものであり、決して限定的なものではない。

投与経路に関わらず、本発明の方法の薬物又は発現ベクターは、理想的には、内耳の感覚上皮に到達する。したがって、最も直接的な投与経路は、内耳の構造の内部へのアクセスを可能にする外科的処置を含む。蝸牛切開を介して接種することにより、聴覚に関連する内耳領域に発現ベクターを直接投与することができる。蝸牛切開は、Ｋａｗａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．（（２００１）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ４（６）：５７５－５８５）に記載されているように、例えば、アブミ骨動脈の下の耳包に、蝸牛壁を貫通する穴を開け、薬物又は発現ベクターを含有する医薬組成物を放出することを含む。内リンパコンパートメントへの投与は、聴覚を担う内耳領域にアデノウイルスベクターを投与するのに特に有用である。或いは、薬物又は発現ベクターはカナロストミーにより半規管に投与され得る。カナロストミーは前庭系及び蝸牛における導入遺伝子発現を提供し、一方、蝸牛切開は、前庭空間における効率的な導入を提供しない。蝸牛空間への直接注射は有毛細胞の機械的損傷をもたらす可能性があるが、カナロストミーの使用により蝸牛機能の損傷のリスクは低減される（Ｋａｗａｍｏｔｏ，ｅｔ ａｌ．、前掲）。投与手順はまた、アポトーシス阻害剤又は抗炎症剤などの、治療又は投与手順の副作用を軽減する因子を含むことができる流体（例えば、人工外リンパ）下で実施し得る。

内耳への別の直接投与経路は、正円窓への注射又は局所適用による、正円窓を介するものである。正円窓を介する投与は、薬物又はアデノウイルスベクターを外リンパ腔に送達するために特に好ましい。正円窓を介した発現ベクターの投与後に、蝸牛及び前庭ニューロン及び蝸牛感覚上皮における導入遺伝子の発現が観察されている（Ｓｔａｅｃｋｅｒ，ｅｔ ａｌ（２００１）Ａｃｔａ Ｏｔｏｌａｒｙｎｇｏｌ．１２１：１５７－１６３）。注目すべきことに、発現ベクター、特に非標的アデノウイルスベクターの内耳細胞への取り込みは、受容体媒介性ではない可能性があるようである。言い換えれば、内耳の細胞のアデノウイルス感染がＣＡＲによってもインテグリンによっても媒介されていないようである。外リンパコンパートメントへの投与後のコルチ器官における細胞の形質導入を増加させるために、アデノウイルスベクターは標的細胞（例えば、支持細胞、血管条の細胞など）へのアデノウイルスベクターの取り込みを増強する１つ以上のリガンドを提示することができる。この点に関して、アデノウイルスベクターは、天然の結合（例えば、ＣＡＲ結合及び／又はインテグリン結合）を減少させ、内耳の標的細胞によるアデノウイルスベクターの取り込みを増強させる非天然アミノ酸配列を有するように改変された１つ以上のアデノウイルス外被タンパク質をコードし得る。

薬物又は発現ベクター（例えば、アデノウイルスベクター）は、内耳への投与のための医薬組成物中に含まれ得る。特定の場合においては、支持細胞を薬物又は発現ベクターへ確実に十分に曝露させるために、複数の適用及び／又は複数の経路、例えば、カナロストミー及び蝸牛切開（ｃｏｃｈｌｅｏｓｔｏｍｙ）を使用することが適切であり得る。

薬物又は発現ベクターは、スポンジ、網目構造、機械的リザーバ若しくはポンプ、又は機械的インプラントなどの、薬物又は発現ベクターの制御された放出又は持続放出が可能なデバイス内又はデバイス上に存在し得る。例えば、薬物又は発現ベクターを含有する医薬組成物中に浸漬した生体適合性スポンジ又はジェルフォームは正円窓に隣接して配置され、それを通って薬物又は発現ベクターが浸透し、蝸牛に到達する（Ｊｅｒｏ，ｅｔ ａｌ（前掲）に記載）。ミニ浸透圧ポンプは、長期間（例えば、５～７日間）にわたる薬物又は発現ベクターの持続放出を提供し、薬物又は発現ベクターを含有する少量の組成物が投与されることを可能にし、これにより、内因性感覚細胞に対する機械的損傷を予防することができる。薬物又は発現ベクターはまた、例えば、ゼラチン、コンドロイチン硫酸、ビス－２－ヒドロキシエチルテレフタレート（ＢＨＥＴ）などのポリホスホエステル、又はポリ乳酸－グリコール酸を含有する徐放性製剤（例えば、米国特許第５，３７８，４７５号明細書を参照）の形態で投与され得る。

或いは、薬物又は発現ベクターは、非経口的に、筋肉内に、静脈内に、経口的に、又は腹腔内に投与され得る。本明細書に記載されるように、発現ベクターは、潜在的宿主細胞上の受容体に対する発現ベクターの結合特異性又は認識を変えるように改変され得る。アデノウイルスに関して、このような操作には、ファイバー、ペントン又はヘキソンの領域の欠失、外被タンパク質の部分への種々の天然又は非天然のリガンドの挿入などが含まれ得る。当業者は、非経口投与が発現ベクターを適切な宿主細胞に効果的に送達するために、大用量又は複数回の投与が必要な場合があることを理解する。組成物のための薬学的に受容可能な担体は、当業者によく知られている（Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃｓ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ，（１９８２）Ｊ．Ｂ．Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｃｏ．，Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ，ＰＡ，Ｂａｎｋｅｒ ａｎｄ Ｃｈａｌｍｅｒｓ，ｅｄｓ．，ｐａｇｅｓ２３８－２５０；ＡＳＨＰ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｎ Ｉｎｊｅｃｔａｂｌｅ Ｄｒｕｇｓ（１９８６）Ｔｏｉｓｓｅｌ，４^ｔｈ ｅｄ．，ｐａｇｅｓ６２２－６３０を参照）。あまり好ましくないが、発現ベクターはまた、インビボで、パーティクル・ボンバードメント法、すなわち遺伝子銃で投与され得る。

当業者はまた、投与量及び投与経路が、宿主の免疫系に起因する発現ベクターの喪失を最小限にするように選択され得ることを知っているであろう。例えば、標的細胞をインビボで接触させるために、本発明の方法を実施する前に、空の発現ベクター（すなわち、目的の核酸分子を保有しない発現ベクター）を宿主に投与することが有利であり得る。空の発現ベクターの事前投与は、宿主内の発現ベクターに対する免疫を作り出すのに役立ち、体の先天性除去機構を妨げ、それにより、免疫系によって除去されるベクターの量を減少させることができる。

投与量。本発明による動物、特にヒトに投与される薬物又は発現ベクターの用量は、妥当な時間枠にわたって動物における所望の応答に十分に影響を及ぼすだけの量であるべきである。当業者は、投与量が年齢、種、損傷した感覚上皮の位置、問題の病理（もし存在すれば）、及び病態又は疾患の状態を含む種々の因子に依存することを認識している。投与量はまた、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤及び／又は細胞周期関連タンパク質キナーゼ阻害剤や、形質導入される感覚上皮の量にも依存する。用量サイズはまた、投与の経路、時期、及び頻度、並びに特定の発現ベクター又は薬物に付随し得る有害な副作用（例えば、外科的外傷）の存在、性質及び程度、さらに所望の生理学的効果によっても決定されるであろう。種々の病態又は疾患状態、特に、慢性の病態又は疾患状態では、複数回投与を含む長期治療が必要な場合があることは、当業者に知られている。

好適な用量及び投薬レジメンは、当業者に知られた従来の範囲発見技術によって決定され得る。発現ベクターがウイルスベクター、最も好ましくはアデノウイルスベクターである場合、約１０^５～約１０^１２のウイルス粒子が患者に送達される。換言すれば、約１０^５粒子／ｍｌ～約１０^１３粒子／ｍｌ（約１０^５粒子／ｍｌ～約１０^１３粒子／ｍ１の範囲内の全ての数を含む）、好ましくは約１０^１０粒子／ｍｌ～約１０^１２粒子／ｍｌの発現ベクター濃度を含む医薬組成物を投与することができ、典型的には、約０．１μｌ～約１００μｌのこのような医薬組成物を内耳に直接投与することを伴う。上記を考慮して、１回の投与量は、ＥＧＦＲ阻害剤並びに／又は遺伝子サイレンシング複合体の補因子及び／若しくは阻害因子をコードする核酸分子を有するアデノウイルスベクターを、好ましくは、少なくとも約１×１０^６粒子（例えば、約４×１０^６～４×１０^１２粒子）、より好ましくは、少なくとも約ｌ×１０^７粒子、より好ましくは少なくとも約ｌ×１０^８粒子（例えば、約４×１０^８～４×１０^１１粒子）、最も好ましくは、少なくとも１×１０^９粒子～少なくとも約１×１０^１０粒子（例えば、約４×１０^９～４×１０^１０粒子）である。或いは、医薬組成物の用量は、約１×１０^１４粒子以下、好ましくは約１×１０^１３粒子以下、さらにより好ましくは約１×１０^１２粒子以下、さらにより好ましくは約１×１０^１１粒子以下、最も好ましくは約１×１０^１０粒子以下（例えば、約１×１０^９粒子以下）を含む。換言すれば、医薬組成物の単回用量は、アデノウイルスベクター（例えば、複製欠損アデノウイルスベクター）を約１×１０^６粒子単位（ｐｕ）、４×１０^６ｐｕ、１×１０^７ｐｕ、４×１０^７ｐｕ、１×１０^８ｐｕ、４×１０^８ｐｕ、１×１０^９ｐｕ、４×１０^９ｐｕ、１×１０^１０ｐｕ、４×１０^１０ｐｕ、１×１０^１１ｐｕ、４×１０^１１ｐｕ、１×１０^１１ｐｕ、４×１０^１１ｐｕ、１×１０^１２ｐｕ、又は４×１０^１２ｐｕであり得る。発現ベクターがプラスミドである場合、好ましくは約０．５ｎｇ～約１０００μｇのＤＮＡが投与される。より好ましくは、約０．１μｇ～約５００μｇが投与され、さらにより好ましくは約１μｇ～約１００μｇのＤＮＡが投与される。最も好ましくは、約５０μｇのＤＮＡが内耳に投与される。当然ながら、他の投与経路では、治療効果を達成するために、より少ない用量又はより多い用量を必要とし得る。投与量及び投与経路における必要な変動は、当業者によい、当該技術分野で知られた慣用的な技術を使用して決定され得る。

内耳の構造の内部空間は限られている。内耳の構造に直接投与される医薬組成物の容量は、多すぎる組成物を強制すると感覚上皮を損傷するので、注意深く監視すべきである。ヒト患者では、投与する容量は好ましくは約１０μｌ～約２ｍｌ（例えば、約２５μｌ～約１．５ｍｌ）の組成物である。例えば、約５０μｌ～約１ｍｌ（例えば、約１００μｌ、２００μｌ、３００μｌ、４００μｌ、５００μｌ、６００μｌ、７００μｌ、８００μｌ又は９００μｌ）の組成物を投与することができる。一実施形態では、内耳構造、例えば、蝸牛管又は半規管の全流体内容物が医薬組成物で置き換えられる。別の実施形態では、本発明の医薬組成物は機械的外傷が最小限に抑えられるように、内耳構造内にゆっくりと放出される。

薬物又はＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤をコードする核酸分子を有する発現ベクターの２つ以上の（すなわち、複数の）用量を投与することが有利な場合がある。本発明の方法は、動物の知覚を変化させるために、薬物又は発現ベクターの複数回投与を提供する。例えば、薬物又は発現ベクターを同じ耳に少なくとも２回投与することができる。複数回投与はバックグラウンドレベルを超える遺伝子発現を保持しながら行われることが好ましい。内耳の感覚上皮を約３０日の間に２用量以上の薬物又は発現ベクターと接触させることもまた好ましい。２回以上の適用が約９０日の間に内耳になされることがより好ましい。しかし、３回、４回、５回、６回、又はそれ以上の用量を任意の時間枠（例えば、２、７、１０、１４、２１、２８、３５、４２、４９、５６、６３、７０、７７、８５日又はそれ以上の投与間隔）で投与することができる。

医薬組成物。本発明の薬物又は発現ベクターは、薬学的に許容される担体と薬物又は発現ベクターとを含む医薬組成物として投与されることが望ましい。本発明との関連では、任意の好適な薬学的に許容される担体を使用することができ、このような担体は当該技術分野でよく知られている。担体の選択は、一つには組成物が投与される特定の部位及び組成物を投与するために使用される特定の方法によって決定される。理想的には、アデノウイルスベクターとの関連では、医薬組成物は自律増殖可能なアデノウイルスを含まないことが好ましい。

好適な製剤としては、水性及び非水性溶液、等張性滅菌溶液（これには、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び製剤を対象とする受容者の内耳の血液又は流体と等張にする溶質を含有することができる）、並びに懸濁剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤、及び保存剤を含むことができる水性及び非水性の滅菌懸濁液が挙げられる。製剤は、市販されている人工内リンパ又は外リンパを含むことができる。製剤は、アンプル及びバイアルなどの単位用量又は複数用量の密封容器で提供することができ、使用直前に滅菌液体担体、例えば水の添加のみを必要とする凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ）（凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ））条件で保存することができる。即席の溶液及び懸濁液は、前述の種類の滅菌粉末、顆粒、及び錠剤から調製することができる。好ましくは、薬学的に許容される担体は緩衝生理食塩溶液である。より好ましくは、本発明の方法で使用するための発現ベクターは、投与前の損傷から発現ベクターを保護するために製剤化された医薬組成物として投与される。例えば、医薬組成物は、ガラス器具、注射器、又は針などの、発現ベクターを調製、保存、又は投与するために使用されるデバイスにおける発現ベクターの損失を減少させるように製剤化することができる。医薬組成物は、発現ベクターの光感受性及び／又は温度感受性を低下させるように製剤化することができる。この目的のために、医薬組成物は、例えば、上記のものなどの薬学的に許容される液体担体、及びポリソルベート８０、Ｌ－アルギニン、ポリビニルピロリドン、トレハロース、及びこれらの組み合わせからなる群から選択される安定化剤を含むことが好ましい。このような医薬組成物を使用することにより、ベクターの保存可能期間が延長され、投与が容易になり、且つ本発明の方法の効率を高める。この点に関して、医薬組成物はまた、形質導入効率を増強するために処方され得る。さらに、当業者は、発現ベクター、例えばウイルスベクターが他の治療剤又は生物学的に活性な薬剤と共に組成物中に存在させ得ることを理解するであろう。例えば、特定の症状の治療に有用な治療因子を存在させることができる。イブプロフェン又はステロイドのような炎症を制御する因子は、ウイルスベクターのインビボ投与に関連する腫脹及び炎症を減少させるために組成物の一部とすることができる。免疫系サプレッサーを本発明の方法と組み合わせて投与して、ベクター自体に対する、又は内耳の障害に関連する免疫応答を減少させることができる。血管新生因子、神経栄養因子、増殖剤などを、医薬組成物中に存在させることができる。同様に、ビタミン及びミネラル、抗酸化剤、並びに微量栄養素を同時に投与することができる。抗生物質（すなわち、殺菌剤及び防カビ剤）は、遺伝子導入手順及び他の障害に関連する感染のリスクを減少させるために存在させ得る。

本明細書に記載されるように、複数のコード配列を内耳に送達するために、いくつかの選択肢が利用可能である。ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤をコードする核酸分子は、さらなる遺伝子産物をコードし得る。或いは、又はさらに、発現ベクターは、異なる遺伝子産物をコードする複数の発現カセットを含み得る。複数のコード配列は異なるプロモーター、例えば、異なるレベル及びパターンの活性を有する異なるプロモーターに作動可能に連結され得る。或いは、複数のコード配列は、同じプロモーターに作動可能に連結されて、ポリシストロン性エレメントを形成し得る。本発明はまた、複数の発現ベクターのカクテルを内耳に投与することを意図する。ここで、各発現ベクターは知覚に有益な遺伝子産物をコードする。複数の発現ベクターのカクテルは、異なるタイプの発現ベクター、例えば、アデノウイルスベクター及びアデノ随伴ウイルスベクターをさらに含み得る。

或いは、又はＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤の投与に加えて、本発明の方法はまた、発現ベクターによってコードされないＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤をコードする核酸分子を有する発現ベクターの投与を包含する。この点において、本明細書に開示される方法及び医薬組成物は、ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する単離された阻害性ＲＮＡ分子、タンパク質、ペプチド、抗体、又は小有機分子と組み合わせて、因子をコードする核酸分子を有する発現ベクターを含むように改変することができる。さらに、本明細書に開示される方法及び医薬組成物は、（ｉ）ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤をコードする核酸分子を有する発現ベクターを、（ｉｉ）ＥＧＦＲシグナル伝達を阻害する単離された阻害性ＲＮＡ分子、タンパク質、ペプチド、抗体、又は小有機分子と組み合わせて含むように改変することができる。

本発明はまた、明細書に開示される方法を実施するためのキットを提供する。理想的には、キットは、ＥＧＦＲ阻害剤をコードする核酸分子、及び（ｉ）上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達阻害剤をコードする核酸分子；（ｉｉ）単離されたＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤（例えば、ＥＧＦＲ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ｍＴＯＲ、ＮＣＫ、ＰＡＫ、ＪＮＫ、ＰＬＣ、ＰＫＣ又は細胞周期関連キナーゼの１つ以上を阻害する阻害性ＲＮＡ又は小有機分子）；又は（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の組み合わせ、を含む。さらに、キットは凍結乾燥形態又は液体形態の活性成分を含む容器（例えば、バイアル、ボトル、シリンジ、又はチューブ）、並びに用量、投与、投与時期などに関する情報を含むキット構成要素を使用するための説明書を含み得る。キットは、活性成分の表示、科学文献の参照、包装材料、臨床試験結果などをさらに含んでもよい。その情報は、様々な研究、例えば、インビボモデルを含む実験動物を用いた研究や、ヒト臨床試験に基づく研究の結果に基づくことができる。

１つの好ましい実施形態では、本発明の方法はまた、少なくとも１つの神経栄養剤をコードする核酸分子の送達を企図する。理想的には、神経栄養剤は神経成長刺激物質であり、これは神経プロセスの成長、発達、及び／又は成熟を誘導する。また、神経栄養因子を投与して、既存のニューロン及び発達中のニューロンを保護又は維持することができる。新たに生じた有毛細胞が適切に機能するためには、神経インパルスを脳に伝達するための神経ネットワークが配置されていなければならない。したがって、内耳の感覚上皮に関連する既存のニューロンを保護すること、新しい神経過程の成長及び成熟を誘導すること、及び／又は、単に既存の神経プロセスを感覚有毛細胞に導くことが有利である。神経栄養因子は、神経産出性サイトカイン、ニューロトロフィン、線維芽細胞増殖因子の３つのサブクラスに分けられる。毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）は神経産出性サイトカインの例示である。ＣＮＴＦは毛様体神経節ニューロンの生存を促進し、ＮＧＦ応答性の特定のニューロンを支持する。ニューロトロフィンには、例えば、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、及び神経突起伸長を刺激する神経成長因子（ＮＧＦ）が含まれる。他の神経栄養因子には、例えば、トランスフォーミング成長因子、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニューロトロフィン３、ニューロトロフィン４／５、及びインターロイキン１－βが含まれる。神経栄養因子はニューロンの生存を増強し、また本発明の方法における使用に適している。神経栄養因子は、実際にはニューロンの分解を逆転させることができると仮定されている。このような因子は、おそらく、年齢、感染、又は外傷に関連するニューロンの変性の治療に有用である。好ましい神経栄養因子は、色素上皮由来因子（ＰＥＤＦ）である。ＰＥＤＦは、Ｃｈａｄｅｒ（１９８７）Ｃｅｌｌ Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ．２０：２０９－２１６；Ｐｉｇｎｏｌｏ，ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６８（１２）：８９４９－８９５７；米国特許第５，８４０，６８６号明細書、国際公開第１９９３／２４５２９号パンフレット、国際公開第１９９９／０４８０６号パンフレット、及び国際公開第２００１／５８４９４号パンフレットにさらに記載されている。

本発明の方法は、他の治療方法を含む治療レジメンの一部であり得る。したがって、本発明の方法が使用される場合、薬物療法又は手術などの多くの他の治療法のいずれかで処置されたか、処置されているか又は処置される感覚障害、すなわち聴覚障害又は平衡障害を予防的又は治療的に処置することが適切である。本発明の方法はまた、人工内耳などの聴覚装置の埋め込みと併せて実施することができる。本発明の方法はまた、内耳内の細胞集団を再生するための幹細胞を含む手順に特に適している。この点において、本発明の方法は幹細胞を形質導入するためにエクスビボで実施することができ、幹細胞はその後に内耳内に移植される。

動物（例えば、哺乳動物、特にヒト）に感覚有毛細胞の変性の危険性がある（予防的処置）か、又は感覚有毛細胞の数の減少又は損傷を示した（治療的処置）ことが決定されたなら、可能な限り早く発現ベクターを投与することが好ましい。治療は、部分的には、使用される特定の核酸分子、発現されるＥＧＦＲシグナル伝達の特定の阻害剤、発現ベクター、投与経路、並びに、認識されている有毛細胞の喪失又は損傷の原因及び程度（もしあれば）に依存する。

ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤をコードする核酸分子を有する発現ベクターは、所与の動物、特にヒトから以前に分離された細胞にエクスビボで導入することができる。このような形質導入された自己又は相同宿主細胞は、ＥＧＦＲシグナル伝達の阻害剤を発現し、インビボで成熟有毛細胞を維持するために、動物又はヒトの内耳に再導入される前駆細胞であり得る。当業者はこのような細胞が患者から単離される必要はなく、代わりに、別の個体から単離して、患者に移植され得ることを理解するであろう。

本発明の方法はまた、他の薬学的に活性な化合物の併用投与を含み得る。「併用投与」とは、上記の発現ベクターの投与の前、投与と同時、例えば、同じ製剤又は別々の製剤で発現ベクターと組み合わせて、又は投与の後に投与することを意味する。例えば、イブプロフェン又はステロイドなどの炎症を制御する因子を、発現ベクターの投与に関連する腫脹及び炎症を減少させるために併用投与することができる。免疫抑制剤を、内耳障害又は本発明の方法の実施に関連する不適切な免疫応答を減少させるために、併用投与することができる。同様に、ビタミン及びミネラル、抗酸化剤、並びに微量栄養素を併用投与することができる。抗生物質、殺菌剤及び防カビ剤を、外科的処置に関連する感染のリスクを減少させるために併用投与することができる。

本発明をさらに説明するために、以下の非限定的な実施例を提供する。

実施例１：聴覚損失に対する防御のためのＥＧＦＲ阻害剤
７５のキナーゼ阻害剤からなるライブラリーのスクリーニングを行い、シスプラチン誘発性有毛細胞喪失を防御する阻害剤を同定した。このスクリーニングで、マウス蝸牛由来の細胞株（ＨＥＩ－ＯＣ１）におけるシスプラチン誘発性細胞死、及びマウス蝸牛移植片におけるシスプラチン誘発性有毛細胞喪失に対して強力に防御する４つの化合物：（１）Ｈｅｒ２阻害剤ムブリチニブ（ＴＡＫ １６５）、（２）Ｐａｎ－ＡＵＲ阻害剤ＳＮＳ３１４（３）ＢＲＡＦ－Ｖ６００Ｅ阻害剤ＧＳＫ２１１８４３６Ａ（ダブラフェニブ）及び（４）ＰＤＧＦＲ阻害剤クレノラニブを同定した。

Ｈｅｒ２阻害剤ムブリチニブ（ＴＡＫ １６５）はＨＥＩ－ＯＣ１細胞におけるシスプラチン誘発性カスパーゼ－３／７活性に対して、４ｎＭのＩＣ_５０及び＞５５μＭのＬＤ_５０で防御効果を示し、マウス蝸牛移植片におけるシスプラチン誘発性有毛細胞喪失に対して、２．５ｎＭのＩＣ_５０及び＞５００ｎＭのＬＤ_５０で防御した（治療指数＞２００）（図１）。同様に、ｐａｎ－ＥｒｂＢ阻害剤であるペリチニブは、ＨＥＩ－ＯＣ１細胞の喪失において、シスプラチン誘発性カスパーゼ－３／７活性に対して０．６μＭのＩＣ_５０及び４０μＭのＬＤ_５０で防御効果を示すことが見出された（図２）。さらに、１時間のプレインキュベーションにより、マウス蝸牛移植片（Ｎ＝３）における、シスプラチン誘発性有毛細胞喪失に対して、ペリチニブは４９％の外有毛細胞の防御作用を示した。

同様に、ｐａｎ－ＥｒｂＢ阻害剤であるペリチニブは、ＨＥＩ－ＯＣ１細胞の喪失において、シスプラチン誘発性カスパーゼ－３／７活性に対して０．６μＭのＩＣ_５０及び４０μＭのＬＤ_５０で防御効果を示すことが見出された（図２）。さらに、１時間のプレインキュベーションにより、マウス蝸牛移植片（Ｎ＝３）における、シスプラチン誘発性有毛細胞喪失に対して、ペリチニブは４９％の外有毛細胞の防御作用を示した。

Ｂ－Ｒａｆ阻害剤は、マウス蝸牛移植片におけるシスプラチン損傷に対して外有毛細胞を防御した。Ｂ－Ｒａｆ阻害剤ダブラフェニブ（ＢＲＡＦ）（図３Ａ）は、マウス蝸牛移植片において、０．０３００μＭのＩＣ_５０及び１３．４７μＭのＬＤ_５０（２０００超の治療指数）で、防御的なシスプラチン誘発性有毛細胞喪失を示した。さらに、ダブラフェニブ（ＢＲＡＦ）は、０．１００μＭでゼブラフィッシュ化合物シスプラチン防御を示した（図１１Ａ）。

さらに、Ｂ－Ｒａｆ阻害剤ベムラフェニブ（ＢＲＡＦ）（図４Ｂ）は、マウス蝸牛移植片において約０．２μＭのＩＣ_５０及び３μＭ超のＬＤ_５０（１５超の治療指数）で防御的なシスプラチン誘発性有毛細胞喪失を示した。Ｂ－Ｒａｆ阻害剤ＰＬＸ－４７５０（ＢＲＡＦ）（図４Ｄ）は、マウス蝸牛移植片において、０．２μＭのＩＣ_５０及び３μＭ超のＬＤ_５０で防御的なシスプラチン誘発性有毛細胞喪失を示した。（１５超の治療指数）。Ｂ－Ｒａｆ阻害剤ＲＡＦ－２６５（ＢＲＡＦ）（図４Ｅ）は、マウス蝸牛移植片において０．０２μＭのＩＣ_５０及び３μＭ超のＬＤ_５０（１５０超の治療指数）で、防御的なシスプラチン誘発性有毛細胞喪失を示した。

ＭＥＫ阻害剤は、図４Ｃに示すように、蝸牛移植片におけるシスプラチン損傷に対して外有毛細胞を防御した。ＭＥＫ阻害剤トラメチニブ（ＭＥＫ）は、マウス蝸牛移植片において、０．０５μＭのＩＣ_５０及び３μＭ超のＬＤ_５０（６０超の治療指数）で防御的なシスプラチン誘発性有毛細胞喪失を示した。

図４Ａに示すように、阻害剤はシグナル伝達カスケードに沿ってシスプラチンを緩和する。

実施例２ 阻害剤はシスプラチン活性化ＢＲａｆシグナル伝達カスケードを緩和する。
図５Ａ及び５Ｂに示すように、Ｂ－Ｒａｆ、ＥＲＫ及びＭＥＫはリン酸化され、５０μＭのシスプラチン処理でＨＥＬ－ＯＣ１細胞において時間依存的に活性化する。ダブラフェニブ処理は、ＨＥＬ－ＯＣ１細胞においてＢ－ＲＡＦ、ＥＲＫ及びＭＥＫのシスプラチン媒介５０μＭ、１時間の活性化を用量依存的に緩和する。

実施例３ ダブラフェニブは、インビボで経口送達すると、成体マウスのシスプラチン誘発性聴覚損失に対して防御作用を示す。
図６Ａは成熟ＦＶＢマウス（雄及び雌）にダブラフェニブ及びシスプラチンを投与するスケジュールを示す。図６Ｂは、シスプラチンとダブラフェニブの同時処置の最初の日から２１日目に、２元配置分散分析とその後のボンフェローニ比較により、ＡＢＲ閾値シフトはシスプラチン単独と比較して平均１１．８～１５．０ｄＢの減少が記録されたことを示す（平均±ＳＥＭ、^＊：Ｐ＜０．０５）。

実施例４ ダブラフェニブは、インビボで経口送達すると、成体マウスの騒音誘発性聴覚損失に対して防御作用を示す。
図７Ａは、ダブラフェニブの投与とＦＶＢマウス（雄及び雌）への騒音曝露のスケジュールを示す。図７Ｂは、ダブラフェニブと騒音曝露の最初の日から１４日目に、２元配置分散分析とその後のボンフェローニ比較により、ＡＢＲ閾値シフトは、担体と比較して平均１８．１～２１．９ｄＢの減少が記録されたことを示す（平均±ＳＥＭ、^＊＊：Ｐ＜０．０１、^＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。

ここで図８Ａ及び８Ｂを参照すると、ダブラフェニブは、騒音曝露の４５分前に経口送達すると、成体マウスの騒音誘発性聴覚損失に対して防御作用を示す。（Ａ）ダブラフェニブの投与及びＦＶＢマウスの騒音曝露（雄及び雌）。（Ｂ）ＡＢＲ閾値シフトは、ダブラフェニブと騒音曝露の最初の日から１４日目に、２元配置分散分析とその後のボンフェローニ比較により、担体と比較して平均１８．１～２１．９ｄＢの減少が記録された（平均±ＳＥＭ、^＊＊：Ｐ＜０．０１、^＊＊＊：Ｐ＜０．００１）。

実施例５：阻害剤の組み合わせは相乗的に作用する。
ここで図９、すなわちマウス蝸牛移植片培養物におけるＢ－Ｒａｆ／ＭＥＫ１／２阻害剤の組み合わせ試験（マウス蝸牛移植片培養）を参照する。化合物単独又は化合物の組み合わせを、２４時間、シスプラチン（１５０ｕＭ）の１時間前に、Ｐ３ ＦＶＢ蝸牛移植片に添加し、蝸牛のミドルターン領域１６０μｍ当たりの外有毛細胞の数を、ファロイジン染色によって計数し（平均±ＳＥＭ、Ｐ＝^＊＜０．０５、Ｐ＝^＊＊＊＜０．００１）、対のない両側スチューデントｔ検定によりシスプラチン単独と比較した。試験した化合物間の初期のモル比は、現在、がん患者に与えられている比（ダブラフェニブを１５０ｍｇ、１日２回＋トラメチニブを２ｍｇ、１日１回）によって決定した。

実施例６ 防御効果が、インビボでゼブラフィッシュ側線の感丘に示される。
感覚有毛細胞の損傷又は死を減少、阻害又は予防することができる小分子を評価するために、ゼブラフィッシュモデル系を使用する方法が提供される。ゼブラフィッシュは、哺乳動物モデル系と比較して、聴覚損失の原因及び予防を研究するための有利な動物モデル系である。哺乳動物における有毛細胞の相対的な接近不能性は、毒素媒介及び他の形態の有毛細胞死の発生を予防する化合物を同定するための、ハイスループットモデルとしてのそれらの使用を制限する。ゼブラフィッシュ（ダニオ・レリオ（Ｄａｎｉｏ ｒｅｒｉｏ））の側線感丘有毛細胞は、構造的にも機能的にも哺乳類の感覚有毛細胞に類似している。化合物ＳＮＳ－３１４（図１０Ａ）及びクレノラニブ（図１０Ｂ）は、蝸牛移植片培養アッセイにおいて、シスプラチン誘発性有毛細胞死を防御した。シスプラチンで、又はシスプラチン無しで処理したマウス蝸牛移植片における化合物ＳＮＳ－３１４及びクレノラニブの用量－応答性。化合物単独又は化合物を、２４時間、シスプラチン（１５０μＭ）の１時間前に、Ｐ３ ＦＶＢ蝸牛移植片に添加し、蝸牛のミドルターン領域１６０μｍ当たりの外有毛細胞の数を、ファロイジン染色によって計数し（平均±ＳＥＭ、Ｐ＝^＊＜０．０５、Ｐ＝^＊＊＜０．００５、^＊＊＊Ｐ＜０．０００５）、対のない両側スチューデントｔ検定によりシスプラチン単独と比較した。

インビボでのゼブラフィッシュ側線感丘有毛細胞の防御。受精後５日目に、Ｔｇ（ｂｒｎ３ｃ：ＧＦＰ）幼生を、ビヒクル単独（ＤＭＳＯ）、４００μＭのシスプラチン（ＣＰ）と共に６時間インキュベートするか、又は次の化合物の１つ：ダブラフェニブ（図１１Ａ）、ムブリチニブ（図１１Ｂ）、クレノラニブ（図１１Ｃ）若しくはＳＮＳ－３１４（図１１Ｄ）で１時間前処理し、続いて試験する化合物及びＣＰ４００μＭと共に６時間共インキュベートした。処理後、動物を新鮮な魚用の水に移して１時間回復させ、次いで固定し、ＧＦＰ及びオトフェルリンについて免疫染色した。異なる処理後の１感丘当たりの有毛細胞の数を定量化し、平均±ＳＥＭとして表した。スチューデントｔ検定を行い（^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１、^＊＊＊ｐ＜０．００１）、ＣＰ４００μＭと比較した。検査した感丘：少なくとも３匹の異なる動物からのＳＯ３（眼窩上線感丘）及びＯ１－２（耳線感丘）。

実施例７ ２つの阻害剤の相乗効果
図１２は、化合物ダブラフェニブ（Ｂ－Ｒａｆキナーゼ阻害剤）及びＡＺＤ５４３８（ＣＤＫ２キナーゼ阻害剤）がマウス蝸牛移植片及びインビボのマウスにおいて、個々の阻害剤よりも良好にシスプラチン及び騒音の聴器毒性を防御することを示している。Ｂ－Ｒａｆ／ＣＤＫ２阻害剤の組み合わせは、マウス蝸牛移植片におけるシスプラチン誘発性有毛細胞喪失を防御する。化合物単独（紫色のバー）又は化合物の組み合わせを、２４時間、シスプラチン（１５０μＭ）の１時間前に、Ｐ３ ＦＶＢ蝸牛移植片に添加し、蝸牛のミドルターン領域１６０μｍ当たりの外有毛細胞の数を、ファロイジン染色によって計数し（平均±ＳＥＭ、Ｐ＝^＊＜０．０５、Ｐ＝^＊＊＜０．００５）、対のない両側スチューデントｔ検定によりシスプラチン単独と比較した。試験した初期のＡＺＤ５４３８／ダブラフェニブの組み合わせは、同じモル比（０．３４／３０）であった。

図１３Ａ～１３Ｄは、阻害剤の組み合わせの経口送達が、個々の化合物の使用よりも有意に良好な防御効果を提供することを示す。

Ｂ－Ｒａｆ／ＣＤＫ２阻害剤の組み合わせは、経口送達すると、マウスの騒音誘発性聴覚損失を完全に防御する。この実施例では、経口送達用の化合物は、１０％ＤＭＳＯ、４０％ＰＥＧ３００、５％Ｔｗｅｅｎ－８０及び４５％生理食塩水（０．９％ＮａＣｌ）である担体に溶解し、１０ｍｌ／ｋｇの体積で与えた。薬剤及び騒音レベルのスケジュールを図１３Ａに示す。図１３Ｂでは、騒音後３日間、ダブラフェニブ（２×６０ｍｇ／ｋｇ／日）が経口送達によって連続的に与えられる。図１３Ｃでは、騒音後３日間、ＡＺＤ５４３８（２×３５ｍｇ／ｋｇ／日）が経口送達によって連続的に与えられる。図１３Ｄでは、騒音後３日間の２つの薬物の組み合わせ（ダブラフェニブ（２×６０ｍｇ／ｋｇ／日）及びＡＺＤ５４３８（２×３５ｍｇ／ｋｇ／日）により、対のない両側スチューデントｔ検定により担体単独と比較して、騒音に対する完全な防御が達成される（平均±ＳＥＭ、^＊：Ｐ＜０．０５、^＊＊：Ｐ＜０．０１）。

Claims (17)

1. 聴覚損失の治療又は予防のための上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達阻害剤の使用であって、前記ＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤は、ＰＡＮ－ＡＵＲ、ＥｒＢｂ－２、ＭＥＫ、又はＨｅｒ－２、オーロラキナーゼ、Ｂ－Ｒａｆ若しくはＰＤＧＦＲからなる細胞周期関連タンパク質キナーゼの少なくとも１つの発現又は活性を阻害する、使用。
2. 前記使用は、ＥＧＦＲ阻害剤をコードする核酸分子を有する発現ベクターを投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. １つ以上の耳保護剤又は再生剤を投与することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達阻害剤はＳＮＳ－３１４である、請求項１に記載の方法。
5. 前記上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達阻害剤はダブラフェニブである、請求項１に記載の方法。
6. 前記上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達阻害剤はクレノラニブである、請求項１に記載の方法。
7. 前記上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達阻害剤はトラメチニブである、請求項１に記載の方法。
8. 前記上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達阻害剤はベムラフェニブである、請求項１に記載の方法。
9. 前記上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達阻害剤はＰＬＸ－４７５０である、請求項１に記載の方法。
10. 前記上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達阻害剤はＲＡＦ－２６５である、請求項１に記載の方法。
11. 少なくとも２つの上皮成長因子受容体（ＥＧＦＲ）シグナル伝達阻害剤の相乗的組み合わせを含む医薬組成物であって、前記ＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤は、ＥＧＦＲ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＮＣＫ、ＰＡＫ、ＪＮＫ、ＰＬＣ、ＰＫＣ又は細胞周期関連タンパク質キナーゼ阻害剤の発現又は活性を阻害する医薬組成物。
12. 前記少なくとも２つの阻害剤の相乗的組み合わせは、経口送達用の剤形である、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 第１の単離されたＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤であって、前記第１のＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤は、ＥＧＦＲ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＮＣＫ、ＰＡＫ、ＪＮＫ、ＰＬＣ、ＰＫＣ、又は細胞周期関連タンパク質キナーゼ阻害剤の発現又は活性を阻害する、第１の単離されたＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤、及び第２の単離されたＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤であって、前記ＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤は、ＥＧＦＲ、Ｒａｓ、Ｒａｆ、ＭＥＫ、ＥＲＫ／ＭＡＰＫ、ＪＡＫ、ＳＴＡＴ、ＰＩ３Ｋ、ＡＫＴ、ＮＣＫ、ＰＡＫ、ＪＮＫ、ＰＬＣ、ＰＫＣ、又は細胞周期関連タンパク質キナーゼ阻害剤の発現、活性を阻害する、第２の単離されたＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤を含むキットであって、前記第１の阻害剤は前記第２の阻害剤と異なるキット。
14. １つ以上の保護剤又は再生剤をさらに含む、請求項１３に記載のキット。
15. 前記第１のＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤はダブラフェニブである、請求項１３に記載のキット。
16. 前記第２のＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤はトラメチニブである、請求項１３に記載のキット。
17. 前記第２のＥＧＦＲシグナル伝達阻害剤はＡＺＤ５４３８である、請求項１３に記載のキット。
    

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