RU2585229C2 - Лечение заболеваний, связанных с атональным гомологом 1 (атон1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена атон1 - Google Patents

Лечение заболеваний, связанных с атональным гомологом 1 (атон1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена атон1 Download PDF

Info

Publication number
RU2585229C2
RU2585229C2 RU2012146815/10A RU2012146815A RU2585229C2 RU 2585229 C2 RU2585229 C2 RU 2585229C2 RU 2012146815/10 A RU2012146815/10 A RU 2012146815/10A RU 2012146815 A RU2012146815 A RU 2012146815A RU 2585229 C2 RU2585229 C2 RU 2585229C2
Authority
RU
Russia
Prior art keywords
aton1
oligonucleotide
polynucleotide
antisense
nucleotides
Prior art date
Application number
RU2012146815/10A
Other languages
English (en)
Other versions
RU2012146815A (ru
Inventor
Джозеф КОЛЛАРД
ШЕРМАН Ольга ХОРКОВА
Original Assignee
Курна, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Курна, Инк. filed Critical Курна, Инк.
Publication of RU2012146815A publication Critical patent/RU2012146815A/ru
Application granted granted Critical
Publication of RU2585229C2 publication Critical patent/RU2585229C2/ru

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/7125—Nucleic acids or oligonucleotides having modified internucleoside linkage, i.e. other than 3'-5' phosphodiesters
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/02—Stomatological preparations, e.g. drugs for caries, aphtae, periodontitis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/16—Otologicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/02—Antineoplastic agents specific for leukemia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2/00—Peptides of undefined number of amino acids; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/111—Antisense spanning the whole gene, or a large part of it
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/11—Antisense
    • C12N2310/113—Antisense targeting other non-coding nucleic acids, e.g. antagomirs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/312—Phosphonates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/313—Phosphorodithioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/314—Phosphoramidates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/31—Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315—Phosphorothioates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/321—2'-O-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/323—Chemical structure of the sugar modified ring structure
    • C12N2310/3231—Chemical structure of the sugar modified ring structure having an additional ring, e.g. LNA, ENA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3521—Methyl
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/352—Nature of the modification linked to the nucleic acid via a carbon atom
    • C12N2310/3525—MOE, methoxyethoxy
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/35—Nature of the modification
    • C12N2310/353—Nature of the modification linked to the nucleic acid via an atom other than carbon
    • C12N2310/3533—Halogen
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к антисмысловому олигонуклеотиду, представляющему собой фосфотиоатный аналог длиной от 19 до 30 нуклеотидов, который представляет собой соединение, гибридизующееся с природным антисмысловым полинуклеотидом гена Атонального гомолога 1 (АТОН1) и увеличивает экспрессию указанного гена АТОН1 in vivo или in vitro по сравнению с нормальным контролем. При этом указанный олигонуклеотид имеет по меньшей мере 50% идентичность последовательности с последовательностью из 19-30 последовательных нуклеиновых кислот молекулы РНК, транскрибированной с полинуклеотида АТОН1. Изобретение также относится к применению указанного олигонуклеотида для лечения заболеваний и расстройств, ассоциированных с экспрессией гена АТОН1. Изобретение расширяет арсенал средств, направленных на лечения заболеваний и расстройств, ассоциированных с экспрессией гена АТОН1. 8 н. и 18 з.п. ф-лы, 1 ил., 1 табл., 2 пр.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0001] Данная заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №61/348656, поданной 26 мая 2010 года, полное содержание которой включено в настоящее описание посредством ссылки.
[0002] Варианты реализации изобретения включают олигонуклеотиды, модулирующие экспрессию и/или функцию гена АТОН1 и ассоциированных с ним молекул.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Гибридизация ДНК-РНК и РНК-РНК важна для многих аспектов функционирования нуклеиновых кислот, включая репликацию ДНК, транскрипцию и трансляцию. Процесс гибридизации также является основным во множестве технологий, которые позволяют либо обнаруживать конкретную нуклеиновую кислоту, либо изменять ее экспрессию. Антисмысловые нуклеотиды, например, нарушают экспрессию генов за счет гибридизации с РНК-мишенью, таким образом препятствуя сплайсингу РНК, транскрипции, трансляции и репликации. Антисмысловая ДНК обладает дополнительной особенностью, заключающейся в том, что гибриды ДНК-РНК выступают в качестве субстрата для ферментативного расщепления рибонуклеазой Н, активность которой присутствует в большинстве типов клеток. Антисмысловые молекулы могут быть доставлены в клетки, как в случае для олигодезоксинуклеотидов (ОДН), или они могут представлять собой продукты экспрессии эндогенных генов в виде молекул РНК. Недавно Федеральное агентство по контролю за лекарственными средствами США (FDA) одобрило антисмысловое лекарственное средство, Витравен (VITRAVENE™) (для лечения цитомегаловирусного ретинита), что отражает полезность этого антисмыслового препарата для терапевтических целей.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0004] Настоящее краткое описание предлагает краткое описание настоящего изобретения с той целью, чтобы вкратце обозначить предмет и сущность настоящего изобретения.
Краткое описание представляют с пониманием того, что его не следует применять для толкования или ограничения объема или смыслового содержания формулы изобретения. [0005] В одном варианте реализации согласно изобретению предложены способы для ингибирования действия природного антисмыслового транскрипта путем применения антисмыслового олигонуклеотида (олигонуклеотидов), нацеленного на любую области природного антисмыслового транскрипта, приводящего к увеличению экспрессии соответствующего смыслового гена. Авторы настоящей заявки также предполагают, что ингибирование природного антисмыслового транскрипта может быть достигнуто с помощью малых интерферирующих РНК (миРНК), рибозимов и малых молекул, рассматриваемых в рамках настоящего изобретения.
[0006] Согласно одному варианту реализации предложен способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида АТОН1 в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, включающий осуществление контакта указанных клеток или тканей с антисмысловым олигонуклеотидом длиной от 5 до 30 нуклеотидов, при этом указанный олигонуклеотид имеет по меньшей мере 50% идентичность последовательности с последовательностью, которая представляет собой обратный комплемент полинуклеотида, содержащего от 5 до 30 последовательных нуклеотидов в пределах нуклеотидов 1-589, соответствующих SEQ ID NO: 2, что приводит к модулированию функции и/или экспрессии полинуклеотида АТОН1 в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.
[0007] В одном варианте реализации олигонуклеотид нацелен на природную антисмысловую последовательность для полинуклеотида АТОН1, например, против нуклеотидов, указанных в последовательности, соответствующей SEQ ID NOS: 2, и любых вариантов, аллелей, гомологов, мутантов, производных, фрагментов и последовательностей, которые представляют собой их комплемент. Примеры антисмысловых олигонуклеотидов указаны в виде последовательностей, соответствующих SEQ ID NOS: 3 и 4.
[0008] Согласно другому варианту реализации предложен способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида АТОН1 в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, включающий осуществление контакта указанных клеток или тканей с антисмысловым олигонуклеотидом длиной от 5 до 30 нуклеотидов, при этом указанный олигонуклеотид имеет по меньшей мере 50% идентичность последовательности с последовательностью, которая представляет собой обратный комплемент антисмысловой последовательности для полинуклеотида АТОН1; что приводит к модулированию функции и/или экспрессии полинуклеотида АТОН1 в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.
[0009] Согласно другому варианту реализации предложен способ модулирования функции и/или экспрессии полинуклеотида АТОН1 в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro, включающий осуществление контакта указанных клеток или тканей с антисмысловым олигонуклеотидом длиной от 5 до 30 нуклеотидов, при этом указанный олигонуклеотид имеет по меньшей мере 50% идентичность последовательности с антисмысловым олигонуклеотидом для антисмыслового полинуклеотида гена АТОН1; что приводит к модулированию функции и/или экспрессии полинуклеотида АТОН1 в клетках или тканях пациента in vivo или in vitro.
[0010] В одном варианте реализации композиция содержит один или более антисмысловых олигонуклеотидов, которые связываются со смысловыми и/или антисмысловыми полинуклеотидами гена АТОН1.
[0011] В одном варианте реализации олигонуклеотиды содержат один или более модифицированных или замещенных нуклеотидов.
[0012] В одном варианте реализации олигонуклеотиды содержат одну или более модифицированных связей.
[0013] В еще одном варианте реализации модифицированные нуклеотиды содержат модифицированные основания, включая молекулы фосфотиоатных, метилфосфонатных производных нуклеиновых кислот, пептидо-нуклеиновых кислот, 2'-O-метил-, фтор- или углерод-, метилен- или других закрытых нуклеиновых кислот (ЗНК; locked nucleic acids, LNA). Предпочтительно, модифицированные нуклеотиды представляют собой молекулы закрытых нуклеиновых кислот, включая ЗНК с α-L-рибо-конфигурацией (α-L-3HK).
[0014] В одном варианте реализации олигонуклеотиды вводят пациенту подкожно, внутримышечно, внутривенно или интраперитонеально.
[0015] В одном варианте реализации олигонуклеотиды вводят в составе фармацевтической композиции. Схема лечения включает по меньшей мере однократное введение антисмысловых соединений пациенту; однако, это лечение может быть модифицировано до введения многократных доз в течение некоторого периода времени. Лечение может быть объединено с одним или более другими типами терапии.
[0016] В одном варианте реализации олигонуклеотиды инкапсулированы в липосому или присоединены к молекуле-носителю (например, холестерину, ТАТ-пептиду).
[0017] Другие аспекты описаны ниже.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0018] Фигура 1 иллюстрирует кратность изменения и стандартное отклонение числа копий мРНК гена АТОН1 в клетках HEP G2 через 48 часов после обработки олигонуклеотидами миРНК, вводимыми с применением агента для трансфекции Липофектамин 2000 (Lipofectamine 2000), по сравнению с контролем. Результаты анализов методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени свидетельствуют о том, что уровни мРНК гена АТОН1 в клетках HEP G2 значимо повышаются через 48 часов после обработки одним из олигонуклеотидов, нацеленных на антисмысловую последовательность Hs.611058 для гена АТОН1. Столбцы диаграммы, обозначенные как CUR-1488 и CUR-1489, соответствуют образцам, обработанным олигонуклеотидами, соответствующими SEQIDNOS: 3 и 4, соответственно.
[0019] Описание Перечня последовательностей - SEQ ID NO: 1: Атональный гомолог 1 (Drosophila) человека (АТОН1), мРНК (номер последовательности в базе данных NCBI (Национального центра биотехнологической информации США): NM_005172); SEQ ID NO: 2: Природная антисмысловая последовательность (Hs.611058) для гена АТОН1; SEQ ID NOs: 3 и 4: Антисмысловые олигонуклеотиды. Символ "*" обозначает фосфотиоатную связь.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ
[0020] Некоторые аспекты изобретения описаны ниже со ссылкой на примеры применения для иллюстрации. Следует понимать, что многочисленные конкретные детали, связи и способы приведены с целью обеспечения полного понимания изобретения. Однако специалист в данной области техники без труда обнаружит, что изобретение может быть применено на практике без одной или более конкретных деталей или с другими способами. Настоящее изобретение не ограничивается упорядочиванием действий или событий, так как некоторые действия могут быть осуществлены в разном порядке и/или одновременно с другими действиями или событиями. Кроме того, не все проиллюстрированные действия или события требуются для реализации методологии в соответствии с настоящим изобретением.
[0021] Все гены, названия генов и продукты генов, описанные в настоящей заявке, соответствуют гомологам из организмов любых видов, для которых применимы композиции и способы, предложенные в настоящей заявке. Таким образом, данные термины включают, но без ограничения, гены и генные продукты из организмов людей и мышей. Понимают, что, когда предложен ген или продукт гена из организма конкретного вида, этот элемент изобретения представлен исключительно в качестве примера, и его не следует истолковывать как ограничение, если контекст, в котором он появляется, ясно не предписывает иное. Соответственно, например, гены, описанные в настоящей заявке, которые в некоторых вариантах реализации относятся к нуклеиновым кислотам и аминокислотным последовательностям млекопитающих, охватывают гомологичные и/или ортологичные гены и продукты генов из организмов других животных, включая, но без ограничения, других млекопитающих, рыб, земноводных, пресмыкающихся и птиц. В одном варианте реализации гены или нуклеотидные последовательности представляют собой гены или последовательности человека.
Определения
[0022] Терминология, применяемая в настоящей заявке, служит исключительно для описания конкретных вариантов реализации и не ограничивает изобретение. В настоящей заявке неопределенная и определенная формы единственного числа также включают множественные формы, если контекст ясно не предписывает иное. Кроме того, в той мере, в какой термины "включающий", "включает", "имеющий", "имеет", "с" или их варианты применяют в подробном описании и/или формуле изобретения, такие термины подразумевают включение в себя подобно термину "содержащий".
[0023] Термин "примерно" или "приблизительно" обозначает нахождение внутри диапазона приемлемой погрешности для конкретной величины, определенного специалистом в данной области техники, который будет зависеть отчасти от того, каким образом величину измеряют или определяют, т.е. от ограничений измерительной системы. Например, термин "примерно" может означать, что величина находится в пределах 1 или более чем 1 стандартного отклонения, как показывает практика в данной области техники. Альтернативно, термин "примерно" может означать диапазон погрешности, составляющий вплоть до 20%, предпочтительно вплоть до 10%, более предпочтительно вплоть до 5% и еще наиболее предпочтительно вплоть до 1% от заданной величины. Альтернативно, применительно к биологическим системам или процессам, термин может означать нахождение в пределах порядка величины, предпочтительно в пределах пятикратного значения и более предпочтительно двукратного значения величины. В тех случаях, когда в заявке и формуле изобретения приведены конкретные значения, то, если не указано иное, следует предполагать термин "примерно", обозначающий нахождение внутри диапазона приемлемой погрешности для конкретной величины.
[0024] В настоящей заявке термин "мРНК" обозначает известный на настоящий момент мРНК-транскрипт(ы) гена-мишени и любые дополнительные транскрипты, происхождение которых может быть объяснено.
[0025] С помощью терминов "антисмысловые олигонуклеотиды" или "антисмысловое соединение" обозначают молекулу РНК или ДНК, которая связывается с другой РНК или ДНК (РНК-, ДНК-мишенью). Например, если антисмысловое соединение представляет собой олигорибонуклеотид, оно связывается с другой РНК-мишенью за счет РНК-РНК-взаимодействий и изменяет активность РНК-мишени. Антисмысловой олигонуклеотид может увеличивать или подавлять экспрессию и/или функцию конкретного полинуклеотида. Определение включает любую чужеродную молекулу ДНК или РНК, подходящую с терапевтической, диагностической или другой точки зрения. Такие молекулы включают, например, молекулы антисмысловых ДНК или РНК, молекулы интерферирующих РНК (РНКи), микроРНК, ложных РНК, миРНК, ферментативные РНК, РНК, применяемые в исправляющей терапии, и РНК, имеющие свойства агонистов и антагонистов, антисмысловые олигомерные соединения, антисмысловые олигонуклеотиды, олигонуклеотиды внешней направляющей последовательности (EGS), сплайс-варианты, праймеры, зонды и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются с по меньшей мере частью нуклеиновой кислоты-мишени. В связи с этим данные соединения могут быть введены в форме одноцепочечных, двухцепочечных, частично одноцепочечных или кольцевых олигомерных соединений.
[0026] В контексте настоящего изобретения термин "олигонуклеотид" относится к олигомеру или полимеру рибонуклеиновой кислоты (РНК) или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК) или их миметикам. Термин "олигонуклеотид" также включает линейные или кольцевые олигомеры природных и/или модифицированных мономеров или связей, включая дезоксирибонуклеозиды, рибонуклеозиды, их замещенные и альфа-аномерные формы, пептидо-нуклеиновые кислоты (ПНК), закрытые нуклеиновые кислоты (ЗНК; locked nucleic acids, LNA), фосфотиоатные, метилфосфонатные производные и т.п. Олигонуклеотиды способны к специфическому связыванию с полинуклеотидом-мишенью за счет регулярных взаимодействий между мономерными звеньями, такими как Уотсон-Криковский тип спаривания оснований, Хугстиновский или обратный Хугстиновский типы спаривания оснований и т.п.
[0027] Олигонуклеотид может быть "химерным", то есть составленным из разных областей. В контексте настоящего изобретения "химерные" соединения представляют собой олигонуклеотиды, которые содержат две или более химически отличные области, например, область (области) ДНК, область (области) РНК, область (области) ПНК и т.д. Каждая химически отличная область состоит из по меньшей мере одной мономерной единицы, т.е. нуклеотида в случае олигонуклеотидного соединения. Эти олигонуклеотиды, как правило, содержат по меньшей мере одну область, в которой олигонуклеотид модифицирован с целью проявления одного или более желаемых свойств. Желаемые свойства олигонуклеотида включают, но без ограничения, например, повышенную устойчивость к деградации нуклеазами, повышенное клеточное поглощение и/или повышенную способность к связыванию с нуклеиновой кислотой-мишенью. Разные области олигонуклеотида могут, таким образом, обладать разными свойствами. Химерные олигонуклеотиды согласно настоящему изобретению могут быть образованы в виде смешанных структур из двух или более олигонуклеотидов, модифицированных олигонуклеотидов, олигонуклеозидов и/или аналогов олигонуклеотидов, описанных выше.
[0028] Олигонуклеотид может быть составлен из областей, которые могут быть соединены в "ряд", то есть когда мономеры соединены последовательно, как в нативной ДНК, или соединены посредством спейсеров. Спейсеры формируют ковалентный "мостик" между областями и имеют в предпочтительных случаях длину, не превышающую примерно 100 углеродных атомов. Спейсеры могут иметь разные функциональные характеристики, например, нести положительный или отрицательный заряд, обладать свойствами специфичного связывания нуклеиновых кислот (интеркаляторы, вещества, связывающиеся с бороздками, токсины, флуорофоры и т.д.), быть липофильными, индуцировать образование специфических вторичных структур, как, например, аланинсодержащие пептиды, которые индуцируют образование альфа-спиралей.
[0029] В настоящей заявке термины "АТОН1" и "Атональный гомолог 1" включают все члены семейства, мутанты, аллели, фрагменты, виды, кодирующие и некодирующие последовательности, смысловые и антисмысловые полинуклеотидные цепи и т.д.
[0030] В настоящем описании слова 'Атональный гомолог Г, АТОН1, АТН1, НАТН1, МАТН-1 и bHLHa рассматривают как имеющие одно и то же значение в литературе и применяют взаимозаменяемо в настоящей заявке.
[0031] В настоящей заявке термин "олигонуклеотид, специфичный к" или "олигонуклеотид, нацеленный на" относится к олигонуклеотиду, содержащему последовательность, (I) способную образовывать стабильный комплекс с частью гена-мишени или (ii) способную образовывать стабильный дуплекс с частью мРНК-транскрипта гена-мишени. Стабильность комплексов и дуплексов может быть определена посредством теоретических расчетов и/или анализов in vitro. Типовые анализы для определения стабильности гибридизационных комплексов и дуплексов описаны в Примерах ниже.
[0032] В настоящей заявке термин "нуклеиновая кислота-мишень" охватывает ДНК, РНК (содержащую пре-мРНК и мРНК), транскрибируемую с такой ДНК, и также кДНК, получаемую на матрице такой РНК, кодирующие, некодирующие последовательности, смысловые или антисмысловые полинуклеотиды. Специфическая гибридизация олигомерного соединения с его нуклеиновой кислотой-мишенью препятствует нормальной функции нуклеиновой кислоты. Это модулирование функции нуклеиновой кислоты-мишени с помощью соединений, которые специфически гибридизуются с последней, в общем случае называют "антисенс-технологией". Затрагиваемые функции ДНК включают, например, репликацию и транскрипцию. Затрагиваемые функции РНК включают все жизненно важные функции, такие как, например, транслокация РНК к месту трансляции белков, трансляция белков на матрице РНК, сплайсинг РНК с образованием одного или более видов мРНК и каталитическая активность, которая может присутствовать у РНК или которой РНК может способствовать. Суммарный эффект такого препятствия функции нуклеиновой кислоты-мишени заключается в модулировании экспрессии кодируемого продукта или олигонуклеотидов.
[0033] РНК-интерференция "РНКи" опосредована молекулами двухцепочечной РНК (дцРНК), которые имеют последовательности, гомологичные их нуклеотидным последовательностям-"мишеням". В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения посредники представляют собой дуплексы "малых интерферирующих" РНК (миРНК) длиной 5-25 нуклеотидов. миРНК образуются в результате разрезания дцРНК ферментом-РНКазой, известным как Дайсер (Dicer). Дуплексные продукты миРНК включаются в состав мультибелкового комплекса, называемого RISC (индуцируемый РНК комплекс сайленсинга). Без привязки к какой-либо конкретной теории, комплекс RISC, как полагают, нацелен на нуклеиновую кислоту-мишень (на роль которой подходит мРНК), при этом дуплекс миРНК взаимодействует с мРНК за счет комплементарности их последовательностей, вызывая расщепление мРНК каталитическим путем. Малые интерферирующие РНК, которые могут быть применены согласно настоящему изобретению, могут быть синтезированы и применены в соответствии со способами, которые хорошо известны в данной области техники и которые будут хорошо знакомы специалисту в данной области техники. Малые интерферирующие РНК для применения в соответствии со способами согласно настоящему изобретению подходящим образом содержат от примерно 1 до примерно 50 нуклеотидов (нт). В примерах неограничивающих вариантов реализации миРНК могут содержать от примерно 5 до примерно 40 нт, от примерно 5 до примерно 30 нт, от примерно 10 до примерно 30 нт, от примерно 15 до примерно 25 нт или примерно 20-25 нуклеотидов.
[0034] Выбор подходящих олигонуклеотидов облегчают путем применения компьютерных программ, которые автоматически выравнивают нуклеотидные последовательности и отмечают идентичные или гомологичные области. Такие программы применяют для сравнения нуклеотидных последовательностей, полученных, например, в результате поиска в базах данных, таких как GenBank, или посредством секвенирования ПЦР-продуктов. Сравнение нуклеотидных последовательностей из организмов ряда видов позволяет выбрать нуклеотидные последовательности, которые обнаруживают подходящую степень идентичности между видами. В случае генов, которые не были просеквенированы, проводят блоттинги по Саузерну с целью определения степени идентичности между генами вида-мишени и других видов. Путем проведения блоттингов по Саузерну при различных степенях строгости условий гибридизации, как хорошо известно в данной области техники, можно получить приблизительную меру идентичности. Эти процедуры позволяют осуществить выбор олигонуклеотидов, которые показывают высокую степень комплементарности нуклеотидным последовательностям-мишеням субъекта, подлежащего контролю, и меньшую степень комплементарно ста соответствующим нуклеотидным последовательностям других видов. Специалист в данной области техники обнаружит, что существует значительная свобода при выборе подходящих областей генов для применения согласно настоящему изобретению.
[0035] С помощью термина "ферментативная РНК" обозначают молекулу РНК, обладающую ферментативной активностью (Cech, (1988) J. American. Med. Assoc. 260, 3030-3035). Ферментативные нуклеиновые кислоты (рибозимы) действуют за счет, во-первых, связывания с РНК-мишенью. Такое связывание происходит через участок ферментативной нуклеиновой кислоты, связывающий РНК-мишень, который находится в непосредственной близости к ферментативному участку молекулы, катализирующему расщепление РНК-мишени. Таким образом, ферментативная нуклеиновая кислота сперва распознает и далее связывает РНК-мишень за счет спаривания оснований, и, как только происходит связывание с нужным сайтом, проявляет ферментативную активность, разрезая РНК-мишень.
[0036] С помощью термина "ложная РНК" обозначают молекулу РНК, которая имитирует природный связывающий домен для лиганда. Ложная РНК, таким образом, конкурирует с природной связывающей мишенью за связывание конкретного лиганда. Например, было показано, что сверхэкспрессия РНК-элемента трансактивационного ответа (TAR) ВИЧ может действовать как "ложная" и эффективно связывает белок tat (транскрипционный трансактиватор) ВИЧ, таким образом препятствуя связыванию этого белка с последовательностями TAR, кодируемыми РНК ВИЧ. Подразумевают, что приведенная информация представляет собой конкретный пример. Специалисты в данной области техники обнаружат, что это всего лишь один пример, и другие варианты реализации могут быть легко разработаны с применением методик, общеизвестных в данной области техники.
[0037] В настоящей заявке термин "мономеры", как правило, обозначает мономеры, соединенные посредством фосфодиэфирных связей или их аналогов с образованием олигонуклеотидов, размеры которых изменяются в пределах от нескольких мономерных единиц, например, от примерно 3-4, до примерно нескольких сотен мономерных единиц. Аналоги фосфодиэфирных связей включают: фосфотиоатные, фосфодитиоатные, метилфосфонатные, фосфоселеноатные, фосфорамидатные связи и т.п., как более подробно описано ниже.
[0038] Термин "нуклеотид" распространяется на встречающиеся в природе нуклеотиды, а также не встречающиеся в природе нуклеотиды. Специалисту в данной области техники должно быть ясно, что различные нуклеотиды, которые ранее считали "не встречающимися в природе", были впоследствии найдены в природе. Таким образом, термин "нуклеотиды" включает не только известные молекулы, содержащие пуриновые и пиримидиновые гетероциклы, но также и их гетероциклические аналоги и таутомеры. Иллюстративные примеры других типов нуклеотидов представляют собой молекулы, содержащие аденин, гуанин, тимин, цитозин, урацил, пурин, ксантин, диаминопурин, 8-оксо-N6-метиладенин, 7-деазаксантин, 7-деазагуанин, N4,N4-этаноцитозин, N6,N6-этано-2,6-диаминопурин, 5-метилцитозин, 5-(С3-С6)-алкинилцитозин, 5-фторурацил, 5-бромурацил, псевдоизоцитозин, 2-гидрокси-5-метил-4-триазолпиридин, изоцитозин, изогуанин, инозин и "не встречающиеся в природе" нуклеотиды, описанные в публикации Benner et al., Патент США №5432272. Термин "нуклеотид" распространяется на каждый и все из этих примеров, а также их аналоги и таутомеры. Особенно интересными нуклеотидами являются те из них, которые содержат аденин, гуанин, тимин, цитозин и урацил, которые рассматривают как встречающиеся в природе нуклеотиды относительно терапевтического и диагностического применения у людей. Нуклеотиды содержат природные 2'-дезокси- и 2'-гидроксисахара, например, описанные в Kornberg and Baker, DNA Replication, 2nd Ed. (Freeman, San Francisco, 1992), a также их аналоги.
[0039] Термин "аналоги" в применении к нуклеотидам включает синтетические нуклеотиды, содержащие модифицированные основания и/или модифицированные сахара (см., например, аналоги, описанные, в основном, в Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York, 1980; Freier & Altmann, (1997) Nucl. Acid. Res., 25(22), 4429-4443, Toulmft, J.J., (2001) Nature Biotechnology 19:17-18; Manoharan M., (1999) Biochemica et Biophysica Acta 1489:117-139; Freier S. M, (1997) Nucleic Acid Research, 25:4429-4443, Uhlman, E., (2000) Drug Discovery & Development, 3: 203-213, Herdewin P., (2000) Antisense & Nucleic Acid Drug Dev., 10:297-310); 2'-O, 3'-С-соединенные [3.2.0]бициклоарабинонуклеозиды. Такие аналоги включают синтетические нуклеотиды, направленные на усиление связывающих свойств, например, стабильности дуплексов или триплексов, специфичности и т.п.
[0040] В настоящей заявке термин "гибридизация" обозначает спаривание практически комплементарных цепей олигомерных соединений. Один механизм спаривания задействует образование водородных связей, которые могут представлять собой Уотсон-Криковские, Хугстиновские или обратные Хугстиновские водородные связи между комплементарными основаниями нуклеозидов или нуклеотидов (нуклеотидами) цепей олигомерных соединений.
Например, аденин и тимин являются комплементарными нуклеотидами, которые спариваются за счет образования водородных связей. Гибридизация может происходить при различных условиях.
[0041] Антисмысловое соединение является "способным к специфичной гибридизации", если связывание соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью препятствует нормальной функции нуклеиновой кислоты-мишени, модулируя функцию и/или активность последней, и обеспечена достаточная степень комплементарности во избежание неспецифического связывания антисмыслового соединения с нуклеотидными последовательностями, не являющимися мишенями, при условиях, в которых желательно специфическое связывание, т.е. при физиологических условиях в случае анализов in vivo или терапевтического лечения и при условиях, в которых проводят анализы в случае анализов in vitro.
[0042] В настоящей заявке фраза "строгие условия гибридизации" или "строгие условия" относится к условиям, при которых соединение согласно изобретению будет гибридизоваться со своей последовательностью-мишенью, но с минимальным количеством других последовательностей. Строгие условия зависят от последовательности и будут различаться в разных обстоятельствах, и, в контексте настоящего изобретения, "строгие условия", при которых олигомерные соединения гибридизуются с последовательностью-мишенью, определяются природой и составом олигомерных соединений и видами анализов, посредством которых их исследуют. В общем случае, строгие условия гибридизации включают низкие концентрации (<0,15 М) солей, содержащих неорганические катионы, такие как Na++ или К++ (т.е. низкую ионную силу), температуру выше точки, расположенной на 20°C-25°C ниже Тпл комплекса олигомерное соединение:последовательность-мишень, и присутствие денатурантов, таких как формамид, диметилформамид, диметилсульфоксид или детергент додецилсульфат натрия (ДСН). Например, скорость гибридизации снижается на 1,1% на каждый добавленный 1% формамида. Примером условий гибридизации с высокой степенью строгости является гибридизация с применением 0,1X буфера хлорид натрия-цитрат натрия (SSC, стандартный цитратно-солевой)/0,1 % (масс/об.) ДСН при 60°С в течение 30 минут.
[0043] В настоящей заявке термин "комплементарный" относится к способности точного спаривания между двумя нуклеотидами или одной или двумя олигомерными цепями. Например, если нуклеиновое основание в определенном положении цепи антисмыслового соединения способно к образованию водородных связей с нуклеиновым основанием в определенном положении цепи нуклеиновой кислоты-мишени, причем, указанная нуклеиновая кислота-мишень представляет собой молекулу ДНК, РНК или олигонуклеотида, то положение, в котором происходит образование водородных связей между олигонуклеотидом и нуклеиновой кислотой-мишенью, считают комплементарным положением. Олигомерное соединение и дополнительная молекула ДНК, РНК или олигонуклеотида комплементарны друг другу, когда достаточное число комплементарных положений в каждой молекуле заняты нуклеотидами, способными образовывать водородные связи друг с другом. Таким образом, термины "специфично гибридизующийся" и "комплементарный" применяют для обозначения достаточной степени точного спаривания, или комплементарности, в пределах достаточного числа нуклеотидов, так что между олигомерным соединением и нуклеиновой кислотой-мишенью происходит стабильное и специфичное связывание.
[0044] Как понимают специалисты в данной области техники, последовательность олигомерного соединения не обязательно должна быть на 100% комплементарна последовательности его нуклеиновой кислоты-мишени для того, чтобы соединение было специфически гибридизуемым. Кроме того, олигонуклеотид может гибридизоваться поверх одного или более сегментов, так что промежуточные или соседние сегменты оказываются не вовлеченными в процесс гибридизации (например, петлевая структура, отсутствие комплементарности или шпилечная структура). Олигомерные соединения согласно настоящему изобретению содержат последовательность, комплементарную на по меньшей мере примерно 70%, или по меньшей мере примерно 75%, или по меньшей мере примерно 80%, или по меньшей мере примерно 85%, или по меньшей мере примерно 90%, или по меньшей мере примерно 95%, или по меньшей мере примерно 99% области-мишени в пределах нуклеотидной последовательности-мишени, на которую эти соединения нацелены. Например, антисмысловое соединение, в котором 18 из 20 нуклеотидов антисмыслового соединения комплементарны области-мишени и, следовательно, специфически гибридизовались бы с ним, характеризовалось бы 90% комплементарностью. В данном примере остальные некомплементарные нуклеотиды могут располагаться в кластерах комплементарных нуклеотидов или чередоваться с комплементарными нуклеотидами и не обязательно должны примыкать друг к другу или к комплементарным нуклеотидам. По этой причине антисмысловое соединение длиной 18 нуклеотидов, содержащее 4 (четыре) некомплементарных нуклеотида, которые фланкированы двумя областями, полностью комплементарными нуклеиновой кислоте-мишени, в целом характеризовалось бы 77,8% комплементарностью с нуклеиновой кислотой-мишенью и попадало бы, таким образом, в рамки настоящего изобретения. Процент комплементарности антисмыслового соединения с областью нуклеиновой кислоты-мишени может быть определен обычным способом с применением программ BLAST (средства поиска основного локального выравнивания) и программ PowerBLAST, известных в данной области техники. Процент гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности может быть определен с помощью, например, программы Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Version 8 for Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.) с применением параметров, установленных по умолчанию, которая использует алгоритм Смита-Ватермана (Adv. Appl. Math., (1981) 2,482-489).
[0045] В настоящей заявке термин "температура плавления (Тпл)" относится к температуре, в условиях определенной ионной силы, pH и концентрации нуклеиновой кислоты, при которой 50% олигонуклеотидов, комплементарных последовательности-мишени, гибридизуются с последовательностью-мишенью в состоянии равновесия. Как правило, строгие условия гибридизации будут отличаться тем, что концентрация соли составляет по меньшей мере примерно от 0,01 до 1,0 М концентрации ионов Na (или других солей) при pH, равном 7,0-8,3, и температура равна по меньшей мере примерно 30°C для коротких олигонуклеотидов (например, длиной от 10 до 50 нуклеотидов). Строгие условия могут также быть достигнуты путем добавления дестабилизирующих агентов, таких как формамид.
[0046] В настоящей заявке термин "модулирование" обозначает либо увеличение (стимулирование), либо ослабление (ингибирование) экспрессии гена.
[0047] Термин "вариант", применительно к последовательности полинуклеотида, может охватывать последовательность полинуклеотида, относящегося к гену дикого типа. Это определение может также включать, например, "аллельные", "сплайс-", "видовые" или "полиморфные" варианты. Сплайс-вариант может быть в значительной степени идентичным исходной молекуле, но будет в общем случае содержать большее или меньшее число полинуклеотидов вследствие альтернативного сплайсинга экзонов во время процессинга мРНК. Соответствующий полипептид может обладать дополнительными функциональными доменами или отличаться отсутствием доменов. Видовые варианты представляют собой последовательности полинуклеотидов, которые варьируют от одного вида к другому. Особенно полезными согласно настоящему изобретению являются варианты продуктов генов дикого типа. Варианты могут возникнуть в результате по меньшей мере одной мутации в нуклеотидной последовательности и могут приводить к появлению измененных мРНК или полипептидов, структура или функция которых могут быть или могут не быть изменены. Любой отдельно взятый природный или рекомбинантный ген может не иметь или иметь одну или много аллельных форм. Обычные мутационные изменения, вызывающие возникновение вариантов, в общем случае приписывают природным делециям, вставкам или заменам нуклеотидов. Каждый из этих типов изменений может произойти отдельно или в комбинации с остальными типами, один или более раз в данной последовательности.
[0048] Итоговые полипептиды в общем случае будут характеризоваться значительной идентичностью аминокислотных последовательностей относительно друг друга. Полиморфный вариант представляет собой вариацию в полинуклеотидной последовательности конкретного гена между отдельными особями данного вида. Полиморфные варианты также могут охватывать "одиночные нуклеотидные полиморфизмы" (ОНП), или мутации, затрагивающие одно основание, при которых полинуклеотидная последовательность изменяется на одно основание. Наличие ОНП может указывать на, например, некоторую популяцию со склонностью к болезненному состоянию, что отражает восприимчивость против устойчивости.
[0049] Производные полинуклеотиды включают нуклеиновые кислоты, подвергнутые химической модификации, например, замещению водорода на алкил, ацил или аминогруппу. Производные, например, производные олигонуклеотиды, могут содержать не встречающиеся в природе фрагменты, такие как измененные остатки Сахаров или связи между остатками Сахаров. Типовыми среди них являются фосфотиоатные и другие содержащие серу виды связей, которые известны в данной области техники. Производные нуклеиновые кислоты могут также содержать метки, включая радионуклеотиды, ферменты, флуоресцентные агенты, хемилюминесцентные агенты, хромогенные агенты, субстраты, кофакторы, ингибиторы, магнитные частицы и т.п.
[0050] "Производным" полипептидом или пептидом является тот, который модифицирован, например, посредством гликозилирования, пегилирования, фосфорилирования, сульфатирования, восстановления/алкилирования, ацилирования, химического сочетания или мягкой обработки формалином. Производное может также быть модифицировано добавлением детектируемой метки, либо напрямую, либо косвенно, включая, но без ограничения, радиоизотопную, флуоресцентную и ферментативную метку.
[0051] В настоящей заявке термин "животное" или "пациент" включает, например, людей, овцу, лосей, оленя, чернохвостого оленя, норок, млекопитающих, обезьян, лошадей, крупный рогатый скот, свиней, коз, собак, кошек, крыс, мышей, птиц, курицу, пресмыкающихся, рыбу, насекомых и паукообразных.
[0052] Термин "млекопитающее" распространяется на теплокровных млекопитающих, которым, как правило, оказывают медицинскую помощь (например, люди и одомашненные животные). Примеры включают кошачьих, псовых, лошадиных, бычьих, и человека, а также только человека.
[0053] Термин "лечение" распространяется на лечение болезненного состояния у млекопитающего и включает: (a) предотвращение возникновения болезненного состояния у млекопитающего, в частности, когда такое млекопитающее предрасположено к болезненному состоянию, но оно еще не было диагностировано у субъекта; (b) ингибирование болезненного состояния, например, остановку его развития; и/или (c) облегчение болезненного состояния, например, индукцию ремиссии болезненного состояния, до тех пор, пока не будет достигнут желаемый результат. Лечение также включает уменьшение интенсивности симптома заболевания (например, уменьшение боли или дискомфорта), при этом такое уменьшение интенсивности симптомов может напрямую влиять или не влиять на заболевание (например, причину, передачу, проявление и т.д.).
[0054] В настоящей заявке термин "рак" относится ко всем типам рака или новообразований или злокачественных опухолей, обнаруженных у млекопитающих, включая, но без ограничения: лейкемии, лимфомы, меланомы, карциномы и саркомы. Рак проявляется в виде "опухоли" или ткани, содержащей злокачественные раковые клетки. Примеры опухолей включают саркомы и карциномы, такие как, но без ограничения: фибросаркома, миксосаркома, липосаркома, хондросаркома, остеогенная саркома, хондрома, ангиосаркома, эндотелио саркома, лимфангио саркома, лимфангиоэндотелиосаркома, синовиома, мезотелиома, саркома Юинга, лейомиосаркома, рабдомиосаркома, карцинома толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичника, рак предстательной железы, плоскоклеточная карцинома, базальноклеточная карцинома, аденокарцинома, карцинома потовых желез, карцинома сальной железы, папиллярная карцинома, папиллярные аденокарциномы, цистаденокарцинома, медуллярная карцинома, бронхогенная карцинома, почечно-клеточная карцинома, гепатома, карцинома желчного протока, хориокарцинома, семинома, эмбриональная карцинома, опухоль Вильмса, рак шейки матки, опухоль яичка, карцинома легкого, мелкоклеточная карцинома легкого, карцинома мочевого пузыря, эпителиальная карцинома, глиома, астроцитома, медуллобластома, краниофарингиома, эпендимома, пинеалома, гемангиобластома, неврома слухового нерва, олигодендроглиома, менингиома, меланома, нейробластома и ретинобластома. Дополнительные виды рака, которые можно лечить с применением предложенной композиции согласно изобретению, включают, но без ограничения, например, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому, множественную миелому, нейробластому, рак молочной железы, рак яичника, рак легкого, рабдомиосаркому, первичный тромбоцитоз, первичную макроглобулинемию, мелкоклеточные опухоли легкого, первичные опухоли мозга, рак желудка, рак толстой кишки, злокачественную инсулиному поджелудочной железы, злокачественный карциноид, рак мочевого пузыря, рак желудочно-кишечного тракта, предраковые заболевания кожи, рак яичка, лимфомы, рак щитовидной железы, нейробластому, рак пищевода, рак мочеполового тракта, злокачественную гиперкальциемию, рак шейки матки, рак эндометрия, рак коры надпочечников и рак предстательной железы.
[0055] В настоящей заявке термин "рак" относится ко всем типам рака или новообразований или злокачественных опухолей, обнаруженных у млекопитающих, включая, но без ограничения: лейкемии (например, Острую миелоцитарную лейкемию и т.д.), лимфомы, меланомы, карциномы и саркомы. Рак проявляется в виде "опухоли" или ткани, содержащей злокачественные раковые клетки. Примеры опухолей включают саркомы и карциномы, такие как, но без ограничения: фибросаркома, миксосаркома, липосаркома, хондросаркома, остеогенная саркома, хондрома, ангиосаркома, эндотелиосаркома, лимфангиосаркома, лимфангиоэндотелиосаркома, синовиома, мезотелиома, саркома Юинга, лейомиосаркома, рабдомиосаркома, карцинома толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак молочной железы, рак яичника, рак предстательной железы, плоскоклеточная карцинома, базальноклеточная карцинома, аденокарцинома, карцинома потовых желез, карцинома сальной железы, папиллярная карцинома, папиллярные аденокарциномы, цистаденокарцинома, медуллярная карцинома, бронхогенная карцинома, почечно-клеточная карцинома, гепатома, карцинома желчного протока, хориокарцинома, семинома, эмбриональная карцинома, опухоль Вильмса, рак шейки матки, опухоль яичка, карцинома легкого, мелкоклеточная карцинома легкого, карцинома мочевого пузыря, эпителиальная карцинома, глиома, астроцитома, медуллобластома, краниофарингиома, эпендимома, пинеалома, гемангиобластома, неврома слухового нерва, олигодендроглиома, менингиома, меланома, нейробластома и ретинобластома. Дополнительные виды рака, которые можно лечить с применением предложенной композиции согласно изобретению, включают, но без ограничения, например, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому, множественную миелому, нейробластому, рак молочной железы, рак яичника, рак легкого, рабдомиосаркому, первичный тромбоцитоз, первичную макроглобулинемию, мелкоклеточные опухоли легкого, первичные опухоли мозга, рак желудка, рак толстой кишки, злокачественную инсулиному поджелудочной железы, злокачественный карциноид, рак мочевого пузыря, рак желудочно-кишечного тракта, предраковые заболевания кожи, рак яичка, лимфомы, рак щитовидной железы, нейробластому, рак пищевода, рак мочеполового тракта, злокачественную гиперкальциемию, рак шейки матки, рак эндометрия, рак коры надпочечников и рак предстательной железы.
[0056] В настоящей заявке термин "неврологическое заболевание или расстройство" относится к любому заболеванию или расстройству нервной системы и/или зрительной системы. "Неврологическое заболевание или расстройство" включает заболевание или расстройства, которые затрагивают центральную нервную систему (мозг, ствол мозга и мозжечок), периферическую нервную систему (включая черепные нервы) и вегетативную нервную систему (части которой находятся и в центральной, и в периферической нервной системе). Неврологическое заболевание или расстройство включает, но без ограничения, приобретенную эпилептиформную афазию; острый диссеминированный энцефаломиелит; адренолейкодистрофию; возрастную макулярную дегенерацию; агенезию мозолистого тела; агнозию; синдром Айкарди; болезнь Александера; болезнь Альпера; альтернирующую гемиплегию; болезнь Альцгеймера; сосудистую деменцию; боковой амиотрофический склероз; анэнцефалию; синдром Ангельмана; ангиоматоз; аноксию; афазию; апраксию; арахноидальные кисты; арахноидит; мальформацию Арнольда-Киари; артериовенозную мальформацию; синдром Аспергера; атаксию-телеангиэктазию; синдром дефицита внимания и гиперактивности; аутизм; вегетативную дисфункцию; боль в спине; болезнь Баттена; болезнь Бехчета; паралич Белла; доброкачественный эссенциальный блефароспазм; доброкачественную фокальную эпилепсию; амиотрофию; доброкачественную внутричерепную гипертензию; болезнь Бинсвангера; блефароспазм; синдром Блоха-Сульцбергера; повреждение плечевого сплетения; абсцесс мозга; травму головного мозга; опухоли мозга (включая мультиформную глиобластому); опухоль спинного мозга; синдром Броун-Секара; болезнь Канавана; синдром запястного канала; каузалгию; центральный болевой синдром; центральный понтинный миелинолиз; цефалический синдром; аневризму сосудов головного мозга; церебральный артериосклероз; церебральную атрофию; церебральный гигантизм; церебральный паралич; болезнь Шарко-Мари-Тута; невропатию и невропатическую боль, вызванные химиотерапией; мальформацию Киари; хорею; хроническую воспалительную демиелинизирующую полинейропатию; хроническую боль; хронический региональный болевой синдром; синдром Коффина-Лоури; кому, включающую устойчивое вегетативное состояние; врожденную лицевую диплегию; кортикобазальную дегенерацию; височный артериит; краниосиностоз; болезнь Крейтцфельдта-Якоба; кумулятивные травматические расстройства; синдром Кушинга; инклюзионную цитомегалию; цитомегаловирусную инфекцию; синдром танцующих глаз-танцующих ног; синдром Денди-Уокера; болезнь Доусона; синдром Де Морсье; паралич Дежерин-Клюмпке; деменцию; дерматомиозит; диабетическую нейропатию; диффузный склероз; вегетативную дистонию; дисграфию; дислексию; дистонию; раннюю инфантильную эпилептическую энцефалопатию; синдром пустого турецкого седла; энцефалит; энцефалоцеле; энцефалотригеминальный ангиоматоз; эпилепсию; паралич Эрба; эссенциальный тремор; болезнь Фабри; синдром Фара; потерю сознания; семейный спастический паралич; фебрильные судороги; синдром Фишера; атаксию Фридрейха; лобно-височную деменцию и другие "таупатии"; болезнь Гоше; синдром Герстманна; гигантоклеточный артериит; гигантоклеточную инклюзионную болезнь; глобоидно-клеточную лейкодистрофию; синдром Гийена-Барре; HTLV-1-ассоциированную миелопатию (миелопатию, ассоциированную с вирусом Т-клеточного лейкоза человека); болезнь Галлервордена-Шпатца; травму головы; головную боль; гемифациальный спазм; наследственную спастическую параплегию; наследственную полиневропатическую атаксию; синдром коленчатого узла; опоясывающий лишай; синдром Хираямы; ВИЧ-ассоциированные деменцию и нейропатию (также неврологические проявления СПИДа); голопрозэнцефалию; болезнь Хантингтона и другие заболевания, обусловленные наличием полиглутаминовых повторов; гидроанэнцефалию; гидроцефалию; гиперкортицизм; гипоксию; иммуноопосредованный энцефаломиелит; миозит с включениями телец; недержание пигмента; инфантильную форму болезни накопления фитановой кислоты; инфантильную болезнь Рефсума; инфантильные спазмы; воспалительную миопатию; внутричерепную кисту; внутричерепную гипертензию; синдром Жубера; синдром Кернса-Сейра; болезнь Кеннеди; синдром Kinsboume; синдром Клиппеля-Фейля; болезнь Краббе; болезнь Кугельберга-Веландер; куру; болезнь Лафора; миастенический синдром Ламберта-Итона; синдром Ландау-Клеффнера; боковой медуллярный синдром (синдром Валленберга); необучаемость; болезнь Лея; синдром Леннокса-Гасто; синдром Леша-Нихена; лейкодистрофию; деменцию с тельцами Леви; лиссэнцефалию; синдром окружения; болезнь Лу Герига (например, болезнь двигательных нейронов, или боковой амиотрофический склероз); заболевание поясничных дисков; болезнь Лайма - неврологические осложнения; болезнь Мачадо-Джозефа; макроэнцефалию; мегацефалию; синдром Мелькерссона-Розенталя; болезнь Меньера; менингит; болезнь Менкеса; метахроматическую лейкодистрофию; микроцефалию; мигрень; синдром Миллера-Фишера; мини-инсульты; митохондриальные миопатии; синдромом Мебиуса; мономелическую амиотрофию; болезнь двигательных нейронов; болезнь мойя-мойя; мукополисахаридозы; мультиинфарктную деменцию; моторную мультифокальную невропатию; рассеянный склероз и другие демиелинизирующие расстройства; множественную системную атрофию с ортостатической гипотензией; мышечную дистрофию; тяжелую псевдопаралитическую миастению; диффузный миелинокластический склероз; раннюю миоклоническую энцефалопатию; миоклонус; миопатию; врожденную миотонию; нарколепсию; нейрофиброматоз; злокачественный нейролептический синдром; неврологические проявления СПИДа; неврологические осложнения после волчанки; нейромиотонию; нейрональный цероидный липофусциноз; нарушения миграции нейронов; болезнь Ниманна-Пика; синдром О'Салливана-МакЛауда; затылочную невралгию; скрытую дизрафию спинного мозга; синдром Охтахара; оливопонтоцеребеллярную атрофию; опсоклонус-миоклонус синдром; неврит зрительного нерва; ортостатическую гипотензию; синдром перегрузки; парестезию; нейродегенеративное заболевание или расстройство (болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, болезнь Альцгеймера, боковой амиотрофический склероз (БАС), деменция, рассеянный склероз и другие заболевания и расстройства, связанные с гибелью нейронов); врожденную парамиотонию; паранеопластические заболевания; пароксизмальные приступы; синдром Парри-Ромберга; болезнь Пелицеуса-Мерцбахера; периодические параличи; периферическую нейропатию; болезненную нейропатию и нейропатическую боль; устойчивое вегетативное состояние; первазивные расстройства развития; световой рефлекс чихания; болезнь накопления фитановой кислоты; болезнь Пика; защемление нерва; опухоли гипофиза; полимиозит; порэнцефалию; постполиомиелитный синдром; постгерпетическую невралгию; постинфекционный энцефаломиелит; ортостатическую гипотензию; синдром Прадера-Вилли; первичный боковой склероз; прионные заболевания; прогрессирующую гемифациальную атрофию; прогрессирующую многоочаговую лейкоэнцефалопатию; прогрессирующую склерозирующую полиодистрофию; прогрессирующий надъядерный паралич; доброкачественную внутричерепную гипертензию; синдром Рамсея-Ханта (типы I и II); энцефалит Расмуссена; синдром рефлекторной симпатической дистрофии; болезнь Рефсума; повторяющиеся расстройства движения; туннельный синдром; синдром беспокойных ног; миелопатию, ассоциированную с ретровирусной инфекцией; синдром Ретта; синдром Рейе; пляску Святого Витта; болезнь Сандхоффа; болезнь Шильдера; шизэнцефалию; септо-оптическую дисплазию; синдром детского сотрясения; опоясывающий лишай; синдром Шая-Дрейджера; синдром Шегрена; апноэ во сне; синдром Сотоса; спастичность; расщепленный позвоночник; повреждение спинного мозга; опухоли спинного мозга; спинальную мышечную атрофию; синдром мышечной скованности; инсульт; синдром Стерджа-Вебера; подострый склерозирующий панэнцефалит; подкорковую атеросклеротическую энцефалопатию; хорею Сиденгама; обмороки; сирингомиелию; позднюю дискинезию; болезнь Тея-Сакса; височный артериит; синдром фиксированного спинного мозга; болезнь Томсена; синдром верхней апертуры грудной клетки; невралгию тройничного нерва; паралич Тодда; синдром Туретта; транзиторную ишемическую атаку; трансмиссивные спонгиоформные энцефалопатии; поперечный миелит; черепно-мозговую травму; тремор; тригеминальную невралгию; тропический спастический парапарез; туберозный склероз; сосудистую деменцию (мультиинфарктную деменцию); васкулит, в том числе височный артериит; болезнь Гиппеля-Линдау; синдром Валленберга; болезнь Верднига-Гоффмана; синдром Веста; хлыстовую травму; синдром Вильямса; болезнь Вильсона и синдром Цельвегера.
[0057] "Пролиферативное заболевание или расстройство" включает, но без ограничения, гемопоэтические неопластические расстройства с участием гиперпластических/неопластических клеток гемопоэтического происхождения, возникающих из миелоидных, лимфоидных или эритроидных ростков или их клеток-предшественников. Эти заболевания включают, но без ограничения, эритробластный лейкоз; острый промиелоцитарный лейкоз (ОПЛ); хронический миелоидный лейкоз (ХМЛ); злокачественные лимфомы, включая, но без ограничения, острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ), который включает В-клеточный ОЛЛ и Т-клеточный ОЛЛ, хронический лимфоцитарный лейкоз (ХЛЛ), пролимфоцитарный лейкоз (ПЛЛ); волосатоклеточный лейкоз (ВКЛ) и макроглобулинемию Вальденстрема (MB). Дополнительные формы злокачественных лимфом включают, но без ограничения, неходжкинскую лимфому и ее варианты, периферические Т-клеточные лимфомы, Т-клеточный лейкоз-лимфому взрослых (ATL), кожную Т-клеточную лимфому (КТКЛ), крупногранулярный лимфоцитарный лейкоз (LGF), болезнь Ходжкина и болезнь Рид-Штернберга.
Полинуклеотидные и олигонуклеотидные композиции и молекулы
[0058] Мишени: В одном варианте реализации мишени включают нуклеотидные последовательности гена Атонального гомолога 1 (АТОН1), включая, без ограничения, смысловые и/или антисмысловые некодирующие и/или кодирующие последовательности, связанные с геном АТОН1.
[0059] Atohl, или Mathl, представляет собой основной транскрипционный фактор, содержащий элемент пространственной структуры типа "спираль-петля-спираль", имеющий важное значение для развития клеток в периферической и центральной частях слуховой системы. В ромбовидном мозге экспрессирующие Atohl клетки-предшественники в ромбической губе дают начало гранулярным клеткам мозжечка, популяции глубоких ядер мозжечка, вентральному ядру улитки, клеткам в медиальном и латеральном вестибулярном ядре и предмозжечковым ядрам (Machold and Fishell, 2005; Wang et al, 2005). Эти предшественники либо не делятся, либо не вырабатываются в организме в Atohl-нулевых мышей (Ben-Arie et al, 1997). В периферической слуховой системе наличие Atohl необходимо и достаточно, чтобы направить дифференцировку и сохранение волосковых клеток улитки (Bermingham et al, 1999), и он экспрессируется в клетках Меркеля и популяции присоединенных хондроцитов (Ben-Arie et al, 2000), хотя его роль в этих типах клеток остается неясной. В спинном мозге Atohl определяет популяцию дорсальных интернейронов, которые заполняют промежуточное серое вещество и выступают в качестве комиссуральных интернейронов спиномозжечковых путей (Bermingham et al, 2001; Helms and Johnson, 1998).
[0060] В центральной нервной системе Atohl необходим для спецификации популяций нейронов в ядрах дорсальной латеральной петли и CN, которые образуются в основном из Atohl-экспрессирующей дорсальной части развивающегося эмбрионального ромбовидного мозга, известного как ромбическая губа (Akazawa et al, 1995; Ben-Arie et al, 1996; Wang etal, 2005).
[0061] В одном варианте реализации антисмысловые олигонуклеотиды применяют для предотвращения или лечения заболеваний или расстройств, ассоциированных с членами семейства АТОН1. Типовые заболевания и расстройства, опосредованные Атональным гомологом 1 (АТОН1), которые можно лечить с помощью клеток/тканей, регенерированных из стволовых клеток, полученных с применением антисмысловых соединений, включают: заболевание или расстройство, ассоциированное с аномальными функцией и/или экспрессией гена АТОН1, рак, заболевание или расстройство, ассоциированное с нарушенным сигнальным путем р53, пролиферативное заболевание или расстройство, аномальную клеточную пролиферацию, неврологическое заболевание или расстройство, заболевание или расстройство, ассоциированное со слуховой системой (например, глухоту, частичную потерю слуха, вестибулярные нарушения вследствие повреждения или потери волосковых клеток внутреннего уха и т.д.), заболевание или расстройство, ассоциированное с вестибулярной системой (например, потерю вестибулярных волосковых клеток, нарушение равновесия и т.д.), остеоартрит, заболевание или расстройство, ассоциированное с сигнальным путем Notch, кишечное заболевание или расстройство (например, колит, кишечное воспаление и т.д.), нарушенный одонтогенез, заболевание или расстройство, ассоциированное с сознательной проприоцептивной чувствительностью, заболевание или расстройство, ассоциированное с интероцепцией, и заболевание или расстройство, ассоциированное с дыханием.
[0062] В одном из вариантов реализации модулирование гена АТОН1 с помощью одного или более антисмысловых олигонуклеотидов представляет собой введение последних пациенту, нуждающемуся в этом, для предотвращения или лечения любого заболевания или расстройства, связанного с аномальными экспрессией, функцией, активностью гена АТОН1 по сравнению с нормальным контролем.
[0063] В одном варианте реализации олигонуклеотиды специфичны для полинуклеотидов гена АТОН1, которые содержат, без ограничения, некодирующие области. Мишени гена АТОН1 включают варианты гена АТОН1; мутанты гена АТОН1, в том числе ОНП; некодирующие последовательности гена АТОН1; аллели, фрагменты и т.п. Предпочтительно, олигонуклеотид представляет собой молекулу антисмысловой РНК.
[0064] В соответствии с вариантами реализации изобретения, молекула нуклеиновой кислоты-мишени не ограничивается одними полинуклеотидами АТОН1, но распространяется на любые из изоформ, рецепторов, гомологов, некодирующих областей гена АТОН1 и т.п.
[0065] В одном варианте реализации олигонуклеотид нацелен на природную антисмысловую последовательность (природную антисмысловую последовательность для кодирующих и некодирующих областей) для мишеней АТОН1, включая, без ограничения, варианты, аллели, гомологи, мутанты, производные, фрагменты и последовательности, которые представляют собой их комплемент. Предпочтительно, олигонуклеотид представляет собой молекулу антисмысловой РНК или ДНК.
[0066] В одном варианте реализации олигомерные соединения согласно настоящему изобретению также включают варианты, в которых разные основания находятся в одном или более нуклеотидных положениях в соединении. Например, если первый нуклеотид представляет собой аденин, то могут быть получены варианты, содержащие тимидин, гуанозин, цитидин или другие природные или неприродные нуклеотиды в этом положении. Это может быть выполнено в любой из позиций антисмыслового соединения. Эти соединения далее исследуют применяя способы, описанные в настоящей заявке, с целью определения их способности ингибировать экспрессию нуклеиновой кислоты-мишени.
[0067] В некоторых вариантах реализации гомология, идентичность последовательностей или комплементарность между антисмысловым соединением и мишенью составляет от примерно 50% до примерно 60%. В некоторых вариантах реализации гомология, идентичность последовательностей или комплементарность составляет от примерно 60% до примерно 70%. В некоторых вариантах реализации гомология, идентичность последовательностей или комплементарность составляет от примерно 70% до примерно 80%. В некоторых вариантах реализации гомология, идентичность последовательностей или комплементарность составляет от примерно 80% до примерно 90%. В некоторых вариантах реализации гомология, идентичность последовательностей или комплементарность составляет примерно 90%, примерно 92%, примерно 94%, примерно 95%, примерно 96%, примерно 97%, примерно 98%, примерно 99% или примерно 100%.
[0068] Антисмысловое соединение способно к специфичной гибридизации, когда связывание соединения с нуклеиновой кислотой-мишенью препятствует нормальной функции нуклеиновой кислоты-мишени, вызывая потерю активности, и обеспечена достаточная степень комплементарности во избежание неспецифического связывания антисмыслового соединения с нуклеотидными последовательностями, не являющимися мишенями, при условиях, в которых желательно специфическое связывание. Такие условия включают, например, физиологические условия в случае анализов in vivo или терапевтического лечения и условия, в которых проводят анализы в случае анализов in vitro.
[0069] Антисмысловое соединения, будь то ДНК, РНК, химерное соединение, замещенное соединение и т.д., является специфически гибридизуемым, когда связывание соединения с молекулой ДНК- или РНК-мишени препятствует нормальной функции ДНК- или РНК-мишени, вызывая потерю функции, и обеспечена достаточная степень комплементарности во избежание неспецифического связывания антисмыслового соединения с последовательностями, не являющимися мишенями, при условиях, в которых желательно специфическое связывание, т.е. при физиологических условиях в случае анализов in vivo или терапевтического лечения и, в случае анализов in vitro, при условиях, в которых проводят анализы.
[0070] В одном варианте реализации направленное воздействие на ген АТОН1, включающее, без ограничения, антисмысловые последовательности, идентифицируемые и раскрываемые с применением, например, ПЦР, гибридизации и т.д., одну или несколько последовательностей, соответствующих SEQ ID NOS: 2, и т.п., модулирует экспрессию или функцию гена АТОН1. В одном варианте реализации экспрессия или функция увеличиваются по сравнению с контролем. В одном варианте реализации экспрессия или функция подавляются по сравнению с контролем.
[0071] В одном варианте реализации олигонуклеотиды содержат нуклеотидные последовательности, соответствующие SEQ ID NOS: 3 и 4, включая антисмысловые последовательности, идентифицируемые и раскрываемые с применением, например, ПЦР, гибридизации и т.д. Эти олигонуклеотиды могут содержать один или более модифицированных нуклеотидов, более короткие или более длинные фрагменты, модифицированные связи и т.п.. Примеры модифицированных связей или межнуклеотидных связей включают фосфотиоатные, фосфодитиоатные связи и т.п. В одном варианте реализации нуклеотиды содержат фосфатное производное. Фосфатное производное (или модифицированная фосфатная группа), которое может быть присоединено к остатку сахара или аналогу остатка сахара в модифицированных олигонуклеотидах согласно настоящему изобретению, может представлять собой монофосфат, дифосфат, трифосфат, алкилфосфат, алканфосфат, фосфотиоат и т.п. Получение указанных выше аналогов фосфата и их включение в состав нуклеотидов, модифицированных нуклеотидов и олигонуклеотидов, по сути, также известно и не обязательно должно быть описано в настоящей заявке.
[0072] Специфичность и чувствительность антисмысловой последовательности также используются специалистами в данной области техники для терапевтического применения. Антисмысловые олигонуклеотиды были применены в качестве терапевтических агентов для лечения болезненных состояний у животных и человека. Антисмысловые олигонуклеотиды были безопасно и эффективно введены людям, и многочисленные клинические испытания в настоящее время находятся в стадии реализации. Таким образом, установлено, что олигонуклеотиды могут представлять собой подходящие терапевтические средства, которые могут быть сконфигурированы так, чтобы подходить к режимам лечения для обработки клеток, тканей и животных, особенно людей.
[0073] В вариантах реализации настоящего изобретения олигомерные антисмысловые соединения, в частности, олигонуклеотиды, связываются с молекулами нуклеиновых кислот-мишеней и модулируют экспрессию и/или функцию молекул, кодируемых геном-мишенью. Затрагиваемые функции ДНК включают, например, репликацию и транскрипцию. Затрагиваемые функции РНК включают все жизненно важные функции, такие как, например, транслокация РНК к месту трансляции белков, трансляция белков на матрице РНК, сплайсинг РНК с образованием одного или более видов мРНК и каталитическая активность, которая может присутствовать у РНК или которой РНК может способствовать. Функции могут быть усилены или ингибированы в зависимости от желаемых функций.
[0074] Антисмысловые соединения включают антисмысловые олигомерные соединения, антисмысловые олигонуклеотиды, олигонуклеотиды внешней направляющей последовательности (EGS), сплайс-варианты, праймеры, зонды и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются с по меньшей мере частью нуклеиновой кислоты-мишени. Сами по себе эти соединения могут быть введены в форме одноцепочечных, двухцепочечных, частично одноцепочечных или кольцевых олигомерных соединений.
[0075] Нацеливание антисмыслового соединения на молекулу конкретной нуклеиновой кислоты, в контексте настоящего изобретения, может представлять собой многоступенчатый процесс. Процесс обычно начинается с идентификации нуклеиновой кислоты-мишени, функция которой подлежит модулированию. Эта нуклеиновая кислота-мишень может являться, например, клеточным геном (или мРНК, транскрибируемой на матрице гена), экспрессия которого связана с конкретным расстройством или болезненным состоянием, или молекулой нуклеиновой кислоты из инфекционного агента. Согласно настоящему изобретению нуклеиновая кислота-мишень кодирует ген Атонального гомолога 1 (АТОН1).
[0076] Процесс нацеливания обычно также включает определение по меньшей мере одной области-мишени, сегмента или сайта в пределах нуклеиновой кислоты-мишени для того, чтобы антисмысловое взаимодействие могло произойти, так что желаемый эффект, например, модулирование экспрессии, будет достигнут. В контексте настоящего изобретения термин "область" определяют как часть нуклеиновой кислоты-мишени, имеющую по меньшей мере одну поддающуюся идентификации структуру, функцию или характеристику. Внутри областей нуклеиновых кислот-мишеней находятся сегменты. "Сегменты" определяют как меньшие области или субчасти областей в пределах нуклеиновой кислоты-мишени. "Сайты" в настоящем изобретении определяют как позиции в пределах нуклеиновой кислоты-мишени.
[0077] В одном варианте реализации антисмысловые олигонуклеотиды связываются с природными антисмысловыми последовательностями гена Атонального гомолога 1 (АТОН1) и модулируют экспрессию и/или функцию гена АТОН1 (соответствующего SEQ ID NO: 1). Примеры антисмысловых последовательностей включают последовательности, соответствующие SEQ ID NOS: 2-4.
[0078] В одном варианте реализации антисмысловые олигонуклеотиды связываются с одним или более сегментами полинуклеотидов Атонального гомолога 1 (АТОН1) и модулируют экспрессию и/или функцию гена АТОН1. Сегменты содержат по меньшей мере пять последовательных нуклеотидов смысловых или антисмысловых полинуклеотидов АТОН1.
[0079] В одном варианте реализации антисмысловые олигонуклеотиды специфичны к природным антисмысловым последовательностям для гена АТОН1, при этом связывание олигонуклеотидов с природными антисмысловыми последовательностями для гена АТОН1 модулирует экспрессию и/или функцию гена АТОН1.
[0080] В одном варианте реализации олигонуклеотидные соединения содержат последовательности, соответствующие SEQ ID NOS: 3 и 4, антисмысловые последовательности, идентифицируемые и раскрываемые с применением, например, ПЦР, гибридизации и т.д. Эти олигонуклеотиды могут содержать один или более модифицированных нуклеотидов, более короткие или более длинные фрагменты, модифицированные связи и т.п. Примеры модифицированных связей или межнуклеотидных связей включают фосфотиоатные, фосфодитиоатные связи и т.п. В одном варианте реализации нуклеотиды содержат фосфатное производное. Фосфатное производное (или модифицированная фосфатная группа), которое может быть присоединено к остатку сахара или аналогу остатка сахара в модифицированных олигонуклеотидах согласно настоящему изобретению, может представлять собой монофосфат, дифосфат, трифосфат, алкилфосфат, алканфосфат, фосфотиоат и т.п. Получение указанных выше аналогов фосфата и их включение в состав нуклеотидов, модифицированных нуклеотидов и олигонуклеотидов, по сути, также известно и не обязательно должно быть описано в настоящей заявке.
[0081] Поскольку, как известно в данной области техники, инициаторный кодон представляет собой, как правило, 5'-AUG (в транскрибируемых молекулах мРНК; 5'-ATG в соответствующей молекуле ДНК), инициаторный кодон также часто называют "AUG кодон", "старт-кодон" или "AUG старт-кодон". Меньшая часть генов имеет инициаторный кодон, содержащий последовательность РНК 5'-GUG, 5'-UUG или 5'-CUG; и 5'-AUA, 5'-ACG и 5'-CUG, как было показано, функционируют in vivo. Таким образом, термин "инициаторный кодон" и "старт-кодон" может охватывать множество последовательностей кодонов, хотя инициаторная аминокислота в каждом случае представляет собой, как правило, метионин (у эукариот) или формилметионин (у прокариот). Эукариотические и прокариотические гены могут содержать два или более альтернативных старт-кодона, любой из которых может предпочтительно использоваться для инициации трансляции в конкретном типе клеток или ткани, или при конкретном наборе условий. В контексте настоящего изобретения, "старт-кодон" и "инициаторный кодон" относятся к кодону или кодонам, которые используются in vivo для инициации трансляции мРНК, транскрибируемой на матрице гена, кодирующего Атональный гомолог 1 (АТОН1), независимо от последовательности (последовательностей) таких кодонов. Кодон терминации трансляции (или "стоп-кодон") гена может иметь одну из трех последовательностей, т.е. 5'-UAA, 5'-UAG и 5'-UGA (соответствующими последовательностями ДНК являются 5'-ТАА, 5'-TAG и 5'-TGA, соответственно).
[0082] Термины "область старт-кодона" и "область инициаторного кодона" относятся к части такой мРНК или гена, которая охватывает от примерно 25 до примерно 50 последовательных нуклеотидов в любом направлении (т.е. 5' или 3') от инициаторного кодона. Аналогично, термины "область стоп-кодона" и "область кодона терминации трансляции" относятся к части такой мРНК или гена, охватывает от примерно 25 до примерно 50 последовательных нуклеотидов в любом направлении (т.е. 5' или 3') от кодона терминации трансляции. Следовательно, "область старт-кодона" (или "область инициаторного кодона") и "область стоп-кодона" (или "область кодона терминации трансляции") обе являются областями, на которые могут быть эффективно нацелены антисмысловые соединения согласно настоящему изобретению.
[0083] Открытая рамка считывания (ОРС) или "кодирующая область", которая, как известно в данной области техники, относится к области между инициаторным кодоном и кодоном терминации трансляции, также представляет собой область, на которую может быть эффективно направлено воздействие. В контексте настоящего изобретения область-мишень является внутригенной областью, включающей инициаторный кодон или кодон терминации трансляции открытой рамки считывания (ОРС) гена.
[0084] Другая область-мишень включает 5'-нетранслируемую область (5'-НТО), обозначающую в данной области техники часть мРНК в 5'-направлении от инициаторного кодона и, таким образом, содержащую нуклеотиды между 5'-сайтом кэпирования и инициаторным кодоном мРНК (или соответствующие нуклеотиды гена). Еще одна область-мишень включает 3'-нетранслируемую область (3'-НТО), обозначающую в данной области техники часть мРНК в 3'-направлении от кодона терминации трансляции и, таким образом, содержащую нуклеотиды между кодоном терминации трансляции и 3'-концом мРНК (или соответствующие нуклеотиды гена). 5'-сайт кэпирования мРНК содержит N7-метилированный остаток гуанозина, присоединенный к самому крайнему 5'-остатку мРНК посредством 5'-5'-трифосфатной связи. Область 5'-кэпа мРНК, как считают, включает собственно структуру 5'-кэпа, а также первых 50 нуклеотидов, прилегающие к сайту кэпирования. Другая область-мишень согласно настоящему изобретению представляет собой область 5'-кэпа.
[0085] Несмотря на то, что некоторые эукариотические мРНК-транскрипты прямо транслируются, многие из них содержат одну или более областей, известных как "интроны", которые вырезаются из транскрипта, прежде чем он подвергается трансляции. Остальные (и, таким образом, транслируемые) области известны как "экзоны", и они соединяются друг с другом с образованием непрерывной последовательности мРНК. В одном варианте реализации нацеливание на сайты сплайсинга, т.е. на места соединения интрон-экзон или места соединения экзон-интрон, особенно подходит в случаях, в которых аберрантный сплайсинг вовлечен в развитие заболевания или в которых сверхсинтез конкретного продукта сплайсинга вовлечен в развитие заболевания. Соединение в результате аберрантного слияния вследствие перестройки или делеции представляет собой другой вариант реализации сайта-мишени. мРНК-транскрипты, полученные в результате процесса сплайсинга двух (или более) мРНК из различных источников гена известны как "транскрипты слияния". Интроны могут быть эффективно задействованы в качестве мишени с применением антисмысловых соединений, нацеленных на, например, ДНК или пре-мРНК.
[0086] В одном варианте реализации антисмысловые олигонуклеотиды связываются с кодирующими и/или некодирующими областями полинуклеотида-мишени и модулируют экспрессию и/или функцию молекулы-мишени.
[0087] В одном варианте реализации антисмысловые олигонуклеотиды связываются с природными антисмысловыми полинуклеотидами и модулируют экспрессию и/или функцию молекулы-мишени.
[0088] В одном варианте реализации антисмысловые олигонуклеотиды связываются со смысловыми полинуклеотидами и модулируют экспрессию и/или функцию молекулы-мишени.
[0089] Альтернативные РНК-транскрипты могут быть получены из одной и той же геномной области ДНК. Эти альтернативные транскрипты в общем случае известны как "варианты". Конкретнее, "варианты пре-мРНК" представляют собой транскрипты, получаемые из одной и той же геномной ДНК, которые отличаются от других транскриптов, получаемых из этой же геномной ДНК, положением их либо старт-, либо стоп-кодона и содержат как интронные, так и экзонные последовательности.
[0090] После удаления одной или более экзонной или интроной областей или их частей в процессе сплайсинга варианты пре-мРНК становятся источниками меньших "вариантов мРНК". Следовательно, варианты мРНК являются процессированными вариантами пре-мРНК, и каждый уникальный вариант пре-мРНК должен всегда давать уникальный вариант мРНК в результате сплайсинга. Эти варианты мРНК также известны как "альтернативные сплайс-варианты". Если сплайсинга варианта пре-мРНК не происходит, то вариант пре-мРНК идентичен варианту мРНК.
[0091] Варианты могут быть получены путем применения альтернативных сигналов для запуска или остановки транскрипции. Пре-мРНК и мРНК могут иметь более одного старт-кодона или стоп-кодона. Варианты, которые происходят из пре-мРНК или мРНК, использующих альтернативные старт-кодоны, известны как "альтернативные старт-варианты" этих пре-мРНК или мРНК. Те транскрипты, которые используют альтернативный стоп-кодон, известны как "альтернативные стоп-варианты" этих пре-мРНК или мРНК. Один конкретный тип альтернативного стоп-варианта представляет собой "полиА-вариант", в котором множественные получаемые транскрипты являются результатом альтернативного выбора одного из "полиА-стоп-сигналов" транскрипционным аппаратом, что приводит к получению транскриптов, которые заканчиваются на уникальных полиА-сайтах. В контексте настоящего изобретения типы вариантов, описанные в настоящей заявке, также представляют собой варианты реализации нуклеиновых кислот-мишеней.
[0092] Области в целевой нуклеиновой кислоте, с которыми гибридизуются антисмысловые соединения, определяют как часть области-мишени длиной по меньшей мере 5 нуклеотидов, на которую нацелено активное антисмысловое соединение.
[0093] В то время как специфические последовательности некоторых типовых сегментов-мишеней приведены в настоящей заявке, как будет обнаружено специалистом в данной области техники, эти последовательности служат для иллюстрации и описания конкретных вариантов реализации в рамках настоящего изобретения. Дополнительные сегменты-мишени легко поддаются идентификации специалистом в данной области техники в свете настоящего описания.
[0094] Сегменты-мишени длиной 5-100 нуклеотидов, содержащие цепь из по меньшей мере пяти (5) последовательных нуклеотидов, выбранных из нуклеотидов в пределах иллюстративных предпочтительных сегментов-мишеней, как полагают, также являются подходящими для нацеливания.
[0095] Сегменты-мишени могут включать последовательности ДНК или РНК, которые содержат по меньшей мере 5 последовательных нуклеотидов с 5'-конца одного из иллюстративных предпочтительных сегментов-мишеней (остальные нуклеотиды представляют собой последовательную цепь той же самой ДНК или РНК, начинающуюся непосредственно выше от 5'-конца сегмента-мишени и продолжающуюся в пределах от примерно 5 до примерно 100 нуклеотидов). Аналогично предпочтительные сегменты-мишени представлены последовательностями ДНК или РНК, которые содержат по меньшей мере 5 последовательных нуклеотидов с 3'-конца одного из иллюстративных предпочтительных сегментов-мишеней (остальные нуклеотиды представляют собой последовательную цепь той же самой ДНК или РНК, начинающуюся непосредственно ниже 3'-конца сегмента-мишени и продолжающуюся в пределах от примерно 5 до примерно 100 нуклеотидов). Специалист в данной области техники, имеющий в наличии сегменты-мишени, проиллюстрированные в настоящей заявке, будет способен без проведения лишних экспериментов идентифицировать далее предпочтительные сегменты-мишени.
[0096] Как только одну или более областей-мишеней, сегментов-мишеней или сайтов-мишеней идентифицируют, выбирают антисмысловые соединения, которые в достаточной степени комплементарны мишени, т.е. гибридизуются достаточно хорошо и с достаточной специфичностью с получением желаемого эффекта.
[0097] В вариантах реализации настоящего изобретения олигонуклеотиды связываются с антисмысловой цепью конкретной мишени. Олигонуклеотиды имеют длину по меньшей мере 5 нуклеотидов и могут быть синтезированы таким образом, что каждый олигонуклеотид нацелен на перекрывающиеся последовательности, так что олигонуклеотиды синтезируют для покрытия всей длины полинуклеотида-мишени. Указанные мишени также включают и кодирующие, и некодирующие области.
[0098] В одном варианте реализации предпочитают воздействовать на конкретные нуклеиновые кислоты антисмысловыми олигонуклеотидами. Нацеливание антисмыслового соединения на конкретную нуклеиновую кислоту представляет собой многоступенчатый процесс. Процесс обычно начинается с идентификации последовательности нуклеиновой кислоты, функция которой подлежит модулированию. Эта последовательность может представлять собой, например, клеточный ген (или мРНК, транскрибируемую на матрице этого гена), экспрессия которого связана с конкретным расстройством или болезненным состоянием, или некодирующий полинуклеотид, такой как, например, некодирующая РНК (нкРНК).
[0099] Молекулы РНК могут быть классифицированы на (1) матричные РНК (мРНК), которые транслируются в белки, и (2) РНК, не кодирующие белки (нк РНК). нкРНК включают микроРНК, антисмысловые транскрипты и другие единицы транскрипции (ЕТ), содержащие высокую плотность стоп-кодонов и не имеющие каких-либо протяженных "открытых рамок считывания". Многие нкРНК, по-видимому, начинаются с сайтов инициации в 3'-нетранслируемых областях (3'-НТО) кодирующих белок локусов. нкРНК, как правило, редки и по меньшей мере половина из нкРНК, которые были просеквенированы Международным консорциумом по анализу РНК (FANTOM), по-видимому, не являются полиаденилированными. Большинство исследователей по очевидным причинам сфокусировали внимание на полиаденилированных мРНК, которые подвергаются процессингу и экспорту в цитоплазму. Недавно было показано, что набор неполиаденилированных ядерных РНК может быть очень большим и что многие такие транскрипты появляются из так называемых межгенных областей. Механизм, посредством которого нкРНК могут регулировать экспрессию генов, заключается в спаривании оснований с транскриптами-мишенями. РНК, которые функционируют за счет спаривания оснований, могут быть сгруппированы в (1) цис-кодируемые РНК, которые кодируются в одном и том же участке гена, но на противоположной цепи по отношению к РНК, на которые они воздействуют, показывая, таким образом, совершенную комплементарность их мишени, и (2) транс-кодируемые РНК, которые кодируются в участках хромосом, отличных от участков для РНК, на которые они воздействуют, и не показывают в совершенной степени потенциального спаривания оснований с их мишенями.
[00100] Без привязки к какой-либо конкретной теории, модификация антисмыслового полинуклеотида антисмысловыми олигонуклеотидами, описанными в настоящей заявке, может изменять экспрессию соответствующих смысловых информационных РНК. Однако такая регуляция может быть либо несогласованной (антисмысловой "нокдаун" приводит к повышению уровня информационной РНК), либо согласованной (антисмысловой "нокдаун" приводит к сопутствующему понижению уровня информационной РНК). В этих случаях антисмысловые олигонуклеотиды могут быть нацелены на перекрывающиеся или неперекрывающиеся части антисмыслового транскрипта, в результате чего происходит его "нокдаун" или секвестрирование. Кодирующие, а также некодирующие антисмысловые {молекулы} можно нацеливать одинаковым образом, и обе категории способны регулировать соответствующие смысловые транскрипты - либо согласованным, либо несогласованным образом. Стратегии, которые применяют для выявления новых олигонуклеотидов для взаимодействия с мишенями, могут быть основаны на "нокдауне" антисмысловых РНК-транскриптов антисмысловыми олигонуклеотидами или на любых других способах модулирования желаемой мишени.
[00101] Стратегия 1: В случае несогласованной регуляции "нокдаун" антисмыслового транскрипта повышает экспрессию обычного (смыслового) гена. В случае, если этот ген кодирует известную или предполагаемую мишень для лекарственного средства, то "нокдаун" его антисмыслового эквивалента может предположительно имитировать действие агониста рецептора или стимулятора фермента.
[00102] Стратегия 2: В случае согласованной регуляции можно одновременно осуществить "нокдаун" как антисмыслового, так и смыслового транскриптов и тем самым добиться синергетического уменьшения экспрессии обычного (смыслового) гена. Если, например, антисмысловой олигонуклеотид применяют для достижения "нокдауна", тогда эта стратегия может быть применена для нацеленного воздействия одним антисмысловым олигонуклеотидом на смысловой транскрипт и другим антисмысловым олигонуклеотидом на соответствующий антисмысловой транскрипт или единственным энергетически симметричным антисмысловым олигонуклеотидом, одновременно нацеленным на перекрывающиеся смысловые и антисмысловые транскрипты.
[00103] Согласно настоящему изобретению, антисмысловые соединения включают антисмысловые олигонуклеотиды, рибозимы, олигонуклеотиды внешней направляющей последовательности (EGS), миРНК соединения, одно- или двухцепочечные РНК-интерферирующие (РНКи) соединения, такие как миРНК соединения, и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются с по меньшей мере частью нуклеиновой кислоты-мишени и модулируют ее функцию. Соответственно, они могут представлять собой ДНК, РНК, ДНК-подобные соединения, РНК-подобные соединения или их смеси или могут представлять собой миметики одного или более из указанных соединений. Такие соединения могут представлять собой одноцепочечные, двухцепочечные, кольцевые или шпилькообразные олигомерные соединения и могут содержать структурные элементы, такие как внутренние или концевые выпетливания, некомплементарные положения или петли. Антисмысловые соединения обычно получают в виде линейных соединений, но они могут быть соединены или получены иным способом для получения кольцевых и/или разветвленных соединений. Антисмысловые соединения могут включать такие конструкты, как, например, две гибридизованных цепи, образующих полностью или частично двухцепочечное соединение или одиночную цепь с самокомплементарностью, достаточной для гибридизации и образования полностью или частично двухцепочечного соединения. Указанные две цепи могут быть связаны внутренними связями, имея свободные 3'- или 5'-концы, или могут быть связаны с образованием непрерывной шпилькообразной структуры или петли. Указанная шпилькообразная структура может содержать липкий конец либо на 5'-, либо на 3'-конце, образующий удлинение одноцепочечного характера. Указанные двухцепочечные соединения необязательно могут содержать липкие концы. Другие модификации могут включать конъюгированные группы, присоединенные к одному из концов, нуклеотидам в определенных положениях, сахарам в определенных положениях или к одной из межнуклеозидных связей. Альтернативно, указанные две цепи могут быть связаны посредством не-нуклеинового фрагмента или линкерной группы. Образованная только одиночной цепью дцРНК может принимать форму самокомплементарной шпилькообразной молекулы, складывающейся с самой собой с образованием дуплекса. Таким образом, указанные дцРНК могут быть полностью или частично двухцепочечными. Специфическое модулирование экспрессии генов может быть достигнуто за счет стабильной экспрессии шпилек дцРНК в трансгенных клеточных линиях, однако, в некоторых вариантах реализации указанные экспрессия или функция генов увеличиваются. При образовании из двух цепей или одиночной цепи, принимающей форму самокомплементарной шпилькообразной молекулы, складывающейся с самой собой с образованием дуплекса, указанные две цепи (или образующие дуплекс области одиночной цепи) представляют собой комплементарные цепи РНК, которые спариваются основаниями по Уотсону-Крику.
[00104] При попадании в систему, соединения согласно настоящему изобретению могут вызывать действие одного или нескольких ферментов или структурных белков по расщеплению или другим модификациям нуклеиновой кислоты-мишени или могут работать по механизму "занятия положения" (occupancy-based mechanism). В общем случае, нуклеиновые кислоты (в том числе олигонуклеотиды) могут быть описаны как "ДНК-подобные" (т.е. содержащие, как правило, один или более 2'-дезоксисахаров и, как правило, преимущественно Т, а не U основания) или "РНК-подобные" (т.е. содержащие, как правило, один или более 2'-гидрокси- или 2'-модифицированных Сахаров и, как правило, преимущественно U, а не Т основания). Спирали нуклеиновых кислот могут быть представлены структурами более чем одного типа, чаще всего А- и В-формами. Считают, что, в общем случае, олигонуклеотиды, которые имеют структуру, подобную В-форме, являются "ДНК-подобными", а олигонуклеотиды, которые имеют структуру, подобную А-форме, являются "РНК-подобными". В некоторых (химерных) вариантах реализации антисмысловое соединение может содержать области как А-, так и В-формы.
[00105] В одном варианте реализации желаемые олигонуклеотиды или антисмысловые соединения содержат по меньшей мере одно из следующего: антисмысловую РНК, антисмысловую ДНК, химерные антисмысловые олигонуклеотиды, антисмысловые олигонуклеотиды, содержащие модифицированные связи, интерферирующие РНК (РНКи), малые интерферирующие РНК (миРНК); микро интерферирующие РНК (микро-РНК); малые временные РНК (мвРНК); или короткие шпилечные РНК (кшРНК); малые РНК индуцированной активации гена (РНКа); малые активирующие РНК (маРНК) или их комбинации.
[00106] дцРНК может также активировать экспрессию генов, механизм, который получил название "малые РНК-индуцированной активации генов" или РНКа. дцРНК, нацеленные на промоторы генов, вызывают мощную транскрипционную активацию ассоциированных генов. РНКа была продемонстрирована в клетках человека с помощью синтетических дцРНК, называемых "малые активирующие РНК" (маРНК). В настоящее время неизвестно, консервативна ли РНКа в других организмах.
[00107] Было обнаружено, что малые двухцепочечные РНК (дцРНК), такие как малые интерферирующие РНК (миРНК) и микроРНК (микро-РНК), запускают эволюционно консервативный механизм, известный как РНК-интерференция (РНКи). РНКи неизбежно ведет к выключению (сайленсингу) генов за счет ремоделирования хроматина, что приводит к подавлению транскрипции, деградации комплементарной мРНК или блокированию трансляции белка. Тем не менее, в примерах, подробно описанных в последующей экспериментальной части, показано, что олигонуклеотиды вызывают увеличение экспрессии и/или функции полинуклеотидов Атонального гомолога 1 (АТОН1) и кодируемых ими продуктов. дцРНК может также выступать в качестве малых активирующих РНК (маРНК). Без привязки к какой-либо конкретной теории, посредством нацеленного действия на последовательности в промоторах генов-мишеней маРНК индуцируют экспрессию гена-мишени в результате явления, называемого дцРНК-индуцированной транскрипционной активацией (РНКа).
[00108] Согласно другому варианту реализации "предпочтительные сегменты-мишени", определенные в настоящей заявке, можно применять для отбора дополнительных соединений, которые модулируют экспрессию полинуклеотидов Атонального гомолога 1 (АТОН1). "Модуляторы" представляют собой соединения, понижающие или повышающие экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей АТОН1, и содержащие по меньшей мере 5-нуклеотидный участок, комплементарный предпочтительному сегменту-мишени. Способ отбора включает этапы осуществления контакта предпочтительного сегмента- мишени молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей смысловые или природные антисмысловые полинуклеотиды АТОН1 с одним или несколькими потенциальными модуляторами, и отбор одного или более потенциального модулятора, понижающего или повышающего экспрессию молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полинуклеотиды АТОН1, например, SEQ ID NO: 3 и 4. После того, как подтверждена способность потенциального(ых) модулятора(ов) к модулированию (например, понижению или повышению) экспрессии молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полинуклеотиды АТОН1, указанный модулятор можно применять для дальнейших исследований функций полинуклеотидов АТОН1, или для применения в качестве агента для исследований, диагностики или лечения согласно настоящему изобретению.
[00109] Нацеленное воздействие при помощи природной антисмысловой последовательности предпочтительно модулирует функцию гена-мишени. Например, гена АТОН1 (в частности, под номером доступа NM_005172). Согласно одному из вариантов реализации мишень представляет собой антисмысловой полинуклеотид гена АТОН1. Согласно одному из вариантов реализации антисмысловой олигонуклеотид нацелен на смысловые и/или природные антисмысловые последовательности полинуклеотидов АТОН1 (в частности, под номером доступа NM_005172), их варианты, аллели, изоформы, гомологи, мутанты, производные, фрагменты и комплементарные последовательности. Предпочтительно, указанный олигонуклеотид представляет собой антисмысловую молекулу, и указанные мишени включают кодирующие и некодирующие участки антисмысловых и/или смысловых полинуклеотидов АТОН1.
[00110] Предпочтительные целевые сегменты согласно настоящему изобретению могут также быть скомбинированы с соответствующими комплементарными антисмысловыми соединениями, предложенными в настоящем изобретении, с формированием стабилизированных двуцепочечных (дуплексных) олигонуклеотидов.
[00111] В данной области техники показано, что такие двуцепочечные олигонуклеотидные фрагменты модулируют экспрессию мишеней и регулируют трансляцию, а также процессинг РНК, посредством антисмыслового механизма. Кроме того, указанные двуцепочечные фрагменты могут подвергаться химическим модификациям. Например, показано, что такие двуцепочечные фрагменты ингибируют мишень посредством классической гибридизации антисмысловой цепи указанного дуплекса с мишенью, запуская тем самым ферментное расщепление мишени.
[00112] Согласно одному из вариантов реализации антисмысловой олигонуклеотид нацелен на полинуклеотиды Атонального гомолога 1 (АТОН1) (в частности, под номером доступа NM_005172), их варианты, аллели, изоформы, гомологи, мутанты, производные, фрагменты и комплементарные последовательности. Предпочтительно, указанный олигонуклеотид представляет собой антисмысловую молекулу.
[00113] Согласно вариантам реализации настоящего изобретения целевая молекула нуклеиновой кислоты не ограничивается собственно АТОН1 и может быть представлена любыми изоформами, рецепторами, гомологами и т.п. молекулами АТОН1.
[00114] Согласно одному из вариантов реализации олигонуклеотид нацелен на природную антисмысловую последовательность полинуклеотидов АТОН1, например, полинуклеотидов, представленных в последовательностях SEQ ID NO: 2, и любых их вариантов, аллелей, гомологов, мутантов, производных, фрагментов и комплементарных последовательностей. Примеры антисмысловых олигонуклеотидов представлены последовательностями SEQ ID NO: 3 и 4.
[00115] Согласно одному из вариантов реализации указанные олигонуклеотиды комплементарны или связываются с нуклеиновыми кислотами антисмысловых последовательностей АТОН1, включая, не ограничиваясь указанными, некодирующие смысловые и/или антисмысловые последовательности, связанные с полинуклеотидами АТОН1, и модулируют экспрессию и/или функцию молекул АТОН1.
[00116] Согласно одному из вариантов реализации указанные олигонуклеотиды комплементарны природным антисмысловым последовательностям нуклеиновых кислот АТОН1, представленным в последовательностях SEQ ID NO: 2 или связываются с ними, и модулируют экспрессию и/или функцию молекул АТОН1.
[00117] Согласно одному из вариантов реализации олигонуклеотиды содержат последовательности, состоящие по меньшей мере из 5 последовательных нуклеотидов последовательностей SEQ ID NO: 3 и 4, и модулируют экспрессию и/или функцию молекул АТОН1.
[00118] Указанные полинуклеотидные мишени включают АТОН1, в том числе представителей этого семейства, варианты АТОН1; мутанты АТОН1, в том числе SNP; некодирующие последовательности АТОН1; аллели АТОН1; видовые варианты, фрагменты и т.п.Предпочтительно, указанный олигонуклеотид представляет собой антисмысловую молекулу.
[00119] В одном из вариантов реализации олигонуклеотид, который нацелен на полинуклеотиды АТОН1, включает: антисмысловую РНК, интерферирующую РНК (иРНК), малую интерферирующую РНК (миРНК); микро интерферирующую РНК (микроРНК), малую, временную РНК (мвРНК), или короткую шпилечную РНК (кшРНК); малую РНК-индуцированной активации гена (РНКа), или малую активирующую РНК (маРНК).
[00120] Согласно одному из вариантов реализации направленное воздействие на полинуклеотиды Атонального гомолога 1 (АТОН1), например, SEQ ID NOS: 2-4, модулирует экспрессию или функцию таких мишеней. Согласно одному из вариантов реализации экспрессия или функция регулируются повышающе по сравнению с контролем. Согласно одному из вариантов реализации экспрессия или функция регулируются понижающе по сравнению с контролем.
[00121] Согласно одному из вариантов реализации антисмысловые соединения включают последовательности, представленные в последовательностях SEQ ID NOS: 3 и 4. Такие олигонуклеотиды могут содержать один или более модифицированный нуклеотид, более короткие или более длинные фрагменты, модифицированные связи и т.п..
[00122] Согласно одному из вариантов реализации последовательности SEQ ID NOS: 3 и 4 содержат один или более ЗНК-нуклеотид. В таблице 1 приведены типовые антисмысловые олигонуклеотиды, подходящие для применения в способах согласно настоящему изобретению.
Таблица 1:
ID последовательности Наименование антисмысловой последовательности Последовательность
SEQ ID NO:3 CUR-1488 A*G*C*C*A*A*C*T*G*C*C*C*T*T*G*T*T*T*A
SEQ ID NO:4 CUR-1489 T*C*T*A*G*T*A*G*T*G*T*C*A*A*A*C*G*C*A
[00123] Модулирование нужной целевой нуклеиновой кислоты может быть осуществлена несколькими известными в данной области техники способами. Например, антисмысловые олигонуклеотиды, миРНК и т.д. Молекулы ферментативной нуклеиновой кислоты (например, рибозимы) представляют собой молекулы нуклеиновой кислоты, способные катализировать одну или несколько разнообразных реакций, включая способность многократно расщеплять другие отдельные молекулы нуклеиновой кислоты чувствительным к последовательности нуклеиновых оснований сиквенс-специфичным образом. Такие молекулы ферментативной нуклеиновой кислоты могут применяться, например, для нацеленного действия на практически любой РНК-транскрипт.
[00124] Из-за сиквенс-специфичности транс-расщепляющие молекулы ферментативной нуклеиновой кислоты являются многообещающими потенциальными терапевтическими агентами для лечения заболеваний человека. Ферментативные молекулы нуклеиновых кислот могут быть сконструированы для расщепления конкретных РНК мишеней в общем пуле клеточной РНК. Такое расщепление делает указанные мРНК нефункциональными и отменяет экспрессию белка с этой РНК. Таким образом, синтез белка, связанного с болезненным состоянием может быть избирательно заблокирована.
[00125] В общем случае, ферментативные нуклеиновые кислоты с активностью по расщеплению РНК действуют, во-первых, за счет связывания с РНК-мишенью. Такое связывание происходит посредством мишень-связывающего фрагмента ферментативной нуклеиновой кислоты, который располагается в непосредственной близости к ферментативному фрагменту указанной молекулы, расщепляющему целевую РНК. Таким образом, указанная ферментативная нуклеиновая кислота сначала распознает целевую РНК, а потом связывается с ней посредством комплементарного спаривания оснований, и после связывания с соответствующим участком ферментативно расщепляет целевую РНК. Стратегическое расщепление такой целевой РНК уничтожит ее способность к прямому синтезу кодируемого белка. После того, как ферментативная нуклеиновая кислота связала и расщепила целевую РНК, она отсоединяется от этой РНК, освобождается для другой мишени и может повторно связывать и расщеплять новые мишени.
[00126] Ряд подходов, таких как in vitro стратегии отбора (извлечения) (Orgel, (1979) Proc. R. Soc. London, В 205, 435), был использован для получения новых нуклеиновых катализаторов, способных катализировать различные реакции, такие как расщепление и лигирование фосфодиэфирных связей и амидных связей.
[00127] Получение рибозимов, обладающих оптимальной каталитической активностью, внесет существенный вклад в любую стратегию, включающую применение РНК-расщепляющих рибозимов для регулирования генной экспрессии. Рибозим типа «головка молотка», например, функционирует со скоростью каталитической реакции (kcat) приблизительно 1 мин-1 в присутствии насыщающих (10 мМ) концентраций кофактора Mg2+. Показано, что синтетический «РНК-лигазный» рибозим катализирует соответствующую реакцию самоизменения со скоростью приблизительно 100 мин-1. Кроме того, известно, что определенные модифицированные рибозимы типа «головка молота», имеющие субстрат-связывающие ДНК-»ручки», катализируют расщепление РНК со скоростями оборотов, достигающими 100 мин-1. Наконец, замещение специфического остатка каталитического ядра «головки молота» определенными нуклеотидными аналогами дает модифицированные рибозимы, демонстрирующие повышение скорости каталитической реакции вплоть до 10-кратного. Эти результаты показывают, что рибозимы могут обеспечивать химические преобразования с каталитическими скоростями, значительно превышающими таковые, демонстрируемые in vitro большинством природных саморасщепляющих рибозимов. В этом случае возможно, что структуры некоторых саморасщепляющих рибозимов можно оптимизировать, чтобы получить максимальную каталитическую активность, или что могут быть получены совершенно новые РНК мотивы, демонстрирующие значительно увеличенные скорости фосфодиэфирного расщепления РНК.
[00128] Внутримолекулярное расщепление РНК-субстрата РНК катализатором, соответствующим модели «головка молота», впервые было показано в 1987 (Uhlenbeck, О.С. (1987) Nature, 328: 596-600). Указанный РНК катализатор был выделен и вступал в реакцию с различными РНК-молекулами, подтверждая, что он действительно является катализатором.
[00129] Каталитические РНК, сконструированные на основе мотива «головка молота», применялись для расщепления специфических целевых последовательностей осуществлением подходящего спаривания оснований в каталитической РНК для обеспечения необходимого спаривания оснований с целевыми последовательностями. Это позволило применить указанную каталитическую РНК для расщепления специфических целевых последовательностей и показать, что каталитические РНК, сконструированные согласно модели «головка молота», предположительно способны расщеплять специфические субстратные РНК in vivo.
[00130] РНК-интерференция (РНКи) стала мощным инструментом модулирования генной экспрессии у млекопитающих и в клетках млекопитающих. Этот подход предполагает получение малых интерферирующих РНК (миРНК) в виде самой РНК или в виде ДНК, с применением экспрессионной плазмиды или вируса и кодирующей последовательности для малых шпилечных РНК, которые процессируются в миРНК. Эта система обеспечивает эффективный транспорт пре-миРНК в цитоплазму, где они проявляют активность, и позволяет применение регулируемых и тканеспецифичных промоторов генной экспрессии
[00131] Согласно одному из вариантов реализации олигонуклеотид или антисмысловое соединение содержит олигомер или полимер рибонуклеиновой кислоты (РНК) и/или дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК), или их миметик, химеру, аналог или гомолог. Этот термин включает олигонуклеотиды, состоящие из встречающихся в природе нуклеотидов, Сахаров и ковалентных межнуклеозидных (скелетных) связей, а также олигонуклеотиды, содержащие не встречающиеся в природе фрагменты, функционирующие сходным образом. Такие модифицированные или замещенные олигонуклеотиды часто предпочтительнее нативных форм, так как они обладают необходимыми свойствами, такими как, например, увеличенное поглощение клетками, увеличенная связывающая способность в отношении целевой нуклеиновой кислоты и повышенная стабильность в присутствии нуклеаз.
[00132] Согласно настоящему изобретению указанные олигонуклеотиды или «антисмысловые соединения» включают антисмысловые олигонуклеотиды (например, РНК, ДНК, их миметики, химеры, аналоги или гомологи), рибозимы, олигонуклеотиды внешних вспомогательных последовательностей (EGS), миРНК соединения, одно- или двуцепочечные РНК-интерферирующие (РНКи) соединения, такие как миРНК соединения, каРНК, аРНК, и другие олигомерные соединения, которые гибридизуются по меньшей мере с частью целевой нуклеиновой кислоты и модулируют ее функцию. Соответственно, они могут представлять собой ДНК, РНК, ДНК-подобные соединения, РНК-подобные соединения или их смеси, или могут представлять собой миметики одного или более из указанных соединений. Такие соединения могут представлять собой одноцепочечные, двуцепочечные, кольцевые или шпилькообразные олигомерные соединения и могут содержать структурные элементы, такие как внутренние или концевые выпетливания, некомплементарные положения или петли. Антисмысловые соединения обычно получают в виде линейных соединений, но они могут быть объединены или получены иным способом для получения кольцевых или и/или разветвленных соединений. Антисмысловые соединения могут включать такие конструкты, как, например, две гибридизованных цепи, формирующих полностью или частично двуцепочечное соединение, или одиночная цепь с достаточной самокомплементарностью для гибридизации и формирования полностью или частично двуцепочечного соединения. Указанные две цепи могут быть связаны внутренними связями, имея свободные 3' или 5' концы, или могут связываться с образованием непрерывной шпилькообразной структуры или петли. Указанная шпилькообразная структура может содержать липкий конец на 5' или на 3' конце, образующий удлинение одноцепочечного характера. Указанные двуцепочечные соединения в некоторых случаях могут содержать липкие концы. Другие модификации могут включать конъюгированные группы, присоединенные к одному из концов, нуклеотидам в определенных положениях, сахарам в определенных положениях или к одной из межнуклеозидных связей. Как вариант, указанные две цепи могут быть связаны посредством не-нуклеинового фрагмента или линкерной группы. Сформированная одиночной цепью дцРНК может принимать форму самокомплементарной шпилькообразной молекулы, складывающейся с самой собой с образованием дуплекса. Таким образом, указанные дцРНК могут быть полностью или частично двуцепочечными. Специфическое модулирование генной экспрессии может быть достигнуто стабильной экспрессией дцРНК-шпилек в трансгенных клеточных линиях. При формировании из двух цепей или одиночной цепи, принимающей форму самокомплементарной шпилькообразной молекулы, складывающейся с самой собой с формированием дуплекса, указанные две цепи (или формирующие дуплекс участки одиночной цепи) представляют собой комплементарные цепи РНК, которые спариваются по Уотсону-Крику.
[00133] При введении в систему соединения, предложенные в настоящем изобретении, могут приводить к активации одного или более ферментов или структурных белков, влияя на расщепление или иные модификации целевой нуклеиновой кислоты, либо могут действовать через механизмы «заполнения». Как правило, нуклеиновые кислоты (включая олигонуклеотиды) могут быть названы «ДНК-подобными» (т.е., как правило, содержащими один или более 2'-дезокси-сахар и, как правило, преимущественно Т, а не U, основания) или «РНК-подобными» (т.е., как правило, содержащими один или более 2'- гидроксил или 2'-модифицированные сахара и, как правило, преимущественно Т, а не U, основания). Спирали нуклеиновых кислот могут быть представлены структурами более чем одного типа, чаще всего А- и В-формами. Предполагают, что, как правило, олигонуклеотиды, имеющие структуру типа В-формы, «ДНК-подобны», а имеющие структуру типа А-формы, «РНК-подобны». Согласно некоторым вариантам реализации (с химерами) антисмысловое соединение может содержать участки как А-, так и В-формы.
[00134] Антисмысловые соединения согласно настоящему изобретению могут содержать антисмысловой фрагмент приблизительно от 5 до приблизительно 80 нуклеотидов (т.е. приблизительно от 5 до приблизительно 80 связанных нуклеозидов) длиной. Это относится к длине указанной антисмысловой цепи или части указанного антисмыслового соединения. Иными словами, одноцепочечное антисмысловое соединение, предложенное в настоящем изобретении, содержит от 5 до приблизительно 80 нуклеотидов, а двуцепочечное антисмысловое соединение, предложенное в настоящем изобретении, (такие как, например, дцРНК) содержит смысловую и антисмысловую цепь или фрагменты от 5 до приблизительно 80 нуклеотидов длиной. Специалисту в данной области техники будет ясно, что под этим понимаются антисмысловые фрагменты, составляющие в длину 5, 6, 7,8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79 или 80 нуклеотидов, или принадлежащие любому диапазону в пределах указанного.
[00135] Согласно одному из вариантов реализации антисмысловые соединения, предложенные в настоящем изобретении, содержат антисмысловые фрагменты 10-50 нуклеотидов длиной. Специалисту в данной области техники будет ясно, что сюда включены олигонуклеотиды, содержащие антисмысловые фрагменты, составляющие в длину 10, 11, 12, 13,14,15,16,17,18,19,20, 21, 22,23, 24,25, 26,27,28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, или 50 нуклеотидов, или принадлежащие любому диапазону в пределах указанного. Согласно некоторым вариантам реализации длина указанных олигонуклеотидов составляет 15 нуклеотидов.
[00136] Согласно одному из вариантов реализации антисмысловые или олигонуклеотидные соединения, предложенные в настоящем изобретении, содержат антисмысловые фрагменты, составляющие от 12 или 13 до 30 нуклеотидов в длину. Специалисту в данной области техники будет ясно, что сюда включены антисмысловые соединения, содержащие антисмысловые фрагменты, составляющие в длину 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 или 30 нуклеотидов, или принадлежащие любому диапазону в пределах указанного.
[00137] Согласно одному из вариантов реализации олигомерные соединения, предложенные в настоящем изобретении, также включают варианты, в которых в одном или нескольких положениях нуклеотидов указанного соединения присутствуют различающиеся основания. Например, если первый нуклеотид представляет собой аденозин, могут быть получены варианты, которые содержат тимидин, гуанозин или цитидин в этом положении. Это может быть осуществлено в любом положении указанного антисмыслового или дцРНК-соединения. Такие соединения затем тестируют с применением способов, описанных в настоящей заявке, для определения их способности ингибировать экспрессию целевой нуклеиновой кислоты.
[00138] Согласно некоторым вариантам реализации степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности между указанным антисмысловым соединением и мишенью составляет от приблизительно 40% до приблизительно 60%. Согласно некоторым вариантам реализации степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности составляют приблизительно от 60% до приблизительно 70%. Согласно некоторым вариантам реализации степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности составляют приблизительно от 70% до приблизительно 80%. Согласно некоторым вариантам реализации степень гомологии, идентичности последовательностей или комплементарности составляют приблизительно от 80% до приблизительно 90%. Согласно некоторым вариантам реализации гомология, идентичность последовательностей или комплементарность составляют приблизительно 90%, приблизительно 92%, приблизительно 94%, приблизительно 95%, приблизительно 96%, приблизительно 97%, приблизительно 98%, приблизительно 99% или приблизительно 100%.
[00139] Согласно одному из вариантов реализации антисмысловые олигонуклеотиды, такие как, например, молекулы нуклеиновой кислоты, представленные в последовательностях SEQ ID NOS: 3 и 4, включают одну или более чем одну замену или модификацию. Согласно одному из вариантов реализации указанные нуклеотиды заменены закрытыми нуклеиновыми кислотами (ЗНК).
[00140] Согласно одному из вариантов реализации указанные олигонуклеотиды нацелено взаимодействуют с одним или более участком молекул нуклеиновой кислоты смысловых и/или антисмысловых кодирующих и/или некодирующих последовательностей, связанных с АТОН1, и последовательностей, представленных в последовательностях SEQ ID NO: 1 и 2. Олигонуклеотиды также нацелены на перекрывающиеся участки, соответствующие SEQ ID NO: 1 и 2.
[00141] Некоторые предпочтительные олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, представляют собой химерные олигонуклеотиды. «Химерные олигонуклеотиды» или «химеры» в контексте настоящего изобретения представляют собой олигонуклеотиды, которые содержат два или более химически отличных участка, каждый из которых состоит по меньшей мере из одного нуклеотида. Такие олигонуклеотиды, как правило, содержат по меньшей мере один участок модифицированных нуклеотидов, обеспечивающий одно или более полезное свойство (такое как, например, увеличенная устойчивость к нуклеазам, увеличенное поглощение клетками, повышенная связывающая способность по отношению к мишени) и участок, который представляет собой субстрат для ферментов, способных к расщеплению РНК:ДНК или РНК:РНК гибридов. Как пример, РНКаза Н представляет собой клеточную эндонуклеазу, которая расщепляет РНК-цепь РНК:ДНК дуплекса. Активация РНКазы Н, таким образом, приводит к расщеплению целевой РНК, тем самым значительно повышая эффективность антисмыслового модулирования генной экспрессии. Соответственно, при использовании химерных олигонуклеотидов сопоставимые результаты часто могут быть получены с более короткими олигонуклеотидами, по сравнению с фосфоротиоатными дезоксиолигонуклеотидами, гибридизующимися с тем же целевым участком. Расщепление целевой РНК может быть определено стандартным способом посредством гель-электрофореза и, при необходимости, сопутствующих методик гибридизации нуклеиновых кислот, известных в данной области техники. Согласно одному из вариантов реализации химерный олигонуклеотид содержит по меньшей мере один участок, модифицированный для увеличения способности связываться с мишенью, и, как правило, участок, функционирующий как субстрат РНКазы Н. Связывающая способность олигонуклеотида по отношению к мишени (в данном случае, нуклеиновой кислоте, кодирующей ras) определяется стандартным способом измерением температуры плавления пары олигонуклеотид/мишень, представляющим собой температуру, при которой олигонуклеотид и мишень диссоциируют; диссоциацию определяют спектрофотометрически. Чем выше температура плавления, тем больше связывающая способность указанного олигонуклеотида по отношению к мишени.
[00142] Химерные антисмысловые соединения, предложенные в настоящем изобретении, могут быть получены в виде составных структур из двух или более олигонуклеотидов, модифицированных олигонуклеотидов, олигонуклеозидов и/или миметиков олигонуклеотидов согласно приведенным выше описаниям. Такие соединения также известны в данной области техники как гибриды или гапмеры. Примеры патентов США, в которых описано получение таких гибридных структур, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 5013830; 5149797; 5220007; 5256775; 5366878; 5403711; 5491133; 5565350; 5623065; 5652355; 5652356; и 5700922, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[00143] Согласно одному из вариантов реализации модифицируемый участок указанного олигонуклеотида содержит по меньшей мере один нуклеотид, модифицированный по 2' положению сахара, наиболее предпочтительно 2'-O-алкил, 2'-O-алкил-O-алкил или 2'-фтор-модифицированный нуклеотид. Согласно другому варианту реализации РНК модификации включают 2'-фтор, 2'-амино и 2'-O-метильные модификации рибозы пиримидинов, лишенные азотистого основания остатки или обратное основание на 3'-конце указанной РНК. Такие модификации олигонуклеотидов осуществляют стандартными способами; показано, что такие олигонуклеотиды имеют более высокую температуру плавления (т.е. большую способность связываться с мишенью), чем 2'-дезоксиолигонуклеотиды, относительно определенной мишени. В результате такой повышенной связывающей способности значительно усиливается ингибирование генной экспрессии РНКи-олигонуклеотидом. РНКаза Н представляет собой клеточную эндонуклеазу, расщепляющую РНК цепь РНК:ДНК дуплексов; активация этого фермента, таким образом, приводит к расщеплению целевой РНК, и, следовательно, может значительно увеличивать эффективность РНКи ингибирования. Расщепление целевой РНК может быть подтверждено обычным способом посредством гель-электрофореза. Согласно одному из вариантов реализации указанный химерный олигонуклеотид также модифицирован для увеличения устойчивости к нуклеазе. Клетки содержат множество экзо- и эндонуклеаз, способных разлагать нуклеиновые кислоты. Показано, что некоторые нуклеотидные и нуклеозидные модификации придают олигонуклеотиду, в состав которого они входят, большую устойчивость к нуклеазному расщеплению по сравнению с нативным олигодезоксинуклеотидом. Устойчивость к нуклеазам измеряют обычным способом, инкубируя олигонуклеотиды с клеточными экстрактами или растворами с выделенными нуклеазами и измеряя содержание интактных олигонуклеотидов спустя определенное время, как правило, посредством гель-электрофореза. Олигонуклеотиды, модифицированные для увеличения устойчивости к нуклеазам, остаются интактными на протяжении более длительного времени по сравнению с немодифицированными олигонуклеотидами. Показано, что ряд модификаций олигонуклеотидов усиливают или придают им устойчивость к нуклеазам. Олигонуклеотиды, которые содержат по меньшей мере одну фосфоротиоатную модификацию, на настоящий момент более предпочтительны. В некоторых случаях модификации олигонуклеотидов, усиливающие способность связываться с мишенью также, независимым образом, способны повышать устойчивость к нуклеазам.
[00144] Специфические примеры некоторых предпочтительных олигонуклеотидов, предусмотренных настоящим изобретением, включают содержащие модифицированные остовы, например, фосфоротиоаты, фосфотриэфиры, метилфосфонаты, алкильные с короткой цепью или циклоалкильные связи между сахарами или гетероатомные с короткой цепью или гетероциклические связи между сахарами. Наиболее предпочтительными являются олигонуклеотиды с фосфоротиоатными остовами и с гетероатомными остовами, в частности, СН2--NH-O-CH2, CH,--N(CH3)-O--CH2 [известный как метилен(метилимино) или MMI остов], СН2 --O--N (СН3)-СН2, СН2 -N (CH3)-N (СН3)-СН2 и O--N (СН3)-СН2 -СН2 остовы, где нативный фосфодиэфирный остов представлен в виде O-P--O-CH,). Амидные остовы, описанные в De Mesmaeker et al. (1995) Асе. Chem. Res. 28:366-374, также являются предпочтительными. Также предпочтительными являются олигонуклеотиды, содержащие морфолиновые остовы (Summerton and Weller, патент США 5034506). Согласно другому варианту реализации, такому как остов на основе пептидной нуклеиновой кислоты (ПНК), фосфодиэфирный остов олигонуклеотида заменен полиамидным остовом, нуклеотиды связаны прямо или непрямо с азотными атомами азагрупп полиамидного остова. Олигонуклеотиды могут также содержать один или более фрагмент замещенного сахара. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат один из следующих заместителей в положении 2': ОН, SH, SCH3, F, OCN, ОСН3 ОСН3, ОСН3 O(CH2)nСН3, O(CH2)n NH2 или O(СН2)n СНЗ, где n принимает значения от 1 до приблизительно 10; С1-С10 низшие алкилы, алкоксиалкокси, замещенные низшие алкилы, алкарил или аралкил; CI; Br; CN; CF3; OCF3; О--, S-, или N-алкил; О--, S--, или N-алкенил; SOCH3; SO2 СН3; ONO2; NO2; N3; NH2; гетероциклоалкил; гетероциклоалкарил; аминоалкиламино; полиалкиламино; замещенные силилы; РНК расщепляющую группу; репортерную группу; интеркалятор; группу, улучшающую фармакокинетические свойства олигонуклеотида; или группу, улучшающую фармакодинамические свойства олигонуклеотида, и другие заместители, обладающие сходными свойствами. Предпочтительная модификация включает 2'-метоксиэтокси [2'-O-СН2 СН2 ОСН3, также известный как 2'-O-(2-метоксиэтил)]. Другие предпочтительные модификации включают 2'-метокси (2'-O-СНЗ), 2'-пропокси (2'-ОСН2 СН2СН3) и 2'-фтор (2'-F). Сходные модификации могут быть также осуществлены в других положениях олигонуклеотида, в частности, по 3' положению сахара 3' концевого нуклеотида и 5' положению 5' концевого нуклеотида. Олигонуклеотиды могут также содержать миметики Сахаров, такие как циклобутилы, вместо пентофуранозильной группы.
[00145] Олигонуклеотиды могут также содержать, дополнительно или альтернативно, модификации или замены нуклеинового основания (часто называемого в данной области техники просто «основанием»). Используемые в настоящей заявке термины «немодифицированные» или «природные» нуклеотиды включают аденин (А), гуанин (G), тимин (Т), цитозин (С) и урацил (U). Модифицированные нуклеотиды включают нуклеотиды, обнаруживаемые в природных нуклеиновых кислотах редко или временно, например, гипоксантин, 6-метиладенин, 5-Ме пиримидины, в частности, 5-метилцитозин (также называемый 5-метил-2' дезоксицитозин и часто упоминаемый в данной области техники как 5-Ме-С), 5-гидроксиметилцитозин (ГМЦ), гликозил ГМЦ и гентобиозил ГМЦ, а также синтетические нуклеотиды, например, 2-аминоаденин, 2-(метиламино)аденин, 2-(имидазолилалкил)аденин, 2-(аминоалкиламино)аденин или другие гетерозамещенные алкиладенины, 2-тиоурацил, 2-тиотимин, 5-бромурацил, 5-гидроксиметилурацил, 8-азагуанин, 7-деазагуанин, N6 (6-аминогексил)аденин и 2,6-диаминопурин. «Универсальное» основание из известных в данной области техники, например, инозин, может также быть включено. Показано, что 5-Ме-С замещения увеличивают стабильность дуплексов нуклеиновых кислот на 0,6-1,2°С и на настоящий момент являются предпочтительными замещениями оснований.
[00146] Другая модификация олигонуклеотидов, предложенных в настоящем изобретении, включает химическое связывание с указанным олигонуклеотидом одного или нескольких фрагментов или конъюгатов, увеличивающих активность или поглощение клетками указанного олигонуклеотида. Такие фрагменты включают, не ограничиваясь перечисленными, липидные фрагменты, такие как фрагменты холестерина, фрагмент холестерила, алифатические цепи, например, додекандиольные или ундецильные остатки, цепь полиамина или полиэтиленгликоля, или адамантан-уксусную кислоту. Олигонуклеотиды, содержащие липофильные фрагменты, и способы получения таких олигонуклеотидов известны в данной области техники, см., например, патенты США 5138045, 5218105 и 5459255.
[00147] Необязательно, чтобы все положения конкретного нуклеотида были модифицированы единообразно, и на самом деле в одном олигонуклеотиде, или даже в одном нуклеозиде в составе олигонуклеотида может содержаться более одной из упомянутых выше модификаций. Настоящее изобретение также включает олигонуклеотиды, которые представляют собой химерные олигонуклеотиды согласно данному выше определению.
[00148] Согласно другому варианту реализации молекула нуклеиновой кислоты, предложенная в настоящем изобретении, конъюгирована с другим фрагментом, включая, но не ограничиваясь перечисленными, лишенные оснований нуклеотиды, полиэфиры, полиамины, полиамиды, пептиды, углеводороды, липиды или полиуглеводородные соединения. Специалистам в данной области техники будет ясно, что такие молекулы могут быть связаны с любым одним или более чем одним нуклеотидом, содержащим молекулу нуклеиновой кислоты, в нескольких положениях на сахаре, основании или фосфатной группе.
[00149] Олигонуклеотиды, применяемые согласно настоящему изобретению, могут быть удобно и просто получены с применением общеизвестной техники твердофазного синтеза. Оборудование для такого синтеза коммерчески доступно от ряда поставщиков, включая Applied Biosystems. Можно также применять любые другие способы такого синтеза; фактический синтез указанного олигонуклеотида не представляет трудностей для среднего специалиста в данной области техники. Также общеизвестна возможностьприменения сходных методик для получения других олигонуклеотидов, таких как фосфоротиоатные и алкилатные производные. Также общеизвестна возможность использования сходных техник и коммерчески доступных модифицированных амидитов и продуктов на основе стекла с контролируемым размером пор (CPG), таких как биотин-, флуоресцеин-, акридин- или псорален-модифицированные амидиты и/или CPG (доступные от Glen Research, Sterling VA) для синтеза флуоресцентно меченых, биотинилированных или других модифицированных олигонуклеотидов, таких как холестерин-модифицированные олигонуклеотиды.
[00150] В соответствии с настоящим изобретением подразумевается применение модификаций, например, применение мономеров ЗНК для усиления силы, специфичности и продолжительности действия и расширение диапазона путей введения олигонуклеотидов, состоящих из конкретных компонентов, таких как МОЭ, АНК, ФАНК, ФТ и т.д. Это может быть достигнуто замещением некоторых мономеров в конкретных олигонуклеотидах ЗНК-мономерами. ЗНК-модифицированный олигонуклеотид может иметь размер, соответствующий исходному соединению, или может быть больше, либо, предпочтительно, меньше. Предпочтительно, чтобы такие ЗНК-модифицированные олигонуклеотиды содержали менее чем приблизительно 70%, более предпочтительно менее чем приблизительно 60%, наиболее предпочтительно менее чем приблизительно 50% мономеров ЗНК, и чтобы их размеры составляли приблизительно от 5 до 25 нуклеотидов, более предпочтительно приблизительно от 12 до 20 нуклеотидов.
[00151] Предпочтительные модифицированные олигонуклеотидные остовы включают, не ограничиваясь перечисленными: фосфоротиоаты, хиральные фосфоротиоаты, фосфородитиоаты, фосфотриэфиры, аминоалкилфосфотриэфиры, метил- и другие алкилфосфонаты, включая З'алкиленфосфонаты и хиральные фосфонаты, фосфинаты, фосфорамидаты, включая З'-амино фосфорамидат и аминоалкилфосфорамидаты, тионофосфорамидаты, тионоалкилфосфонаты, тионоалкилфосфотриэфиры, и боранофосфаты, включающие нормальные 3'-5' связи, 2'-5' связанные аналоги, и имеющие обращенную полярность, где соседние пары нуклеозидных единиц связаны 3'-5' к 5'-3' или 2'-5' к 5'-2'. Различные соли, смешанные соли и свободные кислоты также включены.
[00152] Примеры патентов США, раскрывающих получение вышеприведенных фосфорсодержащих связей, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 3687808; 4469863; 4476301; 5023243; 5177196; 5188897; 5264423; 5276019; 5278302; 5286717; 5321131; 5399676; 5405939; 5453496; 5455233; 5466677; 5476925; 5519126; 5536821; 5541306; 5550111; 5563 253; 5571799; 5587361; и 5625050, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[00153] Предпочтительные модифицированные олигонуклеотидные остовы, не включающие атомы фосфора, образованы алкильными с короткой цепью или циклоалкильными межнуклеозидными связями, смешанными гетероатомными и алкильными или циклоалкильными межнуклеозидными связями, или одной или более гетероатомными с короткой цепью или гетероциклическими межнуклеозидными связями. Они включают остовы с морфолиновыми связями (образованными частично сахаром нуклеозида); силоксановые остовы; сульфидные, сульфоксидные и сульфоновые остовы; формацетильные и тиоформацетильные остовы; метиленформацетильные и тиоформацетильные остовы; алкенсодержащие остовы; сульфаматные остовы; метилениминовые и метиленгидразиновые остовы; сульфонатные и сульфонамидные остовы; амидные остовы; и другие, содержащие смешанные N, О, S и СН2-компоненты.
[00154] Примеры патентов США, содержащие указание по получению описанных выше олигонуклеотидов, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 5034506; 5166315; 5185444; 5214134; 5216141; 5235033; 5264562; 5264564; 5405938; 5434257;5466677; 5470967; 5489677; 5541307; 5561225; 5596086; 5602240; 5610289; 5602240; 5608046; 5610289; 5618704; 5623070; 5663312; 5633360; 5677437; и 5677439, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[00155] В других предпочтительных миметиках олигонуклеотидов и сахара, и межнуклеозидная связь, т.е. остов, нуклеотидных единиц, заменены новыми группами. Основания сохраняют для гибридизации с подходящим целевым соединением нуклеиновой кислоты. Одно из таких олигомерньгх соединений, олигонуклеотидный миметик, продемонстрировавший прекрасную способность к гибридизации, называют пептидной нуклеиновой кислотой (ПНК). В ПНК-соединениях сахарный остов олигонуклеотида заменен амидсодержащим остовом, например, аминоэтилглициновым остовом. Основания нуклеиновых кислот сохранены и связаны прямо или непрямо с азотными атомами азагрупп амидной части остова. Примеры патентов США, в которых описано получение ПНК-соединений, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 5539082; 5714331; и 5719262, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки. Дальнейшее описание ПНК-соединений можно найти у Nielsen, et al. (1991) Science 254,1497-1500.
[00156] Согласно варианту реализации изобретения олигонуклеотиды с фосфоротиоатными остовами и олигонуклеозиды с гетероатомными остовами, и в частности- CH2-NH-O-CH2-, -CH2-N (СН3)-0-СН2-, известным как метилен (метилимино) или MMI остов, - CH2-O-N (СН3)-CH2-, -CH2N(CH3)-N(CH3) СН2- и -O-N(CH3)-CH2-CH2-, где нативный фосфодиэфирный остов представлен как -O-Р-O-СН2- согласно упомянутому выше патенту США 5489677, и амидные остовы согласно упомянутому выше патенту США 5602240. Также предпочтительными являются олигонуклеотиды, содержащие морфолиновые остовы согласно вышеупомянутому патенту США 5034506.
[00157] Модифицированные олигонуклеотиды могут также содержать один или более фрагмент замещенного сахара. Предпочтительные олигонуклеотиды содержат один из следующих заместителей по положению 2': ОН; F; О-, S-, или N-алкил; О-, S-, или N-алкенил; О-, S- или N-алкинил; или О алкил-О-алкил, где указанные алкил, алкенил и алкинил могут представлять собой замещенный или незамещенный C→CO алкил или C2→CO алкенил и алкинил. В частности, предпочтительными являются O(СН2)n OmСН3, O(СН2)n, ОСН3, O(CH2)nNH2, O(CH2)nCH3, O(CH2)nONH2 и O(CH2nON(CH2)nCH3)2, где n и т могут принимать значения от 1 до приблизительно 10. Другие предпочтительные олигонуклеотиды содержат один из следующих заместителей по положению 2': С→СО, (низшие алкилы, замещенные низшие алкилы, алкарил, аралкил, О-алкарил или О-аралкил, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, SO2CH3, ONO2, NO2, N3, NH2, гетероциклоалкил, гетероциклоалкарил, аминоалкиламино, полиалкиламино, замещенные силилы, РНК расщепляющую группу, репортерную группу, интеркалятор, группу, улучшающую фармакокинетические свойства олигонуклеотида, или группу, улучшающую фармакодинамические свойства олигонуклеотида, и другие заместители, обладающие сходными свойствами. Предпочтительная модификация включает 2'-метоксиэтокси (2'-O-СН2СН2OСН3, также известную как 2'-O-(2- метоксиэтил) или 2'-МОЭ), т.е. алкоксиалкокси группу. Еще одна предпочтительная модификация включает 2'-диметиламинооксиэтокси, т.е., O(CH2)2ON(CH3)2 группу, также известную как 2'-ДМАОЭ, согласно описанию в приведенных ниже в настоящей заявке примерах, и 2'- диметиламиноэтоксиэтокси (также известной в данной области техники как 2'-O-диметиламиноэтоксиэтил или 2'-ДМАЭОЭ), т.е., 2'-O-CH2-O-CH2-N (СН2)2.
[00158] Другие предпочтительные модификации включают 2'-метокси (2'-OСН3), 2'-аминопропокси (2'-OCH2CH2CH2NH2) и 2'-фтор (2'-F). Сходные модификации могут быть также осуществлены в других положениях олигонуклеотида, в частности, по 3' положению сахара 3' концевого нуклеотида или в 2'-5'связанных олигонуклеотидах и 5' положению 5' концевого нуклеотида. Олигонуклеотиды могут также содержать миметики Сахаров, например, циклобутильные фрагменты вместо пентофуранозильного сахара. Примеры патентов США, в которых описано получение таких модифицированных сахарных структур, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 4981957; 5118800; 5319080; 5359044; 5393878; 5446137; 5466786; 5514785; 5519134; 5567811; 5576427; 5591722; 5597909; 5610300; 5627053; 5639873; 5646265; 5658873; 5670633; и 5700920, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[00159] Олигонуклеотиды могут также содержать модифицированные или замещенные нуклеиновые основания (часто называемое в данной области техники просто «основания»). В контексте настоящей заявки «немодифицированные» или «природные» нуклеотиды включают пуриновые основания аденин (А) и гуанин (G), и пиримидиновые основания тимин (Т), цитозин (C) и урацил (U). Модифицированные нуклеотиды включают другие синтетические и природные нуклеотиды, такие как 5-метилцитозин (5-me-C), 5-гидроксиметил цитозин, ксантин, гипоксантин, 2- аминоаденин, 6-метил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-пропил и другие алкильные производные аденина и гуанина, 2-тиоурацил, 2-тиотимин и 2-тиоцитозин, 5-галогенурацил и цитозин, 5-пропинил урацил и цитозин, 6-азо урацил, цитозин и тимин, 5-урацил (псевдо-урацил), 4-тиоурацил, 8-галоген, 8-амино, 8-тиол, 8-тиоалкил, 8-гидроксил и другие 8-замещенные аденины и гуанины, 5-галоген, в частности, 5-бром, 5-трифторметил и другие 5-замещенные урацилы и цитозины, 7-метилгуанин и 7-метиладенин, 8-азагуанин и 8-азааденин, 7-деазагуанин и 7-деазааденин и 3-деазагуанин и 3-деазааденин.
[00160] Далее, нуклеотиды включают описанные в патенте США 3687808, описанные в 'The Concise Encyclopedia of Polymer Science And Engineering', стр.858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, описанные у Englisch et al., 'Angewandle Chemie, International Edition', 1991, 30, стр.613, и описанные у Sanghvi, Y.S., Chapter 15, 'Antisense Research and Applications', стр.289-302, Crooke, S.T и Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993. Некоторые из этих нуклеотидов подходят, в частности, для увеличения связывающей способности олигомерных соединений, предложенных в настоящем изобретении. Такие включают 5-замещенные пиримидины, 6-азапиримидины и N-2, N-6 и 0-6 замещенные пурины, в том числе 2-аминопропиладенин, 5- пропинилурацил и 5-пропинилцитозин. 5-метилцитозиновые замещения, как было показано, повышают стабильность дуплексов нуклеиновых кислот на 0,6-1,2°С (Sanghvi, Y.S., Crooke, S.T, Lebleu, В., eds, 'Antisense Research and Applications', CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) и на настоящий момент являются предпочтительными замещениями оснований, в частности, в комбинации с 2'-0-метоксиэтиловыми модификациями Сахаров.
[00161] Примеры патентов США, в которых описано получение вышеупомянутых модифицированных нуклеотидов, а также других модифицированных нуклеотидов, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 3687808, а также 4845205; 5130302; 5134066; 5175273; 5367066; 5432272; 5457187; 5459255; 5484908; 5502177; 5525711; 5552540; 5587469; 5596091; 5614617; 5750692 и 5681941, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[00162] Другая модификация олигонуклеотидов, предложенных в настоящем изобретении, подразумевает химическое связывание с олигонуклеотидом одного или более фрагмента или конъюгата, стимулирующего активность, распределение в клетках или поглощение клетками указанного олигонуклеотида.
[00163] Такие фрагменты содержат, не ограничиваясь перечисленными, липидные фрагменты, такие как фрагменты холестерина, холевая кислота, тиоэфир, например, гексил-S-тритилтиол, тиохолестерин, алифатические цепи, например, додекандиольные или ундецильные остатки, фосфолипид, например, ди-гексадецил-гас-глицерин или триэтиламмоний 1,2-ди-О-гексадецил-гас-глицеро-3-Н-фосфонат, цепь полиамина или полиэтиленгликоля, или адамантан-уксусную кислоту, пальмитиловый фрагмент, или октадециламиновый или гексиламино-карбонил-t оксихолестериновый фрагмент.
[00164] Примеры патентов США, в которых описано получение таких олигонуклеотидных конъюгатов, включают, не ограничиваясь перечисленными, патенты США 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552 538; 5578717, 5580731; 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486 603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762 779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082 830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5 245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241, 5391723; 5416203, 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585481; 5587371; 5595726; 5597696; 5599923; 5599 928 и 5688941, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[00165] Поиск новых лекарственных средств: Соединения, предложенные в настоящем изобретении, могут также применяться для поиска новых лекарств и валидации мишеней. Настоящее изобретение включает применение описанных в настоящей заявке соединений и предпочтительных целевых сегментов при поиске новых лекарственных средств для выяснения взаимосвязей, существующих между полинуклеотидами Атонального гомолога 1 (АТОН1) и болезнью, фенотипом или состоянием. Такие способы включают определение или модуляцию полинуклеотидов АТОН1, включая контактирование образца, ткани, клетки или организма с соединениями, предложенными в настоящем изобретении, измерение уровня нуклеиновой кислоты или белка полинуклеотидов АТОН1 и/или оценка соответствующего фенотипического или химического конечного состояния через некоторое время после лечения, и, в некоторых случаях, сравнение измеряемой величины с необработанными образцами или образцами, обработанными другими предложенными в настоящем изобретении соединениями. Эти способы могут применяться параллельно или в комбинации с другими экспериментами по определению функций неизвестных генов в процессе валидации мишеней или для определения обоснованности применения конкретного генного продукта в качестве мишени для лечения или предотвращения конкретного заболевания, состояния или фенотипа.
Оценка повышающего регулирования или ингибирования экспрессии генов:
[00166] Перенос экзогенной нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина или в организм-хозяина может быть оценен прямым определением присутствия указанной нуклеиновой кислоты в указанных клетке или организме. Такое определение может быть проведено несколькими известными специалистам в данной области техники способами. Например, присутствие экзогенной нуклеиновой кислоты может быть определено посредством саузерн-блоттинга или полимеразной цепной реакции (ПЦР) с применением праймеров, специфически амплифицирующих нуклеотидные последовательности, связанные с указанной нуклеиновой кислотой. Экспрессия указанных экзогенных нуклеиновых кислот также может быть измерена с применением общепринятых способов, в том числе анализа генной экспрессии. Например, иРНК, полученная из экзогенной нуклеиновой кислоты, может быть обнаружена и количественно определена с применением нозерн-блоттинга и ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР).
[00167] Экспрессия РНК с указанной экзогенной нуклеиновой кислоты может также быть определена измерением ферментативной активности или активности репортерного белка. Например, антисмысловая модулирующая активность может быть непрямо измерена через понижение или повышение экспрессии целевой нуклеиновой кислоты в качестве показателя того, что экзогенная нуклеиновая кислота производит эффекторную РНК. Используя консервативность последовательностей, возможно сконструировать праймеры и использовать для амплификации кодирующих участков указанных генов-мишеней. Сначала может быть использована наиболее активно экспрессируемая кодирующая область каждого гена для построения модели контрольного гена, хотя может быть использована любая кодирующая или некодирующая область. Каждый контрольный ген получен встраиванием каждой кодирующей области между кодирующей репортер областью и ее поли(A)-сигналом. Эти плазмиды производят иРНК с репортерным геном в вышележащей части гена и потенциальной мишенью РНКи в 3' некодирующей области. Эффективность индивидуальных антисмысловых олигонуклеотидов может быть проанализирована по модулированию репортерного гена. Репортерные гены, подходящие для применения в способах, предложенных в настоящем изобретении, включают гены синтазы ацетогидроксикислот (АГКС), щелочной фосфатазы (ЩФ), бетагалактозидазы (LacZ), бета глюкоронидазы (GUS), хлорамфеникол ацетилтрансферазы (ХАТ), зеленого флуоресцентного белка (GFP), красного флуоресцентного белка (RFP), желтого флуоресцентного белка (YFP), голубого флуоресцентного белка (CFP), пероксидазы хрена (ПОХ), люциферазы (Luc), нопалин синтазы (NOS), октопин синтазы (OCS) и их производных. Доступны различные селективные маркеры, придающие устойчивость к ампициллину, блеомицину, хлорамфениколу, гентамицину, гигромицину, канамицину, линкомицину, метотрексату, фосфинотрицину, пуромицину и тетрациклину. Способы определения модулирования репортерного гена хорошо известны в данной области техники, и включают, не ограничиваясь перечисленными: флуорометрические способы (например, флуоресцентная спектроскопия, сортировка флуоресцентно-активированных клеток (FACS), флуоресцентная микроскопия), определение устойчивости к антибиотику.
[00168] Экспрессия белка и иРНК АТОН1 может быть проанализирована с применением известных специалистам в данной области техники способов, описанных в любом из разделов настоящей заявки. Например, для измерения уровней белка могут применяться методы иммуноанализа, такие как ELISA. Наборы ELISA для анализа АТОН1 коммерчески доступны, например, от R&D Systems (Minneapolis, MN).
[00169] Согласно вариантам реализации экспрессия АТОН1 (например, иРНК или белка) в образце (например, в клетках или тканях in vivo или in vitro), обработанном с применением антисмыслового олигонуклеотида, предложенного в настоящем изобретении, оценивается посредством сравнения с экспрессией АТОН1 в контрольном образце. Например, экспрессия белка или нуклеиновой кислоты может сравниваться с применением известных специалистам в данной области техники способов с таковой в плацебо-образце или в необработанном образце. Как вариант, может быть проведено сравнение с образцом, обработанным контрольным антисмысловым олигонуклеотидом (например, имеющим измененную или иную последовательность), в зависимости от того, какую информацию необходимо получить. Согласно другому варианту реализации различие в экспрессии белка или нуклеиновой кислоты АТОН1 между необработанным и обработанным образцами может сравниваться с различием в экспрессии различных нуклеиновых кислот (включая любые стандартные, признанные исследователем подходящими, например, конститутивный ген) в обработанном и необработанном образцах.
[00170] Наблюдаемые различия могут быть выражены в удобной форме, например, в виде пропорции или доли, для сравнения с контролем. Согласно вариантам реализации уровень иРНК или белка АТОН1 в образце, обработанном антисмысловым олигонуклеотидом, предложенным в настоящем изобретении, повышается или снижается приблизительно 1,25-кратно-10-кратно или более относительно необработанного образца или образца, обработанного контрольной нуклеиновой кислотой. Согласно вариантам реализации уровень иРНК или белка АТОН1 повышается или снижается по меньшей мере приблизительно 1,25-кратно, по меньшей мере приблизительно 1,3-кратно, по меньшей мере приблизительно 1,4-кратно, по меньшей мере приблизительно 1,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 1,6-кратно, по меньшей мере приблизительно 1,7-кратно, по меньшей мере приблизительно 1,8-кратно, по меньшей мере приблизительно 2-кратно, по меньшей мере приблизительно 2,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 3-кратно, по меньшей мере приблизительно 3,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 4-кратно, по меньшей мере приблизительно 4,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 5-кратно, по меньшей мере приблизительно 5,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 6-кратно, по меньшей мере приблизительно 6,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 7-кратно, по меньшей мере приблизительно 7,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 8-кратно, по меньшей мере приблизительно 8,5-кратно, по меньшей мере приблизительно 9-кратно, по меньшей мере приблизительно 9,5-кратно, или по меньшей мере приблизительно 10-кратно или более.
Наборы, исследования реагенты, диагностика и терапия
[00171] Соединения, предложенные в настоящем изобретении, можно применять для диагностики, лечения и профилактики, а также в качестве реагентов для исследований и компонентов наборов. Кроме того, антисмысловые олигонуклеотиды, способные ингибировать генную экспрессию с высокой специфичностью, часто используются специалистами в данной области техники для выяснения функций отдельных генов или распознавания функций различных компонентов биологического пути.
[00172] Для применения в наборах и для диагностики, и в различных биологических системах, соединения, предложенные в настоящем изобретении, по отдельности или в комбинации с другими соединениями или терапевтическими средствами подходят в качестве инструмента дифференциального и/или комбинаторного анализа для определения паттернов экспрессии части или всего набора генов, экспрессируемых в клетках и тканях.
[00173] Используемый в настоящей заявке термин «биологическая система» или «система» определен как любой организм, клетка, клеточная культура или ткань, экспрессирующая, или с приобретенной способностью экспрессировать, продукты Атонального гомолога 1 (АТОН1). Они включают, не ограничиваясь перечисленными: человека, трансгенных животных, клетки, культуры клеток, ткани, ксенотрансплантаты, трансплантаты и их комбинации.
[00174] Согласно одному из неограничивающих примеров паттерны экспрессии в клетках или тканях, обработанных одним или несколькими антисмысловыми соединениями, сравнивают с контрольными клетками или тканями, не обработанными антисмысловыми соединениями, и исходя из полученных паттернов анализируют дифференциальные уровни генной экспрессии, так как они связаны, например, с болезнью, сигнальными путями, локализацией в клетках, уровнями экспрессии, размером, структурой или функцией изучаемых генов. Эти исследования могут быть выполнены на стимулированных или не стимулированных клетках в присутствии или в отсутствие других соединений, которые влияют на паттерны экспрессии.
[00175] Примеры способов анализа генной экспрессии, известных в данной области техники, включают анализ на ДНК-чипах или на микрочипах, SAGE (серийный анализ экспрессии генов), READS (рестриктазная амплификация расщепляемых кДНК), TOGA (полный анализ генной экспрессии), белковые чипы и протеомику, секвенирование меток экспрессируемой последовательности (EST), вычитающий РНК фингерпринтинг (SuRF), вычитающее клонирование, дифференциальный дисплей (DD), сравнительная геномная гибридизация, FISH (флуоресцентная гибридизация in situ) и масс-спектрометрические методы.
[00176] Соединения, предложенные в настоящем изобретении, подходят для исследований и диагностики, поскольку такие соединения гибридизуются с нуклеиновыми кислотами, кодирующими Атональный гомолог 1 (АТОН1). Например, олигонуклеотиды, гибридизующиеся с эффективностью и в условиях, описанных в настоящей заявке, являясь эффективными модуляторами АТОН1, представляют собой эффективные праймеры или зонды в условиях, благоприятных для амплификации или определения гена, соответственно. Такие праймеры и зонды подходят для способов, требующих специфического определения молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих АТОН1, и для амплификации указанных молекул нуклеиновой кислоты для определения или для применения в дальнейших исследованиях АТОН1. Гибридизация указанных антисмысловых олигонуклеотидов, в частности, праймеров и зондов, предложенных в настоящем изобретении, с нуклеиновой кислотой, кодирующей АТОН1, может быть определена при помощи известных в данной области техники способов. Такие способы могут включать конъюгирование фермента с указанным олигонуклеотидом, радиоактивное мечение указанного олигонуклеотида и любые другие подходящие способы детекции. Могут также быть подготовлены наборы для определения уровней АТОН1 в образце при помощи таких способов определения.
[00177] Специфичность и чувствительность антисмысловых соединений также используются специалистами в данной области техники для терапевтических целей. Антисмысловые соединения применялись в качестве терапевтических компонентов при лечении болезненных состояний у животных, в том числе человека. Лекарственные средства на основе антисмысловых олигонуклеотидов безопасно и эффективно вводили людям, и в настоящее время проводятся многочисленные клинические испытания. Таким образом, установлено, что антисмысловые соединения могут применяться в качестве терапевтических средств, которые могут быть модифицированы под терапевтические схемы для лечения клеток, тканей и животных, в особенности человека.
[00178] В случае терапевтических средств животное, предпочтительно человек, у которого, предположительно, имеется заболевание или расстройство, лечение которого может проводиться модулированием экспрессии полинуклеотидов АТОН1, получает лечение в виде введения антисмысловых соединений в соответствии с настоящим изобретением. Например, согласно одному из неограничивающих вариантов реализации указанные способы включают этап введения животному, нуждающемуся в лечении, терапевтически эффективного количества модулятора АТОН1. Модуляторы АТОН1, предложенные в настоящем изобретении, эффективно модулируют активность АТОН1 или модулируют экспрессию белка АТОН1. Согласно одному из вариантов реализации указанные активность или экспрессия АТОН1 у животного подавлены приблизительно на 10% по сравнению с контролем. Предпочтительно, указанные активность или экспрессия АТОН1 у животного подавлены приблизительно на 30%. Более предпочтительно, указанные активность или экспрессия АТОН1 у животного подавлены приблизительно на 50% или более. Таким образом, указанные олигомерные соединения модулируют экспрессию иРНК Атонального гомолога 1 (АТОН1) по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, или на 100% относительно контроля.
[00179] Согласно одному из вариантов реализации указанные активность и/или экспрессия Атонального гомолога 1 (АТОН1) у животного повышены приблизительно на 10% по сравнению с контролем. Предпочтительно, указанные активность или экспрессия АТОН1 у животного повышены приблизительно на 30%. Более предпочтительно, указанные активность или экспрессия АТОН1 у животного повышены на 50% или более. Таким образом, указанные олигомерные соединения изменяют экспрессию иРНК АТОН1 по меньшей мере на 10%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 25%, по меньшей мере на 30%, по меньшей мере на 40%, по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 60%, по меньшей мере на 70%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 80%, по меньшей мере на 85%, по меньшей мере на 90%, по меньшей мере на 95%, по меньшей мере на 98%, по меньшей мере на 99%, или на 100% относительно контроля.
[00180] Например, снижение экспрессии Атонального гомолога 1 (АТОН1) может быть определено в сыворотке, крови, жировой ткани, печени или любой другой жидкости организма, ткани или органе указанного животного. Предпочтительно, клетки, содержащиеся в указанных анализируемых жидкостях, тканях или органах, содержат молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую пептиды АТОН1 и/или собственно белок АТОН1.
[00181] Соединения, предложенные в настоящем изобретении, можно применять для фармацевтических композиций посредством добавления эффективного количества соединения к подходящему фармацевтически приемлемому разбавителю или носителю. Применение соединений и способов, предложенных в настоящем изобретении, может также подходить для профилактики.
Коньюгаты
[00182] Другая модификация олигонуклеотидов, предложенных в настоящем изобретении, включает химическое связывание с указанным олигонуклеотидом одного или нескольких фрагментов или конъюгатов, которые повышают активность, усиливают клеточное распределение или поглощение клетками указанного олигонуклеотида. Такие фрагменты или конъюгаты могут включать конъюгированные группы, ковалентно связанные с функциональными группами, такими как первичные или вторичные гидроксильные группы. Конъюгированные группы, предложенные в настоящем изобретении, включают интеркаляторы, репортерные молекулы, полиамины, полиамиды, полиэтиленгликоли, простые полиэфиры, группы, улучшающие фармакодинамические свойства олигомеров, и группы, улучшающие фармакокинетические свойства олигомеров. Типовые конъюгированные группы включают холестерины, липиды, фосфолипиды, биотин, феназин, фолат, фенантридин, антрахинон, акридин, флуоресцеины, родамины, кумарины и красители. Группы, усиливающие фармакодинамические свойства, в контексте настоящего изобретения включают группы, улучшающие поглощение, повышающие сопротивление разрушению и/или усиливающие сиквенс-специфичную гибридизацию с целевой нуклеиновой кислотой. Группы, улучшающие фармакокинетические свойства, в контексте настоящего изобретения включают группы, улучшающие поглощение, распределение, метаболизм или выведение соединений, предложенных в настоящем изобретении. Типовые конъюгированные группы описаны в международной заявке на патент PCT/US92/09196, поданной 23 октября 1992, и патенте США 6287860, включенных в настоящую заявку посредством ссылки. Конъюгированные фрагменты включают, не ограничиваясь перечисленными: липидные фрагменты, такие как фрагменты холестерина, холевую кислоту, тиоэфир, например, гексил-5-тритилтиол, тиохолестерин, алифатические цепи, например, додекандиольные или ундецильные остатки, фосфолипид, например, ди-гексадецил-гас-глицерин или триэтиламмоний 1,2-ди-О-гексадецил-гас-глицеро-3-Нфосфонат, цепь полиамина или полиэтиленгликоля, или адамантан-уксусную кислоту, пальмитиловый фрагмент, октадециламин или фрагмент гексиламино-карбонил-оксихолестерина. Олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, могут быть также конъюгированы с активными лекарственными веществами, например, аспирином, варфарином, фенилбутазоном, ибупрофеном, супрофеном, фенбуфеном, кетопрофеном, (S)-(+)-пранопрофеном, карпрофеном, дансилсаркозином, 2,3,5-трийодбензойной кислотой, флуфенамовой кислотой, фолиновой кислотой, бензотиадиазидом, хлортиазидом, диазепином, индометицином, барбитуратом, цефалоспорином, сульфамидным препаратом, антидиабетическим средством, антибактериальным веществом или антибиотиком.
[00183] Примеры патентов США, в которых описано получение таких олигонуклеотидных конъюгатов, включают, не ограничиваясь перечисленными: патенты США 4828979; 4948882; 5218105; 5525465; 5541313; 5545730; 5552538; 5578717, 5580731; 5580731; 5591584; 5109124; 5118802; 5138045; 5414077; 5486603; 5512439; 5578718; 5608046; 4587044; 4605735; 4667025; 4762779; 4789737; 4824941; 4835263; 4876335; 4904582; 4958013; 5082830; 5112963; 5214136; 5082830; 5112963; 5214136; 5245022; 5254469; 5258506; 5262536; 5272250; 5292873; 5317098; 5371241, 5391723; 5416203, 5451463; 5510475; 5512667; 5514785; 5565552; 5567810; 5574142; 5585481;5587371;5595726;5597696;5599923; 5599928 и 5688941.
Составы
[00184] Соединения, предложенные в настоящем изобретении, также могут быть смешаны, инкапсулированы, конъюгированы или иным образом связаны с другими молекулами, молекулярными структурами или смесями соединений, например, липосомами, молекулами-мишенями рецепторов, составами для перорального, ректального, местного или иного пути введения, для способствования поглощению, распределению и/или абсорбции. Примеры патентов США, в которых описано получение таких способствующих поглощению, распределению и/или абсорбции составов, включают, не ограничиваясь перечисленными: патенты США 5108921; 5354844; 5416016; 5459127; 5521291; 5543165; 5547932; 5583020; 5591721; 4426330; 4534899; 5013556; 5108921; 5213804; 5227170; 5264221; 5356633; 5395619; 5416016; 5417978; 5462854; 5469854; 5512295; 5527528; 5534259; 5543152; 5556948; 5580575; и 5595756, каждый из которых включен в настоящую заявку посредством ссылки.
[00185] Хотя указанные антисмысловые олигонуклеотиды не обязательно должны вводиться при помощи вектора, чтобы модулировать экспрессию и/или функцию мишени, варианты реализации настоящего изобретения включают векторные конструкции для экспрессии антисмысловых олигонуклеотидов, включая промоторы, последовательности генов составных промоторов и обладающие выраженной конститутивной промоторной активностью, или промоторной активностью, которая может быть индуцирована при необходимости.
[00186] Согласно одному из вариантов реализации осуществление изобретения включает введение по меньшей мере одного из вышеуказанных антисмысловых олигонуклеотидов при помощи подходящей системы доставки на основе нуклеиновой кислоты. Согласно одному из вариантов реализации такая система включает невирусный вектор, функционально связанный с указанным полинуклеотидом. Примеры таких невирусных векторов включают собственно олигонуклеотид (например, любая(ые) из последовательностей SEQ ID NO: 3 и 4) или его комбинацию с подходящим белковым, полисахаридным или липидным составом.
[00187] Дополнительно, подходящие системы доставки нуклеиновой кислоты включают вирусные векторы, как правило, на основе последовательности одного или нескольких аденовирусов, аденоассоциированного вируса (ААВ), хелпер-зависимого аденовируса, ретровируса, или липосомального комплекса с японским гемагглютинирующим вирусом (HVJ). Предпочтительно, указанный вирусный вектор содержит сильный эукариотический промотор, функционально связанный с указанным полинуклеотидом, например, промотор цитомегаловируса (ЦМВ).
[00188] Дополнительные предпочтительные векторы включают вирусные векторы, белки слияния и химические конъюгаты. Ретровирусные векторы включают вирусы мышиного лейкоза Молони и ВИЧ-вирусы. Один из предпочтительных ВИЧ-вирусных векторов содержит по меньшей мере два вектора, где гены gag и pol происходят из генома ВИЧ, а ген env - из другого вируса. Предпочтительными являются ДНК-вирусные векторы. Такие векторы включают pox-векторы, такие как ортопокс- или авипокс-векторы, герпесвирусные векторы, такие как векторы на основе вируса простого герпеса (HSV) I, аденовирусные векторы и векторы на основе аденоассоциированного вируса.
[00189] Антисмысловые соединения, предложенные в настоящем изобретении, включают любые фармацевтически приемлемые соли, сложные эфиры или соли таких сложных эфиров, или любое другое соединение, которое при введении животному, включая человека, способно обеспечить получение (прямо или непрямо) биологически активного метаболита или его компонента.
[00190] Термин «фармацевтически приемлемые соли» относится к физиологически и фармацевтически приемлемым солям соединений, предложенных в настоящем изобретении: т.е. солям, сохраняющим необходимую биологическую активность исходного соединения и, кроме того, не дающих нежелательных токсических эффектов. Предпочтительные примеры фармацевтически приемлемых солей олигонуклеотидов и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860, включенном в настоящую заявку посредством ссылки.
[00191] Настоящее изобретение также включает фармацевтические композиции и составы, содержащие антисмысловые соединения, предложенные в настоящем изобретении. Фармацевтические композиции, предложенные в настоящем изобретении, могут вводиться различными способами в зависимости от того, требуется ли местное или системное лечение, и от того, на какую область необходимо воздействовать. Введение может быть местным (в том числе через глаза и через слизистые оболочки, включая вагинальное и ректальное введение), через легкие, например, посредством вдыхания или вдувания порошков или аэрозолей, в том числе при помощи небулайзера; интратрахеально, интраназально, эпидермально и трансдермально), пероральным или парентеральным. Парентеральное введение включает внутривенные, внутриартериальные, подкожные, внутрибрюшинные или внутримышечные инъекцию или инфузию; или внутричерепное, например, интратекальное или интравентрикулярное, введение.
[00192] При лечении тканей центральной нервной системы введение может осуществляться, например, инъекцией или инфузией в спинномозговую жидкость. Введение антисмысловой РНК в спинномозговую жидкость описано, например, в заявке на патент США, опубликованной под номером 2007/0117772, "Methods for slowing familial ALS disease progression)) («Способы замедления развития наследственного заболевания БАС»), включенной в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте.
[00193] Если предполагается введение антисмыслового олигонуклеотида, предложенного в настоящем изобретении, в клетки центральной нервной системы, введение может осуществляться совместно с одним или несколькими агентами, способными обеспечить проникновение указанного антисмыслового олигонуклеотида через гематоэнцефалический барьер. Инъекция может быть сделана, например, в энторинальную область коры или гиппокамп.Доставка нейротрофических факторов введением аденовирусного вектора в двигательные нейроны мышечной ткани описана, например, в патенте США 6632427, "Adenoviral-vector-mediated gene transfer into medullary motor neurons» («Перенос генов в двигательные нейроны мозга, опосредованный аденовирусным вектором»), включенном в настоящую заявку посредством ссылки. Доставка векторов непосредственно в мозг, например, в стриатум, таламус, гиппокамп или черную субстанцию известна в данной области техники и описана, например, в патенте США 6756523, «Adenoviras vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system particularly in brain» («Аденовирусные векторы для переноса чужеродных генов в клетки центральной нервной системы, в частности, клетки мозга»), включенном в настоящую заявку посредством ссылки. Введение может быть быстрым в случае инъекции или осуществляться в течение некоторого промежутка времени в случае медленной инфузии или введения составов с замедленным высвобождением.
[00194] Рассматриваемые антисмысловые олигонуклеотиды могут быть связаны или конъюгированы с агентами, обеспечивающими необходимые фармацевтические или фармакокинетические свойства. Например, указанный антисмысловой олигонуклеотид может сочетаться с любым веществом, которое, как известно в данной области техники, способствует проникновению или транспорту через гематоэнцефалический барьер, таким как антитело к рецептору трансферрина, и вводимому путем внутривенной инъекции. Указанное антисмысловое соединение может быть связано с вирусным вектором, например, придающим указанному антисмысловому соединению большую эффективность и/или усиливающим транспорт указанного антисмыслового соединения через гематоэнцефалический барьер. Осмотическое преодоление гематоэнцефалического барьера может также быть достигнуто, например, инфузией Сахаров, включая, но не ограничиваясь перечисленными, мезоэритрит, ксилит, D(+) галактозу, D(+) лактозу, D(+) ксилозу, дульцит, миоинозитол, L(-) фруктозу, D(-) маннит, D(+) глюкозу, D(+) арабинозу, D(-) арабинозу, целлобиозу, D(+) мальтозу, D(+) раффинозу, L(+) рамнозу, D(+) мелибиозу, D(-) рибозу, адонит, D(+) арабит, L(-) арабит, D(+) фукозу, L(-) фукозу, D(-) ликсозу, L(+) ликсозу и L(-) ликсозу, или аминокислот, включая, но не ограничиваясь перечисленными, глутамин, лизин, аргинин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, цистеин, глутаминовую кислоту, глицин, гистидин, лейцин, метионин, фенилаланин, пролин, серии, треонин, тирозин, валин и таурин. Способы и материалы для повышения проникновения через гематоэнцефалический барьер описаны, например, в патенте США 4866042, «Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier» («Способы доставки генетического материала через гематоэнцефалический барьер»), патенте США 6294520, «Material for passage through the blood-brain barrier» («Материал для прохождения через гематоэнцефалический барьер») и патенте США 6936589, «Parenteral delivery systems» («Парентеральные системы доставки»), включенных в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте.
[00195] Рассматриваемые антисмысловые соединения могут быть смешаны, инкапсулированы, конъюгированы или иным образом связаны с другими молекулами, молекулярными структурами или смесями соединений, например, липосомами, молекулами-мишенями рецепторов, составами для перорального, ректального, местного или иного пути введения, для способствования поглощению, распределению и/или абсорбции. Например, катионные липиды могут также быть включены в указанный состав для облегчения поглощения олигонуклеотидов. Одной из таких композиций, как показано, способствующей поглощению, является LIPOFECTIN (доступный у GIBCO-BRL, Bethesda, MD).
[00196] Олигонуклеотиды, содержащие по меньшей мере одну 2'-O-метоксиэтильную модификацию, предположительно подходят, в частности, для перорального введения. Фармацевтические композиции и составы для местного применения могут включать трансдермальные пластыри, мази, лосьоны, кремы, гели, капли, суппозитории, спреи, жидкости и порошки. Обычные фармакологические носители, водные, порошковые или масляные основы, загустители и т.п. могут быть необходимы или желательны. Подходящие применения включают также покрытия для презервативов, перчаток и т.п.
[00197] Фармацевтические составы, предложенные в настоящем изобретении, которые могут быть представлены в виде удобной единичной дозированной формы, могут быть получены согласно общепринятым методикам, хорошо известным в области фармацевтической индустрии. Такие техники включают этап соединения активных ингредиентов с фармацевтическими носителями и вспомогательными веществами. Как правило, указанные составы получают равномерным глубоким соединением активных ингредиентов с жидкими носителями или тонкомолотыми твердыми носителями, или с ними обоими, и затем, при необходимости, придают продукту форму.
[00198] Композиции, предложенные в настоящем изобретении, могут быть получены в виде любой из многих возможных лекарственных форм, включая, но не ограничиваясь перечисленными, таблетки, капсулы, гелевые капсулы, жидкие сиропы, мягкие гели, суппозитории и клизмы. Композиции, предложенные в настоящем изобретении, могут также быть получены в виде суспензий на основе водных, неводных или смешанных сред. Водные суспензии могут дополнительно содержать вещества, увеличивающие вязкость суспензии, включая, например, натрия карбоксиметилцеллюлозу, сорбит и/или декстран. Указанная суспензия может также содержать стабилизаторы.
[00199] Фармацевтические композиции, предложенные в настоящем изобретении, включают, не ограничиваясь перечисленными: растворы, эмульсии, пены и содержащие липосомы составы. Фармацевтические композиции и составы, предложенные в настоящем изобретении, могут содержать один или более усилители проникновения, носители, вспомогательные вещества или другие активные или неактивные ингредиенты.
[00200] Эмульсии представляют собой, как правило, гетерогенные системы, где одна жидкость распределена в другой в виде капель, как правило, более 0,1 мкм в диаметре. Эмульсии могут содержать дополнительные компоненты помимо дисперсных фаз, и активное лекарственное вещество может присутствовать в растворе в водной фазе, масляной фазе или быть представлено отдельной фазой. Микроэмульсии также относятся к вариантам реализации настоящего изобретения. Эмульсии и их применение хорошо известны в данной области техники и подробнее описаны в патенте США 6287860.
[00201] Составы, предложенные в настоящем изобретении, включают липосомальные составы. В контексте настоящего изобретения термин «липосома» означает пузырьки, состоящие из амфифильных липидов, образующих один или более чем один сферический бислой. Липосомы представляют собой однослойные или многослойные пузырьки с мембраной, образованной липофильными веществами и водной внутренней фазой, где содержится композиция, которую необходимо доставить. Катионные липосомы представляют собой положительно заряженные липосомы, которые предположительно взаимодействуют с отрицательно заряженными молекулами ДНК с образованием стабильного комплекса. pH-чувствительные или отрицательно заряженные липосомы, предположительно, скорее захватывают ДНК, чем образуют с ней комплексы. Как катионные, так и некатионные липосомы применялись для доставки ДНК в клетки.
[00202] Липосомы также включают «стерически стабилизированные» липосомы, что при использовании в настоящей заявке относится к липосомам, содержащим один или более специализированный липид. После включения в липосомы эти специализированные липиды образуют липосомы с увеличенной продолжительностью существования по сравнению с липосомами, не содержащими таких специализированных липидов. Примеры стерически стабилизированных липосом являются такие, в которых часть образующего пузырек липидного компонента липосомы содержит один или более гликолипид или дериватизирован одним или несколькими гидрофильными полимерами, таких как фрагмент полиэтиленгликоля (ПЭГ). Липосомы и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860.
[00203] Фармацевтические составы и композиции, предложенные в настоящем изобретении, могут также включать поверхностно-активные вещества. Применение поверхностно-активных веществ в лекарственных продуктах, составах и эмульсиях хорошо известно в данной области техники. Поверхностно-активные вещества и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860, включенном в настоящую заявку посредством ссылки.
[00204] Согласно одному из вариантов реализации настоящее изобретение включает различные усилители проникновения, способствующие эффективной доставке нуклеиновых кислот, в частности, олигонуклеотидов. Кроме способствования диффузии нелипофильных препаратов через клеточные мембраны, усилители проникновения повышают проникающую способность липофильных препаратов. Усилители проникновения могут быть разделены на пять больших категорий, а именно, поверхностно-активные вещества, жирные кислоты, соли желчных кислот, хелатирующие агенты, и нехелатирующие не-ПАВ-вещества. Усилители проникновения и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860, включенном в настоящую заявку посредством ссылки.
[00205] Специалисту в данной области техники будет понятно, что составы получают согласно стандартным методикам в соответствии с их назначением, т.е. способом введения.
[00206] Предпочтительные составы для местного применения включают такие, в которых олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, смешаны с агентами для местного введения, такими как липиды, липосомы, жирные кислоты, сложные эфиры жирных кислот, стероиды, хелатирующие агенты и поверхностно-активные вещества. Предпочтительные липиды и липосомы включают нейтральные (например, диолеилфосфатидил DOPE этаноламин, димиристоилфосфатидил холин DMPC, дистеаролфосфатидилхолин) отрицательно заряженные (например, димиристоилфосфатидил глицерина DMPG) и катионные (например, диолеилтетраметиламинопропил DOTAP и диолеилфосфатидил этаноламин DOTMA).
[00207] Для местного или другого применения олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, могут быть инкапсулированы в липосомы или входить в состав липосомальных комплексов, в частности, с катионными липосомами. Как вариант, олигонуклеотиды могут входить в состав липидных комплексов, в частности с катионными липидами. Предпочтительные жирные кислоты и сложные эфиры, их фармацевтически приемлемые соли, и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860.
[00208] Композиции и составы для перорального введения включают порошки или гранулы, содержащие микрочастицы, наночастицы, суспензии или растворы в воде или неводных средах, капсулы, гелевые капсулы, порционные упаковки, таблетки или минитаблетки. Присутствие загустителей, вкусоароматических агентов, разбавителей, эмульгаторов, диспергирующих агентов или связующих веществ может быть желательным. Предпочтительными составами для перорального приема являются такие, в которых олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, вводятся совместно с одним или несколькими усилителями проникновения, поверхностно-активными веществами и хелатирующими веществами. Предпочтительные поверхностно-активные вещества включают жирные кислоты и/или сложные эфиры или их соли, желчные кислоты и/или их соли. Предпочтительные желчные кислоты/соли и жирные кислоты и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860, включенном в настоящую заявку посредством ссылки. Также предпочтительными являются комбинации усилителей проникновения, например, жирные кислоты/соли в комбинации с желчными кислотами/солями. В частности, предпочтительной является комбинация натриевой соли лауриновой кислоты, каприновой кислоты и УДХК. Другие усилители проникновения включают полиоксиэтилен-9-лауриловый эфир, полиоксиэтилен-20-цетиловый эфир. Олигонуклеотиды, предложенные в настоящем изобретении, могут быть введены перорально, в гранулированной форме, включая высушенные распылением частицы, или в составе комплексов микро- или наночастиц. Комплексообразующие агенты для олигонуклеотидов и их применение подробнее описаны в патенте США 6287860, включенном в настоящую заявку посредством ссылки.
[00209] Композиции и составы для парентерального, интратекального или интравентрикулярного введения могут включать стерильные водные растворы, которые могут также содержать буферы, разбавители и другие подходящие добавки, включая, но не ограничиваясь перечисленными, усилители проникновения, переносчики и другие фармацевтически приемлемые носители или вспомогательные вещества.
[00210] Определенные варианты реализации настоящего изобретения включают фармацевтические композиции, содержащие одно или более олигомерное соединение и один или более другой химиотерапевтический агент, действующий с помощью не-антисмыслового механизма. Примеры таких химиотерапевтических агентов включают, не ограничиваясь перечисленными, химиотерапевтические лекарственные средства для лечения рака, такие как даунорубицин, дауномицин, дактиномицин, доксорубицин, эпирубицин, идарубицин, эзорубицин, блеомицин, мафосфамид, ифосфамид, цитозина арабинозид, бис-хлорэтил-нитрозомочевина, бусульфан, митомицин С, актиномицин D, митрамицин, преднизон, гидроксипрогестерон, тестостерон, тамоксифен, дакарбазин, прокарбазин, гексаметилмеламин, пентаметилмеламин, митоксантрон, амсакрин, хлорамбуцил, метилциклогексилнитрозомочевина, мустарген, мелфалан, циклофосфамид, 6-меркаптопурин, 6-тиогуанин, цитарабин, 5-азацитидин, гидроксимочевина, дезоксикоформицин, 4-гидроксипероксицикло-фосфорамид, 5-фторурацил (5-FU), 5-фтордезоксиуридин (5-FUdR), метотрексат (МТХ), колхицин, таксол, винкристин, винбластин, этопозид (VP-16), триметрексат, иринотекан, топотекан, гемцитабин, тенипозид, цисплатин и диэтилстильбэстрол(ВЕ8). При применении с соединениями, предложенными в настоящем изобретении, такие химиотерапевтические агенты могут применяться индивидуально (например, 5-FU и олигонуклеотид), последовательно (например, 5-FU и олигонуклеотид в течение некоторого времени, затем МТХ и олигонуклеотид), или в комбинации с одним или несколькими другими такими химиотерапевтическими агентами (например, 5-FU, МТХ и олигонуклеотид, или 5-FU, лучевая терапия и олигонуклеотид). Противовоспалительные лекарственные средства, включая, но не ограничиваясь перечисленными, нестероидные противовоспалительные лекарственные средства и кортикостероиды, и противовирусные лекарственные средства, включая, но не ограничиваясь перечисленными, рибавирин, видарабин, ацикловир и ганцикловир, могут также быть скомбинированы в композициях, предложенных в настоящем изобретении. Комбинации антисмысловых соединений и других не-антисмысловых лекарственных средств также входят в объем настоящего изобретения. Два или более скомбинированных соединения могут применяться совместно или последовательно.
[00211] Согласно другому сходному варианту осуществления композиции, предложенные в настоящем изобретении, могут содержать одно или несколько антисмысловых соединений, в частности, олигонуклеотидов, нацеленных на первую нуклеиновую кислоту, и одно или несколько дополнительных антисмысловых соединений, нацеленных на вторую нуклеиновую кислоту. Например, первой мишенью может быть конкретная антисмысловая последовательность Атонального гомолога 1 (АТОН1), а второй мишенью может быть участок другой нуклеотидной последовательности. Как вариант, композиции, предложенных в настоящем изобретении, могут содержать два антисмысловых соединения или более, нацеленных на разные участки одной и той же целевой нуклеиновой кислоты Атонального гомолога 1 (АТОН1). Многочисленные примеры антисмысловых соединений приведены в настоящей заявке, другие могут быть выбраны из подходящих соединений, известных в данной области техники. Два или более скомбинированных соединения могут применяться совместно или последовательно.
Дозирование:
[00212] Получение фармацевтических композиций и их последующее введение (дозирование) должны быть знакомы специалистам в данной области техники. Дозы зависят от тяжести и чувствительности к лечению болезненного состояния-мишени терапии, курс лечения может длиться от нескольких дней до нескольких месяцев, или до излечения, или до облегчения болезненного состояния. Оптимальный режим дозирования может быть рассчитан на основании измерений накопления препарата в организме пациента. Специалист без труда определит оптимальные дозировки, методологию дозировок и частоту повторения. Оптимальные дозы могут варьировать в зависимости от относительной эффективности конкретных олигонуклеотидов, и, как правило, могут быть рассчитаны исходя из ЕС50, эффективных для животных моделей in vitro и in vivo. Как правило, доза составляет от 0,01 мкг до 100 г на кг массы тела, и может вводиться однократно или чаще ежедневно, еженедельно, ежемесячно или ежегодно, или даже каждые 2-20 лет. Специалист без труда может рассчитать частоту введения доз, основанную на времени удержания и концентрациях лекарства в жидкостях или тканях организма. После проведения эффективного лечения может быть желательно применение поддерживающей терапии у пациента для предотвращения рецидива заболевания, при этом указанный олигонуклеотид вводится в поддерживающих дозах, варьирующих от 0,01 мкг до 100 г на кг массы тела, от однократного или более частого ежедневного приема до однократного приема один раз в 20 лет.
[00213] Согласно вариантам реализации пациент получает дозу лекарственного средства, составляющую по меньшей мере приблизительно 1, по меньшей мере приблизительно 2, по меньшей мере приблизительно 3, по меньшей мере приблизительно 4, по меньшей мере приблизительно 5, по меньшей мере приблизительно 6, по меньшей мере приблизительно 7, по меньшей мере приблизительно 8, по меньшей мере приблизительно 9, по меньшей мере приблизительно 10, по меньшей мере приблизительно 15, по меньшей мере приблизительно 20, по меньшей мере приблизительно 25, по меньшей мере приблизительно 30, по меньшей мере приблизительно 35, по меньшей мере приблизительно 40, по меньшей мере приблизительно 45, по меньшей мере приблизительно 50, по меньшей мере приблизительно 60, по меньшей мере приблизительно 70, по меньшей мере приблизительно 80, по меньшей мере приблизительно 90, или по меньшей мере приблизительно 100 мг/кг массы тела. Некоторые вводимые дозировки антисмысловых олигонуклеотидов описаны, например, в патенте США 7563884, «Antisense modulation of РТР1 В expression)) («Антисмысловое модулирование экспрессии РТР1В»), включенном в настоящую заявку посредством ссылки во всей полноте.
[00214] Хотя выше и были описаны различные варианты реализации настоящего изобретения, следует понимать, что они представлены только в качестве примеров, а не для ограничения. Многочисленные модификации раскрытых вариантов реализации могут быть осуществлены согласно описаниям в настоящей заявке, не выходя за рамки сущности и объема настоящего изобретения. Таким образом, объем и сущность настоящего изобретения не ограничены какими-либо из приведенных выше вариантов реализации.
[00215] Все упоминаемые здесь документы включены в настоящую заявку посредством ссылок. Все публикации и патентные документы, упомянутые в настоящей заявке, включены посредством ссылок в том же объеме, как если бы каждая публикация или каждый патентный документ были упомянуты в индивидуальном порядке. Цитируя различные источники в данном документе, заявители не признают, что какой-либо из источников представляет «предшествующий уровень техники» относительно настоящего изобретения. Варианты реализации предложенных в изобретении композиций и способов проиллюстрированы приведенными ниже примерами.
ПРИМЕРЫ
[00216] Следующие неограничивающие Примеры предназначены для иллюстрации некоторых вариантов реализации настоящего изобретения. Следует иметь в виду, что вариации содержания и вариантов элементов описанных компонентов очевидны специалистам в данной области и входят в объем настоящего изобретения..
Пример 1: Конструирование антисмысловых олигонуклеотидов, специфичных к молекуле нуклеиновой кислоты, антисмысловой к Атональному гомологу 1(АТОН1) и/или смысловой цепи полинуклеотида АТОШ
[00217] Как указано выше, термин «олигонуклеотид, специфичный для» или «олигонуклеотид с нацеленным действием» относится к олигонуклеотиду, имеющему последовательность, (i) способную формировать стабильный комплекс с фрагментом гена-мишени или (ii) способную формировать стабильный дуплекс с фрагментом иРНК транскрипта гена-мишени.
[00218] Отбор подходящих олигонуклеотидов упрощается при применении компьютерных программ (например, IDT AntiSense Design, IDT OligoAnalyzer), автоматически идентифицирующих в каждой конкретной последовательности субпоследовательности из 19-25 нуклеотидов, способных образовывать гибриды с целевой полинуклеотидной последовательностью, имеющие требуемую температуру плавления (как правило, 50-60°С) и не образующие гомодимеров или других комплексных вторичных структур.
[00219] Отбор подходящих олигонуклеотидов выполняют с применением компьютерных программ, которые автоматически выравнивают последовательности нуклеиновых кислот и определяют участки идентичности или гомологии. Такие программы применяют для сравнения последовательностей нуклеиновых кислот, полученных, например, из баз данных, таких как GenBank, или секвенированием продуктов ПЦР. Сравнение последовательностей нуклеиновых кислот различных генов и межгенных областей конкретного генома позволяет отобрать последовательности нуклеиновых кислот, которым свойственна необходимая степень специфичности к нужному гену. Такие процедуры позволяют провести отбор олигонуклеотидов, проявляющих значительную степень комплементарности целевым последовательностям нуклеиновых кислот и более низкую степень комплементарности другим последовательностям нуклеиновых кислот из конкретного генома. Специалисту в данной области техники будет ясно, что существует значительная свобода выбора подходящих участков генов для применения согласно настоящему изобретению.
[00220] Антисмысловое соединение является «специфически гибридизуемым», если связывание указанного соединения с целевой нуклеиновой кислотой нарушает нормальное функционирование целевой нуклеиновой кислоты, приводя к модулированию функции и/или активности, и степень комплементарности достаточна, чтобы избежать неспецифичного связывания указанного антисмыслового соединения с нецелевыми последовательностями нуклеиновой кислоты в условиях, при которых необходимо специфическое связывание, т.е., в физиологических условиях в случае in vivo методик анализа или терапевтического воздействия, и в условиях, при которых проводится анализ, в случае исследований in vitro.
[00221] Характеристики гибридизации олигонуклеотидов, описанных в настоящей заявке, могут быть определены с применением одного или более in vitro способа анализа из известных специалистам в данной области техники. Например, указанные характеристики олигонуклеотидов, описанных в настоящей заявке, могут быть получены путем определения силы связывания целевых природных антисмысловых последовательностей и молекул потенциального лекарственного средства с применением анализа кривых плавления.
[00222] Сила связывания целевых природных антисмысловых последовательностей и молекулы потенциального лекарственного средства (далее - Молекулы) может быть оценена с применением любых стандартных способов измерения силы межмолекулярных взаимодействий, например, анализа кривых плавления.
[00223] Анализ кривых плавления определяет температуру, при которой происходит быстрый переход от двуцепочечной к одноцепочечной конформации комплекса природной антисмысловой последовательности/Молекулы. Эта температура широко используется как надежная мера силы взаимодействия между двумя молекулами.
[00224] Анализ кривых плавления может быть выполнен с применением кДНК-копии актуальной природной антисмысловой молекулы РНК или синтетического нуклеотида ДНК или РНК, соответствующего связывающему сайту Молекулы. Доступны многочисленные наборы, включающие все необходимые реагенты для проведения анализа (например, набор MeltDoctor от Applied Biosystems Inc.). Такие наборы содержат подходящий буферный раствор, содержащий один из связывающих двуцепочечную ДНК (дцДНК) красителей (таких как красители HRM от ABI, SYBR Green, SYTO и т.д.). Свойства дцДНК красителей таковы, что они практически не флуоресцируют в свободной форме, но очень выраженно флуоресцируют при связывании с дпДНК.
[00225] Для проведения анализа указанную кДНК или соответствующий олигонуклеотид смешивают с Молекулой в концентрациях, определенных согласно протоколам конкретных производителей. Смесь подогревают до 95°С для диссоциации пре-формированных комплексов дцДНК, затем медленно охлаждают до комнатной температуры или другой более низкой температуры, указанной производителем набора, для ренатурации молекул ДНК. Вновь сформировавшиеся комплексы затем медленно нагревают до 95°С, одновременно непрерывно измеряя интенсивность флуоресценции в результате реакции. Интенсивность флуоресценции обратно пропорциональна количеству присутствующих в реакции дцДНК. Информация может быть получена с применением инструмента на основе ПЦР в реальном времени, совместимого с набором (например, StepOne Plus Real Time PCR System от ABI или инструмент HghtTyper от Roche Diagnostics, Lewes, UK).
[00226] Пики плавления получают построением графика зависимости отрицательной производной флуоресценции по температуре (-d(Флуоресценция)/dT) по оси y) от температуры (ось x) с применением подходящего программного обеспечения (например, HghtTyper (Roche) или SDS Dissociation Curve, ABI). Информацию анализируют с целью определить температуру быстрого перехода комплекса дцДНК в одноцепочечные молекулы. Эту температуру называют температурой плавления и она прямо пропорциональна силе взаимодействия между двумя молекулами. Как правило, температура плавления превышает 40°C.
Пример 2: Модулирование полинуклеотидов АТОН1
Обработка клеток HepG2 антисмысловыми олигонуклеотидами
[00227] Все антисмысловые олигонуклеотиды, используемые в Примере 2, были сконструированы согласно описанию в Примере 1. Производителю (IDT Inc., Coralville, IA (Коралвилль, Айова)) был проинструктирован относительно получения синтетических содержащих фосфотиоатную связь олигонуклеотидов и обеспечил синтетические фосфотиоатные аналоги, приведенные в таблице 1. Звездочкой в нуклеотидах обозначено наличие фосфотиоатной связи. Олигонуклеотиды, необходимые для эксперимента из Примера 2, могут быть синтезированы с применением любого подходящего способа, соответствующего существующему уровню данной области техники, например, способа, применяемого IDT: на твердой подложке, такой как 5-микронные стеклянные бусы с контролируемой пористостью (CPG), с применением фосфорамидитовых мономеров (стандартные нуклеотиды с защитой всех активных групп защитными группами, например, тритильная группа на сахаре, бензоил на А и С и N-2-изобутирил на G). Защитные группы предотвращают нежелательные реакции во время синтеза олигонуклеотидов. Защитные группы удаляют в конце процесса синтеза. Исходный нуклеотид связывается с твердой подложкой через 3'-углерод и синтез протекает в направлении от 3' к 5'. Добавление нового основания в растущую цепь олигонуклеотида происходит в четыре этапа: 1) защитную группу удаляют с 5' кислорода иммобилизованного нуклеотида с помощью трихлоруксусной кислоты; 2) указанный иммобилизованный нуклеотид и следующий в очереди нуклеотид связывают при помощи тетразола; указанная реакция протекает с образованием промежуточного тетразолильного производного фосфорамидита. 3) непрореагировавшие свободные нуклеотиды и побочные продукты реакции отмывают и непрореагировавшие иммобилизованные олигонуклеотиды кэпируют для предупреждения их участия в следующем цикле синтеза; кэпирование осуществляют ацетилированием свободных 5'-гидроксилов с применением уксусного ангидрида и N-метилимидазола; 4) для стабилизации связи между нуклеотидами фосфор окисляют с применением йода и воды, если необходимо получить фосфодиэфирную связь, либо реагента Beaucage (3Н-1,2-бензодитиол-3-он-1,1-диоксида), если требуется фосфотиоатная связь. С помощью варьирования указанных двух окисляющих агентов можно сконструировать гибридный остов. Цикл из четырех описанных выше этапов повторяют для каждого нуклеотида в последовательности. Когда последовательность синтезирована полностью, олигонуклеотид отщепляют от твердой подложки и удаляют защитные группы с применением гидроксида аммония при высокой температуре. Защитные группы отмывают обессоливанием, и оставшиеся олигонуклеотиды лиофилизируют.
[00228] Для осуществления эксперимента, смоделированного в Примере 3, клетки HepG2 от АТСС (cat# НВ-8065) выращивали на ростовой среде (MEM/EBSS (Hyclone cat #SH30024, либо Mediatech cat # MT-10-010-CV)+10% ЭБС (Mediatech cat# MT35- 011-CV)+пенициллин/стрептомицин (Mediatech cat# MT30-002-CI)) при 37°C и 5% CO2. 3a день до эксперимента клетки пересевали с плотностью 0,5×104/мл в 6-луночные планшеты и инкубировали при 37°С и 5% CO2 в течение ночи. В день эксперимента среду в 6-луночных планшетах заменяли на свежую ростовую среду.
[00229] Олигонуклеотиды, полученные от производителя в лиофилизованной форме, разводили до концентрации 20 мкмоль в деионизированной воде, не содержащей РНКаз и ДНКаз. Два мкл этого раствора инкубировали с 400 мкл среды Opti-MEM (Gibco cat#31985-070) и 4 мкл липофектамина 2000 (Invitrogen cat# 11668019) при комнатной температуре в течение 20 мин, затем по капле вводили в одну ячейку 6-луночного планшета с клетками HepG2. Сходную смесь, содержащую 2 мкл воды вместо раствора олигонуклеотида, применяли для контрольной «пустой» транскрипции. После 3-18 ч инкубации при 37°C и 5% CO2 среду заменяли на свежую ростовую среду. Через 48 ч после добавления антисмысловых олигонуклеотидов среду удаляли и выделяли РНК из клеток с применением SV Total RNA Isolation System от Promega (cat # Z3105) или набора RNeasy Total RNA Isolation kit от Qiagen (cat# 74181), следуя инструкциям производителя. 600 нг выделенной РНК вводили в реакцию обратной транскрипции, проводимую с применением кДНК-набора Verso cDNA kit от Thermo Scientific (cat#AB1453B) или набора High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (cat# 4368813) согласно описанию в протоколе производителя. кДНК, полученные в результате реакции обратной транскрипции, применяли для мониторинга генной экспрессии при помощи ПЦР в реальном времени с применением ABI Taqman Gene Expression Mix (cat#4369510) и праймеров/зондов, сконструированных ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00245453_s1 (ATOH1) от Applied Biosystems Inc., Foster City CA). Использовали следующий цикл ПЦР: 50°C в течение 2 мин, 95°C в течение 10 мин, 40 циклов при (95°C в течение 15 секунд, 60°C в течение 1 мин) с применением аппарата для ПЦР в реальном времени StepOne Plus Real Time PCR Machine (Applied Biosystems). Изменение кратности генной экспрессии после обработки антисмысловыми олигонуклеотидами вычисляли на основании разности значений dCt, нормализованных по 18S, между обработанными и контрольными образцами.
[00230] Результаты: Результаты ПЦР в режиме реального времени показывают, что уровни иРНК АТОН1 в клетках Hep G2 значительно повышаются в течение 48 ч после обработки одним из олигонуклеотидов, сконструированных для антисмысловой последовательности АТОН1 Hs.611058 (Фиг.1).
[00231] Хотя настоящее изобретение было иллюстрировано и описано посредством ссылок на один или несколько вариантов реализации, эквивалентные изменения и модификации будут очевидны для специалистов после прочтения и понимания настоящего описания и прилагаемых чертежей. Кроме того, хотя конкретные свойства согласно настоящему изобретению могут раскрываться только в одном из нескольких вариантов реализации, такие свойства могут быть скомбинированы с одним или несколькими другими свойствами других вариантов реализации, что может быть необходимо и полезно для любого или частного случая применения.
[00232] Реферат настоящего изобретения позволит читателю быстро понять техническую суть изобретения. Подразумевается, что он не будет использован для целей толкования или ограничения сути и объема приведенной ниже формулы изобретения.

Claims (26)

1. Олигонуклеотид, представляющий собой фосфотиоатный аналог длиной от 19 до 30 нуклеотидов, который представляет собой соединение, гибридизующееся с природным антисмысловым полинуклеотидом гена Атонального гомолога 1 (АТОН1) и увеличивает экспрессию указанного гена Атонального гомолога 1 (АТОН1) in vivo или in vitro по сравнению с нормальным контролем, и при этом указанный олигонуклеотид, представляющий собой фосфотиоатный аналог, имеет по меньшей мере 50% идентичность последовательности с последовательностью из 19-30 последовательных нуклеиновых кислот молекулы РНК, транскрибированной с полинуклеотида Атонального гомолога 1 (АТОН1).
2. Олигонуклеотид, представляющий собой фосфотиоатный аналог, по п. 1, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид имеет длину от 19 до 30 нуклеотидов и имеет по меньшей мере 90% идентичность последовательности с последовательностью длиной от 19 до 30 нуклеотидов РНК, транскрибированной с гена АТОН1.
3. Олигонуклеотид, представляющий собой фосфотиоатный аналог, по п. 1, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид специфически гибридизуется с комплементарным участком в составе природного антисмыслового полинуклеотида гена Атонального гомолога 1 (АТОН1) и увеличивает экспрессию указанного гена Атонального гомолога 1 (АТОН1) in vivo или in vitro по сравнению с нормальным контролем.
4. Фармацевтическая композиция для предотвращения и/или лечения заболевания или состояния, ассоциированного с по меньшей мере одним полинуклеотидом Атонального гомолога 1 (АТОН1) и/или по меньшей мере одним продуктом, который он кодирует, при этом указанная композиция содержит эффективное количество одного или более олигонуклеотидов, представляющих собой фосфотиоатный аналог длиной от 19 до 30 нуклеотидов, специфичных по отношению к одному или более природному антисмысловыму полинуклеотиду Атонального гомолога 1 (АТОН1) по пп. 1-3 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.
5. Фармацевтическая композиция по п. 4, отличающаяся тем, что указанные олигонуклеотиды, представляющие собой фосфотиоатные аналоги, имеют по меньшей мере примерно 40% идентичность последовательности по сравнению с любой из нуклеотидных последовательностей, соответствующих SEQ ID NOS: 3 и 4.
6. Фармацевтическая композиция по п. 4, отличающаяся тем, что указанные олигонуклеотиды, представляющие собой фосфотиоатные аналоги, содержат нуклеотидные последовательности, соответствующие SEQ ID NOS: 3 и 4.
7. Фармацевтическая композиция по п. 6, отличающаяся тем, что олигонуклеотиды, соответствующие SEQ ID NOS: 3 и 4, содержат одну или более модификаций или замен.
8. Фармацевтическая композиция по п. 7, отличающаяся тем, что указанные одна или более модификаций выбраны из: фосфотиоата, метилфосфоната, пептидо-нуклеиновой кислоты, закрытой нуклеиновой кислоты и их комбинаций.
9. Способ предотвращения или лечения заболевания, ассоциированного с по меньшей мере одним полинуклеотидом Атонального гомолога 1 (АТОН1) и/или по меньшей мере одним продуктом, который он кодирует, включающий: введение пациенту терапевтически эффективной дозы по меньшей мере одного антисмыслового олигонуклеотида, представляющего собой фосфотиоатный аналог длиной от 19 до 30 нуклеотидов, который связывается с природной антисмысловой последовательностью указанного по меньшей мере одного полинуклеотида Атонального гомолога 1 (АТОН1) и увеличивает экспрессию указанного по меньшей мере одного полинуклеотида Атонального гомолога 1 (АТОН1), что приводит к предотвращению или лечению заболевания, ассоциированного с указанным по меньшей мере одним полинуклеотидом Атонального гомолога 1 (АТОН1) и/или по меньшей мере одним кодируемым им продуктом.
10. Способ по п. 9, отличающийся тем, что заболевание, ассоциированное с указанным по меньшей мере одним полинуклеотидом Атонального гомолога 1 (АТОН1), выбрано из: заболевания или расстройства, ассоциированного с аномальной функцией и/или экспрессией гена АТОН1, рака, заболевания или расстройства, ассоциированного с нарушенным сигнальным путем р53, пролиферативного заболевания или расстройства, аномальной клеточной пролиферации, неврологического заболевания или расстройства, заболевания или расстройства, ассоциированного со слуховой системой (например, глухоты, частичной потери слуха, вестибулярных нарушений вследствие повреждения или потери волосковых клеток внутреннего уха и т.д.), заболевания или расстройства, ассоциированного с вестибулярной системой (например, потери вестибулярных волосковых клеток, нарушения равновесия и т.д.), остеоартрита, заболевания или расстройства, ассоциированного с сигнальным путем Notch, кишечного заболевания или расстройства (например, колита, кишечного воспаления и т.д.), нарушенного одонтогенеза, заболевания или расстройства, ассоциированного с сознательной проприоцептивной чувствительностью, заболевания или расстройства, ассоциированного с интероцепцией, и заболевания или расстройства, ассоциированного с дыханием.
11. Способ увеличения экспрессии полинуклеотида Атонального гомолога 1 (АТОН1) в биологической системе, включающий: осуществление контакта указанной системы с по меньшей мере одним олигонуклеотидом, представляющим собой фосфотиоатный аналог длиной от 19 до 30 нуклеотидов, при этом указанный по меньшей мере один олигонуклеотид, представляющий собой фосфотиоатный аналог, специфичен для природного антисмыслового полинуклеотида для полинуклеотида АТОН1 и имеет по меньшей мере 50% идентичность последовательности с последовательностью, которая представляет собой обратный комплемент природной антисмысловой последовательности для полинуклеотида Атонального гомолога 1 (АТОН1); что приводит к увеличению экспрессии полинуклеотида Атонального гомолога 1 (АТОН1).
12. Способ по п. 11, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один олигонуклеотид содержит по меньшей мере одну из олигонуклеотидных последовательностей, соответствующих SEQ ID NOS: 3 и 4.
13. Способ увеличения экспрессии полинуклеотида Атонального гомолога 1 (АТОН1) в биологической системе по п. 11, включающий: осуществление контакта указанной биологической системы с по меньшей мере одним олигонуклеотидом, представляющим собой фосфотиоатный аналог длиной от 19 до 30 нуклеотидов, при этом указанный по меньшей мере один олигонуклеотид, представляющий собой фосфотиоатный аналог, специфичным образом нацелен на природный антисмысловой полинуклеотид для полинуклеотида АТОН1 и имеет по меньшей мере 50% идентичность последовательности с последовательностью, которая представляет собой обратный комплемент полинуклеотида, содержащего от 5 до 30 последовательных нуклеотидов в пределах нуклеотидов 1-589 природного антисмыслового транскрипта, соответствующего SEQ ID NO: 2; что приводит к увеличению экспрессии полинуклеотида Атонального гомолога 1 (АТОН1).
14. Способ увеличения экспрессии полинуклеотида Атонального гомолога 1 (АТОН1) в биологической системе, включающий: осуществление контакта указанной системы с по меньшей мере одним олигонуклеотидом, представляющим собой фосфотиоатный аналог длиной от 19 до 30 нуклеотидов, который нацелен на участок природного антисмыслового полинуклеотида для полинуклеотида Атонального гомолога 1 (АТОН1); что приводит к его связыванию с указанным природным антисмысловым полинуклеотидом и увеличению экспрессии полинуклеотида Атонального гомолога 1 (АТОН1).
15. Способ по п. 14, отличающийся тем, что экспрессия гена Атонального гомолога 1 (АТОН1) увеличивается in vivo или in vitro по сравнению с контролем.
16. Способ по п. 14, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один олигонуклеотид, представляющий собой фосфотиоатный аналог, нацелен на природную антисмысловую последовательность для полинуклеотида Атонального гомолога 1 (АТОН1), которая соответствует SEQ ID NO: 2.
17. Способ по п. 14, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один олигонуклеотид, представляющий собой фосфотиоатный аналог, нацелен на последовательность природного антисмыслового полионуклеотида, которая является антисмысловой по отношению к кодирующим и/или некодирующим нуклеотидным последовательностям полинуклеотида Атонального гомолога 1 (АТОН1).
18. Способ по п. 14, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один олигонуклеотид, представляющий собой фосфотиоатный аналог, нацелен на природный антисмысловой полинуклеотид, который имеет перекрывающиеся или неперекрывающиеся последовательности с полинуклеотидом Атонального гомолога 1 (АТОН1).
19. Способ по п. 14, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один олигонуклеотид, представляющий собой фосфотиоатный аналог, содержит одну или более модификаций, выбранных из: по меньшей мере одного модифицированного остатка сахара, по меньшей мере одной модифицированной межнуклеозидной связи, по меньшей мере одного модифицированного нуклеотида и их комбинаций.
20. Способ по п. 18, отличающийся тем, что указанные одна или более модификаций включают по меньшей мере один модифицированный остаток сахара, выбранный из: 2′-O-метоксиэтил-модифицированного остатка сахара, 2′-метокси-модифицированного остатка сахара, 2′-O-алкил-модифицированного остатка сахара, бициклического остатка сахара и их комбинаций.
21. Способ по п. 19, отличающийся тем, что указанные одна или более модификаций включают по меньшей мере одну модифицированную межнуклеозидную связь, выбранную из: фосфотиоата, 2′-O-метоксиэтила (МОЭ), 2′-фтор, алкилфосфоната, фосфодитиоата, алкилфосфонотиоата, фосфорамидата, карбамата, карбоната, триэфирфосфата, ацетамидата, карбоксиметилового эфира и их комбинаций.
22. Способ по п. 19, отличающийся тем, что указанные одна или более модификаций включают по меньшей мере один модифицированный нуклеотид, выбранный из: пептидо-нуклеиновой кислоты, закрытой нуклеиновой кислоты, арабинонуклеиновой кислоты (2-дезокси-2′-фтор-β-D-арабинонуклеиновой кислоты, FANA), их аналога, производного и комбинаций.
23. Способ увеличения экспрессии гена Атонального гомолога 1 (АТОН1) в клетках или тканях млекопитающих in vivo или in vitro, включающий: осуществление контакта указанных клеток или тканей с по меньшей мере одним олигонуклеотидом, представляющий собой фосфотиоатный аналог, малой интерферирующей РНК (миРНК) длиной от 19 до 30 нуклеотидов, причем указанный по меньшей мере один олигонуклеотид, представляющий собой фосфотиоатный аналог, миРНК специфичен к природному антисмысловому полинуклеотиду для полинуклеотида Атонального гомолога 1 (АТОН1), при этом указанный по меньшей мере один олигонуклеотид, представляющий собой фосфотиоатный аналог, миРНК имеет по меньшей мере 50% идентичность последовательности с последовательностью, которая представляет собой по меньшей мере 19 последовательных нуклеиновых кислот молекулы РНК, транскрибированной с полинуклеотида Атонального гомолога 1 (АТОН1); и увеличение экспрессии гена Атонального гомолога 1 (АТОН1) в клетках или тканях млекопитающих in vivo или in vitro.
24. Способ по п. 23, отличающийся тем, что указанный олигонуклеотид, представляющий собой фосфотиоатный аналог, имеет по меньшей мере 80% идентичность последовательности с указанной последовательностью РНК, транскрибированной с полинуклеотида Атонального гомолога 1 (АТОН1).
25. Способ увеличения экспрессии гена Атонального гомолога 1 (АТОН1) в клетках или тканях млекопитающих in vivo или in vitro, включающий: осуществление контакта указанных клеток или тканей с по меньшей мере одним олигонуклеотидом, представляющим собой фосфотиоатный аналог длиной примерно от 19 до 30 нуклеотидов, специфичным к некодирующим последовательностям природной антисмысловой цепи полинуклеотида Атонального гомолога 1 (АТОН1), при этом указанный по меньшей мере один олигонуклеотид, представляющий собой фосфотиоатный аналог, имеет по меньшей мере 50% идентичность последовательности с по меньшей мере одной нуклеотидной последовательностью, соответствующей SEQ ID NO: 1 или пре-РНК для указанной последовательности SEQ ID NO: 1; и увеличение экспрессии гена Атонального гомолога 1 (АТОН1) в клетках или тканях млекопитающих in vivo или in vitro.
26. Способ идентификации и выбора по меньшей мере одного олигонуклеотида, представляющего собой фосфотиоатный аналог длиной от 19 до 30 нуклеотидов, специфичного по отношению к природному антисмысловому транскрипту гена АТОН1, выбранному в качестве полинуклеотида-мишени, для применения in vivo или in vitro, включающий: идентификацию по меньшей мере одного олигонуклеотида, представляющего собой фосфотиоатный аналог длиной от 19 до 30 нуклеотидов, содержащего по меньшей мере 5 последовательных нуклеотидов, которые по меньшей мере частично комплементарны полинуклеотиду, представляющему собой антисмысловую последовательность для выбранного полинуклеотида-мишени, при этом указанный олигонуклеотид способен формировать с указанным полинуклеотидом-мишенью стабильный комплекс, и при этом не образует гомодимеров или других комплексных структур;
измерение температуры плавления гибрида олигонуклеотида, представляющего собой фосфотиоатный аналог, и указанного полинуклеотида-мишени или полинуклеотида, представляющего собой антисмысловую последовательность для указанного выбранного полинуклеотида-мишени, при строгих условиях гибридизации;
и выбор по меньшей мере одного олигонуклеотида, представляющего собой фосфотиоатный аналог длиной от 19 до 30 нуклеотидов, для применения in vivo или in vitro в случае, если указанная температура плавления составляет приблизительно 50-60°С, причем указанный олигонуклеотид, представляющий собой фосфотиоатный аналог длиной от 19 до 30 нуклеотидов, представляет собой нуклеотид по любому из пп. 1-3.
RU2012146815/10A 2010-05-26 2011-05-25 Лечение заболеваний, связанных с атональным гомологом 1 (атон1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена атон1 RU2585229C2 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US34865610P 2010-05-26 2010-05-26
US61/348,656 2010-05-26
PCT/US2011/037833 WO2011150005A2 (en) 2010-05-26 2011-05-25 Treatment of atonal homolog 1 (atoh1) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to atoh1

Publications (2)

Publication Number Publication Date
RU2012146815A RU2012146815A (ru) 2014-07-10
RU2585229C2 true RU2585229C2 (ru) 2016-05-27

Family

ID=45004739

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
RU2012146815/10A RU2585229C2 (ru) 2010-05-26 2011-05-25 Лечение заболеваний, связанных с атональным гомологом 1 (атон1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена атон1

Country Status (15)

Country Link
US (4) US8895528B2 (ru)
EP (2) EP3299464B1 (ru)
JP (2) JP5973996B2 (ru)
KR (2) KR101857090B1 (ru)
CN (2) CN107412251A (ru)
AR (1) AR081420A1 (ru)
CA (1) CA2799207C (ru)
DK (1) DK2576783T3 (ru)
ES (1) ES2664572T3 (ru)
HK (1) HK1250742A1 (ru)
NO (1) NO2576783T3 (ru)
RU (1) RU2585229C2 (ru)
SA (1) SA111320487B1 (ru)
TW (2) TWI688391B (ru)
WO (1) WO2011150005A2 (ru)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2094836B1 (en) 2006-11-15 2016-06-08 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Generation of inner ear cells
NO2576783T3 (ru) 2010-05-26 2018-04-28
US9920317B2 (en) 2010-11-12 2018-03-20 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding RNAs
EP3702460A1 (en) 2010-11-12 2020-09-02 The General Hospital Corporation Polycomb-associated non-coding rnas
US10174315B2 (en) 2012-05-16 2019-01-08 The General Hospital Corporation Compositions and methods for modulating hemoglobin gene family expression
DK2850186T3 (en) 2012-05-16 2019-04-08 Translate Bio Ma Inc COMPOSITIONS AND PROCEDURES FOR MODULATING SMN GENFAMILY EXPRESSION
EP2850190B1 (en) 2012-05-16 2020-07-08 Translate Bio MA, Inc. Compositions and methods for modulating mecp2 expression
US10837014B2 (en) 2012-05-16 2020-11-17 Translate Bio Ma, Inc. Compositions and methods for modulating SMN gene family expression
WO2013173652A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating gene expression
WO2013173598A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating atp2a2 expression
WO2013173645A1 (en) 2012-05-16 2013-11-21 Rana Therapeutics, Inc. Compositions and methods for modulating utrn expression
JP2015527398A (ja) 2012-09-07 2015-09-17 マサチューセッツ アイ アンド イヤー インファーマリー 聴覚喪失治療
US20140134136A1 (en) * 2012-11-02 2014-05-15 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Compositions and methods for auditory therapy
US9572815B2 (en) 2013-03-15 2017-02-21 St. Jude Children's Research Hospital Methods and compositions of p27KIP1 transcriptional modulators
WO2016022776A2 (en) * 2014-08-06 2016-02-11 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Increasing atoh1 life to drive sensorineural hair cell differentiantion
TWI710635B (zh) * 2014-10-09 2020-11-21 美商珍維克公司 編碼人類無調同源物-1(hath1)之腺病毒載體
CA2966044A1 (en) 2014-10-30 2016-05-06 The General Hospital Corporation Methods for modulating atrx-dependent gene repression
WO2016149455A2 (en) 2015-03-17 2016-09-22 The General Hospital Corporation The rna interactome of polycomb repressive complex 1 (prc1)
JP6902025B2 (ja) 2015-06-18 2021-07-14 ティン セラピューティックス エルエルシー 聴覚損失の予防および治療のための方法および組成物
WO2017096233A1 (en) 2015-12-04 2017-06-08 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Treatment of hearing loss by inhibition of casein kinase 1
CA3013038A1 (en) 2016-01-29 2017-08-03 Massachusetts Eye And Ear Infirmary Expansion and differentiation of inner ear supporting cells and methods of use thereof
JP7130639B2 (ja) 2016-11-01 2022-09-05 ザ・リサーチ・ファウンデーション・フォー・ザ・ステイト・ユニヴァーシティ・オブ・ニューヨーク ５－ハロウラシル修飾マイクロｒｎａ及びがんの処置におけるその使用
US11883491B2 (en) 2017-05-03 2024-01-30 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Compositions and methods for prevention and treatment of hearing loss
AU2020298647A1 (en) * 2019-07-04 2022-02-24 Ractigen Therapeutics Oligomeric nucleic acid molecule activating atoh1 gene and use thereof
EP4073102A4 (en) 2019-12-12 2024-05-08 Ting Therapeutics LLC COMPOSITIONS AND METHODS FOR PREVENTION AND TREATMENT OF HEARING LOSS
US11857551B1 (en) 2020-07-10 2024-01-02 Ting Therapeutics Llc Methods for the prevention and treatment of hearing loss

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2233333C2 (ru) * 1993-05-18 2004-07-27 Рон-Пуленк Роре С.А. Вирусные векторы и их применение в генной терапии
WO2009100438A2 (en) * 2008-02-07 2009-08-13 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Compounds that enhance atoh-1 expression
RU2008145510A (ru) * 2003-03-04 2010-05-27 Уайт (Us) Композиции и способы диагностики и лечения астмы или других аллергических или воспалительных заболеваний

Family Cites Families (397)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US510892A (en) 1893-12-19 Brush-holder
US3687808A (en) 1969-08-14 1972-08-29 Univ Leland Stanford Junior Synthetic polynucleotides
US4469863A (en) 1980-11-12 1984-09-04 Ts O Paul O P Nonionic nucleic acid alkyl and aryl phosphonates and processes for manufacture and use thereof
US4426330A (en) 1981-07-20 1984-01-17 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US4534899A (en) 1981-07-20 1985-08-13 Lipid Specialties, Inc. Synthetic phospholipid compounds
US5023243A (en) 1981-10-23 1991-06-11 Molecular Biosystems, Inc. Oligonucleotide therapeutic agent and method of making same
US4476301A (en) 1982-04-29 1984-10-09 Centre National De La Recherche Scientifique Oligonucleotides, a process for preparing the same and their application as mediators of the action of interferon
JPS5927900A (ja) 1982-08-09 1984-02-14 Wakunaga Seiyaku Kk 固定化オリゴヌクレオチド
FR2540122B1 (fr) 1983-01-27 1985-11-29 Centre Nat Rech Scient Nouveaux composes comportant une sequence d'oligonucleotide liee a un agent d'intercalation, leur procede de synthese et leur application
US4605735A (en) 1983-02-14 1986-08-12 Wakunaga Seiyaku Kabushiki Kaisha Oligonucleotide derivatives
US4948882A (en) 1983-02-22 1990-08-14 Syngene, Inc. Single-stranded labelled oligonucleotides, reactive monomers and methods of synthesis
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
US4824941A (en) 1983-03-10 1989-04-25 Julian Gordon Specific antibody to the native form of 2'5'-oligonucleotides, the method of preparation and the use as reagents in immunoassays or for binding 2'5'-oligonucleotides in biological systems
US4587044A (en) 1983-09-01 1986-05-06 The Johns Hopkins University Linkage of proteins to nucleic acids
US5118802A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology DNA-reporter conjugates linked via the 2' or 5'-primary amino group of the 5'-terminal nucleoside
US5118800A (en) 1983-12-20 1992-06-02 California Institute Of Technology Oligonucleotides possessing a primary amino group in the terminal nucleotide
US5550111A (en) 1984-07-11 1996-08-27 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education Dual action 2',5'-oligoadenylate antiviral derivatives and uses thereof
FR2567892B1 (fr) 1984-07-19 1989-02-17 Centre Nat Rech Scient Nouveaux oligonucleotides, leur procede de preparation et leurs applications comme mediateurs dans le developpement des effets des interferons
US5367066A (en) 1984-10-16 1994-11-22 Chiron Corporation Oligonucleotides with selectably cleavable and/or abasic sites
US5430136A (en) 1984-10-16 1995-07-04 Chiron Corporation Oligonucleotides having selectably cleavable and/or abasic sites
US5258506A (en) 1984-10-16 1993-11-02 Chiron Corporation Photolabile reagents for incorporation into oligonucleotide chains
US4828979A (en) 1984-11-08 1989-05-09 Life Technologies, Inc. Nucleotide analogs for nucleic acid labeling and detection
US4754065A (en) 1984-12-18 1988-06-28 Cetus Corporation Precursor to nucleic acid probe
FR2575751B1 (fr) 1985-01-08 1987-04-03 Pasteur Institut Nouveaux nucleosides de derives de l'adenosine, leur preparation et leurs applications biologiques
US5235033A (en) 1985-03-15 1993-08-10 Anti-Gene Development Group Alpha-morpholino ribonucleoside derivatives and polymers thereof
US5166315A (en) 1989-12-20 1992-11-24 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US5506337A (en) 1985-03-15 1996-04-09 Antivirals Inc. Morpholino-subunit combinatorial library and method
US5034506A (en) 1985-03-15 1991-07-23 Anti-Gene Development Group Uncharged morpholino-based polymers having achiral intersubunit linkages
US5185444A (en) 1985-03-15 1993-02-09 Anti-Gene Deveopment Group Uncharged morpolino-based polymers having phosphorous containing chiral intersubunit linkages
US5405938A (en) 1989-12-20 1995-04-11 Anti-Gene Development Group Sequence-specific binding polymers for duplex nucleic acids
US4683195A (en) 1986-01-30 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or-cloning nucleic acid sequences
US4683202A (en) 1985-03-28 1987-07-28 Cetus Corporation Process for amplifying nucleic acid sequences
US4762779A (en) 1985-06-13 1988-08-09 Amgen Inc. Compositions and methods for functionalizing nucleic acids
US4800159A (en) 1986-02-07 1989-01-24 Cetus Corporation Process for amplifying, detecting, and/or cloning nucleic acid sequences
US5317098A (en) 1986-03-17 1994-05-31 Hiroaki Shizuya Non-radioisotope tagging of fragments
JPS638396A (ja) 1986-06-30 1988-01-14 Wakunaga Pharmaceut Co Ltd ポリ標識化オリゴヌクレオチド誘導体
DE3788914T2 (de) 1986-09-08 1994-08-25 Ajinomoto Kk Verbindungen zur Spaltung von RNS an eine spezifische Position, Oligomere, verwendet bei der Herstellung dieser Verbindungen und Ausgangsprodukte für die Synthese dieser Oligomere.
US5276019A (en) 1987-03-25 1994-01-04 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US5264423A (en) 1987-03-25 1993-11-23 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Inhibitors for replication of retroviruses and for the expression of oncogene products
US4904582A (en) 1987-06-11 1990-02-27 Synthetic Genetics Novel amphiphilic nucleic acid conjugates
JP2828642B2 (ja) 1987-06-24 1998-11-25 ハワード フローレイ インスティテュト オブ イクスペリメンタル フィジオロジー アンド メディシン ヌクレオシド誘導体
US5585481A (en) 1987-09-21 1996-12-17 Gen-Probe Incorporated Linking reagents for nucleotide probes
US4924624A (en) 1987-10-22 1990-05-15 Temple University-Of The Commonwealth System Of Higher Education 2,',5'-phosphorothioate oligoadenylates and plant antiviral uses thereof
US5188897A (en) 1987-10-22 1993-02-23 Temple University Of The Commonwealth System Of Higher Education Encapsulated 2',5'-phosphorothioate oligoadenylates
US5525465A (en) 1987-10-28 1996-06-11 Howard Florey Institute Of Experimental Physiology And Medicine Oligonucleotide-polyamide conjugates and methods of production and applications of the same
DE3738460A1 (de) 1987-11-12 1989-05-24 Max Planck Gesellschaft Modifizierte oligonukleotide
US4866042A (en) 1987-11-18 1989-09-12 Neuwelt Edward A Method for the delivery of genetic material across the blood brain barrier
US5403711A (en) 1987-11-30 1995-04-04 University Of Iowa Research Foundation Nucleic acid hybridization and amplification method for detection of specific sequences in which a complementary labeled nucleic acid probe is cleaved
WO1989005358A1 (en) 1987-11-30 1989-06-15 University Of Iowa Research Foundation Dna and rna molecules stabilized by modifications of the 3'-terminal phosphodiester linkage and their use as nucleic acid probes and as therapeutic agents to block the expression of specifically targeted genes
US5288512A (en) 1987-12-15 1994-02-22 The Procter & Gamble Company Reduced calorie fats made from triglycerides containing medium and long chain fatty acids
US5082830A (en) 1988-02-26 1992-01-21 Enzo Biochem, Inc. End labeled nucleotide probe
EP0406309A4 (en) 1988-03-25 1992-08-19 The University Of Virginia Alumni Patents Foundation Oligonucleotide n-alkylphosphoramidates
NL8800756A (nl) 1988-03-25 1989-10-16 Vereniging Voor Christelijk Wetenschappelijk Onderwijs Genetisch gemanipuleerde plantecellen en planten, alsmede daarvoor bruikbaar recombinant dna.
US5278302A (en) 1988-05-26 1994-01-11 University Patents, Inc. Polynucleotide phosphorodithioates
US5109124A (en) 1988-06-01 1992-04-28 Biogen, Inc. Nucleic acid probe linked to a label having a terminal cysteine
US5216141A (en) 1988-06-06 1993-06-01 Benner Steven A Oligonucleotide analogs containing sulfur linkages
US5175273A (en) 1988-07-01 1992-12-29 Genentech, Inc. Nucleic acid intercalating agents
US5262536A (en) 1988-09-15 1993-11-16 E. I. Du Pont De Nemours And Company Reagents for the preparation of 5'-tagged oligonucleotides
US5512439A (en) 1988-11-21 1996-04-30 Dynal As Oligonucleotide-linked magnetic particles and uses thereof
US5457183A (en) 1989-03-06 1995-10-10 Board Of Regents, The University Of Texas System Hydroxylated texaphyrins
US5599923A (en) 1989-03-06 1997-02-04 Board Of Regents, University Of Tx Texaphyrin metal complexes having improved functionalization
US5354844A (en) 1989-03-16 1994-10-11 Boehringer Ingelheim International Gmbh Protein-polycation conjugates
US6294520B1 (en) 1989-03-27 2001-09-25 Albert T. Naito Material for passage through the blood-brain barrier
US5108921A (en) 1989-04-03 1992-04-28 Purdue Research Foundation Method for enhanced transmembrane transport of exogenous molecules
US5391723A (en) 1989-05-31 1995-02-21 Neorx Corporation Oligonucleotide conjugates
US5256775A (en) 1989-06-05 1993-10-26 Gilead Sciences, Inc. Exonuclease-resistant oligonucleotides
US4958013A (en) 1989-06-06 1990-09-18 Northwestern University Cholesteryl modified oligonucleotides
US5227170A (en) 1989-06-22 1993-07-13 Vestar, Inc. Encapsulation process
US6203976B1 (en) 1989-07-18 2001-03-20 Osi Pharmaceuticals, Inc. Methods of preparing compositions comprising chemicals capable of transcriptional modulation
US5451463A (en) 1989-08-28 1995-09-19 Clontech Laboratories, Inc. Non-nucleoside 1,3-diol reagents for labeling synthetic oligonucleotides
US5134066A (en) 1989-08-29 1992-07-28 Monsanto Company Improved probes using nucleosides containing 3-dezauracil analogs
US5254469A (en) 1989-09-12 1993-10-19 Eastman Kodak Company Oligonucleotide-enzyme conjugate that can be used as a probe in hybridization assays and polymerase chain reaction procedures
US5591722A (en) 1989-09-15 1997-01-07 Southern Research Institute 2'-deoxy-4'-thioribonucleosides and their antiviral activity
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
US5527528A (en) 1989-10-20 1996-06-18 Sequus Pharmaceuticals, Inc. Solid-tumor treatment method
US5356633A (en) 1989-10-20 1994-10-18 Liposome Technology, Inc. Method of treatment of inflamed tissues
US5399676A (en) 1989-10-23 1995-03-21 Gilead Sciences Oligonucleotides with inverted polarity
US5264564A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences Oligonucleotide analogs with novel linkages
US5264562A (en) 1989-10-24 1993-11-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs with novel linkages
ATE190981T1 (de) 1989-10-24 2000-04-15 Isis Pharmaceuticals Inc 2'-modifizierte nukleotide
US5292873A (en) 1989-11-29 1994-03-08 The Research Foundation Of State University Of New York Nucleic acids labeled with naphthoquinone probe
US5177198A (en) 1989-11-30 1993-01-05 University Of N.C. At Chapel Hill Process for preparing oligoribonucleoside and oligodeoxyribonucleoside boranophosphates
US5457189A (en) 1989-12-04 1995-10-10 Isis Pharmaceuticals Antisense oligonucleotide inhibition of papillomavirus
US5130302A (en) 1989-12-20 1992-07-14 Boron Bilogicals, Inc. Boronated nucleoside, nucleotide and oligonucleotide compounds, compositions and methods for using same
US5580575A (en) 1989-12-22 1996-12-03 Imarx Pharmaceutical Corp. Therapeutic drug delivery systems
US5469854A (en) 1989-12-22 1995-11-28 Imarx Pharmaceutical Corp. Methods of preparing gas-filled liposomes
US5486603A (en) 1990-01-08 1996-01-23 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide having enhanced binding affinity
US5587361A (en) 1991-10-15 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5681941A (en) 1990-01-11 1997-10-28 Isis Pharmaceuticals, Inc. Substituted purines and oligonucleotide cross-linking
US5587470A (en) 1990-01-11 1996-12-24 Isis Pharmaceuticals, Inc. 3-deazapurines
US5459255A (en) 1990-01-11 1995-10-17 Isis Pharmaceuticals, Inc. N-2 substituted purines
US5623065A (en) 1990-08-13 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped 2' modified oligonucleotides
US5670633A (en) 1990-01-11 1997-09-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5578718A (en) 1990-01-11 1996-11-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Thiol-derivatized nucleosides
US5646265A (en) 1990-01-11 1997-07-08 Isis Pharmceuticals, Inc. Process for the preparation of 2'-O-alkyl purine phosphoramidites
US5852188A (en) 1990-01-11 1998-12-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages
US5149797A (en) 1990-02-15 1992-09-22 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of rna and production of encoded polypeptides
US5220007A (en) 1990-02-15 1993-06-15 The Worcester Foundation For Experimental Biology Method of site-specific alteration of RNA and production of encoded polypeptides
AU7579991A (en) 1990-02-20 1991-09-18 Gilead Sciences, Inc. Pseudonucleosides and pseudonucleotides and their polymers
US5214136A (en) 1990-02-20 1993-05-25 Gilead Sciences, Inc. Anthraquinone-derivatives oligonucleotides
US5321131A (en) 1990-03-08 1994-06-14 Hybridon, Inc. Site-specific functionalization of oligodeoxynucleotides for non-radioactive labelling
US5470967A (en) 1990-04-10 1995-11-28 The Dupont Merck Pharmaceutical Company Oligonucleotide analogs with sulfamate linkages
US5264618A (en) 1990-04-19 1993-11-23 Vical, Inc. Cationic lipids for intracellular delivery of biologically active molecules
GB9009980D0 (en) 1990-05-03 1990-06-27 Amersham Int Plc Phosphoramidite derivatives,their preparation and the use thereof in the incorporation of reporter groups on synthetic oligonucleotides
US6034233A (en) 1990-05-04 2000-03-07 Isis Pharmaceuticals Inc. 2'-O-alkylated oligoribonucleotides and phosphorothioate analogs complementary to portions of the HIV genome
EP0455905B1 (en) 1990-05-11 1998-06-17 Microprobe Corporation Dipsticks for nucleic acid hybridization assays and methods for covalently immobilizing oligonucleotides
IE66205B1 (en) 1990-06-14 1995-12-13 Paul A Bartlett Polypeptide analogs
US5650489A (en) 1990-07-02 1997-07-22 The Arizona Board Of Regents Random bio-oligomer library, a method of synthesis thereof, and a method of use thereof
US5623070A (en) 1990-07-27 1997-04-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
US5610289A (en) 1990-07-27 1997-03-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogues
DE69126530T2 (de) 1990-07-27 1998-02-05 Isis Pharmaceutical, Inc., Carlsbad, Calif. Nuklease resistente, pyrimidin modifizierte oligonukleotide, die die gen-expression detektieren und modulieren
US5541307A (en) 1990-07-27 1996-07-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Backbone modified oligonucleotide analogs and solid phase synthesis thereof
US5602240A (en) 1990-07-27 1997-02-11 Ciba Geigy Ag. Backbone modified oligonucleotide analogs
US5138045A (en) 1990-07-27 1992-08-11 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5218105A (en) 1990-07-27 1993-06-08 Isis Pharmaceuticals Polyamine conjugated oligonucleotides
US5608046A (en) 1990-07-27 1997-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Conjugated 4'-desmethyl nucleoside analog compounds
US5489677A (en) 1990-07-27 1996-02-06 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleoside linkages containing adjacent oxygen and nitrogen atoms
US5688941A (en) 1990-07-27 1997-11-18 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods of making conjugated 4' desmethyl nucleoside analog compounds
US5618704A (en) 1990-07-27 1997-04-08 Isis Pharmacueticals, Inc. Backbone-modified oligonucleotide analogs and preparation thereof through radical coupling
US5677437A (en) 1990-07-27 1997-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. Heteroatomic oligonucleoside linkages
PT98562B (pt) 1990-08-03 1999-01-29 Sanofi Sa Processo para a preparacao de composicoes que compreendem sequencias de nucleo-sidos com cerca de 6 a cerca de 200 bases resistentes a nucleases
US5245022A (en) 1990-08-03 1993-09-14 Sterling Drug, Inc. Exonuclease resistant terminally substituted oligonucleotides
US5177196A (en) 1990-08-16 1993-01-05 Microprobe Corporation Oligo (α-arabinofuranosyl nucleotides) and α-arabinofuranosyl precursors thereof
US5512667A (en) 1990-08-28 1996-04-30 Reed; Michael W. Trifunctional intermediates for preparing 3'-tailed oligonucleotides
US5214134A (en) 1990-09-12 1993-05-25 Sterling Winthrop Inc. Process of linking nucleosides with a siloxane bridge
US5561225A (en) 1990-09-19 1996-10-01 Southern Research Institute Polynucleotide analogs containing sulfonate and sulfonamide internucleoside linkages
EP0549686A4 (en) 1990-09-20 1995-01-18 Gilead Sciences Inc Modified internucleoside linkages
US5432272A (en) 1990-10-09 1995-07-11 Benner; Steven A. Method for incorporating into a DNA or RNA oligonucleotide using nucleotides bearing heterocyclic bases
DE69132510T2 (de) 1990-11-08 2001-05-03 Hybridon, Inc. Verbindung von mehrfachreportergruppen auf synthetischen oligonukleotiden
EP0557459B1 (en) 1990-11-13 1997-10-22 Immunex Corporation Bifunctional selectable fusion genes
JP3220180B2 (ja) 1991-05-23 2001-10-22 三菱化学株式会社 薬剤含有タンパク質結合リポソーム
US5719262A (en) 1993-11-22 1998-02-17 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having amino acid side chains
US5714331A (en) 1991-05-24 1998-02-03 Buchardt, Deceased; Ole Peptide nucleic acids having enhanced binding affinity, sequence specificity and solubility
US5539082A (en) 1993-04-26 1996-07-23 Nielsen; Peter E. Peptide nucleic acids
US5371241A (en) 1991-07-19 1994-12-06 Pharmacia P-L Biochemicals Inc. Fluorescein labelled phosphoramidites
US6307040B1 (en) 1992-03-05 2001-10-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Sugar modified oligonucleotides that detect and modulate gene expression
US5571799A (en) 1991-08-12 1996-11-05 Basco, Ltd. (2'-5') oligoadenylate analogues useful as inhibitors of host-v5.-graft response
US7217571B1 (en) 1991-08-21 2007-05-15 The Regents Of The University Of California Gene therapy by small fragment homologous replacement
US5474796A (en) 1991-09-04 1995-12-12 Protogene Laboratories, Inc. Method and apparatus for conducting an array of chemical reactions on a support surface
US5521291A (en) 1991-09-30 1996-05-28 Boehringer Ingelheim International, Gmbh Conjugates for introducing nucleic acid into higher eucaryotic cells
NZ244306A (en) 1991-09-30 1995-07-26 Boehringer Ingelheim Int Composition for introducing nucleic acid complexes into eucaryotic cells, complex containing nucleic acid and endosomolytic agent, peptide with endosomolytic domain and nucleic acid binding domain and preparation
US5661134A (en) 1991-10-15 1997-08-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for modulating Ha-ras or Ki-ras having phosphorothioate linkages of high chiral purity
US5576302A (en) 1991-10-15 1996-11-19 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides for modulating hepatitis C virus having phosphorothioate linkages of high chiral purity
DE59208572D1 (de) 1991-10-17 1997-07-10 Ciba Geigy Ag Bicyclische Nukleoside, Oligonukleotide, Verfahren zu deren Herstellung und Zwischenprodukte
US6335434B1 (en) 1998-06-16 2002-01-01 Isis Pharmaceuticals, Inc., Nucleosidic and non-nucleosidic folate conjugates
US5605662A (en) 1993-11-01 1997-02-25 Nanogen, Inc. Active programmable electronic devices for molecular biological analysis and diagnostics
US5484908A (en) 1991-11-26 1996-01-16 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotides containing 5-propynyl pyrimidines
US5359044A (en) 1991-12-13 1994-10-25 Isis Pharmaceuticals Cyclobutyl oligonucleotide surrogates
US5700922A (en) 1991-12-24 1997-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. PNA-DNA-PNA chimeric macromolecules
US5565552A (en) 1992-01-21 1996-10-15 Pharmacyclics, Inc. Method of expanded porphyrin-oligonucleotide conjugate synthesis
US5595726A (en) 1992-01-21 1997-01-21 Pharmacyclics, Inc. Chromophore probe for detection of nucleic acid
FR2687679B1 (fr) 1992-02-05 1994-10-28 Centre Nat Rech Scient Oligothionucleotides.
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
US5633360A (en) 1992-04-14 1997-05-27 Gilead Sciences, Inc. Oligonucleotide analogs capable of passive cell membrane permeation
IL101600A (en) 1992-04-15 2000-02-29 Yissum Res Dev Co Synthetic partially phosphorothioated antisense oligodeoxynucleotides and pharmaceutical compositions containing them
US5434257A (en) 1992-06-01 1995-07-18 Gilead Sciences, Inc. Binding compentent oligomers containing unsaturated 3',5' and 2',5' linkages
EP0577558A2 (de) 1992-07-01 1994-01-05 Ciba-Geigy Ag Carbocyclische Nukleoside mit bicyclischen Ringen, Oligonukleotide daraus, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung und Zwischenproduckte
US5272250A (en) 1992-07-10 1993-12-21 Spielvogel Bernard F Boronated phosphoramidate compounds
US5652355A (en) 1992-07-23 1997-07-29 Worcester Foundation For Experimental Biology Hybrid oligonucleotide phosphorothioates
US5288514A (en) 1992-09-14 1994-02-22 The Regents Of The University Of California Solid phase and combinatorial synthesis of benzodiazepine compounds on a solid support
WO1994008026A1 (en) 1992-09-25 1994-04-14 Rhone-Poulenc Rorer S.A. Adenovirus vectors for the transfer of foreign genes into cells of the central nervous system, particularly in brain
US6710174B2 (en) 2001-09-13 2004-03-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of vascular endothelial growth factor receptor-1 expression
ATE223485T1 (de) 1992-10-15 2002-09-15 Toray Industries Verfahren zur herstellung von rekombinant mhcii protein in mikroorganismen
US5583020A (en) 1992-11-24 1996-12-10 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. Permeability enhancers for negatively charged polynucleotides
US5574142A (en) 1992-12-15 1996-11-12 Microprobe Corporation Peptide linkers for improved oligonucleotide delivery
JP3351476B2 (ja) 1993-01-22 2002-11-25 三菱化学株式会社 リン脂質誘導体及びそれを含有するリポソーム
US5476925A (en) 1993-02-01 1995-12-19 Northwestern University Oligodeoxyribonucleotides including 3'-aminonucleoside-phosphoramidate linkages and terminal 3'-amino groups
US5395619A (en) 1993-03-03 1995-03-07 Liposome Technology, Inc. Lipid-polymer conjugates and liposomes
GB9304618D0 (en) 1993-03-06 1993-04-21 Ciba Geigy Ag Chemical compounds
AU6449394A (en) 1993-03-30 1994-10-24 Sterling Winthrop Inc. Acyclic nucleoside analogs and oligonucleotide sequences containing them
CA2159629A1 (en) 1993-03-31 1994-10-13 Sanofi Oligonucleotides with amide linkages replacing phosphodiester linkages
DE4311944A1 (de) 1993-04-10 1994-10-13 Degussa Umhüllte Natriumpercarbonatpartikel, Verfahren zu deren Herstellung und sie enthaltende Wasch-, Reinigungs- und Bleichmittelzusammensetzungen
US5462854A (en) 1993-04-19 1995-10-31 Beckman Instruments, Inc. Inverse linkage oligonucleotides for chemical and enzymatic processes
PT698092E (pt) 1993-05-11 2007-10-29 Univ North Carolina Oligonucleótidos complementares de uma cadeia codificadora que combatem splicing aberrante e métodos para a sua utilização
EP0804590A1 (en) 1993-05-21 1997-11-05 Targeted Genetics Corporation Bifunctional selectable fusion genes based on the cytosine deaminase (cd) gene
IT1264857B1 (it) 1993-06-21 1996-10-17 Zambon Spa Composizione farmaceutica liquida per uso orale contenente acido 2-(4-isobutilfenil) propionico
US5534259A (en) 1993-07-08 1996-07-09 Liposome Technology, Inc. Polymer compound and coated particle composition
US5417978A (en) 1993-07-29 1995-05-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Liposomal antisense methyl phosphonate oligonucleotides and methods for their preparation and use
CA2170869C (en) 1993-09-03 1999-09-14 Phillip Dan Cook Amine-derivatized nucleosides and oligonucleosides
US5491084A (en) 1993-09-10 1996-02-13 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Uses of green-fluorescent protein
US5502177A (en) 1993-09-17 1996-03-26 Gilead Sciences, Inc. Pyrimidine derivatives for labeled binding partners
JPH09506253A (ja) 1993-11-30 1997-06-24 マクギル・ユニヴァーシティ Ｄｎａメチルトランスフェラーゼの阻害
US5908779A (en) 1993-12-01 1999-06-01 University Of Connecticut Targeted RNA degradation using nuclear antisense RNA
US5457187A (en) 1993-12-08 1995-10-10 Board Of Regents University Of Nebraska Oligonucleotides containing 5-fluorouracil
US5446137B1 (en) 1993-12-09 1998-10-06 Behringwerke Ag Oligonucleotides containing 4'-substituted nucleotides
EP0733059B1 (en) 1993-12-09 2000-09-13 Thomas Jefferson University Compounds and methods for site-directed mutations in eukaryotic cells
US5595756A (en) 1993-12-22 1997-01-21 Inex Pharmaceuticals Corporation Liposomal compositions for enhanced retention of bioactive agents
US5519134A (en) 1994-01-11 1996-05-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Pyrrolidine-containing monomers and oligomers
US5593853A (en) 1994-02-09 1997-01-14 Martek Corporation Generation and screening of synthetic drug libraries
JPH10501681A (ja) 1994-02-22 1998-02-17 ダナ−ファーバー キャンサー インスティチュート 核酸送達システムならびにその合成および使用方法
US5902880A (en) 1994-08-19 1999-05-11 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. RNA polymerase III-based expression of therapeutic RNAs
ES2079316B1 (es) 1994-02-23 1996-08-16 Univ Oviedo Sistema integrado flotacion-biologico de tratamiento de aguas residuales.
US5539083A (en) 1994-02-23 1996-07-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Peptide nucleic acid combinatorial libraries and improved methods of synthesis
US6551618B2 (en) 1994-03-15 2003-04-22 University Of Birmingham Compositions and methods for delivery of agents for neuronal regeneration and survival
US6015880A (en) 1994-03-16 2000-01-18 California Institute Of Technology Method and substrate for performing multiple sequential reactions on a matrix
US5596091A (en) 1994-03-18 1997-01-21 The Regents Of The University Of California Antisense oligonucleotides comprising 5-aminoalkyl pyrimidine nucleotides
US5627053A (en) 1994-03-29 1997-05-06 Ribozyme Pharmaceuticals, Inc. 2'deoxy-2'-alkylnucleotide containing nucleic acid
US5625050A (en) 1994-03-31 1997-04-29 Amgen Inc. Modified oligonucleotides and intermediates useful in nucleic acid therapeutics
US5525711A (en) 1994-05-18 1996-06-11 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Pteridine nucleotide analogs as fluorescent DNA probes
US5807522A (en) 1994-06-17 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods for fabricating microarrays of biological samples
US5543152A (en) 1994-06-20 1996-08-06 Inex Pharmaceuticals Corporation Sphingosomes for enhanced drug delivery
US5525735A (en) 1994-06-22 1996-06-11 Affymax Technologies Nv Methods for synthesizing diverse collections of pyrrolidine compounds
US5549974A (en) 1994-06-23 1996-08-27 Affymax Technologies Nv Methods for the solid phase synthesis of thiazolidinones, metathiazanones, and derivatives thereof
US5597696A (en) 1994-07-18 1997-01-28 Becton Dickinson And Company Covalent cyanine dye oligonucleotide conjugates
US5580731A (en) 1994-08-25 1996-12-03 Chiron Corporation N-4 modified pyrimidine deoxynucleotides and oligonucleotide probes synthesized therewith
US5597909A (en) 1994-08-25 1997-01-28 Chiron Corporation Polynucleotide reagents containing modified deoxyribose moieties, and associated methods of synthesis and use
US6645943B1 (en) 1994-10-25 2003-11-11 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5591721A (en) 1994-10-25 1997-01-07 Hybridon, Inc. Method of down-regulating gene expression
US5512295A (en) 1994-11-10 1996-04-30 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Synthetic liposomes for enhanced uptake and delivery
FR2727867B1 (fr) 1994-12-13 1997-01-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Transfert de genes dans les motoneurones medullaires au moyen de vecteurs adenoviraux
GB9501465D0 (en) 1995-01-25 1995-03-15 King S College London Nucleoside phosphorothioate derivatives,synthesis and use thereof
DE19502912A1 (de) 1995-01-31 1996-08-01 Hoechst Ag G-Cap Stabilisierte Oligonucleotide
IT1276642B1 (it) 1995-03-03 1997-11-03 Consiglio Nazionale Ricerche Trascritto antisenso presente in linfociti b ed oligodeossinucleotidi sintetici utili per inibirne l'azione
IT1275862B1 (it) 1995-03-03 1997-10-24 Consiglio Nazionale Ricerche Trascritto antisenso associato ad alcuni tipi di cellule tumorali ed oligodeossinucleotidi sintetici utili nella diagnosi e nel trattamento
US5543165A (en) 1995-06-06 1996-08-06 Hill; Julie B. Process of making a soluble tea product with champagne-like properties
US5739311A (en) 1995-06-07 1998-04-14 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of phosphorothioate oligonucleotides using restriction endonucleases
US5569588A (en) 1995-08-09 1996-10-29 The Regents Of The University Of California Methods for drug screening
US5652356A (en) 1995-08-17 1997-07-29 Hybridon, Inc. Inverted chimeric and hybrid oligonucleotides
DK0882061T3 (da) 1996-02-14 2004-09-27 Isis Pharmaceuticals Inc Sukkermodificerede gapped oligonukleotider
DK0888385T3 (da) 1996-03-14 2003-12-15 Genentech Inc GDNF receptor og anvendelser deraf
CA2251945A1 (en) 1996-04-17 1997-10-23 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibitors of vascular endothelial growth factor (vefg/vpf) expression
US5786213A (en) 1996-04-18 1998-07-28 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of endogenous gastrin expression for treatment of colorectal cancer
US5756710A (en) 1996-06-05 1998-05-26 The Trustees Of Columbia University In City Of New York Phosphorothioate oligonucleotides that bind to the V3-loop and uses thereof
US5898031A (en) 1996-06-06 1999-04-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligoribonucleotides for cleaving RNA
US20040203024A1 (en) * 1996-06-06 2004-10-14 Baker Brenda F. Modified oligonucleotides for use in RNA interference
US5849902A (en) * 1996-09-26 1998-12-15 Oligos Etc. Inc. Three component chimeric antisense oligonucleotides
US5739119A (en) 1996-11-15 1998-04-14 Galli; Rachel L. Antisense oligonucleotides specific for the muscarinic type 2 acetylcholine receptor MRNA
US7008776B1 (en) 1996-12-06 2006-03-07 Aventis Pharmaceuticals Inc. Compositions and methods for effecting the levels of high density lipoprotein (HDL) cholesterol and apolipoprotein AI very low density lipoprotein (VLDL) cholesterol and low density lipoprotein (LDL) cholesterol
US7235653B2 (en) 1996-12-31 2007-06-26 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide compositions and methods for the modulation of the expression of B7 protein
JP3756313B2 (ja) 1997-03-07 2006-03-15 武 今西 新規ビシクロヌクレオシド及びオリゴヌクレオチド類縁体
US6013786A (en) 1997-08-22 2000-01-11 Hybridon, Inc. MDM2-specific antisense oligonucleotides
ES2242291T5 (es) 1997-09-12 2016-03-11 Exiqon A/S Análogos de nucleósidos bicíclicos y tricíclicos, nucleótidos y oligonucleótidos
US7572582B2 (en) 1997-09-12 2009-08-11 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US6794499B2 (en) 1997-09-12 2004-09-21 Exiqon A/S Oligonucleotide analogues
US7285288B1 (en) 1997-10-03 2007-10-23 Board Of Regents, The University Of Texas System Inhibition of Bcl-2 protein expression by liposomal antisense oligodeoxynucleotides
US6034883A (en) 1998-01-29 2000-03-07 Tinney; Charles E. Solid state director for beams
US6175409B1 (en) 1999-04-02 2001-01-16 Symyx Technologies, Inc. Flow-injection analysis and variable-flow light-scattering methods and apparatus for characterizing polymers
US20040186071A1 (en) 1998-04-13 2004-09-23 Bennett C. Frank Antisense modulation of CD40 expression
US7321828B2 (en) 1998-04-13 2008-01-22 Isis Pharmaceuticals, Inc. System of components for preparing oligonucleotides
US6221587B1 (en) 1998-05-12 2001-04-24 Isis Pharmceuticals, Inc. Identification of molecular interaction sites in RNA for novel drug discovery
EP1082012A4 (en) 1998-05-26 2002-01-16 Icn Pharmaceuticals NEW NUCLEOSIDES WITH BICYCLICAL SUGAR PART
US6833361B2 (en) 1998-05-26 2004-12-21 Ribapharm, Inc. Nucleosides having bicyclic sugar moiety
US6100090A (en) 1999-06-25 2000-08-08 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of PI3K p85 expression
US20030139359A1 (en) 2001-12-04 2003-07-24 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of phospholipid scramblase 3 expression
US6242589B1 (en) 1998-07-14 2001-06-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Phosphorothioate oligonucleotides having modified internucleoside linkages
US6867294B1 (en) 1998-07-14 2005-03-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Gapped oligomers having site specific chiral phosphorothioate internucleoside linkages
US6214986B1 (en) 1998-10-07 2001-04-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of bcl-x expression
WO2000027424A2 (en) 1998-11-06 2000-05-18 Alcon Laboratories, Inc. Upregulation of endogenous prostaglandins to lower intraocular pressure
US5985663A (en) 1998-11-25 1999-11-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense inhibition of interleukin-15 expression
ATE533515T1 (de) 1999-01-27 2011-12-15 Coda Therapeutics Inc Formulierungen enthaltend antisense nukleotide spezifisch für connexine
CZ296576B6 (cs) 1999-02-12 2006-04-12 Sankyo Company Limited Nukleosidový analog a oligonukleotidový analog a farmaceutický prostredek, sonda a primer s jeho obsahem
US7534773B1 (en) 1999-02-26 2009-05-19 The University Of British Columbia TRPM-2 antisense therapy
US20040137423A1 (en) 1999-03-15 2004-07-15 Hayden Michael R. Compositions and methods for modulating HDL cholesterol and triglyceride levels
EP1100895B1 (en) 1999-03-15 2007-06-13 University of British Columbia Abc1 polypeptide and methods and reagents for modulating cholesterol levels
ATE501269T1 (de) 1999-03-18 2011-03-15 Exiqon As Detektion von genmutationen mittels lna primer
US7084125B2 (en) 1999-03-18 2006-08-01 Exiqon A/S Xylo-LNA analogues
US6734291B2 (en) 1999-03-24 2004-05-11 Exiqon A/S Synthesis of [2.2.1]bicyclo nucleosides
DK1163250T3 (da) 1999-03-24 2006-11-13 Exiqon As Forbedret syntese af [2.2.1]bicyclonukleosider
NZ514350A (en) 1999-03-26 2004-12-24 Aventis Pharma Inc Compositions and methods for effecting the levels of cholesterol
EP1171617B1 (en) 1999-04-08 2008-02-13 Novartis Vaccines and Diagnostics, Inc. Enhancement of the immune response for vaccine and gene therapy applications
AU4657500A (en) 1999-04-21 2000-11-02 Pangene Corporation Locked nucleic acid hybrids and methods of use
ATE356824T1 (de) 1999-05-04 2007-04-15 Santaris Pharma As L-ribo-lna analoge
US20030233670A1 (en) 2001-12-04 2003-12-18 Edgerton Michael D. Gene sequences and uses thereof in plants
US6525191B1 (en) 1999-05-11 2003-02-25 Kanda S. Ramasamy Conformationally constrained L-nucleosides
DE19925073C2 (de) 1999-06-01 2001-07-19 Stefan Weiss Nucleinsäuremoleküle mit spezifischer Erkennung von nativem PrP·S··c·, Herstellung und Verwendung
US6656730B1 (en) 1999-06-15 2003-12-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotides conjugated to protein-binding drugs
WO2001000669A2 (en) 1999-06-25 2001-01-04 Genset A bap28 gene and protein
US20040006031A1 (en) 2002-07-02 2004-01-08 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of HMG-CoA reductase expression
US6147200A (en) 1999-08-19 2000-11-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 2'-O-acetamido modified monomers and oligomers
WO2001021631A2 (en) 1999-09-20 2001-03-29 Millennium Pharmaceuticals, Inc. Secreted proteins and uses thereof
US6617442B1 (en) 1999-09-30 2003-09-09 Isis Pharmaceuticals, Inc. Human Rnase H1 and oligonucleotide compositions thereof
US6986988B2 (en) 1999-10-06 2006-01-17 Quark Biotech, Inc. Method for enrichment of natural antisense messenger RNA
WO2001025488A2 (en) 1999-10-06 2001-04-12 Quark Biotech, Inc. Method for enrichment of natural antisense messenger rna
WO2001051630A1 (en) 2000-01-07 2001-07-19 Baylor University Antisense compositions and methods
AU2001230913B2 (en) 2000-01-14 2005-06-30 The Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methanocarba cycloalkyl nucleoside analogues
US6303374B1 (en) 2000-01-18 2001-10-16 Isis Pharmaceuticals Inc. Antisense modulation of caspase 3 expression
US20020055479A1 (en) 2000-01-18 2002-05-09 Cowsert Lex M. Antisense modulation of PTP1B expression
US6287860B1 (en) 2000-01-20 2001-09-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of MEKK2 expression
US8017369B2 (en) 2000-02-23 2011-09-13 The Trustees Of The University Of Pennsylvania System and method of up-regulating bone morphogenetic proteins (BMP) gene expression in bone cells via the application of fields generated by specific and selective electric and electromagnetic signals
JP2001247459A (ja) 2000-03-03 2001-09-11 Oakland Uniservices Ltd 癌の組み合わせ療法
EP1268768A2 (en) 2000-03-27 2003-01-02 University Of Delaware Targeted chromosomal genomic alterations with modified single stranded oligonucleotides
US6936467B2 (en) 2000-03-27 2005-08-30 University Of Delaware Targeted chromosomal genomic alterations with modified single stranded oligonucleotides
US7402434B2 (en) 2000-05-08 2008-07-22 Newman Stuart A Splice choice antagonists as therapeutic agents
JP2004530420A (ja) 2000-06-29 2004-10-07 ファーマ パシフィック プロプライエタリー リミテッド インターフェロン−α誘導性遺伝子
WO2002009700A1 (en) 2000-07-28 2002-02-07 Cancer Research Technology Limited Cancer treatment by combination therapy
EP1314734A1 (en) 2000-08-29 2003-05-28 Takeshi Imanishi Novel nucleoside analogs and oligonucleotide derivatives containing these analogs
ES2300366T3 (es) 2000-09-02 2008-06-16 Grunenthal Gmbh Oligonucleotidos antisentido contra el vr1.
US6444464B1 (en) 2000-09-08 2002-09-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of E2F transcription factor 2 expression
JP2004509619A (ja) 2000-09-20 2004-04-02 アイシス・ファーマシューティカルス・インコーポレーテッド Ｆｌｉｐ−ｃ発現のアンチセンスモジュレーション
US20030186920A1 (en) 2000-10-13 2003-10-02 Sirois Martin G. Antisense oligonucleotide directed toward mammalian vegf receptor genes and uses thereof
US20030228618A1 (en) 2000-11-24 2003-12-11 Erez Levanon Methods and systems for identifying naturally occurring antisense transcripts and methods, kits and arrays utilizing same
US20050222029A1 (en) 2001-01-04 2005-10-06 Myriad Genetics, Incorporated Compositions and methods for treating diseases
US7423142B2 (en) 2001-01-09 2008-09-09 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of anti-apoptotic genes
US20020147165A1 (en) 2001-02-22 2002-10-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of calreticulin expression
CA2437898A1 (en) 2001-02-26 2002-09-06 Pharma Pacific Pty. Ltd Interferon-alpha induced gene
AUPR497101A0 (en) 2001-05-14 2001-06-07 Queensland University Of Technology Polynucleotides and polypeptides linked to cancer and/or tumorigenesi
IL143379A (en) 2001-05-24 2013-11-28 Yissum Res Dev Co Oligonucleotide against human ache isoform r and its uses
US7053195B1 (en) 2001-06-12 2006-05-30 Syngenta Participatious Ag Locked nucleic acid containing heteropolymers and related methods
US20050019915A1 (en) 2001-06-21 2005-01-27 Bennett C. Frank Antisense modulation of superoxide dismutase 1, soluble expression
CA2921821A1 (en) 2001-07-12 2003-01-23 University Of Massachusetts In vivo production of small interfering rnas that mediate gene silencing
US7153954B2 (en) 2001-07-12 2006-12-26 Santaris Pharma A/S Method for preparation of LNA phosphoramidites
US7425545B2 (en) 2001-07-25 2008-09-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of C-reactive protein expression
US20030096772A1 (en) 2001-07-30 2003-05-22 Crooke Rosanne M. Antisense modulation of acyl CoA cholesterol acyltransferase-2 expression
US7259150B2 (en) 2001-08-07 2007-08-21 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of apolipoprotein (a) expression
CA2459347C (en) 2001-09-04 2012-10-09 Exiqon A/S Locked nucleic acid (lna) compositions and uses thereof
US6936589B2 (en) 2001-09-28 2005-08-30 Albert T. Naito Parenteral delivery systems
US20040214766A1 (en) 2001-10-01 2004-10-28 Kari Alitalo VEGF-C or VEGF-D materials and methods for treatment of neuropathologies
EP1436402B1 (en) 2001-10-10 2006-02-22 Société des Produits Nestlé S.A. Coffee plant with reduced alpha-d-galactosidase activity
US7125982B1 (en) 2001-12-05 2006-10-24 Frayne Consultants Microbial production of nuclease resistant DNA, RNA, and oligo mixtures
US6965025B2 (en) 2001-12-10 2005-11-15 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of connective tissue growth factor expression
CA2365811A1 (en) 2001-12-21 2003-06-21 Institut De Cardiologie A new gene therapy using antisense strategy to estrogen receptors (er .alpha. and/or er .beta.) to optimize vascular healing and cardioprotection after vascular injury
KR20030056538A (ko) 2001-12-28 2003-07-04 주식회사 웰진 리본형 안티센스 올리고뉴클레오티드에 의한 형질전이성장 인자-β1의 효과적 저해제 개발
US20030191075A1 (en) 2002-02-22 2003-10-09 Cook Phillip Dan Method of using modified oligonucleotides for hepatic delivery
WO2003070157A2 (en) 2002-02-25 2003-08-28 Jacob See-Tong Pang Vitamin d upregulated protein 1 (vdup-1) methods and uses thereof
WO2003077215A2 (en) 2002-03-08 2003-09-18 Glen Research Corporation Fluorescent nitrogenous base and nucleosides incorporating same
GB2386836B (en) 2002-03-22 2006-07-26 Cancer Res Ventures Ltd Anti-cancer combinations
US7169916B2 (en) 2002-04-01 2007-01-30 Isis Pharmaceuticals, Inc. Chloral-free DCA in oligonucleotide synthesis
US20050215504A1 (en) 2002-04-02 2005-09-29 Bennett C F Antisense modulation of sterol regulatory element-binding protein-1 expression
EP2264172B1 (en) 2002-04-05 2017-09-27 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Oligomeric compounds for the modulation of hif-1alpha expression
US6808906B2 (en) 2002-05-08 2004-10-26 Rigel Pharmaceuticals, Inc. Directionally cloned random cDNA expression vector libraries, compositions and methods of use
US7569575B2 (en) 2002-05-08 2009-08-04 Santaris Pharma A/S Synthesis of locked nucleic acid derivatives
US7199107B2 (en) 2002-05-23 2007-04-03 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of kinesin-like 1 expression
US7148342B2 (en) 2002-07-24 2006-12-12 The Trustees Of The University Of Pennyslvania Compositions and methods for sirna inhibition of angiogenesis
US7838568B2 (en) 2002-08-02 2010-11-23 Bfs Diversified Products, Llc Insulation boards and methods for their manufacture
US20040033480A1 (en) 2002-08-15 2004-02-19 Wong Norman C.W. Use of resveratrol to regulate expression of apolipoprotein A1
US7750211B2 (en) 2002-09-10 2010-07-06 The Samuel Roberts Noble Foundation Methods and compositions for production of flavonoid and isoflavonoid nutraceuticals
AU2003283966A1 (en) 2002-09-25 2004-04-23 Pharmacia Corporation Antisense modulation of farnesoid x receptor expression
WO2004031350A2 (en) 2002-09-26 2004-04-15 Amgen, Inc. Modulation of forkhead box o1a expression
US20040219565A1 (en) * 2002-10-21 2004-11-04 Sakari Kauppinen Oligonucleotides useful for detecting and analyzing nucleic acids of interest
KR20120038546A (ko) 2002-11-01 2012-04-23 더 트러스티스 오브 더 유니버시티 오브 펜실바니아 ＨＩＦ-1 알파의 ｓｉＲＮＡ 억제를 위한 조성물 및 방법
WO2004041838A1 (en) 2002-11-01 2004-05-21 University Of Massachusetts Regulation of transcription elongation factors
GB2394658A (en) 2002-11-01 2004-05-05 Cancer Rec Tech Ltd Oral anti-cancer composition
WO2004044132A2 (en) 2002-11-05 2004-05-27 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modified oligonucleotides for use in rna interference
CA2504694C (en) 2002-11-05 2013-10-01 Isis Pharmaceuticals, Inc. Polycyclic sugar surrogate-containing oligomeric compounds and compositions for use in gene modulation
US20060009410A1 (en) 2002-11-13 2006-01-12 Crooke Rosanne M Effects of apolipoprotein B inhibition on gene expression profiles in animals
ES2607471T3 (es) 2002-11-18 2017-03-31 Roche Innovation Center Copenhagen A/S Diseño antisentido
US7144999B2 (en) 2002-11-23 2006-12-05 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of hypoxia-inducible factor 1 alpha expression
US7713738B2 (en) 2003-02-10 2010-05-11 Enzon Pharmaceuticals, Inc. Oligomeric compounds for the modulation of survivin expression
US7598227B2 (en) 2003-04-16 2009-10-06 Isis Pharmaceuticals Inc. Modulation of apolipoprotein C-III expression
US7339051B2 (en) 2003-04-28 2008-03-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for the treatment of severe acute respiratory syndrome (SARS)
WO2004108081A2 (en) 2003-06-02 2004-12-16 Isis Pharmaceuticals, Inc. Oligonucleotide synthesis with alternative solvents
CA2524495A1 (en) 2003-06-03 2005-01-13 Eli Lilly And Company Modulation of survivin expression
US7825235B2 (en) 2003-08-18 2010-11-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of diacylglycerol acyltransferase 2 expression
NZ576775A (en) 2003-09-18 2010-12-24 Isis Pharmaceuticals Inc Modulation of eIF4E expression
EP1687410A4 (en) 2003-10-07 2008-04-09 Isis Pharmaceuticals Inc ANTISENSE OLIGONUCLEOTIDES OPTIMIZED TO TARGET THE KIDNEY
WO2005045034A2 (en) 2003-10-23 2005-05-19 Sirna Therapeutics, Inc. RNA INTERFERENCE MEDIATED TREATMENT OF PARKINSON DISEASE USING SHORT INTERERING NUCLEIC ACID (siNA)
US8673634B2 (en) * 2003-11-13 2014-03-18 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Method for the treatment of hearing loss
AU2004303464B2 (en) 2003-12-23 2009-10-01 Santaris Pharma A/S Oligomeric compounds for the modulation of BCL-2
US7468431B2 (en) 2004-01-22 2008-12-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Modulation of eIF4E-BP2 expression
GB0403041D0 (en) 2004-02-11 2004-03-17 Milner Anne J Induction of apoptosis
EP1566202A1 (en) 2004-02-23 2005-08-24 Sahltech I Göteborg AB Use of resistin antagonists in the treatment of rheumatoid arthritis
US7402574B2 (en) 2004-03-12 2008-07-22 Avi Biopharma, Inc. Antisense composition and method for treating cancer
WO2005113571A2 (en) * 2004-05-13 2005-12-01 The University Of North Carolina At Chapel Hill Methods for the delivery of oligomeric compounds
US8394947B2 (en) 2004-06-03 2013-03-12 Isis Pharmaceuticals, Inc. Positionally modified siRNA constructs
US7297786B2 (en) 2004-07-09 2007-11-20 University Of Iowa Research Foundation RNA interference in respiratory epitheial cells
WO2006023880A2 (en) 2004-08-23 2006-03-02 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for the characterization of oligonucleotides
EP1833840B9 (en) 2004-11-09 2010-11-10 Santaris Pharma A/S Potent lna oligonucleotides for the inhibition of hif-1a
US7220549B2 (en) 2004-12-30 2007-05-22 Helicos Biosciences Corporation Stabilizing a nucleic acid for nucleic acid sequencing
CA2608964A1 (en) 2005-06-27 2007-01-04 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Rnai modulation of hif-1 and therapeutic uses thereof
US20070213292A1 (en) 2005-08-10 2007-09-13 The Rockefeller University Chemically modified oligonucleotides for use in modulating micro RNA and uses thereof
EP1937312B1 (en) 2005-08-30 2016-06-29 Ionis Pharmaceuticals, Inc. Chimeric oligomeric compounds for modulation of splicing
US7838658B2 (en) 2005-10-20 2010-11-23 Ian Maclachlan siRNA silencing of filovirus gene expression
EP2325315B1 (en) 2005-10-28 2014-05-07 Alnylam Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for inhibiting expression of huntingtin gene
JP5129149B2 (ja) * 2005-10-31 2013-01-23 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ ミシガン 癌を処置および診断するための組成物および方法
EP1942948A4 (en) 2005-11-04 2010-03-03 Alnylam Pharmaceuticals Inc COMPOSITIONS AND METHODS FOR INHIBITING THE EXPRESSION OF THE NAV1.8 GENE
EP2641970B1 (en) 2005-11-17 2014-12-24 Board of Regents, The University of Texas System Modulation of gene expression by oligomers targeted to chromosomal DNA
US20070248590A1 (en) 2005-12-02 2007-10-25 Sirtris Pharmaceuticals, Inc. Modulators of CDC2-like kinases (CLKS) and methods of use thereof
CN101378764A (zh) 2005-12-09 2009-03-04 贝勒研究院 通过血液白细胞微阵列分析对系统性红斑狼疮的诊断、预后和疾病发展的监测
CN100356377C (zh) 2005-12-20 2007-12-19 无锡永中科技有限公司 文档显示方法
WO2007071824A1 (en) 2005-12-20 2007-06-28 Oy Jurilab Ltd Novel genes and markers associated with high-density lipoprotein -cholesterol (hdl-c)
WO2007087113A2 (en) * 2005-12-28 2007-08-02 The Scripps Research Institute Natural antisense and non-coding rna transcripts as drug targets
US7569686B1 (en) 2006-01-27 2009-08-04 Isis Pharmaceuticals, Inc. Compounds and methods for synthesis of bicyclic nucleic acid analogs
PL2314594T3 (pl) 2006-01-27 2014-12-31 Isis Pharmaceuticals Inc Zmodyfikowane w pozycji 6 analogi bicykliczne kwasów nukleinowych
NZ571568A (en) 2006-03-31 2010-11-26 Alnylam Pharmaceuticals Inc Double-stranded RNA molecule compositions and methods for inhibiting expression of Eg5 gene
JP2009536222A (ja) 2006-05-05 2009-10-08 アイシス ファーマシューティカルズ， インコーポレーテッド Ｐｃｓｋ９の発現を調節するための化合物および方法
JP5570806B2 (ja) 2006-05-11 2014-08-13 アルナイラム ファーマシューティカルズ， インコーポレイテッド Ｐｃｓｋ９遺伝子の発現を阻害するための組成物および方法
US7666854B2 (en) 2006-05-11 2010-02-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Bis-modified bicyclic nucleic acid analogs
CA2651453C (en) 2006-05-11 2014-10-14 Isis Pharmaceuticals, Inc. 5'-modified bicyclic nucleic acid analogs
EP1867338A1 (en) 2006-05-30 2007-12-19 Université Libre De Bruxelles Pharmaceutical composition comprising apolipoproteins for the treatment of human diseases
DE102006032710A1 (de) 2006-07-14 2008-01-17 BSH Bosch und Siemens Hausgeräte GmbH Körperschallgedämmtes Mahlwerk für eine Lebensmittelmühle
US7363884B2 (en) 2006-08-10 2008-04-29 Kokusan Denki Co., Ltd. Engine control device with reverse control function
US7725791B2 (en) 2006-10-20 2010-05-25 Texas Instruments Incorporated Single lead alternating TDI/TMS DDR JTAG input
WO2008057556A2 (en) 2006-11-06 2008-05-15 Beth Israel Deaconess Medical Center Identification and use of small molecules to modulate ese-1 transcription factor function and to treat ese-1 transcription factor associated diseases
WO2008066672A2 (en) 2006-11-06 2008-06-05 Beth Israel Deaconess Medical Center Identification and use of small molecules to modulate transcription factor function and to treat transcription factor associated diseases
EP2094836B1 (en) * 2006-11-15 2016-06-08 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Generation of inner ear cells
US8093222B2 (en) 2006-11-27 2012-01-10 Isis Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating hypercholesterolemia
WO2008087561A2 (en) 2007-01-19 2008-07-24 Plant Bioscience Limited Methods and compositions for modulating the sirna and rna-directed-dna methylation pathways
WO2008124660A2 (en) 2007-04-06 2008-10-16 The Johns Hopkins University Methods and compositions for the treatment of cancer
US20080293142A1 (en) 2007-04-19 2008-11-27 The Board Of Regents For Oklahoma State University Multiple shRNA Expression Vectors and Methods of Construction
BRPI0913657A2 (pt) 2008-07-01 2020-08-04 Monsanto Technology Llc constructos de dna recombinante e métodos para a modulação da expressão de um gene-alvo
MY188457A (en) * 2008-10-03 2021-12-10 Opko Curna Llc Treatment of apolipoprotein-a1 related diseases by inhibition of natural antisense transcript to apolipoprotein-a1
EP2177615A1 (en) 2008-10-10 2010-04-21 Fraunhofer-Gesellschaft zur Förderung der angewandten Forschung e.V. Method for a genome wide identification of expression regulatory sequences and use of genes and molecules derived thereof for the diagnosis and therapy of metabolic and/or tumorous diseases
US8606289B2 (en) 2008-11-10 2013-12-10 Qualcomm Incorporated Power headroom-sensitive scheduling
WO2010058227A2 (en) 2008-11-22 2010-05-27 The University Of Bristol NOVEL USES OF VEGFxxxB
ES2661787T3 (es) * 2009-05-01 2018-04-04 Curna, Inc. Tratamiento de enfermedades relacionadas con hemoglobina (hbf/hbg) por inhibición de transcrito antisentido natural para hbf/hbg
NO2576783T3 (ru) 2010-05-26 2018-04-28
WO2013080784A1 (ja) 2011-11-30 2013-06-06 シャープ株式会社 メモリ回路とその駆動方法、及び、これを用いた不揮発性記憶装置、並びに、液晶表示装置

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2233333C2 (ru) * 1993-05-18 2004-07-27 Рон-Пуленк Роре С.А. Вирусные векторы и их применение в генной терапии
RU2008145510A (ru) * 2003-03-04 2010-05-27 Уайт (Us) Композиции и способы диагностики и лечения астмы или других аллергических или воспалительных заболеваний
WO2009100438A2 (en) * 2008-02-07 2009-08-13 Massachusetts Eye & Ear Infirmary Compounds that enhance atoh-1 expression

Also Published As

Publication number Publication date
EP3299464A1 (en) 2018-03-28
DK2576783T3 (en) 2018-03-12
US9624493B2 (en) 2017-04-18
JP2013529909A (ja) 2013-07-25
EP2576783A4 (en) 2014-10-01
US9970008B2 (en) 2018-05-15
TW201200138A (en) 2012-01-01
US20180230468A1 (en) 2018-08-16
US20130085112A1 (en) 2013-04-04
US20150038553A1 (en) 2015-02-05
KR101857090B1 (ko) 2018-06-26
EP2576783A2 (en) 2013-04-10
SA111320487B1 (ar) 2015-01-08
AR081420A1 (es) 2012-08-29
CN107412251A (zh) 2017-12-01
TWI614016B (zh) 2018-02-11
JP2016185148A (ja) 2016-10-27
NO2576783T3 (ru) 2018-04-28
KR20130112695A (ko) 2013-10-14
EP3299464B1 (en) 2019-10-02
RU2012146815A (ru) 2014-07-10
US10253320B2 (en) 2019-04-09
CA2799207A1 (en) 2011-12-01
ES2664572T3 (es) 2018-04-20
US20170152515A1 (en) 2017-06-01
KR20180053419A (ko) 2018-05-21
US8895528B2 (en) 2014-11-25
CN102947451B (zh) 2017-09-22
HK1250742A1 (zh) 2019-01-11
CA2799207C (en) 2019-03-26
WO2011150005A2 (en) 2011-12-01
EP2576783B1 (en) 2017-11-29
TWI688391B (zh) 2020-03-21
WO2011150005A3 (en) 2012-04-05
TW201731516A (zh) 2017-09-16
CN102947451A (zh) 2013-02-27
JP5973996B2 (ja) 2016-08-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2585229C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с атональным гомологом 1 (атон1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена атон1
RU2620980C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с фратаксином (fxn), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта fxn
RU2611191C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных со связывающим половые гормоны глобулином (гспг), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к гспг
RU2615450C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с ядерным респираторным фактором 1(nrf1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к nrf1
RU2597972C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с геном альфа-l-идуронидазы (idua), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена idua
RU2588654C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с альфа-субъединицей потенциалзависимого натриевого канала (scna), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена scna
RU2639550C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с сайт-1 мембраносвязанной пептидазой транскрипционных факторов (mbtps1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к mbtps1
RU2611195C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с интерферон- связанным регулятором развития 1 (ifrd1), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к ifrd1
RU2616283C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с субстратом рецептора инсулина 2 (irs2), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к irs2
RU2611190C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с геном dlg, путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена dlg
RU2624048C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с геном сиалидазы 4 (neu4), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена neu4
RU2619185C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с разобщающим белком 2 (ucp2), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к ucp2
ES2627763T3 (es) Tratamiento de enfermedades relacionadas con el homólogo tipo delta 1 (dlk1) por inhibición de transcrito antisentido natural a dlk1
RU2611192C2 (ru) ЛЕЧЕНИЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С РНКазой Н1, ПУТЕМ ИНГИБИРОВАНИЯ ПРИРОДНОГО АНТИСМЫСЛОВОГО ТРАНСКРИПТА К РНКазе Н1
RU2611187C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с интерферон-регуляторным фактором 8 (irf8), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта к irf8
RU2608493C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с nanog, путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта nanog
RU2620978C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с метионинсульфоксидредуктазой а (msra), путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена msra
WO2012009347A2 (en) Treatment of bcl2 binding component 3 (bbc3) related diseases by inhibition of natural antisense transcript to bbc3
RU2575608C2 (ru) Лечение заболеваний, связанных с белком апоптозного ответа простаты par4, путем ингибирования природного антисмыслового транскрипта гена par4