JP2004530420A

JP2004530420A - インターフェロン−α誘導性遺伝子

Info

Publication number: JP2004530420A
Application number: JP2002563192A
Authority: JP
Inventors: − フランソワメリテ、ジャン; ドロン、ミシェル; トヴェイ、ミヒャエル、ジェラール
Original assignee: ファーマパシフィックプロプライエタリーリミテッド
Priority date: 2000-06-29
Filing date: 2001-06-29
Publication date: 2004-10-07
Also published as: EP1294754A1; WO2002062840A1; US20030176341A1; US20060141580A1

Abstract

本発明は、配列番号１のｃＤＮＡ配列に対応する、インターフェロン−α投与によりアップレギュレートされる遺伝子の同定に関する。この遺伝子の発現産物の測定は、インターフェロン−α、および１型インターフェロン受容体で作用する他のインターフェロンを用いる治療に対する応答性を予測するのに有用であると言われている。同じ遺伝子によりコードされるタンパク質の治療的使用も企図される。

Description

【０００１】
（発明の分野）
本発明は、そのコード配列が従来は未知であると考えられる、インターフェロン−α（ＩＦＮ−α）投与によりアップレギュレートされるヒト遺伝子の同定に関する。この遺伝子の発現産物の検出は、ＩＦＮ−α、および１型インターフェロン受容体で作用する他のインターフェロンに対する応答性を予測するのに有用であり得る。同じ遺伝子によりコードされる単離された新規タンパク質の治療的使用も企図される。
【０００２】
（発明の背景）
ＩＦＮ−αは、多くの疾患の治療で広く使用されている。ＩＦＮ−αを使用して治療される疾患には、新生物疾患（例えば、白血病、リンパ腫、および固形腫瘍）、ＡＩＤＳ関連カポジ肉腫、およびウイルス感染症（例えば、慢性肝炎）がある。ＩＦＮ−αはまた、自己免疫疾患、マイコバクテリウム疾患、神経変性疾患、寄生体疾患、およびウイルス疾患の治療のために、口粘膜経路による投与が提唱されている。特にＩＦＮ−αは、例えば、多発性硬化症、らい病、結核、脳炎、マラリア、子宮頚癌、陰部ヘルペス、Ｂ型肝炎とＣ型肝炎、ＨＩＶ、ＨＰＶおよびＨＳＶ−１と２の治療について提唱されている。これはまた、関節炎、ループスおよび糖尿病の治療についても示唆されている。新生物疾患、例えば、多発性骨髄腫、ヘアリーセル白血病、慢性骨髄性白血病、低グレードリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、カルチノイド腫瘍、子宮頚癌、肉腫（例えばカポジ肉腫）、腎腫瘍、癌（腎細胞癌、肝細胞癌、上咽頭癌、血液癌、結腸直腸癌、神経膠芽細胞腫、喉頭パピローマ、肺癌、結腸癌、悪性黒色腫、および脳腫瘍を含む）もまた、口粘着経路（すなわち、経口および鼻内経路）によるＩＦＮ−αの投与により治療可能であることが示唆されている。
【０００３】
ＩＦＮ−αは、１型インターフェロンファミリーのメンバーであり、１型インターフェロン受容体との相互作用を介してその特徴的な生物活性を示す。他の１型インターフェロンには、ＩＦＮ−β、ＩＦＮ−ω、およびＩＦＮ−τがある。
【０００４】
残念ながら、インターフェロン−αのような１型インターフェロンによる治療の必ずしもすべての候補患者（例えば、慢性ウイルス肝炎、新生物疾患、および再発性弛緩性多発性硬化症の患者）が、１型インターフェロン療法に良好に応答することはなく、また応答する者のうちほんの一部のみが長期的効果を示す。医師が１型インターフェロンの治療の結果を自信を持って予測できないことは、そのような治療のコスト−利益比に関して、治療の膨大な生物薬学的時間と失われた時間の無駄と、患者が受ける重大な副作用の点から、重大な問題を提起している。さらに、ＩＦＮ−αの異常産生は、多くの自己免疫疾患を引き起こすことが証明されている。これらの理由のために、１型インターフェロンは、多くの遺伝子の発現を調節して治療作用を示すため、１型インターフェロン応答性遺伝子の同定に大きな関心が寄せられている。実際、患者が治療にうまく応答するかいなかを決定するのは、１型インターフェロン治療により誘導される遺伝子発現の特異的パターンである。
【０００５】
（発明の要約）
ヒト遺伝子ｃＤＮＡは現在、口粘膜経路または腹腔内経路によるＩＦＮ−αの投与によりアップレギュレートされるマウス遺伝子に対応するとして同定されている。従って対応するヒト遺伝子は、ＩＦＮ−αアップレギュレート遺伝子と呼ばれる。
【０００６】
同じ遺伝子によりコードされるタンパク質を、以後ＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質と呼ぶ。このタンパク質およびその機能性変種は現在、特に抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、または免疫調節剤として使用するための治療薬として企図される。例えばこれらは、自己免疫疾患、マイコバクテリウム疾患、神経変性疾患、寄生体疾患、またはウイルス疾患、関節炎、糖尿病、ループス、多発性硬化症、らい病、結核、脳炎、マラリア、子宮頚癌、陰部ヘルペス、Ｂ型肝炎またはＣ型肝炎、ＨＩＶ、ＨＰＶ、ＨＳＶ−１または２、または新生物疾患、例えば、多発性骨髄腫、ヘアリーセル白血病、慢性骨髄性白血病、低グレードリンパ腫、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、カルチノイド腫瘍、子宮頚癌、肉腫（例えばカポジ肉腫）、腎腫瘍、癌（腎細胞癌、肝細胞癌、上咽頭癌、血液癌、結腸直腸癌、神経膠芽細胞腫、喉頭パピローマ、肺癌、結腸癌、悪性黒色腫、および脳腫瘍を含む）の治療で使用してもよい。すなわち、そのようなタンパク質は、１型インターフェロンで治療可能な疾患を治療するのに有用であり得る。
【０００７】
１型インターフェロン治療患者（例えば、ＩＦＮ−αを用いて、例えば口粘膜経路または非経口経路により治療される患者）の細胞試料中の、ＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質その天然に存在する変種、または対応するｍＲＮＡの測定もまた、そのような治療に対する応答性を予測するのに使用される。あるいは、かつさらに好ましくは、そのような応答性は、例えばヒト末梢血単核細胞の試料を１型インターフェロンでインビトロで処理し、ＨｕＩＦＲＧ１５．４遺伝子に対応する発現産物（好ましくはｍＲＮＡ）のアップレギュレーションまたはダウンレギュレーションを調べることにより、判定される。
【０００８】
本発明の第１の面において：
（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｉｉ）実質的に類似の機能、例えば免疫調節活性および／または抗ウイルス活性および／または抗腫瘍活性を有する、その変種；または
（ｉｉｉ）実質的に類似の機能、例えば免疫調節活性および／または抗ウイルス活性および／または抗腫瘍活性を保持する（ｉ）または（ｉｉ）の断片、
を含む単離されたポリペプチドが提供される。
【０００９】
本発明はまた、ヒトまたは非ヒト動物の治療で使用するための、さらに詳しくは抗ウイルス剤、抗腫瘍剤または免疫調節剤として使用するための、そのようなタンパク質を提供する。上記したように、そのような使用は、任意の１型インターフェロンで治療可能な疾患を包含してもよい。
【００１０】
本発明の別の面において、上記の本発明のポリペプチドをコードする単離されたポリヌクレオチドまたはその相補体が提供される。そのようなポリヌクレオチドは典型的には、以下を含む配列を含む：
（ａ）配列番号１の核酸、またはそのコード配列および／またはそれに相補的な配列；
（ｂ）例えば厳密性（ストリンジェント）条件下で、（ａ）で定義した配列に相補的な配列にハイブリダイズする配列；
（ｃ）遺伝コードの結果として、（ａ）または（ｂ）で定義した配列と縮重した配列；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で定義した配列と、少なくとも６０％の同一性を有する配列。
【００１１】
本発明はまた、以下を提供する：
− 本発明のポリヌクレオチドを含み、本発明のポリペプチドを発現することができる発現ベクター；
− 本発明の発現ベクターを含有する宿主細胞；
− 本発明のポリペプチドに特異的な抗体；
− １型インターフェロンで治療可能な疾患を有する被験体の治療法であって、該患者に、有効量のＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質またはその機能性変種を投与することを含む方法；
− 抗ウイルス剤または抗腫瘍剤または免疫調節剤として治療に使用するための、さらに詳しくは１型インターフェロンで治療可能な疾患の治療に使用するための、薬剤の製造におけるそのようなポリペプチドの使用；
− 本発明のポリペプチドと薬剤学的に許容される担体もしくは希釈剤を含む医薬組成物；
− 本発明のポリペプチドの産生方法であって、本発明の宿主細胞を、ポリペプチドの発現を得るのに適した条件下で維持し、該ポリペプチドを単離することを含む方法；
− ヒトまたは非ヒト動物の治療的処置で使用するための、さらに詳しくは抗ウイルス剤、抗腫瘍剤または免疫調節剤として使用するための、上記で定義したポリペプチドのインビボ発現を指令する、例えば発現ベクターの形の本発明のポリヌクレオチド；
− そのようなポリヌクレオチドと薬剤学的に許容される担体もしくは希釈剤を含む医薬組成物；
− １型インターフェロンで治療可能な疾患を有する被験体の治療法であって、有効量のそのようなポリヌクレオチドを該患者に投与することを含む方法；
− 抗ウイルス剤、は抗腫瘍剤または免疫調節剤として治療に使用するための、さらに詳しくは１型インターフェロンで治療可能な疾患の治療に使用するための、薬剤、例えばベクター調製物の製造におけるそのようなポリヌクレオチドの使用；
− 免疫調節活性および／または抗ウイルス活性および／または抗腫瘍活性を有する化合物の同定方法であって、ＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質またはその天然に存在する変種を発現することができる細胞を提供し、該細胞を試験化合物とともにインキュベートし、ＨｕＩＦＲＧ１５．４遺伝子発現のアップレギュレーションを追跡することを含む方法。
【００１２】
さらに別の面において本発明は、患者からの細胞試料（例えば血液試料）中の、ＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質またはその天然に存在する変種（例えばアレレ変種）、または対応するｍＲＮＡのレベルを測定することを含んでなる、１型インターフェロンを用いる治療、例えばＩＦＮ−α治療（例えば、口粘膜経路または非経口経路、例えば静脈内、皮下、または筋肉内経路によるＩＦＮ−α治療）に対する患者の応答性を予測する方法であって、該試料は、１型インターフェロン（例えばＩＦＮ−α）の投与（例えば、口粘膜経路または静脈内経路）後に該患者から得られるか、または該測定の前に、１型インターフェロン（例えば、ＩＦＮ−α）でインビトロで処理される、上記方法が提供される。本発明はまた、そのような試験を実施するためのキットを包含する。
【００１３】
（配列の簡単な説明）
配列番号１は、ヒトタンパク質ＨｕＩＦＲＧ１５．４のアミノ酸配列とそのコードするｃＤＮＡである。
配列番号２は、ＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質のアミノ酸配列のみである。
【００１４】
（発明の詳細な説明）
上記したようにヒトタンパク質ＨｕＩＦＲＧ１５．４とその機能性変種は現在、治療的に有用な物質として、さらに詳しくは抗ウイルス剤、抗腫瘍剤、または免疫調節剤としての使用が企図される。
【００１５】
この目的のためにＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質の変種は、ＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質と実質的に同じ機能活性を有し、ＩＦＮ−αの投与に応答してアップレギュレートされる、天然に存在する変種（アレレ変種または種変種）でもよい。あるいは治療用途のＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質の変種は、配列番号２とは異なるが非天然の変異体である配列を含んでよい。
【００１６】
「機能性変種」という用語は、ＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質の基本的機能と基本的に同じ性質を有するポリペプチドを含む。ＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質の基本的性質は、免疫調節ペプチドであると見なされる。機能性変種ポリペプチドは、追加的にまたは代替的に、抗ウイルス活性（例えば、アポトーシス）および／または抗腫瘍活性を示す。
【００１７】
所望の抗ウイルス活性は、例えば以下のように試験される。試験すべき変種をコードする配列は、ウイルスパッケージングシグナルψおよび薬剤耐性マーカーを含有する、モロニーマウス白血病ウイルス（ＭｏＭｕＬＶ）から得られるレトロウイルスベクターのようなレトロウイルスベクター中にクローン化される。ウイルスｇａｇおよびｐｏｌ遺伝子を含有する向汎性パッケージング細胞株は、次に組換えレトロウイルスベクターおよびプラスミドｐＶＳＶ−Ｇ（水疱性口内炎ウイルスエンベロープ糖タンパク質を含有する）と同時トランスフェクションされて、高力価の感染性複製不能ウイルスが産生される（バーンズ（Ｂｕｒｎｓ）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８４，５２３２−５２３６）。次に感染性組換えウイルスを使用して、インターフェロン感受性繊維芽細胞またはリンパ芽球細胞をトランスフェクションし、次に変種タンパク質を安定に発現する細胞株を選択し、標準的インターフェロンバイオアッセイでウイルス感染に対する耐性について試験する（トベイ（Ｔｏｖｅｙ）ら、Ｎａｔｕｒｅ，２７１，６２２−６２５，１９７８）。標準的増殖測定法（モスマン（Ｍｏｓｍａｎｎ，Ｔ．）、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ，６５，５５−６３，１９８３）を使用する増殖阻害と、標準的方法を使用するＭＨＣクラスＩおよびクラスＩＩの発現も調べてもよい。
【００１８】
ＨｕＩＦＲＧ１５．４の所望の機能性変種は、基本的に配列番号２の配列からなる。配列番号２の機能性変種は、少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、例えば少なくとも１００の連続アミノ酸の領域にわたって、または配列番号２の完全長にわたって、配列番号２のアミノ酸配列と、少なくとも６０％〜７０％の同一性、好ましくは少なくとも８０％または少なくとも９０％および特に好ましくは少なくとも９５％、少なくとも９７％または少なくとも９９％の同一性を有するポリペプチドでもよい。タンパク質の同一性を測定する方法は、当該分野で公知である。
【００１９】
例えば１、２、または３から１０、２０または３０置換のアミノ酸置換を作成してもよい。例えば、以下の表に従って保存的置換を作成してもよい。２列目の同じブロック中、および好ましくは３列目の同じ行のアミノ酸は、互いに置換できる。
【００２０】

【００２１】
本発明の治療で使用される変種ポリペプチド配列は、より短いポリペプチド配列、例えば長さが少なくとも２０アミノ酸のペプチドでもよく、または５０、６０、７０、８０、１００、１５０または２００アミノ酸までの長さも、ＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質の適切な生物活性を保持する限り、本発明の範囲内にあると考えられる。特に（しかし、排他的ではない）本発明のこの面は、変種が、完全な天然に存在するタンパク質配列のフラグメントである時を包含する。
【００２２】
また、抗ＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質抗体を作成するのに使用することができるＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質の修飾型およびその断片も、本発明に包含される。そのような変種は、ＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質のエピトープを含むであろう。
【００２３】
本発明のポリペプチドは、化学的に修飾（例えば、翻訳的に修飾）してもよい。例えばこれらは、グリコシル化されるかおよび／または修飾アミノ酸残基を含有してもよい。これらはまた、Ｎ末端および／またはＣ末端で配列の付加により、例えばその精製を助けるためにヒスチジン残基またはＴ７標識の提供により、または細胞膜への挿入を促進するためにシグナル配列の付加により、修飾してもよい。そのような修飾ポリペプチドは、本発明の「ポリペプチド」という用語の範囲に含まれる。
【００２４】
本発明のポリペプチドは、露出性の標識物で標識してもよい。露出性の標識物は、ポリペプチドが検出されることを可能にする任意の適切な標識物である。適切な標識物には、ラジオアイソトープ（例えば、^１２５Ｉ、^３５Ｓ）、または酵素、抗体、ポリヌクレオチド、およびリンカー（例えば、ビオチン）がある。本発明の標識ポリペプチドは、アッセイで使用してもよい。そのようなアッセイにおいて、固体支持体に結合したポリペプチドを提供することが好ましい。本発明はまた、容器中のキットの形でパッケージングされたそのような標識したおよび／または固定化したポリペプチドに関する。キットは場合により、他の適切な試薬、対照、または説明書などを含有してもよい。
【００２５】
本発明のポリペプチドは、合成法または組換え法により作成してもよい。本発明のそのようなポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸（例えばＤアミノ酸）を含むように修飾してもよい。本発明の変種ポリペプチドは、インビトロおよび／またはインビボでの安定性を上昇させるための修飾を有してもよい。ポリペプチドが合成法により産生される時、そのような修飾は、産生中に導入される。ポリペプチドはまた、合成または組換え産生後に、修飾してもよい。
【００２６】
タンパク質修飾分野では、多くの側鎖修飾が公知であり、本発明のポリペプチド中に存在してもよい。そのような修飾には、例えばアルデヒドと反応し次にＮａＢＨ_４と反応させる還元的アルキル化によるアミノ酸の修飾、メチルアセトイミデートによるアミジノ化、または無水酢酸によるアシル化がある。
【００２７】
本発明のポリペプチドは、実質的に単離した型である。ポリペプチドは、ポリペプチドの目的を妨害しない担体または希釈剤と混合してもよく、それでも実質的に単離されていると見なされる。本発明のポリペプチドはまた、実質的に精製された型で、一般に調製物中９０重量％より多い、例えば９５、９８または９９重量％より多いポリペプチドが本発明のポリペプチドである調製物中でポリペプチドを含む。
【００２８】
ポリヌクレオチド
本発明はまた、ＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質またはその変種をコードする単離されたヌクレオチド配列、ならびにこれに相補的な単離されたヌクレオチド配列を含む。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡまたはＲＮＡ、１本鎖または２本鎖（ゲノムＤＮＡ、合成ＤＮＡ、ｃＤＮＡを含む）でもよい。好ましくはヌクレオチド配列は、ＤＮＡ配列であり、最も好ましくはｃＤＮＡ配列である。
【００２９】
前記したように、そのようなポリヌクレオチドは典型的には：
（ａ）配列番号１の核酸、またはそのコード配列、および／またはそれに相補的な配列；
（ｂ）例えば厳密性条件下で、（ａ）で定義した配列に相補的な配列にハイブリダイズする配列；
（ｃ）遺伝コードの結果として（ａ）または（ｂ）で定義した配列と縮重した配列；
（ｄ）（ａ）、（ｂ）、または（ｃ）で定義した配列と少なくとも６０％の同一性を有する配列、
を含むであろう。
【００３０】
適切なコード配列を含むポリヌクレオチドは、ヒト細胞から単離されるか、または例えばサムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）モレキュラークローニング、実験室マニュアル、第２版、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）に記載のような、当該分野で公知の方法に従って合成される。
【００３１】
本発明のポリヌクレオチドは、その中に合成または修飾ヌクレオチドを含有してもよい。ポリヌクレオチドへの多くの異なる型の修飾が当該分野で公知である。それらには、メチルホスフォネートおよびホスホチオエート骨格、分子の３’末端および／または５’末端のアクリジンまたはポリリジン鎖の付加がある。そのような修飾は、本発明のポリヌクレオチドのインビボ活性の上昇または寿命の延長のために行われる。
【００３２】
典型的には本発明のポリヌクレオチドは、ヌクレオチド配列を含有し、これは好ましくはヌクレオチドの連続的配列であり、選択的条件下で配列番号１のコード配列またはコード配列の相補体にハイブリダイズすることができる。そのようなハイブリダイゼーションは、バックグランドより有意に高いレベルで起きるであろう。バックグランドハイブリダイゼーションは、例えばｃＤＮＡライブラリー中に存在する他のｃＤＮＡにより起きるかも知れない。本発明のポリヌクレオチドと配列番号１のコード配列またはコード配列の相補体との間の相互作用により生成するシグナルレベルは、他のポリヌクレオチドと配列番号１のコード配列との間の相互作用より、典型的には少なくとも１０倍、好ましくは少なくとも１００倍強い。相互作用の強度は、例えばプローブを例えば^３２Ｐで放射能標識して測定される。選択的ハイブリダイゼーションは、典型的には低い厳密性（約４０℃の０．３Ｍ塩化ナトリウムと０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）、中程度の厳密性（例えば、約５０℃の０．３Ｍ塩化ナトリウムと０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）、または高い厳密性（例えば、約６０℃の０．０３Ｍ塩化ナトリウムと０．０３Ｍクエン酸ナトリウム）の条件下で行われる。
【００３３】
配列番号１のコード配列は、ヌクレオチド置換（例えば１、２または３から１０、２５、５０または１００の置換）により修飾してもよい。縮重置換が行われるかおよび／または、修飾配列が例えば上記表に示すように翻訳された時、保存的アミノ酸置換が起きるような置換が行われてもよい。配列番号１のコード配列は、代替的にまたは追加的に、１つ以上の挿入および／または欠失および／または一端または両端での伸長により修飾されてよい。
【００３４】
配列番号１から選択されたＤＮＡ配列、そのコード配列、およびそれに相補的なＤＮＡ配列に選択的にハイブリダイズすることができる本発明のポリヌクレオチドは、標的配列に一般的に少なくとも７０％、好ましくは少なくとも８０％または９０％およびさらに好ましくは少なくとも９５％または９７％相同的である。この相同性は、典型的には少なくとも２０、好ましくは少なくとも３０、例えば少なくとも４０、６０または１００またはそれ以上の連続的ヌクレオチドの領域にわたる。
【００３５】
上記の相同性の程度と最小のサイズの任意の組合せは本発明のポリヌクレオチドを定義するのに使用され、より厳密な組合せ（すなわち、より長い長さにわたってより高い相同性）が好ましい。すなわち例えば２５、好ましくは３０ヌクレオチド以上にわたって少なくとも８０％の相同性のポリヌクレオチドが適当であり、４０ヌクレオチドにわたって少なくとも９０％の相同性のポリヌクレオチドが同様に好ましい。
【００３６】
本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはタンパク質配列の同族体は、相同性計算の公知の手段によって決定され、例えばタンパク質相同性は、アミノ酸同一性（時に「ハード（ｈａｒｄ）相同性」と呼ばれる）に基づき計算される。例えばＵＷＧＣＧパッケージは、相同性を計算するのに使用できるＢＥＳＴＦＩＴプログラムを提供する（例えば、そのデファオルト設定に基づき使用される）（デベロー（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ）ら、（１９８４）ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ１２，３８７−３９５）。例えばアルツチュル・エス・エフ（ＡｌｔｓｃｈｕｌＳ．Ｆ．）（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３６，２９０−３００；アルツチュル・エス・エフ（ＡｌｔｓｃｈｕｌＳ．Ｆ．）ら（１９９３）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５，４０３−１０に記載のように、相同性またはラインアップ配列を計算するのにまたは同等のまたは対応する配列を同定するのに、ＰＩＬＥＵＰおよびＢＬＡＳＴアルゴリズムを、そのデファオルト設定に基づき使用することができる。
【００３７】
ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション（ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）から公に入手できる。このアルゴリズムは、データベース配列中の同じ長さの単語と並べた時、ある正の閾値スコアＴに一致するかまたは満足する問題の配列中の長さＷの短い単語を同定することにより、まず高スコア配列対（ＨＳＰｓ）を同定する。Ｔは、近隣単語スコア閾値と呼ばれる（アルツチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）ら、前述）。これらの近隣単語ヒットは、それらを含むＨＳＰｓを見つけるための検索を開始するための元になる。単語ヒットは、累積整列スコアが増加する限り、各配列に沿って両方向に伸長される。各方向の単語ヒットの延長は、以下の時停止する：累積整列スコアが、その最大達成値から量Ｘだけ低下した時；１つ以上の負のスコアの残基整列の蓄積により、累積スコアがゼロまたはそれ以下になった時；またはいずれかの配列の末端に到達した時。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメータＷ、ＴおよびＸは、整列の感度と速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、デフォルト値として、単語長さ（Ｗ）が１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（ヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）とヘニコフ（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９，１０９１５−１０９１９）整列（Ｂ）が５０、予測（Ｅ）が１０、Ｍ＝５、Ｎ＝４を使用し、および両方の鎖の比較を使用する。
【００３８】
ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列の間の類似性の統計解析を行う；例えば、カーリン（Ｋａｒｌｉｎ）とアルツチュル（Ａｌｔｓｃｈｕｌ）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ９０：５８７３−５７８７を参照。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の１つの尺度は、最も小さい和確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列の一致が偶然起きる確率を示す。例えば第１の配列と第２の配列との比較における最も小さい和確率が約１未満、好ましくは約０．１未満、さらに好ましくは約０．０１未満、および最も好ましくは約０．００１未満なら、その配列は別の配列と同様であると見なされる。
【００３９】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のタンパク質の産生において有用であり、これは、インビトロ、インビボ、またはエクスビボで起きる。そのようなポリヌクレオチドにおいて、本発明の所望のタンパク質のコード配列は、選択された宿主細胞中の所望のタンパク質の発現を指令することができるプロモーター配列に機能できる形で結合しているであろう。そのようなポリヌクレオチドは一般的に、発現ベクターの形にある。免疫調節活性および／または抗ウイルス活性および／または抗腫瘍活性を有する本発明のポリペプチドのインビボの発現を指令する本発明のポリヌクレオチド（例えば発現ベクターの形）は、治療薬としても使用される。
【００４０】
そのような目的の発現ベクターは、組換えＤＮＡ技術の分野で一般的な方法に従って構築される。これらは、例えばプラスミドＤＮＡの使用を含む。これらは、複製開始点とともに提供される。そのようなベクターは、１つ以上の選択マーカー遺伝子、例えば細菌プラスミドの場合はアンピシリン耐性遺伝子を含有してもよい。本発明のベクターの他の特徴は、適切なイニシエーター、エンハンサーおよび他の要素（例えば、好ましくかつ正しい配向で位置しているポリアデニル化シグナル）を含有して、タンパク質発現を可能にする。他の適当な非プラスミドベクターは、当業者に公知である。この点でさらに例として、サムブルーク（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら１９８９（前述）を再度参照されたい。そのようなベクターは、例えばウイルスベクターを追加的に含有してもよい。適当なウイルスベクターの例には、単純ヘルペスウイルスベクター、複製欠損レトロウイルス（レンチウイルスを含む）、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＨＰＶウイルス（例えば、ＨＰＶ−１６とＨＶＰ−１８）および弱毒化インフルエンザウイルスベクターがある。
【００４１】
プロモーターおよび他の発現制御シグナルは、発現が計画される宿主細胞に適合性があるように選択される。例えば酵母プロモーターには、エス・セレビッシェ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＧＡＬ４やＡＤＨプロモーター、エス・ポンベ（Ｓ．ｐｏｍｂｅ）ｎｍｔ１およびａｄｈプロモーターがある。哺乳動物プロモーターには、重金属（例えば、カドミウム）に応答して誘導されるメタロチオネインプロモーターおよびβ−アクチンプロモーターがある。ＳＶ４０ラージＴ抗原プロモーター、またはアデノウイルスプロモーターのようなウイルスプロモーターも使用される。使用可能なウイルスプロモーターの他の例には、モロニーマウス白血病ウイルス末端繰返し配列（ＭＭＬＶＬＴＲ）、ラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＶＭ）ＩＥプロモーター、およびＨＰＶプロモーター、特にＨＰＶ上流制御領域（ＵＲＲ）がある。他の適当なプロモーターは、組換えＤＮＡ分野の当業者に公知である。
【００４２】
本発明の発現ベクターは、さらに真核生物ゲノム配列、好ましくは哺乳動物ゲノム配列、またはウイルスゲノム配列に相補的配列を提供する本発明の所望のポリペプチドのためのコード配列の両側に位置する配列を含む。これは、相同的組換えによる真核生物細胞またはウイルスのゲノム内への本発明のそのようなポリヌクレオチドの導入を可能にする。特に、ウイルス配列が両側に位置する発現カセットを含むプラスミドベクターを使用して、本発明のポリヌクレオチドを哺乳動物細胞に送達するのに適したウイルスベクターが調製される。
【００４３】
本発明はまた、ＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質またはその変種を発現するように修飾されたインビトロの細胞、例えば原核生物細胞または真核生物細胞を含む。そのような細胞は、安定な、例えば真核生物細胞株を含み、ここでＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質またはその変種をコードするポリヌクレオチドは、宿主のゲノム内に取り込まれる。本発明の宿主細胞は、哺乳動物細胞または昆虫細胞、下等真核生物細胞（例えば酵母）、または原核生物細胞（例えば、細菌細胞）でもよい。本発明のポリペプチドをコードするベクターの挿入により修飾される細胞の具体的な例には、哺乳動物ＨＥＫ２９３Ｔ、ＣＨＯ、ＨｅＬａおよびＣＯＳ細胞がある。好ましくは細胞株は、安定なだけでなく、ポリペプチドの成熟したグリコシル化を可能にするものが選択される。発現は、例えば、形質転換された卵母細胞中で行われる。
【００４４】
本発明のポリペプチドは、トランスジェニック非ヒト動物、好ましくはマウスの細胞で発現される。本発明のポリペプチドを発現することができるトランスジェニック非ヒト動物は、本発明の範囲に含まれる。
【００４５】
本発明のポリヌクレオチドはまた、アンチセンス配列の産生を提供することができるように、アンチセンス配向で上記のベクター中に挿入される。アンチセンスＲＮＡまたは他のアンチセンスポリヌクレオチドもまた、合成手段により産生される。
【００４６】
ヒトまたはヒトではない動物の治療に使用される、配列番号２で定義されるアミノ酸配列のコード配列またはその天然に存在する変種のアンチセンスをインビボで発現することができる、例えば発現ベクターの形の、ポリヌクレオチドもまた、本発明の追加の面を構成することが企図される。そのようなポリヌクレオチドは、ＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質のアップレギュレーションに関連する疾患の治療に有用であろう。
【００４７】
本発明のポリヌクレオチドは、本発明のポリペプチドのｃＤＮＡ内の配列を標的とする核酸増幅のためのプライマーのセット、またはＰＣＲ増幅のためのプライマー対を包含する。本発明はまた、本発明のポリペプチドのｃＤＮＡまたはＲＮＡ内の配列を標的とするのに適したプローブを提供し、これは、露出性の標識物、例えば放射能標識物または非放射能標識物（例えば、酵素またはビオチン）で標識されてよい。そのようなプローブは、固体支持体に結合してもよい。そのような固体支持体は、さらなる核酸（例えば、他の１型インターフェロンアップレギュレートされた遺伝子、例えばＩＦＮ−αの口腔粘膜または静脈内投与に応答してアップレギュレートされるとして同定される遺伝子に対応する、ｍＲＮＡまたはその増幅産物）のプローブを運搬するマイクロアレイ（一般的に核酸、プローブまたはＤＮＡチップとも呼ばれる）でもよい。そのようなマイクロアレイを構築する方法は公知である（例えば、アフィマックス・テクノロジーズ（ＡｆｆｙｍａｘＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）Ｎ．Ｖ．のＥＰ−Ｂ０４７６０１４号および０６１９３２１号、およびＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ増刊、１９９９年１月号、標題「チッピング予測」を参照）。
【００４８】
そのようなプライマーまたはプローブの核酸配列は、好ましくは少なくとも１０、好ましくは少なくとも１５または少なくとも２０、例えば少なくとも２５、少なくとも３０または少なくとも４０ヌクレオチドの長さである。しかしこれは、最大４０、５０、６０、７０、１００または１５０ヌクレオチドの長さまたはそれ以上でもよい。
【００４９】
本発明の別の面は、ＨｕＩＦＲＧ１５．４遺伝子中の突然変異（例えば、単一のヌクレオチド多型（ＳＮＰｓ））を同定するための本発明のプローブまたはプライマーの使用である。
【００５０】
前記したように、別の面において本発明は、ＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質または天然に存在するその変種を発現することができる細胞を提供し、該細胞を試験化合物とインキュベートし、ＨｕＩＦＲＧ１５．４遺伝子発現のアップレギュレーションを追跡することを含む、免疫調節活性および／または抗ウイルス活性および／または抗腫瘍活性を有する化合物の同定方法を提供する。そのような追跡は、ＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質またはその天然に存在する変種をコードするｍＲＮＡをプローブ結合することにより行われる。あるいは１つ以上のＨｕＩＦＲＧ１５．４および天然に存在する変種の１つ以上に特異的に結合することができる抗体または抗体断片も使用される。
【００５１】
抗体
別の面において本発明はまた、従来法により得られ、かつ本発明のポリペプチドに特異的な抗体（例えば、ポリクローナル抗体または好ましくはモノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体と抗原結合能を保持するその断片）に関する。そのような抗体は、例えば、免疫沈降を含む精製、単離またはスクリーニング法に有用であり、ＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質またはその変種の機能をさらに解明するための手段として使用されるであろう。これらは、それ自身が治療薬であり得る。そのような抗体は、本発明のタンパク質の特異的エピトープに対して作成される。抗体は、あるタンパク質に高親和性で結合するが、他のタンパク質には結合しないかまたは低親和性で結合する時、そのタンパク質に特異的に結合する。抗体の特異的結合能を測定するための競合的結合アッセイまたは免疫放射アッセイのための種々のプロトコールが知られている。
【００５２】
医薬組成物
本発明のポリペプチドは典型的には、薬剤学的に許容される担体もしくは希釈剤とともに投与するために製剤化される。この薬剤学的に許容される担体もしくは希釈剤は、例えば等張溶液でもよい。例えば固体経口剤は、活性化合物とともに、希釈剤、例えば乳糖、デキストロース、サッカロース、セルロース、コーンスターチまたはポテトスターチ；滑沢剤、例えばシリカ、タルク、ステアリン酸、ステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム、および／またはポリエチレングリコール；結合剤、例えばデンプン、アラビアゴム、ゼラチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースまたはポリビニルピロリドン；崩壊剤、例えばデンプン、アルギン酸、アルギン酸塩またはナトリウムデンプングリコレート；発泡剤；色素；甘味剤；湿潤剤、例えばリシチン、ポリソルベート、ラウリル硫酸塩；および一般的に、製剤で使用される非毒性かつ薬学的不活性な物質を含有する。そのような医薬調製物は、公知の方法で製造され、例えば混合、造粒法、打錠法、糖衣、またはフィルムコーティングプロセスで製造される。
【００５３】
経口投与用の液体分散物は、シロップ剤、乳剤および懸濁剤でもよい。シロップ剤は、担体として、例えばサッカロースまたはグリセリンおよび／またはマンニトールおよび／またはソルビトールとともにサッカロースを含有してもよい。
【００５４】
懸濁剤と乳剤は、担体として例えば天然ゴム、寒天、アルギン酸ナトリウム、ペクチン、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、またはポリビニルアルコールを含有してもよい。筋肉内注射のための懸濁剤または溶液剤は、活性化合物とともに、薬剤学的に許容される担体、例えば無菌水、オリーブ油、オレイン酸エチル、グリコール、例えばプロピレングリコール、および所望であれば、適切な量の塩酸リドカインを含有してもよい。
【００５５】
静脈内投与または点滴用の溶液は、担体として例えば無菌水を含有してもよく、または好ましくはこれらは、無菌、水性、等張の食塩水の形でもよい。
【００５６】
本発明で使用されるＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質またはその機能的類似体の適切な用量は、種々のパラメータ、特に使用される物質；治療される患者の年齢、体重および症状；投与経路；および必要な処方によって決定される。再度医師が、特定の患者の必要な投与経路や用量を決定するであろう。典型的な１日当たりの用量は、特異的インヒビターの活性、治療される被験体の年齢、体重および症状、および投与の頻度と経路に従って、約０．１〜５０ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは約０．１ｍｇ／ｋｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重である。好ましくは１日当たりの用量レベルは、５ｍｇ〜２ｇである。
【００５７】
治療用途に適した本発明のポリヌクレオチドはまた、典型的には薬剤学的に許容される担体もしくは希釈剤との投与用に製剤化されるであろう。そのようなポリヌクレオチドは、インビボで所望のポリペプチドの発現が達成される任意の公知の方法により投与される。例えばポリヌクレオチドは、注射（好ましくは、皮内、皮下または筋肉内）により投与される。あるいは核酸を、直接皮膚を通して粒子介在送達装置を使用して投与してもよい。治療用核酸に適した本発明のポリヌクレオチドは、あるいは例えば鼻内または経口投与により、口腔粘膜表面に投与される。
【００５８】
治療用途に適した本発明の非ウイルスベクターは、例えばリポソームまたは界面活性剤含有ベクター送達粒子中にパッケージングされる。本発明の核酸構築体の取り込みは、いくつかのトランスフェクション法（例えばトランスフェクション物質の使用を含むもの）により増強される。これらの物質の例には、陽イオン性物質、例えばリン酸カルシウム、およびＤＥＡＥデキストラン、リポフェクタント（例えば、リポフェクタムおよびトランスフェクタム）がある。投与される核酸の用量は変化してもよい。典型的には核酸は、１ｐｇ〜１ｍｇ、好ましくは粒子介在遺伝子送達には１ｐｇ〜１０μｇ核酸、そして他の経路には１０μｇ〜１ｍｇの範囲で投与される。
【００５９】
１型インターフェロン応答性の予測
また前記したように、さらに別の面において本発明は、１型インターフェロンによる治療（例えば、口腔粘膜経路または静脈内経路によるＩＦＮ−α治療のようなＩＦＮ−α治療）に対する患者の応答性を予測する方法であって、患者の細胞試料中のＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質またはその天然に存在する変種または対応するｍＲＮＡのレベルを測定することを含んでなり、該試料は、１型インターフェロンが投与された後に該患者から得られるか、または該測定前に１型インターフェロンでインビトロで処理される、上記方法を提供する。
【００６０】
好ましくは、応答性を試験するための１型インターフェロンは、治療用に選択された１型インターフェロンであろう。これは、提唱された治療経路および提唱された治療用量で投与される。好ましくは分析される以後の試料は、例えば血液試料または血液試料から単離された末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）の試料である。
【００６１】
より便利で好ましくは、血液から単離したＰＢＭＣｓを含む患者から得られた試料を、インビトロで１型インターフェロン（例えば、約１〜１０，０００ＩＵ／ｍｌの用量範囲）で処理される。そのような処理は、数時間（例えば、約７〜８時間）の長さである。そのようなインビトロ試験の好適な処理条件は、正常ドナーから取ったＰＢＭＣｓを同じインターフェロンで試験し、適切な発現生成物のアップレギュレーションを調べることにより決定される。使用される１型インターフェロンは、好ましくは患者の治療に提唱された１型インターフェロン（例えば、組換えＩＦＮ−α）である。そのような試験のＰＢＭＣｓは、従来法で血液試料からフィコール−ヒペーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）密度勾配を使用して単離してもよい。１型インターフェロン応答性のそのようなインビトロ試験の適切なプロトコールの例を、以下の表３に示す。
【００６２】
試料は、１型インターフェロンによりインビトロ処理の後に適宜、ＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質またはその天然に存在する変種のレベルについて分析される。これは、ＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質およびその天然に存在する変種（例えば、そのアレレ変種）に特異的に結合することができる１つまたは複数の抗体を使用して行ってもよい。しかし好ましくは試料は、ＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質またはその天然に存在する変種をコードするｍＲＮＡについて分析される。そのようなｍＲＮＡ分析は、ｍＲＮＡの検出について公知の任意の方法（例えば、ノーザンブロット検出またはｍＲＮＡ差別ディスプレイ）を使用する。検出前に、試料中に存在する目的のｍＲＮＡまたはその一部を増幅するのに、種々の公知の核酸増幅プロトコールが使用できる。目的のｍＲＮＡまたは対応する増幅核酸は、固体支持体に結合した核酸プローブを使用して、プローブ結合してもよい。そのような固体支持体は、前記したように、１型インターフェロンでアップレギュレートされた遺伝子、例えばＩＦＮ−αの口腔粘膜または静脈内投与に応答してアップレギュレートされるとして同定された遺伝子に対応する、さらなるｍＲＮＡまたはその増幅生成物のレベルを測定するためのプローブを有するミクロアレイでもよい。
【００６３】
以下の例は本発明を例示する。
【００６４】
例
【００６５】
例１
正常な成体マウスの各鼻孔にＰ２０エッペンドルフマイクロピペットを使用して、５μｌのクリスタルバイオレットを適用すると、口咽頭腔の全表面にわたってほとんど直後に色素が分布することが、実験で証明されている。口咽頭腔の染色は、色素の適用後約３０分後もまだ明らかであった。これらの結果は、同じ方法で適用された１２５Ｉ−標識組換えヒトＩＦＮ−α１−８を使用して確認された。同じ投与法を使用して、以下に示す試験で口腔粘膜投与を行った。
【００６６】
６週齢の雄のＤＢＡ／２マウスを、リン酸緩衝化生理食塩水（ＰＢＳ）中のライフテクノロジーズ社（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．）から購入した１００，０００ＩＵの組換えマウスインターフェロンα（ＩＦＮα）、プロテインインスチチュート社（ＰｒｏｔｅｉｎＩｎｓｔｉｔｕｔｅＩｎｃ．）から購入した１０μｇの組換えヒトインターロイキン１５（ＩＬ−１５）、１００μｇ／ｍｌのウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含有するＰＢＳで処理したか、または未処理のままとした。８時間後、マウスを頚部脱臼により屠殺し、口咽頭腔から外科的にリンパ組織を取り出し、液体窒素中で急速凍結し、−８０℃で保存した。チョムクジンスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）とサッチ（Ｓａｃｃｈｉ）１９８７の方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１６２，１５６−１５９）によりリンパ組織からＲＮＡを抽出し、ｍＲＮＡ差別ディスプレイ分析を行った（ラング・ピー（Ｌａｎｇ．Ｐ．）とパルディー・エー・ビー（Ｐａｒｄｅｅ，Ａ．Ｂ．），Ｓｃｉｅｎｃｅ２５７，９６７−９７１）。
【００６７】
差別ディスプレイ分析
差別ディスプレイ分析は、ゲンフンターコーポレーション（ＧｅｎＨｕｎｔｅｒＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）の「メッサージクリーン（ＭｅｓｓａｇｅＣｌｅａｎ）」と「ＲＮＡイメージ（ＲＮＡｉｍａｇｅ）」キットを、基本的に製造業者が記載するように使用して行った。簡単に説明すると、ＲＮＡをＲＮＡを含まないＤＮＡａｓｅで処理し、１μｇを、３つの１塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡ、Ｃ、またはＧのいずれかを使用して、１００μｌの反応緩衝液中で逆転写した。ＲＮＡはまた、９個の２塩基アンカードオリゴ−（ｄＴ）プライマーＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、ＧＣのいずれかを使用して逆転写した。比較すべきすべて試料を、同じ実験で逆転写し、アリコートに分けて凍結した。ＴａｑＤＮＡポリメラーゼとα−^３２ＰｄＡＴＰ（３，０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ）を含有する１０μｌの増幅混合物中のわずかに１μｌの逆転写試料で、増幅を行った。８０の５’末端（ＨＡＰ）ランダム配列プライマーを、（ＨＴ１１）Ａ、Ｃ、Ｇ、ＡＡ、ＣＣ、ＧＧ、ＡＣ、ＣＡ、ＧＡ、ＡＧ、ＣＧ、またはＧＣプライマーのそれぞれと組合せて使用した。次に試料を、７％変性ポリアクリルアミドゲルで流し、オートラジオグラフィーに暴露した。推定の示差的に発現されたバンドを切り取り、供給業者の説明書に従って再増幅し、ＩＦＮ処理、ＩＬ−１５処理、および賦形剤処理動物の口咽頭腔から抽出したＲＮＡのノーザンブロットとハイブリダイズするプローブとしてさらに使用した。
【００６８】
クローニングと配列決定
差別ディスプレイスクリーニングからの再増幅バンドを、ｐＰＣＲ−ＳｃｒｉｐｔＳＫ（＋）プラスミド（ストラタジーン（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ））のＳｆｒ１部位にクローン化し、ｃＤＮＡ末端の迅速増幅から増幅されたｃＤＮＡを、ｐＣＲ３プラスミド（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ））中のＴＡクローニングにより単離した。自動ジデオキシシーケンサー（パーキン・エルマー（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）ＡＢＩＰＲＩＳＭ３７７）を使用して配列決定した。
【００６９】
ヒトｃＤＮＡの単離
差別ディスプレイスクリーニングから同定された示差的に発現されたマウス３’配列を、米国ナショナル・センター・フォー・バイオテクノロジー・インフォメーション（ＮＣＢＩ、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）のＧｅｎＢａｎｋ（登録商標）のｄｂＥＳＴデータベース中に存在するランダムなヒトの発現配列標識（ＥＳＴ）と比較した。差別ディスプレイスクリーニングから単離されたマウスＥＳＴと関連するかも知れない配列をコンチグ（ｃｏｎｔｉｇ）で組合せて、推定ｃＤＮＡに対応するヒトコンセンサス配列を構築するのに使用した。そのようなｃＤＮＡの１つは、５５６ヌクレオチドの長さであった。これは、ＩＦＮ−αの口腔粘膜投与後にマウスの口腔のリンパ組織中でその発現が約５倍増強されることがわかったマウス遺伝子に対応した。
【００７０】
推定ｃＤＮＡが真のヒト遺伝子に対応することを確認するために、コンセンサス配列の５’末端と３’末端から得られたプライマーを使用して、ヒト末梢血白血球（ＰＢＬ）から抽出したｍＲＮＡから、特異的逆転写とＰＣＲ増幅によりｃＤＮＡを合成した。予測されたサイズのユニークなｃＤＮＡ断片を得て、クローン化し配列決定した（配列番号１）。このｃＤＮＡの配列は、両方向に３回配列決定することにより確認した。このヒトｃＤＮＡは、６３〜４５８位に３９６ｂｐの読みとり枠（ＯＲＦ）を含有し、１３１アミノ酸（配列番号２）をコードする。
【００７１】
例２
ＩＦＮ−αの腹腔内投与
オスのＤＢＡ／２マウスに、２００μｌのＰＢＳ中のライフテクノロジーズ社（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．）から購入した１００，０００ＩＵの組換えマウスＩＦＮαを腹腔内投与したか、または等量のＰＢＳのみで処理した。４時間後、頚部脱臼により動物を屠殺し、通常の方法で脾臓を取り出した。チョムクジンスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）とサッチ（Ｓａｃｃｈｉ）の方法（Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．（１９８７）１６２，１５６−１５９）により総ＲＮＡを抽出し、試料当たり１０．０μｇの総ＲＮＡを、グリオキサールの存在下でノーザンブロッティングを行い、ダンドイ−ドロン（Ｄａｎｄｏｙ−Ｄｒｏｎ）ら（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．（１９９８）２７３，７６９１−７６９７）が記載したように、ＨｕＩＦＲＧ１５．４ｍＲＮＡのｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ブロットをまず、オートラジオグラフィーに暴露し、次にホスホルマージャー（Ｐｈｏｓｐｈｏｌｍａｇｅｒ）を使用して製造業者の説明書に従って定量した。賦形剤のみで処理した動物に比較して、ＩＦＮ−α処理動物の脾臓から抽出したＲＮＡの試料では、増強したレベル（約５〜１０倍）のＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質のｍＲＮＡが検出された。
【００７２】
例３
１型インターフェロン応答性のインビトロの試験
正常ドナーからヒト末梢血単核細胞（ＰＢＭＣｓ）を、フィコール−ヒペーク（Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ）密度勾配を使用して単離し、ＰＢＳ中１０，０００ＩＵの組換えヒトＩＦＮ−α２（シェリング−プラウ（Ｓｈｅｒｉｎｇ−Ｐｌｏｕｇｈ）からのイントロンＡ）または等量のＰＢＳのみで処理した。８時間後、細胞を遠心分離（８００×ｇで１０分）し、細胞ペレットを回収した。上記例２に記載のように、チョムクジンスキー（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ）とサッチ（Ｓａｃｃｈｉ）の方法により細胞ペレットから総ＲＮＡを抽出し、試料当たり１０．０μｇの総ＲＮＡを、グリオキサールの存在下でノーザンブロッティングを行い、ＨｕＩＦＲＧ１５．４ｍＲＮＡのｃＤＮＡプローブとハイブリダイズさせた。ＰＢＳのみで処理した動物に比較して、ＩＦＮ−α処理ＰＢＭＣｓから抽出したＲＮＡの試料では、増強したレベルのＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質のｍＲＮＡ（約３倍）が検出された。
【００７３】
同じ操作を使用して、１型インターフェロンで処理する予定の患者から取ったＰＢＭＣｓを使用して、１型インターフェロン応答性を予測してもよい。
【００７４】
例４
ＨｕＩＦＲＧ１５．４の生物活性の測定
ＨｕＩＦＲＧ１５．４ｃＤＮＡを、真の組換えタンパク質およびＥＧＦＰ融合タンパク質として発現して、このタンパク質の細胞性および亜細胞性局在化を促進した。ＥＧＦＰタンパク質をコードする遺伝子を、ＨｕＩＦＲＧ１５．４ｃＤＮＡの５’末端の上流にクローン化した。ＨｕＩＦＲＧ１５．４ｃＤＮＡと、ＨｕＩＦＲＧ１５．４−ＧＦＰ融合タンパク質をコードするｃＤＮＡの両方を、構成性真核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ３．１と誘導性真核生物発現ベクターｐＲｅｖＴＲＥ中で発現させた。すなわち、ＨｕＩＦＲＧ１５．４ｃＤＮＡ、またはＨｕＩＦＲＧ１５．４−ＧＦＰ融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを、製造業者が記載したようにプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５／ＨｉｓＴＯＰＯ（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、グロニンゲン（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ）、オランダ）中にサブクローン化し、これを使用して、製造業者の説明書に従ってスーパーフェクト（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ＧｍＢＨ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、ドイツ）を使用して、ヒトＨｅＬａ細胞をトランスフェクションした。簡単に説明すると、ＥＧＦＰ／ＨｕＩＦＲＧ１５．４融合タンパク質をコードするｃＤＮＡを含有するプラスミドｐｃＤＮＡ３．１−Ｖ５／ＨｉｓＴＯＰＯの２μｇを、４μｇのスーパーフェクト（Ｓｕｐｅｒｆｅｃｔ）（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、ＧｍＢＨ、ヒルデン（Ｈｉｌｄｅｎ）、ドイツ）と混合し、細胞培養について処理した顕微鏡スライド（ベクトンディッキンソン（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）、フランクリンレークス（ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ）、アメリカ合衆国）上で、１０％胎児牛血清（インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、グロニンゲン（Ｇｒｏｎｉｎｇｅｎ）、オランダ）を含有するＤＭＥＭ培地の存在下で、ヒトＨｅＬａ細胞と３７℃で１２時間接触させた。次に細胞を３回洗浄し、新鮮な培地中に再懸濁し、３７℃でさらに３６時間インキュベートした。次に細胞を、オーソパーメアフィクス（Ｏｒｔｈｏｐｅｒｍｅａｆｉｘ）（オーソクリニカルダイアグノスティクス（ＯｒｔｈｏｃｌｉｎｉｃａｌＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、バンクーバー、カナダ）で固定し、核を１００ｎｇ／ｍｌのヨウ化プロピオジウムで染色し、フルオロモント−Ｇ（Ｆｌｕｏｒｏｍｏｎｔ−Ｇ）（サザンバイオテクノロジーズアソーシエーツ（ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ）、アメリカ合衆国）を使用して密封した。次に共焦点顕微鏡（ライカ（Ｌｅｉｃａ））を使用して、蛍光を検出した。ＥＧＦＧ／ＨｕＩＦＲＧ１５．４融合タンパク質が、トランスフェクションしたＨｅＬａ細胞の細胞質全体に発現されていることが証明された。
【００７５】
ＨｕＩＦＲＧ１５．４ｃＤＮＡ、またはＨｕＩＦＲＧ１５．４−ＧＦＰ融合タンパク質をコードするｃＤＮＡをまた、ｐＲｅｖ−ＴＲＥ（クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、パロアルト（ＰａｌｏＡｌｔｏ）、カリホルニア州）にサブクローン化し、次にこれを使用して、製造業者が記載するように、アンフォパック（Ａｍｐｈｏｐａｃｋ）封入株（クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、パロアルト（ＰａｌｏＡｌｔｏ）、カリホルニア州）をトランスフェクションした。次に、レトロウイルスベクターを含有する細胞上清を集め、これを使用して、製造業者が記載するように、ＨｅＬａＴｅｔ／ＯｎまたはＷＩＳＨＴｅｔ／Ｏｎ標的細胞（クロンテク（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）、パロアルト（ＰａｌｏＡｌｔｏ）、カリホルニア州）を連続的に感染させた。アンフォパック（Ａｍｐｈｏｐａｃｋ）封入株から得られたウイルスで標的細胞を最後に連続感染した２〜３日後に、標的細胞をヒグロマイシンで処理し、耐性コロニーを限界希釈により単離した。
【００７６】
ドキシサイクリンの存在下または非存在下で、未変性のＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質またはＨｕＩＦＲＧ１５．４−ＧＦＰ融合タンパク質の誘導発現が、未変性のＨｕＩＦＲＧ１５．４タンパク質またはＨｕＩＦＲＧ１５．４−ＧＦＰ融合タンパク質をコードする遺伝子でトランスフェクションしたヒトＨｅＬａ細胞のクローンのアポトーシスを引き起こすことがわかった。簡単に説明すると値フェニルしたＨｅＬａ細胞を、１．０μｇ／ｍｌのデオキシサイクリンの存在下または非存在下で２４時間試験し、蛍光活性化細胞ソーター（ＦＡＣＳＣＡＬＩＢＵＲ、ベクトンディッキンソン（ＢｅｃｔｏｎＤｉｃｋｉｎｓｏｎ）、フランクリンレークス（ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ）、アメリカ合衆国）でアネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖ−ＰＥ染色（ホスファチジルセリンエクスターナリゼーション）により測定した。
【００７７】
従って、例えばウイルス感染に対するＩＦＮ−α応答により誘導されるように、細胞中のＨｕＩＦＲＧ１５．４の発現は、アポトーシスに至る。従いＨｕＩＦＲＧ１５．４は、ウイルスで感染されている細胞中でアポトーシスを引き起こすことにより抗ウイルス作用を有する。

Claims

（ｉ）配列番号２のアミノ酸配列；
（ｉｉ）免疫調節活性および／または抗ウイルス活性および／または抗腫瘍活性から選択された実質的に類似の機能を有する、その変種；または
（ｉｉｉ）免疫調節活性および／または抗ウイルス活性および／または抗腫瘍活性から選択された実質的に類似の機能を保持する、（ｉ）または（ｉｉ）の断片、
を含む単離されたポリペプチド。
配列番号のアミノ酸配列により定義されるポリペプチドおよび／またはその天然に存在する変種に対する特異的抗体を作成するのに適した、該ポリペプチドの変種または断片。
請求項１または２のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
ｃＤＮＡである、請求項３のポリヌクレオチド。
請求項１のポリペプチドをコードするポリヌクレオチドであって：
（ａ）配列番号１の核酸配列、またはそのコード配列および／またはそれに相補的な配列；
（ｂ）（ａ）で定義した配列にハイブリダイズする配列；
（ｃ）遺伝コードの結果として、（ａ）または（ｂ）で定義した配列と縮重した配列；または
（ｄ）（ａ）、（ｂ）または（ｃ）で定義した配列と、少なくとも６０％の同一性を有する配列
を含む上記ポリヌクレオチド。
請求項１または２のポリペプチドを発現することができる、請求項３〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
請求項６の発現ベクターを含有する宿主細胞。
請求項１または請求項２のポリペプチドに特異的な抗体。
請求項１のポリペプチドのインビボの発現を指令する、単離されたポリヌクレオチド。
ヒトまたは非ヒト動物の治療的処置で使用するための、請求項１のポリペプチドまたは請求項９のポリヌクレオチド。
請求項１のポリペプチドまたは請求項９のポリヌクレオチドと、薬剤学的に許容される担体もしくは希釈剤とを含む医薬組成物。
抗ウイルス剤、抗腫瘍剤または免疫調節剤として治療に使用するための薬剤の製造における、請求項１のポリペプチドまたは請求項９のポリヌクレオチドの使用。
１型インターフェロンで治療可能な疾患を有する患者の治療法であって、請求項１のポリペプチドまたは請求項９のポリヌクレオチドの有効量を該患者に投与することを含む方法。
請求項１または２のポリペプチドの産生方法であって、ポリペプチドの発現を得るのに適した条件下で請求項７の宿主細胞を培養し、該ポリペプチドを単離することを含む、上記方法。
免疫調節活性および／または抗ウイルス活性および／または抗腫瘍活性を有する化合物の同定方法であって、配列番号２のポリペプチドまたはその天然に存在する変種を発現することができる細胞を提供し、該細胞を試験化合物とともにインキュベートし、該ポリペプチドまたはその変種をコードする遺伝子のアップレギュレーションを追跡することを含む、上記方法。
ヒトまたは非ヒト動物の治療的処置で使用するための、配列番号２で定義されるアミノ酸配列のコード配列または該コード配列の天然に存在する変種に対するアンチセンス配列を、インビボで発現することができるポリヌクレオチド。
治療的処置で使用するための請求項８の抗体。
請求項４のｃＤＮＡ内の配列を標的とする、核酸増幅のためのプライマーセット。
請求項３〜５のいずれか１項に記載のポリヌクレオチドから得られる核酸プローブ。
固体支持体に結合された、請求項１９のプローブ。
患者からの細胞試料中の、配列番号２のアミノ酸配列により定義されるタンパク質またはその天然に存在する変種、または対応するｍＲＮＡのレベルを測定することを含む、１型インターフェロンを用いる治療に対する患者の応答性を予測する方法であって、該試料は、１型インターフェロンの投与後に該患者から得られるか、または該測定の前に、１型インターフェロンでインビトロで処理される、上記方法。
試料を得る前に投与されるか、またはインビトロで試料を処理するために使用されるインターフェロンは、該患者の治療で使用する予定のインターフェロンである、請求項２１の方法。
患者の血液試料から単離された末梢血単核細胞を含む試料は、１型インターフェロンでインビトロで処理される、請求項２１または請求項２２の方法。
測定は、配列番号２の配列により定義されるタンパク質または該タンパク質の天然に存在する変種をコードするｍＲＮＡのレベルを測定することを含む、請求項２１〜２３のいずれか１項に記載の方法。
請求項１のポリペプチドを発現することができる非ヒトトランスジェニック動物。