PT2396038E - Tratamento das doenças associadas com o factor neurotrófico derivado do cérebro (bdnf) por inibição do produto antisenso natural da transcrição para bdnf - Google Patents

Tratamento das doenças associadas com o factor neurotrófico derivado do cérebro (bdnf) por inibição do produto antisenso natural da transcrição para bdnf Download PDF

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Description

DESCRIÇÃO
TRATAMENTO DAS DOENÇAS ASSOCIADAS COM O FACTOR NEUROTRÓFICO DERIVADO DO CÉREBRO (BDNF) POR INIBIÇÃO DO PRODUTO ΑΝΤΙ— SENSO NATURAL DA TRANSCRIÇÃO PARA BDNF
REFERENCIA CRUZADA
Este pedido reivindica o beneficio sobre o Pedido Provisório dos Estados unidos N° 61/152,132, arquivado a 12 de Fevereiro de 2009.
ÁREA DA DESCRIÇÃO
Os exemplos da descrição compreendem a modulação por oligonucleótidos da expressão e/ou da função do BDNF e de moléculas associadas.
ANTECEDENTES
As hibridações de DNA-RNA e RNA-RNA são importantes para muitos aspectos da função do ácido nucleico, incluindo a replicação, transcrição e a tradução de DNA. A hibridação também é essencial para uma variedade de tecnologias que detectam um ácido nucleico especifico ou alteram a sua expressão. Os nucleótidos anti-senso, por exemplo, interrompem a expressão do gene para marcar o RNA, interferindo assim com o splicing, transcrição, tradução e replicação do RNA. O DNA anti-senso tem ainda a particularidade dos híbridos de DNA-RNA servirem como substrato para a digestão por ribonuclease H, uma actividade que está presente na maioria dos tipos de células. As moléculas anti-senso podem ser entregues nas células, como é o caso dos oligodesoxinucleótidos (ODN), ou podem ser expressas a partir de genes endógenos como moléculas de RNA. O FDA aprovou recentemente um fármaco anti-senso, o VITRAVENE™ (para o tratamento da retinite por citomegalovirus), o que reflete a utilidade da terapêutica anti-senso.
Pruunsild et al. 2007 (Genomics, vol.90 (3):397-406) descrevem a disseção do locus BDNF humano: transcrição bidirecional, união complexa e vários promotores.
Beiter et al. 2008 (Cellular and Molecular Life Sciences, vol. 66 (1):94-112) descrevem a transcrição anti-senso: um olhar crítico em ambas as direções.
Liu et al. 2006 (Brain Research, vol. 1067 (1):1-12) descrevem genes BDNF de roedores, novos promotores, variantes de processamento e regulação por cocaína.
Qing-Rong Liu et al. 2005 (American Journal of Medicai Genetics, Part B: Neuropsychiatric Genetics, vol. 134B (1):93-103) descrevem genes BDNF humanos, padrões de processamento e avaliações de associações com abuso de substâncias e doença de Parkinson.
Liu et al. 2006 (International Journal of Developmental Neuroscience, vol. 24 (8):559) descrevem a regulação diferencial dos genes BDNF/BDNFOS senso e anti-senso humanos e o gene BDNF de roedores: possíveis papéis na doença de Alzheimer e em vícios. O documento WO 98/01573 descreve a clonagem recombinante associada com a transformação. O documento WO 2006/072005 descreve métodos de sobrevivência/proliferação de alta eficiência de células estaminais embrionárias humanas e de sobrevivência embrionária humana em cultura.
RESUMO DA INVENÇÃO A invenção é definida pelas reivindicações. Os aspectos/instâncias da presente descrição que constituem a invenção são definidos pelas reivindicações.
RESUMO DA DESCRIÇÃO
Este resumo serve para apresentar um resumo da descrição, para indicar brevemente a natureza e o conteúdo da descrição.
Num caso, a invenção proporciona métodos para inibir a ação dum transcrito anti-senso natural usando oligonucleótidos anti-senso dirigidos a qualquer região do transcrito anti-senso natural, resultando num aumento da regulação do gene senso correspondente. É também contemplado aqui que a inibição do transcrito anti-senso natural pode ser conseguida por siRNA, ribozimas e moléculas pequenas, que estão dentro do âmbito da presente descrição.
Um exemplo proporciona um método de modulação da função e/ou expressão de um polinucleótido de BDNF em células do paciente ou tecidos in vivo ou in vitro, compreendendo o contacto das referidas células ou tecidos com um oligonucleótido anti-senso com 5 a 30 nucleótidos de comprimento, em que o referido oligonucleótido tem pelo menos 50% de identidade de sequência com um complemento inverso de um polinucleótido que compreende 5 a 30 nucleótidos consecutivos dentro de nucleótidos de 1 a 3175 de SEQ ID n°: 2 (Figura 3) modulando assim a função e/ou expressão do polinucleótido de BDNF em células ou tecidos do paciente, in vivo ou in vitro.
Num outro exemplo preferido, um oligonucleótido tem como alvo uma sequência anti-senso natural de polinucleótidos de BDNF, por exemplo, os nucleótidos apresentados na SEQ ID n°: 2, e quaisquer variantes, alelos, homólogos, mutantes, derivados, fragmentos e sequências complementares. Exemplos de oligonucleótidos anti-senso são apresentados na SEQ ID n°s: 3 a 8 (Figura 4).
Outro exemplo proporciona um método de modulação de função e/ou expressão de um polinucleótido de BDNF em células ou tecidos do paciente, in vivo ou in vitro, compreendendo o contacto das referidas células ou tecidos com um oligonucleótido anti-senso com 5 a 30 nucleótidos de comprimento, em que o referido oligonucleótido tem pelo menos 50% identidade de sequência com um complemento inverso dum anti-senso do polinucleótido de BDNF; modulando assim a função e/ou expressão do polinucleótido de BDNF em células ou tecidos de pacientes, in vivo ou in vitro.
Outro exemplo proporciona um método de modulação de função e/ou expressão de um polinucleót ido de BDNF em células ou tecidos do paciente, in vivo ou in vitro, compreendendo o contacto das referidas células ou tecidos com um oligonucleótido anti-senso com 5 a 30 nucleótidos de comprimento, em que o referido oligonucleótido tem pelo menos 50% identidade de sequência com um oligonucleótido anti-senso de um polinucleótido de BDNF anti-senso; modulando assim a função e/ou expressão do polinucleótido de BDNF em células ou tecidos de pacientes, in vivo ou in vitro.
Num exemplo preferido, uma composição compreende um ou mais oligonucleótidos anti-senso que se ligam a polinucleótidos de BDNF senso e/ou anti-senso.
Num outro exemplo preferido, os oligonucleótidos compreendem um ou mais nucleótidos modificados ou substituídos.
Num outro exemplo preferido, os oligonucleótidos compreendem uma ou mais ligações modificadas.
Ainda noutro exemplo, os nucleótidos modificados compreendem bases modificadas que incluem fosforotioato, metilfosfonato, ácidos nucleicos de péptidos, 2'-0-metilo, fluoro- ou carbono, metileno ou outras moléculas de ácidos nucleicos bloqueados (LNA). Preferivelmente, os nucleótidos modificados são moléculas de ácidos nucleicos bloqueados, incluindo a-L-LNA.
Noutro exemplo preferido, os oligonucleótidos são administrados a um paciente por via subcutânea, intramuscular, intravenosa ou intraperitoneal.
Num outro exemplo preferido, os oligonucleótidos são administrados numa composição farmacêutica. Um regime de tratamento compreende a administração de compostos anti-senso, pelo menos uma vez ao paciente; no entanto, este tratamento pode ser modificado para incluir doses múltiplas durante um período de tempo. 0 tratamento pode ser combinado com um ou mais tipos de terapias.
Num outro exemplo preferido, os oligonucleótidos são encapsulados num lipossoma ou ligados a uma molécula transportadora (por exemplo, colesterol, péptido TAT).
Outros aspectos são descritos abaixo. BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS Figura 1
Figura 1 A: é um gráfico de resultados de PCR em tempo real que mostra a razão de mudança + o desvio padrão no mRNA de BDNF após o tratamento de células HepG2 com gapmer de LNA de oligonucleótidos fosforotioato, introduzidos pela utilização de Lipofectamina 2000, em comparação com o controlo. Os resultados de PCR em tempo real indicam que os niveis de mRNA de BDNF em células HepG2 aumentam significativamente 48h após o tratamento com dois dos gapmers de LNA com cadeia principal totalmente constituída por fosforotioato, concebidos para o BDNF anti-senso NM_170735 (CUR-0071, P = 0.04, CUR-0073, P = 0.07, CUR-0075, P = 0.03). As barras designadas por CUR-0071, CUR-0072, CUR-0073, CUR-0074, CUR-0075 e CUR-0076 correspondem a amostras tratadas com as SEQ ID n°s: 6, 7, 8, 3, 4 e 5, respectivamente.
Figura 1 B: é um gráfico de resultados de PCR em tempo real que mostra a razão de mudança + o desvio padrão no mRNA de BDNF após o tratamento de células HepG2 com gapmer de LNA de oligonucleótidos fosforotioato, introduzidos pela utilização de Lipofectamina 2000, em comparação com o controlo. Os resultados de PCR em tempo real indicam que os níveis de BDNF anti-senso diminuíram significativamente após o tratamento com todos os oligos, excepto com o CUR-0072, o que possivelmente se deve ao facto de diferentes oligos afectarem diferentes variantes de processamento de BDNF e/ou BDNF anti-senso NM_170735. As barras designadas por CUR-0071, CUR-0072, CUR-0073, CUR-0074, CUR-0075 e CUR-0076 correspondem a amostras tratadas com as SEQ ID n°s: 6, 7, 8, 3, 4 e 5, respetivamente.
Figura 1C: é um gráfico de resultados de PCR em tempo real que mostra a razão de mudança + o desvio padrão no mRNA de BDNF após o tratamento de células CHP212 com gapmer de LNA de oligonucleótidos fosforotioato, introduzidos pela utilização de Lipofectamina 2000, em comparação com o controlo. Os resultados de PCR em tempo real indicam que os níveis de mRNA de BDNF em células CHP212 diminuíram significativamente 48h após o tratamento com dois dos gapmers LNA com espinha dorsal totalmente constituída por fosforotioato, concebidos para o BDNF anti-senso NM_170735 As barras designadas por CUR-0071, CUR-0072 e CUR-0076 correspondem a amostras tratadas com as SEQ ID n°s: 6, 7 e 3, respectivamente. A Figura 2 mostra a SEQ ID n° : 1: factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) de Homo sapiens, variante de transcrição 1, mRNA. (Acesso NCBI n° : NM_170735) e SEQ ID n°: 11 apresentam a sequência genómica de BDNF (os exões estão apresentados em letras maiúsculas, os intrões em letra minúscula). A Figura 3 mostra a SEQ ID n°: 2: sequência anti-senso BDNF natural (NR_002832.1) cadeia oposta de BDNF de Homo sapiens (não-codificante de proteína) (BDNFOS), RNA não-codificante. A Figura 4 mostra os oligonucleótidos anti-senso, SEQ ID n°s: 3 a 8. *indica uma ligação fosforotioato e + indica a modificação LNA. A Figura 5 mostra as SEQ ID n°s: 9 e 10.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Vários aspectos da invenção são descritos abaixo com referência a exemplos de aplicações para ilustração. Deve- se compreender que são estabelecidos numerosos detalhes específicos, relações e métodos para proporcionar uma total compreensão da descrição. Um perito na arte relevante, no entanto, reconhecerá facilmente que a invenção pode ser praticada sem um ou mais dos detalhes específicos ou com outros métodos. A presente descrição não é limitada pela ordem de ações ou eventos, já que algumas ações podem ocorrer em diferentes ordens e/ou concorrentemente com outros eventos ou atos. Além disso, nem todos os atos ou eventos ilustrados são necessários para implementar um método de acordo com a presente descrição.
Todos os genes, nomes de genes e produtos de genes aqui descritos destinam-se a corresponder a homólogos de qualquer espécie para a qual as composições e métodos aqui descritos são aplicáveis. Assim, os termos incluem, mas não estão limitados a genes e produtos de genes de seres humanos e ratos. Compreende-se que, quando um gene ou produto do gene duma espécie em particular é descrito, esta descrição destina-se a ser apenas exemplificativa, e não deve ser interpretada como uma limitação, a menos que o contexto o indique claramente. Assim, por exemplo, os genes aqui descritos, os quais em alguns casos, estão relacionados com sequências de ácidos nucleicos e de aminoácidos de mamíferos, têm a intenção de abranger genes e produtos de genes homólogos e/ou ortólogos de outros animais, incluindo, mas não estando limitados a outros mamíferos, peixes, anfíbios, répteis e aves. Em exemplos preferidos, os genes ou sequências de ácidos nucleicos são humanos.
Definições A terminologia aqui utilizada tem por objectivo descrever apenas exemplos específicos e não tem a intenção de limitar a descrição. Tal como aqui utilizado, as formas singulares "um" e "o" também pretendem incluir as formas de plural, a menos que o contexto indique claramente o contrário. Além disso, na medida em que os termos "incluindo", "inclui", "tendo", "tem", "com" ou variantes dos mesmos são utilizados na descrição detalhada e/ou nas reivindicações, estes termos destinam-se a ser inclusivos, de forma semelhante ao termo "compreendendo". 0 termo "cerca de" ou "aproximadamente" significa dentro duma margem de erro aceitável para o valor especifico, como determinado por um perito na arte, que irá depender em parte, de como o valor é medido ou determinado, ou seja, das limitações do sistema de medida. Por exemplo, "cerca de" pode significar dentro de 1 ou mais do que 1 desvio padrão, pela prática na arte. Alternativamente, "cerca de" pode significar um intervalo de até 20%, preferivelmente até 10%, mais preferivelmente até 5%, e ainda mais preferencialmente até 1% de um determinado valor. Alternativamente, em particular no que diz respeito a sistemas ou processos biológicos, o termo pode significar dentro de uma ordem de magnitude, de preferência dentro de 5 vezes, e mais preferencialmente dentro de 2 vezes, de um valor. Quando valores específicos são descritos no pedido e nas reivindicações, a menos que indicado o contrário, o termo "cerca de" significa dentro duma margem de erro aceitável, pelo que o valor específico deve ser assumido.
Tal como aqui utilizado, o termo "mRNA" significa transcritos de mRNA presentemente conhecidos de um gene alvo, e quaisquer outras transcrições que possam ser esclarecidas.
Por "oligonucleótidos anti-senso" ou "composto anti-senso" entende-se uma molécula de RNA ou DNA que se liga a outro RNA ou DNA (RNA ou DNA alvo) . Por exemplo, se é um oligonucleótido de RNA, liga-se a outro RNA alvo através de interações RNA-RNA e altera a atividade do RNA alvo (Eguchi et ai., (1991) Ann. Rev. Biochem. 60, 631-652). Um oligonucleótido anti-senso pode regular positivamente ou regular negativamente a expressão e/ou função de um polinucleótido especifico. A definição destina-se a incluir qualquer molécula de RNA ou de DNA estranha que seja útil do ponto de vista terapêutico, diagnóstico ou outro. Tais moléculas incluem, por exemplo, moléculas de RNA ou de DNA anti-senso, RNA de interferência (RNAi), micro RNA, moléculas de RNA de captura, siRNA, RNA enzimático, RNA terapêutico de edição e RNA agonista e antagonista, compostos oligoméricos anti-senso, oligonucleótidos anti-senso, oligonucleótidos de sequência guia externa (EGS), processadores alternados, primers, sondas e outros compostos oligoméricos que hibridam com, pelo menos uma porção do ácido nucleico alvo. Como tal, estes compostos podem ser introduzidos na forma de compostos oligoméricos de cadeia simples, de cadeia dupla, de cadeia parcialmente simples ou circulares.
No contexto da presente descrição, o termo "oligonucleótido" refere-se a um oligómero ou polímero de ácido ribonucleico (RNA) ou ácido desoxirribonucleico (DNA) miméticos dos mesmos. O termo "oligonucleótido", também inclui oligómeros lineares ou circulares de monómeros ou ligações naturais e/ou modificadas, incluindo desoxirribonucleósidos, ribonucleósidos, formas substituídas e alfa-anoméricas dos mesmos, ácidos nucleicos peptídicos (PNA), ácidos nucleicos bloqueados (LNA), fosforotioato, metilfosfonato, e semelhantes. Os oligonucleótidos são capazes de se ligar especif icamente a um polinucleót ido alvo por meio de um padrão regular de monómero-a-monómero, tal como por emparelhamento de bases tipo Watson-Crick, emparelhamento de bases tipo Hoõgsteen ou Hoõgsteen reverso, ou semelhantes. 0 oligonucleótido pode ser "quimérico", ou seja, composto por diferentes regiões. No contexto desta descrição compostos "quiméricos" são oligonucleótidos, que contêm duas ou mais regiões químicas, por exemplo, regiões de DNA, regiões de RNA, regiões de PNA, etc. Cada região química é constituída, pelo menos, por uma unidade monomérica, isto é, um nucleótido, no caso dum composto de oligonucleótidos. Estes oligonucleótidos normalmente compreendem pelo menos uma região em que o oligonucleótido é modificado, de forma a apresentar uma ou mais propriedades desejadas. As propriedades desejadas do oligonucleótido incluem, mas não estão limitadas a, por exemplo, um aumento da resistência à degradação por nucleases, aumento da absorção celular, e/ou aumento da afinidade de ligação para o ácido nucleico alvo. Diferentes regiões do oligonucleótido podem, como tal, ter diferentes propriedades. Os oligonucleótidos quiméricos da presente invenção podem ser formados como estruturas mistas de dois ou mais oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos e/ou análogos de oligonucleótidos, como descrito acima. 0 oligonucleótido pode ser composto por regiões que podem ser ligadas em "registo", isto é, quando os monómeros estão ligados consecutivamente, como no DNA nativo, ou ligados por meio de separadores. Os separadores servem para constituir uma "ponte" covalente entre as regiões e, em casos preferidos, têm um comprimento não superior a cerca de 100 átomos de carbono. Os separadores podem ter diferentes funcionalidades, por exemplo, ter carga positiva ou negativa, ter propriedades especiais de ligação de ácidos nucleicos (intercaladores, ligantes do sulco, toxinas, fluoróforos, etc.), sendo lipofílicos, induzindo estruturas secundárias especiais como, por exemplo, péptidos contendo alanina que induzem as alfa-hélices.
Como aqui utilizado "BDNF" e "factor neurotrófico derivado do cérebro" incluem todos os membros da família, mutantes, alelos, fragmentos, espécies, sequências codificantes e não codificantes, cadeias de polinucleótidos senso e anti-senso, etc.
Como aqui utilizado, os termos "factor neurotrófico derivado do cérebro", "factor-neurotrófico derivado do cérebro" e BDNF, são utilizados indiferentemente no presente pedido.
Como aqui utilizado, o termo "oligonucleótido específico para" ou "oligonucleótido que tem como alvo" refere-se a um oligonucleótido com uma sequência (i) capaz de formar um complexo estável com uma porção do gene alvo ou, (ii) capaz de formar um dúplex estável com uma porção de um transcrito de mRNA do gene alvo. A estabilidade dos complexos e dúplices pode ser determinada por cálculos teóricos e/ou em ensaios in vitro. São descritos nos exemplos abaixo Exemplos de ensaios para a determinação da estabilidade de complexos e dúplices de hibridização.
Tal como aqui utilizado, o termo "ácido nucleico alvo" abrange DNA, RNA (compreendendo pré mRNA e mRNA) transcrito a partir de tal DNA, e também a partir de cDNA derivado de tal RNA, sequências codificantes, sequências não codificantes e polinucleótidos senso ou anti-senso. A hibridação específica de um composto oligomérico com o seu ácido nucleico alvo interfere com a função normal do ácido nucleico. Esta modulação da função de um ácido nucleico alvo por compostos que hibridam especificamente com o mesmo é geralmente referida como "anti-senso". As funções de DNA com as quais interfere incluem, por exemplo, replicação e transcrição. As funções de RNA com as quais interfere incluem todas as funções vitais tais como, por exemplo, a translocação do RNA para o local da tradução da proteína, a tradução da proteína a partir do RNA, o processamento do RNA para produzir uma ou mais espécies de mRNA, e a atividade catalítica que pode ser envolvida em, ou facilitada pelo RNA. 0 efeito global desta interferência na função do ácido nucleico alvo é a modulação da expressão de um produto codificado ou dos oligonucleótidos. A interferência de RNA "iRNA" é mediada por moléculas de RNA de cadeia dupla (dsRNA) que têm homologia específica de sequências para as suas sequências de ácido nucleico “alvo" (Caplen, N. J., et al., (2001) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98: 9742-9747). Em determinados casos da presente invenção, os mediadores são dúplices de 5-25 nucleótidos de RNA de "pequena interferência" (siRNAs). Os siRNAs são derivados do processamento de dsRNA por uma enzima RNase conhecida como Dicer (Bernstein, E., et al., (2001) Nature 409: 363-366). Os produtos do dúplex de siRNA são recrutados num complexo multi-proteico RNA denominado RISC (Complexo de silenciamento induzido por RNA) . Sem se pretender ficar limitado por qualquer teoria em particular, acredita-se então que um RISC é guiado para um ácido nucleico alvo (adequadamente mRNA), onde o dúplex de siRNA interage de uma forma com uma sequência específica, para mediar a clivagem de uma forma catalítica (Bernstein, E., et al. , (2001) Nature 409: 363-366; Boutla, A., et al., (2001) Curr Biol 11: 1776-1780). Pequenos RNAs de interferência, que podem ser utilizados de acordo com a presente invenção, podem ser sintetizados e utilizados de acordo com procedimentos que são bem conhecidos na arte e que serão familiares para qualquer perito. Pequenos RNAs de interferência para utilização nos métodos da presente invenção compreendem, adequadamente, entre cerca de 1 a cerca de 50 nucleótidos (nt). Em exemplos de casos não limitativos, os siRNAs podem compreender cerca de 5 a cerca de 40 nt, cerca de 5 a cerca de 30 nt, cerca de 10 a cerca de 30 nt, cerca de 15 a cerca de 25 nt, ou cerca de 20-25 nucleótidos. A seleção de oligonucleótidos adequados é facilitada pela utilização de programas de computador que alinham automaticamente sequências de ácidos nucleicos e indicam regiões de identidade ou homologia. Tais programas são usados para comparar as sequências de ácidos nucleicos obtidas, por exemplo, pela pesquisa de bases de dados como o GenBank ou por sequenciação de produtos de PCR. A comparação de sequências de ácidos nucleicos duma gama de espécies permite a seleção de sequências de ácidos nucleicos que apresentem um grau apropriado de identidade entre espécies. No caso dos genes que não foram sequenciados, são realizados Southern blots para permitir uma determinação do grau de identidade entre os genes em espécies alvo e noutras espécies. Através da realização de Southern blots com diferentes graus de severidade, tal como é bem conhecido na arte, é possível obter uma medida aproximada da identidade. Estes procedimentos permitem a seleção de oligonucleótidos que exibem um elevado grau de complementaridade para as sequências alvo de ácidos nucleicos numa matéria a ser controlada e um menor grau de complementaridade para as correspondentes sequências de ácidos nucleicos em outras espécies. Um perito na arte compreenderá que existe uma latitude considerável na seleção de regiões de genes apropriados para serem utilizados na presente descrição. O termo "RNA enzimático" significa uma molécula de RNA com atividade enzimática (Cech, (1988) J. American. Med. Assoe. 260, 3030-3035). Os ácidos nucleicos enzimáticos (ribozimas) atuam primeiro por ligação a um RNA alvo. Tal ligação ocorre através da porção de ligação alvo dum ácido nucleico enzimático, que é mantido em estreita proximidade com uma porção enzimática da molécula que atua para clivar o RNA alvo. Assim, o ácido nucleico enzimático primeiro reconhece e depois liga-se a um RNA alvo através de emparelhamento de bases, e uma vez ligado ao sítio correto, atua enzimaticamente para cortar o RNA alvo. 0 termo "RNA de captura" significa uma molécula de RNA que mimetiza o domínio de ligação natural para um ligando. Por conseguinte, o RNA de captura compete com o alvo de ligação natural pela ligação de um ligando específico. Por exemplo, tem sido mostrado que o excesso de expressão do RNA da resposta de trans-ativação (TAR) do VIH pode atuar como um "isco" e ligar-se eficientemente à proteína tat do VIH, impedindo-a de se ligar a sequências TAR codificadas no RNA do VIH (Sullenger et al., (1990) Cell, 63, 601- 608). Pretende-se que este seja um exemplo específico. Os peritos na arte irão reconhecer que este é apenas um exemplo, e outros casos podem ser facilmente criados utilizando técnicas geralmente conhecidas na arte.
Tal como aqui utilizado, o termo "monómeros" normalmente indica monómeros ligados por ligações fosfodiéster ou análogos do mesmo, para formar oligonucleótidos que variam em tamanho poucas unidades monoméricas, por exemplo, de cerca de 3-4, a cerca de várias centenas de unidades monoméricas. Os análogos de ligações fosfodiéster incluem: fosforotioato, fosforoditioato, fosfonatos de metilo, fosforoselenoato, fosforamidato, e semelhantes, como mais detalhadamente descritos abaixo. O termo "nucleótido" abrange os nucleótidos que ocorrem naturalmente, bem como nucleótidos que ocorrem de forma não natural. Deve ficar claro para o perito na arte que vários nucleótidos que anteriormente foram considerados "de ocorrência não natural", foram posteriormente encontrados na natureza. Assim, o termo "nucleótidos" inclui não só as conhecidas purinas e moléculas contendo heterociclos de pirimidina, mas também análogos heterocíclicos e tautómeros dos mesmos. Exemplos ilustrativos de outros tipos de nucleótidos são as moléculas contendo adenina, guanina, timina, citosina, uracilo, purina, xantina, diaminopurina, 8-oxo-N6-metiladenina, 7-deazaxantina, 7-deasazaguanina, N4, N4-etanocitosina, N6, N6-etano-2,6-diaminopurina, 5-metilcitosina, 5-(C3-C6)-alquinilcitosina, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, pseudo-isocitosina, 2-hidroxi-5-metil-4-triazolopiridina, isocitosina, isoguanina , inosina e os nucleótidos de "ocorrência não natural" descritos em Benner et ai., Patente dos Estados Unidos n° 5,432,272. 0 termo "nucleótido" destina-se a cobrir todos estes exemplos, assim como análogos e tautómeros dos mesmos. Os nucleótidos especialmente interessantes são aqueles que contêm adenina, guanina, timina, citosina e uracilo, considerados os nucleótidos que ocorrem de forma natural, em relação à aplicação terapêutica e de diagnóstico em seres humanos. Os nucleótidos incluem os açúcares naturais 2'-desoxi e 2'-hidroxilo, por exemplo, como descrito em Kornberg e Baker, DNA Replication, 2nd Ed. (Freeman, San Francisco, 1992), bem como os seus análogos. 0 termo "análogos", em referência aos nucleótidos, inclui nucleótidos sintéticos com porções de bases modificadas e/ou porções de açúcar modificadas (ver, por exemplo, os descritos em geral por Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, Nova Iorque, 1980; Freier e Altmann, (1997) Nucl. Acid. Res., 25 (22), 4429-4443, Toulmé, J.J., (2001) Nature Biotechnology 19: 17-18; Manoharan M., (1999) Biochemica et Biophysica Acta 1489: 117-139; Freier S. M., (1997) Nucleic Acid Research, 25: 4429-4443, Uhlman, E., (2000) Drug Discovery & Development, 3: 203-213, Herdewin P., (2000) Antisense &
Nucleic Acid Drug Dev., 10: 297-310); 2'-0, 3'-C-linked [3.2.0] bicycloarabinonucleosides (ver, por exemplo N. K. Christensen, et al, (1998) J. Am. Chem. Soc., 120: 5458-5463; Prakash TP, Bhat B. (2007) Curr Top Med Chem. 7(7) : 641-9; Cho EJ, et al (2009) Annual Review of Analytical Chemistry, 2, 241-264). Tais análogos incluem os nucleótidos sintéticos concebidos para melhorar as propriedades de ligação, por exemplo, a estabilidade e a especificidade dos dúplices ou tríplices, ou semelhantes.
Tal como aqui utilizado, "hibridação" significa o emparelhamento de cadeias substancialmente complementares de compostos oligoméricos. Um mecanismo de emparelhamento envolve uma ligação de hidrogénio, que pode ser uma ligação de hidrogénio de Watson-Crick, de Hoõgsteen ou de Hoõgsteen invertida, entre nucleósidos complementares ou bases de nucleótidos (nucleótidos) das cadeias dos compostos oligoméricos. Por exemplo, a adenina e a timina são nucleótidos complementares que se emparelham através da formação de ligações de hidrogénio. A hibridação pode ocorrer sob diferentes circunstâncias.
Um composto anti-senso é "especificamente hibridizante" quando a ligação do composto com o ácido nucleico alvo interfere com a função normal do ácido nucleico alvo, provocando uma modulação da função e/ou da atividade, e existe um grau suficiente de complementaridade para evitar a ligação não específica do composto anti-senso a sequências de ácidos nucleicos não alvo, sob condições em que a ligação específica é desejada, isto é, sob condições fisiológicas, no caso de ensaios in vivo ou de tratamento terapêutico e sob as condições em que os ensaios são executados, no caso de ensaios in vitro.
Tal como aqui utilizada, a frase "condições de hibridação rigorosas" ou "condições rigorosas" refere-se a condições sob as quais um composto da descrição irá hibridar com a sua sequência alvo, mas com um número mínimo de outras sequências. As condições rigorosas são dependentes da sequência e serão diferentes em circunstâncias diferentes e, no contexto da presente descrição, as "condições rigorosas" em que os compostos oligoméricos hibridam com uma sequência alvo são determinadas pela natureza e composição dos compostos oligoméricos e pelos ensaios nos quais estão a ser analisados. Em geral, as condições rigorosas de hibridação compreendem concentrações baixas (<0,15 M) de sais com catiões inorgânicos como Na++ ou K++ (isto é, baixa força iónica), temperatura superior a 20°C-25°C abaixo da Tm do composto oligomérico:complexo da sequência alvo, e a presença de agentes desnaturantes como formamida, dimetilformamida, sulfóxido de dimetilo, ou o detergente de sulfato de dodecilo de sódio (SDS). Por exemplo, a taxa de hibridação diminui 1.1% para cada 1% de formamida. Um exemplo duma condição rigorosa de hibridação é o tampão de cloreto de sódio-citrato de sódio 0. IX (SSC)/0.1% (p/v) de SDS a 60°C durante 30 minutos. O termo "complementar", tal como aqui utilizado, refere-se à capacidade de emparelhamento preciso entre dois nucleótidos numa ou duas cadeias oligoméricas. Por exemplo, se uma nucleobase numa determinada posição de um composto anti-senso é capaz de estabelecer uma ligação de hidrogénio com uma nucleobase numa determinada posição de um ácido nucleico alvo, sendo o referido ácido nucleico alvo um DNA, RNA, ou uma molécula de oligonucleótido, então a posição da ligação de hidrogénio entre o oligonucleótido e o ácido nucleico alvo é considerada como sendo uma posição complementar. O composto oligomérico e o DNA, RNA, ou molécula de oligonucleótido são complementares entre si quando um número suficiente de posições complementares em cada molécula é ocupado por nucleótidos que se podem ligar uns com os outros por ligações de hidrogénio. Assim, "hibridação específica" e "complementar" são termos que são utilizados para indicar um grau suficiente de emparelhamento preciso ou de complementaridade de um número suficiente de nucleótidos, de forma que ocorra uma ligação estável e específica entre o composto oligomérico e um ácido nucleico alvo. É entendido na arte que a sequência de um composto oligomérico não necessita de ser 100% complementar à do seu ácido nucleico alvo para ser especificamente hibridizante. Além disso, um oligonucleót ido pode hibridar num ou mais segmentos de forma que os segmentos intervenientes ou adjacentes não estejam envolvidos na hibridização (por exemplo, uma estrutura cíclica, uma estrutura de incompatibilidade ou em gancho). Os compostos oligoméricos da presente invenção compreendem pelo menos cerca de 70%, ou pelo menos cerca de 75%, ou pelo menos cerca de 80%, ou pelo menos cerca de 85%, ou pelo menos cerca de 90%, ou pelo menos cerca de 95%, ou pelo menos cerca de 99% de complementaridade de sequência com uma região alvo dentro da sequência de ácidos nucleicos alvo a que se destinam. Por exemplo, um composto anti-senso no qual 18 de 20 nucleótidos do composto anti-senso são complementares com uma região alvo e que iria, como tal, hibridar especificamente, representaria 90 por cento de complementaridade. Neste exemplo, os restantes nucleótidos não complementares podem ser agrupados ou intercalados com nucleótidos complementares e não precisam de ser contíguos uns com os outros ou com os nucleótidos complementares. Como tal, um composto anti-senso que tenha 18 nucleótidos de comprimento, possuindo 4 (quatro) nucleótidos não complementares, que são flanqueados por duas reqiões de complementaridade completa com o ácido nucleico alvo, teria 77,8% de complementaridade geral com o ácido nucleico alvo e cairia, assim, dentro do âmbito da presente descrição. A percentagem de complementaridade dum composto anti-senso com uma região de um ácido nucleico alvo pode ser determinada de forma rotineira utilizando programas BLAST (ferramentas de pesquisa de alinhamento local básico) e programas Powerblast conhecidos na arte (Altschul et ai., (1990) J. Mol. Biol., 215, 403-410; Zhang e Madden, (1997) Genome Res., 7, 649-656) . A percentagem de homologia, a identidade ou complementaridade da sequência, pode ser determinada, por exemplo, pelo programa Gap (Wisconsin Sequence Analysis Package, Versão 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, Madison Wis.), usando as configurações padrão, que utilizam o algoritmo de Smith e Waterman (Adv. Appl. Math., (1981) 2, 482-489) .
Tal como aqui utilizado, o termo "Ponto de Fusão Térmica (Tm)" refere-se à temperatura, sob força iónica, pH e concentração de ácido nucleico definidos, em que 50% dos oligonucleótidos complementares à sequência alvo hibridam com a sequência alvo em equilíbrio. Normalmente, as condições rigorosas serão aquelas em que a concentração de sal é pelo menos cerca de 0.01 a 1.0 M a concentração do ião Na (ou outros sais), a um pH de 7.0 a 8.3 e a uma temperatura de pelo menos cerca de 30°C para oligonucleótidos curtos (por exemplo, de 10 a 50 nucleótidos). As condições rigorosas também podem ser alcançadas com a adição de agentes desestabilizadores como a formamida.
Tal como aqui utilizado, "modulação" significa um aumento (estimulação) ou uma diminuição (inibição) na expressão de um gene. 0 termo "variante", quando utilizado no contexto de uma sequência de polinucleótidos, pode incluir uma sequência de polinucleótidos relacionada com um gene de tipo selvagem. Esta definição também pode incluir, por exemplo, variantes "alélicas", "de processamento", "de espécies" ou "polimórficas". Uma variante de processamento pode ter uma identidade significativa com uma molécula de referência, mas normalmente terá um maior ou menor número de polinucleótidos devido ao processamento alternado dos exões durante o processamento do mRNA. 0 polipéptido correspondente pode possuir domínios funcionais adicionais ou uma ausência de domínios. Variantes de espécies são sequências polinucleótídicas que variam de uma espécie para outra. As variantes dos produtos de genes de tipo selvagem são de particular utilidade na descrição. As variantes podem resultar de pelo menos uma mutação na sequência de ácidos nucleicos e podem resultar em mRNAs alterados ou em polipéptidos cuja estrutura ou função podem ou não ser alteradas. Qualquer gene natural ou recombinante pode não ter nenhuma ou ter uma ou várias formas alélicas. Alterações mutacionais comuns, que dão origem a variantes, são geralmente atribuídas a deleções, adições ou substituições naturais de nucleótidos. Cada um destes tipos de alterações pode ocorrer por si só, ou em combinação com os outros, uma ou mais vezes numa determinada sequência.
Os polipéptidos resultantes, normalmente terão identidade significativa de aminoácidos em relação uns aos outros. Uma variante polimórfica é uma variação na sequência de polinucleótidos de um gene específico entre os indivíduos de uma dada espécie. As variantes polimórficas também podem abranger "polimorfismos de nucleótido único" (SNPs), ou mutações de uma única base, em que a sequência de polinucleótidos varia de acordo com uma base. A presença de SNPs pode ser indicativa, por exemplo, duma determinada população com uma propensão para um estado de doença, isto é, a susceptibilidade contra a resistência.
Os polinucleótidos derivados incluem ácidos nucleicos sujeitos a uma modificação química, por exemplo, substituição de hidrogénio por um grupo alquilo, acilo ou amino. Os derivados, por exemplo, oligonucleótidos derivados, podem compreender porções de ocorrência não natural, como porções de açúcar modificados ou ligações entre açúcares. Exemplos destes casos são o fosforotioato e outras espécies contendo enxofre que são conhecidas na arte. Os ácidos nucleicos derivados também podem conter marcadores, incluindo radionucleótidos, enzimas, agentes fluorescentes, agentes quimioluminescentes, agentes cromogénicos, substratos, cofactores, inibidores, partículas magnéticas e semelhantes.
Um polipéptido ou péptido "derivado de", é um que é modificado, por exemplo, por glicosilação, a peguilação, fosforilação, sulfatação, redução/alquilação, acilação, acoplamento químico ou tratamento com formalina leve. Um derivado também pode ser modificado para conter um marcador detectável, direta ou indiretamente, incluindo mas não limitado a um marcador radioisótopo, fluorescente e de enzima.
Como aqui utilizado, o termo "animal" ou "paciente" pretende incluir, por exemplo, seres humanos, ovelhas, uapitis, veados, veados-mula, visons, mamíferos, macacos, cavalos, gado bovino, porcos, cabras, cães, gatos, ratazanas, ratos, pássaros, galinhas, répteis, peixes, insetos e aracnídeos. 0 termo "mamífero" inclui mamíferos de sangue quente que normalmente são submetidos cuidados médicos (por exemplo, seres humanos e animais domésticos) . Exemplos dos mesmos incluem felinos, caninos, equinos, bovinos e humanos, bem como apenas os humanos. "Tratar" ou "tratamento" cobre o tratamento de um estado de doença num mamífero, e inclui: (a) prevenir a ocorrência do estado de doença num mamífero, particularmente quando tal mamífero está predisposto ao estado de doença mas ainda não foi diagnosticado como estando doente; (b) inibir o estado de doença, por exemplo, impedindo o seu desenvolvimento; e/ou (c) aliviar o estado de doença, por exemplo, causando a regressão do estado de doença até ser atingido um ponto final desejado. 0 tratamento também inclui a melhoria de um sintoma de uma doença (por exemplo, diminuir a dor ou desconforto), sendo que tal melhoria pode ou não estar a afectar diretamente a doença (por exemplo, causa, transmissão, expressão, etc.).
Como aqui utilizado, o termo "cancro" refere-se a qualquer tumor maligno, particularmente aos provenientes do pulmão, rim ou tiroide. 0 cancro manifesta-se como um "tumor" ou tecido, compreendendo células malignas do cancro. Exemplos de tumores incluem sarcomas e carcinomas, tais como, mas não limitados a: fibrossarcoma, mixossarcoma, lipossarcoma, condrossarcoma, sarcoma osteogénico, cordoma, angiossarcoma, endoteliossarcoma, linfangiossarcoma, linfangioendoteliossarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, leiomiossarcoma, rabdomiossarcoma, carcinoma do cólon, cancro do pâncreas, cancro da mama, cancro do ovário, cancro da próstata, carcinoma das células escamosas, carcinoma das células basais, adenocarcinoma, carcinoma da glândula sudorípara, carcinoma da glândula sebácea, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistoadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogénico, carcinoma das células renais, hepatoma, carcinoma do dueto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionário, tumor de Wilms, cancro cervical, tumor testicular, carcinoma do pulmão, carcinoma das células pequenas do pulmão, carcinoma da bexiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acústico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma e retinoblastoma. Como observado acima, a descrição permite especificamente o diagnóstico diferencial de tumores de pulmão, rim e tiroide.
Composições e Moléculas de Polinucleótidos e Oligonucleótidos
Alvos: Num exemplo, os alvos compreendem sequências de ácidos nucleicos do factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), incluindo, sem limitações, sequências senso e/ou anti-senso, não codificantes e/ou codificantes associadas com o BDNF.
As neurotrofinas são uma classe de factores de crescimento estruturalmente relacionados que promovem a sobrevivência e diferenciação neuronal. Estas estimulam o crescimento das neurites, sugerindo que podem promover a regeneração de neurónios lesados e agir como alvos derivados dos fatores neurotroficos para estimular o surgimento colateral nos tecidos alvo que produzem a neurotrofina (Korsching, (1993) J. Neurosci., 13: 2739). 0 factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) foi inicialmente caracterizado como uma proteína básica presente em extractos de cérebro e capaz de aumentar a sobrevivência dos gânglios da raiz dorsal (Leibrock, et ai., (1989) Nature, 341: 149). Quando a comunicação axonal com o corpo celular é interrompida por uma lesão, as células de Schwann produzem factores neurotróficos como o factor de crescimento do nervo (NGF) e o BDNF. As neurotrofinas são libertadas das células de Schwann e dispersas de forma difusa, em forma de gradiente, ao redor dos axônios em regeneração, que então se estendem distalmente ao longo do gradiente de densidade das neurotrofinas (Ide, (1996) Neurosci. Res, 25: 101). A aplicação local de BDNF de nervos seccionados em ratos recém-nascidos demonstrou impedir a morte massiva dos neurónios motores que se segue à axonotomia (DiStefano, et al., (1992) Neuron, 8: 983; Oppenheim, et al., (1992) Nature, 360: 755; Yan, et al. , (1992) Nature, 360: 753) . O titulo de mRNA de BDNF aumenta várias vezes o nivel normal quatro dias após a axonotomia e atinge o seu máximo às 4 semanas (Meyer, et al., (1992) J. Cell Biol. 119: 45) . Além disso, tem sido descrito que o BDNF aumenta a sobrevivência de neurónios colinérgicos em cultura (Nonomura et al., (1995) Brain Res. 683: 129) .
Exemplos de doenças e distúrbios mediadas pelo factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF), que podem ser tratados com células/tecidos regenerados a partir de células estaminais obtidas utilizando os compostos anti-senso compreendem: uma doença ou um distúrbio associado a uma neurogénese defeituosa; uma doença ou desordem neurodegenerativa (por exemplo, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, esclerose lateral amiotrófica, etc.); uma desordem neuropsiquiátrica (depressão, esquizofrenia, transtorno esquizofreniforme, transtorno esquizoafetivo e transtorno delirante); transtornos de ansiedade, como transtorno do pânico, fobias (incluindo agorafobia), um transtorno obsessivo-compulsivo, um distúrbio de stresse pós-traumático, uma doença bipolar, anorexia nervosa, bulimia nervosa, uma doença autoimune do sistema nervoso central (por exemplo, esclerose múltipla), perda de memória, um distúrbio da memória a longo prazo ou a curto prazo, esquecimento benigno, um distúrbio da aprendizagem na infância, traumatismo craniano fechado, uma perturbação do défice de atenção, reação neuronal a uma infecção virai, dano cerebral, narcolepsia, um distúrbio do sono (por exemplo, distúrbios do ritmo circadiano, insónia e narcolepsia); rompimento de nervos ou lesão do nervo, rompimento do cordão nervoso cerebrospinal (CNS) e lesão das células cerebrais ou nervosas, um deficit neurológico associado à SIDA, um distúrbio de tiques motores e nervosos caracterizada por tiques motores e/ou vocais (por exemplo, transtorno de Tourette, transtorno de tiques motores ou vocais crónicos, transtorno do tique transitório, e transtorno do movimento estereotipado), um transtorno de abuso de substâncias (por exemplo, a dependência de substâncias, abuso de substâncias e as sequelas do abuso/dependência de substâncias, como o transtorno psicológico induzido por substâncias, a abstinência de substâncias e demência induzida por substâncias ou distúrbio amnésico), lesão cerebral traumática, zumbido, neuralgia (por exemplo, neuralgia do trigémeo), dor (por exemplo, dor crónica, dor crónica inflamatória, dor associada com artrite, fibromialgia, dor nas costas, dor associada ao cancro, dor associada com doenças digestivas, dor associada com a doença de Crohn, dor associada com doenças autoimunes, dor associada com doenças endócrinas, dor associada com neuropatia diabética, dor em membro fantasma, dor espontânea, dor crónica pós-operatória, dor temporomandibular crónica, causalgia, neuralgia pós-herpética, dor relacionada com a SIDA, sindromes de dor regional complexa tipo I e II, neuralgia do trigémeo, dor lombar crónica, dor associada com lesão da medula espinhal, dor associada ao consumo de drogas e dor aguda recorrente, dor neuropática), atividade neuronal inadequada que resulta em neurodistesias numa doença como a diabetes, uma MS e uma doença dos neurónios motores, ataxias, rigidez muscular (espasticidade), disfunção da articulação temporomandibular, sindrome da deficiência de recompensa (RDS), neurotoxicidade causada pelo álcool ou abuso de substâncias (por exemplo, ecstasy, metanf etaminas etc.)/· atraso mental ou deficit cognitivo (por exemplo, atraso mental não sindrómico ligado ao X, sindrome do X frágil, sindrome de Down, autismo), afasia, paralisia de Bell, doença de Creutzfeldt-Jacob, encefalite, degeneração macular relacionada com a idade, sindrome de ondine, sindrome de WAGR, perda auditiva, sindrome de Rett, epilepsia, lesão da medula espinal, acidente vascular cerebral, hipóxia, isguémia, lesão cerebral, lesão do nervo óptico, neuropatia diabética, neuropatia periférica, complicações do transplante nervoso, doença dos neurónios motores, lesão do nervo periférico, obesidade, uma sindrome metabólica, cancro, asma, uma doença atópica, uma inflamação alérgica, eczema, uma doença ou desordem neuro-oncológica, doença ou desordem neuro-imunológica e doença ou desordem neuro-otológica; e uma doença ou distúrbio associado com o envelhecimento e senescência.
Num exemplo preferido, os oligonucleótidos são específicos para os polinucleótidos do BDNF, gue incluem, sem limitações, regiões não codificantes. Os alvos do BDNF compreendem variantes de BDNF e BDNFOS; mut antes de BDNF ou BDNFOS, incluindo SNPs; seguências não codificantes do BDNF; alelos, fragmentos e outros semelhantes. De preferência, o oligonucleótido é uma molécula de RNA anti-senso.
De acordo com os exemplos da descrição, a molécula de ácido nucleico alvo não está limitada apenas a polinucleótidos do BDNF, mas estende-se a gualguer uma das isoformas, receptores, homólogos, regiões não codificantes e outros semelhantes do BDNF.
Num outro exemplo preferido, um oligonucleótido tem como alvo uma sequência anti-senso natural (anti-senso natural para as regiões codificantes e não codificantes) de alvos de BDNF, incluindo, sem limitações, variantes, alelos, mutantes, homólogos, derivados, fragmentos e sequências complementares às mesmas. De preferência, o oligonucleótido é uma molécula de RNA ou DNA anti-senso.
Noutro exemplo preferido, os compostos oligoméricos da presente invenção também incluem variantes nas quais está presente uma base diferente numa ou mais das posições dos nucleótidos do composto. Por exemplo, se o primeiro nucleótido é uma adenina, podem ser produzidas variantes que contêm timidina, guanosina, citidina ou outros nucleótidos naturais ou não naturais nesta posição. Isto pode ser feito em qualquer das posições do composto anti-senso. Estes compostos são então testados usando os métodos aqui descritos para determinar a sua capacidade de inibir a expressão de um ácido nucleico alvo.
Em alguns casos, a homologia, identidade de sequência ou complementaridade, entre o composto anti-senso e o alvo é de cerca de 50% a cerca de 60%. Em alguns casos, a homologia, identidade de sequência ou complementaridade, é de cerca de 60% a cerca de 70%. Em alguns casos, a homologia, identidade de sequência ou complementaridade, é de cerca de 70% a cerca de 80%. Em alguns casos, a homologia, identidade de sequência ou complementaridade, é de cerca de 80% a cerca de 90%. Em alguns casos, a homologia, identidade de sequência ou complementaridade, é de cerca de 90%, cerca de 92%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100%.
Um composto anti-senso é especificamente hibridizante quando a ligação do composto com o ácido nucleico alvo interfere com a função normal do ácido nucleico alvo, causando uma perda de atividade, e existe um grau suficiente de complementaridade para evitar a ligação não específica do composto anti-senso com sequências de ácidos nucleicos não alvo, sob condições em que a ligação específica é desejada. Tais condições incluem, por exemplo, condições fisiológicas, no caso de ensaios in vivo ou tratamentos terapêuticos, e condições em que os ensaios são executados, no caso de ensaios in vitro.
Um composto anti-senso, seja DNA, RNA, quimérico, substituído, etc., é especificamente hibridizante quando a ligação do composto com o DNA ou RNA alvo interfere com a função normal do DNA ou RNA alvo, causando uma perda de utilidade, e existe um grau suficiente de complementaridade para evitar a ligação não específica do composto anti-senso com sequências não alvo, sob condições em que a ligação específica é desejada, ou seja, sob condições fisiológicas, no caso de ensaios in vivo ou tratamentos terapêuticos, e sob condições em que os ensaios são executados, no caso de ensaios in vitro.
Noutro exemplo preferido, a marcação do BDNF, incluindo sem limitações sequências anti-senso que são identificadas e expandidas, utilizando, por exemplo, PCR, hibridação, etc., de uma ou mais das sequências apresentadas como SEQ ID n° : 2, e outras semelhantes, modula a expressão ou função do BDNF. Num exemplo, a expressão ou função é regulada para positivamente em relação a um controlo. Noutro exemplo preferido, a expressão ou função é regulada negativamente, em relação a um controlo.
Noutro caso preferido, os oligonucleótidos compreendem sequências de ácidos nucleicos apresentadas como SEQ ID n°s: 3 a 8, incluindo as sequências anti-senso que são identificadas e expandidas, utilizando, por exemplo, PCR, hibridação, etc. Estes oligonucleótidos podem compreender um ou mais nucleótidos modificados, fragmentos mais curtos ou mais longos, ligações modificadas e outros semelhantes. Exemplos de ligações modificadas entre nucleótidos compreendem fosforotioato, fosforoditioato ou outras semelhantes. Noutro exemplo preferido, os nucleótidos compreendem um derivado de fósforo. 0 derivado de fósforo (ou grupo fosfato modificado) que pode ser ligado ao açúcar ou à porção análoga do açúcar nos oligonucleótidos modificados da presente invenção pode ser um monofosfato, difosfato, trifosfato, fosfato de alquilo, fosfato de alcano, fosforotioato e outros semelhantes. A preparação dos análogos de fosfato acima mencionados, e a sua incorporação em nucleótidos, nucleótidos modificados e oligonucleótidos, por si só, também é conhecida e não precisa ser aqui descrita. A especificidade e a sensibilidade do anti-senso também são aproveitadas pelos peritos na arte para fins terapêuticos. Os oligonucleótidos anti-senso têm sido utilizados como grupos terapêuticos no tratamento de estados de doença em animais e no homem. Os oligonucleótidos anti-senso têm sido segura e eficazmente administrados a humanos e estão presentemente em curso numerosos ensaios clínicos. Estabelece-se assim que os oligonucleótidos podem ser modalidades terapêuticas úteis que podem ser configuradas para serem úteis em protocolos de tratamento para o tratamento de células, tecidos e animais, especialmente em seres humanos.
Nos exemplos da presente descrição os compostos oligoméricos anti-senso, particularmente os oligonucleótidos, ligam-se a moléculas alvo de ácidos nucleicos e modulam a expressão e/ou função das moléculas codificadas por um gene alvo. As funções de DNA com as quais interferem compreendem, por exemplo, replicação e transcrição. As funções de RNA com as quais interferem, compreendem todas as funções vitais tais, como por exemplo a translocação do RNA para o local da tradução da proteína, a tradução da proteína a partir do RNA, processamento do RNA para produzir uma ou mais espécies de mRNA, e a atividade catalítica que pode ser envolvida em, ou facilitada pelo RNA. As funções podem ser reguladas positivamente ou inibidas dependendo das funções pretendidas.
Os compostos anti-senso incluem, compostos oligoméricos anti-senso, oligonucleótidos anti-senso, oligonucleótidos de sequência guia externa (EGS), processadores alternativos, primers, sondas e outros compostos oligoméricos que hibridam, pelo menos, com uma porção do ácido nucleico alvo. Como tal, estes compostos podem ser introduzidos na forma de compostos oligoméricos de cadeia simples, cadeia dupla, cadeia parcialmente simples ou circular.
Marcar como alvo um composto anti-senso com uma molécula específica de ácido nucleico, no contexto da presente descrição, pode ser um processo de múltiplos passos. 0 processo geralmente começa com a identificação de um ácido nucleico alvo cuja função é a de ser modulado. Este ácido nucleico alvo pode ser, por exemplo, um gene celular (ou mRNA transcrito a partir do gene), cuja expressão está associada com um distúrbio ou estado de doença específico, ou uma molécula de ácido nucleico de um agente infeccioso.
Na presente descrição, o ácido nucleico-alvo codifica o factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF). 0 processo de marcar como alvo normalmente também inclui a determinação de pelo menos uma região alvo, segmento, ou local dentro do ácido nucleico alvo para a interacção anti-senso ocorrer, de tal forma que o efeito desejado, por exemplo, a modulação da expressão, ocorra. Dentro do contexto da presente descrição, o termo ''região" é definido como uma porção do ácido nucleico alvo com pelo menos uma estrutura, função ou caracteristica identificável. Dentro das regiões dos ácidos nucleicos alvo existem segmentos. Os "segmentos" são definidos como regiões menores ou sub-porções das regiões dentro dum ácido nucleico alvo. Os "locais", conforme usado na presente descrição, são definidos como posições dentro dum ácido nucleico alvo.
Num exemplo preferido, os oligonucleótidos anti-senso ligam-se às sequências anti-senso naturais do factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e modulam a expressão e/ou função do factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) (SEQ ID n° : 1). Exemplos de sequências anti-senso incluem SEQ ID n°s: 2 a 8.
Noutro exemplo preferido, os oligonucleótidos anti-senso ligam-se a um ou mais segmentos dos polinucleótidos do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) e modulam a expressão e/ou função de factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF). Os segmentos compreendem, pelo menos, cinco nucleótidos consecutivos dos polinucleótidos senso ou anti-senso do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF).
Noutro exemplo preferido, os oligonucleótidos anti-senso são específicos para as sequências anti-senso naturais do factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) em que a ligação dos oligonucleótidos com as sequências anti-senso naturais do factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) modula a expressão e/ou função do fator neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF).
Noutro exemplo preferido, os compostos de oligonucleótidos compreendem sequências apresentadas como SEQ ID n°s: 3 a 8, sequências anti-senso que são identificadas e expandidas, utilizando, por exemplo, PCR, hibridação, etc. Estes oligonucleótidos podem compreender um ou mais nucleótidos modificados, fragmentos mais ou menos compridos, ligações modificadas e outros semelhantes. Exemplos de ligações modificadas entre nucleótidos compreendem fosforotioato, fosforoditioato ou outros semelhantes. Noutro exemplo preferido, os nucleótidos compreendem um derivado do fósforo. 0 derivado do fósforo (ou grupo fosfato modificado) que pode ser ligado ao açúcar ou a uma porção análoga do açúcar dos oligonucleótidos modificados da presente invenção pode ser um monofosfato, difosfato, trifosfato, fosfato de alquilo, fosfato de alcano, fosforotioato e outros semelhantes. A preparação dos análogos de fosfato acima mencionado, e a sua incorporação em nucleótidos, nucleótidos modificados e oligonucleótidos, por si só, também é conhecida e não precisa ser aqui descrita.
Uma vez que, como é conhecido na arte, o codão de iniciação da tradução é normalmente 5'-AUG (em moléculas transcritas de mRNA; 5'-ATG na molécula de DNA correspondentes), o codão de iniciação da tradução é também referido como "codão AUG", "o codão de iniciação" ou o "codão de iniciação AUG". Uma minoria de genes tem um codão de iniciação da tradução com a sequência de RNA 5'-GUG, 5'-UUG ou 5'-CUG; e 5'-AUA, 5'-ACG e 5'-CUG que funcionam in vivo. Assim, os termos "codão de iniciação da tradução" e "codão de iniciação" podem abranger muitas sequências de codões, apesar do aminoácido iniciador em cada ocorrência ser normalmente a metionina (em eucariotas) ou a formilmetionina (em procariotas). Os genes eucarióticos e procarióticos podem ter dois ou mais codões de iniciação alternativos, qualquer um dos quais pode ser preferencialmente utilizado para a iniciação da tradução num tipo especifico de célula ou tecido, ou sob um conjunto especifico de condições. No contexto da descrição, "codão de iniciação" e "codão de iniciação da tradução" referem-se ao codão ou codões que são utilizados in vivo para iniciar a tradução de um transcrito de mRNA a partir de um gene que codifica o factor neurotrófico derivado de Cérebro (BDNF), independentemente da sequência de tais codões. Um codão de fim da tradução (ou "codão de terminação") de um gene pode ter uma de três sequências, isto é, 5'-UAA, 5'-UAG e 5'-UGA (as sequências de DNA correspondentes são 5'-TAA, 5'-TAG e 5'-TGA, respetivamente).
Os termos "região do codão de iniciação" e "região do codão de iniciação de tradução" referem-se a uma porção de mRNA ou gene que abrange de cerca de 25 a cerca de 50 nucleótidos contíguos em qualquer direção (isto é, 5' ou 3') a partir dum codão de iniciação da tradução. Da mesma forma, os termos "região do codão de terminação" e "região do codão de terminação da tradução" referem-se a uma porção de mRNA ou gene que abrange de cerca de 25 a cerca de 50 nucleótidos contíguos em qualquer direção (isto é, 5' ou 3') a partir dum o codão de terminação da tradução. Consequentemente, a "região do codão de iniciação" (ou a "região do codão de iniciação da tradução") e a "região do codão de terminação" (ou a "região do codão de terminação da tradução") são todas regiões que podem ser marcadas de forma eficaz com os compostos anti-senso da presente descrição. A grelha de leitura aberta (ORF) ou "região de codificação", que é conhecida na arte para se referir à região entre o codão de iniciação da tradução e o codão de terminação de tradução, é também uma zona que pode ser marcada de forma eficaz. Dentro do contexto da presente descrição, uma região alvo é a região intragénica que engloba o codão de iniciação ou terminação da tradução da grelha de leitura aberta (ORF) de um gene.
Outra região alvo inclui a região 5' não traduzida (5'UTR), conhecida na arte para se referir à porção dum mRNA na direção 5' a partir do codão de iniciação da tradução e, incluindo assim, os nucleótidos entre o local CAP 5' e o codão de iniciação da tradução dum mRNA (ou nucleótidos correspondentes no gene). Ainda outra região alvo inclui a região 3' não traduzida (3'UTR), conhecida na arte para se referir à porção dum mRNA na direção 3' a partir do codão de terminação da tradução e, incluindo assim, os nucleótidos entre o codão de terminação da tradução e a extremidade 3' dum mRNA (ou nucleótidos correspondentes no gene). 0 local cap 5' de um mRNA compreende um resíduo de guanosina N7-metilada unido ao restante resíduo-5' do mRNA através duma ligação trifosfato 5'-5'. Considera-se que a região cap 5' dum mRNA inclui a a estrutura cap 5' em si, bem como os primeiros 50 nucleótidos adjacentes ao local cap. Outra região alvo desta descrição é a região cap 5'.
Apesar de alguns transcritos de mRNA eucariótico serem diretamente traduzidos, muitos contêm uma ou mais regiões, conhecidas como "intrões", que são excisadas a partir dum transcrito, antes de ser traduzido. As restantes (e consequentemente traduzidas) regiões são conhecidas como "exões" e são unidas entre si para formar uma sequência contínua de mRNA. Num exemplo, a marcação dos locais de splice, ou seja, junções intrão-exão ou junções exão-intrão, é particularmente útil em situações em que a ocorrência dum splicing anormal está implicada na doença, ou em que um excesso de produção de um produto específico de splicing está implicado na doença. Uma ligação anormal por fusão devida ao rearranjo ou exclusão é outro exemplo de um local alvo. Transcritos de mRNA produzidos por meio do processo de splicing de dois (ou mais) mRNAs de diferentes fontes genéticas são conhecidos como "transcritos de fusão". Os intrões podem ser eficazmente marcados utilizando compostos anti-senso direcionados, por exemplo, para DNA ou pré-mRNA.
Noutro exemplo preferido, os oligonucleótidos anti-senso ligam-se a regiões codificantes e/ou não codificantes de um polinucleótido alvo e modulam a expressão e/ou função da molécula alvo.
Noutro exemplo preferido, os oligonucleótidos anti-senso ligam-se a polinucleótidos anti-senso naturais e modulam a expressão e/ou função da molécula alvo.
Noutro exemplo preferido, os oligonucleótidos anti-senso ligam-se a polinucleótidos senso e modulam a expressão e/ou função da molécula alvo.
Transcritos alternativos de RNA podem ser produzidos a partir da mesma região genómica de DNA. Estes transcritos alternativos são geralmente conhecidos como "variantes". Mais especificamente, as "variantes pré-mRNA" são transcritos produzidos a partir do mesmo DNA genómico que diferem de outros transcritos produzidos a partir do mesmo DNA genómico tanto na sua posição de iniciação como de terminação e contêm sequências intrónicas e exónicas.
Após a excisão de uma ou mais regiões de intrões ou exões ou porções das mesmas, durante o splicing, as variantes de pré-mRNA produzem "variantes de mRNA" mais pequenas. Por conseguinte, as variantes de mRNA são variantes pré-mRNA processadas e cada variante pré-mRNA única deve produzir sempre uma variante de mRNA única como resultado do splicing. Estas variantes de mRNA também são conhecidas como "variantes de splicing alternativas". Se não ocorrer splicing da variante de pré-mRNA, então a variante de pré-mRNA é idêntica à variante de mRNA.
As variantes podem ser produzidas através da utilização de sinais alternativos para iniciar ou terminar a transcrição. Os pré-mRNAs e mRNAs podem possuir mais de um codão de iniciação ou de terminação. As variantes que se originam a partir de um pré-mRNA ou mRNA que utilizam codões de iniciação alternativos são conhecidas como "variantes de iniciação alternativos" desse pré-mRNA ou mRNA. Esses transcritos que usam um codão de terminação alternativo são conhecidos como "variantes de terminação alternativas" desse pré-mRNA ou mRNA. Um tipo especifico de variante de terminação alternativa é a "variante poliA", na qual os múltiplos transcritos produzidos resultam da seleção alternativa de um dos "sinais de terminação poliA" pela maquinaria de transcrição, produzindo assim transcritos que terminam em locais poliA exclusivos. Dentro do contexto da descrição, os tipos de variantes aqui descritas também são exemplos de ácidos nucleicos alvo.
As localizações no ácido nucleico alvo em que os compostos anti-senso hibridam são definidas como porções com pelo menos 5 nucleótidos de comprimento de uma região alvo, para o qual um composto anti-senso ativo se destina.
Enquanto as sequências específicas de determinados segmentos alvo exemplificativos são aqui apresentadas, um perito na arte vai reconhecer que estes servem para ilustrar e descrever os exemplos específicos dentro do âmbito da presente descrição. Segmentos alvo adicionais são facilmente identificáveis por um perito na arte tendo em conta esta descrição.
Segmentos alvo com 5-100 nucleótidos de comprimento, que compreendem um trecho de pelo menos cinco (5) nucleótidos consecutivos, selecionados dentro dos segmentos alvo ilustrativos preferidos, também são considerados adequados para marcação.
Segmentos alvo pode incluir sequências de DNA ou de RNA, que compreendem pelo menos os 5 nucleótidos consecutivos do terminal 5' de um dos segmentos alvo ilustrativos preferidos (sendo os restantes nucleótidos uma extensão consecutiva do mesmo DNA ou RNA, começando imediatamente a montante do terminal 5' do segmento alvo e continuando até o DNA ou RNA conter cerca de 5 a cerca de 100 nucleótidos) . De modo semelhante os segmentos alvo preferidos são representados por sequências de DNA ou de RNA que compreendem pelo menos os 5 nucleótidos consecutivos do terminal 3' de um dos segmentos alvo ilustrativos preferidos (sendo os restantes nucleótidos uma extensão consecutiva do mesmo DNA ou RNA, começando imediatamente a jusante do terminal 3' do segmento alvo e continuando até o DNA ou RNA conter cerca de 5 a cerca de 100 nucleótidos). Alguém com conhecimentos na arte armado com os segmentos-alvo aqui ilustradas será capaz, sem experimentação indevida, identificar outros segmentos alvo preferidos.
Uma vez que tenham sido identificados um ou mais segmentos regiões ou locais alvo, são escolhidos os compostos anti- senso que sejam suficientemente complementares ao alvo, ou seja, que hibridam suficientemente bem e com especificidade suficiente, para se obter o efeito desejado.
Em exemplos da descrição os oligonucleótidos ligam-se a uma cadeia anti-senso dum alvo especifico. Os oligonucleótidos têm pelo menos 5 nucleótidos de comprimento e podem ser sintetizados de forma que cada oligonucleótido marque sequências sobrepostas, de tal maneira que os oligonucleótidos são sintetizados para cobrir todo o comprimento do polinucleótido alvo. Os alvos incluem regiões codificantes e não codificantes.
Num exemplo, prefere-se marcar ácidos nucleicos específicos por oligonucleótidos anti-senso. A marcação dum composto anti-senso para um ácido nucleico específico, é um processo de múltiplos passos. 0 processo normalmente começa com a identificação de uma sequência de ácido nucleico, cuja função é a de ser modulado. Este pode ser, por exemplo, um gene celular (ou mRNA transcrito a partir do gene), cuja expressão está associada com um distúrbio ou estado de doença específico, ou um polinucleótido não codificante, como por exemplo, RNA não codificante (ncRNA).
Os RNAs podem ser classificados em (1) RNA mensageiro (mRNA), que são traduzidos em proteínas, e (2) RNAs não codificantes de proteínas (ncRNAs). Os ncRNAs compreendem microRNAs, transcritos anti-senso e outras Unidades de Transcrição (TU) contendo uma elevada densidade de codões de terminação e sem qualquer "grelha de leitura aberta" extensa. Muitos ncRNAs parecem começar em locais de iniciação em regiões 3' não traduzidas (3'UTRs) de loci codificantes de proteínas. Os ncRNAs são frequentemente raros e, pelo menos, metade do ncRNAs que foram sequenciados pelo consórcio FANTOM não parecem ser poliadenilados. A maioria dos investigadores tem-se focado, por razões óbvias, nos mRNAs poliadenilados que são processados e exportados para o citoplasma. Mostrou-se recentemente que o conjunto de RNAs nucleares não poliadenilados pode ser muito grande, e que muitos desses transcritos surgem a partir das chamadas regiões intergénicas (Cheng, J. et ai., (2005) Science 308 (5725), 1149- 1154; Kapranov, P. et ai., (2005) Genome Res. 15 (7), 987-997) . O mecanismo pelo qual os ncRNAs podem regular a expressão génica é por emparelhamento de bases com transcritos alvo. Os RNAs que funcionam por emparelhamento de bases podem ser agrupados em (1) RNAs cis-codifiçados, que são codificados no mesmo local genético, mas na cadeia oposta aos RNAs sobre os quais agem e que, como tal, mostram uma complementaridade perfeita com o seu alvo, e (2) RNAs trans-codifiçados que são codificados numa localização cromossomal distinta dos RNAs sobre os quais agem e, normalmente, não apresentam potencial de emparelhamento de bases perfeito com os seus alvos.
Sem se pretender ficar limitado pela teoria, a perturbação de um polinucleótido anti-senso pelos oligonucleótidos anti-senso aqui descritos, pode alterar a expressão dos RNAs senso mensageiros correspondentes. No entanto, esta regulação pode ser discordante (o silenciamento anti-senso resulta no aumento do RNA mensageiro) ou concordante (o silenciamento anti-senso resulta na concomitante diminuição do RNA mensageiro) . Nestes casos, os oligonucleótidos anti-senso podem ser direcionados para partes sobrepostas ou não sobrepostas do transcrito anti-senso, resultando no seu silenciamento ou sequestro. Anti-sensos codificantes ou não codificantes pode ser marcados de forma idêntica e cada uma das categorias é capaz de regular os transcritos senso correspondentes - quer de uma forma concordante como discordantes. As estratégias que são utilizadas na identificação de novos oligonucleótidos para uso contra um alvo podem ser baseadas no silenciamento de transcritos de RNA anti-senso por oligonucleótidos anti-senso ou em quaisquer outros meios de modulação do alvo desejado.
Estratégia 1: No caso de regulação discordante, o silenciamento do transcrito anti-senso eleva a expressão do gene convencional (senso). Esse último gene deveria codificar um fármaco alvo conhecido ou putativo e, posteriormente o silenciamento do seu homólogo anti-senso pode conseguir mimetizar a ação de um agonista do receptor ou um estimulante da enzima.
Estratégia 2: No caso da regulação concordante, pode-se concomitantemente silenciar os transcritos anti-senso e senso e, assim alcançar uma redução sinérgica da expressão génica convencional (senso) . Se, por exemplo, um oligonucleótido anti-senso for usado para conseguir o silenciamento, então esta estratégia pode ser usada para aplicar um oligonucleótido anti-senso marcado para o transcrito senso e outro oligonucleótido anti-senso para o transcrito anti-senso correspondente, ou um único oligonucleótido anti-senso energicamente simétrico que tem simultaneamente como alvo transcritos sobrepostos senso e anti-senso.
De acordo com a presente descrição, os compostos anti-senso incluem os oligonucleótidos anti-senso, ribozimas, oligonucleótidos de sequência guia externa (EGS), compostos de siRNA, compostos de RNA de interferência (RNAi) de cadeia única ou dupla como os compostos de siRNA, e outros compostos oligoméricos que hibridam com pelo menos uma porção do ácido nucleico alvo e modulam a sua função. Como tal, podem ser DNA, RNA, semelhantes a DNA, semelhantes a RNA ou misturas dos mesmos ou podem ser miméticos de um ou mais destes. Estes compostos podem ser compostos oligoméricos de cadeia simples, de cadeia dupla, circulares ou em forma de gancho e podem conter elementos estruturais, tais como protuberâncias, desfasamentos ou loops internos ou terminais. Os compostos anti-senso são rotineiramente preparados de forma linear, mas podem ser unidos ou, por outro lado, preparados para assumir uma forma circular e/ou ramificada. Os compostos anti-senso podem incluir constructos como, por exemplo, duas cadeias hibridadas para formar um composto total ou parcialmente formado por uma cadeia dupla ou uma cadeia única com suficiente auto complementaridade para permitir a hibridação e a formação de um composto total ou parcialmente formado por uma cadeia dupla. As duas cadeias podem ser ligadas internamente deixando livre os terminais 3' ou 5' ou podem ser ligadas para formar uma estrutura continua em forma de gancho ou em loop. A estrutura em forma de gancho pode conter uma saliência tanto na extremidade 5' como na 3', produzindo uma extensão de cadeia simples. Os compostos de cadeia dupla, opcionalmente, podem incluir saliências nas extremidades. Outras modificações podem incluir grupos conjugados ligados a um dos terminais, posições de nucleótidos selecionados, posições de açúcar ou a uma das ligações internucleósidos. Alternativamente, as duas cadeias podem ser ligadas através duma porção ou grupo de ligação dum ácido não nucleico. Quando formado a partir duma cadeia única, o dsRNA pode assumir a forma duma molécula de tipo gancho auto-complementar que se dobra sobre si mesma para formar um dúplex. Assim, os dsRNAs podem ser total ou parcialmente formados por cadeia dupla. A modulação especifica da expressão de genes pode ser conseguida por expressão estável de dsRNA em forma de gancho em linhas celulares transgénicas, no entanto, em alguns casos, a expressão ou a função do gene é regulada positivamente. Quando formadas a partir de duas cadeias, ou uma cadeia simples que assume a forma duma molécula de tipo gancho auto-complementar dobrada sobre si mesma para formar um dúplex, as duas cadeias (ou regiões que formam dúplices duma cadeia dupla) são cadeias complementares de RNA que se emparelham em forma Watson-Crick.
Uma vez introduzidos num sistema, os compostos da descrição podem provocar a ação duma ou mais enzimas ou proteínas estruturais para efetuar a clivagem ou outra modificação do ácido nucleico alvo, ou pode funcionar através de mecanismos baseados em ocupação. Em geral, os ácidos nucleicos (incluindo oligonucleótidos) podem ser descritos como "semelhantes DNA" (ou seja, geralmente, com um ou mais açúcares 2'-desoxi e, geralmente, bases T em vez de U) ou "semelhantes a RNA" (ou seja, geralmente com um ou mais açúcares 2'-hidroxilo ou 2'-modificados e, geralmente, bases U em vez de T). As hélices de ácidos nucleicos podem adoptar mais do que um tipo de estrutura, mais comummente as formas A- e B-. Acredita-se que, em geral, os oligonucleótidos que têm a estrutura em forma -B são "semelhantes DNA" e aqueles que têm uma estrutura em forma -A são "semelhantes a RNA". Em alguns casos (quiméricos), um composto anti-senso pode conter regiões de forma -A e -B.
Noutro exemplo preferido, os oligonucleótidos ou compostos anti-senso desejados, compreendem pelo menos um dos seguintes: RNA anti-senso, DNA anti-senso, oligonucleótidos anti-senso quiméricos, oligonucleótidos anti-senso que compreendem ligações modificadas, RNA de interferência (RNAi), RNA de interferência curto (siRNA); um RNA de interferência micro (miARN); um RNA temporal pequeno (stRNA); ou um RNA curto em forma de gancho (shRNA); ativação do gene induzido pelo RNA pequeno (RNAa); RNAs pequenos de activação (saRNAs), ou combinações dos mesmos. 0 dsRNA também pode ativar a expressão de genes, um mecanismo que tem sido denominado "ativação de genes induzido por RNA pequeno" ou RNAa. Os promotores dos dsRNAs dirigidos a genes induzem uma ativação transcripcional potente dos genes associados. 0 RNAa foi demonstrado em células humanas utilizando dsRNAs sintéticos, designados por "RNAs pequenos de ativação" (saRNAs) . Atualmente não se sabe se o RNAa é conservado noutros organismos.
Descobriu-se que o RNA pequeno de cadeia dupla (dsRNA), tal como o RNA pequeno de interferência (siRNA) e microRNA (miRNA), são o gatilho de um mecanismo evolutivo conservado conhecido como interferência de RNA (RNAi). A RNAi conduz, invariavelmente, ao silenciamento génico através da remodelação da cromatina para suprimir assim a transcrição, a degradação do mRNA complementar, ou o bloqueando da tradução de proteínas. No entanto, nos casos descritos em detalhe na secção de Exemplos que se segue, mostra-se que os oligonucleótidos aumentam a expressão e/ou função dos polinucleótidos do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) e dos produtos codificados dos mesmos. Os dsRNAs também podem atuar como RNAs pequenos de ativação (saRNA). Sem se pretender ficar limitado pela teoria, pela marcação de sequências em promotores de genes, saRNAs iriam induzir a expressão do gene alvo num fenómeno referido como ativação transcricional induzida por dsRNA (RNAa).
Num outro exemplo, os "segmentos alvo preferidos" aqui identificados podem ser utilizados numa avaliação de compostos adicionais que modulam a expressão dos polinucleótidos do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF). Os "moduladores" são aqueles compostos que diminuem ou aumentam a expressão de uma molécula de ácido nucleico que codifica o factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) e os que compreendem, pelo menos, uma porção de 5 nucleótidos que é complementar a um segmento alvo preferido. 0 método de avaliação compreende os passos de contacto de um segmento alvo preferido duma molécula de ácido nucleico que codifica polinucleótidos senso ou anti-senso naturais do factor neurotrófico derivado Cérebro (BDNF) com um ou mais moduladores candidatos, e a seleção de um ou mais moduladores candidatos que diminuem ou aumentam a expressão de uma molécula de ácido nucleico que codifica polinucleótidos do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF), por exemplo, SEQ ID n°s: 3 a 8. Uma vez demonstrado que o modulador ou moduladores candidatos são capazes de modular (por exemplo, aumentando ou diminuindo) a expressão de uma molécula de ácido nucleico que codifica polinucleótidos do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF), o modulador pode então ser utilizado em estudos de investigação da função dos polinucleótidos do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF), ou utilizado como como agente de pesquisa, diagnóstico ou terapêutico, de acordo com a presente descrição. A marcação da sequência anti-senso natural modula, preferivelmente, a função do gene alvo. Por exemplo, o gene do BDNF (por exemplo, número de acesso NM_170735, Figura 2). Num exemplo preferido, o alvo é um polinucleótido anti-senso do gene de BDNF. Num exemplo preferido, um oligonucleótido anti-senso marca as sequências senso e/ou anti-senso naturais dos polinucleótidos do factor neurotrófico derivado Cérebro (BDNF) (por exemplo, número de acesso NM_170735, Figura 2), variantes, alelos, isoformas, homólogos, mutantes, derivados, fragmentos e sequências complementares dos mesmos. De preferência, o oligonucleótido é uma molécula anti-senso e os alvos incluem regiões codificantes e não codificadoras de polinucleótidos anti-senso e/ou senso do BDNF.
Os segmentos alvos preferidos da presente invenção também podem ser combinados com os respectivos compostos anti-senso complementares da presente invenção para formar oligonucleótidos estabilizados de cadeia dupla (dúplices).
Mostrou-se na arte que tais porções oligonucleotídicas de cadeia dupla modulam a expressão do alvo e regulam a tradução, assim como o processamento do RNA através de um mecanismo anti-senso. Além disso, as porções de cadeia dupla podem ser sujeitas a modificações químicas (Fire et al., (1998) Nature, 391, 806-811; Timmons e Fire, (1998) Nature, 395, 854; Timmons et al., (2001) Gene, 263, 103-112; Tabara et al. , (1998) Science, 282, 430-431; Montgomery et al. , (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95, 15502-15507; Tuschl et al., (1999) Genes Dev., 13, 3191-3197; Elbashir et al., (2001) Nature, 411, 494-498; Elbashir et al. , (2001) Genes Dev. 15, 188-200) . Mostrou-se, por exemplo, que tais porções de cadeia dupla inibem o alvo por hibridação clássica da cadeia anti-senso do dúplex com o alvo, despoletando assim a degradação enzimática do alvo (Tijsterman et al. , (2002) Science, 295, 694-697).
Num caso preferido, um oligonucleótido anti-senso marca os polinucleótidos (por exemplo, número de acesso NM_170735), variantes, alelos, isoformas, homólogos, derivados, mutantes, fragmentos e sequências complementares dos mesmos do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF). Preferencialmente o oligonucleótido é uma molécula anti-senso .
De acordo com exemplos da descrição, a molécula de ácido nucleico alvo não está limitado apenas ao factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF), mas estende-se a qualquer uma das isoformas, receptores, homólogos e análogos das moléculas do factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF).
Num outro exemplo preferido, um oligonucleótido marca uma uma sequência anti-senso natural de polinucleótidos de BDNF, por exemplo, polinucleótidos apresentados como SEQ ID n°: 2, e quaisquer variantes, alelos, homólogos, mutantes, derivados, fragmentos e sequências complementares dos mesmos. Os exemplos de oligonucleótidos anti-senso são apresentados como SEQ ID n°s: 3 a 8.
Num exemplo, os oligonucleótidos são complementares ou ligam-se a sequências de ácidos nucleicos do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) anti-senso, incluindo, sem limitações, sequências não codificantes senso e/ou anti-senso associadas com os polinucleótidos do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) e modulam a expressão e/ou função das moléculas do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) .
Noutro caso preferido, os oligonucleótidos são complementares ou ligam-se a sequências de ácidos nucleicos de BDNF anti-senso naturais, definidas como SEQ ID n°: 2 e modulam a expressão e/ou função das moléculas de BDNF.
Num caso preferido, os oligonucleótidos compreendem sequências de pelo menos 5 nucleótidos consecutivos das SEQ ID n°s: 3 a 8 e modulam a expressão e/ou função das moléculas do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF).
As polinucleótidos alvos compreendem o BDNF, incluindo membros da família do mesmo, variantes do BDNF; mutantes do BDNF, incluindo SNPs; sequências não codificantes do BDNF; alelos de BDNF; variantes de espécies, fragmentos e outros semelhantes. De preferência, o oligonucleótido é uma molécula anti-senso.
Noutro caso preferido, o oligonucleótido que marca os polinucleótidos do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF), compreende: RNA anti-senso, RNA de interferência (RNAi), RNA de interferência curto (siRNA); um RNA de interferência micro (miARN); um RNA temporal pequeno (stRNA); ou um RNA curto em forma de gancho (shRNA); ativação do gene induzido pelo RNA pequeno (RNAa); RNAs pequenos de activação (saRNAs).
Noutro exemplo preferido, a marcação dos polinucleótidos do fator neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF), por exemplo, SEQ ID n°: 2, modula a expressão ou função destes alvos. Num exemplo, a expressão ou função é regulada positivamente em relação a um controlo. Noutro caso preferido, a expressão ou a função é regulada negativamente, em relação a um controlo.
Noutro caso preferido, os compostos anti-senso compreendem sequências apresentadas como SEQ ID n°s: 3 a 8. Estes oligonucleótidos podem compreender um ou mais nucleótidos modificados, fragmentos mais curtos ou mais longos, ligações modificadas e outros semelhantes.
Noutro caso preferido, as SEQ ID n°s: 3 a 8 compreendem um ou mais nucleótidos de LNA. A Tabela 1 mostra os oligonucleótidos anti-senso exemplares úteis nos métodos da presente descrição.
Tabela 1
A modulação de um ácido nucleico alvo desejado pode ser levada a cabo de várias maneiras conhecidas na arte. Por exemplo, oligonucleótidos anti-senso, siRNA, etc. As moléculas de ácidos nucleicos enzimáticos (por exemplo, ribozimas) são moléculas de ácidos nucleicos capazes de catalisar uma ou mais de uma variedade de reações, incluindo a capacidade de clivar repetidamente outras moléculas separadas de ácidos nucleicos na forma duma sequência específica de bases nucleotídicas. Tais moléculas de ácidos nucleicos enzimáticos podem ser utilizadas, por exemplo, para marcar virtualmente qualquer transcrito de RNA (Zaug et al., 324, Nature 429, 1986; Cech, 260 JAMA 3030, 1988; e Jefferies et al., 17 Nucleic Acids Research 1371, 1989) .
Devido à sua especificidade de sequência, as moléculas de ácidos nucleicos enzimáticos trans-clivadas mostram potencial como agentes terapêuticos para doenças humanas (Usman & McSwiggan, (1995) Ann. Rep. Med. Chem. 30, 285-294; Christoffersen e Marr, (1995) J. Med. Chem. 38, 2023-2037). Moléculas de ácidos nucleicos enzimáticos podem ser concebidas para clivar RNA alvos específicos dentro do antecedente do RNA celular. Tal evento de clivagem torna o mRNA não funcional e anula a expressão da proteína desse RNA. Deste modo, a síntese de uma proteína associada com um estado de doença pode ser seletivamente inibida.
De forma geral, os ácidos nucleicos enzimáticos com atividade de clivagem de RNA atuam ligando-se primeiro a um RNA alvo.
Tal ligação ocorre através da porção de ligação ao alvo dum ácido nucleico enzimático que é mantido em estreita proximidade com uma porção enzimática da molécula que atua para clivar o RNA alvo. Assim, o ácido nucleico enzimático primeiro reconhece e depois liga-se a um RNA alvo através do emparelhamento de bases complementar e, uma vez ligado ao sítio correto, atua enzimaticamente para cortar o RNA alvo. A clivagem estratégica de tal RNA alvo vai destruir a sua capacidade de dirigir a síntese de uma proteína codificada. Depois dum ácido nucleico enzimático ter ligado e cortado o seu RNA alvo, é libertado desse RNA para procurar outro alvo e pode ligar e cortar repetidamente novos alvos. Várias abordagens, como as estratégias de seleção (evolução) in vitro (Orgel, (1979) Proc. R. Soc. London, B 205, 435), têm sido utilizadas para desenvolver novos catalisadores de ácidos nucleicos capazes de catalisar uma variedade de reações, como a clivagem e ligação de ligações fosfodiéster e ligações amida, (Joyce, (1989) Gene, 82, 83-87; Beaudry et al., (1992) Science 257, 635-641; Joyce, (1992) Scientific American 267, 90-97; Breaker et al., (1994) TIBTECH 12, 268; Bartel et al. , (1993) Science 261: 1411- 1418; Szostak, (1993) TIBS 17, 89-93; Kumar et al. , (1995) FASEB. J., 9, 1183; Breaker, (1996) Curr. Op. Biotech., 7, 442). O desenvolvimento de ribozimas que são óptimas para a atividade catalítica iria contribuir de forma significativa para qualquer estratégia que use ribozimas de clivagem de RNA para o propósito de regular a expressão génica. A ribozima cabeça de martelo, por exemplo, funciona com uma taxa catalítica (kcat) de cerca de 1 min-1 na presença de concentrações de saturação (10 mM) de cofactor de Mg2 +. Mostrou-se que uma ribozima "RNA ligase" artificial catalisa a reação de auto-modificação correspondente com uma taxa de cerca de 100 min-1. Além disso, sabe-se que certas ribozimas cabeça de martelo modificadas que possuem braços de liqação ao substrato feitos de DNA catalisam a clivagem de RNA com várias taxas de turn-over que se aproximam de 100 min-1. Finalmente, a substituição dum resíduo específico dentro do núcleo catalítico da cabeça de martelo com certos nucleótidos análogos origina ribozimas modificadas que mostram, um aumento de 10 vezes na taxa catalítica. Estes resultados demonstram que as ribozimas podem promover transformações químicas com taxas catalíticas que são significativamente maiores do que as exibidas in vitro pela maioria das ribozimas naturais de auto-clivagem. É então possível que as estruturas de certas ribozimas de auto-clivagem possam ser optimizadas para originar uma atividade catalítica máxima, ou que motivos de RNA inteiramente novos, que exibem taxas significativamente mais rápidas para clivagem de RNA fosfodiéster, possam ser feitos. A clivagem intermolecular de um substrato de RNA por um catalisador de RNA que se encaixa no modelo de "cabeça de martelo" foi exibido pela primeira vez em 1987 (Uhlenbeck, O. C. (1987) Nature, 328: 596-600). O catalisador de RNA foi recuperado e feito reagir com múltiplas moléculas de RNA, demonstrando que foi realmente catalítico.
Os RNAs catalíticos concebidos com base no motivo "cabeça de martelo" têm sido usados para clivar sequências alvo específicas, fazendo alterações de bases apropriadas no RNA catalítico, para manter o emparelhamento de bases necessário com as sequências alvo (Haseloff e Gerlach, (1988) Nature, 334, 585; Talbot e Bruening, (1988) Nature, 334, 196; Uhlenbeck, O. C. (1987) Nature, 328: 596-600; Koizumi, M. et ai., (1988) FEBS Lett, 228: 228-230). Isto permitiu o uso de RNA catalítico para clivar sequências alvo específicas e indica que os RNAs catalíticos concebidos de acordo com o modelo "cabeça de martelo" podem, possivelmente, clivar RNAs substrato específicos in vivo. (ver Haseloff e Gerlach, (1988) Nature, 334, 585; Talbot e Bruening, (1988) Nature, 334, 196; Uhlenbeck, 0. C. (1987) Nature, 328: 596-600). A interferência de RNA (RNAi) tornou-se uma ferramenta poderosa para a modulação da expressão génica em mamíferos e células de mamíferos. Esta abordagem requer a entrega de RNA pequeno de interferência (siRNA), como RNA por si só ou como DNA, utilizando um plasmideo ou virus de expressão e a sequência codificante para o RNA pequeno em forma de gancho, que são processados em siRNAs. Este sistema permite o transporte eficiente dos pré-siRNAs para o citoplasma, onde são ativos e, permite a utilização de promotores regulados e específicos de tecidos da expressão do gene.
Num exemplo preferido, um composto oligonucleotídico ou anti-senso compreende um oligómero ou polímero de ácido ribonucleico (RNA) e/ou ácido desoxirribonucleico (DNA), ou um mimético, quimera, análogo ou homólogo do mesmo. Este termo inclui oligonucleotidos compostos por nucleótidos e açúcares que ocorrem naturalmente e ligações internucleósidos (espinha dorsal), assim como oligonucleotidos com porções de ocorrência não natural que funcionam de forma semelhante. Tais oligonucleotidos modificados ou substituídos são muitas vezes preferidos às formas nativas devido a propriedades desejáveis como, por exemplo, o aumento da captação celular, o aumento da afinidade para um ácido nucleico alvo e o aumento da estabilidade na presença de nucleases.
De acordo com a presente descrição, os oligonucleotidos ou "compostos anti-senso" incluem oligonucleotidos anti-senso (por exemplo, RNA, DNA, mimético, quimera, análogo ou homólogo dos mesmos), ribozimas, oligonucleótidos de sequência guia externa (EGS), compostos de siRNA, interferência de RNA de cadeia única ou dupla (RNAi) compostos como os compostos de siRNA, saRNA, aRNA, e outros compostos oligoméricos que hibridam com, pelo menos, uma porção do ácido nucleico alvo e modulam a sua função. Como tal, podem ser DNA, RNA, semelhantes a DNA, semelhantes a RNA ou misturas dos mesmos, ou podem ser miméticos de um ou mais destes. Estes compostos podem ser compostos oligoméricos de cadeia simples, de cadeia dupla, circulares ou em forma de gancho e podem conter elementos estruturais como protuberâncias, desfasamentos ou loops internos ou terminais. Os compostos anti-senso são rotineiramente preparados de forma linear, mas podem ser unidos ou, por outro lado, preparados para assumir uma forma circular e/ou ramificada. Os compostos anti-senso podem incluir constructos como, por exemplo, duas cadeias hibridadas para formar um composto total ou parcialmente formado por uma cadeia dupla ou uma cadeia única com suficiente auto complementaridade para permitir a hibridação e a formação de um composto total ou parcialmente formado por uma cadeia dupla. As duas cadeias podem ser ligadas internamente deixando livre os terminais 3' ou 5' ou podem ser ligadas para formar uma estrutura contínua em forma de gancho ou em loop. A estrutura em forma de gancho pode conter uma saliência tanto na extremidade 5' como na 3', produzindo uma extensão de cadeia simples. Os compostos de cadeia dupla, opcionalmente, podem incluir saliências nas extremidades. Outras modificações podem incluir grupos conjugados ligados a um dos terminais, posições de nucleótidos selecionados, posições de açúcar ou a uma das ligações internucleósidos. Alternativamente, as duas cadeias podem ser ligadas através duma porção ou grupo de ligação dum ácido não nucleico. Quando formado a partir duma cadeia única, o dsRNA pode assumir a forma duma molécula de tipo gancho auto-complementar que se dobra sobre si mesma para formar um dúplex. Assim, os dsRNAs podem ser total ou parcialmente formados por cadeia dupla. A modulação especifica da expressão génica pode ser conseguida por expressão estável de dsRNA em forma de gancho em linhas celulares transgénicas (Hammond et ai., (1991) Nat. Rev. Genet., 2, 110-119; Matzke et al., (2001) Curr. Opin. Genet. Dev., 11, 221-227; Sharp, (2001) Genes Dev., 15, 485-490). Quando formadas a partir de duas cadeias, ou uma cadeia simples que assume a forma duma molécula de tipo gancho auto-complementar dobrada sobre si mesma para formar um dúplex, as duas cadeias (ou regiões que formam dúplices duma cadeia única) são cadeias complementares de RNA que se emparelham em forma Watson-Crick.
Uma vez introduzidos num sistema, os compostos da descrição podem provocar a ação duma ou mais enzimas ou proteínas estruturais para efetuar a clivagem ou outra modificação do ácido nucleico alvo, ou podem funcionar através de mecanismos baseados em ocupação. Em geral, os ácidos nucleicos (incluindo oligonucleótidos) podem ser descritos como "semelhantes DNA" (ou seja, geralmente, com um ou mais açúcares 2'-desoxi e, geralmente, bases T em vez de U) ou "semelhantes a RNA" (ou seja, geralmente com um ou mais açúcares 2'-hidroxilo ou 2'-modificados e, geralmente, bases U em vez de T). As hélices de ácidos nucleicos podem adoptar mais do que um tipo de estrutura, mais comummente as formas A- e B-. Acredita-se que, em geral, os oligonucleótidos que têm a estrutura em forma -B são "semelhantes DNA" e aqueles que têm uma estrutura em forma -A são "semelhantes a RNA". Em alguns casos (quiméricos), um composto anti-senso pode conter regiões de forma -A e -B.
Os compostos anti-senso de acordo com esta invenção podem compreender uma porção anti-senso de cerca de 5 a cerca de 80 nucleótidos (isto é, de cerca de 5 a cerca de 80 nucleósidos ligados) de comprimento. Isto refere-se ao comprimento da cadeia ou porção anti-senso do composto anti-senso. Por outras palavras, um composto anti-senso de cadeia simples da invenção compreende de 5 a cerca de 80 nucleótidos, e um composto anti-senso de cadeia dupla da invenção (como um dsRNA, por exemplo) compreende uma cadeia ou porção senso e uma cadeia ou porção anti-senso de 5 a cerca de 80 nucleótidos de comprimento. Um perito na arte irá apreciar que este compreende porções anti-senso de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, ou 80 nucleótidos de comprimento, ou qualquer intervalo no meio.
Num exemplo, os compostos anti-senso da descrição têm porções anti-senso de 10 a 50 nucleótidos de comprimento. Um perito na arte irá apreciar que esta engloba oligonucleótidos com porções anti-senso de 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 nucleótidos de comprimento, ou qualquer intervalo nomeio. Em alguns casos, os oligonucleótidos são de 15 nucleótidos de comprimento.
Num exemplo, os compostos anti-senso ou oligonucleotideos da descrição têm porções anti-senso de 12 ou de 13 a 30 nucleótidos de comprimento. Um perito na arte irá apreciar que isto inclui compostos anti-senso com porções anti-senso de 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ou 30 nucleótidos de comprimento, ou qualquer intervalo no meio.
Noutro caso preferido, os compostos oligoméricos da presente invenção também incluem variantes nas quais uma base diferente está presente numa ou mais das posições de nucleótidos do composto. Por exemplo, se o primeiro nucleótido é uma adenosina, podem ser produzidas as variantes que contêm timidina, guanosina ou citidina nesta posição. Isto pode ser feito em qualquer das posições dos compostos anti-senso ou de dsRNA. Estes compostos são então testados usando os métodos aqui descritos para determinar a sua capacidade para inibir a expressão de um ácido nucleico alvo.
Em alguns casos, a homologia, identidade de sequência ou complementaridade, entre o composto anti-senso e o alvo é de cerca de 40% a cerca de 60%. Em alguns casos, a homologia, identidade de sequência ou complementaridade, é de cerca de 60% a cerca de 70%. Em alguns casos, a homologia, identidade de sequência ou complementaridade, é de cerca de 70% a cerca de 80%. Em alguns casos, a homologia, identidade de sequência ou complementaridade, é de cerca de 80% a cerca de 90%. Em alguns casos, a homologia, identidade de sequência ou complementaridade, é de cerca de 90%, cerca de 92%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou cerca de 100%.
Noutro caso preferido, os oligonucleótidos anti-senso, como por exemplo, as moléculas de ácidos nucleicos apresentadas nas SEQ ID n°s: 2 e 8 compreendem uma ou mais substituições ou modificações. Num exemplo, os nucleótidos são substituídos por ácidos nucleicos bloqueados (LNA).
Noutro caso preferido, os oligonucleótidos marcam uma ou mais regiões das moléculas de ácido nucleico senso e/ou anti- senso de sequências codificantes e/ou não-codificantes associadas à sequências de BDNF e às sequências apresentadas como SEQ ID n°s: 1 e 2. Os oligonucleótidos também são dirigidos às regiões de sobreposição SEQ ID n°s: 1, 2.
Alguns oligonucleótidos preferidos desta descrição são oligonucleótidos quiméricos. Os "oligonucleótidos quiméricos" ou "quimeras", no contexto da presente descrição, são oligonucleótidos que contêm duas ou mais regiões quimicamente distintas, cada uma composta de, pelo menos, um nucleótido. Estes oligonucleótidos, tipicamente, contêm pelo menos uma região de nucleótidos modificados que confere uma ou mais propriedades benéficas (como por exemplo, o aumento da resistência às nucleases, o aumento da captação nas células, o aumento da afinidade de ligação para o alvo) e uma região que é um substrato para enzimas capazes de clivar híbridos RNA:DNA ou RNA:RNA. A título de exemplo, a RNase H é uma endonuclease celular que cliva a cadeia de RNA duma cadeia dupla RNA:DNA. A ativação da RNase H resulta, como tal, na clivagem do alvo de RNA, aumentando substancialmente a eficiência de modulação anti-senso da expressão génica. Por conseguinte, os resultados comparáveis podem muitas vezes ser obtidos com oligonucleótidos mais curtos quando são utilizados oligonucleótidos quiméricos, em comparação com os desoxioligonucleótidos fosforotioato que hibridam com a mesma região alvo. A clivagem do RNA alvo pode ser rotineiramente detectada por electroforese em gel e, se necessário, técnicas de hibridação de ácidos nucleicos associados conhecidas na arte. Num exemplo preferido, um oligonucleótido quimérico compreende pelo menos uma região modificada para aumentar a afinidade de ligação ao alvo, e, geralmente, uma região que atua como um substrato para a RNAase Η. A afinidade de um oligonucleótido para o seu alvo (neste caso, um ácido nucleico que codifica ras) é rotineiramente determinada medindo a Tm de um par oligonucleótido/alvo, que é a temperatura à qual o oliqonucleótido e o alvo se dissociam; a dissociação é detectada espectrofotometricamente. Quanto maior a Tm, maior é a afinidade do oligonucleótido para o alvo.
Compostos químicos anti-senso da descrição podem ser formados como estruturas compostas de dois ou mais oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleótidos e/ou oligonucleótidos miméticos, como descrito acima. Tais compostos também têm sido referidos na arte como híbridos ou gapmers. Patentes representativas dos Estados Unidos, que ensinam a preparação de tais estruturas híbridas compreendem, mas não estão limitados às patentes dos Estados Unidos n°s 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,366,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356 e 5,700,922.
Noutro exemplo preferido, a região do oligonucleótido que é modificada compreende pelo menos um nucleótido modificado na posição 2' do açúcar, mais preferivelmente nucleótido modificado 2'-O-alquilo, 2'-O-alquil-O-alquilo ou 2'-fluoro. Noutros exemplos preferenciais, as modificações de RNA incluem modificações 2'-fluoro, 2'-amino e 2'-0-metilo na ribose de pirimidinas, resíduos abásicos ou duma base invertida na extremidade 3' do RNA. Tais modificações são rotineiramente incorporadas em oligonucleótidos e mostrou-se que estes oligonucleótidos têm uma Tm mais elevada (isto é, maior afinidade de ligação ao alvo) que; 2'-desoxioligonucleótidos contra um determinado alvo. O efeito de tal aumento da afinidade é o aumento considerável da inibição do oligonucleótido de RNAi da expressão génica. A RNAse H é uma endonuclease celular que cliva a cadeia de RNA dos dúplices RNA:DNA; a ativação desta enzima, por conseguinte, resulta na clivagem do RNA alvo, e, assim, pode aumentar consideravelmente a eficiência da inibição do RNAi. A clivagem do RNA alvo pode ser rotineiramente demonstrada por electroforese em gel. Noutro exemplo preferido, o oligonucleótido quimérico também é modificado para aumentar a resistência à nuclease. As células contêm uma variedade de exo e endonucleases que podem degradar ácidos nucleicos. Mostrou-se que um certo número de modificações de nucleótidos e nucleósidos tornam o oligonucleótido no qual são incorporados mais resistentes à digestão por nucleases que o oligodesoxinucleótido nativo. A resistência às nucleases é normalmente medida por incubação de oligonucleótidos com extractos celulares ou soluções de nucleases isoladas e pela medição da extensão do oligonucleótido intacto que permanece ao longo do tempo, geralmente por electroforese em gel. Os oligonucleótidos que tenham sido modificados para melhorar a sua resistência às nucleases sobrevivem intactos durante mais tempo do que oligonucleótidos não modificados. Demonstrou-se que uma variedade de modificações dos oligonucleótidos melhora ou confere resistência às nucleases. Os oligonucleótidos que contêm pelo menos uma modificação fosforotioato são, presentemente, preferidos. Em alguns casos, as modificações dos oligonucleótidos que aumentam a afinidade de ligação ao alvo também são, de forma independente, capazes de aumentar a resistência às nucleases. Algumas modificações desejáveis podem ser encontradas em De Mesmaeker et ai., (1995) Acc. Chem. Res., 28: 366-374.
Exemplos específicos de alguns oligonucleótidos preferidos previstos para esta invenção incluem os que compreendem cadeias principais modificadas, por exemplo, fosforotioatos, fosfotriésteres, fosfonatos de metilo, ligações entre açúcares de alquilos de cadeia curta ou de cicloalquilos ou ligações entre açúcares heteroatómicas de cadeia curta ou heterocíclicas. Os preferidos são os oligonucleótidos com cadeias principais de fosforotioato e os com cadeias principais com heteroátomos, particularmente as cadeias principais CH2-NH-0-CH2, CH, - N(CH3)-0-CH2 [conhecido como um metileno (metilimino) ou cadeia principal de MMI], CH2-0-N(CH3)-CH2, CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-0 e -N(CH3)-CH2-CH2, em que o cadeia principal nativa de fosfodiéster está representada como O-P-O-CH). As cadeias principais de amida descritas por De Mesmaeker et al. , (1995) Acc. Chem. Res. 28: 366-374, também são preferidas. Também são preferidos os oligonucleótidos com estruturas de cadeias principais de morfolino (Summerton e Weller, Patente dos Estados Unidos n° 5034506) . Noutros exemplos preferenciais, como no caso da cadeia principal de ácido nucleico peptídico (PNA), a cadeia principal fosfodiéster do oligonucleótido é substituída por uma cadeia principal de poliamida, sendo os nucleótidos ligados, direta ou indiretamente, aos átomos aza de azoto da cadeia principal de poliamida (Nielsen et al. (1991) Science 254, 1497). Os oligonucleótidos também podem compreender uma ou mais porções de açúcar substituídas. Os oligonucleótidos preferidos compreendem um dos seguintes na posição 2': OH, SH, SCH3, F, OCN, OCH3 OCH3, OCH3 0(CH2)n CH3, 0(CH2)n NH2 ou 0(CH2)n CH3 em que n é de 1 a cerca de 10; Cl a CIO alquilo inferior, alcoxialcoxi, alquilo inferior substituído, alcarilo ou aralquilo; Cl; Br; CN; CF3; 0CF3; O-, S-, ou N-alquilo; O-, S- ou N-alcenilo; SOCH3; S02 CH3; 0N02; N02; N3; NH2; heterocicloalquilo; eterocicloalcarilo; aminoalquilamino; polialquilamino; silil substituído; um grupo de clivagem de RNA; um grupo repórter; um intercalador; um grupo para melhorar as propriedades farmacocinéticas de um oligonucleótido; ou um grupo para melhorar as propriedades farmacodinâmicas de um oligonucleótido e outros substituintes com propriedades semelhantes. Uma modificação preferida inclui 2'- metoxietoxi [2'-0-CH2 CH2 0CH3, também conhecido como 2'-0- (2-metoxietilo)] (Martin et ai., (1995) Helv. Chim. Acta, 78, 486). Outras modificações preferidas incluem 2'-metoxi (2'-0-CH3), 2'-propoxi (2'-OCH2 CH2CH3) e 2'-fluoro (2'-F). Também podem ser feitas modificações semelhantes noutras posições do oligonucleótido, em particular na posição do 3' do açúcar no terminal 3' do nucleótido e a posição de 5' do terminal 5' do nucleótido. Os oligonucleótidos também podem ter miméticos de açúcar tais como ciclobutilos em vez do grupo pentofuranosilo.
Os oligonucleótidos também podem incluir, adicionalmente ou alternativamente, modificações ou substituições de nucleobases (muitas vezes referidas na arte simplesmente como "base"). Tal como aqui utilizado, os nucleótidos "não modificados" ou "naturais" incluem a adenina (A), a guanina (G) , a timina (T) , a citosina (C) e o uracilo (U) . Os nucleótidos modificados incluem nucleótidos encontrados com pouca frequência ou de forma transitória em ácidos nucleicos naturais, por exemplo, hipoxantina, 6-metiladenina, pirimidinas 5-Me, especialmente 5-metilcitosina (também referida como 5-metil-2' desoxicitosina e muitas vezes referida na arte como 5-Me-C), 5-hidroximetilcitosina (HMC), glicosilo HMC e gentobiosil HMC, bem como nucleótidos sintéticos, por exemplo, 2-aminoadenina, 2-(metilamino)adenina, 2- (imidazolilalquilo)adenina, 2-(aminoalquilamino)adenina ou outros alquiladeninas hetero substituídas, 2-tiouracilo, 2-tiotimina, 5- bromouracilo, 5-hidroximetiluracilo, 8-azaguanina, 7-desazaguanina, N6 (6-amino-hexil)adenina e 2,6-diaminopurina. (Kornberg, A., DNA Replication, WH Freeman & Co., San Francisco, 1980, pp75-77; Gebeyehu, G., (1987) et ai., Nucl. Acids Res. 15: 4513). Pode ser incluída uma base "universal" conhecida na arte, como por exemplo, a inosina. As substituições de 5-Me-C têm mostrado aumentar a estabilidade do dúplex de ácido nucleico em 0.6-1.2°C. (Sanghvi, Y. S., in Crooke, S. T. e Lebleu, B., eds., Antisense Research and Applications, CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) e são, presentemente, as substituições de bases preferidas.
Outra modificação dos oligonucleótidos da presente descrição envolve ligar guimicamente ao oligonucleótido uma ou mais porções ou conjugados gue aumentam a atividade ou a absorção celular do oligonucleótido. Tais porções incluem, mas não estão limitadas a radicais lipídicos, tais como uma fração de colesterol, uma fração de colesteril (Letsinger et ai., (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. EUA 86, 6553), ácido eólico (Manoharan et ai., (1994) Bioorg. Med. Chem. Let. 4, 1053), um tioéter, por exemplo, hexil-S-tritilotiol (Manoharan et ai., (1992) Ann. N. Y. Acad. Sei. 660, 306; Manoharan et ai., (1993) Bioorg. Med. Chem. Let. 3, 2765), um tiocolesterol (Oberhauser et ai., (1992) Nucl. Acids Res. 20, 533), uma cadeia alifática, por exemplo, resíduos de dodecandiol ou undecilo (Saison-Behmoaras et ai., EMBO J. 1991, 10, 111; Kabanov et ai., (1990) FEBS Lett. 259, 327; Svinarchuk et al. , (1993) Biochimie 75, 49), um fosfolípido, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou trietilamónio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan et al. , (1995) Tetrahedron Lett. 36, 3651; Shea et al., (1990) Nucl. Acids Res. 18, 3777), uma poliamina ou uma cadeia de polietilenoglicol (Manoharan et al., (1995) Nucleosides & Nucleotides, 14, 969), ou ácido acético adamantano (Manoharan et al. , (1995) Tetrahedron Lett. 36, 3651) . Os oligonucleótidos que compreendem porções lipofílicas e os métodos para a preparação de tais oligonucleótidos são conhecidos na arte, por exemplo, nas Patentes dos Estados Unidos n°s 5,138,045, 5,218,105 e 5,459,255. Não é necessário que todas as posições de um dado oligonucleótido sejam uniformemente modificadas e, de facto, mais do que uma das modificações acima mencionadas podem ser incorporados num único oligonucleótido, ou mesmo num único nucleósido dentro dum oligonucleótido. A presente descrição também inclui oligonucleótidos que são oligonucleótidos quiméricos, como definido acima.
Noutro exemplo, a molécula de ácido nucleico da presente invenção é conjugada com outra porção, incluindo, mas não estando limitada aos nucleótidos abásicos, poliéter, poliamina, poliamidas, péptidos, hidratos de carbono, lipidos, ou compostos de poli-hidrocarbonetos. Os peritos na arte reconhecerão que estas moléculas podem ser ligadas a um ou mais nucleótidos compreendendo a molécula de ácido nucleico em várias posições do açúcar, da base ou do grupo fosfato.
Os oligonucleótidos utilizados de acordo com esta descrição podem ser conveniente e rotineiramente criados através da bem conhecida técnica de síntese em fase sólida. 0 equipamento para tal síntese é vendido por vários fabricantes, incluindo a Applied Biosystems. Também podem ser utilizados quaisquer outros meios para tal síntese; a síntese dos oligonucleótidos faz parte das competências dum perito na arte. É também bem conhecida a utilização de técnicas semelhantes para preparar outros oligonucleótidos como o fosforotioato e derivados alquilados. É também bem conhecida a utilização de técnicas semelhantes e produtos de amiditos modificados e vidro de porosidade controlada (CPG) comercialmente disponíveis como a biotina, fluoresceína, acridina ou amiditos modificados com psoraleno e/ou CPG (disponível em Glen Research, Sterling VA) para sintetizar oligonucleótidos marcados de forma fluorescente, biotinilados ou outros oligonucleótidos modificados, como os oligonucleótidos modificados com colesterol.
De acordo com a descrição, a utilização de modificações, como a utilização de monómeros de LNA para aumentar a potência, a especificidade e a duração da ação e para alargar as vias de administração de oligonucleótidos compostos por produtos químicos como MOE, ANA, FANA, PS, etc., (Uhlmann, et al., (2000) Current Opinios in Drug Discovery & Development Vol.3 No2). Isto pode ser conseguido através da substituição de alguns dos monómeros nos oligonucleótidos atuais por monómeros de LNA. Os oligonucleótidos modificados por LNA podem ter um tamanho semelhante ao do composto original ou podem ser maior ou, de preferência, menor. Prefere-se que estes oligonucleótidos modificados com LNA contenham menos do que cerca de 70%, mais preferencialmente menos do que cerca de 60%, mais preferencialmente menos do que 50% de monómeros de LNA e que os seus tamanhos estejam entre cerca de 5 e 25 nucleótidos, mais preferencialmente entre cerca de 12 e 20 nucleótidos.
As cadeias principais preferidas de oligonucleótidos modificados incluem, mas não estão limitadas a fosforotioatos, fosforotioatos quirais, fosforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquifosfotriésteres, fosfonatos de metilo e alquilo compreendendo 3'alquileno fosfonatos e fosfonatos quirais, fosfinatos, fosforamidatos incluindo 3'-amino fosforamidato e aminoalquilofosforamidatos, tionofosforamidatos, tionoalquilfosfonatos, tionoalquilfosfotriésteres e boranofosfatos com ligações 3'-5', análogos ligados 2'-5' dos mesmos, e os com polaridade invertida, em que os pares adjacentes de unidades de nucleósidos estão ligados de 3'-5' para 5'-3' ou de 2'-5' para 5'-2' Também são incluídos vários sais, sais mistos e formas de ácidos livres.
Patentes representativas dos Estados Unidos que ensinam a preparação dos fósforos que contêm ligações acima descritos, compreendem mas não estão limitadas às Patentes dos Estados Unidos n°s 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5, 177,196; 5,188,897; 5,264,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361 e 5,625, 050 .
As cadeias principais preferidas dos oligonucleótido modificados que não incluem um átomo de fósforo têm cadeias principais formadas por ligações alquilo de cadeia curta ou cicloalquilo, ligações internucleósidos heteroatómicas mistas e alquilo ou cicloalquilo ou uma ou mais ligações internucleósidos heteroatómicas de cadeia curta ou heterocíclicas. Estes compreendem os que possuem ligações morfolino (formadas em parte, a partir da porção de açúcar de um nucleósido); cadeias principais de siloxano; cadeias principais de sulfureto, sulfóxido e sulfona; cadeias principais de formacetilo e tioformacetilo; cadeias principais de formacetilo e tioformacetilo de metileno; cadeias principais contendo alqueno; cadeias principais de sulfamato; cadeias principais de metileneimina e metilenohidrazina; cadeias principais de sulfonato e sulfonamida; cadeias principais de amida; e outras com partes de componentes misturados de N, O, S e CH2.
Patentes representativas dos Estados Unidos que ensinam a preparação dos oligonucleótidos acima compreendem, mas não estão limitadas às patentes dos Estados Unidos n°s 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264, 562; 5, 264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596, 086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623, 070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437 e 5,677,439.
Noutros oligonucleótidos miméticos preferenciais, tanto o açúcar como a ligação internucleótidos, ou seja, a cadeia principal, das unidades de nucleótidos são substituídos por novos grupos. As unidades de base são mantidas para a hibridação com um composto alvo adequado de ácidos nucleicos. Um composto oligomérico, um oligonucleótido mimético com excelentes propriedades de hibridação, é conhecido como um ácido nucleico peptídico (PNA). Em compostos PNA, a cadeia principal de açúcar dum oligonucleótido é substituída por uma cadeia principal contendo amida, em particular uma cadeia principal aminoetilglicina. As nucleobases são retidas e são ligados direta ou indiretamente, a átomos aza de azoto da porção amida da cadeia principal. Patentes representativas dos Estados Unidos que ensinam a preparação de compostos PNA incluem, mas não estão limitadas às patentes dos Estados Unidos n°s 5,539,082; 5,714,331 e 5,719,262. Podem ser encontrados ensinamentos adicionais sobre compostos PNA em Nielsen et al., (1991) Science 254, 1497-1500.
Noutro caso preferido da descrição os oligonucleótidos com cadeias principais de fosforotioato e oligonucleósidos com cadeias principais de heteroátomos, e em particular -CH2-NH-0-CH2-, -CH2-N (CH3)-0-CH2 conhecido como uma cadeia principal de metileno (metilimino) ou MMI, - CH2-0-N (CH3)-CH2-, -CH2N(CH3)-N(CH3) CH2-e-0-N(CH3)-CH2- CH2- em que a cadeia principal nativa de fosfodiéster é representada por -0=P-0-CH2 da patente dos Estados Unidos n° 5,489,677acima referenciada e as cadeias principais de amida da patente dos
Estados Unidos n° 5,602,240 acima referenciada. Também são preferidos os oligonucleótidos possuindo estruturas de cadeia principal de morfolino da patente dos Estados uNidos n° 5,034,506 acima referenciada.
Os oligonucleótidos modificados também podem conter uma ou mais porções de açúcar substituídos. Os oligonucleótidos preferidos compreendem um dos seguintes na posição 2': OH; F; O-, S- ou N-alguilo; O-, S- ou N-alcenilo; O-, S- ou N-alcinilo; ou O-alquil-O-alquilo, em que o alquilo, alcenilo e alcinilo podem ser substituídos ou não substituídos em C por alquilo CO ou C2 por alcenilo e alcinilo CO. São particularmente preferidos 0(CH2)n OmCH3, O (CH2)n, OCH3, O (CH2)nNH2., 0(CH2)nCH3, 0(CH2)n0NH2 e O(CH2nON(CH2)nCH3)2 em que nem pode ser de 1 a cerca de 10. Outros oligonucleótidos preferidos compreendem um dos seguintes na posição 2': C para CO, (alquilo inferior, alquilo inferior substituído, alcarilo, aralquilo, O-alcarilo ou O-aralquilo, SH, SCH3, OCN, Cl, Br, CN, CF3, OCF3, SOCH3, S02CH3, 0N02, N02, N3, NH2, heterocicloalquilo, heterocicloalcarilo, aminoalquilamino, polialquilamino, silil substituo, um grupo de clivagem de RNA, um grupo repórter, um intercalador, um grupo para melhorar as propriedades farmacocinéticas dum oligonucleótido, ou um grupo para melhorar as propriedades farmacodinâmicas dum oligonucleido e outros substituintes com propriedades semelhantes. Uma modificação preferida compreende 2'-metoxietoxi (2 '-0-CH2CH20CH3, também conhecido como 2'-O- (2- metoxietilo) ou 2'-MOE) (Martin et ai., (1995) Helv. Chim. Acta, 78, 486-504), isto é, um grupo alcoxialcoxi. Uma outra modificação preferida compreende 2'dimetilaminooxietoxi, isto é, um grupo O(CH2)20N(CH3)2, também conhecido como 2'-DMAOE, tal como descrito nos exemplos abaixo, e 2'-dimetilaminoetoxietoxi (também conhecido na arte como 2'-O-dimetilaminoetoxietilo ou 2'-DMAEOE), ou seja, 2'-0-CH2-0-CH2-N(CH2)2.
Outras modificações preferidas compreendem 2'-metoxi (2'-0-CH3), 2'-aminopropoxi (2'-0 CH2CH2CH2NH2) e 2'-fluoro (2'-F). Também podem ser feitas modificações semelhantes noutras posições do oligonucleótido, em particular na posição 3' do açúcar do terminal 3' do nucleótido ou nos oligonucleótidos ligados 2'-5' e na posição 5' do terminal 5' do nucleótido. Os oligonucleótidos também podem ter miméticos de açúcar como as porções ciclobutilo em lugar do açúcar pentofuranosilo. As patentes representativas dos Estados Unidos gue ensinam a preparação de tais estruturas de açúcar modificadas compreendem, mas não estão limitados às patentes dos Estados Unidos n°s 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514, 785; 5,519,134; 5,567,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646, 265; 5,658,873; 5,670,633 e 5,700,920.
Os oligonucleótidos também podem incluir modificações ou substituições de nucleobases (normalmente referidas na arte apenas como "base"). Tal como agui utilizado, os nucleótidos "não modificados" ou "naturais" compreendem as bases purinas adenina (A) e guanina (G) e as bases pirimidinas timina (T), citosina (C) e uracilo (U). Os nucleótidos modificados incluem nucleótidos naturais e sintéticos como o 5-metilcitosina (5-Me-C), 5-hidroximetilcitosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metil e outros derivados alguilo da adenina e da guanina, 2-propil e outros derivados alguilo da adenina e da guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina e 2-tiocitosina, 5-halouracilo e citosina, 5-propinilo uracilo e citosina, 6-azo-uracilo, citosina e timina, 5-uracilo (pseudo-uracilo), 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8- tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo e outras adeninas e guaninas 8-substituidas, 5-halo, particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo e outros uracilos e citosinas 5-substituldos, 7-metilguanina e 7-metiladenina, 8-azaguanina e 8-aza-adenina, 7-deazaguanina e 7-deazaadenosina e 3-deazaguanina e 3-deaza-adenina.
Além disso, os nucleótidos compreendem os descritos na Patente dos Estados Unidos n° . 3,687, 808, os descritos em "The Concise Encyclopedia of Polymer Science and Engineering", páginas 858-859, Kroschwitz, J.I., ed. John Wiley & Sons, 1990, as descritas por Englisch et al., "Angewandle Chemie, International Edition", 1991, 30, página 613, e as descritas por Sanghvi, Y. S., Capítulo 15, "Antisense Research and Applications", páginas 289-302, Crooke, S. T. e Lebleu, B. ea., CRC Press, 1993. Alguns destes nucleótidos são particularmente úteis para aumentar a afinidade de ligação dos compostos oligoméricos da presente descrição. Estes incluem as pirimidinas 5-substituídas, 6-azapirimidinas e as purinas N-2, N-6 e 0-6 substituídas, compreendendo a 2-aminopropiloadenina, 5- propiniluracilo e 5-propinilcitosina. As substituições 5-metilcitosina demonstraram aumentar a estabilidade do dúplex de ácido nucleico em 0.6-1.2°C (Sanghvi, Y. S., Crooke, S. T. e Lebleu, B., eds, "Antisense Research and Applications", CRC Press, Boca Raton, 1993, pp. 276-278) e são presentemente as substituições de bases preferidas, ainda mais particularmente quando combinadas com as modificações do açúcar 2'-Ometoxietil.
As patentes representativas dos Estados Unidos que ensinam a preparação dos nucleótidos modificados mencionados acima, bem como outros nucleótidos modificados incluem, mas não estão limitados às patentes dos Estados Unidos n°s 3,687,808 assim como 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175, 273; 5, 367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,596,091; 5,614,617; 5,750,692 e 5,681,941.
Outra modificação dos oligonucleótidos da presente descrição envolve a ligação química ao oligonucleótido de uma ou mais porções ou conjugados, que aumentem a atividade, a distribuição celular, ou a absorção celular do oligonucleótido.
Tais porções compreendem, mas não estão limitadas a, radicais lipidicos como uma fração de colesterol (Letsinger et al. , (1989) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 86, 6553-6556), ácido eólico (Manoharan et al., (1994) Bioorg. Med. Chem. Let., 4, 1053-1060), um tioéter, por exemplo, hexil-S-tritilotiol (Manoharan et al. , (1992) Ann. N. Y. Acad. Sei., 660, 306-309; Manoharan et al. , (1993) Bioorg. Med. Chem. Let., 3, 2765-2770), um tiocolesterol (Oberhauser et al., (1992). Nucl. Acids Res., 20, 533-538), uma cadeia alifática, por exemplo, resíduos de dodecandiol ou undecilo (Kabanov et al., (1990). FEBS Lett, 259, 327-330; Svinarchuk et al., (1993) Biochimie 75, 49-54), um fosfolipido, por exemplo, di-hexadecil-rac-glicerol ou trietilamónio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan et al. , (1995) Tetrahedron Lett., 36, 3651-3654; Shea et al., (1990) Nucl. Acids Res., 18, 3777-3783), uma poliamina ou uma cadeia de polietileno glicol (Manoharan et al., (1995) Nucleosides & Nucleotides, 14, 969-973), ou acético ácido adamantano (Manoharan et al., (1995) Tetrahedron Lett., 36, 3651-3654), uma porção de palmitilo (Mishra et al., (1995) Biochim. Biophys. Acta, 1264, 229-237), ou uma porção de octadecilamina ou hexilamino-carbonil-oxicolesterol (Crooke et al. , (1996) J. Pharmacol. Exp. Ther., 277, 923-937).
As patentes representativas dos Estados Unidos que ensinam a preparação de tais conjugados de oligonucleótidos incluem, mas não estão limitados às patentes dos Estados Unidos n°s 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552, 538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486, 603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605, 735; 4,667, 025; 4, 762, 779; 4, 789, 737; 4, 824, 941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082, 830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5, 245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391, 723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5, 565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599, 928 e 5,688,941.
Descoberta de fármacos: Os compostos da presente descrição também podem ser aplicados nas áreas de descoberta de fármacos e validação de alvos. A presente descrição compreende a utilização dos compostos e dos segmentos alvo preferidos aqui identificados nos esforços da descoberta de medicamentos para elucidar as relações que existem entre os polinucleótidos do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) e o estado, condição, ou fenótipo duma doença. Estes métodos incluem a detecção ou modulação dos polinucleótidos do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF), compreendendo o contacto duma amostra, tecido, célula ou organismo com os compostos da presente invenção, a medição do nivel de ácido nucleico ou de proteína dos polinucleótidos do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) e/ou desfecho fenotipico ou químico relacionado em algum momento após o tratamento, e, opcionalmente, a comparação do valor medido para uma amostra não tratada ou amostra tratada com um composto adicional da divulgação. Estes métodos também podem ser realizados em paralelo ou em combinação com outras experiências para determinar a função de genes desconhecidos, para o processo de validação de alvos ou para determinar a validade de um produto específico dum gene, como um alvo para o tratamento ou prevenção de uma determinada doença, condição, ou fenótipo.
Avaliação da regulação positiva ou inibição da expressão génica: A transferência de um ácido nucleico exógeno para uma célula ou organismo hospedeiro pode ser avaliada através da detecção direta da presença do ácido nucleico na célula ou organismo. Tal detecção pode ser conseguida por vários métodos bem conhecidos na arte. Por exemplo, a presença do ácido nucleico exógeno pode ser detectada por Southern blot ou por uma técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando primers que amplificam especificamente sequências de nucleótidos associados com o ácido nucleico. A expressão dos ácidos nucleicos exógenos também pode ser medida utilizando métodos convencionais, incluindo a análise da expressão génica. Por exemplo, o mRNA produzido a partir de um ácido nucleico exógeno pode ser detectado e quantificado utilizando um Northern blot e um PCR de transcrição reversa (RT-PCR).
Expressão de RNA do ácido nucleico exógeno, também pode ser detectada por medição da atividade enzimática ou da atividade da proteína repórter. Por exemplo, atividade moduladora anti-senso pode ser medida indiretamente como uma diminuição ou aumento da expressão do ácido nucleico alvo, como indicação de que o ácido nucleico exógeno está a produzir o RNA efector. Com base na conservação da sequência, os primers podem ser concebidos e utilizados para amplificar as regiões codificantes dos genes alvo. Inicialmente, a região codificante mais expressa de cada gene pode ser utilizada para construir um modelo de gene controlo, apesar de qualquer região codificante ou não codificante poder ser utilizada. Cada gene controlo é montado pela inserção de cada região codificante entre uma região codificante repórter e o seu sinal poli(A). Estes plasmídeos iriam produzir um mRNA com um gene repórter na porção a montante do gene e um potencial alvo RNAi na região não codificante 3'. A eficácia dos oligonucleótidos anti-senso individuais seria ensaiada por modulação do gene repórter. Os genes repórter úteis nos métodos da presente invenção incluem acetohidroxiácido sintase (AHAS), fosfatase alcalina (AP), beta-galactosidase (LacZ), beta-glucoronidase (GUS), cloranfenicol acetiltransferase (CAT), proteína fluorescente verde (GFP), proteína vermelho fluorescente (RFP), proteína fluorescente amarela (YFP), proteína fluorescente ciano (PCP), peroxidase de rábano (HRP), luciferase (Luc), nopalina-sintetase (NOS), octopina-sintetase (OCS) e derivados dos mesmos. Estão disponíveis vários marcadores selecionáveis que conferem resistência à ampicilina, bleomicina, cloranfenicol, gentamicina, higromicina, canamicina, lincomicina, metotrexato, fosfinotricina, puromicina e tetraciclina. Os métodos para determinar a modulação de um gene repórter são bem conhecidos na arte, e incluem, mas não estão limitados a métodos fluorométricos (por exemplo, espectroscopia de fluorescência, separação de células ativadas por fluorescência (FACS), microscopia de fluorescência) e determinação da resistência aos antibióticos. A expressão da proteína BDNF e do mRNA pode ser testada usando métodos conhecidos pelos peritos na arte e aqui descritos. Por exemplo, imunoensaios como o ELISA podem ser utilizados para medir os níveis de proteína. Kits ELISA de BDNF estão comercialmente disponíveis, por exemplo, na R&D Systems (Minneapolis, MN).
Em alguns casos, a expressão do BDNF (por exemplo, mRNA ou proteína) numa amostra (por exemplo, células ou tecidos in vivo ou in vitro) tratada utilizando um oligonucleótido anti-senso da descrição é avaliada por comparação com a expressão de BDNF numa amostra controlo. Por exemplo, a expressão da proteína ou do ácido nucleico pode ser comparada, utilizando métodos conhecidos pelos peritos na arte, com a duma amostra falsamente tratada ou não tratada. Em alternativa, a comparação com uma amostra tratada com um oligonucleótido anti-senso controlo (por exemplo, um com uma sequência alterada ou diferente) pode ser feita dependendo da informação desejada. Num outro exemplo, uma diferença na expressão da proteína ou do ácido nucleico do BDNF numa amostra tratada versus numa amostra não tratada, pode ser comparada com a diferença na expressão dum ácido nucleico diferente (incluindo qualquer padrão que seja considerado adequado pelo investigador, por exemplo, um gene constitutivo) numa amostra tratada versus numa amostra não tratada.
As diferenças observadas podem ser expressas como desejado, por exemplo, sob a forma duma proporção ou fracção, para serem utilizadas em comparação com um controlo. Em alguns casos, o nível de mRNA ou proteína do BDNF, numa amostra tratada com um oligonucleótido anti-senso da presente descrição, é aumentado ou diminuído de cerca de 1.25 vezes a cerca de 10 vezes ou mais, relativamente a uma amostra não tratada ou a uma amostra tratada com um ácido nucleico controlo. Em alguns casos, o nível de mRNA ou de proteína do BDNF é aumentado ou diminuído, pelo menos, cerca de 1.25 vezes, pelo menos cerca de 1.3 vezes, pelo menos cerca de 1.4 vezes, pelo menos cerca de 1.5 vezes, pelo menos cerca de 1.6 vezes, pelo menos cerca de 1.7 vezes, pelo menos cerca de 1.8 vezes, pelo menos cerca de 2 vezes, pelo menos cerca de 2.5 vezes, pelo menos cerca de 3 vezes, pelo menos cerca de 3.5 vezes, pelo menos cerca de 4 vezes, pelo menos cerca de 4.5 vezes, pelo menos cerca de 5 vezes, pelo menos cerca de 5.5 vezes, pelo menos cerca de 6 vezes, pelo menos cerca de 6.5 vezes, pelo menos cerca de 7 vezes, pelo menos cerca de 7.5 vezes, pelo menos cerca de 8 vezes, pelo menos cerca de 8.5 vezes, pelo menos cerca de 9 vezes, pelo menos cerca de 9.5 vezes ou pelo menos cerca de 10 vezes ou mais.
Kits, Reagentes de Pesquisa, Diagnósticos e Terapêuticas
Os compostos da presente descrição podem ser utilizados para diagnóstico, profilaxia e terapêutica, e como reagentes de investigação e componentes dos kits. Além disso, os oligonucleótidos anti-senso, que são capazes de inibir a expressão génica com excelente especificidade, são muitas vezes utilizados pelos peritos para elucidar a função de genes específicos ou para distinguir entre as funções de vários membros de uma via biológica.
Para utilização em kits e diagnósticos e em vários sistemas biológicos, os compostos da presente descrição são úteis, quer isoladamente quer em combinação com outros compostos ou terapêuticas, como ferramentas de análise diferencial e/ou combinatória para elucidar padrões de expressão duma parte ou dum complemento inteiro dos genes expressos dentro de células e tecidos.
Tal como aqui utilizado, o termo "sistema biológico" ou "sistema" é definido como qualquer organismo, célula, cultura de células ou tecido que expressa, ou é tornado competente para expressar os produtos dos genes do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF). Estes incluem, mas não estão limitados a, seres humanos, animais transgénicos, células, culturas de células, tecidos, xenoenxertos, transplantes e combinações dos mesmos.
Como exemplo não limitativo, os padrões de expressão dentro de células ou tecidos tratados com um ou mais compostos anti-senso são comparados com células ou tecidos controlo não tratados com os compostos anti-senso e os padrões produzidos são analisados para níveis diferenciais de expressão génica dependendo se dizem respeito a, por exemplo, associação de doenças, via de sinalização, localização celular, nivel de expressão, dimensão, estrutura ou função dos genes analisados. Estas análises podem ser realizadas em células estimuladas ou não estimuladas e na presença ou ausência de outros compostos que afectam os padrões de expressão.
Exemplos de métodos de análise da expressão génica conhecidos na arte incluem arranjos ou microarranjos de DNA (Brazma e Vilo, (2000) FEBS Lett., 480, 17-24; Celis, et ai., (2000) FEBS Lett., 480, 2 -16), SAGE (análise em série da expressão do gene) (Madden, et ai., (2000) Drugs Discov. Today, 5, 415- 425), READS (amplificação com enzimas de restrição de cDNAs digeridos) (Prashar e Weissman, (1999) Methods Enzymol., 303, 258-72), TOGA (análise da expressão génica total) (Sutcliffe, et ai., (2000) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A, 97, 1976-1981), matrizes proteicas e proteómicas (Celis et ai., (2000) FEBS Lett., 480, 2-16; Jungblut, et ai., Electrophoresis, 1999, 20, 2100-10), sequenciação por marcador de sequência expressa (EST) (Celis et ai., FEBS Lett., 2000, 480, 2-16; Larsson, et ai., J. Biotechnol., 2000, 80, 143-57), fingerprinting subtrativa de RNA (SuRF) (Fuchs, et ai., (2000) Anal. Biochem. 286, 91-98; Larson, et ai., (2000) Cytometry 41, 203-208), clonagem subtrativa, exibição diferencial (DD) (Jurecic e Belmont, (2000) Curr. Opin. Microbiol. 3, 316-21), hibridação genómica comparativa (Carulli, et ai., (1998) J. Cell Biochem. Suppl., 31, 286-96), técnicas FISH (hibridação fluorescente in situ) (Goning e Gusterson, (1999) Eur. J. Cancer, 35, 1895-904) e métodos de espectrometria de massa (To, Comb. (2000) Chem. High Throughput Screen, 3, 235-41).
Os compostos da presente descrição são úteis para a investigação e diagnóstico, uma vez gue estes compostos hibridam com ácidos nucleicos gue codificam o factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF). Por exemplo, os oligonucleótidos gue hibridam com tanta eficiência e sob as condições agui descritas, de forma a serem moduladores eficazes do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF), são primers ou sondas eficazes sob condições que favorecem a amplificação ou a detecção de genes, respectivamente. Estes primers e sondas são úteis em métodos que requerem a detecção especifica de moléculas de ácidos nucleicos que codificam o factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) e na amplificação das referidas moléculas de ácidos nucleicos para a detecção ou para a utilização em estudos posteriores sobre o factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF). A hibridação dos oligonucleótidos anti-senso da descrição, em particular dos primers e sondas, com um ácido nucleico que codifica o factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF), pode ser detectada por meios conhecidos na arte. Tais meios podem incluir a conjugação duma enzima ao oligonucleótido, a marcação radioativa do oligonucleótido, ou qualquer outro meio de detecção adequado. Também podem ser preparados os Kits que utilizam tais meios de detecção para detectar o nivel do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) numa amostra. A especificidade e a sensibilidade dos anti-senso também é aproveitada pelos peritos na arte para fins terapêuticos. Os compostos anti-senso têm sido utilizados como porções terapêuticas no tratamento de estados de doença em animais, incluindo seres humanos. Os fármacos de oligonucleótidos anti-sentso têm sido segura e eficazmente administrados a humanos e estão presentemente em curso numerosos ensaios clínicos. Estabelece-se assim que os compostos anti-senso podem ser modalidades terapêuticas úteis que podem ser configuradas para serem úteis em protocolos de tratamento para o tratamento de células, tecidos e animais, especialmente em seres humanos.
Para terapêutica, um animal, preferencialmente um ser humano, suspeito de ter uma doença ou um distúrbio que pode ser tratado pela modulação da expressão dos polinucleótidos do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) é tratado por administração de compostos anti-senso, em conformidade com esta descrição. Por exemplo, num exemplo não limitante, os métodos compreendem a etapa de administração, ao animal com necessidade de tratamento, duma quantidade terapeuticamente eficaz do modulador do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF). Os moduladores do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) da presente descrição modulam eficazmente a atividade do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) ou modulam a expressão da proteína do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF). Num exemplo, a atividade ou a expressão do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) num animal é inibida em cerca de 10% em comparação com um controlo. De um modo preferido, a atividade ou a expressão do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) num animal é inibida em cerca de 30%. Mais preferencialmente, a atividade ou a expressão do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) num animal é inibida por 50% ou mais. Assim, os compostos oligoméricos modulam a expressão do mRNA do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) em pelo menos 10%, pelo menos 50%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, em pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100%, em comparação com um controlo.
Num exemplo, a atividade ou a expressão do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) num animal é aumentada em cerca de 10% em comparação com um controlo. De um modo preferido, a atividade ou a expressão do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) num animal é aumentada em cerca de 30%. Mais preferencialmente, a atividade ou a expressão do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) num animal é aumentada em 50% ou mais. Assim, os compostos oligoméricos modulam a expressão do mRNA do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) em pelo menos 10%, pelo menos 50%, pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 40%, pelo menos 50%, em pelo menos 60%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98%, pelo menos 99% ou 100%, em comparação com um controlo.
Por exemplo, a redução da expressão do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) pode ser medido no soro, sangue, tecido adiposo, fígado ou gualguer outro fluido corporal, tecidos ou órgãos do animal. De preferência, as células contidas nos referidos fluidos, tecidos ou órgãos a serem analisados contêm uma molécula de ácido nucleico gue codifica os péptidos do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) e/ou a proteína do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) em si.
Os compostos da invenção podem ser utilizados em composições farmacêuticas através da adição duma quantidade eficaz dum composto a um diluente ou veiculo farmaceuticamente aceitável adequado. A utilização dos compostos e métodos da presente descrição também pode ser útil profilacticamente.
Conjugados
Outra modificação dos oligonucleótidos da presente descrição envolve a ligação química ao oligonucleótido duma ou mais porções ou conjugados que aumentam a atividade, a distribuição celular ou a absorção celular do oligonucleótido. Estas porções ou conjugados podem incluir grupos conjugados ligados de forma covalente a grupos funcionais, tais como grupos hidroxilo primários ou secundários. Os grupos conjugados da invenção incluem intercaladores, moléculas repórter, poliaminas, poliamidas, polietileno-glicóis, poliéteres, grupos que melhoram as propriedades farmacodinâmicas dos oligómeros, e grupos que melhoram as propriedades farmacocinéticas dos oligómeros. Os grupos conjugados típicos incluem colesteróis, lipídos, fosfolipídios, biotina, fenazina, ácido fólico, fenantridina, antraquinona, acridina, fluoresceínas, rodaminas, cumarinas e corantes. Os grupos que melhoram as propriedades farmacodinâmicas, no contexto da presente descrição, incluem grupos que melhoram a absorção, aumentam a resistência à degradação e/ou reforçam a hibridação específica da sequência com o ácido nucleico alvo. Os grupos que melhoram as propriedades farmacocinéticas, no contexto da presente descrição, incluem grupos que melhoram a absorção, distribuição, metabolismo ou excreção dos compostos da presente descrição. Grupos conjugados representativos são descritos no Pedido de Patente Internacional N° PCT/US92/09196, arquivado a 23 de outubro de 1992, e na Patente dos Estados Unidos n° 6,287,860. As porções conjugadas incluem, mas não estão limitadas a radicais lipidicos como uma porção de colesterol, ácido eólico, um tioéter, por exemplo, hexil-5-tritilotiol, um tiocolesterol, uma cadeia alifática, por exemplo resíduos de dodecandiol ou undecilo, um fosfolípido, por exemplo di-hexadecil-rac-glicerol ou trietilamónio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-Hfosfonato, uma poliamina ou uma cadeia de polietileno glicol, ou ácido acético adamantano, uma porção de palmitilo, ou uma porção de octadecilamina ou dehexilamino-carbonil-oxicolesterol. Os oligonucleótidos da presente descrição também podem ser conjugados com fármacos ativos, por exemplo, aspirina, varfarina, fenilbutazona, ibuprofeno, suprofeno, fenbufeno, cetoprofeno, (S)-(+)-pranoprofeno, carprofeno, dansilsarcosina, 2,3,5 ácido triiodobenzóico, ácido flufenâmico, ácido folínico, uma benzotiadiazida, clorotiazida, uma diazepina, indometicina, um barbiturato, uma cefalosporina, um fármaco sulfa, um antidiabético, um antibacteriano ou um antibiótico.
As patentes representativas dos Estados Unidos gue ensinam a preparação de tais oligonucleótidos conjugados incluem, mas não estão limitados às patentes dos Estados Unidos n°s 4,828,979; 4,948,882; 5,218,105; 5,525,465; 5,541,313; 5,545,730; 5,552,538; 5,578,717, 5,580,731; 5,580,731; 5,591,584; 5,109,124; 5,118,802; 5,138,045; 5,414,077; 5,486,603; 5,512,439; 5,578,718; 5,608,046; 4,587,044; 4,605, 735; 4,667, 025; 4, 762, 779; 4, 789, 737; 4, 824, 941; 4,835,263; 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,082,830; 5,112,963; 5,214,136; 5,245,022; 5,254,469; 5,258,506; 5,262,536; 5,272,250; 5,292,873; 5,317,098; 5,371,241, 5,391,723; 5,416,203, 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 e 5,688,941.
Formulações
Os compostos da presente descrição também podem ser misturados, encapsulados, conjugados ou, de outra forma, associados com outras moléculas, estruturas de moléculas ou misturas de compostos, como por exemplo, lipossomas, moléculas marcadas por receptores, formulações orais, rectais, tópicas ou outras formulações, para auxiliar na absorção, distribuição e/ou absorção. As patentes representativas dos Estados Unidos que ensinam a preparação de tais formulações auxiliares de absorção, distribuição e/ou absorção incluem, mas não estão limitados às patentes dos Estados Unidos n°s 5,108,921; 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127; 5,521,291; 5,543,165; 5,547,932; 5,583,020; 5,591,721; 4,426,330; 4,534,899; 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804; 5,227,170; 5,264,221; 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016; 5,417,978; 5,462,854; 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528; 5,534,259; 5,543,152; 5,556,948; 5,580,575 e 5,595, 756 .
Embora os oligonucleótidos anti-senso não precisem ser administrados no contexto de um vector de forma a modular a expressão e/ou função dum alvo, alguns exemplos da descrição estão relacionados com construções de vectores de expressão para a expressão de oligonucleótidos anti-senso, incluindo promotores, sequências génicas de promotores híbridos e possuem uma forte atividade de promotor constitutivo, ou uma atividade de promotor que pode ser induzida no caso desejado.
Num exemplo, a prática descrita envolve a administração de pelo menos um dos oligonucleótidos anti-senso anteriores com um sistema de entrega adequado de ácidos nucleicos. Num exemplo, esse sistema inclui um vector não virai operacionalmente ligado ao polinucleótido. Exemplos de tais vectores não virais incluem o oligonucleótido sozinho (por exemplo, gualguer uma ou mais das SEQ ID n°s: 3 a 8) ou em combinação com uma formulação proteica, polissacárida, ou lipídica adeguada.
Sistemas de entrega de ácidos nucleicos adicionalmente adeguados incluem vectores virais, tipicamente seguenciados a partir de pelo menos um entre um adenovirus, vírus associados com adenovirus (AAV), adenovirus dependente de ajudantes, retrovirus, ou complexo lipossoma-vírus hemaglutinante do Japão (HVJ). De um modo preferido, o vector viral compreende um forte promotor eucariótico, operacionalmente ligado ao polinucleótidos, por exemplo, um promotor de citomegalovírus (CMV).
Vectores preferidos adicionais incluem vectores virais, proteínas de fusão e conjugados químicos. Os vectores retrovirais incluem o vírus de leucemia murina de Moloney e de vírus baseados no VIH. Um vector viral preferido com base no VIH compreende pelo menos dois vectores, em que os genes gag e pol são do genoma dum VIH e o gene env é de outro vírus. Os vectores virais de DNA São preferidos. Estes vectores incluem vectores tais como vectores orthopox ou avipox, vectores de herpes vírus tal como o vetor do vírus do herpes simplex I (HSV) [Geller, A. I. et al. , (1995) J. Neurochem. , 64: 487; Lim, F., et al. , in DNA Cloning: Mammalian Systems, D. Glover, Ed. (Oxford University Press, Oxford England) (1995); Geller, I.A. et al., (1993) Proc Natl. Acad. Sei.: U.S.A: 90 7603; Geller, I.A., et al., (1990) Proc Natl. Acad. Sei U.S.A: 87: 1149], Adenovirus Vectors (LeGal LaSalle et al., Science, 259: 988 (1993); Davidson, et al. , (1993) Nat. Genet. 3: 219; Yang, et al, (1995) J. Virol 69: 2004) e vectores de virus adeno-associados (Kaplitt, M. G., et al., (1994) Nat. Genet. 8: 148) .
Os compostos anti-senso da descrição abrangem quaisquer sais, ésteres, ou sais de tais ésteres farmaceuticamente aceitáveis, ou qualquer outro composto que, após administração a um animal, incluindo um ser humano, seja capaz de proporcionar (direta ou indiretamente) o metabolito biologicamente ativo ou um resíduo do mesmo. O termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" refere-se a sais fisiologicamente e farmaceuticamente aceitáveis dos compostos da presente descrição: isto é, sais que retêm a atividade biológica desejada do composto parental e que não conferem efeitos toxicológicos indesejáveis do mesmo. Para os oligonucleótidos, os exemplos preferidos de sais farmaceuticamente aceitáveis e as suas utilizações são ainda descritos nas Patentes dos Estados Unidos n° 6,287,860. A presente descrição também inclui composições e formulações farmacêuticas que incluem os compostos anti-senso da descrição. As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser administradas duma série de formas, dependendo se é desejado o tratamento local ou sistémico e da área a ser tratada. A administração pode ser tópica (incluindo oftálmica e pelas membranas mucosas, incluindo a entrega vaginal e rectal), pulmonar, por exemplo, por inalação ou insuflação de pós ou aerossóis, incluindo por nebulizador; intratraqueal, intranasal, epidérmica e transdérmica), por via oral ou parentérica. A administração parentérica inclui a administração por injeção ou infusão intravenosa, intraarterial, subcutânea, intraperitoneal ou intramuscular; ou administração intracraniana, por exemplo, intratecal ou intraventricular.
Para o tratamento de tecidos no sistema nervoso central, a administração pode ser feita, por exemplo, por injeção ou infusão no fluido cerebrospinal. A administração de RNA anti-senso no liquido cefalorraquidiano é descrita, por exemplo, no Pedido de Patente n° 2007/0117772, "Métodos para retardar a progressão da doença familiar ELA".
Quando se pretende que o oligonucleótido anti-senso da presente descrição seja administrado às células do sistema nervoso central, a administração pode ser com um ou mais agentes capazes de promover a penetração do oligonucleótido anti-senso através da barreira hemato-encefálica. A injeção pode ser feita, por exemplo, no córtex entorrinal ou no hipocampo. A entrega de factores neurotróficos, por administração de um vector de adenovirus a neurónios motores em tecido muscular é descrita em, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 6,632,427, "Transferência de genes mediada por um vector Adenoviral em neurónios motores medulares". A entrega de vectores diretamente ao cérebro, por exemplo, no estriado, no tálamo, no hipocampo, ou na substância nigra, é conhecida na arte e descrita, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 6,756,523, "Os vectores de adenovirus para a transferência de genes externos em células do sistema nervoso central, particularmente no cérebro". A administração pode ser rápida, como por injeção ou feita ao longo dum período de tempo, como por infusão lenta ou administração de formulações de libertação prolongada.
Os oligonucleótidos anti-senso em questão também podem ser ligados ou conjugados com agentes que proporcionam propriedades farmacêuticas ou farmacodinâmicas desejáveis. Por exemplo, o oligonucleótido anti-senso pode ser acoplado a qualquer substância conhecida na técnica para promover a penetração ou transporte através da barreira hemato-encefálica, como um anticorpo para o receptor de transferrina e, administrado por injeção intravenosa. 0 composto anti-senso pode ser ligado a um vector virai, por exemplo, o que faz com que o composto anti-senso seja mais eficaz e/ou aumente o transporte do composto anti-senso através da barreira hemato-encefálica. A ruptura osmótica da barreira hemato-encefálica também pode ser realizada, por exemplo, pela infusão de açúcares, incluindo, mas não estando limitandos a mesoeritritol, xilitol, D(+) galactose, D (+) lactose, D(+) xilose, dulcitol, mioinositol, L(-) frutose, D(-) manitol, D(+) glicose, D(+) arabinose, D(-) arabinose, celobiose, D(+) maltose, D(+) rafinose, L(+) ramnose, D(+) melibiose, D(-) ribose, adonitol, D(+) arabitol, L(-) arabitol, D(+) fucose, L(-) fucose, D(-) lixose, L(+) lixose, e L(-) lixose, ou aminoácidos, incluindo, mas não estando limitados a glutamina, lisina, arginina, asparagina, ácido aspártico, cisteina, ácido glutâmico, glicina, histidina, leucina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, tirosina , valina, e taurina. Métodos e materiais para melhorar a penetração da barreira hemato-encefálica estão descritos, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n°s 4,866,042, "Método para a administração de material genético através da barreira hemato-encefálica", 6,294,520, "Material para a passagem através da barreira hemato-encefálica" e 6,936,589, "Sistemas de entrega parentérica".
Os compostos anti-senso em questão podem ser misturados, encapsulados, conjugados ou, de outra forma, associados com outras moléculas, estruturas de moléculas ou misturas de compostos, por exemplo, lipossomas, as moléculas marcadas por receptores, formulações orais, rectais ou tópicas ou outras formulações para auxiliar na captação, distribuição e/ou absorção. Por exemplo, os lipidos catiónicos podem ser incluídos na formulação para facilitar a captação de oligonucleótidos. Uma composição indicada para facilitar a captação é a LIPOFECTAMINA (disponível em GIBCO-BRL, Bethesda, MD).
Acredita-se que os oligonucleótidos com pelo menos uma modificação de 2'-O-metoxietilo são particularmente úteis para administração oral. As composições e as formulações farmacêuticas para administração tópica podem incluir emplastros transdérmicos, unguentos, loções, cremes, géis, gotas, supositórios, sprays, líquidos e pós. Os veículos, bases aquosas, em pó ou oleosas, os agentes espessantes ou outros semelhantes farmaceuticamente convencionais podem ser necessários ou desejáveis. Preservativos de revestimento, luvas e similares também podem ser úteis.
As formulações farmacêuticas da presente descrição, que podem ser convenientemente apresentadas na forma de unidades de dosagem, podem ser preparadas de acordo com técnicas convencionais bem conhecidas na indústria farmacêutica. Tais técnicas incluem a etapa de associação dos ingredientes ativos com os veículos farmacêuticos ou excipientes. De forma geral, as formulações são preparadas associando uniforme e infimamente os ingredientes ativos com veículos líquidos ou veículos sólidos finamente divididos ou ambos e, posteriormente, se necessário, dando forma ao produto.
As composições da presente invenção podem ser formuladas em qualquer uma das muitas formas de dosagem possíveis como por exemplo, mas não se limitando a comprimidos, cápsulas, cápsulas de gel, xaropes líquidos, geles moles, supositórios e enemas. As composições da presente invenção também podem ser formuladas como suspensões em meios aquosos, não-aquosos ou mistos. As suspensões aquosas podem ainda conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão incluindo, por exemplo, carboximetilcelulose de sódio, sorbitol e/ou dextrano. A suspensão também pode conter estabilizadores.
As composições farmacêuticas da presente invenção incluem, mas não estão limitadas a soluções, emulsões, espumas e formulações contendo lipossomas. As composições e formulações farmacêuticas da presente invenção podem compreender um ou mais intensificadores de penetração, veículos, excipientes ou outros ingredientes ativos ou inativos.
As emulsões são geralmente sistemas heterogéneos de um líquido disperso num outro, sob a forma de goticulas normalmente superiores a 0.1 mm de diâmetro. As emulsões podem conter componentes adicionais, para além das fases dispersas, e a substância ativa que pode estar presente como uma solução quer na fase aquosa, quer na fase oleosa ou como uma fase separada. As microemulsões são incluídas como um exemplo da presente descrição. As emulsões e as suas utilizações são bem conhecidas na arte e encontram-se descritas na Patente dos Estados Unidos n° 6,287,860.
As formulações da presente invenção incluem formulações lipossómicas. Tal como utilizado na presente descrição, o termo "lipossoma" significa uma vesícula composta de lípidos anfifílicos organizados numa bicamada ou bicamadas esféricas. Os lipossomas são vesículas unilamelares ou multilamelares que têm uma membrana formada a partir de um material lipofílico e um interior aquoso que contém a composição a ser entregue. Os lipossomas catiónicos são lipossomas carregados positivamente que se crê que interagem com as moléculas de DNA carregadas negativamente, para formar um complexo estável. Acredita-se que os lipossomas que são sensíveis ao pH ou carregados negativamente prendem o DNA em vez de formarem um complexo com o mesmo. Tanto os lipossomas catiónicos como os não catiónicos têm sido utilizados para entregar o DNA às células.
Os lipossomas também incluem lipossomas "estericamente estabilizados", um termo que, como aqui utilizado, refere-se a lipossomas que compreendem um ou mais lípidos especializados. Quando incorporados em lipossomas, estes lípidos especializados resultam em lipossomas com maior tempo de vida de circulação em relação aos lipossomas sem tais lípidos especializados. Os exemplos de lipossomas estericamente estabilizados são aqueles nos quais parte da porção lipídica formadora de vesículas de lipossomas compreende um ou mais glicolípidos ou é derivada de um ou mais polímeros hidrófilos, tal como uma porção de polietilenoglicol (PEG). Os lipossomas e as suas utilizações são ainda descritos na Patente dos Estados Unidos n° 6,287,860.
As formulações e composições farmacêuticas da presente invenção também podem incluir tensioativos. A utilização de tensioativos em produtos, formulações e emulsões de fármacos é bem conhecida na arte. Os tensioativos e os seus usos são ainda descritos na Patente dos Estados Unidos n°. 6,287,860.
Num exemplo, a presente descrição emprega vários potenciadores de penetração para efetuar a entrega eficaz de ácidos nucleicos, em especial oligonucleótidos. Além de auxiliar a difusão de fármacos não lipofílicos através das membranas celulares, os potenciadores de penetração também aumentar a permeabilidade dos fármacos lipofílicos. Os intensificadores de penetração podem ser classificados como pertencentes a uma de cinco grandes categorias, isto é, agentes tensioactivos, ácidos gordos, sais biliares, agentes quelantes e não-quelantes não tensioactivos. Os intensificadores de penetração e as suas utilizações são ainda descritos na Patente dos Estados Unidos n° 6,287,860.
Um especialista na técnica irá reconhecer que as formulações são rotineiramente concebidas de acordo com o seu uso pretendido, isto é, a via de administração.
As formulações preferidas para a administração tópica incluem aquelas em que os oligonucleótidos da presente descrição são em mistura com um agente de entrega tópica, tal como lípidos, lipossomas, ácidos gordos, ésteres de ácidos gordos, esteróides, agentes quelantes e tensioactivos. Os lípidos e lipossomas preferidos incluem neutros (por exemplo, dioleoil-fosfatidil-etanolamina DOPE, dimiristoilfosfatidilo colina DMPC, distearolifosfatidil colina) negativos (por exemplo, dimiristoilfosfatidil glicerol DMPG) e catiónicos (por exemplo, dioleoil tetrametil aminopropilo DOTAP e dioleoil-fosfatidil-etanolamina DOTMA).
Para administração tópica ou outra administração, os oligonucleótidos da descrição podem ser encapsulados em lipossomas ou podem formar complexos dos mesmos, em especial para lipossomas catiónicos. Alternativamente, os oligonucleótidos podem ser complexados com lípidos, em particular com lípidos catiónicos. Os ácidos gordos, ésteres preferidos, os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, e as suas utilizações são ainda descritos na Patente dos Estados Unidos n° 6,287,860.
As composições e as formulações para administração oral incluem pós ou grânulos, micropartícuias, nanopartícuias, suspensões ou soluções em água ou em meios não-aquosos, cápsulas, cápsulas de gel, saquetas, comprimidos ou mini-comprimidos. Os agentes espessantes, agentes aromatizantes, diluentes, emulsionantes, auxiliares de dispersão ou aglutinantes podem ser desejáveis. As formulações orais preferidas são aquelas em que os oligonucleótidos da invenção são administrados em conjunto com um ou mais agentes tensioactivos e quelantes potenciadores de penetração. Os tensioactivos preferidos incluem ácidos gordos e/ou ésteres ou sais dos mesmos, ácidos biliares e/ou sais dos mesmos. Os ácidos/sais biliares e ácidos gordos preferidos e suas utilizações são ainda descritos na Patente dos Estados Unidos n° 6,287,860. Também preferidas são as combinações de potenciadores de penetração, por exemplo, ácidos/sais gordos em combinação com os ácidos/sais biliares. Uma combinação particularmente preferida é o sal de sódio do ácido láurico, ácido cáprico e UDCA. Outros potenciadores de penetração incluem o éter de polioxietileno-9-laurilo, éter de polioxietileno-20-cetílico. Os oligonucleótidos da presente descrição podem ser entregues por via oral, na forma granular, incluindo partículas secas pulverizadas, ou partículas complexadas para formar micro ou nanopartícuias. Agentes complexantes de oligonucleótido e suas utilizações são ainda descritos na Patente dos Estados Unidos n° 6,287, 860 .
Composições e formulações para a administração parenteral, intratecal ou intraventricular podem incluir soluções aquosas estéreis que também podem conter tampões, diluentes e outros aditivos adequados tais como, mas não estando limitados a potenciadores de penetração, compostos transportadores e outros veículos farmaceuticamente aceitáveis ou excipientes.
Alguns exemplos da descrição proporcionam composições farmacêuticas contendo um ou mais compostos oligomérico e um ou mais agentes quimioterápicos que atuam por um mecanismo não anti-senso. Exemplos de tais agentes quimioterápicos incluem, mas não estão limitados a fármacos quimioterápicos do cancro, tais como daunorrubicina, daunomicina, dactinomicina, doxorubicina, epirubicina, idarubicina, esorrubicina, bleomicina, mafosfamida, ifosfamida, citosina arabinosido, biscloroetil nitrosureia, busulfano, mitomicina C, actinomicina D, mitramicina, prednisona, hidroxiprogesterona, testosterona, tamoxifeno, dacarbazina, procarbazina, hexametilmelamina, pentametilmelamina, mitoxantrona, amsacrina, clorambucil, metilciclo-hexilnitrosoureia, mostardas de azoto, melfalano, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-azacitidina, hidroxiureia, desoxicoformicina, 4-hidroxiperoxiciclo-fosforamida, 5-fluorouracilo (5-FU), 5-fluorodesoxiuridina (5-FUdR), metotrexato (MTX), colchicina, taxol, vincristina, vinblastina, etoposida (VP-16), trimetrexato, irinotecano, topotecano, gemcitabina, teniposido, cisplatina e dietilestilbestrol (DES). Quando utilizados com os compostos da presente descrição, estes agentes quimioterápicos podem ser utilizados individualmente (por exemplo, 5-FU e oligonucleótido), sequencialmente (por exemplo, 5-FU e oligonucleót ido por um período de tempo seguido de MTX e oligonucleótido) , ou em combinação com um ou mais outros de tais agentes quimioterápicos (por exemplo, 5-FU, MTX e oligonucleótido, ou 5-FU, radioterapia e de oligonucleótidos). Os fármacos anti-inflamatórios, incluindo mas não estando limitados a fármacos não esteróides anti-inf lamatórios e corticosteróides e drogas antivirais, incluindo mas não estando limitadas a ribivirina, vidarabina, aciclovir e ganciclovir, também podem ser combinados nas composições da presente descrição. As combinações de compostos anti-senso com outros fármacos não anti-senso também estão dentro do âmbito desta descrição.
Dois ou mais compostos combinados podem ser utilizados em conjunto ou sequencialmente.
Noutro exemplo relacionado, as composições da presente descrição pode conter um ou mais compostos anti-senso, particularmente oligonucleótidos, direcionados para um primeiro ácido nucleico e um ou mais compostos anti-senso adicionais direcionados para um segundo ácido nucleico alvo. Por exemplo, o primeiro alvo pode ser uma sequência anti-senso especifica do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) , e o segundo alvo pode ser uma região de outra sequência de nucleótidos. Alternativamente, as composições da presente descrição podem conter dois ou mais compostos anti-senso direcionados para diferentes regiões do mesmo ácido nucleico alvo do factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF). Numerosos exemplos de compostos anti-senso são aqui ilustrados e outros podem ser selecionados de entre os compostos adequados conhecidos na arte. Dois ou mais compostos combinados podem ser utilizados em conjunto ou sequencialmente.
Administração
Acredita-se que a formulação de composições terapêuticas e sua subsequente administração (doseamento) está dentro das capacidades dos peritos na arte. A dosagem depende da gravidade e da capacidade de resposta do estado de doença a ser tratado, durando o curso do tratamento de vários dias a vários meses, ou até que a cura seja efectuada ou seja conseguida uma diminuição do estado da doença. Esquemas óptimos de administração podem ser calculados a partir de medições de acumulação do fármaco no corpo do paciente. Os peritos na arte podem facilmente determinar as dosagens óptimas, metodologias de administração e taxas de repetição. Dosagens óptimas podem variar dependendo da potência relativa de oligonucleótidos individuais e podem, geralmente, ser estimadas com base nas EC50s que se verificou serem eficazes in vitro e em modelos animais in vivo. Em geral, a dosagem varia de O.Olmg a lOOg por kg de peso corporal, e pode ser administrada uma ou mais vezes diariamente, semanalmente, mensalmente ou anualmente ou mesmo, uma vez cada 2 a 20 anos. Os peritos na arte podem facilmente estimar as taxas de repetição de administração com base na medição de tempos de residência e concentrações do fármaco em fluidos ou tecidos corporais. A seguir a um tratamento bem-sucedido, pode ser desejável submeter o paciente a terapia de manutenção para prevenir a recorrência do estado de doença, em que o oligonucleótido é administrado em doses de manutenção, que vão de O.Olmg a lOOg por kg de peso corporal, uma ou mais vezes diariamente, a uma vez a cada 20 anos. Em alguns casos, o paciente é tratado com uma dosagem de fármaco que é, pelo menos, cerca de 1, pelo menos cerca de 2, pelo menos cerca de 3, pelo menos cerca de 4, pelo menos cerca de 5, pelo menos cerca de 6, pelo menos cerca de 7, em menos cerca de 8, pelo menos 9, pelo menos cerca de 10, pelo menos cerca de 15, pelo menos cerca de 20, pelo menos cerca de 25, pelo menos cerca de 30, pelo menos cerca de 35, pelo menos cerca de 40, pelo menos cerca de 45, em menos cerca de 50, pelo menos cerca de 60, pelo menos cerca de 70, pelo menos cerca de 80, pelo menos cerca de 90, ou pelo menos cerca de 100 mg/kg de peso corporal. Certas dosagens injetadas de oligonucleótidos anti-senso são descritas, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 7,563,884, "Modulação anti-senso da expressão da PTP1B".
Enquanto vários exemplos da presente invenção tenham sido descritos acima, deve ser entendido que os mesmos foram apresentados apenas como forma de exemplo, e não como limitação. Podem ser feitas numerosas modificações aos exemplos descritos de acordo com a presente descrição, sem se afastarem do espírito ou âmbito da invenção. Assim, a amplitude e o âmbito da presente descrição não deve ser limitado por qualquer um dos exemplos acima descritos.
Por citação de várias referências neste documento, os requerentes não admitem que qualquer referência particular seja "arte prévia" à sua invenção. Exemplos de composições e métodos da invenção são ilustrados nos seguintes exemplos.
EXEMPLOS
Os seguintes exemplos não-limitativos servem para ilustrar casos selecionados da descrição. Será apreciado que as variações nas proporções e alternativas nos elementos dos componentes indicados serão óbvios para os peritos na arte e estão dentro do âmbito dos exemplos da presente invenção.
Exemplo 1: Elaboração de oligonucleótidos anti-senso específicos para uma molécula de ácido nucleico anti-senso para um polinucleótido do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) e/ou uma cadeia senso dum polinucleótido do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF)
Tal como indicado acima, o termo "oligonucleótido específico para" ou "oligonucleótido que marca" refere-se a um oligonucleótido com uma sequência (i) capaz de formar um complexo estável com uma porção do gene alvo, ou (ii) capaz de formar uma dúplex estável com uma porção de um transcrito de mRNA do gene alvo. A seleção de oligonucleótidos adequados é facilitada pela utilização de programas de computador que alinham automaticamente as sequências de ácidos nucleicos e indicam as regiões de identidade ou homologia. Tais programas são usados para comparar sequências de ácidos nucleicos obtidas, por exemplo, por pesquisa de bases de dados como o GenBank ou por sequenciação de produtos de PCR. A comparação de sequências de ácidos nucleicos a partir de dum conjunto de espécies permite a seleção de sequências de ácidos nucleicos que apresentem um grau apropriado de identidade entre espécies. No caso dos genes que não tenham sido sequenciados, são realizados Southern blots para permitir uma determinação do grau de identidade entre os genes em espécies alvo e noutras espécies. Através da realização de Southern blots com diferentes graus de rigidez, tal como é bem conhecido na arte, é possível obter uma medida aproximada da identidade. Estes procedimentos permitem a seleção de oligonucleótidos que exibem um elevado grau de complementaridade para as sequências alvo de ácidos nucleicos num caso a ser controlado e um menor grau de complementaridade para as sequências de ácidos nucleicos correspondentes noutras espécies. Um perito na arte compreenderá que existe uma latitude considerável na seleção de regiões de genes apropriadas para utilização na presente descrição.
Um composto anti-senso é "especificamente hibridizante" quando a ligação do composto com o ácido nucleico alvo interfere com a função normal do ácido nucleico alvo, provocando uma modulação da função e/ou da atividade, e existe um grau suficiente de complementaridade para evitar a ligação não específica do composto anti-senso com sequências de ácidos nucleicos não alvo, sob condições nas quais a ligação específica é desejada, isto é, sob condições fisiológicas, no caso de ensaios in vivo ou tratamento terapêutico e sob as condições em que os ensaios são realizados, no caso de ensaios in vitro.
As propriedades de hibridação dos oligonucleótidos aqui descritos podem ser determinadas por um ou mais ensaios in vitro, como conhecido na arte. Por exemplo, as propriedades dos oligonucleótidos aqui descritos podem ser obtidas por determinação da força de ligação entre o alvo anti-senso natural e as moléculas dum fármaco potencial, utilizando o ensaio de curva de fusão. A força de ligação entre o alvo anti-senso natural e uma molécula dum fármaco potencial (Molécula) pode ser estimada utilizando qualquer um dos métodos estabelecidos de medição da intensidade das interações intermoleculares, por exemplo, um ensaio de curva de fusão.
Um ensaio de curva de fusão determina a temperatura à qual ocorre uma rápida transição da conformação de cadeia dupla para a conformação de cadeia simples no anti-senso natural/complexo de Molécula. Esta temperatura é geralmente aceite como uma medida fiável da força de interação entre as duas moléculas.
Um ensaio de curva de fusão pode ser realizado usando uma cópia de cDNA da molécula de RNA anti-senso natural ou um nucleótido sintético de DNA ou RNA que corresponde ao sitio de ligação da molécula. Vários kits contendo todos os reagentes necessários para a realização deste ensaio estão disponíveis (por exemplo, Applied Biosystems Inc. , MeltDoctor Kit) . Estes kits incluem uma solução tampão adequada com um dos corantes de ligação do DNA de cadeia dupla (dsDNA) (tais como corantes de ABI GRH, SYBR Green, SYTO, etc) . As propriedades dos corantes de cDNA são tais que eles praticamente não emitem nenhuma fluorescência na forma livre, mas são altamente fluorescente quando ligados ao dsDNA.
Para realizar o ensaio, ο cDNA ou um oligonucleótido correspondente são misturados com a Molécula em concentrações definidas pelos protocolos específicos do fabricante. A mistura é aquecida a 95°C para dissociar todos os complexos pré-formados de dsDNA, e posteriormente arrefecida lentamente até à temperatura ambiente ou a outra temperatura inferior definida pelo fabricante do kit, para permitir que as moléculas de DNA hibridem. Os complexos recém-formados são então lentamente aquecidos a 95°C, com recolha contínua e simultânea de dados sobre a quantidade de fluorescência que é produzida pela reação. A intensidade de fluorescência é inversamente proporcional às quantidades de dsDNA presentes na reação. Os dados podem ser recolhidos por meio de um instrumento de PCR em tempo real compatível com o kit (por exemplo, ABI's StepOne Plus Real Time PCR System ou LightTyper instrument, Roche Diagnostics, Lewes, UK).
Os picos de fusão são construídos através da representação gráfica da derivada negativa da fluorescência em relação à temperatura (-d(fluorescência)/dT) no eixo dos y) em função da temperatura (eixo do x) , utilizando software apropriado (por exemplo, LightTyper (Roche) ou SDS Dissociation Curve, ABI) . Os dados são analisados para identificar a temperatura da transição rápida do complexo dsDNA a moléculas de cadeia simples. Esta temperatura é chamada Tm e é diretamente proporcional à força de interação entre as duas moléculas. Tipicamente, a Tm exceda os 40 0 C.
Exemplo 2: Modulação de polinucleótidos de BDNF
Tratamento de células HepG2 com oligonucleótIdos anti-senso:
As células HepG2 de ATCC (Cat# HB-8065) foram cultivadas em meio de crescimento (MEM/EBSS (Hyclone Cat# SH30024, ou Mediatech cat# 10-010-MT-CV) + FBS a 10% (Mediatech Cat# MT35-011-CV) + penicilina/estreptomicina (Mediatech cat# MT30-002-CI)), a 37°C e 5% de CO2. Um dia antes da experiência, as células foram novamente colocadas em placas a uma densidade de 1.5xl05/ml em placas de 6 poços e incubadas a 37°C e 5% de CO2. No dia da experiência, o meio das placas de 6 poços foi mudado para meio de crescimento fresco. Todos os oligonucleótidos anti-senso foram diluídos para a concentração de 20 mM. Dois ml desta solução foram incubados com 400 ml de meio Opti-MEM (Gibco Cat# 31985-070) e 4 ml de Lipofectamina 2000 (Invitrogen Cat# 11668019) à temperatura ambiente durante 20 minutos e, aplicados a cada poço das placas de 6 poços com células HepG2. Uma mistura semelhante, incluindo 2 ml de água em vez da solução de oligonucleótido, foi usada para os controlos falsos transferidos. Após 3-18 h de incubação a 37°C e 5% de CO2, o meio foi mudado para meio de crescimento fresco. 48h após a adição de oligonucleótidos anti-senso o meio foi removido e o RNA foi extraído das células usando o sistema de isolamento de RNA SV total da Promega (Cat# Z3105) ou o kit de isolamento de RNA RNeasy Total da Qiagen (Cat# 74181) seguindo as instruções dos fabricantes. Foram adicionados 600ng de RNA à reação de transcrição reversa realizada utilizando o kit de cDNA Verso da Thermo Scientific (Cat# AB1453B) ou o Kit de Transcrição Reversa de cDNA de Elevada capacidade (Cat# 4368813), como descrito no protocolo do fabricante. O cDNA desta reação de transcrição reversa foi usado para monitorizar a expressão do gene por PCR em tempo real usando o ABI Taqman Gene Expression Mix (cat# 4369510) e primers/sondas concebidas pela ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay pela Applied Biosystems Inc., Foster City CA) . O seguinte ciclo de PCR foi usado: 50°C durante 2 min, 95°C durante 10 min, 40 ciclos de (95°C durante 15 segundos, 60°C durante 1 min) utilizando a máquina de PCR em tempo real StepOne Plus (Applied Biosystems). 0 número de alterações na expressão génica após tratamento com oligonucleótidos anti-senso foi calculado com base na diferença em valores dCT 18S normalizados entre as amostras tratadas e as amostras falsas transferidas.
Detecção de oligos para anti-senso de BDNF:
Ensaio ABI ID HsO0417345_ml
Sequência do contexto GCACACCTGGAGATACTCTATTATA (SEQ ID n°: 9)
Detecção de oligos para o BDNF:
Ensaio ABI ID Hs00542425_sl CCTGCAGAATGGCCTGGAATTACAA (SEQ ID n°: 10)
Resultados
Os resultados da PCR em tempo real mostram que os níveis de mRNA do BDNF em células HepG2 aumentam significativamente 48h depois do tratamento com dois dos gapmers de LNA com cadeia principal totalmente de fosforotioato concebido para o anti-senso de BDNF (CUR-71, P = 0.04, CUR-73, P = 0.07, CUR-76, P = 0.03) (Figura IA). Nas mesmas amostras os níveis de anti-senso de BDNF diminuíram significativamente após o tratamento com todos os oligos excepto CUR-72 o que, possivelmente, se deve a diferentes aos oligos que afectam diferentes variantes de processamento de BDNF e/ou anti-senso de BDNF (Figura 1B).
Tratamento de células CHP212 com oligonucleótIdos anti-senso :
As células CHP212 de ATCC (Cat# CRL-2273) foram cultivadas em meio de crescimento (MEM/F12 (ATCC Cat# 30-2003, ou
Mediatech cat# 10-080-CV) + FBS a 10% (Mediatech Cat# MT35-011-CV) + penicilina/estreptomicina (Mediatech cat# MT30-002-CI)), a 37°C e 5% de CO2. Um dia antes da experiência, as células foram novamente colocadas em placas a uma densidade de 1.5xl05/ml em placas de 6 poços e incubadas a 37°C e 5% de CO2. No dia da experiência, o meio das placas de 6 poços foi mudado para meio de crescimento fresco. Todos os oligonucleótidos anti-senso foram diluídos para a concentração de 20 mM. Dois ml desta solução foram incubados com 400 ml de meio Opti-MEM (Gibco Cat# 31985-070) e 4 ml de Lipofectamina 2000 (Invitrogen Cat# 11668019) à temperatura ambiente durante 20 minutos e, aplicados a cada poço das placas de 6 poços com células CHP212. Uma mistura semelhante, incluindo 2 ml de água em vez da solução de oligonucleótido, foi usada para os controlos falsos transferidos. Após 3-18 h de incubação a 37°C e 5% de CO2, o meio foi mudado para meio de crescimento fresco. 48h após a adição de oligonucleótidos anti-senso o meio foi removido e o RNA foi extraído das células usando o sistema de isolamento de RNA SV total da Promega (Cat# Z3105) ou o kit de isolamento de RNA RNeasy Total da Qiagen (Cat# 74181) seguindo as instruções dos fabricantes. Foram adicionados 600ng de RNA à reação de transcrição reversa realizada utilizando o kit de cDNA Verso da Thermo Scientific (Cat# AB1453B) ou o Kit de Transcrição Reversa de cDNA de Elevada capacidade (Cat# 4368813), como descrito no protocolo do fabricante. O cDNA desta reação de transcrição reversa foi usado para monitorizar a expressão génica por PCR em tempo real usando o ABI Taqman Gene Expression Mix (cat# 4369510) e primers/sondas concebidas pela ABI (Applied Biosystems Taqman Gene Expression Assay: Hs00542425_sl pela Applied Biosystems Inc., Foster City CA) . O seguinte ciclo de PCR foi usado: 50°C durante 2 min, 95°C durante 10 min, 40 ciclos de (95°C durante 15 segundos, 60°C durante 1 min) utilizando a máquina de PCR em tempo real StepOne Plus (Applied Biosystems). 0 número de alterações na expressão génica após tratamento com oligonucleótidos anti-senso foi calculado com base na diferença em valores dCT 18S normalizados entre as amostras tratadas e as amostras falsas transferidas.
Resultados:
Os resultados da PCR em tempo real mostram que os níveis de mRNA do BDNF em células CHP212 aumentam significativamente 48h depois do tratamento com três oligos de concebidos para o antis-senso de BDNF (Figura 1C).
Exemplo 3: Modulação Anti-senso do polinucleótido e do produto proteico do BDNF e efeito sobre a memória e aprendizagem em ratos transgénicos amiloides
Os oligonucleótidos anti-senso específicos para o BDNF-AS (por exemplo, os oligonucleótidos identificados pelas SEQ ID n°s 3-8) são administrados a ratinhos J20, que expressam o transgene da proteína precursora do amilóide humana (APP) carregando ambas as mutações APP Sueca e Indiana. Como descrito, por exemplo, por Nagahara et ai., 2009, "Neuroprotective effects of brain-derived neurotrophic factor in rodent and primate models of Alzheimer's disease", Nature Medicine, 15 (3) : 331-337, aqui incorporada por referência, estes ratinhos mostram placas corticais e progressiva perda de células no córtex entorrinal começando na idade de 2-3 meses, e declínio cognitivo por volta dos 6-7 meses. São recolhidas amostras de sangue pré-tratamento vários dias antes da administração, pela da recolha de 4-7 gotas da veia da cauda. Cada oligonucleótido anti-senso é dissolvido em PBS e administrado num ratinho por injeção no córtex entorrinal ou no hipocampo de cerca de 10 mg/kg. Administra-se aos ratinhos controlo da mesma ninhada (WT da mesma idade) o mesmo volume de PBS sozinho. Um mês mais tarde, a memória espacial é testada nos ratos tratados e nos ratos controlo no labirinto aquático de Morris, e comparado o seu desempenho. Também são testados os efeitos restauradores medindo a aprendizagem dependente do hipocampo e a aprendizagem independente do hipocampo. Após o teste, os ratinhos são sacrificados e os tecidos cerebrais (córtex entorrinal e giro dentado do hipocampo) são recolhidos para análise de expressão da proteína e do mRNA do BDNF. Os níveis de concentração e de secreção da proteína do BDNF humano são determinados utilizando um kit de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) (comercialmente disponível, por exemplo, Quantikine human BDNF, R&D Systems, Minneapolis, MN) , de acordo com as instruções do fabricante. O mRNA é analisado utilizando uma RT-PCR, como aqui descrito noutro local.
Exemplo 4: Modulação Anti-senso do polinucleótidos e do produto proteico do BDNF e efeito sobre a memória e aprendizagem em ratos SAM-P8. A estirpe P8 dos ratinhos de senescência acelerada (SAM), como descrito, por exemplo, na Patente dos Estados Unidos n° 6,310,048, "Modulação Anti-senso da expressão da proteína beta amiloide", aqui incorporada por referência, revela um aumento, relacionado com a idade, da diminuição da aprendizagem (aquisição) e da memória (retenção), bem como um aumento, relacionado com a idade, na acumulação de Proteína percursora do amilóide e ΑβΡ. Os ratinhos SAM-P8 têm um tempo de vida médio de 17.2 meses, em oposição a um tempo de vida normal de 24 meses em ratinhos RI normais.
Os ratinhos SAM-P8 são divididos em sete grupos de 10 ratinhos cada. Aos 11 meses de idade (4 semanas antes da formação), um grupo recebe 0.2 microlitros de soro de vitelo por injeção ventricular intracerebral (ICV), enquanto os outros seis grupos recebem uma ou duas injeções ICV de 0.2 microlitros (cada uma de 2 microlitros e com 60ng de oligonucleótido) de oligonucleótidos anti-senso da presente descrição. A administração é feita abrindo um orifício através do crânio por cima do terceiro ventrículo (-0.5 em relação à bregma; 0.5 mm em direção à sutura central) . O escalpe é fechado e os ratos são devolvidos às suas gaiolas. Duas semanas após esta primeira injeção, um dos grupos de ratinhos tratados e o grupo que recebeu soro são injetados com o veículo de solução salina que é utilizada como o transportador dos oligonucleótidos anti-senso. Neste momento (duas semanas antes do treino), cada um dos oligonucleótidos é administrado em solução salina ICV em todos os ratinhos dum grupo. Cada administração contém 0.2 microlitros (60ng de oligonucleótido por injeção).
Duas semanas após a última injeção, quando os ratinhos têm 12 meses de idade, são treinados para evitar choque nas patas num labirinto em T. Os processos de formação e de ensaio são os mesmos que os descrito por Flood et al. , Physiology & Behavior, 58: 819-822 (1995); e Flood et al. , Neurobiology of Aging, 14: 159-166 (1993), e na Patente dos Estados Unidos n° 6,310,048, todos aqui incorporados por referência. Todos os ratos são treinados até fazerem a sua primeira resposta de evasão. Os resultados dos testes de retenção, quando testados 1 hora após o treino e uma semana depois, são comparados. Uma semana após o treino original, é testada a retenção tanto para os ratos com 4 meses como para os ratos com 12 meses de idade, continuando o treino até que cada rato se evada 5 vezes em 6 tentativas de treino consecutivas. Os resultados são expressos em média e com um erro padrão da média. Os ensaios para a primeira evasão, ou para um critério de evasões 5 em 6 ensaios consecutivos, são analisados oneway ANOVAs separados. As diferenças estatísticas entre as médias dos ratinhos de 12 meses de idade que receberam oligonucleótidos anti-senso, são comparadas com as médias dos ratinhos de 12 meses de idade que receberam o veículo de solução salina, usando o teste T de Dunnett.
As amostras são recuperadas das regiões da amígdala, hipocampo e septo do cérebro de cada um de quatro ratinhos, dois tratados com o veículo de solução salina e os outros dois tratados com os oligonucleótidos anti-senso. As amostras são testadas quanto à expressão da proteína do BDNF por ELISA ou imuno-blotting contra um anticorpo que híbrida especificamente com o BDNF.
Exemplo 5: Modulação Anti-senso do polinucleótido e do produto proteico do BDNF e efeito sobre a progressão da doença em doentes com Esclerose Lateral Amiotrófica
Uma composição farmacêutica compreendendo um oligonucleótido anti-senso da presente descrição (por exemplo, um oligonucleótido identificado por qualquer uma das SEQ ID n°s: 3-8) é administrada ao fluido cerebrospinal de um indivíduo que sofre de ELA familiar. Uma bomba Medtronic SynchroMed II é usada para fornecer a composição ao fluido cerebrospinal. A bomba é implantada cirurgicamente de acordo com as instruções do fabricante. 0 reservatório da bomba está carregado com a composição farmacêutica, em solução salina tamponada com fosfato. A composição farmacêutica é administrada numa quantidade que produz uma infusão de 8 mg a 12 mg/dia do oligonucleótido anti-senso para o fluido cerebrospinal. 0 oligonucleótido anti-senso é infundido, pelo menos durante 28 dias. 0 fármaco é bombeado a uma dose programada para um cateter que é implantado intratecalmente por meio duma cirurgia. A progressão da doença é medida por métodos de rotina na arte e aqui descritos, por exemplo, por meio de indicadores, incluindo ALSFRS-R, e medições de FEVi, FVC e força muscular. Esses métodos são usados por um médico para avaliar o estado da doença no inicio do tratamento, e para proporcionar uma referência do estado de doença. São realizadas avaliações posteriores em intervalos de tempo determinados pelo médico, durante o período de entrega. A expressão da proteína e do mRNA do BDNF no líquido cefalorraquidiano é analisada. Os níveis de concentração de e de secreção da proteína de BDNF humano são determinados utilizando um kit de ensaio de imunoabsorção enzimática (ELISA) (por exemplo, Quantikine humen BDNF, R&D Systems, Minneapolis, MN), de acordo com as instruções do fabricante. 0 mRNA é analisado utilizando uma RT-PCR, como aqui descrito noutro local.
Embora a descrição tenha sido ilustrada e descrita em relação a uma ou mais implementações, ocorrerão alterações e modificações equivalentes aos peritos na arte após a leitura e compreensão desta especificação e dos desenhos anexos. Além disso, enquanto uma característica específica da divulgação pode ter sido descrita em relação a apenas uma das várias implementações, tal característica pode ser combinada com uma ou mais características diferentes das outras implementações, como pode ser desejado e vantajoso para qualquer aplicação específica. 0 resumo da descrição vai permitir que o leitor a determine rapidamente a natureza da descrição técnica. Apresenta-se com o conhecimento de que não será usado para interpretar ou limitar o âmbito ou significado das reivindicações que se seguem.

Claims (18)

  1. REIVINDICAÇÕES 1. Um oligonucleótido anti-senso que marca um transcrito anti-senso natural do factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) para utilização como um composto terapêutico, em que o transcrito anti-senso natural do BDNF é um transcrito de BDNFOS, e em que o oligonucleótido anti-senso aumenta a expressão do factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF).
  2. 2. Um oligonucleótido anti-senso que marca um transcrito anti-senso natural do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) , em que o transcrito anti-senso natural do BDNF é um transcrito do BDNFOS, para utilização na prevenção ou tratamento duma doença ou distúrbio associado com o factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF), em que o referido oligonucleótido anti-senso aumenta a expressão de um factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF), em que a doença ou distúrbio é selecionado a partir do grupo constituído pela doença ou distúrbio neuro-otológico, perda de audição, síndrome de Rett, doença de Alzheimer, esquizofrenia, doença de Huntington, lesão da medula espinal, depressão, disfunção cognitiva, distúrbio bipolar, síndrome WAGR e obesidade.
  3. 3. Utilização de um oligonucleótido anti-senso que marca um transcrito anti-senso natural do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF), em que o transcrito anti-senso natural do BDNF é um transcrito do BDNFOS, para a produção dum fármaco para a prevenção ou o tratamento duma doença ou distúrbio associado com o factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF), em que o referido oligonucleótido anti-senso aumenta a expressão de um factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF), em que a doença ou distúrbio é selecionado a partir do grupo constituído pela doença ou distúrbio neuro-otológico, perda de audição, síndrome de Rett, doença de Alzheimer, esquizofrenia, doença de Huntington, lesão da medula espinal, depressão, disfunção cognitiva, distúrbio bipolar, sindrome WAGR e obesidade.
  4. 4. Um método in vitro para aumento da expressão dum factor neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) em células ou tecidos de pacientes, compreendendo: o contacto das referidas células ou tecidos com um oligonucleótido anti-senso que tem como alvo um transcrito anti-senso natural do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF), em que o transcrito anti-senso natural do BDNF é um transcrito BDNFOS; aumentando desse modo a expressão dum factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) .
  5. 5. Utilização, de acordo com a reivindicação 3, ou um oligonucleótido anti-senso para utilização de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, ou um método de acordo com a reivindicação 4, em que o transcrito anti-senso natural tem uma sequência de ácidos nucleicos como apresentada na SEQ ID n°: 2.
  6. 6. Utilização, de acordo com a reivindicação 3 ou a reivindicação 5, ou um oligonucleótido anti-senso para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, ou 5, ou um método de acordo com a reivindicação 4 ou reivindicação 5, em que o oligonucleótido anti-senso tem cadeia simples, ou em que o oligonucleótido anti-senso é um composto de siRNA.
  7. 7. Utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3, 5 ou 6, ou um oligonucleótido anti-senso para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 5 ou 6, ou um método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 a 6, em que o oligonucleótido anti-senso compreende uma das SEQ ID Nos: 3, 5, 6, 7, ou 8.
  8. 8. Utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 e de 5 a 7, ou um oligonucleótido anti-senso para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e de 5 a 7, ou um método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 a 7, em que o expressão de um factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) é aumentada em pelo menos 10%.
  9. 9. Utilização, de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 e de 5 a 8, ou um oligonucleótido anti-senso para utilização de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 e de 5 a 8, ou um método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 a 8, em que o oligonucleótido anti-senso compreende ainda, uma ou mais modificações que incluem: a. pelo menos, uma ligação modificada entre nucleósidos selecionada a partir de: um fosforotioato, alquilofosfonato, fosforoditioato, alquilfosfonotioato, fosforamidato, carbamato, carbonato, triéster de fosfato, acetamidato, éster de carboximetilo e combinações dos mesmas; b. pelo menos um nucleótido modificado selecionado entre: um ácido nucleico peptídico (PNA), um ácido nucleico bloqueado (LNA), um ácido arabino-nucleico (FANA), um análogo, um derivado e combinações dos mesmos; ou c. pelo menos uma porção modificada de açúcar selecionada entre: uma porção modificada de açúcar 2'-O-metoxietilo, uma porção modificada de açúcar 2'-fluoro, uma porção modificada de açúcar 2'-metoxi, uma porção modificada de açúcar 2'-0-alquilo, uma porção de açúcar biciclica e combinações das mesmas.
  10. 10. Um oligonucleótido anti-senso que marca um transcrito anti-senso natural do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) , em que o transcrito anti-senso natural do BDNF é um transcrito do BDNFOS, em que o oligonucleótido anti-senso aumenta a expressão de um factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF), em que o oligonucleótido anti-senso é um composto de siRNA.
  11. 11. Um oligonucleótido anti-senso que marca um transcrito anti-senso natural do factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) , em que o transcrito anti-senso natural do BDNF é um transcrito do BDNFOS, em que o oligonucleótido anti-senso aumenta a expressão de um factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF), em que o oligonucleótido anti-senso compreende uma das SEQ ID n°s: 3, 5, 6, 7 ou 8.
  12. 12. 0 oligonucleótido anti-senso, de acordo com a reivindicação 10 ou a reivindicação 11, em que o transcrito do BDNF tem a sequência de ácidos nucleicos apresentada na SEQ ID n°: 2.
  13. 13. O oligonucleótido anti-senso, de acordo com a reivindicação 11 ou a reivindicação 12, em que o oligonucleótido anti-senso tem cadeia simples ou em que o oligonucleótido anti-senso é um composto de siRNA.
  14. 14. O oligonucleótido anti-senso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 a 13, em que a expressão de um factor neurotrófico derivado do Cérebro (BDNF) aumenta em pelo menos 10% .
  15. 15. O oligonucleótido anti-senso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 a 14, em que o oligonucleótido anti-senso compreende, adicionalmente, uma ou mais modificações que incluem: a. pelo menos, uma ligação modificada entre nucleósidos selecionada a partir de: um fosforotioato, alquilofosfonato, fosforoditioato, alquilfosfonotioato, fosforamidato, carbamato, carbonato, triéster de fosfato, acetamidato, éster de carboximetilo e combinações das mesmas; b. pelo menos um nucleótido modificado selecionado entre: um ácido nucleico peptídico (PNA), um ácido nucleico bloqueado (LNA), um ácido arabino-nucleico (FANA), um análogo, um derivado e combinações dos mesmos; ou c. pelo menos uma porção modificada de açúcar selecionada entre: uma porção modificada de açúcar 2'-O-metoxietilo, uma porção modificada de açúcar 2'-fluoro, uma porção modificada de açúcar 2'-metoxi, uma porção modificada de açúcar 2'-0-alquilo, uma porção de açúcar biciclica e combinações das mesmas.
  16. 16. Um oligonucleótido anti-senso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 e de 12-15, em que o oligonucleót ido anti-senso tem entre 10 a 30 nucleótidos de comprimento.
  17. 17. Um oligonucleótido anti-senso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 e de 12-16, em que o oligonucleót ido anti-senso tem pelo menos 90% de complementaridade de sequência com um transcrito do BDNF.
  18. 18. Uma composição farmacêutica que compreende pelo menos um oligonucleótido anti-senso, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 10 a 17, e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
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