JP2008516993A - 疼痛の治療および予防における神経膠細胞由来bdnfの調節 - Google Patents
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Abstract
疼痛の治療または予防ならびに痛覚の低減のための方法および製品であって、P2X受容体阻害薬、TNP‐ATP、BDNFアンチセンス分子またはBDNFsiRNAのような作用物質の投与による哺乳類宿主における神経膠細胞由来脳由来神経栄養因子(BDNF)発現または活性の調節を包含する方法および製品。疼痛の治療または予防ならびに痛覚の低減のための化合物を同定するかまたは特性化するための関連方法も記載される。
Description
関連出願の引照
本出願は、米国特許仮出願第60/620,722号(2004年10月22日提出)(この記載内容は参照により本明細書中で援用される)の35 U.S.C. §119 (e)下での利益を主張する。
本出願は、米国特許仮出願第60/620,722号(2004年10月22日提出)(この記載内容は参照により本明細書中で援用される)の35 U.S.C. §119 (e)下での利益を主張する。
本発明の分野
本発明は、神経膠細胞由来BDNF(脳由来神経栄養因子)の調節に関するし、特に被験者における疼痛を治療または予防するための神経膠細胞由来BDNFの調節に関する。本発明は、疼痛の治療または予防のために用いられ得る化合物を同定するかまたは特性化する方法にも関する。
本発明は、神経膠細胞由来BDNF(脳由来神経栄養因子)の調節に関するし、特に被験者における疼痛を治療または予防するための神経膠細胞由来BDNFの調節に関する。本発明は、疼痛の治療または予防のために用いられ得る化合物を同定するかまたは特性化する方法にも関する。
発明の背景
疼痛の治療および予防のための新規の且つ改良された方法ならびに作用物質に対する必要性は、医療における有意の進行中の関心事である。目下用いられている治療薬はほとんど、疼痛の実際の原因を治療することなく疼痛の症候の治療に集中する。さらに、これらの治療薬は必ずしも特異的でなく、多数の望ましくない副作用を引き起こし得る。
疼痛の治療および予防のための新規の且つ改良された方法ならびに作用物質に対する必要性は、医療における有意の進行中の関心事である。目下用いられている治療薬はほとんど、疼痛の実際の原因を治療することなく疼痛の症候の治療に集中する。さらに、これらの治療薬は必ずしも特異的でなく、多数の望ましくない副作用を引き起こし得る。
疼痛知覚に関与するメカニズムをより良好に定義する必要性が依然として存在する。痛覚の新規発見メカニズムに基づいて、疼痛の実際の原因での介入により疼痛を治療するかまたは予防し得る新規の且つ特異的治療薬を提供する必要性も依然として存在する。
発明の要約
本発明は、疼痛の治療または予防のための神経膠細胞由来BDNFの調節(例えば低減)に関する。本発明は、神経膠細胞由来BDNFを調節(例えば低減)し得る化合物の同定または特性化にも関する。
本発明は、疼痛の治療または予防のための神経膠細胞由来BDNFの調節(例えば低減)に関する。本発明は、神経膠細胞由来BDNFを調節(例えば低減)し得る化合物の同定または特性化にも関する。
第一の態様において、本発明は、被験者における疼痛を治療するかまたは予防する方法であって、被験者における神経膠細胞由来BDNFを低減することを包含する方法を提供する。
別の態様では、本発明は、被験者における痛覚の低減方法であって、被験者における神経膠細胞由来BDNFを低減することを包含する方法を提供する。
さらに別の態様では、本発明は、被験者における疼痛の治療または予防のための組成物であって、(a)上記被験者における神経膠細胞由来BDNFを低減し得る作用物質;および(b)製薬上許容可能な担体を含む組成物を提供する。
さらなる態様では、本発明は、疼痛の治療または予防のためのその使用のための使用説明書と一緒に本明細書中に記載の組成物を含むパッケージを提供する。さらに別の態様では、本発明は、(a)被験者における神経膠細胞由来BDNFを低減し得る作用物質;および(b)上記被験者における疼痛の治療または予防のためのその使用のための使用説明書を含むパッケージを提供する。
さらなる態様では、本発明は、被験者における疼痛の治療または予防のための、および/または疼痛の治療または予防のための薬剤の調製のための本明細書中に記載された組成物の使用を提供する。さらなる態様では、本発明は、被験者における疼痛の治療または予防のための神経膠細胞由来BDNFを低減し得る作用物質の使用、および/または被験者における疼痛の治療または予防のための薬剤の調製のための神経膠細胞由来BDNFを低減し得る作用物質の使用を提供する。
さらに別の実施形態では、本発明は、疼痛の治療または予防のための化合物の同定または特性化方法であって、(a)試験化合物を、BDNFを発現するかまたはBDNF活性を有する神経膠細胞と接触させ;そして(b)BDNF発現または活性が試験化合物の存在下で低減されるか否かを確定することを包含する方法であり;低減が疼痛の治療または予防のために試験化合物が用いられ得るということの指標である方法を提供する。
さらに別の実施形態では、本発明は、疼痛の治療または予防のための化合物の同定または特性化方法であって、(a)レポータータンパク質をコードし得るレポーター遺伝子を含む二次核酸と操作可能的に連結されるBDNF遺伝子と普通は関連する転写的調節素子を含む一次核酸を含む神経膠細胞と試験化合物を接触させ;そして(b)レポーター遺伝子発現またはレポータータンパク質活性が試験化合物の存在下で低減されるか否かを確定することを包含する方法であり;レポーター遺伝子発現またはレポータータンパク質活性における低減が疼痛の治療または予防のために試験化合物が用いられ得るということの指標である方法を提供する。
さらなる実施形態では、本発明は、疼痛の治療または予防のための化合物の同定または特性化方法であって、(a)試験化合物を、BDNFポリペプチドを分泌し得る神経膠細胞と接触させ;そして(b)上記BDNFポリペプチドの分泌が試験化合物の存在下で低減されるか否かを確定することを包含する方法であり;BNDFポリペプチドの分泌における低減が疼痛の治療または予防のために試験化合物が用いられ得るということの指標である方法を提供する。
別の実施形態では、本発明は、疼痛の治療または予防のための化合物の同定または特性化方法であって、(a)試験化合物を神経膠細胞と接触させ;そして(b)上記神経膠細胞の刺激が試験化合物の存在下で低減されるか否かを確定することを包含する方法であり;上記神経膠細胞の刺激における低減が疼痛の治療または予防のために試験化合物が用いられ得るということの指標である方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、(a)神経膠細胞中でのBDNF発現;(b)神経膠細胞からのBDNFの放出または分泌;(c)神経膠細胞の刺激;(d)神経膠細胞由来BDNF活性;および(e)(a)〜(d)の任意の組合せからなる群から選択されるパラメーターを低減し得る方法または作用物質を提供する。
別の実施形態では、神経膠細胞はマイクログリア、星状膠細胞および乏突起膠細胞からなる群から選択され、さらなる実施形態では、神経膠細胞は上記被験者の中枢神経系中に位置する。別の実施形態では、神経膠細胞は刺激神経膠細胞であり、さらなる実施形態では、刺激神経膠細胞はATPと接触されたことがあるか、および/または刺激神経膠細胞は末梢神経または神経路損傷に対して後シナプス性である。
さらなる別の実施形態では、BDNFは配列番号2、4、6およびその断片から成る群から選択される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。
さらなる別の実施形態では、BDNFは配列番号2、4、6およびその断片から成る群から選択される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む。
さらに別の実施形態では、上記疼痛のシグナルは末梢神経系(PNS)細胞にまたは中枢神経系(CNS)細胞に起源を有する。複数の実施形態では、疼痛は神経障害性疼痛であり、さらなる一実施形態では、神経障害性疼痛は神経または神経路損傷に関連し、および/または体性および内臓痛からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、神経障害性疼痛は化学的傷害に関連する。さらなる一実施形態では、疼痛は、慢性疼痛、慢性炎症性疼痛、関節炎に関連した疼痛、繊維筋痛、背痛、癌関連疼痛、消化器疾患に関連した疼痛、クローン病に関連した疼痛、自己免疫疾患に関連した疼痛、内分泌疾患に関連した疼痛、糖尿病性神経障害に関連した疼痛、幻肢痛、自発痛、慢性術後痛、慢性側頭下顎痛、灼熱痛、ヘルペス感染後神経痛、AIDS関連疼痛、IおよびII型複合性局所疼痛症候群、三叉神経痛、慢性背痛、脊髄損傷に関連した疼痛、薬剤摂取に関連した疼痛ならびに再発性急性疼痛からなる群から選択される。
さらに別の実施形態では、当該方法は、被験者における神経膠細胞由来BDNFを低減し得る作用物質を上記被験者に投与することを包含する。別の実施形態では、当該使用、組成物およびパッケージは、このような作用物質を含む。一実施形態では、作用物質は神経膠細胞の刺激を低減または抑制し得るし、さらなる一実施形態では、作用物質はATP受容体の阻害薬であり、さらなる一実施形態では、ATP受容体はP2X受容体であり、さらなる一実施形態では、作用物質はTNP‐ATPである。別の実施形態では、作用物質はBDNF発現を抑制し得るし、さらなる一実施形態では、作用物質はアンチセンス分子、リボザイム、siRNAおよびsiRNA様分子からなる群から選択される。さらに別の実施形態では、作用物質はアンチセンス分子であり、さらなる一実施形態では、アンチセンス分子はBDNFをコードするmRNAの一部と実質的に相補性であり、さらなる一実施形態では、アンチセンス分子は配列番号1、3および5から成る群から選択される配列と実質的に同一である核酸配列の一部と相補性である。さらに別の実施形態では、作用物質はsiRNAであり、さらなる一実施形態では、siRNAの配列は配列番号7、8、9、10およびその断片から成る群から選択される配列と実質的に同一である。さらに別の実施形態では、作用物質はくも膜下腔内に投与されるか、あるいはくも膜下腔投与のために適合される。
一実施形態では、被験者は哺乳類であり、さらなる一実施形態では、哺乳類はヒトである。
一実施形態では、被験者は哺乳類であり、さらなる一実施形態では、哺乳類はヒトである。
発明の詳細な説明
第一の態様において、本発明は、神経膠由来BDNFの調節(例えば低減)に基づいた、疼痛の治療および予防のための方法および化合物に関する。本明細書中で用いる場合、「BDNF」または「脳由来神経栄養因子」は本明細書中で互換的に用いられ、そして種々のニューロン・プロセス、例えば神経形成、シナプス形成、損傷ネットワークの修復、発達中ニューロンの生存および分化、脳および脊髄中の成熟ニューロン、正常シナプス(例えば抑制性および/または興奮性)の維持、樹状突起および軸索成長および行動過程の調節(例えば抗うつ、気分安定化、記憶)に関与する神経栄養因子に関する。BDNFポリペプチドは中枢神経系に遍在し、種々の細胞源、例えばニューロン(例えば一次感覚ニューロンおよび後シナプスニューロン)、神経膠細胞(例えばマイクログリア、星状細胞または乏突起膠細胞)、非神経免疫細胞(例えばリンパ球、例えばTおよびBリンパ球)、白血球、マクロファージおよび内皮細胞により産生される。複数の実施形態では、BDNFは、配列番号2(ヒトBDNF;図6も参照)または6(マウスBDNF;図7も参照)のポリペプチド、その断片の配列、あるいはそれと実質的に同一である配列を含む。さらなる実施形態では、BDNFは、配列番号2、4または6のポリペプチドまたはその断片をコードし得る核酸配列、あるいはそれと実質的に同一であるかまたはハイブリダイゼーション判定基準により関連づけられる配列によりコードされる(以下参照)。さらなる実施形態では、このような核酸配列は、配列番号1(ヒトBDNF DNA;図6も参照)、3(マウスBDNF DNA;図7も参照)または5(ラットBDNF DNA;図18も参照)の配列、その断片、あるいはそれと実質的に同一であるかまたはハイブリダイゼーション判定基準により関連づけられる配列を含み得る(以下参照)。
第一の態様において、本発明は、神経膠由来BDNFの調節(例えば低減)に基づいた、疼痛の治療および予防のための方法および化合物に関する。本明細書中で用いる場合、「BDNF」または「脳由来神経栄養因子」は本明細書中で互換的に用いられ、そして種々のニューロン・プロセス、例えば神経形成、シナプス形成、損傷ネットワークの修復、発達中ニューロンの生存および分化、脳および脊髄中の成熟ニューロン、正常シナプス(例えば抑制性および/または興奮性)の維持、樹状突起および軸索成長および行動過程の調節(例えば抗うつ、気分安定化、記憶)に関与する神経栄養因子に関する。BDNFポリペプチドは中枢神経系に遍在し、種々の細胞源、例えばニューロン(例えば一次感覚ニューロンおよび後シナプスニューロン)、神経膠細胞(例えばマイクログリア、星状細胞または乏突起膠細胞)、非神経免疫細胞(例えばリンパ球、例えばTおよびBリンパ球)、白血球、マクロファージおよび内皮細胞により産生される。複数の実施形態では、BDNFは、配列番号2(ヒトBDNF;図6も参照)または6(マウスBDNF;図7も参照)のポリペプチド、その断片の配列、あるいはそれと実質的に同一である配列を含む。さらなる実施形態では、BDNFは、配列番号2、4または6のポリペプチドまたはその断片をコードし得る核酸配列、あるいはそれと実質的に同一であるかまたはハイブリダイゼーション判定基準により関連づけられる配列によりコードされる(以下参照)。さらなる実施形態では、このような核酸配列は、配列番号1(ヒトBDNF DNA;図6も参照)、3(マウスBDNF DNA;図7も参照)または5(ラットBDNF DNA;図18も参照)の配列、その断片、あるいはそれと実質的に同一であるかまたはハイブリダイゼーション判定基準により関連づけられる配列を含み得る(以下参照)。
本発明は、(1)神経膠細胞中でのBDNF発現;(2)神経膠細胞からのBDNFの放出または分泌;(3)神経膠細胞の刺激;および/または(4)神経膠細胞由来BDNF活性を低減することにより神経膠細胞由来BDNFを低減するための方法も提供する。
したがって、一実施形態では、本発明は、神経膠由来BDNFを低減することにより疼痛を治療するための方法に関する。本明細書中で用いる場合、「神経膠細胞」は、神経系の非ニューロン細胞と定義される。一実施形態では、神経膠細胞は神経系中に、そしてさらなる実施形態では、中枢神経系(例えば脊髄)中に位置する。一実施形態では、神経膠細胞はマイクログリア、星状細胞および乏突起膠細胞から選択される。一実施形態では、神経膠細胞は乏突起膠細胞である。乏突起膠細胞は、典型的には白質の髄鞘形成ならびに灰質中の周囲細胞体を形成する。それらは大型で、ニューロン周囲を包む派生物をほとんど有さない。別の実施形態では、神経膠細胞は星状細胞である。星状細胞は、典型的には血管およびニューロン間の連結を形成する。それらは乏突起膠細胞より小さく、広範な分岐を保有する。別の実施形態では、神経膠細胞はマイクログリアである。マイクログリアは、神経系において免疫機能を働かせる。一旦活性化または刺激されると、マイクログリアは壊死組織片を貪食し得る。それらは非常に小さい細胞であるが、しかし一旦活性化または刺激されると大きくなる。複数の実施形態において、神経膠細胞は通常は、OX‐42(CR3/CD11b)、グリア原繊維酸性タンパク質および/またはRIPを発現する。本明細書中で用いる場合、「神経膠細胞由来BDNF」という用語は神経膠細胞により産生され、放出されまたは分泌されるBDNFと定義され、そして複数の実施形態において、マイクログリア、星状細胞および/または乏突起膠細胞により産生されるかまたは分泌されるBDNFを含む。
さらなる実施形態では、BDNF活性または発現のモジュレーター(阻害薬)を用いて、被験者における疼痛を治療するかまたは予防し、あるいは痛覚を低減し得る。一実施形態では、阻害薬(例えば作用物質または化合物)はくも膜下腔内に投与され得る。一実施形態では、これらのモジュレーターは、BDNF下流シグナル伝達を低減し得る作用物質(例えばBDNF受容体(例えばTrkBまたはp75NTR)の阻害薬、例えばK‐252aまたは抗TrkB抗体;MAPK(ras有糸分裂活性化プロテインキナーゼ)経路の阻害薬;PIK‐Akt(ホスファチジルイノシトール‐3キナーゼ‐Akt)経路の阻害薬;PLCγ(ホスホリパーゼCγ)経路の阻害薬)である。別の実施形態では、これらのモジュレーターは、神経膠細胞の刺激(例えばATP刺激)を抑制し得る化合物(例えばP2X(例えばP2X4およびP2X7)受容体の阻害薬、例えばTNP‐ATP、ミノサイクリンおよびプロペントフィリン)である。さらに別の実施形態では、これらのモジュレーターは、BDNF発現を低減し得る化合物または作用物質(例えばdsRNA BDNF、siRNA分子、siRNA様分子、アンチセンスオリゴヌクレオチド、リボザイム等)である。一実施形態では、作用物質または化合物がアンチセンスオリゴヌクレオチドである場合、それは、BDNFをコードするmRNAの一部と実質的に相補性であり、そしてさらなる一実施形態では、それは、配列番号1、3および5から成る群から選択さえる配列と実質的に同一である核酸配列の一部と相補性である。さらなる実施形態では、作用物質または化合物がsiRNAである場合、siRNAの配列は、配列番号7、8、9、10およびその断片から成る群から選択される配列と実質的に同一である。
一実施形態では、本発明は、急性および慢性疼痛の治療に、さらに特定的には神経障害性疼痛の治療にも関する。「神経障害性疼痛」とは、本明細書中で用いる場合、中枢神経系における神経損傷(例えば化学的傷害後、圧挫または横切後、神経の圧迫後、疾患に起因する神経変性後、化学的傷害後)に関連した慢性疼痛を指す。一実施形態では、化学的傷害は化学療法に起因し得る。一実施形態では、神経障害性疼痛は、神経または神経路損傷に関連する。さらなる一実施形態では、神経障害性疼痛は、内臓および/または体性疼痛に関連する。複数の実施形態において、疼痛のシグナルは、末梢神経系細胞、あるいは神経膠細胞に対して経シナプス性である感覚繊維に起源を有し得る。複数の実施形態において、疼痛は、多数の症状、例えば慢性炎症性疼痛、関節炎に関連した疼痛、繊維筋痛、背痛、癌関連疼痛、消化器疾患に関連した疼痛、クローン病に関連した疼痛、自己免疫疾患に関連した疼痛、内分泌疾患に関連した疼痛、糖尿病性神経障害に関連した疼痛、幻肢痛、自発痛、慢性術後痛、慢性側頭下顎痛、灼熱痛、ヘルペス感染後神経痛、AIDS関連疼痛、IおよびII型複合性局所疼痛症候群、三叉神経痛、慢性背痛、脊髄損傷に関連した疼痛、薬剤摂取に関連した疼痛および/または再発性急性疼痛に関連し得る。一実施形態では、薬剤摂取に関連した疼痛は化学療法治療に関連した疼痛である。
本明細書中に記載される方法は、痛覚を低減するための神経膠細胞由来BDNFの低減にも関する。「痛覚」とは、本明細書中で用いる場合、疼痛の感覚構成成分を指す。疼痛は、種々の刺激、例えば圧力、損傷、熱刺激または化学的(例えばイオン性)刺激(これらに限定されない)の結果であり得る。
「BDNF活性」とは、本明細書中で用いる場合、BDNFに関連した任意の検出可能な表現型を指す。例えばBDNF活性は、TrkBチロシンリン酸化のレベル(例えばウエスタンブロッティングを使用)、MAP(ERK)経路活性化のレベル(例えばウエスタンブロッティングを使用)、Aktリン酸化のレベル(例えばウエスタンブロッティングを使用)、PLCγ経路活性化のレベル、神経伝達物質放出の報告のレベル、NMDA受容体リン酸化のレベル、細胞生存、細胞分化および細胞死(例えばアポトーシス)を測定することにより査定され得る。アポトーシスに関する多数の検定、例えばTUNEL染色、アネキシンV染色、FACS分析、アガロース電気泳動、ウエスタンブロット、組織学、電子顕微鏡、カスパーゼ検定、ELISA、ミトコンドリア検定(例えばチトクロームC放出検定)、カテプシンおよびカルパイン検定等が用いられ得る。複数の実施形態において、BDNF活性は、神経細胞の(例えばLIニューロン)陰イオン逆転電位(E陰イオン)にも影響を及ぼし得る。陰イオン逆転電位は、例えばグラミシジン穿孔パッチクランプ記録法を用いることにより確定され得る(以下の実施例の節参照)。
「BDNF発現」は、BDNF転写体の産生および/またはBDNFポリペプチドまたはタンパク質の分泌の両方に関する。したがってBDNF発現は、複数の実施形態において、直接的にタンパク質レベル(例えば免疫細胞化学、ELISAおよび/またはウエスタン分析により)を、あるいはBDNFコード核酸のレベル(例えばBDNF mRNAレベルまたは転写体)を査定することにより、確定され得る。これらのレベルは、例えば逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応[RT‐PCR]法、マイクロ・アレイベースの方法のような方法を用いることにより、あるいはノーザン分析により、確定され得る。
例えば神経膠細胞中でのBDNF活性または発現を低減し得る化合物は、それらがCNS組織またはCNS細胞と接触するようなやり方で投与され得る。用いられ得る化合物としては、タンパク質の活性を直接または間接的に修飾するもの、ならびにタンパク質の産生および/または安定性を調節するもの(例えば転写、翻訳、突然変異、翻訳後修飾、リン酸化、分ピルおよび分解のレベルで)が挙げられるが、これらに限定されない。
このような化合物の一クラスは、神経膠細胞の刺激の抑制により作用するものである。実際、BDNFは、神経膠細胞の刺激(例えばATP刺激)に応答して分泌される。多数の化合物がマイクログリアの活性化を抑制することが当該技術分野で既知である。神経膠細胞の活性化を抑制することにより、これらの化合物はBDNFの分泌を制限し、それにより疼痛の予防または治療のために用いられ得る。これらの化合物としてはP2X受容体(例えばP2X4およびP2X7)阻害薬、例えばTNP‐ATPが挙げられるが、これらに限定されない。
BDNFの発現を限定するために用いられ得る別のクラスの化合物は、BDNF転写体のレベルを下げる化合物である。そうすることにより、これらの化合物は産生され得る、したがって疼痛を治療または予防するために用いられ得るBDNFポリペプチドの数を限定する。これらの化合物としてはdsRNA(例えば配列番号7、8、9または10)、siRNA、siRNA様分子、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムが挙げられるが、これらに限定されない。
疼痛を治療するかまたは予防するために用いられ得るさらなるクラスの化合物または作用物質は、BDNFシグナルの媒介を抑制し得る化合物である。これらの化合物は、例えばBDNF受容体、例えばTrkBまたはp75NTRに作用し得る。一実施形態では、BDNF受容体はTrkB受容体である。TrkBシグナル伝達を抑制し得る化合物としては、K‐252a(Calbiochemから市販)またはTrkBに対する中和抗体(抗TrkB抗体[例えばIgG])(BD Transduction Laboratoriesから市販)が挙げられるが、これらに限定されない。あるいはこれらの化合物は、BDNFとその受容体との結紮時に活性化される種々のシグナル伝達経路に作用し得る。
さらに、BDNF発現の調節は、BDNF発現を調節する転写因子の調節(例えばリン酸化による媒介)からも生じ得る。このような転写因子としては、NFκBおよびBrn‐3cが挙げられるが、これらに限定されない。
さらに、BDNF活性の調節は、神経膠細胞からのBDNF分泌を調節する(例えば低減する)ことによっても達成され得る。
本明細書中に記載される方法は、BDNF分解を調節する(例えば増強する)ことも意図する。このような分解増強は、BDNFを産生する細胞(例えば神経膠細胞)中で、またはBDNF受容体を保有する細胞(例えばBDNF受容体、例えばTrkBまたはp75NTRを有するニューロン細胞)中で細胞内的に起こり得る。後者の場合、その分解の前に、BDNFはBDNF受容体と接触後に、細胞内で移動されている。別の実施形態では、BDNFが一旦分泌されると、分解速度増大も細胞外で観察され得る。
一実施形態では、本明細書中に記載される方法および使用は、脊椎動物被験者に当てはまる。別の実施形態では、被験者は哺乳類であり、さらなる実施形態では、ヒトである。
上記のように、活性を保有するBDNFの相同体、変異体および/または断片も、記載される方法において抑制され得る。相同体としては、BDNFのアミノ酸配列と実質的に同一であり、BDNFと有意の構造的および機能的相同性を共有するタンパク質配列が挙げられる。変異体としては、任意の修飾および/またはアミノ酸置換、欠失または付加によりBDNFと異なるタンパク質またはペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。修飾は、ポリペプチド主鎖(即ちアミノ酸配列)、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ末端を含めてどこでも起こり得る。このような置換、欠失または付加は、1つまたは複数のアミノ酸を包含し得る。断片は、BDNFの断片または一部、あるいはBDNFの相同体または変異体の断片または一部を包含する。
上記のように、活性を保有するBDNFの相同体、変異体および/または断片も、記載される方法において抑制され得る。相同体としては、BDNFのアミノ酸配列と実質的に同一であり、BDNFと有意の構造的および機能的相同性を共有するタンパク質配列が挙げられる。変異体としては、任意の修飾および/またはアミノ酸置換、欠失または付加によりBDNFと異なるタンパク質またはペプチドが挙げられるが、これらに限定されない。修飾は、ポリペプチド主鎖(即ちアミノ酸配列)、アミノ酸側鎖およびアミノまたはカルボキシ末端を含めてどこでも起こり得る。このような置換、欠失または付加は、1つまたは複数のアミノ酸を包含し得る。断片は、BDNFの断片または一部、あるいはBDNFの相同体または変異体の断片または一部を包含する。
「相同性」または「相同な」とは、2つのペプチドまたは2つの核酸分子間の配列類似性を指す。相同性は、整列化配列中の各位置を比較することにより確定され得る。核酸間またはアミノ酸配列間の相同性の程度は、当該配列により共有される位置での同一のまたは整合するヌクレオチドまたはアミノ酸の数の一関数である。当該用語が本明細書中で用いられる場合、2つの配列が実質的に同一であり、そして配列の機能的活性が保存されるならば、所定の配列(核酸またはアミノ酸)は別の配列と「相同」である(本明細書中で用いる場合、「相同の」という用語は進化的関連性を意味しない)。2つの核酸配列または2つのアミノ酸配列は、最適に整列される(容認されたギャプを有する)場合、それらが少なくとも約50%の配列類似性または同一性を共有するならば、あるいは配列が限定機能モチーフを共有するならば、「実質的に同一である」とみなされる。代替的実施形態では、最適に整列された実質的に同一の配列における配列類似性は、少なくとも60%、70%、75%、80%、85%、90%または95%であり得る。本明細書中で用いる場合、配列間の相同性の所定パーセンテージは、最適整列化配列における配列同一性の程度を意味する。「非関連性」または「非相同性」配列は配列番号1〜10のいずれかと40%未満の同一性を、しかし好ましくは約25%未満の同一性を共有する。
実質的相補性核酸は、一分子の「相補体」が他の分子と実質的に同一である核酸である。
同一性の比較のための配列の最適整列は、種々のアルゴリズム、例えばSmith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math 2: 482の局所的相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443の相同性アルゴリズム、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444の類似性検索方法、ならびにこれらのアルゴリズムのコンピューター処理履行(例えばGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI, U.S.A.))を用いて実行され得る。配列同一性は、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-10(発表済みデフォルト設定を使用)に記載されたBLASTアルゴリズムを用いても確定され得る。BLAST分析を実施するためのソフトウエアは、National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/でのインターネットによる)を通して入手可能である。BLASTアルゴリズムは、先ず、データベース中の同一長さのワードで整列される場合にいくつかの正値閾値スコアTと整合するかまたはそれを満たす問合わせ配列中の長さWの短いワードを同定することにより、高スコアリング配列対(HSP)を同定することを包含する。Tは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる。最初の隣接ワードヒットは、より長いHSPを見つけ出すための検索を開始するための種子として作用する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大され得る限り、各配列に沿った両方向で拡張される。各方向でのワードヒットの拡張は、以下のパラメーターが満たされると、停止される:累積アラインメントスコアはその最大達成値から量Xだけ減少する;1つまたは複数の負‐スコアリング残基アラインメントの累積のため、累積スコアはゼロまたはそれ以下になる;あるいはいずれかの配列の末端が到達される。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXは、アラインメントの感度および速度を確定する。BLASTプログラムは、デフォルトとしてワード長(W)11、BLOSUM62スコアリング・マトリックス(Henikoff and Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919)アラインメント(B)50、期待値(E)10(または1または0.1または0.01または0.001または0.0001)、M=5、N=4を、ならびに両鎖の比較を用い得る。BLASTアルゴリズムを用いる2つの配列間の統計学的類似性の一測定は、最小和確率(P(N))であり、これは、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の整合が偶然に起こる確率の指標を提供する。本発明の代替的実施形態では、試験配列の比較における最小和確率が約1未満、好ましくは約0.1未満、さらに好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は実質的に同一であると考えられる。
同一性の比較のための配列の最適整列は、種々のアルゴリズム、例えばSmith and Waterman, 1981, Adv. Appl. Math 2: 482の局所的相同性アルゴリズム、Needleman and Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443の相同性アルゴリズム、Pearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444の類似性検索方法、ならびにこれらのアルゴリズムのコンピューター処理履行(例えばGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA(Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, Madison, WI, U.S.A.))を用いて実行され得る。配列同一性は、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-10(発表済みデフォルト設定を使用)に記載されたBLASTアルゴリズムを用いても確定され得る。BLAST分析を実施するためのソフトウエアは、National Center for Biotechnology Information(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/でのインターネットによる)を通して入手可能である。BLASTアルゴリズムは、先ず、データベース中の同一長さのワードで整列される場合にいくつかの正値閾値スコアTと整合するかまたはそれを満たす問合わせ配列中の長さWの短いワードを同定することにより、高スコアリング配列対(HSP)を同定することを包含する。Tは、隣接ワードスコア閾値と呼ばれる。最初の隣接ワードヒットは、より長いHSPを見つけ出すための検索を開始するための種子として作用する。ワードヒットは、累積アラインメントスコアが増大され得る限り、各配列に沿った両方向で拡張される。各方向でのワードヒットの拡張は、以下のパラメーターが満たされると、停止される:累積アラインメントスコアはその最大達成値から量Xだけ減少する;1つまたは複数の負‐スコアリング残基アラインメントの累積のため、累積スコアはゼロまたはそれ以下になる;あるいはいずれかの配列の末端が到達される。BLASTアルゴリズムパラメーターW、TおよびXは、アラインメントの感度および速度を確定する。BLASTプログラムは、デフォルトとしてワード長(W)11、BLOSUM62スコアリング・マトリックス(Henikoff and Henikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919)アラインメント(B)50、期待値(E)10(または1または0.1または0.01または0.001または0.0001)、M=5、N=4を、ならびに両鎖の比較を用い得る。BLASTアルゴリズムを用いる2つの配列間の統計学的類似性の一測定は、最小和確率(P(N))であり、これは、2つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列間の整合が偶然に起こる確率の指標を提供する。本発明の代替的実施形態では、試験配列の比較における最小和確率が約1未満、好ましくは約0.1未満、さらに好ましくは約0.01未満、最も好ましくは約0.001未満である場合、ヌクレオチドまたはアミノ酸配列は実質的に同一であると考えられる。
2つの核酸配列が実質的に相補性であるという代替的指標は、2つの配列が中等度緊縮下で、または好ましくは緊縮下で、互いにハイブリダイズする、ということである。中等度緊縮条件下でのフィルター結合配列とのハイブリダイゼーションは、例えば、0.5 MNaHPO4、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1 mMEDTA中で65℃で実施され、そして0.2×SSC/0.1%SDS中で42℃で洗浄する(Ausubel et al. (eds), 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. 1, Green Publishing Associates, Inc., and John Wiley & Sons, Inc., New York, at p. 2.10.3参照)。あるいは、緊縮条件下でのフィルター結合配列とのハイブリダイゼーションは、例えば、0.5 MNaHPO4、7%SDS、1 mMEDTA中で65℃で実施され、そして0.1×SSC/0.1%SDS中で68℃で洗浄する(Ausubel et al. (eds), 1989、上記、参照)。ハイブリダイゼーション条件は、当該配列によって、既知の方法に従って修飾され得る(Tijssen, 1993, Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology- - Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2 “Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays”, Elsevier, New York参照)。一般に、緊縮条件は、限定イオン強度およびpHでの特定配列に関する融点より約5℃低くなるよう選択される。
本発明はさらに、疼痛の予防および/または治療のための組成物であって、製薬上許容可能な担体と混合して神経膠細胞由来BDNFを低減し得る作用物質を含む組成物を提供する。複数の実施形態において、作用物質は(1)神経膠細胞中でのBDNF発現;(2)神経膠細胞からのBDNFの放出または分泌;(3)神経膠細胞の刺激;および/または(4)神経膠細胞由来BDNF活性を低減し得る。一実施形態では、このような組成物は、CNS神経細胞または組織、例えば脊髄組織または細胞への投与に適しており、あるいは適合される。さらなる実施形態では、このような組成物は、BDNF発現または活性の阻害薬であり得る。本明細書中で用いる場合、「阻害薬」とは、BDNF遺伝子の発現、BDNF mRNAまたは転写体の安定性、BDNF mRNAまたは転写体の翻訳、BDNFポリペプチドの分泌を、直接または間接的に下向き調節するかまたは低減する化合物である。一実施形態では、「阻害薬」は、BDNF活性薬(例えばBDNFの遺伝子発現を増強する転写因子(例えばNFκBおよびBrn‐3c))をも下向き調節するかまたは抑制し得る。複数の実施形態において、BDNFは、マイクログリア、星状細胞および/または乏突起膠細胞から得られる。さらなる実施形態では、組成物はくも膜下腔内投与のために適合され得る。
本発明はさらに、疼痛の治療または予防のための神経膠細胞由来BDNFを低減し得る上記組成物あるいは上記作用物質または化合物の使用を提供する。本発明はさらにまた、疼痛の治療または予防のための薬剤の調製のためのBDNF活性または発現を低減し得る上記組成物または上記作用物質の使用を提供する。別の実施形態では、作用物質は、被験者のCNS組織、例えばCNS細胞への投与のために処方され得る。さらに別の実施形態では、作用物質はくも膜下腔内投与のために適合され得る。さらなる実施形態では、化合物は、例えばBDNF発現または活性の阻害薬であり得る。
本発明はさらに、上記組成物または作用物質を、疼痛の治療または予防のためのそれらの使用のための使用説明書と一緒に含むキットまたはパッケージ(例えば商業用パッケージ)を提供する。
種々の実施形態では、神経膠細胞由来BDNFを調節し得る、例えば低減し得る作用物質は、疼痛を治療するために処方物または薬剤中に治療的に用いられ得る。本発明は、神経膠細胞由来BDNFを調節し得る、一実施形態では低減し得る治療的用量の作用物質が薬理学的に許容可能な処方物中で投与される医学的処置の対応する方法も提供する。したがって本発明は、BDNF活性または発現を調節し得る、一実施形態では低減し得る化合物、ならびに薬理学的に許容可能な賦形剤または担体を調節し得る化合物を含む治療用組成物も提供する。治療用組成物は、生理学的に許容可能なpHで水溶液に可溶性であり得る。
一実施形態では、本明細書中に記載される作用物質は、それがCNS組織またはCNSニューロンと接触するようになるよう投与され得る。本明細書中で用いる場合、「中枢神経系」またはCNSは、脳および脊髄(例えば腰部の)を含む神経系の部分である。それに対して「末梢神経系」またはPNSは、脳および脊髄以外の神経系の部分である。一実施形態では、CNS組織は表在性後角であり、さらなる実施形態では、椎弓板Iニューロンである。このようなものとして、複数の実施形態において、本発明の一作用物質は、直接的頭蓋内またはくも膜下腔内注射あるいは脳脊髄液中への注射によりin vivoでCNS細胞を治療するために投与され得る。あるいは作用物質は、血液脳関門を横断して、CNSに進入し得る形態で全身的に(例えば静脈内または経口的に)投与され得る。「神経性の」および「ニューロン性の」は、互換的に本明細書中で用いられ、ともにニューロンに関する。「非ニューロン性の」は、ニューロン以外の細胞に関して本明細書中で用いられ、そして神経系の細胞の情況では、ニューロン以外の神経系の細胞(例えば神経膠細胞)に関する。
本発明は、CNS細胞中の神経膠細胞由来BDNFを調節し得る、例えば低減し得る作用物質を含む製剤組成物(薬剤)も提供する。一実施形態では、このような組成物は、疼痛を治療するかまたは弱めるのに十分な治療的または予防的有効量で作用物質を、そして製薬上許容可能な担体を含む。「治療的有効量」とは、所望の治療的結果、例えば疼痛の低減を達成するために、必要な投薬量での必要な時間での、有効な量を指す。神経膠細胞由来BDNFを調節し得る、一実施形態では低減し得る作用物質の治療的有効量は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに個体における所望の応答を引き出す化合物の能力といった因子によって変わり得る。投薬量レジメンは、最適治療的応答を提供するよう調整され得る。治療的有効量は、化合物の任意の毒性または有害作用より治療的に有益な作用が勝っている量でもある。「予防的有効量」とは、所望の予防的結果、例えば疼痛の開始または疼痛の重症度の増大を防止するかまたは抑制することを達成するために、必要な投薬量での必要な時間での、有効な量を指す。予防的有効量は、治療的有効量に関して上記されたのと同様に確定され得る。任意の特定被験者に関しては、特定の投薬量レジメンが、個々の必要性に従って、ならびに組成物の投与を施すかまたは指示するヒトの専門的判断に従って、経時的に調整され得る。
本明細書中で用いる場合、「製薬上許容可能な担体」または「賦形剤」は、生理学的に適合性である任意のおよび全ての溶媒、分散媒質、コーティング、抗細菌薬および抗真菌薬、等張および吸収遅延剤等を包含する。一実施形態では、担体は非経口投与に適している。あるいは担体は、静脈内、くも膜下腔内、舌下または経口投与に適切であり得る。製薬上許容可能な担体としては、滅菌水溶液または分散液、ならびに滅菌注射用溶液または分散液の即時調合調製物ための滅菌粉末が挙げられる。薬学的活性物質のためのこのような媒質および作用物質の使用は、当該技術分野で周知である。任意の慣用的媒質または作用物質が活性化合物と非相溶性である限りという点を除いて、本発明の製剤組成物中のその使用が意図される。補充活性化合物も、当該組成物中に組み入れられ得る。
治療用組成物は、典型的には、製造および貯蔵条件下で滅菌性且つ安定でなければならない。組成物は、溶液、マイクロエマルション、リポソーム、または高薬剤濃度に適したその他の秩序構造物として処方され得る。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール(例えばグリセロール、プロピレングリコールおよび液体ポリエチレングリコール等)、ならびにその適切な混合物を含有する溶媒または分散媒質であり得る。例えばレシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合は必要粒子サイズの保持により、そして界面活性剤の使用により、適正な流動性は維持され得る。多くの場合、等張剤、例えば糖、ポリアルコール、例えばマンニトール、ソルビトール、または塩化ナトリウムを組成物中に含むのが好ましい。注射用組成物の長期吸収は、吸収を遅延する作用物質、例えば一ステアリン酸塩およびゼラチンを組成物中に含むことによりもたらされ得る。さらに神経膠細胞由来BDNFを調節し得る、一実施形態では低減または下向き調節し得る化合物は、持続放出性処方物中で、例えば徐放性ポリマーを含む組成物中で投与され得る。活性化合物は、制御放出処方物、例えば植込錠および微小封入送達系のように、迅速放出に対して化合物を保護する担体を用いて調製され得る。生分解性の生体適合性ポリマー、例えばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、ポリ乳酸およびポリ乳酸ポリグリコール酸コポリマー(PLG)が用いられ得る。このような処方物の調製のための多数の方法は特許を得ているか、あるいは一般的に当業者に既知である。
滅菌注射用溶液は、上で列挙された成分のうちの1つまたは組合せとともに、適切な溶媒中に必要量で、活性化合物(例えば神経膠細胞由来BDNFを低減し得る化合物)を組み入れ、必要な場合には、その後濾過滅菌することにより調製され得る。一般に、塩基性分散媒質および上で列挙されたものからの必要な他の成分を含有する滅菌ビヒクル中に活性化合物を組み入れることにより、分散液は調製される。滅菌注射用溶液の調製のための滅菌粉末の場合、好ましい製造方法は、活性成分の粉末+予め滅菌濾過されたその溶液からの任意の付加的な所望の成分を生じる真空乾燥および凍結乾燥である。本発明の代替的態様に従って、神経膠細胞由来BDNFを調節し得る、一実施形態では低減し得る化合物が、その溶解度を増強する1つまたは複数の付加的化合物を用いて処方され得る。
本発明の別の態様に従って、神経膠細胞由来BDNFを低減し得る作用物質を含む本発明の治療用組成物は、疼痛の治療または予防のためのそれらの使用のための使用説明書をさらに含む容器またはパッケージ(例えば商業用パッケージ)中で提供され得る。
神経膠細胞由来BDNFの低減が本明細書中に記載されるような疼痛感覚の低減と相関するとすれば、本発明のさらなる態様は、BDNF阻害薬をコードする核酸分子、例えばdsRNA、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドまたはリボザイムを被験者に投与することによる疼痛の治療である。適切な投与方法としては、遺伝子療法が挙げられる(下記参照)。
本発明の核酸は、DNAの直接注射、受容体媒介性DNA取込み、ウイルス媒介性トランスフェクションまたは非ウイルス性トランスフェクションおよび脂質ベースのトランスフェクション(これらはすべて、遺伝子療法ベクターの使用を包含し得る)のような方法を用いてin vivoで細胞に送達され得る。直接注射は、in vivoで細胞中に裸DNAを導入するために用いられてきた(例えばAcsadi et al. (1991) Nature 332:815-818;Wolff et al. (1990) Science 247: 1465-1468参照)。細胞中にin vivoでDNAを注射するための送達装置(例えば「遺伝子銃」)が用いられ得る。このような装置は、商業的に入手可能であり得る(例えばBioRadから)。裸DNAは、DNAを陽イオン、例えばポリリシンと錯体を形成し、これを細胞表面受容体に関するリガンドと結合することによっても、細胞中に導入され得る(例えばWu, G. and Wu, C.H. (1988) J. Biol. Chem. 263: 14621;Wilson et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 963-967;および米国特許第5,166,320号参照)。DNA‐リガンド複合体と受容体との結合は、受容体媒介性エンドサイトーシスによるDNAの取込みを促進し得る。エンドソームを崩壊し、それにより細胞質中に物質を放出するアデノウイルス・キャプシドに連結されるDNA‐リガンド複合体は、細胞内リソソームによる複合体の分解を回避するために用いられ得る(例えばCuriel et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8850;Cristiano et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2122-2126参照)。
欠陥レトロウイルスは、遺伝子療法ベクターとしての使用のために十分に特性化されている(再検討のためには、Miller, A.D. (1990) Blood 76: 271参照)。組換えレトロウイルスを産生するための、そしてこのようなウイルスを用いてin vitroまたはin vivoで細胞を感染するためのプロトコールはCurrent Protocols in Molecular Biology, Ausubel, F.M. et al. (eds.) Greene Publishing Associates, (1989), Sections 9.10-9.14およびその他の標準実験室マニュアルに見出され得る。適切なレトロウイルスの例としてはpLJ、pZIP、pWEおよびpEMが挙げられ、これらは当業者に周知である。適切なパッキングウイルス系統の例としては、.psi.Cre、.psi.2および.psi.Amが挙げられる。レトロウイルスは、多数の異なる細胞型、例えば上皮細胞、内皮細胞、リンパ球、筋原細胞、肝細胞、骨髄細胞中に、in vivoおよび/またはin vitroで、種々の遺伝子を導入するために用いられてきた(例えばEglitis, et al. (1985) Science 230: 1395-1398;Danos and Mulligan (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 6460-6464;Wilson et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 3014-3018;Armentano et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 6141-6145;Huber et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8039-8043;Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 8377-8381;Chowdhury et al. (1991) Science 254: 1802-1805;van Beusechem et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 7640-7644;Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3: 641-647;Dai et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10892-10895;Hwu et al. (1993) J. Immunol. 150: 4104-4115;米国特許第4,868,116号;米国特許第4,980,286号;PCT出願WO 89/07136;PCT出願WO 89/02468;PCT出願WO 89/05345およびPCT出願WO 92/07573参照)。
遺伝子療法ベクターとして用いるために、アデノウイルスのゲノムは、それが本発明の核酸化合物をコードし、発現するが、しかし正常溶解性ウイルス生活環において複製するその能力に関して不活性化されるよう、操作され得る(例えばBerkner et al. (1988) BioTechniques 6: 616;Rosenfeld et al. (1991) Science 252: 431-434;およびRosenfeld et al. (1992) Cell 68: 143-155参照)。アデノウイルスAd菌株5d1324型またはアデノウイルスの他の菌株(例えばAd2、Ad3、Ad7等)由来の適切なアデノウイルスベクターは、当業者で周知である。組換えアデノウイルスは、それらが有効な遺伝子送達ビヒクルであるべき分裂中細胞を必要とせず、そして広範な種々の細胞型、例えば気道上皮細胞(Rosenfeld et al. (1992)上記)、内皮細胞(Lemarchand et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 6482-6486)、肝細胞(Herz and Gerard (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 2812-2816)、および筋細胞(Quantin et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 2581-2584)を感染させるために用いられ得る。
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、遺伝子療法目的のためにDNAの送達のための遺伝子療法ベクターとして用いられ得る。AAVは、効率的複製および増殖的生活環のためのヘルパーウイルスとして別のウイルス、例えばアデノウイルスまたはヘルペスウイルスを要する天然欠損ウイルスである(Muzyczka et al. Curr. Topics in Micro. And Immunol. (1992) 158: 97-129)。AAVは、非分裂中細胞中にDNAを組込むために用いられ得る(例えばFlotte et al. (1992) Am. J. Respir. Cell. Mol. Biol. 7: 349-356;Samulski et al. (1989) J. Virol. 63: 3822-3828;およびMcLaughlin et al. (1989) J. Virol. 62: 1963-1973参照)。Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 5: 3251-3260に記載されたようなAAVベクターは、細胞中にDNAを導入するために用いられ得る(例えばHermonat et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6466-6470;Tratschin et al. (1985) Mol. Cell. Biol. 4: 2072-2081;Wondisford et al. (1988) Mol. Endocrinol. 2: 32-39;Tratschin et al. (1984) J. Virol. 51: 611-619およびFlotte et al. (1993) J. Biol. Chem. 268: 3781-3790参照)。レンチウイルス遺伝子療法ベクターも、本発明に用いるために適合され得る。
遺伝子療法のための一般的方法は、当該技術分野で既知である(例えば米国特許第5,399,346号(Anderson等)参照)。遺伝物質を送達するための生体的合成カプセルは、PCT公告WO 95/05452(Baetge等)に記載されている。造血細胞中への遺伝子移入の方法も報告されている(Clapp, D.W., et al., Blood 78: 1132-1139 (1991);Anderson, Science 288: 627-9 (2000);およびCavazzana-Calvo et al., Science 288: 669-72 (2000)参照)。
神経膠細胞由来BDNFおよび疼痛間の相関に相関を考えると、このような神経膠細胞由来BDNFを低減し得る化合物が疼痛の予防および治療のために用いられ得る。したがって本発明はさらに、神経膠細胞由来BDNFを低減し得る化合物の同定および特性化のためのスクリーニング方法に関する。
したがって本発明はさらに、候補または試験化合物が神経膠細胞由来BDNF活性または発現を低減し得る、そして次に疼痛の予防および治療のために有用であるか否かを確定する方法を提供する。このような方法は、候補化合物の存在下対非存在下で、適切な系におけるBDNF活性および/または発現を検定することを包含し得る。一実施形態では、当該方法は、BDNF活性を有するかまたはBDNFを発現する神経膠細胞を上記候補化合物と接触させ、そしてBDNF活性または発現が試験化合物の存在下で低減されたか否かを確定することを包含する。BDNF活性または発現の低減は、試験化合物が疼痛の治療または予防のために用いられ得る、ということを示す。一実施形態では、神経膠細胞は刺激化神経膠細胞である(例えばATP刺激神経膠細胞、あるいは末梢神経または神経路損傷に対して後シナプス性である)。別の実施形態では、神経膠細胞は、マイクログリア、星状細胞および乏突起膠細胞から選択される。さらなる実施形態では、神経膠細胞は、BDNFを内因的に発現する。別の実施形態では、上記神経膠細胞は、BDNF遺伝子を発現するよう遺伝子工学処理された。本明細書中に記載される方法は、試験化合物、例えばdsRNA、siRNA、siRNA様分子、リボザイムおよび/またはオリゴヌクレオチドのアンチセンスに関してスクリーニングするために用いられ得る。
本発明は、疼痛の治療または予防において用いられ得る化合物を同定するかまたは特性化するための別のスクリーニング方法も提供する。一実施形態では、当該方法は、神経膠細胞を候補化合物と接触させ、そして神経膠刺激が試験化合物の存在下で低減されたか否かを確定することを包含する。神経膠細胞活性化の低減は、試験/候補化合物は、疼痛の治療または予防のために用いられ得る、ということを示す。一実施形態では、神経膠細胞は、刺激神経膠細胞(例えばATP刺激神経膠細胞、あるいは末梢神経または神経路損傷に対して後シナプス性)である。別の実施形態では、神経膠細胞は、マイクログリア、星状細胞および乏突起膠細胞から選択される。
上記のように、本発明はさらに、BDNF遺伝子発現を低減し得る化合物の同定および特性化のための方法に関する。このような方法は、試験化合物の存在下対非存在下でBDNF遺伝子発現を検定することを包含し得る。このような遺伝子発現は、対応するRNAまたはタンパク質の検出により、あるいはレポーター遺伝子と操作可能的に連結されたBDNF遺伝子と普通は関連した転写調節素子(単数または複数)を含む適切な受容体構築物の使用によって測定され得る。第一核酸配列が第二核酸配列と機能的関係で配置される場合、第一核酸配列は第二核酸配列と「操作可能的に連結され」得る。例えばプロモーターがコード配列の転写または発現に影響を及ぼす場合、プロモーターは、コード配列と操作可能的に連結される。一般的に、操作可能的連結DNA配列は連続性であり、そして2つのタンパク質コード領域を連結する必要がある場合、リーディングフレーム内に存在する。しかしながら例えばエンハンサーは一般的にプロモーターから数キロベース分離される場合に機能し、そしてイントロン配列は可変長を有し得るため、いくつかのポリヌクレオチド素子は操作可能的に連結され得るが、しかし連続性でない。「転写調節素子」とは、開始および終結シグナル、エンハンサー、およびプロモーター、スプライシングシグナル、ポリアデニル化シグナル(それらが操作可能的に連結されるタンパク質コード配列の転写を誘導するかまたは制御する)のようなDNA配列を指す総称的用語である。このようなレポーター遺伝子の発現は、例えば産生されるRNAまたはタンパク質の量により、転写または翻訳レベルで測定され得る。RNAは、例えばノーザン分析により、または逆転写酵素‐ポリメラーゼ連鎖反応(RT‐PCR)により、検出され得る(例えばSambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual (second edition), Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, USA参照)。タンパク質レベルは、親和性試薬(例えば抗体またはその断片[方法に関しては、例えばHarlow, E. and Lane, D (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY参照];タンパク質と結合するリガンド)を用いて直接的に、あるいはその他の特性(例えば、グリーン蛍光タンパク質の場合には蛍光)により、または検出可能な物質(例えば変更された分光分析的特性を有する)を産生する酵素活性を必然的に生じ得るタンパク質の活性または検出可能な表現型(例えば細胞増殖の変化)の測定により、検出され得る。適切なレポーター遺伝子としては、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ、β‐Dガラクトシダーゼ、ルシフェラーゼおよび/またはグリーン蛍光タンパク質が挙げられるが、これらに限定されない。
一実施形態では、候補化合物はさらに、それがBDNF媒介性過程またはBDNF活性を調節し得るか否かを確定するために検定され得る。
本発明は、BDNFを分泌する神経膠細胞の能力を低減するそれらの能力に基づいて疼痛の治療または予防に用いられ得る化合物に関するさらなるスクリーニング方法も提供する。一実施形態では、当該方法は、BDNFを分泌し得る細胞(例えば神経膠細胞)の存在下で試験化合物を接触させ、そしてBDNFの分泌が試験化合物の存在下で低減されるか否かを確定することを包含する。神経膠細胞からのBDNF分泌の低減は、試験化合物が疼痛の治療または予防に用いられ得る、ということの指標である。一実施形態では、神経膠細胞は、刺激神経膠細胞である(例えばATP刺激神経膠細胞、あるいは末梢神経または神経路損傷に対して後シナプス性)。一実施形態では、神経膠細胞は、マイクログリア、星状細胞および乏突起膠細胞から選択される。
本発明は、BDNFを分泌する神経膠細胞の能力を低減するそれらの能力に基づいて疼痛の治療または予防に用いられ得る化合物に関するさらなるスクリーニング方法も提供する。一実施形態では、当該方法は、BDNFを分泌し得る細胞(例えば神経膠細胞)の存在下で試験化合物を接触させ、そしてBDNFの分泌が試験化合物の存在下で低減されるか否かを確定することを包含する。神経膠細胞からのBDNF分泌の低減は、試験化合物が疼痛の治療または予防に用いられ得る、ということの指標である。一実施形態では、神経膠細胞は、刺激神経膠細胞である(例えばATP刺激神経膠細胞、あるいは末梢神経または神経路損傷に対して後シナプス性)。一実施形態では、神経膠細胞は、マイクログリア、星状細胞および乏突起膠細胞から選択される。
本明細書中に記載されるスクリーニング方法は、単一試験化合物、あるいは複数の試験化合物または試験化合物のライブラリー(例えば組合せライブラリー)とともに用いられ得る。後者の場合、化合物の組合せにより提供される相乗作用も、同定され、特定化され得る。上記の化合物は、疼痛の予防および/または治療のために用いられ得るし、あるいは改善された特異性、効能および/または薬理学的(薬物動態的)特性を有する付加的化合物の開発および試験のためのリード化合物として用いられ得る。一実施形態では、化合物は、適切な作用部位で、例えばCNS組織中で(例えば脊髄中で)その活性形態に変えられるプロドラッグであり得る。ある種の実施形態では、本発明のスクリーニング/試験方法の1つまたは複数のステップは自動化され得る。
本発明の種々の実施形態が本明細書中に開示されているが、しかし当業者の共通の一般的知識に従って本発明の範囲内で、多数の適合および修正がなされ得る。このような修正は、実質的に同一の方法で同一結果を達成するために、本発明の任意の態様に代わる既知の等価物の置換を包含する。数字の範囲は、当該範囲を限定する数を含む。特許請求の範囲において、「〜を含む」という語は、大まかな用語として用いられ、「〜を包含するが、しかし限定されない」という語句と実質的に等価である。以下の実施例は本発明の種々の態様を例証するものであって、本明細書中に開示されるような本発明の広範な態様を限定しない。
実施例
実施例1 ‐ 材料および方法
末梢神経損傷モデルおよび行動試験。 成体雄Sprague-Dawleyラットの坐骨神経注意にポリエチレン・カフ(長さ2 mm、内径0.7 mm)を外科的に埋め込むことにより、末梢神経損傷を誘導した。擬似手術(対照として使用)に関しては、すべての外科的手順を動物に施したが、但し、カフを埋め込まなかった。機械的刺激に対する50%引っ込め閾値または50%足引っ込め閾値を査定した。神経損傷後、2 gまたはそれ以下への機械的閾値の漸次低減(14〜17日間)を示した動物のみを、さらなる実験のために用いた。このモデルにおいて誘導された末梢神経損傷を有する動物では、マイクログリア活性化マーカーOX‐42に関するラベリング増大により示されるように、神経カフと同じ側の脊髄にマイクログリア活性化が認められた(図5Bおよび5C)。
実施例1 ‐ 材料および方法
末梢神経損傷モデルおよび行動試験。 成体雄Sprague-Dawleyラットの坐骨神経注意にポリエチレン・カフ(長さ2 mm、内径0.7 mm)を外科的に埋め込むことにより、末梢神経損傷を誘導した。擬似手術(対照として使用)に関しては、すべての外科的手順を動物に施したが、但し、カフを埋め込まなかった。機械的刺激に対する50%引っ込め閾値または50%足引っ込め閾値を査定した。神経損傷後、2 gまたはそれ以下への機械的閾値の漸次低減(14〜17日間)を示した動物のみを、さらなる実験のために用いた。このモデルにおいて誘導された末梢神経損傷を有する動物では、マイクログリア活性化マーカーOX‐42に関するラベリング増大により示されるように、神経カフと同じ側の脊髄にマイクログリア活性化が認められた(図5Bおよび5C)。
切片調製。 前記のような成体(>50日齢)雄ラットから、脊髄の傍矢状切片(300〜350 μm)を調製した。以下の:126NaCl、26NaHCO3、10グルコース、2.5KCl、2CaCl2、2MgCl2、1.25NaH2PO4(95%O2/5%COを発泡、pH7.4)(mM)を含有する人工脳脊髄液(ACSF)を用いて、切片を連続還流(2〜3 ml/分)した。
記録法。 穿孔パッチ記録のために、以下の:130メチル硫酸カリウム(KMeSO4)、5CsCl、2MgCl2、11BAPTA、1CaCl2、4ATP、0.4GTP、10HEPES(〜pH7.4)(mM)を含有する溶液をピペット先端に充填した。25 μg/mlグラミシジンD[グラミシジン・ストックは、ジメチルスルホキシド(DMSO)中10 mg/mlであった]を補足したこの同一溶液をピペットに詰め戻した。アクセス抵抗が25〜45 MΩで安定である場合、この方式での記録を選択した。全細胞電圧クランプ記録法に関しては、グラミシジンDを欠く上記溶液をピペットに充填した。マイクロピペットを介して加圧排出により10〜50分間、GABAを局所的に適用した。データ獲得およびPSCの分析を、前記と同様に実施した;膜電位測定を前記と同様に補正した。LIニューロンの入力抵抗も静止膜電位も、この試験に用いられる薬剤またはプロトコールのいずれかにより有意に影響を及ぼされなかった。測定値はすべて、指示された場合を除いて、平均±SEMとして示す。平均値の比較のためにスチューデントt検定を、分割表のためのカイ二乗検定を、そして反復測定に関する分散の混合要因分析(post-hocテューキーHSD検定)を用いて、統計学的有意を試験した。
マイクログリア培養。 記載されたような標準条件下で、ラット一次培養マイクログリアを調製した。要するに、Wistarラット新生仔から混合膠細胞培養を調製し、10%ウシ胎仔血清を含有するDMEM培地中に10〜16日間保持した。フラスコを静かに振盪することにより一次培養からマイクログリアを分離し、プラスチック皿上で再プレートかした。細胞スクレーパーを用いて皿表面から細胞を取り出し、100 μlのPBS中に収集した;その後、細胞計数器を用いてマイクログリアの細胞密度を測定し、PBSの容積を調整して、最終密度を1000細胞/10 μlとした。この方法により、>95%純度のマイクログリア培養を得た。ATP刺激のために、精製マイクログリアをATP(50 μM)とともに1時間インキュベートした。
くも膜下腔内注射およびELISA。 薬剤投与の少なくとも3日前に、ラットをペントバルビタールナトリウム(65 mg/kg)で麻酔し、腰椎カテーテル(PE‐10ポリエチレン管)をくも膜下腔内に挿入した。手術からの回復時に、くも膜下腔内リドカイン(2%、30 μl)注射により下半身麻痺を誘導して、適正カテーテル局在化を確証した。リドカインに対する適切な一過性麻痺ならびに運動障害欠如を示す動物のみを、行動試験のために用いた。薬剤/ビヒクル投与後、動物を屠殺し、それらの脊柱を解剖して、カテーテルの精確な配置を視覚的に確証した。薬剤は、BDNF(10 μg/日または10 μg/注射)および抗TrkB抗体(2時間毎に12 μgまたは30 μg/注射)、TrkB‐Fc(5 μg/注射)(これらはすべて、生理食塩水プラス10%(v/v)DMSO中に調製した)を含有した。ウイルス媒介性形質導入に関しては、BDNFおよびEGFPをコードするアデノウイルスベクターを1回(20 μl;2.0×1010PFU/ml)投与した。用いた用量では、反射作用および行動観察を把握し、是正し、そして位置づけることにより査定されるように、運動障害または鎮静を生じる化合物はなかった。マイクログリアが小妨害RNA(siRNA)でリポフェクトかされた実験に関して、抗BDNFおよびスクランブルsiRNAはDharmacon Inc.から入手した。BDNF siRNAは、4つのプール化21‐ヌクレオチド二重鎖で構成された。4つの二重鎖の配列を以下に示す:
1)TCGAAGAGCTGCTGGATGA(配列番号7)
2)TATGTACACTGACCATTAA(配列番号8)
3)GAGCGTGTGTGACAGTATT(配列番号9)
4)GAACTACCCAATCGTATGT(配列番号10)。
2)TATGTACACTGACCATTAA(配列番号8)
3)GAGCGTGTGTGACAGTATT(配列番号9)
4)GAACTACCCAATCGTATGT(配列番号10)。
メーカーの使用説明書に従って、リポフェクタミン2000TMとともにBDNFまたはスクランブルsiRNAでマイクログリア培養をトランスフェクトした。要するに、siRNAおよびリポフェクタミンを無血清培地中で希釈し、混合して、マイクログリア培養に付加した。トランスフェクトを5時間生じさせて、その後のくも膜下腔内注射のために上記と同様にマイクログリアを収集した。すべての場合に、30 μlのマイクログリア+上清を正常ラットにくも膜下腔内注射した。 免疫組織化学。 還流浮動切片で、免疫組織化学検査を実施した。CR3/CD11bを標識するOX‐42(セダルラン、1:1000)を、マイクログリアに関する特異的マーカーとして用いた。第一抗体とともに4℃で一晩インキュベーション後、切片をすすぎ、ビオチニル化抗マウスIgG(1:1000)とともに室温で1時間インキュベートした。次に切片を再びすすぎ、アビジン‐ビオチンペルオキシダーゼ複合体(Vector Laboratories)中に1時間浸漬した。最後に、0.003%過酸化水素を含有する0.05%3,3‘‐ジアミノベンジジン(DAB)で陽性ラベリングを可視化した。
BDNF分泌を測定するために、上記の種々の実験条件下でマイクログリアを調製し、37℃で6時間インキュベートして、上記in vivo実験を模擬した。
カルシウム画像処理。 カルシウム画像処理のために脊髄切片を調製し、前記のようにGABAに対する応答に関して試験した。マイクログリアの一次培養を上記と同様に調製し、標準カバーガラスに移して、HEPES緩衝生理食塩水(+0.01%DMSO)中の2.5 μMフラ‐2‐AMとともに45分間インキュベートした。蛍光体負荷後、微小ピペットからのATP(10 μM)の短時間(〜5秒)適用を用いて、個々のマイクログリア中の[Ca2+]iの変化を惹起した。エピ蛍光光学機器を装備したZeiss Axioscope上の40×水浸対物レンズを用いて、[Ca2+]iを蛍光定量的に測定した。CCDカメラと結合されたTILL Photonicsモノクロメーターを用いて画像を獲得し、当該領域(比演算のために)を明らかに異なるニューロン細胞体に関して抜き出した。
実施例2 ‐ 結果
マイクログリアが椎弓板I(LI)ニューロン中のE陰イオンに影響を及ぼし得るか否かを調べるために、前記のようにin vivoでナイーブラットの腰椎レベルにくも膜下腔内カテーテルを介してマイクログリアを投与し、その後、これらの動物から調製した急性脊髄切片中のLIニューロンからの穿孔パッチおよび全細胞記録を作成した。各動物を屠殺する前に、侵害受容性引っ込め閾値を確定して、治療に応答する触覚性異痛の存在または非存在を確証した。ATP(50 μM)で刺激されていたマイクログリアを投与した動物において、侵害受容性引っ込め閾値は漸進的に低減して、約5時間後に最小に達した(図1A)。これに対して、対照非刺激マイクログリアで処理した動物では、引っ込め閾値の変化は認められなかった(図1A)。大脳皮質および脊髄由来マイクログリアは、足引っ込め閾値において比較可能な低減を生じる、ということが判明した。皮質のサイズが大きいため、それはより大きなマイクログリアを生じ、したがってその後の検査のために用いた。
マイクログリアが椎弓板I(LI)ニューロン中のE陰イオンに影響を及ぼし得るか否かを調べるために、前記のようにin vivoでナイーブラットの腰椎レベルにくも膜下腔内カテーテルを介してマイクログリアを投与し、その後、これらの動物から調製した急性脊髄切片中のLIニューロンからの穿孔パッチおよび全細胞記録を作成した。各動物を屠殺する前に、侵害受容性引っ込め閾値を確定して、治療に応答する触覚性異痛の存在または非存在を確証した。ATP(50 μM)で刺激されていたマイクログリアを投与した動物において、侵害受容性引っ込め閾値は漸進的に低減して、約5時間後に最小に達した(図1A)。これに対して、対照非刺激マイクログリアで処理した動物では、引っ込め閾値の変化は認められなかった(図1A)。大脳皮質および脊髄由来マイクログリアは、足引っ込め閾値において比較可能な低減を生じる、ということが判明した。皮質のサイズが大きいため、それはより大きなマイクログリアを生じ、したがってその後の検査のために用いた。
くも膜下腔内マイクログリア投与の5時間後に調製した切片から、電気生理学的記録を作成した。LIニューロンからの電圧クランプ記録法を用いて、対照マイクログリアを注射したラットから採取した脊髄切片において、E陰イオンは−68.3±1.8 mV(n=6;図1B)である、ということが判明した。他方、ATP刺激マイクログリアの投与後のラットからのLIニューロンでは、E陰イオンは−61.6±1.1 mV(n=16;p<0.0001)であった。電流クランプ記録法を用いて、GABAは対照動物からのLIニューロンにおいて過分極を引き起こす(図1C上)が、一方、ATP刺激マイクログリアが投与されていたラットからのニューロンにおいてGABAは脱分極を生じる(図1C、下)、ということが判明した。したがってATP刺激マイクログリアのくも膜下腔内投与はLIニューロンにおけるE陰イオンの脱分極シフトを生じ、そして過分極から脱分極にGABA惹起応答を転換した。抑制応答におけるこれらの変化は、ATP刺激マイクログリアにより引き起こされる侵害受容性引っ込め閾値の低減と同時に起こる。
E陰イオンにおけるシフトを実行するために、ATP刺激マイクログリアはLI後角ニューロンにシグナルを送る。活性化マイクログリアは種々の生物学的活性シグナル伝達分子を分泌することが既知であり、そのうちの1つはBDNFであって、これは、感作および炎症に次いで起こる後角ニューロンの過敏性と、そして海馬における陰イオン勾配シフトとの両方に関与している。ナイーブラットにBDNFをくも膜下腔内投与して、それは、ATP刺激マイクログリアにより生じたものに匹敵する足引っ込め閾値の低減を生じる、ということが判明した(図2A)。
BDNFがE陰イオンにおけるシフトを引き起こし得るか否かを確定するために、それをナイーブラットから採取した脊髄切片に浴適用した。BDNFで処理した(>90分)切片におけるLIニューロン(n=9)のE陰イオンは、対照非処理切片からのLIニューロン(n=9;p<0.005;図2B)のものより有意に低陰性である、ということが判明した。したがって、GABAに対する応答は、BDNF投与中は抑制性であるというよりむしろ興奮性であり得る、という可能性がある。カルシウム画像処理を用いたLIニューロン(n=96)における短時間GABA適用後の細胞内カルシウム([Ca2+]i)のレベルをモニタリングすることにより、この組織を検査した。BDNFを用いた還流中、そしてグルタメート受容体遮断薬の存在下で、[Ca2+]iの上昇を伴ってGABAに応答するニューロンの割合は経時的に増大し、80〜120分に記録されたニューロンの31%に達した(p<0.05;図2C)。GABAA受容体遮断薬ビククリンを浴適用することにより[Ca2+]iの上昇を防止して、作用がGABAA受容体により媒介されることを確証した。したがって、切片におけるBDNFの短期投与はE陰イオンの脱分極シフトを引き起こし、そして約30%の細胞では、GABAに正味興奮を生じさせる、と結論づけられた。
BDNFへのin vivoでの持続性長期曝露の作用を確定するために、くも膜下腔内カテーテルを介してBDNF形質導入組換えアデノウイルス(adBDNF)を投与した(n=16)。このadBDNFは、4日間の注射後試験中に、足引っ込め閾値の漸進的低減を生じた。これに対して、BDNFをコードしない対照アデノウイルスの注射は、同一期間中に足引っ込め閾値に影響を及ぼさなかった(n=6;p<0.005;図2D)。adBDNF処理の長期作用のため、処置動物から採取した切片中のE陰イオンの変化に関して試験し得た。adBDNF注射ラット(n=7)からのLIニューロン中のE陰イオンは、対照アデノウイルスで処理したラットから測定されたいいより有意に低陰性である(n=4;p<0.01;図2E、F)、ということが判明した。さらに、GABA適用は、adBDNF注射ラットからのいくつかのLIニューロンに作用電位を発火させた(試験した7細胞のうち2つ)が、一方、これは対照条件では観察されなかった。したがってBDNFの短期投与と同様に、持続性局所放出は足引っ込め閾値の低減、E陰イオンにおける脱分極シフトを引き起こし、そしてGABAの作用を抑制から興奮に切り替え得た。
これらの結果は、外因性BDNFが触覚性異痛およびE陰イオンのシフトを生じるのに十分である、ということを示す。BDNFが末梢神経損傷の後遺症の内因性媒介物質であり得るか否かを調べるために、TrkB受容体(抗TrkB)に対する機能遮断抗体ならびにBDNF隔離融合タンパク質(TrkB‐Fc)(これらは各々、BDNFの作用を遮断することが実証されている)を用いた。末梢神経損傷後2週間で異痛を発症していたラットに、くも膜下腔内カテーテルにより抗TrkBまたはTrkB‐Fcを投与した。これらの作用物質の投与の前および後に、足引っ込め閾値を測定した。これらの作用物質の各々は、足引っ込め閾値における低減を短期間に逆転する(それぞれn=7&4、p<0.05;図3A)ということが判明した。これに対して、末梢神経損傷を有するラットへのビヒクル投与は、引っ込め閾値の変化を生じなかった(図3A)。BDNF‐TrkBシグナル伝達がLIニューロンにおけるE陰イオンの神経損傷誘発性シフトのために必要であるか否かを確定するために、末梢神経損傷の2週間後に異痛を有するラットから採取した脊髄切片に短期的に適用した抗TrkBの作用を調べた。抗TrkBで処理した切片(n=7)中のLIニューロンのE陰イオンは、ビヒクル処理切片(n=6;p<0.05;図3B、C)と比較して有意により陰性であった、ということが判明した。総合すると、これらの知見は、末梢神経損傷に起因する触覚性異痛およびLIニューロンのEの脱分極シフトの両方を持ちこたえるためには内因性BDNFが必要である、ということを示す。
BDNF‐TrkBシグナル伝達の妨害がATP刺激マイクログリアを投与することにより生じる触覚性異痛およびLIニューロンEにおけるシフトを防止するはずであるか否かを試験するために、ATP刺激マイクログリアを抗TrkBまたはTrkB‐Fcと一緒に投与した。ATP刺激マイクログリアをこれらの遮断薬のいずれかと一緒に投与しても、くも膜下腔内注射後5時間に亘る足引っ込め閾値の変化は生じなかった(それぞれn=8&7;図4A)。これに対して、異痛は、これらの作用物質を伴わないATP刺激マイクログリアの投与後、漸進的に発症した(n=8)。ATPで刺激されたマイクログリアは、脊髄内の細胞からのBDNFの放出を引き起こし得る。遮断薬は、投与マイクログリアそれ自体からというよりむしろ、この供給源からのBDNFの作用を妨害し得る。これら2つの可能性間を区別するために、BDNFに対して向けられる二本鎖RNA(BDNF siRNA)で培養マイクログリアを前処理した。この前処理後、マイクログリアをATPで刺激し、そしてナイーブラット中にくも膜下腔内注射した場合、引っ込め閾値の変化を引き起こすことはできなかった(n=7;図4A)。siRNAの潜在的非特異的作用に関して制御するために、ATP刺激前にBDNF siRNAのスクランブル・バージョンでマイクログリアを処理した;これらのマイクログリアは、強い異痛を引き出した(n=4;図4A)。さらにまた抗TrkBでまたはBDNF siRNAで処理したマイクログリアにおけるATP惹起カルシウム応答は、ビヒクル処理対照マイクログリアのものと異ならず、このことは、抗TrkBまたはBDNF siRNAによる処理がATPに対するマイクログリアの応答に影響を及ぼさなかった、ということを実証する(図4D)。しかしながらBDNF‐TrkBシグナル伝達の妨害は、マイクログリア誘導性触覚性異痛を防止した。
ATP刺激マイクログリアにより生じるE陰イオンの脱分極シフトは、BDNF‐TrkBシグナル伝達を妨害することにより防止され得る。ATP刺激マイクログリアを抗TrkBと一緒に施された、またはBDNF siRNA前処理後の動物からのLIニューロンにおけるE陰イオンは、非刺激マイクログリアを施された動物からのLIニューロンにおけるものと有意に異ならない、ということが判明した。しかしながらこれらの群のラットのいずれかから採取したLIニューロンにおけるE陰イオンは、ATP刺激マイクログリアをビヒクルとともに投与されていた動物から採取したLIニューロンのものと比較して、有意により陰性であった(図4C)。したがって抗TrkBおよびBDNF siRNAは、ATP刺激マイクログリアにより誘導されたE陰イオンのシフトを防止した。
さらにATP刺激(n=3)は培養中のマイクログリアからのBDNFの放出を生じたが、しかしビヒクル対照(n=4)は生じなかった(p<0.001;図4E)。P2X受容体遮断薬TNP‐ATPで培養を処理することにより、ATPのこの作用を遮断した(n=3;p<0.05)。さらに、BDNF siRNAによるマイクログリアの前処理は、ATP刺激によるBDNFの放出を防止した(n=3;p<0.001)。これらの知見を上記の行動および電気生理学的結果と合わせて考えると、ATP刺激マイクログリアにより引き起こされる足引っ込め閾値の低減およびLIニューロンにおけるE陰イオンのシフトはともに、BDNF‐TrkBシグナル伝達を、そしてBDNFの供給源がマイクログリアそれ自体であることを必要とする、と結論づけられた。
マイクログリアATPシグナル伝達の抑制が末梢神経損傷により引き起こされるE陰イオンのシフトを抑制し得るか否かを試験するために、マイクログリア中のP2X受容体に作用を及ぼすことにより、神経損傷誘導性触覚性異痛を逆転することが示されているTNP‐ATPを用いた。末梢神経損傷の2週間後に異痛ラットから採取した脊髄切片に、TNP‐ATPを短期的に浴適用した。TNP‐ATPの存在下では、LIニューロンのE陰イオンは−59.3±1.8 mV(n=6)であったが、これは、神経損傷動物から採取した非処理切片からのLIニューロンにおけるもの(−49.3±4.5 mV、n=6、p<0.05)と比較して、有意により陰性であった。したがってP2X受容体活性化は、末梢神経損傷を有する銅粒におけるE陰イオンの脱分極シフトを持ちこたえるために必要である、と結論づけられた。さらに全実験条件を通しての足引っ込め閾値とLIニューロンにおけるE陰イオンとの間の逆相関が判明したが、これは、マイクログリアおよび異痛間の重要な機械学的リンクとしてのE陰イオンを示唆する。
ニューロン起源のBDNFが脳および脊髄における抑制シナプスの正常代謝回転のために必要である、ということは明らかである;実際、長期後シナプス性可塑性を誘発することが既知の刺激パターンは、表在性後角における一次求心性神経からのBDNFの放出を引き出すことが実証されている。しかしながら、BDNF機能遮断抗体の適用は長期可塑性の誘導のみを弱め、維持に影響を及ぼさないことが実証されているので、正常可塑性のためにはTrkB受容体の短期活性化のみが必要である、ということは明らかである。これに対して、抑制の病態生理学的抑圧はTrkB受容体の反復的活性化を必要とし得る:中和抗体(抗TrkB)の適用によるTrkB抑制は、ここでは、疼痛過敏を、ならびにLIニューロン陰イオン勾配の低減(神経損傷から生じる)を迅速に弱めることが示された。したがって本明細書中に記載される試験は、それが、正常ニューロン機能のために重要な無傷過程(即ちBDNFのニューロン性プール)を残しながら、疾患を触媒する過程を排除するための戦略を表すため、すべてのBDNF作用を操作するというよりむしろ、神経障害性疼痛の治療的介入のためにマイクログリア由来BDNFを標的にするという利点を実証する。したがって一実施形態では、本明細書中に記載される方法は、正常ニューロン性過程に及ぼす作用を全くまたは実質的に全く生じない。
本出願全体を通して、種々の参考文献は、本発明に関する当該技術分野の状態をより詳述に記載するために参照される。これらの参考文献の記載内容は、参照により本明細書中で援用される。
Claims (80)
- 被験者における疼痛の治療または予防方法であって、前記被験者において神経膠由来BDNFを低減することを包含する方法。
- 以下の:
(a)神経膠細胞中でのBDNF発現;
(b)神経膠細胞からのBDNFの放出または分泌;
(c)神経膠細胞の刺激;
(d)神経膠細胞由来BDNF活性;および
(e)(a)〜(d)の任意の組合せ
からなる群から選択されるパラメーターを低減することを包含する請求項1記載の方法。 - 前記神経膠細胞がマイクログリア、星状膠細胞および乏突起膠細胞からなる群から選択される請求項1記載の方法。
- 前記神経膠細胞が前記被験者の中枢神経系中に位置する請求項1記載の方法。
- 前記BDNFが配列番号2、4、6およびその断片から成る群から選択される配列と実質的に同一のアミノ酸配列を含む請求項1記載の方法。
- 前記疼痛のシグナルが末梢神経系(PNS)細胞にまたは中枢神経系(CNS)細胞に起源を有する請求項1記載の方法。
- 前記疼痛が神経障害性疼痛である請求項1記載の方法。
- 前記神経障害性疼痛が神経または神経路損傷に関連する請求項7記載の方法。
- 前記神経障害性疼痛が体性および内臓痛からなる群から選択される請求項7記載の方法。
- 前記神経障害性疼痛が化学的傷害に関連する請求項7記載の方法。
- 前記疼痛が慢性疼痛、慢性炎症性疼痛、関節炎に関連した疼痛、繊維筋痛、背痛、癌関連疼痛、消化器疾患に関連した疼痛、クローン病に関連した疼痛、自己免疫疾患に関連した疼痛、内分泌疾患に関連した疼痛、糖尿病性神経障害に関連した疼痛、幻肢痛、自発痛、慢性術後痛、慢性側頭下顎痛、灼熱痛、ヘルペス感染後神経痛、AIDS関連疼痛、IおよびII型複合性局所疼痛症候群、三叉神経痛、慢性背痛、脊髄損傷に関連した疼痛、薬剤摂取に関連した疼痛ならびに再発性急性疼痛からなる群から選択される請求項1記載の方法。
- 前記被験者における神経膠細胞由来BDNFを低減し得る作用物質を前記被験者に投与することを包含する請求項1記載の方法。
- 前記作用物質が神経膠細胞の刺激を低減または抑制し得る請求項12記載の方法。
- 前記作用物質がATP受容体の阻害薬である請求項13記載の方法。
- 前記ATP受容体がP2X受容体である請求項14記載の方法。
- 前記作用物質がTNP‐ATPである請求項15記載の方法。
- 前記作用物質がBDNF発現を抑制し得る請求項12記載の方法。
- 前記作用物質がアンチセンス分子、リボザイム、siRNAおよびsiRNA様分子からなる群から選択される請求項17記載の方法。
- 前記作用物質がアンチセンス分子である請求項18記載の方法。
- 前記アンチセンス分子がBDNFをコードするmRNAの一部と実質的に相補性である請求項19記載の方法。
- 前記アンチセンス分子が配列番号1、3および5から成る群から選択される配列と実質的に同一である核酸配列の一部と相補性である請求項19記載の方法。
- 前記作用物質がsiRNAである請求項21記載の方法。
- 前記siRNAの配列が配列番号7、8、9、10およびその断片から成る群から選択される配列と実質的に同一である請求項22記載の方法。
- 前記作用物質がくも膜下腔内に投与される請求項12記載の方法。
- 前記被験者が哺乳類である請求項1記載の方法。
- 前記哺乳類がヒトである請求項25記載の方法。
- 被験者における痛覚の低減方法であって、前記被験者における神経膠細胞由来BDNFを低減することを包含する方法。
- 以下の:
(a)神経膠細胞中でのBDNF発現;
(b)神経膠細胞からのBDNFの放出または分泌;
(c)神経膠細胞の刺激;
(d)神経膠細胞由来BDNF活性;および
(e)(a)〜(d)の任意の組合せ
からなる群から選択されるパラメーターを低減することを包含する請求項27記載の方法。 - 前記神経膠細胞がマイクログリア、星状膠細胞および乏突起膠細胞からなる群から選択される請求項27記載の方法。
- 神経膠細胞由来BDNFを低減し得る作用物質を前記被験者に投与することを包含する請求項27記載の方法。
- 前記作用物質が神経膠細胞の刺激を低減または抑制し得る請求項30記載の方法。
- 前記作用物質がATP受容体の阻害薬である請求項31記載の方法。
- 前記ATP受容体がP2X受容体である請求項32記載の方法。
- 前記作用物質がTNP‐ATPである請求項33記載の方法。
- 前記作用物質がBDNF発現を抑制し得る請求項30記載の方法。
- 前記作用物質がアンチセンス分子、リボザイム、siRNAおよびsiRNA様分子からなる群から選択される請求項35記載の方法。
- 前記作用物質がアンチセンス分子である請求項36記載の方法。
- 前記アンチセンス分子がBDNFをコードするmRNAの一部と実質的に相補性である請求項37記載の方法。
- 前記アンチセンス分子が配列番号1、3および5から成る群から選択される配列と実質的に同一である核酸配列の一部と相補性である請求項37記載の方法。
- 前記作用物質がsiRNAである請求項36記載の方法。
- 前記siRNAの配列が配列番号7、8、9、10およびその断片から成る群から選択される配列と実質的に同一である請求項40記載の方法。
- 前記作用物質がくも膜下腔内に投与される請求項30記載の方法。
- 被験者における疼痛の治療または予防のための組成物であって、以下の:
(a)前記被験者における神経膠細胞由来BDNFを低減し得る作用物質;および
(b)製薬上許容可能な担体
を含む組成物。 - 前記作用物質が以下の:
(a)神経膠細胞中でのBDNF発現;
(b)神経膠細胞からのBDNFの放出または分泌;
(c)神経膠細胞の刺激;
(d)神経膠細胞由来BDNF活性;および
(e)(a)〜(d)の任意の組合せ
からなる群から選択されるパラメーターを低減し得る請求項43記載の組成物。 - 前記神経膠細胞がマイクログリア、星状膠細胞および乏突起膠細胞からなる群から選択される請求項43記載の組成物。
- くも膜下腔内投与のために適合される請求項43記載の組成物。
- 疼痛の治療または予防のためのその使用のための使用説明書と一緒に請求項43記載の組成物を含むパッケージ。
- 以下の:
(a)被験者における神経膠細胞由来BDNFを低減し得る作用物質;および
(b)前記被験者における疼痛の治療または予防のためのその使用のための使用説明書
を含むパッケージ。 - 前記作用物質が以下の:
(a)神経膠細胞中でのBDNF発現;
(b)神経膠細胞からのBDNFの放出または分泌;
(c)神経膠細胞の刺激;
(d)神経膠細胞由来BDNF活性;および
(e)(a)〜(d)の任意の組合せ
からなる群から選択されるパラメーターを低減し得る請求項48記載のパッケージ。 - 前記神経膠細胞がマイクログリア、星状膠細胞および乏突起膠細胞からなる群から選択される請求項48記載のパッケージ。
- 被験者における疼痛の治療または予防のための請求項43記載の組成物の使用。
- 疼痛の治療または予防のための薬剤の調製のための請求項43記載の組成物の使用。
- 被験者における疼痛の治療または予防のための神経膠細胞由来BDNFを低減し得る作用物質の使用。
- 被験者における疼痛の治療または予防のための薬剤の調製のための神経膠細胞由来BDNFを低減し得る作用物質の使用。
- 前記作用物質が以下の:
(a)神経膠細胞中でのBDNF発現;
(b)神経膠細胞からのBDNFの放出または分泌;
(c)神経膠細胞の刺激;
(d)神経膠細胞由来BDNF活性;および
(e)(a)〜(d)の任意の組合せ
からなる群から選択されるパラメーターを低減し得る請求項53記載の使用。 - 前記神経膠細胞がマイクログリア、星状膠細胞および乏突起膠細胞からなる群から選択される請求項53記載の使用。
- 前記作用物質が神経膠細胞の刺激を低減または抑制し得る請求項53記載の使用。
- 前記作用物質がATP受容体の阻害薬である請求項57記載の使用。
- 前記ATP受容体がP2X受容体である請求項58記載の使用。
- 前記作用物質がTNP‐ATPである請求項59記載の使用。
- 前記作用物質がBDNF発現を抑制し得る請求項53記載の使用。
- 前記作用物質がアンチセンス分子、リボザイム、siRNAおよびsiRNA様分子からなる群から選択される請求項61記載の使用。
- 前記作用物質がアンチセンス分子である請求項62記載の使用。
- 前記アンチセンス分子がBDNFをコードするmRNAの一部と実質的に相補性である請求項63記載の使用。
- 前記アンチセンス分子が配列番号1、3および5から成る群から選択される配列と実質的に同一である核酸配列の一部と相補性である請求項63記載の使用。
- 前記作用物質がsiRNAである請求項62記載の使用。
- 前記siRNAの配列が配列番号7、8、9、10およびその断片から成る群から選択される配列と実質的に同一である請求項66記載の使用。
- 前記作用物質がくも膜下腔内投与のために適合される請求項53記載の使用。
- 疼痛の治療または予防のための化合物の同定または特性化方法であって、以下の:
(a)試験化合物を、BDNFを発現するかまたはBDNF活性を有する神経膠細胞と接触させ;そして
(b)前記BDNF発現または活性が前記試験化合物の存在下で低減されるか否かを確定する
ことを包含する方法であり、前記低減が疼痛の治療または予防のために前記試験化合物が用いられ得るということの指標である方法。 - 前記神経膠細胞が刺激神経膠細胞である請求項69記載の方法。
- 前記刺激神経膠細胞がステップ(a)前にATPと接触されていた請求項70記載の方法。
- 前記刺激神経膠細胞が末梢神経または神経路損傷に対して後シナプス性である請求項70記載の方法。
- 前記神経膠細胞がマイクログリア、星状膠細胞および乏突起膠細胞からなる群から選択される請求項69記載の方法。
- 前記試験化合物がdsRNA、siRNA、siRNA様分子、オリゴヌクレオチドのアンチセンスおよびリボザイムから成る群から選択される請求項69記載の方法。
- 疼痛の治療または予防のための化合物の同定または特性化方法であって、以下の:
(a)レポータータンパク質をコードし得るレポーター遺伝子を含む二次核酸と操作可能的に連結されるBDNF遺伝子と普通は関連する転写的調節素子を含む一次核酸を含む神経膠細胞と試験化合物を接触させ;そして
(b)レポーター遺伝子発現またはレポータータンパク質活性が前記試験化合物の存在下で低減されるか否かを確定する
ことを包含する方法であり、レポーター遺伝子発現またはレポータータンパク質活性における前記低減が疼痛の治療または予防のために前記試験化合物が用いられ得るということの指標である方法。 - 前記神経膠細胞がマイクログリア、星状膠細胞および乏突起膠細胞からなる群から選択される請求項75記載の方法。
- 疼痛の治療または予防のための化合物の同定または特性化方法であって、以下の:
(a)試験化合物を、BDNFポリペプチドを分泌し得る神経膠細胞と接触させ;そして
(b)前記BDNFポリペプチドの分泌が前記試験化合物の存在下で低減されるか否かを確定する
ことを包含する方法であり、前記BNDFポリペプチドの分泌における低減が疼痛の治療または予防のために前記試験化合物が用いられ得るということの指標である方法。 - 前記神経膠細胞がマイクログリア、星状膠細胞および乏突起膠細胞からなる群から選択される請求項77記載の方法。
- 疼痛の治療または予防のための化合物の同定または特性化方法であって、以下の:
(a)試験化合物を神経膠細胞と接触させ;そして
(b)前記神経膠細胞の刺激が前記試験化合物の存在下で低減されるか否かを確定する
ことを包含する方法であり、前記神経膠細胞の刺激における低減が疼痛の治療または予防のために前記試験化合物が用いられ得るということの指標である方法。 - 前記神経膠細胞がマイクログリア、星状膠細胞および乏突起膠細胞からなる群から選択される請求項79記載の方法。
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