CN101555476B - 小干扰rna及筛选方法及制备治疗神经性疼痛药物的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种小干扰RNA及筛选方法及制备治疗神经性疼痛药物的应用，首先对照EGFP和Cav2.2 e37a/37b的基因序列设计引物，通过PCR的方法构建EGFP-e37a/37b融合基因，然后通过干扰试验筛选出序列为CAGTTTGTTGCGTTGTATTGC的小干扰RNA，该小干扰RNA可以对疼痛靶点N型钙通道α 1亚基进行干扰，并特异性干扰外显子e37a mRNA的表达水平，仅是对e37a能产生沉默效应，对e37b不起作用。用该小干扰RNA制备的治疗神经性疼痛药物，副作用小。可以用于制备治疗神经性疼痛(例如神经性头痛、三叉神经痛、坐骨神经痛、肋间神经痛、癌痛、幻肢痛等)方面的药物。
Description
技术领域
本发明涉及一种治疗神经性疼痛药物的制备技术，尤其涉及一种小干扰RNA及筛选方法及制备治疗神经性疼痛药物的应用。
背景技术
N型电压依赖性钙通道(VDCCs)在疼痛的传递与调控中具有重要作用。它们密集分布于脊髓背角伤害感受性神经元突触前末梢，参与主要疼痛介质如谷氨酸和P物质等释放的调节。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)现象是指内源性或外源性双链RNA(dsRNA)介导细胞内的mRNA发生特异性降解，导致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失，属于转录后的基因沉默机制。近年，随着对RNA干扰现象机制的深入研究，RNAi已经成为一种功能基因组研究的有效工具。
在N型VDCCs的Cav2.2mRNA中存在两种外显因子，一种是e37a；另一种是e37b。e37a和e37b为人、大鼠、小鼠共有的保守基因序列，均为97个核苷酸。其中，外显子e37a特异地表达于背根节神经元，而不表达于脊髓、延髓、中脑、小脑、丘脑、海马及大脑皮层；另一种外显子e37b在上述所有组织中均表达。
现有技术中，由于e37a与e37b两个外显子的序列之间具有同源性，仅存在微小差距，此两个外显子编码的氨基酸仅相差14个，因此，临床应用的N型VDCCs阻断剂，如ω—Ctx等，在治疗疼痛时，对e37a和e37b均能产生沉默效应。
上述现有技术至少存在以下缺点：
副作用较大，如容易抑制交感神经紧张性，引起体位性低血压、心率减慢等；抑制中枢突触传递(包括兴奋性和抑制性突触传递)，引起共济失调、眩晕、幻觉、精神错乱、恶心、呕吐、眼球震颤等症状。
发明内容
本发明的目的是提供一种副作用较小的小干扰RNA及筛选方法及制备治疗神经性疼痛药物的应用。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的小干扰RNA，该小干扰RNA的序列为CAGTTTGTTGCGTTGTATTGC。
本发明的上述的小干扰RNA的筛选方法，包括步骤：
A、对照EGFP报道基因和Cav2.2e37a基因序列设计EGFP-e37a引物，并通过该引物构建EGFP-e37a融合基因；
所述EGFP-e37a引物包括：
L 5’GAA TTC CGC CAC CAT GGT GAG CAA GGG 3’；
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所述EGFP-e37a融合基因包括：
5’GAATTC—EGFP报道基因—Cav2.2e37a基因—AGATCT3’；
B、设计多对小干扰RNA，分别用所述多对小干扰RNA与所述EGFP-e37a融合基因进行RNA干扰试验；
C、检测所述RNA干扰试验效果，选择使所述EGFP-e37a融合基因受到干扰的程度符合设计要求的小干扰RNA。
本发明的上述的小干扰RNA制备治疗神经性疼痛药物的应用，该小干扰RNA用于制备治疗神经性疼痛的药物。
由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明所述的小干扰RNA及筛选方法及制备治疗神经性疼痛药物的应用，由于首先对照EGFP报道基因和Cav2.2e37a基因序列设计EGFP-e37a引物，并通过PCR、酶切的方法构建EGFP-e37a融合基因，然后通过干扰试验筛选出序列为CAGTTTGTTGCGTTGTATTGC的小干扰RNA，该小干扰RNA仅对外显子e37a产生沉默效应，用该小干扰RNA制备的治疗神经性疼痛的药物，副作用小。
具体实施方式
本发明的小干扰RNA(siRNA)，其较佳的具体实施方式是，该siRNA的序列为：CAGTTTGTTGCGTTGTATTGC。
本发明的上述的小干扰RNA的筛选方法，其较佳的具体实施方式是，包括步骤：
步骤A、首先，对照EGFP报道基因和Cav2.2e37a基因序列设计EGFP-e37a引物，并通过该引物构建EGFP-e37a融合基因；
所述EGFP-e37a引物包括：
L 5’GAA TTC CGC CAC CAT GGT GAG CAA GGG 3’；
R1 5’AGC CAA CGG GTG GCG CAA TAC AAC GCA ACA AAC TGT ACA TAT CCT TAT AATGAA TCC GGC AAC TTG TAC AGC TCG TC 3’；
R2 5’AGA TCT TTA CTT GTA GGC CAA CCT ACG AGG GCA GTT CTT CCC TAA GCC AACGGG TGG CG 3’；
所述EGFP-e37a融合基因包括：
5’GAATTC—EGFP报道基因—Cav2.2 e37a基因—AGATCT 3’；
步骤B、然后，设计多对siRNA，分别用多对siRNA与EGFP-e37a融合基因进行RNA干扰(RNAi)试验；
步骤C、检测RNA干扰试验效果，选择使EGFP-e37a融合基因受到干扰的程度符合设计要求的小干扰RNA。设计要求可以为，小干扰RNA对所述EGFP-e37a融合基因的干扰效率大于或等于70％，也可以选用其它的设计要求。
在上述的RNA干扰试验，还可以对比小干扰RNA对Cav2.2 e37b基因的干扰效果，具体包括步骤：
步骤D、对照EGFP报道基因和Cav2.2 e37b基因序列设计EGFP-e37b引物，并通过该引物构建EGFP-e37b融合基因；
所述EGFP-e37b引物包括：
L 5’GAA TTC CGC CAC CAT GGT GAG CAA GGG 3’；
R1 5’AAC CCA GAG GTG GGG ACA TGT GTT TCA GCA TCT CAA ACA TGT CAT TGT AACTGA TGC GCC CAC TTG TAC AGC TCG TC 3’；
R2 5’AGA TCT TTA GTT GTA TGC AAC TCG AGC CGG GCA TTT CTT CCC CAA ACC CAGAGG TGG GG 3’。
所述EGFP-e37b融合基因包括：
5’GAATTC—EGFP报道基因—Cav2.2 e37b基因—AGATCT3’。
步骤E、用上述步骤C中选择的小干扰RNA与EGFP-e37b融合基因进行RNA干扰试验；
步骤F、检测RNA干扰试验效果，选择对EGFP-e37b融合基因无干扰的小干扰RNA。
上述的RNA干扰试验可以采用以下两种方法：
一种是：首先，将融合基因和小干扰RNA分别放入表达载体质粒中进行表达；然后，用小干扰RNA的表达载体质粒与融合基因的表达载体质粒进行共转染，进行RNA干扰试验；
另一种是：首先，用脂质体转染的方法将融合基因表达载体转染到BHK细胞，并挑选有绿色荧光的细胞建立单克隆细胞株；然后，用小干扰RNA，以单克隆细胞株为靶细胞进行RNA干扰试验。
上述的融合基因可以通过PCR和酶切的方法构建，构建完成后，还可以通过PCR方法、酶切方法、测序方法等一种或多种方法鉴定所构建的融合基因序列是否正确。
本发明的上述的小干扰RNA制备治疗神经性疼痛药物的应用，其较佳的具体实施方式是，该siRNA用于制备治疗神经性疼痛的药物。这里的神经性疼痛可以是神经性头痛、三叉神经痛、坐骨神经痛、肋间神经痛、癌痛、幻肢痛等一种或多种，还可以是其它的神经性疼痛。
具体实施例，包括：
步骤1、对照EGFP和Cav2.2 e37a/37b的基因序列设计引物，通过PCR和酶切的方法构建了EGFP-37a/37b融合基因，通过PCR、酶切、测序等方法鉴定序列为正确。
步骤2、按照siRNA的设计原则(如遵循Tuschl规则等)设计四对siRNA，分别编码为I号、II号、III号、IV号：
siRNA I：AAGGATATGTACAGTTTGTTG；
siRNA II：CAGTTTGTTGCGTTGTATTGC；
siRNAIII：AAGAACTGCCCTCGTAGGTTG；
siRNAIV：AACTGCCCTCGTAGGTTGGCC。
步骤3、将这四对siRNA分别与EGFP-37a/37b融合基因进行RNAi试验。
步骤4、用荧光显微镜、流式细胞仪等方法检测RNAi效果：在荧光显微镜下可见siRNAII使细胞的荧光效率明显受到抑制，流式细胞术可见siRNAII的RNAi效率在48小时达到了80％以上，其余三条siRNA抑制作用不明显。并且，siRNAII仅对EGFP-37a产生特异性的沉默效应；
步骤5、将得到的有效且特异性干扰外显子e37a mRNA的表达水平的siRNA序列，用western blot的方法检测融合基因的蛋白表达情况，结果可见对应蛋白条带明显减弱。
步骤6、以Cav2.2的全基因表达质粒在293FT细胞系中进行表达，并共转染siRNA II表达质粒，用Western blot的方法检测蛋白表达情况，得到与步骤5一致的结果，从而验证了siRNA II的有效性和特异性。
本发明通过构建EGFP报道基因和37a/37b的融合基因，遵循Tuschl规则设计siRNA，利用荧光显微镜和流式细胞仪的方法检测出起作用的siRNA序列，并用western blot的方法验证，即对融合基因和全基因的蛋白表达情况进行检测，得到有效且特异性干扰外显子e37amRNA的表达水平的siRNA序列。
该siRNA序列可以对疼痛靶点N型钙通道α1亚基进行干扰，并特异性干扰外显子e37amRNA的表达水平，不仅是对e37a能产生沉默效应，而且对e37b不起作用，即对e37a有特异性沉默效应。
在人、鼠的背根节神经元中，外显子e37a的表达水平为外显子e37b的1/10，e37a具有不同于e37b的生物物理特性，激活电压低且钙电流密度大，因此虽然表达较低但具有更高的生物学效能，这为疼痛治疗提供了一个非常有意义的新靶标。本发明针对该靶标筛选的siRNA，可以为神经性疼痛治疗提供新的可行性方法和药物。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (3)
1.一种小干扰RNA，其特征在于，该小干扰RNA的序列为CAGTTTGTTGCGTTGTATTGC。
2.一种权利要求1所述的小干扰RNA制备治疗神经性疼痛药物的应用，其特征在于，该小干扰RNA用于制备治疗神经性疼痛的药物。
3.根据权利要求2所述的小干扰RNA制备治疗神经性疼痛药物的应用，其特征在于，所述神经性疼痛包括以下一种或多种：神经性头痛、三叉神经痛、坐骨神经痛、肋间神经痛、癌痛、幻肢痛。
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| CN101555476A (zh) | 2009-10-14 |
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