JP2005514005A - 新規のlna組成物およびその使用 - Google Patents
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Abstract
Description
Molecular Cloning、A Laboratory Manual、Second Ed.、J.Sambrook et al.Ed、Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989 Current Protocols In Molecular Biology、F.M.Ausbel et al.Ed、Current Publications、1993
a)問題の修飾塩基を次のオリゴヌクレオチドに組込み[5'-d(GTGAMATGC)(Mは修飾塩基)]、
b)修飾塩基を組込んだ1.5×10-6Mのオリゴヌクレオチドを配列3'-d(CACTYTACG)[YはそれぞれA、C、G、Tである]を有する4種の1.5×10-6Mのオリゴヌクレオチドと10mMリン酸ナトリウム、100mM塩化ナトリウム、0.1mM EDTA、pH7.0の緩衝液中で混合し、
c)オリゴヌクレオチドをハイブリッド形成させ、
d)ハイブリッド形成したヌクレオチドを加熱し、260nmの波長で記録した融解曲線の一次導関数の最大値が得られる温度を観察して、4種のハイブリッド形成したヌクレオチドそれぞれのTmを検出する。
結合している原子および(ii)介在原子とともに単環式部分を形成していて、存在し、可能なビラジカルに関与していない置換基R2、R2*、R3、R4*のそれぞれがそれぞれ独立に、水素、場合によって置換されているC1-6-アルキル、場合によって置換されているC2-6-アルケニル、ヒドロキシ、C1-6-アルコキシ、C2-6-アルケニルオキシ、カルボキシ、C1-6-アルコキシカルボニル、C1-6-アルキルカルボニル、ホルミル、アミノ、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ、カルバモイル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)-アミノカルボニル、アミノ-C1-6-アルキルアミノカルボニル、モノおよびジ(C1-6-アルキル)アミノ-C1-6-アルキルアミノカルボニル、C1-6-アルキルカルボニルアミノ、カルバミド、C1-6-アルカノイルオキシ、スルホノ、C1-6-アルキルスルホニルオキシ、ニトロ、アジド、スルファニル、C1-6-アルキルチオ、ハロゲン、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドならびにそれらの塩基性塩および酸付加塩から選択される。
X、B、Pは上のように定義され、
置換基R2、R2*、R3およびR3*の1つは、先行するモノマーへのヌクレオシド間結合または2'/3'末端基を表わす基P*であり、
R1*、R2、R2*、R3、R4*、R5、R5*、R6、R6*、R7およびR7*の2つは、合わせたとき、-(CR*R*)r-M-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r-M-(CR*R*)s-M-、-M-(CR*R*)r+s-M-、-M-(CR*R*)r-M-(CR*R*)s-、-(CR*R*)r+s-、-M-、-M-M-から選択され、各Mは独立に-O-、-S-、-Si(R*)2-、-N(R*)-、>C=O、-C(=O)-N(R*)-および-N(R*)-C(=O)-から選択される。ビラジカルに含まれていない各R*およびR1(1*)-R7(7*)は独立に、水素、ハロゲン、アジド、シアノ、ニトロ、ヒドロキシ、メルカプト、アミノ、モノまたはジ(C1-6-アルキル)アミノ、場合によって置換されているC1-6-アルコキシ、場合によって置換されているC1-6-アルキル、DNAインターカレーター、光化学的に活性な基、熱化学的に活性な基、キレート基、リポーター基およびリガンドから選択され、かつ/または2つの隣接する(非ジェミナル)R*はともに二重結合を示し、rおよびsのそれぞれが0〜4である。ただし、r+sの和は1〜5である。
以下の実施例において、化合物参照番号は、上記のスキーム1および2に示す化合物を表す。
1,2-O-イソプロピリデン-5-O-メタンスルホニル-4-C-メタンスルホニルオキシメチル-3-O-(p-メトキシベンジル)-α-メトキシベンジル)-α-D-リボフラノース[上のスキーム1における化合物2]の合成
塩化メシル(8.6g、7.5mモル)を無水ピリジン(30cm3)中4-C-ヒドロキシメチル-1,2-O-イソプロピリデン-3-O-p-メトキシベンジル-α-D-リボフラノース[R.Yamaguchi、T.Imanishi、S.Kohgo、H.Horie and H.Ohrui、Biosci.Biotechnol.Biochem.、1999、63、736頁](1、10.0g、29.4mモル)の攪拌溶液に1滴ずつ加え、反応混合物を室温で一夜攪拌した。混合物を減圧下で蒸発乾固し、残留物をトルエン(2×25cm3)で共蒸発し、CH2Cl2(200cm3)に溶解し、NaHCO3飽和水溶液(2×100cm3)と塩水(50cm3)で連続的に洗浄した。有機相を乾燥し(Na2SO4)、ろ過し、減圧下で蒸発乾固した。得られた無色の粘稠油状物をカラムクロマトグラフィー[溶離剤CH2Cl2中0.5〜1%(容量/容量)MeOH]に続いて、MeOHからの結晶化により精製して、フラノース2を白色固体物質(13.6g、93%)として得た。Rf 0.57(CH2Cl2/MeOH 95:5,v/v);δH(CDCl3)7.30(2H,d,J 8.7)、6.90(2H,d,J 8.5)、5.78(1H,d,J 3.7)、4.86(1H,d,J 12.0)、4.70(1H,d,J 11.4)、4.62(1H,dd,J 5.0および3.8)、4.50(1H,d,J 11.1)、4.39(1H,d,J 12.3)、4.31(1H,d,J 11.0)、4.17(1H,d,J 5.1)、4.11(1H,d,J 11.0)、3.81(3H,s)、3.07(3H,s)、2.99(3H,s)、1.68(3H,s)、1.34(3H,s);δc(CDCl3)159.8、129.9、128.8、114.1、114.0、104.5、83.2、78.0、77.9、72.6、69.6、68.8、55.4、38.1、37.5、26.3、25.7。
メチル5-O-メタンスルホニル-4-C-メタンスルホニルオキシメチル-3-O-(p-メトキシベンジル)-D-リボフラノシド[上のスキーム1における化合物3]の合成
H2O(45cm3)とMeOH中15%HCl(450cm3、重量/重量)との混合物中フラノシド2(13.5g、27.2mモル)の懸濁液を室温で72時間にわたり攪拌した。NaHCO3飽和水溶液(100cm3)に続いて、NaHCO3(固体)を加えて混合物を注意深く中和した後、混合物を減圧下で蒸発乾固した。H2O(100cm3)を加え、EtOAc(3×100cm3)を用いて抽出を行った。合わせた有機相を塩水(100cm3)で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、ろ過した後、減圧下で蒸発乾固した。残留物をトルエン(2×25cm3)で共蒸発し、カラムクロマトグラフィー[CH2Cl2中1〜2%(容量/容量)MeOH]により精製して、フラノシド3をアノマー混合物(透明油状物、11/0g、86%、アノマー間比約6:1)として得た。Rf 0.39、0.33(CH2Cl2/MeOH 95:5,v/v);δH(CDCl3,主アノマーのみ)7.28(2H,d,J 8.4)、6.91(2H,d,J 8.9)、4.87(1H,s)、4.62(1H,d,J 11.4)、4.53(1H,d,J 11.2)、4.41(2H,s)、4.31(1H,d,J 9.8)、4.24(1H,d,J 4.6)、4.06(1H,d,J 10.0)、3.98(1H,br s)、3.81(3H,s)、3.33(3H,s)、3.06(3H,s)、3.03(3H,s);δc(CDCl3,主アノマーのみ)160.0、130.1、128.5、114.3、107.8、81.7、81.2、73.8、73.6、69.7、69.6、55.5、55.4、37.5、37.4。
(1R,3RS,4R,7S)-1-メタンスルホニルオキシメチル-3-メトキシ-7-(p-メトキシベンジルオキシ)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.2]ヘプタン[上のスキーム1における化合物4]の合成
0℃の無水DMF(50cm3)中化合物3(10.9g、23.2mモル)のアノマー混合物の攪拌溶液に水素化ナトリウム(2.28gの鉱油中60%(重量/重量)懸濁液、95.2mモル)を10分間にわたって加え、混合物を室温で12時間攪拌した。氷冷H2O(200cm3)を徐々に加え、EtOAc(3×200cm3)を用いて抽出を行った。合わせた有機相をNaHCO3飽和水溶液(2×100cm3)と塩水(50cm3)で連続的に洗浄し、乾燥して(Na2SO4)、ろ過し、減圧下で蒸発乾固した。残留物をカラムクロマトグラフィー[CH2Cl2中0.5〜1%(容量/容量)MeOH]により精製して、最初に主異性体(6.42g、74%)を、次いで[CH2Cl2中1.5%(容量/容量)MeOH]副異性体(1.13g、13%)を両者とも透明油状物として得た。Rf 0.56、0.45(CH2Cl2/MeOH 95:5,v/v);δH(CDCl3,主要異性体)7.16(2H,d,J 8.8)、6.74(2H,d,J 8.4)、4.65(1H,s)、4.42〜4.32(4H,m)、3.95〜3.94(2H,m)、3.84(1H,d,J 7.4)、3.66(3H,s)、3.54(1H,d,J 7.4)、3.21(3H,s)、2.90(3H,s);δc(CDCl3,主要異性体)159.6、129.5、129.3、114.0、105.3、83.2、78.6、77.2、72.1、71.8、66.3、55.6、55.4、37.8;δH(CDCl3,副生異性体)7.27(2H,d,J 8.9)、6.89(2H,d,J 8.6)、4.99(1H,s)、4.63〜4.39(4H,m)、4.19(1H,s)、4.10〜3.94(2H,m)、3.91(1H,s)、3.81(3H,s)、3.47(3H,s)、3.05(3H,s);δc(CDCl3,副生異性体)159.7、129.6、129.5、114.1、104.4、86.4、79.3、77.1、72.3、71.9、66.2、56.4、55.4、37.7。
(1R,4R,7S)-1-アセトキシメチル-3-メトキシ-7-(p-メトキシベンジルオキシ)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン[スキーム1における化合物5]の合成
ジオキサン(25cm3)中フラノシド4(主異性体、6.36g、17.0mモル)の攪拌溶液に18-クラウン-6(9.0g、34.1mモル)とKOAc(8.4g、85.6mモル)を加えた。攪拌混合物を還流下で12時間加熱し、次に、減圧下で蒸発乾固した。残留物をCH2Cl2(100cm3)に溶解し、洗浄をNaHCO3飽和水溶液(2×50cm3)と塩水(50cm3)で連続的に行った。分離した有機相を乾燥し(Na2SO4)、ろ過し、減圧下で蒸発乾固した。残留物をカラムクロマトグラフィー[CH2Cl2中1%(容量/容量)MeOH]により精製して、フラノシド5を白色固体物質(1アノマー、5.23g、91%)を得た。Rf 0.63(CH2Cl2/MeOH 95:5,v/v);δH(CDCl3)7.27〜7.24(2H,m)、6.90〜6.87(2H,m)、4.79(1H,s)、4.61(1H,d,J 11.0)、4.49(2H,m)、4.28(1H,d,J 11.0)、4.04(3H,m)、3.80(3H,s)、3.68(1H,m)、3.36(3H,s)、2.06(3H,s);δc(CDCl3)170.7、159.5、129.5、129.4、113.9、105.1、83.3、78.9、77.2、72.0、71.9、61.0、55.4、55.3、20.8。
(1S,4R,7S)-1-ヒドロキシメチル-3-メトキシ-7-(p-メトキシベンジルオキシ)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン[スキーム1における化合物6]の合成
飽和メタノール性アンモニア(200cm3)中フラノシド5(1アノマー、5.16g、15.3mモル)の溶液を室温で48時間攪拌した。反応混合物を減圧下で蒸発乾固し、トルエン(2×50cm3)で共蒸発し、残留物をカラムクロマトグラフィー[CH2Cl2中2〜3%(容量/容量)MeOH]により精製して、フラノシド6を白色固体物質(1アノマー、3.98g、88%)を得た。Rf 0.43(CH2Cl2/MeOH 95:5,v/v);δH(CDCl3)7.27(2H,d,J 8.6)、6.88(2H,d,J 8.9)、4.79(1H,s)、4.59(1H,d,J 11.3)、4.53(1H,d,J 11.4)、4.09(2H,s)、3.97(1H,d,J 7.5)、3.86(2H,br s)、3.80(3H,s)、3.75〜3.62(2H,m)、3.37(3H,s);δc(CDCl3)159.4、129.7、129.3、113.9、105.2、85.6、78.3、77.4、71.9、71.8、58.8、55.5、55.3。
(1S,4R,7S)-3-メトキシ-7-(p-メトキシベンジルオキシ)-1-(p-メトキシベンジルオキシメチル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン[スキーム1における化合物7]の合成
0℃の無水DMF(50cm3)中フラノシド6(1アノマー、3.94g、13.3mモル)の攪拌溶液にNaHの懸濁液[鉱油中60%(重量/重量)、1.46g、60.8mモル]を加えた後、塩化p-メトキシベンジル(2.74g、17.5mモル)を1滴ずつ加えた。混合物を室温まで加温し、攪拌をさらに4時間継続し、その後、氷冷H2O(50cm3)を1滴ずつ加えた。混合物をCH2Cl2(3×100cm3)で抽出し、合わせた有機相を塩水(100cm3)で洗浄し、乾燥し(Na2SO4)、ろ過し、減圧下で蒸発乾固し、トルエン(3×50cm3)で共蒸発した。残留物(4.71g)を7とアルデヒド11との混合物であると暫定的に特定し、さらに精製せずに11(以下を参照)の調製に用いた。
4-C-メタンスルホニルオキシメチル-3,5-ジ-O-(p-メトキシベンジル)-1,2-O-イソプロピリデン-α-D-リボフラノース[スキーム1における化合物9]の合成
4-C-ヒドロキシメチル-3,5-ジ-O-(p-メトキシベンジル)--1,2-O-イソプロピリデン-α-D-リボフラノース[R.Yamaguchi、T.Imanishi、S.Kohgo、H.Horie and H.Ohrui、Biosci.Biotechnol.Biochem.、1999、63、736頁](8、3.2g、6.95mモル)を、2について述べた手順に従ってMsCl(2.00g、17.5mモル)およびピリジン(10cm3)を用いてメシル化した。処理の後に、無色の粘稠油状物をカラムクロマトグラフィー[CH2Cl2中1%(容量/容量)MeOH]により精製して、誘導体9を透明油状物として89%の収率(3.17g)で得た。Rf 0.45(CH2Cl2/MeOH 98:2,v/v);δH(CDCl3)7.22(2H,d,J 8.9)、7.18(2H,d,J 8.7)、6.86(4H,d,J 8.3)、5.76(1H,d,J 3.8)、4.83(1H,d,J 12.0)、4.64(1H,d,J 11.6)、4.59(1H,m)、4.49〜4.35(4H,m)、4.24(1H,d,J 5.3)、3.80(6H,s)、3.56(1H,d,J 10.5)、3.45(1H,d,J 10.5)、3.06(3H,s)、1.67(3H,s)、1.33(3H,s);δc(CDCl3)159.6、159.4、129.9、129.8、129.7、129.5、129.4、129.3、114.0、113.9、113.8、113.7、113.6、104.5、84.9、78.6、78.1、73.4、72.4、71.0、69.9、55.3、38.0、26.4、25.9。
4-C-メタンスルホニルオキシメチル-3,5-ジ-O-(p-メトキシベンジル)-D-リボフラノース[スキーム1における化合物10]の合成
3の合成について述べた手順に従ってMeOH中15%HCl(重量/重量、120cm3)とH2O(12cm3)の混合物を用いてフラノシド9(3.1g、5.76mモル)のメタノール分解を行った。処理後、粗生成物をカラムクロマトグラフィー[CH2Cl2中0.5〜1%(容量/容量)MeOH]により精製して10の主アノマー(1.71g、58%)と[CH2Cl2中1〜1.5%(容量/容量)MeOH]10の副アノマー(0.47g、16%)を両者とも透明油状物として得た。Rf 0.31、0.24(CH2Cl2/MeOH 98:2,v/v);δH(主アノマー,CDCl3)159.8、159.5、129.9、129.8、129.6、129.5、129.0、114.2、114.1、114.0、113.9、107.9、84.7、79.9、74.2、73.5、73.5、70.2、64.4、55.6、55.4、37.4。
スキーム1における化合物7の別法による調製
フラノシド10(主アノマー、1.68g、3.28mモル)の閉環を4の合成について述べた手順に従って無水DMF(10cm3)中NaH(鉱油中60%懸濁液(重量/重量)、0.32g、13.1mモル)を用いて行い、7とアルデヒド11との混合物であると暫定的に判断された粗生成物を得た(以下を参照)(1.13g)。
(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-3-(p-メトキシベンジルオキシ)-4-(p-メトキシベンジルオキシメチル)-テトラヒドロフラン-2-カルバルデヒド[スキーム1における化合物11]
80%氷酢酸(100cm3)中粗フラノシド7(上述のように調製した11との混合物として)の溶液を50℃で4時間攪拌した。減圧下で溶媒を留出させ、残留物を無水エタノール(3×25cm3)とトルエン(2×25cm3)で連続的に共蒸発し、カラムクロマトグラフィー[CH2Cl2中4〜5%(容量/容量)MeOH]により精製して、アルデヒド11を無色油状物(4.6g)として得た。Rf 0.37(CH2Cl2/MeOH 95:5,v/v);δH(CDCl3)9.64(1H,br s)、7.27〜7.17(4H,m)、6.87〜6.84(4H,m)、4.59(1H,d,J 11.6)、4.51〜4.41(2H,m)、4.35(1H,s)、3.92〜3.90(2H,m)、3.79(6H,s)、3.77〜3.68(3H,m)、3.55(2H,br s);δc(CDCl3)203.6、159.5、159.4、129.7、129.6、129.5、129.2、114.0、113.9、113.8、87.3、86.7、81.0、75.1、73.4、71.6、67.6、55.3。
スキーム2における化合物12a〜eを得るための臭化アリールマグネシウムとアルデヒド11との反応の一般的手順
無水DMF(10cm3)中アルデヒド11(スキーム2)の溶液を、0℃の無水THFに溶解した臭化アリールマグネシウムの攪拌溶液に、5分間にわたって1滴ずつ加えた。混合物を室温まで加熱し、12時間攪拌した。混合物を減圧下で蒸発乾固し、残留物をCH2Cl2で希釈し、NH4Cl飽和水溶液で数回洗浄した。有機相を乾燥し(Na2SO4)、ろ過し、減圧下で蒸発乾固した。得られた粗生成物のカラムクロマトグラフィーによりスキーム2に示した化合物12a〜eを得た。
(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-2-[(R)-ヒドロキシ(フェニル)メチル]-4-(p-メトキシベンジルオキシ)-3-(p-メトキシベンジルオキシメチル)-テトラヒドロフラン[スキーム2の化合物12a]の合成
臭化フェニルマグネシウム(THF中1.0M溶液、14.2cm3、14.2mモル)とアルデヒド11(515mg、1.28mモル)とのグリニャール反応により、スキーム2に示したように12aが得られた。粗生成物をカラムクロマトグラフィー[CH2Cl2中4%(容量/容量)MeOH]により精製して、テトラヒドロフラン12a(540mg、88%)を無色油状物として得た。Rf 0.34(CH2Cl2/MeOH 95:5,v/v);δH(CDCl3)7.40〜7.19(7H,m)、6.91〜6.73(6H,m)、4.73(1H,d,J 6.4)、4.48(2H,s)、4.08(2H,s)、3.88(1H,d,J 9.4)、3.79(1H,m)、3.78(3H,s)、3.76(3H,s)、3.75〜3.69(2H,m)、3.50(1H,d,J 9.4)、3.45(1H,s)、3.42(1H,br s)、3.26(1H,br s);δc(CDCl3)159.5、159.3、140.7、129.7、129.6、129.5、129.2、128.5、128.0、127.3、113.9、113.8、113.7、89.4、84.6、81.8、75.3、74.7、73.5、71.6、69.3、55.3;m/z(FAB)503[M+Na]+、479[M-H]+、461[M-H-H2O]+。
(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-2-[(R)-ヒドロキシ(4-フルオロ-3-メチルフェニル)メチル]-4-(p-メトキシベンジルオキシ)-3-(p-メトキシベンジルオキシメチル)-テトラヒドロフラン[スキーム2の化合物12b]の合成
臭化4-フルオロ-3-メチルフェニルマグネシウム(THF中1.0M溶液、15.0cm3、15.0mモル)とアルデヒド11(603mg、1.5mモル)とのグリニャール反応により、スキーム2に示したように12bが得られた。粗生成物をカラムクロマトグラフィー[CH2Cl2中4〜5%(容量/容量)MeOH]により精製して、テトラヒドロフラン12b(611mg、85%)を無色油状物として得た。Rf 0.34(CH2Cl2/MeOH 95:5,v/v);δH(CDCl3)7.24〜7.12(5H,m)、6.98〜6.84(5H,m)、6.77(1H,d,J 8.5)、4.65(1H,dd,J 2.8および6.4)、4.49(2H,s)、4.15(2H,s)、4.01(1H,dd,J 2.3および6.5)、3.87(1H,d,J 9.3)、3.79(3H,s)、3.78(3H,s)、3.76〜3.68(2H,m)、3.52(1H,s)、3.47(1H,d,J 10.3)、3.42(1H,d,J 2.9)、3.22(1H,s)、2.24(3H,d,J 0.8);δc(CDCl3)162.7、159.5、159.4、136.2、136.1、130.3、130.2、129.7、129.6、129.5、129.4、129.1、126.1、126.0、115.1、114.8、114.0、113.9、113.8、89.3、84.5、81.8、75.3、74.0、73.5、71.7、69.2、55.4、55.3、14.7(d,J 3.9);m/z(FAB)535[M+Na]+、511[M-H]+、493[M-H-H2O]+。
(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-2-[(R)-ヒドロキシ(1-ナフチル)メチル]-4-(p-メトキシベンジルオキシ)-3-(p-メトキシベンジルオキシメチル)-テトラヒドロフラン[スキーム2の化合物12c]の合成
1-ブロモナフタレン(1.55g、7.5mモル)をTHF(10cm3)中マグネシウム切削屑(182mg、7.5mモル)およびヨウ素(10mg)の攪拌混合物に加えた。混合物を40℃で1時間攪拌した後、室温に冷却した。THF(10cm3)中アルデヒド1(603mg、1.5mモル)を徐々に加え、反応物を12時間攪拌した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー[CH2Cl2中4〜5%(容量/容量)MeOH]により精製して、テトラヒドロフラン12c(756mg、95%)を無色油状物として得た。Rf 0.35(CH2Cl2/MeOH 95:5,v/v);δH(CDCl3)8.08(1H,m)、7.86(1H,m)、7.79(1H,d,J 8.2)、7.72(1H,d,J 7.2)、7.49〜7.44(3H,m)、7.18(2H,d,J 8.4)、6.84(2H,d,J 8.6)、6.74(2H,d,J 8.7)、6.68(2H,d,J 8.8)、5.52(1H,dd,J 3.7および5.6)、4.45(2H,s)、4.34(1H,dd,J 2.5および5.9)、4.03(1H,d,J 11.0)、3.96(1H,d,J 11.0)、3.93(1H,d,J 9.5)、3.80(1H,d,J 9.3)、3.77(3H,s)、3.75(1H,d,J 2.6)、3.72(3H,s)、3.68(1H,d,J 9.3)、3.56(1H,d,J 3.7)、3.49(1H,d,J 9.3)、3.34(1H,s);δc(CDCl3)159.5、159.3、136.3、134.0、131.0、129.7、129.6、129.5、129.4、129.0、128.6、128.2、125.6、125.5、123.5、114.0、113.8、113.7、88.7、84.7、81.9、75.5、73.5、71.7、71.3、69.3、55.4、55.3;m/z(FAB)553[M+Na]+、529[M-H]+、511[M-H-H2O]+。
(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-2-[(R)-ヒドロキシ(1-フェニル)メチル]-4-(p-メトキシベンジルオキシ)-3-(p-メトキシベンジルオキシメチル)-テトラヒドロフラン[スキーム2の化合物12d]の合成
化合物12cの合成について述べた手順に従って、アルデヒド11(515mg、1.28mモル)、1-ブロモピレン(1.0g、3.56mモル)、マグネシウム切削屑(155mg、6.4mモル)、ヨウ素(10mg)およびTHF(20cm3)からテトラヒドロフラン12dを合成した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー[CH2Cl2中3〜4%(容量/容量)MeOH]により精製して、テトラヒドロフラン12d(690mg、89%)を淡黄色固体として得た。Rf 0.35(CH2Cl2/MeOH 95:5,v/v);δH(CDCl3)8.23(2H,d,J 8.4および9.2)、8.19〜8.13(3H,m)、8.05〜7.99(4H,m)、7.14(2H,d,J 8.8)、6.82(2H,d,J 9.0)、6.30(2H,d,J 8.7)、6.20(2H,d,J 8.6)、5.87(1H,d,J 7.2)、4.43(2H,s)、4.41(1H,m)、4.01(1H,d,J 9.4)、3.91(1H,d,J 11.8)、3.86(1H,d,J 9.2)、3.77(1H,d,J 1.9)、3.76(3H,s)、3.70〜3.64(3H,m)、3.52〜3.45(1H,m)、3.44(3H,s);δc(CDCl3)159.5、158.9、133.9、131.4、131.1、130.7、.129.7、129.5、129.2、128.9、128.5、127.8、127.7、127.5、126.0、125.5、125.3、125.2、125.1、125.0、124.9、122.9、113.9、113.3、89.5、83.5、82.0、75.7、73.4、71.3、71.0、69.3、55.3、55.0;m/z(MALDI)627[M+Na]+、609[M++Na-H2O]+。
(2S,3R,4S)-4-ヒドロキシ-2-[(R)-ヒドロキシ(2,4,5-トリメチルフェニル)メチル]-4-(p-メトキシベンジルオキシ)-3-(p-メトキシベンジルオキシメチル)-テトラヒドロフラン[スキーム2の化合物12e]の合成
化合物12cの合成について述べた手順に従って、アルデヒド11(515mg、1.28mモル)、1-ブロモ-2,4,5-トリメチルベンゼン(1.28g、6.4mモル)、マグネシウム切削屑(155mg、6.4mモル)、ヨウ素(10mg)およびTHF(20cm3)からテトラヒドロフラン12eを合成した。粗生成物をカラムクロマトグラフィー[CH2Cl2中3〜4%(容量/容量)MeOH]により精製して、テトラヒドロフラン12e(589mg、85%)を無色油状物として得た。Rf 0.34(CH2Cl2/MeOH 95:5,v/v);δH(CDCl3)7.25(2H,d,J 8.7)、7.21(2H,d,J 8.9)、6.90(1H,s)、6.87(1H,s)、6.85(2H,d,J 8.9)、6.76(2H,d,J 8.7)、4.95(1H,dd,J 3.6および5.9)、4.48(2H,s)、4.18〜4.08(3H,m)、3.89(1H,d,J 9.6)、3.80(1H,m)、3.79(3H,s)、3.77(3H,s)、3.71(1H,d,J 9.2)、3.64(1H,d,J 2.6)、3.51(1H,d,J 9.4)、3.24(1H,s)、3.18(1H,d,J 3.4)、2.25(3H,s)、2.22(3H,s)、2.21(3H,s);δc(CDCl3)159.5、159.3、136.0、135.8、134.2、132.5、132.0、129.8、129.7、129.6、129.5、128.5、113.9、113.8、88.6、84.7、81.7、75.4、73.5、71.7、70.9、69.4、55.3、19.5、19.4、19.0;m/z(FAB)545[M+Na]+、521[M-H]+、503[M-H-H2O]+。
スキーム2に示した化合物13a〜eを得るための環化の一般的手順
N,N,N',N'-テトラメチルアゾジカルボキサミド(TMAD)を0℃のベンゼン中スキーム2に示した化合物12a〜eおよびトリブチルホスフィンの攪拌溶液に1回で加えた。混合物を室温で12時間攪拌した後、ジエチルエーテル(50cm3)で希釈した。有機相をNH4Cl飽和水溶液(2×20cm3)と塩水(25cm3)で連続的に洗浄し、乾燥して(Na2SO4)、ろ過し、減圧下で蒸発乾固した。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー[CH2Cl2中1.5〜2%(容量/容量)MeOH]により精製してスキーム2に示した化合物13a〜eを得た。
(1S,3S,4R,7S)-7-(p-メトキシベンジルオキシ)-1-(p-メトキシベンジルオキシメチル)-3-フェニル-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン[スキーム2の化合物13a]
TMAD(310mg、1.8mモル)、PBu3(364mg、1.8mモル)およびベンゼン(10cm3)の存在下での化合物12a(540mg、1.13mモル)の環化の後の一般的処理とカラムクロマトグラフィーにより化合物13aを無色油状物(400mg、77%)として得た。Rf 0.51(CH2Cl2/MeOH 98:2,v/v);δH(CDCl3)7.36〜7.33(7H,m)、7.10(2H,d,J 8.3)、6.88(2H,d,J 8.7)、6.78(2H,d,J 8.7)、5.17(1H,s,H-3)、4.59(2H,br s,-CH2(MPM))、4.43(1H,d,J 11.3,-CH2(MPM))、4.34(1H,d,J 11.3,-CH2(MPM))、4.19(1H,s,H-4)、4.09(1H,d,J 7.7,H-6)、4.06(1H,d,J 7.7,H-6)、4.01(1H,s,H-7)、3.82〜3.77(5H,m,-C1-CH2-O-,OCH3,3.76(3H,s,-OCH3);δc(CDCl3)159.4、159.3、139.4(C-1')、130.3、129.7、129.5、129.3、128.5、127.5、125.4、113.9、113.8、85.9(C-1)、84.1(C-3)、81.1(C-4)、77.4(C-7)、73.7(-CH2(MPM))、73.4(C-6)、71.8(-CH2(MPM))、66.3(-C1-CH2-O-)、55.4(-OCH3)、55.3(-OCH3);m/z(FAB)467[M+Na-H2O]+、461[M-H]+。
(1S,3S,4R,7S)-3-(4-フルオロ-3-メチルフェニル)-7-(p-メトキシベンジルオキシ)-1-(p-メトキシベンジルオキシメチル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン[スキーム2の化合物13b]
TMAD(275mg、1.6mモル)、PBu3(325mg、1.6mモル)およびベンゼン(10cm3)の存在下での化合物12b(540mg、1.13mモル)の環化の後の一般的処理とカラムクロマトグラフィーにより化合物13bを無色油状物(445mg、84%)として得た。Rf 0.52(CH2Cl2/MeOH 98:2,v/v);δH(CDCl3)7.28(2H,d,J 8.7)、7.11(2H,d,J 8.6)、7.08〜7.09(2H,m,H-2'およびH-6')、6.94(1H,dd,J 8.5および9.2,H-5')、6.88(2H,d,J 8.6)、6.79(2H,d,J 8.4)、5.08(1H,s,H-3)、4.62〜4.55(2H,m,-CH2(MPM))、4.45(1H,d,J 11.1,-CH2(MPM))、4.36(1H,d,J 11.6,-CH2(MPM))、4.13(1H,s,H-4)、4.07、4.03(各1H,2d,各J 7.6,H-6)、3.99(1H,s,H-7)、3.81(2H,m,-C1-CH2-O-)、3.80(3H,s,-OCH3,3.77(3H,s,-OCH3)、2.23(3H,d,J 1.6,Ar-CH3);δc(CDCl3)162.3(C-4')、159.4、159.3、134.8、134.7、130.3、129.6、129.5、129.2、128.5、128.4、128.3、124.2、115.1、114.8、113.9、113.8、85.9(C-1)、83.5(C-3)、81.0(C-4)、77.1(C-7)、73.6(-CH2(MPM))、73.4(C-6)、71.8(-CH2(MPM))、66.2(-C1-CH2-O-)、55.4(-OCH3)、55.3(-OCH3)、14.7(d,J 3.3,Ar-CH3);m/z(FAB)494[M]+、493[M-H]+。
(1S,3S,4R,7S)-7-(p-メトキシベンジルオキシ)-1-(p-メトキシベンジルオキシメチル)-3-(1-ナフチル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン[スキーム2の化合物13c]
TMAD(345mg、2.0mモル)、PBu3(405mg、2.0mモル)およびベンゼン(15cm3)の存在下での化合物12c(700mg、1.32mモル)の環化の後の一般的処理とカラムクロマトグラフィーにより化合物13cを無色油状物(526mg、78%)として得た。Rf 0.53(CH2Cl2/MeOH 98:2,v/v);δH(CDCl3)7.91〜7.86(2H,m)、7.78(1H,d,J 8.2)、7.73(1H,d,J 7.1)、7.53〜7.46(3H,m)、7.32(2H,d,J 8.7)、7.04(2H,d,J 8.7)、6.90(2H,d,J 8.3)、6.71(2H,d,J 8.6)、5.79(1H,s,H-3)、4.67〜4.61(2H,m,-CH2(MPM))、4.43(1H,s,H-4)、4.38(1H,d,J 11.2,-CH2(MPM))、4.27(1H,d,J 10.9,-CH2(MPM))、4.16(2H,br s,H-6)、4.08(1H,s,H-7)、3.91、3.87(各1H,2d,各J 11.0,-C1-CH2-O-)、3.81(3H,s,-OCH3)、3.72(3H,s,-OCH3);δc(CDCl3)159.3、134.6(C-1')、133.5、130.3、129.8、129.7、129.4、129.3、128.9、128.1、126.4、125.8、125.6、123.8、122.7、113.9、113.7、85.7(C-1)、82.3(C-3)、79.9(C-4)、78.2(C-7)、73.7(-OCH2(MPM))、73.5(C-6)、71.8(-OCH2(MPM))、66.3(-C1-CH2-O-)、55.4(-OCH3)、55.3(-OCH3);m/z(FAB)512[M]+、511[M-H]+。
(1S,3S,4R,7S)-7-(p-メトキシベンジルオキシ)-1-(p-メトキシベンジルオキシメチル)-3-(1-ピレニル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン[スキーム2の化合物13d]
TMAD(275mg、1.6mモル)、PBu3(325mg、1.6mモル)およびベンゼン(10cm3)の存在下での化合物12d(650mg、1.08mモル)の環化の後の一般的処理とカラムクロマトグラフィーにより化合物13dを淡黄色固体(496mg、79%)として得た。Rf 0.53(CH2Cl2/MeOH 98:2,v/v);δH(CDCl3)8.29(1H,d,J 8.2)、8.18〜8.12(5H,m)、8.08〜8.01(2H,m)、7.96(1H,d,J 7.5)、7.35(2H,d,J 8.5)、6.97(2H,d,J 8.9)、6.92(2H,d,J 8.8)、6.60(2H,d,J 8.8)、6.09(1H,s,H-3)、4.71〜4.65(2H,m,-CH2(MPM))、4.49(1H,s,H-4)、4.34(1H,d,J 11.4,-CH2(MPM))、4.23(1H,d,J 11.1,-CH2(MPM))、4.25(1H,d,J 7.6,H-6)、4.21(1H,d,J 7.8,H-6)、4.16(1H,s,H-7)、3.95〜3.94(2H,m,-C1-CH2-O-)、3.81(3H,s,-OCH3)、3.59(3H,s,-OCH3);δc(CDCl3)159.4、159.3、132.2(C-1')、131.4、130.8、130.7、130.4、129.5、129.4、128.0、127.5、127.4、126.9、126.1、125.6、125.4、124.9、124.8、124.7、123.6、122.0、113.9、113.7、85.9(C-1)、82.7(C-3)、80.6(C-4)、77.9(C7)、73.9(-OCH2(MPM))、73.5(C-6)、71.8(-OCH2(MPM))、66.3(-C1-CH2-O-)、55.4(-OCH3)、55.2(-OCH3);m/z(FAB)587[M+H]+、586[M]+。
(1S,3S,4R,7S)-7-(p-メトキシベンジルオキシ)-1-(p-メトキシベンジルオキシメチル)-3-(2,4,5-トリメチルフェニル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン[スキーム2の化合物13e]
TMAD(275mg、1.6mモル)、PBu3(325mg、1.6mモル)およびベンゼン(10cm3)の存在下での化合物12e(550mg、1.05mモル)の環化の後の一般的処理とカラムクロマトグラフィーにより化合物13eを無色油状物(425mg、80%)として得た。Rf 0.52(CH2Cl2/MeOH 98:2,v/v);δH(CDCl3)7.30(2H,d,J 9.0)、7.24(1H,s,H-6')、7.13(2H,d,J 8.9)、6.89(1H,s,H-3')、6.88(2H,d,J 8.8)、6.79(2H,d,J 8.6)、5.18(1H,s,H-3)、4.64〜4.57(2H,m,-CH2(MPM))、4.46(1H,d,J 11.2,-CH2(MPM))、4.36(1H,d,J 11.5,-CH2(MPM))、4.18(1H,s,H-4)、4.14(1H,s,H-7)、4.09(1H,d,J 7.9,H-6)、4.04(1H,d,J 7.7,H-6)、3.86(2H,s,-C1-CH2-O-)、3.80(3H,s,-OCH3)、3.76(3H,s,-OCH3)、2.21(6H,s,2 x Ar-CH3)、2.17(3H,s,Ar-CH3);δc(CDCl3)159.4、159.3、135.5(C-1')、134.4、134.0、131.7、131.3、130.5、129.9、129.4、129.2、127.2、113.9、113.8、85.6(C-1)、82.4(C-3)、79.4(C-4)、77.6(C-7)、73.5(-OCH2(MPM))、73.4(C-6)、71.8(-OCH2(MPM))、66.3(-C1-CH2-O-)、55.4(-OCH3)、55.3(-OCH3)、19.5(-CH3)、19.3(-CH3)、18.4(-CH3);m/z(FAB)504[M]+、503[M-H]+。
スキーム2に示した化合物14a〜eを得るためのp-メトキシベンジル基の酸化的除去の一般的手順
室温のCH2Cl2(少量のH2Oを含む)中化合物13a〜eの攪拌溶液に2,3-ジクロロ-5,6-ジシアノキノン(DDQ)を加えると、ただちに濃緑色〜黒色を呈し、徐々に退色して淡褐色〜黄色となった。反応混合物を室温で4時間激しく攪拌した。沈殿物をシリカゲルの薄いパッドに通してろ過により除去し、EtOAcで洗浄した。合わせたろ液をNaHCO3飽和水溶液(2×25cm3)と塩水(25cm3)で連続的に洗浄した。分離した有機相を乾燥し(Na2SO4)、ろ過し、減圧下で蒸発乾固した。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー[CH2Cl2中4〜5%(容量/容量)MeOH]により精製して、化合物14a〜eを得た。
(1S,3S,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-3-フェニル-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン[スキーム2の化合物14a]
化合物13a(400mg、0.86mモル)をCH2Cl2(10cm3)とH2O(0.5cm3)との混合物中DDQ(600mg、2.63mモル)で処理した。一般的処理とカラムクロマトグラフィーの後に化合物14aを白色固体物質(128mg、66%)として得た。Rf0.30(CH2Cl2/MeOH 9:1、容積/容積)、δH((CD3)2CO/CD3OD、(CD3)2COを化合物に加えた後、溶液が透明になるまでCD3ODを加えた)7.40〜7.22(5H,m)、4.99(1H,s)、4.09(1H,s)、4.04(1H,s)、4.01(1H,d,7.7)、3.86(1H,d,J 7.7)、3.90(2H,br s)、3.77(2H,br s)、δC((CD3)2CO/CD3OD、(CD3)2COを化合物に加えた後、溶液が透明になるまでCD3ODを加えた)140.0、128.2、127.2、125.4、87.2、83.7、83.5、72.3、70.2、58.4、m/z(FAB)223[M+H]+
(1S,3S,4R,7S)-3-(4-フルオロ-3-メチルフェニル)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン[スキーム2の化合物14b]
化合物13b(400mg、0.81mモル)をCH2Cl2(10cm3)とH2O(0.5cm3)との混合物中DDQ(570mg、2.5mモル)で処理した。一般的処理とカラムクロマトグラフィーの後に化合物14bを白色固体物質(137mg、67%)として得た。Rf 0.31(CH2Cl2/MeOH 9:1,v/v);δH(CD3OD)7.23(1H,d,J 8.1)、7.19(1H,m)、6.99(1H,dd,J 8.5および9.3)、4.99(1H,s)、4.09(1H,s)、4.06(1H,s)、4.03(1H,d,J 7.6)、3.93〜3.91(3H,m)、2.25(3H,d,J 1.4);δc(CD3OD)161.9(d,J 243.3)、136.4(d,J 3.4)、129.6(d,J 5.0)、126.1(d,J 22.8)、125.5(d,J 8.0)、115.7(d,J 22.9)、88.5、85.0、84.3、73.5、71.3、59.4、14.5(d,J 3.7);m/z(FAB)255[M+H]+。
(1S,3S,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-3-(1-ナフチル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン[スキーム2の化合物14b]
化合物13c(475mg、0.93mモル)をCH2Cl2(10cm3)とH2O(0.5cm3)との混合物中DDQ(600mg、2.63mモル)で処理した。一般的処理とカラムクロマトグラフィーの後に化合物14cを白色固体物質(170mg、67%)として得た。Rf0.31(CH2Cl2/MeOH 9:1、容積/容積)、δH(CDCl3/CD3OD、CD3ODを化合物に加えた後、溶液が透明になるまでCDCl3を加えた)7.94〜7.86(2H,m)、7.80〜7.74(2H,m)、7.55〜7.46(3H,m)、5.74(1H,s)、4.56(2H,br s)、4.37(1H,s)、4.24(1H,s)、4.17〜4.11(2H,m)、4.04(2H,br s)、δC(CDCl3/CD3OD、CD3ODを化合物に加えた後、溶液が透明になるまでCDCl3を加えた)134.7、134.0、130.2、129.3、128.6、126.8、126.2、125.8、123.8、122.8、87.4、83.1、82.2、73.1、71.5、59.0、m/z(FAB)273[M+H]+、272[M]+
(1S,3S,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-3-(1-ピレニル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン[スキーム2の化合物14d]
化合物13d(411mg、0.7mモル)をCH2Cl2(10cm3)とH2O(0.5cm3)との混合物中DDQ(570mg、2.5mモル)で処理した。一般的処理とカラムクロマトグラフィーの後に化合物14dを白色固体物質(182mg、75%)として得た。Rf0.32(CH2Cl2/MeOH 9:1、容積/容積)、δH(CDCl3/CD3OD、CD3ODを化合物に加えた後、溶液が透明になるまでCDCl3を加えた)8.32(1H,d,J 7.8)、8.23〜8.18(5H,m)、8.06(2H,br s)、8.01(1H,d,J 7.6)、6.06(1H,s)、4.47(1H,s)、4.36(1H,s)、4.27〜4.18(2H,m)、4.10(2H,br s)、δC(CDCl3/CD3OD)132.2、131.0、128.5、127.8、127.3、126.5、125.9、125.7、125.1、123.6、122.1、87.7、83.7、82.6、73.1、71.4、58.9、m/z(FAB)347[M+H]+、346[M]+
(1S,3S,4R,7S)-7-ヒドロキシ-1-ヒドロキシメチル-3-(2,4,5-トリメチルフェニル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン[スキーム2の化合物14e]
化合物13e(355mg、0.7mモル)をCH2Cl2(10cm3)とH2O(0.5cm3)との混合物中DDQ(570mg、2.5mモル)で処理した。一般的処理とカラムクロマトグラフィーの後に化合物14eを白色固体物質(120mg、65%)として得た。Rf0.31(CH2Cl2/MeOH 9:1、容積/容積)、δH(CDCl3/CD3OD、CD3ODを化合物に加えた後、溶液が透明になるまでCDCl3を加えた)7.23(1H,s)、6.92(1H,s)、5.14(1H,s)、4.26(1H,s)、4.10(1H,s)、4.08(1H,d,J 7.7)、4.00〜3.95(3H,m)、2.23(6H,s)、2.21(1H,s)、δC(CDCl3/CD3OD、CD3ODを化合物に加えた後、溶液が透明になるまでCDCl3を加えた)135.6、133.9、133.8、131.7、131.2、126.6、86.6、82.1、81.9、72.3、70.6、58.5、19.2、19.0、18.1、m/z(FAB)265[M+H]+、264[M]+
化合物14aからeをジメトキシトリチル化して、スキーム2に示す化合物15aからeを得る一般的な手順
塩化4,4'-ジメトキシトリチル(DMTCl)を化合物14aからeの無水ピリジン中の攪拌溶液に一度に加えた。混合物を室温で4時間攪拌した後、メタノール(0.2cm3)を加え、生じた混合物を減圧下で蒸発乾固した。残留物を無水CH3CN(2×5cm3)および無水トルエン(2×5cm3)で共蒸発し、その後CH2Cl2(20cm3、微量の酸は塩基性アルミナの短いパッドでろ過することによって除去した)に溶解した。生じた溶液をNaHCO3飽和水溶液(2×10cm3)および塩水(10cm3)で連続的に洗浄した。分離された有機相を乾燥し(Na2SO4)、ろ過し、減圧下で蒸発乾固した。得られた粗生成物をカラムクロマトグラフィー[CH2Cl2中の0.25から0.50%(v/v)MeOH、0.5%のEt3Nを含む]により精製して化合物15aからeを得た。
(1R,3S,4R,7S)-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-7-ヒドロキシ-3-フェニル-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン[スキーム2の化合物15a]
無水ピリジン(2cm3)中のDMTCl(214mg、0.63mmol)を使用した化合物14a(108mg、0.49mmol)のジメトキシトリチル化、次いで一般的な後処理手順およびカラムクロマトグラフィーにより、化合物15aを白色固体物質(180mg、71%)として得た。Rf 0.31(CH2Cl2/MeOH 98:2,v/v);δH(CDCl3)7.66〜7.21(14H,m)、6.84(4H,d,J 8.8)、5.19(1H,s)、4.29(1H,s)、4.13(1H,s)、4.07(1H,d,J 8.4)、4.01(1H,d,J 8.3)、3.78(6H,s)、3.55(1H,d,J 10.2)、3.50(1H,d,J 10.7)、2.73(1H,br s);δc(CDCl3)158.6、149.8、144.9、139.4、136.2、135.9、135.8、130.3、130.2、128.5、128.3、128.0、127.6、126.9、125.4、123.9、113.3、86.4、86.0、83.8、83.4、73.0、71.6、60.2、55.3;m/z(FAB)525[M+H]+、524[M]+。
(1R,3S,4R,7S)-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-3-(4-フルオロ-3-メチルフェニル)-7-ヒドロキシ-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン[スキーム2の化合物15b]
無水ピリジン(2cm3)中のDMTCl(129mg、0.42mmol)を使用した化合物14b(95mg、0.38mmol)のジメトキシトリチル化、次いで一般的な後処理手順およびカラムクロマトグラフィーにより、化合物15bを白色固体物質(126mg、61%)として得た。Rf 0.32(CH2Cl2/MeOH 98:2,v/v);δH(CDCl3)7.53〜7.15(11H,m)、6.97(1H,dd,J 8.7および8.9)、6.84(4H,d,J 8.8)、5.11(1H,s)、4.26(1H,d,J 3.9)、4.08(1H,s)、4.03(1H,d,J 8.0)、3.95(1H,d,J 8.0)、3.78(6H,s)、3.54(1H,d,J 10.5)、3.47(1H,d,J 10.1)、2.26(3H,d,J 1.5)、2.08(1H,br s);δc(CDCl3)160.8(d,J 244.1)、158.7、144.9、135.9、134.7、134.6、130.3、130.2、130.1、128.5、128.4、128.3、128.0、127.0、125.2、124.9、124.4、124.3、115.2、114.9、113.4、86.5、86.0、83.7、83.0、72.9、71.7、60.1、55.3、14.8(d,J 3.1);m/z(FAB)556[M]+。
1R,3S,4R,7S)-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-7-ヒドロキシ-3-(1-ナフチル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン[スキーム2の化合物15c]
無水ピリジン(2cm3)中のDMTCl(170mg、0.5mmol)を使用した化合物14c(125mg、0.46mmol)のジメトキシトリチル化、次いで一般的な後処理手順およびカラムクロマトグラフィーにより、化合物15c(158mg、60%)を白色固体物質として得た。Rf 0.35(CH2Cl2/MeOH 98:2,v/v);δH(CDCl3)7.95〜7.86(3H,m)、7.79(1H,d,J 8.3)、7.58〜7.41(9H,m)、7.35〜7.23(3H,m)、6.86(4H,d,J 8.8)、5.80(1H,s)、4.36(1H,s)、4.32(1H,d,J6.5)、4.17(1H,d,J 8.3)、4.06(1H,d,J 8.0)、3.78(6H,s)、3.62〜3.56(2H,m)、2.00(1H,d,J 6.6);δc(CDCl3)158.7、144.9、136.0、135.9、134.5、133.6、130.3、129.8、129.0、128.3、128.2、128.1、127.0、126.5、125.9、125.6、123.9、122.6、113.4、86.6、85.7、82.5、81.7、73.1、72.6、60.2、55.3;m/z(FAB)575[M+H]+、574[M]+。
(1R,3S,4R,7S)-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-7-ヒドロキシ-3-(1-ピレニル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン[スキーム2の化合物15d]
無水ピリジン(2cm3)中のDMTCl(140mg、0.42mmol)を使用した化合物14d(130mg、0.38mmol)のジメトキシトリチル化、次いで一般的な後処理手順およびカラムクロマトグラフィーにより、化合物15dを白色固体物質(147mg、61%)として得た。Rf 0.37(CH2Cl2/MeOH 98:2,v/v);δH(CDCl3)8.46(1H,d,J 8.0)、8.19〜8.00(7H,m)、7.61(2H,dd,J 1.6および7.4)、7.48(4H,d,J 8.3)、7.35(2H,dd,J 7.2および7.5)、7.25(1H,m)、7.15(1H,m)、6.88(4H,d,J 9.0)、6.10(1H,s)、4.46(1H,s)、4.43(1H,br s)、4.25(1H,d,J 8.1)、4.12(1H,d,J 8.1)、3.79(6H,s)、3.71〜3.63(2H,m)、2.22(1H,br s);δc(CDCl3)158.7、149.8、144.9、136.1、136.0、135.9、132.1、131.4、130.9、130.6、130.3、130.2、129.2、129.1、128.4、128.3、128.2、128.1、127.5、127.4、127.0、126.9、126.2、125.5、125.4、124.9、124.8、124.7、123.8、123.7、121.9、113.4、86.6、86.1、83.2、82.2、73.2、72.4、60.3、55.3;m/z(FAB)649[M+H]+、648[M]+。
(1R,3S,4R,7S)-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-7-ヒドロキシ-3-(2,4,5-トリメチルフェニル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン[スキーム2の化合物15e]
無水ピリジン(2cm3)中のDMTCl(113mg、0.33mmol)を使用した化合物14e(80mg、0.3mmol)のジメトキシトリチル化、次いで一般的な後処理手順およびカラムクロマトグラフィーにより、化合物15eを白色固体物質(134mg、78%)として得た。Rf 0.32(CH2Cl2/MeOH 98:2,v/v);δH(CDCl3)7.55(2H,d,J 7.9)、7.45〜7.42(4H,m)、7.32〜7.21(4H,m)、6.93(1H,s)、6.84(4H,d,J 8.2)、5.20(1H,s)、4.40(1H,s)、4.08(1H,s)、4.04(1H,d,J 8.3)、3.95(1H,d,J 8.2)、3.78(6H,s)、3.56(1H,d,J 10.5)、3.47(1H,d,J 10.2)、2.24(3H,s)、2.22(3H,s)、2.19(3H,s);δc(CDCl3)158.6、145.0、136.0、135.7、134.4、134.2、131.8、131.3、130.3、130.2、128.3、128.0、127.2、126.9、113.3、86.4、85.7、82.1、81.8、73.0、71.8、60.2、55.3、19.6、19.3、18.4;m/z(FAB)567[M+H]+、566[M]+。
スキーム2に示すホスホルアミダイト誘導体16aからeの一般的な合成手順
2-シアノエチルN,N'-ジイソプロピルホスホルアミドクロリダイトを無水CH2Cl2中のヌクレオシド15aからeとN,N-ジイソプロピルエチルアミン(DIPEA)の攪拌溶液に室温で1滴ずつ加えた。混合物を室温で6時間攪拌した後、メタノール(0.2cm3)を加え、生じた混合物をEtOAc(20cm3、0.5%のEt3N、v/vを含む)で希釈した。有機相をNaHCO3飽和水溶液(2×10cm3)および塩水(10cm3)で連続的に洗浄した。分離された有機相を乾燥し(Na2SO4)、ろ過し、減圧下で蒸発乾固した。得られた残留物をカラムクロマトグラフィー[n-ヘキサン中の25から30%(v/v)EtOAc、0.5%のEt3Nを含む]により精製してアミダイト16aからeを得た。
(1R,3S,4R,7S)-7-[2-シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィンオキシ]-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-3-フェニル-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン[スキーム2の化合物16a]の合成
DIPEA(0.4cm3)および無水CH2Cl2(2.0cm3)の存在下における、2-シアノエチルN,N-ジイソプロピルホスホルアミドクロリダイト(85mg、0.36mmol)を用いた化合物15a(170mg、0.32mmol)の処理、次いで一般的な後処理手順およびカラムクロマトグラフィーにより、ホスホルアミダイト16aを白色固体物質(155mg、66%)として得た。Rf0.45、0.41(CH2Cl2/MeOH 98:2、v/v);δp(CDCl3)149.3、148.9。
(1R,3S,4R,7S)-7-[2-シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィンオキシ]-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-3-(4-フルオロ-3-メチルフェニル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン[スキーム2の化合物16b]の合成
DIPEA(0.3cm3)および無水CH2Cl2(2.0cm3)の存在下における、2-シアノエチルN,N'-ジイソプロピルホスホルアミドクロリダイト(53mg、0.22mmol)を用いた化合物15b(95mg、0.17mmol)の処理、次いで一般的な後処理手順およびカラムクロマトグラフィーにより、ホスホルアミダイト16bを白色固体物質(85mg、66%)として得た。Rf0.45、0.41(CH2Cl2/MeOH 98:2、v/v);δp(CDCl3)149.3、148.8。
(1R,3S,4R,7S)-7-[2-シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィンオキシ]-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-3-(1-ナフチル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン[スキーム2の化合物16c]の合成
DIPEA(0.4cm3)および無水CH2Cl2(2.0cm3)の存在下における、2-シアノエチルN,N'-ジイソプロピルホスホルアミドクロリダイト(75.7mg、0.32mmol)を用いた化合物5c(158mg、0.28mmol)の処理、次いで一般的な後処理手順およびカラムクロマトグラフィーにより、ホスホルアミダイト16cを白色固体物質(127mg、60%)として得た。Rf0.47、0.44(CH2Cl2/MeOH 98:2、v/v);δp(CDCl3)149.2、149.1。
(1R,3S,4R,7S)-7-[2-シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィンオキシ]-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-3-(1-ピレニル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン[スキーム2の化合物16d]の合成
DIPEA(0.3cm3)および無水CH2Cl2(2.0cm3)の存在下における、2-シアノエチルN,N'-ジイソプロピルホスホルアミドクロリダイト(64mg、0.27mmol)を用いた化合物15d(140mg、0.22mmol)の処理、次いで一般的な後処理手順およびカラムクロマトグラフィーにより、ホスホルアミダイト16dを白色固体物質(124mg、68%)として得た。Rf0.51、0.47(CH2Cl2/MeOH 98:2、v/v);δp(CDCl3)149.4、149.1。
(1R,3S,4R,7S)-7-[2-シアノエトキシ(ジイソプロピルアミノ)ホスフィンオキシ]-1-(4,4'-ジメトキシトリチルオキシメチル)-3-(2,4,5-トリメチルフェニル)-2,5-ジオキサビシクロ[2.2.1]ヘプタン[スキーム2の化合物16e]の合成
DIPEA(0.3cm3)および無水CH2Cl2(2.0cm3)の存在下における、2-シアノエチルN,N'-ジイソプロピルホスホルアミドクロリダイト(64mg、0.27mmol)を用いた化合物15e(130mg、0.23mmol)の処理、次いで一般的な後処理手順およびカラムクロマトグラフィーにより、ホスホルアミダイト16eを白色固体物質(111mg、63%)として得た。Rf0.44、0.42(CH2Cl2/MeOH 98:2、v/v);δp(CDCl3)149.0。
オリゴヌクレオチドの合成、脱保護および精製
すべてのオリゴマーは、CPG固体支持体(BioGenex)上、0.2molスケールで、Biosearch 8750 DNA合成機でホスホルアミダイト手法を使用して調製した。ホスホルアミダイト16aからc(カップリング時間10分)およびホスホルアミダイト16dと16e(カップリング時間20分)の段階的なカップリング効率は>96%であり、非修飾デオキシヌクレオシドおよびリボヌクレオシドホスホルアミダイト(標準のカップリング時間)では一般に>99%であり、すべての場合で1Hテトラゾールを活性剤として使用した。32%のアンモニア水溶液を使用して(12時間、55℃)標準の脱保護および固体支持体からの切断を行った後、オリゴマーをエタノール沈殿により精製した。オリゴマーの組成をMALDI-MS分析で、純度を(>80%)をキャピラリーゲル電気泳動によって確認した。選択したMALDI-MSデータ([M-H]-;実測/計算:ON3 2731/2733、ON4 2857/2857、ON6 3094/3093)。
熱変性の調査
熱変性実験は、PTP-6ペルチエ温度プログラミング素子を取り付けたPerkin-Elmer UV/VISスペクトロメーターで、塩緩衝液(10mMのリン酸ナトリウム、100mMの塩化ナトリウム、0.1mMのEDTA、pH7.0)の媒体を使用して行った。修飾および非修飾オリゴヌクレオチドの吸光係数が同一であると仮定して、2本の相補性な鎖の濃度1.5mMを使用した。温度を1℃/分の速度で上昇させながら、吸光度を260nmでモニターした。2重鎖の融解温度(Tm値)は、得られた融解曲線の1次導関数の最大値として決定した。
化合物16aから16eおよびモノマー17aから17eを含むオリゴマーの合成
誘導体17aから17e(図1、表1、スキーム1、スキーム2)を含むLNAを合成し、これらはすべて、locked C3'-エンドRNA様フラノースの立体配座をとることで知られているLNA型2'-O,4'-C-メチレン-β-D-リボフラノシル部分に基づいている[S.Obika、D.Nanbu、Y.Hari、K.Morio、Y.In、T.Ishida、およびT.Imanishi、Tetrahedron Lett.、1997、38、8735;S.K.Singh、P.Nielsen、A.A.KoshkinおよびJ.Wengel、Chem.Commun.、1998、455;A.A.Koshkin、S.K.Singh、P.Nielsen、V.K.Rajwanshi、R.Kumar、M.Meldgaard、C.E.OlsenおよびJ.Wengel、Tetrahedron、1998、54、3607;S.Obika、D.Nanbu、Y.Hari、J.Andoh、K.Morio、T.DoiおよびT.Imanishi、Tetrahedron Lett.、1998、39、5401]。LNA型アリールC-グリコシド17aから17eの取り込みに適しているホスホルアミダイト構築ブロック16aから16eの合成は、スキーム1およびスキーム2に示されており、実験セクションで詳述されている。適切な合成経路の設計において、最近文献に記載された反応に類似の反応を利用することに決めた。したがって、アルデヒド11(スキーム2)の2つのp-メトキシベンジル基ではなく、2つのO-ベンジル基を有する、アルデヒド11(スキーム2)に対応するアルデヒドのカルボニル基に対する様々な複素環のグリニャール試薬の立体選択的な攻撃により、locked-C-ヌクレオシドが供給されることが報告されている[S.Obika、Y.Hari、K.MorioおよびT.Imanishi、Tetrahedron Lett.、2000、41、215;S.Obika、Y.Hari、K.MorioおよびT.Imanishi、Tetrahedron Lett.、2000、41、221]。本発明で選択した合成経路の主要な中間体、すなわち新規アルデヒド11は、2つの異なる経路に従って、既知のフラノシド1から合成した[R.Yamaguchi、T.Imanishi、S.Kohgo、H.HorieおよびH.Ohrui、Biosci.Biotechnol.Biochem.、1999、63、736]。一般に、その後の段階(すなわち13→14)でのベンジル保護の除去によっても、例えば化合物13および14(スキーム2)内に存在するベンジルのO-C結合の切断が生じる可能性があるので、O-ベンジル保護ではなくO-(p-メトキシ)ベンジル保護が望ましい。アルデヒド11を得る一経路では、フラノシド1の位置選択的なp-メトキシベンジル化、次いでメシル化およびメタノリシスにより、メチルフラノシド9のアノマー混合物が得られた。塩基で誘起した環状化、次いでアセチル加水分解により、1(スキーム1およびスキーム2)から約24%の全収率でアルデヒド11が得られた。この収率は、異なる戦略に従った場合に比べて向上していた。したがって、1のジ-O-メシル化、次いでメタノリシスおよび塩基で誘起した2-OH基からの分子内求核攻撃により、環状化したメチルフラノシド4のアノマー混合物が得られた。4の残りのメシルオキシ基を酢酸基で置換し、次いで脱アセチル化、p-メトキシベンジル化、その後アセチル加水分解することにより、所要のアルデヒド11(スキーム1)が得られた。
ハイブリダイゼーション特性を評価するための熱変性調査
中心塩基が4種の天然塩基のそれぞれである4種の9量体DNA標的に対する、オリゴヌクレオチドON1からON11(以下の表1)のハイブリダイゼーションを、熱変性実験によって調査した(Tmの測定;詳細は実験セクションを参照のこと)。参照DNAのON1と比較すると、1種の非塩基性LNAモノマーAbLの導入(ON2)によって、0℃より高い温度で安定な2重鎖の形成が阻止されることが、以前に報告されている(対向塩基としてアデニンのみでしか評価していない)[L.KvaernoおよびJ.Wengel、Chem.Commun.、1999、657]。フェニルモノマー17a(ON3)では、5から12℃の範囲のTm値が観察された。このように、フェニル部分はAbLと比較して2重鎖を安定化させるが、相補性標的鎖内の中心アデニン塩基に対して優先度が示されていることから(表1)、万能的なハイブリダイゼーションは達成されていない。さらに、ON1:参照DNA2重鎖と比較して有意な不安定化が観察された。ON3と同配列であるが中心モノマーとして17aの代わりに17b、17cまたは17eを含むオリゴマー(表1、それぞれON7、ON8およびON9)では、ON3で得られた結果と類似の結果が得られた。
RNA様鎖におけるピレンLNAユニットの影響
ON5、ON6、ON10およびON11(上記表1参照)を合成した。前者は完全に2'-OMe-RNAモノマーからなっており、後者3つは6個の2'-OMe-RNAモノマー(図1参照)、2個のLNAチミンモノマーTL(図1参照)、および1個の中心LNAピレンモノマー17d(オリゴマーON6)または1個の中心モノマー17b(ON10)もしくは17c(ON11)からなっている。ON6に対応するが3個のTLモノマーを有する配列が、非常に高い熱安定性の相補DNAと2重鎖を形成することが以前に示されている。したがってON6は、高親和性モノマーを万能塩基の周りに導入した際の影響を評価するのに適している。表1で見られるように、2'-OMe-RNAの参照ON5は、熱安定性がわずかに増加し、かつワトソン-クリックの識別が保存されて(参照DNAのON1と比較して)、DNA相補体と結合する。実際、LNA/2'-OMe-RNAキメラON6は、4つのTm値(37、38、39および40℃)から明らかになったように、万能的なハイブリダイゼーションの挙動を示す。ON6で得られた4つのTm値はすべて、2つの完全に相補性な参照2重鎖ON1:DNA(Tm=28℃)およびON5:DNA(Tm=35℃)で得られたTm値より高い。
ハイブリダイゼーションプローブにおける塩基対合の選択性
塩基対合の選択性を決定するために、ON6(表2)を用いた系統的な熱変性調査を行った。上記表1に示した調査で使用した4種のDNA相補体(DNA標的鎖、モノマーY=A、C、GまたはT)のそれぞれについて、中心ピレンLNAモノマー17dを含むON6を、ON6の3'末端側の隣接位置に4種の塩基の組合せがあるものすべて(DNA標的鎖、モノマーZ=A、C、GまたはT、モノマーX=T)、および同様にON6の5'末端側にあるもの(DNA標的鎖、モノマーX=A、C、GまたはT、モノマーZ=T)とハイブリダイズさせた。4つのデータポイントの8つのサブセットすべてで、一致したものと3つのミスマッチとの間で十分から優れたワトソン-クリック識別が観察された(以下の表2、ΔTm値は5から25℃の範囲内である)。
キメラオリゴヌクレオチド
これらのキメラオリゴヌクレオチドは、様々な主鎖に付着しているピレンおよび他の既知の万能塩基(例えばLNA型ユニット、リボフラノースユニット、またはデオキシリボースユニット、あるいは2'-OMe-RNA/LNAオリゴ内のキシロースユニットなど他の糖ユニット)からなっている。これらキメラオリゴヌクレオチドを用いた実験は、PyLをピレニル-2'-OMe-リボヌクレオチドモノマーで置換することによって2'-OMe-RNA/LNAオリゴON6に類似の結果が得られることの可能性を評価するためである。
ピレン-LNA-アンカーオリゴ(T)プライミング(T-20VNアンカープライマー)を使用した、改良した逆転写
真核細胞由来の無処置のmRNAを単離し、次いでポリ(A)+mRNAを2本鎖の相補DNA(cDNA)に変換することは、例えばノーザンブロット分析または発現マイクロアッセイを使用したRT-PCR、完全長cDNAのクローニングおよび配列決定、発現クローニング、EST配列決定、ならびに発現プロファイル作成を含めたいくつかの分子生物学的な用途に重要な手段である。ほとんどの真核細胞mRNAは、その3'末端にいわゆるポリ(A)テールを形成するポリアデニル酸ユニット域(tract)を有する。mRNAの単離は、ポリ(A)テールが高塩基濃度条件下で、オリゴ(dT)セルロースなどの基質上に結合されたオリゴ-dTと安定なdT-A塩基対を形成する能力に依存している。ポリアデニル化されたmRNAは、オリゴ(dT)セルロースを充填したカラムでのアフィニティークロマトグラフィーで、バッチ結合および溶出によって、またはオリゴ(dT)をコーティングした磁気粒子に結合させることによって、全RNA調製物から選択することができる。基質または粒子の洗浄に次いで、TE緩衝液またはジエチルピロカルボネートで処理した水を用いてポリ(A)+RNAを溶出させる。第1鎖cDNAは、RNA依存性DNAポリメラーゼ、いわゆる逆転写酵素(RT)によって、ポリ(A)+RNAを鋳型として使用し、典型的にはオリゴ(dT)オリゴヌクレオチドをプライマーとして使用して合成する。
第1鎖cDNAの合成における、ピレン-LNA-アンカーオリゴ(T)20(T-20-VNアンカープライマー)を使用した、改良した逆転写
A.全RNA鋳型
10から20mgの全RNA
5mgの本発明のアンカーオリゴ(T)プライマー(ON12またはON13またはON14またはON15、表3)
DEPC水、最終体積12mlまで
あるいは
B.ポリ(A)+RNA鋳型
1から5mgのポリ(A)+RNA
5mgの本発明のアンカーオリゴ(dT)プライマー(ON12またはON13またはON14またはON15、表3)
DEPC水、最終体積12mlまで
逆転写における、ピレン-LNA-アンカーオリゴ(T)20プライマーを使用した、トレハロースで刺激する第1鎖cDNAの改良した合成
A.全RNA鋳型
10から20mgの全RNA
5mgの本発明のオリゴ(T)プライマー(ON12またはON13またはON14またはON15、表3)
DEPC水、最終体積9mlまで
あるいは
B.ポリ(A)+RNA鋳型
1から5mgのポリ(A)+RNA
5mgの本発明のアンカーオリゴ(dT)プライマー(ON12またはON13またはON14またはON15、表3)
DEPC水、最終体積9mlまで。
ステップ2:降温:1分間で35℃まで下げる(勾配アニーリング)
ステップ3:35℃、2分間(完全なアニーリング)
ステップ4:45℃、5分間
ステップ5:昇温:+0.1℃/秒で+15℃(60℃まで)
ステップ6:55℃、2分間
ステップ7:60℃、2分間
ステップ8:さらに10回ステップ6へ進む
ステップ9:+4℃、同様
ピレン-LNA-アンカーオリゴ(T)20プライマーを使用した、第1鎖cDNAの改良した蛍光色素標識化
A.全RNA鋳型
10から20mgの全RNA
5mgの本発明のアンカーオリゴ(T)プライマー(ON12またはON13またはON14またはON15、表4)
DEPC水、最終体積8mlまで
あるいは
B.ポリ(A)+RNA鋳型
1mgのポリ(A)+RNA
5mgの本発明のアンカーオリゴ(T)プライマー(ON12またはON13またはON14またはON15、表4)
DEPC水、最終体積8mlまで。
縮重ピレン-LNA-修飾PCRプライマーを使用したタンパク質および酵素ファミリーのスクリーニングおよびクローニング
ほとんどのタンパク質および酵素は、その一次配列に基づいて、限られた数のファミリーに分類することができる。ある特定のファミリーに属するタンパク質またはタンパク質ドメインは、一般に機能性質を共有しており、共通の祖先から派生している。タンパク質配列のファミリーを調査する際、進化の間に一部の領域が他の領域よりもよく保存されていることは明らかである。一般にこれらの領域は、タンパク質の機能および/またはその三次元構造の維持に重要である。このような類似配列群の定常および可変特性を分析することによって、所定のタンパク質ファミリーまたはドメインに、そのメンバーを関連しない他のすべてのタンパク質から識別するシグネチャーを導くことが可能である。新しく同定かつ配列決定されたタンパク質を特定のタンパク質または酵素ファミリーに割り当てるためにシグネチャー配列を使用することができるが、これらの保存されたシグネチャーはまた、原核生物、古細菌および真核生物の幅広い様々な種において関連するタンパク質または酵素についてスクリーニングするのに使用できる、縮重オリゴヌクレオチドプローブの設計において非常に有用な基礎を形成する。
1.レトロウイルスアスのパルチルプロテアーゼ(登録番号PF00077)
2.例えばラットmapキナーゼerk2など真核細胞タンパク質キナーゼ内のタンパク質キナーゼドメイン(登録番号PF00069)
3.C型肝炎ウイルスの非構造的なタンパク質キナーゼE2/NS1(登録番号PF01560)
4.古細菌のATPase(登録番号PF01637)
5.ホメオボックスに関連するロイシンジッパー(PF02183)
6.アポトーシス阻止タンパク質(PF02331)
7.DNA修復タンパク質キナーゼrad10(PF03834)
8.グリコヒドロラーゼファミリー11(PF00457)
9.グリコヒドロラーゼファミリー12(PF01670)
ピレン-LNA修飾縮重オリゴヌクレオチドプライマーを使用した、細菌、古細菌および真菌由来のグリコヒドロラーゼファミリー45遺伝子のPCRスクリーニング
1A.グリコヒドロラーゼファミリー45中の保存されたシグネチャーアミノ酸配列に対応するピレン-LNA修飾縮重PCRプライマーの設計
グリコヒドロラーゼファミリー45に属する酵素配列を表す、Pfam Protein family database of alignments and Hidden Markov Models(ウェブアドレス:http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/browse/top_twenty.shtml)の30エントリーの複数の配列アラインメントを使用して、この酵素ファミリー内の2つの高度に保存されている領域を特定した。これらのシグネチャー配列を、細菌、古細菌および真菌などの生物試料でグリコヒドロラーゼファミリー45遺伝子をスクリーニングするためのオリゴヌクレオチドプライマーを含む2つの縮重ピレン-LNAの設計における基礎として使用した。
DNeasy Tissue KitまたはDNeasy Plant Kitを使用して製造者の指示に従って(Qiagen、米国)、あるいはFastDNA KitまたはFastDNA Kit for soilおよびFastPrep FP120装置を使用して製造者の指示に従って(Q-BIOgene、米国)、生物試料由来のゲノムDNAを単離した。
RNaseを含まない微量遠心管(Ambion、米国)で以下を混合する。
A.全RNA鋳型
0.1から1mgの全RNA
5mgのアンカーオリゴ(dT)プライマー(20TVN)
DEPC最終体積8mlまで、
あるいは
B.ポリ(A)+RNA鋳型
10から100ngのポリ(A)+RNA
5mgのアンカーオリゴ(dT)プライマー(20TVN)
5mgのランダムpd(N)6プライマー
DEPC最終体積8mlまで。
1μLのSuperasin(RNAse阻害剤、20U/μL、Ambion)
4μLの5×RT緩衝液(Invitrogen)
2μLの0.1M DTT(Invitrogen)
1μLのdNTP(20mMのdATP、dGTP、dTTP、dCTP、Pharmacia)
1μLのSuperscript II RT(Invitrogen、200U/ml)、よく混合する(気泡が生じないように)。
最適のDNAポリメラーゼを使用した標準的なPCR増幅を組み立てる(以下の例は、InvitrogenからのPfx DNAポリメラーゼで使用する)。
1から5μLの鋳型(上記RT-PCR反応から)または100から200ngのゲノムDNA
5μLの10×Pfx緩衝液
1μLのMgSO4
5μLのdNTP混合物(それぞれ2mMのdATP、dCTP、dGTP、およびdTTP、Pharmacia、米国)
1μLの順方向プライマー(10から20μMのON16またはON17またはON18、表5)
1μLの逆方向プライマー(10から20μMのON19REVまたはON20REVまたはON21REV、表5)
0.5μLのPfx
H2O→最終体積50μL
94℃、5分間
(94℃/1分間、50℃/1分間、68℃/2分間)を40サイクル
10℃、無期限
クローニングしたPCR断片のヌクレオチド配列を、50から150ngのプラスミド鋳型、Taqデオキシターミナルサイクル配列決定キット(Perkin-Elmer、米国)、蛍光標識したターミネーター、および5pmolのM13順方向もしくは逆方向プライマー(Invitrogen、米国)または合成オリゴヌクレオチドプライマーを使用したジデオキシチェーンターミネーション法(Sanger、Nicklen、およびCoulson、1977、PNAS,USA、74:5463-5467)によって決定した。配列データの分析は、Devereux他(Devereux,J.、Haeberli,P.、およびSmithies,O.、(1984)、Nucleic Acids Res.、12、387-395)に従って行った。
Claims (110)
(b)前記標的分子を鋳型として前記第1の核酸を伸長させる段階と
を含む標的核酸分子を増幅する方法。
(b)前記ハイブリッド形成を検出する段階と
を含む標的核酸分子を検出する方法。
(b)前記標的RNAを鋳型として前記核酸を伸長させる段階と
を含む標的RNAを増幅する方法。
(b)前記標的分子を鋳型として前記核酸を伸長させる段階と
を含む標的核酸分子を増幅する方法。
(b)前記ハイブリッド形成を検出する段階と
を含む標的核酸分子を検出する方法。
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