CN106466479A - 脑源性神经营养因子前体蛋白用作治疗情感障碍的靶点 - Google Patents

Abstract

本申请属于生物制药领域，具体涉及对脑源性神经营养因子前体蛋白(proBDNF)或其信号传递分子具有中和或抑制活性的结合分子或对BDNF或其信号传递分子具有刺激或促进活性的结合分子在制备用于预防、缓解或治疗情感障碍的药物中的应用。本发明首次发现proBDNF是治疗包括抑郁症在内的情感障碍的重要靶点，特异性结合proBDNF的结合分子对于情感障碍具有显著的预防、缓解或治疗作用。

Description

脑源性神经营养因子前体蛋白用作治疗情感障碍的靶点

技术领域

本发明属于生物制药领域，具体涉及对脑源性神经营养因子前体蛋白(proBDNF)或其信号传递分子具有中和或抑制活性的结合分子在制备用于预防、缓解或治疗包括抑郁症在内的情感障碍的药物中的应用。

背景技术

抑郁症是一种严重危害人类身心健康的精神障碍疾病，它严重影响了患者的日常工作和生活。有数据显示，15％的抑郁症患者伴有自杀倾向，而且近60％的自杀死亡者罹患抑郁症或者其他种类的情感障碍。世界卫生组织发表的《2001年世界卫生报告》指出，抑郁症目前已成为世界第四大疾患。预计到2020年，抑郁障碍将成为发展中国家最为严重的疾病负担之一，重度抑郁会成为死亡和残疾的第二大原因。

抑郁症的成年患者临床上往往表现为情绪低落，兴趣缺乏，自我评价过低，不适当的内疚、绝望和自我仇恨，有些患者还可能出现食欲减少、体重下降、注意力不集中、失眠、记忆减退、社会活动减少、性欲下降等等，严重者甚至自杀。这些症状是慢性的，但随着时间的推移复发频率逐渐增加，随每次复发而逐渐加重。虽然抑郁症的发病率逐年提高，然而其发病机制并不十分清楚。目前关于抑郁症的假说很多，许多研究者认为抑郁症受遗传因素、社会因素、环境因素、神经递质及其受体功能异常、神经内分泌轴异常的影响。

近年来，在一系列临床与实验研究基础上，有学者提出了抑郁发生的“神经营养及可塑性”理论。该理论认为，抑郁症的发生主要是和中枢神经系统内以脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)为代表的神经营养因子产生减少和成熟海马神经元再生下降从而引起海马结构可塑性改变相关。

神经营养因子(neurotrophic factors，NTFs)是一类小分子多肽物质，包括神经生长因子(nerve growth factor，NGF)、脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)、神经营养素-3(neurotrophin-3，NT-3)和神经营养素-4/5(neurotrophin-4/5，NT-4/5)。

BDNF是继神经生长因子(NGF)之后，第二个被发现的神经营养因子，分子量为12.4kDa。它的表达非常广泛，除了在中枢神经系统的海马和皮层中有较高的表达外，在周围神经系统、视网膜、运动神经元、肾脏及前列腺都有表达，甚至在人类的唾液中也发现了BDNF。

BDNF有助于中枢和外周神经系统神经元的产生、存活，并能有效促进神经元分化及突触的发生，增加突触终末的密度和促进树突和轴突的生长。目前在抑郁症研究中，涉及最多的中枢神经系统区域即海马。有文献报道，与正常人群相比，抑郁症患者的海马出现萎缩。BDNF参与了将刺激信号转变为突触可塑性改变的过程。可见，BDNF在调节神经元存活、分化、突触可塑性以及损伤修复等方面具有重要功能。另有证据显示，BDNF不仅是调控神经系统发育和情感障碍的重要因子，同时也是重要的痛觉调质。

成熟的BDNF是由其前体蛋白(precursor for brain-derivedneurotrophic factor，pro-BDNF)裂解而成。成熟的BDNF至少能结合两种受体，一个是高亲和力的酪氨酸激酶家族(trk)中的成员之一trkB；另一个是低亲和力的神经营养因子受体(LNGFR)，也称为p75NTR受体。成熟的BDNF和trkB结合后，通过PI3K-Akt、CAMP-PKA、PKC信号传导通路发挥其促进神经元存活再生及神经元轴突延长的功能，而p75NTR的存在能促进这一过程的发生，p75NTR受体能促进TrkB受体高亲和位点的形成，从而增强Trk受体磷酸化作用。

除BDNF之外，BDNF的前体蛋白proBDNF也越来越受到广泛的关注。有研究表明，大鼠正常生理状态下pro-BDNF分布在延髓网状核、孤束核、三叉神经脊髓束和中央管区域的末梢、尾部和延髓腹外侧、下橄榄核腹外侧；桥核、被盖背核、背侧旁核、三叉神经感觉核、面核、前庭耳蜗核；中脑导水管周围的灰质、外侧膝状体；海马中神经元突起末梢和胞体、锥体细胞层的神经元和分子层的神经末梢；小脑齿状回颗粒细胞层的神经元胞体和神经突起末梢等部位。除中枢神经系统外，大鼠外周组织的浅表神经末梢、人的唾液和成年海鲈的肝脏、肾脏以及肌肉上也有proBDNF的分布。

proBDNF是由BDNF基因经过转录、翻译后在内质网内合成的，其人源肽链长度为247个氨基酸，氨基酸序列为SEQ ID NO:1，理论分子量为27.8KD。由于蛋白糖基化修饰程度不同，分子量可以在32-36kD的范围内。proBDNF的分子氨基酸序列第1-18位点是信号肽序列(SEQID NO:2)，在分泌的过程中在这个位点产生2个片段，其中一个片段是包含序列第19-128位氨基酸即前体结构域的多肽片段，称为前体结构域(proBDNF pro-domain)(SEQ ID NO:3)，另一个片段则是氨基酸序列第129-247即成熟结构域所编码的片段，加工后形成有生物活性的成熟BDNF(SEQ ID NO:4)。ProBDNF在胞内被费林蛋白酶切割，在胞外被基质金属蛋白酶(MMP)和组织纤溶酶原激活物(tPA)切割，生成成熟BDNF，继而促进神经元的存活和可塑性。

目前有证据显示，proBDNF不仅作为成熟BDNF合成的中间产物，也可作为配体与其高亲和力受体p75神经营养因子受体(P75neurotrophin receptor，p75NTR，SEQ ID NO:5)和sortilin(SEQ ID NO:6)结合发挥生物学功效。现有技术已知神经营养因子前体(包括proNGF和proBDNF等)可以促进细胞凋亡及炎性反应，但对于proBDNF在情感障碍中的作用尚不清楚。ProBDNF结合p75NTR和sortilin的胞外结构域(SEQ ID NO:7)，形成复合物，其转导包括RhoA、JNK和NFκB在内的若干信号。通过激活RhoA，proBDNF触发神经突塌陷(Sun Y et al,2012,PlosOne 7(4):e35883).

发明概述

本发明人经过深入的研究，首次发现proBDNF是治疗包括抑郁症在内的情感障碍的重要靶点。对脑源性神经营养因子前体蛋白(proBDNF)或其信号传递分子具有中和或抑制活性的结合分子，例如，特异性结合proBDNF的结合分子，尤其是抗proBDNF的多克隆抗体，对于包括抑郁症在内的情感障碍具有显著的缓解、预防或治疗作用，由此完成了本发明。

本发明提供对脑源性神经营养因子前体蛋白(proBDNF)具有中和或抑制活性的结合分子在制备用于预防、缓解或治疗情感障碍的药物中的应用。

根据本发明，所述情感障碍选自抑郁症和焦虑症。

根据本发明，所述结合分子包括阻碍proBDNF基因表达的结合分子，例如反义RNA、siRNA和miRNA；特异性结合proBDNF的结合分子；或者促进proBDNF切割成BDNF的结合分子，例如费林蛋白酶(furin)，MMP2、7、9，以及组织组织纤溶酶原激活物(tPA)。该结合分子还包括与proBDNF的受体p75和sortilin或其片段结合并阻断由proBDNF触发的信号的分子，例如化合物质、肽和抗体等，或者miRNA/siRNA，它们抑制p75NTR和sortilin及其下游分子的表达。

根据本发明，所述结合分子还可以是促进proBDNF切割成成熟BDNF的分子。对本领域技术人员而言，proBDNF公知是成熟BDNF的前体。成熟BDNF是亲神经的，而proBDNF是神经变性的。根据本发明，在重度抑郁症患者和抑郁症动物模型中，proBDNF及其受体是上调的，导致proBDNF信号与成熟BDNF信号间的失衡。ProBDNF被费林蛋白酶、MMP7/9和tPA切割。一个合理的药物开发途径就是找到能增加proBDNF切割成成熟BDNF的药物，从而恢复proBDNF和成熟BDNF信号间的平衡。该药物可以是小化学物质，也可以是大蛋白分子。

根据本发明，所述特异性结合proBDNF的结合分子选自抗体，与该前体蛋白结合的受体p75(SEQ ID NO:5)、sortilin(SEQ ID NO:6)或其片段，例如sortilin ECD-Fc(SEQ ID NO:8)和p75ECD-Fc(SEQ IDNO:9)，及其功能变体，例如化学修饰变体，取代、添加或缺失变体。

根据本发明，所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、鼠源抗体或其片段。其中，所述片段包括Fab、F(ab')、F(ab')₂、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体或四链抗体。

根据本发明，所述多克隆抗体以proBDNF或其片段为抗原免疫动物而产生。其中，所述片段包括但不限于SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。

本发明还提供对BDNF或其信号传递分子具有刺激或促进活性的结合分子通过恢复BDNF/proBDNF信号平衡在制备用于预防、缓解或治疗情感障碍的药物中的应用。

根据本发明，所述结合分子为BDNF或其信号传递分子本身。

根据本发明，所述结合分子为BDNF的受体TrkB。

根据本发明，所述结合分子为BDNF或其受体TrkB的有义核酸，包括有义DNA和有义RNA。

根据本发明，所述结合分子为BDNF或TrkB的激动剂。

情感障碍为精神障碍，其特征为抑郁期，有时与躁狂期交替出现。虽然许多人不时经历悲伤或躁狂情绪，但情感障碍患者具有严重或延迟的情感状态，破坏其日常功能。情感障碍包括重度抑郁障碍，双相情感障碍(躁郁症)，焦虑和心境恶劣(忧郁性人格)。在分类和诊断情感障碍中，医生确定情感障碍是否是单相或双相。当情感经历仅有一个极端(被抑郁状态)，则该病症称为单相。重度抑郁是指单一严重的抑郁期，以消极或绝望想法和体征如疲惫为标志。在重度抑郁症中，有些患者具有分隔的抑郁时段。抑郁时段之间，有些患者并不感到抑郁，或具有其他与抑郁相关的症状。而其他一些患者具有更高频的抑郁时段。

双相抑郁或双相障碍(有时也称作躁狂症)是指患者经历两种情感极端的病症，这类患者在抑郁(情绪低落)和躁狂或轻度躁狂(情绪高涨)间交替。他们的情绪从抑郁走向狂乱、异常高涨。躁狂和轻度躁狂类似，但躁狂通常更为严重，并且使患者虚弱。心境恶劣为反复出现或长期的抑郁，有可能持续一生。心境恶劣与重度抑郁症类似，但其是慢性、长久和轻微的。患者的症状不如重度抑郁那么严重，但可历经数年。抑郁的轻微形式似乎总是存在。有些病例中，患者还在心境恶劣的高峰经历重度抑郁时段，该病症有时称作双抑郁症。

利用动物模型确定抑郁症在本领域是公知的。许多行为能用来测试动物是否经历抑郁样症状。这些测试包括强迫游泳实验(FST)、旷场实验(OFT)、高架十字迷宫实验(EPMT)或糖水偏好实验(SPT)等。FST测试动物在水中游泳或不游泳的时间百分比。OFT测试动物在空旷地带移动的距离。EPMT测试动物是否更喜欢保持开臂或闭臂。SPT测试动物是否更喜欢饮用糖水或清水。测量指示动物是否患有抑郁样症状。

本发明将昆虫细胞中制备的proBDNF注射至小鼠脑侧室，在强迫游泳实验(FST)中导致不动时间增加，表明proBDNF可引起抑郁样行为。本发明还通过大量实验数据证实，增加成熟BDNF或减少proBDNF能缓解、预防或治疗抑郁症。其中，增加成熟BDNF可通过给药外源BDNF，或促进proBDNF切割成BDNF。而减少proBDNF，则有多种途径，包括但不限于减少proBDNF的转录、翻译和表达，降低、中和或抑制表达后proBDNF的生物活性，诸如利用受体、抗体或其片段与proBDNF的结合等。另外，本领域技术人员容易理解，减少proBDNF的下游信号传递分子也能缓解、预防或治疗抑郁症。所述下游信号分子包括但不限于proBDNF的受体p75和sortilin，或其片段。如无特别说明，本申请下文中的proBDNF、p75和sortilin或其片段统称为“proBDNF”。从分子水平和蛋白水平上，本发明的结合分子作为药剂可分为核酸药剂和蛋白/抗体药剂。

一.核酸药剂

本发明的结合分子作为药剂可以抑制基因表达(即抑制和/或阻遏基因的表达)。所属技术领域中，该药剂被称为“基因沉默物”，这对本领域技术人员来说是熟知的，包括但不限于核酸序列，例如RNA、DNA或核酸类似物，可以是单链的或双链的，选自编码目标蛋白的核酸、寡核苷酸、核酸、核酸类似物，包括但不限于肽核酸(PNA)、假性互补PNA(pc-PNA)、锁核酸(LNA)及其衍生物等。核酸药剂包括但不限于编码阻遏蛋白的核酸序列、反义分子、核酶、小抑制性核酸分子，包括但不限于RNAi、shRNAi、siRNA、微小RNAi(miRNA)、反义寡核苷酸等。

在一些实施方案中，抑制proBDNF或其下游信号传递分子，如p75和sortilin的药剂是核酸。考虑到BDNF对维持正常情绪至关重要，而proBDNF作为BDNF的前体，完全封闭和阻断proBDNF的转录和翻译并不可取。因此，本发明的核酸抑制剂优选是proBDNF下游信号传递分子，如p75和sortilin或其片段的核酸抑制剂。核酸抑制剂包括但不限于RNA干扰诱导分子，例如siRNA、dsRNA、stRNA、shRNA及其变体，其中RNA干扰分子使proBDNF的基因表达沉默。在一些实施方案中，核酸抑制剂是反义寡核酸，或核酸类似物，例如DNA、RNA、肽核酸(PNA)、假互补PNA(pc-PNA)或锁核酸(LNA)等。在可选实施方案中，核酸是DNA或RNA，以及核酸类似物，例如PNA、pcPNA和LNA。核酸可以是单链或双链的，选自编码目标蛋白的核酸、寡核苷酸、PNA等。这种核酸序列包括但不限于编码阻遏蛋的核酸序列、反义分子、核酶、小抑制核酸序列，例如RNAi、shRNAi、siRNA、微小RNAi(mRNAi)、反义寡核苷酸等。

在一些实施方案中，单链RNA(ssRNA)，一种在真核细胞中内源发现的RNA形式，可用于形成RNAi分子。细胞的ssRNA分子包括信使RNA(以及前信使RNA前体)、小核RNA、小核仁RNA、转移RNA和核糖体RNA。双链RNA(dsRNA)诱导尺寸依赖性的免疫应答，使得大于30bp的dsRNA激活干扰素应答，而较短的dsRNAs将进入Dicer酶下游的细胞内源RNA干扰机制中。

RNA干扰(RNAi)为抑制选定的靶多肽的表达，提供了有力的方法。RNAi使用靶向编码靶多肽的信使RNA的小干扰RNA(siRNA)双链体，进行选择性降解。基因表达的siRNA依赖性转录后沉默，包括在siRNA指导的位点处切割靶信使RNA分子。

RNA干扰(RNAi)是一种进化上保守的过程，将与靶基因相同和高度相似的RNA的序列的表达或导入，引起从被靶向的基因转录的信使RNA(mRNA)的序列特异性降解或特异性转录后基因沉默(PTGS)(参见Coburn,G.和Cullen,B.，(2002)J.of Virology 76(18):9225)，由此抑制靶基因的表达。在一个实施方案中，RNA是双链RNA(dsRNA)。该过程已经在植物、脊椎动物和哺乳动物细胞中进行了描述。自然界中，RNAi由dsRNA特异性核酸内切酶Dicer启动，该酶促进了长的dsRNA持续不断地裂解成被称为siRNAs的双链片段。siRNAs被整合到蛋白复合物(被称为“RNA诱导的沉默复合物”，或“RISC)中，该复合物识别并裂解靶mRNA。也可以通过引入抑制或沉默靶基因的表达的核酸分子，例如合成的siRNA或RNA干扰剂，来启动RNAi。本申请中使用的“靶基因表达的抑制”，包括与没有诱导RNAi的情况相比，靶基因或靶基因编码的蛋白的表达或蛋白活性或水平的任何降低。降低可以是与还没有被RNA干扰剂靶向的靶基因的表达或靶基因编码的蛋白的活性或水平相比，至少30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或99％或以上的降低。

“短干扰RNA”(siRNA)，在本申请中也称作“小干扰RNA”，被定义为其功能通过例如RNAi来抑制靶基因表达的药剂。siRNA可以是化学合成的，可以通过体外转录生产，或者可以在宿主细胞中生产。在一个实施方案中，siRNA是双链RNA(dsRNA)分子，其长度为大约15到大约40个核苷酸，优选为大约15到大约28个核苷酸，更优选为大约19到大约25个核苷酸长，更优选大约19、20、21、22或23个核苷酸长，可以在每条链上含有3’和/或5’突出端，其长度为大约0、1、2、3、4或5个核苷酸。突出端的长度在两条链之间是独立的，即一条链上突出端的长度不依赖于第二条链上突出端的长度。优选情况下，siRNA能够通过靶信使RNA(mRNA)的降解或特异性转录后基因沉默(PTGS)促进RNA干扰。

siRNA还包括小发夹(也称茎环)RNA(shRNA)。在一个实施方案中，这些shRNA包含短的(例如大约19到大约25个核苷酸)反义链，其后跟着大约5到大约9个核苷酸的核苷酸环，以及类似的正义链。任选地，正义链可以在核苷酸环结构前面，反义链跟在后面。这些shRNAs可以包含在质粒、逆转录病毒和慢病毒中，可以从例如pol IIIU6启动子或另一种启动子表达(参见例如Stewart等，RNA；9(4):493-501,Apr.2003，在此以其全文引作参考)。

RNA干扰药剂的靶基因或序列，可以是细胞基因或基因组序列，例如proBDNF序列。siRNA可以与靶基因或基因组序列或其片段基本上同源。当在本申请中使用时，术语“同源的”被定义为是与靶mRNA或其片段基本上相同的、足够互补的或相似的，能够执行靶的RNA干扰。除了天然RNA分子之外，适合于抑制或干扰靶序列表达的RNA，还包括RNA衍生物和类似物。优选情况下，siRNA与其靶相同。

优选情况下，siRNA只靶向一个序列。每种RNA干扰药剂，例如siRNA，可以通过例如表达情况分析来筛选其潜在的降低靶的效应。这种方法对于本领域技术人员来说是已知的，描述在例如Jackson等，Nature Biotechnology 6:635-637,2003中。除了表达情况分析之外，人们也可以在序列数据库中筛选潜在的靶序列的相似序列，以鉴定能够具有降低靶效应的潜在序列。例如，按照Jackson等(同上)，15个或者可能少至11个连续的核苷酸序列一致，就足以指导非靶向转录本的沉默。因此，人们可以一开始就通过使用任何已知的序列比对方法，例如BLAST进行序列一致性分析，筛选提出的siRNAs，以避免可能的降低靶的沉默效应。

siRNA分子不是必需限于只含有RNA的分子，而是例如进一步包含了化学修饰的核苷酸和非核苷酸，也包括了其中核糖分子被另一种糖分子或具有类似功能的分子所取代的分子。此外，可以使用核苷酸残基之间的非天然键合，例如硫代磷酸酯键合。例如，含有D-阿拉伯糖呋喃糖苷结构代替在RNA中发现的天然存在的D核糖糖苷的siRNA，可以用于本发明的RNAi分子中(US专利申请No.5,177,196)。其它例子包括在核苷的糖和杂环碱基之间含有O-键合的RNA分子，它赋予了核酸酶抗性以及与寡核苷酸分子紧密的互补链结合，与含有2’-O-甲基核糖、阿拉伯糖以及特别是D-阿拉伯糖的寡核苷酸相似(US专利申请No.5,177,196)。

RNA链可以使用报告基团例如荧光团的反应性官能团进行衍生。特别有用的衍生物是在RNA链的一个或多个末端进行修饰，典型为正义链的3’末端。例如，3’末端的2’-羟基可以用各种基团容易地、选择性地衍生。

其它有用的RNA衍生物包括具有修饰的糖部分的核苷酸，例如2’-O-烷基化残基或2’-O-甲基核糖基衍生物和2’-O-氟代核糖基衍生物。RNA碱基也可以被修饰。可使用任何可用于抑制或干扰靶序列表达的修饰碱基。例如，可以掺入卤化的碱基，例如5-溴尿嘧啶和5-碘尿嘧啶。碱基也可以被烷基化，例如可以掺入7-甲基鸟嘌呤来代替鸟嘌呤残基。也可掺入能够产生成功抑制的非天然碱基。

最优选的siRNA修饰包括2’-脱氧-2’-氟代尿苷或锁核酸(LNA)，以及含有磷酸二酯键或不同数量的硫代磷酸酯键的RNA双链体。这种修饰对于本领域技术人员来说是已知的，并描述在例如Braasch等，Biochemistry,42:7967-7975,2003中。对siRNA分子进行的大部分有用的修饰，可以使用为反义寡核苷酸技术建立的化学方法来导入。优选情况下，修饰包含最少的2’-O-甲基修饰，优选完全不含该修饰。修饰也优选不含siRNA的游离5’-羟基的修饰。

siRNA和miRNA分子具有与它们的3’-或5’-末端共价连接的各种“尾”，这在本领域中是已知的。它们可用于稳定化通过本发明方法递送的siRNA和miRNA分子。总的来说，连接到RNA分子的3’或5’末端的插入基团、各种类型的报告基团以及亲脂基团，对于本领域技术人员来说是熟知的，并可用于本发明的方法。3’-胆固醇或3’-吖啶修饰的寡核苷酸可用于制备可用于本发明的修饰的RNA分子，关于它们的合成的描述，可以在例如下面的文章中发现：Gamper,H.B.,Reed,M.W.,Cox,T.,Virosco,J.S.,Adams,A.D.,Gall,A.,Scholler,J.K.和Meyer,R.B.(1993)Facile Preparation and Exonuclease Stability of3’-Modified Oligodeoxynucleotides(3’-修饰的寡脱氧核苷酸的方便制备和核酸外切酶稳定性)，Nucleic Acids Res.21 145-150；以及Reed,M.W.,Adams,A.D.,Nelson,J.S.和Meyer,R.B.,Jr.(1991)Acridine andCholesterol-Derivatized Solid Supports for Improved Synthesis of3’-Modified Oligonucleotides(用于改进3’-修饰的寡核苷酸的合成的吖啶和胆固醇衍生化的固相支持物)，Bioconjugate Chem.2 217-225(1993)。

其它可用于靶向p75NTR和sortilin表达的siRNA可以容易地设计和测试。因此，用于本申请描述的方法的siRNA，包括长度为大约15到大约40，或大约15到大约28个核苷酸的siRNA分子，它们与proBDNF基因同源。优选情况下，靶向proBDNF的siRNA分子的长度为大约19到大约25个核苷酸。更优选情况下，靶向proBDNF的siRNA分子的长度为大约19、20、21或22个核苷酸。靶向proBDNF的siRNA分子也可以含有3’羟基。靶向proBDNF的siRNA分子可以是单链的或双链的；这样的分子可以是平末端的，或者含有突出的末端(例如5’、3’)。在具体实施方案中，RNA分子是双链的，具有平末端或含有突出末端。

在一个实施方案中，靶向p75NTR和sortilin的至少一条链的RNA分子具有长度为大约0到大约6个核苷酸(例如嘧啶核苷酸、嘌呤核苷酸)的3’突出末端。在其它实施方案中，3’突出端的长度从大约1到大约5个核苷酸，从大约1到大约3个核苷酸，从大约2到大约4个核苷酸。在一个实施方案中，靶向proBDNF的RNA分子是双链的，一条链具有3’突出端，另一条链可以是平末端的或具有突出端。在靶向proBDNF的RNA分子是双链的，并且两条链都含有突出端的实施方案中，每条链的突出端的长度可以是相同的或不同的。在具体实施方案中，本发明的RNA含有大约19、20、21或22个配对的核苷酸，并在RNA的两个3’末端具有从大约1到大约3，特别是大约2个核苷酸的突出端。在一个实施方案中，3’突出端可被稳定化以对抗降解。在优选实施方案中，RNA通过包含嘌呤核苷酸例如腺嘌呤和鸟嘌呤核苷酸被稳定化。任选地，用修饰的类似物取代嘧啶核苷酸，例如用2’-脱氧胸腺嘧啶核苷取代尿苷2核苷酸3’突出端，是耐受的，并且不影响RNAi的效能。2’羟基的缺少，显著地增加了突出端在组织培养基中的核酸酶抗性。

选择siRNA序列使得siRNA的反义(引导)链最大化地摄入到RISC中，从而最大化RISC靶向人类p75NTR和sortilin mRNA以进行降解的能力。这可以通过扫描在反义链的5’-末端具有最低的结合自由能的序列来实现。较低的自由能导致siRNA双链体反义链的5’-末端的增加的解链，从而确保反义链将被RISC吸纳，并指导人类p75NTR和sortilinmRNA的序列特异性裂解。

在优选实施方案中，siRNA或修饰的siRNA在可药用载体中进行递送。其它的载体试剂例如脂质体，可以添加到可药用载体中。

在另一个实施方案中，siRNA的递送，是通过将编码小发夹RNA(shRNA)的载体，在可药用载体中递送到个体器官中的细胞。在转录后，shRNA被细胞转变成能够靶向例如p75NTR和sortilin的siRNA。在一个实施方案中，载体可以是可调控的载体，例如可以用四环素诱导的载体。

在一个实施方案中，在本申请描述的方法中使用的RNA干扰药剂，在不使用载体的情况下进行静脉内注射后，在体内被细胞主动摄入，这表明了RNA干扰药剂，例如在本发明方法中使用的siRNA的有效的体内递送。

也可以使用其它的策略来递送RNA干扰药剂，例如在本发明方法中使用的siRNA或shRNA，这些策略例如通过载体，例如质粒或病毒载体，例如慢病毒载体进行递送。可以使用的这样的载体描述在例如Xiao-Feng Qin等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,100:183-188中。其它的递送方法包括使用碱性肽递送RNA干扰药剂，例如本发明的siRNA或shRNA，例如通过将RNA干扰药剂与碱性肽，例如TAT肽的片段结合或混合，也可以通过与阳离子脂类混合或配制在颗粒中来递送。

正如提到的，dsRNA，例如siRNA或shRNA，可以使用可诱导的载体进行递送，例如可用四环素诱导的载体。可以使用例如在Wang等，Proc.Natl.Acad.Sci.100:5103-5106,using pTet-On vectors(使用pTet-On载体)(BD Biosciences Clontech,Palo Alto,CA)中描述的方法。在一些实施方案中，载体可以是质粒载体、病毒载体，或任何其它适用于插入片段和外源序列并用于导入到真核细胞中的适合载体。载体可以是表达载体，能够指导激动剂或拮抗剂核酸分子的DNA序列转录成RNA。病毒表达载体可以选自例如基于逆转录病毒、慢病毒、EpsteinBarr病毒、牛乳头状瘤病毒、腺病毒和腺相关病毒的载体，或任何上述病毒的杂交病毒。在一个实施方案中，载体是染色体外的。使用适合的染色体外载体，为在对象中将拮抗核酸分子在染色体外维持在高拷贝数下，提供了一种手段，从而消除了染色体整合的潜在影响。

可用于本发明方法的RNA干扰分子和核酸抑制剂，可以使用任何已知的技术法来生产，例如直接化学合成，通过暴露于重组Dicer蛋白或果蝇胚胎裂解物将较长的双链RNA进行加工，通过源自于S2细胞的体外系统，使用噬菌体RNA聚合酶，RNA依赖性RNA聚合酶，以及基于DNA的载体。使用细胞裂解物或体外加工，还可以包括随后从裂解物等中分离短的，例如21-23个核苷酸的siRNA。化学合成通常通过制造两个单链RNA寡聚物，然后将两个单链RNA寡聚物退火成双链RNA来进行。其它的例子包括在WO 99/32619和WO 01/68836中公开的方法，其中讲述了siRNA的化学和酶法合成。此外，大量的商业化服务机构可用于设计和制造特异性siRNA(参见例如QIAGEN Inc.,Valencia,CA和AMBION Inc.,Austin,TX)。

在一些实施方案中，药剂是抑制p75NTR和sortilin的表达和/或抑制proBDNF蛋白活性的蛋白或多肽或RNAi药剂。在这样的实施方案中，细胞可以被修饰(例如通过同源重组)，以提供药剂的增加的表达，例如用全部或部分异源启动子替代全部或部分天然存在的启动子，以便使细胞以较高水平表达proBDNF的天然抑制剂药剂，例如proBDNF的蛋白或miRNA抑制剂。异源启动子的插入方式，使得它与编码药剂的目标核酸可操作地连接。参见例如Transkaryotic Therapies,Inc.的PCT国际公开No.WO 94/12650，Cell Genesys,Inc.的PCT国际公开No.WO 92/20808，以及Applied Research Systems的PCT国际公开No.WO91/09955。细胞也可以被工程化，以在可诱导调控的元件控制下表达含有药剂的内源基因，在这种情况下内源基因的调控序列可以通过同源重组来替换。基因活化技术描述在Chappel的美国专利No.5,272,071，Sherwin等的美国专利No.5,578,461，Selden等的PCT/US92/09627(W093/09222)，以及Skoultchi等的PCT/US90/06436(WO91/06667)中。药剂可以通过在适合于表达miRNA的培养条件下培养转化的宿主细胞来制备。然后可以从这样的培养物(即从培养基或细胞提取液)中，使用已知的纯化技术例如凝胶过滤和离子交换层析，来纯化得到的表达的药剂。核酸药剂抑制剂的纯化也可以包括含有将与蛋白结合的试剂的亲和柱；一个或多个在亲和树脂上的柱步骤，例如伴刀豆球蛋白A-琼脂糖、肝素-toyopearl^TM或Cibacrom blue 3GA琼脂糖凝胶；一个或多个涉及疏水相互作用层析的步骤，使用的树脂例如苯基醚、丁基醚或丙基醚；免疫亲和层析，或互补cDNA亲和层析。

在一个实施方案中，p75NTR和sortilin的核酸抑制剂可以通过合成获得，例如通过z专业技术人员已知的任何合成方法化学合成核酸。然后可以通过本技术领域任何已知的方法纯化合成的p75NTR和sortilin的核酸抑制剂。用于核酸的化学合成的方法包括但不限于使用磷酸三酯、磷酸酯或亚磷酰胺化学方法和固相技术的体外化学合成，或通过脱氧核苷H-膦酸酯中间体(参见Bhongle的美国专利No.5,705,629)。

在有些情况下，例如当需要增加核酸酶稳定性时，带有核酸类似物和/或修饰的核苷间键合的核酸可能是优选的。含有修饰的核苷间键合的核酸，也可以使用本技术领域熟知的反应试剂和方法来合成。例如，合成含有膦酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、甲氧基乙基氨基磷酸酯、甲乙缩醛、硫代甲乙缩醛、二异丙基甲硅烷、乙酰胺、氨基甲酸酯、二亚甲基硫醚(-CH₂-S-CH₂)、二甲亚砜(-CH₂-SO-CH₂)、二甲砜(-CH₂-SO₂-CH₂)、2’-O-烷基和2’-脱氧-2’-氟硫代磷酸酯核苷间键合的核酸的方法，在本技术领域中是熟知的(参见Uhlmann等，1990,Chem.Rev.90:543-584；Schneider等，1990,Tetrahedron Lett.31:335，及其引用的参考文献)。Cook等的美国专利Nos.5,614,617和5,223,618，Acevedo等的5,714,606，Cook等的5,378,825，Buhr等的5,672,697和5,466,786，Cook等的5,777,092，De Mesmacker等的5,602,240，Cook等的5,610,289以及Wang的5,858,988，也描述了用于增强核酸酶稳定性和细胞摄取的核酸类似物。

合成的siRNA分子，包括shRNA分子，可以使用多种本领域技术人员已知的技术来获得。例如，siRNA分子可以使用本技术领域已知的方法化学合成或重组生产，例如使用适当保护的核糖核苷氨基磷酸酯和常规的DNA/RNA合成仪(参见例如Elbashir,S.M.等，(2001)Nature 411:494-498；Elbashir,S.M.,W.Lendeckel和T.Tuschl(2001)Genes&Development 15:188-200；Harborth,J.等，(2001)J.Cell Science114:4557-4565；Masters,XR.等，(2001)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA98:8012-8017；以及Tuschl,T.等，(1999)Genes&Development13:3191-3197)。可选地，有几个商业化RNA合成供应商可用，包括但不限于Proligo(Hamburg,Germany)、Dharmacon Research(Lafayette,CO,USA)、Pierce Chemical(Perbio Science的分部，Rockford,IL,USA)、Glen Research(Sterling,VA,USA)、ChemGenes(Ashland,MA,USA)和Cruachem(Glasgow,UK)。因此，siRNA分子不是非常难以合成，并且可以适合于RNAi的质量容易地提供。此外，由质粒载体、反转录病毒和慢病毒编码的dsRNA可以被表达成茎环结构(Paddison,P.J.等，(2002)Genes Dev.16:948-958；McManus,M.T.等，(2002)RNA8:842-850；Paul,CP.等，(2002)Nat.Biotechnol.20:505-508；Miyagishi,M.等，(2002)Nat.Biotechnol.20:497-500；Sui,G.等，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 99:5515-5520；Brummelkamp,T.等，(2002)Cancer Cell2:243；Lee,N.S.等，(2002)Nat.Biotechnol.20:500-505；Yu,J.Y.等，(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 99:6047-6052；Zeng,Y.等，(2002)Mol.Cell 9:1327-1333；Rubinson,D.A.等，(2003)Nat.Genet.33:401-406；Stewart,S.A.等，(2003)RNA 9:493-501)。这些载体一般在dsRNA上游具有polIII启动子，可以分别表达正义和反义RNA链和/或作为发夹结构。在细胞中，Dicer将短的发夹RNA(shRNA)加工成有效的siRNA。

本发明siRNA分子的靶向区域，可以选自给定的靶基因序列例如p75NTR和sortilin编码序列中，从起始密码子开始的下游从大约25到50个核苷酸，从大约50到75个核苷酸，或从大约75到100个核苷酸。核苷酸序列可以包含5’或3’UTR，以及起始密码子附近的区域。设计本发明的siRNA的一种方法包括鉴定23个核苷酸的基序AA(N19)TT(其中N可以是任何核苷酸)，并选择具有至少25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％或75％G/C含量的命中序列。序列的“TT”部分是可选的。可选地，如果不能发现这样的序列，搜索可以扩展到使用基序NA(N21)，其中N可以是任何核苷酸。在这种情况下，正义siRNA的3’末端可以被转变成TT，以允许相对于正义和反义3’突出端的序列组成产生对称的双链体。然后可以合成反义siRNA分子，它与23个核苷酸的序列基序的1到21位核苷酸互补。使用对称的3’TT突出端可能是有利的，以确保形成的小干扰核糖核蛋白颗粒(siRNP)含有大约相等比例的正义和反义靶RNA裂解siRNP(Elbashir等，(2001)，同上，和Elbashir等，2001，同上)。序列数据库，包括但不限于NCBI、BLAST、Derwent和GenSeq的分析，以及可商购的寡核苷酸合成软件如也可用于针对EST文库筛选siRNA序列，以确保只有一个基因被定靶。

RNA干扰药剂的递送：将RNA干扰药剂例如siRNA或含有RNA干扰药剂的载体，递送到靶细胞(例如脑细胞或其它目标靶细胞，例如中枢和外周神经系统的细胞)的方法，可以包括(i)注射含有RNA干扰药剂例如siRNA的组合物，或(ii)将细胞，例如脑细胞，与含有RNA干扰药剂例如siRNA的组合物直接接触。在一个实施方案中，RNA干扰药剂可以靶向脑部，例如皮层和海马区，proBDNF在此过表达。在另一个实施方案中，RNA干扰药剂例如siRNA，可以直接注射到血管中，例如静脉、动脉、微静脉或微动脉中。在另一个实施方案中，RNA干扰药剂可以直接地局部注射或施加到患处。

给药可以通过单次注射或两次或多次注射。RNA干扰药剂在可药用载体中进行递送。一种或多种RNA干扰药剂可以同时使用。RNA干扰药剂，例如靶向p75NTR和/或sortilin mRNA的siRNA，可以单独递送，或与其它RNA干扰药剂，例如针对其它细胞基因的siRNA组合递送。P75NTR和/或sortilin siRNA也可以与其它用于治疗或预防情感障碍的药剂组合给药。

在一个实施方案中，特定的细胞被定向进行RNA干扰，以限制由RNA干扰的非特异性定靶所引起的RNA干扰的潜在副作用。方法可以使用例如包括细胞定向部分和用于将RNA干扰有效递送到细胞中的RNA干扰结合部分的复合物或融合分子。例如，抗体-鱼精蛋白融合蛋白，当与siRNA混合时，结合siRNA，并将siRNA选择性递送到表达抗体所识别的抗体的细胞中，导致只在表达抗原的细胞中引起基因表达的沉默。siRNA或RNA干扰诱导性分子结合部分是蛋白或核酸结合结构域或蛋白的片段，结合部分与定靶部分的一部分融合。定靶部分的位置可以在构建物的羧基末端或氨基末端，或在融合蛋白的中间。

也可以使用病毒介导的递送机制将siRNA体外和体内递送到细胞，如在Xia,H.等，(2002)Nat Biotechnol 20(10):1006中描述的。shRNA的质粒或病毒介导的递送机制也可用于将shRNA体外和体内递送到细胞，如同在Rubinson,D.A.等，((2003)Nat.Genet.33:401-406)和Stewart,S.A.,等((2003)RNA 9:493-501)中描述的。

RNA干扰药剂，例如siRNA，也可以经过血管或血管外循环、血液或淋巴系统以及脑脊液，导入到细胞中。

具体的RNA干扰药剂的剂量，是实现特定靶基因的RNA干扰，例如翻译后基因沉默(PTGS)，从而导致靶基因表达的抑制或靶基因编码的蛋白的活性或水平的抑制所必需的量。

还已了解，RNAi分子不是必须与它们的靶序列完全匹配。但是，优选情况下，siRNA反义(引导)链的5’和中间部分与靶核酸序列完全互补。

因此，在本发明中起到p75NTR和sortilin的核酸抑制剂作用的RNAi分子式包括但不限于未修饰的和修饰的双链(ds)RNA分子，包括短的临时RNA(short-temporal RNA)(stRNA)、小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA(miRNA)、双链RNA(dsRNA)(参见例如Baulcombe,Science 297:2002-2003,2002)。dsRNA分子例如siRNA，也可以含有3’突出端，优选为3’UU或3’TT突出端。在一个实施方案中，本发明的siRNA不包括含有超过大约30-40个碱基、大约40-50个碱基、大约50个碱基或以上的ssRNA的RNA分子。在一个实施方案中，本发明的siRNA分子在它们的长度中，有超过大约25％、超过大约50％、超过大约60％、超过大约70％、超过大约80％、超过大约90％是双链的。在一些实施方案中，p75NTR和sortilin的核酸抑制剂是任何结合并抑制proBDNF mRNA的表达的药剂，其中p75NTR和/或sortilinmRNA或其表达(即转录或翻译)被抑制了。

在本发明的另一个实施方案中，抑制p75NTR和sortilin的药剂是催化性核酸构建物，例如核酶，它们能够裂解RNA转录本，从而阻止野生型蛋白的产生。核酶利用位于核酶催化位点两侧的两个与靶互补的序列区域，靶向特定的序列并与其退火。结合后，核酶以位点特异性方式裂解靶。特异性识别和裂解本申请描述的基因产物的序列，例如裂解p75NTR和sortilin或其同源物或变体的核酶，其设计和测试可以通过本领域技术人员熟知的技术来完成(例如Lleber和Strauss，(1995)Mol Cell Biol 15:540.551，其公开内容在此引为参考)。

在本发明的另一个实施方案中，编码成熟BDNF或其受体，例如TrkB的DNA或RNA，通过高表达同样可用于治疗情感障碍。该DNA或RNA又称为有义核酸，可直接注射或由细胞带入体内。

二.蛋白/抗体药剂

本发明的结合分子是蛋白药剂。在一些实施方案中，抑制proBDNF及其受体的药剂是蛋白和/或肽抑制剂或其片段，包括但不限于突变的蛋白、治疗性蛋白和重组蛋白。蛋白和肽抑制剂也可以包括例如突变蛋白、遗传修饰蛋白、肽、合成的肽、重组蛋白、嵌合蛋白、抗体、人源化蛋白、人源化抗体、嵌合抗体、修饰蛋白及其片段。在一些实施方案中，抑制proBDNF及其受体的药剂是proBDNF及其受体的显性失活变体，例如proBDNF及其受体的无功能变体。

本发明的结合分子可以是完整的免疫球蛋白分子，例如多克隆或单克隆抗体，或者抗原结合片段，包括但不限于Fab、F(ab’)、F(ab’)₂、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体、四链抗体以及至少含有足以赋予与proBDNF及其受体的特异性抗原结合的免疫球蛋白的片段的(多)肽或其片段。在优选实施方案中，本发明的结合分子是单克隆抗体或多克隆抗体。

在一些实施方案中，用于本发明方法的基因和/或基因产物的抑制剂，例如抗体，包括单克隆的、嵌合的、人源化的和重组抗体，及其抗原结合片段。在一些实施方案中，可以使用中和抗体作为proBDNF及其受体的抑制剂。抗体可以通过用抗原免疫接种动物，例如兔或小鼠，来容易地产生。免疫的小鼠对于提供用于制造杂交瘤的B细胞源来说，是特别有用的，杂交瘤可以被培养以产生大量的单克隆抗体。

在本发明的一个实施方案中，被鉴定的基因产物的抑制剂，可以是抗体分子或抗体分子的表位结合部分等。抗体提供了对广泛的靶抗原和半抗原的高的结合亲和性和独特的特异性。用于本发明的单克隆抗体包括完整抗体及其片段，它们是按照常规的技术产生的，例如杂交瘤合成、重组DNA技术和蛋白合成。

有用的单克隆抗体和片段可以源自于任何物种(包括人类)，或者可以形成为使用了来自一个以上物种的序列的嵌合蛋白。人类单克隆抗体或“人源化”鼠抗体，也可用于本发明。例如，可以通过将编码鼠Fv区域(即含有抗原结合位点)或其互补决定区的核苷酸序列，与编码人类恒定区结构域和Fc区的核苷酸序列遗传重组，将鼠单克隆抗体“人源化”。人源化的靶向部分被识别，从而降低了抗体或多肽在宿主受体中的免疫反应性，以与欧洲专利申请No.0,411,893 A2中公开的相似方式，使得半衰期增加，不利的免疫反应的可能性降低。优选情况下，鼠单克隆抗体应以人源化形式使用。抗原结合活性由6个互补决定区(CDRs)的氨基酸的序列和构象决定，它们位于抗体的轻链和重链的可变部分(Fv)(各三个)。25-kDa的单链Fv(scFv)分子，由轻链可变区(V_L)和重链可变区(V_H)通过短的肽连接序列连接而成，是目前为止开发的最小的抗体片段。已经开发了将scFv分子展示在含有scFv基因的丝状噬菌体表面上的技术。在单个scFv-噬菌体文库的大的合并体中可以存在具有广泛抗原特异性的scFv分子。可用于本发明方法的高亲和性单克隆抗体及其嵌合衍生物的一些例子，描述在欧洲专利申请EP 186,833、PCT专利申请WO 92/16553和美国专利No.6,090,923中。

嵌合抗体是免疫球蛋白分子，其特征为两个或多个片段或部分源自于不同动物物种。一般来说，嵌合抗体的可变区源自于非人类哺乳动物抗体，例如鼠单克隆抗体，免疫球蛋白恒定区源自于人类免疫球蛋白分子。优选情况下，当常规测定时，两个区域及组合具有低的免疫原性。

scFv分子的一个局限是与靶抗原相互作用的单价性。改进scFv与其靶抗原的结合的最简单的方法之一是通过产生多聚体增加其功能亲和性。相同的scFv分子结合形成的二体、三体和四体，可以包含多个相同的Fv模块。因此，这些反应试剂是多价的，但是单特异性的。两个不同的scFv分子，各含有源自不同亲本Ig的V_H和V_L结构域，它们的联合形成了功能完整的双特异性二体。双特异性scFv的一种独特的应用，是通过两个(相邻的)表面表位，同时结合在同一个靶分子的两个位点上。这些反应试剂与单个scFv或Fab片段相比，优点是显著的亲和性增加。已经工程化了多种多价的基于scFv的结构，包括例如微型抗体(miniantibodies)、二聚微型抗体、微体(minibodies)、(scFv)₂、二体和三体。这些分子具有不同的价(2到4个结合位点)、尺寸(50到120kDa)、灵活性和生产容易性。单链Fv抗体片段(scFvs)主要是单体，其中V_H和V_L结构域通过至少12个残基的多肽连接序列连接。具有12和25个氨基酸长度的连接序列的单体scFv，在所有条件下都是热力学稳定的。非共价的二体和三体分子，可以通过缩短连接单个scFv分子的可变重链和可变轻链的肽连接序列，容易地工程化和生产。scFv二聚体通过提供高度灵活性的两亲性螺旋来连接，而微型抗体结构可以被修饰，以产生二聚体双特异性(DiBi)微型抗体，其中含有通过双螺旋连接的两个微型抗体(4个scFv分子)。基因融合或二硫键合的scFv二聚体提供了中等程度的灵活性，可以通过直接克隆技术添加C-末端Gly4Cys序列来产生。scFv-CH3微体含有两个scFv分子，它们直接地(LD微体)或通过非常灵活的铰链区(Flex微体)与IgG CH3结构域相连。这些双价构建物分子量为大约80kDa，能够显著地结合抗原。Flex微体在小鼠中显示出令人印象深刻的肿瘤定位。双和三特异性多聚体可以通过将不同的scFv分子连接而形成。当Fab或单链Fv片段(scFv)被复合形成二体、三体或更大的集合体时，可以实现功能亲和性的增加。多价scFvs与单价scFv和Fab片段相比，最重要的优点是与靶抗原的功能性结合亲和性(亲和力)的增加。高的亲和性要求scFv多体能够同时结合不同的靶抗原。scFv二体与scFv单体相比，功能性亲和性的增加是显著的，主要可以从解离率的降低看出，这种降低是由于与两个或以上靶抗原的多重结合，以及当一个Fv解离时重新结合而引起的。当这样的scFv分子连接成多体时，它们可以被设计成对单一靶抗原具有高度亲和性，或对不同靶抗原具有多重特异性。与抗原的多重结合依赖于Fv模块中的正确排列和定向。对于多价scFVs靶中的全部亲和性来说，抗原结合位点必须指向同样的方向。如果多重结合在空间上不可能，那么功能性亲和性的显著增加，可能是由于增加的重新结合的效应，它依赖于扩散速度和抗原浓度。在本发明中，也考虑到了将抗体与改进它们的性质的部分结合。例如，抗体与增加它们的体内半衰期的PEG的结合物，可用于本发明。通过对来自未接触抗原或免疫接种过的动物或患者的B淋巴细胞的编码可变抗体片段的基因进行PCR扩增，制备了免疫文库。使用了特异性针对免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因家族的寡核苷酸的组合。免疫球蛋白种系基因可用于制备半合成的抗体所有组成部分，具有使用简并引物通过PCR扩增的可变片段的互补决定区。这些单一部分的文库的优点在于，可以从单一文库中分离出针对大量抗原的抗体片段。噬菌体展示技术可用于增加抗体片段的亲和性，其中从已经存在的抗体片段，通过随机的、基于密码子的或定点突变，通过将每个结构域与来自未接触抗原的全部组成成分的片段的结构域进行改组，或通过使用细菌增变株，制备了新的文库。

任选地，SCID-hu小鼠，例如由Genpharm开发的模型小鼠，可用于产生抗体或其片段。在一个实施方案中，考虑到了一种通过利用多价相互作用效应而产生的被称为peptabody的新型高亲和性结合分子。将短的肽配体通过半刚性的铰链区，与软骨寡聚基质蛋白的螺旋卷曲组件结构域融合，产生了五聚体多价结合分子。在本发明的优选实施方案中，配体和/或嵌合抑制剂，可以通过使用双特异性抗体来靶向组织，例如通过将抗配体抗体(Ab)和针对特定靶的Ab进行化学连接而产生的双特异性抗体。为了避免化学结合的局限性，抗体的分子结合物可用于在细胞表面分子上生产针对配体的重组双特异性单链Ab和/或嵌合抑制剂。任选地，可以给药两种或以上与靶向部分连接的活性药剂和/或抑制剂，其中每种结合物包含靶向部分，例如不同的抗体。每种抗体与不同的靶位点表位(与相同的或不同的靶位点抗原相关)反应。不同的抗体和与其相连的药剂附加地积累在目标靶位点处。基于抗体或不基于抗体的靶向部分，可用于将配体或抑制剂递送到靶位点。优选情况下，不受调节的或疾病相关的抗原的天然结合药剂用于此目的。

本发明还包括所述结合分子的功能变体。只要变体能与亲代结合分子竞争特异性结合proBDNF或其片段，则该变体分子就是本发明结合分子的功能变体。换言之，所述功能变体仍能结合proBDNF或其片段。功能变体包括但不限于一级结构序列基本相似，但含有例如在亲代结合分子中未发现的体外或体内化学和/或生化修饰的衍生物。这种修饰包括乙酞化、酞化、核苷酸或者核苷酸衍生物的共价附着、脂质或者脂质衍生物的共价附着、交联、二硫键形成、糖基化、羟基化、甲基化、氧化、聚乙二醇化、蛋白酶解加工、磷酸化等，只要亲代结合分子的氨基酸和/或核苷酸序列中的修饰不显著影响或改变由所述核苷酸序列编码的或者含有所述氨基酸序列的所述结合分子的结合特性，即所述结合分子仍能识别并结合其靶位。

所述功能变体可以具有保守序列修饰，包括核苷酸和氨基酸取代、添加和缺失。这些修饰可以通过本领域己知的标准技术导入，例如定向诱变和随机PCR介导的诱变，并且可包含天然以及非天然核苷酸和氨基酸。

保守氨基酸取代包括其中氨基酸残基由具有相似结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换的取代。具有相似侧链的氨基酸残基在本领域中公知，包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、无电荷极性侧链氨基酸(例如天冬酞胺、谷氨酞胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半肤氨酸、色氨酸)、非极性侧链氨基酸(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、分支侧链氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香侧链氨基酸(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)。本领域技术人员明白也可以使用除上述氨基酸之外的其它氨基酸。另外，变体可具有非保守的氨基酸取代，例如氨基酸由具有不同结构或者化学性质的另一氨基酸残基置换。相似的小变异也可包括氨基酸缺失或者插入，或者这二者。使用本领域熟知的计算机程序可以发现并确定哪些氨基酸残基可以被取代、插入或者缺失而不消除免疫学活性。

此外，功能变体还包含氨基酸序列在氨基末端或者羧基末端或者这两端的截短体。本发明的功能变体与亲代结合分子相比对proBDNF或其片段可具有增加或降低的结合亲和性。本发明的功能变体与所述亲代结合分子具有大约50％至大约99％、优选大约60％至大约99％、更优选大约70％至大约99％、甚至更优选大约80％至大约99％、最优选大约90％至大约99％、特别是大约95％至大约99％，以及特别是大约97％至大约99％的氨基酸序列同源性。本领域技术人员已知的计算机算法如Gap或者Bestfit可用于最佳地排列氨基酸序列以进行对比以及明确相似或相同的氨基酸残基。功能变体可以通过使用本领域己知的普通分子生物学方法改变亲代结合分子或其一部分而获得，所述方法包括但不限于易错PCR、寡核苷酸指导的诱变、定点诱变以及重链和/或轻链改组法。在一个实施方案中，本发明的功能变体对于proBDNF具有中和活性。所述中和活性与亲代结合分子相比可以相同或者更高或更低。当使用术语(人)结合分子时，其也涵盖所述(人)结合分子的功能变体。

作为本发明的优选方式，所述的结合分子是单克隆抗体。本发明的单克隆抗体或其片段可以是人源化、嵌合或鼠源的。此处所用的“人源化抗体”指的是具有对应于人所产生抗体的氨基酸序列的抗体，和/或通过本领域公知的制备人源化抗体的技术制备的抗体。人源化抗体主要指鼠源(或其它非人源的)单克隆抗体以基因克隆及DNA重组技术改造，重新表达的抗体，其大部分氨基酸序列为人源序列取代，基本保留亲本鼠单克隆抗体的亲和力和特异性，又降低了其异源性，有利应用于人体。人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体(也称CDR植入抗体grafting antibody)、表面重塑抗体或全人源化抗体。人源化抗体可以使用本领域已知的各种方法产生，例如人源化抗体选自一个噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人抗体。人源化抗体还可以通过在转基因动物中引入人免疫球蛋白位点而制备，所述的转基因动物例如，内源性免疫球蛋白基因已经被部分或完全灭活的小鼠。此外，人源化抗体还可以通过使得产生针对特定抗原的抗体的人B淋巴细胞永生化而制备。

作为本发明的优选方式，所述的结合分子是特异性结合proBDNF的多克隆抗体。本发明中，所用的术语“多克隆抗体(多抗)”指一组与抗原有特异性结合能力的球蛋白，其是由抗原刺激机体，产生免疫学反应后，由机体的浆细胞合成并分泌的。抗原通常是由多个抗原决定簇组成的，由一种抗原决定簇刺激机体，由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体。由多种抗原决定簇刺激机体，相应地就产生各种各样的单克隆抗体，这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。多克隆抗体的好处在于它们的效价高，特异性高，亲和力强，灵敏度好，便于人为处理和质量控制。此外，多克隆抗体制备相对容易，更为经济。

多克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来制得。所述的proBDNF或其片段可被施用于动物(如羊，兔，小鼠，大鼠等)以诱导多克隆抗体的产生。与之相似，表达proBDNF或其片段的细胞也可用来免疫动物来生产抗体。多克隆抗体可以用淋巴结注射法，皮下多点注射法，多途径联合注射法等免疫方法制得。在本发明的具体实施方案中，采用proBDNF片段(例如，SEQ ID NO:10)作为抗原，与弗氏佐剂混合后，背部皮下多点注射，免疫绵羊，并进行加强免疫，最终获得高效价的多克隆抗体。

三.proBDNF拮抗剂和BDNF激动剂

ProBDNF结合sortilin和p75，形成复合物激活若干胞内信号，诸如RhoA、JNK和NFκB。ProBDNF转导的信号在触发神经变性通向情感障碍的过程中起关键作用。在药物开发领域，优选方式是采用拮抗剂阻断引起疾病的信号途径。由于proBDNF/sortilin/p75信号途径对情感障碍的发生至关重要，因此使用拮抗剂作为药剂阻断信号途径是理想的。

所述药剂可以是与proBDNF、sortilin和p75间结合位点相互作用的小分子。ProBDNF、sortilin和p75的晶体学有助于以合理方式设计该药物。利用下游信号作为读出筛选药物可生成领先药物。

所述药剂也可以是大分子，诸如针对p75和sortilin的miRNA、siRNA，这些大分子减少p75和sortilin的表达，以致为治疗目的通向疾病的信号途径被封闭。

所述药剂还可以是针对sortilin和/或p75的不同变体的单抗或多抗，防止proBDNF与这些受体的结合。所述抗体将封闭proBDNF的信号，从而对情感障碍具有治疗作用。

此外，本发明药剂包括BDNF或其受体的激动剂，以刺激或促进BDNF或其受体的活性，恢复BDNF/proBDNF信号传递平衡，从而预防或治疗包括抑郁症在内的情感障碍。

四.药物组合物

本发明提供包含治疗有效量的所述结合分子的药物组合物。该组合物还可包含药学上可接受的载体。药物组合物可通过常规途径给药，包括但不限于静脉内、腹腔内注射等。本发明的药物组合物还可以与其他抑郁症的治疗剂联用。

本发明所用术语“药学上可接受的载体”是指当结合分子本体和载体组合，并适当施用动物或人时，不会产生不利的、过敏的或其它不良反应。本文所用的“药学上可接受的载体”应当与本发明的结合分子相容，即能与其共混而不会在通常情况下大幅度降低组合物的效果。

本发明所述的“有效量”是指足以产生有益和所需结果的量，所述结果包括减轻疾病进展或治愈的临床结果。可通过一次或多次给药来达到“有效量”。具体的剂量应当考虑给药途径、病人状况等因素来决定。

作为药学上可接受的载体或其组分的一些物质的具体例子是糖类，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；西黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石；固体润滑剂，如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇，如丙二醇、甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，如润湿剂，如月桂基硫酸钠；着色剂；调味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等渗盐溶液；和磷酸盐缓冲液等。

本发明的组合物，根据不同需要，可制成各种剂型，并可由医师根据患者种类、年龄、体重和大致疾病状况、给药方式等因素确定对病人有益的剂量进行施用。给药方式可采用注射或其它治疗方式。

本发明的结合分子可以未分离的或者分离的形式使用。此外，本发明的结合分子可以单独施用或者在包含至少一种本发明的结合分子(或其变体或片段)的混合物中施用。换言之，所述结合分子可以组合施用，例如作为包含两种或更多种本发明的结合分子、其变体或片段的药物组合物。例如，具有不同但互补活性的结合分子可以组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、缓解或治疗作用，或者也可以将具有相同活性的结合分子组合在一个治疗方案中以达到希望的预防、缓解或治疗作用。

可以调整给药方案以提供最佳的所需应答(例如治疗应答)。合适的剂量范围例如是0.1-100mg/kg体重，优选0.5-15mg/kg体重。此外，例如可以给药一次推注、随时间给药多次分开剂量或者根据治疗情况的紧急性而可以按比例降低或增加剂量。本发明的结合分子和组合物优选是无菌的。使得这些分子和组合物无菌的方法为本领域所熟知。

五.本发明采用慢性不可预知轻度应激(CUMS)方法成功建造了大鼠抑郁症模型

1.实验动物的选择及分组

选择成年雄性wistar大鼠100只，体重约为200-250克，随机分成10组。其中一组正常饲养，自由饲用食物和水，作为对照组；其余九组给予CUMS。

2.建模

实验组大鼠单鼠单笼饲养，给予CUMS刺激，对照组大鼠每5只一笼，正常喂养。

CUMS抑郁模型制作方案：

(1)笼子倾斜45°，7小时

(2)距鼠尾1厘米处，夹尾1分钟

(3)禁食，24小时

(4)禁水，24小时

(5)4℃冷水游泳，5分钟

(6)黑白颠倒，24小时

(7)200转/分水平摇晃，5分钟

(8)不同的噪音，6小时

(9)放异物，12小时

(10)潮湿垫料，12小时

(11)不给予任何刺激，24小时

(12)40℃热水游泳，5分钟

以上的12种刺激随机安排到21天内，每天1种，每种刺激不能出现3次以上，同种刺激不能连续出现，使动物不能预料刺激的发生。第22天对所有动物进行行为学评价：旷场实验(Open-field Test)，强迫游泳实验(Forced-swimming Test)和1％蔗糖水偏好实验(1％Sucrosepreference Test)测定，处理前后若数据具有统计学差异(p＜0.05)，则说明模型建立成功。

六.本发明采用下列行为学实验方法评价大鼠抑郁模型及其治疗效果(Yang CR et al.,2014Neurotoxicity Research Neurotox Res.2014Apr；25(3):235-47；Ruan CS et al.,Eur J Neurosci.2014Aug；40(4):2680-90)

(1)1％糖水偏好实验(1％sucrose preference test，SPT)测定

1％糖偏好＝1％糖水消耗/(水耗+1％糖水消耗)

CUMS刺激开始前，要对所有实验大鼠进行糖水适应的训练，时间约为4天，将2瓶糖水放在笼子上24小时后，其中一瓶糖水用纯水替代同样24小时，然后再禁食禁水24小时，最后单鼠单笼，每个笼子上放一瓶约75ml的纯水和一瓶约75ml的1％糖水，供大鼠1小时内自由饮用。适应阶段结束后，进行21天的CUMS刺激。第22天禁水、禁食23小时，第24小时测定动物1小时饮用1％蔗糖溶液的量。测定前后水瓶的重量差为动物1小时饮用1％蔗糖溶液的量。1％蔗糖溶液消耗量以1％蔗糖消耗量/(水和糖消耗量之和)进行评定，每周测定1次。相对于对照组，该比值在模型大鼠组明显下降，说明抑郁组大鼠欣快感降低，这是抑郁症的核心表现之一。

(2)旷场实验(Open-field test，OFT)

方法：将动物置入100cm×100cm×50cm周壁、箱底为黑色的箱内，且其底面由25块相等的20cm×20cm正方形组成，视频跟踪分析软件(ANY-maze)系统自动划分。将动物放入正中央格后开始测定，每次测定5min，测试过程采用摄像机记录，每只大鼠只进行一次行为测定，测定完毕，粪便清理干净后，用75％酒精擦拭干净箱底，再进行下一只测定，采用单盲法。测定指标为5min内不运动时间、攀爬次数(两只前爪离开底面)和水平运动距离(四只爪穿过格子数)。

(3)强迫游泳实验(Forced swimming test，FST)

强迫游泳实验是基于之前Porsoltetal建立的实验方法。实验时，大鼠被放在开放的圆柱型白塑料容器内(直径40cm，高80cm)，往其注入40cm的水，温度约为22℃-25℃。记录处于该环境的大鼠产生绝望的不动状态过程中的一系列参数。总记录时间为5min，采用单盲法。测定指标为不动时间(大鼠在水面漂浮只有轻微的活动或是身体垂直于水面只有鼻子露出水面的时间)。相对于对照组，该值在模型大鼠组明显下降。

七.本发明采用下列分子生物学方法检测BDNF和proBDNF的转录和表达水平(Zhou L et al:J Affect Disord.2013Sep 25；150(3):776-84；Xiong J et al.,Neuro Oncol.2013Aug；15(8):990-1007)

1.动物模型的取材及相关实验方法

直接取材：断颈处死大鼠方法：先用乙醚麻醉，然后用剪刀沿颈部剪下鼠头，立即放置冰上，迅速剥去头皮，剪开头颅骨，分离脑膜，取出全脑，切除小脑，留大脑剥离出其海马和皮层，迅速将其放置液氮中，留取做western blot和RT-PCR的标本。

灌注取材：大鼠用0.3％的戊巴比妥钠麻醉后，打开胸腔，充分暴露出心脏，灌注针向着主动脉方向刺入左侧心尖，先给予灭菌的0.9％生理盐水灌注，直到肝脏发白，再更换4％多聚甲醛溶液灌注，见有肌肉抽搐表示灌注良好，直到身体僵硬，头、身体、尾部成一直线后，迅速取出完整脑组织。然后将其放入4％多聚甲醛溶液，4℃放置12-48小时，然后再放入30％蔗糖溶液里，4℃放置，直到脑组织沉底，取出进行冰冻切片(贴片16μm，漂片30μm)。留作组织进行高尔基染色。

2.Western blot

2.1蛋白样品制备：

组织中总蛋白的提取：

将0.1g组织放于匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将其尽量剪碎后，加入1ml RIPA裂解液于匀浆器中，迅速在冰上进行匀浆。再置于冰上10-20min，用移液器将裂解液移至1.5ml离心管中，然后在4℃下12000rpm的条件下离心20min，取上清分装于0.5ml离心管中，并置于-20℃保存。

2.2蛋白含量检测

用BCA蛋白定量试剂盒(北京康为公司)测定每个样品的蛋白含量后，根据公式计算出含50μg蛋白的溶液体积，即为上样量。

按照BCA蛋白检测试剂盒说明书，操作如下：

(1)稀释BSA标准品：用RIPA稀释液按下表稀释BSA标准品。

(2)配置BCA工作液：根据BSA标准品和待测样品的数量，将试剂A和试剂B以50:1的体积比混匀。

(3)取标准品20μl加至96孔板的标准品孔中。

(4)加入2μl待测蛋白样品到96孔板的样品孔中，并加入RIPA裂解液18μl，每孔溶液补足至20μl，充分混匀，但尽量不要产生气泡。

(5)在标准品和蛋白样品孔中各加入A、B混合液200μl，充分混匀。

(6)盖上96孔板盖，37℃孵育30分钟。

(7)冷却至室温，用酶标仪测定其562nm处的吸光值。

(8)绘制标准曲线，计算样品中的蛋白浓度。

注意：检测范围是：20-2000μg/ml。如果所得到的蛋白浓度不在检测范围内，应重新稀释样品后再次测定。

2.3电泳

按上述方法配10％分离胶和12％浓缩胶，以50μg蛋白的体积上样，电泳时间一般2-3小时，电压为80V，至蛋白marker的最后一条能看到时，即可终止电泳，进行转膜。转完膜后蛋白凝胶可用考马斯亮蓝染色液染半个小时(置于脱色摇床上摇)，然后用脱色液洗脱染液直至能清楚观察到蛋白条带。观察目的蛋白条带是否分离出来。此法可确定电泳效果。

2.4转膜

转一张膜需准备6张与凝胶大小相等的滤纸和一张PVDF膜。放置的顺序为滤纸-蛋白凝胶-PVDF膜-滤纸。用夹子夹住，将其放入转移槽槽中，注意要将蛋白凝胶接触负极，用恒流400mA转膜2小时(转移时间应根据目的蛋白条带大小决定)。用该方法转移时会产热，因此转移槽内最好放一冰盒，将整个转移槽埋入冰内，通上转膜仪。

转完后，将膜用1×丽春红染液染5min(置于脱色摇床上摇)。然后用双蒸水或TBST溶液冲洗染液几次，就可看到膜上的蛋白，观察目的蛋白条带是否转移完全。蛋白凝胶可用考马斯亮蓝染色半个小时(置于脱色摇床上摇)，然后用脱色液洗脱染液，观察蛋白凝胶上的蛋白条带是否转移完全。通过以上染色方法确定转膜效果。

2.5封闭

将膜用TBST从下向上浸湿后，移至含有5％的脱脂奶粉的培养皿中，室温下，摇床上摇动封闭1小时。

2.6孵育抗体

将PVDF膜用滤纸吸干，然后将其置于保鲜膜或自封袋上，使一抗和膜充分接触，再用封口机将保鲜膜或自封袋封好，以防抗体流出，4℃摇床孵育过夜。第二天将膜置于摇床上，用TBST冲洗PVDF膜3次，每次15min。用同样的方法孵育二抗，室温1小时。再将膜置于摇床上，用TBST冲洗PVDF膜3次，每次15min。

一级抗体

二级抗体

2.7显影

将A和B两种试剂在凝胶成像仪上等体积混合，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触。用伯乐凝胶成像仪的Image Lab软件，将PVDF膜进行拍照，用ImageJ软件分析目的条带的灰度。

3.RT-PCR方法(Zhou L et al:J Affect Disord.2013Sep 25；150(3):776-84；Xiong J et al.,Neuro Oncol.2013Aug；15(8):990-1007)

3.1从http:www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez中查找大鼠BDNF、trkB及内参β-肌动蛋白的基因序列，用primer premier软件设计引物。

3.2总RNA的提取：采用Trizol法提取研究大鼠大脑皮层和海马中的总RNA

1)提取方法：

匀浆化作用：通过离心来沉淀细胞后，弃上清，用移液管加1mlTrizol试剂反复吹打来裂解细胞至均一通亮的液态后，将匀浆样品在15～30℃条件下孵育5分钟以使核蛋白体完全分解。

分离阶段：每1ml Trizol加0.2ml氯仿。盖紧样品管盖，用手用力摇晃试管15秒，并将其在30℃下孵育2～3分钟。在2～8℃下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心15分钟。离心后混合物分成三层：下层红色的苯酚-氯仿层，中间层，上层无色的水样层。RNA存在于水样层当中。水样层的容量大约为所加Trizol容量的60％。

RNA的沉淀：将水样层转移到一干净的试管中，通过将水样层和异丙醇混合来沉淀RNA。最初均化时的每1ml Trizol对应0.5ml异丙醇。将混合的样品在15～30℃条件下孵育10分钟并在2～8℃下以不超过12,000×g的离心力高速冷冻离心10分钟。RNA沉淀在离心前通常不可见，之后形成一胶状片状沉淀附着于试管壁和管底。

RNA的洗脱：移去上层悬液。用75％的乙醇洗涤RNA沉淀一次，每1ml的Trizol至少加1ml的75％乙醇。旋涡振荡混合样品并在2～8℃下以不超过7,500×g的离心力高速冷冻离心5分钟。

RNA的再溶解：在操作的最后，简单干燥RNA沉淀。尤为重要的是，不能让RNA沉淀完全干燥那样会极大地降低它的可溶性。用移液管尖分几次移取无RNA酶的DEPC水来溶解RNA，并在55～60℃下孵育10分钟。

2)提取的总RNA，用NanoDrop ND-1000紫外-可见分光光度计检测其浓度及纯度。合格的RNA置于-80℃冰箱保存。

3.3RNA逆转录为cDNA

采用TAKARA逆转录试剂盒(PrimeScript RT reagent kit)(PerfectReal Time)50μl体系，总的RNA小于或等于2500ng。

RNA反转录温度系统

37℃，15min

85℃，5s

4℃，永久

cDNA存储在-20℃；而RNA存储在-80℃。

根据所测的RNA样本浓度，计算配逆转录反应体系所需加无RNase ddH₂O和Total RNA的量。cDNA产物可以直接作为PCR的模板。

4.高尔基染色(Golgi staining)

采用FD NeuroTechnologies,Inc.的高尔基染色试剂盒。

(1)将组织切成1cm3大小的正方体(海马和皮层要保留完整)，将其浸入A，B混合液中，室温12小时后换一次A，B混合液，固定2周，浸泡液的体积至少是组织块的5倍。

注意A，B混合液要提前48小时配置，整个固定，染色、脱水、透明过程中都应避光。

(2)将A，B混合液倒掉，换成C液，放置4℃冰箱，12小时后换一次C液，至少避光放置48小时，最长不能超过一周。注意A，B液均为有毒物质，不能直接倒入下水池。

(3)将组织片用冰冻切片机切成150μm厚的片子。冠状位切片。注意避光。

(4)用双蒸水冲洗组织片子2次，每次2min。

(5)按D液:E液:双蒸水为1:1:2的比例配制染色液。然后用D，E混合液浸泡组织片子10min。

(6)用双蒸水冲洗组织2次，每次4min。

(7)分别用50％、75％和95％的乙醇脱水，每次4min。

(8)用无水乙醇脱水4次，每次4min。

(9)用二甲苯透明3次，每次4min。

(10)用中性树胶封片，观察，用共聚焦显微镜获取图片。

(11)用LAS AF Lite软件计算树突棘长度

所有的统计分析均使用17.0版SPSS。计量资料的实验数据以均数±标准误表示，一组样本经处理前后比较用配对t检验进行检测；两组样本之间的差异用独立样本t检验进行检测，多组资料之间的比较用单因素方差分析检测。P值<0.05(双尾)被认为有统计学意义。

七.技术效果

本发明的大量实验数据显示，大鼠出现抑郁表现后，在蛋白水平，其大脑皮层和海马中proBDNF及其受体p75NTR和Sortilin的表达上调，Trkb和BDNF表达下调。在分子转录水平，抑郁大鼠皮层和海马中BDNF和TrkB下降，而Sortilin和p75上升。

通过对大鼠抑郁模型进行干预(侧脑室注射、腹腔注射、肌肉注射抗体或因子)后，anti-proBDNF组的行为学和NSS组相比有明显改善，AVV-BDNF组的行为学和AVV-proBDNF、AVV-EGFP组相比也有明显改善。通过高尔基染色，抑郁症的形成与树突棘的长度减少成正相关。proBDNF的减少与BDNF的增加在抑郁症的形成过程中发挥了重要的作用，并且促进了大脑中神经元的再生。

本申请研究表明，BDNF含量与抑郁症的产生有着密不可分的关系，proBDNF与成熟BDNF具有不同的生物活性，是治疗包括抑郁症在内的情感障碍的靶点。生理状态下，海马神经元及部分神经内分泌细胞能合成并释放内源性pro-BDNF，pro-BDNF有着与成熟BDNF相反的作用。该研究成果为治疗抑郁症提供了新的方向，随着对抑郁症的进一步深入研究，对神经营养因子及其前体蛋白功能认识的不断完善，将会为抑郁症的治疗产生重要意义。

附图说明

为了更清楚地描述本发明的技术方案，下面将结合附图作简要介绍。显而易见，这些附图仅是本申请记载的一些具体实施方式，本发明包括但不限于这些附图。所有图中，*和#表示有差异，p<0.05；**、***和###表示有明显差异，p<0.01。

图1：正常大鼠给予21天不同的刺激，抑郁大鼠分别给予侧脑室注射anti-proBDNF和NSS(正常羊血清)抗体，腹腔注射anti-proBDNF和NSS抗体，大鼠OFT(旷场试验)水平运动距离的定量分析。

图2：正常大鼠给予21天不同的刺激，抑郁大鼠分别给予侧脑室注射anti-proBDNF和NSS抗体，腹腔注射anti-proBDNF和NSS抗体，大鼠OFT不动时间的定量分析。

图3：正常大鼠给予21天不同的刺激，抑郁大鼠分别给予侧脑室注射anti-proBDNF和NSS抗体，腹腔注射anti-proBDNF和NSS抗体，大鼠OFT站立次数的定量分析。

图4：正常大鼠给予21天不同的刺激，抑郁大鼠分别给予侧脑室注射anti-proBDNF和NSS抗体，腹腔注射anti-proBDNF和NSS抗体，大鼠FST(强迫游泳实验)不动时间的定量分析。

图5：正常大鼠给予21天不同的刺激，抑郁大鼠分别给予侧脑室注射anti-proBDNF和NSS抗体，腹腔注射anti-proBDNF和NSS抗体，大鼠1％糖水消耗的定量分析。

图6：肌肉注射三种因子后三组大鼠FST不动时间的定量分析。

图7：肌肉注射三种因子后三组大鼠OFT不动时间的定量分析。

图8：肌肉注射三种因子后三组大鼠OFT水平运动距离的定量分析。

图9：肌肉注射三种因子后三组大鼠OFT站立次数的定量分析。

图10：肌肉注射三种因子后三组大鼠1％糖水消耗的定量分析。

图11a：抑郁组和对照组proBDNF在大鼠皮层区域表达的变化；图11b：抑郁组和对照组proBDNF在大鼠海马区域表达的变化；图11c：抑郁组和对照组proBDNF在大鼠皮层区域表达变化的定量分析，*抑郁组与对照组比较有差异，p<0.05；图11d：抑郁组和对照组proBDNF在大鼠海马区域表达变化的定量分析，*抑郁组与对照组比较有差异，p<0.05。

图12a：抑郁组和对照组sortilin在大鼠皮层区域表达的变化；图12b：抑郁组和对照组sortilin在大鼠海马区域表达的变化；图12c：抑郁组和对照组sortilin在大鼠皮层区域表达变化的定量分析，*抑郁组与对照组比较有差异，p<0.05；图12d：抑郁组和对照组sortilin在大鼠海马区域表达变化的定量分析，*抑郁组与对照组比较有差异，p<0.05。

图13a：抑郁组和对照组p75在大鼠皮层区域表达的变化；图13b：抑郁组和对照组p75在大鼠海马区域表达的变化；图13c：抑郁组和对照组p75在大鼠皮层区域表达变化的定量分析，*抑郁组与对照组比较有差异，p<0.05；图13d：抑郁组和对照组p75在大鼠海马区域表达变化的定量分析，*抑郁组与对照组比较有差异，p<0.05。

图14a：抑郁组和对照组Trkb在大鼠皮层区域表达的变化；图14b：抑郁组和对照组Trkb在大鼠海马区域表达的变化；图14c：抑郁组和对照组Trkb在大鼠皮层区域表达变化的定量分析，*抑郁组与对照组比较有差异，p<0.05；图14d：抑郁组和对照组Trkb在大鼠海马区域表达变化的定量分析，***抑郁组与对照组比较有明显差异，p<0.01。

图15a：肌动蛋白在大鼠皮层和海马区域表达变化；图15b：BDNF在大鼠皮层和海马区域表达变化；图15c：BDNF在大鼠皮层区域表达变化定量分析，**抑郁组与对照组比较有明显差异，p<0.01；图15d：BDNF在大鼠海马区域表达变化定量分析，*抑郁组与对照组比较有差异，p<0.05。

图16a：肌动蛋白在大鼠皮层和海马区域表达变化；图16b：TrkB在大鼠皮层和海马区域表达变化；图16c：TrkB在大鼠皮层区域表达变化定量分析，*抑郁组与对照组比较有差异，p<0.05；图16d：TrkB在大鼠海马区域表达变化定量分析，*抑郁组与对照组比较有差异，p<0.05。

图17a：肌动蛋白在大鼠皮层和海马区域表达变化；图17b：sortilin在大鼠皮层和海马区域表达变化；图17c：sortilin在大鼠皮层区域表达变化定量分析，*抑郁组与对照组比较有差异，p<0.05；图17d：sortilin在大鼠海马区域表达变化定量分析，**抑郁组与对照组比较有明显差异，p<0.01。

图18a：肌动蛋白在大鼠皮层区域表达变化；图18b：肌动蛋白在大鼠海马区域表达变化；图18c：P75在大鼠皮层区域表达变化；图18d：P75在大鼠海马区域表达变化；图18e：P75在大鼠皮层区域表达变化定量分析，*抑郁组与对照组比较有差异，p<0.05；图18f：P75在大鼠海马区域表达变化定量分析，***抑郁组与对照组比较有明显差异，p<0.01。

图19：正常大鼠给予21天不同的刺激，抑郁大鼠分别给予侧脑室注射anti-proBDNF和NSS抗体，腹腔注射anti-proBDNF和NSS抗体，大鼠大脑皮层神经元树突棘长度的定量分析。

图20：正常大鼠给予21天不同的刺激，抑郁大鼠分别给予侧脑室注射anti-proBDNF和NSS抗体，腹腔注射anti-proBDNF和NSS抗体，大鼠大脑海马神经元树突棘长度的定量分析。

图21a：抑郁组皮层神经元树突棘长度高尔基染色结果；图21b：对照组皮层神经元树突棘长度高尔基染色结果；图21c：抑郁组海马神经元树突棘长度高尔基染色结果；图21d：对照组海马神经元树突棘长度高尔基染色结果。

图22a：侧脑室注射两种抗体后anti-proBDNF组大鼠皮层神经元树突棘长度的高尔基染色结果；图22b：侧脑室注射两种抗体后NSS组大鼠皮层神经元树突棘长度的高尔基染色结果；图22c：侧脑室注射两种抗体后anti-proBDNF组大鼠海马神经元树突棘长度的高尔基染色结果；图22d：侧脑室注射两种抗体后NSS组大鼠海马神经元树突棘长度的高尔基染色结果。

图23a：腹腔注射两种抗体后，NSS组大鼠大脑皮层神经元树突棘长度的高尔基染色结果；图23b：腹腔注射两种抗体后，anti-proBDNF组大鼠大脑皮层神经元树突棘长度高尔基染色结果。

图24a：腹腔注射两种抗体后，NSS组大鼠大脑海马神经元树突棘长度的高尔基染色结果；图24b：腹腔注射两种抗体后，anti-proBDNF组大鼠大脑海马神经元树突棘长度高尔基染色结果。

图25：肌肉注射三种因子后，三组大鼠大脑皮层神经元树突棘长度的定量分析；***AVV-proBDNF组与AVV-BDNF组比较有显著性差异，p<0.01；###AVV-EGFP组与AVV-BDNF组比较有显著性差异，p<0.01。

图26a：肌肉注射三种因子后，AVV-BDNF组大鼠大脑皮层神经元树突棘长度的高尔基染色结果；图26b：肌肉注射三种因子后，AVV-proBDNF组大鼠大脑皮层神经元树突棘长度高尔基染色结果；图26c：肌肉注射三种因子后，AVV-EGFP组大鼠大脑皮层神经元树突棘长度的高尔基染色结果。

图27：肌肉注射三种因子后，三组大鼠大脑海马树突棘长度的定量分析；***AVV-PRPBDNF组与AVV-BDNF组比较有显著性差异，p<0.01；###AVV-EGFP组与AVV-BDNF组比较有显著性差异，p<0.01。

图28a：肌肉注射三种因子后，AVV-BDNF组大鼠大脑海马神经元树突棘长度的高尔基染色结果；图28b：肌肉注射三种因子后，AVV-proBDNF组大鼠大脑海马神经元树突棘长度的高尔基染色结果；图28c：肌肉注射三种因子后，AVV-EGFP组大鼠大脑海马神经元树突棘长度的高尔基染色结果。

图29：腹膜内注射重组sortilin ECD-Fc和p75ECD-Fc对大鼠抑郁症的影响；**和***表示与抑郁大鼠比较，对照和给药受体片段均具显著性差异，p<0.01。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面将结合实施例对本发明的优选方案进行描述。这些描述只是举例说明本发明的特征和优点，而非限制本发明的保护范围。

实施例1

抑郁症大鼠建模及其确认

根据上文所述方法，通过CUMS建立抑郁症大鼠模型。

与对照比较，通过OFT(包括站立次数、水平运动距离和不动时间)、FST(不动时间)和SPT(糖水消耗)行为学测试，结果均具有统计学意义(p<0.05或p<0.01)，确认抑郁症大鼠模型建造成功(Yang CR et al.,2014Neurotoxicity Research Neurotox Res.2014Apr；25(3):235-47；Ruan CSet al.,Eur J Neurosci.2014Aug；40(4):2680-90)。

实施例2

蛋白和转录水平检测

1.根据上文Western blot方法，测定大鼠皮层和海马区域的肌动蛋白(actin，SEQ ID NO:23)、proBDNF(SEQ ID NO:24)、sortilin(SEQ IDNO:26)、p75(SEQ ID NO:25)和trkb(SEQ ID NO:27)的蛋白水平。结果参见下表11-17和图11-14。

Western blot结果显示，大鼠海马和皮层区，抑郁组proBDNF的表达明显高于对照组(p<0.05)。

表11：大鼠抑郁模型中proBDNF在皮层表达变化的比较

组别	proBDNF/肌动蛋白(％)
		对照组	0.2754±0.027829(n＝3)
抑郁组	0.3673±0.01582*(n＝6)

*抑郁组与对照组比较有差异，p<0.05。

表12：大鼠抑郁模型中proBDNF在海马表达变化的比较(N＝5)

组别	proBDNF/肌动蛋白(％)
		对照组	0.1239±0.01120
抑郁组	0.1886±0.01807*

*抑郁组与对照组比较有差异，p<0.05。

Western blot结果显示，大鼠海马和皮层区，抑郁组sortilin的表达明显高于对照组(p<0.05)。

表13：大鼠抑郁模型中sortilin在海马表达变化的比较

组别	sortilin/肌动蛋白(％)
		对照组	0.4371±0.1282(n＝3)
抑郁组	0.8733±0.08611*(n＝4)

*抑郁组与对照组比较有差异，p<0.05。

表14：大鼠抑郁模型中sortilin在皮层表达变化的比较

组别	sortilin/肌动蛋白(％)
		对照组	0.4296±0.06553(n＝3)
抑郁组	0.6998±0.0477*(n＝3)

*抑郁组与对照组比较有差异，p<0.05。

Western blot结果显示，大鼠海马和皮层区，抑郁组p75的表达明显高于对照组(p<0.05)。

表15：大鼠抑郁模型中p75在皮层表达变化的比较

组别	p75/肌动蛋白(％)
		对照组	0.7518±0.04834(n＝3)
抑郁组	1.434±0.1157*(n＝6)

*抑郁组与对照组比较有差异，p<0.05。

表16：大鼠抑郁模型中p75在海马表达变化的比较

组别	p75/肌动蛋白(％)
		对照组	0.2758±0.04413(n＝3)
抑郁组	0.4598±0.03708*(n＝6)

*抑郁组与对照组比较有差异，p<0.05。

Western blot结果显示，大鼠海马和皮层区，抑郁组Trkb的表达明显低于对照组(p<0.05)。

表17：大鼠抑郁模型中Trkb在皮层表达变化的比较

组别	Trkb/肌动蛋白(％)
		对照组	0.4751±0.04429(n＝5)
抑郁组	0.3215±0.03150*(n＝6)

*抑郁组与对照组比较有差异，p<0.05。

表18：大鼠抑郁模型中Trkb在海马表达变化的比较

组别	Trkb/肌动蛋白(％)
		对照组	0.5940±0.02050(n＝4)
抑郁组	0.2037±0.02670***(n＝5)

***抑郁组与对照组比较有明显差异，p<0.01。

2.根据上文RT-PCR方法，测定大鼠皮层和海马区域的肌动蛋白(actin，SEQ ID NO:28)、BDNF(SEQ ID NO:29)、trkb(SEQ ID NO:30)、sortilin(SEQ ID NO:31)和p75(SEQ ID NO:32)的转录水平。

各基因引物序列如下：

β-肌动蛋白：

正向引物：5'-TCACCAACTGGGACG-3'(SEQ ID NO:21)

反向引物：5'-AGGCATACAGGGACAA-3'(SEQ ID NO:22)

BDNF：

正向引物：5'-GACAAGGCAACTTGGCCTAC-3'(SEQ ID NO:11)

反向引物：5'-CCTGTCACACACGCTCAGCTC-3'(SEQ ID NO:12)

TrkB：

正向引物：5′-TCATAAGATCCCCCTGGATG-3′(SEQ ID NO:13)

反向引物：5′-TGCTTCTCAGCTGCCTGAC-3′(SEQ ID NO:14)

Sortilin：

正向引物：5′-ACCAACAATACGCACCAGC-3′(SEQ ID NO:15)

反向引物：5′-AATAGCCATGCCGAACTCC-3′(SEQ ID NO:16)

P75：

正向引物：5′-AGGGCACATACTCAGACGAA-3′(SEQ ID NO:17)

反向引物：5′-AGATGGAGCAATAGACAGGAAT-3′(SEQ IDNO:18)

RT-PCR反应体系，循环

肌动蛋白

2％琼脂糖凝胶80v，5min，120V，25min，产物：207bp。

BDNF

2％琼脂糖凝胶80v，5min，120V，25min，产物442bp。

Trk B

2％琼脂糖凝胶80v，5min，120V，25min，产物：242bp。

Sortilin

2％琼脂糖凝胶80v，5min，120V，25min，产物：234bp。

P75

2％琼脂糖凝胶80v，5min，120V，25min，产物：324bp。

RT-PCR凝胶显影，结果参见下表19-26和图15-18。

大鼠皮层和海马区域，抑郁组BDNF的转录水平明显低于对照组(p<0.05)。

表19：21天不同的刺激后，大鼠皮层区域BDNF/肌动蛋白(％)的比较

组别	BDNF/肌动蛋白(％)
		对照组	1.326±0.01495(n＝3)
抑郁组	1.138±0.02952**(n＝3)

**抑郁组与对照组比较有显著性差异，p<0.01。

表20：21天不同的刺激后，大鼠海马区域BDNF/肌动蛋白(％)的比较

组别	BDNF/肌动蛋白(％)
		对照组	1.233±0.02904(n＝4)
抑郁组	1.101±0.03376*(n＝4)

*抑郁组与对照组比较有差异，p<0.05。

大鼠皮层和海马区域，抑郁组TrkB的转录水平明显低于对照组(p<0.05)。

表21：21天不同的刺激后，大鼠皮层区域TrkB/肌动蛋白(％)的比较

组别	TrkB/肌动蛋白(％)
		对照组	1.076±0.05427(n＝3)
抑郁组	0.8201±0.07418*(n＝3)

*抑郁组与对照组比较有差异，p<0.05。

表22：21天不同的刺激后，大鼠海马区域TrkB/肌动蛋白(％)的比较

组别	TrkB/肌动蛋白(％)
		对照组	1.233±0.02904(n＝3)
抑郁组	1.101±0.03376*(n＝4)

*抑郁组与对照组比较有差异，p<0.05。

大鼠皮层和海马区域，抑郁组sortilin的转录水平明显高于对照组(p<0.05)。

表23：21天不同的刺激后，大鼠皮层区域是sortilin/肌动蛋白(％)的比较

组别	TrkB/肌动蛋白(％)
		对照组	0.6626±0.03712(n＝3)
抑郁组	0.8437±0.03487*(n＝3)

*抑郁组与对照组比较有差异，p<0.05。

表24：21天不同的刺激后，大鼠海马区域是sortilin/肌动蛋白(％)的比较

组别	sortilin/肌动蛋白(％)
		对照组	0.6489±0.01488(n＝4)
抑郁组	0.7554±0.01492**(n＝4)

**抑郁组与对照组比较有显著性差异，p<0.01。

大鼠皮层和海马区域，抑郁组P75的转录水平明显高于对照组(p<0.05)。

表25：21天不同的刺激后，大鼠皮层区域是p75/肌动蛋白(％)的比较(N＝4)

组别	p75/肌动蛋白(％)
		对照组	0.7131±0.02262
抑郁组	0.9166±0.06435*

*抑郁组与对照组比较有差异，p<0.05。

表26：21天不同的刺激后，大鼠海马区域是p75/肌动蛋白(％)的比较(N＝4)

组别	p75/肌动蛋白(％)
		对照组	1.255±0.02552
抑郁组	1.507±0.02166***

***抑郁组与对照组比较有显著性差异，p<0.01。

实施例3

肌内注射AVV8-BDNF、AAV8-proBDNF和AAV8-EGFP三种因子

注射方法和剂量：在三组抑郁模型鼠两侧胫骨前肌肉分别注射50μl AAV8-BDNF、AAV8-proBDNF和AAV8-EGFP(Virovek根据合同制备,参见Yao et al.,Mol Psychiatry.,2015PMID:25917367)，用PBS进行1:1的稀释，只注射一次。两周后进行行为学测试评价。

施用上述三种因子后，通过FST、OFT和SPT行为学实验分别检测不动时间、水平运动距离和糖水消耗的结果比较，参见下表6-10和图6-10。

表6：肌肉注射三种因子后，三组大鼠FST不动时间的比较(N＝7)

组别	不动时间(s)
		AVV8-BDNF组	78.71±18.22
AVV8-proBDNF组	180.1±20.33**
		AVV8-EGFP组	146.3±18.2#

**AVV8-proBDNF组与AVV8-BDNF组比较有显著性差异，p<0.01；和

#AVV8-EGFP组与AVV8-BDNF组比较有差异，p<0.05。

表7：肌肉注射三种因子后，三组大鼠OFT不动时间的比较(N＝7)

组别	不动时间(s)
		AVV8-BDNF组	69.44±11.96
AVV8-proBDNF组	137.9±12.69**
		AVV8-EGFP组	146.0±14.54##

**AVV8-proBDNF组与AVV8-BDNF组比较有显著性差异，p<0.01；和

##AVV8-EGFP组与AVV8-BDNF组比较有显著性差异，p<0.01。

表8：肌肉注射三种因子后，三组大鼠OFT水平运动距离的比较(N＝7)

组别	水平运动距离(m)
		AVV8-BDNF组	27.73±1.953
AVV8-proBDNF组	11.41±1.193***
		AVV8-EGFP组	7.889±1.605###

***AVV8-proBDNF组与AVV8-BDNF组比较有显著性差异，p<0.01；和

###AVV8-EGFP组与AVV8-BDNF组比较有显著性差异，p<0.01。

表9：肌肉注射三种因子后，三组大鼠OFT站立次数的比较(N＝7)

组别	站立次数(次)
		AVV8-BDNF组	23.00±2.845
AVV8-proBDNF组	12.71±2.135**
		AVV8-EGFP组	8.571±1.088###

**AVV8-proBDNF组与AVV8-BDNF组比较有显著性差异，p<0.01；和

###AVV8-EGFP组与AVV8-BDNF组比较有显著性差异，p<0.01。

表10：肌肉注射三种因子后，三组大鼠1％糖水消耗的比较(N＝7)

组别	1％糖水消耗(％)
		AVV8-BDNF组	80.14±3.203
AVV8-proBDNF组	53.86±6.300*
		AVV8-EGFP组	50.43±8.443#

*AVV8-proBDNF组与AVV8-BDNF组比较有显著性差异，p<0.05；和

#AVV8-EGFP组与AVV8-BDNF组比较有显著性差异，p<0.05。

如上所述，肌内注射三种因子后，高尔基染色的比对结果参见下表29-30和图25-28。

表29：肌肉注射三组因子后，三组大鼠大脑皮层树突棘长度的比较(N＝7)

组别	树突棘长度(μm)
		AVV8-EGFP组	1.140±0.0749###
AVV8-proBDNF组	1.038±0.1073***
		AVV8-BDNF组	3.612±0.3224

***AVV8-proBDNF组与AVV8-BDNF组比较有显著性差异，p<0.01；和

###AVV8-EGFP组与AVV8-BDNF组比较有显著性差异，p<0.01。

表30：肌肉注射三组因子后，三组大鼠大脑海马神经元树突棘长度的比较(N＝7)

组别	树突棘长度(μm)
		AVV8-EGFP组	1.096±0.05748###
AVV8-proBDNF组	0.7033±0.07482***
		AVV8-BDNF组	3.552±0.4913

***AVV8-proBDNF组与AVV8-BDNF组比较有显著性差异，p<0.01；和

###AVV8-EGFP组与AVV8-BDNF组比较有显著性差异，p<0.01。

实施例4

1.proBDNF和NSS抗体的制备

抗proBDNF多克隆抗体的制备

利用如下氨基酸序列的人proBDNF抗原制备多克隆抗体：

APMKEANIRGQGGLAYPGVRTHGTLESVNGPKAGSRGLTSLADTFEHVIEELLDEDQKVRPNEENNKDADLYTSRVMLSSQVPLEPPLLFLLEEYKNYLDAANMSMRVRR(SEQ ID NO:10)

(1)采用PCR扩增人proBDNF片段(反向引物5’-CTAGCGCCGAACCCTCATAGA-3’(SEQ ID NO:20)；正向引物5’-TTAGCGCCGAACCCTCATAGA-3’(SEQ ID NO:19)，并把其克隆到载体pET100/D-TOPO(Invitrogen)的多克隆位点内，把质粒转染到大肠杆菌BL21内培养，细菌群生长在含100μg/ml的氨苄青霉素的1000ml LB中；在300rpm，37℃条件下进行摇荡，测培养液在580nm处的OD值0.8，然后添加IPTG至终浓度为0.5mM后，30℃条件下过夜孵化，4℃ 11000g离心，20分钟后收集细菌；菌斑悬浮在40ml的缓冲液中，缓冲液为50mM的磷酸化钾盐缓冲液，其中含有0.3M氯化钠，10％甘油，0.005％Triton-X 100，10mM imidazole和1mM DTT和1mM的PMSF；加入Lysozyme到溶液中至终浓度为0.2mg/ml，将该溶液置于冰上25分钟，溶解细胞；然后将该溶液进行超声裂解10次，每次30s，功率为50W，反应全程置于冰上；再次11000g，4℃离心20分钟；得到的沉淀物置于50ml的缓冲液I(由20mM pH 8.0的Tris，加入0.2M的氯化钠和1％脱氧胆酸钠盐组成)中；在冰上混匀30分钟，得到的悬浊液再次3000g离心10分钟；离心得到的沉淀物再放入冰的50ml缓冲液II(由10mMpH＝8.0的Tris，加入1mM EDTA和0.25％脱氧胆酸钠盐组成)，得到的缓解液再次3000g离心10分钟；离心得到的沉淀用40ml缓冲液II洗3遍，洗完后，溶解在40ml的8M尿素溶液中；把溶解的蛋白溶液11000g 4℃离心25分钟；获得的上清液加入镍柱内，当所有上清液都滤过后，用含有8M尿素，5mM咪唑和0.5M氯化钠的洗液清洗镍柱；再测洗出液的OD值，直到其OD值降到接近于洗液后停止清洗；含有8M尿素，1M咪唑和0.5M氯化钠唑的洗脱缓冲液加入镍柱内以洗脱目的蛋白，所收集到的蛋白通过凝胶电泳分离后进行考马斯亮蓝染色；含目的蛋白的洗脱液再用0.75M左旋精氨酸，5mM GSH(R)，0.5mM GSSH(O)，5mMEDTA和0.1M Tris(pH＝9.5)组成的溶液，来稳定蛋白质和中和PH值；蛋白溶液用2L的PBS 4℃条件下透析4小时，再换5L PBS透析4小时，再用10L PBS透析过夜；

(2)0.5mg步骤(1)得到的脑源性神经营养因子前体蛋白加入2ml含有0.4％戊二醛的PBS再加入2ml弗氏完全佐剂形成乳剂；将其皮下注射到成年绵羊背部和腹股沟的多个注射位点；随后每两周注射一次，注射抗原剂量减半，同时改用不完全弗氏佐剂，直到抗体滴度达到1/10000。

(3)抗体纯化采用蛋白G柱，如Fan et al.,2008Eur J Neurosci.2008May；27(9):2380-90中所述。

(4)对照用正常羊血清免疫球蛋白(NSS)的制备和纯化参见Fan etal.,2008Eur J Neurosci.2008May；27(9):2380-90。

2.给药proBDNF与NSS的抗体

2.1侧脑室注射anti-proBDNF和NSS抗体(下文中以L表示侧脑室注射)

(1)立体定向手术模型建立

用3％戊巴比妥钠将大鼠腹腔注射麻醉后(30mg/kg)，固定于脑立体定向仪上，剪去头顶部毛发，酒精消毒后切开皮肤，参照Paxinos的《大鼠脑立体定位图》选择左侧侧脑室为注射靶区，于前囟中点向后1.0mm，中线旁开1.5mm处，用牙科钻钻开颅骨，暴露硬脑膜，再用微量注射器自脑表面垂直进针3.8mm，以10μl/min的速度(浓度是1μg/μl，20μg的anti-proBDNF抗体溶解于20μl的灭菌的0.9％生理盐水中)，将20μg的anti-proBDNF抗体缓慢注入，留针2min后缓慢撤针，缝合切口。严格消毒，防止创口感染，同时注意大鼠的保暖。对照组则注入等量的NSS抗体。

(2)侧脑室定位

为验证上述方法定位的准确性，正式实验前，在侧脑室注射蛋白上样液(1×)进行定位验证。

侧脑室注射抗体后，通过OFT行为学实验分别检测水平运动距离、不动时间和站立次数。

2.2腹腔注射anti-proBDNF和NSS抗体(下文中以A表示腹腔注射)

注射方法和剂量：在两组抑郁模型鼠腹腔分别注射anti-proBDNF和NSS，1ml/100g(每100g体重的大鼠注射1ml)，0.08g/ml(每毫升溶液含0.08g抗体粉末)，注射4天后再次注射，共注射两次，第二次的剂量是第一次的一半。24小时后如上进行OFT行为学测试。比较结果参见下表1-3和图1-3。

表1：正常大鼠给予21天不同的刺激，抑郁大鼠分别给予侧脑室注射anti-proBDNF和NSS抗体，腹腔注射anti-proBDNF和NSS抗体，大鼠OFT水平运动距离的比较(

组别	水平运动距离(m)
		对照组	19.68±0.9478(n＝11)
抑郁组	11.33±1.144(n＝11)
		L-anti-proBDNF组	22.26±2.316(N＝10)
L-NSS组	8.779±2.178(N＝10)
		A-anti-proBDNF组	16.58±0.9711(N＝6)
A-NSS组	6.729±1.769(N＝6)

***对照组与抑郁组比较有差异，p<0.01；***对照组与L-NSS组比较有差异，p<0.01；

***对照组与A-NSS组比较有差异，p<0.01；

***L-anti-proBDNF组与抑郁组比较有差异p<0.01；

***L-anti-proBDNF组与L-NSS组比较有差异，p<0.01；

***L-anti-proBDNF组与A-NSS组比较有差异，p<0.01；

*A-anti-proBDNF组与抑郁组比较有差异，p<0.05；

**A-anti-proBDNF组与L-NSS组比较有差异，p<0.01；和

**A-anti-proBDNF组与A-NSS组比较有差异，p<0.01。

表2：正常大鼠给予21天不同的刺激，抑郁大鼠分别给予侧脑室注射anti-proBDNF和NSS抗体，腹腔注射anti-proBDNF和NSS抗体，大鼠OFT不动时间的比较

组别	不动时间(s)
		对照组	70.88±3.848(N＝11)
抑郁组	206.4±22.46(N＝11)
		L-anti-proBDNF组	66.44±16.88(N＝10)
L-NSS组	208.4±20.74(N＝10)
		A-anti-proBDNF组	117.7±12.01(N＝6)
A-NSS组	209.5±16.40(N＝6)

***对照组与抑郁组比较有差异，p<0.01；

***对照组与L-NSS组比较有差异，p<0.01；

***对照组与A-NSS组比较有差异，p<0.01；

***L-anti-proBDNF组与抑郁组比较有差异，p<0.01；

***L-anti-proBDNF组与L-NSS组比较有差异，p<0.01；

***L-anti-proBDNF组与A-NSS组比较有差异，p<0.01；

***A-anti-proBDNF组与抑郁组比较有差异，p<0.01；

**A-anti-proBDNF组与L-NSS组比较有差异，p<0.01；和

**A-anti-proBDNF组与A-NSS组比较有差异，p<0.01。

表3：正常大鼠给予21天不同的刺激，抑郁大鼠分别给予侧脑室注射anti-proBDNF和NSS抗体，腹腔注射anti-proBDNF和NSS抗体，大鼠OFT站立次数的比较

组别	站立次数(次)
		对照组	22.33±1.900(N＝11)
抑郁组	4.222±1.103(N＝11)
		L-anti-proBDNF组	18.40±1.568(N＝10)
L-NSS组	5.80±1.020(N＝10)
		A-anti-proBDNF组	18.00±0.9309(N＝6)
A-NSS组	5.400±1.208(N＝6)

***对照组与抑郁组比较有差异，p<0.01；

***对照组与L-NSS组比较有差异，p<0.01；

***对照组与A-NSS组比较有差异，p<0.01；

***L-anti-proBDNF组与抑郁组比较有差异，p<0.01；

***L-anti-proBDNF组与L-NSS组比较有差异，p<0.01；

***L-anti-proBDNF组与A-NSS组比较有差异，p<0.01；

***A-anti-proBDNF组与抑郁组比较有差异，p<0.01；

***A-anti-proBDNF组与L-NSS组比较有差异，p<0.01；

***A-anti-proBDNF组与A-NSS组比较有差异，p<0.01。

如上所述，侧脑室和腹腔注射抗体后，分别通过FST和SPT行为学实验检测不动时间和糖水消耗，比较结果参见下表4-5和图4-5。

表4：正常大鼠给予21天不同的刺激，抑郁大鼠分别给予侧脑室注射anti-proBDNF和NSS抗体，腹腔注射anti-proBDNF和NSS抗体，大鼠FST不动时间的比较

组别	不到时间(s)
		对照组	86.64±9.059(N＝11)
抑郁组	200.5±17.10(N＝11)
		L-anti-proBDNF组	101.8±13.79(N＝10)
L-NSS组	173.6±3.516(N＝10)
		A-anti-proBDNF组	90.20±25.20(N＝6)
A-NSS组	194±29.58(N＝6)

***对照组与抑郁组比较有差异，p<0.01；

**对照组与L-NSS组比较有差异，p<0.01；

***对照组与A-NSS组比较有差异，p<0.01；

**L-anti-proBDNF组与抑郁组比较有差异，p<0.01；

*L-anti-proBDNF组与L-NSS组比较有差异，p<0.05；

**L-anti-proBDNF组与A-NSS组比较有差异，p<0.01；

***A-anti-proBDNF组与抑郁组比较有差异，p<0.01；

*A-anti-proBDNF组与L-NSS组比较有差异，p<0.05；和

**A-anti-proBDNF组与A-NSS组比较有差异，p<0.01。

表5：正常大鼠给予21天不同的刺激，抑郁大鼠分别给予侧脑室注射anti-proBDNF和NSS抗体，腹腔注射anti-proBDNF和NSS抗体，大鼠1％糖水消耗的比较

组别	1％糖水消耗(％)
		对照组	0.8918±0.05001(N＝11)
抑郁组	0.3653±0.07435(N＝11)
		L-anti-proBDNF组	0.7240±0.01435(N＝10)
L-NSS组	0.1540±0.06794(N＝10)
		A-anti-proBDNF组	0.9317±0.04968(N＝6)
A-NSS组	0.3740±0.1716(N＝6)

***对照组与抑郁组比较有差异，p<0.01；

***对照组与L-NSS组比较有差异，p<0.01；

***对照组与A-NSS组比较有差异，p<0.01；

**L-anti-proBDNF组与抑郁组比较有差异，p<0.01；

***L-anti-proBDNF组与L-NSS组比较有差异，p<0.01；

*L-anti-proBDNF组与A-NSS组比较有差异，p<0.05；

***A-anti-proBDNF组与抑郁组比较有差异，p<0.01；

***A-anti-proBDNF组与L-NSS组比较有差异，p<0.01；和

***A-anti-proBDNF组与A-NSS组比较有差异，p<0.01。

如上所述，通过侧脑室和腹腔注射抗体，给药前后的高尔基染色比对结果参见下表27-28和图19-24。

表27：正常大鼠给予21天不同的刺激，抑郁大鼠分别给予侧脑室注射anti-proBDNF和NSS抗体，腹腔注射anti-proBDNF和NSS抗体，大鼠皮层区域树突棘长度的比较

组别	树突棘长度(μm)
		对照组	2.770±0.2553(N＝11)
抑郁组	0.7583±0.2485(N＝11)
		L-anti-proBDNF组	2.571±0.2832(N＝10)
L-NSS组	1.137±0.07868(N＝10)
		A-anti-proBDNF组	2.475±0.1794(N＝6)
A-NSS组	1.392±0.1390(N＝6)

***对照组与抑郁组比较有差异，p<0.01；

***对照组与L-NSS组比较有差异，p<0.01；

**对照组与A-NSS组比较有差异，p<0.01；

***L-anti-proBDNF组与抑郁组比较有差异，<0.01；

***L-anti-proBDNF组与L-NSS组比较有差异，p<0.01；

**L-anti-proBDNF组与A-NSS组比较有差异，p<0.05；

***A-anti-proBDNF组与抑郁组比较有差异，p<0.01；

***A-anti-proBDNF组与L-NSS组比较有差异，p<0.01；和

**A-anti-proBDNF组与A-NSS组比较有差异，p<0.01。

表28：正常大鼠给予21天不同的刺激，抑郁大鼠分别给予侧脑室注射anti-proBDNF和NSS抗体，腹腔注射anti-proBDNF和NSS抗体，大鼠海马区域树突棘长度的比较

组别	树突棘长度(μm)
		对照组	2.892±0.2017(N＝11)
抑郁组	0.7317±0.2390(N＝11)
		L-anti-proBDNF组	2.716±0.2070(N＝10)
L-NSS组	1.136±0.09440(N＝10)
		A-anti-proBDNF组	2.495±0.07343(N＝6)
A-NSS组	1.266±0.08959(N＝6)

***对照组与抑郁组比较有差异，p<0.01；

***对照组与L-NSS组比较有差异，p<0.01；

***对照组与A-NSS组比较有差异，p<0.01；

***L-anti-proBDNF组与抑郁组比较有差异，p<0.01；

***L-anti-proBDNF组与L-NSS组比较有差异，p<0.01；

***L-anti-proBDNF组与A-NSS组比较有差异，p<0.05；

***A-anti-proBDNF组与抑郁组比较有差异，p<0.01；

***A-anti-proBDNF组与L-NSS组比较有差异，p<0.01；和

***A-anti-proBDNF组与A-NSS组比较有差异，p<0.01。

实施例5

重组sortilin ECD-Fc(SEQ ID NO:8)和p75ECD-Fc(SEQ ID NO:9)对大鼠抑郁症的影响

SD雄性大鼠，2-3个月龄，被分成四组，每组n＝10：1.正常对照组；2.抑郁症组+标准盐水；3.抑郁症组+sortilin ECD-Fc；4.抑郁症组+p75ECD-Fc。

对所有抑郁症组，将大鼠经历CUMS三周。CUMS后两周，即第14天，大鼠以10mg/kg的剂量，通过腹膜内注射标准盐水，或者注射重组sortilin ECD-Fc或p75ECD-Fc(其制备方法是克隆与人免疫球蛋白片段C融合的p75胞外结构域或sortilin胞外结构域片段(SEQ ID NO:7)，CHO细胞表达，并经由蛋白G柱纯化)，第18天时，大鼠重复注射上述药剂，但剂量减半为5mg/kg。第22天时，所有大鼠进行糖水消耗测试和强迫游泳实验。糖浓度以水和糖水消耗的总量为基础计算。结果(参见图29)显示，注射sortilin ECD-Fc或p75ECD-Fc能够阻断糖水消耗的减少以及强迫游泳实验中不动时间的增加。

上文提及的所有文献都在本申请中引作参考，就如同每一篇文献被单独引作参考那样。以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明实质和原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，但这些改进和修饰也落入随附的权利要求请求保护的范围内。

Claims (19)

1.对脑源性神经营养因子前体蛋白(proBDNF)或其信号传递分子具有中和或抑制活性的结合分子在制备用于预防、缓解或治疗情感障碍的药物中的应用。

2.权利要求1所述的应用，其中所述信号传递分子是proBDNF的受体p75NTR、sortilin或其片段。

3.权利要求1或2所述的应用，其中所述情感障碍选自抑郁症和焦虑症。

4.权利要求1所述的应用，其中所述结合分子选自抑制和/或阻碍proBDNF或其信号传递分子基因表达的结合分子，特异性结合proBDNF或其信号传递分子的结合分子，或者促进proBDNF切割成BDNF的结合分子。

5.权利要求4所述的应用，其中所述抑制和/或阻碍基因表达的结合分子选自反义核酸、siRNA、shRNA、dsRNA、miRNA或核酶。

6.权利要求4所述的应用，其中所述促进proBDNF切割成成熟BDNF的结合分子选自费林蛋白酶、基质金属蛋白酶(MMP)2/7/9和组织纤溶酶原激活物(tPA)。

7.权利要求4所述的应用，其中所述特异性结合proBDNF或其信号传递分子的结合分子选自抗体，与proBDNF结合的受体p75、sortilin或其片段，及其功能变体。

8.权利要求2或7所述的应用，其中受体片段选自p75ECD-Fc和sortilin ECD-Fc。

9.权利要求7所述的应用，其中所述功能变体选自化学修饰变体，取代、添加或缺失变体。

10.权利要求7所述的应用，其中所述抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、嵌合抗体、鼠源抗体或其片段。

11.权利要求10所述的应用，其中所述片段选自Fab、F(ab')、F(ab')₂、Fv、dAb、Fd、互补决定区(CDR)片段、单链抗体(scFv)、二价单链抗体、单链噬菌体抗体、双特异双链抗体、三链抗体或四链抗体。

12.权利要求10所述的应用，其中所述多克隆抗体以proBDNF或其片段免疫动物而产生。

13.权利要求12所述的应用，其中所述片段为SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。

14.权利要求1或2所述的应用，其中所述结合分子为阻止proBDNF与其受体sortilin或p75结合的拮抗剂。

15.对BDNF或其信号传递分子具有刺激或促进活性的结合分子通过恢复BDNF/proBDNF信号传递平衡在制备用于预防、缓解或治疗情感障碍的药物中的应用。

16.权利要求15的应用，其中所述结合分子为BDNF或其信号传递分子本身。

17.权利要求15的应用，其中所述结合分子为BDNF的受体TrkB。

18.权利要求15的应用，其中所述结合分子为BDNF或其受体TrkB的有义核酸。

19.权利要求15的应用，其中所述结合分子为BDNF或TrkB的激动剂。