CN102366631A - 表达bdnf-ha2tat的重组腺相关病毒在制备治疗抑郁症疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种表达BDNF-HA₂TAT的重组腺相关病毒在制备治疗抑郁症疾病药物中的应用。本发明优点在于：本发明的表达BDNF-HA₂TAT的重组腺相关病毒即可以分泌表达大分子蛋白BDNF，表达的BDNF又有穿过血脑屏障作用，同时将BDNF基因序列导入AAV载体，可以持续分泌表达BDNF，解决了BDNF需反复给药的难题；通过抗抑郁效力筛选实验证明了可分泌表达BDNF-HA₂TAT的重组腺相关病毒具有抗抑郁的作用，建立了一种有效预防和治疗抑郁障碍和应激障碍等精神疾病的手段和方法。

Description

表达BDNF-HA2TAT的重组腺相关病毒在制备治疗抑郁症疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及一种重组载体的应用，具体地说，是一种表达BDNF-HA₂TAT的重组腺相关病毒在制备治疗抑郁症疾病药物中的应用。

背景技术

抑郁障碍存在海马神经元萎缩、细胞凋亡加速、神经元再生障碍等神经病理学改变。如何有效的保护海马神经元一直是抑郁障碍研究的热点和难点。脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)是神经营养因子家族中的重要成员，BDNF表达下调可能参与慢性应激所致抑郁症海马结构和功能的改变。将外源性 BDNF注入强迫游泳和学习无助的抑郁大鼠模型的海马齿状回可以产生抗抑郁样活性，这说明BDNF中枢给药对于抑郁症来说是有效的。然而BDNF抗抑郁作用的发挥一方面有赖于其有效的中枢血药浓度，另一方面中枢多次给药以及输注设备持久存在会引起神经组织的额外损伤。尽管外周静脉内给药简便、无损伤，但由于BDNF在血液循环中存在降解和血脑屏障的通透性问题，以致很难到达中枢神经的保护效应。

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)是目前发现的唯一无致病性的单链DNA病毒, 也是已知的唯一能与人基因组特异染色体定点整合的天然复制缺陷病毒。它无明显的致病性，无免疫源性及炎症反应；不能独立复制，在无辅助病毒(如腺病毒、疱疹病毒)感染时，AAV只能整合在宿主细胞的DNA中，呈潜伏感染状态，插入的外源基因表达时间长，转移外源基因时不伴随任何病毒基因的表达。AAV以点特异方式固定地整合在人19号染色体上，不存在致癌及插入突变；宿主范围广，不仅可感染分裂期细胞，对非分裂期细胞(如神经元、肌细胞等)也较敏感。基于以上特点而开发的腺相关病毒载体是继腺病毒和逆转录病毒后出现的新型基因治疗工具。如果将BDNF基因序列导入AAV载体，则可以持续分泌表达BDNF。

近年来，经鼻入脑的给药方式为国内外中枢神经系统给药方式研究的热点，这种给药方式既可以避免腹腔或静脉注射途径中需经血液循环入脑而引起的全身副作用，又可以避免在血液循环中降解过快，并且有着脑内药物浓度高的优点。以往的研究发现脂溶性好的小分子物质（小于10kD）可以沿“鼻-脑”通路入脑，但大分子蛋白难以沿此通路入脑。由于在基因治疗中对神经系统有治疗作用的基因产物多为大分子蛋白，因此，寻求将大分子蛋白经“鼻-脑”通路导入脑内的方法，将为解决基因治疗的难题提供一种新的思路和方法。穿膜肽为近年来新发现的一种具有蛋白转导功能的短肽，研究发现它的蛋白转导机制为新的非能量、非受体、非温度依赖的转导方法，常用的穿膜肽有果蝇的Ant蛋白、TAT蛋白和人工合成的多聚精氨酸等。Murriel等通过腹腔注射穿膜肽2B2半乳糖苷酶，发现穿膜肽能携带该蛋白通过血脑屏障到达脑组织，同时能保持酶的活性，且在该过程中对神经细胞及血脑屏障的免疫反应很弱。上述实验均显示穿膜肽能够携带蛋白质透过血脑屏障并保持蛋白的活性，同时对神经细胞、血脑屏障的免疫性很弱。

中国专利文献CN1124343C公开了一种由脑组织获得的神经营养因子，涉及编码了脑源神经营养因子（BDNF）的核酸序列以及用这些核酸顺序大量制得的BDNF蛋白及其片段和衍生物，还涉及BDNF蛋白质在制造治疗神经系统疾病或失调的药物中的用途。中国专利文献CN101078013A公开了神经营养因子BDNF、NT-3信号通路新成员Dok5的鉴定和应用，克隆了人dok5的基因为治疗多种神经系统疾病提供了新的作用靶点，因此可用于开发神经系统疾病的药物。中国专利文献CN101302529A公开了共表达GDNF和BDNF的转基因神经干细胞，描述了一种构建共表达GDNF和BDNF的转基因神经干细胞的方法及其用途和意义，为临床治疗神经退行性疾病-帕金森氏病和/或其他中枢神经系统疾病提供了一种转基因神经干细胞治疗新途径。王海珍等通过克隆人BDNF基因，构建含有TAT-BDNF的重组表达载体，为进一步表达融合蛋白及探讨TAT携带BDNF穿透血脑屏障治疗中枢神经系统疾病奠定了基础（详见：王海珍等.BDNF的克隆及pTAT/HA-BDNF重组表达载体的构建[J].神经损伤与功能重建,2008,3(5):304-306.）。李惠明等采用PCR和体外连接的方法构建了带有信号肽的脑源性神经营养因子(BDNF)的融合基因，将此基因插入到腺相关病毒载体穿梭质粒pSNAV，然后用重组质粒pSNAV-Ig-BDNF转染包装细胞，筛选出永久细胞株后，用携带腺相关病毒rep及cap基因的单纯疱疹病毒超感染包装细胞，成功包装出含有目的基因的一型血清型腺相关病毒（详见：李惠明等.表达分泌型脑源性神经营养因子的腺相关病毒载体的构建及其表达的检测[J].生物工程学报,2008,24(2):328-332.）。但是关于表达BDNF-HA₂TAT的重组腺相关病毒在制备治疗抑郁症疾病药物中的应用目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种表达BDNF-HA₂TAT的重组腺相关病毒在制备治疗抑郁症疾病药物中的应用。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种表达BDNF-HA₂TAT的重组腺相关病毒在制备治疗抑郁症疾病药物中的应用，所述的表达BDNF-HA₂TAT的重组腺相关病毒是由下列方法构建得到的：

a、克隆BDNF cDNA 融合基因，将 PCR产物连接入 pGEM-T Easy 载体，获得的pGEM-T Easy/BDNF转化受体菌E.Coli DH5α，碱裂解法提取重组质粒 DNA；

b、酶切获取带有粘性末端的BDNF基因，将BDNF基因插入携带穿膜肽TAT的载体质粒pSSCMV-HA₂TAT，构建重组载体质粒pSSCMV-BDNF-HA₂TAT；

c、在磷酸钙作用下，重组载体质粒pSSCMV-BDNF-HA₂TAT、包装质粒pAAV/Ad和辅助质粒pFG140三质粒共转染HEK293细胞，转染的包装细胞继续培养，收获病毒上清，即表达BDNF- HA₂TAT的重组腺相关病毒。

所述的BDNF cDNA具有SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。

所述的步骤a中BDNF基因扩增的上游引物和下游引物分别具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列。

本发明优点在于：

1、本发明的表达BDNF-HA₂TAT的重组腺相关病毒即可以分泌表达大分子蛋白BDNF，表达的BDNF又有穿过血脑屏障作用，同时将BDNF基因序列导入AAV载体，可以持续分泌表达BDNF，解决了BDNF需反复给药的难题；

2、通过抗抑郁效力筛选实验证明了可分泌表达BDNF-HA₂TAT的重组腺相关病毒具有抗抑郁的作用，建立了一种有效预防和治疗抑郁障碍和应激障碍等精神疾病的手段和方法。

附图说明

附图1是目的基因BDNF克隆结果：1，DNA Marker；2，PCR产物。

附图2是重组质粒pGEM-T Easy/ BDNF酶切鉴定结果：1，重组质粒；2，重组质粒酶切；3，DNA Marker。

附图3是重组质粒pSSCMV-BDNF-HA₂TAT酶切鉴定结果：1，重组质粒；2，重组质粒酶切；3，DNA Marker。

附图4是重组质粒PUC19-BDNF-HA₂TAT酶切鉴定结果：1，DNA Marker；2，重组质粒酶切；3，重组质粒。

附图5是BDNF-HA₂TAT测序结果。

附图6是Hela细胞免疫组织化学染色结果。

附图7是BDNF-HA₂TAT/AAV连续经鼻给5d的FST结果。数据为mean±SEM，* p＜0.05；*** p＜0.001。

附图8是BDNF-HA₂TAT/AAV连续经鼻给5d的OPF结果。数据为mean±SEM， ** p＜0.01。

附图9是BDNF-HA₂TAT/AAV连续经鼻给10d的FST结果。数据为mean±SEM，* p＜0.05；** p＜0.01；*** p＜0.001。

附图10是BDNF-HA₂TAT/AAV连续经鼻给10d的OPF结果。数据为mean±SEM，* p＜0.05。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1  构建包装表达BDNF的重组腺相关病毒

克隆BDNF cDNA 融合基因，将 PCR 产物连接入 pGEM-T Easy 载体，获得的pGEM-T Easy/BDNF转化受体菌E.ColiDH5α，碱裂解法提取重组质粒 DNA，酶切鉴定；酶切获取带有粘性末端的BDNF基因，将BDNF基因插入携带穿膜肽TAT的载体质粒，构建重组载体质粒pSSCMV-BDNF-HA₂TAT，重组质粒pSSCMV-BDNF-HA₂TAT经EcoRI 和 BamHI酶切制备BDNF-HA₂TAT片段并连接到PUC19质粒中测序；在磷酸钙作用下，重组载体质粒pSSCMV-BDNF-HA₂TAT、包装质粒pAAV/Ad和辅助质粒pFG140三质粒共转染HEK293细胞，制备表达BDNF-HA₂TAT的重组腺相关病毒，纯化病毒，滴定效价。

一、重组载体的构建

（一）实验材料：

 1．主要试剂

dNTPs  10mM

Tap DNA 聚合酶                  天根公司

T4 DNA 连接酶                   promaga公司

限制性内切酶EcoR I              MBI公司

KpnI                                   MBI公司

BamHI                                MBI公司

琼脂糖

胰蛋白胨

酵母提取物

SYPR Green Kit

2．重要试剂配制

（1）TE 缓冲液 

1M Tirs-HCl 1ml（PH8.0），0.5M EDTA 0.2ml（PH8.0），ddH₂O定容至 100ml。

（2）2.5M CaCl₂

称取无水CaCl₂ 55.5g，ddH₂O定容至 200ml，高压灭菌，4℃保存。

（3）制备固体含氨苄青霉素（Amp）的LB平板培养基

10g胰蛋白胨；5g酵母提取物；10g NaCl； 12g琼脂或琼脂糖；加蒸馏水定容至1000ml，使其充分溶解，1 mol/L NaOH调PH至7.0，高压灭菌 25min，常温保存备用。

制备LB固体平板时，取无抗菌素固体 LB，在微波炉内加热融化，自然冷却至约50℃时，加入 Amp 10ml（1:200），混均后倒入无菌平皿中，每个平板导入32-40ml，常温凝固，4℃保存。

（4）碱裂解法提取质粒所需液体

溶液 I： 1M Tris-HCl 12.5ml，0.5M EDTA （PH 8.0）10ml，葡萄糖 4.730g，加ddH2O至 500ml。115℃高压灭菌15min后，4℃保存。

溶液 II：10% SDS 10ml，10M NaOH 2ml，加ddH₂O至 100ml。使用时临时配制。

溶液 III：5M 醋酸钾 300ml，冰醋酸 57.5ml，ddH₂O定容至 500ml。4℃保存。

（5）0.25％胰酶

称取胰酶 2.5g，D-Hank’s 液定容至1000ml，振荡溶解，滤菌后-20℃保存。

3．质粒和菌株

F BDNF质粒，pGEM-T Easy质粒（50μg/μl，promaga公司），pSSCMV-HA₂TAT质粒，PUC19质粒，pAAV/Ad质粒，pFG140质粒，大肠杆菌 Top10，HEK293细胞。

4．实验仪器：

PCR仪，低压电泳仪，水平电泳槽，紫外线透射仪，数码相机，高压灭菌锅，电热恒温水浴箱，摇床，低温高速离心机，水平式离心机，超净工作台，显微镜

（二）实验方法：

1．目的基因BDNF的克隆

（1）设计合成引物

以F BDNF质粒为模板，应用 PCR 方法扩增获得删除了终止序列的BDNF片段，目的基因BDNF的cDNA核苷酸序列见SEQ ID NO.1。在其上游和下游分别加入限制性内切酶 EcoRI 和 KpnI 位点。所需引物如下：

上游引物F（50pmol/μl）：5’-CG GAA TTC ATG ACC ATC CTT TTC CTT AC-3’ （SEQ ID NO.2）；

下游引物R（50pmol/μl）：5’-C GGT ACC TCT TCC CCT TTT AAT GGT C-3’ （SEQ ID NO.3）。

（2）BDNF基因的扩增

1）建立 PCR 反应体系（0.5ml 离心管）：

10×PCR buffer              10μl

dNTPmix                      2μl

上游引物 F                   1μl

下游引物 R                   1μl 

模版                            1μl

Taq DNA 聚合酶            1μl

MgCl₂（25mM）            6μl

加ddH₂O至                 100μl

011石蜡油 50μl覆盖表面；

2）PCR反应：

94℃ 5min， 

94℃ 1min，48℃ 1min，72℃ 90s，共30个循环，

72℃ 5min；

3）制备琼脂糖凝胶，待PCR反应结束后，取5μl反应产物加样、电泳，紫外灯下观察电泳凝胶；

4）收集从电泳凝胶下切下的含DNA片段的琼脂糖凝胶至1.5ml离心管内，称重确定体积（每100mg琼脂糖凝胶相当于100μl体积）；

5）加入等体积的酚/氯仿抽提，轻轻混匀，离心12000r/min×5min，取上清；

6）加入1/10 体积的3M醋酸钠，2.5 倍体积预冷的无水乙醇，混匀；

7）-20℃放置 30min，4℃离心12000r/min×10min，弃上清；

8）70%乙醇洗离心物沉淀一次，离心12000r/min×5min，弃上清；

9）37℃干燥后，加50μl TE溶解沉淀，定量，4℃备用。

（3）将 PCR扩增产物与pGEM-T Easy 载体连接

建立连接反应体系（0.5ml 离心管）：

pGEM-T Easy质粒                 1μl

PCR反应产物  0.1μg/μl         2μl

T4DNA连接酶                      1μl

10×T4DNA连接酶缓冲液       2.5μl

加ddH₂O至                         25μl                      

混匀，23℃过夜。

（4）受体菌制备：

1)取一单菌落Top10菌种于5ml LB培养液的试管中，37℃振荡培养4h；

2）取1.5ml入离心管中，离心10000r/min×10min，弃上清；

3）沉淀用冰冷的100mM CaCl₂洗一次，离心12000r/min×10min，弃上清；

4）再用冰冷的100mM CaCl₂将细菌悬起，4℃备用。

（5）pGEM-T Easy/BDNF转化Top10菌

1）取连接产物pGEM-T Easy/BDNF 10μl加入含100μl Top10菌的离心管中，混匀；

2）冰上放置30min，42℃热休克90s，冰上放置2min；

3）加入0.4ml LB培养液，37℃水浴2h；

4）将LB（含1.2%琼脂）用微波炉融化后，自然放冷致50℃左右，加入Amp，倒入无菌培养皿中，4℃备用；

5）水浴2h后的转化菌离心8000r/min×10min，将上清弃到仅余100μl，全部涂于上一步制备的LB培养皿中；

6）平皿在室温下正向放置15min后，37℃倒置过夜；

7）第二天可见平皿中有百个菌落生成，挑取其中6个菌落种于5ml含Amp的LB中，37℃振荡培养过夜。

（6）小量提取重组质粒 DNA——碱裂解法

1）每个样本取1.5ml菌液，离心12000r/min×5min，将液体倒尽；

2）将细菌重悬于预冷的100μl溶液I，剧烈震荡；

3）加入200μl新鲜配制的溶液Ⅱ悬浮，颠倒混匀；

4）加入150μl预冷的溶液Ⅲ，颠倒混匀；

5）加入450μl酚/氯仿抽提一次，离心12000r/min×10min；

6）将上清移入新离心管中，用2.5倍体积预冷的无水乙醇沉淀，4℃离心12000r/min×10min，弃上清；

7）沉淀用1ml 70%乙醇洗一次，离心12000r/min×5min，弃上清；

8）37℃干燥30min后，用含RNase的TE 50μl溶解沉淀，4℃备用。

（7）提取的重组质粒 DNA酶切鉴定

1）建立酶切体系：

质粒                     6个（0.2μg/个）

EcoRI                    1μl

Buffer                    6μl

加ddH₂O至          60μl

先将ddH₂O， Buffer， EcoRI混匀后分装6管，再加入样本。37℃温浴1h；

2）1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察电泳凝胶。

（8）大量提取重组质粒 DNA——碱裂解法

1）大摇酶切鉴定阳性的细菌，4℃离心5000r/min×10min，弃上清；

2）用预冷的STE洗一次细菌，4℃离心5000r/min×10min，弃上清；

3）将细菌沉淀物重悬于3ml溶液 I中；

4）加溶液新鲜配制的Ⅱ 6ml；

5）加预冷的溶液Ⅲ 4.5ml，摇匀，4℃离心5000r/min×10min，上清移入新管内；

6）用等体积的异丙醇沉淀，离心7000r/min×10min，弃上清；

7）37℃干燥30min后，用2ml TE和20μl RNase溶解，37℃温浴 2h；

8）等体积的酚/氯仿抽提后，无水乙醇沉淀，-20℃过夜；

9）离心12000r/min×10min，沉淀干燥后，用750μl TE溶解；

10）加入750μl 14%的PEG8000，1.6M NaCl沉淀DNA，离心12000r/min× 10min，弃除液相RNA ，干燥后，用400μl TE溶解；

11）重复一次步骤8；

12）沉淀用70%乙醇洗一次，离心12000r/min×10min，弃上清，干燥后，用200μl TE溶解，-20℃备用。

2． 融合基因BDNF-HA₂TAT的克隆

（1）制备BDNF和pSSCMV-HA₂TAT载体

此处应用EcoRI和 KpnI酶切，因为KpnI 的缓冲液是无盐的Buffer，所以要分两次消化，先消化KpnI，再补齐NaCl后消化 EcoRI。

第一步：消化KpnI：

1）T-BDNF大提质粒  1μg/μl      5μg（5μl）

KpnI                                              1μl   

KpnI缓冲液                                   2μl

加ddH₂O 至                                 20μl  

充分混匀，37℃ 2h。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

2）pSSCMV-HA₂TAT  1μg/μl        2μl

KpnI                                                      0.5μl    

KpnI缓冲液                                         2μl

加ddH₂O 至                                          20μl 

充分混匀，37℃ 2h 。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

第二步：消化EcoRI

1）T-BDNF/ KpnI               19μl

EcoRI                                4μl   

EcoRI缓冲液                    5μl

加ddH₂O 至                      50μl 

充分混匀，37℃ 2h 。制备1%琼脂糖凝胶，电泳，胶回收片段，-20℃备用。

2）pSSCMV-HA₂TAT/ KpnI          19μl

EcoRI                                                 0.5μl    

EcoRI缓冲液                                     3μl

加ddH₂O 至                                      30μl 

充分混匀，37℃ 2h。制备1%琼脂糖凝胶，电泳，胶回收片段，-20℃备用。

（2）目的基因片段与pSSCMV-HA₂TAT载体连接

建立连接反应体系

T-BDNF            0.1μg/μl              1μl

pSSCMV-HA₂TAT   0.05μg/μl       1μl

10×buffer                                    2.5μl

T4DNA 连接酶                             1μl

加ddH₂O 至                                25μl

充分混匀，23℃过夜。

（3）pSSCMV-BDNF-HA₂TAT转化Top10菌

方法同步骤1中（5）pGEM-T Easy/BDNF转化Top10菌。

（4）小提重组质粒以及酶切鉴定

方法同步骤1中（6）pGEM-T Easy/BDNF重组质粒的小提以及（7）酶切鉴定。

酶切鉴定时用EcoRI和BamHI：

pSSCMV-BDNF-HA₂TAT          4个

EcoRI                                  0.2μl

BamHI                                 0.2μl

10×bufferI                             4μl

加ddH₂O 至                         40μl

37℃温浴1h。1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察电泳凝胶。

（5）大提质粒

方法同步骤1中（8）pGEM-T Easy/BDNF重组质粒的大提。

定量，-20℃备用。

（6） 制备BDNF-HA₂TAT片段并连接到PUC19质粒中测序 

1）BDNF-HA₂TAT片段和PUC19载体的制备

pSSCMV-BDNF-HA₂TAT          5μl

EcoRI                                 0.5μl

BamHI                                0.5μl

2×bufferT                            10μl

加ddH₂O 至                        50μl

充分混匀，37℃ 2h。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收片段。

PUC19                   2μl

EcoRI                          0.75μl

BamHI                         0.75μl

2×bufferT                       10μl

加ddH₂O 至                    50μl

充分混匀，37℃ 2h。1%琼脂糖凝胶电泳鉴定，胶回收片段。定量。

2）BDNF-HA₂TAT片段连接到PUC19质粒

BDNF-HA₂TAT                   1μl

PUC19                              1μl

T4DNA 连接酶                  1μl

10×buffer                         2.5μl

 加ddH₂O 至                     25μl

充分混匀，23℃过夜。

（7）基因重组产物的筛选、鉴定

1）应用步骤1（4）中的CaCl₂法制备Top10感受菌；

2）应用步骤1（5）中pGEM-T Easy/BDNF转化Top10菌的方法转化细菌；

3）应用步骤1（6）中的方法小提重组质粒；

4）应用步骤1（7）中的方法对小提重组质粒进行鉴定；

PUC19- BDNF-HA₂TAT           5μl  

EcoRI                                0.3μl

BamHI                               0.3μl

2×bufferT                           10μl

加ddH₂O 至                       50μl

37℃温浴1h。1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察电泳凝胶；

5）选电泳结果正确者进行测序。

二、病毒包装

1．病毒包装

（1）转染前准备

1）复苏HEK293细胞：取出冻存的HEK293细胞，37℃温浴约1min融化。吸出细胞悬液，离心1200rpm×5min，留取细胞沉淀。用19%胎牛血清，DMEM高糖培养基培养，扩增细胞至直径15cm的平皿中，待细胞70-80%成片时开始转染。

2）准备辅助质粒：

pAAV/Ad质粒                （1μg/μl）375μl；

pAAV/Ad质粒辅助子（pFG140）（1μg/μl）375μl；

pSSCMV-BDNF-HA₂TAT       （1μg/μl）375μl。

3）准备转染试剂

阳离子转染试剂PEL 9ml  (8μl/μg DNA)； 

质粒稀释液45ml；

转染试剂稀释液36ml。

（2）转染和收获重组腺相关病毒AAV/BDNF-HA₂TAT

1）将质粒3种依次加入45ml质粒稀释液中；

2）将转染试剂9ml加入36ml转染试剂稀释液中；

3）将稀释后的转染试剂加入质粒稀释液中，室温10min；

4）每个平皿的293细胞中加入3ml质粒和转染试剂混合液；

5）72h后取细胞，将细胞悬存于30ml HEPES buffer中，冻容3次；

6）超声粉碎细胞，离心10000r/min×20min，留上清，加等体积上的饱和(NH₄)₂SO₄沉淀；

7）4℃过夜，离心12000r/min×20min，取沉淀，容在含Ca、Mg的PBS中，透析三天；

8）离心，除残渣，过膜除菌，加保护液分装，-20℃保存。

2．病毒定量——荧光定量PCR

1）取病毒液0.1ml，加入DNasel 100μl，37℃温浴1h；

2）加等体积的蛋白酶K消化液（20mM Tris HCl PH8.0，20mMEDTA，0.1%SDS），37℃温浴1h；

3）酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，纯化核酸备用；

4）建立PCR反应体系：

2×SYPR Green Mix    10μl

F引物                         1μl

R引物                         1μl

模板                           1μl

加ddH₂O至                20μl

PCR反应引物为：上游引物F：5’-AAGTCCCGTTGTTGATTTTGGTG-3’（SEQ ID NO.4）；下游引物R：5’-CAAGTACGCCCCCTATTGAC-3’（SEQ ID NO.5）。

5）PCR反应

预变性 94℃ 3min； 

变性 94℃ 1min，退火 54℃ 1min，延伸 68℃ 1min，共40个循环；

再延伸 68℃ 5min。

3．免疫组织化学证实BDNF的表达

1）Hela细胞复苏后用5%的牛血清，DMEM高糖培养基；

2）用6孔板，细胞计数1×10⁵/ml；

3）过夜后，换成无血清培养液，加病毒液0.1ml，2h后换成完全培养基，72 h后固定做免疫组化。

三、结果

1．BDNF-HA₂TAT融合基因的构建和鉴定

（1）目的基因BDNF的克隆

采用PCR的方法，以F BDNF质粒为模版，克隆出两端分别带有EcoRI和KpnI限制性内切酶序列；PCR产物与pGEM-T Easy载体相连，应用EcoRI限制性内切酶消化，琼脂糖凝胶电泳鉴定重组质粒，阳性质粒可见760bp的目的片段（见图1和图2）。

（2）构建重组质粒pSSCMV-BDNF-HA₂TAT

重组质粒pGEM-T Easy/BDNF和pSSCMV-HA₂TAT载体分别应用EcoRI和 KpnI酶切后，将目的基因片段与pSSCMV-HA₂TAT载体连接，重组质粒pSSCMV/BDNF-HA₂TAT经EcoRI 和 BamHI酶切后，琼脂糖凝胶电泳可见865bp的目的片段（见图3和图4），证实融合基因成功插入载体质粒的多克隆位点。

（3）融合基因BDNF-HA₂TAT测序

重组质粒pSSCMV-BDNF-HA₂TAT经EcoRI 和 BamHI酶切制备BDNF-HA₂TAT片段并连接到PUC19质粒中测序。采用Sanger单链末端终止法测出全部的核苷酸序列，应用DNASIS软件分析比较该序列与设计的序列完全一致（见图5）

2．重组腺相关病毒的包装和滴定

包装分泌表达BDNF-HA₂TAT的重组腺相关病毒

用3质粒（pAAV/Ad质粒、pAAV/Ad质粒辅助子、pSSCMV -BDNF-HA₂TAT）磷酸钙共沉淀法转染293细胞系，转染的包装细胞，继续培养72h后，收获病毒上清。应用荧光定量PCR测定病毒滴度为8.32×10⁹/ml，应用免疫组织化学证实BDNF的表达（见图6）。

实施例2  表达BDNF-HA ₂ TAT的重组腺相关病毒的动物实验

表达脑源性神经营养因子的重组腺相关病毒经鼻脑通路进入大脑产生抗抑郁样作用：C57 BL/6雌性和雄性成年小鼠各分为经鼻滴入生理盐水和BDNF-HA₂TAT/AAV两处理组，两处理又各分为1d给药组，连续5天给药组和连续10天给药组；1d给药组分别在给药后1，2，3天进行行为学测试（强迫游泳实验（forced swimming test, FST）和旷场探究实验（open-field exploration test, OPF），连续5天给药组和连续10天给药组分别在给药后1，3，7天进行行为学测试（FST和OPF）。

C57 BL/6小鼠经鼻给予BDNF-HA₂TAT/AAV：BDNF-HA₂TAT/AAV连续经鼻给药5d和10d，各组小鼠分别在1d，3d，7d进行行为学测试：早上为OPF，晚上为FST。

（1）BDNF-HA₂TAT/AAV连续经鼻给5d，各组小鼠分别在1d，3d，7d后进行行为学测试：雌性和雄性C57 BL/6小鼠1d后测试组，经鼻给予BDNF-HA₂TAT/AAV会显著减少FST 6min的不动时间，同时均不会影响OPF的1h总的活动距离（见图7和图8）。

（2）BDNF-HA₂TAT/AAV连续经鼻给10d，各组小鼠分别在1d，3d，7d后行为学测试：雌性和雄性C57 BL/6小鼠1d后测试组，经鼻给予BDNF-HA₂TAT/AAV会显著减少FST 6min的不动时间，同时均不会影响OPF的1h总的活动距离；雌性C57 BL/6小鼠7d后测试组，经鼻给予BDNF-HA₂TAT/AAV会显著减少FST 6min的不动时间，同时均不会影响OPF的1h总的活动距离，但是雄性C57 BL/6小鼠7d后测试组，经鼻给予BDNF-HA₂TAT/AAV在显著减少FST 6min的不动时间的同时会增加OPF 1h总的活动距离（见图9和图10）。

结论：分泌表达BDNF-HA₂TAT的重组腺相关病毒可感染鼻粘膜细胞，经鼻给药达到一定剂量时在正常C57BL/6小鼠产生抗抑郁样作用，其中雌鼠对这种给药方式更敏感，效果也更持久。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110>  西安交通大学医学院第一附属医院

<120>  表达BDNF-HA₂TAT的重组腺相关病毒在制备治疗抑郁症疾病药物中的应用

<130>  /

<160>  5    

<170>  PatentIn version 3.3

<210>  1

<211>  1598

<212>  DNA

<213>  智人（Homo sapiens）

<400>  1

ggctgctctc gctgccgctc cccccggcga actagcatga aatctccctg cctctgccga     60

gatcaaatgg agcttctcgc tgatggggtg cgagtattac ctccgccatg caatttccac    120

tatcaataat ttaacttctt tgctgcagaa cagaaggagt acataccggg caccaaagac    180

tcgcgccccc tccccccttt aattaagcga agggaacgtg aaaaaataat agagtgtggg    240

agttttgggg ccgaagtctt tcccggagca gctgccttga tggttacttt gacaagtagt    300

gactgaaaag ttccaccagg tgagaagagt gatgaccatc cttttcctta ctatggttat    360

ttcatacttt ggttgcatga aggctgcccc catgaaagaa gcaaacatcc gaggacaagg    420

tggcttggcc tacccaggtg tgcggaccca tgggactctg gagagcgtga atgggcccaa    480

ggcaggttca agaggcttga catcattggc tgacactttc gaacacatga tagaagagct    540

gttggatgag gaccagaaag ttcggcccaa tgaagaaaac aataaggacg cagacttgta    600

cacgtccagg gtgatgctca gtagtcaagt gcctttggag cctcctcttc tctttctgct    660

ggaggaatac aaaaattacc tagacgctgc aaacatgtcc atgagggtcc ggcgccactc    720

tgaccctgcc cgccgagggg agctgagcgt gtgtgacagt attagtgagt gggtaacggc    780

ggcagacaaa aagactgcag tggacatgtc gggcgggacg gtcacagtcc ttgaaaaggt    840

ccctgtatca aaaggccaac tgaagcaata cttctacgag accaagtgca atcccatggg    900

ttacacaaaa gaaggctgca ggggcataga caaaaggcat tggaactccc agtgccgaac    960

tacccagtcg tacgtgcggg cccttaccat ggatagcaaa aagagaattg gctggcgatt   1020

cataaggata gacacttctt gtgtatgtac attgaccatt aaaaggggaa gatagtggat   1080

ttatgttgta tagattagat tatattgaga caaaaattat ctatttgtat atatacataa   1140

cagggtaaat tattcagtta agaaaaaaat aattttatga actgcatgtg taaatgaagt   1200

ttatacagta cagtggttct acaatctatt tattggacat gtccatgacc agaagggaaa   1260

cagtcatttg cgcacaactt aaaaagtctg cattacattc cttgataatg ttgtggtttg   1320

ttgccgttgc caagaactga aaacataaaa agttaaaaaa aataataaat tgcatgctgc   1380

tttaattgtg aattgataat aaactgtcct ctttcagaaa acagaaaaaa acacacacac   1440

acacaacaaa aatttgaacc aaaacattcc gtttacattt tagacagtaa gtatcttcgt   1500

tcttgttagt actatatctg ttttactgct tttaacttct gatagcgttg gaattaaaac   1560

aatgtcaagg tgaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaa                           1598

<210>  2

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  2

cggaattcat gaccatcctt ttccttac                                        28

<210>  3

<211>  26

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  3

cggtacctct tcccctttta atggtc                                          26

<210>  4

<211>  23

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  4

aagtcccgtt gttgattttg gtg                                             23

<210>  5

<211>  20

<212>  DNA

<213>  人工序列

<400>  5

caagtacgcc ccctattgac                                                 20

 

Claims (3)

1.一种表达BDNF-HA₂TAT的重组腺相关病毒在制备治疗抑郁症疾病药物中的应用，其特征在于，所述的表达BDNF-HA₂TAT的重组腺相关病毒是由下列方法构建得到的：

a、克隆BDNF cDNA 融合基因，将 PCR产物连接入pGEM-T Easy载体，获得的pGEM-T Easy/BDNF转化受体菌E.Coli DH5α，碱裂解法提取重组质粒 DNA；

b、酶切获取带有粘性末端的BDNF基因，将BDNF基因插入携带穿膜肽TAT的载体质粒pSSCMV-HA₂TAT，构建重组载体质粒pSSCMV-BDNF-HA₂TAT；

c、在磷酸钙作用下，重组载体质粒pSSCMV-BDNF-HA₂TAT、包装质粒pAAV/Ad和辅助质粒pFG140三质粒共转染HEK293细胞，转染的包装细胞继续培养，收获病毒上清，即表达BDNF- HA₂TAT的重组腺相关病毒。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的BDNF cDNA具有SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的步骤a中BDNF基因扩增的上游引物和下游引物分别具有SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所述的核苷酸序列。

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