KR20210130578A

KR20210130578A - 폐섬유증 치료 또는 예방을 위한 세포 치료제 조성물

Info

Publication number: KR20210130578A
Application number: KR1020200048968A
Authority: KR
Inventors: 심재혁; 하신우
Original assignee: 주식회사 아바테라퓨틱스; 주식회사 더블유아이
Priority date: 2020-04-22
Filing date: 2020-04-22
Publication date: 2021-11-01

Abstract

본 발명은 재조합 아데노 부속 바이러스 또는 렌티바이러스 같은 유전자 전달 시스템을 매개로 중간엽 줄기세포 등과 같은 숙주세포에서 항시 반응 또는 염증에 반응하여 항 염증 인자(TNF 또는 IL-1 길항제), COVID-19 저해제(EK2 펩타이드)와 항 섬유화 인자(miR-29c, amiR-TBX4, NKX2.1)가 발현될 수 있도록 하였으며, 이들의 COVID-19 또는 다른 인자에 의한 폐섬유증 치료제로의 용도에 관한 것이다.

Description

폐섬유증 치료 또는 예방을 위한 세포 치료제 조성물{Cell therapeutic agent for preventing or treating pulmonary fibrosis}

본 발명은 재조합 아데노 부속 바이러스 또는 렌티바이러스 같은 유전자 전달 시스템을 매개로 중간엽 줄기세포 등과 같은 숙주세포에서 염증에 반응하여 항 염증 인자(TNF 또는 IL-1 길항제), COVID-19 저해제(EK2 펩타이드)와 항 섬유화 인자(miR-29c, amiR-TBX4, NKX2.1)가 발현될 수 있도록 하였으며, 이들의 COVID-19 또는 다른 인자에 의한 폐섬유증 치료제로의 용도에 관한 것이다.

특발성 폐섬유증(idiopathic pulmonary fibrosis)은 원인 미상의 만성 섬유성 간질성 폐질환(interstitial lung disease)으로 호흡곤란의 진행, 폐용적 및 폐확산능의 감소와 조직검사상 통상형 간질성 폐렴(usual interstitial pneumonia)의 소견을 특징으로 한다. 특발성 폐섬유증은 폐 내에 섬유화가 진행하여 대개 진단 후 3년 내에 반수가 사망한다고 알려진 치명적인 질환이다. 주로 50세 이후에 발병하며, 서서히 진행하는 가래를 동반하지 않은 기침 및 운동 시 호흡곤란과 피로함이 주된 증상이다.

유병률 및 발병률은 국가에 따라서 다양하나, 북미 및 유럽에 비해서 아시아인의 유병률은 낮은 것으로 알려졌고 북미에서는 10만 명당 3 내지 9명 정도의 발병률, 유병률은 10만 명당 10 내지 60명가량이나 국내에서는 발병률이 10만 명당 1.7명으로 비교적 적은 편이다.

잘 알려진 위험인자로는 남성, 70대 이상의 고령, 흡연이 있고 그 외에 역류성 식도염, 분진과 관련된 직업력, 대기오염 등이 위험인자로 알려졌다. 그중 고령은 특발성 폐섬유증의 발병에서 가장 강한 위험인자라고 알려졌다.

특발성 폐섬유증의 발병 기전은 반복적인 상피세포의 손상으로 비정상적인 상처회복 과정이 유발되어 과도한 섬유아세포의 증식 및 기질 생성에 의한 폐 실질의 섬유화가 진행되어 발생하는 것으로 알려졌다.

특발성 폐섬유증은 이전에는 질병의 경과를 바꾸는 입증된 약물치료가 없었으나, 2014년 미국 식약청에서 특발성 폐섬유증 치료제로 퍼페니돈(pirfenidone)과 닌테다닙(nintedanib)이 신약 승인을 받았다.

2019년 말 중국 우한에서 발생한 폐렴의 원인으로 신종 코로나 바이러스인 COVID-19가 밝혀졌다. 코로나-19에 감염되면 2~3일에서 14일 정도 잠복기를 거쳤다가 37.5도 이상의 고열, 기침, 인후통, 가래, 근육통, 호흡곤란, 폐렴 등의 증상이 발생하고, 심한 경우 후유증으로 폐섬유증이 남는 경우가 있다.

최근 폐섬유증에서 중간엽 줄기세포를(mesenchymal stem or stromal cells, MSCs)를 이용한 치료법이 새로운 가능성으로 제안된 바 있다. 중간엽 줄기세포 (mesenchymal stem or stromal cells, MSCs)는 손상된 부위로 이동하여 여러 측분비인자(paracrine factor)의 분비, 내피와 상피 투과성 (endothelial and epithelial permeability) 조절, 염증 감소, 조직 재생 (tissue repair) 증진 및 세균 증식 (bacterial growth) 억제 등 다양한 효과를 나타낸다.

대한민국 등록특허 제10-1830290호: 지방 유래 줄기세포로부터 추출된 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 폐 섬유증 예방 또는 치료용 조성물 대한민국 특허등록 제10-1811481호 : 중간엽 줄기세포 처리방법 및 산화적 스트레스 관련 질병 치료에의 그의 용도

본 발명의 과제는 항 염증 및 항 섬유화활성 관련 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터에 의해 형질 감염된 중간엽 줄기세포와 이의 용도를 제공하는 것이다.

상기한 과제를 달성하기 위해 본 발명은

서열번호 1의 염기서열을 갖는 miR-29c;

서열번호 2 내지 서열번호 5로 이루어진 군에서 선택된 shRNA;

서열번호 6의 염기서열을 갖는 amiR-TBX4-1;

서열번호 7의 염기서열을 갖는 amiR-TBX4-2; 및

전사 인자 NKX 2.1을 인코딩하는 서열번호 8의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 폴리뉴클레오티드와,

EK1 펩타이드를 인코딩하는 서열번호 9의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와,

TNF-알파 길항제 및 IL-1 길항제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 치료용 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드,

를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

이때 상기 폴리뉴클레오티드의 발현은 염증 반응적 방식 또는 항시 발현 방식으로 조절될 수 있다.

또한 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질 감염된 숙주세포를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 폐섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질 감염된 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 폐섬유증 예방 또는 치료용 세포 치료제 조성물을 제공한다.

본 발명은 코로나바이러스나 다른 인자에 의한 폐의 염증과 섬유화를 개선하여 폐 섬유증의 예방 또는 치료용 세포 치료제 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.

도 1은 본 발명에 따른 재조합 벡터 대한 모식도를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명에 따른 폐섬유증 치료제, 치료방법을 나타낸 모식도이다.
도 3은 재조합 아데노 부속 바이러스의 혈청형에 따른 HEK293 세포주 형질도입 유무를 GFP 발현 비교를 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 인간 지방세포 유래 중간엽줄기세포에 혈질도입될 수 있는 재조합 아데노 부속 바이러스의 혈청형을 면역 블롯팅을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

마이크로RNA(miRNA)는 다양한 유전자 발현을 조절하는 non-coding RNA을 말하며, mRNA의 번역을 억제하거나, mRNA의 분해를 유도함으로써 전사 후 단계에서 유전자의 발현을 억제하거나 타겟 RNA의 분해를 유도한다. 전사 후 조절은 세포 내 신호전달과 같이 정확하고 정밀한 유전자 발현이 요구되는 과정에서 강력한 조절 방법으로 이용되고 있으며, 외부자극에 의한 유전자의 발현변화 중 절반 정도가 전사 후 단계에서 조절되므로, 전사 후 조절이 전체 유전자의 발현조절에서 매우 중요한 역할을 한다고 보고되고 있다. 몇몇 연구에서는 miRNA는 세포 분화, 증식, 세포사멸, 발생, 면역, 물질대사 및 줄기세포 유지 등과 같은 많은 생물학적 과정을 통제하는 중요한 역할을 수행하는 것으로 밝혀졌다. miRNA 는 펩타이드나 항체 치료제와 달리 개발 기간이 짧고, 확실한 질환 표적 유전자만 밝혀진다면 이론적으로 모두 치료제를 개발할 수 있다는 장점이 있다. 또한, miRNA는 일반적으로 1개가 아닌 복수의 표적 유전자의 발현을 동시에 조절함으로 매우 높은 특이성과 효능을 가지고 있다.

본 발명에서, miRNA 핵산 분자는 발현 벡터에 포함되거나 세포에 도입된 형태로 제공될 수 있다.

본 명세서에서 용어 "벡터"는 전달 벡터와 발현 벡터를 포함한다.

본 명세서에서 용어 "전달 벡터"는 단리된 핵산을 포함하고 단리된 핵산을 세포 내부로 전달하는데 사용될 수 있는 물질의 조성을 지칭한다. 선형 폴리뉴클레오티드, 이온성 또는 양친매성 화합물과 연결된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드 및 바이러스를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 구체적으로 상기 전달 벡터는 자가 복제성 플라스미드 또는 바이러스를 포함한다. 상기 용어는 세포 내로의 핵산의 전이를 촉진시키는 비-플라스미드 및 비-바이러스성 화합물, 예컨대 폴리리신 화합물, 리포솜 등을 추가적으로 포함할 수 있는 것으로 해석되어야한다. 바이러스성 전달 벡터는 아데노 바이러스 벡터, 재조합 아데노-부속 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

아데노-부속 바이러스를 매개로 한 유전자 도입은 효율과 오랜 발현 (long duration of expression)이 우수하다. 또한 아데노-부속 바이러스는 아직까지 인체에 질병과 면역반응을 일으키지 않는 것으로 알려져 있고, 독립된 episome 형태로 유전자 발현을 하기 때문에 환자의 유전자 변이 (genotoxicity)의 위험성 또한 매우 낮다. 이러한 아데노-부속 바이러스 매개 유전자 도입의 강점을 바탕으로 이미 다른 영역에서는 임상적 치료제 개발에 적용되고 있으며, 현재 파킨슨병, 척수근육위축(Spinal muscular atrophy), 맥락막결손(Choroideraemia), 혈우병 B(Haemophilia B) 등의 질환에서 I/II상 또는 III상의 임상 실험이 시행되고 있다. 그리고, 최근에 선천적 실명 치료제 '럭스터나'와 지단백지질분해효소 결핍 치료제 '글리베라', 척수성 근위축증 치료제 '졸겐스마' 등이 FDA에서 AAV 매개 유전자 치료제로 통과되었다.

본 명세서에서 사용된 용어 "렌티바이러스 벡터"는 레트로바이러스의 일종이다. 상기 벡터는 렌티바이러스 트랜스퍼 벡터로 혼용하여 지칭되기도 한다. 상기 렌티바이러스 벡터는 감염 대상인 세포의 게놈 DNA에 삽입되어 안정되게 유전자를 발현시킨다. 또한, 상기 벡터는 분열세포 및 비분열세포에 유전자를 전달할 수 있다. 상기 벡터는 인체의 면역반응을 유도하지 않기 때문에 발현이 지속적이다. 또한, 종래에 사용되는 바이러스 벡터인 아데노바이러스 벡터에 비하여 큰 사이즈의 유전자도 전달 가능한 이점이 있다.

본 명세서에서 용어 "발현 벡터"는 숙주 세포에서 목적 유전자를 발현시키기 위하여, 발현시킬 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 제어서열을 포함하는 재조합 뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 지칭한다. 발현 벡터는 발현을 위한 충분한 시스 작용 인자(cis-acting element)를 포함하고, 발현을 위한 다른 요소는 숙주 세포 또는 시험관 내 발현 시스템에 의해 제공될 수 있다. 상기 발현 벡터는 재조합 폴리뉴클레오티드를 포함하는 플라스미드 벡터; 코즈미드 벡터; 그리고 박테리오파아지 벡터, 아데노바이러스 벡터, 렌티바이러스, 레트로바이러스 벡터 및 아데노-부속 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 본 발명의 벡터에서 상기 스위치 분자를 코딩하는 핵산 분자는 상기 벡터의 프로모터와 작동적으로 결합(operatively linked)되어 있다.

본 명세서에서, 용어 "작동적으로 결합된"은 핵산 발현 조절 서열(예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다.

본 발명의 재조합 벡터를 세포 내로 도입하고 발현시키는 방법은 관련 기술분야에 잘 알려져 있다. 벡터는 당업계에 공지된 방법에 의해 숙주 세포, 예를 들어 포유동물, 박테리아, 효모, 또는 곤충 세포 내로 쉽게 도입될 수 있다. 예를 들면, 벡터는 물리적, 화학적, 또는 생물학적 수단에 의해 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 상기 물리적 수단은 인산칼슘 침전, 리포펙션, 입자 폭격(particle bombardment), 미세주입, 전기천공 등을 포함한다. 상기 화학적 수단은 콜로이드 분산액 시스템, 예컨대 거대분자 복합체, 나노 캡슐, 마이크로스피어, 비드, 및 수중유 에멀젼, 마이셀 (micelle), 혼합된 마이셀, 및 리포좀을 포함하는 지질-기반 시스템을 포함한다. 또한, 상기 생물학적 수단은 DNA 또는 RNA 벡터의 사용을 포함한다.

상기 중간엽 줄기세포는 지방, 골수 유래, 제대혈 유래, 그 외 태반, 근육, 신경 조직 등 다양한 성체조직 유래의 중간엽 줄기세포를 사용할 수 있고, 바람직하게는 지방 유래 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다. 골수, 조직, 지방 등의 채취 대상인 동물은 포유동물일 수 있다. 상기 동물이 인간일 경우 골수, 조직 등은 본 발명의 조성물의 처리에 의해 연골세포, 골세포, 지방세포로의 분화가 유도된 중간엽 줄기 세포를 세포치료제로서 투여하게 될 환자 자신의 것이나 타인 유래의 것일 수 있다.

본 발명에서는 항 염증 활성 관련하여 아래와 같은 관련 핵산 분자를 포함한다.

- 염증 반응적 방식 또는 항시 발현 방식으로 폐 염증을 타겟팅하여 TNF 와 IL-1 길항제를 높은 레벨로 분비

- 항시 발현(Constitutive expression): 닭 베타-액틴 유전자 프로모터 + CMV 인핸서(CAG)

- 염증-반응 발현: 활성 NF-kB 반응 프로모터 (PB2)

- TNF 길항제: 용해성 인간 TNFR2

- IL-1 길항제: 용해성 IL-1R 길항제

항 섬유화 활성과 관련하여 아래와 같은 관련 핵산 분자를 포함한다.

- 폐포 상피세포의 활성과 세포사를 방지할 수 있는 마이크로RNA 생산: microRNA-29c mimic

- 초기 배아 전사 인자 T-box gene 4 (TBX4)

TBX-4 계열 중간엽 전구세포는 손상된 성인 폐에서 근섬유모세포(myofibroblast)의 주된 근원이다. 즉, TBX-4 계열 세포를 절제하였을 때 그리고 SMA- or COL1-alpha2-발현 섬유아세포에서 TBx4 삭제했을 때 폐섬유화가 감소하였다(J. Clin . Invest., 2016, 126(8), 3063).

amiR-TBX4를 이용해 Tbx4를 침묵(silencing) 시키고, TNF나 IL-1 길항제 cDNA 발현을 통해 염증을 억제시키는 두 가지 기능을 동시에 재조합 아데노-부속 바이러스 또는 렌티바이러스에 패키징함.

- ACE1 유지/발전을 위한 전사인자 NKX2.1 생산

항 COVID 활성과 관련하여 아래와 같은 관련 핵산 분자를 포함한다.

- 스파이크 단백질 타겟팅하는 pan-coronavirus 융합 펩타이드 저해제 분비

- EK1 펩타이드

구분	서열	이름
서열번호 1	UAGCACCAUUUGAAAUCGGUUA	miR-29c
서열번호 2	TGG ATC CCA TGG CCG ACT ATA	shRNA-1
서열번호 3	GGA CGA CAA CGG CCA CAT TAT	shRNA-2
서열번호 4	GGA TCA CGC AGC TCA AGA TTG	shRNA-3
서열번호 5	GGT GGA AGC AGT TCA CTT AAA	shRNA-4
서열번호 6	AGGGCTCTGCGTTTGCTCCAGGTAGTCCGCTGCTCCCTTGGGCCTGGGCCCACTGACAGCCCTGGTGCCTCTGGCCGGCTGCACACCTCCTGGCGGGCAGCTGTGgttctcaattttcagctgggtTGTTCTGGCAATACCTGACCCAGCTCTAGATTGAGAACCACGGAGGCCTGCCCTGACTGCCCACGGTGCCGTGGCCAAAGAGGATCTAAGGGCACCGCTGAGGGCCTACCTAACCATCGTGGGGAATAAGGACAGTGTCACCC	amiR-TBX4-1
서열번호 7	AGGGCTCTGCGTTTGCTCCAGGTAGTCCGCTGCTCCCTTGGGCCTGGGCCCACTGACAGCCCTGGTGCCTCTGGCCGGCTGCACACCTCCTGGCGGGCAGCTGTGtggagccgaaagcattgttctTGTTCTGGCAATACCTGAGAACAATCGTCTCGGCTCCACACGGAGGCCTGCCCTGACTGCCCACGGTGCCGTGGCCAAAGAGGATCTAAGGGCACCGCTGAGGGCCTACCTAACCATCGTGGGGAATAAGGACAGTGTCACCC	amiR-TBX4-2
서열번호 8	ATGTGGTCCGGAGGCAGTGGGAAGGCGCGGGGCTGGGAGGCCGCGGCGGGAGGGAGGAGCAGCCCCGGCAGGCTCAGCCGCCGCCGAATCATGTCGATGAGTCCAAAGCACACGACTCCGTTCTCAGTGTCTGACATCTTGAGTCCCCTGGAGGAAAGCTACAAGAAAGTGGGCATGGAGGGCGGCGGCCTCGGGGCTCCGCTGGCGGCGTACAGGCAGGGCCAGGCGGCACCGCCAACAGCGGCCATGCAGCAGCACGCCGTGGGGCACCACGGCGCCGTCACCGCCGCCTACCACATGACGGCGGCGGGGGTGCCCCAGCTCTCGCACTCCGCCGTGGGGGGCTACTGCAACGGCAACCTGGGCAACATGAGCGAGCTGCCGCCGTACCAGGACACCATGAGGAACAGCGCCTCTGGCCCCGGATGGTACGGCGCCAACCCAGACCCGCGCTTCCCCGCCATCTCCCGCTTCATGGGCCCGGCGAGCGGCATGAACATGAGCGGCATGGGCGGCCTGGGCTCGCTGGGGGACGTGAGCAAGAACATGGCCCCGCTGCCAAGCGCGCCGCGCAGGAAGCGCCGGGTGCTCTTCTCGCAGGCGCAGGTGTACGAGCTGGAGCGACGCTTCAAGCAACAGAAGTACCTGTCGGCGCCGGAGCGCGAGCACCTGGCCAGCATGATCCACCTGACGCCCACGCAGGTCAAGATCTGGTTCCAGAACCACCGCTACAAAATGAAGCGCCAGGCCAAGGACAAGGCGGCGCAGCAGCAACTGCAGCAGGACAGCGGCGGCGGCGGGGGCGGCGGGGGCACCGGGTGCCCGCAGCAGCAACAGGCTCAGCAGCAGTCGCCGCGACGCGTGGCGGTGCCGGTCCTGGTGAAAGACGGCAAACCGTGCCAGGCGGGTGCCCCCGCGCCGGGCGCCGCCAGCCTACAAGGCCACGCGCAGCAGCAGGCGCAGCACCAGGCGCAGGCCGCGCAGGCGGCGGCAGCGGCCATCTCCGTGGGCAGCGGTGGCGCCGGCCTTGGCGCACACCCGGGCCACCAGCCAGGCAGCGCAGGCCAGTCTCCGGACCTGGCGCACCACGCCGCCAGCCCCGCGGCGCTGCAGGGCCAGGTATCCAGCCTGTCCCACCTGAACTCCTCGGGCTCGGACTACGGCACCATGTCCTGCTCCACCTTGCTATACGGTCGGACCTGGTGA

본 발명은 상기한 바와 같은 재조합 벡터 또는 형질 감염된 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 폐섬유증 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.

상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가적으로 포함할 수 있다. 상기 담체는 약품 제조 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸셀룰로스, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 조성물은 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 및 이의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.

상기 담체는 본 발명의 조성물 총 중량을 기준으로 약 1 중량% 내지 약 99.99 중량%, 바람직하게는 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량%로 포함될 수 있으며, 상기 약학적으로 허용 가능한 첨가제는 약 0.1 중량% 내지 20 중량%로 포함될 수 있다.

상기 조성물은 통상의 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나, 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질 중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 서술한 바와 같은 폐 섬유증을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

상기 개체는 포유동물, 구체적으로 인간일 수 있다. 상기 조성물의 투여 경로 및 투여량은 환자의 상태 및 부작용의 유무에 따라 다양한 방법 및 양으로 대상에게 투여될 수 있고, 최적의 투여 방법 및 투여량은 통상의 기술자가 적절한 범위로 선택할 수 있다. 또한, 상기 세포 치료제 조성물은 치료하고자 하는 질환에 대하여 치료 효과가 공지된 다른 약물 또는 생리학적 활성물질과 병용하여 투여되거나, 다른 약물과의 조합 제제 형태로 제형화될 수 있다.

상기 세포 치료제 조성물을 비경구적으로 투여하는 경우, 기관내 주사(intratracheal injection) 방식이 바람직하다. 상기 재조합 벡터를 유효성분으로 하는 세포 치료제 조성물을 폐섬유증 부위에 투여시 폐섬유증 부위 세포를 형질 감염함으로써 치료 효과를 나타낼 수 있다.

상기 투여는 1회 이상, 1 내지 4회 투여될 수 있고, 구체적으로 2회로 나누어 투여될 수 있다. 이를 반복 투여하는 경우에는 12 내지 48시간, 24 내지 36시간 간격, 1주, 2주 내지 4주 간격으로 투여할 수 있고, 구체적으로는 24시간 또는 1주 이상 간격으로 투여할 수 있다. 상기 투여는 렌티바이러스의 경우, 성인 기준 1일 10x10⁶내지 10x10¹²TU, 구체적으로 10x10⁸내지 10x10¹⁰TU의 양으로 투여될 수 있다. 한편, 세포의 경우, 성인 기준 1일 5 x 10⁶세포/kg 체중 (low dose) 또는 1 x 10⁷세포/kg 체중 (high dose)의 양으로 투여될 수 있다. 투여량이 많은 경우에는 하루에 수회에 걸쳐 투여될 수 있다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일뿐 본 발명의 범위가 이들만으로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

gfp 인코딩 재조합 아데노-부속 바이러스 제조

pAAVsc-CB6-Egfp 플라스미드 구조물(EGFP : enhanced green fluorescent protein)을 AAV1, AAV2, AAV2-TM, AAV3b, AAV4, AAV5, AAV6, AAV62, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh8, AAVrh10, AAVrh39 및 AAVrh43 캡시드에 패키징하였다.

재조합 아데노 부속 바이러스(rAAV) 생산을 위해 HEK293 세포에 형질감염 시킨 후 CsCl₂ 침강법으로 바이러스 입자만 정제하였다. 이후 Egfp 프라이머/프로브 세트를 이용하여 QX200 ddPCR system (Bio-Rad)에서 ddPCR(droplet digitalPCR)을 수행하여 적정하였다.

세포 배양

인간 지방세포 유래 중간엽줄기세포 (AD-MSC)는 Min et al (PNAS, 2019, 116(36), 17970)에 기재된 바대로 인간 백색지방조직(human white fat tissue)으로부터 분리하였고, MSC 배지(Sciencell, Cat #: 7501)에서 배양하였다.

5 x 10⁴ AD-MSC를 48-웰 플레이트에 이식한 후 하루 후 세포를 GFP(green fluorescent protein)를 인코딩하는 다양한 재조합 아데노-부속 바이러스 혈청형의 2 x 10¹¹ 또는 2 x 10¹⁰ 게놈 복사물(GCs)로 처리하였다.

처리 이틀 후 형질도입 효율을 형광현미경(epifluorescence microscopy)으로 GFP 발현을 형광분석하거나 항-GFP 항체로 면역블롯팅(immunoblotting)으로 GFP 발현을 분석하였다.

면역블롯팅 분석

세포는 TNT 용해 버퍼(50mM Tris-HCl (pH 74), 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 50mM NaF, 1mM Na3VO4, 1mM PMSF, protease inhibitor cocktail (Sigma))를 이용해 용해시킨 후 세포 용해물로부터 단백질 양은 DC protein assay (Bio-Rad)로 분석하였다.

동등한 양의 단백질을 SDS-PAGE 분석 후 Immunobilon-P 막 (Millipore)으로 옮긴 후 항-GFP 항체(JL-8, 632381, Takara, 1:1000)와 Hsp90 antibody (675402, Biolegend, 1:1000)로 면역블록팅한 후 ECL (Thermo fisher scientific) 시약으로 확인하였다.

Claims

서열번호 1의 염기서열을 갖는 miR-29c;
서열번호 2 내지 서열번호 5로 이루어진 군에서 선택된 shRNA;
서열번호 6의 염기서열을 갖는 amiR-TBX4-1;
서열번호 7의 염기서열을 갖는 amiR-TBX4-2; 및
전사 인자 NKX 2.1을 인코딩하는 서열번호 8의 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리뉴클레오티드와,
EK1 펩타이드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드와,
TNF-알파 길항제 및 IL-1 길항제로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 치료용 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드,
를 포함하는 재조합 벡터.
제1항에 있어서, 상기 재조합 벡터는 레트로바이러스 벡터, 아데노바이러스 벡터, 아데노 부속 바이러스(AAV) 벡터, 벡시니아바이러스 벡터, 허피스바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 및 아비폭스바이러스 벡터로 이루어진 군에서 선택된 것을　특징으로 하는 재조합 벡터.
제2항에 있어서,
상기 아데노 부속 바이러스는 혈청형 2, 혈청형 5, 혈청형 6 또는 혈청형 6.2인 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제1항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는
사이토메갈로바이러스 인핸서/닭 베타-액틴/토끼 β-글로빈 프로모터(CAG) 프로모터 또는 활성 NF-κB 반응 프로모터 서열의 조절하에 있는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터.
제1항의 재조합 벡터로 형질 감염된 숙주세포.
제5항에 있어서, 상기 숙주세포는 중간엽 줄기세포인 것을 특징으로 하는, 형질 감염된 숙주세포.
제1항의 재조합 벡터를 유효성분으로 포함하는 폐섬유증 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제5항의 형질 감염된 숙주세포를 유효성분으로 포함하는 폐섬유증 예방 또는 치료용 세포 치료제 조성물.