KR20220154104A - 유전자 상향조절을 위한 mirna-485 억제제 - Google Patents

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KR20220154104A
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류진협
고한석
김대훈
민현수
임유나
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Abstract

본 개시내용은 SIRT1, PGC-1α, CD36, LRRK2, NRG1, STMN2, VLDLR, NRXN1, GRIA4, NXPH1, PSD-95, 및/또는 시냅토파이신 단백질 또는 SIRT1, PGC-1α, CD36, LRRK2, NRG1, STMN2, VLDLR, NRXN1, GRIA4, NXPH1, PSD-95, 및/또는 시냅토파이신 유전자 발현의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 치료하기 위한 miRNA 억제제의 용도를 포함한다. 일부 양태에서, miRNA 억제제는 카스파제-3 단백질 또는 유전자 발현의 증가된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 치료하는데 사용될 수 있다. 본 개시내용에 유용한 miRNA 억제제는 miR-485 발현 및/또는 활성을 억제시킬 수 있고, 이는 차례로 SIRT1, PGC-1α, CD36, LRRK2, NRG1, STMN2, VLDLR, NRXN1, GRIA4, NXPH1, PSD-95, 및/또는 시냅토파이신 단백질 또는 유전자 발현의 수준을 증가시킬 수 있고/거나; 카스파제 3 단백질 또는 유전자 발현의 수준을 감소시킬 수 있다.

Description

유전자 상향조절을 위한 MIRNA-485 억제제
관련 출원에 대한 상호-참조
본 PCT 출원은 2020년 2월 7일 출원된 미국 가출원 번호 62/971,767; 2020년 3월 13일 출원된 62/989,486; 2020년 7월 1일 출원된 63/047,155; 및 2020년 8월 11일 출원된 63/064,314의 우선권을 주장하고; 이들 각각은 이들 전체가 참조로 본원에 편입된다.
EFS-웹을 통해 전자적으로 제출된 서열 목록 참조
본원과 제출된 ASCII 텍스트 파일 (명칭: 4366_014PC04_Seqlisting_ST25.txt; 크기: 264,023 바이트; 및 창작일: 2021년 2월 5일)에서 전자적으로 제출된 서열의 내용은 이 전체가 참조로 본원에 편입된다.
개시내용의 분야
본 개시내용은 감소된 SIRT1 발현과 연관된 질환 및 장애 (예를 들면, 신경퇴행성 질환 및 장애, 예를 들면, 알츠하이머병)의 치료를 위한 miR-485 억제제 (예를 들면, 적어도 하나의 miR-485 결합 부위를 포함하는 뉴클레오티드 분자를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 용도를 제공한다.
개시내용의 배경
시르툴린 1 (NAD-의존적 데아세틸라제 시르투인-1로서 또한 알려짐)은 인간에서 SIRT1 유전자에 의해 인코딩되는 효소이다. 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD)-의존적 히스톤 데아세틸라제의 한 계열에 속하고 다양한 기질을 탈아세틸화시킬 수 있다. Rahman, S., 등, Cell Communication and Signaling 9:11 (2011). 따라서, 시르툴린 1은, 유전자 발현, 대사, 및 노화의 제어를 포함하는, 광범위한 생리학적 기능에서 역할을 하는 것으로서 설명되었다. 그리고, 비정상 시르툴린 활성은 특정 인간 질환과 연관되었다. 가령, 신경퇴행성 장애를 가진 대상체는 낮은 수준의 시르툴린 1 활성을 나타내는 것으로서 설명되었다.
신경퇴행성 장애, 예컨대 알츠하이머병 (AD) 및 파킨슨병은 전세계적으로 사망률 및 이환율의 일반적이고 증가하는 원인이다. 2050년까지, 전세계적으로 1억 명이 넘는 사람들이 AD에 의해 영향받을 것으로 추정된다. Gaugler 등, Alzheimer's Dement 12(4): 459-509 (2016); Pan 등, Sci Adv 5(2) (2019). AD의 비용은 전세계적으로 미화 8000억 달러 이상으로 추정된다. 지난 20년 동안, 연구자들은 Aβ 생산 및 응집을 억제시킬 수 있거나, 아밀로이드 베타 청소를 촉진시킬 수 있는 화합물 및 항체를 개발하기 위해 노력해 왔다. 불행히도, 이들 시도는 경증 AD 환자들로 대규모 임상 시험에서 성공적인 임상적 이점을 달성하지 못했다. Panza 등, Nat Rev Neurol 15(2): 73-88 (2019).
현재, 신경퇴행성 장애에 대하여 알려진 치유법은 없다. 이용가능한 치료 옵션은 일반적으로, 장애의 기저 원인을 해결하는 것과 대조적으로, 다양한 증상을 경감하는 것으로 제한된다. 그러므로, 신경퇴행성 장애 치료하기에 대한 새롭고 더욱 효과적인 접근법이 매우 바람직하다.
개시내용의 간단한 개요
miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 대상체는 SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는다. 일부 양태에서, miRNA 억제제는 자가포식을 유도하고/하거나 염증을 치료 또는 예방한다.
miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, CD36 단백질 및/또는 CD36 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 증가시키는 방법이 또한 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 대상체는 CD36 단백질 및/또는 CD36 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는다.
본 개시내용은 추가로 miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, PGC-1α 단백질 및/또는 PGC-1α 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 증가시키는 방법을 제공한다. 일부 양태에서, 대상체는 PGC-1α 단백질 및/또는 PGC-1α 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는다.
miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, LRRK2 단백질 및/또는 LRRK2 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 대상체는 LRRK2 단백질 및/또는 LRRK2 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는다.
miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, NRG1 단백질 및/또는 NRG1 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 증가시키는 방법이 또한 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 대상체는 NRG1 단백질 및/또는 NRG1 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는다.
miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, STMN2 단백질 및/또는 STMN2 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 대상체는 STMN2 단백질 및/또는 STMN2 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는다.
miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, VLDLR 단백질 및/또는 VLDLR 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 대상체는 VLDLR 단백질 및/또는 VLDLR 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는다.
miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, NRXN1 단백질 및/또는 NRXN1 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 대상체는 NRXN1 단백질 및/또는 NRXN1 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는다.
miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, GRIA4 단백질 및/또는 GRIA4 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 대상체는 GRIA4 단백질 및/또는 GRIA4 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는다.
miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, NXPH1 단백질 및/또는 NXPH1 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 대상체는 NXPH1 단백질 및/또는 NXPH1 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는다.
miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, PSD-95 단백질 및/또는 PSD-95 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 대상체는 PSD-95 단백질 및/또는 PSD-95 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는다.
miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 증가시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 대상체는 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는다.
miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자 수준의 감소를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 감소시키는 방법이 본원에 제공된다. 일부 양태에서, 대상체는 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자의 증가된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는다.
일부 양태에서, 상기 방법에서 사용될 수 있는 miR-485 억제제는 신경발생을 유도한다. 특정 양태에서, 신경발생 유도하기는 신경 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 증가된 증식, 분화, 이동, 및/또는 생존을 포함한다. 일부 양태에서, 신경발생 유도하기는 신경 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 증가된 수를 포함한다. 일부 양태에서, 신경발생 유도하기는 증가된 축삭돌기, 수상돌기, 및/또는 시냅스 발달을 포함한다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 식세포작용을 유도한다.
miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 치료 방법이 또한 본원에 제공되고, 여기서 miRNA 억제제는 SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 수준을 증가시킨다. miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, CD36 단백질 및/또는 CD36 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 치료 방법이 또한 본원에 제공되고, 여기서 miRNA 억제제는 CD36 단백질 및/또는 CD36 유전자의 수준을 증가시킨다. miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, PGC-1α 단백질 및/또는 PGC-1α 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 치료 방법이 또한 본원에 제공되고, 여기서 miRNA 억제제는 PGC-1α 단백질 및/또는 PGC-1α 유전자의 수준을 증가시킨다. miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, LRRK2 단백질 및/또는 LRRK2 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 치료 방법이 또한 본원에 제공되고, 여기서 miRNA 억제제는 LRRK2 단백질 및/또는 LRRK2 유전자의 수준을 증가시킨다. miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, NRG1 단백질 및/또는 NRG1 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 치료 방법이 또한 본원에 제공되고, 여기서 miRNA 억제제는 NRG1 단백질 및/또는 NRG1 유전자의 수준을 증가시킨다. miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, STMN2 단백질 및/또는 STMN2 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 치료 방법이 또한 본원에 제공되고, 여기서 miRNA 억제제는 STMN2 단백질 및/또는 STMN2 유전자의 수준을 증가시킨다. miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, VLDLR 단백질 및/또는 VLDLR 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 치료 방법이 또한 본원에 제공되고, 여기서 miRNA 억제제는 VLDLR 단백질 및/또는 VLDLR 유전자의 수준을 증가시킨다. miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, NRXN1 단백질 및/또는 NRXN1 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 치료 방법이 또한 본원에 제공되고, 여기서 miRNA 억제제는 NRXN1 단백질 및/또는 NRXN1 유전자의 수준을 증가시킨다. miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, GRIA4 단백질 및/또는 GRIA4 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 치료 방법이 또한 본원에 제공되고, 여기서 miRNA 억제제는 GRIA4 단백질 및/또는 GRIA4 유전자의 수준을 증가시킨다. miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, NXPH1 단백질 및/또는 NXPH1 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 치료 방법이 또한 본원에 제공되고, 여기서 miRNA 억제제는 NXPH1 단백질 및/또는 NXPH1 유전자의 수준을 증가시킨다. miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, PSD-95 단백질 및/또는 PSD-95 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 치료 방법이 또한 본원에 제공되고, 여기서 miRNA 억제제는 PSD-95 단백질 및/또는 PSD-95 유전자의 수준을 증가시킨다. miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 치료 방법이 또한 본원에 제공되고, 여기서 miRNA 억제제는 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 수준을 증가시킨다. miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 치료 방법이 또한 본원에 제공되고, 여기서 miRNA 억제제는 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자의 수준을 감소시킨다.
일부 양태에서, miRNA 억제제는 miR485-3p를 억제시킨다. 일부 양태에서, miR485-3p는 5'-GUCAUACACGGCUCUCCUCUCU-3' (서열번호: 1)를 포함한다. 일부 양태에서, miRNA 억제제는 5'-UGUAUGA-3' (서열번호: 2)를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 여기서 miRNA 억제제는 길이가 약 6 내지 약 30개 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 양태에서, miRNA 억제제는 SIRT1 유전자의 전사 및/또는 SIRT1 단백질의 발현을 증가시키거나; CD36 유전자의 전사 및/또는 CD36 단백질의 발현을 증가시키거나; PGC1 유전자의 전사 및/또는 PGC1 단백질의 발현을 증가시키거나; LRRK2 유전자의 전사 및/또는 LRRK2 단백질의 발현을 증가시키거나; NRG1 유전자의 전사 및/또는 NRG1 단백질의 발현을 증가시키거나; STMN2 유전자의 전사 및/또는 STMN2 단백질의 발현을 증가시키거나; VLDLR 유전자의 전사 및/또는 VLDLR 단백질의 발현을 증가시키거나; NRXN1 유전자의 전사 및/또는 NRXN1 단백질의 발현을 증가시키거나; GRIA4 유전자의 전사 및/또는 GRIA4 단백질의 발현을 증가시키거나; NXPH1 유전자의 전사 및/또는 NXPH1 단백질의 발현을 증가시키거나; PSD-95 유전자의 전사 및/또는 PSD-95 단백질의 발현을 증가시키거나; 시냅토파이신 유전자의 전사 및/또는 시냅토파이신 단백질의 발현을 증가시키거나; 카스파제-3 유전자의 전사 및/또는 카스파제-3 단백질의 발현을 감소시키거나; 이들의 임의의 조합이다.
일부 양태에서, miRNA 억제제는 뉴클레오티드 서열의 5'에서 적어도 1 뉴클레오티드, 적어도 2 뉴클레오티드, 적어도 3 뉴클레오티드, 적어도 4 뉴클레오티드, 적어도 5 뉴클레오티드, 적어도 6 뉴클레오티드, 적어도 7 뉴클레오티드, 적어도 8 뉴클레오티드, 적어도 9 뉴클레오티드, 적어도 10 뉴클레오티드, 적어도 11 뉴클레오티드, 적어도 12 뉴클레오티드, 적어도 13 뉴클레오티드, 적어도 14 뉴클레오티드, 적어도 15 뉴클레오티드, 적어도 16 뉴클레오티드, 적어도 17 뉴클레오티드, 적어도 18 뉴클레오티드, 적어도 19 뉴클레오티드, 또는 적어도 20개 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 양태에서, miRNA 억제제는 뉴클레오티드 서열의 3'에서 적어도 1 뉴클레오티드, 적어도 2 뉴클레오티드, 적어도 3 뉴클레오티드, 적어도 4 뉴클레오티드, 적어도 5 뉴클레오티드, 적어도 6 뉴클레오티드, 적어도 7 뉴클레오티드, 적어도 8 뉴클레오티드, 적어도 9 뉴클레오티드, 적어도 10 뉴클레오티드, 적어도 11 뉴클레오티드, 적어도 12 뉴클레오티드, 적어도 13 뉴클레오티드, 적어도 14 뉴클레오티드, 적어도 15 뉴클레오티드, 적어도 16 뉴클레오티드, 적어도 17 뉴클레오티드, 적어도 18 뉴클레오티드, 적어도 19 뉴클레오티드, 또는 적어도 20개 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 양태에서, miRNA 억제제는 5'-UGUAUGA-3' (서열번호: 2), 5'-GUGUAUGA-3' (서열번호: 3), 5'-CGUGUAUGA-3' (서열번호: 4), 5'-CCGUGUAUGA-3' (서열번호: 5), 5'-GCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 6), 5'-AGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 7), 5'-GAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 8), 5'-AGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 9), 5'-GAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 10), 5'-GGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 11), 5'-AGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 12), 5'-GAGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 13), 5'-AGAGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 14), 및 5'-GAGAGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 15)로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖는다.
일부 양태에서, miRNA 억제제는 5'-UGUAUGAC-3' (서열번호: 16), 5'-GUGUAUGAC-3' (서열번호: 17), 5'-CGUGUAUGAC-3' (서열번호: 18), 5'-CCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 19), 5'-GCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 20), 5'-AGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 21), 5'-GAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 22), 5'-AGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 23), 5'-GAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 24), 5'-GGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 25), 5'-AGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 26), 5'-GAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 27), 5'-AGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 28), 5'-GAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 29), 및 AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC (서열번호: 30)로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖는다.
일부 양태에서, miRNA 억제제는 5'-TGTATGA-3' (서열번호: 62), 5'-GTGTATGA-3' (서열번호: 63), 5'-CGTGTATGA-3' (서열번호: 64), 5'-CCGTGTATGA-3' (서열번호: 65), 5'-GCCGTGTATGA-3' (서열번호: 66), 5'-AGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 67), 5'-GAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 68), 5'-AGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 69), 5'-GAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 70), 5'-GGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 71), 5'-AGGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 72), 5'-GAGGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 73), 5'-AGAGGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 74), 5'-GAGAGGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 75); 5'-TGTATGAC-3' (서열번호: 76), 5'-GTGTATGAC-3' (서열번호: 77), 5'-CGTGTATGAC-3' (서열번호: 78), 5'-CCGTGTATGAC-3' (서열번호: 79), 5'-GCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 80), 5'-AGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 81), 5'-GAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 82), 5'-AGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 83), 5'-GAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 84), 5'-GGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 85), 5'-AGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 86), 5'-GAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 87), 5'-AGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 88), 5'-GAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 89), 및 5'-AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 90)로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖는다.
일부 양태에서, miRNA 억제제의 서열은 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30) 또는 5'-AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 90)에 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성이다. 특정 양태에서, miRNA 억제제는 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30) 또는 5'-AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 90)에 적어도 90% 유사성을 갖는 서열을 갖는다. 일부 양태에서, miRNA 억제제는 1개 치환 또는 2개 치환을 가진 뉴클레오티드 서열 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30) 또는 5'-AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 90)를 포함한다. 일부 양태에서, miRNA 억제제는 뉴클레오티드 서열 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30) 또는 5'-AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 90)를 포함한다. 일부 양태에서, miRNA 억제제는 뉴클레오티드 서열 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30)를 포함한다.
일부 양태에서, miRNA 억제제는 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다. 특정 양태에서, 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드는 잠금 핵산 (LNA), 비잠금 핵산 (UNA), 아라비노 핵산 (ABA), 브릿징된 핵산 (BNA), 및/또는 펩티드 핵산 (PNA)이다.
일부 양태에서, miRNA 억제제는 백본 변형을 포함한다. 특정 양태에서, 백본 변형은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO) 및/또는 포스포로티오에이트 (PS) 변형이다.
일부 양태에서, miRNA 억제제는 전달 제제로 전달된다. 특정 양태에서, 전달 제제는 미셀, 엑소좀, 지질 나노입자, 세포외 소포, 또는 합성 소포이다.
일부 양태에서, miRNA 억제제는 바이러스성 벡터에 의해 전달된다. 특정 양태에서, 바이러스성 벡터는 AAV, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 또는 렌티바이러스이다. 일부 양태에서, 바이러스성 벡터는 AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, 또는 이들의 임의의 조합의 혈청형을 갖는 AAV이다.
일부 양태에서, miRNA 억제제는 전달 제제와 함께 전달된다. 특정 양태에서, 전달 제제는 리피도이드, 리포솜, 리포플렉스, 지질 나노입자, 중합체성 화합물, 펩티드, 단백질, 세포, 나노입자 모방체, 나노튜브, 또는 접합체를 포함한다.
일부 양태에서, 전달 제제는
[WP]-L1-[CC]-L2-[AM] (화학식 I)
또는
[WP]-L1-[AM]-L2-[CC] (화학식 II)
식중
WP는 수용성 생체고분자 모이어티이고;
CC는 양으로 하전된 담체 모이어티이고;
AM은 보조제 모이어티이고;
L1 및 L2는 독립적으로 임의적 링커임,
를 포함하는 양이온성 담체 단위체를 포함하고, 여기서 약 1:1의 이온성 비로 핵산과 혼합된 경우, 양이온성 담체 단위체는 미셀을 형성한다.
일부 양태에서, miRNA 억제제는 이온성 결합을 통해 양이온성 담체 단위체와 상호작용한다. 일부 양태에서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 글리콜), 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀성 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(당류), 폴리(α-하이드록시산), 폴리(비닐 알코올), 폴리글리세롤, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린 ("POZ") 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 다른 양태에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG"), 폴리글리세롤, 또는 폴리(프로필렌 글리콜) ("PPG")을 포함한다.
일부 양태에서, 수용성 중합체는
Figure pct00001
, (화학식 I)
를 포함한다,
일부 양태에서, n은 1-1000이다. 특정 양태에서, n은 적어도 약 110, 적어도 약 111, 적어도 약 112, 적어도 약 113, 적어도 약 114, 적어도 약 115, 적어도 약 116, 적어도 약 117, 적어도 약 118, 적어도 약 119, 적어도 약 120, 적어도 약 121, 적어도 약 122, 적어도 약 123, 적어도 약 124, 적어도 약 125, 적어도 약 126, 적어도 약 127, 적어도 약 128, 적어도 약 129, 적어도 약 130, 적어도 약 131, 적어도 약 132, 적어도 약 133, 적어도 약 134, 적어도 약 135, 적어도 약 136, 적어도 약 137, 적어도 약 138, 적어도 약 139, 적어도 약 140, 또는 적어도 약 141이다. 추가 양태에서, n은 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 140 내지 약 150, 약 150 내지 약 160이다.
일부 양태에서, 수용성 중합체는 선형, 분지형, 또는 수지상이다.
일부 양태에서, 양이온성 담체 모이어티는 하나 이상의 염기성 아미노산을 포함한다. 특정 양태에서, 양이온성 담체 모이어티는 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 마침내 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 31, 적어도 32, 적어도 33, 적어도 34, 적어도 35, 적어도 36, 적어도 37, 적어도 38, 적어도 39, 적어도 40, 적어도 41, 적어도 42, 적어도 43, 적어도 44, 적어도 45, 적어도 46, 적어도 47, 적어도 48, 적어도 49, 또는 적어도 50개 염기성 아미노산을 포함한다. 특정 양태에서, 양이온성 담체 모이어티는 약 30 내지 약 50개 염기성 아미노산을 포함한다.
일부 양태에서, 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신, 히스티딘, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 양이온성 담체 모이어티는 약 40개 라이신 단량체를 포함한다.
일부 양태에서, 보조제 모이어티는 면역 반응, 염증성 반응, 및/또는 조직 미세환경을 조절할 수 있다. 특정 양태에서, 보조제 모이어티는 이미다졸 유도체, 아미노산, 비타민, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 보조제 모이어티는
Figure pct00002
, (화학식 II),
을 포함하되, 식중 G1 및 G2의 각각은 H, 방향족 고리, 또는 1-10 알킬이거나, G1 및 G2는 함께 방향족 고리를 형성하고, 식중 n은 1-10이다.
일부 양태에서, 보조제 모이어티는 니트로이미다졸을 포함한다. 특정 양태에서, 보조제 모이어티는 메트로니다졸, 티니다졸, 니모라졸, 디메트리다졸, 프레토마니드, 오르니다졸, 메가졸, 아자니다졸, 벤즈니다졸, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 보조제 모이어티는 아미노산을 포함한다.
일부 양태에서, 보조제 모이어티는
Figure pct00003
(화학식 III),
식중 Ar은
Figure pct00004
또는
Figure pct00005
이고,
식중 Z1 및 Z2의 각각은 H 또는 OH임,
을 포함한다.
일부 양태에서, 보조제 모이어티는 비타민을 포함한다. 특정 양태에서, 비타민은 환식 고리 또는 환식 헤테로 원자 고리 및 카르복실기 또는 하이드록실기를 포함한다.
일부 양태에서, 비타민은
Figure pct00006
(화학식 IV),
을 포함하되, 식중 Y1 및 Y2의 각각은 C, N, O, 또는 S이고, n은 1 또는 2이다.
일부 양태에서, 비타민은 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 비타민 C, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E, 비타민 M, 비타민 H, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 예를 들어, 비타민은 비타민 B3일 수 있다.
일부 양태에서, 보조제 모이어티는 적어도 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 적어도 약 13, 적어도 약 14, 적어도 약 15, 적어도 약 16, 적어도 약 17, 적어도 약 18, 적어도 약 19, 또는 적어도 약 20개 비타민 B3을 포함한다. 특정 양태에서, 보조제 모이어티는 약 10개 비타민 B3을 포함한다.
일부 양태에서, 전달 제제는 약 120 내지 약 130개 PEG 단위체를 가진 약 수용성 생체고분자 모이어티, 약 30 내지 약 40개 라이신을 가진 폴리-라이신을 포함하는 양이온성 담체 모이어티, 및 약 5 내지 약 10개 비타민 B3을 가진 보조제 모이어티를 포함한다.
일부 양태에서, 전달 제제는 miRNA 억제제와 연관되고, 이에 의해 미셀을 형성한다. 예를 들어, 연관은 공유 결합, 비-공유 결합, 또는 이온성 결합일 수 있다.
일부 양태에서, 미셀에서 양이온성 담체 단위체 및 miRNA 억제제는 양이온성 담체 단위체의 양전하 및 miRNA 억제제의 음전하의 이온성 비가 약 1:1이 되도록 용액에서 혼합된다. 일부 양태에서, 양이온성 담체 단위체는 miRNA 억제제를 효소적 분해로부터 보호할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용으로 치료될 수 있는 질환 또는 병태는 알츠하이머병을 포함한다. 특정 양태에서, 질환 또는 병태는 자폐 스펙트럼 장애, 정신 지체, 발작, 뇌졸중, 파킨슨병, 척수 손상, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 특정 양태에서, 질환 또는 병태는 파킨슨병이다.
일부 양태에서, 전달 제제는 미셀이다. 일부 양태에서, 미셀은 (i) 약 100 내지 약 200개 PEG 단위체, (ii) 아민기를 각각 가진, 약 30 내지 약 40개 라이신, (iii) 티올기를 각각 가진, 약 15 내지 약 20개 라이신, 및 (iv) 비타민 B3에 각각 연결된, 약 30 내지 약 40개 라이신을 포함한다. 일부 양태에서, 미셀은 (i) 약 120 내지 약 130개 PEG 단위체, (ii) 아민기를 각각 가진, 약 32개 라이신, (iii) 티올기를 각각 가진, 약 16개 라이신, 및 (iv) 비타민 B3에 각각 연결된, 약 32개 라이신을 포함한다.
일부 양태에서, 표적화 모이어티는 PEG 단위체에 추가로 연결된다. 일부 양태에서, 표적화 모이어티는 LAT 1 표적화 리간드이다. 일부 양태에서, 표적화 모이어티는 펜닐 알라닌이다.
도 1은 본 개시내용의 담체 단위체의 예시적 구성을 도시한다. 제시된 예는 양이온성 담체 모이어티를 포함하고, 이는 음이온성 페이로드, 예를 들면, 핵산 예컨대 유전자, 예를 들면, miRNA (안티미어)를 표적화하는 안티센스 올리고뉴클레오티드와 정전기적으로 상호작용할 수 있다. 일부 양태에서, AM은 WP와 CC 사이 위치될 수 있다. CC 및 AM 구성요소는 단순성을 위하여 선형 배열로 묘사된다. 하지만, 도 4에서 예시된 대로, CC 및 AM은 스캐폴드 방식으로 배열될 수 있다.
도 2a, 2b, 2c, 및 2d는 SIRT1 발현이 알츠하이머병 대상체에서 감소됨을 도시한다. 도 2a는 정상 (즉, AD 없는 대상체) 및 AD 환자들 (각 그룹당 n = 6)로부터 중심 전회 조직에서 대표적 SIRT1 단백질 발현의 비교를 제공한다. 도 2b는 도 2a에서 도시된 결과의 정량적 비교를 제공한다. SIRT1 밴드는 밀도계측에 의해 분석되었고 β-액틴으로 정규화되었다. SIRT1 단백질의 상대 수준은 대조군 (n=6) 또는 AD 중심 전회 (n=6) 조직으로부터 도시된다. 도 2c는 6개월령 야생형 (WT) (n=4), 6개월령 5XFAD (n=3), 11개월령 야생형 (WT), 및 11개월령 5XFAD 마우스 (n=3)에서 에서 SIRT1 mRNA 발현의 비교를 제공한다. 비교적 분석은 동일 연령에서 마우스에 대하여 수행되었다. 도 2d는 연령별 5XFAD 마우스에서 SIRT1 mRNA 발현의 비교를 제공한다. 각 연령 그룹의 5xFAD 발현은 WT로 정규화되었다. 도 2b, 2c, 및 2d에서, 막대는 평균 ± SD를 나타낸다.
도 3a 및 3b는 정상 (즉, AD 없는 대상체) 및 AD 환자들, 각각에서 miR485-3p 및 miR485-5p 발현의 비교를 제공한다.
도 4는 대조군 올리고뉴클레오티드 또는 miR485 억제제 어느 한쪽으로 형질감염된 일차 피질 뉴런에서 마우스 miR485-3p 발현의 상대 수준의 비교를 제공한다. 왼쪽에 그래프는 3 시간 동안 (본원에 "miRNA 억제제" 또는 "miR-485 억제제"로서 또한 지칭된) miR485-3p ASO로 치료후 miR485-3p 발현을 도시한다. 오른쪽에 그래프는 6 시간 동안 miR485-3p ASO로 치료후 발현을 도시한다. 그래프들의 각각에서, 왼쪽 막대는 대조군 그룹을 나타내고 오른쪽 막대는 miR-485 억제제 형질감염된 그룹을 나타낸다.
도 5a 및 5b는 miR-485 억제제가 SIRT1 및 PGC-1α 발현을 증가시킬 수 있음을 도시한다. 도 5a는 miR-대조군, miR485-3p ("miR485-3p 모방체"), 또는 miR-485 억제제 ("miR485-3p ASO")로 형질감염된 마우스 일차 피질 뉴런에서 SIRT1 및 PGC-1α 단백질 발현을 도시하는 웨스턴 블랏 결과를 제공한다. 도 5b는 도 5a에서 도시된 결과의 정량적 비교를 제공한다.
도 6a, 6b, 및 6c는 miR-485 억제제가 SIRT1의 3' UTR에 기능적으로 결합함을 도시한다. 도 6a는 추정의 miR-485-3p 표적 부위를 보여주는 SIRT1 3'-UTR에서 야생형 (WT) 또는 돌연변이체 형태 (MT)의 도식적 표현이다. 도 6b는 48 시간 동안 SIRT1 3'-UTR WT 또는 MT 리포터 작제물 및 miR-대조군, miR-485-3p로 공-형질감염된 HEK293T 세포에서 상대 루시퍼라제 활성의 비교를 제공한다. 적어도 3개의 독립적 실험은 수행되었다. 도 6c는 SIRT1의 WT 3' UTR과 비교하여 돌연변이체 씨드 영역을 갖는 SIRT1의 3' UTR에 miR485-3p의 상대 결합의 비교를 제공한다.
도 7a, 7b, 7c, 7d, 7e, 7f, 및 7g는 miR-485 억제제가 Aβ 침착을 감소시키고 APP 처리를 변경시킴을 도시한다. 도 7a는 10개월령 5XFAD 마우스에서 miR-485 억제제 ICV 주사의 일정을 제공한다. 도 7b는 대조군 (n=5) 및 miR-485 억제제 ("miR485-3p ASO") (n=5) 주사된 5XFAD 마우스로부터 피질 및 해마의 DG 영역에서 Aβ (6E10)에 대한 면역조직화학 염색의 대표적 이미지를 제공한다. 도 7c는 도 7b에서 도시된 결과의 정량적 비교 (mm2당 Aβ 플라크의 평균 수)를 제공한다. 도 7d는 대조군 (n=3) 또는 miR-485 억제제 ("miR485-3p ASO") (n=3) 주사된 10개월령 5XFAD 마우스에서 불용성 Aβ 분획들에 면역블랏을 제공한다. 도 7e는 도 7d에서 도시된 데이터의 정량적 비교를 제공한다. 왼쪽 막대는 대조군 그룹을 나타내고 오른쪽 막대는 miR-485 억제제 그룹을 나타낸다. 도 7f는 대조군 (n=3) 또는 miR-485 억제제 ("miR485-3p ASO") (n=3) 주사된 10개월령 5XFAD 마우스에서 APP, sAPPβ, sAPPα, β-CTFs, BACE1, Adam10, SIRT1 및 PGC-1α 단백질 발현을 도시하는 웨스턴 블랏을 제공한다. 도 7g는 도 7f에서 도시된 데이터의 정량적 비교 (즉, 상대 수준)를 제공한다. 도 7g에서 도시된 그래프들의 각각에서, 왼쪽 막대는 대조군을 나타내고 오른쪽 막대는 miR-485 억제제 그룹을 나타낸다.
도 8a, 8b, 8c, 8d, 8e, 8f, 8g, 및 8h는 miR-485 억제제가 CD36 발현을 증가시킴으로써 양쪽 시험관내 및 생체내 Aβ의 식세포작용을 향상시킴을 도시한다. 도 8a는 대조군 (5마리 마우스로부터 n=11 이미지) 또는 miR485-3p ASO ("miR485-3p ASO") (5마리 마우스로부터 n=11 이미지) 주사된 5XFAD 마우스의 관상 절편에서 Iba1 (미세아교세포) 및 β-아밀로이드 1-16 (6E10, Aβ 플라크를 검출하기 위함)의 면역조직화학 분석을 제공한다. 도 8b는 도 8a에서 도시된 데이터의 정량적 비교 (mm2당 Iba1+Aβ+ 세포의 평균 수)를 제공한다. 도 8c는 대조군 (3마리 마우스로부터 n=7 이미지) 또는 miR-485 억제제 ("miR485-3p ASO") (3마리 마우스로부터 n=7 이미지) 투여된 마우스의 해마 및 피질에서 Aβ 플라크에 대한 ThS 염색의 대표적 이미지를 제공한다. 도 8d는 도 8c에서 도시된 데이터의 정량적 비교를 제공한다. 도 8e는 하기 중 하나로 형질감염되고/거나 치료된: (i) 대조군 올리고뉴클레오티드로 형질감염된, (ii) fAβ(1-42) (1 μM)로 치료된, 또는 (iii) miR-485 억제제 ("miR485-3p ASO")로 형질감염되고 fAβ(1-42) (1 μM)로 치료된 마우스 일차 혼합된 아교 세포에서 일차 아교 세포 (Iba1+)에 의한 Aβ 플라크 (Aβ 1-42)의 흡수를 도시하는 면역조직화학 분석을 제공한다. 도 8f는 항-Iba1, 항-CD68 (포식소체) 및 항-β-아밀로이드 1-16 (6E10)을 사용하여 대조군 (n=6) 또는 miR-485 억제제 ("miR485-3p ASO") (n=6) 주사된 5XFAD 마우스로부터 조직학적 뇌 절편의 면역조직화학 분석을 제공한다. 도 8g는 도 8f에서 도시된 결과의 정량적 비교 (mm2당 Iba1+Aβ+ CD68+ 세포의 평균 수)를 제공한다. 도 8h는 어느 한쪽 대조군 올리고뉴클레오티드 또는 miR-485 억제제 ("miR485-3p ASO")로 형질감염되고 추가로 fAβ(1-42) (1 μM)로 치료된 BV2 미세아교 세포의 상청액에서 Aβ 수준의 비교를 제공한다. 상청액은 4 시간의 치료후 수집되었고 ELISA를 사용하여 분석되었다.
도 9a, 9b, 9c, 9d, 및 9e는 miR-485 억제제가 CD36 발현을 증가시킬 수 있음을 도시한다. 도 9a는 대조군 (n=3) 또는 miR-485 억제제 ("miR485-3p ASO") (n=3) 주사된 10개월령 5XFAD 마우스에서 CD36 단백질 발현의 상대 수준의 비교를 제공한다. 도 9b는 도 9a에서 도시된 결과의 정량적 비교를 제공한다. 도 9c는 항-Iba1 및 항-β-아밀로이드 1-16 (6E10)을 사용하여 대조군 또는 miR-485 억제제 ("miR485-3p ASO") 치료된 5XFAD 마우스로부터 조직학적 뇌 절편에서의 면역조직화학 분석을 제공한다. 도 9d는 대조군 (n=3), miR485-3p 모방체, 또는 miR-485 억제제 ("miR485-3p ASO") (n=3) 형질감염된 일차 혼합된 아교 세포에서 Alexa488-접합된 항-CD36 항체를 사용하여 유세포 분석법에 의해 측정된 대로 CD36의 세포 표면 발현을 제공한다. 도 9e는 도 9d에서 도시된 결과의 정량적 비교 (상대 평균 형광 강도)를 제공한다.
도 10은 miR-485 억제제가 CD36의 3' UTR에 기능적으로 결합할 수 있음을 도시한다. 상대 루시퍼라제 활성은 48 시간 동안 CD36 3'-UTR WT 또는 MT 리포터 작제물 및 miR-대조군 또는 miR-485 억제제로 공-형질감염된 HEK293T 세포에서 측정되었다.
도 11은 miR-485 억제제가 CD36 조절을 통해서 증가된 Aβ 식세포작용을 촉진시킬 수 있음을 도시한다. 어느 한쪽 대조군 올리고뉴클레오티드 또는 miR-485 억제제 ("miR485-3p ASO")로 형질감염되고 추가로 fAβ(1-42) (1 μM)로 치료된 BV2 미세아교 세포의 상청액내 Aβ 수준. 지시된 경우, 차단 항-CD36 항체는 또한 첨가되었다. 상청액은 4 시간의 치료후 수집되었고 ELISA를 사용하여 분석되었다.
도 12a, 12b, 12c, 12d, 12e, 12f, 12h, 12i, 및 12j는 miR-485 억제제가 아교 세포에서 신경염증을 감소시킬 수 있음을 도시한다. 도 12a는 3 또는 6 시간 동안 fAβ(1-42) (1 μM)로 치료된 대조군 또는 miR-485 억제제 ("miR485-3p ASO") 형질감염된 일차 혼합된 아교 세포에서 SIRT1, NF-κB (p65), TNF-α 및 IL-1β 단백질 발현을 도시하는 웨스턴 블랏 분석을 제공한다. "(1)"은 대조군 올리고뉴클레오티드 단독으로 형질감염된 세포에 상응한다. "(2)"는 fAβ(1-42) 단독으로 치료된 세포에 상응한다. "(3)"은 miR-485 억제제로 형질감염되고 fAβ(1-42)로 치료된 세포에 상응한다. 도 12b는 도 12a에서 제공된 결과의 정량적 비교를 제공한다. 도 12b에서 도시된 그래프들의 각각에서, 왼쪽 막대는 대조군을 나타내고, 중간 막대는 fAβ(1-42) 단독으로 치료된 세포를 나타내고, 오른쪽 막대는 miR-485 억제제로 형질감염되고 fAβ(1-42)로 치료된 세포를 나타낸다. 도 12c는 대조군 (n=3) 또는 miR-485 억제제 ("miR485-3p ASO") (n=3) 주사된 10개월령 5XFAD 마우스에서 Iba1, NF-κB (p65), TNF-α 및 IL-1b 단백질의 면역블랏 검출을 제공한다. 2개의 독립적 실험으로부터 결과는 도시된다 (즉, 세트 #1 및 세트 #2). 도 12d는 도 12c에서 도시된 결과의 정량적 비교를 제공한다. 도 12d에서 도시된 그래프들의 각각에서, 왼쪽 막대는 대조군을 나타내고 오른쪽 막대는 miR-485 억제제 그룹을 나타낸다. 도 12e는 대조군 (5마리 마우스로부터 n=11 이미지) 또는 miR-485 억제제 ("miR485-3p ASO") (5마리 마우스로부터 n=11 이미지) 주사된 5XFAD 마우스에서 Iba1 및 TNF-α 발현의 면역조직화학 분석을 제공한다. 도 12f는 도 12e에서 도시된 결과의 정량적 비교 (mm2당 Iba1 및 TNF-α-염색된 세포의 평균 수)를 제공한다. 도 12g는 대조군 (5마리 마우스로부터 n=11 이미지) 또는 miR-485 억제제 ("miR485-3p ASO") (5마리 마우스로부터 n=11 이미지) 주사된 5XFAD 마우스에서 Iba1 및 IL-1β 발현의 면역조직화학 분석을 제공한다. 도 12h는 도 12g에서 도시된 결과의 정량적 비교 (mm2당 Iba1 및 IL-1β-염색된 세포의 평균 수)를 제공한다. 도 12i 및 12j는 mPFF (마우스 알파 시누클레인 응집 형태; 1 μg/mL) 및 가변 농도의 miR-485 억제제 (50 및 100 nM)로 치료된 일차 혼합된 아교 세포의 상청액에서 관찰된 TNF-α (도 12i) 및 IL-1β (도 12j)의 양의 비교를 제공한다.
도 13a, 13b, 13c, 13d, 13e, 13f, 및 13g는 miR-485 억제제가 뉴런성 손실을 호전시키고, 신경발생을 촉진시키고, 포스트-시냅스를 증가시킴을 도시한다. 도 13a는 대조군 (n=3) 또는 miR-485 억제제 ("miR485-3p ASO") (n=5) 주사된 10개월령 5XFAD 마우스의 해마 (좌) 및 피질 (우)에서 NeuN 및 절단된 카스파제 3 단백질 발현을 도시하는 면역블랏을 제공한다. 도 13b는 도 13a에서 제공된 결과의 정량적 비교를 제공한다. 도 13c는 대조군 (n=4) 또는 miR-485 억제제 ("miR485-3p ASO") (n=5) 주사된 10개월령 5XFAD 마우스로부터 관상 뇌 절편에서 NeuN 및 절단된 카스파제-3 발현을 도시하는 면역조직화학 분석을 제공한다. 도 13d는 도 13c에서 도시된 결과의 정량적 비교 (mm2당 NeuN 및 절단된 카스파제-3-염색된 세포의 평균 수)를 제공한다. 도 13e는 대조군 (n=3) 또는 miR-485 억제제 ("miR485-3p ASO") (n=5) 주사된 10개월령 5XFAD 마우스에서 PSD-95 단백질 발현의 면역블랏 분석을 제공한다. 2개의 독립적 실험으로부터 결과는 도시된다 (즉, 세트 #1 및 세트 #2). 도 13f는 도 13e에서 도시된 결과의 정량적 비교를 제공한다. 도 13g는 miR-485 억제제로 치료된 5XFAD 마우스 또는 대조군 마우스의 뇌 조직에서 더블코르틴 (DCX)-양성 세포의 비교를 제공한다.
도 14a 및 14b는 miR-485 억제제가 5XFAD 마우스에서 인지 저하를 개선함을 도시한다. 도 14a 및 14b는 대조군 올리고뉴클레오티드 또는 miR-485 억제제 ("miR485-3p ASO") 어느 한쪽으로 치료된 마우스 (10개월령 5XFAD 마우스)에 대하여 Y-미로 및 수동 회피 테스트, 각각으로부터 결과를 제공한다. 대조군 또는 miR485-3p 주사된 5XFAD 마우스에 대한 평균 교대 (%) 그리고 Y-미로에서 각 아암으로의 총 진입 횟수. 수동 회피 테스트에서 대조군 또는 miR485-3p 주사된 5XFAD 마우스에 대하여 초 단위로 어두운 구획에서의 시간 및 대기시간을 통해서 평균 단계.
도 15는 miR-485 억제제가 5XFAD 마우스를 통해서 입증된 대로 알츠하이머병을 치료할 수 있는 가능한 비-제한 상이한 수단의 개략도를 제공한다. 5XFAD내 miR-485 억제제는 뉴런에서 SIRT1 발현을 증가시킬 수 있다. SIRT1은 차례로 아밀로이드 생산 효소의 조절을 통해서 아밀로이드 베타 생산을 감소시킬 수 있다. 또한, miR-485 억제제는 아교 세포에서 Aβ 플라크의 식세포작용 및 CD36 발현을 향상시킬 수 있다. 동시에, miR-485 억제제는 SIRT1 발현을 유도할 수 있고 신경염증 및 뉴런성 손상을 감소시킬 수 있다.
도 16a, 16b, 및 16c는 SIRT1 및 PGC-1α의 발현이 miR-485 억제제의 단일 뇌실내 투여후 마우스 뇌 피질에서 증가함을 도시한다. 도 16a는 miR-485 억제제 (100 μg/마우스)의 투여 후 6, 24, 48, 및 72 시간에 SIRT1 (왼쪽 그래프) 및 PGC-1α (오른쪽 그래프)의 발현 수준을 제공한다. 도 16b 및 16c는 SIRT1과 PGC-1α 발현, 각각과, 약 50 시간의 과정 동안의 시간 사이 양성 상관관계를 도시한다. 도 16a, 16b, 및 16c의 각각에서, SIRT1 및 PGC-1α 발현 수준은 대조군 (즉, miR-485 억제제로 치료되지 않은 마우스에서 발현 수준)으로 정규화된 채 도시된다. 도 16a에서 제공된 퍼센트 값은 miR-485 억제제 투여 이후 48 시간에 대조군에 비해 SIRT1 및 PGC-1α 발현에서 평균 퍼센트 증가를 나타낸다. 도 16a에서, 제공된 p 값은 t 테스트의 p 값을 나타낸다. 도 16b 및 16c에서, 제공된 p 값은 피어슨의 상관관계의 p 값을 나타낸다. "C.C"는 피어슨의 상관관계의 상관관계 계수를 나타낸다.
도 17a, 17b, 및 17c는 SIRT1 및 PGC-1α의 발현이 miR-485 억제제의 단일 정맥내 투여 후 마우스 뇌의 해마에서 증가함을 도시한다. 도 17a는 miR-485 억제제 (100 μg/마우스)의 투여 후 6, 24, 48, 및 72 시간에 SIRT1 (왼쪽 그래프) 및 PGC-1α (오른쪽 그래프)의 발현 수준을 제공한다. 도 17b 및 17c는 SIRT1 및 PGC-1α 발현, 각각과, 약 24 시간의 과정 동안의 시간 사이 양성 상관관계를 도시한다. 도 17a, 17b, 및 17c의 각각에서, SIRT1 및 PGC-1α 발현 수준은 대조군 (즉, miR-485 억제제로 치료되지 않은 마우스에서 발현 수준)으로 정규화된 채 도시된다. 도 17a에서 제공된 퍼센트 값은 miR-485 억제제 투여 이후 24 시간에 대조군에 비해 SIRT1 및 PGC-1α 발현에서 평균 퍼센트 증가를 나타낸다. 도 17a에서, 제공된 p 값은 t 테스트의 p 값을 나타낸다. 도 17b 및 17c에서, 제공된 p 값은 피어슨의 상관관계의 p 값을 나타낸다. "C.C"는 피어슨의 상관관계의 상관관계 계수를 나타낸다.
도 18a 및 18b는 CD36의 발현이 miR-485 억제제 (100 μg/마우스)의 단일 정맥내 투여 후 단일 후 마우스 뇌에서 증가함을 도시한다. 도 18a는 miR-485 억제제 (100 μg/마우스)의 투여 후 24, 48, 72, 및 120 시간에 CD36의 발현 수준을 제공한다. 도 18b는 CD36 발현과 약 80 시간의 과정 동안의 시간 사이 양성 상관관계를 도시한다. 도 18a 및 18b의 각각에서, CD36 발현은 대조군 (즉, miR-485 억제제로 치료되지 않은 마우스에서 발현 수준)으로 정규화된 채 도시된다. 도 18a에서 제공된 퍼센트 값은 miR-485 억제제 투여 이후 48 시간에 대조군에 비해 CD36 발현에서 평균 퍼센트 증가를 나타낸다. 도 18a에서, 제공된 p 값은 t 테스트의 p 값을 나타낸다. 도 18b에서, 제공된 p 값은 피어슨의 상관관계의 p 값을 나타낸다. "C.C"는 피어슨의 상관관계의 상관관계 계수를 나타낸다.
도 19a 및 19b는 miR-485 억제제의 투여가 숫컷 및 암컷 랫트, 각각의 체중에 관한 관찰가능한 효과가 없음을 도시한다. 도시된 대로, 숫컷 및 암컷 랫트는 miR-485 억제제의 하기 용량 중 하나를 받았다: (i) 0 mg/kg (G1), (ii) 3.75 mg/kg (G2), (iii) 7.5 mg/kg (G3), 및 (iv) 15 mg/kg (G4). 체중은 miR-485 억제제 투여 후 0, 3, 7, 및 14 일차에 측정되었다.
도 20a 및 20b는 miR-485 억제제의 투여가 숫컷 및 암컷 랫트, 각각에서 사망률에 관한 효과가 없음을 도시한다. 도시된 대로, 숫컷 및 암컷 랫트는 miR-485 억제제의 하기 용량 중 하나를 받았다: (i) 0 mg/kg (G1), (ii) 3.75 mg/kg (G2), (iii) 7.5 mg/kg (G3), 및 (iv) 15 mg/kg (G4). 동물의 사망률은 miR-485 억제제 투여 후 0 일차부터 14 일까지 매일 측정되었다.
도 21a 및 21b는 miR-485 억제제의 투여가 숫컷 및 암컷 랫트, 각각에 투여된 때 지속하는 임상적 역효과가 없음을 도시한다. 도시된 대로, 숫컷 및 암컷 랫트는 miR-485 억제제의 하기 용량 중 하나를 받았다: (i) 0 mg/kg (G1), (ii) 3.75 mg/kg (G2), (iii) 7.5 mg/kg (G3), 및 (iv) 15 mg/kg (G4). 측정된 역효과는 하기를 포함하였다: (i) NOA (관찰가능한 이상 없음), (ii) 울혈 (꼬리), (iii) 부종 (안면), (iv) 부종 (앞다리), 및 (v) 부종 (뒷다리). 역효과는 miR-485 억제제 투여 후 0 시간, 0.5 시간, 1 시간, 2 시간, 4 시간, 6 시간, 1 일, 3 일, 5 일, 8 일, 11 일, 및 14 일에 측정되었다.
도 22a 및 22b는 miR-485 억제제의 투여가 숫컷 및 암컷 랫트, 각각에서 관찰가능한 병리학적 이상이 없음을 도시한다. 도시된 대로, 숫컷 및 암컷 랫트는 miR-485 억제제의 하기 용량 중 하나를 받았다: (i) 0 mg/kg (G1), (ii) 3.75 mg/kg (G2), (iii) 7.5 mg/kg (G3), 및 (iv) 15 mg/kg (G4).
도 23a, 23b, 23c, 23d, 23e, 23f, 23g, 23h, 23i, 23j, 및 23k는 파킨슨병 마우스 모델 (즉, 6-OHDA 마우스)에서 miR-485 억제제 투여의 치료적 효과를 도시한다. 도 23a는 실험적 설계의 도식을 제공한다. 도 23b는 PBS 또는 miR-485 억제제로 치료된 6-OHDA 마우스에 대하여 로타로드 대기시간 (실시예에서 기재된 대로 동물이 로타로드-트레드밀에서 떨어지는데 걸린 시간)의 비교를 제공한다. 도 23c는 PBS 또는 miR-485 억제제로 치료된 6-OHDA 마우스의 경우 동물이 유선 케이지에서 떨어질 때와 대기 시간의 비교를 제공한다. 도 23d는 PBS 또는 miR-485 억제제로 치료된 6-OHDA 마우스에 대하여 장대를 타고 내려오는데 걸린 시간의 비교를 제공한다. 도 23e는 PBS 또는 miR-485 억제제로 치료된 6-OHDA 마우스에 대하여 발 미끄러짐의 횟수 (왼쪽 그래프) 그리고 빔의 길이를 가로지르는데 걸린 시간의 비교를 제공한다. 도 23f 및 23h는 하기 그룹으로부터 마우스의 흑질 (SN) 및 선조체 (STR), 각각에서 티로신 하이드록실라제 (TH) 발현을 도시하는 웨스턴 블랏 분석을 제공한다: (i) PBS로 치료된 야생형 마우스 (Con + PBS; 좌로부터 1번째 및 3번째 열); (ii) PBS로 치료된 6-OHDA 마우스 (Exp + PBS; 좌로부터 2번째 및 4번째 열); (iii) miR-485 억제제로 치료된 야생형 마우스 (Con + miR-485; 좌로부터 5번째 및 7번째 열); 및 (iv) miR-485 억제제로 치료된 6-OHDA 마우스 (Exp + miR-485; 좌로부터 6번째 및 8번째 열). 도 23g 및 23i는 도 23f 및 23h, 각각에서 도시된 결과의 정량적 비교 (상대 TH 발현)를 제공한다. 도 23j는 상이한 치료 그룹으로부터 마우스의 흑질에서 측정된 경우 하기 단백질: TNF-α, IL-1β, Iba1, GFAP, 및 β-액틴 (대조군)의 발현을 도시하는 웨스턴 블랏 분석을 제공한다. 상이한 치료 그룹은 다음과 같았다: (i) PBS로 치료된 야생형 마우스 (Con + PBS; 좌로부터 1번째 및 3번째 열); (ii) PBS로 치료된 6-OHDA 마우스 (Exp + PBS; 좌로부터 2번째 및 4번째 열); (iii) miR-485 억제제로 치료된 야생형 마우스 (Con + miR-485; 좌로부터 5번째 및 7번째 열); 및 (iv) miR-485 억제제로 치료된 6-OHDA 마우스 (Exp + miR-485; 좌로부터 6번째 및 8번째 열). 도 23k는 도 23j에서 도시된 IL-1β 발현의 정량적 비교를 제공한다.
도 24a 및 24b는 일차 피질 뉴런 및 일차 혼합된 아교 세포, 각각에서 자가포식에 관한 miR-485 억제제의 효과를 도시한다. 도 24a는 mPFF 마우스 알파 시누클레인 응집 형태; 1 μg/mL) 및 증가하는 농도의 miR-485 억제제로 치료된 일차 피질 뉴런에서 p62 및 LC3B의 발현을 비교하는 웨스턴 블랏 결과를 제공한다. 도 24a에서, 왼쪽에 겔은 24-시간 치료 후 결과를 도시하고, 오른쪽에 겔은 48-시간 치료 후 결과를 도시한다. 도 24b는 mPFF 마우스 알파 시누클레인 응집 형태; 1 μg/mL) 및 증가하는 농도의 miR-485 억제제로 치료된 일차 혼합된 아교 세포에서 p62 및 LC3B의 발현을 비교하는 웨스턴 블랏을 제공한다. 도 24a 및 24b의 각각에서, (좌로부터) 1번째 열은 미치료된 세포 (즉, mPFF 없음 및 miR-485 억제제 없음)를 나타내고, (좌로부터) 2번째 열은 mPFF만 치료된 세포를 나타낸다.
도 25a 및 25b는 마우스 해마에서 바이러스성 벡터 주사 부위들 및 렌티바이러스 유도된 miR-485-3p 과발현을, 각각 도시한다. 도 25a는 표적 양측 바이러스성 벡터 주사 부위들 (즉, 후방 해마에서 치상회 (DG) 및 CA1)을 도시한다. 도 25b는 후방 및 전방 해마 DG 및 CA1에서의 녹색 형광성 단백질 (GFP) 발현을 도시한다.
도 26은 인지 및 기억에 대한 설치류 행동 테스트의 계획을 도시한다. OFT (야외 테스트), Y-미로, NORT (신규한 물체 인식 테스트), 및 PAT (수동 회피 테스트)는 지시된 날에 실행되었다.
도 27a 및 27b는 어느 한쪽 렌티-대조군 벡터 (n=8) (흑색 막대) 또는 렌티-miR485-3p 벡터 (n=7) (회색 막대) 주사된 마우스에 대하여 야외 테스트 (OFT)로부터 결과를 도시한다. 도 27a는 대조군 또는 렌티-miR485-3p 벡터 주사된 마우스에 대하여 30 분 동안 이동된 총 거리 (cm)를 제공한다. 도 27b는 대조군 또는 렌티-miR485-3p 벡터 주사된 마우스에 대하여 중심 구역 활동 (%)을 제공한다. 오차 막대는 평균 ± 평균 평균의 표준 오차 (SEM)를 나타낸다. 통계적 유의성은 미짝짓기된 t-테스트, 이어서 본페로니 사후 통계 테스트에 의해 결정되었다.
도 28a 및 28b는 어느 한쪽 렌티-대조군 벡터 (n=8) (흑색 막대) 또는 렌티-miR485-3p 벡터 (n=7) (회색 막대) 주사된 마우스에 대하여 Y-미로 테스트로부터 결과를 도시한다. 도 28a는 Y-미로에서 각 아암으로의 총 진입 횟수를 도시하고 도 28b는 대조군 또는 렌티-miR485-3p 주사된 마우스에 대하여 평균 교대 (%)를 도시한다. P 값=0.795. 오차 막대는 평균 ± SEM을 나타낸다. 통계적 유의성은 미짝짓기된 t-테스트, 이어서 본페로니 사후 통계 테스트에 의해 결정되었다.
도 29a, 29b, 29c, 29d, 29e, 29f, 및 29g는 어느 한쪽 렌티-대조군 벡터 또는 렌티-miR485-3p 벡터 주사된 마우스에 대하여 신규한 물체 인식 테스트 (NORT)로부터 결과를 도시한다. 도 29a는 신규한 물체 인식 테스트 실험 계획을 도시한다. ("신규한 거부 인식 테스트" 하에) 실시예 19는 실험 계획의 상세된 설명을 제공한다. 도 29b는 단기 기억 테스트 후 어느 한쪽 신규한 또는 익숙한 물체에 대하여 상이한 치료 그룹으로부터 동물의 선호도를 도시한다 (물체 x miR485-3p 상호작용 p 값=0.1288; 물체 p=0.5287, F(1.22)=0.4098; 바이러스 p=0.0143, F(1.22)=7.075; 렌티-대조군 n=11, 렌티-mir485-3p n=9). 도 29c는 챔버에서 배치된 후 3 일차에 (또는 물체 인식 훈련 후 다음 날에) (장기 기억 테스트2) 어느 한쪽 신규한 또는 익숙한 물체에 대하여 상이한 치료 그룹으로부터 동물의 선호도를 도시한다 (물체 x mir485-3p 상호작용 p 값<0.0001, F(1.26)=33.75, 물체 p=0.0459, F(1.26)=43.18; 렌티-대조군 n=8, 렌티-mir485-3p n=7). 도 29d는 챔버에서 배치된 후 24 일차에 (또는 거부 인식 훈련 후 22 일차에) (장기 기억 테스트3) 어느 한쪽 신규한 또는 익숙한 물체에 대하여 상이한 치료 그룹으로부터 동물의 선호도를 도시한다 (물체 x mir485-3p 상호작용 p 값=0.0169, F(1.26)=6.523, 물체 p<0.0001, F(1.26)=37.29; 렌티-대조군 n=8, 렌티-mir485-3p n=7). 도 29e, 29f, 및 29g는, 도 29b, 29c, 및 29d, 각각에서 제공된 결과에 기반하여, 차별 지수 (새롭고 익숙한 물체들을 구별하는 능력)를 제공한다. 오차 막대는 평균 ± SEM을 나타낸다. 통계적 유의성은 2원 Anova 및 미짝짓기된 t-테스트, 이어서 본페로니 사후 통계 테스트에 의해 결정되었다. N.S.=중요하지 않음.
도 30은 어느 한쪽 렌티-대조군 벡터 (n=8) (흑색) 또는 렌티-miR485-3p 벡터 (n=7) (회색) 주사된 마우스에 대하여 수동 회피 테스트 (PAT)로부터 결과, 즉, 진입 대기시간 시간 (초)을 도시한다. P 값=0.18, 오차 막대는 평균 ± SEM을 나타낸다. 통계적 유의성은 미짝짓기된 t-테스트, 이어서 본페로니 사후 통계 테스트에 의해 결정되었다.
도 31a 및 31b는 실험적 설계 그리고 아밀로이드 베타 (Aβ) 생산 및 Aβ의 뉴런에서 뉴런 확산 테스트하기로부터 결과를 도시한다. 도 31a는 실시예 19에서 기재된 대로 실험적 설계를 도시한다. 도 31b는 바이러스 발현 (3번째 및 6번째 이미지, 각각) 및 아밀로이드 베타 (2번째 및 5번째 이미지, 각각)를 테스트하는 렌티-대조군 벡터 또는 렌티-miR485-3p 형질도입된 세포에 대하여 면역세포화학 결과를 도시한다.
도 32는 절단된 타우 (C3) 생산 그리고 절단된 타우의 뉴런에서 뉴런 확산 테스트하기로부터 결과를 도시한다. 바이러스 발현 (3번째 및 6번째 이미지, 각각) 및 절단된 타우 생산 (C3) (2번째 및 5번째 이미지, 각각)을 테스트하는 렌티-대조군 벡터 또는 렌티-miR485-3p 형질도입된 세포에 대하여 면역세포화학 결과를 도시한다.
도 33a 및 33b는 PSD-95 및 시냅토파이신 단백질 발현, 각각 테스트하기로부터 결과를 도시한다. 도 33a는 바이러스 발현 (3번째 및 6번째 이미지, 각각) 및 PSD-95 단백질 발현 (2번째 및 5번째 이미지, 각각)을 테스트하는 렌티-대조군 벡터 또는 렌티-miR485-3p 형질도입된 세포에 대하여 면역세포화학 결과를 도시한다. 도 33b는 바이러스 발현 (3번째 및 6번째 이미지, 각각) 및 시냅토파이신 단백질 발현 (2번째 및 5번째 이미지, 각각)을 테스트하는 렌티-대조군 벡터 또는 렌티-miR485-3p 형질도입된 세포에 대하여 면역세포화학 결과를 도시한다.
도 34는 절단된 카스파제 3 단백질 발현 테스트하기로부터 결과를 도시한다. 바이러스 발현 (3번째 및 6번째 이미지, 각각) 및 절단된 카스파제 3 발현 (2번째 및 5번째 이미지, 각각)을 테스트하는 렌티-대조군 벡터 또는 렌티-miR485-3p 형질도입된 세포에 대하여 면역세포화학 결과를 도시한다.
도 35a, 35b, 및 35c는 실험적 설계 (도 35a) 그리고 미세아교 세포 특이적 마커 (이온화된 칼슘-결합 어댑터 단백질-1 (Iba-1) (도 35b)), 및 마우스 일차 미세아교 세포에서 절단된 카스파제 3 단백질 발현 (도 35c) 테스트하기로부터 결과를 도시한다. 도 35a는 실시예 19에서 기재된 대로 실험적 설계를 도시한다. 도 35b는 바이러스 발현 (3번째 및 6번째 이미지, 각각) 및 Iba-1 발현 (2번째 및 5번째 이미지, 각각)을 테스트하는 렌티-대조군 벡터 또는 렌티-miR485-3p 형질도입된 세포에 대하여 면역세포화학 결과를 도시한다. 도 35c는 바이러스 발현 (3번째 및 6번째 이미지, 각각) 및 마우스 일차 미세아교 세포에서 절단된 카스파제 3 발현 (2번째 및 5번째 이미지, 각각)을 테스트하는 렌티-대조군 벡터 또는 렌티-miR485-3p 형질도입된 세포에 대하여 면역세포화학 결과를 도시한다.
도 36a 및 36b는 성상세포 특이적 마커, 아교 섬유질 산성 단백질 (GFAP) 및 마우스 일차 성상세포에서 절단된 카스파제 3 단백질 발현, 각각 테스트하기로부터 결과를 도시한다. 도 36a는 바이러스 발현 (3번째 및 6번째 이미지, 각각) 및 마우스 일차 성상세포에서 GFAP 발현 (2번째 및 5번째 이미지, 각각)을 테스트하는 렌티-대조군 벡터 또는 렌티-miR485-3p 형질도입된 세포에 대하여 면역세포화학 결과를 도시한다. 도 36b는 바이러스 발현 (3번째 및 6번째 이미지, 각각) 및 마우스 일차 성상세포에서 절단된 카스파제 3 단백질 발현 (2번째 및 5번째 이미지, 각각)을 테스트하는 렌티-대조군 벡터 또는 렌티-miR485-3p 형질도입된 세포에 대하여 면역세포화학 결과를 도시한다.
도 37a, 37b, 및 37c는 실험적 설계 (도 37a) 그리고 미세아교 세포 특이적 마커 (이온화된 칼슘-결합 어댑터 단백질-1 (Iba-1) (도 37b)), 및 인간 미세아교 세포에서 절단된 카스파제 3 단백질 발현 (도 37c) 테스트하기로부터 결과를 도시한다. 도 37a는 실시예 19에서 기재된 대로 실험적 설계를 도시한다. 도 37b는 바이러스 발현 (3번째 및 6번째 이미지, 각각) 및 인간 미세아교 세포에서 Iba-1 발현 (2번째 및 5번째 이미지, 각각)을 테스트하는 렌티-대조군 벡터 또는 렌티-miR485-3p 형질도입된 세포에 대하여 면역세포화학 결과를 도시한다. 도 37c는 바이러스 발현 (3번째 및 6번째 이미지, 각각) 및 인간 미세아교 세포에서 에서 절단된 카스파제 3 발현 (2번째 및 5번째 이미지, 각각)을 테스트하는 렌티-대조군 벡터 또는 렌티-miR485-3p 형질도입된 세포에 대하여 면역세포화학 결과를 도시한다.
도 38a 및 38b는 성상세포 특이적 마커, 아교 섬유질 산성 단백질 (GFAP) 및 인간 성상세포에서 절단된 카스파제 3 단백질 발현, 각각 테스트하기로부터 결과를 도시한다. 도 38a는 바이러스 발현 (3번째 및 6번째 이미지, 각각) 및 인간 성상세포에서 GFAP 발현 (2번째 및 5번째 이미지, 각각)을 테스트하는 렌티-대조군 벡터 또는 렌티-miR485-3p 형질도입된 세포에 대하여 면역세포화학 결과를 도시한다. 도 38b는 바이러스 발현 (3번째 및 6번째 이미지, 각각) 및 인간 성상세포에서 절단된 카스파제 3 단백질 발현 (2번째 및 5번째 이미지, 각각)을 테스트하는 렌티-대조군 벡터 또는 렌티-miR485-3p 형질도입된 세포에 대하여 면역세포화학 결과를 도시한다.
도 39a, 39b, 39c, 및 39d는 파킨슨병 마우스 모델 (즉, 6-OHDA)에서 miR-485 억제제의 2개 상이한 용량 (2 mg/kg 또는 5 mg/kg)의 치료적 효과를 도시한다. 건강한 동물 및 PBS로 치료된 6-OHDA 마우스는 대조군으로서 사용되었다. 도 39a는 로타로드 대기시간 (실시예에서 기재된 대로 동물이 로타로드-트레드밀에서 떨어지는데 걸린 시간)의 비교를 제공한다. 도 39b는 장대를 타고 내려오는데 걸린 시간의 비교를 제공한다. 도 39c는 동물이 유선 케이지에서 떨어질 때와 대기 시간의 비교를 제공한다. 도 39d는 빔의 길이를 가로지르는데 발생한 발 미끄러짐의 횟수 (왼쪽 그래프)의 비교를 제공한다. 도면의 각각에서, "(1)"은 건강한 대조군 그룹에 상응하고; "(2)"는 PBS로 치료된 6-OHDA 마우스에 상응하고; "(3)"은 2.5 mg/kg의 miR-485 억제제로 치료된 6-OHDA 마우스에 상응하고; "(4)"는 5 mg/kg의 miR-485 억제제로 치료된 6-OHDA 마우스에 상응한다.
도 40a, 40b, 40c, 및 40d는 BV2 미세아교 세포에서 자가포식에 관한 miR-485 억제제의 효과를 도시한다. 도 40a는 섬유질 아밀로이드 베타 (oAβ)로 치료되고 가변하는 용량의 miR-485 억제제 (0 nM, 50 nM, 100 nM, 또는 300 nM)로 형질감염된 BV2 세포에서 FOXO3a, LC3-I, 및 LC3-II 단백질의 발현을 비교하는 웨스턴 블랏 결과를 제공한다. oAβ로도 치료되지 않았고 miR-485 억제제로도 형질감염되지 않았던 세포는 대조군으로서 사용되었다. 도 40b, 40c, 및 40d는 치료 그룹으로부터 BV2 세포에서 FOXO3, p62, 및 LC3-II 단백질, 각각의 발현의 정량적 비교를 제공한다. 도면의 각각에서, "(1)"은 (즉, oAβ로도 치료되지 않았고 miR-485 억제제로도 형질감염되지 않은) 대조군 세포에 상응하고; "(2)"는 oAβ 단독으로 치료된 BV2 세포에 상응하고; "(3)"은 oAβ 및 50 nM의 miR-485 억제제로 치료된 BV2 세포에 상응하고; "(4)"는 oAβ 및 100 nM의 miR-485 억제제로 치료된 BV2 세포에 상응하고; "(5)"는 oAβ 및 300 nM의 miR-485 억제제로 치료된 BV2 세포에 상응한다.
본 개시내용은, 적어도 하나의 miR-485 결합 부위를 포함하는 뉴클레오티드 분자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, miR-485 억제제의 용도에 관한 것이고, 여기서 뉴클레오티드 분자는 단백질을 인코딩하지 않는다. 일부 양태에서, miRNA 결합 부위 또는 부위들은 내인성 miR-485에 결합할 수 있고, 이는 내인성 SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 발현 수준을 억제시키고/거나 감소시킨다. 일부 양태에서, miRNA 결합 부위 또는 부위들에 내인성 miR-485의 결합은 내인성 CD36 단백질 및/또는 CD36 유전자의 발현 수준을 억제시킬 수 있고/거나 감소시킬 수 있다. 비슷하게, 일부 양태에서, miRNA 결합 부위 또는 부위들에 내인성 miR-485의 결합은 내인성 PGC-1α의 발현 수준을 억제시킬 수 있고/거나 감소시킬 수 있다. 일부 양태에서, miRNA 결합 부위 또는 부위들에 내인성 miR-485의 결합은 내인성 LRRK2 단백질 및/또는 LRRK2 유전자의 발현 수준을 억제시킬 수 있고/거나 감소시킬 수 있다. 일부 양태에서, miRNA 결합 부위 또는 부위들에 내인성 miR-485의 결합은 내인성 NRG1 단백질 및/또는 NRG1 유전자의 발현 수준을 억제시킬 수 있고/거나 감소시킬 수 있다. 일부 양태에서, miRNA 결합 부위 또는 부위들에 내인성 miR-485의 결합은 내인성 STMN2 단백질 및/또는 STMN2 유전자의 발현 수준을 억제시킬 수 있고/거나 감소시킬 수 있다. 일부 양태에서, miRNA 결합 부위 또는 부위들에 내인성 miR-485의 결합은 내인성 VLDLR 단백질 및/또는 VLDLR 유전자의 발현 수준을 억제시킬 수 있고/거나 감소시킬 수 있다. 일부 양태에서, miRNA 결합 부위 또는 부위들에 내인성 miR-485의 결합은 내인성 NRXN1 단백질 및/또는 NRXN1 유전자의 발현 수준을 억제시킬 수 있고/거나 감소시킬 수 있다. 일부 양태에서, miRNA 결합 부위 또는 부위들에 내인성 miR-485의 결합은 내인성 GRIA4 단백질 및/또는 GRIA4 유전자의 발현 수준을 억제시킬 수 있고/거나 감소시킬 수 있다. 일부 양태에서, miRNA 결합 부위 또는 부위들에 내인성 miR-485의 결합은 내인성 NXPH1 단백질 및/또는 NXPH1 유전자의 발현 수준을 억제시킬 수 있고/거나 감소시킬 수 있다. 일부 양태에서, miRNA 결합 부위 또는 부위들에 내인성 miR-485의 결합은 내인성 PSD-95 단백질 및/또는 PSD-95 유전자의 발현 수준을 억제시킬 수 있고/거나 감소시킬 수 있다. 일부 양태에서, miRNA 결합 부위 또는 부위들에 내인성 miR-485의 결합은 내인성 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 발현 수준을 억제시킬 수 있고/거나 감소시킬 수 있다. 일부 양태에서, miRNA 결합 부위 또는 부위들에 내인성 miR-485의 결합은 내인성 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자의 발현 수준을 촉진시킬 수 있고/거나 증가시킬 수 있다.
따라서, 일부 양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 miR-485 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 추가 양태에서, 대상체에서 SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 수준 증가시키기는 SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태 (예를 들면, 신경퇴행성 질환 및 장애) 치료하기에서 유용할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 miR-485 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, CD36 단백질 및/또는 CD36 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 추가 양태에서, 대상체에서 CD36 단백질 및/또는 CD36 유전자의 수준 증가시키기는 CD36 단백질 및/또는 CD36 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태 (예를 들면, 신경퇴행성 질환 및 장애) 치료하기에서 유용할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 miR-485 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, PGC-1α 단백질 및/또는 PGC-1α 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 추가 양태에서, 대상체에서 PGC-1α 단백질 및/또는 PGC-1α 유전자의 수준 증가시키기는 PGC-1α 단백질 및/또는 PGC-1α 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태 (예를 들면, 신경퇴행성 질환 및 장애) 치료하기에서 유용할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 miR-485 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, LRRK2 단백질 및/또는 LRRK2 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 추가 양태에서, 대상체에서 LRRK2 단백질 및/또는 LRRK2 유전자의 수준 증가시키기는 LRRK2 단백질 및/또는 LRRK2 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태 (예를 들면, 신경퇴행성 질환 및 장애) 치료하기에서 유용할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 miR-485 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, NRG1 단백질 및/또는 NRG1 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 추가 양태에서, 대상체에서 NRG1 단백질 및/또는 NRG1 유전자의 수준 증가시키기는 NRG1 단백질 및/또는 NRG1 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태 (예를 들면, 신경퇴행성 질환 및 장애) 치료하기에서 유용할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 miR-485 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, STMN2 단백질 및/또는 STMN2 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 추가 양태에서, 대상체에서 STMN2 단백질 및/또는 STMN2 유전자의 수준 증가시키기는 STMN2 단백질 및/또는 STMN2 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태 (예를 들면, 신경퇴행성 질환 및 장애) 치료하기에서 유용할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 miR-485 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, VLDLR 단백질 및/또는 VLDLR 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 추가 양태에서, 대상체에서 VLDLR 단백질 및/또는 VLDLR 유전자의 수준 증가시키기는 VLDLR 단백질 및/또는 VLDLR 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태 (예를 들면, 신경퇴행성 질환 및 장애) 치료하기에서 유용할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 miR-485 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, NRXN1 단백질 및/또는 NRXN1 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 추가 양태에서, 대상체에서 NRXN1 단백질 및/또는 NRXN1 유전자의 수준 증가시키기는 NRXN1 단백질 및/또는 NRXN1 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태 (예를 들면, 신경퇴행성 질환 및 장애) 치료하기에서 유용할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 miR-485 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, GRIA4 단백질 및/또는 GRIA4 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 추가 양태에서, 대상체에서 GRIA4 단백질 및/또는 GRIA4 유전자의 수준 증가시키기는 GRIA4 단백질 및/또는 GRIA4 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태 (예를 들면, 신경퇴행성 질환 및 장애) 치료하기에서 유용할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 miR-485 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, NXPH1 단백질 및/또는 NXPH1 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 추가 양태에서, 대상체에서 NXPH1 단백질 및/또는 NXPH1 유전자의 수준 증가시키기는 NXPH1 단백질 및/또는 NXPH1 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태 (예를 들면, 신경퇴행성 질환 및 장애) 치료하기에서 유용할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 miR-485 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, PSD-95 단백질 및/또는 PSD-95 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 추가 양태에서, 대상체에서 PSD-95 단백질 및/또는 PSD-95 유전자의 수준 증가시키기는 PSD-95 단백질 및/또는 PSD-95 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태 (예를 들면, 신경퇴행성 질환 및 장애) 치료하기에서 유용할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 miR-485 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 증가시키는 방법에 관한 것이다. 추가 양태에서, 대상체에서 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 수준 증가시키기는 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태 (예를 들면, 신경퇴행성 질환 및 장애) 치료하기에서 유용할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 대상체에게 miR-485 억제제를 투여하는 단계를 포함하는, 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자 수준의 감소를 필요로 하는 대상체에서 이 수준을 감소시키는 방법에 관한 것이다. 추가 양태에서, 대상체에서 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자의 수준 감소시키기는 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자의 증가된 수준과 연관된 질환 또는 병태 (예를 들면, 신경퇴행성 질환 및 장애) 치료하기에서 유용할 수 있다.
본 개시내용이 더욱 상세히 기재되기 전에, 본 개시내용이 기재된 특정한 조성 또는 공정 단계로 제한되지 않고, 그 자체가, 물론, 가변할 수 있음이 이해되어야 한다. 본 개시내용을 읽을 때 당업자에게 명백할 바와 같이, 본원에 기재되고 예시된 각각의 개별 양태는 본 개시내용의 범위 또는 정신으로부터 이탈하지 않고 다른 여러 양태 중 임의의 것의 속성으로부터 쉽게 분리되거나 이와 조합될 수 있는 별개 구성요소 및 속성을 갖는다. 임의의 인용된 방법은 인용된 사건의 순서로 또는 논리적으로 가능한 임의의 다른 순서로 실시될 수 있다.
본원에 제공된 표제는, 본 명세서를 전체로서 참조로 정의될 수 있는, 본 개시내용의 다양한 양태의 제한이 아니다. 또한, 본원에 사용된 전문용어가 단지 특정한 양태를 설명하기 위한 것이고, 본 개시내용의 범위가 첨부된 청구항에 의해서만 제한될 것이므로, 제한되기 위한 것이 아님이 또한 이해되어야 한다.
I. 용어
본 개시내용이 보다 쉽게 이해될 수 있도록, 특정 용어가 먼저 정의된다. 본원에서 사용된 대로, 본원에 달리 명시적으로 제공된 경우를 제외하고, 하기 용어들의 각각은 하기 제시된 의미를 가질 수 있다. 추가의 정의는 본원 전체에 설명된다.
용어 "한" 또는 "하나" 독립체가 그 독립체의 하나 이상을 지칭함이 유의되어야 하고; 예를 들어, "한 뉴클레오티드 서열"은 하나 이상의 뉴클레오티드 서열을 나타내는 것으로 이해된다. 이와 같이, 용어 "한" (또는 "하나"), "하나 이상", 및 "적어도 하나"는 본원에 교환가능하게 사용될 수 있다. 청구항이 어느 임의적 요소를 제외하도록 작성될 수 있음이 추가로 유의된다. 이와 같이, 본 진술은 청구항 요소의 인용, 또는 부정적인 제한의 사용과 관련하여 "단독으로", "오직" 및 기타 등등 같은 배타적 용어의 사용에 대하여 선행 근거의 역할을 하기 위한 것이다.
게다가, 본원에 사용된 경우 "및/또는"은 다른 것과 함께 또는 다른 것 없이 2개의 특정된 속성 또는 구성요소의 각각의 특정 개시로서 간주되어야 한다. 그래서, 본원에 어구 예컨대 "A 및/또는 B"에서 사용된 경우 용어 "및/또는"은 "A 및 B", "A 또는 B", "A" (단독) 및 "B" (단독)를 포함하기 위한 것이다. 마찬가지로, 어구 예컨대 "A, B, 및/또는 C"에서 사용된 경우 용어 "및/또는"은 하기 양태들의 각각: A, B, 및 C; A, B 또는 C; A 또는 C; A 또는 B; B 또는 C; A 및 C; A 및 B; B 및 C; A (단독); B (단독); 및 C (단독)를 포괄하기 위한 것이다.
양태가 본원에 언어 "포함하는"으로 기재되는 곳마다, "으로 이루어지는" 및/또는 "으로 본질적으로 이루어지는"의 관점에서 기재된 달리 유사한 양태가 또한 제공됨이 이해된다.
달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 본 개시내용이 관련되는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 예를 들어, Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press; 및 Oxford Dictionary of Biochemistry and Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Press는 본 개시내용에서 사용된 많은 용어의 일반 사전을 숙련자에게 제공한다.
단위, 접두사, 및 기호는 그들의 국제단위계 (Systeme International de Unites (SI)) 허용된 형태로 표시된다. 숫자 범위는 범위를 정의하는 숫자를 포함한다. 값의 범위가 인용되는 경우, 그 범위의 인용된 상한 및 하한 사이, 각각의 중간 정수 값, 및 이들의 각 분수가 또한 그러한 값들 사이의 각 하위범위와 함께, 구체적으로 개시되는 것이 이해되어야 한다. 임의의 범위의 상한 및 하한은 독립적으로 범위에 포함되거나 제외될 수 있고, 어느 하나, 둘 다 포함되지 않거나 둘 다 포함되는 각 범위는 또한 본 개시내용 내에 포괄된다. 그래서, 본원에 인용된 범위는, 인용된 종점을 포함하는, 범위 이내 모든 값에 대하여 약칭으로 이해된다. 예를 들어, 1 내지 10의 범위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 및 10으로 이루어지는 군으로부터 임의의 수, 수들의 조합, 또는 하위-범위를 포함하는 것으로 이해된다.
값이 명시적으로 인용되는 경우, 인용된 값과 거의 동일한 정량 또는 양인 값이 또한 본 개시내용의 범위 내에 있음이 이해되어야 한다. 조합이 개시되는 경우, 그 조합의 요소들의 각 하위조합은 또한 구체적으로 개시되고 본 개시내용의 범위 내에 있다. 반대로, 상이한 요소 또는 요소들의 그룹이 개별적으로 개시되는 경우, 이들의 조합은 또한 개시된다. 개시내용의 임의의 요소가 복수의 대안을 갖는 것으로 개시되는 경우, 각 대안이 단독으로 또는 기타 대안과 임의의 조합으로 배제되는 그 개시내용의 예는 또한 이에 의해 개시되고; 개시내용의 하나 초과의 요소는 그러한 배제를 가질 수 있고, 그러한 배제를 갖는 요소들의 모든 조합은 이에 의해 개시된다.
뉴클레오티드는 그들의 일반적으로 허용된 단일-문자 코드에 의해 지칭된다. 달리 지시되지 않는 한, 뉴클레오티드 서열은 왼쪽에서 오른쪽으로 5'에서 3' 배향으로 쓰여진다. 뉴클레오티드는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 권장된 그들의 일반적으로 알려진 1-문자 기호로 본원에 지칭된다. 따라서 'a'는 아데닌을 나타내고, 'c'는 시토신을 나타내고, 'g'는 구아닌을 나타내고, 't'는 티민을 나타내고, 'u'는 우라실을 나타낸다.
아미노산 서열은 왼쪽에서 오른쪽으로 아미노에서 카르복시 배향으로 쓰여진다. 아미노산은 어느 한쪽 그들의 일반적으로 알려진 3 문자 기호로 또는 IUPAC-IUB 생화학 명명 위원회에 의해 권장된 1-문자 기호로 본원에 지칭된다.
용어 "약"은 대략, 대략적으로, 쯤, 또는 의 영역에서를 의미하기 위해 본원에 사용된다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 제시된 수치 값의 위아래 경계를 확장함으로써 그 범위를 수정한다. 일반적으로, 용어 "약"은, 예를 들면, 10 퍼센트, 위 또는 아래 (더 높거나 더 낮음)의 변동에 의해 명시된 값 위아래로 수치 값을 수정할 수 있다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "아데노-연관된 바이러스" (AAV)는, 비제한적으로, AAV 유형 1, AAV 유형 2, AAV 유형 3 (유형 3A 및 3B 포함), AAV 유형 4, AAV 유형 5, AAV 유형 6, AAV 유형 7, AAV 유형 8, AAV 유형 9, AAV 유형 10, AAV 유형 11, AAV 유형 12, AAV 유형 13, AAVrh.74, 뱀 AAV, 조류 AAV, 솟과 AAV, 갯과 AAV, 말과 AAV, 양 AAV, 염소 AAV, 새우 AAV, AAV 혈청형 그리고 Gao 등 (J. Virol. 78:6381 (2004)) 및 Moris 등 (Virol. 33:375 (2004))에 의해 개시된 분기군, 그리고 지금 알려지거나 나중에 발견된 임의의 기타 AAV를 포함한다. 예를 들면, FIELDS 등 VIROLOGY, volume 2, chapter 69 (4th ed., Lippincott-Raven Publishers), 참조. 일부 양태에서, "AAV"는 알려진 AAV의 유도체를 포함한다. 일부 양태에서, "AAV"는 변형된 또는 인공 AAV를 포함한다.
용어 "투여", "투여하기", 및 이의 문법적 별형은 조성물, 예컨대 본 개시내용의 miRNA 억제제를, 대상체에게 약학적으로 허용가능한 루트를 통해 도입하는 것을 지칭한다. 조성물, 예컨대 본 개시내용의 miRNA 억제제를 포함하는 미셀의 대상체에의 도입은 종양내, 구강내, 폐내, 비강내, 비경구 (정맥내, 동맥내, 근육내, 복강내, 또는 피하), 직장, 림프내, 척추강내, 안구주위 또는 국부를 포함하는 임의의 적합한 루트에 의한 것이다. 투여는 자가-투여 그리고 타인에 의한 투여를 포함한다. 투여의 적합한 루트는 조성물 또는 제제가 이의 의도된 기능을 수행하도록 한다. 예를 들어, 적합한 루트가 정맥내이면, 조성물은 조성물 또는 제제를 대상체의 정맥에 도입함으로써 투여된다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "과 연관된"은 둘 이상의 실체 또는 특성 사이 밀접한 관계를 지칭한다. 가령, 본 개시내용으로 치료될 수 있는 질환 또는 병태 (예를 들면, SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태)를 기재하는데 사용된 경우, 용어 "과 연관된"은 대상체가 단백질 및/또는 유전자의 비정상 발현을 나타내는 때 대상체가 질환 또는 병태를 앓는 증가된 가능성을 지칭한다. 일부 양태에서, 단백질 및/또는 유전자의 비정상 발현은 질환 또는 병태를 야기시킨다. 일부 양태에서, 비정상 발현은 질환 또는 병태를 반드시 야기시키지 않지만 이와 연관된다. 대상체가 질환 또는 병태와 연관된 단백질 및/또는 유전자의 비정상 발현을 나타내는지 여부를 결정하는데 사용될 수 있는 적합한 방법의 비-제한 예는 본 개시내용에서 다른 곳에 제공된다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "대략"은, 관심의 하나 이상의 값에 적용된 경우, 명시된 참조 값과 유사한 값을 지칭한다. 특정 양태에서, 용어 "대략"은 달리 명시되지 않거나 달리 문맥에서 명백하지 않은 한 명시된 참조 값의 어느 한쪽 방향으로 (초과 또는 미만) 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 1%, 또는 그 이하 내에 해당하는 값의 범위를 지칭한다 (그러한 수가 가능한 값의 100%를 초과할 경우 제외).
본원에 사용된 경우에, 용어 "보존된"은 비교되는 둘 이상의 서열의 동일 위치에서 교대되지 않은 채 발생하는 것들인 폴리뉴클레오티드 서열 또는 폴리펩티드 서열의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기, 각각을 지칭한다. 비교적 보존되는 뉴클레오티드 또는 아미노산은 서열에서 다른 곳에 나타나는 뉴클레오티드 또는 아미노산보다 더욱 관련된 서열 중에서 보존되는 것들이다.
일부 양태에서, 둘 이상의 서열은 이들이 서로에 100% 동일하면 "완전히 보존된" 또는 "동일한"이라고 한다. 일부 양태에서, 둘 이상의 서열은 이들이 서로에 적어도 70% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 90% 동일, 또는 적어도 95% 동일하면 "고도로 보존된"이라고 한다. 일부 양태에서, 둘 이상의 서열은 이들이 서로에 약 70% 동일, 약 80% 동일, 약 90% 동일, 약 95%, 약 98%, 또는 약 99% 동일하면 "고도로 보존된"이라고 한다. 일부 양태에서, 둘 이상의 서열은 이들이 서로에 적어도 30% 동일, 적어도 40% 동일, 적어도 50% 동일, 적어도 60% 동일, 적어도 70% 동일, 적어도 80% 동일, 적어도 90% 동일, 또는 적어도 95% 동일하면 "보존된"이라고 한다. 일부 양태에서, 둘 이상의 서열은 이들이 서로에 약 30% 동일, 약 40% 동일, 약 50% 동일, 약 60% 동일, 약 70% 동일, 약 80% 동일, 약 90% 동일, 약 95% 동일, 약 98% 동일, 또는 약 99% 동일하면 "보존된"이라고 한다. 서열의 보존은 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전체 길이에 적용할 수 있거나 이의 부문, 영역 또는 속성에 적용할 수 있다.
용어 "에서 유래된"은, 본원에 사용된 경우에, 특정된 분자 또는 유기체, 또는 특정된 분자 또는 유기체로부터 정보 (예를 들면, 아미노산 또는 핵산 서열)에서 단리되거나 상기를 사용하여 만들어지는 구성요소를 지칭한다. 예를 들어, 제2 핵산 서열에서 유래되는 핵산 서열은 제2 핵산 서열의 뉴클레오티드 서열과 동일하거나 실질적으로 유사한 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 경우에, 유래된 종은, 예를 들어, 자연 발생 돌연변이유발, 인공 지시된 돌연변이유발 또는 인공 무작위 돌연변이유발에 의해 수득될 수 있다. 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 유래하는데 사용된 돌연변이유발은 의도적으로 지시되거나 의도적으로 무작위이거나, 각각의 혼합물일 수 있다. 최초에서 유래된 상이한 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 창출하기 위한 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 돌연변이유발은 (예를 들면, 폴리머라제 불충실에 의해 야기된) 무작위 이벤트일 수 있고 유래된 뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 식별은, 예를 들면, 본원에 논의된 대로, 적절한 스크리닝 방법으로 이루어질 수 있다. 일부 양태에서, 제2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에서 유래되는 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열, 각각에 대한 적어도 약 50%, 적어도 약 51%, 적어도 약 52%, 적어도 약 53%, 적어도 약 54%, 적어도 약 55%, 적어도 약 56%, 적어도 약 57%, 적어도 약 58%, 적어도 약 59%, 적어도 약 60%, 적어도 약 61%, 적어도 약 62%, 적어도 약 63%, 적어도 약 64%, 적어도 약 65%, 적어도 약 66%, 적어도 약 67%, 적어도 약 68%, 적어도 약 69%, 적어도 약 70%, 적어도 약 71%, 적어도 약 72%, 적어도 약 73%, 적어도 약 74%, 적어도 약 75%, 적어도 약 76%, 적어도 약 77%, 적어도 약 78%, 적어도 약 79%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100%의 서열 동일성을 갖고, 여기서 제1 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열은 제2 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열의 생물학적 활성을 보유한다.
본원에 사용된 경우에, "코딩 영역" 또는 "코딩 서열"은 아미노산으로 번역가능한 코돈으로 이루어지는 폴리뉴클레오티드의 한 부문이다. "정지 코돈" (TAG, TGA, 또는 TAA)이 아미노산으로 전형적으로 번역되지 않아도, 코딩 영역의 부분인 것으로 간주될 수 있지만, 임의의 측접하는 서열, 예를 들어 프로모터, 리보솜 결합 부위, 전사적 종결자, 인트론, 및 기타 등등은 코딩 영역의 부분이 아니다. 코딩 영역의 경계는, 생성된 폴리펩티드의 아미노 말단을 인코딩하는, 5' 말단에서 시작 코돈, 및 생성된 폴리펩티드의 카르복시 말단을 인코딩하는, 3' 말단에서 번역 정지 코돈에 의해 전형적으로 결정된다.
용어 "상보적" 및 "상보성"은 왓슨-크릭 염기-짝짓기 규칙에 의해 서로 관련되는 둘 이상의 올리고머 (즉, 핵염기 서열을 각각 포함함), 또는 올리고머와 표적 유전자 사이를 지칭한다. 예를 들어, 핵염기 서열 "T-G-A (5'→3')"는 핵염기 서열 "A-C-T (3'→ 5')"에 상보적이다. 상보성은 "부분적"일 수 있고, 여기에서 주어진 핵염기 서열의 모든 핵염기보다 적은 수가 염기 짝짓기 규칙에 따라 다른 핵염기 서열에 매칭된다. 예를 들어, 일부 양태에서, 주어진 핵염기 서열과 다른 핵염기 서열 사이 상보성은 약 70%, 약 75%, 약 80%, 약 85%, 약 90%, 또는 약 95%일 수 있다. 따라서, 특정 양태에서, 용어 "상보적"은 표적 핵산 서열 (예를 들면, miR-485 핵산 서열)에 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 매치 또는 상보성을 지칭한다. 또는, 예시를 계속하기 위해 주어진 핵염기 서열과 다른 핵염기 서열 사이 "완전한" 또는 "완벽한" (100%) 상보성이 있을 수 있다. 일부 양태에서, 핵염기 서열 사이 상보성의 정도는 서열 사이 하이브리드화의 효율 및 강도에서 상당한 영향을 갖는다.
용어 "다운스트림"은 참조 뉴클레오티드 서열에 대해 3' 위치되는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 특정 양태에서, 다운스트림 뉴클레오티드 서열은 전사의 시작점을 따르는 서열에 관련한다. 예를 들어, 유전자의 번역 개시 코돈은 전사의 시작 부위의 다운스트림 위치된다.
용어 "부형제" 및 "담체"는 교환가능하게 사용되고 화합물, 예를 들면, 본 개시내용의 miRNA 억제제의 투여를 추가로 촉진시키기 위해 약학적 조성물에 첨가된 불활성 서브스턴스를 지칭한다.
용어 "발현"은, 본원에 사용된 경우에, 폴리뉴클레오티드가 유전자 산물, 예를 들면, RNA 또는 폴리펩티드를 생산하는 공정을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드의 마이크로 RNA 결합 부위, 작은 헤어핀 RNA (shRNA), 작은 간섭 RNA (siRNA), 또는 임의의 기타 RNA 산물로의 전사를 제한 없이 포함한다. 폴리뉴클레오티드의 메신저 RNA (mRNA)로의 전사, 및 mRNA의 폴리펩티드로의 번역을, 제한 없이, 포함한다. 발현은 "유전자 산물"을 생산한다. 본원에 사용된 경우에, 유전자 산물은, 예를 들면, 핵산, 예컨대 유전자의 전사에 의해 생산된 RNA일 수 있다. 본원에 사용된 경우에, 유전자 산물은 어느 한쪽 핵산, 유전자의 전사에 의해 생산된 RNA 또는 miRNA, 또는 전사체로부터 번역되는 폴리펩티드일 수 있다. 본원에 기재된 유전자 산물은 추가로 전사후 변형, 예를 들면, 폴리아데닐화 또는 스플라이싱을 가진 핵산, 또는 번역후 변형, 예를 들면, 인산화, 메틸화, 글리코실화, 지질의 첨가, 다른 단백질 아단위체와의 연관, 또는 단백질분해 절단을 가진 폴리펩티드를 포함한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "상동성"은 중합체성 분자 사이, 예를 들면 핵산 분자 사이 전반적 관련성을 지칭한다. 일반적으로, 용어 "상동성"은 2개 분자 사이 진화적 관계를 암시한다. 그래서, 상동인 2개 분자는 공통 진화적 조상을 가질 것이다. 본 개시내용의 맥락에서, 용어 상동성은 양쪽 동일성 및 유사성을 포괄한다.
일부 양태에서, 중합체성 분자는 분자에서 단량체의 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 적어도 약 99%가 동일하거나 (정확하게 동일 단량체) 유사 (보존적 치환)하면 서로에 "상동"인 것으로 간주된다. 용어 "상동"은 반드시 적어도 2개 서열 (예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열) 사이 비교를 지칭한다.
본 개시내용의 맥락에서, 치환은 (이들이 아미노산 치환으로서 지칭되는 경우조차) 핵산 수준에서 실행된다, 즉, 아미노산 잔기를 대안적 아미노산 잔기로 치환하기는 제1 아미노산을 인코딩하는 코돈을 제2 아미노산을 인코딩하는 코돈으로 치환시킴으로써 실행된다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "동일성"은 중합체성 분자 사이, 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 분자 사이 전반적 단량체 보존을 지칭한다. 임의의 추가의 수식어, 예를 들면, 폴리뉴클레오티드 A 없이 용어 "동일한"은 폴리뉴클레오티드 B와 동일하고, 폴리뉴클레오티드 서열이 100% 동일함 (100% 서열 동일성)을 암시한다. 예를 들면, "70% 동일한"으로서 2개 서열 기재하기는 이들을, 예를 들면, "70% 서열 동일성"을 갖는 것으로서 기재하기와 같다.
2개 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 퍼센트 동일성의 계산은, 예를 들어, 최적 비교 목적으로 2개 서열을 정렬시킴으로써 수행될 수 있다 (예를 들면, 갭은 최적 정렬을 위하여 제1 및 제2 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 한쪽 또는 양쪽에 도입될 수 있고 비-동일한 서열은 비교 목적으로 무시될 수 있다). 특정 양태에서, 비교 목적으로 정렬된 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 또는 100%이다. 상응하는 아미노산 위치에 아미노산, 또는 폴리뉴클레오티드의 경우에 염기는 그 다음 비교된다.
제1 서열에서 한 위치가 제2 서열에서 상응하는 위치와 동일한 아미노산 또는 뉴클레오티드에 의해 점유되는 경우, 분자는 그 위치에 동일하다. 2개 서열 사이 퍼센트 동일성은, 2개 서열의 최적 정렬을 위하여 도입될 필요가 있는, 갭의 수, 및 각 갭의 길이를 고려하여, 서열에 의해 공유된 동일한 위치의 수의 함수이다. 서열의 비교 그리고 2개 서열 사이 퍼센트 동일성의 결정은 수학적 알고리즘을 사용하여 성취될 수 있다.
상이한 서열 (예를 들면, 폴리뉴클레오티드 서열)을 정렬하는데 사용될 수 있는 적합한 소프트웨어 프로그램은 다양한 소스로부터 이용가능하다. 퍼센트 서열 동일성을 결정하기 위한 하나의 적합한 프로그램은 미국 정부의 국립 생명공학 정보 센터 BLAST 웹 사이트 (blast.ncbi.nlm.nih.gov)에서 이용가능한 BLAST 프로그램 제품군의 부분인, bl2seq이다. Bl2seq는 어느 한쪽 BLASTN 또는 BLASTP 알고리즘을 사용하는 2개 서열 사이 비교를 수행한다. BLASTN은 핵산 서열을 비교하는데 사용되고, 한편 BLASTP는 아미노산 서열을 비교하는데 사용된다. 다른 적합한 프로그램은, 예를 들면, EMBOSS 생물정보학 프로그램 제품군의 부분인 Needle, Stretcher, Water, 또는 Matcher이고 www.ebi.ac.uk/Tools/psa에서 유럽 생물정보학 연구소 (European Bioinformatics Institute (EBI))로부터 또한 이용가능하다.
서열 정렬은 당업계에서 알려진 방법 예컨대 MAFFT, Clustal (ClustalW, Clustal X 또는 Clustal Omega), MUSCLE, 등을 사용하여 실행될 수 있다.
폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 참조 서열과 정렬하는 단일 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 표적 서열 내에서 상이한 영역은 그들의 자체 퍼센트 서열 동일성을 각각 가질 수 있다. 퍼센트 서열 동일성 값이 가장 가까운 10분의 1로 반올림됨을 유의된다. 예를 들어, 80.11, 80.12, 80.13 및 80.14는 80.1로 반내림되고 80.15, 80.16, 80.17, 80.18 및 80.19는 80.2로 반올림된다. 또한 길이 값이 항상 정수인 것이 유의된다.
특정 양태에서, 제2 아미노산 서열 (또는 핵산 서열)에 대한 제1 아미노산 서열 (또는 핵산 서열)의 백분율 동일성 (%ID) 또는 은 %ID = 100 x (Y/Z)로서 계산되고, 식중 Y는 (시각 검사 또는 특정한 서열 정렬 프로그램에 의해 정렬된 경우에) 제1 및 제2 서열의 정렬에서 동일한 매치로서 채점된 아미노산 잔기 (또는 핵염기)의 수이고 Z는 제2 서열에서 잔기의 총수이다. 제1 서열의 길이가 제2 서열보다 더 길면, 제2 서열에 대한 제1 서열의 퍼센트 동일성은 제1 서열에 대한 제2 서열의 퍼센트 동일성보다 더 높을 것이다.
당업자는 퍼센트 서열 동일성의 계산을 위한 서열 정렬의 생성이 일차 서열 데이터에 의해 독점적으로 구동된 이진 서열-서열 비교에 제한되지 않는다는 것을 이해할 것이다. 서열 정렬이 서열 데이터를 이종 소스 예컨대 구조적 데이터 (예를 들면, 결정학적 단백질 구조), 기능적 데이터 (예를 들면, 돌연변이의 위치), 또는 계통발생적 데이터로부터의 데이터와 통합함으로써 생성될 수 있음이 또한 이해될 것이다. 다중 서열 정렬을 생성하기 위해 이종 데이터를 통합하는 적합한 프로그램은 www.tcoffee.org에서 이용가능한, 그리고, 예를 들면, EBI로부터 대안적으로 이용가능한 T-Coffee이다. 퍼센트 서열 동일성을 계산하는데 사용된 최종 정렬이 어느 한쪽 자동으로 또는 수동으로 큐레이션될 수 있음이 또한 이해될 것이다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "단리된", "정제된", "추출된", 및 이의 문법적 별형은 교환가능하게 사용되고 하나 이상의 정제 공정을 겪은 본 개시내용의 원하는 조성물, 예를 들면, 본 개시내용의 miRNA 억제제의 제조물의 상태를 지칭한다. 일부 양태에서, 본원에 사용된 경우에 단리하기 또는 정제하기는 오염물을 함유하는 샘플로부터 본 개시내용의 조성물의 (예를 들면, 분획), 예를 들면, 본 개시내용의 miRNA 억제제를 부분적으로 제거하는, 제거하기의 공정이다.
일부 양태에서, 단리된 조성물은 검출가능한 바람직하지 않은 활성을 갖지 않거나, 대안적으로, 바람직하지 않은 활성의 수준 또는 양은 허용가능한 수준 또는 양 이하이다. 다른 양태에서, 단리된 조성물은 허용가능한 양 및/또는 농도 및/또는 활성 이상에서, 본 개시내용의 원하는 조성물의 양 및/또는 농도를 갖는다. 다른 양태에서, 단리된 조성물은 조성물이 수득되는 시작 물질과 비교된 경우에 농축된다. 이 농축은 시작 물질과 비교된 경우에 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 적어도 약 99.9%, 적어도 약 99.99%, 적어도 약 99.999%, 적어도 약 99.9999%, 또는 99.9999% 초과만큼일 수 있다.
일부 양태에서, 단리된 제조물은 잔류 생물학적 산물이 실질적으로 없다. 일부 양태에서, 단리된 제조물은 임의의 오염 생물학적 물질이 100% 없거나, 적어도 약 99% 없거나, 적어도 약 98% 없거나, 적어도 약 97% 없거나, 적어도 약 96% 없거나, 적어도 약 95% 없거나, 적어도 약 94% 없거나, 적어도 약 93% 없거나, 적어도 약 92% 없거나, 적어도 약 91% 없거나, 적어도 약 90% 없다. 잔류 생물학적 산물은 비생물적 물질 (화학물질 포함) 또는 원치않는 핵산, 단백질, 지질, 또는 대사산물을 포함할 수 있다.
용어 "결합된"은 본원에 사용된 경우에 제2 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열, 각각에 공유적으로 또는 비-공유적으로 연결된 제1 아미노산 서열 또는 폴리뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 제1 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열은 제2 아미노산 또는 폴리뉴클레오티드 서열에 직접적으로 연결 또는 병치될 수 있거나 대안적으로 중간 서열은 제1 서열을 제2 서열에 공유적으로 연결시킬 수 있다. 용어 "결합된"은 5'-말단 또는 3'-말단에서 제2 폴리뉴클레오티드 서열에 제1 폴리뉴클레오티드 서열의 융합을 의미하고, 뿐만 아니라 제2 폴리뉴클레오티드 서열 (또는 제1 폴리뉴클레오티드 서열, 각각)에서 임의의 2개 뉴클레오티드에 전체 제1 폴리뉴클레오티드 서열 (또는 제2 폴리뉴클레오티드 서열)의 삽입을 포함한다. 제1 폴리뉴클레오티드 서열은 포스포디에스테르 결합 또는 링커에 의해 제2 폴리뉴클레오티드 서열에 결합될 수 있다. 링커는, 예를 들면, 폴리뉴클레오티드일 수 있다.
"miRNA 억제제"는, 본원에 사용된 경우에, miRNA 발현, 기능, 및/또는 활성을 감소, 변경, 및/또는 조절할 수 있는 화합물을 지칭한다. miRNA 억제제는, miRNA 억제제가 표적 miRNA 서열에 하이브리드화하도록, 표적 miRNA 핵산 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있다. 가령, 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는, miR-485 억제제가 miR-485 서열에 하이브리드화하도록, 표적 miR-485 핵산 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 뉴클레오티드 분자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 추가 양태에서, miR-485 서열에 대한 miR-485의 하이브리드화는 miR-485의 발현, 기능, 및/또는 활성을 감소, 변경, 및/또는 조절한다 (예를 들면, 하이브리드화는 SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 발현에서 증가를 초래한다).
용어 "miRNA", "miR", 및 "마이크로RNA"는 교환가능하게 사용되고 RNA-기반 유전자 조절에 관여되는 진핵생물에서 발견된 마이크로RNA 분자를 지칭한다. 본 용어는 전구체로부터 가공된 단일-가닥 RNA 분자를 지칭하는데 사용될 것이다. 일부 양태에서, 용어 "안티센스 올리고머"는 본 개시내용의 마이크로RNA 분자를 기재하는데 또한 사용될 수 있다. 본 개시내용에 관련된 miRNA의 명칭 및 그들의 서열은 본원에 제공된다. 마이크로RNA는 표적 mRNA의 탈안정화 또는 번역적 억제로 이어지는 불완전 염기 짝짓기를 통해서 표적 mRNA에 결합하고 인식하며 이에 의해 표적 유전자 발현을 하향조절한다. 반대로, miRNA 결합 부위를 포함하는 분자 (일반적으로 miRNA의 씨드 영역에 상보적인 서열을 포함하는 분자)를 통해 miRNA 표적화하기는 표적 유전자의 상향조절을 초래하는 miRNA-유도 번역적 억제를 감소 또는 억제시킬 수 있다.
용어 "미스매치" 또는 "미스매치들"은 염기 짝짓기 규칙에 따라 표적 핵산 서열 (예를 들면, miR-485)에 매칭되지 않는 올리고머 핵염기 서열 (예를 들면, miR-485 억제제)에서 (인접 또는 분리되든) 하나 이상의 핵염기를 지칭한다. 완벽한 상보성이 종종 요구되지만, 일부 양태에서, 하나 이상 (예를 들면, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 미스매치들)은 표적 핵산 서열과 관련하여 발생할 수 있다. 올리고머 내에서 임의의 위치에 이형은 포함된다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 안티센스 올리고머 (예를 들면, miR-485 억제제)는 말단 근처 핵염기 서열에서의 이형, 내부에서의 이형을 포함하고, 존재하는 경우 전형적으로 5' 및/또는 3' 말단의 약 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 아단위체 이내이다. 일부 양태에서, 1, 2, 또는 3개 핵염기는 제거될 수 있고 여전히 표적내 결합하기를 제공할 수 있다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "조절하다", "변형하다", 및 이의 문법적 별형은, 일반적으로 특정 농도, 수준, 발현, 기능 또는 행동에 적용된 경우, 특정 농도, 수준, 발현, 기능 또는 행동을 증가시킴 또는 감소시킴, 예를 들면, 직접적으로 또는 간접적으로 촉진시킴/자극시킴/상향조절시킴 또는 방해함/억제시킴/하향조절시킴으로써 변경시키는 능력, 예컨대, 예를 들면, 길항제 또는 작용제로서 작용하는 능력을 지칭한다. 일부 경우에, 조절자는 대조군에 비해, 또는 일반적으로 예상되는 활성의 평균 수준에 비해 또는 대조군 활성 수준에 비해 특정 농도, 수준, 활성 또는 기능을 증가 및/또는 감소시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miRNA 억제제, 예를 들면, miR-485 억제제는 miR-485 발현, 기능, 및/또는 활성을 조절 (예를 들면, 감소, 변경, 또는 폐지)할 수 있고, 이에 의해, SIRT1 단백질 또는 유전자 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있다.
"핵산", "핵산 분자", "뉴클레오티드 서열", "폴리뉴클레오티드", 및 이의 문법적 별형은 교환가능하게 사용되고 리보뉴클레오시드 (아데노신, 구아노신, 우리딘 또는 시티딘; "RNA 분자") 또는 데옥시리보뉴클레오시드 (데옥시아데노신, 데옥시구아노신, 데옥시티미딘, 또는 데옥시시티딘; "DNA 분자")의 포스페이트 에스테르 중합체성 형태, 또는 이들의 임의의 포스포에스테르 유사체, 예컨대 포스포로티오에이트 및 티오에스테르를, 어느 한쪽 단일 가닥 형태, 또는 이중-가닥 나선으로 지칭한다. 단일 가닥 핵산 서열은 단일-가닥 DNA (ssDNA) 또는 단일-가닥 RNA (ssRNA)를 지칭하다. 이중 가닥 DNA-DNA, DNA-RNA 및 RNA-RNA 나선은 가능하다. 용어 핵산 분자, 및 특히 DNA 또는 RNA 분자는 분자의 일차 및 이차 구조만을 지칭하고, 임의의 특정한 삼차 형태로 제한하지 않는다. 그래서, 이 용어는, 특히, 선형 또는 원형 DNA 분자 (예를 들면, 제한 단편), 플라스미드, 초나선 DNA 및 염색체에서 발견된 이중-가닥 DNA를 포함한다. 특정한 이중-가닥 DNA 분자의 구조 논의에서, 서열은 DNA의 비-전사된 가닥 (즉, mRNA에 상동인 서열을 갖는 가닥)을 따라 5'에서 3' 방향으로 서열만을 제공하는 정상 관례에 따라 본원에 기재될 수 있다. "재조합 DNA 분자"는 분자성 생물학적 조작을 겪은 DNA 분자이다. DNA는, 비제한적으로, cDNA, 게놈성 DNA, 플라스미드 DNA, 합성 DNA, 및 절반-합성 DNA를 포함한다. 본 개시내용의 "핵산 조성물"은 하나 이상의 핵산을 본원에 기재된 경우에 포함한다.
용어 "약학적으로 허용가능한 담체", "약학적으로 허용가능한 부형제", 및 이의 문법적 이형은 인간을 포함하는 동물에 사용을 위하여 미국 연방 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 미국 약전에서 열거된 제제 중 임의의 것, 뿐만 아니라 대상체에 조성물의 투여를 금지하고 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 폐기하지 않는 정도로 바람직하지 않은 생리학적 효과의 생산을 야기시키지 않는 임의의 담체 또는 희석제를 포괄한다. 약학적 조성물을 제조하는데 유용하고 일반적으로 안전하고, 비-독성이고, 바람직한 부형제 및 담체가 포함된다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "약학적 조성물"은, 하나 이상의 다른 화학적 구성요소, 예컨대 약학적으로 허용가능한 담체 및 부형제와 혼합되거나 섞인, 또는 상기에 현탁된, 본원에 기재된 화합물 중 하나 이상, 예컨대, 예를 들면, 본 개시내용의 miRNA 억제제를 지칭한다. 약학적 조성물의 하나의 목적은 대상체에게 본 개시내용의 miRNA 억제제를 포함하는 제조물의 투여를 용이하게 하는 것이다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는, 본원에 사용된 경우에, 리보뉴클레오티드, 데옥시리보뉴클레오티드, 이들의 유사체, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 지칭한다.
일부 양태에서, 본 용어는 분자의 일차 구조를 지칭한다. 그래서, 본 용어는 삼중-, 이중- 및 단일-가닥 데옥시리보핵산 ("DNA"), 뿐만 아니라 삼중-, 이중- 및 단일-가닥 리보핵산 ("RNA")을 포함한다. 폴리뉴클레오티드의 예를 들어 알킬화에 의해, 및/또는 캡핑에 의해 변형된, 그리고 미변형된 형태를 또한 포함한다.
일부 양태에서, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 폴리데옥시리보뉴클레오티드 (2-데옥시-D-리보스 함유), 스플라이싱되든 스플라이싱되지 않든, tRNA, rRNA, shRNA, siRNA, miRNA 및 mRNA를 포함하는, 폴리리보뉴클레오티드 (D-리보스 함유), 퓨린 또는 피리미딘 염기의 N- 또는 C-글리코시드인 임의의 다른 유형의 폴리뉴클레오티드, 및 노르무클레오티딕 백본을 함유하는 기타 중합체, 예를 들어, 폴리아미드 (예를 들면, 펩티드 핵산 "PNA") 및 폴리모르폴리노 중합체, 그리고 중합체가 염기 짝짓기 및 염기 스태킹을 허용하는, 예컨대 DNA 및 RNA에서 발견되는 구성으로 핵염기를 함유함을 제공하는 기타 합성 서열-특이적 핵산 중합체를 포함한다.
본 개시내용의 일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드는, 예를 들면, 올리고뉴클레오티드, 예컨대 안티센스 올리고뉴클레오티드일 수 있다. 일부 양태에서, 올리고뉴클레오티드는 RNA이다. 일부 양태에서, RNA는 합성 RNA이다. 일부 양태에서, 합성 RNA는 적어도 하나의 비천연 핵염기를 포함한다. 일부 양태에서, 특정 부류의 모든 핵염기는 비천연 핵염기로 대체되었다 (예를 들면, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드에서 모든 우리딘은 비천연 핵염기, 예를 들면, 5-메톡시우리딘으로 대체될 수 있다).
용어 "폴리펩티드", "펩티드", 및 "단백질"은, 예를 들면, SIRT1 유전자에 의해 인코딩되는 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 지칭하기 위해 본원에 교환가능하게 사용된다. 중합체는 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 본 용어는 또한 자연적으로 또는 개입; 예를 들어, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작 또는 변형, 예컨대 표지화 구성요소와의 접합에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포괄한다. 예를 들어, 아미노산의 하나 이상의 유사체 (예를 들어, 비천연 아미노산 예컨대 호모시스테인, 오르니틴, p-아세틸페닐알라닌, D-아미노산, 및 크레아틴 포함)를 함유하는 폴리펩티드, 뿐만 아니라 당업계에 알려진 다른 변형이 본 정의 내에 또한 포함된다. 용어 "폴리펩티드"는, 본원에 사용된 경우에, 임의의 크기, 구조, 또는 기능의 단백질, 폴리펩티드, 및 펩티드를 지칭한다.
폴리펩티드는 유전자 산물, 자연 발생 폴리펩티드, 합성 폴리펩티드, 동족체, 동원체, 이원체, 단편 및 기타 등가물, 변이체, 및 전술한 것들의 유사체를 포함한다.
폴리펩티드는 단일 폴리펩티드일 수 있거나 다분자성 복합체 예컨대 이량체, 삼량체 또는 사량체일 수 있다. 이들은 단일 쇄 또는 다중쇄 폴리펩티드를 또한 포함할 수 있다. 가장 흔한 디술피드 연결은 다중쇄 폴리펩티드에서 발견되다. 용어 폴리펩티드는 하나 이상의 아미노산 잔기가 상응하는 자연 발생 아미노산의 인공 화학적 유사체인 아미노산 중합체에 또한 적용할 수 있다. 일부 양태에서, "펩티드"는 약 50개 아미노산 길이 이하, 예를 들면, 약 5, 약 10, 약 15, 약 20, 약 25, 약 30, 약 35, 약 40, 약 45, 또는 약 50개 아미노산 길이일 수 있다.
용어 "예방하다", "예방하기", 및 이의 이형은 본원에 사용된 경우에, 질환, 장애 및/또는 병태의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시킴; 특정한 질환, 장애, 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 속성, 또는 임상 징후의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시킴; 특정한 질환, 장애, 및/또는 병태의 하나 이상의 증상, 속성, 또는 징후의 발병을 부분적으로 또는 완전히 지연시킴; 특정한 질환, 장애, 및/또는 병태로부터의 진행을 부분적으로 또는 완전히 지연시킴; 및/또는 질환, 장애, 및/또는 병태와 관련된 병리 발달의 위험을 감소시킴을 지칭한다. 일부 양태에서, 결과 예방하기는 예방성 치료를 통해서 달성된다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "프로모터" 및 "프로모터 서열"은 교환가능하고 코딩 서열 또는 기능적 RNA의 발현을 제어할 수 있는 DNA 서열을 지칭한다. 일반적으로, 코딩 서열은 프로모터 서열에 대해 3' 위치된다. 프로모터는 천연 유전자로부터 그들의 전체가 유래될 수 있거나, 자연에서 발견된 상이한 프로모터에서 유래된 상이한 요소로 구성될 수 있거나, 심지어 합성 DNA 세그먼트를 포함할 수 있다. 상이한 프로모터가 상이한 조직 또는 세포 유형에서, 또는 상이한 발달의 스테이지에서, 또는 상이한 환경적 또는 생리학적 조건에 반응하여 유전자의 발현을 지시할 수 있음이 당업자에 의해 이해된다. 대부분의 시간에 대부분의 세포 유형에서 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 일반적으로 "구성적 프로모터"로서 지칭된다. 특정 세포 유형에서 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 일반적으로 "세포-특이적 프로모터" 또는 "조직-특이적 프로모터"로서 지칭된다. 발달 또는 세포 분화의 특정 스테이지에서 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 일반적으로 "발달적으로-특이적 프로모터" 또는 "세포 분화-특이적 프로모터"로서 지칭된다. 프로모터를 유도하는 제제, 생물학적 분자, 화학물질, 리간드, 광, 또는 기타 등등으로 세포를 노출 또는 처리한 후 유도되고 유전자가 발현되도록 하는 프로모터는 일반적으로 "유도성 프로모터" 또는 "조절가능한 프로모터"로서 지칭된다. 대부분의 경우에 조절 서열의 정확한 경계가 완전히 정의되지 않았으므로, 상이한 길이의 DNA 단편이 동일한 프로모터 활성을 가질 수 있음이 추가로 인식된다.
프로모터 서열은 전사 개시 부위에 의해 이의 3' 말단에서 전형적으로 결합되고 업스트림 (5' 방향) 연장하여 배경 위 검출가능한 수준에서 전사를 개시하는데 필요한 염기 또는 요소의 최소 수를 포함한다. 프로모터 서열 내에서 (예를 들어, 뉴클레아제 S1과의 맵핑에 의해 편리하게 정의된) 전사 개시 부위, 뿐만 아니라 RNA 폴리머라제의 결합을 담당하는 단백질 결합 도메인 (공통 서열)이 발견될 것이다. 일부 양태에서, 본 개시내용과 사용될 수 있는 프로모터는 조직 특이적 프로모터를 포함한다.
본원에 사용된 경우에, "예방성"은 질환 또는 병태의 발병을 예방하기 위해, 또는 질환 또는 병태와 연관된 증상을 예방 또는 지연시키기 위해 사용된 치료적 또는 작용 과정을 지칭한다.
본원에 사용된 경우에, "예방"은 건강을 유지하고 질환 또는 병태의 발병을 예방하기 위해, 질환 또는 병태와 연관된 증상을 예방 또는 지연시키기 위해 취해진 조치를 지칭한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "유전자 조절 영역" 또는 "조절 영역"은 코딩 영역의 업스트림 (5' 비-코딩 서열), 이내에, 다운스트림 (3' 비-코딩 서열) 위치된 뉴클레오티드 서열을 지칭하고, 이는 연관된 코딩 영역의 전사, RNA 처리, 안정성, 또는 번역에 영향을 미친다. 조절 영역은 프로모터, 번역 리더 서열, 인트론, 폴리아데닐화 인식 서열, RNA 처리 부위, 효과기 결합 부위, 또는 스템-루프 구조를 포함할 수 있다. 코딩 영역이 진핵 세포에서 발현을 위하여 의도되면, 폴리아데닐화 신호 및 전사 종결 서열은 보통 코딩 서열에 대해 3' 위치될 것이다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제 (예를 들면, 하나 이상의 miR-485 결합 부위를 포함하는 RNA를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드)는 하나 이상의 코딩 영역과 작동가능하게 연관된 프로모터 및/또는 기타 발현 (예를 들면, 전사) 대조군 요소를 포함할 수 있다. 작동가능한 연관에서 유전자 산물을 위한 코딩 영역은 유전자 산물의 발현을 조절 영역(들)의 영향 또는 제어 하에 배치하는 방식으로 하나 이상의 조절 영역과 연관된다. 예를 들어, 코딩 영역 및 프로모터는 프로모터 기능의 유도가 코딩 영역에 의해 인코딩된 유전자 산물을 인코딩하는 mRNA의 전사를 초래하면, 그리고 프로모터와 코딩 영역 사이 연결의 성격이 유전자 산물의 발현을 지시하는 프로모터의 능력을 방해하지 않거나 전사될 DNA 템플레이트의 능력을 방해하지 않으면 "작동가능하게 연관된"다. 프로모터 외에, 다른 발현 제어 요소, 예를 들어 인핸서, 오퍼레이터, 리프레서, 및 전사 종결 신호는 유전자 산물 발현을 지시하기 위해 코딩 영역과 작동가능하게 또한 연관될 수 있다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "유사성"은 중합체성 분자 사이, 예를 들면 폴리뉴클레오티드 분자 (예를 들면 miRNA 분자) 사이 전반적 관련성을 지칭한다. 서로에 대한 중합체성 분자의 퍼센트 유사성의 계산은, 퍼센트 유사성의 계산이 당업계에서 이해되는 대로 보존적 치환을 고려하는 것을 제외하고, 퍼센트 동일성의 계산과 동일한 방식으로 수행될 수 있다. 유사성의 백분율이 사용된 비교 척도, 즉, 예를 들면, 그들의 진화적 근접성, 전하, 부피, 유연성, 극성, 소수성, 방향성, 등전점, 항원성, 또는 이들의 조합에 따라 핵산이 비교되는 여부에 의존적임이 이해된다.
용어 "대상체", "환자", "개체", 및 "숙주", 및 이들의 이형은 본원에 교환가능하게 사용되고 제한 없이, 인간, 가정 동물 (예를 들면, 개, 고양이 및 기타 등등), 농장 동물 (예를 들면, 소, 양, 돼지, 말 및 기타 등등), 및 진단, 치료, 또는 요법이 요구되는 실험실 동물 (예를 들면, 원숭이, 랫트, 마우스, 토끼, 기니 피그 및 기타 등등)을 포함하는 임의의 포유류 대상체, 특히 인간을 지칭한다. 본원에 기재된 방법은 양쪽 인간 요법 및 수의학적 응용에 적용가능하다.
본원에 사용된 경우에, 어구 "치료를 필요로 하는 대상체"는, 예를 들면, SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 발현 수준을 증가시키기 위해 본 개시내용의 miRNA 억제제 (예를 들면, miR-485 억제제)의 투여로부터 이익을 얻을 대상체, 예컨대 포유류 대상체를 포함한다.
본원에 사용된 경우에, 용어 "치료적으로 유효량"은 치료를 필요로 하는 대상체에서 원하는 치료적 효과, 약리학적 및/또는 생리학적 효과를 생산하는데 충분한 본 개시내용의 miRNA 억제제를 포함하는 시약 또는 약학적 화합물의 양이다. 치료적으로 유효량은 예방이 요법으로 간주될 수 있기 때문에 "예방성으로 유효량"일 수 있다.
용어 "치료하다", "치료", 또는 "치료하기"는, 본원에 사용된 경우에, 예를 들면, 질환 또는 병태의 중증도에서의 감소; 질환 과정의 지속기간에서의 감소; 질환 또는 병태 (예를 들면, 당뇨병)와 연관된 하나 이상의 증상의 호전 또는 제거; 질환 또는 병태를 반드시 치유하지 않고, 질환 또는 병태를 가진 대상체에게 유익한 효과의 제공을 지칭한다. 본 용어는 또한 이들의 질환 또는 병태 또는 이들의 증상의 예방 또는 방지를 포함한다.
용어 "업스트림"은 참조 뉴클레오티드 서열에 대해 5' 위치되는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다.
"벡터"는 숙주 세포에 핵산의 클로닝 및/또는 전달을 위한 임의의 비히클을 지칭한다. 벡터는 또 다른 핵산 세그먼트가 부착된 세그먼트의 복제를 일으키기 위해 부착될 수 있는 레플리콘일 수 있다. "레플리콘"은 생체내 자율 복제 단위체로서 기능하는, 즉, 이의 자체 제어 하에서 복제할 수 있는 임의의 유전적 요소 (예를 들면, 플라스미드, 파지, 코스미드, 염색체, 바이러스)를 지칭한다. 용어 "벡터"는 시험관내, 생체외 또는 생체내 세포에 핵산을 도입하기 위하여 양쪽 바이러스성 및 비바이러스성 비히클을 포함한다. 예를 들어, 플라스미드, 변형된 진핵 바이러스, 또는 변형된 박테리아성 바이러스를 포함하는 다수의 벡터는 알려지고 당업계에서 사용된다. 적합한 벡터에 폴리뉴클레오티드의 삽입은 상보적 응집 말단을 갖는 선정된 벡터에 적절한 폴리뉴클레오티드 단편을 결찰시킴으로써 성취될 수 있다.
벡터는 벡터를 편입한 세포의 선택 또는 식별을 제공하는 선택가능한 마커 또는 리포터를 인코딩하도록 조작될 수 있다. 선택가능한 마커 또는 리포터의 발현은 벡터에서 함유된 기타 코딩 영역을 편입 및 발현시키는 숙주 세포의 식별 및/또는 선택을 허용한다. 당업계에서 알려지고 사용된 선택가능한 마커 유전자의 예는 암피실린, 스트렙토마이신, 겐타마이신, 카나마이신, 하이그로마이신, 바이알라포스 제초제, 술폰아미드, 및 기타 등등에 내성을 제공하는 유전자; 및 표현형 마커로서 사용되는 유전자, 즉, 안토시아닌 조절 유전자, 이소펜타닐 트랜스퍼라제 유전자, 및 기타 등등을 포함한다. 당업계에서 알려지고 사용된 리포터의 예는 루시퍼라제 (Luc), 녹색 형광성 단백질 (GFP), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제 (CAT), β-갈락토시다제 (LacZ), β-글루쿠로니다제 (Gus), 및 기타 등등을 포함한다. 선택가능한 마커는 리포터인 것으로 또한 간주될 수 있다.
II. 사용 방법
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 하나 이상의 유전자의 발현 및/또는 활성을 조절함으로써 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는 대상체에서) 치료적 효과를 발휘할 수 있다. 본원에 기재된 경우에, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 SIRT1, CD36, PGC1, LRRK2, NRG1, STMN2, VLDLR, NRXN1, GRIA4, NXPH1, DLG4 (본원에 "PSD-95 유전자"로서 또한 지칭됨), SYP (본원에 "시냅토파이신 유전자"로서 또한 지칭됨), CASP3 (본원에 "카스파제-3 유전자"로서 또한 지칭됨), 또는 이들의 조합으로부터 선택된 유전자의 발현 및/또는 활성을 조절할 수 있다. 어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, 그러한 조절을 통해서, miR-485 억제제는, 비제한적으로, 세포 항상성 (예를 들면, CD36, SIRT1, PGC1α), 단백질 항상성 (예를 들면, LRRK2 및 SIRT1), 자가포식-리소좀성 경로와 연관된 것들 (예를 들면, SIRT1 및 CD36), 식세포작용 (예를 들면, CD36), 아교 생물학 (예를 들면, CD36 및 SIRT1), 신경발생/시냅스생성 (예를 들면, SIRT1, PGC1α, STMN2, 및 NRG1) 신경염증 (예를 들면, CD36 및 SIRT1), 미토콘드리아와 연관된 것들 (예를 들면, PGC1α), 및 이들의 조합 (예를 들면, SIRT1 및 PGC1α)을 포함하는, 많은 생물학적 공정에 영향을 줄 수 있다.
SIRT1 조절
일부 양태에서, 본 개시내용은 miR-485 활성을 억제시키는 화합물 (즉, miR-485 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자 발현의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, miR-485 활성 억제하기는 대상체에서 SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 발현을 증가시킨다.
NAD-의존적 데아세틸라제 시르투인-1로서 또한 알려진, 시르투인 1 (SIRT1)은 인간에서 SIRT1 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. SIRT1 유전자는 인간에서 염색체 10에 위치된다 (GenBank 수탁 번호 NC_000010.11의 뉴클레오티드 67,884,656 내지 67,918,390, 더하기 가닥 배향). SIRT1 유전자, 및 이의 인코딩된 단백질의 동의어는 알려지고 "조절 단백질 SIR2 동족체 1", "침묵 교배-유형 정보 조절 2 동족체 1", "SIR2", "SIR2-유사 단백질 1", "SIR2L1", "SIR2알파", "시르투인 유형 1", "hSIRT1", 또는 "hSIR2"를 포함한다.
대안적 스플라이싱에서 비롯하는, 인간 SIRT1 단백질의 적어도 2개 알려진 아이소폼이 있다. SIRT1 아이소폼 1 (UniProt 식별자: Q96EB6-1)은 747개 아미노산으로 이루어지고 정규 서열 (서열번호: 31)로서 선정되었다. SIRT1 아이소폼 2 ("델타-엑손8로서 또한 알려짐) (UniProt 식별자: Q96EB6-2)는 561개 아미노산으로 이루어지고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: 454-639: 누락 (서열번호: 32). 하기 표 1은 2개 SIRT1 아이소폼에 대하여 서열을 제공한다.
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본원에 사용된 경우에, 용어 "SIRT1" (이의 동의어 포함)은 세포에 의해 자연적으로 발현되는 SIRT1의 임의의 변이체 또는 아이소폼을 포함한다. 따라서, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 SIRT1 아이소폼 1의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 SIRT1 아이소폼 2의 발현을 증가시킬 수 있다. 추가 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 양쪽 SIRT1 아이소폼 1 및 아이소폼 2의 발현을 증가시킬 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, 양쪽 아이소폼 1 및 아이소폼 2는 본원에 "SIRT1"로서 집합적으로 지칭된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 상응하는 대상체에서 SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 발현)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 또는 적어도 약 300% 만큼 SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 발현을 증가시킨다.
어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 miR-485, 예를 들면, miR-485-3p의 발현 및/또는 활성을 감소시킴으로써 SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 발현을 증가시킨다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 miR-485-3p의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 상응하는 대상체에서 miR-485-3p 발현)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100% 만큼 miR-485-3p의 발현 및/또는 활성을 감소시킨다. 특정 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 상응하는 대상체에서 miR-485-5p 발현)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100% 만큼 miR-485-5p의 발현 및/또는 활성을 감소시킨다. 추가 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 상응하는 대상체에서 miR-485-3p 및 miR-485-5p 발현)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 약 100% 만큼 양쪽 miR-485-3p 및 miR-485-5p의 발현 및/또는 활성을 감소시킨다. 일부 양태에서, miR-485-3p 및/또는 miR-485-5p의 발현은 miR-485 억제제의 투여 후 완전히 억제된다.
본원에 기재된 경우에, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 대상체에게 투여된 경우 SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 발현을 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 본 개시내용은 SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 치료 방법을 제공한다. 특정 양태에서, 본 방법은 miR-485 활성을 억제시키는 화합물 (즉, miR-485 억제제)를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하고, 여기서 miR-485 억제제는 SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 수준을 증가시킨다.
CD36 조절
본원에 기재된 경우에, 출원인은 인간 CD36 3'-UTR이 miR-485-3p를 위한 표적 부위를 포함하는 것 그리고 miR-485-3p의 결합이 CD36 발현을 감소시킬 수 있다는 것을 확인하였다 (예를 들면, 실시예 7 및 8, 참조). 따라서, 일부 양태에서, 본 개시내용은 miR-485 활성을 억제시키는 화합물 (즉, miR-485 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, CD36 단백질 및/또는 CD36 유전자 발현의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, miR-485 활성 억제하기는 대상체에서 CD36 단백질 및/또는 CD36 유전자의 발현을 증가시킨다.
클러스터 결정인자 36 (CD36)은 혈소판 당단백질 4로서 또한 알려지고, 인간에서 CD36 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. CD36 유전자는 염색체 7 (GenBank 수탁 번호 NC_000007.14의 뉴클레오티드 80,602,656 내지 80,679,277, 더하기 가닥 배향)에 위치된다. CD36 유전자, 및 이의 인코딩된 단백질의 동의어는 알려지고 "혈소판 당단백질 IV", "지방산 트랜스로카제", "스캐빈저 수용체 클래스 B 구성원 3", "당단백질 88", "당단백질 IIIb", "당단백질 IV", "트롬보스폰딘 수용체", "GPIIIB", "PAS IV", "GP3B", "GPIV", "FAT", "GP4", "BDPLT10", "SCARB3", "CHDS7", "PASIV", 또는 "PAS-4"를 포함한다.
대안적 스플라이싱에서 비롯하는, 인간 CD36 단백질의 적어도 4개 알려진 아이소폼이 있다. CD36 아이소폼 1 (UniProt 식별자: P16671-1)은 472개 아미노산으로 이루어지고 정규 서열 (서열번호: 36)로서 선정되었다. CD36 아이소폼 2 ("ex8-del"로서 또한 알려짐) (UniProt 식별자: P16671-2)는 288개 아미노산으로 이루어지고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: 274-288: SIYAVFESDVNLKGI　→　ETCVHFTSSFSVCKS; 및 289-472: 누락 (서열번호: 37). CD36 아이소폼 3 ("ex6-7-del"로서 또한 알려짐) (UniProt 식별자: P16671-3)은 433개 아미노산으로 이루어지고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: 234-272: 누락 (서열번호: 38). CD36 아이소폼 4 ("ex4-del"로서 또한 알려짐 (UniProt 식별자: P16671-4)는 412개 아미노산으로 이루어지고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: 144-203: 누락 (서열번호: 39). 하기 표 2는 4개 CD36 아이소폼에 대하여 서열을 제공한다.
Figure pct00008
본원에 사용된 경우에, 용어 "CD36" (이의 동의어 포함)은 세포에 의해 자연적으로 발현되는 CD36의 임의의 변이체 또는 아이소폼을 포함한다. 따라서, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 CD36 아이소폼 1의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 CD36 아이소폼 2의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 CD36 아이소폼 3의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 CD36 아이소폼 4의 발현을 증가시킬 수 있다. 추가 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 양쪽 CD36 아이소폼 1 및 아이소폼 2, 및/또는 아이소폼 3 및 아이소폼 4, 및/또는 아이소폼 1 및 아이소폼 4, 및/또는 아이소폼 2 및 아이소폼 3의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 모든 CD36 아이소폼의 발현을 증가시킬 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, 아이소폼 1, 아이소폼 2, 아이소폼 3, 및 아이소폼 4는 본원에 "CD36"으로서 집합적으로 지칭된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 상응하는 대상체에서 CD36 단백질 및/또는 CD36 유전자의 발현)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 또는 적어도 약 300% 만큼 CD36 단백질 및/또는 CD36 유전자의 발현을 증가시킨다.
어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 miR-485의 발현 및/또는 활성을 감소시킴으로써 CD36 단백질 및/또는 CD36 유전자의 발현을 증가시킨다. miR-485의 2개 알려진 성숙한 형태: miR-485-3p 및 miR-485-5p가 있다. 본원에 개시된 경우에, 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 miR-485-3p의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 miR-485-5p의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있다. 추가 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 양쪽 miR-485-3p 및 miR-485-5p의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있다.
PGC1 조절
본원에 제공된 본 개시내용은 본 개시내용의 miR-485 억제제가, 예를 들면, 본원에 개시된 질환 또는 장애를 앓는 대상체에서 PGC-1α의 발현을 추가로 조절할 수 있음을 입증한다 (예를 들면, 실시예 3, 참조). 그러므로, 일부 양태에서, 본 개시내용은 miR-485 활성을 억제시키는 화합물 (즉, miR-485 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, PGC-1α 단백질 및/또는 PGC-1α 유전자 발현의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, miR-485 활성 억제하기는 대상체에서 PGC-1α 단백질 및/또는 PGC-1α 유전자의 발현을 증가시킨다.
PPARG 보조활성자 1 알파 또는 리간드 효과 조절자-6으로서 또한 알려진, 퍼옥시좀 증식자-활성화된 수용체 감마 보조활성자 1-알파 (PGC1-α)는 인간에서 PPARGC1A 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. PGC1-α 유전자는 인간에서 염색체 4 (GenBank 수탁 번호 NC_000004.12의 뉴클레오티드 23,792,021 내지 24,472,905, 더하기 가닥 배향)에 위치된다. PGC1-α 유전자, 및 이의 인코딩된 단백질의 동의어는 알려지고 "PPARGC1A", "LEM6", "PGC1", "PGC1A", "PGC-1v", "PPARGC1, "PGC1알파", 또는 "PGC-1(알파)"을 포함한다.
대안적 스플라이싱에서 비롯하는, 인간 PGC1-α 단백질의 적어도 9개 알려진 아이소폼이 있다. PGC1-α 아이소폼 1 (UniProt 식별자: Q9UBK2-1)은 798개 아미노산으로 이루어지고 정규 서열 (서열번호: 40)로서 선정되었다. PGC1-α 아이소폼 2 ("아이소폼 NT-7a"로서 또한 알려짐) (UniProt 식별자: Q9UBK2-2)는 271개 아미노산으로 이루어지고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: 269-271: DPK → LFL; 272-798: 누락 (서열번호: 41). PGC1-α 아이소폼 3 ("아이소폼 B5"로서 또한 알려짐) (UniProt 식별자: Q9UBK2-3)은 803개 아미노산으로 이루어지고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: 1-18: MAWDMCNQDSESVWSDIE → MDETSPRLEEDWKKVLQREAGWQ (서열번호: 42). PGC1-α 아이소폼 4 ("아이소폼 B4"로서 또한 알려짐) (UniProt 식별자: Q9UBK2-4)는 786개 아미노산으로 이루어지고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: 1-18: MAWDMCNQDSESVWSDIE → MDEGYF (서열번호: 43). PGC1-α 아이소폼 5 ("아이소폼 B4-8a"로서 또한 알려짐) (UniProt 식별자: Q9UBK2-5)는 289개 아미노산으로 이루어지고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: 1-18: MAWDMCNQDSESVWSDIE → MDEGYF; 294-301: LTPPTTPP → VKTNLISK; 302-798: 누락 (서열번호: 44). PGC1-α 아이소폼 6 ("아이소폼 B5-NT"로서 또한 알려짐) (UniProt 식별자: Q9UBK2-6)은 276개 아미노산으로 이루어지고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: 1-18: MAWDMCNQDSESVWSDIE → MDETSPRLEEDWKKVLQREAGWQ; 269-271: DPK → LFL; 272-798: 누락 (서열번호: 45). PGC1-α 아이소폼 7 ("B4-3ext"로서 또한 알려짐) (UniProt 식별자: Q9UBK2-7)은 138개 아미노산으로 이루어지고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: 1-18: MAWDMCNQDSESVWSDIE → MDEGYF; 144-150: LKKLLLA → VRTLPTV; 151-798: 누락 (서열번호: 46). PGC1-α 아이소폼 8 ("아이소폼 8a"로서 또한 알려짐) (UniProt 식별자: Q9UBK2-8)은 301개 아미노산으로 이루어지고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: 294-301: LTPPTTPP → VKTNLISK; 302-798: 누락 (서열번호: 47). PGC1-α 아이소폼 9 ("아이소폼 9" 또는 "L-PGG-1알파"로서 또한 알려짐) (UniProt 식별자: Q9UBK2-9)는 671개 아미노산으로 이루어지고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: 1-127: 누락 (서열번호: 48). 하기 표 3은 9개 PGC1-α 아이소폼에 대하여 서열을 제공한다.
Figure pct00009
Figure pct00010
본원에 사용된 경우에, 용어 "PGC1-α" (이의 동의어 포함)는 세포에 의해 자연적으로 발현되는 PGC1-α의 임의의 변이체 또는 아이소폼을 포함한다. 따라서, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 PGC1-α 아이소폼 1의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 PGC1-α 아이소폼 2의 발현을 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 PGC1-α 아이소폼 1의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 PGC1-α 아이소폼 2의 발현을 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 PGC1-α 아이소폼 3의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 PGC1-α 아이소폼 4의 발현을 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 PGC1-α 아이소폼 5의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 PGC1-α 아이소폼 6의 발현을 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 PGC1-α 아이소폼 7의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 PGC1-α 아이소폼 8의 발현을 증가시킬 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 PGC1-α 아이소폼 9의 발현을 증가시킬 수 있다. 추가 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 PGC1-α 아이소폼 1, 아이소폼 2, 아이소폼 3, 아이소폼 4, 아이소폼 5, 아이소폼 6, 아이소폼 7, 아이소폼 8, 및 아이소폼 9의 발현을 증가시킬 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, 양쪽 아이소폼 1 및 아이소폼 2는 본원에 "PGC1-α"로서 집합적으로 지칭된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 상응하는 대상체에서 PGC1-α 단백질 및/또는 PGC1-α 유전자의 발현)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 또는 적어도 약 300% 만큼 PGC1-α 단백질 및/또는 PGC1-α 유전자의 발현을 증가시킨다.
어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 miR-485의 발현 및/또는 활성을 감소시킴으로써 PGC1-α 단백질 및/또는 PGC1-α 유전자의 발현을 증가시킨다. miR-485의 2개 알려진 성숙한 형태: miR-485-3p 및 miR-485-5p가 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 miR-485-3p의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 miR-485-5p의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있다. 추가 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 양쪽 miR-485-3p 및 miR-485-5p의 발현 및/또는 활성을 감소시킬 수 있다.
LRRK2 조절
일부 양태에서, 본원에 제공된 본 개시내용은 본 개시내용의 miR-485 억제제가, 예를 들면, 본원에 개시된 질환 또는 장애 (예를 들면, 파킨슨병)를 앓고 있는 대상체에서 LRRK2의 발현을 조절할 수 있음을 입증한다. 그러므로, 일부 양태에서, 본 개시내용은 miR-485 활성을 억제시키는 화합물 (즉, miR-485 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, LRRK2 단백질 및/또는 LRRK2 유전자 발현의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, miR-485 활성 억제하기는 대상체에서 LRRK2 단백질 및/또는 LRRK2 유전자의 발현을 증가시킨다.
류신-풍부 반복부 키나제 2 (LRRK2)는 인간에서 LRRK2 유전자에 의해 인코딩되는 키나제 효소이다. LRRK2 유전자는 인간에서 염색체 12 (GenBank 수탁 번호 NC_000012.12의 뉴클레오티드 40,224,890 내지 40,369,285, 더하기 가닥 배향)에 위치된다. LRRK2 유전자, 및 이의 인코딩된 단백질의 동의어는 알려지고 PARK8, RIPK7, ROCO2, AURA17, 및 DARDARIN을 포함한다.
하기 표 4는 LRRK2 단백질에 대하여 아미노산 서열을 제공한다.
Figure pct00011
본원에 사용된 경우에, 용어 "LRRK2" (이의 동의어 포함)는 세포에 의해 자연적으로 발현되는 LRRK2의 임의의 변이체 또는 아이소폼을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 상응하는 대상체에서 LRRK2 단백질 및/또는 LRRK2 유전자의 발현)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 또는 적어도 약 300% 만큼 LRRK2 단백질 및/또는 LRRK2 유전자의 발현을 증가시킨다.
어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 miR-485, 예를 들면, miR-485-3p의 발현 및/또는 활성을 감소시킴으로써 LRRK2 단백질 및/또는 LRRK2 유전자의 발현을 증가시킨다.
NRG1 조절
본원에 제공된 본 개시내용은 본 개시내용의 miR-485 억제제가, 예를 들면, 본원에 개시된 질환 또는 장애 (예를 들면, 파킨슨병, 참조)를 앓는 대상체에서 NRG1의 발현을 추가로 조절할 수 있음을 입증한다. 그러므로, 일부 양태에서, 본 개시내용은 miR-485 활성을 억제시키는 화합물 (즉, miR-485 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, NRG1 단백질 및/또는 NRG1 유전자 발현의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, miR-485 활성 억제하기는 대상체에서 NRG1 단백질 및/또는 NRG1 유전자의 발현을 증가시킨다.
뉴레귤린 1은 인간에서 NRG1 유전자에 의해 인코딩되는 세포 접착 분자이다. NRG1은 수용체의 EGFR 계열에서 작용하는 뉴레귤린 계열의 4개 단백질 중 하나이다. NRG1 유전자는 인간에서 염색체 8 (GenBank 수탁 번호 NC_000008.11의 뉴클레오티드 31,639,245 내지 32,774,046)에 위치된다. NRG1 유전자, 및 이의 인코딩된 단백질의 동의어는 알려지고 "GGF", "HGL", "HRG", "NDF", "ARIA", "GGF2", "HRG1", "HRGA", "SMDF", "MST131", "MSTP131", 및 "NRG1-IT2"를 포함한다.
대안적 스플라이싱에서 비롯하는, 인간 NRG1 단백질의 적어도 11개 알려진 아이소폼이 있다. NRG1 아이소폼 1 ("알파"로서 또한 알려짐) (UniProt 식별자: Q02297-1)은 길이가 640개 아미노산이고 정규 서열 (서열번호: 91)로서 선정되었다. NRG1 아이소폼 2 ("알파1A"로서 또한 알려짐) (UniProt 식별자: Q02297-2)는 648개 아미노산 길이이고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: 234-234: K　→　KHLGIEFIE (서열번호: 92). NRG1 아이소폼 3 ("알파2B"로서 또한 알려짐) (UniProt 식별자: Q02297-3) 은 462개 아미노산 길이이고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: (i) 424-462: YVSAMTTPAR...SPPVSSMTVS　→　HNLIAELRRN...SSIPHLGFIL; 및 (ii) 463-640: 누락 (서열번호: 93). NRG1 아이소폼 4 ("알파3"으로서 또한 알려짐) (UniProt 식별자: Q02297-4)는 247개 아미노산으로 이루어지고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: (i) 234-247: KAEELYQKRVLTIT　→　SAQMSLLVIAAKTT; 및 (ii) 248-260: 누락 (서열번호: 94). NRG1 아이소폼 6 ("베타1" 및 "베타1A"로서 또한 알려짐) (UniProt 식별자: Q02297-6)은 길이가 645개 아미노산이고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: 213-234: QPGFTGARCTENVPMKVQNQEK　→　PNEFTGDRCQNYVMASFYKHLGIEFME (서열번호: 95). NRG1 아이소폼 7 ("베타2"로서 또한 알려짐) (UniProt 식별자: Q02297-7)은 647개 아미노산으로 이루어지고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: 213-233: QPGFTGARCTENVPMKVQNQE　→　PNEFTGDRCQNYVMASFY (서열번호: 96). NRG1 아이소폼 8 ("베타3" 및 "GGFHFB1"로서 또한 알려짐) (UniProt 식별자: Q02297-8)은 241개 아미노산으로 구성되고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: (i) 213-241: QPGFTGARCTENVPMKVQNQEKAEELYQK　→　PNEFTGDRCQNYVMASFYSTSTPFLSLPE; 및 (ii) 242-640: 누락 (서열번호: 97). NRG1 아이소폼 9 ("GGF2" 및 "GGFHPP2"로서 또한 알려짐) (UniProt 식별자: Q02297-9)는 길이가 422개 아미노산이고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: (i) 1-33: MSERKEGRGKGKGKKKERGSGKKPESAAGSQSP　→　MRWRRAPRRS...EVSRVLCKRC; (2) 134-168: EIITGMPASTEGAYVSSESPIRISVSTEGANTSSS　→　A; (3) 213-241: QPGFTGARCTENVPMKVQNQEKAEELYQK　→　PNEFTGDRCQNYVMASFYSTSTPFLSLPE; 및 (iv) 242-640: 누락 (서열번호: 98). NRG1 아이소폼 10 ("SMDF"로서 또한 알려짐) (UniProt 식별자: Q02297-10)은 296개 아미노산 길이이고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: (i) 1-166: 누락; (ii) 167-167: S　→　MEIYSPDMSE...ETNLQTAPKL; (iii) 213-241: QPGFTGARCTENVPMKVQNQEKAEELYQK　→　PNEFTGDRCQNYVMASFYSTSTPFLSLPE; 및 (iv) 242-640: 누락 (서열번호: 99). NRG1 아이소폼 11 ("유형 IV-베타1a"로서 또한 알려짐) (UniProt 식별자: Q02297-11)은 590개 아미노산 길이이고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: (i) 1-21: 누락; (ii) 22-33: KKPESAAGSQSP　→　MGKGRAGRVGTT; (iii) 134-168: EIITGMPASTEGAYVSSESPIRISVSTEGANTSSS　→　A; 및 (iv) 213-234: QPGFTGARCTENVPMKVQNQEK　→　PNEFTGDRCQNYVMASFYKHLGIEFME (서열번호: 100). NRG1 아이소폼 12 (UniProt 식별자: Q02297-12)는 420개 아미노산으로 이루어지고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: (i) 213-233: QPGFTGARCTENVPMKVQNQE　→　PNEFTGDRCQNYVMASFY; 및 (ii) 424-640: 누락 (서열번호: 101).
하기 표 5는 알려진 아이소폼을 포함하는 NRG1 단백질에 대하여 아미노산 서열을 제공한다.
Figure pct00012
Figure pct00013
본원에 사용된 경우에, 용어 "NRG1" (이의 동의어 포함)은 세포에 의해 자연적으로 발현되는 NRG1의 임의의 변이체 또는 아이소폼을 포함한다. 따라서, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 NRG1 아이소폼 1 (즉, 정규 서열)의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 NRG1 아이소폼 2의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 NRG1 아이소폼 3의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 NRG1 아이소폼 4의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 NRG1 아이소폼 6의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 NRG1 아이소폼 7의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 NRG1 아이소폼 8의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 NRG1 아이소폼 9의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 NRG1 아이소폼 10의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 NRG1 아이소폼 11의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 NRG1 아이소폼 12의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 NRG1 아이소폼 1, NRG1 아이소폼 2, NRG1 아이소폼 3, NRG1 아이소폼 4, NRG1 아이소폼 6, NRG1 아이소폼 7, NRG1 아이소폼 8, NRG1 아이소폼 9, NRG1 아이소폼 10, NRG1 아이소폼 11, 및 NRG1 아이소폼 12의 발현을 증가시킬 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, NRG1의 상기-기재된 아이소폼은 본원에 "NRG1"로서 집합적으로 지칭된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 상응하는 대상체에서 NRG1 단백질 및/또는 NRG1 유전자의 발현)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 또는 적어도 약 300% 만큼 NRG1 단백질 및/또는 NRG1 유전자의 발현을 증가시킨다.
어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 miR-485, 예를 들면, miR-485-3p의 발현 및/또는 활성을 감소시킴으로써 NRG1 단백질 및/또는 NRG1 유전자의 발현을 증가시킨다.
STMN2 조절
본원에 제공된 본 개시내용은 본 개시내용의 miR-485 억제제가, 예를 들면, 본원에 개시된 질환 또는 장애 (예를 들면, 파킨슨병, 참조)를 앓는 대상체에서 STMN2의 발현을 추가로 조절할 수 있음을 입증한다. 그러므로, 일부 양태에서, 본 개시내용은 miR-485 활성을 억제시키는 화합물 (즉, miR-485 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, STMN2 단백질 및/또는 STMN2 유전자 발현의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, miR-485 활성 억제하기는 대상체에서 STMN2 단백질 및/또는 STMN2 유전자의 발현을 증가시킨다.
스타스민-2는 인단백질의 스타스민 계열의 구성원이고 인간에서 STMN2 유전자에 의해 인코딩된다. 스타스민 단백질은 미세소관 역학 및 신호 전달에서 기능한다. 인코딩된 단백질은 뉴런성 성장에서 조절 역할을 하고 골형성에 관여되는 것으로 또한 생각된다. STMN2 유전자는 인간에서 염색체 8 (NC_000008.11의 뉴클레오티드 79,611,117 내지 79, 666,162)에 위치된다. STMN2 유전자, 및 이의 인코딩된 단백질의 동의어는 알려지고 "SCG10" 및 "SCGN10"을 포함한다.
대안적 스플라이싱에서 비롯하는, 인간 STMN2 단백질의 적어도 2개 알려진 아이소폼이 있다. STMN2 아이소폼 1 (UniProt 식별자: Q93045-1)은 길이가 179개 아미노산이고 정규 서열 (서열번호: 102)로서 선정되었다. STMN2 아이소폼 2 (UniProt 식별자: Q93045-2)는 길이가 187개 아미노산이고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: 161-179: ERHAAEVRRNKELQVELSG　→　LVKFISSELKESIESQFLELQREGEKQ (서열번호: 103).
하기 표 6은 STMN2 단백질에 대하여 아미노산 서열을 제공한다.
Figure pct00014
본원에 사용된 경우에, 용어 "STMN2" (이의 동의어 포함)는 세포에 의해 자연적으로 발현되는 STMN2의 임의의 변이체 또는 아이소폼을 포함한다. 따라서, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 STMN2 아이소폼 1 (즉, 정규 서열)의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 STMN2 아이소폼 2의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 STMN2 아이소폼 1 및 STMN2 아이소폼 2의 발현을 증가시킬 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, STMN2의 상기-기재된 아이소폼은 본원에 "STMN2"로서 집합적으로 지칭된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 상응하는 대상체에서 STMN2 단백질 및/또는 STMN2 유전자의 발현)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 또는 적어도 약 300% 만큼 STMN2 단백질 및/또는 STMN2 유전자의 발현을 증가시킨다.
어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 miR-485, 예를 들면, miR-485-3p의 발현 및/또는 활성을 감소시킴으로써 STMN2 단백질 및/또는 STMN2 유전자의 발현을 증가시킨다.
VLDLR 조절
본원에 제공된 본 개시내용은 본 개시내용의 miR-485 억제제가, 예를 들면, 본원에 개시된 질환 또는 장애 (예를 들면, 알츠하이머병, 참조)를 앓는 대상체에서 VLDLR의 발현을 추가로 조절할 수 있음을 입증한다. 그러므로, 일부 양태에서, 본 개시내용은 miR-485 활성을 억제시키는 화합물 (즉, miR-485 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, VLDLR 단백질 및/또는 VLDLR 유전자 발현의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, miR-485 활성 억제하기는 대상체에서 VLDLR 단백질 및/또는 VLDLR 유전자의 발현을 증가시킨다.
초저밀도-지단백질 수용체 (VLDLR)는 저밀도-지단백질 (LDL) 수용체 계열의 막횡단 지단백질 수용체이다. VLDLR은 많은 조직에서 발현되고, 발달 중인 뇌에서 뉴런성 이동을 포함하는, 다양한 생물학적 공정에서 중요한 역할을 한다. 인간에서, VLDLR은 VLDLR 유전자에 의해 인코딩되고, 이는 염색체 9 (NC_000009.12의 뉴클레오티드 2,621,786 내지 2,660,056)에 위치된다. VLDLR 유전자, 및 이의 인코딩된 단백질의 동의어는 알려지고 "CAMRQ1", "CARMQ1", "CHRMQ1", "VLDLRCH", 및 "VLDL-R"을 포함한다.
대안적 스플라이싱에서 비롯하는, 인간 VLDLR 단백질의 적어도 2개 알려진 아이소폼이 있다. 긴 VLDLR 아이소폼 (Uniprot 식별자: P98155-1)은 길이가 873개 아미노산이고 정규 서열 (서열번호: 111)로서 선정되었다. 짧은 VLDLR 아이소폼 (Uniprot 식별자: P98155-2)은 845개 아미노산 길이이고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: 751-779: STATTVTYSETKDTNTTEISATSGLVPGG　→　R. (서열번호: 112). 표 7 (하기)은 VLDLR 단백질에 대하여 아미노산 서열을 제공한다.
Figure pct00015
본원에 사용된 경우에, 용어 "VLDLR" (이의 동의어 포함)은 세포에 의해 자연적으로 발현되는 VLDLR의 임의의 변이체 또는 아이소폼을 포함한다. 따라서, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 긴 VLDLR 아이소폼 (즉, 정규 서열)의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 짧은 VLDLR 아이소폼의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 긴 VLDLR 아이소폼 및 짧은 VLDLR 아이소폼의 발현을 증가시킬 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, VLDLR의 상기-기재된 아이소폼은 본원에 "VLDLR"로서 집합적으로 지칭된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 상응하는 대상체에서 VLDLR 단백질 및/또는 VLDLR 유전자의 발현)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 또는 적어도 약 300% 만큼 VLDLR 단백질 및/또는 VLDLR 유전자의 발현을 증가시킨다.
어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 miR-485, 예를 들면, miR-485-3p의 발현 및/또는 활성을 감소시킴으로써 VLDLR 단백질 및/또는 VLDLR 유전자의 발현을 증가시킨다.
NRXN1 조절
본원에 제공된 본 개시내용은 본 개시내용의 miR-485 억제제가, 예를 들면, 본원에 개시된 질환 또는 장애 (예를 들면, 알츠하이머병, 참조)를 앓는 대상체에서 NRXN1의 발현을 추가로 조절할 수 있음을 입증한다. 그러므로, 일부 양태에서, 본 개시내용은 miR-485 활성을 억제시키는 화합물 (즉, miR-485 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, NRXN1 단백질 및/또는 NRXN1 유전자 발현의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, miR-485 활성 억제하기는 대상체에서 NRXN1 단백질 및/또는 NRXN1 유전자의 발현을 증가시킨다.
뉴렉신 1 (NRXN1)은 인간에서 NRXN1 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. NRXN1 유전자는 인간에서 염색체 2 (NC_000003.12의 뉴클레오티드 49,918,503 내지 51,032,536)에 위치된다. NRXN1 유전자, 및 이의 인코딩된 단백질의 동의어는 알려지고 "PTHSL2", "SCZD17", 및 "Hs.22998"을 포함한다.
대안적 프로모터 활용 및 대안적 스플라이싱에서 비롯하는, 인간 NRXN1 단백질의 적어도 6개 알려진 아이소폼이 있다. NRXN1 아이소폼 1a (UniProt 식별자: Q9ULB1-1)는 1,477개 아미노산으로 이루어지고 정규 서열 (서열번호: 104)로서 선정되었다. NRXN1 아이소폼 2a (UniProt 식별자: Q9ULB1-2)는 1,496개 아미노산으로 이루어지고 다음과 같이 아이소폼 1a 정규 서열과 상이하다:　379-386: 누락; 1239-1239: A　→　AGNNDNERLAIARQRIPYRLGRVVDEWLLDK; 1373-1375: 누락 (서열번호: 105). NRXN1 아이소폼 3a (UniProt 식별자: Q9ULB1-3)은 1,547개 아미노산으로 이루어지고 다음과 같이 아이소폼 1a 정규 서열과 상이하다:　258-258: →　EIKFGLQCVLPVLLHDNDQGKYCCINTAKPLTEK; 386-386: M　→　MVNKLHCS; 1239-1239: A　→　AGNNDNERLAIARQRIPYRLGRVVDEWLLDK (서열번호: 106). NRXN1-베타 아이소폼 4 (UniProt 식별자: Q9ULB1-4)는 139개 아미노산으로 이루어지고 다음과 같이 아이소폼 1a 정규 서열과 상이하다:　1-1335: 누락; 1336-1344: GKPPTKEPI　→　MDMRWHCEN; 1373-1375: 누락 (서열번호: 107). NRXN1 아이소폼 1b (UniProt 식별자: P58400-2)는 472개 아미노산으로 이루어지고 NRXN1-베타 (서열번호: 108)에 대하여 정규 서열로서 선정되었다. NRXN1-베타 아이소폼 3b (UniProt 식별자: P58400-1)는 442개 아미노산으로 이루어지고 다음과 같이 아이소폼 1b 정규 서열과 상이하다: 205-234: 누락 (서열번호: 109).
하기 표 8은 6개 NRXN1 아이소폼에 대하여 서열을 제공한다.
Figure pct00016
Figure pct00017
본원에 사용된 경우에, 용어 "NRXN1" (이의 동의어 포함)은 세포에 의해 자연적으로 발현되는 NRXN1 및 NRXN1-베타의 임의의 변이체 또는 아이소폼을 포함한다. 따라서, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 NRXN1 아이소폼 1a의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 NRXN1 아이소폼 2a의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 NRXN1 아이소폼 3a의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 NRXN1 아이소폼 4의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 NRXN1-베타 아이소폼 1b의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 NRXN1-베타 아이소폼 3b의 발현을 증가시킬 수 있다. 추가 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 NRXN1 아이소폼 1a, NRXN1-베타 아이소폼 1b, NRXN1 아이소폼, 2a, NRXN1 아이소폼 3a, NRXN1-베타 아이소폼 3b, 및 NRXN1 아이소폼 4 중 하나 이상의 발현을 증가시킬 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, NRXN1 아이소폼 1a, NRXN1-베타 아이소폼 1b, NRXN1 아이소폼, 2a, NRXN1 아이소폼 3a, NRXN1-베타 아이소폼 3b, 및 NRXN1 아이소폼 4는 본원에 "NRXN1"로서 집합적으로 지칭된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 상응하는 대상체에서 NRXN1 단백질 및/또는 NRXN1 유전자의 발현)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 또는 적어도 약 300% 만큼 NRXN1 단백질 및/또는 NRXN1 유전자의 발현을 증가시킨다.
어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 miR-485, 예를 들면, miR-485-3p의 발현 및/또는 활성을 감소시킴으로써 NRXN1 단백질 및/또는 NRXN1 유전자의 발현을 증가시킨다.
GRIA4 조절
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는, 예를 들면, 본원에 개시된 질환 또는 장애 (예를 들면, 알츠하이머병, 참조)를 앓는 대상체에서 GRIA4의 발현을 추가로 조절할 수 있다. 그러므로, 일부 양태에서, 본 개시내용은 miR-485 활성을 억제시키는 화합물 (즉, miR-485 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, GRIA4 단백질 및/또는 GRIA4 유전자 발현의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, miR-485 활성 억제하기는 대상체에서 GRIA4 단백질 및/또는 GRIA4 유전자의 발현을 증가시킨다.
글루타메이트 수용체 4 (GRIA4)는 신속한 시냅스 흥분성 신경전달을 매개하는 L-글루타메이트-개폐 이온 채널 계열의 한 구성원이다. 이들 채널은 글루타메이트 작용제, 알파-아미노-3-하이드록시-5-메틸-4-이속사졸프로피오네이트 (AMPA)에 또한 반응성이다. 인간에서, GRIA4는 GRIA4 유전자에 의해 인코딩되고, 이는 염색체 11 (NC_000011.10의 뉴클레오티드 105,609,540 내지 105,982,092)에 위치된다. GRIA4 유전자, 및 이의 인코딩된 단백질의 동의어는 알려지고 "GLUR4", "GLURD", "GluA4", "GLUR4C", "NEDSGA", 및 "글루타메이트 이오노트로픽 수용체 AMPA 유형 아단위체 4"를 포함한다.
대안적 스플라이싱에서 비롯하는, 인간 GRIA4의 적어도 2개 알려진 아이소폼이 있다. GRIA4 아이소폼 1 (UniProt 식별자: P48058-1)은 902개 아미노산으로 이루어지고 정규 서열 (서열번호: 113)로서 선정되었다. GRIA4 아이소폼 2 (UniProt 식별자: P48058-2)는 길이가 433개 아미노산이고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: (i) 424-433: ESPYVMYKKN　→　PLMKNPILRN; 및 (ii) 434-902: 누락 (서열번호: 114).
하기 표 9는 상이한 GRIA4 아이소폼에 대하여 서열을 제공한다.
Figure pct00018
본원에 사용된 경우에, 용어 "GRIA4" (이의 동의어 포함)는 세포에 의해 자연적으로 발현되는 GRIA4의 임의의 변이체 또는 아이소폼을 포함한다. 따라서, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 GRIA4 아이소폼 1 (즉, 정규 서열)의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 GRIA4 아이소폼 2의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 GRIA4 아이소폼 1 및 GRIA4 아이소폼 2의 발현을 증가시킬 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, GRIA4의 상기-기재된 아이소폼은 본원에 "GRIA4"로서 집합적으로 지칭된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 상응하는 대상체에서 GRIA4 단백질 및/또는 GRIA4 유전자의 발현)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 또는 적어도 약 300% 만큼 GRIA4 단백질 및/또는 GRIA4 유전자의 발현을 증가시킨다.
어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 miR-485, 예를 들면, miR-485-3p의 발현 및/또는 활성을 감소시킴으로써 GRIA4 단백질 및/또는 GRIA4 유전자의 발현을 증가시킨다.
NXPH1 조절
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는, 예를 들면, 본원에 개시된 질환 또는 장애 (예를 들면, 알츠하이머병, 참조)를 앓는 대상체에서 NXPH1의 발현을 추가로 조절할 수 있다. 그러므로, 일부 양태에서, 본 개시내용은 miR-485 활성을 억제시키는 화합물 (즉, miR-485 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, NXPH1 단백질 및/또는 NXPH1 유전자 발현의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, miR-485 활성 억제하기는 대상체에서 NXPH1 단백질 및/또는 NXPH1 유전자의 발현을 증가시킨다.
뉴렉소필린-1 (NXPH1)은 인간에서 NXPH1 유전자에 의해 인코딩되는 단백질이다. NXPH1 유전자는 뉴렉소필린 계열의 한 구성원이고 가변 N-말단 도메인, 고도로 보존된, N-글리코실화된 중심 도메인, 짧은 링커 영역, 및 시스테인-풍부 C-말단 도메인을 가진 분비된 단백질을 인코딩한다. 이 단백질은 수상돌기와 축삭돌기 사이 접착을 촉진시키는 단백질의 한 그룹인 알파 뉴렉신과 매우 단단한 복합체를 형성한다. 인간에서, NXPH1 유전자는 염색체 7 (NC_000007.14의 뉴클레오티드 8,433,609 내지 8,752,961)에 위치된다. NXPH1 유전자, 및 이의 인코딩된 단백질의 동의어는 알려지고 "NPH1" 및 "Nbla00697"을 포함한다.
하기 표 10은 NXPH1 단백질에 대하여 아미노산 서열을 제공한다.
Figure pct00019
본원에 사용된 경우에, 용어 "NXPH1" (이의 동의어 포함)은 세포에 의해 자연적으로 발현되는 NXPH1의 임의의 변이체 또는 아이소폼을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 상응하는 대상체에서 NXPH1 단백질 및/또는 NXPH1 유전자의 발현)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 또는 적어도 약 300% 만큼 NXPH1 단백질 및/또는 NXPH1 유전자의 발현을 증가시킨다.
어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 miR-485, 예를 들면, miR-485-3p의 발현 및/또는 활성을 감소시킴으로써 NXPH1 단백질 및/또는 NXPH1 유전자의 발현을 증가시킨다.
PSD-95 조절
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는, 예를 들면, 본원에 개시된 질환 또는 장애 (예를 들면, 알츠하이머병, 참조)를 앓는 대상체에서 PSD-95의 발현을 조절할 수 있다. 그러므로, 일부 양태에서, 본 개시내용은 miR-485 활성을 억제시키는 화합물 (즉, miR-485 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, PSD-95 단백질 및/또는 PSD-95 유전자 (즉, DLG4) 발현의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, miR-485 활성 억제하기는 대상체에서 PSD-95 단백질 및/또는 PSD-95 유전자의 발현을 증가시킨다.
시냅스-연관된 단백질 90 (SAP-90)으로서 또한 알려진, 포스트시냅스성 밀도 단백질 95 (PSD-95)는 인간에서 DLG4 (디스크 대형 동족체 4) 유전자 (본원에 "PSD-95 유전자"로서 또한 지칭됨)에 의해 인코딩되는 단백질이다. DLG4 유전자는 인간에서 염색체 17 (GenBank 수탁 번호 NC_000017.11의 뉴클레오티드 7,187,180-7,220,050, 빼기 가닥 배향)에 위치된다. DLG4 유전자, 및 이의 인코딩된 단백질의 동의어는 알려지고 "디스크 대형 MAGUK 스캐폴드 단백질 4", "MRD62", "PSD95", 및 "SAP90"을 포함한다.
대안적 스플라이싱에서 비롯하는, 인간 PSD-95 단백질의 적어도 3개 알려진 아이소폼이 있다. PSD-95 아이소폼 1 (PSD95-알파로서 또한 알려짐) (UniProt 식별자: P78352-1)은 724개 아미노산으로 이루어지고 정규 서열 (서열번호: 116)로서 선정되었다. PSD-95 아이소폼 2 (PSD95-베타로서 또한 알려짐) (UniProt 식별자: P78352-2)는 767개 아미노산으로 이루어지고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: 1-10: MDCLCIVTTK　→　MSQRPRAPRSALWLLAPPLLRWAPPLLTVLHSDLFQALLDILDYYEASLSESQ (서열번호: 117). PSD-95 아이소폼 3 (UniProt 식별자: P78352-3)은 721개 아미노산으로 이루어지고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: 51-53: 누락 (서열번호: 118).
하기 표 11은, 알려진 아이소폼을 포함하는, PSD-95 단백질에 대하여 아미노산 서열을 제공한다.
Figure pct00020
본원에 사용된 경우에, 용어 "PSD-95" (이의 동의어 포함)는 세포에 의해 자연적으로 발현되는 PSD-95의 임의의 변이체 또는 아이소폼을 포함한다. 따라서, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 PSD-95 아이소폼 1의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 PSD-95 아이소폼 2의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 PSD-95 아이소폼 3의 발현을 증가시킬 수 있다. 추가 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 PSD-95 아이소폼 1, PSD-95 아이소폼 2, 및 PSD-95 아이소폼 3의 발현을 증가시킬 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, PSD-95의 상기-기재된 아이소폼은 본원에 "PSD-95"로서 집합적으로 지칭된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 상응하는 대상체에서 PSD-95 단백질 및/또는 PSD-95 유전자의 발현)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 또는 적어도 약 300% 만큼 PSD-95 단백질 및/또는 PSD-95 유전자의 발현을 증가시킨다.
어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 miR-485, 예를 들면, miR-485-3p의 발현 및/또는 활성을 감소시킴으로써 PSD-95 단백질 및/또는 PSD-95 유전자의 발현을 증가시킨다.
시냅토파이신 조절
본원에 제공된 본 개시내용은 추가로 본원에 기재된 miR-485 억제제가, 예를 들면, 본원에 개시된 질환 또는 장애 (예를 들면, 파킨슨병, 참조)를 앓는 대상체에서 시냅토파이신의 발현을 조절할 수 있음을 입증한다. 그러므로, 일부 양태에서, 본 개시내용은 miR-485 활성을 억제시키는 화합물 (즉, miR-485 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자 (즉, SYP) 발현의 증가를 필요로 하는 대상체에서 이 발현을 증가시키는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, miR-485 활성 억제하기는 대상체에서 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 발현을 증가시킨다.
주요 시냅스성 소포 단백질 p38로서 또한 알려진, 시냅토파이신은 인간에서 SYP 유전자 (본원에 "시냅토파이신 유전자"로서 또한 지칭됨)에 의해 인코딩되는 단백질이다. SYP 유전자는 X 염색체의 짧은 아암 (GenBank 수탁 번호 NC_000023.11의 뉴클레오티드 49,187,804-49,200,259, 빼기 가닥 배향)에 위치된다. SYP 유전자, 및 이의 인코딩된 단백질의 동의어는 알려지고 "MRX96" 및 "MRXSYP"를 포함한다.
대안적 스플라이싱에서 비롯하는, 시냅토파이신 단백질의 적어도 2개 알려진 아이소폼이 있다. 시냅토파이신 아이소폼 1 (UniProt 식별자: P08247-1)은 313개 아미노산으로 이루어지고 정규 서열 (서열번호: 119)로서 선정되었다. 시냅토파이신 아이소폼 2 (UniProt 식별자: P08247-2)는 길이가 195개 아미노산이고 다음과 같이 정규 서열과 상이하다: 1-118: 누락 (서열번호: 120).
하기 표 12는, 임의의 알려진 아이소폼을 포함하는, 시냅토파이신 단백질에 대하여 아미노산 서열을 제공한다.
Figure pct00021
본원에 사용된 경우에, 용어 "시냅토파이신" (이의 동의어 포함)은 세포에 의해 자연적으로 발현되는 시냅토파이신의 임의의 변이체 또는 아이소폼을 포함한다. 따라서, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 시냅토파이신 아이소폼 1의 발현을 증가시킬 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 시냅토파이신 아이소폼 2의 발현을 증가시킬 수 있다. 추가 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 양쪽 시냅토파이신 아이소폼 1 및 시냅토파이신 아이소폼 2의 발현을 증가시킬 수 있다. 달리 지시되지 않는 한, 시냅토파이신의 상기-기재된 아이소폼은 본원에 "시냅토파이신"으로서 집합적으로 지칭된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 상응하는 대상체에서 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 발현)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 또는 적어도 약 300% 만큼 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 발현을 증가시킨다.
어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 miR-485, 예를 들면, miR-485-3p의 발현 및/또는 활성을 감소시킴으로써 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 발현을 증가시킨다.
카스파제-3 조절
일부 양태에서, 본원에 제공된 본 개시내용은 본 개시내용의 miR-485 억제제가, 예를 들면, 본원에 개시된 질환 또는 장애 (예를 들면, 파킨슨병)를 앓는 대상체에서 카스파제-3의 발현을 조절할 수 있음을 입증한다. 그러므로, 일부 양태에서, 본 개시내용은 miR-485 활성을 억제시키는 화합물 (즉, miR-485 억제제)을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자 (즉, CASP3) 발현의 감소를 필요로 하는 대상체에서 이 발현을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 양태에서, miR-485 활성 억제하기는 대상체에서 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자의 발현을 감소시킨다.
카스파제-3은 시스테인-아스파르트산 프로테아제 (카스파제) 계열의 한 구성원이고, 카스파제-8 및 카스파제-9와 상호작용함으로써 세포 자멸사에서 중심 역할을 한다. 인간에서, 카스파제-3 단백질은 CASP3 유전자 (본원에 "카스파제-3 유전자"로서 또한 지칭됨)에 의해 인코딩된다. CASP3 유전자는 인간에서 염색체 4 (GenBank 수탁 번호 NC_000004.12의 뉴클레오티드 184,627,696-184,649,509, 빼기 가닥 배향)에 위치된다. CASP3 유전자, 및 이의 인코딩된 단백질의 동의어는 알려지고 "아포페인", "CPP32", "SREBP 절단 활성 1", 단백질 야마", "SCA-1", "PARP 절단 프로테아제", "프로카스파제 3", 및 "야마"를 포함한다.
하기 표 13은 카스파제-3 단백질 전구체, 뿐만 아니라 카스파제-3 단백질의 절단된 형태에 대하여 아미노산 서열을 제공한다.
Figure pct00022
본원에 사용된 경우에, 용어 "카스파제-3" (이의 동의어 포함)은 세포에 의해 자연적으로 발현되는 카스파제-3 (예를 들면, 절단된 카스파제-3)의 임의의 변이체 또는 아이소폼을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 상응하는 대상체에서 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자의 발현)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 100% 만큼 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자의 발현을 감소시킨다.
어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 miR-485, 예를 들면, miR-485-3p의 발현 및/또는 활성을 감소시킴으로써 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자의 발현을 감소시킨다.
본 개시내용으로부터 명백할 바와 같이, SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 임의의 질환 또는 병태는 본 개시내용으로 치료될 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 CD36 단백질의 및/또는 CD36 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 임의의 질환 또는 병태 치료하기에 유용할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 PGC1-α 단백질 및/또는 PGC1-α 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는데 또한 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 LRRK2 단백질 및/또는 LRRK2 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는데 또한 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 NRG1 단백질 및/또는 NRG1 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는데 또한 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 STMN2 단백질 및/또는 STMN2 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는데 또한 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 VLDLR 단백질 및/또는 VLDLR 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는데 또한 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 NRXN1 단백질 및/또는 NRXN1 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는데 또한 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 GRIA4 단백질 및/또는 GRIA4 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는데 또한 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 NXPH1 단백질 및/또는 NXPH1 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는데 또한 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 PSD-95 단백질 및/또는 PSD-95 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용은 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자의 비정상 (예를 들면, 증가된) 수준과 연관된 질환 또는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 그러한 단백질 및/또는 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된 또는 증가된) 수준과 연관된 질환 또는 병태는 신경퇴행성 질환 또는 장애를 포함한다. 본원에 사용된 경우에, 용어 "신경퇴행성 질환 또는 장애"는 신경계 내에서, 특히 뇌의 뉴런 내에서 진행성 병리학적 변화에 의해 야기된 질환 또는 장애를 지칭한다. 일부 양태에서, 신경계의 그러한 진행성 파괴는 신체적 (예를 들면, 운동실조) 및/또는 정신적 (예를 들면, 치매) 손상을 초래할 수 있다. 본 개시내용으로 치료될 수 있는 신경퇴행성 질환 또는 장애의 비-제한 예는 알츠하이머병, 파킨슨병, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 본 개시내용으로 치료될 수 있는 다른 질환 또는 병태는, 비제한적으로, 자폐 스펙트럼 장애, 정신 지체, 발작, 뇌졸중, 척수 손상, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용으로 치료될 수 있는 질환 또는 장애는 알츠하이머병을 포함한다. 특정 양태에서, 알츠하이머병은 치매전 알츠하이머병, 초기 알츠하이머병, 중등도 알츠하이머병, 진행성 알츠하이머병, 조기 발병 가족성 알츠하이머병, 염증성 알츠하이머병, 비-염증성 알츠하이머병, 피질 알츠하이머병, 조기-발병 알츠하이머병, 후기-발병 알츠하이머병, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 치료될 수 있는 질환 또는 장애는 파킨슨증을 포함한다. 본원에 사용된 경우에, 용어 "파킨슨증"은 파킨슨병에서 보여진 움직임 이상의 조합을 야기하는 신경학적 장애의 한 그룹을 지칭한다. 그러한 움직임 이상의 비-제한 예는 떨림, 느린 움직임 (서동증), 자세 불안정, 자세 반사 소실, 구부린 자세, 동결 현상 (발이 땅에 일시적으로 "풀칠된" 경우), 언어 장애, 근육 강직 (경직), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 파킨슨증은 파킨슨병, 진행성 핵상 마비 (PSP), 다계통 위축 (MSA), 피질기저 변성 (CBD), 정상압 수두증 (NSA), 혈관성 파킨슨증 (뇌혈관 질환으로서 또한 알려짐), 미만성 루이소체 질환, 파킨슨-치매, X-연관 근긴장이상-파킨슨증, 이차성 파킨슨증 (환경적 병인, 예를 들면, 독소, 약물, 뇌염 후, 뇌 종양, 두부 외상, 정상압 수두증에서 비롯), 또는 이들의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용으로 치료될 수 있는 파킨슨증은 파킨슨병이다. 본원에 사용된 경우에, 용어 "파킨슨병" (PD)은 운동 및 비-운동 발현 (즉, 증상)으로 이어지고 흑색선조체 시스템에서 도파민성 뉴런의 광범위한 퇴행을 특징으로 하는 신경퇴행성 장애를 지칭한다. PD의 운동 및 비-운동 발현의 비-제한 예는 본 개시내용에서 다른 곳에 제공된다. 단백질병증 (α-시누클레인 비정상 응집)은 PD의 특질이다. PD의 다른 예시적 속성은 도파민성 뉴런 손상, 미토콘드리아성 기능장애, 신경염증, 단백질 항상성 (예를 들면, 손상된 단백질 및 세포소기관 아교 세포 기능장애의 자가포식적 청소), 및 이들의 조합을 포함한다. 어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 PD의 이들 속성 중 하나 이상을 개선함으로써 PD를 치료할 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 개선할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 CD36 단백질 및/또는 CD36 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 개선할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 PGC1-α 단백질 및/또는 PGC1-α 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 개선할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 LRRK2 단백질 및/또는 LRRK2 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 개선할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 NRG1 단백질 및/또는 NRG1 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 개선할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 STMN2 단백질 및/또는 STMN2 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 개선할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 VLDLR 단백질 및/또는 VLDLR 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 개선할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 NRXN1 단백질 및/또는 NRXN1 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 개선할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 GRIA4 단백질 및/또는 GRIA4 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 개선할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 NXPH1 단백질 및/또는 NXPH1 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 개선할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 PSD-95 단백질 및/또는 PSD-95 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 개선할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 개선할 수 있다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자의 비정상 (예를 들면, 증가된) 수준과 연관된 질환 또는 병태의 하나 이상의 증상을 개선할 수 있다. 그러한 증상의 비-제한 예는 하기 기재된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 만큼 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 인지 장애의 하나 이상의 증상의 발생 또는 발생의 위험을 감소시킨다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, 투여하기에 앞서 대상체에서 기억 상실)와 비교하여 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 기억 상실을 감소시킨다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 만큼 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 기억 상실 또는 기억 상실의 발생의 위험을 감소시킨다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, 투여하기에 앞서 대상체에서 기억 유지)와 비교하여 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 기억 유지를 개선시킨다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 또는 그 이상만큼 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 기억 유지를 개선 및/또는 증가시킨다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, 투여하기에 앞서 대상체에서 공간 작업 기억)와 비교하여 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 공간 작업 기억을 개선시킨다. 본원에 사용된 경우에, 용어 "공간 작업 기억"은 짧은 시기 동안 작업 기억에서 공간 정보 활동을 유지하는 능력을 지칭한다. 일부 양태에서, 공간 작업 기억은 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 또는 그 이상만큼 개선 및/또는 증가된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, 투여하기에 앞서 대상체에서 식세포작용적 활성)와 비교하여 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 (예를 들면, CD36 단백질 및/또는 CD36 유전자의 발현을 증가시킴으로써) 스캐빈저 세포 (예를 들면, 아교 세포)의 식세포작용적 활성을 증가시킨다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 또는 그 이상만큼 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 뉴런의 수지상 척추 밀도를 증가시킨다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, 투여하기에 앞서 대상체에서 아밀로이드 베타 (Aβ) 플라크 부하)와 비교하여 (예를 들면, CD36 단백질 및/또는 CD36 유전자의 발현을 증가시킴으로써) (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 아밀로이드 베타 (Aβ) 플라크 부하를 감소시킨다. 본원에 사용된 경우에, "아밀로이드 베타 플라크"는 몇몇 아밀로이드 베타 펩티드의 큰 응집체 및 작은 연관을 포함하는 아밀로이드 베타의 이상한 침착의 모든 형태를 지칭하고 아밀로이드 베타 펩티드의 임의의 변이형을 함유할 수 있다. 아밀로이드 베타 (Aβ) 플라크는 뉴런성 변화, 예를 들면, 시냅스 조성, 시냅스 형상, 시냅스 밀도에서의 이상, 시냅스성 전도도의 손실, 수상돌기 직경에서의 변화, 수상돌기 길이에서의 변화, 척추 밀도에서의 변화, 척추 영역에서의 변화, 척추 길이에서의 변화, 또는 척추 머리 직경에서의 변화를 야기시키는 것으로 알려진다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 만큼 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 아밀로이드 베타 플라크 부하를 감소시킨다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, 투여하기에 앞서 대상체에서 신경발생)와 비교하여 (예를 들면, CD36 단백질 및/또는 CD36 유전자의 발현을 증가시킴으로써) (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 신경발생을 증가시킨다. 본원에 사용된 경우에, 용어 "신경발생"은 뉴런이 창출되는 공정을 지칭한다. 신경발생은 신경 줄기 및 전구 세포의 증식, 이들 세포의 새로운 신경 세포 유형으로의 분화, 뿐만 아니라 새로운 세포의 이동 및 생존을 포괄한다. 본 용어는 정상 발달 동안, 주로 출생전 및 주산기 발달 동안 발생하는 때 신경발생, 뿐만 아니라 질환, 손상 또는 치료적 개입 이후 발생하는 신경 세포 재생을 포함하기 위한 것이다. 성인 신경발생은 또한 "신경" 또는 "신경" 재생으로 명명된다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 또는 그 이상만큼 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 신경발생을 증가시킨다.
일부 양태에서, 신경발생 증가하기 및/또는 유도하기는 신경 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 증가된 증식, 분화, 이동, 및/또는 생존과 연관된다. 따라서, 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제 투여하기는 대상체에서 신경 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 증식을 증가시킬 수 있다. 특정 양태에서, 신경 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 증식은 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 또는 그 이상만큼 증가된다. 일부 양태에서, 신경 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 생존은 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 또는 그 이상만큼 증가된다.
일부 양태에서, 신경발생 증가하기 및/또는 유도하기는 신경 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 증가된 수와 연관된다. 특정 양태에서, 신경 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 수는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 또는 그 이상만큼 증가된다.
일부 양태에서, 신경발생 증가하기 및/또는 유도하기는 증가된 축삭돌기, 수상돌기, 및/또는 시냅스 발달과 연관된다. 특정 양태에서, 축삭돌기, 수상돌기, 및/또는 시냅스 발달은 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 20%, 적어도 약 30%, 적어도 약 40%, 적어도 약 50%, 적어도 약 60%, 적어도 약 70%, 적어도 약 80%, 적어도 약 90%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 또는 그 이상만큼 증가된다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 아밀로이드 베타 플라크 부하의 발달을 예방 및/또는 억제시킨다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 아밀로이드 베타 플라크 부하의 발달의 개시를 지연시킨다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제 투여하기는 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 아밀로이드 베타 플라크 부하 발달의 위험을 낮춘다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, 투여하기에 앞서 대상체에서 뉴런의 수지상 척추 밀도)와 비교하여 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 뉴런의 수지상 척추 밀도를 증가시킨다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 또는 그 이상만큼 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 뉴런의 수지상 척추 밀도를 증가시킨다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, 투여하기에 앞서 대상체에서 뉴런의 수지상 척추의 손실)와 비교하여 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 뉴런의 수지상 척추의 손실을 감소시킨다. 특정 양태에서, miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 만큼 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 뉴런의 수지상 척추의 손실을 감소시킨다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, 투여하기에 앞서 대상체에서 신경염증)와 비교하여 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 (예를 들면, SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 발현을 증가시킴으로써) 신경염증을 감소시킨다. 특정 양태에서, miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 만큼 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 신경염증을 감소시킨다. 일부 양태에서, 감소된 신경염증은 염증성 매개체의 감소된 양을 생산하는 아교 세포를 포함한다. 따라서, 특정 양태에서, (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에게 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 만큼 아교 세포에 의해 생산된 염증성 매개체의 양을 감소시킨다. 일부 양태에서, 아교 세포에 의해 생산된 염증성 매개체는 TNF-α를 포함한다. 일부 양태에서, 염증성 매개체는 IL-1β를 포함한다. 일부 양태에서, 아교 세포에 의해 생산된 염증성 매개체는 양쪽 TNF-α 및 IL-1β를 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 (예를 들면, SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 발현을 증가시킴으로써) 자가포식을 증가시킨다. 본원에 사용된 경우에, 용어 "자가포식"은 세포 항상성을 유지하기 위해 수명이 긴 단백질, 단백질 응집체, 뿐만 아니라 손상된 세포소기관의 분해를 담당하는 세포성 스트레스 반응 및 생존 경로를 지칭한다. 당연히, 자가포식의 이상은 많은 신경퇴행성 질환 (예를 들면, 알츠하이머병 및 파킨슨병)을 포함하는 다수의 질환과 연관되었다. 일부 양태에서, (예를 들면, 퇴행성 질환을 앓는) 대상체에게 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 또는 적어도 약 300% 또는 그 이상만큼 자가포식을 증가시킨다. 자가포식에서의 증가는 당업계에서 알려진 임의의 적합한 방법에 의해 측정될 수 있다. 가령, 일부 양태에서, 자가포식에서의 증가는 자가포식소체 생물발생과 연관된 유전자 (예를 들면, LC3B)의 발현을 측정함으로써 관찰될 수 있다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 (예를 들면, SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 발현을 증가시킴으로써) 알파-세크레타제 활성을 증가시킨다. 본원에 사용된 경우에, 용어 "알파-세크레타제"는 이의 막횡단 영역에서 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)을 절단시키는 단백질분해 효소의 한 계열을 지칭한다. 알파 세크레타제는 ADAM ("디스인테그린 및 메탈로프로테아제 도메인") 계열 (예를 들면, ADAM10)의 구성원이고, 이는 세포의 표면에서 발현되고 세포 막에서 고정된다. 구체적으로, 알파 세크레타제는 APP가 베타 세크레타제 및 감마 세크레타제에 의해 대신 처리되는 때 알츠하이머병-연관된 펩티드 아밀로이드 베타를 발생시키는 단편 내에서 절단한다. 그래서, 일부 양태에서, 알파-세크레타제 절단은 아밀로이드 베타 형성을 배제하고 APP 처리에서 비-아밀로이드생성 경로의 부분으로 간주된다. 일부 양태에서, (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에게 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 또는 적어도 약 300% 또는 그 이상만큼 알파-세크레타제 활성을 증가시킨다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 (예를 들면, SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 발현을 증가시킴으로써) 베타-세크레타제 1 (BACE1) 활성을 감소시킨다. 본원에 사용된 경우에, 용어 "베타-세크레타제 1" 또는 "BACE1"은 뉴런에서 주로 발현되는 효소를 지칭한다. BACE1은 말초 신경 세포내 수초의 형성에서 중요한 아스파르트산 프로테아제이다. 일부 양태에서, (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에게 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 만큼 BACE1 활성을 감소시킨다.
당업계에서 알려지는 바와 같이, 많은 신경퇴행성 질환은 특정 운동 및/또는 비-운동 증상을 나타낸다. 가령, 파킨슨병과 연관된 운동 증상의 비-제한 예는 휴식시 떨림, 자발적 움직임의 감소 (서동증), 경직, 자세 불안정, 보행 동결, 필기 장애 (소서증), 감소된 안면 표정, 및 제어되지 않는 빠른 움직임을 포함한다. 파킨슨병과 연관된 비-운동 증상의 비-제한 예는 자율신경계 기능장애, 신경정신과적 문제 (기분, 인지, 행동, 또는 사고 변화), 감각 변화 (특히 변화된 후각), 및 수면 장애를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, 투여하기에 앞서 대상체에서 상응하는 운동 증상)와 비교하여 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 하나 이상의 운동 증상을 개선한다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 또는 그 이상만큼 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 하나 이상의 운동 증상을 개선한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, 투여하기에 앞서 대상체에서 상응하는 비-운동 증상)와 비교하여 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 하나 이상의 비-운동 증상을 개선한다. 특정 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 또는 그 이상만큼 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 하나 이상의 비-운동 증상을 개선한다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, 투여하기에 앞서 대상체에서 시냅스성 기능)와 비교하여 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 시냅스성 기능을 개선한다. 본원에 사용된 경우에, 용어 "시냅스성 기능"은 전기적 또는 화학적 신호를 또 다른 세포 (예를 들면, 뉴런)에 돌려주기 위한 세포 (예를 들면, 뉴런)의 시냅스의 능력을 지칭한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 100%, 적어도 약 150%, 적어도 약 200%, 적어도 약 250%, 또는 적어도 약 300% 또는 그 이상만큼 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 시냅스성 기능을 개선한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, 투여하기에 앞서 대상체에서 시냅스성 기능의 상실)와 비교하여 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 시냅스성 기능의 상실을 예방, 지연, 및/또는 호전시킬 수 있다. 일부 양태에서, miR-485 억제제 투여하기는 참조 (예를 들면, miR-485 억제제의 투여를 받지 않았던 대상체)와 비교하여 적어도 약 5%, 적어도 약 10%, 적어도 약 15%, 적어도 약 20%, 적어도 약 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 또는 약 100% 만큼 (예를 들면, 신경퇴행성 질환을 앓는) 대상체에서 시냅스성 기능의 상실을 예방, 지연, 및/또는 호전시킨다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 당업계에서 알려진 임의의 적합한 루트에 의해 투여될 수 있다. 특정 양태에서, miR-485 억제제는 괄호로, 근육내로, 피하로, 안과, 정맥내로, 복강내로, 피내로, 안와내로, 뇌내로, 두개내로, 뇌실내로, 척수내로, 뇌실내, 척수강내로, 인트라시스테말리, 낭내로, 종양내로, 또는 이들의 조합으로 투여된다. 특정 양태에서, miR-485 억제제는 뇌실내로 (ICV) 투여된다. 특정 양태에서, miR-485 억제제는 정맥내로 투여된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 하나 이상의 추가의 치료적 제제와 조합으로 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 추가의 치료적 제제 및 miR-485 억제제는 동시에 투여된다. 특정 양태에서, 추가의 치료적 제제 및 miR-485 억제제는 순차적으로 투여된다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제의 투여는 임의의 역효과를 초래하지 않는다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 대상체에게 투여된 때 체중에 불리하게 영향을 주지 않는다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 대상체에게 투여된 때 증가된 사망률을 초래하지 않거나 병리학적 이상을 야기시키지 않는다.
III. 본 개시내용에 유용한 miRNA-485 억제제
miR-485 활성을 억제시킬 수 있는 화합물 (miR-485 억제제)이 본원에 개시된다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 적어도 하나의 miR-485 결합 부위를 포함하는 뉴클레오티드 분자를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 분자는 단백질을 인코딩하지 않는다. 본원에 기재된 경우에, 일부 양태에서, miR-485 결합 부위는 표적 miRNA 핵산 서열 (즉, miR-485)에 적어도 부분적으로 상보적이어서, miR-485 억제제는 miR-485 핵산 서열에 하이브리드화한다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR 억제제의 miR-485 결합 부위는 miR-485의 핵산 서열에 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 상보성을 갖는다. 특정 양태에서, miR-485 결합 부위는 miR-485의 핵산 서열에 완전히 상보적이다.
miR-485 헤어핀 전구체는 양쪽 miR-485-5p 및 miR-485-3p를 생성할 수 있다. 본 개시내용의 맥락에서 "miR-485"는 달리 특정되지 않는 한 양쪽 miR-485-5p 및 miR-485-3p를 포괄한다. 인간 성숙한 miR-485-3p는 서열 5'- GUCAUACACGGCUCUCCUCUCU-3' (서열번호: 1; miRBase 수탁 번호 MIMAT0002176)를 갖는다. miR-485-3p 5'-UCAUACA-3' (서열번호: 49)의 5' 말단 하위서열은 씨드 서열이다. 인간 성숙한 miR-485-5p는 서열 5'-AGAGGCUGGCCGUGAUGAAUUC-3' (서열번호: 33; miRBase 수탁 번호 MIMAT0002175)를 갖는다. miR-485-5p 5'-GAGGCUG-3' (서열번호: 50)의 5' 말단 하위서열은 씨드 서열이다.
당업자에게 명백할 바와 같이, 인간 성숙한 miR-485-3p는 다른 종의 것에 상당한 서열 유사성을 갖는다. 가령, 마우스 성숙한 miR-485-3p는 5'- 및 3'- 말단의 각각에서 단일 아미노산에 의해 인간 성숙한 miR-485-3p와 상이하다 (즉, 5'-말단에서 잉여 "A" 및 3'-말단에서 누락 "C"를 갖는다). 마우스 성숙한 miR-485-3p는 하기 서열: 5'-AGUCAUACACGGCUCUCCUCUC-3' (서열번호: 34; miRBase 수탁 번호 MIMAT0003129; 밑줄친 부문은 인간 성숙한 miR-485-3p와 중복에 해당함)을 갖는다. 마우스 성숙한 miR-485-5p에 대한 서열은 인간의 것과 동일하다: 5'-agaggcuggccgugaugaauuc-3' (서열번호: 33; miRBase 수탁 번호 MIMAT0003128). 다른 예시적 포유류 종으로부터 상응하는 서열에 인간 성숙한 miR-485-3p 및 miR-485-5p를 위한 서열 정렬은 도 5a 및 5b에서 제공된다. 서열에서의 유사성 때문에, 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 도 5a 및 5b에서 도시된 하나 이상의 종으로부터 miR-485-3p 및/또는 miR-485-5p를 결합시킬 수 있다. 특정 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 양쪽 인간 및 마우스로부터 miR-485-3p 및/또는 miR-485-5p에 결합할 수 있다.
일부 양태에서, miR-485 결합 부위는 miR-485-3p의 서열 (또는 이의 하위서열)에 상보적 (예를 들면, 완전히 상보적)인 단일-가닥 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 양태에서, miR-485-3p 하위서열은 씨드 서열을 포함한다. 따라서, 특정 양태에서, miR-485 결합 부위는 서열번호: 49에서 제시된 핵산 서열에 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 상보성을 갖는다. 특정 양태에서, miR-485 결합 부위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 미스매치들을 제외하고 miR-485-3p에 상보적이다. 추가 양태에서, miR-485 결합 부위는 서열번호: 1에서 제시된 핵산 서열에 완전히 상보적이다.
일부 양태에서, miR-485 결합 부위는 miR-485-5p의 서열 (또는 이의 하위서열)에 상보적 (예를 들면, 완전히 상보적)인 단일-가닥 폴리뉴클레오티드 서열이다. 일부 양태에서, miR-485-5p 하위서열은 씨드 서열을 포함한다. 특정 양태에서, miR-485 결합 부위는 서열번호: 50에서 제시된 핵산 서열에 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 서열 상보성을 갖는다. 특정 양태에서, miR-485 결합 부위는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 미스매치들을 제외하고 miR-485-5p에 상보적이다. 추가 양태에서, miR-485 결합 부위는 서열번호: 35에서 제시된 핵산 서열에 완전히 상보적이다.
miRNA의 씨드 영역은 표적 mRNA와 단단한 이중체를 형성한다. 대부분의 miRNA는 표적 mRNA의 3' 미번역된 영역 (UTR)과 불완전하게 염기-짝짓기하고, miRNA의 5' 근위 "씨드" 영역은 대부분의 짝짓기 특이성을 제공한다. 임의의 이론에 얽매이지 않고, (씨드 서열을 포괄하는) 처음 9개 miRNA 뉴클레오티드가 더 큰 특이성을 제공하는 반면 이 영역의 miRNA 리보뉴클레오티드 3'가 더 낮은 서열 특이성을 허용하고 그래서 더 높은 정도의 미스매칭된 염기 짝짓기를 용인한다고 믿어지고, 위치 2-7이 가장 중요하다. 따라서, 본 개시내용의 특이적 양태에서, miR-485 결합 부위는 miR-485의 씨드 서열의 전체 길이에 걸쳐 완전히 상보적 (즉, 100% 상보적)인 하위서열을 포함한다.
본 개시내용의 맥락에서 사용될 수 있는 miRNA 서열 및 miRNA 결합 서열은, 비제한적으로, 본원에 제공된 서열 목록에서 서열들의 전부 또는 한 부문, 뿐만 아니라 miRNA 전구체 서열, 또는 이들 miRNA의 하나 이상의 보체를 포함한다. 이름으로 특정 miRNA 또는 miRNA 결합 부위를 포함하는 본 개시내용의 임의의 양태는 서열이 특정된 miRNA 서열 또는 이의 상보적 서열의 성숙한 서열에 적어도 약 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 71%, 적어도 약 72%, 적어도 약 73%, 적어도 약 74%, 적어도 약 75%, 적어도 약 76%, 적어도 약 77%, 적어도 약 78%, 적어도 약 79%, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 miRNA 또는 이의 상보적 서열을 포함하도록 또한 고려된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miRNA 결합 서열은, 변형된 서열이 miR-485에 여전히 특이적으로 결합할 수 있는 한, 본원에 제공된 서열 목록에서 그들 서열의 5', 3', 또는 양쪽 5' 및 3' 말단에서 추가의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miRNA 결합 서열은, 변형된 서열이 miR-485에 여전히 특이적으로 결합할 수 있는 한, 제공된 서열 목록에서 그들 서열에 관하여 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 또는 그 이상 뉴클레오티드에서 상이할 수 있다.
miRNA 결합 분자 또는 miRNA에 관하여 본원에 논의된 임의의 방법 및 조성물이 합성 miRNA 결합 분자에 관하여 구현될 수 있음이 또한 구체적으로 고려된다. 본 개시내용에서 RNA 서열에 관련된 본 개시내용이 상응하는 DNA 서열에 동일하게 적용가능함이 또한 이해된다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miRNA-485 억제제는 뉴클레오티드 서열의 5'에서 적어도 1 뉴클레오티드, 적어도 2 뉴클레오티드, 적어도 3 뉴클레오티드, 적어도 4 뉴클레오티드, 적어도 5 뉴클레오티드, 적어도 6 뉴클레오티드, 적어도 7 뉴클레오티드, 적어도 8 뉴클레오티드, 적어도 9 뉴클레오티드, 적어도 10 뉴클레오티드, 적어도 11 뉴클레오티드, 적어도 12 뉴클레오티드, 적어도 13 뉴클레오티드, 적어도 14 뉴클레오티드, 적어도 15 뉴클레오티드, 적어도 16 뉴클레오티드, 적어도 17 뉴클레오티드, 적어도 18 뉴클레오티드, 적어도 19 뉴클레오티드, 또는 적어도 20개 뉴클레오티드를 포함한다. 일부 양태에서, miRNA-485 억제제는 뉴클레오티드 서열의 3'에서 적어도 1 뉴클레오티드, 적어도 2 뉴클레오티드, 적어도 3 뉴클레오티드, 적어도 4 뉴클레오티드, 적어도 5 뉴클레오티드, 적어도 6 뉴클레오티드, 적어도 7 뉴클레오티드, 적어도 8 뉴클레오티드, 적어도 9 뉴클레오티드, 적어도 10 뉴클레오티드, 적어도 11 뉴클레오티드, 적어도 12 뉴클레오티드, 적어도 13 뉴클레오티드, 적어도 14 뉴클레오티드, 적어도 15 뉴클레오티드, 적어도 16 뉴클레오티드, 적어도 17 뉴클레오티드, 적어도 18 뉴클레오티드, 적어도 19 뉴클레오티드, 또는 적어도 20개 뉴클레오티드를 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 길이가 약 6 내지 약 30개 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 길이가 7개 뉴클레오티드이다. 추가 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 길이가 8개 뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 길이가 9개 뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 길이가 10개 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, miR-485 억제제는 길이가 11개 뉴클레오티드이다. 추가 양태에서, miR-485 억제제는 길이가 12개 뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 길이가 13개 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 길이가 14개 뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 길이가 15개 뉴클레오티드이다. 추가 양태에서, miR-485 억제제는 길이가 16개 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 길이가 17개 뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 길이가 18개 뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 길이가 19개 뉴클레오티드이다. 특정 양태에서, miR-485 억제제는 길이가 20개 뉴클레오티드이다. 추가 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 길이가 21개 뉴클레오티드이다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 길이가 22개 뉴클레오티드이다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 서열번호: 2 내지 30으로부터 선택된 서열에 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99%, 또는 약 100% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특정 양태에서, miR-485 억제제는 서열번호: 2 내지 30으로 이루어지는 군으로부터 선택된 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 여기서 뉴클레오티드 서열은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 미스매치들을 임의로 포함할 수 있다.
일부 양태에서, miRNA 억제제는 5'-UGUAUGA-3' (서열번호: 2), 5'-GUGUAUGA-3' (서열번호: 3), 5'-CGUGUAUGA-3' (서열번호: 4), 5'-CCGUGUAUGA-3' (서열번호: 5), 5'-GCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 6), 5'-AGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 7), 5'-GAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 8), 5'-AGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 9), 5'-GAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 10), 5'-GGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 11), 5'-AGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 12), 5'-GAGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 13), 5'-AGAGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 14), 또는 5'-GAGAGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 15)를 포함한다.
일부 양태에서, miRNA 억제제는 5'-UGUAUGAC-3' (서열번호: 16), 5'-GUGUAUGAC-3' (서열번호: 17), 5'-CGUGUAUGAC-3' (서열번호: 18), 5'-CCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 19), 5'-GCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 20), 5'-AGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 21), 5'-GAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 22), 5'-AGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 23), 5'-GAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 24), 5'-GGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 25), 5'-AGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 26), 5'-GAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 27), 5'-AGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 28), 5'-GAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 29), 또는 AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC (서열번호: 30)를 갖는다.
일부 양태에서, miRNA 억제제는 5'-TGTATGA-3' (서열번호: 62), 5'-GTGTATGA-3' (서열번호: 63), 5'-CGTGTATGA-3' (서열번호: 64), 5'-CCGTGTATGA-3' (서열번호: 65), 5'-GCCGTGTATGA-3' (서열번호: 66), 5'-AGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 67), 5'-GAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 68), 5'-AGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 69), 5'-GAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 70), 5'-GGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 71), 5'-AGGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 72), 5'-GAGGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 73), 5'-AGAGGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 74), 5'-GAGAGGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 75); 5'-TGTATGAC-3' (서열번호: 76), 5'-GTGTATGAC-3' (서열번호: 77), 5'-CGTGTATGAC-3' (서열번호: 78), 5'-CCGTGTATGAC-3' (서열번호: 79), 5'-GCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 80), 5'-AGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 81), 5'-GAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 82), 5'-AGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 83), 5'-GAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 84), 5'-GGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 85), 5'-AGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 86), 5'-GAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 87), 5'-AGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 88), 5'-GAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 89); 및 AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC (서열번호: 90)로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖는다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miRNA 억제제 (즉, miR-485 억제제)는 5'-AGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 28) 또는 5'-AGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 88)에 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, miRNA 억제제는 5'-AGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 28) 또는 5'-AGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 88)에 적어도 90% 유사성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 일부 양태에서, miRNA 억제제는 1개 치환 또는 2개 치환을 가진 뉴클레오티드 서열 5'-AGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 28) 또는 5'-AGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 88)를 포함한다. 일부 양태에서, miRNA 억제제는 뉴클레오티드 서열 5'-AGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 28) 또는 5'-AGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 88)를 포함한다. 특정 양태에서, miRNA 억제제는 뉴클레오티드 서열 5'-AGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 28)를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 본원에 개시된 서열, 예를 들면, 서열번호: 2 내지 30 중 어느 하나, 그리고 N 말단에서 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4 또는 적어도 5개 추가의 핵산, C 말단에서 적어도 1, 적어도 2, 적어도 3, 적어도 4, 또는 적어도 5개 추가의 핵산, 또는 양쪽을 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 본원에 개시된 서열, 예를 들면, 서열번호: 2 내지 30 중 어느 하나, 그리고 N 말단에서 1개 추가의 핵산 및/또는 C 말단에서 1개 추가의 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 본원에 개시된 서열, 예를 들면, 서열번호: 2 내지 30 중 어느 하나, 그리고 N 말단에서 1 또는 2개 추가의 핵산 및/또는 C 말단에서 1 또는 2개 추가의 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 본원에 개시된 서열, 예를 들면, 서열번호: 2 내지 30 중 어느 하나, 그리고 N 말단에서 1 내지 3개 추가의 핵산 및/또는 C 말단에서 1 내지 3개 추가의 핵산을 포함한다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 5'-GAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 29)를 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는 1개 miR-485 결합 부위를 포함한다. 추가 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 적어도 2개 miR-485 결합 부위를 포함한다. 특정 양태에서, miR-485 억제제는 3개 miR-485 결합 부위를 포함한다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 4개 miR-485 결합 부위를 포함한다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 5개 miR-485 결합 부위를 포함한다. 특정 양태에서, miR-485 억제제는 6개 이상의 miR-485 결합 부위를 포함한다. 일부 양태에서, 모든 miR-485 결합 부위는 동일하다. 일부 양태에서, 모든 miR-485 결합 부위는 상이하다. 일부 양태에서, miR-485 결합 부위 중 적어도 하나는 상이하다. 일부 양태에서, 모든 miR-485 결합 부위는 miR-485-3p 결합 부위이다. 다른 양태에서, 모든 miR-485 결합 부위는 miR-485-5p 결합 부위이다. 추가 양태에서, miR-485 억제제는 적어도 하나의 miR-485-3p 결합 부위 및 적어도 하나의 miR-485-5p 결합 부위를 포함한다.
III.a. 화학적으로 변형된 폴리뉴클레오티드
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 적어도 하나의 화학적으로 변형된 뉴클레오시드 및/또는 뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드가 화학적으로 변형되는 경우 폴리뉴클레오티드는 "변형된 폴리뉴클레오티드"로서 지칭될 수 있다.
"뉴클레오시드"는 유기 염기 (예를 들면, 퓨린 또는 피리미딘) 또는 이의 유도체 (본원에 "핵염기"로서 또한 지칭됨)와 조합으로 당 분자 (예를 들면, 펜토스 또는 리보스) 또는 이의 유도체를 함유하는 화합물을 지칭한다. "뉴클레오티드"는 포스페이트 기를 포함하는 뉴클레오시드를 지칭한다. 변형된 뉴클레오티드는 하나 이상의 변형된 또는 비-천연 뉴클레오시드를 포함하기 위해 임의의 유용한 방법으로, 예컨대, 예를 들어, 화학적으로, 효소적으로, 또는 재조합으로 합성될 수 있다.
폴리뉴클레오티드는 결합된 뉴클레오시드의 한 영역 또는 영역들을 포함할 수 있다. 그러한 영역은 가변 백본 연결을 가질 수 있다. 연결은 표준 포스포디에스테르 연결일 수 있고, 이 경우에 폴리뉴클레오티드는 뉴클레오티드의 영역을 포함할 것이다.
본원에 개시된 변형된 폴리뉴클레오티드는 다양한 별개 변형을 포함할 수 있다. 일부 양태에서, 변형된 폴리뉴클레오티드는 1, 2개, 또는 그 이상의 (임의로 상이한) 뉴클레오시드 또는 뉴클레오티드 변형을 함유한다. 일부 양태에서, 변형된 폴리뉴클레오티드는, 미변형된 폴리뉴클레오티드에 비교된 경우, 하나 이상의 바람직한 특성, 예를 들면, 개선된 열적 또는 화학적 안정성, 감소된 면역원성, 감소된 분해, 표적 마이크로RNA에 대한 증가된 결합, 다른 마이크로RNA 또는 다른 분자에 대한 감소된 비-특이적 결합을 나타낼 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, miR-485 억제제)는 화학적으로 변형된다. 본원에 사용된 경우에, 폴리뉴클레오티드에 관하여, 용어 "화학적 변형" 또는, 적절한 경우, "화학적으로 변형된"은, 비제한적으로, 이의 핵염기, 당, 백본, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 그들의 위치, 패턴, 퍼센트 또는 집단 중 하나 이상에서 아데노신 (A), 구아노신 (G), 우리딘 (U), 티미딘 (T) 또는 시티딘 (C) 리보- 또는 데옥시리보뉴클레오시드에 관한 변형을 지칭한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, miR-485 억제제)는 동일한 뉴클레오시드 유형의 전부 또는 임의의 것의 균일한 화학적 변형 또는 동일한 뉴클레오시드 유형의 전부 또는 임의의 것에서 동일한 시작 변형의 하향 적정에 의해 생산된 변형의 집단, 또는 무작위 편입만을 가진 동일한 뉴클레오시드 유형의 모든 임의의 것의 화학적 변형의 측정된 퍼센트를 가질 수 있다 추가 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, miR-485 억제제)는 전체 폴리뉴클레오티드 내내 동일한 뉴클레오시드 유형의 2, 3, 또는 4개의 균일한 화학적 변형을 가질 수 있다 (예컨대 모든 우리딘 및/또는 모든 시티딘, 등은 동일한 식으로 변형된다).
변형된 뉴클레오티드 염기 짝짓기는 표준 아데닌-티민, 아데닌-우라실, 또는 구아닌-시토신 염기 쌍, 뿐만 아니라 비-표준 또는 변형된 염기를 포함하는 뉴클레오티드 및/또는 변형된 뉴클레오티드 사이 형성된 염기 쌍을 포괄하고, 여기서 수소 결합 주개 및 수소 결합 받개의 배열은 비-표준 염기와 표준 염기 사이 또는 2개 상보적 비-표준 염기 구조 사이 수소 결합을 허용한다. 그러한 비-표준 염기 짝짓기의 하나의 예는 변형된 핵염기 이노신과 아데닌, 시토신 또는 우라실 사이 염기 짝짓기이다. 염기/당 또는 링커의 임의의 조합은 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드에 편입될 수 있다.
숙련된 기술자는, 달리 언급되는 경우를 제외하고, 본원에서 제시된 폴리뉴클레오티드 서열이 대표적 DNA 서열에서 "T"를 인용할 것이지만 서열이 RNA를 나타내는 경우, "T"가 "U"에 대하여 치환될 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 본 개시내용의 TD는 RNA로서, DNA로서, 또는 양쪽 RNA 및 DNA 단위체를 포함하는 하이브리드 분자로서 투여될 수 있다.
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, miR-485 억제제)는 적어도 2개 (예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 8, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 18, 20개 또는 그 이상) 변형된 핵염기의 조합을 포함한다.
일부 양태에서, 폴리뉴클레오티드에서 핵염기, 당, 백본 연결, 또는 이들의 임의의 조합은 적어도 약 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100% 만큼 변형된다.
(i) 염기 변형
특정 양태에서, 화학적 변형은 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, miR-485 억제제)에서 핵염기에 있다. 일부 양태에서, 적어도 하나의 화학적으로 변형된 뉴클레오시드는 변형된 우리딘 (예를 들면, 슈도우리딘 (ψ), 2-티오우리딘 (s2U), 1-메틸-슈도우리딘 (m1ψ), 1-에틸-슈도우리딘 (e1ψ), 또는 5-메톡시-우리딘 (mo5U)), 변형된 시토신 (예를 들면, 5-메틸-시티딘 (m5C)) 변형된 아데노신 (예를 들면, 1-메틸-아데노신 (m1A), N6-메틸-아데노신 (m6A), 또는 2-메틸-아데닌 (m2A)), 변형된 구아노신 (예를 들면, 7-메틸-구아노신 (m7G) 또는 1-메틸-구아노신 (m1G)), 또는 이들의 조합이다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, miR-485 억제제)는 특정한 변형에 대하여 균일하게 변형된다 (예를 들면, 완전히 변형된다, 전체 서열 내내 변형된다). 예를 들어, 폴리뉴클레오티드는, 폴리뉴클레오티드 서열에서 모든 시토신 잔기가 5-메틸-시티딘 (m5C)으로 대체되는 것을 의미하는, 동일한 유형의 염기 변형, 예를 들면, 5-메틸-시티딘 (m5C)으로 균일하게 변형될 수 있다. 비슷하게, 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오시드 예컨대 상기 제시된 것들의 임의의 것으로 대체에 의해 서열에서 존재하는 임의의 유형의 뉴클레오시드 잔기에 대하여 균일하게 변형될 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, miR-485 억제제)는 적어도 2개 (예를 들면, 2, 3, 4개 또는 그 이상)의 변형된 핵염기의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (예를 들면, miR-485 억제제)에서 핵염기의 한 유형의 적어도 약 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%는 변형된 핵염기이다.
(ii) 백본 변형
일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (즉, miR-485 억제제)는 뉴클레오시드 사이 임의의 유용한 연결을 포함할 수 있다. 본 개시내용의 조성물에서 유용한, 백본 변형을 포함하는, 그러한 연결은, 비제한적으로 하기를 포함한다: 3'-알킬렌 포스포네이트, 3'-아미노 포스포르아미데이트, 알켄 함유 백본, 아미노알킬포스포르아미데이트, 아미노알킬포스포트리에스테르, 보라노포스페이트, -CH2-O-N(CH3)-CH2-, -CH2-N(CH3)-N(CH3)-CH2-, -CH2-NH-CH2-, 키랄 포스포네이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본, 메틸렌 (메틸이미노), 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본, 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본, 모르폴리노 연결, -N(CH3)-CH2-CH2-, 헤테로원자 인터뉴클레오시드 연결을 가진 올리고뉴클레오시드, 포스피네이트, 포스포르아미데이트, 포스포로디티오에이트, 포스포로티오에이트 인터뉴클레오시드 연결, 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, PNA, 실록산 백본, 술파메이트 백본, 술피드 술폭시드 및 술폰 백본, 술포네이트 및 술폰아미드 백본, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 티오노포스포르아미데이트.
Figure pct00023
일부 양태에서, 상기 개시된 백본 연결의 존재는 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (즉, miR-485 억제제)의 분해에 대한 안정성 및 내성을 증가시킨다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (즉, miR-485 억제제)에서 백본 연결의 적어도 약 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%는 변형된다 (예를 들면, 이들의 전부는 포스포로티오에이트이다).
일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (즉, miR-485 억제제)에서 포함될 수 있는 백본 변형은 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO) 및/또는 포스포로티오에이트 (PS) 변형을 포함한다.
(iii) 당 변형
본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (즉, miR-485 억제제)에 편입될 수 있는 변형된 뉴클레오시드 및 뉴클레오티드는 핵산의 당에서 변형될 수 있다. 일부 양태에서, 당 변형은 miR-485 핵산 서열에 miR-485 억제제의 결합의 친화성을 증가시킨다. miR-485 억제제에서 친화성-향상 뉴클레오티드 유사체, 예컨대 LNA 또는 2'-치환된 당 편입하기는 miR-485 억제제의 길이 및/또는 크기가 감소되게 할 수 있다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (즉, miR-485 억제제)에서 뉴클레오티드의 적어도 약 5%, 적어도 10%, 적어도 15%, 적어도 20%, 적어도 25%, 적어도 약 30%, 적어도 약 35%, 적어도 약 40%, 적어도 약 45%, 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 100%는 당 변형 (예를 들면, LNA)을 함유한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 또는 22개 뉴클레오티드 단위체는 당 변형된다 (예를 들면, LNA).
일반적으로, RNA는 당 그룹 리보스를 포함하고, 이는 산소를 갖는 5-원 고리이다. 예시적, 비-제한 변형된 뉴클레오티드는 (예를 들면, S, Se, 또는 알킬렌, 예컨대 메틸렌 또는 에틸렌을 가진) 리보스 내 산소의 대체; (예를 들면, 리보스를 사이클로펜틸 또는 사이클로헥세닐로 대체하기 위한) 이중 결합의 부가; (예를 들면, 사이클로부탄 또는 옥세탄의 4-원 고리를 형성하기 위한) 리보스의 고리 수축; (예를 들면, 추가의 탄소 또는 헤테로원자를 갖는 6- 또는 7-원 고리를 형성하기 위해, 예컨대 포스포르아미데이트 백본을 또한 갖는 안하이드로헥시톨, 알트리톨, 만니톨, 사이클로헥사닐, 사이클로헥세닐, 및 모르폴리노를 위하여) 리보스의 고리 확장; 다환형 형태 (예를 들면, 트리사이클로; 및 "비잠금" 형태, 예컨대 글리콜 핵산 (GNA) (예를 들면, R-GNA 또는 S-GNA, 리보스가 포스포디에스테르 결합에 부착된 글리콜 단위체에 의해 대체되는 경우), 트레오스 핵산 (TNA, 리보스가 α-L-트레오푸라노실-(3'→2')로 대체되는 경우), 및 펩티드 핵산 (PNA, 2-아미노-에틸-글리신 연결이 리보스 및 포스포디에스테르 백본을 대체하는 경우)을 포함한다. 당 그룹은 리보스내 상응하는 탄소의 것과 반대의 입체화학적 구성을 소유하는 하나 이상의 탄소를 또한 함유할 수 있다. 그래서, 폴리뉴클레오티드 분자는, 예를 들면, 아라비노스를 당으로서 함유하는 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
리보스의 2' 하이드록실기 (OH)는 다수의 상이한 치환체로 변형 또는 대체될 수 있다. 2'-위치에서 예시적 치환은, 비제한적으로, H, 할로, 임의로 치환된 C1-6 알킬; 임의로 치환된 C1-6 알콕시; 임의로 치환된 C6-10 아릴옥시; 임의로 치환된 C3-8 사이클로알킬; 임의로 치환된 C3-8 사이클로알콕시; 임의로 치환된 C6-10 아릴옥시; 임의로 치환된 C6-10 아릴-C1-6 알콕시, 임의로 치환된 C1-12 (헤테로사이클릴)옥시; 당 (예를 들면, 리보스, 펜토스, 또는 본원에 기재된 임의의 것); 폴리에틸렌글리콜 (PEG), -O(CH2CH2O)nCH2CH2OR, 식중 R은 H 또는 임의로 치환된 알킬이고, n은 0 내지 20 (예를 들면, 0 내지 4, 0 내지 8, 0 내지 10, 0 내지 16, 1 내지 4, 1 내지 8, 1 내지 10, 1 내지 16, 1 내지 20, 2 내지 4, 2 내지 8, 2 내지 10, 2 내지 16, 2 내지 20, 4 내지 8, 4 내지 10, 4 내지 16, 및 4 내지 20)의 정수임; 예시적 브릿지가 메틸렌, 프로필렌, 에테르, 아미노 브릿지, 아미노알킬, 아미노알콕시, 아미노, 및 아미노산을 포함하는, 2'-하이드록실이 C1-6 알킬렌 또는 C1-6 헤테로알킬렌 브릿지에 의해 동일한 리보스 당의 4'-탄소에 연결된 "잠금" 핵산 (LNA)을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (즉, mir-485 억제제)에서 존재하는 뉴클레오티드 유사체는, 예를 들면, 2'-O-알킬-RNA 단위체, 2'-OMe-RNA 단위체, 2'-O-알킬-SNA, 2'-아미노-DNA 단위체, 2'-플루오로-DNA 단위체, LNA 단위체, 아라비노 핵산 (ANA) 단위체, 2'-플루오로-ANA 단위체, HNA 단위체, INA (인터칼레이팅 핵산) 단위체, 2'MOE 단위체, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, LNA는, 예를 들면, 옥시-LNA (예컨대 베타-D-옥시-LNA, 또는 알파-L-옥시-LNA), 아미노-LNA (예컨대 베타-D-아미노-LNA 또는 알파-L-아미노-LNA), 티오-LNA (예컨대 베타-D-티오0-LNA 또는 알파-L-티오-LNA), ENA (그와 같은 베타-D-ENA 또는 알파-L-ENA), 또는 이들의 임의의 조합이다. 추가 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (즉, miR-485 억제제)에서 포함될 수 있는 뉴클레오티드 유사체는 잠금 핵산 (LNA), 비잠금 핵산 (UNA), 아라비노 핵산 (ABA), 브릿징된 핵산 (BNA), 및/또는 펩티드 핵산 (PNA)을 포함한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (즉, miR-485 억제제)는 양쪽 변형된 RNA 뉴클레오티드 유사체 (예를 들면, LNA) 및 DNA 단위체를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 갭머이다. 예를 들면, 미국 특허 번호 8,404,649; 8,580,756; 8,163,708; 9,034,837, 참조; 이들의 모두는 그들 전체가 참조로 본원에 편입됨. 일부 양태에서, miR-485 억제제는 마이크로미르이다. 미국 특허 출원 공개 번호 US20180201928 참조, 이 전체가 참조로 본원에 편입됨.
일부 양태에서, 본 개시내용의 폴리뉴클레오티드 (즉, miR-485 억제제)는 엔도- 및 엑소-뉴클레아제에 의한 신속한 분해를 예방하기 위해 변형을 포함할 수 있다. 변형은, 비제한적으로, 예를 들어, (a) 말단 변형, 예를 들면, 5' 말단 변형 (인산화, 탈인산화, 접합, 역위 연결, 등), 3' 말단 변형 (접합, DNA 뉴클레오티드, 역위 연결, 등), (b) 염기 변형, 예를 들면, 변형된 염기, 안정화 염기, 불안정화 염기, 또는 파트너의 확장된 레퍼토리와 염기 짝짓기하는 염기, 또는 접합된 염기로의 대체, (c) (예를 들면, 2' 위치 또는 4' 위치에서) 당 변형 또는 당의 대체, 뿐만 아니라 (d) 포스포디에스테르 연결의 변형 또는 대체를 포함하는, 인터뉴클레오시드 연결 변형을 포함한다.
IV. 벡터 및 전달 시스템
일부 양태에서, 본 개시내용의 miR-485 억제제는, 예를 들면, 당업계에서 알려진 임의의 관련한 전달 시스템을 사용하여, SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 비정상 (예를 들면, 감소된) 수준과 연관된 질환 또는 병태를 앓는 대상체에게 투여될 수 있다. 특정 양태에서, 전달 시스템은 벡터이다. 따라서, 일부 양태에서, 본 개시내용은 본 개시내용의 miR-485 억제제를 포함하는 벡터를 제공한다.
일부 양태에서, 벡터는 바이러스성 벡터이다. 일부 양태에서, 바이러스성 벡터는 아데노바이러스성 벡터 또는 아데노-연관된 바이러스성 벡터이다. 특정 양태에서, 바이러스성 벡터는 AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, 또는 이들의 임의의 조합의 혈청형을 갖는 AAV이다. 일부 양태에서, 아데노바이러스성 벡터는 3세대 아데노바이러스성 벡터이다. ADEASY™은 아데노바이러스성 벡터 작제물의 단연 가장 대중적 창출 방법이다. 시스템은 2개 유형의 플라스미드: 셔틀 (또는 전달) 벡터 및 아데노바이러스성 벡터로 이루어진다. 관심의 이식유전자는 셔틀 벡터에 클로닝되고, 검증되고, 제한 효소 PmeI로 선형화된다. 이 작제물은 그 다음, PADEASY™을 함유하는 BJ5183 E. 콜리 세포인, ADEASIER-1 세포로 형질전환된다. PADEASY™은 바이러스 생산에 필요한 아데노바이러스성 유전자를 함유하는 ~33Kb 아데노바이러스성 플라스미드이다. 셔틀 벡터 및 아데노바이러스성 플라스미드는 아데노바이러스성 플라스미드로의 이식유전자의 상동 재조합을 촉진하는 매칭 좌우 상동성 아암을 갖는다. 초나선 PADEASY™ 및 셔틀 벡터로 표준 BJ5183을 또한 공-형질전환시킬 수 있지만, 이 방법은 비-재조합 아데노바이러스성 플라스미드의 더 높은 배경을 초래한다. 재조합 아데노바이러스성 플라스미드는 그 다음 크기 및 적절한 제한 소화 패턴에 대하여 검증되어 이식유전자가 아데노바이러스성 플라스미드에 삽입됨, 그리고 재조합의 다른 패턴이 발생하지 않음을 결정한다. 일단 검증되면, 재조합 플라스미드는 PacI로 선형화되어 ITR에 의해 측접된 선형 dsDNA 작제물을 창출한다. 293개 또는 911개 세포는 선형화된 작제물로 형질감염되고, 바이러스는 약 7-10 일 후에 수확될 수 있다. 이 방법 이외에도, 본 출원이 제출된 당시에 당업계에서 알려진 아데노바이러스성 벡터 작제물을 창출하는 다른 방법은 본원에 개시된 방법을 실시하는데 사용될 수 있다.
일부 양태에서, 바이러스성 벡터는 레트로바이러스성 벡터, 예를 들면, 렌티바이러스성 벡터 (예를 들면, 3세대 또는 4세대 렌티바이러스성 벡터)이다. 렌티바이러스성 벡터는 세포주가 3개 별도 플라스미드 발현 시스템으로 형질감염되는 일시적 형질감염 시스템에서 보통 창출된다. 이들은 전달 벡터 플라스미드 (HIV 프로바이러스의 부문들), 패키징 플라스미드 또는 작제물, 및 상이한 바이러스의 이종 엔벨로프 유전자 (env)를 가진 플라스미드를 포함한다. 벡터의 3개 플라스미드 구성요소는 패키징 세포에 놓여지고 이는 그 다음 HIV 껍질에 삽입된다. 벡터의 바이러스 부문은 바이러스가 세포 시스템 내부에서 복제할 수 없도록 삽입 서열을 함유한다. 현행 3세대 렌티바이러스성 벡터는 9개 HIV-1 단백질 중 단 3개 (Gag, Pol, Rev)를 인코딩하고, 이는 별도 플라스미드로부터 발현되어 복제-유능 바이러스의 재조합-매개된 생성을 회피한다. 4세대 렌티바이러스성 벡터에서, 레트로바이러스성 게놈은 추가로 감소되었다 (TAKARA® LENTI-X™ 4세대 패키징 시스템).
당업계에서 알려진 임의의 AAV 벡터는 본원에 개시된 방법에서 사용될 수 있다. AAV 벡터는 알려진 벡터를 포함할 수 있거나 변이형, 단편, 또는 이의 융합체를 포함할 수 있다. 일부 양태에서, AAV 벡터는 AAV 유형 1 (AAV1), AAV2, AAV3A, AVV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AVV9, AVV10, AVV11, AVV12, AVV13, AAVrh.74, 조류 AAV, 솟과 AAV, 갯과 AAV, 말과 AAV, 염소 AVV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 솟과 AAV, 새우 AVV, 뱀 AVV, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3A, AVV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AVV9, AVV10, AVV11, AVV12, AVV13, AAVrh.74, 조류 AAV, 솟과 AAV, 갯과 AAV, 말과 AAV, 염소 AVV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 양 AAV, 새우 AVV, 뱀 AVV, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 AAV 벡터에서 유래된다.
일부 양태에서, AAV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3A, AVV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AVV9, AVV10, AVV11, AVV12, AVV13, AAVrh.74, 조류 AAV, 솟과 AAV, 갯과 AAV, 말과 AAV, 염소 AVV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 양 AAV, 새우 AVV, 뱀 AVV, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 2개 AAV 벡터에서 유래된 키메라 벡터이다.
특정 양태에서, AAV 벡터는 당업계에서 알려진 적어도 2개 상이한 AAV 벡터의 영역을 포함한다.
일부 양태에서, AAV 벡터는 제1 AAV (예를 들면, AAV1, AAV2, AAV3A, AVV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AVV9, AVV10, AVV11, AVV12, AVV13, AAVrh.74, 조류 AAV, 솟과 AAV, 갯과 AAV, 말과 AAV, 염소 AVV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 양 AAV, 새우 AVV, 뱀 AVV, 또는 이들의 임의의 유도체)로부터 역위 말단 반복부 및 제2 AAV (예를 들면, AAV1, AAV2, AAV3A, AVV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AVV9, AVV10, AVV11, AVV12, AVV13, AAVrh.74, 조류 AAV, 솟과 AAV, 갯과 AAV, 말과 AAV, 염소 AVV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 양 AAV, 새우 AVV, 뱀 AVV, 또는 이들의 임의의 유도체)로부터 제2 역위 말단 반복부를 포함한다.
일부 양태에서, AVV 벡터는 AAV1, AAV2, AAV3A, AVV3B, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AVV9, AVV10, AVV11, AVV12, AVV13, AAVrh.74, 조류 AAV, 솟과 AAV, 갯과 AAV, 말과 AAV, 염소 AVV, 영장류 AAV, 비-영장류 AAV, 양 AAV, 새우 AVV, 뱀 AVV, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된 AAV 벡터의 한 부문을 포함한다. 일부 양태에서, AAV 벡터는 AAV2를 포함한다.
일부 양태에서, AVV 벡터는 스플라이스 수용자 부위를 포함한다. 일부 양태에서, AVV 벡터는 프로모터를 포함한다. 당업계에서 알려진 임의의 프로모터는 본 개시내용의 AAV 벡터에서 사용될 수 있다. 일부 양태에서, 프로모터는 RNA Pol III 프로모터이다. 일부 양태에서, RNA Pol III 프로모터는 U6 프로모터, H1 프로모터, 7SK 프로모터, 5S 프로모터, 아데노바이러스 2 (Ad2) VAI 프로모터, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 프로모터는 거대세포바이러스 최초 유전자 (CMV) 프로모터, EF1a 프로모터, SV40 프로모터, PGK1 프로모터, Ubc 프로모터, 인간 베타 액틴 프로모터, CAG 프로모터, TRE 프로모터, UAS 프로모터, Ac5 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, CaMKIIa 프로모터, GAL1 프로모터, GAL10 프로모터, TEF 프로모터, GDS 프로모터, ADH1 프로모터, CaMV35S 프로모터, 또는 Ubi 프로모터이다. 특이적 양태에서, 프로모터는 U6 프로모터를 포함한다.
일부 양태에서, AAV 벡터는 구성적으로 활성 프로모터 (구성적 프로모터)를 포함한다. 일부 양태에서, 구성적 프로모터는 하이포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HPRT), 아데노신 데아미나제, 피루베이트 키나제, 베타-액틴 프로모터, 거대세포바이러스 (CMV), 유인원 바이러스 (예를 들면, SV40), 유두종 바이러스, 아데노바이러스, 인간 면역결핍 바이러스 (HIV), 라우스 육종 바이러스, 레트로바이러스 긴 말단 반복부 (LTR), 뮤린 줄기 세포 바이러스 (MSCV) 및 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터로 이루어지는 군으로부터 선택된다.
일부 양태에서, 프로모터는 유도성 프로모터이다. 일부 양태에서, 유도성 프로모터는 조직 특이적 프로모터이다. 특정 양태에서, 조직 특이적 프로모터는 뉴런, 아교 세포, 또는 양쪽 뉴런 및 아교 세포에서 AVV 벡터의 코딩 영역의 전사를 구동시킨다.
일부 양태에서, AVV 벡터는 하나 이상의 인핸서를 포함한다. 일부 양태에서, 하나 이상의 인핸서는 본원에 개시된 프로모터와 함께 또는 AAV 단독으로 존재한다. 일부 양태에서, AAV 벡터는 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열을 포함한다. 일부 양태에서, 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열은 bGH 폴리(A), 액틴 폴리(A), 헤모글로빈 폴리(A), 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 3'UTR 폴리(A) 꼬리 서열은 bGH 폴리(A)를 포함한다.
일부 양태에서, 본원에 개시된 miR-485 억제제는 전달 제제와 투여된다. 사용될 수 있는 전달 제제의 비-제한 예는 리피도이드, 리포솜, 리포플렉스, 지질 나노입자, 중합체성 화합물, 펩티드, 단백질, 세포, 나노입자 모방체, 나노튜브, 미셀, 또는 접합체를 포함한다.
그래서, 일부 양태에서, 본 개시내용은 또한 본 개시내용의 miRNA 억제제 (즉, miR-485 억제제) 및 전달 제제를 포함하는 조성물을 제공한다. 일부 양태에서, 전달 제제는
[WP]-L1-[CC]-L2-[AM] (화학식 I)
또는
[WP]-L1-[AM]-L2-[CC] (화학식 II)
식중
WP는 수용성 생체고분자 모이어티이고;
CC는 양으로 하전된 담체 모이어티이고;
AM은 보조제 모이어티이고;
L1 및 L2는 독립적으로 임의적 링커임,
를 포함하는 양이온성 담체 단위체를 포함하고,
여기서 약 1:1의 이온성 비로 핵산과 혼합된 경우, 양이온성 담체 단위체는 미셀을 형성한다.
일부 양태에서, 본 개시내용의 miRNA 억제제 (즉, miR-485 억제제)를 포함하는 조성물은 이온성 결합을 통해 양이온성 담체 단위체와 상호작용한다.
일부 양태에서, 수용성 중합체는 폴리(알킬렌 글리콜), 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀성 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(당류), 폴리(α-하이드록시산), 폴리(비닐 알코올), 폴리글리세롤, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린 ("POZ") 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 수용성 중합체는 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG"), 폴리글리세롤, 또는 폴리(프로필렌 글리콜) ("PPG")을 포함한다. 일부 양태에서, 수용성 중합체는
Figure pct00024
, (화학식 III),
을 포함하되, 식중 n은 1-1000이다.
일부 양태에서, n은 적어도 약 110, 적어도 약 111, 적어도 약 112, 적어도 약 113, 적어도 약 114, 적어도 약 115, 적어도 약 116, 적어도 약 117, 적어도 약 118, 적어도 약 119, 적어도 약 120, 적어도 약 121, 적어도 약 122, 적어도 약 123, 적어도 약 124, 적어도 약 125, 적어도 약 126, 적어도 약 127, 적어도 약 128, 적어도 약 129, 적어도 약 130, 적어도 약 131, 적어도 약 132, 적어도 약 133, 적어도 약 134, 적어도 약 135, 적어도 약 136, 적어도 약 137, 적어도 약 138, 적어도 약 139, 적어도 약 140, 또는 적어도 약 141이다. 일부 양태에서, n은 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 140 내지 약 150, 약 150 내지 약 160이다.
일부 양태에서, 수용성 중합체는 선형, 분지형, 또는 수지상이다. 일부 양태에서, 양이온성 담체 모이어티는 하나 이상의 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 양이온성 담체 모이어티는 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 적어도 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 31, 적어도 32, 적어도 33, 적어도 34, 적어도 35, 적어도 36, 적어도 37, 적어도 38, 적어도 39, 적어도 40, 적어도 41, 적어도 42, 적어도 43, 적어도 44, 적어도 45, 적어도 46, 적어도 47, 적어도 48, 적어도 49, 또는 적어도 50개 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 양이온성 담체 모이어티는 약 30 내지 약 50개 염기성 아미노산을 포함한다. 일부 양태에서, 염기성 아미노산은 아르기닌, 라이신, 히스티딘, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 양이온성 담체 모이어티는 약 40개 라이신 단량체를 포함한다.
일부 양태에서, 보조제 모이어티는 면역 반응, 염증성 반응, 및/또는 조직 미세환경을 조절할 수 있다. 일부 양태에서, 보조제 모이어티는 이미다졸 유도체, 아미노산, 비타민, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 보조제 모이어티는
Figure pct00025
, (화학식 IV),
을 포함하되, 식중 G1 및 G2의 각각은 H, 방향족 고리, 또는 1-10 알킬이거나, G1 및 G2는 함께 방향족 고리를 형성하고, n은 1-10이다.
일부 양태에서, 보조제 모이어티는 니트로이미다졸을 포함한다. 일부 양태에서, 보조제 모이어티는 메트로니다졸, 티니다졸, 니모라졸, 디메트리다졸, 프레토마니드, 오르니다졸, 메가졸, 아자니다졸, 벤즈니다졸, 또는 이들의 임의의 조합을 포함한다. 일부 양태에서, 보조제 모이어티는 아미노산을 포함한다.
일부 양태에서, 보조제 모이어티는
Figure pct00026
(화학식 V),
를 포함하되, 식중 Ar은
Figure pct00027
또는
Figure pct00028
이고,
식중 Z1 및 Z2의 각각은 H 또는 OH이다.
일부 양태에서, 보조제 모이어티는 비타민을 포함한다. 일부 양태에서, 비타민은 환식 고리 또는 환식 헤테로 원자 고리 및 카르복실기 또는 하이드록실기를 포함한다. 일부 양태에서, 비타민은
Figure pct00029
(화학식 VI),
을 포함하되, 식중 Y1 및 Y2의 각각은 C, N, O, 또는 S이고, n은 1 또는 2이다.
일부 양태에서, 비타민은 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 비타민 C, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E, 비타민 M, 비타민 H, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택된다. 일부 양태에서, 비타민은 비타민 B3이다.
일부 양태에서, 보조제 모이어티는 적어도 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 적어도 약 13, 적어도 약 14, 적어도 약 15, 적어도 약 16, 적어도 약 17, 적어도 약 18, 적어도 약 19, 또는 적어도 약 20개 비타민 B3을 포함한다. 일부 양태에서, 보조제 모이어티는 약 10개 비타민 B3을 포함한다.
일부 양태에서, 조성물은 약 120 내지 약 130개 PEG 단위체를 가진 수용성 생체고분자 모이어티, 약 30 내지 약 40개 라이신을 가진 폴리-라이신을 포함하는 양이온성 담체 모이어티, 및 약 5 내지 약 10개 비타민 B3을 가진 보조제 모이어티를 포함한다.
일부 양태에서, 조성물은 (i) 약 100 내지 약 200개 PEG 단위체를 가진 수용성 생체고분자 모이어티, (ii) 아민기를 가진 약 30 내지 약 40개 라이신 (예를 들면, 약 32개 라이신), (iii) 티올기를 각각 갖는 약 15 내지 20개 라이신 (예를 들면, 티올기를 각각 가진 약 16개 라이신), 및 (iv) 비타민 B3에 융합된 약 30 내지 40개 라이신 (예를 들면, 비타민 B3에 각각 융합된 약 32개 라이신)을 포함한다. 일부 양태에서, 조성물은 추가로 수용성 중합체에 결합된 표적화 모이어티, 예를 들면, LAT1 표적화 리간드, 예를 들면, 페닐 알라닌을 포함한다. 일부 양태에서, 조성물에서 티올기는 디술피드 결합을 형성한다.
일부 양태에서, 조성물은 (1) (i) 약 100 내지 약 200개 PEG 단위체, (ii) 아민기를 가진 약 30 내지 약 40개 라이신 (예를 들면, 약 32개 라이신), (iii) 티올기를 각각 갖는 약 15 내지 20개 라이신 (예를 들면, 티올기를 각각 가진 약 16개 라이신), 및 (iv) 비타민 B3에 융합된 약 30 내지 40개 라이신 (예를 들면, 비타민 B3에 각각 융합된 약 32개 라이신)을 포함하는 미셀, 및 (2) miR485 억제제 (예를 들면, 서열번호: 30)를 포함하고, 여기서 miR485 억제제는 미셀 내에서 캡슐화된다. 일부 양태에서, 조성물은 추가로 PEG 단위체에 결합된 표적화 모이어티, 예를 들면, LAT1 표적화 리간드, 예를 들면, 페닐 알라닌을 포함한다. 일부 양태에서, 미셀에서 티올기는 디술피드 결합을 형성한다.
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 miRNA 억제제 (즉, miR-485 억제제, 예를 들면, 서열번호: 30)를 포함하는 미셀을 제공하고 여기서 miRNA 억제제 및 전달 제제는 서로 연관된다.
일부 양태에서, 연관은 공유 결합, 비-공유 결합, 또는 이온성 결합이다. 일부 양태에서, 양이온성 담체 단위체의 양이온성 담체 모이어티의 양전하는 용액에서 본원에 개시된 miR-485 억제제와 혼합된 경우 미셀을 형성하는데 충분하고, 여기서 용액에서 양이온성 담체 단위체의 양이온성 담체 모이어티의 양전하 및 miR-485 억제제 (또는 억제제를 포함하는 벡터)의 음전하의 전반적 이온성 비는 약 1: 1이다.
일부 양태에서, 양이온성 담체 단위체는 효소적 분해로부터 본 개시내용의 miRNA 억제제 (즉, miR-485 억제제)를 보호할 수 있다. 이 전체가 참조로 본원에 편입되는, 2020년 12월 30일 공개된, PCT 공개 번호 WO2020/261227 참조.
V. 약학적 조성물
일부 양태에서, 본 개시내용은 또한 대상체에게 투여에 적합한 본원에 개시된 miR-485 억제제 (예를 들면, miR-485 억제제를 포함하는 벡터 또는 폴리뉴클레오티드)를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 약학적 조성물은 일반적으로 대상체에게 투여에 적합한 형태로 본원에 기재된 miR-485 억제제 (예를 들면, 폴리뉴클레오티드 또는 벡터) 및 약학적으로-허용가능한 부형제 또는 담체를 포함한다. 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체는 투여되는 중인 특정한 조성물에 의해, 뿐만 아니라 조성물을 투여하는데 사용된 특정한 방법에 의해 부분적으로 결정된다.
따라서, 본 개시내용의 miR-485 억제제를 포함하는 약학적 조성물의 매우 다양한 적합한 제형이 있다. (예를 들면, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., Easton, Pa. 18th ed. (1990), 참조). 약학적 조성물은 일반적으로 멸균 제형화되고 미국 식품의약국의 모든 우수 의약품 제조관리 기준 (GMP) 규정을 완전히 준수한다.
VI. 키트
본 개시내용은 또한 본 개시내용의 miRNA 억제제 (예를 들면, 본원에 개시된 폴리뉴클레오티드, 벡터, 또는 약학적 조성물) 및 임의로 사용 지침, 예를 들면, 본원에 개시된 방법에 따른 사용 지침을 포함하는 키트 또는 제조 제품을 제공한다. 일부 양태에서, 키트 또는 제조 제품은 하나 이상의 용기에서 miR-485 억제제 (예를 들면, 벡터, 예를 들면, 본 개시내용의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약학적 조성물)를 포함한다. 일부 양태에서, 키트 또는 제조 제품은 miR-485 억제제 (예를 들면, 벡터, 예를 들면, 본 개시내용의 AAV 벡터, 폴리뉴클레오티드, 또는 약학적 조성물) 및 브로셔를 포함한다. 당업자는 본원에 개시된 miR-485 억제제 (예를 들면, 본 개시내용의 벡터, 폴리뉴클레오티드, 및 약학적 조성물, 또는 이들의 조합)가 당업계에서 잘 알려지는 확립된 키트 형식 중 하나로 용이하게 편입될 수 있음을 용이하게 인식할 것이다.
하기 실시예는 제한의 방식이 아닌 예시의 방식으로 제공된다.
실시예
실시예 1: 물질 및 방법
달리 제공되지 않는 한, 하기 기재된 실시예는 하기 물질 및 방법 중 하나 이상을 사용한다:
인간 조직
알츠하이머병 (AD)을 가진 환자들로부터 그리고 대조군으로부터 뇌 중심 전회 샘플은 네덜란드 뇌 은행에서 구매되었다. 이들 환자들 및 대조군에 관련된 정보는 표 1에 나타난다.
마우스
B6SJLF1/J (JAX#100012), 및 5마리 가족성 AD 돌연변이 (5XFAD) 유전자이식 마우스 (#MMRRC#034848)는 잭슨 실험실(The Jackson Laboratory) (Bar Harbor, ME, USA)에서 구매되었다. 5XFAD 마우스는, 2개 FAD 돌연변이 (M146L 및 L286V)를 운반하는 돌연변이체 인간 프레세닐린 1 (PS1)과 함께, 스웨덴 (K670N, M671L), 플로리다 (I716V), 및 런던 (V717I) 돌연변이를 가진 돌연변이체 인간 아밀로이드 전구체 단백질 (APP)을 과발현시킨다. 이들 이식유전자는 뉴런에서 Thy1 프로모터에 의해 조절된다. 5XFAD 마우스의 유전자형은 잭슨 실험실에 의해 제공된 표준 PCR 조건에 따라 꼬리 DNA의 PCR 분석에 의해 확인되었다. 혼합된 유전자형의 마우스는 12-시간 명/12-시간 암 주기 그리고 음식 및 물에 자유롭게 케이지당 4 내지 5마리 수용되었다. 모든 동물 절차는 실험실 동물의 관리 및 사용에 대하여 건양 대학교 가이드라인에 따라 수행되었다. 동물 연구는 건양 대학교 위원회 (허가 번호: P-18-18-A-01)에 의해 승인되었다.
6-하이드록시도파민 (6-OHDA) 마우스 (C57BL/6; 8 주령; 20-23 g)는 KOATECH (대한민국, 평택)에서 수득되었다. 마우스는 통제된 환경에서 수용되었고 음식 및 물이 자유롭게 제공되었다.
마우스 전두 피질 조직을 사용하는 차세대 시컨싱
NGS는 Theragen Etex Bio Institute (서울, 대한민국, www.theragenetex.com/kr/bio)에 의해 NovaSeq 6000 시스템 (Illumina)에서 수행되었다. TruSeq Stranded mRNA Library Kit (Illumina)는 라이브러리를 구축하는데 사용되었다. 그 이후, 데이터는 mRNA 시컨싱을 위하여 '원시 판독'을 사용하여 처리되었다. 원시 판독은 'RSEM' 발현 값의 계산을 위하여 STAR 정렬기 v2.7.1을 사용하여 GRCm38.96 (NCBI)에 정렬되었다. Dobin 등, Bioinformatics 29(1): 15-21 (2013). 우리는 STAR 정렬기를 디폴트 옵션으로서 수행하였다. 각 샘플에 대하여 판독의 총 수가 상이하므로, 정규화는 TMM 방법에 의해 수행되었다. 13개 마우스 샘플은 동일한 식으로 처리되었다. 모든 데이터는 GSE142633으로서 GEO (Gene Expression Omnibus, www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)에서 이용가능하다.
공공 데이터베이스 활용, 재분석, 및 네트워크 분석
우리는 인지 손상에 매우 관련되는 miRNA를 확인하기 위해 Weinberg 등으로부터의 결과를 사용하였다. Weinberg 등, Front Neurosci 9:430 (2015). 도 EV1에서 도시된 100개 유전자는 Weinberg 등의 표 1로부터 추출되었다. 우리는 log2를 Weinberg 등의 결과에서 가져왔고, 이들을 정돈하고, 표적 miRNA를 표시하였다. "miRDB"는 특정 유전자를 표적하는 miRNA를 검색하는데 사용되었다. Wong 등, Nucleic Acids Res 43:D146-52 (2015). "Genecard" 데이터베이스는 질환 또는 생물학적 증상에 관련된 유전자를 검색하는데 사용되었다. Rebhan 등, Bioinformatics 14(8):656-64 (1998). 도 EV2A에서의 결과는 2019년 8월에 키워드, "염증", "아밀로이드 베타 분해" 및 "알츠하이머"를 사용함으로부터 검색 결과를 보여준다. 우리는 벤 다이어그램용 분석을 위하여 R의 "벤다이어그램" 패키지를 사용하였다. Cytoscape (버전 3.7.1)의 "GeneMAINA" (버전 3.5.1) 패키지는 단백질 대 단백질 상호작용 분석에 사용되었다. Franz 등, Nucleic Acids Res 46(W1):W60-W64 (2018). 우리는 단백질 상호작용 분석을 위한 입력으로서 hsa-miR-485-3p 표적 유전자 및 알츠하이머-관련 유전자를 포함하였던 265개 공통 유전자를 사용하였다. 이들 중에서, 139개 유전자는 이웃 유전자 없이 상호작용하였다. 이밖에도, 9개 유전자는 대뇌 신경계 질환 (AD 포함)과 고도로 연관되었고 동시에, 낮은 발현은 환자 그룹에서 또는 치매 마우스 모델에서 보고되었다.
miR-485 억제제의 뇌실내 주사
miR485-3p 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO) (즉, miR-485 억제제) (AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC) (서열번호: 30) 및 대조군 올리고뉴클레오티드 ("miR-대조군") (CCTTCCCTGAAGGTTCCTCCTT) (서열번호: 61)는 Integrated DNA Technologies (USA)에 의해 합성되었다. 모든 동물은 산소 중 3-5 % 이소플루란으로 처음에 마취되었고 정위 프레임 (JeongDo)에 고정되었다. 뇌실내 (ICV) 주사를 위하여, miR-485 억제제 또는 비-표적화 대조군 올리고뉴클레오티드는 생체내 jetPEI 시약 (Polyplus)으로 제형화되었다. 생체내 jetPEI 시약으로 제형화된, miR-485 억제제 (1.5 μg) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드는 1.5　μL/분으로 10 μL Hamilton 주사기 (26-구경 뭉툭 바늘)로 주사되었다. miR-485 억제제 및 대조군 올리고뉴클레오티드는 뇌실내 (ICV)로 10-개월령 5XFAD 마우스에 5　μL의 부피로 주입되었다. miR-485 억제제 또는 비-표적화 대조군 올리고뉴클레오티드는 2 주 동안 1주 1회 주어졌다. 뇌실내 (ICV) 위치는 전정으로부터 좌표를 사용하여 식별되었다: AP=-0.2 mm, L=±1.0 mm, 복부 (V)=-2.5mm.
miR-485 억제제의 정맥내 주사
miR485-3p 안티센스 올리고뉴클레오티드 (ASO) (즉, miR-485 억제제) (AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC) (서열번호: 30) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드 ("miR-대조군") (CCTTCCCTGAAGGTTCCTCCTT) (서열번호: 61)는 나노입자에 로딩되었고, 이는 페길화된 (PEG) 쉘, 가교된 코어, 및 하나 이상의 뇌 표적을 포함한다. 일부 양태에서, ASO는 형광적으로 태깅되어 (예를 들면, Cy5.5) 생체내 이미지화를 사용하는 추적을 허용하였다. 미셀 또는 ASO의 주사 전에, 형광 이미지는 주사전 이미지로서 촬영되었다. ASO 로딩된 나노입자 (25 μg의 ASO)는 마우스에 정맥내로 투여되었고 (꼬리-정맥 주사) 마우스의 형광 이미지는 IVIS 생체내 이미지화 시스템을 사용하여 원하는 시간에 촬영되었다. 달리 지시되지 않는 한, 마우스는 ASO 로딩된 나노입자의 단일 용량을 받았다. 형광 이미지는 최대 16 시간 관찰되었고, ASO 로딩된 미셀의 시간 의존적 형광 강도는 나체된 ASO 주사된 마우스와 비교되었다. ASO 로딩된 미셀 및 ASO의 형광 이미지는 ASO의 분포로서 간주되었고, 2개 그룹의 생체-분포 행동은 비교되었다.
모든 동물은 산소 중 3-5 % 이소플루란으로 처음에 마취되었고 정위 프레임 (JeongDo)에 고정되었다. 뇌실내 (ICV) 주사를 위하여, miR-485 억제제 또는 비-표적화 대조군 올리고뉴클레오티드는 생체내 jetPEI 시약 (Polyplus)으로 제형화되었다. 생체내 jetPEI 시약으로 제형화된, miR-485 억제제 (1.5 μg) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드는 1.5　μL/분으로 10 μL Hamilton 주사기 (26-구경 뭉툭 바늘)로 주사되었다. miR-485 억제제 및 대조군 올리고뉴클레오티드는 뇌실내 (ICV)로 10-개월령 5XFAD 마우스에 5　μL의 부피로 주입되었다. miR-485 억제제 또는 비-표적화 대조군 올리고뉴클레오티드는 2 주 동안 1주 1회 주어졌다. 뇌실내 (ICV) 위치는 전정으로부터 좌표를 사용하여 식별되었다: AP=-0.2 mm, L=±1.0 mm, 복부 (V)= -2.5mm.
아교 세포 및 피질 뉴런 배양 및 형질감염
마우스 일차 혼합된 아교 세포는 1- 내지 3-일령 C57BL/6 마우스의 대뇌 피질로부터 배양되었다. 대뇌 피질은 해부되었고 피펫팅에 의해 단일-세포 현탁액으로 분쇄되었다. 그 다음, 단일-세포 현탁액은 0.05 mg/ml 폴리-D-라이신 (PDL)으로 사전-코딩된 6-웰 플레이트로 플레이팅되었고 2 주 동안 25　mM 글루코스, 10% (vol/vol) 열-불활성화된 태아 솟과 혈청, 2 mM 글루타민 및 1,000　단위/mL 페니실린-스트렙토마이신 (P/S)으로 보충된 DMEM 배지에서 배양되었다. 일차 피질 뉴런은 배아 17 일차 마우스로부터 배양되었다. 간단하게, 피질은 해부되었고 빙냉된 HBSS (Welgene, LB003-02) 용액에서 인큐베이션되었고 37℃에 15 분 동안 아큐맥스 (Sigma, Cat#A7089)에서 해리되었다. 배양물은 HBSS에서 2회 린스처리되었다. 마우스 뉴런은 2% B27 (Gibco, Cat#17504), 1% 피루브산나트륨, 및 1% P/S를 함유하는 신경기저 배지 (Gibco, Cat#21103049)에 재현탁되었다. 세포는 70 μM 셀 스트레이너 (SPL, 93070)를 통해서 여과되었고, 배양 플레이트에서 플레이팅되었고 가습된 5% CO2 인큐베이터에 37℃에서 유지되었다. 배지는 매 3 일 교환되었고 그 다음 시험관내 12-13 일 후, 세포는 실험에 사용되었다. 일차 아교 세포 또는 피질 뉴런은 TRANSIT-X2® 형질감염 시약 (Mirus Bio)를 사용하여 100 nM miR-대조군, 100 nM has-miR485-3p 모방체 또는 100 nM miR-485 억제제로 형질감염되었다.
루시퍼라제 검정
miR-485-3p에 대하여 표적 부위를 함유하는 인간 SIRT1 3'-UTR은 PCR 증폭에 의해 cDNA로부터 증폭되었고 psiCHECK2 벡터 (Promega, Cat#C8021)에 삽입되었다. 96-웰 플레이트에서 HEK293T 세포는 리포펙타민 2000 (Invitrogen, Cat#11668-027)을 사용하여 psiCHECK2-Sirt1-3'UTR 야생형 (WT) 또는 psiCHECK2-Sirt1-3'UTR 돌연변이체 (MT) 및 miR-485-3p와 공-형질감염되었다. 세포는 48 시간 후에 수확되었고, 이중 루시퍼라제 검정 시스템 (Promega, Cat#E1910)은 루시퍼라제 리포터 활성을 측정하는데 사용되었다. 3개 독립적 실험은 삼중으로 수행되었다.
miR-485-3p에 대하여 표적 부위를 함유하는 인간 CD36 3'-UTR은 PCR 증폭에 의해 cDNA로부터 증폭되었고 pMir-표적 벡터 (Addgene)에 삽입되었다. 96-웰 플레이트에서 HEK293T 세포는 리포펙타민 2000 (Invitrogen, Cat#11668-027)을 사용하여 pMir-CD36-3'UTR WT 또는 pMir-CD36-3'UTR MT 및 pRL-SV40 벡터 (Addgene) 및 miR-485-3p와 공-형질감염되었다. 세포는 24~48 시간 후에 수확되었고, 이중 루시퍼라제 검정 시스템 (Promega, Cat#E1910)은 루시퍼라제 리포터 활성을 측정하는데 사용되었다. 3개 독립적 실험은 삼중으로 수행되었다.
시험관내 결합 검정
스트렙타비딘 자성 비드 (Invitrogen, Cat#11205D)는 시험관내 결합 검정을 위하여 다음과 같이 제조되었다. 비드 (50 μL)는 500 μL의 1X B&W 완충액 (5 mM Tris-HCl, pH 7.4; 0.5 mM EDTA; 1 M NaCl)으로 5회 세정되었다. 상청액을 제거한 후, 비드는 4℃에서 2 시간 동안 100 μg의 효모 tRNA (Invitrogen, Cat# AM7119)를 함유하는 500 μL의 1X B&W 완충액으로 인큐베이션되었다. 비드는 500 μL의 1X B&W 완충액으로 2회 세정되었고 실온에서 10　분 동안 400 pmol의 비오틴-miR485-3p를 함유하는 200 μL의 1X B&W 완충액으로 인큐베이션되었다. 상청액은 제거되었고 비드는 500 μL의 1X B&W 완충액으로 2회 세정되었고 자성 스탠드로 수집되었다. miRNA-코팅된 비드는 4℃에서 밤새 1 μg의 시험관내 전사된 표적 mRNA를 함유하는 500 μL의 1X B&W 완충액으로 인큐베이션되었다. 다음 날, 비드는 1 ml의 1X B&W 완충액으로 5회 세정되었고 그 다음 200 μL의 RNase-없는 물에 재현탁되었다. 결합된 RNA는 제조업체의 지침 하에 QiaZol 용해 시약 (Qiagen, Cat#79306)으로 추출되었다. 추출된 RNA는 StepOnePlus 실시간 PCR 시스템 (Applied Biosystems, REF: 4376592)에 의해 정량화되었다.
웨스턴 블랏
뇌 조직, 일차 아교 세포 또는 피질 뉴런 세포는 30 분 동안 빙상에서 프로테아제/포스파타제 억제제 칵테일 (Cell Signaling Technology, Cat#5872)을 함유하는 빙냉된 RIPA 완충액 (iNtRON Biotechnology)에서 균질화되었다. 용해물은 4 ℃에서 15 분 동안 13,000 rpm으로 원심분리되었고, 상청액은 수집되었다. 샘플은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리되었고, PVDF 막으로 전달되었고 하기 일차 항체로 인큐베이션되었다: 토끼 항-PGC-1α (Abcam, Cat# ab54481, 1:1000), 토끼 항-APP (Cell Signaling Technology, Cat#2452, 1:1000), 마우스 항-sAPPα (IBL, Cat#11088, 1:1000), 마우스 항-sAPPα (IBL, Cat#10321, 1:1000), 토끼 항-Adam10 (Abcam, Cat#ab1997, 1:100), 마우스 항-CTFs (Biolegend, Cat#SIG-39152, 1:1000), 토끼 항-β-아밀로이드 (1-42) (Cell Signaling Technology, Cat#14974, 1:1000), 토끼 항-BACE1 (Abcam, Cat# ab2077, 1:1000), 마우스 항-NeuN (Millipore, #MAB377, 1:1000), 토끼 항-절단된 카스파제 3 (Cell Signaling Technology, Cat#9664, 1:1000), 마우스 항-GFAP (Merck, Cat#MAB360, 1:1000), 토끼 항-IL-1β (abcam, Cat#9722, 1:1000), 토끼 항-NF-kB(p65) (Cell Signaling Technology, Cat#8242, 1:1000), 염소 항-Iba1 (Abcam, Cat#ab5076, 1:1000), 토끼 항-SIRT1 (Abcam, Cat#04-1557), 마우스 항-TNF-α (Santa Cruz, Cat#sc-52746), 항-액틴 (Santa Cruz, Cat#sc-47778). 결과는 향상된 화학발광 시스템을 사용하여 시각화되었고, 밀도계적 분석 (Image J 소프트웨어, NIH)에 의해 정량화되었다. 모든 실험은 독립적으로 적어도 3회 수행되었다.
뇌 조직에서 티로신 하이드록실라제 발현을 측정하기 위해 (실시예 15 참조), 뇌 조직은 30 분 동안 빙상에서 프로테아제/포스파타제 억제제 칵테일 (Cell Signaling Technology, Cat#5872)을 함유하는 빙냉된 RIPA 완충액 (iNtRON Biotechnology)에서 균질화되었다. 용해물은 4 ℃에서 15 분 동안 13,000 rpm으로 원심분리되었고, 상청액은 수집되었다. 샘플은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동에 의해 분리되었고, PVDF 막으로 전달되었고 하기 일차 항체로 인큐베이션되었다: 토끼 항-티로신 하이드록실라제 (TH; 1:2000; Pel-Freez, Brown Beer, Wisconsin, USA), 및 마우스 항-β-액틴 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA). 이어서, 막은 실온에서 1 시간 동안 이차 항체로 인큐베이션되었고, 밴드는 웨스턴-블랏 검출 시약 (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)을 사용하여 마지막으로 검출되었다. 정량적 분석을 위하여, 각 밴드의 밀도는 컴퓨터 이미지화 장치 및 동반 소프트웨어 (Fuji Film, 도꾜, 일본)를 사용하여 측정되었고, 수준은 각 샘플을 위한 하우스키핑 단백질 밴드로 정규화된 밀도로서 정량적으로 발현되었다. 모든 실험은 독립적으로 적어도 3회 수행되었다.
가용성 및 불용성 Aβ 추출
뇌 조직 샘플은 빙상에서 프로테아제/포스파타제 억제제를 함유하는 RIPA 완충액으로 균질화되었고, 이어서 15 분 동안 12,000 rpm으로 원심분리되었다. 상청액은 수집되었다. 뇌 조직으로부터 불용성 분획을 수득하기 위해, 뇌 용해물의 펠릿은 30 분 동안 빙상에서 프로테아제/포스파타제 억제제 칵테일을 함유하는 불용성 추출 완충액 [50mM Tris-HCl (pH7.5) + 2% SDS]에서 용해되었다. 용해물은 4 ℃에서 15 분 동안 13,000 rpm으로 원심분리되었다. 단백질은 비신코닌산 (BCA) 검정 키트 (Bio-Rad Laboratories, Cat#5000116)를 사용하여 정량화되었고 동일 최종 농도로 조정되었다. 변성 후, 용해물은 웨스턴 블랏팅을 위하여 처리되어 불용성 Aβ를 측정하였다.
면역조직화학
면역조직화학을 위하여, miR-485 억제제 또는 대조군 올리고뉴클레오티드 주사된 5XFAD 뇌는 제거되었고, 사후-고정되었고 파라핀에 포매되었다. 경색을 통해서 관상 절편 (10-μM 두께)은 마이크로톰을 사용하여 절단되었고 슬라이드에 장착되었다. 파라핀은 제거되었고, 절편은 PBS-T로 세정되었고 2 시간 동안 10% 솟과 혈청 알부민에서 차단되었다. 그후, 하기 일차 항체는 적용되었다: 정제된 마우스 항-β-아밀로이드, 1-16 (Biolegend, #803001, 1 μg/ml), 토끼 항-β-아밀로이드 (1-42) (Cell Signaling Technology, #14974s, 1:100), 토끼 항-Iba-1 (Wako, #019-19741, 2 μg/ml), 염소 항-Iba-1 (Abcam, #ab5076, 2 μg/ml), 토끼 항-CD68 (Abcam, #ab125212, 1 μg/ml), 토끼 항-GFAP (Abcam, #ab16997, 1:100), 마우스 항-GFAP (Millipore, #MAB360, 1:500) 랫트 항-CD36 (Abcam, #ab80080, 1:100), 마우스 항-TNF-α (Santa Cruz, #sc-52746, 1:100), 토끼 항-IL-1β (Abcam, #ab9722, 1 μg/ml), 토끼 항-절단된 카스파제-3 (Cell Signaling Technology, #9662S, 1:300), 마우스 항-NeuN (Millipore, #MAB377, 10 μg/ml). 이미지는 공초점 현미경 (Leica DMi8)을 사용하여 수득되었다. 상대 밴드 강도는 ImageJ 소프트웨어 (NIH)를 사용하여 액틴에 비해 정규화되었다.
티오플라빈-S 염색
티오플라빈-S(ThS) 염색을 위하여, 슬라이싱된 뇌는 8 분 동안 여과된 1% 수성 티오플라빈-S 용액으로 염색되었다. 절편은 그 다음 80%, 95% 에탄올로 린스처리되었고 증류수로 3회 세정되었다. 이후, 뇌 슬라이스는 장착되었고 슬라이드는 밤새 어둠 속에서 건조하게 되었다. 이미지는 Leica 형광 현미경에서 촬영되었다.
Aβ 1-42 피브릴의 제조
Aβ1-42 헥사플루오로이소프로파날 (HFIP) 펩티드 (#AS-64129)는 AnaSpec (Fremont, Ca, USA)에서 수득되었다. Aβ 1-42 피브릴은 이전에 기재된 대로 제조되었다. Coraci 등, American J of Pathology 160(1): 101-12 (2002). fAβ 합성 인간 Aβ1-42를 형성하기 위해, Aβ1-42. HFIP 펩티드는 5 mM의 스톡 농도로 DMSO에 용해되었다. 스톡은 그 다음 무혈청 DMEM에서 100 μM로 희석되었고 37℃에서 72 시간 동안 인큐베이션되었다. 섬유질 Aβ (fAβ)는 SDS-PAGE에 의해 확인되었다.
시험관내 식세포작용 검정 (ELISA 및 면역세포화학)
BV2 미세아교 세포 (2 x 105)는 6-웰 플레이트에 밤새 플레이팅되었다. 세포는 제조업체의 지침에 따라 TRANSIT-X2® 형질감염 시약 (Mirus Bio, Cat#MIR6000)을 사용하여 형질감염되었고 1 μM의 최종 농도에서 4 시간 동안 fAβ로 치료되었다. 적용가능한 경우, 항-CD36 항체는 fAβ를 가진 배지에 적용되었다. 4 시간 후, 배지는 BV2 미세아교세포로부터 수집되었다. 상청액 중 인간 Aβ (1-42)의 수준은 제조업체의 지침에 따라 인간 Aβ42 ELISA 키트 (Invitrogen, Cat#KHB3441)에 의해 측정되었다.
이밖에도, 아교 식세포작용은 형광 현미경에 의해 검증되었다. 커버슬립은 폴리-l-라이신로 코팅된 다음 밤새 24-웰 플레이트의 웰에서 휴식하는 커버슬립당 8 x 104 일차 아교 세포를 플레이팅하였다. 일차 아교 세포는 제조업체의 지침에 따라 TRANSIT-X2® 형질감염 시약 (Mirus Bio)을 사용하여 형질감염되었고 1 μM의 최종 농도로 4 시간 동안 미표지화된 fAβ에 인큐베이션되었다. 4-시간 인큐베이션 후, 세포는 차가운 PBS로 세정되었다. Aβ 흡수 측정을 위하여, 일차 아교 세포는 그 다음 -20℃에 1 시간 동안 100% 메탄올로 고정되었고, PBS-T로 세정되었고 4 ℃에서 마우스 항-β-아밀로이드 1-16, 토끼 항-GFAP (abcam, #ab16997, 1:100) 및 토끼 항-Iba-1 (Wako, #019-19741, 2 μg/ml)로 인큐베이션되었다
FACS 분석
모든 염색 단계는 어둠 속에서 수행되었고 BD Fc 블록으로 차단되었다. 일차 아교 세포는 4 ℃에 30 분 동안 하기 항체: Alexa 488-접합된 항-마우스 CD36 (Biolegend, Cat#102607, 5 μg/ml) 또는 아이소타입 대조군 Ab (Biolegend, Cat#400923, 5 μg/ml)를 사용하여 염색되었다. 30 분후, 세포는 FACS 완충액 (PBS+1%)으로 세정되었다. 데이터는 CellQuest (BD Bioscience) 및 FlowJo 소프트웨어 (Treestar) 패키지로 분석되었다.
실시간 PCR
총 RNA는 소형 및 대형 RNA 키트 (Macherey Nagel, Dfiren)의 단리를 사용하여 단리되었다. cDNA는 miScript II RT 키트 (Qiagen, 힐덴, 독일)을 사용하여 합성되었다. 분석을 위하여 miR-485-3p의 발현은 CFX 연계 시스템 (Bio-Rad)에서 TOPREAL™ qPCR 2X PreMIX (Enzynomics, 대한민국)를 사용하는 TaqMan miRNA 분석에 의해 수행되었다. 개별 cDNA의 실시간 PCR 측정은 SYBR 그린 및 Taq 맨 프로브를 사용하여 수행되어 Bio-Rad 실시간 PCR 시스템을 가진 이중체 DNA 형성을 측정하였다. 프라이머는 다음과 같았고: 프로브: FAM-CGAGGTCGACTTCCTAGA-NFQ. (서열번호: 51) miR-485-3p 정방향: 5'-CATACACGGCTCTCCTCTCTAAA-3' (서열번호: 52); 마우스 프라이머: 액틴 정방향: 5'-TCCTGTGGCATCCATGAAAC-3' (서열번호: 53), 역방향: 5'-CAATGCCTGGGTACATGGTG-3' (서열번호: 54); TNF 정방향: 5'-CCAAGTGGAGGAGCAGCT-3' (서열번호: 55), 역방향: 5'-GACAAGGTACAACCCATCGG-3' (서열번호: 56); IL-1β 정방향: 5'-TTCGACACATGGGATAACGAGG-3' (서열번호: 57), 역방향: 5'-TTTTTGCTGTGAGTCCCGGAG-3' (서열번호: 58); miR-16 정방향: 5'-CAGCCTAGCAGCACGTAAAT-3' (서열번호: 59); 역방향: 5'-GAATCGAGCACCAGTTACG-3' (서열번호: 60); miR-16 수준은 정규화에 사용되었다. 상대 유전자 발현은 2-△△ct 방법에 의해 분석되었다.
ELISA (TNF-α 및 IL-1β)
일차 혼합된 아교 (2 x 105) 세포는 밤새 6-웰 플레이트에 플레이팅되었다. 세포는 1 μg/ml의 최종 농도로 18 시간 동안 마우스 α-시누클레인 PFF (응집된 형태)를 가진 miR-485 억제제 치료되었다. 18 시간 후, 배지는 일차 혼합된 아교 세포로부터 수집되었다. 상청액내 TNF-a 및 IL-1b의 수준은 마우스 TNF-a ELISA 키트 (R&D 시스템, Cat# MTA00B) 및 마우스 IL-1b ELISA 키트 (R&D 시스템, Cat# MLB00C)에 의해 측정되었다. ELISA는 제조업체의 지침에 따라 수행되었다.
행동 테스트 (Y-미로 및 수동 회피)
Y-미로는 서로 120°인 3개의 흑색 불투명 플라스틱 아암 (30 cm × 8 cm × 15 cm)으로 이루어졌다. 5XFAD 마우스는 중앙에 배치되었고 모두 3개 아암을 탐색하게 되었다. 아암 진입의 횟수 및 시도의 횟수 (시프트는 중심에서 10cm 이동이고, 3개 별도 아암으로 진입함)는 교대의 백분율을 계산하기 위해 기록되었다. 진입은 Y-미로 아암을 진입하는 모두 3개 종속물로 정의되었다. 교대 행동은 트라이어드 수를 아암 진입의 수에서 2를 뺀 다음 100을 곱한 것으로서 정의되었다.
수동 회피 챔버는 백색 (밝은) 및 흑색 (어두운) 구획 (41cm × 21cm × 30cm)으로 분할되었다. 밝은 구획은 60W 전기 램프가 들어있었다. (어둠의) 바닥 부분은 5 mm 떨어져 이격된 다수의 (2-mm) 스테인리스 스틸 막대가 들어있었다. 테스트는 3 일 동안 실시되었다. 첫번째 날은 마우스를 5 분 동안 밝은 구역에서 적응시킨다. 두번째 날은 훈련 시기이다. 연구는 2개 단계로 이루어진다. 제1 단계는 각 마우스를 밝은 구역에 배치하고 그 다음 어두운 구역으로 2회 움직여진다. 제1 단계 1 시간 후, 각 마우스는 밝은 구획에 배치된다. 2개 구획을 분리시키는 문은 30 초 후에 개방되었고 마우스가 어두운 구획에 진입한 후, 문은 닫혔고 전기 발 충격 (0.3 mA/10 g)은 그리드 바닥을 통해서 3 초 동안 전달되었다. 마우스가 5 분 초과 동안 어두운 구역으로 가지 않으면, 회피를 학습한 것으로 간주되고, 훈련은 최대 5회 실시되었다. 훈련 시험 24 시간 후, 마우스는 테스트하기 위하여 밝은 챔버에 배치되었다. 대기시간은 2개 구획을 분리시키는 문이 개방된 후 마우스가 어두운 챔버에 진입하는데 걸린 시간으로서 정의되었다. 마우스가 어두운 구역에 진입하고 밝은 구역으로 나오는데 걸린 시간은 TDC (어두운 구획에서 보낸 시간)로서 정의되었다.
행동 테스트 (로타로드)
마우스는 3 연속 일 동안 1일 1회 600 초 동안 10 rpm의 고정된 스피드로 로타로드 기구 (3cm 막대 직경)에서 훈련되었다. 막대에서의 성능은 300 초 지나 4-40 rpm의 일정한 가속도 비율로 평가되었다. 2개 연속 시도는 60 분 간격으로 수행되었다.
행동 테스트 (줄 매달리기 테스트)
운동 협응의 줄 매달리기 테스트를 위하여, 마우스는 2 mm 두께 및 55 cm 길이 팽팽한 금속 줄에서 테스트되었다. 주문-제작된 것은 마우스가 떨어질 수 있는 60 cm 길이인 흑색 폴리스티렌 박스로 이루어지는 매달리기 기구이었다. 매달린 후 줄에서 떨어지는 마우스의 대기시간은 마우스당 3회 시도에서 가장 긴 매달기 시간을 측정하여 기록되었다.
행동 테스트 (장대 테스트)
장대 테스트는 동물의 민첩성을 사정하고 서동증의 치수일 수 있다. 마우스는 거친-표면화된 장대 (직경이 8mm 및 높이가 55 cm)의 상단에 머리가 위로 향하게 배치되었다. 성능은 각 마우스가 상단에서 바닥에 도달하는데 걸린 총 시간으로서 측정되었다. 실제 테스트 전, 마우스는 3일 동안 5회 시도/일로 훈련되었다. 각 마우스의 자발운동 활성은 6-OHDA 및 miR-485 억제제 i.v. 투여후 6 일에 수행된 5회 시도의 평균으로서 평가되었다.
행동 테스트 (평균대 테스트)
마우스는 0.5 cm 폭, 1 m 길이 평균대 기구에서 있었다. 평균대는 통로의 끝에 어두운 휴식 상자가 있는 50 cm 높이인 투명한 플랙시글라스 구조로 이루어졌다. 마우스는 아침에 3회 동안 대에서 훈련되었고, 최소 15 분의 시도간 휴식 기간을 허용하였다. 마우스는 그들의 홈 케이지에 다시 배치되기 전 적어도 10 초 동안 어두운 휴식 상자에 두어졌다. 마우스는 그 다음 훈련 세션 후 적어도 2 시간에 오후에 다시 테스트되었다. 테스트 세션 동안, 마우스 성능은 기록되었다. 테스트는 적어도 10 분의 시도간 휴식 기간을 가진 3회 시도로 이루어졌다. 총 발 미끄러짐의 횟수는 3회 테스트 중 마지막에 대하여 수동으로 계산되었다. SOD1G93A 돌연변이체의 경우 마우스는 PBS 또는 miR-485 억제제 주사 후 44 또는 48 일에 테스트되었다.
데이터 분석
모든 데이터는 평균 ± SD로서 제시된다. NGS 데이터는 R (버전 3.5.2)을 사용하여 분석되었다. 2개 상이한 그룹에 대하여 수득된 값에서 통계적 유의성은 미짝짓기된 t-테스트를 사용하여 결정되었다. 통계적 테스트는 GraphPad Prism 5 또는 8 (GraphPad Software, La Jolla, CA)을 사용하여 수행되었다. 2개 그룹 사이 통계적 유의성은 2-원 Anova 및 미짝짓기된 t-테스트에 의해 분석되었다. 행동 테스트는 비모수 통계적 절차에 의해 사정되었다.
실시예 2: miR-485 억제제의 제조
(a) 알킨 변형된 티로신의 합성: 알킨 변형된 티로신은 BBB에서 LAT1 수송체로 본 개시내용의 미셀을 유도하기 위해 양이온성 담체 단위체의 조직 특이적 표적화 모이어티 (TM, 도 1 참조)의 합성을 위한 중간체로서 생성되었다.
아세토니트릴 (4.0 ml)내 N-(tert-부톡시카르보닐)-L-티로신 메틸 에스테르 (Boc-Tyr-OMe) (0.5g, 1.69 mmol) 및 K2CO3 (1.5 당량, 2.54 mmol)의 혼합물은 프로파르길 브로마이드 (1.2 당량, 2.03 mmol)에 한 방울씩 첨가되었다. 반응 혼합물은 60 ℃에서 밤새 가열되었다. 반응 후, 반응 혼합물은 물:에틸 아세테이트 (EA)를 사용하여 추출되었다. 그 다음, 유기 층은 염수 용액을 사용하여 세정되었다. 조 물질은 플래시 컬럼 (헥산 10%내 EA)에 의해 정제되었다. 다음에, 생성된 생성물은 1,4-디옥산 (1.0 ml) 및 6.0 M HCl (1.0 ml)에 용해되었다. 반응 혼합물은 100 ℃에서 밤새 가열되었다. 다음에, 디옥산은 제거되었고 EA에 의해 추출되었다. 수성 NaOH (0.5 M) 용액은 pH 값이 7이 되는 때까지 혼합물에 첨가되었다. 반응물은 증발기에 의해 농축되었고 0℃에 12,000 rpm으로 원심분리되었다. 침전물은 탈이온수로 세정되었고 동결건조되었다.
(b) 폴리(에틸렌 글리콜)- b -폴리(L-라이신) (PEG-PLL)의 합성: 이 합성 단계는 본 개시내용의 양이온성 담체 단위체의 수용성 생체고분자 (WP) 및 양이온성 담체 (CC)를 생성하였다 (도 1 참조).
폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(L-라이신)은 거대개시제로서 모노메톡시 PEG (MeO-PEG)와 Lys(TFA)-NCA의 개환 중합에 의해 합성되었다. 간략하게, MeO-PEG (600 mg, 0.12 mmol) 및 Lys(TFA)-NCA (2574 mg, 9.6 mmol)는 1M 티오우레아 및 DMF(또는 NMP)를 함유하는 DMF에 별도로 용해되었다. Lys(TFA)-NCA 용액은 마이크로 주사기에 의해 MeO-PEG 용액에 적하되었고 반응 혼합물은 37 ℃에서 4 일 동안 교반되었다. 반응 병은 아르곤 및 진공으로 퍼징되었다. 모든 반응은 아르곤 대기에서 수행되었다. 반응 후, 혼합물은 과량의 디에틸 에테르에 침전되었다. 침전물은 메탄올에 재-용해되었고 차가운 디에틸 에테르에 재차 침전되었다. 그 다음 여과되었고 백색 분말은 진공에서 건조 후 수득되었다. PEG-PLL(TFA)내 TFA 기의 탈보호를 위하여, 다음 단계는 이어졌다.
MeO-PEG-PLL(TFA) (500 mg)은 메탄올 (60 mL)에 용해되었고 1N NaOH (6 mL)는 교반하면서 중합체 용액에 적하되었다. 혼합물은 37℃에서 교반하면서 1 일 동안 유지되었다. 반응 혼합물은 10 mM HEPES에 대해 4회 동안 그리고 증류수에 대해 투석되었다. PEG-PLL의 백색 분말은 동결건조 후 수득되었다.
(b) 아지도-폴리(에틸렌 글리콜)- b -폴리(L-라이신) (N 3 -PEG-PLL)의 합성: 이 합성 단계는 본 개시내용의 양이온성 담체 단위체의 수용성 생체고분자 (WP) 및 양이온성 담체 (CC)를 생성하였다 (도 1 참조).
아지도-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(L-라이신)은 아지도- PEG (N3-PEG)와 Lys(TFA)-NCA의 개환 중합에 의해 합성되었다. 간략하게, N3-PEG (300 mg, 0.06 mmol) 및 Lys(TFA)-NCA (1287 mg, 4.8 mmol)는 1M 티오우레아 및 DMF(또는 NMP)를 함유하는 DMF에 별도로 용해되었다. Lys(TFA)-NCA 용액은 마이크로 주사기에 의해 N3-PEG 용액에 적하되었고 반응 혼합물은 37 ℃에서 4 일 동안 교반되었다. 반응 병은 아르곤 및 진공으로 퍼징되었다. 모든 반응은 아르곤 대기에서 수행되었다. 반응 후, 혼합물은 과량의 디에틸 에테르에 침전되었다. 침전물은 메탄올에 재-용해되었고 차가운 디에틸 에테르에 재차 침전되었다. 그 다음 여과되었고 백색 분말은 진공에서 건조 후 수득되었다. PEG-PLL(TFA)내 TFA 기의 탈보호를 위하여, 다음 단계가 이어졌다.
N3-PEG-PLL (500 mg)은 메탄올 (60 mL)에 용해되었고 1N NaOH (6 mL)는 교반하면서 중합체 용액에 적하되었다. 혼합물은 37℃에서 교반하면서 1 일 동안 유지되었다. 반응 혼합물은 10 mM HEPES에 대해 4회 동안 그리고 증류수에 대해 투석되었다. N3-PEG-PLL의 백색 분말은 동결건조 후 수득되었다.
(c) (메톡시 또는) 아지도-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(L-라이신/니코틴아미드/메르캅토프로판아미드) (N 3 -PEG-PLL(Nic/SH))의 합성: 이 단계에서, 조직-특이적 보조제 모이어티 (AM, 도 1 참조)는 본 개시내용의 양이온성 담체 단위체의 WP-CC 구성요소에 부착되었다. 양이온성 담체 단위체에서 사용된 조직-특이적 보조제 모이어티 (AM)는 니코틴아미드 (비타민 B3)이었다. 이 단계는 도 1에 묘사된 양이온성 담체 단위체의 WP-CC-AM 구성요소를 산출할 것이다.
아지도-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(L-라이신/니코틴아미드/메르캅토프로판아미드) (N 3 -PEG-PLL(Nic/SH))는 EDC/NHS의 존재 하에서 N3-PEG-PLL 및 니코틴산의 화학적 변형에 의해 합성되었다. N3-PEG-PLL (372 mg, 25.8 μmol) 및 니코틴산 (556.7 mg, PEG-PLL의 NH2에 대해 1.02 당량)은 탈이온수 및 메탄올 (1:1)의 혼합물에 별도로 용해되었다. EDC·HCl (556.7 mg, N3-PEG-PLL의 NH2에 대해 1.5 당량)은 니코틴산 용액에 첨가되었고 NHS (334.2 mg, PEG-PLL의 NH2에 대해 1.5 당량)는 혼합물에 적가되었다.
반응 혼합물은 N3-PEG-PLL 용액에 첨가되었다. 반응 혼합물은 교반하면서 16 시간 동안 37 ℃에서 유지되었다. 16 시간 후, 3,3'-디티오디프로폰산 (36.8 mg, 0.1 당량)은 메탄올에 용해되었고, EDC·HCl (40.3 mg, 0.15 당량), 및 NHS (24.2 mg, 0.15 당량)는 탈이온수에 각각 용해되었다. 그 다음, NHS 및 EDC·HCl은 3,3'-디티오디프로폰산 용액에 순차적으로 첨가되었다. 혼합물 용액은 조 N3-PEG-PLL(Nic) 용액을 첨가한 후 37 ℃에서 4 시간 동안 교반되었다.
정제를 위하여, 혼합물은 2 시간 동안 메탄올에 대해 투석되었고, DL-디티오트레이톨 (DTT, 40.6 mg, 0.15 당량) 첨가되었고, 그 다음 30 분 동안 활성화되었다.
DTT를 제거하기 위하여, 혼합물은 메탄올, 탈이온수내 50 % 메탄올, 탈이온수 순차적으로 투석되었다.
d) 페닐 알라닌-폴리(에틸렌 글리콜)-b-폴리(L-라이신/니코틴아미드/메르캅토프로판아미드) (Phe-PEG-PLL(Nic/SH))의 합성: 이 단계에서, 조직-특이적 표적화 모이어티 (TM)는 이전의 단계에서 합성된 WP-CC-AM 구성요소에 부착되었다. TM 구성요소 (페닐 알라닌)은 단계 (c)의 생성물과 단계 (a)에서 생성된 중간체의 반응에 의해 생성되었다.
혈관내 뇌 내피 조직을 표적하기 위해, LAT1 표적화 아미노산으로서, 페닐 알라닌은 구리 촉매의 존재 하에서 N3-PEG-PLL(Nic/SH)와 알킨 변형된 티로신 사이 클릭 반응에 의해 도입되었다 간략하게, N3-PEG-PLL(Nic/SH) (130 mg, 6.5 μmol) 및 알킨 변형된 페닐 알라닌 (5.7 mg, 4.0 당량)은 탈이온수 (또는 50 mM 인산나트륨 완충액)에 용해되었다. 그 다음, CuSO4·H2O (0.4 mg, 25 mol%) 및 트리스(3-하이드록시프로필트리아졸릴메틸)아민 (THPTA, 3.4 mg, 1.2 당량)은 탈이온수가 용해되었고 N3-PEG-PLL(Nic/SH) 용액이 첨가되었다. 그 다음, 아스코르브산나트륨 (3.2 mg, 2.5 당량)은 혼합물 용액에 첨가되었다. 반응 혼합물은 실온에서 16 시간 동안 교반하면서 유지되었다. 반응 후, 혼합물은 투석 막 (MWCO = 7,000)으로 전달되었고 탈이온수에 대해 1 일 동안 투석되었다. 최종 생성물은 동결건조 후 수득되었다.
(e) 다중이온 복합체 (PIC) 미셀 제조 - 본 개시내용의 양이온성 담체 단위체가 상기 기재된 대로 생성되었다면, 미셀은 생산되었다. 본 실시예에서 기재된 미셀은 안티센스 올리고뉴클레오티드 페이로드와 조합된 양이온성 담체 단위체를 포함하였다.
나노 크기조정된 PIC 미셀은 MeO- 또는 Phe-PEG-PLL(Nic) 및 miRNA를 혼합시킴으로써 제조되었다. PEG-PLL(Nic)은 0.5 mg/mL 농도로 HEPES 완충액 (10 mM)에 용해되었다. 그 다음 RNAse 없는 물내 miRNA 용액 (22.5 μM)은 miRNA 억제제 (서열번호: 2-30) (예를 들면, AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC; 서열번호: 30) 대 중합체의 2:1 (v/v) 비로 중합체 용액과 혼합되었다.
중합체 대 항-miRNA의 혼합 비는 미셀 형성 조건, 즉, 중합체 (본 개시내용의 담체)내 아민 대 항-miRNA (페이로드)내 포스페이트 사이 비를 최적화함으로써 결정되었다. 중합체 (담체) 및 항-miRNA (페이로드)의 혼합물은 3000 rpm으로 다중-와동에 의해 90 초 동안 격렬하게 혼합되었고, 실온에서 30 분 동안 유지되어 미셀을 안정화시켰다.
미셀 (10 μM의 항-miRNA 농도)는 사용에 앞서 4 ℃에서 보관되었다. MeO- 또는 Phe- 미셀은 동일한 방법을 사용하여 제조되었고, 상이한 양의 Phe-함유 미셀 (25% ~75%)은 미셀 제조 동안 양쪽 중합체를 혼합시킴으로써 또한 제조되었다.
실시예 3: 알츠하이머병에서 SIRT1 발현의 분석
이전의 연구는 SIRT1 수준이 인간 AD 환자들의 뇌에서 감소되었고 이 감소가 초기부터 후기까지 AD 진행에 영향을 미쳤다는 것을 보고하였다 (Julien 등, 2009, Lutz 등, 2014). 본원에 개시된 miR-485 억제제의 잠재 치료적 효과 사정하기를 시작하기 위해, SIRT1 발현은 알츠하이머병 (AD) 환자들로부터 사후 뇌 (중심 전회) 샘플에서 사정되었다. 도 2a 및 2b에 도시된 대로, SIRT1 단백질 수준은 정상 인간 뇌와 비교하여 AD 환자 뇌에서 현저히 감소되었다.
상기 결과를 확인하기 위해, SIRT1 발현은 확립된 AD 동물 모델 (즉, 5마리 가족성 AD 돌연변이 (5XFAD) 유전자이식 마우스)에서 사정되었다. 1c에서 도시된 대로, 야생형 대조군 동물에 비교하여 6-개월령 AD 마우스들 사이 SIRT1 발현에서 유의미한 차이는 없었다. 하지만, 11-개월령 AD 마우스에서, SIRT1 발현에서 유의미한 감소가 있었다 (도 2c 참조). SIRT1 발현은 5XFAD 노령화된 마우스에 따라 점차적으로 감소되었다 (도 2d).
상기 결과는 초기 연구를 확인하고 SIRT1 발현이 AD에서 하향-조절됨을 입증하여, SIRT1이 AD 발병기전에서 역할을 할 수 있음을 시사한다.
실시예 4: miR485-3p 발현 조절하기에서 miR-485 억제제의 효능의 분석
SIRT1 발현을 조절할 수 있는 잠재적 miRNA 후보를 식별하기 위해, AD 환자들의 뇌 샘플은 샘플에서 과발현된 miRNA에 대하여 추가로 분석되었다. 도 3a에 도시된 대로, miR485-3p 발현은 정상 건강한 조직에 비교하여 AD 환자들의 중심 전회 조직에서 상당히 더 높았다. 유의미한 차이는 miR485-5p를 포함하는 다른 SIRT1 관련된 miRNA에 대하여 관찰되지 않았다 (도 3b 참조).
다음에, 공공으로 이용가능한 알고리즘 (예를 들면, Targetscan 및 miRbase 프로그램)을 사용하여, miR-485-3p가 SIRT1의 3'UTR에서 결합 부위를 갖는다는 것이 예측되었다. 확인하기 위해, 마우스에서 miR485-3p 발현을 조절하는 인간 miR485-3p 모방체 및 억제제의 능력은 사정되었다. 도 4에서 도시된 대로, 실시간 PCR 분석을 사용하여, miR485-3p 발현에서 유의미한 감소는 인간 miR485-3p 억제제로 형질감염된 경우 마우스 일차 피질 뉴런에서 관찰되었다.
이 결과는 본원에 개시된 miR485 억제제가 miR485-3p 발현을 감소 및/또는 억제시킬 수 있음을 확인한다.
실시예 5: SIRT1의 miR-485 억제제 조절의 분석
miR485-3p와 SIRT1 발현 사이 관계를 이해하기 위해, 마우스 일차 피질 뉴런은 하기 중 하나로 형질감염되었다: (i) 인간 miR-대조군, (ii) 인간 miR485-3p, 또는 (iii) miR485-3p 억제제. 그 다음, SIRT1의 발현은 형질감염된 세포에서 사정되었다. 도 5a 및 5b에서 도시된 대로, SIRT1 단백질 발현은 miR-대조군 형질감염된 뉴런과 비교하여 miR485-3p 형질감염된 일차 피질 뉴런에서 감소되었다. 반대로, 본원에 개시된 miRNA 억제제로 형질감염된 일차 피질 뉴런은 상당히 더 높은 수준의 SIRT1 단백질을 발현시켰다. 그리고, 도 5a 및 5b에서 도시된 대로, SIRT1 발현은 PGC-1α 발현과 상관관계가 있는 것으로 나타났다.
이들 결과는 본 개시내용의 miR485 억제제가 miR485-3p 발현을 조절함으로써 SIRT1 발현을 증가시킬 수 있음을 입증한다. 결과는 추가로 본원에 개시된 miRNA 억제제가 세포에서 PGC-1α 단백질 발현 증가시키기에 또한 유용할 수 있음을 입증한다.
실시예 6: SIRT1에 대한 miR485-3p의 결합의 분석
SIRT1에서 miR485-3p를 위한 표적 부위를 확인하기 위해, 잠재적 miR485-3p 부위의 어느 한쪽 야생형 또는 돌연변이된 서열을 함유하는 SIRT1 3'-UTR의 루시퍼라제 리포터 플라스미드는 작제되었다 (도 6a 참조). 그 다음, HEK293T 세포는 플라스미드로 형질감염되었고, 프로모터 활성은 형질감염된 세포에서 측정되었다. 도 6b에서 도시된 대로, 야생형 프로모터 활성은 상당히 감소되었지만 돌연변이체 형태는 miR485-3p 형질감염된 세포에서 상이하지 않았다.
다음에, SIRT1의 3' UTR에 대한 miR485-3p의 물리적 결합은 시험관내 결합 검정을 사용하여 사정되었다. 간략히, 스트렙타비딘-miR483-3p-코팅된 자성 비드는 SIRT1 각각의 시험관내 전사된 야생형 3' UTR 및 돌연변이체 3' UTR로 인큐베이션되었다. 결합 RNA는 용출되었고 실시간 PCR에 의해 정량화되었다. 상대 결합은 공식: 상대 결합 = 100 x 2((조정된 입력)-(Ct IP)) / 100 x 2((조정된 입력)-(Ct WT))을 사용하여 계산되었다. 야생형 씨드 (즉, miRNA가 결합하는 부위) 서열과 비교하여, 상대 결합 효율은 3' UTR 함유 돌연변이체 씨드 서열에서 상당히 감소되었다 (도 6c 참조).
상기 결과는 집합적으로 miR485-3p가 SIRT1의 3'-UTR을 직접적으로 표적할 수 있음 그리고 이 상호작용이 SIRT1 발현을 음성으로 조절할 수 있음을 입증한다.
실시예 7: 베타 아밀로이드 (Aβ) 플라크 형성에 관한 miR-485 억제제의 분석
알츠하이머병에 관한 본원에 개시된 miR-485 억제제의 잠재 치료적 이익을 탐색하기 위해, 아밀로이드 플라크 형성 및 불용성 Aβ 수준에 관한 miR-485 억제제의 효과는 10-개월령 5XFAD 마우스에서 사정되었다. 5XFAD 유전자이식 마우스가 2 개월에 시작하는 아밀로이드 플라크 침착을 나타내고 보여주고 그러한 플라크에 Aβ의 응집이 AD가 진행함에 따라 악화하는 것으로 나타났다. Eimer 등, Mol Neurodegener 8:2 (2013); 및 Naslund 등, Proc Natl Acad Sci 91:8378-08382 (1994).
간략히, 생체내 jetPEI 시약으로 제형화된 miR-485 억제제는 정위 주사에 의해 동물의 우측 뇌실에서 주사되었다. 동물은 제2 투여를 1 주 후에 받았다 (도 7a 참조). 그 다음, 아밀로이드 플라크 형성의 횟수는 6E10 염색 및 티오플라빈 S를 사용하는 면역형광 현미경검사를 사용하여 정량화되었다. 도 7b 및 7c에서 도시된 대로, 아밀로이드 플라크의 수는 miR-대조군으로 치료된 동물과 비교하여 miR-485 억제제로 치료된 5XFAD 동물에서 두드러지게 감소되어, miR-485 억제제가 AD 마우스에서 아밀로이드 부담을 호전시킬 수 있음을 시사하였다.
Aβ 생산에 관한 miR-485 억제제의 효과를 추가로 조사하기 위해, α-세크레타제, ADAM (A 디스인테그린 및 메탈로프로테아제) 10, 및 β-세크레타제 BACE1을 포함하는, 불용성 Aβ 1-42, 아밀로이드 전구체 단백질 (APP) 및 APP 처리 효소의 수준은 상이한 치료 그룹으로부터 AD 마우스의 전두 피질에서 사정되었다.
도 7d 및 7e에서 도시된 대로, (즉, miR-대조군으로 치료된) 대조군 동물과 비교하여 miR-485 억제제로 치료된 AD 마우스에서 불용성 Aβ 1-42 생산의 유의미한 감소가 있었다. miR-485 치료된 동물은 또한, 대조군 동물과 비교하여, 전두 피질에서 감소된 수준의 β-CTFs 및 sAPPβ (즉, BACE의 주요 산물)을 나타냈다 (도 7f 및 7g 참조). 따라서, 억제제 치료된 AD 동물에서 BACE1의 감소된 발현이 또한 있었다. 그리고, 초기에 나타난 결과를 확인하면 (실시예 4 참조), miR-485 억제제로 치료된 AD 마우스는 상당히 감소된 수준의 SIRT1 및 PGC-1α 단백질을 가졌다. 하지만, 테스트된 단백질의 일부는 miR-485 투여에 의해 음성으로 조절되지 않았다. 가령, 상이한 치료 그룹으로부터 동물 중에 총 APP 수준에서 유의미한 차이는 없었다 (도 7f 및 7g 참조). 그리고, Adam10 및 sAPPα 단백질 경우에, miR-485 억제제의 투여는 대조군 동물과 비교하여 이들 단백질의 발현을 상당히 증가시켰다.
상기 결과는 본원에 개시된 miR-485 억제제가 상이한 유전자를 조절할 수 있고 이에 의해, 생체내 양쪽 Aβ 생산 및 플라크 형성을 감소시킬 수 있음을 입증한다.
실시예 8: Aβ 플라크 식세포작용에 관한 miR-485 억제제의 분석
알츠하이머병은 Aβ 생산과 청소 사이 불균형에 의해 야기된다. 이전의 연구는 아교 세포가 AD 뇌에서 응집된 Aβ의 청소 및 식세포작용을 매개하고, 여기에서 이들이 AD의 경감에 기여하는 것을 보여주었다. Ries 등, Front Aging Neurosci 8:160 (2016). 그러므로, AD에서 아교 세포의 역할을 추가로 탐색하기 위해, 아교 세포 및 Aβ 플라크의 공-국소화(colocalization)는 Iba1 및 6E10 항체를 사용하는 면역조직화학 분석을 사용하여 AD 마우스에서 사정되었다.
도 8a-8d에서 도시된 대로, miR-485 억제제로 치료된 AD 마우스에서 Aβ 플라크 및 아교 세포의 상당히 더 높은 공국소화가 있었다. 이밖에도, AD 마우스에 miR-485 억제제의 투여는 일차 아교 세포에 의해 Aβ 플라크의 흡수를 일관되게 증가시켰다 (도 8e 참조).
다음에, 아교 세포에 의한 Aβ 탐식 및 청소를 추가로 사정하기 위해, Aβ 플라크를 내재화한 CD68+ 미세아교 식세포의 수는 CD68, 6E10, 및 Iba1 공-면역염색을 사용하여 정량화되었다. 리소좀/엔도솜-연관 막 당단백질 계열의 막횡단 당단백질인 CD68은 파편 청소를 위한 스캐빈저 수용체로서 작용한다. Yamada 등, Cell Mol Life Sci 54(7):628-40 (1998).
도 8f 및 8g에서 도시된 대로, 아밀로이드 플라크를 둘러싸는 Iba1+ 미세아교세포의 클러스터링은 (즉, miR-대조군으로 치료된) 대조군 동물과 비교하여 miR-485 억제제로 치료된 AD 마우스에서 확산한 CD68 분포를 나타냈다.
상기 결과를 확인하기 위해, Aβ 응집체는 Aβ 단량체 (100　μM)를 37℃에서 밤새 인큐베이션시키고 그 다음 펩티드 스톡을 세포 배양 배지로 희석시킴으로써 제조되었다. 그 다음, 일차 아교 세포는 miR-485 억제제로 형질감염되었고 추가로 4 시간 동안 1　μM 섬유질 아밀로이드 베타 (fAβ)로 치료되었다. 상기 결과와 일치하게, 조건화된 배지에서 Aβ 수준은 대조군 형질감염된 세포와 비교하는 miR485-3p ASO 형질감염된 세포에서 상당히 감소되었다 (도 8h).
상기 결과는 본원에 개시된 miR-485 억제제가 미세아교 Aβ 식세포작용을 향상시킬 수 있음을 입증한다.
실시예 9: CD36의 miR-485 억제제 조절의 분석
본원에 기재된 경우에, CD36/SR-BII는 아교 세포에 의한 Aβ의 식세포작용에 기여할 수 있다. 공공으로 이용가능한 알고리즘을 사용하여 (실시예 3 참조), miR-485-3p가 또한 CD36의 3'UTR에서 결합 부위를 갖는 것이 예측되었다. 따라서, 본원에 개시된 miR-485 억제제가 CD36 발현을 또한 조절할 수 있는지 여부를 사정하기 위해, AD 마우스는 (이전 실시예에서 기재된 대로) 어느 한쪽 miR-485 억제제 또는 miR-대조군으로 치료되었고, 그 다음 CD36의 발현은 동물에서 사정되었다.
도 9a 및 9b에서 도시된 대로, miR-485 억제제로 치료된 AD 마우스는 대조군 동물과 비교하여 상당히 더 높은 CD36 발현을 나타냈다. 이밖에도, CD36 발현은 면역조직화학을 사용하는 Iba-1-양성 미세아교 세포에서 두드러지게 더 높았다 (도 9c).
상기 관찰에 기반하여, miR485-3p 또는 miR-485 억제제를 이용한 형질감염이 마우스 일차 아교 세포에서 CD36 발현을 변경시킬 수 있는지 여부가 다음에 검사되었다. 도 9d 및 9e에서 도시된 대로, CD36 발현은 miR-대조군과 비교하여 miR485-3p 형질감염된 일차 아교 세포에서 두드러지게 감소되었다. 반대로, miR-485 억제제로 형질감염된 세포는 상당히 더 높은 CD36 발현을 나타냈다.
상기 결과는 본 개시내용의 miR-485 억제제가 miR-485-3p의 발현을 조절함으로써 CD36 발현을 또한 증가시킬 수 있음을 입증한다.
실시예 10: CD36에 miR485-3p의 결합의 분석
CD36의 3'-UTR 내에서 miR485-3p를 위한 표적 부위를 확인하기 위해, 잠재적 miR485-3p 부위의 어느 한쪽 야생형 또는 돌연변이된 서열을 함유하는 루시퍼라제 리포터 플라스미드는 작제되었다. 그 다음, HEK293T 세포는 플라스미드로 형질감염되었고, 프로모터 활성은 형질감염된 세포에서 측정되었다. 도 10에서 도시된 대로, 야생형 프로모터 활성은 상당히 감소되었지만 돌연변이체 형태는 miR485-3p 형질감염된 세포에서 상이하지 않았다.
다음에, SIRT1의 3' UTR에 miR485-3p의 물리적 결합은 실시예 5에서 기재된 대로 시험관내 결합 검정을 사용하여 사정되었다. 상대 결합 효율은 3' UTR-함유 돌연변이체 씨드 서열에서 상당히 감소되었다.
상기 결과는 집합적으로 miR485-3p가 CD36의 3'-UTR을 직접적으로 표적할 수 있고 이 상호작용이 CD36 발현을 음성으로 조절할 수 있음을 입증한다.
실시예 11: Aβ 식세포작용에 관한 CD36의 조절의 분석
Aβ 식세포작용에 관한 CD36의+ 아교 세포의 역할을 추가로 사정하기 위해, CD36 억제 항체가 아교 식세포작용에 영향을 미칠 수 있는지 여부가 검사되었다. 간략히, 일차 아교 세포는 어느 한쪽 miR-485 억제제 또는 miR-대조군으로 형질감염되었다. 형질감염된 세포는 어느 한쪽 CD36 차단 항체 또는 대조군 IgG로 치료되었고, 그 다음 4 시간 동안 1 μM 섬유질 아밀로이드 베타 (fAβ)로 치료되었다. ELISA 검정은 상이한 형질감염된 세포로부터 수집된 조건화된 배지에서 Aβ 식세포작용을 결정하는데 사용되었다.
도 11에서 도시된 대로, Aβ 수준은 대조군 형질감염된 세포와 비교하여 miR-485 억제제로 형질감염된 세포에서 상당히 감소되었다. 하지만, 이 효과는 CD36 차단 항체로 치료된 세포에서 상당히 폐기되었다.
이들 결과는 본원에 개시된 miR-485 억제제가 miR485-3p 의존적 방식으로 CD36 발현을 조절할 수 있고, 이에 의해, Aβ 식세포작용에 영향을 줄 수 있음을 확인한다.
실시예 12: 신경염증에 관한 miR-485 억제제의 분석
AD는 뇌 내에서 염증과 연관되는 것으로 알려지고, fAβ-자극된-아교세포에 의한 염증성 매개체의 분비는 뉴런성 손실 및 인지 저하에 기여할 수 있다. Cunningham 등, J Neurosci 25(40):9275-84 (2005). 그러므로, 본원에 개시된 miR-485 억제제가 신경염증에서 임의의 효과를 갖는지 여부를 사정하기 위해, 일차 아교 세포는 miR-485 억제제 또는 miR-대조군으로 형질감염되었고, 이어서 1 μM 섬유질 아밀로이드 베타 (fAβ)로 치료되었다. 그 다음, SIRT1 및 상이한 염증성 매개체 (즉, NF-κB, TNF-α, 및 IL-1β)의 수준은 세포에서 검사되었다.
도 12a 및 12b에서 도시된 대로 (그리고 이전 데이터와 일치하여 - 실시예 4 참조), SIRT1 발현은 fAβ 치료된 일차 아교 세포에서 두드러지게 감소되었지만, 이 감소는 miR-485 억제제로 형질감염된 세포에서 상당히 회복되었다. 관찰된 SIRT1 발현은 NF-κB 발현, 뿐만 아니라 TNF-α 및 IL-1β의 발현 수준과 상관관계가 있었다 (도 12a 및 12b 참조). miR-485 억제제로 형질감염된 세포에서, 이들 염증성 매개체의 상당히 감소된 수준이 있었고, 이는 용량 의존적인 것으로 나타났다 (도 12i 및 12j 참조).
신경염증에 관한 miR-485 억제제의 효과를 추가로 특성규명하기 위해, AD 마우스는 이전 기재된 대로 miR-485 억제제로 치료되었다 (실시예 1 참조). 그 다음, Iba-1 (즉, 활성화된 미세아교 마커) 및 GFAP (즉, 활성화된 성상세포 마커)의 발현 패턴은 사정되었다.
도 12c 및 12d에서 도시된 대로, 높은 수준의 Iba-1을 발현시키는 미세아교세포 및 높은 수준의 GFAP를 발현시키는 성상세포는 miR-485 억제제로 치료된 AD 마우스에서 상당히 감소되었다. 그리고, 형질감염된 세포로 상기 관찰된 대로, NF-κB, TNF-α, 및 IL-1β의 발현 수준은, 실시간 PCR, 웨스턴 블랏, 및 면역조직화학을 사용하여 측정된 경우, miR-485 억제제 치료된 동물에서 또한 상당히 더 낮았다 (도 12e-12h 참조).
상기 결과는 miR485-3p 발현을 감소시킴으로써, 본원에 개시된 miR-485 억제제가 아교 세포 활성화에 영향을 줄 수 있고 조절 SIRT1/NF-κB 신호전달을 통해 전염증성 사이토카인 생산을 감소시킬 수 있음을 입증한다.
실시예 13: 뉴런성 손실 및 포스트-시냅스에 관한 miR-485 억제제의 분석
이전 기재된 대로, 5XFAD 유전자이식 마우스는 2 개월에 시작하는 아밀로이드 플라크 침착 및 9 개월에 피질 층 V에서 뉴런성 손실을 나타낸다 (실시예 7 참조). 5XFAD 마우스에서 시냅스성 및 뉴런성 손실은 Aβ 축적 및 신경염증과 상관관계가 있었다. Eimer 등, Mol Neurodegener 8:2 (2013). (예를 들면, miR-485 억제제를 이용한 SIRT1 및 CD36 발현의 조절이 AD 마우스에서 Aβ 처리, 식세포작용, 및 염증을 제어할 수 있는) 이전 실시예로부터 결과에 비추어, 본원에 개시된 miR-485 억제제가 뉴런성 세포사에 관한 임의의 효과를 갖는지 여부는 NeuN (뉴런성 세포 마커) 및 절단된 카스파제-3을 사정함으로써 검사되었다.
웨스턴 블랏 분석에 기반하여, NeuN의 발현은 증가되었고, 반면 카스파제-3의 단백질 발현은 miR-485 억제제 치료된 동물의 피질 영역에서 감소되었다 (도 13a 및 13b 참조). 이 효과는, 하지만, 동일 조건 하에 해마에서 보여지지 않았다. 유사한 결과는 면역조직화학을 사용하여 관찰되었다 (도 13c 및 13d 참조).
다음에, 포스트-시냅스에 관한 miR-485 억제제의 효과는 PSD-95 발현을 사정함으로써 검사되었다. 도 13e 및 13f에서 도시된 대로, PSD-95 단백질 발현은 대조군 동물과 비교하여 miR-485 억제제로 치료된 AD 마우스의 전두 피질에서 상당히 더 높았다.
상기 결과는 추가로 억제제가 뉴런성 손실을 최소화할 뿐만 아니라 포스트-시냅스를 증가시킬 수 있음을 보여줌으로써 AD에 관한 본원에 개시된 miR-485 억제제의 치료적 효과를 입증한다.
실시예 14: 인지 기능에 관한 miR-485 억제제의 분석
실시예 13에서 상기 관찰된 결과 (즉, 증가된 포스트-시냅스 및 감소된 뉴런성 손실)가 인지 기능에서 개선과 상관관계가 있는지 여부를 결정하기 위해, AD 마우스는 이전 실시예에서 기재된 대로 miR-485 억제제 또는 miR-대조군으로 재차 치료되었다. 그 다음, 인지 기능은 Y-미로 및 수동 회피 과업 (PAT)을 사용하여 동물에서 사정되었고, 이는 공간 작업 기억을 평가하기 위한 행동 패러다임으로서 널리 허용된다.
마지막 주사 2 일후, 우리는 자발적 교대 백분율이 miR-485 억제제 치료된 마우스에서 상당히 증가되었음을 알아내었다. 아암 진입의 총 횟수는 대조군과 miR-485 억제제 치료된 5XFAD 사이 상당히 상이하지 않아, Y-미로에서 일반 운동 및 탐색 활동의 수준이 변화되지 않았음을 나타냈다 (도 14a). 이밖에도, 우리는, 전기 발 충격과 자발적으로 선호된 특정 환경 컨텍스트 (어둠 대 빛) 사이에 형성된 연관성에 기반하여, 수동 회피 과업에서 연상 기억을 검사하였다. 스텝-쓰루 대기시간은 대조군과 miR-485 억제제 치료된 5XFAD 사이 유사하였다. 하지만, miR-485 억제제 치료된 마우스는 전기 충격을 받은 24시간 후 어두운 구획에서 시간을 소비하기 위한 대기시간에서의 상당한 감소를 보여주었다 (도 14b).
상기 결과는 집합적으로 본원에 개시된 miR-485 억제제가 신경퇴행성 질환, 예컨대 AD에서 관여된 상이한 유전자의 발현을 조절 (즉, 증가)할 수 있음을 입증한다. 상기 실시예에서 나타난 대로, 그러한 유전자는 SIRT1, CD36, 및 PGC-1α를 포함한다. 어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, 상기 결과는 이들 유전자의 발현을 조절함으로써, 본원에 개시된 miR-485 억제제가 AD의 많은 양태를 치료 (예를 들면, 양쪽 Aβ 생산 및 플라크 형성을 감소, Aβ 플라크 식세포작용을 촉진, 신경염증을 감소, 뉴런성 손실을 감소, 포스트-시냅스를 증가, 그리고 인지 기능을 개선)할 수 있다 (도 15 참조).
실시예 15: 생체내 SIRT1, PGC-1α, 및 CD36 발현 조절하기에서 miR-485 억제제의 효능의 분석
SIRT1, PGC-1α, 및 CD36의 발현 조절하기에서 본원에 개시된 miR-485 억제제의 효능을 추가로 사정하기 위해, miR-485 억제제 (실시예 1 참조)의 단일 용량 (100 μg/마우스; 5 mg/kg)은 야생형 숫컷 Crl:CD1 (ICR) 마우스에 (정맥내 투여를 통해) 투여되었고, 이는 KOATECH (대한민국)에서 구매되었다. 대조군 동물은 miR-대조군을 받았다 (실시예 1 참조). 그 다음, 동물은 투여후 다양한 시점에 희생되었고, SIRT1, PGC-1α, 및 CD36의 발현 수준은 웨스턴 블랏을 사용하여 뇌의 양쪽 피질 및 해마에서 사정되었다.
도 16a-16c, 17a-17c, 및 18a-18b에서 도시된 대로, miR-485 억제제의 단일 투여는 양쪽 피질 및 해마에서 SIRT1, PGC-1α, 및 CD36 발현의 신속한 증가를 초래하였다. SIRT1 경우에, 피크 발현은 투여후 약 48 시간에 피질에서 (대조군 동물에서 발현보다 대략 300% 증가) 및 투여후 약 24 시간에 해마에서 (대조군보다 대략 150% 증가) 관찰되었다 (도 16a 및 17a, 각각 참조). PGC-1 α에 대한 피크 발현은 피질에서 투여후 약 48 시간에 (대조군보다 대략 100% 증가) 및 해마에서 투여후 약 24 시간에 (대조군보다 대략 50% 증가) 또한 관찰되었다 (도 16b 및 17b, 각각 참조). 유사한 결과는 CD36에 대하여 관찰되었다 (도 18a 참조).
결과는 본원에 개시된 miR-485 억제제의 효능을 SIRT1, PGC-1α, 및 CD36 발현 조절하기에서 확인한다. 비교를 위하여, 작은 분자 ApoE4는 생체내 SIRT1 발현 정규화에 관한 양성 효과를 갖는 것으로 이전에 나타났다. Campagna 등, Sci Rep 8(1):17574 (Dec. 2018) 참조. (날마다 40 mg/kg의 용량으로) 56 일의 매일 투여 후, 해마에서 SIRT1 발현의 대략 20% 증가가 있었지만 피질에서 증가는 없었다. 본원에 개시된 miR-485 억제제 (예를 들면, 서열번호: 28)로, 훨씬 더 낮은 용량 (즉, 5 mg/kg)으로 단일 투여는 양쪽 해마 및 피질에서 상당히 더 큰 SIRT1 발현을 초래하였다.
실시예 16: 파킨슨병에 관한 miR-485 억제제의 치료적 효과의 분석
상기 제공된 실시예에 추가로, 파킨슨병에 관한 본원에 개시된 miR-485 억제제의 치료적 효과는, 예를 들면, 이 전체가 본원에 참조로 편입되는 Thiele 등, J Vis Exp. 60:3234 (2012)에서 기재된 6-OHDA 마우스 모델을 사용하여 검사되었다. 구체적으로, 도파민성 변성에 관한 miR-485 억제제의 효과는 사정되었다. 일측성 6-OHDA 모델은 진행성 역행 흑질선조체 병리와 부분 선조체 병변을 유도하고 PD와 관련한 행동적 및 신경화학적 매개변수에 기반하여 사정한다.
간략히, 마우스는 6-하이드록시도파민 (6-OHDA)의 투여 대략 30 분 전에 데시프라민 (0.9% NaCl내 25 mg/kg)으로 복강내로 주사되었고 그 다음 증기 Isotroy (Toikaa Pharmaceuticals Limited, Gujarat, 인도)의 흡입에 의해 마취되었다. 마취된 마우스는 정위 프레임 (JEUNG DO BIO & PLANT CO., LTD, 서울, 대한민국)에 배치되었고 15 μg/3 μl의 총 용량에 대하여 0.5 μl/분의 속도로 오른쪽 선조체 (전후: +0.9mm, 중외측: -2.2mm, 배복측: -2.5mm, 전정에 대해)에 6-OHDA (0.9% NaCl에 용해된 0.02% 아스코르브산내 5 μg/μl; Sigma Aldrich)의 일측성 주사를 받았다. 모든 주사는 주사기 펌프 (Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA)에 부착된 Hamilton 주사기 (30 S 바늘)를 사용하여 수행되었다. 주사 후, 바늘은 5 분후 천천히 빠져나왔다.
동물에서 뇌 병변을 유도하기 위한 6-OHDA의 투여 후, 1 일 후에, 동물은 정맥내 투여 (꼬리-정맥 주사)를 통해 어느 한쪽 miR-485 억제제 (50 μg/두부) (서열번호: 30) 또는 대조군 올리고뉴클레오티드 (서열번호: 61)의 단일 용량을 받았다. 도 23a 참조. miR-485 억제제 투여후 6 일차에, 동물에서 운동 기능은 하기 테스트: 장대 테스트, 로타로드, 줄 매달리기 테스트, 및 평균대 중 하나 이상을 사용하여 사정되었다 (실시예 1 참조). miR-485 억제제 투여후 9 일차에, 동물은 희생되었고 뇌 조직에서 miR-485 억제제 투여의 효과는 웨스턴 블랏을 사용하여 티로신 하이드록실라제 발현을 측정함으로써 사정되었다. 신경염증에 관한 miR-485 억제제의 효과는 웨스턴 블랏 분석을 사용하여 또한 사정되었다.
도 23b-23e에서 도시된 대로, miR-485 억제제로 치료된 6-OHDA 마우스는 적어도 로타로드 (떨어지는 시간까지 증가된 대기시간을 나타냄), 줄 매달리기 테스트 (떨어지는 시간까지 증가된 대기시간을 나타냄), 및 평균대 (발 미끄러짐의 감소된 횟수)를 사용하여 측정된 경우에 개선된 운동 기능을 나타냈다. miR-485 억제제 치료된 동물은 또한 양쪽 흑질 (SN) 및 선조체 (STR)에서 더 높은 티로신 하이드록실라제 발현 (즉, 도파민성 뉴런에 대한 마커)을 나타내어, 감소된 도파민 뉴런 손상을 나타냈다 (도 23f-23i 참조). IL-1β의 상당히 감소된 발현은 대조군 동물과 비교하여 miR-485 억제제 치료된 동물의 흑질에서 관찰되었다 (도 23j 및 23k 참조). 하지만, miR-485 억제제 투여는 Iba-1 (활성화된 미세아교 마커), GFAP (활성화된 성상세포 마커), 및 TNF-α 발현에 상당히 영향을 주는 것으로 나타나지 않았다.
다음에, 파킨슨병에 관한 miR-485 억제제의 치료적 효과를 추가로 사정하기 위해, 추가의 6-OHDA 마우스는 하기 용량: 2.5 mg/kg 또는 5 mg/kg 중 하나로 miR-485 억제제의 단일 정맥내 투여로 치료되었다. PBS 또는 대조군 올리고뉴클레오티드로 치료된 건강한 및 6-OHDA 마우스는 대조군으로서 사용되었다. 그 다음, miR-485 억제제 투여후 6 일차에, 동물에서 운동 기능은 하기 테스트: 장대 테스트, 로타로드, 줄 매달리기 테스트, 및 평균대 (실시예 1 참조) 중 하나 이상을 사용하여 재차 사정되었다.
도 39a-39d에서 도시된 대로, 그리고 이전 데이터와 일치하여, 용량 중 어느 한쪽으로, miR-485 억제제로 치료된 동물은 상당히 개선된 운동 기능을 나타냈다. 집합적으로, 본 실시예에서 제공된 결과는 본원에 개시된 miR-485 억제제가 질환 예컨대 파킨슨증 (예를 들면, 감소된 도파민 뉴런 손상 및/또는 감소된 신경염증)과 연관된 뉴런 손상을 개선할 수 있고, 이는, 차례로, 운동 기능을 개선할 수 있음을 시사한다.
실시예 17: 자가포식에 관한 miR-485 억제제의 효과의 분석
본원에 기재된 경우에, 자가포식은 세포 항상성을 유지하기 위해 수명이 긴 단백질, 단백질 응집체, 뿐만 아니라 손상된 세포소기관의 적절한 분해에서 중요한 역할을 한다. 그러므로, 본원에 개시된 miR-485 억제제가 CNS의 세포에서 자가포식에 관한 임의의 효과를 갖는지 여부를 사정하기 위해, 양쪽 일차 피질 뉴런 및 일차 혼합된 아교 세포는 24 또는 48 시간 동안 마우스 α-시누클레인 PFF (아그레르게이티드 형태) (mPFF) (1 μg/mL)와 조합하여 가변하는 농도의 miR-485 억제제로 치료되었다. 그 다음, p62 (기질을 자가포식소체에 동원하는 어댑터 분자) 및 LC3B (자가포식소체 생물발생의 마커)의 발현 수준은 웨스턴 블랏 분석을 사용하여 세포에서 사정되었다.
도 24a 및 24b에서 도시된 대로, 테스트된 모든 농도에 대하여, miR-485 억제제는 일차 피질 뉴런에서 p62 발현에 관한 임의의 상당한 효과를 갖지 않았다. 하지만, miR-485 억제제 치료는 mPFF 치료된 일차 피질 뉴런에서 LC3B 발현의 유의미한 회복을 초래하였다. 가령, 48 시간에, mPFF만으로 치료된 일차 피질 뉴런에서 검출된 최소 LC3B 발현이 있었다 (도 24a, 오른쪽 겔, 2번째 수직 레인 참조). 하지만, miR-485 억제제 농도가 증가하면서, LC3B의 발현에서 점진적 증가가 있었다 (도 24a, 오른쪽 겔, 3번째, 4번째, 및 5번째 수직 레인 참조). 유사한 결과는 일차 혼합된 아교 세포에서 관찰되었다 (도 24b 참조).
상기 결과를 확인하기 위해, BV2 미세아교 세포는 가변하는 용량의 miR-485 억제제 (0 nM, 50 nM, 100 nM, 및 300 nM)로 형질감염되었고 이어서 1 μM의 최종 농도로 24 시간 동안 섬유질 아밀로이드 베타 (oAβ)로 치료되었다. 그 다음, 자가포식과 연관된 상이한 단백질, 즉, FOXO3a, LC3, 및 p62의 발현 수준은 웨스턴 블랏 분석을 사용하여 사정되었다. 도 40a-40d에서 도시된 대로, miR-485 억제제로 형질감염된 세포내 이들 단백질의 발현에서 용량-의존적 증가가 있었다.
상기 결과는 집합적으로 본원에 개시된 miR-485 억제제가 양쪽 일차 피질 뉴런 및 아교 세포에서 자가포식 플럭스를 향상시킬 수 있음을 입증하고, 이는 본원에 개시된 신경퇴행성 질환 (예를 들면, 파킨슨병 및/또는 알츠하이머병) 치료하기에서 유용할 수 있다.
실시예 18: miR-485 억제제의 안전성 프로파일의 분석
miR-485 억제제의 생체내 투여가 임의의 역효과를 초래할 수 있는지 여부를 사정하기 위해, 단일 용량 독성 테스트는 수행되었다. 간략히, miR-485 억제제는 하기 용량: (i) 0 mg/kg (G1), (ii) 3.75 mg/kg (G2), (iii) 7.5 mg/kg (G3), 및 (iv) 15 mg/kg (G4) 중 하나로 숫컷 및 암컷 랫트에 투여되었다. 그 다음, 체중, 사망률, 임상적 징후, 및 병리에서 임의의 이상은 전달후 다양한 시점에 동물에서 관찰되었다.
도 19a 및 19b에서 도시된 대로, (테스트된 모든 용량으로) miR-485 억제제의 투여는 양쪽 숫컷 및 암컷 랫트에서 체중에 관한 임의의 비정상 효과를 갖는 것으로 나타나지 않았다. 비슷하게, 사망률 및 병리학적 이상은 치료된 동물 중 임의의 것에서 관찰되지 않았다 (도 20a, 20b, 22a, 및 22b 참조). 가능한 임상적으로 관련한 부작용 (예를 들면, NOA, 울혈 (꼬리), 및 부종 (안면, 앞다리, 또는 뒷다리))에 관해서는, 임의의 그러한 효과는 모든 치료된 동물에서 투여 후 1일까지 사라졌다 (도 21a 및 21b 참조).
집합적으로, 상기 결과는 본원에 개시된 miR-485 억제제가 SIRT1, PGC-1α, 및 CD36의 발현 조절하기에서 유능할 뿐만 아니라, 생체내 투여된 경우 안전함을 입증한다.
실시예 19: miRNA 바이러스성-전달 시스템에 의한 새로운 알츠하이머병 동물 모델의 개발
본원에 개시된 miR-485 억제제의 치료적 효과 및 miR485-3p 발현이 알츠하이머병 (AD)에서 갖는 역할을 추가로 사정하기 위해, 새로운 동물 모델이 개발되었다. 간략히, 하기 물질 및 방법 중 하나 이상은 새로운 AD 동물 모델을 작제하는데 사용되었다:
렌티바이러스성 전달 플라스미드
성숙한 마우스 miR-485-3p (예를 들면, 485-3p-렌티-미니-7-GFP-F)를 함유하는 p렌티-III-mir-GFP 벡터의 서열은 다음과 같았다 (miR-485-3p 서열은 대문자로 표기된다):
렌티-mir-GFP-클로닝 벡터 서열:
Figure pct00030
Figure pct00031
Figure pct00032
Figure pct00033
293T 세포에서 렌티바이러스 생산
HEK 293T 세포는 이들이 70-80% 밀집도 (예를 들면, 10 ml의 DMEM 완전 성장 배지내 3 × 106 세포)에 도달하는 때까지 10 cm 조직 배양 플레이트에서 플레이팅되었다. 바이러스성 DNA의 형질감염 2시간 전에, 배양 배지는 293T 세포로부터 제거되었고 5 ml의 DMEM 성장 배지로 대체되었다. TransIT®-렌티 시약 (Mirus Bio, Cat#s 6600, 6603, 6604, 6605, 6606, 및 6610)은 실온으로 가온되었고 서서히 와동되었다. 1 ml의 Opti-MEM 감소된-혈청 배지는 멸균 튜브에 배치되었다. 10 ug의 pMDLg/pRRE 패키징 플라스미드 (Addgene, 플라스미드 #12251), 5 ug의 pRSV-REV 패키징 플라스미드 (Addgene, 플라스미드 #12253), 2.5 ug의 pMD2.G 외피 플라스미드 (Addgene, 플라스미드 #12259), 및 (상기 논의된) 2.5 ug의 485-3p-렌티-미니-7-GFP-F 플라스미드는 별도 멸균 튜브에서 조합되었고, 철저히 혼합되었고, Opti-MEM 감소된-혈청 배지를 함유하는 튜브로 전달되었다. 35 ul의 TransIT®-렌티 시약은 희석된 것에 첨가되었고 20 분 동안 실온에서 인큐베이션되어 형질감염 복합체를 형성시켰다. TransIT®-렌티 시약: (상기 제조된) DNA 복합체는 293T 세포를 함유하는 10-cm 배양 플레이트에 적하식 분포되었다. 형질감염된 세포 배양물은 렌티바이러스 수확 전에 72 시간 동안 5% CO2에 37℃에서 인큐베이션되었다.
72-시간 인큐베이션 이후, 세포는 멸균 튜브에서 6000 RPM으로 15 분 동안 원심분리되었다. 바이러스-함유 상청액은 29000 RPM으로 2 시간 동안 초-원심분리되어 바이러스-함유 펠릿을 수득하였다. 펠릿은 차가운 PBS에서 1:1000 희석되었고 분취량은 -80℃에 보관되었다.
바이러스 적정
바이러스성 제조물의 역가를 확립하기 위해, 293T 세포는 DMEM 완전 성장 배지의 6-웰 조직 배양 플레이트에서 웰당 4 × 105 세포로 플레이팅되었다. 다음 날, 대략 1 mL의 성장 배지는 웰들의 각각에 남겨졌고, 1 μL의 렌티바이러스성 작제물 (어느 한쪽 대조군 벡터 또는 miR-485-3p 및 GFP를 포함하는 벡터) 및 폴리브렌 (8 μg/mL)은 개별 웰에 첨가되었다. 렌티바이러스성 작제물은 첨가 전에 연속해서 희석되었다 (1, 0.1, 및 0.01). 6 시간의 인큐베이션 후, 배지는 신선한 배지로 교환되었다. 그 다음, 48 시간 후, 세포는 따뜻한 PBS로 세정되었고, 트립신처리되었고, GFP 발현에 대하여 유세포 분석법 (BD Accuri C6 플러스)에 의해 분석되었다.
동물
마우스 (야생형; 숫컷; C57BL/6J; 6 주령)는 Dae Han Bio Link Co Ltd (충주시, 대한민국)에서 구매되었다. 수술 및 행동 실험을 겪는 마우스는 다른 수컷의 공격으로 인한 신체적 상해 및 심리적 불안을 제거하기 위해 단일 케이지에서 사육되었다. 물 및 음식은 12시간 명/12시간 암 주기 환경에서 자유롭게 제공되었다.
외모 및 체중에서 임의의 신체적 이상은 뇌에 렌티바이러스성 대조군 벡터 (miR-485-3p 없음) 및 렌티-mir485-3p 벡터로 주사된 양쪽 마우스에서 수술 후 정기적으로 체크되었다. 모든 행동 실험은 명 시기에서 실행되었고, 각 그룹내 모든 마우스는 동일 조건 하에 테스트되었다.
생체내 렌티바이러스성 벡터 주사 및 조직 제조
6 주령 마우스는 마취제 (2,2,2-트리브로모에탄올 (250 mg/kg i.p.; Sigma-Aldrich, cat # 75-80-9))를 사용하여 복강내 주사로 마취되었다. 정위 수술 장비 및 Hamilton 주사기 700 시리즈를 사용하여, 렌티바이러스성 벡터는 해마에서 치상회 및 CA1 영역 (AP= -2 mm, L= ±1.5mm, 복부 (V)= -2.7 & -2.0 mm)에 주사되었다. 부위당 바이러스 부피는 1.5 ul이었고, 주사 유속은 0.2 ul/분이었고, 주사 후 남은 시간은 15 분이었다. 수술 후, 마취에서 회복의 과정 및 체중은 수술로 인한 임의의 건강 문제가 있는지를 보기 위해 체크되었다.
행동 실험이 완료된 후, 마우스는 마취되었고, 심장 관류를 통해서 희생되었고, 뇌는 주의해서 제거되었고 4℃에 4 시간 동안 4% 파라포름알데하이드에서 후-고정되었고 그 다음 약 48 시간 동안 4℃에서 30% 수크로스/0.1 M PBS에 동결보존되었다. 뇌는 OCT 화합물 (Tissue-Tek®, Sakura, Inc., cat # 4583)에 포매되었고 Leica CM1860 저온유지장치 (Leica Microsystems)를 사용하여 -22℃에서 40 μm-두께 슬라이스로 시상으로 절개되었다. 바이러스 GFP 이미지의 경우에, 핵은 DAPI (1:500; Invitrogen, cat #D 3571)로 염색되었고 하드세트 안티-페이드 배지로 장착되었다. 이미지는 공초점 현미경 (Leica DMi8)을 사용하여 수득되었다.
행동 테스트
마우스 행동 실험은 하기 순서대로 실행되었다: (i) 야외 테스트, (ii) Y-미로, (iii) 신규한 물체 인식 테스트, 및 (iv) 수동 회피 테스트. (예를 들면, 도 26 참조). 하나의 행동 실험이 완료된 경우, 다음 실험은 2 일의 회복 기간으로 실행되었다. 수동 회피를 배제하는 행동 실험은 스마트 3.0 비디오 추적 시스템 (Panlab, worldwideweb.harvardapparatus.com/smart-video-tracking-system)을 사용하여 분석되었다.
(i) 야외 테스트
마우스는 백색 무광 챔버 (450 mm x450 mm x450 mm)의 중심에 배치되었고 30 분 동안 자유롭게 움직이게 되었다. 디지털 비디오 추적은 수행되었다. cm 단위로 총 거리를 분석함으로써, 30 분 동안 기저 이동력은 측정되었고, 중심 거리 (중심 구역에서 이동된 거리) (cm) 및 전체 영역에서 움직여진 총 거리 (cm)는 기록되었다. 총 거리 x 100으로 나눈 중심 거리는 중심 구역 활동 (%)으로서 계산되었다.중심 거리-총 거리 비는 불안-관련 반응의 지수로서 사용될 수 있다.
(ii) Y-미로
Y-미로는, 서로 120°인, 3개의 백색 무광 플라스틱 아암 (65 mm x400 mm x130 mm)으로 이루어졌다. 마우스는 중심에서 배치되었고 8 분 동안 자유롭게 움직이고 모든 3개 아암을 탐색하게 되었다. 아암 진입의 횟수 및 시도의 횟수 (시프트는 중심으로부터 10 cm이고, 3개 별도 아암에 진입한다)는 교대의 백분율을 계산하기 위해 기록되었다. 진입은 Y-미로 아암에 진입하는 모든 3개 종속물로서 정의되었다. 교대 행동은 아암 진입의 횟수 빼기 2로 나눗셈되고 100 곱셈된 트라이어드의 수로서 정의되었다.
(iii) 신규한 물체 인식 테스트
마우스는 백색 무광 챔버 (450 mm x450 mm x450 mm)의 중심에 배치되었고 첫째 날 (1 일차)에 5 분 동안 자유롭게 움직여서 공간에 적응하게 되었다. 24 시간 (2 일차) 후, 2개 동일한 물체는 챔버의 첫번째 및 네번째 쿼터에서 배치되었고, 마우스는 10 분 동안 자유롭게 움직여서 2개 물체 (A&A) 및 공간에 대하여 학습하게 되었다. 1 시간의 단기 기억 측정 후, 2개 물체 중 하나는 상이한 형상 및 색 (A&B)으로 교환되었고, 새로운 물체에 대한 호기심 (코 찌르기의 횟수)은 측정되었다. 장기 기억 측정을 위하여, 24 시간 (3 일차) 후 및 3 주 (24 일차) 후 2개 물체 중 하나는 상이한 형상 및 색 (예를 들면, A&C 내지 A&D)로 교환되었고, 새로운 물체에서 코 찌르기의 횟수는 측정 및 분석되었다. 결과는 각 그룹에 대하여 새로운 및 익숙한 물체에 관해 코 찌르기의 횟수를 분석함으로써 비교되었고, 판별 지수는 하기 공식: [(신규한-익숙한)/(신규한+익숙한)]으로 계산되었다.
(iv) 수동 회피 테스트
수동 회피 테스트는 실시예 1에 기재된 대로 수행되었다.
세포 배양
마우스 일차 뉴런성 세포 배양
해마를 포함하는 피질은 18.5 일령의 배아에 상응하는 마우스의 머리에서 단리되었고 일차 배양은 예를 들면, Seibenhener ML. 등, J Vis Exp., (65): 3634 (2012)에 기재된 대로 수행되었다. DIV (시험관내 일수)의 8번째 날에, 뉴런성 세포는 폴리브렌을 사용하여 485-3p-렌티-미니-7-GFP-F 렌티바이러스성 벡터 또는 렌티바이러스성 대조군 벡터 (miR-485-3p 없음)로 형질도입되었고, GFP 발현은 30 시간 후에 관찰되었다. 세포가 적절하게 감염되었음을 확인한 후, 면역세포화학은, 상기 기재된 대로, 4% 파라포름알데하이드를 사용하여 고정 후 (30 시간 후에) 수행되었다 (예를 들면, 생체내 렌티바이러스성 벡터 주사 및 조직 제조 참조).
마우스 일차 아교 세포 배양물
생후 1-일령 마우스는 희생되었고, 혼합된 아교 세포는 배양되었다. 미세아교 세포는 DIV (시험관내 일수)의 10번째 날에 단리되었고 성상세포는 DIV의 11번째 날에 단리되어 아교 세포 배양물을, 예를 들면, Lian H., 등, Bio Protoc., 6(21): e1989 (2016)에 기재된 대로 제조하였다. DIV의 14번째 날에, 아교 세포는 폴리브렌을 사용하여 485-3p-렌티-미니-7-GFP-F 렌티바이러스성 벡터 또는 렌티바이러스성 대조군 벡터 (miR-485-3p 없음)로 형질도입되었고, GFP 발현은 30 시간 후에 관찰되었다. 세포가 적절하게 감염되었음을 확인한 후, 면역세포화학은, 상기 기재된 대로, 4% 파라포름알데하이드를 사용하여 고정 후 수행되었다 (예를 들면, 생체내 렌트바이러스성 벡터 주사 및 조직 제조 참조).
인간 세포주
중추 신경계 (CNS) 피질, 불멸화된 인간 성상세포, 및 태아 SV40 세포에서 유래된 인간 미세아교세포 일차 세포는 폴리브렌을 사용하여 485-3p-렌티-미니-7-GFP-F 렌티바이러스성 벡터 또는 렌티바이러스성 대조군 벡터 (miR-485-3p 없음)로 형질도입되었고, GFP 발현은 24 시간 후에 관찰되었다. 세포가 적절하게 감염되었음을 확인한 후, 면역세포화학은, 상기 기재된 대로, 4% 파라포름알데하이드를 사용하여 고정 후 수행되었다 (예를 들면, 생체내 렌티바이러스성 벡터 주사 및 조직 제조 참조).
질환 유도
CA1은 AD 질환의 발병에서 중요한 역할을 하는 뇌의 한 부분으로서 알려진다. AD의 병리가, 해마의 CA1과 해마밑동 사이 경계인 원위 CA1에서 시작하고, CA2까지 진행하는 것으로 믿어진다. 예를 들면, Arjun V. Masurkar, J Alzheimers Dis Parkinsonism, 8(1):412 (2018) 참조. 그러므로, 해마 치상회에서 신경발생을 억제시키기 위해 그리고 CA1에서 병리를 유도하기 위해, 양쪽 영역은 miR-485-3p를 과발현시키기 위하여 표적 부위로서 선택되었다.
설치류 해마에서 신경 회로는 흥분성 삼시냅스성 경로 (내후각 피질 (EC)-치상회 (DG)-CA3-CA1-EC)로 구성된다 예를 들면, Wei D. 등, Nat Rev Neurosci, 11:339-350 (2010) 참조. 실험은 CA3-CA1을 포함하는 전체 해마 영역에 투영되도록 설계되었다. 렌티바이러스성 벡터가 단 하나의 좌표를 선택함으로써 주사되면, 전체 해마에서 miR-485-3p 발현시키기에 한계가 있을 것으로 생각된다. 그러므로, 주사 좌표는 렌티바이러스성 벡터가 후방 해마에 주사되고 바이러스-감염된 뉴런이 전방 해마에 투영되도록 설정되었다.
마우스 해마 DG 및 CA1은 렌티-miR485-3p GFP-F 함유 벡터의 반구당 2-점 주사 (총 4 점) (도 25a)로 처리되었다. 도 25b에서 도시된 대로, 양쪽 전방 해마 및 후방 해마의 치상회 및 CA1에서 유의미한 GFP 발현이 있었다. 이 결과는 상기 기재된 방법을 사용하여, miR-485-3p가 마우스 해마 전반에 걸쳐서 성공적으로 과발현되었음을 입증한다.
실시예 20: miR485-3p 과발현에 의한 인지-관련 행동 변화의 관찰
다음에, 인지, 학습, 및 기억-관련 행동 변화에 관한 miR485-3p 과발현의 효과는 관찰되었다. 간략히, miR485-3p 과발현 후 약 한 달 후에, 실시예 19에서 기재된 상이한 행동 테스트는 도 26에서 기재된 대로 수행되었다.
야외 테스트
(기본 이동력 및 불안-관련 반응에서 변화를 측정하기 위한) 야외 테스트로, 대조군 그룹에 비교하여 렌티-miR485-3p 벡터 주사된 마우스 그룹의 움직임 (이동된 총 거리)에서 유의미한 차이는 없었다 (도 27a). 유사한 결과는 센터존 활동 (즉, 야외 경기장의 중심 부문에서 보낸 시간의 양; 불안-유사 활동을 나타내는 것으로 생각된 중심 시간에서의 증가)이 2개 그룹 사이 사정된 경우 관찰되었다 (도 27b). 그래서, 마우스 해마에서 miR485-3p의 과발현은 이동력 및 감정-관련 (예를 들면, 불안) 기능에 영향을 주지 않았다.
Y-미로 테스트
본원 (예를 들면, 실시예 14 및 실시예 19)에 기재된 경우에, Y-미로 테스트는 공간 작업 기억을 평가하는 행동 실험이다. 테스트는 정상 설치류가 새로운 환경을 탐색하는 것을 좋아한다는 개념에 기반된다 (예를 들면, 정상 마우스는 일반적으로 Y-미로 기구의, 이전에 방문된 것으로 돌아가는 것보다, 이전에 방문된 아암에서 새로운 아암으로 돌아다니는 것을 선호한다). 이 작용을 수행하기 위해, 다양한 뇌 영역, 예컨대 해마, 중격, 기저 전뇌, 및 전전두 피질은 관여된다. 따라서 Y-미로 테스트는 이들 상이한 뇌 영역의 임의의 것의 적절한 기능화를 사정하는데 유용할 수 있다.
관찰된 대로, 대조군 그룹과 mir485-3p 과발현 그룹 사이 총 아암 진입 횟수에서 통계적으로 유의미한 차이는 없었다 (도 28a). 비슷하게, 교대 행동 (즉, 정상 마우스가 도착된 것과 상이한 아암을 선택할 것이라는 개념)은 상이한 동물 중에 또한 비교가능하였다 (도 28b). 이들 결과는 Y-미로에서 일반 운동 및 탐색 활동의 수준이 miR-485 과발현 후 변화되지 않았음을 나타낸다.
신규한 물체 인식 테스트
본원 (예를 들면, 실시예 19)에 기재된 경우에, 신규한 물체 인식 테스트는 물체 인식 기억에서 가능한 결손을 사정하기 위해 설치류 모델에서 종종 사용되는 행동 테스트이다. 이 테스트는 익숙한 물체보다 더 많은 호기심으로 새로운 물체를 찾기 위한 마우스의 특징에 기반되고, 양쪽 단기 및 장기 기억을 측정한다.
대조군 그룹 (즉, 해마에서 miR485-3p 과발현 없음)과 비교하여, 실험 그룹 (즉, 해마에서 miR485-3p 과발현)으로부터 마우스는 물체를 양쪽 단기 (물체 인식 훈련 후 1 시간에; 도 29b 및 29e 참조) 및 장기 (물체 인식 훈련 후 24 시간 (도 29c 및 29f 참조) 및 3 주 (도 29d 및 29g 참조)에) 인식하는 그들의 능력에서 통계적으로 유의미한 손상을 나타냈다. 대조군 그룹으로부터 동물은 오래되고 새로운 물체 사이 구별할 수 있었고 새로운 물체를 탐색하는데 더 많은 흥미를 보여주었다. 반대로, miR485-3p 과발현을 가진 마우스는 오래되고 새로운 물체 사이 구별하지 못했다. 이들 결과는 해마에서 miR485-3p의 과발현이 양쪽 단기 및 장기 기억의 형성에서 해로운 영향을 갖는다는 것을 시사한다.
수동 회피 테스트
본원에 기재된 경우에, 수동 회피 테스트는 두려움-동기 테스트이다. 혐오 자극, 예컨대 발-충격이 주어지는 환경 (즉, 연상 기억)을 회피하기 위해 환경에 대하여 인식하고 학습하는 마우스의 능력을 테스트한다.
도 30에서 도시된 대로, 대조군 그룹 및 miR485-3p 과발현 그룹의 진입 대기 시간 값에서 유의미한 차이는 없었다. 이 데이터는 마우스 해마에서 miR485-3p의 과발현이 두려움 획득에 관한 임의의 두드러진 효과를 갖지 않았음을 입증한다.
집합적으로, 상기 결과는 해마 내에서 miR-485의 과발현이, 많은 AD 환자들에서 관찰된 것과 유사한, 양쪽 단기 및 장기 기억을 손상시킴을 입증한다. 상기 결과는 또한 본원에 개시된 miR-485 억제제가 (예를 들면, 상이한 뇌 영역 내에서 miR-485의 발현을 감소시킴으로써) AD 환자들에서 특정 인지 기능 (예를 들면, 단기 및 장기 기억) 개선하기에서 유용할 수 있음을 시사한다.
실시예 21: 신경 세포에 관한 miR-485-3p 과발현의 효과
상기 기재된 miR485-3p 과발현 (예를 들면, 실시예 20)에 의해 유도된 인지 저하가 해마 내에서 세포성 변화로 야기되었는지 여부를 관찰하기 위해, 신경 세포는 실시예 19에서 기재된 대로 렌티-miR485-3p (실험 그룹) 또는 렌티-대조군 벡터 (대조군 그룹)로 형질도입되었다 (도 31a 참조).
도 31b는, 렌티-대조군 그룹과 대조적으로, 아밀로이드 베타가 증가되었고 miR485-3p로 과발현된 세포에서 축적되었음을 도시한다. 아밀로이드 베타는 실험 그룹에서 바이러스로 감염되지 않았던 세포에서 또한 관찰되어, 아밀로이드 베타가 뉴런에서 뉴런으로 확대함을 입증하였다. AD의 신경병리학적 특질로서 알려진, 절단된 타우 단백질은 렌티-대조군 그룹과 비교하여 miR485-3p 과발현 그룹에서 증가되는 것으로 또한 관찰되었다 (도 32). 추가적으로, miR485-3p를 과발현시키기 위해 형질도입된 뉴런에서, 양쪽 PSD-95 (양쪽 NMDA 및 AMPA 수용체의 시냅스성 분포 및 활동을 조절하는 중요한 스캐폴딩 단백질; 도 33a 참조) 및 시냅토파이신 (막 예비융합을 조절함으로써 시냅스성 소포로부터 신경전달물질 방출에서 역할을 한다고 생각됨; 도 33b 참조)의 발현에서 두드러진 감소가 또한 있었다. 어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, 일부 양태에서, miR485-3p 과발현이 뉴런 아밀로이드 베타 발현을 증가, 타우병증을 유도, 시냅스생성을 약화, 및/또는 뉴런성 세포사를 증가시킴으로써 신경 세포 운명에 음성으로 영향을 줄 수 있다고 생각된다 (도 34 참조).
다음에, miR485-3p의 과발현이 다른 신경 세포에 또한 영향을 줄 수 있는지 여부를 사정하기 위해, 마우스 일차 성상세포 및 미세아교 세포는 실시예 19에서 기재된 대로 렌티-miR485-3p 또는 렌티-대조군 벡터로 형질도입되었다 (도 35a 참조). 렌티-바이러스 감염은 마우스 전뇌에서 단리된 미세아교세포의 세포-특이적 마커인 Iba-1 (도 35b), 및 성상세포의 세포-특이적 마커인 GFAP (도 36a)의 발현, 그리고 각 세포의 특징 및 GFP 신호의 관찰을 통해서 확인되었다. 양쪽 미세아교세포 (도 35c 및 도 37c) 및 성상세포 (도 36b 및 도 38b)에서, 절단된 카스파제 3은 miR485-3p 과발현의 결과로서 증가되었다. 이들 결과는 miR485-3p가 뉴런을 직접적으로 손상시킬 뿐만 아니라, 신경염증 및 시냅스 항상성에서 주요 역할을 하는 아교 세포의 신경아교증을 야기시킴을 입증한다.
실시예 19-21에서 상기 기재된 결과는 추가로 miR485-3p 발현이 알츠하이머병 유도에서 가질 수 있는 역할을 입증한다. 어느 하나의 이론에 얽매이지 않고, miR485-3p의 발현을 감소 및/또는 억제시킴으로써, 본원에 기재된 miR-485 억제제는 다양한 신경퇴행성 질환 및 장애, 예컨대 알츠하이머병의 치료를 위한 유용한 치료제일 수 있다.
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개요 및 요약 섹션이 아니라, 상세한 설명 섹션이 청구항을 해석하는데 사용되기 위한 것임이 이해되어야 한다. 개요 및 요약 섹션은 본 발명자(들)에 의해 고려된 대로 본 개시내용의 모든 예시적 양태가 아닌 하나 이상을 설명할 수 있고, 그래서, 본 개시내용 및 첨부된 청구항을 어떤 식으로든 제한하기 위한 것은 아니다.
본 개시내용은 특정된 기능 및 이들의 관계의 구현을 예시하는 기능적 구축 블록의 도움으로 상기 기재되었다. 이들 기능적 구축 블록의 경계는 설명의 편의를 위해 본원에 임의적으로 정의되었다. 대안적 경계는 특정된 기능 및 이들의 관계가 적절하게 수행되는 한 정의될 수 있다.
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SEQUENCE LISTING <110> BIORCHESTRA CO., LTD. <120> MIRNA-485 INHIBITOR FOR GENE UPREGULATION <130> 4366.014PC04/C-K/DKC <150> US 62/971,767 <151> 2020-02-07 <150> US 62/989,486 <151> 2020-03-13 <150> US 63/047,155 <151> 2020-07-01 <150> US 63/064,314 <151> 2020-08-11 <160> 122 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 22 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 1 gucauacacg gcucuccucu cu 22 <210> 2 <211> 7 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 2 uguauga 7 <210> 3 <211> 8 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 3 guguauga 8 <210> 4 <211> 9 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 4 cguguauga 9 <210> 5 <211> 10 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 5 ccguguauga 10 <210> 6 <211> 11 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> oligonucleotide <400> 6 gccguguaug a 11 <210> 7 <211> 12 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 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aagagtggtg cagagagaaa aaagagcagt gggaatagga 1560 gctttgttcc ttgggttctt gggagcagca ggaagcacta tgggcgcagc gtcaatgacg 1620 ctgacggtac aggccagaca attattgtct ggtatagtgc agcagcagaa caatttgctg 1680 agggctattg aggcgcaaca gcatctgttg caactcacag tctggggcat caagcagctc 1740 caggcaagaa tcctggctgt ggaaagatac ctaaaggatc aacagctcct ggggatttgg 1800 ggttgctctg gaaaactcat ttgcaccact gctgtgcctt ggaatgctag ttggagtaat 1860 aaatctctgg aacagatttg gaatcacacg acctggatgg agtgggacag agaaattaac 1920 aattacacaa gcttaataca ctccttaatt gaagaatcgc aaaaccagca agaaaagaat 1980 gaacaagaat tattggaatt agataaatgg gcaagtttgt ggaattggtt taacataaca 2040 aattggctgt ggtatataaa attattcata atgatagtag gaggcttggt aggtttaaga 2100 atagtttttg ctgtactttc tatagtgaat agagttaggc agggatattc accattatcg 2160 tttcagaccc acctcccaac cccgagggga cccgacaggc ccgaaggaat agaagaagaa 2220 ggtggagaga gagacagaga cagatccatt cgattagtga acggatctcg acggtatcga 2280 aagcttggga ttcgaattta aaagaaaagg ggggattggg gggtacagtg caggggaaag 2340 aatagtagac ataatagcaa 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acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg 3240 gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct 3300 tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag 3360 gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg 3420 aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca 3480 aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct 3540 atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca 3600 tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg 3660 gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc 3720 ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc 3780 tcggcatgga cgagctgtac aagtgaggta ccgatatcga attcatagct agccctgcag 3840 gtctagactc gaggtcatac acggctctcc tctctgcggc cgcagtcgag tacccatacg 3900 acgtcccaga ctacgcttga gtttaaacac gcgtggtgtg gaaagtcccc aggctcccca 3960 gcaggcagaa gtatgcaaag catgcatctc aattagtcag caaccaggtg tggaaagtcc 4020 ccaggctccc cagcaggcag aagtatgcaa agcatgcatc tcaattagtc agcaaccata 4080 gtcccgcccc taactccgcc catcccgccc ctaactccgc ccagttccgc ccattctccg 4140 ccccatggct gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggccgcctc ggcctctgag 4200 ctattccaga agtagtgagg aggctttttt ggaggccatg accgagtaca agcccacggt 4260 gcgcctcgcc acccgcgacg acgtccctcg ggccgtacgc accctcgccg ccgcgttcgc 4320 cgactacccc gccacgcgcc acaccgtgga cccggaccgc cacatcgagc gggtcaccga 4380 gctgcaagaa ctcttcctca cgcgcgtcgg gctcgacatc ggcaaggtgt gggtcgcgga 4440 cgacggcgcc gcggtggcgg tctggaccac gccggagagc gtcgaagcgg gggcggtgtt 4500 cgccgagatc ggcccgcgca tggccgagtt gagcggttcc cggctggccg cgcagcaaca 4560 gatggaaggg ctcctggcgc cgcaccggcc caaggagccc gcgtggttcc tggccaccgt 4620 cggcgtctcg cccgaccacc agggcaaggg tctgggcagc gccgtcgtgc tccccggagt 4680 ggaggcggcc gagcgcgccg gggtgcccgc cttcctggag acctccgcgc cccgcaacct 4740 ccccttctac gagcggctcg gcttcaccgt caccgccgac gtcgaggtgc ccgaaggacc 4800 gcgcacctgg tgcatgaccc gcaagcccgg tgcctgaacg cgttccggaa atcaacctct 4860 ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc cttttacgct 4920 atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta tggctttcat 4980 tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt ggcccgttgt 5040 caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg gttggggcat 5100 tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta ttgccacggc 5160 ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt tgggcactga 5220 caattccgtg gtgttgtcgg ggaagctgac gtcctttcca tggctgctcg cctgtgttgc 5280 cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca atccagcgga 5340 ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtctcg ccttcgccct 5400 cagacgagtc ggatctccct ttgggccgcc tccccgcctg tccggatgga agggctaatt 5460 cactcccaac gaatacaaga tctgcttttt gcttgtactg ggtctctctg gttagaccag 5520 atctgagcct gggagctctc tggctaacta gggaacccac tgcttaagcc tcaataaagc 5580 ttgccttgag tgcttcaagt agtgtgtgcc cgtctgttgt gtgactctgg taactagaga 5640 tccctcagac ccttttagtc agtgtggaaa attctagcag tagtagttca tgtcatctta 5700 ttattcagta tttataactt gcaaagaaat gaatatcaga gagtgagagg aacttgttta 5760 ttgcagctta taatggttac aaataaagca atagcatcac aaatttcaca aataaagcat 5820 ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt ccaaactcat caatgtatct tatcatgtct 5880 ggcatctatg tcgggtgcgg agaaagaggt aatgaaatgg cattatgggt attatgggtc 5940 tgcattaatg aatcggccaa cgatcccggt gtgaaatacc gcacagatgc gtaaggagaa 6000 aataccgcat caggcgctct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 6060 ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 6120 gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 6180 aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 6240 gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 6300 ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 6360 cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 6420 cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 6480 gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 6540 cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 6600 agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag gacagtattt ggtatctgcg 6660 ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 6720 ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 6780 gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 6840 cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 6900 attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacagtt 6960 accaatgctt aatcagtgag gcacctatct cagcgatctg tctatttcgt tcatccatag 7020 ttgcctgact ccccgtcgtg tagataacta cgatacggga gggcttacca tctggcccca 7080 gtgctgcaat gataccgcga gacccacgct caccggctcc agatttatca gcaataaacc 7140 agccagccgg aagggccgag cgcagaagtg gtcctgcaac tttatccgcc tccatccagt 7200 ctattaattg ttgccgggaa gctagagtaa gtagttcgcc agttaatagt ttgcgcaacg 7260 ttgttgaaaa aggatcttca cctagatcct tttcacgtag aaagccagtc cgcagaaacg 7320 gtgctgaccc cggatgaatg tcagctactg ggctatctgg acaagggaaa acgcaagcgc 7380 aaagagaaag caggtagctt gcagtgggct tacatggcga tagctagact gggcggtttt 7440 atggacagca agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc tctggtaagg ttgggaagcc 7500 ctgcaaagta aactggatgg ctttctcgcc gccaaggatc tgatggcgca ggggatcaag 7560 ctctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc 7620 aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat 7680 cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt 7740 caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaagac gaggcagcgc ggctatcgtg 7800 gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag 7860 ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc 7920 tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc 7980 tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga 8040 agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga 8100 actgttcgcc aggctcaagg cgagcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg 8160 cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg 8220 tggccggctg ggtgtggcgg 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Claims (110)

  1. SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 상기 수준을 증가시키는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 대상체가 SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는, 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 상기 miRNA 억제제가 자가포식을 유도하고/하거나 염증을 치료 또는 예방하는, 방법.
  4. CD36 단백질 및/또는 CD36 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 상기 수준을 증가시키는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 CD36 단백질 및/또는 CD36 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는, 방법.
  6. PGC-1α 단백질 및/또는 PGC-1α 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 상기 수준을 증가시키는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 PGC-1α 단백질 및/또는 PGC-1α 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는, 방법.
  8. LRRK2 단백질 및/또는 LRRK2 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 상기 수준을 증가시키는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 LRRK2 단백질 및/또는 LRRK2 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는, 방법.
  10. NRG1 단백질 및/또는 NRG1 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 상기 수준을 증가시키는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 NRG1 단백질 및/또는 NRG1 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는, 방법.
  12. STMN2 단백질 및/또는 STMN2 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 상기 수준을 증가시키는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 STMN2 단백질 및/또는 STMN2 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는, 방법.
  14. VLDLR 단백질 및/또는 VLDLR 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 상기 수준을 증가시키는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. 제 1 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 VLDLR 단백질 및/또는 VLDLR 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는, 방법.
  16. NRXN1 단백질 및/또는 NRXN1 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 상기 수준을 증가시키는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제 1 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 NRXN1 단백질 및/또는 NRXN1 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는, 방법.
  18. GRIA4 단백질 및/또는 GRIA4 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 상기 수준을 증가시키는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  19. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 GRIA4 단백질 및/또는 GRIA4 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는, 방법.
  20. NXPH1 단백질 및/또는 NXPH1 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 상기 수준을 증가시키는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  21. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 NXPH1 단백질 및/또는 NXPH1 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는, 방법.
  22. PSD-95 단백질 및/또는 PSD-95 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 상기 수준을 증가시키는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  23. 제 1 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 PSD-95 단백질 및/또는 PSD-95 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는, 방법.
  24. 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자 수준의 증가를 필요로 하는 대상체에서 상기 수준을 증가시키는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 감소된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는, 방법.
  26. 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자 수준의 감소를 필요로 하는 대상체에서 상기 수준을 감소시키는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 방법.
  27. 제 1 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체가 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자의 증가된 수준과 연관된 질환 또는 병태를 갖는, 방법.
  28. 제 1 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miRNA 억제제가 신경발생을 유도하는, 방법.
  29. 제 28 항에 있어서, 신경발생 유도하는 것이 신경 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 증가된 증식, 분화, 이동, 및/또는 생존을 포함하는, 방법.
  30. 제 28 항 또는 제 29 항에 있어서, 신경발생 유도하는 것이 신경 줄기 세포 및/또는 전구 세포의 증가된 수를 포함하는, 방법.
  31. 제 28 항 내지 제 30 항 중 어느 한 항에 있어서, 신경발생 유도하는 것이 증가된 축삭돌기, 수상돌기, 및/또는 시냅스 발달을 포함하는, 방법.
  32. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miRNA 억제제가 식세포작용을 유도하는, 방법.
  33. SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 miRNA 억제제가 상기 SIRT1 단백질 및/또는 SIRT1 유전자의 수준을 증가시키는, 방법.
  34. CD36 단백질 및/또는 CD36 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 miRNA 억제제가 상기 CD36 단백질 및/또는 CD36 유전자의 수준을 증가시키는, 방법.
  35. PGC-1α 단백질 및/또는 PGC-1α 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 miRNA 억제제가 상기 PGC-1α 단백질 및/또는 PGC-1α 유전자의 수준을 증가시키는, 방법.
  36. LRRK2 단백질 및/또는 LRRK2 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 miRNA 억제제가 상기 LRRK2 단백질 및/또는 LRRK2 유전자의 수준을 증가시키는, 방법.
  37. NRG1 단백질 및/또는 NRG1 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 miRNA 억제제가 상기 NRG1 단백질 및/또는 NRG1 유전자의 수준을 증가시키는, 방법.
  38. STMN2 단백질 및/또는 STMN2 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 miRNA 억제제가 상기 STMN2 단백질 및/또는 STMN2 유전자의 수준을 증가시키는, 방법.
  39. VLDLR 단백질 및/또는 VLDLR 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 miRNA 억제제가 상기 VLDLR 단백질 및/또는 VLDLR 유전자의 수준을 증가시키는, 방법.
  40. NRXN1 단백질 및/또는 NRXN1 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 miRNA 억제제가 상기 NRXN1 단백질 및/또는 NRXN1 유전자의 수준을 증가시키는, 방법.
  41. GRIA4 단백질 및/또는 GRIA4 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 miRNA 억제제가 상기 GRIA4 단백질 및/또는 GRIA4 유전자의 수준을 증가시키는, 방법.
  42. NXPH1 단백질 및/또는 NXPH1 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 miRNA 억제제가 상기 NXPH1 단백질 및/또는 NXPH1 유전자의 수준을 증가시키는, 방법.
  43. PSD-95 단백질 및/또는 PSD-95 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 miRNA 억제제가 상기 PSD-95 단백질 및/또는 PSD-95 유전자의 수준을 증가시키는, 방법.
  44. 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 miRNA 억제제가 상기 시냅토파이신 단백질 및/또는 시냅토파이신 유전자의 수준을 증가시키는, 방법.
  45. 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자의 비정상 수준과 연관된 질환 또는 병태의 치료를 필요로 하는 대상체에서 이를 치료하는 방법으로서, miR-485를 억제시키는 화합물 (miRNA 억제제)을 상기 대상체에게 투여하는 단계를 포함하되, 상기 miRNA 억제제가 상기 카스파제-3 단백질 및/또는 카스파제-3 유전자의 수준을 감소시키는, 방법.
  46. 제 1 항 내지 제 45 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miRNA 억제제가 miR485-3p를 억제시키는, 방법.
  47. 제 46 항에 있어서, 상기 miR485-3p가 5'-gucauacacggcucuccucucu-3' (서열번호: 1)를 포함하는, 방법.
  48. 제 1 항 내지 제 47 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miRNA 억제제가 5'-UGUAUGA-3' (서열번호: 2)를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 상기 miRNA 억제제는 길이가 약 6 내지 약 30개 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  49. 제 1 항 내지 제 48 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miRNA 억제제가 SIRT1 유전자의 전사 및/또는 SIRT1 단백질의 발현을 증가시키거나; CD36 유전자의 전사 및/또는 CD36 단백질의 발현을 증가시키거나; PGC1 유전자의 전사 및/또는 PGC1 단백질의 발현을 증가시키거나; LRRK2 유전자의 전사 및/또는 LRRK2 단백질의 발현을 증가시키거나; NRG1 유전자의 전사 및/또는 NRG1 단백질의 발현을 증가시키거나; STMN2 유전자의 전사 및/또는 STMN2 단백질의 발현을 증가시키거나; VLDLR 유전자의 전사 및/또는 VLDLR 단백질의 발현을 증가시키거나; NRXN1 유전자의 전사 및/또는 NRXN1 단백질의 발현을 증가시키거나; GRIA4 유전자의 전사 및/또는 GRIA4 단백질의 발현을 증가시키거나; NXPH1 유전자의 전사 및/또는 NXPH1 단백질의 발현을 증가시키거나; PSD-95 유전자의 전사 및/또는 PSD-95 단백질의 발현을 증가시키거나; 시냅토파이신 유전자의 전사 및/또는 시냅토파이신 단백질의 발현을 증가시키거나; 카스파제-3 유전자의 전사 및/또는 카스파제-3 단백질의 발현을 감소시키거나; 이들의 임의의 조합인, 방법.
  50. 제 1 항 내지 제 49 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miRNA 억제제가 상기 뉴클레오티드 서열의 5'에서 적어도 1 뉴클레오티드, 적어도 2 뉴클레오티드, 적어도 3 뉴클레오티드, 적어도 4 뉴클레오티드, 적어도 5 뉴클레오티드, 적어도 6 뉴클레오티드, 적어도 7 뉴클레오티드, 적어도 8 뉴클레오티드, 적어도 9 뉴클레오티드, 적어도 10 뉴클레오티드, 적어도 11 뉴클레오티드, 적어도 12 뉴클레오티드, 적어도 13 뉴클레오티드, 적어도 14 뉴클레오티드, 적어도 15 뉴클레오티드, 적어도 16 뉴클레오티드, 적어도 17 뉴클레오티드, 적어도 18 뉴클레오티드, 적어도 19 뉴클레오티드, 또는 적어도 20개 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  51. 제 1 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miRNA 억제제가 상기 뉴클레오티드 서열의 3'에서 적어도 1 뉴클레오티드, 적어도 2 뉴클레오티드, 적어도 3 뉴클레오티드, 적어도 4 뉴클레오티드, 적어도 5 뉴클레오티드, 적어도 6 뉴클레오티드, 적어도 7 뉴클레오티드, 적어도 8 뉴클레오티드, 적어도 9 뉴클레오티드, 적어도 10 뉴클레오티드, 적어도 11 뉴클레오티드, 적어도 12 뉴클레오티드, 적어도 13 뉴클레오티드, 적어도 14 뉴클레오티드, 적어도 15 뉴클레오티드, 적어도 16 뉴클레오티드, 적어도 17 뉴클레오티드, 적어도 18 뉴클레오티드, 적어도 19 뉴클레오티드, 또는 적어도 20개 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  52. 제 1 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miRNA 억제제가 5'-UGUAUGA-3' (서열번호: 2), 5'-GUGUAUGA-3' (서열번호: 3), 5'-CGUGUAUGA-3' (서열번호: 4), 5'-CCGUGUAUGA-3' (서열번호: 5), 5'-GCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 6), 5'-AGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 7), 5'-GAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 8), 5'-AGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 9), 5'-GAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 10), 5'-GGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 11), 5'-AGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 12), 5'-GAGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 13), 5'-AGAGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 14), 5'-GAGAGGAGAGCCGUGUAUGA-3' (서열번호: 15); 5'-UGUAUGAC-3' (서열번호: 16), 5'-GUGUAUGAC-3' (서열번호: 17), 5'-CGUGUAUGAC-3' (서열번호: 18), 5'-CCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 19), 5'-GCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 20), 5'-AGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 21), 5'-GAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 22), 5'-AGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 23), 5'-GAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 24), 5'-GGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 25), 5'-AGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 26), 5'-GAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 27), 5'-AGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 28), 5'-GAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 29), 또는 AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC (서열번호: 30)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖는, 방법.
  53. 제 1 항 내지 제 46 항 및 제 49 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miRNA 억제제가 5'-TGTATGA-3' (서열번호: 62), 5'-GTGTATGA-3' (서열번호: 63), 5'-CGTGTATGA-3' (서열번호: 64), 5'-CCGTGTATGA-3' (서열번호: 65), 5'-GCCGTGTATGA-3' (서열번호: 66), 5'-AGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 67), 5'-GAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 68), 5'-AGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 69), 5'-GAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 70), 5'-GGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 71), 5'-AGGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 72), 5'-GAGGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 73), 5'-AGAGGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 74), 5'-GAGAGGAGAGCCGTGTATGA-3' (서열번호: 75); 5'-TGTATGAC-3' (서열번호: 76), 5'-GTGTATGAC-3' (서열번호: 77), 5'-CGTGTATGAC-3' (서열번호: 78), 5'-CCGTGTATGAC-3' (서열번호: 79), 5'-GCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 80), 5'-AGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 81), 5'-GAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 82), 5'-AGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 83), 5'-GAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 84), 5'-GGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 85), 5'-AGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 86), 5'-GAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 87), 5'-AGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 88), 5'-GAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 89), 및 5'-AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 90)로 이루어지는 군으로부터 선택된 서열을 갖는, 방법.
  54. 제 1 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miRNA 억제제의 서열이 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30) 또는 5'-AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 90)에 적어도 약 50%, 적어도 약 55%, 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 또는 적어도 약 95% 서열 동일성인, 방법.
  55. 제 54 항에 있어서, 상기 miRNA 억제제가 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30) 또는 5'-AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 90)에 적어도 90% 유사성을 갖는 서열을 갖는, 방법.
  56. 제 1 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miRNA 억제제가 1개 치환 또는 2개 치환을 갖는 상기 뉴클레오티드 서열 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30) 또는 5'-AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 90)를 포함하는, 방법.
  57. 제 1 항 내지 제 51 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miRNA 억제제가 상기 뉴클레오티드 서열 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30) 또는 5'-AGAGAGGAGAGCCGTGTATGAC-3' (서열번호: 90)를 포함하는, 방법.
  58. 제 57 항에 있어서, 상기 miRNA 억제제가 상기 뉴클레오티드 서열 5'-AGAGAGGAGAGCCGUGUAUGAC-3' (서열번호: 30)를 포함하는, 방법.
  59. 제 1 항 내지 제 58 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miRNA 억제제가 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드를 포함하는, 방법.
  60. 제 59 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 변형된 뉴클레오티드가 잠금 핵산 (LNA), 비잠금 핵산 (UNA), 아라비노 핵산 (ABA), 브릿징된 핵산 (BNA), 및/또는 펩티드 핵산 (PNA)인, 방법.
  61. 제 1 항 내지 제 60 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miRNA 억제제가 백본 변형을 포함하는, 방법.
  62. 제 61 항에 있어서, 상기 백본 변형이 포스포로디아미데이트 모르폴리노 올리고머 (PMO) 및/또는 포스포로티오에이트 (PS) 변형인, 방법.
  63. 제 1 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miRNA 억제제가 전달 제제로 전달되는, 방법.
  64. 제 63 항에 있어서, 상기 전달 제제가 미셀, 엑소좀, 지질 나노입자, 세포외 소포, 또는 합성 소포인, 방법.
  65. 제 1 항 내지 제 64 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miRNA 억제제가 바이러스성 벡터에 의해 전달되는, 방법.
  66. 제 65 항에 있어서, 상기 바이러스성 벡터가 AAV, 아데노바이러스, 레트로바이러스, 또는 렌티바이러스인, 방법.
  67. 제 66 항에 있어서, 상기 바이러스성 벡터가 AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9, AAV10, 또는 이들의 임의의 조합의 혈청형을 갖는 AAV인, 방법.
  68. 제 1 항 내지 제 67 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 miRNA 억제제가 전달 제제와 함께 전달되는, 방법.
  69. 제 68 항에 있어서, 상기 전달 제제가 리피도이드, 리포솜, 리포플렉스, 지질 나노입자, 중합체성 화합물, 펩티드, 단백질, 세포, 나노입자 모방체, 나노튜브, 또는 접합체를 포함하는, 방법.
  70. 제 68 항 또는 제 69 항에 있어서, 상기 전달 제제가
    [WP]-L1-[CC]-L2-[AM] (화학식 I)
    또는
    [WP]-L1-[AM]-L2-[CC] (화학식 II)
    을 포함하는 양이온성 담체 단위체를 포함하되,
    식중
    WP는 수용성 생체고분자 모이어티이고;
    CC는 양으로 하전된 담체 모이어티이고;
    AM은 보조제 모이어티이고;
    L1 및 L2는 독립적으로 임의적 링커이고,
    여기서 약 1:1의 이온성 비로 핵산과 혼합된 경우, 상기 양이온성 담체 단위체가 미셀을 형성하는, 방법.
  71. 제 70 항에 있어서, 상기 miRNA 억제제가 이온성 결합을 통해 상기 양이온성 담체 단위체와 상호작용하는, 방법.
  72. 제 70 항 또는 제 71 항에 있어서, 상기 수용성 중합체가 폴리(알킬렌 글리콜), 폴리(옥시에틸화 폴리올), 폴리(올레핀성 알코올), 폴리(비닐피롤리돈), 폴리(하이드록시알킬메타크릴아미드), 폴리(하이드록시알킬메타크릴레이트), 폴리(당류), 폴리(α-하이드록시산), 폴리(비닐 알코올), 폴리글리세롤, 폴리포스파젠, 폴리옥사졸린 ("POZ") 폴리(N-아크릴로일모르폴린), 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  73. 제 70 항 내지 제 72 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용성 중합체가 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG"), 폴리글리세롤, 또는 폴리(프로필렌 글리콜) ("PPG")을 포함하는, 방법.
  74. 제 70 항 내지 제 73 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용성 중합체가
    Figure pct00034
    , (화학식 I),
    을 포함하되, 식중 n은 1-1000인 방법.
  75. 제 74 항에 있어서, 상기 n이 적어도 약 110, 적어도 약 111, 적어도 약 112, 적어도 약 113, 적어도 약 114, 적어도 약 115, 적어도 약 116, 적어도 약 117, 적어도 약 118, 적어도 약 119, 적어도 약 120, 적어도 약 121, 적어도 약 122, 적어도 약 123, 적어도 약 124, 적어도 약 125, 적어도 약 126, 적어도 약 127, 적어도 약 128, 적어도 약 129, 적어도 약 130, 적어도 약 131, 적어도 약 132, 적어도 약 133, 적어도 약 134, 적어도 약 135, 적어도 약 136, 적어도 약 137, 적어도 약 138, 적어도 약 139, 적어도 약 140, 또는 적어도 약 141인, 방법.
  76. 제 74 항에 있어서, 상기 n이 약 80 내지 약 90, 약 90 내지 약 100, 약 100 내지 약 110, 약 110 내지 약 120, 약 120 내지 약 130, 약 140 내지 약 150, 약 150 내지 약 160인, 방법.
  77. 제 70 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 수용성 중합체가 선형, 분지형, 또는 수지상인, 방법.
  78. 제 70 항 내지 제 77 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온성 담체 모이어티가 하나 이상의 염기성 아미노산을 포함하는, 방법.
  79. 제 78 항에 있어서, 상기 양이온성 담체 모이어티가 적어도 3, 적어도 4, 적어도 5, 적어도 6, 적어도 7, 적어도 8, 적어도 9, 적어도 10, 적어도 11, 적어도 12, 적어도 13, 적어도 14, 마침내 15, 적어도 16, 적어도 17, 적어도 18, 적어도 19, 적어도 20, 적어도 21, 적어도 22, 적어도 23, 적어도 24, 적어도 25, 적어도 26, 적어도 27, 적어도 28, 적어도 29, 적어도 30, 적어도 31, 적어도 32, 적어도 33, 적어도 34, 적어도 35, 적어도 36, 적어도 37, 적어도 38, 적어도 39, 적어도 40, 적어도 41, 적어도 42, 적어도 43, 적어도 44, 적어도 45, 적어도 46, 적어도 47, 적어도 48, 적어도 49, 또는 적어도 50개 염기성 아미노산을 포함하는, 방법.
  80. 제 79 항에 있어서, 상기 양이온성 담체 모이어티가 약 30 내지 약 50개 염기성 아미노산을 포함하는, 방법.
  81. 제 79 항 또는 제 80 항에 있어서, 상기 염기성 아미노산이 아르기닌, 라이신, 히스티딘, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  82. 제 70 항 내지 제 81 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온성 담체 모이어티가 약 40개 라이신 단량체를 포함하는, 방법.
  83. 제 70 항 내지 제 82 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보조제 모이어티가 면역 반응, 염증성 반응, 및/또는 조직 미세환경을 조절할 수 있는, 방법.
  84. 제 70 항 내지 제 82 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보조제 모이어티가 이미다졸 유도체, 아미노산, 비타민, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  85. 제 84 항에 있어서, 상기 보조제 모이어티가
    Figure pct00035
    , (화학식 II),
    을 포함하되, 식중 G1 및 G2의 각각은 H, 방향족 고리, 또는 1-10 알킬이거나, G1 및 G2는 함께 방향족 고리를 형성하고, n은 1-10인 방법.
  86. 제 84 항에 있어서, 상기 보조제 모이어티가 니트로이미다졸을 포함하는, 방법.
  87. 제 84 항에 있어서, 상기 보조제 모이어티가 메트로니다졸, 티니다졸, 니모라졸, 디메트리다졸, 프레토마니드, 오르니다졸, 메가졸, 아자니다졸, 벤즈니다졸, 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는, 방법.
  88. 제 70 항 내지 제 84 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보조제 모이어티가 아미노산을 포함하는, 방법.
  89. 제 88 항에 있어서, 상기 보조제 모이어티가
    Figure pct00036
    (화학식 III),
    을 포함하되, 식중 Ar은
    Figure pct00037
    또는
    Figure pct00038
    이고,
    Z1 및 Z2의 각각은 H 또는 OH인, 방법.
  90. 제 70 항 내지 제 84 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보조제 모이어티가 비타민을 포함하는, 방법.
  91. 제 90 항에 있어서, 상기 비타민이 환식 고리 또는 환식 헤테로 원자 고리 및 카르복실기 또는 하이드록실기를 포함하는, 방법.
  92. 제 90 항 또는 제 91 항에 있어서, 상기 비타민이
    Figure pct00039
    (화학식 IV),
    을 포함하되, 식중 Y1 및 Y2의 각각은 C, N, O, 또는 S이고, n은 1 또는 2인 방법.
  93. 제 90 항 내지 제 92 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비타민이 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B3, 비타민 B6, 비타민 B7, 비타민 B9, 비타민 B12, 비타민 C, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E, 비타민 M, 비타민 H, 및 이들의 임의의 조합으로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 방법.
  94. 제 90 항 내지 제 93 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 비타민이 비타민 B3인, 방법.
  95. 제 90 항 내지 제 94 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 보조제 모이어티가 적어도 약 2, 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 11, 적어도 약 12, 적어도 약 13, 적어도 약 14, 적어도 약 15, 적어도 약 16, 적어도 약 17, 적어도 약 18, 적어도 약 19, 또는 적어도 약 20개 비타민 B3을 포함하는, 방법.
  96. 제 95 항에 있어서, 상기 보조제 모이어티가 약 10개 비타민 B3을 포함하는, 방법.
  97. 제 90 항 내지 제 96 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전달 제제가 약 120 내지 약 130 PEG 단위체를 가진 약 수용성 생체고분자 모이어티, 약 30 내지 약 40개 라이신을 가진 폴리-라이신을 포함하는 양이온성 담체 모이어티, 및 약 5 내지 약 10개 비타민 B3를 가진 보조제 모이어티를 포함하는, 방법.
  98. 제 90 항 내지 제 97 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 전달 제제가 상기 miRNA 억제제와 연관되고, 이에 의해 미셀을 형성하는, 방법.
  99. 제 98 항에 있어서, 상기 연관성은 공유 결합, 비-공유 결합, 또는 이온성 결합인, 방법.
  100. 제 98 항 또는 제 99 항에 있어서, 상기 양이온성 담체 단위체의 양전하 및 상기 miRNA 억제제의 음전하의 상기 이온성 비가 약 1:1이 되도록 상기 미셀에서 상기 양이온성 담체 단위체 및 상기 miRNA 억제제가 용액에서 혼합되는, 방법.
  101. 제 98 항 내지 제 100 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 양이온성 담체 단위체가 상기 miRNA 억제제를 효소적 분해로부터 보호할 수 있는, 방법.
  102. 제 2 항, 제 3 항, 제 5 항, 제 7 항, 제 9 항, 제 11 항, 제 13 항, 제 15 항, 제 17 항, 제 19 항, 및 제 21 항 내지 제 101 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환 또는 병태가 알츠하이머병을 포함하는, 방법.
  103. 제 2 항, 제 3 항, 제 5 항, 제 7 항, 제 9 항, 제 11 항, 제 13 항, 제 15 항, 제 17 항, 제 19 항, 및 제 21 항 내지 제 101 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환 또는 병태가 자폐 스펙트럼 장애, 정신 지체, 발작, 뇌졸중, 파킨슨병, 척수 손상, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  104. 제 103 항에 있어서, 상기 질환 또는 병태가 파킨슨병인, 방법.
  105. 제 63 항에 있어서, 상기 전달 제제가 미셀인, 방법.
  106. 제 105 항에 있어서, 상기 미셀이 (i) 약 100 내지 약 200개 PEG 단위체, (ii) 아민기를 각각 가진, 약 30 내지 약 40개 라이신, (iii) 티올기를 각각 가진, 약 15 내지 약 20개 라이신, 및 (iv) 비타민 B3에 각각 연결된, 약 30 내지 약 40개 라이신을 포함하는, 방법.
  107. 제 105 항에 있어서, 상기 미셀이 (i) 약 120 내지 약 130개 PEG 단위체, (ii) 아민기를 각각 가진, 약 32개 라이신, (iii) 티올기를 각각 가진, 약 16개 라이신, 및 (iv) 비타민 B3에 각각 연결된, 약 32개 라이신을 포함하는, 방법.
  108. 제 106 항 또는 제 107 항에 있어서, 표적화 모이어티가 상기 PEG 단위체에 추가로 연결되는, 방법.
  109. 제 108 항에 있어서, 상기 표적화 모이어티가 LAT 1 표적화 리간드인, 방법.
  110. 제 109 항에 있어서, 상기 표적화 모이어티가 펜닐 알라닌인, 방법.
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