KR102618947B1 - 뇌 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물 - Google Patents
뇌 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102618947B1 KR102618947B1 KR1020177020915A KR20177020915A KR102618947B1 KR 102618947 B1 KR102618947 B1 KR 102618947B1 KR 1020177020915 A KR1020177020915 A KR 1020177020915A KR 20177020915 A KR20177020915 A KR 20177020915A KR 102618947 B1 KR102618947 B1 KR 102618947B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- aav
- mice
- rhes
- subject
- mtorc1
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 57
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 20
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 title description 2
- 208000023105 Huntington disease Diseases 0.000 claims abstract description 102
- 210000001577 neostriatum Anatomy 0.000 claims abstract description 71
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 claims abstract description 51
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims abstract description 50
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 claims abstract description 45
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 27
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 claims abstract description 16
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 claims abstract description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 161
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 65
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 56
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 56
- 241000702423 Adeno-associated virus - 2 Species 0.000 claims description 54
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 38
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 36
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 33
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 32
- 241001655883 Adeno-associated virus - 1 Species 0.000 claims description 27
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 24
- 230000004900 autophagic degradation Effects 0.000 claims description 23
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 18
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- 241000702421 Dependoparvovirus Species 0.000 claims description 13
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 claims description 13
- 241001634120 Adeno-associated virus - 5 Species 0.000 claims description 8
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 claims description 8
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 claims description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 7
- 230000011664 signaling Effects 0.000 claims description 7
- 241000972680 Adeno-associated virus - 6 Species 0.000 claims description 5
- 230000031154 cholesterol homeostasis Effects 0.000 claims description 3
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 claims description 2
- 230000004065 mitochondrial dysfunction Effects 0.000 claims description 2
- 230000002861 ventricular Effects 0.000 claims description 2
- 108010035196 Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Proteins 0.000 abstract description 113
- 102000008135 Mechanistic Target of Rapamycin Complex 1 Human genes 0.000 abstract description 113
- 102100027988 GTP-binding protein Rhes Human genes 0.000 abstract description 102
- 101000578396 Homo sapiens GTP-binding protein Rhes Proteins 0.000 abstract description 101
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 abstract description 7
- 102000016914 ras Proteins Human genes 0.000 abstract description 5
- 101710199249 GTP-binding protein Rhes Proteins 0.000 abstract description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 abstract description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 126
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 124
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 90
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 70
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 70
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 68
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 50
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 44
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 44
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 41
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 41
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 39
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 31
- 101710197658 Capsid protein VP1 Proteins 0.000 description 30
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 30
- 102000013530 TOR Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 27
- 108010065917 TOR Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 27
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 27
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 27
- 101710118046 RNA-directed RNA polymerase Proteins 0.000 description 26
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 26
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 26
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 25
- 101150020518 RHEB gene Proteins 0.000 description 25
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 25
- 230000006870 function Effects 0.000 description 25
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 25
- 102000046951 Ras Homolog Enriched in Brain Human genes 0.000 description 24
- 108700019578 Ras Homolog Enriched in Brain Proteins 0.000 description 24
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 24
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 23
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 23
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 22
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 22
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 22
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 22
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 22
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 22
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 22
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 22
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 21
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 21
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 21
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 21
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 20
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 17
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 16
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 16
- 239000000047 product Substances 0.000 description 16
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 15
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 14
- 102000012749 Dopamine and cAMP-Regulated Phosphoprotein 32 Human genes 0.000 description 14
- 108010090047 Dopamine and cAMP-Regulated Phosphoprotein 32 Proteins 0.000 description 14
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 14
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 14
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 14
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 13
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 13
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 13
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 13
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 12
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 12
- AKCRNFFTGXBONI-UHFFFAOYSA-N torin 1 Chemical compound C1CN(C(=O)CC)CCN1C1=CC=C(N2C(C=CC3=C2C2=CC(=CC=C2N=C3)C=2C=C3C=CC=CC3=NC=2)=O)C=C1C(F)(F)F AKCRNFFTGXBONI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 12
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 12
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 12
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 12
- 239000013607 AAV vector Substances 0.000 description 11
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 11
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 11
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 11
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 11
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 11
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 10
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 10
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 10
- HKVAMNSJSFKALM-GKUWKFKPSA-N Everolimus Chemical compound C1C[C@@H](OCCO)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 HKVAMNSJSFKALM-GKUWKFKPSA-N 0.000 description 9
- 101001123331 Homo sapiens Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha Proteins 0.000 description 9
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 9
- 102100028960 Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1-alpha Human genes 0.000 description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 9
- 229960005167 everolimus Drugs 0.000 description 9
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 9
- 102000013446 GTP Phosphohydrolases Human genes 0.000 description 8
- 108091006109 GTPases Proteins 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 8
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 8
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 8
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 8
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 8
- 238000003762 quantitative reverse transcription PCR Methods 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 8
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 8
- KWTSXDURSIMDCE-QMMMGPOBSA-N (S)-amphetamine Chemical compound C[C@H](N)CC1=CC=CC=C1 KWTSXDURSIMDCE-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 7
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 7
- 229940025084 amphetamine Drugs 0.000 description 7
- 210000004957 autophagosome Anatomy 0.000 description 7
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 7
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 7
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 7
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 7
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 7
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 7
- 230000000324 neuroprotective effect Effects 0.000 description 7
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 7
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 7
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 7
- 241000580270 Adeno-associated virus - 4 Species 0.000 description 6
- 208000002267 Anti-neutrophil cytoplasmic antibody-associated vasculitis Diseases 0.000 description 6
- 102000004072 Beclin-1 Human genes 0.000 description 6
- 108090000524 Beclin-1 Proteins 0.000 description 6
- 101000839052 Blattella germanica Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase 1 Proteins 0.000 description 6
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 6
- 102100021454 Histone deacetylase 4 Human genes 0.000 description 6
- 101000899259 Homo sapiens Histone deacetylase 4 Proteins 0.000 description 6
- 108090000895 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Proteins 0.000 description 6
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 6
- 230000002293 adipogenic effect Effects 0.000 description 6
- 210000004961 autolysosome Anatomy 0.000 description 6
- 230000003542 behavioural effect Effects 0.000 description 6
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 6
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 6
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 6
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 6
- 230000003447 ipsilateral effect Effects 0.000 description 6
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 6
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 6
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 6
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 6
- 230000010741 sumoylation Effects 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010045171 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Proteins 0.000 description 5
- 230000004543 DNA replication Effects 0.000 description 5
- 101000832685 Homo sapiens Small ubiquitin-related modifier 2 Proteins 0.000 description 5
- 102000004286 Hydroxymethylglutaryl CoA Reductases Human genes 0.000 description 5
- 102100028888 Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase, cytoplasmic Human genes 0.000 description 5
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 5
- 102100024542 Small ubiquitin-related modifier 2 Human genes 0.000 description 5
- 102000009822 Sterol Regulatory Element Binding Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010020396 Sterol Regulatory Element Binding Proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 5
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 5
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 description 5
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 5
- 210000002161 motor neuron Anatomy 0.000 description 5
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 5
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 5
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 5
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 5
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 5
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 5
- 241000202702 Adeno-associated virus - 3 Species 0.000 description 4
- 241001164823 Adeno-associated virus - 7 Species 0.000 description 4
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 101710197665 Capsid protein VP2 Proteins 0.000 description 4
- 102000005636 Cyclic AMP Response Element-Binding Protein Human genes 0.000 description 4
- 102100035989 E3 SUMO-protein ligase PIAS1 Human genes 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 4
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 4
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 108010029031 Regulatory-Associated Protein of mTOR Proteins 0.000 description 4
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 4
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 4
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 4
- 230000002886 autophagic effect Effects 0.000 description 4
- 210000004958 brain cell Anatomy 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 4
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 4
- -1 i.e. Proteins 0.000 description 4
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 4
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 4
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N rapamycin Natural products COCC(O)C(=C/C(C)C(=O)CC(OC(=O)C1CCCCN1C(=O)C(=O)C2(O)OC(CC(OC)C(=CC=CC=CC(C)CC(C)C(=O)C)C)CCC2C)C(C)CC3CCC(O)C(C3)OC)C ZAHRKKWIAAJSAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 229960002930 sirolimus Drugs 0.000 description 4
- QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N sirolimus Chemical compound C1C[C@@H](O)[C@H](OC)C[C@@H]1C[C@@H](C)[C@H]1OC(=O)[C@@H]2CCCCN2C(=O)C(=O)[C@](O)(O2)[C@H](C)CC[C@H]2C[C@H](OC)/C(C)=C/C=C/C=C/[C@@H](C)C[C@@H](C)C(=O)[C@H](OC)[C@H](O)/C(C)=C/[C@@H](C)C(=O)C1 QFJCIRLUMZQUOT-HPLJOQBZSA-N 0.000 description 4
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 4
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 3
- 102100036512 7-dehydrocholesterol reductase Human genes 0.000 description 3
- 108010056679 7-dehydrocholesterol reductase Proteins 0.000 description 3
- 241001164825 Adeno-associated virus - 8 Species 0.000 description 3
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 241000255581 Drosophila <fruit fly, genus> Species 0.000 description 3
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 101000628899 Homo sapiens Small ubiquitin-related modifier 1 Proteins 0.000 description 3
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 102100021695 Lanosterol 14-alpha demethylase Human genes 0.000 description 3
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 3
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 3
- 101100087591 Mus musculus Rictor gene Proteins 0.000 description 3
- 206010060860 Neurological symptom Diseases 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 3
- 108010038241 Protein Inhibitors of Activated STAT Proteins 0.000 description 3
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 3
- 102100026940 Small ubiquitin-related modifier 1 Human genes 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 3
- 230000003915 cell function Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 3
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 3
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 3
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 3
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 3
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Natural products O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 3
- 230000008437 mitochondrial biogenesis Effects 0.000 description 3
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 3
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 3
- 108010079892 phosphoglycerol kinase Proteins 0.000 description 3
- 238000010149 post-hoc-test Methods 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 230000037432 silent mutation Effects 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000005100 tissue tropism Effects 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101100524321 Adeno-associated virus 2 (isolate Srivastava/1982) Rep68 gene Proteins 0.000 description 2
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- BNYNOWJESJJIOI-XUXIUFHCSA-N Arg-Lys-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N BNYNOWJESJJIOI-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000024806 Brain atrophy Diseases 0.000 description 2
- 102220549387 Carbonic anhydrase-related protein 10_S33N_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 2
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 101150040636 ELP1 gene Proteins 0.000 description 2
- 102100038132 Endogenous retrovirus group K member 6 Pro protein Human genes 0.000 description 2
- 101710091045 Envelope protein Proteins 0.000 description 2
- 102000053171 Glial Fibrillary Acidic Human genes 0.000 description 2
- 101710193519 Glial fibrillary acidic protein Proteins 0.000 description 2
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701027 Human herpesvirus 6 Species 0.000 description 2
- 102000018251 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010091358 Hypoxanthine Phosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 101150057269 IKBKB gene Proteins 0.000 description 2
- HUORUFRRJHELPD-MNXVOIDGSA-N Ile-Leu-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N HUORUFRRJHELPD-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 2
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 2
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 2
- 101710146773 Lanosterol 14-alpha demethylase Proteins 0.000 description 2
- 241000713666 Lentivirus Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 101100452374 Mus musculus Ikbke gene Proteins 0.000 description 2
- SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-valine Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O SITLTJHOQZFJGG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 229940122907 Phosphatase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 2
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 2
- 101710188315 Protein X Proteins 0.000 description 2
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 2
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 2
- SYOMXKPPFZRELL-ONGXEEELSA-N Val-Gly-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N SYOMXKPPFZRELL-ONGXEEELSA-N 0.000 description 2
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 2
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 2
- 230000001594 aberrant effect Effects 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 2
- 206010002026 amyotrophic lateral sclerosis Diseases 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000009227 behaviour therapy Methods 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 230000031018 biological processes and functions Effects 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000007978 cacodylate buffer Substances 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 2
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 201000004559 cerebral degeneration Diseases 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 230000003412 degenerative effect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 2
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 2
- 238000003197 gene knockdown Methods 0.000 description 2
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 2
- 210000005046 glial fibrillary acidic protein Anatomy 0.000 description 2
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010147 glycylglutamine Proteins 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 2
- 210000003712 lysosome Anatomy 0.000 description 2
- 230000001868 lysosomic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004142 macroautophagy Effects 0.000 description 2
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 2
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 2
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 2
- 230000007659 motor function Effects 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 230000023105 myelination Effects 0.000 description 2
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 2
- 230000006764 neuronal dysfunction Effects 0.000 description 2
- 230000003955 neuronal function Effects 0.000 description 2
- 230000006576 neuronal survival Effects 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000001936 parietal effect Effects 0.000 description 2
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 101150066583 rep gene Proteins 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 230000001177 retroviral effect Effects 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M sodium dimethylarsinate Chemical compound [Na+].C[As](C)([O-])=O IHQKEDIOMGYHEB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000012385 systemic delivery Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 2
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 2
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 2
- 230000028838 turning behavior Effects 0.000 description 2
- 230000003827 upregulation Effects 0.000 description 2
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 2
- SNYUHPPZINRDSG-UHFFFAOYSA-N 1-(oxiran-2-ylmethyl)-4-[1-(oxiran-2-ylmethyl)piperidin-4-yl]piperidine Chemical compound C1CC(C2CCN(CC3OC3)CC2)CCN1CC1CO1 SNYUHPPZINRDSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PLRACCBDVIHHLZ-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine Chemical compound C1N(C)CCC(C=2C=CC=CC=2)=C1 PLRACCBDVIHHLZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 2'-deoxyinosine Chemical group C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- 101710169336 5'-deoxyadenosine deaminase Proteins 0.000 description 1
- 102100032533 ADP/ATP translocase 1 Human genes 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100036664 Adenosine deaminase Human genes 0.000 description 1
- 108010024878 Adenovirus E1A Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010087905 Adenovirus E1B Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000007730 Akt signaling Effects 0.000 description 1
- YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ala-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YYSWCHMLFJLLBJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- SVBXIUDNTRTKHE-CIUDSAMLSA-N Ala-Arg-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SVBXIUDNTRTKHE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- HMRWQTHUDVXMGH-GUBZILKMSA-N Ala-Glu-Lys Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN HMRWQTHUDVXMGH-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- PUBLUECXJRHTBK-ACZMJKKPSA-N Ala-Glu-Ser Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PUBLUECXJRHTBK-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- WMYJZJRILUVVRG-WDSKDSINSA-N Ala-Gly-Gln Chemical compound C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O WMYJZJRILUVVRG-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- TZDNWXDLYFIFPT-BJDJZHNGSA-N Ala-Ile-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O TZDNWXDLYFIFPT-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- DPNZTBKGAUAZQU-DLOVCJGASA-N Ala-Leu-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)N DPNZTBKGAUAZQU-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N Ala-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Lys Natural products NCCCCC(NC(=O)C(N)C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MDNAVFBZPROEHO-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Val Natural products CC(C)C(C(O)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(C)N)CCCCN MDNAVFBZPROEHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VJVQKGYHIZPSNS-FXQIFTODSA-N Ala-Ser-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N VJVQKGYHIZPSNS-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- JNJHNBXBGNJESC-KKXDTOCCSA-N Ala-Tyr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O JNJHNBXBGNJESC-KKXDTOCCSA-N 0.000 description 1
- BHSYMWWMVRPCPA-CYDGBPFRSA-N Arg-Arg-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N BHSYMWWMVRPCPA-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- OVVUNXXROOFSIM-SDDRHHMPSA-N Arg-Arg-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O OVVUNXXROOFSIM-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 1
- SQKPKIJVWHAWNF-DCAQKATOSA-N Arg-Asp-Lys Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O SQKPKIJVWHAWNF-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- PBSOQGZLPFVXPU-YUMQZZPRSA-N Arg-Glu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O PBSOQGZLPFVXPU-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- UFBURHXMKFQVLM-CIUDSAMLSA-N Arg-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UFBURHXMKFQVLM-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- COXMUHNBYCVVRG-DCAQKATOSA-N Arg-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O COXMUHNBYCVVRG-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- YFHATWYGAAXQCF-JYJNAYRXSA-N Arg-Pro-Phe Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 YFHATWYGAAXQCF-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- WOZDCBHUGJVJPL-AVGNSLFASA-N Arg-Val-Lys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N WOZDCBHUGJVJPL-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- SGAUXNZEFIEAAI-GARJFASQSA-N Asn-His-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)C(=O)O SGAUXNZEFIEAAI-GARJFASQSA-N 0.000 description 1
- OLISTMZJGQUOGS-GMOBBJLQSA-N Asn-Ile-Arg Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N OLISTMZJGQUOGS-GMOBBJLQSA-N 0.000 description 1
- ZYPWIUFLYMQZBS-SRVKXCTJSA-N Asn-Lys-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N ZYPWIUFLYMQZBS-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- AYOAHKWVQLNPDM-HJGDQZAQSA-N Asn-Lys-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O AYOAHKWVQLNPDM-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- VWADICJNCPFKJS-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O VWADICJNCPFKJS-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- LTXGDRFJRZSZAV-CIUDSAMLSA-N Asp-Glu-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N LTXGDRFJRZSZAV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- RRKCPMGSRIDLNC-AVGNSLFASA-N Asp-Glu-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O RRKCPMGSRIDLNC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- CYCKJEFVFNRWEZ-UGYAYLCHSA-N Asp-Ile-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O CYCKJEFVFNRWEZ-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 1
- OEDJQRXNDRUGEU-SRVKXCTJSA-N Asp-Leu-His Chemical compound N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)O OEDJQRXNDRUGEU-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- WQSXAPPYLGNMQL-IHRRRGAJSA-N Asp-Met-Tyr Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N WQSXAPPYLGNMQL-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- RVMXMLSYBTXCAV-VEVYYDQMSA-N Asp-Pro-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O RVMXMLSYBTXCAV-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- XYPJXLLXNSAWHZ-SRVKXCTJSA-N Asp-Ser-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O XYPJXLLXNSAWHZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003805 Autism Diseases 0.000 description 1
- 208000020706 Autistic disease Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 101150005734 CREB1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 101150044789 Cap gene Proteins 0.000 description 1
- 235000011305 Capsella bursa pastoris Nutrition 0.000 description 1
- 240000008867 Capsella bursa-pastoris Species 0.000 description 1
- 240000004160 Capsicum annuum Species 0.000 description 1
- 235000008534 Capsicum annuum var annuum Nutrition 0.000 description 1
- 235000002283 Capsicum annuum var aviculare Nutrition 0.000 description 1
- 235000013303 Capsicum annuum var. frutescens Nutrition 0.000 description 1
- 235000002284 Capsicum baccatum var baccatum Nutrition 0.000 description 1
- 235000002568 Capsicum frutescens Nutrition 0.000 description 1
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000724252 Cucumber mosaic virus Species 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N Cyclic adenosine monophosphate Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H]2N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- BUIYOWKUSCTBRE-CIUDSAMLSA-N Cys-Arg-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O BUIYOWKUSCTBRE-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- BSFFNUBDVYTDMV-WHFBIAKZSA-N Cys-Gly-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BSFFNUBDVYTDMV-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- UCSXXFRXHGUXCQ-SRVKXCTJSA-N Cys-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N UCSXXFRXHGUXCQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- XSQAWJCVYDEWPT-GUBZILKMSA-N Cys-Met-Arg Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N XSQAWJCVYDEWPT-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- JAHCWGSVNZXHRR-SVSWQMSJSA-N Cys-Thr-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CS)N JAHCWGSVNZXHRR-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 1
- SAEVTQWAYDPXMU-KATARQTJSA-N Cys-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O SAEVTQWAYDPXMU-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- 150000008574 D-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 102000003844 DNA helicases Human genes 0.000 description 1
- 108090000133 DNA helicases Proteins 0.000 description 1
- 101710177611 DNA polymerase II large subunit Proteins 0.000 description 1
- 101710184669 DNA polymerase II small subunit Proteins 0.000 description 1
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010061818 Disease progression Diseases 0.000 description 1
- 108700011831 Drosophila hd Proteins 0.000 description 1
- 208000012661 Dyskinesia Diseases 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N Ecdysone Natural products O=C1[C@H]2[C@@](C)([C@@H]3C([C@@]4(O)[C@@](C)([C@H]([C@H]([C@@H](O)CCC(O)(C)C)C)CC4)CC3)=C1)C[C@H](O)[C@H](O)C2 UPEZCKBFRMILAV-JNEQICEOSA-N 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 1
- 101000768061 Escherichia phage P1 Antirepressor protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 1
- 102100027541 GTP-binding protein Rheb Human genes 0.000 description 1
- 101000834253 Gallus gallus Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 206010071602 Genetic polymorphism Diseases 0.000 description 1
- JHPFPROFOAJRFN-IHRRRGAJSA-N Gln-Glu-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)O JHPFPROFOAJRFN-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- QBLMTCRYYTVUQY-GUBZILKMSA-N Gln-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O QBLMTCRYYTVUQY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- UWKPRVKWEKEMSY-DCAQKATOSA-N Gln-Lys-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O UWKPRVKWEKEMSY-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- PAOHIZNRJNIXQY-XQXXSGGOSA-N Gln-Thr-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O PAOHIZNRJNIXQY-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- RUFHOVYUYSNDNY-ACZMJKKPSA-N Glu-Ala-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O RUFHOVYUYSNDNY-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- NKSGKPWXSWBRRX-ACZMJKKPSA-N Glu-Asn-Cys Chemical compound C(CC(=O)O)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N NKSGKPWXSWBRRX-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- VAIWPXWHWAPYDF-FXQIFTODSA-N Glu-Asp-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O VAIWPXWHWAPYDF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- SJPMNHCEWPTRBR-BQBZGAKWSA-N Glu-Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O SJPMNHCEWPTRBR-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- MWMJCGBSIORNCD-AVGNSLFASA-N Glu-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MWMJCGBSIORNCD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- UGSVSNXPJJDJKL-SDDRHHMPSA-N Glu-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N UGSVSNXPJJDJKL-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 1
- QXUPRMQJDWJDFR-NRPADANISA-N Glu-Val-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O QXUPRMQJDWJDFR-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- 102000006587 Glutathione peroxidase Human genes 0.000 description 1
- 108700016172 Glutathione peroxidases Proteins 0.000 description 1
- KRRMJKMGWWXWDW-STQMWFEESA-N Gly-Arg-Phe Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 KRRMJKMGWWXWDW-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- KQDMENMTYNBWMR-WHFBIAKZSA-N Gly-Asp-Ala Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KQDMENMTYNBWMR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- TZOVVRJYUDETQG-RCOVLWMOSA-N Gly-Asp-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CN TZOVVRJYUDETQG-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- JUGQPPOVWXSPKJ-RYUDHWBXSA-N Gly-Gln-Phe Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O JUGQPPOVWXSPKJ-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- YYPFZVIXAVDHIK-IUCAKERBSA-N Gly-Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)CN YYPFZVIXAVDHIK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- NTBOEZICHOSJEE-YUMQZZPRSA-N Gly-Lys-Ser Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NTBOEZICHOSJEE-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- GWNIGUKSRJBIHX-STQMWFEESA-N Gly-Tyr-Arg Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)NC(=O)CN)O GWNIGUKSRJBIHX-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 101150053603 HMGCR gene Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- NQKRILCJYCASDV-QWRGUYRKSA-N His-Gly-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 NQKRILCJYCASDV-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- UROVZOUMHNXPLZ-AVGNSLFASA-N His-Leu-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 UROVZOUMHNXPLZ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 238000010867 Hoechst staining Methods 0.000 description 1
- 101000796932 Homo sapiens ADP/ATP translocase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101001030705 Homo sapiens Huntingtin Proteins 0.000 description 1
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 1
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010021143 Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- 108060006678 I-kappa-B kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000001284 I-kappa-B kinase Human genes 0.000 description 1
- BEWFWZRGBDVXRP-PEFMBERDSA-N Ile-Glu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BEWFWZRGBDVXRP-PEFMBERDSA-N 0.000 description 1
- KIMHKBDJQQYLHU-PEFMBERDSA-N Ile-Glu-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N KIMHKBDJQQYLHU-PEFMBERDSA-N 0.000 description 1
- OUUCIIJSBIBCHB-ZPFDUUQYSA-N Ile-Leu-Asp Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O OUUCIIJSBIBCHB-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- PHRWFSFCNJPWRO-PPCPHDFISA-N Ile-Leu-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N PHRWFSFCNJPWRO-PPCPHDFISA-N 0.000 description 1
- UIEZQYNXCYHMQS-BJDJZHNGSA-N Ile-Lys-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)O)N UIEZQYNXCYHMQS-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- AKOYRLRUFBZOSP-BJDJZHNGSA-N Ile-Lys-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N AKOYRLRUFBZOSP-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 1
- WLRJHVNFGAOYPS-HJPIBITLSA-N Ile-Ser-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N WLRJHVNFGAOYPS-HJPIBITLSA-N 0.000 description 1
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 1
- YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N Ketamine Chemical compound C=1C=CC=C(Cl)C=1C1(NC)CCCCC1=O YQEZLKZALYSWHR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HGCNKOLVKRAVHD-UHFFFAOYSA-N L-Met-L-Phe Natural products CSCCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 HGCNKOLVKRAVHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 125000000415 L-cysteinyl group Chemical group O=C([*])[C@@](N([H])[H])([H])C([H])([H])S[H] 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N L-leucyl-L-arginine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ZURHXHNAEJJRNU-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O ZURHXHNAEJJRNU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- PDQDCFBVYXEFSD-SRVKXCTJSA-N Leu-Leu-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PDQDCFBVYXEFSD-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- ONPJGOIVICHWBW-BZSNNMDCSA-N Leu-Lys-Tyr Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 ONPJGOIVICHWBW-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- PTRKPHUGYULXPU-KKUMJFAQSA-N Leu-Phe-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PTRKPHUGYULXPU-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N Leu-Val-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O AAKRWBIIGKPOKQ-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXUCYYZNZFGLL-SRVKXCTJSA-N Lys-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KCXUCYYZNZFGLL-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 108010062166 Lys-Asn-Asp Proteins 0.000 description 1
- BYPMOIFBQPEWOH-CIUDSAMLSA-N Lys-Asn-Asp Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N BYPMOIFBQPEWOH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- DGWXCIORNLWGGG-CIUDSAMLSA-N Lys-Asn-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O DGWXCIORNLWGGG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ZXEUFAVXODIPHC-GUBZILKMSA-N Lys-Glu-Asn Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O ZXEUFAVXODIPHC-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- WVJNGSFKBKOKRV-AJNGGQMLSA-N Lys-Leu-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O WVJNGSFKBKOKRV-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 1
- XABXVVSWUVCZST-GVXVVHGQSA-N Lys-Val-Gln Chemical compound NC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN XABXVVSWUVCZST-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 1
- RPWQJSBMXJSCPD-XUXIUFHCSA-N Lys-Val-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C(C)C)C(O)=O RPWQJSBMXJSCPD-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- DRRXXZBXDMLGFC-IHRRRGAJSA-N Lys-Val-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN DRRXXZBXDMLGFC-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- HMZPYMSEAALNAE-ULQDDVLXSA-N Lys-Val-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O HMZPYMSEAALNAE-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-L Malonate Chemical compound [O-]C(=O)CC([O-])=O OFOBLEOULBTSOW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000009308 Mechanistic Target of Rapamycin Complex 2 Human genes 0.000 description 1
- 108010034057 Mechanistic Target of Rapamycin Complex 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000036626 Mental retardation Diseases 0.000 description 1
- QAHFGYLFLVGBNW-DCAQKATOSA-N Met-Ala-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN QAHFGYLFLVGBNW-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- UZVWDRPUTHXQAM-FXQIFTODSA-N Met-Asp-Ala Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O UZVWDRPUTHXQAM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- FJVJLMZUIGMFFU-BQBZGAKWSA-N Met-Asp-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O FJVJLMZUIGMFFU-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- KQBJYJXPZBNEIK-DCAQKATOSA-N Met-Glu-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N KQBJYJXPZBNEIK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- CRVSHEPROQHVQT-AVGNSLFASA-N Met-Met-Lys Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N CRVSHEPROQHVQT-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- QEDGNYFHLXXIDC-DCAQKATOSA-N Met-Pro-Gln Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O QEDGNYFHLXXIDC-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- PHURAEXVWLDIGT-LPEHRKFASA-N Met-Ser-Pro Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N PHURAEXVWLDIGT-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- CQRGINSEMFBACV-WPRPVWTQSA-N Met-Val-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(O)=O CQRGINSEMFBACV-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- KPVLLNDCBYXKNV-CYDGBPFRSA-N Met-Val-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O KPVLLNDCBYXKNV-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 101001135571 Mus musculus Tyrosine-protein phosphatase non-receptor type 2 Proteins 0.000 description 1
- 108010083674 Myelin Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000006386 Myelin Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010047562 NGR peptide Proteins 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 208000009869 Neu-Laxova syndrome Diseases 0.000 description 1
- 208000029726 Neurodevelopmental disease Diseases 0.000 description 1
- 108010065395 Neuropep-1 Proteins 0.000 description 1
- 101710138657 Neurotoxin Proteins 0.000 description 1
- 108010077850 Nuclear Localization Signals Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 241000701945 Parvoviridae Species 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- DDYIRGBOZVKRFR-AVGNSLFASA-N Phe-Asp-Glu Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)N DDYIRGBOZVKRFR-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- LWPMGKSZPKFKJD-DZKIICNBSA-N Phe-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O LWPMGKSZPKFKJD-DZKIICNBSA-N 0.000 description 1
- SWCOXQLDICUYOL-ULQDDVLXSA-N Phe-His-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SWCOXQLDICUYOL-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- BEEVXUYVEHXWRQ-YESZJQIVSA-N Phe-His-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CN=CN2)NC(=O)[C@H](CC3=CC=CC=C3)N)C(=O)O BEEVXUYVEHXWRQ-YESZJQIVSA-N 0.000 description 1
- DVOCGBNHAUHKHJ-DKIMLUQUSA-N Phe-Ile-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DVOCGBNHAUHKHJ-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 1
- KBVJZCVLQWCJQN-KKUMJFAQSA-N Phe-Leu-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O KBVJZCVLQWCJQN-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- KDYPMIZMXDECSU-JYJNAYRXSA-N Phe-Leu-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 KDYPMIZMXDECSU-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- ZOGICTVLQDWPER-UFYCRDLUSA-N Phe-Tyr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O ZOGICTVLQDWPER-UFYCRDLUSA-N 0.000 description 1
- YUPRIZTWANWWHK-DZKIICNBSA-N Phe-Val-Glu Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)N YUPRIZTWANWWHK-DZKIICNBSA-N 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 1
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 1
- DRVIASBABBMZTF-GUBZILKMSA-N Pro-Ala-Met Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 DRVIASBABBMZTF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- XZONQWUEBAFQPO-HJGDQZAQSA-N Pro-Gln-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XZONQWUEBAFQPO-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- AJCRQOHDLCBHFA-SRVKXCTJSA-N Pro-His-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O AJCRQOHDLCBHFA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- CFVRJNZJQHDQPP-CYDGBPFRSA-N Pro-Ile-Met Chemical compound CSCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 CFVRJNZJQHDQPP-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 102000004245 Proteasome Endopeptidase Complex Human genes 0.000 description 1
- 108090000708 Proteasome Endopeptidase Complex Proteins 0.000 description 1
- 102000009516 Protein Serine-Threonine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108010009341 Protein Serine-Threonine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 101710150114 Protein rep Proteins 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108090000944 RNA Helicases Proteins 0.000 description 1
- 102000004409 RNA Helicases Human genes 0.000 description 1
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 101710152114 Replication protein Proteins 0.000 description 1
- 241000725643 Respiratory syncytial virus Species 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000003861 Ribosomal protein S6 Human genes 0.000 description 1
- 108090000221 Ribosomal protein S6 Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- MOVJSUIKUNCVMG-ZLUOBGJFSA-N Ser-Cys-Ser Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N)O MOVJSUIKUNCVMG-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- BPMRXBZYPGYPJN-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O BPMRXBZYPGYPJN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- MUARUIBTKQJKFY-WHFBIAKZSA-N Ser-Gly-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O MUARUIBTKQJKFY-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- LWMQRHDTXHQQOV-MXAVVETBSA-N Ser-Ile-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O LWMQRHDTXHQQOV-MXAVVETBSA-N 0.000 description 1
- FPCGZYMRFFIYIH-CIUDSAMLSA-N Ser-Lys-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FPCGZYMRFFIYIH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- HHJFMHQYEAAOBM-ZLUOBGJFSA-N Ser-Ser-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O HHJFMHQYEAAOBM-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- JCLAFVNDBJMLBC-JBDRJPRFSA-N Ser-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O JCLAFVNDBJMLBC-JBDRJPRFSA-N 0.000 description 1
- BMKNXTJLHFIAAH-CIUDSAMLSA-N Ser-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BMKNXTJLHFIAAH-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- LLSLRQOEAFCZLW-NRPADANISA-N Ser-Val-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O LLSLRQOEAFCZLW-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- ANOQEBQWIAYIMV-AEJSXWLSSA-N Ser-Val-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N ANOQEBQWIAYIMV-AEJSXWLSSA-N 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000009642 Severe combined immunodeficiency due to adenosine deaminase deficiency Diseases 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 108010013803 Sterol 14-Demethylase Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- PZVGOVRNGKEFCB-KKHAAJSZSA-N Thr-Asn-Val Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N)O PZVGOVRNGKEFCB-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 1
- VGYBYGQXZJDZJU-XQXXSGGOSA-N Thr-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VGYBYGQXZJDZJU-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 1
- ZBKDBZUTTXINIX-RWRJDSDZSA-N Thr-Ile-Gln Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O ZBKDBZUTTXINIX-RWRJDSDZSA-N 0.000 description 1
- YOOAQCZYZHGUAZ-KATARQTJSA-N Thr-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YOOAQCZYZHGUAZ-KATARQTJSA-N 0.000 description 1
- MXNAOGFNFNKUPD-JHYOHUSXSA-N Thr-Phe-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O MXNAOGFNFNKUPD-JHYOHUSXSA-N 0.000 description 1
- GVMXJJAJLIEASL-ZJDVBMNYSA-N Thr-Pro-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GVMXJJAJLIEASL-ZJDVBMNYSA-N 0.000 description 1
- SGAOHNPSEPVAFP-ZDLURKLDSA-N Thr-Ser-Gly Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(O)=O SGAOHNPSEPVAFP-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- RNFZZCMCRDFNAE-WFBYXXMGSA-N Trp-Asn-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O RNFZZCMCRDFNAE-WFBYXXMGSA-N 0.000 description 1
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000001742 Tumor Suppressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010040002 Tumor Suppressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- JBBYKPZAPOLCPK-JYJNAYRXSA-N Tyr-Arg-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O JBBYKPZAPOLCPK-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- OLWFDNLLBWQWCP-STQMWFEESA-N Tyr-Gly-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O OLWFDNLLBWQWCP-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- HVPPEXXUDXAPOM-MGHWNKPDSA-N Tyr-Ile-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 HVPPEXXUDXAPOM-MGHWNKPDSA-N 0.000 description 1
- QPOUERMDWKKZEG-HJPIBITLSA-N Tyr-Ser-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 QPOUERMDWKKZEG-HJPIBITLSA-N 0.000 description 1
- IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N UNPD107823 Natural products O1C2COP(O)(=O)OC2C(O)C1N1C(N=CN=C2N)=C2N=C1 IVOMOUWHDPKRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N Uranyl acetate Chemical compound O.O.O=[U]=O.CC(O)=O.CC(O)=O COQLPRJCUIATTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UDNYEPLJTRDMEJ-RCOVLWMOSA-N Val-Asn-Gly Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)NCC(=O)O)N UDNYEPLJTRDMEJ-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 1
- OVLIFGQSBSNGHY-KKHAAJSZSA-N Val-Asp-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O OVLIFGQSBSNGHY-KKHAAJSZSA-N 0.000 description 1
- SCBITHMBEJNRHC-LSJOCFKGSA-N Val-Asp-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N SCBITHMBEJNRHC-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N Val-Leu-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- GVJUTBOZZBTBIG-AVGNSLFASA-N Val-Lys-Arg Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N GVJUTBOZZBTBIG-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- JAKHAONCJJZVHT-DCAQKATOSA-N Val-Lys-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N JAKHAONCJJZVHT-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- KISFXYYRKKNLOP-IHRRRGAJSA-N Val-Phe-Ser Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N KISFXYYRKKNLOP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- MIKHIIQMRFYVOR-RCWTZXSCSA-N Val-Pro-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C(C)C)N)O MIKHIIQMRFYVOR-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- AJNUKMZFHXUBMK-GUBZILKMSA-N Val-Ser-Arg Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)O)N AJNUKMZFHXUBMK-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- GBIUHAYJGWVNLN-AEJSXWLSSA-N Val-Ser-Pro Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N GBIUHAYJGWVNLN-AEJSXWLSSA-N 0.000 description 1
- GBIUHAYJGWVNLN-UHFFFAOYSA-N Val-Ser-Pro Natural products CC(C)C(N)C(=O)NC(CO)C(=O)N1CCCC1C(O)=O GBIUHAYJGWVNLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OFTXTCGQJXTNQS-XGEHTFHBSA-N Val-Thr-Ser Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O OFTXTCGQJXTNQS-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- IECQJCJNPJVUSB-IHRRRGAJSA-N Val-Tyr-Ser Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O IECQJCJNPJVUSB-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002679 ablation Methods 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N ac1mix0p Chemical compound C1=CC=C2N(C[C@H](C)CN(C)C)C3=CC(OC)=CC=C3SC2=C1.O([C@H]1[C@]2(OC)C=CC34C[C@@H]2[C@](C)(O)CCC)C2=C5[C@]41CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C2O QPMSXSBEVQLBIL-CZRHPSIPSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N all-trans-retinoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C SHGAZHPCJJPHSC-YCNIQYBTSA-N 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N alpha-Ecdysone Natural products C1C(O)C(O)CC2(C)C(CCC3(C(C(C(O)CCC(C)(C)O)C)CCC33O)C)C3=CC(=O)C21 UPEZCKBFRMILAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004873 anchoring Methods 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- 108010001271 arginyl-glutamyl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 108010062796 arginyllysine Proteins 0.000 description 1
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 1
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 1
- 208000036556 autosomal recessive T cell-negative B cell-negative NK cell-negative due to adenosine deaminase deficiency severe combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000028600 axonogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 1
- 230000006736 behavioral deficit Effects 0.000 description 1
- WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N benzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=CC=C1 WPYMKLBDIGXBTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 1
- 238000012742 biochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000001851 biosynthetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 230000008499 blood brain barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000001218 blood-brain barrier Anatomy 0.000 description 1
- 210000005013 brain tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001159 caudate nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 238000000423 cell based assay Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000010001 cellular homeostasis Effects 0.000 description 1
- 230000019522 cellular metabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000004640 cellular pathway Effects 0.000 description 1
- 125000003636 chemical group Chemical group 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003081 coactivator Effects 0.000 description 1
- 230000001447 compensatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000002596 correlated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940095074 cyclic amp Drugs 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000001120 cytoprotective effect Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 210000001947 dentate gyrus Anatomy 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N deoxycholic acid Natural products C1CC2CC(O)CCC2(C)C2C1C1CCC(C(CCC(O)=O)C)C1(C)C(O)C2 KXGVEGMKQFWNSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002074 deregulated effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000001784 detoxification Methods 0.000 description 1
- OGGXGZAMXPVRFZ-UHFFFAOYSA-M dimethylarsinate Chemical compound C[As](C)([O-])=O OGGXGZAMXPVRFZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 230000005750 disease progression Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 230000003828 downregulation Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N ecdysone Chemical compound C1[C@@H](O)[C@@H](O)C[C@]2(C)[C@@H](CC[C@@]3([C@@H]([C@@H]([C@H](O)CCC(C)(C)O)C)CC[C@]33O)C)C3=CC(=O)[C@@H]21 UPEZCKBFRMILAV-JMZLNJERSA-N 0.000 description 1
- 230000037149 energy metabolism Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000005713 exacerbation Effects 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000003304 gavage Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000030414 genetic transfer Effects 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 description 1
- 108010049041 glutamylalanine Proteins 0.000 description 1
- 108010079547 glutamylmethionine Proteins 0.000 description 1
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N glycerol 1-phosphate Chemical compound OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 1
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 1
- 108010015792 glycyllysine Proteins 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010842 high-capacity cDNA reverse transcription kit Methods 0.000 description 1
- 210000004295 hippocampal neuron Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003284 homeostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 102000054185 human HTT Human genes 0.000 description 1
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007954 hypoxia Effects 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000010365 information processing Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010027338 isoleucylcysteine Proteins 0.000 description 1
- 229960003299 ketamine Drugs 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 231100000518 lethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000001665 lethal effect Effects 0.000 description 1
- 108010047926 leucyl-lysyl-tyrosine Proteins 0.000 description 1
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 230000004322 lipid homeostasis Effects 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- 108010063431 methionyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 108010068488 methionylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 230000004898 mitochondrial function Effects 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000007479 molecular analysis Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000000921 morphogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000465 moulding Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000005012 myelin Anatomy 0.000 description 1
- 210000004165 myocardium Anatomy 0.000 description 1
- 210000004898 n-terminal fragment Anatomy 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000626 neurodegenerative effect Effects 0.000 description 1
- 230000014511 neuron projection development Effects 0.000 description 1
- 230000002981 neuropathic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002581 neurotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000618 neurotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000005937 nuclear translocation Effects 0.000 description 1
- 230000006911 nucleation Effects 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 229910000489 osmium tetroxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000004792 oxidative damage Effects 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 239000006179 pH buffering agent Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000008529 pathological progression Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 108010040003 polyglutamine Proteins 0.000 description 1
- 229920000155 polyglutamine Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004896 polypeptide structure Anatomy 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 238000013105 post hoc analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 210000002243 primary neuron Anatomy 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108010004914 prolylarginine Proteins 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009979 protective mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000009163 protein therapy Methods 0.000 description 1
- 230000007398 protein translocation Effects 0.000 description 1
- 150000003212 purines Chemical class 0.000 description 1
- 210000002637 putamen Anatomy 0.000 description 1
- 150000003230 pyrimidines Chemical class 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 239000013608 rAAV vector Substances 0.000 description 1
- 239000013645 rAAV1 vector Substances 0.000 description 1
- 230000007420 reactivation Effects 0.000 description 1
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 229930002330 retinoic acid Natural products 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000010825 rotarod performance test Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 229960001153 serine Drugs 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000003625 skull Anatomy 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000003270 steroid hormone Substances 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 108010045815 superoxide dismutase 2 Proteins 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 description 1
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 229950003937 tolonium Drugs 0.000 description 1
- HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M tolonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=C(C)C(N)=CC2=[S+]C3=CC(N(C)C)=CC=C3N=C21 HNONEKILPDHFOL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002463 transducing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 229960001727 tretinoin Drugs 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JOPDZQBPOWAEHC-UHFFFAOYSA-H tristrontium;diphosphate Chemical compound [Sr+2].[Sr+2].[Sr+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O JOPDZQBPOWAEHC-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N tungsten Chemical compound [W] WFKWXMTUELFFGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010937 tungsten Substances 0.000 description 1
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 238000003142 viral transduction method Methods 0.000 description 1
- 230000004580 weight loss Effects 0.000 description 1
- 238000009736 wetting Methods 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
- BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N xylazine Chemical compound CC1=CC=CC(C)=C1NC1=NCCCS1 BPICBUSOMSTKRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960001600 xylazine Drugs 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
- A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
- A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
- A61K9/0085—Brain, e.g. brain implants; Spinal cord
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y306/00—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6)
- C12Y306/05—Hydrolases acting on acid anhydrides (3.6) acting on GTP; involved in cellular and subcellular movement (3.6.5)
- C12Y306/05002—Small monomeric GTPase (3.6.5.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
- C12N2750/00011—Details
- C12N2750/14011—Parvoviridae
- C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
- C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Virology (AREA)
- Psychology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
본 개시내용은 치료 전의 대상체에서의 기능 또는 수준에 비해 대상체의 뇌에서 mTORC1 기능을 활성화시키고/거나, 선조체에 풍부화된 Ras 동족체 (Ras Homolog Enriched in Striatum) (Rhes) 수준을 증가시키는 치료제를 투여하는 것을 포함하는, 헌팅톤병 (HD)의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에서 헌팅톤병 (HD)을 치료 또는 예방하는 방법, 및 치료 전의 대상체에서의 기능 또는 수준에 비해 대상체의 뇌에서 mTORC1 기능을 활성화시키고/거나, 선조체에 풍부화된 Ras 동족체 (Rhes) 수준을 증가시키는 치료제를 투여함으로써 mHTT-연관된 대사적 표현형 및/또는 선조체 위축의 반전을 조정하는 방법을 제공한다.
Description
관련 출원
이 출원은 2014년 12월 30일에 출원된 미국 가출원 일련 번호 62/098,085의 우선권의 이익을 주장하며, 이 출원은 본원에 참조로 포함된다.
연방정부의 지원을 받은 연구에 관한 언급
이 발명은 미국 국립 보건원 (National Institutes of Health)에 의해 수여된 NS50210 및 NS052789-S1 하에 정부 지원으로 이루어졌다. 정부는 본 발명에서 특정 권리를 갖는다.
헌팅톤병 (HD)은 단백질 헌팅틴 (HTT)을 코딩하는 헌팅틴의 엑손 1에서의 CAG 반복체 확장에 의해 유발되는 치명적인 상염색체-우성 신경퇴행성 질환이다 (1993). 모든 조직 및 뇌 영역에서의 HTT 발현에도 불구하고, 선조체는 가장 현저하며 초기의 퇴행을 입증한다. 돌연변이체 HTT (mHTT)는 미토콘드리아 생물발생 (Cui et al., 2006; Tsunemi et al., 2012), 콜레스테롤 항상성 (Karasinska and Hayden, 2011; Valenza and Cattaneo, 2011; Valenza et al., 2005), 축삭 성장 (Li et al., 2001), 및 시냅스형성 (Milnerwood and Raymond, 2010)을 비롯한 다수의 세포 경로에 부정적으로 영향을 미치며, 이들 모두는 뉴런 기능이상 및 소실에 기여할 수 있다. 이들 다양한 표현형은 다양한 근본적인 생물학적 프로세스를 조절하는 핵심 성분의 파괴로부터 초래될 수 있다. 이러한 1차 병원성 사건을 확인하는 것은 치료제 개발을 용이하게 할 것이다.
유전자 전달은 세포 및 분자 수준 둘 다에서 생물학적 사건 및 질환 프로세스의 분석을 위한 강력한 도구로서 현재 폭넓게 인식되어 있다. 보다 최근, 유전적 (예를 들어, ADA 결핍증) 또는 후천적 (예를 들어, 암 또는 감염성 질환) 중 어느 하나의 인간 질환의 치료를 위한 유전자 요법의 적용은 상당한 주목을 받았다. 개선된 유전자 전달 기술의 출현 및 결함성 유전자-관련된 질환의 계속 확장하는 라이브러리의 확인으로, 유전자 요법은 치료 이론에서 실질적 현실로 급속하게 진화하였다.
전통적으로, 유전자 요법은 외인성 유전자가 선천적 유전적 에러를 수정하기 위해 환자의 세포 내로 도입된 절차로서 정의되었다. 4500가지 초과의 인간 질환이 현재 유전적인 것으로서 분류되었지만, 인간 게놈에서의 특이적 돌연변이가 이들 질환의 상대적으로 소수에 대해 확인되었다. 최근까지, 이들 드문 유전적 질환은 유전자 요법 노력의 독점적인 목표를 대표하였다. 따라서, 지금까지 NIH 승인된 유전자 요법 프로토콜의 대부분은 공지된 선천적 유전적 에러를 갖는 개체의 체세포 내로의 결함성 유전자의 기능적 카피의 도입을 향한 것이었다. 최근에야, 연구자들 및 임상의들은 대부분의 인간 암, 특정 형태의 심혈관 질환, 및 많은 퇴행성 질환은 또한 중요한 유전적 성분을 가지며, 신규 유전자 요법을 설계하는 목적으로, "유전적 장애"로 고려되어야 함을 인정하기 시작하였다. 따라서, 유전자 요법은 보다 최근 질환에 걸린 유기체 내로의 새로운 유전적 정보의 도입을 통한 질환 표현형의 수정으로서 폭넓게 정의되었다.
생체내 유전자 요법에서, 전달된 유전자는 수용자 유기체의 세포 내로 계내에서, 즉 수용자 내에서 도입된다. 생체내 유전자 요법은 몇몇 동물 모델에서 조사되었다. 몇몇 최근 간행물은 기관 및 조직, 예컨대 근육, 조혈 줄기 세포, 동맥벽, 신경계, 및 폐 내로의 계내에서의 직접적 유전자 전달의 실행가능성을 보고하였다. 골격 근육, 심장 근육 내로의 DNA의 직접적 주사 및 혈관구조 내로의 DNA-지질 복합체의 주사는 또한 생체내에서 삽입된 유전자 생성물(들)의 검출가능한 발현 수준을 생성하는 것으로 보고되었다.
중추 신경계의 질환의 치료는 다루기 힘든 문제로 남아 있다. 이러한 질환의 예는 헌팅톤병이다. 이 장애에서 결함성인 단백질은, 정맥내로 전달될 경우, 혈액-뇌 장벽을 넘지 않거나, 뇌로 직접적으로 전달될 경우, 넓게 분포되지 않는다. 보다 초기 데이터는 mTOR 경로를 억제하는 것이 유익할 수 있음을 지시하였다. 그러나, 본 발명자들의 연구는 이것이 유해함을 밝혀내며, 또한 이 경로를 자극하는 요법이 유익한 것임을 보인다.
요약
본 발명은 특정 실시양태에서, 치료 전의 대상체에서의 기능 또는 수준에 비해 대상체의 뇌에서 mTORC1 기능을 활성화시키고/거나, 선조체에 풍부화된 Ras 동족체 (Ras Homolog Enriched in Striatum) (Rhes) 수준을 증가시키는 치료제를 투여하는 것을 포함하는, 헌팅톤병 (HD)의 치료 또는 예방이 필요한 대상체에서 (예를 들어, 질환 유전자가 유전된 대상체에서) 헌팅톤병 (HD)을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 대상체는 미토콘드리아 기능이상, 이상 콜레스테롤 항상성, 선조체 위축, 손상된 도파민 신호전달 및/또는 감소된 자가포식을 가질 수 있다.
본 발명은 특정 실시양태에서, 치료 전의 대상체에서의 기능 또는 수준에 비해 대상체의 뇌에서 mTORC1 기능을 활성화시키고/거나, 선조체에 풍부화된 Ras 동족체 (Rhes) 수준을 증가시키는 치료제를 투여함으로써 mHTT-연관된 대사적 표현형 및/또는 선조체 위축의 반전을 조정하는 방법을 제공한다.
본 발명은 AAV 반전된 말단 반복체의 쌍 사이에 삽입된 핵산을 포함하는 벡터를 함유하는 AAV 입자를 뇌 세포에 투여함으로써 핵산을 뇌 세포에 전달하는 것을 포함하는, 치료제를 포유동물의 뇌 세포에 전달하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, AAV는 AAV2/1이다. 특정 실시양태에서, AAV는 AAV2/5이다. 본원에 사용된 용어 AAV2/1는 AAV2 ITR 및 AAV1 캡시드를 의미하는 데 사용되고, 용어 AAV2/2는 AAV2 ITR 및 AAV2 캡시드이고, 용어 AAV2/4는 AAV2 ITR 및 AAV4 캡시드인 등이다. 특정 실시양태에서, AAV는 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6 및/또는 AAV9이다. 특정 실시양태에서, AAV는 AAV1이다. 특정 실시양태에서, AAV는 AAV2이다. 특정 실시양태에서, AAV는 AAV5이다. 특정 실시양태에서, AAV는 AAV6이다. 특정 실시양태에서, AAV는 AAV8이다. 특정 실시양태에서, AAV는 AAV9이다. 특정 실시양태에서, AAV는 AAVrh10이다.
특정 실시양태에서, AAV 캡시드는 임의의 참조 AAV 혈청형 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3과, 예를 들어, AAV1 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3과, 또는 예를 들어, AAV2 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3, 또는 예를 들어, AAV3 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3, 또는 예를 들어, AAV4 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3, 또는 예를 들어, AAV5 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3, 또는 예를 들어, AAV6 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3, 또는 예를 들어, AAV7 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3, 또는 예를 들어, AAV8 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3, 또는 예를 들어, AAV9 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3, 또는 예를 들어, AAVrh10 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3, 또는 예를 들어, AAVrh74 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3과 적어도 80％ 상동성을 갖는다.
특정 실시양태에서, AAV 캡시드는 임의의 참조 AAV 혈청형 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3과, 예를 들어, AAV1 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3과, 또는 예를 들어, AAV2 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3, 또는 예를 들어, AAV3 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3, 또는 예를 들어, AAV4 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3, 또는 예를 들어, AAV5 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3, 또는 예를 들어, AAV6 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3, 또는 예를 들어, AAV7 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3, 또는 예를 들어, AAV8 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3, 또는 예를 들어, AAV9 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3, 또는 예를 들어, AAVrh10 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3, 또는 예를 들어, AAVrh74 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및/또는 VP3과 100％ 상동성을 갖는다.
특정 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
특정 실시양태에서, 치료제는 치료 핵산이다. 특정 실시양태에서, 치료제는 단백질이다.
특정 실시양태에서, 제제는 대상체의 뇌에 투여된다. 특정 실시양태에서, 제제는 뇌 중의 1 내지 5개의 위치에서, 예컨대 뇌 중의 1, 2, 또는 3개의 위치에서 주사된다. 특정 실시양태에서, 제제는 포유동물의 선조체, 피질 또는 뇌실 공간에 투여된다.
도 1A 내지 1B. mTORC1 활성은 HD 인간 및 마우스 선조체에서 감소된다. (A) mTOR, 릭터 (Rictor), 랍터 (Raptor), 및 mTORC1 활성 (pS6)의 이뮤노블롯팅은 질환에 걸리지 않은 개체 (N=6)에 비해 HD를 갖는 환자 (N=10; 확장된 계열에 대해 도 S1A 참조)의 선조체에서 감소된 mTORC1 활성을 나타내었다. β-액틴은 로딩 대조군으로서 사용되었다. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. ***P<0.001, 스튜던트 t-검정. (B) 6-주령 N171-82Q 및 WT 마우스 선조체 용해물로부터의 mTOR, 릭터, 랍터, 및 pS6의 이뮤노블롯팅. β-액틴은 로딩 대조군으로서 사용되었다. 패널 A 및 B에 대한 농도측정 분석은 연령- 및 성별-매칭된 WT 한배새끼 (N=4)에 비해 HD 환자 (N=10) 대 대조군 (N=6), 및 6-주령 N171-82Q 마우스 (N=4)에서 감소된 pS6 수준을 밝혀내었다. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. *P<0.05; ***P<0.001, 스튜던트 t-검정.
도 2A 내지 2G. mTORC1 경로의 활성화는 HD 마우스에서 대사-관련된 결핍을 수정한다. (A) 웨스턴 블롯은 비처리된 것에 비해 AAV.caRheb의 편측 주사로 처리된 N171-82Q 마우스에서의 증가된 pS6 및 DARPP-32 면역반응성을 나타낸다. 마우스를 7주령에서 주사하고, 선조체 용해물을 10주령에서 수확하였다. 우측, DARPP-32 면역반응성의 농도측정 정량화 (N=군 당 4 마우스; *P<0.05, 터키 사후 검정으로의 일원 ANOVA). (B) 7주령에서 AAV.caRheb의 편측 주사로 처리된 10-주령 N171-82Q 마우스로부터의 선조체 균질물에서의 PGC1-α의 RT-qPCR 분석. 비주사된 반대측 반구로부터의 선조체 용해물은 내부 대조군으로서 기능하였다 (N=군 당 8). (C 내지 G) 7주령에서의 AAV.caRheb의 편측 주사 후 10-주령 N171-82Q 및 WT 마우스로부터의 선조체 균질물에서의 유전자를 해독하는 ROS의 RT-qPCR 분석. 비주사된 반대측 반구로부터의 용해물은 내부 대조군 (N=군 당 8)으로서 기능하였다. 모든 유전자를 내인성 β-액틴에 대해 정규화하였다. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. C=대조군. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 스튜던트 t-검정.
도 3A 내지 3F. mTOR은 HD 마우스 선조체에서의 콜레스테롤 생합성 경로 유전자를 조절한다. (A 및 B) 정상 배지에서 성장된 WT (Q7) 및 돌연변이체 (Q111) 선조체 세포를 250 nM 토린 (Torin)1 또는 DMSO (대조군)로 처리하였다. 총 세포 추출물을 처리 24시간 후에 얻었다. HMGCR 및 HMGCS1의 유전자 발현 수준을 내인성 β-액틴에 대해 정규화하였다. (C 내지 F) 7주령에서의 AAV.caRheb의 편측 주사 후 10-주령 N171-82Q 및 WT 마우스의 선조체 균질물로부터의 지방형성 유전자의 RT-qPCR 분석. 비주사된 반대측 반구로부터의 용해물은 내부 대조군으로서 기능하였다 (N=군 당 8). 모든 유전자를 내인성 β-액틴에 대해 정규화하였다. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. C=대조군. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 스튜던트 t-검정.
도 4A 내지 4D. AAV.caRheb는 N171-82Q 마우스에서 기저 자가포식을 증가시킨다. (A 및 B) 7주령에서의 AAV.caRheb의 편측 주사 후 N171-82Q 마우스로부터의 선조체 용해물에서의 자가포식 (LC3 및 베클린 (Beclin)1)의 생화학적 평가. 선조체를 주사후 3주에 수확하였다. 비주사된 반대측 선조체는 내부 대조군으로서 기능한다 (N=군 당 6 마우스). 대표적인 웨스턴 블롯 및 농도측정 분석은 AAV.caRheb-처리된 N171-82Q 마우스 선조체에서의 증가된 LC3II 및 베클린1 수준을 밝혀내었다. β-액틴은 로딩 대조군으로서 사용되었다. 데이터는 평균 + SEM이다. **P<0.01; 스튜던트 t-검정. (C) 좌측 패널: 자가포식소체 (화살표) 및 자가용해소체 (이중 화살표)의 대표적인 현미경사진. 스케일 바는 0.5 μm이다. 우측 패널: AAV.eGFP 및 AAV.caRheb 처리된 N171-82Q 마우스 (군 당 3 마우스 검사됨; 7 내지 10 세포/반구/동물)로부터의 선조체 뉴런에서 검출된 자가포식소체 및 자가용해소체의 빈도. 비는 카운팅된 세포의 총 수에 비한 자가포식소체 또는 자가용해소체의 수를 지시한다. (D) 반대 반구 내로의 AAV.eGFP 또는 AAV.caRheb 주사 후 N171-82Q 마우스로부터의 선조체 섹션의 초미세구조 TEM 분석 (N=군 당 3 마우스). 좌측 패널: 대조군 처리된 선조체로부터의 선조체 뉴런의 대표적인 현미경사진은 내형질 과립 덩어리 및 세포기관이 없는 전자-투명 세포질을 나타낸다. 우측 패널: AAV.caRheb 처리된 뉴런은 세포기관 및 내형질 과립 덩어리로 풍부화된 정상 세포질을 나타낸다. 스케일 바는 5 μm이다.
도 5A 내지 5G. mTORC1은 mHTT 응집체 청소에 관여하는 유전자를 조절한다. (A 내지 F) 7주령에서의 AAV.caRheb의 편측 주사 후 10-주령 N171-82Q 및 WT 마우스의 선조체 균질물로부터의 유전자의 RT-qPCR 분석. 비주사된 반대측 측면은 내부 대조군 (N=군 당 8)으로서 기능한다. (A 및 B) mHTT의 SUMO 변형에 관련된 유전자의 발현. (C 내지 E) IKK 관련된 유전자 (Ikbkb, Ikbkap, 및 Ikbke)의 발현. (F) HDAC4의 발현. 모든 유전자를 내인성 β-액틴에 대해 정규화하였다. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. C=대조군. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 스튜던트 t-검정. (G) 좌측 패널, 10-주 N171-82Q 마우스 (N=처리군 당 4; 스케일 바: 50 μm)의 해마 내로의 AAV.caRheb 및 AAV.eGFP의 단일 편측 주사 2주 후에 EM48으로의 N171-82Q 마우스 선조체의 면역조직화학적 염색. 우측 패널, AAV.caRheb는 EM48 양성 응집체를 감소시켰다. 화살표: Em48 양성 응집체. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. *P<0.05. 스튜던트 t 검정.
도 6A 내지 6E. mTORC1은 MSN 성장을 촉진시키고, mHTT-유도된 운동신경 표현형에 반대작용한다. (A) 11-주령 N171-82Q 마우스의 선조체 내로의 AAV.caRheb의 단일 편측 주사 2주 후, 항-DARPP-32로의 MSN의 면역조직화학적 염색. 마우스는 2주 동안 비히클 또는 RAD001이 주어졌다. (B 및 C) (A)에서와 같이 처리된 동물의 조직으로부터의 MSN 세포 면적 및 선조체 부피의 정량화 (N=처리군 당 4; 평균 + SEM). (D) 6주령에 AAV.mHTT/AAV.eGFP 또는 AAV.mHTT/AAV.caRheb로 편측으로 주사된 WT 마우스. 주사후 4주에 시험된 경우, AAV.mHTT/AAV.eGFP는 암페타민에 반응하여 동측 회전 행동을 유도하였다. AAV.caRheb의 공동-주사는 암페타민 투여 후 AAV.mHTT-유도된 동측 회전을 변경시켰으며, 마우스는 반대측 회전을 나타내었다 (N=처리군 당 4). *P<0.05, **P<0.001, ***P<0.001, 스튜던트 t-검정. 스케일 바: 100 μm (A 내지 D). (E) 좌측 패널, (D)로부터의 AAV.mHTT/AAV.eGFP 또는 AAV.mHTT/AAV.caRheb 주사된 마우스로부터의 섹션의 항-DARPP-32로의 MSN의 면역조직화학적 염색. 반대측 비주사된 반구는 대조군으로서 나타내어진다. 우측 패널, 비주사된 반대측 선조체의 백분율로서 표현되는 MSN 면적의 정량화. *P<0.05, 스튜던트 t-검정. 스케일 바: 50 μm.
도 7A 내지 7D. 선조체내 Rhes 과발현은 N171-82Q 마우스에서 질환 표현형을 개선시킨다. (A) 질환에 걸리지 않은 개체 (Ctl, N=4) 및 HD 환자 (N=10), 및 6-주령 N171-82Q (N=5) 및 WT (N=4) 한배새끼의 선조체 용해물로부터의 내인성 Rhes 수준의 RT-qPCR 분석. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. *P<0.05, ***P<0.001, 스튜던트 t-검정. (B) 7주령에서의 선조체 내로의 AAV.Rhes, AAV.RhesS33N, 또는 염수의 양측 주사 후 N171-82Q 및 WT 마우스의 로타로드 평가 (14주령에서 N=군 당 10 내지 14 마우스; 18주령에서 N=군 당 6 내지 13 마우스). 14 및 18 주령에서 연속적인 3일로부터의 로타로드 데이터가 떨어짐까지의 시간 (latency to fall)으로서 나타내어진다. 염수 및 AAV.RhesS33N-주사된 N171-82Q 마우스는 14 및 18주령에서 로타로드 상에서 AAV.Rhes-주사된 N171-82Q 마우스에 비해 상당히 나쁘게 수행하였다. NS=통계적으로 유의하지 않음. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001, 터키 사후 검정으로의 일원 ANOVA. (C) 7주령에서 AAV.Rhes의 편측 주사 및 AAV.GFP의 반대측 주사 후 N171-82Q 마우스 선조체 조직 섹션의 MSN 면적의 DARPP-32 염색 및 정량화. 조직을 19주령에서 수확하였다 (N=3 마우스/군; GFP=245 세포; Rhes=251 세포). 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. ***P<0.001, 스튜던트 t-검정. 스케일 바: 50 μm. (D) 연구의 종료 (19주령)에서 수확된 AAV.Rhes- 또는 염수-처리된 N171-82Q 및 WT 마우스 (n=군 당 6 내지 9)로부터의 선조체에서의 PGC-1α의 qPCR 분석. C=대조군. *P<0.05, 스튜던트 t-검정.
도 8. 손상된 mTOR이 그를 통해 HD에서의 복합 질환 표현형에 기여하는 제안된 메커니즘. 정상적인 생리학적 조건 하에서, mTOR은 뉴런 기능 및 생존에 결정적인 다양화된 생물학적 프로세스를 조절한다. HD에서, mHTT는 mTOR과의 직접적 상호작용에 의해 mTORC1 기능을 방해하여, 다수의 경로에 부정적으로 영향을 미침으로써 뉴런 기능 이상을 유발한다. 선조체에서, mHTT는 Rhes, 즉, 선조체 풍부화된 mTOR 조절제를 방해함으로써 mTORC1 활성을 더 손상시킨다. 따라서, Rhes 및 mTORC1 활성의 수반 소실은 HD에서 선조체 조직을 초기 퇴행에 대해 취약하게 할 수 있다.
도 S1A 내지 S1B. mTORC1 활성은 HD 인간 및 마우스 선조체에서 감소된다. (A) 웨스턴 블롯은 질환에 걸리지 않은 개체 (N=6)에 비해 HD를 갖는 환자 (N=10)의 선조체에서 감소된 mTORC1 활성 (pS6)을 입증한다. β-액틴은 로딩 대조군으로서 사용되었다 (도 1A와 관련됨). (B) 14-주령 N171-82Q 및 WT 마우스 선조체 용해물로부터의 내인성 mTORC1 활성 (pS6)의 생화학적 분석. β-액틴은 로딩 대조군으로서 사용되었다. 농도측정 분석은 연령- 및 성별-매칭된 WT 한배새끼 (N=4)에 비해 14-주령 N171-82Q 마우스 (N=5)에서 감소된 pS6 수준을 밝혀내었다. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. *P<0.05, 스튜던트 t-검정.
도 S2A 내지 S2H. AAV1은 마우스에서 선조체 뉴런을 유효하게 형질도입한다. HD 마우스 선조체의 대표적인 면역조직화학 사진은 6주령에서 AAV1.eGFP 주사 후 18-주령 마우스에서의 뉴런 (NeuN)의 왕성한 형질도입을 나타내었다. 또한, 문헌 [McBride et al., PNAS: 105(15):5868-73, 2008]을 참조한다. (B 내지 H) AAV.caRheb는 N171-82Q 마우스 선조체에서 대사-관련된 결핍을 개선시킨다. B) 웨스턴 블롯은 AAV.eGFP 처리된 동물에 비해 AAV.caRheb의 편측 주사로 처리된 N171-82Q 마우스에서 선조체 용해물의 증가된 pS6 및 DARPP-32 수준을 나타낸다. 마우스를 10주령에서 주사하고, 조직을 13주령에서 수확하였다. 우측, DARPP-32 면역반응성의 농도측정 정량화 (N=군 당 4 마우스; *P<0.05, 스튜던트 t-검정). (C 내지 H) 10주령에서 AAV.caRheb의 편측 주사 및 AAV.eGFP의 반대측 주사 후 13주령 N171-82Q 마우스의 선조체 균질물로부터의 대사 관련된 유전자 및 N171-82Q 트랜스진의 RT-qPCR 분석 (N=군 당 4). 모든 유전자를 β-액틴에 대해 정규화하였다. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. *P<0.05, **P<0.01, 스튜던트 t-검정.
도 S3A 내지 S3F. A,B. 토린1은 HD의 선조체 세포 모델에서 대사 유전자 발현 유전자를 억제한다. 정상 혈청 조건에서 성장된 Q7 및 Q111 선조체 세포를 토린1 또는 DMSO (대조군)로 처리하였다. 총 세포 추출물을 24시간 후에 얻었다. (A) 생화학적 평가는 토린1 처리로 Q7 및 Q111 세포에서 감소된 mTORC1 활성 (pS6 및 p4E-BP1), PGC1-α, 및 DARPP-32 발현을 나타낸다. (B) 토린1 처리 24시간 후 CREB 및 그의 공동활성화제인 TORC1에 대한 대표적인 웨스턴 블롯. 농도측정 분석은 토린1이 Q7 및 Q111 세포에서 TORC1 및 CREB 수준을 억제하였음을 나타낸다. 값은 4개의 독립적인 실험의 비히클-처리된 대조군 + SEM의 백분율이다 (N=처리군 당 4). 내인성 β-액틴은 로딩 대조군이었다. *P<0.05; **P<0.01, 스튜던트 t-검정. C 내지 F. mTOR은 AAV.caRheb 대 AAV.eGFP 처리된 HD 트랜스제닉 마우스 선조체에서의 콜레스테롤 생합성 유전자 발현을 변경시킨다. 10주령에서 AAV.caRheb의 편측 주사 후 13-주령 N171-82Q 및 WT 마우스의 선조체 균질물로부터의 지방형성 유전자의 RT-qPCR 분석. AAV.eGFP 주사된 반대측 반구로부터의 용해물은 내부 대조군으로서 기능하였다 (N=군 당 4). 모든 유전자를 내인성 β-액틴에 대해 정규화하였다. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. C=대조군. *P<0.05, **P<0.01, 스튜던트 t-검정.
도 S4. 기저 자가포식은 N171-82Q 마우스 선조체에서 향상된다. 10주령에서 AAV.eGFP의 주사 후 N171-82Q 및 WT 마우스로부터의 선조체 용해물에서의 LC3II의 생화학적 평가. 선조체를 주사후 3주에 수확하였다. 농도측정 분석은 WT (N=5)에 비해 N171-82Q 마우스 (N=9)의 선조체에서 증가된 LC3II 수준을 밝혀내었다. β-액틴은 로딩 대조군으로서 사용되었다. 데이터는 평균 + SEM이다. *P<0.05, 스튜던트 t-검정.
도 S5. 해마의 AAV.eGFP 형질도입. 10주령에서 치아 이랑 내로의 AAV1.eGFP 주사 2주 후 N171-82Q 마우스의 해마에서의 eGFP 발현. 스케일 바: 1 mm (좌측), 100 μm (우측).
도 S6A 내지 S6B. RAD001은 N171-82Q 마우스의 선조체에서 mTORC1 활성을 억제한다. (A) 비히클 (2％ DMSO) 또는 mTORC1 억제제 RAD001을 받은 N171-82Q 마우스로부터의 선조체 용해물에서의 mTORC1 활성 (pS6)의 생화학적 평가 (N=군 당 3 마우스). 마우스를 2주 동안 처리하고, 선조체를 마지막 용량 24시간 후에 수확하였다. 마우스로부터의 샘플의 이뮤노블롯의 농도측정 분석. β-액틴은 로딩 대조군으로서 사용되었다. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. ***P<0.001, 스튜던트 t-검정. (B) 11-주령 N171-82Q 마우스의 선조체 내로의 AAV.caRheb의 단일 편측 주사 2주 후, pS6에 대한 면역조직화학적 염색 (녹색) 및 훽스트 염색 (청색)의 대표적인 현미경사진. 마우스는 2주 동안 비히클 (N=3) 또는 RAD001 (N=4)이 주어졌다. 스케일 바: 25 μm.
도 S7A 내지 S7C. Rhes 발현 수준은 HD 트랜스제닉 마우스 선조체에서 감소된다. (A) 17-주령 N171-82Q (N=4) 및 WT 마우스 (N=6)에서의 내인성 선조체 Rhes 수준. Rhes mRNA 풍부도를 내인성 β-액틴에 대해 정규화하였다. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. *P<0.05; 스튜던트 t-검정. (B) Rheb 수준은 6-주령 N171-82Q (N=5) 및 WT 마우스 (N=4), 및 17-주령 N171-82Q (N=4) 및 WT 마우스 (N=6)로부터의 N171-82Q 마우스 선조체에서 변화되지 않는다. 스튜던트 t-검정. (C) N171-82Q 마우스는 5 및 10주령에서 정상과 구별하기 어려운 정도로 수행한다 (N=군 당 10 내지 14 마우스). 연속적인 4일로부터의 로타로드 데이터가 떨어짐까지의 시간으로서 나타내어진다. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. 터키 사후 검정으로의 일원 ANOVA.
도 S8. Rhes 및 GTP아제 결핍성 Rhes S33N으로의 N171-82Q 마우스 선조체의 형질도입. 선조체에서 AAV.Rhes, AAV.RhesS33N, 또는 염수로 형질도입된 N171-82Q 마우스에서의 mTORC1 활성 (p-4E-BP1) 및 Rhes 트랜스진 (플래그)의 대표적인 웨스턴 블롯. 마우스를 7주령에서 주사하고, 선조체 조직을 주사후 3주에 수확하였다. β-액틴은 로딩 대조군으로서 사용되었다.
도 2A 내지 2G. mTORC1 경로의 활성화는 HD 마우스에서 대사-관련된 결핍을 수정한다. (A) 웨스턴 블롯은 비처리된 것에 비해 AAV.caRheb의 편측 주사로 처리된 N171-82Q 마우스에서의 증가된 pS6 및 DARPP-32 면역반응성을 나타낸다. 마우스를 7주령에서 주사하고, 선조체 용해물을 10주령에서 수확하였다. 우측, DARPP-32 면역반응성의 농도측정 정량화 (N=군 당 4 마우스; *P<0.05, 터키 사후 검정으로의 일원 ANOVA). (B) 7주령에서 AAV.caRheb의 편측 주사로 처리된 10-주령 N171-82Q 마우스로부터의 선조체 균질물에서의 PGC1-α의 RT-qPCR 분석. 비주사된 반대측 반구로부터의 선조체 용해물은 내부 대조군으로서 기능하였다 (N=군 당 8). (C 내지 G) 7주령에서의 AAV.caRheb의 편측 주사 후 10-주령 N171-82Q 및 WT 마우스로부터의 선조체 균질물에서의 유전자를 해독하는 ROS의 RT-qPCR 분석. 비주사된 반대측 반구로부터의 용해물은 내부 대조군 (N=군 당 8)으로서 기능하였다. 모든 유전자를 내인성 β-액틴에 대해 정규화하였다. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. C=대조군. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 스튜던트 t-검정.
도 3A 내지 3F. mTOR은 HD 마우스 선조체에서의 콜레스테롤 생합성 경로 유전자를 조절한다. (A 및 B) 정상 배지에서 성장된 WT (Q7) 및 돌연변이체 (Q111) 선조체 세포를 250 nM 토린 (Torin)1 또는 DMSO (대조군)로 처리하였다. 총 세포 추출물을 처리 24시간 후에 얻었다. HMGCR 및 HMGCS1의 유전자 발현 수준을 내인성 β-액틴에 대해 정규화하였다. (C 내지 F) 7주령에서의 AAV.caRheb의 편측 주사 후 10-주령 N171-82Q 및 WT 마우스의 선조체 균질물로부터의 지방형성 유전자의 RT-qPCR 분석. 비주사된 반대측 반구로부터의 용해물은 내부 대조군으로서 기능하였다 (N=군 당 8). 모든 유전자를 내인성 β-액틴에 대해 정규화하였다. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. C=대조군. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 스튜던트 t-검정.
도 4A 내지 4D. AAV.caRheb는 N171-82Q 마우스에서 기저 자가포식을 증가시킨다. (A 및 B) 7주령에서의 AAV.caRheb의 편측 주사 후 N171-82Q 마우스로부터의 선조체 용해물에서의 자가포식 (LC3 및 베클린 (Beclin)1)의 생화학적 평가. 선조체를 주사후 3주에 수확하였다. 비주사된 반대측 선조체는 내부 대조군으로서 기능한다 (N=군 당 6 마우스). 대표적인 웨스턴 블롯 및 농도측정 분석은 AAV.caRheb-처리된 N171-82Q 마우스 선조체에서의 증가된 LC3II 및 베클린1 수준을 밝혀내었다. β-액틴은 로딩 대조군으로서 사용되었다. 데이터는 평균 + SEM이다. **P<0.01; 스튜던트 t-검정. (C) 좌측 패널: 자가포식소체 (화살표) 및 자가용해소체 (이중 화살표)의 대표적인 현미경사진. 스케일 바는 0.5 μm이다. 우측 패널: AAV.eGFP 및 AAV.caRheb 처리된 N171-82Q 마우스 (군 당 3 마우스 검사됨; 7 내지 10 세포/반구/동물)로부터의 선조체 뉴런에서 검출된 자가포식소체 및 자가용해소체의 빈도. 비는 카운팅된 세포의 총 수에 비한 자가포식소체 또는 자가용해소체의 수를 지시한다. (D) 반대 반구 내로의 AAV.eGFP 또는 AAV.caRheb 주사 후 N171-82Q 마우스로부터의 선조체 섹션의 초미세구조 TEM 분석 (N=군 당 3 마우스). 좌측 패널: 대조군 처리된 선조체로부터의 선조체 뉴런의 대표적인 현미경사진은 내형질 과립 덩어리 및 세포기관이 없는 전자-투명 세포질을 나타낸다. 우측 패널: AAV.caRheb 처리된 뉴런은 세포기관 및 내형질 과립 덩어리로 풍부화된 정상 세포질을 나타낸다. 스케일 바는 5 μm이다.
도 5A 내지 5G. mTORC1은 mHTT 응집체 청소에 관여하는 유전자를 조절한다. (A 내지 F) 7주령에서의 AAV.caRheb의 편측 주사 후 10-주령 N171-82Q 및 WT 마우스의 선조체 균질물로부터의 유전자의 RT-qPCR 분석. 비주사된 반대측 측면은 내부 대조군 (N=군 당 8)으로서 기능한다. (A 및 B) mHTT의 SUMO 변형에 관련된 유전자의 발현. (C 내지 E) IKK 관련된 유전자 (Ikbkb, Ikbkap, 및 Ikbke)의 발현. (F) HDAC4의 발현. 모든 유전자를 내인성 β-액틴에 대해 정규화하였다. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. C=대조군. *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001, 스튜던트 t-검정. (G) 좌측 패널, 10-주 N171-82Q 마우스 (N=처리군 당 4; 스케일 바: 50 μm)의 해마 내로의 AAV.caRheb 및 AAV.eGFP의 단일 편측 주사 2주 후에 EM48으로의 N171-82Q 마우스 선조체의 면역조직화학적 염색. 우측 패널, AAV.caRheb는 EM48 양성 응집체를 감소시켰다. 화살표: Em48 양성 응집체. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. *P<0.05. 스튜던트 t 검정.
도 6A 내지 6E. mTORC1은 MSN 성장을 촉진시키고, mHTT-유도된 운동신경 표현형에 반대작용한다. (A) 11-주령 N171-82Q 마우스의 선조체 내로의 AAV.caRheb의 단일 편측 주사 2주 후, 항-DARPP-32로의 MSN의 면역조직화학적 염색. 마우스는 2주 동안 비히클 또는 RAD001이 주어졌다. (B 및 C) (A)에서와 같이 처리된 동물의 조직으로부터의 MSN 세포 면적 및 선조체 부피의 정량화 (N=처리군 당 4; 평균 + SEM). (D) 6주령에 AAV.mHTT/AAV.eGFP 또는 AAV.mHTT/AAV.caRheb로 편측으로 주사된 WT 마우스. 주사후 4주에 시험된 경우, AAV.mHTT/AAV.eGFP는 암페타민에 반응하여 동측 회전 행동을 유도하였다. AAV.caRheb의 공동-주사는 암페타민 투여 후 AAV.mHTT-유도된 동측 회전을 변경시켰으며, 마우스는 반대측 회전을 나타내었다 (N=처리군 당 4). *P<0.05, **P<0.001, ***P<0.001, 스튜던트 t-검정. 스케일 바: 100 μm (A 내지 D). (E) 좌측 패널, (D)로부터의 AAV.mHTT/AAV.eGFP 또는 AAV.mHTT/AAV.caRheb 주사된 마우스로부터의 섹션의 항-DARPP-32로의 MSN의 면역조직화학적 염색. 반대측 비주사된 반구는 대조군으로서 나타내어진다. 우측 패널, 비주사된 반대측 선조체의 백분율로서 표현되는 MSN 면적의 정량화. *P<0.05, 스튜던트 t-검정. 스케일 바: 50 μm.
도 7A 내지 7D. 선조체내 Rhes 과발현은 N171-82Q 마우스에서 질환 표현형을 개선시킨다. (A) 질환에 걸리지 않은 개체 (Ctl, N=4) 및 HD 환자 (N=10), 및 6-주령 N171-82Q (N=5) 및 WT (N=4) 한배새끼의 선조체 용해물로부터의 내인성 Rhes 수준의 RT-qPCR 분석. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. *P<0.05, ***P<0.001, 스튜던트 t-검정. (B) 7주령에서의 선조체 내로의 AAV.Rhes, AAV.RhesS33N, 또는 염수의 양측 주사 후 N171-82Q 및 WT 마우스의 로타로드 평가 (14주령에서 N=군 당 10 내지 14 마우스; 18주령에서 N=군 당 6 내지 13 마우스). 14 및 18 주령에서 연속적인 3일로부터의 로타로드 데이터가 떨어짐까지의 시간 (latency to fall)으로서 나타내어진다. 염수 및 AAV.RhesS33N-주사된 N171-82Q 마우스는 14 및 18주령에서 로타로드 상에서 AAV.Rhes-주사된 N171-82Q 마우스에 비해 상당히 나쁘게 수행하였다. NS=통계적으로 유의하지 않음. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001, 터키 사후 검정으로의 일원 ANOVA. (C) 7주령에서 AAV.Rhes의 편측 주사 및 AAV.GFP의 반대측 주사 후 N171-82Q 마우스 선조체 조직 섹션의 MSN 면적의 DARPP-32 염색 및 정량화. 조직을 19주령에서 수확하였다 (N=3 마우스/군; GFP=245 세포; Rhes=251 세포). 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. ***P<0.001, 스튜던트 t-검정. 스케일 바: 50 μm. (D) 연구의 종료 (19주령)에서 수확된 AAV.Rhes- 또는 염수-처리된 N171-82Q 및 WT 마우스 (n=군 당 6 내지 9)로부터의 선조체에서의 PGC-1α의 qPCR 분석. C=대조군. *P<0.05, 스튜던트 t-검정.
도 8. 손상된 mTOR이 그를 통해 HD에서의 복합 질환 표현형에 기여하는 제안된 메커니즘. 정상적인 생리학적 조건 하에서, mTOR은 뉴런 기능 및 생존에 결정적인 다양화된 생물학적 프로세스를 조절한다. HD에서, mHTT는 mTOR과의 직접적 상호작용에 의해 mTORC1 기능을 방해하여, 다수의 경로에 부정적으로 영향을 미침으로써 뉴런 기능 이상을 유발한다. 선조체에서, mHTT는 Rhes, 즉, 선조체 풍부화된 mTOR 조절제를 방해함으로써 mTORC1 활성을 더 손상시킨다. 따라서, Rhes 및 mTORC1 활성의 수반 소실은 HD에서 선조체 조직을 초기 퇴행에 대해 취약하게 할 수 있다.
도 S1A 내지 S1B. mTORC1 활성은 HD 인간 및 마우스 선조체에서 감소된다. (A) 웨스턴 블롯은 질환에 걸리지 않은 개체 (N=6)에 비해 HD를 갖는 환자 (N=10)의 선조체에서 감소된 mTORC1 활성 (pS6)을 입증한다. β-액틴은 로딩 대조군으로서 사용되었다 (도 1A와 관련됨). (B) 14-주령 N171-82Q 및 WT 마우스 선조체 용해물로부터의 내인성 mTORC1 활성 (pS6)의 생화학적 분석. β-액틴은 로딩 대조군으로서 사용되었다. 농도측정 분석은 연령- 및 성별-매칭된 WT 한배새끼 (N=4)에 비해 14-주령 N171-82Q 마우스 (N=5)에서 감소된 pS6 수준을 밝혀내었다. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. *P<0.05, 스튜던트 t-검정.
도 S2A 내지 S2H. AAV1은 마우스에서 선조체 뉴런을 유효하게 형질도입한다. HD 마우스 선조체의 대표적인 면역조직화학 사진은 6주령에서 AAV1.eGFP 주사 후 18-주령 마우스에서의 뉴런 (NeuN)의 왕성한 형질도입을 나타내었다. 또한, 문헌 [McBride et al., PNAS: 105(15):5868-73, 2008]을 참조한다. (B 내지 H) AAV.caRheb는 N171-82Q 마우스 선조체에서 대사-관련된 결핍을 개선시킨다. B) 웨스턴 블롯은 AAV.eGFP 처리된 동물에 비해 AAV.caRheb의 편측 주사로 처리된 N171-82Q 마우스에서 선조체 용해물의 증가된 pS6 및 DARPP-32 수준을 나타낸다. 마우스를 10주령에서 주사하고, 조직을 13주령에서 수확하였다. 우측, DARPP-32 면역반응성의 농도측정 정량화 (N=군 당 4 마우스; *P<0.05, 스튜던트 t-검정). (C 내지 H) 10주령에서 AAV.caRheb의 편측 주사 및 AAV.eGFP의 반대측 주사 후 13주령 N171-82Q 마우스의 선조체 균질물로부터의 대사 관련된 유전자 및 N171-82Q 트랜스진의 RT-qPCR 분석 (N=군 당 4). 모든 유전자를 β-액틴에 대해 정규화하였다. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. *P<0.05, **P<0.01, 스튜던트 t-검정.
도 S3A 내지 S3F. A,B. 토린1은 HD의 선조체 세포 모델에서 대사 유전자 발현 유전자를 억제한다. 정상 혈청 조건에서 성장된 Q7 및 Q111 선조체 세포를 토린1 또는 DMSO (대조군)로 처리하였다. 총 세포 추출물을 24시간 후에 얻었다. (A) 생화학적 평가는 토린1 처리로 Q7 및 Q111 세포에서 감소된 mTORC1 활성 (pS6 및 p4E-BP1), PGC1-α, 및 DARPP-32 발현을 나타낸다. (B) 토린1 처리 24시간 후 CREB 및 그의 공동활성화제인 TORC1에 대한 대표적인 웨스턴 블롯. 농도측정 분석은 토린1이 Q7 및 Q111 세포에서 TORC1 및 CREB 수준을 억제하였음을 나타낸다. 값은 4개의 독립적인 실험의 비히클-처리된 대조군 + SEM의 백분율이다 (N=처리군 당 4). 내인성 β-액틴은 로딩 대조군이었다. *P<0.05; **P<0.01, 스튜던트 t-검정. C 내지 F. mTOR은 AAV.caRheb 대 AAV.eGFP 처리된 HD 트랜스제닉 마우스 선조체에서의 콜레스테롤 생합성 유전자 발현을 변경시킨다. 10주령에서 AAV.caRheb의 편측 주사 후 13-주령 N171-82Q 및 WT 마우스의 선조체 균질물로부터의 지방형성 유전자의 RT-qPCR 분석. AAV.eGFP 주사된 반대측 반구로부터의 용해물은 내부 대조군으로서 기능하였다 (N=군 당 4). 모든 유전자를 내인성 β-액틴에 대해 정규화하였다. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. C=대조군. *P<0.05, **P<0.01, 스튜던트 t-검정.
도 S4. 기저 자가포식은 N171-82Q 마우스 선조체에서 향상된다. 10주령에서 AAV.eGFP의 주사 후 N171-82Q 및 WT 마우스로부터의 선조체 용해물에서의 LC3II의 생화학적 평가. 선조체를 주사후 3주에 수확하였다. 농도측정 분석은 WT (N=5)에 비해 N171-82Q 마우스 (N=9)의 선조체에서 증가된 LC3II 수준을 밝혀내었다. β-액틴은 로딩 대조군으로서 사용되었다. 데이터는 평균 + SEM이다. *P<0.05, 스튜던트 t-검정.
도 S5. 해마의 AAV.eGFP 형질도입. 10주령에서 치아 이랑 내로의 AAV1.eGFP 주사 2주 후 N171-82Q 마우스의 해마에서의 eGFP 발현. 스케일 바: 1 mm (좌측), 100 μm (우측).
도 S6A 내지 S6B. RAD001은 N171-82Q 마우스의 선조체에서 mTORC1 활성을 억제한다. (A) 비히클 (2％ DMSO) 또는 mTORC1 억제제 RAD001을 받은 N171-82Q 마우스로부터의 선조체 용해물에서의 mTORC1 활성 (pS6)의 생화학적 평가 (N=군 당 3 마우스). 마우스를 2주 동안 처리하고, 선조체를 마지막 용량 24시간 후에 수확하였다. 마우스로부터의 샘플의 이뮤노블롯의 농도측정 분석. β-액틴은 로딩 대조군으로서 사용되었다. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. ***P<0.001, 스튜던트 t-검정. (B) 11-주령 N171-82Q 마우스의 선조체 내로의 AAV.caRheb의 단일 편측 주사 2주 후, pS6에 대한 면역조직화학적 염색 (녹색) 및 훽스트 염색 (청색)의 대표적인 현미경사진. 마우스는 2주 동안 비히클 (N=3) 또는 RAD001 (N=4)이 주어졌다. 스케일 바: 25 μm.
도 S7A 내지 S7C. Rhes 발현 수준은 HD 트랜스제닉 마우스 선조체에서 감소된다. (A) 17-주령 N171-82Q (N=4) 및 WT 마우스 (N=6)에서의 내인성 선조체 Rhes 수준. Rhes mRNA 풍부도를 내인성 β-액틴에 대해 정규화하였다. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. *P<0.05; 스튜던트 t-검정. (B) Rheb 수준은 6-주령 N171-82Q (N=5) 및 WT 마우스 (N=4), 및 17-주령 N171-82Q (N=4) 및 WT 마우스 (N=6)로부터의 N171-82Q 마우스 선조체에서 변화되지 않는다. 스튜던트 t-검정. (C) N171-82Q 마우스는 5 및 10주령에서 정상과 구별하기 어려운 정도로 수행한다 (N=군 당 10 내지 14 마우스). 연속적인 4일로부터의 로타로드 데이터가 떨어짐까지의 시간으로서 나타내어진다. 데이터는 평균 + SEM을 나타낸다. 터키 사후 검정으로의 일원 ANOVA.
도 S8. Rhes 및 GTP아제 결핍성 Rhes S33N으로의 N171-82Q 마우스 선조체의 형질도입. 선조체에서 AAV.Rhes, AAV.RhesS33N, 또는 염수로 형질도입된 N171-82Q 마우스에서의 mTORC1 활성 (p-4E-BP1) 및 Rhes 트랜스진 (플래그)의 대표적인 웨스턴 블롯. 마우스를 7주령에서 주사하고, 선조체 조직을 주사후 3주에 수확하였다. β-액틴은 로딩 대조군으로서 사용되었다.
치료제
특정 실시양태에서, 본 발명은 이를 필요로 하는 대상체에 대한 치료제를 제공한다. 특정 실시양태에서, 치료제는 mTORC1 조절제를 포함한다.
특정 실시양태에서, mTORC1 조절제는 Rheb (호모 사피엔스 (Homo sapiens) 뇌에 풍부화된 Ras 동족체 (RHEB), mRNA NCBI 참조 서열: NM_005614.3)이다. Rheb 서열 (코딩 서열은 볼드체로 표시됨):
특정 실시양태에서, mTORC1 조절제는 Rhes (호모 사피엔스 RASD 패밀리, 구성원 2 (RASD2), mRNA NCBI 참조 서열: NM_014310.3)이다. Rhes 서열 (코딩 서열은 볼드체로 표시됨):
특정 실시양태에서, Rhes는 서열식별번호: 3에 의해 코딩되는 단백질과 적어도 90％ 동일하다 (예를 들어, 서열식별번호: 3에 의해 코딩되는 단백질과 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％ 동일함). 특정 실시양태에서, Rhes는 상기 볼드체로 표시된 Rhes 코딩 서열인 서열식별번호: 4에 의해 코딩되는 단백질과 적어도 90％ 동일하다 (예를 들어, 서열식별번호: 4에 의해 코딩되는 단백질과 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 98％, 99％ 또는 100％ 동일함). 특정 실시양태에서, Rheb를 코딩하는 핵산은 서열식별번호: 3 또는 4의 단편 또는 변이체이거나, 서열식별번호: 3 또는 4와 실질적 동일성을 갖는다.
특정 실시양태에서, 치료제는 바이러스 벡터에 함유된다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 아데노-연관된 바이러스 (AAV) 벡터이다.
발현 카세트 및 벡터
본 발명은 또한 Rhes 또는 Rheb를 코딩하는 서열을 포함하는 발현 카세트를 제공한다.
특정 실시양태에서, 발현 카세트는 프로모터를 더 함유한다. 특정 실시양태에서, 프로모터는 조절가능한 프로모터이다. 특정 실시양태에서, 프로모터는 구조적 프로모터이다. 특정 실시양태에서, 프로모터는 PGK, CMV 또는 RSV 프로모터이다.
본 발명은 상기 기재된 발현 카세트를 함유하는 벡터를 제공한다. 특정 실시양태에서, 벡터는 바이러스 벡터이다. 특정 실시양태에서, 바이러스 벡터는 아데노바이러스, 렌티바이러스, 아데노-연관된 바이러스 (AAV), 폴리오바이러스, HSV, 또는 뮤린 말로니 (Maloney)-기재 바이러스 벡터이다.
본원에 사용된 바와 같은 "발현 카세트"는 종결 신호에 작동적으로 연결될 수 있는 관심의 뉴클레오티드 서열에 작동적으로 연결된 프로모터를 포함할 수 있는, 적절한 숙주 세포에서의 특정 뉴클레오티드 서열의 발현을 지정할 수 있는 핵산 서열을 의미한다. 이는 또한 뉴클레오티드 서열의 적절한 번역에 요구되는 서열을 포함할 수 있다. 코딩 영역은 통상적으로 관심의 단백질을 암호화한다. 관심의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트는 키메라일 수 있다. 발현 카세트는 또한 천연 발생이지만 이종 발현에 유용한 재조합 형태에 함유된 것일 수 있다. 발현 카세트 중의 뉴클레오티드 서열의 발현은 숙주 세포가 일부 특정 자극에 노출된 경우에만 전사를 개시하는 구조적 프로모터의 또는 조절가능한 프로모터의 제어 하에 있을 수 있다. 다세포 유기체의 경우, 프로모터는 또한 특정 조직 또는 기관 또는 발달의 단계에 특이적일 수 있다.
"작동적으로-연결된"은 서열 중 하나의 기능이 또다른 것에 의해 영향을 받도록 단일 핵산 단편 상의 핵산 서열의 회합을 지칭한다. 예를 들어, 조절성 DNA 서열은 조절성 DNA 서열이 코딩 DNA 서열의 발현에 영향을 미치도록 (즉, 코딩 서열 또는 기능적 RNA가 프로모터의 전사적 제어 하에 있도록) 2개의 서열이 적합화되는 경우, RNA 또는 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 서열"과 작동적으로 연결되거나" "그와 회합된다"고 이야기된다. 코딩 서열은 센스 또는 안티센스 배향에서 조절성 서열에 작동적으로-연결될 수 있다.
아데노
연관된 바이러스 (
AAV
)
아데노 연관된 바이러스 (AAV)는 파르보비리다에 패밀리의 작은 비병원성 바이러스이다. AAV는 복제를 위한 헬퍼 바이러스에 대한 그의 의존성에 의해 이 패밀리의 다른 구성원과 구별된다. 헬퍼 바이러스의 부재 하에서, AAV는 염색체 19의 q 아암 내로 좌위 특이적 방식으로 통합될 수 있다. 대략 5 kb 게놈의 AAV는 플러스 또는 마이너스 극성 중 어느 하나의 단일 가닥 DNA의 1개의 절편으로 이루어진다. 게놈의 말단은 헤어핀 구조 내로 폴딩되고, 바이러스 DNA 복제의 원점으로서 기능할 수 있는 짧은 반전된 말단 반복체이다. 물리적으로, 파르보바이러스 비리온은 비-외피성이며, 그의 이십면체 캡시드는 직경이 대략 20 nm이다.
지금까지, 수많은 혈청학적으로 별개의 AAV가 확인되었으며, 12개 묶음 초과가 인간 또는 영장류로부터 단리되었다. AAV2의 게놈은 길이가 4680 뉴클레오티드이며, 2개의 오픈 리딩 프레임 (ORF)을 함유한다. 좌측 ORF는 단일-가닥 자손 게놈의 생성 외에 복제 및 전사의 조절에 관여하는 비-구조적 Rep 단백질인 Rep 40, Rep 52, Rep 68 및 Rep 78을 코딩한다. 게다가, 2개의 Rep 단백질은 인간 염색체 19의 q 아암의 영역 내로의 AAV 게놈의 우선적 통합과 연관되었다. Rep68/78은 또한 NTP 결합 활성 뿐만 아니라 DNA 및 RNA 헬리카제 활성을 소유하는 것으로 나타났다. Rep 단백질은 핵 국재화 신호 뿐만 아니라 몇몇 잠재적인 인산화 부위를 소유한다. 이들 키나제 부위 중 하나의 돌연변이는 복제 활성의 소실을 초래하였다.
게놈의 말단은 바이러스 DNA 복제의 원점으로서 기능하는 T-형상 헤어핀 구조 내로 폴딩될 잠재성을 갖는 짧은 반전된 말단 반복체 (ITR)이다. ITR 영역 내에서, ITR의 기능에 중추적인 2개의 요소, 즉, GAGC 반복 모티프 및 말단 해결 부위 (trs)가 기재되었다. 반복 모티프는 ITR이 선형 또는 헤어핀 입체형태 중 어느 하나인 경우 Rep에 결합하는 것으로 나타났다. 이 결합은 부위- 및 가닥-특이적 방식으로 일어나는 trs에서의 절단을 위한 위치 Rep68/78로서 기능한다. 복제에 있어서의 그들의 역할 외에, 이들 2개의 요소는 바이러스 통합에 중추적인 것으로 보인다. 인접한 trs를 갖는 Rep 결합 부위는 염색체 19 통합 좌위 내에 함유된다. 이들 요소는 기능적이며 좌위 특이적 통합에 필수적인 것으로 나타났다.
AAV 비리온은 VP1, VP2 및 VP3으로 지칭되는 3개의 관련된 단백질로 이루어진, 직경이 대략 25 nm인 비-외피화된, 이십면체 입자이다. 우측 ORF는 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및 VP3을 코딩한다. 이들 단백질은 각각 1:1:10의 비로 발견되며, 모두 우측 ORF로부터 유래된다. 캡시드 단백질은 교대 스플라이싱 및 비통상적 출발 코돈의 사용에 의해 서로 상이하다. 결실 분석은 교대로 스플라이싱된 메시지로부터 번역되는 VP1의 제거 또는 변경이 감염성 입자의 감소된 수율을 초래함을 나타내었다. VP3 코딩 영역 내의 돌연변이는 임의의 단일-가닥 자손 DNA 또는 감염성 입자를 생성하는 데 실패를 초래한다. AAV 입자는 AAV 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자이다. AAV 캡시드 폴리펩티드는 전체 VP1, VP2 및 VP3 폴리펩티드를 코딩할 수 있다. 입자는 AAV2 및 다른 AAV 캡시드 단백질 (즉, 키메라 단백질, 예컨대 AAV1 및 AAV2)을 포함하는 입자일 수 있다. AAV2 캡시드 단백질의 아미노산 서열에서의 변이는, AAV2 캡시드를 포함하는 생성된 바이러스 입자가 AAV1과는 항원학적으로 또는 면역학적으로 별개로 잔류하는 한, 표준 방법에 의해 통상적으로 측정될 수 있기 때문에 본원에서 고려된다. 구체적으로, 예를 들어, ELISA 및 웨스턴 블롯을 사용하여 바이러스 입자가 AAV1과 항원학적으로 또는 면역학적으로 별개인지 여부를 측정할 수 있다. 게다가, AAV2 바이러스 입자는 바람직하게는 AAV1과는 별개의 조직 향성을 보유한다.
AAV2 입자는 AAV2 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자이다. 전체 VP1, VP2, 및 VP3 폴리펩티드를 코딩하는 AAV2 캡시드 폴리펩티드는 전체적으로 NC_001401에 제시된 뉴클레오티드에 의해 코딩되는 아미노산 서열 (AAV2 캡시드 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열)을 갖는 폴리펩티드와 적어도 약 63％ 상동성 (또는 동일성)을 가질 수 있다. 캡시드 단백질은 NC_001401에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질과 약 70％ 상동성, 약 75％ 상동성, 80％ 상동성, 85％ 상동성, 90％ 상동성, 95％ 상동성, 98％ 상동성, 99％ 상동성, 또는 심지어 100％ 상동성을 가질 수 있다. 캡시드 단백질은 NC_001401에 제시된 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질과 약 70％ 동일성, 약 75％ 동일성, 80％ 동일성, 85％ 동일성, 90％ 동일성, 95％ 동일성, 98％ 동일성, 99％ 동일성, 또는 심지어 100％ 동일성을 가질 수 있다. 입자는 또다른 AAV 및 AAV2 캡시드 단백질, 즉, 키메라 단백질을 포함하는 입자일 수 있다. AAV2 캡시드 단백질의 아미노산 서열에서의 변이는, AAV2 캡시드를 포함하는 생성된 바이러스 입자가 AAV4와는 항원학적으로 또는 면역학적으로 별개로 잔류하는 한, 표준 방법에 의해 통상적으로 측정될 수 있기 때문에 본원에서 고려된다. 구체적으로, 예를 들어, ELISA 및 웨스턴 블롯을 사용하여 바이러스 입자가 AAV1과 항원학적으로 또는 면역학적으로 별개인지 여부를 측정할 수 있다. 게다가, AAV2 바이러스 입자는 바람직하게는 AAV1과는 별개의 조직 향성, 예컨대 본원의 실시예에 예시된 것을 보유하지만, 적어도 1종의 AAV2 외피 단백질을 포함하는 AAV2 키메라 입자는 AAV2 외피 단백질만으로 이루어진 AAV2 입자의 것과는 상이한 조직 향성을 가질 수 있다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 추가로 AAV2 반전된 말단 반복체의 쌍을 포함하는 벡터를 함유하는, 즉 캡시드화하는 AAV2 입자를 제공한다. AAV2 ITR의 뉴클레오티드 서열은 관련 기술분야에 공지되어 있다. 게다가, 입자는 AAV1 및 AAV2 캡시드 단백질 둘 다, 즉, 키메라 단백질을 포함하는 입자일 수 있다. 더욱이, 입자는 다른 AAV (예를 들어, AAV1 내지 AAV9 및 AAVrh10)로부터의 AAV 반전된 말단 반복체의 쌍을 포함하는 벡터를 캡시드화하는 입자일 수 있다. 입자에서 캡시드화된 벡터는 반전된 말단 반복체 사이에 삽입된 외인성 핵산을 더 포함할 수 있다.
AAV의 하기 특색은 이를 유전자 전달을 위한 매력적인 벡터로 만들었다. AAV 벡터는 시험관내에서 세포 게놈 내로 안정하게 통합되고; 넓은 숙주 범위를 소유하고; 시험관내에서 및 생체내에서 분열 및 비-분열 세포 둘 다를 형질도입하고, 형질도입된 유전자의 높은 수준의 발현을 유지하는 것으로 나타났다. 바이러스 입자는 열 안정성이고, 용매, 세정제, pH, 온도의 변화에 내성이며, CsCl 구배에 대해 또는 다른 수단에 의해 농축될 수 있다. 본 발명은 AAV 입자, 재조합 AAV 벡터, 및 재조합 AAV 비리온을 투여하는 방법을 제공한다. 예를 들어, AAV2 입자는 AAV2 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자이거나, AAV1 입자는 AAV1 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자이다. 재조합 AAV2 벡터는 AAV2의 적어도 1개의 고유한 핵산을 포함하는 핵산 구축물이다. 재조합 AAV2 비리온은 재조합 AAV2 벡터를 함유하는 입자이다. 용어 "AAV2 ITR" 내로 고려되기 위해, 뉴클레오티드 서열은 AAV2 ITR을 AAV1 ITR로부터 구별하는 본원에 기재된 하나 또는 둘 다의 특색을 보유해야 한다: (1) 3개의 (AAV1에서와 같이 4개라기 보다는) "GAGC" 반복체 및 (2) AAV2 ITR Rep 결합 부위에서 첫번째 2개의 "GAGC" 반복체에서 제4 뉴클레오티드가 T라기 보다는 C이다.
전달되는 또다른 제제를 코딩하는 단백질 또는 서열의 발현을 유도하는 프로모터는 공지된 고려사항, 예컨대 프로모터에 기능적으로 연결된 핵산의 발현의 수준 및 벡터가 사용되는 세포 유형에 의해 선택되는 임의의 바람직한 프로모터일 수 있다. 프로모터는 외인성 또는 내인성 프로모터일 수 있다. 프로모터로는 예를 들어, 공지된 강한 프로모터, 예컨대 SV40 또는 유도성 메탈로티오네인 프로모터, 또는 AAV 프로모터, 예컨대 AAV p5 프로모터를 들 수 있다. 프로모터의 추가의 예로는 액틴 유전자, 이뮤노글로불린 유전자, 시토메갈로바이러스 (CMV), 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스로, 아데노바이러스 프로모터, 예컨대 아데노바이러스 주요 후기 프로모터, 유도성 열 쇼크 프로모터, 호흡기 융합 바이러스, 라우스 육종 바이러스 (RSV) 등으로부터 유래된 프로모터를 들 수 있다. 추가의 예로는 조절된 프로모터를 들 수 있다.
AAV 벡터는 프로모터에 기능적으로 연결된 외인성 (이종) 핵산을 더 포함할 수 있다. "이종 핵산"은 임의의 이종 또는 외인성 핵산이 세포, 조직 또는 유기체 내로의 전달을 위한 벡터 내로 삽입될 수 있음을 의미한다. 핵산은 예를 들어 폴리펩티드 또는 단백질 또는 안티센스 RNA를 코딩할 수 있다. "기능적으로 연결된"은 프로모터가 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 이종 핵산의 발현, 예컨대 이종 핵산에 비해 프로모터의 적절한 배향을 촉진시킬 수 있도록 하는 것을 의미한다. 게다가, 이종 핵산은 바람직하게는 관련 기술분야에 공지된 바와 같이, 기능적으로 코딩하는, 즉, 핵산이 발현되도록 하는 핵산의 발현을 위한 모든 적절한 서열을 갖는다. 핵산은 예를 들어, 발현 제어 서열, 예컨대 인핸서, 및 필요한 정보 프로세싱 부위, 예컨대 리보솜 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결자 서열을 포함할 수 있다. 핵산은 패키징될 수 있는 핵산의 크기에 의해서만 제한되는 1개 초과의 유전자 생성물을 코딩할 수 있다.
본 발명의 특정 실시양태에서, 이종 핵산은 벡터가 그 내로 전달되는 대상체에 의해 요구되는 상실된 또는 결함성 단백질을 대체하는 유익한 단백질, 예컨대 Rheb 또는 Rhes를 코딩할 수 있다.
AAV1 입자는 AAV1 캡시드 단백질을 포함하는 바이러스 입자이다. AAV1 캡시드 단백질의 아미노산 서열에서의 변이는, AAV1 캡시드를 포함하는 생성된 바이러스 입자가 다른 AAV 캡시드와는 항원학적으로 또는 면역학적으로 별개로 잔류하는 한, 표준 방법에 의해 통상적으로 측정될 수 있기 때문에 본원에서 고려된다. 구체적으로, 예를 들어, ELISA 및 웨스턴 블롯을 사용하여 바이러스 입자가 다른 AAV 혈청형과 항원학적으로 또는 면역학적으로 별개인지 여부를 측정할 수 있다.
본원에 사용된 용어 "폴리펩티드"는 아미노산의 중합체를 지칭하며, 전장 단백질 및 그의 단편을 포함한다. 따라서, "단백질" 및 "폴리펩티드"는 종종 본원에서 호환적으로 사용된다. 치환은 중성인 것으로 공지된 파라미터에 의해 선택될 수 있다. 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 이해될 것인 바와 같이, 본 발명은 또한 아미노산 서열 또는 다른 특성에서의 약간의 변이를 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 변이는 대립유전자 변이 (예를 들어 유전적 다형성으로 인한)로서 자연적으로 발생할 수 있거나, 인간 개입 (예를 들어, 클로닝된 DNA 서열의 돌연변이유발에 의해), 예컨대 유도된 점, 결실, 삽입 및 치환 돌연변이체에 의해 생성될 수 있다. 아미노산 서열의 사소한 변화, 예컨대 보존적 아미노산 대체, 작은 내부 결실 또는 삽입, 및 분자의 말단에서의 부가 또는 결실은 일반적으로 바람직하다. 이들 변형은 아미노산 서열의 변화를 초래하거나, 침묵 돌연변이를 제공하거나, 제한 부위를 변형시키거나, 다른 특이적 돌연변이를 제공할 수 있다.
본 방법은 AAV 반전된 말단 반복체의 쌍 사이에 삽입된 핵산을 포함하는 벡터를 함유하는 AAV 입자를 세포에 투여함으로써 핵산을 세포에 전달하는 것을 포함하는, 핵산을 세포에 전달하는 방법을 제공한다. 세포에의 투여는 임의로 바람직한 액체, 예컨대 조직 배양 배지, 또는 완충 염수 용액에 함유된 입자를 세포와 간단히 접촉시키는 것을 비롯한, 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 입자는 임의의 바람직한 시간 길이 동안 세포와 접촉하여 잔류하게 될 수 있으며, 전형적으로 입자를 투여하고, 무기한으로 잔류하게 된다. 이러한 시험관내 방법을 위해, 바이러스는 관련 기술분야에 공지된 바와 같이 및 본원에 예시된 바와 같이, 표준 바이러스 형질도입 방법에 의해 세포에 투여될 수 있다. 투여하는 바이러스의 역가는 특히 세포 유형에 따라 다양할 수 있지만, 일반적으로 AAV 형질도입에 사용되는 것이 전형적일 것이다. 추가적으로, 본 실시예에서 특정 세포를 형질도입하는 데 사용되는 역가가 이용될 수 있다. 세포는 인간 뿐만 아니라 다른 큰 (비-설치류) 포유동물, 예컨대 영장류, 말, 양, 염소, 돼지, 및 개에서의 임의의 바람직한 세포를 포함할 수 있다.
보다 구체적으로, 본 발명은 핵산을 AAV 반전된 말단 반복체의 쌍 사이에 삽입된 핵산을 포함하는 뇌 중의 세포, 특히 중간 가시 뉴런에 전달함으로써 핵산을 세포에 전달하는 방법을 제공한다.
본 발명은 AAV 반전된 말단 반복체의 쌍 사이에 삽입된 핵산을 포함하는 AAV 입자를 대상체에게 투여함으로써 핵산을 대상체 중의 세포에 전달하는 것을 포함하는, 핵산을 대상체 중의 세포에 전달하는 방법을 추가로 제공한다.
또한, AAV 반전된 말단 반복체의 쌍 사이에 삽입된 핵산을 포함하는 AAV 입자를 대상체에게 투여함으로써 핵산을 대상체 중의 뉴런 또는 다른 세포에 전달하는 것을 포함하는, 핵산을 대상체 중의 뇌 세포, 예컨대 선조체 또는 피질 중의 뉴런에 전달하는 방법이 제공된다.
본 개시내용의 특정 실시양태는 본원에 기재된 바와 같은 바이러스 벡터를 포함하는 세포를 제공한다.
AAV 벡터
한 실시양태에서, 본 개시내용의 바이러스 벡터는 AAV 벡터이다. "AAV" 벡터는 아데노-연관된 바이러스를 지칭하며, 천연 발생 야생형 바이러스 그 자체 또는 그의 유도체를 지칭하는 데 사용될 수 있다. 상기 용어는 달리 요구되는 경우를 제외하고는, 모든 하위유형, 혈청형 및 위형, 및 천연 발생 및 재조합 형태 둘 다를 커버한다. 본원에 사용된 용어 "혈청형"은 정의된 항혈청과의 캡시드 단백질 반응성에 기초하여 다른 AAV에 의해 확인되며 그로부터 구별되는 AAV를 지칭하며, 예를 들어, 영장류 AAV의 8가지 공지된 혈청형, AAV-1 내지 AAV-9 및 AAVrh10이 있다. 예를 들어, 혈청형 AAV2는 AAV2의 cap 유전자로부터 코딩되는 캡시드 단백질 및 동일한 AAV2 혈청형으로부터의 5' 및 3' ITR 서열을 함유하는 게놈을 함유하는 AAV를 지칭하는 데 사용된다. 본원에 사용된 바와 같이, 예를 들어, rAAV1은 동일한 혈청형으로부터의 캡시드 단백질 및 5'-3' ITR 둘 다를 갖는 AAV를 지칭하는 데 사용될 수 있거나, 이는 1개의 혈청형으로부터의 캡시드 단백질 및 상이한 AAV 혈청형으로부터의 5'-3' ITR, 예를 들어, AAV 혈청형 2로부터의 캡시드 및 AAV 혈청형 5로부터의 ITR을 갖는 AAV를 지칭할 수 있다. 본원에 예시된 각각의 예에 대해, 벡터 설계 및 제조의 설명은 캡시드 및 5'-3' ITR 서열의 혈청형을 기재한다. 약어 "rAAV"는 재조합 아데노-연관된 바이러스를 지칭하며, 재조합 AAV 벡터 (또는 "rAAV 벡터")로도 지칭된다.
"AAV 바이러스" 또는 "AAV 바이러스 입자"는 적어도 1종의 AAV 캡시드 단백질로 (바람직하게는 야생형 AAV의 모든 캡시드 단백질에 의해) 및 캡시드화된 폴리뉴클레오티드로 구성된 바이러스 입자를 지칭한다. 입자가 이종 폴리뉴클레오티드 (즉, 야생형 AAV 게놈 이외의 폴리뉴클레오티드, 예컨대 포유동물 세포에 전달되는 트랜스진)를 포함하는 경우, 이는 전형적으로 "rAAV"로 지칭된다.
한 실시양태에서, AAV 발현 벡터는 작동적으로 연결된 성분으로서 전사의 방향으로 전사 개시 영역, 관심의 DNA 및 전사 종결 영역을 비롯한 제어 요소를 적어도 제공하는 공지된 기술을 사용하여 구축된다. 제어 요소는 포유동물 세포에서 기능적이도록 선택된다. 작동적으로 연결된 성분을 함유하는 생성된 구축물은 기능적 AAV ITR 서열과 플랭킹된다 (5' 및 3').
"아데노-연관된 바이러스 반전된 말단 반복체" 또는 "AAV ITR"은 DNA 복제의 원점으로서 및 바이러스에 대한 패키징 신호로서 시스로 함께 기능하는 AAV 게놈의 각각의 말단에서 발견되는 관련 기술분야에 인식된 영역을 의미한다. AAV ITR은 AAV rep 코딩 영역과 함께, 포유동물 세포 게놈 내로의 2개의 플랭킹된 ITR 사이에 개재된 뉴클레오티드 서열로부터의 유효한 절제 및 구제, 및 그의 통합을 제공한다.
AAV ITR 영역의 뉴클레오티드 서열은 공지되어 있다. 본원에 사용된 바와 같은 "AAV ITR"은 야생형 뉴클레오티드 서열이 나타내어질 필요는 없지만, 예를 들어, 뉴클레오티드의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 변경될 수 있다. 추가적으로, AAV ITR은 제한 없이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7 등을 비롯한 몇몇 AAV 혈청형 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 게다가, AAV 벡터 중의 선택된 뉴클레오티드 서열에 플랭킹된 5' 및 3' ITR은, 이들이 의도되는 바와 같이, 즉, 숙주 세포 게놈 또는 벡터로부터의 관심의 서열의 절제 및 구제를 허용하도록, 및 AAV Rep 유전자 생성물이 세포에 존재하는 경우 수용자 세포 게놈 내로 이종 서열의 통합을 허용하도록 기능하는 한, 반드시 동일하거나 동일한 AAV 혈청형 또는 단리체로부터 유래될 필요는 없다.
한 실시양태에서, AAV ITR은 제한 없이 AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7 등을 비롯한 몇몇 AAV 혈청형 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있다. 게다가, AAV 발현 벡터 중의 선택된 뉴클레오티드 서열에 플랭킹된 5' 및 3' ITR은, 이들이 의도되는 바와 같이, 즉, 숙주 세포 게놈 또는 벡터로부터의 관심의 서열의 절제 및 구제를 허용하도록, 및 AAV Rep 유전자 생성물이 세포에 존재하는 경우 수용자 세포 게놈 내로 DNA 분자의 통합을 허용하도록 기능하는 한, 반드시 동일하거나 동일한 AAV 혈청형 또는 단리체로부터 유래될 필요는 없다.
한 실시양태에서, AAV 캡시드는 AAV2로부터 유래될 수 있다. AAV 벡터에 사용하기에 적합한 DNA 분자는 크기가 약 5 킬로베이스 (kb) 미만, 약 4.5 kb 미만, 약 4 kb 미만, 약 3.5 kb 미만, 약 3 kb 미만, 약 2.5 kb 미만일 것이며, 관련 기술분야에 공지되어 있다.
한 실시양태에서, 선택되는 뉴클레오티드 서열은 생체내에서 대상체에서의 그의 전사 또는 발현을 지정하는 제어 요소에 작동적으로 연결된다. 이러한 제어 요소는 선택되는 유전자와 정상적으로 회합되는 제어 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 이종 제어 서열이 채용될 수 있다. 유용한 이종 제어 서열은 일반적으로 포유동물 또는 바이러스 유전자를 코딩하는 서열로부터 유래된 것들을 포함한다. 예로는 SV40 초기 프로모터, 마우스 유선 종양 바이러스 LTR 프로모터; 아데노바이러스 주요 후기 프로모터 (Ad MLP); 단순 포진 바이러스 (HSV) 프로모터, 시토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터, 예컨대 CMV 급초기 프로모터 영역 (CMVIE), 라우스 육종 바이러스 (RSV) 프로모터, pol II 프로모터, pol III 프로모터, 합성 프로모터, 혼성 프로모터 등을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 또한, 비-바이러스 유전자, 예컨대 뮤린 메탈로티오네인 유전자로부터 유래된 서열은 또한 본원에서 용도를 발견할 것이다. 이러한 프로모터 서열은 예를 들어, 스트라타진 (Stratagene) (미국 캘리포니아주 샌 디에고)으로부터 시판된다.
한 실시양태에서, 이종 프로모터 및 다른 제어 요소, 예컨대 CNS-특이적 및 유도성 프로모터, 인핸서 등 둘 다는 특히 유용할 것이다. 이종 프로모터의 예로는 CMV 프로모터를 들 수 있다. CNS-특이적 프로모터의 예로는 미엘린 기저 단백질 (MBP), 아교 섬유 산성 단백질 (GFAP), 및 뉴런 특이적 에놀라제 (NSE)로부터의 유전자로부터 단리된 것들을 들 수 있다. 유도성 프로모터의 예로는 엑디손, 테트라시클린, 저산소증 및 아우핀에 대한 DNA 반응성 요소를 들 수 있다.
한 실시양태에서, AAV ITR에 의해 결합된 관심의 DNA 분자를 갖는 AAV 발현 벡터는 선택된 서열(들)을 그로부터 절제되는 주요 AAV 오픈 리딩 프레임 ("ORF")을 가진 AAV 게놈 내로 직접적으로 삽입함으로써 구축될 수 있다. AAV 게놈의 다른 부분은 또한, ITR의 충분한 부분이 복제 및 패키징 기능을 허용하도록 잔류하는 한, 결실될 수 있다. 이러한 구축물은 관련 기술분야에 널리 공지된 기술을 사용하여 설계될 수 있다.
대안적으로, AAV ITR은 표준 라이게이션 기술을 사용하여 또다른 벡터에 존재하는 선택된 핵산 구축물의 동일하며 융합된 5' 및 3'를 함유하는 바이러스 게놈으로부터 또는 AAV 벡터로부터 절제될 수 있다. 예를 들어, 라이게이션은 20 mM 트리스 (Tris)-Cl (pH 7.5), 10 mM MgCl2, 10 mM DTT, 33 μg/ml BSA, 10 mM 내지 50 mM NaCl, 및 0℃에서 40 uM ATP, 0.01 내지 0.02 (바이스 (Weiss)) 단위 T4 DNA 리가제 ("점착성 말단" 라이게이션에 대해) 또는 14℃에서 1 mM ATP, 0.3 내지 0.6 (바이스) 단위 T4 DNA 리가제 ("블런트 말단" 라이게이션에 대해) 중 어느 하나로 달성될 수 있다. 세포간 "점착성 말단" 라이게이션은 통상적으로 30 내지 100 μg/ml 총 DNA 농도 (5 내지 100 nM 총 종료 농도)에서 수행된다. AAV 벡터는 ITR을 함유한다.
추가적으로, 키메라 유전자는 1개 이상의 선택된 핵산 서열의 5' 및 3' 배열된 AAV ITR 서열을 포함하도록 합성적으로 생성될 수 있다. 포유동물 CNS 세포에서의 키메라 유전자 서열의 발현을 위한 바람직한 코돈이 사용될 수 있다. 완전한 키메라 서열은 표준 방법에 의해 제조되는 올리고뉴클레오티드의 중첩으로부터 어셈블리된다.
rAAV 비리온을 생성하기 위해, AAV 발현 벡터는 공지된 기술을 사용하여, 예컨대 형질감염에 의해 적합한 숙주 세포 내로 도입된다. 다수의 형질감염 기술이 일반적으로 관련 기술분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, New York]을 참조한다. 특히 적합한 형질감염 방법으로는 인산칼슘 공-침전, 배양된 세포 내로의 직접 미세-주사, 전기천공, 리포좀 매개 유전자 전달, 지질-매개 형질도입, 및 고-진공 미세투사물을 사용한 핵산 전달을 들 수 있다.
한 실시양태에서, rAAV 비리온을 생성하기 위한 적합한 숙주 세포로는 이종 DNA 분자의 수용자일 수 있거나, 그것으로서 사용된 미생물, 효모 세포, 곤충 세포, 및 포유동물 세포를 들 수 있다. 상기 용어는 형질감염된 원래 세포의 자손을 포함한다. 따라서, 본원에 사용된 바와 같은 "숙주 세포"는 일반적으로 외인성 DNA 서열로 형질감염된 세포를 지칭한다. 안정한 인간 세포주인 293 (예를 들어, 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)을 통해 수탁 번호 ATCC CRL1573 하에 용이하게 이용가능함)으로부터의 세포가 본 개시내용의 실시에 사용될 수 있다. 특히, 인간 세포주 293은 아데노바이러스 유형-5 DNA 단편으로 형질전환된 인간 배아 신장 세포주이며, 아데노바이러스 E1a 및 E1b 유전자를 발현한다. 293 세포주는 용이하게 형질감염되며, rAAV 비리온을 생성하는 특히 편리한 플랫폼을 제공한다.
"AAV rep 코딩 영역"은 복제 단백질 Rep 78, Rep 68, Rep 52 및 Rep 40을 코딩하는 AAV 게놈의 관련 기술분야에 인식된 영역을 의미한다. 이들 Rep 발현 생성물은 DNA 복제의 AAV 원점의 인식, 결합 및 니킹, DNA 헬리카제 활성 및 AAV (또는 다른 이종) 프로모터로부터의 전사의 조정을 비롯한 많은 기능을 소유하는 것으로 나타났다. Rep 발현 생성물은 AAV 게놈을 복제하기 위해 집합적으로 요구된다. AAV rep 코딩 영역의 적합한 동족체로는 또한 AAV-2 DNA 복제를 매개하는 것으로도 공지된 인간 포진바이러스 6 (HHV-6) rep 유전자를 들 수 있다.
"AAV cap 코딩 영역"은 캡시드 단백질 VP1, VP2, 및 VP3, 또는 그의 기능적 동족체를 코딩하는 AAV 게놈의 관련 기술분야에 인식된 영역을 의미한다. 이들 Cap 발현 생성물은 바이러스 게놈을 패키징하기 위해 집합적으로 요구되는 패키징 기능을 공급한다.
한 실시양태에서, AAV 헬퍼 기능은 AAV 발현 벡터의 형질감염 전에, 또는 그와 공동으로, 숙주 세포를 AAV 헬퍼 구축물로 형질감염시킴으로써 숙주 세포 내로 도입된다. 따라서, AAV 헬퍼 구축물은 생산적 AAV 감염에 필요한 상실된 AAV 기능을 보완하는 AAV rep 및/또는 cap 유전자의 적어도 일시적 발현을 제공하는 데 사용된다. AAV 헬퍼 구축물은 AAV ITR이 결여되어 있으며, 그들 자신을 복제하거나 패키징할 수 없다. 이들 구축물은 플라스미드, 파지, 트랜스포존, 코스미드, 바이러스, 또는 비리온의 형태일 수 있다. 다수의 AAV 헬퍼 구축물, 예컨대 Rep 및 Cap 발현 생성물 둘 다를 코딩하는 통상적으로 사용되는 플라스미드 pAAV/Ad 및 pIM29+45가 기재되었다. Rep 및/또는 Cap 발현 생성물을 코딩하는 다수의 다른 벡터가 기재되었다.
바이러스 벡터의 전달 방법으로는 AAV를 대상체 내로 주사하는 것을 들 수 있다. 일반적으로, rAAV 비리온은 생체내 또는 시험관내 형질도입 기술 중 어느 하나를 사용하여 CNS의 세포 내로 도입될 수 있다. 시험관내에서 형질도입되는 경우, 바람직한 수용자 세포를 대상체로부터 제거하고, rAAV 비리온으로 형질도입하고, 대상체 내로 재도입할 것이다. 대안적으로, 그들 세포가 대상체에서 부적절한 면역 반응을 생성하지 않을 경우 공통유전자성 또는 이종유전자성 세포가 사용될 수 있다.
형질도입된 세포를 대상체 내로 전달 및 도입하는데 적합한 방법은 기재된 바 있다. 예를 들어, 세포는 재조합 AAV 비리온을 예를 들어, 적절한 배지에서 CNS 세포와 조합하고, 관심의 DNA를 갖는 세포에 대해 스크리닝함으로써 시험관내에서 형질도입될 수 있으며, 이는 통상적인 기술, 예컨대 서던 블롯 및/또는 PCR을 사용하여, 또는 선택가능한 마커를 사용함으로써 스크리닝될 수 있다. 그 후, 형질도입된 세포는 하기에서 보다 충분히 설명되는 제약 조성물로 제제화되며, 조성물은 다양한 기술에 의해, 예컨대 이식, 근육내, 정맥내, 피하 및 복강내 주사에 의해 대상체 내로 도입될 수 있다.
한 실시양태에서, 제약 조성물은 관심의 핵산의 치료학적 유효량, 즉, 해당 질환 상태의 증상을 감소시키거나 개선시키는 데 충분한 양, 또는 바람직한 이익을 부여하는 데 충분한 양을 생성하는 충분한 유전 물질을 포함할 것이다. 제약 조성물은 또한 제약학적으로 허용되는 부형제를 함유할 것이다. 이러한 부형제로는 그 자체는 조성물을 받는 개체에게 유해한 항체의 생성을 유도하지 않으며, 과도한 독성 없이 투여될 수 있는 임의의 제약 제제를 들 수 있다. 제약학적으로 허용되는 부형제로는 소르비톨, 트윈 (Tween)80, 및 액체, 예컨대 물, 염수, 글리세롤 및 에탄올을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 제약학적으로 허용되는 염, 예를 들어, 광물산 염, 예컨대 염산염, 브로민화수소산염, 포스페이트, 술페이트 등; 및 유기산의 염, 예컨대 아세테이트, 프로피오네이트, 말로네이트, 벤조에이트 등은 그 안에 포함될 수 있다. 추가적으로, 보조 물질, 예컨대 습윤화제 또는 유화제, pH 완충 물질 등은 이러한 비히클에 존재할 수 있다. 제약학적으로 허용되는 부형제의 철저한 논의는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991)]에서 이용가능하다.
1개 초과의 트랜스진이 전달되는 바이러스 벡터에 의해 발현될 수 있음이 이해되어야 한다. 대안적으로, 각각 1개 이상의 상이한 트랜스진을 발현하는 별개의 벡터가 또한 본원에 기재된 바와 같이 대상체에게 전달될 수 있다. 게다가, 또한, 본 개시내용의 방법에 의해 전달되는 바이러스 벡터는 다른 적합한 조성물 및 요법과 조합되는 것으로 의도된다.
이 명세서의 교시내용의 관점에서 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백한 바와 같이, 첨가되어야 하는 유효량의 바이러스 벡터는 경험적으로 결정될 수 있다. 투여는 치료의 과정 전반에 걸쳐 하나의 용량으로, 연속적으로 또는 간헐적으로 수행될 수 있다. 투여의 가장 유효한 수단 및 투여량을 결정하는 방법은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 바이러스 벡터, 요법의 조성물, 표적 세포, 및 치료되는 대상체에 따라 다양할 것이다. 단일 및 다중 투여가 치료하는 의사에 의해 선택되는 용량 수준 및 패턴으로 수행될 수 있다.
특정 실시양태에서, rAAV는 1x105 내지 1x1016 vg/ml의 약 0.3 내지 2 ml의 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, rAAV는 1x107 내지 1x1014 vg/ml의 약 1 내지 3 ml의 용량으로 투여된다. 특정 실시양태에서, rAAV는 1x108 내지 1x1013 vg/ml의 약 1 내지 2 ml의 용량으로 투여된다.
rAAV 입자를 함유하는 제제는 비히클 중에 rAAV 입자의 유효량, 즉, 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정되는 유효량을 함유할 것이다. rAAV 입자는 전형적으로 조성물의 약 1％ 내지 약 95％ (w/w) 범위이거나, 적절할 경우 심지어 더 높거나 더 낮을 수 있다. 투여되는 양은 치료를 위해 고려되는 동물 또는 인간 대상체의 연령, 체중 및 신체 상태와 같은 인자에 의존한다. 유효 투여량은 용량 반응 곡선을 확립하는 통상적인 시험을 통해 관련 기술분야의 통상의 기술자에 의해 확립될 수 있다. 대상체는 하나 이상의 용량으로 rAAV 입자의 투여에 의해 치료된다. 다중 용량은 적당한 효소 활성을 유지하는 데 요구되는 바와 같이 투여될 수 있다.
물, 수성 염수, 인공 CSF, 또는 다른 공지된 물질을 비롯한 비히클은 대상 발명으로 채용될 수 있다. 제제를 제조하기 위해, 정제된 조성물을 단리하고, 동결건조시키고, 안정화할 수 있다. 그 후, 조성물을 적절한 농도로 조정하고, 임의로 항-염증제와 조합하고, 사용을 위해 패키징할 수 있다.
본 발명은 상기 기재된 단백질, 또는 단백질을 코딩하는 핵산 분자를 세포에서 표적 단백질의 수준을 증가시키는 데 충분한 양으로 세포 내로 도입함으로써 세포에서 표적 단백질의 수준을 증가시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 표적 단백질의 축적은 적어도 10％ 증가된다. 표적 단백질의 축적은 적어도 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 95％, 또는 99％ 증가된다.
치료제를 코딩하는 핵산
용어 "핵산"은 당, 포스페이트, 및 퓨린 또는 피리미딘 중 어느 하나인 염기를 함유하는 단량체 (뉴클레오티드)로 구성된, 단일- 또는 이중-가닥 형태 중 어느 하나의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드 및 그의 중합체를 지칭한다. 구체적으로 제한되지 않는다면, 상기 용어는 참조 핵산과 유사한 결합 특성을 가지며 천연 발생 뉴클레오티드와 유사한 방식으로 대사되는 천연 뉴클레오티드의 공지된 유사체를 함유하는 핵산을 포함한다. 달리 지시되지 않는다면, 특정 핵산 서열은 또한 그의 보존적으로 변형된 변이체 (예를 들어, 축퇴성 코돈 치환) 및 상보성 서열, 뿐만 아니라 명확하게 지시된 서열을 포함한다. 구체적으로, 축퇴성 코돈 치환은 하나 이상의 선택된 (또는 모든) 코돈의 제3 위치가 혼합된-염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 생성함으로써 달성될 수 있다.
"핵산 단편"은 주어진 핵산 분자의 부분이다. 대다수의 유기체에서 데옥시리보핵산 (DNA)은 유전 물질인 반면, 리보핵산 (RNA)은 DNA 내에 함유된 유전 정보의 단백질 내로의 전달에 관여한다. 개시된 뉴클레오티드 서열 및 그에 의해 코딩되는 단백질 또는 부분-길이 단백질의 단편 및 변이체는 본 발명에 의해 포함된다. "단편" 또는 "부분"은 폴리펩티드 또는 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의, 또는 그의 아미노산 서열의 전장 또는 전장 미만을 의미한다. 특정 실시양태에서, 단편 또는 부분은 생물학적으로 기능적이다 (즉, 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 99％ 또는 100％의 Rheb 또는 Rhes를 보유함).
분자의 "변이체"는 천연 분자의 서열과 실질적으로 유사한 서열이다. 뉴클레오티드 서열에 대해, 변이체는, 유전 암호의 축퇴성 때문에, 천연 단백질과 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 서열을 포함한다. 이들과 같은 천연 발생 대립유전자 변이체는 예를 들어, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 및 혼성화 기술로와 같이 분자 생물학 기술의 사용으로 확인될 수 있다. 변이체 뉴클레오티드 서열은 또한 합성적으로 유래된 뉴클레오티드 서열, 예컨대 예를 들어, 천연 단백질을 코딩하는 부위-지정 돌연변이유발을 사용함으로써 생성된 것들, 뿐만 아니라 아미노산 치환을 갖는 폴리펩티드를 코딩하는 것들을 포함한다. 일반적으로, 본 발명의 뉴클레오티드 서열 변이체는 천연 (내인성) 뉴클레오티드 서열과 적어도 40％, 50％, 60％, to 70％, 예를 들어, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 내지 79％, 일반적으로 적어도 80％, 예를 들어, 81％ 내지 84％, 적어도 85％, 예를 들어, 86％, 87％, 88％, 89％, 90％, 91％, 92％, 93％, 94％, 95％, 96％, 97％, 내지 98％ 서열 동일성을 가질 것이다. 특정 실시양태에서, 변이체는 생물학적으로 기능적이다 (즉, 야생형 Rhes 또는 Rheb의 활성의 5％, 10％, 15％, 20％, 25％, 30％, 35％, 40％, 45％, 50％, 55％, 60％, 65％, 70％, 75％, 80％, 85％, 90％, 95％, 99％ 또는 100％를 보유함).
특정 핵산 서열의 "보존적으로 변형된 변이"는 동일하거나 본질적으로 동일한 아미노산 서열을 코딩하는 핵산 서열을 지칭한다. 유전 암호의 축퇴성 때문에, 다수의 기능적으로 동일한 핵산은 임의의 주어진 폴리펩티드를 코딩한다. 예를 들어, 코돈 CGT, CGC, CGA, CGG, AGA 및 AGG는 모두 아미노산 아르기닌을 코딩한다. 따라서, 아르기닌이 코돈에 의해 특정화되는 모든 위치에서, 코돈은 코딩되는 단백질을 변경시키지 않고 기재된 상응하는 코돈 중 임의의 것으로 변경될 수 있다. 이러한 핵산 변이는 "보존적으로 변형된 변이"의 한 종인 "침묵 변이"이다. 폴리펩티드를 코딩하는 본원에 기재된 모든 핵산 서열은 또한 달리 언급되는 경우를 제외하고는, 모든 가능한 침묵 변이를 기재한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 핵산 중의 각각의 코돈 (통상적으로 단지 메티오닌에 대한 코돈인 ATG 제외)이 표준 기술에 의해 기능적으로 동일한 분자를 생성하도록 변형될 수 있음을 인식할 것이다. 따라서, 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 각각의 "침묵 변이"는 각각의 기재된 서열에 내포된다.
용어 폴리뉴클레오티드 서열의 "실질적 동일성"은 폴리뉴클레오티드가 표준 파라미터를 사용하여 기재된 정렬 프로그램 중 하나를 사용하여 참조 서열에 비해 적어도 70％, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 또는 79％, 또는 적어도 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 또는 89％, 또는 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 또는 94％, 또는 심지어 적어도 95％, 96％, 97％, 98％, 또는 99％ 서열 동일성을 갖는 서열을 포함함을 의미한다. 관련 기술분야의 통상의 기술자는 이들 값이 코돈 축퇴성, 아미노산 유사성, 리딩 프레임 위치화 등을 고려함으로써 2개의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단백질의 상응하는 동일성을 측정하도록 적절하게 조정될 수 있음을 인식할 것이다. 이들 목적을 위한 아미노산 서열의 실질적 동일성은 통상적으로 적어도 70％, 적어도 80％, 90％, 또는 심지어 적어도 95％의 서열 동일성을 의미한다.
펩티드의 맥락에서 용어 "실질적 동일성"은 펩티드가 특정된 비교 윈도우에 비해 참조 서열과 적어도 70％, 71％, 72％, 73％, 74％, 75％, 76％, 77％, 78％, 또는 79％, 또는 80％, 81％, 82％, 83％, 84％, 85％, 86％, 87％, 88％, 또는 89％, 또는 적어도 90％, 91％, 92％, 93％, 또는 94％, 또는 심지어, 95％, 96％, 97％, 98％ 또는 99％ 서열 동일성을 포함함을 지시한다. 2개의 펩티드 서열이 실질적으로 동일하다는 지시는 한 펩티드가 제2 펩티드에 대해 유발된 항체와 면역학적으로 반응성이라는 것이다. 따라서, 펩티드는 예를 들어, 2개의 펩티드가 보존적 치환에 의해서만 상이한 경우, 제2 펩티드와 실질적으로 동일하다.
유전 물질을 세포 내로 도입하는 방법
외인성 유전 물질 (예를 들어, 1종 이상의 치료 단백질을 코딩하는 cDNA)은 유전적으로 변형된 세포를 제공하기 위해, 유전적 전달 방법, 예컨대 형질감염 또는 형질도입에 의해 생체내에서 세포 내로 도입된다. 다양한 발현 벡터 (즉, 표적 세포 내로의 외인성 유전 물질의 전달을 용이하게 하기 위한 비히클)는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같은 "세포의 형질감염"은 첨가되는 DNA의 혼입에 의해 새로운 유전 물질의 세포에 의한 획득을 지칭한다. 따라서, 형질감염은 물리적 또는 화학적 방법을 사용한 세포 내로의 핵산의 삽입을 지칭한다. 인산칼슘 DNA 공-침전; DEAE-덱스트란; 전기천공; 양이온성 리포좀-매개 형질감염; 및 텅스텐 입자-촉진 미세입자 포격을 비롯한 몇몇 형질감염 기술은 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 인산스트론튬 DNA 공-침전은 또다른 가능한 형질감염 방법이다.
대조적으로, "세포의 형질도입"은 DNA 또는 RNA 바이러스를 사용하여 핵산을 세포 내로 전달하는 프로세스를 지칭한다. 핵산을 세포 내로 전달하기 위한 RNA 바이러스 (즉, 레트로바이러스)는 본원에서 형질도입 키메라 레트로바이러스로 지칭된다. 레트로바이러스 내에 함유된 외인성 유전 물질은 형질도입된 세포의 게놈 내로 혼입된다. 키메라 DNA 바이러스 (예를 들어, 치료제를 코딩하는 cDNA를 운반하는 아데노바이러스)로 형질도입된 세포는 그의 게놈 내로 혼입된 외인성 유전 물질을 갖지 않을 것이지만, 세포 내에 염색체외적으로 보유되는 외인성 유전 물질을 발현할 수 있을 것이다.
전형적으로, 외인성 유전 물질은 새로운 유전자의 전사를 제어하는 프로모터와 함께 이종 유전자 (통상적으로 치료 단백질을 코딩하는 엑손을 포함하는 cDNA의 형태로)를 포함한다. 프로모터는 전사를 개시하는 데 필요한 특이적 뉴클레오티드 서열을 특징적으로 갖는다. 임의로, 외인성 유전 물질은 바람직한 유전자 전사 활성을 얻는 데 요구되는 추가의 서열 (즉, 인핸서)을 더 포함한다. 이 논의의 목적으로, "인핸서"는 간단히 프로모터에 의해 나타내어지는 기저 전사 수준을 변화시키는 코딩 서열과 (시스로) 인접하여 작동하는 임의의 비-번역된 DNA 서열이다. 외인성 유전 물질은, 프로모터 및 코딩 서열이 코딩 서열의 전사를 허용하도록 작동적으로 연결되도록, 프로모터로부터 바로 하류의 세포 게놈 내로 도입될 수 있다. 레트로바이러스 발현 벡터는 삽입된 외인성 유전자의 전사를 제어하는 외인성 프로모터 요소를 포함할 수 있다. 이러한 외인성 프로모터는 구조적 및 유도성 프로모터 둘 다를 포함한다.
천연-발생 구조적 프로모터는 필수적 세포 기능의 발현을 제어한다. 그 결과, 구조적 프로모터의 제어 하의 유전자는 세포 성장의 모든 조건 하에서 발현된다. 예시적인 구조적 프로모터로는 특정 구조적 또는 "하우스키핑" 기능을 코딩하는 하기 유전자에 대한 프로모터를 들 수 있다: 히포크산틴 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HPRT), 디히드로폴레이트 리덕타제 (DHFR), 아데노신 데아미나제, 포스포글리세롤 키나제 (PGK), 피루베이트 키나제, 포스포글리세롤 뮤타제, 액틴 프로모터, 및 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다른 구조적 프로모터. 또한, 많은 바이러스 프로모터는 진핵 세포에서 구조적으로 기능한다. 이들로는 많은 다른 것들 중에서도, SV40의 초기 및 후기 프로모터; 원숭이 백혈병 바이러스 및 다른 레트로바이러스의 긴 말단 반복체 (LTR); 및 단순 포진 바이러스의 티미딘 키나제 프로모터를 들 수 있다. 따라서, 상기-언급된 구조적 프로모터 중 임의의 것은 이종 유전자 삽입체의 전사를 제어하는 데 사용될 수 있다.
유도성 프로모터의 제어 하에 있는 유전자는 유도제, (예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터의 제어 하의 전사는 특정 금속 이온의 존재 하에서 크게 증가됨)의 존재 하에서만 또는 보다 큰 정도로 발현된다. 유도성 프로모터는 그들의 유도 인자가 결합되는 경우 전사를 자극하는 반응성 요소 (RE)를 포함한다. 예를 들어, 혈청 인자, 스테로이드 호르몬, 레티노산 및 시클릭 AMP에 대한 RE가 있다. 특정 RE를 함유하는 프로모터는 유도성 반응을 얻기 위해 선택될 수 있으며, 일부의 경우, RE 그 자체가 상이한 프로모터에 부착함으로써, 재조합 유전자에 유도성을 부여할 수 있다. 따라서, 적절한 프로모터 (구조적 대 유도성; 강한 대 약한)를 선택함으로써, 유전적으로 변형된 세포에서 치료제의 발현의 존재 및 수준 둘 다를 제어할 수 있다. 치료제를 코딩하는 유전자가 유도성 프로모터의 제어 하에 있는 경우, 계내에서의 치료제의 전달은 유전적으로 변형된 세포를 계내에서 치료제의 전사를 허용하는 조건에 노출시킴으로써, 예를 들어, 제제의 전사를 제어하는 유도성 프로모터의 특정 유도제의 복강내 주사에 의해 촉발된다. 예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터의 제어 하에 유전자에 의해 코딩되는 치료제의 유전적으로 변형된 세포에 의한 계내 발현은 유전적으로 변형된 세포를 계내에서 적절한 (즉, 유도하는) 금속 이온을 함유하는 용액과 접촉시킴으로써 향상된다.
따라서, 계내에서 전달되는 치료제의 양은 (1) 삽입되는 유전자의 직접적 전사에 사용되는 프로모터의 성질 (즉, 프로모터가 구조적인지 유도성인지, 강한지 약한지 여부); (2) 세포 내로 삽입된 외인성 유전자의 카피의 수; (3) 환자에게 투여되는 (예를 들어, 삽입되는) 형질도입된/형질감염된 세포의 수; (4) 삽입물 (예를 들어, 이식편 또는 캡슐화된 발현 시스템)의 크기; (5) 삽입물의 수; (6) 형질도입된/형질감염된 세포 또는 삽입물이 장소에 방치되는 시간의 길이; 및 (7) 유전적으로 변형된 세포에 의한 치료제의 생성 속도와 같은 인자를 제어함으로써 조절된다. 특정 치료제의 치료학적 유효 용량의 전달을 위한 이들 인자의 선택 및 최적화는 상기-개시된 인자 및 환자의 임상적 프로파일을 고려하여, 과도한 실험 없이 관련 기술분야의 통상의 기술자의 범위 내인 것으로 간주된다.
적어도 하나의 프로모터 및 치료제를 코딩하는 적어도 하나의 이종 핵산 외에, 발현 벡터는 발현 벡터로 형질감염되거나 형질도입된 세포의 선별을 용이하게 하기 위해, 선별 유전자, 예를 들어, 네오마이신 저항성 유전자를 포함할 수 있다. 대안적으로, 세포는 2개 이상의 발현 벡터, 즉, 치료제(들)을 코딩하는 유전자(들)를 함유하는 적어도 하나의 벡터, 선별 유전자를 함유하는 다른 벡터로 형질감염된다. 적합한 프로모터, 인핸서, 선별 유전자 및/또는 신호 서열 (하기 설명됨)의 선택은 과도한 실험 없이 관련 기술분야의 통상의 기술자의 범위 내인 것으로 간주된다.
치료제는 세포외, 세포내 또는 막 위치로의 전달을 위해 표적화될 수 있다. 유전자 생성물이 세포로부터 분비되는 것이 바람직할 경우, 발현 벡터는 세포로부터 세포외 환경으로 치료 유전자 생성물을 분비하기 위한 적절한 분비 "신호" 서열을 포함하도록 설계된다. 유전자 생성물이 세포 내에 보유되는 것이 바람직할 경우, 이 분비 신호 서열은 생략된다. 유사한 방식으로, 발현 벡터는 세포 원형질막 내의 치료제를 앵커링하기 위한 "보유" 신호 서열을 포함하도록 구축될 수 있다. 예를 들어, 모든 막 단백질은 소수성 막횡단 영역을 가지며, 이는 막 중의 단백질의 전위를 중단시키고, 단백질이 분비되는 것을 허용하지 않는다. 유전자 생성물을 특정 위치에 표적화하기 위한 신호 서열을 포함하는 발현 벡터의 구축은 과도한 실험에 대한 필요 없이 관련 기술분야의 통상의 기술자의 범위 내인 것으로 간주된다.
치료 방법
본 개시내용의 특정 실시양태는 본원에 기재된 바와 같은 단백질 또는 단백질을 코딩하는 벡터를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서의 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
본 개시내용의 특정 실시양태는 포유동물에서의 헌팅톤병을 치료하는 데 유용한 의약을 제조하기 위한 본원에 기재된 바와 같은 단백질 또는 단백질을 코딩하는 벡터의 용도를 제공한다.
본 개시내용은 또한 본원에 기재된 벡터를 함유하는 포유동물 세포를 제공한다. 세포는 인간일 수 있으며, 뇌로부터의 것일 수 있다.
본 개시내용의 특정 측면은 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드, 벡터, 및 유전적으로 조작된 세포 (생체내에서 변형됨), 및 이들의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 개시내용은 둘 다 치료학적 유효 용량의 치료제의 전신적 전달이 가능한 유전자 또는 단백질 요법을 위한 방법에 관한 것이다.
한 측면에 따르면, 포유동물 수용자에서 치료제를 발현하기 위한 세포 발현 시스템이 제공된다. 발현 시스템 (본원에서 "유전적으로 변형된 세포"로도 지칭됨)은 세포 및 치료제를 발현하기 위한 발현 벡터를 포함한다. 발현 벡터로는 이종 유전 물질을 세포에 전달하기 위한 바이러스, 플라스미드, 및 다른 비히클을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 따라서, 본원에 사용된 용어 "발현 벡터"는 이종 유전 물질을 세포에 전달하기 위한 비히클을 지칭한다. 특히, 발현 벡터는 재조합 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 또는 렌티바이러스 또는 레트로바이러스 벡터이다.
발현 벡터는 이종 유전자의 전사를 제어하기 위한 프로모터를 더 포함한다. 프로모터는 유도성 프로모터 (하기 설명됨)일 수 있다. 발현 시스템은 포유동물 수용자에의 투여에 적합하다. 발현 시스템은 복수의 비-불멸화된 유전적으로 변형된 세포를 포함할 수 있으며, 각각의 세포는 적어도 1종의 치료제를 코딩하는 적어도 하나의 재조합 유전자를 함유한다.
세포 발현 시스템은 생체내에서 형성된다. 더 또다른 측면에 따르면, 생체내에서 포유동물 수용자를 치료하는 방법이 제공된다. 방법은 이종 유전자 생성물을 발현하기 위한 발현 벡터를 계내에서, 예컨대 정맥내 투여를 통해 환자의 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 생체내에서 발현 시스템을 형성하기 위해, 치료제를 발현하기 위한 발현 벡터는 생체내에서 포유동물 수용자 내로 정맥내로 도입되며, 여기서, 벡터는 혈관구조를 통해 뇌로 이동한다.
더 또다른 측면에서, 생체내에서 포유동물 수용자를 치료하는 방법이 제공된다. 방법은 표적 단백질을 생체내에서 환자 내로 도입하는 것을 포함한다.
이종 유전자를 발현하기 위한 발현 벡터는 이종 유전자 생성물의 전사를 제어하기 위한 유도성 프로모터를 포함할 수 있다. 따라서, 계내에서의 치료제의 전달은 세포를 계내에서 이종 유전자의 전사를 유도하는 조건에 노출시킴으로써 제어된다.
폴리펩티드 (예를 들어, Rhes 또는 Rheb) 중 하나의 "변이체"는 천연 단백질과 완전히 동일하지는 않은 폴리펩티드이다. 이러한 변이체 단백질은 1개 이상의 아미노산의 삽입, 결실 또는 치환에 의해 아미노산 서열을 변경시킴으로써 얻어질 수 있다. 단백질의 아미노산 서열은 예를 들어 치환에 의해 변형되어, 천연 폴리펩티드에 비해 실질적으로 동일하거나 개선된 품질을 갖는 폴리펩티드를 생성한다. 치환은 보존된 치환일 수 있다. "보존된 치환"은 아미노산을 유사한 측쇄를 갖는 또다른 아미노산으로 치환하는 것이다. 보존된 치환은 전반적인 펩티드가 그의 공간적 입체형태를 보유하지만 생물학적 활성이 변경되도록, 아미노산의 전하 또는 아미노산의 측쇄의 크기의 (대안적으로, 측쇄 내의 화학기의 크기, 전하 또는 종류의) 가능한 최소의 변화를 만드는 아미노산으로의 치환일 것이다. 예를 들어, 통상적인 보존된 변화는 Asp가 Glu, Asn 또는 Gln으로; His가 Lys, Arg 또는 Phe로; Asn이 Gln, Asp 또는 Glu로 및 Ser이 Cys, Thr 또는 Gly로일 수 있다. 알라닌은 통상적으로 다른 아미노산에 대해 치환하는 데 사용된다. 20개의 필수 아미노산은 하기와 같이 그룹핑될 수 있다: 극성 측쇄를 갖는 알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프롤린, 페닐알라닌, 트립토판 및 메티오닌; 비하전된 극성 측쇄를 갖는 글리신, 세린, 트레오닌, 시스틴, 티로신, 아스파라긴 및 글루타민; 산성 측쇄를 갖는 아스파르테이트 및 글루타메이트; 및 염기성 측쇄를 갖는 리신, 아르기닌, 및 히스티딘.
아미노산 변화는 상응하는 핵산 서열의 코돈을 변화시킴으로써 달성된다. 이러한 폴리펩티드는 생물학적 활성을 변형시키거나 개선시키기 위해 폴리펩티드 구조에서 특정 아미노산으로 다른 아미노산에 대해 치환하는 것에 기초하여 얻어질 수 있다고 알려져 있다. 예를 들어, 대안적 아미노산의 치환을 통해, 작은 입체형태적 변화는 증가된 활성을 초래하는 폴리펩티드에 대해 부여될 수 있다. 대안적으로, 특정 폴리펩티드에서의 아미노산 치환은, 그 후 다른 목적을 위해 유용한 출발 폴리펩티드의 충분한 특성을 보유하는 펩티드-분자 접합체를 제공하기 위해 다른 분자에 연결되는 잔기를 제공하는 데 사용될 수 있다.
폴리펩티드에 대해 상호작용성 생물학적 기능을 부여하는 데 있어서 아미노산의 소수성 지수를 사용할 수 있으며, 여기서, 특정 아미노산은 유사한 소수성 지수를 가지며 여전히 유사한 생물학적 활성을 보유하는 다른 아미노산에 대해 치환될 수 있음이 밝혀져 있다. 대안적으로, 유사 아미노산의 치환은, 특히 생성되는 폴리펩티드에 바람직한 생물학적 기능이 면역학적 실시양태에서의 사용을 위해 의도되는 경우, 친수성에 기초하여 이루어질 수 있다. 그의 인접한 아미노산의 친수성에 의해 지배되는 바와 같이, "단백질"의 최대 국소 평균 친수성은 그의 면역원성과 상관된다. 따라서, 치환은 각각의 아미노산에 할당되는 친수성에 기초하여 이루어질 수 있음이 주목된다.
각각의 아미노산에 대한 값을 할당하는 친수성 지수 또는 소수성 지수 중 어느 하나를 사용하는 데 있어서, 이들 값이 ±2인 경우 (±1이 특히 바람직하고, ±0.5에서의 것들이 가장 바람직함) 아미노산의 치환을 수행하는 것이 바람직하다.
변이체 단백질은 상응하는 천연 단백질의 아미노산 서열과 적어도 50％, 적어도 약 80％, 또는 심지어 적어도 약 90％, 그러나 100％ 미만의 인접한 아미노산 서열 상동성 또는 동일성을 갖는다.
변이체 폴리펩티드의 아미노산 서열은 본질적으로 천연 폴리펩티드의 아미노산 서열에 상응한다. 본원에 사용된 바와 같은 "에 본질적으로 상응한다"는 천연 단백질에 의해 생성되는 반응과 실질적으로 동일한 생물학적 반응을 유발할 폴리펩티드 서열을 지칭한다. 이러한 반응은 천연 단백질에 의해 생성되는 수준의 적어도 60％일 수 있으며, 심지어 천연 단백질에 의해 생성되는 수준의 적어도 80％일 수 있다.
변이체는 상응하는 천연 단백질에 비해 상응하는 천연 단백질에 존재하지 않는 아미노산 잔기 또는 결실을 포함할 수 있다. 변이체는 또한 상응하는 천연 단백질에 비해 말단절단된 "단편", 즉, 전장 단백질의 단지 부분일 수 있다. 단백질 변이체는 또한 적어도 1종의 D-아미노산을 갖는 펩티드를 포함한다.
변이체 단백질은 변이체 단백질을 코딩하는 단리된 DNA 서열로부터 발현될 수 있다. "재조합"은 유전자 조작의 프로세스에 의해 생성된 펩티드 또는 핵산으로서 정의된다. 유전 암호의 중복성으로 인해, 개별적 뉴클레오티드는 코돈에서 용이하게 교환되며, 여전히 동일한 아미노산 서열을 초래할 수 있음이 관련 기술분야에 널리 공지되어 있음을 유념해야 한다.
본 개시내용은 발현 벡터를 세포 또는 환자에게 투여함으로써 포유동물에서의 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 유전자 요법 방법을 위해, 분자 생물학 및 유전자 요법의 기술분야의 통상의 기술자는 과도한 실험 없이 본 개시내용의 신규 방법에 사용되는 발현 벡터의 적절한 투여량 및 투여 경로를 결정할 수 있을 것이다.
한 실시양태에 따르면, 세포는 생체내에서 형질전환되거나, 다르게는 유전적으로 변형된다. 포유동물 수용자로부터의 세포는 치료제를 코딩하는 이종 (예를 들어, 재조합) 유전자를 발현하기 위한 외인성 유전 물질을 함유하는 벡터로 생체내에서 형질전환되며 (즉, 형질도입되거나 형질감염되며), 치료제는 계내에서 전달된다.
본원에 사용된 바와 같은 "외인성 유전 물질"은 세포에서 자연적으로 발견되지 않는; 또는 그것이 세포에서 자연적으로 발견되는 경우, 세포에 의해 생물학적으로 유의한 수준에서 전사되거나 발현되지 않는 천연 또는 합성 중 어느 하나의 핵산 또는 올리고뉴클레오티드를 지칭한다. 따라서, "외인성 유전 물질"은 예를 들어, 안티-센스 RNA로 전사될 수 있는 비-천연 발생 핵산, 뿐만 아니라 "이종 유전자" (즉, 동일한 유형의 천연-발생 세포에서 발현되지 않거나 생물학적으로 비유의한 수준에서 발현되는 단백질을 코딩하는 유전자)를 포함한다.
요약하면, 용어 "치료제"로는 상기 열거된 상태와 연관된 제제, 뿐만 아니라 그의 기능적 등가물을 들 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 본원에 사용된 용어 "기능적 등가물"은 포유동물 수용자에 대해 그것이 기능적 등가물로 간주되는 치료제와 동일하거나 개선된 유익한 효과를 갖는 분자 (예를 들어, 펩티드 또는 단백질)를 지칭한다.
유전자 대체 요법을 잘 받아들이는 상기-개시된 치료제 및 상태는 단지 예시적이며, 본 개시내용의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않는다. 공지된 상태를 치료하기 위한 적합한 치료제의 선택은 과도한 실험 없이 관련 기술분야의 통상의 기술자의 범위 내인 것으로 간주된다.
본 발명의 제제의 투여량, 제제 및 투여 경로
본 발명의 제제는 헌팅톤병과 연관된 적어도 하나의 증상의 감소를 초래하도록 투여된다. 투여되는 양은 선택되는 조성물, 특정 질환, 포유동물의 체중, 신체 상태, 및 연령, 및 예방 또는 치료가 달성되는지 여부를 포함하나 이에 제한되지 않는 다양한 인자에 따라 다양할 것이다. 이러한 인자는 관련 기술분야에 널리 공지된 동물 모델 또는 다른 시험 시스템을 채용하여 임상의에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명은 본 발명의 제제, 예를 들어, Rhes 또는 Rheb, 발현 벡터, 또는 바이러스 입자의 투여에 의한 헌팅톤병의 치료를 상정한다. 본 발명에 따른 치료제의 투여는 예를 들어, 수용자의 생리학적 상태, 투여의 목적이 치료적인지 예방적인지 여부, 및 숙련된 실시자에게 공지된 다른 인자에 따라 연속적이거나 간헐적일 수 있다. 본 발명의 제제의 투여는 본질적으로 미리 선택된 기간에 걸쳐 연속적일 수 있거나, 일련의 이격된 용량으로일 수 있다. 국소 및 전신 투여 둘 다가 고려된다.
하기 논의되는 바와 같이 임의로 지속된 방출을 위해 (예를 들어 미세캡슐화를 사용하여) 제제화될 수 있는 본 발명의 치료제(들)를 갖는 1종 이상의 적합한 단위 투여 형태는 비경구를 포함하여, 정맥내 및 근육내 경로에 의해, 뿐만 아니라 질환에 걸린 조직 내로의 직접적 주사에 의해서를 포함하여, 다양한 경로에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 치료제는 뇌 내로 직접적으로 주사될 수 있다. 대안적으로, 치료제는 뇌 및 척수 상태에 대해 경막내로 도입될 수 있다. 제제는 적절할 경우, 편리하게는 별개의 단위 투여 형태로 존재할 수 있으며, 약학에 널리 공지된 방법 중 임의의 것에 의해 제조될 수 있다. 이러한 방법은 치료제와 액체 담체, 고체 매트릭스, 반-고체 담체, 미분된 고체 담체 또는 이들의 조합의 회합을 야기한 후, 필요할 경우, 생성물을 바람직한 전달 시스템 내로 도입하거나 성형하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 치료제가 투여용으로 제조되는 경우, 이는 제약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 조합되어 제약 제제, 또는 단위 투여 형태를 형성할 수 있다. 이러한 제제 중의 총 활성 성분은 0.1 내지 99.9 중량％의 제제를 포함한다. "제약학적으로 허용되는"은 제제의 다른 성분과 혼화성이며, 그의 수용자에게 유해하지 않은 담체, 희석제, 부형제, 및/또는 염이다. 투여용 활성 성분은 분말로서 또는 과립으로서; 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로서 존재할 수 있다.
본 발명의 치료제를 함유하는 제약 제제는 널리 공지되어 있으며 용이하게 이용가능한 성분을 사용하여 관련 기술분야에 공지된 저차에 의해 제조될 수 있다. 본 발명의 치료제는 또한 예를 들어 근육내, 피하, 또는 정맥내 경로에 의한 비경구 투여에 적절한 용액으로서 제제화될 수 있다.
본 발명의 치료제의 제약 제제는 또한 수성 또는 무수 용액 또는 분산액의 형태, 또는 대안적으로 에멀젼 또는 현탁액의 형태를 취할 수 있다.
따라서, 치료제는 비경구 투여 (예를 들어, 주사, 예를 들어, 볼루스 주사 또는 연속 주입에 의해)용으로 제제화될 수 있으며, 앰풀, 예비-충전된 주사기, 작은 부피 주입 용기 중에, 또는 첨가되는 보존제를 갖는 다회-용량 용기 중에 단위 용량 형태로 존재할 수 있다. 활성 성분은 유성 또는 수성 비히클 중에 현탁액, 용액, 또는 에멀젼으로서 이러한 형태를 취할 수 있으며, 제제화제, 에컨대 현탁화제, 안정화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 대안적으로, 활성 성분은 사용 전에 적합한 비히클, 예를 들어, 멸균, 피로겐-무함유 물로의 재구성을 위한, 멸균 고체의 무균 단리에 의해 또는 용액으로부터의 동결건조에 의해 얻어진 분말 형태일 수 있다.
각각의 투여 형태의 개별적 에어로졸 용량에 함유된 활성 성분 또는 성분들의 단위 함량은, 필요한 유효량이 복수의 투여 단위의 투여에 의해 도달될 수 있기 때문에, 그것 자체가 특정 징후 또는 질환을 치료하기 위한 유효량을 구성할 필요는 없음이 이해될 것이다. 더욱이, 유효량은 개별적으로, 또는 일련의 투여로, 투여 형태에서 용량 미만을 사용하여 달성될 수 있다.
본 발명의 제약 제제는 임의적 성분으로서, 관련 기술분야에 널리 공지된 유형의 제약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 가용화제 또는 유화제, 및 염을 포함할 수 있다. 본 발명의 제약 제제에 유용한 담체 및/또는 희석제의 구체적인 비-제한적 예로는 물 및 생리학적으로 허용되는 완충 염수 용액, 예컨대 포스페이트 완충 염수 용액 (pH 7.0 내지 8.0) 및 물을 들 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 비-제한적 실시예에 의해 예시할 것이다.
실시예 1
헌팅톤병 마우스에서의 이상 mTORC1 활성을 회복시키는 것은 질환 표현형을 개선시킨다
라파마이신의 기계적 표적 (mTOR)은 세포 성장 및 대사를 조절하는 신호를 통합하는 세린-트레오닌 키나제이다 (Laplante and Sabatini, 2012). mTOR은 2가지 별개의 복합체, 즉, mTORC1 및 mTORC2를 형성한다. 영양-풍부 조건 하에서, mTORC1은 활성화되고, 단백질 번역 및 세포 성장을 촉진시킨다. 대조적으로, 영양 철회는 mTORC1을 불활성화시키고, 세포 생존 메커니즘으로서 거대자가포식 (이하 자가포식으로 지칭됨)을 개시한다. mTORC1은 미토콘드리아 생물발생을 양성적으로 제어하며 (Cunningham et al., 2007), 콜레스테롤 합성을 제어함으로써 지질 항상성을 조절한다 (Peterson et al., 2011; Porstmann et al., 2008). 더욱이, 뇌에서, mTORC1은 수초화, 액손 성장, 및 재생을 촉진시키며 (Kim et al., 2012; Park et al., 2008; Sun et al., 2011), mTORC1의 핵심적 활성화제인 뇌에 풍부화된 Ras 동족체 (Rheb)의 유전적 결실은 감소된 피질 두께 및 결함성 수초화를 유발한다 (Zou et al., 2011).
선조체에서 Rhes (선조체에 풍부화된 Ras 동족체)는 mTORC1의 핵심적 활성화제로서 기능한다 (Subramaniam et al., 2012). Rhes의 유전적 넉아웃은 mTORC1 활성을 감소시키며, L-DOPA 유도된 운동이상에 대한 유해 반응을 약화시킨다 (Subramaniam et al., 2012). 추가적으로 Rhes는 HD 발병기전에 관련된 프로세스인 (Steffan et al., 2004) SUMO화를 용이하게 한다 (Subramaniam et al., 2009). 시험관내에서, Rhes는 mHTT의 SUMO화를 촉진시켜 세포독성을 유도하며 (Subramaniam et al., 2009), siRNA를 갖는 외인적으로 첨가된 Rhes를 감소시키는 것은 mHTT 단편으로 형질감염된 세포의 생존을 증가시켰다 (Lu and Palacino, 2013; Seredenina et al., 2011). 생체내에서, Rhes의 유전적 제거는 신경독소-유도된 4 선조체 병변에 대해 보호하며 (Mealer et al., 2013), R6/1 HD 마우스에서 운동신경 증상 발병을 일시적으로 지연시킨다 (Baiamonte et al., 2013). Rhes는 선조체에서 높게 발현되기 때문에 (Spano et al., 2004), Rhes-mHTT 상호작용은 HD에서 현저한 선조체 퇴행의 기저를 이룰 수 있음이 제안되었다.
그러나, 다른 데이터는 HD에서 Rhes에 대한 병원성 역할에 의문을 제기한다. Rhes 수준은 HD 환자 미상핵에서 감소되며 (Hodges et al., 2006), R6/1 HD 모델에서의 Rhes 제거는 뇌 퇴행을 예방하지 않는다 (Baiamonte et al., 2013). 게다가, Rhes KO 마우스는 HD 마우스에서 발견되는 것과 닮은 뇌 위축 및 행동 이상을 발달시킨다 (Baiamonte et al., 2013; Spano et al., 2004). 또한, Rhes는 HD에서 널리-확립된 보호적 메커니즘인 자가포식을 촉진시킨다 (Mealer et al., 2014). 따라서, 선조체 mTORC1 신호전달을 매개화하는 데 있어서 Rhes의 중요한 기능을 고려하여, 본 발명자들은 Rhes 및 mTORC1 활성의 수반 소실이 HD에서 초기 선조체 병리학에 기여하며, Rheb 또는 Rhes의 상향-조절을 통해 mTORC1 기능을 향상시키는 것이 신경보호적일 것이라고 가설화하였다.
이 가설을 시험하기 위해, 본 발명자들은 HD 트랜스제닉 마우스의 성인 선조체에서 Rhes 및 mTORC1 활성을 정확하게 조정하였다. 본 발명자들은 mTORC1 활성화로, 개선된 mHTT-연관된 대사적 표현형 및 선조체 위축의 반전을 비롯한 유익한 효과를 밝혀내었다. 일관되게, 생체내에서 mTORC1 활성 또는 Rhes 수준을 복구시키는 것은 보호적이었다. 또한, 본 발명자들은 Rhes의 신경보호적 특성이 그의 GTP아제 활성에 의존하며, 이는 mTORC1을 활성화시키는 데 요구되지만, SUMO화 관련된 활성과는 독립적임을 보였다. 집합적으로, 이들 데이터는 손상된 Rhes/mTORC1 활성이 HD에서 주목할 만한 선조체 발병기전과 관련됨을 시사하며, 손상된 mTORC1 기능이 HD에서 복합 질환 표현형의 기저를 이루는 근본적인 메커니즘을 나타낼 수 있음을 시사한다.
결과
mTORC1 활성은 HD의 선조체에서 감소된다
본 발명자들의 가설의 첫번째 시험으로서, 본 발명자들은 HD 뇌에서 mTORC1 활성을 조사하였다. 본 발명자들은 mTORC1 활성이 mTORC1 활성의 확립된 마커인 리보좀 단백질 S6 (pS6)의 감소된 인산화에 의해 검출되는 바와 같이 HD 환자 및 N171-82Q 마우스로부터의 선조체 조직에서 감소됨을 밝혀내었다 (도 1A; 도 S1A, B). HD 마우스에서, mTORC1 활성은 신경학적 증상의 발병 전에 6주령에서 손상된다 (도 1B). 감소된 mTORC1 활성은 mTOR, 또는 mTOR 복합체의 성분 (예를 들어 릭터 및 랍터)의 감소된 발현과 연관되지 않는다 (도 1A, B; 도 S1A). 본 발명자들은 다음으로 선조체 뉴런을 형질도입하는 아데노-연관된 바이러스 (AAV)를 조작하여 (도 S2A) (McBride et al., 2008), mTORC1의 널리 확립된 양성 조절제인 Rheb를 발현시켰다 (Laplante and Sabatini, 2012). 이 방식으로, 본 발명자들은 생체내에서 mTORC1 활성화를 정확하게 향상시킬 수 있다. 본 발명자들은 이전에 마우스 뇌에서 mTORC1 신호전달을 활성화시키는 것으로 나타난 (Kim et al., 2012; Zou et al., 2011) 구성적 활성 Rheb 돌연변이체 (caRheb; S16H)를 사용하였다. N171-82Q 마우스 선조체 내로의 AAV.caRheb의 편측 주사는 주사후 3주에 증가된 pS6에 의해 지시되는 바와 같이 mTORC1 활성을 현저하게 유도하였다 (도 2A). 중간 가시 뉴런 (MSN)에서의 도파민 신호전달의 근본적인 성분인 DARPP-32 수준의 선택적 감소는 HD 마우스 및 인간 뇌에서 병리학적 진행의 지표이다 (Bibb et al., 2000; Hodges et al., 2006). AAV.caRheb 형질도입은 반대측 비주사된 조직에 비해 N171-82Q 마우스 선조체에서 DARPP-32 수준의 33％ 증가를 촉진시켰다 (도 2A). 더욱이, AAV.caRheb는 증가되는 경우 HD 모델에서 미토콘드리아 기능 및 운동신경 결핍을 개선시키는 미토콘드리아 생물발생의 주요 조절제인 (Cui et al., 2006; Tsunemi et al., 2012) 미토콘드리아-전사 조절제, 즉, PPARγ 공동활성화제 1α (PGC1-α)의 발현을 상향조절하였다 (도 2B). 증가된 미토콘드리아 활성과 일치하게, 반응성 산소 종 해독 (ROS) 유전자인 SOD2, cyt-c, 및 ANT1의 수준은 또한 AAV.caRheb 처리된 뇌에서 증가되었다 (도 2C 내지 F). HD 모델 유기체에서 최근 확인된 신경보호적 항산화 효소인 글루타티온 페록시다제 (Mason et al., 2013)는 caRheb 형질도입 후 HD 뇌에서 선택적으로 증가하였다 (도 2G). 개선된 프로파일은 바이러스 주사 또는 mHTT 트랜스진의 하향조절의 간접적 효과에 의해 설명될 수 없었으며; AAV.caRheb 주사된 뇌를 AAV.eGFP 처리된 뇌와 비교한 경우 유사한 결과가 얻어졌으며, caRheb는 mHTT 트랜스진 발현에 영향을 미치지 않았다 (도 S2B 내지 H). 본 발명자들은 다음으로 시험관내 연구를 수행하였으며, 확장된 (Q111) 및 정상 (Q7) Htt를 발현하는 선조체 세포 (Trettel et al., 2000)를 mTOR의 ATP-경쟁적 억제제인 토린1로 처리하였다. 토린1은 라파마이신에 의한 억제에 저항성인 것들을 비롯한 TOR 기능을 강력하게 억제한다 (Thoreen et al., 2009). 토린1 처리는 Q7 및 Q111 세포에서 pS6 및 p-4E-BP1 수준 뿐만 아니라 DARPP-32 발현을 감소시켰다 (도 S3A). 토린1은 또한 PGC1-α, PGC1-α-조절된 유전자 cAMP 반응 요소-결합 단백질 (CREB), 및 조절된 CREB 1의 형질유도제 (TORC1)를 억제시켰다 (도 S3A, B). 함께, 본 발명자들의 시험관내 및 생체내 결과는 mTORC1이 WT 및 돌연변이체 HTT 대립유전자의 환경에서 PGC1-α 및 PGC1-α 조절된 대사적 유전자를 조절함을 지시한다.
mTORC1은 HD 뇌에서 지방형성 유전자 발현을 제어한다
본 발명자들은 다음으로 손상된 mTORC1 활성이 다른 HD-특이적 대사적 경로 변경의 기저를 이루는지 여부를 측정하였다. 이상 콜레스테롤 생합성은 HD 마우스 및 인간 뇌에서 관찰되었다 (Karasinska and Hayden, 2011; Valenza and Cattaneo, 2011). 지질 생합성에 요구되는 유전자의 발현은 스테롤 조절 요소-결합 단백질 (SREBP)의 핵 전사촉진에 의해 제어된다. mHTT는 세포 및 HD 마우스에서 SREBP의 핵 전위를 억제하는 것으로 보고되었으며, 이는 기능이상적 콜레스테롤 합성에 기여할 수 있다 (Valenza et al., 2005). mTORC1은 또한 SREBP 전사촉진을 조절한다 (Peterson et al., 2011; Porstmann et al., 2008). mTORC1 활성을 감소시키는 것이 HD의 환경에서 콜레스테롤 합성을 변경시키는 지를 측정하기 위해, 본 발명자들은 토린1을 배양된 Q7 또는 Q111 선조체 세포에 적용하였다. 토린1은 돌연변이체 및 정상 세포주 둘 다에서 SREBP 표적 유전자 HMG-CoA 리덕타제 (HMGCR), 즉, 콜레스테롤 합성에서의 속도-제한 효소 및 HMGCS1의 발현을 감소시켰다 (도 3A, B).
N171-82Q 마우스에서, HMGCR은 HD 환자 뇌에서 발견된 것과 유사하게 (Hodges et al., 2006), 대조군에 비해 상당히 감소된다 (도 3C). AAV.caRheb는 HMGCR 수준을 정상화하였으며, 또한 스테롤 생합성에 요구되는 효소: HMG-CoA 신타제 1 (HMGCS1), 라노스테롤 14α-데메틸라제 (CYP51), 및 7-데히드로콜레스테롤 리덕타제 (DHCR7)의 발현을 증가시켰다 (도 3C 내지 F; 도 S3 C 내지 F). 본 발명자들의 시험관내 발견과 유사하게, 선조체 지방형성 유전자 발현의 mTOR의 조절은, AAV.caRheb가 또한 WT 선조체에서 이들 유전자의 발현을 또한 증가시켰기 때문에, HTT에서의 폴리글루타민 확장의 상태에 독립적이다 (도 3C 내지 3F). HMGCR 유전자 발현의 감소는 N171-82Q 마우스 (프리온 프로모터로부터 발현된 프로모터)에서 온건하지만, HMGCR, HMGCS1, DHCR7, 및 CYP51의 감소된 발현은 HD 인간 및 다른 마우스 모델에서 관찰된다 (Hodges et al., 2006; Valenza et al., 2005). 함께, 본 발명자들의 결과는 mTORC1이 선조체에서 지방형성 유전자 발현을 촉진시킴을 지시하며, 손상된 mTORC1 활성이 HD에서 감소된 지방형성 유전자 발현에 기여할 수 있음을 시사한다.
mTORC1은 mHTT 청소에 관련된 경로를 향상시킨다
mTORC1 활성은 일반적으로 자가포식 유도의 길항화와 연관되지만, 자가포식은 mTORC1 의존적 및 독립적 경로를 통해 일어날 수 있다. HD와 관련하여, 기저 자가포식 활성은 뉴런 생존을 유지하고, 응집체 청소를 촉진시키는 데 중요하다 (Jeong et al., 2009; Ravikumar et al., 2004; Yamamoto et al., 2006). 따라서, 본 발명자들은 다음으로 AAV.caRheb 처리된 HD 마우스 선조체에서의 자가포식에 대한 mTORC1 활성화의 효과를 조사하였다. 본 발명자들은 WT 마우스에 비해 N171-82Q 마우스에서 자가포식소체-막-회합된 단백질인 LC3-II의 증가된 기저 수준을 밝혀내었다 (도 S4). AAV.caRheb 처리는 LC3-II (도 4A) 및 베클린-1, 즉, 자가포식 유도에 필요한 단백질 (도 4B)의 수준을 증가시켰다. 향상된 자가포식과 자가포식소체 성숙의 손상 사이를 구별하기 위해, 전자 현미경검사 (EM)를 사용하여 하나의 반구에서 AAV.caRheb 또는 다른 반구에서 AAV.eGFP로 처리된 마우스의 뇌에서 자가포식소체 및 자가용해소체의 상대적 수를 정량화하였다. 자가포식소체/자가용해소체 비는 반구 사이에서 유사한 반면, 자가포식소체 및 자가용해소체 둘 다는 대조군 처리된 반대측 측면에 비해 AAV.caRheb 처리로 증가되었으며 (도 4C), 이는 자가포식이 생체내에서 증가된 mTORC1 활성의 환경에서 활성화됨을 시사한다. 본 발명자들은 또한 대조군 처리된 (AAV.eGFP) N171-82Q 마우스 뇌가 인 스트레스에 의해 유도된 선조체 병리학과 유사한 표현형인 (Kreiner et al., 2013) 전자-밀집 내형질 과립 덩어리 및 세포질 세포소기관이 고갈되었음을 주목하였다 (도 4D). 반대로, AAV.caRheb 처리된 반구에서의 세포는 풍부화된 전자-밀집 세포질 세포소기관을 나타내었다.
최근의 연구는 mHTT의 자가포식/프로테아좀 퇴행이 번역후 변형 (PTM)을 통해 일어남을 시사한다 (Jeong et al., 2009; Jia et al., 2012; O'Rourke et al., 2013; Thompson et al., 2009). 예를 들어, SUMO E3 리가제 PIAS1은 세포 모델에서 mHTT에의 SUMO2 접합을 촉진시킴으로써 mHTT 응집체 형성을 증가시키며, mHTT 단백질을 발현하는 드로소필라 (Drosophila)에서의 PIAS1 오르토로그를 감소시키는 것은 보호적이다 (O'Rourke et al., 2013). 본 발명자들은 SUMO2 수준이 14-주령 N171-82Q 마우스 선조체에서 상승되었으며, AAV.caRheb가 N171-82Q 마우스 및 WT 대조군 한배새끼 둘 다에서 PIAS1 및 SUMO2 발현을 억제하였음을 밝혀내었다 (도 5A, B). 본 발명자들은 또한 mHTT 퇴행을 유도하며 프로테아좀 및 리소좀에 의한 청소에 대해 mHTT를 표적화하는 키나제인 IκB 키나제 (IKK)를 조사하였다 (Thompson et al., 2009). 내인성 IKK 관련된 유전자 (Ikbkb, Ikbkap, 및 Ikbke)는 N171-82Q 마우스 선조체에서 감소되었으며, AAV.caRheb는 그들의 발현을 복구시켰다 (도 5C 내지 E). 추가적으로, HDAC4는 mHTT 응집체 형성의 중요한 조절제이며, HDAC4의 감소는 세포질 응집체를 감소시키고, 뉴런 기능을 개선시키고, HD 마우스의 수명을 연장시킨다 (Mielcarek et al., 2013). 여기서, 본 발명자들은 AAV.caRheb 형질도입이 N171-82Q 마우스 선조체에서 HDAC4 발현을 감소시켰음을 밝혀내었다 (도 5F). HTT 단편-함유 응집체는 선조체에서 소수이며 비일관적이지만, N171-82Q 마우스에서의 해마에서는 왕성하다. 따라서, 본 발명자들은 해마에서 응집체 부하를 시험하였다. mHTT 청소에 관여하는 유전자에 대한 AAV.caRheb의 관찰된 효과와 일치하게, AAV는 해마 뉴런을 유효하게 형질도입하며 (도 S5), AAV.caRheb 주사된 동물은 AAV.eGFP 주사된 마우스에 비해 유의하게 감소된 mHTT 응집체 로드를 나타내었다 (도 5G).
향상된 mTORC1 활성은 HD 마우스에서 선조체 위축을 구제하며, 운동신경 표현형을 개선시킨다
N171-82Q 마우스는 보존된 MSN 수를 갖는 현저한 선조체 위축을 나타낸다 (Cheng et al., 2011; Schilling et al., 1999). mTORC1 활성이 어떻게 질환에 걸린 뇌에서 선조체 부피에 영향을 미치는 지를 조사하기 위해, 본 발명자들은 측정가능한 선조체 위축이 있는 연령인 11-주령 N171-82Q 마우스의 선조체 내로의 편측 AAV.caRheb 주사를 수행하였으며 (Cheng et al., 2011), 처리된 반구를 비처리된 측면과 비교하였다. AAV.caRheb는 비처리된 반대측 반구에 비해 MSN 세포 크기 및 선조체 부피에 긍정적으로 영향을 미쳤다 (도 6A 내지 C). caRheb가 mTORC1을 통해 작용하는 지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 공지된 mTORC1 억제제인 RAD001을 투여하였다 (Fox et al., 2010). RAD001 처리는 caRheb의 형태학적 효과를 반전시켰으며, S6 인산화를 약화시켰다 (도 6A 내지 6C; 도 S6A, B). 추가적으로, 본 발명자들은 caRheb의 부재 하에서의 2주의 RAD001 처리가 N171-82Q 마우스에서의 MSN 위축의 온건하지만 유의한 악화를 유발하였음을 밝혀내었다 (도 6A, B). 이들 결과는 AAV.caRheb가 mTORC1 경로를 통해 MSN 성장을 촉진시키거나 MSN 크기를 보존하며, 생체내에서 mTORC1을 손상시키는 것은 이 표현형을 악화시킴을 시사한다.
손상된 선조체 도파민 회로는 HD 마우스에서의 운동신경 증상과 연관된다 (Bibb et al., 2000; Johnson et al., 2006). 따라서, 도파민 경로에 대한 AAV.caRheb의 기능적 영향을 측정하기 위해, 본 발명자들은 N171-82Q 마우스에게 편측으로 주사하였으며, 이들을 암페타민 유도된 회전 시험으로 처리하였다. 암페타민은 하나의 반구 대 다른 반구에서 불균형화된 도파민 신호전달이 있을 경우, 마우스에서 도파민 방출을 촉발시키며, 회전 행동을 유도한다. 이를 위해, 본 발명자들은 mHTT를 발현하는 AAV (AAV.mHTT)를 6-주령 WT 마우스 내로 AAV.caRheb 또는 대조군 바이러스 (AAV.eGFP) 중 어느 하나와 공동-주사하였다. AAV.mHTT/AAV.eGFP의 편측 주사는 mHTT 독성의 지시인 주사된 측면을 향한 동측 회전을 유발하였다 (도 6D). 대조적으로, AAV.mHTT와 AAV.caRheb의 공동-주사는 동측 회전을 유도하지 않은 대신, 마우스는 반대측 회전을 나타내었다 (도 6D). 행동 결과와 일치하게, AAV.mHTT/eGFP의 주사는 비처리된 반대측 선조체에 비해 MSN 위축을 유발한 반면, AAV.mHTT와 AAV.caRheb의 공동-주사는 MSN 위축을 방지하였다 (도 6E). 따라서, mTORC1 활성을 향상시키는 것은 mHTT-유도된 뉴런 위축 및 도파민 경로 손상에 유익이 된다.
Rhes, 즉, 선조체-풍부화된 mTOR 활성화제의 외인성 첨가는 HD 트랜스제닉 마우스에서 mHTT-연관된 질환 표현형을 구제한다
선조체에서, mTOR은 대부분 선조체-풍부화된 GTP아제 단백질인 Rhes에 의해 조절된다 (Subramaniam et al., 2012). 이전 시험관내 연구는 HD에서의 Rhes의 독성 역할을 암시하지만 (Subramaniam et al., 2009), 생체내에서의 그의 질환 관련성은 불명확하다. 본 발명자들은 Rhes 수준이 HD 인간 및 마우스 선조체에서 감소되었음을 밝혀내었다 (도 7A 및 S7A). Rheb 수준은 감소되지 않는다 (도 S7B). 특히, Rhes는 신경학적 증상의 발병 전에 상당히 감소되며; 6-주령 N171-82Q 마우스는 비록 12 내지 14주령까지 임상적 증상이 명확하지 않더라도 야생형 Rhes 수준의 73％를 갖는다 (도 7A 및 S7C). 따라서, 본 발명자들은 Rhes 수준을 향상시키는 것이 어떻게 질환 표현형에 영향을 미치는 지를 조사하였다. mHTT의 N-말단 단편은 이전에 시험관내에서 Rhes와 상호작용하며 세포독성을 부여하는 것으로 나타났기 때문에, N171-82Q 모델은 생체내에서 이 질문을 시험하기에 이상적이다 (Subramaniam et al., 2009). Rhes가 HD 독성의 중요한 매개자인 경우, N171-82Q 마우스 선조체에서의 Rhes의 급성 과발현은 질환 표현형을 악화시킬 것으로 예상될 것이다. Rhes를 발현하는 AAV (AAV.Rhes)를 7-주령 N171-82Q 마우스 및 WT 한배새끼 내로 주사하였다. 보다 초기 시험관내 연구로부터 예상되었던 것과 대조적으로, 그러나 Rheb에 의한 mTORC1 활성화에 대한 본 발명자들의 발견과 일치하게, Rhes 과발현은 14 및 18주령에서 로타로드 시험에 의해 측정된 바와 같이 염수-처리된, 질환 한배새끼에 비해 N171-82Q 마우스에서 운동신경 기능을 개선시켰다 (도 7B). 또한, 편측 주사 후, AAV.Rhes는 대조군-처리된 반대측 반구에 비해 MSN 세포 크기를 상당히 증가시켰다 (도 7C). Rheb와 유사하게, AAV.Rhes는 미토콘드리아 전사 조절제인 PGC1-α의 발현을 상향조절하였다 (도 7D).
세포 기재 검정에서, Rhes는 mHTT의 SUMO화를 촉진시킴으로써 mHTT 독성을 향상시킨다 (Subramaniam et al., 2009). 생체내에서 Rhes의 관찰된 질환 변형 효과가 mTORC1 또는 SUMO화 경로를 통한 것인 지를 확인하기 위해, 본 발명자들은 제거된 GTP아제 활성 및 감소된 mTORC1 활성화, 그러나 무손상 SUMO화 조정 활성을 갖는 Rhes 돌연변이체인 RhesS33N을 발현하는 AAV (AAV.RhesS33N)를 생성하였다 (Subramaniam et al., 2012; Subramaniam et al., 2009). 선조체 주사 후, AAV.RhesS33N-처리된 N171-82Q 마우스는 AAV.Rhes로 주사된 N171-82Q 마우스에 비해 감소된 mTORC1 활성을 나타내었다 (도 S8). AAV.RhesS33N은 N171-82Q 마우스에서 운동신경 결핍을 변형시키는 데 실패하였으며, 이는 대조군 처리된 N171-82Q 마우스와 유사하게 수행하였다 (도 7B). 특히, Rhes S33N은, 이전 시험관내 관찰 (Subramaniam et al., 2009)에 기초하여 예측할 것인 바와 같이, 추가의 행동 악화를 유발하지 않는다. 집합적으로, 이들 데이터는 Rhes가 mTORC1 활성화를 통해 부분적으로 HD 행동 결핍을 구제함을 시사한다.
논의
점증적으로, 본 발명자들은 손상된 mTORC1 활성이 HD와 연관된 다양한 표현형적 변화의 상류이며, 대사적 및 퇴행성 표현형의 기저를 이룰 수 있음을 보인다. 본 발명자들은 mTORC1 활성화가 HD 마우스에서 에너지 대사, 자가포식, 및 선조체 세포 기능을 촉진시켰음을 밝힌다. mTORC1의 신경보호적 역할과 일치하게, 본 발명자들은 Rhes, 즉, 선조체-풍부화된 mTOR 활성화제가 신경학적 증상의 발병 전에 HD 뇌에서 감소되며, 외인성 Rhes 첨가가 HD 마우스에서 운동신경 결핍 및 뇌 병리현상을 경감시킴을 밝힌다. 특히, 증상적 HD 마우스에서 선조체 세포 성장 및 기능을 촉진시키는 능력은 mHTT-적재 뉴런에서 형성력이 있다는 개념을 뒷받침하며 (Yamamoto et al., 2000), mTORC1 활성화를 통해 질환 발병 후의 선조체 위축을 반전시킬 가능성을 강조한다. mHTT는 Rhes (Subramaniam et al., 2009) 및 mTOR (Ravikumar et al., 2004)에 결합하는 증가된 경향을 갖기 때문에, mHTT에 의한 Rhes 및 mTOR 기능의 수반 소실은 선조체를 HD에서 초기 퇴행에 보다 취약하게 만들 수 있음이 가능하다 (도 8). 선조체 부피가 HD 환자에서 질환 진행의 강한 예측자임을 고려하면 (Tabrizi et al., 2013), 선조체 mTORC1 활성을 정상 수준으로 복구시키는 요법은 질환을 경감시킬 수 있다. mHTT가 에너지 생성을 방해하는 핵심적 질환 메커니즘은 그의 발현이 인간 미상체 및 HD 트랜스제닉 마우스 선조체에서 감소되는 PGC-1α 활성의 억제이다 (Cui et al., 2006; Hodges et al., 2006; Tsunemi et al., 2012). 감소된 PGC-1α 수준은 또한, PGC-1α KO 마우스에서의 도파민작용성 뉴런이 MPTP 매개된 산화적 손상에 취약하기 때문에, HD 뇌를 산화적 스트레스에 대해 감작화시킬 수 있다 (St-Pierre et al., 2006). 뇌 PGC-1α 발현을 복구시키는 것은 R6/2 HD 마우스에서의 선조체 위축을 개선시키며 (Cui et al., 2006), N171-82Q 및 R6/2 HD 마우스 모델에서 운동신경 표현형을 개선시킨다 (Cui et al., 2006; Tsunemi and La Spada, 2011). mTOR이 HD 마우스 뇌에서 PGC-1α 활성의 양성 조절제라는 본 발명자들의 발견은 PGC-1α 활성을 향상시키는 것, 및 PGC-1α 활성이 그에 의해 손상될 수 있는 잠재적인 메커니즘에 대한 치료 표적을 제공한다.
언뜻 보기에, 이들 데이터는 mTORC1 억제가 보호적임을 지시하는 HD 분야의 통상적인 관점에 상충하는 것으로 보일 수 있다 (Ravikumar et al., 2004; Roscic et al., 2011). 라파마이신의 전신적 전달에 의한 mTORC1의 억제는 드로소필라 및 N171-82Q HD 마우스에서 질환 표현형을 약화시킨다 (Ravikumar et al., 2004). 그러나, 라파마이신에 의해 유도된 행동 개선은 뇌에서의 mTORC1 억제라기 보다는, 골격 근육에 대한 유익한 효과를 반영할 수 있음이 가능하다. 이와 관련하여, 라파마이신으로 처리된 R6/2 HD 마우스에서, 로타로드 개선은 일시적이며, 가속화된 체중 감소 및 향상된 뇌 위축과 연관된다 (Fox et al., 2010). 흥미롭게도, mTORC1 활성은 R6/2 마우스 골격 근육에서 비정상적으로 상승된다 (She et al., 2011). 본 발명자들의 데이터와 함께, 이들 발견은 균형화된 mTORC1 활성을 복구시키는 것이 중요하다는 개념을 뒷받침하고, mTOR 활성에 대한 mHTT의 조직 특이적 효과가 있을 수 있다는 흥미로운 점을 상승시키며; 골격 근육과는 달리, 뇌 mTORC1 활성은 HD에서 이미 손상된다.
mTORC1 향상이 신경보호적이라는 발견은 또한 HD 모델에서 치료적인 것으로 나타난 다양한 제제에 대한 역할을 뒷받침하는 보다 초기 연구에 대한 기계적 기초를 제공한다. 예를 들어, BDNF-TrkB 신호전달을 복구시키는 것은 몇몇 전임상 HD 모델에서 널리 확립된 신경보호적 효과를 갖는다 (Jiang et al., 2013; Simmons et al., 2013; Xie et al., 2010; Zuccato et al., 2001). 이 신호전달 캐스케이드의 생리학적 결과는 mTORC1 활성화이다 (Troca-Marin et al., 2011; Zhou et al., 2010). 더욱이, RNAi 스크린은 Lkb-1을 세포 및 드로소필라 HD 모델에서 강력한 질환 변형제로서 확인하였다 (Schulte et al., 2011). Lkb-1은 mTORC1을 음성적으로 조절하는 종양 서프레서이다 (Shaw et al., 2004). Lkb-1을 억제하는 것은 1차 뉴런에서 mHTT-유도된 이형 신경돌기 성장을 개선시켰으며, mHTT 대립유전자를 발현하는 드로소필라에서 치사성 및 신경퇴행성 표현형을 구제하였다 (Schulte et al., 2011). 함께, 이들 결과는 mTORC1 활성을 재-균형화하는 것이 HD에서 유익하다는 본 발명자들의 관점과 일치한다.
자가포식은 세포 항상성 및 단백질 청소에 필수적이다 (Wong and Cuervo, 2010). 본 발명자들은 mTORC1 활성화가 HD 마우스 뇌에서 자가포식 활성을 자극하며, mHTT 퇴행을 촉진시키는 데 관련된 유전자 (PIAS1, SUMO2, IKK, 및 HDAC4)의 발현을 변경시킴을 밝힌다. 이들 결과는, mTORC1이 일반적으로 자가포식에 대해 억제성인 것으로 간주되기 때문에 놀라울 수 있다. 그러나, 최근의 증거는 자가포식이 mTOR 자극된 조건 하에서 (Narita et al., 2011), 및 연장된 기아 조건 하에서 일어날 수 있으며, mTOR의 재활성화는 지속된 자가포식에 요구되는 리소좀의 형성을 촉진시킴을 입증한다 (Yu et al., 2010). 본 발명자들은 향상된 기저 또는 품질 제어 자가포식이 세포 성장 및 대사적 활성에 필요한 반응이며, 기아-유도된 자가포식과는 달리, mTORC1 활성화와 일치한다고 의심한다. mTORC1이 자가포식을 유도하는 정확한 메커니즘은 불명확하지만, 본 발명자들은 mTORC1 향상이 자가포식 소포 핵형성에 관여하는 필수적 성분인 베클린1 수준을 증가시켰음을 밝혀내었다. 흥미롭게도, 베클린 1의 과발현은 mHTT 응집체의 자가포식 청소를 유도한다 (Shoji-Kawata et al., 2013). 추가적으로, 본 발명자들은 mTORC1이 IKK, 즉, mHTT 퇴행을 촉진시키는 공지된 자가포식 유도제 (Thompson et al., 2009)의 발현을 상향조절함을 밝힌다. 또한, 이후 mTORC1을 활성화시키는 IGF1/Akt 신호전달의 자극은 mHTT 인산화를 유도하며, mHTT 퇴행을 표적화한다 (Humbert et al., 2002; Yamamoto et al., 2006). 점증적으로, 데이터는 mHTT 퇴행에 대한 다양한 메커니즘이 상호관련되며, mTORC1 활성에 의해 제어됨을 나타낸다.
선조체-풍부화된 단백질인 Rhes는 mHTT의 SUMO화를 촉진시킴으로써 선조체 퇴행을 유발하는 것으로 제안되어 있으며; SUMO1의 siRNA 넉다운은 시험관내에서 Rhes 매개된 세포독성을 제거한다 (Subramaniam et al., 2009). Rhes의 잠재적인 독성 역할과는 대조적으로, 본 발명자들은 Rhes 첨가가 HD 마우스에서 신경병리학적 및 운동신경 표현형을 개선시키며, Rhes의 이 신경보호적 특성은 그의 GTP아제 활성을 요구함을 밝힌다. 이는 Rhes의 GTP아제 활성이 mHTT-매개된 세포독성과는 관여되지 않는 시험관내 조건과는 대조적이다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 생체내에서 Rhes 수준을 감소시키는 것이 HD 마우스 선조체에서 SUMO1의 보상적 상향-조절을 유발함을 밝힌다 (데이터는 나타내지 않음). 이는 SUMO1 및 SUMO2 변형된 단백질이 HD 사후 인간 뇌에서 축적된다는 관찰과 일치한다 (O'Rourke et al., 2013). 추가적으로, GTP아제 결핍성, 그러나 SUMO화 무손상 Rhes 돌연변이체를 과발현시키는 것은, 이전 시험관내 결과 (Subramaniam et al., 2009)에 기초하여 예측할 것인 바와 같이, N171-82Q 마우스에서 운동신경 표현형을 악화시키지 않으며, 이는 MSN 독성의 생체내 조정자가 단리된 배양 시스템에서의 것과는 별개임을 암시한다.
Rhes의 세포보호적 역할과 일치하게, 본 발명자들은 최근 Rhes의 siRNA 넉-다운이 트랜스제닉 HD 마우스에서 선조체 위축 및 행동 표현형을 악화시킴을 보고하였다 (Lee et al., 2014). 한편, 다른 연구는 Rhes KO 마우스를 R6/1 마우스와 교배시키는 것이 로타로드 결핍을 지연시켰음을 보였다 (Baiamonte et al., 2013). 그러나, Rhes의 유전적 결실은 R6/1 마우스에서 선조체 위축을 방지하지 않으며; Rhes KO 마우스는 HD 마우스와 유사한 중증 뇌 퇴행을 입증한다 (Baiamonte et al., 2013). 또한, Rhes 수준은 HD 환자 및 HD 마우스 모델 선조체에서 감소되며, 증상적 HD 환자는 질환에 걸리지 않은 개체에 비해 선조체 Rhes의 현저한 83％ 감소를 나타낸다 (도 7A). Rhes는 최근 자가포식을 촉진시키며 (Mealer et al., 2014), 세포내 철 항상성을 조절하는 (Choi et al., 2013) 것으로 나타났다. 따라서, Rhes를 감소시키는 것 보다는 복구시키는 것이 HD 뇌에서 유익할 수 있다.
mTORC1 활성을 정상화하는 것이 HD 표현형을 개선시킨다는 발견은 탈조절된 mTOR 활성을 갖는 신경학적 질환에 대한 폭넓은 치료 영향을 가질 수 있다. 예를 들어, 신경발달 장애, 예컨대 취약 X 정신 지체 및 자폐증은 일반적으로 과다활성 mTORC1 활성과 연관되며; 이들 상태에서 mTORC1을 억제하는 것은 질환 표현형을 개선시킨다 (Bhattacharya et al., 2012; Tsai et al., 2012). 대조적으로, 뉴런 mTORC1 활성이 감소된 근위축 측삭 경화증 (ALS)의 경우, mTORC1의 자극은 퇴행성 프로세스에 반대작용한다 (Saxena et al., 2013). 따라서, mTORC1 기능의 항상성 수준을 복구시키는 것은 신경학적 질환에 폭넓게 유익할 수 있다.
요약하면, 본 발명자들의 연구는 mTORC1 경로에 집중되는 HD에서의 복합 병리학적 표현형의 상호-연관성으로의 새로운 통찰을 제공한다. 그리고, 다른 신경퇴행성 질환 분야에서의 이전 연구와 함께, mTORC1 활성화의 정도가 치료 유용성을 위해 주의깊게 제어되어야 한다는 관찰을 강조한다. 뇌에서 mHTT의 발현을 감소시키는 것은 HD의 환경에서 mTORC1 활성을 구제하는 직접적인 방식이 될 것인 반면, mTORC1 활성의 재균형은 치료 유익이 될 수 있다.
실험 절차
동물. 모든 동물 프로토콜은 유니버시티 오브 아이오와 동물 보호 및 사용 위원회 (University of Iowa Animal Care and Use Committee)에 의해 승인되었다. N171-82Q 마우스는 잭슨 래버러토리즈 (Jackson Laboratories) (미국 메인주 바 하버)로부터 얻었으며, B6C3F1/J 배경 상에서 유지하였다. 마우스를 돌연변이체 인간 HTT 트랜스진에 대해 특이적인 프라이머를 사용하여 유전자형분석하고, 반접합성 및 연령-매칭된 야생형 한배새끼를 지시된 실험에 사용하였다. 마우스를 제어된 온도 환경에서 12-시간 명/암 주기 상에서 하우징하였다. 먹이 및 물을 무제한으로 제공하였다. 약리학적 연구를 위해, RAD001을 LC 래버러토리즈 (LC Laboratories)로부터 얻고, 2％ DMSO에 2 mg/ml로 희석하고, -20℃에서 저장하였다. 신선하게 해동된 비히클 및 RAD001 (30 μmol/kg)을 이전에 기재된 바와 같이 (Fox et al., 2010) 위관영양에 의해 2주 동안 주 당 3회 (월요일, 수요일 및 금요일) 주었다. 마우스를 마지막 용량 24시간 후에 희생시켰다.
플라스미드 및 AAV
AAV 벡터 혈청형 1 (AAV2/1)을 이 연구에 사용하였다. Rhes 및 Rheb cDNA 서열을 마우스 선조체 cDNA 라이브러리로부터 증폭시켰다. 플래그 에피토프를 웨스턴 블롯 검출용 PCR에 의해 3'-말단에 혼입시켰다. GTP아제 불활성 Rhes 돌연변이체 (RhesS33N) 및 과다활성 Rheb 돌연변이체 (caRheb;S16H)를 퀵체인지 (QuikChange) 부위-지정 돌연변이유발 (애질런트 테크놀로지 (Agilent Technology))에 의해 생성하였다. 돌연변이유발용 프라이머를 퀵체인지 프라이머 설계 프로그램 (QuikChange Primer Design Program) (http://www.stratagene.com)에 기초하여 설계하였다. Rhes, RhesS33N, 및 caRheb 서열을 닭 β-액틴 프로모터의 제어 하에서 AAV 발현 벡터 내로 클로닝하였다. AAV.Rhes 및 AAV.RhesS33N 벡터는 또한 IRES 서열의 제어 하에서 향상된 GFP (eGFP)를 발현한다. 또한, N-말단 myc-태그부착된 N171-82Q 서열을 pCMVHD- N171-82Q 플라스미드로부터 PCR 증폭시키고 (Harper et al., 2005), 동일한 AAV 발현 벡터 내로 클로닝하여 AAV.mHTT를 생성하였다. 모든 AAV는 유니버시티 오브 아이오와 벡터 코어 (University of Iowa Vector Core)에 의해 생성하였다. AAV 역가를 RT-PCR에 의해 측정하였다 (Rhes: 3 × 1012 바이러스 게놈/ml, RhesS33N: 3 × 1012 바이러스 게놈/ml, caRheb: 3 × 1012 바이러스 게놈/ml, eGFP: 3 × 1012 바이러스 게놈/ml, 및 mHTT (N171-82Q): 3 × 1012 바이러스 게놈/ml).
주사
선조체에 사용된 정위적 좌표는 정수리점에 대해 0.86 mm 입쪽, 중간선에 대해 ±1.8 mm 측면, 두개골 표면에 대해 3.5 mm 복측이다. N171-82Q 마우스 및 WT 한배새끼를 7주령에 AAV.Rhes, AAV.RhesS33N, 또는 염수로 주사하였다. 모든 행동 연구를 위해, 마우스를 5-μl의 AAV로 양측으로 주사하였다. 편측 주사 연구를 위해, AAV의 5-μl 주사를 사용하였다. 해마에 사용된 정위적 좌표는 정수리점에 비해 AP:-2.0 mm, ML:+ 1.5 mm, DV:-2.3 mm이며; 마우스를 1-ul의 AAV로 편측으로 주사하였다. WT 마우스에서 암페타민 유도된 회전 시험을 위해, 3 μl AAV.mHTT를 선조체 내로 2 μl AAV.caRheb 또는 2 μl AAV.eGFP 중 어느 하나로 공동-주사하였다. 모든 연구에 대한 주사 속도는 0.2 μl/분이었다. 마우스를 표준 승인된 방법 (Harper et al., 2005; McBride et al., 2008)을 사용하여 지시된 연령에서 희생시켰다.
세포 배양 및 형질감염
전장 HTT를 갖는 돌연변이체 (Q111) 및 WT (Q7) 선조체 세포 (Trettel et al., 2000)는 마시 맥도날드 (Marcy MacDonald) 박사에 의해 친절하게 제공되었다. Q7 및 Q111 세포를 37℃에서 10％ 소 태아 혈청, 1％ 비-필수 아미노산, 2 mM L-글루타민, 및 400 μg/ml G418 (제네티신 (Geneticin); 인비트로젠 (Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스버드)로 보충된 둘베코 변형 이글 배지 (DMEM; 시그마 케미컬 코포레이션 (Sigma Chemical Co), 미국 미주리주 세인트 루이스)에서 성장시켰다. mTOR-억제 연구를 위해, 세포를 DMSO 또는 250 nM 토린1 (토크리스 (Tocris), 브리스톨 (Bristol), 영국)로 24시간 동안 처리하였다.
마우스 뇌 단리
조직학적 분석에 사용된 마우스를 케타민/크실라진 믹스로 마취시키고, 0.9％ 차가운 염수 20 ml, 그 후 0.1 M PO4 완충제 중 4％ 파라포름알데히드 20 ml로 경심장으로 관류하였다. 뇌를 꺼내고, 밤새 후고정하고, 40-μm 두께 섹션을 수집하였다. 분자 분석에 사용된 마우스를 0.9％ 차가운 염수 20 ml로 관류하고, 뇌를 꺼내고, 1-mm-두께 관상절편 내로 블로킹하였다. 선조체의 조직 펀치를 조직 코어러 (직경 1.4 mm)를 사용하여 취하였다. 조직 펀치를 액체 질소에서 플래쉬 동결하고, 사용할 때까지 -80℃에서 저장하였다.
면역조직화학 및 정량
부유하는, 40-μm 관상 뇌 섹션을 비오틴-표지된 항체를 사용하여 중간 가시 뉴런 또는 mHTT 응집체의 면역조직화학적 염색을 위해 프로세싱하였다. 섹션을 5％ 정상 염소 혈청에서 1시간 동안 블로킹한 후, 1차 항체 (DARPP-32, 1:200, 셀 시그널링 (Cell Signaling))로 밤새 인큐베이션하고, 세척하였다. mHTT 응집체를 em48 항체 (1:200, mEM48; 에모리 유니버시티 스쿨 오브 메디신 (Emory University School of Medicine), 엑스. 제이. 리 (X. J. Li)로부터 기증)로 면역염색하였다. S6 인산화를 포스포-S6 항체 (S235/236, 1:300, 셀 시그널링)로 검출하였다. 섹션을 염소 항-토끼 또는 염소 항-마우스 비오티닐화 IgG 2차 항체 (1:200; 벡터 래버러토리즈 (Vector laboratories))에서 실온에서 1시간 동안 인큐베이션한 후, 아비딘-비오티닐화 서양고추냉이 페록시다제 복합체 (ABC; 벡터 랩스 (Vector Labs))로 처리하였다. 모든 절차에서, 1차 항체의 결실은 대조군으로서 기능하였다. 염색된 섹션을 수퍼프로스트 플러스 (Superfrost Plus) 슬라이드 (피셔 사이언티픽 (Fisher Scientific), 미국 펜실베니아주 피츠버그) 상으로 실장하였다. 화상을 올림푸스 DP 컨트롤러 (Olympus DP Controller) 소프트웨어 (올림푸스, 미국 뉴욕주 멜빌)를 갖는 올림푸스 BX60 광학 현미경 및 DP70 카메라를 사용하여 캡쳐하였다. 각각의 뇌에 대해, 4개의 대표적인 섹션을 선택하고, 70개의 DARPP-32 양성 중간 가시 뉴런 (MSN)의 면적을 각각의 반구로부터 40x 대물렌즈 하에 수동으로 추적하였다. DARPP-32 양성 MSN의 면적을 올림푸스 DP2-BSW 소프트웨어 (버전 2.1)에 의해 정량화하였다. 동측 주사된 측면의 평균 MSN 면적을 반대측 대조군 측면과 비교하고, 평균 + SEM으로서 표현하였다. EM48 양성 포함물을 처리군에 대해 맹검된 실험자에 의해 카운팅하였다.
입체학
선조체 부피를 부피의 카발리에리 (Cavalieri) 추정자를 갖는 점 카운팅 방법을 사용하여 계산하였다 (Michel and Cruz-Orive, 1988). 간략하게, DARPP-32 염색된 관상 섹션 (40 μm 두께)의 화상을 올림푸스 DP 컨트롤러 소프트웨어 (올림푸스, 미국 뉴욕주 멜빌)를 갖는 올림푸스 BX60 광학 현미경 및 DP70 카메라를 사용하여 캡쳐하였다. 격자 패턴을 갖는 아세테이트 쉬트를 화상 상에 무작위 각도로 정치하고, 선조체에 가로놓인 격자 교차점을 카운팅하였다. 480 μm 떨어진 간격으로의 일련의 섹션의 무작위 조직적 세트를 사용하였다. 최소 200개의 점을 5개의 섹션에 걸쳐 카운팅하였다. 좌측 및 우측 선조체 부피를 식 Vol (대상)= ∑P (대상)·t·a(p) (여기서, ∑P (대상)=선조체에 가로놓인 점의 합계, t=섹션 사이의 거리, 및 Ap=점 당 면적)를 사용함으로써 점 카운트로부터 동일한 섹션 상에서 독립적으로 측정하였다.
전자 현미경검사
마우스를 마취시키고, 염수 용액, 그 후 0.1M 카코딜산나트륨 완충제 (pH 7.4) 중 2.5％ 글루타르알데히드로 심장내로 관류하였다. 뇌를 꺼내고, 2.5％ 글루타르알데히드, 0.1M 카코딜산나트륨 완충제 (pH 7.4)에서 24시간 동안 후고정하였다. 100 μm 관상 섹션을 바이브라톰으로 커팅하고, 0.1M 카코딜레이트 중 1％ OsO4에서 1시간 동안 고정하고, 1％ 우라닐 아세테이트로 염색하고, 탈수시키고, 에포네이트 (Eponate) 812에 끼웠다. 세미틴 (Semithin) 1-μm 톨루이딘 블루 (Toluidine Blue) 염색된 섹션을 광학 현미경 하에서 조사하여 선조체를 확인하였다. 선조체의 극박 섹션 (80 nm)을 JEOL EX 1200 투과 전자 현미경으로 조사하였다.
웨스턴 블롯 분석
마우스 선조체를 수확하고, 프로테아제 억제제 (컴플리트 미니 (Complete Mini), 로슈 어플라이드 사이언스 (Roche Applied Science), 독일 만하임) 및 포스파타제 억제제 (포스스탑 포스파타제 억제제 칵테일 (PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail), 로슈 어플라이드 사이언스, 독일 만하임)를 갖는 50 mM 트리스 (Tris) (pH 8.0), 150 mM NaCl, 1％ NP450 세정제, 0.1％ SDS 세정제, 0.5％ 데옥시콜릭산, 및 1 mM β-머캅토에탄올을 함유하는 RIPA 완충제에서 용해시켰다. 조직을 얼음 상에서 균질화시키고, 14,000g에서 20분 동안 스핀시켰다. 상청액을 분석에 사용하였다. 단백질 농도를 BCA 검정 (피어스 (Pierce), 미국 일리노이주 락포드)에 의해 측정하고, 단백질 20 내지 30 μg을 환원시키고, 4％ 내지 10％ 아크릴아미드 겔 상에서 SDS-PAGE에 의해 분리하고, 0.2 μm 이모빌론 (Immobilon) PVDF 막 (밀리포어 (Millipore), 미국 매사추세츠주 빌레리카)으로 옮겼다. 사용된 1차 항체는 하기와 같았다: DARPP-32 (1:1000, 셀 시그널링), β-액틴 (시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich), 1:5000), S6 (1:1000, 셀 시그널링), 포스포-S6 (S235/236, 1:1000, 셀 시그널링), 4EBP1 (1:1000, 셀 시그널링), 포스포-4E-BP1 (T37/46, 1:1000, 셀 시그널링), mTOR (1:1000, 셀 시그널링), 릭터 (1:1000, 셀 시그널링), 랍터 (1:1000, 셀 시그널링), CREB (1:1000, 셀 시그널링), TORC1 (1:1000, 셀 시그널링), PGC1-α (1:1000, 앱캠 (abcam)), LC3 (1:1000, 노부스 바이올로지컬즈 (Novus Biologicals)), 및 베클린1 (1:1000, 셀 시그널링). 사용된 2차 항체는 HRP-염소 항-마우스 IgG 및 HRP-염소 항-토끼 IgG (셀 시그널링)이었다. 블롯을 ECL 플러스 웨스턴 블롯팅 검출 시스템 (ECL Plus Western Blotting Detection System) (지이 헬스케어 (GE Healthcare), 미국 펜실베니아주 피츠버그)을 사용하여 전개한 후, 필름에 노출시켰다. 단백질 정량화를 NIH 이미지 (Image)J 소프트웨어 또는 VersaDocTM 이미징 시스템 (Imaging System) (바이오래드 (Biorad)) 및 콴터티 원 (Quantity One) R 분석 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 밴드 밀도를 동일한 샘플 및 레인으로부터 하우스키핑 (β-액틴) 밴드에 대해 정규화하였다.
뇌 샘플
인간 부검 뇌 조직의 관상 섹션을 질환에 걸리지 않은 개체 및 본세틀 (Vonsattel) 등급 2, 3 및 4 HD를 갖는 환자로부터 얻었다 (크리스토퍼 로스 박사 (Dr. Christopher Ross), 존스 홉킨스 유니버시티 (Johns Hopkins University); 뉴욕 브레인 뱅크 앳 콜롬비아 유니버시티 (New York Brain Bank at Columbia University), 알츠하이머병 연구 센터 (Alzheimer Disease Research Center), 타우브 인스티튜트 (Taub Institute)). 조직을 13 내지 49시간 범위의 사후 간격 (PMI)으로 플래쉬 동결하였다. 미상핵/피각핵을 빙냉 금속 스테이지 상에 정치된 동결된 조직으로부터 절개하고, 프로테아제 억제제 (컴플리트 미니, 로슈 어플라이드 사이언스, 독일 만하임) 및 포스파타제 억제제 (포스스탑 포스파타제 억제제 칵테일, 로슈 어플라이드 사이언스, 독일 만하임)를 갖는 RIPA 완충제에서 균질화하였다. 용해물을 14,000g에서 20분 동안 스핀시켰다. 상청액을 웨스턴 블롯 분석을 위해 수집하였다. 추가의 동결된 조직을 RNA 추출을 위해 TRIzol을 사용하여 프로세싱하였다.
정량적 실시간 PCR (RT-qPCR).
RNA를 TRIzol 1 ml를 사용하여 선조체 펀치로부터 단리하였다. 무작위-프라임화된 제1-가닥 상보성 DNA (cDNA) 합성을 500 ng 총 RNA (고성능 cDNA 역전사 키트 (High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit); 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems), 미국 캘리포니아주 포스터 시티)를 제조자의 프로토콜에 따라 사용하여 수행하였다. 실시간 PCR을 서열 검출 시스템 (프리즘 (Prism) 7900HT, 어플라이드 바이오시스템즈) 상에서 SYBR 그린 PCR 믹스 (인비트로젠) 또는 택맨 (TaqMan) 2x 유니버셜 마스터 믹스 (Universal Master Mix) (어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 수행하였다. 하기 택맨 프라이머/프로브 세트를 어플라이드 바이오시스템즈로부터 얻었다: Rhes (Mm04209172_m1 및 Hs04188091_mH), PGC1-α (Mm01208835_m1), 및 HMGCS1 (Mm01304569_m1), 및 HDAC4 (Mm01299557_m1). SYBR 그린 RT PCR에 대한 프라이머 서열은 신청에 의해 이용가능하다. 상대적 유전자 발현을 β-액틴에 대해 정규화하는 ΔΔCT 방법을 사용하여 측정하였다.
행동 시험
암페타민 유도된 회전 검정
마우스를 복강내 암페타민 (3 mg/kg; 시그마)으로 주사한 후, 정사각형 플라스틱 활동 챔버 (50 x 50 cm)의 중심에 개별적으로 정치하였다. 마우스를 암페타민 유도 전에 챔버에서 20분 동안 길들였다. 그 후, 회전 행동을 천장에 실장된 비디오 카메라에 의해 40분 동안 기록하였다. 순 회전을 40분 세션에서 동측 회전의 수 - 반대측 회전의 수로서 표현하였다.
가속화 로타로드
수컷 N171-82Q 마우스를 6주령에서, 그 후 10, 14, 및 18주령에서 기준선 운동신경 기능에 대해 시험하였다. 각각의 시험 전에, 마우스를 먼저 로타로드 상에서 4분 동안 길들이고, 1시간 동안 휴식시켰다. 시험을 연속적인 4일 동안 일 당 3번의 시험 (시험 사이에 30분의 휴식)으로 수행하였다. 각각의 시험에 대해, 마우스를 4분에 걸쳐 분 당 4 내지 40회 회전으로 가속화되는 로드 상에 정치한 후, 40 rpm에서 속도 유지하였다. 떨어짐까지의 시간 (또는 마우스가 달리지 않고 2번의 연속적 회전 동안 매달려 있는 경우)을 운동신경 성능의 등급화로서 사용하였다. 시험을 300초에서 중단하고, 그 시간에 로타로드에 남아 있는 마우스를 300초로서 점수화하였다. 매일 각각의 군에 대한 3번의 시험으로부터의 데이터를 평균 ± SEM으로서 제시한다. 마우스는 항상 명/암 주기의 암 단계에서 시험하였다. 모든 행동 시험은 마우스 유전자형 및 처리에 대해 맹검인 실험자로 수행하였다.
통계적 분석
데이터를 스튜던트 t-검정 또는 일원 ANOVA 분석, 그 후 터키 사후 분석을 사용하여 분석하여 개별적 군 사이의 유의한 차이에 대해 평가하였다. 모든 통계적 분석은 그래프패드 프리즘 (GraphPad Prism) 버전 5.0c를 사용하여 수행하였다. 데이터를 평균 ± SEM으로서 나타낸다. 모든 경우, P < 0.05를 유의한 것으로 간주하였다.
참고문헌
모든 간행물, 특허 및 특허 출원은 본원에 참조로 포함된다. 상기 명세서에서 이 발명은 그의 특정 바람직한 실시양태에 관하여 설명되었으며, 많은 상세사항이 예시의 목적을 위해 제시되었지만, 본 발명은 추가의 실시양태가 허용가능하며, 본원에 설명된 특정 상세사항은 본 발명의 기본적 원리로부터 벗어나지 않고 상당히 다양화될 수 있음이 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백할 것이다.
본 발명의 설명의 맥락에서 용어 "a" 및 "an" 및 "the" 및 유사한 언급대상은 본원에서 달리 지시되거나 맥락에 의해 명백하게 반대되지 않는다면, 단수 및 복수 둘 다를 커버하는 것으로 간주되어야 한다. 용어 "포함하는" "갖는" "비롯한" 및 "함유하는"은 달리 언급되지 않는다면 개방 가능한 용어 (즉, "포함하나 이에 제한되지 않는"을 의미함)로서 간주되어야 한다. 본원에서 값의 범위의 인용은 본원에서 달리 지시되지 않는다면, 단지 범위 내에 해당하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 지칭하는 약칭 방법으로서 기능하는 것으로 의도되며, 각각의 별개의 값은 그것이 본원에 개별적으로 인용된 것처럼 본 명세서에 포함된다. 본원에 설명된 모든 방법은 본원에서 달리 지시되거나 다르게는 맥락에 의해 명백하게 상충되지 않는다면 임의의 적합한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예, 또는 예시적인 언어 (예를 들어, "예컨대")의 사용은 단지 본 발명을 보다 잘 조명하는 것으로 의도되며, 달리 청구되지 않는다면 본 발명의 범위에 대한 제한을 제기하지 않는다. 본 명세서의 어떤 언어도 임의의 비-청구된 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로서 지시하는 것으로 간주되지 않아야 한다.
본 발명의 실시하기 위해 본 발명자들에게 공지된 가장 양호한 방식을 비롯한 이 발명의 실시양태가 본원에 설명된다. 그들 실시양태의 변형은 상기 설명을 읽을 때 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 명백하게 될 수 있다. 본 발명자들은 통상의 기술자가 이러한 변형을 적절하게 채용할 것을 예상하며, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 설명된 것과는 달리 실시되는 것을 의도한다. 따라서, 이 발명은 적용가능한 법에 의해 허용되는 바와 같은 그에 첨부된 청구범위에 인용된 요지의 모든 변형 및 등가물을 포함한다. 더욱이, 그의 모든 가능한 변형에서 상기-설명된 요소의 임의의 조합은 본원에서 달리 지시되거나 다르게는 맥락에 의해 명백하게 상충되지 않는다면 본 발명에 의해 포함된다.
SEQUENCE LISTING
<110> UNIVERSITY OF IOWA RESEARCH FOUNDATION
<120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING BRAIN DISEASES
<130> 17023.164WO1
<140> PCT/US2015/068034
<141> 2015-12-30
<150> 62/098,085
<151> 2014-12-30
<160> 4
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 2092
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
ggcgtaatta aaaagcggcg gaagaaggtg ggagggtcat gacgcagcga gtttcagtcg 60
tgacttttct gggggcatcg cggcgtcccc tttttttgcc tttaaagtaa aacgtcgccc 120
cgacgcaccc cccgcgtatt tcggggggcg gaggcggcgg gccacggcgc gaagaggggc 180
ggtgctgacg ccggccggtc acgtgggcgt gttgtggggg ggaggggcgc cgccgcgcgg 240
tcggttccgg gcggttggga gcgcgcgagc tagcgagcga gaggcagccg cgcccgccgc 300
cgcccctgct ctgtatgccg ctctctcccg gcgcggccgc cgccgatcac agcagcagga 360
gccaccgccg ccgcggttga tgtggttggg ccggggctga ggaggccgcc aagatgccgc 420
agtccaagtc ccggaagatc gcgatcctgg gctaccggtc tgtggggaaa tcctcattga 480
cgattcaatt tgttgaaggc caatttgtgg actcctacga tccaaccata gaaaacactt 540
ttacaaagtt gatcacagta aatggacaag aatatcatct tcaacttgta gacacagccg 600
ggcaagatga atattctatc tttcctcaga catactccat agatattaat ggctatattc 660
ttgtgtattc tgttacatca atcaaaagtt ttgaagtgat taaagttatc catggcaaat 720
tgttggatat ggtggggaaa gtacaaatac ctattatgtt ggttgggaat aagaaagacc 780
tgcatatgga aagggtgatc agttatgaag aagggaaagc tttggcagaa tcttggaatg 840
cagctttttt ggaatcttct gctaaagaaa atcagactgc tgtggatgtt tttcgaagga 900
taattttgga ggcagaaaaa atggacgggg cagcttcaca aggcaagtct tcatgctcgg 960
tgatgtgatt ctgctgcaaa gcctgaggac actgggaata tattctacct gaagaagcaa 1020
actgcccgtt ctccttgaag ataaactatg cttctttttt cttctgttaa cctgaaagat 1080
atcatttggg tcagagctcc cctcccttca gattatgtta actctgagtc tgtccaaatg 1140
agttcacttc cattttcaaa ttttaagcaa tcatattttc aatttatata ttgtatttct 1200
taatattatg accaagaatt ttatcggcat taatttttca gtgtagtttg ttgtttaaaa 1260
taatgtaatc atcaaaatga tgcatattgt tacactacta ttaactaggc ttcagtatat 1320
cagtgtttat ttcattgtgt taaatgtata cttgtaaata aaatagctgc aaacctcagt 1380
cctttgtgct acttgatgtg gctttcaaag aagagaagcc ttgtcctgag tttctcactt 1440
ggcttcagga aggccccagg ttggattcca gaaaccagtg aagatgtggc cacaggagga 1500
ggtgtgctga ggtggctgct gaccgtggac tccctgcgca gtggcctgca gatgttgggg 1560
ctgggttaca gctgattgaa gctgagtggc cctggggggt ctgtgagggg agttcctccc 1620
cagtgatgaa attctctcct tccaccctca aatccctaga ccttgactga aatgctccgt 1680
ggtcgggagc ctggtcaagg aggaggagct gctgagaggc attgttcgcc cttgctcata 1740
gcttagctcg atgtccgtgt cagacaggag atgattgaga acagccttgc ctgtcactgt 1800
cctagaacac cctggagttt agtgttctgt gtcagagtct tgggagcctc cttcagaccc 1860
agatgacggg cctccctctg tccaaggagc agctgtaaag gagaagaggg atttcatttg 1920
tttggtggct gttaccttgt ctgtaagtca aacttggagt tgagcagtgc tttttaaacg 1980
attccctttt gcagctaaaa tttcacaggg ctatttctaa tacgtaagca aatgttacca 2040
ttgactttat taataaaata tagttttgct ttgcaaaaaa aaaaaaaaaa aa 2092
<210> 2
<211> 184
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Met Pro Gln Ser Lys Ser Arg Lys Ile Ala Ile Leu Gly Tyr Arg Ser
1 5 10 15
Val Gly Lys Ser Ser Leu Thr Ile Gln Phe Val Glu Gly Gln Phe Val
20 25 30
Asp Ser Tyr Asp Pro Thr Ile Glu Asn Thr Phe Thr Lys Leu Ile Thr
35 40 45
Val Asn Gly Gln Glu Tyr His Leu Gln Leu Val Asp Thr Ala Gly Gln
50 55 60
Asp Glu Tyr Ser Ile Phe Pro Gln Thr Tyr Ser Ile Asp Ile Asn Gly
65 70 75 80
Tyr Ile Leu Val Tyr Ser Val Thr Ser Ile Lys Ser Phe Glu Val Ile
85 90 95
Lys Val Ile His Gly Lys Leu Leu Asp Met Val Gly Lys Val Gln Ile
100 105 110
Pro Ile Met Leu Val Gly Asn Lys Lys Asp Leu His Met Glu Arg Val
115 120 125
Ile Ser Tyr Glu Glu Gly Lys Ala Leu Ala Glu Ser Trp Asn Ala Ala
130 135 140
Phe Leu Glu Ser Ser Ala Lys Glu Asn Gln Thr Ala Val Asp Val Phe
145 150 155 160
Arg Arg Ile Ile Leu Glu Ala Glu Lys Met Asp Gly Ala Ala Ser Gln
165 170 175
Gly Lys Ser Ser Cys Ser Val Met
180
<210> 3
<211> 3047
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 3
cccttgcgcc tccttgcccg gccgcgccca gcccggcgtc ccgagcagcg caggggagga 60
tccccgcgca gtgacccggg agccaccaca gactctggga ggctcggcgg ctggagcagc 120
aggcagctcc ccgcagctcc cggcgcttcc aggcagctct ctgagccgtg ccagaggccc 180
ggcccgccat tcccagcccc gagccatgat gaagactttg tccagcggga actgcacgct 240
cagtgtgccc gccaaaaact cataccgcat ggtggtgctg ggtgcctctc gggtgggcaa 300
gagctccatc gtgtctcgct tcctcaatgg ccgctttgag gaccagtaca cacccaccat 360
cgaggacttc caccgtaagg tatacaacat ccgcggcgac atgtaccagc tcgacatcct 420
ggatacctct ggcaaccacc ccttccccgc catgcgcagg ctgtccatcc tcacagggga 480
tgtcttcatc ctggtgttca gcctggataa ccgggagtcc ttcgatgagg tcaagcgcct 540
tcagaagcag atcctggagg tcaagtcctg cctgaagaac aagaccaagg aggcggcgga 600
gctgcccatg gtcatctgtg gcaacaagaa cgaccacggc gagctgtgcc gccaggtgcc 660
caccaccgag gccgagctgc tggtgtcggg cgacgagaac tgcgcctact tcgaggtgtc 720
ggccaagaag aacaccaacg tggacgagat gttctacgtg ctcttcagca tggccaagct 780
gccacacgag atgagccccg ccctgcatcg caagatctcc gtgcagtacg gtgacgcctt 840
ccaccccagg cccttctgca tgcgccgcgt caaggagatg gacgcctatg gcatggtctc 900
gcccttcgcc cgccgcccca gcgtcaacag tgacctcaag tacatcaagg ccaaggtcct 960
tcgggaaggc caggcccgtg agagggacaa gtgcaccatc cagtgagcga gggatgctgg 1020
ggcggggctt ggccagtgcc ttcagggagg tggccccaga tgcccactgt gcgcatctcc 1080
ccaccgaggc cccggcagca gtcttgttca cagaccttag gcaccagact ggaggccccc 1140
gggcgctggc ctccgcacat tcgtctgcct tctcacagct ttcctgagtc cgcttgtcca 1200
cagctccttg gtggtttcat ctcctctgtg ggaggacaca tctctgcagc ctcaagagtt 1260
aggcagagac tcaagttaca ccttcctctc ctggggttgg aagaaatgtt gatgccagag 1320
gggtgaggat tgctgcgtca tatggagcct cctgggacaa gcctcaggat gaaaaggaca 1380
cagaaggcca gatgagaaag gtctcctctc tcctggcata acacccagct tggtttgggt 1440
ggcagctggg agaacttctc tcccagccct gcaactctta cgctctggtt cagctgcctc 1500
tgcaccccct cccaccccca gcacacacac aagttggccc ccagctgcgc ctgacattga 1560
gccagtggac tctgtgtctg aagggggcgt ggccacacct cctagaccac gcccaccact 1620
tagaccacgc ccacctcctg accgcgttcc tcagcctcct ctcctaggtc cctccgcccg 1680
acagttgtgc tttgttgtgg ttgcagctgt tttcgtgtca tgtatagtag tagaaatgga 1740
aatcattgta ctgtaaaagc ctagtgactc cctccttggc caggccctca cccagttcag 1800
atccacggcc tccacccggg acgccttcct cctctgctcc caaacagggt ttccgtggcc 1860
tgtttgcagc tagacattga cctccgccat tgagctccac ggtttacaga caattgcaca 1920
agcgtggggt gggcaggcca ggactgcttt tttttaatgc tcccatttca cagaggatac 1980
caccgagact cggaggggac acgatgagca ccaggcccca cctttgtccc ctagcaaatt 2040
cagggtacag ctccacctag aaccaggctg ccctctactg tgctcgttcc tcaagcattt 2100
attaagcacc tactgggtgc tgggttcact gtgtcctagg aaaccaagag ggtccccagt 2160
cctggcctct gcccgcccct gctgccccac caccttctgc acacacagcg gtggggaggc 2220
ggggaggagc agctgggacc cagaactgag cctgggaggg atccgacaga aaagctcagg 2280
gcgggtcttc tccttgtgcc cgggattggg ctatgctggg taccaccatg tactcaggca 2340
tggtgggttt tgaacccata aaccaaaggc ccttgtcatc agctcttaac aagtatattt 2400
tgtattttaa tctctctaaa catattgaag ttttagggcc ctaaggaacc ttagtgatct 2460
tctattgggt ctttctgagg ttcagagagg gtaagtaact tcctccaggt cacacagcaa 2520
gtctgtgggt ggcagaagca agctagcgct gggcattcag tacataccac gatgtgctcc 2580
ctctcttgat gcttggcccc tggggccttc agggctttgg gacatcttgt cctcaaccct 2640
ctccctagat cagtctgtga gggtccctgt agatattgtg tacaccatgc ccatgtatat 2700
acaagtacac acagatgtac acacagatgt acacatgctc cagccccagc tctgcatacc 2760
tgcacctgca ccccagcctt ggcccctgcc tgcgtctgtg ctcaaagcag cagctccaac 2820
cctgcctctg tccccttccc cacccactgc ctgagccttc tgagcagacc aggtaccttg 2880
gctgcaccgg tgtgtggccc gctctcaccc aggcacagcc ccgccaccat ggatctccgt 2940
gtacactatc aataaaagtg ggtttgttac aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 3000
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaa 3047
<210> 4
<211> 266
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Met Met Lys Thr Leu Ser Ser Gly Asn Cys Thr Leu Ser Val Pro Ala
1 5 10 15
Lys Asn Ser Tyr Arg Met Val Val Leu Gly Ala Ser Arg Val Gly Lys
20 25 30
Ser Ser Ile Val Ser Arg Phe Leu Asn Gly Arg Phe Glu Asp Gln Tyr
35 40 45
Thr Pro Thr Ile Glu Asp Phe His Arg Lys Val Tyr Asn Ile Arg Gly
50 55 60
Asp Met Tyr Gln Leu Asp Ile Leu Asp Thr Ser Gly Asn His Pro Phe
65 70 75 80
Pro Ala Met Arg Arg Leu Ser Ile Leu Thr Gly Asp Val Phe Ile Leu
85 90 95
Val Phe Ser Leu Asp Asn Arg Glu Ser Phe Asp Glu Val Lys Arg Leu
100 105 110
Gln Lys Gln Ile Leu Glu Val Lys Ser Cys Leu Lys Asn Lys Thr Lys
115 120 125
Glu Ala Ala Glu Leu Pro Met Val Ile Cys Gly Asn Lys Asn Asp His
130 135 140
Gly Glu Leu Cys Arg Gln Val Pro Thr Thr Glu Ala Glu Leu Leu Val
145 150 155 160
Ser Gly Asp Glu Asn Cys Ala Tyr Phe Glu Val Ser Ala Lys Lys Asn
165 170 175
Thr Asn Val Asp Glu Met Phe Tyr Val Leu Phe Ser Met Ala Lys Leu
180 185 190
Pro His Glu Met Ser Pro Ala Leu His Arg Lys Ile Ser Val Gln Tyr
195 200 205
Gly Asp Ala Phe His Pro Arg Pro Phe Cys Met Arg Arg Val Lys Glu
210 215 220
Met Asp Ala Tyr Gly Met Val Ser Pro Phe Ala Arg Arg Pro Ser Val
225 230 235 240
Asn Ser Asp Leu Lys Tyr Ile Lys Ala Lys Val Leu Arg Glu Gly Gln
245 250 255
Ala Arg Glu Arg Asp Lys Cys Thr Ile Gln
260 265
Claims (19)
- 치료제를 포함하는 헌팅톤병 (HD)의 치료가 필요한 대상체에서 헌팅톤병 (HD)을 치료하기 위한 제약 조성물로서, 여기서 치료제는 S16H의 돌연변이를 갖는 뇌에 풍부화된 구성적 활성 Ras 동족체 (caRheb) 돌연변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 아데노-연관된 바이러스 (AAV) 벡터에 함유된 것이고, 여기서 제약 조성물은 헌팅톤병을 치료하기 위해 직접적으로 또는 혈류를 통해 대상체의 뇌에 투여되도록 제제화된 것인 제약 조성물.
- 제1항에 있어서, 대상체가 미토콘드리아 기능이상, 이상 콜레스테롤 항상성, 선조체 위축, 손상된 도파민 신호전달, 감소된 자가포식, 또는 그의 임의의 조합을 가질 수 있는 것인 제약 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, AAV가 AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV9, 또는 그의 임의의 조합인 제약 조성물.
- 제3항에 있어서, AAV가 AAV2인 제약 조성물.
- 제3항에 있어서, AAV가 AAV2/1인 제약 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 치료제가 대상체의 선조체, 피질 또는 뇌실 공간에 투여되는 것인 제약 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 대상체가 인간인 제약 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 대상체의 중추신경계 중의 1 내지 5개의 위치에서 주사되는 것을 특징으로 하는 제약 조성물.
- 제8항에 있어서, 뇌 중의 단일 위치에서 주사되는 것을 특징으로 하는 제약 조성물.
- 제1항 또는 제2항에 있어서, 헌팅톤병의 치료가 필요한 대상체는 헌팅톤병에 대한 질환 유전자가 유전된 대상체인 제약 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US201462098085P | 2014-12-30 | 2014-12-30 | |
| US62/098,085 | 2014-12-30 | ||
| PCT/US2015/068034 WO2016109649A1 (en) | 2014-12-30 | 2015-12-30 | Methods and compositions for treating brain diseases |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20170098931A KR20170098931A (ko) | 2017-08-30 |
| KR102618947B1 true KR102618947B1 (ko) | 2023-12-27 |
Family
ID=56285031
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020177020915A KR102618947B1 (ko) | 2014-12-30 | 2015-12-30 | 뇌 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물 |
Country Status (13)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11612641B2 (ko) |
| EP (1) | EP3240577B1 (ko) |
| JP (1) | JP6782701B2 (ko) |
| KR (1) | KR102618947B1 (ko) |
| CN (1) | CN107405414A (ko) |
| AU (1) | AU2015374043B2 (ko) |
| BR (1) | BR112017013674A2 (ko) |
| CA (1) | CA2971687C (ko) |
| ES (1) | ES2962439T3 (ko) |
| HK (1) | HK1245127A1 (ko) |
| NZ (1) | NZ733014A (ko) |
| SG (1) | SG11201704829QA (ko) |
| WO (1) | WO2016109649A1 (ko) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2015346162B2 (en) | 2014-11-14 | 2022-02-10 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS) |
| ES2878451T3 (es) | 2014-11-14 | 2021-11-18 | Voyager Therapeutics Inc | Polinucleótidos moduladores |
| KR102618947B1 (ko) | 2014-12-30 | 2023-12-27 | 유니버시티 오브 아이오와 리써치 파운데이션 | 뇌 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물 |
| MX2018014152A (es) | 2016-05-18 | 2019-03-28 | Voyager Therapeutics Inc | Composiciones y métodos para tratar la enfermedad de huntington. |
| AU2017267665C1 (en) | 2016-05-18 | 2023-10-05 | Voyager Therapeutics, Inc. | Modulatory polynucleotides |
| CL2016003282A1 (es) * | 2016-12-21 | 2017-08-18 | Univ Chile | Virus aav/igf2, método de tratamiento genético y su uso en enfermedades relacionadas con mal plegamiento de proteínas tal como la enfermedad de huntington |
| WO2018132791A1 (en) * | 2017-01-16 | 2018-07-19 | The Regents Of The University Of California | Treatment of neurodegenerative conditions by disruption of rhes |
| WO2018204803A1 (en) | 2017-05-05 | 2018-11-08 | Voyager Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of treating huntington's disease |
Family Cites Families (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050255086A1 (en) * | 2002-08-05 | 2005-11-17 | Davidson Beverly L | Nucleic acid silencing of Huntington's Disease gene |
| US20050009112A1 (en) | 2003-03-07 | 2005-01-13 | Fred Hutchinson Cancer Research Center, Office Of Technology Transfer | Methods for identifying Rheb effectors as lead compounds for drug development for diabetes and diseases associated with abnormal cell growth |
| WO2006116716A2 (en) | 2005-04-27 | 2006-11-02 | University Of Florida | Materials and methods for enhanced degradation of mutant proteins associated with human disease |
| KR101286870B1 (ko) * | 2009-11-30 | 2013-07-16 | (주)아모레퍼시픽 | 황기 추출물을 포함하는 대사 촉진 조성물 |
| CN104039790B (zh) * | 2011-10-28 | 2016-04-13 | 诺华股份有限公司 | 嘌呤衍生物及它们在治疗疾病中的应用 |
| EP2773382A4 (en) * | 2011-11-01 | 2016-03-23 | Childrens Medical Center | CO-ACTIVATION OF MTOR AND STAT3 PATHWAYS TO PROMOTE NEURONAL SURVIVAL AND REGENERATION |
| CN106924741A (zh) | 2011-11-08 | 2017-07-07 | 因特利凯有限责任公司 | 使用多种药剂的治疗方案 |
| WO2013116691A1 (en) * | 2012-02-02 | 2013-08-08 | The Washington University | Methods for improving muscle strength |
| KR101626526B1 (ko) | 2014-10-30 | 2016-06-02 | 경북대학교 산학협력단 | ｈＲｈｅｂ를 유효성분으로 포함하는 허혈성 뇌질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
| KR102618947B1 (ko) | 2014-12-30 | 2023-12-27 | 유니버시티 오브 아이오와 리써치 파운데이션 | 뇌 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물 |
-
2015
- 2015-12-30 KR KR1020177020915A patent/KR102618947B1/ko active IP Right Grant
- 2015-12-30 ES ES15876243T patent/ES2962439T3/es active Active
- 2015-12-30 JP JP2017534822A patent/JP6782701B2/ja active Active
- 2015-12-30 WO PCT/US2015/068034 patent/WO2016109649A1/en active Application Filing
- 2015-12-30 AU AU2015374043A patent/AU2015374043B2/en active Active
- 2015-12-30 CA CA2971687A patent/CA2971687C/en active Active
- 2015-12-30 NZ NZ733014A patent/NZ733014A/en unknown
- 2015-12-30 EP EP15876243.5A patent/EP3240577B1/en active Active
- 2015-12-30 US US15/540,746 patent/US11612641B2/en active Active
- 2015-12-30 CN CN201580077153.9A patent/CN107405414A/zh active Pending
- 2015-12-30 BR BR112017013674A patent/BR112017013674A2/pt not_active Application Discontinuation
- 2015-12-30 SG SG11201704829QA patent/SG11201704829QA/en unknown
-
2018
- 2018-04-11 HK HK18104750.2A patent/HK1245127A1/zh unknown
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 2013. 43rd Annual Meeting of the Society-For-Neuroscience.(Poster #306.05)(2013.11.11.)* |
| Journal of Biological Chemistry. 2006. Vol.281, No.29, pp.19793-19797.* |
| Molecular Therapy. 2012. Vol.20, No.2, pp.275-286.* |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3240577A4 (en) | 2018-07-25 |
| AU2015374043B2 (en) | 2021-05-13 |
| EP3240577A1 (en) | 2017-11-08 |
| CN107405414A (zh) | 2017-11-28 |
| JP6782701B2 (ja) | 2020-11-11 |
| HK1245127A1 (zh) | 2018-08-24 |
| BR112017013674A2 (pt) | 2018-02-06 |
| NZ733014A (en) | 2024-05-31 |
| CA2971687A1 (en) | 2016-07-07 |
| SG11201704829QA (en) | 2017-07-28 |
| ES2962439T3 (es) | 2024-03-19 |
| US20180000907A1 (en) | 2018-01-04 |
| WO2016109649A1 (en) | 2016-07-07 |
| AU2015374043A1 (en) | 2017-07-13 |
| JP2018502112A (ja) | 2018-01-25 |
| US11612641B2 (en) | 2023-03-28 |
| CA2971687C (en) | 2024-05-28 |
| KR20170098931A (ko) | 2017-08-30 |
| EP3240577B1 (en) | 2023-07-05 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR102618947B1 (ko) | 뇌 질환을 치료하기 위한 방법 및 조성물 | |
| US20240226203A9 (en) | Compositions and methods of treating huntington's disease | |
| US20230295663A1 (en) | Compositions and methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (als) | |
| US20220333131A1 (en) | Modulatory polynucleotides | |
| US11155817B2 (en) | Therapeutic for treatment of diseases including the central nervous system | |
| JP2006521825A (ja) | ｒＡＡＶ導入を高めるための化合物および方法 | |
| EP2187898B1 (en) | Use of viral vectors carrying the cyp46a1 gene for the treatment of alzheimer's disease | |
| US20240343768A1 (en) | Gene therapy for tuberous sclerosis | |
| WO2020176732A1 (en) | TREATMENT OF PULMONARY FIBROSIS WITH SERCA2a GENE THERAPY | |
| EP3962514A1 (en) | Methods and compositions involving tert activating therapies | |
| JP2022531177A (ja) | 神経変性障害を治療するための方法 | |
| KR20240150772A (ko) | 폴리q 질환 치료를 위한 치료 인자 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| GRNT | Written decision to grant |