ES2962439T3

ES2962439T3 - Agente terapéutico que activa la función mTORC1 para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Huntington

Info

Publication number: ES2962439T3
Application number: ES15876243T
Authority: ES
Inventors: Beverly Davidson; John Lee
Original assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF
Current assignee: University of Iowa Research Foundation UIRF
Priority date: 2014-12-30
Filing date: 2015-12-30
Publication date: 2024-03-19
Anticipated expiration: 2035-12-30
Also published as: AU2015374043A1; SG11201704829QA; EP3240577A1; KR102618947B1; HK1245127A1; US11612641B2; JP6782701B2; CA2971687C; AU2015374043B2; CA2971687A1; KR20170098931A; EP3240577B1; US20180000907A1; EP3240577A4; WO2016109649A1; BR112017013674A2; JP2018502112A; CN107405414A

Abstract

La presente divulgación proporciona métodos para tratar o prevenir la enfermedad de Huntington (EH) en un sujeto que lo necesita, que comprende administrar un agente terapéutico que activa la función mTORC 1 y/o aumenta el nivel de Ras Homolog enriquecido en Striatum (Rhes) en el cerebro del sujeto en comparación con a la función o nivel en el sujeto antes del tratamiento, y métodos para modular los fenotipos metabólicos asociados a mHTT y/o revertir la atrofia estriado mediante la administración de un agente terapéutico que activa la función mTORCl y/o aumenta el nivel de Ras Homolog enriquecido en Striatum (Rhes) en el cerebro del sujeto en comparación con la función o nivel en el sujeto antes del tratamiento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Agente terapéutico que activa la función mTORCI para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Huntington

Antecedentes

[0001] La enfermedad de Huntington (EH) es una enfermedad neurodegenerativa autosómica dominante mortal causada por la expansión repetida de CAG en el exón 1 de la huntingtina, que codifica la proteína huntintina (HTT) (1993). A pesar de la expresión de HTT en todos los tejidos y regiones del cerebro, el cuerpo estriado demuestra la degeneración más profunda y temprana. La HTT mutante (mHTT) afecta negativamente a múltiples vías celulares, incluyendo la biogénesis de las mitocondrias (Cuiet al.,2006; Tsunemiet al.,2012), la homeostasis del colesterol (Karasinska y Hayden, 2011; Valenza y Cattaneo, 2011; Valenzaet al.,2005), el crecimiento axonal (Liet al.,2001) y la sinaptogénesis (Milnerwood y Raymond, 2010), todos los cuales pueden contribuir a la disfunción y pérdida neuronal. Estos fenotipos variados pueden ser el resultado de la alteración de un componente central que regula una gama de procesos biológicos fundamentales. Identificar un suceso patogénico primario de este tipo facilitaría el desarrollo terapéutico.

[0002] La transferencia de genes ahora es ampliamente reconocida como una poderosa herramienta para el análisis de sucesos biológicos y procesos patológicos tanto a nivel celular como molecular. Más recientemente, la aplicación de la terapia génica para el tratamiento de enfermedades humanas, ya sea heredadas (por ejemplo, deficiencia de ADA) o adquiridas (por ejemplo, cáncer o enfermedad infecciosa), ha recibido considerable atención. Con la llegada de técnicas mejoradas de transferencia de genes y la identificación de una biblioteca en constante expansión de enfermedades relacionadas con genes defectuosos, la terapia génica ha evolucionado rápidamente desde una teoría de tratamiento hasta una realidad práctica.

[0003] Tradicionalmente, la terapia génica se ha definido como un procedimiento en el que se introduce un gen exógeno en las células de un paciente para corregir un error genético innato. Aunque actualmente más de 4.500 enfermedades humanas se clasifican como genéticas, se han identificado mutaciones específicas en el genoma humano para relativamente pocas de estas enfermedades. Hasta hace poco, estas enfermedades genéticas raras representaban las dianas exclusivas de los esfuerzos de terapia génica. Por consiguiente, la mayoría de los protocolos de terapia génica aprobados por los NIH hasta la fecha se han dirigido a la introducción de una copia funcional de un gen defectuoso en las células somáticas de un individuo que tiene un error genético innato conocido. Solo recientemente, han comenzado los investigadores y médicos a apreciar que la mayoría de los cánceres humanos, ciertas formas de enfermedades cardiovasculares y muchas enfermedades degenerativas también tienen componentes genéticos importantes, y que, con el fin de diseñar nuevas terapias genéticas, deben considerarse "trastornos genéticos". Por lo tanto, más recientemente, la terapia génica se ha definido ampliamente como la corrección del fenotipo de una enfermedad mediante la introducción de nueva información genética en el organismo afectado.

[0004] En la terapia génicain vivo,un gen transferido se introduce en las células del organismo receptorin situ,es decir, dentro del receptor. La terapia génicain vivose ha examinado en varios modelos animales. Varias publicaciones recientes han informado sobre la viabilidad de la transferencia directa de genesin el lugaren órganos y tejidos tales como músculos, células madre hematopoyéticas, la pared arterial, el sistema nervioso y el pulmón. También se ha informado de que la inyección directa de ADN en el músculo esquelético, el músculo cardíaco y la inyección de complejos de ADN-lípido en la vasculatura producen un nivel de expresión detectable del producto o productos génicos insertadosin vivo.

[0005] El tratamiento de las enfermedades del sistema nervioso central sigue siendo un problema difícil de resolver. Un ejemplo de tal enfermedad es la enfermedad de Huntington. Las proteínas deficientes en este trastorno, cuando se suministran por vía intravenosa, no cruzar la barrera hematoencefálica, o, cuando se suministran directamente al cerebro, no se distribuyen ampliamente. Datos anteriores indicaron que inhibir la vía de mTOR puede resultar beneficioso. Sin embargo, el trabajo de los inventores revela que esto es perjudicial y también muestra que las terapias que estimulan esta vía son las beneficiosas.

[0006] Leeet al."Rhes modulation reveals a critical role for mTOR activity in Huntington's Disease", 43a Reunión Anual de la Sociedad de Neurociencia, San Diego, CA, EE. UU., 09-13 de noviembre de 2013, 11 de noviembre de 2013, describen que la expresión transgénica de Rheb de tipo silvestre activa mTORC1 y mejora los fenotipos de la enfermedad de Huntington.

Sumario

[0007] La presente invención se refiere a un agente terapéutico que activa la función de mTORC1 en el cerebro de un sujeto en comparación con la función en el sujeto antes del tratamiento para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Huntington (EH) en el sujeto, en donde el agente terapéutico comprende un homólogo de Ras constitutivamente activo enriquecido en el cerebro (Rheb) mutante (caRheb; S16H), en donde el agente terapéutico se administra al cerebro del sujeto, y en donde el agente terapéutico se administra mediante la administración de un vector vírico adenoasociado (AAV) que comprende un ácido nucleico que codifica el agente terapéutico funcionalmente unido a un promotor.

[0008] La divulgación proporciona métodos para tratar o prevenir la enfermedad de Huntington (EH) en un sujeto que lo necesite (por ejemplo, en un sujeto que ha heredado el gen de la enfermedad), que comprende administrar un agente terapéutico que activa la función de mTORC1 y/o aumenta los niveles de un homólogo de Ras enriquecido en el cuerpo estriado (Rhes) en el cerebro del sujeto en comparación con la función o el nivel en el sujeto antes del tratamiento. El sujeto puede tener disfunción mitocondrial, homeostasis anómala del colesterol, atrofia estriatal, alteración de la señalización de dopamina y/o autofagia disminuida.

[0009] La divulgación proporciona métodos para modular los fenotipos metabólicos asociados a mHTT y/o invertir la atrofia de cuerpo estriado mediante la administración de un agente terapéutico que activa la función de mTORC1 y/o aumenta los niveles del homólogo de Ras enriquecido en el cuerpo estriado (Rhes) en el cerebro del sujeto en comparación con la función o nivel en el sujeto antes del tratamiento.

[0010] La divulgación proporciona un método para administrar un agente terapéutico a una célula cerebral de un mamífero que comprende administrar a la célula cerebral una partícula de AAV que contiene un vector que comprende el ácido nucleico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas del AAV, suministrando así el ácido nucleico a la célula cerebral. En determinadas realizaciones, el AAV es AAV2/1. En determinadas realizaciones, el AAV es AAV2/5. Como se usa en el presente documento, el término AAV2/1 se utiliza para referirse a una ITR de AAV2 y una cápsida de AAV1, el término AAV2/2 es una ITR de AAV2 y una cápsida de AAV2, el término AAV2/4 es una ITR de AAV2 y una cápsida de AAV4, etc. En determinadas realizaciones, el AAV es AAV1, AAV2, AAV5, AAV6 y/o AAV9. En determinadas realizaciones, el AAV es AAV1. En determinadas realizaciones, el AAV es AAV2. En determinadas realizaciones, el AAV es AAV5. En determinadas realizaciones, el AAV es un AAV6. En determinadas realizaciones, el AAV es un AAV8. En determinadas realizaciones, el AAV es un AAV9. En determinadas realizaciones, el AAV es un AAVrh10.

[0011] En determinadas realizaciones, la cápsida de VAA tiene al menos el 80% de homología con cualquier proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápsida del serotipo de VAA de referencia, por ejemplo, con una proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápsida de AAV1, o por ejemplo, con una proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápsida de AAV2, o por ejemplo, una proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápsida de AAV3, o por ejemplo, una proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápsida de a AV4, o por ejemplo, una proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápsida de a AV5, o por ejemplo, una proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápsida de A<a>V6, o por ejemplo, una proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápsida de AAV7, o por ejemplo, una proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápsida de AAV8, o por ejemplo, una proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápsida de AAV9, o por ejemplo, una proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápsida de AAVrh10, o por ejemplo, una proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápsida de AAVrh74.

[0012] En determinadas realizaciones, la cápsida de AAV tiene el 100 % de homología con cualquier proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápsida del serotipo de AAV de referencia, por ejemplo, con una proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápsida de AAV1, o por ejemplo, con una proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápsida de AAV2, o por ejemplo, una proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápsida de AAV3, o por ejemplo, una proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápsida de AAV4, o por ejemplo, una proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápsida de AAV5, o por ejemplo, una proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápsida de AAV6, o por ejemplo, una proteína v P1, VP2 y/o VP3 de la cápsida de AAV7, o por ejemplo, una proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápsida de AAV8, o por ejemplo, una proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápsida de AAV9, o por ejemplo, una proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápsida de AAVrh10, o por ejemplo, una proteína VP1, VP2 y/o VP3 de la cápsida de AAVrh74.

[0013] En determinadas realizaciones, el sujeto es un ser humano.

[0014] El agente terapéutico divulgado puede ser un ácido nucleico terapéutico. De acuerdo la invención reivindicada, el agente terapéutico es una proteína.

[0015] De acuerdo la invención reivindicada, el agente se administra al cerebro del sujeto. En determinadas realizaciones, el agente se inyecta en 1-5 ubicaciones del cerebro, tales como a la una, dos o tres ubicaciones en el cerebro. En determinadas realizaciones, el agente se administra al cuerpo estriado, la corteza o el espacio ventricular del mamífero.

Breve descripción de las figuras

[0016]

Figuras 1A-1B. La actividad de mTORC1 se reduce en el cuerpo estriado humano y de ratón con EH. (A) Inmunotransferencia de mTOR, Rictor, Raptor y la actividad de mTORC1 (pS6) mostraron una actividad reducida de mTORC1 en el cuerpo estriado de pacientes con EH (N = 10; véase la Fig. S1A para series ampliadas) en comparación con individuos no afectados (N=6). Se utilizó p-actina como control de carga. Los datos representan la media ETM. ***P<0,001, prueba de la t de Student. (B) Inmunotransferencia de mTOR, Rictor, Raptor y pS6 de lisados estriatales de ratón N171-82Q y de TS de 6 semanas de edad. Se utilizó la p-actina como control de carga. Los análisis de densitometría para los paneles A y B revelaron niveles reducidos de pS6 en pacientes en EH (N = 10) frente a los controles (N = 6) y ratones N171-82Q de 6 semanas de edad (N = 4) en comparación con los compañeros de camada de TS de edad y sexo coincidentes (N = 4). Los datos representan la media ETM.*P<0,05; ***P<0,001, prueba de la t de Student.

Figuras 2A-2G. La activación de la vía de mTORCI corrige las deficiencias relacionadas con el metabolismo en ratones con EH. (A) La transferencia de Western muestra una inmunorreactividad aumentada de pS6 y DARPP-32 en ratones N171-82Q tratados con inyección unilateral de AAV.caRheb, en comparación con los no tratados. Se inyectó a los ratones a las 7 semanas de edad y se recogieron lisados del cuerpo estriado a las 10 semanas de edad. Derecha, cuantificación por densitometría de la inmunorreactividad de DARPP-32 (N = 4 ratones por grupo; *P<0,05, ANOVA unidireccional con pruebaa posterioride Tukey). (B) Análisis por RT-qPCR de PGC1-a en homogeneizados del cuerpo estriado de ratones N171-82Q de 10 semanas de edad tratados con inyección unilateral de AAV.caRheb a las 7 semanas de edad. Los lisados estriatales de los hemisferios contralaterales no inyectados sirvieron como controles internos (N = 8 por grupo). (C-G) Análisis por RT-qPCR de genes desintoxicantes de ROS en homogeneizados del cuerpo estriado de ratones N171-82Q y TS de 10 semanas de edad después de la inyección unilateral de AAV.caRheb a las 7 semanas de edad. Los lisados de los hemisferios contralaterales no inyectados sirvieron como controles internos (N = 8 por grupo). Todos los genes se normalizaron con respecto la p-actina endógena. Los datos representan la media ETM. C=Control. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001, prueba de la t de Student.

Figuras 3A-3F. mTOR regula los genes de la vía biosintética del colesterol en el cuerpo estriado de ratones con EH. (A y B) Las células estriatales de TS (Q7) y mutantes (Q111) cultivadas en medios normales se trataron con Torin1 250 nM o DMSO (control). Los extractos celulares totales se obtuvieron 24 horas después del tratamiento. Los niveles de expresión génica de HMGCR y HMGCS1 se normalizaron con respecto a la p-actina endógena. (C-F) Análisis por RT-qPCR de genes lipogénicos de homogeneizados del cuerpo estriado de ratones N171-82Q y TS de 10 semanas de edad después de la inyección unilateral de AAV.caRheb a las 7 semanas de edad. Los lisados de los hemisferios contralaterales no inyectados sirvieron como controles internos (N = 8 por grupo). Todos los genes se normalizaron con respecto la p-actina endógena. Los datos representan la media ETM. C=Control. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001, prueba de la t de Student.

Figuras 4A-4D. AAV.caRheb aumenta la autofagia basal en ratones N171-82Q. (A y B) Evaluación bioquímica de la autofagia (LC3 y Beclina1) en lisados estriatales de ratones N171-82Q después de la inyección unilateral de AAV.caRheb a las 7 semanas de edad. Se recogieron los cuerpos estriados 3 semanas posinyección. Los cuerpos estriados contralaterales no inyectados sirven como controles internos (N = 6 ratones por grupo). Las transferencias de Western representativas y los análisis de densitometría revelaron niveles aumentados de LC3II y Beclina1 en el cuerpo estriado de ratones N171-82Q tratados con AAV.caRheb. Se utilizó la p-actina como control de carga. Los datos son media ETM.**P<0,01; prueba de la t de Student. (C) Paneles izquierdos: microfotografías representativas de un autofagosoma (flecha) y un autolisosoma (doble flecha). La barra de escala es de 0,5 pm. Panel derecho: frecuencia de autofagosomas y autolisosomas detectados en neuronas del cuerpo estriado de ratones N171-82Q tratados con AAV.eGFP y AAV.caRheb (3 ratones examinados por grupo; 7-10 células/hemisferio/animal). La relación indica el número de autofagosomas o autolisosomas sobre el número total de células contadas. (D) Análisis por MET ultraestructural de cortes estriatales de ratones N171-82Q después de inyecciones de AAV.eGFP o AAV.caRheb en hemisferios opuestos (N = 3 ratones por grupo). Panel izquierdo: una microfotografía representativa de las neuronas estriatales de los estriados tratados de control muestra un citoplasma translúcido electrónicamente, desprovisto de masa granular endoplasmática y orgánulos. Panel derecho: Las neuronas tratadas con AAV.caRheb muestran un citoplasma normal enriquecido con orgánulos y masa granular endoplasmática. La barra de escala es de 5 pm.

Figuras 5A-5G. mTORC1 regula los genes implicados en la elim inación de agregados de mHTT. (A-F) Análisis por RT-qPCR de genes de homogeneizados del cuerpo estriado de ratones N171-82Q y TS de 10 semanas de edad después de la inyección unilateral de AAV. caRheb a las 7 semanas de edad. El lado contralateral no inyectado sirvió como control interno (N=8 por grupo). (A y B) Expresión de genes implicados en la modificación con SUMO de mHTT. (C-E) Expresión de genes relacionados con IKK (Ikbkb, Ikbkap e Ikbke). (F) Expresión de HDAC4. Todos los genes se normalizaron con respecto la p-actina endógena. Los datos representan la media ETM. C=Control. *P<0,05, **P<0,01, ***P<0,001, Prueba t de Student. (G) Paneles izquierdos, tinción inmunohistoquímica del cuerpo estriado de un ratón N171-82Q con EM48 2 semanas después de una única inyección unilateral de AAV.caRheb y AAV.eGFP en el hipocampo de ratones N171-82Q de 10 semanas (N = 4 por grupo de tratamiento; Barra de escala: 50 pm). Panel derecho, AAV.caRheb redujo los agregados positivos para<e>M48. Flechas: Agregados positivos para Em48. Los datos representan la media ETM. *P <0,05. Prueba de la t de Student.

Figuras 6A-6E. mTORC1 propicia el crecim iento de MSN y contrarresta los fenotipos motores inducidos por mHTT. (A) Tinción inmunohistoquímica de MSN (del inglésmédium spiny neurons,neuronas espinosas medias) con anti-DARPP-32, 2 semanas después de una única inyección unilateral de AAV.caRheb en el cuerpo estriado de ratones N171-82Q de 11 semanas de edad. Los ratones recibieron vehículo o RAD001 durante 2 semanas. (B y C) Cuantificación del área de células MSN y volúmenes del cuerpo estriado de tejidos de animales tratados como en (A) (N = 4 por grupo de tratamiento; media ETM). (D) Ratones de TS inyectados unilateralmente con AAV.mHTT/AAV.eGFP o AAV.mHTT/AAV.caRheb a las 6 semanas de edad. Cuando se analizó 4 semanas después de la inyección, AAV.mHTT/AAV.eGFP indujo un comportamiento de rotación ipsilateral en respuesta a la anfetamina. La coinyección de AAV.caRheb alteró la rotación ipsilateral inducida por AAV.mHTT después de la administración de anfetamina, presentando los ratones rotación contralateral (N = 4 por grupo de tratamiento). *P<0,05, **P<0,001, ***P<0,001, prueba de la t de Student. Barras de escala: 100 |jm (A-D). (E) Paneles izquierdos, tinción inmunohistoquímica de MSN con anti-DARPP-32 de cortes de ratones inyectados con AAV.mHTT/AAV.eGFp o AAV.mHTT/AAV.caRheb de (D). El hemisferio contralateral no inyectado se muestra como control. Paneles derechos, cuantificación del área de MSN expresada como porcentaje de cuerpos estriados contralaterales no inyectados. *P<0,05, prueba de la t de Student. Barras de escala: 50 jm .

Figuras 7A-7D. La sobreexpresión intraestriatal de Rhes mejora los fenotipos de la enfermedad en ratones N171-82Q. (A) Análisis por RT-qPCR de los niveles endógenos de Rhes de lisados estriatales de individuos no afectados (Ctl, N=4) y pacientes con EH (N=10), y N171-82Q (N=5) y compañeros de camada de TS de 6 semanas de edad (N=4). Los datos representan la media ETM. *P<0,05, ***P<0,001, prueba de la t de Student. (B) Evaluación de Rotarod de ratones N171-82Q y de TS después de la inyección bilateral de AAV. Rhes, AAV.RhesS33N o solución salina en el cuerpo estriado a las 7 semanas de edad (N = 10-14 ratones por grupo a las 14 semanas de edad; N=6-13 ratones por grupo a las 18 semanas de edad). Los datos de Rotarod de tres días consecutivos a las 14 y 18 semanas de edad se muestran como latencia para la caída. Los ratones N171-82Q inyectados con solución salina y AAV.RhesS33N tuvieron un desempeño significativamente peor en comparación con los ratones N171-82Q inyectados con AAV.Rhes en el rotarod a las 14 y 18 semanas de edad. NS = no estadísticamente significativo. Los datos representan la media ETM. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001, ANOVA unidireccional con pruebaa posterioride Tukey. (C) Tinción con DARPP-32 y cuantificación del área de MSN de cortes de tejido estriado de ratones N171-82Q después de la inyección unilateral de AAV.Rhes y la inyección contralateral de AAV.GFP a las 7 semanas de edad. Los tejidos se recogieron a las 19 semanas de edad (N = 3 ratones/grupo; GFP=245 células; Rhes=251 células). Los datos representan la media ETM. ***P<0,001, prueba de la t de Student. Barras de escala: 50 jm . (D) Análisis por qPCR de PGC-1a en el cuerpo estriado de ratones N171-82Q y de TS tratados con AAV.Rhes o solución salina (n = 6-9 por grupo) recogido al final del estudio (19 semanas de edad). C=Control. *P<0,05, prueba de la t de Student.

Figura 8. Mecanismo propuesto a través del cual mTOR alterado contribuye a los complejos fenotipos de la enfermedad en la EH. En una condición fisiológica normal, mTOR regula diversos procesos biológicos que son cruciales para la función y la supervivencia neuronal. En la EH, mHTT altera la función de mTORC1 mediante la interacción directa con mTOR, causando disfunción neuronal al afectar negativamente múltiples vías. En el cuerpo estriado, mHTT altero aún más la actividad de mTORC1 al interferir con Rhes, un regulador de mTOR enriquecido en el cuerpo estriado. Por tanto, una pérdida concomitante de la actividad de Rhes y mTORC1 puede hacer que el tejido estriatal sea vulnerable a la degeneración temprana en la EH.

Figuras S1A-S1B. La actividad de mTORCl se reduce en el cuerpo estriado humano y de ratón con EH. (A) La transferencia de Western demuestra una actividad reducida de mTORC1 (pS6) en el cuerpo estriado de pacientes con EH (N=10) en comparación con individuos no afectados (N=6). Se utilizó la p-actina como control de carga (relacionado con la Figura 1A). (B) Análisis bioquímico de la actividad endógena de mTORC1 (pS6) de lisados estriatales de ratón N171-82Q y de TS de 14 semanas de edad. Se utilizó la p-actina como control de carga. El análisis por densitometría reveló un nivel reducido de pS6 en ratones N171-82Q de 14 semanas de edad (N=5) en comparación con los compañeros de camada de TS de la misma edad y sexo (N=4). Los datos representan la media ETM.*P<0,05, prueba de la t de Student.

Figuras S2A-S2H. AAV1 transduce eficientemente neuronas del cuerpo estriado en ratones. Una imagen inmunohistoquímica representativa del cuerpo estriado de un ratón con<e>H mostró una transducción robusta de neuronas (NeuN) en un ratón de 18 semanas después de la inyección de AAV1.eGFP a las 6 semanas de edad. Véase también McBrideet al,PNAS: 105(15):5868-73, 2008. (B-H) AAV.caRheb mejora las deficiencias relacionadas con el metabolismo en el cuerpo estriado del ratón N171-82Q. B) La transferencia de Western muestra niveles aumentados de pS6 y DARPP-32 de lisados estriatales en ratones N171-82Q tratados con inyección unilateral de AAV.caRheb, en comparación con los animales tratados con AAV.eGFP. Se inyectó a los ratones a las 10 semanas de edad y se recogieron tejidos a las 13 semanas de edad. Derecha, cuantificación por densitometría de la inmunorreactividad de DARPP-32 (N = 4 ratones por grupo; *P<0,05, prueba de la t de Student). (C-H) Análisis por RT-qPCR de genes relacionados con el metabolismo y el transgén N171-82Q de homogeneizados de cuerpo estriado de ratones N171-82Q de 13 semanas de edad después de la inyección unilateral de AAV.caRheb y la inyección contralateral de AAV.eGFP a las 10 semanas de edad (N = 4 por grupo). Todos los genes se normalizaron con respecto a la p-actina. Los datos representan la media ETM. *P<0,05, **P<0,01, prueba de la t de Student.

Figuras S3A-S3F. A,B. Torin1 inhibe los genes de expresión génica del metabolismo en el modelo de células estriatales de EH. Las células estriatales Q7 y Q111 cultivadas en condiciones séricas normales se trataron con Torin1 o DMSO (control). 24 horas después se obtuvieron extractos celulares totales. (A) La evaluación bioquímica muestra una reducción de la actividad de mTORC1 (pS6 y p4E-BP1), de PGC1-a y de la expresión de DARPP-32 en las células Q7 y Q111 con tratamiento con Torin1. (B) Una transferencia de Western representativa para CREB y su coactivador, TORC1, 24 horas después del tratamiento con Torin1. Los análisis por densitometría muestran que Torin1 suprimió los niveles de TORC1 y CREB en las células Q7 y Q111. Los valores son porcentajes de controles tratados con vehículo ETM de cuatro experimentos independientes (N = 4 por grupo de tratamiento). La p-actina endógena fue el control de carga. *P<0,05; **P<0,01, prueba de la t de Student. C-F. mTOR altera la expresión del gen de biosíntesis de colesterol en el cuerpo estriado de ratones transgénicos con EH tratados con AAV.caRheb frente a AAV.eGFP. Análisis por RT-qPCR de genes lipogénicos de homogeneizados del cuerpo estriado de ratones N171-82Q y TS de 13 semanas de edad después de la inyección unilateral de AAV.caRheb a las 10 semanas de edad. Los lisados de los hemisferios contralaterales inyectados con AAV.eGFP sirvieron como controles internos (N = 4 por grupo). Todos los genes se normalizaron con respecto la p-actina endógena. Los datos representan la media ETM. C=Control. *P<0,05, **P<0,01, prueba de la t de Student. Figura S4. La autofagia basal se potencia en el cuerpo estriado de ratones N171-82Q. Evaluación bioquímica de LC3II en lisados de cuerpos estriados de ratones N171-82Q y de TS después de la inyección de AAV.eGFP a las 10 semanas de edad. Se recogieron los cuerpos estriados 3 semanas posinyección. El análisis por densitometría reveló niveles aumentados de LC3II en el cuerpo estriado de ratones N171-82Q (N=9) en comparación con los TS (N=5). Se utilizó la p-actina como control de carga. Los datos son la media ETM. *P<0,05, prueba de la t de Student.

Figura S5. Transducción AAV.eGFP en el hipocampo. Expresión de eGFP en el hipocampo de ratones N171-82Q 2 semanas después de la inyección de AAVI.eGFP en la circunvolución dentada a las 10 semanas de edad. Barras de escala: 1 mm (izquierda), 100 pm (derecha).

Figuras S6A-S6B. RAD001 inhibe la actividad de mTORC1 en el cuerpo estriado de ratones N171-82Q. (A) Evaluación bioquímica de la actividad de mTORC1 (pS6) en lisados de cuerpo estriado de ratones N171-82Q que recibieron vehículo (DMSO al 2% ) o inhibidor de mTORC1 RAD001 (N = 3 ratones por grupo). Los ratones se trataron durante 2 semanas y se recogieron los cuerpos estriados 24 horas después de la última dosis. Análisis densitométrico de inmunotransferencias de muestras de ratones. Se utilizó la p-actina como control de carga. Los datos representan la media ETM. ***P<0,001, prueba de la t de Student. (B) Microfotografías representativas de tinción inmunohistoquímica para pS6 (verde) y tinción de Hoescht (azul), 2 semanas después de una única inyección unilateral de AAV.caRheb en el cuerpo estriado de ratones N171-82Q de 11 semanas de edad. Los ratones recibieron vehículo (N=3) o RAD001 (N=4) durante 2 semanas. Barras de escala: 25 pm.

Figuras S7A-S7C. Los niveles de expresión de Rhes están reducidos en el cuerpo estriado de ratones transgénicos con EH. (A) Niveles endógenos de Rhes estriatal en ratones N171-82Q (N = 4) y de TS (N = 6) de 17 semanas de edad. La abundancia de ARNm de Rhes se normalizó con respecto a la p-actina endógena. Los datos representan la media ETM.*P<0,05; prueba de la t de Student. (B) Los niveles de Rheb no cambian en los cuerpos estriados de ratones N171-82Q, de ratones N171-82Q (N=5) y de TS (N=4) 6 semanas de edad, y de ratones N171-82Q de 17 semanas de edad (N=4) y de ratones de TS (N=6). Prueba de la t de Student. (C) Los ratones N171-82Q se desempeñan de manera indistinguible de lo normal a las 5 y 10 semanas de edad (N = 10 14 ratones por grupo). Los datos de Rotarod de cuatro días consecutivos se muestran como latencia para la caída. Los datos representan la media ETM. ANOVA unidireccional con prueba de Tukeya posteriori.

Figura S8. Transducción del cuerpo estriado de ratón N171-82Q con Rhes y Rhes S33N deficiente en GTPasa. Transferencia de Western representativa de la actividad de mTORC1 (p-4E-BP1) y de transgenes Rhes (Flag) en ratones N171-82Q transducidos con AAV.Rhes, AAV.RhesS33N o solución salina en el cuerpo estriado. Se inyectó a los ratones a las 7 semanas de edad y se recogieron los tejidos del cuerpo estriado 3 semanas después de la inyección. Se utilizó la p-actina como control de carga.

Descripción detallada

[0017] La presente invención se define en las reivindicaciones.

[0018] La presente invención se refiere a un agente terapéutico que activa la función de mTORCl en el cerebro de un sujeto en comparación con la función en el sujeto antes del tratamiento para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Huntington (EH) en el sujeto, en donde el agente terapéutico comprende un homólogo de Ras constitutivamente activo enriquecido en el cerebro (Rheb) mutante (caRheb; S16H), en donde el agente terapéutico se administra al cerebro del sujeto, y en donde el agente terapéutico se administra mediante la administración de un vector vírico adenoasociado (AAV) que comprende un ácido nucleico que codifica el agente terapéutico funcionalmente unido a un promotor.

Agentes terapéuticos

[0019] La divulgación proporciona agentes terapéuticos para un sujeto que los necesita. En determinadas realizaciones, el agente terapéutico comprende un regulador de mTORC1.

[0020] En determinadas realizaciones, el regulador de mTORC1 es Rheb (Homólogo de Ras enriquecido en cerebro (RHEB)Homo sapiens,referencia de secuencia de ARNm del NCBI: NM_005614.3). Secuencia de Rheb (secuencia codificante indicada en negrita):

GGCGTAATTAAAAAGCGGCGGAAGAAGGTGGGAGGGTCATGACGCAGCGAG TTTCAGTCGTGACTTTTCTGGGGGCATCGCGGCGTCCCCTTTTTTTGCCTTTAAAGTA AAACGTCGCCCCGACGCACCCCCCGCGTATTTCGGGGGGCGGAGGCGGCGGGCCAC GGC GC GA AGAGGGGC GGT GC T GAC GC C GGC C GGT C AC GT GGGC GT GTT GT GGGGG GGAGGGGCGCCGCCGCGCGGTCGGTTCCGGGCGGTTGGGAGCGCGCGAGCTAGCG AGCGAGAGGCAGCCGCGCCCGCCGCCGCCCCTGCTCTGTATGCCGCTCTCTCCCGGC GCGGCCGCCGCCGATCACAGCAGCAGGAGCCACCGCCGCCGCGGTTGATGTGGTTG GGCCGGGGCTGAGGAGGCCGCCAAGATGCCGCAGTCCAAGTCCCGGAAGATCGC GATCCTGGGCTACCGGTCTGTGGGGAAATCCTCATTGACGATTCAATTTGTTG

AAGGCCAATTTGTGGACTCCTACGATCCAACCATAGAAAACACTTTTACAAAGT TGATCACAGTAAATGGACAAGAATATCATCTTCAACTTGTAGACACAGCCGGG CAAGATGAATATTCTATCTTTCCTCAGACATACTCCATAGATATTAATGGCTAT ATTCTTGTGTATTCTGTTACATCAATCAAAAGTTTTGAAGTGATTAAAGTTATC CATGGCAAATTGTTGGATATGGTGGGGAAAGTACAAATACCTATTATGTTGGT TGGGAATAAGAAAGACCTGCATATGGAAAGGGTGATCAGTTATGAAGAAGGGA AAGCTTTGGCAGAATCTTGGAATGCAGCTTTTTTGGAATCTTCTGCTAAAGAAA ATCAGACTGCTGTGGATGTTTTTCGAAGGATAATTTTGGAGGCAGAAAAAATG

GACGGGGCAGCTTCACAAGGCAAGTCTTCATGCTCGGTGATGTGATTCTGCTGC

AAAGCCTGAGGACACTGGGAATATATTCTACCTGAAGAAGCAAACTGCCCGTTCTC

CTTGAAGATAAACTATGCTTCTTTTTTCTTCTGTTAACCTGAAAGATATCATTTGGGT

CAGAGCTCCCCTCCCTTCAGATTATGTTAACTCTGAGTCTGTCCAAATGAGTTCACT

TCCATTTTCAAATTTTAAGCAATCATATTTTCAATTTATATATTGTATTTCTTAATATT

ATGACCAAGAATTTTATCGGCATTAATTTTTCAGTGTAGTTTGTTGTTTAAAATAAT

GTAATCATCAAAATGATGCATATTGTTACACTACTATTAACTAGGCTTCAGTATATC

AGTGTTTATTTCATTGTGTTAAATGTATACTTGTAAATAAAATAGCTGCAAACCTCA

GTCCTTTGTGCTACTTGATGTGGCTTTCAAAGAAGAGAAGCCTTGTCCTGAGTTTCT

CACTTGGCTTCAGGAAGGCCCCAGGTTGGATTCCAGAAACCAGTGAAGATGTGGCC

ACAGGAGGAGGTGTGCTGAGGTGGCTGCTGACCGTGGACTCCCTGCGCAGTGGCCT

GCAGATGTTGGGGCTGGGTTACAGCTGATTGAAGCTGAGTGGCCCTGGGGGGTCTG

TGAGGGGAGTTCCTCCCCAGTGATGAAATTCTCTCCTTCCACCCTCAAATCCCTAGA

CCTTGACTGAAATGCTCCGTGGTCGGGAGCCTGGTCAAGGAGGAGGAGCTGCTGAG

AGGCATTGTTCGCCCTTGCTCATAGCTTAGCTCGATGTCCGTGTCAGACAGGAGATG

ATTGAGAACAGCCTTGCCTGTCACTGTCCTAGAACACCCTGGAGTTTAGTGTTCTGT

GTCAGAGTCTTGGGAGCCTCCTTCAGACCCAGATGACGGGCCTCCCTCTGTCCAAGG AGC AGCTGT AAAGGAGAAGAGGGATTT C ATTTGTTT GGT GGCT GTTACCTTGTCT GT

AAGTCAAACTTGGAGTTGAGCAGTGCTTTTTAAACGATTCCCTTTTGCAGCTAAAAT

TTCACAGGGCTATTTCTAATACGTAAGCAAATGTTACCATTGACTTTATTAATAAAA

TATAGTTTTGCTTTGCAAAAAAAAAAAAAAAAAA (SEQ ID N0:1).

En determinadas realizaciones, Rheb es al menos el 90% idéntica a la proteína codificada por SEQ ID NO: 1 (por ejemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la proteína codificada por SEQ ID NO: 1). En determinadas realizaciones, la Rheb es al menos el 90 % idéntica a la proteína codificada por la secuencia codificante de Rheb, SEQ ID NO:2 (por ejemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% idéntica a la proteína codificada por SEQ ID NO:2), indicada en negrita arriba. En determinadas realizaciones, Rheb es un mutante de Rheb constitutivamente activo (caRheb; S16H). En determinadas realizaciones, el ácido nucleico que codifica Rheb es un fragmento o variante de SEQ ID NO: 1 o 2, o tiene identidad sustancial con SEQ ID NO: 1 o 2.

[0021] En determinadas realizaciones, el regulador de mTORC1 es Rhes (Familia RASD, miembro 2 (RASD2) deHomo sapiens,secuencia de referencia de NCBI de ARNm: NM_014310.3). Secuencia de Rhes (secuencia codificante indicada en negrita):

CCCTTGCGCCTCCTTGCCCGGCCGCGCCCAGCCCGGCGTCCCGAGCAGCGCA

GGGGAGGATCCCCGCGCAGTGACCCGGGAGCCACCACAGACTCTGGGAGGCTCGG

CGGCTGGAGCAGCAGGCAGCTCCCCGCAGCTCCCGGCGCTTCCAGGCAGCTCTCTG

AGCCGTGCCAGAGGCCCGGCCCGCCATTCCCAGCCCCGAGCCATGATGAAGACTT

TGTCCAGCGGGAACTGCACGCTCAGTGTGCCCGCCAAAAACTCATACCGCATG

GTGGTGCTGGGTGCCTCTCGGGTGGGCAAGAGCTCCATCGTGTCTCGCTTCCT

CAATGGCCGCTTTGAGGACCAGTACACACCCACCATCGAGGACTTCCACCGTA

AGGTATACAACATCCGCGGCGACATGTACCAGCTCGACATCCTGGATACCTCT

GGCAACCACCCCTTCCCCGCCATGCGCAGGCTGTCCATCCTCACAGGGGATGT

CTTCATCCTGGTGTTCAGCCTGGATAACCGGGAGTCCTTCGATGAGGTCAAGC

GCCTTCAGAAGCAGATCCTGGAGGTCAAGTCCTGCCTGAAGAACAAGACCAAG

GAGGCGGCGGAGCTGCCCATGGTCATCTGTGGCAACAAGAACGACCACGGCG

AGCTGTGCCGCCAGGTGCCCACCACCGAGGCCGAGCTGCTGGTGTCGGGCGA

CGAGAACTGCGCCTACTTCGAGGTGTCGGCCAAGAAGAACACCAACGTGGACG

AGATGTTCTACGTGCTCTTCAGCATGGCCAAGCTGCCACACGAGATGAGCCCC

GCCCTGCATCGCAAGATCTCCGTGCAGTACGGTGACGCCTTCCACCCCAGGCC

CTTCTGCATGCGCCGCGTCAAGGAGATGGACGCCTATGGCATGGTCTCGCCCT

TCGCCCGCCGCCCCAGCGTCAACAGTGACCTCAAGTACATCAAGGCCAAGGTC

CTTCGGGAAGGCCAGGCCCGTGAGAGGGACAAGTGCACCATCCAGTGAGCGAGGGATGCTGGGGCGGGGCTTGGCCAGTGCCTTCAGGGAGGTGGCCCCAGATGCCCA CTGTGCGCATCTCCCCACCGAGGCCCCGGCAGCAGTCTTGTTCACAGACCTTAGGCA CCAGACTGGAGGCCCCCGGGCGCTGGCCTCCGCACATTCGTCTGCCTTCTCACAGCT TTCCTGAGTCCGCTTGTCCACAGCTCCTTGGTGGTTTCATCTCCTCTGTGGGAGGAC ACATCTCTGCAGCCTCAAGAGTTAGGCAGAGACTCAAGTTACACCTTCCTCTCCTGG GGTT GGA AGA A AT GTT GAT GC C AGAGGGGT GAGGATTGC T GC GT C AT AT GG AGC CT CCTGGGACAAGCCTCAGGATGAAAAGGACACAGAAGGCCAGATGAGAAAGGTCTC CTCTCTCCTGGCATAACACCCAGCTTGGTTTGGGTGGCAGCTGGGAGAACTTCTCTC CCAGCCCTGCAACTCTTACGCTCTGGTTCAGCTGCCTCTGCACCCCCTCCCACCCCC AGCACACACACAAGTTGGCCCCCAGCTGCGCCTGACATTGAGCCAGTGGACTCTGT GTCTGAAGGGGGCGTGGCCACACCTCCTAGACCACGCCCACCACTTAGACCACGCC CACCTCCTGACCGCGTTCCTCAGCCTCCTCTCCTAGGTCCCTCCGCCCGACAGTTGT GCTTTGTTGTGGTTGCAGCTGTTTTCGTGTCATGTATAGTAGTAGAAATGGAAATCA TTGTACTGTAAAAGCCTAGTGACTCCCTCCTTGGCCAGGCCCTCACCCAGTTCAGAT CCACGGCCTCCACCCGGGACGCCTTCCTCCTCTGCTCCCAAACAGGGTTTCCGTGGC CTGTTTGCAGCTAGACATTGACCTCCGCCATTGAGCTCCACGGTTTACAGACAATTG CACAAGCGTGGGGTGGGCAGGCCAGGACTGCTTTTTTTTAATGCTCCCATTTCACAG AGGATACCACCGAGACTCGGAGGGGACACGATGAGCACCAGGCCCCACCTTTGTCC CCTAGCAAATTCAGGGTACAGCTCCACCTAGAACCAGGCTGCCCTCTACTGTGCTCG TTCCTCAAGCATTTATTAAGCACCTACTGGGTGCTGGGTTCACTGTGTCCTAGGAAA CCAAGAGGGTCCCCAGTCCTGGCCTCTGCCCGCCCCTGCTGCCCCACCACCTTCTGC ACACACAGCGGTGGGGAGGCGGGGAGGAGCAGCTGGGACCCAGAACTGAGCCTGG GAGGGATCCGACAGAAAAGCTCAGGGCGGGTCTTCTCCTTGTGCCCGGGATTGGGC TATGCTGGGTACCACCATGTACTCAGGCATGGTGGGTTTTGAACCCATAAACCAAA GGCCCTTGTCATCAGCTCTTAACAAGTATATTTTGTATTTTAATCTCTCTAAACATAT TGAAGTTTTAGGGCCCTAAGGAACCTTAGTGATCTTCTATTGGGTCTTTCTGAGGTT C AGAGAGGGT A AGT A AC TTCC TC C AGGT C AC AC AGC A AGT C TGT GGGT GGC AGA AG CAAGCTAGCGCTGGGCATTCAGTACATACCACGATGTGCTCCCTCTCTTGATGCTTG GCCCCTGGGGCCTTCAGGGCTTTGGGACATCTTGTCCTCAACCCTCTCCCTAGATCA GTCTGTGAGGGTCCCTGTAGATATTGTGTACACCATGCCCATGTATATACAAGTACA CACAGATGTACACACAGATGTACACATGCTCCAGCCCCAGCTCTGCATACCTGCAC CTGCACCCCAGCCTTGGCCCCTGCCTGCGTCTGTGCTCAAAGCAGCAGCTCCAACCC TGCCTCTGTCCCCTTCCCCACCCACTGCCTGAGCCTTCTGAGCAGACCAGGTACCTT GGCTGCACCGGTGTGTGGCCCGCTCTCACCCAGGCACAGCCCCGCCACCATGGATC TCCGTGTACACTATCAATAAAAGTGGGTTTGTTACAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA AAA (SEQ ID N0:3).

En determinadas realizaciones, Rhes es al menos el 90%idéntica a la proteína codificada por SEQ ID NO: 3 (por ejemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o 100 % idéntica a la proteína codificada por SEQ ID NO:3). En determinadas realizaciones, la Rhes es al menos el 90 % idéntica a la proteína codificada por la secuencia codificante de Rhes, SEQ ID NO:4 (por ejemplo, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99% o 100% idéntica a la proteína codificada por SEQ ID NO:4), indicada en negrita arriba. En determinadas realizaciones, el ácido nucleico que codifica Rheb es un fragmento o variante de SEQ ID NO: 3 o 4, o tiene identidad sustancial con SEQ ID NO: 3 o 4.

[0022] En determinadas realizaciones, el agente terapéutico está contenido en un vector vírico. En determinadas realizaciones, el vector vírico es un vector vírico adenoasociado (AAV).

Casetes de expresión y vectores

[0023] La divulgación también proporciona un casete de expresión que comprende una secuencia que codifica Rhes o Rheb.

[0024] En determinadas realizaciones, el casete de expresión contiene además un promotor. En determinadas realizaciones, el promotor es un promotor regulable. En determinadas realizaciones, el promotor es un promotor constitutivo. En determinadas realizaciones, el promotor es un promotor de PGK, CMV o<r>S<v>.

[0025] La divulgación proporciona un vector que contiene el casete de expresión descrito anteriormente. En determinadas realizaciones, el vector es un vector vírico. En determinadas realizaciones, el vector vírico es un vector adenovírico, lentivírico, vírico adenoasociado (AAV), de poliovirus, VHS, o vírico basado en el Maloney murino.

[0026] "Casete de expresión", como se usa en el presente documento, significa una secuencia de ácido nucleico capaz de dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos particular en una célula hospedadora apropiada, que puede incluir un promotor unido operativamente a la secuencia de nucleótidos de interés que puede estar unida operativamente a señales de terminación. También puede incluir secuencias necesarias para la traducción adecuada de la secuencia de nucleótidos. La región codificante normalmente codifica una proteína de interés. El casete de expresión que incluye la secuencia de nucleótidos de interés puede ser quimérico. El casete de expresión también puede ser uno de origen natural pero que se haya obtenido en una forma recombinante útil para la expresión heteróloga. La expresión de la secuencia de nucleótidos en el casete de expresión puede estar bajo el control de un promotor constitutivo o de un promotor regulable que inicia la transcripción sólo cuando la célula hospedadora se expone a algún estímulo particular. En el caso de un organismo multicelular, el promotor también puede ser específico para un tejido, órgano o etapa del desarrollo particular.

[0027] "Unido operativamente" se refiere a la asociación de secuencias de ácido nucleico en un único fragmento de ácido nucleico de modo que la función de una de las secuencias se ve afectada por la otra. Por ejemplo, se dice que una secuencia de ADN reguladora está "unida operativamente" o "asociada con" una secuencia de ADN que codifica un ARN o un polipéptido si las dos secuencias están situadas de manera que la secuencia de ADN reguladora afecte la expresión de la secuencia de ADN codificante (es decir, que la secuencia codificante o ARN funcional está bajo el control transcripcional del promotor). Las secuencias codificantes pueden unirse operativamente a secuencias reguladoras en orientación sentido o antisentido.

Virus adenoasociados (AAV)

[0028] El virus adenoasociado (AAV) es un pequeño virus no patógeno de la familiaParvoviridae.El AAV se diferencia de los demás miembros de esta familia por su dependencia de un virus auxiliar para su replicación. En ausencia de un virus auxiliar, el AAV puede integrarse de manera específica de locus en el brazo q del cromosoma 19. El genoma de aproximadamente 5 kb del AAV consiste en un segmento de ADN monocatenario de polaridad positiva o negativa. Los extremos del genoma son repeticiones terminales invertidas cortas que pueden plegarse en estructuras de horquilla y servir como origen de replicación del ADN vírico. Desde el punto de vista físico, el virión del parvovirus no tiene envoltura y su cápsida icosaédrica tiene aproximadamente 20 nm de diámetro.

[0029] Hasta ahora, se han identificado numerosos VAA serológicamente distintos y se han aislado más de una docena de seres humanos o primates. El genoma de AAV2 tiene 4680 nucleótidos de longitud y contiene dos marcos de lectura abiertos (ORF). El ORF izquierdo codifica las proteínas Rep no estructurales, Rep 40, Rep 52, Rep 68 y Rep 78, que participan en la regulación de la replicación y la transcripción, además de la producción de genomas de progenie monocatenarios. Adicionalmente, dos de las proteínas Rep se han asociado con la integración preferencial de genomas de AAV en una región del brazo q del cromosoma 19 humano. También se ha demostrado que Rep68/78 posee actividad de unión a NTP, así como actividades de helicasa de ADN y ARN. Las proteínas Rep poseen una señal de localización nuclear, así como varios posibles sitios de fosforilación. La mutación de uno de estos sitios para cinasa dio como resultado en una pérdida de la actividad de replicación.

[0030] Los extremos del genoma son repeticiones terminales invertidas (ITR, del inglésinverted terminal repeats)cortas que tienen el potencial de plegarse en estructuras de horquilla en forma de T que sirven como origen de la replicación del ADN vírico. Dentro de la región del RTI se han descrito dos elementos que son fundamentales para la función del RTI, un motivo de repetición GAGC y el sitio de resolución terminal (trs). Se ha demostrado que el motivo de repetición se une a Rep cuando la ITR tiene una conformación lineal o de horquilla. Esta unión sirve para posicionar Rep68/78 para la escisión en el trs, que se produce de una manera específica de sitio y de cadena. Además de su papel en la replicación, estos dos elementos parecen ser fundamentales para la integración vírica. Dentro del locus de integración del cromosoma 19 se encuentra un sitio de unión de Rep con un trs adyacente. Se ha demostrado que estos elementos son funcionales y necesarios para la integración específica en el locus.

[0031] El virión del AAV es una partícula icosaédrica no envuelta de aproximadamente 25 nm de diámetro, que consiste en tres proteínas relacionadas denominadas VP1, VP2 y VP3. El ORF derecho codifica las proteínas de la cápsida VP1, VP2, y VP3. Estas proteínas se encuentran en una relación de 1:1:10 respectivamente y todas proceden del ORF derecho. Las proteínas de la cápsida se diferencian entre sí por el uso del corte y empalme alternativo y un codón de inicio inusual. El análisis por deleción ha demostrado que la eliminación o alteración de VP1 que se traduce a partir de un mensaje con corte y empalme alternativo da como resultado un rendimiento reducido de partículas infecciosas. Las mutaciones dentro de la región codificante de VP3 dan como resultado el fallo en la producción de ADN monocatenario de progenie o partículas infecciosas. Una partícula de AAV es una partícula vírica que comprende una proteína de la cápsida de AAV. Un polipéptido de la cápsida del AAV puede codificar la totalidad de los polipéptidos VP1, VP2 y VP3. La partícula puede ser una partícula que comprende AAV2 y otras proteínas de la cápsida del AAV (es decir, una proteína quimérica, tales como AAV1 y AAV2). En el presente documento se contemplan variaciones en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápsida de AAV2, siempre que la partícula vírica resultante que comprenda la cápsida del AAV2 permanezca antigénica o inmunológicamente distinta del AAV1, como puede determinarse rutinariamente mediante métodos convencionales. Específicamente, por ejemplo, Se pueden utilizar ELISA y transferencias de Western para determinar si una partícula vírica es antigénica o inmunológicamente distinta del AAV1. Adicionalmente, la partícula vírica de AAV2 conserva preferentemente un tropismo tisular distinto del AAV1.

[0032] Una partícula de AAV2 es una partícula vírica que comprende una proteína de la cápsida del AAV2. Un polipéptido de la cápsida del AAV2 que codifique la totalidad de los polipéptidos VP1, VP2 y VP3 puede tener en conjunto al menos el 63 % de homología (o identidad) con el polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos codificada por los nucleótidos expuestos en NC_001401 (secuencia de nucleótidos que codifica la proteína de la cápsida del AAV2). La proteína de la cápsida puede tener aproximadamente el 70 % de homología, aproximadamente el 75 % de homología, 80 % de homología, 85 % de homología, 90 % de homología, 95 % de homología, 98 % de homología, 99% de homología, o incluso el 100% de homología con la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en NC_001401. La proteína de la cápsida puede tener aproximadamente el 70 % de identidad, aproximadamente el 75 % de identidad, 80 % de identidad, 85 % de identidad, 90 % de identidad, 95 % de identidad, 98 % de identidad, 99 % de identidad, o incluso el 100 % de identidad con la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos expuesta en NC_001401. La partícula puede ser una partícula que comprende otra proteína de la cápsida del AAV y AAV2, es decir, una proteína quimérica. En el presente documento se contemplan variaciones en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápsida de AAV2, siempre que la partícula vírica resultante que comprenda la cápsida del AAV2 permanezca antigénicamente o inmunológicamente distinta del AAV4, como puede determinarse rutinariamente mediante métodos convencionales. Específicamente, por ejemplo, Se pueden utilizar ELISA y transferencias de Western para determinar si una partícula vírica es antigénica o inmunológicamente distinta del AAV1. Adicionalmente, la partícula vírica de AAV2, conserva preferentemente un tropismo tisular distinto del AAV1, tal como el ejemplificado en los ejemplos en el presente documento, aunque una partícula quimérica de VAA2 que comprende al menos una proteína de cubierta de VAA2 puede tener un tropismo tisular diferente al de una partícula de VAA2 que consiste únicamente en proteínas de cubierta de VAA2.

[0033] En determinadas realizaciones, la invención proporciona además una partícula de AAV2 que contiene, es decir, que encapsida, un vector que comprende un par de repeticiones terminales invertidas del AAV2. La secuencia de nucleótidos de las ITR del AAV2 se conocen en la técnica. Adicionalmente, la partícula puede ser una partícula que comprende la proteína de la cápsida tanto de AAV1 como de AAV2, es decir, una proteína quimérica. Además, la partícula puede ser una partícula que encapsida un vector que comprende un par de repeticiones terminales invertidas del AAV procedentes de otros AAV (por ejemplo, AAV1-AAV9 y AAVrh10). El vector encapsidado en la partícula puede comprender además un ácido nucleico exógeno insertado entre las repeticiones terminales invertidas.

[0034] Las siguientes características del AAV lo han convertido en un vector atractivo para la transferencia de genes. Se han mostrado que los vectores de AAV se integranin vitrode forma estable en el genoma celular; poseen una amplia gama de hospedadores; transducen células en división y no en divisiónin vitroein vivoy mantienen altos niveles de expresión de los genes transducidos. Las partículas víricas son termoestables, resistente a disolventes, a detergentes, a cambios en el pH, a la temperatura, y pueden concentrarse en gradientes de CsCl o por otros medios. La divulgación proporciona métodos para administrar partículas de AAV, vectores de AAV recombinantes y viriones de AAV recombinantes. Por ejemplo, una partícula de AAV2 es una partícula vírica que comprende una proteína de la cápsida de AAV2, o una partícula de AAV1 es una partícula vírica que comprende una proteína de la cápsida de AAV1. Un vector de AAV2 recombinante es una construcción de ácido nucleico que comprende al menos un ácido nucleico exclusivo de AAV2. Un virión de AAV2 recombinante es una partícula que contiene un vector de AAV2 recombinante. Para ser considerada dentro de la expresión "ITR de AAV2", la secuencia de nucleótidos debe conservar una o ambas características descritas en el presente documento que distinguen a la ITR de AAV2 de la ITR de AAV1: (1) tres (en lugar de cuatro como en AAV1) repeticiones "GAGC" y (2) en el sitio de unión de Rep de la ITR de AAV2, el cuarto nucleótido en las dos primeras repeticiones "GAGC" es una C en lugar de una T.

[0035] El promotor para impulsar la expresión de la proteína o la secuencia que codifica otro agente a suministrar puede ser cualquier promotor deseado, seleccionado por consideraciones conocidas, tales como el nivel de expresión de un ácido nucleico funcionalmente unido al promotor y el tipo de célula en la que se va a utilizar el vector. Los promotores pueden ser un promotor exógeno o endógeno. Los promotores pueden incluir, por ejemplo, promotores fuertes conocidos tales como SV40 o el promotor de metalotioneína inducible, o un promotor de AAV, tal como un promotor p5 de AAV. Los ejemplos adicionales de promotores incluyen promotores procedentes de genes de actina, genes de inmunoglobulina, citomegalovirus (CMV), adenovirus, virus del papiloma bovino, promotores adenovíricos, tales como el promotor tardío principal adenovírico, un promotor de choque térmico inducible, virus sincitial respiratorio, virus del sarcoma de Rous (RSV), etc. Los ejemplos adicionales incluyen promotores regulados.

[0036] El vector de AAV puede comprender además un ácido nucleico exógeno (heterólogo) funcionalmente unido al promotor. Por "ácido nucleico heterólogo" se entiende que cualquier ácido nucleico heterólogo o exógeno puede insertarse en el vector para su transferencia a una célula, tejido u organismo. El ácido nucleico puede codificar un polipéptido o una proteína o un ARN antisentido, por ejemplo. Por "unido funcionalmente" se entiende que el promotor puede propiciar la expresión del ácido nucleico heterólogo, como se conoce en la técnica, tal como la orientación apropiada del promotor con respecto al ácido nucleico heterólogo. Adicionalmente, el ácido nucleico heterólogo tiene preferentemente todas las secuencias apropiadas para la expresión del ácido nucleico, como se conoce en la materia, para codificar funcionalmente, es decir, permitir que el ácido nucleico se exprese. El ácido nucleico puede incluir, por ejemplo, secuencias de control de la expresión, tales como un potenciador y sitios de procesamiento de información necesarios, tales como sitios de unión a ribosomas, sitios de corte y empalme de ARN, sitios de poliadenilación y secuencias terminadoras transcripcionales. El ácido nucleico puede codificar más de un producto genético, limitado únicamente por el tamaño del ácido nucleico que se puede empaquetar.

[0037] El ácido nucleico heterólogo puede codificar proteínas beneficiosas que reemplazan las proteínas faltantes o defectuosas necesarias para el sujeto al que se transfiere el vector, tales como Rheb o Rhes.

[0038] Una partícula de AAV1 es una partícula vírica que comprende una proteína de la cápsida del AAV1. En el presente documento se contemplan variaciones en la secuencia de aminoácidos de la proteína de la cápsida de AAV1, siempre que la partícula vírica resultante que comprenda la cápsida del AAV1 permanezca antigénicamente o inmunológicamente distinta de otras cápsidas del AAV, como puede determinarse rutinariamente mediante métodos convencionales. Específicamente, por ejemplo, se pueden utilizar ELISA y transferencias de Western para determinar si una partícula vírica es antigénica o inmunológicamente distinta de otros serotipos de AAV.

[0039] El término "polipéptido", como se usa en el presente documento, se refiere a un polímero de aminoácidos e incluye proteínas de longitud completa y fragmentos de las mismas. Por tanto, "proteína" y "polipéptido" a menudo se usan indistintamente en el presente documento. Las sustituciones pueden seleccionarse por parámetros conocidos para que sean neutros. Como apreciarán los expertos en la materia, la divulgación también incluye los polipéptidos que tienen ligeras variaciones en las secuencias de aminoácidos u otras propiedades. Tales variaciones pueden surgir naturalmente como variaciones alélicas (por ejemplo, debido a polimorfismo genético) o pueden producirse por intervención humana (por ejemplo, mediante mutagénesis de secuencias de ADN clonadas), tal como mutantes inducidos puntuales, de deleción, de inserción y de sustitución. Generalmente se prefieren cambios menores en la secuencia de aminoácidos, tales como sustituciones conservadoras de aminoácidos, pequeñas deleciones o inserciones internas, y adiciones o deleciones en los extremos de las moléculas. Estas modificaciones pueden dar como resultado cambios en la secuencia de aminoácidos, proporcionar mutaciones silenciosas, modificar un sitio de restricción o proporcionar otras mutaciones específicas.

[0040] La divulgación proporciona un método para suministrar un ácido nucleico a una célula que comprende administrar a la célula una partícula de AAV que contiene un vector que comprende el ácido nucleico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas del AAV, suministrando así el ácido nucleico a la célula. La administración a la célula se puede realizar por cualquier medio, incluyendo simplemente poner en contacto la partícula, opcionalmente contenida en un líquido deseado tal como medio de cultivo de tejidos, o una solución salina tamponada, con las células. Se puede permitir que la partícula permanezca en contacto con las células durante cualquier período de tiempo deseado y normalmente la partícula se administra y se deja permanecer indefinidamente. Para tales métodosin vitro,el virus puede administrarse a la célula por métodos de transducción vírica convencionales, como se conoce en la técnica y como se ejemplifica en el presente documento. Los títulos de los virus a administrar pueden variar, particularmente dependiendo del tipo de célula, pero será típico del utilizado para la transducción de AAV en general. Además, se pueden utilizar los títulos utilizados para transducir las células particulares en los presentes ejemplos. Las células pueden incluir cualquier célula deseada en humanos así como en otros mamíferos grandes (no roedores), tales como primates, caballo, oveja, cabra, cerdo y perro.

[0041] Más específicamente, la divulgación proporciona un método para suministrar un ácido nucleico a una célula en el cerebro, particularmente neuronas espinosas medianas, que comprende el ácido nucleico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas del AAV, suministrando así el ácido nucleico a la célula.

[0042] La divulgación proporciona además un método para suministrar un ácido nucleico a una célula en un sujeto que comprende administrar al sujeto una partícula de AAV que comprende el ácido nucleico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas del AAV, suministrando así el ácido nucleico a una célula del sujeto.

[0043] También se proporciona un método para suministrar un ácido nucleico a una célula cerebral, tal como una neurona en el cuerpo estriado o la corteza en un sujeto, que comprende administrar al sujeto una partícula de AAV que comprende el ácido nucleico insertado entre un par de repeticiones terminales invertidas del AAV, suministrando así el ácido nucleico a la neurona u otra célula del sujeto.

[0044] Ciertas realizaciones de la presente divulgación proporcionan una célula que comprende un vector vírico como se describe en el presente documento.

Vectores AAV

[0045] El vector vírico de la divulgación es un vector de AAV. Un vector de "AAV" se refiere a un virus adenoasociado, y puede usarse para referirse al propio virus de tipo silvestre de origen natural o a sus derivados. El término cubre todos los subtipos, serotipos y pseudotipos, y formas tanto de origen natural como recombinantes, excepto cuando se precisó otra cosa. Como se usa en el presente documento, el término "serotipo" se refiere a un AAV que se identifica y se distingue de otros AAV basándose en la reactividad de las proteínas de la cápsida con antisueros definidos, por ejemplo, existen ocho serotipos conocidos de VAA de primates, AAV-1 a AAV-9 y AAVrh10. Por ejemplo, el serotipo AAV2 se utiliza para referirse a un AAV que contiene proteínas de la cápsida codificadas a partir del gen cap de AAV2 y un genoma que contiene secuencias de ITR 5' y 3' del mismo serotipo de AAV2. Como se usa en el presente documento, por ejemplo, rAAV1 puede usarse para referirse a un AAV que tiene proteínas de la cápsida e ITR 5'-3' del mismo serotipo o puede referirse a un AAV que tiene proteínas de la cápsida de un serotipo y las ITR 5'-3' de un serotipo de AAV diferente, por ejemplo, la cápsida de AAV serotipo 2 y las ITR del AAV serotipo 5. Para cada ejemplo ilustrado en el presente documento, la descripción del diseño y producción del vector describe el serotipo de la cápsida y las secuencias de las ITR 5'-3'. La abreviatura "rAAV" se refiere a virus adenoasociado recombinante, también denominado vector de AAV recombinante (o "vector de rAAV").

[0046] Un "virus AAV" o "partícula vírica de AAV" se refiere a una partícula vírica compuesta por al menos una proteína de la cápsida de AAV (preferentemente por todas las proteínas de la cápsida de un AAV de tipo silvestre) y un polinucleótido encapsidado. Si la partícula comprende un polinucleótido heterólogo (es decir, un polinucleótido distinto de un genoma de AAV de tipo silvestre, tal como un transgén que se suministrará a una célula de mamífero), normalmente se le denomina "rAAV".

[0047] En una realización, los vectores de expresión de AAV se construyen usando técnicas conocidas para proporcionar al menos componentes unidos operativamente en la dirección de la transcripción, elementos de control que incluyen una región de iniciación transcripcional, el ADN de interés y una región de terminación transcripcional. Los elementos de control se seleccionan para que sean funcionales en una célula de mamífero. La construcción resultante que contiene los componentes unidos operativamente está flanqueada (5' y 3') por secuencias ITR del AAV funcionales.

[0048] Por "repeticiones terminales invertidas de virus adenoasociados" o "ITR de AAV" se entiende las regiones reconocidas en la técnica que se encuentran en cada extremo del genoma de AAV que funcionan juntas enciscomo orígenes de replicación del ADN y como señales de empaquetamiento para el virus. Las ITR del AAV, junto con la región codificante de rep AAV, proporcionan la escisión y rescate eficientes e integración de una secuencia de nucleótidos interpuestos entre dos ITR flanqueantes en el genoma de una célula de mamífero.

[0049] Las secuencias de nucleótidos de las regiones ITR del AAV son conocidas. Como se usa en el presente documento, una "ITR del AAV" no necesita tener representada la secuencia de nucleótidos de tipo silvestre, pero puede ser alterada, por ejemplo, por la inserción, deleción o sustitución de nucleótidos. Adicionalmente, la ITR del AAV puede obtenerse de cualquiera de varios serotipos de AAV, entre los que se incluyen, sin limitación, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7, etc. Adicionalmente, las ITR 5' y 3' que flanquean una secuencia de nucleótidos seleccionada en un vector de AAV no necesitan ser necesariamente idénticas o proceder del mismo serotipo o aislado de AAV, siempre y cuando funcionen según lo previsto, es decir, para permitir la escisión y el rescate de la secuencia de interés de un genoma o vector de una célula hospedadora, y para permitir la integración de la secuencia heteróloga en el genoma de la célula receptora cuando los productos del gen Rep de AAV están presentes en la célula.

[0050] En una realización, las ITR del AAV pueden proceder de cualquiera de varios serotipos de AAV, entre los que se incluyen, sin limitación, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV7, etc. Adicionalmente, las ITR 5' y 3' que flanquean una secuencia de nucleótidos seleccionada en un vector de expresión de AAV no necesitan ser necesariamente idénticas o proceder del mismo serotipo o aislado de AAV, siempre y cuando funcionen según lo previsto, es decir, para permitir la escisión y el rescate de la secuencia de interés de un genoma o vector de una célula hospedadora, y para permitir la integración de la molécula de ADN en el genoma de la célula receptora cuando los productos del gen Rep de AAV están presentes en la célula.

[0051] En una realización, las cápsidas de AAV pueden proceder de AAV2. Las moléculas de ADN adecuadas para su uso en vectores de AAV tendrán menos de aproximadamente 5 kilobases (kb), menos de aproximadamente 4,5 kb, menos de aproximadamente 4 kb, menos de aproximadamente 3,5 kb, menos de aproximadamente 3 kb, menos de aproximadamente 2,5 kb de tamaño, y son conocidas en la técnica.

[0052] En una realización, la secuencia de nucleótidos seleccionada está operativamente unida a elementos de control que dirigen la transcripción o expresión de la misma en el sujetoin vivo.Dichos elementos de control pueden comprender secuencias de control normalmente asociadas con el gen seleccionado. Como alternativa, se pueden emplear secuencias de control heterólogas. Las secuencias de control heterólogas útiles generalmente incluyen las obtenidas de secuencias que codifican genes de mamíferos o víricos. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, el promotor temprano de SV40, el promotor del virus de tumor mamario de ratón (LTR, por sus siglas en inglés); promotor tardío principal de adenovirus (Ad MLP); un promotor del virus del herpes simple (HSV), un promotor del citomegalovirus (CMV), tal como la región del promotor temprano inmediato del CMV (CMVIE), un promotor del virus del sarcoma de Rous (RSV), promotores de pol II, promotores de pol III, promotores sintéticos, promotores híbridos, y similares. Además, las secuencias procedentes de genes no víricos, tales como el gen murino de la metalotioneína, también encontrarán uso en el presente documento. Dichas secuencias promotoras están disponibles en el mercado en, por ejemplo, Stratagene (San Diego, Calif.).

[0053] En una realización, tanto los promotores heterólogos como otros elementos de control, tales como promotores inducibles y específicos del SNC, potenciadores y similares, serán de especial utilidad. Los ejemplos de promotores heterólogos incluyen el promotor de CMV. Loa ejemplos de promotores específicos del SNC incluyen los aislados de los genes de la proteína básica de mielina (MBP), la proteína ácida fibrilar de la glía (GFAP) y la enolasa específica de neuronas (NSE). Los ejemplos de promotores inducibles incluyen elementos sensibles del ADN para ecdisona, tetraciclina, hipoxia y aufina.

[0054] En una realización, el vector de expresión de AAV que alberga la molécula de ADN de interés unida por las ITR del AAV, se puede construir insertando directamente la secuencia o secuencias seleccionadas en un genoma de AAV al que se le han extraído los principales marcos de lectura abiertos ("ORF") de AAV. También se pueden eliminar otras porciones del genoma del AAV, siempre que quede una porción suficiente de las ITR para permitir funciones de replicación y empaquetamiento. Tales construcciones pueden diseñarse usando técnicas bien conocidas en la técnica.

[0055] Como alternativa, las ITR del AAV se pueden escindir del genoma vírico o de un vector de AAV que contiene las mismas y fusionarse a 5' y 3' de una construcción de ácido nucleico seleccionada que está presente en otro vector usando técnicas de ligamiento convencionales. Por ejemplo, los ligamientos se pueden realizar en Tris-Cl 20 mM, pH 7,5, MgCl 10 mM2, TDT 10 mM, BSA 33 pg/ml, NaCl 10 mM-50 mM y ATP 40 uM, 0,01-0,02 unidades (Weiss) de ADN ligasa T4 a 0 °C (para ligamiento de "extremo cohesivo") o ATP 1 mM, 0,3-0,6 unidades (Weiss) de ADN ligasa T4 a 14 °C (para ligamiento de "extremo romo").

Los ligamientos intermoleculares de "extremos cohesivos" normalmente se realizan a concentraciones de ADN totales de 30-100 pg/ml (concentración final total de 5-100 nM). Vectores de AAV que contienen ITR.

[0056] Adicionalmente, se pueden producir genes quiméricos sintéticamente para incluir secuencias ITR del AAV dispuestas en 5' y 3' de una o más secuencias de ácidos nucleicos seleccionadas. Pueden usarse codones preferidos para la expresión de la secuencia génica quimérica en células del SNC de mamíferos. La secuencia quimérica completa se ensambla a partir de oligonucleótidos solapantes preparados mediante métodos convencionales.

[0057] Para producir viriones de rAAV, se introduce un vector de expresión de AAV en una célula hospedadora adecuada usando técnicas conocidas, tales como por transfección. Se conocen generalmente en la técnica numerosas técnicas de transfección. Véase, por ejemplo, Sambrooket al.(1989) Molecular Cloning, a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Nueva York. Los métodos de transfección particularmente adecuados incluyen la coprecipitación con fosfato de calcio, microinyección directa en células cultivadas, electroporación, transferencia de genes mediada por liposomas, transducción mediada por lípidos y suministro de ácidos nucleicos mediante microproyectiles de alta velocidad.

[0058] En una realización, las células hospedadoras adecuadas para producir viriones de rAAV incluyen microorganismos, células de levadura, células de insecto o células de mamífero, que pueden ser, o haber sido, utilizadas como receptores de una molécula de ADN heteróloga. La expresión incluye la progenie de la célula original que se ha transfectado. Por tanto, una "célula hospedadora" como se usa en el presente documento se refiere a una célula que se ha transfectado con una secuencia de ADN exógeno. Las células de la línea celular humana estable, 293 (fácilmente disponible a través de, por ejemplo, la Colección Americana de Cultivos Tipo con el Número de Referencia ATCC CRL1573) se pueden utilizar en la práctica de la presente divulgación. Particularmente, la línea celular humana 293 es una línea celular de riñón embrionario humano que se ha transformado con fragmentos de ADN de adenovirus tipo 5 y expresa los genes adenovíricos E1a y E1b. La línea celular 293 se transfecta fácilmente y proporciona una plataforma particularmente conveniente para producir viriones de rAAV.

[0059] Por "región codificante de rep de AAV" se entiende la región reconocida en la técnica del genoma de AAV que codifica las proteínas de replicación Rep 78, Rep 68, Rep 52 y Rep 40. Se ha demostrado que estos productos de expresión Rep poseen muchas funciones, entre ellas el reconocimiento, unión y mellado del origen de replicación del ADN del AAV, actividad de ADN helicasa y modulación de la transcripción a partir de promotores AAV (u otros heterólogos). Los productos de expresión Rep son necesarios colectivamente para replicar el genoma de AAV. Los homólogos adecuados de la región codificante de rep de AAV incluyen el gen rep del herpesvirus humano 6 (HHV-6), que también se sabe que participa en la replicación del ADN de AAV-2.

[0060] Por "región codificante de cap de AAV" se entiende la región reconocida en la técnica del genoma de AAV que codifica las proteínas de la cápsida VP1, VP2 y VP3 u homólogos funcionales de las mismas. Estos productos de expresión de Cap suministran las funciones de empaquetamiento que se precisan colectivamente para empaquetar el genoma vírico.

[0061] En una realización, las funciones auxiliares del AAV se introducen en la célula hospedadora transfectando la célula hospedadora con una construcción auxiliar de AAV antes o al mismo tiempo que, la transfección del vector de expresión de AAV. Por lo tanto, se utilizan construcciones auxiliares de AAV para proporcionar al menos la expresión transitoria de los genes rep y/o cap de AAV para complementar las funciones faltantes de AAV que son necesarias para una infección productiva por AAV. Las construcciones auxiliares de AAV carecen de la ITR del AAV y no pueden replicarse ni empaquetarse. Estas construcciones pueden tener la forma de un plásmido, fago, transposón, cósmido, virus o virión. Se han descrito varias construcciones auxiliares de AAV, tales como los plásmidos comúnmente utilizados pAAV/Ad y pIM29+45 que codifican productos de expresión tanto de Rep como de Cap. Se han descrito varios otros vectores que codifican productos de expresión de Rep y/o Cap.

[0062] Los métodos de suministro de vectores víricos incluyen inyectar el AAV en el sujeto. Por lo general, los viriones de rAAV pueden introducirse en células del SNC utilizando técnicas de transducciónin vivooin vitro.Si se transducein vitro,la célula del receptor deseada se retirará del sujeto, se transducirá con viriones de rAAV y se reintroducira en el sujeto. Como alternativa, se pueden usar células singénicas o xenogénicas cuando las células no generen una respuesta inmunitaria inapropiada en el sujeto.

[0063] Se han descrito métodos adecuados para el suministro e introducción de células transducidas en un sujeto. Por ejemplo, las células pueden transducirsein vitrocombinando viriones de AAV recombinantes con células del SNC, por ejemplo, en medios apropiados, y el cribado de las células que albergan el ADN de interés se puede cribar usando técnicas convencionales tales como transferencias de Southern y/o PCR, o usando marcadores de selección. Las células transducidas pueden luego formularse en composiciones farmacéuticas, descritas más detalladamente a continuación, y la composición introducida en el sujeto mediante diversas técnicas, tales como por injertado, inyección intramuscular, intravenosa, subcutánea e intraperitoneal.

[0064] En una realización, las composiciones farmacéuticas comprenderán suficiente material genético para producir una cantidad terapéuticamente eficaz del ácido nucleico de interés, es decir, una cantidad suficiente para reducir o mejorar los síntomas de la patología en cuestión o una cantidad suficiente para conferir el beneficio deseado. Las composiciones farmacéuticas también contendrán un excipiente farmacéuticamente aceptable. Tales excipientes incluyen cualquier agente farmacéutico que no induce por sí mismo la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que recibe la composición y que puede administrarse sin producir toxicidad indebida. Los excipientes farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, sorbitol, Tween80 y líquidos tales como agua, solución salina, glicerol y etanol. En el presente documento, pueden incluirse sales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo, sales de ácidos minerales, tales como clorhidratos, bromhidratos, fosfatos, sulfatos y similares; y las sales de ácidos orgánicos, tales como acetatos, propionatos, malonatos, benzoatos y similares. Adicionalmente, pueden estar presentes en dichos vehículos sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponantes del pH y similares. Un análisis exhaustivo de excipientes farmacéuticamente aceptables está disponible en Remington' s Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991).

[0065] Debe entenderse que el vector vírico suministrado podría expresar más de un transgén. Como alternativa, también pueden suministrarse al sujeto vectores separados, cada uno de los cuales expresa uno o más transgenes distintos, como se describe en el presente documento. Adicionalmente, también se pretende que los vectores víricos suministrados mediante los métodos de la presente divulgación se combinen con otras composiciones y terapias adecuadas.

[0066] Como resulta evidente para los expertos en la materia en vista de las enseñanzas de la presente memoria descriptiva, se puede determinar empíricamente una cantidad eficaz de vector vírico que debe añadirse. La administración puede realizarse en una dosis, de forma continua o intermitente durante el curso del tratamiento. Los métodos para determinar los medios y las dosificaciones de administración más eficaces son bien conocidos por los expertos en la materia y variarán en función del vector vírico, la composición de la terapia, las células diana y el sujeto que se está tratando. Se pueden realizar administraciones únicas o múltiples, siendo el médico tratante quien seleccione el nivel y la pauta de la dosis.

[0067] En determinadas realizaciones, el rAAV se administra en una dosis de aproximadamente 0,3-2 ml de 1 x1051 x1016gv/ml. En determinadas realizaciones, el rAAV se administra en una dosis de aproximadamente 1-3 ml de 1 x107-1 x1014gv/ml. En determinadas realizaciones, el rAAV se administra en una dosis de aproximadamente 1-2 ml de 1 x108-1 x1013gv/ml.

[0068] Las formulaciones que contienen partículas de rAAV contendrán una cantidad eficaz de partículas de rAAV en un vehículo, siendo la cantidad eficaz fácilmente determinada por un experto en la materia. Las partículas de rAAV normalmente pueden variar de aproximadamente el 1 % y aproximadamente el 95 % (p/p) de la composición, o incluso más o menos, si corresponde. La cantidad a administrar depende de factores tales como la edad, el peso y el estado físico del sujeto animal o humano considerado para el tratamiento. Un experto en la materia puede establecer dosis eficaces mediante ensayos de rutina que establezcan curvas de respuesta a la dosis. El sujeto se trata mediante la administración de partículas de rAAV en una o más dosis. Se pueden administrar múltiples dosis según sea necesario para mantener una actividad enzimática adecuada.

[0069] Con la invención en cuestión pueden emplearse vehículos que incluyan agua, solución salina acuosa, LCR artificial u otras sustancias conocidas. Para preparar una formulación, la composición purificada se puede aislar, liofilizar y estabilizar. La composición puede entonces ajustarse a una concentración apropiada, opcionalmente combinarse con un agente antiinflamatorio y envasarse para su uso.

[0070] La divulgación proporciona un método para aumentar el nivel de una proteína diana en una célula mediante la introducción de una proteína o molécula de ácido nucleico que codifica una proteína descrita anteriormente en una célula en una cantidad suficiente para aumentar el nivel de la proteína diana en la célula. En determinadas realizaciones, la acumulación de proteína diana aumenta en al menos el 10%. La acumulación de proteína diana aumenta en al menos el 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % 95 % o 99 %.

Ácidos nucleicos que codifican agentes terapéuticos

[0071] La expresión "ácido nucleico" se refiere a desoxirribonucleótidos o ribonucleótidos y polímeros de los mismos en forma tanto monocatenaria como bicatenaria, compuestos por monómeros (nucleótidos) que contienen un azúcar, fosfato y una base que es purina o pirimidina. A menos que esté específicamente limitado, la expresión abarca los ácidos nucleicos que contienen análogos conocidos de nucleótidos naturales que tienen propiedades de unión similares a las del ácido nucleico de referencia y que se metabolizan de manera similar a la de los nucleótidos de origen natural. A menos que se indique otra cosa, una secuencia particular del ácido nucleico también abarca variantes modificadas conservativamente de la misma (por ejemplo, sustituciones de codones degenerados) y secuencias complementarias, así como la secuencia explícitamente indicada. Específicamente, las sustituciones de codones degenerados pueden lograrse generando secuencias en las que la tercera posición de uno o más codones seleccionados (o todos) está sustituida con restos de base mixta y/o desoxiinosina.

[0072] Un "fragmento de ácido nucleico" es una porción de una molécula de ácido nucleico determinada. El ácido desoxirribonucleico (ADN) en la mayoría de los organismos es el material genético, mientras que el ácido ribonucleico (ARN) participa en la transferencia de la información contenida en el ADN a las proteínas. La presente divulgación también abarca fragmentos y variantes de las secuencias de nucleótidos divulgadas y proteínas o proteínas de longitud parcial codificadas por las mismas. Por "fragmento" o "porción" se entiende una longitud completa o menos que la longitud completa de la secuencia de nucleótidos que codifica, o la secuencia de aminoácidos de, un polipéptido o proteína. En determinadas realizaciones, el fragmento o porción es biológicamente funcional (es decir, conserva el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de Rheb o Rhes).

[0073] Una "variante" de una molécula es una secuencia que es sustancialmente similar a la secuencia de la molécula nativa. Para secuencias de nucleótidos, las variantes incluyen las secuencias que, a causa de la degeneración del código genético, codifican la secuencia de aminoácidos idéntica a la proteína nativa. Variantes alélicas de origen natural tales como éstas pueden identificarse con el uso de técnicas de biología molecular, como, por ejemplo, con la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y técnicas de hibridación. Las secuencias de nucleótidos variantes también incluyen secuencias de nucleótidos obtenidas sintéticamente, tales como los generadas, por ejemplo, usando mutagénesis dirigida, que codifican la proteína nativa, así como las que codifican un polipéptido que tiene sustituciones de aminoácidos. Por lo general, las variantes de secuencia de nucleótidos de la divulgación tendrán al menos el 40 %, 50 %, 60 %, hasta el 70 %, por ejemplo, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, hasta el 79 %, generalmente al menos el 80 %, por ejemplo, 81 %-84 %, al menos el 85 %, por ejemplo, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, hasta el 98 %, de identidad de secuencia con la secuencia de nucleótidos nativa (endógena). En determinadas realizaciones, la variante es biológicamente funcional (es decir, conserva el 5 %, 10 %, 15 %, 20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 99 % o 100 % de actividad de Rhes o Rheb de tipo silvestre).

[0074] "Variaciones modificadas de forma conservativa" de una secuencia de ácido nucleico particular se refiere a las secuencias de ácido nucleico que codifican secuencias de aminoácidos idénticas o esencialmente idénticas. A causa de la degeneración del código genético, un gran número de ácidos nucleicos funcionalmente idénticos codifican cualquier polipéptido dado. Por ejemplo, los codones CGT, CGC, CGA, CGG, AGA y AGG, codifican todos el aminoácido arginina. Por tanto, en cada posición donde se especifica una arginina mediante un codón, el codón puede alterarse a cualquiera de los codones descritos correspondientes sin alterar la proteína codificada. Dichas variaciones de ácido nucleico son "variaciones silenciosas", que son un tipo de "variaciones modificadas de forma conservativa". Cada secuencia de ácido nucleico descrita en el presente documento que codifica un polipéptido también describe cada posible variación silenciosa, salvo que se indique lo contrario. Un experto en la materia reconocerá que cada codón en un ácido nucleico (excepto ATG, que normalmente es el único codón para la metionina) puede modificarse para producir una molécula funcionalmente idéntica mediante técnicas convencionales. Por consiguiente, cada "variación silenciosa" de un ácido nucleico que codifica un polipéptido está implícita en cada secuencia descrita.

[0075] La expresión "identidad sustancial" de secuencias de polinucleótidos significa que un polinucleótido comprende una secuencia que tiene al menos el 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, o al menos el 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, o al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, o incluso al menos el 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia, en comparación con una secuencia de referencia usando uno de los programas de alineación descritos usando parámetros convencionales. Un experto en la materia reconocerá que estos valores pueden ajustarse adecuadamente para determinar la identidad correspondiente de proteínas codificadas por dos secuencias de nucleótidos, teniendo en cuenta la degeneración de codones, la similitud de aminoácidos, el posicionamiento del marco de lectura y similares. Para estos fines, la identidad sustancial de las secuencias de aminoácidos normalmente significa una identidad de secuencia de al menos el 70 %, al menos el 80 %, 90 %, o incluso al menos el 95 %.

[0076] La expresión "identidad sustancial" en el contexto de un péptido indica que un péptido comprende una secuencia con al menos el 70 %, 71 %, 72 %, 73 %, 74 %, 75 %, 76 %, 77 %, 78 %, 79 %, u 80 %, 81 %, 82 %, 83 %, 84 %, 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, o al menos el 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, o 94 %, o incluso, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 %, de identidad de secuencia con la secuencia de referencia en una ventana de comparación especificada. Una indicación de que dos secuencias peptídicas son sustancialmente idénticas es que un péptido es inmunológicamente reactivo con anticuerpos generados contra el segundo péptido. Por tanto, un péptido es sustancialmente idéntico a un segundo péptido, por ejemplo, cuando los dos péptidos difieren solo por sustituciones conservativas.

Métodos para introducir material genético en las células

[0077] El material genético exógeno (por ejemplo, un ADNc que codifica una o más proteínas terapéuticas) se introduce en la célulain vivomediante métodos de transferencia genética, tales como la transfección o la transducción, para proporcionar una célula genéticamente modificada. Un experto en la materia conoce diversos vectores de expresión (es decir, vehículos para facilitar el suministro de material genético exógeno a una célula diana).

[0078] Como se usa en el presente documento, "transfección de células" se refiere a la adquisición por parte de una célula de nuevo material genético mediante la incorporación de ADN añadido. Por tanto, la transfección se refiere a la inserción de ácido nucleico en una célula mediante métodos físicos o químicos. Los expertos en la materia conocen varias técnicas de transfección, entre las que se incluyen: coprecipitación de ADN con fosfato de calcio; DEAEdextrano; electroporación; transfección mediada por liposomas catiónicos; y bombardeo de micropartículas facilitado por partículas de tungsteno. La coprecipitación del ADN con fosfato de estroncio es otro posible método de transfección.

[0079] En cambio, "transducción de células" se refiere al proceso de transferir ácido nucleico a una célula utilizando un virus de ADN o ARN. Un virus de ARN (es decir, un retrovirus) para transferir un ácido nucleico a una célula se denomina en el presente documento retrovirus quimérico transductor. El material genético exógeno contenido dentro del retrovirus se incorpora al genoma de la célula transducida. Una célula que se ha transducido con un virus de ADN quimérico (por ejemplo, un adenovirus que porta un ADNc que codifica un agente terapéutico), no tendrá el material genético exógeno incorporado a su genoma pero será capaz de expresar el material genético exógeno que se conserva extracromosómicamente dentro de la célula.

[0080] Normalmente, el material genético exógeno incluye el gen heterólogo (normalmente en forma de ADNc que comprende los exones que codifican la proteína terapéutica) junto con un promotor para controlar la transcripción del nuevo gen. Característicamente, el promotor tiene una secuencia de nucleótidos específica necesaria para iniciar la transcripción. Opcionalmente, el material genético exógeno incluye además secuencias adicionales (es decir, potenciadores) necesarias para obtener la actividad de transcripción del gen deseada. A los efectos de este análisis, un "potenciador" es simplemente cualquier secuencia de ADN no traducida que funciona de manera contigua a la secuencia codificante (encis)para cambiar el nivel de transcripción basal dictado por el promotor. El material genético exógeno puede introducirse en el genoma celular inmediatamente secuencia abajo del promotor de modo que el promotor y la secuencia codificante estén unidos operativamente para permitir la transcripción de la secuencia codificante. Un vector de expresión retrovírico puede incluir un elemento promotor exógeno para controlar la transcripción del gen exógeno insertado. Dichos promotores exógenos incluyen promotores tanto constitutivos como inducibles.

[0081] Los promotores constitutivos naturales controlan la expresión de funciones celulares esenciales. Como resultado, un gen bajo el control de un promotor constitutivo se expresa en todas las condiciones de crecimiento celular. Los promotores constitutivos ilustrativos incluyen los promotores de los siguientes genes que codifican ciertas funciones constitutivas o "de mantenimiento": promotor de hipoxantina fosforribosil transferasa (HPRT), dihidrofolato reductasa (DHFR), adenosina desaminasa, fosfoglicerol cinasa (PGK), piruvato cinasa, fosfoglicerol mutasa, actina y otros promotores constitutivos conocidos por los expertos en la materia. Además, muchos promotores víricos funcionan constitutivamente en las células eucariotas. Esto incluyen: los promotores tempranos y tardíos de SV40; las repeticiones terminales largas (LTR) del virus de la leucemia de Moloney y otros retrovirus; y el promotor de timidina cinasa del virus del herpes simple, entre muchos otros. Por consiguiente, cualquiera de los promotores constitutivos mencionados anteriormente puede usarse para controlar la transcripción de un inserto génico heterólogo.

[0082] Los genes que están bajo el control de promotores inducibles se expresan sólo o en mayor grado, en presencia de un agente inductor, (por ejemplo, la transcripción bajo el control del promotor de metalotioneína aumenta considerablemente en presencia de ciertos iones metálicos). Los promotores inducibles incluyen elementos sensibles (ES) que estimulan la transcripción cuando se unen sus factores inductores. Por ejemplo, hay ES para factores séricos, hormonas esteroides, ácido retinoico y AMP cíclico. Se pueden elegir promotores que contengan un ES particular para obtener una respuesta inducible y, en algunos casos, el propio ES puede estar unido a un promotor diferente, confiriendo así inducibilidad al gen recombinante. Por tanto, seleccionando el promotor apropiado (constitutivo frente a inducible; fuerte frente a débil), es posible controlar tanto la existencia como el nivel de expresión de un agente terapéutico en la célula genéticamente modificada. Si el gen que codifica el agente terapéutico está bajo el control de un promotor inducible, el suministro del agente terapéuticoin situse desencadena al exponer la célula genéticamente modificadain situa las condiciones para permitir la transcripción del agente terapéutico, por ejemplo, mediante inyección intraperitoneal de inductores específicos de los promotores inducibles que controlan la transcripción del agente. Por ejemplo, la expresiónin situpor parte de células genéticamente modificadas de un agente terapéutico codificado por un gen bajo el control del promotor de metalotioneína, se potencia al poner en contacto las células genéticamente modificadas con una solución que contiene los iones metálicos apropiados (es decir, inductores)in situ.

[0083] Por consiguiente, la cantidad de agente terapéutico que se administrain situse regula controlando factores tales como: (1) la naturaleza del promotor utilizado para dirigir la transcripción del gen insertado, (es decir, si el promotor es constitutivo o inducible, fuerte o débil); (2) el número de copias del gen exógeno que se insertan en la célula; (3) el número de células transducidas/transfectadas que se administran (por ejemplo, se implantan) al paciente; (4) el tamaño del implante (por ejemplo, injerto o sistema de expresión encapsulado); (5) el número de implantes; (6) el tiempo que las células o implantes transducidos/transfectados se dejan en su lugar; y (7) la tasa de producción del agente terapéutico por parte de la célula genéticamente modificada. La selección y optimización de estos factores para la administración de una dosis terapéuticamente eficaz de un agente terapéutico particular se considera que está dentro del alcance de un experto en la materia sin experimentación indebida, teniendo en cuenta los factores divulgados anteriormente y el perfil clínico del paciente.

[0084] Además de al menos un promotor y al menos un ácido nucleico heterólogo que codifica el agente terapéutico, el vector de expresión puede incluir un gen de selección, por ejemplo, un gen de resistencia a neomicina, para facilitar la selección de células que se han transfectado o transducido con el vector de expresión. Como alternativa, las células se transfectan con dos o más vectores de expresión, al menos un vector que contiene el gen o los genes que codifican el o los agentes terapéuticos, conteniendo el otro vector un gen de selección. La selección de un promotor adecuado, un potenciador, el gen de selección y/o la secuencia señal (descritos a continuación) se considera que está dentro del alcance de un experto en la materia sin experimentación indebida.

[0085] El agente terapéutico puede direccionarse para su suministro a una ubicación extracelular, intracelular o de membrana. Si es conveniente que el producto génico sea secretado por las células, el vector de expresión está diseñado para incluir una secuencia "señal" de secreción apropiada para secretar el producto génico terapéutico desde la célula al medio extracelular. Si es conveniente que el producto génico se retenga dentro de la célula, esta secuencia señal de secreción se omite. De manera similar, el vector de expresión puede construirse para incluir secuencias señal de "retención" para anclar el agente terapéutico dentro de la membrana plasmática celular. Por ejemplo, todas las proteínas de membrana tienen regiones transmembrana hidrófobas, que detienen la translocación de la proteína en la membrana y no permiten que la proteína sea secretada. Se considera que la construcción de un vector de expresión que incluye secuencias señal para direccionar un producto génico a una ubicación particular está dentro del alcance de un experto en la técnica sin necesidad de experimentación indebida.

Métodos de tratamiento

[0086] También se divulga en el presente documento un método para tratar una enfermedad en un mamífero que comprende administrar una proteína o un vector que codifica una proteína como se describe en el presente documento al mamífero.

[0087] El mamífero puede ser un ser humano.

[0088] También se divulga en el presente documento el uso de una proteína o vector que codifica una proteína como se describe en el presente documento para preparar un medicamento útil para tratar la enfermedad de Huntington en un mamífero.

[0089] En el presente documento se divulga además una célula de mamífero que contiene un vector descrito en el presente documento. La célula puede ser humana y puede provenir del cerebro.

[0090] Ciertos aspectos de la divulgación se relacionan con polinucleótidos, polipéptidos, vectores y células modificadas por ingeniería genética (modificadasin vivo),y el uso de ellos. En particular, la divulgación se refiere a un método para terapia génica o proteica que es capaz de suministrar sistémicamente una dosis terapéuticamente eficaz del agente terapéutico.

[0091] De acuerdo con un aspecto, se proporciona un sistema de expresión celular para expresar un agente terapéutico en un receptor mamífero. El sistema de expresión (también denominado en el presente documento "célula genéticamente modificada") comprende una célula y un vector de expresión para expresar el agente terapéutico. Los vectores de expresión incluyen, pero no se limitan a, virus, plásmidos y otros vehículos para suministrar material genético heterólogo a las células. Por consiguiente, la expresión "vector de expresión", como se usa en el presente documento, se refiere a un vehículo para suministrar material genético heterólogo a una célula. En particular, el vector de expresión es un vector recombinante de adenovirus, de virus adenoasociado o de lentivirus o de retrovirus.

[0092] El vector de expresión incluye además un promotor para controlar la transcripción del gen heterólogo. El promotor puede ser un promotor inducible (descrito más adelante). El sistema de expresión es adecuado para la administración al receptor mamífero. El sistema de expresión puede comprender una pluralidad de células genéticamente modificadas no inmortalizadas, conteniendo cada célula al menos un gen recombinante que codifica al menos un agente terapéutico.

[0093] El sistema de expresión celular se formain vivo.De acuerdo con otro aspecto más, se proporciona un método para tratar a un receptor mamíferoin vivo.El método incluye introducir un vector de expresión para expresar un producto génico heterólogo en una célula del pacientein situ,tal como a través de administración intravenosa. Para formar el sistema de expresiónin vivo,se introduce un vector de expresión para expresar el agente terapéuticoin vivoen el receptor mamífero i.v., donde el vector migra a través de la vasculatura hasta el cerebro.

[0094] De acuerdo con otro aspecto más, se proporciona un método para tratar a un receptor mamíferoin vivo.El método incluye introducir la proteína diana en el pacientein vivo.

[0095] El vector de expresión para expresar el gen heterólogo puede incluir un promotor inducible para controlar la transcripción del producto del gen heterólogo. Por consiguiente, el suministro del agente terapéuticoin situse controla exponiendo la célulain situa las condiciones, que inducen la transcripción del gen heterólogo.

[0096] Una "variante" de uno de los polipéptidos (por ejemplo, Rhes o Rheb) es un polipéptido que no es completamente idéntico a una proteína nativa. Dicha proteína variante se puede obtener alterando la secuencia de aminoácidos mediante inserción, deleción o sustitución de uno o más aminoácidos. Se modifica la secuencia de aminoácidos de la proteína, por ejemplo, por sustitución, para crear un polipéptido que tenga cualidades sustancialmente iguales o mejoradas en comparación con el polipéptido nativo. La sustitución puede ser una sustitución conservada. Una "sustitución conservada" es una sustitución de un aminoácido por otro aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Una sustitución conservada sería una sustitución por un aminoácido que haga el cambio más pequeño posible en la carga del aminoácido o en el tamaño de la cadena lateral del aminoácido (alternativamente, en el tamaño, carga o tipo de grupo químico dentro de la cadena lateral) de modo que el péptido general conserva su conformación espacial pero tiene una actividad biológica alterada. Por ejemplo, los cambios conservados comunes podrían ser Asp a Glu, Asn o Gln; His a Lys, Arg a Phe; Asn a Gln, Asp o Glu y Ser a Cys, Thr o Gly. La alanina se usa comúnmente para sustituir otros aminoácidos. Los 20 aminoácidos esenciales se pueden agrupar de la siguiente manera: alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, triptófano y metionina que tienen cadenas laterales no polares; glicina, serina, treonina, cistina, tirosina, asparagina y glutamina que tienen cadenas laterales polares no cargadas; aspartato y glutamato que tienen cadenas laterales ácidas; y lisina, arginina e histidina que tienen cadenas laterales básicas.

[0097] Los cambios de aminoácidos se logran cambiando los codones de la secuencia de ácido nucleico correspondiente. Se sabe que dichos polipéptidos se pueden obtener basándose en la sustitución de ciertos aminoácidos por otros aminoácidos en la estructura polipeptídica con el fin de modificar o mejorar la actividad biológica. Por ejemplo, mediante la sustitución de aminoácidos alternativos, se pueden conferir pequeños cambios conformacionales a un polipéptido que dan como resultado una actividad aumentada. Como alternativa, se pueden usar sustituciones de aminoácidos en ciertos polipéptidos para proporcionar restos, que luego pueden unirse a otras moléculas para proporcionar conjugados de péptido-molécula que, conservan suficientes propiedades del polipéptido de partida para que sea útil para otros fines.

[0098] Se puede utilizar el índice hidropático de los aminoácidos para conferir una función biológica interactiva a un polipéptido, en donde se encuentra que determinados aminoácidos pueden sustituirse por otros aminoácidos con índices hidropáticos similares y seguir manteniendo una actividad biológica similar. Como alternativa, la sustitución de aminoácidos similares también se puede hacer basándose en la hidrofilia, particularmente cuando la función biológica deseada en el polipéptido que se va a generar está destinada a su uso en realizaciones inmunológicas. La mayor hidrofilia promedio local de una "proteína", regida por la hidrofilia de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con su inmunogenicidad. Por consiguiente, cabe señalar que se pueden realizar sustituciones basándose en la hidrofilia asignada a cada aminoácido.

[0099] Al utilizar el índice de hidrofilia o el índice hidropático, que asigna valores a cada aminoácido, se prefiere realizar sustituciones de aminoácidos donde estos valores sean de ±2, con ± 1 siendo particularmente preferido, siendo aquellas con ±0,5 las sustituciones más preferidas.

[0100] La proteína variante tiene al menos el 50 %, al menos aproximadamente el 80 % o incluso al menos aproximadamente el 90 % pero menos del 100 %, de homología o identidad de secuencia de aminoácidos contigua con la secuencia de aminoácidos de una proteína nativa correspondiente.

[0101] La secuencia de aminoácidos del polipéptido variante corresponde esencialmente a la secuencia de aminoácidos del polipéptido nativo. Como se usa en el presente documento "corresponde esencialmente a" se refiere a una secuencia polipeptídica que provocará una respuesta biológica sustancialmente igual a la respuesta generada por la proteína nativa. Tal respuesta puede ser al menos el 60 % del nivel generado por la proteína nativa, e incluso puede ser al menos el 80 % del nivel generado por la proteína nativa.

[0102] Una variante puede incluir restos de aminoácidos no presentes en la proteína nativa correspondiente o deleciones con respecto a la proteína nativa correspondiente. Una variante también puede ser un "fragmento" truncado en comparación con la proteína nativa correspondiente, es decir, sólo una porción de una proteína de longitud completa. Las variantes de proteínas también incluyen péptidos que tienen al menos un D-aminoácido.

[0103] La proteína variante se puede expresar a partir de una secuencia de ADN aislada que codifica la proteína variante. "Recombinante" se define como un péptido o ácido nucleico producido mediante procesos de ingeniería genética. Cabe señalar que es bien conocido en la técnica que, debido a la redundancia en el código genético, los nucleótidos individuales pueden intercambiarse fácilmente en un codón y aun así dar como resultado una secuencia de aminoácidos idéntica.

[0104] La presente divulgación proporciona métodos para tratar una enfermedad en un mamífero mediante la administración de un vector de expresión a una célula o paciente.

Para los métodos de terapia génica, una persona con conocimientos habituales en la técnica de biología molecular y terapia génica podría determinar, sin excesiva experimentación, las dosificaciones y vías de administración apropiadas del vector de expresión utilizado en los nuevos métodos de la presente divulgación.

[0105] Las células pueden transformarse o modificarse genéticamente de otro modoin vivo.Las células del mamífero receptor se transforman (es decir, se transducen o transfectan)in vivocon un vector que contiene material genético exógeno para expresar un gen heterólogo (por ejemplo, recombinante) que codifica un agente terapéutico y se suministra el agente terapéuticoin situ.

[0106] Como se usa en el presente documento, "material genético exógeno" se refiere a un ácido nucleico o un oligonucleótido, ya sea natural o sintético, que no se encuentra naturalmente en las células; o si se encuentra naturalmente en las células, las células no lo transcriben ni expresan en niveles biológicamente significativos. Por tanto, "material genético exógeno" incluye, por ejemplo, un ácido nucleico no de origen natural que puede transcribirse en ARN antisentido, así como un "gen heterólogo" (es decir, un gen que codifica una proteína que no se expresa o se expresa en niveles biológicamente insignificantes en una célula de origen natural del mismo tipo).

[0107] En resumen, la expresión "agente terapéutico" incluye, pero no se limita a, agentes asociados con las condiciones enumeradas anteriormente, así como sus equivalentes funcionales. Como se usa en el presente documento, la expresión "equivalente funcional" se refiere a una molécula (por ejemplo, un péptido o proteína) que tiene el mismo efecto beneficioso o un efecto beneficioso mejorado en el receptor mamífero que el agente terapéutico del cual se considera equivalente funcional.

[0108] Los agentes terapéuticos y las afecciones susceptibles de terapia de reemplazo génico divulgados anteriormente son meramente ilustrativos y no pretenden limitar el alcance de la presente divulgación. La selección de un agente terapéutico adecuado para tratar una afección conocida se considera dentro del alcance de un experto en la materia sin experimentación indebida.

Dosificaciones, formulaciones y vías de administración de los agentes de la divulgación

[0109] Los agentes de la divulgación se administran de manera que den como resultado una reducción de al menos un síntoma asociado con la enfermedad de Huntington. La cantidad administrada variará dependiendo de varios factores, incluidos, pero no está limitado a, la composición elegida, la enfermedad concreta, el peso, el estado físico y la edad del mamífero, y si se debe lograr prevención o tratamiento. El médico puede determinar fácilmente tales factores empleando modelos animales u otros sistemas de prueba que sean bien conocidos en la técnica.

[0110] La divulgación prevé el tratamiento de la enfermedad de Huntington mediante la administración de un agente, por ejemplo, Rhes o Rheb, un vector de expresión o una partícula vírica de la divulgación. La administración de los agentes terapéuticos en conformidad con la presente divulgación puede ser continua o intermitente, dependiendo, por ejemplo, de la condición fisiológica del receptor, si el propósito de la administración es terapéutico o profiláctico, y otros factores conocidos por los médicos expertos. La administración de los agentes de la divulgación puede ser esencialmente continua durante un periodo de tiempo preseleccionado o puede ser en una serie de dosis espaciadas. Se contempla tanto la administración local como la sistémica.

[0111] Una o más formas de dosificación unitaria adecuadas que tiene agente o agentes terapéuticos de la divulgación, que, como se analiza más adelante, opcionalmente, pueden formularse para una liberación sostenida (por ejemplo, mediante microencapsulación), pueden administrarse por una diversidad de vías, incluida la parenteral, incluidas las vías intravenosa e intramuscular, así como por inyección directa en el tejido enfermo. Por ejemplo, el agente terapéutico puede inyectarse directamente en el cerebro. Alternativamente, el agente terapéutico puede introducirse por vía intratecal para afecciones del cerebro y de la médula espinal. Las formulaciones pueden, cuando sea apropiado, presentarse convenientemente en formas de dosificación unitarias discretas y pueden prepararse mediante cualquiera de los métodos bien conocidos en farmacia. Dichos métodos pueden incluir la etapa de asociar el agente terapéutico con transportadores líquidos, matrices sólidas, transportadores semisólidos, transportadores sólidos finamente divididos o combinaciones de los mismos, y luego, si fuera necesario, introducir o dar forma al producto en el sistema de suministro deseado.

[0112] Cuando los agentes terapéuticos de la divulgación se preparan para la administración, pueden combinarse con un transportador, diluyente o excipiente farmacéuticamente aceptable para formar una formulación farmacéutica, o forma de dosificación unitaria. Los principios activos totales en tales formulaciones incluyen del 0,1 al 99,9 % en peso de la formulación. Un "farmacéuticamente aceptable" es un transportador, diluyente, excipiente y/o sal que es compatible con los otros ingredientes de la formulación y no es perjudicial para el receptor del mismo. El principio activo para la administración puede estar presente en forma de polvo o gránulos; como una solución, una suspensión o una emulsión.

[0113] Las formulaciones farmacéuticas que contienen los agentes terapéuticos de la divulgación se pueden preparar mediante procedimientos conocidos en la técnica utilizando ingredientes bien conocidos y fácilmente disponibles. Los agentes terapéuticos de la divulgación también pueden formularse como soluciones apropiadas para administración parenteral, por ejemplo por las vías intramuscular, subcutánea o intravenosa.

[0114] Las formulaciones farmacéuticas de los agentes terapéuticos de la divulgación también pueden tomar la forma de una solución o dispersión acuosa o anhidra, o alternativamente la forma de una emulsión o suspensión.

[0115] Por tanto, los agentes terapéuticos pueden formularse para administración parenteral (por ejemplo, mediante inyección, por ejemplo, inyección en bolo o infusión continua), y pueden presentarse en forma de dosis unitaria en ampollas, jeringuillas precargadas, recipientes de infusión de pequeños volúmenes o en recipientes multidosis con un conservante añadido. Los principios activos pueden tomar formas tales como suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden comprender agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes. Como alternativa, los principios activos pueden estar en forma de polvo, obtenido por aislamiento aséptico de un sólido estéril o por liofilización de una solución, para la constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua apirógena estéril, antes de su uso.

[0116] Se apreciará que el contenido unitario del principio o principios activos o contenidos en una dosis de aerosol individual de cada forma farmacéutica no necesita constituir en sí mismo una cantidad eficaz para tratar la indicación o enfermedad particular, ya que la cantidad eficaz necesaria puede alcanzarse mediante la administración de una pluralidad de unidades de dosificación. Además, la cantidad eficaz se puede lograr usando menos que la dosis en la forma de farmacéutica, ya sea individualmente o en una serie de administraciones.

[0117] Las formulaciones farmacéuticas de la divulgación pueden incluir, como ingredientes opcionales, transportadores farmacéuticamente aceptables, diluyentes, agentes solubilizantes o emulsionantes y sales del tipo bien conocido en la técnica. Los ejemplos no limitantes específicos de transportadores y/o diluyentes que son útiles en las formulaciones farmacéuticas de la divulgación incluyen agua y soluciones salinas tamponadas fisiológicamente aceptables tales como soluciones salinas tamponadas con fosfato de pH 7,0-8,0 y agua.

[0118] La invención se ilustrará ahora por el siguiente Ejemplo no limitante.

Ejemplo 1

Restablecer la actividad anómala de mTORCI en ratones con enfermedad de Huntington mejora los fenotipos de enfermedad

[0119] La diana según el mecanismo de la rapamicina (mTOR) es una serina-treonina cinasa que integra señales para regular el crecimiento y el metabolismo celular (Laplante y Sabatini, 2012). mTOR forma 2 complejos distintos, mTORCI y mTORC2. En condiciones ricas en nutrientes, mTORC1 se activa y propicia la traducción de proteínas y el crecimiento celular. En cambio, la extracción de nutrientes inactiva mTORC1 e inicia la macroautofagia (en lo sucesivo denominada autofagia) como mecanismo de supervivencia celular. mTORC1 controla positivamente la biogénesis mitocondrial (Cunninghamet al.,2007) y regula la homeostasis de los lípidos controlando la síntesis de colesterol (Petersonet al.,2011; Porstmannet al.,2008). Además, en el cerebro, mTORC1 propicia la mielinización, el crecimiento y la regeneración de axones (Kimet al.,2012; Parket al.,2008; Sunet al.,2011), y la deleción genética del homólogo de Ras enriquecido en el cerebro (Rheb), un activador clave de mTORC1, causa disminución del grosor cortical y mielinización defectuosa (Zouet al.,2011).

[0120] En el cuerpo estriado, Rhes (homólogo de Ras enriquecido en el cuerpo estriado) sirve como un activador clave de mTORC1 (Subramaniamet al.,2012). La genosupresión de Rhes reduce la actividad de mTORC1 y atenúa las respuestas adversas a la discinesia inducida por L-DOPA (Subramaniamet al.,2012). Adicionalmente, Rhes facilita la SUMOilación (Subramaniamet al.,2009), un proceso implicado en la patogenia de la EH (Steffanet al.,2004).In vitro,Rhes propicia la SUMOilación de mHTT para inducir citotoxicidad (Subramaniamet al.,2009), y la reducción de Rhes agregado exógenamente con ARNip aumentó la supervivencia de las células transfectadas con fragmentos de mHTT (Lu y Palacino, 2013; Seredeninaet al.,2011).In vivo,la ablación genética de Rhes protege contra las lesiones del cuerpo estriado 4 inducidas por neurotoxinas (Mealeret al.,2013), y retrasa transitoriamente el inicio de síntomas motores en ratones con EH R6/1 (Baiamonteet al.,2013). Debido a que Rhes se expresa altamente en el cuerpo estriado (Spanoet al.,2004), se ha propuesto que las interacciones Rhes-mHTT pueden ser la base de la prominente degeneración estriatal en la EH.

[0121] Sin embargo, otros datos ponen en duda el papel patogénico del Rhes en la EH. Los niveles de Rhes están reducidos en el núcleo caudado de pacientes con HD (Hodgeset al.,2006), y la ablación de Rhes en los modelos de EH R6/1 no previene la degeneración cerebral (Baiamonteet al.,2013). Adicionalmente, los ratones genosuprimidos para Rhes desarrollan atrofia cerebral y anomalías conductuales similares a las encontradas en ratones con EH (Baiamonteet al.,2013; Spanoet al.,2004). Además, Rhes propicia la autofagia (Mealeret al.,2014), un mecanismo de protección bien establecido en la EH. Por lo tanto, dada la función crucial de Rhes en la mediación de la señalización de mTORC1 estriatal, la hipótesis de los inventores es que una pérdida concomitante de la actividad de Rhes y mTORC1 contribuye a la patología del cuerpo estriado temprana en la EH, y que la potenciar la función de mTORC1, a través de la regulación al alza de Rheb o Rhes, sería neuroprotector.

[0122] Para probar esta hipótesis, los inventores modularon de forma acusada la actividad de Rhes y mTORC1 en el cuerpo estriado adulto de ratones transgénicos con EH. Encontraron efectos beneficiosos con la activación de mTORC1, incluyendo fenotipos metabólicos mejorados asociados a mHTT y la inversión de la atrofia estriatal. Sistemáticamente, restablecer la actividad de mTORC1 o los niveles de Rhesin vivoera protector. Además, demostraron que la propiedad neuroprotectora de Rhes depende de su actividad de GTPasa, que es necesaria para activar mTORC1 pero independiente de la actividad de SUMOilación relacionada. De manera conjunta, estos datos sugieren que la actividad alterada de Rhes/mTORC1 es importante para la notable patogenia del cuerpo estriado en la EH y sugieren que la función alterada de mTORC1 puede representar un mecanismo fundamental subyacente a los fenotipos complejos de la enfermedad en la EH.

Resultados

La actividad de mTORC1 está reducida en el cuerpo estriado de la EH

[0123] Como primera prueba de la hipótesis de los inventores, estos examinaron la actividad de mTORC1 en el cerebro con EH. Encontraron que la actividad de mTORC1 se reduce en los tejidos del cuerpo estriado de pacientes con EH y ratones N171-82Q, como se detecta mediante la fosforilación reducida de la proteína ribosómica S6 (pS6), un marcador establecido de la actividad de mTORC1 (Figura 1A; Figuras S1A,B). En ratones con EH, la actividad de mTORC1 se ve afectada a las 6 semanas de edad, antes del inicio de los síntomas neurológicos (Figura 1B). La actividad reducida de mTORC1 no está asociada con una expresión reducida de mTOR o componentes del complejo mTOR (por ejemplo, Rictor y Raptor) (Figuras 1A, B; Figura S1A). A continuación se modificaron por ingeniería genética virus adenoasociados (<a>A<v>), que transducen neuronas estriatales (Figura S2A) (McBrideet al.,2008), para expresar Rheb, un regulador positivo bien establecido de mTORC1 (Laplante y Sabatini, 2012). De esta manera, los inventores pueden mejorar drásticamente la activación de mTORC1in vivo.Utilizaron un mutante de Rheb constitutivamente activo (caRheb; S16H) previamente demostrado que activa la señalización de mTORC1 en el cerebro de un ratón (Kimet al.,2012; Zouet al.,2011). Inyección unilateral de

[0124] AAV.caRheb en el cuerpo estriado de un ratón N171-82Q indujo notablemente la actividad de mTORC1 como lo indica el aumento de pS6 3 semanas posinyección (Figura 2A). La reducción selectiva de los niveles de DARPP-32, un componente fundamental de la señalización de dopamina en las neuronas espinosas medianas (MSN), es un indicador de la progresión patológica en cerebros humanos y de ratones con EH (Bibbet al.,2000; Hodgeset al.,2006). La transducción de AAV.caRheb propició un aumento del 33 % de los niveles de DARPP-32 en el tejido estriado del ratón N171-82Q en comparación con el tejido contralateral no inyectado (Figura 2A). Además, AAV.caRheb reguló al alza la expresión del regulador transcripcional mitocondrial, coactivador de PPARy 1 a (PGC1 -a) (Figura 2B), un regulador maestro de la biogénesis mitocondrial que cuando aumenta mejora la función mitocondrial y las deficiencias motoras en modelos de EH (Cuiet al.,2006; Tsunemiet al.,2012). De acuerdo con una actividad aumentada de las mitocondrias, los niveles de genes desintoxicantes de especies reactivas de oxígeno (ROS), SOD2, cyt-c y ANT1 también aumentaron en los cerebros tratados con AAV.caRheb (Figuras 2C-F). La glutatión peroxidasa, una enzima antioxidante neuroprotectora identificada recientemente en organismos modelo de EH (Masonet al.,2013), aumentó selectivamente en cerebros con EH después de la transducción de caRheb (Figura 2G). El perfil mejorado no podría explicarse por un efecto indirecto de la inyección de virus o la regulación a la baja del transgén mHTT; se obtuvieron resultados similares cuando se compararon cerebros inyectados con AAV.caRheb con cerebros tratados con AAV.eGFP, y caRheb no afectó la expresión del transgén mHTT (Figuras S2B-H). A continuación, los inventores realizaron estudiosin vitroy trataron células estriatales que expresan Htt expandido (Q111) y normal (Q7) (Trettelet al.,2000) con un inhibidor competitivo con ATP de mTOR, Torin1. Torin1 inhibe potentemente las funciones de TOR, incluidas las que son resistentes a la inhibición por rapamicina (Thoreenet al.,2009). El tratamiento con Torin1 redujo los niveles de pS6 y p-4E-BP1, así como la expresión de DARPP-32 en las células Q7 y Q111 (Figura S3A). Torinl también reprimió a PG ci-a, los genes regulados por PGC1-a, la proteína de unión al elemento de respuesta a AMPc (CREB) y el transductor de CREB 1 regulado (TORCI) (Figuras S3A, B). En conjunto, los resultadosin vitroein vivode los inventores indican que mTORC1 regula los genes metabólicos regulados por PGC1-a y PGC1-a en el contexto de alelos de HTT de TS y mutantes.

mTORCI controla la expresión de genes lipogénicos en cerebros con EH

[0125] A continuación, los inventores determinaron si la actividad alterada de mTORC1 subyace a otras alteraciones de la vía metabólica específica de la EH. Se ha observado una biosíntesis aberrante de colesterol en cerebros humanos y de ratones con EH (Karasinska y Hayden, 2011; Valenza y Cattaneo, 2011). La expresión de genes necesarios para la biosíntesis de lípidos está controlada por la transactivación nuclear de proteínas de unión a elementos reguladores de esteroles (SREBP). Se ha informado que mHTT inhibe la translocación nuclear de SREBP en las células y ratones con EH, lo que puede contribuir a la síntesis disfuncional del colesterol (Valenzaet al.,2005). mTORC1 también regula la transactivación de SREBP (Petersonet al.,2011; Porstmannet al.,2008). Para determinar si la reducción de la actividad de mTORC1 altera la síntesis de colesterol en el contexto de la EH, los inventores aplicaron Torin1 a células estriatales Q7 o Q111 cultivadas. Torin1 redujo la expresión de los genes diana de SREBP HMG-CoA reductasa (HMGCR), la enzima limitante de la velocidad en la síntesis de colesterol, y HMGCS1 en líneas celulares tanto mutantes como normales (Figuras 3A, B).

[0126] En ratones N171-82Q, HMGCR se reduce significativamente (Figura 3C) en comparación con los controles, de manera similar a lo que se ha encontrado en el cerebro de pacientes con EH (Hodgeset al.,2006). AAV.caRheb normalizó los niveles de HMGCR y también aumentó la expresión de las enzimas necesarias para la biosíntesis de esteroles: HMG-CoA sintasa 1 (HMGCS1), lanosterol 14a-desmetilasa (CYP51) y 7-deshidrocolesterol reductasa (DHCR7) (Figuras 3C-F; Figuras S3 C-F). De manera similar a los resultados de los inventoresin vitro,la regulación de mTOR de la expresión estratial de genes lipogénicos es independiente del estado de expansión de la poliglutamina en la HTT, dado que AAV.caRheb también aumentó la expresión de estos genes en el cuerpo estriado de los TS (Figuras 3C-3F). Aunque la reducción de la expresión del gen HMGCR es leve en ratones N171-82Q (transgén expresado a partir de un promotor priónico), la expresión reducida de HMGCR, HMGCS1, DHCR7 y CYP51 se observa en modelos humanos y otros de ratones con EH (Hodgeset al.,2006; Valenzaet al.,2005). En conjunto, los resultados de los inventores indican que mTORC1 propicia la expresión de genes lipogénicos en el cuerpo estriado y sugieren que la actividad alterada de mTORC1 puede contribuir a una expresión reducida de genes lipogénicos en la EH.

mTORC1 potencia las vías implicadas en la elim inación de mHTT

[0127] La actividad de mTORC1 generalmente se asocia con la antagonización de la inducción de la autofagia, aunque la autofagia puede producirse a través de vías dependientes e independientes de mTORC1. Con relevancia para la HD, la actividad autofágica basal es fundamental para mantener la supervivencia neuronal y propiciar la eliminación de agregados (Jeonget al.,2009; Ravikumaret al.,2004; Yamamotoet al.,2006). Por ello, a continuación, los inventores examinaron los efectos de la activación de mTORC 1 en la autofagia en el cuerpo estriado de ratones con EH tratados con AAV.caRheb. Encontraron niveles basales aumentados de la proteína asociada a la membrana del autofagosoma, LC3-II, en ratones N171-82Q en comparación con ratones de TS (Figura S4). El tratamiento con AAV.caRheb aumentó los niveles de LC3-II (Figura 4A) y Beclina-1, una proteína necesaria para la inducción de la autofagia (Figura 4B). Para distinguir entre autofagia potenciada y el deterioro de la maduración autofagolisosómica, se utilizó microscopía electrónica (ME) para cuantificar el número relativo de autofagosomas y autolisosomas en cerebros de ratones tratados con AAV.caRheb en un hemisferio o AAV.eGFP en el otro hemisferio. Si bien la relación autofagosomas/autolisosomas fue similar entre hemisferios, tanto los autofagosomas como los autolisosomas aumentaron con el tratamiento con AAV.caRheb en comparación con los lados contralaterales tratados de control (Figura 4C), lo que sugiere que la autofagia se activa en el contexto de una actividad aumentada de mTORC1in vivo.Los inventores también observaron que el cerebro de los ratones N171-82Q tratados con control (AAV.eGFP) de control carecía de masa granular endoplásmica electrodensa y de orgánulos citoplásmicos (Figura 4D), un fenotipo similar a la patología del cuerpo estriado inducida por estrés nucleolar (Kreineret al.,2013). Por el contrario, las células en los hemisferios tratados con AAV.caRheb mostraron orgánulos citoplasmáticos electrodensos enriquecidos.

[0128] Un trabajo reciente sugiere que la degradación autofágica/proteosómica de mHTT se produce a través de modificaciones postraduccionales (MPT) (Jeonget al.,2009; Jiaet al.,2012; O'Rourkeet al.,2013; Thompsonet al.,2009). Por ejemplo, la ligasa SUMO E3 PIAS1 aumenta la formación de agregados de mHTT al propiciar la conjugación de SUMO2 con mHTT en modelos celulares, y reducir el ortólogo de PIAS 1 enDrosophilaque expresa la proteína mHTT es protector (O'Rourkeet al.,2013). Los inventores descubrieron que los niveles de SUMO2 estaban elevados en el cuerpo estriado de ratones N171-82Q de 14 semanas de edad y que AAV.caRheb reprimió la expresión de PIAS1 y SUMO2 tanto en ratones N171-82Q como en compañeros de camada de TS de control (Figuras 5A, B). También examinaron la cinasa IkB (IKK), una cinasa que induce la degradación de mHTT y tiene como diana a mHTT para su eliminación por el proteosoma y lisosomas (Thompsonet al.,2009). Los genes endógenos relacionados con IKK (Ikbkb, Ikbkap e Ikbke) estaban reducido en el cuerpo estriado de ratones N171-82Q y AAV.caRheb restableció su expresión (Figuras 5C-E). Adicionalmente, HDAC4 es un regulador importante de la formación de agregados de mHTT y la reducción de HDAC4 reduce los agregados citoplásmicos, mejora la función neuronal y prolonga la esperanza de vida de los ratones con EH (Mielcareket al.,2013). En este caso, los inventores encontraron que la transducción de AAV.caRheb redujo la expresión de HDAC4 en el cuerpo estriado de ratones N171-82Q (Figura 5F). Los agregados que contienen fragmentos de HTT son pocos e inconsistentes en el cuerpo estriado, pero robustos en el hipocampo de ratones N171-82Q. Por lo tanto, los inventores probaron la carga agregada en el hipocampo. AAV transduce eficientemente las neuronas del hipocampo (Figura S5), y los animales a los que se les inyectó AAV.caRheb mostraron una carga de agregados de mHTT significativamente reducida en comparación con los ratones a los que se les inyectó AAV.eGFP (Figura 5G), lo que es concordante con los efectos observados de AAV.caRheb sobre los genes implicados en la eliminación de mHTT.

La actividad potenciada de mTORCI rescata la atrofia estriatal y mejora los fenotipos motores en ratones con EH

[0129] Los ratones N171-82Q presentan atrofia estriatal pronunciada con números de MSN conservados (Chenget al.,2011; Schillinget al.,1999). Para examinar cómo la actividad de mTORC1 afecta el volumen del cuerpo estriado en el cerebro enfermo, los inventores realizaron una inyección unilateral de AAV.caRheb en el cuerpo estriado de ratones N171-82Q de 11 semanas de edad, una edad en la que se produce una atrofia estriatal medible (Chenget al.,2011), y compararon el hemisferio tratado con el lado no tratado. AAV.caRheb afectó positivamente el tamaño de las células MSN y el volumen estriatal en comparación con los hemisferios contralaterales no tratados (Figuras 6A-C). Para confirmar que caRheb actúa a través de mTORC1, administraron RAD001, un conocido inhibidor de mTORC1 (Foxet al.,2010). El tratamiento con RAD001 invirtió los efectos morfológicos de caRheb y atenuó la fosforilación de S6 (Figuras 6A-6C; Figuras S6A, B). Adicionalmente, descubrieron que 2 semanas de tratamiento con RAD001 en ausencia de caRheb provocó una exacerbación leve pero significativa de la atrofia de las MSN en ratones N171-82Q (Figuras 6A, B). Estos resultados sugieren que AAV.caRheb promueve el crecimiento de las MSN o conserva el tamaño de las MSN a través de la vía mTORC1, y que la alteración de mTORC1in vivoexacerba este fenotipo.

[0130] La alteración del circuito de dopamina estriatal se asocia con síntomas motores en ratones con EH (Bibbet al.,2000; Johnsonet al.,2006). Por lo tanto, para determinar el impacto funcional de AAV.caRheb en las vías de la dopamina, se inyectaron unilateralmente ratones N171-82Q y se sometieron a pruebas de rotación inducidas por anfetamina. La anfetamina desencadena la liberación de dopamina e induce un comportamiento rotacional en ratones si hay un desequilibrio en la señalización de dopamina en un hemisferio frente al otro. Para ello, coinyectaron AAV que expresa mHTT (AAV.mHTT) en ratones de TS de 6 semanas de edad con AAV.caRheb o virus de control (AAV.eGFP). La inyección unilateral de AAV.mHTT/AAV.eGFP provocó una rotación ipsilateral hacia el lado inyectado, una indicación de toxicidad de mHTT (Figura 6D). En cambio, la coinyección de AAV.caRheb con AAV.mHTT no indujo la rotación ipsilateral, en cambio, los ratones mostraron rotaciones contralaterales (Figura 6D). De acuerdo con los resultados conductuales, la inyección de AAV.mHTT/eGFP causó atrofia de las MSN en comparación con el cuerpo estriado contralateral no tratado, mientras que la coinyección de AAV.caRheb con AAV.mHTT evitó la atrofia de las MSN (Figura 6E). Por tanto, potenciar la actividad de mTORC1 beneficia la atrofia neuronal impulsada por mHTT y el deterioro de la vía de la dopamina.

La adición exógena de Rhes, un activador de mTOR enriquecido en el cuerpo estriado, rescata fenotipos de enfermedades asociadas a mHTT en ratones transgénicos con EH

[0131] En el cuerpo estriado, mTOR está regulada predominantemente por una proteína GTPasa enriquecida en el cuerpo estriado, Rhes (Subramaniamet al.,2012). Estudiosin vitroprevios implican un papel tóxico de Rhes en la EH (Subramaniamet al.,2009), pero su relevancia en la enfermedadin vivono está clara. Los inventores encontraron que los niveles de Rhes se redujeron en el cuerpo estriado humano y ratón con EH (Figuras 7A y S7A). Los niveles de Rheb no se reducen (Figura S7B). De forma notable, Rhes se reduce significativamente antes de la aparición de los síntomas neurológicos; los ratones N171-82Q de 6 semanas de edad tienen el 73% de niveles de Rhes de tipo silvestre, aunque los síntomas clínicos no son evidentes hasta las 12-14 semanas de edad (Figuras 7A y S7C). Por lo tanto, los inventores investigaron cómo la potenciación de los niveles de Rhes afecta los fenotipos de enfermedad. Como se demostró previamente que el fragmento aminoterminal de mHTT interactúa con Rhes y confiere citotoxicidadin vitro,el modelo N171-82Q es ideal para poner a prueba esta cuestiónin vivo(Subramaniamet al.,2009). Si Rhes es un mediador crucial de la toxicidad en la EH, se esperaría que la sobreexpresión aguda de Rhes en el ratón N17182Q exacerbe los fenotipos de enfermedad. Se inyectaron AAV que expresan Rhes (AAV.Rhes) en ratones N171-82Q de 7 semanas de edad y en los compañeros de camada de<t>S. A diferencia de lo que se esperaba a partir de los trabajos anterioresin vitro,pero de forma concordante con los resultados de los inventores sobre la activación de mTORC1 por parte de Rheb, la sobreexpresión de Rhes mejoró la función motora en ratones N171-82Q en comparación con los compañeros de camada enfermos tratados con suero salino según lo determinado mediante pruebas de rotarod a las 14 y 18 semanas de edad (Figura 7B). Además, después de la inyección unilateral, AAV.Rhes aumentó significativamente el tamaño de las células MSN en comparación con los hemisferios contralaterales tratados con control (Figuras 7C). Al igual que Reb, AAV.Rhes reguló al alza la expresión del regulador transcripcional mitocondrial, PGC1-a (Figura 7D).

[0132] En ensayos basados en células, Rhes potencia la toxicidad de mHTT al propiciar la SUMOilación de mHTT (Subramaniamet al.,2009). Para determinar si los efectos modificadores de la enfermedad observados de Rhesin vivoson a través de las vías de SUMOilación o de mTORCI, los inventores generaron AAV que expresan RhesS33N (AAV.RhesS33N), un mutante de Rhes con actividad de GTPasa abolida y activación reducida de mTORCI pero con actividad moduladora de la SUMOilación intacta (Subramaniamet al.,2012; Subramaniamet al.,2009). Después de las inyecciones en el cuerpo estriado, los ratones N171-82Q tratados con AAV.RhesS33N mostraron una actividad de mTORCI reducida en comparación con los ratones N171-82Q a los que se les inyectó AAV.Rhes

[0133] (Figura S8). AAV.RhesS33N no logró modificar las deficiencias motoras en ratones N171-82Q, que se desempeñaron de manera similar a los ratones N171-82Q tratados de control (Figura 7B). De forma notable, Rhes S33N no provoca una mayor exacerbación conductual, como uno podría predecir basándose en anteriores observacionesin vitro(Subramaniamet al.,2009). De manera conjunta, estos datos sugieren que Rhes rescata las deficiencias conductuales en la EH en parte mediante la activación de mTORCI.

Análisis

[0134] Acumulativamente, los inventores muestran que la actividad alterada de mTORC 1 está aguas arriba de diversos cambios fenotípicos asociados con la EH y puede ser la base de los fenotipos metabólicos y degenerativos. Encontraron que la activación de mTORC1 propició el metabolismo energético, la autofagia y la función de las células estriatales en ratones con EH. De forma concordante con el papel neuroprotector de mTORC1, encontraron que Rhes, un activador de mTOR enriquecido en el cuerpo estriado, se reduce en los cerebros con EH antes del inicio de los síntomas neurológicos, y que la adición exógena de Rhes alivia las deficiencias motoras y la patología cerebral en ratones con EH. De forma notable, la capacidad de propiciar el crecimiento y la función de las células estriatales en ratones con EH sintomáticos respalda la idea de que existe plasticidad en las neuronas cargadas con mHTT (Yamamotoet al.,2000), y destaca la posibilidad de invertir la atrofia estriatal después del inicio de la enfermedad mediante la activación de mTORC1. Debido a que mHTT tiene una propensión aumentada a unirse a Rhes (Subramaniamet al.,2009) y mTOR (Ravikumaret al.,2004), es posible que una pérdida concomitante de la función de Rhes y de mTOR por mHTT pueda hacer que el cuerpo estriado sea más vulnerable a la degeneración temprana en la EH (Figura 8). Dado que el volumen estriatal es un fuerte factor predisponente de la progresión de la enfermedad en pacientes con EH (Tabriziet al.,2013), las terapias que restablecen la actividad de mTORC1 en el cuerpo estriado a niveles normales pueden aliviar la enfermedad. Un mecanismo clave de la enfermedad por el cual mHTT interfiere con la producción de energía es la represión de la actividad de PGC-1a, cuya expresión está reducida en la ínsula de Reil humana y en el cuerpo estriado de ratones transgénicos con HD (Cuiet al.,2006; Hodgeset al.,2006; Tsunemiet al.,2012). Los niveles reducidos de PGC-1a también pueden sensibilizar a los cerebros con EH al estrés oxidativo, ya que las neuronas dopaminérgicas en ratones genosuprimidos para PGC-1a son vulnerables al daño oxidativo mediado por MPTP (St-Pierreet al.,2006). El restablecimiento de la expresión de PGC-1a en el cerebro mejora la atrofia estriatal en ratones R6/2 HD (Cuiet al.,2006), y mejora los fenotipos motores en los modelos de ratón N171-82Q y R6/2 HD (Cuiet al.,2006; Tsunemi y La Spada, 2011). El resultado de los inventores de que mTOR es un regulador positivo de la actividad de PGC-1a en cerebros de ratones con EH proporciona una diana terapéutica para potenciar la actividad de PGC-1a y un posible mecanismo por el cual la actividad de PGC-1a puede verse afectada.

[0135] A primera vista, estos datos pueden parecer contradecir la visión convencional en el campo de la EH que indica que la inhibición de mTORC1 es protectora (Ravikumaret al.,2004; Roscicet al.,2011). La inhibición de mTORC1 mediante el suministro sistémico de rapamicina atenúa los fenotipos de enfermedad en ratones con HD N171-82Q y enDrosophila(Ravikumaret al.,2004). Es posible sin embargo que, las mejoras conductuales inducidas por la rapamicina pueden reflejar los efectos beneficiosos sobre el músculo esquelético, en lugar de la inhibición de mTORC1 en el cerebro. En línea con esto, en ratones R6/2 HD tratados con rapamicina, la mejora en el rotarod es transitoria y se asocia con una pérdida de peso acelerada y una mayor atrofia cerebral (Foxet al.,2010). Curiosamente, la actividad de mTORC1 está anormalmente elevada en los músculos esqueléticos de ratones R6/2 (Sheet al.,2011). Junto con los datos de los inventores, estos resultados respaldan la idea de que restablecer la actividad equilibrada de mTORC1 es fundamental y plantean el punto interesante de que puede haber efectos específicos de tejido de mHTT sobre la actividad de mTOR; a diferencia del músculo esquelético, la actividad cerebral de mTORC1 ya está alterada en la EH.

[0136] El resultado de que la potenciación de mTORC1 es neuroprotectora también proporciona una base mecanicista para estudios anteriores que respaldan el papel de varios agentes que han demostrado ser terapéuticos en modelos de EH. Por ejemplo, el restablecimiento de la señalización de BDNF-TrkB tiene efectos neuroprotectores bien establecidos en varios modelos preclínicos de EH (Jianget al.,2013; Simmonset al.,2013; Xieet al.,2010; Zuccatoet al.,2001). Una consecuencia fisiológica de esta cascada de señalización es la activación de mTORC1 (Troca-Marinet al.,2011; Zhouet al.,2010). Además, un cribado con ARNi identificó a Lkb-1 como un potente modificador de la enfermedad en modelos de EH de células y deDrosophila(Schulteet al.,2011). Lkb-1 es un supresor tumoral que regula negativamente a mTORC1 (Shawet al.,2004). La supresión de Lkb-1 mejoró el crecimiento de neuritas dismórficas inducido por mHTT en neuronas primarias y rescató la letalidad y los fenotipos neurodegenerativos enDrosophilaque expresan un alelo mHTT (Schulteet al.,2011). En conjunto, estos resultados son concordantes con la opinión de los inventores de que reequilibrar la actividad de mTORC1 es beneficioso en la EH.

[0137] La autofagia es esencial para la homeostasis celular y la eliminación de proteínas (Wong y Cuervo, 2010). Encontraron que la activación de mTORC1 estimula la actividad autofágica en cerebros de ratones con EH y altera la expresión de genes implicados en estimular la degradación de mHTT (PIAS1, SUMO2, IKK y HDAC4). Estos resultados pueden resultar sorprendentes, ya que mTORC1 generalmente se considera inhibidor de la autofagia. Sin embargo, la evidencia reciente demuestra que la autofagia puede ocurrir en condiciones estimuladas por mTOR (Naritaet al.,2011), y en condiciones de inanición prolongada, la reactivación de mTOR propicia la formación de lisosomas, los cuales son necesarios para la autofagia sostenida (Yuet al.,2010). Los inventores sospechan que la autofagia basal potenciada o de control de calidad es una respuesta necesaria al crecimiento celular y la actividad metabólica y, a diferencia de la autofagia inducida por la inanición, es concordante con la activación de mTORCl. Aunque el mecanismo preciso por el cual mTORCl induce la autofagia no está claro, los inventores encontraron que la potenciación de mTORC1 aumentó los niveles de beclina1, un componente esencial implicado en la nucleación de vesículas autofágicas. Curiosamente, la sobreexpresión de beclina 1 induce la eliminación autofágica de agregados de mHTT (Shoji-Kawataet al.,2013). Adicionalmente, encontraron que mTORC1 regula al alza la expresión de IKK, un inductor de autofagia conocido que propicia la degradación de mHTT (Thompsonet al.,2009). Además, la estimulación de la señalización de IGF1/Akt, que a su vez activa a mTORC1, induce la fosforilación de mHTT y tiene como diana a la degradación de mHTT (Humbertet al.,2002; Yamamotoet al.,2006). En conjunto, los datos muestran que diversos mecanismos para la degradación de mHTT están interrelacionados y controlados por la actividad de mTORC1.

[0138] Se propone que la proteína enriquecida en estriado, Rhes, causa degeneración estriatal al propiciar la SUMOilación de mHTT; la atenuación génica por ARNip de SUMO1 elimina la citotoxicidad mediada por Rhesin vitro(Subramaniamet al.,2009). Contrariamente al posible papel tóxico del Rhes, los inventores encontraron que la adición de Rhes mejora los fenotipos neuropatológicos y motores en ratones con EH, y que esta propiedad neuroprotectora de Rhes precisa su actividad de GTPasa. Esto contrasta con la condiciónin vitro,donde la actividad de GTPasa de Rhes no está implicada en la citotoxicidad mediada por mHTT. Curiosamente, los inventores encontraron que reducir los niveles de Rhesin vivoprovoca una regulación al alza compensatoria de SUMO1 en el cuerpo estriado de ratones con EH (datos no mostrados). Esto es concordante con la observación de que las proteínas modificadas SUMO1 y SUMO2 se acumulan en cerebros humanos con EH cadavéricos (O'Rourkeet al.,2013). Adicionalmente, la sobreexpresión del mutante de Rhes deficiente en GTPasa pero con SUMOilación intacta no exacerba los fenotipos motores en ratones N171-82Q, como se podría predecir basándose en resultados anterioresin vitro(Subramaniamet al.,2009), lo que implica que los moduladores elin vivode la toxicidad de MSN son distintos de los de un sistema de cultivo aislado.

[0139] De acuerdo con el papel citoprotector de Rhes, los inventores informaron recientemente que la eliminación del ARNip de Rhes exacerba la atrofia estriatal y los fenotipos conductuales en ratones transgénicos con EH (Leeet al.,2014). Por otro lado, otro trabajo demostró que el cruce de ratones KO para Rhes con ratones R6/1 retrasó las deficiencias en el rotarod (Baiamonteet al.,2013). Sin embargo, la eliminación genética de Rhes no previene la atrofia estriatal en los ratones R6/1; y los ratones KO para Rhes demuestran una degeneración cerebral grave similar a la de los ratones con EH (Baiamonteet al.,2013). Además, los niveles de Rhes están reducidos en pacientes con EH y en el cuerpo estriado del modelo de ratones con EH, los pacientes con EH sintomáticos mostraron una sorprendente reducción del 83 % de Rhes estriatal en comparación con los individuos no afectados (Figura 7A). Recientemente se ha demostrado que Rhes propicia la autofagia (Mealeret al.,2014) y regula la homeostasis del hierro intracelular (Choiet al.,2013). Por lo tanto, restableces en lugar de reducir Rhes puede ser beneficioso en los cerebros con EH.

[0140] El resultado de que la normalización de la actividad de mTORC1 mejora los fenotipos de la EH puede tener una amplia implicación terapéutica para las enfermedades neurológicas con actividad de mTOR desregulada. Por ejemplo, los trastornos del desarrollo neurológico, tales como el retraso mental por cromosoma X frágil y el autismo, generalmente se asocian con una actividad hiperactiva de mTORC1; la supresión de mTORC1 en estas condiciones mejora los fenotipos de enfermedad (Bhattacharyaet al.,2012; Tsaiet al.,2012). En cambio, en el caso de la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), donde la actividad neuronal de mTORC1 está reducida, la estimulación de mTORC1 contrarresta el proceso degenerativo (Saxenaet al.,2013). Por tanto, restablecer el nivel homeostático de la función de mTORC1 puede beneficiar ampliamente a las enfermedades neurológicas.

[0141] En resumen, el estudio de los inventores proporciona nuevos conocimientos sobre la interconectividad de fenotipos patológicos complejos en la EH, que convergen en la vía de mTORC1. Y, junto con trabajos previos en otros campos de enfermedades neurodegenerativas, destaca la observación de que el grado de activación de mTORCI debe controlarse cuidadosamente para lograr utilidad terapéutica. Si bien reducir la expresión de mHTT en el cerebro sería una forma directa de rescatar la actividad de mTORC1 en el contexto de la EH, un reequilibrio de la actividad de mTORC1 puede ser de beneficio terapéutico.

Procedimientos experimentales

[0142] Animales. Todos los protocolos para animales fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Iowa. Los ratones N171-82Q se obtuvieron de Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME) y se mantuvieron en un acervo genético de B6C3F1/J. Los ratones se genotiparon utilizando cebadores específicos para el transgén HTT humano mutante, y se utilizaron compañeros de camada hemicigotos y de tipo silvestre de la misma edad para los experimentos indicados. Los ratones se alojaron en un ambiente de temperatura controlada en un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas. El alimento y el agua se proporcionaron a voluntad. Para estudios farmacológicos, RAD001 se obtuvo de LC Laboratories, se diluyó a 2 mg/ml en DMSO al 2 % y se almacenó a -20 °C. Se administraron vehículo recién descongelado y RAD001 (30 pmol/kg) 3 veces por semana (lunes, miércoles y viernes) durante dos semanas mediante alimentación forzada como se describió anteriormente (Foxet al.,2010). Se sacrificó a los ratones tras 24 horas después de la última dosis.

Plásmidos y AAV

[0143] Para este estudio se utilizaron vectores de AAV de serotipo 1 (AAV2/1). Las secuencias de ADNc de Rhes y Rheb se amplificaron a partir de una biblioteca de ADNc de cuerpo estriado de ratón. Se incorporó un epítopo Flag al extremo 3' mediante PCR para la detección por transferencia de Western. El mutante de Rhes con GTPasa inactiva (RhesS33N) y el mutante Rheb hiperactivo (caRheb;S16H) se generaron mediante mutagénesis dirigida Quik-Change (Agilent Technology). Los cebadores para la mutagénesis se diseñaron basándose en el programa de diseño de cebadores QuikChange (http://www.stratagene.com). Las secuencias de Rhes, RhesS33N y caRheb se clonaron en vectores de expresión de AAV bajo el control de un promotor de p-actina de pollo. Los vectores AAV.Rhes y AAV.RhesS33N también expresan GFP potenciada (eGFP) bajo el control de una secuencia IRES. Además, se amplificó por PCR una secuencia de N171-82Q etiquetada con myc aminoterminal a partir del plásmido pCMVHD-N l7 l-82Q (Harperet al.,2005) y se clonó en el mismo vector de expresión de AAV para generar AAV.mHTT. Todos los AAV se produjeron por Vector Core de la Universidad de Iowa. Los títulos de AAV se determinaron mediante RT-PCR (Rhes: 3 x 1012 genomas víricos/ml, RhesS33N: 3 x 1012 genomas víricos/ml, caRheb: 3 x 1012 genomas víricos/ml, eGFP: 3 x 1012 genomas víricos/ml y mHTT (N171-82Q): 3 x 1012 genomas víricos/ml).

Inyecciones

[0144] Las coordenadas estereotácticas utilizadas para el cuerpo estriado son 0,86 mm rostral al bregma, ±1,8 mm lateral a la línea media, 3,5 mm ventral a la superficie del cráneo. A ratones N171-82Q y compañeros de camada de TS se les inyectó AAV.Rhes, AAV.RhesS33N o solución salina a las 7 semanas de edad. Para todos los estudios conductuales, a los ratones se les inyectaron bilateralmente 5 pl de AAV. Para los estudios de inyección unilateral, se utilizaron inyecciones de 5 pl de AAV. Las coordenadas estereotácticas utilizadas para el hipocampo son AP:-2,0 mm, ML:+ 1,5 mm, DV: -2,3 mm respecto al bregma; a los ratones se les inyectó unilateralmente 1 ul de AAV. Para las pruebas de rotación inducida por anfetamina en ratones de TS, se inyectaron conjuntamente 3 pl de AAV.mHTT con 2 pl de AAV.caRheb o 2 pl de AAV.eGFP en el cuerpo estriado. Las velocidades de inyección para todos los estudios fueron de 0,2 pl/min. Los ratones se sacrificaron a las edades indicadas utilizando métodos convencionales aprobados (Harperet al.,2005; McBrideet al.,2008).

Cultivo celular y transfecciones

[0145] Las células de cuerpo estriado mutantes (Q111) y de TS (Q7) (Trettelet al.,2000) con HTT de longitud completa fueron amablemente proporcionadas por la Dra. Marcy MacDonald. Las células Q7 y Q111 se cultivaron a 37 °C en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Sigma Chemical Co, St. Louis, MO) complementado con suero fetal bovino al 10%, aminoácidos no esenciales al 1 %, L-glutamina 2 mM y G418 400 pg/ml (Geneticina; Invitrogen, Carlsbad, CA). Para los estudios de inhibición de mTOR, las células se trataron con DMSO o Torin1 250 nM (Tocris, Bristol, RU) durante 24 horas.

Aislam iento de cerebros de ratón

[0146] Los ratones utilizados en análisis histológicos se anestesiaron con una mezcla de cetamina/xilacina y se perfundieron transcardialmente con 20 ml de solución salina al 0,9 % fría, seguido de 20 ml de paraformaldehído al 4 % en tampón PO40,1 M. Los cerebros se extrajeron y se fijaron durante la noche y se recogieron cortes de 40 pm de grosor. A los ratones utilizados para los análisis moleculares se les perfundieron 20 ml de solución salina al 0,9 % fría y se extrajo el cerebro y se incluyeron en bloques en cortes frontales de 1 mm de grosor. Se tomaron trozos de tejido con sacabocados del cuerpo estriado utilizando un extractor de tejido (1,4 mm de diámetro). Los trozos de tejido se congelaron instantáneamente en nitrógeno líquido y se almacenaron a -80 °C hasta su uso.

Inmunohistoquímica y cuantificación

[0147] Se procesaron cortes cerebrales frontales flotantes de 40 |jm para la tinción inmunohistoquímica de neuronas espinosas medianas o agregados de mHTT utilizando anticuerpos marcados con biotina. Las cortes se bloquearon en suero de cabra normal al 5 % durante 1 hora, luego se incubaron con anticuerpo primario (DARPP-32, 1:200, Cell Signaling) durante la noche y se lavaron. Los agregados de mHTT se inmunotiñeron con el anticuerpo em48 (1:200, mEM48; cedido por X. J. Li, Facultad de Medicina de la Universidad de Emory). La fosforilación de S6 se detectó con un anticuerpo ara fosfo-S6 (S235/236, 1:300, Cell Signaling). Los cortes se incubaron en anticuerpos secundarios IgG biotinilados de cabra anti-conejo o de cabra anti-ratón (1:200; Vector Laboratories) durante 1 hora a temperatura ambiente y luego se trataron con complejos de avidina-peroxidasa de rábano picante biotinilada (ABC; Vector Labs). En todos los procedimientos, la eliminación del anticuerpo primario sirvió como control. Los cortes teñidos se montaron en portaobjetos Superfrost Plus (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). Las imágenes se capturaron utilizando un microscopio óptico Olympus BX60 y una cámara DP70 con el programa informático Olympus DP Controller (Olympus, Melville, N<y>). Para cada cerebro, se eligieron cuatro cortes representativos y se rastrearon manualmente áreas de 70 neuronas espinosas medianas (MSN) positivas para DARPP-32 con un objetivo de 40x de cada hemisferio. Las áreas de MSN positivas para DARPP-32 se cuantificaron mediante el programa informático Olympus DP2-BSW (versión 2.1). Las áreas de MSN promedio de los lados inyectados ipsilaterales se compararon con los lados de control contralaterales y se expresaron como medias ETM. Un investigador que desconocía los grupos de tratamiento contó las inclusiones positivas para EM48.

Estereología

[0148] El volumen estriatal se calculó utilizando métodos de recuento de puntos con el estimador de volumen de Cavalieri (Michel y Cruz-Orive, 1988). Resumiendo, se capturaron imágenes de cortes frontales teñidos con DARPP-32 (40 jm de grosor) utilizando un microscopio óptico Olympus BX60 y una cámara DP70 con el programa informático Olympus DP Controller (Olympus, Melville, NY). Se colocó una lámina de acetato con un patrón de cuadrícula sobre la imagen en ángulos aleatorios y se contó el número de intersecciones de la cuadrícula que recubrían el cuerpo estriado. Se utilizó un conjunto sistemático aleatorio de cortes en serie con un intervalo de 480 jm . Se contabilizaron un mínimo de 200 puntos en 5 cortes. Los volúmenes estriatales izquierdo y derecho se determinaron de forma independiente en los mismos cortes a partir del recuento de puntos utilizando la fórmula Vol (objeto)= IP(objeto) ■t • a(p),en que IP(objeto)=suma de puntos que recubren el cuerpo estriado, t=distancia entre cortes, y Ap=área por punto.

Microscopía electrónica

[0149] Los ratones se anestesiaron y se perfundieron por vía intracardíaca con solución salina seguida de glutaraldehído al 2,5% en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M, pH 7,4. Los cerebros se extrajeron y se fijaron posteriormente en glutaraldehído al 2,5 %, tampón de cacodilato de sodio 0,1 M, pH 7,4 durante 24 horas. Se cortaron cortes frontales de 100 jm con vibratomo y se fijaron en OsO4 al 1 % en cacodilato 0,1 M durante 1 h, se tiñeron con acetato de uranilo al 1 %, se deshidrataron e incluyeron en Eponate 812. Se examinaron cortes semifinos de 1 jm teñidos con azul de toluidina al microscopio óptico para identificar el cuerpo estriado. Se examinaron cortes ultrafinos de cuerpo estriado (80 nm) con un microscopio electrónico de transmisión JEOL EX 1200.

Análisis por transferencia de Western

[0150] Se recogieron los cuerpos estriados de ratón y se lisaron en tampón RIPA que contenía Tris 50 mM (pH 8,0), NaCl 150 mM, detergente NP450 1 %, detergente SDS al 0,1 %, ácido desoxicólico al 0,5 % y p-mercaptoetanol 1 mM con inhibidores de proteasas (Complete Mini, Roche Applied Science, Mannheim, Alemania) e inhibidores de la fosfatasa (PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail, Roche Applied Science, Mannheim, Alemania). Los tejidos se homogeneizaron en hielo y se centrifugaron a 14.000 g durante 20 min. Se utilizó el sobrenadante para el análisis. La concentración de proteínas se determinó mediante el ensayo de BCA (Pierce, Rockford, IL) y 20-30 jg de proteína se redujeron y separaron mediante SDS-PAGE en geles de acrilamida al 4% -10% y se transfirieron a membranas Immobilon de PVDF de 0,2 jm (Millipore, Billerica, MA). Los anticuerpos primarios utilizados fueron los siguientes: DARPP-32 (1: 1000, Cell Signaling), p-actina (Sigma-Aldrich, 1:5000), S6 (1:1000, Cell Signaling), fosfo-S6 (S235/236, 1:1000, Cell Signaling), 4EBP1 (1: 1000, Cell Signaling), fosfo-4E-BP1 (T37/46, 1:1000, Cell Signaling), mTOR (1: 1000, Cell Signaling), Rictor (1: 1000, Cell Signaling), Raptor (1:1000, Cell Signaling), CREB (1: 1000, Cell Signaling), TORC1 (1: 1000, Cell Signaling), PGC1-a (1: 1000, abcam), LC3 (1:1000, Novus Biologicals) y Beclinal (1:1000, Cell Signaling). Los anticuerpos secundarios utilizados fueron IgG anti-ratón de cabra-HRP e IgG anti-conejo de cabra-HRP (Cell Signaling). Las transferencias se revelaron utilizando ECL Plus Western Blotting Detection System (GE Healthcare, Pittsburg, PA) y luego se expusieron a una película. La cuantificación de proteínas se realizó utilizando el programa informático NIH Imaged o el VersaDocTM Imaging System (Biorad) y el programa informático de análisis Quantity One R. Las densidades de las bandas se normalizaron con respecto a las bandas de (p-actina) constitutiva de las mismas muestras y carriles.

Muestras de cerebro

[0151] Se obtuvieron cortes frontales de tejidos cerebrales de autopsias humanas de individuos no afectados y pacientes con EH de grado 2, 3 y 4 de Vonsattel (Dr. Christopher Ross, Universidad Johns Hopkins; Banco de Cerebros de Nueva York en la Universidad de Columbia, Centro de Investigación de la Enfermedad de Alzheimer, Instituto Taub). Los tejidos se congelaron instantáneamente con intervalospostmortem(IPM) que oscilaron entre las 13 y las 49 horas. Se disecaron los núcleos caudados/putamen de los tejidos congelados colocados en una platina metálica helada y se homogeneizaron en tampón RIPA con inhibidores de proteasas (Complete Mini, Roche Applied Science, Mannheim, Alemania) e inhibidores de la fosfatasa (PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Cocktail, Roche Applied Science, Mannheim, Alemania). Los lisados se centrifugaron a 14.000 g durante 20 min. El sobrenadante se recogió para análisis por transferencia de Western. Se procesaron tejidos congelados adicionales para la extracción de ARN utilizando TRIzol.

PCR cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR.

[0152] Se aisló ARN de trozos extraídos con sacabocados de cuerpo estriado utilizando 1 ml de TRIzol. La síntesis de ADN complementario (ADNc) de primera cadena cebada aleatoriamente se realizó utilizando 500 ng de ARN total (High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit; Applied Biosystems, Foster City, CA) según el protocolo del fabricante. La PCR en tiempo real se realizó en un sistema de detección de secuencias (Prism 7900HT, Applied Biosystems) utilizando la mezcla con PCR verde SYBR (Invitrogen) o TaqMan 2x Universal Master Mix (Applied Biosystems). Los siguientes juegos de cebadores/sonda Taqman se obtuvieron de Applied Biosystem: Rhes (Mm04209172_m1 y Hs04188091_mH), PGC1-a (Mm01208835_m1), y HMGCS1 (Mm01304569_m1), y HDAC4 (Mm01299557_m1). Las secuencias de los cebadores para la RT PCR con SYBR green están disponibles previa solicitud. La expresión génica relativa se determinó utilizando el método de AACT, normalizándose con respecto a la p-actina.

Pruebas conductuales

Ensayo rotacional inducido por anfetamina

[0153] A los ratones se les inyectó anfetamina intraperitoneal (3 mg/kg; Sigma), y luego se colocaron individualmente en el centro de una cámara de actividad de plástico cuadrada (50 x 50 cm). Se permitió a los ratones habituarse en la cámara durante 20 min antes de la inducción de la anfetamina. Luego se registró el comportamiento rotacional durante 40 min mediante una cámara de vídeo montada en el techo. La rotación neta se expresó como número de giros ipsilaterales - número de giros contralaterales en una sesión de 40 min.

Aceleración en Rotarod

[0154] Se evaluó la función motora inicial de ratones N171-82Q macho a las 6 semanas de edad y luego a las 10, 14 y 18 semanas de edad. Antes de cada prueba, los ratones se habituaron primero al rotarod durante 4 minutos y descansaron durante una hora. Las pruebas se realizaron en tres ensayos por día (con 30 minutos de descanso entre ensayos) durante cuatro días consecutivos. Para cada prueba, se colocaron ratones sobre la varilla que acelera de 4 40 rotaciones por minuto durante 4 minutos y luego se mantuvo la velocidad a 40 rpm. La latencia para la caída (o si los ratones aguantaban durante dos rotaciones consecutivas sin correr) se utilizó como calificación del rendimiento motor. Las pruebas se detuvieron a los 300 segundos y los ratones que permanecían en el rotarod en ese momento se puntuaron como 300 s. Los datos de los tres ensayos para cada grupo en cada día se presentan como medias ± ETM. Los ratones se sometieron siempre a las pruebas en la fase oscura del ciclo luz/oscuridad. Todos los experimentos conductuales se realizaron sin que el investigador conociera los genotipos de los ratones ni los tratamientos.

Análisis estadísticos

[0155] Los datos se analizaron mediante la prueba de la t de Student o el análisis ANOVA unidireccional, seguido por el análisis aposterioride Tukey para evaluar diferencias significativas entre grupos individuales. Todos los análisis estadísticos se realizaron con GraphPad Prism versión 5.0c. Los datos se presentan como la media ±ETM. En todos los casos, P < 0,05 se consideró significativo.

Referencias

[0156]

(1993). A novel gene containing a trinucleotide repeat that is expanded and unstable on Huntington's disease chromosomes. Grupo de investigación colaborativa de la enfermedad de Huntington. Cell 72, 971-983.

Baiamonte, B.A., Lee, F.A., Brewer, S.T., Spano, D. y LaHoste, G.J. (2013). Attenuation of Rhes activity significantly delays the appearance of behavioral symptoms in a mouse model of Huntington's disease. PLoS One 8, e53606. Bhattacharya, A., Kaphzan, H., Alvarez-Dieppa, A.C., Murphy, J.P., Pierre, P. y Klann, E. (2012). Genetic removal of p70 S6 kinase 1 corrects molecular, synaptic, and behavioral phenotypes in fragile X syndrome mice. Neuron 76, 325-337.

Bibb, J.A., Yan, Z., Svenningsson, P., Snyder, G.L., Pieribone, V.A., Horiuchi, A., Naim, A.C., Messer, A. y Greengard, P. (2000). Severe deficiencies in dopamine signaling in presymptomatic Huntington's disease mice. Proc Natl Acad Sci U S A 97, 6809-6814.

Cheng, Y., Peng, Q., Hou, Z., Aggarwal, M., Zhang, J., Mori, S., Ross, C.A. y Duan, W. (2011). Structural MRI detects progressive regional brain atrophy and neuroprotective effects in N171-82Q Huntington's disease mouse model. Neuroimage 56, 1027-1034.

Choi, B.R., Bang, S., Chen, Y., Cheah, J.H. y Kim, S.F. (2013). PKA modulates iron trafficking in the striatum via small GTPase, Rhes. Neuroscience 253, 214-220.

Cui, L., Jeong, H., Borovecki, F., Parkhurst, C.N., Tanese, N. y Krainc, D. (2006). Transcriptional repression of PGC-1alpha by mutant huntingtin leads to mitochondrial dysfunction and neurodegeneration. Cell 127, 59-69. Cunningham, J.T., Rodgers, J.T., Arlow, D.H., Vazquez, F., Mootha, V.K. y Puigserver, P. (2007). mTOR controls mitochondrial oxidative function through a YY1-PGC-1alpha transcriptional complex. Nature 450, 736-740.

Fox, J.H., Connor, T., Chopra, V., Dorsey, K., Kama, J.A., Bleckmann, D., Betschart, C., Hoyer, D., Frentzel, S., Difiglia, M.,et al.(2010). The mTOR kinase inhibitor Everolimus decreases S6 kinase phosphorylation but fails to reduce mutant huntingtin levels in brain and is not neuroprotective in the R6/2 mouse model of Huntington's disease. Mol Neurodegener 5, 26.

Harper, S.Q., Staber, P.D., He, X., Eliason, S.L., Martins, I.H., Mao, Q., Yang, L., Kotin, R.M., Paulson, H.L. y Davidson, B.L. (2005). RNA interference improves motor and neuropathological abnormalities in a Huntington's disease mouse model. Proc Natl Acad Sci U S A 102, 5820-5825.

Hodges, A., Strand, A.D., Aragaki, A.K., Kuhn, A., Sengstag, T., Hughes, G., Elliston, L.A., Hartog, C., Goldstein, D.R., Thu, D.,et al.(2006). Regional and cellular gene expression changes in human Huntington's disease brain. Hum Mol Genet 15, 965-977.

Humbert, S., Bryson, E.A., Cordelieres, F.P., Connors, N.C., Datta, S.R., Finkbeiner, S., Greenberg, M.E. y Saudou, F. (2002). The IGF-1/Akt pathway is neuroprotective in Huntington's disease and involves Huntingtin phosphorylation by Akt. Dev Cell 2, 831-837.

Jeong, H., Then, F., Melia, T.J., Jr., Mazzulli, J.R., Cui, L., Savas, J.N., Voisine, C., Paganetti, P., Tanese, N., Hart, A. C.,et al.(2009). Acetylation targets mutant huntingtin to autophagosomes for degradation. Cell 137, 60-72. Jia, H., Kast, R.J., Steffan, J.S. y Thomas, E.A. (2012). Selective histone deacetylase (HDAC) inhibition imparts beneficial effects in Huntington's disease mice: implications for the ubiquitin-proteasomal and autophagy systems. Hum Mol Genet 21, 5280-5293.

Jiang, M., Peng, Q., Liu, X., Jin, J., Hou, Z., Zhang, J., Mori, S., Ross, C.A., Ye, K. y Duan, W. (2013). Smallmolecule TrkB receptor agonists improve motor function and extend survival in a mouse model of Huntington's disease. Hum Mol Genet 22, 2462-2470.

Johnson, M.A., Rajan, V., Miller, C.E. y Wightman, R.M. (2006). Dopamine release is severely compromised in the R6/2 mouse model of Huntington's disease. J Neurochem 97, 737-746.

Karasinska, J.M. y Hayden, M.R. (2011). Cholesterol metabolism in Huntington disease. Nat Rev Neurol 7, 561 572.

Kim, S.R., Kareva, T., Yarygina, O., Kholodilov, N. y Burke, R.E. (2012). AAV transduction of dopamine neurons with constitutively active Rheb protects from neurodegeneration and mediates axon regrowth. Mol Ther 20, 275 286. Kreiner, G., Bierhoff, H., Armentano, M., Rodriguez-Parkitna, J., Sowodniok, K., Naranjo, J.R., Bonfanti, L., Liss, B., Schutz, G., Grummt, I.,et al.(2013). A neuroprotective phase precedes striatal degeneration upon nucleolar stress. Cell Death Differ.

Laplante, M. y Sabatini, D.M. (2012). mTOR signaling in growth control and disease. Cell 149, 274-293.

Lee, J.H., Sowada, M.J., Boudreau, R.L., Aerts, A.M., Thedens, D.R., Nopoulos, P. y Davidson, B.L. (2014). Rhes Suppression Enhances Disease Phenotypes in Huntington's Disease Mice. J Huntingtons Dis 3, 65-71.

Li, H., Li, S.H., Yu, Z.X., Shelbourne, P. y Li, X.J. (2001). Huntingtin aggregateassociated axonal degeneration is an early pathological event in Huntington's disease mice. J Neurosci 21, 8473-8481.

Lu, B. y Palacino, J. (2013). A novel human embryonic stem cell-derived Huntington's disease neuronal model exhibits mutant huntingtin (mHTT) aggregates and soluble mHTT-dependent neurodegeneration. FASEB J 27, 1820-1829.

Mason, R.P., Casu, M., Butler, N., Breda, C., Campesan, S., Clapp, J., Green, E.W., Dhulkhed, D., Kyriacou, C.P. y Giorgini, F. (2013). Glutathione peroxidase activity is neuroprotective in models of Huntington's disease. Nat Genet 45, 1249-1254.

McBride, J.L., Boudreau, R.L., Harper, S.Q., Staber, P.D., Monteys, A.M., Martins, I., Gilmore, B.L., Burstein, H., Peluso, R.W., Polisky, B.,et al.(2008). Artificial miRNAs mitigate shRNA-mediated toxicity in the brain: implications for the therapeutic development of r Na í. Proc Natl Acad Sci U S A 105, 5868-5873.

Mealer, R.G., Murray, A.J., Shahani, N., Subramaniam, S. y Snyder, S.H. (2014). Rhes, a Striatal-selective Protein Implicated in Huntington Disease, Binds Beclin-1 and Activates Autophagy. J Biol Chem 289, 3547-3554. Mealer, R.G., Subramaniam, S. y Snyder, S.H. (2013). Rhes Deletion Is Neuroprotective in the 3-Nitropropionic Acid Model of Huntington's Disease. J Neurosci 33, 4206-4210.

Michel, R.P. y Cruz-Orive, L.M. (1988). Application of the Cavalieri principle and vertical sections method to lung: estimation of volume and pleural surface area. J Microsc 150, 117-136.

Mielcarek, M., Landles, C., Weiss, A., Bradaia, A., Seredenina, T., Inuabasi, L., Osborne, G.F., Wadel, K., Touller, C., Butler, R.,et al.(2013). HDAC4 reduction: a novel therapeutic strategy to target cytoplasmic huntingtin and ameliorate neurodegeneration. PLoS Biol 11, e1001717.

Milnerwood, A.J. y Raymond, L.A. (2010). Early synaptic pathophysiology in neurodegeneration: insights from Huntington's disease. Trends Neurosci 33, 513-523.

Narita, M., Young, A.R., Arakawa, S., Samarajiwa, S.A., Nakashima, T., Yoshida, S., Hong, S., Berry, L.S., Reichelt, S., Ferreira, M.,et al.(2011). Spatial coupling of mTOR and autophagy augments secretory phenotypes. Science 332, 966-970.

O'Rourke, J.G., Gareau, J.R., Ochaba, J., Song, W., Rasko, T., Reverter, D., Lee, J., Monteys, A.M., Pallos, J., Mee, L.,et al.(2013). SUMO-2 and PIAS1 modulate insoluble mutant huntingtin protein accumulation. Cell Rep 4, 362-375.

Park, K.K., Liu, K., Hu, Y., Smith, P.D., Wang, C., Cai, B., Xu, B., Connolly, L., Kramvis, I., Sahin, M.,et al.(2008). Promoting axon regeneration in the adult CNS by modulation of the PTEN/mTOR pathway. Science 322, 963-966. Peterson, T.R., Sengupta, S.S., Harris, T.E., Carmack, A.E., Kang, S.A., Balderas, E., Guertin, D.A., Madden, K.L., Carpenter, A.E., Finck, B.N.,et al.(2011). mTOR complex 1 regulates lipin 1 localization to control the SREBP pathway. Cell 146, 408-420.

Porstmann, T., Santos, C.R., Griffiths, B., Cully, M., Wu, M., Leevers, S., Griffiths, J.R., Chung, Y.L. y Schulze, A. (2008). SREBP activity is regulated by mTORC1 and contributes to Akt-dependent cell growth. Cell Metab 8, 224 236.

Ravikumar, B., Vacher, C., Berger, Z., Davies, J.E., Luo, S., Oroz, L.G., Scaravilli, F., Easton, D.F., Duden, R., O'Kane, C.J.,et al.(2004). Inhibition of mTOR induces autophagy and reduces toxicity of polyglutamine expansions in fly and mouse models of Huntington disease. Nat Genet 36, 585-595.

Roscic, A., Baldo, B., Crochemore, C., Marcellin, D. y Paganetti, P. (2011). Induction of autophagy with catalytic mTOR inhibitors reduces huntingtin aggregates in a neuronal cell model. J Neurochem 119, 398-407.

Saxena, S., Roselli, F., Singh, K., Leptien, K., Julien, J.P., Gros-Louis, F. y Caroni, P. (2013). Neuroprotection through Excitability and mTOR Required in ALS Motoneurons to Delay Disease and Extend Survival. Neuron 80, 80-96.

Schilling, G., Becher, M.W., Sharp, A.H., Jinnah, H.A., Duan, K., Kotzuk, J.A., Slunt, H.H., Ratovitski, T., Cooper, J.K., Jenkins, N.A.,et al.(1999). Intranuclear inclusions and neuritic aggregates in transgenic mice expressing a mutant N-terminal fragment of huntingtin. Hum Mol Genet 8, 397-407.

Schulte, J., Sepp, K.J., Wu, C., Hong, P. y Littleton, J.T. (2011). High-content chemical and RNAi screens for suppressors of neurotoxicity in a Huntington's disease model. PLoS One 6, e23841.

Seredenina, T., Gokce, O. y Luthi-Carter, R. (2011). Decreased striatal RGS2 expression is neuroprotective in Huntington's disease (HD) and exemplifies a compensatory aspect of HD-induced gene regulation. PLoS One 6, e22231.

Shaw, R.J., Bardeesy, N., Manning, B.D., Lopez, L., Kosmatka, M., DePinho, R.A. y Cantley, L.C. (2004). The LKB1 tumor suppressor negatively regulates mTOR signaling. Cancer Cell 6, 91-99.

She, P., Zhang, Z., Marchionini, D., Diaz, W.C., Jetton, T.J., Kimball, S.R., Vary, T.C., Lang, C.H. y Lynch, C.J. (2011). Molecular characterization of skeletal muscle atrophy in the R6/2 mouse model of Huntington's disease. Am J Physiol Endocrinol Metab 301, E49-61.

Shoji-Kawata, S., Sumpter, R., Leveno, M., Campbell, G.R., Zou, Z., Kinch, L., Wilkins, A.D., Sun, Q., Pallauf, K., Macduff, D.,et al.(2013). Identification of a candidate therapeutic autophagy-inducing peptide. Nature.

494(7436):201-6.

Simmons, D.A., Belichenko, N.P., Yang, T., Condon, C., Monbureau, M., Shamloo, M., Jing, D., Massa, S.M. y Longo, F.M. (2013). A Small Molecule TrkB Ligand Reduces Motor Impairment and Neuropathology in R6/2 and BACHD Mouse Models of Huntington's Disease. J Neurosci 33, 18712-18727.

Spano, D., Branchi, I., Rosica, A., Pirro, M.T., Riccio, A., Mithbaokar, P., Affuso, A., Arra, C., Campolongo, P., Terracciano, D.,et al.(2004). Rhes is involved in striatal function. Mol Cell Biol 24, 5788-5796.

St-Pierre, J., Drori, S., Uldry, M., Silvaggi, J.M., Rhee, J., Jager, S., Handschin, C., Zheng, K., Lin, J., Yang, W.,et al.(2006). Suppression of reactive oxygen species and neurodegeneration by the PGC-1 transcriptional coactivators. Cell 127, 397-408.

Steffan, J.S., Agrawal, N., Pallos, J., Rockabrand, E., Trotman, L.C., Slepko, N., Illes, K., Lukacsovich, T., Zhu, Y.Z., Cattaneo, E.,et al.(2004). SUMO modification of Huntingtin and Huntington's disease pathology. Science 304, 100-104.

Subramaniam, S., Napolitano, F., Mealer, R.G., Kim, S., Errico, F., Barrow, R., Shahani, N., Tyagi, R., Snyder, S.H. y Usiello, A. (2012). Rhes, a striatal-enriched small G protein, mediates mTOR signaling and L-DOPAinduced dyskinesia. Nat Neurosci 15, 191-193.

Subramaniam, S., Sixt, K.M., Barrow, R. y Snyder, S.H. (2009). Rhes, a striatal specific protein, mediates mutanthuntingtin cytotoxicity. Science 324, 1327-1330.

Sun, F., Park, K.K., Belin, S., Wang, D., Lu, T., Chen, G., Zhang, K., Yeung, C., Feng, G., Yankner, B.A.,et al.(2011). Sustained axon regeneration induced by co-deletion of PTEN and SOCS3. Nature 480, 372-375.

Tabrizi, S.J., Scahill, R.I., Owen, G., Durr, A., Leavitt, B.R., Roos, R.A., Borowsky, B., Landwehrmeyer, B., Frost, C., Johnson, H.,et al.(2013). Predictors of phenotypic progression and disease onset in premanifest and earlystage Huntington's disease in the TRACK-H<d>study: analysis of 36-month observational data. Lancet Neurol. Thompson, L.M., Aiken, C.T., Kaltenbach, L.S., Agrawal, N., Illes, K., Khoshnan, A., Martinez-Vincente, M., Arrasate, M., O'Rourke, J.G., Khashwji, H.,et al.(2009). IKK phosphorylates Huntingtin and targets it for degradation by the proteasome and lysosome. J Cell Biol 187, 1083-1099.

Thoreen, C.C., Kang, S.A., Chang, J.W., Liu, Q., Zhang, J., Gao, Y., Reichling, L.J., Sim, T., Sabatini, D.M. y Gray, N.S. (2009). An ATP-competitive mammalian target of rapamycin inhibitor reveals rapamycin-resistant functions of mTORC1. J Biol Chem 284, 8023-8032.

Trettel, F., Rigamonti, D., Hilditch-Maguire, P., Wheeler, V.C., Sharp, A.H., Persichetti, F., Cattaneo, E. y MacDonald, M.E. (2000). Dominant phenotypes produced by the HD mutation in STHdh(Q111) striatal cells. Hum Mol Genet 9, 2799-2809.

Troca-Marin, J.A., Alves-Sampaio, A. y Montesinos, M.L. (2011). An increase in basal BDNF provokes hyperactivation of the Akt-mammalian target of rapamycin pathway and deregulation of local dendritic translation in a mouse model of Down's syndrome. J Neurosci 31, 9445-9455.

Tsai, P.T., Hull, C., Chu, Y., Greene-Colozzi, E., Sadowski, A.R., Leech, J.M., Steinberg, J., Crawley, J.N., Regehr, W.G. y Sahin, M. (2012). Autistic-like behaviour and cerebellar dysfunction in Purkinje cell Tsc1 mutant mice. Nature 488, 647-651.

Tsunemi, T., Ashe, T.D., Morrison, B.E., Soriano, K.R., Au, J., Roque, R.A., Lazarowski, E.R., Damian, V.A., Masliah, E. y La Spada, A.R. (2012). PGC-1alpha rescues Huntington's disease proteotoxicity by preventing oxidative stress and promoting TFEB function. Sci Transl Med 4, 142ra197.

Tsunemi, T., y La Spada, A.R. (2011). PGC-1alpha at the intersection of bioenergetics regulation and neuron function: From Huntington's disease to Parkinson's disease and beyond. Prog Neurobiol. Mayo de 2012;97(2):142-51. Valenza, M. y Cattaneo, E. (2011). Emerging roles for cholesterol in Huntington's disease. Trends Neurosci 34, 474-486.

Valenza, M., Rigamonti, D., Goffredo, D., Zuccato, C., Fenu, S., Jamot, L., Strand, A., Tarditi, A., Woodman, B., Racchi, M.,et al.(2005). Dysfunction of the cholesterol biosynthetic pathway in Huntington's disease. J Neurosci 25, 9932-9939.

Wong, E. y Cuervo, A.M. (2010). Autophagy gone awry in neurodegenerative diseases. Nat Neurosci 13, 805-811. Xie, Y., Hayden, M.R. y Xu, B. (2010). BDNF overexpression in the forebrain rescues Huntington's disease phenotypes in YAC128 mice. J Neurosci 30, 14708-14718.

Yamamoto, A., Cremona, ML y Rothman, J.E. (2006). Autophagy-mediated clearance of huntingtin aggregates triggered by the insulin-signaling pathway. J Cell Biol 172, 719-731.

Yamamoto, A., Lucas, J.J. y Hen, R. (2000). Reversal of neuropathology and motor dysfunction in a conditional model of Huntington's disease. Cell 101, 57-66.

Yu, L., McPhee, C.K., Zheng, L., Mardones, G.A., Rong, Y., Peng, J., Mi, N., Zhao, Y., Liu, Z., Wan, F.,et al.(2010). Termination of autophagy and reformation of lysosomes regulated by mTOR. Nature 465, 942-946.

Zhou, X., Lin, D.S., Zheng, F., Sutton, M.A. y Wang, H. (2010). Intracellular calcium and calmodulin link brainderived neurotrophic factor to p70S6 kinase phosphorylation and dendritic protein synthesis. J Neurosci Res 88, 1420-1432.

Zou, J., Zhou, L., Du, X.X., Ji, Y., Xu, J., Tian, J., Jiang, W., Zou, Y., Yu, S., Gan, L.,et al.(2011). Rheb1 is required for mTORC1 and myelination in postnatal brain development. Dev Cell 20, 97-108.

Zuccato, C., Ciammola, A., Rigamonti, D., Leavitt, B.R., Goffredo, D., Conti, L., MacDonald, M.E., Friedlander, R.M., Silani, V., Hayden, M.R.,et al.(2001). Loss of huntingtin-mediated BDNF gene transcription in Huntington's disease. Science 293, 493-498.

[0157] El uso de los términos "un" y "uno/una" y "el/la" y referentes similares en el contexto de la descripción de la invención debe interpretarse de modo que cubra tanto el singular como el plural, a menos que se indique lo contrario en el presente documento o el contexto lo contradiga claramente. Las expresiones "que comprende", "que tiene(n)", "que incluye(n)", y "que contiene(n)" se han de interpretar como expresiones abiertas (es decir, que significan "que incluye(n), aunque no de forma limitativa"), salvo que se indique lo contrario. La enumeración de intervalos de valores en el presente documento meramente pretende servir como método abreviado de hacer referencia de manera individual a cada valor separado que se encuentre dentro del intervalo, salvo que se indique lo contrario en el presente documento y cada valor separado se incorpora a la memoria descriptiva como si se enumerara de manera individual en el presente documento. Todos los procedimientos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique otra cosa en el presente documento o claramente se contradiga por el contexto. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o del lenguaje de ejemplo (por ejemplo, "tal como") proporcionado en el presente documento, está destinado simplemente a explicar mejor la invención y no representa una limitación en el ámbito de la invención a menos que se reivindique otra cosa. Ninguna expresión de la memoria descriptiva debe interpretarse en el sentido de que indica algún elemento no reivindicado como esencial para la práctica de la invención.

[0158] En el presente documento se describen realizaciones de esta invención, incluido el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la invención. Las variaciones de esas realizaciones pueden resultar evidentes para los expertos en la materia tras la lectura de la descripción anterior.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un agente terapéutico que activa la función de mTORCI en el cerebro de un sujeto en comparación con la función en el sujeto antes del tratamiento, para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Huntington (EH) en el sujeto, en donde el agente terapéutico comprende un homólogo de Ras constitutivamente activo enriquecido en el cerebro (Rheb) mutante (caRheb; S16H), en donde el agente terapéutico se administra al cerebro del sujeto, y

en donde el agente terapéutico se administra mediante la administración de un vector vírico adenoasociado (AAV) que comprende un ácido nucleico que codifica el agente terapéutico unido funcionalmente a un promotor.

2. El agente terapéutico para el uso de la reivindicación 1, en donde el sujeto puede tener disfunción mitocondrial, homeostasis anómala del colesterol, atrofia estriatal, alteración de la señalización de dopamina y/o autofagia disminuida.

3. El agente terapéutico para el uso de la reivindicación 1 o 2, en donde el AAV es AAV1, AAV2, AAV5, AAV6, AAV9 y/o AAV2/1.

4. El agente terapéutico para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el agente terapéutico se administra al cerebro del sujeto directamente o a través del torrente sanguíneo.

5. El agente terapéutico para el uso de la reivindicación 4, en donde el agente terapéutico se administra al cuerpo estriado, la corteza o el espacio ventricular del sujeto.

6. El agente terapéutico para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el sujeto es un ser humano.

7. El agente terapéutico para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el agente terapéutico se inyecta en 1-5 ubicaciones en el cerebro, preferentemente en una única ubicación en el cerebro.