JP2006521825A - ｒＡＡＶ導入を高めるための化合物および方法 - Google Patents

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Abstract

ｒＡＡＶ導入を改変する因子および方法が提供される。

Description

［関連出願との関係］
本発明は、２００３年３月３１日に出願された米国出願第６０／４５９，３２３号および２００３年１０月１６日に出願された米国出願第６０／５１２，３４７号の出願日の利益を請求し、これらの開示は、本明細書に引用することにより組み込まれる。
［政府権利の申し立て］
本発明は、米国政府からの助成（国立衛生研究所からの助成ＨＬ５８３４０）で少なくとも部分的に行われた。政府は、本発明におけるある種の権利を有し得る。
組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）は、多数の標的臓器および遺伝性もしくは後天性疾患の遺伝子治療ベクター、ワクチンベクターとしてのまたは診断用のその可能性を強調するいくつかの特性を有する。さらに、ｒＡＡＶベクター系は、アデノウイルスおよびレトロウイルスを包含する他の遺伝子送達媒体よりも大きな利点を潜在的に提供する。これらには、分裂していないかもしくはゆっくり分裂する細胞に容易に形質導入しそして本質的に細胞の生涯にわたって存続するｒＡＡＶの能力、全てのウイルス遺伝子をベクターから取り除くことができるので望ましくない細胞性免疫応答がないこと、およびＡＡＶはこれまでにヒト疾患と関連したことがないという事実が包含される。
ＣＦＴＲ遺伝子を発現する血清型２型ｒＡＡＶ（ｒＡＡＶ−２）ベクターは、臨床試験において利用される最初のＡＡＶベクターであった。このベクターは、嚢胞性線維症にかかっている患者において見込みを示しており、そして第ＩＩ相試験に進んでいる（非特許文献１；非特許文献２；非特許文献３；非特許文献４）。近年では、Ｂ型血友病にかかっている患者での第Ｉ相臨床試験におけるｒＡＡＶ２第ＩＸ因子ベクター（非特許文献５）およびＣＮＳ疾患にかかっている患者の第Ｉ相臨床試験におけるｒＡＡＶ２サルコグリカンベクターを包含する、さらなるｒＡＡＶ２ベクターが、多数の病状を処置するために臨床試験に進められたかもしくは現在進められている。さらに、パーキンソン病（非特許文献６）およびカナバン病（非特許文献７）を処置するタンパク質を発現するｒＡＡＶの臨床試験が提示されている。
ＡＡＶの他の血清型は、機能、構造および遺伝子レベルで全て密接に関連するが、それらは存在することが知られている（例えば、非特許文献８；および非特許文献９を参照）。全てのＡＡＶ血清型は、相同なｒｅｐ遺伝子により媒介される非常に類似した複製特性を示し；全て、ＡＡＶ−２において発現されるもののような３つの関連するキャプシドタンパク質を有し、そして全て５’−３’ＩＴＲ配列を含有する。現在、ＡＡＶの８つの血清型が、ＡＡＶ−１〜ＡＡＶ−６に利用可能な完全なゲノム配列情報（非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６）ならびにＡＡＶ−７およびＡＡＶ８のキャプシド遺伝子配列（非特許文献１７）とともに記述されている。ＡＡＶ−６は、ＡＡＶ−１とＡＡＶ−２との間の組み換え体であることが示されている。さらに、ｒｅｐおよびｃａｐの両方において多数のアミノ酸が相互に異なるＡＡＶ−３の２つの単離株および配列がある（非特許文献１６）。ＡＡＶ−５は血清型の最も遠縁のものであり、そしてそのＩＴＲにおいて血清型特異的末端分離部位（ｔｅｒｍｉｎａｌ ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｓｉｔｅ）（ｔｒｓ）を示す（非特許文献１４）。他の血清型からのｒｅｐタンパク質は、たとえＡＡＶ−５ ＩＴＲに結合しても、それらはｔｒｓで効率よく切断しない。ＡＡＶおよびｒＡＡＶ血清型における最近の開発に加えて、多数のグループがｒＡＡＶ偽型で実験している。
細胞膜へのｒＡＡＶの結合のための細胞表面受容体使用におけるバリエーションが様々な血清型間に存在し、そして様々な組織および細胞タイプにおける形質導入効率の違いに部分的に関与し得る。相反するデータが存在するが、様々な組織および細胞タイプにおける導入遺伝子発現の効率に血清型間で違いがあることが明らかになってきている。例えば、ｒＡＡＶ−５もまたｒＡＡＶ−２と比較して増大を示すが、ｒＡＡＶ−１およびｒＡＡＶ−７は全体的にマウス筋肉組織の形質導入に桁違いに優れているようである（非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０）。ｒＡＡＶ−８はマウス肝臓にｒＡＡＶ−２より１００倍まで高く形質導入し（非特許文献１７）、そしてｒＡＡＶ−５はマウス気道の細胞の形質導入において優れているようである（非特許文献２１；非特許文献２２）。ｒＡＡＶ−５は、一般に、ＣＮＳ、筋肉、肝臓および網膜を包含するこれまでに試験された全ての組織タイプにおいてｒＡＡＶ−２に基づくベクターより優れているようである（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４）。同様に、ｒＡＡＶ−６はマウス気道上皮および肺胞に形質導入することにおいてｒＡＡＶ−２より効率がよく、一方、ｒＡＡＶ−３は平滑筋細胞に形質導入することにおいて優れている（非特許文献２５；非特許文献２６）。ｒＡＡＶ−４は、ほぼ限定的にマウスＣＮＳにおける上衣細胞に形質導入し、一方、ｒＡＡＶ−５はニューロンおよび星状細胞の両方に形質導入する（非特許文献２３）。網膜では、多数の研究が、光受容体細胞および網膜色素上皮に形質導入する能力において血清型間で大きな違いを示している（非特許文献２７；非特許文献２８；非特許文献２９）。
ｒＡＡＶは、様々なヒト、サルおよびげっ歯動物細胞系において非常に広範な宿主指向性を有することにもかかわらず（非特許文献３０；非特許文献３１）、ヒト気道上皮および他の組織における全体的形質導入効率はかなり低いようである。以前の研究は、ｒＡＡＶゲノムの一本鎖から二本鎖への転化が、ＡＡＶ媒介遺伝子導入の律速段階であり得ることを示唆している（非特許文献３２；非特許文献３３）。これらの研究は、アデノウイルスＥ４ｏｒｆ６が、ｒＡＡＶ複製の溶解期（ｌｙｔｉｃ ｐｈａｓｅ）に特有の経路によって、線状二本鎖複製型ダイマー（Ｒｆｄ）およびモノマー（Ｒｆｍ）への一本鎖ＤＮＡゲノムの転化を高めることを示した。これらの複製型の構造は、１個の共有結合している末端を有する頭部−頭部および尾部−尾部配向線状コンカテマーからなる（非特許文献３２；非特許文献３３）。対照的に、最近の研究は、頭部−尾部モノマーおよびコンカテマー構造を有する二本鎖環状中間体へのｒＡＡＶゲノムの転化の代替経路を明らかにしている（非特許文献３４；非特許文献３５；非特許文献３６）。環状ＡＡＶゲノムもしくはＲｆ中間体のいずれかの形成をもたらす別個の経路は、異なる細胞性因子により調節されるようである。例えば、アデノウイルスＥ４ｏｒｆ６発現は環状ゲノム形成を減らし、一方、アデノウイルスＥ２ａはその形成を高める（非特許文献３４）。同様に、ＵＶ照射もまたＡＡＶ環状中間体形成を高めるが、Ｒｆ中間体は高めない（非特許文献３６）。
さらに最近では、細胞結合タンパク質ＦＫ５０６−（ＦＫＢＰ−５２）がチロシン残基でリン酸化された場合に（上皮増殖因子受容体プロテインチロシンキナーゼにより）、ＦＫＢＰ−５２はＡＡＶ ＩＴＲの一本鎖Ｄ配列に結合して第二鎖合成の障害を引き起こすことが示された（非特許文献３７；非特許文献３８）。インビトロおよびインビボでの多数の細胞タイプにおけるｒＡＡＶ導入の効率は、ＦＫＢＰ−５２のリン酸化状態と相関する。例えば、ＨｅＬａ細胞において、細胞ホスファターゼ（ＴＣ−ＰＴＰ）の過剰発現は、ＦＫＢＰ−５２の脱リン酸化、ＡＡＶ第二鎖ＤＮＡ合成の増加および導入遺伝子発現の増加をもたらした。ＴＣ−ＰＴＰの野生型（ｗｔ）もしくは触媒的突然変異型のいずれかを発現するトランスジェニックマウスを作製した。ｗｔ ＴＣ−ＰＴＰホスファターゼを発現するトランスジェニックマウスからの造血幹細胞は、ｒＡＡＶ２により形質導入されたが、ホスファターゼネガティブ突然変異体からのものは、形質導入されなかった。これらの結果は、第二鎖ＤＮＡ合成への障害が、感染するベクターゲノムＤＮＡのＤ配列へのＦＫＢＰ−５２の結合に起因することおよびこの結合がリン酸化により調節されることを
示唆する。従って、ＡＡＶの形質導入頻度を増加することを目標とする多数の戦略は、発現可能な形態への非機能性ウイルスゲノムの分子転化を高めることに（非特許文献３３；非特許文献３６）もしくは導入遺伝子カセットを改変することによって転写および翻訳効率を増加することにより（非特許文献３９；非特許文献４０）焦点を当てている。
ｒＡＡＶの形質導入効率を改善することを目標とする第二の方法は、細胞表面受容体へのｒＡＡＶの結合に焦点を当てている。多数の一次および二次細胞表面受容体分子が、様々なＡＡＶ血清型に同定されている。同定される一次受容体（ヘパリン硫酸およびシアル酸）は多数の細胞タイプ上に存在し、そしてまたＡＡＶ以外の多数のウイルスによっても利用される。これは、付着および細胞の侵入にさらに多くの特異性を与える追加の受容体が存在する可能性があることを示唆し、そしていくつかのそのような共受容体が同定されている。従って、ｒＡＡＶ導入効率を改善するさらなる戦略は、細胞表面受容体（非特許文献４１）および／もしくはウイルスコートタンパク質における受容体リガンド（非特許文献４２；非特許文献４３；非特許文献４４）の操作に焦点を当てている。
細胞表面膜への結合および二本鎖ＤＮＡゲノムへの成功した転化は重要であるが、これらの事象の効率は、既定の細胞タイプに形質導入するｒＡＡＶの全体的な能力もしくは効率と必ずしも相関しない。ｒＡＡＶの輸送およびアンコーティングのさらに詳細な理解が蓄積されるにつれて、これは近年ますます明白である（非特許文献３５；非特許文献４５；非特許文献４６；非特許文献４７；非特許文献４８）。例えば、極性ヒト気道上皮細胞は、送達の経路によりｒＡＡＶ−２により様々な効率で形質導入され；側底面からの侵入は、頂端面から投与されるベクターと比較して細胞における遺伝子発現の約２００倍の増加をもたらす（非特許文献３５；非特許文献４９）。驚くべきことに、２つの細胞面間のｒＡＡＶ細胞表面結合の違いは約５倍のみである。この結果は、ベクターが送達の経路によりこれらの細胞において異なって移動するという発見につながった（非特許文献３５；非特許文献４９）。
以前の報告は、ｒＡＡＶ−２およびイヌパルボウイルスの核への細胞内輸送がある種の細胞タイプの遅い律速プロセスであることを明らかに示している（非特許文献５０；非特許文献４６；非特許文献５１；非特許文献４９）。イヌパルボウイルスおよびｒＡＡＶ−２はまた、クラスリン依存性受容体エンドサイトーシスによって取り込まれそしてトランスフェリン（しかしデキストランのような流体相マーカーはそうではない）と同様にエンドソームコンパートメントを通してプロセシングされることも示されている（非特許文献５０；非特許文献５２；非特許文献５３；非特許文献３４）。トランスフェリン輸送は詳細に研究され、そして初期エンドソームを通して核周辺リサイクリングエンドソーム（ＰＮＲＥ）に移動することが示されている（非特許文献５４；非特許文献５５）。ＰＮＲＥを通したトランスフェリンのリサイクリングは、ＰＮＲＥコンパートメントへの初期エンドソームの移動および融合を導くいくつかの低分子量ＧＴＰアーゼ（Ｒａｂ５、Ｒａｂ４およびＲａｂ１１）の協調的相互作用を必要とする（非特許文献５４）。
ｒＡＡＶ導入の効率を改善する因子を開発するために考案された研究は、トリペプチドＬＬｎＬおよびＺ−ＬＬＬのようなプロテオソームインヒビターがｒＡＡＶの導入を増大できることを示している。このクラスの因子は、極性細胞タイプにおけるプロテアソームのカルパイン、カテプシン、システインプロテアーゼならびにキモトリプシン様プロテアーゼ活性を阻害することによりｒＡＡＶのユビキチン化に影響を与える（非特許文献４９；非特許文献４８）。さらに、ヒドロキシウレア、ノボビオシン、アムサクリンおよびエトプシドを包含するＤＮＡ代謝に影響を与える因子は、これらの薬剤が一本鎖ｒＡＡＶゲノムの二本鎖型への転化の速度を増加するという仮説に基づいてｒＡＡＶ導入を高める能力に関して試験された。結果は、エトポシド、ヒドロキシウレアおよびカンポテシンが、単独で利用する場合にｒＡＡＶ導入を高めることに有効であるが、組み合わせて使用する
場合に相加もしくは相乗効果をもたらさないことを示した（非特許文献５６）。さらに、これらの因子は、遺伝子転化が律速である細胞タイプにおいてｒＡＡＶ導入を高めることにおいて有効であると記載されただけであった。遺伝子転化に続く段階（すなわち、ビリオンの細胞内輸送およびプロセシング）は、一次細胞および気道のような分化した組織における重要な律速段階であるようである（非特許文献５７；非特許文献４９）。
ｒＡＡＶベクターの改善された形質導入効率の必要性が存在する。
従って、必要とされることは、インビボでｒＡＡＶ導入もしくはｒＡＡＶ導入頻度を改変する、例えば増加するかもしくは高めることができる因子の同定である。また必要とされることは、肝臓および気道におけるもののような、分裂していないかもしくはゆっくり分裂する細胞もしくは組織におけるｒＡＡＶ異種導入遺伝子の発現を増加するかもしくは高める因子の同定である。
Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ａｉｔｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，２０００ ＲＤＡＣ，２００１ Ｊａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｂｌａｃｋｌｏｗ，１９８８ Ｒｏｓｅ，１９７４ Ｓｒｉｖａｓｔａｖａ ｅｔ ａｌ．，１９８３ Ｍｉｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９６７ Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｇａｏ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｒａｂｉｎｏｗｉｔｚ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｈｉｌｄｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ａｕｒｉｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｍｉｎｇｏｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ａｕｒｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｌｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２ Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｓａｎｌｉｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｑｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｑｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３ Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｑｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７ Ｗｉｃｋｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６ａ Ｗｉｃｋｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９６ｂ Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｓｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｈａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００１ Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２ Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｈａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｂｅｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｓｏｎｎｉｃｈｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００ Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８ Ｒｕｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５ Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，２０００
［発明の要約］
本発明は、真核細胞、例えば哺乳類肺もしくは肝臓細胞のような哺乳類細胞、または真核細胞の集団、例えば組織もしくは臓器のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）導入を改変する因子（ａｇｅｎｔ）もしくは因子の組み合わせを同定する方法を提供する。例えば、本発明はｒＡＡＶ導入を高める、例えばｒＡＡＶエンドサイトーシスを高める、プロテオソーム、エンドソームおよびトランス−ゴルジが包含されるがこれらに限定されるものではない細胞内コンパートメントを通したｒＡＡＶの輸送およびプロセシングを高める、ウイルス核酸もしくはタンパク質分解を減少する、ウイルスアンコーティングを増加するそして／または例えば微小管もしくはミクロフィラメントのような細胞骨格成分を介した、ウイルスもしくはウイルスゲノムの核輸送を増加する因子を同定する方法を提供する。該方法は、細胞もしくは細胞の集団を１つもしくはそれ以上の因子およびウイルスと接触させることを含んでなる。次に、ウイルス導入が改変されるかどうかを決定する。好ましい細胞には、哺乳類、鳥類、魚類および爬虫類、特にヒト、非ヒト霊長類、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリおよびシチメンチョウのような家畜哺乳類および鳥類が包含される。例えば、空気−液体界面で培養した極性ヒト気道上皮細胞もしくはヒト気管支異種移植片は、ウイルス導入を改変する因子を同定するために有用である。
１つの態様として、試験する因子は、望ましい特性、例えば治療特性またはｒＡＡＶ導入を改変すると同定される他の因子の機能および／もしくは構造特性を有するものを包含する因子から選択される。因子もしくは因子のライブラリーは、本発明の方法において無作為にスクリーニングすることができる。あるいはまた、試験する因子は、ｒＡＡＶで処理する特定の細胞タイプ、組織タイプもしくは疾患タイプに望ましい特性を有する因子から選択することができる。さらに、因子は、プロテオソームを調節する因子、例えばプロテオソームに結合する、ウイルスとプロテオソームとの相互作用を改変する、プロテオソームの機能を改変する、プロテオソームを安定させる、もしくはプロテオソームの輸送を改変するが、プロテオソームのタンパク質分解活性を阻害しない因子から選択することができる。本明細書において用いる場合、「プロテオソーム調節因子」である因子には、プ
ロテオソームのタンパク質分解活性を阻害する因子は包含されない。例えば、嚢胞性線維症にかかっている患者の肺への送達用のＣＦＴＲ ｒＡＡＶベクターの導入を高めるのに有用な因子を同定するために、嚢胞性線維症患者集団において用いられるかもしくは使用が認められている因子、臨床試験中のもしくはＦＤＡ認可を有する因子、および／またはウイルス導入、例えばｒＡＡＶエンドサイトーシス、細胞内コンパートメント（１つもしくは複数）、例えばエンドソームコンパートメントを通したｒＡＡＶの輸送およびプロセシング、減少したウイルス核酸もしくはタンパク質分解、増加したウイルスアンコーティングまたはウイルスもしくはウイルスゲノムの増加した核輸送と関連する因子、細胞骨格要素、例えば微小管もしくはミクロフィラメントと相互作用する因子から因子を選択することができる。１つの態様として、該因子はプロテオソームのタンパク質分解活性を阻害する因子ではない。１つの態様として、該因子は細胞膜へのウイルス結合の後にそしてウイルスゲノムの発現可能な形態をもたらす第二鎖合成の前にｒＡＡＶによる哺乳類細胞の形質導入を改変する、例えば高める。無作為化スクリーニングは、導入遺伝子を発現するｒＡＡＶ、例えばＧＦＰをコードするレポーター導入遺伝子、または指標細胞系上での化学ライブラリーのハイスループットスクリーニングを用いて行うことができる。形質導入は、ｒＡＡＶによりコードされるレポーター導入遺伝子の発現を用いて評価することができる。１つの態様として、化学ライブラリーは、プロテアソーム、ウイルスもしくはウイルスがそれを通してプロセシングされる他の細胞内プロセシング経路、例えばエンドソームコンパートメントと相互作用することが既知である化学構造に基づいて選択される。あるいはまた、例えば、ｒＡＡＶ導入に影響を及ぼすプロテオソームとの相互作用によって、ｒＡＡＶ導入を高める因子を同定するためにペプチドライブラリーをスクリーニングすることができる。
本発明の因子は、ｒＡＡＶベクターの任意の血清型もしくは偽型で試験しそして／もしくは使用することができる。ｒＡＡＶ導入を高めると同定される因子は、増大の程度、細胞もしくは組織タイプ特異性または増大に用いる濃度のバリエーションがあり得るが、全てのＡＡＶ血清型および偽型で機能することができると予見される。
本発明の因子は、相加的もしくは相乗的形質導入効果をもたらすために、多数の細胞もしくは組織タイプの形質導入の効率を増加するために、ｒＡＡＶ異種導入遺伝子発現の期間を増加するために、導入遺伝子の発現の期間を短縮するために、あるいは因子もしくは複数の因子がない場合または因子を単独で使用する場合の同じベクターによる形質導入もしくはその発現と比較して治療もしくは予防効果を得るために必要なウイルスの量を減らすために単独でもしくは組み合わせて使用することができる。また、本発明の１つもしくはそれ以上の因子は、相加的もしくは相乗的形質導入効果をもたらすために、多数の細胞もしくは組織タイプの形質導入の効率を増加するために、ｒＡＡＶ異種導入遺伝子発現の期間を増加するために、ｒＡＡＶと宿主細胞との接触と導入遺伝子の発現との間の時間差を減少するために、または因子がない場合、単一の因子もしくは全てではない因子における同じベクターによる形質導入もしくはその発現と比較して所望の効果を得るために必要なウイルスの量を減らすために、細胞受容体への結合を増加するか、二本鎖型への一本鎖ｒＡＡＶベクターの転化を促進するか、もしくはプロテオソームタンパク質分解機能を阻害する因子と組み合わせて使用することができるとも考えられる。組み合わせて使用する本発明の因子は、ｒＡＡＶ導入を高めることにおいて相乗的もしくは相加的であることができる。ｒＡＡＶ導入の相加効果の例には、例えば、感染と導入遺伝子の発現との間の短縮された時間差および発現の全体的により長い期間が包含される。
従って、本発明は、哺乳類細胞のｒＡＡＶ導入を高める方法を提供する。該方法には、哺乳類細胞を少なくとも１つのｒＡＡＶおよび例えばｒＡＡＶ導入を相加的にもしくは相乗的に高めるのに有効な量の少なくとも２つの因子と接触させることが包含される。
本発明の因子は、単一の異種導入遺伝子、すなわち、ＡＡＶ配列に由来しない、例えばＡＡＶタンパク質をコードしないもののみを含有するｒＡＡＶベクターで、またはＤｕａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）;Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）；およびＤｕａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）に記述されているようなｒＡＡＶベクターが１つより多くの異種導入遺伝子および／もしくは転写調節要素を含有するデュアルベクター戦略で用いることができる。発現される遺伝子は、どのような制御要素（例えばプロモーター、オペレーター）が所望されようと、ポリペプチド、触媒ＲＮＡもしくはアンチセンスＲＮＡをコードするＤＮＡセグメントのいずれかであることができる。
本発明には、プロテオソームに結合し、そして／またはその１つもしくはそれ以上の活性、プロテアソームとウイルスとの会合、および／もしくはプロテアソームの細胞内ポジショニングを改変する因子を包含するプロテオソームを調節する因子が包含される。プロテオソームは、サイトゾルおよび核における主要なタンパク質分解複合体であり、そして細胞質と核との間で輸送されることができる。例えば、２６Ｓプロテオソーム複合体は、１９Ｓ調節ユニットならびにキモトリプシン様活性、すなわち、大きい疎水性残基の後ろでの切断、トリプシン様活性、すなわち、塩基性残基の後ろでの切断、ポスト−グルタミル（ｐｏｓｔ−ｇｌｕｔａｍｙｌ）ヒドロラーゼ活性、すなわち、酸性残基の後ろでの切断、分枝アミノ酸切断活性および小さい中性アミノ酸切断活性を有する２０Ｓ触媒コアを含んでなる。本明細書に記述するように、認可された抗生物質、ドキソルビシンもまたｒＡＡＶ導入を高める。ドキソルビシンは、プロテアソームへのウイルス結合および／もしくはその後の核への輸送を促進することができる。対照的に、ＬＬｎＬおよびＺ−ＬＬＬのようなプロテアソームインヒビターは、プロテアソームのコアタンパク質分解活性をより顕著に阻害する。
従って、ｒＡＡＶ導入を改変する異なるもしくは重複する特性を個々に有する因子、ならびに同様のもしくは同一の特性を有する因子の組み合わせた使用は、相加および／もしくは相乗効果をもたらし、そしてそのようにしてｒＡＡＶ導入を高めることができる。従って、ウイルス導入を高める因子は、治療ペプチドもしくはポリペプチドを導入しそして／もしくは発現するためにｒＡＡＶを用いる遺伝子治療において、またはポリペプチドもしくはペプチドへの免疫応答を誘導するように、ウイルス、真菌、細菌、酵母もしくは癌細胞からのもののような免疫原性予防ポリペプチドもしくはペプチドを導入しそして／もしくは発現するためにｒＡＡＶを用いるワクチンにおいて特に有用である。本発明の因子はまた、細胞もしくは組織のインビボ細胞標識に役立つ、または化学療法戦略を追跡しそして／もしくは目標に向ける診断マーカーの開発にも有用である。さらに、本発明の因子は、治療タンパク質、例えば成長ホルモン、サイトカインもしくは他の組み換えタンパク質の製造に用いる細胞、組織もしくは動物のｒＡＡＶ導入を高めることができる。
さらに、形質導入される細胞は、ウイルス感染の前に、ウイルス感染と同時に、ウイルス感染の後に、もしくはその任意の組み合わせで１つもしくはそれ以上の因子と接触させることができる。形質導入される細胞は、単一の時点、例えば１つの因子の単回投与または２つもしくはそれ以上の因子の単回投与で、あるいは上記のように、複数の時点、例えば１つの因子の複数回投与、２つもしくはそれ以上の因子の組み合わせの複数回投与、２つもしくはそれ以上の因子の逐次もしくは交互投与で１つもしくはそれ以上の因子と接触させることができる。
以下に記述するように、気道上皮の頂端膜でのウイルス結合、例えばウイルス受容体の限られた分布、およびＡＡＶ−２のエンドサイトーシスは、この組織タイプの形質導入における主要な律速段階ではない。実際に、分化したヒト気道上皮は、頂端面からかなり効率よくｒＡＡＶ−２を内在化する。むしろ、エンドソームプロセシングおよび核への内在化したウイルスの輸送は、気道の頂端膜からの感染後にＡＡＶ−２が直面する大きな障害
である。環状型ゲノムへの一本鎖ＡＡＶ ＤＮＡの効率のよい転化をもたらした側底感染と対照的に、頂端感染は５０日までの間転写的に不活性の状態の持続性細胞内一本鎖ウイルスＤＮＡを生じさせた。ＡＡＶ−２のエンドソームプロセシングおよび核への細胞内経路指定の効率を上げるプロテアソームインヒビターを用いて、側底面からの形質導入のもの近くまで、２００倍を上回る頂端面からの顕著に高められた形質導入が認められた。また、ＡＡＶキャプシドタンパク質がエンドサイトーシス後にユビキチン化されること、および侵入してくるウイルスのユビキチンにより媒介されるプロテアソーム分解がプロテアソームもしくはユビキチンリガーゼインヒビターのいずれかでの処理により阻止できることも見出された。
さらに、重要なことに、マウス肺におけるプロテアソームインヒビターのインビボ使用は、ｒＡＡＶ遺伝子導入を大きい細気管支において検出できないレベルから上皮細胞の１０．４＋／−１．６％の平均まで増大した。従って、気道における形質導入の主要なエンドソームプロセシング障害を回避するための、ｒＡＡＶエンドサイトーシス、プロテオソーム、エンドソームおよびトランス−ゴルジが包含されるがこれらに限定されるものではない細胞内コンパートメントを通したｒＡＡＶの輸送およびプロセシング、ウイルス核酸もしくはタンパク質分解、ウイルスアンコーティングならびに／または例えば微小管もしくはミクロフィラメントのような細胞骨格成分を介した、ウイルスもしくはウイルスゲノムの核輸送を改変する１つもしくはそれ以上の因子の使用は、嚢胞性線維症のような呼吸器疾患のインビボＡＡＶ媒介遺伝子治療の、ならびにウイルスプロセシングが律速事象であると思われる他の組織の臨床的に有用な戦略、またはインビボｒＡＡＶ媒介ワクチンの戦略を提供することができる。
同様に以下に記述するように、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５キャプシド粒子の両方にパッケージングされたルシフェラーゼレポーターを導くＲＳＶ ＬＴＲプロモーターを有する組み換えＡＡＶ−２構築物の形質導入効率を多数の細胞系においてそしてインビボで肺において比較した。インビトロでのプロテオソームモジュレーターおよび／もしくはプロテオソームインヒビターを包含する本発明の因子とウイルスとの共投与は、ＡＡＶ−２の形質導入効率を増加しただけでなく、それはまたわずかに低い程度にであることが多いがＡＡＶ−５媒介遺伝子導入も増大した。内在化ウイルスＤＮＡの量の有意な差は、感染の２４時間後に検出されなかったので、プロテアソームインヒビターの存在下での増加した導入遺伝子発現は、ウイルスゲノム分解から独立している。感染ＨｅＬａ細胞溶解物からの免疫沈降したウイルスタンパク質のウェスタンブロットアッセイおよびインビトロ再構成実験は、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５キャプシドの両方のユビキチンコンジュゲートの証拠を示した。これらの研究は、ｒＡＡＶ−２のユビキチン／プロテアソーム経路に関する以前に報告された障害がｒＡＡＶ−５キャプシド侵入経路にも有効であることを示唆する。偽型ｒＡＡＶおよびプロテオソームインヒビターＺ−ＬＬＬのインビボ共投与は、全肺ルシフェラーゼ発現を感染後１４および４２日でそれぞれ１７．２倍および２．１倍誘導し、一方、ｒＡＡＶおよび異なるｒＡＡＶ導入促進剤、ドキソルビシンの共投与は、気管および気管支ルシフェラーゼ発現をＺ−ＬＬＬにより誘導される発現レベルに対して感染後１４、４２および９０日により高いレベルで誘導した。驚くべきことに、４２日で、ウイルスおよびＺ−ＬＬＬおよびドキソルビシンを共投与したマウスの気管および気管支におけるルシフェラーゼ発現は、気管内注入により投与した場合に相加的より多かった。ヒト極性気道上皮において、組み合わせたドキソルビシンおよびＬＬｎＬは、ｒＡＡＶからのルシフェラーゼ発現を相乗的に１０００倍より多く増大し、一方、個々にドキソルビシンおよびＬＬｎＬは形質導入をそれぞれ１００倍および１０倍増大した。また本明細書に記述するように、プロテオソームに結合しそして／もしくはプロテオソーム活性を調節する他の因子は、ｒＡＡＶ導入効率を改変することができる。
さらに、ウイルス導入を改変する因子、例えば、ｒＡＡＶエンドサイトーシス、細胞内
コンパートメントを通したｒＡＡＶの輸送およびプロセシング、ウイルス核酸もしくはタンパク質分解、ウイルスアンコーティングおよび核輸送のモジュレーターの活性は、ウイルス導入と関連する経路における分子を改変することができる、ＥＤＴＡもしくはＥＧＴＡのような因子、例えばカルシウムキレート剤もしくは細胞内カルシウムレベルのモジュレーターのような因子の添加により高めることができる。従って、ウイルス導入を改変する１つもしくはそれ以上の因子は、ウイルス導入を改変する１つもしくはそれ以上の因子の活性を高めるかもしくはそれと相乗的に働く因子とともに用いることができる。従って、本発明はまた、２つもしくはそれ以上の因子、例えば、ウイルス導入を改変する第一の因子および第一の因子の活性を高めるかもしくは第一の因子と相乗的に働く第二の因子を含んでなる組成物もしくはキットも提供する。
従って、本発明はまた、真核細胞もしくは細胞の集団のアデノ随伴ウイルス導入を改変する方法も提供する。該方法は、細胞もしくは細胞の集団をウイルスのある量およびウイルス導入を改変するのに有効な本発明の少なくとも１つの因子のある量と接触させることを含んでなる。該因子は、ウイルスと同時に、ウイルスと細胞を接触させる前にもしくはウイルスと細胞を接触させた後に細胞と接触させることができる。１つの態様として、本発明は、哺乳類細胞を少なくとも１つのｒＡＡＶおよびｒＡＡＶエンドサイトーシス、細胞内コンパートメントにおけるｒＡＡＶ輸送もしくはプロセシング、ウイルス核酸もしくはタンパク質分解、および／またはウイルスもしくはウイルスゲノムの核輸送を改変する少なくとも１つの因子と接触させる方法を提供する。１つの態様として、該因子はプロテオソームタンパク質分解活性のインヒビターではない。該因子（１つもしくは複数）および／もしくはウイルスは、所望の効果を得るために、すなわち、ｒＡＡＶ導入を高めるために、１回もしくは反復投与で各々投与することができる。ＡＡＶは広い宿主範囲（例えば肺発現に）を有することが示されており、そして筋肉において存続するので、ｒＡＡＶは任意の動物において、そして特に哺乳類、鳥類、魚類および爬虫類、特にウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ニワトリおよびシチメンチョウのような家畜哺乳類および鳥類において遺伝子を発現するために用いることができる。ヒトおよび動物使用の両方が特に好ましい。
１つの態様として、少なくとも１つのｒＡＡＶおよび／もしくは偽型ｒＡＡＶならびに本発明の１つもしくはそれ以上の因子は、形質導入効率および導入遺伝子発現を改変する、例えば増加する方法、導入遺伝子発現効率を検出するかもしくは決定する方法、プロモーターの強さおよび／もしくはＲＮＡ安定性をスクリーニングする方法、ならびに血液疾患（例えば鎌状赤血球貧血、サラセミア、血友病およびファンコニ貧血）、アルツハイマー病およびパーキンソン病のような神経学的疾患、ならびに骨格筋、心筋もしくは平滑筋に関する筋肉疾患、ならびに肺の疾患、例えば嚢胞性線維症および喘息を包含するベクターが有用な治療的もしくは予防的治療において用いることができる。特に、本発明のベクターにおいて有用な治療遺伝子には、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、γ−グロビン遺伝子、第ＶＩＩＩ因子遺伝子、第ＩＸ因子遺伝子、嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質遺伝子（ＣＦＴＲ）、ファンコニ貧血相補群、ジストロフィン遺伝子、アンチセンス遺伝子、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子（パーキンソン病）、グルコセレブロシダーゼ遺伝子（ゴーシェ病）、アリールスルファターゼＡ遺伝子（異染性白質萎縮症）、エリスロポエチン遺伝子、ならびにワクチンに有用なもののような免疫原性ポリペプチドもしくはペプチドをコードする遺伝子、または他のペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質のような他の遺伝子産物をコードする遺伝子が包含される。１つの態様として、ｒＡＡＶは触媒ＲＮＡ、例えばリボザイムもしくはｓｉＲＮＡ、例えば細胞において発現される特定のＲＮＡの発現を減少するために有用なものをコードする。
また本発明の範囲内であるのは、ｒＡＡＶベクターにおける１つより多くのオープンリ
ーディングフレームの包含であり、すなわち、複数の遺伝子が個々のベクターに存在することができる。さらに、ｒＡＡＶは感染後にコンカテマーを形成することができるので、そのコンカテマーの各モノマーは異なる遺伝子もしくはその一部を含んでなることができる。
組み換えアデノ随伴ウイルスの環状中間体は、連結配列にエピソーム存続を与えることができる。
さらに、２つもしくはそれ以上の異なるｒＡＡＶでの共感染は、分子間組み換えによって、任意の特定のｒＡＡＶの１つもしくはそれ以上のコピーを有するコンカテマーをもたらす。ｒＡＡＶのパッケージング容量を超える大きい調節要素および遺伝子は、２つの独立したｒＡＡＶベクターを生物の細胞もしくは組織に共感染させることにより一緒にすることができるので、少なくとも２つの異なるｒＡＡＶゲノムを含んでなるコンカテマーであることができる単一の分子、例えば核エピソームを形成するためのｒＡＡＶゲノムの分子間組み換えの意味は、ｒＡＡＶでの遺伝子治療に特に関連がある。例えば、エンハンサーおよび／もしくはプロモーターを１つのベクターに導入することができ、一方、最小プロモーターの有無で、オープンリーディングフレーム、例えば興味のある遺伝子を含んでなるＤＮＡを第二のベクターに導入する。従って、２つのベクターでの共感染後に、導入遺伝子カセットサイズは、単一のＡＡＶベクターだけのものを超えて増加され、そしてオープンリーディングフレームを含んでなるＤＮＡは、エンハンサーおよび／もしくはプロモーターに連結される。本発明の別の態様として、遺伝子の２つの独立した領域をコードするベクターを完全なスプライシング単位を形成するように一緒にする。理論により拘束されることなしに、本発明の因子は、本発明の因子で処理していない細胞と比較してｒＡＡＶの増大した形質導入頻度をもたらすウイルスゲノムの定常状態存在量を増加することによりｒＡＡＶのコンカテマー化および／もしくは分子間組み換えを増加することができる。細胞質および／もしくは核におけるｒＡＡＶビリオンのプロセシングを改変する本発明の因子はまた、核におけるウイルスＤＮＡの提示に影響を与え、従って、遺伝子転化産物を改変することもできる。そのような改変された提示は、核内の特定の部位でビリオンのより局所的な蓄積を与えることによりコンカテマー化に影響を与えることができる。あるいはまた、ウイルスＤＮＡとの関連因子（すなわち、Ｒｅｐもしくは宿主細胞タンパク質）のユビキチン化は、これらの関連因子の生物学的性質に影響を与え、そして線状、環状および／もしくはコンカテマー化プロセスに影響を及ぼすことができる。従って、本発明の因子は、上記に説明する機序により分子内コンカテマー化および多数のベクター技術の効率に影響を及ぼすことができる。
従って、複数のｒＡＡＶベクターの使用は、ｒＡＡＶベクター内の導入遺伝子の現在のサイズの制約を克服するために有用であり、そしてより大きい転写調節領域、例えば、より強い異種プロモーターもしくは内在性プロモーター、例えばＣＦＴＲ内在性プロモーター、または１つもしくはそれ以上のエンハンサー配列の導入を可能にする。
従って、各々個々のｒＡＡＶベクターにおける２つもしくはそれ以上、例えば複数のＤＮＡセグメントは、１つより多いｒＡＡＶからのＤＮＡセグメントを有する単一のＤＮＡ分子をもたらすように、細胞に送達することができる。本発明の１つの態様として、１つのｒＡＡＶは、連結された：ＡＡＶの５’ＩＴＲを含んでなる第一のＤＮＡセグメント；ＡＡＶ配列を含んでならない第二のＤＮＡセグメント（非ＡＡＶ配列）、すなわち、異種配列；およびＡＡＶの３’ＩＴＲを含んでなる第三のＤＮＡセグメントを含んでなる第一の組み換えＤＮＡ分子を含んでなることができる。第二の組み換えＡＡＶは、連結された：ＡＡＶの５’ＩＴＲを含んでなる第一のＤＮＡセグメント；ＡＡＶ配列を含んでならないそして第二のＤＮＡセグメントが第一の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントにおける配列と異なる配列を有する第二のＤＮＡセグメント；およびＡＡＶの３’ＩＴＲ
を含んでなる第三のＤＮＡセグメントを含んでなる第二の組み換えＤＮＡ分子を含んでなる。ｒＡＡＶの１つは、偽型であることができる。
本発明の１つの態様として、１つのｒＡＡＶベクターは、３’ＩＴＲを含んでなる第三のＤＮＡセグメントに連結された、場合によりプロモーター、例えば異種プロモーターに作動可能に連結されていてもよいオープンリーディングフレーム（しかし、場合により全オープンリーディングフレームではない）の５’末端および５’スプライス部位を含んでなる第二のＤＮＡセグメントに連結された５’ＩＴＲを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含んでなる。第二のｒＡＡＶベクターは、３’ＩＴＲを含んでなる第三のＤＮＡセグメントに連結された３’スプライス部位およびオープンリーディングフレームの３’末端（残り）（すなわち、第一のベクターの第二のＤＮＡセグメントと一緒になって第二のベクターの第二のＤＮＡセグメントは、機能性遺伝子産物をコードする）を含んでなる第二のＤＮＡセグメントに連結された５’ＩＴＲを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含んでなる。「機能性」遺伝子産物は、適切な細胞、組織もしくは生物に存在する場合に検出可能な活性を有するかもしくは検出可能な活性を有することができる、例えば少なくとも１つの活性、そして好ましくは基準、例えば対応する遺伝子産物、例えば野生型（全長）ポリペプチドもしくはリボザイムと実質的に同じ活性を有するものである。好ましくは、第二のＤＮＡセグメントは一緒になって、例えばＣＦＴＲ、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィンもしくはエリスロポエチンをコードするＤＮＡを含んでなる。第二のＤＮＡセグメントは、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡもしくはその組み合わせから得られるかもしくは由来することができる。例えば、第一のベクターの第二のＤＮＡセグメントは、１つより多くのエキソンを含んでなる遺伝子の１つもしくはそれ以上の、しかし全てではないエキソンを含んでなることができ、そして第二のベクターの第二のＤＮＡセグメントは、第一のベクターに存在しない遺伝子の少なくとも１つのエキソン、または異なる遺伝子からの１つもしくはそれ以上のエキソン（それにより、キメラポリペプチドをコードする）を含んでなることができる。第一のベクターの第二のＤＮＡセグメントは、それぞれの遺伝子の内在性プロモーター、例えばｅｐｏプロモーター、もしくは異種プロモーターを含んでなることができる。
別の態様として、１つのｒＡＡＶベクターは、３’ＩＴＲを含んでなる第三のＤＮＡセグメントに連結されたプロモーターおよび／もしくはエンハンサーを含んでなる第二のＤＮＡセグメントに連結された５’ＩＴＲを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含んでなる。場合により、第一のｒＡＡＶベクターは、スプライスドナーおよび／もしくはスプライスアクセプターを含まなくてもよい。第二のｒＡＡＶベクターは、３’ＩＴＲを含んでなる第三のＤＮＡセグメントに連結された場合によりプロモーター（第一のベクターにおけるのと異なるプロモーターもしくは第一のベクターにおけるプロモーターの第二のコピー）に連結されていてもよいオープンリーディングフレームの少なくとも一部を含んでなる第二のＤＮＡセグメントに連結された５’ＩＴＲを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含んでなる。例えば、第一の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントは、少なくとも１つの異種エンハンサーおよび／もしくは少なくとも１つの異種プロモーターを含んでなり、すなわち、該エンハンサーおよび／もしくはプロモーター配列は、ＡＡＶ配列に由来しない。好ましくは、第二の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントは、機能性遺伝子産物をコードするオープンリーディングフレームの一部を含んでなる。
１つの態様として、少なくとも１つの偽型ｒＡＡＶ、例えば導入遺伝子を含有するベクター、および少なくとも１つの、好ましくは少なくとも２つもしくはそれ以上のエンハンサー配列を含んでなる第二のベクターでの細胞の共感染は、最小プロモーターからの導入遺伝子発現の増大をもたらすことができる。さらに、増大はまた、プロモーターなしに導入遺伝子を含有するベクターにおけるＩＴＲのシス活性化によって達成することもできる。従って、組織特異的エンハンサーを包含する大きい調節要素は、細胞内コンカテマー化
の後に第二の導入遺伝子を含有するＡＡＶベクターの発現をシスに調節するために別個のｒＡＡＶベクターにより細胞に導入することができる。
本発明のさらに別の態様として、第一の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントは、リコンビナーゼのシス作用組込み配列（１つもしくは複数）を含んでなり、そしてまた組込み配列（１つもしくは複数）に特異的なリコンビナーゼもしくはインテグラーゼ、例えばバクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘ系（米国特許第５，６５８，７７２号）、酵母のＦＬＰ／ＦＲＴ系、ファージミューのＧｉｎリコンビナーゼ、エシェリキア・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＰｉｎリコンビナーゼ、ｐＳＲ１プラスミドのＲ／ＲＳ系、レトロトランスポゼースまたはレンチウイルスもしくはレトロウイルスからのインテグラーゼもコードする。第二の組み換えＤＮＡ分子における第二のＤＮＡセグメントは、オープンリーディングフレームの少なくとも一部、および好ましくはオープンリーディングフレームに作動可能に連結されたプロモーターを含んでなる。第一および第二の組み換えＤＮＡ分子を含んでなるコンカテマーの形成、およびリコンビナーゼもしくはインテグラーゼの発現は、宿主ゲノムへのコンカテマーもしくはその一部の組込みを高める。また、シス作用組込み配列および対応するリコンビナーゼもしくはインテグラーゼを含んでなるｒＡＡＶベクターは、指向性組み換えを導くために有用であり、それは上記に説明するように、２つもしくはそれ以上のｒＡＡＶベクターを用いる場合に特に有用であることができる。
従って、本発明のベクターは、宿主細胞において１つもしくはそれ以上の遺伝子を送達しそして／もしくは発現する方法において、ベクター（１つもしくは複数）を有する宿主細胞を製造するために、そしてｒＡＡＶ（１つもしくは複数）を含んでなる組成物の製造において有用である。宿主細胞は、本発明の因子の有無で、各ｒＡＡＶと個々に、例えば順次接触させることができる。宿主細胞に遺伝子（１つもしくは複数）を送達するために、組み換えアデノウイルスヘルパーウイルスを用いることができる。
従って、本発明はまた、宿主細胞において遺伝子産物を発現する方法も提供する。宿主細胞は、好ましくは哺乳類宿主細胞、例えばマウス、イヌ、野生（ｆｅｒａｌ）もしくはヒト細胞であり、そして肺、ニューロンもしくは筋肉細胞であることができる。該方法は、宿主細胞を少なくとも１つのｒＡＡＶベクターおよび本発明の少なくとも１つの因子と接触させることを含んでなる。１つの態様として、宿主細胞を少なくとも２つの異なるｒＡＡＶベクターと接触させる。１つの態様として、ｒＡＡＶベクターの１つは偽型ｒＡＡＶである。本明細書に説明するように、宿主細胞を他のベクター（１つもしくは複数）との接触に対して異なる時間で各ベクターと接触させることができると予見されるが、好ましくは、宿主細胞を同時にベクターと接触させる。本発明の２つもしくはそれ以上の因子もまた該方法に用いることができ、そしてベクター（１つもしくは複数）と細胞との接触の前に、同時にもしくは後に細胞と接触させることができる。１つの態様として、該因子はミクロフィラメントもしくは微小管合成、形成もしくは分解を調節し、ｒＡＡＶエンドサイトーシスを調節し、細胞におけるｒＡＡＶ輸送を調節し、細胞におけるｒＡＡＶプロセシングを調節し、細胞におけるｒＡＡＶ核酸分解を調節し、細胞におけるｒＡＡＶタンパク質分解を調節し、核へのｒＡＡＶ輸送を調節し、そして／または核へのウイルスゲノム輸送を調節する。１つの態様として、ミクロフィラメントもしくは微小管合成、形成もしくは分解、ｒＡＡＶエンドサイトーシス、細胞におけるｒＡＡＶ輸送、細胞におけるｒＡＡＶプロセシング、細胞におけるｒＡＡＶ核酸分解、細胞におけるｒＡＡＶタンパク質分解、核へのｒＡＡＶ輸送および／または核へのウイルスゲノム輸送を調節する２つの因子を用いる。
また提供されるのは、細胞における導入遺伝子の発現を導く方法である。該方法は、オープンリーディングフレーム、例えばマーカー遺伝子もしくは対応する野生型オープンリーディングフレームに対して１つもしくはそれ以上の遺伝子改変を有するオープンリーデ
ィングフレームに連結された非ＡＡＶプロモーターを含んでなる導入遺伝子を含んでなる本発明のｒＡＡＶと宿主細胞を接触させることを含んでなる。本発明の１つもしくはそれ以上の因子もまた該方法に用いることができ、そしてベクター（１つもしくは複数）と細胞との接触の前に、同時にもしくは後に細胞と接触させることができる。次に、例えば異なるプロモーターに連結された導入遺伝子もしくは同じプロモーターを有するが野生型オープンリーディングフレームに連結された導入遺伝子を含んでなるｒＡＡＶと接触させた宿主細胞または本発明の因子と接触させていないものに対して、導入遺伝子の発現を検出するかもしくは決定する。
従って、１つの態様として、本発明は内在性遺伝子産物の異常発現と関連する症状を予防するか、抑制するかもしくは処置する方法を提供する。該方法は、該症状の危険性があるかもしくはそれを有する哺乳類を、ＡＡＶ導入を高める少なくとも１つの因子の有効量および機能性遺伝子産物の少なくとも一部をコードする導入遺伝子（哺乳類におけるその発現は、例えば、ドミナントネガティブ、アンチセンスもしくは触媒ＲＮＡによって、対応する内在性遺伝子産物の異常発現を抑制するか、または機能性遺伝子産物をコードし、それにより該症状の１つもしくはそれ以上の徴候を防ぐかもしくは抑制する）を含んでなる少なくとも１つのｒＡＡＶの有効量と接触させることを含む。１つの態様として、該因子は化学療法薬、脂質低下薬、抗生物質もしくは食品添加剤である。１つの態様として、該因子はカンプトテシンではない。別の態様として、該因子はシスプラチンではない。
本発明は、ｒＡＡＶ媒介遺伝子治療を必要とする哺乳類におけるｒＡＡＶ導入を相加的にもしくは相乗的に高めるための薬剤の製造のための哺乳類細胞のｒＡＡＶ導入を高める２つもしくはそれ以上の因子の使用を提供する。さらに提供されるのは、導入遺伝子で抑制するかもしくは処置することができる内在性遺伝子産物の異常発現と関連する症状を有する哺乳類における機能性遺伝子産物の少なくとも一部をコードする導入遺伝子を含んでなる少なくとも１つのｒＡＡＶの導入を高めるための薬剤の製造のための、化学療法薬、脂質低下薬、抗生物質もしくは食品添加剤の使用、またはｒＡＡＶエンドサイトーシス、細胞内コンパートメントにおけるｒＡＡＶ輸送もしくはプロセシング、ウイルス核酸もしくはタンパク質分解、ウイルスもしくはウイルスゲノムの核輸送を改変する少なくとも１つの因子の使用である。
［発明の詳細な記述］
定義
「ベクター」は、本明細書において用いる場合、ポリヌクレオチドを含んでなるかもしくはそれと結合し、そしてインビトロもしくはインビボのいずれかで、細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介するために用いることができる高分子もしくは高分子の結合をさす。実例となるベクターには、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、リポソームおよび他の遺伝子送達媒体が包含される。「標的ポリヌクレオチド」もしくは「導入遺伝子」と呼ばれることもある、送達されるポリヌクレオチドは、遺伝子治療において興味のあるコーディング配列（治療のもしくは興味のあるタンパク質をコードする遺伝子のような）、ワクチン開発において興味のあるコーディング配列（哺乳類において免疫応答を誘発するのに適当なタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドを発現するポリヌクレオチドのような）および／または選択可能なもしくは検出可能なマーカーを含んでなることができる。
「ＡＡＶ」はアデノ随伴ウイルスであり、そして天然に存在する野生型ウイルス自体もしくはその誘導体をさすために用いることができる。該用語は、他に必要とされる場合を除いて、全ての亜型、血清型および偽型、ならびに天然に存在する型および組み換え型の両方を対象とする。本明細書において用いる場合、「血清型」という用語は、特定の抗血清とのキャプシドタンパク質反応性により同定されそしてそれに基づいて他のＡＡＶと区別されるＡＡＶをさし、例えば、８つの血清型の霊長類ＡＡＶ、ＡＡＶ−１〜ＡＡＶ−８
がある。例えば、血清型ＡＡＶ２は、ＡＡＶ２のｃａｐ遺伝子からコードされるキャプシドタンパク質ならびに同じＡＡＶ２血清型からの５’および３’ＩＴＲ配列を含有するゲノムを含有するＡＡＶをさすために用いられる。偽型ＡＡＶは、１つの血清型からのキャプシドタンパク質および第二の血清型の５’−３’ＩＴＲを含むウイルスゲノムを含有するＡＡＶをさす。偽型ｒＡＡＶは、キャプシド血清型の細胞表面結合特性およびＩＴＲ血清型と一致する遺伝的性質を有すると予想される。偽型ｒＡＡＶは、当該技術分野において記述されている標準的技術を用いて製造される。本明細書において用いる場合、例えば、ｒＡＡＶ５は、同じ血清型からのキャプシドタンパク質および５’−３’ＩＴＲの両方を有するＡＡＶをさすために用いることができ、もしくはそれは血清型５型からのキャプシドタンパク質および異なるＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶ血清型２型からの５’−３’ＩＴＲを有するＡＡＶをさすことができる。本明細書に例示する各実施例でベクター設計および製造の記述は、キャプシドおよび５’−３’ＩＴＲ配列の血清型を記述する。略語「ｒＡＡＶ」は、組み換えＡＡＶベクター（もしくは「ｒＡＡＶベクター」）とも呼ばれる組み換えデノ随伴ウイルスをさす。
「形質導入」もしくは「形質導入すること」は、本明細書において用いる場合、ポリヌクレオチド、例えば細胞における導入遺伝子の発現をもたらす宿主細胞への外来ポリヌクレオチド、例えばｒＡＡＶベクターにおける導入遺伝子の導入のプロセスをさす用語である。該プロセスには、１）細胞表面受容体に結合した後のＡＡＶのエンドサイトーシス、２）細胞のサイトゾルにおけるエンドソームもしくは他の細胞内コンパートメントからの脱出、３）核へのウイルス粒子もしくはウイルスゲノムの輸送、４）ウイルス粒子のアンコーティング、および環状中間体を包含する発現可能な二本鎖ＡＡＶゲノム型の生成が包含される。ｒＡＡＶ発現可能二本鎖型は核エピソームとして存続することができ、もしくは場合により宿主ゲノムに組込むことができる。本発明の因子による、細胞表面受容体に結合した後のＡＡＶのエンドサイトーシス、細胞のサイトゾルへのエンドソームもしくは他の細胞内コンパートメントからの脱出、核へのウイルス粒子もしくはウイルスゲノムの輸送、またはウイルス粒子のアンコーティング、および環状中間体を包含する発現する二本鎖ＡＡＶゲノム型の生成のいずれかもしくは組み合わせの改変は、改変された発現レベルもしくは発現の存続、または核への改変された輸送、または導入ポリヌクレオチドを発現する宿主細胞もしくは細胞の集団の改変されたタイプもしくは相対数をもたらすことができる。ｒＡＡＶによって導入されるポリヌクレオチドの改変された発現もしくは存続は、タンパク質発現（例えばＥＬＩＳＡによる）、フローサイトメトリーおよびウェスタンブロット、ハイブリダイゼーションアッセイによるＤＮＡおよびＲＮＡ生産の測定（例えば、ノーザンブロット、サザンブロット）ならびにゲルシフト移動度アッセイが包含されるがこれらに限定されるものではない当該技術分野に周知である方法により決定することができる。本発明の因子は、好ましくは、インビトロもしくはインビボで導入ポリヌクレオチド、例えばｒＡＡＶベクターにおける導入遺伝子の発現を改変するように、ウイルスエンドサイトーシス、エンドソームもしくは他の細胞内サイトゾルコンパートメントからの脱出、および核中もしくは核への輸送、核におけるウイルス粒子のアンコーティング、および／または核におけるｒＡＡＶゲノムの増加するコンカテマー化もしくは二本鎖発現可能型の生成を改変するか、高めるかもしくは増加する。外来ポリヌクレオチドの導入に使用する方法には、トランスフェクション、リポフェクション、ウイルス感染、形質転換および電気穿孔、ならびに非ウイルス遺伝子送達技術のような周知の技術が包含される。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞において安定にもしくは一時的に維持されることができる。
「増加した形質導入もしくは形質導入頻度」、「改変された形質導入もしくは形質導入頻度」または「増大した形質導入もしくは形質導入頻度」は、未処理の細胞に対して処理した細胞における上記の活性の１つもしくはそれ以上の増加をさす。形質導入効率を増加する本発明の因子は、導入遺伝子の発現を測定すること、導入遺伝子の機能を測定するこ
と、もしくは該因子で処理していない宿主細胞と比較して同じ導入遺伝子効果をもたらすために必要なｒＡＡＶベクター粒子の数を決定することを包含することができる、１つもしくはそれ以上の形質導入活性への効果を測定することにより決定することができる。
「プロテオソームモジュレーター」は、プロテオソームと相互作用すること、それに結合すること、あるいはその機能、および／またはその輸送もしくは位置を改変することによりｒＡＡＶ導入もしくはｒＡＡＶ導入頻度を改変するかもしくは高める因子もしくは因子のクラスをさす。プロテオソームモジュレーターは、例えば、抗生物質、ドキシルビシンのような、当該技術分野において記述されているような他の細胞機能を有することができる。本発明のプロテオソームモジュレーターには、例えばトリペプチジルアルデヒド（Ｚ−ＬＬＬもしくはＬＬｎＬ）のようなプロテオソームインヒビター、プロテアソームのカルパイン、カテプシン、システインプロテアーゼおよび／もしくはキモトリプシン様プロテアーゼ活性を阻害する因子（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｓｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）は包含されない。
「二本鎖発現可能型の生成」もしくは「一本鎖から二本鎖ｒＡＡＶゲノムへの転化」は、ｒＡＡＶ感染宿主細胞の核においてｒＡＡＶ一本鎖ベクターＤＮＡゲノムの相補鎖を複製することおよび二本鎖ＤＮＡ ｒＡＡＶゲノムを生成するためのベクターゲノムへの相補鎖のアニーリングのプロセスをさす。ｒＡＡＶ導入を増加するか、改変するかもしくは高める本明細書に記述する本発明の因子には、核輸送の速度もしくは定常状態機序によって遺伝子転化事象を導くことができる核における一本鎖ウイルスＤＮＡゲノムの定常状態を増加する因子が包含される。本明細書に記述する本発明の目的では、一本鎖から二本鎖への転化を高める因子には、Ｒｕｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．（１９９５）により記述されているＤＮＡ修復酵素の濃度を増加するかもしくは代替ＤＮＡ修復機序を活性化する因子は包含されない。
「遺伝子送達」は、遺伝子導入のための細胞への外来ポリヌクレオチドの導入をさし、そしてターゲッティング、結合、取り込み、輸送、局在化、レプリコン組込みおよび発現を包含することができる。
「遺伝子導入」は、ターゲッティング、結合、取り込み、輸送、局在化およびレプリコン組込みを包含することができるが、その後の遺伝子の発現とは異なるそしてそれを意味しない細胞への外来ポリヌクレオチドの導入をさす。
「遺伝子発現」もしくは「発現」は、遺伝子転写、翻訳および翻訳後修飾のプロセスをさす。
「検出可能なマーカー遺伝子」は、該遺伝子を保有する細胞が特異的に検出される（例えば、該マーカー遺伝子を保有しない細胞から区別される）ことを可能にする遺伝子である。多種多様なそのようなマーカー遺伝子が、当該技術分野において既知である。
「選択可能なマーカー遺伝子」は、対応する選択因子の存在下で、該遺伝子を保有する細胞がそれに関してもしくは対して（ｆｏｒ ｏｒ ａｇａｉｎｓｔ）特異的に選択されることを可能にする遺伝子である。実例として、抗生物質耐性遺伝子は、対応する抗生物質の存在下でそれに関して宿主細胞がポジティブに選択されることを可能にするポジティブ選択可能マーカー遺伝子として用いることができる。様々なポジティブおよびネガティブ選択可能マーカーが当該技術分野において既知であり、それらのいくつかを以下に記述する。
「ｒＡＡＶ」ベクターは、本明細書において用いる場合、ＡＡＶ由来のものではないポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶに異種のポリヌクレオチド）、典型的には細胞の遺伝的形質転換のための興味のある配列を含んでなるＡＡＶベクターをさす。本発明の好ましいベクター構築物において、異種ポリヌクレオチドには少なくとも１つの、好ましくは２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する。ｒＡＡＶベクターという用語には、ｒＡＡＶベクター粒子およびｒＡＡＶベクタープラスミドの両方が包含される。
「ＡＡＶウイルス」もしくは「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質（好ましくは、野生型ＡＡＶのキャプシドタンパク質の全てによる）およびキャプシドに包まれたポリヌクレオチドからなるウイルス粒子をさす。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳類細胞に送達される導入遺伝子のような野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含んでなる場合、それは典型的に「ｒＡＡＶ」と呼ばれる。
「ｒＡＡＶワクチン」は、本明細書において用いる場合、ベクターと接触させた宿主において免疫応答を誘発することができるペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードする、ＡＡＶ由来のものではないポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶに異種のポリヌクレオチド）を含んでなるＡＡＶベクターをさす。ポリヌクレオチドの発現は、中和抗体応答および／もしくは細胞性応答、例えば細胞傷害性Ｔ細胞応答の生成をもたらすことができる。本発明の好ましいベクター構築物において、異種ポリヌクレオチドには少なくとも１つの、好ましくは２つのＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する。
ＡＡＶの「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（例えば野生型ＡＡＶ）が哺乳類細胞により複製されそしてパッケージングされることを可能にするウイルスをさす。アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびワクシニアのようなポックスウイルスを包含する、ＡＡＶの様々なそのようなヘルパーウイルスが当該技術分野において既知である。亜群Ｃのアデノウイルス５型が最も一般的に用いられるが、アデノウイルスには多数の異なる亜群が包含される。ヒト、非ヒト哺乳類および鳥類由来の多数のアデノウイルスが既知であり、そしてＡＴＣＣのような寄託場所から利用可能である。ヘルペス科のウイルスには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が包含され；これらもまたＡＴＣＣのような寄託場所から利用可能である。
「感染性」ウイルスもしくはウイルス粒子は、ウイルス種が指向性である細胞中に送達することができるポリヌクレオチド成分を含んでなるものである。該用語は、ウイルスの任意の複製能力を必ずしも意味しない。
「複製能力のある」ウイルス（例えば、複製能力のあるＡＡＶ、「ＲＣＡ」と省略されることもある）は、感染性でありそしてまた感染細胞において（すなわち、ヘルパーウイルスもしくはヘルパーウイルス機能の存在下で）複製されることもできる表現型的に野生型のウイルスをさす。ＡＡＶの場合、複製能力は、一般に、機能性ＡＡＶパッケージング遺伝子の存在を必要とする。本明細書に記述するような好ましいｒＡＡＶベクターは、１つもしくはそれ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子の欠如のために哺乳類細胞において（特にヒト細胞において）複製能力を欠いている。好ましくは、そのようなｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶパッケージング遺伝子と侵入してくるｒＡＡＶベクターとの間の組み換えによりＲＣＡが生成される可能性を最小限に抑えるために任意のＡＡＶパッケージング遺伝子配列を欠く。本明細書に記述するような好ましいｒＡＡＶベクター調製物は、あるとしてもごくわずかのＲＣＡ（好ましくは１０２個のｒＡＡＶ粒子当たり約１個未満のＲＣＡ、より好ましくは１０４個のｒＡＡＶ粒子当たり約１個未満のＲＣＡ、さらにより好ましくは１０８個のｒＡＡＶ粒子当たり約１個未満のＲＣＡ、なおさらに好ましくは１０１２
個のｒＡＡＶ粒子当たり約１個未満のＲＣＡ、最も好ましくはＲＣＡがない）を含有するものである。
「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドを包含する任意の長さのヌクレオチド、またはそのアナログのポリマー形態をさす。ポリヌクレオチドは、メチル化もしくはキャップ化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログのような改変されたヌクレオチドを含んでなることができ、そして非ヌクレオチド成分により遮ることができる。存在する場合、ヌクレオチド構造への改変は、ポリマーの組み立ての前もしくは後に与えることができる。ポリヌクレオチドという用語は、本明細書において用いる場合、二本鎖および一本鎖分子を同義的にさす。他に特定されないかもしくは必要とされない限り、ポリヌクレオチドである本明細書に記述する本発明の任意の態様には、二本鎖形態および二本鎖形態を構成することが既知であるかもしくは予測される２本の相補的一本鎖形態の各々の両方が包含される。
「転写調節配列」もしくは「ＴＲＳ」は、本明細書において用いる場合、それが作動可能に連結される遺伝子もしくはコーディング配列の転写を制御するゲノム領域をさす。本発明において有用な転写調節配列には、一般に、少なくとも１つの転写プロモーターが包含され、そしてまた転写の１つもしくはそれ以上のエンハンサーおよび／もしくはターミネーターを包含することもできる。
「作動可能に連結された」は、そのように記述される成分が協調して機能することを可能にする関係にそれらがある、２つもしくはそれ以上の成分の配置をさす。実例として、ＴＲＳもしくはプロモーターがコーディング配列の転写を促進する場合、転写調節配列もしくはプロモーターはコーディング配列に作動可能に連結される。作動可能に連結されたＴＲＳは、一般に、コーディング配列とシスに連結されるが、必ずしもそれに直接隣接していない。
「異種の」は、それを比較する存在の残りのものと遺伝子型で異なる存在に由来することを意味する。例えば、異なる細胞タイプに遺伝子工学技術により導入されるポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである（そして、発現される場合、異種ポリペプチドをコードすることができる）。同様に、その天然のコーディング配列から取り除かれそして異なるコーディング配列に作動可能に連結されるＴＲＳもしくはプロモーターは、異種ＴＲＳもしくはプロモーターである。
「パッケージング」は、本明細書において用いる場合、ウイルスベクター、特にＡＡＶベクターの組み立ておよびキャプシド封入（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）をもたらす一連の細胞内事象をさす。従って、適当なベクターが適切な条件下でパッケージング細胞系に導入される場合、それはウイルス粒子に組み立てられることができる。ウイルスベクター、特にＡＡＶベクターのパッケージングと関連する機能は、本明細書にそして当該技術分野において記述されている。
「ターミネーター」は、リードスルー転写を減少するかもしくは防ぐ傾向があるポリヌクレオチド配列をさす（すなわち、それはターミネーターの片側に起因する転写がターミネーターの反対側までずっと続くのを減少するかもしくは防ぐ）。転写が中断される程度は、典型的に、塩基配列および／もしくはターミネーター配列の長さの関数である。特に、多数の分子生物学系において周知であるように、「転写終結配列」と一般に呼ばれる特定のＤＮＡ配列は、おそらくＲＮＡポリメラーゼ分子を停止させそして／もしくは転写されるＤＮＡから離れさせることにより、ＲＮＡポリメラーゼによるリードスルー転写を中断する傾向がある特定の配列である。そのような配列特異的ターミネーターの典型的な例には、ポリアデニル化（「ポリＡ」）配列、例えばＳＶ４０ポリＡが包含される。そのよ
うな配列特異的ターミネーターに加えてもしくはその代わりに、プロモーターとコーディング領域の間の比較的長いＤＮＡ配列の挿入もまた、一般に介在配列の長さに比例して、コーディング領域の転写を中断する傾向がある。この効果は、おそらく、ＲＮＡポリメラーゼ分子が転写されるＤＮＡから離れるようになるいくらかの傾向がいつもあるので生じ、そしてコーディング領域に到達する前に横断する配列の長さを増加することは、一般に、コーディング領域の転写が完了されるかもしくは場合によってはさらに開始される前に離脱が起こる可能性を増す。従って、ターミネーターは、転写を一方向のみから（「一方向性」ターミネーター）もしくは両方向から（「両方向性」ターミネーター）防ぐことができ、そして配列特異的終結配列もしくは配列非特異的ターミネーターもしくは両方を含んでなることができる。様々なそのようなターミネーター配列が当該技術分野において既知であり；そして本発明との関連内でそのような配列の実例となる使用を以下に提供する。
「宿主細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」、「パッケージング細胞系」および他のそのような用語は、本発明において有用な高等真核細胞、好ましくは哺乳類細胞、最も好ましくはヒト細胞を意味する。これらの細胞は、組み換えベクター、ウイルスもしくは他の導入ポリヌクレオチドのレシピエントとして用いることができ、そして導入された最初の細胞の子孫を包含する。単一細胞の子孫は、最初の親細胞と必ずしも完全に同一ではない可能性がある（形態においてもしくはゲノムの補足（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）において）と理解される。
「治療遺伝子」、「予防遺伝子」、「標的ポリヌクレオチド」、「導入遺伝子」、「興味のある遺伝子」などは一般に、ベクターを用いて導入される遺伝子もしくは複数の遺伝子をさす。典型的に、本発明との関連で、そのような遺伝子はｒＡＡＶベクター（このベクターには逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域が隣接し、従って、複製されそしてｒＡＡＶ粒子にキャプシド封入されることができる）内に位置する。標的ポリヌクレオチドは、多数の異なる用途にｒＡＡＶベクターを作製するために本発明において用いることができる。そのようなポリヌクレオチドには：（ｉ）構造タンパク質もしくは酵素の損失、欠陥もしくは次善レベルにより引き起こされる欠損症を軽減するために遺伝子治療の他の形態において有用なタンパク質をコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）アンチセンス分子に転写されるポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）転写もしくは翻訳因子に結合するおとりに転写されるポリヌクレオチド；（ｉｖ）サイトカインのような細胞モジュレーターをコードするポリヌクレオチド；（ｖ）レシピエント細胞をヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のような特定の薬剤に感受性にすることができるポリヌクレオチド；および（ｖｉ）様々な癌の処置のためのＥ１Ａ腫瘍抑制遺伝子もしくはｐ５３腫瘍抑制遺伝子のような、癌治療のためのポリヌクレオチドが包含されるがこれらに限定されるものではない。レシピエント宿主細胞における導入遺伝子の発現をもたらすために、それは好ましくはプロモーター、それ自身のもしくは異種プロモーターのいずれかに作動可能に連結される。多数の適当なプロモーターが当該技術分野において既知であり、その選択は、標的ポリヌクレオチドの発現の所望のレベル；構成的発現、誘導性発現、細胞特異的もしくは組織特異的発現などを所望するかどうかにより決まる。ｒＡＡＶベクターはまた、選択可能なマーカーを含有することもできる。
「遺伝子」は、転写されそして翻訳された後に特定のタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドをさす。
「組み換え体」は、ポリヌクレオチドに適用する場合、該ポリヌクレオチドがクローニング、制限および／もしくはライゲーション工程、ならびに自然界に見出されるポリヌクレオチドと異なった構築物をもたらす他の方法の様々な組み合わせの産物であることを意
味する。組み換えウイルスは、組み換えポリヌクレオチドを含んでなるウイルス粒子である。該用語には、それぞれ、最初のポリヌクレオチド構築物の複製および最初のウイルス構築物の子孫が包含される。
「制御要素」もしくは「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳もしくは分解を包含する、ポリヌクレオチドの機能調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。該調節は、プロセスの頻度、速度もしくは特異性に影響を及ぼすことができ、そして増大するかもしくは抑制性の性質であることができる。当該技術分野において既知である制御要素には、例えば、プロモーターおよびエンハンサーのような転写調節配列が包含される。プロモーターは、ある条件下でＲＮＡポリメラーゼに結合しそして通常はプロモーターから下流に（３’方向に）位置するコーディング領域の転写を開始することができるＤＮＡ領域である。プロモーターには、ＡＡＶプロモーター、例えばＰ５、Ｐ１９、Ｐ４０およびＡＡＶ ＩＴＲプロモーター、ならびに異種プロモーターが包含される。
「発現ベクター」は、興味のあるポリペプチドをコードする領域を含んでなるベクターであり、そして意図された標的細胞におけるタンパク質の発現をもたらすために使用される。発現ベクターはまた、標的におけるタンパク質の発現を促進するためにコード領域に作動可能に連結された制御要素も含んでなる。制御要素およびそれらが発現用に作動可能に連結される遺伝子もしくは複数の遺伝子の組み合わせは、「発現カセット」と呼ばれることもあり、その多数は当該技術分野において既知でありそして利用可能であるか、もしくは当該技術分野において利用可能である成分から容易に構築することができる。
「遺伝子改変」は、遺伝要素が有糸分裂もしくは減数分裂による以外で細胞に導入されるプロセスをさす。該要素は細胞に異種であることができ、またはそれは細胞にすでに存在する要素の追加コピーもしくは改善されたバージョンであることができる。遺伝子改変は、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿もしくはポリヌクレオチド−リポソーム複合体と接触させることのような、当該技術分野において既知である任意の方法によって細胞に組み換えプラスミドもしくは他のポリヌクレオチドをトランスフェクションすることによりもたらすことができる。遺伝子改変はまた、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスもしくはウイルスベクターでの形質導入もしくは感染によりもたらすこともできる。好ましくは、遺伝要素は、細胞における染色体もしくはミニ染色体に導入されるが；細胞およびその子孫の表現型および／もしくは遺伝子型を変える任意の改変は、この用語に包含される。
遺伝子配列がインビトロで細胞の延長培養中にその機能を果たすために利用可能である場合に、細胞は該配列で「安定に」改変される、形質導入されるもしくは形質転換されると言われる。好ましい例として、そのような細胞は、改変された細胞の子孫によっても遺伝される遺伝子改変が導入される点において「遺伝的に」改変される。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーをさすために本明細書において同義的に用いられる。該用語にはまた、改変されているアミノ酸ポリマー；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、アセチル化、ホスホニル化、脂質付加、もしくは標識成分との結合も包含される。「ＣＦＴＲ」などのようなポリペプチドは、遺伝子治療およびそのための組成物との関連で説明される場合、完全なタンパク質の所望の生化学機能を保持するそれぞれの完全なポリペプチド、またはその任意のフラグメントもしくは遺伝子操作された誘導体をさす。同様に、遺伝子治療に使用するＣＦＴＲおよび他のそのような遺伝子（典型的に、レシピエント細胞に送達される「導入遺伝子」と呼ばれる）への言及には、所望の生化学機能を保有する完全なポリペプチドまたはその任意のフラグメントもしくは遺伝子操作された誘導体をコードするポリヌクレ
オチドが包含される。
「単離された」プラスミド、ウイルスもしくは他の物質は、該物質もしくは同様の物質が天然に存在するかもしくは最初にそこから調製される場所に同様に存在し得る他の成分の少なくともいくらかを欠いている物質の調製物をさす。従って、例えば、単離された物質は、供給源混合物からそれを濃縮するために精製技術を用いることにより調製することができる。濃縮は、溶液の容量当たりの重量のような絶対的基準で測定することができ、もしくはそれは、供給源混合物に存在する第二の潜在的妨害物質に関して測定することができる。本発明の態様の増加する濃縮は、ますますより好ましい。従って、例えば、２倍の濃縮は好ましく、１０倍の濃縮はより好ましく、１００倍の濃縮はより好ましく、１０００倍の濃縮はさらにより好ましい。
ＡＡＶの調製物は、感染性ＡＡＶ粒子：感染性ヘルパーウイルス粒子の比率が少なくとも約１０２：１；好ましくは少なくとも約１０４：１、より好ましくは少なくとも約１０６：１；さらにより好ましくは少なくとも約１０８：１である場合にヘルパーウイルスを「実質的に含まない」と言われる。調製物はまた、好ましくは、同等量のヘルパーウイルスタンパク質（すなわち、上記のヘルパーウイルス粒子不純物が破壊された形態で存在した場合にヘルパーウイルスのそのようなレベルの結果として存在するようなタンパク質）も含まない。ウイルスおよび／もしくは細胞タンパク質混入は、一般に、ＳＤＳゲル上でクーマシー染色バンドの存在（例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に対応するもの以外のバンドの出現）として認められることができる。
「効率」は、ウイルス生産、複製もしくはパッケージングを表すことに用いる場合、該方法の有用な性質：特に、増殖速度および細胞当たり生産されるウイルス粒子の数をさす。「高効率」生産は、特定の培養期間にわたる、細胞当たり少なくとも１００個のウイルス粒子；好ましくは少なくとも約１０，０００個そしてより好ましくは細胞当たり少なくとも約１００，０００個の粒子の生産を示す。
本発明に従って処置する「個体」もしくは「被験体」は、脊椎動物、特に哺乳類種のメンバーをさし、そして家畜、スポーツ動物（ｓｐｏｒｔｓ ａｎｉｍａｌｓ）、およびヒトを包含する霊長類が包含されるがこれらに限定されるものではない。
個体もしくは細胞の「処置」は、処置が開始される時点での個体もしくは細胞の自然経過を改変しようとする任意のタイプの介入、例えば、個体における予防、治療もしくは他の有益な効果を引き出すことである。例えば、個体の処置は、遺伝的もしくは誘発的遺伝子欠損、ウイルス、細菌もしくは寄生生物による感染、腫瘍性もしくは形成不全疾患、または自己免疫もしくは免疫抑制のような免疫系機能障害が包含される（がこれらに限定されるものではない）任意の病的状態により引き起こされる病状を減少するかもしくは限定するために行われることができる。処置には、製薬学的組成物のような組成物の投与、および組成物で処理されている適合する細胞の投与が包含される（がこれらに限定されるものではない）。処置は、予防的にもしくは治療的に；すなわち、病的事象の開始もしくは病原因子との接触の前にもしくは後に行われることができる。
本発明の実施は、他に示されない限り、当該技術分野の技量の範囲内である、分子生物学、ウイルス学、微生物学、組み換えＤＮＡおよび免疫学の通常の技術を用いる。そのような技術は、文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｇａｉｔ，１９８４；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｃｏｌｉｇａｎ
ｅｔ ａｌ．，１９９５；およびＳｃｏｐｅｓ １９９４を参照。
Ｉ．ｒＡＡＶベクター
組み換えＡＡＶベクターは、特に嚢胞性線維症および鎌状赤血球貧血のような疾患の、ヒト遺伝子治療用の潜在的に有力な手段である。遺伝子治療の他の方法に対するｒＡＡＶベクターの主要な利点は、宿主細胞に安定に組込まれるようになるためにそれらが一般に標的細胞の進行中の複製を必要としないことである。
ｒＡＡＶベクターおよび／もしくはウイルスはまた、疾患の感染、進行および／もしくは重症度を防ぐための治療もしくは予防ワクチンの開発にも潜在的に有力である。ワクチン開発のためのｒＡＡＶベクターの主要な利点は、それらが核エピソームとして本質的に細胞の生涯にわたって存続することができ、従って、免疫学的興味のあるペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質の長期発現を提供することである。興味のある導入遺伝子には、ウイルス遺伝子、例えばＨＩＶのエンベロープ（ｅｎｖ）もしくはｇａｇ遺伝子；細菌遺伝子、例えばストレプトコッカス細胞壁タンパク質；真菌、例えばコクシジオイデス真菌症（ｃｏｃｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ）；寄生虫、例えばリーシュマニア症、もしくは癌遺伝子、例えばｐ５３が包含される。
ｒＡＡＶベクターおよび／もしくはウイルスはまた、１つもしくはそれ以上の検出可能なマーカーを含有することもできる。実例として、細菌ベータ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子；ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＡＰ）遺伝子ならびにインビトロおよびインビボの両方でレポーター分子として用いられている様々な細胞表面マーカーをコードする遺伝子を包含する様々なそのようなマーカーが既知である。ｒＡＡＶベクターおよび／もしくはウイルスはまた、１つもしくはそれ以上の選択可能なマーカーを含有することもできる。
組み換えＡＡＶベクターおよび／もしくはウイルスはまた、例えば、通常のｍＲＮＡの翻訳をそれと二本鎖を形成することにより阻止するために用いることができるアンチセンスｍＲＮＡ（ｍＲＮＡの相補物）をコードするポリヌクレオチド、およびリボザイム（ＲＮＡ触媒）をコードするポリヌクレオチドを包含する、タンパク質をコードしないポリヌクレオチドを含んでなることもできる。
ＩＩ．ＡＡＶベクターの選択および製造
様々な血清型は、遺伝子レベルでさえ、機能的にそして構造的に関連しているので、任意の血清型のアデノ随伴ウイルスがｒＡＡＶを製造するために適している（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗ，１９８８；およびＲｏｓｅ，１９７４を参照）。全てのＡＡＶ血清型は、相同なｒｅｐ遺伝子により媒介される同様の複製特性を明らかに示し；そして全て、ＡＡＶ２において発現されるもののような３つの関連するキャプシドタンパク質を一般に保有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範な交差ハイブリダイゼーション；およびＩＴＲに対応する末端での類似する自己アニーリングセグメントの存在を示すヘテロ二本鎖分析によりさらに示唆される。同様の感染力パターンもまた、各血清型における複製機能が同様の調節制御下にあることを示唆する。様々な血清型の中で、ＡＡＶ２は最も一般的に用いられる。
本発明のＡＡＶベクターは、典型的に、ＡＡＶに異種であるポリヌクレオチドを含んでなる。該ポリヌクレオチドは、典型的に、ある種の表現型の発現のアップもしくはダウンレギュレーションのような、遺伝子治療との関連で標的細胞に機能を提供する能力のために興味深いものである。そのような異種ポリヌクレオチドもしくは「導入遺伝子」は、一般に、所望の機能もしくはコード配列を提供するために十分な長さのものである。
意図される標的細胞において異種ポリヌクレオチドの転写が所望される場合、当該技術分野において既知であるように、例えば標的細胞内での転写の所望のレベルおよび／もし
くは特異性により、それはそれ自体のもしくは異種のプロモーターに作動可能に連結されることができる。様々なタイプのプロモーターおよびエンハンサーが、これに関連して使用に適している。構成的プロモーターは、継続するレベルの遺伝子転写を提供し、そして治療もしくは予防ポリヌクレオチドが継続する基準で発現されることが所望される場合に好ましい。誘導性プロモーターは、一般に、誘導因子のない場合に低い活性を示し、そして誘導物質の存在下でアップレギュレーションされる。それらは、発現がある時点でもしくはある位置でのみ所望される場合に、または誘導因子を用いて発現のレベルを滴定することが所望される場合に好ましい可能性がある。プロモーターおよびエンハンサーはまた組織特異的であることもでき：すなわち、それらは、おそらくそれらの細胞に独自に存在する遺伝子調節要素のために、ある種の細胞タイプにおいてのみそれらの活性を示す。
プロモーターの説明に役立つ例は、シミアンウイルス４０からのＳＶ４０後期プロモーター、バキュロウイルスポリヘドロンエンハンサー／プロモーター要素、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ ｔｋ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からの前初期プロモーターおよびＬＴＲ要素を含む様々なレトロウイルスプロモーターである。誘導性プロモーターには、重金属イオン誘導性プロモーター（マウス乳癌ウイルス（ｍＭＴＶ）プロモーターもしくは様々な成長ホルモンプロモーターのような）およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの存在下で活性であるＴ７ファージからのプロモーターが包含される。実例として、組織特異的プロモーターの例には、様々なサーファクチンプロモーター（肺における発現用）、ミオシンプロモーター（筋肉における発現用）およびアルブミンプロモーター（肝臓における発現用）が包含される。多種多様な他のプロモーターが当該技術分野において既知でありそして一般に利用可能であり、そして多数のそのようなプロモーターの配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのような配列データベースにおいて利用可能である。
意図される標的細胞において翻訳もまた所望される場合、異種ポリヌクレオチドは、好ましくは、翻訳を促進する制御要素（リボソーム結合部位、すなわち「ＲＢＳ」およびポリアデニル化シグナルのような）も含んでなる。従って、異種ポリヌクレオチドは、一般に、適当なプロモーターに作動可能に連結された少なくとも１つのコーディング領域を含んでなり、そしてまた例えば作動可能に連結されたエンハンサー、リボソーム結合部位およびポリ−Ａシグナルを含んでなることもできる。異種ポリヌクレオチドは、１つのコード領域、または同じもしくは異なるプロモーターの制御下の１つより多くのコード領域を含んでなることができる。制御要素およびコード領域の組み合わせを含有する全単位は、発現カセットと呼ばれることが多い。
異種ポリヌクレオチドは、ＡＡＶゲノムのコーディング領域中にもしくは好ましくはその代わりに（すなわち、ＡＡＶ ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の代わりに）組み換え技術により組込まれるが、一般にＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域が両側に隣接する。これは、複製能力のあるＡＡＶゲノムを再生するかもしれない組み換えの可能性を減らすために好ましくは（必ずしもではないが）ＡＡＶ由来の任意の介在配列なしに、コーディング配列から上流および下流の両方に、いずれも直接並んで、ＩＴＲが現れることを意味する。しかしながら、単一のＩＴＲは、２個のＩＴＲを含んでなる配置と通常は関連する機能を実行するために十分であることができ（例えばＷＯ９４／１３７８８を参照）、従って、1個のみのＩＴＲを有するベクター構築物を本発明のパッケージングおよび製造方法とともに用いることができる。
ｒｅｐの天然プロモーターは自己調節性であり、そして生産されるＡＡＶ粒子の量を限定することができる。ｒｅｐ遺伝子はまた、ｒｅｐがベクター構築物の一部としてもしくは別個に提供されようと、異種プロモーターに作動可能に連結されることもできる。ｒｅｐ遺伝子発現により強力にダウンレギュレーションされない任意の異種プロモーターが適
当であるが；ｒｅｐ遺伝子の構成的発現は宿主細胞にマイナスの影響を有する可能性があるので誘導性プロモーターが好ましい。実例として、重金属イオン誘導性プロモーター（メタロチオネインプロモーターのような）；ステロイドホルモン誘導性プロモーター（ＭＭＴＶプロモーターもしくは成長ホルモンプロモーターのような）；およびＴ７ ＲＮＡポリメラーゼの存在下で活性であるＴ７ファージからのもののようなプロモーターを包含する、多種多様な誘導性プロモーターが当該技術分野において既知である。誘導性プロモーターの特に好ましいサブクラスは、ｒＡＡＶベクターの複製およびパッケージングを補足するために用いられるヘルパーウイルスにより誘導されるものである。アデノウイルスＥ１Ａタンパク質により誘導できるアデノウイルス初期遺伝子プロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター；ＶＰ１６もしくは１ＣＰ４のようなヘルペスウイルスタンパク質により誘導できるヘルペスウイルスプロモーター；ならびにワクシニアもしくはポックスウイルス誘導性プロモーターを包含する、多数のヘルパーウイルス誘導性プロモーターもまた記述されている。
ヘルパーウイルス誘導性プロモーターを同定しそして試験する方法は、記述されている（例えばＷＯ９６／１７９４７を参照）。従って、候補プロモーターがヘルパーウイルス誘導性であるかどうかおよびそれらが高効率パッケージング細胞の作製において有用であるかどうかを決定する方法は、当該技術分野において既知である。簡潔に言えば、１つのそのような方法は、推定上のヘルパーウイルス誘導性プロモーター（当該技術分野において既知であるかもしくはプロモーターのない「レポーター」遺伝子への連結のような周知の技術を用いて同定されるいずれか）でＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子のｐ５プロモーターを置換することを含む。次に、好ましくは抗生物質耐性遺伝子のようなポジティブ選択可能マーカーに連結された、ＡＡＶ ｒｅｐ−ｃａｐ遺伝子（ｐ５を置換された）は、適当な宿主細胞（以下に例示するＨｅＬａもしくはＡ５４９細胞のような）に安定に組込まれる。選択条件下（例えば抗生物質の存在下）で比較的よく増殖することができる細胞を次にヘルパーウイルスの添加時にｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するそれらの能力に関して試験する。ｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ発現の初期試験として、Ｒｅｐおよび／もしくはＣａｐタンパク質を検出するために免疫蛍光を用いて細胞を容易にスクリーニングすることができる。次に、パッケージング能力および効率の確認は、侵入してくるｒＡＡＶベクターの複製およびパッケージングの機能試験により決定することができる。この方法論を用いて、マウスメタロチオネイン遺伝子由来のヘルパーウイルス誘導性プロモーターが、ｐ５プロモーターの適当な代替物として同定され、そして高力価のｒＡＡＶ粒子を製造するために用いられている（ＷＯ９６／１７９４７に記述されているように）。
様々なＡＡＶゲノムの相対的キャプシド封入サイズ制限を考えると、ゲノムへの大きい異種ポリヌクレオチドの挿入は、ＡＡＶ配列の一部の除去を必要とする。１つもしくはそれ以上のＡＡＶ遺伝子の除去は、複製能力のあるＡＡＶ（「ＲＣＡ」）を生成する可能性を減らすために、どんな場合でも望ましい。従って、ｒｅｐ、ｃａｐもしくは両方のコードもしくはプロモーター配列は、これらの遺伝子により提供される機能をトランスに提供することができるので、好ましくは取り除かれる。
得られるベクターは、これらの機能が「欠損する」と見なされる。ベクターを複製しそしてパッケージングするために、欠けている機能は、様々な欠けているｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ遺伝子産物の必要な機能を一緒にコードする、パッケージング遺伝子もしくはその複数で補足される。パッケージング遺伝子もしくは遺伝子カセットには、好ましくはＡＡＶ ＩＴＲが隣接せず、そして好ましくはｒＡＡＶゲノムと任意の実質的な相同性を共有しない。従って、ベクター配列と別個に提供されるパッケージング遺伝子との間の複製中の相同的組み換えを最低限に抑えるために、２つのポリヌクレオチド配列の重複を避けることが望ましい。相同性のレベルおよび対応する組み換え頻度は、相同配列の増加する長さとともにそして共有される同一性のそれらのレベルとともに増加する。既定の系
において懸念をもたらす相同性のレベルは、当該技術分野において既知であるように、理論的に決定しそして実験的に確認することができる。しかしながら、典型的に、重複配列がその全長にわたって少なくとも８０％同一である場合には約２５ヌクレオチド未満の配列、もしくはそれがその全長にわたって少なくとも７０％同一である場合には約５０ヌクレオチド未満の配列であれば、組み換えを実質的に減らすかもしくはなくすことができる。もちろん、さらに低いレベルの相同性は、組み換えの可能性をさらに減らすので好ましい。任意の重複する相同性なしにさえ、ＲＣＡを生成するいくらかの残存頻度があるようである。ＲＣＡを生成する（例えば非相同的組み換えにより）頻度のなおさらなる減少は、Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９８／２７２０４により記述されているように、ＡＡＶの複製およびキャプシド封入機能を「分けること」により得られることができる。
ｒＡＡＶベクター構築物および相補的パッケージング遺伝子構築物は、多数の異なる形態で本発明において使用されることができる。ウイルス粒子、プラスミドおよび安定に形質転換された宿主細胞は全て、一時的にもしくは安定に、パッケージング細胞にそのような構築物を導入するために用いることができる。
本発明のある態様として、ＡＡＶベクターおよびもしあれば相補的パッケージング遺伝子（１つもしくは複数）は、細菌プラスミド、ＡＡＶ粒子もしくはその任意の組み合わせの形態で提供される。別の態様として、ＡＡＶベクター配列、パッケージング遺伝子（１つもしくは複数）もしくは両方のいずれかは、遺伝子改変された（好ましくは遺伝的に改変された）真核細胞の形態で提供される。ＡＡＶベクター配列、ＡＡＶパッケージング遺伝子、もしくは両方を発現するように遺伝的に改変された宿主細胞の開発は、信頼できるレベルで発現される物質の確立した供給源を提供する。
従って、様々な異なる遺伝子改変された細胞を本発明との関連で用いることができる。実例として、安定に組込まれたｒＡＡＶベクターの少なくとも１つの完全なコピーを有する哺乳類宿主細胞を用いることができる。プロモーターに作動可能に連結された少なくともＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を含んでなるＡＡＶパッケージングプラスミドは、複製機能を供給するために用いることができる（米国特許５，６５８，７７６に記述されているように）。あるいはまた、プロモーターに作動可能に連結されたＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子を有する安定な哺乳類細胞系は、複製機能を供給するために用いることができる（例えば、Ｔｒｅｍｐｅ ｅｔ ａｌ．（ＷＯ９５／１３３９２）；Ｂｕｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．（ＷＯ９８／２３０１８）；およびＪｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（米国第５，６５６，７８５号）を参照）。上記のようなキャプシド封入タンパク質を提供するＡＡＶｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子と一緒にもしくは別個に提供することができる（例えば、上記の出願および特許ならびにＡｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．（ＷＯ９８／２７２０４）を参照）。他の組み合わせが可能であり、そして本発明の範囲内に包含される。
ＩＩＩ．ｒＡＡＶを製造すること
遺伝子治療のような目的のために有用な組み換えＡＡＶ粒子を製造するために、パッケージング細胞系に、好ましくは、興味のある１つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド（もしくは「標的」ポリヌクレオチド）を取り囲んでいるＡＡＶ逆方向末端反復（ＩＴＲ）領域を含んでなる組み換えＡＡＶベクターを供給する。
標的ポリヌクレオチドは、一般に、プロモーター、それ自体のもしくは異種のプロモーターのいずれかに作動可能に連結される。多数の適当なプロモーターが当該技術分野において既知であり、その選択は、標的ポリヌクレオチドの発現の所望のレベル（すなわち、構成的発現、誘導性発現、細胞特異的もしくは組織特異的発現などを所望するかどうか）により決まる。
好ましくは、ｒＡＡＶベクターはまた、ｒＡＡＶベクターに感染している細胞の選択を
可能にするためにポジティブ選択可能マーカーを含有することもできる。ネガティブ選択可能マーカーもまた含むことができ；これらの同じ細胞に対して選択する手段としてそれは必要にもしくは望ましくなるはずである。好ましい態様として、Ｓ．Ｄ．Ｌｕｐｔｏｎにより記述されている「二機能性選択可能融合遺伝子」を利用することができる；例えばＰＣＴ／ＵＳ９１／０８４４２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０５６０１を参照。簡潔に言えば、これらの構築物は、ドミナントポジティブ選択可能マーカーとネガティブ選択可能マーカーとの間の直接翻訳融合を含む。好ましいポジティブ選択可能マーカーは、ｈｐｈ、ｎｅｏおよびｇｐｔよりなる群から選択される遺伝子に由来し、そして好ましいネガティブ選択可能マーカーは、シトシンデアミナーゼ、ＨＳＶ−Ｉ ＴＫ、ＶＺＶ ＴＫ、ＨＰＲＴ、ＡＰＲＴおよびｇｐｔよりなる群から選択される遺伝子に由来する。特に好ましいマーカーは、ポジティブ選択可能マーカーがｈｐｈもしくはｎｅｏに由来しそしてネガティブ選択可能マーカーがシトシンデアミナーゼもしくはＴＫ遺伝子に由来する二機能性選択可能融合遺伝子である。
有用な標的ポリヌクレオチドを多数の異なる用途のためにｒＡＡＶベクターにおいて用いることができる。そのようなポリヌクレオチドには：（ｉ）構造タンパク質もしくは酵素の損失、欠陥もしくは次善レベルにより引き起こされる欠損症を軽減するために遺伝子治療の他の形態において有用なタンパク質をコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）アンチセンス分子に転写されるポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）転写もしくは翻訳因子に結合するおとりに転写されるポリヌクレオチド；（ｉｖ）サイトカインのような細胞モジュレーターをコードするポリヌクレオチド；（ｖ）レシピエント細胞をヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のような特定の薬剤に感受性にすることができるポリヌクレオチド；および（ｖｉ）いくつかの肺癌および乳癌と関連する失われたもしくは損傷を受けたｐ５３遺伝子の置換のための野生型ｐ５３腫瘍抑制因子ｃＤＮＡ、または乳癌および卵巣癌を包含する様々な異なる癌の腫瘍形成および／もしくは転移を抑制することができるＥ１Ａ腫瘍抑制遺伝子のような、癌治療のためのポリヌクレオチドが包含されるがこれらに限定されるものではない。
得られる組み換えＡＡＶ粒子の治療もしくは予防特異性は、導入される特定のベクターもしくはプロベクターにより決定されるので、同じ基本パッケージング細胞系をこれらの用途のいずれかのために改変することができる。例えば、特定の標的ポリヌクレオチドを含んでなるベクターは、例えば、ｒＡＡＶプロベクターを含んでなるプラスミドの電気穿孔もしくはトランスフェクション、またはｒＡＡＶベクターもしくはプロベクターを含んでなるｒＡＡＶもしくはヘルパーウイルスでの感染を包含する；いくつかの可能な方法のいずれかによりＡＡＶベクターの製造用のパッケージング細胞に導入することができる。
ヘルパーウイルスは、ｒＡＡＶベクターの導入の前に、間にもしくは後に導入することができる。例えば、プラスミドをヘルパーウイルスと一緒に培養物に共感染させることができ；そして次に当該技術分野において既知であるような複製およびパッケージングに適当な条件において細胞を十分な期間、典型的には２〜５日間培養することができる（上記の参考文献および以下の実施例を参照）。溶解物を調製し、そして組み換えＡＡＶベクター粒子を当該技術分野において既知である技術により精製する。
以下の実施例においてもまた説明する、好ましい態様として、組み換えＡＡＶベクターは、パッケージングに使用する哺乳類細胞にそれ自体が安定に組込まれる。次に、そのようなｒＡＡＶ「生産細胞」を培養し、そして使用する状態になるまで保存することができる。そのような生産細胞からｒＡＡＶ粒子の生産を誘導するために、使用者はヘルパーウイルスを細胞に感染させそしてＡＡＶの複製およびパッケージングに適当な条件下で細胞を培養しさえすればよい（下記のように）。
あるいはまた、１つもしくはそれ以上のＡＡＶスプリット−パッケージング遺伝子またはｒＡＡＶベクターを組み換えヘルパーウイルスの一部として導入することができる。例えば、アデノウイルスのＥ１、Ｅ３および／もしくはＥ４遺伝子を１つもしくはそれ以上のスプリット−パッケージング遺伝子またはｒＡＡＶベクターで置換することができる。アデノウイルスベクターへの、例えばＥ１および／もしくはＥ３領域へのクローニングを容易にする技術は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｂｅｔｔ，Ａ．Ｊ．ｅｔ
ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，８８０２−８８０６（１９９４）を参照）。従って、組み換えアデノウイルスのようなヘルパーウイルスは、（当該技術分野において既知であるように）そのようなヘルパーウイルスにおける多数の遺伝子（例えばアデノウイルスのＥ３遺伝子）をヘルパーウイルス活性をなくすことなしに置換することができるので、ヘルパーウイルス機能ならびにＡＡＶパッケージング遺伝子および／もしくはｒＡＡＶプロベクターを提供するために用いることができる。追加の遺伝子は、トランスに任意の必要なヘルパーウイルス機能を提供することによりそのようなヘルパーウイルスに挿入することができる。例えば、ヒト２９３細胞は、アデノウイルスＥ１突然変異体を補足することができるアデノウイルス遺伝子を含有する。従って、異種遺伝子はまた、トランスにそのようなアデノウイルス機能を効果的に提供することができる細胞において使用する、Ｅ１遺伝子が取り除かれているアデノウイルスにクローン化することもできる。あるいはまた、ヘルパーウイルスの使用は、パッケージング細胞において全ての必要なヘルパーウイルス機能を提供することによりなくすことができる。
ＩＶ．細胞への遺伝物質の導入
当該技術分野において記述され、そして本明細書および上記に引用する参考文献の両方において説明されているように、遺伝物質は細胞（ＡＡＶの製造用の哺乳類「生産」細胞のような）に、そのような細胞を形質転換するかもしくは形質導入するための様々な手段のいずれかを用いて導入することができる。実例として、そのような技術には、例えば、細菌プラスミドでのトランスフェクション、ウイルスベクターでの感染、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、および様々な脂質に基づく組成物のいずれかを用いる導入（「リポフェクション」と呼ばれることが多い方法）が包含される。これらの技術を実施するための方法および組成物は、当該技術分野において記述されており、そして広く利用可能である。
適当に改変された細胞の選択は、当該技術分野における任意の技術により行うことができる。例えば、細胞を改変するために使用するポリヌクレオチド配列は、当該技術分野において既知であるような１つもしくはそれ以上の検出可能なもしくは選択可能なマーカーと同時にもしくはそれに作動可能に連結して導入することができる。実例として、選択可能なマーカーとして薬剤耐性遺伝子を用いることができる。次に、薬剤耐性細胞を選別して培養し、そして次に所望の配列、すなわち、パッケージング遺伝子産物、もしくは必要に応じて、異種ポリヌクレオチドの産物の発現に関して試験することができる。導入ポリヌクレオチドの獲得、局在化および／もしくは維持の試験は、ＤＮＡハイブリダイゼーションに基づく技術（サザンブロッティングおよび当該技術分野において既知であるような他の方法）を用いて行うことができる。発現の試験は、遺伝子改変細胞から抽出されるＲＮＡのノーザン分析により、もしくは対応する遺伝子産物の間接的免疫蛍光により容易に行うことができる。パッケージング能力および効率の試験および確認は、ＡＡＶ粒子の生産を試験するために、ＡＡＶの残りの機能成分およびヘルパーウイルスを細胞に導入することにより得られることができる。細胞が複数のポリヌクレオチド構築物で遺伝的に改変される場合、それらを別個に細胞に導入し、そして各段階を順次確認することが一般により好都合である（必須ではないが）。そのような技術を記述する参考文献には、本明細書に引用するものが包含される。
Ｖ．ヘルパーウイルスの選択および製造
上記に説明するように、ＡＡＶは自己複製に欠陥のあるパルボウイルスであり、そしてある種の複製機能を供給するためにヘルパーウイルスに一般に依存しなければならない。
アデノウイルス、ヘルペスウイルス（ＨＳＶ１、サイトメガロウイスルおよびＨＨＶ−６が包含されるがこれらに限定されるものではない）およびポックスウイルス（特にワクシニア）を包含する、多数のそのようなヘルパーウイルスが同定されている。任意のそのようなウイルスを本発明で用いることができる。
高い頻度で、ヘルパーウイルスは、意図される宿主細胞に感染することができるタイプおよび亜群のアデノウイルスである。亜群Ｃのヒトアデノウイルス、特に血清型１、２、４、６および７型が一般に用いられる。血清型５型が一般に好ましい。
アデノウイルスの特徴および増殖パターンは、当該技術分野において既知である。読者は、例えばＨｏｒｏｗｉｔｚ（１９８５）を参照することができる。パッケージングされるアデノウイルスゲノムは、環を形成するように末端タンパク質複合体を介して左側および右側末端のアデノウイルスＩＴＲによって連結された、線状ＤＮＡ分子である。初期、中期および後期成分の制御およびコード領域は、ゲノム内で重複する。初期領域遺伝子はアデノウイルスゲノムの複製に関与し、そしてそれらの位置によりＥ１、Ｅ２、Ｅ３およびＥ４領域に分類される。
必須ではないが、原則として、ヘルパーウイルス株は遺伝子治療を最終的に受ける被験体において複製に欠陥のあることが望ましい。従って、ｒＡＡＶ製造において存在する任意の残りのヘルパーウイルスは、複製能力を欠く。Ｅ１ＡもしくはＥ１ＡとＥ３領域の両方が取り除かれているアデノウイルスは、大部分のヒト細胞に感染性ではない。それらは、欠けている活性を補足することができる許容細胞系（例えばヒト２９３細胞系）において複製されることができる。ヘルパー機能と関連すると思われるアデノウイルスの領域ならびにそうではない領域は、当該技術分野において同定されそして記述されている（例えば、Ｐ．Ｃｏｌｏｓｉ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９７／１７４５８およびその中に引用される参考文献を参照）。
ＶＩ．遺伝子治療のためのｒＡＡＶの使用
ＡＡＶベクターは、遺伝子治療もしくはワクチン接種の目的のための個体への投与に用いることができる。ｒＡＡＶ治療に適当な疾患には、ウイルス、細菌もしくは寄生虫感染により誘発されるもの、様々な悪性腫瘍ならびに過剰増殖性疾患、自己免疫疾患および先天的欠損症が包含されるがこれらに限定されるものではない。
遺伝子治療は、細胞内のもしくは細胞により分泌されるいずれかの特定のタンパク質の発現のレベルを高めるために行うことができる。本発明のベクターは、遺伝子標識、欠けているかもしくは欠損する遺伝子の置換、または治療遺伝子の挿入のためのいずれかに細胞を遺伝子改変するために用いることができる。あるいはまた、発現のレベルを減少するポリヌクレオチドを細胞に提供することができる。これは、悪性腫瘍の過程において増幅されるかもしくは過剰発現される遺伝子、または微生物感染の過程において導入されるかもしくは過剰発現される遺伝子の産物のような、望ましくない表現型の抑制に用いることができる。発現レベルは、例えば、標的遺伝子もしくはＲＮＡ転写産物のいずれかと安定なハイブリッドを形成することができる（アンチセンス治療）、関連するｍＲＮＡを切断するためにリボザイムとして働くことができるもしくは標的遺伝子の産物のおとりとして働くことができる配列を含んでなる治療もしくは予防ポリヌクレオチドを供給することにより減少することができる。
本発明の方法によるｒＡＡＶベクターの導入は、当該技術分野において利用可能でありそして周知である送達技術（外科的および非外科的の両方）の任意の数の使用を伴うことができる。そのような送達技術には、例えば、血管内カテーテル挿入、カニューレ挿入、注入、吸入、気管内、皮下、塗擦、局所、経口、経皮、動脈内、静脈内および／もしくは腹腔内投与が包含される。ベクターはまた、実例として、血管移植片（ＰＴＦＥおよびダ
クロン）、心臓弁、血管内ステント、血管内ペービング（ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒ ｐａｖｉｎｇ）ならびに他の非血管プロテーゼを包含するバイオプロテーゼによって導入することもできる。ベクター溶液の送達、頻度、組成物および投与量範囲に関する一般的技術は、当該技術分野の技量の範囲内である。
特に、組織への本発明のベクターの送達には、宿主動物にベクターを導入する任意の物理的もしくは生物学的方法を用いることができる。ベクターは、ＡＡＶ投与に周知であるように、むき出しの組み換えベクターおよびウイルスコートタンパク質にパッケージングされるベクターＤＮＡの両方を意味する。ＡＡＶベクターをリン酸緩衝食塩水に単に溶解することは、筋肉組織発現に有用な媒体を提供するために十分であることが示されており、そしてベクターと共投与することができる担体もしくは他の成分への既知の制約はない（ＤＮＡを分解する組成物は、ベクターでの通常の方法において回避されるべきであるが）。製薬学的組成物は、注入可能な製剤としてもしくは経皮輸送により筋肉に送達される局所用製剤として製造することができる。筋肉内注射および経皮輸送の両方のための多数の製剤がこれまでに開発されており、そして本発明の実施において用いることができる。ベクターは、投与および取り扱いを簡単にするために任意の製薬学的に許容しうる担体と用いることができる。
筋肉内注射の目的のために、ゴマ油もしくはピーナッツ油のような添加剤におけるまたは水性プロピレングリコールにおける溶液、ならびに滅菌した水性溶液を用いることができる。そのような水性溶液は、所望に応じて緩衝化し、そして液状希釈剤を最初に食塩水もしくはグルコースで等張にすることができる。遊離の酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含有する）もしくは薬理学的に許容しうる塩としてのＡＡＶベクターの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適当に混合した水において製造することができる。ＡＡＶウイルス粒子の分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物においてそして油において製造することができる。保存および使用の通常の条件下で、これらの製剤は微生物の増殖を防ぐために防腐剤を含有する。これに関連して、用いる滅菌した水性媒質は、当業者に周知である標準的な技術により全て容易に得ることができる。
注入可能な用途に適当な製薬学的形態には、滅菌した水性の溶液もしくは分散液および滅菌した注入可能な溶液もしくは分散液の即時調製用の滅菌した粉末が包含される。全ての場合において、該形態は無菌でなければならず、そして容易な注射針通過（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の混入作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、その適当な混合物、および植物油を含有する溶媒もしくは分散媒質であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持により、そして界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらすことができる。多くの場合において、等張剤、例えば、糖もしくは塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注入可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅らせる因子、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によりもたらすことができる。
滅菌した注入可能な溶液は、必要に応じて上記に列挙する様々な他の成分とともに適切な溶媒に必要な量のＡＡＶベクターを導入し、続いて濾過滅菌することにより製造される。一般に、分散液は、基本分散媒質および上記に列挙するものからの必要な他の成分を含有する滅菌した賦形剤に滅菌した有効成分を導入することにより製造される。滅菌した注
入可能な溶液の調製用の滅菌した粉末の場合、好ましい製造方法は、その前もって滅菌濾過した溶液から有効成分と任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす真空乾燥および凍結乾燥技術である。
局所投与の目的のために、その他の点では上記の非経口溶液と同様の、希薄な滅菌した水性溶液（通常は約０．１％〜５％の濃度の）は、経皮パッチへの導入に適当な容器において製造され、そして製薬等級ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような既知の担体を含むことができる。
特に興味深いのは、気道上皮に適切に機能する嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）を供給することによる、嚢胞性線維症の遺伝子欠損の修正である。従って、天然のＣＦＴＲタンパク質、ならびにその突然変異体およびフラグメントをコードするｒＡＡＶベクターは全て、本発明の好ましい態様である。
本発明の組成物は、インビボでならびにエクスビボで用いることができる。インビボ遺伝子治療は、被験体に直接本発明のベクターを投与することを含んでなる。製薬学的組成物は、液状溶液もしくは懸濁液として、エマルジョンとして、または使用前の液体における溶解もしくは懸濁に適当な固体形態として供給することができる。気道への投与のために、投与の好ましい形態は、適切なエアロソルビライザー（ａｅｒｏｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｒ）装置で使用する場合に固体もしくは液状エアロゾルのいずれかを与える組成物を用いて、エアロゾルによってである。気道への投与の別の好ましい形態は、ベクターを注入するためにフレキシブル光ファイバー気管支鏡を用いることである。典型的に、ウイルスベクターは、リンガー平衡塩溶液（ｐＨ７．４）のような製薬学的に適当なパイロジェンフリーのバッファー中である。必要とされないが、製薬学的組成物は場合により正確な量の投与に適当な単位投与形態物で供給されてもよい。
ウイルスの有効量は、処置の目的により投与される。有効量は、単回もしくは分割用量で与えることができる。低いパーセンテージの形質導入が遺伝子欠損を治療することができる場合、処置の目的は、一般に、形質導入のこのレベルを満たすかもしくは超えることである。ある場合には、形質導入のこのレベルは、標的細胞の約１〜５％のみの形質導入により成し遂げることができるが、より典型的には、所望の組織タイプの細胞の２０％、通常は少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９５％、そしてなおさらに好ましくは所望の組織タイプの細胞の少なくとも約９９％である。指針として、気管支鏡検査法により与えられる単回用量に存在するベクター粒子の数は、ＤＮアーゼ耐性およびＤＮアーゼ感受性粒子の両方を包含して、一般に少なくとも約１ｘ１０８であり、そしてより典型的には５ｘ１０８、１ｘ１０１０、そしてある場合には１ｘ１０１１粒子である。ＤＮアーゼ耐性粒子に関して、該用量は一般に１ｘ１０６〜１ｘ１０１４粒子の間、より一般的には約１ｘ１０８〜１ｘ１０１２粒子の間である。１８０日に1回の処置が十分であり得るが、処置は、必要に応じて、２もしくは３週ごとにも繰り返すことができる。
宿主細胞における所望のＤＮＡ配列の存在を確かめるために、様々なアッセイを行うことができる。そのようなアッセイには、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲのような、当業者に周知である「分子生物学」アッセイ；例えば、免疫学的手段（免疫沈降、免疫アフィニティーカラム、ＥＬＩＳＡおよびウェスタンブロット）による、ベクターに存在する遺伝子から発現されるポリペプチドの存在を検出することのような「生化学」アッセイ、または本発明の範囲内に入る特定の核酸分子の存在および／もしくは発現を同定するために有用な任意の他のアッセイによるが包含される。
導入されたＤＮＡセグメントから生産されるＲＮＡを検出しそして定量するために、ＲＴ−ＰＣＲを用いることができる。ＰＣＲのこの適用では、逆転写酵素のような酵素を用いて、ＲＮＡをＤＮＡに逆転写することが最初に必要であり、そして次に通常のＰＣＲ技術の使用によってＤＮＡを増幅する。大部分の場合においてＰＣＲ技術は、有用であるが、ＲＮＡ産物の完全性を示さない。ＲＮＡ産物の性質に関するさらなる情報は、ノーザンブロッティングにより得ることができる。この技術はＲＮＡ種の存在を示し、そしてそのＲＮＡの完全性に関する情報を与える。ＲＮＡ種の有無はまた、ドットもしくはスロットブロットノーザンハイブリダイゼーションを用いて決定することもできる。これらの技術はノーザンブロッティングの改変であり、そしてＲＮＡ種の有無を示すだけである。
サザンブロッティングおよびＰＣＲは、問題になっているＤＮＡセグメントを検出するために用いることができるが、それらは該ＤＮＡセグメントが発現されているかどうかに関する情報を提供しない。発現は、導入されたＤＮＡ配列のポリペプチド産物を特異的に同定することもしくは宿主細胞における導入されたＤＮＡセグメントの発現によりもたらされる表現型変化を評価することにより評価することができる。
従って、遺伝子改変の効果は、生理液サンプル、例えば、尿、血漿、血清、血液、脳脊髄液または鼻もしくは肺洗浄液の分析を包含するいくつかの基準によりモニターすることができる。生検もしくは外科的切除により取り除かれたサンプルは、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ベクター特異的プローブを用いるＰＣＲ増幅、ＲＮアーゼ保護、免疫組織学もしくは免疫蛍光細胞計数により分析することができる。ベクターが気管支鏡検査法により投与される場合、肺機能試験を行うことができ、そして気管支洗浄を炎症性サイトカインの存在に関して評価することができる。処置された被験体はまた、臨床的特徴に関して、そして細胞が治療もしくは予防ポリヌクレオチドにより運ばれることが意図される機能を発現するかどうかを決定するためにモニターすることもできる。
インビボもしくはエクスビボ治療で使用するかどうかの決定ならびに特定の組成物、用量および投与の経路の選択は、処置する症状および被験体の特徴が包含されるがこれらに限定されるものではない多数の異なる因子により決まる。そのような特徴の評価および適切な治療もしくは予防処方計画の設計は、最終的に、処方する医師の責任である。
先の記述は、とりわけ、ヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス）および細胞タンパク質を実質的に含まない組み換えＡＡＶベクターの高力価調製物を製造する方法を提供する。本発明の精神からそれることなしに当業者によってこれらの方法にバリエーションが適用され得ることが理解される。
ＶＩＩ．有用な因子を同定する典型的な方法
遺伝子治療ベクターとしてのｒＡＡＶの有用性は、その形質導入特性に基づく。本明細書に記述するものを包含する、ＡＡＶ導入を検出する方法は当該技術分野において既知であり、そして細胞表面受容体への結合もしくは二本鎖ゲノムへの一本鎖ｒＡＡＶベクターの核内ゲノム転化の速度に影響を与えることによる以外の手段によりＡＡＶ導入を改善する能力に関して因子のライブラリー、タイプおよびクラスをスクリーニングするために有用である。
形質導入は、ベクターに含まれる異種導入遺伝子のタンパク質発現もしくはその定常状態レベルにより特定されることができる。従って、形質導入は、ウイルスベクター、例えばｒＡＡＶでの成功した遺伝子送達の測定可能な機能的終点である。様々な導入遺伝子がＡＡＶベクターを感染させた細胞から発現されており、そして緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）のような細胞内で発現されるタンパク質、嚢胞性線維症膜貫通タンパク質（ＣＦＴＲ）のような細胞膜結合タンパク質、ならびにＥｐｏ、ＦＶＩＩＩおよびＦＩＸのような分泌タンパク質が包含される。しかしながら、全ての導入遺伝子が、既定のベクターおよび
組織標的での形質導入の程度を完全に評価することができるわけではない。例えば、分泌タンパク質は、既定の導入遺伝子を発現する細胞タイプの数の表示を与えない。さらに、遺伝子発現の機能性マーカーは、既定の標的細胞タイプ内で適切に機能する既定の導入遺伝子タンパク質産物の能力に依存する。
ＶＩＩＩ．本発明の実施において有用な因子
ｒＡＡＶは、ｒＡＡＶエンドサイトーシス、適切な細胞内コンパートメント（プロテオソーム、エンドソームおよびトランス−ゴルジが包含されるがこれらに限定されるものではない）を通したｒＡＡＶの輸送およびプロセシング、核への輸送、ならびにウイルスアンコーティングが包含されるがこれらに限定されるものではない形質導入効率の律速であり得る結合とｄｓＤＮＡへの転化の間の多数の複雑な細胞内事象を受けなければならない。さらに、これらの細胞内プロセシング事象の効率を改変する因子はまた、核におけるウイルスＤＮＡの量、従って、定常状態によって、遺伝子転化産物の存在量を増加するという最終結果を有することもできる。従って、ｒＡＡＶ細胞内プロセシングの増大後のゲノム転化産物の増加は、必ずしも遺伝子転化の増加した速度を示さない。ｒＡＡＶでの形質導入を高める方法は、核における二本鎖ゲノム転化産物の程度を増加すると予想される。これは、本質的に核における遺伝子転化酵素のレベルを変えるＤＮＡ損傷剤、トポイソメラーゼインヒビターもしくはアデノウイルス初期遺伝子産物を用いてゲノム転化を直接増大することを目的とする以前の方法（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｆｅｒｒａｒｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｈａｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｒｕｓｓｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５）との重要な違いである。しかしながら、核における遺伝子転化が律速ではない場合、形質導入を限定する細胞内ウイルスプロセシング事象が優位を占め得る。
従って、本発明の実施において有用な因子には、ｒＡＡＶ導入効率、例えば、ｒＡＡＶエンドサイトーシス、細胞内コンパートメントを通したｒＡＡＶの輸送およびプロセシング、ウイルス核酸もしくはタンパク質分解、ウイルスアンコーティング、ならびにウイルスもしくはウイルスゲノムの核輸送を改変するかまたはそうでなければプロテオソームを調節する因子が包含される。好ましい因子は、ｒＡＡＶ導入を高めるかもしくは増加するものである。本発明において有用な因子のクラスには、抗生物質、化学療法薬、例えばアントラサイクリン、プロテオソームモジュレーター、脂質低下薬および食品添加剤が包含されるがこれらに限定されるものではない。典型的な因子には、プロテアソーム（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｓｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）、ならびにプロテオソームおよびユビキチン経路を調節する、例えば、プロテオソームに結合しそして／もしくはプロテオソーム、ユビキチン、ユビキチンキャリアタンパク質もしくはユビキチンリガーゼの活性を調節するが、プロテオソームの活性、例えばプロテアソームのまたはユビキチン、ユビキチンキャリアタンパク質もしくはユビキチンリガーゼのタンパク質分解活性を実質的に改変しない因子が包含される。これらの因子の例には、抗生物質、例えばエポキソミシン、脂質低下薬、例えばシムバスタチン、食品添加剤、例えばタンニン酸、および化学療法薬、例えばシスプラチン、ドキソルビシンのようなアントラサイクリン、およびカンプトテシンが包含されるがこれらに限定されるものではない。
ＩＸ．本発明の因子の投薬量、製剤および投与の経路
本発明に従って同定される因子の投与は、例えば、レシピエントの生理的状態、投与の目的が治療であるか予防であるか、および熟練した医師に既知である他の因子により、連続的もしくは断続的であることができる。本発明の因子の投与は、事前に選択した期間にわたって本質的に連続的であることができ、もしくは一連の間隔をあけた投与においてであることができる。局所および全身投与の両方が意図される。本発明の因子が予防目的に用いられる場合、本発明の因子は、好ましくは全身投与による、慢性使用に適している。
以下に説明するように、場合により持続放出用に調合することができる、本発明の因子を含んでなる１つもしくはそれ以上の適当な単位投与形態物は、経口もしくは非経口（直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸郭内、肺内および鼻腔内経路によってを包含する）を包含する様々な経路により投与することができる。例えば、肝臓への投与には、静脈内投与が好ましい。肺への投与には、気道投与が好ましい。製剤は、必要に応じて、別個の単位投与形態物において都合よく与えることができ、そして製薬学に周知である方法のいずれかにより製造することができる。そのような方法には、液体担体、固体マトリックス、半固体担体、細かく分割された固体担体もしくはその組み合わせと因子を会合させ、そして次に、必要に応じて、所望の送達系に生成物を導入するかもしくは成形する段階を含むことができる。
本発明の因子が経口投与用に製造される場合、それらは好ましくは、製薬学的製剤もしくは単位投与形態物を形成するために製薬学的に許容しうる担体、希釈剤もしくは賦形剤と組み合わされる。そのような製剤における総有効成分は、製剤の０．１〜９９．９重量％を含んでなる。「製薬学的に許容しうる」により、担体、希釈剤、賦形剤および／もしくは塩は、製剤の他の成分と適合性でなければならず、そしてそのレシピエントにとって有害でないことを意味する。経口投与用の有効成分は、粉末としてもしくは顆粒として；溶液、懸濁液もしくはエマルジョンとして；またはチューインガムからの有効成分の摂取のための合成樹脂のような達成可能なベースにおいて存在することができる。有効成分はまた、ボーラス、舐剤もしくはパスタ剤として与えることもできる。
本発明の因子を含有する製薬学的製剤は、周知のそして容易に利用可能な成分を用いて当該技術分野において既知である方法により製造することができる。例えば、因子を一般的な賦形剤、希釈剤もしくは担体と調合し、そして錠剤、カプセル剤、懸濁剤、散剤などに形成することができる。そのような製剤に適当である賦形剤、希釈剤および担体の例には下記のもの：澱粉、糖、マンニトールおよびケイ酸誘導体のような充填剤および増量剤；カルボキシメチルセルロース、ＨＰＭＣおよび他のセルロース誘導体、アルギネート、ゼラチンおよびポリビニル−ピロリドンのような結合剤；グリセロールのような保湿剤；炭酸カルシウムおよび重炭酸ナトリウムのような崩壊剤；パラフィンのような溶解を遅らせるための因子；第四級アンモニウム化合物のような再吸収促進因子；セチルアルコール、モノステアリン酸グリセロールのような界面活性剤；カオリンおよびベントナイトのような吸着性担体；ならびにタルク、ステアリン酸カルシウムおよびマグネシウムならびに固体ポリエチルグリコールのような潤滑剤が包含される。
例えば、本発明の因子を含有する錠剤もしくはカプセル剤は、炭酸カルシウム、酸化マグネシウムおよび炭酸マグネシウムのような緩衝剤を含むことができる。カプレットおよび錠剤はまた、セルロース、アルファ化澱粉、二酸化ケイ素、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、微晶質セルロース、澱粉、タルク、二酸化チタン、安息香酸、クエン酸、コーンスターチ、鉱油、ポリプロピレングリコール、リン酸ナトリウムおよびステアリン酸亜鉛などのような不活性成分を含むこともできる。本発明の因子を含有する硬もしくは軟ゼラチンカプセル剤は、ゼラチン、微晶質セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、澱粉、タルクおよび二酸化チタンなどのような不活性成分、ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および植物油のような液状賦形剤を含有することができる。さらに、本発明の因子の腸溶コーティングしたカプレットもしくは錠剤は、胃における分解に抵抗しそして十二指腸のより中性〜アルカリ性環境において溶解するように設計される。
本発明の因子はまた、都合のよい経口投与用のエリキシル剤もしくは溶液としてまたは例えば筋肉内、皮下もしくは静脈内経路による、非経口投与に適切な溶液として調合することもできる。
本発明の因子の製薬学的製剤はまた、水性もしくは無水の溶液もしくは分散液の形態、あるいはまたエマルジョンもしくは懸濁液の形態をとることもできる。
従って、治療薬は非経口投与（例えば注射、例えばボーラス注射もしくは連続注入による）用に調合することができ、そしてアンプル、事前に充填した注射器、小容量注入容器における単位投与形態でもしくは防腐剤を添加した複数回投与容器において与えることができる。有効成分は、油性もしくは水性賦形剤における懸濁液、溶液もしくはエマルジョンのような形態をとることができ、そして沈殿防止剤、安定剤および／もしくは分散剤のような調合剤（ｆｏｒｍｕｌａｔｏｒｙ ａｇｅｎｔｓ）を含有することができる。あるいはまた、有効成分は、使用前の適当な賦形剤、例えば滅菌したパイロジェンフリーの水での再構成用の、滅菌した固体の無菌単離によるかもしくは溶液からの凍結乾燥により得られる、粉末形態であることができる。
これらの製剤は、先行技術において周知である製薬学的に許容しうる賦形剤および添加剤を含有することができる。例えば、水に加えて、アセトン、エタノール、イソプロピルアルコール、「Ｄｏｗａｎｏｌ」の名称で販売される製品のようなグリコールエーテル、ポリグリコールおよびポリエチレングリコール、短鎖酸のＣ１〜Ｃ４アルキルエステル、好ましくは乳酸エチルもしくはイソプロピル、「Ｍｉｇｌｙｏｌ」の名称で販売される製品のような脂肪酸トリグリセリド、ミリスチン酸イソプロピル、動物油、鉱油および植物脂ならびにポリシロキサンのような溶媒から選択される、生理学的観点から許容しうる１つもしくはそれ以上の有機溶媒を用いて溶液を製造することが可能である。
本発明の組成物はまた、セルロースおよび／もしくはセルロース誘導体のような増粘剤を含有することもできる。それらはまた、キサンタン、グアルもしくはカルボ（ｃａｒｂｏ）ゴムまたはアラビアゴムのようなゴム、あるいはまたポリエチレングリコール、ベントンおよびモントモリロナイトなどを含有することもできる。
必要に応じて、酸化防止剤、界面活性剤、他の防腐剤、フィルム形成剤、角質溶解剤もしくは面ぽう溶解剤、香料および着色剤から選択される添加剤を加えることが可能である。また、記述する症状もしくはいくつかの他の症状用であれ、他の有効成分を加えることもできる。
例えば、酸化防止剤の中で、ｔ−ブチルヒドロキノン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンおよびα−トコフェロールならびにその誘導体を挙げることができる。局所使用のために主に調整される生薬形態は、クリーム、ミルク、ゲル、分散液もしくはミクロエマルジョン、多かれ少なかれ濃化されたローション、含浸パッド、軟膏もしくはスティック（ｓｔｉｃｋｓ）の形態、あるいはまたスプレーもしくはフォーム形態のエアロゾル製剤の形態、あるいはまた石鹸のケークの形態をとる。
さらに、因子は持続放出投与形態物などのような製剤によく適している。製剤は、それらが場合によりある期間にわたって、唯一もしくは好ましくは腸もしくは気道の特定の部分において有効成分を放出するように構成することもできる。例えば、ポリラクチド−グリコラート、リポソーム、ミクロエマルジョン、微粒子、ナノ粒子もしくはろうのようなポリマー物質から、コーティング、エンベロープおよび保護マトリックスを製造することができる。これらのコーティング、エンベロープおよび保護マトリックスは、留置器具、例えばステント、カテーテル、腹膜透析管類などをコーティングするために有用である。
本発明の因子は、経皮投与用のパッチによって送達することができる。因子の経皮投与に適当なパッチの例は、米国特許第５，５６０，９２２号を参照。経皮送達用のパッチは
、裏当て層および１つもしくはそれ以上の皮膚透過促進剤と一緒に因子をその中に分散しているかもしくは溶解しているポリマーマトリックスを含んでなることができる。裏当て層は、因子に不浸透性である任意の適当な材料で製造されることができる。裏当て層は、マトリックス層の保護カバーとして働き、そしてまた支持機能も与える。裏当ては、それがポリマーマトリックスと本質的に同じサイズの層であるように形成することができ、あるいはそれがポリマーマトリックスの側面を超えて広がるかまたはポリマーマトリックスの側面もしくは複数の側面を覆うことができそして次に裏当て層の拡張表面が接着手段のベースであることができる形で外側に広がることができるようにそれはより大きい大きさのものであることができる。あるいはまた、ポリマーマトリックスは、ポリアクリレートもしくはアクリレート／酢酸ビニルコポリマーのような接着性ポリマーを含有するかもしくはそれで調合されることができる。長期使用には、微小孔性および／もしくは通気性の裏当てラミネートを使用することが望ましい可能性があり、そのようにして皮膚の水和もしくは浸軟を最小限に抑えることができる。
裏当て層を製造するのに適当な材料の例は、高および低密度ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、ポリビニルクロリド、ポリ（エチレンフタレート）のようなポリエステル、金属箔のフィルム、そのような適当なポリマーフィルムの金属箔ラミネートなどである。好ましくは、裏当て層に使用する材料は、アルミホイルのような金属箔でのそのようなポリマーフィルムのラミネートである。そのようなラミネートにおいて、ラミネートのポリマーフィルムは、通常、接着性ポリマーマトリックスと接触している。
裏当て層は、所望の保護および支持機能を与える任意の適切な厚さであることができる。適当な厚さは、約１０〜約２００ミクロンである。
一般に、生物学的に許容しうる接着性ポリマー層を形成するために用いるポリマーは、因子が制御された速度で通過することができる成形ボディ、薄壁もしくはコーティングを形成することができるものである。適当なポリマーは、生物学的にそして製薬学的に適合し、非アレルギー性であり、そして該手段を接触させる体液もしくは組織に不溶性であり且つそれらと適合する。皮膚水分によるマトリックスの溶解もしくは侵食は、因子の放出速度ならびに除去の便宜上所定の位置にとどまる投与量単位の能力に影響を与えるので、可溶性ポリマーの使用は避けるべきである。
接着性ポリマー層を製造するための典型的な材料には、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、エチレン／プロピレンコポリマー、エチレン／エチルアクリレートコポリマー、エチレン／酢酸ビニルコポリマー、シリコーンエラストマー、特に医療等級ポリジメチルシロキサン、ネオプレンゴム、ポリイソブチレン、ポリアクリレート、塩素化ポリエチレン、ポリビニルクロリド、ビニルクロリド−ビニルアセテートコポリマー、架橋ポリメタクリレートポリマー（ヒドロゲル）、ポリビニリデンクロリド、ポリ（エチレンテレフタレート）、ブチルゴム、エピクロロヒドリンゴム、エチレンビニルアルコールコポリマー、エチレン−ビニルオキシエタノールコポリマー；シリコーンコポリマー、例えば、ポリシロキサン−ポリカーボネートコポリマー、ポリシロキサン−ポリエチレンオキシドコポリマー、ポリシロキサン−ポリメタクリレートコポリマー、ポリシロキサン−アルキレンコポリマー（例えばポリシロキサン−エチレンコポリマー）、ポリシロキサン−アルキレンシランコポリマー（例えばポリシロキサン−エチレンシランコポリマー）など；セルロースポリマー、例えばメチルもしくはエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびセルロースエステル；ポリカーボネート；ポリテトラフルオロエチレンなどが包含される。
好ましくは、生物学的に許容しうる接着性ポリマーマトリックスは、室温より低いガラス転移温度を有するポリマーから選択されるべきである。該ポリマーは、室温である程度
の結晶化度を有することができるが、必ずしもその必要はない。架橋モノマー単位もしくは部位をそのようなポリマーに導入することができる。例えば、架橋モノマーをポリアクリレートポリマーに導入することができ、それはポリマーに因子を分散させた後にマトリックスを架橋するための部位を提供する。ポリアクリレートポリマー用の既知の架橋モノマーには、ブチレンジアクリレートおよびジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレートなどのようなポリオールのポリメタクリル酸エステルが包含される。そのような部位を提供する他のモノマーには、アリルアクリレート、アリルメタクリレート、ジアリルマレエートなどが包含される。
好ましくは、可塑剤および／もしくは保湿剤を接着性ポリマーマトリックス内に分散させる。水溶性ポリオールは、一般にこの目的に適している。製剤における保湿剤の導入は、投与単位が皮膚の表面上の水分を吸収することを可能にし、それは次には皮膚の刺激を減らすことおよび送達系の接着性ポリマー層が機能しなくなることを防ぐのに役立つ。
経皮送達系から放出される因子は、皮膚の各層に浸透することができなければならない。因子の浸透の速度を増すために、経皮薬剤送達系は、特に、分子の浸透に最も大きい抵抗性を与える皮膚の最外層、角質層の浸透性を増加することができなければならない。因子の経皮送達用のパッチの製造は、当該技術分野において周知である。
吸入による上（鼻）もしくは下気道への投与のために、本発明の因子は、吸入器、噴霧器もしくは加圧パックまたはエアロゾルスプレーを送達する他の都合のより手段から都合よく送達される。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素もしくは他の適当なガスのような適当な推進剤を含んでなることができる。加圧エアロゾルの場合、定量を送達するために弁を与えることにより投与量単位を決定することができる。
あるいはまた、吸入もしくは吹送による投与のために、組成物は乾燥粉末、例えば、因子とラクトースもしくは澱粉のような適当な粉末ベースとの粉末ミックスの形態をとることができる。粉末組成物は、例えば、カプセルもしくはカートリッジ、または吸入器、噴霧器もしくは定量吸入器を用いて粉末をそれから投与することができる例えばゼラチンもしくはブリスターパックにおいて単位投与形態物で与えることができる。
鼻腔内投与のために、因子は、プラスチックボトル噴霧器もしくは定量吸入器によるような、点鼻薬、液状スプレーによって投与することができる。噴霧器の典型は、Ｍｉｓｔｏｍｅｔｅｒ（Ｗｉｎｔｒｏｐ）およびＭｅｄｉｈａｌｅｒ（Ｒｉｋｅｒ）である。
本発明の因子の局所送達もまた、因子を疾患の部位でもしくはその近くに投与する様々な技術によってであることができる。部位特異的もしくは標的化局所送達技術の例は、利用可能な技術を限定するものではなく、それらを説明するものである。例には、注入もしくは留置カテーテルのような局所送達用カテーテル、例えば針注入カテーテル、シャントおよびステントまたは他の埋め込み可能な装置、部位特異的担体、直接注入もしくは直接使用が包含される。
局所投与のために、因子は、標的領域への直接使用に当該技術分野において既知であるように調合されることができる。この目的のための通常の形態には、創傷包帯、被覆包帯もしくは他のポリマー被覆、軟膏、クリーム、ローション、パスタ剤、ゼリー、スプレーおよびエアロゾルが包含される。軟膏およびクリームは、例えば、適当な増粘剤および／もしくはゲル化剤を添加して水性もしくは油性ベースで調合されることができる。ローションは、水性もしくは油性ベースで調合されることができ、そしてまた一般に１つもしくはそれ以上の乳化剤、安定剤、分散剤、沈殿防止剤、増粘剤もしくは着色剤も含有する。
有効成分はまた、例えば米国特許４，１４０，１２２号：第４，３８３，５２９号；もしくは第４，０５１，８４２号に開示されているように、イオン導入によって送達されることもできる。局所用製剤に存在する本発明の因子の重量パーセントは、様々な因子により決まるが、一般に製剤の総重量の０．０１％〜９５％、そして典型的には０．１〜２５重量％である。
点眼薬もしくは点鼻薬のような滴剤は、１つもしくはそれ以上の分散剤、可溶化剤もしくは沈殿防止剤もまた含んでなる水性もしくは非水性のベースで調合されることができる。液状スプレーは、加圧パックから都合よく送達される。滴剤は、簡単な目薬容器−ふたの閉まったボトルによって、もしくは特別に成形した閉合によって、液状の中身を滴下して送達するのに適したプラスチックボトルによって送達されることができる。
因子はさらに、口もしくは喉における局所投与用に調合されることができる。例えば、有効成分は、風味をつけたベース、通常はショ糖およびアカシアもしくはトラガカントをさらに含んでなるロゼンジ；ゼラチンおよびグリセリンもしくはショ糖およびアカシアのような不活性ベースに組成物を含んでなるトローチ；ならびに適当な液状担体に本発明の組成物を含んでなるうがい薬として調合されることができる。
本明細書に記述する製剤および組成物はまた、抗微生物剤もしくは防腐剤のような他の成分を含有することもできる。さらに、有効成分はまた他の因子、例えば気管支拡張薬と組み合わせて用いることもできる。
本発明の因子は、単独でもしくは製薬学的に許容しうる担体と組み合わせて哺乳類に投与することができる。上記のように、有効成分と担体との相対的割合は、化合物の溶解性および化学的性質、選択した投与経路ならびに標準的な製薬学的技法により決定される。
本発明の因子の投薬量は、投与の形態、選択した特定の化合物および処置中の特定の患者の生理的特徴によって異なる。一般に、少量の投与量を最初に使用し、そして必要に応じて、該状況下で最適な効果に到達するまで少しずつ増加する。
本発明は、下記の実施例によりさらに記述されるが、それらに限定されない。特に、下記の実施例は、ｒＡＡＶ導入を検出する様々な方法を例示するために提供され、それらの方法はＷＯ００／７５３６５に記述されている。
エンドソームプロセシングインヒビターは、極性気道細胞におけるｒＡＡＶ導入を増加することができる
材料および方法
ヒト気管支上皮の一次培養および利用する試薬
一次ヒト気道上皮細胞は、以前に記述されているように（Ｋｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、肺移植からの気管支サンプルの酵素消化によって集めた。単離された一次気道細胞をコラーゲン被覆Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＨＡ培養インサート（ｉｎｓｅｒｔｓ）（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｃｏｒｐ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）上に５ｘ１０５細胞／ｃｍ２の密度で接種した。一次培養物を空気−液体界面で２週より多くにわたって培養し、その時点までに粘膜繊毛上皮への分化が起こる。細胞の側底側のみに供給するために使用する培養培地は、４９％のＤＭＥＭ、４９％のハムＦ１２および２％のＵｌｔｒａｓｅｒ Ｇ（ＢｉｏＳｅｐｒａ，Ｃｅｄｅｘ，Ｆｒａｎｃｅ）を含有した。ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、カンプトテシン（Ｃａｍｐ）、エトポシド（Ｅｔｏｐ）、アフィジコリン（Ａｐｈｉ）、ヒドロキシウレア（ＨＵ）およびゲニステイン（Ｇｅｎｉ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入した。ト
リペプチジルアルデヒドプロテアソームインヒビターＮ−アセチル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−ノルロイシン（ＬＬｎＬ）およびベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシナル（Ｚ−ＬＬＬ）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から購入した。ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）インヒビターは、Ｂａｃｈｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．（Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ，ＰＡ）から入手した。抗ＡＡＶキャプシドモノクローナル抗体（抗Ｖｐ１、２および３）はＡｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ（Ｂｅｌｍｏｎｔ，ＭＡ）から購入し、そして抗ユビキチン抗体はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｃ．（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ）から購入した。
組み換えＡＡＶウイルスストックの製造
組み換えＡＡＶは、ＣａＰＯ４共トランスフェクションプロトコルにより製造し、そして３回の等密度塩化セシウム超遠心分離によって精製した。プロウイルスプラスミドｐＣｉｓＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉは、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）に記述されている。ＲＳＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリ−アデニル化シグナルの転写制御下でアルカリホスファターゼレポーター遺伝子をコードするプロウイルスプラスミドｐＣｉｓＲＳＶ．Ａｌｋｐｈｏｓは、ＡＶ．Ａｌｋｐｈｏｓを作製するために使用した（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ＡＶ．ＬａｃＺ製造に使用したプロウイルスプラスミドｐＣｉｓＲＳＶ．ＬａｃＺは、最初に３４７４ｂｐのＮｏｔＩ消化したβ−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｐＣＭＶβ，Ｃｌｏｎｔｅｃｈから）をｐＲｅｐ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎｅ）のＮｏｔＩ部位に挿入することにより作製した。ＲＳＶプロモーター、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子およびＳＶ４０ポリＡシグナルを含む全β−ガラクトシダーゼ発現カセットをＳａｌＩで切り出し、そして次に平滑末端ライゲーションによりｐＳｕｂ２０１バックボーンにクローン化した（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。混入するヘルパーアデノウイルスを不活性化するために組み換えウイルスストックを５８℃で６０分間加熱した。典型的な収量は、プラスミド基準に対するＤＮＡスロットブロットハイブリダイゼーションアッセイに基づいて５ｘ１０５〜５ｘ１０９粒子／μｌであった。増殖に使用する組み換えアデノウイルスの第二のレポーターアッセイ（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）に基づくようなアデノウイルス混入のレベル（ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉ用のＡｄ．ＣＭＶＡｌｋｐｈｏｓおよびＡＶ．Ａｌｋｐｈｏｓ用のＡｄ．ＣＭＶＬａｃＺ、ＡＶ．ＬａｃＺ用のＡｄ．ＣＭＶＧＦＰ）は、アデノウイルスの存在下で２９３細胞の感染に使用する１ｘ１０１０のｒＡＡＶ粒子当たり１個未満の機能性粒子であった。Ｒｅｐ／Ｃａｐをコードするプラスミドでのトランスフェクションは、Ｒｅｐタンパク質の抗体染色のコントロールとして役立った。ウイルスは、インビトロもしくはインビボ感染の前にＰＢＳにおいて透析した。
極性気道上皮細胞および一次ヒト繊維芽細胞の形質導入
完全に分化した気管支細胞のｒＡＡＶ感染は、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）に記述されているように行った。気道細胞の頂端面からの感染には、５μｌのｒＡＡＶを５０μｌの培養培地と混合し、そしてＭｉｌｌｉｃｅｌｌインサートの頂端コンパートメント上に直接使用した（ＭＯＩ＝１０，０００粒子／細胞）。頂端感染中に、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌの側底側は培養培地に継続的に浸した。底側への遺伝子導入は、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌインサートを逆さにしそして５０μｌの容量で支持フィルター膜の底にウイルスベクターを２時間使用することにより行った。次に、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌインサートを最初のウイルス接種材料と追加の４５０μｌの培地の継続的存在下で直立位置に戻した。頂端および側底感染の両方で、ｒＡＡＶを含有する培地を２４時間後に取り除き、そして新しい培養培地で置換するか（底側では）もしくは空気にさらした（頂端側では）。極性気道細胞におけるＡＡＶ導入の効率への異なる因子の効果を試験するために、１μの各溶液を気道上皮の感染の前にＡＡＶと混合した。因子は、他に示されない限り、通常、２４時間のＡ
ＡＶ感染期間中与えられた。ヒドロキシウレア（リン酸緩衝食塩水に溶解する）、Ｈ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨ（０．９％氷酢酸に溶解する）およびＨ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−ＯＨ（５０％メタノールに溶解する）を除いて因子の大部分はＤＭＳＯに溶解した。因子の作業濃度は下記の通りであった：０．１μＭのカンプトテシン、１０μＭのエトポシド、５μｇ／ｍｌのアフィジコリン、４０ｍＭのヒドロキシウレア、５０μＭのゲニステイン、４０μＭのＬＬｎＬおよび４μＭのＺ−ＬＬＬ。ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）インヒビター（Ｈ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨおよびＨ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−ＯＨ）を使用する場合、気道細胞を感染前に６０分間２ｍＭの最終濃度で両方のインヒビターの組み合わせで前処理し、その後に、側底面からの全２４時間の感染期間中インヒビター（０．２ｍＭ）の継続的存在が続いた。ＥＧＴＡ処理に関する研究は、極性気道上皮の頂端膜を水中３ｍＭのＥＧＴＡで１０分間一時的に処理することにより行った（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。低張ＥＧＴＡ処理の後に、培養物を培養培地で２回洗浄し、そして４０μＭのＬＬｎＬの有無でｒＡＡＶを感染させた。ヒト一次繊維芽細胞（Ｐ４）は、１０％のウシ胎仔血清（ＦＢＳ）、１％のペニシリンおよびストレプトマイシンならびに８９％のＤＭＥＭにおいて維持した。ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉでの感染は、２％のＦＢＳ ＤＭＥＭ中１０００ＤＮＡ粒子／細胞のＭＯＩで８０％融合性繊維芽細胞で２４時間行った。
ｒＡＡＶのＳ ３５ ラベリング
改変した以前に公開されたプロトコル（Ｍｉｚｕｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６）に従って、ｒＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉのキャプシドタンパク質におけるメチオニン残基を放射性ウイルスストックの製造中に標識した。簡潔に言えば、準集密的（ｓｕｂｃｏｎｆｌｕｅｎｔ）２９３細胞の２０枚の１５０ｍｍプレートにＡｄ．ＬａｃＺ（５ｐｆｕ／細胞）を１時間感染させ、その後にｐＣｉｓＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉ（２５０μｇ）およびｐＲｅｐＣａｐ（７５０μｇ）のリン酸カルシウムトランスフェクションを続けた。細胞をさらに１０時間インキュベーションし、この時点で培地を２％のＦＢＳメチオニンフリーＤＭＥＭに４５〜６０分間変えた。培地を４００ｍｌの２％ ＦＢＳメチオニンフリーＤＭＥＭ当たり１５ｍＣｉのＳ３５−メチオニン（最終＝１．４９ＭＢｑ／ｍｌ）を含有するラベリング培地に再度交換し、そして細胞を３７℃で１．５時間パルスした。ラベリング後に、Ｌ−メチオニンを加えて３０ｍｇ／Ｌの最終濃度に戻し、そして細胞を３７℃でさらに３０分間インキュベーションした。細胞溶解物を調製し、そしてウイルスを上記のような等密度塩化セシウム超遠心分離により精製した。標識されたウイルス調製物の典型的な比活性は５ｘ１０−６ｃｐｍ／粒子であり、これは他の研究者（Ｂａｒｔｌｅｔ ｅｔ
ａｌ．，１９９９）により報告される５．５ｘ１０−７ｃｐｍ／粒子の比活性よりわずかに高い。
ウイルス結合／侵入アッセイおよびウイルス粒子のｉｎ ｓｉｔｕ局在化
極性気管支上皮細胞へのｒＡＡＶの結合を評価するために、Ｓ３５で標識したＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉを頂端面もしくは底面のいずれかに使用し（ＭＯＩ＝５０，０００粒子／細胞）、続いて４℃で６０分間インキュベーションした。分化した気道上皮へのｒＡＡＶの組み合わせた結合／侵入は、培養物を採取する前に３７℃でさらに２〜２４時間インキュベーションしたことを除いて、同じ条件下で測定した。これらの組み合わせたウイルス結合／侵入アッセイは、導入遺伝子発現を終点とするｒＡＡＶ導入の機能研究に用いるものと同一の感染条件下で行った。ＰＢＳにおいて３回洗浄した後に、室温で５分間５ｍｌの液体シンチレーションカクテルの添加により細胞をｉｎ ｓｉｔｕで溶解し、そして放射能をシンチレーションカウンターにおいて定量した。
極性ヒト気管支上皮細胞内のｒＡＡＶ粒子の細胞内局在化を分析するために、粘膜面もしくは漿膜面のいずれかにＳ３５標識したウイルス（ＭＯＩ＝５０，０００粒子／細胞）を使用することにより感染を行った。感染後２時間で、トランスウェルを培地で３回洗浄し、そして４％のパラホルムアルデヒドにおいて一晩固定し、その後に凍結保護し、そし
て凍結切片用に包埋した。以前に公開されたプロトコル（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）に従って、１０μｍの凍結切片に写真乳剤をかぶせ、そして５週間感光させた。
極性気道上皮培養物の感染後のｒＡＡＶウイルスゲノムの分子分析
結合しそして取り込まれたウイルスの分子状態をｒＡＡＶ感染後の異なる時点でアッセイした。細胞表面に結合したウイルスの量を調べるために、ｒＡＡＶ感染を４℃で１時間行った。結合後に、３７℃で４〜２４時間ウイルスの存在下でインキュベーションを続けることによりウイルス内在化の程度を評価した。ウイルスＤＮＡを改変されたハートプロトコルに従って抽出し、そしてサザンブロットをＨｙｂｏｎｄＮ＋ナイロン膜（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で行った（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。５ｘ１０６ｃｐｍ／ｍｌの導入遺伝子ＦＧＦＰ特異的プローブで１．６ｋｂの一本鎖ウイルスＤＮＡ、２．７ｋｂの二本鎖環状中間体、およびウイルスゲノムからの４．７ｋｂの二本鎖複製が検出された。ブロットを５５℃で２０分間０．２ｘＳＳＣ／０．１％のＳＤＳのストリンジェンシーで２回洗浄した。ウイルス内在化を評価することを目的とする研究では、細胞表面に結合しているウイルスを３７℃で１０分間０．５％のトリプシンおよび５．３ｍＭのＥＤＴＡを含有する１ｍｌのバッファーでのトリプシン処理（５００μｌのバッファーをＭｉｌｌｉｃｅｌｌインサートの頂端および側底コンパートメントに加えた）、続いてよく冷えたＰＢＳで２回洗浄することにより取り除いた。外部から結合しているＡＡＶウイルスは、４℃で６０分間感染させた細胞から抽出されるハートＤＮＡにおける１．６ｋｂのウイルスゲノムバンドの強さにより決定した。内在化ウイルスは、３７℃で４および２４時間の感染後にトリプシン処理した細胞から抽出されるハートＤＮＡにおける１．６ｋｂのウイルスゲノムバンドの強さにより決定した。内在化ウイルスの分子構造の動力学変化は、ウイルスを培養培地から取り除いた後２、１０、３０および５０日でアッセイした。
免疫沈降によるユビキチン化ＡＡＶキャプシドタンパク質の検出
ＡＡＶユビキチン化へのプロテアソームインヒビターの効果を分析するために、ヒト一次繊維芽細胞を１Ｘ ＲＩＰＡバッファーにおいてウイルス感染後６時間で溶解した。次に、細胞溶解物を３０μｌのプロテインＡ−アガロースで清澄化した。上清を１０μｌのモノクローナル抗ＶＰ１、２および３抗体（クローンＢ１、ＡＲＰ）とインキュベーションし、続いて３０μｌのプロテインＡ−アガロースを加えた。ペレットを１Ｘ ＲＩＰＡバッファーで４回洗浄し、そして１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。ニトロセルロースフィルターに移した後、ブロットを１：１０００希釈の抗ユビキチンモノクローナル抗体（クローンＰ４Ｄ１，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，カタログ番号ｓｃ−８０１７）、続いて１：５００のＨＲＰ結合二次抗体（ＢＭＢ）で調べた。最終洗浄後に、ＥＣＬシステム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いて免疫反応性を視覚化した。
マウスにおけるインビボ研究
動物研究は、アイオワ大学の組織ガイドラインに従って行った。マウス肺におけるＡＡＶ媒介遺伝子導入へのプロテアソームインヒビターの効果を決定するために、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスをメトキシフルラン室を用いて軽く麻酔した。Ａ．Ｖ．ＬａｃＺ（５ｘ１０１０粒子）をＷａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）により記述されているように鼻吸引により１０μｌの滴注において単独でもしくは４００μＭのＺ−ＬＬＬとともに投与した。ＤＭＳＯ溶媒の予期しない毒性を防ぐために、プロテアソームインヒビターＺ−ＬＬＬを４０ｍＭのストック溶液としてエタノールに溶解し、そして１％の最終濃度でウイルス接種材料に含んだ。Ｚ−ＬＬＬがない場合のウイルス感染コントロールもまた、１％の最終濃度のエタノールを含有した。一次培養したヒト気道細胞および繊維芽細胞の両方における研究は、４０μＭのＬＬｎＬと４μＭのＺ−ＬＬＬとの間で同様の増大効率を示しており、そしてまたエタノールにおけるＬＬｎＬの難溶性のために（ＤＭＳＯにおける低用量は、以前に気管に投与された）、Ｚ−ＬＬＬのみをこの特定のマウス肺研究において試験した。動物を感染後２、１０および１５０日で安楽死させ、そしてＰＢＳ（１
０ｍｌ）を右心室に注入し、続いて完全なカセットとして肺および心臓を取り除いた。気管に挿管し、そして以下の溶液を順番に：ＰＢＳ、０．５％グルタルアルデヒド、１ｍＭのＭｇＣｌ２／ＰＢＳそして最後にＸ−ｇａｌ染色試薬を室温で一晩のインキュベーションの間に１０ｃｍの水圧で注入した。Ｘ−ｇａｌ染色したマウス肺を次に室温で４８時間１０％中性緩衝ホルマリンにおいて後固定し、そして連続する１０％、２０％および３０％ショ糖／ＰＢＳ溶液において凍結保護した。肺（各条件にＮ＝３）をＯＣＴ（最適切断温度；Ｂａｘｔｅｒ，Ｗａｒｒｅｎｄａｌｅ，ＰＡ）に包埋し、そして１５μｍの連続切片を気道上皮における陽性細胞のパーセンテージを計算することにより遺伝子導入に関して分析した。気道の直径を形態計測解析後の結果の分類（＞３６０μｍ、２６０〜３５０μｍ、１６０〜２５０μｍ、＜１５０μｍ）のために記録した。１５０より多くの気道断面を各実験条件用に定量した。
結果
極性気道上皮におけるｒＡＡＶゲノムの分子分析
最近の研究により、分化した気道上皮の頂端面でのＡＡＶ−２受容体、ヘパリン硫酸プロテオグリカンならびに共受容体、ＦＧＦＲ−１およびαＶβ５インテグリンの欠如が示された（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｇｏｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。しかしながら、頂端膜および側底膜での放射性ウイルスの結合の違いは、４〜７倍のみであった（側底＞頂端）（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。結合のこれらの違いは、ｒＡＡＶ−２での感染の極性において認められる２００倍の相違（側底＞＞頂端）（Ｄｕａｎ
ｅｔ ａｌ．，１９９８）を説明するのに不十分である。これらの結果は、ウイルス結合および／もしくは取り込みが気道上皮における不十分な粘膜形質導入に寄与する唯一の限定因子ではないことを示唆した。この目的のために、空気−液体界面で培養したヒト気管支上皮の頂端および側底感染後５０日でのｒＡＡＶ ＤＮＡの分子状態を評価した。この時点で、ＥＧＦＰレポーターから測定される遺伝子発現は、側底感染培養物において＞２００倍高かった（データは示さない）（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。培養物からのハートＤＮＡを３２Ｐ標識したＥＧＦＰプローブでサザンブロットハイブリダイゼーションにより評価した。かなりの量の頂端で使用したｒＡＡＶは、気道細胞に感染することができた。しかしながら、一本鎖ウイルスゲノム（ｓｓＤＮＡ）のみがこの時点（５０日）で検出された。この結果は、ｒＡＡＶが粘膜面から取り込まれることができることおよび取り込まれたウイルスｓｓＤＮＡがいくつかの未知の細胞内コンパートメントにおいて安定に隔離されたことを明らかに示唆する。対照的に、側底で使用したｒＡＡＶの大部分は、１％の非変性アガロースゲルにおいて２．８ｋｂおよび＞１２ｋｂに移動する二本鎖型に転化された。以前の報告（Ｓａｎｌｉｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）と一致して、ハートＤＮＡのその後の制限酵素マッピングおよびサザンブロットは、この２．８ｋｂのバンドがスーパーコイル状の環状エピソーム分子であることを裏付けた（データは示さない）。側底感染後に著しくより強い＞１２ｋｂバンドの正体は現在未知であるが、ＡＡＶゲノムのエピソーム環状コンカテマーである可能性がある。総合すると、これらの結果は、環状ゲノムへのＡＡＶウイルスＤＮＡの効率の悪い分子転化が気道の頂端面からのｒＡＡＶ媒介遺伝子導入の大きな障害であることを示唆する。さらに、自己プライミングによる線状複製ではなく、環状化が極性気道上皮におけるｒＡＡＶ遺伝子転化の主要経路である。
プロテアソームインヒビターは、極性気道上皮におけるｒＡＡＶ感染を劇的に高める
ｒＡＡＶは気道における頂端感染後にいくつかの細胞コンパートメント（１つもしくは複数）内に潜伏したままのようであること、およびウイルスゲノムの分子転化を改変する因子は、気道上皮におけるｒＡＡＶ導入を高める可能性があることを考慮して、ＤＮＡ損傷剤（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、ＤＮＡ合成およびトポイソメラーゼインヒビター（Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５）および細胞チロシンキナーゼインヒビター（Ｑｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９
８）を包含する、いくつかの因子をこの関連で試験した。カンプトテシン、エトポシド、ヒドロキシウレアおよびゲニステインの使用は、側底面からのｒＡＡＶ導入の１０〜６０倍の増大をもたらした。しかしながら、興味深いことに、これらの因子のいずれも頂端面からのｒＡＡＶ導入を促進しなかった（データは示さない）。他の細胞タイプにおけるｒＡＡＶ導入に関与する核内事象に影響を及ぼすことが既知である化学物質（Ｓａｎｌｉｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９）は、気道におけるｒＡＡＶ頂端感染を増大しなかったので、ユビキチン−プロテオソーム経路のようなエンドサイトーシスプロセシングに影響を与える他の因子を試験した。プロテアソーム系は、ＨＩＶのようなウイルスを包含する、多数の外来および内在性分子の細胞内プロセシングを調節することが既知である（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。プロテアソーム経路のいくつかの特異的な細胞透過性のペプチドアルデヒドインヒビターが、最近発見されている（Ｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９４；Ｆｅｎｔｅａｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。これらのインヒビターはプロテアソームコア内のタンパク質分解酵素の活性部位に結合し、そしてそれらの機能を可逆的に妨げる（Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。プロテアソームが感染後にｒＡＡＶを隔離する細胞内コンパートメントであるかどうかを試験するために、トリペプチジルアルデヒドプロテアソームインヒビター（システインプロテアーゼインヒビター）Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシナル−Ｌ−ノルロイシナル（ＬＬｎＬ、カルパインインヒビターＩとも呼ばれる）をｒＡＡＶ感染の時点でヒト気管支上皮細胞の極性培養物に使用した。驚くべきことに、４０μＭのＬＬｎＬをｒＡＡＶと一緒に漿膜面に使用した場合に導入遺伝子発現の２００倍より大きい増大が感染後２日で得られた。同様の結果が、別のユビキチン−プロテアソーム経路インヒビター、Ｎ−カルボベンゾキシル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシナル（Ｚ−ＬＬＬ、ＭＧ１３２とも呼ばれる）（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）を試験した場合に得られた（データは示さない）。しかしながら、最も重要な結果は、これらのプロテアソームインヒビターがまた、粘膜面からのｒＡＡＶ導入も実質的に増加したことであった（以下を参照）。他の因子と比較した場合に、プロテアソームインヒビターは、気道上皮におけるｒＡＡＶ導入の最も強力なエンハンサーであることが見出された。
プロテアソームインヒビターは、分極化した方法で気道上皮におけるｒＡＡＶ導入を増大する
プロテオソームインヒビターは、漿膜面からのｒＡＡＶ導入の効率を著しく増加するようであるが、気道における遺伝子送達の臨床応用に最も密接な関係がある経路は粘膜面である。頂端膜からのｒＡＡＶ導入へのプロテアソームインヒビターの効果を試験するために、ＬＬｎＬでの処理後の気道上皮の粘膜面および漿膜面の両方からのｒＡＡＶ導入の並列速度論的比較を行った。粘膜面へのＬＬｎＬおよびｒＡＡＶの共投与は、感染後２２日でピークに達する、ＡＡＶ導入の持続的増大をもたらした。粘膜感染と対照的に、ＬＬｎＬの存在下での漿膜面からのｒＡＡＶ感染は、感染後７２時間で遺伝子発現の一時的ピークをもたらしただけであり、それは２２日までに未処理のサンプルのものと同等のレベルに戻った。これらの結果は、ＡＡＶウイルスを頂端膜もしくは側底膜のいずれかに使用する場合にプロテアソームインヒビターＬＬｎＬが異なる増大プロファイルをもたらすことを示唆した。気道上皮によるＬＬｎＬの分極した取り込みによりもたらされる潜在的効果を除くために、頂端面および側底面の両方からのｒＡＡＶおよびＬＬｎＬ投与の異なる組み合わせを試験した。感染中にＬＬｎＬをｒＡＡＶと同じもしくは反対の面に使用したかどうかにかかわらず、ＡＡＡＶ導入の同様の増大パターンが得られた（データは示さない）。
ＬＬｎＬ投与が特定の気道細胞タイプのｒＡＡＶ導入を増大したかどうかを決定するために、アルカリホスファターゼ遺伝子をコードするｒＡＡＶベクター（Ａｌｋｐｈｏｓ）を利用した。この問題に取り組むためにＡｌｋｐｈｏｓの標準的な組織化学染色により形質導入された細胞タイプを評価した。ＬＬｎＬがない場合に、ｒＡＡＶはウイルスの漿膜
使用後３日で基底細胞を優先的に形質導入した。ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉウイルスを利用する以前の結果と一致して、ＬＬｎＬの共投与は、ＡＶ．Ａｌｋｐｈｏｓ導入の劇的な増加をもたらした。興味深いことに、繊毛細胞形質導入は、ｒＡＡＶ感染の時点でのＬＬｎＬでの処理により最も顕著に増加された。対照的に、基底細胞はＬＬｎＬ処理に最も低い応答性であった。これらの結果は、ＬＬｎＬ作用機序が、極性（すなわち、繊毛）および非極性（すなわち、基底）細胞タイプで異なる、いくつかの細胞特異的成分を有し得ることを示唆した。
ＬＬｎＬの最適化はｒＡＡＶ導入を増大した
ＬＬｎＬの存在下で得られるｒＡＡＶ導入の増大をさらに改善することを目的として、ｒＡＡＶ感染後のＬＬｎＬ投与のタイミングおよび回数を改変するいくつかの詳細な速度論的研究を行った。いくつかの重要な結果が、これらの研究から生じた。第一に、側底感染後に、３日に1回のＬＬｎＬの投与は、３０日の終わりまでにレベルが感染の時点で１回処理した培養物のものと同様であったことにもかかわらず、ピーク導入遺伝子発現の長さを増加した。第二に、ＬＬｎＬの連続投与は細胞に有毒であり、そして１０日までに導入遺伝子発現を取り除いた。第三に、７、１０および１５日にＬＬｎＬの存在下でのｒＡＡＶでの培養物の再感染は、同様のパターンの増大をもたらし、そして予想されるように、３０日で認められる導入遺伝子発現の最終レベルを高めた（１５日に第二の感染からのデータのみを示す）。しかしながら最も顕著には、側底側から感染させた培養物は全て、ＬＬｎＬが投与されたかどうかにかかわらず、相互の２〜３倍以内の同様の長期の導入遺伝子発現レベルをもたらした。
ウイルス感染の時点でのＬＬｎＬ投与は頂端面および側底面の両方からのｒＡＡＶ導入を増大したことにもかかわらず、この誘導の反応速度論は著しく異なった。側底感染後の増大は一時的であり、一方、頂端感染後の増大は長期であった。さらに、頂端膜からのＬＬｎＬでの誘導は長続きしたが、３０日までに導入遺伝子発現の最大レベルは、基底感染から得られるものの１／８のみであった。低張ＥＧＴＡ溶液の使用は、頂端面からのＡＡＶ導入を７〜１０倍増加することが示されている（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０００）。従って、ＧＦＴＡおよびＬＬｎＬの組み合わせた投与は、頂端面からのｒＡＡＶ導入のなおさらなる増加を与えることができる。興味深いことに、ＬＬｎＬの存在下でｒＡＡＶでの感染の前のＥＧＴＡでの気道培養物の処理は、最初の３日以内の形質導入の一時的ピーク、および３０日に達する著しく増加した（２００倍）長期レベルの導入遺伝子発現を与えた。この長期レベルの導入遺伝子発現は、底面からのｒＡＡＶ感染に匹敵するが、ＥＧＴＡ単独で処理した頂端感染上皮において認められるレベルよりかなり上回った。要約すると、これらの結果は、ＥＧＴＡおよびＬＬｎＬがｒＡＡＶ導入への相乗効果を有し、通常は側底感染後にのみ見られるレベルで頂端面からの形質導入を可能にすることを示す。
ウイルス結合および内在化は、ＬＬｎＬ処理により影響を受けない
ＬＬｎＬの作用は、典型的に、プロテアソーム系のその選択的且つ可逆的阻害に起因すると考えられている。しかしながら、ウイルス結合および／もしくはエンドサイトーシスへの任意の起こり得る効果を除外することは重要であった。１型単純ヘルペスウイルスに見出されているように（Ｅｖｅｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、ＬＬｎＬ処理は４℃のｒＡＡＶ結合に有意な効果を有さなかった。同様に、３７℃で２時間の感染期間の間のＳ３５標識ｒＡＡＶの取り込みは、ＬＬｎＬ処理により改変されなかった。これらの結果を考えると、ＬＬｎＬはウイルス結合および侵入より遠位の地点で作用する。興味深いことに、感染後２４時間で、細胞内放射能の量の非常に著しい減少が、どちらの面に感染させたかにかかわらず、ＬＬｎＬで処理した上皮において認められた。この時点での導入遺伝子発現の一致した増加を考えると、ＬＬｎＬはプロセシングおよび核へのウイルスの経路指定を加速することができ、そこで、アンコーティングおよびＳ３５標識キャプシド
タンパク質のクリアランスが起こる。この機序により、Ｓ３５同位体は培養培地に希釈され、そして細胞に関連する計数の減少を説明することができる。
ＬＬｎＬはｒＡＡＶのエンドソームプロセシングおよび核輸送を高める
ＬＬｎＬが核へのｒＡＡＶの輸送を増加するという仮説を試験するために、頂端面および側底面からの感染後のＳ３５標識ｒＡＡＶ粒子のｉｎ ｓｉｔｕ局在化をＬＬｎＬの有無で行った。完全な放射性標識キャプシドタンパク質の喪失は感染後２４時間で起こったので、２時間の時間点をこのアッセイに選択した。写真乳剤オーバーレイを用いて、Ｓ３５標識ｒＡＡＶ粒子の細胞内分布を盲式形態計測解析により評価した。ウイルス粒子の大部分は、ＬＬｎＬがない場合に細胞質に局在した。これは、感染が頂端面もしくは側底面から行われたかどうかにかかわらずそうであった。対照的に、ＬＬｎＬ処理は、放射性標識ｒＡＡＶ粒子の細胞内分布を実質的に変え、核関連粒子への顕著なシフトをもたらした。これらの結果は、感染後２４時間での全細胞計数からの結果を立証し、それは、ＬＬｎＬがウイルスアンコーティングおよびその後の培地へのＳ３５同位体の喪失を増加することを示唆した。
ＬＬｎＬは感染後の特定の時間枠内でｒＡＡＶ導入を増大する
これまで証拠は、ＬＬｎＬが核へのｒＡＡＶの細胞内経路指定を増加するように働き得ることを示唆している。さらに、ＬＬｎＬ作用は、それが投与される上皮面から独立している（すなわち、ＬＬｎＬの漿膜使用は粘膜感染を増大し、そして逆もまた同様である）。これは、ＬＬｎＬが形質導入を高めるためにＡＡＶ粒子とともに取り込まれる必要がないことを示す。従って、ＬＬｎＬは、ｒＡＡＶエンドサイトーシス後のしかしエンドソームプロセシング中の特定の時点で作用し得る。この仮説に機能的裏づけを与えるために、側底面からの感染後の様々な時点でのＬＬｎＬ作用の速度論的解析を行った。これらの実験において、ＬＬｎＬはｒＡＡ感染の時点でもしくは感染後の様々な時点で培養培地に加えた。ウイルス媒介導入遺伝子発現を感染後２４時間間隔で定量した。ＬＬｎＬがウイルス感染後０、２４、４８および７２時間で投与されたかどうかにかかわらず増大が得られた。しかしながら、２４もしくは４８時間でのＬＬｎＬの添加は、最も強いレベルの増大を与えた。ＡＡＶ発現を減少するＬＬｎＬの能力は、感染後７２時間までに衰えるようであり、そして最初のＡＡＶ感染後１５日までに完全に失われた（データは示さない）。総合すると、ｒＡＡＶが細胞に侵入した後に、それはプロテアソームインヒビターにより促進される遊離に敏感である細胞内コンパートメントに標的化され得るようである。さらに、感染後１５日でのＬＬｎＬ増大効果の喪失は、導入遺伝子産物の増大した転写、翻訳および／もしくは安定性が、この結果に関与する機序におそらく寄与しないことを示唆する。
ＬＬｎＬおよびＥＧＴＡの組み合わせた処理は、内在化したｒＡＡＶの分解を防ぐ
ＬＬｎＬによるｒＡＡＶ導入の増大に関与する分子機序（１つもしくは複数）をさらに明らかにするために、感染細胞におけるｒＡＡＶゲノムをハートＤＮＡのサザンブロッティングにより分析した。Ｓ３５標識ウイルスを用いる研究と一致して、極性気道上皮のいずれの面へのｒＡＡＶ結合もＬＬｎＬ処理により影響を受けなかった。サザンブロッティングはまた、異なる組織サンプル間で異なる、底面からの２〜７倍高いウイルス結合も示した（データは示さない）。トリプシンで表面結合ウイルスをはがした後にウイルス内在化の程度を比較した。以前の結果を裏付けて、ウイルスの取り込みは側底面から一層活発であったが、かなりの量のｒＡＡＶが感染期間中に頂端面から取り込まれた。ＬＬｎＬ単独ではまた、内在化したＡＡＶウイルスＤＮＡの酵素分解を実質的に妨げず、核への増大したウイルス輸送が、ＬＬｎＬによる認められる増大において一層重要であり得ることを示唆する。しかしながら、低張ＥＧＴＡおよびＬＬｎＬの両方での処理は、頂端面から内在化されるウイルスの量を実質的に増加した。低張ＥＧＴＡ処理単独では、頂端感染後にＡＡＶ ＤＮＡの存続もしくはＡＡＶ媒介遺伝子発現をわずかに増加しただけであったの
で（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０００）、ＥＧＴＡおよびＬＬｎＬの組み合わせた効果に関与する主要な機序は、内在化したウイルスの減少した分解およびエンドサイトーシスの増加した速度のためである可能性がある。ＥＧＴＡおよびＬＬｎＬのこれらの相乗効果は、頂端膜からのｒＡＡＶ導入を２００倍より多く増大する。さらに、線状複製型もしくは環状型への一本鎖ウイルスゲノムの転化は、それぞれ、アデノウイルス初期遺伝子産物もしくはＵＶ照射による増大したＡＡＶ導入と関連付けられている（Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｓａｎｌｉｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。Ａｄ．ｄ１８０２およびｒＡＡＶを共感染させた培養物からのハートＤＮＡのサザンブロットは、ＬＬｎＬにより増大されるＡＡＶ導入が、明らかに、Ａｄ．ｄ１８０２共感染により生産されるアデノウイルスＥ４ｏｒｆ６タンパク質の存在下で見られるような線状複製中間体（４．７ｋｂバンド）の形成によって媒介されないことを示した。
気道におけるｒＡＡＶ感染後のウイルスキャプシドタンパク質のユビキチン化は、形質導入の効率を改変する
ユビキチン化分子のプロテアソームに依存する分解は、内在性および外来タンパク質の両方の除去のための主要経路である（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ユビキチンのその活性化酵素（Ｅ１）による活性化、ユビキチンキャリアタンパク質（Ｅ２）への活性化ユビキチンの移動およびその後のユビキチンリガーゼ（Ｅ３）によるタンパク質物質への活性化ユビキチンの送達を包含する、この経路の調節におけるいくつかの別個の段階が同定されている。最終的に、ユビキチン化タンパク質は、ＡＴＰ依存性プロセスを通して２６Ｓプロテアソームにより分解される。プロテアソームインヒビターによるｒＡＡＶ導入の増大が、エンドソームコンパートメントからのユビキチン化ウイルスの遊離を伴うかどうかを試験するために、感染後のＡＡＶキャプシドタンパク質上のユビキチン側鎖の程度、ならびにプロテアソームインヒビターでの処理がユビキチン化の程度を改変するかどうかを調べた。ＡＡＶキャプシドタンパク質をウイルス感染後６時間でｒＡＡＶ感染ヒト極性気道細胞および融合性ヒト繊維芽細胞から抗ＶＰ１、２、３抗体を用いて免疫沈降させた。その後の抗ユビキチン特異的抗体でのウェスタン分析は、プロテアソーム処理後の繊維芽細胞におけるユビキチン化ＡＡＶキャプシドの細胞レベルの顕著な増加を示した。ユビキチン化は、２２０〜２５０ｋｄにキャプシドタンパク質（６３ｋｄ、７３ｋｄおよび８７ｋｄ）の分子量を著しく増加し、そして他の分子のユビキチン化後のサイズ変化と一致する（Ｂｒｅｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。残念なことに、空気−液体界面培養したヒト気道細胞から回収可能なウイルスの限られた量は、この系においてユビキチン化キャプシドを検出できることを不可能にした（データは示さない）。それにもかかわらず、融合性一次繊維芽細胞もまた、プロテアソームインヒビターでの処理の後に導入遺伝子発現の増大（１０倍）を示した。従って、プロテオソームインヒビターは、プロテオソームにおけるユビキチン化ＡＡＶのターゲッティングおよび／もしくは分解を減らすことによりｒＡＡＶ導入を増加する。そのようなプロテアソーム阻害の最終結果は、ユビキチン化ウイルスキャプシドの存在量を増加すると予想される。
極性気道モデルにおける技術的制約により、ユビキチン化ウイルスキャプシドの直接検出は妨げられるので、ユビキチンプロテアソーム経路における他の段階の調節もまた、プロテアソームインヒビターＬＬｎＬおよびＺ−ＬＬＬで見られるものと同様にｒＡＡＶ導入を増加できるかどうかを決定した。Ｈ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨおよびＨ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−ＯＨのようないくつかのジペプチドは、ユビキチンリガーゼＥ３を阻害することが知られている（Ｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。これらのユビキチンリガーゼインヒビターの使用は、ヒト気道細胞の側底面からのｒＡＡＶ導入を実際に増大した。総合すると、繊維芽細胞および極性気道上皮の両方におけるデータは、ＡＡＶキャプシドがエンドサイトーシス後にユビキチン化されること、およびこのプロセスがｒＡＡＶ導入の障害であることを示唆する。トリペプチドプロテアソームインヒビターによるｒＡＡＶ導入の増
大に関与する最も有望な機序は、ユビキチン化ウイルス分解および／もしくはプロテアソームへのターゲッティングの防止を含む。
インビボでのプロテアソームインヒビターによるｒＡＡＶ導入の長期増大
インビボ遺伝子治療のためのプロテアソームインヒビターの潜在的有用性を評価するために、マウス肺におけるインビボｒＡＡＶ媒介遺伝子導入のためのこれらの因子の毒性および効能の両方を試験した。マウスにおけるこれらのプロテアソームインヒビターの毒性を評価するために、気管内および全身（ＩＶ）送達の両方を用いて、極性気道細胞において遺伝子導入を誘導するために用いられるより１０、１００および１０００倍高い有効用量のＬＬｎＬもしくはＺ−ＬＬＬを投与した。毒性は、肺および肝臓の組織学的評価により示されず、もしくは動物の死によって証明されなかった。これらのプロテアソームインヒビターがインビボでｒＡＡＶ導入を改善することができるかどうかを調べるために、ＡＶ．ＬａｃＺ（５ｘ１０１０粒子）を鼻腔内投与により単独でもしくは４００μＭのＺ−ＬＬＬの存在下で送達した。短期および長期の効果を評価するためにマウス肺を感染後３、１０および１５０日で採取した。底面からの、もしくは頂端面からのＥＧＴＡと併せたプロテアソームインヒビター処理は、ｒＡＡＶ導入への顕著な即時増大をもたらし、しかしながら、感染後３および１０日での肺組織のＸ−ｇａｌ染色は、プロテアソームインヒビターで処理したもしくは未処理のグループのいずれかにおける検出可能な導入遺伝子発現を示さなかった。対照的に、Ｚ−ＬＬＬで処理したサンプルにおいて１５０日でかなりの形質導入が得られた。標的化導入遺伝子発現は、実質におけるよりむしろ誘導気道に主に限定された。肺胞細胞は、めったに形質導入されなかった。平均して約５．８８％のみの気道細胞がＡＶ．ＬａｃＺにより形質導入され、そしてＬａｃＺ陽性細胞は全誘導気道にわたって認められたが、特有の形質導入プロファイルが明らかであった。より大きい細気管支（＞３５０ｍｍ）における形質導入効率は、気道上皮の１０．３６±１．６３％の平均に達し、一方、より小さい細気管支（＜１５０ｍｍ）における気道細胞の１．３７±０．４１％がβ−ガラクトシダーゼ導入遺伝子を発現した。遠位および近位気道における導入遺伝子発現の範囲は、それぞれ、０〜４％および５〜１８％であった。より大きい気道においてより高いそしてより一貫性のある形質導入を示すこの形質導入プロファイルは、おそらく、より小さい気道を含む肺の領域へのウイルスのより不均一な送達を示す。ＡＶ．ＬａｃＺのみに感染した肺からの凍結切片の試験は、全部で３１５の気道切片（ｎ＝３動物）において２個のみのｌａｃＺ陽性細胞を示した。
説明
気道の頂端面からの効率の悪い遺伝子導入は、組み換えアデノウイルス（Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｐｉｃｋｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、アデノ随伴ウイルス（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、レトロウイルス（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８）および非ウイルスリポソームベクター（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９）を利用する嚢胞性線維症の多数の遺伝子治療方法における主要な障害であった。一般に、気道上皮の頂端膜を通した効率の悪いウイルス媒介遺伝子送達は、主に、この面上の受容体もしくは共受容体の欠如のためであると考えられている。
極性気道上皮におけるｒＡＡＶ感染の分子分析は、いくつかの独自の結果を示している。第一に、気道上皮の頂端膜での既知のＡＡＶ−２受容体および共受容体の以前に報告された欠如（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）は、ＡＡＶ感染を阻止しないという決定的な証拠がある。側底面からの形質導入（導入遺伝子発現により決定されるような）は、頂端面からより２００倍効率がよいが、Ｓ３５標識ウイルスもしくはサザンブロッティングのいずれかでのウイルスエンドサイトーシスの定量的および半定量的分析は、頂端面からのウイルスの取り込みが側底膜からより２〜７倍だけ効率が悪いことを示している。従って、以前に同定されていない代わりの受容体／共受容体および／もしくは受容体に依存しない機序（１つもしくは複数）が、気道の粘膜面からのＡＡＶ取り込みに関与する可能性があると推定することは理にかなっている。
極性は、多数のタンパク質のエンドソームプロセシングに顕著に影響を与えることが広く認められており、そして別個の選別機序が頂端および側底コンパートメントに記述されている（Ｏｄｏｒｉｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｂｏｕｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。側底および頂端感染後のウイルス取り込みの効率と導入遺伝子発現との間の直接的相関関係の欠如は、さらなるエンドサイトーシス後の障害がｒＡＡＶ媒介遺伝子導入に存在することを示唆する。感染の側底対頂端経路を取るＡＡＶ核輸送の程度の違いは、基底および頂端細胞コンパートメントが、ＡＡＶ導入の極性に影響を与え得る別個の生物学的性質を有することを示唆する。ｒＡＡＶ導入のエンドソームプロセシング障害は、極性上皮細胞に限定されない可能性がある。この考えの裏づけとして、核へのウイルス粒子の細胞内輸送障害は、ＮＩＨ３Ｔ３細胞において認められている。さらに、ｒＡＡＶは、機能的に活性の状態にＵＶ照射によりレスキューされるまで融合性一次繊維芽細胞において７日もの間にわたって不活性状態でとどまることができる。従って、感染のエンドサイトーシス後の障害は、多数の細胞タイプに存在する。
気道において、粘膜面からのＡＡＶ導入の主要な律速段階は、内在化したウイルスの効率の悪いエンドソームプロセシングを含むようである。プロテアソームによる調節された細胞内タンパク質分解は、多数の生理的および病的状態において重要な役割を果たす（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｋａｔｏ，１９９９）。多数の特異的プロテアソームインヒビターの最近の同定は、新規な治療方法としてこの細胞酵素系における薬理学的介入の基盤を整えている。例えば、いくつかの細胞透過性合成トリペプチドアルデヒド（本研究に使用するＬＬｎＬおよびＺ−ＬＬＬのような）は、有望な癌治療薬もしくは抗炎症薬であることが示されている（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｋｌｏｅｔｚｅｌ，１９９８；Ｗｏｊｃｉｋ，１９９９）。さらに、プロテアソームは、ＨＩＶ感染における抗ウイルス機能を有することが示唆されており（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、プロテオソーム機能の阻害が組み換えウイルスでの形質導入を促進することにおいて有益であり得ることを示す。気道におけるｒＡＡＶの頂端感染は侵入後の事象により著しく限定されるという分子的証拠に基づき、ユビキチン／プロテアソーム経路は、この障害において役立つと思われる。プロテアソームは、内在性および外来タンパク質のクリアランスのためのコンパートメントとして一般に知られている。しかしながら、最近の研究はまた、プロテアソーム系がエンドサイトーシスを調節することに関与することも示唆した（Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｓｔｒｏｕｓ
ｅｔ ａｌ．，１９９９）。遺伝子送達の観点から、プロテアソームインヒビターはトランスフェクションされたプラスミドＤＮＡを分解から保護することが示されている（Ｃｏｏｎｒｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。本明細書に記述する結果は、気道上皮へのｒＡＡＶ媒介遺伝子導入もまたプロテアソームインヒビターによって著しく高められることを明らかに示す。さらに、この増大は、プロテアソームインヒビターにより刺激される核へのウイルス輸送と相関関係がある。プロテアソームインヒビターは頂端面からのＡＡＶ導入の長期レベルを増加したが、側底感染へのそれらの効果は、主に、形質導入の長期レベルよりむしろ速度を改変するようであった。これらの違いは、頂端面および側底面からのｒＡＡＶ導入に関与する根本的に別個の経路を強調する。
いくつかの結果はまた、エンドサイトーシス後のウイルスのユビキチン化が、侵入してくるＡＡＶを選別するための重要な機序であり得るという考えも裏付ける。第一に、タンパク質のユビキチンに依存する分解を阻止することが既知であるプロテアソームインヒビターでの気道上皮の処理は、ｒＡＡＶ遺伝子導入を高める。第二に、気道上皮におけるユビキチンＥ３リガーゼ活性の阻害もまた、形質導入を高める。最後に、ｒＡＡＶキャプシドタンパク質は、融合性ヒト繊維芽細胞において感染後にユビキチン化され、そしてこのユビキチン化の程度は、ユビキチン−プロテアソーム分解経路の阻害により増大される。
適用した観点から、本研究における最も重要な結果の１つは、マウス肺においてプロテアソームインヒビターにより誘導される持続する高レベルのｒＡＡＶ導入である。ｒＡＡＶとＺ−ＬＬＬとの共投与は、感染後１５０日で導入遺伝子発現を検出できないレベルから近位気管支上皮細胞の１０．３６＋／−１．６３％まで増大した。このレベルの遺伝子発現は、ＣＦＴＲ欠損症の治療修正に十分であると考えられる（Ｃｒｙｓｔａｌ，１９９９）。臨床応用のためのこの戦略の実現可能性は、マウスへのプロテアソームインヒビター投与後の検出可能な局所もしくは全身毒性の欠如によりさらに支持される。さらに、いくつかの他の臓器、例えば心臓骨格筋および肝臓における予備研究は、ｒＡＡＶ２のユビキチン化が臓器特異的な方法で起こり得ることを示唆している。骨格筋および心筋におけるプロテアソームインヒビターの使用は、短期もしくは長期ｒＡＡＶ媒介遺伝子導入のいずれにも影響がなかった。しかしながら、肝臓におけるＺ−ＬＬＬの使用は、感染後１ヶ月でｒＡＡＶ導入の７倍の増加をもたらした。これらの結果は、トリペプチドプロテアソームインヒビターが、ウイルスプロセシングの細胞生物学により、肺以外の臓器において遺伝子導入を増加するために使用できることを示唆する。
要するに、ｒＡＡＶ−２での気道における頂端感染の重要な障害は、エンドソームプロセシングおよびユビキチン化の段階にある。ユビキチン−プロテアソーム系の調節は、嚢胞性線維症の遺伝子治療用の気道の粘膜面からのｒＡＡＶ導入を高めるための革新的戦略を示している。
インビボで肺気道上皮および肝臓におけるＬａｃＺ遺伝子の発現
肺もしくは肝臓における本発明の因子の有無でのｒＡＡＶのインビボ活性は、ＬａｃＺ遺伝子を用いて試験することができる。ＬａｃＺ遺伝子を含有するｒＡＡＶベクター、組み換えＡＶ．ＬａｃＺ（約５ｘ１０１０粒子）をＰＢＳ中のウイルスのみもしくはＰＢＳ中４０μＭのＬＬｎＬと組み合わせたウイルスとしてマウス肺に投与した。ウイルスは、３０μｌの総容量で３０Ｇの針でＣ５７Ｂａｌｂ／ｃマウス気管に直接注入した。マウス肺におけるウイルスの拡散を保証するために、ウイルスを投与した直後に同じシリンジを通して５０μｌの空気を肺に送り込んだ。感染後９０日で、肺を損なわずに採取し、そして４％パラホルムアルデヒドにおいて固定し、続いて凍結切片にした。ＡＡＶ媒介導入遺伝子発現は、ＬａｃＺの１０μｍ組織切片染色により評価した。
組み換えＡＶ．ＬａｃＺ（約５ｘ１０１０粒子）はまた、ＰＢＳ中のウイルスのみ、ＰＢＳ中４０μＭのＺ−ＬＬＬと組み合わせたウイルス、もしくはＰＢＳ中２０μＭのＬＬｎＬと組み合わせたウイルスとしてマウス肝臓にも投与した。ウイルスは、Ｃ５７Ｂ６マウスの門脈に直接注入した。ＡＡＶ媒介ＬａｃＺ導入遺伝子発現は、凍結組織切片における感染後２および４週での組織学染色により評価した。
ｒＡＡＶ導入を高めるために有用な追加の因子を決定する方法
Ａ．ｒＡＡＶ導入を高める因子をスクリーニングするために、任意の数の細胞を使用することができる。試験する因子の濃度の範囲は、例えば、因子の望ましいプロファイル、因子の望ましい毒性プロファイルおよび／もしくはインビボで用いる因子の濃度に基づいて決定することができる。スクリーニングに選択する細胞タイプの有用性は、化合物、例えばｒＡＡＶ導入を増加することが既知であるＬＬｎＬおよびＺＬＬのような実施例１に記述するプロテオソームインヒビターを試験することにより確かめることができる。例えば、ＡＡＶ２ＦＬＡＧ−ＬｕｃベクターをプロテオソームインヒビターＭＧ１３２の有無でＨｅＬａ、フェレット繊維芽細胞、ＩＢ３およびＨｕｈ（肝臓）細胞に形質導入するために用いた。ＭＧ１３２は、試験した全ての細胞タイプにおけるＡＡＶ導入を高めることが確かめられ；ＨｅＬａ細胞形質導入は８０μＭのＭＧ１３２で約５００倍、そして４０μ
Ｍで２００倍高められ；フェレット繊維芽細胞形質導入は、２０μＭのＭＧ１３２で約２００倍、そして４μＭで１７倍高められ；ＩＢ３−１細胞形質導入は２０〜８０μＭのＭＧ１３２で約３０〜７０倍高められ；そしてＨｕｈ−７細胞形質導入は、２０〜８０μＭのＭＧ１３２で約１５倍高められた。ＤＭＳＯもしくはＥＴＯＨのいずれかをＭＧ１３２の賦形剤として使用した場合にＨｅＬａ細胞におけるｒＡＡＶ導入効率の差はなかった。Ｂ．任意の細胞株もしくは系；または一次細胞を用いることができるが、ｒＡＡＶ導入を高める追加の因子をスクリーニングするためにＨｅＬａ細胞を選択した。因子は、抗炎症薬（例えばデキサメタゾンおよびサイクロスポリンＡ）、ＮＳＡＩＤ（例えばイブプロフェン）、β−アドレナリン製剤（例えばアルブテロール）、抗生物質（例えばシプロフロキサシン、コリソン（ｃｏｌｉｓｏｎ）、ゲンタマイシン、トブラマイシンおよびエポキソマイシン）、脂質低下薬（例えばロバスタチン、シムバスタチンおよびエイコサペンタエン酸）、食品添加剤（例えばタンニン酸）、ウイルスプロテアーゼインヒビター（例えばノルビル、カレトラおよびビラセプト）、化学療法薬（例えばアクラシノマイシンＡ、ドキソルビシン、ドキシル、カンプトテシン、タキソールおよびシスプラチン）およびプロテアーゼインヒビター（例えばキモスタチン、ベスタチンおよびクロロキン）のような様々なクラスから選択した。試験する因子の濃度の範囲は、溶解性プロファイル、毒性プロファイルおよび／もしくはインビボで以前に用いられた濃度に基づいて選択した。
ＨｅＬａ細胞に因子、例えばリトナビル（ノルビル）（１、１０および１００μＭ）、サイクロスポリンＡ（２．５、２５および２５０μｇ／ｍｌ）、エポキソミシン（１、１０および５０μＭ）、アクラシノマイシンＡ（５、５０もしくは５００μＭ）、キモスタチン（１、１０および１００μＭ）、ベスタチン（１、１０および１００μＭ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）（０．１、１および１０μＭ）、カンプトテシン（カンプトサル（ｃａｍｐｔｏｓａｒ）（１、１０および１００μＭ）、エイコサペンタン酸（１、１０および１００μＭ）、タンニン酸（２、２０、２００および２０００μＭ）、シムバスタチン、プロドラッグ（２、２０および２００μＭ）、シスプラチン（０．２、２および２０μｇ／ｍＬ）およびクロロキン（４、４０および４００μＭ）の存在下で１００ｒＡＡＶのＭＯＩで２時間感染させた。感染後４８時間で、細胞を分析用に採取した。ｒＡＡＶ導入は、細胞培養物から培地を取り除き、１００μＬのレポーター溶解バッファー（ＲＬＢ）を加え、そして凍結することにより測定した。上清を融解し、そしてマイクロチューブに移し、さらに２回凍結融解し、そして１０分間遠心分離により清澄化し、そして次に照度計上でレポーター遺伝子発現に関して分析した。タンパク質をブラッドフォード分析により決定し、そして結果をｍｇタンパク質当たりの相対発光単位（ＲＬＵ／ｍｇ）として表した。データを図１Ａ〜Ｅに示す。
ドキソルビシン、エポキソミシンおよびカンプトテシンは全て、試験した用量範囲で形質導入の用量依存的増加を示した。試験した用量でドキソルビシンおよびエポキソミシンは形質導入効率をそれぞれ１６９倍および１２０倍まで増加し、カンプトテシンは形質導入効率を１５倍増加し、タンニン酸は形質導入効率を１７倍増加し、シスプラチンは形質導入効率を１６倍増加し、そしてシムバスタチンは形質導入効率を４倍増加した。
シムバスチンおよびロバスタチンに関して、これらの薬剤はプロドラッグとして調合され、そして活性化された開環型への転化は確認されず、それが陰性結果に寄与した可能性があることに留意すべきである。同様に、ドキソルビシンのリポソーム製剤、ドキシルは、細胞培養細胞に生物学的に利用可能であることを確認することができなかった。従って、統計的に陰性と最初にスクリーニングされた因子は、細胞培養細胞に容易に生物学的に利用可能ではない製剤を反映する可能性があり、または限られた用量範囲もしくは暴露時間を反映する可能性がある。
インビボおよびインビトロでＮＦ−ＫＢ媒介シグナル伝達を阻害することが既知である
放線菌類から単離された天然に存在する抗生物質、エポキソミシンは、プロテオソーム特異的キモトリプシン様プロテアーゼを阻害することによりプロテオソームを阻害する。トポイソメラーゼＩＩを阻害し、そして核酸合成を阻害する抗腫瘍抗生物質、ドキソルビシンは、２０Ｓプロテオソームにより細胞質から核にトランスロケーションされる。可逆的ＤＮＡトポイソメラーゼインヒビター、カンプトテシンは、ユビキチン／２６Ｓプロテオソーム経路によってトポイソメラーゼをダウンレギュレーションする。シムバスタチンは、プロテオソーム活性を調節する因子であり、タンニン酸はキモトリプシン様活性を阻害し、そして癌化学予防薬であり、そしてシスプラチンはＤＮＡを架橋する化学療法薬である。
Ｃ．ｒＡＡＶ導入効率を高める因子の組み合わせが、組み合わせて使用する場合に相乗もしくは相加効果を有するかどうかを決定するために、細胞をプロテオソームモジュレーター、ドキソルビシンおよびプロテオソームインヒビターＺ−ＬＬＬもしくはＬＬｎＬと接触させた。スプライシングベクターおよび偽型ｒＡＡＶを包含する、異なるＡＡＶベクターを試験した。利用するウイルスストックは、下記のとおりであった：Ａｖ２ＲＳＶｌｕｃ、５ｘ１０８粒子／μｌ；Ａｖ２ＲＳＶｌｕｃＣａｐ５（ＡＶ２／５ＣＭＶＬｕｃとも呼ばれる）、２ｘ１０９粒子／μｌ；Ａｖ２ＣＭＶｌｕｃ、１．３ｘ１０９粒子／μｌ；およびＡｖ２ＣＭＶｌｕｃＣａｐ５、１．１ｘ１０９粒子／μｌ。因子の組み合わせは、形質導入の効率を決定するために単独で使用する因子と比較した。単独で用いる場合にＬＬｎＬは４０、２００もしくは４００μＭで、Ｚ−ＬＬＬは４μＭで、そしてドキソルビシンは０．５もしくは１μＭで使用した。ＬＬｎＬとドキソルビシンとの組み合わせを使用する場合には、ＬＬｎＬを４、１０、２０、４０、２００もしくは４００μＭで、そしてドキソルビシンを１もしくは５μＭで使用した。極性気道上皮、ＨｅＬａ細胞もしくはフェレット繊維芽細胞の頂端面をこれらの因子およびｒＡＡＶ（ウェル当たり５ｘ１０９粒子）と接触させた。
結果は、ＬＬｎＬが４０μＭでＨｅＬａ、フェレット繊維芽細胞および極性上皮細胞そして２００〜４００μＭでＡ５４９細胞において形質導入を高めることを示した。ドキソルビシンは、１μＭでＨｅＬａおよびフェレット繊維芽細胞そして５μＭでＡ５４９もしくは極性気道細胞において形質導入を高め、そしてフェレット繊維芽細胞にｌａｃＺスプライシングベクターを感染させた場合に形質導入を約１００倍高めた。ドキソルビシンはまた、ＬＬｎＬより大きい程度にＡＡＶ２およびＡＡＶ５導入も高めた。ドキソルビシンおよびＬＬｎＬを共投与した場合に相乗効果が認められた。
因子投与がない場合に、極性上皮細胞の頂端面からの形質導入は、ＡＡＶ２キャプシドを有するＡＡＶベクターよりＡＡＶ５キャプシドを有するＡＡＶベクターで大きかった。ドキソルビシンの存在下で、２００〜６００倍の誘導が極性細胞のＡＡＶ２およびＡＡＶ５頂端感染に認められた。従って、本発明の因子は、血清型、偽型および複数ベクター戦略においてを包含する、ｒＡＡＶ導入を高めることができる。
Ｄ．マウスへのドキソルビシンのリポソーム製剤、ドキシル（２、１０もしくは２０ｍｇ／ｋｇの範囲で投与する）の静脈内投与と併せたオスＢａｌｂ／ｃマウスへの１０１１のＡＶ２ＦＬＡＧ−ｌｕｃ ｒＡＡＶ粒子の気管内投与は、２０ｍｇ／ｋｇ用量のドキシルで７日までにＡＶ２ＦＬＡＧ−ｌｕｃ形質導入を２ｌｏｇ高めた。特に、２０ｍｇ／ｋｇのドキシルで、形質導入は７日までに平均して６７倍そして３０日までに４倍高められた（図２）。以前にドキシルは細胞系スクリーニングにおいて陰性を示し、一方、遊離化合物ドキソルビシンは細胞系スクリーニングにおいて陽性を示したことは注目に値する（図１Ａ〜Ｅ）。リポソーム製剤は、それらをインビボでより生物的に利用可能にするそれらの増大した安定性もしくは循環半減期を包含するインビボ使用に望ましい特性を有する。これらの同じ特性は、リポソーム製剤を上記のようなインビトロスクリーニングにはあまり望ましくないようにする。従って、当業者は、所望の用途にそれらを適応させるために本発明の因子の製剤戦略を考案することができる。製剤設計に加えて、当業者は、ｒＡＡ
Ｖ導入効率を最大にするために送達の経路を適応させることができる。
さらなる実験において、ＦＶＩＩＩをコードする偽型ｒＡＡＶベクターをオスＲａｇ−１マウスにおいて試験した。当該技術分野において記述されているように、正常マウスは血清におけるタンパク質検出を分かりにくくする可能性があるヒトＦＶＩＩＩのインヒビターを生産するのでＲａｇ１マウスを使用した。Ｒａｇ−１マウスは、これらのインヒビターを生産するのに必要な経路に欠陥があることが既知であり、従って、インヒビターを生産しないか、より低いレベルのインヒビターを生産するか、もしくはインヒビターの発生に長期間を有する。血清型５型キャプシドタンパク質ならびに最小肝臓特異的要素ＨＮＦ３／ＥＢＰおよびヒトＢドメイン欠失ＦＶＩＩＩ遺伝子を含んでなる異種導入遺伝子に隣接するＡＡＶ−２の５’−３’ＩＴＲを含有するｒＡＡＶベクターを構築した（第二の構築物は、それがＢドメイン欠失イヌＦＶＩＩＩ遺伝子を含有することを除いて同一であった）。動物に１０１２のｒＡＡＶベクター粒子を０日に２０ｍｇ／ｋｇのドキシルと同時に側尾静脈を介して静脈内に投与した。循環する生物学的に利用可能なＦＶＩＩＩ活性は、ＥＬＩＳＡおよびＣｏａｔｅｓｔを包含する当該技術分野において既知である技術により３１、５３および９０日に血清から測定した。図３に示すデータは、ドキシルで処理していない動物が、３１および５３日に０．９９ｎｇ／ｍｌの範囲の辛うじて検出可能なレベルのＦＶＩＩＩを有し、それが９０日までに０．１３ｎｇ／ｍｌまで減少したことを示す。対照的に、２０ｍｇ／ｋｇのドキシルを投与した動物は、４０倍を超えるレベルのＦＶＩＩＩタンパク質を有した。興味深いことに、９０日にドキシルで処理していない動物において見られるＦＶＩＩＩタンパク質の減少（０．１３ｎｇ／ｍｌ）は、ドキシルで処理した動物において明白ではなく（４０．１６ｎｇ／ｍｌ）、ドキシルがｒＡＡＶ導入をより短期間で明らかなように高めただけでなく、本発明の因子がまた発現を延長したことも示す。ドキシルがｒＡＡＶ導入に影響を及ぼしており、そして単にＦＶＩＩＩタンパク質翻訳もしくは安定性に影響を及ぼしていないことを示すために、５３日の時点で肝臓組織にＲＳ−ＰＣＲを行った。表１に個々の動物に示すデータは、ドキシルで処理した動物において認められるＦＶＩＩＩタンパク質の増加が、検出されるｍＲＮＡのレベルと相関関係があることを示す。
ドキシルによりもたらされるインビボｒＡＡＶ導入の増加を、当該技術分野において記述されているようなサイトキサン媒介耐性化戦略を利用してヒトＦＶＩＩＩタンパク質に耐性化したオスＦＶＩＩＩノックアウトマウスにおいて上記の同じベクターおよびプロトコルを利用してさらに確かめた。動物をｒＡＡＶベクター送達の時点で開始する５０ｍｇ／ｋｇのサイトキサンの週1回の注射で処理した。表２に示すデータは、１４および２５日にＥＬＩＳＡもしくはＣｏａｔｅｓｔにより試験した場合に前述の結果を裏付け、すなわち、ドキシルを投与した動物は、ｒＡＡＶ導入の少なくとも１０倍の増大を示した。
Figure 2006521825
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従って、プロテオソームもしくはユビキチン経路における分子のような、細胞内ＡＡＶ輸送経路における分子と、それらの分子に結合することおよび／もしくはそれらの活性を阻害することにより相互作用する因子は、ｒＡＡＶ導入を高めるために有用である。
インビトロおよびインビボでの極性気道上皮のｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−５導入にお
けるプロテアソーム関与
ＬＬｎＬのような小さいトリペプチドインヒビターでのプロテアソームの阻害は、インビトロで極性ヒト気道上皮そしてインビボでマウス肺の両方の頂端膜からのｒＡＡＶ−２導入を顕著に増大することができる（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ＡＡＶ−５は、気道上皮の頂端膜に対するより高い指向性、およびその上の代わりの受容体を有することが報告されているので、ｒＡＡＶ−５での頂端面からの気道上皮の増加した形質導入は、改変されたプロテアソーム関与のためである可能性がある。プロテオソームモジュレーターおよびプロテオソームインヒビターの共投与は、細胞タイプに依存して両方の血清型の形質導入を増大することが見出された（図４〜６）。
気道形質導入における血清型特異的な違いをよりよく理解するために、極性ヒト気道上皮培養物およびマウス肺におけるｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−５導入へのプロテアソームインヒビターの効果を調べた（図８）。導入遺伝子に隣接するＡＡＶ−２からの５’および３’ＩＴＲを含有するプロウイルス構築物をＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５キャプシドの両方にパッケージングしてルシフェラーゼ導入遺伝子を発現するＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃおよびＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃＣａｐ５ウイルスを作製した。ｒＡＡＶ−２は、頂端面対側底面からの形質導入の著しい違いを示したが、ｒＡＡＶ−５はそうではなかった。ＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃでの形質導入は、感染後５および１４日でそれぞれ側底膜から３６倍および１０３倍大きかった。対照的に、ＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃＣａｐ５は、両方の時点で同様の効率で頂端膜および側底膜から上皮に形質導入した。
ＬＬｎＬは、頂端面および側底面からのＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃ形質導入を増大する。しかしながら、ＬＬｎＬの使用は、ウイルスを頂端面に使用した場合にのみ選択的にＡＶ．ＲＳＶｌｕｃＣａｐ５導入を１２倍増加した。これらの結果は、細胞極性によりもたらされる様々なＡＡＶキャプシド侵入経路に対するプロテアソームの関与の興味深い違いを示唆する。
プロテアソームインヒビターＺ−ＬＬＬは、マウス肺においてｒＡＡＶ−２での長期（５ヶ月）形質導入を誘導することが見出された。ＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃＣａｐ５のインビボ形質導入効率を決定するために、マウスに６ｘ１０１０粒子のＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃＣａｐ５を単独で（コントロール）もしくは２００μＭのＺ−ＬＬＬ、２００μＭのドキソルビシンもしくは２００μＭのＺ−ＬＬＬと２００μＭのドキソルビシンと組み合わせて鼻吸引により感染させた（グループ当たり１２匹のマウス）。Ｚ−ＬＬＬの共投与は、全肺ルシフェラーゼ発現を感染後１４日（２週）および４２日（６週）でそれぞれ１７．２倍および２．１倍誘導した（図９）。興味深いことに、ルシフェラーゼ発現は、感染後３ヶ月でさらに減少していた（図１０）。
ドキソルビシンの共投与は、２週でＺ−ＬＬＬのものよりほぼ１０倍高いレベルで全肺ルシフェラーゼ発現を誘導した。ドキソルビシンはまた、２週でＺ−ＬＬＬより高いレベルで気管および気管支ルシフェラーゼ発現も誘導した。６週で、同様のパターンがＺ−ＬＬＬおよびドキソルビシンのみで認められ、しかしながら、ルシフェラーゼレベルは、ウイルス、Ｚ−ＬＬＬおよびドキソルビシンを共投与したマウスの気管および気管支において相加的より大きかった。感染後３ヶ月までに、相乗作用はもはや認められなかった。これらの結果は、ｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−５でのインビボ研究間のＺ−ＬＬＬによる誘導の反応速度論および寿命における著しい違いを示唆する。インビボ形質導入は、ｒＡＡＶ−２と比較してｒＡＡＶ−５で顕著により効率がよいので、プロテアソーム活性を改変することは、ｒＡＡＶ−５での形質導入の速度を単に高めることができる。ｒＡＡＶ−２の場合、この基本速度はインビボで頂端膜から顕著に減少され、プロテアソームインヒビターによる形質導入のより持続した増大を与えることができる。
これらの結果はまた、異なる結果を得るための異なる因子およびベクターの使用も強調する。例えば、長期にわたる特定の細胞における導入遺伝子発現の着実な増加をもたらす因子およびベクターは、ある種の疾患もしくは症状に有用であることができ、一方、導入遺伝子発現の高バースト（ｈｉｇｈ ｂｕｒｓｔ）をもたらす因子およびベクターは、血友病のような代謝性疾患に有用であることができる。
ユビキチン化およびプロテアソーム活性は、タンパク質分解および細胞内輸送を制御する無数の細胞内プロセスに影響を及ぼすことができる。ユビキチン／プロテアソーム系により制御されるｒＡＡＶ導入の分子機序を同定するために以下の実施例を設計する。これらの研究は、ｒＡＡＶ導入における律速段階に影響を与える経路および／もしくは分子のより明確な理解をもたらすことができ、そしてまたｒＡＡＶのプロセシング（すなわち、エンドソーム脱出、核への輸送およびアンコーティング）、従って形質導入を高めるさらに有用な因子を同定するために用いることもできる。
ｒＡＡＶの血清型のエンドソーム経路
気道上皮細胞系におけるｒＡＡＶ輸送の細胞内経路（１つもしくは複数）を描くために、蛍光標識したｒＡＡＶおよび細胞内エンドソームマーカーでの共局在化技術、様々なエンドソームコンパートメントの生化学的精製、ならびに外因的に発現される特定のドミナントネガティブＲａｂタンパク質を使用するエンドソーム移動の阻害を用いて２型および５型ｒＡＡＶの細胞内輸送の経路を決定する。Ｒａｂは、様々な細胞内ドメインへのエンドソームコンパートメントのプログラム化された送達を与える低分子量ＧＴＰアーゼであり、そしてＧＴＰに依存する機序によって膜融合を促進する。二重標識したｒＡＡＶの色変化に基づいてｒＡＡＶが脱出するエンドソームコンパートメントを決定するために蛍光色素消光抗体の単一細胞微量注入を用いた。ｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ５は、多数の細胞内コンパートメント（後期エンドソーム［ＬＥ］、ゴルジ、核周辺リサイクリングエンドソーム［ＰＮＲＥ］）を通って移動することができるが、これらのコンパートメントのうち１つだけが細胞質への出口点である。
Ａ．ｒＡＡＶ２の細胞内蓄積
以前の研究は、Ｃｙ３で標識したｒＡＡＶ２が、Ｈｅｌａ細胞において視覚化した場合にＦＩＴＣで標識したトランスフェリンと共局在化するが、ＦＩＴＣで標識したデキストランとは共局在化しないことを示している（Ｂａｒｔｌｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｓａｎｌｉｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ウイルスは感染後１時間までに核に蓄積し始めるが、かなりの量が各周辺組織に蓄積する。トランスフェリンは、受容体の細胞内選別の細胞内倉庫である、ＰＮＲＥ（各周辺リサイクリングエンドソームとも呼ばれる）を通って移動することが既知である。従って、ｒＡＡＶ２もまた、このコンパートメントを通って移動する可能性がある。
Ｒａｂタンパク質には、小胞選別および膜融合におけるそれらの重要性が周知である一群の低分子量ＧＴＰアーゼが包含される。これらのＲａｂタンパク質の多くは、様々な細胞内選別経路のマーカーとして詳細に特性化されている。ｒＡＡＶ２輸送をトランスフェリン選別経路（Ｒａｂ５→Ｒａｂ４→Ｒａｂ１１）（Ｒｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｔｒｉｓｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６）と比較する細胞内マーカーとしてのＧＦＰ−Ｒａｂ融合タンパク質。
方法
ラベリング
ｒＡＡＶを以前にＤｕａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）およびＳａｎｌｉｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ．（２０００）に記述されているように１価のＣｙ３蛍光色素で標識した。典型的に約２個の蛍光色素が、機能活性の８５％より大きい保持を有してｒＡＡＶキャプシドを標識する。標識したｒＡＡＶの品質管理分析を容易にするために、ルシフェラーゼ遺伝
子を発現するｒＡＡＶを用いた。全てのラベリング方法では、以前にＤｕａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）に記述されているように三重トランスフェクションによりｒＡＡＶを作製する。ラベリング方法は、遊離の蛍光色素からウイルスを単離するためにＧ５０セファデックスゲル濾過工程を含むように改変した。次に画分をスロットブロットおよび機能活性により評価し、そして次にピーク画分をＥＭにより分析した。
細胞内ＧＦＰ標識エンドソームマーカー
Ｒａｂ４、５、７、９および１１エンドソーム、ゴルジおよびプロテアソームを包含する様々な細胞内コンパートメントを示すＮ末端ＧＦＰ標識タンパク質を発現するｃＤＮＡ、ならびにＧＴＰ加水分解（各Ｒａｂにより媒介されるエンドソーム融合に必要とされる機能）を妨げるこれらのＲａｂの各々のドミナントネガティブ構築物を得た（表３）。
Figure 2006521825
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ＧＦＰ標識ＲａｂコンパートメントとＣｙ３−ｒＡＡＶ２との共局在化
ＨｅＬａ細胞を標準的なプロトコルおよびリポフェクトアミン／ＤＮＡ複合体を用いてＧＦＰ標識Ｒａｂ４、Ｒａｂ５およびＲａｂ１１発現構築物でトランスフェクションした。トランスフェクション後４８時間で、ＨｅＬａ細胞にガラスカバースリップ上でＣｙ３−ｒＡＡＶ２を５０，０００粒子／細胞のＭＯＩで４℃で１時間感染させた。次に細胞を十分に洗浄し、そして分析用に固定するかもしくは３７℃に１時間移した。次に、サンプルをＣｙ３およびＧＦＰシグナルの共局在化に関して共焦点顕微鏡検査により評価した。結果および結論
ＧＦＰ標識Ｒａｂ５およびＲａｂ４は、初期エンドソームリサイクリングコンパートメント内のそれらの重複する分布（Ｔｒｉｓｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９）と一致してトランスフェクション後４８時間でＨｅＬａ細胞における同様の分布パターンを示す。対照的に、ＰＮＲＥを示すＲａｂ１１−ＧＦＰは、細胞内で非常に独特な分布を示した。Ｃｙ３−ｒＡＡＶ２およびＲａｂ１１−ＧＦＰでの共局在化実験は、感染後１時間で大きいパーセンテージの重複を示す。しかしながら、予想されるように、３７℃で開始されたエンドサイトーシスの前に結合したＣｙ３−ｒＡＡＶとシグナルの重複は検出されなかった。これらの結果は、ｒＡＡＶ２がＲａｂ１１コンパートメントを通って移動することを示唆する。ＨｅＬａ細胞において、このコンパートメントは主にＰＮＲＥの境界を定める。しかしながら、Ｒａｂ１１はまたＰＮＲＥからゴルジへの移動を制御することも示されているのでトランス−ゴルジといくらかの重複が存在する。この可能性を評価するためにゴルジ特異的マーカーＴＧＮ−３８を用いる。Ｃｙ３とＲａｂ１１シグナルとの間のかなりの程度の重複が認められたが、特定の細胞内および核内ドメインがシグナルの重複のない領域を含有した。これらの細胞内ドメインは、ｒＡＡＶ２がそれらを通って移動する可能性がある他の潜在的エンドソームコンパートメントである（すなわち、後期エンドソーム、ゴルジ、リソソーム）。
Ｂ．Ｒａｂ５およびＲａｂ１１とｒＡＡＶとの局在化
ｒＡＡＶの輸送パターンおよびウイルスが細胞を通って移動する方法をプロテアソームインヒビターが改変する効果を評価するためにエンドソーム精製技術を用いた。
方法
密度勾配
エンドソームの混合集団をそれらのサイズおよび浮遊密度に従って単離するために密度
勾配遠心分離を用いた。イオジキサノールは、広範囲の密度にわたって低い粘性で等浸透圧条件を提供することができるので、それを分画用の媒質として使用する。
小胞単離
１５０ｍｍの皿上で培養したＩＢ２、ＨｅｌａもしくはＡ５４９細胞の融合性単層を１０ｍＭのＨｅｐｅｓを補足したあらかじめ温めたＭＥＭにおいて０．８ｍｇ／ｍｌのビオチン−トランスフェリン（Ｓｉｇｍａ Ｃｏ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）もしくはＡＶ２Ｌｕｃ（ＭＯＩ＝１０，０００）と３７℃で３０分間インキュベーションした。細胞をトリプシン処理により採取し（これは、外側の、膜に結合したｒＡＡＶ２を取り除く（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００））、よく冷えたＰＢＳで３回洗浄し、そしてよく冷えた均質化バッファー（０．２５Ｍのショ糖、１０ｍＭのトリエタノールアミン、１ｍＭのＥＤＴＡ、１ｍＭのＰＭＳＦ、１００μｇのアプロチニン）に採取した。次に細胞をＤｕａｌｌ組織粉砕機において均質化し、そして１０００ｘｇで４℃で１０分間遠心分離した。細胞内小胞コンパートメントおよび膜を含有するが、核を含有しない上清を脱核上清（ｐｏｓｔ−ｎｕｃｌｅａｒ ｓｕｐｅｒｎａｔａｎｔ）（ＰＮＳ）と称した。次に、ＰＮＳを３２％の最終濃度を得るように６０％のイオジキサノール溶液と合わせ、そして次にＳＷ５５Ｔｉ遠心管に載せ、そして２４％および２０％のイオジキサノールの２段階勾配をかぶせた。全てのイオジキサノール溶液は、均質化バッファーにおいて調製した。サンプルを３０，５００ｒｐｍで４℃で１時間遠心分離した。小胞画分は２４％／２０％イオジキサノールの間の相間に移動するので４℃で遠心管の上から下へ画分を集めた（３２０〜５００μｌ／画分）。
ウェスタンブロット分析
５０μｌの各画分をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上に載せ、そしてＲａｂ５（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）、Ｒａｂ１１（Ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および／もしくはビオチン−トランスフェリン（Ｚｙｍｅｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）に関してウェスタンブロットした。ウェスタンブロットは、ＨＲＰ結合ストレプトアビジンもしくは二次抗体を使用してＥＣＬ化学発光を用いて発色させた。
ウイルスＤＮＡのＴａｑＭａｎ ＰＣＲ定量
ＡＶ２ＬｕｃＤＮＡ定量のためのＰＣＲプライマーおよびＴａｑｍａｎプローブは、Ｐｒｉｍｅｒ Ｅｘｐｒｅｓｓソフトウェアプログラムを用いて選択した。フォワードプライマー、Ｐ１（５’−ＴＴＴＴＴＧＡＡＧＣＧＡＡＧＧＴＴＧＴＧＧ−３’；配列番号：１）およびリバースプライマー、Ｐ２（５’−ＣＡＣＡＣＡＣＡＧＴＴＣＧＣＣＴＣＴＴＴＧ−３’；配列番号：２）は、ＡＶ２ＬｕｃＤＮＡのプロモーター領域中の３２ｂｐフラグメントを増幅するために選択した。Ｔａｑｍａｎプローブ（５’−ＡＴＣＴＧＧＡＴＡＣＣＧＧＧＡＡＡＡＣＧＣＴＧＧＧＣＧＴＴＡＡＴ−３’；配列番号：３）は、製造業者により概説される一般規則に従って設計した。Ｔａｑｍａｎプローブは、５’レポーター色素、６−カルボキシフルオレセイン（ＦＡＭ）および３’クエンチャー色素、６−カルボキシテトラメチルローダミンを保有し、そしてＧｅｎｏｓｙｓにより合成された。２５μｌのＰＣＲ混合物は、１０μｌのＡＶ２Ｌｕｃ勾配サンプル、プライマーＰ１およびＰ２（最終濃度５００ｎＭ）、Ｔａｑｍａｎプローブ（最終濃度１００ｎＭ）および１２．５μｌのＴａｑｍａｎユニバーサルマスターミックス（ＰＥ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）からなった。ＡＶ２ＬｕｃＤＮＡ増幅では、５０℃で２分間を１サイクル、そして９５℃で１０分間を１サイクルの後に、４０サイクルにわたって９５℃で１５秒そして６０℃で１分からなる２段階ＰＣＲ方法を続けた。増幅、データ収集および解析は、ＡＢＩ Ｐｒｉｓｍ ７７００配列検出器システム（Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄｅｔｅｃｔｏｒ Ｓｙｓｔｅｍ）（ＰＥ ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて行った。精製されたＡＶ２Ｌｕｃ、コントロール、および細胞内分画からのサンプルの全ての
標準希釈物を二重反復で実施し、そしてＡＶ２Ｌｕｃを定量するためにコピー数の平均値を用いた。ＡＶ２Ｌｕｃの標準曲線は、傾きが−３．７４〜−３．３２の間でありそして相関係数が＞０．９９０であった場合に受け入れられた。
結果および結論
精製されたエンドソームの細胞内分画は、前負荷ビオチン−トランスフェリンを含有する損なわれていないエンドソームを単離することにより示された。予想されるように、トランスフェリン免疫反応性は、ウェスタンブロッティングにより検出した場合にＲａｂ５およびＲａｂ１１コンパートメントと共分画する（画分３および４）。チューブの底の残留免疫反応性は、溶解したエンドソームおよびＰＮＳにおける遊離のＲａｂもしくはトランスフェリンに相当する。無負荷細胞のＰＮＳへの遊離のビオチン−トランスフェリンの添加は、ピーク小胞画分における検出可能な免疫反応性をもたらさない（データは示さない）。
この方法がウイルスを含有するエンドソームを単離するために用いることができるかどうかを調べるために、同様の評価をＡＶ２Ｌｕｃ感染Ｈｅｌａ細胞（ＭＯＩ＝１０，０００）に行った。ピークＲａｂ５／Ｒａｂ１１陽性小胞画分（＃２〜４）は、３７℃で３０分の感染後に、内在化したｒＡＡＶゲノムと共単離する。約５０％のｒＡＡＶ ＤＮＡがエンドソーム画分内に含まれた。また、チューブの底のＰＮＳにもかなりの部分のｒＡＡＶ ＤＮＡがあった。これは、おそらく、エンドソームから出ている遊離のｒＡＡＶもしくはプロセシング中のエンドソーム溶解のいずれかに相当する。しかしながら、実験プランに提示するさらに洗練された方法を使用せずに、ＰＮＳに残っているベクターがエンドソームから出ていたという解釈は、注意深く解釈されるべきである。
Ｃ．精製のためのＨＡ標識Ｒａｂタンパク質の使用
細胞を通したトランスフェリン移動を研究するためのＲａｂ５およびＲａｂ１１エンドソームコンパートメントの免疫親和性単離を記述する以前の報告に基づいて（Ｔｒｉｓｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９）、ＨＡ標識Ｒａｂマーカータンパク質を用いて多数のエンドソームコンパートメントを免疫単離するために新規な方法を開発した。以下に記述するようなこれらのＨＡ標識構築物は、それらのＲａｂ対応物（ｃｏｕｎｔｅｒｐａｒｔｓ）の内在性部位にならびにＲａｂ５コンパートメントを免疫単離する我々の能力を区分化する（ｐａｒｔｉｔｉｏｎ）。
方法
Ｎ末端ＨＡ標識Ｒａｂは、ＨＡエピトープを含有するフォワードプライマーを用いてＲａｂ５、Ｒａｂ７およびＲａｂ１１のＰＣＲにより作製した。ＣＭＶに導かれるプラスミド発現構築物をリポフェクトアミントランスフェクション後にＨｅｌａ細胞においてＨＡ−Ｒａｂ５およびＨＡ−Ｒａｂ１１を発現するために用いた。トランスフェクション後７２時間で、エンドソーム画分を精製し、そしてイオジキサノール勾配からの様々な画分をＨＡ、Ｒａｂ５およびＲａｂ１１のウェスタンブロッティングにより評価した。次に、エンドソームの混合集団を下記の免疫親和性単離戦略に使用した。
ＨＡ標識Ｒａｂ５エンドソームコンパートメントの免疫親和性単離
Ｒａｂ５エンドソームは、改変を有する以前の方法（Ｔｒｉｓｃｈｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９９）に基づいて単離した。Ｈｅｌａ細胞にＨＡ−Ｒａｂ５発現プラスミドをトランスフェクションし、そしてピーク小胞画分（＃３、４および５）をイオジキサノール勾配から合わせ、そして抗ＨＡ抗体に結合しているダイナビーズＭ−５００（Ｄｙｎａｌ
Ｉｎｃ）を用いて免疫親和性精製した。二次抗体（４０μｇの抗ウサギ）をゆっくり揺り動かしながら２５℃で２４時間０．１Ｍのホウ酸バッファー（ｐＨ９．５）においてダイナビーズ（４ｘ１０８ビーズ／ｍｌを含有する２００μｌ）に結合させた。次に、ビーズを磁石中に３分間置いて上清を取り除き、そして４℃で５分間０．１％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ／ＰＢＳにおいて３回洗浄した。０．２Ｍのトリス（ｐＨ８．５）／ＢＳＡにおける最後の洗浄は、２４時間行った。最後に、ビーズをＢＳＡ／ＰＢＳに再懸濁し、そして１０
７ビーズ当たり４μｇの一次抗ＨＡ抗体に４℃でＯ／Ｎ結合させ、そしてＢＳＡ／ＰＢＳにおいて洗浄した。様々なＨＡ標識Ｒａｂを発現する２ｘ１０７細胞からの小胞画分（３００μｌ）を２ｍＭのＥＤＴＡ、５％のＢＳＡおよびプロテアーゼインヒビターを含有するＰＢＳにおいて７００μｌの被覆ビーズと混合した。次に、混合物をゆっくりと揺り動かしながら４℃で６時間インキュベーションし、続いて磁気捕捉し、そして同じチューブにおいて３回（各１５分）洗浄した。次に、ビーズおよび濃縮されたエンドソームをＲａｂ５コンパートメントの濃縮を評価するためにウェスタンブロッティング用にＰＢＳに再懸濁した。
結果および結論
外因的に発現させたＨＡ−Ｒａｂ５およびＨＡ−Ｒａｂ１１は、イオジキサノール勾配において典型的にエンドソームを含有する画分に区分化する。外因的に発現させたＨＡ標識融合物と内在性Ｒａｂ対応物との共局在化を評価するために、抗ＨＡ、抗Ｒａｂ５および抗Ｒａｂ１１を用いるピーク小胞画分のウェスタンブロットを行った。ＨＡ免疫反応性は、ＨＡ標識Ｒａｂをトランスフェクションした細胞からのエンドソームにおいてのみ見られた。この免疫反応性は、Ｒａｂタンパク質の各々のピーク免疫反応性と一致した。これらの結果は、標識したＲａｂがエンドソームに適切に組み込み、そして内在性の膜結合Ｒａｂ対応物と区分化することを示した。
抗ＨＡ結合ダイナビーズビーズでの免疫親和性単離戦略を用いて、ＨＡ−Ｒａｂ５でトランスフェクションしたＨｅｌａ細胞からのピークエンドソーム画分（＃４）をＲａｂ５エンドソーム単離に使用した。免疫単離は、１°抗ＨＡおよび２°抗ウサギ抗体の存在下でもしくは特異性のコントロールとして２°抗ウサギ抗体のみで行った。結果は、ＨＡ−Ｒａｂ５マーカーを用いてＲａｂ５含有小胞の約３０％の免疫単離および２°抗ウサギ抗体を単独で用いた場合に検出できない混入を示す。
Ｄ．エンドソーム脱出を追跡するためのｒＡＡＶの二重蛍光色素ラベリング
ｒＡＡＶの細胞内輸送の最も難しいが重要な点の１つは、ビリオンが細胞質に出る正確なエンドソームコンパートメントを決定することである。プロテアソームインヒビターは、エンドソーム脱出の速度および／もしくはｒＡＡＶがそこから細胞質に入るコンパートメントを変えることによりｒＡＡＶ生活環のこの点を調節する可能性がある。
方法
エンドソーム脱出を研究するために、単一細胞イメージングおよび二重標識したｒＡＡＶキャプシド上の２つの蛍光色素の１つに対する消光抗体の微量注入を行った。複数の蛍光色素がｒＡＡＶキャプシドに同様の効率で連結されることができるシステムとしてＭｏｌｅｃｕｌａｒ ＰｒｏｂｅｓからのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒシステムを選択した。３種の色素（Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＲ４８８［緑色］、Ａｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＲ５６８［赤色］およびＡｌｅｘａ ＦｌｕｏｒＲ６４７［青色］）をこの関連で有用として選択した。好ましくは、ｒＡＡＶの二重ラベリングは感染パターンを変えない。また好ましくは、Ａｌｅｘａ−４８８（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）に対する消光抗体の微量注入は、二重標識したｒＡＡＶの蛍光をシフトすることができる。エンドソーム脱出を評価する一般的な方法は、Ａｌｅｘａ−４８８および他の色素の１つで二重標識するｒＡＡＶでの感染後に生細胞の細胞質に抗Ａｌｅｘａ−４８８を注入することである。Ａｌｅｘａ−４８８／５６８二重標識ｒＡＡＶ、黄色から赤色へのウイルスの蛍光のシフト（すなわち、緑色蛍光色素の消光）は、細胞質へのウイルスの移動を示す。この方法は、ｒＡＡＶがそこから細胞質に移動するコンパートメントを評価するためにＧＦＰ標識エンドソームコンパートメントおよび／もしくはドミナントネガティブＲａｂと組み合わせて用いる。
ｒＡＡＶのＡｌｅｘａラベリング．
１価のＡｌｅｘａスクシンイミジルエステル反応性色素（Ａｌｅｘａ−４８８および／もしくはＡｌｅｘａ−５６８）を５０μｌの１Ｍ重炭酸塩に溶解した。０．５ｍｌのＨｅｐｅｓバッファー中の０．５ｘ１０１２粒子（スロットブロットにより決定する）の精製
されたＡＶ２Ｌｕｃを反応混合物に加え、そして２時間インキュベーションした。二重ラベリングを行った場合、等モル量の２つの蛍光色素を用い、そして反応時間を３時間に延長した。標識されたｒＡＡＶ２を排除クロマトグラフィーにより遊離の色素から分離した。ルシフェラーゼアッセイを用いて画分をＨｅＬａ細胞上で感染力価に関して試験した。次に、５つのピーク画分を合わせ、そして蛍光イメージング研究に使用した。イメージング研究を行った。
結果および結論
機能性粒子の評価は、８５％より大きい活性がＡｌｅｘａ色素での標識後に保持されたことを示した（データは示さない）。これは、Ｃｙ３ラベリングで認められた結果と同様であった。Ａｌｅｘ−５６８標識ｒＡＡＶ２を感染させたＨｅｌａ細胞からの結果は、ＧＦＰ標識Ｒａｂ１１コンパートメントとシグナルのかなりの重複を示した。認められる分布は、Ｃｙ３標識ｒＡＡＶ２で見られるものと非常に類似していた。これらの研究から、ｒＡＡＶのＡｌｅｘａラベリングを行うことができ、そしてそれはＣｙ３ラベリングよりわずかに高感度であったと結論付けた。これらの研究では、約３〜４個の蛍光色素が各ｒＡＡＶキャプシド上に標識された。二重ラベリング方法もまたｒＡＡＶを効率よく標識するために適用することができるかどうかを調べるために、Ｈｅｌａ細胞の１時間の感染後に二重Ａｌｅｘａ−４８８／５６８およびＡｌｅｘａ−５６８標識ｒＡＡＶ２を比較する研究を行った。Ａｌｅｘａ−５６８のみと比較した場合に、Ａｌｅｘａ−４８８／５６８シグナルにおける重複を示すこれらの研究は、両方の色素を結合反応に加える場合にｒＡＡＶビリオンの優勢が二重標識されることを裏付ける。
細胞質へのｒＡＡＶのエンドソーム放出を視覚化するアッセイを開発し始めるために、ｒＡＡＶがいったん細胞質に入ると抗Ａｌｅｘａ−４８８の単一細胞注入が二重標識Ａｌｅｘａ−４８８／５６８からの緑色蛍光を消光できるかを決定した。これらの実験からの結果を図１７Ｃに示し、そして抗Ａｌｅｘａ−４８８の注入後の感染後２時間でのＨｅｌａ細胞におけるＡｌｅｘａ−４８８／５６８二重標識ＡＶ２Ｌｕｃの蛍光を表す。３個の細胞を視野に示し、これらのうち２個に抗体を微量注入した（閉じた矢じり）。この研究から、Ａｌｅｘａ−５６８の赤色チャンネル蛍光をそのままにしながら、Ａｌｅｘａ−４８８蛍光のレベルは抗Ａｌｅｘａ−４８８の注入により顕著に消光されることが明らかである。対照的に、両方の蛍光色素の蛍光は、未注入細胞においてまったく高いままである（開いた矢印）。注入細胞における残留Ａｌｅｘａ−４８８蛍光は、抗体結合から保護されたエンドソームコンパートメントになお残留するウイルスと解釈される。これらの結果は、かなりの部分のｒＡＡＶが感染後２時間までに細胞質に遊離している可能性があることを示唆する。
Ｅ．ｒＡＡＶ−２の細胞内輸送パターンは、顕著な細胞タイプ特異性を示す
細胞タイプ間で異なる可能性があるｒＡＡＶ−２導入の細胞内機序をさらに調べるために、ＨｅＬａおよびＩＢ３細胞の形質導入後にＣｙ３−ｒＡＡＶ−２の免疫蛍光局在化を行った。ｒＡＡＶ−２は同様の効率でこれら２つの細胞タイプに侵入することにもかかわらず、ＨｅＬａ細胞はＩＢ３細胞よりかなりｒＡＡＶ−２で形質導入可能である。しかしながら、ＩＢ３細胞は、形質導入のトリペプチジルプロテオソームインヒビター誘導にＨｅＬａ細胞よりはるかに高い応答性を示す。形質導入におけるこれらの違いは、ＨｅＬａおよびＩＢ３細胞間のｒＡＡＶ−２の細胞内輸送パターンにおけるバリエーションが反映する可能性がある。
方法
ルシフェラーゼを発現するｒＡＡＶ２をＣｙ３で標識し、そしてカラムクロマトグラフィーにより精製した。Ｎ末端ＥＧＦＰ−Ｒａｂ融合物が作製されるようにＲａｂ１１、Ｒａｂ７およびＲａｂ９をｐＥＧＦＰ−Ｃ３ベクターにクローン化した。ＩＢ３およびＨｅＬａ細胞をリポフェクトアミンを用いて様々なＥＧＦＰ標識Ｒａｂでトランスフェクションし、そしてＣｙ３標識ｒＡＡＶ−２を１０，０００粒子／細胞のＭＯＩで４℃で３０分間感染させた。次に細胞を洗浄し、そして３７℃に３０分〜２時間移した。細胞を固定し
、そして蛍光顕微鏡検査により評価した。
結果
Ｃｙ３標識ｒＡＡＶ−２がＨｅＬａおよびＩＢ３細胞の感染後に蓄積した主要な小胞コンパートメントを評価するために蛍光顕微鏡検査を用いた。Ｃｙ３−ＡＡＶ−２およびＥＧＦＰ−Ｒａｂ１１のかなりの程度の共局在化が、感染後３０分から２時間までにＨｅＬａ細胞において認められた。このパターンは、しかしながら、ＩＢ３細胞では認められなかった。対照的に、Ｃｙ３標識ｒＡＡＶ−２は、ＩＢ３細胞においてＥＧＦＰ−Ｒａｂ９と主に共局在化された。ＨｅＬａ細胞において、Ｃｙ３−ＡＡＶおよびＥＧＦＰ−Ｒａｂ９の共局在化の程度は顕著ではなかった。これらの結果は、ｒＡＡＶ−２が細胞タイプ特異的に細胞内コンパートメントの多様性によって移動することを示唆する。
ｒＡＡＶの改変された輸送
プロテアソーム調節因子は、以下の機序：１）ｒＡＡＶが、細胞内輸送の経路を変えずにそれが細胞質に現れる主要コンパートメントに蓄積する速度を増加すること；２）それが細胞質に現れるコンパートメントにおけるより効率のよい蓄積をもたらすようにｒＡＡＶ細胞内輸送の経路を改変すること；３）ｒＡＡＶがエンドソームコンパートメントから抜け出る効率を増加すること；および／もしくは４）細胞質における遊離のｒＡＡＶの核輸送の速度を高めることの１つもしくはそれ以上によってｒＡＡＶ導入を増加するように働く。
いくつかの系統の証拠は、プロテアソームインヒビターが、核へのウイルス輸送の速度を増加すること（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）および／もしくはキャプシドのウイルスプロセシングを増大すること（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）によりｒＡＡＶ導入を高めるように働き得ることを示唆する。第一に、トリペプチドＬＬｎＬおよびＺ−ＬＬＬのようなプロテアソームインヒビターは、１）ウイルスのエンドサイトーシス、２）細胞内のウイルスＤＮＡの安定性もしくは３）導入遺伝子発現を導くプロモーター活性を増大することなしにｒＡＡＶ２もしくはｒＡＡＶ５の両方のウイルスの形質導入を高める（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ，２０００；Ｙａｎ ｅｔ ａｌ，２００２）。第二に、プロテアソームインヒビターは、極性ヒト気道上皮の感染後１週までに加え、そしてなお形質導入（すなわち、遺伝子発現）を高めることができる。第三に、２型および５型のウイルスキャプシドは、プロテアソームインヒビターの存在下でインビボで増大したユビキチン化を示し、そして精製されたウイルスもまたインビトロでユビキチン化されることができる（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）。一緒になって、これらの結果は、プロテアソーム活性を調節することが、少なくとも２つの血清型のｒＡＡＶ導入を高めることおよび増大の機序が細胞内ウイルスプロセシングのいくつかの面を含むことを強く示唆する。
Ａ．プロテアソームインヒビターは、核へのｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ２／５細胞の輸送を増加する
最も大きい効果を有するものを同定するために多数の様々なクラスのプロテアソームインヒビターをスクリーニングした。２つのクラスの化合物（トリペプチジルアルデヒドＬＬｎＬおよびアントラサイクリン誘導体ドキソルビシン）、ならびに２種の気道細胞系（ＩＢ３およびＡ５４９）においてｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ２／５導入を誘導するそれらの能力を下記に記述する。
方法
ＬＬｎＬおよびＺ−ＬＬＬは、プロテアソームのカルパイン、カテプシン、システインプロテアーゼならびにキモトリプシン様プロテアーゼ活性を阻害することが示されている２つのトリペプチジルアルデヒドである（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｄｏｎｋｏｒ，２０００；Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。ドキソルビシンもまた、プロテアソームのキモトリプシン様プロテアーゼ活性を阻害することが示されている（Ｋｉｙｏｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。両方のクラスのプロテアソームインヒビ
ターは、プロテアソーム複合体にきつく結合する。これらの２つのプロテアソーム調節因子の用量応答曲線をＩＢ３、Ａ５４９、Ｈｅｌａおよび一次繊維芽細胞上で評価した。応答は多数の細胞系でそしてルシフェラーゼ発現を導く３つの異なるプロモーターで一致した。１組では、ＡＶ２もしくはＡＶ５キャプシドにパッケージングされるＡＡＶ２に基づくゲノムを有するＣＭＶに導かれるルシフェラーゼ構築物を用いた。細胞にＡＶ２ＬｕｃおよびＡＶ２／５Ｌｕｃの様々な用量（ＭＯＩ １００〜１０００粒子／細胞）で感染させた。感染の時点で、細胞を様々な濃度のＬＬｎＬもしくはドキソルビシンで処理し、そして感染後２４時間で遺伝子発現をアッセイした。ウイルスの核取り込みへのプロテアソームインヒビターの効果は、細胞質および核におけるウイルスＤＮＡを分画するための以前に記述されているプロトコルを用いて評価した（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，２００２）。次に、細胞質および核画分におけるウイルスＤＮＡ含有量をルシフェラーゼＤＮＡプローブに対するスロットブロットハイブリダイゼーションにより評価した。
結果および結論
この分析からの結果は、ＬＬｎＬおよびＤｏｘの両方が２つの独立した気道細胞系においてｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ２／５導入を著しく増大することを示した（図１１）。該傾向はこれらの２つの細胞系およびｒＡＡＶの２つの血清型間で同様であったが、誘導のいくつかの特徴は注目に値する。第一に、ＩＢ３細胞における形質導入は、ＬＬｎＬにより最も顕著に誘導可能であり（＞２００倍）、一方、Ａ５４９細胞は１０倍低いレベルの誘導を得るためにはるかに高い濃度のＬＬｎＬを必要とした。従って、ＩＢ３細胞は、ｒＡＡＶのＬＬｎＬ誘導に特に感受性であるようである。第二に、両方の細胞系におけるｒＡＡＶ導入は、Ｄｏｘにより非常に誘導可能であった（２００倍）。
ＬＬｎＬでの処理が核へのｒＡＡＶの移動を増加したという極性ヒト気道上皮細胞における以前の結果を考慮して（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）、感染の時点でのＬＬｎＬおよびＤｏｘ処理もまた核へのｒＡＡＶ移動を増大するかどうかを決定した。ｒＡＡＶ２に感染したＩＢ３細胞からの核および細胞質抽出物の細胞内分画は、ＤｏｘおよびＬｌｎＬの両方が核コンパートメントにおけるウイルスＤＮＡの画分を顕著に増加したことを示した（図１２ＡおよびＢ）。これらの結果は、これら２つのプロテアソーム調節因子が、核にウイルスを移動させることによりｒＡＡＶ導入を増加するように働くことを示唆する。要約すると、これらの結果は、ユビキチン／プロテアソーム系が何らかの方法でｒＡＡＶの細胞内プロセシングおよび核へのその移動を制御するように働くという一連の増大する研究を裏付ける。
Ｂ．ＬＬｎＬおよびＤｏｘは、プロテアソームを調節しそしてｒＡＡＶ導入を高めるために別個の機序によって働く。
ＬＬｎＬおよびＤｏｘがプロテアソームとの別個の機械的相互作用によってｒＡＡＶ導入を増大する可能性があるという仮説を試験するために、組み合わせて加えた場合のｒＡＡＶ導入へのそれらの効果を評価した。これらの薬剤の各々がプロテアソームと別個の機械的相互作用により形質導入を増大するように働く場合、それらの累積効果はいずれか個々により大きいはずである。
方法
Ｈｅｌａ、Ａ５４９、ＩＢ３および一次胎児繊維芽細胞を様々な濃度のＬＬｎＬ、ＤｏｘもしくはＬＬｎＬ＋Ｄｏｘの存在下でＡＶ２ＬｕｃおよびＡＣ２／５Ｌｕｃ導入に関して評価した。示すデータは、各化合物単独より大きい程度にｒＡＶ２Ｌｕｃ導入を誘導する最も最適な用量の組み合わせのＨｅｌａおよびＡ５４９細胞からである。
結果および結論
複数のプロテアソームインヒビターによるプロテアソームの協調的阻害は、ｒＡＡＶ導入の増加した増大を与えることができる（図１３）。組み合わせたＤｏｘおよびＬＬｎＬ処理は、いずれかの化合物単独より大きくｒＡＡＶ導入を高めるという結果は、それ自体、誘導の機序が相互から独立していることを証明しない。そのような薬剤がｒＡＡＶ導入
を協調的に高める可能性があるいくつかの潜在的理由がある。第一に、ＬＬｎＬおよび／もしくはＤｏｘは、ｒＡＡＶのエンドソーム経路指定を改変し、エンドソーム脱出を高め、そして／もしくは核孔に細胞質においてｒＡＡＶを移動させる可能性がある。これらの化合物の各々は、異なる程度にこれらのプロセスの任意の１つもしくはそれ以上に影響を与え、そしてｒＡＡＶ導入への相加的もしくは相乗的な影響を与える可能性がある。Ｈｅｌａ細胞は、Ａ５４９細胞よりｒＡＡＶ導入にＤｏｘおよびＬＬｎＬのより大きい相加効果を与えるようである。さらに、一次胎児繊維芽細胞において、形質導入への相加効果が見られないことに注目すべきである（データは示さない）。この細胞系において、ＤｏｘはｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ５の導入を最も顕著に高め、そしてＬＬｎＬは、それが単独で形質導入を１０倍誘導したことにもかかわらず付加的誘導を与えない。これらの興味深い細胞特異的な違いはまた、ｒＡＡＶ導入を改変するある種の細胞プロセスがプロテアソームとのＬＬｎＬおよびＤｏｘ相互作用により独自に制御され得ることも意味する。
プロテアソームインヒビターが気道上皮の頂端膜からのｒＡＡＶ導入を増大する機序（１つもしくは複数）は、頂端および側底コンパートメントにおける細胞内輸送の生物学的違いにおいて示される可能性がある。極性気道上皮の頂端膜および側底膜からのエンドサイトーシス経路は、ｒＡＡＶの小胞輸送およびプロセシングを調節するためにユビキチン／プロテアソーム系を異なって利用する可能性があるので、極性が細胞内輸送をどのように改変するかを直接視覚化するために２つの異なる蛍光色素で標識されたｒＡＡＶウイルスでの上皮の頂端膜および側底膜からの共感染研究を用いた。細胞系および極性気道モデルを用いて同定されるｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ５のエンドソーム輸送経路は、ＧＦＰ標識した細胞内マーカーもしくはドミナントネガティブＲａｂタンパク質のいずれかを発現する組み換えアデノウイルスとヒトおよびマウス気管支異種移植片モデルをインビボで用いることができる。
Ａ．上皮の極性およびユビキチン／プロテアソーム系は、頂端膜および側底膜からのｒＡＡＶ導入に独自に影響を及ぼす
頂端膜からのｒＡＡＶ導入の細胞内障害を理解するために特に重要であるのは、上皮の極性が頂端膜および側底膜からのウイルスの細胞内輸送をどのように改変するかの理解である。ｒＡＡＶは、頂端膜からより２００倍効果的に極性ヒト気道上皮の側底膜から形質導入することが以前に報告された（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。興味深いことに、頂端膜からのこの減少した形質導入は、側底膜への高親和性ヘパラン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰＧ）ＡＡＶ２受容体の区分化と相関するが、頂端膜対側底膜からのウイルスエンドサイトーシスの実質的な違いと相関しない（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．１９９９、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）。これらの結果は、使用するプロテアソームインヒビターがない場合にｒＡＡＶ２のエンドサイトーシスだけでなく乏しい細胞内プロセシングももたらすｒＡＡＶ２の同定されていない代わりの頂端受容体が、ヒト気道上皮の頂端面上に存在し得ることを示唆する（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）。対照的に、ｒＡＡＶ５は、頂端面および側底面の両方の上に存在する代わりの受容体のその使用のためにｒＡＡＶ２より効果的に気道上皮の頂端面に感染することが示唆されている（Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）。この結果は、ｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ５の異なる受容体がまた、異なるエンドソームプロセシング経路も利用し得る可能性を高める。
方法
極性ヒト気道上皮は、以前にＤｕａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）およびＤｕａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）に記述されているように作製した。ＡＶ２Ｌｕｃおよび偽型ＡＶ２／５Ｌｕｃウイルスをこれらの研究に利用した。感染は、以前にＤｕａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）に記述されているように５００μｌの細胞培養培地において、等量のウイルスをＬＬｎＬ（４０μＭ）の存在下で頂端膜もしくは側底膜に１６時間使用することにより行った。感染後に、上皮を洗浄し、そしてＬ
ＬｎＬもしくはウイルスを欠いている培地を再供給し、そして感染後５および１４日でルシフェラーゼアッセイ用に採取した。
結果および結論
気道上皮の頂端膜および側底膜からのＡＶ２ＬｕｃおよびＡＶ２／５Ｌｕｃ導入の比較は、いくつかの興味深い結果をもたらした（図１４）。第一に、これらの研究は、頂端膜と比較した場合に側端膜から形質導入するｒＡＡＶ２の＞２００倍高い効率を示す以前の結果を裏付けた。第二に、それらはまた、違いはＺａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２０００）により以前に報告されたほど大きくなかったが、ＡＶ２Ｌｕｃと比較した場合にＡＶ２／５Ｌｕｃでの頂端膜からのわずかに高いレベルの形質導入も示した。第三に、ｒＡＡＶ２のみが頂端膜および側底膜からの感染の極性を示した。最後に、両方のＡＡＶ血清型の頂端形質導入のみが、プロテアソームインヒビターＬＬｎＬの添加により高められた。従って、データは、受容体侵入経路から独立しているｒＡＡＶ導入とプロテアソームとの間の一般的な関連を示唆する。
Ｂ．ｒＡＡＶ遺伝子転化は、頂端膜からの極性気道上皮の形質導入における律速段階ではない
これまでのところデータは、プロテアソームの阻害が核へ移動するそしてそのコード遺伝子を発現するｒＡＡＶの能力を増加することを示唆する。ｒＡＡＶは、＋もしくは−鎖をパッケージングする一本鎖ＤＮＡウイルスであるので、それはコード導入遺伝子を発現するためにそのゲノムをデュプレックス二本鎖型に転化しなければならない。プロテアソーム阻害がこのプロセスにも影響を与える場合、作用機序は提示するより複雑であり得る。プロテアソームインヒビターの存在下でのウイルスの増加した核取り込みはまた、ｒＡＡＶのゲノム転化も疑いなく増加するので、転化酵素のレベルへの直接的プロテアソームインヒビター効果と例えば微小管もしくはミクロフィラメントのような細胞骨格成分を介したウイルスもしくはウイルスべゲノムの増加した核輸送の間を区別する。
第二鎖合成もまた気道上皮における律速でありそしてプロテアソーム阻害により増大される可能性があるかどうかを検討するために、第二鎖合成を必要としない自己相補性ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ、二本鎖ＡＡＶもしくはｄｓＡＡＶとしても知られている）を使用した。半分の長さのゲノム（＜２．５ｋｂ）を含有するこれらのウイルスは、２本のアニーリングした一本鎖ゲノム（＝、すなわち、ｄｓＡＡＶ）もしくは共有結合的に結合した末端からなる複製型（Ｒｆ）モノマーゲノム（⊃、すなわち、ｓｃＡＡＶ）のいずれかをパッケージングすることが示されている（ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，２００１）。ｓｃＡＡＶベクターはコード導入遺伝子を発現するために第二鎖合成を必要としないことが示されているので、それらの遺伝子発現の開始ははるかに迅速である。細胞内プロセシングがヒト気道上皮の頂端導入における主要な律速段階であり、そして第二鎖合成はそうでないことを示すためにｓｃＡＡＶベクターおよび全長ＡＡＶベクターを用いた。
方法
半分のゲノムの長さの１組のウイルスベクターを作製した。４種のＧＦＰに基づくウイルスをこの分析用に作製した（ＡＡＶ２もしくはＡＡＶ５キャプシドにパッケージングされる４．７ｋｂもしくは２．４ｋｂの長さのゲノムのいずれかを有したＡＶ２ｅＧＦＰ、ｓｃＡＶ２ｅＧＦＰ、ＡＣ２／５ｅＧＦＰおよびｓｃＡＶ２／５ｅＧＦＰ）。ＡＡＶ２キャプシドウイルスのデータは、ｒＡＡＶ５ウイルスのデータと同一であった。ｓｃＡＡＶ／ｄｓＡＡＶ構造の機能的確認は、Ｈｅｌａ細胞における遺伝子転化および遺伝子発現速度の分析、ＤＮＡ合成イインヒビターヒドロキシウレア（ＨＵ）に対するＨｅｌａ細胞における形質導入の感受性により、そして変性ＮａＨＯゲル電気泳動により行った。極性気道上皮に感染の時点で使用するＬＬｎＬの有無で様々なベクター構築物を頂端膜から感染させた。遺伝子発現は、様々な感染後の時点でＧＦＰ蛍光の定量的形態計測によりモニターした。
結果および結論
Ｈｅｌａ細胞での全長ｒＡＡＶおよびｓｃＡＡＶベクターの評価は、ＡＶ２ｅＧＦＰと
比較した場合にｓｃＡＶ２ｅＧＦＰの遺伝子発現の以前に報告されたより速い開始速度およびより高いレベルを示した（図１５Ａ）（ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，２００１）。さらに、５ｍＭのＨＵでのＨｅｌａ細胞の前処理は、ＡＶ２ｅＧＦＰからの遺伝子発現を著しく減少したが、ｓｃＡＶ２ｅＧＦＰウイルスではそうでなかった（図１５Ｂ）。これら結果は、ｓｃＡＡＶベクターがコード導入遺伝子を発現するためにＤＮＡ合成を必要としないという考えを裏付ける（ＭｃＣａｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，２００１）。さらに、感染Ｈｅｌａ細胞からのハートＤＮＡの分子特性化は、ＡＶ２ｅＧＦＰと比較した場合に感染後２４時間ではるかに高いパーセンテージの全長ｓｃＡＶ２ｅＧＦＰゲノム（２．４ｋｂ）を示し、それは非変性ゲルにおいて１．６ｋｂに移動する大部分は一本鎖であった（図１５Ｃ）。さらに、ウイルスＤＮＡの変性ＮａＨＯゲル分析は、約７５％がＲｆであることを示した（データは示さない）。ハートＤＮＡ分析を考えると、残りはおそらくｄｓＡＡＶであると推測する。Ｈｅｌａ細胞上でｓｃＡＶ２ｅＧＦＰベクターで見られる遺伝子発現の明らかな増大と対照的に、気道上皮上でのｓｃＡＶ２ｅＧＦＰおよび全長ＡＶ２ｅＧＦＰベクターの分析からの結果は、プロテアソームインヒビターの有無で頂端導入における識別できる違いを示さなかった（図１６〜１７）。データはｒＡＡＶ２血清型に関してのみ示されるが、これらの結果はｒＡＡＶ２／５でも同一であった。これらの結果は、第二鎖合成がヒト気道上皮のｒＡＡＶ導入における主要な律速段階ではないことを強く示唆する。さらに、ＬＬｎＬがｓｃＡＶ２ｅＧＦＰと全長ＡＶ２ｅＧＦＰウイルスとの間の発現のプロファイルを改変しなかったという結果はまた、このプロテアソームインヒビターが気道上皮における第二鎖合成の速度を改変しないことも示唆する。
Ｃ．プロテアソームインヒビターは、極性ヒト気道上皮におけるＣＦＴＲのｒＡＡＶ媒介機能修正の効能を高める
下記のように、ＬＬｎＬおよびＤｏｘの組み合わせた投与は、ＣＦＴＲにより媒介されるクロライド電流のほぼ正常レベルを回復することができるレベルまでヒト極性気道上皮の頂端膜からのｒＡＡＶ導入を増大するように相乗的に働く。さらに、これらの方法を用いるマウス肺における５型および２型ｒＡＡＶベクターの分析は、ヒト気道上皮と比較した場合にプロテアソームインヒビターに対する相乗的応答と最適なＡＡＶ血清型の両方における種特異的な違いを示唆する（図１８）。
方法
ＡＶ２．Ｌｕｃ、ＡＶ２／５Ｌｕｃ、ｓｃＡＶ２ｅＧＦＰ、ＡＶ２ＬａｃＺｄｏｎｏｒ、ＡＶ２ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒ、ＡＶ２ｔｇＣＦ、ＡＶ２／５ｔｇＣＦ、ＡＶ２ＣＦ８３およびＡＶ２／５ＣＦ８３を包含するいくつかのベクターをこの分析に使用した。ＡＶ２ＬａｃＺｄｏｎｏｒおよびＡＶ２ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒウイルスは、分子間組み換え後にＬａｃＺ発現を再構成する２つのトランス−スプライシングベクターであり、そして以前にＤｕａｎ ｅｔ ａｌ．（２００１）に記述されている。これらのベクターは、この方法を用いて送達を増大するための組み合わせたプロテアソームインヒビター処理の有用性を確立するために使用した。ＡＶ２ｔｇＣＦは、ＣＦＴＲの発現がＩＴＲからそれて導かれる現在臨床的に使用されているＡＡＶ２に基づく全長ＣＦＴＲベクターである（Ａｉｔｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）。ＡＶ２／５ｔｇＣＦウイルスは、ＡＶ２ｔｇＣＦと同一のプロウイルス構造を有するが、ＡＡＶ５キャプシドにパッケージングされる。ＡＶ２ＣＦ８３およびＡＶ２／５ＣＦ８３ウイルスは、遺伝子発現を増加するためにＡＶ２ｔｇＣＦプロウイルスゲノムに挿入された追加の８３ｂｐ最小プロモーターを有し、そしてそれぞれＡＡＶ２およびＡＡＶ５キャプシドにパッケージングされる。現在の研究に使用するＣＦＴＲベクターは全て、Ｔａｒｇｅｔ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄにより提供された。極性ヒトＣＦおよび非ＣＦ気道上皮の感染は、ＤｏｘおよびＬＬｎＬの存在下で２４時間１０，０００粒子／細胞の用量で頂端膜から全て行った。
マウス肺における遺伝子導入のインビボ評価
ＢＬ６マウスの肺へのインビボ遺伝子送達は、以前にＤｕａｎ ｅｔ ａｌ．（２００
０）に記述されているようにプロテアソームインヒビター（２００μＭのＺ−ＬＬおよび／もしくは２００μＭのＤｏｘ）の存在下で１ｘ１０１１粒子のＡＶ２ＬｕｃもしくはＡＶ２／５Ｌｕｃの鼻孔吸入により行った。インビボ研究では、トリペプチドＺ−ＬＬＬを使用することが必要であり、Ｚ−ＬＬＬはエタノールにおける溶解性がはるかに高いのでＬＬｎＬの代わりに用いた。ＬＬｎＬおよびＺ−ＬＬＬは、ヒト極性気道上皮においてｒＡＡＶを増大するために同様に機能する（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）。インビボ使用では、トリペプチドプロテアソームインヒビターの濃度は、ｒＡＡＶ導入を増大するために５〜１０倍高く、そしてＬＬｎＬは２００μＭでエタノールに不溶性である。以前にＤｕａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）に記述されているようにマウス肺および気管を様々な感染後の時点で分析用に別個に採取し、そしてルシフェラーゼ活性に関してアッセイした。ここに示すデータは、ヒト極性気道上皮での研究との比較のために１４日の時点のみを示す（図１９）。
ＣＦＴＲ相補性の機能アッセイ．
極性ＣＦ気道上皮におけるＣＦＴＲクロライド輸送異常の相補性は、以前にＬｉｕ ｅｔ ａｌ．（２００２）に記述されているように行った。ＤｏｘおよびＬＬｎＬの存在下で２４時間の頂端感染後１５日で上皮の短絡回路電流をＵｓｓｉｎｇチャンバーにおいて測定した。クロライドのＣＦＴＲ媒介輸送は、低内腔クロライドおよび１００μＭのアミロリドで平衡化した上皮の内腔浴への０．１ｍＭのＩＢＭＸ／１０μＭホルスコリンの添加後に生成される電流の増加として解釈した。全てのＣＦＴＲ媒介電流は、側底浴への１００μＭのブメタニドの添加により可逆的に妨げられた。
結果および結論
極性気道上皮のＬＬｎＬおよび／もしくはＤｏｘ処理の影響を評価する実験は、ｒＡＡＶ導入での形質導入効率への劇的な相乗的影響を示した。図１５においてみられるように、頂端面からの形質導入の増大は、ＬＬｎＬおよびＤｏｘの存在下でそれぞれ１０倍および１００倍増加した。驚くべきことに、感染の時点でのＤｏｘおよびＬＬｎＬの組み合わせた添加は、全長ＡＶ２Ｌｕｘ（図１７Ａ）もしくは自己相補的ｓｃＡＶ２ｅＧＦＰ（図１７Ｂ〜Ｅ）の両方で形質導入を１０００倍高めた。この高レベルの増大はまた、ＬａｃＺの高レベル二重ベクタートランス−スプライシング再構成を促進することもできた（図１７Ｆ）。再構成されたＬａｃＺ遺伝子産物の発現は、ＡＶ２ＬａｃｄｏｎｏｒおよびＡＶ２ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒウイルスの両方を共感染させた上皮においてのみ見られた。
最適なプロテアソームインヒビターの組み合わせ（ＤｏｘおよびＬＬｎＬ）の有無でＡＡＶ２およびＡＡＶ５キャプシド媒介形質導入の両方を比較した、ＣＦＴＲ ｒＡＡＶベクターを用いるＣＦ極性気道上皮におけるＣＦＴＲ相補性研究は、いくつかの興味深い結果を示した（図１９）。第一に、ｒＡＡＶ２キャプシドベクターは、プロテアソームインヒビターがない場合にｒＡＡＶ５と同様にもしくはそれよりわずかによく機能することは明らかであった。これらの結果は、ルシフェラーゼベクターを用いて前に説明するものと同様であるが（図１９）、１つの以前の報告（Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）と異なる。第二に、ルシフェラーゼに基づくベクターで見られるように、ｒＡＡＶ２媒介ＣＦＴＲ送達は、ｒＡＡＶ５で見られるものより劇的によくプロテアソームインヒビターの存在下で機能した。これらの結果は、プロテアソームインヒビターの存在下で、ｒＡＡＶ２キャプシドに基づくベクターが、おそらく、ＣＦの遺伝子治療のより優れたベクターであることを示唆する。第三に、プロモーターとしてＩＴＲを利用する現在の臨床ベクターＡＶ２ｔｇＣＦと比較した場合にＡＶ２ＣＦ８３最小プロモーターで見られる修正の明確な増加があった。累積的に、これらの結果は、ＣＦＴＲの機能発現を得るためにプロテアソームを調節することにより細胞内障害を回避する必要性を示し、そしてかなりのベクターＤＮＡをＲＴ ＰＣＲで検出可能なｍＲＮＡなしに気道上皮において見出すことができる（Ａｉｔｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）というＡＶ２ｔｇＣＦ（ｔｇＡＡＶＣＦ
とも呼ばれる）での現在の臨床結果を裏付ける。これまでのところ、結果は、ベクターからのｍＲＮＡ発現とＣＦＴＲ機能修正との直接的相関関係を示している。
マウス肺におけるｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ２／５ベクターの形質導入ならびに形質導入へのＤｏｘおよびＺ−ＬＬＬの効果を比較する研究は、ヒト極性気道モデルにおいてみられるものといくつかの顕著な違いを示している。第一に、ＡＶ２／５ベクターは、ＡＶ２ベクターと比較した場合にマウス肺および気管においてかなりよく（１００倍）機能する。マウスにおけるこの結果は、ＡＶ２／５とＡＶ２を比較する該分野におけるいくつかの他の報告（Ａｕｒｒｉｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）を裏付けるが、これらの２つの血清型でほぼ同等の形質導入を示す極性ヒト気道上皮における結果と顕著に異なる。第二に、Ｚ−ＬＬＬおよびＤｏｘは両方とも、ＡＶ２／５ベクターからの導入遺伝子発現をそれぞれ１０倍および１００倍誘導のレベルまで実質的に増加した。第三に、ＤｏｘおよびＺ−ＬＬＬの両方を感染の時点で与えた場合のＡＶ２／５ベクターの誘導における相乗作用の欠如。実際に、これら２つの薬剤の組み合わせは、全体的な形質導入を阻害するようであった（図１９）。
マウスおよびヒト気道におけるｒＡＶ２およびｒＡＶ２／５導入間のこれらの違いは、いくつかの理由で気道におけるｒＡＡＶ導入へのプロテアソーム関与の機序を評価することに関連する。第一に、マウスは前臨床モデルとして広く用いられ、そしてヒトとの間の形質導入生物学の違いに関する知識がもたらされている。第二に、トリペプチジルアルデヒド（すなわち、ＬＬｎＬおよびＺ−ＬＬＬ）およびアントラサイクリン誘導体（すなわち、Ｄｏｘ）は、重複するが別個の機序によってｒＡＡＶの細胞内プロセシングを増大することができる。従って、マウス気道におけるｒＡＡＶ導入の誘導における相乗作用の欠如は、これらの化合物の作用機序に関する手掛かりを与えることができる。
さらなるプロテアソームモジュレーターのインビトロおよびインビボ活性
ドキソルビシンでの結果に基づいて、少数のＦＤＡに認可されたアントラサイクリンをＡＡＶ導入へのそれらの相対的インビトロおよびインビボ活性に関して試験した。ＨｅＬａ細胞に１００ｐｐｃＡＡＶ２ＦＬＡＧ−Ｌｕｃを異なるアントラサイクリン、例えばドキソルビシン、ダウナルビシン（セルビジン）、エピルビシン（エレンス（Ｅｌｌｅｎｃｅ）ＴＭ）およびイダルビシン（イダマイシンＲ）の存在下で２時間感染させ、そして４８時間後に細胞を採取した。アントラサイクリンは製薬等級であり、そして製造業者の説明書に従って調製した。使用前に、因子を滅菌水に等しい質量、例えば０．６μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬおよび６μｇ／ｍＬに希釈した。結果を図２０に示す。例えば、３μｇ／ｍＬのイダマイシンはルシフェラーゼ発現を５０００倍を上回って増加し、一方、ドキソルビシンはルシフェラーゼ発現を５８倍増加した。一般に、効能は以下のとおりであった：イダルビシン＞ダウナルビシン＞エピルビシン＞ドキソルビシン。
１０匹の５〜７週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（グループ当たり５匹のオスおよび５匹のメス）の６グループを鼻腔内送達後の単回投与での異なるアントラサイクリン誘導体の相対的インビボ効能および安全性の比較に用いた。処理を表４に示すように与えた。動物を投与後７日間追跡した。
Figure 2006521825
モジュレーターの用量はヒト用量同等物（Ｈｕｍａｎ Ｄｏｓｅ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ）（ＨＤＥ）に基づき、そして以下に表５に要約する。鼻腔内用量投与では、用量をＨＤＥの１０％で一定に保った。静脈内陽性コントロール（ドキシル）では、１０ｍｇ／ｋｇ（ＨＤＥの７５％）の用量を用いた。これは、以前の研究における平均およびメジアンルシフェラーゼ発現の１０％の増加を与えた最低用量に相当した。
Figure 2006521825
安全性終点には、罹患率および死亡率、臨床観察、体重、総括的検視観察および組織病理学が包含された。形質導入終点には、ルシフェラーゼおよびＧＦＰ分析が包含された。
殺す日に、左肺を肺外気管支のレベルで固定し、取り除き、そしてドライアイス上で凍結した。左肺を均質化し、そしてＰｒｏｍｅｇａのルシフェラーゼアッセイシステム（Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）を用いてルシフェラーゼ発現に関して処理した。発光は、Ｂｅｒｔｈｏｌｄ ＡｕｔｏＬｕｍａｔ ＬＢ９５３装置を用いて測定した。サンプルをＰｉｅｒｃｅのクーマシープラスプロテインアッセイ試薬（Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ）を用いて総タンパク質に関して正規化した。
１０％のＨＤＥでのドキソルビシンおよびイダマイシンの鼻腔内投与は、両方ともいくらかの動物の早死に、乱れた被毛状態および病気のマウスと関連した。さらに、生存した動物もまた該週にわたってかなりの体重を減らした。鼻腔内にドキシルで処理したマウスは、早死にがなくそしてそれらが臨床的に正常のようであった点においてドキソルビシンもしくはイダマイシンで処理した動物よりよい結果であった。しかしながら、それらもまた体重を減らした。静脈内にドキシルで処理したマウスは、最もうまくいった。
ドキソルビシンおよびイダマイシンの鼻腔内処理は、増加したルシフェラーゼ発現をもたらした（図２１および表６）。１０％のＨＤＥでのドキシルでの処理（静脈内および鼻腔内の両方）は、投与後７日で、それぞれ、４９倍および７４倍のルシフェラーゼ発現の平均増加をもたらした。
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Figure 2006521825
全ての公開、特許および特許出願は、引用することにより本明細書に組み込まれる。上記の明細書において、本発明はそのある種の好ましい態様に関して記述されており、そして多数の詳細が説明の目的のために記載されているが、本発明は追加の態様の余地があることおよび本明細書における詳細のあるものは本発明の基本原理からそれることなしに大幅に変更でき得ることが当業者に明らかである。
様々な因子の有無でｒＡＡＶ ＦＬＡＧ−ＬｕｃでトランスフェクションしたＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼ活性。ＨｅＬａ細胞を１００ｐｐｃＡＡＶ ＦＬＡＧ−Ｌｕｃと２時間接触させ、そして４８時間後に細胞を採取した。Ｎ＝３、平均±標準偏差。 ドキシルでのｒＡＡＶ導入のインビボ増大。ドキシルを静脈内に投与したオスＢａｌｂ／ｃマウスに１ｘ１０１１ＤＲＰ ＡＡＶ２ＦＬＡＧ−Ｌｕｃ（０．１：００４）を気管内注入した。 ドキシルで処理したＲａｇ−１マウスにおける第ＶＩＩＩ因子のｒＡＡＶ導入のインビボ増大。ドキシル（２０ｍｇ／ｋｇ）を静脈内に投与したＲａｇ−１マウスに１ｘ１０１２ＤＲＰ ＡＡＶ５−ＦＶＩＩＩを感染させ、そして殺した時の第ＶＩＩＩ因子レベルを決定した。データは、平均±標準偏差である。 Ａ）ＡＶ．ＲＳＶＬｕｃもしくはＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃＣａｐ５（１００もしくは１０００ｐｐｃ）またはＢ）ＡＶ２ＣＭＶｌｕｃもしくはＡＶ２ＣＭＶｌｕｃＣａｐ５（５００ｐｐｃ）での感染、およびＬＬｎＬ（４０、２００もしくは４００μＭ）、Ｚ−ＬＬＬ（４μＭ）もしくはドキソルビシン（０．５、１．０もしくは５．０μＭ）またはＬＬｎＬ（４、１０、２０もしくは２００μＭ）とドキソルビシン（０．５、１．０もしくは５．０μＭ）の組み合わせの共投与後のＨｅＬａ細胞におけるルシフェラーゼ活性。Ｃ）ＨｅＬａ細胞でのＡＡＶ−２ベクターにおけるＣＭＶおよびＲＳＶプロモーターの比較。 ＡＶ２ＣＭＶｌｕｃもしくはＡＶ２ＣＭＶｌｕｃＣａｐ５（５００ｐｐｃ）での感染、およびＬＬｎＬ（４０、２００もしくは４００μＭ）、Ｚ−ＬＬＬ（４μＭ）もしくはドキソルビシン（５μＭ）の共投与後のＡ５４９細胞におけるルシフェラーゼ活性。Ａ）ＡＶ２ＣＭＶｌｕｃおよびＡＶ２ＣＭＶｌｕｃＣａｐ５の比較。Ｂ）ＡＶ２ＣＭＶｌｕｃを感染させたＡ５４９細胞における様々な量のＬＬｎＬの用量応答。 ＡＶ２ＣＭＶｌｕｃもしくはＡＶ２ＣＭＶｌｕｃＣａｐ５（５００ｐｐｃ）での感染、およびＬＬｎＬ（４０、２００もしくは４００μＭ）、Ｚ−ＬＬＬ（４μＭ）もしくはドキソルビシン（１μＭ）の共投与後のフェレット繊維芽細胞におけるルシフェラーゼ活性。Ａ）ＡＶ２ＣＭＶｌｕｃおよびＡＶ２ＣＭＶｌｕｃＣａｐ５の比較。Ｂ）フェレット繊維芽細胞におけるＡＶ２ＣＭＶｌｕｃおよびＡＶ２ＣＭＶｌｕｃＣａｐ５の１および５日でのＲＬＵ。 １もしくは２種のプロテオソームモジュレーターでのＨｅＬａ（Ａ）、フェレット繊維芽細胞（Ｂ）およびＡ５４９（Ｃ）細胞におけるルシフェラーゼ活性の比較。 ５ｘ１０９のＡＶ２ＲＳＶＬｕｃもしくはＡＶ２ＲＳＶｌｕｃＣａｐ５での頂端感染およびＬＬｎＬ（４０μＭ）もしくはドキソルビシン（１．０もしくは５．０μＭ）またはＬＬｎＬ（４０μＭ）とドキソルビシン（１．０もしくは５．０μＭ）の組み合わせの共投与後３日および１５日での極性気道上皮細胞におけるルシフェラーゼ活性。 ＡＶ２ＲＳＶｌｕｃＣａｐ５（計６ｘ１０１０粒子用に、４０μｌにおける２ｘ１０９粒子／μｌの１０μｌで３回）での感染（鼻吸引による）およびＺ−ＬＬＬ（２００μＭ）、ドキソルビシン（２００μＭ）もしくはＺ−ＬＬＬ（２００μＭ）とドキソルビシン（２００μＭ）の組み合わせの共投与後２週（Ａ）もしくは６週（Ｂ）でのＣ５７Ｂ１６マウス肺もしくは気管および気管支におけるルシフェラーゼ活性。各グループで、ｎ＝１２。肺およびいくらかの気管支組織を有する気管を単離し、そして抽出後に、組織抽出物におけるルシフェラーゼ活性／総タンパク質を決定した。 ＡＶ２ＲＳＶｌｕｃＣａｐ５での感染およびＺ−ＬＬＬ（２００μＭ）、ドキソルビシン（２００μＭ）もしくはＺ−ＬＬＬ（２００μＭ）とドキソルビシン（２００μＭ）の組み合わせの共投与後２週、６週もしくは３ヶ月でのマウス肺もしくは気管および気管支におけるルシフェラーゼ活性。ルシフェラーゼアッセイは、８０％の感度で行った。肺およびいくらかの気管支組織を有する気管を単離し、そして抽出後に、組織抽出物におけるルシフェラーゼ活性／総タンパク質を決定した。 不死化ヒト気道細胞系ＩＢ３（パネルＡ）およびＡ５４９（パネルＢ）のＡＶ２ＬｕｃおよびＡＶ２／５Ｌｕｃ導入へのプロテアソームインヒビターＬＬｎＬおよびドキソルビシン（Ｄｏｘ）の効果を評価した。プロテアソーム調節因子を感染の時点で各ｒＡＡＶベクター（細胞当たり５００粒子のＭＯＩ）と共投与し、そして２４時間後に形質導入を評価した。様々な濃度の各化学物質を各グラフに示すように評価した。データは、平均（＋／−ＳＥＭ）相対ルシフェラーゼ活性実験（Ｎ＝４）を表す。 ＬＬｎＬおよびＤｏｘは両方とも、核へのｒＡＡＶのトランスロケーションを促進する。ＩＢ３細胞に４０μＭのＬＬｎＬもしくは１μＭのＤｏｘの有無でＡＶ２ｅＧＦＰ（ＭＯＩ＝１０００粒子／細胞）を感染させた。感染後２４時間で、細胞質（Ｃｙｔ）および核（Ｎｕｃ）画分を単離した。（Ａ）各画分におけるウイルスＤＮＡをＰ３２標識したｅＧＦＰプローブに対するスロット−ブロットハイブリダイゼーションにより検出し、そしてＢｉｏＲａｄ ｐｈｏｓｐｈｏｉｍａｇｅｒを用いて視覚化した（Ｎ＝３単離を各条件に示す）。Ｐ３２シグナルは、ＢｉｏＲａｄソフトウェアを用いて定量した。（Ｂ）核および細胞質画分におけるシグナルのパーセンテージ分布を３つの実験点の平均シグナルに基づいて計算した。（Ｃ）ｉｎ ｓｉｔｕオートラジオグラフィーによる極性ヒト気道上皮におけるＳ３５−キャプシド標識したｒＡＡＶ２局在化の結果。感染は、ＬＬｎＬ処理の有無で行った。 ＤｏｘおよびＬＬｎＬは、ｒＡＶ２導入の相加的誘導を与える。Ｈｅｌａ細胞（左側のパネル）およびＡ５４９細胞（右側のパネル）に示す薬剤の組み合わせの存在下でｒＡＡＶ（ＭＯＩ ５００粒子／細胞）を感染させ、そして発現される導入遺伝子を感染後２４時間で評価した（平均＋／−ＳＥＭ、Ｎ＝４）。賦形剤で処理したｒＡＡＶ感染細胞に対する誘導倍数を各棒の上に示す。 （Ａ）ＡＶ２Ｌｕｃおよび（Ｂ）ＡＶ２／５Ｌｕｃ導入へのプロテアソームインヒビターＬＬｎＬの効果をＬＬｎＬ（４０μＭ）の有無で１０，０００粒子／細胞のＭＯＩでのヒト極性気道上皮の頂端および側底感染後に評価した。ルシフェラーゼ活性を感染後５および１４日で測定した。値は、３つの独立した組織サンプルの平均（＋／−ＳＥＭ）相対ルシフェラーゼ活性を表す（合計Ｎ＝６〜９のトランスウェル）。 全長および自己相補的ｅＧＦＰ発現ＡＡＶベクターの分析。ＨｅＬａ細胞にＭＯＩ＝１０００粒子／細胞で感染させた。（Ａ）ＡＶ２ｅＧＦＰおよびｓｃＡＶ２ｅＧＦＰベクターの相対的ｅＧＦＰ発現面積の定量。値は、３つの独立した感染および各実験点の１０個の無作為視野の定量の平均（＋／−ＳＥＭ）を表す。（Ｂ）感染後２４時間で分析した遺伝子発現でのヒドロキシウレア（５ｍＭ）での処理に対するＡＶ２ｅＧＦＰおよびｓｃＡＶ２ｅＧＦＰベクターの応答。（Ｃ）感染後２４時間でＡＶ２ｅＧＦＰ感染（レーン１および２）およびｓｃＡＶ２ｅＧＦＰ感染（レーン３および４）Ｈｅｌａ細胞から採取したハートＤＮＡのサザンブロット分析、Ｐ３２標識したｅＧＦＰ ＤＮＡプローブをサザンブロットに使用した。 自己相補的および全長ｅＧＦＰベクターでの極性ヒト気道上皮の頂端感染後のｅＧＦＰ発現の定量。蛍光の相対平均面積を、感染後１、３、７、１５および３０日に１０，０００粒子／細胞のＭＯＩでＬＬｎＬ（４０μＭ）の有無でＡＶ２ｅＧＦＰおよびｓｃＡＶ２ｅＧＦＰベクターでの形質導入後に評価した。値は、３つの独立した組織サンプルの平均（＋／−ＳＥＭ）を表す。各組織サンプルで、様々な時点で各サンプルにおける１０個の無作為視野を撮像することにより３個のトランスウェルを評価した（各実験時点で合計Ｎ＝９のトランスウェル）。 プロテアソーム調節因子の組み合わせた投与は、極性ヒト気道上皮の頂端面からのｒＡＡＶ導入を相乗的に誘導することができる。（Ａ）１ｘ１０９粒子のＡＶ２ＬｕｃをＬＬｎＬ（４０μＬ）および／もしくはＤｏｘ（５μＭ）の様々な組み合わせの有無で極性ヒト気道上皮培養物の頂端面に使用した。ルシフェラーゼ発現は、感染後３および１７日でアッセイした（Ｂ〜Ｅ）。同様の結果が、感染後１５日に自己相補的（２．３ｋｂ）ｓｃＡＶ２ｅＧＦＰベクターでの頂端感染後に認められた（Ｆ）。ＬＬｎＬおよびＤｏｘの組み合わせた投与は、トランス−スプライシングされるＬａｃＺ遺伝子産物のデュアルベクターヘテロダイマー媒介送達を増大する。共投与するＬＬｎＬ（４０μＭ）およびＤｏｘ（５μＭ）の有無で極性気道上皮の各トランスウェルに感染させるために１０１０粒子のＡＶ２ＬａｃＺｄｏｎｏｒ（Ｄで示す）および／もしくはＡＶ２ｌａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒ（Ａで示す）を用いた。β−ガラクトシダーゼ活性は、感染後１５日で評価した。データは、３つの独立した実験の平均（＋／−ＳＥＭ）相対ルシフェラーゼもしくはβ−ガラクトシダーゼ活性（１／１０サンプル当たり）を表す。 マウス肺へのインビボ遺伝子導入。形質導入を誘導するプロテアソーム調節因子の能力を評価するためにＡＶ２およびＡＶ２／５ルシフェラーゼベクターを用いた。結果は、各条件の感染後１４日での（Ｎ＝５）マウス肺からの平均（＋／−ＳＥＭ）ルシフェラーゼ発現を示す。 組み合わせたＣＦＴＲｒＡＡＶおよびプロテアソームインヒビター処理を用いるＣＦ気道上皮におけるＣＦＴＲクロライド輸送異常の相補性。結果は、示す条件下で処理したＣＦ気道上皮におけるＩＢＭＸ／ホルスコリンに対する平均＋／−ＳＥＭ（Ｎ＝９）ΔＩｓｃ応答を示す。アッセイは感染後１５日で行い、そして非ＣＦ未処理コントロールを完全に機能性のＣＦＴＲの基準として示す。 アントラサイクリンプロテオソームモジュレーターのスクリーニング。Ａ）ル試験した因子の濃度に対するシフェラーゼ活性のグラフ。Ｂ）様々な処理のルシフェラーゼ活性の変化倍数。 アントラサイクリンプロテオソームモジュレーターのインビボ結果。

Claims (66)

  1. 哺乳類細胞の組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）導入を高める方法であって、哺乳類細胞を、少なくとも１つのｒＡＡＶおよびｒＡＡＶ導入を相加的にもしくは相乗的に高めるのに有効な量の少なくとも２つの因子と接触させることを含んでなる方法。
  2. ｒＡＡＶがマーカー遺伝子もしくは選択可能な遺伝子を含んでなる請求項１の方法。
  3. 一本鎖から二本鎖へのｒＡＡＶゲノム転化を改変する因子と細胞を接触させることをさらに含んでなる請求項１の方法。
  4. ｒＡＡＶの細胞取り込みを改変する因子と細胞を接触させることをさらに含んでなる請求項１の方法。
  5. 該因子が、ｒＡＡＶおよび該因子の１つと接触させた対応する哺乳類細胞の形質導入、もしくは少なくとも１つのｒＡＡＶと接触させるが該因子と接触させない対応する哺乳類細胞の形質導入、に対して形質導入を少なくとも２倍高める請求項１の方法。
  6. 該因子が、ｒＡＡＶおよび該因子の１つと接触させた対応する哺乳類細胞の形質導入、もしくは少なくとも１つのｒＡＡＶと接触させるが該因子と接触させない対応する哺乳類細胞の形質導入、に対して形質導入を少なくとも４倍高める請求項１の方法。
  7. 該因子が、ｒＡＡＶおよび該因子の１つと接触させた対応する哺乳類細胞の形質導入、もしくは少なくとも１つのｒＡＡＶと接触させるが該因子と接触させない対応する哺乳類細胞の形質導入、に対して形質導入を少なくとも１０倍高める請求項１の方法。
  8. 該因子の１つが化学療法薬、脂質低下薬、抗生物質もしくは食品添加剤である請求項１の方法。
  9. １つのｒＡＡＶが、連結された：
    ｉ）ＡＡＶの５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含んでなる第一のＤＮＡセグメント；
    ｉｉ）異種のＤＮＡを含んでなる第二のＤＮＡセグメント；および
    ｉｉｉ）ＡＡＶの３’ＩＴＲを含んでなる第三のＤＮＡセグメント
    を含んでなる第一の組み換えＤＮＡ分子を含んでなる請求項１の方法。
  10. 連結された：
    ｉ）ＡＡＶの５’ＩＴＲを含んでなる第一のＤＮＡセグメント、および
    ｉｉ）第一の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントにおける配列と異なる配列を有する異種のＤＮＡを含んでなる第二のＤＮＡセグメント；および
    ｉｉｉ）ＡＡＶの３’ＩＴＲを含んでなる第三のＤＮＡセグメント
    を含んでなる第二の組み換えＤＮＡ分子を含んでなる第二のｒＡＡＶをさらに含んでなる請求項９の方法。
  11. 第一の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントが、場合により少なくとも１つの転写調節要素に作動可能に連結されていてもよい、遺伝子産物のオープンリーディングフレームの一部、およびオープンリーディングフレームの部分に対して３’のスプライスドナー部位を含んでなり、そして第二の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントが、第一の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントと一緒になって機能性遺伝子産物をコードする、オープンリーディングフレームの残りに対して５’のスプライスアクセプター部位を含んでなる、請求項１０の方法。
  12. 転写調節要素がプロモーターである請求項１１の方法。
  13. 転写調節要素がエンハンサーである請求項１１の方法。
  14. 第一の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントがエンハンサーを含んでなり、そして第二の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントが機能性遺伝子産物をコードするオープンリーディングフレームを含んでなる請求項１０の方法。
  15. 第一の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントがプロモーターを含んでなり、そして第二の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントが機能性遺伝子産物をコードするオープンリーディングフレームを含んでなる請求項１０の方法。
  16. 細胞が肺細胞、上皮細胞、肝細胞、筋肉細胞、造血細胞、心臓細胞もしくは神経細胞である請求項１の方法。
  17. 機能性遺伝子産物の発現が高められる請求項１１、１４もしくは１５の方法。
  18. 第二のＤＮＡセグメントが機能性遺伝子産物をコードする請求項９の方法。
  19. 機能性遺伝子産物が治療ペプチドもしくはポリペプチドまたは予防ペプチドもしくはポリペプチドである請求項１１、１４、１５もしくは１８の方法。
  20. 機能性ポリペプチドが嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質、β−グロビン、γ−グロビン、チロシンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィンもしくはエリスロポエチンである請求項１９の方法。
  21. 該因子の１つがエポキソミシン（ｅｐｏｘｏｍｉｃｉｎ）、ドキソルビシン、ドキシル、ダウノルビシン、イダルビシン、エピルビシン、アクラルビシン、カンプトテシン、シムバスタチン、タンニン酸、シスプラチン、ＬＬｎＬもしくはＺ−ＬＬＬである請求項１の方法。
  22. 細胞がヒト細胞、イヌ細胞、マウス細胞、ラット細胞もしくはウサギ細胞である請求項１の方法。
  23. 細胞をウイルスと接触させる前に細胞を少なくとも１つの因子と接触させる請求項１の方法。
  24. 細胞を少なくとも１つの因子と接触させる前に細胞をウイルスと接触させる請求項１の方法。
  25. 該因子の少なくとも１つがミクロフィラメントもしくは微小管を調節する請求項１の方法。
  26. 該因子の少なくとも１つがｒＡＡＶエンドサイトーシスを調節する請求項１の方法。
  27. 該因子の少なくとも１つが細胞におけるｒＡＡＶ輸送を調節する請求項１の方法。
  28. 該因子の少なくとも１つが細胞におけるｒＡＡＶプロセシングを調節する請求項１の方法。
  29. 該因子の少なくとも１つが細胞におけるｒＡＡＶ核酸分解を調節する請求項１の方法。
  30. 該因子の少なくとも１つが細胞におけるｒＡＡＶタンパク質分解を調節する請求項１の方法。
  31. 該因子の少なくとも１つが核へのｒＡＡＶ輸送を調節する請求項１の方法。
  32. 該因子の少なくとも１つが核へのウイルスゲノム輸送を調節する請求項１の方法。
  33. 内在性遺伝子産物の異常発現と関連する症状を抑制するかもしくは処置する方法であって、該症状の危険性があるかもしくはそれを有する哺乳類を、ＡＡＶ導入を高める少なくとも１つの因子の有効量、および機能性遺伝子産物であって哺乳類におけるその発現が該症状の少なくとも１つの徴候を抑制するかもしくは処置する該機能性遺伝子産物の少なくとも一部をコードする導入遺伝子を含んでなる少なくとも１つのｒＡＡＶの有効量、と接触させることを含んでなり、ここで該因子は化学療法薬、脂質低下薬、抗生物質もしくは食品添加剤である、上記方法。
  34. 異常発現が、内在性遺伝子産物の欠如もしくはその減少した発現である請求項３３の方法。
  35. １つのｒＡＡＶが、連結された：
    ｉｖ）ＡＡＶの５’ＩＴＲを含んでなる第一のＤＮＡセグメント；
    ｖ）異種のＤＮＡを含んでなる第二のＤＮＡセグメント；および
    ｖｉ）ＡＡＶの３’ＩＴＲを含んでなる第三のＤＮＡセグメント
    を含んでなる第一の組み換えＤＮＡ分子を含んでなる請求項３３の方法。
  36. 連結された：
    ｉｉ）ＡＡＶの５’ＩＴＲを含んでなる第一のＤＮＡセグメント、および
    ｉｉ）第一の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントにおける配列と異なる配列を有する異種のＤＮＡを含んでなる第二のＤＮＡセグメント；および
    ｉｉｉ）ＡＡＶの３’ＩＴＲを含んでなる第三のＤＮＡセグメント
    を含んでなる第二の組み換えＤＮＡ分子を含んでなる第二のｒＡＡＶをさらに含んでなる請求項３５の方法。
  37. 第一の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントが、場合により転写調節要素に連結されていてもよい、遺伝子産物のオープンリーディングフレームの一部、およびオープンリーディングフレームの部分に対して３’のスプライスドナー部位を含んでなり、第二の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントが、第一の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントと一緒になって機能性遺伝子産物をコードする、オープンリーディングフレームの残りに対して５’のスプライスアクセプター部位を含んでなる請求項３６の方法。
  38. 転写調節要素がプロモーターである請求項３７の方法。
  39. 第一の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントがエンハンサーを含んでなり、そして第二の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントが機能性遺伝子産物をコードするオープンリーディングフレームを含んでなる請求項３６の方法。
  40. 第一の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントがプロモーターを含んでなり、そ
    して第二の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントが機能性遺伝子産物をコードするオープンリーディングフレームを含んでなる請求項３６の方法。
  41. 導入遺伝子の発現が高められる請求項３３の方法。
  42. 導入遺伝子が嚢胞性線維症膜貫通調節タンパク質、β−グロビン、γ−グロビン、チロシンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィンもしくはエリスロポエチンをコードする請求項３３の方法。
  43. 哺乳類細胞を少なくとも１つのｒＡＡＶおよびｒＡＡＶ導入を高めるために有効な、ｒＡＡＶエンドサイトーシス、細胞内コンパートメントにおけるｒＡＡＶ輸送もしくはプロセシング、ウイルス核酸もしくはタンパク質分解、ウイルスもしくはウイルスゲノムの核輸送を改変する少なくとも１つの因子と接触させることを含んでなり、ただし該因子はプロテオソームタンパク質分解活性のインヒビターではない、哺乳類細胞のｒＡＡＶ導入を高める方法。
  44. ｒＡＡＶがマーカー遺伝子もしくは選択可能な遺伝子を含んでなる請求項４３の方法。
  45. 一本鎖から二本鎖へのｒＡＡＶゲノム転化を改変する因子と細胞を接触させることをさらに含んでなる請求項４３の方法。
  46. ｒＡＡＶの細胞取り込みを改変する因子と細胞を接触させることをさらに含んでなる請求項４３の方法。
  47. 該因子の１つが化学療法薬、脂質低下薬、抗生物質もしくは食品添加剤である請求項４３の方法。
  48. 細胞が肺細胞、上皮細胞、肝細胞、心臓細胞、造血細胞、筋肉細胞もしくは神経細胞である請求項４３の方法。
  49. ｒＡＡＶが治療もしくは予防遺伝子産物を発現する請求項４３の方法。
  50. 細胞がヒト細胞、イヌ細胞、マウス細胞、ラット細胞もしくはウサギ細胞である請求項４３の方法。
  51. 少なくとも１つの因子がミクロフィラメントもしくは微小管を調節する請求項４３の方法。
  52. 少なくとも１つの因子がｒＡＡＶエンドサイトーシスを調節する請求項４３の方法。
  53. 少なくとも１つの因子が細胞におけるｒＡＡＶ輸送を調節する請求項４３の方法。
  54. 少なくとも１つの因子が細胞におけるｒＡＡＶプロセシングを調節する請求項４３の方法。
  55. 少なくとも１つの因子が細胞におけるｒＡＡＶ核酸分解を調節する請求項４３の方法。
  56. 少なくとも１つの因子が細胞におけるｒＡＡＶタンパク質分解を調節する請求項４３の方法。
  57. 少なくとも１つの因子が核へのｒＡＡＶ輸送を調節する請求項４３の方法。
    項１の方法。
  58. 少なくとも１つの因子が核へのウイルスゲノム輸送を調節する請求項４３の方法。
  59. 少なくとも１つの因子がプロテオソームの細胞内局在性を調節する請求項４３の方法。
  60. 少なくとも１つの因子がエポキソミシン、ドキソルビシン、ドキシル、ダウノルビシン、イダルビシン、エピルビシン、アクラルビシン、シムバスタチンもしくはタンニン酸である請求項３３もしくは４３の方法。
  61. ｒＡＡＶ媒介遺伝子治療を必要とする哺乳類におけるｒＡＡＶ導入を相加的にもしくは相乗的に高めるための薬剤の製造のための哺乳類細胞のｒＡＡＶ導入を高める２つもしくはそれ以上の因子の使用。
  62. 哺乳類における機能性遺伝子産物の少なくとも一部をコードする導入遺伝子を含んでなる少なくとも１つのｒＡＡＶの導入を高めるための薬剤の製造のための、化学療法薬、脂質低下薬、抗生物質もしくは食品添加剤の使用。
  63. 哺乳類における機能性遺伝子産物の少なくとも一部をコードする導入遺伝子を含んでなる少なくとも１つのｒＡＡＶの導入を高めるための薬剤の製造のための、ｒＡＡＶエンドサイトーシス、細胞内コンパートメントにおけるｒＡＡＶ輸送もしくはプロセシング、ウイルス核酸もしくはタンパク質分解、ウイルスもしくはウイルスゲノムの核輸送を改変する少なくとも１つの因子の使用であって、ただし該因子はプロテオソームタンパク質分解活性のインヒビターではない、上記使用。
  64. 薬剤がｒＡＡＶをさらに含んでなる請求項６１〜６３のいずれか１つの使用。
  65. 薬剤が少なくとも２つの異なるｒＡＡＶを含んでなる請求項６４の使用。
  66. 哺乳類が、導入遺伝子で抑制するかもしくは処置することのできる内在性遺伝子産物の異常発現と関連する症状を有する請求項６２もしくは６３の使用。
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