JP2004534543A - シュードタイプ化アデノ関連ウイルスおよびその使用 - Google Patents

シュードタイプ化アデノ関連ウイルスおよびその使用 Download PDF

Info

Publication number
JP2004534543A
JP2004534543A JP2003512375A JP2003512375A JP2004534543A JP 2004534543 A JP2004534543 A JP 2004534543A JP 2003512375 A JP2003512375 A JP 2003512375A JP 2003512375 A JP2003512375 A JP 2003512375A JP 2004534543 A JP2004534543 A JP 2004534543A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
aav
raav
dna segment
polypeptide
recombinant dna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
JP2003512375A
Other languages
English (en)
Inventor
エンゲルハート，ジヨン・エフ
ヤン，ツイーイング
Original Assignee
ユニバーシテイ・オブ・アイオワ・リサーチ・フアウンデーシヨン
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by ユニバーシテイ・オブ・アイオワ・リサーチ・フアウンデーシヨン filed Critical ユニバーシテイ・オブ・アイオワ・リサーチ・フアウンデーシヨン
Publication of JP2004534543A publication Critical patent/JP2004534543A/ja
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14145—Special targeting system for viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2810/00—Vectors comprising a targeting moiety
    • C12N2810/50—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein
    • C12N2810/60—Vectors comprising as targeting moiety peptide derived from defined protein from viruses

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

シュードタイプ化ｒＡＡＶおよびシュードタイプ化ｒＡＡＶを使用する方法が提供される。

Description

【技術分野】
【０００１】
関連出願との関係
本出願は、３５Ｕ．Ｓ．Ｃ．§１１９（ｅ）に基づき２００１年７月１３日に出願された特許文献１の出願日の利益を主張し、その開示は引用により全部、本明細書に編入する。
政府の権利の表明
本発明の少なくとも一部はアメリカ合衆国の政府の補助金でなされた（国立衛生研究所の認可番号ＨＬ５８３４０およびＰ３０ＤＫ５４７５９）。政府は本発明に特定の権利を有することができる。
【背景技術】
【０００２】
発明の背景
ＡＡＶは非分裂細胞に感染し、そして免疫原性無しに広い多様な生物においてインビボで長期の潜伏感染を樹立する能力を持つ小さい、欠損性の、非病原性の一本鎖ＤＮＡウイルスであるので、ヒトの遺伝子治療に理想的な媒体であると現在考えられている（非特許文献１）。例えば最近、有望な結果が血友病Ｂのための遺伝子治療に基づき２型組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ−２）を用いた臨床試験から得られた（非特許文献２）。さらに筋肉遺伝子導入に使用された非ウイルスおよびウイルスベクターの中で、ｒＡＡＶ−２ベクターは筋肉中で持続的な導入遺伝子発現を支持することができるので特に魅力的である。筋肉に基づく遺伝子治療のプロトコールは、筋ジストロフィーのような遺伝する筋肉疾患ならびに分泌される治療用タンパク質を生産する場について広く調査されてきた。しかしウイルス力価におけるさらなる改善が患者の機能的欠陥を完全に正すために必要である（Ｒａｙ ｅｔ ａｌ．，２０００）。
【０００３】
インビボで使用するためのｒＡＡＶ−２ベクターの効力を強化するために種々の方法が開発されてきている。Ｈａｇｓｔｒｏｍ ｅｔ ａｌ．（２０００）は、導入遺伝子発現カセットを修飾することによりｒＡＡＶ−２ベクターからより高レベルの第ＩＸ因子生産を示した（非特許文献３）。さらにＤｕａｎ ｅｔ ａｌ．，（非特許文献４）は，第２のスーパーエンハンサーｒＡＡＶベクターを同時投与した時、ｒＡＡＶが媒介する筋肉中の導入遺伝子発現に２００倍以上の強化を観察した。ｒＡＡＶ−２媒介型遺伝子導入を改善するさらなる手段を同定するために、さらに広いパネルの低分子化学化合物が上に挙げたウイルスゲノムを対象とした取り組みを補強するために調査された。例えば一本鎖Ｄ配列結合タンパク質の脱リン酸化はｒＡＡＶ−２の形質導入の活性化と相関し、そしてこの内容において一連のチロシンキナーゼインヒビターが遺伝子変換を強化することによりｒＡＡＶ−２の形質導入を上昇させるために開発された（非特許文献５）。
【０００４】
さらにｒＡＡＶ−２の細胞内トラフィッキングに対するバリアを克服するための努力では、ｒＡＡＶ−２形質導入の劇的な上昇が、プロテアソームインヒビターをウイルスと同時投与する時に分極した気道細胞で観察された（非特許文献６）。ユビキチン−プロテオソーム系の調節はｒＡＡＶ−２媒介型導入遺伝子発現の有意な強化、そして同時にウイルスの核トラフィッキングの増加をもたらすかもしれない。すなわちＡＡＶ−２キャプシドタンパク質のユビキチン化は、非発現性区分への細胞内トラフィッキングを別ルートで送ることにより、あるいは入って来るビリオンのウイルス分解を促進することにより、ｒＡＡＶ−２の形質導入に対するバリアとしての役割を果たすかもしれない。繊維芽細胞中の細胞内トラフィッキングがＡＡＶ−２の形質導入に対するバリアとなり得るという証拠も記載された（非特許文献７および非特許文献８）。
【０００５】
さらにＡＡＶ−２ゲノムの環状化および／またはコンカテマー化は、ｒＡＡＶに固有の４．７ｋｂのパッケージング限界を克服することができる（非特許文献９；非特許文献４；非特許文献１０；非特許文献１１；および非特許文献１２）。これらの取り組みは、独立したＡＡＶ−２ベクターのヘテロ二量化およびトランス−スプライシングを使用して大きな導入遺伝子（１つまたは複数）および調節要素（１つまたは複数）の送達を可能とする。
【０００６】
最近、さらなるＡＡＶ血清型に由来する組換えウイルスストックの調製が、それら血清型のクローニングを介して可能となった（非特許文献１３；非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；および非特許文献１８）。ＡＡＶ血清型の６種の霊長類単離物のクローニングおよびシークエンシングでは、それらが類似のゲノム組織化を共有することが示された。ＡＡＶ ＤＮＡ複製、プロウイルスの組込みおよび子孫のＡＡＶ ＤＮＡのウイルス粒子へのパッケージングには、各末端で逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）に挟まれた２つの大きなオープンリーディングフレームを有する最少配列が必要である。左のオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）は４つの非構造的Ｒｅｐタンパク質をコードする。これらのタンパク質はＡＡＶ転写を調節するだけでなく、ＡＡＶ複製、ウイルス集成にも関与し、そしてさらに潜伏感染中にウイルスゲノムの宿主染色体への部位特異的組込みにも役割を果たしている。ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４およびＡＡＶ−６のＲｅｐ ＯＲＦの配列は約８５％同一であるが、ＡＡＶ−５は他のＡＡＶ血清型と５４．５％の相同性を有するのみである。
【０００７】
ＡＡＶゲノムの右半分は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３と呼ぶ３つのウイルスキャプシドタンパク質をコードし、そしてＲｅｐ ＯＲＦよりも保存されていない。ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３およびＡＡＶ−６はキャプシドタンパク質のアミノ酸配列において約８０％の相同性を共有するが、すべての６種の血清型のキャプシドＯＲＦの並列配置では全アミノ酸同一性に４５％未満まで低下を生じた（非特許文献１３）。最も多様な領域は成熟ビリオンの外面で生じるようである（非特許文献１３；および非特許文献１４）。このキャプシドタンパク質配列における多様性は、６種のＡＡＶ血清型間の血清学的特徴および改変した組織親和性（ｔｒｏｐｉｓｍ）の差異の基礎である。
【０００８】
特に配列比較ではＡＡＶ−５キャプシドタンパク質が他の血清型のタンパク質とは有意に異なることを示す。例えばＡＡＶ−２とＡＡＶ−５キャプシドの詳細な配列比較では、４５％未満の相同性を示し、最も多様な領域はビリオンの外面上である。ＡＡＶ−５は細胞に入るために異なるレセプターおよび／または補助受容体を利用するらしい。実際にＡＡＶ−２とＡＡＶ−５との間で異なる形質導入プロフィールが、インビボの分極した気道上皮、筋肉および神経細胞を含む数種の異なる細胞型で証明された（非特許文献１９；非特許文献２０；および非特許文献２１）。さらにＮＯＤ／ＳＣＩＤマウスを対象とした最近の研究でも、ＡＡＶ−５が筋肉にはＡＡＶ−２よりも良いベクターであるかもしれないことが示唆された（非特許文献２２）。しかしこれらの研究のいずれも差異の原因となるウイルス形質導入の細胞内段階（１つまたは複数）を同定しなかった。
【０００９】
すなわち必要なことはｒＡＡＶ媒介型遺伝子送達の効力を上昇させるための方法である。
【特許文献１】
米国特許出願第６０／３０５，２０４号明細書
【非特許文献１】
Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，２：３５７−６２（１９９５）
【非特許文献２】
Ｋａｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．，２４：２５７−６１（２０００）
【非特許文献３】
Ｈａｇｓｔｒｏｍｅ ｅｔ ａｌ．，Ｂｌｏｏｄ．９５：２５３６−４２（２０００）
【非特許文献４】
Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，６：５９５−８（２０００ａ）
【非特許文献５】
Ｑｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：１５９３−９（１９９８）
【非特許文献６】
Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０５：１５７３−１５８７（２０００ｂ）
【非特許文献７】
Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：９９２−６（２０００）
【非特許文献８】
Ｈａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：４０８０−９０（２００１）
【非特許文献９】
Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１０：１５５３−１５５７（１９９９）
【非特許文献１０】
Ｎａｋａｉ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，１８：５２７−３２（２０００）
【非特許文献１１】
Ｓｕｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，６：５９９−６０２（２０００）
【非特許文献１２】
Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９７：６７１６−６７２１（２０００）
【非特許文献１３】
Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：９３９−４７（１９９９）
【非特許文献１４】
Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：１３０９−１９（１９９９）；Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７３：４２９３−８（１９９９）；
【非特許文献１５】
Ｃｈｉｏｒｉｎｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７１：６８２３−３３（１９９７）
【非特許文献１６】
Ｍｕｒａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，２２１：２０８−１７（１９９６）
【非特許文献１７】
Ｒｕｔｌｅｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：３０９−１９（１９９８）
【非特許文献１８】
Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７２：２２２４−３２（１９９８）
【非特許文献１９】
Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９７：３４２８−３２（２０００）
【非特許文献２０】
Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７４：３８５２−８（２０００）
【非特許文献２１】
Ｈｉｌｄｉｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７５：６１９９−２０３（２００１）
【非特許文献２２】
Ｃｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｔｈｅｒ．，２：６１９−２３（２０００）
【発明の開示】
【００１０】
発明の要約
本発明はシュードタイプ化（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）組換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）により真核細胞の形質導入を改変、例えば強化する方法、およびシュードタイプ化ｒＡＡＶによる形質導入を改変させる薬剤の同定法を提供する。シュードタイプ化ｒＡＡＶはＡＡＶキャプシドタンパク質およびｒＡＡＶゲノムの任意の組み合わせを含んでなる感染性ウイルスである。シュードタイプ化ｒＡＡＶはｒＡＡＶの組織または細胞特異性を改変させるために有用であり、そして単独で、または非−シュードタイプ化ｒＡＡＶと一緒に使用して１以上の遺伝子を細胞、例えば哺乳動物細胞に伝達することができる。例えばシュードタイプ化ｒＡＡＶは、非−シュードタイプ化ｒＡＡＶに対する免疫応答を発生した哺乳動物に非−シュードタイプ化ｒＡＡＶの投与後に使用することができる。任意のＡＡＶ血清型に由来するキャプシドタンパク質をｒＡＡＶゲノムと使用することができ、このゲノムは異なる血清型の野生型ＡＡＶゲノムに由来するか、または得ることができ、あるいはゲノムはキメラゲノム、すなわち２以上の異なる血清型に由来するＡＡＶ ＤＮＡから形成された、例えば２つのＩＴＲ（各ＩＴＲは異なる血清型またはキメラＩＴＲに由来する）を有するキメラゲノムである。２つのＡＡＶ血清型またはキメラＩＴＲに由来するＩＴＲを含んでなるようなキメラゲノムの使用は、転写的に活性な分子内コンカテマーの生産をさらに強化することができる指向的組換え（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）をもたらすことができる。すなわち本発明のｒＡＡＶベクター中の５’および３’ＩＴＲは相同的であり、すなわち同じ血清型、異種、すなわち異なる血清型、またはキメラ、すなわち１より多くのＡＡＶ血清型に由来するＩＴＲ配列を有するＩＴＲに由来することができる。１つの態様では、ｒＡＡＶのキャプシドは血清型ＡＡＶ−５のｃａｐ遺伝子によりコードされ、そしてｒＡＡＶのｒｅｐタンパク質およびＩＴＲは血清型ＡＡＶ−２に由来する。別の態様では、ｒＡＡＶのキャプシドはＡＡＶの血清型１〜６の１つのｃａｐ遺伝子によりコードされ、そしてｒＡＡＶのｒｅｐタンパク質およびＩＴＲはキャプシドの血清型とは異種のＡＡＶの血清型に由来する。
【００１１】
このように本発明は真核細胞、哺乳動物の肺、上皮、例えば鼻上皮、神経、筋肉または肝臓細胞のような哺乳動物の細胞あるいは真核細胞群のシュードタイプ化ｒＡＡＶ形質導入を改変する薬剤を同定する方法を提供する。この方法は細胞または細胞群を１以上の薬剤およびシュードタイプ化ウイルスと接触させることを含んでなる。次にウイルスの形質導入が改変したかどうかを、マーカー遺伝子、選択可能な遺伝子または治療用遺伝子産物の発現を検出することにより測定する。好適な細胞には哺乳動物、鳥、魚および爬虫類、特にヒト、非−ヒト霊長類、畜牛、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリおよび七面鳥のような家畜化された哺乳動物および鳥の細胞を含む。好適な薬剤は例えばウイルスのエンドサイトーシスを強化し、エンドソームまたはプロテオソーム中のウイルス核酸またはタンパク質の分解を減少させることにより、エンドソームのプロセッシングを強化し、かつ／またはウイルスの核への輸送を強化することによりウイルスの形質導入を強化するものである。すなわちウイルスの形質導入を強化する薬剤は治療用ペプチドまたはポリペプチドを誘導および／または発現させるためにｒＡＡＶを使用する遺伝子治療に特に有用である。さらに形質導入される細胞は、ウイルス感染の前に、ウイルス感染と同時に、ウイルス感染の後に、あるいはそれらを組み合わせて１以上の薬剤と接触させることができる。
【００１２】
これから記載するように、ｒＡＡＶ−２ゲノムは相補する（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔｉｎｇ）ＡＡＶ−２ Ｒｅｐタンパク質の存在下でＡＡＶ−５キャプシドにパッケージングして感染性粒子を得た。異なる血清型のｒＡＡＶベクターに関する感染経路を直接的に比較するために、ＡＡＶ−２キャプシドにパッケージングされたｒＡＡＶ−２ゲノムを有するｒＡＡＶも調製した。ついでｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５（ＡＡＶ−５キャプシドにシュード−パッケージングされたＡＡＶ−２ゲノム）についてマウスの筋肉細胞への遺伝子送達効率を比較した。未分化の筋芽細胞におけるこれら２種のベクターによる類似レベルの形質導入にもかかわらず、シュードタイプ化ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５はｒＡＡＶ−２に比べてインビトロの分化した筋芽細胞（＞５００倍）およびインビボの骨格筋細胞（＞２００倍）で、劇的に強化された形質導入を示した。形質導入効率における血清型特異的差異は筋肉細胞へのウイルス結合とは直接相関しなかったが、感染に対するエンドサイトーシス的または細胞内バリアが関与すると思われた。さらにシュードタイプ化ウイルスはデュシェンヌ型（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ’ｓ）筋ジストロフィーのマウスモデルを対象とした形質導入効率を有意に向上させたことも示した。
【００１３】
また以下に記載するように、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５キャプシド粒子の両方にパッケージングされたルシフェラーゼレポーターを駆動するＲＳＶ ＬＴＲプロモーターを持つ組換えＡＡＶ−２構築物の形質導入効率を、多数の細胞系およびインビボの肺で比較した。インビトロでプロテオソームインヒビターとウイルスの同時投与はＡＡＶ−２の形質導入効率を上昇させただけでなく、しばしばわずかに低い程度ではあったがＡＡＶ−５媒介型遺伝子導入も増した。プロテオソームインヒビターの存在下で増加した導入遺伝子の発現は、感染から２４時間後に内面化されたウイルスＤＮＡの量に有意な差異が検出されなかったので、ウイルスゲノムの分解とは無関係であった。感染したＨｅＬａ細胞溶解物から免疫沈降したウイルスタンパク質のウエスタンブロットアッセイおよびインビトロの再構成実験では、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５キャプシド両方のユビキチン共役の証拠が明らかとなった。これらの研究はｒＡＡＶ−２に関するユビキチン／プロテアソーム経路が関与するこれまでに報告されたバリアが、ｒＡＡＶ−５キャプシドエントリー経路にも活性であることを示唆している。シュードタイプ化ｒＡＡＶおよびプロテオソームインヒビターＺ−ＬＬＬのインビボ同時投与は、感染から１４および４２日後にそれぞれ１７．２−および２．１倍の全肺ルシフェラーゼ発現を誘導した。
【００１４】
細胞、例えばヒト細胞の、ｒＡＡＶによる形質導入を強化するための薬剤には、限定するわけではないがペプチドシステインプロテアーゼインヒビター、例えばＬＬｎＬのようなシステインプロテアーゼインヒビターを含むエンドソームプロテアーゼまたはプロテオソームインヒビター、あるいはそれらの類似体を含む。したがって本発明は真核細胞をウイルスおよび式（Ｉ）：Ｒ１−Ａ−（Ｂ）ｎ−Ｃの化合物（式中、Ｒ１はＮ−末端アミノ酸ブロッキング基であり；各ＡおよびＢは独立してアミノ酸であり；Ｃはアミノ酸であり、ここで末端カルボキシ基はホルミル（ＣＨＯ）基により置換されており；そしてｎは０、１、２または３である）、あるいはそれら製薬学的に許容され得る塩を含んでなる薬剤に接触させる方法をさらに提供する。１つの態様では、Ｒ１が（Ｃ１−Ｃ１０）アルカノイルである。別の態様では、Ｒ１がアセチルまたはベンジルオキシカルボニルである。さらに別の態様では、Ｒ１が（Ｃ１−Ｃ１０）アルカノイルまたはベンジルオキシカルボニルであり；ＡおよびＢは各々がイソロイシンであり；Ｃがノル−ロイシンまたはノル−バリンであり、ここで末端のカルボキシ基はＣＨＯ基により置換されており；そしてＮが１である。さらなる態様では、Ｃがアラニン、アルギニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、ノル−ロイシンまたはノル−バリンであり、ここで末端のカルボキシ基はＣＨＯ基により置換されており、例えば１つの態様ではＣがノル−ロイシンまたはノル−バリンであり、そして末端のカルボキシ基がＣＨＯ基で置換されている。さらに別の態様では、ＡおよびＢは各々独立してアラニン、アルギニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、ノル−ロイシンまたはノル−バリンであり、例えば１つの態様ではＡおよびＢがそれぞれイソロイシンである。
【００１５】
本発明の別の薬剤は、式（ＩＩ）：
【００１６】
【化１】
Figure 2004534543
【００１７】
式中、
Ｒ２はＮ−末端アミノ酸ブロッキング基であり；
Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は各々が独立して水素、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、アリールまたはアリール（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであり；そして
Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は各々が独立して水素、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、アリールまたはアリール（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルである、
の化合物またはそれらの製薬学的に許容され得る塩である。
【００１８】
Ｒ２が（Ｃ１−Ｃ１０）アルカノイル、例えばアセチルまたはベンジルオキシカルボニルでもよく；Ｒ３が水素または（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、例えば２−メチルプロピルでもよい。Ｒ５が水素または（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、例えばブチルまたはプロピルでもよい。１つの態様ではＲ２がアセチルまたはベンジルオキシカルボニルであり；Ｒ３およびＲ４が各々２−メチルプロピルであり；Ｒ５がブチルまたはプロピルであり；そしてＲ６、Ｒ７およびＲ８は各々が独立して水素である。１つの態様ではＲ１がＨ、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルカノイル、（＝Ｏ）、（＝Ｓ）、ＯＨ、ＳＲ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチルまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシであり、ここでアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはアルカノイルはハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチル、ＮＲＲまたはＳＲの１以上で場合により置換されてもよく、ここで各Ｒが独立してＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであり；Ｒ２が（＝Ｏ）または（＝Ｓ）であり；Ｒ３がＨ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシまたは（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキルであり、ここでアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはシクロアルキルは、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチル、ＳＲまたはＮＲＲの１以上で場合により置換されてもよく、ここで各Ｒは独立してＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであり；Ｒ４がＨ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシまたは（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキルであり、ここでアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはシクロアルキルはハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチル、ＳＲまたはＮＲＲの１以上で場合により置換されてもよく、ここで各Ｒは独立してＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであり；Ｒ５がＨ、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルカノイル、（＝Ｏ）、（＝Ｓ）、ＯＨ、ＳＲ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチルであり、ここでアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはアルカノイルはハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチル、ＮＲＲまたはＳＲの１以上で場合により置換されてもよく、ここで各Ｒは独立してＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであり；そしてＸがＯ、ＳまたはＮＲであり、ここでＲはＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであり、あるいはそれらの製薬学的に許容され得る塩である。
【００１９】
本発明の方法に有用な他の薬剤は、式（ＩＩＩ）：
【００２０】
【化２】
Figure 2004534543
【００２１】
式中、
Ｒ１はＨ、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルカノイル、（＝Ｏ）、（＝Ｓ）、ＯＨ、ＳＲ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチルまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシであり、ここでアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはアルカノイルはハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチル、ＮＲＲまたはＳＲの１以上で場合により置換されてもよく、ここで各Ｒは独立してＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであり；Ｒ２は（＝Ｏ）または（＝Ｓ）であり；Ｒ３はＨ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシまたは（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキルであり、ここでアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはシクロアルキルは、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチル、ＳＲまたはＮＲＲの１以上で場合により置換されてもよく、ここで各Ｒは独立してＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであり；Ｒ４はＨ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシまたは（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキルであり、ここでアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはシクロアルキルはハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチル、ＳＲまたはＮＲＲの１以上で場合により置換されてもよく、ここで各Ｒは独立してＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであり；Ｒ５はＨ、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルカノイル、（＝Ｏ）、（＝Ｓ）、ＯＨ、ＳＲ、ＣＮ、ＮＯ２またはトリフルオロメチルであり、ここでアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはアルカノイルはハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチル、ＮＲＲまたはＳＲの１以上で場合により置換されてもよく、ここで各Ｒは独立してＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであり；そしてＸはＯ、ＳまたはＮＲであり、ここでＲはＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルである、
の化合物、あるいはそれらの製薬学的に許容され得る塩を含む。
【００２２】
好ましくはＲ１がＯＨである。Ｒ２が（＝Ｏ）であり；Ｒ３がＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであることも好ましく、そしてより好ましくはＲ３がメチルである。他の好適な態様には、Ｒ４がＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであり、そしてより好ましくはＲ４がＨであり；Ｒ５がハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチルまたはＯＨであり、そしてさらに好ましくはＲ５がＯＨであるものを含む。式（ＩＩＩ）の化合物にはＸがＯまたはＳであり、好ましくはＯであり；ここで両方の−−−−−−が単結合であり；ここで１つの−−−−−−が二重結合であるか、またはここで２つの−−−−−−が二重結合であるものを含む。より好適な態様では、Ｒ１がＯＨであり、Ｒ２が（＝Ｏ）であり、Ｒ３がメチルであり、Ｒ４がＨであり、Ｒ５がＯＨであり、ＸがＯであり、そして両方の−−−−−−−が二重結合である。
【００２３】
本発明の方法に有用なさらに別の薬剤は、式（ＩＩＩ）：
【００２４】
【化３】
Figure 2004534543
【００２５】
式中、Ｒ１はハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチルまたはＯＨである、
の化合物である。好ましくはＲ１がＯＨである。またＲ２が（＝Ｏ）であり；Ｒ３がＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであることも好ましく、そしてより好ましくはＲ３がメチルである。他の好適な態様はＲ４がＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであり、そしてより好ましくはＲ４がＨであり；Ｒ５がハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチルまたはＯＨであり、そしてより好ましくはＲ５がＯＨである。式（ＩＩＩ）の化合物は、ＸがＯまたはＳ、好ましくはＯであり；ここで両方の−−−−−−が単結合であり、ここで１つの−−−−−−が二重結合であり、あるいはここで両−−−−−−が二重結合であるものを含む。より好適な態様では、Ｒ１がＯＨであり、Ｒ２が（＝Ｏ）であり、Ｒ３がメチルであり、Ｒ４がＨであり、Ｒ５がＯＨであり、ＸがＯであり、そして両−−−−−−が二重結合である。
【００２６】
本発明の方法に有用な別の薬剤には、ユビキチンの活性化、ユビキチンのユビキチンキャリアータンパク質への輸送、ユビキチンリガーゼまたはそれらの組み合わせを阻害する薬剤を含む。好適なユビキチンリガーゼインヒビターには、式（ＩＶ）：
Ｒ−Ａ−Ａ１−Ｒ１
式中、Ｒは水素、アミノ酸またはペプチドであり、ここでＮ−末端アミノ酸はアミノ基でアセチル、アシル、トリフルオロアセセチルまたはベンジルオキシカルボニルで場合により保護されることができ；
Ａはアミノ酸または直接結合であり；
Ａ１はアミノ酸であり；そして
Ｒ１はヒドロキシまたはアミノ酸であり、ここでＣ−末端アミノ酸はカルボキシ基で（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、フェニル、ベンジルエステルまたはアミド（例えば、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２、ここで各Ｒは独立して水素または（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである）で場合により保護されることができる、
の化合物、またはそれらの製薬学的に許容され得る塩を含む。
【００２７】
Ｒに関する具体的な値は水素である。
【００２８】
Ａに関する具体的な値はアミノ酸である。Ａに関する別の具体的な値はＩｌｅ、ＬｅｕまたはＨｉｓである。Ａに関する別の具体的な値はＬｅｕまたはＨｉｓである。
【００２９】
Ａ１に関する具体的な値はＡｌａまたはＧｌｙである。Ａ１に関する別の具体的な値はＡｌａである。
【００３０】
Ｒ１に関する具体的な値はヒドロキシである。
【００３１】
具体的にはペプチドはジペプチド（すなわち２つのアミノ酸を含んでなることができる）であることができる。
【００３２】
具体的にはペプチドはＨ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｈ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｈ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｈ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＯＨまたはＨ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＯＨであることができる。さらに具体的にはペプチドはＨ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨまたはＨ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−ＯＨであることができる。
【００３３】
さらにプロセッシング、例えばウイルスのエンドソームプロセッシングを阻害する薬剤の活性は、エンドソームプロセッシングに関係する経路中の分子を改変させることができるＥＤＴＡまたはＥＧＴＡのような薬剤、例えば細胞内カルシウムレベルのカルシウムキレーターまたはモジュレーターのような薬剤の添加により強化することができる。すなわちエンドソームプロセッシングのインヒビターを含む薬剤およびインヒビター（１つまたは複数）の活性を強化する薬剤の組み合わせを本発明の方法に使用することができる。
【００３４】
また本発明は真核細胞または細胞群のｒＡＡＶの形質導入を改変させる方法も提供する。この方法は細胞または細胞群を１以上のｒＡＡＶ、例えばシュードタイプ化ｒＡＡＶ、および少なくとも１つの薬剤とウイルスの形質導入を改変させるために有効な量で接触させることを含んでなる。薬剤はウイルスと同時に細胞と、細胞とウイルスの接触前に、または細胞とウイルスを接触させた後に接触させることができる。薬剤（１つまたは複数）および／またはウイルスは所望の効果を達成するように、すなわちｒＡＡＶの形質導入を強化するためにそれぞれ１回投与されるか、あるいは反復投与することができる。ＡＡＶは広い宿主範囲を有し（肺での発現に関して）、そして筋肉中で存続することが示されているので、ｒＡＡＶは任意の動物、特に哺乳動物、鳥、魚および爬虫類、特に畜牛、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、ニワトリおよび七面鳥のような家畜化された哺乳動物および鳥で遺伝子を発現させるために使用することができる。ヒトおよび家畜での使用が特に好ましい。発現させる遺伝子はどの制御要素（例えばプロモーター、オペレーター）が望ましいかにかかわらず、ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントであるか、または非−コードＤＮＡセグメントのいずれかであることができ、その転写により幾つかのＲＮＡを含む分子（転写制御要素、＋ＲＮＡまたはアンチ−センス分子のような）のすべてまたは部分が生産される。１つの態様では、ｒＡＡＶのキャプシドは血清型ＡＡＶ−５のｃａｐ遺伝子によりコードされ、そしてｒＡＡＶのｒｅｐタンパク質およびＩＴＲが血清型ＡＡＶ−２に由来する。別の態様では、ｒＡＡＶのキャプシドがＡＡＶの血清型１〜６の１つのｃａｐ遺伝子によりコードされ、そしてｒＡＡＶのｒｅｐタンパク質およびＩＴＲがキャプシドの血清型とは異種のＡＡＶの血清型に由来する。
【００３５】
特に本発明のシュードタイプ化ｒＡＡＶおよび任意の本発明の１以上の薬剤は、形質導入効率および／または導入遺伝子発現を改変、例えば上昇させるための方法、導入遺伝子発現効率を検出または測定する方法、プロモーター強度および／またはＲＮＡ安定性をスクリーニングするための方法、ならびに血液障害（例えば鎌形赤血球貧血、サラセミア、血友病およびファンコーニ貧血）、アルツハイマー病およびパーキンソン病のような神経障害、および骨格筋、心筋または平滑筋が関与する筋肉障害ならびに肺の疾患、例えば嚢胞性繊維症および喘息の治療を含む治療的または予防的治療に使用することができる。特にシュードタイプ化ｒＡＡＶは限定するわけではないがβ−グロビン遺伝子、γ−グロビン遺伝子、第ＶＩＩＩ因子遺伝子、第ＩＸ因子遺伝子、嚢胞性繊維症膜貫通受容体（ｃｙｃｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓｉｓ ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ ｃｏｎｄｕｃｔａｎｃｅ ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＣＦＴＲ）遺伝子、エリトロポエチン（ｅｐｏ）遺伝子、ファンコーニ貧血相補群、リボザイムをコードする遺伝子、アンチセンス遺伝子、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子（パーキンソン病）、グルコセレブロシダーゼ遺伝子（ゴーシェ病）、アリールスルファターゼＡ遺伝子（異染色性白質萎縮症）、ジストロフィン遺伝子、ジスフェルリン（ｄｙｓｆｅｒｌｉｎ）遺伝子、ＡＴＰ結合カセット輸送遺伝子、または他のポリペプチドもしくはタンパク質をコードする遺伝子を含む治療用遺伝子を送達するために使用することができる。また本発明の範囲の中にあるのは、本発明のベクター中に１より多くの遺伝子またはオープンリーディングフレームを包含することであり、すなわち複数の遺伝子が個々のベクターに存在してよい。
【００３６】
さらに２以上の異なるｒＡＡＶを用いた同時感染は、分子間組換えを通して特定のｒＡＡＶの１以上のコピーを有するコンカテマーを生じる。少なくとも２つの異なるｒＡＡＶゲノムを含んでなるコンカテマーであり得る単一分子、例えばエピソームを形成するためのｒＡＡＶゲノムの分子間組換えの意義は、ｒＡＡＶのパッケージング容量を越えた大きな調節要素および遺伝子を生物の同時感染する細胞または組織により２つの独立したｒＡＡＶベクターで一緒に持ち込むことができるので特に遺伝子治療に意味がある。例えばエンハンサーおよび／またはプロモーターを１つのベクターに導入することができ、同時に最小プロモーターを持つ、または持たないオープンリーディンクイフレイム、例えば目的遺伝子を含んでなるＤＮＡを第２ベクターに導入する。すなわち２つのベクターで同時感染させた後、導入遺伝子カセットのサイズは単一ＡＡＶベクター単独のサイズを越えて上昇し、そしてオープンリーディンクイフレイムを含んでなるＤＮＡがエンハンサーおよび／またはプロモーターに連結される。本発明の別の態様では、遺伝子の２つの独立した領域をコードするベクターを一緒にして完全なスプライシング単位を形成する。１つの態様では、ｒＡＡＶのキャプシドは血清型ＡＡＶ−５のｃａｐ遺伝子によりコードされ、そしてｒＡＡＶのｒｅｐタンパク質およびＩＴＲは血清型ＡＡＶ−２に由来する。別の態様では、ｒＡＡＶのキャプシドはＡＡＶの血清型１〜６の１つのｃａｐ遺伝子によりコードされ、そしてｒＡＡＶのｒｅｐタンパク質およびＩＴＲはキャプシドの血清型とは異種のＡＡＶの血清型に由来する。例えばｒＡＡＶが筋肉に形質導入するために使用される１つの態様では、ｒＡＡＶのキャプシドは血清型ＡＡＶ−１またはＡＡＶ−５のｃａｐ遺伝子によりコードされ、そしてｒＡＡＶのｒｅｐタンパク質およびＩＴＲはそれぞれ血清型ＡＡＶ−２またはＡＡＶ−１に由来する。
【００３７】
このように本発明はｒＡＡＶベクター内の導入遺伝子に関する現在のサイズの限界を克服するために有用であり、そしてより大きな転写調節領域、例えばより強力な異種プロモーターまたは内因性ＣＦＴＲプロモーター、例えばＣＦＴＲ内因性プロモーターまたは１以上のエンハンサー配列の包含を可能とする。
【００３８】
本発明のさらなる態様では、複製起点、および起点に結合し、そして起点に連結するＤＮＡの複製および／または維持を促進するタンパク質をコードするＤＮＡを含んでなるベクター、および目的遺伝子を含んでなる別のベクターを、同時に感染させた後に一緒にしてエピソーム、好ましくは遺伝子を含んでなる自律複製エピソームを形成する。１つの態様では、複製起点およびタンパク質をコードするＤＮＡはＥＢＶ、例えばＯｒｉＰおよびＥＢＮＡ−１に由来する。１つの態様では、ｒＡＡＶのキャプシドは血清型ＡＡＶ−５のｃａｐ遺伝子によりコードされ、そしてｒＡＡＶのｒｅｐタンパク質およびＩＴＲは血清型ＡＡＶ−２に由来する。別の態様では、ｒＡＡＶのキャプシドはＡＡＶの血清型１〜６の１つのｃａｐ遺伝子によりコードされ、そしてｒＡＡＶのｒｅｐタンパク質およびＩＴＲはキャプシドの血清型とは異種のＡＡＶの血清型に由来する。
【００３９】
したがって複数のＤＮＡセグメント（個々のｒＡＡＶベクター中の各々）は、１より多くのｒＡＡＶに由来する複数のＤＮＡセグメントを有する単一のＤＮＡ分子を生じるように細胞に送達される。本発明の１つの態様では、１つのｒＡＡＶは：ｉ）ＡＡＶの５’−ＩＴＲを含んでなる第１ＤＮＡセグメント；ｉｉ）ＡＡＶ配列を含まない第２ＤＮＡセグメント；およびｉｉｉ）ＡＡＶの３’−ＩＴＲを含んでなる第３ＤＮＡセグメントを連結して含んでなる第１組換えＤＮＡ分子を含んでなることができる。第２組換えＡＡＶは：ｉ）ＡＡＶの５’−ＩＴＲを含んでなる第１ＤＮＡセグメント；ｉｉ）ＡＡＶ配列を含まない第２ＤＮＡセグメント、そしてその第２ＤＮＡセグメントは第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントとは異なる；および；ｉｉｉ）ＡＡＶの３’−ＩＴＲを含んでなる第３ＤＮＡセグメントを連結して含んでなる第２組換えＤＮＡ分子を含んでなる。少なくとも１つのｒＡＡＶはシュードタイプ化ｒＡＡＶである。
【００４０】
このように本発明の１つの態様では１つのｒＡＡＶベクターは、オープンリーディンクイフレイム（しかし全オープンリーディンクイフレイムではない）の５’末端に操作可能に連結されたプロモーターを含んでなる第２ＤＮＡセグメントに連結された５’ＩＴＲおよび３’ＩＴＲを含んでなる第３ＤＮＡセグメントに連結された５’スプライス部位を含んでなる第１ＤＮＡセグメントを含んでなる。第２ｒＡＡＶベクターは、３’スプライス部位およびオープンリーディンクイフレイムの３’末端（残り）を含んでなる第２ＤＮＡセグメントに連結された５’ＩＴＲを含んでなる第１ＤＮＡを含んでなり、すなわち第２ベクターの第２ＤＮＡセグメントは第１ベクターの第２ＤＮＡセグメントと一緒に、３’ＩＴＲを含んでなる第３ＤＮＡセグメントに連結された機能的ペプチドまたはポリペプチドをコードする。「機能的」ペプチドまたはポリペプチドは、参照ペプチドまたはポリペプチド、例えば野生型（完全長）ポリペプチドと実質的に同じ活性を有するものである。好ましくは第２ＤＮＡセグメントは一緒に、例えばＣＦＴＲ、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィンまたはエリトロポエチンをコードするＤＮＡを含んでなる。第２ＤＮＡセグメントはｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたはそれらの組み合わせから得られるか、または由来することができる。例えば第１ベクターの第２ＤＮＡセグメントは、１より多くのエキソンを含んでなる遺伝子の１以上の、しかしすべてではないエキソンを含んでなることができるそして第２ベクターの第２ＤＮＡセグメントは第１ベクター中には存在しない遺伝子の少なくとも１つのエキソンを含んでなることができる。第１ベクターの第２ＤＮＡセグメントは各遺伝子の内因性プロモーター、例えばｅｐｏプロモーターを含んでなることができる。１つの態様では、ｒＡＡＶのキャプシドは血清型ＡＡＶ−５のｃａｐ遺伝子によりコードされ、そしてｒＡＡＶのｒｅｐタンパク質およびＩＴＲは血清型ＡＡＶ−２に由来する。別の態様では、ｒＡＡＶのキャプシドはＡＡＶの血清型１〜６の１つのｃａｐ遺伝子によりコードされ、そしてｒＡＡＶのｒｅｐタンパク質およびＩＴＲはキャプシドの血清型とは異種のＡＡＶの血清型に由来する。
【００４１】
別の態様では１つのｒＡＡＶベクターは、３’ＩＴＲを含んでなる第３ＤＮＡセグメントに連結されたプロモーターおよび／またはエンハンサーを含んでなる第２ＤＮＡセグメントに連結された５’ＩＴＲを含んでなる第１ＤＮＡセグメントを含んでなる。第２ｒＡＡＶベクターは、３’ＩＴＲを含んでなる第３ＤＮＡセグメントに連結されたプロモーター（第１ベクター中のプロモーターとは異なるか、または第１ベクター中のプロモーターの第２コピー）に場合により連結されたオープンリーディンクイフレイムの少なくとも一部を含んでなる第２ＤＮＡセグメントに連結された５’ＩＴＲを含んでなる第１ＤＮＡセグメントを含んでなる。例えば第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントは、少なくとも１つの異種エンハンサーおよび／または少なくとも１つの異種プロモーターを含んでなり、すなわちエンハンサーおよび／またはプロモーター配列はＡＡＶ配列に由来しない。好ましくは第２組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントは、機能的タンパク質をコードするオープンリーディンクイフレイムの一部を含んでなる。このように少なくとも１つのシュードタイプ化ｒＡＡＶ（例えば導入遺伝子を含むベクター、および少なくとも１つの好ましくは少なくとも２つ以上のエンハンサー配列を含んでなる第２ベクター）を用いた細胞の同時感染は、最小プロモーターからの導入遺伝子発現の強化をもたらすことができる。さらに強化はプロモーター無しで導入遺伝子を含むベクター中のＩＴＲのシス−活性化によっても達成することができる。すなわち組織特異的エンハンサーを含む大きな調節要素を別個のｒＡＡＶベクターにより細胞に導入して、細胞内のコンカテマー化後に第２導入遺伝子含有ＡＡＶベクターの発現をシスで調節することができる。１つの態様では、ｒＡＡＶのキャプシドはｒＡＡＶのキャプシドは血清型ＡＡＶ−５のｃａｐ遺伝子によりコードされ、そしてｒＡＡＶのｒｅｐタンパク質およびＩＴＲは血清型ＡＡＶ−２に由来する。別の態様では、ｒＡＡＶのキャプシドはＡＡＶの血清型１〜６の１つのｃａｐ遺伝子によりコードされ、そしてｒＡＡＶのｒｅｐタンパク質およびＩＴＲはキャプシドの血清型とは異種のＡＡＶの血清型に由来する。
【００４２】
本発明のさらに別の態様では、第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントは宿主細胞の複製機能の起点、例えばＯｒｉＰのようなウイルスの複製起点を含んでなる。好ましくはヒト細胞中で起点は機能性である。また好ましくは第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントはさらに複製起点に結合するタンパク質、例えばＥＢＮＡ−１をコードするＤＮＡを含んでなる。第２組換えＤＮＡ分子中の第２ＤＮＡセグメントは、オープンリーディンクイフレイムの少なくとも一部分、および好ましくはオープンリーディンクイフレイムに操作可能に連結されたプロモーターを含んでなる。
【００４３】
本発明のさらに別の態様では、第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントは、組換え酵素用のシス−作用性（ｃｉｓ−ａｃｔｉｎｇ）組込み配列（１つまたは複数）を含んでなり、そして組込み配列（１つまたは複数）に特異的な組換え酵素またはインテグラーゼ、例えばバクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘ系（米国特許第５，６５８，７７２号明細書）、酵母のＦＬＰ／ＦＲＴ系、ファージＭｕのＧｉｎ組換え酵素、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のＰｉｎ組換え酵素、ｐＳＲ１プラスミドのＲ／ＲＳ系、レンチウイルスまたはレトロウイルスのレトロトランスポサーゼまたはインテグラーゼもコードする。第２組換えＤＮＡ分子中の第２ＤＮＡセグメントは、オープンリーディンクイフレイムの少なくとも一部分、および好ましくはオープンリーディンクイフレイムに操作可能に連結されたプロモーターを含んでなる。第１および第２組換えＤＮＡ分子を含んでなるコンカテマーの形成、および組換え酵素またはインテグラーゼの発現は、コンカテマーまたはそれらの部分の宿主ゲノムへの組込みを強化するだろう。また上で検討したような指向的組換えを駆動するために有用であるシス−作用性組込み配列および対応する組換え酵素またはインテグラーゼを含んでなるｒＡＡＶベクターは、２以上のｒＡＡＶベクターを使用する時に、特に有用となり得る。１つの態様では、ｒＡＡＶのキャプシドは血清型ＡＡＶ−５のｃａｐ遺伝子によりコードされ、そしてｒＡＡＶのｒｅｐタンパク質およびＩＴＲは血清型ＡＡＶ−２に由来する。別の態様では、ｒＡＡＶのキャプシドはＡＡＶの血清型１〜６の１つのｃａｐ遺伝子によりコードされ、そしてｒＡＡＶのｒｅｐタンパク質およびＩＴＲはキャプシドの血清型とは異種のＡＡＶの血清型に由来する。
【００４４】
このように本発明のベクターはベクター（１つまたは複数）を有する宿主細胞を調製するために、宿主細胞に１以上の導入遺伝子を送達および／または発現する方法に、ならびにｒＡＡＶ（１つまたは複数）を含んでなる組成物の調製に有用である。宿主細胞は本発明の薬剤を用いて、または用いずに各ｒＡＡＶに別々に、例えば順次に接触させることができる。遺伝子（１つまたは複数）を宿主細胞に送達するために、組換えアデノウイルスヘルパーウイルスを使用してもよい。
【００４５】
このように本発明は宿主細胞中でポリペプチドを発現させるための方法を提供する。宿主細胞は好ましくは哺乳動物細胞、例えばマウス、イヌ、フェラル（ｆｅｒａｌ）またはヒト細胞であり、そして肺、神経または筋肉細胞でよい。この方法は宿主細胞を少なくとも２つのｒＡＡＶベクターと接触させることを含んでなり、ｒＡＡＶベクターの少なくとも１つはシュードタイプ化ｒＡＡＶである。宿主細胞は好ましくはベクターと同時に接触させられるが、宿主細胞は他のベクター（１つまたは複数）との接触に関して各ベクターと異なる時期に接触させてもよいと想定する。本発明の１以上の薬剤も方法に使用することができ、そして細胞とベクター（１つまたは複数）の接触前、同時または後に接触させることができる。１つの態様では、ｒＡＡＶのキャプシドは血清型ＡＡＶ−５のｃａｐ遺伝子によりコードされ、そしてｒＡＡＶのｒｅｐタンパク質およびＩＴＲは血清型ＡＡＶ−２に由来する。別の態様では、ｒＡＡＶのキャプシドはＡＡＶの血清型１〜６の１つのｃａｐ遺伝子によりコードされ、そしてｒＡＡＶのｒｅｐタンパク質およびＩＴＲはキャプシドの血清型とは異種のＡＡＶの血清型に由来する。
【００４６】
また細胞中の導入遺伝子の発現を検出する方法も提供する。この方法は宿主細胞を、オープンリーディンクイフレイム、例えばマーカー遺伝子、または対応する野生型のオープンリーディンクイフレイムに比べて１以上の遺伝的修飾を有するオープンリーディンクイフレイムに連結された非−ＡＡＶプロモーターを含んでなる導入遺伝子を含んでなる本発明のシュードタイプ化ｒＡＡＶと接触させることを含んでなる。次に導入遺伝子の発現を、例えば異なるプロモーターに連結された導入遺伝子、または同じプロモーターを持つが野生型のオープンリーディンクイフレイムに連結されている導入遺伝子を含んでなるｒＡＡＶと接触させた宿主細胞に対して検出または測定する。場合により細胞を本発明の１以上の薬剤と接触させてもよい。
【００４７】
本発明はｒＡＡＶおよびウイルスの形質導入を改変させる薬剤と接触させた細胞も提供する。１つの態様では、細胞をＡＡＶ−５キャプシドを含んでなるｒＡＡＶおよびウイルスの形質導入を改変させる薬剤と接触させる。別の態様では細胞をシュードタイプ化されたｒＡＡＶおよびウイルスの形質導入を改変させる薬剤と接触させる。１つの態様では、ｒＡＡＶのキャプシドは血清型ＡＡＶ−５のｃａｐ遺伝子によりコードされ、そしてｒＡＡＶのｒｅｐタンパク質およびＩＴＲは血清型ＡＡＶ−２に由来する。別の態様では、ｒＡＡＶのキャプシドはＡＡＶの血清型１〜６の１つのｃａｐ遺伝子によりコードされ、そしてｒＡＡＶのｒｅｐタンパク質およびＩＴＲはキャプシドの血清型とは異種のＡＡＶの血清型に由来する。
［発明の詳細な記述］
定義
「ベクター」は、本明細書において用いる場合、ポリヌクレオチドを含んでなるかもしくはそれと会合しそしてインビトロもしくはインビボのいずれかにおいて細胞へのポリヌクレオチドの送達を仲介するために用いることができる高分子もしくは複数の高分子の会合をさす。実例となるベクターには、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、リポソームおよび他の遺伝子送達媒体が包含される。「標的ポリヌクレオチド」もしくは「導入遺伝子」と呼ばれることもある送達されるポリヌクレオチドは、遺伝子治療における対象のコーディング配列（治療対象のタンパク質をコードする遺伝子のような）および／または選択可能なもしくは検出可能なマーカーを含んでなることができる。
【００４８】
「ＡＡＶ」はアデノ随伴ウイルスであり、そしてウイルス自体もしくはその誘導体をさすために用いることができる。該用語は、他に必要とされる場合を除いて、全てのサブタイプ、血清型およびシュードタイプ、ならびに天然に存在する形態および組換え形態の両方を包含する。本明細書において用いる場合、「血清型」という用語は、その結合特性によって同定されそしてそれに基づいて他のＡＡＶと区別されるＡＡＶをさし、例えば、６つの血清型の霊長類ＡＡＶ、ＡＡＶ−１−ＡＡＶ−６があり、そして該用語は同じ結合特性を有するシュードタイプを包含する。従って、例えば、ＡＡＶ−５血清型には、ＡＡＶ−５の結合特性を有するＡＡＶ、例えば、ＡＡＶ−５キャプシドおよびＡＡＶ−５に由来しないかもしくはそれから得られないまたはそのゲノムがキメラであるｒＡＡＶゲノムを含んでなるシュードタイプＡＡＶが包含される。「ｒＡＡＶ」という略語は、組換えＡＡＶベクター（もしくは「ｒＡＡＶ」ベクター）とも呼ばれる組換えアデノ随伴ウイルスをさす。
【００４９】
「形質導入」もしくは「形質導入すること」は、本明細書において用いる場合、外因性ポリヌクレオチド、例えば細胞における導入遺伝子の発現をもたらす宿主細胞への該ポリヌクレオチド、例えばｒＡＡＶベクターにおける導入遺伝子の導入のためのプロセスをさす用語である。該プロセスには、１）細胞膜へのウイルスの結合、２）エンドサイトーシス、３）エンドソームからの脱出および核へのトラフィッキング、４）ウイルス粒子の脱殻、５）モノマーもしくはコンカテマーの環状および線状中間体を包含する、発現可能な二本鎖形態を形成するための第二のＤＮＡ鎖の合成、および６）宿主ゲノムへの組込みが包含され、例えば本発明の因子によるこれらのいずれかの改変、もしくはその組み合わせは、宿主細胞もしくは細胞の集団における導入ポリヌクレオチドの改変された発現もしくは持続性をもたらす。ｒＡＡＶによって導入されるポリヌクレオチドの改変された発現もしくは持続性は、タンパク質発現、ならびにＤＮＡおよびＲＮＡハイブリダイゼーションが包含されるがこれらに限定されるものではない当該技術分野において周知である方法により決定することができる。本発明の因子は、インビトロもしくはインビボにおいて導入ポリヌクレオチド、例えばｒＡＡＶベクターにおける導入遺伝子の発現を改変するために、好ましくは、ウイルスのエンドサイトーシス（Ｓａｎｌｉｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ．，２００１）、エンドソームからの脱出および核へのトラフィッキング、ならびに／もしくは核におけるウイルス粒子の脱殻を増大もしくは増加する。外因性ポリヌクレオチドの導入に用いる方法には、トランスフェクション、リポフェクション、ウイルス感染、形質転換および電気穿孔、ならびに非ウイルス性遺伝子送達技術のような周知の方法が包含される。導入ポリヌクレオチドは、宿主細胞において安定にもしくは一時的に保持することができる。安定な保持は、典型的に、導入ポリヌクレオチドが宿主細胞と適合する複製起点を含有するか、あるいは染色体外レプリコン（例えばプラスミド）または核もしくはミトコンドリア染色体のような宿主細胞のレプリコンに組込むいずれかを必要とする。
【００５０】
「遺伝子送達」は、遺伝子導入のための細胞への外因性ポリヌクレオチドの導入をさし、そしてターゲティング、結合、取り込み、輸送、局在化、レプリコン組込みおよび発現を包含することができる。
【００５１】
「遺伝子導入」は、ターゲティング、結合、取り込み、輸送、局在化およびレプリコン組込みを包含することができる細胞への外因性ポリヌクレオチドの導入をさすが、遺伝子のその後の発現とは異なりそしてそれを意味しない。
【００５２】
「遺伝子発現」もしくは「発現」は、遺伝子転写、翻訳および翻訳後修飾のプロセスをさす。
【００５３】
「検出可能なマーカー遺伝子」は、遺伝子を保有する細胞が特異的に検出される（マーカー遺伝子を保有しない細胞と区別される）ことを可能にする遺伝子である。多種類のそのようなマーカー遺伝子が当該技術分野において既知である。
【００５４】
「選択可能なマーカー遺伝子」は、対応する選択因子の存在下で、遺伝子を保有する細胞が（ｆｏｒ ｏｒ ａｇａｉｎｓｔ）特異的に選択されることを可能にする遺伝子である。例として、抗生物質耐性遺伝子は、対応する抗生物質の存在下で宿主細胞が正に選択されることを可能にする正の選択可能なマーカー遺伝子として用いることができる。様々な正および負の選択可能なマーカーが当該技術分野において既知であり、これらのいくつかを以下に記述する。
【００５５】
「ｒＡＡＶベクター」は、本明細書において用いる場合、ＡＡＶ起源ではないポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶと異種のポリヌクレオチド）、典型的には細胞の遺伝子形質転換のための対象の配列を含んでなるＡＡＶベクターをさす。本発明の好ましいベクター構築物において、異種のポリヌクレオチドには、少なくとも一つの、好ましくは二つのＡＡＶ逆末端反復配列（ＩＴＲ）が隣接する。ｒＡＡＶベクターという用語には、ｒＡＡＶベクター粒子およびｒＡＡＶベクタープラスミドの両方が包含される。
【００５６】
「ＡＡＶウイルス」もしくは「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも一つのＡＡＶキャプシドタンパク質および包膜されたポリヌクレオチドからなるウイルス粒子をさす。粒子が異種のポリヌクレオチド（すなわち、哺乳動物細胞に送達される導入遺伝子のような野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含んでなる場合、それは典型的に「ｒＡＡＶ」と呼ばれる。ＡＡＶ「キャプシドタンパク質」には、野生型ＡＡＶのキャプシドタンパク質、ならびにｒＡＡＶゲノムをパッケージングすることが構造的および／もしくは機能的に可能でありそして野生型ＡＡＶによって用いられる受容体と異なり得る少なくとも一つの特定の細胞受容体に結合するＡＡＶキャプシドタンパク質の改変された形態が包含される。改変されたＡＡＶキャプシドタンパク質には、ＡＡＶの２つもしくはそれ以上の血清型からのアミノ酸配列を有するもののようなキメラＡＡＶキャプシドタンパク質、例えば、ＡＡＶ−２からのキャプシドタンパク質の部分に融合もしくは連結されたＡＡＶ−５からのキャプシドタンパク質の部分から形成されるキャプシドタンパク質、およびＡＡＶキャプシドタンパク質に融合もしくは連結された標識または他の検出可能な非ＡＡＶキャプシドペプチドもしくはタンパク質を有するＡＡＶキャプシドタンパク質が包含され、例えば、トランスフェリン受容体に結合する抗体分子の部分をＡＡＶ−２キャプシドタンパク質に組換え的に融合させることができる。
【００５７】
ＡＡＶの「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（例えば野生型ＡＡＶ）が哺乳動物細胞によって複製されそしてパッケージングされることを可能にするウイルスをさす。アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびワクシニアのようなポックスウイルスを包含する、ＡＡＶの様々なそのようなヘルパーウイルスが当該技術分野において既知である。亜群Ｃのアデノウイルス５型が最も一般に用いられるが、アデノウイルスには多数の異なる亜群が包含される。ヒト、非ヒト哺乳類および鳥類起源の多数のアデノウイルスが既知であり、そしてＡＴＣＣのような受託者から入手可能である。ヘルペス科のウイルスには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）、ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が包含され；これらもまたＡＴＣＣのような受託者から入手可能である。
【００５８】
「感染性」ウイルスもしくはウイルス粒子は、ウイルス種が親和性である細胞にそれが送達することができるポリヌクレオチド成分を含んでなるものである。該用語は、必ずしもウイルスの任意の複製能力を意味しない。
【００５９】
「複製可能な」ウイルス（例えば、「ＲＣＡ」と省略されることもある複製可能なＡＡＶ）は、感染性でありそしてまた感染細胞において（すなわち、ヘルパーウイルスもしくはヘルパーウイルス機能の存在下で）複製されることもできる表現型的に野生型のウイルスをさす。ＡＡＶの場合、複製能力は、一般に、機能性ＡＡＶパッケージング遺伝子の存在を必要とする。好ましいｒＡＡＶベクターは、本明細書において記述するように、１つもしくはそれ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子の欠如によって哺乳動物細胞において（特にヒト細胞において）複製能力を欠く。好ましくは、そのようなｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶパッケージング遺伝子および入ってくるｒＡＡＶベクター間の組換えによってＲＣＡが生成される可能性を最小限にするために任意のＡＡＶパッケージング遺伝子配列を欠く。好ましいｒＡＡＶベクター調製物は、本明細書において記述するように、あるとしてもごくわずかのＲＣＡ（好ましくは１０２ｒＡＡＶ粒子当たり約１ＲＣＡ未満、より好ましくは１０４ｒＡＡＶ粒子当たり約１ＲＣＡ未満、さらにより好ましくは１０８ｒＡＡＶ粒子当たり約１ＲＣＡ未満、さらにより好ましくは１０１２ｒＡＡＶ粒子当たり約１ＲＣＡ未満、最も好ましくは少しのＲＣＡもない）を含有するものである。
【００６０】
「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドを包含する任意の長さのヌクレオチドまたはその類似体のポリマー形態をさす。ポリヌクレオチドは、メチル化されたもしくはキャップ付きヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体のような修飾されたヌクレオチドを含んでなることができ、そして非ヌクレオチド成分によって遮断することができる。存在する場合、ヌクレオチド構造への修飾は、ポリマーの集合の前もしくは後に与えることができる。ポリヌクレオチドという用語は、本明細書において用いる場合、二本鎖および一本鎖分子を互換的にさす。他に特定もしくは必要とされない限り、ポリヌクレオチドである本明細書において記述する本発明の任意の態様には、二本鎖形態および二本鎖形態を構成することが既知であるかもしくは予測される二つの相補的な一本鎖形態の各々の両方が包含される。
【００６１】
「転写調節配列」もしくは「ＴＲＳ」は、本明細書において用いる場合、それが操作可能に連結される遺伝子もしくはコーディング配列の転写を制御するゲノム領域をさす。本発明において有用な転写調節配列は、一般に、少なくとも一つの転写プロモーターを含み、そしてまた転写の一つもしくはそれ以上のエンハンサーおよび／もしくはターミネーターも含むことができる。
【００６２】
「操作可能に連結された」は、２つもしくはそれ以上の成分の配置をさし、ここで、そのように記述される成分は、それらが協調して機能することを可能にする関係にある。例として、転写調節配列もしくはプロモーターは、ＴＲＳもしくはプロモーターがコーディング配列の転写を促進する場合にコーディング配列に操作可能に連結される。操作可能に連結されたＴＲＳは、一般に、コーディング配列とシスに連結されるが、必ずしもそれに直接隣接するとは限らない。
【００６３】
「異種の」は、それを比較する存在の残りのものと遺伝子型で区別可能な存在に由来することを意味する。例えば、異なる細胞タイプに遺伝子工学技術によって導入されたポリヌクレオチドは、異種のポリヌクレオチドである（そして、発現される場合、異種のポリペプチドをコードすることができる）。同様に、その天然のコーディング配列から取り除かれそして異なるコーディング配列に操作可能に連結されるＴＲＳもしくはプロモーターは、異種のＴＲＳもしくはプロモーターである。
【００６４】
「レプリコン」は、適切な宿主細胞におけるポリヌクレオチドの複製を可能にさせる複製起点を含んでなるポリヌクレオチドをさす。レプリコンの例には、エピソーム（プラスミドを包含する）、ならびに染色体（核もしくはミトコンドリア染色体のような）が包含される。細胞へのポリヌクレオチドの「安定な組込み」は、細胞において安定に保持される傾向があるレプリコンにポリヌクレオチドが組込まれていることを意味する。プラスミドのようなエピソームは多数の世代にわたって保持されることもあり得るが、エピソームで保有される遺伝物質は、一般に、染色体で組込まれた物質より失われやすい。しかしながら、ポリヌクレオチドの保持は、多くの場合、ポリヌクレオチド中にもしくはその近くに選択可能なマーカーを導入しそして次に選択圧力下でポリヌクレオチドを保有する細胞を保持することによってもたらすことができる。ある場合には、配列が染色体に組込まれるようにならなければ有効にそれらを安定に保持することができず；それ故、選択可能なマーカーを含んでなる配列の保持の選択は、マーカーが染色体に安定に組込まれるようになる細胞の選択をもたらすことができる。抗生物質耐性遺伝子は、当該技術分野において周知であるように、その点において都合よく用いることができる。典型的に、安定に組込まれたポリヌクレオチドは、平均して少なくとも約２０世代、好ましくは少なくとも約１００世代にわたって保持されると予想され、さらにより好ましくはそれらは永久に保持される。真核生物の染色体のクロマチン構造は、組込まれたポリヌクレオチドの発現のレベルに影響を与えることができる。エピソーム上に保有される遺伝子を有することは、特定の遺伝子の多数の安定に保持されたコピーを有することが所望される場合に特に有用であることができる。本発明との関連で特に望ましい性質を有する安定な細胞系の選択を以下に記述しそして説明する。
【００６５】
「パッケージング」は、本明細書において用いる場合、ウイルスベクター、特にＡＡＶベクターの集合および包膜をもたらす一連の細胞以下の事象をさす。従って、適当なベクターを適切な条件下でパッケージング細胞系に導入すると、それをウイルス粒子にすることができる。ウイルスベクター、特にＡＡＶベクターのパッケージングと関連する機能は、本明細書においておよび当該技術分野において記述されている。
【００６６】
「ターミネーター」は、読み通し（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）転写を減らすかもしくは防ぐ傾向があるポリヌクレオチド配列をさす（すなわち、それは、ターミネーターの片側で起こる転写がターミネーターの反対側までずっと続くのを減らすかもしくは防ぐ）。転写が中断される程度は、典型的に、ターミネーター配列の塩基配列および／もしくは長さの関数である。特に、多数の分子生物学系において周知であるように、「転写終結配列」と一般に呼ばれる特定のＤＮＡ配列は、おそらく、ＲＮＡポリメラーゼ分子を止めそして／もしくは転写されるＤＮＡから離させることによって、ＲＮＡポリメラーゼによる読み通し転写を中断する傾向がある特異的配列である。そのような配列特異的ターミネーターの典型的な例には、ポリアデニル化（「ポリＡ」）配列、例えばＳＶ４０ポリＡが包含される。そのような配列特異的ターミネーターに加えてもしくはそれらの代わりに、プロモーターおよびコーディング領域間の比較的長いＤＮＡ配列の挿入もまた、一般に介在配列の長さに比例して、コーディング領域の転写を中断する傾向がある。この効果は、おそらく、ＲＮＡポリメラーゼ分子が、転写されるＤＮＡから離されるようになるいくらかの傾向がいつもあるので起こり、そしてコーディング領域に達する前に横切る配列の長さを増やすことは、一般に、コーディング領域の転写を完了するかもしくはおそらく開始さえする前に遊離が起こる可能性を増す。従って、ターミネーターは、一方向のみ（「単一方向」ターミネーター）もしくは両方向（「双方向」ターミネーター）からの転写を防ぐことができ、そして配列特異的終結配列もしくは配列非特異的ターミネーターもしくは両方を含んでなることができる。様々なそのようなターミネーター配列は当該技術分野において既知であり；そして本発明の文脈内でのそのような配列の実例となる使用を以下に提供する。
【００６７】
「宿主細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」、「パッケージング細胞系」および他のそのような用語は、本発明において有用な高等真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞を意味する。これらの細胞は、組換えベクター、ウイルスもしくは他の導入ポリヌクレオチドのレシピエントとして用いることができ、そして形質導入した元の細胞の子孫を含む。単細胞の子孫は、元の親細胞と（形態においてもしくはゲノム補完物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）において）必ずしも完全に同一であるとは限らないかもしれないと理解される。
【００６８】
「治療遺伝子」、「標的ポリヌクレオチド」、「導入遺伝子」、「対象の遺伝子」などは、一般に、ベクターを用いて導入される一つの遺伝子もしくは複数の遺伝子をさす。典型的には、本発明との関連で、そのような遺伝子は、ｒＡＡＶベクター（このベクターには逆末端反復（ＩＴＲ）領域が隣接し、従って、複製されそしてｒＡＡＶ粒子中に包膜することができる）内に位置する。標的ポリヌクレオチドは、多数の異なる用途のためのｒＡＡＶベクターを生成するために本発明において用いることができる。そのようなポリヌクレオチドには、（ｉ）構造タンパク質もしくは酵素の不足している、欠けているもしくは次善のレベルによって引き起こされる欠損症を軽減するために遺伝子治療の他の形態で有用なタンパク質をコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）アンチセンス分子に転写されるポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）転写もしくは翻訳因子に結合するおとりに転写されるポリヌクレオチド；（ｉｖ）サイトカインのような細胞モジュレーターをコードするポリヌクレオチド；（ｖ）レシピエント細胞をヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のような特定の薬剤に感受性にすることができるポリヌクレオチド；および（ｖｉ）様々な癌の処置のためのＥ１Ａ腫瘍抑制遺伝子もしくはｐ５３腫瘍抑制遺伝子のような、癌治療のためのポリヌクレオチドが包含されるが、これらに限定されるものではない。レシピエント宿主細胞における導入遺伝子の発現をもたらすために、それは、好ましくは、プロモーター、それ自身のもしくは異種のプロモーターのいずれかに操作可能に連結される。多数の適当なプロモーターが当該技術分野において既知であり、その選択は、標的ポリヌクレオチドの発現の所望のレベル；構成的発現、誘導性発現、細胞特異的もしくは組織特異的発現などを所望するかどうかにより決まる。ｒＡＡＶベクターまはた、選択可能なマーカーを含有することもできる。
【００６９】
「遺伝子」は、転写されそして翻訳された後に特定のタンパク質をコードすることができる少なくとも一つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドをさす。
【００７０】
「組換え」は、ポリヌクレオチドに適用する場合、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限および／もしくはライゲーション工程、ならびに天然に存在するポリヌクレオチドと異なる構築物をもたらす他の方法の様々な組み合わせの産物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含んでなるウイルス粒子である。該用語には、それぞれ、元のポリヌクレオチド構築物の複製物および元のウイルス構築物の子孫が包含される。
【００７１】
「制御要素」もしくは「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳もしくは分解を包含する、ポリヌクレオチドの機能調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。調節は、プロセスの頻度、速度もしくは特異性に影響を与えることができ、そして本質的に増大するかもしくは抑制性であることができる。当該技術分野において既知である制御要素には、例えば、プロモーターおよびエンハンサーのような転写調節配列が包含される。プロモーターは、ある条件下でＲＮＡポリメラーゼに結合しそして通常はプロモーターの下流に（３’方向に）位置するコーディング領域の転写を開始することができるＤＮＡ領域である。プロモーターには、ＡＡＶプロモーター、例えば、Ｐ５、Ｐ１９、Ｐ４０およびＡＡＶ ＩＴＲプロモーター、ならびに異種のプロモーターが包含される。
【００７２】
「発現ベクター」は、対象のポリペプチドをコードする領域を含んでなるベクターであり、そして意図する標的細胞におけるタンパク質の発現をもたらすために用いる。発現ベクターはまた、標的におけるタンパク質の発現を容易にするためにコードする領域に操作可能に連結された制御要素も含んでなる。制御要素および発現のためにそれらが操作可能に連結される一つの遺伝子もしくは複数の遺伝子の組み合わせは、「発現カセット」と呼ばれることもあり、これらの多数は既知であり、そして当該技術分野において入手可能であるかもしくは当該技術分野において入手可能である成分から容易に構築することができる。
【００７３】
「遺伝子改変」は、有糸分裂もしくは減数分裂による以外で遺伝要素が細胞に導入されるプロセスをさす。該要素は細胞と異種であることができ、またはそれはすでに細胞に存在する要素の追加コピーもしくは改良バージョンであることができる。遺伝子改変は、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿のような当該技術分野において既知である任意のプロセスによって細胞を組換えプラスミドもしくは他のポリヌクレオチドでトランスフェクションすること、またはポリヌクレオチド−リポソーム複合体と接触させることによってもたらすことができる。遺伝子改変はまた、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスもしくはウイルスベクターでの形質導入もしくは感染によってもたらすこともできる。好ましくは、遺伝要素は、細胞における染色体もしくはミニ染色体に導入されるが；細胞およびその子孫の表現型および／もしくは遺伝子型を変える任意の改変がこの用語に包含される。
【００７４】
細胞は、遺伝子配列がインビトロにおける細胞の長期培養中にその機能を実行するために利用可能である場合に該配列で「安定に」改変される、形質導入されるもしくは形質転換されると言われる。好ましい例において、そのような細胞は、改変された細胞の子孫によっても遺伝可能である遺伝子改変が導入されるという点において「遺伝可能に」改変される。
【００７５】
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーをさすために本明細書において互換的に用いる。該用語はまた、修飾されているアミノ酸ポリマー；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、アセチル化、ホスホニル化（ｐｈｏｓｐｈｏｎｙｌａｔｉｏｎ）、脂質化、もしくは標識化成分との結合も包含する。「ＣＦＴＲ」などのようなポリペプチドは、遺伝子治療およびそのための組成物との関連で説明する場合、それぞれの完全なポリペプチド、または完全なタンパク質の所望の生化学機能を保持するその任意のフラグメントもしくは遺伝子操作された誘導体をさす。同様に、ＣＦＴＲ、および遺伝子治療における使用のための他のそのような遺伝子（典型的には、レシピエント細胞に送達される「導入遺伝子」と呼ばれる）への言及には、完全なポリペプチドまたは所望の生化学機能を保有する任意のフラグメントもしくは遺伝子操作された誘導体をコードするポリヌクレオチドが包含される。
【００７６】
「単離された」プラスミド、ウイルス、もしくは他の物質は、該物質もしくは同様の物質が天然に存在するかもしくは最初に調製される場合に同様に存在し得る他の成分の少なくともいくらかを欠いている物質の調製物をさす。従って、例えば、単離された物質は、供給源混合物からそれを濃縮するために精製技術を用いることによって調製することができる。濃縮は、溶液の容量当たりの重量のような絶対基準で測定することができ、もしくは供給源混合物に存在する第二の潜在的に干渉する物質に対して測定することができる。本発明の態様の濃縮を増加することは、さらに一層好ましい。従って、例えば、２倍濃縮は好ましく、１０倍濃縮はより好ましく、１００倍濃縮はより好ましく、１０００倍濃縮はさらにより好ましい。
【００７７】
ＡＡＶの調製物は、感染性ＡＡＶ粒子：感染性ヘルパーウイルス粒子の比が少なくとも約１０２：１；好ましくは少なくとも約１０４：１；より好ましくは少なくとも約１０６：１；さらにより好ましくは少なくとも約１０８：１である場合にヘルパーウイルスを「実質的に含まない」と言われる。調製物はまた、好ましくは、相当する量のヘルパーウイルスタンパク質（すなわち、上述のヘルパーウイルス粒子不純物が崩壊した形態で存在する場合にそのようなレベルのヘルパーウイルスの結果として存在するであろうタンパク質）も含まない。ウイルスおよび／もしくは細胞タンパク質汚染は、一般に、ＳＤＳゲル上のクーマシー染色バンドの存在（例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に対応するもの以外のバンドの出現）として観察することができる。
【００７８】
ウイルス生成、複製又はパッケージングを説明する際に使用される「効率」は、本方法の有用な性質：特に細胞当たり産生されるウイルス粒子の増殖速度及び数を指す。「高い効率」の産生は、特定された培養期間の経過にわたり細胞当たり少なくとも１００個のウイルス粒子、好ましくは少なくとも約１０，０００個、更に好ましくは少なくとも約１００，０００個の粒子の産生を示す。
【００７９】
本発明に従って処理された「個体」又は「被験者は、脊椎動物、特に哺乳動物種のメンバーを指し、そして家畜、スポーツ動物及びヒトを包含する霊長類を包含するがそれらに限定はされない。
【００８０】
個体又は細胞の「処理」は、処理が開始される時点で個体又は細胞の自然の経過を変える試みにおけるすべてのタイプの介入、例えば、個体における予防、治療又は他の有利な効果を引き出すことである。例えば、個体の処理は、遺伝した欠陥又は誘発された遺伝子的欠陥、ウイルス、バクテリアもしくは寄生生物による感染症、新生物形成もしくは形成不全状態、又は自己免疫もしくは免疫抑制の如き免疫系機能不全を包含する（しかしこれらに限定はされない）すべての病理学的状態により引き起こされる病理を減少又は限定することであると理解されうる。処理は、製薬学的組成物の如き組成物の投与及び組成物で処理された適合性細胞の投与を包含する（しかしこれらに限定はされない）。処理は、予防的に又は治療的に、即ち、病理学的イベントの開始又は病因薬剤との接触の前又は後に、行うことができる。
【００８１】
本発明の実施は、特記しない限り、当該技術分野の熟練の範囲内にある分子生物学、ウイルス学、微生物学、組み換えＤＮＡ及び免疫学の慣用の技術を使用するであろう。このような技術は文献に十分に説明されている。例えば、
【００８２】
【表１】
Figure 2004534543
【００８３】
参照。
【００８４】
Ｉ．ｒＡＡＶベクター
組み換えＡＡＶベクターはヒト遺伝子治療、特に嚢胞繊維症及び鎌状赤血球貧血の如き疾患のために潜在的に強力な手段である。遺伝子治療への他のアプローチにまさるｒＡＡＶベクターの主要に利点は、それらが一般に宿主細胞に安定に組み込まれるために標的細胞の進行する複製を必要としないということである。
【００８５】
ｒＡＡＶベクター及び／又はウイルスは、１つ又はそれより多くの検出可能なマーカーも含むことができる。例として、バクテリアβ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＡＰ）遺伝子、及び生体外もしくは生体内の両方においてレポーター分子として使用されている種々の細胞表面マーカーをコードしている遺伝子を包含する種々のこのようなマーカーが知られている。ｒＡＡＶベクター及び／又はウイルスは１つ又はそれより多くの選択可能なマーカーも含むことができる。
【００８６】
組み換えＡＡＶベクター及び／又はウイルスはタンパク質をコードしていないポリヌクレオチドを含んでなることもでき、これらのポリヌクレオチドは、例えば、正常なｍＲＮＡと二本鎖を形成することにより正常なｍＲＮＡの翻訳を阻止するのに使用することができるアンチセンスｍＲＮＡ（ｍＲＮＡの相補体）をコードしているポリヌクレオチド及びリボザイム（ＲＮＡ触媒）をコードしているポリヌクレオチドを包含する。
【００８７】
ＩＩ．ＡＡＶベクターの選択及び調製
いかなる血清型のアデノ関連ウイルスｒＡＡＶを調製するのに適当である。何故ならば、種々の血清型は遺伝子レベルにおいてさえ機能的に且つ構造的に関連しているからである。（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗ，ｐｐ．１６５−１７４ ｏｆ Ｐａｒｖｏｖｉｒｕｓｅｓ ａｎｄ Ｈｕｍａｎ Ｄｉｓｅａｓｅ，Ｊ．Ｒ．Ｐａｔｔｉｓｏｎ，ｅｄ．（１９８８）；ａｎｄ Ｒｏｓｅ，Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，３，１，１９７４参照）。すべてのＡＡＶ血清型は明らかに相同性ｒｅｐ遺伝子により媒介される同様な複製特性を示し、そしてすべて一般にＡＡＶ２において発現されるカプシドタンパク質の如き３種の関連したカプシドタンパク質を有する。関連性の程度はゲノムの長さに沿った血清型間の広範なクロスハイブリダイゼーションを示すヘテロデュプレックス分析；及びＩＴＲｓに相当する末端における相似の自己アニーリングセグメントの存在により更に示唆される。同様な感染性パターンは、各血清型における複製機能が同様な調節制御の下にあることも示唆する。種々のＡＡＶ血清型の中でも、ＡＡＶ２が最もよく使用される。
【００８８】
本発明のＡＡＶベクターは、典型的にはＡＡＶに対して異種である（ｈｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ）ポリヌクレオチドを含んでなる。このポリヌクレオチドは、典型的には、遺伝子治療の状況において、ある種の表現型の発現のアップレギュレーションもしくはダウンレギュレーションの如き機能を標的細胞に与える能力の故に興味深い。このような異種ポリヌクレオチド又は「導入遺伝子」は、一般に所望の機能又はコード配列を与えるのに十分な長さである。
【００８９】
意図する標的細胞において異種ポリヌクレオチドの転写が望まれる場合には、それは当該技術分野で知られているとおり、例えば、標的細胞内の転写の所望のレベル及び／又は特異性に依存して、それ自身のプロモーター又は異種プロモーターに操作可能に連結される（ｏｐｅｒａｂｌｙ ｌｉｎｋｅｄ）ことができる。種々のタイプのプロモーター及びエンハンサーがこの状況で使用するのに適当である。構成的プロモーターは、遺伝子転写の進行するレベル（ｏｎｇｏｉｎｇ ｌｅｖｅｌ）を与えそして治療的ポリヌクレオチドが進行するベース（ｏｎｇｏｉｎｇ ｂａｓｉｓ）で発現されることが望まれる場合に好ましい。誘導性プロモーターは一般に誘導物質の不存在下に低い活性を示しそして誘導物質の存在下にアップレギュレーションされる。誘導性プロモーターは、ある時間にのみ又はある位置でのみ発現が望まれる場合、又は誘導薬剤を使用する発現のレベルを滴定することが望ましい場合に好ましいことがある。プロモーター及びエンハンサーは組織特異的であってもよい。即ち、それらは多分ある種の細胞型においてのみそれらの活性を示すが、これは多分これらの細胞において独特に見いだされる遺伝子調節エレメントによるものである。
【００９０】
プロモーターの例示的例は、シミアンウイルス４０からのＳＶ４０後期プロモーター、バクロウイルス多面体エンハンサー／プロモーターエレメント、ヘルペスシンプレックスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶ ｔｋ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からの前初期プロモーター及びＬＴＲエレメントを包含する種々のレトロウイルスプロモーターである。誘導性プロモーターは重金属イオン誘導性プロモーター（例えば、マウス乳房腫瘍ウイルス（ｍＭＴＶ）プロモーターもしくは種々の成長ホルモンプロモーター）及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼの存在下に活性であるＴ７ファージからのプロモーターを包含する。例示として、組織特異的プロモーターの例は、サーファクチンプロモーター（肺における発現のための）、ミオシンプロモーター（筋肉における発現のための）及びアルブミンプロモーター（肝臓における発現のための）を包含する。多様な他のプロモーターが知られており、そして一般に当該技術分野で入手可能であり、そして多くのこのようなプロモーターの配列はＧｅｎＢａｎｋデータベースの如き配列データベースにおいて入手可能である。
【００９１】
意図する標的細胞において翻訳も望まれる場合には、異種ポリヌクレオチドは好ましくは翻訳を促進する制御エレメント（リボソーム結合部位又は“ＲＢＳ”及びポリアデニル化シグナル）も含んでなるであろう。従って、異種ポリヌクレオチドは一般に適当なプロモーターに操作可能に連結された少なくも１つのコード領域を含んでなり、そして例えば、操作可能に連結されたエンハンサー、リボソーム結合部位及びポリ−Ａシグナルを含んでなることもできる。異種ポリヌクレオチドは同じもしくは異なるプロモーターの制御下の１つのコード領域又は１つより多くのコード領域を含んでなることができる。制御エレメント及びコード領域の組み合わせを含む全体のユニットはしばしば発現カセットと呼ばれる。
【００９２】
異種ポリヌクレオチドは、組み換え技術によってＡＡＶゲノムコード領域に又はＡＡＶゲノムコード領域の代わりに（即ち、ＡＡＭｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子の代わりに）組み込まれるが、一般に両側にＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）領域が隣接している。これは、ＩＴＲが、好ましくは（必須ではないけれども）複製コンピテントＡＡＶゲノムを再生させることがありうる組み換えの可能性を減少させるためにＡＡＶ起点のなんらの介在配列なしに、直接の重なり合いにおいて、コード配列から上流及び下流の両方に現れることを意味する。しかしながら、シングルＩＴＲは普通は２つのＩＴＲを含んでなる構成と関連した機能を行うのに十分であり得（例えば、ＷＯ９４／１３７８８参照）、かくして１つのみのＩＴＲを有するベクター構築物を本発明のパッケージング及び産生方法に関して使用することができる。
【００９３】
ｒｅｐのための天然のプロモーターは自己調節性であり、そして産生されるＡＡＶ粒子の量を制限することができる。ｒｅｐ遺伝子は、ｒｅｐがベクター構築物の一部として与えられていようと別々に与えられていようと、異種プロモーターに操作可能に連結されることもできる。ｒｅｐ遺伝子発現により強くダウンレギュレーションされないいかなる異種プロモーターも適当であるが、誘導性プロモーターガ好ましい。何故ならば、ｒｅｐ遺伝子の構成的発現は宿主細胞に負の影響を与えることがあるからである。例示として、重金属イオン誘導性プロモーター（例えば、メタロチオネインプロモーター）；ステロイドホルモン誘導性プロモーター（例えば、ＭＭＴＶプロモーターもしくは成長ホルモンプロモーター）；及びＴ７ＲＮＡポリメラーゼの存在下に活性であるＴ７ファージからのプロモーターの如きプロモーターを包含する、多種類の誘導性プロモーターが当該技術分野で知られている。誘導性プロモーターの特に好ましいサブクラスは、ｒＡＡＶベクターの複製及びパッケージングを補足するために使用されるヘルパーウイルスにより誘導される誘導性プロモーターである。アデノウイルスＥ１Ａタンパク質により誘導可能なアデノウイルス初期遺伝子プロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター；ＶＰ１６もしくは１ＣＰ４の如きヘルペスウイルスタンパク質により誘導可能なヘルペスウイルスプロモーター；並びにワクシニアもしくはポックスウイルス誘導性プロモーターを包含する多数のヘルパーウイルス誘導性プロモーターも記載されている。
【００９４】
ヘルパーウイルス誘導性プロモーターを同定しそして試験する方法が記載されている（例えば、ＷＯ９６／１７９４７参照）。かくして、候補プロモーターがヘルパーウイルス誘導性であるかないか、及びそれらが高い効率のパッケージング細胞の発生に有用であるかないかを決定するための方法が当該技術分野で知られている。簡単に言えば、１つのこのような方法は、（当該技術分野で知られているか又はプロモーターのない「レポーター」遺伝子への連結の如き周知の技術を使用して同定される）推定上のヘルパーウイルス誘導性プロモーターによりＡＡＶｒｅｐ遺伝子のｐ５プロモーターを置き換えることを含む。好ましくは抗生物質耐性遺伝子の如き正の選択性マーカーに連結されたＡＡＶｒｅｐ−ｃａｐ遺伝子（ｐ５が置き換えられている）は、次いで適当な宿主細胞（下記に例示されるＨｅｌａもしくはＡ５４９細胞の如き）に安定に組み込まれる。次いで、選択条件下に（例えば、抗生物質の存在下に）相対的に十分に増殖することができる細胞を、ヘルパーウイルスの添加によりｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子を発現するそれらの能力について試験する。ｒｅｐ及びｃａｐ発現についての最初の試験として、細胞はＲｅｐ及び／又はＣａｐタンパク質を検出するために免疫蛍光を使用して容易にスクリーニングされうる。次いでパッケージング能力及び効率の確認は、入ってくるｒＡＡＶベクターの複製及びパッケージングについての機能試験により決定されうる。この方法を使用して、マウスメタロチオネイン遺伝子由来のヘルパーウイルス誘導性プロモーターが、ｐ５プロモーターに対する適当な代替物として同定され、そして高い力価のｒＡＡＶ粒子を産生するために使用される（ＷＯ９６／１７９４７に記載のとおり）。
【００９５】
種々のＡＡＶゲノムの相対的包膜化サイズ限界が与えられると、大きな異種ポリヌクレオチドのゲノムへの挿入はＡＡＶ配列の一部の除去を必要とする。複製コンピテントＡＡＶ（“ＲＣＡ”）を発生する可能性を減少させるために、１つ又はそれより多くのＡＡＶ遺伝子の除去がいずれにせよ望ましい。従って、ｒｅｐ、ｃａｐ又は両方のためのコード配列もしくはプロモーター配列は好ましくは除去される。何故ならば、これらの遺伝子により与えられる機能はトランスで（ｉｎ ｔｒａｎｓ）与えられ得るからである。
【００９６】
得られるベクターは、これらの機能において「欠陥がある（ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ）」と言われる。このベクターを複製しそしてパッケージングするために、失われた機能（ｍｉｓｓｉｎｇ ｆｕｎｃｔｉｏｎｓ）は、種々の失われたｒｅｐ及び／又はｃａｐ遺伝子産生物のために必要な機能を一緒にコードするパッケージング遺伝子又は複数のそれらにより補足される。パッケージング遺伝子又は遺伝子カセットは、好ましくはＡＡＶＩＴＲｓが隣接しておらず、そして好ましくはｒＡＡＶゲノムとのなんらの実質的な相同性も共有しない。かくして、ベクター配列と別々に与えられたパッケージング遺伝子との複製期間中の相同性組み換えを最小にするために、２つのポリヌクレオチドの配列の重なりを回避することが望ましい。相同性のレベル及び対応する組み換えの頻度は、相同性配列の増加する長さ及びそれらの共有されたアイデンティティーのレベルと共に増加する。与えられたシステムにおいて懸念を与える相同性のレベルは、当該技術分野で知られているとおり、理論的に決定されそして実験的に確かめられうる。しかしながら、典型的には、もしそれがその全長にわたり少なくとも８０％同一である場合、重なり配列が約２５ヌクレオチド配列よりも小さければ、又はもしそれがその全長にわたって少なくとも７０％同一である場合、重なり配列が約５０ヌクレオチド配列より小さければ、組み換えは実質的に減少させるか又は排除することができる。もちろん、より低いレベルの相同性が好ましい。何故ならばそれらは組み換えの可能性を更に減少させるからである。なんらの重なり相同性もなしですら、ＲＣＡを発生する頻度がいくらか残ると思われる。ＲＣＡを発生する頻度の更なる減少（例えば非相同性組み換えにより）すら、Ａｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９８／２７２０４により記載されているとおり、ＡＡＶの複製及び包膜化機能を「分割する」ことにより得ることができる。
【００９７】
ｒＡＡＶベクター構築物及び相補性パッケージング遺伝子構築物は多数の異なる形態で本発明において実施することができる。ウイルス粒子、プラスミド、及び安定に形質転換された宿主細胞は、すべて、このような構築物を一時的にもしくは安定に、パッケージング細胞に導入するのに使用することができる。
【００９８】
本発明のある態様では、ＡＡＶベクター及び相補性パッケージング遺伝子（１つ又は複数）は、もしあれば、バクテリアプラスミド、ＡＡＶ粒子、又はそれらの任意の組み合わせの形態で与えられる。他の態様では、ＡＡＶベクター配列、パッケージング遺伝子、又は両方は、遺伝子改変された（好ましくは遺伝的に改変された）真核生物細胞の形態で与えられる。ＡＡＶベクター配列、ＡＡＶパッケージング遺伝子又は両方を発現するように遺伝的に変えられた宿主細胞の開発は、信頼性のあるレベルで発現される物質の確立されたソースを提供する。
【００９９】
かくして、種々の異なる遺伝子改変された細胞を本発明の状況において使用することができる。例示として、安定に組み込まれたｒＡＡＶベクターの少なくとも１つの完全なコピーを有する哺乳動物宿主細胞を使用することができる。少なくともプロモーターに操作可能に連結されたＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含んでなるＡＡＶパッケージングプラスミドを、複製機能を与えるのに使用することができる（米国特許第５，６５８，７７６に記載のとおり）。別法として、プロモーターに操作可能に連結されたＡＡＶｒｅｐ遺伝子を有する安定な哺乳動物細胞系を、複製機能を与えるのに使用することができる（例えば、Ｔｒｅｍｐｅ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９５／１３３９２））；Ｂｕｒｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，（ＷＯ９８／２３０１８）；及びＪｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，（米国特許第５，６５６，７８５号）参照）。上記したとおりの包膜化タンパク質を与えるＡＡＶｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子と一緒に又は別々に与えられることができる。（例えば、上記した出願及び特許並びにＡｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，（ＷＯ９８／２７２０４）参照）。他の組み合わせが可能でありそして本発明の範囲内に包含される。
【０１００】
ＩＩＩ．ｒＡＡＶの発生
遺伝子治療のような目的に有用な組み換えＡＡＶ粒子を発生させるために、パッケージング細胞系は、好ましくは、１つ又はそれより多くの問題のポリヌクレオチド（又は「標的」ポリヌクレオチド）を取り囲んでいるＡＡＶ逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）領域を含んでなる組み換えＡＡＶベクターを与えられる。
【０１０１】
標的ポリヌクレオチドは、一般にプロモーター、それ自身のプロモーター又は異種プロモーター、に操作可能に連結されている。多数の適当なプロモーターが当該技術分野で知られており、その選択は標的ポリヌクレオチドの発現の所望のレベル（即ち、構成的発現、誘導性発現、細胞特異的もしくは組織特異的発現を望むかどうか等）に依存する。
【０１０２】
好ましくは、ｒＡＡＶベクターは、ｒＡＡＶベクターにより感染された細胞の選択を可能とするために正の選択可能なマーカーも含有する。負の選択可能なマーカーも包含され得る（それが必要であるか又は望ましいならばこれらの同じ細胞に対して選択する手段として）。好ましい態様では、Ｓ．Ｄ．Ｌｕｐｔｏｎにより記載された二官能性の選択可能な融合遺伝子を使用することができる。例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０８４４２及びＰＣＴ／ＵＳ９４／０５６０１参照。簡単に言えば、これらの構築物は主要な正の選択可能なマーカーと負の選択可能なマーカーとの直接的翻訳融合を含む。好ましい正の選択可能なマーカーは、ｈｐｈ、ｎｅｏ及びｇｐｔよりなる群から選ばれる遺伝子由来のものであり、そして好ましい負の選択可能なマーカーはシトシンデアミナーゼ、ＨＳＶ−ＩＴＫ、ＶＺＶ ＴＫ、ＨＰＲＴ、ＡＰＲＴ及びｇｐｔよりなる群から選ばれる遺伝子由来のものである。特に好ましいマーカーは、正の選択可能なマーカーがｈｐｈもしくはｎｅｏ由来のものでありそして負の選択可能なマーカーがシトシンデアミナーゼもしくはＴＫ遺伝子由来のものである二官能性の選択可能な融合遺伝子である。
【０１０３】
有用な標的ポリヌクレオチドは、多数の異なる用途のためのｒＡＡＶベクターにおいて使用することができる。このようなポリヌクレオチドは（ｉ）構造タンパク質もしくは酵素の失われた、欠陥のある又は最適以下のレベルにより引き起こされる欠陥を緩和するために他の形態の遺伝子治療において有用なタンパク質をコードしているポリヌクレオチド；（ｉｉ）アンチセンス分子に転写されるポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）転写もしくは翻訳因子に結合するデコイに転写されるポリヌクレオチド；（ｉｖ）サイトカインの如き細胞モジュレーターをコードしているポリヌクレオチド；（ｖ）レシピエント細胞を特異的薬剤に感受性にすることができるポリヌクレオチド，例えば、ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子；（ｖｉ）ある肺ガン及び乳癌と関連した失われた又は損傷されたｐ５３遺伝子の置き換えのための野生型ｐ５３腫瘍抑制ｃＤＮＡ又は乳癌及び子宮癌を包含する種々の異なる癌の腫瘍形成もしくは転移を抑制することができるＥ１Ａ腫瘍抑制遺伝子の如き癌治療のためのポリヌクレオチド；を包含するがそれらに限定はされない。
【０１０４】
得られる組み換えＡＡＶ粒子の治療特異性は導入された特定のベクター又はプロベクターにより決定されるので、同じ基本パッケージング細胞系をこれらの用途のいずれかのために修飾することができる。例えば、特異的標的ポリヌクレオチドを含んでなるベクターを、例えば、ｒＡＡＶプロベクターを含んでなるプラスミドのエレクトロポレーションもしくはトランスフェクション又はｒＡＡＶベクターもしくはプロベクターを含んでなるｒＡＡＶもしくはヘルパーウイルスによる感染を包含するいくつかの可能な方法のいずれかにより、ＡＡＶベクターの産生のためにパッケージング細胞に導入することができる。
【０１０５】
ヘルパーウイルスはｒＡＡＶベクターの導入の前、導入期間中又は導入の後に導入することができる。例えば、プラスミドをヘルパーウイルスと共に培養物に共感染させる（ｃｏ−ｉｎｆｅｃｔｅｄ）ことができ；次いで細胞を、当該技術分野で知られているとおりの（上記文献及び下記実施例参照）複製及びパッケージングに適当な条件において十分な期間、典型的には２〜５日間培養することができる。ライセートを調製しそして組み換えＡＡＶベクター粒子を当該技術分野で知られている技術により精製する。
【０１０６】
下記実施例でも示されている好ましい態様では、組み換えＡＡＶベクターはそれ自体哺乳動物細胞に安定に組み込まれて、パッケージングのために使用される。このようなｒＡＡＶ「産生細胞」を次いで増殖させそして使用の準備ができるまで貯蔵する。このような産生細胞からｒＡＡＶ粒子の産生を誘導するために、使用者は細胞をヘルパーウイルスで感染させることのみを必要としそしてＡＡＶの複製及びパッケージングに適当な条件下に細胞を培養する（下記するとおり）。
【０１０７】
別法として、ＡＡＶスプリット−パッケージング遺伝子（ＡＡＶ ｓｐｌｉｔ−ｐａｃｋａｇｉｎｇ ｇｅｎｅｓ）又はｒＡＡＶベクターの１つ又はそれより多くを組み換えヘルパーウイルスの一部として導入することができる。例えば、アデノウイルスのＥ１、Ｅ３及び／又はＥ４遺伝子を１種又はそれより多くのスプリット−パッケージング遺伝子又はｒＡＡＶベクターで置き換えることができる。アデノウイルスベクターへの、例えば、Ｅ１及び／又はＥ３領域へのクローニングを促進する技術は当該技術分野で知られている（例えば、Ｂｅｔｔ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９１，８８０２−８８０６（１９９４）参照）。かくして、組み換えアデノウイルスの如きヘルパーウイルスを使用して、ヘルパーウイルス機能及びＡＡＶパッケージング遺伝子及び／又はｒＡＡＶプロベクターを与えることができる。何故ならば（当該技術分野で知られているとおり）このようなヘルパーウイルスにおける多数の遺伝子（例えば、アデノウイルスのＥ３遺伝子）は、ヘルパーウイルス活性を排除することなく置き換えられ得るからである。いかなる必要なヘルパーウイルス機能もトランスで与えることによりこのようなヘルパーウイルスに追加の遺伝子を挿入することができる。例えば、ヒト２９３細胞は、アデノウイルスＥ１突然変異体を相補することができるアデノウイルス遺伝子を含有する。かくして、このようなアデノウイルス機能をトランスで有効に与えることができる細胞において使用するために、Ｅ１遺伝子を欠失させたアデノウイルスに、異種遺伝子をクローニングすることもできる。別法として、パッケージング細胞においてすべての必要なヘルパーウイルス機能を与えることによりヘルパーウイルスの使用を省くことができる。
【０１０８】
ＩＶ．遺伝物質の細胞への導入
当該技術分野で記載されているとおり、そして本明細書及び上記引用文献の両方に記載されているとおり、細胞（ＡＡＶの産生のための哺乳動物「産生」細胞の如き）に、このような細胞を形質転換又は形質導入するための種々の手段のいずれかを使用して、遺伝物質を導入することができる。例示として、このような技術は、例えば、バクテリアプラスミドによるトランスフェクション、ウイルスベクターによる感染、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、及び種々の脂質をベースとする組成物のいずれかを使用する導入（しばしばリポフェクションと呼ばれる方法）を包含する。これらの技術を実行するための方法及び組成物は当該技術分野で記載されておりそして広く入手可能である。
【０１０９】
適当に変えられた細胞の選択は、当該技術分野のいかなる技術によっても行うことができる。例えば、細胞を変えるために使用されるポリヌクレオチド配列は、当該技術分野で知られているとおりの１種又はそれより多くの検出可能なもしくは選択可能なマーカーと同時に導入されるか又はこのマーカーに操作可能に連結させることができる。例示として、選択可能なマーカーとして薬剤耐性遺伝子を使用することができる。次いで薬剤耐性細胞を選びそして増殖させ、次いで所望の配列の発現、即ち、適当なものとして、パッケージング遺伝子産物又は異種ポリヌクレオチドの産物について試験する。導入されたポリヌクレオチドの取得、局在化及び／又は維持についての試験をＤＮＡハイブリダイゼーションをベースとする技術（例えば、サザーンブロッティング及び当該技術分野で知られている他の方法）を使用して行うことができる。発現についての試験は、遺伝子改変された細胞から抽出されたＲＮＡのノーザン分析又は対応する遺伝子産物に対する間接免疫蛍光により容易に行うことができる。パッケージング能力及び効率の試験及び確認は、ＡＡＶ及びヘルパーウイルスの残りの機能的成分を細胞に導入して、ＡＡＶ粒子の産生について試験することにより得ることができる。細胞が複数のポリヌクレオチド構築物で遺伝的に改変される場合には、一般にそれらを細胞に別々に導入しそして各段階を順次に確認することが好都合である（必須ではないけれども）。このような技術を記載している文献は本明細書に引用された文献を包含する。
【０１１０】
Ｖ．ヘルパーウイルスの選択及び調製
上記したとおり、ＡＡＶは自己複製に欠陥のあるパルボウイルスであり、一般にある種の複製機能を与えるためにヘルパーウイルスに頼らなければならない。アデノウイルス、ヘルパーウイルス（ＨＳＶ１、サイトメガロウイルス及びＨＨＶ−６を包含するがそれらに限定はされない）及びポックスウイルス（特にワクシニア）を包含する多数のこのようなヘルパーウイルスが同定されている。このようなウイルスはいずれも本発明で使用することができる。
【０１１１】
しばしば、ヘルパーウイルスは意図する宿主細胞に感染することができるタイプ及びサブグループのアデノウイルスである。サブグループＣ、特に血清型１、２、４、６及び７のヒトアデノウイルスがよく使用される。血清型５が一般に好ましい。
【０１１２】
アデノウイルスの特徴及び増殖パターンは当該技術分野で知られている。読者は例えば、Ｈｏｒｏｗｉｔｚ，“Ａｄｅｎｏｖｉｒｉｄａｅ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ，”ｐｐ．７７１−８１６ ｉｎ Ｆｕｎｄａｍｅｎｔａｌ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ，Ｆｉｅｌｄｓ ｅｔ ａｌ．， ｅｄｓ．を参照することができる。パッケージングされたアデノウイルスゲノムは、末端タンパク質複合体を介して左側及び右側末端におけるアデノウイルスＩＲＴｓを介して連結されて環を形成する線状ＤＮＡ分子である。初期、中期及び後期成分のための制御及びエンコード領域はゲノム内で重なる。初期領域遺伝子はアデノウイルスゲノムの複製に関係があり、そしてそれらの位置に依存してＥ１、Ｅ２、Ｅ３及びＥ４領域に分類される。
【０１１３】
必須ではないけれども、一般に、ヘルパーウイルス株は最終的に遺伝子治療を受けるべき被験者における複製に欠陥があることが望ましい。かくして、ｒＡＡＶ調製物中に存在するいかなる残留ヘルパーウイルスも複製不能であろう。Ｅ１Ａ又はＥ１Ａ及びＥ３領域の両方が除去されているアデノウイルスは、大抵のヒト細胞に感染性ではない。それらは、失われた活性を相補することができる許容細胞系（例えば、ヒト２９３細胞系）において複製されうる。ヘルパー機能と関連すると思われるアデノウイルスの領域及び関連しない領域は同定されておりそして当該技術分野で記載されている（例えば、Ｐ．Ｃｏｌｏｓｉ ｅｔ ａｌ．，ＷＯ９７／１７４５８及びそれに引用された文献参照）。
【０１１４】
ＶＩ．遺伝子治療のためのｒＡＡＶの使用
ＡＡＶベクターは遺伝子治療の目的で個体に投与するために使用することができる。遺伝子治療に適当な疾患は、ウイルス、バクテリアもしくは寄生虫感染症、種々の悪性疾患及び過増殖性状態、自己免疫状態及び先天性欠損症を包含するがこれらに限定はされない。
【０１１５】
遺伝子治療は、細胞内のもしくは細胞により分泌される特定のタンパク質の発現のレベルを高めるために行うことができる。本発明のベクターは、遺伝子マーキング、失われたもしくは欠陥のある遺伝子の置き換え又は治療遺伝子の挿入のために細胞を遺伝子的に変えるのに使用することができる。別法として、発現のレベルを減少させるポリヌクレオチドを細胞に与えることができる。これは、悪性疾患の経過期間中に増幅されもしくは過発現される遺伝子の産物又は微生物感染の経過期間中に導入されもしくは過発現される遺伝子の産物の如き望ましくない表現型の抑制のために使用することができる。発現レベルは、標的遺伝子又はＲＮＡ転写産物のいずれかと安定なハイブリッドを形成することができる配列（アンチセンス治療）、リボザイムとして作用して関連したｍＲＮＡを切断することができる配列、又は標的遺伝子の産物に対するデコイとして作用することができる配列を含んでなる治療ポリヌクレオチドを与えることにより減少させることができる。
【０１１６】
本発明の方法によるｒＡＡＶベクターの導入は、当該技術分野で利用可能でありそして周知のいくらかの数のデリバリー技術（外科的及び非外科的）の使用を含むことができる。このようなデリバリー技術は、例えば、血管カテーテル法、カニューレ挿入、注射、吸入法、塗擦、局所的、経口、径皮、動脈内、静脈内、及び／又は腹腔内投与を包含する。ベクターは、例示として、血管移植片（ＰＴＦＥ及びダクロン）、心臓弁、血管内ステント、血管内ペービング、並びに他の非血管プロテーゼを包含するバイオプロテーゼにより導入することもできる。ベクター溶液のデリバリー、頻度、組成物及び用量範囲に関する一般的技術は当該技術の熟練の範囲内にある。
【０１１７】
特に、本発明のベクターの組織へのデリバリーのために、宿主動物にベクターを導入するいかなる物理的もしくは生物学的方法も使用することができる。ベクターは、ＡＡＶ投与について周知されているとおり、裸の組み換えベクター及びウイルスコートタンパク質にパッケージングされたベクターＤＮＡの両方を意味する。ＡＡＶベクターをリン酸緩衝液中に単に溶解することは、筋肉組織発現に有用なベヒクルを与えるのに十分であることが証明されており、そしてベクターと共投与されうる担体もしくは他の成分に関する制約は知られていない（ＤＮＡを分解する組成物はベクターに関する普通の方法で回避されるべきであるけれども）。経皮輸送により筋肉にデリバリーされるべき注射可能な配合物又は局所的配合物として製薬学的組成物を調製することができる。筋肉内注射及び経皮輸送の両方のための多数の配合物が以前に開発されておりそして本発明の実施に使用することができる。ベクターは投与及び取り扱いを容易にするためにすべての製薬学的に許容できる担体と共に使用することができる。
【０１１８】
筋肉内注射の目的で、ごま油又は落花生油の如きアジュバント中の溶液又は水性プロピレングリコール中の溶液を使用することができ、そして無菌水性溶液を使用することができる。このような水性溶液は、所望により緩衝化することができ、そして液体希釈剤は最初に食塩もしくはグルコースで等張性とすることができる。ヒドロキシプロピルセルロースの如き界面活性剤と適当に混合された水中の、遊離酸（ＤＮＡは酸性ホスフェート基を含有する）又は製薬学的に許容できる塩としてのＡＡＶベクターの溶液を調製することができる。ＡＡＶウイルス粒子の、グリセロール、液体ポリエチレングリコール及びそれらの混合物中の分散液及び油中の分散液を調製することもできる。通常の貯蔵及び使用条件下に、これらの調製物は微生物の増殖を阻止するために保存剤を含有する。これに関して、使用される無菌水性媒体は当業者に周知の標準技術によりすべて容易に得ることができる。
【０１１９】
注射可能な使用に適当な製薬学的形態は、無菌の水性溶液もしくは分散液、及び無菌の注射可能な水性溶液もしくは分散液をその場で調製するための無菌の粉末を包含する。すべての場合に、この形態は無菌でなければならずそして容易に注射可能である程度に流動性でなければならない。この形態は製造及び貯蔵条件下に安定でなければならず、そしてバクテリア及び菌・カビ類（ｆｕｎｇｉ）の如き微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの適当な混合物及び植物油を含有する溶媒又は分散媒体であることができる。例えば、レシチンの如きコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒度の維持により及び界面活性剤の使用により適性な流動性を維持することができる。種々の抗バクテリア剤及び抗菌・カビ剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等により微生物の作用を阻止することができる。多くの場合に、等張剤、例えば、糖又は塩化ナトリウムを含むことが好ましいであろう。注射可能な組成物の長期の吸収は吸収遅延剤、例えば、アルミニウムモノステアレート及びゼラチンの使用により引き起こすことができる。
【０１２０】
無菌の注射可能な溶液は、必要な量のＡＡＶベクターを必要に応じて上記した種々の他の成分と共に適当な溶媒中に加え、次いでろ過滅菌することにより調製される。一般に、分散液は、滅菌された活性成分を基本分散媒体と上記した成分からの必要な他の成分を含有する無菌のビヒクル中に導入することにより調製される。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌の粉末の場合には、好ましい調製方法は、活性成分プラス予め無菌ろ過された溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末を生じさせる真空乾燥及び凍結乾燥技術である。
【０１２１】
局所的投与の目的で、他の点では上記の非経口溶液と同様な希薄な無菌の水性溶液（通常、約０．１％〜５％濃度の）は、経皮パッチに導入するのに適当な容器中に調製されそして既知の担体、例えば、製薬学的銘柄のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含むことができる。
【０１２２】
特に興味深いのは、適正に機能する嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）を気道上皮に与えることによる嚢胞性繊維症の遺伝子欠陥の矯正である。かくして、天然のＣＦＴＲタンパク質をコードしているｒＡＡＶベクター及びその突然変異体及びそのフラグメントはすべて本発明の好ましい態様である。
【０１２３】
本発明の組成物は、生体内でも生体外でも使用できる。生体内遺伝子治療は、本発明のベクターを被験者に直接投与することを含んでなる。製薬学的組成物は、液体溶液もしくは懸濁液として、乳液として又は使用前に液体中に溶解もしくは懸濁させるのに適当な固体形態として供給することができる。気道に投与するために、好ましい投与方式は、適当なエアロソルビライザー装置と共に使用されるとき固体又は液体エアゾルを与える組成物を使用する、エアゾルによる。気道への他の好ましい投与方式は、柔軟性光ファイバー気管支鏡を使用してベクターを滴下する（ｉｎｓｔｉｌｌ）ことである。典型的には、ウイルスベクターは、製薬学的に適当な発熱物質のない緩衝液、例えば、リンガーの生理的塩類溶液（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ｐＨ７．４）中にある。必要ではないけれども、製薬学的組成物は場合により正確な量の投与に適した単投与形態で供給されてもよい。
【０１２４】
処理の目的に依存して有効量のウイルスが投与される。有効量は単一投与量又は分割された投与量で与えられることができる。低い百分率の形質導入が遺伝子的欠陥を治癒させることができる場合には、処理の目的は一般にこのレベルの形質導入を満足させるか又は越えることである。ある場合には、このレベルの形質導入は、標的細胞の約１〜５％のみの形質導入により達成されうるが、更に典型的には所望の組織型の細胞の２０％より多く、通常所望の組織型の細胞の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約８０％、更に好ましくは少なくとも約９５％、なお一層好ましくは少なくとも約９９％である。ガイドとして、気管支鏡により与えられる単一投与量中に存在するベクター粒子の数は、ＤＮアーゼ耐性粒子及びＤＮア−ゼ感受性粒子の両方を含めて、一般に少なくとも約１×１０８であり、更に典型的には５×１０８、１×１０１０であり、そしてある場合には１×１０１１粒子である。ＤＮア−ゼ耐性粒子として、投与量は一般に１×１０６〜１×１０１４粒子であり、更に一般的には約１×１０８〜１×１０１２粒子である。処理はしばしば必要に応じて２週間毎又は３週間毎に反復されうるが、１８０日で一回の処理で十分なことがありうる。
【０１２５】
宿主細胞中の所望のＤＮＡ配列の存在を確かめるために、種々のアッセイを行うことができる。このようなアッセイは、例えば、当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ、例えば、サザーン及びノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲ及びＰＣＲ；「生化学的」アッセイ、例えば、ベクター中に存在する遺伝子から発現されたポリペプチドの存在を、例えば免疫学的手段（免疫沈降、イムノアフィニティーカラム、ＥＬＩＳＡｓ及びウエスタンブロット）又は本発明の範囲内に入る特定の核酸分子の存在及び／又は発現を同定するのに有用な任意の他のアッセイにより検出することを包含する。
【０１２６】
導入されたＤＮＡセグメントから産生されたＲＮＡを検出しそして定量するために、ＲＴ−ＰＣＲを使用することができる。ＰＣＲのこの適用においては、最初に、逆転写酵素の如き酵素を使用してＲＮＡをＤＮＡに逆転写し、次いで慣用のＰＣＲ技術の使用によりＤＮＡを増幅させることが必要である。大抵の場合に、ＰＣＲ技術は、有用ではあるけれども、ＲＮＡ産物の完全性を証明しないであろう。ＲＮＡ産物の性質に関する更なる情報はノーザンブロッティングにより得ることができる。この技術はＲＮＡ種の存在を証明しそしてそのＲＮＡの完全性に関する情報を与える。ＲＮＡ種の存在又は不存在は、ドットもしくはスロットブロットノーザンハイブリダイゼーションを使用して決定することもできる。これらの技術はノーザンブロッティングの修正でありそしてＲＮＡ種の存在もしくは不存在を証明するだけである。
【０１２７】
問題のＤＮＡセグメントを検出するのにサザーンブロッティング及びＰＣＲを使用することができるが、それらはＤＮＡセグメントが発現されているかどうかに関する情報を与えない。発現は、導入されたＤＮＡ配列のポリペプチド産物を特別に同定するか又は宿主細胞における導入されたＤＮＡセグメントの発現により引き起こされる表現型の変化を評価することにより評価することができる。
【０１２８】
かくして、遺伝的変化の有効性をいくつかの基準によりモニターすることができる。生検又は外科的切除により取り出されたサンプルをｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション、ベクター特異的プローブを使用するＰＣＲ増幅、ＲＮアーゼプロテクション、免疫組織学又は免疫蛍光細胞計数により分析することができる。ベクターが気管支鏡により投与される場合には、肺機能試験を行うことができ、そして気管支洗浄は炎症性サイトカインの存在について評価することができる。処理された被験者は臨床的特徴をモニターされることもでき、そして細胞が治療性ポリヌクレオチドにより運ばれることを意図した機能を発現するかどうかを決定するためにモニターされることもできる。
【０１２９】
生体内治療又は生体外治療を使用するかどうかの決定、及び特定の組成物、用量及び投与経路の選択は処理される条件及び被験者の特徴を包含するがそれらに限定はされない多数の異なるファクターに依存するであろう。このような特徴の評価及び適当な治療方法の設計は、最終的には処方する医師の責任である。
【０１３０】
前記説明は、中でも、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）及び細胞タンパク質が実質的にない組み換えＡＡＶベクターの高力価調製物を発生させる方法を提供する。本発明の精神から逸脱することなく、当業者によりこれらの方法に変更が加えられうることは理解される。
【０１３１】
ＶＩＩ．本発明の実施において有用な薬剤
本発明の実施において有用な薬剤はｒＡＡＶ形質導入効率を変える薬剤を含む。好適な薬剤はｒＡＡＶ形質導入を増強または増進する薬剤である。そのような薬剤は、ウイルスのエンドサイトーシスを増強する薬剤、例えば、ブレフェルジンＡ（ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ Ａ）、エンドソームプロセッシングおよび／または核への移行（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）を増強する薬剤、例えばシステインプロテアーゼ阻害剤を含む。好ましくは、阻害剤は、エンドソームの、例えばリソソームのシステインプロテアーゼ阻害剤である。より好ましくは、本発明の薬剤は可逆的システインプロテアーゼ阻害剤である。本発明の範囲内のシステインプロテアーゼ阻害剤は、シスタチン、例えばシスタチンＢまたはシスタチンＣ、アンチパイン、ロイペプチン、Ｅ−６４、Ｅ−６４ｃ、Ｅ−６４ｄ、ＫＯ２（Ｗａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｐｈａｒｍａ．Ｓｃｉ．，８７，１３２２（１９９８））、ＬＬｎＬ、Ｚ−ＬＬＬ、ＣＢＺ−Ｖａｌ−ｐｈｅ−Ｈ、米国特許第５，６０７，８３１号、同第５，３７４，６２３号、同第５．６３９，７３２号、同第５，６５８，９０６号、同第５，７１４，４８４号、同第５，５６０，９３７号、同第５，３７４，６２３号、同第５，６０７，８３１号、同第５，７２３，５８０号、同第５，７４４，３３９号、同第５，８２７，８７７号、同第５，８５２，００７号および同第５，７７６，７１８号、日本特許第１００７７２７６号、同第８１９８８７０号、同第８０８１４３１号、同第７１２６２９４号、同第４２０２１７０号、ＷＯ９６／２１００６およびＷＯ９６／４０７３７において開示されているようなシステインプロテアーゼ阻害剤を含む。
【０１３２】
好適なシステインプロテアーゼ阻害剤はペプチドまたはその類似体である。本発明の範囲内の好適なペプチドシステインプロテアーゼ阻害剤は、２〜１０個、より好ましくは３〜１０個、なおより好ましくは３〜８個のアミノ酸残基を含有する。「アミノ酸」は、ＤまたはＬ型の天然アミノ酸（例えば、Ａｌａ，Ａｒｇ，Ａｓｎ，Ａｓｐ，Ｃｙｓ，Ｇｌｕ，Ｇｌｎ，Ｇｌｙ，Ｈｉｓ，Ｈｙｌ，Ｈｙｐ，Ｉｌｅ，Ｌｅｕ，Ｌｙｓ，Ｍｅｔ，Ｐｈｅ，Ｐｒｏ，Ｓｅｒ，Ｔｈｒ，Ｔｒｐ，ＴｙｒおよびＶａｌ）、ならびに非天然アミノ酸（例えば、ホスホセリン、ホスホスレオニン、ホスホチロシン、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート；馬尿酸、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸、スタチン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、ペニシラミン、オルニチン、シトルリン、α−メチル−アラニン、ｐ−ベンゾイルフェニルアラニン、フェニルグリシン、プロパルギルグリシン、サルコシン、ｎｏｒ−ロイシン、ｎｏｒ−バリンおよびｔｅｒｔ−ブチルグリシン）の残基を含む。ペプチド類似体は、少なくとも１種のＤ型のアミノ酸および／または非天然アミノ酸、または天然アミノ酸ではない他の部分を含有する分子である。
【０１３３】
好適なペプチドシステインプロテアーゼ阻害剤は、式（Ｉ）：Ｒ１−Ａ−（Ｂ）ｎ−Ｃ［式中、Ｒ１はＮ−末端アミノ酸ブロッキング基であり；各ＡおよびＢは独立してアミノ酸であり；Ｃは、末端カルボキシ基がＣＨＯ基によって置換されたアミノ酸であり；そしてｎは０，１，２または３である］の化合物、またはその製薬学的に許容しうる塩を含む。１つの好適な実施態様では、Ｒ１は（Ｃ１−Ｃ１０）アルカノイル、アセチルまたはベンジルオキシカルボニルである。その他の好適な実施態様では、各ＡおよびＢは独立してアラニン、アルギニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、ｎｏｒ−ロイシンまたはｎｏｒ−バリンであり、そしてより好ましくは各ＡおよびＢはイソロイシンである。なおその他の好適な実施態様では、Ｃは、末端カルボキシ基がＣＨＯ基によって置換されたアラニン、アルギニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、ｎｏｒ−ロイシンまたはｎｏｒ−バリンであり、そしてより好ましくは、Ｃは、末端カルボキシ基がＣＨＯ基によって置換されたｎｏｒ−ロイシンまたはｎｏｒ−バリンである。
【０１３４】
さらなる好適な実施態様では、Ｒ１は（Ｃ１−Ｃ１０）アルカノイルまたはベンジルオキシカルボニルであり；ＡおよびＢは各々イソロイシンであり；Ｃは、末端カルボキシ基がＣＨＯ基によって置換されたｎｏｒ−ロイシンまたはｎｏｒ−バリンであり、そしてＮは１である。
【０１３５】
また、式（ＩＩ）：
【０１３６】
【化４】
Figure 2004534543
【０１３７】
［式中、
Ｒ２は、Ｎ−末端アミノ酸ブロッキング基であり；
Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は、各々独立して、水素、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、アリールまたはアリール（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであり；そして
Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は、各々独立して、水素、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、アリールまたはアリール（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルである］
の化合物、またはその製薬学的に許容しうる塩は、本発明の範囲内に含まれる。好ましくは、Ｒ２は（Ｃ１−Ｃ１０）アルカノイル、アセチルまたはベンジルオキシカルボニルである。また好ましくは、Ｒ３は、水素または（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、例えば２−メチルプロピルである。Ｒ４が水素または（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、例えば２−メチルプロピルであることが好適である。
【０１３８】
その他の好適な実施態様では、Ｒ５は水素または（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、例えばブチルまたはプロピルである。
【０１３９】
さらなる好適な実施態様では、Ｒ２はアセチルまたはベンジルオキシカルボニルであり；Ｒ３およびＲ４は各々２−メチルプロピルであり；Ｒ５はブチルまたはプロピルであり；そしてＲ６、Ｒ７およびＲ８は、各々独立して水素である。
【０１４０】
本発明の方法において有用なその他の好適な薬剤は、式（ＩＩＩ）：
【０１４１】
【化５】
Figure 2004534543
【０１４２】
［式中、
Ｒ１は、Ｈ、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルカノイル、（＝Ｏ）、（＝Ｓ）、ＯＨ、ＳＲ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチルまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシであり、この場合、いかなるアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはアルカノイルも、１個以上のハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチル、ＮＲＲまたはＳＲ（式中、各Ｒは、独立してＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルである）により場合によっては置換されていてもよく；
Ｒ２は、（＝Ｏ）または（＝Ｓ）であり；
Ｒ３は、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシまたは（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキルであり、この場合、いかなるアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはシクロアルキルも、１個以上のハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチル、ＳＲまたはＮＲＲ（式中、各Ｒは、独立してＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルである）により場合によっては置換されていてもよく；
Ｒ４は、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシまたは（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキルであり、この場合、いかなるアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはシクロアルキルも、１個以上のハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチル、ＳＲまたはＮＲＲ（式中、各Ｒは、独立してＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルである）により場合によっては置換されていてもよく；
Ｒ５は、Ｈ、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルカノイル、（＝Ｏ）、（＝Ｓ）、ＯＨ、ＳＲ、ＣＮ、ＮＯ２またはトリフルオロメチルであり、この場合、いかなるアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはアルカノイルも、１個以上のハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチル、ＮＲＲまたはＳＲ（式中、各Ｒは、独立してＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルである）により場合によっては置換されていてもよく；そして
Ｘは、Ｏ，ＳまたはＮＲ（式中、ＲはＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルである）である］
の化合物、またはその製薬学的に許容しうる塩である。
【０１４３】
次の定義が、別に記述しない限り適合する。アルキルは直鎖または分枝の基を示すが、「プロピル」のような個々の基に関しては直鎖基のみを含み、「イソプロピル」のような分枝鎖異性体は特に言及される。アリールは、フェニル基または少なくとも１個の環が芳香環である約９〜１０個の環原子を有するオルト縮合した二環式の炭素環式基を示す。
【０１４４】
適当なＮ−アミノ酸ブロッキング基は当業者には既知である（参照、例えば、Ｔ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ，Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐｓ Ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ；Ｗｉｌｅｙ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８１、およびここに引用されている文献）。Ｒ１について好適な価値あるものは、（Ｃ１−Ｃ１０）アルカノイル（例えばアセチル）およびベンジルオキシカルボニルを含む。
【０１４５】
ＶＩＩＩ．本発明の薬剤の用量、製剤および投与経路
本発明にしたがって同定された薬剤の投与は、例えば、投与の目的が治療的であっても予防的であっても、レシピエントの生理学的状態、および習熟した医者には既知の他のファクターによって、連続的または断続的であってもよい。本発明の薬剤の投与は、本質的に、予定された期間にわたって連続的であってもよく、または一連の間隔を置いた用量であってもよい。両局所的および全身的投与が考えられる。本発明の薬剤が予防目的のために用いられる場合、本発明の薬剤は、好ましくは全身的投与によって長引く使用に対して受け入れられる。
【０１４６】
塩を含む式（Ｉ），（ＩＩ），（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の化合物を含む、本発明の薬剤は、他の用量が有益な効果を与えるかもしれないが、好ましくは、約０．０１μＭ〜約１ｍＭ、より好ましくは約０．１μＭ〜約４０μＭ、なおより好ましくは約１μＭ〜４０μＭの用量において投与される。例えば、ＬＬｎＬの好適な用量は、約１μＭ〜４０μＭを含むが、一方Ｚ−ＬＬＬの好適な用量は０．１μＭ〜約４μＭを含む。
【０１４７】
以下に議論されるように、場合によっては持続的放出のために製剤化されてもよい本発明の薬剤を含有する１種以上の適当な単位用量製剤が、経口的か、あるいは肛門内、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸内、肺内および鼻内経路を含む非経口経路を含む、種々の経路によって投与することができる。例えば、肝臓への投与では、静脈内投与が好適である。肺への投与では、気道投与が好適である。製剤は、適当であれば、分離した単位投与剤形において便宜的に提供されてもよく、そして製薬業には周知のいかなる方法によって製造されてもよい。そのような方法は、液体キャリヤー、固形マトリックス、半固形キャリヤー、微細固形キャリヤーまたはそれらの組み合わせ物と本薬剤を混合させ、次いで、必要ならばその生成物を所望の送達システムに導入または成型する段階を含んでもよい。
【０１４８】
本発明の薬剤が経口投与のために製造される場合は、それらは、好ましくは、製薬学的製剤または単位投与剤形を形成するために、製薬学的に許容しうるキャリヤー、希釈剤または添加物と合わせられる。そのような製剤中の総有効成分は、製剤の０．１〜９９．９重量％を含有する。「製薬学的に許容しうる」ということは、キャリヤー、希釈剤、添加物および／または塩が製剤の他の成分と適合し、そしてそれのレシピエントに対して有害であってはならないことを意味する。経口投与のための有効成分は、散剤または粒剤として；液剤、懸濁剤または乳濁剤として；またはチューインガムからの有効成分の摂取を達成できる合成樹脂のような基剤中に存在してもよい。また有効成分は、丸剤、舐剤またはペースト剤として存在してもよい。
【０１４９】
本発明の薬剤を含有する製薬学的製剤は、周知の、そして容易に入手できる成分を用いて当該技術分野における既知の操作によって製造することができる。例えば、本薬剤は、通常の添加物、希釈剤またはキャリヤーとともに製剤化され、そして錠剤、カプセル剤、懸濁剤、散剤などに形成することができる。そのような製剤のために適当である添加物、希釈剤およびキャリヤーの例は、次のような賦形剤および増量剤、例えば澱粉、糖類、マンニトールおよびケイ酸誘導体；結合剤、例えばカルボキシメチルセルロース、ＨＰＭＣおよび他のセルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチン、およびポリビニル−ピロリドン；湿潤剤、例えばグリセロール；崩壊剤、例えば炭酸カルシウムおよび重炭酸ナトリウム；溶解を遅延させる薬剤、例えばパラフィン；吸収促進剤、例えば第４級アンモニウム化合物；界面活性剤、例えばセチルアルコール、モノステアリン酸グリセロール；吸着キャリヤー、例えばカオリンおよびベントナイト；および滑沢剤、例えばタルク、ステアリン酸カルシウムおよびマグネシウム、および固形ポリエチルグリコールを含む。
【０１５０】
例えば、本発明の薬剤を含有する錠剤またはキャプレット剤（ｃａｐｌｅｔｓ）は、緩衝剤、例えば炭酸カルシウム、酸化マグネシウムおよび炭酸マグネシウムを含むことができる。キャプレット剤および錠剤は、また不活性成分、例えばセルロース、前糊化澱粉、二酸化ケイ素、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、微結晶セルロース、澱粉、タルク、二酸化チタン、安息香酸、クエン酸、コーンスターチ、鉱油、ポリプロピレングリコール、リン酸ナトリウムおよびステアリン酸亜鉛などを含むことができる。本発明の薬剤を含有する硬質または軟質ゼラチンカプセル剤は、不活性成分、例えばゼラチン、微結晶セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、澱粉、タルクおよび二酸化チタンなど、ならびに液体媒質、例えばポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および植物油を含んでもよい。さらに、本発明の薬剤の腸溶性キャプレット剤または錠剤は、胃における崩壊に対して抵抗し、そして十二指腸のより中性ないしアルカリ性環境において溶解するように設計される。
【０１５１】
また、本発明の薬剤は、経口投与のために便利なエリキシル剤または液剤として、または例えば筋肉内、皮下または静脈内経路による非経口投与に適当な液剤として製剤化することができる。
【０１５２】
本発明の薬剤の製薬学的製剤は、また、水性または無水の溶液または懸濁液の形態か、あるいはまた乳濁液または懸濁液の形態をとることもできる。
【０１５３】
かくして、治療剤は、非経口投与（例えば、注射、例えば大量注射または連続注入によっる）のために製剤化されてもよく、そしてアンプル、予め充填された注射器、少容量の注入容器中の単位用量剤形、または添加された保存剤を含有する多用量容器において提供されてもよい。有効成分は、油性または水性媒質中の懸濁剤、液剤または乳濁剤のような剤形をとってもよく、そして懸濁、安定化および／または分散剤のような製剤化薬剤を含有してもよい。あるいはまた、有効成分は、使用前に、適当な媒質、例えば無菌の、発熱物質不含の水を用いて構成するために、無菌固形物の無菌分離によるか、または溶液からの凍結乾燥によって得られる粉末形態において存在してもよい。
【０１５４】
これらの製剤は、先行技術において周知である製薬学的に許容しうる媒質および補助剤を含有することができる。例えば、水に加えて、溶媒、例えばアセトン、エタノール、イソプロピルアルコール、製品名「Ｄｏｗａｎｏｌ」として販売されている製品のようなグリコールエーテル、ポリグリコールおよびポリエチレングリコール、短鎖の酸のＣ１−Ｃ４アルキルエステル、好ましくは乳酸エチルまたはイソプロピル、製品名「Ｍｉｇｌｙｏｌ」として市販されている製品のような脂肪酸トリグリセリド、ミリスチン酸イソプロピル、動物油、鉱油および植物油およびポリシロキサンから選ばれる生理学的観点から許容しうる１種以上の溶媒を用いて、液剤を製造することも可能である。
【０１５５】
また、本発明による組成物は、粘稠化剤、例えばセルロースおよび／またはセルロース誘導体を含有することもできる。またそれらは、ガム類、例えばキサンタンガム、グアまたはカルボガムまたはアラビヤゴムか、あるいはまたポリエチレングリコール、ベントンおよびモンモリロナイトなどを含有してもよい。
【０１５６】
必要ならば、抗酸化剤、界面活性剤、他の保存剤、膜形成剤、角質分解またはコメド分解剤、芳香剤および着色剤から選ばれる補助剤を添加することも可能である。また、既述の症状でも他の症状のためであっても、他の有効成分が添加されてもよい。
【０１５７】
例えば、抗酸化剤の中では、ｔ−ブチルヒドロキノン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンおよびα−トコフェロールおよびその誘導体が挙げられてもよい。局所適用のために主に調整されたガレヌス剤形は、クリーム剤、乳剤、ゲル剤、懸濁剤またはミクロエマルション剤、多かれ少なかれ粘稠化されたローション剤、含浸パッド剤、軟膏剤またはスティック剤の形態、あるいはまた、スプレーまたはフォーム形態におけるエアゾル製剤の形態、あるいはまたケーキまたは石けんの形態をとる。
【０１５８】
さらに、本薬剤は、徐放用量剤形などとして製剤化するためによく適合する。製剤は、それらが、できる限り一定期間にわたって、腸または呼吸気道の特定の部分においてのみ、または好ましく、有効成分を放出するように構成することができる。コーティング剤、エンベロープ剤および保護マトリックス剤は、高分子物質、例えばポリアクチド−グリコレート、リポソーム、ミクロエマルション、ミクロ粒子、ナノ粒子またはワックスから作成されてもよい。これらのコーティング剤、エンベロープ剤および保護マトリックス剤は、内在する用具、例えばステント、カテーテル、腹腔透析チューブなどをコーティングするために有用である。
【０１５９】
本発明の薬剤は、経皮投与のためのパッチ剤を介して送達することができる。参照、薬剤の経皮送達に適当なパッチ剤の例のために、米国特許第５，５６０，９２２号。経皮送達のためのパッチ剤は、裏打ち層ならびに１種以上の皮膚浸透促進剤とともに薬剤を中に分散または溶解したポリマーマトリックスを含有することができる。裏打ち層は、薬剤に対して非浸透性であるすべての適当な材料から作成できる。裏打ち層はマトリックス層の保護カバーとして役立ち、そしてまた支持機能をも提供する。裏打ち層は、それがポリマーマトリックスと本質的に同じ大きさの層であるように形成できるか、あるいはそれがポリマーマトリックスの縁を越えて広がるか、またはポリマーマトリックスの縁を覆うように、より大きい面積をもってもよく、次いで裏打ち層の広がりの表面が粘着手段のための基剤である方式で外に広がってもよい。あるいはまた、ポリマーマトリックスは、粘着ポリマー、例えばポリアクリレートまたはアクリレート／酢酸ビニルコポリマーを含有しても、またそれから形成されてもよい。長期間適用では、皮膚の水和または浸軟が最小化されるので、微小多孔性および／または呼吸可能な裏打ち薄層を使用することが望まれる。
【０１６０】
裏打ち層を作成するのに適当な材料の例は、高密度および低密度ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、塩化ポリビニル、ポリエステル、例えばポリ（エチレンフタレート）、金属ホイル、そのような適当なポリマーフィルムの金属ホイルラミネートなどのフィルムである。好ましくは、裏打ち層に使用される材料は、金属ホイル、例えばアルミニウムホイルによるそのようなポリマーフィルムのラミネートである。そのようなラミネートでは、ラミネートのポリマーフィルムは、通常は、粘着ポリマーマトリックスに接しているであろう。
【０１６１】
裏打ち層は、所望の保護と支持機能を提供できるいかなる適当な厚さであってもよい。適当な厚さは、約１０〜約２００ミクロンである。
【０１６２】
一般に、生物学的に許容しうる粘着ポリマー層を形成するのに使用されるそれらのポリマーは、薬剤が制御された速度で通過できる成型した本体、薄い壁またはコーティングを形成することができるポリマーである。適当なポリマーは、生物学的および製薬学的に適合でき、非アレルギー性で、そして用具が接触する体液または組織に不溶であり、それに適合できる。可溶性ポリマーの使用は避けるべきであり、何故ならば、皮膚の水分によるマトリックスの分解または侵食が、薬剤の放出速度ならびに除去の都合でその場所に残る用量単位の機能に影響するからである。
【０１６３】
粘着ポリマー層を組み立てる典型的材料は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、エチレン／プロピレンコポリマー、エチレン／エチルアクリレートコポリマー、エチレン／酢酸ビニルコポリマー、シリコンエラストマー、特に医療用のポリジメチルシロキサン、ネオプレンゴム、ポリイソブチレン、ポリアクリレート、塩素化ポリエチレン、塩化ポリビニル、塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマー、架橋ポリメタクリレートポリマー、（ヒドロゲル）、塩化ポリビニリデン、ポリ（エチレンフタレート）、ブチルゴム、エピクロロヒドリンゴム、エチレンビニルアルコールコポリマー、エチレン−ビニルオキシエタノールコポリマー；シリコンコポリマー、例えばポリシロキサン−ポリカーボネートコポリマー、ポリシロキサンポリエチレンオキシドコポリマー、ポリシロキサン−ポリメタクリレートコポリマー、ポリシロキサン−アルキレンコポリマー（例えば、ポリシロキサン−エチレンコポリマー）、ポリシロキサン−アルキレンシランコポリマー（例えば、ポリシロキサン−エチレンシランコポリマー）など；セルロースポリマー、例えばメチルまたはエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびセルロースエステル；ポリカーボネート；ポリテトラフルオロエチレン；等々を含む。
【０１６４】
好ましくは、生物学的に許容しうる粘着ポリマーマトリックスは、室温以下のガラス転移温度を有するポリマーから選ばれるべきである。ポリマーは、必ずしも必要ではないが、室温において結晶化度を有してもよい。架橋性モノマー単位または部位が、そのようなポリマー中に組み入れられてもよい。例えば、架橋性モノマーはポリアクリレートポリマー中に組み入れることができ、これがポリマー中への本薬剤の分散後マトリックスを架橋するための部位を提供する。ポリアクリレートポリマーのための既知の架橋性モノマーは、ポリオールのポリメタクリル酸エステル、例えばブチレンジアクリレートおよびジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレートなどを含む。そのような部位を提供する他のモノマーは、アリルアクリレート、アリルメタクリレート、マレイン酸ジアリルなどを含む。
【０１６５】
好ましくは、可塑剤および／または湿潤剤が粘着ポリマーマトリックス内に分散される。水溶性ポリオールは一般にこの目的のために適当である。製剤における湿潤剤の組み入れは、投薬単位に皮膚の表面における水分を吸収させ、これが順に、皮膚の刺激を減少させ、そして送達システムの粘着ポリマー層が無効になるのを防ぐのに役立つ。
【０１６６】
経皮送達システムから放出された薬剤は、皮膚の各層に浸透できなければならない。薬剤の浸透速度を増加させるためには、経皮薬物送達システムは、特に、分子の浸透に対して最大の抵抗を提供する皮膚の最外層、角質層の浸透性を増加することが必要である。薬剤の経皮送達のためのパッチ剤の作製は当該技術分野においては周知である。
【０１６７】
吸入による上部（鼻）または下部呼吸気道への投与では、本発明の薬剤は、便利には、注入器、ネブライザー、またはエアゾルスプレー剤を送達する圧縮パック剤または他の便利な手段から送達される。圧縮パック剤は、適当な噴射剤、例えばジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素または他の適当な気体を含有できる。圧縮エアゾルの場合、用量単位は、一定量を送達するためのバルブを備えることによって決定することができる。
【０１６８】
あるいはまた、吸入または注入による投与では、組成物は、乾燥散剤、例えば本薬剤と適当な粉末基剤、例えばラクトースまたは澱粉の粉末混合物の形態をとってもよい。粉末組成物は、例えば、カプセル剤またはカートリッジ剤における単位用量形態において、または散剤が吸入器、注入器または定量用量吸入器を用いて投与されてもよいゼラチンまたは気泡パック剤（ｂｌｉｓｔｅｒ ｐａｃｋｓ）において提供されてもよい。
【０１６９】
鼻内投与では、本薬剤は、点鼻剤、液体スプレー剤を介して、例えばプラスチック瓶噴霧器または定量用量吸入器を介して投与されてもよい。典型的な噴霧器はＭｉｓｔｏｍｅｔｅｒ（Ｗｉｎｔｒｏｐ）およびＭｅｄｉｈａｌｅｒ（Ｒｉｋｅｒ）である。
【０１７０】
本発明の薬剤の局所送達は、また、疾患部位か、その近くに薬剤を投与する種々の技術によって実施できる。部位特異的または標的指向的局所送達の例は、限定することを意図せず利用できる技術の例を示す。例は、局所送達カテーテル、例えば注入または内在カテーテル、例えば針注入カテーテル、シャントおよびステントまたは他の移植できる用具、部位特異的キャリヤー、直接注射、または直接適用を含む。
【０１７１】
局所投与では、本薬剤は、標的領域への直接適用のために当該技術分野において既知であるように製剤化できる。この目的のための慣用的剤形は、創傷包帯剤、被覆用帯びまたは他のポリマー被覆剤、軟膏剤、クリーム剤、ローション剤、ペースト剤、ゼリー剤、スプレー剤およびエアゾル剤を含む。軟膏剤およびクリーム剤は、例えば、適当な粘稠化剤および／またはゲル化剤の添加による水性または油性基剤とともに製剤化することができる。ローション剤は水性または油性基剤とともに製剤化されてもよく、そしてまた一般に、１種以上の乳化剤、安定剤、分散化剤、懸濁化剤、増粘剤または着色剤を含有している。また、有効成分は、例えば、米国特許第４，１４０，１２２号；同第４，３８３，５２９号；または同第４，０５１，８４２号に開示されているように、イオン導入法を介して送達できる。局所製剤中に存在する本発明の薬剤の重量パーセントは、種々の因子に依存するが、一般に、製剤の総重量の０．０１％〜９５％、典型的には０．１〜２５重量％であろう。
【０１７２】
滴剤、例えば点眼剤または点鼻剤は、また１種以上の分散剤、可溶化剤または懸濁化剤を含有する水性または非水性基剤を用いて製剤化されてもよい。液体スプレー剤は、便利には、圧縮パック剤から送達される。滴剤は、簡単な点眼用キャップ瓶を介するか、または液体内容物を滴下送達するために適合されたプラスチック瓶を介して、特別に成型された密閉容器を介して送達することができる。
【０１７３】
さらに本薬剤は、口または喉内の局所投与のために製剤化されてもよい。例えば、有効成分は、着香した基剤、通常スクロースおよびアカシアまたはトラガカントをさらに含有する口中剤；不活性基剤、例えばゼラチンおよびグリセリンまたはスクロースおよびアカシア中に組成物を含有するパステル剤；および適当な液体キャリヤー中に本発明の組成物を含有するマウスウォッシュ剤として製剤化されてもよい。
【０１７４】
また、本明細書に既述される製剤および組成物は、他の成分、例えば抗微生物剤または保存剤を含有してもよい。さらにまた、有効成分は、他の薬剤、例えば気管支拡張薬と組み合わせて使用されてもよい。
【０１７５】
本発明の薬剤は、単独で、または製薬学的に許容しうるキャリヤーと組み合わせて、哺乳動物に投与することができる。先に記したように、有効成分およびキャリヤーの相対的割合は、化合物の溶解度と化学的性質、選ばれた投与経路および標準の製薬学的実行によって決定される。
【０１７６】
本薬剤の用量は、投与の形態、選ばれた特定の化合物および治療下の特定の患者の生理学的特徴とともに変化するであろう。一般に、低用量が最初に使用され、そして必要ならば、その環境下での最適効果が達成されるまで小増加量ずつ増加される。
【０１７７】
本発明は、限定されるものではないが、次に示す実施例によってさらに記述することができる。
【実施例１】
【０１７８】
プソイドタイプＡＡＶ−５による筋肉遺伝子送達の増強は筋芽細胞分化と相関する。
【０１７９】
筋肉におけるｒＡＡＶ−５の増進した形質導入に関与するメカニズムをより良く理解するために、プソイドタイプのウイルスの筋肉導入が評価されたが、このウイルスではｒＡＡＶ−２ゲノムがＡＡＶ−５キャプシド中にパッケージされた（ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５）。このハイブリッドウイルスは、ＡＡＶ−２ゲノムの十分に確立された分子特性を保持しており、したがって、筋肉へのｒＡＡＶ遺伝子送達の効率に及ぼすこのキャプシドの影響を直接決定することを可能にする。下記のように、筋芽細胞におけるイン・ビトロの研究および筋肉におけるイン・ビボの研究が、プソイドタイプｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスによる遺伝子送達が分化した筋原繊維においてはｒＡＡＶ−２ベクター以上に大きく増強されたが、未分化の筋芽細胞では増強されないことを例証した。興味あることに、ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスによる遺伝子伝達における増強は、増進したウイルスの結合とは完全には相関せず、このことは、侵入後のプロセッシング結果がＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５の異なるキャプシド構造によって影響を受ける可能性があることを示唆している。これらの知見は、ｒＡＡＶ−２の細胞内プロセッシングが、気道のような他の組織において見られるように、筋肉におけるｒＡＡＶ−２形質導入に対する部分的バリヤーをまた表していることを示唆する。
【０１８０】
材料および方法
組み換えＡＡＶ作製 ＥＧＦＰを発現するｒＡＡＶ−２ウイルスが、ｐｃｉｓＧＦＰｏｒｉ３プロウイルスプラスミド（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）を用いて生成された。ルシフェラーゼ遺伝子を作動するＲＳＶプロモーターを有するプロウイルスプラスミドｐｃｉｓＲＳＶ．Ｌｕｓｉｆｅｒａｓｅは、２段階のクローニングによって生成された。第１に、ｐＲＥＰ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）からの１ｋｂ平滑末端ＳａｌＩフラグメントが、ｐＳｕｂ２０１の平滑末端ＸｂａＩ骨格中に挿入されてｐＤＤ５を生成した（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。第２に、ｐＧＬ３Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からの１．７ｋｂＫｐｎＩ／ＸｂａＩフラグメントが、ｐＤＤ５のＫｐｎＩ／ＮｈｅＩ部位中に挿入されてｐｃｉｓＲＳＶ．Ｌｕｓｉｆｅｒａｓｅを生成した。２種のヘルパープラスミド（ｐＡＶ５−ＴｒａｎｓおよびｐＡＶ２−Ｒｅｐ）が使用されてＡＡＶ−５キャプシド中にＡＡＶ−２ゲノムをパッケージした（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２００１）。簡単に言えば、ＡＡＶ−５コーディング領域（ＣａｐおよびＲｅｐ）がＰＣＲを用いてＡＡＶ−５ウイルスＤＮＡから増幅された（Ｂａｎｔｅｌ−Ｓｃｈａａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ｐＡＶ５−Ｔｒａｎｓは、ｐＡＡＶ／Ａｄ中のＡＡＶ−２ＣａｐおよびＲｅｐ遺伝子をＡＡＶ−５ＣａｐおよびＲｅｐ遺伝子を含有する４．３ｋｂフラグメント（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９）と置換することによって生成された。ｐＡＶ２−Ｒｅｐは、ｐＡＡＶ／Ａｄ中のＡＡＶ−２Ｃａｐ遺伝子を欠失することによって生成された（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８９）。
【０１８１】
ｒＡＡＶ−２ウイルス保存液は、Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．（１９９８）において記述された３種のプラスミドトランスフェクション アデノウイルス不含プロトコールにしたがって調製された。簡単に言えば、６０％集密の２９３細胞が、比率１：１：３におけるプロウイルスプラスミド（ｐｃｉｓＥＧＦＰｏｒｉ３またはｐｃｉｓＲＳＶ−ｌｕｓｉｆｅｒａｓｅ）、ＡＡＶ−２ヘルパープラスミド（ｐＸＸ−２）およびアデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＸＸ６−８０）を用いてコトランスフェクションされた（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。粗ウイルス溶解物は、Ｂｅｃｋｍａｎ Ｂｉｏｓｙｓ ２０００ ＨＰＬＣ Ｗｏｒｋｓｔａｔｉｏｎおよび直線Ｎａｃｌ勾配を用いてＰｏｒｏｓヘパリンカラム（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ，Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）において精製された。顕著なＡ２８０ピークフラクション（ＡＡＶフラクション）がプールされ、そしてＨＥＰＥＳバッファー（２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ，１５０ｍＭＮａＣｌ，ｐＨ７．８）に対して透析され、そして５％グリセロール中−８０℃において一定分量ずつ保存された。典型的な収量は、２０個の１５０ｍｍプレート調製物について約５ｘ１０１２ＤＮＡ粒子であった。野生型ＡＡＶ−２による汚染はＹａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）の記述のように決定され、そして１ｘ１０１０ｒＡＡＶ粒子当たり機能性粒子１個未満であった。
【０１８２】
プソイドタイプｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルス（ＡＡＶ−５キャプシド中にパッケージされたｒＡＡＶ−２ゲノム）は、改変アデノウイルス不含系を用いて生成された。簡単に言えば、６０％集密の２９３細胞が、比率１：１：１：３におけるプロウイルスプラスミド（ｐｃｉｓＥＧＦＰｏｒｉ３またはｐｃｉｓＲＳＶ−ｌｕｓｉｆｅｒａｓｅ）、ＡＡＶ−２Ｒｅｐプラスミド（ｐＡＶ２−Ｒｅｐ）、ＡＡＶ−５ヘルパープラスミド（ｐＡＶ５−Ｔｒａｎｓ）およびアデノウイルスヘルパープラスミド（ｐＸＸ６−８０）を用いてコトランスフェクションされた。粗ウイルス溶解物は、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）既述のようにｒＡＡＶ−２について３回のＣｓＣｌ平衡等密度遠心分離を通して精製された。この調製からの典型的な収量は、２０個の１５０ｍｍプレート調製物について約５ｘ１０１２ＤＮＡ粒子であった。ウイルス保存液の物理的タイターは、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９７）既述のようにプラスミド標準に対するスロット・ブロットハイブリダイゼーションによって決定された。野生型（ｗｔ）ＡＡＶ−２／５ハイブリッド汚染は、ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子についてＤＮＡ ＰＣＲによって評価された。簡単に言えば、ウイルス保存液がプロテイナーゼＫにより３７℃で３０分間消化された。次いで、ネステッドＰＣＲがＡＡＶ−５ＣａｐおよびＲｅｐ遺伝子特異的プライマーセットを用いて実施された。ｗｔハイブリッドウイルスの１粒子未満が、プラスミドＲｅｐおよびＣａｐ標準に対して決定されたように、１ｘ１０１０プソイドタイプウイルス粒子（感度の限界）において検出された。
【０１８３】
ＡＡＶ−５キャプシド中へのｒＡＡＶ−２ゲノムの包膜が、ｒＡＡＶ−２ゲノムの分子特性を変えなかったことを確認するために、数回の対照実験が、ＣＭＶ−ＥＧＦＰ発現カセットを担持しているＡＡＶを用いて実施された。第１に、Ｒｆｍ（複製型モノマー）およびＲｆｄ（複製型ダイマー）の導入は、Ａｄ．ｄｌ８０２混合感染の存在下で両ｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスについて同等であった（データ未掲載）。またＡｄ．ｄｌ８０２混合感染は、ｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスからのＥＧＦＰ発現を同程度まで誘導した。第２に、以前に記述されたバクテリア・レスキューアッセイ（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．１９９８）を用いて、類似の分子構造を有する環状モノマーおよび多量体が、いずれかｒＡＡＶ−２またはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスにより感染されたＨｅｌａ細胞において同定された（データ未掲載）。
【０１８４】
Ｃ２Ｃ１２細胞における組み換えＡＡＶ形質導入。 Ｃ２Ｃ１２筋肉細胞系は、ＡＴＣＣ（カタログ番号ＣＲＬ−１７７２）から得られた。細胞は、１０％ＦＢＳ（胎児ウシ血清）、１００Ｕ／ｍｌペニシリンＧおよび１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）において培養され、そして５％ＣＯ２における３０℃培養器中で維持された。分化は１０％ウマ血清において細胞を培養することによって誘導された（Ｙａｔｔｅ ｅｔ ａｌ．１９９７）。感染は、各実験において特定された指示時間量の間、血清不含ＤＭＥＭ中で実施された。必要な場合は、２０％ＦＢＳ ＤＭＥＭが感染後２時間目に添加されて最終血清レベルを１０％にもたらした。ヘパリン競合実験の場合には、ウイルスは遊離ヘパリン（Ｓｉｇｍａ）２０μｇ／ｍｌとともに氷上で６０分間プレインキュベーションされ、次いで、感染が遊離ヘパリン２０μｇ／ｍｌ（最終濃度）含有の血清不含培地において実施された（Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．２０００）。ｒＡＡＶ結合に及ぼすシアル酸の影響を検討するために、Ｃ２Ｃ１２細胞は先ず血清不含ＤＭＥＭにより洗浄され、次いで、血清不含培地中２００ｍＵ／ｍｌの最終酵素濃度においてＩＩＩ型ノイラミニダーゼ（シアリダーゼ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，カタログ番号Ｎ７８８５）とともに、３７℃で２時間インキュベートされた。次にＣ２Ｃ１２細胞は、ウイルスのインキュベーション前に血清不含ＤＭＥＭにより洗浄された（Ｐｉｋｃｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，２０００；およびＷａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２００１）。
【０１８５】
ｒＡＡＶ形質導入に及ぼすプロテアソームインヒビターの影響を解析するために、指示量のウイルス粒子が血清不含培地においてプロテアソームの存在または不在下でＣ２Ｃ１２細胞に適用された。トリペプチド・プロテアソームインヒビター、Ｎ−Ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−Ｌｅｕｃｙｌ−Ｌ−Ｌｅｕｃｙｌ−Ｎｏｒｌｅｕｃｉｎｅ（ＬＬｎＬ）およびｂｅｎｚｙｌｏｘｙｃａｒｂｏｎｙｌ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ｌ−ｌｅｕｃｉｎａｌ（Ｚ−ＬＬＬ）は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ，ＣＡ）から購入された。感染後１時間目に、最終血清濃度が追加のＦＢＳによって１０％まで増加された。両ウイルスおよびプロテアソームインヒビターが感染後４時間に細胞から除去された。トランスジーン発現は感染後２４時間において定量された。
【０１８６】
Ｃ２Ｃ１２細胞におけるｒＡＡＶ形質導入の解析。 Ｃ２Ｃ１２細胞におけるｒＡＡＶ形質導入の効率が、ＥＧＦＰまたはルシフェラーゼトランスジーンの発現レベルによってモニターされた。ＥＧＦＰ発現は蛍光顕微鏡法によってモニターされ、そしてルシフェラーゼ発現は、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．（２０００）に記述されたプロトコールを用いて測定感度７５％において決定された。Ｃ２Ｃ１２細胞におけるウイルスの結合および持続を評価するために、低分子量ＨｉｒｔＤＮＡがウイルス感染後の指示した時間において回収された。次いで、ＤＮＡサンプルは０．８％アガロースゲルにおいて分離され、そしてＤｕａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９９）記述のようにＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋ナイロン膜上にブロットされた。各列は１個の３５ｍｍプレート細胞培養からのＤＮＡを表す。ウイルスゲノムは、１０６ｃｐｍ／ｍｌにおけるトランスジーン特異的プローブにより検出され、そしてストリンジェンシー０．１ｘＳＳＣ，０．１％ＳＤＳにおいて６０℃２０分間洗浄された。
【０１８７】
Ｃ２Ｃ１２細胞におけるα−２，３−結合シアル酸発現の検出。 Ｃ２Ｃ１２細胞が無菌のポジティブ荷電のガラススライド上に濃度２ｘ１０５細胞／スライドにおいて塗布され、そして分化が前記のように導入された。ＭＡＬ ＩＩレクチン結合アッセイが、血清不含培地において４℃で１０分間、細胞を最初に冷却することによって実施された。次いで、培養物はビオチニル化ＭＡＬ ＩＩ（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ Ｉｎｃ．カタログ番号Ｂ−１２６５）とともに４℃で３０分間インキュベートされた。血清不含ＤＭＥＭによる３回の洗浄後、細胞は、リン酸バッファー生理食塩水（ＰＢＳ）中４％パラホルムアルデヒドにより固定された。固定後、細胞はＨＥＰＥＳバッファーにより洗浄され、次いで、蛍光イソチオシアネート（ＦＩＴＣ）共役アビジンとともに室温で１５分間インキュベートされた。最後に、細胞はＣｉｔｉｆｌｕｏ ａｎｔｉｆａｄｅｎｔを用いて検鏡標本に作製され、そして細胞表面のα−２，３−結合シアル酸の量が間接的蛍光顕微鏡法によって決定された。
【０１８８】
マウス骨格筋におけるｒＡＡＶ形質導入の評価。 Ｓｎｊ／ＳｃＳｎマウスはＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙから購入された。Ｓｎｊマウスは正常なＢＬ１０株である。ＳｃＳｎマウス（ｍｄｘ）はジストロフィン遺伝子のエクソン２３に自然突然変異を有し、そしてマウスのジストロフィンを発現しない（Ｂｕｌｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９８４）。ジストロフィン表現型は成熟マウスにおいてのみ現れるので、６カ月齢のマウスが使用された。前脛骨へのｒＡＡＶの送達はＤｕａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）にしたがって実施された。マウス内の可変性を減少させるために、各マウスの左前脛骨筋が２ｘ１０１０粒子のｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスにより感染され、そして同じマウスの右前脛骨筋が２ｘ１０１０粒子のｒＡＡＶ−２により感染された。ＥＧＦＰ発現は、いずれか新しく分離された筋肉またはパラホルムアルデヒド固定組織からの１５μｍ凍結切片において決定された。ｍｄｘマウス筋肉における病理学的変化を可視化するために、マウスは、組織の採取前５時間に尾静脈を通してＥｖａｎｓブルー染料（１０ｍｇ／ｍｌ）４００μｌを注入された。収縮で誘導される筋肉損傷と染料の拡散を促進するために、マウスは、染料注射後の最初の１時間に、３０分間隔で１０分間２回泳がすことによって運動させた。ルシフェラーゼを発現するｒＡＡＶ−２またはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５の筋肉当たり２ｘ１０１０粒子による感染に続いて、筋肉ルシフェラーゼレベルがＤｕａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）記述のように分析された。
【０１８９】
結果
ＡＡＶ−５キャプシド中のｒＡＡＶ−２ゲノムの包膜は分化したＣ２Ｃ１２細胞では形質導入を増強するが、未分化のＣ２Ｃ１２細胞では増強しない。 Ｃ２Ｃ１２細胞は、マウスのＣ３Ｈ株由来の筋芽細胞であって、収縮性筋管に分化し、そして筋肉特異的タンパク質を生産することができる。未分化のＣ２Ｃ１２細胞では、ｒＡＡＶ−２またはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５の同数のＤＮＡ粒子が感染のために使用された場合、トランスジーン発現における有意な差異は、ＣＭＶ作動のＥＧＦＰベクターを用いて観察されなかった（図２）。しかしながら、分化したＣ２Ｃ１２細胞が同一条件下で感染された場合、ＥＧＦＰ発現における劇的増加が、ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５感染細胞において観察されたが、ｒＡＡＶ−２感染細胞では観察されなかった（図２）。トランスジーン発現における明らかな増加にもかかわらず、ＥＧＦＰポジティブ細胞のパーセンテージの定量は、細胞当たりに基づくトランスジーン発現における平均的増加に関して定量的情報をほとんどもたらさなかった。
【０１９０】
ｒＡＡＶ形質導入の時間経過をさらに特徴づけ、そしてプロモーターおよび／またはトランスジーン関連の人為的結果を排除するために、研究は、ＲＳＶプロモーター作動のルシフェラーゼを含有するベクターを用いて繰り返された。ルシフェラーゼレポーター遺伝子の使用は、また、より感受性の定量的分析を可能にした。図３に見られるように、低レベルの形質導入が、未分化の筋芽細胞において両ｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスについて観察された。ＣＭＶ−ＥＧＦＰベクターを用いる知見と一致して、ｒＡＡＶ−２に媒介されるルシフェラーゼ発現は、分化したＣ２Ｃ１２細胞において大きさの次数を落とした。これに対して、ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスからのトランスジーン発現は、十分分化した筋管において有意に増強され、感染後７２時間において未分化の細胞に較べてルシフェラーゼ活性において５００倍を超える増大を有した（図３Ｂ）。これらの知見は、プソイドタイプｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスが、イン・ビボにおける有糸分裂後の筋原繊維への遺伝子送達のためのより有効なベクターであると証明できることを示唆した。
【０１９１】
ウイルスの結合における差異は、ｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスによるＣ２Ｃ１２細胞形質導入における不一致を説明できない。 次に、分化したＣ２Ｃ１２細胞において見られる異なる形質導入プロフィルが、変化したキャプシド構造によって予測できるようなウイルスの結合における差異によるものであるか否かが決定された。また、従来の研究は、ウイルスのエンドサイトーシスがまたｒＡＡＶベクターからのトランスジーン発現に影響することを示唆した（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．１９９９；およびＷａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ウイルスの結合効率を比較するために、Ｃ２Ｃ１２細胞（未分化または分化）が、ｒＡＡＶ−２またはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスとともに４℃で６０分間インキュベートされた。低分子量ＨｉｒｔＤＮＡが、細胞外の結合ウイルスを除去するためにＰＢＳ洗浄またはトリプシン消化後に感染細胞から回収された。細胞表面への全体のウイルスの結合はＨｉｒｔＤＮＡのサザンブロッティングによって決定された（図４）。驚くべきことに、低い形質導入を与えたＡＡＶ−２キャプシドは、両未分化および分化Ｃ２Ｃ１２細胞においてＡＡＶ−５キャプシドよりも高い結合効率を媒介した（図４、列６および１２）。さらにまた、表面結合ｒＡＡＶ−２はトリプシンによって容易に除去された（図４、列５および１１）。大きく対照的に、同じ感染条件下でｒＡＡＶ−２に比較した場合、細胞の分化状態にかかわりなく、より低いレベルのｒＡＡＶ−２ｃａｐ５プソイドタイプウイルスが細胞表面に結合した。このデータは、ウイルスの結合ではなく、エンドサイトーシスのメカニズムおよび／または細胞内プロセッシングにおける差異が、プソイドタイプウイルスを用いて見られた高いレベルの形質導入に関与しているに違いないことを示唆した。
【０１９２】
ｒＡＡＶ−２とｒＡＡＶ−２ｃａｐ５間の細胞内プロセッシングにおける大きな差異をさらに精査するために、それらの形質導入プロフィルが、プロテアソームインヒビターによる処理後に比較された。トリペプチド・プロテアソームインヒビターは、近年、分極した気道細胞において持続的なｒＡＡＶ−２形質導入を増強することが示された。この誘導は、ウイルスのユビキチン化、エンドソームのプロセッシングおよび核移送のようなウイルスのエンドサイトーシスのいくつかの態様における変化を伴う（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００ｂ）。したがって、プロテアソームインヒビターへの応答は、ＡＡＶがエンドソームのコンパートメントを通してプロセスされる分子メカニズムを間接的に反映するであろう。完全に分化したＣ２Ｃ１２細胞が、６００粒子／細胞のｍｏｉにおいていずれかｒＡＡＶ−２またはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５により感染された（図５）。いずれか４０μＭＬＬｎＬまたは４μＭＺ−ＬＬＬの存在下で、ｒＡＡＶ−２形質導入は、それぞれ６または１０倍増強された。興味あることに、ＬＬｎＬまたはＺ−ＬＬＬの適用は、ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５感染細胞でのトランスジーン発現において有意な減少をもたらした。このデータは、ｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５が、分化したＣ２Ｃ１２細胞におけるエンドサイトーシス後に別の細胞内経路に従うことを示唆した。
【０１９３】
また、サザンブロット分析は、ＡＡＶ−５キャプシド結合のその他の興味ある様相を明らかにした。トリプシン処理が最初に使用されて、ウイルス粒子が、４℃のインキュベーションの間にインターナリゼーションされないことを確認した（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９；およびＤｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００ｂ）。２つの仮説がこの研究において作られた。第１には、原形質膜が不活性化され、そして４℃では活性なエンドサイトーシスを欠如する。第２に、厳しいトリプシン処理（０．５％トリプシン）がすべての表面結合ウイルス粒子を除去するであろう。これは、多数の異なる細胞タイプ、例えばＨｅＬａ細胞（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）、一次培養のヒト気道上皮細胞（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００ｂ）およびＣ２Ｃ１２細胞におけるｒＡＡＶ−２ウイルスの場合事実であった（図４）。予期せぬことに、有意な量のトリプシン耐性ウイルスＤＮＡが、ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルス感染Ｃ２Ｃ１２細胞において検出された。このデータは、いずれか非常に効率的および／または迅速なＡＡＶ−５キャプシドのインターナリゼーションが起きたか、あるいはＡＡＶ−５キャプシドとそのレセプターとの間の相互作用が、非常に高い親和力を有し、そして／または比較的トリプシン非感受性であるかを示唆した。
【０１９４】
分化したＣ２Ｃ１２細胞におけるｒＡＡＶ−２ｃａｐ５プソイドタイプウイルスの増進した形質導入は増進したウイルス結合と相関する。 ４℃におけるウイルス結合研究から得られた情報は、また、Ｃ２Ｃ１２細胞の分化がｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスによる形質導入において有意な増進をもたらす理由に対して光を放った。増進したトランスジーン発現と合致して、ウイルス結合における８倍の増進は、未分化の細胞に比較されるように分化した細胞におけるｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスについて観察された（図４における列９および３を比較せよ）。しかしながら、増進した結合の大きさは、分化した細胞におけるトランスジーン発現の増進よりも約２次数低い大きさであった（図３）。またこれらの知見は、ＡＡＶ−５キャプシドの増強したウイルス結合が、分化した筋管において見られた増進した形質導入効率を完全には説明できないことを示唆した。
【０１９５】
近年、２，３−結合シアル酸がｒＡＡＶ−５の細胞レセプターとして同定され、またはそのレセプター複合体の必須成分である（Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０００）。マアキア・アムレンシス（Ｍａａｃｋｉａ ａｍｕｒｅｎｓｉｓ）レクチンＩＩ（ＭＡＬ ＩＩ）は、α−２，３−結合シアル酸に優先的に結合し、したがって、このシアル酸型の量を調査するために使用することができる。分化したＣ２Ｃ１２細胞におけるｒＡＡＶ−２ｃａｐ５プソイドタイプウイルスの増強した結合をさらに特徴づけるために、両未分化および分化細胞におけるＭＡＬ ＩＩ結合パターンが試験された。ウイルスの結合プロフィルと一致して、α−２，３−結合シアル酸の細胞表面発現は、増強したＭＡＬ ＩＩ結合によって示されるように、分化した細胞において有意に上方制御された（図６）。
【０１９６】
シアル酸とＡＡＶ−５キャプシドタンパク質間の相互作用をさらに解析するために、Ｃ２Ｃ１２細胞が、ＩＩＩ型ＮＡシアリダーゼにより前処理された。図６に示されるように、シアリダーゼ処理はＣ２Ｃ１２細胞へのＡＡＶ−５キャプシドの結合を完全に失わせた（図７、列１および７）。しかしながら、同一処理はこれらの細胞におけるＡＡＶ−２キャプシド結合にはほとんど効果をもたなかった（図７、列４および１０）。対照として、ウイルス結合における遊離ヘパリンの効果がまた評価された。硫酸ヘパリンプロテオグリカン（ＨＳＰＧ）は、ＡＡＶ−２ウイルスの主たる接着レセプターとして報告されている（Ｓｕｍｍｅｒｆｏｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。ＨＳＰＧはまた、単純ヘルペスウイルスおよびヒト免疫不全ウイルスを含む多くの他のウイルスの最初の結合に関与している（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。他の報告と一致して、遊離ヘパリンによる前処理は、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるＡＡＶ−２キャプシド結合を劇的に低下させた。
【０１９７】
血清型特異的キャプシドの侵入経路は感染後のウイルスゲノムの安定性に影響する。 先に議論したように、異なるキャプシドレセプターを通して侵入した後のウイルスの細胞内プロセッシングにおける差異は、完全に分化したＣ２Ｃ１２細胞におけるｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５プソイドタイプウイルスの異なった形質導入プロフィルを説明できる決定的因子であると思われる。このプロセスをさらに特徴づけるために、これら２種の組み換えベクターを有するウイルスゲノムの持続性の動態が解析された（図８）。この解析にとって重要なことは、２種の組み換えウイルスがそれらのキャプシド構造のみによって異なり、そして同一のウイルスゲノムを有するという事実である。分化したＣ２Ｃ１２細胞は、いずれかｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５により同じ粒子ｍｏｉにおいて４℃で９０分間感染された。ＨｉｒｔＤＮＡは、いずれか感染直後に４℃において、または３７℃にシフト後２４および４８時間において調製された。図４および図７において示された知見と一致して、ｒＡＡＶ−２ウイルスは、４℃で９０分のインキュベーションの間に、より効率的に分化したＣ２Ｃ１２細胞に接着した。しかしながら、３７℃において感染後４８時間には、ＡＡＶ−２キャプシドによって送達された一本鎖ウイルスゲノムの細胞内レベルは、ほとんど検出不能なレベルまで落ちた。興味あることに、ＡＡＶ−５キャプシドによって導入されたウイルスゲノムは、有意に比較的安定であった。プソイドタイプウイルスとｒＡＡＶ−２との間の唯一の相違はウイルスキャプシドであったので、取り込まれたＡＡＶ−２とＡＡＶ−５ウイルスのキャプシドをコードしたゲノムをプロセッシングする異なる経路が、ウイルスゲノムの持続性に影響するという仮説が立てられた。しかしながら、また、１．６ｋｂの一本鎖ウイルスゲノムがトランスジーン発現には直接には関与していないということも強調されるべきである。それにもかかわらず、これらのゲノムは、トランスジーンの発現可能形態へのゲノム変換のための前駆体であり、それ故に、一本鎖ＤＮＡウイルスゲノムの安定性は、ウイルスがコードされたトランスジーンを最終的に発現できる程度までには影響されるようである。
【０１９８】
ＡＡＶ−５キャプシドは正常および異栄養の筋肉の増進した形質導入を媒介する。 イン・ビトロの知見をさらに拡大するために、マウス骨格筋にける両プソイドタイプｒＡＡＶ−２ｃａｐ５および生来のｒＡＡＶ−２の形質導入効率が試験された。２組の実験が、いずれかＣＭＶ−ＥＧＦＰまたはＲＳＶ−ｌｕｓｉｆｅｒａｓｅ発現カセットを保持するウイルスを用いて実施された。トランスジーンの発現は、感染後１週および１月目に評価された。Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）の結果と一致して、ｒＡＡＶ−２媒介のＥＧＦＰ発現は、正常な筋肉では感染後１週目にはわずかに検出可能であった（図９Ａ）。明らかに対照的に、感染後１週目には、有意に高いレベルのＥＧＦＰ発現がｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスにより感染した正常な筋肉において検出された（図９Ｅ）。また、感染後１月目のトランスジーン発現の評価は、ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５により感染した正常な筋肉では、ｒＡＡＶ−２に較べてはるかに高いＥＧＦＰ発現を例証した（図９Ｇおよび９Ｃ）。
【０１９９】
従来の報告は、異栄養筋肉におけるｒＡＡＶ−２形質導入が疾病経過により有意に低下されることを示唆しており（Ｃｏｒｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）、それ故、プソイドタイプｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスは、罹患ｍｄｘ骨格筋において若干レベルの増進した形質導入を与えているであろう。正常な筋肉において見られるように、ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５感染は、生来のｒＡＡＶ−２ウイルスの感染に較べた場合、ｍｄｘ筋肉において有意に高いレベルの形質導入を与えた（図９Ｆおよび９Ｈ）。しかしながら、ｒＡＡＶに媒介されるＥＧＦＰのレベルは、正常な対照同腹児に較べて、いずれかｒＡＡＶ−２ｃａｐ５またはｒＡＡＶ−２ウイルスにより感染されたｍｄｘマウスにおいて有意に低下された（図９Ａ−Ｈ）。
【０２００】
異栄養筋肉におけるＥＧＦＰ発現がまた感染後６カ月に試験された。１週目および１月目の知見と一致して、顕著なＥＧＦＰ発現がｒＡＡＶ−２ｃａｐ５感染の筋肉サンプルにおいてのみ見い出された（図９Ｉ−Ｎ）。ごくわずかのＥＧＦＰポジティブな筋原繊維がｒＡＡＶ−２感染筋肉において検出された。さらにまた、各々個々の筋原繊維におけるＥＧＦＰ発現の強さは、ｒＡＡＶ−２感染群でははるかに低かった。興味あることに。Ｅｖａｎｓブルーポジティブな、損傷筋原繊維は、ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５によっては非損傷のＥｖａｎｓブルーネガティブな筋原繊維と同等の効率において形質導入されるようであった（図９Ｉ、９Ｋ，９Ｍおよび９Ｎ）。
【０２０１】
正常および異栄養筋肉における形質導入プロフィルのより定量的な理解を得るための努力において、より感受性のＲＳＶ−ｌｕｓｉｆｅｒａｓｅ発現カセットを担持するウイルスが使用された。図１０において例証されるように、ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスの感染は、生来のｒＡＡＶ−２ウイルスに比較した場合、感染後１週目および１月目にルシフェラーゼ発現において２００倍以上の増強をもたらした。驚くべきことに、類似の増強プロフィルは両正常および異栄養筋肉においても達成された。レポーター遺伝子および／または検出に使用される方法のいくつかの態様が、ＥＧＦＰおよび／またはルシフェラーゼレポーターの異栄養筋肉発現における不一致に潜在的に影響した。これらは、罹患筋原繊維の設定におけるトランスジーン産物の半減期、免疫原性、およびトランスジーン発現アッセイの感度（検出のための最小閾値および最大飽和レベル）を含む。ルシフェラーゼはプロテアーゼ分解に対して非常に感受性であって、トランスフェクションされた哺乳動物細胞では、その半減期は約３時間である（Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。これに対して、ＧＦＰは極端に安定であり、そしてより長い半減期を有する（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８２）。したがって、レポータータンパク質の分解における疾病に誘導される変化はこれらの観察を説明できるとは考えられない。従来の研究は、トランスジーンにコードされているタンパク質の免疫原性が免疫応答能のあるマウスにおけるトランスジーン発現の安定性について重要な決定因子であることを示唆している（Ｔｒｉｐａｔｈｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。それ故、Ｄｕｃｈｅｎｎｅの筋ジストロフィーの設定において、ＥＧＦＰがルシフェラーゼよりも強い免疫原性があるということは納得できる。ＥＧＦＰおよびルシフェラーゼの免疫原性に関するこれらの可能性のある結末にもかかわらず、本データは、ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５プソイドタイプウイルスが両正常およびｍｄｘ骨格筋の形質導入においてはるかに強く有効（＞２００倍）であったことを明確に例証した。両生来のｒＡＡＶ−２およびプソイドタイプｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスにおけるウイルスゲノムの同一性にもかかわらず、これらの知見は、増進した形質導入についての唯一の決定因子として筋原繊維とＡＡＶ５型キャプシドとの相互作用を暗示している。
【０２０２】
検討
この研究では、２種の異なるウイルスキャプシドによって送達される同一のｒＡＡＶ−２ゲノムの形質導入効率が試験された。このキャプシド改変戦略は、ｒＡＡＶ−２を用いてほとんど形質導入できないある種の細胞について、いずれか標的とされる発現を導くため、または形質導入効率を改良するために多数の研究者によって広く使用されてきた（Ｇｉｒｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９；およびＷｕ ｅｔ ａｌ．，２０００）。この研究の原理は、ｒＡＡＶ−５がある種の細胞タイプにおいてｒＡＡＶに媒介される遺伝子伝達を有意に増強できるという近年の知見に基づいた（Ｄａｖｉｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００；およびＺａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）。両ウイルスＩＴＲおよびキャプシドタンパク質についての相同性は、ＡＡＶ−２とＡＡＶ−５との間で６０％だけであるので、いずれかウイルスゲノムまたはキャプシド構造が、ｒＡＡＶ−５により改善された形質導入効率に関与できることは考えられることである。ウイルスキャプシド単独の機能的寄与をより良く理解するために、ｒＡＡＶ−２ゲノムがＡＡＶ−５キャプシドにパッケージされたハイブリッドウイルス系が利用された。このプソイドタイプウイルスは、形質導入効率におけるウイルスゲノムのいかなる寄与も比較的排除するであろう。両分化した細胞におけるイン・ビトロの研究およびマウス骨格筋におけるイン・ビボのデータとも、プソイドタイプウイルスが、トランスジーン発現の媒介において生来のｒＡＡＶ−２ウイルスよりも有意に有効であることを示した。
【０２０３】
１つの予期せぬ発見は、ｒＡＡＶの形質導入効率が、Ｃ２Ｃ１２細胞における細胞の分化状態によって有意に影響されたことであった。さらにまた、分化の影響は、解析されたｒＡＡＶの２種の血清型について反対の効果を有した。ｒＡＡＶ−２感染の場合には、Ｃ２Ｃ１２細胞の分化はウイルスの形質導入を１０倍低下させた。これに対して、分化は、プソイドタイプｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスによりトランスジーン発現を５００倍以上増進した。筋芽細胞の収縮性筋管への分化は、多くの細胞因子の整合のとれた発現を必要とする。生長因子が欠乏している場合（Ｃ２Ｃ１２細胞の分化を誘導するための場合のように）、増殖しつつある筋細胞は最終分化段階に入り、そして種々の分化因子（例えばミオゲニン、ｐ２１／ＷＡＦ１）および収縮性タンパク質（例えばミオシンおよびトロポニン）の発現を開始する（Ｗａｌｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９６７）。どの因子がプソイドタイプウイルスによる分化した細胞の増強した形質導入に直接結びつけられるのかは、現在、明らかではない。しかしながら、本明細書に記述されるデータは、細胞表面のレクチン発現における分化に関係する変化が、プソイドタイプウイルスの感染後、ウイルスのＡＡＶ−５キャプシドの筋管への結合を増進することに寄与することを示唆している。それにもかかわらず、細胞表面へのｒＡＡＶの結合は、ｒＡＡＶ−２とｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスとの間の形質導入効率における差異の主たる決定因子であるとは思われない。筋細胞へのｒＡＡＶ−２ｃａｐ５の全体の接着はｒＡＡＶ−２についてよりも弱かった。さらにまた、ｒＡＡＶ−２とは違って、プソイドタイプｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスによる分化した筋管の形質導入はプロテアーゼインヒビターによってネガティブに制御された。かくして、筋管の細胞内特性における分化に誘導される変化は、ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５による比較的高レベルの形質導入に寄与するより重要な因子であるかもしれない。例えば、筋肉分化は、侵入するプソイドタイプビリオンの細胞内プロセッシングおよび／または脱外被を増強できる。あるいはまた、細胞の分化は、ＡＡＶ−２キャプシドにパッケージされたビリオンの細胞内の移動に悪い影響を与え、そしてより低い形質導入をもたらすであろう。さらにまた、分化はＡＡＶ−５のインターナリゼーションの速度を変えるが膜におけるｒＡＡＶ−２レセプターを変えないであろう。
【０２０４】
ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスに対してｒＡＡＶ−２を比較するイン・ビボ解析からの結果は、また全く興味あるものであった。数種の以前の報告は、ｒＡＡＶ−２が異栄養骨格筋を効率的に形質導入し、そして高レベルの、種々のサルコグリカンおよびミクロジストロフィンを含む治療的タンパク質を生産することを示唆した（Ｃｏｒｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｇｒｅｅｌｉｓｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９；およびＷａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０００）。しかしながら、また近年の研究は、トランスジーンが遍在性のウイルスプロモーターによって作動される場合には、ｒＡＡＶ−２に媒介されるトランスジーン発現が、異栄養筋肉において有意に低下されることを示唆している（Ｃｏｒｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）。これは、抗原提示細胞における異所性トランスジーン発現と、続くトランスジーン発現細胞の免疫クリアランスによるものとされた。ｒＡＡＶに媒介されるＲＳＶ−ｌｕｃｉｆｅｒａｓｅ遺伝子送達を評価している本明細書に記述の研究は、正常筋肉とｍｄｘ筋肉間で遺伝子発現においてほとんど差異がないことを例証した。しかしながら、ｍｄｘマウスにおいてｒＡＡＶ媒介のＥＧＦＰ発現を評価する結果は、ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５プソイドタイプウイルスによる感染後に高レベルの形質導入が観察された（図８Ｉ−Ｎ）。ｒＡＡＶ−２と比較して、ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５媒介のＥＧＦＰ遺伝子発現が正常筋肉におけるよりもｍｄｘにおいて低かったけれども、ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスによるトランスジーン発現においては疾病に伴う影響はより低いと考えられた。異なるキャプシド構造がＡＡＶ−２とＡＡＶ−５の類似しない細胞の屈性を決定する（Ｄａｖｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，２０００およびＺａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２０００）ので、ｒＡＡＶ−２とｒＡＡＶ−２ｃａｐ５のＥＧＦＰ発現に及ぼす疾病に伴う影響の差異は、ＡＡＶ−５感染に対する樹状細胞の低下した感受性によって説明されるであろう。
【０２０５】
近年の研究は、ｒＡＡＶ−２が、アデノウイルス、レトロウイルスおよびヘルペスウイルスを含む他のウイルスよる筋肉遺伝子伝達の成熟依存性バリヤーを回避できることを示唆した（Ｐｒｕｃｈｎｉｃ ｅｔ ａｌ．，２０００）。筋原繊維の成熟および筋芽細胞の分化は別の生物学的プロセスを表すので、ＡＡＶ−５キャプシドがこのバリヤーの克服において付加的利点を提供できるか否かを決定することが残されている。また、ｒＡＡＶ−２がＩ型遅筋原繊維を優先的に形質導入し、そしてこの傾向が、ｒＡＡＶ−２レセプターヘパラン硫酸プロテオグリカンの過剰発現に関連していることが示唆された。ＡＡＶ−５キャプシド感染についての潜在性筋原繊維サブタイプ選択のさらなる試験は、ＡＡＶ−５プソイドタイプが分化した筋肉における形質導入を増進する理由へのさらなる機械論的洞察の蓋を開けるかもしれない。
【０２０６】
要約すれば、これらの研究は、ＡＡＶ−２とＡＡＶ−５キャプシド間の生物学的差異および筋細胞における細胞−ベクター相互作用へのそれらの影響に光を当てた。これらの２種のベクター間におけるウイルス感染プロセスの生物学の差異は、分化した筋原繊維中にトランスジーンを送達するためのそれらの効率に有意に影響を与える。興味あることには、骨格筋は、気道のような他の組織において見られるｒＡＡＶ−２感染に対する多くのバリヤーを欠いていると慣例的に考えられてきた。しかしながら、ｒＡＡＶ−２とｒＡＡＶ−２ｃａｐ５間の比較研究は、筋肉が、遺伝子治療ベクターとしてのその完全な利用を限定するエンドサイトーシスおよび／または細胞内プロセッシングを伴うｒＡＡＶ−２感染に対する類似のバリヤーをまた有するかもしれないことを示唆する。これに関して、これらの研究からの主要な教訓は、ウイルス結合の効率は、形質導入効率と常に直接相関するとは限らないことである。このことは、ｒＡＡＶベクターのエンドサイトーシスにおける報告された補助受容体の影響があれば、必ずしも驚くべきことではない。筋芽細胞の分化によって誘導される表現型の差異を評価する研究は、ＡＡＶエンドサイトーシスおよび／または細胞内プロセッシングの効率を制御する細胞因子に対して、より多くの光を放ち始めているであろう。
【実施例２】
【０２０７】
アデノ随伴ウイルス２および５型双方は、数種の細胞系において形質導入効率に影響を及ぼすユビキチン化の基質である
ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５の形質導入に対するプロテオソーム阻害剤の影響を、トランスジーン発現を使用して比較した。ＡＡＶ−５ ＩＴＲはＡＡＶ−２ ＩＴＲとわずか５８％相同であり（Ｃｈｉｏｒｉｎｉｎら、１９９９）、そして、ウイルストラフィッキングおよびＤＮＡ鎖変換の機構がこれら２つの型の組換えＡＡＶ間で異なる可能性があることが可能である。トランスジーン発現に対するＡＡＶ ＩＴＲの可能な影響を排除するために、同一のＡＡＶ−２トランスジーン構築物をＡＡＶ−２もしくはＡＡＶ−５いずれかのキャプシド中にパッケージした。ネイティブ（ｎａｔｉｖｅ）ｒＡＡＶ−２ウイルスおよびＡＡＶ−５シュードタイプ（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅｄ）ウイルスについてのトランスジーン発現アッセイは、同一の感染条件下でのこれら２種の異なる血清型の形質導入効率の直接の評価および比較を助長した。
材料および方法
シュードタイピングのためのヘルパープラスミドのクローニング。単離された野性型ＡＡＶ−５ウイルスＤＮＡは、９５℃で５分間加熱すること、次いで一夜６０℃への緩徐な冷却によりアニーリングした。ＰＣＲのアプローチは、唯一の制限酵素部位をもつ２種のＰＣＲ産物を再集成することにより、完全長のＡＡＶ−５コーディング領域のクローニングを可能にした。ＡＡＶ−５ Ｒｅｐのためのプライマーの組は：順：５’−ｇｃｔｃｔａｇａＧＡＴＧＴＡＡＴＧＣＴＴＡＴＴＧＴＣＡＣＧＣＧＡ−３’（配列番号１）；逆：５’−ｃｃｃａａｇｃｔｔＧＡＴＴＧＧＧＴＴＴＴＧＧＴＴＴＣＧＧＴＧＧＧＣ−３’（配列番号２）であった。ＡＡＶ−５ Ｃａｐのためのプライマーは：順：５’ｔｇｃａｃｔｇｃａｇＧＣＧＡＧＴＡＧＴＣＡＴＧＴＣＴＴＴＴＧＴＴ ＧＡＴＣＡＣＣＣ−３’（配列番号３）逆：５’−ｃｃｃａａｇｃｔｔｃｇｔｃｔａｇａＧＡＣＣＡＣＡＡＧＡＧＧＣＡＧＴＡＴＴＴＴＡＣＴＧＡＣ−３’（配列番号４）であった。ＡＡＶ遺伝子成分に対する相同配列は大文字の塩基で提示し、また、小文字の塩基はクローニング制限部位（下線を付けられる）へのオーバーハングを表す。
【０２０８】
２．１ｋｂのＡＡＶ−５ Ｒｅｐおよび２．３ｋｂのＣａｐコーディング領域を個別に増幅し、そして、各フラグメントをｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫＩＩにサブクローニングした。各フラグメントの重ね合わせられた領域中の唯一のＢｃｌＩ部位を用い、２種のＡＡＶ−５フラグメントを連結して、いずれの端にもＩＴＲ構造を伴わない４．３ｋｂのＡＡＶ−５ゲノムを生成させた。ＡＡＶ−５のパッケージングのためのヘルパープラスミド（ｐＡＶ５−Ｔｒａｎｓ）は、ＡＡＶ−２パッケージングヘルパープラスミド（ｐＡＡＶ−２／Ａｄ）（Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８９）中のＡＡＶ−２配列を４．３ｋｂの完全長のＡＡＶ−５コーディングフラグメントで置き換えることにより生成させた。ＡＡＶ−２ Ｒｅｐ配列のみをもつ第二のヘルパープラスミド（ｐＡＶ２−Ｒｅｐ）は、ｐＡＡＶ−２／ＡｄのＡＡＶ−２ Ｃａｐコーディング領域中の１．１ｋｂのＡｐａＩフラグメントを欠失させることにより生成させた。ＡＡＶ−２キャプシドが生成されなかったことを確認するために、ｐＡｖ２Ｒｅｐでトランスフェクトされた、Ａｄ５．ＣＭＶｌａｃＺに感染させた２９３細胞のライセートのウェスタンブロッティングを実施した。
【０２０９】
ｒＡＡＶストックの生成。ネイティブｒＡＡＶ−２ウイルス（ｒＡＡＶ−２ＲＳＶｌｕｃ）およびｒＡＡＶ−５シュードタイプウイルス（ｒＡＡＶ−２−ｃａｐ５ＲＳＶｌｕｃ）のストックは、Ｄｕａｎら（２００１ａ）に記述されたプラスミドｐｃｉｓＡＶ２ＲＳＶｌｕｃを用いて生成させた。このｒＡＡＶ−２プロウイルスプラスミドは、ｐＳｕｂ２０１からの２個のＡＡＶ−２ ＩＴＲで隣接される、ＲＳＶ ＬＴＲプロモーターが駆動するルシフェラーゼ遺伝子をコードする。慣例のＣａＰＯ４コトランスフェクションプロトコルを使用して、Ａｄ５．ＣＭＶｌａｃＺに共感染させた２９３細胞からｒＡＡＶを産生させた。ネイティブｒＡＡＶ−２ウイルスを産生させるため、該コトランスフェクションプロトコルは、１：３の比でｐＡＡＶ−２／Ａｄを含むプロウイルスプラスミドｐｃｉｓＡＶ２ＲＳＶｌｕｃを包含した。ｒＡＡＶ−２−ｃａｐ５シュードタイプウイルスは、アデノウイルスに感染させた２９３細胞に同一のｒＡＡＶ−２構築物ｐｃｉｓＡＶ２ＲＳＶｌｕｃを１：１：３の比でｐＡＶ２−ＲｅｐおよびｐＴｒａｎｓ−ＡＶ５と一緒にトランスフェクトすることにより生成させた。細胞をトランスフェクション４０時間後に収集し、そして、凍結融解すること、ＤＮアーゼＩ消化、およびデオキシコール酸処理によりウイルス粒子を放出させた。双方のウイルスストックは、同一のＣｓＣｌ２超遠心手順を使用して精製した。
【０２１０】
３回のＣｓＣｌ２バンド形成（ｂａｎｄｉｎｇ）後に、１．３６ないし約１．４２ｇ／ｃｍ３の画分を収集した。いかなる可能な残存するアデノウイルス汚染も不活性化するために、ＡＡＶ画分を６０℃で１時間加熱した。ＣｓＣｌ２を除去するための４℃で２日間のＨｅｐｅｓ緩衝生理的食塩水に対する透析後に、ウイルスストックをスロットブロットにより定量し、そしてトランスジーン発現を培養細胞で試験した。野性型ＡＡＶ−２での汚染を測定し、そして１×１０１０ｒＡＡＶ−２粒子あたり１個未満の機能的粒子であることが見出された。野性型ＡＡＶ−２／５ハイブリッド汚染を、ＲｅｐおよびＣａｐ遺伝子についてのネステッドＰＣＲにより評価した。野性型ハイブリッドウイルスの１個未満の粒子が、１×１０１０シュードタイプウイルス粒子中で検出された（実施例１を参照されたい）。ヘルパーアデノウイルスＡｄ５．ＣＭＶｌａｃＺでの汚染は、β−ガラクトシダーゼ活性についての組織化学的染色により評価した。典型的には、ヘルパーウイルス汚染は、１０１０ＤＮＡ粒子中で１個未満である。
【０２１１】
インビトロでの細胞の形質導入。ＨｅＬａ、２９３およびＩＢ３細胞、ならびに初代胎児線維芽細胞を、１０％ウシ胎児血清およびペニシリン（１００Ｕ／ｍｌ）−ストレプトマイシン（１００μｇ／ｍｌ）を補充されたダルベッコの改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で単層として培養し、そして５％ＣＯ２の３７℃のインキュベーター中で維持した。未分化Ｃ２Ｃ１２筋細胞系を該条件で同様に培養したが、しかしながら細胞にＦＢＳよりむしろウマ血清を供給することにより分化を誘導した。典型的には、Ｃ２Ｃ１２細胞の十分に分化した培養物は１０％ウマ血清の添加後５〜７日までに発生し、その時点でそれらを実験に使用した（実施例１；Ｙａｆｆｅら、１９７７）。全部の他の細胞系は、６穴（１×１０６／ウェル）もしくは１２穴（５×１０５／ウェル）プレートに接種し、そして１８時間付着させた。感染１時間前に、細胞にプロテオソーム阻害剤を含むもしくは含まない新鮮培地を再供給した。トリペプチジルアルデヒドプロテオソーム阻害剤Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−ノルロイシン（ＬＬｎＬもしくはＭＧ１１０）はボストン バイオケム（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ）（マサチューセッツ州ボストン）から購入し、そして、カルボベンゾキシ−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシナール（ＺＬＬ、Ｚ−ＬＬＬもしくはＭＧ１３２ともまた称される）はカルビオケム−ノヴァビオケン（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｎ）（カリフォルニア州ラホヤ）からであった。これらの阻害剤は、４０ｍＭのＬＬｎＬおよび４ｍＭのＺＬＬを含む１０００ｘストック溶液としてＤＭＳＯに溶解し、そして−２０℃で保存した。ウイルス感染は血清を含まないＤＭＥＭ中で実施し、そして感染後２時間に等量のＤＭＥＭ−２０％ＦＢＳを添加して最終血清濃度を１０％にした。プロテオソーム阻害剤を伴う感染の場合には、典型的な最終濃度は４０μＭ ＬＬｎＬおよび４μＭ ＺＬＬであった。化学物質は培地で希釈し、また、処理は１時間の感染前インキュベーションを伴って実施し、かつ、２４時間の感染の間、培地中の存在を継続した。
【０２１２】
形質導入分析。トランスジーン発現の分析のため、感染させた細胞中のルシフェラーゼ活性を、感染２４時間後にプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からのアッセイキットを用いて測定した。細胞を１２穴プレートの各ウェル中で２００μｌの溶解緩衝液で溶解した。細胞膜および破片は１０，０００×ｇで１分間の微小遠心分離によりペレットにした。上清を、アッセイマニュアルに記述されている手順に従ってルシフェラーゼ基質と反応させた。ルミノメーター（ＴＤ−２０／２０、ターナー デザインズ インストゥルメント（Ｔｕｒｎｅｒ Ｄｅｓｉｇｎｓ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）、カリフォルニア州サニーベール）は７０％の感度でルシフェラーゼ活性を測定した。ウイルスＤＮＡアッセイのために、Ｙａｎら（２０００）に以前に記述されたところの改変を伴うＨｉｒｔの手順に従って、低分子量ＤＮＡを抽出した。２×１０６個の感染させた細胞からのＨｉｒｔ ＤＮＡを５０μｌのＴＥに溶解し、そして半分を１％アガロースゲル上で分離した。ウイルスＤＮＡのサザンブロットを、ランダムプライミングによりα−Ｐ３２−ｄＣＴＰで標識されたルシフェラーゼフラグメントプローブとハイブリダイズさせた。
【０２１３】
ユビキチン化されたＡＡＶキャプシドの免疫沈降。プロテオソーム阻害剤で処理されたＨｅｌａ細胞中のＡＡＶユビキチン化の検出は、改変を伴いＤｕａｎら（２０００）に記述されたとおり実施した。２×１０６個のＨｅｌａ細胞を、血清を含まないＤＭＥＭ中でｒＡＡＶ−２ＲＳＶｌｕｃもしくはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ＲＳＶｌｕｃの２×１０９ＤＮＡ粒子に感染させた。感染は４０μＭのＬＬｎＬの存在を伴いもしくは伴わずに同時に実施した。感染４時間後に、細胞を０．８ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液中で溶解した。細胞ライセートを１０μｌのプロテインＧ プラス−アガロース（ＰｒｏｔｅｉｎＧ ＰＬＵＳ−Ａｇａｒｏｓｅ）（サンタ クルズ バイオテック（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ））で前澄明化し（ｐｒｅ−ｃｌｅａｒｅｄ）、そしてその後、１０μｌのマウス抗ＶＰ１−３モノクローナル抗体（クローンＢ１、アメリカン リサーチ プロダクツ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））とともに４℃で１時間インキュベートし、次いで３０μｌのプロテイン Ｇ プラス−アガロース（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｇ ＰＬＵＳ−Ａｇａｒｏｓｅ）を添加した。４℃で一夜インキュベーション後に、ビーズを１ｍｌの氷冷ＲＩＰＡ緩衝液で４回洗浄し、そして１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。ニトロセルロースフィルターへの転写後に、ブロットを２００倍希釈の抗ユビキチンモノクローナル抗体（クローンＰ４Ｄ１、サンタ クルズ バイオテック（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈ））、次いで２０００倍のワサビペルオキシダーゼ結合二次抗体でプロービングした。最終洗浄後に、ユビキチン化されたウイルスタンパク質をＥＣＬ系（アマーシャム ファルマシア（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ））で可視化した。
【０２１４】
ＡＡＶ粒子のインビトロユビキチン化。インビトロユビキチン化アッセイに使用された全試薬は、ボストン バイオケム インク（Ｂｏｓｔｏｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ，Ｉｎｃ．）（マサチューセッツ州ボストン）から購入した。ユビキチン−タンパク質結合キット（カタログ番号Ｋ９６０）は、ＡＴＰ含有エネルギー緩衝液、ユビキチン基質溶液、およびＨｅＬａ細胞の細胞質抽出物画分ＩＩからの精製された結合酵素（Ｅ１、Ｅ２およびＥ３）よりなる。加えて、全部の潜在的Ｅ２およびＥ３がこの抽出物中に存在するわけでないため、それらの陰イオン交換結合の特徴により画分ＩＩ抽出物と識別される画分Ｉ抽出物（カタログ番号Ｆ−３７５）を、ユビキチン化反応に補充することができる。ＨｅＬａ細胞の画分Ｉは、画分ＩＩ抽出物で表されない付加的なＥ２およびＥ３を提供する（Ｈｅｒｓｈｋｏら、１９８３）。画分ＩＩは２０Ｓおよび２６Ｓプロテオソーム、もしくは他のタンパク質分解活性を含有しないが、しかしユビキチンＣ末端加水分解酵素（ＵＣＨ）を含有する。ユビキチン化されたタンパク質産物の収量を向上させるために、ユビキチンアルデヒド（Ｕｂ−Ｈ、カタログ番号Ｕ−２０１）をＵＣＨ活性の阻害に使用した（Ｍｅｌａｎｄｒｉら、１９９６）。画分Ｉ抽出物は、プロテアソーム活性（反応の間にＬＬｎＬ（２００μＭ）により阻害されるはずである）を含有する。精製されたＡＡＶビリオンへのユビキチン結合は、改変を伴い、供給元により提供された標準的プロトコルに従って実施した。簡潔には、２５μｇの画分ＩＩ酵素結合成分、６０μｇのユビキチンおよび２μｇのユビキチンアルデヒド、５μｌの１０×エネルギー緩衝液を混合し、そして５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ緩衝液、ｐＨ７．６で最終の５０μｌの反応容量にした。ＵＣＨの阻害を見込むために該混合物を３７℃で５分間インキュベートした。ｒＡＡＶ−２もしくはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスの３×１０８粒子を含有した１μｌのウイルス溶液の添加により結合を開始した。３７℃で１時間のインキュベーション後に、ＥＤＴＡ（最終１０ｍＭ）の添加により反応をクエンチし、そしてスピード−バック（Ｓｐｅｅｄ−Ｖａｃ）を介して約１５μｌに濃縮した。サンプルをＳＤＳ負荷緩衝液と混合し、そして１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。ＡＡＶウイルスタンパク質は、抗ＡＡＶキャプシドモノクローナル抗体Ｂ１を用いるウェスタンブロッティングを介して分析した。ユビキチン化は、免疫反応性キャプシドタンパク質の増大された見かけの分子量により可視化された。ＡＡＶ粒子のユビキチン化が画分ＩＩ中で見出されない付加的なＥ２およびＥ３酵素を必要としたかどうかを試験するために、上述された同一の反応条件に１２．５μｇのＨｅＬａ細胞抽出物画分Ｉを補充し、そしてウェスタンブロット分析により結合を同様に評価した。画分Ｉとともに導入されるプロテアソーム活性を阻害するために、画分Ｉを使用した場合にのみ２００μＭのＬＬｎＬ（最終濃度）もまた添加した。
結果
ＡＡＶ−５キャプシドタンパク質を用いるｒＡＡＶ−２ゲノムのシュードタイピング。ＩＴＲおよびＲｅｐ遺伝子の交差相補を示した他の血清型のＡＡＶと異なり、ＡＡＶ−５はより独特である。ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５のＩＴＲ間の５８％の相同性、ならびにＲｅｐタンパク質結合およびＴＲＳ認識モチーフの低い保存は、ＡＡＶ−５ ＲｅｐおよびＩＴＲがＡＡＶ−２で完全にすることができないことを示唆する。しかしながら、ＡＡＶ−２ Ｒｅｐタンパク質の存在下で、ｒＡＡＶ−２構築物はＡＡＶ−５キャプシドによりシュードパッケージされて感染性粒子を集成することができる（Ｃｈｉｏｒｉｎｉら、１９９９）。図１Ａに示されるとおり、初期の最終目標は、ネイティブｒＡＡＶ−２ビリオンでの形質導入の効率を直接比較するために、ＲＳＶに駆動されるルシフェラーゼレポーターをコードするｒＡＡＶ−２ゲノムでパッケージされるシュードＡＡＶ−５ビリオンを創製することであった。ｒＡＡＶ−２プロウイルスプラスミドｐｃｉｓＡＶ２ＲＳＶｌｕｃを、アデノウイルスに感染させた２９３細胞中でＡＡＶ−２ Ｒｅｐタンパク質発現プラスミド（ｐＡＶ２−Ｒｅｐ）と一緒にトランスフェクトした場合、子孫のウイルスＤＮＡは、使用される補充キャプシド発現プラスミドに依存して、ＡＡＶ−２キャプシドもしくはＡＡＶ−５キャプシドのいずれか中に効率的にパッケージされる可能性がある。等密度勾配遠心法によるウイルスの精製後のＤＮＡスロットブロットによる定量は、ｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスについて類似のパッケージング効率が得られたことを示した。典型的な産生収量は、４０枚の１５０ｍｍプレートのバッチ培養あたり３×１０１２粒子であった。ｒＡＡＶ−２ＲＳＶｌｕｃもしくはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ＲＳＶｌｕｃ中でのｐｃｉｓＡＶ２ＲＳＶｌｕｃのパッケージングについて、効率の有意差は見出されなかった（図１）。
【０２１５】
ＡＡＶ−２はより長い時間の間、遺伝子移入ベクターとして開発中であったため、ウイルス産生の機構の、ＡＡＶ−５についてより多くの理解が存在する。例えば、低下されたＡＡＶ−２ Ｒｅｐ６８／７８タンパク質発現がｒＡＡＶ−２ウイルスのずっとより高い収量をもたらすことが既知である（Ｌｉら、１９９７；およびＸｉａｏら、１９９８）。シュードタイプウイルスのパッケージング効率を増大させるために、ＡＡＶ−５ Ｒｅｐ遺伝子コーディング領域をヘルパープラスミドｐＡＶ５−ｔｒａｎｓから欠失させた。図１Ｂおよび図１Ｃに示されるとおり、無効にするＡＡＶ−５ Ｒｅｐタンパク質発現は、シュードパッケージされたｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスの収量の向上をもたらさなかった。同様に、ＡＡＶ−５ ｐ４０配列の代わりに強力な一貫した異種プロモーター（ＣＭＶ前初期プロモーター／エンハンサー）を用いることは、収量のわずかな増大のみをもたらした。これらの結果は、ＡＡＶ−５ Ｒｅｐタンパク質は、ｐ４０プロモーターが駆動するＡＡＶ−５ Ｃａｐ発現のトランス活性化においてＡＡＶ−２ Ｒｅｐタンパク質と全く異なる機構を介して作用するかもしれないことを意味する。
【０２１６】
ネイティブおよびシュードタイプＡＡＶ−２ベクターが期待されたとおりパッケージされたことを確認するために、ネイティブｒＡＡＶ−２ＲＳＶｌｕｃおよびシュードタイプｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ＲＳＶｌｕｃの免疫学的特徴を評価した。無傷のＡＡＶ−２粒子のみを認識するマウスモノクローナル抗体Ａ２０（アメリカン リサーチ プロダクツ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ））は、ウイルスＤＮＡについてのドットブロッティングアッセイ、もしくは免疫沈降アッセイ次いでサザンブロッティングのいずれかにより評価されるとおり、ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５のＤＮアーゼ抵抗性粒子に対する免疫反応性を立証しなかった（データは示されない）。対照的に、Ｂ１と命名される異なるモノクローナル抗体は、ウェスタンブロット上で同一の感受性で双方のウイルスと反応した（データは示されない）。Ｂ１は、ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３を認識する商業的に製造された抗ＡＡＶ−２抗体である。Ｂ１のエピトープは、見かけ上、ＡＡＶ−２とＡＡＶ−５との間の高い相同性を伴う領域中に位置する。類似の数の精製されたＤＮアーゼ抵抗性粒子を、変性スロットブロットもしくはウェスタンブロットにより評価した場合、識別可能なレベルの免疫反応性がＢ１抗体に対してみられた。さらに、ＶＰ１、２および３キャプシドタンパク質の比もまた、精製されたｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５双方について識別可能であった。
【０２１７】
ＡＡＶ−５キャプシド中でのｒＡＡＶ−２ゲノムの被包化はＨｅＬａ細胞中でのトランスジーン発現の効率を変える。異なる細胞系におけるＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５の変動する指向性を考えれば、比較の基礎としての機能的力価測定は問題が多い。この目的のため、同等の力価のＤＮアーゼ抵抗性の物理的粒子を比較の基礎として使用した。基礎の形質導入の程度の全体的差異が懸念がより小さかったためである。同等の数の、ｒＡＡＶ−２ＲＳＶｌｕｃもしくはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ＲＳＶｌｕｃの物理的粒子を感染に使用した場合（図１１Ａ）、トランスジーン発現は一貫してほぼ全細胞系（ＨｅＬａ細胞、初代胎児線維芽細胞、ＩＢ３細胞、２９３細胞および未分化Ｃ２Ｃ１２筋細胞）でｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスについて６〜１５倍より低かった（図１１Ｂ）。これは、分化Ｃ２Ｃ１２細胞が、ｒＡＡＶ−２に比較してｒＡＡＶ−２ｃａｐ５からおよそ３０倍より高いルシフェラーゼ発現を生じた一例外を伴った。
【０２１８】
これらの細胞型における該２種のウイルス間の形質導入の差異の可能な一説明は、それらのそれぞれの細胞表面受容体のレベルであるかもしれない。ＡＡＶ−２についてはヘパリン硫酸プロテオグリカン（ＨＳＰ）が主受容体であり、また、２，３結合シアル酸がＡＡＶ−５の受容体として同定されている。この概念を支持して、分化Ｃ２Ｃ１２細胞におけるｒＡＡＶ−２ｃａｐ５感染の誘導は、部分的に、膜の増大された２，３結合シアル酸による（実施例１を参照されたい）。
【０２１９】
受容体結合もしくはエンドサイトーシスが形質導入効率の観察された差異の原因であったかどうかをさらに検討するために、２種のウイルスで同時に感染させた各細胞型から低分子量Ｈｉｒｔ ＤＮＡを精製し、そして、細胞内ウイルスＤＮＡのサザンブロット分析を実施した。胎児線維芽細胞、ＩＢ３および２９３細胞において、シュードタイプウイルスについてのより低い形質導入が、ウイルスのより低い取込みを反映するようである。制限された量のウイルスＤＮＡのみを、ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ＲＳＶｌｕｃ感染後にこれらの細胞系から回収することができたからである（データは示されない）。しかしながら、Ｈｅｌａ細胞においては、インターナリゼーションされた（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚｅｄ）ウイルスＤＮＡの量は２種のウイルスについて類似であり、そして、従って、該差異は細胞内プロセシングの何らかの局面によるようである。図１１Ｃは、Ｈｅｌａ細胞におけるトランスジーン発現およびウイルスＤＮＡの取込みの時間経過の動的分析を立証する。ネイティブｒＡＡＶ−２により媒介されるトランスジーン発現レベルは感染後２４時間で最高であり、そしてその後漸進的に減少した。シュードタイプｒＡＡＶ−２ｃａｐ５は第２日にピーク発現レベルを生じた。減少する遺伝子発現レベルと矛盾せず、ｒＡＡＶ−２感染後のインターナリゼーションされたウイルスＤＮＡの量は３日の経過にわたって徐々に下落した。しかしながら、ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５感染後のウイルスＤＮＡは、低レベルの遺伝子発現にもかかわらずより豊富かつより安定の双方であった。これらの知見は、ｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５でのＨｅＬａ細胞のウイルス感染における差異が、単に受容体のインターナリゼーションによることがありそうでないことを示唆する。
【０２２０】
トリペプチルアルデヒドプロテオソーム阻害剤はｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５双方の形質導入効率を高める。ＨｅＬａ細胞における、ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスに比較してのネイティブｒＡＡＶ−２の６倍より高いトランスジーン発現は、増大されたウイルスゲノムのインターナリゼーションと相関しているようでない。ウイルスゲノムは同一であるため、ウイルスＤＮＡの安定性、鎖変換および遺伝子転写の効率もまた、双方の血清型で同一のままであるはずである。従って、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５キャプシド進入経路により助長される細胞内プロセシングの差異が、これら２種のウイルスでの形質導入の効率を達成する代替の運命を賦与するかもしれない。
【０２２１】
プロテオソーム系は、多くのタンパク質およびＨＩＶのようなウイルスの細胞内プロセシングを調節することが既知である（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９８）。以前に、ＬＬｎＬもしくはＺＬＬのような細胞浸透性のトリペプチルアルデヒドプロテオソーム阻害剤が、インビボでヒト気管支上皮細胞およびマウス肺の極性化培養物の頂側表面へのｒＡＡＶ−２に媒介される遺伝子移入を実質的に増強することが見出された（Ｄｕａｎら、２０００ｂ）。これゆえに、プロテオソーム経路はｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスでの遺伝子移入にもまた影響を及ぼすかもしれない。この目的のため、ｒＡＡＶ−２ＲＳＶｌｕｃおよびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ＲＳＶｌｕｃの形質導入効率を、トリペプチルプロテオソーム阻害剤（４０μＭ ＬＬｎＬもしくは４μＭ ＺＬＬ）の存在もしくは非存在下で比較した。４種の異なる細胞系でのこれらの実験からの結果を表１に要約する。試験された全４種の細胞系は、ＬＬｎＬもしくはＺＬＬの存在下でｒＡＡＶ−２もしくはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５双方の形質導入の増強を立証した。ネイティブおよびシュードタイプウイルスの形質導入に対するこれらの阻害剤の影響の有意の差異は、胎児線維芽細胞および２９３細胞について見出されなかった。しかしながら、ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスで達成されたものと比較して、トランスジーン発現の有意により高い誘導が、ＨｅＬａおよびＩＢ３細胞のネイティブｒＡＡＶ−２感染後にみられた。これらの知見は、双方の血清型のＡＡＶがプロテアソーム障壁に対し感受性であるかもしれないことを示唆する。
【０２２２】
【表２】
Figure 2004534543
【０２２３】
多様なウイルスＭＯＩおよび双方の阻害剤の用量の影響もまたＨｅＬａ細胞で評価した（図１２）。細胞は、ネイティブｒＡＡＶ−２もしくはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５（それぞれ２５０粒子／細胞で）での感染前に、増大する用量のＬＬｎＬ（１００μＭまで）もしくはＺＬＬ（１０μＭまで）とともに１時間プレインキュベートした。最高用量の阻害剤は細胞に対し毒性であり、かつ、感染後２４時間に２０％以上の細胞の減少に至り、そしてこれゆえにデータはこれらの条件について提示されない。しかしながら、約４０μＭのＬＬｎＬもしくは４μＭのＺＬＬの濃度は細胞に対し明らかな毒性を示さなかった。ＨｅＬａ細胞は、双方の血清型のウイルスについて、ＬＬｎＬ処理後に形質導入の用量依存性の増大を立証した。ＬＬｎＬの最大の影響のより微妙な差異が、該２種のウイルス間でみられた（ｒＡＡＶ−２について４０μＭおよびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５について８μＭでのピーク形質導入）。しかしながら、ＺＬＬの最大の影響は双方の血清型について類似であり、そして０．８μＭで頂点に達した（図１２Ａ）。４０μＭのＬＬｎＬにより助長される誘導のレベルは、ｒＡＡＶ−２およびｒＡＡｖ２−ｃａｐ５双方について感染のＭＯＩに依存しなかった（図１２Ｂ）。これらの実験において、ｒＡＡＶ−２の形質導入は、シュードタイプｒＡＡＶ−２ｃａｐ５での感染後にみられたものよりおよそ３倍より高かった（図１２Ｂ）。
【０２２４】
ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５双方のキャプシドタンパク質はユビキチン化の基質である。ユビキチン化された分子のプロテオソーム依存性の分解は、内因性および外来性双方のタンパク質の処分（ｄｉｓｐｏｓａｌ）の一主経路を代表する（Ｐｉｃａｋｒｔ、２００１およびＳｃｈｗａｒｔｚら、１９９９）。最近の研究は、ユビキチン−プロテオソーム系が受容体に媒介されるエンドサイトーシスを調節する可能性があることもまた立証した（Ｓｔｒｏｕｓら、１９９９）。以前に、ＡＡＶ−２キャプシドタンパク質がヒト線維芽細胞中でユビキチン化されること、およびＬＬｎＬ処理がこの細胞型におけるｒＡＡＶトランスジーン発現を１０倍増強することが見出された（Ｄｕａｎら、２０００ｂ）。
【０２２５】
ＡＡＶ−５キャプシドが感染後にユビキチン化されるかどうかを試験するために、抗キャプシド抗体を用いる免疫沈降実験、次いで抗ユビキチン抗体を用いるウェスタンブロットを実施した。Ｂ１抗体は、ＡＡＶ−５およびＡＡＶ−２双方のキャプシドタンパク質を同等の感受性で認識する（データは示されない）。これらの実験は胎児線維芽細胞、ＩＢ３、２９３およびＨｅＬａ細胞で実施した。しかしながら、ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５でのＨｅＬａ細胞を除く全細胞型の低レベルの感染により、不十分なウイルス回収が、胎児線維芽細胞、ＩＢ３および２９３細胞における決定的な分析を予防した。例えば、（Ｈｉｒｔ ＤＮＡサザンブロットにより測定されるところの）インターナリゼーションされたウイルスゲノムは、ＨｅＬａ細胞を除く全細胞系について、ｒＡＡＶ−２に比較してｒＡＡＶ−２ｃａｐ５感染後に有意により低かった（データは示されない）。ＨｅＬａ細胞におけるウイルスの取込みはｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５双方のウイルスについて類似であったため、キャプシドのユビキチン化の比較分析をこの細胞系で実施した（図１１Ｃ）。さらに、ＡＡＶキャプシドのユビキチン化がプロテアソーム阻害剤による応答性に結び付けられた場合に、ＬＬｎＬはｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５双方の形質導入を同様に増強した（２．６倍異なるのみ）ため、それはＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５双方のキャプシドで明白であるとみられる。
【０２２６】
免疫沈降実験からの結果は、ｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５双方のウイルスからのキャプシドタンパク質が、ＬＬｎＬの存在下にＨｅｌａ細胞中でユビキチン化されたことを立証した（図１３Ａ、レーン２および６）。プロテアソーム阻害剤の存在は、ユビキチン化されたキャプシドの蓄積をみるために必要とされ、これらの分子で期待されるかもしれないように、プロテアソームにより迅速に分解される。興味深いことに、実際に、ユビキチン化されたキャプシドが分解のためにプロテアソームに標的を定められる場合は、プロテアソーム阻害剤での処理が細胞中のウイルスゲノムの安定性の安定性もまた増大させるかもしれないことを期待することができる。しかしながら、図１３Ｂに示されるとおり、これはｒＡＡＶ−２もしくはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５いずれかのウイルスについて真実でなかった。細胞内のウイルスＤＮＡの豊富さの変化は、ＬＬｎＬの存在を伴いもしくは伴わずに、感染後２４時間で検出されなかった。この結果は、ＬＬｎＬの存在が、有意に増大されたレベルの形質導入にも関わらずヒト気道上皮細胞の頂側からのインターナリゼーションされたＡＡＶ−２ウイルスＤＮＡの酵素的分解を実質的に予防しなかったという以前の報告（Ｄｕａｎら、２０００ｂ）と矛盾しない。プロテオソーム阻害剤ＬＬｎＬの作用は、典型的には、プロテオソーム系のその選択的かつ可逆的阻害に帰されている。しかしながら、ｒＡＡＶ−２もしくはＡＡＶ−５ベクターの形質導入に対するプロテオソーム阻害剤の増強の影響は、分解を単純に予防することによるよりもむしろ、ウイルスのエンドソームプロセシングもしくは核トラフィッキングを変えることにより生じられるかもしれない。
【０２２７】
ウイルスキャプシドタンパク質へのユビキチン側鎖の結合は、有意の分子量増加をもたらし、これはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上での移動パターンの変化につながった。ユビキチン化後にＡＡＶ−２もしくはＡＡＶ−５キャプシドタンパク質についてみられた高分子量スメアは、ＡＡＶ−２に感染させたヒト線維芽細胞での以前の結果（Ｄｕａｎら、２０００ｂ）と矛盾しなかった。しかしながら、本実験において、ＨｅＬａ細胞中のユビキチン化されたＡＡＶタンパク質の高分子量スメアは、以前の研究で見出されたより低くかつより不均質な分子質量を有した。これは細胞型特異的差異に関係づけることができる。また、ネイティブｒＡＡＶ−２に感染させた細胞からの高分子スメアの強度は、ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５シュードタイプウイルスのものより濃かったようである。この差異は小さいとは言え、ｒＡＡＶ−２の形質導入がプロテアソーム阻害剤に対し３倍より応答性でありかつ細胞内ｒＡＡＶ−２ウイルスゲノムがｒＡＡＶ−２ｃａｐ５由来のものより少なく安定であった（図１１Ｃおよび１２Ａ）ことは興味深い。ｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５での感染後に同等レベルのウイルスＤＮＡがＨｅＬａ細胞により取り込まれるという事実を考えれば、キャプシド標的分子の豊富さは双方の血清型について類似であると想定される。
【０２２８】
ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５キャプシドのユビキチン化の知見をさらに確証するために、インビトロ再構成実験を実施して、精製された無傷のビリオンがユビキチン化の基質であるかどうかを直接決定した。ＨｅＬａ細胞抽出物から単離されたユビキチン結合系の精製された活性成分（画分Ｉおよび画分ＩＩ）を、基質としての精製されたｒＡＡＶ−２もしくはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスとともに使用した。Ｂ１抗キャプシド抗体を用いるウェスタンブロット分析を使用して、ユビキチンの付加により引き起こされるキャプシドの移動の増大（７．６ｋＤａ）を可視化した。図１３Ｃ（レーン５−７）にみられるとおり、ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスは、画分ＩＩ単独の存在下でユビキチン化の優先的な基質であり、抗キャプシド免疫反応性バンドのより高分子量のスメアを生じさせた。より高分子量のキャプシド分子の認識できる増大は、画分ＩＩ単独の存在下にｒＡＡＶ−２を用いて検出されなかった（図１３Ｃ、レーン２−４）。興味深いことに、結合反応への画分ＩおよびＩＩの添加は、ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスについて最も容易に明白であったＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５双方のキャプシドへの見かけのユビキチン化の強度を増大させ（レーン９−１４）、また、有意により少ないユビキチン化がｒＡＡＶ−２について全条件下でみられた。沸騰水浴中で加熱することによるウイルスの前処理は変性されたキャプシドをもたらし、これらはユビキチン化されかつ結合効率を増大させた（図１４）。ＶＰ−１およびＶＰ−２の強度は、画分ＩおよびＩＩの非存在下での結合緩衝液中でのウイルスのインキュベーション後に、未知の理由から顕著により少なく強かった。しかしながら、結合抽出物画分ＩおよびＩＩの非存在下での精製されたウイルスとの比較に基づけば、ＶＰ−３は、研究された条件下でユビキチン化の支配的標的であるようである。
考察
ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５のウイルスゲノム、ＲｅｐおよびＣａｐタンパク質ならびにＩＴＲの有意の相違は、組織指向性、細胞受容体、宿主範囲およびおそらくなお複製機構の差異を予測する。これゆえに、これら２つの型のＡＡＶでの遺伝子移入の効率の増大方法を探す場合に、多数の潜在的因子を考慮しなければならない。さらに、遺伝子移入についての組換えＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５の報告された効率の差異は、これら２種のウイルスのベクターとしての独特の機能的局面の原因である生物学について学ぶ機会もまた提供する。生物学のこうした差異は、多くの血清型のＡＡＶを用いるベクター送達を向上させるための基礎を提供する可能性がある。生物学の可能な差異は、細胞膜受容体結合およびエンドサイトーシス、細胞内トラフィッキング、脱殻、第二鎖合成の開始およびｓｓＤＮＡのその活性の発現可能な形態への変換、ウイルスゲノムの安定性および長期持続性などを包含する。しかしながら本研究においてこうした差異は最小化された。例えば、これらの実験において、ｒＡＡＶ−２ゲノムをＡＡＶ−５キャプシドでシュードタイプさせて、ネイティブｒＡＡＶ−２ベクターを用いる遺伝子発現の比較を別の方法で達成するかもしれないウイルスゲノム中の潜在的差異を最小限にした。さらに、プロテアソーム阻害剤に対するｒＡＡＶ感染の応答性について多数の細胞系をスクリーニングしたとは言え、機械論的研究の大多数は、それらの相違する受容体進入経路にもかかわらず、ｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５について同等レベルのウイルス取込みを立証する（Ｚａｂｎｅｒら、２０００）ＨｅＬａ細胞で実施された。この考慮は、ｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルス間の形質導入の比較の局面を大きく単純化した。
【０２２９】
ＨｅＬａ細胞においては、ｒＡＡＶ−２は、シュードタイプｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスのものより６倍より高い形質導入効率を立証した。これらの結果は、ネイティブｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−５ベクターを使用してＨｅＬａ細胞中でのβ−ガラクトシダーゼ発現を比較するＣｈｉｏｒｉｎｉら（１９９９）による知見（ｒＡＡＶ−２での形質導入の７倍より高いレベルを立証した）を支持する。興味深いことに、本明細書に記述される研究は、低分子量Ｈｉｒｔ ＤＮＡのサザンブロット分析を使用して、２４時間の期間内に細胞により取込まれるウイルスゲノムのレベルがｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５について事実上同一であったことを立証した。これは、ＨｅＬａ細胞におけるＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５の結合およびインターナリゼーションの差異が、それらが異なる受容体に媒介される機構により細胞に進入する場合であっても最小限であるかもしれないことを立証する。シュードタイプウイルスによりＨｅＬａ細胞に導入される付加的なウイルスＤＮＡは分解に対しより抵抗性である傾向があった。一緒にすれば、これらの結果は、該２種のＡＡＶベクターの血清型についての異なるエンドソームプロセシングおよび／もしくは核トラフィッキング機構に対する潜在性を示唆する。
【０２３０】
ＡＡＶの形質導入に関連するエンドサイトーシスおよび核トラフィッキングの機構の現実の理解はわかりにくいままである。多様なシグナル伝達経路がこれらの過程で役割を演じているかもしれない。以前、ユビキチン−プロテオソーム経路がＡＡＶ−２の形質導入に関与していることが報告された。プロテオソーム機能を阻害することにより、ｒＡＡＶ−２に媒介されるトランスジーン発現の実質的増強が観察された。本研究において、プロテオソーム阻害剤がｒＡＡＶ−２のみならずしかしまたｒＡＡＶ−２ｃａｐ５に媒介される遺伝子移入も高めることが立証された。この増強の程度は分析される細胞型により大きく影響された。ＨｅＬａおよびＩＢ３細胞においては、ＡＡＶ−５に関してＡＡＶ−２の形質導入に対するより大きな増強効果が観察された。これはまた、ＡＡＶ−２とＡＡＶ−５との間のインターナリゼーションされたウイルスのプロセシングの差異も意味した。プロテアソーム阻害剤がウイルスゲノムの安定性に影響を及ぼさなかったという事実を考えれば、これらの阻害剤はインターナリゼーションされたビリオンの分解を減少させることにより形質導入を増強するのではないようである。
【０２３１】
細胞性プロセシングにおけるウイルスのユビキチン結合の機能は現在のところ定義されていない。本研究から、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５双方のキャプシドがＨｅＬａ細胞中でユビキチン化されることが明瞭である。さらに、Ｈｅｌａ細胞でのプロテオソーム阻害剤とのウイルスの共投与は、増大されたトランスジーン発現のユビキチン化されたＡＡＶキャプシドタンパク質の量との相関を表した。現在、プロテアソーム阻害剤に応答してのウイルスのユビキチン化と高められた遺伝子移入との間の因果関係を識別することは困難である。
【０２３２】
いくつかの可能性が、ｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−５双方の形質導入におけるユビキチン／プロテアソーム経路の機能的関与を説明するかもしれない。第一に、キャプシドのユビキチン化は、相対的に回復力に富むキャプシドの完全なプロテアーゼ消化の非存在下での「袋小路の」エンドソーム区画へのウイルスの細胞内経路変更（ｒｅｒｏｕｔｉｎｇ）のシグナルであるかもしれない。この仮説は、ＨＩＶについて示唆されたとおり、入ってくるウイルスに対する細胞内の生得の免疫性の一機構としてユビキチン化を引き起こすとみられる（Ｓｃｈｗａｒｔｚら、１９９８）。この場合、ウイルスキャプシドのユビキチン化は、その潜伏期の生活環を完了させるｒＡＡＶの能力に対し有害であるとみられる。第二の代替の一仮説は、ＡＡＶキャプシドタンパク質のユビキチン化が、エンドソーム回避（ｅｎｄｏｓｏｍｅ ｅｓｃａｐｅ）、核輸入（ｎｕｃｌｅａｒ ｉｍｐｏｒｔｉｎｇ）もしくはウイルス粒子解体のようなウイルスプロセシングのシグナルとしてはたらくことである。プロテアソーム阻害剤での細胞の処理はキャプシドのユビキチン化のレベルを増強するため、この代替の説明は、増大されたユビキチン化が、ｒＡＡＶの潜伏期の生活環の完了に利する正のシグナルであることを示唆するかもしれない。プロテアソーム阻害剤の存在下での高められた形質導入の明瞭な機構の欠如にもかかわらず、これらの研究は、ＡＡＶキャプシドのユビキチン化がＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５双方にとっての細胞性相互作用の共通の成分であるかもしれないことを示唆する。ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５は最も相違する血清型のＡＡＶであるため、これらの機構は他の血清型にもまた同様に当てはまることがありそうかもしれない。ＡＡＶのユビキチン化の機構をさらに解明することは、遺伝子治療への複数のｒＡＡＶ血清型の応用において大きな治療上の利益を有するかもしれない。
【実施例３】
【０２３３】
インビトロおよびインビボでの極性化気道上皮細胞のｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−５形質導入へのプロテアソームの関与
ＬＬｎＬのような小型トリペプチド阻害剤でのプロテアソームの阻害は、インビトロの極性化ヒト気道上皮細胞およびインビボのマウス肺の双方の頂側膜からのｒＡＡＶ−２形質導入を有意に増強する可能性がある（Ｄｕａｎら、２０００）。ＡＡＶ−５は気道上皮細胞の頂側膜に対するより高い指向性およびその上の代替受容体を有することが報告されているため、ｒＡＡＶ−５を用いる頂側膜からの気道上皮細胞の増大された形質導入は、変えられたプロテアソームの関与によるかもしれない。プロテアソーム阻害剤の共投与は、双方の血清型の形質導入を細胞型依存性の様式で増強することが見出された（表１を参照されたい）。
【０２３４】
気道の形質導入における血清型特異的差異をより良好に理解するために、極性化ヒト気道上皮細胞培養物およびマウス肺におけるｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−５の形質導入に対するプロテアソーム阻害剤の影響を検査した。ｒＡＡＶ−２プロウイルス構築物をＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５双方のキャプシド中にパッケージして、ルシフェラーゼトランスジーンを発現するＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃおよびＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃＣａｐ５ウイルスを生成させた。ｒＡＡＶ−２は頂側からの形質導入において側底表面に対し有意の差異を立証したが、しかしｒＡＡＶ−５はしなかった。ＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃでの形質導入は、感染後それぞれ５および１４日に、側底膜から３６および１０３倍より大きかった。対照的に、ＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃＣａｐ５は、双方の時間点で類似の効率で頂側および側底膜から上皮細胞に形質導入した。
【０２３５】
ＬＬｎＬは頂側および側底表面からのＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃの形質導入を増強する。しかしながら、ＬＬｎＬの適用は、ウイルスを頂側表面に適用した場合にのみ、ＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃＣａｐ５の形質導入を１２倍選択的に増大させた。これらの結果は、細胞の極性により達成される多様なＡＡＶキャプシド進入経路についてのプロテアソームの関与の興味深い差異を示唆する。
【０２３６】
プロテアソーム阻害剤Ｚ−ＬＬＬは、マウス肺におけるｒＡＡＶ−２での長期（５ヶ月）の形質導入を誘導することが見出された。ＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃＣａｐ５のインビボ形質導入効率を決定するために、マウスを、ＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃＣａｐ５の６×１０１０粒子に単独で（対照）鼻吸引によりもしくは２００μＭのＺ−ＬＬＬとともに（群あたり１２匹のマウス）感染させた。Ｚ−ＬＬＬの共投与は、感染後１４（２週）および４２（６週）日後にそれぞれ１７．２および２．１倍の全肺ルシフェラーゼ発現を誘導した（図１５）。興味深いことに、ルシフェラーゼ発現は感染後３ヶ月でさらに低下した（図１６）。
【０２３７】
これらの観察結果は、ｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−５を用いるインビボ研究間の、Ｚ−ＬＬＬによる誘導の動力学および寿命の顕著な差異を示唆する。インビボ形質導入はｒＡＡＶ−２に比較してｒＡＡＶ−５で有意により効率的であるため、プロテアソーム活性を変えることは、単純に、ｒＡＡＶ−５での形質導入の速度を高めるかもしれない。ｒＡＡＶ−２の場合には、この基礎速度がインビボの頂側膜から有意に低下されて、プロテアソーム阻害剤による形質導入のより持続性の増強を示すかもしれない。
【０２３８】
【表３】
Figure 2004534543
【０２３９】
【表４】
Figure 2004534543
【０２４０】
【表５】
Figure 2004534543
【０２４１】
全部の刊行物、特許および特許出願は、引用することにより本明細書に組み込まれる。前述の明細において、本発明はそのある好ましい態様に関して記述され、また、多くの詳細が具体的説明の目的上示された一方、本発明は付加的な態様を受け入れることができること、および、本明細書の詳細のあるものを本発明の基本原理から離れることなく相当に変動させてよいことが、当業者に明らかであろう。
【図面の簡単な説明】
【０２４２】
【図１】発明にかかる、ｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスの製造。ＡＡＶ−５粒子中へのｒＡＡＶ−２ゲノムのシュードタイピングの根底にある原理を図Ａに図解で具体的に説明する。ＡＡＶ−２ Ｒｅｐタンパク質およびヘルパーアデノウイルスの存在下で、ｒＡＡＶ−２ ＩＴＲにより隣接される配列をプロウイルスプラスミド（ｐｃｉｓＡＶＶ−２）から摘出かつ複製する。第二のｔｒａｎｓプラスミドにより提供されるキャプシドタンパク質の血清型に依存して、ｒＡＡＶ−２ゲノムは、ネイティブのＡＡＶ−２もしくはＡＡＶ−５シュードタイプ粒子いずれか中にパッケージされることができる。図Ｂは、ＡＡＶ−５粒子中へのｒＡＡＶ−２ ＤＮＡのパッケージングについて試験された多様なヘルパープラスミドを示す。ｒＡＡＶ−２ゲノムをＡＡＶ−５粒子中にシュードパッケージするためにＡＡＶ−２ Ｒｅｐタンパク質が必要であり、そしてヘルパープラスミドｐＡＶ２−Ｒｅｐにより提供された。このプラスミドは、ｒＡＡＶ−２製造のための慣例のヘルパープラスミドｐＡＡＶ−２／Ａｄから、ＡＡＶ−２キャプシドコーディング領域を欠失させることにより生じさせた。ｐＡＶ５−Ｔｒａｎｓは、完全長のＡＡＶ−５ ＲｅｐおよびＣａｐコーディング配列でＡＡＶ−２ゲノムを置き換えることにより生成させた。それは、真正のｒＡＡＶ−５ベクターを生成させるため、もしくはＡＡＶ−５キャプシド中にＡＡＶ−２をシュードタイプするためのヘルパーとして使用することができる。ＡＡＶ−５キャプシド発現プラスミドｐ４０Ａｖ５Ｃａｐ（１６１４）はＣａｐ遺伝子転写のための元のｐ４０プロモーターをコードする。ｐＣＭＶＡｖ５Ｃａｐ（１９２４）は、ｈＣＭＶプロモーター／エンハンサーがｐ４０プロモーターにとって代わることを除き類似である。ｐＣＭＶＡｖ５Ｃａｐ（２１９６）は、ＣＭＶプロモーターがＶＰ１開始暗号のすぐ上流にあるように欠失されたスプライシングシグナルを伴うｐＣＭＶＡｖ５Ｃａｐ（１９２４）由来である。ウイルス産生に対する多様なＡＡＶ−５ヘルパープラスミドの影響を図Ｃに示し、ｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスのウイルス収量は３回の独立した調製物の平均（＋／−ＳＥＭ）である。
【図２】発明にかかる、筋芽細胞の分化はｒＡＡＶ−２ｃａｐ５での形質導入を増大させるが、しかしｒＡＡＶ−２ウイルスはさせない。未分化（図Ａ、Ｂ、ＣおよびＤ）ならびに分化（図Ｅ、Ｆ、ＧおよびＨ）Ｃ２Ｃ１２細胞の感染を、３０００ＤＮＡ粒子／細胞のｒＡＡＶ−２（図Ａ、Ｂ、ＥおよびＦ）もしくはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルス（図Ｃ、Ｄ、ＧおよびＨ）のいずれかでの２４時間の感染後のＥＧＦＰトランスジーン発現について評価した。ＥＧＦＰ発現は蛍光顕微鏡検査により感染７２時間後に評価した。ノマルスキ（Ｎｏｍａｒｓｋｉ）および蛍光顕微鏡写真を各図のそれぞれ左および右に提示する。ＥＧＦＰ発現細胞の割合の定量分析を図Ｉに示す。値は、３回の独立した実験からの１５より多い定量された１０倍野についての平均（＋／−ＳＥＭ）を表す。
【図３】発明にかかる、分化および未分化Ｃ２Ｃ１２細胞におけるｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスからのＲＳＶ−ルシフェラーゼ発現の定量分析。未分化および分化Ｃ２Ｃ１２細胞を、ｒＡＡＶ−２もしくはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスのいずれかに、３０００ＤＮＡ粒子／細胞のｍｏｉで２４時間感染現させた（図Ａ）。模擬感染細胞を背景酵素活性の陰性対照として使用した。ルシフェラーゼ活性を感染後２４、４８および７２時間に測定した。２種のベクター型についての相対ルシフェラーゼ発現の比（ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５／ｒＡＡＶ−２）を図Ｂに示す。図ＡおよびＢ中の値は３回の独立したデータ点についての平均（＋／−ＳＥＭ）を表す。
【図４】発明にかかる、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるウイルス結合の検査。ウイルス結合は、Ｃ２Ｃ１２細胞の４℃感染後にウイルスＤＮＡのサザンブロット分析により評価した（図Ａ）。Ｃ２Ｃ１２細胞を４℃で１０分間前冷却した。血清を含まないＤＭＥＭで洗浄した後、ｒＡＡＶ−２（レーン５、６、１１および１２）もしくはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５（レーン２、３、８および９）ウイルス（ＡＡＶ−２ ＣＭＶ−ＥＧＦＰカセットを含む）を、２０００粒子／細胞のｍｏｉで細胞に４℃で６０分間適用した。模擬感染細胞を陰性対照として包含した（レーン１、４、７および１０）。インキュベーションの終了時に、細胞をＰＢＳ単独で洗浄した（レーン１、３、４、６、７、９、１０および１２）か、もしくは洗浄する前に０．５％トリプシンで処理した（レーン２、５、８および１１）かのいずれかであった。その後Ｈｉｒｔ ＤＮＡを調製し、そしてトランスジーン（ＥＧＦＰ）特異的３２Ｐ標識プローブを用いるサザンブロットにより分析した。３回の独立した実験からのウイルス結合を図Ｂで濃度測定法により定量した（平均＋／−ＳＥＭ）。図Ｂ中のレーン番号は図Ａ中の標識付けに対応する。感染なし：模擬感染細胞。シュード：ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルス。ＡＡＶ−２：ネイティブｒＡＡＶ−２ウイルス。
【図５】発明にかかる、プロテアソーム阻害剤は、分化Ｃ２Ｃ１２細胞におけるｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５形質導入に示差的に影響を及ぼす。異なるＡＡＶ血清型の細胞内プロセシングに対するプロテアソーム阻害剤の影響を分析するために、完全に分化したＣ２Ｃ１２細胞を、ｒＡＡＶ−２もしくはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５いずれかのルシフェラーゼベクターに６００ＤＮＡ粒子／細胞のｍｏｉで４時間感染させた。トリペプチドプロテアソーム阻害剤（４０μＭ ＬＬｎＬもしくは４μＭ Ｚ−ＬＬＬ）もまた感染期間の間に培地に添加した。ルシフェラーゼ発現を感染後２４時間に定量した。データは、各実験条件についての３個の独立したサンプルの平均（＋／−ＳＥＭ）を表す。
【図６】発明にかかる、ＡＡＶ−５受容体はＣ２Ｃ１２細胞の分化後にアップレギュレートされる。分化Ｃ２Ｃ１２細胞におけるｒＡＡＶ−２ｃａｐ５の増大された形質導入をＡＡＶ−５受容体と相互に関連付けるため、細胞表面のα−２，３−結合シアル酸発現を、ＭＡＬ ＩＩレクチン結合アッセイを使用して測定した。ＭＡＬ ＩＩレクチン結合は、間接的アビジン−ＦＩＴＣ蛍光顕微鏡検査（図ＢおよびＤ）を使用して、未分化（図ＡおよびＢ）ならびに分化（図ＣおよびＤ）Ｃ２Ｃ１２細胞中で可視化した。図ＡおよびＣはそれぞれ図ＢおよびＤのノマルスキ（Ｎｏｍａｒｓｋｉ）顕微鏡写真を表す。完全に分化した細胞における増大したＡＡＶ−５受容体発現が、図Ｄ中で明瞭に立証される。
【図７】発明にかかる、Ｃ２Ｃ１２細胞におけるｒＡＡＶ結合に影響を及ぼす因子。Ｃ２Ｃ１２細胞におけるｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルス感染に対するヘパリン競争もしくはシアリダーゼ（ＮＡ ＩＩＩ）処理の影響を評価した（図Ａ）。未分化（レーン１−６）もしくは分化（レーン７−１２）Ｃ２Ｃ１２細胞のｒＡＡＶ−２もしくはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５感染（１０００ＤＮＡ粒子／細胞のｍｏｉ）を、処理なし（レーン３、６、９および１２）、シアリダーゼ処理（レーン１、４、７および１０）もしくはヘパリン（最終濃度２０μｇ／ｍｌ）競争（レーン２、５、８および１１）後に評価した。Ｈｉｒｔ ＤＮＡを４℃で６０分間のインキュベーション後に収集し、そして３２Ｐ標識ＥＧＦＰプローブに対するサザンブロッティングにより評価した。図Ｂは、３回の独立した実験からのＤＮＡシグナルの濃度測定的定量からの結果を描く。値は、未処理の対照に比較した、シアリダーゼ処理もしくはヘパリン競争後の結合の阻害（平均＋／−ＳＥＭ、Ｎ＝３）のパーセントとして表す。シュード：ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルス。
【図８】発明にかかる、分化Ｃ２Ｃ１２細胞におけるｒＡＡＶウイルスゲノムの持続性の動的分析。筋管におけるｒＡＡＶ形質導入をより良好に理解するために、分化Ｃ２Ｃ１２細胞を、ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５（レーン１、２および３）もしくはｒＡＡＶ−２（レーン４、５および６）のいずれかに、１０００ＤＮＡ粒子／細胞のｍｏｉで感染させた。Ｈｉｒｔ ＤＮＡを、感染後９０分（レーン１および４）、２４時間（レーン２および４）ならびに４８時間（レーン３および６）に収集した。左の図は３２Ｐ標識ＥＧＦＰプローブでハイブリダイズされたサザンブロットを描く。右の図は対応する臭化エチジウム染色されたゲルを描く。双方の図のレーンのラベルはＤＮＡラダーを除き同一である。シュード：ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルス。
【図９】発明にかかる、正常およびジストロフィー筋におけるＥＧＦＰ発現の動的比較。６月齢の正常もしくはｍｄｘマウスの前脛骨筋を、２×１０１０粒子の示されるウイルスに感染させた。ＥＧＦＰ発現を蛍光顕微鏡検査により多様な時間点で測定した。図ＡないしＨは、感染１週間および１ヶ月後の新たに摘出された筋からの全マウント組織の写真を示す。三重の実験からの代表的な写真を示す。顕微鏡写真Ａ、Ｂ、ＥおよびＦは８秒の露出時間で撮影した。顕微鏡写真Ｃ、Ｄ、ＧおよびＨは１秒の露出時間でであった。ｍｄｘ脛骨筋の感染６ヶ月後のＥＧＦＰ発現を、パラホルムアルデヒド固定された低温保存された組織切片（１５μｍ）で、損傷を受けた筋線維をはっきり区別するためのエバンスブルー灌流後に評価した（Ｉ−Ｎ）。Ｉ−Ｋの顕微鏡写真（ｒＡＡＶ−２感染）は右脚から取り、また、Ｌ−Ｎ（ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５感染）においては同一マウスの左脚から取った。図ＩおよびＬの顕微鏡写真は１５秒露出であり、また、Ｊ、Ｋ、ＭおよびＮは２秒露出であった。ＦＩＴＣ顕微鏡写真を図Ｉ、Ｊ、ＬおよびＭに表す。図ＪおよびＭ（ＦＩＴＣチャンネル）はそれぞれ図ＫおよびＮ（エバンスブルー、ローダミンチャンネル）で示された野に同一である。
【図１０】発明にかかる、脛骨筋のｒＡＡＶ−２ｃａｐ５もしくはｒＡＡＶ−２感染後のルシフェラーゼ活性の定量的検査。ｒＡＡＶルシフェラーゼ発現ベクターを使用して、２×１０１０粒子のｒＡＡＶ−２（ＡＶ２）もしくはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５（ＡＶ２／５）での感染後１週間および１ヶ月での正常およびｍｄｘの前脛骨筋におけるトランスジーン発現を評価した。データは、各実験群からの３個の独立した筋サンプルについての組織１ｍｇあたりの平均（＋／−ＳＥＭ）の相対ルシフェラーゼ活性を表す。
【図１１】発明にかかる、ネイティブおよびシュードタイプｒＡＡＶ−２ベクターの評価。ネイティブｒＡＡＶ−２ウイルスおよびＡＡＶ−５シュードタイプウイルス（ｒＡＡＶ−２ｃａｐ５）の双方は、プロウイルスプラスミドｐｃｉｓＡＶ２ＲＳＶｌｕｃ由来の同一のルシフェラーゼレポーターを含有した。研究に使用された双方のウイルスストックの力価を、１ｍｌあたり同等な物理的粒子に調節した。プラスミドＤＮＡ標準に対するスロットブロッティングによるこれら２種の組換えウイルスストックの力価測定を図Ａに示す。図Ｂは、一連の細胞型（ＨｅＬａ細胞、初代胎児線維芽細胞、ＩＢ３細胞、２９３細胞および未分化もしくは分化Ｃ２Ｃ１２筋細胞）におけるネイティブｒＡＡＶ−２およびシュードタイプｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルスいずれかでの感染後の形質導入効率の差異を具体的に説明する。実験は、１２穴プレート中で細胞を５×１０８個の完全な粒子に感染させることにより実施した。感染２４時間後にルシフェラーゼ活性を測定した。データは４回の独立した実験の平均（＋／−ＳＥＭ）を表す。図Ｃは、ｒＡＡＶ−２もしくはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５での感染後のＨｅＬａ細胞におけるトランスジーン発現およびウイルスゲノム持続性の時間経過を比較する。ｒＡＡＶ−２（白三角）もしくはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５（黒丸）の１×１０９粒子を６穴プレートの感染に使用し、そして、ルシフェラーゼ活性を感染後２４時間、４８時間および７２時間にアッセイした。データは３回の独立した実験の平均（＋／−ＳＥＭ）を表した（左図）。低分子量Ｈｉｒｔ ＤＮＡもまた、感染させたＨｅＬａ細胞から２４時間（レーン１および４）、４８時間（レーン２および５）ならびに７２時間（レーン３および６）の時間点で収集し、そして、Ｐ３２標識ルシフェラーゼプローブでのサザンブロッティングのため１％アガロースゲル上で分離した（右図）。レーン１ないし３はｒＡＡＶ−２に感染させた細胞からである一方、レーン４−６はｒＡＡＶ−２ｃａｐ５に感染させた細胞からである。
【図１２】発明にかかる、ｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−２ｃａｐ５形質導入に対するプロテオソーム阻害剤の影響。ＨｅＬａ細胞を、多様な投薬量のプロテオソーム阻害剤ＬＬｎＬもしくはＺＬＬの存在下に、２５０粒子／細胞のＭＯＩのｒＡＡＶ−２もしくはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ルシフェラーゼ発現ウイルスに感染させた（図Ａ）。ＨｅＬａ細胞を、４０μＭのＬＬｎＬの存在下で多様な用量のｒＡＡＶ−２もしくはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５に感染させた（図Ｂ）。全図において、ルシフェラーゼ活性を感染後２４時間に測定し、そして、データは４回の独立した実験の平均（＋／−ＳＥＭ）を表した。
【図１３】発明にかかる、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５キャプシドタンパク質のユビキチン化。図ＡはＨｅＬａ細胞におけるユビキチン化されたＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５キャプシドタンパク質についてのウェスタンブロット分析を立証する。ＨｅＬａ細胞を、４０μＭのＬＬｎＬの存在を伴いもしくは伴わずに、ｒＡＡＶ−２もしくはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ルシフェラーゼ発現ウイルスに感染させた。感染４時間後に細胞をトリプシン処理し、ＰＢＳで２回洗浄し、その後１ｍｌのＲＩＰＡ緩衝液中で溶解した。ＨｅＬａ細胞ライセートからのウイルスをＢ１抗体で免疫沈降させ、そして抗ユビキチンモノクローナル抗体に対するウェスタンブロッティングにかけた。レーン１：ＬＬｎＬを伴わないｒＡＡＶ−２感染；レーン２：ＬＬｎＬを伴うｒＡＡＶ−２感染；レーン３：ＬＬｎＬを伴わない模擬感染細胞、レーン４：ＬＬｎＬを伴う模擬感染細胞；レーン５：ＬＬｎＬを伴わないｒＡＡＶ−２ｃａｐ５感染；レーン６：ＬＬｎＬを伴うｒＡＡＶ−２ｃａｐ５感染。図Ｂは、４０μＭのＬＬｎＬの存在（レーン１および３）もしくは非存在（レーン２および４）下でｒＡＡＶ−２（レーン１および２）もしくはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５（レーン３および４）に感染させたＨｅＬａ細胞からの低分子量Ｈｉｒｔ ＤＮＡのサザンブロット分析を提示する。ｒＡＡＶ−２もしくはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルス粒子へのインビトロユビキチン結合を図Ｃで実施した。ｒＡＡＶ−２もしくはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５の３×１０８粒子を画分ＩＩ（レーン１−７）もしくは画分ＩおよびＩＩ（レーン８−１４）酵素とともに３７℃で３０分もしくは２時間インキュベートし、そしてその後１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。ユビキチン化されたＡＡＶキャプシドタンパク質の増大された移動の大きさを、抗ＡＡＶキャプシドマウスモノクローナル抗体Ｂ１を用いるウェスタンブロッティングおよびＥＣＬ検出により可視化した。各結合反応の条件はゲルの下に示す。
【図１４】発明にかかる、ｒＡＡＶ−２もしくはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５ウイルス粒子へのインビトロユビキチン結合。ｒＡＡＶ−２（レーン３−６）もしくはｒＡＡＶ−２ｃａｐ５（レーン１１−１４）の３×１０８粒子を画分ＩＩもしくは画分ＩおよびＩＩ酵素とともに３７℃で２時間インキュベートし、そしてその後１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分離した。ユビキチン化されたＡＡＶキャプシドタンパク質の増大された移動の大きさを、抗ＡＡＶキャプシドマウスモノクローナル抗体Ｂ１を用いるウェスタンブロッティングおよびＥＣＬ検出により可視化した。沸騰水浴中で１０分間加熱することによりウイルスを前処理した場合に結合効率が増大した。各結合反応の条件はゲルの下に示す。
【図１５】発明にかかる、ＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃＣａｐ５（６×１０１０粒子）での感染（鼻吸引）およびＺ−ＬＬＬ（２００μＭ）の共投与の２週（Ａ）もしくは６週（Ｂ）後のマウス肺におけるルシフェラーゼ活性。各群について、ｎ＝１２。
【図１６】発明にかかる、ＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃＣａｐ５での感染およびＺ−ＬＬＬ（２００μＭ）の共投与の２週、６週もしくは３ヶ月後のマウス肺におけるルシフェラーゼ活性（詳細については図１５を参照されたい）。

Claims (67)

  1. 哺乳動物細胞のｒＡＡＶ形質導入を改変する方法であって：
    ＡＡＶキャプシドタンパク質および：
    ｉ）ＡＡＶの５’−ＩＴＲを含んでなる第１ＤＮＡセグメント；
    ｉｉ）ＡＡＶ配列を含まない第２ＤＮＡセグメント；および
    ｉｉｉ）ＡＡＶの３’−ＩＴＲを含んでなる第３ＤＮＡセグメント、
    を連結して含んでなる第１組換えＤＮＡ分子を含んでなり、ここで第１組換えＤＮＡ分子中のＩＴＲの少なくとも１つはＡＡＶのキャプシドタンパク質に関するＡＡＶの血清型とは異なるＡＡＶの血清型に由来する少なくとも１つのｒＡＡＶ、および薬剤と哺乳動物細胞を、ウイルスの形質導入を改変させるために有効な量で接触させることを含んでなる上記方法。
  2. 哺乳動物細胞のｒＡＡＶ形質導入を改変する方法であって：
    ＡＡＶ−５キャプシドタンパク質および：
    ｉ）ＡＡＶの５’−ＩＴＲを含んでなる第１ＤＮＡセグメント；
    ｉｉ）ＡＡＶ配列を含まない第２ＤＮＡセグメント；および
    ｉｉｉ）ＡＡＶの３’−ＩＴＲを含んでなる第３ＤＮＡセグメント、
    を連結して含んでなる第１組換えＤＮＡ分子を含んでなる少なくとも１つのｒＡＡＶ、および薬剤と哺乳動物細胞を、ウイルスの形質導入を改変させるために有効な量で接触させることを含んでなる上記方法。
  3. 細胞をさらに、ＡＡＶキャプシドタンパク質および：
    ｉ）ＡＡＶの５’−ＩＴＲを含んでなる第１ＤＮＡセグメント；
    ｉｉ）ＡＡＶ配列を含まないが、第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメント中の配列とは異なる配列を含んでなる第２ＤＮＡセグメント；および
    ｉｉｉ）ＡＡＶの３’−ＩＴＲを含んでなる第３ＤＮＡセグメント、
    を連結して含んでなる第２組換えＤＮＡ分子を含んでなるさらなるｒＡＡＶと接触させることを含んでなる請求項１または２に記載の方法。
  4. さらなるｒＡＡＶがシュードタイプ化ｒＡＡＶである請求項３に記載の方法。
  5. 第１組換えＤＮＡ分子中の第２ＤＮＡセグメントが、プロモーターに操作可能に連結されたオープンリーディングフレームの部分を含んでなる請求項３に記載の方法。
  6. 第１組換えＤＮＡ分子がオープンリーディングフレームの部分に対して３’側にスプライス供与部位を含んでなる、請求項５に記載の方法。
  7. 第２組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントが別のオープンリーディングフレームの部分に対して５’側にスプライス受容部位を含んでなり、これは第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントと一緒になって機能的なペプチドまたはポリペプチドをコードする請求項６に記載の方法。
  8. 第２組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントが、プロモーターに操作可能に連結されたオープンリーディングフレームの部分を含んでなる、請求項３に記載の方法。
  9. 第２組換えＤＮＡ分子がオープンリーディングフレームの部分に対して３’側にスプライス供与部位を含んでなる、請求項８に記載の方法。
  10. 第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントが別のオープンリーディングフレームの部分に対して５’側にスプライス受容部位を含んでなり、これは第２組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントと一緒になって機能的なペプチドまたはポリペプチドをコードする請求項９に記載の方法。
  11. 第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントがエンハンサーを含んでなり、そして第２組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントがオープンリーディングフレームを含んでなる、請求項３に記載の方法。
  12. 第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントがプロモーターを含んでなり、そして第２組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントがオープンリーディングフレームを含んでなる、請求項３に記載の方法。
  13. 第２組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントがエンハンサーを含んでなり、そして第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントがオープンリーディングフレームを含んでなる、請求項３に記載の方法。
  14. 第２組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントがプロモーターを含んでなり、そして第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントがオープンリーディングフレームを含んでなる、請求項３に記載の方法。
  15. 少なくとも１つのｒＡＡＶがキメラＩＴＲまたはキメラゲノムを有する、請求項３に記載の方法。
  16. ｒＡＡＶがキメラＩＴＲまたはキメラゲノムを有する、請求項１または２に記載の方法。
  17. 細胞が肺細胞、上皮細胞、筋肉細胞、肝臓細胞または神経細胞である、請求項１または２に記載の方法。
  18. 細胞が機能的なペプチドまたはポリペプチドを発現する請求項７に記載の方法。
  19. 機能的なペプチドまたはポリペプチドが治療用のペプチドまたはポリペプチドである、請求項１８に記載の方法。
  20. 機能的ポリペプチドが嚢胞性線維症膜コンダクタンス受容体、β−グロビン、γ−グロビン、チロシンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィンまたはエリスロポエチンである、請求項１９に記載の方法。
  21. 細胞が機能的なペプチドまたはポリペプチドを発現する請求項１０に記載の方法。
  22. 機能的なペプチドまたはポリペプチドが治療用のペプチドまたはポリペプチドである、請求項２１に記載の方法。
  23. 機能的ポリペプチドが嚢胞性繊維症膜貫通受容体、β−グロビン、γ−グロビン、チロシンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィンまたはエリトロポエチンである、請求項２２に記載の方法。
  24. オープンリーディングフレームが機能的なペプチドまたはポリペプチドをコードする請求項１１に記載の方法。
  25. 機能的なペプチドまたはポリペプチドが治療用のペプチドまたはポリペプチドである、請求項２４に記載の方法。
  26. 機能的ポリペプチドが嚢胞性繊維症膜貫通受容体、β−グロビン、γ−グロビン、チロシンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィンまたはエリトロポエチンである、請求項２５に記載の方法。
  27. オープンリーディングフレームが機能的なペプチドまたはポリペプチドをコードする請求項１２に記載の方法。
  28. 機能的なペプチドまたはポリペプチドが治療用ペプチドまたはポリペプチドである、請求項２７に記載の方法。
  29. 機能的ポリペプチドが嚢胞性繊維症膜貫通受容体、β−グロビン、γ−グロビン、チロシンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィンまたはエリトロポエチンである、請求項２８に記載の方法。
  30. オープンリーディングフレームが機能的なペプチドまたはポリペプチドをコードする請求項１３に記載の方法。
  31. 機能的なペプチドまたはポリペプチドが治療用のペプチドまたはポリペプチドである、請求項３０に記載の方法。
  32. 機能的ポリペプチドが嚢胞性繊維症膜貫通受容体、β−グロビン、γ−グロビン、チロシンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィンまたはエリトロポエチンである、請求項３１に記載の方法。
  33. オープンリーディングフレームが機能的なペプチドまたはポリペプチドをコードする請求項１４に記載の方法。
  34. 機能的ペプチドまたはポリペプチドが治療用ペプチドまたはポリペプチドである、請求項３３に記載の方法。
  35. 機能的ポリペプチドが嚢胞性繊維症膜貫通受容体、β−グロビン、γ−グロビン、チロシンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィンまたはエリトロポエチンである、請求項３４に記載の方法。
  36. 薬剤がウイルスの形質導入を強化する請求項１または２に記載の方法。
  37. 薬剤がプロテオソームインヒビターである請求項１または２に記載の方法。
  38. 薬剤がＬＬｎＬまたはＺ−ＬＬＬである請求項１または２に記載の方法。
  39. 薬剤がユビキチンの活性化、ユビキチンのユビキチンキャリアータンパク質への転移、ユビキチンリガーゼまたはそれらの組み合わせを阻害する、請求項１または２に記載の方法。
  40. 薬剤がユビキチンリガーゼを阻害する請求項１または２に記載の方法。
  41. 薬剤がＨ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｈ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−ＯＨまたはそれらの組み合わせである、請求項１または２に記載の方法。
  42. さらに形質導入を改変する薬剤の活性を強化する第２薬剤を投与することを含んでなる、請求項１または２に記載の方法。
  43. 第２薬剤がＥＧＴＡである請求項４２に記載の方法。
  44. 宿主細胞中で機能的ペプチドもしくはポリペプチドを発現させる方法であって：シュードタイプ化ｒＡＡＶの形質導入を改変する薬剤および少なくとも２つのｒＡＡＶと宿主細胞を、機能的ペプチドもしくはポリペプチドを発現させるために有効な量で接触させ、ここで少なくとも１つのｒＡＡＶはシュードタイプ化ｒＡＡＶであり、ここで１つのｒＡＡＶはＡＡＶキャプシドタンパク質および
    ｉ）ＡＡＶの５’−ＩＴＲを含んでなる第１ＤＮＡセグメント；
    ｉｉ）ＡＡＶ配列を含まない第２ＤＮＡセグメント、ここで第２ＤＮＡセグメントはエンハンサー、プロモーターまたはペプチドもしくはポリペプチドの少なくとも一部分をコードするオープンリーディングフレームの少なくとも一部分、またはそれらの組み合わせを含んでなり；および
    ｉｉｉ）ＡＡＶの３’−ＩＴＲを含んでなる第３ＤＮＡセグメント、
    を連結して含んでなる第１組換えＤＮＡ分子を含んでなり、ここで第１組換えＤＮＡ分子中のＩＴＲの少なくとも１つはＡＡＶのキャプシドタンパク質に関するＡＡＶの血清型とは異なるＡＡＶの血清型に由来し；
    ここで第２ｒＡＡＶはＡＡＶキャプシドタンパク質および：
    ｉ）ＡＡＶの５’−ＩＴＲを含んでなる第１ＤＮＡセグメント；
    ｉｉ）ＡＡＶ配列を含まないが、配列は第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメント中の配列とは異なる第２ＤＮＡセグメント、ここで第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントがオープンリーディングフレームの部分を含まない場合、第２組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントは機能的ペプチドもしくはポリペプチドをコードし、そしてここで第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントがオープンリーディングの部分をコードする場合、第２組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントは、第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントと一緒になって機能的なペプチドもしくはポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームの部分を含んでなり；および
    ｉｉｉ）ＡＡＶの３’−ＩＴＲを含んでなる第３ＤＮＡセグメント、
    を連結して含んでなる第２組換えＤＮＡ分子を含んでなる上記方法。
  45. 宿主細胞中で機能的ペプチドもしくはポリペプチドを発現させる方法であって：シュードタイプ化ｒＡＡＶの形質導入を改変する薬剤および少なくとも２つのｒＡＡＶと宿主細胞を、機能的ペプチドもしくはポリペプチドを発現するために有効な量で接触させ、ここで少なくとも１つのｒＡＡＶはシュードタイプ化ｒＡＡＶであり、ここで１つのｒＡＡＶはＡＡＶキャプシドタンパク質および
    ｉ）ＡＡＶの５’−ＩＴＲを含んでなる第１ＤＮＡセグメント；
    ｉｉ）ＡＡＶ配列を含まない第２ＤＮＡセグメント、ここで第２ＤＮＡセグメントはエンハンサー、プロモーターまたはペプチドもしくはポリペプチドの部分をコードするオープンリーディングフレームの少なくとも一部分、またはそれらの組み合わせを含んでなり；
    ｉｉｉ）ＡＡＶの３’−ＩＴＲを含んでなる第３ＤＮＡセグメント；
    を連結して含んでなる第１組換えＤＮＡ分子を含んでなり；そして
    ここで第２ｒＡＡＶはＡＡＶキャプシドタンパク質および：
    ｉ）ＡＡＶの５’−ＩＴＲを含んでなる第１ＤＮＡセグメント；
    ｉｉ）ＡＡＶ配列を含まないが、配列は第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメント中の配列とは異なる第２ＤＮＡセグメント、ここで第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントがオープンリーディングフレームの部分を含まない場合、第２組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントは機能的ペプチドもしくはポリペプチドをコードし、そしてここで第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントがオープンリーディングの部分をコードする場合、第２組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントは、第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントと一緒になって機能的なペプチドもしくはポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームの部分を含んでなり；および
    ｉｉｉ）ＡＡＶの３’−ＩＴＲを含んでなる第３ＤＮＡセグメント、
    を連結して含んでなる第２組換えＤＮＡ分子を含んでなり、ここで第２組換えＤＮＡ分子中の少なくとも１つのＩＴＲは、ＡＡＶキャプシドタンパク質に関するＡＡＶの血清型とは異なるＡＡＶの血清型に由来する上記方法。
  46. 第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントが、プロモーターに操作可能に連結されたオープンリーディングフレームの部分を含んでなる請求項４４または４５に記載の方法。
  47. 第１組換えＤＮＡ分子がオープンリーディングフレームの部分に対して３’側にスプライス供与部位を含んでなる、請求項４６に記載の方法。
  48. 第２組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントが別のオープンリーディングフレイムの部分に対して５’側にスプライス受容部位を含んでなり、これは第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントと一緒になって機能的なペプチドまたはポリペプチドをコードする請求項４７に記載の方法。
  49. 第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントがエンハンサーを含んでなり、そして第２組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントがオープンリーディングフレイムを含んでなる、請求項４４または４５に記載の方法。
  50. 第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントがプロモーターを含んでなり、そして第２組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントがオープンリーディングフレームを含んでなる、請求項４４または４５に記載の方法。
  51. 少なくとも１つのｒＡＡＶがキメラＩＴＲを有する、請求項４４または４５に記載の方法。
  52. 少なくとも１つのｒＡＡＶがキメラゲノムを有する、請求項４４または４５に記載の方法。
  53. 細胞が肺細胞、上皮細胞、筋肉細胞、肝臓細胞または神経細胞である、請求項４４または４５に記載の方法。
  54. 機能的ペプチドまたはポリペプチドが治療用ペプチドまたはポリペプチドである、請求項４４または４５に記載の方法。
  55. 機能的ポリペプチドが嚢胞性繊維症膜貫通受容体、β−グロビン、γ−グロビン、チロシンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィンまたはエリトロポエチンである、請求項６０に記載の方法。
  56. 薬剤がプロテオソームインヒビターである請求項４４または４５に記載の方法。
  57. 薬剤がＬＬｎＬまたはＺ−ＬＬＬである請求項４４または４５に記載の方法。
  58. 薬剤がユビキチンの活性化、ユビキチンのユビキチンキャリアータンパク質への転移、ユビキチンリガーゼまたはそれらの組み合わせを阻害する、請求項４４または４５に記載の方法。
  59. 薬剤がユビキチンリガーゼを阻害する請求項４４または４５に記載の方法。
  60. 薬剤がＨ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｈ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−ＯＨまたはそれらの組み合わせである、請求項４４または４５に記載の方法。
  61. さらに形質導入を改変する薬剤の活性を強化する第２薬剤を投与することを含んでなる、請求項４４または４５に記載の方法。
  62. 第２薬剤がＥＧＴＡである請求項６１に記載の方法。
  63. 内因性遺伝子産物の発現の不存在、または減少もしくは異常に関連する状態を抑制または処置する方法であって：シュードタイプ化ｒＡＡＶの形質導入を改変する薬剤および、対応する内因性遺伝子産物に関する機能的遺伝子産物の少なくとも一部分をコードする導入遺伝子を含んでなる少なくとも１つのｒＡＡＶと該状態の危険性がある、または状態を有する哺乳動物を、状態を抑制もしくは処置するために有効な量で接触させることを含んでなり、ここで少なくとも１つのｒＡＡＶはシュードタイプ化ｒＡＡＶであり、ここで１つのｒＡＡＶはＡＡＶキャプシドタンパク質および
    ｉ）ＡＡＶの５’−ＩＴＲを含んでなる第１ＤＮＡセグメント；
    ｉｉ）ＡＡＶ配列を含まない第２ＤＮＡセグメント、ここで第２ＤＮＡセグメントはエンハンサー、プロモーターまたは機能的遺伝子産物の少なくとも一部分をコードするオープンリーディングフレームの少なくとも一部分、またはそれらの組み合わせを含んでなり；および
    ｉｉｉ）ＡＡＶの３’−ＩＴＲを含んでなる第３ＤＮＡセグメント、
    を連結して含んでなる第１組換えＤＮＡ分子を含んでなり、ここで第１組換えＤＮＡ分子中のＩＴＲの少なくとも１つはＡＡＶのキャプシドタンパク質に関するＡＡＶの血清型とは異なるＡＡＶの血清型に由来し；
    ここで第２ｒＡＡＶはＡＡＶキャプシドタンパク質および：
    ｉ）ＡＡＶの５’−ＩＴＲを含んでなる第１ＤＮＡセグメント；
    ｉｉ）ＡＡＶ配列を含まないが、第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメント中の配列とは異なる配列を含んでなる第２ＤＮＡセグメント、ここで第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントがオープンリーディングフレームの部分を含まない場合、第２組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントは機能的遺伝子産物をコードし、そして第１組換えＤＮＡ分子中の第２ＤＮＡセグメントがオープンリーディングの部分をコードする場合、第２組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントは第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントと一緒になって機能的な遺伝子産物をコードするオープンリーディングフレームの部分を含んでなり；および
    ｉｉｉ）ＡＡＶの３’−ＩＴＲを含んでなる第３ＤＮＡセグメント、
    を連結して含んでなる第２組換えＤＮＡ分子を含んでなる上記方法。
  64. 内因性遺伝子産物の発現の不存在、または減少もしくは異常に関連する状態を抑制または処置する方法であって：シュードタイプ化ｒＡＡＶの形質導入を改変する薬剤および、対応する内因性遺伝子産物に関する機能的遺伝子産物の少なくとも一部分をコードする導入遺伝子を含んでなる少なくとも１つのｒＡＡＶと該状態の危険性がある、または状態を有する哺乳動物を、状態を抑制または処置するために有効な量で接触させることを含んでなり、ここで少なくとも１つのｒＡＡＶはシュードタイプ化ｒＡＡＶであり、ここで１つのｒＡＡＶはＡＡＶキャプシドタンパク質および
    ｉ）ＡＡＶの５’−ＩＴＲを含んでなる第１ＤＮＡセグメント；
    ｉｉ）ＡＡＶ配列を含まないがエンハンサー、プロモーターまたは機能的遺伝子産物の部分をコードするオープンリーディングフレームの少なくとも一部分、またはそれらの組み合わせを含んでなる第２ＤＮＡセグメント；
    ｉｉｉ）ＡＡＶの３’−ＩＴＲを含んでなる第３ＤＮＡセグメント；
    を連結して含んでなる第１組換えＤＮＡ分子を含んでなり；そして
    ここで第２ｒＡＡＶはＡＡＶキャプシドタンパク質および：
    ｉ）ＡＡＶの５’−ＩＴＲを含んでなる第１ＤＮＡセグメント；
    ｉｉ）ＡＡＶ配列を含まないが、第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメント中の配列とは異なる配列を含んでなる第２ＤＮＡセグメント、ここで第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントがオープンリーディングフレームの部分を含まない場合、第２組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントは機能的遺伝子産物をコードし、そして第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントがオープンリーディングの部分をコードする場合、第２組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントは、第１組換えＤＮＡ分子の第２ＤＮＡセグメントと一緒になって機能的な遺伝子産物をコードするオープンリーディングフレームの部分を含んでなり；および
    ｉｉｉ）ＡＡＶの３’−ＩＴＲを含んでなる第３ＤＮＡセグメント、
    を連結して含んでなる第２組換えＤＮＡ分子を含んでなり、ここで第２組換えＤＮＡ分子中の少なくとも１つのＩＴＲは、ＡＡＶキャプシドタンパク質に関するＡＡＶの血清型とは異なるＡＡＶの血清型に由来する上記方法。
  65. 導入遺伝子が嚢胞性繊維症膜貫通受容体、β−グロビン、γ−グロビン、チロシンヒドロキシラーゼ、グルコセレブロシダーゼ、アリールスルファターゼＡ、第ＶＩＩＩ因子、ジストロフィンまたはエリトロポエチンの少なくとも一部をコードする、請求項６３または６４に記載の方法。
  66. ＡＡＶキャプシドタンパク質および：
    ｉ）ＡＡＶの５’−ＩＴＲを含んでなる第１ＤＮＡセグメント；
    ｉｉ）ＡＡＶ配列を含まない第２ＤＮＡセグメント；および
    ｉｉｉ）ＡＡＶの３’−ＩＴＲを含んでなる第３ＤＮＡセグメント、
    を連結して含んでなる第１組換えＤＮＡ分子を含んでなり、ここで第１組換えＤＮＡ分子中のＩＴＲの少なくとも１つはＡＡＶキャプシドタンパク質に関するＡＡＶの血清型とは異なるＡＡＶの血清型に由来する少なくとも１つのｒＡＡＶ、および
    薬剤と、ウイルスの形質導入を改変させるために有効な量で接触させた細胞。
  67. ＡＡＶ−５キャプシドタンパク質および：
    ｉ）ＡＡＶの５’−ＩＴＲを含んでなる第１ＤＮＡセグメント；
    ｉｉ）ＡＡＶ配列を含まない第２ＤＮＡセグメント；および
    ｉｉｉ）ＡＡＶの３’−ＩＴＲを含んでなる第３ＤＮＡセグメント、
    を連結して含んでなる第１組換えＤＮＡ分子を含んでなる少なくとも１つのｒＡＡＶ、および薬剤と、ウイルスの形質導入を改変させるために有効な量で接触させた細胞。
JP2003512375A 2001-07-13 2002-07-12 シュードタイプ化アデノ関連ウイルスおよびその使用 Pending JP2004534543A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US30520401P 2001-07-13 2001-07-13
PCT/US2002/021926 WO2003006616A2 (en) 2001-07-13 2002-07-12 Pseudotyped adeno-associated viruses and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
JP2004534543A true JP2004534543A (ja) 2004-11-18

Family

ID=23179780

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2003512375A Pending JP2004534543A (ja) 2001-07-13 2002-07-12 シュードタイプ化アデノ関連ウイルスおよびその使用

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20030103939A1 (ja)
EP (1) EP1419245A4 (ja)
JP (1) JP2004534543A (ja)
CA (1) CA2453405A1 (ja)
WO (1) WO2003006616A2 (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7562558B2 (ja) 2019-04-12 2024-10-07 アセンド アドヴァンスト セラピーズ リミテッド プラスミドシステム

Families Citing this family (50)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6924128B2 (en) 1994-12-06 2005-08-02 Targeted Genetics Corporation Packaging cell lines for generation of high titers of recombinant AAV vectors
US6346415B1 (en) * 1997-10-21 2002-02-12 Targeted Genetics Corporation Transcriptionally-activated AAV inverted terminal repeats (ITRS) for use with recombinant AAV vectors
US6436392B1 (en) * 1998-05-20 2002-08-20 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors
US6893865B1 (en) 1999-04-28 2005-05-17 Targeted Genetics Corporation Methods, compositions, and cells for encapsidating recombinant vectors in AAV particles
WO2000075365A2 (en) * 1999-06-08 2000-12-14 University Of Iowa Research Foundation Compounds and methods to enhance raav transduction
US7122335B1 (en) 1999-06-08 2006-10-17 University Of Iowa Research Foundation Compounds and methods to enhance rAAV transduction
US7241447B1 (en) * 1999-10-07 2007-07-10 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors and uses thereof
US8241622B2 (en) * 2001-07-13 2012-08-14 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated virus vectors with intravector heterologous terminal palindromic sequences
JP2007524379A (ja) * 2003-03-31 2007-08-30 ユニバーシテイ・オブ・アイオワ・リサーチ・フアウンデーシヨン 上皮ナトリウムチャンネル関連障害のＰｈａｒｍｉｃｏ−遺伝子治療
WO2005007827A2 (en) * 2003-07-14 2005-01-27 University Of Georgia Research Foundation, Inc. Avian adeno-associated virus vector
US20050100890A1 (en) * 2003-10-15 2005-05-12 Davidson Beverly L. Methods for producing and using in vivo pseudotyped retroviruses
US8999678B2 (en) 2005-04-07 2015-04-07 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Method of increasing the function of an AAV vector
CA2651180A1 (en) * 2006-04-28 2007-11-08 University Of Iowa Research Foundation Methods and compounds to alter virus infection
ES2714007T3 (es) 2007-04-09 2019-05-24 Univ Florida Composiciones de vectores rAAV que tienen proteínas de la cápside modificadas en tirosina y métodos para su uso
US9725485B2 (en) 2012-05-15 2017-08-08 University Of Florida Research Foundation, Inc. AAV vectors with high transduction efficiency and uses thereof for gene therapy
US9611302B2 (en) 2007-04-09 2017-04-04 University Of Florida Research Foundation, Inc. High-transduction-efficiency RAAV vectors, compositions, and methods of use
US20100076061A1 (en) * 2008-04-30 2010-03-25 University Of Iowa Research Foundation Repeated administration of lentiviral vectors to respiratory cells
CA2762118A1 (en) 2008-05-20 2010-01-28 Eos Neuroscience, Inc. Vectors for delivery of light-sensitive proteins and methods of use
US9217155B2 (en) 2008-05-28 2015-12-22 University Of Massachusetts Isolation of novel AAV'S and uses thereof
MX2011009193A (es) * 2009-03-04 2011-12-16 Deutsches Krebsforsch Proteina activadora del ensamblaje (aap) y su uso para la fabricacion de particulas de parvovirus que consisten esencialmente de vp3.
US8734809B2 (en) 2009-05-28 2014-05-27 University Of Massachusetts AAV's and uses thereof
US9272053B2 (en) 2010-04-23 2016-03-01 University Of Massachusetts AAV-based treatment of cholesterol-related disorders
EP2561073B1 (en) 2010-04-23 2016-08-24 University of Massachusetts Cns targeting aav vectors and methods of use thereof
ES2661680T3 (es) 2011-04-21 2018-04-03 University Of Massachusetts Composiciones basadas en VAAr y métodos para tratar deficiencias de alfa-1 anti-tripsina
US10294281B2 (en) 2012-05-15 2019-05-21 University Of Florida Research Foundation, Incorporated High-transduction-efficiency rAAV vectors, compositions, and methods of use
US10072251B2 (en) 2014-02-19 2018-09-11 University Of Massachusetts Recombinant AAVS having useful transcytosis properties
EP4410805A2 (en) 2014-03-18 2024-08-07 University of Massachusetts Raav-based compositions and methods for treating amyotrophic lateral sclerosis
WO2015164786A1 (en) 2014-04-25 2015-10-29 University Of Massachusetts Recombinant aav vectors useful for reducing immunity against transgene products
US10689653B2 (en) 2014-06-03 2020-06-23 University Of Massachusetts Compositions and methods for modulating dysferlin expression
US10370432B2 (en) 2014-10-03 2019-08-06 University Of Massachusetts Heterologous targeting peptide grafted AAVS
US10711270B2 (en) 2014-10-03 2020-07-14 University Of Massachusetts High efficiency library-identified AAV vectors
EP3209311B1 (en) 2014-10-21 2024-03-06 University of Massachusetts Recombinant aav variants and uses thereof
WO2016126857A1 (en) 2015-02-03 2016-08-11 University Of Florida Research Foundation, Inc. Recombinant aav1, aav5, and aav6 capsid mutants and uses thereof
EP3256170B1 (en) 2015-02-13 2020-09-23 University of Massachusetts Compositions and methods for transient delivery of nucleases
CA3021949C (en) 2015-04-24 2023-10-17 University Of Massachusetts Modified aav constructs and uses thereof
US11253576B2 (en) 2015-10-22 2022-02-22 University Of Massachusetts Methods and compositions for treating metabolic imbalance in neurodegenerative disease
CA3002980A1 (en) 2015-10-22 2017-04-27 University Of Massachusetts Prostate-targeting adeno-associated virus serotype vectors
CA3011939A1 (en) 2016-02-02 2017-08-10 University Of Massachusetts Method to enhance the efficiency of systemic aav gene delivery to the central nervous system
WO2017139381A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 University Of Iowa Research Foundation Methods to produce chimeric adeno-associated virus/bocavirus parvovirus
US11060088B2 (en) 2016-02-12 2021-07-13 University Of Massachusetts Anti-angiogenic miRNA therapeutics for inhibiting corneal neovascularization
AU2017229347A1 (en) 2016-03-07 2018-11-01 University Of Iowa Research Foundation AAV-mediated expression using a synthetic promoter and enhancer
EP3440210A4 (en) 2016-04-05 2019-11-27 University of Massachusetts COMPOSITIONS AND METHODS FOR SELECTIVE INHIBITION OF EXPRESSION OF GRAINHEAD PROTEIN
US11413356B2 (en) 2016-04-15 2022-08-16 University Of Massachusetts Methods and compositions for treating metabolic imbalance
US11882815B2 (en) 2016-06-15 2024-01-30 University Of Massachusetts Recombinant adeno-associated viruses for delivering gene editing molecules to embryonic cells
US10457940B2 (en) 2016-09-22 2019-10-29 University Of Massachusetts AAV treatment of Huntington's disease
AU2017341849B2 (en) 2016-10-13 2024-03-21 University Of Massachusetts AAV capsid designs
US11142775B2 (en) 2017-01-13 2021-10-12 University Of Iowa Research Foundation Bocaparvovirus small noncoding RNA and uses thereof
US11859179B2 (en) 2017-05-09 2024-01-02 University Of Massachusetts Methods of treating amyotrophic lateral sclerosis (ALS)
AU2018338188A1 (en) 2017-09-22 2020-04-02 University Of Massachusetts SOD1 dual expression vectors and uses thereof
PL3722434T3 (pl) * 2019-04-12 2022-12-12 Freeline Therapeutics Limited Układ plazmidowy

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5173414A (en) * 1990-10-30 1992-12-22 Applied Immune Sciences, Inc. Production of recombinant adeno-associated virus vectors
US5604090A (en) * 1994-06-06 1997-02-18 Fred Hutchinson Cancer Research Center Method for increasing transduction of cells by adeno-associated virus vectors
US5843742A (en) * 1994-12-16 1998-12-01 Avigen Incorporated Adeno-associated derived vector systems for gene delivery and integration into target cells
US6083702A (en) * 1995-12-15 2000-07-04 Intronn Holdings Llc Methods and compositions for use in spliceosome mediated RNA trans-splicing
US6287569B1 (en) * 1997-04-10 2001-09-11 The Regents Of The University Of California Vaccines with enhanced intracellular processing
US6156303A (en) * 1997-06-11 2000-12-05 University Of Washington Adeno-associated virus (AAV) isolates and AAV vectors derived therefrom
US6200560B1 (en) * 1998-10-20 2001-03-13 Avigen, Inc. Adeno-associated virus vectors for expression of factor VIII by target cells
WO2001025465A1 (en) * 1999-10-07 2001-04-12 University Of Iowa Research Foundation Adeno-associated viruses and uses thereof
WO2001027303A1 (en) * 1999-10-12 2001-04-19 The University Of North Carolina At Chapel Hill Adeno-associated virus vectors encoding factor viii and methods of using the same
US20020076754A1 (en) * 2000-04-20 2002-06-20 Liangwu Sun Overcoming AAV vector size limitation through viral DNA hetero-dimerization
AU2001255575B2 (en) * 2000-04-28 2006-08-31 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Recombinant aav vectors with aav5 capsids and aav5 vectors pseudotyped in heterologous capsids

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7562558B2 (ja) 2019-04-12 2024-10-07 アセンド アドヴァンスト セラピーズ リミテッド プラスミドシステム

Also Published As

Publication number Publication date
WO2003006616A3 (en) 2003-11-20
WO2003006616A2 (en) 2003-01-23
EP1419245A2 (en) 2004-05-19
EP1419245A4 (en) 2006-04-05
US20030103939A1 (en) 2003-06-05
CA2453405A1 (en) 2003-01-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10793835B2 (en) Chimeric adeno-associated virus/ bocavirus parvovirus vector
JP2004534543A (ja) シュードタイプ化アデノ関連ウイルスおよびその使用
US20240002882A1 (en) Methods to produce chimeric adeno-associated virus/bocavirus parvovirus
US7749491B2 (en) Compounds and methods to enhance rAAV transduction
US8236557B2 (en) Hybrid-AAV vectors to deliver large gene expression cassette
JP4969002B2 (ja) ｒＡＡＶ形質導入を増加するための化合物および方法
US11999965B2 (en) Bocaparvovirus small noncoding RNA and uses thereof
KR20160033217A (ko) 변종 ａａｖ 및 조성물, 세포, 기관 및 조직으로의 유전자 전이를 위한 방법 및 용도
JP2008506363A (ja) ベクター内非相同末端パリンドローム配列を有するアデノ随伴ウイルスベクター
Yan et al. Establishment of a high-yield recombinant adeno-associated virus/human bocavirus vector production system independent of bocavirus nonstructural proteins
US7122335B1 (en) Compounds and methods to enhance rAAV transduction
US20210163984A1 (en) Compositions for reducing sarcolipin expression and preventing and treating muscular dystrophy and cardiomyopathy and methods of use
AU2002320417A1 (en) Pseudotyped adeno-associated viruses and uses thereof