JP2008506363A

JP2008506363A - ベクター内非相同末端パリンドローム配列を有するアデノ随伴ウイルスベクター

Info

Publication number: JP2008506363A
Application number: JP2007511093A
Authority: JP
Inventors: エンゲルハート，ジヨン・エフ; ヤン，ツイーイング
Original assignee: ユニバーシテイ・オブ・アイオワ・リサーチ・フアウンデーシヨン
Priority date: 2004-04-30
Filing date: 2005-05-02
Publication date: 2008-03-06
Also published as: CA2562788A1; US20040248301A1; WO2005111220A2; US8241622B2; EP1756288A2; AU2005243221A1; WO2005111220A3

Abstract

本発明は組み換えＡＡＶベクター（その少なくとも１つは非相同末端パリンドローム配列を有する）およびこれらのベクターを使用する方法を提供する。

Description

［関連出願へのクロスリファレンス］
本願は、２００４年４月３０日に出願された米国出願第１０／８３７，０２９号の出願日の利益を請求し、その開示は本明細書に引用することにより組み込まれる。

［政府権利の申し立て］
本発明は、米国政府からの助成（国立衛生研究所からの助成ＨＬ５８３４０およびＤＫ５４７５９）で少なくとも一部分行われた。政府は、本発明におけるある種の権利を有し得る。

アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、アデノウイルスもしくはヘルペスウイルスのようなヘルパーウイルスの存在下で複製するヘルパー依存性の生活環を有する一本鎖ＤＮＡパルボウイルスである（非特許文献１；非特許文献２）。２型ＡＡＶ（ＡＡＶ−２）ＤＮＡゲノムは４６８１ヌクレオチドの長さであり、そして１４５ヌクレオチドの長さの逆方向末端反復配列（ＩＴＲ）の同一の５’および３’コピーならびにｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の２つの主要なオープンリーディングフレームを含有する４３９１ヌクレオチドのユニーク配列を含む（非特許文献３；非特許文献４）。このユニーク領域は、ｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するために用いられる３つの転写プロモーターｐ_５、ｐ_１９およびｐ_４０を含有する。ＩＴＲは、二次ステムループ構造を形成することができるパリンドローム配列を含有し、そして機能性複製起点（ｏｒｉ）を提供するためにシスに必要とされる。さらに、ＡＡＶＩＴＲはまた、キャプシド封入（ｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｏｎ）、組込み、および宿主細胞染色体もしくは組み換えプラスミドのいずれかからのｒＡＡＶのレスキューに必要な配列も提供する。ＡＡＶＩＴＲ配列は、２つの異なる面で機能する。第一に、上記のように、ＩＴＲ配列はＡＡＶ生産、組み立ておよびパッケージングに必要とされる。第二に、ＡＡＶＩＴＲは宿主細胞における連結導入遺伝子の存続および発現において機能する。

アデノウイルスのようなヘルパーの存在下での増殖性ＡＡＶ感染において、感染する親ＡＡＶ一本鎖ゲノムは、ヘアピン構造を形成するＩＴＲの能力の結果として自己プライミング機序により親二本鎖複製型（ＲＦ）に転化される（非特許文献５；非特許文献６）。次に、親ＲＦ分子は、ヘルパー機能とＡＡＶｒｅｐ遺伝子産物、Ｒｅｐ７８およびＲｅｐ６８の両方を必要とするプロセスにおいて子孫ＲＦ分子の大きいプールを形成するように増幅される。ＡＡＶＲＦゲノムは頭部−頭部もしくは尾部−尾部マルチマーもしくはコンカテマーの混合物であり、そして前もって形成された空のＡＡＶキャプシドにパッケージングされる子孫一本鎖（ＳＳ）ＤＮＡゲノムの前駆体である。Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０は、前もって形成されたキャプシドと相互作用してＤＮＡパッケージングのためのＤＮＡヘリカーゼ機能を提供する（非特許文献７；非特許文献８）。

ＡＡＶ複製および組み立ての反応速度論は調べられている。ＡＡＶおよびアデノウイルスを同時に感染させたヒトＨｅＬａもしくは２９３細胞において、３相の増殖周期がある。最初の８〜１０時間に、細胞はＥ１、Ｅ２Ａ、Ｅ４およびＶＡＲＮＡを包含するアデノウイルス遺伝子のサブセットの発現の結果としてＡＡＶ複製に許容状態になる。この期間中に、感染するＡＡＶゲノムは、自己対合ヘアピンを形成することができる、ＩＴＲにより提供される末端塩基対合３’ヒドロキシル基から自己プライミングにより最初の親二本鎖ＲＦＤＮＡに転化される。この最初の二本鎖ゲノム生成はまた、ＡＡＶタンパク質
の転写および発現の鋳型も提供する。感染後約１０〜２０時間の第二相において、多量のＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐタンパク質が合成され、そして一定レベルまでのモノマーおよびコンカテマー二本鎖ＡＡＶＲＦゲノムの大増幅がある。１６〜３０時間の間のＡＡＶ増殖の第三相の間に、一本鎖子孫分子が鎖置換複製機序により合成され、そして前もって形成されたキャプシドにパッケージングされ、続いて成熟した感染性ＡＡＶ粒子が蓄積する（非特許文献９；非特許文献６）。Ｒｅｐ６８およびＲｅｐ７８はＩＴＲに結合し、そして成熟鎖の５’末端である部位でＲＦ分子におけるヘアピンを切断する部位特異的鎖特異的エンドヌクレアーゼである。さらに、これらのタンパク質は、酵素活性にとって重要であるがＩＴＲへの結合には重要ではないＡＴＰ結合部位を含有する。さらに、Ｒｅｐ７８および６８はＤＮＡおよびＲＮＡヘリカーゼ活性の両方を有する。Ｒｅｐタンパク質はまた、転写も調節する（非特許文献５；非特許文献１０；非特許文献１１；非特許文献１２；非特許文献１３）。Ｒｅｐ７８はｐ５プロモーターの、すなわちそれ自体の合成の負の自己調節因子であるが、キャプシドタンパク質生産を高めるためのｐ４０プロモーターのアクチベーターである。Ｒｅｐ５２およびＲｅｐ４０はＩＴＲに結合しないが、成熟粒子の組み立てにおいてヘリカーゼを提供する。また、より小さいｒｅｐタンパク質は抗リプレッサーであり、そしてＲｅｐ７８によるｐ５の負の自己調節を阻止する。興味のある導入遺伝子が隣接する５’および３’ＩＴＲ配列のみを含有するｒＡＡＶベクターは、ｒｅｐおよびｃａｐ機能がトランスに許容細胞に提供されることを除いて野生型ＡＡＶと同様に複製される。

選択圧の不在下で、組み換えＡＡＶ（ｒＡＡＶ）ベクターは一般にエピソームゲノムとして存続する。現在、多数の研究により、ｒＡＡＶベクターはインビボで投与した場合に長期間にわたって存続できること、および存続するベクターゲノムの主要な形態は、環状である頭部−尾部コンカテマーであるマルチマー構造のようであることが示されている。これらの頭部−尾部マルチマーがどのようにして形成されるかは不明であるが、通常のＡＡＶ複製プロセスはｒｅｐタンパク質を必要とし、そして頭部−頭部もしくは尾部−尾部コンカテマーのみを与えるのでそれに関連するはずはない。環状コンカテマーが、ＡＡＶ組込みに示唆されているように、組込み中間体であるかどうかもまた不明である。しかしながら、入手可能な証拠は、これらの頭部−尾部コンカテマーの大部分がエピソームであることおよび肝臓もしくは筋肉のような臓器におけるベクターの組込まれたコピーが非常にまれであることを示す（非特許文献１４；非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１；非特許文献２２；非特許文献２３；非特許文献２４；非特許文献２５；非特許文献２６；非特許文献２７；非特許文献２８；非特許文献２９；非特許文献３０；非特許文献３１）。

ｒＡＡＶに基づくベクターシステムは、１０年以上にわたってヒト遺伝子治療用に大いに注目されている。現在、ｒＡＡＶベクターは８つの異なる血清型から作製されているが（非特許文献３２；非特許文献３３）、ｒＡＡＶ−２は遺伝子導入ベクターとして最も広く研究されており、そして嚢胞性線維症（非特許文献１３；非特許文献３４；非特許文献３５）およびＢ型血友病（非特許文献３６；非特許文献３７）の臨床試験において使用されている。過去１０年間にわたって、ＡＡＶの分子ウイルス学の知識は著しく拡大している。受容体相互作用、細胞内輸送およびゲノム転化の様々な面の洞察により、ｒＡＡＶベクターシステムの設計および性能の改善がもたらされている。例えば、ｒＡＡＶ−２ゲノム転化の分子機序を評価する研究により、線状および／もしくは環状コンカテマー化を伴う潜伏ウイルスゲノム存続のユニークな機序が明らかにされている（非特許文献２６；非特許文献３８）。ｒＡＡＶゲノムコンカテマー化の分子機序を評価する研究により、このプロセスは自己プライミング複製とは対照的に２つの独立したウイルスゲノムの分子間連結によって起こることが示されている（非特許文献３８）。この重要な発見により、ｒＡＡＶベクターの４．７ｋｂのパッケージング制限を越える導入遺伝子カセットを送達するためにデュアルベクターヘテロダイマー化方法の開発がもたらされている。この革新的な
方法は、別個にコードされる導入遺伝子エキソンを同じ細胞に送達するために２つの独立したベクターを利用し、これらのベクターは、分子間組み換えにより形成されるヘテロダイマーゲノムにわたるトランス−スプライシングにより導入遺伝子産物を再構成することができる（非特許文献３９）。そのような方法は単一のＡＡＶベクターの容量を効果的に倍にしており、そして筋肉（非特許文献４０；非特許文献４１；非特許文献４２）、肝臓（非特許文献４３）、眼（非特許文献４４）および肺においてレポーター遺伝子で成功裡に試験されている。これらの研究は、嚢胞性線維症、デュシェンヌ型筋ジストロフィーおよび血友病Ａ（これらの全ては、単一のｒＡＡＶベクターのパッケージング容量に匹敵するかもしくは越える大きいｃＤＮＡ発現カセットの送達を必要とする）のような疾患に対するデュアルトランス−スプライシングベクターの適用の道を開いている。

デュアルｒＡＡＶベクター方法の有望な見込みにもかかわらず、現在のシステムからの遺伝子発現のレベルは、単一のベクター内でコードされる導入遺伝子の送達より実質的に低いままである。現在、いくつかの因子がデュアルベクターヘテロダイマー化方法の効率を限定する。第一に、感染多重度は、両方の送達されるベクターが同じ細胞に感染するように十分に高くなければならない。第二に、デュアルベクタートランス−スプライシング方法との関連で、機能性導入遺伝子の生成は正しい方向の２つのウイルスゲノムの連結に方向的に依存する。同じ方向の２つのミニ遺伝子エキソンを含有するデュアルベクターでは、尾部−頭部（Ｔ−Ｈ）組み換え事象により形成されるヘテロダイマーのみがトランス−スプライシングによって活性の再構成された導入遺伝子産物をもたらすことができる。Ｔ−Ｈ配向ヘテロダイマーおよびより大きいコンカテマーの比率を増加することを目指す方法は、導入遺伝子産物のデュアルベクタートランス−スプライシング送達の効率をおそらく改善し得るが、ｒＡＡＶゲノムの分子間組み換えに関与する機序はほとんど分からないままである。筋肉における以前の研究は、ダブル−Ｄ（ｄｏｕｂｌｅ−Ｄ）構造を有するモノマー環状ウイルスゲノム中間体がエピソームで安定なコンカテマーの形成の前駆体であり得ることを示唆している（非特許文献２６；非特許文献４２）。これらの研究において、分子間組み換えは時間依存的にモノマー環状ゲノム間で起こり、高分子量環状コンカテマーをもたらすようであった。対照的に、ｒＡＡＶおよび線状ＡＡＶ様ゲノムでの肝臓における研究は、コンカテマー化がＩＴＲから独立しており、そして主に線状分子間末端−末端ライゲーションを伴い得ることを示唆している（非特許文献４３；非特許文献４５）。これら２つの機序ならびにコンカテマーの分子構造における潜在的な組織特異的相違の明確な説明は、ｒＡＡＶデュアルベクター方法の効率を改善するために重要であり得る。

必要とされることは、一般にｒＡＡＶベクターならびにｒＡＡＶデュアルベクター技術の効率を上げる方法である。

Ｂｅｒｎｓｅｔａｌ．，１９９６Ｃａｒｔｅｒｅｔａｌ．，２０００Ｓｒｉｖａｓｔａｖａｅｔａｌ．，１９８３Ｓｍｕｄａｅｔａｌ．，１９９１Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２Ｃａｒｔｅｒｅｔａｌ．，１９８９Ｍｙｅｒｓｅｔａｌ．，１９８０Ｋｉｎｇｅｔａｌ．，２００１Ｒｅｄｅｍａｎｎｅｔａｌ．，１９９８Ｃａｒｔｅｒｅｔａｌ．，１９９２Ｆｌｏｔｔｅｅｔａｌ．，１９９５Ｈａｌｌｅｋｅｔａｌ．，１９９８Ｆｌｏｔｔｅｅｔａｌ．，１９９６Ｆｌｏｔｔｅｅｔａｌ．，１９９３Ａｆｉｏｎｅｅｔａｌ．，１９９６Ｋａｐｌｉｔｔｅｔａｌ．，１９９４Ｘｉａｏｅｔａｌ．，１９９６Ｋｅｓｓｌｅｒｅｔａｌ．，１９９６Ｋｏｅｒｂｅｒｌｅｔａｌ．，１９９７Ｐｏｎｎａｚｈａｇａｎｅｔａｌ．，１９９７Ｚａｄｏｒｉｅｔａｌ．，２００１Ｆｉｓｈｅｒｅｔａｌ．，１９９７Ｈｅｒｚｏｇｅｔａｌ．，１９９７Ｓｎｙｄｅｒｅｔａｌ．，１９９７Ｍｉａｏｅｔａｌ．，１９９８Ｄｕａｎｅｔａｌ．，１９９８Ｄｕａｎｅｔａｌ．，１９９９Ｖｉｎｃｅｎｔ−Ｌａｃａｚｅｅｔａｌ．，１９９９ＭｃＫｅｏｎｅｔａｌ．，１９９６Ｎａｋａｉｅｔａｌ．，２００１Ｓｃｈｎｅｐｐｅｔａｌ．，２００３Ｃｈａｏｅｔａｌ．，２０００Ｇｒｉｍｍｅｔａｌ．，２００３Ｗａｇｎｅｒｅｔａｌ．，１９９９Ｗａｇｎｅｒｅｔａｌ．，１９９８Ｈａｇｓｔｒｏｍｅｔａｌ．，２０００Ｋａｙｅｔａｌ．，２０００Ｙａｎｇｅｔａｌ．，１９９９Ｙａｎｅｔａｌ．，２００２Ｄｕａｎｅｔａｌ．，２０００Ｓｕｎｅｔａｌ．，２０００Ｙａｎｅｔａｌ．，２０００Ｎａｋａｉｅｔａｌ．，２００３Ｒｅｉｃｈｅｔａｌ．，２００３Ｎａｋａｉｅｔａｌ．，２０００

［発明の要約］
本発明は、興味のある配列に隣接する末端パリンドローム配列（ＴＰＳ）を有するｒＡＡＶベクターのセットを提供し、これらのベクターは、宿主細胞、宿主細胞溶解物もしくは宿主に導入した場合に、ベクターの各々における少なくとも１つのＴＰＳ間の方向性（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）ベクター間相同性のために、例えば細胞の核内で、頭部−尾部（もしくは尾部−頭部）コンカテマーの形成の増加をもたらす。ベクター内相同５’および３’ＴＰＳを有する当該技術分野において既知であるｒＡＡＶベクターと異なり、本発明は、興味のある核酸セグメントに隣接する非相同５’および３’ＴＰＳを含有するｒＡＡＶベクター（ベクター内非相同ＴＰＳＡＡＶベクターと本明細書において呼ばれる）を含むようにセットにおけるベクターの少なくとも１つを提供する。本明細書において用いる場合、「末端パリンドローム配列」もしくは「ＴＰＳ」は、二次構造、場合により天然のＡＡＶＴＰＳに存在するステムもしくはステムループ構造を形成することができ、そしてウイルスゲノムに存在する場合に、そのゲノムのパッケージングもしくは複製、および／またはプロウイルスレスキューを実質的に妨げない、すなわち、ベクター内非相同ＴＰＳｒＡＡＶベクターが、適切なウイルスおよび／もしくは細胞タンパク質の存在下でパッケージングされそして複製されることができる、ＡＡＶベクターの５’もしくは３
’末端に存在するパリンドローム配列（ＰＳ）である。例えば、ベクター内非相同ＴＰＳは、相互に７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％もしくは５％未満を包含する８０％未満の核酸配列同一性を有するか、または核酸配列同一性がなく、そして１つの態様として、ベクターにおける少なくとも１つのＴＰＳは、二次構造を形成する天然のＡＡＶＴＰＳにおける配列に７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％もしくは５％未満を包含する８０％未満の核酸配列同一性を有するか、または核酸配列同一性がない。参照配列に対してポリヌクレオチドもしくはポリペプチド配列の核酸およびアミノ酸配列同一性もしくは相同性を決定することは当該技術分野の技量の範囲内である。本明細書において用いる場合、「方向性ベクター間相同性」は、２つもしくはそれ以上のベクターのセットの１つのベクターの５’ＴＰＳもしくは３’ＴＰＳの、セットの第二のベクターのそれぞれ３’ＴＰＳもしくは５’ＴＰＳとの核酸配列の方向性をさし、ここで、第一のベクターの５’ＴＰＳもしくは３’ＴＰＳおよび第二のベクターの３’ＴＰＳもしくは５’ＴＰＳは相同であり、すなわち、相同なＴＰＳは頭部−尾部もしくは尾部−頭部方向性である。場合により、第一のベクターの５’ＴＰＳおよび第二のベクターの３’ＴＰＳは相同であり、そして第一のベクターの３’ＴＰＳおよび第二のベクターの５’ＴＰＳは相同である。

従って、セットにおけるｒＡＡＶベクターの少なくとも１つは非相同ＴＰＳを有し、そしてセットにおける１つのベクターの少なくとも１つのＴＰＳはセットのもう１つのベクターにおける１つのＴＰＳに相同であり、すなわち、ベクター間ＴＰＳ相同性がある。相同なＰＳは、細胞、細胞抽出物もしくは宿主における単一のベクターに存在する場合に、それらがベクター内非相同ＰＳに対して増加した効率で分子内組み換えを受けるように十分な配列相同性を有するＰＳであり、例えば、相同なＰＳは相互に少なくとも８０％もしくはそれ以上、例えば８５％、９０％、９５％そして１００％までの核酸配列同一性を有し、それによりこれらのＰＳ間の組み換えを容易にする。相同なＰＳは、天然のＡＡＶＩＴＲ血清型に存在するＩＴＲにおけるＰＳもしくは他のパルボウイルスのＰＳの相同性をさすために用いることができる。

従って、本発明のベクターにおいて有用なＰＳには、ＡＡＶもしくはヒトＢ１９パルボウイルス、イヌパルボウイルスもしくはマウスの微小ウイルスのような別のパルボウイルスのＩＴＲにおけるＰＳ、アデノウイルスもしくはワクシニアウイルスのようなポックスウイルスからのＰＳのような、ＡＡＶ以外のウイルスに存在するＰＳのような天然のＰＳ（すなわち、天然に存在する配列）、ならびにシュード（ｐｓｅｕｄｏ）ＰＳと本明細書において呼ばれる合成配列（すなわち、天然に存在しないもの）、およびその改変形態、例えば活性、例えばプロモーター、エンハンサー、インテグラーゼの組込み部位、例えばＣｒｅもしくはＦｌｐリコンビナーゼの部位、遺伝子産物のオープンリーディングフレーム、またはその組み合わせを有するかもしくはコードする配列の挿入を有するＰＳが包含される。従って、「シュードＰＳ」は、二次構造を形成する天然のＡＡＶＴＰＳにおける配列に対して７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％もしくは５％未満を包含する８０％未満の核酸配列同一性を共有するか、または核酸配列同一性を共有しない、不完全なパリンドローム配列を包含する、パリンドロームＤＮＡ配列である。

１つの態様として、興味のある核酸セグメントに隣接する非相同ＴＰＳを有するｒＡＡＶベクター（「第一の」ｒＡＡＶベクター）は、細胞、細胞溶解物もしくは宿主に第一のｒＡＡＶベクターの５’および／もしくは３’ＴＰＳのいずれかとの方向性ベクター間相同性ならびに興味のある異なる核酸配列を有する１つもしくはそれ以上のｒＡＡＶベクターと導入した場合に、頭部−尾部コンカテマーの形成および興味のある核酸セグメントの方向性配置（すなわち、同じ５’→３’配置における）の増加をもたらす。従って、宿主細胞、宿主細胞溶解物もしくは宿主への方向性ＴＰＳを含有する本発明のベクターのセットの導入は、宿主細胞、宿主細胞溶解物もしくは宿主に導入した場合に頭部−頭部、尾部
−尾部および頭部−尾部コンカテマーの混合物をもたらす相同なＴＰＳを含有する単一のベクターセットまたは非相同ＴＰＳを含有する単一のベクターセットに対して、頭部−尾部コンカテマーの比率、数、存続および／もしくは転写活性の増加をもたらす。頭部−尾部コンカテマー形成の増加は、本発明のベクターを含有する宿主細胞、宿主細胞溶解物もしくは宿主における興味のある核酸セグメント（１つもしくは複数）の発現の増加もしくは存続をもたらすことができる。

従って、ベクター内非相同ＴＰＳｒＡＡＶベクターにおける５’−３’ＴＰＳ配列同一性の減少もしくは欠如の結果として、細胞もしくはその抽出物において、ベクター内非相同ＴＰＳｒＡＡＶベクターは、相同なＴＰＳを有する対応するｒＡＡＶベクターに対して分子内組み換えによって環状モノマーを形成する減少した効率を有する。例えば、ベクター内非相同ＴＰＳを有するベクターは、細胞に存在する場合に、対応するベクター内相同ＴＰＳを有するベクター、例えば、５’および３’ＴＰＳが配列同一性を有するベクターに対して環状ゲノムを形成する減少した能力、例えば、少なくとも１０倍、２０倍、５０倍、６０倍もしくはそれ以上減少した能力を有する。

従って、本発明は、調節要素を含むことができる興味のある核酸セグメントに隣接する５’ＴＰＳおよび３’ＴＰＳ、天然のＡＡＶＤ配列のような少なくとも１つのＡＡＶゲノムキャプシド封入シグナルおよび／もしくは場合により適切なＲｅｐタンパク質と相互作用して前もって形成されたｒＡＡＶキャプシドに一本鎖ｒＡＡＶゲノムを巻き込む異種（例えば非ＡＡＶ）配列もしくは構造（キャプシド封入機能）、例えばＰ１配列（ＷＯ００／６５０３８を参照）、ならびにＡＡＶＩＴＲ末端分離部位（「ｔｒｓ」）配列として機能し、そしてＡＡＶＲｅｐタンパク質により認識されることができ、そしてウイルスキャプシドに効率よくパッケージングされることができるＡＡＶゲノムをもたらすようにＲｅｐにより切断されることができる少なくとも１つの部位、構造もしくは二次構造を含むｒＡＡＶベクターを提供し、そしてここで、ベクター内非相同ＴＰＳベクターでは、ｒＡＡＶベクター内の５’ＴＰＳおよび３’ＴＰＳは対称的ではなく、すなわち、それらは１００％の配列相補性を有さない。従って、例えば、ＡＡＶ−２ゲノムからの５’ＴＰＳ（比較のためにＤ配列を欠く）およびＡＡＶ−５ゲノムからの３’ＴＰＳ（比較のためにＤ配列を欠く）を有するベクターは、非相同ＴＰＳを有するベクターである。キャプシド封入および末端分離部位は、感染性ウイルス子孫の生産のためにＴＰＳ配列内で必要とされ、ベクターを切断しそしてキャプシド封入する代わりの方法がトランスに提供される場合には宿主細胞に送達される遺伝子治療ｒＡＡＶベクターから削除できることを当業者は認識する。

米国特許第６，４３６，３９２号およびＷＯ０１／２５４６５に記述されているようなデュアルベクター方法において利用する場合、細胞に興味のある核酸セグメント、例えば導入遺伝子のような遺伝要素を導入するためにベクター内非相同ＴＰＳｒＡＡＶベクターを１つもしくはそれ以上の他のｒＡＡＶベクターとともに用いることができる。１つの態様として、本発明のｒＡＡＶベクターは方向性ベクター間相同性を有して構築され、例えば、第一のｒＡＡＶベクターの３’ＴＰＳは、各ベクターの５’および３’ＴＰＳ間の核酸セグメントが細胞、細胞溶解物もしくは宿主への導入後にＴＰＳに５’−３’の方向性で連結されるようになるように第二のｒＡＡＶベクター（これは場合によりベクター内非相同ＴＰＳベクターであってもよい）の５’ＴＰＳに相同であり、ここで、ベクターの少なくとも１つはベクター内非相同ＴＰＳＡＡＶベクターである。あるいはまた、ベクター間ＴＰＳ相同性を有する２つのベクターにおけるＴＰＳが隣接する核酸セグメントは、両方ともＴＰＳにアンチセンスの方向性であることができる。１つの態様として、セットにおけるｒＡＡＶベクターの１つはベクター内相同ＴＰＳＡＡＶベクターである。１つの態様として、２つより多くのｒＡＡＶベクターがセットに用いられ、その少なくとも１つはベクター内非相同ＴＰＳＡＡＶベクターであり、そしてその少なくとも２つは
、いったんこれらのベクターが細胞もしくは細胞抽出物に存在すると分子間組み換えのためにベクターにおけるＴＰＳ間の核酸セグメントが方向的に配置されるようになる（５’−３’もしくは３’−５’）ようにベクター間ＴＰＳ相同性を有する。

従って、セットの２つもしくはそれ以上の適切に選択されたｒＡＡＶベクターにおけるベクター内ＴＰＳ非相同性（例えば、第一のＡＡＶベクターはベクター内非相同ＴＰＳＡＡＶベクターであり、そして場合によりベクター内非相同ＴＰＳベクターであってもよい第二のｒＡＡＶベクターは、第一のｒＡＡＶベクターにおけるＴＰＳの１つに相同である１つのＴＰＳを有する）は、方向性分子間組み換えによって頭部−尾部コンカテマー（キメラＤＮＡ分子）、例えば線状コンカテマーの収率を上げることができる。例えば、興味のある第一の核酸セグメント、例えば遺伝子調節配列、またはオープンリーディングフレームもしくはその一部に連結された５’ＴＰＳ（配列１）および３’ＴＰＳ（配列２）を有する第一のベクター内非相同ＴＰＳｒＡＡＶベクター、ならびに第二の３’ＴＰＳ（配列１）に連結された興味のある第二の核酸セグメントに連結された第二の５’ＴＰＳ（配列２）を有する第二のベクター内非相同ＴＰＳｒＡＡＶベクターは、細胞への導入後に、当該技術分野において記述されているが相同なＴＰＳがアニーリングした後の鎖フィルインのような他の機序により起こることもできるような、方向性相同的組み換えを受けることができ、以下の方向性：３’配列１に連結された第二の核酸セグメントに連結された配列２の少なくとも一部に連結された第一の核酸セグメントにその少なくとも一部が場合により連結されていてもよい配列１に連結された第二の核酸セグメントに連結された配列２の少なくとも一部に連結された第一の核酸セグメントに連結された配列１５’の各ベクターからの配列を含むキメラＤＮＡ分子をもたらす。同様に、３つ（もしくはそれ以上の）異なるベクター内非相同ＴＰＳＡＡＶベクターを用いることができる。例えば、興味のある第一の核酸セグメント、例えば遺伝子調節配列、またはオープンリーディングフレームもしくはその一部に連結された５’ＴＰＳ（配列１）および３’ＴＰＳ（配列２）を有する第一のベクター内非相同ＴＰＳｒＡＡＶベクター、第二の３’ＴＰＳ（配列３）に連結された興味のある第二の核酸セグメントに連結された第二の５’ＴＰＳ（配列２）を有する第二のベクター内非相同ＴＰＳｒＡＡＶベクター、第三の３’ＴＰＳ（配列１）に連結された興味のある第三の核酸セグメントに連結された第三の５’ＴＰＳ（配列３）を有する第三のベクター内非相同ＴＰＳｒＡＡＶベクターは、細胞への導入後に、方向性分子間組み換えを受けることができ、以下の方向性：３’配列１に連結された第三の核酸セグメントに連結された配列３の少なくとも一部に連結された第二の核酸セグメントに連結された配列２の少なくとも一部に連結された第一の核酸セグメントに連結された配列１の少なくとも一部に場合により連結されていてもよい第三の核酸セグメントに連結された配列３の少なくとも一部に連結された第二の核酸セグメントに連結された配列２の少なくとも一部に連結された第一の核酸セグメントに連結された配列１５’の各ベクターからの配列を含むキメラＤＮＡ分子をもたらす。従って、当該技術分野において記述されているように、ＡＡＶベクターにおけるＴＰＳ間の組み換えは、組み換え部位においてもしくはその近くで挿入および／もしくは欠失をもたらし得る。

本明細書において記述されているように、デュアルベクタートランス−スプライシング方法により送達される大きい導入遺伝子を再構成することもしくは単一の環状ＡＡＶゲノム（環状モノマー）の形成を減らすことができるより効率のよいベクターを設計する目的で、ＴＰＳ配列がＡＡＶゲノムの分子間組み換えを媒介する機序を評価した。この目的のために、ウイルスゲノムのいずれかの末端でのＡＡＶ−２ＴＰＳおよびＡＡＶ−５ＴＰＳを特徴とする新規なベクター内非相同ＴＰＳＡＡＶベクターを作製した。このベクター内非相同ＴＰＳゲノムは、ＡＡＶ−２もしくはＡＡＶ−５キャプシドのいずれかに効率よくパッケージングされて感染性ビリオンを生成した。ベクター内非相同ＡＶ２：５ＴＰＳウイルスは、ベクター内相同ＡＶ２：２ＴＰＳベクターおよびベクター内相同ＡＶ５：５ＴＰＳベクターと比較した場合に、コードされるＥＧＦＰ導入遺伝子を発現するそれ
らの同様な能力にもかかわらず、感染細胞において環状中間体を形成する有意に減少した能力を有した。

ベクター内非相同ＡＶ２：５ＴＰＳベクター内に含有される相違するＴＰＳ配列が頭部−尾部のように分子間コンカテマー化を導くことができるかどうかを調べるために、２つのベクター内非相同ＴＰＳトランス−スプライシングベクター（ＡＶ５：２ＬａｚＺｄｏｎｏｒおよびＡＶ２：５ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒ）を作製し、ここで、各々はドナーもしくはアクセプタースプライス配列が隣接するβ−ガラクトシダーゼミニ遺伝子の１つのエキソンを送達した。これらのベクター内非相同ＴＰＳトランス−スプライシングＡＡＶベクターをベクター内相同ＴＰＳトランス−スプライシングＡＡＶベクターセット（ＡＶ５：５およびＡＶ２：２）とβ−ガラクトシダーゼ遺伝子発現を再構成するそれらの効率について比較した。この比較からの結果は、ベクター内非相同ＴＰＳデュアルベクターセットがベクター内相同ＴＰＳＡＡＶベクターと比較した場合に有意に増大したトランス−スプライシング効率（キャプシド血清型により、６〜１０倍）を有することを示した。ウイルスゲノム構造の分子研究により、ベクター内非相同ＴＰＳＡＡＶベクターは、線状形態ゲノムの増加した存在量のためにより効率の良い方向性コンカテマー化（組み換えとも当該技術分野において呼ばれる）を与えることが示唆された。理論によって拘束されることを所望せずに、宿主細胞もしくは宿主抽出物におけるｒＡＡＶゲノムの環状コンカテマー化は、ベクター間相同的組み換えによって起こることが当該技術分野において記述されている。ベクター内相同ＴＰＳを有するベクターでは、この事象は頭部−頭部、頭部−尾部もしくは尾部−尾部構造をもたらすことができる。ベクター内非相同ＴＰＳおよびベクター間相同ＴＰＳを含有する本発明のｒＡＡＶは、ベクター間相同性が、異なるベクターにおける核酸セグメントの５’→３’方向に関して組み換え事象の方向性を導くように方向性コンカテマー化もしくは方向性組み換えを受ける。従って、これらの研究は、ＡＡＶゲノムの分子間および分子内相同的組み換えを導くことにおけるＴＰＳ配列の重要性の直接証拠を提供する。さらに、ベクター内非相同ＴＰＳＡＡＶベクターゲノムの使用は、ウイルスゲノム転化産物を操作しそして分子間組み換え事象、例えば導入遺伝子の効率のよいデュアルＡＡＶベクター再構成のためのものを導く新戦略を提供する。さらに、ベクター内非相同ＴＰＳｒＡＡＶベクターの使用は、１つもしくはそれ以上の対応するベクター内相同ＴＰＳｒＡＡＶベクターに対して、例えば２倍、３倍、６倍、１０倍、２０倍もしくはそれ以上、コードされる遺伝子産物の発現の増加した効率をもたらすことができる。

ベクター内非相同ＴＰＳＡＡＶベクターは、場合により、天然のｒＡＡＶベクター、すなわち、相同なＴＰＳを有する単一のベクターと同様の細胞形質導入能力（効率）を有し、そして例えば完全な核酸発現カセットを送達するために、遺伝子導入ベクターとして用いることができ、このベクターは、ベクター内非相同ＴＰＳＡＡＶベクターにおける３’ＴＰＳに相同である５’ＴＰＳを有する別のＡＡＶベクターの不在下、もしくはベクター内非相同ＴＰＳベクターにおける５’ＴＰＳに相同である３’ＴＰＳを有する別のＡＡＶベクターの不在下でさえ、細胞における改変されたベクターゲノム構造に起因する、例えば線状形態の増加に起因する改変された、例えば増大したゲノム安定性および／もしくは転写活性を有することができる。しかしながら、感染細胞において環状中間体を形成することができるｒＡＡＶベクター、すなわち、ベクター内相同ＴＰＳを有するものと異なり、ベクター内非相同ＴＰＳＡＡＶによる細胞の形質導入は、線状形態ゲノムの存在量の増加をもたらす。さらに、ベクター内非相同ＴＰＳｒＡＡＶベクターの形質導入生物学は、以下の特性：形質導入細胞におけるゲノム転化もしくは代謝回転の速度、エピソーム存続および染色体組込みにおいて相同ＴＰＳｒＡＡＶベクターのものと異なり得る。これらの相違は、ｒＡＡＶが線状コンカテマーとして存続するかもしくは染色体に組込むことを好むことが報告された、肝臓のようないくつかの特別な組織もしくは臓器に形質導入するためにベクター内非相同ＴＰＳｒＡＡＶベクターがより効率のよい導入遺伝子
媒体であるかもしれないことを意味する。従って、ベクター内非相同ＴＰＳベクターにおけるＴＰＳの完全な配列を改変できることは、ＴＰＳにおける機能性要素の導入を可能にする。そのような要素はまた、導入遺伝子ゲノムのいずれかの末端に方向的に置くこともできる。機能性要素には、導入遺伝子の発現に影響を与えるもの（すなわち、プロモーターを包含する調節要素）、組込みに影響を与えるもの（すなわち、機能的に発現されるインテグラーゼタンパク質の作用を標的とする配列）、もしくは方向性組み換えを高めるようにウイルスゲノム間の組み換えを導く内因性もしくは組み換え的に発現されるタンパク質の作用の部位である配列（すなわち、ＣＲＥ、トランスポゾンなど）を包含することができる。従って、ウイルスゲノム構造を改変する１つの方法は、転写的に活性の状態にゲノム転化を導くことに関与するＴＰＳの改変によってである。同じ改変はまた、組み換え事象を導くことによりデュアルベクター方法を高めることもできる。

従って、本発明は少なくとも２つのｒＡＡＶのセットもしくは少なくとも２つのｒＡＡＶを含んでなる組成物を提供する。第一のｒＡＡＶは、連結された：第一の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメント；興味のある核酸セグメント、すなわち、ＡＡＶに由来しないセグメント、例えば、ＡＡＶタンパク質もしくはその一部をコードしないセグメントを含んでなる第二のＤＮＡセグメント；および第一の３’ＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメントを含んでなる第一の組み換えＤＮＡ分子を含む。セットもしくは組成物はまた、連結された：第二の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメント；第一のｒＡＡＶベクターにおける興味のある核酸セグメントと異なる興味のある第二の核酸セグメント；および第二の３’ＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメントを含んでなる第二の組み換えＤＮＡ分子を含む第二のｒＡＡＶも含む。ベクターの少なくとも１つはベクター内非相同ＴＰＳＡＡＶベクターであり、そして１つのベクターにおける少なくとも３’ＴＰＳはもう１つのベクターにおける５’ＴＰＳに相同である。場合により、両方のベクターはベクター内非相同ＴＰＳＡＡＶベクターであってもよい。１つの態様として、第一のｒＡＡＶは、連結された：５’ＡＡＶＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメント；興味のある核酸セグメントを含んでなる第二のＤＮＡセグメント；および３’ＴＰＳを含んでなる第三のＡＡＶセグメントを含んでなる第一の組み換えＤＮＡ分子を含み、ここで、第一のものにおける５’ＡＡＶＴＰＳおよび３’ＴＰＳは非相同ＴＰＳであり、すなわち、該ｒＡＡＶはベクター内非相同ＴＰＳＡＡＶである。セットもしくは組成物はまた、連結された：５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメント；第一の組み換えＤＮＡ分子における興味のある核酸セグメントと異なる興味のある核酸セグメントを含んでなる第二のＤＮＡセグメント；および３’ＡＡＶＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメントを含んでなる第二の組み換えＤＮＡ分子を含む第二のｒＡＡＶも含み、ここで、第二のＡＡＶにおける５’ＴＰＳおよび３’ＴＰＳは場合により非相同ＴＰＳであってもよく、そしてここで、第一の組み換えＤＮＡ分子の３’ＴＰＳは、第二の組み換え分子の５’ＴＰＳに相同である。さらに別の態様として、第一のｒＡＡＶは、連結された：５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメント；興味のある核酸セグメントを含んでなる第二のＤＮＡセグメント；および３’ＡＡＶＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメントを含んでなる第一の組み換えＤＮＡ分子を含み、ここで、第一のｒＡＡＶにおける５’ＴＰＳおよび３’ＡＡＶＴＰＳは非相同ＴＰＳである。セットもしくは組成物はまた、連結された：５’ＡＡＶＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメント；第一の組み換えＤＮＡ分子における興味のある核酸セグメントと異なる興味のある第二の核酸セグメント；および３’ＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメントを含んでなる第二の組み換えＤＮＡ分子を含む第二のｒＡＡＶも含み、ここで、第二のｒＡＡＶにおける５’ＡＡＶＴＰＳおよび３’ＴＰＳは非相同ＴＰＳであり、そしてここで、第一のｒＡＡＶの３’ＡＡＶＴＰＳは第二のｒＡＡＶの５’ＡＡＶＴＰＳに相同である。第二の核酸セグメントの少なくとも１つは機能性遺伝子産物、すなわち、検出可能な活性を有するものまたは適切な細胞、組織もしくは生物に存在する場合に活性を有することができるものをコードするか、あるいは２つの第二のＤＮＡセグメントは一緒に機能性遺伝子産物をコードする。本発
明の範囲内には、本発明のベクターにおける１つより多くのオープンリーディングフレーム、個々のベクターもしくはベクターのセットにおけるオープンリーディングフレームおよび別のオープンリーディングフレームの一部、ならびに／または個々のベクターもしくはベクターのセットにおける１つもしくはそれ以上の転写調節要素が包含される。２つもしくはそれ以上のｒＡＡＶベクターまたは別々に各個々のｒＡＡＶベクターを含むセットもしくは組成物は、２つの異なるｒＡＡＶベクターにおける少なくとも２つの相同なＴＰＳが分子間組み換えを受けて１つもしくはそれ以上の機能性遺伝子産物をコードするキメラＤＮＡ分子（分子間組み換えの産物）を生成する宿主細胞をもたらすように、例えば感染、リポソームによって、プラスミドもしくはヴィロソームとして、宿主細胞に送達することができる。従って、ベクターは、同時にもしくは順次細胞と接触させることができる。さらに、細胞と接触させる、少なくとも２つの異なるベクターを含むベクターのセットにおける各ベクターの量は同じ、すなわち１：１の比率、もしくは任意の他の比率、例えば１：１．２、１：１．５、１：１．７５、１：２もしくはそれ以上、例えば１：３、１：５もしくは１：１０であることができること、および所望の効果（例えば、ベクターの１つにおける少なくとも１つの核酸セグメントの発現もしくは発現の調節）が得られる限り、ベクターの１つもしくはそれ以上を細胞と再接触させることができること（反復送達）が想定される。

１つの態様において、１つのｒＡＡＶベクターは、第一の３’ＴＰＳを含んでなるＤＮＡセグメントに連結されたオープンリーディングフレームに操作可能に連結されたプロモーターを含んでなる興味のある核酸セグメントに連結された第一の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含み、ここで、第一の５’ＴＰＳおよび第一の３’ＴＰＳは非相同ＴＰＳである。第二のｒＡＡＶベクターは、第二の３’ＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメントに連結された第二のオープンリーディングフレームに操作可能に連結された第二のプロモーターを含んでなる興味のある第二の核酸セグメントに連結された第二の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含み、ここで、第二のｒＡＡＶにおける第二の５’ＴＰＳおよび第二の３’ＴＰＳは場合により非相同ＴＰＳであってもよく、そしてここで、第一の３’ＴＰＳは第二の５’ＴＰＳに相同である。別の態様において、１つのｒＡＡＶベクターは、第一の３’ＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメントに連結された第一のオープンリーディングフレームに操作可能に連結された第一のプロモーターを含んでなる興味のある核酸セグメントに連結された第一の５’ＡＡＶＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含み、ここで、第一のｒＡＡＶにおける第一の５’ＴＰＳおよび第一の３’ＴＰＳは非相同ＴＰＳである。第二のｒＡＡＶベクターは、第二の３’ＡＡＶＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメントに連結された第二のオープンリーディングフレームに操作可能に連結された第二のプロモーターを含んでなる興味のある第二の核酸セグメントに連結された第二の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含み、ここで、第二の５’ＴＰＳおよび第二の３’ＴＰＳは場合により非相同ＴＰＳであってもよく、そしてここで、第一の３’ＴＰＳは第二の５’ＴＰＳに相同である。さらに別の態様において、１つのｒＡＡＶベクターは、第一の３’ＡＡＶＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメントに連結された第一のオープンリーディングフレームに操作可能に連結された第一のプロモーターを含んでなる第二のＤＮＡセグメントに連結された第一の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含み、ここで、第一の５’ＴＰＳおよび第一の３’ＴＰＳは非相同ＴＰＳである。第二のｒＡＡＶベクターは、第二の３’ＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメントに連結された第二のオープンリーディングフレームに操作可能に連結された第二のプロモーターを含んでなる第二のＤＮＡセグメントに連結された第二の５’ＡＡＶＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含み、ここで、第二の５’ＴＰＳおよび第二の３’ＴＰＳは場合により非相同ＴＰＳであってもよく、そしてここで、第一の３’ＴＰＳは第二の５’ＴＰＳに相同である。この態様において、頭部−尾部コンカテマーの形成は２つのオープンリーディングフレームの転写干渉を減少するので、２つのオープンリーディングフレームの発現は、２つのｒＡＡＶベクター
と接触させた細胞において高められることができる。１つの態様において、オープンリーディングフレームの少なくとも１つは、治療遺伝子産物もしくは別の遺伝子産物と一緒に哺乳類に治療利益を与える遺伝子産物をコードする。これらのベクターは、同時にもしくは順次細胞と接触させることができる。

さらに別の態様において、オープンリーディングフレームの１つは触媒ＲＮＡ、例えば、遺伝子の１つの対立遺伝子、例えば欠陥があるかもしくは有害な遺伝子産物をコードする対立遺伝子のｍＲＮＡを分解するものをコードし、一方、もう１つのオープンリーディングフレームは野生型（機能性）遺伝子産物をコードすることができる。従って、１つのｒＡＡＶベクターは突然変異体遺伝子の遺伝子発現をノックアウトするために用いられ、そして場合により、もう１つのｒＡＡＶベクターは正常な機能性遺伝子産物を発現するために用いられる。従って、１つの態様において、１つのｒＡＡＶベクターは、第一の３’ＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメントに連結された、突然変異体遺伝子産物に対応するＲＮＡの触媒ＲＮＡをコードするＤＮＡフラグメントを含んでなる第二のＤＮＡセグメントに連結された第一の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含んでなり、ここで、場合により第一の５’ＴＰＳおよび第一の３’ＴＰＳは非相同ＴＰＳであってもよい。第二のｒＡＡＶベクターは、第二の３’ＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメントに連結された機能性遺伝子産物をコードするオープンリーディングフレームを含んでなる第二のＤＮＡセグメントに連結された第二の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含んでなり、ここで、第二の５’ＴＰＳおよび第二の３’ＴＰＳは場合により非相同ＴＰＳであってもよく、そしてここで、第一の３’ＴＰＳは場合により第二の５’ＴＰＳに相同であってもよい。これらのベクターは、同時にもしくは順次細胞と接触させることができる。

１つの態様において、１つのｒＡＡＶベクターは、第一の３’ＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメントに連結された、突然変異体遺伝子産物に対応するＲＮＡの触媒ＲＮＡをコードするＤＮＡフラグメントを含んでなる第二のＤＮＡセグメントに連結された第一の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含んでなり、ここで、場合により第一の５’ＴＰＳおよび第一の３’ＴＰＳは非相同ＴＰＳであってもよい。第二のｒＡＡＶベクターは、第二の３’ＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメントに連結された機能性遺伝子産物をコードするオープンリーディングフレームを含んでなる第二のＤＮＡセグメントに連結された第二の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含んでなり、ここで、第二の５’ＴＰＳおよび第二の３’ＴＰＳは場合により非相同ＴＰＳであってもよく、そしてここで、第一の３’ＴＰＳは場合により第二の５’ＴＰＳに相同であってもよい。この態様において、これらのベクターは、同時にもしくは順次細胞と接触させることができる。

別の態様において、１つのｒＡＡＶベクターは、場合により転写調節要素に連結されていてもよい、オープンリーディングフレームの一部（オープンリーディングフレームのこの部分は、第一の３’ＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメントに連結されたドナースプライス部位に対して５’でありそして操作可能に連結される）、例えば選択した遺伝子のオープンリーディングフレームの５’末端を含んでなる第二のＤＮＡセグメントに連結された第一の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含み、ここで、第一の５’ＴＰＳおよび第一の３’ＴＰＳは非相同ＴＰＳである。１つの態様において、ベクターにおける転写調節要素は異種プロモーター、すなわち、オープンリーディングフレームに対応する遺伝子の内因性プロモーターではない非ＡＡＶプロモーターであり、一方、別の態様において、転写調節要素にはエンハンサーおよびプロモーターが包含される。第二のｒＡＡＶベクターは、第二の３’ＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメントに連結された選択した遺伝子のオープンリーディングフレームの残りもしくは異なる遺伝子のオープンリーディングフレームに対して５’でありそして操作可能に連結されるアクセプタース
プライス部位を含んでなる第二のＤＮＡセグメントに連結された第二の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含み、ここで、第二の５’ＴＰＳおよび第二の３’ＴＰＳは場合により非相同ＴＰＳであってもよく、そしてここで、第一の３’ＴＰＳは第二の５’ＴＰＳに相同である。１つの態様として、１つのｒＡＡＶベクターは、場合により転写調節要素に連結されていてもよい、オープンリーディングフレームの一部（オープンリーディングフレームのこの部分は、第一の３’ＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメントに連結されたドナースプライス部位に操作可能に連結される）を含んでなる第二のＤＮＡセグメントに連結された第一の５’ＡＡＶＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含み、ここで、第一の５’ＴＰＳおよび第一の３’ＴＰＳは非相同ＴＰＳである。１つの態様として、ｒＡＡＶベクターにおける転写調節要素は異種プロモーターであり、一方、別の態様において、ｒＡＡＶベクターにおける転写調節要素には異種エンハンサーおよびプロモーターが包含される。第二のｒＡＡＶベクターは、第二の３’ＡＡＶＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメントに連結された、選択した遺伝子のオープンリーディングフレームの残りもしくは異種のオープンリーディングフレームに対して５’でありそして操作可能に連結されるアクセプタースプライス部位を含んでなる第二のＤＮＡセグメントに連結された第二の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含む。第二の５’ＴＰＳおよび第二の３’ＴＰＳは場合により非相同ＴＰＳであってもよく、そして第一の３’ＴＰＳは第二の５’ＴＰＳに相同である。さらに別の態様において、１つのｒＡＡＶベクターは、場合により転写調節要素に連結されていてもよい、オープンリーディングフレームの一部（オープンリーディングフレームのこの部分は、第一の３’ＡＡＶＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメントに連結されたドナースプライス部位に操作可能に連結される）を含んでなる第二のＤＮＡセグメントに連結された第一の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含み、ここで、第一の５’ＴＰＳおよび第一の３’ＴＰＳは非相同ＴＰＳである。第二のｒＡＡＶベクターは、第二の３’ＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメントに連結された、選択した遺伝子のオープンリーディングフレームの残りもしくは異種のオープンリーディングフレームに対して５’でありそして操作可能に連結されるアクセプタースプライス部位を含んでなる第二のＤＮＡセグメントに連結された第二の５’ＡＡＶＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含む。第二の５’ＴＰＳおよび第二の３’ＴＰＳは非相同ＴＰＳであり、そして第一の３’ＴＰＳは第二の５’ＴＰＳに相同である。従って、２つのｒＡＡＶベクターと細胞を接触させた後に、方向性分子間組み換えは２つのｒＡＡＶベクターから形成される頭部−尾部コンカテマーをもたらし、それは転写単位であり、そしてその転写はＲＮＡをもたらし、それはスプライシングされると遺伝子産物（例えば、野生型遺伝子産物もしくは２つのオープンリーディングフレームが野生型（非組み換え）細胞のゲノムにおいて通常は連結されない場合には融合タンパク質）のｍＲＮＡを与える。

本発明の１つの態様において、第一の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントは、転写調節要素、例えばプロモーターおよび／もしくはエンハンサーに操作可能に連結されたオープンリーディングフレームの一部、例えばマルチエキソン遺伝子のエキソンを含んでなる。例えば、プロモーターは、オープンリーディングフレームに対応する遺伝子の内因性プロモーターであることができる。別の態様において、少なくとも２つのｒＡＡＶベクターにおけるエキソンは異なる遺伝子からであり、すなわち、一緒にそれらは融合ポリペプチドをコードする。１つの態様において、２つより多くのベクター内非相同ＴＰＳ
ｒＡＡＶベクターが遺伝子を導入するために用いられ、例えば、１つのベクターはプロモーターに連結されたオープンリーディングフレームの第一のエキソンを有し、第二のベクターは適切なスプライス部位が隣接する１つもしくはそれ以上の下流エキソンを有し、そして第三のベクターはスプライスドナー遺伝子が隣接するオープンリーディングフレームの３’末端を有する。

別の態様において、第一のｒＡＡＶベクターは、第一の３’ＴＰＳを含んでなる第三の
ＤＮＡセグメントに連結された転写調節要素を含んでなる第二のＤＮＡセグメントに連結された第一の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含み、ここで、第一の５’ＴＰＳおよび第一の３’ＴＰＳは非相同ＴＰＳである。第二のｒＡＡＶベクターは、第二の３’ＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメントに連結された、場合により対応する内因性もしくは最小プロモーターに連結されていてもよい、オープンリーディングフレームを含んでなる第二のＤＮＡセグメントに連結された第二の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含み、ここで、第二の５’ＴＰＳおよび第二の３’ＴＰＳは場合により非相同ＴＰＳであってもよく、そしてここで、第一の３’ＴＰＳは第二の５’ＴＰＳに相同である。１つの態様として、第一のｒＡＡＶベクターにおける転写調節要素はプロモーターであり、一方、別の態様において、転写調節要素はエンハンサーである。さらに別の態様として、第一のｒＡＡＶベクターは、第一の３’ＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメントに連結された転写調節要素を含んでなる第二のＤＮＡセグメントに連結された第一の５’ＡＡＶＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含み、ここで、第一の５’ＴＰＳおよび第一の３’ＴＰＳは非相同ＴＰＳである。第二のｒＡＡＶベクターは、第二の３’ＡＡＶＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメントに連結された、場合により内因性もしくは最小プロモーターに連結されていてもよい、オープンリーディングフレームを含んでなる第二のＤＮＡセグメントに連結された第二の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含み、ここで、第二の５’ＴＰＳおよび第二の３’ＴＰＳは場合により非相同ＴＰＳであってもよく、そしてここで、第一の３’ＴＰＳは第二の５’ＴＰＳに相同である。さらに別の態様において、第一のｒＡＡＶベクターは、第一の３’ＡＡＶＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメントに連結された転写調節要素を含んでなる第二のＤＮＡセグメントに連結された第一の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含み、ここで、第一の５’ＴＰＳおよび第一の３’ＴＰＳは非相同ＴＰＳである。第二のｒＡＡＶベクターは、第二の３’ＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメントに連結された、場合により内因性もしくは最小プロモーターに連結されていてもよい、オープンリーディングフレームを含んでなる第二のＤＮＡセグメントに連結された第二の５’ＡＡＶＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメントを含み、ここで、第二の５’ＴＰＳおよび第二の３’ＴＰＳは場合により非相同ＴＰＳであってもよく、そしてここで、第一の３’ＴＰＳは第二の５’ＴＰＳに相同である。１つの態様として、ベクターの少なくとも１つ、そして場合により両方のベクターは１つもしくはそれ以上のスプライス部位を含まず、例えば、いずれのベクターもスプライスドナーもしくはスプライスアクセプター部位を含まない。従って、細胞を２つのｒＡＡＶベクターと接触させ、そして頭部−尾部コンカテマーが形成された後に、１つの態様として、第一のｒＡＡＶベクターにおけるエンハンサーは第二の（下流の）ｒＡＡＶベクターにおけるプロモーターからの転写を高める。別の態様において、第一のｒＡＡＶにおける転写調節要素はプロモーター、例えば構成的もしくは誘導性プロモーターである。従って、細胞を２つのｒＡＡＶベクターと接触させ、そして頭部−尾部コンカテマーが形成された後に、第一のｒＡＡＶベクターにおけるプロモーターは、オープンリーディングフレームに対するプロモーターの方向性配置のために第二の（下流の）ｒＡＡＶベクターにおけるオープンリーディングフレームの転写を誘導する。

また提供されるのは、本発明の１つもしくはそれ以上のｒＡＡＶベクターまたは本発明の組成物と接触させた宿主細胞である。本発明の範囲内の宿主細胞には真核細胞、例えば鳥類、両生類、爬虫類もしくは哺乳類細胞、例えばヒツジ、ウシ、ブタ、ウマ、イヌ、ヤギ、ネコもしくはヒト細胞が包含され、そして真核生物の脳、網膜、肝臓、肺、心臓、筋肉もしくは造血細胞が包含される。宿主細胞は他のベクター（１つもしくは複数）との接触に対して異なる時間で、すなわち順次各ベクターと接触させることができると想定されるが、宿主細胞は好ましくはベクターの両方と同時に接触させる。従って、本発明のベクターおよび組成物は、宿主細胞において送達しそして／もしくは核酸産物を発現する方法において、そして該ベクター（１つもしくは複数）を有する宿主細胞を製造するために有
用である。従って、本発明はまた、少なくとも２つのｒＡＡＶベクターを用いて宿主細胞において導入しそして遺伝子産物、例えばポリペプチドを発現する方法も提供する。

さらに提供されるのは、本発明のｒＡＡＶベクターを例えば全身もしくは局所投与によって動物の細胞もしくは組織に投与する方法である。本発明は、ｒＡＡＶベクター内の導入遺伝子に対する現在のサイズ制限を克服するために有用であり、より大きい転写調節領域、例えばより強力な異種プロモーターもしくは内因性プロモーターの導入、および異なるｒＡＡＶベクター間の定方向分子間組み換え事象の増加した生成、従って機能性導入遺伝子形成を高めることを可能にする。

少なくとも２つの異なるｒＡＡＶゲノムを含んでなる環状もしくは線状コンカテマーであることができる、単一のエピソームを形成するｒＡＡＶゲノムの方向性分子間組み換えの意義は、ｒＡＡＶでの遺伝子治療に特に関連する。第一に、ｒＡＡＶのパッケージング容量を超える大きい調節要素および遺伝子を２つの独立したベクターで組織もしくは細胞を重感染することにより一緒にすることができる。例えば、エンハンサーおよび／もしくはプロモーターを１つのベクターに導入することができ、一方、最小プロモーターを有するもしくは有さない、興味のある治療もしくは予防遺伝子のオープンリーディングフレームを含んでなるＤＮＡをもう１つのベクターに導入する。従って、２つのベクターでの重感染後に、導入遺伝子カセットサイズは単一のＡＡＶベクターのみのものを超えて増加され、そしてオープンリーディングフレームを含んでなるＤＮＡはエンハンサーおよび／もしくはプロモーターに連結される。本発明の別の態様として、遺伝子の２つの独立した領域をコードするベクターを分子間組み換えにより一緒にして完全なスプライシング単位の鋳型を形成する。

従って、そのようなベクターの使用は、遺伝子治療システムの開発に役立つことができる。例えば、本発明のベクターが有用である治療的もしくは予防的治療には、血液疾患（例えば、鎌状赤血球貧血、サラセミア、血友病およびファンコニ貧血）、アルツハイマー病およびパーキンソン病のような神経学的疾患、ならびに骨格筋、心筋もしくは平滑筋を含む筋肉疾患が包含される。特に、本発明のベクターにおいて有用な治療遺伝子には、α−グロビン遺伝子、β−グロビン遺伝子、γ−グロビン遺伝子、嚢胞性線維症膜貫通コンダクタンス受容体遺伝子（ＣＦＴＲ）、第ＶＩＩＩ因子遺伝子、第ＩＸ因子遺伝子、エリスロポエチン（ｅｐｏ）遺伝子、ファンコニ貧血相補群、ジストロフィン遺伝子、アンチセンス遺伝子、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子（パーキンソン病）、グルコセレブロシダーゼ遺伝子（ゴーシェ病）、アリールスルファターゼＡ遺伝子（異染性白質萎縮症）あるいは他のポリペプチドもしくはタンパク質、または他の遺伝子産物、例えばリボザイムもしくはｓｉＲＮＡのような触媒ＲＮＡをコードする遺伝子が包含される。

さらに提供されるのは、興味のある核酸セグメントに隣接する５’ＴＰＳおよび３’ＴＰＳを含んでなるｒＡＡＶベクターであり、ここで、ＴＰＳの少なくとも１つはシュードＰＳである。１つの態様として、シュードＰＳは配列番号：３、配列番号：８、配列番号：９もしくはその相補物に少なくとも５０％、例えば７０％、８０％、８５％、９０％、９５％もしくはそれ以上、１００％までの核酸配列同一性を有し、そして場合により配列番号：１、配列番号：２、配列番号：４、配列番号：５、配列番号：６および／もしくは配列番号：７、ならびに／またはその相補物に７０％、６０％、５０％、４０％、３０％、２０％、１０％もしくは５％未満を包含する８０％未満の核酸配列同一性を有するか、または核酸配列同一性を有さない。ベクターは、適切な宿主細胞に存在する場合に複製されそしてパッケージングされることができる。

［発明の詳細な記述］
定義
本明細書において用いる場合、「末端パリンドローム配列」もしくは「ＴＰＳ」は、二次構造、場合により天然のＡＡＶＴＰＳに存在するステムもしくはステムループ構造を形成することができ、そしてウイルスゲノムに存在する場合に、そのゲノムのパッケージングもしくは複製、および／またはプロウイルスレスキューを実質的に阻害しない、すなわち、ベクター内非相同ＴＰＳｒＡＡＶベクターが適切なウイルスおよび／もしくは細胞タンパク質の存在下でパッケージングされそして複製されることができる、ＡＡＶベクターの５’もしくは３’末端に存在するパリンドローム配列（ＰＳ）である。

「ＩＴＲ」は、本明細書において用いる場合、全ての既知のＡＡＶ血清型のウイルスゲノムの両末端に存在する配列のような「逆方向末端反復」配列をさす。各ＩＴＲ内にはＰＳがあり、例えば、ＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４およびＡＡＶ−６においてＴＰＳは約１２５ヌクレオチドであり（該ＡＡＶＴＰＳはＤ配列を含まない）、そしてＡＡＶ−５においてＴＰＳは１３７ヌクレオチドであり、それはフォールディングして安定な二次構造、例えばヘアピン様ステムもしくはステムループ構造を形成することができる。ＡＡＶのＩＴＲ（ＴＰＳおよびＤ配列）は、ＡＡＶ複製、プロウイルスレスキューおよびキャプシド封入に必要なシス要素を全て含有する。ＡＡＶ１、２、３、４および６型では、ＩＴＲは１４５ヌクレオチドの長さであり、一方、ＡＡＶ−５では、ＩＴＲは１６９ヌクレオチドの長さである。

「ベクター」は、本明細書において用いる場合、ポリヌクレオチドを含んでなるかもしくはそれと結合し、そしてインビトロもしくはインビボのいずれかで、細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介するために用いることができる高分子もしくは高分子の結合をさす。実例となるベクターには、例えば、プラスミド、ウイルスベクター、リポソームおよび他の遺伝子送達媒体が包含される。「核酸セグメント」、「標的ポリヌクレオチド」もしくは「導入遺伝子」と呼ばれることもある、送達されるポリヌクレオチドは、遺伝子治療において興味のあるコーディング配列（治療的興味のあるタンパク質をコードする遺伝子のような）、ワクチン開発において興味のあるコーディング配列（哺乳類において免疫応答を誘発するのに適当なタンパク質、ポリペプチドもしくはペプチドを発現するポリヌクレオチドのような）および／または選択可能なもしくは検出可能なマーカーを含んでなることができる。

「ＡＡＶ」はアデノ随伴ウイルスであり、そして天然に存在する野生型ウイルス自体もしくはその誘導体をさすために用いることができる。該用語には、他に必要とされる場合を除いて、全ての亜型、血清型およびシュードタイプ、そして天然に存在する形態および組み換え形態の両方が含まれる。本明細書において用いる場合、「血清型」という用語は、特定の抗血清とのキャプシドタンパク質反応性により同定されそしてそれに基づいて他のＡＡＶから識別されるＡＡＶをさし、例えば、８つの血清型の霊長類ＡＡＶ、ＡＡＶ−１〜ＡＡＶ−８がある。例えば、血清型ＡＡＶ−２は、ＡＡＶ−２のｃａｐ遺伝子からコードされるキャプシドタンパク質ならびに同じＡＡＶ−２血清型からの５’および３’ＩＴＲ配列を含有するゲノムを含有するＡＡＶをさすために用いられる。シュードタイプＡＡＶは、１つの血清型からのキャプシドタンパク質および第二の血清型の５’−３’ＩＴＲを含むウイルスゲノムを含有するＡＡＶをさす。シュードタイプｒＡＡＶは、キャプシド血清型の細胞表面結合特性およびＴＰＳ血清型と一致する遺伝的性質を有すると予想される。シュードタイプｒＡＡＶは、当該技術分野において記述されている標準的技術を用いて製造される。本明細書において用いる場合、例えば、ｒＡＡＶ５は、同じ血清型からのキャプシドタンパク質および５’−３’ＩＴＲの両方を有するＡＡＶをさすために用いることができ、もしくはそれは血清型５型からのキャプシドタンパク質および異なるＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶ血清型２型からの５’−３’ＩＴＲを有するＡＡＶをさすことができる。本明細書において説明する各実施例では、ベクター設計および製造の記述は、キ
ャプシドおよび５’−３’ＴＰＳ配列の血清型を記述する。略語「ｒＡＡＶ」は、組み換えＡＡＶベクター（もしくは「ｒＡＡＶベクター」）とも呼ばれる、組み換えアデノ随伴ウイルスをさす。

「形質導入」、「トランスフェクション」、「形質転換」もしくは「形質導入すること」は、本明細書において用いる場合、ポリヌクレオチド、例えば細胞における導入遺伝子の発現をもたらす宿主細胞への外来ポリヌクレオチド、例えばｒＡＡＶベクターにおける導入遺伝子の導入のプロセスをさす用語であり、そして宿主細胞に外来ポリヌクレオチドを導入するために組み換えウイルスの使用を含み、例えば、ウイルスにより媒介されるトランスフェクションは、形質導入と一般に呼ばれる。例えば、ＡＡＶでは該プロセスには、１）細胞表面受容体に結合した後のＡＡＶのエンドサイトーシス、２）細胞のサイトゾルにおけるエンドソームもしくは他の細胞内コンパートメントからの脱出、３）核へのウイルス粒子もしくはウイルスゲノムの輸送、４）ウイルス粒子の脱殻、および環状中間体を包含する、発現可能な二本鎖ＡＡＶゲノム形態の生成が包含される。ｒＡＡＶの発現可能な二本鎖形態は核エピソームとして存続することができ、もしくは場合により宿主ゲノムに組込むことができる。細胞におけるポリヌクレオチドの形質導入、トランスフェクションもしくは形質転換は、例えばＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーおよびウェスタンブロットによる、タンパク質発現（定常状態レベルを包含する）、ハイブリダイゼーションアッセイ、例えばノーザンブロット、サザンブロットおよびゲルシフト移動度アッセイによるＤＮＡおよびＲＮＡの測定が包含されるがこれらに限定されるものではない当該技術分野に周知である方法により決定することができる。外来ポリヌクレオチドの導入に使用する方法には、ウイルス感染もしくはトランスフェクション、リポフェクション、形質転換および電気穿孔、ならびに他の非ウイルス的遺伝子送達技術のような周知の技術が包含される。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞において安定にもしくは一時的に維持されることができる。

「遺伝子送達」は、遺伝子導入のための細胞への外来ポリヌクレオチドの導入をさし、そしてターゲッティング、結合、取り込み、輸送、局在化、レプリコン組込みおよび発現を包含することができる。

「遺伝子導入」は、ターゲッティング、結合、取り込み、輸送、局在化およびレプリコン組込みを包含することができるが、その後の遺伝子の発現と区別されそしてそれを意味しない細胞への外来ポリヌクレオチドの導入をさす。

「遺伝子発現」もしくは「発現」は、遺伝子転写、翻訳および翻訳後修飾のプロセスをさす。

「検出可能なマーカー遺伝子」は、該遺伝子を保有する細胞が特異的に検出される（例えば、該マーカー遺伝子を保有しない細胞から区別される）ことを可能にする遺伝子である。多種多様なそのようなマーカー遺伝子が、当該技術分野において既知である。

「選択可能なマーカー遺伝子」は、対応する選択薬剤の存在下で、該遺伝子を保有する細胞が特異的に選択される（ｆｏｒｏｒａｇａｉｎｓｔ）ことを可能にする遺伝子である。実例として、抗生物質耐性遺伝子は、対応する抗生物質の存在下で宿主細胞がポジティブに選択されることを可能にする正の選択可能マーカー遺伝子として用いることができる。様々な正のおよび負の選択可能マーカーが当該技術分野において既知である。

「ｒＡＡＶ」ベクターは、本明細書において用いる場合、ＡＡＶ由来のものではないポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶ配列に異種のポリヌクレオチド）、典型的には、ベクターに存在する場合にＤＮＡである導入遺伝子もしくは興味のある核酸セグメントと
本明細書において呼ばれる細胞の遺伝的形質転換のための興味のある配列を含んでなるＡＡＶベクターをさす。本発明の好ましいベクター構築物において、異種ポリヌクレオチドには少なくとも１個の、好ましくは２個のＴＰＳが隣接し、その１つはＤ配列に連結される。本発明のベクターにおけるＴＰＳは、様々なＡＡＶＴＰＳ血清型に相同なＴＰＳ、他のパルボウイルスもしくは本発明に記述されるパリンドローム配列を含有する他のウイルスからのＴＰＳであることができ、または合成のＴＰＳ、例えば合成配列が他のＡＡＶ血清型もしくはパルボウイルスに存在しないものであるように本発明に従って構築されるものであることができる。ｒＡＡＶベクターという用語には、ｒＡＡＶベクター粒子およびｒＡＡＶベクタープラスミドの両方が包含される。

「ｒＡＡＶベクターのセット」、「ｒＡＡＶベクターセット」、「ベクターセット」もしくは「セット」は、本明細書において用いる場合、少なくとも１つのｒＡＡＶベクター、または２つもしくはそれ以上のｒＡＡＶベクターをさし、ここで、ベクターの少なくとも１つはベクター内非相同ＴＰＳベクターであり、そしてセットが少なくとも２つの異なるベクターを有する場合、これらのベクターが宿主細胞、宿主細胞溶解物もしくは宿主に導入される場合に、頭部−尾部（尾部−頭部とも本明細書において同義的に呼ばれる）コンカテマーの形成の増加が起こるようにベクターの少なくとも１つのＴＰＳは第二のベクターのＴＰＳと方向性ベクター間相同性を有する。セットのベクターは、個々のウイルス組成物として導入することができ、そして／またはセットの別のもしくは全てのベクターと単一の組成物に組み合わせることができる。セットのベクターは、同時にもしくは異なる時間点で導入することができる。セットのベクターは、等しい比率で（すなわち、１：１）投与するかもしくは様々な比率で混合することができる。

「ＡＡＶウイルス」もしくは「ＡＡＶウイルス粒子」は、少なくとも１つのＡＡＶキャプシドタンパク質（好ましくは、野生型ＡＡＶのキャプシドタンパク質の全てによる）およびキャプシドに包まれたポリヌクレオチドからなるウイルス粒子をさす。粒子が異種ポリヌクレオチド（すなわち、哺乳類細胞に送達される導入遺伝子のような野生型ＡＡＶゲノム以外のポリヌクレオチド）を含んでなる場合、それは典型的に「ｒＡＡＶ」と呼ばれる。

「ｒＡＡＶワクチン」は、本明細書において用いる場合、ベクターと接触させた宿主において免疫応答を誘発することができるペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質をコードする、導入遺伝子もしくは興味のある核酸セグメントとも本明細書において呼ばれるＡＡＶ由来のものではないポリヌクレオチド配列（すなわち、ＡＡＶに異種のポリヌクレオチド）を含んでなるＡＡＶベクターをさす。ポリヌクレオチドの発現は、中和抗体応答および／もしくは細胞性応答、例えば細胞傷害性Ｔ細胞応答の生成をもたらすことができる。本発明の好ましいベクター構築物において、異種ポリヌクレオチドには少なくとも１個の、好ましくは２個のＡＡＶＴＰＳが隣接する。

ＡＡＶの「ヘルパーウイルス」は、ＡＡＶ（例えば野生型ＡＡＶ）が哺乳類細胞により複製されそしてパッケージングされることを可能にするウイルスをさす。アデノウイルス、ヘルペスウイルスおよびワクシニアのようなポックスウイルスを包含する、ＡＡＶの様々なそのようなヘルパーウイルスが当該技術分野において既知である。亜群Ｃのアデノウイルス５型が最も一般的に用いられるが、アデノウイルスには多数の異なる亜群が包含される。ヒト、非ヒト哺乳類および鳥類由来の多数のアデノウイルスが既知であり、そしてＡＴＣＣのような寄託場所から入手可能である。ヘルペス科のウイルスには、例えば、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）およびエプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ならびにサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）および仮性狂犬病ウイルス（ＰＲＶ）が包含され；これらもまたＡＴＣＣのような寄託場所から入手可能である。

「感染性」ウイルスもしくはウイルス粒子は、ウイルス種が指向性である細胞中に送達することができるポリヌクレオチド成分を含んでなるものである。該用語は、ウイルスの任意の複製能力を必ずしも意味しない。

「複製能力のある」ウイルス（例えば、複製能力のあるＡＡＶ、「ＲＣＡ」と省略されることもある）は、感染性でありそしてまた感染細胞において（すなわち、ヘルパーウイルスもしくはヘルパーウイルス機能の存在下で）複製されることもできる表現型的に野生型のウイルスをさす。ＡＡＶの場合、複製能力は、一般に、機能性ＡＡＶパッケージング遺伝子の存在を必要とする。本明細書に記述されるような好ましいｒＡＡＶベクターは、１つもしくはそれ以上のＡＡＶパッケージング遺伝子の欠如のために哺乳類細胞において（特にヒト細胞において）複製能力を欠いている。好ましくは、そのようなｒＡＡＶベクターは、ＡＡＶパッケージング遺伝子と侵入してくるｒＡＡＶベクターとの間の組み換えによりＲＣＡが生成される可能性を最小限に抑えるために任意のＡＡＶパッケージング遺伝子配列を欠く。本明細書に記述されるような好ましいｒＡＡＶベクター調製物は、あるとしてもごくわずかのＲＣＡ（好ましくは１０^２個のｒＡＡＶ粒子当たり約１個未満のＲＣＡ、より好ましくは１０^４個のｒＡＡＶ粒子当たり約１個未満のＲＣＡ、さらにより好ましくは１０^８個のｒＡＡＶ粒子当たり約１個未満のＲＣＡ、なおさらに好ましくは１０^１２個のｒＡＡＶ粒子当たり約１個未満のＲＣＡ、最も好ましくはＲＣＡのない）を含有するものである。

「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドを包含する任意の長さのヌクレオチド、またはそのアナログのポリマー形態をさす。ポリヌクレオチドは、メチル化もしくはキャップ化ヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログのような改変されたヌクレオチドを含んでなることができ、そして非ヌクレオチド成分により遮られることができる。存在する場合、ヌクレオチド構造への改変は、ポリマーの組み立ての前もしくは後に与えることができる。ポリヌクレオチドという用語は、本明細書において用いる場合、二本鎖および一本鎖分子を同義的にさす。他に特定されないかもしくは必要とされない限り、ポリヌクレオチドである本明細書に記述される本発明の任意の態様には、二本鎖形態および二本鎖形態を構成することが既知であるかもしくは予測される２本の相補的一本鎖形態の各々の両方が包含される。

「転写調節配列」もしくは「ＴＲＳ」は、本明細書において用いる場合、それが操作可能に連結される遺伝子もしくはコーディング配列の転写を制御するゲノム領域をさす。本発明において有用な転写調節配列には、一般に、少なくとも１つの転写プロモーターが包含され、そしてまた１つもしくはそれ以上のエンハンサーおよび／もしくは転写のターミネーターを包含することもできる。

「操作可能に連結された」は、そのように記述される成分が協調して機能することを可能にする関係にそれらがある、２つもしくはそれ以上の成分の配置をさす。実例として、転写調節配列（ＴＲＳ）もしくはプロモーターがコーディング配列の転写を促進する場合、ＴＲＳもしくはプロモーターはコーディング配列に操作可能に連結される。操作可能に連結されたＴＲＳは、一般に、コーディング配列とシスに連結されるが、必ずしもそれに直接隣接していない。

「異種の」は、それを比較する存在と遺伝子型で異なる存在に由来することを意味する。例えば、異なる細胞タイプに遺伝子工学技術により導入されるポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである（そして発現される場合、異種ポリペプチドをコードすることができる）。同様に、その天然のコーディング配列から取り除かれそして異なるコーディング配列に操作可能に連結されるプロモーターのような転写調節要素は、異種の転写調節要素である。

「パッケージング」は、本明細書において用いる場合、ウイルスベクターの組み立ておよびキャプシド封入をもたらす一連の細胞内事象をさす。従って、適当なベクターが適切な条件下でパッケージング細胞系に導入される場合、それはウイルス粒子に組み立てられることができる。ウイルスベクターのパッケージングと関連する機能は、当該技術分野において記述されている。

「ターミネーター」は、リードスルー転写を減少するかもしくは防ぐ傾向があるポリヌクレオチド配列をさす（すなわち、それはターミネーターの片側に起因する転写がターミネーターの反対側までずっと続くのを減少するかもしくは防ぐ）。転写が中断される程度は、典型的に、塩基配列および／もしくはターミネーター配列の長さの関数である。特に、多数の分子生物学システムにおいて周知であるように、「転写終結配列」と一般に呼ばれる特定のＤＮＡ配列は、おそらくＲＮＡポリメラーゼ分子を停止させそして／もしくは転写されているＤＮＡから離脱させることにより、ＲＮＡポリメラーゼによるリードスルー転写を中断させる傾向がある特定の配列である。そのような配列特異的ターミネーターの典型的な例には、ポリアデニル化（「ポリＡ」）配列、例えばＳＶ４０ポリＡが包含される。そのような配列特異的ターミネーターに加えてもしくはその代わりに、プロモーターとコーディング領域の間の比較的長いＤＮＡ配列の挿入もまた、一般に介在配列の長さに比例して、コーディング領域の転写を中断させる傾向がある。ＲＮＡポリメラーゼ分子は、転写されているＤＮＡから離出するようになるいくらかの傾向が常にあるのでおそらくこの効果は生じ、そしてコーディング領域に到達する前に横断する配列の長さを増加することは、一般に、コーディング領域の転写が完了するかもしくは場合によってはさらに開始される前に離脱が起こる可能性を増加する。従って、ターミネーターは一方向のみから（「一方向性」ターミネーター）もしくは両方向から（「両方向性」ターミネーター）転写を防ぐことができ、そして配列特異的終結配列もしくは配列非特異的ターミネーターもしくは両方を含んでなることができる。様々なそのようなターミネーター配列は当該技術分野において既知であり；そして本発明との関連内でそのような配列の実例となる使用を以下に提供する。

「宿主細胞」、「細胞系」、「細胞培養物」、「パッケージング細胞系」および他のそのような用語は、本発明において有用な高等真核細胞、好ましくは哺乳類細胞、最も好ましくはヒト細胞を意味する。これらの細胞は、組み換えベクター、ウイルスもしくは他の導入ポリヌクレオチドのレシピエントとして用いることができ、そして形質導入された最初の細胞の子孫を包含する。単一細胞の子孫は、最初の親細胞と必ずしも完全に同一ではない可能性があること（形態においてもしくはゲノム相補物において）が理解される。

「治療遺伝子」、「予防遺伝子」、「標的ポリヌクレオチド」、「導入遺伝子」、「興味のある遺伝子」、「興味のある核酸セグメント」などは一般に、ベクターを用いて導入される１つのポリヌクレオチドもしくは複数のポリヌクレオチドをさす。１つの態様として、そのような遺伝子はウイルスベクター内に位置し、従って、複製されそしてウイルス粒子にキャプシド封入されることができる。標的ポリヌクレオチドは、多数の異なる用途にベクターを作製するために本発明において用いることができる。そのようなポリヌクレオチドには：（ｉ）構造タンパク質もしくは酵素の不足しているか、欠損しているかもしくは次善のレベルにより引き起こされる欠損症を軽減するために遺伝子治療の他の形態において有用なタンパク質をコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）アンチセンス分子もしくはｓｉＲＮＡ分子に転写されるポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）転写もしくは翻訳因子に結合するデコイに転写されるポリヌクレオチド；（ｉｖ）サイトカインのような細胞モジュレーターをコードするポリヌクレオチド；（ｖ）ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のような、特定の薬剤にレシピエント細胞を感受性にすることができるポリヌクレオチド；（ｖｉ）様々な癌の処置のためのＥ１Ａ腫瘍抑制遺伝子もしくはｐ５３腫瘍抑制遺
伝子のような、癌治療のためのポリヌクレオチド；および（ｖｉｉ）診断もしくはマーカー手段として有用なタンパク質をコードするポリヌクレオチドが包含されるがこれらに限定されるものではない。レシピエント宿主細胞においてオープンリーディングフレームの発現をもたらすために、それは好ましくはプロモーター、それ自身のもしくは異種のプロモーターのいずれかに操作可能に連結される。多数の適当なプロモーターが当該技術分野において既知であり、その選択は、標的ポリヌクレオチドの発現の所望のレベル；構成的発現、誘導性発現、細胞特異的もしくは組織特異的発現を所望するかどうかなどにより決まる。ｒＡＡＶはまた、選択可能なマーカーを含有することもできる。「遺伝子」は、転写されそして翻訳された後に特定の遺伝子産物をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドをさす。

「組み換え体」は、ポリヌクレオチドに適用する場合、該ポリヌクレオチドがクローニング、制限および／もしくはライゲーション工程の様々な組み合わせ、ならびに天然に存在するポリヌクレオチドと異なった構築物をもたらす他の方法の産物であることを意味する。組み換えウイルスは、組み換えポリヌクレオチドを含んでなるウイルス粒子である。該用語には、それぞれ、最初のポリヌクレオチド構築物の複製および最初のウイルス構築物の子孫が包含される。

「制御要素」もしくは「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳もしくは分解を包含する、ポリヌクレオチドの機能調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。調節は、プロセスの頻度、速度もしくは特異性に影響を及ぼすことができ、そして高めるかもしくは抑制する性質であることができる。当該技術分野において既知である制御要素には、例えば、プロモーターおよびエンハンサーのような転写調節配列が包含される。プロモーターは、ある条件下でＲＮＡポリメラーゼに結合しそして通常はプロモーターから下流に（３’方向に）位置するコーディング領域の転写を開始することができるＤＮＡ領域である。プロモーターには、ＡＡＶプロモーター、例えばＰ５、Ｐ１９、Ｐ４０およびＡＡＶＴＰＳプロモーター、ならびに異種の（非ＡＡＶ）プロモーターが包含される。

「発現ベクター」は、興味のある遺伝子産物をコードする領域を含んでなるベクターであり、そして意図される標的細胞において遺伝子産物の発現をもたらすために使用される。発現ベクターはまた、標的におけるタンパク質の発現を促進するためにコード領域に操作可能に連結された制御要素も含んでなる。制御要素およびそれらが発現のために操作可能に連結される遺伝子もしくは複数の遺伝子の組み合わせは、「発現カセット」と呼ばれることもあり、その多数は当該技術分野において既知でありそして利用可能であるか、もしくは当該技術分野において利用可能である成分から容易に構築することができる。

「遺伝子改変」は、遺伝要素が有糸分裂もしくは減数分裂による以外で細胞に導入されるプロセスをさす。該要素は細胞に対して異種であることができ、またはそれは細胞にすでに存在する要素の追加コピーもしくは改善されたバージョンであることができる。遺伝子改変は、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿もしくはポリヌクレオチド−リポソーム複合体と接触させることのような、当該技術分野において既知である任意の方法によって細胞に組み換えプラスミドもしくは他のポリヌクレオチドをトランスフェクションすることによりもたらすことができる。遺伝子改変はまた、例えば、ＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスもしくはウイルスベクターでの形質導入もしくは感染によりもたらすこともできる。好ましくは、遺伝要素は、細胞における染色体もしくはミニ染色体に導入されるが；細胞およびその子孫の表現型および／もしくは遺伝子型を変える任意の改変は、この用語に包含される。

遺伝子配列がインビトロで細胞の長時間培養中にその機能を果たすために利用可能であ
る場合に、細胞は該配列で「安定に」改変される、形質導入されるもしくは形質転換されると言われる。好ましい例として、そのような細胞は、改変された細胞の子孫によっても遺伝される遺伝子改変が導入される点において「遺伝的に」改変される。

「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーをさすために本明細書において同義的に用いられる。該用語にはまた、改変されているアミノ酸ポリマー；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、アセチル化、ホスホニル化、脂質化、もしくは標識成分との結合も包含される。「ＣＦＴＲ」などのようなポリペプチドは、遺伝子治療およびそのための組成物との関連で説明される場合、完全なタンパク質の所望の生化学機能を保持するそれぞれの完全なポリペプチド、またはその任意のフラグメントもしくは遺伝子操作された誘導体をさす。同様に、ＣＦＴＲおよび遺伝子治療において使用する他のそのような遺伝子（典型的に、レシピエント細胞に送達される「導入遺伝子」と呼ばれる）への言及には、所望の生化学機能を保有する完全なポリペプチドまたはその任意のフラグメントもしくは遺伝子操作された誘導体をコードするポリヌクレオチドが包含される。

「単離された」ポリヌクレオチド、例えばプラスミド、ウイルスもしくは他の物質は、該物質もしくは同様の物質が天然に存在するかもしくは最初にそこから調製される所に同様に存在し得る他の成分の少なくともいくらかを欠いている該物質の調製物をさす。従って、例えば、単離された物質は、供給源混合物からそれを濃縮するために精製技術を用いることにより調製することができる。濃縮は、溶液の容量当たりの重量のような絶対的基準で測定することができ、もしくはそれは供給源混合物に存在する第二の潜在的妨害物質に関して測定することができる。本発明の態様の濃縮を上げることは、ますますいっそう好ましい。従って、例えば、２倍の濃縮は好ましく、１０倍の濃縮はより好ましく、１００倍の濃縮はより好ましく、１０００倍の濃縮はさらにより好ましい。

ＡＡＶの調製物は、感染性ＡＡＶ粒子：感染性ヘルパーウイルス粒子の比率が少なくとも約１０^２：１；好ましくは少なくとも約１０^４：１、より好ましくは少なくとも約１０^６：１；さらにより好ましくは少なくとも約１０^８：１である場合にヘルパーウイルスを「実質的に含まない」と言われる。調製物はまた、好ましくは、同等量のヘルパーウイルスタンパク質（すなわち、上記のヘルパーウイルス粒子不純物が破壊された形態で存在する場合にヘルパーウイルスのそのようなレベルの結果として存在するようなタンパク質）も含まない。ウイルスおよび／もしくは細胞タンパク質混入は、一般に、ＳＤＳゲル上でクーマシー染色バンドの存在（例えば、ＡＡＶキャプシドタンパク質ＶＰ１、ＶＰ２およびＶＰ３に対応するもの以外のバンドの出現）として認められることができる。

「効率」は、ウイルス生産、複製もしくはパッケージングを表すことに用いる場合、該方法の有用な特性：特に、増殖速度および細胞当たり生産されるウイルス粒子の数をさす。「高効率」生産は、特定の培養期間にわたる、細胞当たり少なくとも１００個のウイルス粒子；好ましくは少なくとも約１０，０００個そしてより好ましくは細胞当たり少なくとも約１００，０００個の粒子の生産を示す。

本発明に従って処置される「個体」もしくは「被験体」は脊椎動物、特に哺乳類種のメンバーをさし、そして家畜、スポーツ動物（ｓｐｏｒｔｓａｎｉｍａｌｓ）、およびヒトを包含する霊長類が包含されるがこれらに限定されるものではない。

個体もしくは細胞の「処置」は、処置が開始される時点での個体もしくは細胞の自然経過を改変しようとする任意のタイプの介入、例えば、個体における予防、治療もしくは他の有益な効果を引き出すことである。例えば、個体の処置は、遺伝的もしくは誘発的遺伝子欠損、ウイルス、細菌もしくは寄生生物による感染、腫瘍性もしくは形成不全性症状、
または自己免疫もしくは免疫抑制のような免疫系機能障害が包含される（がこれらに限定されるものではない）任意の病的症状により引き起こされる病状を減少するかもしくは限定するために行われることができる。処置には、製薬学的組成物のような組成物の投与、および組成物で処理されている適合する細胞の投与が包含される（がこれらに限定されるものではない）。処置は予防的にもしくは治療的に；すなわち、病的事象の開始もしくは病原因子との接触の前にもしくは後に行われることができる。

以下の用語は、２つもしくはそれ以上の核酸もしくはポリヌクレオチド間の配列関係を表すために用いられる：（ａ）「参照配列」、（ｂ）「比較ウィンドウ」、（ｃ）「配列同一性」、（ｄ）「配列同一性のパーセンテージ」および（ｅ）「実質的同一性」。

（ａ）本明細書において用いる場合、「参照配列」は配列比較の基礎として用いる特定の配列である。参照配列は、特定の配列の一部もしくは全体；例えば、全長ｃＤＮＡもしくは遺伝子配列のセグメント、または完全なｃＤＮＡもしくは遺伝子配列としてであることができる。

（ｂ）本明細書において用いる場合、「比較ウィンドウ」は、ポリヌクレオチド配列の連続的なそして特定のセグメントについて言及し、ここで、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列は、２つの配列の最適な比較のために参照配列（これは付加もしくは欠失を含んでならない）と比較して付加もしくは欠失（すなわち、ギャップ）を含んでなることができる。一般に、比較ウィンドウは、少なくとも２０個の連続的ヌクレオチドの長さであり、そして場合により３０、４０、５０、１００もしくはそれ以上であることができる。ポリヌクレオチド配列におけるギャップの包含に起因する参照配列への高い類似性を回避するためにギャップペナルティーが典型的に導入され、そしてマッチの数から引かれることを当業者は理解する。

比較のための配列のアライメントの方法は、当該技術分野において周知である。従って、任意の２つの配列間の同一性パーセントの決定は、数学アルゴリズムを用いて成し遂げることができる。そのような数学アルゴリズムの限定されない例は、Ｍｙｅｒｓａｎｄ
Ｍｉｌｌｅｒ，１９８８のアルゴリズム；Ｓｍｉｔｈｅｔａｌ．，１９８１の局所的相同性アルゴリズム；ＮｅｅｄｌｅｍａｎａｎｄＷｕｎｓｃｈ，１９７０の相同性アライメントアルゴリズム；ＰｅａｒｓｏｎａｎｄＬｉｐｍａｎ，１９８８の類似性検索方法；ＫａｒｌｉｎａｎｄＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３におけるように改変された、ＫａｒｌｉｎａｎｄＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０のアルゴリズムである。

これらの数学アルゴリズムのコンピューターによる実行は、配列同一性を決定するために配列の比較に利用することができる。そのような実行には、ＰＣ／Ｇｅｎｅプログラム（Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｅｔｉｃｓ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａから入手可能）におけるＣＬＵＳＴＡＬ；ＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）ならびにＷｉｓｃｏｎｓｉｎＧｅｎｅｔｉｃｓソフトウェアパッケージ、バージョン８（ＧｅｎｅｔｉｃｓＣｏｍｐｕｔｅｒＧｒｏｕｐ（ＧＣＧ），５７５ＳｃｉｅｎｃｅＤｒｉｖｅ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，ＵＳＡから入手可能）におけるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡおよびＴＦＡＳＴＡが包含されるがこれらに限定されるものではない。これらのプログラムを用いるアライメントは、デフォルトパラメーターを用いて行うことができる。ＣＬＵＳＴＡＬプログラムは、Ｈｉｇｇｉｎｓｅｔａｌ．，１９８８；Ｈｉｇｇｉｎｓｅｔａｌ．，１９８９；Ｃｏｒｐｅｔ
ｅｔａｌ．，１９８８；Ｈｕａｎｇｅｔａｌ．，１９９２；およびＰｅａｒｓｏｎｅｔａｌ．，１９９４により十分に記述されている。ＡＬＩＧＮプログラムは、ＭｙｅｒｓａｎｄＭｉｌｌｅｒ，上記のアルゴリズムに基づく。Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，１９９０のＢＬＡＳＴプログラムは、ＫａｒｌｉｎａｎｄＡｌｔｓｃｈ
ｕｌ上記のアルゴリズムに基づく。

ＢＬＡＳＴ分析を行うためのソフトウェアは、ＮａｔｉｏｎａｌＣｅｎｔｅｒｆｏｒＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙＩｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｉｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／）を通して公的に利用可能である。このアルゴリズムは、データベース配列における同じ長さのワードと整列させた場合にいくらかの正の評価閾値スコアＴにマッチするかもしくはそれを満たす、クエリー配列における長さＷの短いワードを同定することにより高スコアリング配列対（ＨＳＰ）を最初に同定することを含む。Ｔは、近傍ワードスコア閾値と呼ばれる（Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，１９９０）。これらの最初の近傍ワードヒットは、それらを含有するより長いＨＳＰを見出すために検索を開始するシード（ｓｅｅｄ）として働く。次に、累積アライメントスコアを増加することができる限り、ワードヒットを各配列に沿って両方向に伸ばす。累積スコアは、ヌクレオチド配列では、パラメーターＭ（１対のマッチする残基に対する報酬スコア；常に＞０）およびＮ（ミスマッチする残基に対するペナルティースコア；常に＜０）を用いて計算される。アミノ酸配列では、スコアリングマトリックスを用いて累積スコアを計算する。累積アライメントスコアがその最大達成値から量Ｘ減少するか、累積スコアが１つもしくはそれ以上の負のスコアリング残基アライメントの蓄積のために０以下になるか、またはいずれかの配列の末端に到達する場合に各方向におけるワードヒットの伸長は中止される。

配列同一性パーセントを計算することに加えて、ＢＬＡＳＴアルゴリズムはまた、２つの配列間の類似性の統計分析も行う（例えば、Ｋａｒｌｉｎ＆Ａｌｔｓｈｕｌ（１９９３）を参照）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより与えられる類似性の１つの尺度は最小合計確率（Ｐ（Ｎ））であり、これは２つのヌクレオチドもしくはアミノ酸配列間のマッチが偶然起こる確率の指標を与える。例えば、参照核酸配列への試験核酸配列の比較における最小合計確率が約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、そして最も好ましくは約０．００１未満である場合に、試験核酸配列は参照配列に類似するとみなされる。

比較目的のためのギャップ付きアライメントを得るために、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０における）をＡｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，１９９７に記述されているように利用することができる。あるいはまた、分子間の距離関係を検出する繰り返し検索を行うためにＰＳＩ−ＢＬＡＳＴ（ＢＬＡＳＴ２．０における）を用いることができる。Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，上記を参照。ＢＬＡＳＴ、ＧａｐｐｅｄＢＬＡＳＴ、ＰＳＩ−ＢＬＡＳＴを利用する場合、それぞれのプログラム（例えば、ヌクレオチド配列用のＢＬＡＳＴＮ、タンパク質用のＢＬＡＳＴＸ）のデフォルトパラメーターを用いることができる。ＢＬＡＳＴＮプログラム（ヌクレオチド配列用）は、１１のワード長（Ｗ）、１０の期待値（Ｅ）、１００のカットオフ、Ｍ＝５、Ｎ＝−４および両鎖の比較をデフォルトとして使用する。ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ．を参照。アライメントはまた、検査により手動で行うこともできる。

（ｃ）本明細書において用いる場合、２つの核酸配列との関連で「配列同一性」もしくは「同一性」は、配列比較アルゴリズムによりもしくは目視検査により測定されるような、特定の比較ウィンドウにわたって最大一致のために整列した場合に同じである２つの配列における残基の特定のパーセンテージについて言及する。

（ｄ）本明細書において用いる場合、「配列同一性のパーセンテージ」は、比較ウィンドウにわたって２つの最適に整列させた配列を比較することにより決定される値を意味し、ここで、比較ウィンドウにおけるポリヌクレオチド配列の部分は、２つの配列の最適アラインメントのために参照配列（これは付加もしくは欠失を含んでならない）と比較した場合に付加もしくは欠失（すなわち、ギャップ）を含んでなることができる。パーセンテ
ージは、同一の核酸塩基が両方の配列に存在する位置の数を決定してマッチする位置の数をもたらし、マッチする位置の数を比較のウィンドウにおける位置の総数で割り、そして結果に１００をかけて配列同一性のパーセンテージをもたらすことにより計算される。

（ｅ）（ｉ）ポリヌクレオチド配列の「実質的同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、標準的なパラメーターを用いて記述されるアライメントプログラムの１つを用いて参照配列と比較して、少なくとも７０％、７１％、７２％、７３％、７４％、７５％、７６％、７７％、７８％もしくは７９％、好ましくは少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％もしくは８９％、より好ましくは少なくとも９０％、９１％、９２％、９３％もしくは９４％、そして最も好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％もしくは９９％の配列同一性を有する配列を含んでなることを意味する。配列比較のために、典型的に１つの配列は参照配列として働き、それに試験配列を比較する。配列比較アルゴリズムを用いる場合、試験および参照配列をコンピューターに入力し、必要に応じて部分配列座標を指定し、そして配列アルゴリズムプログラムパラメーターを指定する。次に、配列比較アルゴリズムは、指定されたプログラムパラメーターに基づいて、参照配列に対して試験配列（１つもしくは複数）の配列同一性パーセントを計算する。

本発明の実施は、他に示されない限り、当該技術分野の技量の範囲内である、分子生物学、ウイルス学、微生物学、組み換えＤＮＡおよび免疫学の通常の技術を用いる。そのような技術は、文献において十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，１９８９；Ｇａｉｔ，１９８４；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７；ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ；ＭｉｌｌｅｒａｎｄＣａｌｏｓ，１９８７；Ｗｅｉｒｅｔａｌ．；Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，１９８７；Ｃｏｌｉｇａｎｅｔａｌ．，１９９１；Ｃｏｌｉｇａｎｅｔａｌ．，１９９５；およびＳｃｏｐｅｓ，１９９４を参照。

Ｉ．ｒＡＡＶベクター
組み換えＡＡＶベクターは、特に嚢胞性線維症および鎌状赤血球貧血のような疾患のための、ヒト遺伝子治療用の潜在的に有力な手段である。遺伝子治療の他の方法に対するｒＡＡＶベクターの主要な利点は、宿主細胞に安定に組込まれるようになるためにそれらが一般に標的細胞の継続した複製を必要としないことである。

ｒＡＡＶベクターおよび／もしくはウイルスはまた、感染、進行および／もしくは疾患の重症度を抑えるための治療もしくは予防ワクチンの開発にも潜在的に有力である。ワクチン開発のためのｒＡＡＶベクターの主要な利点は、それらが核エピソームとして本質的に細胞の生涯にわたって存続することができ、従って、免疫学的興味のあるペプチド、ポリペプチドもしくはタンパク質の長期発現を与えることである。興味のある導入遺伝子には、ウイルス遺伝子、例えばＨＩＶのエンベロープ（ｅｎｖ）もしくはｇａｇ遺伝子；細菌遺伝子、例えばストレプトコッカス細胞壁タンパク質；真菌、例えばコクシジオイデス真菌症（ｃｏｃｉｄｏｍｙｃｏｓｉｓ）；寄生虫、例えばリーシュマニア症、または癌遺伝子、例えばｐ５３が包含される。

ｒＡＡＶベクターおよび／もしくはウイルスはまた、１つもしくはそれ以上の検出可能なマーカーを含有することもできる。実例として、細菌ベータ−ガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子；ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（ＡＰ）遺伝子ならびにインビトロおよびインビボの両方でレポーター分子として用いられている様々な細胞表面マーカーをコードする遺伝子を包含する様々なそのようなマーカーが既知である。ｒＡＡＶベクターおよび／もしくはウイルスはまた、１つもしくはそれ以上の選択可能なマーカーを含有することもできる。

組み換えＡＡＶベクターおよび／もしくはウイルスはまた、例えば、通常のｍＲＮＡの翻訳をそれと二本鎖を形成することにより阻止するために用いることができるアンチセンスｍＲＮＡ（ｍＲＮＡの相補物）をコードするポリヌクレオチド、およびリボザイム（ＲＮＡ触媒）をコードするポリヌクレオチドを包含する、タンパク質をコードしないポリヌクレオチドを含んでなることもできる。

ＩＩ．ＡＡＶベクターの選択および製造
様々な血清型は、遺伝子レベルでさえ、機能的にそして構造的に関連しているので（例えば、Ｂｌａｃｋｌｏｗ，１９８８；およびＲｏｓｅ，１９７４を参照）、任意の血清型のアデノ随伴ウイルスがｒＡＡＶを製造するために適している。全てのＡＡＶ血清型は、相同なｒｅｐ遺伝子により媒介される同様の複製特性を明らかに示し；そして全て、ＡＡＶ２において発現されるもののような３つの関連するキャプシドタンパク質を一般に保有する。関連性の程度は、ゲノムの長さに沿った血清型間の広範な交差ハイブリダイゼーション；およびＴＰＳに対応する末端での類似する自己アニーリングセグメントの存在を示すヘテロ二本鎖分析によりさらに示唆される。同様な感染性パターンはまた、各血清型における複製機能が同様の調節制御下にあることも示唆する。様々な血清型の中で、ＡＡＶ２は最も一般的に用いられる。

本発明のＡＡＶベクターは、典型的に、ＡＡＶに対して異種であるポリヌクレオチド、すなわち、興味のある核酸セグメントを含んでなる。ポリヌクレオチドは、典型的に、ある種の表現型の発現のアップもしくはダウンレギュレーションのような、遺伝子治療との関連で標的細胞に機能を提供する能力のために興味深い。そのような異種ポリヌクレオチドもしくは「導入遺伝子」は、一般に、所望の機能もしくはコード配列を提供するために十分な長さのものである。

意図される標的細胞において異種ポリヌクレオチドの転写が所望される場合、当該技術分野において既知であるように、例えば標的細胞内での転写の所望のレベルおよび／もしくは特異性により、それはそれ自体のもしくは異種のプロモーターに操作可能に連結されることができる。様々なタイプのプロモーターおよびエンハンサーが、これに関連して使用に適している。構成的プロモーターは、継続するレベルの遺伝子転写を与え、そして治療もしくは予防ポリヌクレオチドが継続的に発現されることが所望される場合に好ましい。誘導性プロモーターは、一般に、誘導因子の不在下で低い活性を示し、そして誘導因子の存在下でアップレギュレーションされる。それらは、発現がある時点でもしくはある位置でのみ所望される場合に、または誘導因子を用いて発現のレベルを滴定することが望ましい場合に好ましい可能性がある。プロモーターおよびエンハンサーはまた組織特異的であることもでき：すなわち、それらは、おそらくそれらの細胞に独自に存在する遺伝子調節要素のために、ある種の細胞タイプにおいてのみそれらの活性を示す。

プロモーターの説明に役立つ例は、シミアンウイルス４０からのＳＶ４０後期プロモーター、バキュロウイルスポリヘドロンエンハンサー／プロモーター要素、単純ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ（ＨＳＶｔｋ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）からの前初期プロモーターおよびＬＴＲ要素を包含する様々なレトロウイルスプロモーターである。誘導性プロモーターには、重金属イオン誘導性プロモーター（マウス乳癌ウイルス（ｍＭＴＶ）プロモーターもしくは様々な成長ホルモンプロモーターのような）およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼの存在下で活性であるＴ７ファージからのプロモーターが包含される。実例として、組織特異的プロモーターの例には、様々なサーファクチンプロモーター（肺における発現用）、ミオシンプロモーター（筋肉における発現用）およびアルブミンプロモーター（肝臓における発現用）が包含される。多種多様な他のプロモーターが当該技術分野において既知でありそして一般に利用可能であり、そして多数のそのようなプロモー
ターの配列は、ＧｅｎＢａｎｋデータベースのような配列データベースにおいて利用可能である。

意図される標的細胞において翻訳もまた所望される場合、異種ポリヌクレオチドは、好ましくは、翻訳を促進する制御要素（リボソーム結合部位、すなわち「ＲＢＳ」およびポリアデニル化シグナルのような）も含んでなる。従って、導入遺伝子異種ポリヌクレオチドは、一般に、適当なプロモーターに操作可能に連結された少なくとも１つのコーディング領域を含んでなり、そしてまた例えば操作可能に連結されたエンハンサー、リボソーム結合部位およびポリＡシグナルを含んでなることもできる。導入遺伝子異種ポリヌクレオチドは、１つのコード領域、または同じもしくは異なるプロモーターの制御下の１つより多くのコード領域を含んでなることができる。制御要素およびコード領域の組み合わせを含有する全単位は、発現カセットと呼ばれることが多い。

異種ポリヌクレオチドは、ＡＡＶゲノムのコーディング領域中にもしくは好ましくはその代わりに（すなわち、ＡＡＶｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子の代わりに）組み換え技術により組込まれるが、一般にＡＡＶＴＰＳ領域が両側に隣接する。これは、複製能力のあるＡＡＶゲノムを再生するかもしれない組み換えの可能性を減らすために好ましくは（必ずしもではないが）ＡＡＶ由来の任意の介在配列なしに、コーディング配列から上流および下流の両方に、いずれも直接並んで、ＴＰＳが現れることを意味する。しかしながら、Ｄ配列とともに単一のＴＰＳは、２個のＴＰＳを含んでなる配置と通常は関連する機能を実行するために十分であることができ（例えば、ＷＯ９４／１３７８８を参照）、従って、1個のみのＴＰＳを有するベクター構築物を本発明のベクターおよび方法において用いることができる。

ｒｅｐの天然のプロモーターは自己調節性であり、そして生産されるＡＡＶ粒子の量を限定することができる。ｒｅｐ遺伝子はまた、ｒｅｐがベクター構築物の一部としてもしくは別個に提供されようと、異種のプロモーターに操作可能に連結されることもできる。ｒｅｐ遺伝子発現により強力にダウンレギュレーションされない任意の異種のプロモーターが適当であるが；ｒｅｐ遺伝子の構成的発現は宿主細胞にマイナスの影響を有する可能性があるので、誘導性プロモーターが好ましい。実例として、重金属イオン誘導性プロモーター（メタロチオネインプロモーターのような）；ステロイドホルモン誘導性プロモーター（ＭＭＴＶプロモーターもしくは成長ホルモンプロモーターのような）；およびＴ７
ＲＮＡポリメラーゼの存在下で活性であるＴ７ファージからのもののようなプロモーターを包含する、多種多様な誘導性プロモーターが当該技術分野において既知である。誘導性プロモーターの特に好ましいサブクラスは、ｒＡＡＶベクターの複製およびパッケージングを補足するために用いられるヘルパーウイルスにより誘導されるものである。アデノウイルスＥ１Ａタンパク質により誘導できるアデノウイルス初期遺伝子プロモーター；アデノウイルス主要後期プロモーター；ＶＰ１６もしくは１ＣＰ４のようなヘルペスウイルスタンパク質により誘導できるヘルペスウイルスプロモーター；ならびにワクシニアもしくはポックスウイルス誘導性プロモーターを包含する、多数のヘルパーウイルス誘導性プロモーターもまた記述されている。

ヘルパーウイルス誘導性プロモーターを同定しそして試験する方法は、記述されている（例えば、ＷＯ９６／１７９４７を参照）。従って、候補プロモーターがヘルパーウイルス誘導性であるかどうかおよびそれらが高効率パッケージング細胞の作製において有用であるかどうかを決定する方法は、当該技術分野において既知である。簡潔に言えば、１つのそのような方法は、推定上のヘルパーウイルス誘導性プロモーター（当該技術分野において既知であるかもしくはプロモーターのない「レポーター」遺伝子への連結のような周知の技術を用いて同定されるいずれか）でＡＡＶｒｅｐ遺伝子のｐ５プロモーターを置換することを含む。次に、好ましくは抗生物質耐性遺伝子のような正の選択可能マーカ
ーに連結された、ＡＡＶｒｅｐ−ｃａｐ遺伝子（ｐ５を置換された）は、適当な宿主細胞（以下に例示するＨｅＬａもしくはＡ５４９細胞のような）に安定に組込まれる。選択条件下（例えば抗生物質の存在下）で比較的よく増殖することができる細胞を次にヘルパーウイルスの添加の際にｒｅｐおよびｃａｐ遺伝子を発現するそれらの能力に関して試験する。ｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ発現の初期試験として、Ｒｅｐおよび／もしくはＣａｐタンパク質を検出するために免疫蛍光を用いて細胞を容易にスクリーニングすることができる。次に、パッケージング能力および効率の確認は、侵入してくるｒＡＡＶベクターの複製およびパッケージングの機能試験により決定することができる。この方法論を用いて、マウスメタロチオネイン遺伝子由来のヘルパーウイルス誘導性プロモーターが、ｐ５プロモーターの適当な代替物として同定され、そして高力価のｒＡＡＶ粒子を製造するために用いられている（ＷＯ９６／１７９４７に記述されているように）。

様々なＡＡＶゲノムの相対的キャプシド封入サイズ制限を考えると、ゲノムへの大きい異種ポリヌクレオチドの挿入は、ＡＡＶ配列の一部の除去を必要とする。１つもしくはそれ以上のＡＡＶ遺伝子の除去は、複製能力のあるＡＡＶ（「ＲＣＡ」）を生成する可能性を減らすために、いかなる場合でも望ましい。従って、ｒｅｐ、ｃａｐもしくは両方のコードもしくはプロモーター配列は、これらの遺伝子により提供される機能をトランスに提供することができるので、好ましくは取り除かれる。

得られるベクターは、これらの機能が「欠損する」と呼ばれる。ベクターを複製しそしてパッケージングするために、欠損する機能は、様々な欠損するｒｅｐおよび／もしくはｃａｐ遺伝子産物の必要な機能を一緒にコードする、パッケージング遺伝子もしくはその複数で補足される。パッケージング遺伝子もしくは遺伝子カセットには、好ましくはＡＡＶＴＰＳが隣接せず、そして好ましくはｒＡＡＶゲノムと任意の実質的な相同性を共有しない。従って、ベクター配列と別個に提供されるパッケージング遺伝子との間の複製中の相同的組み換えを最低限に抑えるために、２つのポリヌクレオチド配列の重複を避けることが望ましい。相同性のレベルおよび対応する組み換え頻度は、相同配列の増加する長さに伴ってそして共有される同一性のそれらのレベルに伴って増加する。既定のシステムにおいて懸念をもたらす相同性のレベルは、当該技術分野において既知であるように、理論的に決定しそして実験的に確認することができる。しかしながら、典型的に、重複配列がその全長にわたって少なくとも８０％同一である場合には約２５ヌクレオチドの配列未満、もしくはそれがその全長にわたって少なくとも７０％同一である場合には約５０ヌクレオチドの配列未満であれば組み換えを実質的に減らすかもしくはなくすことができる。もちろん、さらに低いレベルの相同性は、組み換えの可能性をさらに減らすので好ましい。任意の重複する相同性なしにさえ、ＲＣＡを生成するいくらかの残存頻度があるようである。ＲＣＡを生成する（例えば非相同的組み換えによる）頻度のなおさらなる減少は、Ａｌｌｅｎｅｔａｌ．，ＷＯ９８／２７２０４により記述されているように、ＡＡＶの複製およびキャプシド封入機能を「分けること」により得られることができる。

ｒＡＡＶベクター構築物および相補的パッケージング遺伝子構築物は、多数の異なる形態で本発明において使用されることができる。ウイルス粒子、プラスミドおよび安定に形質転換された宿主細胞は全て、一時的にもしくは安定に、パッケージング細胞にそのような構築物を導入するために用いることができる。

本発明のある態様として、ＡＡＶベクターおよびもしあれば相補的パッケージング遺伝子（１つもしくは複数）は、細菌プラスミド、ＡＡＶ粒子もしくはその任意の組み合わせの形態で提供される。別の態様として、ＡＡＶベクター配列、パッケージング遺伝子（１つもしくは複数）のいずれかもしくは両方は、遺伝子改変された（好ましくは遺伝的に改変された）真核細胞の形態で提供される。ＡＡＶベクター配列、ＡＡＶパッケージング遺伝子、もしくは両方を発現するように遺伝的に改変された宿主細胞の開発は、信頼できる
レベルで発現される物質の確立した供給源を提供する。

従って、様々な異なる遺伝子改変された細胞を本発明との関連で用いることができる。実例として、安定に組込まれたｒＡＡＶベクターの少なくとも１つの完全なコピーを有する哺乳類宿主細胞を用いることができる。プロモーターに操作可能に連結された少なくともＡＡＶｒｅｐ遺伝子を含んでなるＡＡＶパッケージングプラスミドは、複製機能を供給するために用いることができる（米国特許５，６５８，７７６に記述されているように）。あるいはまた、プロモーターに操作可能に連結されたＡＡＶｒｅｐ遺伝子を有する安定な哺乳類細胞系は、複製機能を供給するために用いることができる（例えば、Ｔｒｅｍｐｅｅｔａｌ．（ＷＯ９５／１３３９２）；Ｂｕｒｓｔｅｉｎｅｔａｌ．（ＷＯ９８／２３０１８）；およびＪｏｈｎｓｏｎｅｔａｌ．（米国第５，６５６，７８５号）を参照）。上記のようなキャプシド封入タンパク質を提供するＡＡＶｃａｐ遺伝子は、ＡＡＶｒｅｐ遺伝子と一緒にもしくは別個に提供することができる（例えば、上記の出願および特許ならびにＡｌｌｅｎｅｔａｌ．（ＷＯ９８／２７２０４）を参照）。他の組み合わせが可能であり、そして本発明の範囲内に包含される。

ＩＩＩ．ｒＡＡＶを作製すること
遺伝子治療のような目的のために有用な組み換えＡＡＶ粒子を作製するために、パッケージング細胞系に、好ましくは、興味のある１つもしくはそれ以上のポリヌクレオチド（もしくは「標的」ポリヌクレオチド）を取り囲んでいるＡＡＶＴＰＳ領域を含んでなる組み換えＡＡＶベクターを供給する。

標的ポリヌクレオチドは、一般に、プロモーター、それ自体のもしくは異種のプロモーターのいずれかに操作可能に連結される。多数の適当なプロモーターが当該技術分野において既知であり、その選択は、標的ポリヌクレオチドの発現の所望のレベル（すなわち、構成的発現、誘導性発現、細胞特異的もしくは組織特異的発現などを所望するかどうか）により決まる。

好ましくは、ｒＡＡＶベクターはまた、ｒＡＡＶベクターに感染している細胞の選択を可能にするために正の選択可能マーカーも含有する。負の選択可能マーカーもまた含むことができ；これらの同じ細胞に反対に選択する手段としてそれは必要にもしくは望ましくなるはずである。好ましい態様として、Ｌｕｐｔｏｎにより記述されている「二機能性選択可能融合遺伝子」を利用することができる；例えば、ＰＣＴ／ＵＳ９１／０８４４２およびＰＣＴ／ＵＳ９４／０５６０１を参照。簡潔に言えば、これらの構築物は、優性の正の選択可能マーカーと負の選択可能マーカーとの間の直接翻訳融合を含む。好ましい正の選択可能マーカーは、ｈｐｈ、ｎｅｏおよびｇｐｔよりなる群から選択される遺伝子に由来し、そして好ましい負の選択可能マーカーは、シトシンデアミナーゼ、ＨＳＶ−ＩＴＫ、ＶＺＶＴＫ、ＨＰＲＴ、ＡＰＲＴおよびｇｐｔよりなる群から選択される遺伝子に由来する。特に好ましいマーカーは、正の選択可能マーカーがｈｐｈもしくはｎｅｏに由来しそして負の選択可能マーカーがシトシンデアミナーゼもしくはＴＫ遺伝子に由来する二機能性選択可能融合遺伝子である。

有用な標的ポリヌクレオチドは、多数の異なる用途のためにｒＡＡＶベクターにおいて用いることができる。そのようなポリヌクレオチドには：（ｉ）構造タンパク質もしくは酵素の不足しているか、欠損しているかもしくは次善のレベルにより引き起こされる欠損症を軽減するために遺伝子治療の他の形態において有用なタンパク質をコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）アンチセンス分子に転写されるポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）転写もしくは翻訳因子に結合するデコイに転写されるポリヌクレオチド；（ｉｖ）サイトカインのような細胞モジュレーターをコードするポリヌクレオチド；（ｖ）ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のような、特定の薬剤にレシピエント細胞を感受性にすることが
できるポリヌクレオチド；および（ｖｉ）いくつかの肺癌および乳癌と関連する失われたもしくは損傷を受けたｐ５３遺伝子の置換のための野生型ｐ５３腫瘍抑制因子ｃＤＮＡ、または乳癌および卵巣癌を包含する様々な異なる癌の腫瘍形成および／もしくは転移を抑制することができるＥ１Ａ腫瘍抑制遺伝子のような、癌治療のためのポリヌクレオチドが包含されるがこれらに限定されるものではない。

得られる組み換えＡＡＶ粒子の治療もしくは予防特異性は、導入される特定のベクターもしくはプロベクターにより決定されるので、同じ基本パッケージング細胞系をこれらの用途のいずれかのために改変することができる。例えば、特定の標的ポリヌクレオチドを含んでなるベクターは、例えば、ｒＡＡＶプロベクターを含んでなるプラスミドの電気穿孔もしくはトランスフェクション、またはｒＡＡＶベクターもしくはプロベクターを含んでなるｒＡＡＶもしくはヘルパーウイルスでの感染を包含する；いくつかの可能な方法のいずれかによりＡＡＶベクターの製造のためにパッケージング細胞に導入することができる。

ヘルパーウイルスは、ｒＡＡＶベクターの導入の前に、間にもしくは後に導入することができる。例えば、プラスミドをヘルパーウイルスと一緒に培養物に重感染させることができ；そして次に当該技術分野において既知であるような複製およびパッケージングに適当な条件において（上記の参考文献および以下の実施例を参照）細胞を十分な期間、典型的には２〜５日間培養することができる。溶解物を調製し、そして組み換えＡＡＶベクター粒子を当該技術分野において既知である技術により精製する。

以下の実施例においてもまた説明される、好ましい態様として、組み換えＡＡＶベクターは、パッケージングに使用する哺乳類細胞にそれ自体が安定に組込まれる。次に、そのようなｒＡＡＶ「生産細胞」を培養し、そして使用の準備が整うまで保存することができる。そのような生産細胞からｒＡＡＶ粒子の生産を誘導するために、使用者はヘルパーウイルスを細胞に感染させそしてＡＡＶの複製およびパッケージングに適当な条件下で細胞を培養しさえすればよい（下記のように）。

あるいはまた、１つもしくはそれ以上のＡＡＶ分割パッケージング遺伝子またはｒＡＡＶベクターを組み換えヘルパーウイルスの一部として導入することができる。例えば、アデノウイルスのＥ１、Ｅ３および／もしくはＥ４遺伝子を１つもしくはそれ以上の分割パッケージング遺伝子またはｒＡＡＶベクターで置換することができる。アデノウイルスベクターへの、例えばＥ１および／もしくはＥ３領域へのクローニングを容易にする技術は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｂｅｔｔｅｔａｌ．，１９９４を参照）。従って、組み換えアデノウイルスのようなヘルパーウイルスは、（当該技術分野において既知であるように）そのようなヘルパーウイルスにおける多数の遺伝子（例えば、アデノウイルスのＥ３遺伝子）をヘルパーウイルス活性をなくすことなしに置換することができるので、ヘルパーウイルス機能ならびにＡＡＶパッケージング遺伝子および／もしくはｒＡＡＶプロベクターを提供するために用いることができる。追加の遺伝子は、トランスに任意の必要なヘルパーウイルス機能を提供することによりそのようなヘルパーウイルスに挿入することができる。例えば、ヒト２９３細胞は、アデノウイルスＥ１突然変異体を補足することができるアデノウイルス遺伝子を含有する。従って、異種遺伝子はまた、トランスにそのようなアデノウイルス機能を効果的に提供することができる細胞における使用のために、Ｅ１遺伝子が取り除かれているアデノウイルスにクローン化することもできる。あるいはまた、ヘルパーウイルスの使用は、パッケージング細胞において全ての必要なヘルパーウイルス機能を提供することによりなくすことができる。

ＩＶ．細胞への遺伝物質の導入
当該技術分野において記述され、そして本明細書および上記に引用する参考文献の両方
において説明されているように、遺伝物質は細胞（ウイルスベクターの製造のための哺乳類「生産」細胞のような）に、そのような細胞を形質転換するかもしくは形質導入するための様々な手段のいずれかを用いて導入することができる。実例として、そのような技術には、例えば、細菌プラスミドでのトランスフェクション、ウイルスベクターでの感染、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、および様々な脂質に基づく組成物のいずれかを用いる導入（「リポフェクション」と呼ばれることが多い方法）が包含される。これらの技術を実施するための方法および組成物は、当該技術分野において記述されており、そして広く利用可能である。

適当に改変された細胞の選択は、当該技術分野における任意の技術により行うことができる。例えば、細胞を改変するために使用するポリヌクレオチド配列は、当該技術分野において既知であるような１つもしくはそれ以上の検出可能なもしくは選択可能なマーカーと同時に導入するかもしくはそれに操作可能に連結することができる。実例として、選択可能なマーカーとして薬剤耐性遺伝子を用いることができる。次に、薬剤耐性細胞を選別して培養し、そして次に所望の配列の発現、すなわちパッケージング遺伝子産物、もしくは必要に応じて、異種ポリヌクレオチドの産物に関して試験することができる。導入したポリヌクレオチドの獲得、局在化および／もしくは維持に関する試験は、ＤＮＡハイブリダイゼーションに基づく技術（サザンブロッティングおよび当該技術分野において既知であるような他の方法のような）を用いて行うことができる。発現に関する試験は、遺伝子改変された細胞から抽出されたＲＮＡのノーザン分析により、もしくは対応する遺伝子産物の間接的免疫蛍光法により容易に行うことができる。パッケージング能力および効率の試験および確認は、ウイルス粒子の生産について試験するために、ウイルスの残りの機能成分およびヘルパーウイルスを細胞に導入することにより得られることができる。細胞が複数のポリヌクレオチド構築物で遺伝的に改変される場合、それらを別個に細胞に導入し、そして各段階を順次確認することが一般により好都合である（必須ではないが）。そのような技術を記述する参考文献には、本明細書に引用するものが包含される。

Ｖ．ウイルスベクターの使用
ウイルスベクターは、遺伝子もしくはワクチン治療の目的のために個体への投与に用いることができる。遺伝子もしくはワクチン治療に適当な疾患には、ウイルス、細菌もしくは寄生虫感染により誘発されるもの、様々な悪性腫瘍ならびに過剰増殖性症状、自己免疫症状および先天的欠損症が包含されるがこれらに限定されるものではない。

遺伝子もしくはワクチン治療は、細胞内のもしくは細胞により分泌されるいずれかの特定のタンパク質の発現のレベルを高めるために行うことができる。本発明のベクターは、遺伝子標識、欠けているかもしくは欠損する遺伝子の置換、または治療遺伝子の挿入のためのいずれかに細胞を遺伝子改変するために用いることができる。あるいはまた、発現のレベルを減少するポリヌクレオチドを細胞に提供することができる。これは、悪性腫瘍の過程において増幅されるかもしくは過剰発現される遺伝子、または微生物感染の過程において導入されるかもしくは過剰発現される遺伝子の産物のような、望ましくない表現型の抑制に用いることができる。発現レベルは、例えば、標的遺伝子もしくはＲＮＡ転写産物のいずれかと安定な複合体を形成することができる（アンチセンス治療）か、関連するｍＲＮＡを切断するためにリボザイムとして働くことができるか、もしくは標的遺伝子の産物のデコイとして働くことができる配列を含んでなる治療ポリヌクレオチドを供給することにより減少することができる。

本発明の方法によるウイルスベクターの導入は、当該技術分野において利用可能でありそして周知である送達技術（外科的および非外科的の両方）のいくつでもの使用を伴うことができる。そのような送達技術には、例えば、血管内カテーテル挿入、カニューレ挿入、注入、吸入、塗擦、局所、経口、経皮、動脈内、静脈内および／もしくは腹腔内投与が
包含される。ベクターはまた、実例として、血管移植片（ＰＴＦＥおよびダクロン）、心臓弁、血管内ステント、血管内ペービング（ｉｎｔｒａｖａｓｃｕｌａｒｐａｖｉｎｇ）ならびに他の非血管プロテーゼを包含するバイオプロテーゼによって導入することもできる。ベクター溶液の送達、頻度、組成物および投与量範囲に関する一般的技術は、当該技術分野の技量の範囲内である。

特に、筋肉もしくは肺のような組織への本発明のベクターの送達には、宿主動物にベクターを導入する任意の物理的もしくは生物学的方法を用いることができる。ベクターは、ウイルス投与について周知であるように、むき出しの組み換えベクターおよびウイルスコートタンパク質にパッケージングされたベクターＤＮＡの両方を意味する。ウイルスベクターをリン酸緩衝食塩水に単に溶解することは、筋肉組織発現に有用な媒体を提供するために十分であることが示されており、そしてベクターと共投与することができる担体もしくは他の成分への既知の制約はない（ＤＮＡを分解する組成物は、ベクターでの通常の方法において回避されるべきであるが）。製薬学的組成物は、注入可能な製剤としてもしくは経皮輸送により筋肉に送達される局所用製剤として製造することができる。筋肉内注射および経皮輸送の両方のための多数の製剤がこれまでに開発されており、そして本発明の実施において用いることができる。ベクターは、投与および取り扱いを容易にするために任意の製薬学的に許容しうる担体とともに用いることができる。

筋肉内注射の目的のために、ゴマ油もしくはピーナッツ油のような添加剤におけるまたは水性プロピレングリコールにおける溶液、ならびに滅菌した水性溶液を用いることができる。そのような水性溶液は、所望に応じて緩衝化し、そして液状希釈剤を最初に食塩水もしくはグルコースで等張にすることができる。遊離の酸（ＤＮＡは酸性リン酸基を含有する）もしくは薬理学的に許容しうる塩としてのウイルスベクターの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適当に混合した水において調製することができる。ウイルス粒子の分散液もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびその混合物においてそして油において調製することができる。保存および使用の通常の条件下で、これらの調製物は微生物の増殖を防ぐために防腐剤を含有する。これに関連して、用いられる滅菌した水性媒質は、当業者に周知である標準的な技術により全て容易に得ることができる。

注入可能な用途に適当な製薬学的形態には、滅菌した水性溶液もしくは分散液および滅菌した注入可能な溶液もしくは分散液の即時調製のための滅菌した粉末が包含される。全ての場合において該形態は無菌でなければならず、そして容易な注射可能性（ｓｙｒｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ）が存在する程度に流動性でなければならない。それは、製造および保存の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の汚染作用から保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、その適当な混合物、および植物油を含有する溶媒もしくは分散媒質であることができる。適切な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要とされる粒子サイズの維持により、そして界面活性剤の使用により維持することができる。微生物の作用の防止は、様々な抗菌剤および抗真菌剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらすことができる。多くの場合において等張剤、例えば、糖もしくは塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注入可能な組成物の長期吸収は、吸収を遅らせる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によりもたらすことができる。

滅菌した注入可能な溶液は、必要に応じて上記に列挙する様々な他の成分を有する適切な溶媒に必要な量のウイルスベクターを導入し、続いて濾過滅菌することにより調製される。一般に、分散液は、基本分散媒質および上記に列挙するものからの必要な他の成分を
含有する滅菌した賦形剤に滅菌した有効成分を導入することにより調製される。滅菌した注入可能な溶液の調製のための滅菌した粉末の場合、好ましい調製方法は、その前もって滅菌濾過した溶液から有効成分と任意の追加の所望の成分の粉末をもたらす真空乾燥および凍結乾燥技術である。

局所投与の目的のために、その他の点では上記の非経口溶液と同様の、希薄な滅菌した水性溶液（通常は約０．１％〜５％の濃度の）は、経皮パッチへの導入に適当な容器において調製され、そして製薬学的等級ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような既知の担体を含むことができる。

本発明の組成物は、インビボならびにエクスビボで用いることができる。インビボ遺伝子治療は、被験体に直接本発明のベクターを投与することを含んでなる。例えば、本発明のベクターは、単独でもしくは製薬学的に許容しうる担体と組み合わせて哺乳類のような動物に投与することができる。有効成分および担体の相対的比率は、化合物の溶解性および化学的性質、選択した投与経路ならびに標準的な製薬学的技法により決定される。予防もしくは治療に最も適当である本発明のベクターの投薬量は、投与の形態、選択した特定のベクターおよび処置下の特定の患者の生理的特性によって異なる。一般に、少量の投薬量を最初に使用することができ、そして必要に応じて、該状況下で最適な効果に達するまで少しずつ増やす。本明細書に記述する製剤および組成物はまた、抗菌剤もしくは防腐剤のような他の成分を含有することもでき、そしてまた他の治療薬と組み合わせて使用することもできる。

製薬学的組成物は、液状溶液もしくは懸濁液として、エマルジョンとして、または使用前の液体における溶解もしくは懸濁に適当な固形形態として供給することができる。気道への投与のために、投与の好ましい形態は、適切なエアロソルビライザー（ａｅｒｏｓｏｌｕｂｉｌｉｚｅｒ）装置で使用する場合に固形もしくは液状エアロゾルのいずれかを与える組成物を用いて、エアロゾルによってである。気道への投与の別の好ましい形態は、ベクターを注入するためにフレキシブル光ファイバー気管支鏡を用いることである。典型的に、ウイルスベクターは、リンガー平衡塩溶液（ｐＨ７．４）のような製薬学的に適当なパイロジェンフリーのバッファー中である。必要とされないが、製薬学的組成物は場合により正確な量の投与に適当な単位投与形態物で供給されてもよい。

ウイルスの有効量は、処置の目的により投与される。有効量は、単回もしくは分割用量で与えることができる。低いパーセンテージの形質導入が遺伝子欠損を治療することができる場合、処置の目的は、一般に、形質導入のこのレベルを満たすかもしくは超えることである。ある場合には、形質導入のこのレベルは、標的細胞の約１〜５％のみの形質導入により達成することができるが、より典型的には所望の組織タイプの細胞の２０％、通常は少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約８０％、より好ましくは少なくとも約９５％、そしてさらにより好ましくは所望の組織タイプの細胞の少なくとも約９９％である。指針として、気管支鏡検査法により与えられる単回用量に存在するベクター粒子の数は、ＤＮアーゼ耐性およびＤＮアーゼ感受性粒子の両方を包含して、一般に少なくとも約１ｘ１０^８であり、そしてより典型的には５ｘ１０^８、１ｘ１０^１０、そしてある場合には１ｘ１０^１１粒子である。ＤＮアーゼ耐性粒子に関して、該用量は一般に１ｘ１０^６〜１ｘ１０^１４粒子の間、より一般的には約１ｘ１０^８〜１ｘ１０^１２粒子の間である。１８０日に1回の処置は十分であり得るが、必要に応じて、処置を２もしくは３週ごとにも繰り返すことができる。

遺伝子改変の効果は、いくつかの基準によりモニターすることができる。生検もしくは外科的切除により取り除かれたサンプルは、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ベクター特異的プローブを用いるＰＣＲ増幅、ＲＮアーゼ保護、免疫組織学もしくは免疫蛍
光細胞計数により分析することができる。ベクターが気管支鏡検査法により投与される場合、肺機能試験を行うことができ、そして気管支洗浄を炎症性サイトカインの存在に関して評価することができる。処置した被験体はまた臨床的特徴に関して、そして治療ポリヌクレオチドにより運ばれることが意図される機能を細胞が発現するかどうかを決定するためにモニターすることもできる。

インビボもしくはエクスビボ治療を用いるかどうかの決定、ならびに特定の組成物、用量および投与の経路の選択は、処置する症状および被験体の特徴が包含されるがこれらに限定されるものではない多数の異なる因子により決まる。そのような特徴の評価および適切な治療処方計画の設計は、最終的に、処方する医師の責任である。

先の記述は、とりわけ、ヘルパーウイルス（例えばアデノウイルス）および細胞タンパク質を実質的に含まない組み換えウイルスベクターの高力価調製物を製造する方法を提供する。本発明の精神からそれることなしに当業者によってこれらの方法にバリエーションが適用され得ることが理解される。

本発明は、下記の実施例によりさらに記述されるが、これらに限定されない。

分子間シス活性化による組み換えＡＡＶ媒介遺伝子発現の増大
材料および方法
組み換えＡＡＶベクター
ｐｃｉｓＡＶ．Ｌｕｃプロウイルスプラスミドは、ｐＳｕｂ２０１（Ｓａｍｕｌｓｋｉ
ｅｔａｌ．，１９８７）の平滑化ＸｂａＩ部位への平滑末端ライゲーションにより、ルシフェラーゼ遺伝子およびＳＶ４０後期ポリＡシグナルを含有する、ｐＧＬ３−Ｂａｓｉｃ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からの１９８３ｂｐのＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩフラグメントをクローニングすることにより作製した。同様に、ｐｃｉｓＡＶ．ＳＶ（Ｐ）Ｌｕｃは、ＳＶ４０プロモーター、ルシフェラーゼ遺伝子およびＳＶ４０後期ポリＡシグナルを含有する、ｐＧＬ３−Ｐｒｏｍｏｔｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からの、平滑化した２１７５ｂｐのＮｈｅＩ／ＢａｍＨＩフラグメントを用いて作製した。ｐｃｉｓＡＶ．ＳＶ（Ｐ／Ｅ）Ｌｕｃプラスミドは、ｐｓｕｂ２０１の平滑化ＸｂａＩ部位へのｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）からの２４２７ｂｐのＮｈｅＩ／ＳａｌＩフラグメントの平滑末端ライゲーションにより作製した。この構築物は、ＳＶ４０プロモーター、ルシフェラーゼ遺伝子、ＳＶ４０後期ポリＡシグナルおよびＳＶ４０エンハンサーを含有する。

「スーパー−エンハンサー」ベクター、ｐｃｉｓＡＶ．ＳｕｐＥｎｈは、２段階のクローニング方法を用いて製造した。第一に、ｐＩＲＥＳ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）からのＣＭＶ前初期エンハンサーを含有する０．６２ｋｂの平滑化ＢｇｌＩＩ／ＰｖｕＩフラグメントをｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ（Ｐｒｏｍｅｇａ）における平滑化ＢａｍＨＩ部位にサブクローニングしてｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＣＭＶｅｎｈを作製した。次に、ＣＭＶ前初期エンハンサーおよびＳＶ４０エンハンサーの両方を含有する０．９２ｋｂのＤＮＡセグメントをｐＧＬ３−Ｃｏｎｔｒｏｌ−ＣＭＶｅｎｈのＣｌａＩ／ＳａｌＩ二重消化により遊離させ、そして続いてｐｃｉｓＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉ（Ｄｕａｎｅｔａｌ．，１９９８ｂ）の平滑化ＰｓｔＩ部位に挿入した。得られるｐｃｉｓＡＶ．ＳｕｐＥｎｈプラスミドは、ＳＶ４０エンハンサー、ＣＭＶ前初期エンハンサー、β−ラクタマーゼ遺伝子および細菌複製起点を含有する。アンピシリン耐性遺伝子（β−ラクタマーゼ）および細菌複製起点は、細菌における感染細胞からの環状ＡＡＶゲノムのその後のレスキューを容易にするためにｐｃｉｓＡＶ．ＳｕｐＥｎｈに含まれた。

コントロールベクター、ｐｃｉｓＡＶ．ＡｍｐＯｒｉは、ＰｓｔＩ消化したｐｃｉｓＡ
Ｖ．ＧＦＰ３ｏｒｉへのヒトグリコシルアスパラギナーゼｃＤＮＡからの１．１ｋｂのＳａｌＩ消化したスタッファー配列の平滑末端ライゲーションにより作製した。このプラスミドは、それがいかなるエンハンサー要素も含有しないことを除いて、ｐｃｉｓＡＶ．ＳｕｐＥｎｈのものと同様の構造を有する。ｐｃｉｓＡＶ．ＡｍｐＯｒｉは、２つの異なるＡＡＶベクターの分子間組み換えによる導入遺伝子発現の非特異的増大の陰性コントロールとして用いた。

全てのプラスミドにおけるＴＰＳ配列の完全性は、ＴＰＳの異なる領域内で唯一の切断部位を有する、ＳｍａＩ、ＭｓｃＩおよびＢｓｓＨＩＩを包含する、制限酵素での消化により確かめた。全てのウイルス調製物は、Ｄｕａｎｅｔａｌ．（１９９７）に記述されている方法に従って得られた。ウイルスストックの品質（すなわち、アデノウイルスおよび／もしくは野生型ＡＡＶでの汚染）は、Ｄｕａｎｅｔａｌ．（１９９８ｂ）に以前に記述されているように確かめた。これらの分析により、１０^１０粒子のｒＡＡＶ当たり１個未満の組み換えアデノウイルスおよびｗｔＡＡＶ感染性粒子が示された。ウイルス力価は、プラスミドコピー数基準に対してそれぞれのベクターの各々についてルシフェラーゼ、ＣＭＶエンハンサー、ＳＶ４０エンハンサーもしくはｏｒｉプローブのいずれかを用いて定量的スロット−ブロットハイブリダイゼーションにより決定した。

ルシフェラーゼ酵素アッセイ
ルシフェラーゼアッセイは、ｉｎｖＴＰＳｏ感染したヒト線維芽細胞よりもしくはインビボ感染したマウス前脛骨筋より採取した細胞溶解物から行った。ヒト線維芽細胞に６０ｍｍ皿においてウイルスを感染させた。これらのｉｎｖＴＰＳｏ感染細胞は、細胞をＰＢＳで２回すすぎ、そして次に１ｘＲｅｐｏｒｔ溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）（６０ｍｍプレート当たり４００μｌ）と室温で１５分間インキュベーションすることにより感染後３日で採取した。細胞をエッペンドルフチューブにこすり取り、そして１４，０００ｒｐｍで３０秒間遠心分離した。上清の連続希釈物を製造業者のプロトコルに従ってＰｒｏｍｅｇａからの試薬を用いてルシフェラーゼ活性についてアッセイした。ルシフェラーゼ活性は、９０．３％の感度、１秒の遅延、１０秒の測定の設定で、照度計（ＴＤ−２０／２０，ＴｕｒｎｅｒＤｅｓｉｇｎｓＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔ，Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ，ＣＡ）で各個々のサンプルについて三重反復で検出した。６つの独立したサンプルを各実験条件についてアッセイした。

ルシフェラーゼ活性のインビボアッセイでは、８週齢のＣ５７ＢＬ／６マウスの前脛骨筋に３０μｌのリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）中の示される量およびタイプのＡＡＶベクターを感染させた。全筋肉を感染後３０日もしくは９０日で採取し、そして細胞溶解物調製の前に秤量した。筋肉組織を液体窒素において凍結させ、そしてよく冷えた磁器製乳鉢および乳棒で手研削により粉砕した。筋肉を手持ち式のプラスチック製乳棒で１００μｌの１ｘＲｅｐｏｒｔ溶解バッファーにおいて２分間さらに刻んで均質化した（Ｋｏｎｔｅｓ，Ｖｉｎｅｌａｎｄ，ＮｅｗＪｅｒｓｅｙ）。室温で１５分のインキュベーション後に、粗溶解物を１４，０００ｒｐｍで３０秒間回転させ、そして上清を上記のようなルシフェラーゼ活性アッセイに使用した。変動を最小限に抑えるために、全ての実験サンプルを同じバッチのルシフェラーゼアッセイ試薬を用いて同時に分析し、そして溶解物中のタンパク質含有量に対して正規化した。

結果
シス活性化ベクターの共投与は、線維芽細胞におけるｒＡＡＶ媒介ルシフェラーゼ発現を増加する
２つの独立したＡＡＶベクターからのシス活性化は、分子間コンカテマー化の後に起こることができるという仮説を検証するために、特定の調節要素および／もしくはルシフェラーゼレポーター遺伝子を有するいくつかのｒＡＡＶベクターを構築した（図１）。これ
らのベクターの１つ、ＡＶ．Ｌｕｃは、ルシフェラーゼ導入遺伝子およびＳＶ４０ポリＡシグナルを含有するが、プロモーター配列を含有しない。ＡＶ．ＳＶ（Ｐ）Ｌｕｃは、ＳＶ４０プロモーター（エンハンサー配列を欠く）がルシフェラーゼ導入遺伝子の前に挿入されたことを除いてＡＶ．Ｌｕｃと同様である。ＡＶ．ＳＶ（Ｐ／Ｅ）Ｌｕｃは、ルシフェラーゼ導入遺伝子の発現を導く、ＳＶ４０プロモーターおよびエンハンサーの両方を含み、そしてエンハンサーを含有するベクターとの分子間組み換えがない場合の最大発現のコントロールとして用いた。エンハンサー要素による分子間シス活性化を評価するために、プロモーターもしくは導入遺伝子配列なしにＳＶ４０およびＣＭＶエンハンサー領域を含有する、ｒＡＡＶスーパー−エンハンサーベクター（ＡＶ．ＳｕｐＥｎｈ）もまた構築した。エンハンサー配列が非特異的なスタッファーフラグメントで置換されたことを除いてＡＶ．ＳｕｐＥｎｈと同様である、陰性コントロールベクター（ＡＶ．ＡｍｐＯｒｉ）もまた構築した。

エンハンサーは、プロモーターおよび導入遺伝子に対して前後関係非依存的に転写を刺激するように調節タンパク質により認識されることができるシス作用ＤＮＡ配列である。細胞にＡＶ．ＳＶ（Ｐ）ＬｕｃおよびＡＶ．ＳｕｐＥｎｈベクターを重感染させた場合、ルシフェラーゼ導入遺伝子発現は、分子間組み換えが２つの独立したベクター間で起こった場合にのみ最小ＳＶ４０プロモーターから有意に増加されることができる（図２）。しかしながら、エンハンサーの定義に従って、エンハンサー配列および導入遺伝子カセットが別個の環状ＤＮＡ分子に位置する場合には活性化は起こらないはずである（Ｌｅｗｉｎ，１９９７）。

１ｘ１０^６の初代ヒト線維芽細胞に単一のベクター［ＡＶ．ＬｕｃもしくはＡＶ．ＳＶ（Ｐ）Ｌｕｃ］を１０００ウイルス粒子／細胞に等しい感染多重度（ｍｏｉ）で感染させることにより初期実験を行った。追加の実験点は、同じｍｏｉでＡＶ．ＳｕｐＥｎｈもしくはＡＶ．ＡｍｐＯｒｉのいずれかとＡＶ．ＬｕｃもしくはＡＶ．ＳＶ（Ｐ）Ｌｕｃとの重感染を含んだ。

図３に示されるように、プロモーターのない［ＡＶ．Ｌｕｃ］および最小プロモーター［ＡＶ．ＳＶ（Ｐ）Ｌｕｃ］ルシフェラーゼ構築物単独での線維芽細胞の感染は、両方とも感染後３日でごくわずかな発現しか与えなかった。しかしながら、ＡＶ．ＳｕｐＥｎｈとの重感染は、それぞれ、ＡＶ．ＬｕｃおよびＡＶ．ＳＶ（Ｐ）Ｌｕｃベクターからのルシフェラーゼ発現の１６倍および３５倍の誘導をもたらした。従って、最小ＳＶ４０プロモーターのシス活性化は、エンハンサー要素を含有する第二のＡＡＶベクターの存在下で起こることができる。しかしながら、予期しなかったのは、異種プロモーター配列を含有しないＡＶ．Ｌｕｃ構築物の高レベルのトランス活性化であった。これらの結果は、ＴＰＳが隠れたプロモーターを含有することを示唆する以前の研究を裏付ける（Ｆｌｏｔｔｅ
ｅｔａｌ．，１９９３）。この誘導の特異性は、エンハンサー要素を含有しない別のコントロールベクター、ＡＶ．ＡｍｐＯｒｉの共投与後のトランス活性化の欠如によりさらに示された。

認められるトランス活性化が２つの独立したＡＡＶウイルスの組み換えに起因したことを確かめるために、感染細胞からのＨｉｒｔＤＮＡをコンピテントＳＵＲＥエシェリキア・コリ細胞に形質転換した。予想されるように、細菌コロニーは、ＡＶ．ＬｕｃもしくはＡＶ．ＳＶ（Ｐ）Ｌｕｃ（いずれのベクターもａｍｐ^ｒおよびｏｒｉ配列を含有しない）のいずれか単独で感染させた細胞からは回収されなかった。しかしながら、ＡＶ．ＳｕｐＥｎｈ（これはａｍｐ^ｒおよびｏｒｉ配列を含有するが、ルシフェラーゼ遺伝子を含有しない）を重感染させた細胞において、レスキューされたクローンの約４％は、制限酵素マッピングおよびサザンブロッティング分析によれば、ルシフェラーゼ導入遺伝子も含有した。これらのレスキューされた環状コンカテマープラスミドでのＨｅＬａ細胞のその後の
トランスフェクションにより、ＡＶ．Ｌｕｃ／ＡＶ．ＡｍｐＯｒｉ組み換えＡＡＶゲノムプラスミドと比較した場合に、ＡＶ．Ｌｕｃ／ＡＶ．ＳｕｐＥｎｈからの１０３＋／−６倍高いルシフェラーゼ活性が示された。総合すると、これらの結果は、独立した「スーパー−エンハンサー」ＡＡＶベクターとレポーターｒＡＡＶウイルスとの分子間コンカテマー化が、培養したヒト初代線維芽細胞における導入遺伝子発現の効率を実質的に増加することを示した。

分子間シス活性化は、インビボで筋肉組織におけるＡＡＶ媒介ルシフェラーゼ発現を高める
インビトロ結果がまたインビボでもｒＡＡＶ媒介遺伝子発現を増加するために適用できるかどうかを確かめるために、２ｘ１０^１０粒子のＡＶ．ＬｕｃもしくはＡＶ．ＳＶ（Ｐ）Ｌｕｃを個々にもしくはＡＶ．ＳｕｐＥｎｈ（２ｘ１０^１０粒子）と組み合わせてＣ５７ＢＬ／６マウスの前脛骨筋に注入した。感染した筋肉を感染後３０および９０日で採取した。環状ｒＡＡＶゲノムの分子間組み換えは、３０日の時間点での約５％から感染後９０日までに２５％まで増加した。重要なことには、ＡＶ．ＬｕｃもしくはＡＶ．ＳＶ（Ｐ）ＬｕｃのいずれかとＡＶ．ＳｕｐＥｎｈベクターとの共投与（図４Ａ）は導入遺伝子遺伝子発現の機能的増大をもたらし、３０倍の増加が感染後３０日で認められた。感染後９０日までに、導入遺伝子発現の２００倍［ＡＶ．Ｌｕｃ］および６００倍［ＡＶ．ＳＶ（Ｐ）Ｌｕｃ］より大きい増加が、ＡＶ．ＳｕｐＥｎｈを共投与した場合に認められた。

線維芽細胞におけるインビトロ実験と一致して、ルシフェラーゼ導入遺伝子およびＡＶ．ＳｕｐＥｎｈの両方を含有する細菌でレスキューされたコンカテマーもまた、元のプロウイルスルシフェラーゼプラスミド（ｐｃｉｓＡＶ．Ｌｕｃ）単独よりも１００倍より大きい高いルシフェラーゼ活性を示した。興味深いことに、２ｘ１０^１０粒子のコントロールＡＶ．ＳＶ（Ｐ／Ｅ）Ｌｕｃベクター（これはＳＶ４０エンハンサーおよびプロモーターの両方を含有する）を感染させた９０日の筋肉は、それぞれ、ＡＶ．ＳｕｐＥｎｈ／ＡＶ．ＬｕｃおよびＡＶ．ＳｕｐＥｎｈ／ＡＶ．ＳＶ（Ｐ）Ｌｕｃでの重感染後に見られるレベルより１０倍および１００倍低いルシフェラーゼレベルをもたらした。これらの結果は、分子間シス活性化によってＡＡＶ媒介遺伝子送達を増加するために大きいマルチエンハンサーセグメントを用いる可能性を強調する。そのような適用は、ＡＡＶゲノムのコンカテマー化がその潜伏生活環の固有のプロセスである臓器へのインビボＡＡＶ媒介遺伝子送達に広い意味を有すると思われる。

本明細書に記述されるインビトロおよびインビボ結果は両方とも、導入遺伝子もしくはエンハンサー配列を保有する２つの独立したＡＡＶベクター間の分子間コンカテマー化後の導入遺伝子発現の効果的な増大を示した。驚くべき結果は、内因性プロモーターを欠くＡＡＶベクター（ＡＶ．Ｌｕｃ）からの導入遺伝子発現の強い誘導であった。以前の研究は、ＡＡＶＴＰＳ配列における弱いプロモーター活性を示唆している（Ｆｌｏｔｔｅｅｔａｌ．，１９９３）。従って、別のＡＡＶベクターにより供給されるエンハンサー配列と組み合わせて、ＡＡＶの最大パッケージング容量に匹敵する疾患遺伝子について治療レベルの導入遺伝子発現を達成できることが可能である。１つの注目すべき例は、嚢胞性線維症へのＡＡＶの適用においてである。さらに、本研究の特定の興味深い拡張は、大きい細胞特異的エンハンサー領域を標的化発現に使用することである。

ベクター内非相同ＴＰＳを有するトランス−スプライシングベクター
尾部−頭部ヘテロダイマーを形成する好ましい組み換え傾向を有するデュアルベクターセットを設計することは、トランス−スプライシング効率を下げるランダムな組み換えの制約を克服するための１つの可能な方法である。そのような戦略の基礎となるのは、組み換えプロセスにおけるＴＰＳ関与の明確な概要説明である。これらの問題に取り組むため
に、最も相違する（５０％未満が保存される）ＴＰＳ配列の２つ、すなわち、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５に由来するものを用いて新規なベクター内非相同ＴＰＳベクターゲノム（ＡＶ２：５）を作製した。このベクター内非相同ＴＰＳウイルスベクターは、ウイルスゲノムのいずれかの末端に１個のＡＡＶ−２ＴＰＳおよび１個のＡＡＶ−５ＴＰＳを含有し、そして天然のｒＡＡＶ−２もしくはｒＡＡＶ−５ベクター、すなわち、両末端に相同なＴＰＳを有するものと同様の効率で単一のコードされる導入遺伝子を機能的に形質導入した。ベクター内非相同ＡＶ２：５ＴＰＳウイルスを用いてゲノム環化ならびに分子内および分子間組み換えに起因するウイルスＤＮＡのコンカテマー化におけるＴＰＳ配列の関与を調べた。ベクター内非相同ＴＰＳベクターは、モノマー環状中間体を形成する減少した効率およびデュアルベクターによりコードされるトランス−スプライシングされた遺伝子産物を発現することができる線状ゲノムの方向性尾部−頭部分子間組み換えの増加した効率を示した。これらの結果は、ＴＰＳに媒介される組み換え事象がＡＡＶゲノム環化およびコンカテマー化にとって重要であることを示唆する。従って、独立したベクターゲノム間の方向性分子間組み換えを促進するためにＴＰＳ配列を改変することは、デュアルベクター遺伝子送達を高めるための有用な方法である。

材料および方法
ＡＡＶ−５ＴＰＳクローニング
５’Ａ配列に隣接するＥｃｏＲＩおよびＸｈｏＩ部位ならびにＤ配列の３’末端でＢａｍＨＩ部位を有する、Ｄ配列に連結された１６７ｂｐのＡＡＶ−５ＴＰＳは、以前に公開されたＡＡＶ−５配列（Ｃｈｉｏｒｉｎｉｅｔａｌ．，１９９９）に従ってＩＤＴ
Ｉｎｃ．（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ，ＩＡ）により合成された。合成フラグメントをｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ／ＥｃｏＲＩ部位にクローン化してプラスミド中間体ｐＵＣ．ＡＶ５ＴＰＳを生成せしめた。第二の中間体クローニングベクターは、ルシフェラーゼｃＤＮＡの一部で隔てられたＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５ＴＰＳの両方を含有するｐＴＰＳ．５Ｒ／２Ｌであった。ＢａｍＨＩおよびＸｈｏＩ二重消化を用いて、１個のＡＡＶ−２ＴＰＳをｐＵＣ．ＡＶ５ＴＰＳからのＡＡＶ−５ＴＰＳで置換することによりＡＡＶ−２プロウイルスプラスミドｐＣｉｓ．ＡＶ２．ａｍｐ／ｏｒｉからｐＴＰＳ．５Ｒ：２Ｌを作製した。ｐＵＣ．ＡＶ５ＴＰＳおよびｐＴＰＳ．５Ｒ：２ＬにおけるＡＡＶ−５ＴＰＳ配列は、アイオワ大学のＤＮＡ施設によって行われたジデオキシサーモサイクリングシーケンシング方法により確かめられた。ＴＰＳの二次構造をなくしそして完全な配列読み取りを可能にするために、ＡＡＶ−５ＴＰＳ含有プラスミドをシーケンシングの前にＡ配列とＢ−Ｃループの連結部に位置するＥａｅＩで消化した。その後のクローニングプロセスにおけるＡＡＶ−５ＴＰＳの完全性は、ＥａｅＩ診断アッセイおよびＴＰＳに隣接する他の制限酵素（ＢａｍＨＩ、ＸｈｏＩなどのような）を用いて酵素消化により確かめた。

ｒＡＡＶ−５プロウイルスプラスミドおよびベクター内非相同ＡＶ２：５ＴＰＳプロウイルスプラスミドの構築
様々なプロウイルスプラスミドおよびウイルスの命名は、図５および表１に含まれる。ｐＴＰＳ．５Ｒ：２ＬからのＡＡＶ−５ＴＰＳおよびスタッファー配列の一部を含有する１．４ｋｂのＡｆｌＩＩＩ／ＸｂａＩ（平滑化）フラグメントをｐＵＣ．ＡＶ５ＴＰＳに挿入してＡＡＶ−５プロウイルスプラスミドｐＡＶ５：５ａｍｐ／ｏｒｉを生成せしめた。次に、ｐＡＶ２：２ｅＧＦＰ（以前にｐＣｉｓＡＶ．ＧＦＰ．３ｏｒｉ（５）と記述された）からのｅＧＦＰ発現カセットをＰｓｔＩ部位に挿入してｐＡＶ５：５ｅＧＦＰを生成せしめた。ベクター内非相同ＴＰＳプロウイルスプラスミド、ｐＡＶ２：５ｅＧＦＰは、両末端でＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５ＴＰＳが隣接するｅＧＦＰ発現カセットを特徴とする。それは、１個のＡＡＶ−２ＴＰＳおよびｅＧＦＰカセットを含有する、ｐＡＶ２：２ｅＧＦＰからのＢｇｌＩＩ／ＳａｌＩ（平滑化）フラグメントをｐＡＶ５：５ａｍｐ／ｏｒｉのＢｇｌＩＩ／ＡｆｌＩＩＩ（平滑化）部位に挿入することにより作製した
。ｐＡＶ５：５ａｍｐ／ｏｒｉのＢｇｌＩＩ／ＡｆｌＩＩＩ消化は、１個のＡＡＶ−５ＴＰＳを取り除く。ｐＡＶ５：５ｅＧＦＰおよびｐＡＶ２：５ｅＧＦＰは両方とも、プロウイルスゲノムにアンピシリン耐性遺伝子およびエシェリキア・コリレプリコンを保有し、そしてｐＡＶ２：２ｅＧＦＰのようなＴＰＳ配列を除いて、同一のゲノム構成を有する。ｐＡＶ２：２ｅＧＦＰは、細菌形質転換によりＨｉｒｔＤＮＡから環状ウイルスゲノムを単離することができるｒＡＡＶ−２シャトルウイルス（ＡＶ２：２／２ｅＧＦＰ）を作製するために以前に使用された（Ｄｕａｎｅｔａｌ．，１９９８；Ｙａｎｇｅｔ
ａｌ．，１９９９）。

β−ガラクトシダーゼトランス−スプライシングベクター
３つのｒＡＡＶ−２ β−ガラクトシダーゼトランス−スプライシングデュアルベクターセットを相同なＡＡＶ−２ＴＰＳ、相同なＡＡＶ−５ＴＰＳおよびベクター内非相同ＡＶ２：５ＴＰＳで作製してＴＰＳに媒介される分子間組み換えを評価した（表１）。２型ＴＰＳに基づくベクターは、２つのプロウイルスプラスミド：ｐＡＶ２：２ＬａｃＺｄｏｎｏｒおよびｐＡＶ２：２ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒ（以前にｐＣｉｓＬａｃＺＤｏｎｏｒおよびｐＣｉｓＬａｃＺＡｃｃｅｐｔｏｒと記述された、Ｄｕａｎｅｔａｌ．，２００１）から作製した。これら２つのプラスミドを用いてＡＡＶ−２ＴＰＳに基づくトランス−スプライシングウイルス、ＡＶ２：２ＬａｃＺｄｏｎｏｒおよびＡＶ２：２ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒを作製した。簡潔に言えば、これらのベクターは、ＲＳＶエンハンサー／プロモーターに導かれるβ−ガラクトシダーゼ発現カセットの半分を各々含有する。プロモーターおよびＬａｃＺ遺伝子の５’半分、その後のスプライシングドナー共通配列をドナープロウイルスプラスミドにクローン化した（ｐＡＶ２：２ＬａｃＺｄｏｎ
ｏｒ）。ドナープラスミドのバックボーンは、ｐＳｕｂ２０１（Ｓａｍｕｌｓｋｉｅｔ
ａｌ．，１９８７）からであった。アクセプターベクターは、ｐＡＶ２：２ｅＧＦＰにおけるｅＧＦＰカセットをスプライスアクセプター配列、ＬａｚＺ遺伝子の３’末端の残りおよびＳＶ４０ポリＡシグナルで置換することにより得られた。一連のサブクローニング段階によって、そして導入遺伝子カセットを改変することなしに、ｐＡＶ２：２ＬａｃＺｄｏｎｏｒおよびｐＡＶ２：２ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒにおけるＡＡＶ−２ＴＰＳをＡＡＶ−５ＴＰＳで置換し、このようにして２つのＡＡＶ−５に基づくトランス−スプライシングプロウイルスプラスミド、ｐＡＶ５：５ＬａｃＺｄｏｎｏｒおよびｐＡＶ５：５ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒを作製した。これらのプロウイルスプラスミドを用いてＡＶ５：５ＬａｃＺｄｏｎｏｒおよびＡＶ５：５ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒと呼ばれるｒＡＡＶ−５トランス−スプライシングウイルスを作製した。ベクター内非相同ＡＶ２：５ＴＰＳベクターセットは、ドナープラスミド、ｐＡＶ５：２ＬａｃＺｄｏｎｏｒおよびアクセプタープラスミド、ｐＡＶ２：５ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒから作製した。

ｐＡＶ５：２ＬａｃＺｄｏｎｏｒを構築するために、ｐＡＶ２：２ＬａｃＺｄｏｎｏｒおよびｐＡＶ５：５ＬａｃＺｄｏｎｏｒの両方をＸｍｎＩおよびＳｐｈＩで消化した。次に、ＡＡＶ−５ＴＰＳおよびＲＳＶプロモーターの一部を含有するｐＡＶ５：５ＬａｃＺｄｏｎｏｒからの２．５ｋｂのフラグメントをｐＡＶ２：２ＬａｃＺｄｏｎｏｒのＸｍｎＩ／ＳｐｈＩ消化したバックボーンにクローン化してｐＡＶ５：２ＬａｃＺｄｏｎｏｒを生成せしめた。このプロウイルスプラスミドは、それぞれ、導入遺伝子カセットの５’および３’末端にＡＡＶ−５およびＡＡＶ−２ＴＰＳを含有した（５’末端は、挿入したリーディングフレームの５’末端に最も近位のＴＰＳとして示される）。ｐＡＶ２：５ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒプロウイルスベクターは、ｐＡＶ２：２ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒとｐＡＶ５：５ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒ間のフラグメント交換によりクローン化した。スプライシングアクセプターに連結された部分スタッファー配列およびＡＡＶ−５ＴＰＳを含有するｐＡＶ５：５ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒからの２．３ｋｂのＮｏｔＩ／ＢｇｌＩＩ（平滑化）フラグメントをＡＡＶ−２ＴＰＳを含有するｐＡＶ２：２ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒ由来の２．６ｋｂのＮｏｔＩ／ＸｂａＩ（平滑化）フラグメントで置換してｐＡＶ２：５ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒを生成せしめた。

組み換えＡＡＶベクター製造および精製
本研究は２型および５型キャプシドウイルスの両方を比較しようとしたので、選択した精製の標準法は二重バンドＣｓＣｌ等密度遠心分離であった。ＴａｒｇｅｔｅｄＧｅｎｅｔｉｃｓからのアデノウイルスヘルパープラスミドｐＡＤ４．１を共トランスフェクションカクテルにおいて使用したことを除いて、通常のリン酸カルシウム共トランスフェクションプロトコルを用いて２９３細胞からｒＡＡＶを製造した（Ｙａｎｅｔａｌ．，２００２）。ｒＡＡＶ−２もしくはｒＡＡＶ−５ウイルスを製造するために、共トランスフェクションプロトコルは、ｒＡＡＶ−２プロウイルスプラスミド、ｐＡＶ２ＲｅｐＣａｐおよびｐＡｄ４．１、もしくはＡＡＶ−５プロウイルスプラスミド、ｐＡＶ５ＲｅｐＣａｐおよびｐＡｄ４．１を１：３：３の比率で含んだ。以前に記述されたものと同様のプロトコルを用いてｒＡＡＶ−２ゲノムをＡＡＶ−５キャプシドにもしくはｒＡＡＶ−５ゲノムをＡＡＶ−２キャプシドにシュードタイピングし（ｐｓｅｕｄｏｔｙｐｅ）（Ｙａｎ
ｅｔａｌ．，２００２）、そしてまたそれらを用いてベクター内非相同ＴＰＳベクターをパッケージングした。ベクター内非相同ＴＰＳウイルスは、ｐＡＶ２：５ＴＰＳもしくはｐＡＶ５：２ＴＰＳプロウイルス構築物をｐＲｅｐ５、ｐＡＶ２ＲｅｐＣａｐおよびｐＡｄ４．１と一緒に１：１：３：３の比率で２９３細胞にトランスフェクションすることによりＡＡＶ−２キャプシドでパッケージングした。ＡＡＶ−５キャプシドを用いるベクター内非相同ＴＰＳウイルスは、ｐＡＶ２：５ＴＰＳもしくはｐＡＶ５：２ＴＰＳプロウイルスプラスミドをｐＲｅｐ２、ｐＡＶ５ＲｅｐＣａｐおよびｐＡｄ４．１と１：１：３：３の比率で共トランスフェクションすることにより製造した。細胞をトランスフェク
ション後７０時間で採取し、そして以前に記述されているように（Ｙａｎｅｔａｌ．，２００２）凍結融解、ＤＮアーゼＩ消化およびデオキシコール酸塩処理によりウイルス粒子を遊離した。全てのウイルスストックは、同じＣｓＣｌ超遠心分離法を用いて精製した。２回のＣｓＣｌバンディングの後に、約１．３６〜約１．４２ｇ／ｃｍ^３の画分を集めた。ＣｓＣｌを除くために４℃でＨＥＰＥＳ緩衝食塩水に対して透析した後に、ウイルスストックをスロットブロットにより定量した。

ウイルス感染および導入遺伝子発現の評価
ＨｅＬａ細胞もしくはフェレット胎仔初代線維芽細胞を１０％のウシ胎仔血清（ＨｙＣｌｏｎｅＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ）、１００Ｕ／ｍｌのペニシリンおよび１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンを補足したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）において単層として培養し、そして５％ＣＯ_２で３７℃のインキュベーターにおいて維持した。細胞を感染の１日前に６ウェルプレート当たり５ｘ１０^５細胞もしく１２ウェルプレート当たり２ｘ１０^５細胞の密度で接種した。感染の直前に、細胞を０％血清ＤＭＥＭで１回洗浄した。次に、ウイルスを無血清ＤＭＥＭと混合し、そして細胞に直接加えた。感染後１時間で、等量のＤＭＥＭ／２０％ＦＢＳを各培養物に加え、最終血清含有量を１０％にした。ｅＧＦＰ発現ベクターの評価では、ＡＶ２：２／２ｅＧＦＰ、ＡＶ５：５／５ｅＧＦＰ、、ＡＶ２：５／２ｅＧＦＰおよびＡＶ２：５／５ｅＧＦＰを用いて細胞当たり５００ＤＲＰ（ＤＮアーゼ耐性粒子）の感染多重度（ＭＯＩ）で６ウェルプレートにおいて培養したＨｅＬａ細胞に感染させた。感染後２４時間で、ｅＧＦＰ発現を間接蛍光顕微鏡検査により分析した。Ｙａｎｅｔａｌ．（２００２）に以前に記述されているような改変されたＨｉｒｔ法による低分子量ＤＮＡの抽出のために細胞を集めた。

β−ガラクトシダーゼのＬａｃＺトランス−スプライシング発現の評価は、６ウェルプレート当たり５ｘ１０^５細胞もしく１２ウェルプレート当たり２ｘ１０^５細胞で接種したＨｅＬａ細胞もしくは初代胎仔線維芽細胞上で行った。６ウェル培養物をＸ−ｇａｌ組織化学染色およびＨｉｒｔＤＮＡ抽出に用い、一方、１２ウェル培養物を酵素組織化学アッセイに用いた。ウイルス感染は、各ウイルスについて細胞当たり２．５ｘ１０^３ＤＲＰのＭＯＩを用いて上記のように７０％の飽和密度のＨｅＬａ細胞もしくは９０％の飽和密度の線維芽細胞培養物上で行った。導入遺伝子発現アッセイは、感染後７２時間で行った。トランス−スプライシングベクター感染細胞からのβ−ガラクトシダーゼ発現は、ｉｎ
ｓｉｔｕＸ−ｇａｌ染色および／もしくはＤｕａｎｅｔａｌ．（２００１）に以前に記述されているようなＧａｌａｃｔｏ−ＬｉｇｈｔＰｌｕｓシステム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いる酵素アッセイの両方により評価した。酵素アッセイでは、細胞溶解物上清を４８℃で１時間加熱して内因性β−ガラクトシダーゼ活性を不活性化した。

ＡＡＶ形質導入細胞からの環状ウイルスゲノムのレスキュー
低分子量ＤＮＡをＡＡＶ感染細胞から抽出した（Ｙａｎｅｔａｌ．，２００２；Ｙａｎｅｔａｌ．，２０００）。６ウェルプレート培養物の１つのウェルからの最終ＤＮＡペレットを５０μｌのＨ_２Ｏに溶解し、そして全容量の１／１０（５μｌ）を用いて電気穿孔によりエシェリキア・コリＳｕｒｅ細胞｛（ｅｌ４⁻（ＭｃｒＡ⁻）Δ（ｍｃｒＣＢ−ｈｓｄＳＭＲ−ｍｒｒ）１７１ｅｎｄＡ１ｓｕｐＥ４４ｔｈｉ−１ｇｙｒＡ９６ｒｅｌＡ１ｌａｃｒｅｃＢｒｅｃＪｓｂｃＣｕｍｕＣ：：Ｔｎ５（Ｋａｎ^ｒ）ｕｖｒＣ［Ｆ’ｐｒｏＡＢｌａｃＩ^ｑＺΔ（Ｍ１５Ｔｎ１０（Ｔｅｔ^ｒ））］｝を形質転換した。アンピシリン耐性コロニーの得られる総数を定量し、そしてレスキューされたプラスミドの一部を制限酵素、サザンブロッティングおよびシーケンシングによる分子分析のために精製した。

結果
ｒＡＡＶ−５は、ＨｅＬａ細胞および胎仔線維芽細胞において環状中間体およびヘテロダイマーを形成する
ｒＡＡＶ−２ベクターの形質導入生物学を解明する幅広い多数の知識にもかかわらず、ｒＡＡＶ−２と他のベクター血清型間のウイルスプロセシング事象における類似性および相違について比較的わずかしか知られていない。全てのクローン化されたＡＡＶゲノムの中で、ＡＡＶ−５はウイルスゲノム配列および指向性に関してＡＡＶファミリーの最も異なるメンバーである。

ＡＡＶ−２とＡＡＶ−５ゲノム間の詳細な配列比較は、キャプシドおよびＲｅｐタンパク質の配列ならびにＴＰＳ構造における大きな相違を示す。ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５
ＴＰＳ間のヌクレオチド配列における５０％より低い相同性にもかかわらず、両者は同様のヘアピン二次構造を共有する。しかしながら、ＡＡＶ−５およびＡＡＶ−２Ｒｅｐタンパク質は、それぞれ、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５ＴＰＳで末端分離部位を切断することができず、そしてそれ故にＡＡＶ複製中に交差補完することができない。ＡＡＶＴＰＳはウイルス複製に必要とされる必須のシス機能を全て含有するので、ＤＮＡ鎖転化の機序はこれらのＡＡＶ血清型で異なり得ることが可能である。エピソーム環状モノマーもしくはコンカテマーゲノムの形成を伴うｒＡＡＶ−２ウイルスゲノムの転化生産は、記述されている（Ｄｕａｎｅｔａｌ．，１９９８；Ｍｕｓａｔｏｖｅｔａｌ．，２０００；Ｓｃｈｎｅｐｐｅｔａｌ．，２００３；Ｓｏｎｇｅｔａｌ．，２００１）。しかしながら、ｒＡＡＶ−５が潜伏期感染中にゲノム転化の同様の分子プロセスを受けるかどうかは不明であった。この問題に取り組むために、ｒＡＡＶ−５シャトルウイルス（ＡＶ５：５／５ｅＧＦＰ）を構築してｒＡＡＶ−５ゲノムもまた環状形質導入中間体を形成するかどうか試験した。このＡＶ５：５／５ｅＧＦＰベクターは、２つのＡＡＶ−５ＴＰＳストランド（ｓｔｒａｎｄｓ）のＤ配列間にｅＧＦＰレポーターおよびエシェリキア・コリレプリコン／アンピシリン耐性遺伝子を含有した（図６Ａ）。アンピシリン耐性遺伝子およびエシェリキア・コリレプリコンは、感染細胞から採取したＨｉｒｔＤＮＡの細菌への形質転換による環状形質導入中間体のレスキューおよび増幅を促進した。

ＡＶ５：５／５ｅＧＦＰを感染させたＨｅＬａ細胞においてこのレスキューアッセイを用いる研究により、アンピシリンを含有する寒天プレート上で３２０＋／−２８（ｎ＝４）のコロニー形成単位（ＣＦＵ）をレスキューできることが示された。レスキューされた環状中間体の総数はＡＶ２：２／２ｅＧＦＰ感染から得られるもの（３４８８＋／−２０８ＣＦＵ）より約１１倍低かったが、ＨｅＬａ細胞におけるｒＡＡＶ−５キャプシドに媒介される形質導入は、ｒＡＡＶ−２キャプシドにより媒介される形質導入より約５倍効率が低いので（Ｙａｎｅｔａｌ．，２００２）これは予想される。

ｒＡＡＶ−５環状中間体の構造を評価するために、ＡＶ５：５／５ｅＧＦＰレスキューコロニーからの３１個のプラスミドを制限酵素分析、続いてｅＧＦＰおよびＡＡＶ−５ＴＰＳプローブでのサザンブロッティングにより評価した。図６Ｂは、ＡＡＶ−５環状モノマーゲノムの予想される構造および代表的なレスキューされたＡＡＶ−５環状中間体の制限酵素診断分析を示す。ＰｓｔＩ消化は、モノマーダブル−Ｄ環状中間体を２つのフラグメント、ｅＧＦＰを有する２．０ｋｂの小さいフラグメントおよびＴＰＳを含有する３．０ｋｂのフラグメントに切断した。スクリーニングした３１個のレスキューされたプラスミドのうち３０個（９４％）は、ＥＧＦＰおよびＡＡＶ−５ＴＰＳプローブの両方に陽性にハイブリダイズした。

環状ＡＡＶゲノムに特有であるＴ−Ｈダブル−ＤＩＴＲ連結部を特性化するために、診断用の約３００ｂｐのＴＰＳハイブリダイズフラグメントはＢａｍＨＩ消化により遊離されることが予想される。３０個のレスキューされた中間体のうち２３個（７６％）は、ＡＡＶ−２に基づくベクターについて以前に記述されているように（Ｄｕａｎｅｔａ
ｌ．，１９９８；Ｙａｎｅｔａｌ．，２０００；Ｙａｎｇｅｔａｌ．，１９９９）ＴＰＳハイブリダイズ連結部ダブル−ＤＢａｍＨＩフラグメントを遊離した。これらの結果は、レスキューされたプラスミド（９４％）の大部分が、ＢａｍＨＩ切り出しをもたらしたＴＰＳに隣接する微小な組み換え事象を有するＡＶ５：５ｅＧＦＰウイルスＤＮＡの頭部−尾部自己環化に由来する環状モノマーウイルスゲノムであったことを示す。ダブル−Ｄ環状中間体のＴＰＳ連結部配列の完全性におけるこの変動は、ＡＡＶ−２について以前に記述されている（Ｄｕａｎｅｔａｌ．，１９９９，Ｙａｎｇｅｔａｌ．，１９９９）。

ｒＡＡＶ−５ゲノムが分子間組み換えを受ける程度を評価するために、ＬａｃＺミニ遺伝子のエキソンを各々保有する２つの独立したベクターゲノム間のトランス−スプライシングによりβ−ガラクトシダーゼ発現を再構成するデュアルベクターヘテロダイマー化法を用いた。この目的のために、ウイルスゲノムの両末端にＡＡＶ−５ＴＰＳを各々保有する２つのＬａｃＺトランス−スプライシングベクター（ＡＶ５：５／５ＬａｃＺｄｏｎｏｒおよびＡＶ５：５／５ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒ、図６Ｃ）を構築した。ｒＡＡＶ−２トランス−スプライシングベクターについて以前に認められたように（Ｙａｎｅｔａｌ．，２０００）、β−ガラクトシダーゼ発現の再構成は、ＡＶ５：５／５ＬａｃＺｄｏｎｏｒおよびＡＶ５：５／５ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒを重感染させた胎仔線維芽細胞においてのみ見られた（図６Ｄ）が、各ベクター単独では見られなかった。この結果は、ｒＡＡＶ−５ゲノムが分子間組み換えによってヘテロダイマーを形成できることを示した。初代線維芽細胞におけるＡＡＶ−５キャプシド形質導入のレベルは、ＡＡＶ−２キャプシドベクターのものより約１０倍低いので、再構成されたβ−ガラクトシダーゼ発現のレベルはこれらの研究において低かった。

ベクター内非相同ＡＶ２：５ＴＰＳベクターゲノムは、ＡＡＶ−２もしくはＡＡＶ−５キャプシドのいずれかに効率よくパッケージングして感染性ビリオンを組み立てることができる
エピソームｒＡＡＶ中間体の分子分析により、頭部−尾部ダブル−ＤＴＰＳ構造は、ｒＡＡＶ−２：２およびｒＡＡＶ−５：５形質導入の両方の後にレスキューされる環状中間体の最も一般的なタイプであることが示された。しかしながら、ダブル−Ｄ中間体の配列分析により、単離された環状中間体の約１５％は１個より多いが２個より少ない頭部−尾部ＩＴＲを含有することが示されている（Ｄｕａｎｅｔａｌ．，１９９９）。２つの可能な解釈が、環状中間体のＩＴＲ連結部における不均一性を説明することができる。

第一に、環化は、非特異的な分子内末端−末端ライゲーション、続いてより安定なダブル−Ｄ構造にＴＰＳを減らす細菌における組み換え事象によって起こり得る。この仮説の裏づけとして、ウイルスゲノムの末端−末端連結が、分子内線状コンカテマーの形成に関与することが他者によって提示されていた（Ｎａｋａｉｅｔａｌ．，２００３；Ｎａｋａｉｅｔａｌ．，２０００）。第二に、ウイルスゲノムの分子内環化は、ＴＰＳに媒介される相同的組み換えによって起こる可能性がある。フリップおよびフロップヘアピンループはウイルスゲノムにおいて等しい割合で存在するので予測され得るように、相同的組み換えのこのプロセスが正確ではない場合、これもまた環状ＡＡＶゲノムに存在するＩＴＲ連結部配列における不均一性を説明することができる。

これら２つの可能性を区別するために、ウイルスゲノムのいずれかの末端にＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５ＴＰＳを保有するベクター内非相同ＴＰＳベクターを作製した。ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５ＴＰＳはそれらの配列において５０％未満の相同性を共有するので（図７Ａ）、相同的組み換えがｒＡＡＶゲノム環化の主な機序である場合、そのようなベクター内非相同ＴＰＳベクターはこのプロセスにおいて十分に機能しないと仮説を立てた。しかしながら、そのような実験が有益であるためには、ベクター内非相同ＴＰＳ
ＡＡＶゲノムが感染性ウイルスを効率よく生産できることを確かめることが最初に必要であった。この目的のために、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５キャプシドの両方にｐＡＶ２：５ｅＧＦＰゲノム（図７Ｂ）をパッケージングする方法を開発してそれぞれ子孫ウイルスＡＶ２：５／２ｅＧＦＰもしくはＡＶ２：５／５ｅＧＦＰを作製した。

ＡＡＶ−２キャプシドを有するＡＡＶ−５ゲノムのシュードタイピングと同様に、Ｒｅｐ５およびＲｅｐ２は両方とも、ＡＡＶ−２もしくはＡＡＶ−５キャプシドのいずれかへのｐＡＶ２：５ｅＧＦＰゲノムのパッケージングに必要とされた。ベクター内非相同ＴＰＳウイルスＡＶ２：５／２ｅＧＦＰおよびＡＶ２：５／５ｅＧＦＰの収率は、典型的に、相同なＡＡＶ−２もしくはＡＡＶ−５ＴＰＳを含有するＡＶ２：２／２ｅＧＦＰおよびＡＶ５：５／５ｅＧＦＰで見られるものより１〜２倍だけ低かった。完全なベクター内非相同ＴＰＳウイルスゲノムのパッケージングを確かめるために、１ｘ１０^９粒子のＡＶ２：２／２ｅＧＦＰ、ＡＶ２：５／２ｅＧＦＰおよびＡＶ５：５／５ｅＧＦＰをプロテイナーゼＫで消化し、そして次にウイルスＤＮＡを１％ＮａＯＨアルカリアガロースゲルにおいて分離し、続いてＰ^３２−ｅＧＦＰプローブに対してサザンブロッティングした。図７Ｃは、ＡＶ２：２／２ｅＧＦＰ、ＡＶ２：５／２ｅＧＦＰもしくはＡＶ５：５／５ｅＧＦＰウイルスからのウイルスゲノムが全てそれぞれ均一な４．６、４．４および４．７ｋｂのウイルスゲノムをもたらすことを示した。

これらの結果は、有効なウイルス複製がベクター内非相同ＴＰＳプロウイルスプラスミドから開始されることおよび完全なベクター内非相同ＴＰＳゲノムが効率よく複製されそしてウイルス粒子にパッケージングされることができることを裏付けた。完全なベクターゲノムのパッケージングは、精製されたＡＶ２：５／２ｅＧＦＰ、ＡＶ２：５／５ｅＧＦＰ、ＡＶ２：２／２ｅＧＦＰおよびＡＶ５：５／５ｅＧＦＰウイルスからのウイルスＤＮＡでの一連のスロットブロットハイブリダイゼーション実験によりさらに裏付けられた（図７Ｄ）。この分析に使用したプローブには、ＡＡＶ−２もしくはＡＡＶ−５ＴＰＳの外側の隣接配列（すなわち、プロウイルスバックボーンスタッファー配列）に相補的なＤＮＡ配列、ならびにＡＡＶ−２ＴＰＳ、ＡＡＶ−５ＴＰＳおよびｅＧＦＰ遺伝子に対する特異的プローブが含まれた。スタッファー配列プローブとウイルスＤＮＡとのハイブリダイゼーションにより、ｅＧＦＰプローブと比較した場合にウイルスゲノムの約１０％がそのような配列を含有することが示された。これは、それらのＴＰＳ構造にかかわらずｒＡＡＶ−２もしくはｒＡＡＶ−５パッケージングビリオンの両方で同様であった。このタイプのスタッファー配列パッケージングはまた、ｒＡＡＶベクターに典型的でもある。重要なことには、ＴＰＳ：ＥＧＦＰハイブリダイゼーションの比率は、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５ＴＰＳの両方がＡＶ２：５／５およびＡＶ２／５：２ビリオンに効率よくパッケージングされることを示した。これらの結果は、ベクター内非相同ＴＰＳに基づくベクターゲノムが、相同なＴＰＳを含有するベクターと同様の効率および忠実度でＡＡＶ−２もしくはＡＡＶ−５血清型のウイルスキャプシドに効率よくパッケージングできることを示す。

ベクター内非相同ウイルスＡＶ２：５／２ｅＧＦＰおよびＡＶ２：５／５ｅＧＦＰが相同なＴＰＳを含有するベクターＡＶ２：２／２ｅＧＦＰおよびＡＶ５：５／５ｅＧＦＰと同様の感染力を有したことを確立するために、ＨｅＬａ細胞においてそれらのコードされるｅＧＦＰ導入遺伝子を発現するこれら４つのベクターの能力を比較した。各ウイルスについて同等な数のＤＮアーゼ耐性粒子（ＤＲＰ）でのＨｅＬａ細胞の感染後に、ＥＧＦＰの発現を蛍光顕微鏡検査により比較した。この比較からの結果は図７Ｅに示され、そしてベクター内非相同ＴＰＳウイルス（ＡＶ２：５／２ｅＧＦＰおよびＡＶ２：５／５ｅＧＦＰ）とそれらの相同ＴＰＳ対応物（ＡＶ２：２／２ｅＧＦＰおよびＡＶ５：５／５ｅＧＦＰ）間で区別できないレベルのＥＧＦＰ発現を示す。これらの結果は、ベクター内非相同ＡＶ２：５ＴＰＳゲノムが相同なＴＰＳを含有するゲノムと同様の感染効率でパッケー
ジングされることができることを示す。ＡＡＶ−２キャプシドと比較した場合に、ＡＡＶ−５キャプシド封入ウイルス、ＡＶ２：５／５ｅＧＦＰおよびＡＶ５：５／５ｅＧＦＰのグループにおけるより低いＥＧＦＰ発現は、ＨｅＬａ細胞におけるｒＡＡＶ−５の以前に報告されたより低い感染力（約５倍）（Ｙａｎｅｔａｌ．，２００２）と一致した。要約すると、ベクター内非相同ＴＰＳベクターからの導入遺伝子発現を評価するこれらの研究は、ＡＡＶゲノムのいずれもの末端でのＴＰＳ相同性は、コードされる導入遺伝子の機能性発現に必要ではないことを示す。

ベクター内非相同ＡＶ２：５ＴＰＳウイルスは、ＡＶ２：２もしくはＡＶ５：５ＴＰＳウイルスより低い効率で環状ゲノムを形成する
上記の特性化されたベクター内非相同ＴＰＳベクター、ＡＶ２：５／２ｅＧＰＦを用いて、ＡＡＶゲノムのいずれもの末端のＴＰＳ相同性はウイルス環状中間体の効率のよい形成に必要とされるという仮説を検証した。ＡＶ２：２／２ｅＧＦＰおよびＡＶ５：５／２ｅＧＦＰと比較した場合に、ＡＶ２：５／２ｅＧＦＰを感染させたＨｅＬａ細胞において実際に環状中間体が減少される場合、ＴＰＳ相同性はモノマー環状ウイルスゲノムの形成における分子内相同的組み換えを潜在的に媒介することが示唆される。これら３種のＡＡＶ−２キャプシドパッケージングウイルスで形質導入したＨｅＬａ細胞において同様のｅＧＦＰ発現が感染後２日に見られたが（示さない）、ＡＶ２：５／２ｅＧＦＰ感染細胞から抽出したＨｉｒｔＤＮＡからレスキューされるアンピシリン耐性コロニーの数は、相同なＴＰＳを有するＡＶ２：２／２ｅＧＦＰおよびＡＶ５：５／２ｅＧＦＰウイルスと比較した場合に有意に減少された（８倍）。

制限酵素分析ならびにｅＧＦＰおよびＴＰＳプローブに対するサザンブロッティングによるレスキューされたプラスミドの分子特性化もまた、ＡＶ２：２／２ｅＧＦＰおよびＡＶ５：５／２ｅＧＦＰウイルスと比較した場合にＡＶ２：５／２ｅＧＦＰに由来するレスキューされたクローンの構造におけるかなりのより高いレベルの変動を示した。ＡＡＶ−２ＴＰＳ、ＡＡＶ−５ＴＰＳおよびｅＧＦＰプローブに対するサザンブロットハイブリダイゼーションおよび制限消化を用いるレスキューされたクローンの分子分析を用いてＡＶ２：５／２ｅＧＦＰ、ＡＶ２：２／２ｅＧＦＰおよびＡＶ５：５／２ｅＧＦＰウイルスでの感染後に得られる環状中間体におけるダブル−ＤＴＰＳ連結部の完全性を比較した（表２）。ＣＦＵ計数と一緒に、この分子分析により、ＡＶ２：５／２ｅＧＦＰウイルスがダブル−Ｄ環状中間体を生成する頻度は、ゲノムのいずれもの末端で相同なＴＰＳを有するウイルスのものより６０倍低いことが示された。これらの結果は、ウイルスゲノムのいずれもの末端でのＴＰＳ相同性がＡＡＶゲノムの環化において重要な役割を果たすことを強く示唆する。環状ゲノムを形成するベクター内非相同ＴＰＳベクターのより低い効率は、ＴＰＳに媒介される分子内組み換えによるＡＶ２：５ｅＧＦＰゲノムの自己環化を制限するＡＡＶ−２とＡＡＶ−５ＴＰＳ間の５０％未満の相同性に起因すると思われる。

環状頭部−頭部（Ｈ−Ｈ）および尾部−尾部（Ｔ−Ｔ）ダイマーおよびコンカテマーは、相対する複製起点のために細菌において複製可能ではなく、そしてそのようなものとして細菌システムにおいてレスキューされることができない。しかしながら、頭部−頭部（Ｈ−Ｈ）および尾部−尾部（Ｔ−Ｔ）ダイマーは、２ベクターシステム（これらの一方のみがＯｒｉおよびＡｍｐ遺伝子を含有する）を用いて分子間組み換えによって形成することができる（Ｙａｎｅｔａｌ．，２０００；Ｙａｎｇｅｔａｌ．，１９９９）。従って、ベクター内非相同ＴＰＳベクターはダブル−Ｄ環状モノマーを効率よく形成しないと結論づけられたが、環状Ｈ−ＨおよびＴ−Ｔダイマーの形成において起こる可能性がある分子間組み換えの程度を決定することはできなかった。

ベクター内非相同および相同ＴＰＳベクター間のゲノム転化の分子的相違に関するさらなる洞察を得るために、ＡＶ２：２／２ｅＧＦＰおよびＡＶ２：５／２ｅＧＦＰ感染細胞からのＨｉｒｔＤＮＡにおけるＡＡＶゲノムの分子形態を分析した。このアッセイの目的は、サザンブロットにより線状および環状モノマーもしくはダイマーの存在量を直接区別することであった。このアッセイにおいて、様々な分子形態を区別するために診断制限部位としてＳｔｕＩが選択された。ＳｔｕＩはＣＭＶプロモーターの末端で１回切断し、そして二本鎖ウイルスゲノムのみを消化する。図８Ａに示されるように、ＳｔｕＩ消化、続いてＣＭＶプローブでのサザンブロッティングは、線状モノマー、Ｈ−ＴおよびＴ−Ｔダイマーウイルスゲノムから９４０ｂｐのフラグメントを生成する。Ｈ−Ｔ線状ダイマーゲノムならびにＨ−Ｔ環状ゲノムはまた、ベクタータイプにより４．７もしくは４．４ｋｂの線状フラグメントを生成する。対照的に、Ｈ−Ｈ線状およびＨ−Ｈ／Ｔ−Ｔ環状ダイマーは、両方のベクタータイプについて固有の１．８８ｋｂのフラグメントを生成する。

ＡＶ２：２ｅＧＦＰのサザンブロット分析の結果（図８Ｂ）は、線状および環状Ｈ−Ｔ中間体の両方と一致する、９４０ｂｐおよび４．７ｋｂのＳｔｕＩ消化ＣＭＶハイブリダイズバンドを示した。さらに、未消化のＤＮＡサンプルは、２．８ｋｂに移動しそしてシングルカッターでの消化後に線状４．７ｋｂフラグメントに分子量がシフトする以前に記述されているスーパーコイル状モノマー環状中間体（Ｄｕａｎｅｔａｌ．，１９９８；Ｓａｎｌｉｏｇｌｕｅｔａｌ．，２０００）をもたらした。ＡＶ２：２ｅＧＦＰと
全く対照的に、ＡＶ２：５ｅＧＦＰＨｉｒｔＤＮＡは、ＳｔｕＩ９４０ｂｐ末端フラグメントの有意に増加した存在量および未消化サンプルにおける環状ウイルスゲノムの欠如を示した。これらの結果は、ベクター内非相同ＴＰＳベクターでの線状モノマーゲノムの増加した存在量と最も一致する。ＡＶ２：２ｅＧＦＰおよびＡＶ２：５ｅＧＦＰベクターの線状および環状ゲノムの存在量間のそのような相違はまた、ＨｉｒｔＤＮＡ細菌レスキュー実験とも一致する。

ＡＶ２：２ｅＧＦＰおよびＡＶ２：５ｅＧＦＰ感染細胞からのＨｉｒｔＤＮＡ間で認められる１つのさらなる相違は、ベクター内非相同ＴＰＳウイルスゲノムの明らかなより大きい安定性であった。４８時間の時間点のみを評価したが、これらの結果は、ベクター内非相同ＴＰＳベクターゲノムにより形成される線状中間体が相同ＴＰＳベクターにより形成される他の中間体に対して増加した安定性を有し得ることを示唆する。この結果の背景にある機序は不明であるが、ベクター内非相同ＴＰＳベクターのより均一なゲノム転化産物を反映する可能性がある。例えば、線状二本鎖ゲノムは相同ＴＰＳベクターに確かに存在するが（ＳｔｕＩ消化後の９４０ｂｐのＣＭＶハイブリダイズ末端フラグメントにより示されるように）、それらの前駆体形態は未消化のＤＮＡにおいてはっきりと見えない。従って、分子線状形態は二次構造において全く多様であると仮定しなければならない。そのような分子中間体はＤＮアーゼ消化をより受けやすいことが可能である。

ベクター内非相同ＡＶ２：５ＴＰＳゲノムは方向性分子間組み換えを促進し、そしてデュアルベクタートランス−スプライシング方法の効率を高める
ＨｉｒｔＤＮＡサザンブロット分析および細菌レスキュー実験からの結果は、ｒＡＡＶゲノムのいずれもの末端でのＴＰＳ相同性がｒＡＡＶゲノム環化において重要な役割を果たすことを示唆している。これらの結果は、ＡＡＶゲノムの分子内環化がＴＰＳ配列依存性組み換えプロセスである直接証拠を与える。モノマー環状中間体を形成する減少した能力を有するベクター内非相同ＴＰＳベクターの作製はまた、分子間ヘテロダイマーへの前駆体としてのこれらの構造の関与に取り組む機会も与えた。分子間ヘテロダイマーの形成は、デュアルベクター技術が、単一のベクターゲノムにパッケージングされることができない大きい導入遺伝子を送達するためにｒＡＡＶの機能的容量を増加することを可能にする。この目的にために、ベクター内非相同ＴＰＳベクターを用いて、遺伝子治療のためのデュアルベクター方法の効率を潜在的に改善する基盤としてヘテロダイマーを生成することに関与する根本的な機序を調べた。

デュアルベクタートランス−スプライシング方法を用いて、２つのベクターで独立して送達される２つのＬａｃＺミニ遺伝子エキソンからＬａｃＺ導入遺伝子産物を再構成することにより分子間組み換えの程度を評価した。これに関連して、β−ガラクトシダーゼの再構成は、２つの独立したウイルスゲノム間の方向性Ｈ−Ｔ分子間組み換え事象の直接尺度である。この目的のために、ベクター内非相同ＡＶ２：５ＴＰＳベクターセット（ＡＶ５：２ＬａｃＺｄｏｎｏｒおよびＡＶ２：５ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒ）を図１０Ａに示されるように構築し、そしてこのセットの分子間組み換えの効率を相同ＴＰＳベクターセット（ＡＶ２：２ＬａｃＺｄｏｎｏｒおよびＡＶ２：２ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒ）に対して比較した。ドナーおよびアクセプターウイルスゲノムは両方とも、ＨｅＬａ細胞における分析のためにＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５キャプシドビリオンにパッケージングした。ＨｅＬａ細胞に同等な物理的力価（２．５ｘ１０^３ＤＲＰ／細胞）で感染させ、そして感染後１６時間で細胞へのＤＮＡの取り込みを評価することにより８種全てのウイルスの感染力価を個々に比較した。適切な細胞系がベクター内非相同ＴＰＳベクター（すなわち、２および５型Ｒｅｐタンパク質の両方を必要とする）のモウバリジェーションアッセイ（ｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎａｓｓａｙｓ）に利用できなかったのでこの方法を用いた。これらの研究は、８種全てのウイルスストック（ＡＡＶ−２もしくはＡＡＶ−５キャプシドのいずれかにおけるＡＶ２：２ＬａｃＺｄｏｎｏｒ、ＡＶ２：２ＬａｃＺａｃｃｅｐ
ｔｏｒ、ＡＶ５：２ＬａｃＺｄｏｎｏｒおよびＡＶ２：５ＬａｃＺｄｏｎｏｒ）が、キャプシド血清型の各々について同様なレベルのウイルスＤＮＡを細胞に送達することを裏付けた（データは示さない）。これらのデータは、ＨｅＬａ細胞においてＧＦＰコード導入遺伝子を発現する相同ＴＰＳベクターと同様なベクター内非相同ＴＰＳベクターの能力を示す機能分析を裏付ける（図７Ｅ）。

分子間コンカテマー化の効率を評価する機能的研究を各血清型およびＴＰＳ配置についてドナーおよびアクセプターベクターを重感染させたＨｅＬａ細胞において同様に行った（図１１ＢおよびＣ）。各感染からの相対β−ガラクトシダーゼ活性を感染後３日にアッセイした。これらの実験からの結果は、ベクター内非相同ＴＰＳデュアルベクターセットが、それぞれ、ＡＡＶ−２もしくはＡＡＶ−５キャプシドを有する相同ＴＰＳベクターより機能性ＬａｃＺ遺伝子産物を再構成することに６倍（図１１Ｂ）もしくは１０倍（図１１Ｃ）効果的であることを示した。ベクター内非相同ＴＰＳベクターは線状形態ゲノムの存在量を優先的に増加するという結果を考えると（図１１Ｂ）、これらの結果は、ＡＡＶゲノムの線状コンカテマー化が、配列特異的なようにＴＰＳ相同的組み換えによって起こることができることを示唆する。これに関連して、ベクター内非相同ＴＰＳベクターにおけるＴＰＳの２つのタイプの配列相同性は、機能性ヘテロダイマーの形成を優先的に導くと予想される。

ヘテロダイマーの形成における配列限定的ＴＰＳ組み換えのさらなる証拠を与えるために、相同ＴＰＳおよびベクター内非相同ＴＰＳベクターセットの様々な組み合わせ間のトランス−スプライシングの効率を比較した。予想されるように、これらの実験からの結果は、ＡＶ５：２／２ＬａｃＺｄｏｎｏｒとＡＶ２：２／２ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒもしくはＡＶ２：２／２ＬａｃＺｄｏｎｏｒとＡＶ２：５／２ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒベクターの組み合わせが相同およびベクター内非相同ＴＰＳベクターセットに対して中間レベルの導入遺伝子再構成を与えることを示した（図１１Ｄ）。これらの結果は、ヘテロダイマー形成におけるＴＰＳ配列の重要性のさらなる証拠を与える。

シュードＴＰＳ
上記のように、ベクター内非相同ＴＰＳを有するｒＡＡＶは、細胞における２つもしくはそれ以上のｒＡＡＶの方向性分子間組み換えに有用である。分子内非相同ｒＡＡＶベクターにおける２つのＴＰＳの相違は、異なるＡＡＶ血清型からのＴＰＳ、ＡＡＶの１つの血清型からのＴＰＳとシュードＴＰＳ、すなわち、パリンドローム構造およびステムもしくはステムループ二次構造を有する合成ＤＮＡフラグメント、例えば１つもしくはそれ以上のＡＡＶ血清型からのＴＰＳにほとんどもしくは全く配列相同性を有さないもの（図１２および１３）、または２つの異なるシュードＴＰＳの結果であることができる。Ｄ配列が続く天然のＡＡＶ−ＴＰＳおよびＤ配列を欠くシュードＴＰＳを有するベクター内非相同ＴＰＳｒＡＡＶベクターにおいて、ベクター内非相同ＴＰＳウイルスのプロウイルスゲノム長は２〜２．５ｋｂのみで、野生型ＡＡＶゲノムのものの半分である。そのようなベクター内非相同ＴＰＳウイルスは、ウイルスキャプシド内部に自己相補的もしくは二本鎖ゲノムを含有する。

シュードＴＰＳおよび完全なミニ遺伝子カセット（すなわち、プロモーター、導入遺伝子およびポリＡシグナル）もしくはスプライシングシグナルを有するミニ遺伝子の部分エキソンを含有するｒＡＡＶベクターをｐＵＣ１９バックボーンを有するエシェリキア・コリプラスミドにおいてプロウイルスゲノムとしてクローン化し、そして細菌において増やした。シュードＰＳは、得られる配列がステムループ構造を形成することができ、天然のＡＡＶＰＳのものと同様の自由エネルギー（例えば、表３に記載のとおり決定する）を有し（例えば２５ｋｃａｌ／ｍｏｌ以内）、そして野生型ＡＡＶＴＰＳのものと同様のＴ_ｍ（例えば、表３に記載のとおり決定する）を有する（例えば８℃以内）ように、天然
のＡＡＶＴＰＳにおいて体系的に改変すること（例えば、１個もしくはそれ以上のＧ残基をＡ、ＣもしくはＴ残基に、１個もしくはそれ以上のＡ残基をＧ、ＣもしくはＴ残基に、１個もしくはそれ以上のＣ残基をＴ、ＧもしくはＡ残基に、１個もしくはそれ以上のＴ残基をＣ、ＧもしくはＡ残基に、またはその任意の組み合わせ）により作製した。１つの態様として、天然のＡＡＶＰＳを４つのセグメント、すなわち、Ａ、Ｂ−Ｂ’、Ｃ−Ｃ’およびＡ’に分ける。Ａセグメントにおけるヌクレオチドを改変する場合、Ａ’配列における適合する位置で対応する改変を行う。全配列のＧ−Ｃパーセントは４０％より大きく（例えば、５５％、６５％もしくはそれ以上）、それはＴｍを７０℃より大きくする（例えば、約８５℃〜約８９℃（８９℃は天然のＡＡＶ−２ＴＰＳのＴｍである）を包含する、約８１℃〜９４℃）。Ａ−Ｂ、Ｂ−Ｂ’、Ｂ’−Ｃ’、Ｃ’−ＣおよびＣ−Ａ’の結合連結部で「ヒンジヌクレオチド」を改変する場合、二次構造の保存を確かめるために得られる配列に二次構造予測を用いる。さらに、一般に連結部での不対ヌクレオチドの数は改変されない。例えば、１つの態様において、３個の不対ヌクレオチドがＢ−Ｂ’もしくはＣ−Ｃ連結部にあり、そして別の態様において、１個の不対ヌクレオチドがＢ−Ｃ連結部にある。１つの態様において、ＲＢＥ（Ｒｅｐタンパク質結合要素）およびｔｒｓ（末端分離部位）のヌクレオチドは、それぞれ、Ｒｅｐ結合およびｔｒｓでの切断を阻害するために改変される。場合により、そのようなモチーフ（１つもしくは複数）は、配列に導入されないかもしくは最終的に存在しない。

１つの典型的なシュードＰＳは、配列番号：３（Ｐ１）を有する。Ｐ１における挿入は、二次構造の安定性を増すことができる。シュードＴＰＳの別の例には、Ｐ２（配列番号：７；ＣＣＧＧＡＴＣＣＧＴＣＣＧＡＧＣＣＡＴＴＣＣＧＣＴＣＧＧＴＣＣＧＴＣＣＧＴＣＣＧＧＴＧＣＡＧＡＧＡＧＧＧＧＣＴＣＴＣＴＧＣＡＴＡＧＡＧＧＴＧＴＧＧＧＧＣＡＣＡＣＣＴＣＴＣＣＧＧＡＣＧＧＡＣＧＧＡＣＣＧＡＧＣＧＧＡＡＴＧＧＣＴＣＧＧＡＣＧＧＡＴＣＣＧＧ；Ｔｍ８８℃；二次構造エネルギー−１４６ｋｃａｌ／ｍｏｌ）およびＰ３（配列番号：８；ＡＡＧＧＣＣＴＡＧＧＣＡＧＧＴＧＴＧＧＴＡＡＧＣＧＧＡＣＣＡＧＧＣＡＧＧＣＡＧＡＣＣＴＣＴＣＣＣＣＡＣＴＴＴＧＴＧＧＧＧＡＧＡＴＣＣＧＧＣＧＣＧＣＡＴＡＧＣＧＣＧＣＣＧＧＧＧＴＣＴＧＣＣＴＧＣＣＴＧＧＴＣＣＧＣＴＴＡＣＣＡＣＡＣＣＴＧＣＣＴＡＧＧＣＣＴＴ；Ｔｍ８７℃；二次構造エネルギー−１６２ｋｃａｌ／ｍｏｌ）が包含される。Ｐ３はシュードＴＰＳＰ１と同じＡステムを有するが、Ｂ−Ｃループは改変される。Ｐ２およびＰ３は両方ともＡＡＶ−２と同じステムループ二次構造を共有するが、ＡＡＶ−２ＴＰＳ配列に対する低い相同性を有する（図１６）。相同性アライメントを作製するために、ヒギンズ計算方法を用いた。５のギャップペナルティー、４のＫ−Ｔｕｐｌｅ（ＤＮＡおよびＲＮＡについて）、１０の固定ギャップペナルティーおよび１０の浮動ギャップペナルティーを用いて配列を整列させた。

別のシュードＰＳ、Ｎ１は以下の配列：ｔａｃｔａｔｃａｇｃｇｃａｔａａａａｔｃａｃｔｇａｃｔａｇｔａｔｃｔｔｇｃｃｔａＣＣＧＧＧＣＧＡＣＣＡＡＡＧＧＴＣＧＣＣＣＧＡＣＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＣＣＣＧＧＧＣＧＧｔａｇｇｃａａｇａｔａｃｔａｇｔｃａｇｔｇａｔｔｔｔａｔｃｃｃｃｔｇａｔａｇｔａ（配列番号：９）を有する。Ａ−Ａ’ステム（小文字の）のＮ１における８０ヌクレオチドのパリンドローム配列は、ヌクレオチドをランダムに改変することにより作製し、しかしながら、ＡとＡ’間のＢ−Ｂ’−Ｃ’−Ｃループ（大文字のそしてヒンジに下線を引く）はＡＡＶ−２からである。Ｎ２はＮ１と同じＡ−Ａ’ステム（ランダム）を有するが、ｔａｃｔａｔｃａｇｃｇｃａｔａａａａｔｃａｃｔｇａｃｔａｇｔａｔｃｔｔｇｃｃｔａＣＧＧＣＴＡＧＴＧＣＡＴＡＧＣＡＣＴＡＧＣＣＡＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＡＴＧＣＴＣＣＡＴＣＣＧｔａｇｇｃａａｇａｔａｃｔａｇｔｃａｇｔｇａｔｔｔｔａｔｇｃｇｃｔｇａｔａｇｔａ（配列番号：１０）（Ｂ−Ｃループは大文字、ヒンジに下線を引き、そしてＡ−Ａ’ステムは小文字）をもたらすようにＢ−Ｃループをランダムに作製した。Ｇ−ＣパーセンテージおよびＴｍ値はより低いが、Ｎ１およびＮ２ＴＰＳもまたＡＡＶ−２ＴＰＳと同じステムループ二次構造を
有する。それにもかかわらず、Ｔｍがより低いので、Ｎ１およびＮ２の二次構造はＰ１−Ｐ３ほど安定ではないかもしれない（図１７）。好ましくは、シュードＴＰＳにおけるＧＣ％は少なくとも６５％である。

ベクター内非相同ＴＰＳｒＡＡＶベクターをヒト２９３細胞にトランスフェクションする場合、全ての必要なウイルスタンパク質がトランスに与えられるならばベクター内非相同ＴＰＳウイルスゲノムはプロウイルスプラスミドから切り出され、そして任意のタイプのＡＡＶキャプシドタンパク質でパッケージングされて感染性ビリオンを組み立てることができる。例えば、ベクター内非相同ＴＰＳプロウイルスプラスミドｐＡＶ２：Ｐ．ｔｒａｎｓｇｅｎｅ、アデノウイルスヘルパープラスミドｐＡｄ４．１、ＡＡＶ−２ヘルパーｐＡＶ．Ｔｒａｎｓ２およびＡＡＶ−５Ｒｅｐタンパク質発現プラスミドｐＲｅｐ５でトランスフェクションした２９３細胞は、ＡＡＶ−２キャプシドでキャプシド封入される、ベクター内非相同ＴＰＳウイルス、ＡＶ２：Ｐ／２．ｔｒａｎｓｇｅｎｅ（約１ｘ１０^１１〜１ｘ１０^１２ＤＲＰ／ｍｌ）をもたらし；一方、ｐＡｄ４．１、ｐＡＶ２：Ｐ．ｔｒａｎｓｇｅｎｅ、ＡＡＶ−５ヘルパーｐＡＶ．Ｔｒａｎｓ５およびＡＡＶ−２Ｒｅｐ発現プラスミドｐＲｅｐ２でトランスフェクションした２９３細胞は、ＡＡＶ−５キャプシドでキャプシド封入される、ベクター内非相同ＴＰＳウイルス、ＡＶ２：Ｐ／５．ｔｒａｎｓｇｅｎｅ（約１ｘ１０^１２ＤＲＰ／ｍｌ）をもたらす。

ＨｅＬａ細胞に各ウイルスを１０００ＤＲＰ／細胞のＭＯＩで感染させ、そしてｅＧＦＰ蛍光顕微鏡写真を感染後４８時間で撮った。結果は、ＡＡＶダイマー化が配列依存的プロセスであることを示した（図１４）。ＡＶ２／ＡＶ２ＴＰＳハイブリダイゼーションは、高い効率のよい組み換えおよびＥＧＦＰ発現の再構成をもたらすことができる（ＡＶ．Ｐ：２−ｄｏｎｏｒとＡＶ．２：Ｐ−ａｃｐｔの重感染）。同様に、シュード／シュードＴＰＳ（Ｄ配列のない）ハイブリダイゼーションは、ＡＶ２／ＡＶ２と同じ効率でＥＧＦＰ発現を再構成した（ＡＶ．２：Ｐ−ｄｏｎｏｒとＡＶ．Ｐ：２−ａｃｐｔの重感染）。非常に低い効率のｅＧＦＰ発現再構成が、ＡＶ．２：Ｐ−ｄｏｎｏｒとＡＶ．２：Ｐ−ａｃｐｔもしくはＡＶ．Ｐ：２−ｄｏｎｏｒとＡＶ．Ｐ：２−ａｃｐｔでの感染後に認められた。この効率は、相同なＴＰＳを有するベクターと比較して約６０倍低かった。

デュアルベクタートランス−スプライシング方法の分子的基盤は、ＴＰＳに媒介される分子間組み換えである。各々遺伝子の一部を有する異なるベクターにおける２つの相同なＴＰＳ、例えば２つのシュードＴＰＳの方向性相同的ベクター内ハイブリダイゼーションの後に、遺伝子の機能的再構成は、増加したレベルの頭部−尾部ヘテロダイマーのために促進される。ベクター内非相同ＴＰＳｒＡＡＶは分子内ＴＰＳ組み換えによって環状中間体モノマーを形成する有意に減少した能力を有するので、線状ゲノムからの分子間組み換えが優位を占め、ヘテロダイマーの増大した形成をもたらす。

説明
ｒＡＡＶゲノムの環化はこれまでＡＡＶ−２ＴＰＳを含有するゲノムに関連して研究されているだけであったので、他の相違するＡＡＶ血清型についてのこのプロセスのより明確な理解は、潜伏ＡＡＶ生活環における環状ゲノムの総体的な重要性を理解するのに役立つ可能性がある。この目的のために、それらがＡＡＶ−２に対して一次配列において最も低く保存されているのでＡＡＶ−５ＴＰＳを含有するベクターからの環状中間体形成を評価した。ＡＶ５：５／５ｅＧＦＰシャトルベクターを用いて、９４％のレスキューされた環状中間体は、ＡＶ２：２／２ｅＧＦＰベクターで認められるものと同一の頭部−尾部ダブル−ＤＴＰＳ構造を有した。ＨｅＬａ細胞の感染に関する指向性の違いのために、ダブル−ＤＴＰＳ環状中間体の存在量の違いがこれらのｃａｐ５およびｃａｐ２に基づくベクターで認められたが、ＡＶ２：２／２ｅＧＦＰとＡＶ５：５／２ｅＧＦＰウイルスを比較するその後の分析は、感染後の環状ダブル−ＤＴＰＳゲノムの区別できない存在量を示した。これらの結果は、ＡＡＶ−５に基づくベクターが、ＴＰＳの改変された配列相同性にもかかわらず、ＡＡＶ−２ゲノムと同様の環状中間体形成効率を有することを決定的に示す。それらはまた、環化がｒＡＡＶの全ての血清型の共通経路であると思われることも示唆する。

ＴＰＳがｒＡＡＶウイルスゲノムの環状中間体形成およびその後のコンカテマー化プロセスにおいて果たす役割をより明らかに理解するために、新規なベクター内非相同ＡＶ２：５ＴＰＳウイルスを製造した。ベクター内非相同ＴＰＳベクター（ＡＶ２：５／２ｅＧＦＰおよびＡＶ２：５／５ｅＧＦＰ）を比較する研究は、それらがコードされるｅＧＦＰ導入遺伝子を発現することにおいて相同なＴＰＳを含有するベクター（ＡＶ２：２／２ｅＧＦＰおよびＡＶ５：５／５ｅＧＦＰ）と同じくらい機能性であることを示した。これらの結果は、ウイルスゲノムの両末端での相同なＴＰＳが効率のよい第二鎖合成に必要ではないことを示した。興味深いことに、ＡＶ２：５／２ｅＧＦＰウイルスは、ＡＶ２：２／２ｅＧＦＰおよびＡＶ５：５／２ｅＧＦＰウイルスと比較した場合に環状中間体を形成する実質的に減少した能力を有した。さらに、ベクター内非相同ＴＰＳウイルスから回収された環状中間体は構造においてさらにいっそう不均一であり、そしてＴＰＳおよびｅＧＦＰ導入遺伝子の両方の欠失を保持した。ダブル−ＤＴＰＳ完全環状ゲノム（ｅＧＦＰおよびＴＰＳを含有する）の存在量は、ＡＶ２：２／２ｅＧＦＰおよびＡＶ５：５／２ｅＧＦＰウイルスと比較した場合にＡＶ２：５／２ｅＧＦＰでは６０倍少なかった。これらの結果は、ウイルスゲノムの両末端でのＴＰＳに媒介される相同性がｒＡＡＶゲノムの分子内環化を導くのに重要であることを示唆した。しかしながら、この環化プロセスは、コードされる遺伝子産物の発現には必要でない。従って、二本鎖線状もしくは環状形質導入中間体は両方とも、導入遺伝子発現が可能である。

ベクター内非相同ＴＰＳＥＧＦＰコードベクターを用いた研究は、自己環化におけるＴＰＳ配列の重要性の証拠を与えたが、ウイルスゲノムの分子間組み換えにおけるＴＰＳの同様な必要条件はこれらの研究において直接評価することができなかった。一本鎖線状、二本鎖線状、一本鎖環状もしくは二本鎖環状ゲノムを包含するいくつかの前駆体ウイルスゲノム形態が、分子間ヘテロダイマーおよびコンカテマーの形成におそらく関与し得る
。最近、ＬａｃＺトランス−スプライシングベクターを順次感染させたマウス脛骨筋を評価する研究は、二本鎖ウイルスゲノム間の組み換えがコンカテマー化の主要経路であることを示唆している（Ｄｕａｎｅｔａｌ．，２００３）。これらの研究はまた、内在化したｒＡＡＶゲノムの大部分が一本鎖ＤＮＡとしてとどまり、一方、環化およびコンカテマー化に関与する機能性二本鎖形質導入中間体にほんのわずかしか転化されないことも示唆した。筋肉において、環状モノマー中間体は、ダブル−ＤＴＰＳでの分子間組み換えの前駆体として重要な役割を果たすと考えられている（Ｄｕａｎｅｔａｌ．，１９９８；Ｄｕａｎｅｔａｌ．，１９９９）。しかしながら、この仮説を与える直接証拠は間接的であり、そして時間とともに形成される分子間コンカテマーのタイプに主に基づいている。これに関連して、Ｔ−ＨおよびＨ−Ｈ／Ｔ−Ｔ分子間環状コンカテマーは両方とも、２つの独立したベクターでの重感染後に筋肉ＨｉｒｔＤＮＡからレスキューされることができた（Ｙａｎｅｔａｌ．，２０００；Ｙａｎｇｅｔａｌ．，１９９９）。これらの結果は、環状中間体間の組み換えのプロセスが双方向であり、そしてダブル−ＤＴＰＳにより促進されるという仮説を裏付ける。これらの研究は、様々なゲノム配置を有する環状コンカテマーの存在を示すが、それらは機能性線状ヘテロダイマーが形成される程度を直接評価することはできなかった。

ベクター内非相同ＴＰＳベクターがダブル−Ｄ環状ゲノムを形成する６０倍減少した能力を有することを示す本研究における結果は、機能性遺伝子発現アッセイを用いてヘテロダイマー形成におけるこれらの構造の関与を直接評価する機会を与えた。最初の仮説に反して、ベクター内非相同ＴＰＳベクターは、増加した方向性ヘテロダイマー形成を示した。これらの結果は、相同ＴＰＳベクターおよびベクター内非相同ＴＰＳベクター混合実験と一緒に、線状ウイルスゲノム間の配列特異的ＴＰＳ組み換えの関与を裏付ける。これらの結果は、肝臓におけるＡＡＶゲノムの線状コンカテマー化がＴＰＳに依存しないプロセスによって起こることを示唆する他者による以前のデータ（Ｎａｋａｉｅｔａｌ．，２００３；Ｎａｋａｉｅｔａｌ．，２０００）と全く対照的である。肝臓におけるこれらの以前の結果と本研究との間の食い違いは現在不明であるが、細胞タイプ特異的な相違を反映する可能性がある。

ＡＡＶゲノム中間体としての環状コンカテマーの実証された関与を考えると、線状および環状ゲノムの両方がコンカテマー化プロセスに関与できるという解釈を本研究は支持する（図１４）。ベクター内非相同ＴＰＳベクターに関連して、平衡は線状コンカテマー化を好むようにシフトされているようである。これらの結果は、増加した線状コンカテマーがＤＮＡ−Ｐｋｃｓの不在下で形成されるＳＣＩＤマウスにおける結果（Ｓｏｎｇｅｔ
ａｌ．，２００１）によく似ている。しかしながら、増加したデュアルベクタートランス−スプライシングを示さなかったＳＣＩＤマウスの筋肉における以前の分析（Ｄｕａｎ
ｅｔａｌ．，２００３）と異なり、ベクター内非相同ＴＰＳベクターでの本研究は方向性線状分子間組み換え事象を支持した（図１４）。ＴＰＳ間の組み換えがゲノムコンカテマーのランダムな配置をもたらす相同ＴＰＳベクターと異なり、ベクター内非相同ＴＰＳベクターは方向的に依存するコンカテマー化を可能にし、それはデュアルベクタートランス−スプライシング方法を用いて機能性ゲノムの数を増加する。さらに、ＴＰＳ配列を改変することにより、コンカテマー化および環状：線状ゲノムの比率を改変できることは、組込みの程度および／もしくは発現の安定性のようなｒＡＡＶ媒介遺伝子治療の他の態様において有用であると判明し得る。

全ての公開、特許および特許出願は、引用することにより本明細書に組み込まれる。上記の明細書において本発明はそのある種の好ましい態様に関して記述されており、そして多くの詳細は説明の目的のために記載されているが、本発明は追加の態様の余地があることおよび本明細書に記述する詳細のあるものは本発明の基本原理からそれることなしに大幅に変更でき得ることが当業者に明らかである。

シス活性化に用いるｒＡＡＶベクターの略図。分子間シス活性化によってｒＡＡＶ遺伝子発現を高めるための戦略。２つの独立したｒＡＡＶウイルス、最小プロモーターを有するもしくは有さない導入遺伝子をコードするもの（例えば、ＡＶ．ＳＶ（Ｐ）Ｌｕｃ）とエンハンサー配列を有するもう１つのもの（例えば、ＡＶ．ＳｕｐＥｎｈ）を用いて同じ組織に重感染させた。２つのｒＡＡＶベクター間のその後のコンカテマー化は、同じ環化分子内のエンハンサー要素の存在のために、導入遺伝子の発現を実質的に増大する。分子間シス活性化は、線維芽細胞におけるｒＡＡＶ媒介遺伝子導入を増大する。示されるｒＡＡＶベクターを各個々のベクターについて１０００のｍｏｉでヒト線維芽細胞に感染させた。ルシフェラーゼ活性を感染後３日で調べた。データは、各実験条件について６個の独立したサンプルの平均＋／−ＳＥＭを表す。分子間シス活性化は、インビボで筋肉へのｒＡＡＶ媒介遺伝子導入を増大する。３０μｌのＰＢＳの総容量においてウイルスベクター当たり２ｘ１０^１０粒子で示されるｒＡＡＶベクターをマウス前頸骨筋に感染させた。ｒＡＡＶ感染もしくは擬似感染（ＰＢＳ）筋肉におけるルシフェラーゼ活性を感染後３０日（パネルＡ）および９０日（パネルＢ）で調べた。データは、各実験条件について６個の独立した筋肉サンプルの平均＋／−ＳＥＭを表す。エンハンサー要素を保有するＡＶ．ＳｕｐＥｎｈベクターの共投与は、ＴＰＳおよび最小ＳＶ４０プロモーターの両方からの筋肉におけるｒＡＡＶ媒介ルシフェラーゼ発現を実質的に高めた。ウイルス命名。合計で、ＡＡＶ−２および／もしくはＡＡＶ−５ＴＰＳおよびキャプシドの様々な組み合わせを有する９種のウイルスベクターを評価した。ｐＡＶａ：ｂＴｒａｎｓｇｅｎｅは、ウイルスを生成するために用いるプロウイルスプラスミドを示し、ここで、「ａ」および「ｂ」はＡＡＶ−２もしくはＡＡＶ−５由来のいずれかの２個のＴＰＳを表す。ＡＶａ：ｂＴｒａｎｓｇｅｎｅは、ウイルスキャプシドにパッケージングされるウイルスＤＮＡをさす。ＡＶａ：ｂ／ｃＴｒａｎｓｇｅｎｅは完全な組み換えウイルスをさし、ここで、「ｃ」はキャプシド血清型を示した。全ての場合において、「ａ」および「ｂ」ＴＰＳは、それぞれ、コードされる導入遺伝子のリーディングフレームに対して５’および３’である。ＡＶ５：５ベクターの環化およびヘテロダイマー化。環状中間体およびヘテロダイマーを形成するＡＶ５：５／５ウイルスの能力を確立するために、環状中間体形成をＥＧＦＰシャトルベクターを用いて、そしてデュアルベクターヘテロダイマー化をＬａｃＺトランス−スプライシングベクターセットを用いて評価した。環状中間体形成は、ＡＶ５：５／５ｅＧＦＰ感染ＨｅＬａ細胞（５００粒子／細胞）のＨｉｒｔＤＮＡからの細菌における複製可能なプラスミドのレスキューにより定量した。ｒＡＡＶ−５ゲノムの分子間組み換えを評価するために、フェレット胎仔線維芽細胞にドナーおよび／もしくはアクセプターＬａｃＺトランス−スプライシングベクター（２５００粒子／細胞）を感染させた。（Ａ）ＡＶ５：５ｅＧＦＰウイルスゲノムの略図。（Ｂ）ダブル−Ｄ環状モノマーを代表する、レスキューされた環状ｒＡＡＶ−５中間体の主要形態を左側のパネルに示す。右側のパネルは、ＡＶ５：５／５ｅＧＦＰ感染ＨｅＬａ細胞から単離された典型的なダブル−ＤＴＰＳ環状ゲノムのサザンブロット分析である。ＢａｍＨＩ消化は、ＡＡＶ−５ＴＰＳにハイブリダイズする２２０ｂｐのフラグメントとしてダブル−ＤＴＰＳ連結部を遊離する。ＰｓｔＩ消化は、より大きい３．０ｋｂのＴＰＳハイブリダイズフラグメントおよびより小さい２．０ｋｂのＥＧＦＰハイブリダイズフラグメントを生成する。分析した７６%（３０のうち２３）のレスキューされたプラスミドは、完全なダブル−ＤＴＰＳを有するこの特定の構造を有した。（Ｃ）ヘテロダイマー化を評価するために使用したｒＡＡＶ−５に基づくＬａｃＺトランス−スプライシングベクターの略図。尾部−頭部（Ｔ−Ｈ）方向性のこれら２つのベクターのヘテロダイマー化のみが、機能性ＬａｃＺ遺伝子産物を再構成することができる。５’−ＬａｃＺ、ＬａｃＺゲノムの前半分；３’−ＬａｃＺ、ＬａｃＺゲノムの後半分；ＳＤ、スプライスドナー；ＳＡ、スプライスアクセプター；ＲＳＶ、プロモーター／エンハンサー；ＳＶ４０、ポリアデニル化配列；Ａｍｐ、アンピシリン耐性遺伝子；Ｏｒｉ、細菌複製起点。（Ｄ）フェレット胎仔線維芽細胞にＡＶ５：５／５ＬａｃＺｄｏｎｏｒおよび／もしくはＡＶ５：５／５ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒウイルスをＭＯＩ＝２５００粒子／細胞で重感染させ、そして感染後７日で組織化学Ｘ−ｇａｌ染色によりβ−ガラクトシダーゼ発現について機能的に評価した。ベクター内非相同ＴＰＳウイルスゲノムは、相同なＴＰＳ構造を有するゲノムと同様の効率で感染性ウイルスをもたらす。（Ａ）ＤＮＡＳＩＳソフトウェアを用いてヒギンズの計算により作製されるＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５ＴＰＳ（それぞれ、配列番号：１および配列番号：２）の相同性アライメント。両方の配列における同一のヌクレオチドを陰影をつけることによって示す。末端分離部位モチーフ（ｔｒｓ）に下線を引き、そして各々における切断の部位を垂直な矢印で示す。（Ｂ）ベクター内非相同ＴＰＳプロウイルスプラスミド（ｐＡＶ２：５ｅＧＦＰ）およびＡＶ２：５ｅＧＦＰウイルスゲノムの図式構造。ベクター内非相同ＴＰＳＡＡＶベクターをＡＡＶ−２もしくはＡＡＶ−５キャプシドのいずれかにパッケージングしてそれぞれＡＶ２：５／２ｅＧＦＰもしくはＡＶ２：５／５ｅＧＦＰ感染性ウイルスを組み立てた。ゲノムのいずれもの末端で相同なＡＡＶ−２もしくはＡＡＶ−５ＴＰＳを有する同様なベクターを用いてそれぞれＡＶ２：２／２ｅＧＦＰおよびＡＶ５：５／５ｅＧＦＰウイルスを作製した（図式されない）。（Ｃ）精製されたＡＶ２：５／２ｅＧＦＰウイルスからのウイルスＤＮＡのアルカリサザンブロット分析をＡＶ２：２／２ｅＧＦＰおよびＡＶ５：５ｅＧＦＰウイルスからのウイルスＤＮＡと比較した。各ベクターからの均一なバンドは、このサザンブロットにおいてＰ^３２で標識したＥＧＦＰプローブを用いて視覚化され、そして完全なウイルスゲノムのパッケージングを裏付ける。（Ｄ）ＡＡＶ−２ＴＰＳ、ＡＡＶ−５ＴＰＳ、ＥＧＦＰ導入遺伝子、もしくはプロウイルスプラスミドのバックボーンにおけるスタッファー配列に対する異なるプローブで精製されたウイルスからのＤＮＡを評価するスロットブロット分析。ｐＣａｔは、プローブのいずれかに対する配列相同性を有さないコントロールプラスミドである。ｐＡＶ２：５ｅＧＦＰは、使用した全てのプローブについてハイブリダイゼーションシグナルを比較するために用いるコントロールプロウイルスプラスミドであった。結果は、ベクター内非相同ＴＰＳＡＡＶベクターにおけるＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５ＴＰＳの両方の同等なパッケージングならびに全てのベクターにおけるスタッファー配列のほぼ同等なパッケージング（約１０％）を示す。（Ｅ）ベクター内非相同ＴＰＳウイルス（ＡＶ２：５／２ｅＧＦＰおよびＡＶ２：５／５ｅＧＦＰ）の感染力価をＨｅＬａ細胞における感染後に天然のＡＶ２：２／２ｅＧＦＰおよびＡＶ５：５／５ｅＧＦＰウイルスで得られるものと比較した。ＨｅＬａ細胞に５００粒子／細胞のＡＶ２：２／２ｅＧＦＰ、ＡＶ５：５／５ｅＧＦＰ、ＡＶ２：５／２ｅＧＦＰもしくはＡＶ２：５／５ｅＧＦＰを感染させ、そしてＥＧＦＰ蛍光顕微鏡写真を感染後４８時間で撮った。ベクター内非相同ＴＰＳウイルスは、各血清型の天然のベクターと同様なレベルの形質導入を示した。ＡＡＶ−５キャプシドウイルスでの形質同様は、ＨｅＬａ細胞においてＡＡＶ−２キャプシドベクターで得られるものより約５倍低いことに留意すべきである。ＡＶ２：５／２ｅＧＦＰおよびＡＶ２：２／２ｅＧＦＰ感染ＨｅＬａ細胞から抽出したＨｉｒｔＤＮＡのサザンブロット分析。ＨｅＬａ細胞にＡＶ２：２／２ｅＧＦＰおよびＡＶ２：５／２ｅＧＦＰを５００粒子／細胞のＭＯＩで感染させ、そしてＨｉｒｔＤＮＡを感染後２日に抽出した。各サンプルからのＨｉｒｔＤＮＡの１／４をＳｔｕＩで消化した。ウイルスＤＮＡのサザンブロッティングは、ＣＭＶプロモーターに対するＰ^３２で標識したプローブを用いて行った。（Ａ）可能な二本鎖形質導入中間体からの予測されるＳｔｕＩ消化産物の略図。（Ｂ）ＣＭＶプローブで調べたサザンブロット結果。開いた矢印は、線状ウイルスゲノムの存在の診断に用いる０．９４ｋｂのバンドを示す。詰まった矢印は、切断していないサンプルにおけるモノマースーパーコイル状環状中間体（２．８ｋｂ）およびＳｔｕＩ消化サンプルにおける線状全長ゲノム（４．７ｋｂ）の診断に用いるバンドを示す。一本鎖ウイルスＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）の移動もまた印を付ける。Ｕ、未消化；Ｃ、ＳｔｕＩ消化。（Ｃ）ＡＶ２：２／２ｅＧＦＰおよびＡＶ２：５／２ｅＧＦＰからのＨｉｒｔＤＮＡの時間的経過の比較。サンプルを感染後６時間、１日、２日、３日および５日で得た。より多くのシグナルがＡＶ２：５／２ｅＧＦＰについて認められ、ベクター内非相同ＴＰＳＡＡＶベクターがＨｅＬａ細胞においてより安定であったことを示すと思われる。ほぼ同じシグナルが６時間で両方のベクターについて認められ、しかしながら、ＡＶ２：２／２ｅＧＦＰシグナルは、感染後２日で有意に減少され、そして５日でほとんど存在しなかった。さらに、ＡＶ２：２／２ｅＧＦＰの環状中間体は時間的経過の間に減少した。（Ａ）ベクター内相同ＴＰＳＡＡＶベクターおよび（Ｂ）ベクター内非相同ＴＰＳＡＡＶベクターのトランス−スプライシングベクターおよび分子間組み換えの産物の概略図。デュアルベクター内非相同ＴＰＳｒＡＡＶベクターおよび予想されるヘテロダイマー構造。分割したＬａｃＺミニ遺伝子は、単一のｒＡＡＶパッケージング限度を超える任意の大きいミニ遺伝子の例である。（Ａ）ベクター内非相同ＡＶ２：５ＴＰＳＬａｃＺトランス−スプライシングデュアルベクターセットを作製するために使用したプロウイルスプラスミド。（Ｂ）ベクター内非相同ＡＶ２：５ＴＰＳベクターのウイルス構造。（Ｃ）ＡＡＶ−２ＴＰＳとＡＡＶ−５ＴＰＳ間の相同的組み換えは、ＬａｃＺ遺伝子発現が機能的に可能な尾部−頭部ヘテロダイマーの形成をもたらす。（Ｄ）頭部−頭部ヘテロダイマー形成は、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５ＴＰＳの低い配列相同性により減少されると予測される。ベクター内非相同ＴＰＳベクターと相同ＴＰＳベクター間のデュアルベクターへテロダイマー化の比較。ＬａｃＺ−ミニ遺伝子のデュアルベクター再構成を用いてベクター内非相同ＴＰＳベクターおよび相同ＴＰＳベクターでの尾部−頭部分子間組み換えの程度を評価した。（Ａ）ＡＡＶ−２血清型ウイルス（ＡＶ５：２／２ＬａｃＺｄｏｎｏｒおよびＡＶ２：５／２ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒ）もしくはＡＡＶ−５血清型ウイルス（ＡＶ５：２／５ＬａｃＺｄｏｎｏｒおよびＡＶ２：５／５ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒ）を作製するために使用した、ベクター内非相同ＴＰＳトランス−スプライシングウイルスゲノム、ＡＶ５：２ＬａｃＺｄｏｎｏｒおよびＡＶ２：５ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒの略図。ＡＶ２：２／２ＬａｃＺｄｏｎｏｒおよびＡＶ２：２／２ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒウイルス（示さない）は同様の構造を有するが、ゲノムの両末端にＡＡＶ−２ＴＰＳを含有した。（Ｂ〜Ｄ）ＨｅＬａ細胞に各ウイルスを示されるように単独でもしくは組み合わせて２５００粒子／細胞のＭＯＩで感染させた。β−ガラクトシダーゼ活性を感染後３日で定量した。分析は、（Ｂ）ＡＡＶ−２キャプシド封入ウイルスおよび（Ｃ）ＡＡＶ−５キャプシド封入ウイルスの両方で行った。（Ｄ）ベクター内非相同ＴＰＳおよびベクター内相同ＴＰＳドナーおよびアクセプターベクターの組み合わせを用いる混合実験もまた、ＴＰＳ組み換えにおける配列特異性を評価するために行った。ベクターの組み合わせは、それぞれ、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５ＴＰＳを示す開いたおよび閉じた矢印でグラフ上に図式的に示す。データは、７回の独立した感染の平均（＋／−Ｓ．Ｅ．Ｍ．）を表す。ベクター内非相同ＴＰＳｒＡＡＶベクターの略図。パネル（Ａ）は、異なるＡＡＶ血清型からのＴＰＳを有するベクター内非相同ＴＰＳｒＡＡＶを示す（ｒＡＶ２：５ｔｒａｎｓｇｅｎｅ）。パネル（Ｂ）は、シュードＴＰＳｒＡＡＶベクターを示す。「２」および「５」はＡＡＶ−２もしくはＡＡＶ−５由来のいずれかの２つのＴＰＳを表し、そして「Ｐ」はシュードＴＰＳを表す。パネル（Ｃ）は、対応するプラスミドベクターを示す。（Ａ）配列番号：３を有する典型的なシュードＴＰＳの配列および構造。シュードＰＳの一次構造は、ＡＡＶ−２もしくはＡＡＶ−５ＴＰＳがそうであるようにパリンドロームであるが、シュードＰＳはＡＡＶＴＰＳ配列とほとんどもしくは全く相同性を共有しない。（Ｂ）ＡＡＶ−２５’ＩＴＲ内のＡＡＶ−２ＴＰＳ（配列番号：１）の配列および構造。（Ｃ）ヒギンズ計算方法（Ｈｉｇｇｉｎｓｅｔａｌ．，１９８９）により作製したシュードＰＳ（配列番号：３）およびＡＡＶ−２ＴＰＳ（配列番号：１）の相同性アライメント。ＡＡＶ−２ＩＴＲの末端分離部位（ｔｒｓ）における切断部位を垂直な矢印で示し、そしてＤ配列をボールド体で提示する。両方の配列における下線を引いた文字は、ループ構造を形成する配列を示す（ＡＡＶ−２ＴＰＳのＢ−Ｃ配列）。シュードＰＳ（パネルＤ）およびＡＡＶ−２ＴＰＳ（パネルＥ）の予測される二次構造は、同様なステムループヘアピン構造である。シュードＰＳとＡＡＶ−２ＴＰＳ間には配列相同性がほとんどない（手動比較により計算される配列同一性は、Ａ領域における約３１％の同一性、ＢおよびＣ領域における約２８％の同一性および約５６％の同一性、そして全体で約３９％の同一性を示し、一方、ヒギンズ計算方法を用いて計算される相同性は、Ａ領域における約９．７％の相同性、Ｂ領域における約３６．３％の相同性、そしてＣ領域における０％の相同性、そして全体で約８．６％の相同性を示す）が、両方とも同じ安定なステムループヘアピン構造を共有する。トランス−スプライシングのためのシュードＴＰＳを有するベクター内非相同ＴＰＳＡＡＶ。（Ａ）シュードＴＰＳを含有するベクター内非相同ＴＰＳｒＡＡＶベクターを作製するために使用したプロウイルスプラスミド。詰まった矢印は野生型ＡＡＶ−２ＴＰＳを表し、開いた矢印はシュードＴＰＳを表す。ＳＤ：トランス−スプライシングドナーシグナル配列；ＳＡ：トランス−スプライシングアクセプターシグナル配列。（Ｂ）いずれかの末端にＡＡＶ−２ＴＰＳおよびシュードＴＰＳを有するベクター内非相同ＴＰＳｒＡＡＶベクターの略図。シュードＴＰＳを有するウイルスゲノムにおける末端分離部位の欠如は、シュードＴＰＳで閉じた末端そしてＡＡＶ−２ＴＰＳで開いた末端を有する自己相補的二本鎖ゲノムとしてパッケージングされるゲノムをもたらすことができる。（Ｃ）シュードＴＰＳｒＡＡＶのサザンブロットアッセイ。ＡＶ．２：Ｐ−ｄｏｎｏｒ（レーン１）、ＡＶ．Ｐ：２−ｄｏｎｏｒ（レーン２）、ＡＶ．２：Ｐ−ａｃｐｔ（レーン３）およびＡＶ．Ｐ：２−ａｃｐｔ（レーン４）から抽出したウイルスＤＮＡをアガロースゲルにおいて分離し、そして^３２Ｐで標識したｅＧＦＰプローブにより視覚化した。（Ｄ）シュードＴＰＳｒＡＡＶトランス−スプライシングデュアルベクターセットにより送達される分割したｅＧＦＰミニ遺伝子の再構成。（Ａ）様々なＴＰＳ間の相同性。（Ｂ）様々なＴＰＳの配列アライメント。相同性分析およびアライメントは、ヒギンズ計算方法でＤＮＡｓｉｓｖ３．７ソフトウェアにより作製した。シュードＴＰＳ（配列番号：３）；ＡＡＶ−１ＴＰＳ（配列番号：４）；ＡＡＶ−２ＴＰＳ（配列番号：１）；ＡＡＶ−３ＴＰＳ（配列番号：５）；ＡＡＶ−４ＴＰＳ（配列番号：６）；ＡＡＶ−５ＴＰＳ（配列番号：２）；およびＡＡＶ−６ＴＰＳ（配列番号：１１）。シュードＴＰＳＰ１（配列番号：３）（Ａ）、ＡＡＶ−５ＴＰＳ（配列番号：２）（Ｂ）、シュードＴＰＳＰ３（配列番号：８）（Ｃ）、ＡＡＶ−２ＴＰＳ（配列番号：１）（Ｄ）、シュードＴＰＳＰ２（配列番号：７）（Ｅ）の二次構造、Ｐ１、ＡＡＶ−２ＴＰＳおよびＡＡＶ−５ＴＰＳの比較（Ｆ）、ならびにシュードＰ１、Ｐ２、Ｐ３、ＡＡＶ−２ＴＰＳおよびＡＡＶ−５ＴＰＳの比較。典型的なＰＳの自由エネルギー、Ｇ−Ｃ％およびＴｍの比較。

Claims

少なくとも第一のｒＡＡＶベクターがベクター内非相同末端パリンドローム配列（ＴＰＳ）ベクターであり、そして宿主もしくは宿主細胞への導入後に、両方のベクターからの核酸配列を含んでなるキメラＤＮＡ分子が、相同なＴＰＳを有する対応するｒＡＡＶベクターに対して増加した効率で形成されるように第二のｒＡＡＶベクターが第一のｒＡＡＶベクターのＴＰＳと方向性（ｄｉｒｅｃｔｉｏｎａｌ）ベクター間相同性を有する少なくとも１つのＴＰＳを含有する、少なくとも２つの組み換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）ベクターを含んでなるベクターセット。
ａ）連結された：
ｉ）第一の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメント；
ｉｉ）非ＡＡＶＤＮＡ配列を含んでなる第二のＤＮＡセグメント；および
ｉｉｉ）第一の３’ＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメント、ここで、第一の５’ＴＰＳおよび第一の３’ＴＰＳは非相同ＴＰＳである、
を含んでなる第一の組み換えＤＮＡ分子を含んでなる第一のｒＡＡＶ；ならびに
ｂ）連結された：
ｉ）第二の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメント；
ｉｉ）第一の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントにおける配列と異なる非ＡＡＶＤＮＡ配列を含んでなる第二のＤＮＡセグメント；および
ｉｉｉ）第二の３’ＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメント、ここで、第二の５’ＴＰＳおよび第二の３’ＴＰＳは場合により非相同ＴＰＳであってもよく、第一の３’ＴＰＳは第二の５’ＴＰＳに相同であり、第二のＤＮＡセグメントの少なくとも１つは機能性遺伝子産物をコードするか、もしくは２つの第二のＤＮＡセグメントは一緒に機能性遺伝子産物をコードし、これらの相同なＴＰＳは、ベクターセットでの細胞の感染後に、相同なＴＰＳを有する対応するｒＡＡＶに対して増加した効率でキメラＤＮＡ分子をもたらす方向性分子間組み換えができる、
を含んでなる第二の組み換えＤＮＡ分子を含んでなる第二のｒＡＡＶ
を含んでなる少なくとも２つのｒＡＡＶを含んでなるベクターセット。
第一の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントが、場合により少なくとも１つの異種転写調節要素に連結されていてもよい、遺伝子産物のオープンリーディングフレームの一部、およびオープンリーディングフレームの一部に対して３’のスプライスドナー部位を有し、第二の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントがオープンリーディングフレームの残りに対して５’のスプライスアクセプター部位を含んでなる請求項２のセット。
少なくとも１つの異種転写調節要素がプロモーターである請求項３のセット。
少なくとも１つの異種転写調節要素がエンハンサーである請求項４のセット。
第一の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントがエンハンサーを含んでなる請求項２のセット。
第二の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントが遺伝子産物のオープンリーディングフレームを含んでなる請求項６のセット。
第二の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントが、遺伝子産物のオープンリーディングフレームに操作可能に連結されたプロモーターをさらに含んでなる請求項７のセット。
第一の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントがプロモーターを含んでなる請求項２のセット。
第二の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントが遺伝子産物のオープンリーディングフレームを含んでなる請求項９のセット。
第二の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントが、遺伝子産物のオープンリーディングフレームに操作可能に連結されたプロモーターをさらに含んでなる請求項１０のセット。
第二のＤＮＡセグメントが異なる機能性遺伝子産物を各々コードする請求項２のセット。
第一の３’ＴＰＳがシュード（ｐｓｅｕｄｏ）ＴＰＳである請求項２のセット。
シュードＴＰＳがエンハンサー、プロモーター、インテグラーゼの組込み部位、もしくはさらなる遺伝子産物のオープンリーディングフレームをさらに含んでなる請求項１３のセット。
第一の３’ＴＰＳが天然のＡＡＶＴＰＳである請求項２のセット。
第一の３’ＴＰＳがＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７もしくはＡＡＶ−８ＴＰＳである請求項１５のセット。
第一の５’ＴＰＳもしくは第二の３’ＴＰＳがシュードＴＰＳである請求項２のセット。
シュードＴＰＳがエンハンサー、プロモーター、インテグラーゼの組込み部位、もしくはさらなる遺伝子産物のオープンリーディングフレームをさらに含んでなる請求項１７のセット。
第一の５’ＴＰＳが第二の３’ＴＰＳに相同である請求項２のセット。
第一の５’ＴＰＳおよび第二の３’ＴＰＳが非相同ＴＰＳである請求項２のセット。
第一の５’ＴＰＳもしくは第二の３’ＴＰＳが天然のＡＡＶＴＰＳである請求項２のセット。
第一の５’ＴＰＳもしくは第二の３’ＴＰＳがＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７もしくはＡＡＶ−８ＴＰＳである請求項２１のセット。
遺伝子産物が治療遺伝子産物である請求項２のセット。
遺伝子産物が触媒ＲＮＡである請求項２のセット。
遺伝子産物が予防遺伝子産物である請求項２のセット。
遺伝子産物がポリペプチドもしくはペプチドである請求項２のセット。
ａ）連結された：
ｉ）第一の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメント；
ｉｉ）非ＡＡＶＤＮＡ配列を含んでなる第二のＤＮＡセグメント；および
ｉｉｉ）第一の３’ＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメント、ここで、第一の５’ＴＰＳおよび第一の３’ＴＰＳは非相同ＴＰＳである、
を含んでなる第一の組み換えＤＮＡ分子を含んでなる第一のｒＡＡＶ；ならびに
ｂ）連結された：
ｉ）第二の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメント；
ｉｉ）第一の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントにおける配列と異なる非ＡＡＶＤＮＡ配列を含んでなる第二のＤＮＡセグメント；および
ｉｉｉ）第二の３’ＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメント、ここで、第二の５’ＴＰＳおよび第二の３’ＴＰＳは場合により非相同ＴＰＳであってもよく、第一の３’ＴＰＳは第二の５’ＴＰＳに相同であり、第二のＤＮＡセグメントの少なくとも１つは機能性遺伝子産物をコードするか、もしくは２つの第二のＤＮＡセグメントは一緒に機能性遺伝子産物をコードし、これらの相同なＴＰＳは、組成物での細胞の感染後に、相同なＴＰＳを有する対応するｒＡＡＶに対して増加した効率でキメラＤＮＡ分子をもたらす方向性分子間組み換えができる、
を含んでなる第二の組み換えＤＮＡ分子を含んでなる第二のｒＡＡＶ
を含んでなる少なくとも２つのｒＡＡＶを含んでなる組成物。
送達賦形剤をさらに含んでなる請求項２７の組成物。
賦形剤が製薬学的に許容しうる担体である請求項２８の組成物。
ベクターが宿主細胞において複製されそしてパッケージングされることができる、非ＡＡＶＤＮＡセグメントに隣接する５’ＴＰＳおよび３’ＴＰＳを含んでなり、ここで、ＴＰＳの少なくとも１つはシュードＴＰＳであるｒＡＡＶベクター。
非ＡＡＶＤＮＡセグメントが転写調節要素を含んでなる請求項３０のベクター。
転写調節要素がプロモーターである請求項３１のベクター。
転写調節要素がエンハンサーである請求項３１のベクター。
異種ＤＮＡセグメントが遺伝子産物のオープンリーディングフレームの少なくとも一部を含んでなる請求項３０のベクター。
異種ＤＮＡセグメントが治療遺伝子産物をコードする請求項３０のベクター。
３’ＴＰＳがシュードＴＰＳである請求項３０のベクター。
３’ＴＰＳが天然のＡＡＶＴＰＳである請求項３０のベクター。
３’ＴＰＳがＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７もしくはＡＡＶ−８ＴＰＳである請求項３７のベクター。
５’ＴＰＳがシュードＴＰＳである請求項３０のベクター。
５’ＴＰＳが天然のＡＡＶＴＰＳである請求項３０のベクター。
第一の５’ＴＰＳがＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７もしくはＡＡＶ−８ＴＰＳである請求項４０のベクター。
異種ＤＮＡセグメントに対して３’のスプライスドナーもしくは異種ＤＮＡセグメントに対して５’のスプライスアクセプターをさらに含んでなる請求項３０のベクター。
シュードＴＰＳがエンハンサー、プロモーター、インテグラーゼの組込み部位、もしくはさらなる遺伝子産物のオープンリーディングフレームをさらに含んでなる請求項３６もしくは３９のベクター。
請求項３０のベクターを含んでなるプラスミド。
請求項２７の組成物と接触させた宿主細胞。
請求項３０のベクターと接触させた宿主細胞。
第一のｒＡＡＶが、連結された：
ｉ）第一の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメント；
ｉｉ）非ＡＡＶＤＮＡ配列を含んでなる第二のＤＮＡセグメント；および
ｉｉｉ）第一の３’ＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメント、ここで、第一の５’ＴＰＳおよび第一の３’ＴＰＳは非相同ＴＰＳである、
を含んでなる第一の組み換えＤＮＡ分子を含んでなり；そして
第二のｒＡＡＶが、連結された：
ｉ）第二の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメント；
ｉｉ）第一の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントにおける配列と異なる非ＡＡＶＤＮＡ配列を含んでなる第二のＤＮＡセグメント；および
ｉｉｉ）第二の３’ＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメント、ここで、第二の５’ＴＰＳおよび第二の３’ＴＰＳは場合により非相同ＴＰＳであってもよく、第一の３’ＴＰＳは第二の５’ＴＰＳに相同であり、第二のＤＮＡセグメントの少なくとも１つは機能性遺伝子産物をコードするか、もしくは２つのＤＮＡセグメントは一緒に機能性遺伝子産物をコードし、これらの相同なＴＰＳは、第一および第二のｒＡＡＶでの細胞の感染後に、相同なＴＰＳを有する対応するｒＡＡＶに対して増加した効率でキメラＤＮＡ分子をもたらす方向性分子間組み換えができる、
を含んでなる第二の組み換えＤＮＡ分子を含んでなる、少なくとも２つのｒＡＡＶと接触させた宿主細胞。
第一のｒＡＡＶが、連結された：
ｉ）第一の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメント；
ｉｉ）非ＡＡＶＤＮＡ配列を含んでなる第二のＤＮＡセグメント；および
ｉｉｉ）第一の３’ＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメント、ここで、第一の５’ＴＰＳおよび第一の３’ＴＰＳは非相同ＴＰＳである、
を含んでなる第一の組み換えＤＮＡ分子を含んでなり；そして
ｂ）第二のｒＡＡＶが、連結された：
ｉ）ＡＡＶの第二の５’ＴＰＳを含んでなる第一のＤＮＡセグメント；
ｉｉ）第一の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントにおける配列と異なる非ＡＡＶＤＮＡ配列を含んでなる第二のＤＮＡセグメント；および
ｉｉｉ）第二の３’ＴＰＳを含んでなる第三のＤＮＡセグメント、ここで、第二の５’ＴＰＳおよび第二の３’ＴＰＳは場合により非相同ＴＰＳであってもよく、第一の３’ＴＰＳは第二の５’ＴＰＳに相同であり、そして第二のＤＮＡセグメントの少なくとも１つは
機能性遺伝子産物をコードするか、もしくは２つのＤＮＡセグメントは一緒に機能性遺伝子産物をコードし、これらの相同なＴＰＳは、第一および第二のｒＡＡＶでの細胞の感染後に、相同なＴＰＳを有する対応するｒＡＡＶに対して増加した効率でキメラＤＮＡ分子をもたらす方向性分子間組み換えができる、
を含んでなる第二の組み換えＤＮＡ分子を含んでなる、少なくとも２つのｒＡＡＶと宿主細胞を接触させることを含んでなる、宿主細胞に組み換えＤＮＡを導入する方法。
請求項２７の組成物と宿主細胞を接触させることを含んでなる宿主細胞において機能性遺伝子産物を導入しそして発現する方法。
第一の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントが、場合により少なくとも１つの異種転写調節要素に連結されていてもよい、遺伝子産物のオープンリーディングフレームの一部、およびオープンリーディングフレームに対して３’のスプライスドナー部位を有し、第二の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントがオープンリーディングフレームの残りに対して５’のスプライスアクセプター部位を含んでなる請求項４８もしくは４９の方法。
少なくとも１つの異種転写調節要素がプロモーターである請求項５０の方法。
少なくとも１つの異種転写調節要素がエンハンサーである請求項５０の方法。
第一の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントがエンハンサーを含んでなる請求項４８もしくは４９の方法。
第二の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントが遺伝子産物のオープンリーディングフレームを含んでなる請求項５３の方法。
第二の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントが、遺伝子産物のオープンリーディングフレームに操作可能に連結されたプロモーターをさらに含んでなる請求項５４の方法。
第一の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントがプロモーターを含んでなる請求項４８もしくは４９の方法。
第二の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントが遺伝子産物のオープンリーディングフレームを含んでなる請求項５６の方法。
第二の組み換えＤＮＡ分子の第二のＤＮＡセグメントが、遺伝子産物のオープンリーディングフレームに操作可能に連結されたさらなるプロモーターを含んでなる請求項５７の方法。
第二のＤＮＡセグメントが異なる機能性遺伝子産物を各々コードする請求項４８もしくは４９の方法。
第一の３’ＴＰＳがシュードＴＰＳである請求項４８もしくは４９の方法。
シュードＴＰＳがエンハンサー、プロモーター、インテグラーゼの組込み部位、もしくはさらなる遺伝子産物のオープンリーディングフレームをさらに含んでなる請求項６０の方法。
第一の３’ＴＰＳが天然のＡＡＶＴＰＳである請求項４８もしくは４９の方法。
３’ＴＰＳがＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７もしくはＡＡＶ−８ＴＰＳである請求項６２の方法。
第一の５’ＴＰＳもしくは第二の３’ＴＰＳがシュードＴＰＳである請求項４８もしくは４９の方法。
シュードＴＰＳがエンハンサー、プロモーター、インテグラーゼの組込み部位、もしくはさらなる遺伝子産物のオープンリーディングフレームをさらに含んでなる請求項６４の方法。
第一の５’ＴＰＳもしくは第二の３’ＴＰＳが天然のＴＰＳである請求項４８もしくは４９の方法。
第一の５’ＴＰＳもしくは第二の３’ＴＰＳがＡＡＶ−１、ＡＡＶ−２、ＡＡＶ−３、ＡＡＶ−４、ＡＡＶ−５、ＡＡＶ−６、ＡＡＶ−７もしくはＡＡＶ−８ＴＰＳである請求項６６の方法。
第一の５’ＴＰＳが第二の３’ＴＰＳに相同である請求項４８もしくは４９の方法。
第一の５’ＴＰＳおよび第二の３’ＴＰＳが非相同ＴＰＳである請求項４８もしくは４９の方法。
遺伝子産物がポリペプチドもしくはペプチドである請求項４８もしくは４９の方法。
遺伝子産物が触媒ＲＮＡである請求項４８もしくは４９の方法。
遺伝子産物が治療遺伝子産物である請求項４８もしくは４９の方法。
非ＡＡＶＤＮＡセグメントに隣接する５’ＴＰＳおよび３’ＴＰＳを含んでなる第一のｒＡＡＶベクターであって、第一のｒＡＡＶベクターにおける５’ＴＰＳおよび３’ＴＰＳは非相同ＴＰＳであり、第一のｒＡＡＶベクターにおける５’ＴＰＳもしくは３’ＴＰＳは、第二のｒＡＡＶベクターのそれぞれ３’ＴＰＳもしくは５’ＴＰＳと両方のベクターが宿主細胞もしくは宿主細胞溶解物に存在する場合に方向性分子間組み換えができるように選択され、第二のｒＡＡＶベクターの５’ＴＰＳおよび３’ＴＰＳは異なる非ＡＡＶＤＮＡセグメントに隣接し、第一および第二のｒＡＡＶベクターの方向性分子間組み換えが機能性遺伝子産物を発現することができる転写単位をもたらすように第一のｒＡＡＶベクターにおけるＤＮＡセグメントおよび第二のｒＡＡＶベクターにおけるＤＮＡセグメントは選択されそして各それぞれのベクターにおいて配置される第一のｒＡＡＶベクター。
Ｇ−Ｃパーセントが６０％より大きく、そして／もしくはＴｍが８１℃を超え、そして合成パリンドローム配列がステムループ二次構造を形成する合成パリンドローム配列をもたらすように天然のＡＡＶＴＰＳのＡと対応するＡ’、Ｂと対応するＢ’および／もしくはＣと対応するＣ’セグメントにおける複数のヌクレオチドを置換することを含んでなる、ｒＡＡＶベクターにおける末端パリンドローム配列の少なくとも１つの合成パリンドローム配列の製造方法。
ＢとＢ’間の不対ヌクレオチドの数が２〜６である請求項７４の方法。
ＣとＣ’間の不対ヌクレオチドの数が２〜６である請求項７４の方法。
ＢとＣもしくはＢ’とＣ’間の不対ヌクレオチドの数が２〜６である請求項７４の方法。
ステムループ構造が天然のＡＡＶＴＰＳのものと同一である請求項７４の方法。
合成パリンドローム配列が天然のＡＡＶＴＰＳに５０％未満の核酸配列同一性を有する請求項７４の方法。