JP2009535034A - 哺乳動物細胞のパルボウイルス形質導入を調節若しくはウイルス感染を変えるための方法および化合物、ウイルス受容体若しくは共受容体の同定方法 - Google Patents
哺乳動物細胞のパルボウイルス形質導入を調節若しくはウイルス感染を変えるための方法および化合物、ウイルス受容体若しくは共受容体の同定方法 Download PDFInfo
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Abstract
本発明は、哺乳動物細胞のパルボウイルス形質導入を変える薬剤の同定方法を提供する。哺乳動物細胞中での導入遺伝子発現を高める方法、ならびにパルボウイルスで形質導入した哺乳動物細胞中のNADPHオキシダーゼ活性を高める薬剤の同定方法もまた提供される。
Description
本出願は、2006年4月28日に出願された米国特許出願第60/796,109号および2006年11月7日に出願された米国特許出願第60/857,349号(それらの開示は本明細書に引用することにより組込まれる)の出願日の利益を主張する。
政府の権利の声明
本発明は、米国政府からの助成金(国立保健研究所からの助成金第HL58340号)を用いてなされた。該政府は本発明にある種の権利を有する。
本発明は、米国政府からの助成金(国立保健研究所からの助成金第HL58340号)を用いてなされた。該政府は本発明にある種の権利を有する。
活性酸素種(ROS)は、タンパク質ホスファターゼおよびチオールで調節されるタンパク質/タンパク質相互作用を調節することにより、多様な細胞シグナリング過程で不可欠の役割を演じている(非特許文献1;非特許文献2)。貪食細胞中で、貪食細胞NADPHオキシダーゼ(Nox2gp91phox)複合体の病原体誘発性の活性化が、貪食された病原体の破壊で補助する食胞中のROSの高レベルにつながる。さらに、広範な他の細胞型で、ROSは、血小板由来増殖因子(PDGF)、腫瘍壊死因子α(TNF−α)、インスリン、インターロイキンβ(IL−1β)などのような多様なリガンドに応答しての細胞のシグナリングの媒介において重要な役割を演じている(非特許文献1;非特許文献2)。ROSが細胞のシグナル伝達を促進する機構は、タンパク質の活性部位のチオール基の不可逆的修飾を伴い、それらのなかの十分に研究された一例はタンパク質チロシンホスファターゼ(PTP)である(非特許文献2)。伝達される電子の数に依存して、チオール基のレドックス修飾は、他者に加えてジスルフィド結合、スルフェン酸、スルフィン酸、スルホン酸を包含する多様な産物をもたらし得る(非特許文献3)。
それらの高度に反応性の特性により、細胞は、シグナリングに関与する特定の場所にそれらの作用部位を制限するようにROSを区画化する。例えば、研究は、TNF媒介性アポトーシスで重要なJNKホスファターゼの酸化的不活性化の原因であるH2O2の供給源として、ミトコンドリアのスーパーオキシドが関係あるとされた(非特許文献4)。同様に、ペルオキシレドキシンII(PrxII)が、PDGF受容体不活性化で重要なPTPの活性を制御することにより、PDGFシグナル伝達の負の制御因子として作用することが示された(非特許文献5)。より最近、研究は、リガンド結合したIL−1R1の受容体媒介性のエンドサイトーシスが、Nox2媒介性のエンドソームROS産生を刺激し、かつ、受容体複合体のレドックス活性化を空間的に制限することもまた示した(非特許文献6;非特許文献7)。
細胞シグナリングにおけるROSの十分に確立された重要性に加え、増大する証拠は、ROSが多くの型のウイルス感染症の発病においてもまた決定的に重要な役割を演じていることを示唆する(非特許文献8:非特許文献9;非特許文献10)。この情況において、多くのウイルスが感染の間にROS生成を誘導すること、および、であるから、細胞のROSを消失させる原因である遺伝子の誘導にもまたつながることが既知である。アデノウイルスおよび腫瘍原性ポックスウイルスは、これらのウイルスが複製するために依存する細胞のレドックス不均衡を誘導し得る(非特許文献11;非特許文献12)。例えば、HIV、インフルエンザウイルスおよび肝炎ウイルスは酸化的ストレスを誘導することが既知であり、また、抗酸化薬剤処置はこれらのウイルスにより引き起こされる病的状態を改善することが報告された(非特許文献13;非特許文献14;非特許文献15;非特許文献16;非特許文献17)。A型インフルエンザ感染のin vivo研究(非特許文
献18)において、感染した動物の気道の微小環境は、増大されたスーパーオキシド生成およびH2O2形成、ならびに低下されたアスコルビン酸レベルを包含する、酸化的ストレスの徴候を表した。しかしながら、感染した肺の抗酸化能力は、未感染動物と比較して損なわれておらず、ROSの生成に対するA型インフルエンザの主影響を示唆した。複合させたSODを使用するA型インフルエンザに対する抗酸化薬剤治療は有効であることが判明したが、しかし該投与が特定の期間内であった場合のみであった(非特許文献16)。HIVの場合、酸化的ストレスがその複製を助長し、そして該機構はウイルス遺伝子発現を高め得るレドックスで活性化されるNF−κBが関わると一般に考えられている(非特許文献19;非特許文献20;非特許文献21;非特許文献9)。in vitroモデルを使用する研究は、HIV感染からの病的状態の改善における数種の抗酸化薬剤の有効性を示した(非特許文献22;非特許文献23;非特許文献17)。
献18)において、感染した動物の気道の微小環境は、増大されたスーパーオキシド生成およびH2O2形成、ならびに低下されたアスコルビン酸レベルを包含する、酸化的ストレスの徴候を表した。しかしながら、感染した肺の抗酸化能力は、未感染動物と比較して損なわれておらず、ROSの生成に対するA型インフルエンザの主影響を示唆した。複合させたSODを使用するA型インフルエンザに対する抗酸化薬剤治療は有効であることが判明したが、しかし該投与が特定の期間内であった場合のみであった(非特許文献16)。HIVの場合、酸化的ストレスがその複製を助長し、そして該機構はウイルス遺伝子発現を高め得るレドックスで活性化されるNF−κBが関わると一般に考えられている(非特許文献19;非特許文献20;非特許文献21;非特許文献9)。in vitroモデルを使用する研究は、HIV感染からの病的状態の改善における数種の抗酸化薬剤の有効性を示した(非特許文献22;非特許文献23;非特許文献17)。
対照的に、伝染性軟疣ウイルス(MCV)ゲノムは、細胞がウイルス感染を制限するよう適応させる防御機構である酸化的ストレス誘発性アポトーシスを予防するのを助けるグルタチオンペルオキシダーゼ(Gpx)様タンパク質をコードする(非特許文献8;非特許文献10)。多数のウイルスが感染後に細胞のROSを誘導することが既知であるという事実にもかかわらず、細胞のレドックス状態の変化がウイルス感染/複製を助長若しくは阻害のいずれかをする機構は、不十分に理解されたままである。
Lambeth、Nat.Rev.Immunol.、4:181(2004)
Rheeら、Sci.STKE、2000:PE1(2000)
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[発明の要約]
本発明は、レドックス感受性の細胞内経路を有するウイルスによるウイルス形質導入を変えるための方法および化合物、ならびにそれらのレドックス感受性を変えるためのウイルスの改変方法を提供する。一態様において、哺乳動物細胞のウイルス形質導入を高める方法が提供される。一態様において、本発明は、例えばエンドソームのNADPHオキシダーゼ活性を高めることにより有効量でROS産生を高める化合物を使用して、組換えパルボウイルス、例えば組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)の形質導入を高め、それによりそれらのウイルスによる遺伝子移入を高める方法を提供する。別の態様において、哺乳動物細胞のウイルス形質導入の阻害方法が提供される。一態様において、本発明は、例えばエンドソームのNADPHオキシダーゼ活性を阻害することにより有効量でROS産生を阻害する化合物を使用する、パルボウイルス形質導入の阻害方法を提供する。レドックス感受性の細胞内ウイルスプロセシング経路を高める若しくは阻害する薬剤の同定方法がさらに提供される。
本発明は、レドックス感受性の細胞内経路を有するウイルスによるウイルス形質導入を変えるための方法および化合物、ならびにそれらのレドックス感受性を変えるためのウイルスの改変方法を提供する。一態様において、哺乳動物細胞のウイルス形質導入を高める方法が提供される。一態様において、本発明は、例えばエンドソームのNADPHオキシダーゼ活性を高めることにより有効量でROS産生を高める化合物を使用して、組換えパルボウイルス、例えば組換えアデノ随伴ウイルス(rAAV)の形質導入を高め、それによりそれらのウイルスによる遺伝子移入を高める方法を提供する。別の態様において、哺乳動物細胞のウイルス形質導入の阻害方法が提供される。一態様において、本発明は、例えばエンドソームのNADPHオキシダーゼ活性を阻害することにより有効量でROS産生を阻害する化合物を使用する、パルボウイルス形質導入の阻害方法を提供する。レドックス感受性の細胞内ウイルスプロセシング経路を高める若しくは阻害する薬剤の同定方法がさらに提供される。
後述されるとおり、アデノ随伴ウイルス2型(AAV2)は、その感染の間のエンドソームのROS産生の刺激、および結果として生じる過酸化水素を利用してのビリオンのエンドソームプロセシングの助長の双方をするよう進化した。HeLa細胞、IB3細胞若しくは初代マウス線維芽細胞のrAAV2への感染は、エンドソームのNADPH依存性のスーパーオキシド産生を3ないし4倍刺激した。カタラーゼ負荷によるエンドソーム区画内からの過酸化水素の除去は、rAAV2による形質導入を約80倍有意に低下させた。RaclがrAAV2形質導入に重要でありかつ2種のNADPHオキシダーゼ(Nox1およびNox2)の活性化因子であることを考え、Nox1若しくはNox2ノックアウト(KO)および同腹仔の野生型の初代皮膚線維芽細胞をAAV2に感染させた。これらの実験からの結果は、Nox2−/−線維芽細胞がrAAV2感染後にエンドソームROSを誘導することに失敗し、また、野生型同腹仔の線維芽細胞に比較して18倍より低いレベルの形質導入を有したことを示した。対照的に、rAAV2誘発性のエンドソームのROS若しくは形質導入の差違は、Nox1 KOおよび野生型同腹仔の線維芽細胞で観察されなかった。これらの結果は、AAV2感染がエンドソーム区画中でROSを産生するようにNox2を誘導すること、およびH2O2へのウイルスのエンドソーム曝露が該ウイルスの増殖性細胞内プロセシングに重要であることを示唆した。
本明細書にまた記述されるとおり、パルボウイルスの1サブクラス(例えばAAV2)は、感染の早期段階の間にエンドソームのNox2を刺激し、そして結果として生じるH2O2を利用してキャプシドVP中のCys289のスルホン酸酸化を促進する。このレドックス事象は、AAV2ビリオンの部分的アンフォールディング、およびビリオンのエンドソームエスケープに必要とされるキャプシドVP1のホスホリパーゼA2(PLA2)活性の活性化につながった。
本発明は、従って、哺乳動物細胞のウイルス形質導入を変える薬剤の同定方法を提供する。該方法は、哺乳動物細胞、1種若しくはそれ以上の薬剤、およびレドックス感受性の細胞内経路を有することが疑われるウイルスを接触させること、ならびにウイルスと接触させたがしかし1種若しくはそれ以上の薬剤と接触されない対応する哺乳動物細胞に関し
てエンドソームのNADPHオキシダーゼ活性を変える薬剤の1種若しくはそれ以上を同定することを包含する。エンドソーム区画でROSを生成するNox複合体を不活性化する薬剤は抗ウイルス薬として有用でありうる一方、NoxによるROS産生を高める薬剤は、感染を増強するのに有用、そして従って遺伝子治療ベクター若しくはウイルスワクチンとともに、すなわちそれらの効能を高めるのに有用でありうる。
てエンドソームのNADPHオキシダーゼ活性を変える薬剤の1種若しくはそれ以上を同定することを包含する。エンドソーム区画でROSを生成するNox複合体を不活性化する薬剤は抗ウイルス薬として有用でありうる一方、NoxによるROS産生を高める薬剤は、感染を増強するのに有用、そして従って遺伝子治療ベクター若しくはウイルスワクチンとともに、すなわちそれらの効能を高めるのに有用でありうる。
従って、哺乳動物細胞を、レドックス感受性ウイルス、およびNADPHオキシダーゼ活性を高めるように選択された薬剤と接触させることを包含する、哺乳動物細胞のウイルス感染を高める方法もまた提供される。哺乳動物細胞を、レドックス感受性ウイルス、およびNADPHオキシダーゼ活性を阻害するよう選択された薬剤、例えばアポシニン(apocynin)、若しくは多サブユニットNox複合体を標的とする他の化合物と接触させることを包含する、哺乳動物細胞のウイルス感染の阻害方法がさらに提供される。一態様において、ウイルスは病原性パルボウイルス例えばB19のような病原性ウイルスである。一態様において、該薬剤はプロテオソーム(proteosome)阻害薬剤若しくは修飾因子である。
AAV2はRac1含有エンドソームに進入するため、レドックス依存性形質導入を示すか若しくは形質導入のためのNox複合体を利用する他のウイルスは、Rac1依存性の形質導入経路を有しうる(Rac1はNoxの活性化補助因子であるため)。これゆえに、Rac1がAAV2と同一エンドソームに共局在化することを示す知見は、単離されたHA−Rac1標識エンドソームのプロテオミクスのアプローチを使用してのウイルスの侵入の原因である新受容体の同定を可能にする。
従って、ウイルスに感染した細胞からのRac含有エンドソーム中の分子が同定される方法がさらに提供される。一態様において、Rac含有エンドソームが同定かつ単離されうるようにRacを標識(tag)で標識する(labeled)。一端単離されれば、ウイルスを含むRac含有エンドソームのプロテオームを、対照からのRac含有エンドソームのプロテオームと比較する。ウイルス含有エンドソーム中に存在する分子が受容体若しくは共受容体の候補である。
本明細書でまた記述されるとおり、rAAV2のROS媒介性のエンドソームプロセシングは、キャプシド上のシステイン若しくは他のレドックス感受性残基に対するレドックス媒介性の変化を伴いうる。H2O2に曝露される精製ビリオンに対する構造的変化を、MALDI TOFF MSを使用してマッピングした。これらの実験からの結果は、nM量のH2O2が無傷のキャプシドのトリプシン感受性を高め得ることを示唆する。従って、ROSは、キャプシドがエンドソーム中にある間にアンフォールディングすることを助けかつ該ウイルスのある種の生物学的機能(1種若しくは複数)の活性化において補助しうる。無傷のrAAV2ビリオンのnM量のH2O2での処理は、ウイルスキャプシド中に常在性のホスホリパーゼA2活性もまた刺激した。これらの結果は、AAV2が、Nox2由来のROSを増殖性に誘導および利用の双方をして感染の間にそのビリオンをプロセシングするように進化したことを示唆する。
パルボウイルスキャプシドの改変はレドックス感受性であるため、該ウイルスキャプシドはパルボウイルスベクターを改良するための標的となることができ、そしてタンパク質キャプシドを有する他の型のウイルスのキャプシドタンパク質のレドックス調節は、同様にウイルスベクターを改良しうる。PLA2活性をもつキャプシドのレドックス調節は、酸化による新たなジスルフィド結合の創製、および/若しくはキャプシドの共有修飾、例えばシステインを包含するキャプシド残基の修飾(スルフィン酸、スルホン酸、スルフェン酸など)を伴いうる。システイン若しくは他のレドックス調節可能なアミノ酸、例えばヒスチジン、メチオニンなどが一旦同定されれば、その後、アミノ酸置換、若しくは他の
共有修飾を、キャプシドのレドックス調節される部分に工作することができ、それは、感染後にNoxを活性化しかつ/若しくはウイルス産生を改良することに失敗する細胞中での感染性を改良しうる。あるいは、病原性パルボウイルスビリオン、例えば病原性パルボウイルスのキャプシド中のレドックスで調節される成分の同定は、ビリオンを不活性化するレドックス化学を用いて抗ウイルス薬を同定するのに有用でありうる。
共有修飾を、キャプシドのレドックス調節される部分に工作することができ、それは、感染後にNoxを活性化しかつ/若しくはウイルス産生を改良することに失敗する細胞中での感染性を改良しうる。あるいは、病原性パルボウイルスビリオン、例えば病原性パルボウイルスのキャプシド中のレドックスで調節される成分の同定は、ビリオンを不活性化するレドックス化学を用いて抗ウイルス薬を同定するのに有用でありうる。
従って、本発明は、哺乳動物細胞のウイルス形質導入を高めるウイルスキャプシド改変の同定方法を提供する。該方法は、哺乳動物細胞、および改変ウイルスキャプシド(少なくとも1種の改変が、キャプシド中のレドックス感受性残基の数若しくは位置(すなわち場所)の変化、またはキャプシドのレドックス感受性を変える翻訳後変化(例えば、システイン、メチオニン、リシン、ヒスチジンおよび他のレドックス改変可能なアミノ酸ならびにジスルフィド結合の豊富さ若しくは配置)である)を有するウイルスを接触させること、ならびに、該改変ウイルスによる哺乳動物細胞の形質導入が、対応する未改変ウイルスによる対応する哺乳動物細胞の形質導入に関して変えられているかどうかを同定することを包含する。別の態様において、哺乳動物細胞を、キャプシド変化を伴うウイルスおよび変えられたレドックス感受性、例えばレドックスストレスに対する低下された感受性をもつウイルスのライブラリーと接触させ、同定しかつ特徴付けする。従って、本発明は、ウイルス形質導入に対する細胞の障壁を回避するための、遺伝子治療のための改良されたベクター設計戦略を提供する。
[発明の詳細な記述]
定義
本明細書で使用されるところの「ベクター」は、ポリヌクレオチドを含んでなるか若しくはそれと会合しかつin vitro若しくはin vivoいずれかでの該ポリヌクレオチドの細胞への送達を媒介するのに使用し得る巨大分子若しくは巨大分子の連合を指す。具体的に説明するベクターは、例えばプラスミド、ウイルスベクター、リポソームおよび他の遺伝子送達ベヒクルを包含する。ときに「標的ポリヌクレオチド」若しくは「導入遺伝子」と称される送達されるべきポリヌクレオチドは、遺伝子治療における目的のコーディング配列(治療的すなわち目的のタンパク質をコードする遺伝子のような)、ワクチン開発における目的のコーディング配列(哺乳動物で免疫応答を導き出すのに適するタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドを発現するポリヌクレオチドのような)、および/または選択可能な若しくは検出可能なマーカーを含みうる。
定義
本明細書で使用されるところの「ベクター」は、ポリヌクレオチドを含んでなるか若しくはそれと会合しかつin vitro若しくはin vivoいずれかでの該ポリヌクレオチドの細胞への送達を媒介するのに使用し得る巨大分子若しくは巨大分子の連合を指す。具体的に説明するベクターは、例えばプラスミド、ウイルスベクター、リポソームおよび他の遺伝子送達ベヒクルを包含する。ときに「標的ポリヌクレオチド」若しくは「導入遺伝子」と称される送達されるべきポリヌクレオチドは、遺伝子治療における目的のコーディング配列(治療的すなわち目的のタンパク質をコードする遺伝子のような)、ワクチン開発における目的のコーディング配列(哺乳動物で免疫応答を導き出すのに適するタンパク質、ポリペプチド若しくはペプチドを発現するポリヌクレオチドのような)、および/または選択可能な若しくは検出可能なマーカーを含みうる。
「パルボウイルス」は、パルボウイルス、デペンドウイルスおよびデンソウイルスを包含するウイルスの科である。アデノ随伴ウイルスは例示的一パルボウイルスである。
「AAV」はアデノ随伴ウイルスであり、そして天然に存在する野生型ウイルスそれ自身若しくはその誘導体を指すのに使用しうる。該用語は、別の方法で必要とされる場合を除き、全部のサブタイプ、血清型および偽型、ならびに天然に存在するおよび組換え双方の形態を包括する。本明細書で使用されるところの「血清型」という用語は、規定される抗血清とのキャプシドタンパク質の反応性により同定かつそれに基づき他のAAVと識別されるAAVを指し、例えば霊長類AAVの10血清型(AAV−1ないしAAV−10)が存在する。例えば、血清型AAV2は、AAV2のcap遺伝子からコードされるキャプシドタンパク質、ならびに同一のAAV2血清型からの5’および3’ITR配列を含有するゲノムを含有するAAVを指すのに使用する。シュードタイピングされた(pseudotyped)AAVは、1血清型からのキャプシドタンパク質および第二の血清型の5’−3’ITRを包含するウイルスゲノムを含有するAAVを指す。シュードタイピングされたrAAVは、キャプシドの血清型の細胞表面結合特性、およびITRの血清型と一致する遺伝子特性を有することが期待されるとみられる。シュードタイピングされたrAAVは当該技術分野で記述された標準的技術を使用して製造する。本明細書で使用
されるところの例えばrAAV5は、同一血清型からのキャプシドタンパク質および5’−3’ITR双方を有するAAVを指すのに使用しうるか、若しくは、それは、血清型5からのキャプシドタンパク質および異なるAAV血清型、例えばAAV血清型2からの5’−3’ITRを有するAAVを指すことができる。本明細書で具体的に説明される各例について、ベクターの設計および製造の記述はキャプシドおよび5’−3’ITR配列の血清型を記述する。略語「rAAV」は、組換えAAVベクター(若しくは「rAAVベクター」)ともまた称される組換えアデノ随伴ウイルスを指す。
されるところの例えばrAAV5は、同一血清型からのキャプシドタンパク質および5’−3’ITR双方を有するAAVを指すのに使用しうるか、若しくは、それは、血清型5からのキャプシドタンパク質および異なるAAV血清型、例えばAAV血清型2からの5’−3’ITRを有するAAVを指すことができる。本明細書で具体的に説明される各例について、ベクターの設計および製造の記述はキャプシドおよび5’−3’ITR配列の血清型を記述する。略語「rAAV」は、組換えAAVベクター(若しくは「rAAVベクター」)ともまた称される組換えアデノ随伴ウイルスを指す。
本明細書で使用されるところの「形質導入」若しくは「形質導入すること」は、ポリヌクレオチドの発現につながる宿主細胞中へのウイルスベクターによる外因性ポリヌクレオチド(例えばrAAVベクター中の導入遺伝子)の導入(例えば細胞中の導入遺伝子)の過程を指す用語である。例えば、AAVについて、該過程は1)それが細胞表面受容体に結合した後のAAVのエンドサイトーシス、2)エンドソーム若しくは細胞のサイトゾル中の他の細胞内区画からのエスケープ、3)ウイルス粒子若しくはウイルスゲノムの核への輸送、4)ウイルス粒子の脱コート、および環状中間体を包含する発現可能な二本鎖AAVゲノムの形態の生成を包含する。rAAVの発現可能な二本鎖の形態は、核エピソームとして持続しうるか、若しくは、場合によっては宿主ゲノムに組込まれうる。本発明の薬剤によるエンドソーム活性化および/若しくはエンドソーム滞留(residence)時間の変化は、変えられた発現レベル若しくは発現の持続性、核への変えられた輸送、導入されるポリヌクレオチドを発現する宿主細胞若しくは細胞の集団の変えられた型若しくは相対数、および/または変えられたウイルス産生をもたらしうる。ウイルスを介して導入されるポリヌクレオチドの変えられた発現若しくは持続性は、限定されるものでないが、例えばELISA、フローサイトメトリーおよびウエスタンブロットによるタンパク質発現、ハイブリダイゼーションアッセイ、例えばノーザンブロット、サザンブロットによるDNAおよびRNA産生の測定、ならびにゲルシフト移動度アッセイを挙げることができる当該技術分野に公知の方法により測定し得る。一態様において、本発明の薬剤は、in vitro若しくはin vivoでの導入されるポリヌクレオチド、例えばrAAVベクター中の導入遺伝子の発現を変えるように、エンドソームプロセシングを変えうるかまたはエンドソーム若しくは他の細胞内サイトゾル区画からエスケープしうる、NADPHオキシダーゼ活性、例えばROS産生を高める若しくは増大させる。外因性ポリヌクレオチドの導入に使用される方法は、トランスフェクション、リポフェクション、ウイルス感染、形質転換および電気穿孔法、ならびにウイルス以外の遺伝子送達技術のような公知の技術を包含する。導入されたポリヌクレオチドは宿主細胞中で安定に若しくは一過性に維持されうる。
「増大された形質導入若しくは形質導入頻度」、「変えられた形質導入若しくは形質導入頻度」、または「高められた形質導入若しくは形質導入頻度」は、未処理細胞に関しての処理された細胞での上述された活性の1種若しくはそれ以上の増大を指す。形質導入効率を増大させる本発明の薬剤は、導入遺伝子の発現を測定すること、導入遺伝子の機能を測定すること、若しくは該薬剤で処理されない宿主細胞に比較して同一の導入遺伝子の影響を生じるのに必要な粒子の数を測定することを包含しうる、1種若しくはそれ以上の形質導入活性に対する影響を測定することにより、決定しうる。
「プロテオソーム修飾因子」は、プロテオソームと相互作用すること、それに結合すること、あるいはその機能および/または輸送若しくは場所を変えることにより、rAAV形質導入若しくはrAAV形質導入頻度を変える若しくは高める薬剤若しくは薬剤の分類を指す。プロテオソーム修飾因子は、例えば抗生物質ドキソルビシンのような当該技術分野で記述されるところの他の細胞性機能を有しうる。一態様において、プロテオソーム修飾因子は、例えば、トリペプチジルアルデヒド(Z−LLL若しくはLLnL)、すなわちカルパイン、カテプシン、システインプロテアーゼ、および/若しくはプロテアソーム
のキモトリプシン様プロテアーゼの活性を阻害する薬剤(Wagnerら、2002;Youngら、2000;Seisenbergerら、2001)のようなプロテオソーム阻害薬剤を包含しない。
のキモトリプシン様プロテアーゼの活性を阻害する薬剤(Wagnerら、2002;Youngら、2000;Seisenbergerら、2001)のようなプロテオソーム阻害薬剤を包含しない。
「二本鎖の発現可能な形態の生成」若しくは「一本鎖の二本鎖rAAVゲノムへの転化」は、rAAVに感染した宿主細胞の核中でrAAV一本鎖ベクターDNAゲノムの相補鎖を複製すること、および二本鎖DNAのrAAVゲノムを生じるための相補鎖のベクターゲノムへのアニーリングの過程を指す。rAAV形質導入を増大する、変える若しくは高めるために本明細書に記述される本発明の薬剤は、定常状態の機構を介して遺伝子転化事象を駆動し得る、核輸送の速度、若しくは核中の一本鎖ウイルスDNAゲノムの定常状態を増大させる薬剤を包含する。本明細書に記述される本発明の目的上、一本鎖の二本鎖への転化を高める薬剤は、Russelら(1995)により記述されるDNA修復酵素の濃度を増大させる若しくは代替のDNA修復機構を活性化する薬剤を包含しない。
「遺伝子送達」は、遺伝子移入のための細胞への外因性ポリヌクレオチドの導入を指し、そして、ターゲッティング、結合、取り込み、輸送、局在化、レプリコン組込みおよび発現を包含しうる。
「遺伝子移入」は、ターゲッティング、結合、取り込み、輸送、局在化およびレプリコン組込みを包含しうる細胞中への外因性ポリヌクレオチドの導入を指すが、しかし該遺伝子のその後の発現と異なりかつそれを意味しない。
「遺伝子発現」若しくは「発現」は、遺伝子の転写、翻訳および翻訳後修飾の過程を指す。
「検出可能なマーカー遺伝子」は、該遺伝子を保有する細胞が特異的に検出される(例えば該マーカー遺伝子を保有しない細胞と識別される)ことを可能にする遺伝子である。多様なこうしたマーカー遺伝子が当該技術分野で既知である。
「選択可能なマーカー遺伝子」は、該遺伝子を保有する細胞が、対応する選択薬剤の存在下で賛成して若しくは反対して(for or against)特異的に選択されることを可能にする遺伝子である。具体的説明として、抗生物質耐性遺伝子を、対応する抗生物質の存在下で宿主細胞が陽性に選択されることを可能にする陽性の選択可能なマーカー遺伝子として使用し得る。多様な陽性および陰性の選択可能なマーカーが当該技術分野で既知であり、それらのいくつかを下述する。
本明細書で使用されるところの「rAAVベクター」は、AAV起源のものでないポリヌクレオチド配列(すなわちAAVに対し異種のポリヌクレオチド)、典型的には細胞の遺伝子形質転換のための目的の配列を含んでなるAAVベクターを指す。本発明の好ましいベクター構築物において、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも1個、好ましくは2個のAAVの逆方向末端反復配列(ITR)により隣接される。rAAVベクターという用語は、rAAVベクター粒子およびrAAVベクタープラスミド双方を包含する。
「AAVウイルス」若しくは「AAVウイルス粒子」は、(好ましくは野生型AAVのキャプシドタンパク質の全部による)少なくとも1種のAAVキャプシドタンパク質、およびキャプシド形成されたポリヌクレオチドより構成されるウイルス粒子を指す。粒子が異種ポリヌクレオチド(すなわち、哺乳動物細胞に送達されるべき導入遺伝子のような、野生型AAVゲノム以外のポリヌクレオチド)を含んでなる場合、それは典型的に「rAAV」と称される。
本明細書で使用されるところの「ウイルスワクチン」は、該ベクターと接触された宿主中で免疫応答を導き出すことが可能なペプチド、ポリペプチド若しくはタンパク質をコードする、そのウイルスに対し異種のポリヌクレオチドを含んでなるウイルスベクターを指す。該ポリヌクレオチドの発現は、中和抗体応答および/若しくは細胞媒介性応答、例えば細胞傷害性T細胞応答の生成をもたらしうる。
AAVの「ヘルパーウイルス」は、AAV(例えば野生型AAV)が哺乳動物細胞により複製かつパッケージングされることを可能にするウイルスを指す。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびワクシニアのようなポックスウイルスを包含するAAVの多様なこうしたヘルパーウイルスが当該技術分野で既知である。アデノウイルスは多数の異なるサブグループを包含するとは言え、サブグループCのアデノウイルス5型が最も一般に使用される。ヒト、ヒト以外の哺乳動物およびトリ起源の多数のアデノウイルスが既知であり、そしてATCCのような供託所から入手可能である。ヘルペス科のウイルスは、例えば単純疱疹ウイルス(HSV)およびエプスタイン−バーウイルス(EBV)、ならびにサイトメガロウイルス(CMV)および仮性狂犬病ウイルス(PRV)を包含し;それらもまたATCCのような供託所から入手可能である。
「感染性」ウイルス若しくはウイルス粒子は、該ウイルス種が栄養性である細胞中にそれが送達することが可能であるポリヌクレオチド成分を含んでなるものである。該用語は、ウイルスのいずれかの複製能力を必ずしも意味しない。
「複製能力のある」ウイルス(例えば、ときに「RCA」と略称される、複製能力のあるAAV)は、感染性であり、かつ、感染させた細胞中で(すなわちヘルパーウイルス若しくはヘルパーウイルス機能の存在下で)複製されることもまた可能である、表現型上野生型のウイルスを指す。AAVの場合、複製能力は一般に機能的AAVパッケージング遺伝子の存在を必要とする。本明細書に記述されるところの好ましいrAAVベクターは、1種若しくはそれ以上のAAVパッケージング遺伝子の欠如によって哺乳動物細胞中(とりわけヒト細胞中)で複製能力がない。好ましくは、こうしたrAAVベクターは、AAVパッケージング遺伝子と入ってくるrAAVベクターの間の組換えによりRCAが生成される可能性を最小限にするため、いかなるAAVパッケージング遺伝子配列も欠く。本明細書に記述されるところの好ましいrAAVベクター調製物は、RCAを(あれば)ほとんど含有しない(好ましくは102rAAV粒子あたり約1未満のRCA、より好ましくは104rAAV粒子あたり約1未満のRCA、なおより好ましくは108rAAV粒子あたり約1未満のRCA、なおより好ましくは1012rAAV粒子あたり約1未満のRCA、最も好ましくはRCAなし)ものである。
「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチド若しくはリボヌクレオチドまたはそれらのアナログを包含する、いずれかの長さのポリマーの形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、メチル化若しくはキャッピングされたヌクレオチドおよびヌクレオチドアナログのような修飾ヌクレオチドを含むことができ、そしてヌクレオチド以外の成分により中断されうる。存在する場合、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの集成前若しくは後に与えられうる。本明細書で使用されるところのポリヌクレオチドという用語は、二本鎖および一本鎖分子を互換性に指す。別の方法で明記され若しくは必要とされない限り、ポリヌクレオチドである本明細書に記述される本発明のいかなる態様も、二本鎖の形態、および二本鎖の形態を構成することが既知の若しくは予測される2種の相補的一本鎖の形態のそれぞれの双方を包含する。
「遺伝子」は、転写および翻訳された後に特定の一タンパク質をコードすることが可能である少なくとも1個のオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。
ポリヌクレオチドに適用されるところの「組換え」は、該ポリヌクレオチドが、クローニング、制限および/若しくは連結段階、ならびに天然に見出されるポリヌクレオチドと異なる構築物をもたらす他の手順の多様な組合せの産物であることを意味している。組換えウイルスは組換えポリヌクレオチドを含んでなるウイルス粒子である。該用語は、それぞれ、元のポリヌクレオチド構築物の複製物および元のウイルス構築物の子孫を包含する。
「調節領域」若しくは「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製(replication)、重複(duplication)、転写、スプライシング、翻訳若しくは分解を包含するポリヌクレオチドの機能的調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。該調節は、該過程の頻度、速度若しくは特異性に影響を及ぼすことがあり、そして性質が増強若しくは阻害性でありうる。当該技術分野で既知の調節領域は、例えばプロモーターおよびエンハンサーのような転写制御配列である。プロモーターは、ある種の条件下で、RNAポリメラーゼを結合しかつ通常はプロモーターから下流(3’の方向に)配置されるコーディング領域の転写を開始することが可能なDNA領域である。プロモーターは、AAVプロモーター、例えばP5、P19、P40およびAAV ITRプロモーター、ならびに異種プロモーターを包含する。
「発現ベクター」は、目的のポリペプチドをコードする領域を含んでなるベクターであり、かつ、意図している標的細胞中でのタンパク質の発現を遂げるために使用される。発現ベクターは、標的中でのタンパク質の発現を助長するためにコーディング領域に効果的に連結されている調節領域もまた含んでなる。調節領域、および発現のためにそれらが作動可能に連結されている遺伝子(1種若しくは複数)の組合せは、ときに「発現カセット」と称され、多数のそれらが当該技術分野で既知かつ利用可能であるか、若しくは当該技術分野で利用可能である成分から容易に構築され得る。
「遺伝子変化」は、遺伝因子が有糸分裂若しくは減数分裂による以外で細胞に導入される過程を指す。該因子は細胞に対し異種でありうるか、またはそれは該細胞中に既に存在する因子の付加的なコピー若しくは改良されたバージョンでありうる。遺伝子変化は、例えば、電気穿孔法、リン酸カルシウム沈殿、若しくはポリヌクレオチド−リポソーム複合体と接触させることのような、当該技術分野で既知のいずれかの方法により、組換えプラスミド若しくは他のポリヌクレオチドで細胞をトランスフェクトすることにより遂げることができる。遺伝子変化は、例えばDNA若しくはRNAウイルス若しくはウイルスベクターでの形質導入若しくは感染によってもまた遂げることができる。好ましくは、遺伝因子は細胞中で染色体若しくはミニ染色体中に導入されるが;しかし、細胞およびその子孫の表現型および/若しくは遺伝子型を変えるいかなる変化も本用語に包含される。
細胞は、遺伝子配列がin vitroで該細胞の延長された培養の間にその機能を遂行するために利用可能である場合に、該配列で「安定に」変えられ、形質導入され、若しくは形質転換されたと言われる。好ましい例において、こうした細胞は、該変えられた細胞の子孫によってもまた遺伝可能である遺伝子変化が導入されているため、「遺伝可能に」変えられている。
本明細書で使用されるところの「組換えDNA分子」という用語は、分子生物学的技術によって一緒に結合されたDNAのセグメントから構成されるDNA分子を指す。
本明細書で使用されるところの「転写制御配列」若しくは「TRS」は、それが作動可能に連結されている遺伝子若しくはコーディング配列の転写を制御するゲノム領域を指す。本発明で有用な転写制御配列は、一般に少なくとも1個の転写プロモーターを包含し、
そして1個若しくはそれ以上の転写のエンハンサーおよび/若しくはターミネーターもまた包含しうる。「作動可能に連結されている」は、そのように記述される成分が、それらが協調された様式で機能することを可能にする関係にある、2種若しくはそれ以上の成分の配置を指す。具体的説明として、転写制御配列若しくはプロモーターは、TRS若しくはプロモーターがコーディング配列の転写を促進する場合に、該コーディング配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されているTRSは、一般にコーディング配列とシスに結合されているが、しかしそれは必ずしもそれに直接隣接していなくてもよい。
そして1個若しくはそれ以上の転写のエンハンサーおよび/若しくはターミネーターもまた包含しうる。「作動可能に連結されている」は、そのように記述される成分が、それらが協調された様式で機能することを可能にする関係にある、2種若しくはそれ以上の成分の配置を指す。具体的説明として、転写制御配列若しくはプロモーターは、TRS若しくはプロモーターがコーディング配列の転写を促進する場合に、該コーディング配列に作動可能に連結されている。作動可能に連結されているTRSは、一般にコーディング配列とシスに結合されているが、しかしそれは必ずしもそれに直接隣接していなくてもよい。
「ターミネーター」は、読み通し転写を減少させる若しくは予防する傾向があるポリヌクレオチド配列を指す(すなわち、それは、ターミネーターの一側で発する転写が該ターミネーターの他側まで継続することを減少させる若しくは予防する)。転写が破壊される程度は、典型的に、ターミネーター配列の塩基配列および/若しくは長さの関数である。とりわけ、多数の分子生物学的系で公知であるとおり、一般に「転写終止配列」と称される特定のDNA配列は、おそらくRNAポリメラーゼ分子を停止させかつ/若しくは転写されているDNAから解放することにより、RNAポリメラーゼによる読み通し転写を破壊する傾向がある特殊な配列である。こうした配列特異的ターミネーターの典型的な例は、ポリアデニル化(「ポリA」)配列、例えばSV40ポリAを包含する。こうした配列特異的ターミネーターに加えて、若しくはその代わりに、プロモーターとコーディング領域の間の比較的長いDNA配列の挿入もまた、一般には介在配列の長さに比例してコーディング領域の転写を破壊する傾向がある。この効果はおそらく、転写されているDNAからRNAポリメラーゼ分子が解放されたようになる何らかの傾向が常に存在し、また、コーディング領域に達する前に通り抜けられるべき配列の長さを増大させることが、コーディング領域の転写が完了した若しくはおそらく開始される前にさえ解放が起こるとみられる見込みを一般に増大させるとみられるために生じる。ターミネーターは、従って、一方向のみ(「一方向」ターミネーター)若しくは双方向(「二方向」ターミネーター)からの転写を予防することができ、そして、配列特異的終止配列若しくは配列非特異的ターミネーターまたは双方から構成されうる。多様なこうしたターミネーター配列が当該技術分野で既知であり;そして本発明の情況内のこうした配列の具体的に説明する使用を下に提供する。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、いずれかの長さのアミノ酸のポリマーを指すのに、別の方法で識別されない限り本明細書で互換性に使用される。該用語はまた修飾されているアミノ酸ポリマーも包含する(例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、アセチル化、ホスホニル化(phosphonylation)、脂質化、若しくは標識成分との複合)。遺伝子治療およびそのための組成物の情況で論考される場合の「CFTR」などのようなポリペプチドは、該無傷のタンパク質の所望の生化学的機能を保持する、それぞれの無傷のポリペプチド、またはそのいずれかのフラグメント若しくは遺伝子的に工作された誘導体を指す。同様に、CFTRおよび遺伝子治療での使用のための他のこうした遺伝子(典型的に、レシピエント細胞に送達されるべき「導入遺伝子」と称される)への言及は、所望の生化学的機能を有する無傷のポリペプチドまたはいずれかのフラグメント若しくは遺伝子的に工作された誘導体をコードするポリヌクレオチドを包含する。
本明細書で使用されるところの「組換えタンパク質」若しくは「組換えポリペプチド」という用語は、組換えDNA分子から発現されるタンパク質分子を指す。
核酸、ペプチド、ポリペプチド若しくはウイルスに関して使用される場合の「単離された」という用語は、それがその天然の供給源中で通常連合される少なくとも1種の汚染物質の核酸、ポリペプチド、ウイルス若しくは他の生物学的成分から同定かつ分離されている核酸配列、ペプチド、ポリペプチド若しくはウイルスを指す。例えば、単離された物質
は、供給源混合物からそれを濃縮するための精製技術を使用することにより製造しうる。濃縮は、溶液の容量あたり重量のような絶対的な基準に基づいて(on an absolute basis)測定し得るか、若しくは、それは、供給源混合物に存在する第二の潜在的に妨害する物質に関して測定し得る。本発明の態様の濃縮を増大することがますますより好ましい。例えば、2倍濃縮が好ましく、10倍濃縮がより好ましく、100倍濃縮がより好ましく、1000倍濃縮がなおより好ましい。従って、単離された核酸、ペプチド、ポリペプチド若しくはウイルスは、それが天然に見出されるものと異なる形態若しくは環境で存在する。例えば、所定のDNA配列(例えば遺伝子)は隣接する遺伝子に近接して宿主細胞染色体上で見出され;特定のタンパク質をコードする特定のmRNA配列のようなRNA配列は、多数のタンパク質をコードする多数の他のmRNAとの混合物として細胞中で見出される。単離された核酸分子は一本鎖若しくは二本鎖の形態で存在しうる。単離された核酸分子がタンパク質を発現するのに利用されることになる場合、該分子は少なくともセンスすなわちコーディング鎖を含有することができる(すなわち該分子は一本鎖でありうる)が、しかしセンスおよびアンチセンス双方の鎖を含有しうる(すなわち該分子は二本鎖でありうる)。
は、供給源混合物からそれを濃縮するための精製技術を使用することにより製造しうる。濃縮は、溶液の容量あたり重量のような絶対的な基準に基づいて(on an absolute basis)測定し得るか、若しくは、それは、供給源混合物に存在する第二の潜在的に妨害する物質に関して測定し得る。本発明の態様の濃縮を増大することがますますより好ましい。例えば、2倍濃縮が好ましく、10倍濃縮がより好ましく、100倍濃縮がより好ましく、1000倍濃縮がなおより好ましい。従って、単離された核酸、ペプチド、ポリペプチド若しくはウイルスは、それが天然に見出されるものと異なる形態若しくは環境で存在する。例えば、所定のDNA配列(例えば遺伝子)は隣接する遺伝子に近接して宿主細胞染色体上で見出され;特定のタンパク質をコードする特定のmRNA配列のようなRNA配列は、多数のタンパク質をコードする多数の他のmRNAとの混合物として細胞中で見出される。単離された核酸分子は一本鎖若しくは二本鎖の形態で存在しうる。単離された核酸分子がタンパク質を発現するのに利用されることになる場合、該分子は少なくともセンスすなわちコーディング鎖を含有することができる(すなわち該分子は一本鎖でありうる)が、しかしセンスおよびアンチセンス双方の鎖を含有しうる(すなわち該分子は二本鎖でありうる)。
「異種の」は、それが比較される実体の残部のものと遺伝子型上異なる実体に由来することを意味している。例えば、遺伝子工作技術により異なる細胞型に導入されるポリヌクレオチドは異種ポリヌクレオチドである(そして、発現される場合に異種ポリペプチドをコードし得る)。同様に、その天然のコーディング配列から取り出されかつ異なるコーディング配列に作動可能に連結されているTRS若しくはプロモーターは、異種TRS若しくはプロモーターである。
細胞若しくは生物体中のタンパク質、遺伝子、核酸若しくはポリヌクレオチドに関して使用される場合の「外因性」という用語は、人工的若しくは天然の手段により該細胞若しくは生物体に導入されたタンパク質、遺伝子、核酸若しくはポリヌクレオチドを指す。外因性核酸は異なる生物体若しくは細胞からでありうるか、または、それは該生物体若しくは細胞内に天然に存在する核酸の1個若しくはそれ以上の付加的なコピーでありうる。制限しない例として、外因性核酸は天然の細胞のものと異なる染色体位置にあるか、若しくは、そうでなければ天然に見出されるものと異なる核酸配列により隣接されている(例えば、1遺伝子からのプロモーターを異なる遺伝子からの遺伝子産物のオープンリーディングフレームに連結する発現カセット)。
「配列相同性」という用語は、2種の核酸配列間の塩基の一致の比率若しくは2種のアミノ酸配列の間のアミノ酸の一致の比率を意味している。配列相同性をパーセントとして表す(例えば50%)場合、該パーセントは、いずれかの他の配列と比較される選択された配列の長さにわたる一致の比率を示す。ギャップ(2配列のいずれか中の)が一致を最大にするように許容され;15塩基若しくは未満のギャップ長さを通常使用し、6塩基若しくは未満が好ましく、2塩基若しくは未満がより好ましい。オリゴヌクレオチドをプローブ若しくは処理として使用する場合、標的核酸とオリゴヌクレオチド配列の間の配列相同性は、一般に、20の可能なオリゴヌクレオチド塩基対の一致からの少なくとも17の標的塩基の一致(85%);好ましくは10の可能な塩基対の一致から少なくとも9の一致(90%)、およびより好ましくは20の可能な塩基対の一致から少なくとも19の一致(95%)である。
2種のアミノ酸配列は、それらの配列間に部分的若しくは完全な同一性が存在する場合に相同である。例えば、85%相同性は、2配列を最大の一致のため整列する場合に該アミノ酸の85%が同一であることを意味している。ギャップ(一致されている該2配列のいずれか中の)が一致の最大化において許容され;5若しくは未満のギャップ長さが好ましく、2若しくは未満がより好ましい。あるいは、そして好ましくは、2種のタンパク質
配列(若しくは長さ少なくとも30アミノ酸のそれら由来のポリペプチド配列)は、突然変異データマトリックスおよび6若しくはそれ以上のギャップペナルティを用いてプログラムALIGNを使用してそれらが5以上(標準偏差単位で)でのアライメントスコアを有する場合に、本用語が本明細書で使用されるところの相同である。Dayhoff、1972を参照されたい。該2配列若しくはそれらの部分は、より好ましくは、それらのアミノ酸がALIGNプログラムを使用して至適に整列される場合に50%以上若しくはそれに等しく同一である場合に、相同である。
配列(若しくは長さ少なくとも30アミノ酸のそれら由来のポリペプチド配列)は、突然変異データマトリックスおよび6若しくはそれ以上のギャップペナルティを用いてプログラムALIGNを使用してそれらが5以上(標準偏差単位で)でのアライメントスコアを有する場合に、本用語が本明細書で使用されるところの相同である。Dayhoff、1972を参照されたい。該2配列若しくはそれらの部分は、より好ましくは、それらのアミノ酸がALIGNプログラムを使用して至適に整列される場合に50%以上若しくはそれに等しく同一である場合に、相同である。
「に対応する」という用語は、ポリヌクレオチド配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部若しくは一部分に構造的に関係付けられること、あるいはポリペプチド配列が参照ポリペプチド配列の全部若しくは一部分に構造的に関係付けられる、例えばそれらが少なくとも80%、85%、90%、95%またはそれ以上、例えば99%若しくは100%の配列同一性を有することを意味するのに本明細書で使用される。対比して、「に相補的」という用語は、該相補配列が参照ポリヌクレオチド配列の全部若しくは一部分に相同であることを意味するのに本明細書で使用される。具体的説明のため、ヌクレオチド配列「TATAC」は参照配列「TATAC」に対応し、そして参照配列「GTATA」に相補的である。
以下の用語、すなわち「参照配列」、「比較ウィンドウ(comparison window)」、「配列同一性」、「配列同一性のパーセント」および「実質的同一性」は、2種若しくはそれ以上のポリヌクレオチド間の配列の関係を記述するのに使用する。「参照配列」は配列比較の基礎として使用される規定された配列であり;参照配列は、例えば完全長cDNA若しくは配列表に示される遺伝子配列の1セグメントのようなより長い配列の1サブセットでありうるか、または完全なcDNA若しくは遺伝子配列を含みうる。一般に、参照配列は長さが少なくとも20ヌクレオチド、頻繁には長さが少なくとも25ヌクレオチド、およびしばしば長さが少なくとも50ヌクレオチドである。2種のポリヌクレオチドはそれぞれ(1)該2ポリヌクレオチド間で類似である配列(すなわち完全なポリヌクレオチド配列の一部分)を含むことができ、かつ(2)該2ポリヌクレオチド間で相違する配列をさらに含むことができるため、2種(若しくはそれ以上)のポリヌクレオチド間の配列比較は、典型的に、配列が類似の局所領域を同定かつ比較するための「比較ウィンドウ」にわたり該2ポリヌクレオチドの配列を比較することにより実施する。
本明細書で使用されるところの「比較ウィンドウ」は、少なくとも20の連続するヌクレオチドの概念的セグメントを指し、そして、比較ウィンドウ中のポリヌクレオチド配列の部分は、該2配列の至適のアライメントのための参照配列(付加若しくは欠失を含まない)と比較して、20パーセント若しくは未満の付加若しくは欠失(すなわちギャップ)を含みうる。比較ウィンドウを整列するための配列の至適のアライメントは、SmithとWaterman(1981)の局所相同性アルゴリズム、NeedlemanとWunsch(1970)の相同性アライメントアルゴリズム、PearsonとLipman(1988)の類似性検索法、これらのアルゴリズムのコンピュータ化実装(Wisconsin Geneticsソフトウェアパッケージ リリース7.0、Genetics Computer Group、575 Science Dr.、ウィスコンシン州マディソン中のGAP、BESTFIT、FASTAおよびTFASTA)、若しくは検査により実施することができ、そして、多様な方法により生成される最良のアライメント(すなわち、比較ウィンドウにわたる最高の相同性パーセントをもたらす)を選択する。
「配列同一性」という用語は、2ポリヌクレオチド配列が比較のウィンドウにわたり同一である(すなわちヌクレオチド1つずつ)ことを意味している。「配列同一性のパーセント」という用語は、2ポリヌクレオチド配列が比較のウィンドウにわたり同一である(
すなわちヌクレオチド1つずつ)ことを意味している。「配列同一性のパーセント」という用語は、2種の至適に整列した配列を比較のウィンドウにわたり比較すること、同一核酸塩基(例えばA、T、C、G、U若しくはI)が双方の配列に存在する位置の数を決定して一致した位置の数を生じること、一致した位置の数を比較のウィンドウ中の位置の総数(すなわちウィンドウサイズ)により除算すること、および該結果を100により乗算して配列同一性のパーセントを生じることにより、計算する。本明細書で使用されるところの「実質的同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、少なくとも20ヌクレオチド位置の比較ウィンドウにわたり、頻繁には少なくとも20〜50ヌクレオチドのウィンドウにわたり、参照配列と比較して少なくとも85パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも90ないし95パーセントの配列同一性、より通常は少なくとも99パーセントの配列同一性を有する配列を含んでなり、配列同一性のパーセントが、比較のウィンドウにわたり参照配列の合計20パーセント若しくは未満になる欠失若しくは付加を包含しうるポリヌクレオチド配列と参照配列を比較することにより計算される、ポリヌクレオチド配列の特徴を示す。
すなわちヌクレオチド1つずつ)ことを意味している。「配列同一性のパーセント」という用語は、2種の至適に整列した配列を比較のウィンドウにわたり比較すること、同一核酸塩基(例えばA、T、C、G、U若しくはI)が双方の配列に存在する位置の数を決定して一致した位置の数を生じること、一致した位置の数を比較のウィンドウ中の位置の総数(すなわちウィンドウサイズ)により除算すること、および該結果を100により乗算して配列同一性のパーセントを生じることにより、計算する。本明細書で使用されるところの「実質的同一性」という用語は、ポリヌクレオチドが、少なくとも20ヌクレオチド位置の比較ウィンドウにわたり、頻繁には少なくとも20〜50ヌクレオチドのウィンドウにわたり、参照配列と比較して少なくとも85パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも90ないし95パーセントの配列同一性、より通常は少なくとも99パーセントの配列同一性を有する配列を含んでなり、配列同一性のパーセントが、比較のウィンドウにわたり参照配列の合計20パーセント若しくは未満になる欠失若しくは付加を包含しうるポリヌクレオチド配列と参照配列を比較することにより計算される、ポリヌクレオチド配列の特徴を示す。
ポリペプチドに適用されるところの「実質的同一性」という用語は、2ペプチド配列をデフォルトのギャップ重み付け(gap weight)を使用するプログラムGAP若しくはBESTFITによるように至適に整列する場合に、少なくとも約80パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも約90パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも約95パーセントの配列同一性、および最も好ましくは少なくとも約99パーセントの配列同一性を共有することを意味している。
本明細書で使用されるところの「パッケージング」は、ウイルスベクターの集成およびキャプシド形成をもたらす一連の細胞内事象を指す。従って、適するベクターを適切な条件下でパッケージング細胞株に導入する場合、それはウイルス粒子に集成され得る。
「宿主細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、「パッケージング細胞株」および他のこうした用語は、本発明で有用なより高等な真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞を示す。これらの細胞は、組換えベクター、ウイルス若しくは他の移入ポリヌクレオチドのレシピエントとして使用し得、そして形質導入された元の細胞の子孫を包含し得る。単一細胞の子孫は、元の親細胞に必ずしも完全に同一(形態若しくはゲノム相補物(genomic complement)において)でなくともよい。
「トランスフェクトされた」、「形質転換された」若しくは「トランスジェニック」は、少なくとも1種の組換えDNA配列の存在により変えられた若しくは増強されたいかなる宿主細胞若しくは細胞株も包含するのに本明細書で使用される。
「治療的遺伝子」、「予防的遺伝子」、「標的ポリヌクレオチド」、「導入遺伝子」、「目的の遺伝子」などは、全般的に、ベクターを使用して移入されるべき遺伝子(1種若しくは複数)を指す。典型的には、本発明の情況で、こうした遺伝子はウイルスベクター(複製されかつ粒子中にキャプシド形成され得る)内に配置される。標的ポリヌクレオチドは、多数の異なる応用のためのベクターを生成するのに本発明で使用し得る。こうしたポリヌクレオチドは、限定されるものでないが:(i)欠けている、不足している若しくは至適以下のレベルの構造タンパク質若しくは酵素により引き起こされる欠乏症を解消するための他の形態の遺伝子治療で有用なタンパク質をコードするポリヌクレオチド;(ii)アンチセンス分子に転写されるポリヌクレオチド;(iii)転写若しくは翻訳因子を結合するデコイに転写されるポリヌクレオチド;(iv)サイトカインのような細胞修飾因子をコードするポリヌクレオチド;(v)ヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のような特定の薬物に対しレシピエント細胞を感受性にし得るポリヌクレオチド;および(vi)多様な癌の処置のためのE1A癌抑制遺伝子若しくはp53癌抑制遺伝子のよう
な癌治療のためのポリヌクレオチドを挙げることができる。レシピエント宿主細胞中で導入遺伝子の発現を遂げるために、それは、好ましくはプロモーター(それ自身若しくは異種いずれかのプロモーター)に作動可能に連結される。多数の適するプロモーターが当該技術分野で既知であり、それらの選択は、標的ポリヌクレオチドの所望の発現レベル;構成的発現、誘導可能な発現、細胞特異的若しくは組織特異的発現を欲するかどうか、などに依存する。ウイルスベクターは選択可能なマーカーもまた含有しうる。
な癌治療のためのポリヌクレオチドを挙げることができる。レシピエント宿主細胞中で導入遺伝子の発現を遂げるために、それは、好ましくはプロモーター(それ自身若しくは異種いずれかのプロモーター)に作動可能に連結される。多数の適するプロモーターが当該技術分野で既知であり、それらの選択は、標的ポリヌクレオチドの所望の発現レベル;構成的発現、誘導可能な発現、細胞特異的若しくは組織特異的発現を欲するかどうか、などに依存する。ウイルスベクターは選択可能なマーカーもまた含有しうる。
AAVの調製物は、感染性ヘルパーウイルス粒子に対する感染性AAV粒子の比が少なくとも約102:1;好ましくは少なくとも約104:1、より好ましくは少なくとも約106:1;なおより好ましくは少なくとも約108:1である場合に、ヘルパーウイルスを「実質的に含まない」と言われる。調製物はまた、好ましくは同等な量のヘルパーウイルスタンパク質(すなわち、上で示されたヘルパーウイルス粒子の不純物が破壊された形態で存在した場合にヘルパーウイルスのこうしたレベルの結果として存在するとみられるところのタンパク質)も含まない。ウイルスおよび/若しくは細胞タンパク質の汚染は、一般にSDSゲル上のクマシー染色するバンドの存在(例えば、AAVキャプシドタンパク質VP1、VP2およびVP3に対応するもの以外のバンドの出現)として観察され得る。
ウイルスの産生、複製若しくはパッケージングの記述において使用される場合の「効率」は、該方法の有用な特性、すなわち、とりわけ細胞あたりに産生されるウイルス粒子の増殖速度および数を指す。「高効率」産生は、指定される培養期間の経過にわたる細胞あたり少なくとも100ウイルス粒子;好ましくは細胞あたり少なくとも約10,000、およびより好ましくは少なくとも約100,000粒子の産生を示す。
本発明により処置される「個体」若しくは「被験体」は、脊椎動物、とりわけ哺乳動物種のメンバーを指し、そして、限定されるものでないが家畜、スポーツ動物(sports animal)、およびヒトを包含する霊長類を挙げることができる。個体若しくは細胞の「処置」は、該処置を開始する時点での該個体若しくは細胞の天然の経過を変えるための試みにおけるいずれかの型の介入(例えば個体において予防的、治療的若しくは他の有益な効果を導き出すこと)である。本明細書で使用されるところの「処置すること」若しくは「処置する」は、(i)病理学的状態が発生することを予防すること(例えば予防);(ii)病的な状態を阻害若しくはその発生を阻止すること;(iii)病理学的状態を解消すること;および/または病理学的状態と関連する症状を減少させることを包含する。例えば、個体の処置は、(限定されるものでないが)遺伝若しくは誘発された遺伝的欠損、ウイルス、細菌若しくは寄生性生物体による感染、腫瘍性若しくは形成不全の状態、または自己免疫若しくは免疫抑制のような免疫系機能不全を挙げることができるいずれかの病理学的状態により引き起こされる病状を減少若しくは制限するために着手しうる。処置は、(限定されるものでないが)製薬学的組成物のような組成物の投与、および組成物で処理された適合性の細胞の投与を挙げることができる。処置は、予防的に若しくは治療的にのいずれでも実施しうる(すなわち、病理学的事象の開始若しくは病原体との接触の前若しくは後いずれでも)。
本明細書で使用されるところの「実質的に純粋」若しくは「精製された」は、目的の種が存在する優性な種であり(すなわち、モル基準でそれが該組成物中のいずれかの他の個々の種より豊富である)、そして、好ましくは、実質的に精製された画分は、目的の種が存在する全巨大分子種の少なくとも約50パーセント(モル基準で)を含んでなる組成物であることを意味している。一般に、実質的に純粋な組成物は、該組成物中に存在する全巨大分子種の約80%以上、より好ましくは約85%、約90%、約95%および約99%以上を含むことができる。最も好ましくは、目的の種は、該組成物が本質的に単一巨大分子種よりなる本質的な均質性まで精製されている(汚染物質種が慣習的検出方法により
該組成物中で検出され得ない)。
該組成物中で検出され得ない)。
本明細書で使用されるところの「製薬学的に許容できる塩」は、親化合物がその酸若しくは塩基塩を作成することにより改変されている、開示される化合物の誘導体を指す。製薬学的に許容できる塩の例は、限定されるものでないが、アミンのような塩基性残基の無機若しくは有機酸塩;カルボン酸のような酸性残基のアルカリ若しくは有機塩を挙げることができる。製薬学的に許容できる塩は、例えば非毒性の無機若しくは有機酸から形成される親化合物の慣習的な非毒性の塩若しくは四級アンモニウム塩を包含する。例えば、こうした慣習的非毒性塩は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、フマル酸、リン酸、硝酸などのような無機酸由来のもの;および酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモ酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、2−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、エタンジスルホン酸、シュウ酸、イセチオン酸などのような有機酸から製造される塩を包含する。
本発明で有用な化合物の製薬学的に許容できる塩は、慣習的な化学的方法により、塩基若しくは酸性部分を含有する親化合物から合成し得る。一般に、こうした塩は、遊離酸若しくは塩基の形態のこれらの化合物を、水若しくは有機溶媒中または2者の混合物中で、化学量論的量の適切な塩基若しくは酸と反応させることにより製造し得;一般に、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール若しくはアセトニトリルのような非水性媒体が好ましい。適する塩の一覧は、Remington’s Pharmaceutical Sciences(1985)(その開示は引用することによりここに組み込まれる)に見出される。
「製薬学的に許容できる」という句は、信頼できる医学的判断の範囲内で、合理的な利益/危険比と釣り合う、過剰な毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題若しくは合併症を伴わない、ヒトおよび動物の組織と接触しての使用に適する、化合物、物質、組成物および/若しくは投薬形態物を指すのに本明細書で使用する。
本明細書に開示される化合物の一方のジアステレオマーが、他方と比較して優れた活性を表しうる。必要とされる場合、ラセミ物質の分離は、キラルなカラムを使用するHPLCにより、若しくはカンフォン酸塩化物(camphonic chloride)のような分割薬剤を使用する分割により達成し得る。式Iのキラルな化合物はまた、キラルな触媒若しくはキラルなリガンドを使用して直接に合成もしうる。
「治療上有効な量」は、例えば、宿主における疾患若しくは障害を処置若しくは予防するための、または疾患若しくは障害の症状を処置するための、本発明で有用な化合物の量、若しくは特許請求される化合物の組合せの量を包含することを意図している。化合物の組合せは好ましくは相乗的組合せである。相乗効果は、組合せで投与される場合の化合物の効果が、単一薬剤として単独で投与される場合の該化合物の相加的効果より大きい場合に起こる。一般に、相乗効果は化合物の至適以下の濃度で最も明瞭に示される。相乗効果は、個々の成分と比較しての組合せのより低い細胞傷害性、増大された活性、若しくは何らかの他の有益な効果に関し得る。
「安定な化合物」および「安定な構造」は、反応混合物からの有用な程度の純度までの単離、および有効な治療薬への処方を生き残るのに十分に丈夫である化合物を示すことを意味している。安定な化合物のみを本発明により企図している。
「置換されている」は、「置換されている」を使用する表現で示される原子上の1個若
しくはそれ以上の水素が、示される基(1個若しくは複数)からの選択で置換されているが、但し、示される原子の通常の原子価が超えられず、かつ、該置換が安定な化合物をもたらすことを示すことを意図している。適する示される基は、例えば、アルキル、アルケニル アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、NRxRyおよび/若しくはCOORx(ここで各RxおよびRyは独立にH、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシである)を包含する。置換基がケト(すなわち=O)若しくはチオキソ(すなわち=S)基である場合には、該原子上の2個の水素が置換される。
しくはそれ以上の水素が、示される基(1個若しくは複数)からの選択で置換されているが、但し、示される原子の通常の原子価が超えられず、かつ、該置換が安定な化合物をもたらすことを示すことを意図している。適する示される基は、例えば、アルキル、アルケニル アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、NRxRyおよび/若しくはCOORx(ここで各RxおよびRyは独立にH、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシである)を包含する。置換基がケト(すなわち=O)若しくはチオキソ(すなわち=S)基である場合には、該原子上の2個の水素が置換される。
「中断される」は、「中断される」を使用する表現で示される2個若しくはそれ以上の隣接炭素原子およびそれらが結合されている水素原子(例えばメチル(CH3)、メチレン(CH2)若しくはメチン(CH))の間に、示される基(1個若しくは複数)からの選択物が挿入されているが、但し、示される原子の通常の原子価のそれぞれが超えられず、そして該中断が安定な化合物をもたらすことを示すことを意図している。こうした適する示される基は、例えば、ペルオキシド以外のオキシ(−O−)、チオ(−S−)、カルボニル(−C(=O)−)、カルボキシ(−C(=O)−)、イミン(C=NH)、スルホニル(SO)若しくはスルホキシド(SO2)を包含する。
基、置換基および範囲について下に列挙される特定のおよび好ましい値は具体的説明のみのためであり;それらは該基および置換基についての他の規定される値若しくは規定される範囲内の他の値を除外しない。
「アルキル」は、正、第二、第三若しくは環状炭素原子を含有するC1−C18炭化水素を指す。例は、メチル(Me、−CH3)、エチル(Et、−CH2CH3)、1−プロピル(n−Pr、n−プロピル、−CH2CH2CH3)、2−プロピル(i−Pr、i−プロピル、−CH(CH3)2)、1−ブチル(n−Bu、n−ブチル、−CH2CH2CH2CH3)、2−メチル−1−プロピル(i−Bu、i−ブチル、−CH2CH(CH3)2)、2−ブチル(s−Bu、s−ブチル、−CH(CH3)CH2CH3)、2−メチル−2−プロピル(t−Bu、t−ブチル、−C(CH3)3)、1−ペンチル(n−ペンチル、−CH2CH2CH2CH2CH3)、2−ペンチル(−CH(CH3)CH2CH2CH3)、3−ペンチル(−CH(CH2CH3)2)、2−メチル−2−ブチル(−C(CH3)2CH2CH3)、3−メチル−2−ブチル(−CH(CH3)CH(CH3)2)、3−メチル−1−ブチル(−CH2CH2CH(CH3)2)、2−メチル−1−ブチル(−CH2CH(CH3)CH2CH3)、1−ヘキシル(−CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2−ヘキシル(−CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3−ヘキシル(−CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2−メチル−2−ペンチル(−C(CH3)2CH2CH2CH3)、3−メチル−2−ペンチル(−CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4−メチル−2−ペンチル(−CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、3−メチル−3−ペンチル(−C(CH3)(CH2CH3)2)、2−メチル−3−ペンチル(−CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3−ジメチル−2−ブチル(−C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3−ジメチル−2−ブチル(−CH(CH3)C(CH3)3である。
アルキルは、場合によっては、1個若しくはそれ以上のアルケニル アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルア
ミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、NRxRyおよび/若しくはCOORx(ここで各RxおよびRyは独立にH、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシルである)で置換され得る。アルキルは、場合によっては、1個若しくはそれ以上のペルオキシド以外のオキシ(−O−)、チオ(−S−)、カルボニル(−C(=O)−)、カルボキシ(−C(=O)O−)、スルホニル(SO)若しくはスルホキシド(SO2)で中断され得る。加えて、アルキルは、場合によっては少なくとも部分的に不飽和であり得、それによりアルケニルを提供する。
ミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、NRxRyおよび/若しくはCOORx(ここで各RxおよびRyは独立にH、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシルである)で置換され得る。アルキルは、場合によっては、1個若しくはそれ以上のペルオキシド以外のオキシ(−O−)、チオ(−S−)、カルボニル(−C(=O)−)、カルボキシ(−C(=O)O−)、スルホニル(SO)若しくはスルホキシド(SO2)で中断され得る。加えて、アルキルは、場合によっては少なくとも部分的に不飽和であり得、それによりアルケニルを提供する。
「アルケニル」は、少なくとも1個の不飽和部位、すなわち炭素−炭素のsp2二重結合をもつ正、第二、第三若しくは環状炭素原子を含有するC2−C18炭化水素を指す。例は、限定されるものでないが:エチレンすなわちビニル(−CH=CH2)、アリル(−CH2CH=CH2)、シクロペンテニル(−C5H7)および5−ヘキセニル(−CH2 CH2CH2CH2CH=CH2)を挙げることができる。
アルケニルは、場合によっては、1個若しくはそれ以上のアルケニル アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、NRxRyおよび/若しくはCOORx(ここで各RxおよびRyは独立にH、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシルである)で置換され得る。加えて、アルケニルは、場合によっては、1個若しくはそれ以上のペルオキシド以外のオキシ(−O−)、チオ(−S−)、カルボニル(−C(=O)−)、カルボキシ(−C(=O)O−)、スルホニル(SO)若しくはスルホキシド(SO2)で中断され得る。
「アルキレン」は、1〜18個の炭素原子の、かつ、親アルカンの同一若しくは異なる炭素原子からの2個の水素原子の除去により派生される2個の一価のラジカルセンターを有する、飽和の分枝状若しくは直鎖または環状炭化水素基を指す。典型的なアルキレン基は、限定されるものでないが:メチレン(−CH2−)1,2−エチル(−CH2CH2−)、1,3−プロピル(−CH2CH2CH2−)、1,4−ブチル(−CH2CH2CH2CH2−)などを挙げることができる。
アルキレンは、場合によっては、1個若しくはそれ以上のアルキル、アルケニル アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、NRxRyおよび/若しくはCOORx(ここで各RxおよびRyは独立にH、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシルである)で置換され得る。加えて、アルキレンは、場合によっては、1個若しくはそれ以上のペルオキシド以外のオキシ(−O−)、チオ(−S−)、カルボニル(−C(=O)−)、カルボキシ(−C(=O)O−)、スルホニル(SO)若しくはスルホキシド(SO2)で中断され得る。さらに、アルキレンは、場合によっては少なくとも部分的に不飽和であり得、それによりアルケニレンを提供する。
「アルケニレン」は、2〜18個の炭素原子の、かつ、親アルケンの同一若しくは2個
の異なる炭素原子からの2個の水素原子の除去により派生される2個の一価のラジカルセンターを有する、不飽和の分枝状若しくは直鎖または環状炭化水素基を指す。典型的なアルケニレン基は、限定されるものでないが:1,2−エチレン(−CH=CH−)を挙げることができる。
の異なる炭素原子からの2個の水素原子の除去により派生される2個の一価のラジカルセンターを有する、不飽和の分枝状若しくは直鎖または環状炭化水素基を指す。典型的なアルケニレン基は、限定されるものでないが:1,2−エチレン(−CH=CH−)を挙げることができる。
アルケニレンは、場合によっては、1個若しくはそれ以上のアルキル、アルケニル アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、NRxRyおよび/若しくはCOORx(ここで各RxおよびRyは独立にH、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシルである)で置換され得る。加えて、アルケニレンは、場合によっては、1個若しくはそれ以上のペルオキシド以外のオキシ(−O−)、チオ(−S−)、カルボニル(−C(=O)−)、カルボキシ(−C(=O)O−)、スルホニル(SO)若しくはスルホキシド(SO2)で中断され得る。
「アルコキシ」という用語は基アルキル−O−(ここでアルキルは本明細書で定義される)を指す。好ましいアルコキシ基は、例えばメトキシ、エトキシ、n−プロポキシ、iso−プロポキシ、n−ブトキシ、tert−ブトキシ、sec−ブトキシ、n−ペントキシ、n−ヘキソキシ、1,2−ジメチルブトキシなどを包含する。
アルコキシは,場合によっては、1個若しくはそれ以上のアルキル ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、NRxRyおよびCOORx(ここで各RxおよびRyは独立にH、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシルである)で置換され得る。
「アリール」という用語は、単一環(例えばフェニル)、若しくはその中の少なくとも1個の環が芳香族である複数の縮合(condensed)(縮合(fused))環(例えばナフチル、ジヒドロフェナントレニル、フルオレニル若しくはアントリル)を有する6から20個までの炭素原子の不飽和芳香族炭素環基を指す。好ましいアリールは、フェニル、ナフチルなどを包含する。
アリールは、場合によっては、1個若しくはそれ以上のアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、NRxRyおよびCOORx(ここで各RxおよびRyは独立にH、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシルである)で置換され得る。
「シクロアルキル」という用語は、単一の環式環(cyclic ring)若しくは複数の縮合環を有する3から20個までの炭素原子の環状アルキル基を指す。こうしたシクロアルキル基は、例として、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル、シクロオクチルなどのような単環構造、若しくはアダマンタニルなどのような複数環構造を包含
する。
する。
シクロアルキルは、場合によっては、1個若しくはそれ以上のアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、NRxRyおよびCOORx(ここで各RxおよびRyは独立にH、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシルである)で置換され得る。
シクロアルキルは、場合によっては少なくとも部分的に不飽和であり得、それによりシクロアルケニルを提供する。
「ハロ」という用語はフルオロ、クロロ、ブロモおよびヨードを指す。同様に、「ハロゲン」という用語はフッ素、塩素、臭素およびヨウ素を指す。
「ハロアルキル」は、同一若しくは異なりうる本明細書で定義されるところの1〜4個のハロ基により置換された、本明細書で定義されるところのアルキルを指す。代表的ハロアルキル基は、例として、トリフルオロメチル、3−フルオロドデシル、12,12,12−トリフルオロドデシル、2−ブロモオクチル、3−ブロモ−6−クロロヘプチルなどを包含する。
「ヘテロアリール」という用語は、1、2若しくは3個の芳香環を含有しかつ1個の芳香環中に少なくとも1個の窒素、酸素若しくはイオウ原子を含有し、ならびに未置換であり得るか、または例えば1個若しくはそれ以上の、およびとりわけ1ないし3個のハロ、アルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アルコキシ、アルコキシアルキル、ハロアルキル、ニトロ、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、アルキルチオ、アルキルスルフィニルおよびアルキルスルホニルのような置換基で置換され得る、単環、二環若しくは三環性の環系と本明細書で定義する。ヘテロアリール基の例は、限定されるものでないが、2H−ピロリル、3H−インドリル、4H−キノリジニル、4nH−カルバゾリル、アクリジニル、ベンゾ[b]チエニル、ベンゾチアゾリル、β−カルボリニル、カルバゾリル、クロメニル、シンナオリニル(cinnaolinyl)、ジベンゾ[b,d]フラニル、フラザニル、フリル、イミダゾリル、イミジゾリル(imidizolyl)、インダゾリル、インドリシニル(indolisinyl)、インドリル、イソベンゾフラニル、イソインドリル、イソキノリル、イソチアゾリル、イソキサゾリル、ナフチリジニル、ナプト[2,3−b]、オキサゾリル(naptho[2,3−b],oxazolyl)、ペリミジニル、フェナントリジニル、フェナントロリニル、フェナルサジニル(phenarsazinyl)、フェナジニル、フェノチアジニル、フェノキサチイニル、フェノキサジニル、フタラジニル、プテリジニル、プリニル、ピラニル、ピラジニル、ピラゾリル、ピリダジニル、ピリジル、ピリミジニル、ピリミジニル、ピロリル、キナゾリニル、キノリル、キノキサリニル、チアジアゾリル、チアントレニル、チアゾリル、チエニル、トリアゾリルおよびキサンテニルを挙げることができる。一態様において、「ヘテロアリール」という用語は、炭素、ならびに群ペルオキシド以外の酸素、イオウおよびN(Z)(ここでZは非存在であるかまたはH、O、アルキル、フェニル若しくはベンジルである)から独立に選択される1、2、3若しくは4個のヘテロ原子を含有する5若しくは6個の環原子を含有する単環性芳香環を示す。別の態様において、ヘテロアリールは、それらに由来する約8ないし10個の環原子のオルト縮合二環性複素環、とりわけベンズ誘導体、またはプロピレン若しくはテトラメチレンジラジカルをそれに縮合することにより派生されるものを示す。
ヘテロアリールは、場合によっては、1個若しくはそれ以上のアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、NRxRyおよびCOORx(ここで各RxおよびRyは独立にH、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシルである)で置換され得る。
「複素環」という用語は、群酸素、窒素およびイオウから選択される少なくとも1個のヘテロ原子を含有しかつ場合によってはアルキル若しくはC(=O)ORb(ここでRbは水素若しくはアルキルである)で置換されている、飽和若しくは部分的に不飽和の環系を指す。典型的に、複素環は、群酸素、窒素およびイオウから選択される1個若しくはそれ以上のヘテロ原子を含有する単環、二環若しくは三環性基である。複素環基は環に結合されたオキソ基(=O)もまた含有し得る。複素環基の制限しない例は、1,3−ジヒドロベンゾフラン、1,3−ジオキソラン、1,4−ジオキサン、1,4−ジチアン、2H−ピラン、2−ピラゾリン、4H−ピラン、クロマニル、イミダゾリジニル、イミダゾリニル、インドリニル、イソクロマニル、イソインドリニル、モルホリン、ピペラジニル、ピペリジン、ピペリジル、ピラゾリジン、ピラゾリジニル、ピラゾリニル、ピロリジン、ピロリン、キヌクリジンおよびチオモルホリンを包含する。
複素環は、場合によっては、1個若しくはそれ以上のアルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、NRxRyおよびCOORx(ここで各RxおよびRyは独立にH、アルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシルである)で置換され得る。
窒素複素環およびヘテロアリールの例は、限定されるものでないが、ピロール、イミダゾール、ピラゾール、ピリジン、ピラジン、ピリミジン、ピリダジン、インドリジン、イソインドール、インドール、インダゾール、プリン、キノリジン、イソキノリン、キノリン、フタラジン、ナフチルピリジン、キノキサリン、キナゾリン、シンノリン、プテリジン、カルバゾール、カルボリン、フェナントリジン、アクリジン、フェナントロリン、イソチアゾール、フェナジン、イソキサゾール、フェノキサジン、フェノチアジン、イミダゾリジン、イミダゾリン、ピペリジン、ピペラジン、インドリン、モルホリノ、ピペリジニル、テトラヒドロフラニルなど、ならびにN−アルコキシ窒素含有複素環を挙げることができる。本発明の特定の一態様において、窒素複素環は3−メチル−5,6−ジヒドロ−4H−ピラジノ[3,2,1−jk]カルバゾル−3−イウムヨウ化物であり得る。
別の分類の複素環は、式[−(CH2−)aA−](式中aは2に等しいか若しくはそれより大きく、かつ、各別個の存在でのAはO、N、S若しくはPであり得る)の1個若しくはそれ以上の反復単位を有する複素環化合物の特定の一分類を指す「クラウン化合物」として知られる。クラウン化合物の例は、例のみとして、[−(CH2)3−NH−]3、[−((CH2)2−O)4−((CH2)2−NH)2]などを包含する。典型的には、こうしたクラウン化合物は4から10個までのヘテロ原子および8ないし40個の炭素原子を有し得る。
「アルカノイル」という用語はC(=O)R(ここでRは以前に定義されたところのアルキル基である)を指す。
「アシルオキシ」という用語は−O−C(=O)R(ここでRは以前に定義されたところのアルキル基である)を指す。アシルオキシ基の例は、限定されるものでないがアセトキシ、プロパノイルオキシ、ブタノイルオキシおよびペンタノイルオキシを挙げることができる。上で定義されたところのいかなるアルキル基も、アシルオキシ基を形成するのに使用し得る。
「アルコキシカルボニル」という用語はC(=O)OR(ここでRは以前に定義されたところのアルキル基である)を指す。
「アミノ」という用語は−NH2を指し、また、「アルキルアミノ」という用語は−NR2(ここで少なくとも1個のRがアルキルでありかつ第二のRはアルキル若しくは水素である)を指す。「アシルアミノ」という用語はRC(=O)N(ここでRはアルキル若しくはアリールである)を指す。
「イミノ」という用語は−C=NHを指す。
「ニトロ」という用語は−NO2を指す。
「トリフルオロメチル」という用語は−CF3を指す。
「トリフルオロメトキシ」という用語は−OCF3を指す。
「シアノ」という用語は−CNを指す。
「ヒドロキシ」若しくは「ヒドロキシル」という用語は−OHを指す。
「オキシ」という用語は−O−を指す。
「チオ」という用語は−S−を指す。
「チオキソ」という用語は(=S)を指す。
「ケト」という用語は(=O)を指す。
「炭水化物」という用語は、生存細胞の不可欠の構造成分かつ動物のエネルギー源を指し;小分子を伴う単純な糖ならびに巨大分子物質を包含し;それらが含有する単糖基の数に従って分類される。該用語は、変動可能な数の水素および酸素原子と結合された6(若しくは6の何らかの倍数)個の炭素原子(しかし該2種の前者は常に水を形成するような比率にある)を含有する糖、デンプンおよびガムを包含する化合物の一群の1種を指す(デキストロース、{C6H12O6}のような)。該用語は、2H:1C:1Oの比の炭素、酸素および水素から構成される化合物若しくは分子を指す。炭水化物は、ショ糖および果糖のような単純な糖、またはキチンおよびデンプンのような複合多糖ポリマーであり得る。
炭水化物は、場合によっては、1個若しくはそれ以上のアルキル、アルケニル アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、
アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、NRxRyおよび/若しくはCOORx(ここで各RxおよびRyは独立にH、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシである)で置換され得る。
アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、ケト、チオキソ、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、NRxRyおよび/若しくはCOORx(ここで各RxおよびRyは独立にH、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシである)で置換され得る。
糖は単糖、二糖、オリゴ糖若しくは多糖であり得る。糖はβ若しくはαの立体化学を有し得、(R)若しくは(S)相対配置を有し得、(+)若しくは(−)異性体として存在し得、そしてD若しくはL配置で存在し得る。例えば糖はβ−D−グルコースであり得る。
「糖(saccharide)」という用語はいかなる糖(sugar)若しくは他の炭水化物、とりわけ単糖若しくは炭水化物も指す。糖は生存細胞の不可欠の構造成分かつ動物のエネルギー源である。該用語は小分子を伴う単純な糖ならびに巨大分子物質を包含する。糖はそれらが含有する単糖基の数に従って分類される。
「多糖」という用語は、化学的にすなわちグリコシド結合により一緒に連結されている糖分子を含有する1つの型の炭水化物を指す。該用語は、複数の単糖の鎖から構成される炭水化物である炭水化物の一分類のいずれも指す。多糖は単糖(monosaccharide)(単糖(simple sugar))の複数の単位から構成されるポリマーである。
「オリゴ糖」という用語は2ないし10個の単糖単位を含有する化合物を指す。
適する例示的な糖は、例えば、リボース、ブドウ糖、果糖、マンノース、イドース、グロース、ガラクトース、アルトロース、アロース、キシロース、アラビノース、トレオース、グリセルアルデヒドおよびエリトロースを包含する。
本明細書で使用されるところの「デンプン」は、α−(1,4)−D−グルコース反復サブユニットおよびα−(1,6)−グルコシド結合よりなる、植物に存在する複合多糖を指す。
本明細書で使用されるところの「デキストリン」は、熱、酸、酵素若しくはそれらの組合せによるデンプンの部分的分解により生じられる中間の鎖長をもつブドウ糖のポリマーを指す。
本明細書で使用されるところの「マルトデキストリン」若しくは「ブドウ糖ポリマー」は、主としてα,−1,4結合により連結されたD−グルコース単位よりなりかつ20未満のDE(デキストロース等量)を有する、甘くない栄養素の糖ポリマーを指す。例えば、米国食品医薬品局(21 C.F.R.第184.1444項)を参照されたい。マルトデキストリンは部分的に加水分解されたデンプン生成物である。デンプン加水分解生成物は、一般に、デキストロース等量(DE)(乾燥重量に基づくデキストロースとして計算される還元糖のパーセントである)として表されるそれらの加水分解の程度を特徴とする。
1個若しくはそれ以上の置換基を含有する上の基のいずれに関しても、もちろん、こうした基は、立体的に実際的でなくかつ/若しくは合成で実現不可能であるいかなる置換若しくは置換パターンも含有しないことが理解される。加えて、本発明の化合物は、これらの化合物の置換から生じる全部の立体化学異性体を包含する。
本明細書に記述される化合物内の選択された置換基は、繰り返す(recursive)程度まで存在する。この文脈で、「繰り返し置換基(recursive substituent)」は、ある置換基がそれ自身の別の場合を再び引用しうることを意味している。こうした置換基の繰り返す性質により、理論上、いずれの所定の請求項においても多数が存在しうる。医薬品化学の当業者は、意図している化合物の所望の特性によりこうした置換基の総数が合理的に制限されることを理解する。こうした特性は、例としてかつ制限としてでなく、分子量、溶解性若しくはlog Pのような物性、意図している標的に対する活性のような応用特性、および合成の容易さのような実務特性を包含する。
繰り返し置換基は本発明の意図している一局面である。医薬品および有機化学の当業者はこうした置換基の融通性を理解する。繰り返し置換基が本発明の1請求項に存在する程度まで、該総数は上で示されたとおり決定することができる。
本明細書に記述される化合物は、親化合物、親化合物のプロドラッグ、若しくは親化合物の活性代謝物として投与し得る。
「プロドラッグ」は、こうしたプロドラッグを哺乳動物被験体に投与する場合にin vivoで本発明の活性の親薬物または他の処方(formulas)若しくは化合物を遊離する、いかなる共有結合した物質も包含することを意図している。本発明の化合物のプロドラッグは、修飾がなおかつin vivoで慣例の操作で親化合物に切断されるような方法で、化合物中に存在する官能基を修飾することにより製造する。プロドラッグは、該プロドラッグを哺乳動物被験体に投与する場合に切断して遊離のカルボニル、カルボン酸、ヒドロキシ若しくはアミノ基を形成するいずれかの基に該カルボニル、カルボン酸、ヒドロキシ若しくはアミノ基が結合されている、本発明の化合物を包含する。プロドラッグの例は、限定されるものでないが、本発明の化合物中のアルコールおよびアミン官能基の酢酸エステル、ギ酸エステルおよび安息香酸エステル誘導体などを挙げることができる。
「代謝物」は、現在のこうした活性親薬物または他の処方若しくは化合物を哺乳動物被験体に投与する場合に、in vivoで本発明の活性親薬物または他の処方若しくは化合物と生存細胞が相互作用する生化学的過程から生じる、いかなる物質も指す。代謝物はいずれの代謝経路からの生成物若しくは中間体も包含する。
「代謝経路」は、1化合物を別のものに変換しかつ中間体および細胞機能のためのエネルギーを提供する、一連の酵素に媒介される反応を指す。代謝経路は直線的若しくは循環的であり得る。明らかに、本発明の多数の改変および変形物が上の教示に照らして可能である。従って、付随する請求の範囲の範囲内で、本発明は本明細書にとりわけ記述されるところと別の方法で実施しうることが理解されるべきである。
本発明の実務は、別の方法で示されない限り、当該技術分野の熟練内にある分子生物学、ウイルス学、微生物学、組換えDNAおよび免疫学の慣習的技術を使用することができる。
活性酸素種およびNADPHオキシダーゼ
一般に、脊椎動物は感染に応答するための2種の基礎的な機構、すなわち自然免疫系および獲得免疫系を有する(Fearonら、1996)。自然(innate)すなわち自然(natural)免疫は、侵入する病原体への宿主の以前の曝露に関係なく感染攻撃に直ちに応答する能力である。自然系の要素は、貪食細胞、すなわち多核白血球(PMN)および単核貪食細胞(例えばマクロファージ)、ならびに循環する可溶性のプレ酵素タンパク質の補体カスケードを包含する。これらの要素は、植物(Enyediら、19
92)および昆虫(Hoffmannら、1999)を包含する多様な多細胞生物体の免疫系に機能的類似物を有する比較的非特異的な「パターン認識」系を構成する。であるから、これらの進化上古代の要素は、宿主の免疫系により以前に「見られていない」侵入する微生物で生物体が攻撃される場合に宿主防御の迅速かつ感受性の監視機構を表す。自然系と対照的に、適応免疫は脊椎動物に限定され、そして侵入する病原体若しくは腫瘍細胞の性質を宿主細胞が特異的に規定する正確に調整される系を表す(Janewayら、1994)。こうした精度は、しかしながら、抗原がプロセシングされかつ特異的リンパ球および抗体が生成されるための時間を必要とする。従って、適応系は、特異性を欠く自然系がそうであるより新たな攻撃に対し応答することがよりゆっくりである(Fearonら、1996)。
一般に、脊椎動物は感染に応答するための2種の基礎的な機構、すなわち自然免疫系および獲得免疫系を有する(Fearonら、1996)。自然(innate)すなわち自然(natural)免疫は、侵入する病原体への宿主の以前の曝露に関係なく感染攻撃に直ちに応答する能力である。自然系の要素は、貪食細胞、すなわち多核白血球(PMN)および単核貪食細胞(例えばマクロファージ)、ならびに循環する可溶性のプレ酵素タンパク質の補体カスケードを包含する。これらの要素は、植物(Enyediら、19
92)および昆虫(Hoffmannら、1999)を包含する多様な多細胞生物体の免疫系に機能的類似物を有する比較的非特異的な「パターン認識」系を構成する。であるから、これらの進化上古代の要素は、宿主の免疫系により以前に「見られていない」侵入する微生物で生物体が攻撃される場合に宿主防御の迅速かつ感受性の監視機構を表す。自然系と対照的に、適応免疫は脊椎動物に限定され、そして侵入する病原体若しくは腫瘍細胞の性質を宿主細胞が特異的に規定する正確に調整される系を表す(Janewayら、1994)。こうした精度は、しかしながら、抗原がプロセシングされかつ特異的リンパ球および抗体が生成されるための時間を必要とする。従って、適応系は、特異性を欠く自然系がそうであるより新たな攻撃に対し応答することがよりゆっくりである(Fearonら、1996)。
顆粒球は骨髄に位置する多能性幹細胞から生じ、そして好酸球、好塩基球および好中球を包含する。PMNはヒト末梢循環中で最多の白血球であり、そしてそれらの名称はそれらの典型的に多葉(multilobed)核に由来する。健康成体での成熟PMNの1日産生量はほぼ1011細胞程度である。急性感染症若しくは他の炎症性ストレスの間、PMNは通常の1日の好中球の要求の10倍まで含有する骨髄貯蔵所から動態化される(Nauseefら、2000)。PMNは運動性であり、そしてそれらが感染性微生物に対する第一列の防御としてはたらく炎症の部位にそれらを移動させる非常に可塑性の細胞である。この目的上、PMNはタンパク質分解性および他の細胞傷害性酵素で満たされた顆粒を含有する(Schettlerら、1991;Borregaardら、1997)。酵素を放出することのほかに、PMNはまた、貪食しかつ酸素を高度活性酸素種(ROS)に転化することも可能である。食作用後に、摂取された微生物は、酵素活性およびROS産生の組合せ作用によりファゴソームの内側で死滅されうる。
活性化に際して、PMNは、ROSに転化される極めて多量の酸素を消費することを開始する(呼吸若しくは酸化バーストとして知られる過程)(Babiorら、1976;Babiorら、1978)。この過程は酵素NADPHオキシダーゼの活性に依存する。このオキシダーゼは、受容体媒介性および受容体非依存性の双方の過程により活性化され得る。典型的な受容体依存性の刺激は、補体成分C5a、C3bおよびiC3b(Ogleら、1988)、細菌由来走化性トリペプチドN−ホルミル−Met−Leu−Phe(fMLP)(Williamsら、1977)、レクチン、コンカナバリンA(Weinbaumら、1980)ならびにオプソニン化されたザイモザン(OPZ)(Whitinら、1985)である。受容体非依存性の刺激は、長鎖不飽和脂肪酸およびホルボール12−ミリステート13−アセテート(PMA)(Schnitzlerら、1997)を包含する。活性化に際して、オキシダーゼは膜のサイトゾル側のNADPHから電子を受容し、そしてこれらを膜の他側(細胞の外側若しくは摂取された微生物を含有するファゴソーム中のいずれか)の分子酸素に供与する。こうして、酸素のスーパーオキシドアニオン(・O2−)への1電子還元が、以下の等式:
に描かれるとおり、NADPHを犠牲にして触媒される。こうして消費される酸素の大部分は・O2−として存在することができないが、しかし、スーパーオキシドラジカルの不均化から形成される過酸化水素として説明し得る(Hampton、1998;Roosら、1984):
しかしながら、過酸化水素(H2O2)は高濃度でのみ殺菌性である(Hyslopら、1995)一方、外因性に生成されるスーパーオキシドは、その制限された膜透過性のため、細菌を直接死滅させない(Babiorら、1975;Rosenら、1979)。従って、PMNの破壊能を説明するために多様な二次酸化体が提案されている。
鉄で触媒されるフェントン反応により形成されるヒドロキシルラジカル(・OH)は、大部分の生物学的分子と極めて反応性であるとは言え、それらは制限された作用範囲を有する(Samuniら、1988)。
一重項酸素(1O2)は酸素の電子的励起状態としてしばしば見られ、そして膜脂質と反応して過酸化を開始しうる(Halliwell、1978)。PMNにより生成されるH2O2の大部分は、刺激されたPMNにより放出される酵素、ミエロペルオキシダーゼ(MPO)により消費される(Kettleら、1997;Nauseef、1988;Zipfelら、1997;Klebanoff、1999)。このヘム含有ペルオキシダーゼはアズール親和性顆粒の主構成要素であり、そして塩化物イオンを強い非ラジカル酸化体、次亜塩素酸(HOCl)に酸化するためのH2O2の使用において独特である(Harrisonら、1976)。MPOの他の基質は、ヨウ化物、臭化物、チオシアナイト(thiocyanite)および亜硝酸塩を包含する(Van Dalenら、1997;Vlietら、1997)。
HOClはPMNにより産生されることが既知の最も殺菌性の酸化体であり(Klebanoff、1968)、そして多くの細菌種がMPO/H2O2/塩化物系により容易に死滅される(Albrichら、1982)。
実験的環境で、活性化された貪食細胞によるROS産生は、ルミノール若しくはルシゲニンのような増強薬剤を使用して検出し得る(Faulknerら、1993)。ROS検出のため、ルシゲニンは最初に還元を受けなければならない一方、ルミノールは不安定なエンドペルオキシド(その分解は光子放出により光を生成する)(Halliwellら、1998)を生成するための一電子酸化を受けなければならない。ルミノールは主としてHOClを検出し、これはルミノール検出が主にMPO/H2O2系に依存することを意味している(McNallyら、1996)一方、ルシゲニンを使用する検出はMPO非依存性であり、そして・O2−に対しより特異的である(Annianssonら、1984)。ルミノールは細胞に進入することが可能であり、そしてそれにより細胞内ならびに細胞外で産生されたROSを検出する(Dahlgrenら、1989)一方、ルシゲニンは実際上細胞膜を通過することが不可能であり、そしてそれにより細胞外事象のみを検出する(Dahlgrenら、1985)。しかしながら、真の特異性はこれらの光放射増強化合物のいずれでも決して想定し得ないため(Liochevら、1997)、結果は慎重に解釈されなければならない。
・O2−の産生はO2濃度に依存した程度まで全部の好気性細胞内で起こるようである。ミトコンドリア中では、電子の1〜3%が・O2−を形成すると考えられる。ROSが好気性代謝の量的に有意の産物でもまたあるという事実は、以下の計算により具体的に説明される。すなわち、安静時の正常成体(70kg体重と想定する)が3.5mLのO2/kg/分を利用し、それは352.8l/日若しくは14.7mol/日に同一である。1%が・O2−を作成する場合、これは0.147mol/日若しくは53.66mol/年若しくは年あたり約1.7kgの・O2−を与える。呼吸バーストの間に、O2取り込みの増加は好中球の静止期O2消費のものの10ないし20倍になり得る(Halliwellら、1998)。
ROS産生の原因であるNADPHオキシダーゼは、静止期PMN中で集成されていない(そしてそれにより不活性である)多成分酵素系である。しかしながら、例えばオプソニン化された微生物の細胞表面受容体への結合による貪食細胞の活性化は、原形質膜上の活性酵素複合体の集成に至る(Clark、1990;Segalら、1993)。正常の宿主防御における機能するNADPHオキシダーゼの決定的重要性は、構成するタンパク質成分の1種の欠乏により該オキシダーゼが非機能的である障害、慢性肉芽腫性疾患(CGD)を伴う個体で観察される再発性の細菌および真菌感染症により、最も劇的に具体的に説明される(Smithら、1991;Dinauerら、1993;Dinauerら、1987;Volppら、1988)。機能上適格なオキシダーゼを欠くこうした患者からのPMNは、刺激に際して・O2−を生成することに失敗する。刺激されたPMNによるROSの形成は宿主に有利である生理学的応答でありうるとは言え、それは、これらのラジカルが過剰の組織損傷を生じさせうる多くの炎症状態でもまた有害であり得る(Weiss、1989;Fantoneら、1985;Jacksonら、1988)。
NADPHオキシダーゼの不可欠の成分は原形質膜およびサイトゾルタンパク質を包含する。重要な原形質膜成分は、91kDaの糖タンパク質(gp91phox)および22kDaのタンパク質(p22phox)から構成されるヘテロ二量体のフラボチトクロムbである(Rotrosenら、1992;Segelら、1992)。フラボチトクロムbは、電子をNADPHから分子酸素に輸送するようはたらき、・O2−の生成をもたらす。PMN膜中で、低分子量GTP結合タンパク質Rap1Aがフラボチトクロムbと会合し、そしてin vivoでのNADPHオキシダーゼ調節で重要な役割を演じている(Quinnら、1989;Gabigら、1995)。さらに、サイトゾルタンパク質p47phox、p67phoxおよび第二の低分子量GTP結合タンパク質Rac2がNADPHオキシダーゼ活性に必要とされ(Volppら、1988;Lomaxら、1989a;Lomaxら、1989b)、そしてこれら3種のタンパク質がフラボチトクロムbと会合して機能的NADPHオキシダーゼを形成する(Clarkら、1990;Heyworthら、1991;Quinnら、1993;DeLeoら、1996)。加えて、サイトゾルタンパク質p40phoxが同定されているが、しかしオキシダーゼ機能におけるその役割は完全には定義されていない(Wientjesら、1993)。NADPHオキシダーゼの集成の現在のモデルによれば、p47phoxおよびp67phoxは、PMN活性化の間に全体で転位してフラボチトクロムbと会合する(DeLeoら、1996;Parkら、1992;Iyerら、1994)。Rac2は同時にしかし他2種のサイトゾル成分と独立に転位して、膜結合したフラボチトクロムbと会合する(Heyworthら、1994;Dorseuilら、1995)。多様な形態のCGDを伴う患者のPMNでのオキシダーゼ集成の研究は、p47phoxがフラボチトクロムbに直接結合することを示唆し(Heyworthら、1991)、かつ、gp91phox上の4部位およびp22phox上の2部位を包含するフラボチトクロムbの少なくとも6領域が、p47phoxとの相互作用の推定の部位と同定された(Kle
inbergら、1990;Leusenら、1994;Letoら、1994;Leusenら、1994;Nakanishら、1992;DeLeoら、1995;Sumimotoら、1994;Finanら、1994)。
inbergら、1990;Leusenら、1994;Letoら、1994;Leusenら、1994;Nakanishら、1992;DeLeoら、1995;Sumimotoら、1994;Finanら、1994)。
本発明の方法
本発明の方法は、レドックス感受性の細胞内経路を用いるウイルスのウイルス形質導入を変える薬剤の同定方法、およびウイルス形質導入を高める若しくは阻害するためのそれらの薬剤の使用、細胞内のウイルスのレドックス感受性を変えるためのウイルスキャプシドの改変方法および該方法により製造される改変ウイルス、ならびにRac含有エンドソームにより輸送するウイルスの受容体および共受容体の同定方法を包含する。本発明の方法で有用なウイルスは、レドックス感受性であるかまたはより多く若しくはより少なくレドックス感受性であるように改変されうるもの、例えば、Rac1含有エンドソームとの会合を包含する若しくはNADPHオキシダーゼ活性を変える経路を有するウイルス、例えばアデノウイルス、ポックスウイルス、レンチウイルス、肝炎ウイルス、パルボウイルス、コックサッキーウイルスおよび/若しくはインフルエンザウイルスである。例えば、NADPHオキシダーゼ活性を増大若しくは低下させることによりウイルス形質導入を増大若しくは低下させる薬剤を検出するために、レドックス感受性であるウイルスを1種若しくはそれ以上の薬剤でスクリーニングしうる。ウイルスは改変することができ、例えば、レドックス感受性若しくは非感受性ウイルスのウイルスキャプシドを改変することができ、そしてそれらのウイルスを、ウイルス形質導入を増大若しくは低下させる薬剤を検出するために1種若しくはそれ以上の薬剤でスクリーニングしうる。
本発明の方法は、レドックス感受性の細胞内経路を用いるウイルスのウイルス形質導入を変える薬剤の同定方法、およびウイルス形質導入を高める若しくは阻害するためのそれらの薬剤の使用、細胞内のウイルスのレドックス感受性を変えるためのウイルスキャプシドの改変方法および該方法により製造される改変ウイルス、ならびにRac含有エンドソームにより輸送するウイルスの受容体および共受容体の同定方法を包含する。本発明の方法で有用なウイルスは、レドックス感受性であるかまたはより多く若しくはより少なくレドックス感受性であるように改変されうるもの、例えば、Rac1含有エンドソームとの会合を包含する若しくはNADPHオキシダーゼ活性を変える経路を有するウイルス、例えばアデノウイルス、ポックスウイルス、レンチウイルス、肝炎ウイルス、パルボウイルス、コックサッキーウイルスおよび/若しくはインフルエンザウイルスである。例えば、NADPHオキシダーゼ活性を増大若しくは低下させることによりウイルス形質導入を増大若しくは低下させる薬剤を検出するために、レドックス感受性であるウイルスを1種若しくはそれ以上の薬剤でスクリーニングしうる。ウイルスは改変することができ、例えば、レドックス感受性若しくは非感受性ウイルスのウイルスキャプシドを改変することができ、そしてそれらのウイルスを、ウイルス形質導入を増大若しくは低下させる薬剤を検出するために1種若しくはそれ以上の薬剤でスクリーニングしうる。
遺伝子移入のためのウイルスの使用
ウイルスベクターは、遺伝子治療若しくはワクチン接種の目的上の個体への投与に使用し得る。治療のための適する疾患は、限定されるものでないが、ウイルス、細菌若しくは寄生性感染症により誘発されるもの、多様な悪性病変、および過剰増殖状態、自己免疫状態ならびに先天性欠損を挙げることができる。
ウイルスベクターは、遺伝子治療若しくはワクチン接種の目的上の個体への投与に使用し得る。治療のための適する疾患は、限定されるものでないが、ウイルス、細菌若しくは寄生性感染症により誘発されるもの、多様な悪性病変、および過剰増殖状態、自己免疫状態ならびに先天性欠損を挙げることができる。
遺伝子治療は、細胞内か若しくは細胞により分泌されるかのいずれかの特定の一タンパク質の発現のレベルを高めるために実施し得る。本発明のベクターを、遺伝子マーキング、欠けている若しくは欠陥のある遺伝子の置換、または治療的遺伝子の挿入のいずれかのために細胞を遺伝子的に変えるのに使用しうる。あるいは、発現のレベルを低下させるポリヌクレオチドを細胞に提供しうる。これは、悪性病変の経過の間に増幅若しくは過剰発現される遺伝子、または微生物感染の経過の間に導入若しくは過剰増殖される遺伝子の産物のような望ましくない表現型の抑制に使用しうる。発現レベルは、例えば、標的遺伝子若しくはRNA転写物(アンチセンス治療)いずれかと安定なハイブリッドを形成することが可能、関連するmRNAを切断するためのリボザイムとして作用することが可能、または標的遺伝子の産物のデコイとして作用することが可能な配列を含んでなる治療的若しくは予防的ポリヌクレオチドを供給することにより低下させうる。
本発明の方法によるウイルスベクターの導入は、当該技術分野で利用可能かつ公知であるいずれかの数の送達技術(外科的および非外科的双方)の使用を必要としうる。こうした送達技術は、例えば、血管カテーテル挿入、カニューレ挿入、注入、吸入、気管内、皮下、塗擦、局所、経口、経皮、動脈内、静脈内、および/若しくは腹腔内投与を包含する。ベクターはまた、具体的説明として血管移植片(PTFEおよびダクロン)、心臓弁、血管内ステント、血管内壁修復(paving)、ならびに他の血管以外のプロテーゼを包含するバイオプロテーゼによっても導入し得る。ベクター溶液の送達、頻度、組成および投薬量範囲に関する全般的技術は当該技術分野の熟練内にある。
とりわけ、本発明のベクターの組織への送達のため、ベクターを宿主動物に導入するこ
とができるいかなる物理的若しくは生物学的方法も使用し得る。ベクターは、パルボウイルス投与について公知であるとおり、裸の組換えベクター、およびウイルスコートタンパク質中にパッケージングされたベクターDNA双方を意味している。リン酸緩衝生理的食塩水にウイルスベクターを単純に溶解することは、筋組織発現に有用なベヒクルを提供するのに十分であることが示されており、また、ベクターと共投与し得る担体若しくは他成分に関する既知の制限は存在しない(とは言え、DNAを分解する組成物はベクターを伴う通常の様式で回避すべきである)。製薬学的組成物は、経皮輸送により筋に送達されるべき注入可能な製薬剤若しくは局所製薬剤として製造し得る。筋肉内注入および経皮輸送双方のための多数の製薬剤が以前に開発されており、そして本発明の実務で使用し得る。該ベクターは、投与および取り扱いの容易さのため、いずれの製薬学的に許容できる担体とも使用し得る。
とができるいかなる物理的若しくは生物学的方法も使用し得る。ベクターは、パルボウイルス投与について公知であるとおり、裸の組換えベクター、およびウイルスコートタンパク質中にパッケージングされたベクターDNA双方を意味している。リン酸緩衝生理的食塩水にウイルスベクターを単純に溶解することは、筋組織発現に有用なベヒクルを提供するのに十分であることが示されており、また、ベクターと共投与し得る担体若しくは他成分に関する既知の制限は存在しない(とは言え、DNAを分解する組成物はベクターを伴う通常の様式で回避すべきである)。製薬学的組成物は、経皮輸送により筋に送達されるべき注入可能な製薬剤若しくは局所製薬剤として製造し得る。筋肉内注入および経皮輸送双方のための多数の製薬剤が以前に開発されており、そして本発明の実務で使用し得る。該ベクターは、投与および取り扱いの容易さのため、いずれの製薬学的に許容できる担体とも使用し得る。
筋肉内注入の目的上、ゴマ若しくはラッカセイ油のような補助物質中または水性プロピレングリコール中の溶液、ならびに無菌の水性溶液を使用し得る。こうした水性溶液は、所望の場合は緩衝し得、そして、液体の希釈薬剤を最初に生理的食塩水若しくはブドウ糖で等張にし得る。遊離酸(DNAは酸性のリン酸基を含有する)若しくは薬理学的に許容できる塩としてのウイルスベクターの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性薬剤と適して混合した水中で製造し得る。ウイルス粒子の分散系は、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物ならびに油中でもまた製造し得る。通常の貯蔵および使用条件下で、これらの製薬剤は微生物の増殖を予防するための保存薬剤を含有する。これに関連して、使用される無菌の水性媒体は全部、当業者に公知の標準的技術により容易に得ることができる。
注入可能な使用に適する製薬学的形態物は、無菌の水性溶液若しくは分散系、および無菌の注入可能な溶液若しくは分散系の即座の製造のための無菌粉末を包含する。全部の場合で、該形態物は無菌でなければならず、そして容易な注入可能性(syringability)が存在する程度まで流動性でなければならない。それは製造および貯蔵の条件下で安定でなければならず、そして細菌および真菌のような微生物の汚染作用に対し保存されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、多価アルコール(例えばグリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)、適するそれらの混合物、および植物油を含有する溶媒若しくは分散媒であり得る。適正な流動性は、例えば、レシチンのようなコーティングの使用、分散系の場合は必要とされる粒子径の維持、および界面活性薬剤の使用により維持し得る。微生物の作用の予防は、多様な抗菌および抗真菌薬剤、例えばパラベン類、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらし得る。多くの場合、等張薬剤、例えば糖若しくは塩化ナトリウムを包含することが好ましいであろう。注入可能な組成物の持続的吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの使用によりもたらし得る。
無菌の注入可能な溶液は、必要とされるところの上で列挙された多様な他成分を含む適切な溶媒中に必要とされる量のAAVベクターを組み込むこと、次いで濾過滅菌により製造する。一般に、分散系は、基本的分散媒および上で列挙されたものからの必要とされる他成分を含有する無菌ベヒクルに、滅菌した有効成分を組み込むことにより製造する。無菌の注入可能な溶液の製造のための無菌粉末の場合には、好ましい製造方法は、その以前に滅菌濾過した溶液から有効成分およびいずれかの付加的な所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術である。
局所投与の目的上、それ以外は上の非経口溶液に類似の希薄な無菌の水性溶液(通常約0.1%ないし5%濃度の)を、経皮貼付薬剤への組み込みに適する容器中で製造し、そして製薬学的等級のジメチルスルホキシド(DMSO)のような既知の担体を包含し得る
。
。
本発明の組成物はin vivoならびにex vivoで使用しうる。in vivo遺伝子治療は、本発明のベクターを直接被験体に投与することを含んでなる。製薬学的組成物は、液体の溶液若しくは懸濁薬剤として、乳薬剤として、または使用前の液体への溶解若しくは懸濁に適する固体の形態物として供給し得る。気道への投与のため、好ましい投与様式は、適切な空気可溶化装置(aerosolubilizer)装置で使用される場合に固体若しくは液体いずれかのエアゾルを提供する組成物を使用するエアゾルによる。気道への別の好ましい投与様式は、ベクターを滴下注入するための可撓性光ファイバー気管支鏡を使用することである。典型的には、ウイルスベクターは、リンゲル平衡塩溶液(Ringer’s balanced salt solution)(pH7.4)のような製薬学的に適する発熱物質を含まない緩衝液中にある。必要とされないとは言え、製薬学的組成物は、場合によっては、正確な量の投与に適する単位投薬形態物で供給しうる。
処置の目的に依存するウイルスの有効量を投与する。有効量は単一若しくは分割用量で与えうる。低パーセントの形質導入が遺伝子欠損を治療し得る場合には、処置の目的は、一般に、このレベルの形質導入に一致するか若しくはこれを超えることである。いくつかの場合には、この形質導入レベルは、標的細胞の約1ないし5%のみの形質導入により達成し得るが、しかし、より典型的には所望の組織型の細胞の20%、通常は少なくとも約50%、好ましくは少なくとも約80%、より好ましくは少なくとも約95%、およびなおより好ましくは所望の細胞型の細胞の少なくとも約99%である。一指針として、気管支鏡検査により与える単一用量中に存在するベクター粒子の数は一般に少なくとも約1×108であることができ、そしてより典型的には5×108、1×1010、およびいくつかの場合には1×1011の、DNア―ゼ抵抗性およびDNアーゼ感受性双方の粒子を包含する粒子である。DNアーゼ抵抗性粒子に関して、該用量は、1×106と1×1014粒子の間、より一般的には約1×108と1×1012粒子の間であることができる。該処置は、必要とされるとおり約2若しくは3週ごとに反復し得るとは言え、180日に1回の処置が十分でありうる。
宿主細胞中での所望のDNA配列の存在を確認するために多様なアッセイを実施しうる。こうしたアッセイは、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、RT−PCRおよびPCRのような当業者に公知の「分子生物学的」アッセイ;例えば、免疫学的手段(免疫沈降、免疫親和性カラム、ELISAおよびウエスタンブロット)、あるいは本発明の範囲内にある特定の一核酸分子の存在および/若しくは発現を同定するのに有用ないずれかの他のアッセイにより、ベクター中に存在する遺伝子から発現されるポリペプチドの存在を検出することのような「生化学的」アッセイを包含する。
導入されたDNAセグメントから産生されるRNAを検出かつ定量するためにRT−PCRを使用しうる。PCRのこの応用において、逆転写酵素のような酵素を使用してRNAをDNAに逆転写することが最初に必要であり、そしてその後、慣習的PCR技術の使用により該DNAを増幅する。大部分の例において、PCR技術は有用な一方でRNA産物の完全性を示さないことができる。RNA産物の性質についてのさらなる情報はノーザンブロッティングにより得ることができる。この技術は、RNA種の存在を示しかつそのRNAの完全性についての情報を与える。1RNA種の存在若しくは非存在は、ドット若しくはスロットブロットノーザンハイブリダイゼーションを使用してもまた決定し得る。これらの技術はノーザンブロッティングの変法であり、そしてRNA種の存在若しくは非存在のみを示す。
サザンブロッティングおよびPCRを問題のDNAセグメントを検出するのに使用しう
る一方、それらは該DNAセグメントが発現されているかどうかに関する情報を提供しない。発現は、導入されたDNA配列のポリペプチド産物を特異的に同定すること、若しくは宿主細胞中での該導入されたDNAセグメントの発現によりもたらされる表現型変化を評価することにより、評価しうる。
る一方、それらは該DNAセグメントが発現されているかどうかに関する情報を提供しない。発現は、導入されたDNA配列のポリペプチド産物を特異的に同定すること、若しくは宿主細胞中での該導入されたDNAセグメントの発現によりもたらされる表現型変化を評価することにより、評価しうる。
従って、遺伝子変化の有効性は、生理学的液体サンプル、例えば尿、血漿、血清、血液、脳脊髄液または鼻若しくは肺洗浄液の分析を包含する数種の基準によりモニターし得る。生検若しくは外科的切除により取り出されたサンプルを、in situハイブリダイゼーション、ベクター特異的プローブを使用するPCR増幅、RNアーゼ保護、免疫組織学、若しくは免疫蛍光細胞計数により分析しうる。ベクターを気管支鏡検査により投与する場合、肺機能試験を実施することができ、そして気管支洗浄液を炎症性サイトカインの存在について評価しうる。処置した被験体は、臨床的特徴について、および治療的若しくは予防的ポリヌクレオチドにより伝達されることを意図している機能を該細胞が発現するかどうかを決定するためにもまた、モニターしうる。
in vivo若しくはex vivo治療を使用すべきかどうかの決定、ならびに特定の組成物、用量および投与経路の選択は、限定されるものでないが、処置されている状態および被験体の特徴を挙げることができる多数の異なる因子に依存することができる。こうした特徴の評価および適切な治療若しくは予防療法の設計は、究極的に、処方する医師の責任である。
本発明の方法で有用な例示的化合物
本発明の方法で有用でありうる薬剤は、限定されるものでないが、インターロイキン、アナフィラトキシン、アンジオテンシンII、NSAID、例えばジクロフェナク、カテリシジン、プロリン豊富な抗菌ペプチド、C反応性タンパク質、ヘモゾイン、ヨードラクトン若しくはヨードアルデヒド、例えばヨードヘキサデカナール、カロテノイド、ACE阻害薬剤、降圧薬、ステロイド、メトトレキセート、テトラサイクリンのような抗生物質、ニトロアレン、キニン、芳香族N−オキシド、アスピリン、フラボノイド、アリシン、αトコフェロール、ケルセチン、カテキン、イソチオシアネート、NAC、β−カロテン、ゲニステイン、ダイゼイン、没食子酸プロピル、クルクミン、ピリドキシン−ピロリドンカルボン酸塩、PDE阻害薬剤、クラスIV麻酔薬、揮発性麻酔薬、血中コレステロール低下薬、シクロスポリンA、ポリフェノール、長鎖ω6アラキドン酸、メタドキシン(metadoxine)、チラパザミン、AQ4N、RSR13、モレキサフィン(molexafin)Gd、HIF1阻害薬剤、一酸化窒素供与体、ニトロアスピリン、エイコサノイド、コルチコステロイド、オーラノフィン、酪酸塩、プロピオン酸塩、オキシレスベラトロール、レセルベロール(reserverol)、チオペンタールスクシニルコリン、ジクメロール(dicoumerol)、トリプトライド(triptolide)、米国特許第6,927,238号、同第6,864,288号、同第6,713,605号、同第6,184,203号、同第6,090,851号、同第5,902,831号、同第5,763,496号、同第5,726,155号、同第5.244,916号、同第5,118,601号および同第6,172116号、米国特許出願公開第20040120926号ならびに同第20040001818号明細書に開示される薬剤、PR−39のような陽イオン性ペプチド、プロリン豊富な抗菌ペプチド、DPI、クロモリン、NOSオキシダーゼ阻害薬剤、フェニルヒ素酸化物(phenyl arsine oxide)、ヒスタミン、PLD活性の阻害薬剤、TNF−α、TGF−β、IL−1、インターフェロン、PDGF、ならびにEGF、Rac、ホルミルペプチド、PMA、カルシウムイオノフォア、例えばイオノマイシン若しくはアグマチンを挙げることができる。
本発明の方法で有用でありうる薬剤は、限定されるものでないが、インターロイキン、アナフィラトキシン、アンジオテンシンII、NSAID、例えばジクロフェナク、カテリシジン、プロリン豊富な抗菌ペプチド、C反応性タンパク質、ヘモゾイン、ヨードラクトン若しくはヨードアルデヒド、例えばヨードヘキサデカナール、カロテノイド、ACE阻害薬剤、降圧薬、ステロイド、メトトレキセート、テトラサイクリンのような抗生物質、ニトロアレン、キニン、芳香族N−オキシド、アスピリン、フラボノイド、アリシン、αトコフェロール、ケルセチン、カテキン、イソチオシアネート、NAC、β−カロテン、ゲニステイン、ダイゼイン、没食子酸プロピル、クルクミン、ピリドキシン−ピロリドンカルボン酸塩、PDE阻害薬剤、クラスIV麻酔薬、揮発性麻酔薬、血中コレステロール低下薬、シクロスポリンA、ポリフェノール、長鎖ω6アラキドン酸、メタドキシン(metadoxine)、チラパザミン、AQ4N、RSR13、モレキサフィン(molexafin)Gd、HIF1阻害薬剤、一酸化窒素供与体、ニトロアスピリン、エイコサノイド、コルチコステロイド、オーラノフィン、酪酸塩、プロピオン酸塩、オキシレスベラトロール、レセルベロール(reserverol)、チオペンタールスクシニルコリン、ジクメロール(dicoumerol)、トリプトライド(triptolide)、米国特許第6,927,238号、同第6,864,288号、同第6,713,605号、同第6,184,203号、同第6,090,851号、同第5,902,831号、同第5,763,496号、同第5,726,155号、同第5.244,916号、同第5,118,601号および同第6,172116号、米国特許出願公開第20040120926号ならびに同第20040001818号明細書に開示される薬剤、PR−39のような陽イオン性ペプチド、プロリン豊富な抗菌ペプチド、DPI、クロモリン、NOSオキシダーゼ阻害薬剤、フェニルヒ素酸化物(phenyl arsine oxide)、ヒスタミン、PLD活性の阻害薬剤、TNF−α、TGF−β、IL−1、インターフェロン、PDGF、ならびにEGF、Rac、ホルミルペプチド、PMA、カルシウムイオノフォア、例えばイオノマイシン若しくはアグマチンを挙げることができる。
例示的Nox活性化因子
Nox活性を高めるのに有用でありうる薬剤は、限定されるものでないが、インターロイキン、リン脂質、アナフィラトキシン、アンジオテンシンII、アンジオポエチン、VEGF、ストレプトゾトシン、BMP4、gp 9lds−tat(Walchら、Athero.、167:285(2006)を参照されたい、Wy−14643(Reisynら、Can.Res.、60:4798(2000))、f−met−Leu−Pheのようなホルミルペプチド、BDNF(米国特許出願公開第20060135600号明細書)、NSAID例えばジクロフェナク、TNF−α、TGF−β、IL−1、インターフェロン、PDGF、EGF、Rac、PMA、カルシウムイオノフォア、例えばイオノマイシン、アグマチン、および米国特許第6,172,116号明細書に開示されるものを挙げることができる。
Nox活性を高めるのに有用でありうる薬剤は、限定されるものでないが、インターロイキン、リン脂質、アナフィラトキシン、アンジオテンシンII、アンジオポエチン、VEGF、ストレプトゾトシン、BMP4、gp 9lds−tat(Walchら、Athero.、167:285(2006)を参照されたい、Wy−14643(Reisynら、Can.Res.、60:4798(2000))、f−met−Leu−Pheのようなホルミルペプチド、BDNF(米国特許出願公開第20060135600号明細書)、NSAID例えばジクロフェナク、TNF−α、TGF−β、IL−1、インターフェロン、PDGF、EGF、Rac、PMA、カルシウムイオノフォア、例えばイオノマイシン、アグマチン、および米国特許第6,172,116号明細書に開示されるものを挙げることができる。
例示的Nox阻害薬剤
Nox活性を阻害するのに有用でありうる薬剤は、限定されるものでないが、米国特許第7,202,053号、同第7,202,030号、同第7,067,158号、同第6,927,238号、同第6,864,288号、同第6,713,605号、同第6,184,203号、同第6,090,851号、同第5,902,831号、同第5,763,496号、同第5,726,155号、同第5.244,916号および同第5,118,601号、米国特許出願公開第20040120926号、同第20060160095号、同第20060089362号および同第20040001818号明細書に開示されるもの、PR−39のような陽イオン性ペプチド、プロリン豊富な抗菌ペプチド、DPI、ピロキシカム、MnTMPxp(Francoら、Life Sci.、80:709(2007))、1NAME(Coyleら、ASAIO J.、2007)、アゼルニジピン、アトルバスタチン、パラブトポリン(parabutoporin)、NAC、スタウロスポリン、フルオロホスホン酸ジイソプロピル、カテコール、例えばメチル置換カテコール、フッ化4−(2−アミノエチル)−ベンゼンスルホニル、スチルベン型フィトアレキシンレセルバトロール(reservatrol)、アミノグアニジン、ON0174、S17834(ベンゾ(b)ピラン−4−オン)、スラミン、スルホン酸化(sulphonated)アリール若しくはベンズアミド誘導体(米国特許出願公開第20070037883号明細書)、ロバスタチンおよびコンパクチンのようなイソプレニル化阻害薬剤、ベンゾフラニルおよびベンゾチエニルチオアルカン、クロモリン、NOSオキシダーゼ阻害薬剤、フェニルヒ素酸化物、ヒスタミン、PLD活性の阻害薬剤、ならびに式(I)の化合物を挙げることができる。
Nox活性を阻害するのに有用でありうる薬剤は、限定されるものでないが、米国特許第7,202,053号、同第7,202,030号、同第7,067,158号、同第6,927,238号、同第6,864,288号、同第6,713,605号、同第6,184,203号、同第6,090,851号、同第5,902,831号、同第5,763,496号、同第5,726,155号、同第5.244,916号および同第5,118,601号、米国特許出願公開第20040120926号、同第20060160095号、同第20060089362号および同第20040001818号明細書に開示されるもの、PR−39のような陽イオン性ペプチド、プロリン豊富な抗菌ペプチド、DPI、ピロキシカム、MnTMPxp(Francoら、Life Sci.、80:709(2007))、1NAME(Coyleら、ASAIO J.、2007)、アゼルニジピン、アトルバスタチン、パラブトポリン(parabutoporin)、NAC、スタウロスポリン、フルオロホスホン酸ジイソプロピル、カテコール、例えばメチル置換カテコール、フッ化4−(2−アミノエチル)−ベンゼンスルホニル、スチルベン型フィトアレキシンレセルバトロール(reservatrol)、アミノグアニジン、ON0174、S17834(ベンゾ(b)ピラン−4−オン)、スラミン、スルホン酸化(sulphonated)アリール若しくはベンズアミド誘導体(米国特許出願公開第20070037883号明細書)、ロバスタチンおよびコンパクチンのようなイソプレニル化阻害薬剤、ベンゾフラニルおよびベンゾチエニルチオアルカン、クロモリン、NOSオキシダーゼ阻害薬剤、フェニルヒ素酸化物、ヒスタミン、PLD活性の阻害薬剤、ならびに式(I)の化合物を挙げることができる。
式(I)の化合物:
式中、
R1は、H、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、ト
リフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、NRxRy若しくはCOORx(ここで各RxおよびRyは独立にH、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシであり)であり;
R2は、H、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、NRxRy若しくはCOORx(ここで各RxおよびRyは独立にH、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシであり)であり;
R3は、H、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、O−RZ、NRxRy若しくはCOORx(ここで各RxおよびRyは独立にH、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシであり;また、式中Rzは炭水化物の一価の基であり)であり;
R4は、H、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、NRxRy若しくはCOORx(ここで各RxおよびRyは独立にH、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシであり)であり;
R5は、H、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、NRxRy若しくはCOORx(ここで各RxおよびRyは独立にH、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシであり)であり;ならびに、
R6は、H、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ若しくはNRxRy(ここでRxおよびRyはそれぞれ独立にH、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシであり)であり;
またはその製薬学的に許容できる塩
は、NADPHオキシダーゼの適する強力かつ選択的阻害薬剤である。
R1は、H、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、ト
リフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、NRxRy若しくはCOORx(ここで各RxおよびRyは独立にH、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシであり)であり;
R2は、H、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、NRxRy若しくはCOORx(ここで各RxおよびRyは独立にH、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシであり)であり;
R3は、H、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、O−RZ、NRxRy若しくはCOORx(ここで各RxおよびRyは独立にH、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシであり;また、式中Rzは炭水化物の一価の基であり)であり;
R4は、H、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、NRxRy若しくはCOORx(ここで各RxおよびRyは独立にH、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシであり)であり;
R5は、H、アルキル、アルケニル、アルコキシ、ハロ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アルカノイル、アルコキシカルボニル、アミノ、イミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ、ニトロ、トリフルオロメチル、トリフルオロメトキシ、カルボキシ、カルボキシアルキル、アルキルチオ、アルキルスルフィニル、アルキルスルホニル、シアノ、NRxRy若しくはCOORx(ここで各RxおよびRyは独立にH、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシであり)であり;ならびに、
R6は、H、アルキル、アルコキシ、ハロアルキル、ヒドロキシ、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アミノ、アルキルアミノ、アシルアミノ若しくはNRxRy(ここでRxおよびRyはそれぞれ独立にH、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシであり)であり;
またはその製薬学的に許容できる塩
は、NADPHオキシダーゼの適する強力かつ選択的阻害薬剤である。
式(Ia)の化合物:
式中、
R1はHであり;
R2はアルコキシであり;
R3はヒドロキシル、アルコキシ若しくはO−Rz(ここでRzは炭水化物の一価の基であり)であり;
R4はH、アルコキシ若しくはアルキルであり;
R5はH若しくはヒドロキシルであり;および
R6は、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アミノ、アルキルアミノ若しくはNRxRy(ここでRxおよびRyはそれぞれ独立にH、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシである;
またはその製薬学的に許容できる塩
は、NADPHオキシダーゼの適する強力かつ選択的阻害薬剤である。
R1はHであり;
R2はアルコキシであり;
R3はヒドロキシル、アルコキシ若しくはO−Rz(ここでRzは炭水化物の一価の基であり)であり;
R4はH、アルコキシ若しくはアルキルであり;
R5はH若しくはヒドロキシルであり;および
R6は、アルキル、ハロアルキル、ヒドロキシアルキル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル、アミノ、アルキルアミノ若しくはNRxRy(ここでRxおよびRyはそれぞれ独立にH、アルキル、アルケニル、アリール、ヘテロアリール、複素環、シクロアルキル若しくはヒドロキシである;
またはその製薬学的に許容できる塩
は、NADPHオキシダーゼの適する強力かつ選択的阻害薬剤である。
式(Ib)の化合物:
式中、
R1はHであり;
R2はアルコキシであり;
R3はヒドロキシル、アルコキシ、O−Rz(ここでRzは炭水化物の一価の基であり)であり;
R4はH、アルキル若しくはアルコキシであり;
R5はH若しくはヒドロキシルであり;および
R6はアルキルである;
またはその製薬学的に許容できる塩
は、NADPHオキシダーゼの適する強力かつ選択的阻害薬剤である。
R1はHであり;
R2はアルコキシであり;
R3はヒドロキシル、アルコキシ、O−Rz(ここでRzは炭水化物の一価の基であり)であり;
R4はH、アルキル若しくはアルコキシであり;
R5はH若しくはヒドロキシルであり;および
R6はアルキルである;
またはその製薬学的に許容できる塩
は、NADPHオキシダーゼの適する強力かつ選択的阻害薬剤である。
特定の範囲および値:
式(I)の化合物に関して:R1の特定の値はHであり;R2の特定の値はアルコキシであり;R2の別の特定の値はメトキシであり;R3の特定の値はヒドロキシルであり;R3の別の特定の値はヒドロキシルで置換されているアルコキシであり;R3の別の特定の値は2−ヒドロキシ−エトキシであり;R3の別の特定の値はヒドロキシルであり、R4の特定の値はHであり;R4の別の特定の値はアルコキシであり;R4の別の特定の値はメトキシであり;R4の別の特定の値はアルキルであり;R4の別の特定の値はメチルであり;R5の特定の値はHであり;R5の別の特定の値はヒドロキシルであり;R6の特定の値はアルキルであり;そしてR6の別の特定の値はメチルである。
式(I)の化合物に関して:R1の特定の値はHであり;R2の特定の値はアルコキシであり;R2の別の特定の値はメトキシであり;R3の特定の値はヒドロキシルであり;R3の別の特定の値はヒドロキシルで置換されているアルコキシであり;R3の別の特定の値は2−ヒドロキシ−エトキシであり;R3の別の特定の値はヒドロキシルであり、R4の特定の値はHであり;R4の別の特定の値はアルコキシであり;R4の別の特定の値はメトキシであり;R4の別の特定の値はアルキルであり;R4の別の特定の値はメチルであり;R5の特定の値はHであり;R5の別の特定の値はヒドロキシルであり;R6の特定の値はアルキルであり;そしてR6の別の特定の値はメチルである。
式(Ia)の化合物に関して、R2の特定の値はアルコキシである。R2の別の特定の値はメトキシである。R6の特定の値はアルキルである。R6の別の特定の値はメチルである。
式(Ib)の化合物に関して、R2の特定の値はアルコキシである。R2の別の特定の値はメトキシである。R6の特定の値はメチルである。
式(I)、(Ia)および(Ib)の特定の化合物はアポシニンである。細胞透過性フェノール、アポシニン(4−ヒドロキシ−3−メトキシアセトフェノン;アセトバニロン;式IIの化合物)は、NADPHオキシダーゼの強力かつ選択的阻害薬剤である。
アポシニンは、ピクロリザ属(Picrorhiza)スピーシーズ、例えばコオウレン(P.kurrooa)およびベットコオウレン(P.scrophulariiflora)の乾燥根茎および根で見出され;後者はネオピクロリザ スクロフラリイフロラ(Neopicrorhiza scrophulariiflora)としてもまた知られる。アポシニンは他の供給源から、例えばカナダアサ(Canadian hemp)(アポシマム カンナビナム(Apocymum cannabinum))若しくは他のアポシナム属(Apocynum)スピーシーズ(例えばA.アンドロセミフォリウム(A.androsaemifolium))から、またはイリス属(Iris)スピーシーズの根茎からもまた得ることができるが、但し、該抽出液は実質的な量の心配糖体を含有しない。コオウレン(Picrorhiza kurroa Royle ex Benth)は多年生の木質薬草であり、そして粗抽出液はそこにアポシニンを包含する。
ピクロリザ属(Picrorhiza)の抽出液は、ピクロリザ属(Picrorhiza)スピーシーズの根茎を抽出すること、および該抽出液をカラムクロマトグラフィーにかけることにより得ることができる。あるいは、多量のフェノール性化合物を含む抽出液を、植物材料を無機酸で前処理してグリコシドをそれらのそれぞれのアグリコンに転化することにより得ることができる。所望の場合は、該材料をその後脱脂して蝋および他の高度に親油性の物質を除去しうる。該材料は例えば酢酸エチルおよび/若しくはエタノールで抽出する。有機溶媒を除去しそして水性溶液を得る。抽出液のpHを例えば水酸化ナトリウムを用いて10に増大させて、フェノール性化合物を脱プロトン化しかつそれらを
水層に保持する。水性溶液をその後例えばジエチルエーテルで洗浄してククルビタシンを除去する。水層をその後再酸性化してフェノール性化合物を中和し、そして再度例えばジエチルエーテルで抽出する。有機層を収集しかつ溶媒を除去する。
水層に保持する。水性溶液をその後例えばジエチルエーテルで洗浄してククルビタシンを除去する。水層をその後再酸性化してフェノール性化合物を中和し、そして再度例えばジエチルエーテルで抽出する。有機層を収集しかつ溶媒を除去する。
式(I)の付加的な適する化合物は、例えば、式:
の化合物を包含する。
ROSの治療的若しくは予防的阻害若しくは予防方法で有用な他の化合物は、限定されるものでないが、一般に抗酸化薬剤、アゼルニジピン若しくは他のカルシウム拮抗薬、オルメサルタン若しくは他のAT1受容体遮断薬、グルココルチコイド、例えばデキサメサゾン若しくはヒドロコルチゾン、β−アドレナリン作動薬、例えばイソプロテレノール、リポコルチン、ピリジン、ポリフェノール、例えばバニリン、4−ニトログアヤコール、葉酸およびその代謝的アンタゴニスト、ならびにイミダゾール、ならびにRNAiまたはそれらの組合せを挙げることができる。
本発明の薬剤の投薬量、製薬剤および投与経路
本発明の薬剤は製薬学的組成物として処方し得、そして選ばれた投与経路、すなわち経口で、または非経口で(すなわち静脈内、筋肉内、局所若しくは皮下経路により)に適合
された多様な形態で、ヒト患者のような哺乳動物宿主に投与し得る。
本発明の薬剤は製薬学的組成物として処方し得、そして選ばれた投与経路、すなわち経口で、または非経口で(すなわち静脈内、筋肉内、局所若しくは皮下経路により)に適合
された多様な形態で、ヒト患者のような哺乳動物宿主に投与し得る。
本発明により同定される薬剤の投与は、例えばレシピエントの生理学的状態、投与の目的が治療的であるか若しくは予防的であるか、および当業者に既知の他の因子に依存して、連続的若しくは間歇的でありうる。本発明の薬剤の投与は、予め選択された期間にわたり本質的に連続的でありうるか、若しくは一連の間隔を空けられた用量であることができる。局所および全身双方の投与を企図している。本発明の薬剤を予防目的上使用する場合、本発明の薬剤は、好ましくは全身投与による慢性の使用に従う。
下で論考されるとおり場合によっては徐放のため処方しうる、本発明の薬剤を含んでなる1種若しくはそれ以上の適する単位投薬形態物は、経口、または直腸、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸郭内、肺内および鼻内経路によるを包含する非経口を包含する多様な経路により投与し得る。例えば肝への投与には静脈内投与が好ましい。肺への投与には気道投与が好ましい。製薬剤は、適切な場合、便宜的に別個の単位投薬形態物で提供することができ、そして薬学に公知の方法のいずれかにより製造しうる。こうした方法は、液体担体、固体マトリックス、半固形担体、微粉固体担体若しくはそれらの組合せと該薬剤を連合にもたらす段階、およびその後、必要な場合は生成物を所望の送達系に導入若しくは造形する段階を包含しうる。
有効成分は、注入(infusion)若しくは注入(injection)により静脈内若しくは腹腔内で投与しうる。有効成分若しくはその塩の溶液は、場合によっては非毒性の界面活性薬剤と混合した水中で製造し得る。分散系もまた、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、トリアセチンおよびそれらの混合物ならびに油中で製造し得る。貯蔵および使用の通常の条件下で、これらの製薬剤は微生物の増殖を予防するための保存薬剤を含有する。
注入(injection)若しくは注入(infusion)に適する製薬学的投薬形態物は、無菌の水性溶液若しくは分散系、または場合によってはリポソーム中に被包化された無菌の注入可能な(injectable)若しくは注入可能な(infusible)溶液若しくは分散系の即座の製造に適合されている有効成分を含んでなる無菌粉末を包含し得る。全部の場合で、究極の投薬形態物は、製造および貯蔵の条件下で無菌、流動性かつ安定であるべきである。液体担体若しくはベヒクルは、例えば、水、エタノール、多価アルコール(例えばグリセロール、ポリエチレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど)、植物油、非毒性のグリセリルエステルおよびそれらの適する混合物を含んでなる溶媒若しくは液体の分散媒であり得る。適正な流動性は、例えば、リポソームの形成、分散系の場合は必要とされる粒子径の維持、若しくは界面活性薬剤の使用により維持し得る。微生物の作用の予防は、多様な抗菌および抗真菌薬剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサールなどによりもたらし得る。多くの場合に、等張薬剤、例えば糖、緩衝薬剤若しくは塩化ナトリウムを包含することが好ましいことができる。注入可能な組成物の持続吸収は、吸収を遅延させる薬剤、例えばモノステアリン酸アルミニウムおよびゼラチンの組成物中での使用によりもたらし得る。
無菌の注入可能な溶液は、必要とされるところの上で列挙された他成分の多種多様なものとともに有効成分を必要とされる量で適切な溶媒中に組み込むこと、次いで濾過滅菌により製造する。無菌の注入可能な溶液の製造のための無菌粉末の場合、好ましい製造方法は、前もって滅菌濾過した溶液中に存在する有効成分およびいずれかの付加的な所望の成分の粉末を生じる真空乾燥および凍結乾燥技術である。
本発明の薬剤を経口投与のため調製する場合、それらは好ましくは、製薬学的製薬剤若しくは単位投薬形態物を形成するために製薬学的に許容できる担体、希釈薬剤若しくは賦
形薬剤と組み合わせる。こうした製薬剤中の総有効成分は製薬剤の0.1から99.9重量%までを含んでなる。「製薬学的に許容できる」により、担体、希釈薬剤、賦形薬剤および/若しくは塩が、製薬剤の他成分と適合性でなければならず、かつ、そのレシピエントに対し有害であってはならないことを意味している。経口投与のための有効成分は、散薬剤若しくは顆粒薬剤として;溶液、懸濁薬剤若しくは乳薬剤として;またはチューインガムからの有効成分の摂取のための合成樹脂のような達成可能な基薬剤中に存在しうる。有効成分はまたボーラス、舐薬剤若しくはパスタ薬剤としても提供しうる。
形薬剤と組み合わせる。こうした製薬剤中の総有効成分は製薬剤の0.1から99.9重量%までを含んでなる。「製薬学的に許容できる」により、担体、希釈薬剤、賦形薬剤および/若しくは塩が、製薬剤の他成分と適合性でなければならず、かつ、そのレシピエントに対し有害であってはならないことを意味している。経口投与のための有効成分は、散薬剤若しくは顆粒薬剤として;溶液、懸濁薬剤若しくは乳薬剤として;またはチューインガムからの有効成分の摂取のための合成樹脂のような達成可能な基薬剤中に存在しうる。有効成分はまたボーラス、舐薬剤若しくはパスタ薬剤としても提供しうる。
該薬剤は、不活性希釈薬剤若しくは吸収可能な可食性担体のような製薬学的に許容できるベヒクルと組合せで例えば経口で全身投与しうる。それらは硬若しくは軟殻ゼラチンカプセル中に封入してもよく、錠薬剤に圧縮してもよく、または患者の食事の食物とともに直接組み込みうる。経口投与のためには、有効成分は1種若しくはそれ以上の賦形薬剤と組合せることができ、そして摂取可能な錠薬剤、頬側錠薬剤、トローチ薬剤、カプセル薬剤、エリキシル薬剤、懸濁薬剤、シロップ薬剤、カシェ薬剤などの形態で使用しうる。こうした組成物および製薬剤は少なくとも0.1%の有効成分を含有すべきである。組成物および製薬剤の割合はもちろん変動することができ、そして、便宜的には所定の単位投薬形態物の重量の約2ないし約60%の間でありうる。こうした有用な組成物中の有効成分の量は、有効な投薬量レベルを得ることができるようである。
本発明の薬剤を含有する製薬学的製薬剤は、公知かつ容易に入手可能な成分を使用して当該技術分野で既知の手順により製造し得る。例えば、該薬剤は、一般的な賦形薬剤、希釈薬剤若しくは担体とともに処方し得、そして錠薬剤、カプセル薬剤、懸濁薬剤、散薬剤などに形成し得る。こうした製薬剤に適する賦形薬剤、希釈薬剤および担体の例は、デンプン、糖、マンニトールおよびケイ酸誘導体のような賦形薬剤および増量薬剤;カルボキシメチルセルロース、HPMCおよび他のセルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチンならびにポリビニルピロリドンのような結合薬剤;グリセロールのような湿潤薬剤;炭酸カルシウムおよび重炭酸ナトリウムのような崩壊薬剤;パラフィンのような溶解を遅延させるための薬剤;四級アンモニウム化合物のような再吸収促進薬剤;セチルアルコール、モノステアリン酸グリセロールのような界面活性薬剤;カオリンおよびベントナイトのような吸着性担体;ならびにタルク、ステアリン酸カルシウムおよびマグネシウムのような滑沢薬剤、ならびに固体ポリエチルグリコールを包含する。
例えば、本発明の薬剤を含有する錠薬剤若しくはカプレット薬剤は、炭酸カルシウム、酸化マグネシウムおよび炭酸マグネシウムのような緩衝薬剤を包含し得る。カプレット薬剤および錠薬剤はまた、セルロース、糊化済デンプン、二酸化ケイ素、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、結晶セルロース、デンプン、タルク、二酸化チタン、安息香酸、クエン酸、トウモロコシデンプン、鉱物油、ポリプロピレングリコール、リン酸ナトリウムおよびステアリン酸亜鉛などのような不活性成分もまた包含し得る。本発明の薬剤を含有する硬若しくは軟ゼラチンカプセルは、ゼラチン、結晶セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、デンプン、タルクおよび二酸化チタンなどのような不活性成分、ならびにポリエチレングリコール(PEG)および植物油のような液体ベヒクルを含有し得る。さらに、本発明の薬剤の腸溶性カプレット薬剤若しくは錠薬剤を、胃中の崩壊に抵抗しかつ十二指腸のより中性ないしアルカリ性の環境で溶解するように設計する。
錠薬剤、トローチ薬剤、丸薬剤、カプセル薬剤などは、以下、すなわちトラガカントガム、アラビアゴム、トウモロコシデンプン若しくはゼラチンのような結合薬剤;第二リン酸カルシウムのような賦形薬剤;トウモロコシデンプン、バレイショデンプン、アルギン酸などのような崩壊薬剤;ステアリン酸マグネシウムのような滑沢薬剤もまた含有することができ;ならびに、ショ糖、果糖、乳糖若しくはアスパルテームのような甘味料、また
はペパーミント油、冬緑油若しくはサクランボ香味料のような着香料を添加しうる。単位投薬形態物がカプセル薬剤である場合、それは、上の型の物質に加えて植物油若しくはポリエチレングリコールのような液体担体を含有しうる。多様な他の物質が、コーティングとして、若しくは固体の単位投薬形態物の物理的形態を別の方法で改変するために存在しうる。例えば、錠薬剤、丸薬剤若しくはカプセル薬剤をゼラチン、蝋、セラック若しくは糖などでコーティングしうる。シロップ薬剤若しくはエリキシル薬剤は、有効成分、甘味料としてのショ糖若しくは果糖、保存薬剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、色素、ならびにサクランボ若しくはオレンジ香味料(flavor)のような香味料(flavoring)を含有しうる。もちろん、いずれかの単位投薬形態物の製造において使用されるいかなる物質も、使用される量で製薬学的に許容できかつ実質的に非毒性であるべきである。加えて、有効成分は徐放製薬剤および装置に組み込みうる。
はペパーミント油、冬緑油若しくはサクランボ香味料のような着香料を添加しうる。単位投薬形態物がカプセル薬剤である場合、それは、上の型の物質に加えて植物油若しくはポリエチレングリコールのような液体担体を含有しうる。多様な他の物質が、コーティングとして、若しくは固体の単位投薬形態物の物理的形態を別の方法で改変するために存在しうる。例えば、錠薬剤、丸薬剤若しくはカプセル薬剤をゼラチン、蝋、セラック若しくは糖などでコーティングしうる。シロップ薬剤若しくはエリキシル薬剤は、有効成分、甘味料としてのショ糖若しくは果糖、保存薬剤としてのメチルおよびプロピルパラベン、色素、ならびにサクランボ若しくはオレンジ香味料(flavor)のような香味料(flavoring)を含有しうる。もちろん、いずれかの単位投薬形態物の製造において使用されるいかなる物質も、使用される量で製薬学的に許容できかつ実質的に非毒性であるべきである。加えて、有効成分は徐放製薬剤および装置に組み込みうる。
本発明の薬剤は、便宜的経口投与のためのエリキシル薬剤若しくは溶液として、または例えば筋肉内、皮下若しくは静脈内経路による非経口投与に適切な溶液としてもまた処方し得る。
本発明の薬剤の製薬学的製薬剤はまた、水性若しくは非水性溶液若しくは分散系の形態、または、あるいは乳薬剤若しくは懸濁薬剤の形態もとり得る。
従って、治療的薬剤は、非経口投与(例えば注入、例えばボーラス注入若しくは連続注入による)のため処方することができ、そして、アンプル、充填済シリンジ、小容量注入容器、若しくは添加された保存薬剤を含む多用量容器中の単位投薬形態物で提供しうる。有効成分は、油性若しくは水性ベヒクル中の懸濁薬剤、溶液若しくは乳薬剤のような形態をとることができ、そして懸濁化薬剤、安定薬剤および若しくは分散助薬剤のような配合薬剤(formulatory agent)を含有しうる。あるいは、有効成分は、使用前に適するベヒクル、例えば無菌の発熱物質を含まない水との構成のために無菌の固体の無菌的単離若しくは溶液からの凍結乾燥により得られる粉末の形態にありうる。
これらの製薬剤は、従来技術で公知である製薬学的に許容できるベヒクルおよび補助物質を含有し得る。例えば、水に加えて、アセトン、エタノール、イソプロピルアルコールのような溶媒、名称「Dowanol」の下で販売される製品のようなグリコールエーテル、ポリグリコールおよびポリエチレングリコール、短鎖酸のC1−C4アルキルエステル、好ましくは乳酸エチル若しくはイソプロピル、名称「Miglyol」の下で市販されている製品のような脂肪酸トリグリセリド、ミリスチン酸イソプロピル、動物、鉱物および植物油、ならびにポリシロキサンから選ばれる、生理学的観点から許容できる1種若しくはそれ以上の有機溶媒を使用して溶液を製造することが可能である。
本発明の組成物は、セルロースおよび/若しくはセルロース誘導体のような増粘薬剤もまた含有し得る。それらはキサンタン、グアール若しくはカルボガムまたはアラビアゴムのようなガム、あるいは、ポリエチレングリコール、ベントンおよびモントモリロナイトなども含有し得る。
必要な場合は、抗酸化薬剤、界面活性薬剤、他の保存薬剤、薄膜形成薬剤、角質溶解若しくは面皰溶解薬剤、香料および着色薬剤から選ばれる補助物質を添加することが可能である。また、他の有効成分を、記述される状態のためであれいずれかの他の状態のためであれ添加しうる。
例えば、抗酸化薬剤のなかで、t−ブチルヒドロキノン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンおよびα−トコフェロールならびにその誘導体を挙げることができる。主として局所適用のため調整された(conditioned)ガレノス
製薬剤の形態は、クリーム薬剤、乳液、ゲル薬剤、分散系若しくはマイクロエマルション、より大きい若しくは小さい程度まで増粘されたローション薬剤、含浸パッド、軟膏薬剤若しくは棒状物の形態、または、あるいはスプレー薬剤中のエアゾル製薬剤の形態、若しくは発泡薬剤の形態、または、あるいは石鹸の塊(cake)の形態をとる。
製薬剤の形態は、クリーム薬剤、乳液、ゲル薬剤、分散系若しくはマイクロエマルション、より大きい若しくは小さい程度まで増粘されたローション薬剤、含浸パッド、軟膏薬剤若しくは棒状物の形態、または、あるいはスプレー薬剤中のエアゾル製薬剤の形態、若しくは発泡薬剤の形態、または、あるいは石鹸の塊(cake)の形態をとる。
加えて、該薬剤は徐放投薬形態物などのような製薬剤に良好に適する。該製薬剤は、それらが単に有効成分のみを放出するか、または、それらを好ましくは腸若しくは気道の特定の一部分でおそらくある期間にわたり放出するように構成し得る。コーティング、エンベロープ(envelop)および保護的マトリックスを、例えばポリラクチド−グリコール酸、リポソーム、マイクロエマルション、微粒子、ナノ粒子若しくは蝋のようなポリマー物質から作成しうる。これらのコーティング、エンベロープおよび保護的マトリックスは、体内に留置する装置、例えばステント、カテーテル、腹膜透析チューブなどを被覆するのに有用である。
本発明の薬剤は経皮投与のための貼付薬剤を介して送達し得る。薬剤の経皮送達に適する貼付薬剤の例については米国特許第5,560,922号明細書を参照されたい。経皮送達のための貼付薬剤は、裏打ち層、および1種若しくはそれ以上の皮膚浸透薬剤と一緒に薬剤をその中に分散若しくは溶解させたポリマーマトリックスを含み得る。裏打ち層は該薬剤に不浸透性であるいずれかの適する物質から作成し得る。裏打ち層はマトリックス層の保護カバーとしてはたらき、そして支持機能もまた提供する。裏打ちは、それがポリマーマトリックスと本質的に同一の大きさの層であるように形成し得るか、あるいは、それは、それがポリマーマトリックスの側を超えて拡大し得るかまたはポリマーマトリックスの側(1つ若しくは複数)の上に被せ得、そしてその後裏打ち層の拡大の表面が接着手段の基薬剤になり得る様式で外側に拡大し得るように、より大きい寸法のものであり得る。あるいは、ポリマーマトリックスは、ポリアクリレート若しくはアクリレート/ビニルアセテートコポリマーのような接着性ポリマーを含有し得るか、若しくはそれから処方し得る。長期適用のためには、皮膚の水和若しくは浸軟が最小限にされ得るように、微小孔構造かつ/若しくは呼吸可能な裏打ち積層物を使用することが望ましいことができる。
裏打ち層を作成するのに適する素材の例は、高および低密度ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、ポリ塩化ビニル、ポリ(エチレンフタレート)のようなポリエステルの薄膜、金属箔、こうした適するポリマー薄膜の金属箔積層物などである。好ましくは、裏打ち層に使用される素材はアルミニウム箔のような金属箔とのこうしたポリマー薄膜の積層物である。こうした積層物中で、積層物のポリマー薄膜は通常、接着性ポリマーマトリックスと接触していることができる。
裏打ち層は、所望の保護および支持機能を提供することができるいずれかの適切な厚さであり得る。適する厚さは約10から約200ミクロンまでであることができる。
一般に、生物学的に許容できる接着ポリマー層を形成するのに使用されるポリマーは、制御された速度でその薬剤が通過し得る造形体(shaped body)、薄壁若しくはコーティングを形成することが可能なものである。適するポリマーは、生物学的および製薬学的に適合性、該装置が接触する体液若しくは組織中で非アレルギー性かつ不溶性およびそれらと適合性である。可溶性ポリマーの使用は、皮膚の水分によるマトリックスの溶解若しくは腐食が、薬剤の放出速度ならびに除去の便宜上正しい場所に留まる投薬単位の能力に影響を及ぼすとみられるため、回避されるべきである。
接着性ポリマー層を二次加工するための例示的素材は、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、エチレン/プロピレンコポリマー、エチレン/エチルアクリレートコポリマー、エチレン/ビニルアセテートコポリマー、シリコーンエラストマー、とりわけ医
学等級のポリジメチルシロキサン、ネオプレンゴム、ポリイソブチレン、ポリアクリレート、塩素化ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、塩化ビニル−ビニルアセテートコポリマー、架橋ポリメタクリレートポリマー(ヒドロゲル)、ポリ塩化ビニリデン、ポリ(エチレンテレフタレート)、ブチルゴム、エピクロロヒドリンゴム、エチレンビニルアルコールコポリマー、エチレン−ビニルオキシエタノールコポリマー;シリコーンコポリマー、例えばポリシロキサン−ポリカーボネートコポリマー、ポリシロキサン−ポリエチレンオキシドコポリマー、ポリシロキサン−ポリメタクリレートコポリマー、ポリシロキサン−アルキレンコポリマー(例えばポリシロキサン−エチレンコポリマー)、ポリシロキサン−アルキレンシランコポリマー(例えばポリシロキサン−エチレンシランコポリマー)など;セルロースポリマー、例えばメチル若しくはエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびセルロースエステル;ポリカーボネート;ポリテトラフルオロエチレン;などを包含する。
学等級のポリジメチルシロキサン、ネオプレンゴム、ポリイソブチレン、ポリアクリレート、塩素化ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、塩化ビニル−ビニルアセテートコポリマー、架橋ポリメタクリレートポリマー(ヒドロゲル)、ポリ塩化ビニリデン、ポリ(エチレンテレフタレート)、ブチルゴム、エピクロロヒドリンゴム、エチレンビニルアルコールコポリマー、エチレン−ビニルオキシエタノールコポリマー;シリコーンコポリマー、例えばポリシロキサン−ポリカーボネートコポリマー、ポリシロキサン−ポリエチレンオキシドコポリマー、ポリシロキサン−ポリメタクリレートコポリマー、ポリシロキサン−アルキレンコポリマー(例えばポリシロキサン−エチレンコポリマー)、ポリシロキサン−アルキレンシランコポリマー(例えばポリシロキサン−エチレンシランコポリマー)など;セルロースポリマー、例えばメチル若しくはエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびセルロースエステル;ポリカーボネート;ポリテトラフルオロエチレン;などを包含する。
好ましくは、生物学的に許容できる接着性ポリマーマトリックスは、室温より下のガラス転移温度をもつポリマーから選択すべきである。該ポリマーは室温である程度の結晶度を有しうるが、しかし必ずしも有する必要はない。架橋モノマー単位若しくは部位をこうしたポリマーに組み込み得る。例えば、架橋モノマーをポリアクリレートポリマーに組み込み得、それらは該薬剤をポリマー中に分散した後にマトリックスを架橋するための部位を提供する。ポリアクリレートポリマーのための既知の架橋モノマーは、ブチレンジアクリレートおよびジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレートなどのような多価アルコールのポリメタクリル酸エステルを包含する。こうした部位を提供する他のモノマーは、アリルアクリレート、アリルメタクリレート、ジアリルマレエートなどを包含する。
好ましくは、可塑薬剤および/若しくは湿潤薬剤を接着性ポリマーマトリックス内に分散させる。水溶解性多価アルコールが一般にこの目的上適する。製薬剤中の湿潤薬剤の組み込みは、投薬単位が皮膚の表面上で水分を吸収することを可能にし、それは順に、皮膚刺激を低下させかつ送達系の接着性ポリマー層が作用しなくなることを予防するのを助ける。
経皮送達系から放出される薬剤は皮膚の各層に浸透することが可能でなければならない。薬剤の浸透速度を増大させるため、経皮薬物送達系は、とりわけ、分子の浸透に対する最も大きい抵抗性を提供する皮膚の最外層すなわち角質層の浸透性を増大させることが可能でなければならない。薬剤の経皮送達のための貼付薬剤の二次加工は当該技術分野で公知である。
吸入による上部(鼻)若しくは下部気道への投与のため、本発明の薬剤は、便宜的には、注入器、ネブライザー若しくは加圧パック、またはエアゾルスプレーを送達する他の便宜的手段から送達される。加圧パックは、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素若しくは他の適するガスのような適する噴射薬剤を含みうる。加圧式エアゾルの場合、投薬単位は、計量された量を送達するためのバルブを提供することにより決定しうる。
あるいは、吸入若しくはガス注入による投与のため、組成物は乾燥粉末、例えば該薬剤および乳糖若しくはデンプンのような適する粉末基薬剤の粉末混合物の形態をとりうる。粉末組成物は、例えばカプセル若しくはカートリッジ、または、吸入器、注入器若しくは定量噴霧式吸入器の助けを借りてそれから該粉末を投与しうる例えばゼラチン若しくはブリスターパック中の単位投薬形態物で提供しうる。
鼻内投与のためには、薬剤をプラスチック製瓶噴霧器若しくは定量噴霧式吸入器を介す
るような点鼻薬、液体スプレー薬剤を介して投与しうる。Mistometer(Wintrop)およびMedihaler(Riker)が噴霧器の典型である。
るような点鼻薬、液体スプレー薬剤を介して投与しうる。Mistometer(Wintrop)およびMedihaler(Riker)が噴霧器の典型である。
本発明の薬剤の局所送達は、薬剤を疾患の部位で若しくはその近くに投与する多様な技術によることもまたできる。部位特異的すなわち標的を定めた局所送達技術の例は、利用可能な技術を制限することを意図していないが、しかしそれらの具体的説明であることを意図している。例は、注入若しくは留置カテーテル、例えば針注入カテーテルのような局所送達カテーテル、シャントおよびステント、または他の植え込み式装置、部位特異的担体、直接注入あるいは直接適用を包含する。
局所投与のためには、該薬剤は標的部位への直接適用について当該技術分野で既知であるとおり処方しうる。該薬剤は純粋な形態で、すなわちそれらが液体である場合に塗布しうる。しかしながら、固体若しくは液体でありうる皮膚科的に許容できる担体と組合せの組成物若しくは製薬剤としてそれらを皮膚に投与することが一般に望ましいであろう。本目的上の慣習的形態は、創傷包帯材(dressing)、被覆包帯(bandage)若しくは他のポリマー被覆(covering)、軟膏薬剤、クリーム薬剤、ローション薬剤、パスタ薬剤、ゼリー薬剤、スプレー薬剤およびエアゾル薬剤を包含する。軟膏薬剤およびクリーム薬剤は、例えば、適する増粘薬剤および/若しくはゲル化薬剤の添加を伴う水性若しくは油性基薬剤とともに処方しうる。ローション薬剤は水性若しくは油性基薬剤とともに処方することができ、そして一般に1種若しくはそれ以上の乳化薬剤、安定薬剤、分散助薬剤、懸濁化薬剤、増粘薬剤若しくは着色薬剤もまた含有することができる。有効成分は、例えば米国特許第4,140,122号;同第4,383,529号;若しくは同第4,051,842号明細書に開示されるところのイオントフォレーシスを介してもまた送達し得る。局所製薬剤中に存在する本発明の薬剤の重量パーセントは多様な因子に依存することができるが、しかし一般に製薬剤の総重量の0.01%から95%まで、および典型的には0.1〜25重量%であることができる。
有用な固体担体は、タルク、粘土、結晶セルロース、シリカ、アルミナなどのような微粉固体を包含する。有用な液体担体は、場合によっては非毒性界面活性薬剤の助けを借りて本化合物を有効濃度で溶解若しくは分散し得る、水、アルコール若しくはグリコールまたは水−アルコール/グリコール配合物を包含する。芳香薬剤のような補助物質および付加的な抗菌薬剤を所定の使用のために特性を至適化するように添加し得る。結果として生じる液体組成物は吸収薬剤パッドから塗布し得るか、包帯および他の包帯材を含浸するのに使用し得るか、またはポンプ型若しくはエアゾル噴霧器を使用して冒された領域に噴霧し得る。
合成ポリマー、脂肪酸、脂肪酸塩およびエステル、脂肪アルコール、修飾セルロース若しくは改変無機物質のような増粘薬剤もまた、直接使用者の皮膚へ塗布のため、展性の(spredable)パスタ薬剤、ゲル薬剤、軟膏薬剤、石鹸などを形成するために液体担体とともに使用し得る。
点眼薬若しくは点鼻薬のような滴薬剤は、1種若しくはそれ以上の分散助薬剤、可溶化薬剤若しくは懸濁化薬剤もまた含んでなる水性若しくは非水性基薬剤とともに処方しうる。液体スプレー薬剤は便宜上加圧パックから送達する。滴薬剤は、単純な眼のスポイトキャップ付き瓶を介して、若しくは液体内容物を一滴ずつ送達するよう適合されたプラスチック製瓶を介して、特別に造形されたクロージャーを介して、送達し得る。
該薬剤は、口若しくは咽頭中の局所投与のためさらに処方しうる。例えば、有効成分を、香味づけた基薬剤、通常はショ糖およびアラビアゴム若しくはトラガカントをさらに含んでなる舐薬剤;ゼラチンおよびグリセリン若しくはショ糖およびアラビアゴムのような
不活性基薬剤中に組成物を含んでなる香錠;ならびに適する液体担体中に本発明の組成物を含んでなる含嗽薬剤として処方しうる。
不活性基薬剤中に組成物を含んでなる香錠;ならびに適する液体担体中に本発明の組成物を含んでなる含嗽薬剤として処方しうる。
本明細書に記述される製薬剤および組成物は、抗菌薬剤若しくは保存薬剤のような他成分もまた含有しうる。さらに、有効成分は他薬剤、例えば気管支拡張薬とともにもまた使用しうる。
本発明の薬剤は、単独で若しくは製薬学的に許容できる担体と組合せで哺乳動物に投与しうる。上で示されたとおり、有効成分および担体の相対比は、化合物の溶解性および化学的性質、選ばれた投与経路ならびに標準的な製薬学的実務により決定される。
本薬剤の投薬量は、投与の形態、選ばれる特定の化合物および処置下の特定の患者の生理学的特徴とともに変動することができる。一般に、小投薬量を当初使用することができ、そして、必要な場合は該環境下で至適の影響が達せられるまで小増分ずつ増大することができる。
該薬剤の有用な投薬量はそれらのin vitro活性および動物モデルでのin vivo活性を比較することにより決定し得る。マウスおよび他の動物における有効投薬量のヒトへの外挿方法は当該技術分野で既知であり;例えば米国特許第4,938,949号明細書を参照されたい。
一般に、ローション薬剤のような液体組成物中の該薬剤の濃度は約0.1〜25重量%から、好ましくは約0.5〜10重量%からであることができる。ゲル薬剤若しくは散薬剤のような半固形若しくは固体組成物中の濃度は約0.1〜5重量%、好ましくは約0.5〜2.5重量%であることができる。
単独で若しくは他の薬剤との使用に必要とされる該薬剤またはその活性の塩若しくは誘導体の量は、選択される特定の塩でのみならず、しかしまた投与経路、処置されている状態の性質、ならびに患者の齢および状態でもまた変動することができ、そして究極的には主治医若しくは臨床家の自由裁量であることができる。
該薬剤は、便宜的に単位投薬形態物(例えば単位投薬形態物あたり5ないし1000mg、便宜上10ないし750mg、最も便宜的には50ないし500mgの有効成分を含有する)中で投与しうる。
一般に、しかしながら、適する用量は、1日あたりレシピエントの体重1kgあたり3ないし約50mgのような、1日あたり約0.5から約100mg/kgまで、例えば約10から約75mg/kg体重の範囲、好ましくは6ないし90mg/kg/日の範囲、最も好ましくは15ないし60mg/kg/日の範囲にあることができる。アポシニンを含有する組成物は、毎日の摂取に基づき、少なくとも50μg、好ましくは少なくとも100μg、1000mgまでのアポシニンを含有しうる。一例の1日摂取量は1と100mgの間のアポシニン;好ましくは少なくとも15mg/日の投薬量である。例えば、アポシニンは、1日に3回375mgの用量の根粉末として経口で、毎日の植物の根のアルコール性抽出物の筋肉内注入(40mg/kg)により、若しくは合計2mgについて8用量で投与されるエアゾル送達により、投与しうる。一例示的製薬剤および投薬量は300ないし500mgの根粉末1日2回/1日3回を包含する。さらに、アポシニンのアナログをアポシニンの代わりに若しくはそれに加えて使用しうる。こうしたアナログは、とりわけ、4−ヒドロキシル基が具体的には2−ヒドロキシエチル、2,3−ジヒドロキシプロピルのようなヒドロキシル化アルキル基若しくは糖部分でエステル化されているものである。糖部分がβ−D−グルコースである後者のアナログはアンドロシンとして公知で
ある。これはアポシニンが新鮮根中に存在する通常の形態である。
ある。これはアポシニンが新鮮根中に存在する通常の形態である。
該有効成分は、約0.5から約75μMまで、好ましくは約1ないし50μM、最も好ましくは約2ないし約30μMの有効成分の最高血漿濃度を達成するよう投与しうる。これは、例えば、場合によっては生理的食塩水中の有効成分の0.05ないし5%溶液の静脈内注入により達成しうるか、若しくは約1〜100mgの有効成分を含有するボーラスとして経口投与しうる。所望の血中濃度は、約0.01〜5.0mg/kg/時間を提供するための連続注入、若しくは約0.4〜15mg/kgの有効成分(1種若しくは複数)を含有する間歇的注入により維持しうる。
所望の用量は、便宜的には、単一用量で、若しくは適切な間隔で投与される分割用量として、例えば1日あたり2、3、4若しくはそれ以上の下位用量(sub−dose)として提供しうる。該下位用量それ自身は、例えば、注入器からの複数の吸入、若しくは眼への複数の滴の適用によるような;多数の別個の大まかに間隔を空けた投与にさらに分割しうる。
エンドソーム調製物を単離するための試薬
本発明は全般としてエンドソームの単離方法を提供する。一態様において、該方法は、Rac融合タンパク質をコードする発現カセットを有する外因性核酸でトランスフェクトした組換え細胞を使用しうる。該方法は、細胞に一過性に若しくは安定にのいずれかで導入されている発現カセットからRac融合タンパク質を発現する細胞を使用しうる。発現カセットは融合タンパク質の発現を駆動するプロモーターを包含する。プロモーターは構成的プロモーター若しくは調節可能なプロモーター(例えば誘導可能)でありうる。
本発明は全般としてエンドソームの単離方法を提供する。一態様において、該方法は、Rac融合タンパク質をコードする発現カセットを有する外因性核酸でトランスフェクトした組換え細胞を使用しうる。該方法は、細胞に一過性に若しくは安定にのいずれかで導入されている発現カセットからRac融合タンパク質を発現する細胞を使用しうる。発現カセットは融合タンパク質の発現を駆動するプロモーターを包含する。プロモーターは構成的プロモーター若しくは調節可能なプロモーター(例えば誘導可能)でありうる。
一態様において、Racペプチド若しくはポリペプチドは、連結されたRacポリペプチドを単離、精製若しくは検出するのに有用な他の配列、例えばグルタチオンS−トランスフェラーゼ(GST)配列、His標識、カルモジュリン結合ペプチド、タバコエッチウイルスプロテアーゼ、プロテインA IgG結合ドメインなど、若しくは配列の組合せに融合されているものである。一態様において、His−Rac1が支持体、例えばマルチウェルプレートに固定される。
形質転換のためのRac融合をコードする発現カセットを製造するため、組換えDNA配列若しくはセグメントは環状若しくは直鎖状の二本鎖若しくは一本鎖でありうる。目的の遺伝子産物をコードするmRNA配列に実質的に相補的であるRNA配列をコードするDNA配列は、典型的には、相対する向きで(すなわち5’から3’よりはむしろ3’から5’)カセットにクローン化された「センス」DNA配列である。一般に、DNA配列若しくはセグメントは、細胞中での該DNAの発現を促進する制御配列により隣接されているコーディング領域もまた含有し得る、プラスミドDNAのようなキメラDNAの形態にある。本明細書で使用されるところの「キメラ」は、ベクターが、少なくとも2種の異なる種からのDNAを含んでなるか、または該種の「天然のもの」すなわち野生型に存在しない様式で連結若しくは連合されている同一種からのDNAを含んでなることを意味している。
転写単位若しくはそれらの部分としてはたらくDNA配列は別にして、DNAの一部分は転写されずに調節若しくは構造機能を供しうる。例えば、DNAは、真核生物細胞例えば哺乳動物細胞中で、若しくはある種の細胞型で活性であるプロモーターをそれ自身が含みうるか、または、リンパ増殖性ウイルスの形質転換標的であるゲノム中に既に存在するプロモーターを利用しうる。こうしたプロモーターは、CMVプロモーターならびにSV40後期プロモーターおよびレトロウイルスLTR(末端反復配列エレメント)を包含するとは言え、当該技術分野で公知の多くの他のプロモーター領域、例えばMMTV、RS
V、MLV若しくはHIV LTRを本発明の実務で使用しうる。
V、MLV若しくはHIV LTRを本発明の実務で使用しうる。
イントロン、エンハンサー、ポリアデニル化配列などのような宿主細胞中で機能的な他のエレメントもまた組換えDNAの一部でありうる。こうしたエレメントは、DNAの機能に必要であっても若しくはなくてもよいが、しかし転写、mRNAの安定性などに影響を及ぼすことによりDNAの改良された発現を提供しうる。こうしたエレメントは、細胞中での形質転換するDNAの至適の性能を得るために所望のとおりDNAに包含しうる。
細胞中に導入されるべき組換えDNAは、形質転換されるために探求される細胞の集団からの形質転換細胞の同定および選択を容易にするために、選択可能なマーカー遺伝子若しくはレポーター遺伝子のいずれか、または双方を含有しうる。あるいは、選択可能なマーカーは別個のDNA片上に保有されかつ共形質転換手順で使用しうる。選択可能なマーカーおよびレポーター遺伝子の双方は、宿主細胞中での発現を可能にするように適切な制御配列で隣接されうる。有用な選択可能なマーカーは当該技術分野で公知であり、そして、例えばneo、hpt、dhfr、bar、aroA、puro、hyg、dpaAなどのような抗生物質および除草薬剤耐性遺伝子を包含する。Lindquistら(米国特許第5,848,956号明細書)の表1に列挙される遺伝子もまた参照されたい。
レポーター遺伝子は、潜在的に形質転換された細胞を同定しかつ制御配列の機能性を評価するために使用する。容易にアッセイ可能なタンパク質をコードするレポーター遺伝子が当該技術分野で公知である。一般に、レポーター遺伝子は、レシピエント生物体若しくは組織中に存在しないか若しくはそれらにより発現されずかつその発現が何らかの容易に検出可能な特性、例えば酵素活性により明示されるタンパク質をコードする遺伝子である。例示的レポーター遺伝子は、大腸菌(E.coli)のTn9からのクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ遺伝子(cat)、大腸菌(E.coli)のuidA遺伝子座のβ−グルクロニダーゼ遺伝子(gus)、緑色、赤色若しくは青色蛍光タンパク質遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子を包含する。レポーター遺伝子の発現は、該DNAがレシピエント細胞に導入された後適する時点でアッセイする。
標的細胞を形質転換し得る組換えDNAの一般的構築方法は当業者に公知であり、そしてその組成物および構築方法を利用して本発明で有効なDNAを製造しうる。
組換えDNAは、目的のDNA配列が宿主細胞により発現されるように、組換えDNAを有する形質転換された(トランスジェニック)細胞を生じるための特定の細胞への導入に有用ないずれかの処置、例えば物理的若しくは生物学的方法による、組換えDNAを含んでなる発現ベクターでのトランスフェクションにより、宿主細胞、例えば哺乳動物、細菌、酵母若しくは昆虫細胞または原核生物細胞に容易に導入し得る。一態様において、組換えDNAは細胞のゲノムに安定に組込まれる。
宿主細胞への組換えDNAの物理的導入方法は、カルシウム媒介性の方法、リポフェクション、粒子照射、微小注入法、電気穿孔法などを包含する。宿主細胞への目的のDNAの生物学的導入方法はDNAおよびRNAウイルスベクターの使用を包含する。ウイルスベクター、例えばレトロウイルス若しくはレンチウイルスベクターは、哺乳動物、例えばヒト細胞のような真核生物細胞に遺伝子を挿入するための広範に使用される方法となった。他のウイルスベクターは、ポックスウイルス、例えばワクシニアウイルス、ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、バキュロウイルスなどに由来し得る。
宿主細胞中で組換えDNA配列の存在を確認するため、多様なアッセイを実施しうる。こうしたアッセイは、例えば、サザンおよびノーザンブロッティング、RT−PCRおよびPCRのような当業者に公知の分子生物学的アッセイ;例えば免疫学的手段(ELIS
Aおよびウエスタンブロット)若しくは他の分子アッセイにより特定の遺伝子産物の存在若しくは非存在を検出することのような生化学的アッセイを包含する。
Aおよびウエスタンブロット)若しくは他の分子アッセイにより特定の遺伝子産物の存在若しくは非存在を検出することのような生化学的アッセイを包含する。
導入された組換えDNAセグメントから産生されるRNAを検出かつ定量するためにRT−PCRを使用しうる。PCRのこの応用において、最初に逆転写酵素のような酵素を使用してRNAをDNAに逆転写すること、そしてその後慣習的PCR技術の使用により該DNAを増幅することが必要である。大部分の場合で、PCR技術は有用な一方でRNA産物の完全性を示さないことができる。RNA産物の性質についてのさらなる情報はノーザンブロッティングにより得ることができる。この技術は、RNA種の存在を示しかつそのRNAの完全性に関する情報を与える。RNA種の存在若しくは非存在はドット若しくはスロットブロットノーザンハイブリダイゼーションを使用してもまた決定し得る。これらの技術はノーザンブロッティングの変法であり、そしてRNA種の存在若しくは非存在のみ示す。
サザンブロッティングおよびPCRを問題の組換えDNAセグメントを検出するのに使用しうる一方、それらは、該組換えDNAセグメントが発現されているかどうかに関して情報を提供しない。発現は、導入されたDNA配列のペプチド産物を特異的に同定すること、若しくは宿主細胞中での導入されたDNAセグメントの発現によりもたらされる表現型変化を評価することにより評価しうる。
本発明は以下の制限しない実施例によりさらに記述されるであろう。
実施例
方法
ウイルス、細胞培養およびウイルス感染
ルシフェラーゼ(AV2Luc)若しくは第VIII因子(AV2FVIII)導入遺伝子をコードする組換え2型アデノ随伴ウイルスを多様な細胞型の感染に使用した。HeLaおよびIB3細胞は10%ウシ胎児血清(FBS)および抗生物質を補充したDMEM中で培養した。Nox1およびNox2ノックアウトならびに野生型(wt)同腹仔対照マウス皮膚線維芽細胞を、Bosuら(2001)および下に記述されるとおり新生マウスから生成した。全部の感染について、ウイルスを無血清DMEM中の細胞に適用し、そして等容量の20%FBS/DMEMを感染後2時間に添加した。
ウイルス、細胞培養およびウイルス感染
ルシフェラーゼ(AV2Luc)若しくは第VIII因子(AV2FVIII)導入遺伝子をコードする組換え2型アデノ随伴ウイルスを多様な細胞型の感染に使用した。HeLaおよびIB3細胞は10%ウシ胎児血清(FBS)および抗生物質を補充したDMEM中で培養した。Nox1およびNox2ノックアウトならびに野生型(wt)同腹仔対照マウス皮膚線維芽細胞を、Bosuら(2001)および下に記述されるとおり新生マウスから生成した。全部の感染について、ウイルスを無血清DMEM中の細胞に適用し、そして等容量の20%FBS/DMEMを感染後2時間に添加した。
ウイルス形質導入の効率を評価する研究で、AV2Lucウイルスを1,000粒子/細胞に等しい感染多重度(MOI)で使用し、そしてルシフェラーゼ活性を感染後24時間に測定した。ウイルス侵入を評価する研究で、ウイルスを除去すること、細胞を洗浄すること、および37℃に細胞を移動することの前に、細胞を1,000粒子/細胞のAV2FVIIIと4℃で30分間インキュベートした。細胞をその後示された時間インキュベートし、そして後核上清(postnuclear supernatant)(PNS)を細胞内AAV2の分析のため調製した。Taqman PCRを使用して、Dingら(2006)に記述されるプライマー組および方法を使用して感染後の多様な細胞内画分中のウイルスゲノムの豊富さを定量化した。AAV2形質導入を誘導するためプロテアソーム阻害薬剤を添加した場合に、LLnL(Boston Biochem、マサチューセッツ州ケンブリッジ)および/若しくはドキソルビシン(Calbiochem、カリフォルニア州サンディエゴ)がそれぞれ40μMおよび5μMの濃度で培地中に存在した。エンドソームROSの調節は、培地に、1mg/mLの精製ウシCu/Znスーパーオキシドジスムターゼ(Cu/ZnSOD)(Oxis Research、オレゴン州ポートランド)および/若しくはカタラーゼ(Sigma−Aldrich、ミズーリ
州セントルイス)を添加することにより達成し、その培地はその後、別の方法で示されない限りウイルス感染の20分前に細胞に適用した。SODおよび/若しくはカタラーゼは、別の方法で示されない限り感染の間培地中に留まった。
州セントルイス)を添加することにより達成し、その培地はその後、別の方法で示されない限りウイルス感染の20分前に細胞に適用した。SODおよび/若しくはカタラーゼは、別の方法で示されない限り感染の間培地中に留まった。
小胞分画およびNADPH依存性スーパーオキシド産生についてのアッセイ
小胞分画は、小さい改変を伴う以前に記述されたプロトコル(Liら、2006b)を使用して実施した。簡潔には、掻き取ることおよび4℃のリン酸緩衝生理的食塩水(PBS)中で2回洗浄することにより細胞を収集した。細胞をその後ペレットにし、そして1mLの予め冷却した(4℃)均質化緩衝液(0.25Mショ糖、10mMトリエタノールアミン、1mM EDTA、1mM PMSFおよび100μg/mLアプロチニン)に氷上で再懸濁し、そして窒素減圧容器(Parr Instrument、イリノイ州モリーン)を使用して均質化した。PNS生成、小胞画分のイオジキサノール単離、サンプル収集、品質管理およびNox活性アッセイの方法は、Liら(2006b)に記述されたとおり実施した。
小胞分画は、小さい改変を伴う以前に記述されたプロトコル(Liら、2006b)を使用して実施した。簡潔には、掻き取ることおよび4℃のリン酸緩衝生理的食塩水(PBS)中で2回洗浄することにより細胞を収集した。細胞をその後ペレットにし、そして1mLの予め冷却した(4℃)均質化緩衝液(0.25Mショ糖、10mMトリエタノールアミン、1mM EDTA、1mM PMSFおよび100μg/mLアプロチニン)に氷上で再懸濁し、そして窒素減圧容器(Parr Instrument、イリノイ州モリーン)を使用して均質化した。PNS生成、小胞画分のイオジキサノール単離、サンプル収集、品質管理およびNox活性アッセイの方法は、Liら(2006b)に記述されたとおり実施した。
簡潔には、小胞画分を、既知のエンドソームRabタンパク質を含有しかつ原形質膜およびミトコンドリアのマーカーを欠くことを、ウエスタンブロットにより確認した。Nox活性は、化学発光性のルシゲニンに基づく系を使用して・O2 −生成の速度を測定することにより分析した。アッセイの開始前に、小胞画分をPBS中5μMルシゲニン(Sigma−Aldrich、ミズーリ州セントルイス)と合わせ、そして室温で暗所で10分間インキュベートした。100μMのNADPH(Sigma−Aldrich、ミズーリ州セントルイス)の添加により反応を開始し、そして発光の変化を3分の経過にわたり測定した(5示度/秒)。発光曲線(1分あたりの相対光単位[RLU])の傾き(r>0.95)を使用して、・O2 −形成の速度をNADPHオキシダーゼ活性の指標として計算した。
rAAV2のAlexa546標識および蛍光顕微鏡検査
およそ2×1012の精製AV2FVIIIビリオンを500μLの複合緩衝液(0.1M炭酸ナトリウム、pH9.3)で希釈し、50nMのAlexa546反応性色素(Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド)と室温で1時間インキュベートしかつ継続混合した。反応を停止するために1mLの10mMトリス(pH8.0)を溶液に添加した。標識ウイルスをその後、Kaludovら(2002)に記述されたところのイオン交換高速液体クロマトグラフィーを使用して精製した。精製した標識ウイルスの最終濃度は、ウイルスDNAプローブを使用するスロットブロットハイブリダイゼーションにより決定されたとおり1×1012粒子/mLであった。EGFP−Rac1プラスミドはKlaus Hahn博士からの恵与であり、そして標準的電気穿孔法プロトコルに従ってHeLa細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後36時間に、トランスフェクトしたHeLa細胞を4℃に10分間前冷却し、次いで細胞を104粒子/細胞のMOIのAlexa546標識したAV2FVIIIと4℃で1時間インキュベートした。未結合のウイルスをその後新鮮培地で洗浄することにより除去し、そして、細胞を示された時間37℃に移動することによりウイルス侵入を開始した。細胞をその後4%パラホルムアルデヒド中での固定前にPBSで4回洗浄した。固定した細胞をVectraShieldマウント媒体でマウントし、そしてYokogawa CSU10共焦点顕微鏡で検査した。
およそ2×1012の精製AV2FVIIIビリオンを500μLの複合緩衝液(0.1M炭酸ナトリウム、pH9.3)で希釈し、50nMのAlexa546反応性色素(Invitrogen、カリフォルニア州カールズバッド)と室温で1時間インキュベートしかつ継続混合した。反応を停止するために1mLの10mMトリス(pH8.0)を溶液に添加した。標識ウイルスをその後、Kaludovら(2002)に記述されたところのイオン交換高速液体クロマトグラフィーを使用して精製した。精製した標識ウイルスの最終濃度は、ウイルスDNAプローブを使用するスロットブロットハイブリダイゼーションにより決定されたとおり1×1012粒子/mLであった。EGFP−Rac1プラスミドはKlaus Hahn博士からの恵与であり、そして標準的電気穿孔法プロトコルに従ってHeLa細胞にトランスフェクトした。トランスフェクション後36時間に、トランスフェクトしたHeLa細胞を4℃に10分間前冷却し、次いで細胞を104粒子/細胞のMOIのAlexa546標識したAV2FVIIIと4℃で1時間インキュベートした。未結合のウイルスをその後新鮮培地で洗浄することにより除去し、そして、細胞を示された時間37℃に移動することによりウイルス侵入を開始した。細胞をその後4%パラホルムアルデヒド中での固定前にPBSで4回洗浄した。固定した細胞をVectraShieldマウント媒体でマウントし、そしてYokogawa CSU10共焦点顕微鏡で検査した。
Nox2ノックアウト(KO)マウスへのAAV2媒介性遺伝子移入を評価するin vivo研究
C57BL6背景のNox2 KOおよび同腹仔野生型マウスをメトキシフルランチャンバー中で軽く麻酔した。1×1011粒子のAV2Lucを、鼻吸引により40μLの容量中の20μMドキソルビシン/PBSとともに投与した。マウスを感染後2週間に安
楽死させ、そしてルシフェラーゼ発現アッセイのため肺を収集した。
C57BL6背景のNox2 KOおよび同腹仔野生型マウスをメトキシフルランチャンバー中で軽く麻酔した。1×1011粒子のAV2Lucを、鼻吸引により40μLの容量中の20μMドキソルビシン/PBSとともに投与した。マウスを感染後2週間に安
楽死させ、そしてルシフェラーゼ発現アッセイのため肺を収集した。
精製AAV2ウイルスを使用するin vitroホスホリパーゼA2(PLA2)活性アッセイ
1010精製AV2FVIIIビリオンを、精製ビリオンのキャプシド中のPLA2活性を活性化するために多様な条件で処理した。これは、37℃で15分間の多様な濃度のH2O2とのウイルスのプレインキュベーション、若しくは70℃で2分間の部分的熱変性を包含した。PLA2活性アッセイ前にH2O2を捕捉するため、処理期間の終了時に、H2O2処理したウイルスにカタラーゼを添加した。ビリオンのPLA2活性を、Zadoriら(2001)により記述されたプロトコルを使用する1,2−ジ[1−14C]オレオイルL−3−ホスファチジルコリン(PC)からの放射活性脂肪酸の遊離により測定した。
1010精製AV2FVIIIビリオンを、精製ビリオンのキャプシド中のPLA2活性を活性化するために多様な条件で処理した。これは、37℃で15分間の多様な濃度のH2O2とのウイルスのプレインキュベーション、若しくは70℃で2分間の部分的熱変性を包含した。PLA2活性アッセイ前にH2O2を捕捉するため、処理期間の終了時に、H2O2処理したウイルスにカタラーゼを添加した。ビリオンのPLA2活性を、Zadoriら(2001)により記述されたプロトコルを使用する1,2−ジ[1−14C]オレオイルL−3−ホスファチジルコリン(PC)からの放射活性脂肪酸の遊離により測定した。
MALDI−TOF質量分析を使用するAAV2ビリオンのトリプシン感受性アッセイ
熱変性若しくはH2O2への曝露後のビリオンのキャプシド構造のわずかな変化を、トリプシン消化後のMALDI−TOF質量分析を使用してアッセイした。簡潔には、1010AAV2粒子を、上述されたとおりH2O2(その後20mMトリス、20mM NaCl、pH8.0に対する1時間の透析により除去した)で処理したか、若しくは70℃に加熱し、そしてその後、25mM NH4HCO3(pH8.0)中500ngのブタトリプシンと37℃で16時間インキュベートした。消化された生成物をその後、システイン残基を還元かつ修飾するために10mM DTTおよび55mMのヨードアセトアミドと連続してインキュベートした。元のサンプルの1/20をBruker Biflex III MALDI−TOF MSでアッセイした。システイン修飾の分析のため、個々のシステインを含有するペプチドの理論的m/z値を、修飾なし、ヨードアセトアミド修飾および多様な酸化的(スルフェン酸、スルフィン酸若しくはスルホン酸)修飾を伴い予測した。ExPASy(http://us.expasy.org/tools/peptide−mass.html)を使用してスペクトルを評価し、そして多様なVPタンパク質の理論的スペクトルと比較した。
熱変性若しくはH2O2への曝露後のビリオンのキャプシド構造のわずかな変化を、トリプシン消化後のMALDI−TOF質量分析を使用してアッセイした。簡潔には、1010AAV2粒子を、上述されたとおりH2O2(その後20mMトリス、20mM NaCl、pH8.0に対する1時間の透析により除去した)で処理したか、若しくは70℃に加熱し、そしてその後、25mM NH4HCO3(pH8.0)中500ngのブタトリプシンと37℃で16時間インキュベートした。消化された生成物をその後、システイン残基を還元かつ修飾するために10mM DTTおよび55mMのヨードアセトアミドと連続してインキュベートした。元のサンプルの1/20をBruker Biflex III MALDI−TOF MSでアッセイした。システイン修飾の分析のため、個々のシステインを含有するペプチドの理論的m/z値を、修飾なし、ヨードアセトアミド修飾および多様な酸化的(スルフェン酸、スルフィン酸若しくはスルホン酸)修飾を伴い予測した。ExPASy(http://us.expasy.org/tools/peptide−mass.html)を使用してスペクトルを評価し、そして多様なVPタンパク質の理論的スペクトルと比較した。
ビリオンのエンドソームエスケープについてのアッセイ
30%イオジキサノールクッション(cushion)を使用するプロトコルを、細胞質中のAAV2ビリオンをエンドソームの内側のものから分離するため開発した。簡潔には、ウイルスを除去すること、細胞を洗浄すること、および細胞を37℃に移動することの前に、HeLa細胞を1,000粒子/細胞のAAV2と4℃で30分間インキュベートした。細胞をその後示された時間インキュベートしかつPNSを調製した。総容量500μlのPNSをその後250μlの30%イオジキサノールの上に負荷し、次いで100,000×gで1時間遠心分離した。上清およびペレット内のウイルスゲノムをリアルタイムPCRにより定量した。
30%イオジキサノールクッション(cushion)を使用するプロトコルを、細胞質中のAAV2ビリオンをエンドソームの内側のものから分離するため開発した。簡潔には、ウイルスを除去すること、細胞を洗浄すること、および細胞を37℃に移動することの前に、HeLa細胞を1,000粒子/細胞のAAV2と4℃で30分間インキュベートした。細胞をその後示された時間インキュベートしかつPNSを調製した。総容量500μlのPNSをその後250μlの30%イオジキサノールの上に負荷し、次いで100,000×gで1時間遠心分離した。上清およびペレット内のウイルスゲノムをリアルタイムPCRにより定量した。
C298Sキャプシド変異体AAV2の生成
C289を含有するキャプシドドメインを、Kpn Iを使用してpAV2RepCapからpBluescript II SK(Stratagene、カリフォルニア州ラホヤ)にクローン化した。結果として生じるプラスミド、pBluescriptAV2Capを、QuickChange部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)を使用してC289S突然変異誘発を実施するのに使用した。C289S突然変異をもつキャプシドドメインをその後、Kpn Iを使用してpAV2RepCapに戻しクローン化して、pAV2RepCapC289Sをもたらした。突然変異をその後配列決定により確認した。ルシフェラーゼをコードする組換えAAV2を、それぞれ野生型若しくはC298Sキャプシドを提供するpAV2RepCap若しくはpAV2RepCapC289Sを用い、Yanら(2002)に記述された3プラスミドトランスフェク
ションプロトコルに従って生成した。組換えAAV2を、Yanら(2002)に以前に記述された標準的プロトコルを使用して双方のベクターから精製した。ウイルス力価をリアルタイムPCRおよびスロットブロットハイブリダイゼーションにより決定した。精製ウイルスの力価は、wtキャプシドをもつAAV2について6.5×1011粒子/ml、およびAAV2−C289Sキャプシドについて5×1011粒子/mlであった。
C289を含有するキャプシドドメインを、Kpn Iを使用してpAV2RepCapからpBluescript II SK(Stratagene、カリフォルニア州ラホヤ)にクローン化した。結果として生じるプラスミド、pBluescriptAV2Capを、QuickChange部位特異的突然変異誘発キット(Stratagene)を使用してC289S突然変異誘発を実施するのに使用した。C289S突然変異をもつキャプシドドメインをその後、Kpn Iを使用してpAV2RepCapに戻しクローン化して、pAV2RepCapC289Sをもたらした。突然変異をその後配列決定により確認した。ルシフェラーゼをコードする組換えAAV2を、それぞれ野生型若しくはC298Sキャプシドを提供するpAV2RepCap若しくはpAV2RepCapC289Sを用い、Yanら(2002)に記述された3プラスミドトランスフェク
ションプロトコルに従って生成した。組換えAAV2を、Yanら(2002)に以前に記述された標準的プロトコルを使用して双方のベクターから精製した。ウイルス力価をリアルタイムPCRおよびスロットブロットハイブリダイゼーションにより決定した。精製ウイルスの力価は、wtキャプシドをもつAAV2について6.5×1011粒子/ml、およびAAV2−C289Sキャプシドについて5×1011粒子/mlであった。
NADPHオキシダーゼ欠損マウスおよび皮膚線維芽細胞。
これらの研究で使用したNox1およびNox2ノックアウト系統はPollockら(1995)およびGavazziら(2000)に記述されている。全部の比較研究において、KOおよびWT同腹仔対照を使用した。マウス皮膚線維芽細胞はBasuら(2001)に記述されたとおり新生マウスから生成した。簡潔には、初代皮膚線維芽細胞の培養物を樹立するため、皮膚を新生マウスから取り出しそして0.25%トリプシン−EDTA中4℃で一夜インキュベートした。皮膚の真皮層をその後表皮から分離し、そしてDMEM中0.2%コラゲナーゼ中37℃で1時間インキュベートし、次いで激しく振とうして線維芽細胞を遊離させた。遊離した線維芽細胞をその後ペレットにし、再懸濁し、そして10%FBS、2mM L−グルタミンおよび抗生物質を補充したDMEM中の培養物で維持した。
これらの研究で使用したNox1およびNox2ノックアウト系統はPollockら(1995)およびGavazziら(2000)に記述されている。全部の比較研究において、KOおよびWT同腹仔対照を使用した。マウス皮膚線維芽細胞はBasuら(2001)に記述されたとおり新生マウスから生成した。簡潔には、初代皮膚線維芽細胞の培養物を樹立するため、皮膚を新生マウスから取り出しそして0.25%トリプシン−EDTA中4℃で一夜インキュベートした。皮膚の真皮層をその後表皮から分離し、そしてDMEM中0.2%コラゲナーゼ中37℃で1時間インキュベートし、次いで激しく振とうして線維芽細胞を遊離させた。遊離した線維芽細胞をその後ペレットにし、再懸濁し、そして10%FBS、2mM L−グルタミンおよび抗生物質を補充したDMEM中の培養物で維持した。
結果
アデノ随伴ウイルス(AAV)は遺伝子治療ベクターとしてのそれ使用について最も公知の小型一本鎖DNAパルボウイルスである(Carter、2005)。その単純な4.7kbのゲノムは、そのゲノムの複製およびキャプシド形成に必要とされる2種のウイルス遺伝子RepおよびCapをコードする。組換えAAV(rAAV)は遺伝子治療ベクターとして広範に研究されており、そしてこのベクターを使用する臨床試験が急速に増加している。であるから、AAV感染の過程は、これまで同定された10を上回る血清型の生物学を詳細に分析するための試みにおいてますます研究されつつある。今日まで最も十分に研究された血清型はAAV2型である。ウイルスの型の多くでのように、UV照射若しくはH2O2によるレドックスストレスがAAV2形質導入を増大させることが知られており、そしてN−アセチル−L−システイン(NAC)のような抗酸化薬剤が形質導入を阻害する(Sanliogluら、2004;Sanliogluら、1999)。しかしながら、この観察結果の原因であるレドックスで調節される事象は未知のままである。下述されるとおり、rAAV−2のROS媒介性の形質導入の原因である機構を詳細に分析した。
アデノ随伴ウイルス(AAV)は遺伝子治療ベクターとしてのそれ使用について最も公知の小型一本鎖DNAパルボウイルスである(Carter、2005)。その単純な4.7kbのゲノムは、そのゲノムの複製およびキャプシド形成に必要とされる2種のウイルス遺伝子RepおよびCapをコードする。組換えAAV(rAAV)は遺伝子治療ベクターとして広範に研究されており、そしてこのベクターを使用する臨床試験が急速に増加している。であるから、AAV感染の過程は、これまで同定された10を上回る血清型の生物学を詳細に分析するための試みにおいてますます研究されつつある。今日まで最も十分に研究された血清型はAAV2型である。ウイルスの型の多くでのように、UV照射若しくはH2O2によるレドックスストレスがAAV2形質導入を増大させることが知られており、そしてN−アセチル−L−システイン(NAC)のような抗酸化薬剤が形質導入を阻害する(Sanliogluら、2004;Sanliogluら、1999)。しかしながら、この観察結果の原因であるレドックスで調節される事象は未知のままである。下述されるとおり、rAAV−2のROS媒介性の形質導入の原因である機構を詳細に分析した。
エンドソーム輸送および細胞内プロセシングがAAV2形質導入の律速段階とみなされている(Duanら、2000;Hansenら、2000;Hauckら、2004)。この情況において、プロテアソーム阻害は、今までのところ不十分に定義される機構によりウイルスの核取り込みを増大させることによりin vitroおよびin vivoでAAV形質導入を劇的に高める。AAV2のエンドソームプロセシングが非効率的でありかつH2O2がAAV2形質導入を高めることが既知であることを考えれば、エンドソームのROSが感染後のビリオンのプロセシングに重要でありうる。この目的のため、精製カタラーゼをエンドソームに負荷することによりエンドソームのH2O2の消失がAAV2の形質導入を阻害することができるかどうかを試験した。HeLa細胞上の培地への1mg/mLカタラーゼの添加は、精製したエンドソームの内側のプロナーゼ非感受性カタラーゼの蓄積につながった(図1A)。事実、カタラーゼのエンドソーム負荷は、組換えルシフェラーゼ導入遺伝子の発現により反映されるとおり、IB3(形質転換気管支上皮細胞株)およびHeLa細胞双方のAAV2形質導入を有意に阻害した(図2A)。顕著には、カタラーゼ負荷は、AAV2形質導入を高めるプロテアソーム阻害薬剤の能力もまた双方の細胞株で完全に消失させた(Yanら、2004)(図2A)。エンドソームのカタラーゼ負荷の阻害効果は損なわれたウイルス取り込みによらなかった(図1B)
。感染の間および後の多様な時点でカタラーゼを負荷する時間経過研究は、カタラーゼがウイルス感染の比較的早い段階でAAV2形質導入を阻害するよう作用することを示唆した(図2B)。感染後30分までに、ウイルス形質導入を阻害するカタラーゼ負荷の能力は有意に減少し、そして感染後60分までに完全に非存在となった。これは、H2O2が感染過程の早期に形質導入を高めるよう作用したことを示唆した。
。感染の間および後の多様な時点でカタラーゼを負荷する時間経過研究は、カタラーゼがウイルス感染の比較的早い段階でAAV2形質導入を阻害するよう作用することを示唆した(図2B)。感染後30分までに、ウイルス形質導入を阻害するカタラーゼ負荷の能力は有意に減少し、そして感染後60分までに完全に非存在となった。これは、H2O2が感染過程の早期に形質導入を高めるよう作用したことを示唆した。
細胞シグナル伝達で重要なエンドソームのH2O2の主供給源は、最近、・O2 −を産生するHADPHオキシダーゼであると同定された(Liら、2006)。この情況で、・O2 −不均化はH2O2形成につながり、そして、この反応は多くのエンドソーム区画で通常見出される低pHで非常に速い速度で自発的に起こり得る(Bielskiら、1985)。従って、AAV2感染は、エンドソームのNox活性およびこれゆえにスーパーオキシド産生を刺激しうる。ルシゲニンに基づく化学発光アッセイ(Liら、2006)を使用して、AAV2感染がイオジキサノール分画したエンドソーム中のエンドソームのNADPH依存性の・O2 −産生を促進したかどうかを決定した。事実、NADPH依存性の・O2 −産生の2〜3倍増大がAAV感染後の双方の細胞株の小胞画分で見られた(図2C〜D)。加えて、エンドソーム画分中のウイルスで誘導されたNADPH依存性の・O2 −産生は、NADPHオキシダーゼの既知の阻害薬剤DPIにより阻害された(データは示されない)。これらの知見は、エンドソーム区画中でのNox活性化がAAV2感染後に起こることを示唆した。興味深いことに、AAV2感染に対するこれら2種の細胞株の許容性およびエンドソーム区画中のNADPH依存性の・O2 −を生成する能力で相関が観察され;HeLa細胞の小胞画分はIB3細胞のものより100倍以上高レベルの・O2 −を生成し、これはAAV2ベクターでの形質導入のそれらの相対レベルと直接相関した(図2AおよびC〜D)。これらの知見もまた、エンドソームのROSがAAV2感染に正に影響するという仮説を裏付けた。
これまでのデータは、エンドソーム区画中のH2O2がAAV2感染に機能上重要であったことを示唆した。しかしながら、・O2 −およびH2O2がヒドロキシルラジカルを形成するように反応し得ることを考えれば、H2O2がAAV2のエンドソームプロセシングを媒介する機能上重要なROSであったかどうかは不明であった。この疑問を扱うため、精製したスーパーオキシドジスムターゼ−1(SOD1)および/若しくはカタラーゼを用いてエンドソーム負荷実験を実施した。・O2 −がエンドソーム区画中のAAV2プロセシングに決定的に重要であった場合には、SOD1による・O2 −→H2O2の高められた転化がAAV2形質導入を阻害するであろうという仮説を立てた。しかしながら、エンドソームのNox媒介性の・O2 −産生をクエンチすることが既知の条件(Liら、2006b)下での精製SOD1のエンドソームへの負荷は、プロテアソーム阻害薬剤の非存在若しくは存在下でAAV2形質導入を変えることに失敗した(図2E)。これらの知見は、・O2 −が増殖性AAV2感染に必要でないこと、および・O2 −→H2O2の自発的不均化の速度がAAV2プロセシングに重要なエンドソーム区画中で制限しないことを示唆した。
Rac1 GTPアーゼは、Nox1およびNox2双方の酵素複合体の活性化の補助因子であることが報告されている(Lambeth、2004;Parkら、2004)。加えて、AAV2感染はRac1−GTPの活性化を刺激し、また、ドミナントネガティブなN17Rac1変異体はAAV2感染を有意に阻害する(Sangliogluら、2000)。これらの知見は、AAV2感染におけるRac1で調節されるNox活性化の潜在的重要性を裏付ける。この目的のため、Rac1が結合したエンドソームにAAV2が直接エンドサイトーシスされたかどうかを、GFP−Rac1およびAlexa546標識AAV2を使用して評価した。ウイルス感染の非存在下で、Rac1は主として細胞質全体に均一に分布された(図3A)。ウイルス感染後2分で開始して、EGFP−Rac1局在化が、Alexa546標識AAV2と共局在化してエンドソーム中で増大
することが見られ、そして、この共局在化は感染後30分までに核周囲領域(AAV2を蓄積することが既知の領域)の小胞構造に漸進的に移動した(図3B〜D)。興味深いことに、定量的形態計測を使用して、小胞のAAV2−Rac1共局在化の程度の減少が感染後2分(>95%)から10分(約60%)まで観察された。これらの形態学的観察結果は、AAV2を含有する新たに形成された小胞中のNox活性化と矛盾しない、Rac1とAAV2のエンドソームプロセシングの間の緊密な関連を裏付ける。
することが見られ、そして、この共局在化は感染後30分までに核周囲領域(AAV2を蓄積することが既知の領域)の小胞構造に漸進的に移動した(図3B〜D)。興味深いことに、定量的形態計測を使用して、小胞のAAV2−Rac1共局在化の程度の減少が感染後2分(>95%)から10分(約60%)まで観察された。これらの形態学的観察結果は、AAV2を含有する新たに形成された小胞中のNox活性化と矛盾しない、Rac1とAAV2のエンドソームプロセシングの間の緊密な関連を裏付ける。
Rac1はNox1およびNox2の既知の活性化因子であるため、AAV2感染後に生成されるROSがエンドソーム区画中のNox1および/若しくはNox2いずれかの活性化の結果であったという仮説を立てた。この仮説を扱うため、Nox1−/−およびNox2−/−ノックアウト初代マウス皮膚線維芽細胞(PMDF)のAAV2形質導入が野生型同腹仔の対照PMDFに比較して低下されたかどうかを評価した。これらの研究からの結果(図4A)は、Nox1の存在がPMDFのAAV2形質導入に有意に影響しなかったことを示し;基礎およびプロテアソーム阻害薬剤で誘導したAAV2形質導入は、Nox1+/+およびNox1−/−PMDFの間で同様であり、また、カタラーゼのエンドソーム負荷もまたこれらの条件の全部で形質導入を阻害した。対照的に、プロテアソーム阻害薬剤の非存在および存在下でのAAV2形質導入は、Nox2+/+同腹仔対照細胞と比較してNox2−/−PMDFで有意に(p<0.001)低下された(図4A)。この低下は、ウイルスゲノムコピーの取り込みの差異がNox2+/+およびNox2−/−PMDFの間で観察されなかった(図4B)ため、ノックアウト細胞中の損なわれたウイルス取り込みによらなかった。Nox2+/+PMDFと対照的に、エンドソームのカタラーゼ負荷はNox2−/−PMDFでのAAV2形質導入を有意に変えず(図4A)、Nox2の欠如が、AAV2のエンドソームプロセシングを助長するのに必要とされるエンドソームのH2O2の大多数を消失させるのに十分であったことを示唆した。Nox2−/−PMDFは、AAV2感染後のエンドソーム画分でNADPH依存性の・O2 −産生を誘導することにもまた失敗した一方、2倍の誘導がNox2+/+PMDFを見られた(図4C〜D)。
AAV2形質導入でのNox2の重要性をさらに確証するため、付加的なin vivo実験を肺への組換えAAV2送達で実施した。初代PMDFで見られたとおり、ウイルスの鼻送達後の肺のAAV2形質導入は、Nox2+/+同腹仔に比較してNox2−/−マウスでの約5倍より低いレベルのルシフェラーゼ導入遺伝子発現を示した(図4E)。これらの知見は、Nox2がAAV2感染に応答してのエンドソームのROS産生の主供給源であること、および、Nox2に駆動されるROSがAAV2形質導入に機能上重要であることを強く示唆する。NADPHオキシダーゼもまた形質転換細胞での形質導入に必要とされたことを確認するため、HeLa細胞のAAV2形質導入をDPI(NADPHオキシダーゼの既知の阻害薬剤)の存在若しくは非存在下で実施した。これらの実験からの知見は、DPIがプロテアソーム阻害薬剤の非存在(100倍)および存在(1000倍)下でAAV2形質導入を効果的に阻害したことを明瞭に示した(図4F)。対照的に、ミトコンドリア呼吸(アンチマイシンAおよびロテノン)若しくは一酸化窒素合成酵素(NG−モノメチル−L−アルギニン酢酸塩、L−NMMA)の2種の阻害薬剤はAAV2形質導入に有意に影響せず(図3G)、ROS産生のこれらの経路が関与しなかったことを示唆した。
これまでの研究は、Rac1およびNox2が、レドックス依存性形質導入を助長するように感染後にAAV2含有エンドソームに補充されること、ならびに、AAV2含有エンドソームのカタラーゼ負荷がこの過程を阻害したことを示唆した。これゆえに、Rac1、Nox2およびエンドソームに負荷したウシカタラーゼは、全部、感染後にAAV2ウイルスを含むエンドソーム区画に分画されるはずである。これを確認するため、これらの成分のそれぞれを、培地中の外因性に補充したウシカタラーゼの存在および非存在下で
感染後にHeLa細胞の細胞内分画により位置推定した。これらの研究からの結果は、実際にRac1、Nox2、ウシカタラーゼおよびウイルスゲノムが全部、ウイルス感染により誘導される最高のNADPHオキシダーゼ活性と一致して、エンドソーム画分に分離されたことを示した(図5)。対照的に、内因性の細胞カタラーゼは、カタラーゼが見出されるより高密度のペルオキシソームと一致して、より高密度の画分(#7)に分離された。これらの研究は、カタラーゼ負荷が、感染後のこの早い時点(20分)でエンドソーム区画中のNox活性若しくはウイルス蓄積に影響を及ぼさなかったこともまた明瞭に示した。さらに、AAV2感染後に、エンドソーム画分中のNox2およびRac1双方の顕著な増大が見られ、これらの因子が感染後にAAV2含有エンドソームに補充されるという事実を裏付けた。
感染後にHeLa細胞の細胞内分画により位置推定した。これらの研究からの結果は、実際にRac1、Nox2、ウシカタラーゼおよびウイルスゲノムが全部、ウイルス感染により誘導される最高のNADPHオキシダーゼ活性と一致して、エンドソーム画分に分離されたことを示した(図5)。対照的に、内因性の細胞カタラーゼは、カタラーゼが見出されるより高密度のペルオキシソームと一致して、より高密度の画分(#7)に分離された。これらの研究は、カタラーゼ負荷が、感染後のこの早い時点(20分)でエンドソーム区画中のNox活性若しくはウイルス蓄積に影響を及ぼさなかったこともまた明瞭に示した。さらに、AAV2感染後に、エンドソーム画分中のNox2およびRac1双方の顕著な増大が見られ、これらの因子が感染後にAAV2含有エンドソームに補充されるという事実を裏付けた。
AAV2のキャプシドは、それらのN末端領域が異なる3種のタンパク質、VP1、VP2およびVP3から構成される(図6H)。感染後にAAVキャプシドで発生する機能上決定的に重要なプロセシング事象の詳細な理解は不明なままである。これらの研究で見られるAAV2形質導入に対するエンドソームのROSの機能的重要性を考え、エンドソームのROSがAAV2ビリオンをプロセシングするのに重要であったという仮説を立てた。
AAV2ビリオンの大きな形態学的変化が、50ないし1000nMのH2O2での処理後に電子顕微鏡検査を使用して観察され得なかった(データは示されない)ため、レドックス媒介性のAAV2キャプシド変化は、ありそうには非常にわずかな構造改変であった。この目的のため、MALDI−TOF MSトリプシン感受性アッセイを、H2O2処理により誘導されるAAV2ビリオンの小さな構造変化を分析するために開発した。無傷のAAV2ビリオンはトリプシン消化に対し極めて抵抗性であり、そしてMSにより認識可能なトリプシンフラグメントを生じさせなかった(図6A)。対照的に、70℃で5分間の精製AAV2ビリオンの熱処理は、完全なトリプシン消化、およびVPアミノ酸配列の>90%を包括するVPのトリプシンペプチドフラグメントの大多数のその後の同定を見込んだ(図6B)。顕著には、100nMのH2O2でのAAV2ビリオンの前処理は、熱変性させたウイルスで見られたペプチドのサブセットを遊離する、有意に高められたトリプシン消化をもたらした(図6C)。それらがウイルスキャプシドタンパク質の一次配列に対応するところのH2O2で遊離されるトリプシンペプチドフラグメントの対応する位置を図6Hおよび図7に示す。興味深いことに、これらのペプチドはいくつかの大きな領域、すなわちPLA2活性を伴うVP1の独特のN末端中の1個(図6H)およびビリオン中の提案された高い表面接近可能性をもつアミノ酸残基(Xieら、2002)に隣接する2個に集中される。
これらの知見は、AAV2の細胞内プロセシングにおけるエンドソームのH2O2の機能のいくつかの重要な関連を示唆する。
AAV2ビリオンの構造変化を媒介する原因であるH2O2により誘導される分子改変を詳細に分析するため、ウイルスキャプシド上のシステイン残基のレドックス修飾がこの機構を助長しうるという仮説を立てた。移動される電子の数に依存して、チオール基のレドックス修飾は、他者に加えてジスルフィド結合、スルフェン酸、スルフィン酸、スルホン酸を包含する多様な産物をもたらし得る(Pagetら、2003)。ヨードアセトアミドシステイン修飾およびトリプシン消化を使用して、AAV2 cap ORF中の5個のシステインの状態(図6H)を、MALDI−TOF MSにより無傷、熱変性若しくはH2O2処理したビリオンで分析した(図6、8および9)。結果は、熱変性ビリオン中で全部のシステインがヨードアセトアミドにより修飾され(図6BおよびE、図8ならびに図9)、また、システインの標識は無傷のビリオンで観察されなかった(図6AおよびD、図8ならびに図9)ことを示した。対照的に、100nMのH2O2でのビリオ
ンの処理は、VP1(C289)、VP2(C152)およびVP3(C87)に共通の単一システインのチオール基でのスルホン酸(R−SO3 −)修飾につながった(図6F)。加えて、1000nMのH2O2でのAAV2ビリオンの処理は、ヨードアセトアミド修飾を同時に減少させつつこの特定のシステインのスルホン酸修飾を増大させた(図6G)。
ンの処理は、VP1(C289)、VP2(C152)およびVP3(C87)に共通の単一システインのチオール基でのスルホン酸(R−SO3 −)修飾につながった(図6F)。加えて、1000nMのH2O2でのAAV2ビリオンの処理は、ヨードアセトアミド修飾を同時に減少させつつこの特定のシステインのスルホン酸修飾を増大させた(図6G)。
対照的に、H2O2処理したビリオン内のC482(VP1配列に参照される)は、ヨードアセトアミド修飾のみ示した(図8〜9)。キャプシド中に残存するシステインを含有する対応するペプチドはビリオンのH2O2処理後に検出されず(図9)、これらの領域がH2O2処理後に効率的なトリプシン消化のために露出されなかったことを示唆した。対照的に、スルホン酸を形成するシステイン(C289)およびレドックス修飾されないシステイン(C482)は、100nMのH2O2での処理後にトリプシン消化に到達可能なキャプシドの領域に配置され、それぞれペプチドFHCHFSPRおよびNWLPGPCYRをもたらした(図6Hおよび図7)。C289およびC482を含有するVP2の領域もまた、キャプシド中で表面到達可能なアミノ酸に隣接することが提案されている(Xieら、2002)(図6H)。
VP1キャプシドタンパク質中のN末端領域が、ホスホリパーゼA2(PLA2)様モチーフ、および大部分のパルボウイルスのあいだで高度に保存されている脂質鎖を切断するための活性を含有することが報告されている(Girodら、2002;Zadoriら、2001)。AAV2中で見出されるPLA2モチーフ中の突然変異は、ウイルス侵入後の1段階でwt AAV2の複製を有意に損なう(Girodら、2002;Zadoriら、2001)。PLA2変異体AAV2若しくはブタパルボウイルスが細胞に効果的に進入しかつ核周囲の後期エンドソーム/リソゾーム領域に効率的に輸送するが、しかしウイルスDNA複製を開始することに失敗するという事実に基づけば、VP1のPLA2活性は核へのウイルスのエンドソームプロセシングに決定的に重要でありうる。AAV2キャプシドの電子低温顕微鏡検査は、VP1のN末端が無傷のビリオンの内側に埋められ、そして部分的変性がこの領域およびPLA2活性を露出させるために必要とされることを示した(Girodら、2002;Kronenbergら、2005;Kronenら、2001;Zadoriら、2001)。エンドソームの酸性化がマウス微小ウイルス(パルボウイルス科の1メンバー)のN−VP1の露出を助長することが報告された(Maniら、2006)とは言え、AAV2のPLA2をin vivoで活性化する機構は明確でない。
AAV2感染によるVP1のN末端のレドックスに指図される曝露が、VP1のPLA2活性を遊離するビリオンのコンホメーション変化の指図において重要でありうるという仮説を立てた。この仮説を検証するため、H2O2処理が精製組換えAAV2ビリオン中でウイルスPLA2活性を誘導し得たかどうかを検討した。ウイルスを、30:1から1,200:1までの範囲にわたるH2O2:ビリオン比にて増大する濃度のH2O2(25ないし.1,000nM)で処理した。処理したビリオンを、L−3−ホスファチジルコリン(1,2−ジ[1−14C]オレオイル)(PLA2の基質)とのインキュベーションによりPLA2活性について評価した。興味深いことに、PLA2活性は、50から500nMまでの範囲にわたるH2O2の濃度でAAV2ビリオンから移動された(図6A)。ビリオンのトリプシン感受性を最大に誘導した濃度でもまたあった100nMのH2O2という至適の濃度で、PLA2活性は、こうした活性を評価するのに以前に使用されていた部分的なビリオン熱変性後に見られたものより大きかった(図6I、レーン4をレーン8と比較されたい)。これらの結果は、H2O2濃度の比較的狭い窓がAAV2ビリオン中でPLA2活性を活性化し得たことを示した。
これまでの研究は、PLA2活性を誘導するAAV2キャプシドのコンホメーション変
化をH2O2処理が促進することを示した。キャプシドPLA2のレドックス依存性の活性化がビリオンのエンドソームエスケープに重要であったという仮説を立てた。この仮説を検証するため、遊離の細胞質ビリオンをエンドソームの内側のものから分離するためのイオジキサノールクッション(図10A、上図)。再構成実験を使用して、PBS若しくはHeLa細胞核後上清(PNS)をスパイクした(spiked)精製ビリオンが、高速遠心分離(100,000×g)後に30%イオジキサノールを通って大部分がペレット化した(pelleted)ことが示された(図10A、下図)。対照的に、AAV2に1時間感染させたHeLa細胞からのPNS中のビリオンの大多数(>85%)は上清中に留まった一方、分画前のPNSへの0.1%Triton X−100の添加は>95%のビリオンをペレット中に遊離した(図10A、下図)。AAV2のエンドソームエスケープでのH2O2の重要性を研究するため、この系をカタラーゼのエンドソーム負荷とともに利用した。結果は、エンドソームからのウイルスエスケープ(すなわちペレット中の%)がカタラーゼの非存在下で感染後1時間に最高点に達した(約15%)一方、カタラーゼ負荷がウイルスエスケープを約3倍有意に阻害した(図8B)ことを示した。対照(カタラーゼなし)サンプル中の感染後2時間の細胞質画分中の遊離ウイルスの減少は、ありそうには遊離の細胞質ビリオンの迅速な核輸送を表す。これらの結果は、AAV2形質導入に対するカタラーゼの阻害効果と矛盾せず、そして、ビリオンのH2O2で助長されるプロセシングがウイルスのエンドソームエスケープに重要であるという仮説を裏付ける。
化をH2O2処理が促進することを示した。キャプシドPLA2のレドックス依存性の活性化がビリオンのエンドソームエスケープに重要であったという仮説を立てた。この仮説を検証するため、遊離の細胞質ビリオンをエンドソームの内側のものから分離するためのイオジキサノールクッション(図10A、上図)。再構成実験を使用して、PBS若しくはHeLa細胞核後上清(PNS)をスパイクした(spiked)精製ビリオンが、高速遠心分離(100,000×g)後に30%イオジキサノールを通って大部分がペレット化した(pelleted)ことが示された(図10A、下図)。対照的に、AAV2に1時間感染させたHeLa細胞からのPNS中のビリオンの大多数(>85%)は上清中に留まった一方、分画前のPNSへの0.1%Triton X−100の添加は>95%のビリオンをペレット中に遊離した(図10A、下図)。AAV2のエンドソームエスケープでのH2O2の重要性を研究するため、この系をカタラーゼのエンドソーム負荷とともに利用した。結果は、エンドソームからのウイルスエスケープ(すなわちペレット中の%)がカタラーゼの非存在下で感染後1時間に最高点に達した(約15%)一方、カタラーゼ負荷がウイルスエスケープを約3倍有意に阻害した(図8B)ことを示した。対照(カタラーゼなし)サンプル中の感染後2時間の細胞質画分中の遊離ウイルスの減少は、ありそうには遊離の細胞質ビリオンの迅速な核輸送を表す。これらの結果は、AAV2形質導入に対するカタラーゼの阻害効果と矛盾せず、そして、ビリオンのH2O2で助長されるプロセシングがウイルスのエンドソームエスケープに重要であるという仮説を裏付ける。
in vitro研究は、H2O2媒介性のAAV2形質導入を制御するレドックス事象におけるCys289(VP1配列に参照される)のスルホン酸修飾を関係させる。このシステインがin vivoでAAV2感染にどのように影響を及ぼすかをより良好に理解するために、C289Sキャプシド突然変異をもつ組換えAAV2ウイルスを製造し、そしてHeLa細胞中の形質導入のそのレドックス感受性について試験した。事実、AAV2−C298Sウイルスは、wtキャプシドを含有する組換えウイルスに比較して、有意に低下された形質導入効率および損なわれたエンドソームエスケープを示した(図10C)。重要なことに、AAV2−C298Sウイルスでの残余の形質導入はカタラーゼ負荷に感受性でなく(図10C)、この変異体ウイルスへの感染がもはやレドックス感受性でなかったことを示唆した。対照として、われわれは、ビリオンのH2O2処理後に露出されなかったシステイン(C361)もまた変異させた。組換えAAV2−C361S変異体ルシフェラーゼウイルスでの形質導入の分析は、導入遺伝子発現が野生型キャプシドをもつウイルスのものと有意に異ならなかったことを示した(図10C)。C298Sキャプシド突然変異もカタラーゼ負荷も、感染後のPNS中のウイルスゲノムの総量により反映されるとおり、ウイルス侵入の効率を変えなかった(データは示されない)。キャプシドのレドックス依存性プロセシングに重要であるC298を裏付けて、精製AAV2−C298Sビリオンのin vitro H2O2処理は、wtキャプシドを含有するビリオンに比較してPLA2活性を誘導することに失敗した(図10D、レーン12〜16をレーン7〜11と比較されたい)。興味深いことに、熱変性C289Sビリオンが野生型ビリオンに匹敵するレベルのPLA2活性を表したため、C298S突然変異はPLA2ドメインを機能上破壊しなかった(図10D、レーン6をレーン5と比較されたい)。これらの知見は、C298がキャプシドPLA2ドメインのレドックス活性化に重要であること、および活性化のこの過程がAAV2のエンドソームエスケープを促進することを示す。
電子低温顕微鏡検査を使用するAAV2キャプシドの構造分析は、PLA2モチーフを含有するVP1のN末端のが無傷のビリオンの内側に埋められた球状構造として構成されていることを示した(Girodら、2002)。部分的変性が、キャプシド上の5回軸チャンネルを通るこの領域の露出(Girodら、2002)およびウイルスキャプシドPLA2のin vitro活性化(Kronenbergら、2005)に必要とされ
る。AAV2キャプシドによるPLA2活性化が核移行に必要とされるウイルスプロセシングに不可欠であることが提案されている(Kronenbergら、2005)とは言え、AAV2 PLA2のin vivo活性化の機構は不明である。これらの研究は、エンドソームのNADPHオキシダーゼがAAV2による増殖性感染をそのキャプシドの酸化により助長する機構を発見した。この情況で、極めて低レベルのH2O2は、キャプシド内の独特なシステイン(1個若しくは複数)でスルホン酸を形成することによりビリオンを構造的に変えるように作用し得る。このレドックス媒介性事象は、順に、エンドソームエスケープを助長するのに重要なビリオンからPLA2活性を遊離する。キャプシドはおよそ60個のVPタンパク質サブユニットから構成される(その全部がC289を含有する)ため、何個のシステインがPLA2活性を遊離するために酸化されなければならいかは現在不明である。しかしながら、100nM H2O2処理後のビリオンの定量的システイン標識は、キャプシド中でスルホン酸を形成するシステインの数が極めて少ないかも知れない(<5%、データは示されない)ことを示唆する。ウイルスキャプシドに対するレドックス依存性の構造変化のさらなる解明は、遺伝子治療のためのパルボウイルスの改良につながりうる。さらに、これらの研究をB19のようなPLA2モチーフをまた含有する病原性パルボウイルスに拡大することは、抗ウイルス薬としての抗酸化薬剤の開発においてもまた補助しうる。
る。AAV2キャプシドによるPLA2活性化が核移行に必要とされるウイルスプロセシングに不可欠であることが提案されている(Kronenbergら、2005)とは言え、AAV2 PLA2のin vivo活性化の機構は不明である。これらの研究は、エンドソームのNADPHオキシダーゼがAAV2による増殖性感染をそのキャプシドの酸化により助長する機構を発見した。この情況で、極めて低レベルのH2O2は、キャプシド内の独特なシステイン(1個若しくは複数)でスルホン酸を形成することによりビリオンを構造的に変えるように作用し得る。このレドックス媒介性事象は、順に、エンドソームエスケープを助長するのに重要なビリオンからPLA2活性を遊離する。キャプシドはおよそ60個のVPタンパク質サブユニットから構成される(その全部がC289を含有する)ため、何個のシステインがPLA2活性を遊離するために酸化されなければならいかは現在不明である。しかしながら、100nM H2O2処理後のビリオンの定量的システイン標識は、キャプシド中でスルホン酸を形成するシステインの数が極めて少ないかも知れない(<5%、データは示されない)ことを示唆する。ウイルスキャプシドに対するレドックス依存性の構造変化のさらなる解明は、遺伝子治療のためのパルボウイルスの改良につながりうる。さらに、これらの研究をB19のようなPLA2モチーフをまた含有する病原性パルボウイルスに拡大することは、抗ウイルス薬としての抗酸化薬剤の開発においてもまた補助しうる。
要約
ウイルスは、細胞の自然免疫機構を不活性すること、若しくはこうした機構をウイルスの生存の利益に適合させることのいずれかにより、宿主細胞を効果的に感染させるように進化した。食細胞のNADPHオキシダーゼ(Nox2gp91phox)由来の活性酸素種(ROS)は、典型的には病原体破壊との関連する自然免疫応答の一例である。本明細書に記述されるとおり、AAV2への感染はNox2依存性のエンドソームのROS産生を刺激し、そして結果として生じるH2O2をビリオンの増殖性エンドソームプロセシングを助長するために利用した。MALDI−TOF MS分析は、nM量のH2O2が、パルボウイルス感染に決定的に重要であることが示されたホスホリパーゼA2モチーフの活性化につながるビリオン内のVP1のN末端キャプシドタンパク質の露出を促進したことを示した。それらの知見は、ウイルスがエンドソーム中でそのキャプシドを増殖性にプロセシングするのに宿主経路を利用し得る新たな機構を示し、そしてウイルス−宿主感染への洞察を提供する。
ウイルスは、細胞の自然免疫機構を不活性すること、若しくはこうした機構をウイルスの生存の利益に適合させることのいずれかにより、宿主細胞を効果的に感染させるように進化した。食細胞のNADPHオキシダーゼ(Nox2gp91phox)由来の活性酸素種(ROS)は、典型的には病原体破壊との関連する自然免疫応答の一例である。本明細書に記述されるとおり、AAV2への感染はNox2依存性のエンドソームのROS産生を刺激し、そして結果として生じるH2O2をビリオンの増殖性エンドソームプロセシングを助長するために利用した。MALDI−TOF MS分析は、nM量のH2O2が、パルボウイルス感染に決定的に重要であることが示されたホスホリパーゼA2モチーフの活性化につながるビリオン内のVP1のN末端キャプシドタンパク質の露出を促進したことを示した。それらの知見は、ウイルスがエンドソーム中でそのキャプシドを増殖性にプロセシングするのに宿主経路を利用し得る新たな機構を示し、そしてウイルス−宿主感染への洞察を提供する。
ウイルスと細胞のレドックス均衡の間の相互作用でのさらなる解明は、多様なウイルスの生活環の理解を改良するが、しかしまた、病原性ウイルスの複製を阻害する、若しくは遺伝子治療のアプローチで使用される組換えウイルスでの形質導入を促進する薬物標的を同定することも助ける。
方法
細胞内分画
浮遊密度遠心分離を、細胞内分画およびNox2活性を含有するエンドソームの単離に使用した。細胞を氷冷PBSで2回洗浄し、そして同一緩衝液を使用して1.5mL微小遠心管に廃棄した(scrapped)。細胞をペレットにし、そして0.25Mショ糖、20mM HEPES pH7.4、1mM EDTA、およびEDTAを含まないプロテアーゼ阻害薬剤カクテルを含有する均質化緩衝液(HMB)に再懸濁した。細胞を、細胞破壊高圧チャンバー(Parr instruments、イリノイ州モリーン)中で窒素キャビテーションを使用して均質化した。圧を5分間650−psiに上昇させ、そして突然遊離した。ホモジェネートを3000×gで15分間遠心分離して、未破壊細胞、核および重ミトコンドリア(heavy mitochondria)をペレットにした。重ミトコンドリア上清(HMS)を、改変を伴う以前に記述された方法(Grah
amら、1994;Xiaら、1998)を使用して、12.5mL SW41Ti超遠心管中のイオジキサノール不連続勾配中に底部負荷した。
細胞内分画
浮遊密度遠心分離を、細胞内分画およびNox2活性を含有するエンドソームの単離に使用した。細胞を氷冷PBSで2回洗浄し、そして同一緩衝液を使用して1.5mL微小遠心管に廃棄した(scrapped)。細胞をペレットにし、そして0.25Mショ糖、20mM HEPES pH7.4、1mM EDTA、およびEDTAを含まないプロテアーゼ阻害薬剤カクテルを含有する均質化緩衝液(HMB)に再懸濁した。細胞を、細胞破壊高圧チャンバー(Parr instruments、イリノイ州モリーン)中で窒素キャビテーションを使用して均質化した。圧を5分間650−psiに上昇させ、そして突然遊離した。ホモジェネートを3000×gで15分間遠心分離して、未破壊細胞、核および重ミトコンドリア(heavy mitochondria)をペレットにした。重ミトコンドリア上清(HMS)を、改変を伴う以前に記述された方法(Grah
amら、1994;Xiaら、1998)を使用して、12.5mL SW41Ti超遠心管中のイオジキサノール不連続勾配中に底部負荷した。
該不連続勾配は、EDTAを含まない1.25mL HMB、次いで1.0mLの2.5%、1.0mLの5%、1.5mLの9%、1.5mLの14%、2.5mLの19%、1.5mLの26%、および最後に2mL 32%中のHMSを連続的に伴うイオジキサノール段階%の底部負荷から構成された。イオジキサノール濃度は、EDTAを含まないHMBで希釈した50%イオジキサノール作業溶液(WS)を使用して新たに調製した。WSは、0.25Mショ糖および120mM HEPES pH7.4を含有する1部分の緩衝液を5部分のイオジキサノール60%ストック溶液に添加することにより調製した。該勾配を、SW41Tiスイングローターを使用し100,000×gで4℃で一夜遠心分離した。画分は、フラクションコレクター(Labconco、ミズーリ州カンサスシティ)を使用し、氷上で500μL画分で管の上部から収集した。密度勾配は、以前の研究(Billingtonら、1998;Grahamら、1994;Grahamら、2002;Grahamら、1996;Plonneら、1999)に基づき、以下の区画、すなわち画分#1〜5 原形質膜(密度1.03〜1.05g/mL);画分#7〜13 エンドソーム区画(密度1.055〜1.11g/mL);画分#8〜10 ゴルジ装置(密度1.06〜1.09g/mL);画分#10〜13 軽小胞体(light endoplasmic reticulum)(密度1.09〜1.11g/mL);画分#13〜18 リソソーム(密度1.11〜1.13g/mL);画分#18〜21 軽ミトコンドリア(密度1.13〜1.15g/mL);画分#19〜20 重小胞体(密度1.145g/mL);画分#21〜24 ペルオキシソーム(密度1.18〜1.2g/mL);および画分#22〜24 サイトゾルタンパク質(密度1.26g/mL)を至適に分離するよう設計した。
Rac1レドックス活性エンドソームの小胞免疫単離
HA標識Rac1エンドソームの親和性単離を、Rab5エンドソームの免疫吸収(immunoabsorption)について以前に記述された(Liら、2005;Trischlerら、1999)方法を使用して実施した。細胞を、1ng/mLのIL−1β処理48時間前に、HA標識Rac1を発現する組換えアデノウイルス(Ad.HA−Rac1)に感染させた。細胞内小胞のイオジキサノール単離後に、合わせたピーク小胞画分の一方の半分をスーパーオキシド産生の生化学的分析に直接使用し、また、他方の半分は、抗HA抗体で被覆したDynabeads M−500(Dynal Bioscience)を使用する免疫親和性単離に使用した。使用前に、ビーズは後に続くとおり抗体で被覆した。すなわち、二次抗体(抗ラット)を、0.1Mのホウ酸緩衝液(pH9.5)中でDynabeads(4×108ビーズ/mL)に25℃でゆっくり揺らしながら24時間複合させた。ビーズをその後磁石に3分間入れ、そして0.1%(w/w)BSA/PBS中4℃で5分間洗浄した。0.2Mトリス(pH8.5)/BSAでの最終洗浄を24時間実施した。最後にビーズをBSA/PBSに再懸濁し、そして107ビーズあたり4μgの一次抗HA抗体に4℃で一夜複合させ、そしてその後BSA/PBSで洗浄した。小胞画分を、2mMEDTA、5%BSAおよびプロテアーゼ阻害時を含有するPBS中で700μLの被覆ビーズと混合した。該混合物をゆっくり揺らしながら4℃で6時間インキュベートし、次いで磁性捕捉しかつ同一チューブ中で3回(各15分)洗浄した。HA濃縮したエンドソームを伴うビーズをその後PBSに再懸濁した。結合したペレット(P)および洗浄上清(S)をその後、NADPH依存性のスーパーオキシド産生、ならびにウエスタンブロッティングによるHA−Rac1、p67phox、SOD1、IL−1R1、TRAF6、TNFR1、TRAF2およびRab5の会合について評価した。
HA標識Rac1エンドソームの親和性単離を、Rab5エンドソームの免疫吸収(immunoabsorption)について以前に記述された(Liら、2005;Trischlerら、1999)方法を使用して実施した。細胞を、1ng/mLのIL−1β処理48時間前に、HA標識Rac1を発現する組換えアデノウイルス(Ad.HA−Rac1)に感染させた。細胞内小胞のイオジキサノール単離後に、合わせたピーク小胞画分の一方の半分をスーパーオキシド産生の生化学的分析に直接使用し、また、他方の半分は、抗HA抗体で被覆したDynabeads M−500(Dynal Bioscience)を使用する免疫親和性単離に使用した。使用前に、ビーズは後に続くとおり抗体で被覆した。すなわち、二次抗体(抗ラット)を、0.1Mのホウ酸緩衝液(pH9.5)中でDynabeads(4×108ビーズ/mL)に25℃でゆっくり揺らしながら24時間複合させた。ビーズをその後磁石に3分間入れ、そして0.1%(w/w)BSA/PBS中4℃で5分間洗浄した。0.2Mトリス(pH8.5)/BSAでの最終洗浄を24時間実施した。最後にビーズをBSA/PBSに再懸濁し、そして107ビーズあたり4μgの一次抗HA抗体に4℃で一夜複合させ、そしてその後BSA/PBSで洗浄した。小胞画分を、2mMEDTA、5%BSAおよびプロテアーゼ阻害時を含有するPBS中で700μLの被覆ビーズと混合した。該混合物をゆっくり揺らしながら4℃で6時間インキュベートし、次いで磁性捕捉しかつ同一チューブ中で3回(各15分)洗浄した。HA濃縮したエンドソームを伴うビーズをその後PBSに再懸濁した。結合したペレット(P)および洗浄上清(S)をその後、NADPH依存性のスーパーオキシド産生、ならびにウエスタンブロッティングによるHA−Rac1、p67phox、SOD1、IL−1R1、TRAF6、TNFR1、TRAF2およびRab5の会合について評価した。
結果
粗小胞画分へのHA−Rac1取り込みはIL−1β刺激により有意に高められた(図11、レーン4)。Rac1は未刺激小胞中で低レベルでのみ見出された(レーン1)。これらの知見は、Rac1(Nox2の不可欠の活性化因子)がIL−1β刺激後にエンドソーム区画に特異的に補充されるという考えを裏付ける。HA−Rac1結合したエンドソームの免疫親和性単離は、該精製手順がHA免疫反応性エンドソームのおよそ75%を単離することが可能であったことを示した(レーン5対レーン6)。これは、この細胞株からのHA−Rab5単離について以前報告されたもの(Liら、2005)と類似の効率であった。予期されたとおり、抗HAに結合したペレット中のHA−Rac1についてのこの画分の濃縮は、NADPH依存性の・O2−を産生するその能力で見られた濃縮に酷似した。同様に、SOD1、p67phox(Nox2活性化因子サブユニット)、IL−1R1およびIL−1R1特異的エフェクターTRAF6は全部、一般的エンドソームマーカー(Rab5)に関してHA−Rac1エンドソームで濃縮された。IL−1β刺激の非存在下で、SOD1およびp67phoxはエンドソーム膜に補充することに失敗し、そしてエンドソーム区画中の低レベルのみのIL−1R1/TRAF6が見られた(レーン1)。シグナル特異性の陰性対照として、TNFR1およびその特異的エフェクターTRAF2もまた評価した。TNFR1/TRAF2は、IL−1βで活性化したRac1含有エンドソームに補充されなかった(レーン5)。これらの知見は、リガンドで活性化されたIL−1R1/TRAF6複合体およびRac1を含有するレドックス活性のエンドソーム中のSOD1の濃縮についての直接の証拠を提供する。
粗小胞画分へのHA−Rac1取り込みはIL−1β刺激により有意に高められた(図11、レーン4)。Rac1は未刺激小胞中で低レベルでのみ見出された(レーン1)。これらの知見は、Rac1(Nox2の不可欠の活性化因子)がIL−1β刺激後にエンドソーム区画に特異的に補充されるという考えを裏付ける。HA−Rac1結合したエンドソームの免疫親和性単離は、該精製手順がHA免疫反応性エンドソームのおよそ75%を単離することが可能であったことを示した(レーン5対レーン6)。これは、この細胞株からのHA−Rab5単離について以前報告されたもの(Liら、2005)と類似の効率であった。予期されたとおり、抗HAに結合したペレット中のHA−Rac1についてのこの画分の濃縮は、NADPH依存性の・O2−を産生するその能力で見られた濃縮に酷似した。同様に、SOD1、p67phox(Nox2活性化因子サブユニット)、IL−1R1およびIL−1R1特異的エフェクターTRAF6は全部、一般的エンドソームマーカー(Rab5)に関してHA−Rac1エンドソームで濃縮された。IL−1β刺激の非存在下で、SOD1およびp67phoxはエンドソーム膜に補充することに失敗し、そしてエンドソーム区画中の低レベルのみのIL−1R1/TRAF6が見られた(レーン1)。シグナル特異性の陰性対照として、TNFR1およびその特異的エフェクターTRAF2もまた評価した。TNFR1/TRAF2は、IL−1βで活性化したRac1含有エンドソームに補充されなかった(レーン5)。これらの知見は、リガンドで活性化されたIL−1R1/TRAF6複合体およびRac1を含有するレドックス活性のエンドソーム中のSOD1の濃縮についての直接の証拠を提供する。
従って、ウイルス感染後のHA標識Rac1エンドソームの親和性単離は、AAV若しくは他のパルボウイルス受容体の侵入経路にとって重要な新たな受容体を同定するのに有用であることができ、そしてNox活性のエンドソームにより動くいかなる型のウイルスにも応用可能である。
全部の刊行物、特許および特許出願は引用することにより本明細書に組込まれる。前述の明細において、本発明はそのある好ましい態様に関して記述され、そして多くの詳細が具体的な説明の目的上示された一方、本発明は付加的な態様を許すことができること、および本明細書の詳細のあるものが本発明の基本原理から離れることなくかなり変動されうることが、当業者に明らかであろう。
Claims (37)
- a)哺乳動物細胞、1種若しくはそれ以上の薬剤、およびレドックス感受性パルボウイルスを接触させて混合物を生じせしめる工程;ならびに
b)パルボウイルスと接触されるがしかし該1種若しくはそれ以上の薬剤と接触されない対応する哺乳動物細胞に関してエンドソームのNADPHオキシダーゼ活性を変える、該混合物中の薬剤の1種若しくはそれ以上を同定する工程
を含んでなる、哺乳動物細胞のパルボウイルス形質導入を変える薬剤の同定方法。 - パルボウイルス形質導入が阻害される、請求項1に記載の方法。
- パルボウイルス形質導入が高められる、請求項1に記載の方法。
- パルボウイルスが病原性パルボウイルスである、請求項1ないし3のいずれか1つに記載の方法。
- パルボウイルスがアデノ随伴ウイルス(AAV)である、請求項1ないし3のいずれか1つに記載の方法。
- パルボウイルスが組換えAAVである、請求項1ないし3のいずれか1つに記載の方法。
- a)哺乳動物細胞および改変ウイルスキャプシドを有するパルボウイルスを接触させる工程であって、かつ、少なくとも1種の改変がキャプシド中のレドックス感受性残基の数若しくは位置の変化である、工程;
b)該改変パルボウイルスによる哺乳動物細胞の形質導入が、対応する未改変パルボウイルスによる対応する哺乳動物細胞の形質導入に関して変えられているかどうかを同定する工程
を含んでなる、哺乳動物細胞のパルボウイルス形質導入を高めるウイルスキャプシド改変の同定方法。 - 改変パルボウイルスによる形質導入が高められる、請求項7に記載の方法。
- 改変がレドックス感受性残基の数の増大である、請求項7に記載の方法。
- 改変が、システイン、リシン、ヒスチジン若しくはメチオニン、またはそれらのいずれかの組合せの増大された数である、請求項7に記載の方法。
- キャプシドが翻訳後修飾される、請求項7に記載の方法。
- パルボウイルス、およびエンドソームのNADPHオキシダーゼ活性を高める薬剤と哺乳動物細胞を接触させる工程
を含んでなる、哺乳動物細胞のパルボウイルス感染を高める方法。 - パルボウイルスがアデノ随伴ウイルス(AAV)である、請求項12に記載の方法。
- AAVが組換えAAVである、請求項13に記載の方法。
- 哺乳動物細胞を、導入遺伝子の発現を高めるように、エンドソームのNADPHオキシダーゼ活性を高めるよう選択されたある量の薬剤、および導入遺伝子を有するある量の組
換えパルボウイルスと接触させる工程を含んでなる、哺乳動物細胞中での導入遺伝子発現を高める方法。 - 導入遺伝子が治療的遺伝子産物をコードする、請求項15に記載の方法。
- 遺伝子産物がポリペプチド若しくはペプチドである、請求項16に記載の方法。
- 細胞が、肺細胞、上皮細胞、肝細胞、筋細胞、造血細胞、心細胞若しくは神経細胞である、請求項15ないし17のいずれか1つに記載の方法。
- 細胞がヒト細胞である、請求項15ないし18のいずれか1つに記載の方法。
- 細胞がヒト以外の哺乳動物細胞である、請求項15ないし18のいずれか1つに記載の方法。
- パルボウイルス、およびNADPHオキシダーゼ活性を阻害する薬剤と哺乳動物細胞を接触させる工程
を含んでなる、哺乳動物細胞のパルボウイルス感染の阻害方法。 - 哺乳動物細胞を、そのキャプシドがレドックス感受性アミノ酸残基の数若しくは位置を変えるように改変されているパルボウイルスと接触させる工程
を含んでなる、哺乳動物細胞のパルボウイルス感染を変える方法。 - システイン、リシン、ヒスチジン若しくはメチオニン残基、またはそれらのいずれかの組合せの数が変えられている、請求項22に記載の方法。
- 哺乳動物細胞を、そのキャプシドがレドックス感受性アミノ酸残基の数若しくは位置を変えるように改変されているパルボウイルスと接触させる工程
を含んでなる、ウイルス産生を変える方法。 - 薬剤およびパルボウイルスと接触させた哺乳動物細胞を提供する工程;ならびに
該薬剤が、パルボウイルスと接触されたがしかし該薬剤と接触されない哺乳動物細胞に関してパルボウイルス含有細胞中のNADPHオキシダーゼ活性を変えるかどうかを同定する工程
を含んでなる、パルボウイルスで形質導入した哺乳動物細胞中のNADPHオキシダーゼ活性を変える薬剤の同定方法。 - 該薬剤がNADPHオキシダーゼ活性を高める、請求項25に記載の方法。
- 該薬剤がNADPHオキシダーゼ活性を低下させる、請求項25に記載の方法。
- NADPHオキシダーゼ活性を阻害する薬剤が、DPI、アポシニン若しくはそれらの組合せである、請求項21に記載の方法。
- パルボウイルスがアデノ随伴ウイルス2(AAV2)である、請求項28に記載の方法。
- ウイルスに感染させた哺乳動物細胞からRac含有エンドソームを単離する工程、および、未感染の哺乳動物細胞中のRac含有エンドソーム中に存在しない、ウイルスに感染させたRac含有エンドソーム中の分子を同定する工程
を含んでなる、ウイルス受容体若しくは共受容体の同定方法。 - ウイルスがパルボウイルスである、請求項30に記載の方法。
- パルボウイルスがアデノ随伴ウイルス(AAV)である、請求項31に記載の方法。
- Rac含有エンドソーム中に組換えRacを含んでなる、請求項30ないし32のいずれか1つに記載の方法。
- 組換えRacが融合タンパク質を含んでなる、請求項33に記載の方法。
- ウイルスが病原性ウイルスである、請求項30ないし32のいずれか1つに記載の方法。
- 病原性ウイルスがB19である、請求項35に記載の方法。
- ウイルスが、アデノウイルス、ポックスウイルス、レンチウイルス、肝炎ウイルス、パルボウイルス、コックサッキーウイルス若しくはインフルエンザウイルスである、請求項30ないし32のいずれか1つに記載の方法。
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