JP7062292B2

JP7062292B2 - リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤及びリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤

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Publication number: JP7062292B2
Application number: JP2019034981A
Authority: JP
Inventors: 浩孝今井
Original assignee: Kitasato Institute
Current assignee: Kitasato Institute
Priority date: 2019-02-27
Filing date: 2019-02-27
Publication date: 2022-05-06
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Description

特許法第３０条第２項適用・平成２６年３月博士後期課程修了予定者研究業績発表要旨集平成２６年３月薬学科卒業予定者卒業研究発表要旨集、東京大学大学院薬学系研究科・薬学部発行（発行日平成２５年１２月５日）

特許法第３０条第２項適用・平成２６年３月博士後期課程修了予定者研究業績発表会発表スライド（公開日平成２５年１２月１６日）

特許法第３０条第２項適用・今井浩孝、リン脂質酸化シグナルが関与する新規細胞死経路、『医学のあゆみ』Ｖｏｌ．２４８、Ｎｏ．１３、第１０７５～１０８３頁、医歯薬出版株式会社発行（発行日平成２６年３月２９日）

本発明は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤及びリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤に関する。

生体膜を構成するリン脂質は、２位に不飽和脂肪酸を有している。図１に示すように、鉄を介したフェントン反応により、スーパーオキシド又は過酸化水素から生成したヒドロキシラジカルが上記不飽和脂肪酸と反応すると、リン脂質ヒドロペルオキシドが生じることが知られている。

リン脂質ヒドロペルオキシドグルタチオンペルオキシダーゼ（ｐｈｏｓｐｈｏｌｉｐｉｄｈｙｄｒｏｐｅｒｏｘｉｄｅｇｌｕｔａｔｈｉｏｎｅｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ、以下「ＰＨＧＰｘ」という場合がある。）は、グルタチオンを補酵素として、生成したリン脂質ヒドロペルオキシドを直接還元し、リン脂質ヒドロキシ体に変換する酵素である。このＰＨＧＰｘ遺伝子のノックアウトマウスは、胎性致死であることが知られていた（例えば、非特許文献１を参照）。しかしながら、ＰＨＧＰｘ欠損による細胞死のメカニズムは不明であった。

Imai H, et al., Early embryonic lethality caused by targeted disruption of the mouse PHGPx gene, Biochem Biophys Res Commun., 305, 278-86, 2003.

本発明は、ＰＨＧＰｘ欠損による細胞死の経路に関与する因子を明らかにし、上記細胞死（以下、「リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死」という。）の検出方法及びキット、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に関与するタンパク質及び核酸、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤、並びにリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤を提供することを目的とする。

本発明は以下の通りである。
（１）細胞中の、ＣＤＫ４、ＭＥＫ、ＥＲＫ、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６及びＡｂｈｄ２からなる群より選択される少なくとも１つの因子の活性化状態を検出する工程を有する、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法。
（２）前記検出は、前記因子の細胞内の局在状態を測定すること、前記因子のｍＲＮＡレベルでの発現量を測定すること、前記因子のタンパク質レベルでの発現量を測定すること、前記因子のリン酸化率を測定すること及び上記因子の発現抑制による細胞死の抑制を測定することからなる群より選択される少なくとも１つにより行われる、（１）に記載の方法。
（３）リン酸化した又はリン酸化していない、ＣＤＫ４、ＭＥＫ、ＥＲＫ、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６又はＡｂｈｄ２に対する抗体；ＣＤＫ４、ＭＥＫ、ＥＲＫ、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６又はＡｂｈｄ２のｍＲＮＡ増幅用プライマー；あるいは、ＣＤＫ４、ＭＥＫ、ＥＲＫ、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６又はＡｂｈｄ２に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸；を含む、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出用キット。
（４）配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、発現量を低下させるとリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制されるタンパク質。
（５）配列番号２の塩基配列からなる核酸、又は配列番号２の塩基配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、発現量を低下させるとリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制されるタンパク質をコードする核酸。
（６）配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、発現量を低下させるとリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制されるタンパク質。
（７）配列番号４の塩基配列からなる核酸、又は配列番号４の塩基配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、発現量を低下させるとリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制されるタンパク質をコードする核酸。
（８）配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、発現量を低下させるとリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制されるタンパク質。
（９）配列番号６の塩基配列からなる核酸、又は配列番号６の塩基配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、発現量を低下させるとリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制されるタンパク質をコードする核酸。
（１０）ビタミンＥ又はその誘導体を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤。
（１１）ＣＤＫ４阻害剤又はＣＤＫ４に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤。
（１２）ＭＥＫ阻害剤又はＭＥＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤。
（１３）ＥＲＫ阻害剤又はＥＲＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤。
（１４）Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６又はＡｂｈｄ２に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤。
（１５）ビタミンＥ又はその誘導体を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤。
（１６）ＣＤＫ４阻害剤又はＣＤＫ４に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤。
（１７）ＭＥＫ阻害剤又はＭＥＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤。
（１８）ＥＲＫ阻害剤又はＥＲＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤。
（１９）Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６又はＡｂｈｄ２に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤。
（２０）前記リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患は、心不全である、（１５）～（１９）のいずれかに記載の予防又は治療剤。

本発明により、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法及びキットを提供することができる。また、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に関与するタンパク質及び核酸を提供することができる。また、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤を提供することができる。また、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤を提供することができる。

生体膜新脂質酸化反応とその代謝経路を説明する図である。ＰＨＧＰｘタンパク質を検出するウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞内で生成されたリン脂質ヒドロペルオキシド（１８：０、２０：４ホスファチジルコリン由来のヒドロペルオキシド）の量の経時変化を示すグラフである。タモキシフェン添加によりＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞が致死となるＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。（ａ）は、アポトーシス阻害剤を用いた時のリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制効果を細胞生存率（％）で示した結果を示すグラフである。（ｂ）は、スタウロスポリン処理とタモキシフェン処理の際のアポトーシスの指標の蛍光免疫染色の結果を示す写真である。（ａ）は、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド添加３０分後のＨＭＧＢ１の蛍光免疫染色の結果を示す写真であり、図６（ｂ）は、タモキシフェン添加４８時間後のＨＭＧＢ１の蛍光免疫染色結果を示す写真である。（ａ）は、オートファジー関連因子ＡＴＧ５のノックダウンによるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に対する細胞生存率（％）の結果を示すグラフである。（ｂ）は、ＲＴ－ＰＣＲによるＡＴＧ５の発現抑制の結果を示す写真である。（ａ）は、ネクロトーシス関連因子Ｒｉｐ１のノックダウン細胞によるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に対する細胞生存率（％）の結果を示すグラフである。（ｂ）は、ウエスタンブロッティングによるＲｉｐ１の発現低下の結果を示す写真である。（ａ）は、３－ＡＴＡを使用した、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制の結果を示すグラフである。（ｂ）は、Ｕ－０１２６を使用した、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制の結果を示すグラフである。（ｃ）は、３－ＡＴＡ、Ｕ－０１２６及びビタミンＥの、インビトロにおけるリン脂質自動酸化抑制能を検討した結果を示すグラフである。（ａ）は、ＣＤＫ４のノックダウンによるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に対する細胞生存率（％）の結果を示すグラフである。（ｂ）は、ウエスタンブロッティングによるＣＤＫ４の発現の結果を示す写真である。（ａ）は、ＭＥＫ１のノックダウンによるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に対する細胞生存率（％）の結果を示すグラフである。（ｂ）は、ウエスタンブロッティングによるＭＥＫ１の発現の結果を示す写真である。（ａ）及び（ｂ）は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の際のＭＥＫ及びＥＲＫのリン酸化の経時変化をウエスタンブロッティングで検討した結果を示す写真である。（ａ）は、ＥＲＫ２のノックダウンによるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に対する細胞生存率（％）の結果を示すグラフである。（ｂ）は、ウエスタンブロッティングによるＥＲＫ２の発現の結果を示す写真である。（ａ）は、トロロックスと３－ＡＴＡによるＭＥＫ及びＥＲＫのリン酸化に対する効果をウエスタンブロッティングで検討した結果を示す写真である。（ｂ）は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死経路の一部を示すモデル図である。ＣＤＫ４及びＭＥＫ１のノックダウン細胞におけるフローサイトメトリーを用いたリン脂質酸化の抑制効果について検討した結果を示すグラフである。化合物ライブラリーのスクリーニングから明らかにしたリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死経路のモデル図である。ｓｈＲＮＡライブラリーのスクリーニング手順の概要を示す図である。１５１個の候補遺伝子について、ノックダウンによりリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制効果が高い順に並べた結果を示すグラフである。（ａ）は、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ遺伝子及びＣｄａｄｃ１ｖａｒｉａｎｔ－２（Ｃｄａｄｃ１ｔｖ２）遺伝子の構造を示す図である。（ｂ）は、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇのノックダウンによるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に対する細胞生存率（％）の結果を示すグラフである。Ｃ８７４３６のノックダウンによるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に対する細胞生存率（％）の結果を示すグラフである。ＡＢＨＤ２のノックダウンによるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に対する細胞生存率（％）の結果を示すグラフである。（ａ）及び（ｂ）は、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ，Ｃ８７４３６，ＡＢＨＤ２のノックダウンによるアポトーシス及びネクローシスに対する抑制効果を検討したＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。（ａ）は、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ，Ｃ８７４３６，ＡＢＨＤ２のノックダウン細胞によるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死におけるＥＲＫのリン酸化が亢進した細胞の割合（％）の変化を測定した結果を示すグラフである。（ｂ）は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死経路の一部を示すモデル図である。（ａ）は、フローサイトメトリーにより、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ，Ｃ８７４３６，ＡＢＨＤ２のノックダウン細胞によるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死におけるリン脂質ヒドロペルオキシド生成の抑制効果を検討した結果を示すグラフである。（ｂ）は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死経路の一部を示すモデル図である。（ａ）及び（ｂ）は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死におけるリン脂質ヒドロペルオキシド生成に対する鉄のキレーターの抑制効果をフローサイトメトリーで検討した結果を示すグラフである。（ａ）は、リン脂質ヒドロペルオキシドの生成における、Ｍｎ－ＴＢＡＰ、ＮＡＣ、デフェロキサミン、ビタミンＥの作用点を示すモデル図である。（ｂ）は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死におけるＭｎ－ＴＢＡＰ、ＮＡＣ、デフェロキサミン、ビタミンＥの抑制効果を細胞生存率（％）で示した結果のグラフである。本研究で明らかにしたリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死経路の新規シグナル経路のモデル図である。（ａ）は、発生過程１７．５日目、１８．５日目の野生型マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）及び心臓特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウス（ＫＯ）の写真である。（ｂ）は、発生過程１７．５日目のマウスの心臓の組織切片を、ＤＡＰＩ及びＴＵＮＥＬ染色（ＴＵＮＥＬ）した結果を示す写真である。（ｃ）は、発生過程１７．５日目のマウスの心臓におけるＰＨＧＰｘタンパク質の発現をウエスタンブロッティングにより検出した結果を示す写真である。（ａ）～（ｃ）は、３－ＡＴＡの効果を検討した際の発生過程１８．５日のマウス胎仔の写真である。（ａ）は、餌のビタミンＥ量の低下により引き起こされる不整脈性突然死（心不全）のモデルマウスの説明図、ビタミンＥ添加食から通常食に換えると約１０日で突然死を起こすことを示したマウスの生存率を示すグラフである。（ｂ）は、心臓中のビタミンＥの量を測定した結果を示すグラフである。（ｃ）は、マウスの心電図を示すグラフである。ビタミンＥ低下により引き起こされる心不全による突然死マウスモデルに対する３－ＡＴＡの抑制効果を示したグラフである。ビタミンＥ低下により引き起こされる心不全による突然死マウスモデルに対するＵ－０１２６の抑制効果を示したグラフである。（ａ）は、ｐｉＭＧ－ｄｒＵ６ベクターの構造を示す図である。（ｂ）は、ｓｈＲＮＡが発現し、ｓｉＲＮＡが形成され、標的ＲＮＡが破壊される過程を示すモデル図である。ｐＭＸｓ－ＩＲベクターの構造を示す図である。

［リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法］
１実施形態において、本発明は、細胞中の、ＣＤＫ４、ＭＥＫ、ＥＲＫ、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６及びＡｂｈｄ２からなる群より選択される少なくとも１つの因子の活性化状態を検出する工程を有する、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出方法を提供する。

後述するように、発明者らは、アポトーシス、ネクローシス、オートファジー性細胞死、ネクトローシスとは明確に異なる新規の経路による細胞死（リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死）を見出した。更に、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子に、ＣＤＫ４、ＭＥＫ、ＥＲＫ、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６及びＡｂｈｄ２が含まれることを明らかにした。

したがって、これらの因子の活性化状態を検出することにより、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を検出することができる。本実施形態の方法により、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が進行中であるか否かを検出することもできるし、細胞死が生じた後に当該細胞死がリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死経路を介していたか否かを判断することもできる。

上記因子の活性化状態の検出は、例えば、上記因子の細胞内の局在状態を測定すること、上記因子のｍＲＮＡレベルでの発現量を測定すること、上記因子のタンパク質レベルでの発現量を測定すること、上記因子のリン酸化率を測定すること及び上記因子の発現抑制による細胞死の抑制を測定することからなる群より選択される少なくとも１つにより行うことができる。

細胞内の局在状態は、例えば、対象の細胞を固定し、上記因子に対する蛍光標識抗体で染色し、蛍光顕微鏡で観察することにより、測定することができる。あるいは、対象細胞内で、上記因子と蛍光タンパク質との融合タンパクを発現させ、融合タンパク質の蛍光を蛍光顕微鏡で観察することにより、上記因子の細胞内の局在状態を測定することができる。ここで、蛍光タンパク質としては、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、赤色蛍光タンパク質（ＲＦＰ）等が挙げられる。

上記因子の細胞内の局在状態の測定の結果、例えば、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が進行中でない正常細胞と比較して、上記因子の局在状態に変化が認められた場合に、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を検出することができる。

上記因子のｍＲＮＡレベルでの発現量は、例えば、リアルタイムＰＣＲ、ノーザンブロッティング等により測定することができる。例えば、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が進行中でない正常細胞と比較して、上記因子のｍＲＮＡレベルでの発現量に変化が認められた場合に、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を検出することができる。

上記因子のタンパク質レベルでの発現量は、例えば、上記因子に対する抗体を用いたウエスタンブロッティング等により測定することができる。例えば、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が進行中でない正常細胞と比較して、上記因子のタンパク質レベルでの発現量に変化が認められた場合に、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を検出することができる。

上記因子のリン酸化率は、例えば、リン酸化した上記因子に特異的な抗体を用いたウエスタンブロッティング等により測定することができる。例えば、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が進行中でない正常細胞と比較して、上記因子のリン酸化率に変化が認められた場合に、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を検出することができる。

また、上記因子の発現を抑制することにより、細胞死を抑制することができた場合、当該細胞死には、上記因子が関与すると判断することができる。したがって、このような場合には、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を検出することができる。

上記因子の発現の抑制は、例えば、上記因子に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム、アンチセンス核酸等を細胞に導入することにより行うことができる。また、細胞死の抑制の測定は、例えば、上記因子の発現抑制を行った場合と行わなかった場合における細胞の生存率を測定することにより行うことができる。細胞の生存率の測定は、例えば、ＭＴＴアッセイや顕微鏡撮影による生細胞数の変化の計算により行うことができる。

ｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられる２１～２３塩基対の低分子２本鎖ＲＮＡである。細胞内に導入されたｓｉＲＮＡは、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。

ｓｉＲＮＡは、センス鎖及びアンチセンス鎖オリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機でそれぞれ合成し、例えば、適当なアニーリング緩衝液中、約９０～約９５℃で約１分程度変性させた後、約３０～７０℃で約１～８時間アニーリングさせることにより調製することができる。

ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ）は、ＲＮＡ干渉による遺伝子サイレンシングのために用いられるヘアピン型のＲＮＡ配列である。ｓｈＲＮＡは、ベクターによって細胞に導入し、Ｕ６プロモーター又はＨ１プロモーターで発現させてもよいし、ｓｈＲＮＡ配列を有するオリゴヌクレオチドをＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機で合成し、ｓｉＲＮＡと同様の方法によりセルフアニーリングさせることによって調製してもよい。細胞内に導入されたｓｈＲＮＡのヘアピン構造は、ｓｉＲＮＡへと切断され、ＲＮＡ誘導サイレンシング複合体（ＲＩＳＣ）と結合する。この複合体はｓｉＲＮＡと相補的な配列を持つｍＲＮＡに結合し切断する。これにより、配列特異的に遺伝子の発現を抑制する。

リボザイムは、触媒活性を有するＲＮＡである。リボザイムには種々の活性を有するものがあるが、ＲＮＡを切断する酵素としてのリボザイムの研究により、ＲＮＡの部位特異的な切断を目的とするリボザイムの設計が可能となっている。リボザイムは、グループＩイントロン型、ＲＮａｓｅＰに含まれるＭ１ＲＮＡ等の４００ヌクレオチド以上の大きさのものであってもよく、ハンマーヘッド型、ヘアピン型等と呼ばれる４０ヌクレオチド程度のものであってもよい。

アンチセンス核酸は、標的配列に相補的な核酸である。アンチセンス核酸は、三重鎖形成による転写開始阻害、ＲＮＡポリメラーゼによって局部的に開状ループ構造が形成された部位とのハイブリッド形成による転写抑制、合成の進みつつあるＲＮＡとのハイブリッド形成による転写阻害、イントロンとエクソンとの接合点でのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、スプライソソーム形成部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、ｍＲＮＡとのハイブリッド形成による核から細胞質への移行抑制、キャッピング部位やポリ（Ａ）付加部位とのハイブリッド形成によるスプライシング抑制、翻訳開始因子結合部位とのハイブリッド形成による翻訳開始抑制、開始コドン近傍のリボソーム結合部位とのハイブリッド形成による翻訳抑制、ｍＲＮＡの翻訳領域やポリソーム結合部位とのハイブリッド形成によるペプチド鎖の伸長阻止、核酸とタンパク質との相互作用部位とのハイブリッド形成による遺伝子発現抑制等により、標的遺伝子の発現を抑制することができる。

本実施形態において、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム及びアンチセンス核酸は、安定性や活性を向上させるために、種々の化学修飾を含んでいてもよい。例えば、ヌクレアーゼ等の加水分解酵素による分解を防ぐために、リン酸残基を、例えば、ホスホロチオエート（ＰＳ）、メチルホスホネート、ホスホロジチオネート等の化学修飾リン酸残基に置換してもよい。また、少なくとも一部がペプチド核酸（ＰＮＡ）等の核酸類似体により構成されていてもよい。

［リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出用キット］
１実施形態において、本発明は、リン酸化した又はリン酸化していない、ＣＤＫ４、ＭＥＫ、ＥＲＫ、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６又はＡｂｈｄ２に対する抗体；ＣＤＫ４、ＭＥＫ、ＥＲＫ、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６又はＡｂｈｄ２のｍＲＮＡ増幅用プライマー；あるいは、ＣＤＫ４、ＭＥＫ、ＥＲＫ、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６又はＡｂｈｄ２に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸；を含む、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の検出用キットを提供する。

リン酸化した又はリン酸化していない上記因子に対する抗体は、上記因子の細胞内の局在状態の測定、上記因子のタンパク質レベルでの発現量の測定、上記因子のリン酸化率の測定等に好適である。

上記因子のｍＲＮＡ増幅用プライマーは、上記因子のｍＲＮＡレベルでの発現量の測定等に好適である。

上記因子に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸は、上記因子の発現の抑制に好適である。

本実施形態のキットを用いることにより、対象とする細胞におけるリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を簡便に検出することができる。

［Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ］
１実施形態において、本発明は、配列番号１のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号１のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、発現量を低下させるとリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制されるタンパク質を提供する。ここで、１若しくは数個とは、例えば、１～２０個、１～１０個、１～５個を意味する。

配列番号１は、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇのアミノ酸配列を示す。後述するように、発明者らは、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇが、新規遺伝子によりコードされた新規タンパク質であることを明らかにした。また、後述するように、発明者らは、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇが、新規の細胞死である、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子であることを見出した。

したがって、細胞中のＣｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇタンパク質の活性を抑制又は促進することにより、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を制御することができる。Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇタンパク質の活性の抑制又は促進は、例えば、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇタンパク質の発現量を低下又は上昇させること、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇタンパク質のアミノ酸配列を改変すること等により行うことができる。

Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇタンパク質の発現量の低下は、例えば、細胞中のＣｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ遺伝子を欠失させることにより行うことができる。あるいは、細胞内に、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ遺伝子を標的とした、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸を導入すること等により行うことができる。また、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇタンパク質の発現量の上昇は、細胞内に、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇタンパク質の発現ベクターを導入すること等により行うことができる。

別の実施形態において、本発明は、配列番号２の塩基配列からなる核酸、又は配列番号２の塩基配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、発現量を低下させるとリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制されるタンパク質をコードする核酸を提供する。

配列番号２は、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇをコードする塩基配列を示す。本実施形態の核酸は、配列番号２の塩基配列を有していてもよい。また、本実施形態の核酸は、発現量を低下させるとリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制されるタンパク質をコードする限り、配列番号２の塩基配列とは異なる塩基配列を有していてもよい。この場合、配列番号２の塩基配列と８０％以上の相同性を有することが好ましく、８５％以上の相同性を有することがより好ましく、９０％以上の相同性を有することが更に好ましく、９５％以上の相同性を有することが特に好ましい。

本実施形態の核酸は、人工的に組み換えられたものであってもよい。例えば、発現ベクターに組み込まれた形態であってもよい。

［Ｃ８７４３６］
１実施形態において、本発明は、配列番号３のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号３のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、発現量を低下させるとリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制されるタンパク質を提供する。ここで、１若しくは数個とは、例えば、１～２０個、１～１０個、１～５個を意味する。

配列番号３は、Ｃ８７４３６のアミノ酸配列を示す。後述するように、発明者らは、Ｃ８７４３６が、新規の細胞死である、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子であることを見出した。

したがって、細胞中のＣ８７４３６タンパク質の活性を抑制又は促進することにより、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を制御することができる。Ｃ８７４３６タンパク質の活性の抑制又は促進は、例えば、Ｃ８７４３６タンパク質の発現量を低下又は上昇させること、Ｃ８７４３６タンパク質のアミノ酸配列を改変すること等により行うことができる。

Ｃ８７４３６タンパク質の発現量の低下は、例えば、細胞中のＣ８７４３６遺伝子を欠失させることにより行うことができる。あるいは、細胞内に、Ｃ８７４３６遺伝子を標的とした、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸を導入すること等により行うことができる。また、Ｃ８７４３６タンパク質の発現量の上昇は、細胞内に、Ｃ８７４３６タンパク質の発現ベクターを導入すること等により行うことができる。

別の実施形態において、本発明は、配列番号４の塩基配列からなる核酸、又は配列番号４の塩基配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、発現量を低下させるとリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制されるタンパク質をコードする核酸を提供する。

配列番号４は、Ｃ８７４３６をコードする塩基配列を示す。本実施形態の核酸は、配列番号４の塩基配列を有していてもよい。また、本実施形態の核酸は、発現量を低下させるとリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制されるタンパク質をコードする限り、配列番号４の塩基配列とは異なる塩基配列を有していてもよい。この場合、配列番号４の塩基配列と８０％以上の相同性を有することが好ましく、８５％以上の相同性を有することがより好ましく、９０％以上の相同性を有することが更に好ましく、９５％以上の相同性を有することが特に好ましい。

［Ａｂｈｄ２］
１実施形態において、本発明は、配列番号５のアミノ酸配列からなるタンパク質、又は配列番号５のアミノ酸配列において１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなり、かつ、発現量を低下させるとリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制されるタンパク質を提供する。ここで、１若しくは数個とは、例えば、１～２０個、１～１０個、１～５個を意味する。

配列番号５は、Ａｂｈｄ２のアミノ酸配列を示す。後述するように、発明者らは、Ａｂｈｄ２が、新規の細胞死である、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子であることを見出した。

したがって、細胞中のＡｂｈｄ２タンパク質の活性を抑制又は促進することにより、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を制御することができる。Ａｂｈｄ２タンパク質の活性の抑制又は促進は、例えば、Ａｂｈｄ２タンパク質の発現量を低下又は上昇させること、Ａｂｈｄ２タンパク質のアミノ酸配列を改変すること等により行うことができる。

Ａｂｈｄ２タンパク質の発現量の低下は、例えば、細胞中のＡｂｈｄ２遺伝子を欠失させることにより行うことができる。あるいは、細胞内に、Ａｂｈｄ２遺伝子を標的とした、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム又はアンチセンス核酸を導入すること等により行うことができる。また、Ａｂｈｄ２タンパク質の発現量の上昇は、細胞内に、Ａｂｈｄ２タンパク質の発現ベクターを導入すること等により行うことができる。

別の実施形態において、本発明は、配列番号６の塩基配列からなる核酸、又は配列番号６の塩基配列と８０％以上の相同性を有し、かつ、発現量を低下させるとリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制されるタンパク質をコードする核酸を提供する。

配列番号６は、Ａｂｈｄ２をコードする塩基配列を示す。本実施形態の核酸は、配列番号６の塩基配列を有していてもよい。また、本実施形態の核酸は、発現量を低下させるとリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制されるタンパク質をコードする限り、配列番号６の塩基配列とは異なる塩基配列を有していてもよい。この場合、配列番号６の塩基配列と８０％以上の相同性を有することが好ましく、８５％以上の相同性を有することがより好ましく、９０％以上の相同性を有することが更に好ましく、９５％以上の相同性を有することが特に好ましい。

［リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤］
（ビタミンＥ又はその誘導体）
１実施形態において、本発明は、ビタミンＥ又はその誘導体を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤を提供する。

後述するように、発明者らは、ビタミンＥ又はその誘導体をインビトロで又はインビボで投与することにより、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制することができることを見出した。したがって、ビタミンＥ又はその誘導体は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤として使用することができる。

ビタミンＥの誘導体としては、トロロックス（２，５，７，８－テトラメチル－６－ヒドロキシクロマン－２－カルボン酸）、トログリタゾン（５－［［４－［（３，４－ジヒドロ－６－ヒドロキシ－２，５，７，８－テトラメチル－２Ｈ－１－ベンゾピラン－２－イル）メトキシ］－フェニル］メチル］－２，４－チアゾリジンジオン）等が挙げられる。

ビタミンＥ又はその誘導体の投与量は、培養細胞の培地に添加する場合には、例えば、５０～１０００μＭが好ましく、例えば、１５０～４００μＭが好ましい。また、動物に投与する場合には、例えば１日あたり５０～２６０ｍｇ／ｋｇ体重を数回に分けて投与することが好ましい。

ビタミンＥ又はその誘導体は、それ自体を投与してもよいし、適宜の薬理学的に許容される添加剤と混合した医薬組成物として製剤化したものを投与してもよい。

（医薬組成物）
医薬組成物における製剤化の例としては、必要に応じて糖衣を施した錠剤、カプセル剤、エリキシル剤、マイクロカプセル剤として経口的に使用されるものが挙げられる。また、水若しくは水以外の薬学的に許容される液体との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用されるものが挙げられる。更には、薬理学上許容される担体若しくは媒体、具体的には、滅菌水、生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤等と適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化されたものが挙げられる。

錠剤、カプセル剤に混和することができる添加剤としては、例えば、ゼラチン、コーンスターチ、トラガントガム、アラビアゴムのような結合剤、結晶性セルロースのような賦形剤、コーンスターチ、ゼラチン、アルギン酸のような膨化剤、ステアリン酸マグネシウムのような潤滑剤、ショ糖、乳糖又はサッカリンのような甘味剤、ペパーミント、アカモノ油又はチェリーのような香味剤が挙げられる。調剤単位形態がカプセルである場合には、上記の材料に更に油脂のような液状担体を含有することができる。注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。

注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖、その他の補助薬、例えばＤ－ソルビトール、Ｄ－マンノース、Ｄ－マンニトール、塩化ナトリウムを含む等張液が挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート８０（商標）、ＨＣＯ－５０と併用してもよい。

油性液としてはゴマ油、大豆油が挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。

患者への投与は、例えば、動脈内注射、静脈内注射、皮下注射等のほか、鼻腔内的、経気管支的、筋内的、経皮的、または経口的に当業者に公知の方法により行いうる。投与量は、患者の体重や年齢、投与方法等により変動するが、当業者であれば適当な投与量を適宜選択することが可能である。また、当該化合物がＤＮＡによりコードされうるものであれば、当該ＤＮＡを遺伝子治療用ベクターに組込み、遺伝子治療を行うことも考えられる。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状等により変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。

化合物の投与量は、症状により差異はあるが、経口投与の場合、一般的に成人（体重６０ｋｇとして）においては、１日あたり約０．１～１００ｍｇ、約１．０～５０ｍｇ、約１．０～２０ｍｇであると考えられる。

非経口的に投与する場合は、その１回の投与量は投与対象、対象臓器、症状、投与方法によっても異なるが、例えば注射剤の形では通常成人（体重６０ｋｇとして）においては、通常、１日当り約０．０１～３０ｍｇ、約０．１～２０ｍｇ、約０．１～１０ｍｇを静脈注射により投与するのが好適であると考えられる。

本実施形態の抑制剤による治療効果が期待される好適な例として、心不全、不整脈性突然死等が挙げられる。

（ＣＤＫ４阻害剤又はＣＤＫ４発現抑制剤）
１実施形態において、本発明は、ＣＤＫ４阻害剤又はＣＤＫ４に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤を提供する。

後述するように、発明者らは、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子に、ＣＤＫ４が含まれることを明らかにした。したがって、ＣＤＫ４阻害剤又はＣＤＫ４に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤として使用することができる。

ＣＤＫ４阻害剤としては、例えば、３－ＡＴＡ（３－アミノ－９－チオ［１０Ｈ］－アクリドン）、ＮＳＣ－６２５９８７（１，４－ジメトキシ－９－チオ［１０Ｈ］－アクリドン）等が挙げられる。ＣＤＫ４に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸は、ＣＤＫ４の発現を抑制することができるものであれば特に制限されない。

ＣＤＫ４阻害剤の投与量は、培養細胞の培地に添加する場合には、例えば、５～２０μＭが好ましい。また、動物に投与する場合には、例えば１回あたり２～１０ｍｇ／ｋｇ体重を１日１回投与することが好ましい。

例えば、３－ＡＴＡは、１回あたり１～５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、２～１０ｍｇ／ｋｇ体重を、１日１回投与するとよい。

ＣＤＫ４に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸の投与量は、培養細胞の培地に添加する場合には、例えば、５０ｎＭ～１０μＭが好ましく、例えば、５０～２００ｎＭが好ましい。また、動物に投与する場合には、例えば１回あたり５０～５００ｍｇ／ｋｇ体重を１日１回投与することが好ましい。

ＣＤＫ４阻害剤又はＣＤＫ４に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸は、それ自体を投与してもよいし、適宜の薬理学的に許容される添加剤と混合した医薬組成物として製剤化したものを投与してもよい。医薬組成物の好ましい形態は、上述したものと同様である。

（ＭＥＫ阻害剤又はＭＥＫ発現抑制剤）
１実施形態において、本発明は、ＭＥＫ阻害剤又はＭＥＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤を提供する。

後述するように、発明者らは、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子に、ＭＥＫが含まれることを明らかにした。したがって、ＭＥＫ阻害剤又はＭＥＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤として使用することができる。

ＭＥＫ阻害剤としては、例えば、ＭＥＫｉｎｈｉｂｉｔｏｒＩ（（２Ｚ）－３－アミノ－３－［（２－アミノフェニル）スルファニル］－２－｛３－［ヒドロキシ（ピリジン－４－イル）メチル］フェニル｝プロパ－２－エンニトリル）、Ｕ－０１２６（１，４－ジアミノ－２，３－ジシアノ－１，４－ビス［２－アミノ－フェニルチオ］ブタジエン）等が挙げられる。ＭＥＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸は、ＭＥＫの発現を抑制することができるものであれば特に制限されない。

ＭＥＫ阻害剤の投与量は、培養細胞の培地に添加する場合には、例えば、１～１００μＭが好ましく、例えば、５～２０μＭが好ましい。また、動物に投与する場合には、例えば１回あたり２～１０ｍｇ／ｋｇ体重を１日１回投与することが好ましい。

ＭＥＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸の投与量は、培養細胞の培地に添加する場合には、例えば、５０ｎＭ～１０μＭが好ましく、例えば、５０～２００ｎＭが好ましい。また、動物に投与する場合には、例えば１回あたり５０～５００ｍｇ／ｋｇ体重を１日１回投与することが好ましい。

ＭＥＫ阻害剤又はＭＥＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸は、それ自体を投与してもよいし、適宜の薬理学的に許容される添加剤と混合した医薬組成物として製剤化したものを投与してもよい。医薬組成物の好ましい形態は、上述したものと同様である。

（ＥＲＫ阻害剤又はＥＲＫ発現抑制剤）
１実施形態において、本発明は、ＥＲＫ阻害剤又はＥＲＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤を提供する。本実施形態において、ＥＲＫは、ＥＲＫ１であってもＥＲＫ２であってもよい。

後述するように、発明者らは、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子に、ＥＲＫが含まれることを明らかにした。したがって、ＥＲＫ阻害剤又はＥＲＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤として使用することができる。

ＥＲＫ阻害剤としては、例えば、ＥＲＫＩｎｈｉｂｉｔｏｒ（｛３－（２－アミノエチル）－５－［（４－エトキシフェニル）メチレン］－２，４－チアゾリジンジオン，ＨＣｌ｝）、ＥＲＫＩｎｈｉｂｉｔｏｒＩＩ（｛５－（２－フェニル－ピラゾロ［１，５－ａ］ピリジン－３－イル）－１Ｈ－ピラゾロ［３，４－ｃ］ピリダジン－３－イルアミン｝）等が挙げられる。ＥＲＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸は、ＥＲＫの発現を抑制することができるものであれば特に制限されない。

ＥＲＫ阻害剤の投与量は、培養細胞の培地に添加する場合には、例えば、１～１００μＭが好ましく、例えば、５～２０μＭが好ましい。また、動物に投与する場合には、例えば１回あたり２～１０ｍｇ／ｋｇ体重を１日１回投与することが好ましい。

ＥＲＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸の投与量は、培養細胞の培地に添加する場合には、例えば、５０ｎＭ～１０μＭが好ましく、例えば、５０～２００ｎＭが好ましい。また、動物に投与する場合には、例えば１回あたり５０～５００ｍｇ／ｋｇ体重を１日１回投与することが好ましい。

ＥＲＫ阻害剤又はＥＲＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸は、それ自体を投与してもよいし、適宜の薬理学的に許容される添加剤と混合した医薬組成物として製剤化したものを投与してもよい。医薬組成物の好ましい形態は、上述したものと同様である。

（Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６又はＡｂｈｄ２の発現抑制剤）
１実施形態において、本発明は、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６又はＡｂｈｄ２に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤を提供する。

後述するように、発明者らは、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子に、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６、Ａｂｈｄ２が含まれることを明らかにした。したがって、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６又はＡｂｈｄ２に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤として使用することができる。

Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６又はＡｂｈｄ２に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸は、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６又はＡｂｈｄ２の発現を抑制することができるものであれば特に制限されない。

Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６又はＡｂｈｄ２に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸の投与量は、培養細胞の培地に添加する場合には、例えば、５０ｎＭ～１０μＭが好ましく、例えば、５０～２００ｎＭが好ましい。また、動物に投与する場合には、例えば１回あたり５０～５００ｍｇ／ｋｇ体重を１日１回投与することが好ましい。

Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６又はＡｂｈｄ２に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸は、それ自体を投与してもよいし、適宜の薬理学的に許容される添加剤と混合した医薬組成物として製剤化したものを投与してもよい。医薬組成物の好ましい形態は、上述したものと同様である。

［リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤］
（ビタミンＥ又はその誘導体）
１実施形態において、本発明は、ビタミンＥ又はその誘導体を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤を提供する。

別の実施形態において、本発明は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療のためのビタミンＥ又はその誘導体を提供する。

別の実施形態において、本発明は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤の製造のためのビタミンＥ又はその誘導体の使用を提供する。

別の実施形態において、本発明は、ビタミンＥ又はその誘導体の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療方法を提供する。

後述するように、発明者らは、ビタミンＥ又はその誘導体をインビトロで又はインビボで投与することにより、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制することができることを見出した。したがって、ビタミンＥ又はその誘導体は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤として使用することができる。

ビタミンＥ又はその誘導体を投与する場合には、例えば１日あたり５０～２６０ｍｇ／ｋｇ体重を数回に分けて投与することが好ましい。

ビタミンＥ又はその誘導体は、それ自体を投与してもよいし、適宜の薬理学的に許容される添加剤と混合した医薬組成物として製剤化したものを投与してもよい。医薬組成物の好ましい形態は、上述したものと同様である。

（ＣＤＫ４阻害剤又はＣＤＫ４発現抑制剤）
１実施形態において、本発明は、ＣＤＫ４阻害剤又はＣＤＫ４に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤を提供する。

別の実施形態において、本発明は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療のためのＣＤＫ４阻害剤又はＣＤＫ４に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を提供する。

別の実施形態において、本発明は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤の製造のためのＣＤＫ４阻害剤又はＣＤＫ４に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸の使用を提供する。

別の実施形態において、本発明は、ＣＤＫ４阻害剤又はＣＤＫ４に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療方法を提供する。

後述するように、発明者らは、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子に、ＣＤＫ４が含まれることを明らかにした。したがって、ＣＤＫ４阻害剤又はＣＤＫ４に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤として使用することができる。

ＣＤＫ４阻害剤を投与する場合には、例えば１回あたり１～５０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、２～１０ｍｇ／ｋｇ体重を、１日１回投与することが好ましい。例えば、３－ＡＴＡは、１回あたり０．５～１０ｍｇ／ｋｇ体重、より好ましくは、１～２ｍｇ／ｋｇ体重を、１日１回投与するとよい。

ＣＤＫ４に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸の投与量は、例えば１回あたり５０～５００ｍｇ／ｋｇ体重を１日１回投与することが好ましい。

（ＭＥＫ阻害剤又はＭＥＫ発現抑制剤）
１実施形態において、本発明は、ＭＥＫ阻害剤又はＭＥＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤を提供する。

別の実施形態において、本発明は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療のためのＭＥＫ阻害剤又はＭＥＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を提供する。

別の実施形態において、本発明は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤の製造のためのＭＥＫ阻害剤又はＭＥＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸の使用を提供する。

別の実施形態において、本発明は、ＭＥＫ阻害剤又はＭＥＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療方法を提供する。

後述するように、発明者らは、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子に、ＭＥＫが含まれることを明らかにした。したがって、ＭＥＫ阻害剤又はＭＥＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤として使用することができる。

ＭＥＫ阻害剤を投与する場合には、例えば１回あたり２～１０ｍｇ／ｋｇ体重を１日１回投与することが好ましい。

ＭＥＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を投与する場合には、例えば１回あたり５０～５００ｍｇ／ｋｇ体重を１日１回投与することが好ましい。

（ＥＲＫ阻害剤又はＥＲＫ発現抑制剤）
１実施形態において、本発明は、ＥＲＫ阻害剤又はＥＲＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤を提供する。

別の実施形態において、本発明は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療のためのＥＲＫ阻害剤又はＥＲＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を提供する。

別の実施形態において、本発明は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤の製造のためのＥＲＫ阻害剤又はＥＲＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸の使用を提供する。

別の実施形態において、本発明は、ＥＲＫ阻害剤又はＥＲＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療方法を提供する。

後述するように、発明者らは、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子に、ＥＲＫが含まれることを明らかにした。したがって、ＥＲＫ阻害剤又はＥＲＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤として使用することができる。

ＥＲＫ阻害剤を投与する場合には、例えば１回あたり２～１０ｍｇ／ｋｇ体重を１日１回投与することが好ましい。

ＥＲＫに対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を投与する場合には、例えば１回あたり５０～５００ｍｇ／ｋｇ体重を１日１回投与することが好ましい。

（Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６又はＡｂｈｄ２の発現抑制剤）
１実施形態において、本発明は、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６又はＡｂｈｄ２に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤を提供する。

別の実施形態において、本発明は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療のための、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６又はＡｂｈｄ２に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を提供する。

別の実施形態において、本発明は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤の製造のための、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６又はＡｂｈｄ２に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸の使用を提供する。

別の実施形態において、本発明は、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６又はＡｂｈｄ２に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸の有効量を、治療を必要とする患者に投与することを含む、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療方法を提供する。

後述するように、発明者らは、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子に、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６、Ａｂｈｄ２が含まれることを明らかにした。したがって、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６又はＡｂｈｄ２に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患の予防又は治療剤として使用することができる。

Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６又はＡｂｈｄ２に対する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を投与する場合には、例えば１回あたり５０～５００ｍｇ／ｋｇ体重を１日１回投与することが好ましい。

上述した、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が関連する疾患としては、例えば心不全、不整脈性突然死等が挙げられる。後述するように、発明者らは、マウスを用いたインビボの実験において、上記の予防又は治療剤が、心不全（不整脈性突然死）を予防できることを明らかにした。

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実験例１］
（タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の樹立）
ＰＨＧＰｘ欠損細胞死のメカニズムを明らかにするために、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株を樹立した。この細胞は、タモキシフェンを培地に加えると２４時間以内にＣｒｅ－ｌｏｘＰシステムによりＰＨＧＰｘゲノム遺伝子が欠失する。

具体的には、ＰＨＧＰｘ遺伝子ノックアウトマウス（ＰＨＧＰｘ^－／－）に、ｌｏｘＰ配列に挟まれたＰＨＧＰｘ遺伝子（ｌｏｘＰ－ＰＨＧＰｘ）を遺伝子導入（Ｔｇ）した、Ｔｇ（ｌｏｘＰ－ＰＨＧＰｘ）：ＰＨＧＰｘ^－／－マウスと、ＰＨＧＰｘ^＋／－マウスを交配させた。続いて、遺伝子型がＴｇ（ｌｏｘＰ－ＰＨＧＰｘ）：ＰＨＧＰｘ^－／－である１３．５日胚から、マウス胎仔線維芽細胞（ＭＥＦ）を調製した。続いて、得られた細胞にＳＶ４０ウイルスのＴ抗原遺伝子を遺伝子導入することにより不死化した。続いて、得られた細胞にタモキシフェン誘導型ＣｒｅＥＲＴ２遺伝子を導入した。これにより、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株が得られた。

なお、ＣｒｅＥＲＴ２とは、エストロゲン受容体と融合タンパク質にしたＣｒｅ（ＣｒｅＥＲ）を、エストロゲンに反応せず、タモキシフェンに反応するように変異させたものである。タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地にタモキシフェンを添加すると、ＣｒｅＥＲ２のエストロゲン受容体部分にタモキシフェンが結合し、エストロゲン受容体の核移行シグナルが露出する。その結果、ＣｒｅＥＲ２が核内へ移行し、ｌｏｘＰで挟まれたＰＨＧＰｘゲノム遺伝子が破壊される。添加するタモキシフェンの濃度は終濃度１μＭ程度でよい。

［実験例２］
（タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株へのタモキシフェンの投与）
タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加した。続いて、タモキシフェン添加から０、２４及び４８時間後の細胞を回収し、抗ＰＨＧＰｘ抗体を用いたウエスタンブロッティングにより、各細胞サンプル中のＰＨＧＰｘタンパク質の量を測定した。

図２は、ＰＨＧＰｘタンパク質を検出するウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。その結果、タモキシフェン投与から２４時間以内にＰＨＧＰｘタンパク質の発現量が減少することが確認された。

［実験例３］
（ＰＨＧＰｘ欠損細胞におけるリン脂質ヒドロペルオキシドの検出）
タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加し、生成されるリン脂質ヒドロペルオキシドを検出した。検出には、液体クロマトグラフィー（ＬＣ）－エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳ）／質量分析（ＭＳ）を用いた。

液体クロマトグラフィーには、ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣ装置（ウォーターズ社）を用い、質量分析には、四重極リニアイオントラップ質量分析システム（商品名４０００Ｑ－ＴＲＡＰ、エービー・サイエックス社）を用いた。液体クロマトグラフィーのカラムには、ＡＣＱＵＩＴＹＵＰＬＣ（商標）ＢＥＨＣ１８カラム（０．１７μｍ、１５０ｍｍ×１．０ｍｍ）を使用した。

タモキシフェン添加から、０、１２、２４、３６及び４８時間後の各細胞から抽出した全リン脂質画分のサンプルをオートサンプラーに供し、移動相Ａ（アセトニトリル／メタノール／水＝２：２：１（ｖ／ｖ）、０．１％ほう酸、０．０２８％アンモニア）：移動相Ｂ（イソプロパノール、０．１％ほう酸、０．０２８％アンモニア）の１００：０（０～５分）、５０：５０（５～２５分）、５０：５０（２５～４９分）、１００：０（５９～６０分）及び１００：０（６０～７５分）のステップグラジエント、流量７０μＬ／分、カラム温度３０℃の条件で分離した。

ＭＳ／ＭＳ解析は、ＭＲＭ（ＭｕｌｔｉＲｅａｃｔｉｏｎＭｏｎｉｔｏｒｉｎｇ）の手法を用いてネガティブイオンモードで実施した。イオンスプレー電圧は、－４５００Ｖに設定した。窒素ガスを障壁ガス及びコリジョンガスとして使用した。酸化リン脂質の検出において、コリジョンエネルギーは２０－６５ｅＶに設定した。装置のスキャンレンジは、ｍ／ｚ５０～９５０、スキャンスピード１０００Ｔｈ／秒に設定した。Ｑ０トラッピングをオンにし、リニアイオントラップフィルタイムを１０ミリ秒に設定した。デクラスタリングポテンシャルを－１０５Ｖに設定した。Ｑ１の解像度を「ユニット」に設定した。ホスファチジルコリンヒドロペルオキシド（１８：０：２０：４由来）の特徴的なフラグメンテーションパターンは、ドウェルタイム５０ミリ秒、デクラスタリングポテンシャルを－８０Ｖに設定した。Ｑ１及びＯ３の解像度はユニットに設定し、Ｑ１は８８６ｍ／ｚ、Ｏ３は２８３ｍ／ｚ（コリジョンエネルギー－６０ｅＶ）及び３３５ｍ／ｚ（コリジョンエネルギー－４５ｅＶ）に設定した。

図３は、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加後、０、１２、２４、３６及び４８時間後の細胞内で、１８：０（ステアリン酸）、２０：４（アラキドン酸）をもつホスファチジルコリン（ＰＣ）から酸化により生成した酸化一次生成物であるリン脂質ヒドロペルオキシド（ＰＣＯＯＨ）の生成量を経時的に示したグラフである。タモキシフェンの添加から２４時間後をピークに、アラキドン酸を含むリン脂質の酸化一次生成物であるリン脂質ヒドロペルオキシドが生成された。ＤＨＡを含むリン脂質の酸化一次生成物であるリン脂質ヒドロペルオキシドも同様な結果が得られている（図なし）。

［実験例４］
（ＰＨＧＰｘ欠損細胞のＭＴＴアッセイ）
タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加し、ＭＴＴアッセイにより、細胞の生存率を測定した。また、タモキシフェンと同時に終濃度２００μＭのビタミンＥ添加群についても同様の検討を行った。

より具体的には、タモキシフェンの添加から２４、４８及び７２時間後の細胞の培地にＭＴＴ（３－［４，５－ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｉａｚｏｌ－２－ｙｌ］－２，５－ｄｉｐｈｅｎｙｌｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍｂｒｏｍｉｄ）を添加し、４時間後に各細胞をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解し、５４０ｎｍにおける吸光度を測定した。

図４は、ＭＴＴアッセイの結果を示すグラフである。タモキシフェン添加から４８時間後から７２時間の間に細胞死が起こることが明らかとなった。また、ビタミンＥの添加により細胞死が完全に抑制されることが明らかとなった。

［実験例５］
（リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死とアポトーシスとの比較）
リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死（ＰＨＧＰｘ欠損による細胞死）が、アポトーシスによる細胞死経路を介しているのか否かについて詳細に検討した。

タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地に、カスパーゼ阻害剤であるＺ－ＶＡＤ－ＦＭＫを終濃度５０μＭ、ミトコンドリアタンパク質であるアポトーシス誘導因子（ＡＩＦ）の放出阻害剤であるＤＨＩＱを終濃度３００μＭ、ビタミンＥ誘導体であるトロロックスを終濃度４００μＭ添加したもの、及び、対照として何も添加していない細胞を用意した。各細胞に終濃度１μＭのタモキシフェンを同時に添加した。タモキシフェン、阻害剤添加３日後にＫｅｙｅｎｃｅ社のオールインワン顕微鏡にて、ランダムに２０枚の写真を撮り、付着している生細胞の数をカウントした。対物レンズにＰｌａｎＦｌｏｕｒＥＬＷＤ２０ｘ０．４５（Ｎｉｃｏｎ）を用いて１０倍で観察した（一視野８７７．５μｍ×６６１．２μｍ）。細胞生存率（％）は、タモキシフェンを添加せずに、３日培養した時の細胞数を１００％として表した。

結果を図５（ａ）に示す。カスパーゼ阻害剤、ＡＩＦ系の阻害剤では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制することができなかった。一方ビタミンＥ誘導体であるトロロックスは細胞死を抑制することができた。

次に、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地にアポトーシス誘導試薬であるスタウロスポリンを終濃度０．５μＭで添加したものと、タモキシフェンを終濃度１μＭで添加したものを用意した。５時間後、２４時間後、４８時間後に、各細胞を、蛍光免疫染色し、シトクロムＣ及び活性化カスパーゼ３を染色した。また、ＴＵＮＥＬ（ＴｄＴ－ｍｅｄｉａｔｅｄｄＵＴＰｎｉｃｋｅｎｄｌａｂｅｌｉｎｇ）法によりアポトーシスの特徴であるＤＮＡの断片化を検出した。

結果を図５（ｂ）に示す。スタウロスポリン処理では、５時間後にシトクロムＣの放出が観察され、カスパーゼ３が活性化し、２４時間後にはＴＵＮＥＬ陽性の細胞死（アポトーシス）が観察された。一方、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死では、シトクロムＣの放出やカスパーゼ３の活性化は観察されなかった（図では４８時間後を示したが、６０時間後でも観察されなかった）。ＴＵＮＥＬ染色のみ、核内にドット状の染色が観察されたが、ＤＮＡラダーは検出されなかった。

以上のことから、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死は、典型的なアポトーシスとは異なることが明らかとなった。

［実験例６］
（リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死とネクローシスとの比較）
リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が、ネクローシスによるものか否かについて詳細に検討した。

タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地にタモキシフェンを終濃度１μＭで添加し、細胞死の瞬間をタイムラプス解析で検討した。しかしながら、細胞死の瞬間にネクローシスの特徴である細胞の膨潤は観察されなかった。細胞死の直前に細胞が形を変形し、最後はシャーレよりはがれて突然致死となった（図示せず。）。

続いて、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地に、ネクローシス誘導剤であるｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシドを終濃度３００ｍＭで添加したものと、タモキシフェンを終濃度１μＭで添加したものを用意した。３０分後（ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド添加群）及び４８時間後（タモキシフェン添加群）に、各細胞を、蛍光免疫染色し、ネクローシスの特徴であるＨＭＧＢ１（ＨｉｇｈＭｏｂｉｌｉｔｙＧｒｏｕｐＢｏｘ１）タンパク質の細胞質への放出を観察した。

図６（ａ）は、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド添加３０分後の結果を示す写真であり、図６（ｂ）は、タモキシフェン添加４８時間後の結果を示す写真である。なお、図６（ａ）及び（ｂ）において、ＨＭＧＢ１の分布を赤で、核をＨｏｅｃｈｓｔ（青）で染色した。

その結果、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド添加による細胞死では、ネクローシスの指標であるＨＭＧＢ１の核から細胞質への放出が観察されたのに対し、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死では、ＨＭＧＢ１は核にとどまっており細胞質への放出が認められなかった。

以上のことから、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死は、ネクローシスとは異なることが明らかとなった。

［実験例７］
（リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死とオートファジー性細胞死との比較）
リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が、オートファジー性細胞死によるものか否かについて詳細に検討した。オートファジー性細胞死を起こすためにはＡＴＧ５遺伝子が必須であることが知られている。

タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株に、ＡＴＧ５特異的ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ）を導入し、ＡＴＧ５の発現をノックダウンした細胞を用意した。ＡＴＧ５特異的ｓｈＲＮＡとしては、ＡＴＧ５ｓｈＲＮＡ－３（配列番号７）及びＡＴＧ５ｓｈＲＮＡ－４（配列番号８）の２種類のｓｈＲＮＡを使用した。また、対照として、ｓｈＲＮＡ発現ベクターのみを導入した細胞を用意した。これらの細胞の培地に、タモキシフェンを終濃度１μＭで添加し、２４、３６、４８、６０及び７２時間後の細胞を、Ｋｅｙｅｎｃｅ社のオールインワン顕微鏡にて、ランダムに２０枚の写真を撮り、付着している生細胞の数をカウントした。細胞生存率（％）は、タモキシフェンを添加後２４時間後の細胞数を１００（％）とし、それぞれの時間の生細胞数の割合の変化を細胞生存率（％）として表した。

結果を図７（ａ）及び図７（ｂ）に示す。ＡＴＧ５の発現をノックダウンしても、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制することはできなかった。また、図７（ｂ）に示すように、ＲＴ－ＰＣＲの結果から、ｓｈＲＮＡの導入により、ＡＴＧ５遺伝子の発現がノックダウンされたことが確認された。

以上のことから、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死は、オートファジー性細胞死とは異なることが明らかとなった。

［実験例８］
（リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死とネクトローシスとの比較）
リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が、ネクトローシスによるものか否かについて詳細に検討した。ネクトローシスは、プログラムされたネクローシスとして知られる細胞死の１形態である。また、ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ｉｎｔｅｒａｃｔｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅ１（Ｒｉｐ１）のノックダウンにより、ネクトローシスが顕著に抑制されることが知られている。

タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株に、Ｒｉｐ１特異的ｓｈＲＮＡ（ｓｍａｌｌｈａｉｒｐｉｎＲＮＡ）を導入し、Ｒｉｐ１の発現をノックダウンした細胞を用意した。Ｒｉｐ１特異的ｓｈＲＮＡとしては、Ｒｉｐ１ｓｈＲＮＡ－４（配列番号９）を使用した。また、対照として、ｓｈＲＮＡ発現ベクターのみを導入した細胞、及び培地中に終濃度４００μＭでトロロックスを添加した細胞を用意した。これらの細胞の培地に、タモキシフェンを終濃度１μＭで添加し、２４時間後、７２時間後の生細胞をＫｅｙｅｎｃｅ社のオールインワン顕微鏡にて、ランダムに２０枚の写真を撮り、付着している生細胞の数をカウントした。細胞生存率（％）は、タモキシフェンを添加後２４時間後の細胞数を１００（％）とし、７２時間後の付着している生細胞数の割合を細胞生存率（％）として表した。

結果を図８（ａ）及び図８（ｂ）に示す。Ｒｉｐ１の発現をノックダウンしても、ＰＨＧＰｘ欠損による細胞死を抑制することはできなかった。また、図８（ｂ）に示すように、ウエスタンブロッティングの結果から、ｓｈＲＮＡの導入により、Ｒｉｐ１タンパク質の発現がノックダウンされたことが確認された。

以上のことから、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死は、ネクトローシスとは異なることが明らかとなった。すなわち、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死は、アポトーシス、ネクローシス、オートファジー性細胞死、ネクトローシスとは異なる新規の細胞死であることが明らかとなった。

［実験例９］
（リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制可能な化合物のスクリーニング）
約３００種類の既知の酵素に対する阻害剤ライブラリー（文科省科研費・新学術領域・がん支援・化学療法基盤支援活動班・標準阻害剤キット）を用い、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株に、タモキシフェンを終濃度１μＭで添加した場合の、７２時間後の細胞死を抑制できる化合物をスクリーニングした。その結果、ｃｙｃｌｉｎ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔｋｉｎａｓｅ４（ＣＤＫ４）の阻害剤である、３－ＡＴＡ及びＮＳＣ６２５９８７、並びにｍｉｔｏｇｅｎ－ａｃｔｉｖａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅｋｉｎａｓｅ（ＭＥＫ１／２）の阻害剤である、Ｕ－０１２６及びＭＥＫｉｎｈｉｂｉｔｏｒＩの４種類の化合物が、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制できることを見出した。一方、ｐ３８及びＪＮＫの阻害剤では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制することができなかった。

［実験例１０］
（ＣＤＫ４、ＭＥＫ１／２の阻害剤を使用した、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制）
図９（ａ）は、ＣＤＫ４の阻害剤である３－ＡＴＡを使用した、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制の結果を示すグラフである。図９（ｂ）は、ＭＥＫ１／２の阻害剤であるＵ－０１２６を使用した、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制の結果を示すグラフである。

タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地に、各濃度の３－ＡＴＡ又はＵ－０１２６及び終濃度１μＭのタモキシフェンを添加し、２４時間後、７２時間後の生細胞をＫｅｙｅｎｃｅ社のオールインワン顕微鏡にて、ランダムに２０枚の写真を撮り、付着している生細胞の数をカウントした。細胞生存率（％）は、タモキシフェンを添加後２４時間後の細胞数を１００（％）とし、７２時間後の付着している生細胞数の割合を細胞生存率（％）として表した。

その結果、３－ＡＴＡ及びＵ－０１２６のいずれも、濃度依存的にリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制することが明らかとなった。

図９（ｃ）は、３－ＡＴＡ、Ｕ－０１２６及びビタミンＥの、インビトロにおけるリン脂質自動酸化抑制能を検討した結果を示すグラフである。ジリノレオイルフォスファチジルコリンのエタノール溶液中に、各濃度の３－ＡＴＡ、Ｕ－０１２６及びビタミンＥを添加し、イムロン１プレート（サーモフィッシャーサイエンティフィック社）にそれぞれの量で５０μｌ加え、３７度で乾固させ、更に一晩放置し自動酸化を行った。自動酸化により生成したリン脂質ヒドロペルオキシドの測定には、リン脂質ヒドロペルオキシドと反応して蛍光を発するプローブであるジヒドロローダミン１２３（ＤＨＲ）（モレキュラープローブ社）を１μｇ／ｍｌで３０分反応させ、蛍光プレートリーダーにて蛍光量を測定した（励起波長：４８５ｎｍ、蛍光波長：５３０ｎｍ）。

ビタミンＥは、インビトロでリン脂質の自動酸化を抑制するが、３－ＡＴＡ及びＵ－０１２６は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制できる濃度において、インビトロでのリン脂質の自動酸化を抑制しないことが明らかとなった。このことから、３－ＡＴＡ及びＵ－０１２６は、抗酸化能をもたず、ＣＤＫ４及びＭＥＫ１／２活性を阻害することにより、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制していると考えられた。

［実験例１１］
（ＣＤＫ４のキナーゼ活性がリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に必要である）
レトロウイルス感染系でｓｈＲＮＡをタモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞に発現させることにより、ＣＤＫ４のノックダウン細胞を作成し、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制できるか否かを検討した。

図１０（ａ）は、検討結果を示すグラフである。まず、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株に、ＣＤＫ４特異的ｓｈＲＮＡ（配列番号１０）を導入し、ＣＤＫ４をノックダウンした細胞を用意した（Ｃｄｋ４ＫＤ）。対照として、ベクターのみを導入した細胞を用意した（Ｃｏｎｔｒｏｌ）。更に、ＣＤＫ４をノックダウンした細胞株にヒトＣＤＫ４発現ベクター（ｈＣｄｋ４）、キナーゼ活性が破壊されたヒトＣＤＫ４発現ベクター（ｈＣｄｋ４Ｄ１５８Ｎ）及び対照としてベクターのみ（ｍｏｃｋ）をそれぞれ導入した。続いて、各細胞に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加した。タモキシフェンの添加から２４時間後、７２時間後の生細胞をＫｅｙｅｎｃｅ社のオールインワン顕微鏡にて、ランダムに２０枚の写真を撮り、付着している生細胞の数をカウントした。細胞生存率（％）は、タモキシフェンを添加後２４時間後の細胞数を１００（％）とし、７２時間後の付着している生細胞数の割合を細胞生存率（％）として表した。

なお、ここで導入したヒトＣＤＫ４遺伝子（配列番号１６）は、上述のマウスＣＤＫ４特異的ｓｈＲＮＡに耐性であった。すなわち、ヒトＣＤＫ４遺伝子は、上述のマウスＣＤＫ４特異的ｓｈＲＮＡによって、ノックダウンされないものであった。

その結果、ＣＤＫ４のノックダウン細胞（Ｃｄｋ４ＫＤ／ｍｏｃｋ）では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制された。また、ＣＤＫ４をノックダウンしたうえで、ヒトＣＤＫ４遺伝子を再導入した細胞（Ｃｄｋ４ＫＤ／ｈＣｄｋ４）では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が回復した。一方、ＣＤＫ４をノックダウンしたうえで、キナーゼ活性が破壊されたヒトＣＤＫ４遺伝子を導入した細胞（Ｃｄｋ４ＫＤ／ｈＣｄｋ４Ｄ１５８Ｎ）では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が回復しなかった。なお、図中の星印は、５％未満の危険率で有意差があることを示す。

図１０（ｂ）に、ウエスタンブロッティングにより、ＣＤＫ４タンパク質の発現を確認した結果を示す。

以上の結果から、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死には、ＣＤＫ４のキナーゼ活性が必要であることが明らかとなった。

（ＣＤＫ４をノックダウンした細胞の作製）
上記実験例において、ＣＤＫ４をノックダウンしたタモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞は、次のようにして作製した。

まず、図３３（ａ）に示す、ｓｈＲＮＡベクター（ｐｉＭＧ－ｄｒＵ６）のＵ６プロモーターの下流にＣＤＫ４特異的ｓｈＲＮＡ（配列番号１０）をコードするＤＮＡ断片を組み込んだ。続いて、レトロウイルス感染系を利用して上記ｓｈＲＮＡの発現カセットを対象細胞のゲノムに組み込み、ＣＤＫ４特異的ｓｈＲＮＡを発現させ、ＣＤＫ４をノックダウンした細胞を得た。

図３３（ｂ）は、発現したｓｈＲＮＡからｓｉＲＮＡが形成され、標的ＲＮＡが破壊される過程を示すモデル図である。ｓｈＲＮＡベクターは、東京大学医学部廣瀬謙三先生、名古屋大学医学部菅生厚太郎先生より頂いた。後述するＣＤＫ４以外の遺伝子をノックダウンした細胞、並びに実験例７、８で使用したＡＴＧ５及びＲｉｐ１のノックダウン細胞も同様の方法により作製した。

（ＣＤＫ４の再発現）
再発現実験に用いたレトロウイルス感染系の高発現ベクターとしては、図３４に示すｐＭＸｓ－ＩＲベクターを用いた。ｐＭＸｓ－ＩＲベクターは、東京大学医科学研究所北村俊雄先生に頂いた。後述する、ＣＤＫ４以外の遺伝子の発現も同様の方法により行った。

（ＰｌａｔＥ細胞への遺伝子導入）
ｓｈＲＮＡベクター及びｐＭＸｓ－ＩＲベクターからのレトロウイルスの調製には、ＰｌａｔＥ細胞を使用した。ＰｌａｔＥ細胞とは、ヒト胎児由来腎臓上皮細胞である２９３Ｔ細胞に、ｇａｇ－ｐｏｌ遺伝子及びｅｎｖ遺伝子が組み込まれた細胞である。

ＰｌａｔＥ細胞は、１０％ＦＣＳ、２ｍＭグルタミン（ＧＩＢＣＯ）、１００ｕｎｉｔｓ／ｍｌペニシリン（ＧＩＢＣＯ）、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン（ＧＩＢＣＯ）を含むダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、日水製薬）を用いて、３７℃にてＣＯ_２インキュベーターで培養した。

ＰｌａｔＥ細胞を５×１０^５ｃｅｌｌｓ／シャーレで６ｃｍシャーレ（ＣＯＲＮＩＮＧ）にまき、１日培養した。１．５ｍＬチューブにＤＭＥＭＦＣＳ（－）を２００μＬ、生成したプラスミドＤＮＡ（目的遺伝子を組み込んだｓｈＲＮＡベクター又はｐＭＸｓ－ＩＲベクター）を２μｇ／２μＬ、ＰｌｕｓＲｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号１１５１４－０１５）８μＬを加え、１５分間室温放置した。次に、ＤＭＥＭＦＣＳ（－）５０μＬとＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅＲｅａｇｅｎｔ（ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、製品番号１８３２４－０２０）１２μＬをあらかじめ混ぜておいたものを上記の反応液に加え、１５分室温放置した。リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で細胞を洗浄し、ＤＭＥＭＦＣＳ（－）を１．７２８ｍＬ加えた。続いて、上記の反応液を細胞に添加し、３７℃にて３時間ＣＯ_２インキュベーター中に放置し、遺伝子導入を行った。その後、ＤＭＥＭ１０％ＦＣＳ６ｍＬで反応液を置き換えて、３７℃にて約４８時間培養した。

（ウイルス液の調製）
続いて、培養上清を１５ｍＬチューブ（ＣＯＲＮＩＮＧ）に移し、３，０００ｒｐｍ、５分、４℃の条件で遠心した。上清を新しいチューブに移し、ウイルス液とした。

（ウイルスの感染）
ウイルス感染させる前日にタモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損細胞を６ｃｍシャーレ（ＣＯＲＮＩＮＧ）に１×１０^５ｃｅｌｌｓ／シャーレでまき、１日培養した。最終濃度が８μｇ／ｍＬになるようにＰｏｌｙｂｒｅｎｅ（商標）（Ｈｅｘａｄｉｍｅｔｈｒｉｎｅｂｒｏｍｉｄｅ、ＳＩＧＭＡ、カタログ番号Ｈ９２６８）を加えたウイルス液５ｍＬを、細胞の培地を置き換えることにより感染させ、２４時間培養後に培地を交換した。なお、Ｐｏｌｙｂｒｅｎｅ（商標）は、クリーンベンチ内において、滅菌水で１０ｍｇ／ｍＬとなるように溶解してフィルター滅菌し、使用時に希釈して用いた。

［実験例１２］
（ＭＥＫ１のキナーゼ活性がリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に必要である）
レトロウイルスでｓｈＲＮＡを発現させることにより、ＭＥＫ１のノックダウン細胞を作成し、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制できるか否かを検討した。

図１１（ａ）は、検討結果を示すグラフである。まず、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株に、ＭＥＫ１特異的ｓｈＲＮＡ（配列番号１１）を導入し、ＭＥＫ１をノックダウンした細胞を用意した（ＭＥＫ１ＫＤ）。対照として、ベクターのみを導入した細胞を用意した（Ｃｏｎｔｒｏｌ）。更に、ＭＥＫ１をノックダウンした細胞にヒトＭＥＫ１発現ベクター（ｈＭｅｋ１）、キナーゼ活性が破壊されたヒトＭＥＫ１発現ベクター（ｈＭｅｋ１Ｓ２２２Ａ）及び対照としてベクターのみ（ｍｏｃｋ）をそれぞれ導入した。続いて、各細胞に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加した。タモキシフェンの添加から２４時間後、７２時間後の生細胞をＫｅｙｅｎｃｅ社のオールインワン顕微鏡にて、ランダムに２０枚の写真を撮り、付着している生細胞の数をカウントした。細胞生存率（％）は、タモキシフェンを添加後２４時間後の細胞数を１００（％）とし、７２時間後の付着している生細胞数の割合を細胞生存率（％）として表した。

なお、ここで導入したヒトＭＥＫ１遺伝子（配列番号１７）は、上述のマウスＭＥＫ１特異的ｓｈＲＮＡに耐性であった。すなわち、ヒトＭＥＫ１遺伝子は、上述のマウスＭＥＫ１特異的ｓｈＲＮＡによって、ノックダウンされないものであった。

その結果、ＭＥＫ１のノックダウン細胞（ＭＥＫ１ＫＤ／ｍｏｃｋ）では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制された。また、ＭＥＫ１をノックダウンしたうえで、ヒトＭＥＫ１遺伝子を導入した細胞（ＭＥＫ１ＫＤ／ｈＭｅｋ１）では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が回復した。一方、ＭＥＫ１をノックダウンしたうえで、キナーゼ活性が破壊されたヒトＭＥＫ１遺伝子を導入した細胞（ＭＥＫ１ＫＤ／ｈＭｅｋ１Ｓ２２２Ａ）では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が回復しなかった。なお、図中の星印は、５％未満の危険率で有意差があることを示す。

図１１（ｂ）に、ウエスタンブロッティングにより、ＭＥＫ１タンパク質の発現を確認した結果を示す。

以上の結果から、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死には、ＭＥＫ１のキナーゼ活性が必要であることが明らかとなった。

［実験例１３］
（ＭＥＫ１／２及びＥＲＫのリン酸化は、タモキシフェン添加後３６時間以降で亢進する）
リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の過程で、いつＭＥＫのリン酸化及びその基質であるＥＲＫのリン酸化が起きるのかについて検討した。

タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地に、終濃度１μＭでタモキシフェンを添加した。続いて、タモキシフェンの添加から、２４、２７、３０、３３、３６、３９、４２、４５及び４８時間後の細胞サンプルを用いて、抗ＭＥＫ抗体、抗リン酸化ＭＥＫ抗体、抗ＥＲＫ抗体及び抗リン酸化ＥＲＫ抗体を用いたウエスタンブロッティングを行った。

図１２（ａ）及び図１２（ｂ）は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。その結果、タモキシフェンの添加後３６～４５時間でＭＥＫ１／２のリン酸化が亢進し、タモキシフェンの添加後３６～４８時間でＥＲＫ２のリン酸化が亢進していることが明らかになった。ＥＲＫ１のリン酸化の亢進は見られなかった。タモキシフェンを添加しない場合は、この時間におけるＭＥＫ及びＥＲＫ２のリン酸化は見られなかった（図なし）。

［実験例１４］
（ＥＲＫ２のノックダウンはリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制する）
レトロウイルスでｓｈＲＮＡを発現させることにより、ＥＲＫ２のノックダウン細胞を作成し、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制できるか否かを検討した。

図１３（ａ）は、検討結果を示すグラフである。まず、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株に、ＥＲＫ２特異的ｓｈＲＮＡ（配列番号１２）を導入し、ＥＲＫ２をノックダウンした細胞を用意した（Ｅｒｋ２ｓｈＲＮＡ－２）。対照として、ベクターのみを導入した細胞を用意した（ｍｏｃｋ）。続いて、各細胞に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加した。タモキシフェンの添加から２４時間後、７２時間後の生細胞をＫｅｙｅｎｃｅ社のオールインワン顕微鏡にて、ランダムに２０枚の写真を撮り、付着している生細胞の数をカウントした。細胞生存率（％）は、タモキシフェンを添加後２４時間後の細胞数を１００（％）とし、７２時間後の付着している生細胞数の割合を細胞生存率（％）として表した。

その結果、ＥＲＫ２のノックダウン細胞（Ｅｒｋ２ｓｈＲＮＡ－２）では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制が認められ、ＥＲＫ２をノックダウンするとリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制されることが明らかとなった。

図１３（ｂ）に、ウエスタンブロッティングにより、ＥＲＫ１及びＥＲＫ２タンパク質の発現を確認した結果を示す。

以上の結果から、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死には、ＭＥＫの下流で、ＥＲＫ２が関与していると考えられた。

［実験例１５］
（リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死経路において、リン脂質ヒドロペルオキシドの生成及びＣＤＫ４は、ＭＥＫ１／２の上流で機能している）
タモキシフェンの添加から３９時間後に生じるＭＥＫ及びＥＲＫのリン酸化が、タモキシフェンの添加から２４時間後に生じるリン脂質ヒドロペルオキシドの生成やＣＤＫ４の活性化の下流で機能しているか否かを検討した。具体的には、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地に、脂質酸化抑制剤である、ビタミンＥ誘導体のトロロックス（終濃度４００μＭ）、及びＣＤＫ４阻害剤である３－ＡＴＡ（終濃度１０μＭ）を、終濃度１μＭのタモキシフェンと同時に添加し、タモキシフェンの添加から３９時間後に生じるＭＥＫとＥＲＫ２のリン酸化を、ウエスタンブロッティングにより検討した。

図１４（ａ）は、ウエスタンブロッティングの結果を示す写真である。その結果、トロロックス、３－ＡＴＡ添加によりＭＥＫとＥＲＫ２のリン酸化の亢進が抑制されたことから、脂質酸化、ＣＤＫ４の活性化の下流にＭＥＫ－ＥＲＫ２経路が位置することが明らかになった。

図１４（ｂ）は、以上の結果から明らかになったリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死経路の一部を示すモデル図である。

［実験例１６］
（リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死経路において、ＣＤＫ４は、リン脂質ヒドロペルオキシドの生成の下流で機能している）
ＣＤＫ４及びＭＥＫ１の活性化が、リン脂質ヒドロペルオキシドの生成の下流で機能しているか否かをフローサイトメトリーにより検討した。

図１５は、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞にＣＤＫ４特異的ｓｈＲＮＡ（配列番号１０）を導入した細胞（Ｃｄｋ４ＫＤ）、及びＭＥＫ１特異的ｓｈＲＮＡ（配列番号１１）を導入した細胞（Ｍｅｋ１ＫＤ）を用意した。また、対照として、ベクターのみを導入した細胞（Ｃｏｎｔｒｏｌ）を用意した。各細胞を、終濃度１μＭのタモキシフェンの存在下又は非存在下で２４時間インキュベート後、リン脂質ヒドロペルオキシドの生成を検出できる蛍光色素であるＨ２ＤＣＦＤＡで染色し、フローサイトメトリーで測定した。

その結果、ＣＤＫ４又はＭＥＫ１をノックダウンした細胞においても、タモキシフェンの添加により、リン脂質ヒドロペルオキシドが増加することが確認された。この結果から、ＣＤＫ４及びＭＥＫ１の活性化が、リン脂質ヒドロペルオキシドの生成の下流で機能していることが明らかとなった。

図１６に、以上の結果から明らかとなった、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死経路のモデル図を示す。ＰＨＧＰｘが欠損すると、リン脂質の酸化一次生成物であるリン脂質ヒドロペルオキシドが、２４時間後をピークとして上昇する。その下流でＣＤＫ４が活性化し、３６時間後以降にＭＡＰキナーゼ経路のＭＥＫ、ＥＲＫがリン酸化され、４８時間後から７２時間の間で細胞死を引き起こす。

［実験例１７］
（レンチウイルスｓｈＲＮＡライブラリーを用いた、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子の同定）
リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子を同定するために、レンチウイルス網羅的ｓｈＲＮＡライブラリー（ＳＢＩ社）を用いたスクリーニングを行った。このシステムでは、ｓｈＲＮＡの配列が、Ｇｅｎｅｃｈｉｐ（商品名、アフィメトリクス社）に結合するように作成されているため、ｓｈＲＮＡの配列の同定にＧｅｎｅｃｈｉｐを利用することができる。

まず、網羅的ｓｈＲＮＡを発現することができるプール型のレンチウイルスを、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞に感染させ、ｓｈＲＮＡ発現細胞を作製した。このｓｈＲＮＡ発現細胞の培地に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加し、通常であれば完全に細胞死が起きる９６時間後に生き残っていた細胞を回収した。回収した細胞からＲＮＡを抽出し、細胞に導入されていたｓｈＲＮＡ配列を含むｃＤＮＡを数回増幅し、Ｇｅｎｅｃｈｉｐのプローブを作成し、マイクロアレイ解析を行った。

図１７は、ｓｈＲＮＡライブラリーのスクリーニング手順の概要を示す図である。２回の実験により、２つに分けたレンチウイルス感染細胞をタモキシフェン添加後９６時間後にも生存していた細胞と、タモキシフェン未添加状態で９６時間後に生存している全ての細胞に含まれるｓｈＲＮＡ配列を増幅したプローブを用いてＧｅｎｅｃｈｉｐを行い、タモキシフェン添加細胞で未添加細胞よりも濃縮されたプローブを検出した。２回の実験で濃縮された共通の細胞死実行因子の同定を試みた結果、細胞死実行因子の候補として１５１個の遺伝子を得た。

［実験例１８］
（レトロウイルス感染系を用いた単独ｓｈＲＮＡの発現による、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子の候補遺伝子の確定）
同定されたリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子の候補遺伝子１５１遺伝子それぞれをノックダウンし、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制効果を検討した。

タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞に、候補遺伝子のｓｈＲＮＡ発現ベクターを、レトロウイルス感染系を用いて１種類ずつ導入し、各候補遺伝子をノックダウンした細胞を作製した。各細胞の培地に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加し、９６時間後の細胞死の抑制効果を測定した。具体的には、タモキシフェンの添加から２４時間後、９６時間後の生細胞をＫｅｙｅｎｃｅ社のオールインワン顕微鏡にて、ランダムに２０枚の写真を撮り、付着している生細胞の数をカウントした。細胞生存率（％）は、タモキシフェンを添加後９６時間後の細胞数を１００（％）とし、９６時間後の付着している生細胞数の割合を細胞生存率（％）として計算した。

図１８は、１５１個の候補遺伝子について、タモキシフェンの添加から２４時間後の細胞数に対する、タモキシフェンの添加から９６時間後の細胞数の割合（細胞生存率（％））が高い順に並べた結果を示すグラフである。

リアルタイムＰＣＲにより目的遺伝子の発現抑制を確認でき、かつＣＤＫ４のノックダウン細胞よりもリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を強く抑制できる遺伝子を１７個見出した。また、リアルタイムＰＣＲにより目的遺伝子の発現抑制を確認でき、かつリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制する効果が、ＭＥＫ１のノックダウン細胞よりも高く、ＣＤＫ４のノックダウン細胞よりも低い遺伝子を２０個見出した。

これらの３７個の遺伝子には、アポトーシス等の既知の細胞死に関与する遺伝子は全く含まれていなかった。この結果は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が新規の細胞死であることを更に支持するものである。

［実験例１９］
（Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇは、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子である）
上述した候補遺伝子の中から、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ遺伝子（配列番号２）を見出した。本遺伝子は、新規遺伝子であった。ホモロジー検索の結果から、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇは、Ｃｄｃａｄｃ１の新しいバリアントであることが予想された。しかしながら、Ｃｄａｄｃ１も機能未知の遺伝子であった。Ｃｄａｄｃ１は、シチジンｄＣＭＰデアミナーゼドメインを２つ有すると推定されたが、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇは、シチジンｄＣＭＰデアミナーゼドメインを１つのみ有していると推定された。また、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇは、Ｃ末端の５つのアミノ酸以外はＣｄａｄｃ１と同一のアミノ酸配列を有していた。Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇのアミノ酸配列を配列番号１に示す。図１９（ａ）は、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ遺伝子及びＣｄａｄｃ１ｖａｒｉａｎｔ－２（Ｃｄａｄｃ１ｔｖ２）遺伝子の構造を示す図である。

レトロウイルス感染系でｓｈＲＮＡを発現させることにより、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇのノックダウン細胞を作成し、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制できるか否かを検討した。

図１９（ｂ）は、検討結果を示すグラフである。まず、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株に、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ特異的ｓｈＲＮＡ（配列番号１３）を導入し、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇをノックダウンした細胞を用意した（Ｃｄａｄｃ１ｈＫＤ）。対照として、ベクターのみを導入した細胞を用意した（Ｃｏｎｔｒｏｌ）。更に、これらの細胞にＣｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ発現ベクター（Ｃｄａｄｃ１ｈ）、Ｃｄａｄｃ１ｖａｒｉａｎｔ－２の発現ベクター（Ｃｄａｄｃ１ｔｖ２）、及び対照としてベクターのみ（ｍｏｃｋ）をそれぞれ導入した。

続いて、各細胞に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加した。タモキシフェンの添加から２４時間後、９６時間後の生細胞をＫｅｙｅｎｃｅ社のオールインワン顕微鏡にて、ランダムに２０枚の写真を撮り、付着している生細胞の数をカウントした。細胞生存率（％）は、タモキシフェンを添加後９６時間後の細胞数を１００（％）とし、９６時間後の付着している生細胞数の割合を細胞生存率（％）として計算した。

その結果、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇのノックダウン細胞（Ｃｄａｄｃ１ｈＫＤ／ｍｏｃｋ）では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制された。また、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇをノックダウンしたうえで、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ遺伝子を導入した細胞（Ｃｄａｄｃ１ｈＫＤ／Ｃｄａｄｃ１ｈ）では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が回復した。一方、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇをノックダウンしたうえで、Ｃｄａｄｃ１ｖａｒｉａｎｔ－２遺伝子を導入した細胞（Ｃｄａｄｃ１ｈＫＤ／Ｃｄａｄｃ１ｔｖ２）では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が回復しなかった。

以上の結果から、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇは、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子であることが明らかとなった。また、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇは、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死においてバリアント選択的な機能を有することが明らかとなった。

［実験例２０］
（Ｃ８７４３６は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子である）
上述した候補遺伝子の中から、Ｃ８７４３６遺伝子（配列番号４）を見出した。Ｃ８７４３６遺伝子は、ｃＤＮＡが報告されているのみの機能未知の遺伝子であった。

レトロウイルスでｓｈＲＮＡを発現させることにより、Ｃ８７４３６のノックダウン細胞を作成し、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制できるか否かを検討した。

図２０は、検討結果を示すグラフである。まず、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株に、Ｃ８７４３６特異的ｓｈＲＮＡ（配列番号１４）を導入し、Ｃ８７４３６をノックダウンした細胞を用意した（Ｃ８７４３６ＫＤ）。対照として、ベクターのみを導入した細胞を用意した（Ｃｏｎｔｒｏｌ）。更に、これらの細胞にＣ８７４３６発現ベクター（Ｃ８７４３６）及び対照としてベクターのみ（ｍｏｃｋ）をそれぞれ導入した。なお、Ｃ８７４３６発現ベクターに組み込んだＣ８７４３６のｃＤＮＡは、Ｃ８７４３６特異的ｓｈＲＮＡによりノックダウンされないようサイレント変異を導入したものを用いた。

その結果、Ｃ８７４３６のノックダウン細胞（Ｃ８７４３６ＫＤ／ｍｏｃｋ）では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制された。また、Ｃ８７４３６をノックダウンしたうえで、Ｃ８７４３６遺伝子を導入した細胞（Ｃ８７４３６ＫＤ／Ｃ８７４３６）では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が回復した。

以上の結果から、Ｃ８７４３６は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子であることが明らかとなった。

［実験例２１］
（Ａｂｈｄ２は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子である）
上述した候補遺伝子の中から、Ａｂｈｄ２遺伝子を見出した。Ａｂｈｄ２遺伝子はａｌｐｈａ／ｂｅｔａｈｙｄｒｏｌａｓｅドメイン構造を有する加水分解酵素であると考えられているが、その基質は明らかにされていない。

レトロウイルス感染系でｓｈＲＮＡを発現させることにより、Ａｂｈｄ２のノックダウン細胞を作成し、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制できるか否かを検討した。

図２１は、検討結果を示すグラフである。まず、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株に、Ａｂｈｄ２特異的ｓｈＲＮＡ（配列番号１５）を導入し、Ａｂｈｄ２をノックダウンした細胞を用意した（Ａｂｈｄ２ＫＤ）。対照として、ベクターのみを導入した細胞を用意した（Ｃｏｎｔｒｏｌ）。更に、これらの細胞にＡｂｈｄ２発現ベクター（Ａｂｈｄ２）及び対照としてベクターのみ（ｍｏｃｋ）をそれぞれ導入した。なお、Ａｂｈｄ２発現ベクターに組み込んだＡｂｈｄ２のｃＤＮＡは、Ａｂｈｄ２特異的ｓｈＲＮＡによりノックダウンされないようサイレント変異を導入したものを用いた。

その結果、Ａｂｈｄ２のノックダウン細胞（Ａｂｈｄ２ＫＤ／ｍｏｃｋ）では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制された。また、Ａｂｈｄ２をノックダウンしたうえで、Ａｂｈｄ２遺伝子を導入した細胞（Ａｂｈｄ２ＫＤ／Ａｂｈｄ２）では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が回復した。

以上の結果から、Ａｂｈｄ２は、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の実行因子であることが明らかとなった。

［実験例２２］
（Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６及びＡｂｈｄ２は、アポトーシス、ネクローシスには関与しない）
リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死が抑制されたＣｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇのノックダウン細胞、Ｃ８７４３６のノックダウン細胞及びＡｂｈｄ２のノックダウン細胞が、アポトーシス又はネクローシスを抑制できるか否かについて検討した。

図２２（ａ）は、アポトーシスについて検討した結果を示すグラフである。Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇのノックダウン細胞（Ｃｄａｄｃ１ｈＫＤ）、Ｃ８７４３６のノックダウン細胞（Ｃ８７４３６ＫＤ）、Ａｂｈｄ２のノックダウン細胞（Ａｂｈｄ２ＫＤ）、及び対照細胞（Ｃｏｎｔｒｏｌ）を用意した。各細胞の培地に、アポトーシス誘導試薬であるスタウロスポリンを、終濃度０．０１～１．５０μＭとなるように添加した。続いて、２４時間インキュベートした後、各細胞の細胞生存率（％）をＭＴＴアッセイにより測定した。

その結果、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６及びＡｂｈｄ２は、スタウロスポリン添加によるアポトーシスに対して、全く抑制効果を示さないことが明らかとなった。

図２２（ｂ）は、ネクローシスについて検討した結果を示すグラフである。Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇのノックダウン細胞（Ｃｄａｄｃ１ｈＫＤ）、Ｃ８７４３６のノックダウン細胞（Ｃ８７４３６ＫＤ）、Ａｂｈｄ２のノックダウン細胞（Ａｂｈｄ２ＫＤ）、及び対照細胞（Ｃｏｎｔｒｏｌ）を用意した。各細胞の培地に、ネクローシス誘導試薬であるｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシドを、終濃度２．３～３００．０ｍＭとなるように添加した。終濃度３００ｍＭがネクローシスを誘導する条件である。続いて、３０分間インキュベートした後、各細胞の細胞生存率（％）をＭＴＴアッセイにより測定した。

その結果、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６及びＡｂｈｄ２は、３００ｍＭのｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド添加によるネクローシスに対して、抑制効果を示さないことが明らかとなった。

しかしながら、低濃度領域のｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド添加では、Ｃ８７４３６及びＡｂｈｄ２遺伝子のノックダウン細胞において、弱いながらネクローシスの抑制効果が確認された。ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシド添加により脂質酸化が誘導されることから、ｔｅｒｔ－ブチルヒドロペルオキシドを低濃度添加した条件下においては、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死経路が同時に機能していることが示唆された。

［実験例２３］
（Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ及びＣ８７４３６は、ＥＲＫリン酸化の上流で機能し、Ａｂｈｄ２は、ＥＲＫリン酸化の下流で機能する）
タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株に、終濃度１μＭのタモキシフェンを添加し、抗リン酸化ＥＲＫ抗体で蛍光染色すると、タモキシフェンの添加から３６時間後以降では、ＥＲＫのリン酸化が亢進した細胞を検出することができる。

そこで、タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株のＣｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６又はＡｂｈｄ２をノックダウンし、培地に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加した場合のＥＲＫのリン酸化の亢進を検討した。

Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇをノックダウンしたタモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞（Ｃｄａｄｃ１ｈＫＤ）、Ｃ８７４３６をノックダウンしたタモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞（Ｃ８７４３６ＫＤ）、Ａｂｈｄ２をノックダウンしたタモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞（Ａｂｈｄ２ＫＤ）、及び対照としてのタモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞（Ｃｏｎｔｒｏｌ）を用意した。

続いて、各細胞の培地に、終濃度１μＭのタモキシフェンを添加、未添加細胞を準備し、３６時間後に抗リン酸化ＥＲＫ抗体で蛍光染色した。続いて、蛍光顕微鏡観察により、ＥＲＫがリン酸化された細胞数を数えた。

図２３（ａ）は、ＥＲＫのリン酸化が亢進した細胞の割合（％）を測定した結果を示すグラフである。グラフは、タモキシフェン未添加細胞におけるＥＲＫリン酸化が見られる細胞数１００としたときの、タモキシフェン処理した際にリン酸化ＥＲＫを有する細胞数の増加率を計算し、ＥＲＫのリン酸化が亢進した細胞の割合（％）として表記したものである。

その結果、Ａｂｈｄ２遺伝子のノックダウン細胞のみにおいて、ＥＲＫのリン酸化の亢進が確認された。この結果から、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ及びＣ８７４３６は、ＥＲＫリン酸化の上流で機能し、Ａｂｈｄ２は、ＥＲＫリン酸化の下流で機能していると考えられた。図２３（ｂ）は、以上の結果から明らかになったリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死経路の一部を示すモデル図である。

［実験例２４］
（Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇは、ＰＨＧＰｘ欠損によるリン脂質ヒドロペルオキシドの生成に関与する）
タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株のＣｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇ、Ｃ８７４３６又はＡｂｈｄ２をノックダウンし、培地に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加した場合のＰＨＧＰｘ欠損によるリン脂質ヒドロペルオキシドの生成について検討した。

図２４（ａ）は、フローサイトメトリーにより、リン脂質ヒドロペルオキシドの生成を検出した結果を示すグラフである。具体的には、まず、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇをノックダウンしたタモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞（Ｃｄａｄｃ１ｈＫＤ）、Ｃ８７４３６をノックダウンしたタモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞（Ｃ８７４３６ＫＤ）、Ａｂｈｄ２をノックダウンしたタモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞（Ａｂｈｄ２ＫＤ）、及び対照としてのタモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞（Ｃｏｎｔｒｏｌ）を用意した。

続いて、これらの細胞の培地に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加し、２６時間インキュベート後、リン脂質ヒドロペルオキシドの生成を検出できる蛍光色素であるＨ２ＤＣＦＤＡで染色し、フローサイトメトリーで測定した。

その結果、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇのノックダウン細胞において、ＰＨＧＰｘ欠損によるリン脂質ヒドロペルオキシドの生成が強く抑制されていることが明らかとなった。

このことから、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇは、ＰＨＧＰｘ欠損によるリン脂質ヒドロペルオキシドの生成に関与すると考えられた。図２４（ｂ）は、以上の結果から明らかになったリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死経路の一部を示すモデル図である。

［実験例２５］
（ＰＨＧＰｘ欠損によるリン脂質ヒドロペルオキシドの生成は鉄を介さない）
従来、リン脂質の酸化反応は鉄を介したフェントン反応により生じたヒドロキシラジカルを介しておきると考えられてきた。そこで、鉄のキレーターであるデフェロキサミンを用いてＰＨＧＰｘ欠損によるリン脂質ヒドロペルオキシドの生成が抑制できるか否かについて検討した。

検討には、リン脂質ヒドロペルオキシドの生成を検出できる蛍光色素であるＨ２ＤＣＦＤＡ及びフローサイトメトリーを使用した。タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地に、終濃度１００μＭのデフェロキサミン（ＤＦＯ）又は終濃度２００μＭのビタミンＥを添加したものを用意した。これらの各細胞に、更に終濃度１μＭのタモキシフェンを添加した。対照として、タモキシフェンの存在下（１μＭ）又は非存在下でインキュベートしたタモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞を用いた。タモキシフェンの添加から２６時間後に、各細胞をＨ２ＤＣＦＤＡで染色し、フローサイトメトリーで解析した。

図２５（ａ）及び図２５（ｂ）は、フローサイトメトリーの結果を示すグラフである。ＰＨＧＰｘ欠損によるリン脂質ヒドロペルオキシドの生成は、鉄のキレーターであるデフェロキサミンでは抑制できなかったが、ビタミンＥでは抑制することができた。この結果から、ＰＨＧＰｘ欠損によるリン脂質ヒドロペルオキシドの生成は鉄を介さないことが示された。

［実験例２６］
（フェントン反応の抑制がリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死に及ぼす影響）
フェントン反応を抑制すると考えられる、Ｍａｎｇａｎｅｓｅ（ＩＩＩ）ｔｅｔｒａｋｉｓ（４－ｃａｒｂｏｘｙｐｈｅｎｙｌ）ｐｏｒｐｈｙｒｉｎ（Ｍｎ－ＴＢＡＰ）、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）、デフェロキサミン（ＤＦＯ）をタモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地に添加することにより、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制することができるか否かについて検討した。

Ｍｎ－ＴＢＡＰは、スーパーオキサイドを消去する作用を有し、ＮＡＣは過酸化水素を消去する作用を有し、デフェロキサミンは鉄をキレートする作用を有する。図２６（ａ）は、リン脂質ヒドロペルオキシドの生成における、Ｍｎ－ＴＢＡＰ、ＮＡＣ、デフェロキサミン、ビタミンＥの作用点を示すモデル図である。

タモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞株の培地に、Ｍｎ－ＴＢＡＰ（終濃度１００μＭ）、ＮＡＣ（終濃度５ｍＭ）、デフェロキサミン（終濃度１００μＭ）又はビタミンＥ（終濃度２００μＭ）を添加したものを用意した。対照として、培地に何も添加していないタモキシフェン誘導型ＰＨＧＰｘ欠損ＭＥＦ細胞を用意した。

各細胞の培地に、終濃度１μＭのタモキシフェンを添加した。タモキシフェンの添加から２４時間後、７２時間後の生細胞をＫｅｙｅｎｃｅ社のオールインワン顕微鏡にて、ランダムに２０枚の写真を撮り、付着している生細胞の数をカウントした。細胞生存率（％）は、タモキシフェンを添加後２４時間後の細胞数を１００（％）とし、７２時間後の付着している生細胞数の割合を細胞生存率（％）として表した。

図２６（ｂ）は、各細胞の生存率を測定した結果を示すグラフである。その結果、Ｍｎ－ＴＢＡＰ、ＮＡＣ、デフェロキサミン（ＤＦＯ）の添加では、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死を抑制することができなかった。これらの結果から、ＰＨＧＰｘ欠損によるリン脂質ヒドロペルオキシドの生成は、フェントン反応を介さず、Ｃｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇが関与する系で行われる可能性が考えられた。

図２７に、以上の結果から明らかとなった、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死経路のモデル図を示す。

リン脂質からリン脂質ヒドロペルオキシド（ＰＣＯＯＨ）が生成される過程にＣｄａｄｃ１ｈｏｍｏｌｏｇが関与する。生成されたリン脂質ヒドロペルオキシドは、正常時ではＰＨＧＰｘによりリン脂質ヒドロキシ体（ＰＣＯＨ）に還元される。

ＰＨＧＰｘが欠損すると、リン脂質ヒドロペルオキシドが、２４時間後をピークとして上昇する。その下流でＣＤＫ４及びＣ８７４３６が機能している。３６時間後以降にＭＡＰキナーゼ経路のＭＥＫ、ＥＲＫがリン酸化される。ＥＲＫリン酸化の下流ではＡｂｈｄ２が機能し、４８時間後から７２時間後の間に細胞死を引き起こす。ＰＨＧＰｘが欠損する場合としては、ＰＨＧＰｘ遺伝子が障害を受けた場合、細胞内のグルタチンが枯渇した場合、ビタミンＥが不足した場合、ＰＨＧＰｘを標的とする薬物等による酵素の失活等が挙げられる。

［実験例２７］
（心筋特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスは発生過程の１７．５日で心筋細胞死により致死となる）
ＰＨＧＰｘ欠損マウスは、発生過程の７．５日で致死になることが知られている。ここでは、心臓特異的にＰＨＧＰｘを欠損させたマウスを作製し、その影響を解析した。まず、ＰＨＧＰｘ^＋／－マウスと、心臓特異的プロモーターである筋肉クレアチンキナーゼプロモーター（Ｍｕｓｃｌｅｃｒｅａｔｉｎｅｋｉｎａｓｅ）の下流にＣｒｅ遺伝子を有するマウス（Ｃｒｅ^＋／＋）との交配を繰り返し、Ｃｒｅ^＋／＋ＰＨＧＰｘ^＋／－マウスを得た。

続いて、Ｃｒｅ^＋／＋ＰＨＧＰｘ^＋／－マウスと、上述したＴｇ（ｌｏｘＰ－ＰＨＧＰｘ）^＋／＋：ＰＨＧＰｘ^－／－マウスとを交配することにより、Ｃｒｅ^＋／－Ｔｇ（ｌｏｘＰ－ＰＨＧＰｘ）^＋／－：ＰＨＧＰｘ^－／－マウスを得た。このマウスは、心臓特異的にＰＨＧＰｘを欠損する。

このようにして得られた心臓特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスを観察したところ、発生過程の１６．５日までは正常に生育したが、１７．５日に心筋細胞が突然死を起こし、１８．５日には浮腫を引き起こして致死となった。図２８（ａ）は、発生過程の１７．５日（１７．５ｄｐｃ）及び１８．５日（１８．５ｄｐｃ）における、野生型マウス（Ｃｏｎｔｒｏｌ）及び心臓特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウス（ＫＯ）の写真である。

また、図２８（ｂ）は、発生過程１７．５日目のマウスの心臓の組織切片を、ＤＡＰＩ染色及びＴＵＮＥＬ染色（ＴＵＮＥＬ）した結果を示す写真である。心臓特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウス（ＫＯ）の心臓組織では、ＴＵＮＥＬ染色陽性の細胞（細胞死）が多数認められた。母親にビタミンＥ添加食（５０ｍｇビタミンＥ／１００ｇ餌）を毎日与えた時、発生過程１７．５日目の心臓特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウス（ＫＯ）の心臓組織の細胞死は完全に抑制され、正常に心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスが産まれた。通常食で母親マウスを飼育していたときに１７．５日の心臓特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウス胎児で起きる心筋細胞死においても、カスパーゼ３の活性化やＤＮＡのラダーは観察されず、またリン脂質の酸化体の蓄積が観察された（図なし）。このことからこの心筋細胞死も脂質酸化を介した新規細胞死が誘導されていると考えられた。

また、図２８（ｃ）は、発生過程１７．５日目のマウスの心臓におけるＰＨＧＰｘタンパク質の発現をウエスタンブロッティングにより検出した結果を示す写真である。心臓特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウス（ＫＯ）では、ＰＨＧＰｘタンパク質が欠損していることが確認された。

［実験例２８］
（ＣＤＫ４阻害剤３－ＡＴＡの母親マウス腹腔への投与は、心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウス１８．５日胎仔の致死を抑制する）
ＣＤＫ４阻害剤３－ＡＴＡを母親マウス腹腔に投与することにより、心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの致死を抑制することができるか否かについて検討した。

心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウス胎仔の発生過程１４．５日、１５．５日、１６．５日、１７．５日に、母親マウスの腹腔に１．５ｍｇ／ｋｇ体重の３－ＡＴＡを投与し、発生過程１８．５日目の胎仔を観察した。

その結果、１０匹の心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスのうち、８匹で浮腫が抑制されていた。残りの２匹には浮腫が観察された。また、浮腫が抑制されていた８匹のうち、２匹は生存していた。残りの６匹は死亡していた。

図２９（ａ）～（ｃ）は、発生過程１８．５日のマウス胎仔の写真である。図２９（ａ）は、野生型マウスの写真であり、図２９（ｂ）は、３－ＡＴＡを投与しなかった心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの写真であり（心臓ＰＨＧＰｘＫＯ３－ＡＴＡ（－））、図２９（ｃ）は、３－ＡＴＡを投与した心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの写真である（心臓ＰＨＧＰｘＫＯ３－ＡＴＡ（＋））。

［実験例２９］
（心臓特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスはビタミンＥ添加食により正常に育つが、通常食に変えると１０日前後で突然死を引きおこす）
心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの胎仔期において、母親にビタミンＥ添加食を与えると、致死が完全に抑制された。また、誕生した心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスにビタミンＥ添加食（５０ｍｇビタミンＥ／１００ｇ餌）を毎日与え続けると、正常に生育することが明らかとなった。

ここで、ビタミンＥ添加食は、一日量当たり１３０ｍｇ／ｋｇ体重のビタミンＥを含んでいた。また、通常食は、一日量当たり１３ｍｇ／ｋｇ体重のビタミンＥを含んでいた。

図３０（ａ）は、ビタミンＥ添加食を与えることにより、正常に生育した心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの食餌を、通常食に変えてからの生存率を示すグラフである。正常に生育した心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの食事を通常食に変えると、１０日前後で突然死を引き起こすことが明らかとなった。

図３０（ｂ）は、ビタミンＥ添加食を与えた心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウス（ビタミンＥ添加食）、食餌を通常食に変えることにより死亡した心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウス（通常食ＫＯ（死亡））、及び通常食を与えた野生型マウス（通常食ｗｉｌｄ）の心臓中のビタミンＥの量を測定した結果を示すグラフである。ビタミンＥ添加食を与えた心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの心臓中には、心臓１ｇ当たり約２４ｎｍｏｌのビタミンＥが含まれていた。通常食では心臓１ｇ当たり約４ｎｍｏｌのビタミンＥが含まれていた。このマウス致死モデルでは、心臟のビタミンＥ量の低下により、脂質酸化が起因となる心筋細胞死が誘導される（図なし）。

図３０（ｃ）は、ビタミンＥ添加食を与えた心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウス（ビタミンＥ添加食心臓ＫＯ）、及び食餌を通常食に変えて１０日目の心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウス（通常食心臓ＫＯ）の死直前の心電図を示すグラフである。食餌を通常食に変えた心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの心電図には不整脈が見られ、不整脈性の突然死（心不全）が認められた。

［実験例３０］
（ＣＤＫ４阻害剤３－ＡＴＡは、ビタミンＥ添加食から通常食に変えて起きる心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの心不全による突然死を延命することができる）
ビタミンＥ添加食を与えた心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの食餌を通常食に変えた後、ＣＤＫ４阻害剤３－ＡＴＡを投与した場合の影響を検討した。

図３１は、心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの食餌を通常食に変えたマウス（Ｖｉｔ．Ｅ－）、心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの食餌を通常食に変え、更に食餌を通常食に変えてから４日目から１日１回、２ｍｇ／ｋｇ体重の３－ＡＴＡを腹腔内投与したマウス（Ｖｉｔ．Ｅ－，３－ＡＴＡ＋）、及び心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスにビタミンＥ添加食を与え、更に実験開始後４日目から１日１回、２ｍｇ／ｋｇ体重の３－ＡＴＡを腹腔内投与したマウス（Ｖｉｔ．Ｅ＋，３－ＡＴＡ＋）の生存率を示すグラフである。

心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの食餌を通常食に変えたマウス（Ｖｉｔ．Ｅ－）（ｎ＝２３）の実験開始からの生存期間の中央値は１０日であった。また、心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの食餌を通常食に変え、更に食餌を通常食に変えてから４日目から１日１回、２ｍｇ／ｋｇ体重の３－ＡＴＡを腹腔内投与したマウス（Ｖｉｔ．Ｅ－，３－ＡＴＡ＋）（ｎ＝６）の実験開始からの生存期間の中央値は１８日であった。これらの結果には、１％未満の危険率で有意差が認められた。

以上の結果から、ＣＤＫ４阻害剤３－ＡＴＡは、ビタミンＥ添加食から通常食に変えて起きる心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの心不全による突然死を延命することができることが示された。

［実験例３１］
（ＭＥＫ阻害剤Ｕ－０１２６は、ビタミンＥ添加食から通常食に変えて起きる心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの心不全による突然死を延命することができる）
ビタミンＥ添加食を与えた心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの食餌を通常食に変えた後、ＭＥＫ阻害剤Ｕ－０１２６を投与した場合の影響を検討した。

図３２は、心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの食餌を通常食に変えたマウス（Ｖｉｔ．Ｅ－）、心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの食餌を通常食に変え、更に食餌を通常食に変えてから４日目から１日１回、３ｍｇ／ｋｇ体重のＵ－０１２６を腹腔内投与したマウス（Ｖｉｔ．Ｅ－，Ｕ－０１２６＋）、及び心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスにビタミンＥ添加食を与え、更に実験開始後４日目から１日１回、３ｍｇ／ｋｇ体重のＵ－０１２６を腹腔内投与したマウス（Ｖｉｔ．Ｅ＋，Ｕ－０１２６＋）の生存率を示すグラフである。

心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの食餌を通常食に変えたマウス（Ｖｉｔ．Ｅ－）（ｎ＝２３）の実験開始からの生存期間の中央値は１０日であった。また、心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの食餌を通常食に変え、更に食餌を通常食に変えてから４日目から１日１回、３ｍｇ／ｋｇ体重のＵ－０１２６を腹腔内投与したマウス（Ｖｉｔ．Ｅ－，Ｕ－０１２６＋）（ｎ＝７）の実験開始からの生存期間の中央値は２０日であった。これらの結果には、１％未満の危険率で有意差が認められた。

以上の結果から、ＭＥＫ阻害剤Ｕ－０１２６は、ビタミンＥ添加食から通常食に変えて起きる心臟特異的ＰＨＧＰｘ欠損マウスの心不全による突然死を延命することができることが示された。

Claims

ＥＲＫ２阻害剤又はＥＲＫ２の発現を抑制する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死の抑制剤。
ＥＲＫ２阻害剤又はＥＲＫ２の発現を抑制する、ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、リボザイム若しくはアンチセンス核酸を有効成分とする、リン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死によって引き起こされる心不全又はリン脂質ヒドロペルオキシド依存性細胞死によって引き起こされる不整脈性突然死の予防又は治療剤。