JP2007524379A - 上皮ナトリウムチャンネル関連障害のＰｈａｒｍｉｃｏ−遺伝子治療 - Google Patents

上皮ナトリウムチャンネル関連障害のＰｈａｒｍｉｃｏ−遺伝子治療 Download PDF

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Abstract

上皮ナトリウムチャンネル（ＥＮａＣ）活性を改変するための薬剤および方法。

Description

関連出願との関係
本出願は、２００３年３月３１日に出願された特許文献１、および２００３年１０月１６日に出願された特許文献２の出願日の利益を主張し、その開示は引用により本明細書に編入する。
政府の権利の表明
本発明の少なくとも一部はアメリカ合衆国の政府の補助金でなされた（国立衛生研究所の認可番号ＨＬ５８３４０）。政府は本発明に特定の権利を有することができる。
発明の背景
嚢胞性繊維症（ＣＦ）は、嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）における遺伝的突然変異により引き起こされ、そして白人に最も多い遺伝子障害である。ＣＦＴＲは肺のような多くの器官の上皮細胞の頂端側細胞膜に局在するクロライドチャンネルである。このチャンネルはサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）により活性化され、そしてＰＫＡ−およびＰＫＣ−依存的リン酸化により調節される。クロライドチャンネルとして機能することに加え、ＣＦＴＲは細胞表面上の幾つかの他のイオンチャンネルも制御することが示され（非特許文献１、２）、それらには上皮アミロイド−感受性ナトリウムチャンネル（ＥＮａＣ）（非特許文献３；非特許文献４，５）、外向き整流クロライドチャンネル（ＯＲＣＣ）（非特許文献６；非特許文献７）、腎臓のカリウムチャンネル（ＲＯＭＫ２）（非特許文献８）、およびカルシウム活性化クロライドチャンネル（非特許文献９）を含む。
ＣＦの肺に見られる増加した細菌のコロニー形成の理由について、幾つかのメカニズムが提案された（非特許文献１、２）。これらにはＥＮａＣナトリウム流の脱調節化された増大を導くＣＦＴＲ機能の損失を含み、これはＣＦ肺における気道の脱水および不十分な粘膜繊毛クリアランスに関する主要なメカニズムとして提案された（非特許文献１０；非特許文献１１）。また病原の別のメカニズムには、ＣＦＴＲ機能不全の結果としてＣＦ気道における生来の免疫防御活性を低下させる表面気道液の改変されたイオン組成を含む（非特許文献１、２；非特許文献１１；非特許文献１２）。
従来のＣＦの処置には、胸部理学療法（例えば打診法および体位ドレナージ法）、種々の気管支拡張薬、栄養補助物質（例えば膵臓酵素およびビタミン類）、運動およびリハビリテーション、ならびに慢性の低酸素血症には長期酸素療法を含む。しかし嚢胞性繊維症の多数の臨床試験が、ＣＦＴＲ機能不全に関連する一次的欠陥を正す薬理学的取り組みを評価した。これらには頂端側細胞膜での内因性変異体のＣＦＴＲ機能を高めるための取り組み（非特許文献１３；非特許文献１４）、そしてエーロゾル化したアミロライドを使用するＥＮａＣ機能または気流の正常化を含む（非特許文献１５；非特許文献１６；非特許文献１７；特許文献３および特許文献４）。さらに最近では、組換えアデノ随伴ウイルス（ｒＡＡＶ）が機能的ＣＦＴＲのｃＤＮＡをＣＦ患者の上顎洞および／または肺に送達するために使用されてきた（非特許文献１８；非特許文献１９；非特許文献２０；非特許文献２１）。ｒＡＡＶ−２を使用した最近の試験は、肺の気道上皮中でのベクターゲノムの感動的な安全プロファイルおよび長期存続を示したが、ＣＦＴＲのｍＲＮＡに由来するベクターにより測定した気道細胞の成功裏の形質導入は、恐らく分極したヒトの気道細胞の表面への比較的不十分な結合により（非特許文献２２、２３）、そして既知のｒＡＡＶ−２受容体はヒトの気道の頂端面上には無いという事実から（非特許文献２４）、最適ではなかった。そのような知見は、気道表面で別の受容体に結合するｒＡＡＶ−５のような別の血清型の開発および応用を導き（非特許文献２５）、そして形質導入効率を強化した（非特許文献２２、２３）。
ヒトの気道におけるｒＡＡＶの形質導入に対する細胞内バリアを評価する別の開発では、ｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−５の両方がそれらの生活環を完了し、そして核へ効率的にトラフィックするためのビリオンの能力をモジュレートするユビキチン／プロテアソーム相互作用に感受性であることを示唆した（非特許文献２６）。これらの実験は、頂端側細胞膜に由来する両血清型の形質導入を有意に高めることができるプロテアソームインヒビター／調節剤の応用を導いた（非特許文献２６；非特許文献２７）。興味深いことには、ｒＡＡＶ−２／５ベクターに対してｒＡＡＶ−２を直接比較する実験は、側底側細胞膜から気道上皮に形質導入するためのｒＡＡＶ−２の最大の潜在能力が、頂端側細胞膜または側底側細胞膜からのｒＡＡＶ２／５感染よりも１次元高い規模であることを示唆した（非特許文献２７）。これらの知見は、感染に対する頂バリアを完全に回避することができれば、ｒＡＡＶ−２がＣＦ肺の遺伝子治療用の好適なベクターとして出現できることを示唆している。
ＣＦＴＲのｒＡＡＶ−媒介型遺伝子送達に対するさらなる制限には、このベクターの限定されたパッケージング能力（約５ｋｂ）、およびＣＦＴＲ ｃＤＮＡの比較的大きなサイズ（４．５ｋｂ）がある。プロモーターとしてのＩＴＲの使用（非特許文献２８、２９、３０）、およびインビボの機能に必要ではないと考えられるＣＦＴＲの領域の削除（非特許文献３１；非特許文献３２、３３）を含め、ＣＦＴＲ ｃＤＮＡをｒＡＡＶベクターに合わせる幾つかの方法が使用されて来た。第１の方法は、ｒＡＡＶ−２に基づくベクターを用いて現在、臨床試験で使用されている。インビトロの実験ではプロモーターとして機能するためのＩＴＲの能力が明らかに証明されたが（非特許文献２８、２９、３０）、発現はヘテロロガスなプロモーターに由来するものより大変低い（非特許文献３４）。したがって臨床試験において、プロモーターとしてのＩＴＲの低い活性が、検出可能なベクターに由来するＣＦＴＲ ｍＲＮＡ発現の欠損の主な理由の１つであると現在では考えられている（非特許文献１９）。
このように１または複数のチャンネルタンパク質に関連する気道における状態または障害を抑制または処置するための薬剤を同定する必要性がある。
参考文献
米国特許出願第６０／４５９，３２３号明細書、 米国特許出願第６０／５１２，３４７号明細書 米国特許第４，５０１，７２９号明細書 米国特許第４，８６６，０７２号明細書 Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅｔ ６ １２（１９９８） Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１４３ ６４５（１９９８） Ｓｔｕｔｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７２ １４０３７（１９９７） Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７ ８３３８（２００２） Ｄｏｎａｌｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ．Ｍｅｄ．，７０ ３４３（２００２） Ｇａｂｒｉｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ，３６３ ２６３（１９９３） Ｓｃｈｗｉｅｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９５ ２６７４（１９９８） Ｃａｈｉｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７５ １６６９７（２０００） Ｋｕｎｚｅｌｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｆｌｕｇｅｒｓ Ａｒｃｈ．，４３５ １７８（１９９７） Ｋｎｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０９ ５７１（２００２） Ｇｕｇｇｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，９６ ６０７（１９９９） Ｓｍｉｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，８５ ２２９（１９９６） Ａｈｒｅｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｐｕｌｍｏｎｏｌ．，３３ １４２（２００２） Ｒｕｂｅｎｓｔｅｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ．Ｊ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｃｒｉｔ．Ｃａｒｅ Ｍｅｄ．，７ ４８４（１９９８） Ｋｎｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ Ｍｅｄ．，３２２ １１８９（１９９０） Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ．Ｒｅｓｐｉｒ．Ｊ．，６ １２４３（１９９３） Ｐｏｎｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｐｕｌｍｏｎｏｌ．，３０ ２５（２０００） Ａｉｔｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１２ １９０７（２００１） Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１４ １０７９（２００３） Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，１３ １３４９（２００２） Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｒｙｎｇｏｓｃｏｐｅ，１０９ ２６６（１９９９） Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．，７４ ３６５２（２０００） Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｖｉｒｏｌ．，７４ ３８５２（２０００） Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，９ ２７６１（１９９８） Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７６ ２０６１０（２００１） Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，１０５ １５７３（２０００） Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，７７ ７３６１（２００３） Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６８ ３７８１（１９９３） Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９０：１０６１３（１９９３） Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，９３：１０１６３（１９９３） Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ．，９ ６３５（１９９８） Ｏｓｔｅｄｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９ ３０９３（２００２） Ｏｓｔｅｄｇａａｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９９ ３０９８（２００２） Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．，６ ５９５（２０００）
発明の要約
本発明は、真核細胞、例えば哺乳動物の肺、腎臓または結腸細胞のような哺乳動物の細胞、あるいは例えば組織もしくは臓器中の真核細胞群中のＥＮａＣ活性を改変する薬剤、または薬剤の組み合わせを同定する方法を提供する。この方法は、細胞または細胞群を１または複数の薬剤と接触させ、そしてＥＮａＣのレベルまたは量が改変されるかどうかを測定することを含んでなる。１つの態様では、細胞または細胞群は気道上皮細胞のような上皮細胞である。別の態様では、細胞（１つまたは複数）は腎臓の細管、例えば遠位曲細管を含む遠位ネフロン、連結管、および皮質および髄質集管、皮膚、肝臓、膀胱、結腸、汗腺、乳腺、唾液腺、胎盤またはウロエピセリウム（ｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ）細胞である。好適な細胞には、哺乳動物、鳥、魚および爬虫類の細胞、特にヒト、非−ヒト霊長類、畜牛、ヒツジ、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、マウス、ラット、ウサギ、ニワトリおよび七面鳥のような家畜化された哺乳動物および鳥の細胞を含む。例えば空気−液体界面で成長した分極したヒトの気道の上皮細胞、またはヒトの気管支の異種移植片は、ＥＮａＣのレベルまたは量を抑制または減少させる薬剤を同定するために有用である。本発明の薬剤は、天然または組換えＥＮａＣを含む任意の細胞、例えばＥＮａＣに結合した細胞膜と接触させることができる。ＥＮａＣのレベルまたは量を抑制すると同定された薬剤は、抑制の程度、抑制のタイムコース、および／または期間、細胞または組織型の特異性および／または抑制に使用する濃度に変動を有することができると想定される。
例えば本発明は、ＥＮａＣのレベルまたは量を抑制または下げる１または複数の薬剤、例えば限定するわけではないが１または複数のＥＮａＣサブユニット遺伝子の転写を阻害するもの、ＥＮａＣ転写を改変する分子のレベル、量または活性を改変するもの、ＥＮａＣ ＲＮＡの安定性を改変するもの、および／または分子のトラフィッキング（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）およびプロセッシングを改変するもの、例えば限定するわけではないがプロテアソーム、エンドソームおよびトランス−ゴルジを含む細胞内区画を通る、および／または例えば微小管または微細繊維のような細胞骨格成分を介して細胞質ゾルを通る非ウイルス起源の分子を同定する方法を提供する。１つの態様では、薬剤はＥＮａＣのアンタゴニストではない。別の態様では薬剤は細胞膜に結合するタンパク質、例えばＥＮａＣまたは肝細胞増殖因子の受容体に結合する薬剤ではない。さらに別の態様では、薬剤はＥＮａＣの翻訳後プロセッシングを改変する薬剤ではない。別の態様では、薬剤は哺乳動物のゲノムの遺伝子、もしくはそれにコードされる遺伝子産物、例えば哺乳動物細胞にコードされるタンパク質、遺伝子の相補鎖もしくは遺伝子またはその相補鎖の一部、例えばアンチセンスオリゴヌクレオチドではない。
薬剤または薬剤のライブラリー、例えばペプチドライブラリーを含む化学ライブラリーは、本発明の方法で無作為にスクリーニングすることができる。試験する薬剤は、試験すべき特定の細胞型、組織型または疾患型について望ましい特性を有する薬剤から選択することができる。あるいは試験する薬剤は、所望する特性、例えば治療特性を有するものを含む薬剤、例えば臨床試験における薬剤、あるいはＦＤＡの認可を有する薬剤、またはＥＮａＣのレベルもしくは量を抑制または低下すると同定された薬剤の機能的および／または構造的特性から選択される。１つの態様では、薬剤はプロテアソームをモジュレートする薬剤、例えば限定するわけではないがプロテアソームに結合し、プロテアソームの１または複数の活性を改変し、例えばプロテアソームのタンパク質溶解活性を阻害し、プロテアソームの細胞内の位置またはトラフィッキングを改変し、１または複数の分子とプロテアソームとの相互作用を改変し、またはプロテアソームを安定化する薬剤から選択することができる。プロテアソームは細胞質および核中の主要なタンパク質溶解複合体であり、そして細胞質と核との間を輸送され得る。例えば２６Ｓプロテアソーム複合体は、１９Ｓ調節単位および２０Ｓ触媒コアを含んでなり、これはキモトリプシン様活性、すなわち大きな疎水性残基の後の分解、トリプシン様活性、すなわち塩基性残基の後の分解、ポストグルタミルヒドロラーゼ活性、すなわち酸性残基の後の分解、分枝アミノ酸分解活性および低分子中性アミノ酸分解活性を有する。
このように１つの態様では、化学ライブラリーはプロテアソーム、または他の細胞内プロセッシング経路、例えばエンドソームの区画と相互作用することが知られている化学構造に基づき選択される。別の態様では、薬剤は化学療法剤、抗生物質、脂質低下剤または食品添加物から選択される。抗生物質には限定するわけではないが、マクロライド、ペニシリン、キノロン、スルホンアミドおよびテトラサイクリン、例えばセファロスポリン、バシトラシン、バンコマイシン、リストセチン、エリスロマイシン、オレアンドマイシン、カルボマイシン、スピラマイシン、リンコマイシン、クリンダマイシン、クロルテトラサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、ストレプトマイシン、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、トブラマイシン、ポリミキシン、ニスタチン、アンホテリシンＢ、マイトマイシン、アクチノマイシン、ナリジキシル酸、ノボビオシン、グリセオフルビン、リファンピシンおよびトリメトプリムを含む。化学療法剤には限定するわけではないが、抗真菌剤、抗バクテリア剤、抗ウイルス剤、例えばヌクレオシド類似体、ホスフォノアセテート、ホスフォノホルメート、アマンタジン、リマンタジン、エンビロキシム（ｅｎｖｉｒｏｘｉｍｅ）、４’，６−ジクロロフラビン、カルコンＲｏ０９−０４１０、アリルドン（ａｒｉｌｄｏｎｅ）、ジソキサリル（ｄｉｓｏｘａｒｉｌ）、３’−アジドチミジン、スラミンおよびＨＰＡ２３、および抗ガン剤、例えばシクロホスファミド、ニトロソウレア、カルムスチン（ＢＣＮＵ）、ロムスチン（ＣＣＮＵ）、６−メルカプトプリン、５−フルオロウラシル（５ＦＵ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）、マイトマイシン−Ｃ、ブレオマイシン、ビンクリスチン、ビンブラスチンおよびタモキシフェンのようなアルキル化剤、代謝拮抗物質、植物アルカロイド、抗腫瘍抗生物質およびステロイドホルモンを含む。
本明細書に記載するように、分極したＣＦ気道上皮でのＣＦＴＲ検出を正すためのｒＡＡＶ−２またはｒＡＡＶ−２／５ベクターの能力について、それらを直接比較するために、数種の完全長ＣＦＴＲ ｃＤＮＡ ｒＡＡＶベクターを調製した。このベクターは２型および５型キャプシドのいずれかにパッケージングされ、そして分極したＣＦ気道上皮の頂端側感染後、ＣＦ表現型を随伴するＮａ過吸収およびＣｌ輸送欠損の両方を正すそれらの能力について、およびプロテアソーム調節剤（ＬＬｎＬ／ドキソルビシン）の存在または不存在下でそれらの形質導入効率について分析した。特にＣＦに関する臨床試験で使用されている同一のＩＴＲ−ＣＦＴＲベクター（ＡＶｔｇＣＦ）を、完全長のＣＦＴＲ ｃＤＮＡの発現を支配する最小の８３ｂｐプロモーターを宿すベクター（ＡＶＣＦ８３）と比較した。この比較には、ＣＦＴＲクロライド流の機能的矯正、ベクターが誘導するｍＲＮＡおよびベクターＤＮＡをそれぞれ定量するように、短絡電流（ｓｈｏｒｔ ｃｉｒｃｕｉｔ ｃｕｒｒｅｎｔ）、定量的ＲＳ−ＰＣＲ、およびＴａｑＭａｎ ＤＮＡ ＰＣＲの測定を含んだ。データは、適用したプロテアソーム調節剤の存在下で、ＣＦＴＲに由来するｍＲＮＡの発現、およびＣＦＴＲクロライド輸送の異常の矯正に、ｒＡＡＶ−２に基づくベクターがｒＡＡＶ−２／５よりも効率的であることを示した。
興味深いことには、感染時のプロテアソーム調節剤の適用はｒＡＡＶゲノムの発現可能な状態への機能的変換を改善するだけでなく、ＣＦＴＲ遺伝子発現には無関係の様式でＥＮａＣ過吸収のＣＦ表現型も減少させた。定量的なＲＴ−ＰＣＲは、プロテアソーム調節剤の添加が分極したＣＦ気道上皮のγ−ＥＮａＣサブユニットのｍＲＮＡレベルを１５倍まで下げることを示した。ＥＮａＣ活性に及ぼすこの効果の長期（１５日）持続は、γ−ＥＮａＣプロモーターのドキソルビシン−依存的ＣｐＧメチル化に相関した。これらの予期せぬ知見は、疾患の１次欠損を処置すると同時に、障害の遺伝子治療を高める両方を行うことができる新規な種類の二重治療薬の同定を初めて示す。特にこれらの知見は、ｒＡＡＶ形質導入を改善することに加えて、プロテアソームのモジュレーションもＣＦ気道上皮におけるＥＮａＣナトリウム過吸収欠損を有意に弱めることを示唆する。ＣＦの分極した気道上皮においてｒＡＡＶが媒介するＣＦＴＲの機能的相関の最初の証明を提供するこれらの実験は、プロテアソーム調節剤がｒＡＡＶ形質導入を強化し、そして脱調節されたＥＮａＣにより引き起こされるＣＦでの流体輸送欠損を改善する両方に、二重の治療的潜在能力を有することができることを示唆する。例えばＥＮａＣ活性を改変する薬剤は、分極した気道上皮細胞中での流体輸送または吸収を改変するそれらの能力についてスクリーニングされる得る。１つの態様では、少量の液体中で１または複数の薬剤、そして場合により蛍光色素のような色素を分極した気道上皮細胞と接触させ、そして処理した細胞中の色素の存在もしくは量および／または細胞外液の量（深さ）を、例えば共焦点顕微鏡を使用して検出または測定し、そして未処理細胞と比較する。
さらに、ＥＮａＣ活性を改変する薬剤は、それらと他のプロモーターのメチル化との関連についてスクリーニングされることができ、これにより１より多くのプロモーターのメチル化と関係する薬剤、ならびに唯一のプロモーターのメチル化と関連する薬剤の同定を行うことができる。
二重治療作用を持つ薬剤の同定は、ＣＦ肺疾患ならびに他の疾患に関する臨床試験で大変有用となり得る。すなわちこの方法により同定される１または複数の薬剤は、インビボ治療、例えば嚢胞性繊維症のような呼吸障害の遺伝子治療、および例えば病原、例えばバクテリアの感染による炎症を伴うその他の疾患、および異常な、たとえば上昇したＥＮａＣ活性を伴う状態を含め、臨床的に有用な方法を提供することができる。例えば肺における流体の吸収または輸送の量は、バクテリアのクリアランスと関連する可能性があり、そして哺乳動物に対するＥＮａＣ活性を改変する本発明の１または複数の薬剤のエーロゾル化した送達は、炎症応答を改変し（例えばモジュレートし）、クリアランスの強化または炎症の低下をもたらす。
またデータでは、短い８３ｂｐの最小プロモーターを宿すベクターはＩＴＲプロモーターが駆動するベクターに比べて、機能的相関およびベクターゲノムの転写活性を３０％まで改善したことが示された。
本発明は、哺乳動物細胞中のＥＮａＣの１または複数のサブユニットの転写のレベルまたは量を下げる１または複数の薬剤を同定する方法を提供する。この方法はＥＮａＣを発現する哺乳動物細胞を、プロテアソーム調節剤である少なくとも１つの薬剤と接触させ、ここで薬剤は細胞のゲノムによりコードされる遺伝子または遺伝子産物、遺伝子の相補鎖、または遺伝子またはその相補鎖の一部ではなく、そして
薬剤が哺乳動物細胞中でＥＮａＣの１または複数のサブユニットからの転写のレベルまたは量を下げるかどうかを同定することを含む。
また哺乳動物細胞中のＥＮａＣのα、βおよびγサブユニットからの転写のレベルまたは量を下げる１または複数の薬剤を同定する方法も提供する。この方法はＥＮａＣを発現する哺乳動物細胞を、１または複数の薬剤と接触させ、そして哺乳動物細胞中でＥＮａＣのα、βおよびγサブユニットからの転写のレベルまたは量を下げる１または複数の薬剤を同定することを含む。１つの態様では、薬剤は細胞のゲノムによりコードされる遺伝子または遺伝子産物、その相補鎖、またはその一部ではない。
さらに、哺乳動物細胞中のＥＮａＣの１または複数のサブユニットの転写のレベルまたは量を下げる１または複数の薬剤を同定する方法を提供する。この方法はＥＮａＣを発現する哺乳動物細胞を、ウイルスの形質導入を高める少なくとも１つの薬剤と接触させ、そして哺乳動物細胞中でＥＮａＣの１または複数のサブユニットからの転写のレベルまたは量を下げる１または複数の薬剤を同定することを含む。１つの態様では、薬剤は細胞のゲノムによりコードされる遺伝子または遺伝子産物、その相補鎖、またはその一部ではない。
２重治療活性を有する１または複数の薬剤を同定する方法も提供する。１つの態様では、この方法は、ＥＮａＣの異常な発現または活性に関連する疾患の１または複数の症状を抑制または処置する１または複数の薬剤を選択し、哺乳動物細胞を、１または複数の薬剤および遺伝子治療ベクターと接触させ、そして遺伝子治療ベクターと接触したが、１または複数の薬剤とは接触していない哺乳動物細胞に比べて、遺伝子治療ベクターの効力を高める薬剤を同定することを含む。別の態様では、この方法は哺乳動物細胞中で遺伝子治療ベクターの効力を高める１または複数の薬剤を選択し、ＥＮａＣの異常な発現または活性を有する哺乳動物細胞を、１または複数の薬剤と接触させ、そしてＥＮａＣ発現または活性を改変する薬剤を同定することを含む。
本発明の薬剤は、付加的または相乗的効果を生成するために、例えばＥＮａＣのレベルまたは量を改変するために、組織または臓器、例えば肺中の粘液分泌物から塩および水の再吸収を阻害するために、組織または臓器中の粘液分泌物を水和するために、例えば肺における気道表面の液体容量を増すために、組織または臓器中の粘液クリアランスを促進するために、異常なＥＮａＣ活性に付随する状態、例えば嚢胞性繊維症、リデル症候群、高血圧症、疼痛および肺水腫、ならびに慢性気管支炎、喘息および急性肺傷害を抑制または処置するために、単独または組み合わせて使用することができる。ＣＦに関して、本発明の薬剤は鉱質コルチコイド受容体アンタゴニスト、グルココルチコイド受容体アンタゴニスト、ピラジン利尿剤、ピラジノイルグアニジンナトリウムチャンネル遮断薬、アミロライド、ベンザミル（ｂｅｎｚａｍｉｌ）、フェナミル（ｐｈｅｎａｍｉｌ）、ランチオン（ｌａｎｔｉｏｎｅ）抗生物質、ヌクレオチドまたはジヌクレオチド、ならびに核酸またはオリゴヌクレオチド；ウイルス遺伝子導入ベクター（アデノウイルス、アデノ随伴ウイルスおよびレトロウイルス遺伝子導入ベクターを含む）；酵素；およびホルモン剤または生理学的に活性なタンパク質、またはインスリン、ソマトスタチン、オキシトシン、デスモプレシン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、ナファレリン（ｎａｆａｒｅｌｉｎ）、ロイプロリド、副腎皮質刺激ホルモン、セクレチン、グルカゴン、カリシトニン、成長ホルモン放出ホルモン、成長ホルモン等のようなペプチドと使用することができる。本発明を行うために使用できる酵素剤には、限定するわけではないが、ＤＮＡｓｅ（例えば嚢胞性繊維症の処置に）、α１−アンチトリプシン（例えば気腫の処置においてエラスターゼを阻害するために）等を含む。本発明の方法に使用するために、ステロイドを含む適当な抗炎症剤には、限定するわけではないがベクロメタゾン、ジプロピオネート、プレドニゾン、フルニゾロン、デキサメタゾン、プレドニゾロン、コルチゾン、テオフィリン、アルブテロール、クロモリンナトリウム、エピネフリン、フルニゾリド、硫酸テルブタリン、アルファ−トコフェロール（ビタミンＥ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン、サルメテロール（ｓａｌｍｅｔｅｒｏｌ）およびジプロピオン酸フルチカゾン（ｆｌｕｔｉｃａｓｏｎｅ）を含む。使用することができる抗生物質の例には限定するわけではないが、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、アミノグリコシド、例えばトブラマイシン、ベータ−ラクタム、例えばアンピシリン、セファロスポリン、エリスロマイシンおよびそれらの誘導体、クリンダマイシン等を含む。適当な抗ウイルス剤には、アシクロビル、リバビリン、ガングリオシドおよびフォスカルネットを含む。適当な抗腫瘍剤には、限定するわけではないがエトポシド、タキソールおよびシスプラチンを含む。抗ヒスタミン剤には限定するわけではないが、ジフェンヒドラミンおよびラニタジン（ｒａｎｉｔａｄｉｎｅ）を含む。ペンタミジンおよびその類似体のような抗−カリニ肺炎剤を使用してもよい。リファンピン、エリスロマイシン、クロルエリスロマイシン等のような抗結核剤。二価カチオンのキレーター（例えばＥＧＴＡ、ＥＤＴＡ）、去痰剤および粘液分泌の緩和に有用な他の薬剤（例えばｎ−アセチル−Ｌ−システイン）も本発明の実施において所望により投与することができる。
細胞、組織、臓器または生物は、１つの時点で、または多くの時点で同時に、または順次に本発明の１または複数の薬剤と接触させることができる。当業者は薬剤の投与様式および時期は、薬剤の阻害の期間および程度、薬剤の製薬学的特性、および影響を受けた組織、臓器または生物の元にある疾患状態により影響を受けると考えるだろう。
本発明の方法により同定される薬剤は、動物、例えば哺乳動物の細胞に治療用ペプチドまたはポリペプチドを導入し、かつ／または発現させるために、核酸に基づくベクタ−、例えばウイルスベクターを使用する遺伝子治療と一緒に、またはそれを有力にするためにも特に有用となり得る。また薬剤はウイルス、真菌、バクテリア、酵母またはガン細胞に由来するような、免疫原性の予防用ポリペプチドまたはペプチドを導入し、かつ／または発現させて、核酸に基づくベクターが投与された動物中でそのポリペプチドまたはペプチドに対する免疫応答を誘導するように、核酸に基づくワクチンベクタ−と合わせて有用となり得る。さらに細胞は、核酸に基づく治療の前に、核酸に基づく治療と同時に、核酸に基づく治療の後に、またはそれらを任意に組み合わせて、１または複数の薬剤と接触させることができる。例えば本発明の薬剤は、遺伝子治療ベクター、例えばアデノウイルスベクター、ヘルペスウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクターおよび／またはｒＡＡＶベクターのようなウイルスベクターと使用することができる。例えば本発明の特定の薬剤の二重活性は、遺伝子治療ベクタ−を有力にし、またはそれと一緒に使用されて、効力のある結果を達成するために使用される分子、例えばウイルス粒子の用量もしくは総数を減らし、遺伝子導入、例えば形質導入、頻度を上げ、かつ／またはウイルスベクターについては血清型の感染パターンを広げ、かつ／またはインビボの微小環境を改変して、ウイルス結合の利用性を上げることができるようにする。疾患の１次病態生理学的欠損を処置し、そして遺伝子治療ベクターを効力的にする両方に対して、本発明の薬剤の使用はｐｈａｒｍｉｃｏ−遺伝子治療と呼ぶ。１つの態様では、ベクターはｒＡＡＶベクターではない。ベクター中で発現する遺伝子は、どのような制御要素（例えばプロモーター、オペレーター）を所望しても、ポリペプチドをコードするＤＮＡセグメントであるか、あるいは非コードＤＮＡセグメントのいずれかであり、その転写は、幾つかのＲＮＡを含有する分子（転写制御因子、＋ＲＮＡまたはアンチ−センス分子のような）の全部または一部を生成する。特にそのようなベクター中で有用な治療用遺伝子には、機能的ペプチドまたはポリペプチドをコードするものを含む。「機能的」ペプチドまたはポリペプチドは、参照ペプチドまたはポリペプチド、例えば野生型（完全長）のペプチドまたはポリペプチドと実質的に同じ活性を有するものである。例えば本発明のベクターに有用な治療用遺伝子には、限定する訳ではないがβ−グロビン遺伝子、γ−グロビン遺伝子、第ＶＩＩＩ因子遺伝子、第ＩＸ因子遺伝子、エリスロポエチン遺伝子、嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質遺伝子（ＣＦＴＲ）、ジストロフィン遺伝子、ファンコーニ貧血コンプレメンテーショングループ（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｇｒｏｕｐ）、リボザイムをコードする遺伝子、アンチセンス遺伝子、低密度リポタンパク質（ＬＤＬ）遺伝子、チロシンヒドロキシラーゼ遺伝子（パーキンソン病）、グルコセレブロシダーゼ遺伝子（ゴーシェ病）、アリールスルファターゼ遺伝子（異染色性白質萎縮症）、ならびにワクチンに有用となるもののような免疫原性ポリペプチドもしくはペプチドをコードする遺伝子、または他のポリペプチドもしくはタンパク質をコードする遺伝子を含む。
組織、臓器または生物は、１つの時点で、または多くの時点で同時に、または順次に本発明の１または複数の薬剤および核酸に基づくベクターと接触させることができる。当業者は薬剤の投与様式および時期は、薬剤の阻害の期間および程度、薬剤の製薬学的特性、および影響を受けた組織、臓器または生物の元にある疾患状態により影響を受けると考えるだろう。
上昇したＥＮａＣレベルまたは上昇したＥＮａＣ活性に関連する状態を抑制または処置する方法を提供する。この方法には、状態の危険にあるか、または状態を有する哺乳動物を、１または複数のＥＮａＣサブユニット遺伝子の転写を阻害または低下し、かつ／または１または複数のＥＮａＣサブユニット遺伝子の転写を改変する分子のレベル、量または活性を改変し、そして遺伝子治療ベクターの効力を高める有効量の薬剤と接触させることを含む。
また、上昇したＥＮａＣレベルまたは上昇したＥＮａＣ活性に関連する状態を抑制または処置する方法も提供する。この方法には、状態の危険にあるか、または状態を有する哺乳動物を、１または複数のＥＮａＣサブユニット遺伝子の転写を阻害または低下し、かつ／または１または複数のＥＮａＣサブユニット遺伝子の転写を改変する分子のレベル、量または活性を改変する有効量の薬剤と接触させることを含み、ここで薬剤はプロテアソーム調節剤であり、そして薬剤は哺乳動物のゲノムによりコードされる遺伝子または遺伝子産物、遺伝子の相補鎖、または遺伝子またはその相補鎖の一部ではない。
さらに上昇したＥＮａＣレベルまたは上昇したＥＮａＣ活性に関連する状態を抑制または処置する方法を提供し、ここで状態の危険にあるか、または状態を有する哺乳動物を、ＥＮａＣのα、βおよびγサブユニットの転写を阻害または低下するか、またはＥＮａＣのα、βおよびγサブユニットの転写を改変する分子のレベル、量または活性を改変する有効量の薬剤と接触させる。
また本発明は、上昇したＥＮａＣレベルまたは上昇したＥＮａＣ活性に関連する状態を抑制または処置する方法を提供し、この方法は状態の危険にあるか、または状態を有する哺乳動物を、１または複数のＥＮａＣサブユニット遺伝子の転写を阻害または低下し、かつ／または１または複数のＥＮａＣサブユニット遺伝子の転写を改変する分子のレベル、量または活性を改変し、そして哺乳動物細胞に感染するウイルスの形質導入を高める有効量の薬剤と接触させることを含む。
このように本発明は、哺乳動物における上昇したＥＮａＣレベルまたは上昇したＥＮａＣ活性に関連する状態を抑制または処置する薬剤を調製するための、１または複数のＥＮａＣサブユニット遺伝子の転写を阻害し、または下げ、かつ／または１または複数のＥＮａＣサブユニット遺伝子の転写を改変する分子のレベル、量または活性を改変する１または複数の薬剤の使用を提供する。さらに哺乳動物における上昇したＥＮａＣレベルまたは上昇したＥＮａＣ活性に関連する状態を抑制または処置するための、ＥＮａＣのα、βおよびγサブユニットの転写を阻害し、または下げ、あるいはＥＮａＣのα、βおよびγサブユニットの転写を改変する分子のレベル、量または活性を改変する１または複数の薬剤の使用を提供する。
発明の詳細な説明
定義
本明細書で使用する「ＥＮａＣ活性を改変する」または「ＥＮａＣのレベルまたは量を抑制または低下する」薬剤には、限定するわけではないが細胞、細胞群、組織または臓器のＥＮａＣ活性を阻害する薬剤を含む。例えばＥＮａＣ活性は１または複数のＥＮａＣサブユニット遺伝子の転写を阻害し、ＥＮａＣ転写を改変する分子のレベル、量または活性を改変し、ＥＮａＣ ＲＮＡの安定性を改変し、および／または分子（例えば限定するわけではないがプロテアソーム、エンドソームおよびトランス−ゴルジを含む細胞内区画を通る、および／または例えば微小管または微細繊維のような細胞骨格成分を介して細胞質ゾルを通る、非ウイルス起源の分子）のトラフィッキングおよびプロセッシングを改変することにより阻害することができる。当業者は、ＥＮａＣ活性を改変することには例えば、ＥＮａＣ配列のメチル化のような、１または複数のＥＮａＣサブユニットのプロモーターとの直接的な相互作用を介するＥＮａＣ転写の減少を含むことができ、あるいは負に調節するタンパク質（例えばＥＮａＣのリプレッサー）の、少なくとも１つのＥＮａＣサブユニットプロモーター配列への結合に影響を及ぼすこと、あるいは正に調節する転写因子（例えば１または複数のＥＮａＣプロモーターに結合する転写因子結合タンパク質）の結合の阻害を含むことができる。１つの態様では、ＥＮａＣ活性を改変するか、またはＥＮａＣのレベルまたは量を抑制または低下する薬剤には、ＥＮａＣのアンタゴニストであり、細胞膜結合タンパク質に結合し（例えばＥＮａＣまたは肝細胞増殖因子の受容体に結合し）、ＥＮａＣの翻訳後プロセッシングを改変する薬剤、および／または哺乳動物細胞の遺伝子、もしくはそれにコードされる遺伝子産物、それらの相補鎖もしくはそれらの一部（例えばアンチセンスオリゴヌクレオチド）である薬剤を含まない。
本発明の薬剤に関して本明細書で使用する「二重治療活性」、「二重治療作用」、「二重治療薬」、「ｐｈａｒｍｉｃｏ−遺伝子治療」または「有力にする」とは、疾患の１次病態生理学的効果を処置し、そして疾患を処置するための遺伝子治療ベクターの効力を高める両方に使用する本発明の特定の薬剤を指す。
本明細書で使用する「ベクター」は、ポリヌクレオチドを含んでなるか、またはそれと会合し、そしてインビトロもしくはインビボのいずれかで細胞へのポリヌクレオチドの送達を媒介するために使用することができる高分子または複数の高分子の会合をさす。例えばベクターは組換え起源のポリヌクレオチド配列を含んでなることができる。例示的なベクターには、プラスミド、ウイルスベクター、リポソームおよび他の遺伝子送達媒体を含む。「標的ポリヌクレオチド」または「導入遺伝子」と呼ばれることもある送達されるポリヌクレオチドは、遺伝子治療における対象のコーディング配列（治療対象のタンパク質をコードする遺伝子のような）、ワクチン開発における対象のコーディング配列（哺乳動物に免疫応答を誘導するために適するタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドを発現するポリヌクレオチドのような）、および／または選択可能なもしくは検出可能なマーカーを含んでなることができる。
「ＡＡＶ」はアデノ随伴ウイルスであり、そして自然に存在する野生型のウイルス自体またはその誘導体を指すために用いることができる。この用語は、他に必要とされる場合を除いて、全てのサブタイプ、血清型およびシュードタイプ、および天然に存在する形態および組換え形態の両方を包含する。本明細書で使用する「血清型」という用語は、定めた抗血清とのキャプシドタンパク質の反応性に基づき同定され、そして他のＡＡＶと識別されるＡＡＶを指し、例えば、８つの血清型の霊長類ＡＡＶ、ＡＡＶ−１〜ＡＡＶ−８がある。例えば血清型ＡＡＶ２は、ＡＡＶ２のキャップ遺伝子からコードされるキャプシドタンパク質、および同じＡＡＶ２血清型に由来する５’および３’ＩＴＲ配列を含有するゲノムを含むＡＡＶを指すために使用する。シュードタイプＡＡＶは、１つの血清型に由来するキャプシドタンパク質、および第２の血清型の５’−３’ＩＴＲを含むウイルスゲノムを含有するＡＡＶを指す。シュードタイプｒＡＡＶはキャプシド血清型の細胞表面結合特性を有し、そしてＩＴＲ血清型と一致する遺伝的特性を有すると期待される。シュードタイプｒＡＡＶは、当該技術分野で記載されている標準技法を使用して生成される。例えば本明細書で使用するｒＡＡＶ５は、同じ血清型に由来するキャプシドタンパク質および５’−３’ＩＴＲの両方を有するＡＡＶを指すために使用することができ、または血清型５に由来するキャプシドタンパク質および異なるＡＡＶ血清型、例えばＡＡＶ血清型２に由来する５’−３’ＩＴＲを有するＡＡＶを指すために使用することができる。本明細書に具体的に説明する各実施例に関して、ベクターの設計および生産の記載は、キャプシドおよび５’−３’ＩＴＲ配列の血清型を記載する。「ｒＡＡＶ」という略語は、組換えＡＡＶベクター（もしくは「ｒＡＡＶ」ベクター）とも呼ばれる組換えアデノ随伴ウイルスを指す。
本明細書で使用する「形質導入」、「トランスフェクション」、「形質転換」または「形質導入する（ｔｒａｎｓｄｕｃｉｎｇ）」は、外因性ポリヌクレオチド（例えばｒＡＡＶベクター中の導入遺伝子）を、宿主細胞に導入するプロセスを指す用語であり、ポリヌクレオチド（例えば細胞における導入遺伝子）の発現をもたらし、そして外因性ポリヌクレオチドを宿主細胞へ導入するための組換えウイルスの使用を含み、例えばウイルスが媒介するトランスフェクションは、一般に形質導入と言う。例えばｒＡＡＶベクターについて、このプロセスには、１）ＡＡＶが細胞表面の受容体に結合した後のエンドサイトーシス、２）エンドソームまたは細胞質ゾルまたは細胞の他の細胞内区画からの脱出、３）ウイルス粒子またはウイルスゲノムの核へのトラフィッキング、４）ウイルス粒子の脱殻、および環状中間体を包含する、発現可能な二本鎖ＡＡＶゲノム形態の形成を含む。ｒＡＡＶの発現可能な二本鎖形態は、核エピソームとして存続することができ、または場合により宿主のゲノムに組み込まれてもよい。細胞におけるポリヌクレオチドの形質導入、トランスフェクションまたは形質転換は、限定するわけではないが例えばＥＬＩＳＡ、フローサイトメトリーおよびウエスタンブロットによるタンパク質発現（定常状態レベルを含む）、ハイブリダイゼーション、例えばノーザンブロット、サザンブロットおよびゲルシフト移動度アッセイによるＤＮＡおよびＲＮＡの測定を含め、当該技術分野で周知な方法により測定することができる。外因性ポリヌクレオチドの導入に使用する方法には、化学物質が媒介する方法、例えばＣａ２＋が媒介する方法およリポフェクチン、ウイルス感染および電気穿孔、ならびに非ウイルス遺伝子送達技法をような周知の技法を含む。。導入されたポリヌクレオチドは、宿主細胞において安定に、または一時的に保持され得る。
「上昇した形質導入または形質導入頻度」、「改変された形質導入または形質導入頻度」、「強化された形質導入または形質導入頻度」、「上昇したトランスフェクション頻度」、「改変されたトランスフェクション頻度」、「強化された形質導入頻度」、「上昇した形質転換頻度」、「改変された形質転換頻度」、「強化された形質転換頻度」は、未処理細胞に比べて処置細胞中で上記の１または複数の活性の上昇を指す。形質導入、トランスフェクションまたは形質転換を効率的に上昇させる薬剤は、１または複数の形質導入活性に及ぼす影響を測定することにより決定することができ、これには導入遺伝子の発現を測定すること、導入遺伝子の機能を測定すること、または薬剤で処置しなかった宿主細胞に比べて、同じ導入遺伝子の効果を生じるために必要なベクター分子の数を決定することを含むことができる。
「プロテアソームモジュレーター」とは、プロテアソームと相互作用し、結合し、または機能を改変し、かつ／またはトラフィッキングまたは位置を改変する薬剤または薬剤の種類を指す。プロテアソームモジュレーターは、当該技術分野で記載されている他の細胞機能、例えば抗生物質であるトキシルビシンのような機能を有することができる。
「遺伝子送達」は、遺伝子導入のための細胞への外因性ポリヌクレオチドの導入を指し、そしてターゲティング、結合、取り込み、輸送、局在化、レプリコン組込みおよび発現を包含することができる。
「遺伝子導入」は、ターゲティング、結合、取り込み、輸送、局在化およびレプリコン組込みを包含することができる細胞への外因性ポリヌクレオチドの導入を指すが、その後の遺伝子の発現とは異なり、そしてそれを意味しない。
「遺伝子発現」または「発現」は、遺伝子転写、翻訳および翻訳後修飾のプロセスを指す。
「検出可能なマーカー遺伝子」は、遺伝子を保有する細胞が特異的に検出される（マーカー遺伝子を保有しない細胞と区別される）ことを可能にする遺伝子である。多種類のそのようなマーカー遺伝子が当該技術分野において既知である。
「選択可能なマーカー遺伝子」は、対応する選択した薬剤の存在下で、遺伝子を保有する細胞が選択した薬剤のために、または対して（ｆｏｒ ｏｒ ａｇａｉｎｓｔ）特異的に選択されることを可能にする遺伝子である。例として、抗生物質耐性遺伝子は、対応する抗生物質の存在下で宿主細胞が正に選択されることを可能にする正の選択可能なマーカー遺伝子として用いることができる。様々な正および負の選択可能なマーカーが当該技術分野において既知であり、これらのいくつかを以下に記述する。
本明細書において使用する「ウイルスベクター」は、組換え起源のポリヌクレオチド、典型的には細胞の遺伝子形質転換の対象となる配列を含んでなるウイルスベクターを指す。ウイルスベクターという用語は、ベクター粒子およびベクタープラスミドの両方を包含する。
「ウイルスベクターワクチン」は、ベクターと接触した宿主細胞中で免疫応答を誘導することができるペプチド、ポリペプチドまたはタンパク質をコードするウイルス起源ではないポリヌクレオチド配列（すなわちそのウイルスに対してヘテロロガスなポリヌクレオチド）を含んでなるウイルスベクターを指す。ポリヌクレオチドの発現は、抗体応答の中和および／または細胞が媒介する応答、例えば細胞傷害性Ｔ細胞応答の生成をもたらすことができる。
「感染性」ウイルスもしくはウイルス粒子は、ウイルス種が親和性である細胞に送達されることができるポリヌクレオチド成分を含んでなるものである。この用語は、必ずしもウイルスの任意の複製能力を意味しない。
「複製可能な」ウイルス（例えば、「ＲＣＡ」と省略されることもある複製可能なＡＡＶ）は、感染性であり、そしてまた感染細胞において（すなわち、ヘルパーウイルスもしくはヘルパーウイルス機能の存在下で）複製されることもできる表現型的に野生型のウイルスを指す。
「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドを包含する任意の長さのヌクレオチドまたはその類似体のポリマー形態をさす。ポリヌクレオチドは、メチル化されたもしくはキャップ付きヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体のような修飾されたヌクレオチドを含んでなることができ、そして非ヌクレオチド成分によって遮断することができる。ヌクレオチド構造への修飾が存在する場合、修飾はポリマーの集合の前もしくは後に与えることができる。本明細書で使用するポリヌクレオチドという用語は、二本鎖および一本鎖分子を互換的にさす。他に特定もしくは必要とされない限り、本明細書で記載する本発明の任意の態様は、ポリヌクレオチドは二本鎖形態、および二本鎖形態を構成することが既知であるかもしくは予測される二つの相補的な一本鎖形態の各々の両方を包含する。
本明細書で使用する「転写調節配列」もしくは「ＴＲＳ」は、それが作動可能に連結される遺伝子もしくはコーディング配列の転写を制御するゲノム領域をさす。本発明において使用する転写調節配列は、一般に少なくとも一つの転写プロモーターを含み、そしてまた転写の１つまたは複数のエンハンサーおよび／もしくはターミネーターも含むことができる。
「作動可能に連結された」は、２以上の成分の配置をさし、ここでそのように記述される成分は、それらが協調して機能することを可能にする関係にある。例として、転写調節配列もしくはプロモーターは、ＴＲＳもしくはプロモーターがコーディング配列の転写を促進する場合にコーディング配列に作動可能に連結される。作動可能に連結されたＴＲＳは一般に、コーディング配列とシスに連結されるが、必ずしもそれに直接隣接するとは限らない。
「異種の」は、それを比較する存在の残りとは遺伝子型で区別可能な存在に由来することを意味する。例えば、異なる細胞型に遺伝子工学技術によって導入されたポリヌクレオチドは、異種のポリヌクレオチドである（そして、発現される場合、異種のポリペプチドをコードすることができる）。同様に、その天然のコーディング配列から取り除かれ、そして異なるコーディング配列に作動可能に連結されるＴＲＳもしくはプロモーターは、異種のＴＲＳもしくはプロモーターである。
本明細書で使用する「パッケージング」は、ウイルスベクターの集合および包膜をもたらす一連の細胞内の事象をさす。従って、適当なベクターを適切な条件下でパッケージング細胞系に導入すると、それはウイルス粒子に集成することができる。ウイルスベクター、のパッケージングと関連する機能は、当該技術分野において記載されている。
「ターミネーター」は、読み通し（ｒｅａｄ−ｔｈｒｏｕｇｈ）転写を減らすかもしくは防ぐ傾向があるポリヌクレオチド配列をさす（すなわち、それは、ターミネーターの片側で起こる転写がターミネーターの反対側までずっと続くことを減らすかもしくは防ぐ）。転写が中断される程度は、典型的に、ターミネーター配列の塩基配列および／もしくは長さの関数である。特に、多数の分子生物学系において周知であるように、「転写終結配列」と一般に呼ばれる特定のＤＮＡ配列は、おそらく、ＲＮＡポリメラーゼ分子を止めそして／もしくは転写されるＤＮＡから離させることによって、ＲＮＡポリメラーゼによる読み通し転写を中断する傾向がある特異的配列である。そのような配列特異的ターミネーターの典型的な例には、ポリアデニル化（「ポリＡ」）配列、例えばＳＶ４０ポリＡが包含される。そのような配列特異的ターミネーターに加えてもしくはそれらの代わりに、プロモーターおよびコーディング領域間の比較的長いＤＮＡ配列の挿入もまた、一般に介在配列の長さに比例して、コーディング領域の転写を中断する傾向がある。この効果は、おそらく、ＲＮＡポリメラーゼ分子が、転写されるＤＮＡから離されるようになるいくらかの傾向がいつもあるので起こり、そしてコーディング領域に達する前に横切る配列の長さを増やすことは、一般に、コーディング領域の転写を完了するかもしくはおそらく開始さえする前に遊離が起こる可能性を増す。従って、ターミネーターは、一方向のみ（「単一方向」ターミネーター）もしくは両方向（「双方向」ターミネーター）からの転写を防ぐことができ、そして配列特異的終結配列または配列非特異的ターミネーターまたは両方を含んでなることができる。様々なそのようなターミネーター配列は当該技術分野において既知であり；そして本発明の文脈内でのそのような配列の実例となる使用を以下に提供する。
「宿主細胞」、「細胞株」、「細胞培養物」、「パッケージング細胞株」および他のそのような用語は、本発明において有用な高等真核生物細胞、好ましくは哺乳動物細胞、最も好ましくはヒト細胞を意味する。これらの細胞は、組換えベクター、ウイルスもしくは他の導入ポリヌクレオチドのレシピエントとして用いることができ、そして形質導入した元の細胞の子孫を含む。単細胞の子孫は、元の親細胞と（形態においてもしくはゲノム補完物（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）において）必ずしも完全に同一であるとは限らないかもしれないと理解される。
「治療遺伝子」、「予防遺伝子」、「標的ポリヌクレオチド」、「導入遺伝子」、「対象の遺伝子」などは一般に、ベクターを用いて導入される一つの遺伝子もしくは複数の遺伝子をさす。１つの態様では、そのような遺伝子はウイルスベクター内に配置され、これがウイルス粒子に複製および包膜化される。標的ポリヌクレオチドは、多数の異なる応用のためのベクターを生成するために本発明において用いることができる。そのようなポリヌクレオチドには、限定するわけではないが：（ｉ）構造タンパク質または酵素の不足している、欠けているもしくは最適以下のレベルによって引き起こされる欠損症を軽減するための遺伝子治療の他の形態で有用なタンパク質をコードするポリヌクレオチド；（ｉｉ）アンチセンス分子に転写されるポリヌクレオチド；（ｉｉｉ）転写もしくは翻訳因子に結合するおとりに転写されるポリヌクレオチド；（ｉｖ）サイトカインのような細胞モジュレーターをコードするポリヌクレオチド；（ｖ）レシピエント細胞をヘルペスウイルスチミジンキナーゼ遺伝子のような特定の薬剤に感受性にすることができるポリヌクレオチド；および（ｖｉ）様々な癌の処置のためのＥ１Ａ腫瘍抑制遺伝子もしくはｐ５３腫瘍抑制遺伝子のような、癌治療のためのポリヌクレオチドを包む。レシピエント宿主細胞における導入遺伝子の発現をもたらすために、好ましくはそれ自身のもしくは異種のプロモーターのいずれかのプロモーターに作動可能に連結される。多数の適当なプロモーターが当該技術分野において既知であり、その選択は標的ポリヌクレオチドの発現の所望のレベル；構成的発現、誘導性発現、細胞特異的または組織特異的発現等を所望するかどうかにより決まる。ベクターまはた、選択可能なマーカーを含有することもできる。
「遺伝子」は、転写されそして翻訳された後に特定のタンパク質をコードすることができる少なくとも１つのオープンリーディングフレームを含有するポリヌクレオチドを指す。
ポリヌクレオチドに適用される「組換え」は、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限および／もしくはライゲーション工程、および天然に存在するポリヌクレオチドと異なる構築物をもたらす他の方法の様々な組み合わせの産物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含んでなるウイルス粒子である。この用語は、それぞれ、元のポリヌクレオチド構築物の複製物および元のウイルス構築物の子孫を包含する。
「制御要素」もしくは「制御配列」は、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳もしくは分解を含むポリヌクレオチドの機能調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列である。調節は、プロセスの頻度、速度または特異性に影響を与えることができ、そして本質的に増大するかもしくは抑制性であることができる。当該技術分野において既知である制御要素には例えば、プロモーターおよびエンハンサーのような転写調節配列を含む。プロモーターは、ある条件下でＲＮＡポリメラーゼに結合し、そして通常はプロモーターの下流に（３’方向に）位置するコーディング領域の転写を開始することができるＤＮＡ領域である。プロモーターには、ＡＡＶプロモーター、例えば、Ｐ５、Ｐ１９、Ｐ４０およびＡＡＶ ＩＴＲプロモーター、ならびに異種のプロモーターを含む。
「発現ベクター」は、対象のポリペプチドをコードする領域を含んでなるベクターであり、そして意図する標的細胞におけるタンパク質の発現をもたらすために用いる。発現ベクターはまた、標的におけるタンパク質の発現を容易にするためにコードする領域に作動可能に連結された制御要素も含んでなる。制御要素および発現のためにそれらが作動可能に連結される１つの遺伝子もしくは複数の遺伝子の組み合わせは、「発現カセット」と呼ばれることもあり、これらの多数は既知であり、そして当該技術分野において入手可能であるか、または当該技術分野において入手可能である成分から容易に構築することができる。
「遺伝子改変」とは、有糸分裂もしくは減数分裂による以外で遺伝要素が細胞に導入されるプロセスをさす。この要素は細胞と異種であることができ、またはそれはすでに細胞に存在する要素の追加コピーもしくは改良バージョンであることができる。遺伝子改変は、例えば電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿のような当該技術分野において既知である任意のプロセスによって細胞を組換えプラスミドもしくは他のポリヌクレオチドでトランスフェクションすること、またはポリヌクレオチド−リポソーム複合体と接触させることによってもたらすことができる。遺伝子改変はまた、例えばＤＮＡもしくはＲＮＡウイルスもしくはウイルスベクターでの形質導入もしくは感染により行うこともできる。好ましくは遺伝要素は、細胞の染色体もしくはミニ染色体に導入されるが；細胞およびその子孫の表現型および／もしくは遺伝子型を変える任意の改変がこの用語には含まれる。
細胞は、遺伝子配列がインビトロにおける細胞の長期培養中にその機能を実行するために利用可能である場合にこの配列で「安定に」改変される、形質導入されるもしくは形質転換されると言われる。好ましい例において、そのような細胞は、改変された細胞の子孫によっても遺伝可能である遺伝子改変が導入されるという点において「遺伝可能に」改変される。
「ポリペプチド」および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーをさすために本明細書において互換的に用いる。この用語はまた、修飾されているアミノ酸ポリマー；例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、アセチル化、ホスホニル化（ｐｈｏｓｐｈｏｎｙｌａｔｉｏｎ）、脂質化、もしくは標識化成分との結合も包含する。「ＣＦＴＲ」等のようなポリペプチドは、遺伝子治療およびそのための組成物との関連で検討する場合、それぞれの完全なポリペプチド、または完全なタンパク質の所望の生化学機能を保持するその任意のフラグメントもしくは遺伝子操作された誘導体を指す。同様に、ＣＦＴＲ、および遺伝子治療における使用のための他のそのような遺伝子（典型的には、レシピエント細胞に送達される「導入遺伝子」と呼ばれる）への言及には、完全なポリペプチドまたは所望の生化学機能を保有する任意のフラグメントもしくは遺伝子操作された誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。
「単離された」プラスミド、ウイルス、もしくは他の物質は、その物質もしくは同様の物質が天然に存在するか、または最初に調製される場合に同様に存在し得る他の成分の少なくともいくらかを欠いている物質の調製物をさす。従って、例えば、単離された物質は、供給源混合物からそれを濃縮するために精製技術を用いることによって調製することができる。濃縮は、溶液の容量当たりの重量のような絶対基準で測定することができ、または供給源混合物に存在する第二の潜在的に干渉する物質に対して測定することができる。本発明の態様の濃縮を増加することが、さらに一層好ましい。従って、例えば、２倍濃縮が好ましく、１０倍濃縮はより好ましく、１００倍濃縮はより好ましく、１０００倍濃縮はより一層好ましい。
ウイルス生産、複製又はパッケージングを説明する際に使用される「効率」は、本方法の有用な性質：特に細胞当たり生産されるウイルス粒子の増殖速度及び数を指す。「高い効率」の生産は、特定された培養期間の経過にわたり細胞当たり少なくとも１００個のウイルス粒子、好ましくは少なくとも約１０，０００個、更に好ましくは少なくとも約１００，０００個の粒子の生産を示す。
本発明に従って処理された「個体」または「被験者」は、脊椎動物、特に哺乳動物種のメンバーを指し、そして限定するわけではないが家畜、スポーツ動物およびヒトを包含する霊長類を含む。
個体または細胞の「処理」は、処理が開始される時点で個体または細胞の自然の経過を変える試みにおけるすべての種類の介入、例えば、個体における予防、治療または他の有利な効果を引き出すことである。例えば個体の処理は、遺伝した欠陥または誘発された遺伝子的欠陥、ウイルス、バクテリアもしくは寄生生物による感染、新生物形成もしくは形成不全状態、または自己免疫もしくは免疫抑制のような免疫系機能不全を含む（しかしこれらに限定はされない）すべての病理学的状態により引き起こされる病理を減少または限定することであると理解され得る。処理には製薬学的組成物のような組成物の投与および組成物で処理された適合性細胞の投与を含む（しかしこれに限定されない）。処理は、予防的にまたは治療的に、即ち、病理学的出来事の開始または病原との接触の前または後に、行うことができる。
本発明の実施は他に示さない限り、当該技術分野の技術の範囲内にある分子生物学、ウイルス学、微生物学、組み換えＤＮＡおよび免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は文献に十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９；Ｇａｉｔ，１９８４；Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，１９８７；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙシリーズ：Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｃａｌｏｓ，１９８７；Ｗｅｉｒ ｅｔ ａｌ．，；Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７；Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５；およびＳｃｏｐｅｓ，１９９４を参照にされたい。
Ｉ．本発明の方法に有用な薬剤
異常なＥＮａＣレベル、量または活性に関連する状態を抑制し、処置し、または防止するために有用な薬剤には、限定するわけではないがＥＮａＣのレベルまたは量を抑制または下げるもの、例えば限定するわけではないが、プロテアソーム、エンドソームおよびトランス−ゴルジを含む細胞内区画、および／または例えば微小管または微細繊維のような細胞骨格成分を介する細胞質ゾルを通る分子のトラフィッキングおよびプロセッシングを改変し、１または複数のＥＮａＣサブユニット遺伝子の転写を阻害し、かつ／またはＥＮａＣ転写を改変する分子のレベル、量または活性を改変する薬剤を含む。本発明に有用な薬剤の種類には、限定するわけではないが、抗生物質、化学療法剤、脂質低下剤および食品添加物、ならびに例えばトリペプチジルアルデヒドのようなプロテアソームモジュレーター、カルパイン、カテプシン、システインプロテアーゼ、および／またはプロテアソームのキモトリプシン様プロテアーゼ活性を阻害する薬剤（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｓｅｉｓｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００１）、およびプロテアソームおよびユビキチン経路をモジュレートする薬剤、例えばプロテアソームに結合し、かつ／またはプロテアソーム、ユビキチン、ユビキチンキャリアータンパク質、またはユビキチンリガーゼの活性をモジュレートするが、プロテアソームの活性、例えばプロテアソームまたはユビキチンのタンパク質溶解活性、ユビキチンキャリアータンパク質、またはユビキチンリガーゼを実質的に改変しない薬剤を含む。これら薬剤の例には、限定するわけではないが抗生物質、例えばエポキソミシン、脂質低下剤、例えばシンバスタチン、食品添加物、例えばタンニン酸、および化学療法剤、例えばシスプラチン、ドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシンおよびイダルビシンのようなアントラサイクリン類、およびカンプトテシンを含む。
本発明の範囲内にあるシステインプロテアーゼインヒビターは、シスタチン、例えばシスタチンＢまたはシスタチンＣ、アンチパイン、ロイペプチン、Ｅ−６４、Ｅ−６４ｃ、Ｅ−６４ｄ、ＫＯ２（Ｗａｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９８８）、ＬＬｎＬ、Ｚ−ＬＬＬ、ＣＢＺ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ−Ｈ、米国特許第米国特許第５，６０７，８３１号、同第５，３７４，６２３号、同第５，６３９，７３２号、同第５，６５８，９０６号、同第５，７１４，４８４号、同第５，５６０，９３７号、同第５，３７４，６２３号、同第５，６０７，８３１号、同第５，７２３，５８０号、同第５，７４４，３３９号、同第５，８２７，８７７号、同第５，８５２，００７号および、５，７７６，７１８号明細書、日本国特許第１００７７２７６号、同第８１９８８７０号、同第８０８１４３１号、同第７１２６２９４号、同第４２０２１７０号明細書、国際公開第９６／２１００６号および同第９６／４０７３７号パンフレットに記載されているようなシステインプロテアーゼインヒビター、ならびにＣｄｚ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−ノルバリナル（ＭＧ１１５）、カルボベンズオキシ−イソロイシル−（ガンマ）−ｔ−ブチル−Ｌ−グルタミル−Ｌ−アラニル−Ｌ−ロイシナル（ＰＳＩ）、Ｎ−アセチル−ロイ−ロイノルロイシナル（ＡＬＬＮ）、ＭＬＮ５１９（ミレニウムファルマシューティカルズ：Ｍｉｌｌｅｎｉｕｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ）、［（１Ｒ）−３−メチル−１−［［（２Ｓ）−３−フェニル−２−［（ピラジニルカルボニル）−アミノ］プロパノイル］アミノ］ブチル］ホウ酸（ＰＳ−３４１、一般に「ボルテゾミブ（ｂｏｒｔｅｚｏｍｉｂ）」として知られ、商品名はＶｅｌｃａｄｅ；ミレニウムファルマシューティカルズ）、Ｚ−ＬＬｅ−Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ｈ，ＳＲＩ６９７５（２アセチルピリジンＮフェニルグアニルヒドラゾンジヒドロクロライド、ＡＬＬＭ（Ｎ−アセチル−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−メチオナール）、クラスト−ラクタシスチン（ｃｌａｓｔｏ−ｌａｃｔｏｃｙｓｔｉｎ）ベータラクトン、ならびにＩｑｂａｌ ｅｔ ａｌ．（１９９５）およびＬｅｅ ｅｔ ａｌ．（２０００）に開示されているプロテアソームインヒビターを含み、この開示は引用により特別に本明細書に編入する。
１つの態様では、システインプロテアーゼインヒビターはペプチドまたはその類似体である。例えば本発明の範囲内にあるペプチドのシステインプロテアーゼインヒビターは、２〜２０個、より好ましくは３〜１０個、そしてさらにより好ましくは３〜８個のアミノ酸残基を含んでなる。「アミノ酸」はＤまたはＬ形の天然アミノ酸（例えばＡｌａ、Ａｒｇ、Ａｓｎ、Ａｓｐ、Ｃｙｓ、Ｇｌｕ、Ｇｌｎ、Ｇｌｙ、Ｈｉｓ、Ｈｙｌ、Ｈｙｐ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｌｙｓ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｐｒｏ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、Ｔｒｐ、ＴｙｒおよびＶａｌ）、ならびに非天然アミノ酸（例えばホスホセリン、ホスホトレオニン、ホスホチロシン、ヒドロキシプロリン、ガンマ−カルボキシグルタメート；馬尿酸、オクタヒドロインドール−２−カルボン酸、スタチン、１，２，３，４−テトラヒドロイソキノリン−３−カルボン酸、ペニシラミン、オルニチン、シトルリン、α−メチル−アラニン、パラ−ベンゾイルフェニルアラニン、フェニルグリシン、プロパルギルグリシン、サルコシン、ノル−ロイシン、ノル−バリンおよびｔｅｒｔ−ブチルグリシン）の残基を含んでなる。ペプチド類似体は、Ｄ形の少なくとも１つのアミノ酸および／または非天然アミノ酸、または天然のアミノ酸ではない他の部分を含んでなる分子である。
プロテアーゼインヒビターには式（Ｉ）：Ｒ１−Ａ−（Ｂ）ｎ−Ｃの化合物（式中、Ｒ１はＮ−末端アミノ酸ブロッキング基であり；各ＡおよびＢは独立してアミノ酸であり；Ｃはアミノ酸であり、ここで末端カルボキシ基はホルミル（ＣＨＯ）基により置換されており；そしてｎは０、１、２または３である）、またはそれら製薬学的に許容され得る塩を含む。１つの好適な態様では、Ｒ１が（Ｃ１−Ｃ１０）アルカノイル、アセチルまたはベンジルオキシカルボニルである。別の好適な態様では、各ＡおよびＢが独立してアラニン、アルギニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、ノル−ロイシンまたはノル−バリンであり、そしてより好ましくは各ＡおよびＢはイソロイシンである。さらに別の好適な態様では、Ｃはアラニン、アルギニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、ノル−ロイシンまたはノル−バリンであり、ここで末端カルボキシ基はホルミル（ＣＨＯ）基により置換されており、そしてより好ましくはＣがノル−ロイシンまたはノル−バリンであり、ここで末端カルボキシ基はすでにホルミル（ＣＨＯ）基により置換されている。
１つの態様では、Ｒ１が（Ｃ１−Ｃ１０）アルカノイルである。別の態様では、Ｒ１がアセチルまたはベンジルオキシカルボニルである。さらなる態様では、Ｒ１が（Ｃ１−Ｃ１０）アルカノイルまたはベンジルオキシカルボニルであり；ＡおよびＢがそれぞれイソロイシンであり；Ｃがノル−ロイシンまたはノル−バリンであり、ここで末端カルボキシ基はホルミル（ＣＨＯ）基により置換されており；そしてＮが１である。さらなる態様では、Ｃがアラニン、アルギニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、ノル−ロイシンまたはノル−バリンであり、ここで末端カルボキシ基はＣＨＯ基により置換されており、例えば１つの態様では、Ｃはノル−ロイシンまたはノル−バリンであり、そして末端カルボキシ基はＣＨＯ基により置換されている。さらに別の態様では、ＡおよびＢはそれぞれ独立してアラニン、アルギニン、グリシン、イソロイシン、ロイシン、バリン、ノル−ロイシンまたはノル−バリンであり、例えば１つの態様ではＡおよびＢがそれぞれイソロイシンである。
さらなる好適な態様では、Ｒ１が（Ｃ１−Ｃ１０）アルカノイルまたはベンジルオキシカルボニルであり；ＡおよびＢがそれぞれイソロイシンであり；Ｃがノル−ロイシンまたはノル−バリンであり、ここで末端カルボキシ基はホルミル（ＣＨＯ）基により置換されており；そしてＮが１である。
また本発明の範囲内には式（ＩＩ）：
Figure 2007524379
式中、
Ｒ２はＮ−末端アミノ酸ブロッキング基であり；
Ｒ３、Ｒ４およびＲ５は各々が独立して水素、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、アリールまたはアリール（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであり；そして
Ｒ６、Ｒ７およびＲ８は各々が独立して水素、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、アリールまたはアリール（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルである、
の化合物またはそれらの製薬学的に許容され得る塩を含む。
好ましくはＲ２が（Ｃ１−Ｃ１０）アルカノイル、アセチルまたはベンジルオキシカルボニルである。また好ましくはＲ３が水素または（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、例えば２−メチルプロピルである。Ｒ４が水素または（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、例えば２−メチルプロピルであることが好ましい。別の好適な態様では、Ｒ５が水素または（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、例えばブチルまたはプロピルである。さらに好適な態様では、Ｒ２がアセチルまたはベンジルオキシカルボニルであり；Ｒ３およびＲ４が各々２−メチルプロピルであり；Ｒ５がブチルまたはプロピルであり；そしてＲ６、Ｒ７およびＲ８が各々が独立して水素である。
Ｒ２が（Ｃ１−Ｃ１０）アルカノイル、例えばアセチルまたはベンジルオキシカルボニルでよく；Ｒ３が水素または（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、例えば２−メチルプロピルでよい。Ｒ５が水素または（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、例えばブチルまたはプロピルでよい。１つの態様では、Ｒ２がアセチルまたはベンジルオキシカルボニルであり；Ｒ３およびＲ４が各々２−メチルプロピルであり；Ｒ５がブチルまたはプロピルであり；そしてＲ６、Ｒ７およびＲ８が各々が独立して水素である。
１つの態様ではＲ１がＨ、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルカノイル、（＝Ｏ）、（＝Ｓ）、ＯＨ、ＳＲ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチルまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシであり、ここでアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはアルカノイルは、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチル、ＮＲＲまたはＳＲの１または複数で場合により置換されてもよく、ここで各Ｒが独立してＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであり；Ｒ２が（＝Ｏ）または（＝Ｓ）であり；Ｒ３がＨ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシまたは（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキルであり、ここでアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはシクロアルキルは、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチル、ＳＲまたはＮＲＲの１または複数で場合により置換されてもよく、ここで各Ｒは独立してＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであり；Ｒ４がＨ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシまたは（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキルであり、ここでアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはシクロアルキルは、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチル、ＳＲまたはＮＲＲの１または複数で場合により置換されてもよく、ここで各Ｒは独立してＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであり；Ｒ５がＨ、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルカノイル、（＝Ｏ）、（＝Ｓ）、ＯＨ、ＳＲ、ＣＮ、ＮＯ２またはトリフルオロメチルであり、ここでアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはアルカノイルは、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチル、ＮＲＲまたはＳＲの１または複数で場合により置換されてもよく、ここで各Ｒは独立してＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであり；そしてＸがＯ、ＳまたはＮＲであり、ここでＲはＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであり、あるいはそれらの製薬学的に許容され得る塩である。
本発明の方法に有用な他の好適な薬剤は、式（ＩＩＩ）：
Figure 2007524379
式中、
Ｒ１は、Ｈ、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルカノイル、（＝Ｏ）、（＝Ｓ）、ＯＨ、ＳＲ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチルまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシであり、ここでアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはアルカノイルはハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチル、ＮＲＲまたはＳＲの１または複数で場合により置換されてもよく、ここで各Ｒは独立してＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであり；
Ｒ２は、（＝Ｏ）または（＝Ｓ）であり；
Ｒ３は、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシまたは（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキルであり、ここでアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはシクロアルキルは、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチル、ＳＲまたはＮＲＲの１または複数で場合により置換されてもよく、ここで各Ｒは独立してＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであり；
Ｒ４は、Ｈ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシまたは（Ｃ３−Ｃ８）シクロアルキルであり、ここでアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはシクロアルキルは、ハロゲン、ＯＨ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチル、ＳＲまたはＮＲＲの１または複数で場合により置換されてもよく、ここで各Ｒは独立してＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであり；
Ｒ５は、Ｈ、ハロゲン、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルケニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルキニル、（Ｃ１−Ｃ１０）アルコキシ、（Ｃ１−Ｃ１０）アルカノイル、（＝Ｏ）、（＝Ｓ）、ＯＨ、ＳＲ、ＣＮ、ＮＯ２またはトリフルオロメチルであり、ここでアルキル、アルケニル、アルキニル、アルコキシまたはアルカノイルは、ハロゲン、ＯＨ、ＳＨ、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチル、ＮＲＲまたはＳＲの１または複数で場合により置換されてもよく、ここで各Ｒは独立してＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであり；そして
ＸはＯ、ＳまたはＮＲであり、ここでＲはＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルである、
の化合物、あるいはそれらの製薬学的に許容され得る塩である。
好ましくはＲ１がＯＨである。Ｒ２が（＝Ｏ）であり；Ｒ３がＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであることも好ましく、そしてより好ましくはＲ３がメチルである。他の好適な態様には、Ｒ４がＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであり、そしてより好ましくはＲ４がＨであり；Ｒ５がハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチルまたはＯＨであり、そしてさらに好ましくはＲ５がＯＨであるものを含む。式（ＩＩＩ）の化合物にはＸがＯまたはＳ、好ましくはＯであり；ここで両方の−−−−−−が単結合であり、ここで１つの−−−−−−が二重結合であるか、またはここで２つの−−−−−−が二重結合であるものを含む。より好適な態様では、Ｒ１がＯＨであり、Ｒ２が（＝Ｏ）であり、Ｒ３がメチルであり、 Ｒ４がＨであり、Ｒ５がＯＨであり、ＸがＯであり、そして両方の−−−−−−−が二重結合である。
本発明の方法に有用なさらに別の薬剤は、式（ＩＩＩ）：
Figure 2007524379
式中、Ｒ１はハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチルまたはＯＨである、
の化合物である。好ましくはＲ１がＯＨである。またＲ２が（＝Ｏ）であり；Ｒ３がＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであることも好ましく、そしてより好ましくはＲ３がメチルである。他の好適な態様には、Ｒ４がＨまたは（Ｃ１−Ｃ１０）アルキルであり、そしてより好ましくはＲ４がＨであり；Ｒ５がハロゲン、ＣＮ、ＮＯ２、トリフルオロメチルまたはＯＨであり、そしてより好ましくはＲ５がＯＨであるものを含む。式（ＩＶ）の化合物には、ＸがＯまたはＳ、好ましくはＯであり；ここで両方の−−−−−−が単結合であり、ここで１つの−−−−−−が二重結合であり、あるいはここで両方の−−−−−−が二重結合であるものを含む。より好適な態様では、Ｒ１がＯＨであり、Ｒ２が（＝Ｏ）であり、Ｒ３がメチルであり、Ｒ４がＨであり、Ｒ５がＯＨであり、ＸがＯであり、そして両方の−−−−−−が二重結合である。
本発明の方法に有用な別の薬剤には、ユビキチンの活性化、ユビキチンのユビキチンキャリアータンパク質への輸送、ユビキチンリガーゼまたはそれらの組み合わせを阻害する薬剤を含む。好適なユビキチンリガーゼインヒビターには、式（ＩＶ）：
Ｒ−Ａ−Ａ１−Ｒ１
式中、Ｒは水素、アミノ酸またはペプチドであり、ここでＮ−末端アミノ酸はアミノ基でアセチル、アシル、トリフルオロアセチルまたはベンジルオキシカルボニルを用いて場合により保護されることができ；
Ａは、アミノ酸または直接結合であり；
Ａ１は、アミノ酸であり；そして
Ｒ１は、ヒドロキシまたはアミノ酸であり、ここでＣ−末端アミノ酸はカルボキシ基で（Ｃ１−Ｃ６）アルキル、フェニル、ベンジルエステルまたはアミド（例えば、Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ２、ここで各Ｒは独立して水素または（Ｃ１−Ｃ６）アルキルである）を用いて場合により保護されることができる、
の化合物、あるいはそれらの製薬学的に許容され得る塩を含む。
Ｒに関する具体的な値は水素である。
Ａに関する具体的な値はアミノ酸である。Ａに関する別の具体的な値はＩｌｅ、ＬｅｕまたはＨｉｓである。Ａに関する別の具体的な値はＬｅｕまたはＨｉｓである。
Ａ１に関する具体的な値はＡｌａまたはＧｌｙである。Ａ１に関する別の具体的な値はＡｌａである。
Ｒ１に関する具体的な値はヒドロキシである。
具体的にはペプチドはジペプチド（すなわち２つのアミノ酸を含んでなることができる）であることができる。具体的にはペプチドはＨ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｈ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−ＯＨ、Ｈ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｈ−Ｈｉｓ−Ｇｌｙ−ＯＨ、Ｈ−Ｉｌｅ−Ａｌａ−ＯＨまたはＨ−Ｉｌｅ−Ｇｌｙ−ＯＨであることができる。さらに具体的にはペプチドはＨ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨまたはＨ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−ＯＨであることができる。
他に言及しない限り、以下の定義を適用する。アルキルは直鎖もしくは分枝鎖の基を表すが、「プロピル」のような個々の基に関しては直鎖の基のみを包含し、「イソプロピル」のような分枝鎖異性体は具体的に言及する。アリールはフェニル基、または少なくとも１つの環が芳香族である約９〜１０個の環原子を有するオルト縮合した二環式の炭素環式基を表す。
適当なＮ−アミノ酸ブロッキング基は、当業者に知られている（例えばＴ．Ｗ．Ｇｒｅｅｎｅ、有機合成における保護基（Ｐｒｏｔｅｃｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ Ｉｎ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ）：ウィリー（Ｗｉｌｅｙ）；ニューヨーク、１９８１、およびそこに引用されている参考文献を参照にされたい）。
いったん薬剤がＥＮａＣのレベルまたは量を抑制または下げるために、例えばＥＮａＣの転写を阻害または下げるために有用であると同定されれば、これは組織または臓器、例えば肺の粘液分泌から塩および水の再吸収を抑制するための、組織または臓器における粘液分泌を水和するための、例えば肺における気道表面液体容量を増すための、組織または臓器における粘液クリアランスを促進するための、異常なＥＮａＣ活性に関連する状態（例えば嚢胞性繊維症、リデル症候群および肺水腫、ならびに慢性気管支炎、喘息および急性肺傷害）を抑制または処置するための方法に使用することができる。同定された薬剤は単独で、または他の薬剤、例えばＥＮａＣアンタゴニストと組み合わせて、かつ／または遺伝子治療ベクターもしくはワクチンベクターと組み合わせて投与することができる。
ＩＩ．遺伝物質の細胞への導入
当該技術分野で記載されているように、そして本明細書および上記引用文献の両方に記載されているように、細胞（ウイルスベクターの生産のための哺乳動物「生産」細胞のような）に、そのような細胞を形質転換または形質導入するための種々の手段のいずれかを使用して、遺伝物質を導入することができる。例示として、そのような技術には、例えば、バクテリアプラスミドによるトランスフェクション、ウイルスベクターによる感染、エレクトロポレーション、リン酸カルシウム沈降、および種々の脂質をベースとする組成物のいずれかを使用する導入（しばしばリポフェクションと呼ばれる方法）を含む。これらの技術を実施するための方法および組成物は当該技術分野で記載されており、そして広く入手可能である。
適当に改変された細胞の選択は、当該技術分野の任意の技術により行うことができる。例えば、細胞を改変するために使用されるポリヌクレオチド配列は、当該技術分野で知られているような１または複数の検出可能なもしくは選択可能なマーカーと同時に導入されるか、またはこのマーカーに作動可能に連結させることができる。例示として、選択可能なマーカーとして薬剤耐性遺伝子を使用することができる。次いで薬剤耐性細胞を選びそして増殖させ、次いで所望の配列の発現、すなわち適当なものとして、パッケージング遺伝子産物または異種ポリヌクレオチドの産物について試験する。導入されたポリヌクレオチドの獲得、局在化および／または維持についての試験をＤＮＡハイブリダイゼーションに基づく技術（例えば、サザンブロッティングおよび当該技術分野で知られている他の方法）を使用して行うことができる。発現についての試験は、遺伝的に改変された細胞から抽出されたＲＮＡのノーザン分析、または対応する遺伝子産物に対する間接免疫蛍光により容易に行うことができる。パッケージング能力および効率の試験および確認は、ウイルスおよびヘルパーウイルスの残りの機能的成分を細胞に導入して、ウイルス粒子の生産について試験することにより得ることができる。細胞が複数のポリヌクレオチド構築物で遺伝的に改変される場合には、一般にそれらを細胞に別々に導入し、そして各段階を順次に確認することが好都合である（必須ではないけれども）。このような技術を記載している文献には、本明細書に引用された文献を含む。
ＩＩＩ．ウイルスベクターの使用
ウイルスベクターは遺伝子またはワクチン療法の目的で個体に投与するために使用することができる。遺伝子またはワクチン療法に適当な疾患には、限定するわけではないがウイルス、バクテリアもしくは寄生虫により誘導されるもの、種々の悪性疾患および過増殖性状態、自己免疫状態および先天性欠損症を含む。
遺伝子またはワクチン療法は、細胞内の、もしくは細胞により分泌される特定のタンパク質の発現のレベルを高めるために行うことができる。本発明のベクターは、遺伝子マーキング、失われたもしくは欠陥のある遺伝子の置き換え、または治療遺伝子の挿入のために細胞を遺伝子的に改変するために使用することができる。あるいは発現のレベルを減少させるポリヌクレオチドを細胞に与えることができる。これは、悪性疾患の経過期間中に増幅もしくは過発現される遺伝子産物、または微生物感染の経過期間中に導入されもしくは過発現される遺伝子の産物のような望ましくない表現型を抑制するために使用することができる。発現レベルは、標的遺伝子またはＲＮＡ転写産物のいずれかと安定なハイブリッドを形成することができる配列（アンチセンス治療）、リボザイムとして作用して関連したｍＲＮＡを切断することができる配列、または標的遺伝子産物に対する模造物として作用することができる配列を含んでなる治療ポリヌクレオチドを供給することにより減少させることができる。
本発明の方法によるウイルスベクターの導入は、当該技術分野で利用可能でありそして周知の任意の数送達技術（外科的および非外科的）の使用を含むことができる。このような送達技術には、例えば、血管カテーテル法、カニューレ挿入、注射、吸入法、塗擦、局所的、経口、経皮、動脈内、静脈内、および／または腹腔内投与を含む。ベクターは、例示として、血管移植片（ＰＴＦＥおよびダクロン）、心臓弁、血管内ステント、血管内ペービングならびに他の非血管人工器官を含むバイオ人工器官に、より導入することもできる。ベクター溶液の送達、頻度、組成物および投薬用量範囲に関する一般的技術は、当該技術の技術範囲内にある。
特に本発明のベクターの組織への送達ために、宿主動物にベクターを導入する任意の物理的もしくは生物学的方法を使用することができる。ベクターは、ウイルス投与について周知されているとおり、裸の組み換えベクターおよびウイルスコートタンパク質にパッケージングされたベクターＤＮＡの両方を意味する。ウイルスベクターをリン酸緩衝化生理食塩水中に単に溶解することは、筋肉組織発現に有用な媒体を提供するのに十分であることが証明されており、そしてベクターと共に投与されうる担体もしくは他の成分に関する制約は知られていない（ＤＮＡを分解する組成物はベクターに関する普通の方法では回避されるべきであるが）。経皮輸送により筋肉に送達されるべき注射可能な製剤または局所用製剤として製薬学的組成物を調製することができる。筋肉内注射および経皮輸送の両方のための多数の製剤がこれまでに開発されており、そして本発明の実施に使用することができる。ベクターは投与および取り扱いを容易にするために、任意の製薬学的に許容できる担体と共に使用することができる。
筋肉内注射の目的で、ごま油もしくは落花生油のようなアジュバント中の溶液、または水性プロピレングリコール中の溶液を使用することができ、そして無菌水溶液を使用することができる。このような水溶液は所望により緩衝化することができ、そして液体希釈剤は最初に食塩もしくはグルコースで等張性とすることができる。遊離酸（ＤＮＡは酸性ホスフェート基を含有する）または製薬学的に許容され得る塩としてのウイルスベクターの溶液は、ヒドロキシプロピルセルロースのような界面活性剤と適当に混合された水中に調製することができる。またウイルス粒子の分散物質も、グリセロール、液体ポリエチレングリコールおよびそれらの混合物中に、および油中に調製することができる。通常の貯蔵および使用条件下で、これらの調製物は微生物の増殖を阻止するために保存剤を含有する。これに関して、使用される無菌水性媒体は当業者に周知の標準技術によりすべて容易に得ることができる。
注射可能な使用に適当な製薬学的形態には、無菌の水溶液もしくは分散液、および無菌の注射可能な水溶液もしくは分散液をその場で調製するための無菌の粉末を含む。すべての場合でこの形態は無菌でなければならず、そして容易に注射可能である程度の流動性でなければならない。この形態は製造および貯蔵条件下に安定でなければならず、そしてバクテリアおよび菌・カビ類（ｆｕｎｇｉ）のような微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコール等）、それらの適当な混合物および植物油を含有する溶媒または分散媒体であることができる。例えば、レシチンのようなコーティングの使用により、分散液の場合には必要な粒度の維持により、および界面活性剤の使用により、適性な流動性を維持することができる。種々の抗バクテリア剤および抗菌・カビ剤、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等により微生物の作用を阻止することができる。多くの場合で、等張剤、例えば、糖または塩化ナトリウムを含むことが好ましい。注射可能な組成物の長期の吸収は吸収遅延剤、例えば、アルミニウムモノステアレートおよびゼラチンの使用により引き起こすことができる。
無菌の注射可能な溶液は、必要な量のウイルスベクターを必要に応じて上記した種々の他の成分と共に適当な溶媒中に加え、次いでろ過滅菌することにより調製される。一般に、分散液は、滅菌された有効成分を基本分散媒体と上記した成分からの必要な他の成分を含有する無菌のビヒクル中に導入することにより調製される。無菌の注射可能な溶液を調製するための無菌の粉末の場合には、好適な調製方法は、有効成分に予め無菌ろ過した溶液からの任意の追加の所望の成分の粉末を生じさせる真空乾燥および凍結乾燥技術である。
局所的投与の目的で、他の点では上記の非経口溶液と同様な希薄な無菌の水溶液（通常、約０．１％〜５％濃度の）は、経皮パッチに導入するのに適当な容器中で調製され、そして例えば、製薬学的等級のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）のような既知の担体を含むことができる。
特に興味深いのは、適正に機能する嚢胞性繊維症膜貫通調節タンパク質（ＣＦＴＲ）を気道上皮に与えることによる嚢胞性繊維症の遺伝子欠陥の矯正である。このように天然のＣＦＴＲタンパク質をコードするウイルスベクターおよびその突然変異体およびそのフラグメントはすべて本発明の態様である。
本発明の組成物は、インビボならびにエクスビボでも使用できる。インビボの遺伝子治療は、本発明のベクターを個体に直接投与することを含んでなる。製薬学的組成物は、液体溶液もしくは懸濁液として、乳液としてまたは使用前に液体中に溶解もしくは懸濁させるのに適当な固体形態として供給することができる。気道に投与するために、好ましい投与様式は、適当なエーロゾル投与デバイスと共に使用される時には、固体または液体エーロゾルのいずれかを与える組成物を使用したエーロゾルによる。気道への他の好ましい投与様式は、柔軟性光ファイバー気管支鏡を使用してベクターを滴下する（ｉｎｓｔｉｌｌ）ことである。典型的には、ウイルスベクターは、製薬学的に適当な発熱物質を含まない緩衝液、例えば、リンゲルのバランス塩類溶液（Ｒｉｎｇｅｒ’ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ｐＨ７．４）中である。必要ではないが、製薬学的組成物は場合により正確な量の投与に適した単位剤形で供給されてもよい。
処理の目的に依存して、有効量のウイルスが投与される。有効量は単一または分割された用量で与えられることができる。低い百分率の形質導入が遺伝子的欠陥を治癒させることができる場合には、処理の目的は一般にこのレベルの形質導入を満足させるか、または越えることである。場合により、このレベルの形質導入は、標的細胞のわずか約１〜５％の形質導入により達成され得るが、さらに典型的には所望の組織型の細胞の２０％より多く、通常は所望の組織型の細胞の少なくとも約５０％、好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約９５％、より一層好ましくは少なくとも約９９％である。指針として、気管支鏡により与えられる単一用量中に存在するベクター粒子の数は、ＤＮアーゼ耐性およびＤＮア−ゼ感受性粒子の両方を含めて、一般に少なくとも約１×１０８であり、さらに典型的には５×１０８、１×１０１０であり、そして場合により１×１０１１粒子である。ＤＮア−ゼ耐性粒子という意味では、用量は一般に１×１０６から１×１０１４粒子の間、さらに一般的には約１×１０８から１×１０１２粒子の間である。処理はしばしば必要に応じて２週間毎または３週間毎に反復することができるが、１８０日で一回の処理で十分かもしれない。
宿主細胞中の所望のＤＮＡ配列の存在を確かめるために、種々のアッセイを行うことができる。そのようなアッセイには、例えばサザンおよびノーザンブロッティング、ＲＴ−ＰＣＲおよびＰＣＲのような当業者に周知の「分子生物学的」アッセイ；ベクター中に存在する遺伝子から発現されたポリペプチドの存在を、例えば免疫学的手段（免疫沈降、イムノアフィニティーカラム、ＥＬＩＳＡｓおよびウエスタンブロット）または本発明の範囲内に入る特定の核酸分子の存在および／または発現を同定するのに有用な任意の他のアッセイにより検出することのような「生化学的」アッセイを含む。
導入されたＤＮＡセグメントから産生されたＲＮＡを検出しそして定量するために、ＲＴ−ＰＣＲを使用することができる。ＰＣＲのこの適用においては、最初に、逆転写酵素のような酵素を使用してＲＮＡをＤＮＡに逆転写し、次いで通常のＰＣＲ技術の使用によりＤＮＡを増幅させることが必要である。大抵の場合に、ＰＣＲ技術は有用ではあるが、ＲＮＡ産物の完全性を証明しない。ＲＮＡ産物の性質に関するさらなる情報はノーザンブロッティングにより得ることができる。この技術はＲＮＡ種の存在を証明しそしてそのＲＮＡの完全性に関する情報を与える。ＲＮＡ種の存在または不存在は、ドットもしくはスロットブロットノーザンハイブリダイゼーションを使用して決定することもできる。これらの技術はノーザンブロッティングの修正であり、そしてＲＮＡ種の存在もしくは不存在を証明するだけである。
問題のＤＮＡセグメントを検出すためのにサザーンブロッティングおよびＰＣＲを使用することができるが、それらはＤＮＡセグメントが発現されているかどうかに関する情報を与えない。発現は、導入されたＤＮＡ配列のポリペプチド産物を特異的に同定するか、または宿主細胞における導入されたＤＮＡセグメントの発現によりもたらされる表現型の変化を評価することにより評価することができる。
このように、遺伝的改変の有効性をいくつかの基準によりモニターすることができる。生検または外科的切除により取り出されたサンプルをｉｎ ｓｉｔｕ ハイブリダイゼーション、ベクター特異的プローブを使用するＰＣＲ増幅、ＲＮＡｓｅプロテクション、免疫組織学または免疫蛍光細胞計数により分析することができる。ベクターが気管支鏡により投与される場合には、肺機能試験を行うことができ、そして気管支洗浄は炎症性サイトカインの存在について評価することができる。処理された固体は臨床的特徴を監視されることもでき、そして細胞が治療性ポリヌクレオチドにより運ばれることを意図した機能を発現するかどうかを決定するために監視されることもできる。
インビボまたはエクスビボ治療を使用するかどうかの決定、および特定の組成物、用量および投与経路の選択は、限定するわけではないが処理される条件および個体の特徴を含む多数の異なる因子に依存するであろう。そのような特徴の評価および適当な治療方法の計画は、最終的には処方する医師の責任である。
前述の記載は、中でも、ヘルパーウイルス（例えば、アデノウイルス）および細胞タンパク質が実質的にない組み換えウイルスベクターの高力価調製物を生成する方法を提供する。本発明の精神から逸脱することなく、当業者はこれらの方法に変更を加えることができる考えられる。
ＩＶ．本発明の薬剤の投薬用量、製剤および投与経路
本発明にしたがい同定された薬剤の投与は、例えば、投与の目的が治療的であっても予防的であっても、受容者の生理学的状態、および習熟した医者には既知の他の因子に依存して連続的または断続的であってよい。本発明の薬剤の投与は、本質的に予め定めた期間にわたり連続的であってもよく、または一連の間隔を置いた用量でもよい。局所的および全身的投与の両方が考えられる。本発明の薬剤が予防目的に用いられる場合、本発明の薬剤は、好ましくは全身的投与により長引く使用に対して受け入れられる。
式（Ｉ）、（ＩＩ）、（ＩＩＩ）または（ＩＶ）の化合物（それらの塩を含む）を含む本発明の薬剤は、他の投薬用量が有益な効果を与えるかもしれないが、好ましくは、約０．０１μＭ〜約１ｍＭ、より好ましくは約０．１μＭ〜約４０μＭ、そしてより一層好ましくは約１μＭ〜４０μＭの投薬用量で投与される。例えば、ＬＬｎＬの好適な投薬用量は、約１μＭ〜４０μＭを含む。
以下に検討するように、場合によっては持続的放出のために製剤化されてもよい本発明の薬剤を含んでなる１または複数の適当な単位剤形は、経口的、あるいは直腸内、経皮、皮下、静脈内、筋肉内、腹腔内、胸内、肺内および鼻内経路を含む非経口経路を含む、種々の経路により投与することができる。例えば肝臓への投与では、静脈内投与が好適である。肺への投与では、気道投与が好適である。製剤は、適当であれば、分割した単位剤形で都合よく提示されることができ、そして製薬業界では周知の任意の方法により調製することができる。そのような方法は、液体担体、固形マトリックス、半固体担体、微細固形担体またはそれらの組み合わせ物と本薬剤を混合し、次いで必要ならばその生成物を所望の送達システムに導入または成型する段階を含んでもよい。
本発明の薬剤が経口投与用に調製される場合、それらは好ましくは、製薬学的製剤または単位投与剤形を形成するために、製薬学的に許容し得る担体、希釈剤または賦形剤と合わせられる。そのような製剤中の総有効成分は、製剤の０．１〜９９．９重量％を含んでなる。「製薬学的に許容し得る」ということは、担体、希釈剤、賦形剤および／または塩が製剤の他の成分と適合し、そしてその受容者に対して有害であってはならないことを意味する。経口投与のための有効成分は、粉末または粒子として；溶液、懸濁液または乳液として；あるいはチューインガムから有効成分を摂取することができる合成樹脂のような基剤中に存在してもよい。また有効成分は、丸剤、舐剤またはペースト剤として存在してもよい。
本発明の薬剤を含有する製薬学的製剤は、周知の、そして容易に入手できる成分を用いて当該技術分野における既知の手順により調製することができる。例えば薬剤は、通常の賦形剤、希釈剤または担体とともに製剤化され、そして錠剤、カプセル剤、懸濁液、粉末などを形成することができる。そのような製剤に適当である賦形剤、希釈剤および担体の例は、次の澱粉、糖類、マンニトールおよびケイ酸誘導体のような充填剤および増量剤；カルボキシメチルセルロース、ＨＰＭＣおよび他のセルロース誘導体、アルギン酸塩、ゼラチンおよびポリビニル−ピロリドンのような結合剤；グリセロールのような湿潤剤；炭酸カルシウムおよび重炭酸ナトリウムのような崩壊剤；パラフィンのような溶解を遅延させる薬剤；第４級アンモニウム化合物のような吸収促進剤；セチルアルコール、モノステアリン酸グリセロールのような界面活性剤；カオリンおよびベントナイトのような吸着性キャリヤー；およびタルク、ステアリン酸カルシウムおよびマグネシウムのような滑沢剤、および固形ポリエチルグリコールを含む。
例えば、本発明の薬剤を含有する錠剤またはキャプレットは、炭酸カルシウム、酸化マグネシウムおよび炭酸マグネシウムのような緩衝化剤を含むことができる。またキャプレットおよび錠剤は、セルロース、前糊化澱粉、二酸化ケイ素、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ステアリン酸マグネシウム、微結晶セルロース、澱粉、タルク、二酸化チタン、安息香酸、クエン酸、コーンスターチ、鉱油、ポリプロピレングリコール、リン酸ナトリウムおよびステアリン酸亜鉛等のような不活性成分を含むことができる。本発明の薬剤を含有する硬質または軟質ゼラチンカプセルは、ゼラチン、微結晶セルロース、ラウリル硫酸ナトリウム、澱粉、タルクおよび二酸化チタン等のような不活性成分、ならびにポリエチレングリコール（ＰＥＧ）および植物油のような液体媒質を含んでもよい。さらに、本発明の薬剤の腸溶性コートキャプレットまたは錠剤は、胃における崩壊に対して抵抗し、そして十二指腸のより中性ないしアルカリ性環境において溶解するように設計される。
また本発明の薬剤は、経口投与のために便利なエリキシルまたは溶液として、あるいは例えば筋肉内、皮下または静脈内経路による非経口投与に適当な溶液として製剤化することができる。
また本発明の薬剤の製薬学的製剤は、水性もしくは無水の溶液または懸濁液の形態か、あるいはまた乳液または懸濁液の形態をとることもできる。
このように治療薬は、非経口投与（例えば、注射、例えばボーラス注射または連続注入による）のために製剤化されてもよく、そしてアンプル、予め充填された注射器、少容量の注入容器中の単位剤形、または添加された保存剤を含有する多用量容器で提供され得る。有効成分は、油性または水性媒質中の懸濁液、溶液または乳液のような剤形をとってもよく、そして沈殿防止、安定化および／または分散剤のような製剤化剤を含有してもよい。あるいは有効成分は、使用前に、適当な賦形剤、例えば無菌の発熱物質を含まない水を用いて構成するために、無菌固形物の無菌分離によるか、または溶液からの凍結乾燥によって得られる粉末形態で存在してもよい。
これらの製剤は、従来技術において周知である製薬学的に許容され得る賦形剤および補助剤を含有することができる。例えば、水に加えて、溶媒、例えばアセトン、エタノール、イソプロピルアルコール、製品名「Ｄｏｗａｎｏｌ」として販売されている製品のようなグリコールエーテル、ポリグリコールおよびポリエチレングリコール、短鎖の酸のＣ１−Ｃ４アルキルエステル、好ましくは乳酸エチルまたはイソプロピル、製品名「Ｍｉｇｌｙｏｌ」として市販されている製品のような脂肪酸トリグリセリド、ミリスチン酸イソプロピル、動物油、鉱油および植物油およびポリシロキサンから選ばれる生理学的観点から許容され得る１または複数の有機溶媒溶媒を用いて溶液を製造することも可能である。
また本発明による組成物は、セルロースおよび／またはセルロース誘導体のような増粘剤を含有することもできる。またそれらは、キサンタンガム、グアまたはカルボガムまたはアラビヤゴムのようなガム類、またポリエチレングリコール、ベントンおよびモンモリロナイト等を含有してもよい。
必要ならば、抗酸化剤、表面活性剤、他の保存剤、膜形成剤、角質分解またはコメド分解剤、芳香剤および着色剤から選択される補助剤を添加することも可能である。また既述の症状でも他の症状のためであっても、他の有効成分を添加してよい。
例えば抗酸化剤の中では、ｔ−ブチルヒドロキノン、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエンおよびα−トコフェロールおよびその誘導体を挙げることができる。局所適用のために主に調整されたガレヌス剤形は、クリーム、ミルク、ゲル、懸濁液またはマイクロエマルション、多かれ少なかれ粘稠化されたローション、含浸パッド剤、軟膏またはスティックの形態、あるいはまたスプレーまたはフォームの状態のエーゾルの形態、あるいはまたケーキまたは石けんの形態をとる。
さらに薬剤は、徐放性剤形等として製剤化するためによく適合する。製剤はそれらができる限り一定期間にわたって、腸または気道の特定の部分においてのみ、または好ましく有効成分を放出するように構成することができる。コーティング剤、エンベロープ剤および保護マトリックス剤は、ポリアクチド−グリコレート、リポソーム、マイクロエマルション、マイクロ粒子、ナノ粒子またはワックスのような高分子物質から作成され得る。これらのコーティング剤、エンベロープ剤および保護マトリックス剤は、内在するデバイス、例えばステント、カテーテル、腹腔透析チューブ等をコーティングするために有用である。
本発明の薬剤は、経皮投与のためのパッチ剤を介して送達することができる。薬剤の経皮送達に適当なパッチ剤の例については、米国特許第５，５６０，９２２号明細書を参照にされたい。経皮送達のためのパッチ剤は、裏打ち層および１または複数の皮膚浸透促進剤とともに薬剤を中に分散または溶解したポリマーマトリックスを含んでなることができる。裏打ち層は、薬剤に対して非浸透性であるすべての適当な材料から作成できる。裏打ち層はマトリックス層の保護カバーとして役立ち、そしてまた支持機能をも提供する。裏打ち層は、それがポリマーマトリックスと本質的に同じ大きさの層であるように形成できるか、あるいはそれがポリマーマトリックスの縁を越えて広がるか、またはポリマーマトリックスの縁を覆うように、より大きい面積でもよく、次いで裏打ち層の広がりの表面は粘着手段のための基剤である様式で外側に広がってもよい。あるいはまたポリマーマトリックスは、ポリアクリレートまたはアクリレート／酢酸ビニルコポリマーのような粘着ポリマーを含有しても、またそれから形成されてもよい。長期間適用には、皮膚の水和または浸軟が最小化され得るので、微小多孔性および／または呼吸可能な裏打ち薄層を使用することが望ましいかもしれない。
裏打ち層を作成するために適当な材料の例は、高密度および低密度ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、塩化ポリビニル、ポリエステル、例えばポリ（エチレンフタレート）、金属ホイル、そのような適当なポリマーフィルムの金属ホイルラミネートなどのフィルムである。好ましくは裏打ち層に使用される材料は、アルミニウムホイルのような金属ホイルとポリマーフィルムとのラミネートである。そのようなラミネートでは、ラミネートのポリマーフィルムは通常、粘着ポリマーマトリックスに接している。
裏打ち層は、所望の保護と支持機能を提供できる任意の適当な厚さであることができる。適当な厚さは、約１０〜約２００ミクロンである。
一般に、生物学的に許容しうる粘着ポリマー層を形成するのに使用されるポリマーは、薬剤が制御された速度で通過できる成型した本体、薄い壁またはコーティングを形成することができるポリマーである。適当なポリマーは、生物学的および製薬学的に適合でき、非アレルギー性で、そしてデバイスが接触する体液または組織に不溶であり、それに適合している。可溶性ポリマーの使用は、皮膚の水分によるマトリックスの分解または侵食が薬剤の放出速度、および除去の都合でその場所に残る用量単位の機能に影響するので避けるべきである。
接着ポリマー層を組み立てる例示的材料には、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリウレタン、エチレン／プロピレンコポリマー、エチレン／エチルアクリレートコポリマー、エチレン／酢酸ビニルコポリマー、シリコンエラストマー、特に医療用のポリジメチルシロキサン、ネオプレンゴム、ポリイソブチレン、ポリアクリレート、塩素化ポリエチレン、塩化ポリビニル、塩化ビニル−酢酸ビニルコポリマー、架橋ポリメタクリレートポリマー、（ヒドロゲル）、塩化ポリビニリデン、ポリ（エチレンテレフタレート）、ブチルゴム、エピクロロヒドリンゴム、エチレンビニルアルコールコポリマー、エチレン−ビニルオキシエタノールコポリマー；シリコンコポリマー、例えばポリシロキサン−ポリカーボネートコポリマー、ポリシロキサンポリエチレンオキシドコポリマー、ポリシロキサン−ポリメタクリレートコポリマー、ポリシロキサン−アルキレンコポリマー（例えば、ポリシロキサン−エチレンコポリマー）、ポリシロキサン−アルキレンシランコポリマー（例えば、ポリシロキサン−エチレンシランコポリマー）等；セルロースポリマー、例えばメチルまたはエチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースおよびセルロースエステル；ポリカーボネート；ポリテトラフルオロエチレン；等々を含む。
好ましくは、生物学的に許容しうる粘着ポリマーマトリックスは、室温以下のガラス転移温度を有するポリマーから選ばれるべきである。ポリマーは、必ずしも必要ではないが、室温において結晶化度を有してもよい。架橋化モノマー単位または部位が、そのようなポリマー中に組み入れられてもよい。例えば、架橋化モノマーはポリアクリレートポリマー中に組み入れることができ、これがポリマー中への薬剤の分散後にマトリックスを架橋するための部位を提供する。ポリアクリレートポリマーのための既知の架橋化モノマーには、ポリオールのポリメタクリル酸エステル、例えばブチレンジアクリレートおよびジメタクリレート、トリメチロールプロパントリメタクリレート等を含む。そのような部位を提供する他のモノマーには、アリルアクリレート、アリルメタクリレート、マレイン酸ジアリル等を含む。
好ましくは、可塑剤および／または湿潤剤が粘着ポリマーマトリックス内に分散される。水溶性ポリオールは一般にこの目的のために適当である。製剤への湿潤剤の組み入れは、投薬単位に皮膚表面上の水分を吸収させ、これが次いで皮膚の刺激を減少させ、そして送達システムの粘着ポリマー層が無効になるのを防ぐのに役立つ。
経皮送達システムから放出された薬剤は、皮膚の各層に浸透できなければならない。薬剤の浸透速度を上昇させるためには、経皮薬物送達システムは、特に分子の浸透に対して最大の抵抗を提供する皮膚の最外層、角質層の浸透性を増加することが必要である。薬剤の経皮送達のためのパッチ剤の作製は当該技術分野においては周知である。
吸入による上部（鼻）または下部呼吸気道への投与には、本発明の薬剤は注入器、ネブライザーまたはエーロゾルスプレー剤を送達する圧縮パック剤または他の便利な手段から都合よく送達される。圧縮パック剤は、ジクロロジフルオロメタン、トリクロロフルオロメタン、ジクロロテトラフルオロエタン、二酸化炭素のような適当な噴射剤または他の適当な気体を含有できる。圧縮エーロゾルの場合、用量単位は、一定量を送達するためのバルブを備えることによって決定することができる。
あるいは吸入または注入による投与では、組成物は、乾燥粉末剤、例えば薬剤とラクトースまたは澱粉のような適当な粉末基剤の粉末混合物の形態をとってもよい。粉末組成物は、例えば、カプセル剤またはカートリッジ剤の単位剤形で、または粉末が吸入器、注入器または定量用量吸入器を用いて投与され得るゼラチンまたは気泡パック剤（ｂｌｉｓｔｅｒ ｐａｃｋｓ）で提供されてもよい。
鼻内投与では、薬剤は点鼻剤、液体スプレー剤、例えばプラスチック瓶噴霧器または定量用量吸入器を介して投与されてもよい。典型的な噴霧器はＭｉｓｔｏｍｅｔｅｒ（ウィントロップ：Ｗｉｎｔｒｏｐ）およびＭｅｄｉｈａｌｅｒ（リカー：Ｒｉｋｅｒ）である。
また本発明の薬剤の局所送達は、疾患部位またはその近くに薬剤を投与する種々の技術により実施できる。部位特異的または標的指向的局所送達技法の例は、限定するわけではなく、利用できる技術の具体例を示す。例には注入または内在カテーテルのような局所送達カテーテル、例えば針注入カテーテル、シャントおよびステントまたは他の移植可能なデバイス、部位特異的担体、直接注射、または直接適用を含む。
局所投与では、薬剤は標的領域への直接適用のために当該技術分野において既知であるように製剤化され得る。この目的のための従来の剤形には、創傷包帯、被覆用帯びまたは他のポリマー被覆、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゼリー、スプレーおよびエーロゾルを含む。軟膏およびクリームは、例えば適当な増粘剤および／またはゲル化剤の添加と共に水性または油性基剤を用いて製剤化することができる。ローションは水性または油性基剤を用いて製剤化されてもよく、そしてまた一般に１または複数の乳化剤、安定剤、分散化剤、沈殿防止剤、増粘剤または着色剤を含有する。また有効成分は、例えば、米国特許第４，１４０，１２２号；同第４，３８３，５２９号；または同第４，０５１，８４２号明細書に開示されているように、イオン導入法を介して送達することもできる。局所製剤中に存在する本発明の薬剤の重量パーセントは種々の因子に依存するが、一般に製剤の総重量の０．０１％〜９５％、そして多くは０．１〜２５重量％であろう。
また点眼剤または点鼻剤のような滴剤も、１種以上の分散剤、可溶化剤または沈殿防止剤を含んでなる水性または非水性基剤を用いて製剤化することができる。液体スプレーは、、圧縮パック剤から都合よく送達される。滴剤は、簡単な点眼用キャップ瓶を介するか、または液体内容物を滴下送達するために適合されたプラスチック瓶を介して、特別に成型された密閉容器を介して送達することができる。
さらに薬剤は、口または喉内の局所投与のために製剤化することができる。例えば有効成分は、着香した基剤、通常はシュクロースおよびアカシアまたはトラガカントをさらに含んでなるロゼンジ；ゼラチンおよびグリセリンまたはシュクロースおよびアカシアのような不活性基剤中に組成物を含んでなるパステル剤；および適当な液体担体ー中に本発明の組成物を含んでなるマウスウォッシュとして製剤化することができる。
また本明細書に記載する製剤および組成物は、抗微生物剤または保存剤のような他の成分を含有してもよい。さらにまた有効成分は、他の薬剤、例えば気管支拡張薬と組み合わせて使用してもよい。
本発明の薬剤は単独で、または製薬学的に許容しうる担体と組み合わせて、哺乳動物に投与することができる。上に記載したように、有効成分および担体の相対的割合は、化合物の溶解度と化学的性質、選択した投与経路および標準の製薬学的プラクティスによって決定される。
本薬剤の用量は、投与の形態、選択した特定の化合物および治療下の特定の患者の生理学的特徴とともに変動するであろう。一般に低用量が最初に使用され、そして必要ならば、その環境下での最適効果が達成されるまで少ない増分で増加される。
本発明は限定するわけではないが、以下の実施例によりさらに記載する。ＡＡＶ形質導入を高めるために、本発明の幾つかの薬剤の使用を具体的に説明する以下の実施例は、ＡＡＶ２およびＡＡＶ５血清型ならびにシュードタイプ化ＡＡＶ５／２ウイルスを使用した。しかし本発明の薬剤はすべての血清型およびシュードタイプ化ｒＡＡＶベクターに有用であると考える。
エンドソームのプロセッシングはＡＡＶの形質導入を限定する
側底側細胞膜は、より高いエンドサイトーシス速度を有し、そしてＵＶ照射はエンドソームの取り込みおよび頂端側細胞膜からｒＡＡＶの形質導入を高めるという知見に基づき、ウイルスの取り込みおよび核への輸送に影響を及ぼすエンドソーム経路は頂端側細胞膜から制限されているという可能性があり得る。対照的にこれらの経路は、気道上皮細胞の側底側細胞膜から最大レベルで活性となり得る。エンドソームのプロセッシングの重要性をさらに調査するために、エンドソームのプロセッシングを改変することが知られている幾つかの化学物質の効果（１つまたは複数）を評価した。
方法
最初の実験は、用量滴定および毒性が素早く評価できるので、集密的なヒトの初代繊維芽細胞で行った。選択した薬剤はｒＡＡＶの感染前に繊維芽細胞単層を処理するために使用した。ｒＡＡＶの形質導入は感染から９６時間後にＦＡＣＳ分析で評価し、そして死んだ細胞の割合はヨウ化プロピジウムの取り込みにより同時にアッセイした。
これらの薬剤にはノコダゾール（ｎｏｃｏｄａｚｏｌｅ）（シグマ（Ｓｉｇｍａ）、セントルイス、ミズーリ州；微小管を脱重合し、そしてリソソーム散乱を引き起こす）；硫酸ビンブラスチン（シグマ、セントルイス、ミズーリ州；微小管を脱重合し、細胞内エンドソームおよびリソソームの運動を遮断することによりエンドサイトーシスを阻害する）；サイトカラシンＢ（シグマ、セントルイス、ミズーリ州；微細繊維、すなわちアクチンを脱重合し、そしてエンドソームとリソソームとの融合を遮断する。細胞内のエンドソームおよびリソソームの運動を遮断することにより、エンドサイトーシスを阻害する）；ブレフェルジン（ｂｒｅｆｅｌｄｉｎ）Ａ（ＢＦＡ、シグマ、セントルイス、ミズーリ州；ＥＲからゴルジへのタンパク質輸送を可逆的に遮断する。またＢＦＡは側底側細胞膜ではなく頂端側細胞膜からのエンドサイトーシスを上昇させることも示された。Ｐｒｙｄｚ ｅｔ ａｌ．（１９９２）を参照にされたい）；ＮＨ４Ｃｌ（シグマ、セントルイス、ミズーリ州；エンドソームのｐＨを上げ、そしてイヌのパルボウイルスの脱殻を阻害することが示された向リソソーム性試薬。Ｂａｓａｋ ｅｔ ａｌ（１９９２）を参照にされたい）；クロロキン（シグマ、セントルイス、ミズーリ州；エンドソームのｐＨを上げ、そしてリソソームのシステインプロテアーゼであるカセプシンＢを阻害し、そしてイヌのパルボウイルスの脱殻を阻害することが示された向リソソーム性試薬。Ｂａｓａｋ ｅｔ ａｌ（１９９２）を参照にされたい）；ならびにトリペプチドのアルデヒドシステインプロテアーゼインヒビターであるＬＬｎＬ（Ｎ−アセチル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシナル−Ｌ−ノルロイシナル；カルビオケム−ノバビオケム（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ−Ｎｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ）社、ラジョラ、カリフォルニア州）、およびＺ−ＬＬＬ（Ｎ−カルボベンズオキシル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ノルバリナル；カルビオケム−ノバビオケム社、ラジョラ、カリフォルニア州）を含んだ。これらのトリペプチドはクロロキンと構造的に関連しているが、異なる脂質溶解性およびシステインプロテアーゼに対する特異性を有する（Ｓｅｇｌｅｎ，１９８３）。これらの分子は、ｐＨを変えることとは異なるメカニズムにより、分子のエンドソーム分解を減少する。またそれらは、２６Ｓユビキチンおよびプロテアソーム依存的タンパク質溶解経路を阻害することも示された（Ｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９４）。
結果
イヌのパルボウイルスについて以前に報告されたように（Ｂａｓａｋｅ ｅｔ ａｌ．１９９２）、エンドソームのｐＨを上げるＮＨ４Ｃｌおよびクロロキンの両方がｒＡＡＶの形質導入を有意に阻害した。これらの結果は、感染後のウイルスの放出および／または脱殻を促進することの重要性を支持する。さらに微細繊維の形成を破壊するサイトカラシンＢのような薬剤は、ｒＡＡＶの形質導入について有意な低下を導き、アクチン微細繊維がｒＡＡＶの形質導入に幾らかの役割を果たすらしいことを示唆した。さらに微小管の脱重合を促進し、そしてＭＤＣＫ細胞中のエンドサイトーシスを低下させるビンブラスチンは、ｒＡＡＶの形質導入にはほとんど効果が無かった。
しかし最も興味深いことには、ＥＲのゴルジ小胞輸送を破壊し、そしてまたＭＤＣＫ細胞で頂端側細胞膜エンドサイトーシスを上昇させることも示された（Ｐｒｙｄｚ ｅｔ ａｌ．（１９９２））ＢＦＡによる処理は、ｒＡＡＶの形質導入に有意な強化を導いた点である。ＥＲのゴルジ小胞輸送の重要性は不明であるが、ＵＶ照射も膜のエンドサイトーシスを強化し、そしてＢＦＡが同じ作用するという知見を考慮すれば、これらの知見は受容体に結合したｒＡＡＶの膜のエンドサイトーシスの速度が形質導入の律速段階となり得ることを示唆した。ＢＦＡと同様に、２つのエンドソームプロテアーゼインヒビター（トリペプチドであるＬＬｎＬおよびＺ−ＬＬＬ）の両方が、有意にｒＡＡＶの形質導入を上昇させた。これらのトリペプチドは以前にプラスミドＤＮＡのトランスフェクション効率を上げるために使用され、そしてＤＮＡのリソソーム分解を阻害すると考えられる（Ｃｏｏｎｒｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。
このデータは、エンドサイトーシスおよびエンドソームのプロセッシングがｒＡＡＶの形質導入において鍵となる律速段階であるという仮説を支持する。微小管ではなくアクチン微細繊維がｒＡＡＶの形質導入において重要であり、そして核へのｒＡＡＶ輸送を促進することにより作用することができるらしい。さらにサイトカラシンＢは、分極したＭＤＣＫ細胞のインフルエンザウイルスでの、側底側ではなく頂端側感染を効率的に遮断する（Ｇｏｔｔｌｉｅｂ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。これらの知見は、エンドサイトーシス小胞が分極した上皮細胞の２つの表面で形成されるプロセスにおいて基本的な差異が存在し、そしてアクチン繊維の完全性および／または重合が頂端面で必要となることを示す。しかしビンブラスチンのような微小管脱重合剤がｒＡＡＶ−２の形質導入を阻害しなかったという知見は、イヌのパルボウイルスのノコダゾール阻害に関する以前の報告とは異なる（Ｖｉｈｉｎｅｎ−Ｔａｎｔａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。最後に、トリペプチドプロテアーゼインヒビターを用いた実験は、ｒＡＡＶの形質導入における有意な増加を示した。そのような知見は、ウイルスのエンドソーム分解および／またはエンドソーム放出が、ｒＡＡＶの形質導入における重要な律速度段階となり得ることを示唆する。
分極した気道細胞において、エンドソームのプロセッシングインヒビターはｒＡＡＶの形質導入を増加させることができる
材料および方法
ヒトの気管支上皮の初代培養および使用した試薬
初代ヒト気道上皮細胞は、以前に記載されたように（Ｋｏｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９９１；Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６）、肺の移植片から気管支サンプルの酵素消化により集めた。単離した初代気道細胞を５×１０５細胞／ｃｍ２の密度でコラーゲンをコートしたＭｉｌｌｉｃｅｌｌ−ＨＡ培養挿入物上に播種した（ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）社、ベットフォード、マサチューセッツ州）。初代培養は空気−液体界面で２週間以上成長させ、この時間までに粘液繊毛性上皮への分化が起こる。細胞の側底側にのみ供給するために使用した培養基は、４９％のＤＭＥＭ、４９％のＨａｍ’ｓＦ１２および２％のＵｌｔｒａｓｅｒＧ（バイオセプラ（ＢｉｏＳｅｐｒａ）、セデックス、フランス）を含んだ。ジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）、カンプトテシン（Ｃａｍｐ）、エトポシド（Ｅｔｏｐ）、アフィジコリン（ａｐｈｉｄｉｃｏｌｉｎ）（Ａｐｈｉ）、ヒドロキシウレア（ＨＵ）およびゲニステイン（ｇｅｎｉｓｔｅｉｎ）（Ｇｅｎｉ）は、シグマ（セントルイス、ミズーリ州）から購入した。トリペプチドアルデヒドのプロテアソームインヒビターであるＮ−アセチル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ノルロイシン（ＬＬｎＬ）およびベンジルオキシカルボニル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシナル（Ｚ−ＬＬＬ）は、カルビオケム−ノバビオケム社（ラジョラ、カリフォルニア州）から購入した。ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）インヒビターは、バッケムバイオサイエンス（Ｂａｃｈｅｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社（キングオブプルシア、ペンシルバニア州）から得た。抗−ＡＡＶキャプシドモノクローナル抗体（Ａｎｔｉ−ＶＰ１、２および３）は、アメリカンリサーチプロダクツ（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ）（ベルモント、マサチューセッツ州）から購入し、そして抗−ユビキチン抗体は、サンタクルズバイオテクノロジー（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）社（サンタクルズ、カリフォルニア州）から購入した。
組換えＡＡＶウイルスストックの生産 組換えＡＡＶは、ＣａＰＯ４コートランスフェクションプロトコールにより生産し、そして上記実施例１に記載したように等密度セシウムクロライドの超遠心を３回行うことにより精製した。プロウイルスプラスミドｐＣｉｓＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉは、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）に記載されている。ＲＳＶプロモーターおよびＳＶ４０ポリアデニル化シグナルの転写制御下に、アルカリホスファターゼレポーター遺伝子をコードするプロウイルスプラスミドｐＣｉｓＡＶ．Ａｌｋｐｈｏｓを、ＡＶ．Ａｌｋｐｈｏｓを生成するために使用した（Ｙａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ＡＶ．ＬａｃＺ生産に使用したプロウイルスプラスミドｐＣｉｓＲＳＶ．ＬａｃＺは、最初に３４７４ｂｐのＮｏｔＩ消化β−ガラクトシダーゼ遺伝子（ｐＣＭＶβ由来、クロンテック）を、ｐＲｅｐ４（インビトロジェン）のＮｏｔＩ部位に挿入することにより生成した。全β−ガラクトシダーゼ発現カセット（ＲＳＶプロモーター、β−ガラクトシダーゼレポーター遺伝子およびＳＶ４０ポリＡシグナルを含む）は、ＳａｌＩにより切り取り、そして続いてｐＳｕｂ２０１骨格に平滑末端の連結によりクローン化した（Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８７）。組換えウイルスストックは５８□Ｃで６０分間加熱し、混入しているヘルパーアデノウイルスを不活化した。典型的な収量は、プラスミド標準に対するＤＮＡスロットブロットハイブリダイゼーションアッセイに基づき、５×１０５〜５×１０９粒子／μｌであった。増殖用に使用した組換えアデノウイルス（ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉ用のＡｄ．ＣＭＶＡｌｋｐｈｏｓ、およびＡＶ．Ａｌｋｐｈｏｓ用のＡｄ．ＣＭＶＬａｃＺ、ＡＶ．ＬａｃＺ用のＡｄ．ＣＭＶＧＦＰ）について、第２のレポーターアッセイ（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）に基づくアデノウイルス混入のレベルは、アデノウイルスの存在下で２９３細胞の感染に使用した１×１０１０ｒＡＡＶ粒子あたり１つの機能的粒子よりも少なかった。Ｒｅｐ／Ｃａｐコーディングプラスミドでのトランスフェクションは、Ｒｅｐタンパク質の抗体染色に関する対照として役立てた。ウイルスはインビトロまたはインビボ感染の前にＰＢＳ中で透析した。
分極した気道上皮細胞および初代ヒト繊維芽細胞の形質導入 完全に分化した気管支細胞のｒＡＡＶ感染は、Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）に記載されているように行った。気道細胞の頂端面からの感染について、５μｌのｒＡＡＶを５０μｌの培養基と混合し、そしてＭｉｌｌｉｃｅｌｌ挿入物の頂区画上に直接適用した（ＭＯＩ＝１０．０００粒子／細胞）。頂感染中、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌの側底側は培養基に連続して浸かっていた。基側底側への遺伝子導入は、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ挿入物を上下し、そしてウイルスベクターを５０μｌの容量で２時間、支持フィルター膜の底に適用することにより行った。続いて、Ｍｉｌｌｉｃｅｌｌ挿入物は、連続して存在する元のウイルス接種物にさらに４５０μｌの培地を加えて、直立位置に戻した。頂端側および側底側感染の両方について、ｒＡＡＶを含有する培地は２４時間後に回収し、そして新たな培養基（側底側に）と交換するか、または空気にさらす（頂端側に）いずれかとした。分極した気道細胞におけるＡＡＶの形質導入の効率に及ぼす種々の薬剤の効果を試験するために、気道上皮の感染前に１μｌの各溶液をＡＡＶと混合した。薬剤は通常、他に示さない限り２４時間のＡＡＶ感染期間中に与えられた。ヒドロキシウレア（リン酸緩衝化生理食塩水に溶解）、Ｈ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨ（０．９％の氷酢酸に溶解）、およびＨ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−ＯＨ（５０％メタノールに溶解）を除くほとんどの薬剤はＤＭＳＯに溶解した。薬剤の作業濃度は以下の通りであった：０．１μＭのカンプトテシン、１０μＭのエトポシド、５μｇ／ｍｌのアフィジコリン、４０ｍＭのヒドロキシウレア、５０μＭのゲニステイン、４０μＭのＬＬｎＬおよび４μＭのＺ−ＬＬＬ。ユビキチンリガーゼ（Ｅ３）インヒビター（Ｈ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨおよびＨ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−ＯＨ）を使用する場合、気道細胞は２ｍＭの最終濃度の両インヒビターを組み合わせて感染前に６０分間前処理し、続いて感染期間の全２４時間中、側底側面からインヒビター（０．２ｍＭ）の存在を持続させた。ＥＧＴＡ処理が関与する実験は、分極した気道上皮の頂端側細胞膜を水中３ｍＭのＥＧＴＡで１０分間、一時的に処理することにより行った（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。低張性のＥＧＴＡ処理後、カルチャーは培養基で２回洗浄し、そして４０μＭのＬＬｎＬの存在下または不存在下でｒＡＡＶで感染させた。ヒトの初代繊維芽細胞（Ｐ４）は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１％ペニシリンおよびストレプトマイシンおよび８９％ＤＭＥＭ中で維持した。ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉでの感染は、８０％コンフルエントな繊維芽細胞を用いて、１０００ＤＮＡ粒子／細胞のＭＯＩで２％ＦＢＳ ＤＭＥＭ中にて２４時間行った。
ｒＡＡＶのＳ ３５ 標識化 ｒＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉのキャプシドタンパク質中のメチオニン残基は、変更した以前に公開されたプロトコールに従い、放射性ウイルスストックの生成中に標識した（Ｍｉｚｕｋａｍｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。簡単に説明すると、サブコンフルエントな２９３細胞の２０枚の１５０ｍｍプレートを、Ａｄ．ＬａｃＺ（５ｐｆｕ／細胞）で１時間感染させ、続いてｐＣｉＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉ（２５０μｇ）およびｐＲｅｐＣａｐ（７５０μｇ）のリン酸カルシウムトランスフェクションを行った。細胞はさらに１０時間インキュベーションし、その時点で培地を２％ＦＢＳメチオニン−不含ーＤＭＥＭに４５〜６０分間変えた。培地はもう１度、４００ｍｌの２％ＦＢＳ メチオニン−不含ＤＭＥＭあたり１５ｍＣｉのＳ３５−メチオニンを含有する標識培地に変え（最終＝１．４９ＭＢｑ／ｍｌ）、そして細胞に３７℃で１５時間パルスをかけた。標識後、Ｌ−メチオニンを３０ｍｇ／Ｌの最終濃度に加え戻し、そして細胞をさらに３７℃で３０時間インキュベーションした。細胞溶解物を調製し、そしてウイルスを上記のように等密度セシウムクロライドによる超遠心で精製した。標識したウイルス調製物の典型的な比活性は、５×１０−６ｃｐｍ／粒子であり、これは他の研究者により報告された５．５×１０−７ｃｐｍ／粒子の比活性（Ｂａｒｔｌｅｔ ｅｔ ａｌ．，１９９９）よりもわずかに高い。
ウイルスの結合／侵入（ｅｎｔｒｙ）アッセイおよびウイルス粒子のｉｎ ｓｉｔｕ局在化 ｒＡＡＶの分極した気管支上皮細胞への結合を評価するために、Ｓ３５−標識ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉを頂端面または側底側面のいずれかに適用し（ＭＯＩ＝５０，０００粒子／細胞）、続いて４℃で６０分間インキュベーションした。分化した気道上皮へのｒＡＡＶの合わせた結合／侵入は、同じ条件下で測定したが、カルチャーは３７℃でさらに２〜２４時間インキュベーションした後、それらを回収した。これらの合わせたウイルス結合／侵入アッセイは、終点として導入遺伝子発現を用いたｒＡＡＶ形質導入の機能的実験について使用した条件と同一の感染条件下で行った。ＰＢＳ中で３回洗浄した後、細胞は５ｍｌの液体シンチレーションカクテルを室温で５分間加えることによりその場で溶解し、そして放射活性をシンチレーションカウンターで定量した。
分極したヒト気管支上皮細胞中のｒＡＡＶ粒子の細胞内の位置を分析するために、感染はＳ３５標識ウイルス（ＭＯＩ＝５０，０００粒子／細胞）を粘膜面または漿膜面のいずれかに適用することにより行った。感染から２時間後、トランスウェルを培地で３回洗浄し、そして４％パラホルムアルデヒドで一晩固定した後、凍結切開用に低温保護および包埋した。１０μｍの凍結切片をフォトエマルジョンに重層し、そして以前に公開されたプロトコールに従い５週間、現像した（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。
分極した気道上皮カルチャーの感染後のｒＡＡＶウイルスゲノムの分子分析 結合し、そしてエンドサイトーシスを受けたウイルスの分子状態は、ｒＡＡＶ感染後の異なる時期にアッセイした。細胞表面に結合したウイルスの量を調査するために、ｒＡＡＶ感染を４℃で１時間行った。結合後、ウイルスのインターナリゼーション（ｉｎｔｅｒｎａｌｉｚａｔｉｏｎ）の程度を、ウイルスの存在下で３７℃にて４〜２４時間連続してインキュベーションすることにより評価した。ウイルスのＤＮＡは、変更したＨｉｒｔプロトコールに従い抽出し、そしてＨｙｂｏｎｄ Ｎ＋ナイロン膜（アマシャム：Ａｍｅｒｓｈａｍ）を用いてサザンブロットを行った（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。ウイルスゲノムからの１．６ｋｂの１本鎖ウイルスＤＮＡ、２．７ｋｂの２本鎖環状中間体、および４．７ｋｂの二本鎖複製物を、５×１０６ｃｐｍ／ｍｌの導入遺伝子ＥＧＦＰ特異的プローブで検出した。ブロットは５５℃で２０分間、０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳのストリンジェンシーで２回洗浄した。ウイルスのインターナリゼーションを評価することを目的とする実験では、細胞表面に結合したウイルスを０．５％のトリプシンおよび５．３ｍＭのＥＤＴＡを含む１ｍｌのバッファーを用いて、３７℃で１０分間トリプシン処理することにより除去し（５００μｌのバッファーをＭｉｌｌｉｃｅｌｌ挿入物の頂端側区画および側底側区画に加えた）、続いて氷冷ＰＢＳで２回洗浄した。外側に結合したＡＡＶウイルスは、４℃で６０分間感染させた細胞から抽出されたＨｉｒｔ ＤＮＡ中の１．６ｋｂのウイルスゲノムバンドの強度により測定した。インターナリゼーションしたウイルスは、３７℃で４および２４時間感染させた後、トリプシン処理した細胞から抽出されたＨｉｒｔ ＤＮＡ中の１．６ｋｂのウイルスゲノムバンドの強度により測定した。インターナリゼーションしたウイルスの分子構造における動的な変化は、培養基からウイルスを除去した後、２、１０、３０および５０日にアッセイした。
免疫沈降によるユビキチン化ＡＡＶキャプシドタンパク質の検出 プロテアソームインヒビターがＡＡＶのユビキチン化に及ぼす効果を分析するために、ヒトの初代繊維芽細胞をウイルス感染から６時間後に１Ｘ ＲＩＰＡバッファーに溶解した。次いで細胞溶解物を３０μｌのＰｒｏｔｅｉｎＡ−Ａｇａｒｏｓｅで清澄化した。上清は１０μｌのモノクローナル抗−ＶＰ１、２および３抗体（クローンＢ１、ＡＲＰ）とインキュベーションし、続いて３０μｌのＰｒｏｔｅｉｎＡ−Ａｇａｒｏｓｅを加えた。ペレットはＩＸ ＲＩＰＡバッファーで４回洗浄し、そして１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。ニトロセルロースフィルターに移した後、ブロットは１：１０００希釈の抗−ユビキチンモノクローナル抗体（クローンＰ４Ｄ１、サンタクルズ、カタログ＃ｓｃ−８０１７）、続いて１：５００のＨＲＰ−結合２次抗体（ＢＭＢ）で釣り上げた。最終洗浄後、免疫活性はＥＣＬシステム（アマシャム）を使用して視覚化した。
マウスを対象としたインビボ実験 動物実験は、アイオワ大学の研究所のガイドラインにしたがって行った。マウスの肺において、ＡＡＶが媒介する遺伝子導入にプロテアソームインヒビターが及ぼす効果について測定するために、６週齢のＢＡＬＢ／ｃマウスにメトキシフルランチャンバーを使用して軽く麻酔をかけた。ＡＶ．ＬａｃＺ（５×１０１０粒子）を単独で、または４００μＭのＺ−ＬＬＬと共に、Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．（２０００）に記載されているような鼻吸引により１０μｌの点鼻で投与した。ＤＭＳＯ溶媒の不測の毒性を防ぐために、プロテアソームインヒビターＺ−ＬＬＬは４０ｍＭのストック溶液としてエタノールに溶解し、そして１％の最終濃度でウイルス接種物に含んだ。Ｚ−ＬＬＬの不存在下でのウイルス感染対照も、１％の最終濃度のエタノールを含んだ。初代培養したヒトの気道細胞および繊維芽細胞の両方における実験は、４０μＭのＬＬｎＬと４μＭのＺ−ＬＬＬとの間で類似の高められた効力を示し、そしてエタノール中でのＬＬｎＬの良くない溶解性から（実施例７は気管に投与するＤＭＳＯ中に低用量のＬＬｎＬを使用した）、Ｚ−ＬＬＬのみをこの特別なマウスの肺実験で試験した。動物は感染から２、１０および１５０日後に安楽死させ、そしてＰＢＳ（１０ｍｌ）を右心室に滴注し、続いて肺および心臓を完全なカセットとして摘出した。気管はインキュベーションし、そして１０ｃｍの水圧で以下の溶液にこの順序で滴注した：ＰＢＳ、０．５％グルタルアルデヒド、１ｍＭ ＭｇＣｌ２／ＰＢＳそして最後にＸ−ｇａｌ染色試薬と室温で一晩インキュベーションした。次いでＸ−ｇａｌで染色したマウスの肺を、１０％の中性緩衝化ホルマリンに４８時間、室温で後固定し、そして順次の１０％、２０％および３０％シュクロース／ＰＢＳ溶液中で低温保存した。肺（各条件についてＮ＝３）をＯＣＴ（最適切開温度：バクスター（Ｂａｘｔｅｒ）、ウァーレンダーレ、ペンシルバニア州）に包埋し、そして１５μｍの連続切片を気道上皮における陽性細胞の割合を算出することにより遺伝子導入について分析した。気道の直径は、形態計測分析後に結果を分類するために記録した（＞３６０μｍ、２６０−３５０μｍ、１６０−２５０μｍ、＜１５０μｍ）。１５０より多くの気道切片を、各実験条件について定量した。
結果
分極した気道上皮におけるｒＡＡＶゲノムの分子分析
最近の結果で、分化した気道上皮の頂端面にＡＡＶ−２受容体、ヘパリン硫酸プロテオグリカンおよび共受容体、ＦＧＦＲ−１およびαＶβ５インテグリンの欠如が明らかとなった（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｈｕｇｈｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３；Ｇｏｌｄｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。しかし頂端側細胞膜および側底側細胞膜での放射性ウイルスの結合における差異は、わずか４〜７倍であった（側底側＞頂端側）（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。結合におけるこれらの差異は、ｒＡＡＶ２を用いた感染の極性で観察された２００倍の変動を説明するには不十分である（側底側＞＞頂端側）（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。これらの知見は、ウイルスの結合および／または取り込みが気道上皮における非効率的な粘膜形質導入に寄与する唯一の限定要因ではないことを示唆した。このために、空気−液体界面培養したヒト気管支上皮の頂および側底側感染から５０日後に、ｒＡＡＶ ＤＮＡの分子状態を評価した。この時点で、ＥＧＦＰレポーターから測定された遺伝子発現は、側底側に感染したカルチャー中で２００倍より高かった（データは示さず）（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。カルチャーに由来するＨｉｒｔ ＤＮＡを、３２Ｐ−標識ＥＧＦＰプローブとサザンブロットハイブリダイゼーションにより評価した。頂端側に適用したｒＡＡＶの有意な量は、気道細胞を感染させることができた。しかし１本鎖ウイルスゲノム（ｓｓＤＮＡ）のみがこの時点（５０日）では検出された。この結果は、ｒＡＡＶが粘膜表面からエンドサイトーシスされることができ、そしてエンドサイトーシスを受けたウイルスｓｓＤＮＡは幾つかの未知の細胞内の区画に安定に封鎖されたことを明らかに示唆している。対照的に、側底側に適用されたｒＡＡＶの大部分は、１％の非変性アガロースゲルで２．８ｋｂおよび＞１２ｋｂに移動する二本鎖状態に転換された。以前の報告（Ｓａｎｌｉｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）と一致して、続くＨｉｒｔ ＤＮＡの制限酵素マッピングおよびサザンブロットでは、この２．８ｋｂバンドがスーパーコイル化された、環状のエピソーム分子（データは示さず）であることが確認された。側底側感染後に、有意により強くなる＞１２ｋｂのバンドの正体は現在、未知であるが、ＡＡＶゲノムのエピソームの環状コンカテマーを表すかもしれない。合わせて考えると、これらの結果は、ＡＡＶウイルスＤＮＡの環状ゲノムへの不十分な分子転換が、気道の頂端面からのｒＡＡＶ媒介型の遺伝子導入の有意な障害を示唆する。さらにセルフプライミングを介する直線複製ではない環状化が、分極した気道上皮におけるｒＡＡＶ遺伝子転換の主要な経路である。
プロテアソームモジュレーターは分極した気道上皮におけるｒＡＡＶ感染を劇的に高める ｒＡＡＶは気道における頂端側感染後に、幾つかの細胞区画（１つまたは複数）で潜伏しているらしく、そしてウイルスゲノムの分子転換を改変する薬剤が気道上皮におけるｒＡＡＶの形質導入を高めるかもしれないという事実を考慮して、これに関してＤＮＡ傷害剤（Ａｌｅｘａｎｄｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、ＤＮＡ合成およびトポイソメラーゼインヒビター（Ｒｕｓｓｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、および細胞性チロシンキナーゼインヒビター（Ｑｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９７；Ｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）を含む数種の薬剤を試験した。カンプトテシン、エトポシド、ヒドロキシウレアおよびゲニステインの適用は、側底側面からのｒＡＡＶの形質導入において１０〜６０倍の強化を生じた。しかし興味深いことには、これらの薬剤のいずれも頂端面からのｒＡＡＶの形質導入を促進しなかったことである（データは示さず）。他の細胞型においてｒＡＡＶの形質導入に関与する核内の出来事に影響を及ぼすことが分かっている化学物質は（Ｓａｎｌｉｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９）、気道のｒＡＡＶ頂感染を強化しなかったので、ユビキチン−プロテアソーム経路のようなエンドサイトーシスのプロセッシングに影響を及ぼす他の薬剤を試験した。プロテアソーム系はＨＩＶのようなウイルスを含め、多くの外因性および内因性分子の細胞内プロセッシングをモジュレートすることが知られている（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９８）。プロテアソーム経路の幾つかの特異的な、細胞透過性のペプチドアルデヒドインヒビターが最近見いだされた（Ｒｏｃｋ ｅｔ ａｌ．，１９９４：Ｆｅｎｔｅａｎｙ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。これらのインヒビターはプロテアソームコア内のタンパク質分解酵素の活性部位に結合し、そしてそれらの機能を可逆的に遮断する（Ｒｕｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。プロテアソームが感染後にｒＡＡＶを封鎖する細胞内区画を表すのかどうかを試験するために、トリペプチドのアルデヒドプロテアソームインヒビター（システインプロテアーゼインヒビター）であるＮ−アセチル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシナル−Ｌ−ノルロイシナル（ＬＬｎＬ、ＣａｌｐａｉｎインヒビターＩとも呼ぶ）を、ｒＡＡＶ感染の時点でヒト気管支上皮細胞の分極したカルチャーに適用した。驚くべきことには、４０μＭのＬＬｎＬをｒＡＡＶと一緒に漿膜面に適用した時に、導入遺伝子発現において感染から２日後に２００倍より高い増加が得られた。同様な結果が、別のユビキチン−プロテアソーム経路のインヒビターであるＮ−カルボベンズオキシル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシニル−Ｌ−ロイシナル（Ｚ−ＬＬＬ、ＭＧ１３２とも呼ばれる）（Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）を試験した時も達成された（データは示さず）。しかし最も重要な知見は、これらのプロテアソームインヒビターは、粘膜面からのｒＡＡＶの形質導入も実質的に増加させた点であった（以下を参照にされたい）。他の薬剤と比較した時、プロテアソームインヒビターが気道上皮におけるｒＡＡＶ形質導入の最も強力なエンハンサーとなることが分かった。
プロテアソームモジュレーターは分極した様式の気道上皮におけるｒＡＡＶ形質導入を増加させる プロテアソームモジュレーターは漿膜面からのｒＡＡＶの形質導入の効力を有意に増加するようであるが、気道における遺伝子送達の臨床的応用に最も適切な経路は粘膜面である。プロテアソームインヒビターが頂端側細胞膜からのｒＡＡＶの形質導入に及ぼす効果を試験するために、ＬＬｎＬを用いて処理した後に気道上皮の粘膜および漿膜面の両方から、ｒＡＡＶの形質導入の並んだ動力学的比較を行った。ＬＬｎＬおよびｒＡＡＶの粘膜面への同時投与は、ＡＡＶの形質導入に持続的な上昇をもたらしたが、このピークは感染後２２日であった。粘膜感染とは対照的に、ＬＬｎＬの存在下で漿膜面からのｒＡＡＶ感染は、感染から７２時間後の遺伝子発現に一時的なピークを生じただけであり、これは２２日までに未処理サンプルのレベルに等しいレベルにまで戻った。これらの結果は、プロテアソームインヒビターであるＬＬｎＬは、ＡＶＶウイルスが頂端側細胞膜または側底側細胞膜のいずれかに適用された時、異なる増加プロファイルを生じることを示唆した。気道上皮によるＬＬｎＬの分極した取り込みにより引き起こされる潜在的効果を排除するために、頂端面および側底側面の両方からのｒＡＡＶおよびＬＬｎＬ投与の異なる組み合わせを試験した。感染中、ＬＬｎＬがｒＡＡＶと同じか、または反対面から適用されるかどうかに拘わらず、ＡＡＶの形質導入について類似の増加パターンが達成された（データは示さず）。
ＬＬｎＬ投与が特定の気道細胞型のｒＡＡＶ形質導入を上昇させたかどうかを測定するために、アルカリホスファターゼ遺伝子（Ａｌｋｐｈｏｓ）をコードするｒＡＡＶベクターを利用した。形質導入された細胞は、この問題に取り組むためにＡｌｋｐｈｏｓに関する標準的な組織化学的染色により評価した。ＬＬｎＬの不存在下では、ウイルスの漿膜適用から３日後にｒＡＡＶは基底細胞に優先的に形質導入した。ＡＶ．ＧＦＰ３ｏｒｉウイルスを使用した以前の知見と一致して、ＬＬｎＬの同時投与はＡＶ．Ａｌｋｐｈｏｓの形質導入に劇的な上昇をもたらした。興味深いことには、繊毛のある（ｃｉｌｉａｔｅｄ）細胞の形質導入が、ｒＡＡＶ感染の時点でＬＬｎＬを用いた処置により最も有意に上昇した。対照的に、基底細胞はＬＬｎＬ処理には最も反応が少なかった。これらの知見は、ＬＬｎＬ作用のメカニズムが幾らか細胞特異的成分を有することができ、これは分極（すなわち繊毛を持つ）と非分極（すなわち基底）細胞型で異なることを示した。
ＬＬｎＬ強化型ｒＡＡＶ形質導入の至適化 ＬＬｎＬの存在下で達成されるｒＡＡＶ形質導入における強化をさらに改善する目的で、ｒＡＡＶ感染後のＬＬｎＬ投与の時期および数を変えた幾つかの詳細な動力学的実験を行った。これらの実験から幾つかの重要な結論が生じた。最初に、３０日の終わりまでには、レベルが感染時に１回処理したカルチャーのレベルに類似するという事実にもかかわらず、側底側感染後、３日に１回のＬＬｎＬ投与がピーク導入遺伝子発現の長さを増した。第２に、ＬＬｎＬの連続的投与は細胞に毒性であり、そして１０日までに導入遺伝子の発現を除去した。第３に、ＬＬｎＬの存在下で７、１０および１５日にｒＡＡＶで再感染したカルチャーは、類似の増加パターンをもたらし、そして予想通り、上昇した最終レベルの導入遺伝子発現が３０日に観察された（１５日の２度目の感染からのデータのみを示す）。しかし最も注目すべきは、側底側から感染させたすべてのカルチャーは、ＬＬｎＬが投与されるかどうかに拘わらず、互いに２〜３倍以内で類似する長期の導入遺伝子発現レベルを生産した。
ウイルス感染時のＬＬｎＬ投与が、頂端面および側底側面の両方からのｒＡＡＶ形質導入を増加させた事実にもかかわらず、この導入の動力学は有意に異なった。側底側感染後の強化は一時的であるが、頂感染後の強化は長期であった。さらに頂端側細胞膜からのＬＬｎＬを用いた導入は長期に持続したが、３０日までに導入遺伝子発現の最大レベルは基底感染から生じるレベルのわずか１／８であった。低張性ＥＧＴＡ溶液の適用は、頂端面からのＡＡＶ形質導入を７〜１０倍まで増加させることが示された（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０００）。したがって、ＥＧＴＡとＬＬｎＬとを組み合わせた投与は、頂端面からのｒＡＡＶ形質導入においてさらに一層の増加を提供できた。興味深いことには、ＬＬｎＬの存在下でのｒＡＡＶでの感染前にＥＧＴＡで気道カルチャーを処理すると、最初の３日内で形質導入に一時的なピーク、および有意に上昇した（２００倍）、３０日以降の長期レベルの導入遺伝子発現を与えた。この導入遺伝子発現の長期レベルは、基底面からのｒＡＡＶ感染に匹敵したが、ＥＧＴＡ単独で処理した頂端側から感染した上皮で観察されるレベルよりはるかに上であった。まとめると、これらの結果はＥＧＴＡおよびＬＬｎＬがｒＡＡＶの形質導入に相乗的効果を有し、通常は側底側感染後にのみ見られるレベルに頂端面からの形質導入を可能とすることを示す。
ＬＬＮＬ処理により影響を受けないウイルス結合およびインターナリゼーション
ＬＬｎＬの作用は典型的には、プロテアソーム系のその選択的および可逆的阻害に起因した。しかしウイルス結合および／またはエンドサイトーシスに及ぼす効果の可能性を排除することが重要であった。１型単純ヘルペスウイルスで見られるように（Ｅｖｅｒｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、ＬＬｎＬ処理は４℃でｒＡＡＶ結合に有意な効果が無かった。同様に、３７℃で２時間の感染期間に、Ｓ３５標識ｒＡＡＶの取り込みはＬＬｎＬ処理で変わらなかった。これらの結果を考慮すると、ＬＬｎＬはウイルス結合および侵入に対して遠い点で作用する。興味深いことには、感染後２４時間で、どの表面が感染したかにかかわらずＬＬｎＬで処理した上皮で細胞内放射活性の量に大変有意な減少が観察された。この時点で導入遺伝子発現における一致した増加を考慮すると、ＬＬｎＬはウイルスの核へのプロセッシングおよびルーティング（ｒｏｕｔｉｎｇ）を加速することができ、ここでＳ３５標識キャプシドタンパク質の脱殻およびクリアランスが起こる。このメカニズムにより、Ｓ３５同位体は培養基に希釈され、そして細胞に会合したカウントの減少を説明することができた。
ＬＬｎＬはｒＡＡＶのエンドソームプロセッシングおよび核トラフィッキングを高める ＬＬｎＬがｒＡＡＶの核へのトラフィッキングを上げるという仮説を試験するために、頂端面および側底側面のからの感染後に、Ｓ３５標識ｒＡＡＶ粒子のｉｎ ｓｉｔｕ局在化を、ＬＬｎＬの存在下および不存在下で行った。完全な放射性標識キャプシドタンパク質の損失は感染後２４時間で起こるので、この分析には２時間の時点を選択した。フォトエマルジョンの重層を使用して、Ｓ３５標識ｒＡＡＶ粒子の細胞内の分布を、盲検の形態計測分析により評価した。ウイルス粒子の大部分は、ＬＬｎＬの不存在下で細胞質に局在した。これは感染が頂端面または側底側面から起こるかにかかわらずそうであった。対照的にＬＬｎＬ処理は放射性標識したｒＡＡＶ粒子の細胞内分析を実質的に変え、核に会合した顆粒への有意なシフトを生じた。これらの結果は、感染後２４時間の全細胞カウントからの知見を実証し、これはＬＬｎＬがウイルスの脱殻を増し、そして続いてＳ３５同位体の培地への損失を示唆した。
ＬＬｎＬは感染後、特別な時間枠内でｒＡＡＶの形質導入を増す これまでの証拠は、ＬＬｎＬがｒＡＡＶの核への細胞内ルーティングを上昇させるように作用することができることを示した。さらに、ＬＬｎＬ作用はそれが投与される上皮面には依存してない（すなわちＬＬｎＬの漿膜適用は、粘膜感染を増加させ、そしてその逆も起こる）。これはＬＬｎＬが形質導入を高めるためにＡＡＶ粒子とエンドサイトーシスされる必要がないことを示す。すなわちＬＬｎＬは、エンドソームのプロセッシング中ではなく、ｒＡＡＶのエンドサイトーシス後の特別な時期に作用することができる。この仮説の機能的支持を提供するために、側底側面からの感染後、種々の時期にＬＬｎＬ作用の動力学的分析を行った。これらの実験では、ＬＬｎＬをＡＡＶ感染時、または感染後の種々の時期に培養基に加えた。ウイルスが媒介する導入遺伝子発現は、感染後２４時間の間隔で定量した。増加はＬＬｎＬがウイルス感染後の０、２４、４８および７２に投与されたかどうかとは無関係に達成された。しかし２４または４８時間でのＬＬｎＬの添加が、最強レベルの増加を達成した。ＡＡＶ発現を下げるＬＬｎＬの能力は、感染から７２時間後までに下がるようであり、そして最初のＡＡＶ感染から１５日後までに完全に失われた（データは示さず）。合わせると、ｒＡＡＶが細胞に入った後、これはプロテアソームインヒビターが促進する遊離に対して感受性の細胞内区画に標的化されるらしい。さらに感染から１５日後のＬＬｎＬ増大効果の損失は、導入遺伝子産物の強化された転写、翻訳および／または安定性が、この観察の原因となるメカニズムには寄与しないらしいことを示唆している。
ＬＬｎＬおよびＥＧＴＡの併用処理は、インターナライズしたｒＡＡＶの分解を防止する ＬＬｎＬによるｒＡＡＶの形質導入の増加の原因となる分子メカニズム（１つまたは複数）をさらに明確にするために、感染細胞中のｒＡＡＶゲノムをサザンブロティング Ｈｉｒｔ ＤＮＡにより分析した。Ｓ３５標識ウイルスを使用した実験と一致して、分極した気道上皮のいずれかの面に結合するｒＡＡＶは、ＬＬｎＬ処理に影響を受けなかった。またサザンブロティングは、基底面からの２〜７倍高いウイルス結合を示し、これは異なる組織サンプル間で変動した（データは示さず）。ウイルスのインターナリゼーションの程度は、表面に結合したウイルスをトリプシンで剥がした後に比較した。以前の結果を確認するように、有意な量のｒＡＡＶが感染期間中に頂端面からエンドサイトーシスされたが、ウイルスの取り込みは側底側面のほうが活性であった。ＬＬｎＬ単独ではインターナライズしたＡＡＶウイルスＤＮＡの酵素的分解を実質的に防止せず、核への強化されたウイルストラフィッキングが、ＬＬｎＬによる観察された増加において、より重要かもしれないことを示していた。しかし低張性ＥＧＴＡおよびＬＬｎＬの両方を用いた処理は、頂端面からのウイルスのインターナリゼーションの量を実質的に増加させた。低張性のＥＧＴＡ処理単独では、頂感染後のＡＡＶ ＤＮＡの存続またはＡＡＶ−媒介型遺伝子発現をわずかに上昇させるだけなので（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，２０００）、ＥＧＴＡとＬＬｎＬを合わせた効果の原因となる主なメカニズムは、インターナライズされたウイルスの分解の減少、およびエンドサイトーシスの上昇した速度によるかもしれない。これらＥＧＴＡとＬＬｎＬの相乗効果は、頂端側細胞膜からのｒＡＡＶの形質導入を２００倍より上げた。加えて一本鎖ウイルスゲノムの線状複製または環状形への変換は、それぞれアデノウイルス初期遺伝子産物またはＵＶ照射による強化されたＡＡＶの形質導入と関連した（Ｆｉｓｈｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｓａｎｌｉｏｇｌｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。ＬＬｎＬがＡＡＶの形質導入を強化したことを示したＡｄ．ｄ１８０２およびｒＡＡＶが共感染したカルチャーに由来するＨｉｒｔ ＤＮＡのサザンブロットは、Ａｄ．ｄ１８０２の共感染により生産されたアデノウイルスＥ４ｏｒｆ６タンパク質の存在下で見られるような線状複製物の中間体（４．７ｋｂ）の形成を介して明らかに媒介されなかった。
気道におけるｒＡＡＶ感染後のウイルスキャプシドタンパク質のユビキチン化は、形質導入の効率を改変する ユビキチン化された分子のプロテアソーム依存的分解は、内在性および外来タンパク質の両方の処理に関する主要な経路を表す（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。この経路の調節における幾つかの異なる段階が同定され、それらには：ユビキチンの活性化酵素によるユビキチンの活性化（Ｅ１）、活性化ユビキチンのユビキチンキャリアータンパク質への輸送（Ｅ２）、およびその後のユビキチンリガーゼによる活性化ユビキチンのタンパク質基質への送達（Ｅ３）を含む。最終的にはユビキチン化されたタンパク質は、ＡＴＰ依存的プロセスを介して２６Ｓプロテアソームにより分解される。プロテアソームインヒビターによるｒＡＡＶの形質導入の強化に、エンドソーム区画からのユビキチン化ウイルスの遊離が関与するかどうかを試験するために、感染後、ＡＡＶキャプシドタンパク質上のユビキチン側鎖の程度を調査し、ならびにプロテアソームインヒビターがユビキチン化の程度を変えるかどうかを調査した。ＡＡＶキャプシドタンパク質は、ｒＡＡＶが感染したヒトの分極した気道細胞およびウイルス感染から６時間後のコンフルエントなヒト繊維芽細胞に由来する抗−ＶＰ１、２、３抗体を使用して免疫沈降させた。続いて抗−ユビキチン特異的抗体を用いたウエスタン分析では、プロテアソーム処理後の繊維芽細胞のユビキチン化ＡＡＶキャプシドの細胞レベルに有意な上昇が示された。ユビキチン化は、キャプシドタンパク質の分子量（６３ｋｄ、７３ｋｄおよび８７ｋｄ）を２２０〜２５０ｋｄに有意に上昇させ、そして他の分子のユビキチン化後のサイズの変化と一致している（Ｂｒｅｇｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６）。不幸にも、空気−液体培養したヒトの気道細胞から回収可能な限定された量のウイルスが、この系でユビキチン化キャプシドを検出する能力を排除した（データは示さず）。これにもかかわらず、コンフルエントな初代繊維芽細胞も、プロテアソームインヒビターでの処理後に導入遺伝子発現の増加（１０倍）を示した。このようにプロテアソームインヒビターは、プロテアソームへのユビキチン化ＡＡＶの標的化および／または分解を下げることによりｒＡＡＶの形質導入を上昇させる。そのようなプロテアソームインヒビターの正味の結果は、ユビキチン化ウイルスキャプシドの量を上昇させると期待される。
分極した気道モデルにおける技術的限界から、ユビキチン化ウイルスキャプシドの直接的検出は妨げられたので、ユビキチンプロテアソーム経路における他の段階のモジュレーションも、プロテアソームインヒビターＬＬｎＬおよびＺ−ＬＬＬで見られたようなものと同様にｒＡＡＶの形質導入を上昇させることができるのかどうかを測定した。Ｈ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＯＨおよびＨ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−ＯＨのような数種のジペプチドは、ユビキチンリガーゼＥ３を阻害することが知られている（Ｏｂｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）、これらのユビキチンリガーゼインヒビターの適用は、ヒトの気道細胞の側底側面からのｒＡＡＶ形質導入を実際に強化した。合わせると繊維芽細胞および分極した気道上皮の両方におけるデータは、ＡＡＶキャプシドがエンドサイトーシス後にユビキチン化され、そしてこのプロセスがｒＡＡＶ形質導入の障壁であることを示唆する。トリペプチドのプロテアソームインヒビターによるｒＡＡＶ形質導入の増加の原因となる最も信頼できそうなメカニズムには、ユビキチン化ウイルスの分解および／またはプロテアソームへの標的化の防止が関与する。
インビボでのプロテアソームインヒビターによるｒＡＡＶ形質導入の長期強化 インビボの遺伝子治療用のプロテアソームインヒビターの潜在的用途を評価するために、マウス肺におけるインビボｒＡＡＶ媒介型遺伝子導入に関してこれら薬剤の毒性および効力の両方を試験した。マウスにおけるこれらのプロテアソームインヒビターの毒性を評価するために、分極した気道細胞における遺伝子導入を誘導するために使用したものより１０、１００および１０００倍高い有効用量のＬＬｎＬまたはＺ−ＬＬＬを、気管内および全身（ＩＶ）送達の両方を使用して投与した。肺および肝臓の組織学的評価により、または動物の死により証明される毒性は示されなかった。これらのプロテアソームインヒビターがインビボでｒＡＡＶの形質導入を改善できるのかどうかを調査するために、ＡＶ．ＬａｃＺ（５×１０１０粒子）を単独で、または４００μＭのＺ−ＬＬＬの存在下で、鼻内投与により送達した。マウスの肺は、感染後３、１０および１５０日に回収して、短期および長期効果を評価した。基底面からのプロテアソームインヒビターの処理、またはＥＧＴＡと合わせた頂端面からの処理は、ｒＡＡＶの形質導入に顕著な即時の強化をもたらしたが、感染から３および１０日後の肺組織のＸ−ｇａｌ染色は、プロテアソームインヒビターで処理した群、または未処理群のいずれにも検出可能な導入遺伝子の発現を示さなかった。対照的に、Ｚ−ＬＬＬ処理サンプルでは１５０日で有意な形質導入が達成された。標的化した導入遺伝子発現は、実質よりも誘導気道で主に確認された。肺胞細胞はほとんど形質導入されなかった。平均でわずか約５．８８％の気道細胞がＡＶ．ＬａｃＺにより形質導入され、そしてＬａｃＺ陽性細胞は誘導気道全体で観察され、特徴的な形質導入プロファイルが明らかであった。より大きな細気管支（＞３５０ｍｍ）における形質導入効率は、気道上皮の１０．３６±１．６３％の平均に達し、一方、より小さい細気管支（＜１５０ｍｍ）における気道細胞の１．３７±０．４１％がβ−ガラクトシダーゼ導入遺伝子を発現した。遠位および近位気道における導入遺伝子発現の範囲は、それぞれ０〜４％および５〜１８％であった。より大きな気道でより高く、そしてより一貫した形質導入を示すこの形質導入プロファイルは、より小さい気道を包含する肺の領域へのウイルスの、より不均一な送達を反映しているらしい。ＡＶ．ＬａｃＺ単独により感染した肺に由来する低温−切片の調査では、全部で３１５個の気道切片中にわずか２個のｌａｃＺ陽性細胞が明らかとなった（ｎ＝３動物）。
考察
気道の頂端面からの非効率的な遺伝子導入は、組換えアデノウイルス（Ｗａｌｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｐｉｃｋｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、アデノ随伴ウイルス（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、レトロウイルス（Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８）および非ウイルス性リポソームベクター（Ｃｈｕ ｅｔ ａｌ．，１９９９）を利用した嚢胞性繊維症のための多数の遺伝子治療の取り組みにおいて主要な障害となってきた。一般に、気道上皮の頂端側細胞膜を介する非効率的なウイルス媒介型の遺伝子送達は、主にこの表面上に受容体または共受容体（ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を欠くことによると考えられてきた。
分極した気道上皮におけるｒＡＡＶ感染の分子分析は、幾つかの独自な知見を明らかにした。第１に、以前に報告した気道上皮の頂端側細胞膜で既知のＡＡＶ−２受容体および共受容体の欠損（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９９）が、ＡＡＶ感染を排除しないという決定的証拠がある。側底側面からの形質導入（導入遺伝子発現により測定する時）は、頂端側細胞膜からよりも２００倍以上効率的であるが、Ｓ３５標識ウイルスまたはサザブロッティングのいずれかを用いたウイルスのエンドサイトーシスの定量的および半定量的分析は、頂端面からのウイルスの取り込みが側底側細胞膜からの取り込みよりもわずか２〜７倍低い効率であることを示した。したがって、以前には同定されていない別の受容体／共受容体および／または受容体依存的メカニズム（１つまたは複数）が、気道の粘膜面からのＡＡＶの取り込みに関与しているのかもしれないと予想することは合理的である。
極性が多くのタンパク質のエンドソームプロセッシングに重要な影響を及ぼすことは広く知られており、そして異なる選別メカニズムが頂区画および側底側区画について記載されてきた（Ｏｄｏｒｉｚｚｉ ｅｔ ａｌ．，１９９６；Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｂｏｕｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３）。側底側および頂感染後のウイルスの取り込みの効率と導入遺伝子発現との間の直接的関係の欠如は、ｒＡＡＶ媒介型の遺伝子導入にはさらなるエンドサイトーシス後の障壁が存在することを示唆している。感染経路後の側底側 対 頂端側のＡＡＶの核トラフィッキングの程度における差異は、基底および頂細胞区画がＡＡＶの形質導入の極性に影響を及ぼす可能性がある異なる生物的特性を有することを示唆する。ｒＡＡＶの形質導入に対するエンドソームプロセッシングの障壁は、分極した上皮細胞に限定されない可能性がある。この考えを支持するように、核へのウイルス粒子の弱った細胞内トラフィッキングがＮＩＨ３Ｔ３細胞で観察された。さらにｒＡＡＶは、ＵＶ照射により機能的に活性な状態に救助されるまで、コンフルエントな初代繊維芽細胞中で７日間も不活性な状態に留まることができる。すなわち感染に対するエンドサイトーシス後の障壁が多くの細胞型に存在する。
気道では、粘膜表面からのｒＡＡＶの形質導入の主な律速段階には、インターナライズされたウイルスの非効率的なエンドソームプロセッシングが関与すると思われる。プロテアソームを介する調節された細胞内のタンパク質溶解は、多くの生理学的および病理学的条件下で重要な役割を果たす（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｋａｔｏ，１９９９）。最近、多くの特異的プロテアソームインヒビターの同定が、新規な治療的取り組みとしてこの細胞性酵素系における薬理学的介入のための基礎を与えた。例えば数種の細胞透過性の合成トリペプチドアルデヒド（この実験で使用するＬＬｎＬおよびＺ−ＬＬＬのような）は、有望なガン治療薬または抗炎症剤となることが示された（Ｇｏｌｄｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．，１９９５；Ｋｌｏｅｔｚｅｌ，１９９８；Ｗｏｊｃｉｋ，１９９９）。さらにプロテアソームはＨＩＶ感染において抗ウイルス機能を有することが示唆され（Ｓｃｈｗａｒｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９９８）、プロテアソーム機能の阻害が組換えウイルスを用いた形質導入の促進に有益となり得ることを意味する。気道におけるｒＡＡＶの頂感染は、侵入後の出来事により有意に制限されるという分子的証拠に基づき、ユビキチン／プロテアソーム経路はこの遮断の手段になると思われる。プロテアソームは通常、内因性および外来タンパク質のクリアランスに関する区画として知られている。しかし最近の実験は、プロテアソーム系がエンドサイトーシスの制御にも関与することを示唆した（Ｂｏｎｉｆａｃｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｓｔｒｏｕｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。遺伝子送達の観点から、プロテアソームインヒビターはトランスフェクトされたプラスミドＤＮＡを分解から保護することが示された（Ｃｏｏｎｒｏｄ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。本明細書に記載する結果は、気道上皮へのｒＡＡＶ媒介型の遺伝子導入も、プロテアソームインヒビターにより有意に強化されることを明らかに証明する。さらにこの強化は、プロテアソームインヒビターが刺激する核へのウイルスのトラフィッキングと相関する。プロテアソームインヒビターは頂端面からＡＡＶの形質導入の長期レベルを上昇させたが、それらの側底側感染に及ぼす効果は、長期間のレベルというよりも主に形質導入の速度を変えるようである。これらの差異は、頂端面および側底側面からｒＡＡＶの形質導入に関与する基本的に異なる経路を強調する。
また幾つかの知見は、エンドサイトーシス後のウイルスのユビキチン化が、入って来るＡＶＶを選別する重要なメカニズムとなり得るという概念も支持する。第１に、タンパク質のユビキチン依存的分解を遮断することが知られているプロテアソームインヒビターを用いた気道上皮の処置は、ｒＡＡＶ遺伝子導入を高める。第２に、気道上皮におけるユビキチンＥ３リガーゼ活性の阻害も形質導入を高める。最後にｒＡＡＶキャプシドタンパク質はコンフルエントなヒト繊維芽細胞中での感染後にユビキチン化され、そしてこのユビキチン化の程度は、ユビキチン−プロテアソーム分解経路の阻害により上昇する。
適用した観点から、この実験で最も重要な知見の１つは、マウスの肺におけるプロテアソームインヒビターにより誘導される持続的な高レベルのｒＡＡＶ形質導入である。Ｚ−ＬＬＬとｒＡＡＶの同時投与は、感染から１５０日後に近位気管支上皮細胞に検出不能レベルから１０．３６＋／−１．６３％へ導入遺伝子の発現を増加させた。このレベルの遺伝子発現は、ＣＦＴＲ欠損の治療的相関に十分となると思われる（Ｃｒｙｓｔａｌ，１９９９）。臨床的応用に関してこの方法の可能性は、マウスへのプロテアソームインヒビターの投与後に、検出可能な局所的または全身的毒性が無いことからもさらに支持される。さらに他の臓器、例えば心臓の骨格筋および肝臓における予備実験は、ｒＡＡＶ２のユビキチン化が臓器特異的様式で起こり得ることを示唆した。骨格筋および心筋におけるプロテアソームインヒビターの適用は、短期または長期のｒＡＡＶ媒介型遺伝子導入のいずれにも効果がなかった。しかし肝臓へのＺ−ＬＬＬの適用は（実施例７を参照にされたい）、感染から１カ月後にｒＡＡＶ形質導入に７倍の上昇を導いた。これらを知見は、トリペプチドのプロテアソームインヒビターが、ウイルスプロセッシングの細胞生物学に依存して、肺以外の臓器における遺伝子導入を増加させるため使用できることを示唆する。
結論すると、ｒＡＡＶ−２での気道における頂感染に対する重要な障壁は、エンドソームのプロセッシングおよびユビキチン化のレベルにある。ユビキチン−プロテアソーム系のモジュレーションは、嚢胞性繊維症の遺伝子治療のために、気道の粘膜表面からｒＡＡＶの形質導入を高める革新的方法を明らかにした。
肺の気道上皮および肝臓におけるインビボのＬａｃＺ遺伝子の発現
本発明の薬剤の存在または不存在下で、肺または肝臓におけるｒＡＡＶのインビボ活性は、ＬａｃＺ遺伝子を使用して試験することができる。ＬａｃＺ遺伝子を含有するｒＡＡＶベクター、組換えＡＶ．ＬａｃＺ（５×１０１０粒子）をマウスの肺に、ＰＢＳ中のウイルス単独または４０μＭのＬＬｎＬ（ＰＢＳ中）と組み合わせたウイルスのいずれかとして投与した。ウイルスはＣ５７Ｂａｌｂ／ｃマウスの気管に、３０Ｇ針を用いて全３０μｌを直接滴注した。マウスの肺におけるウイルスの伝播を確実にするために、ウイルスを投与した直後に同じシリンジを介して５０μｌの空気を肺にポンプで送った。感染から９０日後、肺を完全に回収し、そして４％のパラホルムアルデヒドに固定し、続いて低温切開した。ＡＡＶ−媒介型の導入遺伝子の発現は、１０μｍの組織切片をＬａｃＺについて染色することにより評価した。
組換えＡＶ．ＬａｃＺ（５×１０１０粒子）も、マウスの肝臓にＰＢＳ中のウイルス単独、４０μＭのＺ−ＬＬＬ（ＰＢＳ中）と組み合わせたウイルス、または２０μＭのＬＬｎＬ（ＰＢＳ中）と組み合わせたウイルスのいずれかとして投与した。ウイルスはＣ５７Ｂａｌ６マウスの門脈に直接滴注した。ＡＡＶ媒介型のＬａｃＺ導入遺伝子発現は、感染から２および４時間後に凍結した組織切片の組織学的染色により評価した。
ｒＡＡＶの形質導入を高めるために有用なさらなる薬剤の決定法
Ａ．ｒＡＡＶの形質導入を高める薬剤をスクリーニングするために、任意の数の細胞を使用することができる。試験する薬剤の濃度範囲は、例えば薬剤に望むプロファイル、薬剤の望ましい毒性プロファイルおよび／またはインビボで使用する薬剤の濃度に基づき決定することができる。スクリーニング用に選択される細胞型の有用性は、化合物、例えばｒＡＡＶの形質導入を増大させることが知られているＬＬｎＬおよびＺＬＬのようなプロテアソームインヒビターを試験することにより確認することができる。例えばＡＡＶ２ＦＬＡＧ−Ｌｕｃベクターは、プロテアソームインヒビターであるＭＧ１３２の存在または不存在下で、ＨｅＬａ、ケナガイタチの繊維芽細胞、ＩＢ３およびＨｕｈ（肝臓）細胞を形質導入するために使用した。ＭＧ１３２は試験したすべての型の細胞においてＡＡＶの形質導入を高めることが確認され：ＨｅＬａ細胞の形質導入は、８０μＭのＭＧ１３２で約５００倍、そして４０μＭで２００倍強化され：ケナガイタチの繊維芽細胞の形質導入は２０μＭのＭＧ１３２で約２００倍、そして４μＭで１７倍強化され：ＩＢ３−１細胞の形質導入は、２０〜８０μＭのＭＧ１３２で約３０〜７０倍強化され；そしてＨｕｈ−７細胞の形質導入は２０〜８０μＭのＭＧ１３２で約１５倍強化された。ＤＭＳＯまたはＥＴＯＨのいずれかをＭＧ１３２の賦形剤として使用した場合、ＨｅＬａ細胞におけるｒＡＡＶの形質導入効率に差異は無かった。
Ｂ．ＨｅＬａ細胞を、ｒＡＡＶの形質導入を高めるさらなる薬剤をスクリーニングするために選択したが、任意の細胞株または系；あるいは初代細胞を使用することができる。薬剤は、抗炎症剤（例えばデキサメタゾンおよびシクロスポリンＡ）、ＮＳＡＩＤ（例えばイブプロフェン）、β−アドレナリン作用薬（例えばアルブテロール）、抗生物質（例えばシプロフロキサシン、コリゾン（ｃｏｌｉｓｏｎ）、ゲンタマイシン、トブラマイシンおよびエポキソマイシン（ｅｐｏｘｏｍｙｃｉｎ））、脂質低下剤（例えばロバスタチン、シンバスタチンおよびエイコサペンタエン酸）、食品添加物（例えばタンニン酸）、ウイルスプロテアーゼインヒビター（例えばＮｏｒｖｉｒ ＫａｌｅｔｒａおよびＶｉｒａｃｅｐｔ）、化学療法剤（例えばアクラシノマイシン（ａｃｌａｃｉｎｏｍｙｃｉｎ）Ａ、ドキソルビシン、ドキシル、カンプトテシン、タキソールおよびシスプラチン）、およびプロテアーゼインヒビター（例えばキモスタチン、ベスタチンおよびクロロキン）のような様々な種類から選択した。試験する薬剤の濃度範囲は、溶解性のプロファイル、毒性のプロファイルおよび／またはインビボで以前に使用された濃度に基づき選択した。
ＨｅＬａ細胞は、薬剤、例えばリトナビル（Ｎｏｒｖｉｒ）（１、１０および１００μＭ）、シクロスポリンＡ（２．５、２５および２５０μｇ／ｍｌ）、エポキソミシン（ｅｐｏｘｏｍｉｃｉｎ）（１、１０および５０μＭ）、アルカシノマイシン（ａｌｃａｃｉｎｏｍｙｃｉｎ）Ａ（５、５０または５００μＭ）、キモスタチン（１、１０および１００μＭ）、ベスタチン（１、１０および１００μＭ）、ドキソルビシン（アドリアマイシン）（０．１、１および１０μＭ）、カンプトテシン（カンプトサル：ｃａｍｐｔｏｓａｒ）（１、１０および１００μＭ）、エイコサペンタン酸（１、１０および１００μＭ）、タンニン酸（２、２０、２００および２０００μＭ）、シンバスタチン、プロドラッグ（２、２０および２００μＭ）、シスプラチン（０．２、２および２０μｇ／ｍＬ）、およびクロロキン（４、４０および４００μＭ）の存在下で、１００ｒＡＡＶのＭＯＩで２時間、感染させた。感染から４８時間後、細胞を分析のために回収した。ｒＡＡＶの形質導入は、細胞のカルチャーから培地を除去し、１００μＬのレポーター溶解バッファー（ＲＬＢ）を加え、そして凍結することにより測定した。上清を解凍し、そして微小遠心管に移し、さらに２回、凍結解凍し、そして１０分間遠心することにより清澄化し、次いでルモメーター（ｌｕｍｏｍｅｔｅｒ）でレポーター遺伝子の発現について分析した。タンパク質はブラッドフォード（Ｂｒａｄｆｏｒｄ）分析により測定し、そして結果を１ｍｇのタンパク質あたりの相対的光単位として表した（ＲＬＵ／ｍｇ）。データは図１Ａ−Ｅに与える。
ドキソルビシン、エポキソミシンおよびカンプトテシンはすべて、試験した用量範囲で形質導入に用量依存的な上昇を示した。試験した用量で、ドキソルビシンおよびエポキソミシンはそれぞれ１６９倍および１２０倍、形質導入効率を上昇させ、カンプトテシンは１５倍まで形質導入効率を上昇させ、タンニン酸は１７倍まで形質導入効率を上昇させ、シスプラチンは１６倍まで形質導入効率を上昇させ、そしてシンバスタチンは４倍まで形質導入効率を上昇させた。
シンバスタチンおよびロバスタチンに関して、これらの薬剤がプロドラッグとして製剤化され、そして負の結果に寄与する可能性がある活性化された開環形への転換は確認しなかったことに注目されたい。同様に、ドキソルビシン、ドキシルのリポソーム製剤は、細胞カルチャーの細胞に対する生物学的利用性を確認することができなかった。このように、統計的に負であると最初にスクリーニングされた薬剤は、細胞カルチャーの細胞に即座に生物学的利用性とはならない製剤の反映であるか、または限定された用量範囲または暴露時間の反映であり得る。
インビボおよびインビトロでＮＦ−ＫＢ−媒介型のシグナル伝達を阻害することが知られている、放線菌類から単離される天然に存在する抗生物質であるエポキソミシンは、プロテアソーム特異的なキモトリプシン様プロテアーゼを阻害することによりプロテアソームを阻害する。トポイソメラーゼＩＩを阻害し、そして核酸合成を阻害する抗腫瘍性抗生物質であるドキソルビシンは、２０Ｓプロテアソームにより細胞質から核へトラスンロケートされる。可逆性のＤＮＡトポイソメラーゼインヒビターであるカンプトテシンは、ユビキチン／２６Ｓプロテアソーム経路を介してトポイソメラーゼをダウンレギュレートする。シンバスタチンはプロテアソーム活性をモジュレートする薬剤であり、タンニン酸はキモトリプシン様活性を阻害し、そしてガンの化学予防剤であり、そしてシスプラチンはＤＮＡを架橋する化学療法剤である。
Ｃ．ｒＡＡＶの形質導入効率を高める薬剤の組み合わせが、組み合わせて使用した時に相乗的または付加的効果を有するかどうかを測定するために、細胞をプロテアソームモジュレーターであるドキソルビシン、およびプロテアソームインヒビターであるＺ−ＬＬＬまたはＬＬｎＬと接触させた。スプライシングベクターおよびシュードタイプｒＡＡＶを含む種々のＡＡＶベクターを試験した。使用したウイルスストックは以下の通りであった：Ａｖ２ＲＳＶｌｕｃ、５×１０８粒子／μｌ；Ａｖ２ＲＳＶｌｕｃＣａｐ５（Ａｖ２／５ＣＭＶＬｕｃとも呼ぶ）、２×１０９粒子／μｌ；Ａｖ２ＣＭＶｌｕｃ、１．３×１０９粒子／μｌ；およびＡｖ２ＣＭＶｌｕｃＣａｐ５、１．１×１０９粒子／μｌ。薬剤の組み合わせは、単独で使用した薬剤と比較し、形質導入の効率を測定した。単独で使用した時、ＬＬｎＬは４０、２００または４００μＭで、Ｚ−ＬＬＬは４μＭで、そしてドキソルビシンは０．５または１μＭで使用した。ＬＬｎＬおよびドキソルビシンの組み合わせを使用した時、ＬＬｎＬは４、１０、２０、４０、２００または４００μＭで使用し、そしてドキソルビシンは１または５μＭで使用した。分極した気道上皮の頂端面、ＨｅＬａ細胞またはケナガイタチの繊維芽細胞を、薬剤およびｒＡＡＶ（ウェルあたり５×１０９粒子）と接触させた。
結果は、ＬＬｎＬがＨｅＬａ、ケナガイタチの繊維芽細胞および分極した上皮細胞の形質導入を４０μＭで、そしてＡ５４９細胞を２００〜４００μＭで高めることを示した。ドキソルビシンはＨｅＬａおよびケナガイタチの繊維芽細胞の形質導入を１μＭで、そしてＡ５４９細胞または分極した気道細胞を５μＭで強化し、そしてケナガイタチの繊維芽細胞をｌａｃＺスプライシングベクターで感染した時、形質導入を約１００倍強化した。またドキソルビシンは、ＬＬｎＬよりも高い程度でＡＡＶ２およびＡＡＶ５の形質導入を強化した。相乗的効果は、ドキソルビシンおよびＬＬｎＬが同時投与された時に記録された。
薬剤の投与無しでは、分極した上皮細胞の頂端面からの形質導入は、ＡＡＶ５キャプシドを持つＡＡＶベクターでＡＡＶ２キャプシドを持つＡＡＶベクターよりも大きかった。ドキソルビシンの存在下では、２００〜６００倍の導入が分極した細胞のＡＡＶ２およびＡＡＶ５の頂端側感染について観察された。このように本発明の薬剤は、血清型、シュードタイプおよび多数ベクター法においてｒＡＡＶの形質導入を高めることができる。
Ｄ．ドキシル（２、１０または２０ｍｇ／ｋｇの範囲の用量）（ドキソルビシンのリポソーム調製物）のマウスへの静脈内投与と組み合わせた１０１１個のＡＶ２ＦＬＡＧ−ｌｕｃｒＡＡＶ粒子のオスＢａｌｂ／ｃマウスへの気管内投与は、２０ｍｋ／ｋｇ用量のドキシルで７日までに２対数までＡＶ２ＦＬＡＧ−ｌｕｃの形質導入を強化した。具体的には２０ｍｇ／ｋｇのドキシルで、形質導入は７日までに平均６７倍、３０日までに４倍強化された。以前に試験されたドキシルは、細胞株スクリーニングに陰性であったが、試験した遊離化合物のドキソルビシンは細胞株スクリーニングで陽性であった（図１Ａ−Ｅ）ことは注目に値する。リポソーム製剤は、それらをインビボでさらに生物学的に利用できるようにする上昇した安定性または循環半減期を含め、インビボ使用に望ましい特性を有する。これらの同じ特性が、リポソーム製剤を上記のようなインビトロスクリーニングに望ましくなくする。すなわち当業者は、それらを望ましい応用に調整するために、本発明の薬剤に関する製剤法を設計することができる。製剤デザインに加えて、当業者はｒＡＡＶの形質導入効率を最大にするために、送達経路を調整することができる。
さらなる実験では、ＦＶＩＩＩをコードするシュードタイプｒＡＡＶベクターを、オスのＲａｇ−１マウスで試験した。Ｒａｇ−１マウスは、当該技術分野で記載されているように、正常なマウスが血清中のタンパク質検出を混乱し得るヒトＦＶＩＩＩのインヒビターを生産するので使用した。Ｒａｇ−１マウスはこれらのインヒビターを生産するために必要な経路を欠ことが知られており、したがってインヒビターを生産しないか、低レベルのインヒビターを生産するか、またはインヒビターの発生までに長期を有するかのいずれかである。ｒＡＡＶベクターは、血清型５のキャプシドタンパク質、および最小肝臓特異的要素ＨＮＦ３／ＥＢＰおよびヒトＢ−ドメイン欠損ＦＶＩＩＩ遺伝子（第２構築物は、Ｂ−ドメイン欠損イヌＦＶＩＩＩ遺伝子を含むことを除き、同一であった）からなるヘテロロガスな導入遺伝子を挟むＡＡＶ−２の５’−３’ＩＴＲを含むように構築された。動物は、０日に２０ｍｇ／ｋｇのドキシルと同時に、１０１２ｒＡＡＶベクター粒子を外側の尾の静脈を介して静脈内に投与された。循環する生物学的に利用できるＦＶＩＩＩ活性は、３１、５３および９０日に、ＥＬＩＳＡおよびＣｏａｔｅｓｔを含む当該技術分野で既知の技術により血清から測定された。図３に示すデータは、ドキシルで処置されなかった動物が３１日および５３日に０．９９ｎｇ／ｍｌの範囲内にＦＶＩＩＩのかろうじて検出可能レベルを有したが、このレベルは９０日までに０．１３ｎｇ／ｍｌに低下したことを示す。対照的に、２０ｍｇ／ｋｇのドキシルを投与された動物は、４０倍を越えるＦＶＩＩＩタンパク質のレベルを有した。興味深いことには、ドキシルで処置しなかった動物で９０日に見られるＦＶＩＩＩタンパク質の低下は（０．１３ｎｇ／ｍｌ）、ドキシルで処置した動物には現れず（４０．１６ｎｇ／ｍｌ）、ドキシルが明らかに短期間でｒＡＡＶの形質導入を高めるだけでなく、本発明の薬剤が発現も長期化することを示している。ドキシルがｒＡＡＶの形質導入に影響を及ぼし、そしてＦＶＩＩＩタンパク質の翻訳または安定性には全く影響していないことを証明するために、ＲＳ−ＰＣＲを５３日の時点の肝臓組織について行った。表１の個々の動物について提示するデータは、ドキシルで処置した動物において記録されたＦＶＩＩＩタンパク質の上昇が、検出されたｍＲＮＡのレベルと相関していることを示す。
ドキシルにより生産されるインビボのｒＡＡＶの形質導入の上昇は、当該技術分野で記載されているようなサイトキサン（ｃｙｔｏｘａｎ）媒介型の寛容化法（ｔｏｌｅｒｉｚａｔｉｏｎ）を利用して、ヒトＦＶＩＩＩタンパク質に対して寛容化されたオスのＦＶＩＩＩノックアウトマウスを対象として、上記と同じベクターおよびプロトコールを使用してさらに確認した。動物はｒＡＡＶベクター送達の時期から初めて毎週、５０ｍｇ／ｋｇのサイトキシン注射で処置した。表２に提示するデータは、１４および２５日にＥＬＩＳＡまたはＣｏａｔｅｓｔにより試験した時に、以前に記載された結果を確認し、すなわちドキシルを投与された動物は、ｒＡＡＶの形質導入に少なくとも１０倍の強化を示した。
Figure 2007524379
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このように、プロテアソームまたはユビキチン経路における分子のような細胞内ＡＡＶトラフィッキング経路における分子と相互作用する薬剤は、これらの分子に結合し、かつ／またはそれらの活性を阻害することにより、ｒＡＡＶの形質導入を高めるために有用である。
インビトロおよびインビボで、分極した気道上皮のｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−５形質導入におけるプロテアソームの関与
ＬＬｎＬのような低分子トリペプチドインヒビターを用いたプロテアソームの阻害は、インビトロで分極したヒト気道上皮およびインビボのマウス肺の両方の頂端側細胞膜からのｒＡＡＶ−２の形質導入を有意に増すことができる（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ＡＡＶ−５は気道上皮の頂端側細胞膜に、より高い向性およびその上にオルタネート（ａｌｔｅｒｎａｔｅ）受容体を有することが報告されたので、ｒＡＡＶ−５を用いた頂端側細胞膜からの気道上皮の上昇した形質導入は、改変されたプロテアソームの関与によるかもしれない。プロテアソームモジュレーターとプロテアソームインヒビターの同時投与は、細胞型に依存する様式で両血清型の形質導入を増大することが見いだされた。
気道の形質導入において、血清型特異的な差異をより良く理解するために、分極したヒト気道上皮カルチャーおよびマウスの肺を対象として、プロテアソームインヒビターがｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ−５の形質導入に及ぼす効果を調査した（図２および６）。導入遺伝子を挟むＡＡＶ−２−に由来する５’および３’ＩＴＲを含有するプロウイルス構築物を、ＡＡＶ−２およびＡＡＶ−５キャプシドの両方にパッケージングして、ルシェラーゼ導入遺伝子を発現するＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃおよびＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃＣａｐ５ウイルスを生成した。ｒＡＡＶ−５ではなくｒＡＡＶ−２が、頂端面 対 側底側面からの形質導入に有意な差異を示した。ＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃを用いた形質導入は、感染から５および１４日後に側底側細胞膜からそれぞれ３６および１０３倍高かった。対照的に、ＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃＣａｐ５は、両時点で頂端側細胞膜および側底側細胞膜から同じ効率で上皮に形質導入した。
ＬＬｎＬは頂端面および側底側面からＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃの形質導入を増大する。しかしＬＬｎＬの適用は、ウイルスを頂端面に適用した時のみ、ＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃＣａｐ５の形質導入を１２倍に選択的に上昇させた。これらの結果は、細胞の極性により行われる種々のＡＡＶキャプシド侵入経路について、プロテアソームの関与に興味深い差異を示唆している。
プロテアソームインヒビターであるＺ−ＬＬＬは、マウス肺においてｒＡＡＶ−２を用いた長期（５カ月）形質導入を誘導することが分かった。ＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃＣａｐ５のインビボの形質導入効率を測定するために、マウスに６×１０１０粒子のＡＶ２．ＲＳＶｌｕｃＣａｐ５を単独で（対照）、または２００μＭのＺ−ＬＬＬ、２００μＭのドキソルビシンまたは２００μＭのＺ−ＬＬＬおよび２００μｌのドキソルビシンと組み合わせて、鼻吸引により感染させた（１群あたり１２マウス）。Ｚ−ＬＬＬの同時投与は、感染から１４（２週間）および４２（６週間）日に、全肺のルシフェラーゼ発現をそれぞれ１７．２および２．１倍誘導した。興味深いことには、ルシフェラーゼ発現は感染から３カ月後にさらに減少した（図２）。
ドキソルビシンの同時投与は、２週間でＺ−ＬＬＬのレベルよりもほぼ１０倍高いレベルで、全肺のルシフェラーゼ発現を誘導した。またドキソルビシンは、２週間でＺ−ＬＬＬよりも高いレベルで気管および気管支のルシフェラーゼ発現も誘導した。６週間で、類似のパターンがＺ−ＬＬＬおよびドキソルビシン単独で観察されたが、ルシフェラーゼレベルはウイルス、Ｚ−ＬＬＬおよびドキソルビシンを同時投与したマウスの気管および気管支で付加的以上であった。感染後３カ月で、相乗効果はもはや観察されなかった。これらの考察は、ｒＡＡＶ−２を用いたインビボの実験と、ｒＡＡＶ−５を用いたインビボの実験との間で、Ｚ−ＬＬＬによる誘導の動力学および持続に著しい差異を示唆している。インビボの形質導入はｒＡＡＶ−２に比べてｒＡＡＶ−５で有意により効率的であるので、プロテアソーム活性の改変は、単にｒＡＡＶ−５を用いた形質導入の速度を高めるかもしれない。ｒＡＡＶ−２の場合、この基底速度はインビボで頂端側細胞膜からの効率を有意に減少させることができ、プロテアソームインヒビターによる形質導入を、さらに持続的に増加させる。
またこれらの結果は、異なる結果を達成するための異なる薬剤およびベクターの使用も際立たせる。例えば、経時的に特定の細胞中の導入遺伝子の発現に安定な上昇をもたらす薬剤およびベクターは、特定の障害または状態に有用となり得る一方、導入遺伝子発現の高いバーストをもたらす薬剤およびベクターは、血友病のような代謝性障害に有用となり得る。
ユビキチン化およびプロテアソーム活性は、タンパク質分解および細胞内トラフィッキングを制御する多数の細胞内プロセスに影響を与えることができる。以下の例は、ユビキチン／プロテアソーム系により制御されるｒＡＡＶ形質導入の分子メカニズムを同定するために計画する。これらの実験は、ｒＡＡＶ形質導入の律速段階に影響を及ぼす経路および／または分子のさらに明確な理解を導く可能性があり、そしてｒＡＡＶのプロセッシング（すなわちエンドソーム脱出、核へのトラフィッキングおよび脱殻）、故に形質導入を高めるためのさらに有用な薬剤を同定するために使用することもできる。
エンドソームの脱出を追跡するためのｒＡＡＶの二重蛍光色素標識
ｒＡＡＶの細胞内トラフィッキングの最も難しく、しかし重要な観点の１つは、ビリオンが細胞質に出る正確なエンドソーム区画を決定することである。プロテアソームインヒビターは、エンドソームの脱出速度および／またはｒＡＡＶが細胞質に入る区画を変えることにより、このｒＡＡＶの生活環の観点をモジュレートすることができる。
方法
エンドソームのエスケープを実験するために、二重標識ｒＡＡＶキャプシド上の２つの蛍光色素の１つに対する消光抗体の単一細胞影像およびマイクロインジェクションを行った。モレキュラープローブ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ）からのＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒシステムを、多くの蛍光色素が類似の効率でｒＡＡＶキャプシドに連結され得る系として選択した。３種の色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）４８８［緑］、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）５６８［赤］およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（商標）６４７［青］）を、これに関して有用として選択した。好ましくは、ｒＡＡＶの二重標識は、感染パターンを変えない。また好ましくはＡｌｅｘａ−４８８（モレキュラープローブ）に対する消光抗体のマイクロインジェクションは、二重標識ｒＡＡＶの蛍光をシフトすることができる。エンドソームの脱出を評価するための一般的取り組みは、Ａｌｅｘａ−４８８およびもう１つの他の色素で二重標識されたｒＡＡＶで感染させた後、生きている細胞の細胞質に抗−Ａｌｅｘａ−４８８を注入することである。Ａｌｅｘａ−４８８／５６８二重標識ｒＡＡＶで、ウイルスの蛍光の黄色から赤へのシフト（すなわち、緑色の蛍光色素を消す）は、細胞質へのウイルスの移動を示す。この取り組みは、ｒＡＡＶが細胞質へと移動した区画を評価するためのＧＦＰ−タグ付エンドソーム区画および／またはドミナントネガティブＲａｂｓとを組み合わせで使用する。
ｒＡＡＶのＡｌｅｘａ標識 １価のＡｌｅｘａスクシンイミジルエステル反応性色素（Ａｌｅｘａ−４８８および／またはＡｌｅｘａ−５６８）を、５０μｌの１Ｍ重炭酸塩に溶解した。精製したＡＶ２Ｌｕｃの０．５×１０１２粒子（スロットブロットにより測定）（０．５ｍｌのＨｅｐｅｓバッファー中）を反応混合物に加え、そして２時間インキュベーションした。二重標識を行った時、等モル量の２種の蛍光色素を使用し、そして反応時間を３時間に延長した。標識したｒＡＡＶ２は、排除クロマトグラフィーにより遊離の色素から分離した。画分は、ルシフェラーゼアッセイを使用してＨｅＬａ細胞で感染力価について試験した。次いで５つのピーク画分を合わせ、そして蛍光撮像実験に使用した。撮像実験を行った。
結果および結論
機能的粒子の評価は、８５％より高い活性がＡｌｅｘａ色素での標識後に保持されていることを示した（データは示さず）。これはＣｙ３標識で観察された結果に類似した。Ａｌｅｘａ−５６８標識ｒＡＡＶ２で感染させたＨｅＬａ細胞からの結果は、ＧＦＰタグ付Ｒａｂ１１区画でのシグナルとの有意な重複を示した。観察された分布は、Ｃｙ３標識ｒＡＡＶ２で見られた分布に大変類似した。これらの実験から、ｒＡＡＶのＡｌｅｘａ標識を行うことができ、そしてこれはＣｙ３標識よりもわずかに感受性であると結論した。これらの実験では、各ｒＡＡＶキャプシドを約３〜４の蛍光色素で標識した。二重標識手順がｒＡＡＶを効率的に標識するためにも適合するかどうかを調査するために、ＨｅＬａ細胞の感染から１時間後に、二重Ａｌｅｘａ−４８８／５６８およびＡｌｅｘａ−５６８標識ｒＡＡＶ２を比較する実験を行った。Ａｌｅｘａ−４８８／５６８シグナルに重複を示すこれらの実験を、Ａｌｅｘａ−５６８単独と比べて、両色素が結合反応に加えられた時、主要なｒＡＡＶビリオンが二重標識されることを確認する。
始めに、ｒＡＡＶの細胞質中へのエンドソーム放出を視覚化するためのアッセイを開発するために、抗−Ａｌｅｘａ−４８８の単一細胞の、ＡＶ２Ｌｕｃで感染させたＨｅＬａ細胞への注入は、いったんｒＡＡＶが細胞質に入れば二重標識Ａｌｅｘａ−４８８／５６８から緑の蛍光を消すことができると定めた。さらにＡｌｅｘａ−４８８蛍光のレベルは、抗−Ａｌｅｘａ−４８８の注入により有意に消されるが、Ａｌｅｘａ−５６８の赤いチャンネル蛍光を完全なままとする。対照的に、両蛍光色素の蛍光は、非注入細胞では大変高いままであった。注入された細胞中に残るＡｌｅｘａ−４８８の蛍光は、抗体結合から保護されたエンドソーム区画中に未だ残るウイルスと解釈された。これらの知見は、ｒＡＡＶの有意な部分が感染後２時間まで、細胞質中で遊離であり得ることを示唆する。
ｒＡＡＶの改変されたトラフィッキング
プロテアソーム調節剤は、１または複数の以下のメカニズムを通してｒＡＡＶの形質導入を上昇させるように作用する：１）細胞内トラフィッキングの経路を変えることなく、通過して細胞質に出るｒＡＡＶが１次区画に蓄積する速度を上げる；２）ｒＡＡＶが通過して細胞質に出る区画において、より効率的な蓄積を導く様式で、ｒＡＡＶの細胞内トラフィッキングの経路を改変する；３）エンドソーム区画からｒＡＡＶが出る効率を上げる；および／または４）細胞質での遊離ｒＡＡＶの核トラフィッキングの速度を高める。
幾つかの証拠筋は、プロテアソームインヒビターが核へのウイルス輸送の速度を上げることにより（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）、かつ／またはキャプシドのウイルスプロセッシングを高めることにより（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）、ｒＡＡＶの形質導入を高めるために作用できると示唆する。第１にトリペプチドであるＬＬｎＬおよびＺ−ＬＬＬのようなプロテアソームインヒビターは、１）ウイルスのエンドサイトーシス、２）細胞内のウイルスＤＮＡの安定性、または３）導入遺伝子発現を駆動するプロモーター活性を強化せずに、ｒＡＡＶ２またはｒＡＡＶ５ウイルスの両方の形質導入を高める（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）。第２に、プロテアソームインヒビターは分極したヒトの気道上皮の感染後、最高１週間加えることができ、そしてそれでも形質導入（すなわち遺伝子発現）を高める。第３に、２型および５型に関するウイルスキャプシドは、プロテアソームインヒビターの存在下でインビボのユビキチン化を強化し、そして精製したウイルスもインビトロでユビキチン化されることを示す（Ｙａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２）。合わせると、これらの知見は調節プロテアソーム活性が少なくとも２つの血清型についてｒＡＡＶの形質導入を強化し、そして強化のメカニズムには細胞内ウイルスプロセッシングの幾つかの観点が関与することを強く示唆する。
Ａ．プロテアソームインヒビターはｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ２／５細胞の核への輸送を上昇させる
膨大な数の種々のプロテアソームインヒビターがスクリーニングされて、最大効果を有するものが同定された。２種類の化合物（トリペプチドのアルデヒドＬＬｎＬおよびアントラサイクリン誘導体のドキソルビシン）、およびそれらが２種類の気道細胞株（ＩＢ３およびＡ５４９）においてｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ２／５の形質導入を誘導する能力を以下に記載する。
方法
ＬＬｎＬおよびＺ−ＬＬＬは、プロテアソームのカルパイン、カセプシン、システインプロテアーゼならびにキモトリプシン様プロテアーゼ活性を阻害することが示された２種類のトリペプチドのアルデヒドである（Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２；Ｄｏｎｋｏｒ，２０００；Ｓａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９９０）。ドキソルビシンもプロテアソームのキモトリプシン様プロテアーゼ活性を阻害することが示された（Ｋｉｙｏｍｉｙａ ｅｔ ａｌ．，２００２）。両種類のプロテアソームインヒビターは、プロテアソーム複合体にしっかりと結合する。これら２種類のプロテアソーム調節剤に関する用量応答曲線は、ＩＢ３、Ａ５４９、Ｈｅｌａおよび初代繊維芽細胞で評価した。応答は多数の細胞株およびルシフェラーゼ発現を駆動する３種の異なるプロモーターについて一貫していた。１つの組については、ＡＶ２またはＡＶ５キャプシドにパッケージされたＡＡＶ２に基づくゲノムを含むＣＭＶが駆動するルシフェラーゼ構築物を使用した。細胞を種々の用量のＡＶ２ＬｕｃおよびＡＶ２／５Ｌｕｃ（１００〜１０００粒子／細胞のＭＯＩ）で感染させた。感染時、細胞は種々の濃度のＬＬｎＬまたはドキソルビシンで処理し、そして遺伝子発現を感染から２４時間後にアッセイした。ウイルスの核の取り込みに及ぼすプロテアソームインヒビターの効果は、細胞質および核中のウイルスＤＮＡを分画するために以前に記載されたプロトコールを使用して評価した（Ｘｉａｏ ｅｔ ａｌ．，２００２）。次いで細胞質および核画分中のウイルスＤＮＡ含量を、ルシフェラーゼＤＮＡプローブに対するスロットブロットハイブリダイゼーションにより評価した。
結果および結論
この分析からの結果は、ＬＬｎＬおよびＤｏｘの両方が、２つの独立した気道細胞株でｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ２／５の形質導入を有意に増すことができることを証明した（図３）。この傾向はこれら２種の細胞株とｒＡＡＶの２つの血清型との間で類似したが、誘導の幾つかの特徴は注目に価する。第１に、ＩＢ３細胞中の形質導入は、ＬＬｎＬにより最も有意に誘導され得るが（＞２００倍）、Ａ５４９細胞は１０倍低いレベルの誘導を達成するために、さらに一層高濃度のＬＬｎＬを要した。したがってＩＢ３細胞はｒＡＡＶのＬＬｎＬ誘導に特に感受性であるようだ。第２に、両細胞株におけるｒＡＡＶの形質導入は、Ｄｏｘにより高度に誘導性であった（２００倍）。
ＬＬｎＬでの処理はｒＡＡＶの核への移動を上昇させるという、分極したヒト気道上皮細胞における以前の知見を考慮して（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）、感染時のＬＬｎＬおよびＤｏｘ処理も核へのｒＡＡＶの移動を高めるのかどうかを測定した。ｒＡＡＶ２感染ＩＢ３細胞に由来する核および細胞質抽出物の細胞内の分画は、ＤｏｘおよびＬＬｎＬの両方が核区画中のウイルスＤＮＡの画分を有意に増加させたことを示した。これらの知見は、これら２種類のプロテアソーム調節剤がウイルスを核に移動させることによりｒＡＡＶの形質導入を上げるように作用することを示唆する。まとめると、これらの知見はユビキチン化／プロテアソーム系が、ｒＡＡＶの細胞内プロセッシングおよびその核への移動を制御するための幾つかの様式で作用するという、増大している多くの研究内容を支持する。
Ｂ．ＬＬｎＬおよびＤｏｘは、プロテアソームをモジュレートするための異なるメカニズムを介して作用し、そしてｒＡＡＶの形質導入を高める
ＬＬｎＬおよびＤｏｘがプロテアソームとの異なるメカニズムの相互作用を介してｒＡＡＶの形質導入を上げるかもしれないという仮説を試験するために、ｒＡＡＶの形質導入に及ぼすそれらの効果を、組み合わせて加えた時に評価した。これらの各薬剤がプロテアソームとの異なるメカニズムの相互作用により形質導入を上げるように作用すれば、それらの累積的効果は個別の効果よりも大きくなるだろう。
方法
Ｈｅｌａ、Ａ５４９、ＩＢ３および初代繊維芽細胞は、種々の濃度のＬＬｎＬ、ＤｏｘまたはＬＬｎＬ＋Ｄｏｘの存在下でのＡＶ２ＬｕｃおよびＡＶ２／５Ｌｕｃの形質導入について評価した。示すデータは、各化合物単独よりも大きな程度で、ｒＡＶ２Ｌｕｃの形質導入を誘導する最適な用量を組み合わせたＨｅｌａおよびＡ５４９細胞に由来する。
結果および結論
図４における知見は、多数のプロテアソームインヒビターによるプロテアソームの協同的阻害が、ｒＡＡＶの形質導入に上昇した増大を提供できることを証明した。ＤｏｘおよびＬＬｎＬを合わせた処理が、いずれかの化合物単独よりも大きくｒＡＡＶの形質導入を高めるという考察には、またそれ自体、誘導のメカニズムが互いに独立していることを示さない。そのような薬剤が何故ｒＡＡＶの形質導入を協同的に高めるのかという幾つかの潜在的理由がある。第１にＬＬｎＬおよび／またはＤｏｘはｒＡＡＶのエンドソームルーティングを改変し、エンドソーム脱出を強化し、かつ／または細胞質中のｒＡＡＶの核孔へ移動させる。これら各薬剤は、これらプロセスの１または複数に異なる程度で影響を与え、そしてｒＡＡＶの形質導入に付加的または相乗的効果を可能とする。Ｈｅｌａ細胞は、ｒＡＡＶの形質導入にＡ５４９細胞よりも大きなＤｏｘおよびＬＬｎＬの付加的効果を提供するようである。さらに胎児の初代繊維芽細胞では、形質導入に及ぼす付加的効果が見られないことに注目すべきである（データは示さず）。この細胞株では、ＤｏｘがｒＡＡＶ２およびｒＡＡＶ５の形質導入を最も有意に強化し、そしてＬＬｎＬはそれ自体が１０倍の形質導入を誘導したという事実にもかかわらず、付加的な誘導は提供しない。これらの興味深い細胞特異的な差異は、ｒＡＡＶの形質導入を改変する特定の細胞プロセスがＬＬｎＬおよびＤｏｘとプロテアソームとの相互作用により独自に制御され得ることも意味する。
プロテアソーム調節剤の二重治療薬用途
方法
ヒトＣＦ気管支上皮の初代培養およびｒＡＡＶ感染
ＣＦまたは非ＣＦ患者から得た気管支組織から単離した気道上皮細胞は、コラーゲンをコートした半透膜（０．６ｃｍ２のＭｉｌｌｉｃｅｌ−ＨＡ；ミリポア、ベットフォード、マサチューセッツ州）に播種した。これらの空気／液体界面カルチャーを生成する方法および使用した培地は、Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９９８）に記載されている。４種のウイルスベクター、ＡＶ２ＣＦ８３、ＡＶ２ｔｇＣＦ、ＡＶ２／５ＣＦ８３およびＡＶ２／５ｔｇＣＦは、頂端側細胞膜から分極した気道上皮細胞を感染させるために使用した。すべてのベクターはＡＡＶ２ＩＴＲを持ち、そしてトリプルプラスミドトランスフェクション技術を使用して２型または５型のいずれかのキャプシドにパッケージングし、そしてＫａｌｕｄｏｖ ｅｔ ａｌ．（２００２）に記載されているようにイオン交換クロマトグラフィーにより精製した。ＡＶ２ｔｇＣＦは現在、臨床的に使用されているＡＡＶ２に基づく完全長ＣＦＴＲベクターであり、ここでＣＦＴＲの発現はＩＴＲを通される（ｄｒｉｖｅｎ ｏｆｆ）（Ａｉｔｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，２００１；Ｗａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００２）。ＡＶ２／５ｔｇＣＦウイルスは、ＡＶ２ｔｇＣＦと同一のプロウイルス構造を有するが、ＡＡＶ５キャプシドにシュードタイプされている。ＡＶ２ＣＦ８３およびＡＶ２／５ＣＦ８３ウイルスは遺伝子発現を増すために、ＡＶ２ｔｇＣＦプロウイルスゲノムに挿入されたさらなる８３ｂｐの最小プロモーター（Ｌｙｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９）を有し、そしてそれぞれＡＡＶ２およびＡＡＶ５キャプシドにパッケージングされた。気道上皮カルチャーは、４０μＭのＬＬｎＬおよび５μＭのドキソルビシンの存在または不存在下で、１０５粒子／細胞のＭＯＩで上皮の頂端面に７５μｌのウイルスを含有する培地で感染させた。細胞を３７℃で１６時間インキュベーションした後、頂に乗せたウイルスを取り除き、そして上皮はプロテアソーム調節剤の不存在下で、頂界面で０．６ｍｌの側底側培地および空気に戻した。次いでカルチャーは電気生理学的および分子実験前に、さらに１５日間インキュベーションした（基底培地を２日毎に交換）。ウイルス感染前、および感染から１５日後のインキュベーション後に、経上皮（ｔｒａｎｓｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ）抵抗を監視して、上皮の完全性を確認した。経上皮抵抗＞５００オームは、実験の過程で劣化しなかった上皮の電気的完全性を示すために使用した。上記の初代ＣＦ気道モデル系に加えて、形質転換したＣｕＦｉ細胞株をＺａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（２００３）に記載されているように使用して、分極したＣＦ気道上皮も同様に感染させた。
分極した気道上皮における短絡電流（Ｉｓｃ）測定
経上皮短絡電流は、上皮電圧クランプおよび自蔵式Ｕｓｓｉｎｇチャンバーを使用して、Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９８）に記載されているように測定した。チャンバーの側底側を、１３５ｍＭのＮａＣｌ、１．２ｍＭのＣａＣｌ２、２．４ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２および５ｍＭのＨＥＰＥＳを含有するリンゲルバッファー溶液、ｐＨ７．４で満たした。チャンバーの頂端側は、１３５ｍＭのグルコン酸ナトリウム、１．２ｍＭのＣａＣｌ２、２．４ｍＭのＫＨ２ＰＯ４、０．２ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、１．２ｍＭのＭｇＣｌ２および５ｍＭのＨＥＰＥＳを含有する低クロライドリンゲル、ｐＨ７．４で満たした。実験中、チャンバーは３７℃に維持し、そして１００％Ｏ２を曝気した。経上皮電圧はゼロに強制し（ｃｌａｍｐｔｅｄ）、そして生じるＩｓｃを以下のチャンネルアンタゴニストおよびアゴニストを順次加えた後に測定し、そして記録した：１）１００μＭのアミロライド（頂）、２）１００μＭの４、４’−ジイソチオシナ−２，２’−ジスルホン酸スチルベン（ＤＩＤＳ）（頂）、３）１００μＭのＩＢＭＸ／１０μＭのフォルスコリン（頂）、４）１００μＭのブメタニド（側底側）。電圧は頂区画を参照とした。リンゲル溶液およびトランスウェル膜の連続抵抗は、実験を始める前に電気的に補正した。すべての化学的アゴニストおよびアンタゴニストは、直接注入により単層の頂端側または側底側のいずれかに加え、そしてリンゲル溶液に曝気することにより混合した。実験後、膜を回収し、そして−８０℃で保存した。
ＲＮＡプロセッシングおよびＲＮＡ特異的ＰＣＲ 導入遺伝子に由来する組換えＣＦＴＲｍＲＮＡおよび内因性ＣＦＴＲｍＲＮＡは、最近記載され、そして現在ターゲッティド ジェネティック（Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）社のＣＦに関する臨床試験で使用されているＲＮＡ特異的リアルタイム逆転写酵素ＰＣＲ（ＲＳ−ＰＣＲ）法を使用して定量した（Ｇｅｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．，２００３）。全ＲＮＡは、Ｍｉｌｌｉｃｅｌ−ＨＡ膜上で成長させた細胞から、ＲＮｅａｓｙカラム精製法（キアゲン（Ｑｉａｇｅｎ）、バレンシア、カリフォルニア州）を使用して単離した。具体的には、３５０μＬのＲＮｅａｓｙ溶解バッファー（ＲＬＴ＋β−メルカプトエタノール）を、マイクロ遠心管中に回収した膜に直接加え、そしてサンプルを１５秒間ボルテックス処理した。次いで溶解物を取り出し、そしてＱｉａｓｈｒｅｄｄｅｒ（キアゲン、バレンシア、カリフォルニア州）に通し、その後、標準的なミニカラムプロトコールに従い、そしてＲＮＡを３０μＬのＴＥ（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ ｐＨ８、１ｍＭ ＥＤＴＡ）で溶出した。定量は２６０ｎｍの吸収によった。すべてのｃＤＮＡサンプルは、ｒＡＡＶ導入遺伝子由来のＣＦＴＲ、内因性ＣＦＴＲおよびβ−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）について、ＲＳ−ＰＣＲにより二連で試験した。ｒＡＡＶおよび内因性ＣＦＴＲ発現の両方が、ＧＵＳ内因性対照に関して標準化された。この方法は内因性のＣＦＴＲ発現に対するｒＡＡＶ ＣＦＴＲ発現のレベルの直接的な相対的比較を可能とする。
ウイルスゲノムＤＮＡに関するＤＮＡプロセッシングおよびリアルタイムＤＮＡ ＰＣＲ 細胞性ＤＮＡは、ＲＮｅａｓｙカラムに乗せた素通り画分、および第１のカラム洗浄液（ＲＮＡプロセッシングから）からなるプールから、エタノール沈殿により回収した。これは所定のサンプルについてベクターＤＮＡおよびＲＮＡの直接比較を可能とした。回収したＤＮＡは、フェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２４：１）で１回抽出し、２．５容量のエタノール中で沈殿させ、そして２６０ｎｍの吸収により定量した。９０個のＤＮＡ単離物の１７個を無作為に選択し、そしてＤＮＡスパイク回収を評価することによりマトリックス阻害についてスクリーニングした；マトリックス阻害の証拠は無かった（データは示さず）。すべての試験サンプルは、ＡＡＶ−ＣＦＴＲ（ベクター特異的）配列を標的とするリアルタイムの定量的ＴａｑＭａｎ ＰＣＲアッセイで分析した。各２０μＬの反応には２００ｎｇのゲノムＤＮＡを含み、そしてＡＢＩモデル７９００配列検出システム（アプライドバイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ ＢｉｏＳｙｓｔｅｍｓ）、フォスターシティ、カリフォルニア州）を使用して、三連の３８４ウェル形式で流した。標準は、正常なヒト肺ＤＮＡ（クロンテック／ＢＤバイオサイエンス（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ／ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）、パロアルト、カリフォルニア州）のバックグラウンドに希釈したプラスミドｐｔｇＡＡＶＣＦ（ＡＡＶ−ＣＦＴＲ配列を含む）からなり、そしてＰＣＲあたり８×１０６〜８×１０１コピーの範囲とした。ＡＡＶ ＣＦＴＲ特異的ＰＣＲプライマーおよびＴａｑＭａｎプローブは以下の通りであった：
フォワード ５'−ＴＴＧＣＴＧＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＧＧＡＧＡＣ−３'（配列番号：１）；
リバース ５'−ＧＡＴＣＧＡＴＧＣＡＴＣＴＧＡＧＣＴＣＴＴＴＡＴ−３'（配列番号：２）；
プローブ ５'−（ＦＡＭ）ＴＧＣＴＧＣＴＣＴＣＴＡＡＡＧＣＣＴＴＧＴＡＴＣＴＴＧＣＡＣＣ（ＴＡＭＲＡ）−３'（配列番号：３）。
異なるＥＮａＣサブユニットに関する定量的ＲＴ−ＰＣＲ ＲＳ−ＰＣＲによるＣＦＴＲ ｍＲＮＡ定量の後、全ＲＮＡサンプルを使用してｃＤＮＡを生成した（インビトロジェン）。以下のプライマーおよびプローブ配列をＥＮａＣサブユニットのＴａｑＭａｎ ＰＣＲ定量に使用した：α−ＥＮａＣサブユニット；
フォワード ５'−ＣＣＴＣＡＡＣＴＣＧＧＡＣＡＡＧＣＴＣＧ−３'（配列番号：４）；
リバース ５'−ＧＡＧＡＧＴＧＧＴＧＡＡＧＧＡＧＣＴＧＴＡＴＴＴＧ−３'（配列番号： ５）；
プローブ ５'−（ＦＡＭ）ＡＣＣＣＴＣＡＡＴＣＣＣＴＡＣＡＧＧＴＡＣＣＣＧＧＡＡＡＴＴ（ＴＡＭＲＡ）−３'（配列番号：６）。
β−ＥＮａＣサブユニット：
フォワード ５'−ＧＧＡＡＣＣＡＣＡＣＡＣＣＣＣＴＧＧ−３'（配列番号：７）；
リバース ５'−ＣＡＡＡＧＡＧＡＴＣＡＡＧＧＡＣＣＡＴＧＧＧ−３'（配列番号：８）；
プローブ ５'−（ＦＡＭ）ＣＣＴＴＡＴＴＧＡＴＧＡＡＣＧＧＡＡＣＣＣＣＣＡＣＣ（ＴＡＭＲＡ）−３'（配列番号：９）。
γ−ＥＮａＣサブユニット：
フォワード ５'−ＧＣＴＧＧＡＴＴＴＴＣＣＴＧＣＡＧＴＣＡＣ−３'（配列番号：１０）；
リバース ５'ＣＡＧＧＧＣＣＴＣＴＣＴＧＧＴＣＴＣＣＴ−３'（配列番号：１１）；
プローブ ５'−（ＦＡＭ）ＡＡＣＡＴＣＡＡＣＣＣＣＴＡＣＡＡＧＴＡＣＡＧＣＡＣＣＧＴＴＣ（ＴＡＭＲＡ）−３'（配列番号：１２）。
ＥＮａＣサブユニットｍＲＮＡのコピーは、アプライドバイオシステムズ（フォスターシティ、カリフォルニア州）から市販されているプライマー組を使用して、各サンプルのβ−アクチンｍＲＮＡコピー数に標準化した。
γ−ＥＮａＣプロモーターのＣｐＧメチル化分析 γ−ＥＮａＣプロモーターの約−１．８ｋｂで始まるＣｐＧアイランドのメチル化状態は、以前に記載されたＰＣＲ法（Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，２００１）を使用して分析した。簡単に説明すると、ゲノムＤＮＡはドキソルビシンで処理したか、またはしないＡ５４９細胞から単離し、次いでＭｂｏＩ、ＭｂｏＩ／ＭｓｐＩまたはＭｂｏＩ／ＨｐａＩＩで一晩、消化した。次いでＰＣＲ反応は、この領域のＭｓｐＩ／ＨｐａＩＩ部位を挟むプライマーを使用して行った。ＣｐＧアイランド、制限部位およびプライマーの相対的位置は、図１１Ｂに示す。プライマー：
フォワード ５'−ＴＴＧＧＡＡＣＣＧＡＡＡＧＧＴＧＡＧＴＴ−３'（配列番号：１３）；
リバース ５'−ＴＧＡＡＣＡＧＧＣＧＣＴＧＧＧＣＧＧＡＧ−３'（配列番号：１４）。
結果
プロテアソーム調節剤はｒＡＡＶ媒介型のＣＦＴＲを高める
分極したＣＦ気道上皮における機能的相関 プロテアソームインヒビターは、分極したヒトの気道上皮の頂端面からのｒＡＡＶ感染の形質導入効率を劇的に増加させることがすでに示された（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）。プロテアソームインヒビターによるこの強化は、ｒＡＡＶの細胞内プロセッシングの上昇した効率および核での蓄積を反映しているが（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００）、第２鎖合成の効率を直接制御するプロセスには影響しないようである（Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）。したがって、分極した気道上皮におけるｒＡＡＶの形質導入に及ぼすプロテアソームインヒビターの作用は、１本鎖ゲノムの発現可能な形態への上昇した機能的転換が、ｒＡＡＶの核への上昇した大量の流れにより促進されることを示唆する。これらの知見に基づき、現在臨床的に使用されているＩＴＲに駆動される完全長のＣＦＴＲｒＡＡＶベクター（ＡＶ２ｔｇＣＦ、ｔｇＡＡＶ２−ＣＦとも呼ばれている）、および完全長のＣＦＴＲｃＤＮＡの発現を駆動する短い８３ｂｐの合成プロモーター（米国特許第６，３４６，４１５号明細書を参照にされたい）を持つ第２世代のベクター（ＡＶ２ＣＦ８３）の両方の効率を、それらがプロテアソーム調節剤の存在下でヒトＣＦ気道の上皮におけるＣＦＴＲクロライド輸送を矯正する能力について評価した。さらにｒＡＡＶ５はｒＡＡＶ２よりも効率的にヒト気道上皮の頂端面を形質導入すると示唆されてきたので、両方のベクターゲノムを含むシュードタイプｒＡＡＶ２／５ウイルスも評価した。
ＩＴＲまたは合成プロモーターを利用するｒＡＡＶ２またはｒＡＡＶ２／５ベクターは、ＬＬｎＬおよびドキソルビシンを合わせたカクテルの存在下または不存在下で、頂端面から分極したＣＦ気道上皮を感染させるために使用した。感染から１５日後、ＣＦＴＲ媒介型のサイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）感受性の短絡電流（Ｉｓｃ）が、ＩＢＭＸ（１００μＭ）およびフォルスコリン（１０μＭ）による刺激後に評価され、そして正常なヒト気道上皮と比較した。全部で３種のＣＦドナー（ＣＦＢ−１６、ＣＦＢ−１９、ＣＦＢ−２６）からのサンプルを感染させ、そしてＣＦＴＲ相関について分析した。これらの実験からの結果を、図７に示す。プロテアソームインヒビターの不存在下では、２型血清型の最小プロモーターベクター（ＡＶ２ＣＦ８３）で、ｃＡＭＰ誘導性のクロライド電流の最小の回復が見られただけであり（０．７６＋／−０．１６μＡ）、そして試験した他のいずれの３種のウイルス（ＡＶ２ｔｇＣＦ、ＡＶ２／５ｔｇＣＦまたはＡＶ２／５ＣＦ８３）で有意な機能的相関は見られなかった。しかしプロテアソームインヒビターＬＬｎＬおよびドキソルビシンが感染時にのみ提供された時、ＡＶ２ＣＦ８３はＣＦ上皮中のＩＢＭＸ／フォルスコリン刺激で、ＣＦＴＲ媒介型のクロライド電流を最高レベル（２．９＋／−０．３μＡ）で回復し、正常なヒト気道上皮で見られる（３．５＋／−０．８μＡ）約８０％に達した。驚くべきことには、同じ合成プロモーターを持つシュードタイプＡＶ２／５ＣＦ８３が、ＣＦ上皮においてクロライド電流の有意に低い相関を与え（１．０＋／−０．２μＡ）、そしてＩＴＲプロモーターＣＦＴＲベクターＡＶ２ｔｇＣＦ（１．９＋／−０．２μＡ）で見られるよりもさらに一層低かった。各血清型に関して、８３ｂｐの合成プロモーターの付加は、ＩＴＲ駆動ＣＦＴＲベクターと比べた時、ＩＢＭＸ／フォルスコリン応答性Ｉｓｃを有意に上昇させた（ｐ＜０．０３）。
細胞内ウイルスゲノムの機能的活性は、ベクター投与時にＬＬｎＬ／Ｄｏｘを加えることにより有意に強化される 機能的矯正のレベルを、ｒＡＡＶベクターゲノムがＣＦＴＲｍＲＮＡを発現する能力と相関させるために、上皮を機能的分析後に回収し、そしてベクターに由来するｍＲＮＡおよびＤＮＡを各サンプルについて定量した。ベクターに由来するｍＲＮＡの定量は、ベクターに由来する、および内因性ＣＦＴＲのｍＲＮＡのコピーを、β−グルクロニダーゼ（ＧＵＳ）発現のレベルに標準化するＧｅｒａｒｄ ｅｔ ａｌ．（２００３）のＲＳ−ＰＣＲ法に記載されているように行った（ｒＡＡＶ ＣＦ臨床試験サンプルの分析に使用した方法と同じ方法（Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００３を参照にされたい））。この分析からの結果（図８Ａ）は、ベクター投与時にＬＬｎＬ／Ｄｏｘを受けなかったすべてのベクター群で、ベクターに由来するＣＦＴＲｍＲＮＡ転写物はほとんど検出できないことが示された。これらの結果は、これらの実験群で見られるＣＦＴＲ機能の活性の損失を支持する。対照的にＬＬｎＬ／Ｄｏｘ処理は、ＡＶ２ｔｇＣＦおよびＡＶ２ＣＦ８３の両ベクター群で、ベクターに由来するＣＦＴＲｍＲＮＡ転写物のレベルを、１５０倍を越えるまで有意に強化した。類似の誘導レベルがＡＶ２／５ベクター群でも見られたが、ベクターに由来するＣＦＴＲｍＲＮＡの全レベルは、ＡＶ２ベクター群で見られるレベルよりも１０〜４０倍低く留まった。種々のベクター群において、内因性ＣＦＴＲｍＲＮＡレベルに対する導入遺伝子に由来するＣＦＴＲｍＲＮＡの比較も、内因性のレベルに等しいか、またはわずかに高いＡＶ２ｔｇＣＦおよびＡＶ２ＣＦ８３群（図８Ｂ）での大きな相対的発現を反映した。種々のベクター群間のベクターに由来するＣＦＴＲｍＲＮＡにおける倍数の差異は、ＣＦＴＲ矯正における倍数の差異を定量的に映さず、全体的な傾向は類似した。すべてのｒＡＡＶベクターは、プロテアソーム調節剤が感染時に適用された場合、より一層高いレベルのベクターに由来するＣＦＴＲｍＲＮＡを与え、そしてＣＦＴＲの機能的矯正と一致し、ＡＡＶ２ベクターはＡＡＶ２／５ベクターよりも一層高くＣＦＴＲｍＲＮＡを発現した。
プロテアソームインヒビターが頂端側細胞膜からのｒＡＡＶの形質導入を高めるメカニズムの現在の知識は、これらの薬剤が核へのｒＡＡＶの移動を高める細胞内プロセスに作用することを示唆している（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００ａ；Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）。この根元的仮説に基づき、種々の血清型および処理条件のそれぞれについて、形質導入から１５日後に細胞内に留まるウイルスＤＮＡのレベルを評価した。以前の実験を考え（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００ａ；Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）、ＬＬｎＬ／Ｄｏｘは主により多くの核での蓄積および二本鎖中間体への転換により、ウイルスゲノムの転写活性を上げるだろうと予想した。さらに実質的なウイルスＤＮＡはＬＬｎＬ／Ｄｏｘの不存在下で感染した上皮に留まり、これらの形態は主に一本鎖ゲノムとして転写的に不活性であろうと予想された。ＤＮＡ分析からの結果は、これらの仮説を正に支持した。ＬＬｎＬ／Ｄｏｘ処理はベクター型にかかわらず、２−３倍までＤＮＡの存続をわずかに上げるだけであった（図９Ａ）。しかしベクターに由来するｍＲＮＡ／ＤＮＡ比を計算することにより、ウイルスゲノムの転写活性を評価した場合、ＬＬｎＬ／Ｄｏｘ処理は、ＡＶ２ベクター群について４０−５０倍までベクターゲノムの転写活性を有意に強化した（図９Ｂ）。ＡＶ５ベクター群に関して、ベクターに由来するｍＲＮＡ／ＤＮＡ比の強化も大変大きかったが、ＬＬｎＬ／Ｄｏｘの不存在下でのｍＲＮＡレベルがバックグラウンドレベルであったために正確に算出できなかった。これらの知見は、細胞内の全体的な量に有意な影響を及ぼすことなく、プロテアソームのモジュレーションがｒＡＡＶゲノムの転写的に活性な中間体への細胞内プロセッシングを、より効率的にするという概念を支持する。
またベクターに由来するｍＲＮＡ／ＤＮＡ比の評価は、短い８３ｂｐの最小プロモーターを含むベクターの上昇した効率の評価にも有用であった。ＣＦ８３プロモーターは、ＩＴＲプロモーターで見られるよりも３０倍以上高くＩＢ３細胞中の遺伝子のレポーター遺伝子発現を改善したが（Ｌｙｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９９）、遺伝子発現に及ぼす効果は分化した気道上皮では最小であった。ＲＮＡ／ＤＮＡ比は、ＬＬｎＬおよびＤｏｘの存在下で、ＡＶ２ｔｇＣＦと比べた時、ＡＶ２ＣＦ８３に関しては有意に異ならず、合成プロモーターを含むゲノムの転写活性に有意な増加を意味しなかった。しかしＡＶ２／５ＣＦ８３に関するＲＮＡ／ＤＮＡ比は、ＡＶ２／５ｔｇＣＦよりも約３倍高く、合成プロモーターは転写に幾らかの有益な効果を有することができるが、ＩＢ３細胞ほど大きくはないことを示唆する。
プロテアソーム調節剤は、ＥＮａＣサブユニットのｍＲＮＡレベルを減少させることにより、ＣＦ気道上皮におけるアミロライド感受性ナトリウム電流を下げる ＥＮａＣはＣＦ気道上皮におけるベースライン短絡電流の主要成分であり、そして機能的ＣＦＴＲの欠如により大きく上昇する。これまでに、ＣＦＴＲ発現ベクターを用いて、わずか６−１０％の形質導入が、上皮のＣｌ−イオンのギャプ連結部の細胞−細胞共役により、分極した気道上皮におけるＣＦＴＲ媒介型のクロライド電流を完全に矯正できることが示唆された（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）。対照的に、調節不能（ｄｙｓｒｅｇｕｌａｔｅｄ）のＥＮａＣ活性により生じる上昇したＮａ＋電流の標準化には、Ｎａ＋伝導を正しく調節するためにＣＦＴＲがＥＮａＣと物理的に完全に相互作用しなければならないので、ＣＦ上皮の１００％の形質導入が必要である（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）。その結果、各ＣＦＴＲベクター処理群における上昇したアミロライド感受性ナトリウム電流の標準化の程度は、上皮においてベクターに由来するＣＦＴＲを発現する細胞の割合を間接的に推定するため使用することができる。アミロライド感受性のＥＮａＣ短絡電流の評価は、ＬＬｎＬ／Ｄｏｘと共に投与されたすべてのベクター群が、感染から１５日後に上昇したＮａ＋電流の完全な標準化を示したという驚くべき事実を明らかにした（図１０Ａおよび１２）。この知見のさらなる分析では、ＥＮａＣ活性に及ぼすこの効果はベクター投与には無関係であり、そしてｍｏｃｋ感染した対照でも見られることを示した（図１０Ａ）。ＬＬｎＬ／Ｄｏｘが誘導するＥＮａＣ活性におけるこれらの変化にもかかわらず、すべての群間で経膜抵抗に差異は見られず、上皮が実験を通じて完全なままであることを示唆した。さらに１５日のＬＬｎＬ／Ｄｏｘ処理カルチャーの形態学的分析では、対照の未処理カルチャーに比べて上皮の完全性に明らかな形態学変化は無いことが示された。この知見はこれらの実験におけるＥＮａＣのダウンレギュレーションが、ＣＦＴＲの矯正とは無関係であり、そして主にプロテアソーム調節剤により媒介されているという概念を支持する。
１回のＬＬｎＬ／Ｄｏｘでの処理が１５日間、ＣＦ気道上皮におけるＥＮａＣ電流を標準化できたという知見に興味をそそられ、このメカニズムには特定のＥＮａＣサブユニットのダウンレギュレーションが関与するかもしれないと仮説した。このために、定量的ＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲを使用して、ＬＬｎＬ／Ｄｏｘ処理後の分極したＣＦ気道上皮におけるα、βおよびγＥＮａＣサブユニットのｍＲＮＡレベルを測定した（図１０Ｂ）。この分析結果は、β−アクチンｍＲＮＡに対するγ−ＥＮａＣサブユニットの比率は、非処理群（０．２２２＋／−０．０９６、ｎ＝１２）に比べて、ＬＬｎＬ／Ｄｏｘ処理群（０．０１４＋／−０．００４６、ｎ＝９）で最も有意に減少したことを示した。同様に、α−ＥＮａＣおよびβ−ＥＮａＣのｍＲＮＡレベルも、プロテアソーム調節剤の処理後にそれぞれ２および３倍低下した。これらの知見は、主にγ−ＥＮａＣサブユニットの低下した転写が、ＬＬｎＬおよび／またはＤｏｘによるＥＮａＣ電流で観察された阻害の原因になるかもしれないことを示唆した。
ＬＬｎＬおよび／またはＤｏｘがＣＦ気道上皮におけるＥＮａＣ機能を阻害するように作用しているのかどうかを識別するために、各化合物の効果を個別に分析した。この分析結果は、Ｄｏｘ単独がＤｏｘ／ＬＬｎＬを合わせて見られるものに等しいＥＮａＣ Ｉｓｃの阻害を提供し、そしてＬＬｎＬ単独よりも大きかった（データは示さず）。ＥＮａＣサブユニット遺伝子の転写阻害が、ＥＮａＣ機能のＤｏｘ依存的低下の原因であるという仮説を用いて、Ｄｏｘの存在下で見られるアミロライド感受性Ｉｓｃの変化のタイムコースを評価した。この実験には比較的多数のＣＦサンプルを要したので、最近報告された形質転換したＣｕＧｉ細胞モデルを使用して分極した空気−液体界面ＣＦ上皮を生成した（Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００３）。このモデルは以前に、ＣＦに関連する上昇したＥＮａＣ活性の指標である上昇したベースラインのアミロライド感受性Ｉｓｃを示した。この分析結果は、対象の未処理サンプルでは観察されない１〜１４日にわたるＤｏｘ処理ＣＦ上皮のＥＮａＣ Ｉｓｃに漸次的低下を示した（図１０Ｃ）。
ドキソルビシン処理はγ−ＥＮａＣプロモーターのメチル化を上昇させる ドキソルビシンの処理はＭＤＲ−１遺伝子プロモーターのＣｐＧ脱メチル化を導き、そしてその結果としてＭＤＲ発現を上げることが報告されたので（Ｋｕｓａｂａ ｅｔ ａｌ．，１９９９）、γ−ＥＮａＣ遺伝子プロモーターの上昇したＣｐＧメチル化が反対のＤｏｘ依存的効果を生じるかもしれないと仮定した。この仮説を試験するために、ゲノムＤＮＡが容易に作成できる気道細胞モデル系を開発した。第１に、非ＣＦ気道細胞株（Ａ５４９）がＤｏｘ処理後にγ−ＥＮａＣｍＲＮＡ発現に同様の調節変化を生成するのかどうかを測定した。実際に、Ａ５４９細胞のＤｏｘ処理はコンフルエンスに成長したカルチャー中のγ−ＥＮａＣ／β−アクチンｍＲＮＡ比に劇的な低下を導いた（図１１Ａ）。未処理Ａ５４９細胞は、コンフルエンス後にγ−ＥＮａＣｍＲＮＡレベルを進行的に上昇させたが、Ｄｏｘ処理カルチャー中でγ−ＥＮａＣｍＲＮＡレベルはコンフルエンス前および後で一貫して低いままであった。
γ−ＥＮａＣ遺伝子プロモーターを分析した以前の報告では、約−２００〜−３４０ｂｐに適切に広がったＣｐＧアイランドの存在を示した（Ａｕｅｒｂａｃｈ ｅｔ ａｌ．，２０００）。さらなる分析で、γ−ＥＮａＣ遺伝子の転写開始部位の約１．８ｋｂ上流に位置する２番目に大きいＣｐＧアイランドが、オンラインのツールであるＣｐＧ Ｉｓｌａｎｄ Ｓｅａｒｃｈｅｒ、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｅｔｈｄｂ．ｄｅ／を使用して同定された（図１１Ｂ）。メチル化感受性エンドヌクレアーゼ消化ＰＣＲアッセイ（Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９８）を使用して、Ｄｏｘで処理した、またはしなかったＡ５４９細胞に由来するゲノムＤＮＡを、ＣｐＧメチル化について評価した。このアッセイは、多数のＭｓｐＩ／ＨｐａＩＩ部位を含むこのＣｐＧアイランド中の３１０ｂｐ領域を挟むプライマーを利用した。ＭｓｐＩおよびＨｐａＩＩはＤＮＡ中の同じ配列を消化するが、ＨｐａＩＩはＣｐＧメチル化が存在するならば消化しない。この分析結果は、ＣｐＧアイランドのこの領域でＨｐａＩＩ消化に由来する有意なＤｏｘ依存的保護を示した（図１１Ｃ）。これらの知見は、γ−ＥＮａＣプロモーターのＣｐＧメチル化が、Ｄｏｘ処理に応答して正に起こることを示唆した。
考察
現在のｒＡＡＶ形質導入生物学の知識は、受容体量および／またはウイルスの核への移動に影響を及ぼす細胞内バリアの両方が、所定の組織標的における遺伝子治療用のこのベクターの効率に影響を及ぼす重要な決定要因であることを示唆する。ＣＦ肺疾患のための現行の遺伝子治療は、ｒＡＡＶ−２について感動的な安全性プロファイルを示したが、ＣＦＴＲ導入遺伝子発現を示すことはできなかった（Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００３）。この欠点の由来は、ｒＡＡＶ生物学および／またはベクター設計の幾つかの観点による可能性がある。第１に、ＣＦＴＲｃＤＮＡは大変大きいので、現在の試験での低レベル発現は、ＣＦＴＲ遺伝子の発現を駆動するために使用するＩＴＲの低いプロモーター活性による可能性がある。第２に、マウスを対象として実験は、ｒＡＡＶ−５が気道上皮をさらに一層効率的に感染させることを示した（Ｚａｂｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ ｅｔ ａｌ．，２００２）。したがって、肺の遺伝子送達用の治療的基盤（ｐｌａｔｆｏｒｍ）としてのｒＡＡＶ−２の選択が、最適とはなり得ない。第３に、実験はユビキチン／プロテアソーム系により制御される細胞内プロセスが、両２型および５型血清型を用いたｒＡＡＶの形質導入に有意に影響を及ぼす（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００；Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）。本実験は、これら３つのパラメーターのどれが現行のＣＦ肺の遺伝子治療の試みの効力に最大の影響を及ぼすかを直接評価するために計画した。現在、臨床的に使用されているＣＦＴＲ ＡＡＶ−２ベクターをそのまま、ＡＡＶ２／５シュードタイプウイルスおよびＣＦＴＲの上流に最小８３ｂｐのプロモーターを包含する新規ベクター設計の両方と比較した。
現在の臨床試験に対する重要な最初の論及は、適用されるプロテアソームインヒビターの不存在下でのＣＦＴＲ送達および発現の評価であった。この内容については、ＩＴＲプロモーターｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ２／５に基づくベクターは、有意なＣＦＴＲ機能補正またはｍＲＮＡ発現を与えなかったが、１５日間持続する有意な数のウイルスゲノムを気道上皮へ送達することができた。ＡＶ２ｔｇＣＦベクターに関して、この知見は現在の臨床的知見と一致する（Ｆｌｏｔｔｅ ｅｔ ａｌ．，２００３）。プロテアソーム調節剤の同時投与は、両ｒＡＡＶ−２およびｒＡＡＶ２／５ベクターがＣＦＴＲクロライド輸送の異常を矯正する能力を有意に改善した。重要なことは、これが分極したヒトＣＦ気道上皮におけるＣＦＴＲ機能矯正の最初の証明である点である。驚くべきことには、マウスの実験に基づき、ｒＡＡＶ−２ベクターはｒＡＡＶ２／５と比べて有意に高レベルのＣＦＴＲ機能的相関およびｍＲＮＡ発現を与えた。さらにＣＦ８３最小プロモーターの付加は、機能的矯正および／またはＣＦＴＲｍＲＮＡ発現にわずかな改善を与えただけであることを示した。
これらの比較から幾つかの重要な知見は、ヒト気道における我々のｒＡＡＶ形質導入生物学の理解に重要な意味をもつ。第１に、プロテアソーム調節剤がＣＦＴＲｍＲＮＡ発現および機能的矯正を劇的に上昇させたが、それらは細胞中でベクターゲノムの持続性をわずかに上昇させただけであった。そのような知見は、ウイルスゲノムの細胞内プロセッシングが気道の形質導入における主要な律速段階であることを示す以前の実験と一致する。以前の報告に基づき、この律速段階にはユビキチン／プロテアソーム依存的様式での核へのウイルスのトラフィッキングが関与し、そしてウイルスゲノムの第２鎖の合成は関与しないようである（Ｄｕａｎ ｅｔ ａｌ．，２０００ａ；Ｄｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００３）。このメカニズムの支持では、ウイルスゲノムの機能的活性（ｍＲＮＡ／ベクター比）が、ＬＬｎＬ／Ｄｏｘ処理後に４０〜５０倍上昇した。ｒＡＡＶ−２ベクターはｒＡＡＶ−５ベクターよりも良く機能したが、ウイルスゲノムの機能的活性を上げることに及ぼすプロテアソーム調節剤の効果は、２型および５型血清型の両方に共通した。
ＣＦ気道へのｒＡＡＶ媒介型のＣＦＴＲ送達を高めるためのプロテアソーム調節剤の現在の分析から驚くべき知見の１つは、これらの同じ薬剤が独立したメカニズムを介して、ＣＦに関連するＥＮａＣ過活性を同時に標準化するという観察であった。そのような知見は、プロテアソーム調節剤が１次的病状を処置し、そしてＣＦ肺疾患の遺伝子治療を高めるための薬理学的薬剤として、二重治療薬の用途を有することができることを示唆する。アミロライド感受性の上皮ナトリウムチャンネル（ＥＮａＣ）は、気道、腎臓および結腸を含む多くの型の上皮をわたるナトリウム輸送を制御する。ＣＦ気道では、ＣＦＴＲ機能の損失が、抑制されない過剰なＥＮａＣ活性をもたらし、これが次いで気道上皮を脱水し、気道の細胞表面のクリアランス能力を消失させ（Ｊｏｈｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５）、ＣＦ患者に重篤な気道感染の再発を導くと仮定された（Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ｇｕｇｇｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，１９９９）。現在の実験では、ＬＬｎＬとドキソルビシン（Ｄｏｘ）とを組み合わせた投与が、ＣＦＴＲの相補（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ）とは無関係な様式で、ＣＦ上皮に見られる強化されたＥＮａＣ活性を抑制した。このＥＮａＣ活性に及ぼす影響は、γ−ＥＮａＣプロモーターの改変された遺伝子転写により主に現れるらしく、減少したレベルのγ−ＥＮａＣｍＲＮＡを導く。
ＥＮａＣ活性は、チャンネル開放の可能性または細胞表面上の機能的ＥＮａＣ分子の数を改変するいずれかにより調節することができる。以前の実験は、ユビキチン−プロテアソームタンパク質分解系と細胞表面上のＥＮａＣ代謝回転の調節との間の連結を証明した。ＥＮａＣは３種のサブユニット（α、βおよびγ）からなり、その各々がプロリンリッチ領域（ＰＰＸＹ）をＣ−末端に有する。このＰＰＸＹ領域を介してユビキチンリガーゼＮｅｄｄ４はＥＮａＣと相互作用し、そしてαおよびγサブユニットのＮ−末端でリシン残基の基の突然変異が、ユビキチン化および上昇したＥＮａＣ活性の抑制を導く（Ｓｔａｕｂ ｅｔ ａｌ．，１９９７）。さらに、カルボベンズオキシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシル−Ｌ−ロイシナル（ＭＧ１３２）は、膜でのＥＮａＣサブユニットレベルおよびＥＮａＣ活性を上昇させることが示された（Ｍａｌｉｋ ｅｔ ａｌ．，２００１）。これらの知見は、ドキソルビシンがγ−ＥＮａＣプロモーターのＣｐＧメチル化の上昇および他のＥＮａＣサブユニットプロモーターのメチル化の可能性を介して、長期ＥＮａＣ活性を抑制するという本考察と全く対照をなす。さらに１５日間続くＬＬｎＬ／Ｄｏｘの単回投与の長期効果は、Ｎｅｄｄ４ユビキチンリガーゼによるＥＮａＣの短期調節とは異なるらしい転写調節が関与している阻害メカニズムを支持する。興味深いことには、ドキソルビシンはＭＤＲ−１プロモーターのメチル化を改変し、そして多剤耐性遺伝子（ＭＤＲ−１）の転写活性を上げることが示された（Ｋｕｓａｂａ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｎａｋａｙａｍａ ｅｔ ａｌ．，１９９８；Ａｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，２０００）。ＭＤＲ−１およびγ−ＥＮａＣプロモーターのメチル化に及ぼすドキソルビシンの正味の効果は正反対であるが、ＣｐＧメチル化における変化を制御するプロセッシングは、同様に制御され得る。
プロテアソーム調節剤がＣＦ気道上皮におけるベースラインＥＮａＣ活性を改変するという知見は、ｒＡＡＶの形質導入も高めるそれらの合わせた能力の外に、実際的な治療的応用を有することができる。ＥＮａＣの過活性がＣＦで表面の気道流体層を脱水し、そして気道のバクテリアのクリアランスを減少させると考えられている事実を考慮すると、ＥＮａＣ活性を阻害する吸入したプロテアソーム調節剤は、エーロゾル化した化合物（１つまたは複数）としてＣＦ患者の肺に適用して気道のクリアランスを高めることができる。ＥＮａＣを阻害するために、エーロゾル化したアミロライド（細胞に結合したＥＮａＣに直接結合する薬剤）を使用したこれまでの試みは、ＣＦの臨床試験でほとんど機能的な利益を示さなかったが（Ｋｎｏｗｌｅｓ ｅｔ ａｌ．，１９９９；Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，１９９３）、そのような初期の取り組みは阻害化合物の短い半減期によるために失敗した可能性がある。ドキソルビシンはＥＮａＣ活性にさらに一層長い阻害効果を示すので、その効力は有意に改善され得る。すなわち本知見は、現在臨床的に使用されているｒＡＡＶ−２ＣＦＴＲベクターは、プロテアソーム調節剤が感染時に同時に投与されれば、ＣＦ肺疾患の遺伝子治療のために実質的な治療的用途を有することができることを示唆する。疾患の１次的な病態生理学的欠損を処置し、そして同時に遺伝子治療の効力を上げる両方のｐｈａｒｍｉｏ−遺伝子治療の二重の治療的用途は、薬剤開発の新たな分野を表す。
ＥＮａＣの転写を改変する薬剤に関するアッセイ
ＥＮａＣの転写に影響する薬剤は、転写またはＲＮＡの安定性を測定するアッセイ、例えばＥＮａＣの種々のサブユニットに関するＲＴ ＰＣＲのようなインビトロアッセイを含め、種々のアッセイを使用して、Ａ５４９細胞または他の適当な細胞型を１または複数の薬剤で処理した後に評価することができる。例えば細胞、その溶解物、またはインビトロ転写／翻訳混合物は、９６ウェル形式に配置され、続いて高処理量のリアルタイムＰＣＲが９６ウェルプレート中の１または複数のＥＮａＣサブユニットについて行われる。１つの態様では、１または複数の薬剤が細胞、その溶解物、またはインビトロ転写／翻訳混合物に加えられる前、最中または後に細胞をウイルスベクターに感染させることができる。
ＣＦマウスを使用して、ＥＮａＣの機能阻害に関するインビボに基づくスクリーニングも使用することができる。ＣＦマウスの鼻上皮の電気生理学的特性は、ヒトの鼻および肺気道で見いだされる特性に大変類似し（Ｇｒｕｂｂ ｅｔ ａｌ．，１９９４）、そして欠損ＣＦＴＲはＥＮａＣの過剰反応性を導く。細胞に基づくスクリーニングで同定された薬剤がＥＮａＣ転写、したがってＥＮａＣ機能を阻害する能力を確認するために、ＣＦＴＲノックアウトマウスを使用することができる。試験する薬剤は、限定するわけではないがｉ．ｖ．、ｉ．ｐ．、気管内または鼻への適用を含む適切な経路により、鼻の電位差の測定の機能的分析の前に一定間隔（数日から数週間）で、マウスに送達される。簡単に説明すると、内径２００μｍのカテーテルを潅流シリンジポンプに直接連結する。シリンジは１Ｍ ＫＣＬ寒天塩ブリッジを介してカロメロ電極および電圧計に連結した。第２のカロメロ電極は、マウスの皮下に移植した１Ｍ ＫＣＬ寒天を充填した２１ゲージ針に連結した。いったんカテーテルを鼻孔に配置すれば、２μｌ／分の流速で潅流が始まった。カテーテルの位置は、最初の出発バッファー中で最も負の経膜電位を得るように調整した。電位差測定は、以下の潅流バッファーの順序で行った：ｉ）１０ｍＭのＨｅｐｅｓｐＨ７．４、１４５ｍＭのＮａＣｌ、５ｍＭのＫＣＬ、１．２ｍＭのＭｇＳＯ４、１．２ｍＭのＣａ−グルコネート、２．４ｍＭのＫ２ＨＰＯ４、０．４ｍＭのＫＨ２ＰＯ４を含有するＨｅｐｅｓリン酸緩衝化リンゲル溶液（ＨＰＢＲ）、ｉｉ）１００μＭのアミロイドを含むＨＰＢＲ、ｉｉｉ）ＨＰＢＲクロライド不含（クロライドの代わりにグルコネートを使用）、１００μＭアミロライド、ｉｖ）ＨＰＢＲクロライド不含、１００μＭアミロライド、１０μＭフォルスコリン、１００μＭ ＵＴＰ。コンピューターによるｍＶの記録は、各バッファーについて全体で３分間、５秒毎に取った。
アミロライド感受性応答に及ぼす薬剤前処理の影響を評価する。ドキソルビシンの場合、アミロライド感受性の電圧変化は、賦形剤で処置した対照に比べてＣＦマウスで減少すると予測される。低クロライド、フォルスコリンおよびＵＴＰ応答の評価は、上皮の完全性に関する対照として用いる。ＥＮａＣ転写における変化を確認するために、種々のＥＮａＣサブユニットプロモーターについて、ＤＮＡを鼻の細胞から単離し、そしてメチル化感受性ＰＣＲ分析を行う。そのような鼻の電位差（ＰＤ）測定の例を、図２１に与える。
さらなるプロテアソームモジュレーションのインビトロおよびインビボ活性
ドキソルビシンを用いた結果に基づき、少数のＦＤＡ認可アントラサイクリン類をそれらのＡＡＶ形質導入に関する相対的インビトロおよびインビボ活性について試験した。ＨｅＬａ細胞は、種々のアントラサイクリン類、例えばドキソルビシン、ダウノルビシン（Ｃｅｒｕｂｉｄｉｎｅ）、エピルビシン（Ｅｌｌｅｎｃｅ（商標））およびイダルビシン（Ｉｄａｍｙｃｉｎ（商標））の存在下で、１００ｐｐｃのＡＡＶ２ＦＬＡＧ−Ｌｕｃを用いて２時間感染させ、そして細胞を４８時間後に回収した。アントラサイクリン類は医薬品級であり、そして製造元の指示に従い調製した。使用前、薬剤を等量の滅菌水に希釈した（例えば０．６μｇ／ｍＬ、３μｇ／ｍＬおよび６μｇ／ｍＬ）。結果を図１４に示す。例えば３μｇ／ｍＬのイダマイシンは、ルシフェラーゼ発現を５０００倍以上に上昇させたのに対し、ドキソルビシンはルシフェラーゼ発現を５８倍まで上昇させた。一般に効力は以下の通りであった：イダルビシン＞ダウノルビシン＞エピルビシン＞ドキソルビシン。
１０匹の６群の５〜７週齢のＢａｌｂ／ｃマウス（１群あたり５匹のオスおよび５匹のメス）は、単回用量を鼻内送達した後、種々のアントラサイクリン誘導体の相対的インビボ効力および安全性の比較に使用した。処置は図３に示すように投与した。動物は投与後、７日間追跡した。
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モジュレーターの用量は、ヒト用量等価（Ｈｕｍａｎ Ｄｏｓｅ Ｅｑｕｉｖａｌｅｎｔ：ＨＤＥ）に基づき、そして以下の表４にまとめる。鼻内投与については、用量は１０％のＨＤＥの一定に維持した。静脈内陽性対照（ドキシル）については、１０ｍｇ／ｋｇ（７５％）用量のＨＤＥを使用した。これは初期の実験で、平均および中間ルシフェラーゼ発現に１０％の上昇を与える最低用量を表した。
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安全性の終点には、罹病率および死亡率、臨床的所見、体重、全体的な検視、および組織病理学を含んだ。形質導入の終点には、ルシフェラーゼおよびＧＦＰ分析を含んだ。
屠殺の日、左肺を肺外気管支のレベルで絞め、摘出し、そしてドライアイス上で凍結した。左肺を均一化し、そしてプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）（マジソン、ウィスコンシン州）のルシフェラーゼアッセイシステムを使用して、ルシフェラーゼ発現用に処理した。発光はＢｅｒｔｈｏｌｄ ＡｕｔｏＬｕｍａｔ ＬＢ９５３装置を使用して測定した。サンプルはピアス（Ｐｉｅｒｃｅ）（ロックフォード、イリノイ州）のクーマシープラスタンパク質アッセイ試薬を使用して総タンパク質について標準化した。
１０％ＨＤＥでのドキソルビシンおよびイダマイシンの鼻内投与は、両方が数匹の動物の初期死亡率、波立った皮毛、および病気のマウスと関連した。さらに生存した動物も
１週間にわたりかなり体重が減少した。鼻内でドキシル処置した動物は、初期の死亡率が無いこと、およびそれらは臨床的に正常である点でドキソルビシンまたはイダマイシンで処置した動物よりも良かった。しかしそれらも体重が減った。静脈内でドキシル処置したマウスが最も良かった。
ドキソルビシンおよびイダマイシンの鼻内処置は、上昇したルシフェラーゼ発現をもたらした（図１５および表５）。１０％ＨＤＥ（静脈内および鼻内の両方）でドキシルを用いた処置は、投与から７日後のルシフェラーゼ発現に、それぞれ４９倍および７４倍までの平均増加をもたらした。
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全ての刊行物、特許および特許出願は、引用により本明細書に編入する。前記明細書では、本発明はその特定の好適な態様に関して記載し、そして多くの詳細を具体的説明の目的で説明してきたが、当業者には本発明が付加的な態様を受け入れることができ、そして本明細書の特定の詳細は本発明の基本原理から逸脱することなく相当に変動させてよいことが明らかであろう。
図１Ａ−Ｅは、種々の薬剤の存在下または不存在下で、ｒＡＡＶＦＬＡＧ−ＬｕｃでトランスフェクトしたＨｅＬａ細胞中のルシフェラーゼ活性である。ＨｅＬａ細胞は、１００ｐｐｃＡＡＶＦＬＡＧ−Ｌｕｃと２時間接触させ、そして細胞を４８時間後に回収した。Ｎ＝３、平均±標準偏差。 ドキシルを用いたｒＡＡＶ形質導入のインビボ強化。静脈内にドキシルを投与されたオスのＢａｌｂ／ｃマウスは、１×１０１１ＤＲＰのＡＡＶ２ＦＬＡＧ−Ｌｕｃ（０１：００４）を気管内に点滴注入された。 プロテアソームインヒビターであるＬＬｎＬおよびドキソルビシン（Ｄｏｘ）の、不死化ヒト気道細胞株ＩＢ３（パネルＡ）およびＡ５４９（パネルＢ）のＡＶ２ＬｕｃおよびＡＶ２／５Ｌｕｃ形質導入に及ぼす効果を評価した。プロテアソーム調節剤は、感染時に各ｒＡＡＶベクターと同時に投与し（細胞あたり５００粒子のＭＯＩ）、そして形質導入を２４時間後に評価した。種々の濃度の各化学物質は、各グラフ中に示すように評価した。データは、相対的ルシフェラーゼ活性実験の平均（＋／−ＳＥＭ）を表す（Ｎ＝４）。 ＤｏｘおよびＬＬｎＬは、ｒＡＶ２の形質導入にさらなる誘導を提供する。ＨｅＬａ細胞（左パネル）およひＡ５４９細胞（右パネル）は、示した薬剤の組み合わせの存在下にてｒＡＡＶ（５００粒子／細胞のＭＯＩ）で感染させ、そして発現した導入遺伝子を感染後２４時間に評価した（平均＋／−ＳＥＭ、Ｎ＝４）。賦形剤で処理したｒＡＡＶ感染細胞に対する誘導倍率は、各棒の上に示す。 プロテアソーム調節剤の組み合わせ投与は、分極したヒト気道上皮の頂端面からのｒＡＡＶの形質導入を相乗的に誘導することができる。（Ａ）１×１０９粒子のＡＶ２Ｌｕｃを、ＬＬｎＬ（４０μＭ）および／またはＤｏｘ（５μＭ）の種々の組み合わせの不存在および存在下で、分極したヒト気道上皮カルチャーの頂端面に適用した。ルシフェラーゼ発現は、感染から３および１７日後にアッセイした。（Ｂ−Ｅ）類似の結果が、自己相補的（ｓｅｌｆ ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｙ）（２．３ｋｂ）ｓｃＡＶ２ｅＧＦＲベクターでの頂感染後に、感染から１５日で観察された。（Ｆ）ＬＬｎＬおよびＤｏｘの組み合わせ投与は、トランス−スプライスされたＬａｃＺ遺伝子産物の二重ベクターヘテロ二量体が媒介する送達を増した。ＡＶ２ＬａｃＺｄｏｎｏｒ（Ｄで表す）および／またはＡＶ２ＬａｃＺａｃｃｅｐｔｏｒ（Ａにより表す）の１０１０粒子を、ＬＬｎＬ（４０μＭ）およびＤｏｘ（５μＭ）の同時投与の存在または不存在下で、分極した気道上皮の各トランスウェルを感染させるために使用した。β−ガラクトシダーゼ活性を、感染から１５日後に評価した。データは３回の独立した実験に関する相対的ルシフェラーゼまたはβ−ガラクトシダーゼ活性（１／１０サンプルあたり）の平均（＋／−ＳＥＭ）を表す。 マウス肺へのインビボ遺伝子導入。ＡＶ２およびＡＶ２／５ルシフェラーゼベクターを使用して、プロテアソーム調節剤が形質導入を誘導する能力を評価した。結果は、各条件について感染から１４日後のマウス肺に由来するルシフェラーゼ発現の平均（＋／−ＳＥＭ）（Ｎ＝５）を表す。 ＣＦＴＲｒＡＡＶとプロテアソームモジュレーションを組み合わせて使用して、ＣＦ気道上皮におけるＣＦＴＲクロライド輸送異常の相補。結果はｘ軸に印を付けた示した条件下で処理したＣＦ気道上皮におけるＩＢＭＸ／フォルスコリンに応答するデルタＩＳｃの平均（＋／−ＳＥＭ）（Ｎ＝９）を表す。非ＣＦ未処理対照（標準と記した）からの応答は完全に機能的なＣＦＴＲに関する参照として与え、一方、他のすべての処理群は、ＣＦ上皮であった。アッセイは感染から１５日後に行った。 ＣＦ気道上皮における導入遺伝子に由来する、および内因性ＣＦＴＲのｍＲＮＡの発現。（Ａ）ＲＳ−ＰＣＲは、図７で分析したすべてのＣＦ気道上皮サンプルにおけるｒＡＡＶおよび内因性ＣＦＴＲのｍＲＮＡの相対的レベルを測定するために使用した。値はＣＦＴＲのｍＲＮＡの相対コピーの平均＋／−ＳＥＭ（Ｎ＝９）を表す。（Ｂ）内因性ＣＦＴＲｍＲＮＡに対する導入遺伝子由来の相対比率を、各サンプルについて個別に算出し、矯正の相対的レベルの指標としてプロットした。値は平均＋／−ＳＥＭ（Ｎ＝９）で表す。１の相対比は、およそ等しいレベルの導入遺伝子由来および内因性ＣＦＴＲメッセッージを反映する。 ＣＦ気道上皮のｒＡＡＶ感染後のベクターＤＮＡの定量。ｍＲＮＡ単離後に残る全ＤＮＡ画分（核および細胞質）は、示した条件下についてベクターゲノム数についてＴａｑＭａｎ ＰＣＲにより定量した。サンプルは図７および８で分析したものと同一であった。（Ａ）値は各サンプルに関するｒＡＡＶ ＣＦＴＲベクターゲノムの相対コピーの平均＋／−ＳＥＭ（Ｎ＝９）である。（Ｂ）ベクターＤＮＡに対するベクター由来ＣＦＴＲｍＲＮＡの比率は、ベクターゲノムの転写活性の指標として、各個別のサンプルについて算出した。より高い比率は、所定の条件に関してベクターゲノムあたり、より大きいレベルの転写を表す。値は平均＋／−ＳＥＭ（Ｎ＝９）を表す。 プロテアソームモジュレーションは、分極したＣＦ気道上皮におけるアミロライド感受性のナトリウムチャンネルの機能を阻害する。（Ａ）ＣＦ気道上皮は、感染時に適用するＬＬｎＬ／Ｄｏｘの存在または不存在下で、示したウイルスベクターに感染させた。結果は、示した各処置に関して、ＣＦ気道上皮細胞におけるアミロライド感受性ナトリウム電流の平均＋／−ＳＥＭ（Ｎ＝９）を表す。図７および８Ａの結果と比較した時、ＬＬｎＬ／ＤｏｘによるＥＮａＣ活性の減少は、ＣＦＴＲの機能的矯正のレべルには非依存的である。（Ｂ）ＣＦ上皮は、ＬＬｎＬ／Ｄｏｘを用いて、または用いずに１６時間処理し、そして全ｍＲＮＡは処置から１５日後に調製した。種々のＥＮａＣサブユニットｍＲＮＡの量は、定量的ＲＴ−ＰＣＲにより測定し、そしてβ−アクチンｍＲＮＡのレベルに対する種々のＥＮａＣサブユニットの比を算出した。結果は平均＋／−ＳＥＭ（賦形剤群に関してはＮ＝１２；プロテアソームモジュレーション群に関してはＮ＝９）。（Ｃ）ＣＦ上皮におけるアミロライド感受性ナトリウムチャンネルのドキソルビシン阻害の動力学。分極したＣｕＦｉ細胞におけるアミロライド感受性Ｉｓｃを、ドキソルビシンでの処置後１日、３日、１週間および２週間で測定し、そして未処理群と比較した。結果は、それぞれ示した処置について、アミロライド感受性ナトリウム電流の平均＋／−ＳＥＭを表す（各群についてＮ＝３）。 ドキソルビシン処置は、γ−ＥＮａＣ遺伝子プロモーターのＣｐＧメチル化を上げる。（Ａ）Ａ５４９細胞を４０μＭのドキソルビシンで処理し、そしてｍＲＮＡはγ−ＥＮａＣサブユニットｍＲＮＡのリアルタイムＴａｑＭａｎ ＲＴ−ＰＣＲのために示した時点で抽出した。β−アクチンｍＲＮＡレベルに対するγ−ＥＮａＣサブユニットの比率を各サンプルについて算出した。結果は、平均＋／−ＳＥＭを表す（Ｎ＝３）。（Ｂ）γ−ＥＮａＣ遺伝子プロモーターに関する該略図。転写開始部位は＋１で標識する；本明細書で実験したＣｐＧアイランドの位置は、黒色長方形で示す；ＣｐＧメチル化を実験するために使用した制限酵素の位置は、垂直線で示す；そしてメチル化感受性ＰＣＲ分析に使用したプライマーの位置は、−３４４９および３１３９ｂｐで矢印により示す。（Ｃ）γ−ＥＮａＣ遺伝子プロモーターの−３４４９から−３１３９ｂｐ領域のメチル化感受性ＰＣＲ分析の結果。ＰＣＲ分析前のゲノムＤＮＡのＭｂｏＩ消化（レーン９）は、陽性対照として役立て、そして２種類のＰＣＲ産物を生じた（１より多い産物は、ＰＣＲフラグメントのＧＣリッチ量によるらしい）。ＤＮＡを鋳型として加えない時（レーン１０）、ＰＣＲ産物は見られない。ＭｂｏＩ／ＨｐａＩＩを用いてＤｏｘ処理したゲノムＤＮＡサンプルを同時消化すると（レーン２−４）、陽性対照で見られるものに類似するＰＣＲ産物を生じ（レーン９）、メチル化によりＨｐａＩＩ部位が消化から保護されることを示す。ＨｐａＩＩ部位の保護の程度は、Ｄｏｘで処理しなかった細胞中で有意に少ないことを示した（レーン１）。対照的に、このＭｂｏＩ酵素がメチル化に感受性ではないので、すべてのサンプルはＤｏｘ処理にかかわらず、ＭｂｏＩ消化後にＰＣＲ産物を生じることができなかった（レーン５〜８）。 ドキソルビシンは、アミロライド感受性ナトリウムチャンネルの阻害に主要な役割を果たす。４０μＭのＬＬｎＬ単独、５μＭのドキソルビシン単独、およびこれら２種類を化学物質の組み合わせを使用して、頂端側および側底側の両方から分極したＣＦ気道上皮を処理した。２週間後、アミロライド感受性のＩｓｃを測定し、そして未処理細胞と比較した。結果は、示した処理のそれぞれについてＣＦ気道上皮細胞におけるアミロライド感受性ナトリウム電流の平均＋／−ＳＥＭを表す（各群についてＮ＝３）。 ５週齢のＢＬＪ６マウスから得た鼻の経上皮電位差（ＰＤ）。Ａ）連続的な追跡は、１）Ｈｅｒｐｅｓリン酸緩衝化リンゲル（ＨＰＢＲ）、２）ＨＰＢＲ＋１００μＭアミロライド、３）Ｃｌを含まないＨＰＢＲ＋１００μＭアミロライド＋１０μＭフォルスコリン中で始めた。Ｂ）矢印を付した各バッファーに切り変えた後のデルタｍＶの変化のまとめ。Ｃ）絶対ｍＶ鼻ＰＤ。値は５匹の独立したマウスに関する平均（＋／−ＳＥＭ）。 アントラサイクリンプロテアソームモジュレーターのスクリーニング。Ａ）ルシフェラーゼ活性対試験した薬剤の濃度のグラフ。Ｂ）種々の処置に関するルシフェラーゼ活性の変化倍率。 アントラサイクリンプロテアソームモジュレーターに関するインビボ結果。

Claims (59)

  1. ２重治療活性を持つ１または複数の薬剤を同定する方法であって：
    ａ）上皮ナトリウムチャンネル（ＥＮａＣ）の異常な発現または活性に関連する疾患の１または複数の症状を抑制または処置する１または複数の薬剤を選択し；
    ｂ）哺乳動物細胞を、該１または複数の薬剤および遺伝子治療ベクターと接触させ；そして
    ｃ）該遺伝子治療ベクターと接触したが、該１または複数の薬剤とは接触していない哺乳動物細胞に比べて、該遺伝子治療ベクターの効力を高める薬剤を同定する、
    ことを含んでなる上記方法。
  2. ２重治療活性を持つ１または複数の薬剤を同定する方法であって：
    ａ）哺乳動物細胞中で遺伝子治療ベクターの効力を高める１または複数の薬剤を選択し；
    ｂ）上皮ナトリウムチャンネル（ＥＮａＣ）の異常な発現または活性を有する哺乳動物細胞を、該１または複数の薬剤と接触させ；そして
    ｃ）ＥＮａＣ発現または活性を改変する薬剤を同定する、
    ことを含んでなる上記方法。
  3. 遺伝子治療ベクターがウイルスベクターである、請求項１または２に記載の方法。
  4. ウイルスベクターがレトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターのアデノウイルスベクターである、請求項３に記載の方法。
  5. 遺伝子治療ベクターがマーカー遺伝子を含んでなる、請求項１に記載の方法。
  6. 哺乳動物細胞が機能的ＣＦＴＲを発現しない、請求項２に記載の方法。
  7. 選択された薬剤がＥＮａＣの１または複数のサブユニットの転写のレベルまたは量を下げるために効果的である、請求項２に記載の方法。
  8. 選択された薬剤がＥＮａＣのα、βおよびγサブユニットの転写のレベルまたは量を下げるために効果的である、請求項２に記載の方法。
  9. 選択された薬剤がＥＮａＣ活性を改変するために効果的である、請求項２に記載の方法。
  10. 哺乳動物細胞中の上皮ナトリウムチャンネル（ＥＮａＣ）の１または複数のサブユニットの転写のレベルまたは量を下げる１または複数の薬剤を同定する方法であって：
    ａ）ＥＮａＣを発現する哺乳動物細胞を、プロテアソーム調節剤である少なくとも１つの薬剤と接触させ、ここで該薬剤は細胞のゲノムによりコードされる遺伝子もしくは遺伝子産物、該遺伝子の相補鎖、または該遺伝子もしくはその相補鎖の一部ではなく；そして
    ｂ）薬剤が哺乳動物細胞中でＥＮａＣの１または複数のサブユニットからの転写のレベルまたは量を下げるかどうかを同定する、
    ことを含んでなる上記方法。
  11. 哺乳動物細胞中のＥＮａＣのα、βおよびγサブユニットからの転写のレベルまたは量を下げる１または複数の薬剤を同定する方法であって：
    ａ）ＥＮａＣを発現する哺乳動物細胞を、少なくとも１つの薬剤と接触させ；そして
    ｂ）該薬剤が哺乳動物細胞中でＥＮａＣのα、βおよびγサブユニットからの転写のレベルまたは量を下げるかどうかを同定する、
    ことを含んでなる上記方法。
  12. 哺乳動物細胞中のＥＮａＣの１または複数のサブユニットの転写のレベルまたは量を下げる１または複数の薬剤を同定する方法であって：
    ａ）ＥＮａＣを発現する哺乳動物細胞を、ウイルスの形質導入を高める少なくとも１つの薬剤と接触させ；そして
    ｂ）該薬剤が哺乳動物細胞中で該ＥＮａＣの１または複数のサブユニットからの転写のレベルまたは量を下げるかどうかを同定する、
    ことを含んでなる上記方法。
  13. 細胞が哺乳動物の肺または腎臓細胞である、請求項１ないし２または１０ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. １つの薬剤が、細胞のゲノムによりコードされる遺伝子もしくは遺伝子産物、該遺伝子の相補鎖、または該遺伝子もしくはその相補鎖の一部ではなく、細胞が哺乳動物の腎臓細胞である、請求項１１または１２のいずれか１項に記載の方法。
  15. 細胞がヒトの細胞、イヌの細胞、マウスの細胞、ラットの細胞またはウサギの細胞である、請求項１ないし２または１０ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
  16. 薬剤の１つが抗生物質である、請求項１ないし２または１０ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
  17. 薬剤の１つが化学療法剤である、請求項１ないし２または１０ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
  18. 薬剤の１つが脂質低下剤である、請求項１ないし２または１０ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
  19. 薬剤の１つが食品添加物である、請求項１ないし２または１０ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
  20. 薬剤の１つがエポキソミシン、ドキソルビシン、ドキシル、ダウノルビシン、イダルビシン、エピルビシン、アクラルビシン、カンプトテシン、シンバスタチン、タンニン酸またはシスプラチンである、請求項１ないし２または１０ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
  21. 薬剤の１つがプロテアソームの細胞内の局在化をモジュレートする、請求項１ないし２または１０ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
  22. 薬剤がＥＮａＣの翻訳後プロセッシングを改変しない、請求項１ないし２または１０ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
  23. 薬剤の１つがＥＮａＣ転写を調節する１または複数の分子の転写をモジュレートする、請求項１ないし２または１０ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
  24. 薬剤の量が１週間より長く転写のレベルまたは量を下げる、請求項１０ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
  25. 薬剤の量が少なくとも１日、転写のレベルまたは量を下げる、請求項１０ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
  26. 薬剤の量が少なくとも３日、転写のレベルまたは量を下げる、請求項１０ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
  27. 薬剤の量が２週間より長く転写のレベルまたは量を下げる、請求項１０ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
  28. 薬剤の１つが核への、または核からの分子の輸送をモジュレートする、請求項１ないし２または１０ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
  29. 薬剤の１つがエンドソームのプロテアーゼインヒビターである、請求項１ないし２または１０ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
  30. 薬剤の１つがシステインプロテアーゼインヒビターである、請求項１ないし２または１０ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
  31. 薬剤の１つがＴＰＡではない、請求項１ないし２または１０ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
  32. 薬剤の１つがエンドソームのプロセッシングを改変する、請求項１ないし２または１０ないし１２のいずれか１項に記載の方法。
  33. 上昇したＥＮａＣレベルまたは上昇したＥＮａＣ活性に関連する状態を抑制または処置する方法であって：状態の危険にあるか、または状態を有する哺乳動物を、１または複数のＥＮａＣサブユニット遺伝子の転写を阻害または低下し、および／または１または複数のＥＮａＣサブユニット遺伝子の転写を改変する分子のレベル、量または活性を改変し、そして遺伝子治療ベクターの効力を高める、有効量の薬剤と接触させることを含んでなる上記方法。
  34. 上昇したＥＮａＣレベルまたは上昇したＥＮａＣ活性に関連する状態を抑制または処置する方法であって：状態の危険にあるか、または状態を有する哺乳動物を、１または複数のＥＮａＣサブユニット遺伝子の転写を阻害または低下し、および／または１または複数のＥＮａＣサブユニット遺伝子の転写を改変する、分子のレベル、量または活性を改変する有効量の薬剤と接触させることを含んでなり、該薬剤がプロテアソーム調節剤であり、そして該薬剤が哺乳動物のゲノムによりコードされる遺伝子もしくは遺伝子産物、該遺伝子の相補鎖、または該遺伝子もしくはその相補鎖の一部ではない上記方法。
  35. 上昇したＥＮａＣレベルまたは上昇したＥＮａＣ活性に関連する状態を抑制または処置する方法であって：状態の危険にあるか、または状態を有する哺乳動物を、ＥＮａＣのα、βおよびγサブユニットの転写を阻害または低下するか、あるいはＥＮａＣのα、βおよびγサブユニットの転写を改変する分子のレベル、量または活性を改変する、有効量の薬剤と接触させることを含んでなる上記方法。
  36. 上昇したＥＮａＣレベルまたは上昇したＥＮａＣ活性に関連する状態を抑制または処置する方法であって：状態の危険にあるか、または状態を有する哺乳動物を、１または複数のＥＮａＣサブユニット遺伝子の転写を阻害または低下し、および／または１または複数のＥＮａＣサブユニット遺伝子の転写を改変する分子のレベル、量または活性を改変し、そして哺乳動物細胞に感染するウイルスの形質導入を高める、有効量の薬剤と接触させることを含んでなる上記方法。
  37. 薬剤がエポキソミシン、ドキソルビシン、ドキシル、ダウノルビシン、エピルビシン、イダルビシン、アクラルビシン、カンプトテシン、シンバスタチン、タンニン酸またはシスプラチンである、請求項３３ないし３６のいずれか１項に記載の方法。
  38. 薬剤が化学療法剤である、請求項３３ないし３６のいずれか１項に記載の方法。
  39. 薬剤が抗生物質である、請求項３３ないし３６のいずれか１項に記載の方法。
  40. 薬剤が食品添加物である、請求項３３ないし３６のいずれか１項に記載の方法。
  41. 薬剤が脂質低下剤である、請求項３３ないし３６のいずれか１項に記載の方法。
  42. 薬剤がＥＮａＣの翻訳後プロセッシングを改変しない、請求項３３ないし３６のいずれか１項に記載の方法。
  43. 薬剤がＴＰＡではない、請求項３３ないし３６のいずれか１項に記載の方法。
  44. 薬剤がＥＮａＣ転写をモジュレートする１または複数の分子の転写をモジュレートする、請求項３３ないし３６のいずれか１項に記載の方法。
  45. 薬剤が核への、または核からの分子の輸送をモジュレートする、請求項３３ないし３６のいずれか１項に記載の方法。
  46. 薬剤がプロテアソームの細胞内の局在化をモジュレートする、請求項３３ないし３６のいずれか１項に記載の方法。
  47. 薬剤が、薬剤と接触しなかった対応する哺乳動物に比べて、少なくとも２倍、ＥＮａＣの転写レベルを下げる、請求項３３ないし３６のいずれか１項に記載の方法。
  48. 薬剤が、薬剤と接触しなかった対応する哺乳動物に比べて、少なくとも３倍、ＥＮａＣの転写レベルを下げる、請求項３３ないし３６のいずれか１項に記載の方法。
  49. 薬剤が、薬剤と接触しなかった対応する哺乳動物に比べて、少なくとも１０倍、ＥＮａＣの転写レベルを下げる、請求項３３ないし３６のいずれか１項に記載の方法。
  50. さらに哺乳動物を組換えウイルスと接触させることを含んでなる、請求項３３ないし３６のいずれか１項に記載の方法。
  51. 薬剤を哺乳動物の気道と接触させることを含んでなる、請求項３３ないし３６のいずれか１項に記載の方法。
  52. 薬剤がアデノウイルス、レトロウイルス、アデノ随伴ウイルスまたはレンチウイルスベクターの効力または形質導入を高める、請求項３３ないし３６のいずれか１項に記載の方法。
  53. １つの薬剤が細胞のゲノムによりコードされる遺伝子もしくは遺伝子産物、該遺伝子の相補鎖、または該遺伝子もしくはその相補鎖の一部ではなく、細胞が哺乳動物の腎臓細胞である、請求項３３または３５ないし３６のいずれか１項に記載の方法。
  54. 哺乳動物における上昇したＥＮａＣレベルまたは上昇したＥＮａＣ活性に関連する状態を抑制または処置する薬剤を調製するための、１または複数のＥＮａＣサブユニット遺伝子の転写を阻害し、または下げ、および／または１または複数のＥＮａＣサブユニット遺伝子の転写を改変する分子のレベル、量または活性を改変する、１または複数の薬剤の使用。
  55. 哺乳動物における上昇したＥＮａＣレベルまたは上昇したＥＮａＣ活性に関連する状態を抑制または処置するための、ＥＮａＣのα、βおよびγサブユニットの転写を阻害し、または下げ、あるいはＥＮａＣのα、βおよびγサブユニット遺伝子の転写を改変する分子のレベル、量または活性を改変する、１または複数の薬剤の使用。
  56. １または複数の薬剤が遺伝子治療ベクターの効力を高める、請求項５４または５５に記載の使用。
  57. １または複数の薬剤が、哺乳動物細胞に感染するウイルスの形質導入を高める、請求項５４または５５に記載の使用。
  58. 薬剤がプロテアソーム調節剤である、請求項５４または５５に記載の使用。
  59. 薬剤が哺乳動物のゲノムによりコードされる遺伝子もしくは遺伝子産物、該遺伝子の相補鎖、または該遺伝子もしくはその相補鎖の一部ではない、請求項５４または５５に記載の使用。
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