JP6544565B2 - 哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法およびキット、並びに、その利用 - Google Patents
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Description
(a)配列番号9に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号9に示される塩基配列において1または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
本発明のリピート配列が、目的遺伝子1コピーあたりの発現を高めるメカニズムのモデルとして、以下のモデルが考えられ得る(図12を参照)。
目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドの長いリピート配列と、目的遺伝子を具備する発現ベクターとを同時に細胞に導入すると、当該長いリピート配列の中に、少数の発現ベクターが「埋もれた」状態になる。
目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドの逆位反復配列を用いる場合、染色体に組み込まれた逆位反復配列および発現ベクターは、十字架(cruciform)構造を作り、当該十字架構造がHolliday junction resolvaseにより開裂することで、発現ベクター等が染色体外に切り出される。
本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法は、目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含むリピート配列と、目的遺伝子、および、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域をコードするポリヌクレオチドを具備する発現ベクターと、を哺乳動物細胞に同時に導入する工程を含む方法である。
本実施の形態の方法に用いられるリピート配列は、目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチド(以下、「発現促進ポリヌクレオチド」と呼ぶ。)を複数含むものである。これによって、細胞内に、目的遺伝子の発現に適した環境を人工的に生み出すことができる。なお、発現促進ポリヌクレオチドの具体的な構成は特に限定されず、適宜、所望のポリヌクレオチドを用いることができる(例えば、(i)Haiqing Fu et. al., Preventing gene silencing with human replicators, NATURE BIOTECHNOLOGY, Vol.24, No.5, p572-576, (May 2006)、(ii)Carl L Schildkraut et. al., Replicators lessen transcriptional silencing, NATURE BIOTECHNOLOGY, Vol.24, No.5, p523-524, (May 2006)、(iii)Liang Huang et. al., Prevention of Transcriptional Silencing by a Replicator-Binding Complex Consisting of SWI/SNF, MeCP1, and hnRNP C1/C2, MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Vol.31, No.16, p3472-3484, (Aug. 2011)参照)。
(A)哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域(IR)の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチド、
(B)ヒトの第2番染色体短腕16.1の遺伝子密度の低い領域に由来する3,271(bp)のヒトゲノム断片(以下、「B−3−31」とも呼ぶ)。
ポリヌクレオチド(A)は、IRの少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドである。また、ポリヌクレオチド(A)は、IRをコードするポリヌクレオチドであってもよい。
(e)配列番号10または11に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(f)配列番号10または11に示される塩基配列において1または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
(g)配列番号10または11に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
(h)配列番号10または11に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと90%以上、95%以上、97%以上または99%以上の相同性を有し、かつ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
ポリヌクレオチド(B)は、ヒトの第2番染色体短腕16.1の遺伝子密度の低い領域に由来する3,271(bp)のヒトゲノム断片である。
(a)配列番号9に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号9に示される塩基配列において1または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド、
(c)配列番号9に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
(d)配列番号9に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと90%以上、95%以上、97%以上または99%以上の相同性を有し、かつ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
本実施の形態の方法に用いられる発現ベクターは、目的遺伝子、および、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域(MAR)をコードするポリヌクレオチドを具備するものである。
本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法は、リピート配列と発現ベクターとを哺乳動物細胞に同時に導入する工程(換言すれば、導入工程)を含んでいる。
本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法は、導入工程の他に、リピート配列と発現ベクターとが導入された哺乳動物細胞を分離する工程(換言すれば、選抜工程)や、当該選抜工程によって選抜された哺乳動物細胞(換言すれば、形質転換細胞)を培養する工程(換言すれば、培養工程)を含んでいてもよい。また、培養工程によって生産された目的タンパク質を精製する工程(換言すれば、精製工程)を含んでいてもよい。つまり、本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法は、リピート配列と発現ベクターとが導入された哺乳動物細胞を用いた、目的タンパク質を生産する方法をも包含する。
本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキットは、目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含むリピート配列と、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域をコードするポリヌクレオチドを具備する発現ベクターと、を備えている。
(a)配列番号9に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号9に示される塩基配列において1または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
本実施の形態の哺乳動物細胞は、目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含むリピート配列と、目的遺伝子、および、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域をコードするポリヌクレオチドを具備する発現ベクターと、が導入されてなる哺乳動物細胞である。
(a)配列番号9に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号9に示される塩基配列において1または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
G5またはG5/AR1の各々の直列反復配列(direct repeat)または逆位反復配列(inverted repeat)を含むリピート配列を作製した。以下に、作製方法を説明する。
pKV−AR1を、(i)単独で(−)、(ii)G5の直列反復配列と共に(Diir.)、(iii)G5の逆位反復配列と共に(Inv.)、(iv)pG5と共に、ヒト大腸癌細胞であるCOLO 320DMに導入した。
図5(a)および図5(b)に示すリピート配列と発現ベクターとの様々な組み合わせを、2種類の細胞(COLO 320DM、または、CHO DG44)に導入した。薬剤選択によって安定な形質転換体を取得し、当該形質転換体における目的タンパク質(具体的には、d2EGFP)の発現をフローサイトメーターで測定し、当該発現を任意の単位で数値化してグラフにまとめた。試験結果を図5(a)および図5(b)に示す。
図6(a)および図6(b)に示すリピート配列と発現ベクターとの様々な組み合わせを、2種類の細胞(COLO 320DM、または、CHO DG44)に導入した。薬剤選択によって安定な形質転換体を取得し、当該形質転換細胞内の発現ベクターのコピー数をリアルタイムPCRで定量した。より具体的に、発現ベクター内のSRalfaプロモーターのコピー数、および、発現ベクターと共に細胞へ導入したG5またはλファージ由来のDNAのコピー数、をリアルタイムPCRにて定量した。試験結果を図6(a)および図6(b)に示す。
FISH法により、発現ベクターの増幅状況を検討した。
目的遺伝子(d2EGFP)、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチド(AR1、配列番号13)、哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチド(配列番号15)、および、ヒトの第2番染色体短腕16.1の遺伝子密度の低い領域に由来する3,271(bp)のヒトゲノム断片(B−3−31)(配列番号9)を具備する発現ベクター(Vec1)を作製した。
<1−1.リピートの作製>にて説明した方法と同様の方法にて、B−3−31の直列反復配列および逆位反復配列を作製した。
Claims (8)
- 哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法であって、
上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含むリピート配列と、
上記目的遺伝子、および、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域をコードするポリヌクレオチドを具備する発現ベクターと、を哺乳動物細胞に同時に導入する工程を含み、
上記哺乳動物細胞は、哺乳動物由来の培養細胞であり、
上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドは、下記(a)または(b)のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである、方法:
(a)配列番号9に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号9に示される塩基配列において1または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。 - 上記リピート配列は、上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドの直列反復配列を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 上記リピート配列は、上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドの逆位反復配列を含むものである、請求項1に記載の方法。
- 上記核マトリックス結合領域が、Igκ遺伝子座、SV40初期領域、および、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか1つに由来する、請求項1〜3の何れか1項に記載の方法。
- 上記発現ベクターは、更に、哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域をコードするポリヌクレオチドを具備するものである、請求項1〜4の何れか1項に記載の方法。
- 哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキットであって、
上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含むリピート配列と、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域をコードするポリヌクレオチドを具備する発現ベクターと、を備え、
上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドは、下記(a)または(b)のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである、キット:
(a)配列番号9に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号9に示される塩基配列において1または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。 - 目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含むリピート配列と、上記目的遺伝子、および、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域をコードするポリヌクレオチドを具備する発現ベクターと、が導入されてなる哺乳動物細胞であって、
上記哺乳動物細胞は、哺乳動物由来の培養細胞であり、
上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドは、下記(a)または(b)のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである、哺乳動物細胞:
(a)配列番号9に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号9に示される塩基配列において1または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。 - 請求項7に記載の哺乳動物細胞を用いた、目的タンパク質を生産する方法。
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