JP2016208845A - 哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法およびキット、並びに、その利用 - Google Patents
哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法およびキット、並びに、その利用 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2016208845A JP2016208845A JP2015092336A JP2015092336A JP2016208845A JP 2016208845 A JP2016208845 A JP 2016208845A JP 2015092336 A JP2015092336 A JP 2015092336A JP 2015092336 A JP2015092336 A JP 2015092336A JP 2016208845 A JP2016208845 A JP 2016208845A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- expression
- polynucleotide
- target gene
- repeat sequence
- mammalian cell
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 184
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 170
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 93
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 71
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 title claims abstract description 26
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 179
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 179
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 179
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 67
- 102000008297 Nuclear Matrix-Associated Proteins Human genes 0.000 claims abstract description 27
- 108010035916 Nuclear Matrix-Associated Proteins Proteins 0.000 claims abstract description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 46
- 230000010076 replication Effects 0.000 claims description 30
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 27
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 claims description 25
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 18
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 claims description 14
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 claims description 14
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 claims description 8
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 claims description 8
- 101710135898 Myc proto-oncogene protein Proteins 0.000 claims description 8
- 102100038895 Myc proto-oncogene protein Human genes 0.000 claims description 8
- 101710150448 Transcriptional regulator Myc Proteins 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 5
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 55
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 47
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 15
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 12
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 12
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 11
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 9
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 7
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 6
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 6
- 230000030279 gene silencing Effects 0.000 description 6
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 6
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 5
- 235000019688 fish Nutrition 0.000 description 5
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 4
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 108010077544 Chromatin Proteins 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 210000003483 chromatin Anatomy 0.000 description 3
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 3
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 3
- 210000003917 human chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 230000031864 metaphase Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000007067 DNA methylation Effects 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N dithioerythritol Chemical compound SC[C@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-ZXZARUISSA-N 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000012226 gene silencing method Methods 0.000 description 2
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000037426 transcriptional repression Effects 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 1
- 102000006479 Heterogeneous-Nuclear Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010019372 Heterogeneous-Nuclear Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- 101000899111 Homo sapiens Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101000629635 Homo sapiens Signal recognition particle receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N Leupeptin Natural products CC(C)CC(NC(C)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000713333 Mouse mammary tumor virus Species 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108091093105 Nuclear DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108091030071 RNAI Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 102100026900 Signal recognition particle receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229930189065 blasticidin Natural products 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 108091006047 fluorescent proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000034287 fluorescent proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000009368 gene silencing by RNA Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 229930182470 glycoside Natural products 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N leupeptin Chemical compound CC(C)C[C@H](NC(C)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C=O)CCCN=C(N)N GDBQQVLCIARPGH-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- 108010052968 leupeptin Proteins 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- -1 n-octyl glycoside Chemical class 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 210000000299 nuclear matrix Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K trisodium citrate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O HRXKRNGNAMMEHJ-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229940038773 trisodium citrate Drugs 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
Abstract
Description
(a)配列番号9に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号9に示される塩基配列において1または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
本発明のリピート配列が、目的遺伝子1コピーあたりの発現を高めるメカニズムのモデルとして、以下のモデルが考えられ得る(図12を参照)。
目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドの長いリピート配列と、目的遺伝子を具備する発現ベクターとを同時に細胞に導入すると、当該長いリピート配列の中に、少数の発現ベクターが「埋もれた」状態になる。
目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドの逆位反復配列を用いる場合、染色体に組み込まれた逆位反復配列および発現ベクターは、十字架(cruciform)構造を作り、当該十字架構造がHolliday junction resolvaseにより開裂することで、発現ベクター等が染色体外に切り出される。
本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法は、目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含むリピート配列と、目的遺伝子、および、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域をコードするポリヌクレオチドを具備する発現ベクターと、を哺乳動物細胞に同時に導入する工程を含む方法である。
本実施の形態の方法に用いられるリピート配列は、目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチド(以下、「発現促進ポリヌクレオチド」と呼ぶ。)を複数含むものである。これによって、細胞内に、目的遺伝子の発現に適した環境を人工的に生み出すことができる。なお、発現促進ポリヌクレオチドの具体的な構成は特に限定されず、適宜、所望のポリヌクレオチドを用いることができる(例えば、(i)Haiqing Fu et. al., Preventing gene silencing with human replicators, NATURE BIOTECHNOLOGY, Vol.24, No.5, p572-576, (May 2006)、(ii)Carl L Schildkraut et. al., Replicators lessen transcriptional silencing, NATURE BIOTECHNOLOGY, Vol.24, No.5, p523-524, (May 2006)、(iii)Liang Huang et. al., Prevention of Transcriptional Silencing by a Replicator-Binding Complex Consisting of SWI/SNF, MeCP1, and hnRNP C1/C2, MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, Vol.31, No.16, p3472-3484, (Aug. 2011)参照)。
(A)哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域(IR)の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチド、
(B)ヒトの第2番染色体短腕16.1の遺伝子密度の低い領域に由来する3,271(bp)のヒトゲノム断片(以下、「B−3−31」とも呼ぶ)。
ポリヌクレオチド(A)は、IRの少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドである。また、ポリヌクレオチド(A)は、IRをコードするポリヌクレオチドであってもよい。
(e)配列番号10または11に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(f)配列番号10または11に示される塩基配列において1または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
(g)配列番号10または11に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
(h)配列番号10または11に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと90%以上、95%以上、97%以上または99%以上の相同性を有し、かつ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
ポリヌクレオチド(B)は、ヒトの第2番染色体短腕16.1の遺伝子密度の低い領域に由来する3,271(bp)のヒトゲノム断片である。
(a)配列番号9に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号9に示される塩基配列において1または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド、
(c)配列番号9に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと相補的な塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
(d)配列番号9に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドと90%以上、95%以上、97%以上または99%以上の相同性を有し、かつ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
本実施の形態の方法に用いられる発現ベクターは、目的遺伝子、および、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域(MAR)をコードするポリヌクレオチドを具備するものである。
本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法は、リピート配列と発現ベクターとを哺乳動物細胞に同時に導入する工程(換言すれば、導入工程)を含んでいる。
本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法は、導入工程の他に、リピート配列と発現ベクターとが導入された哺乳動物細胞を分離する工程(換言すれば、選抜工程)や、当該選抜工程によって選抜された哺乳動物細胞(換言すれば、形質転換細胞)を培養する工程(換言すれば、培養工程)を含んでいてもよい。また、培養工程によって生産された目的タンパク質を精製する工程(換言すれば、精製工程)を含んでいてもよい。つまり、本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法は、リピート配列と発現ベクターとが導入された哺乳動物細胞を用いた、目的タンパク質を生産する方法をも包含する。
本実施の形態の哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキットは、目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含むリピート配列と、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域をコードするポリヌクレオチドを具備する発現ベクターと、を備えている。
(a)配列番号9に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号9に示される塩基配列において1または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
本実施の形態の哺乳動物細胞は、目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含むリピート配列と、目的遺伝子、および、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域をコードするポリヌクレオチドを具備する発現ベクターと、が導入されてなる哺乳動物細胞である。
(a)配列番号9に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号9に示される塩基配列において1または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。
G5またはG5/AR1の各々の直列反復配列(direct repeat)または逆位反復配列(inverted repeat)を含むリピート配列を作製した。以下に、作製方法を説明する。
pKV−AR1を、(i)単独で(−)、(ii)G5の直列反復配列と共に(Diir.)、(iii)G5の逆位反復配列と共に(Inv.)、(iv)pG5と共に、ヒト大腸癌細胞であるCOLO 320DMに導入した。
図5(a)および図5(b)に示すリピート配列と発現ベクターとの様々な組み合わせを、2種類の細胞(COLO 320DM、または、CHO DG44)に導入した。薬剤選択によって安定な形質転換体を取得し、当該形質転換体における目的タンパク質(具体的には、d2EGFP)の発現をフローサイトメーターで測定し、当該発現を任意の単位で数値化してグラフにまとめた。試験結果を図5(a)および図5(b)に示す。
図6(a)および図6(b)に示すリピート配列と発現ベクターとの様々な組み合わせを、2種類の細胞(COLO 320DM、または、CHO DG44)に導入した。薬剤選択によって安定な形質転換体を取得し、当該形質転換細胞内の発現ベクターのコピー数をリアルタイムPCRで定量した。より具体的に、発現ベクター内のSRalfaプロモーターのコピー数、および、発現ベクターと共に細胞へ導入したG5またはλファージ由来のDNAのコピー数、をリアルタイムPCRにて定量した。試験結果を図6(a)および図6(b)に示す。
FISH法により、発現ベクターの増幅状況を検討した。
目的遺伝子(d2EGFP)、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチド(AR1、配列番号13)、哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチド(配列番号15)、および、ヒトの第2番染色体短腕16.1の遺伝子密度の低い領域に由来する3,271(bp)のヒトゲノム断片(B−3−31)(配列番号9)を具備する発現ベクター(Vec1)を作製した。
<1−1.リピートの作製>にて説明した方法と同様の方法にて、B−3−31の直列反復配列および逆位反復配列を作製した。
Claims (11)
- 哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法であって、
上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含むリピート配列と、
上記目的遺伝子、および、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域をコードするポリヌクレオチドを具備する発現ベクターと、を哺乳動物細胞に同時に導入する工程を含む方法。 - 上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドは、哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域の少なくとも一部をコードするポリヌクレオチドである、請求項1に記載の方法。
- 上記哺乳動物複製開始領域が、c−myc遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、および、β−グロビン遺伝子座の複製開始領域のいずれか1つに由来する、請求項2に記載の方法。
- 上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドは、下記(a)または(b)のポリヌクレオチドを含むポリヌクレオチドである、請求項1に記載の方法:
(a)配列番号9に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、
(b)配列番号9に示される塩基配列において1または数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された塩基配列からなるポリヌクレオチドであって、且つ、目的遺伝子の発現を高める活性を有するポリヌクレオチド。 - 上記リピート配列は、上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドの直列反復配列を含むものである、請求項1〜4の何れか1項に記載の方法。
- 上記リピート配列は、上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドの逆位反復配列を含むものである、請求項1〜4の何れか1項に記載の方法。
- 上記核マトリックス結合領域が、Igκ遺伝子座、SV40初期領域、および、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか1つに由来する、請求項1〜6の何れか1項に記載の方法。
- 上記発現ベクターは、更に、哺乳動物細胞内で機能する哺乳動物複製開始領域をコードするポリヌクレオチドを具備するものである、請求項1〜7の何れか1項に記載の方法。
- 哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキットであって、
上記目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含むリピート配列と、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域をコードするポリヌクレオチドを具備する発現ベクターと、を備える、キット。 - 目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチドを複数含むリピート配列と、上記目的遺伝子、および、哺乳動物細胞内で機能する核マトリックス結合領域をコードするポリヌクレオチドを具備する発現ベクターと、が導入されてなる哺乳動物細胞。
- 請求項10に記載の哺乳動物細胞を用いた、目的タンパク質を生産する方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015092336A JP6544565B2 (ja) | 2015-04-28 | 2015-04-28 | 哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法およびキット、並びに、その利用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015092336A JP6544565B2 (ja) | 2015-04-28 | 2015-04-28 | 哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法およびキット、並びに、その利用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2016208845A true JP2016208845A (ja) | 2016-12-15 |
JP6544565B2 JP6544565B2 (ja) | 2019-07-17 |
Family
ID=57548774
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015092336A Active JP6544565B2 (ja) | 2015-04-28 | 2015-04-28 | 哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法およびキット、並びに、その利用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6544565B2 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110546257A (zh) * | 2017-03-17 | 2019-12-06 | 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 | 用于增强基因表达的组合物和方法 |
EP3456821B1 (en) | 2017-09-19 | 2020-08-12 | Deutsches Krebsforschungszentrum | Non-integrating dna vectors for the genetic modification of cells |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2002066638A1 (fr) * | 2001-02-22 | 2002-08-29 | Gencom Corporation | Gene recombinant contenant une sequence de repetition inversee et utilisation correspondante |
JP2003530886A (ja) * | 2000-04-26 | 2003-10-21 | ザイモジェネティクス,インコーポレイティド | 組換え宿主細胞により対象タンパク質の発現を向上させる方法 |
WO2005111220A2 (en) * | 2004-04-30 | 2005-11-24 | University Of Iowa Research Foundation | Adeno-associated virus vectors with intravector heterologous terminal palindromic sequences |
JP2009082130A (ja) * | 2007-10-02 | 2009-04-23 | Genetai Inc | 促進された遺伝子発現能力を伴う新規発現ベクターおよびそれを使用するための方法 |
JP2012034698A (ja) * | 2011-09-16 | 2012-02-23 | Hiroshima Univ | 遺伝子増幅効率の増加方法、および当該方法を行なうためのキット |
JP2012514976A (ja) * | 2009-01-12 | 2012-07-05 | ボーナス,ウラ | モジュラーdna結合ドメインおよび使用方法 |
JP2012157293A (ja) * | 2011-02-01 | 2012-08-23 | Hiroshima Univ | 哺乳動物細胞内で目的遺伝子の増幅構造を制御し、高発現させる方法 |
-
2015
- 2015-04-28 JP JP2015092336A patent/JP6544565B2/ja active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2003530886A (ja) * | 2000-04-26 | 2003-10-21 | ザイモジェネティクス,インコーポレイティド | 組換え宿主細胞により対象タンパク質の発現を向上させる方法 |
WO2002066638A1 (fr) * | 2001-02-22 | 2002-08-29 | Gencom Corporation | Gene recombinant contenant une sequence de repetition inversee et utilisation correspondante |
WO2005111220A2 (en) * | 2004-04-30 | 2005-11-24 | University Of Iowa Research Foundation | Adeno-associated virus vectors with intravector heterologous terminal palindromic sequences |
JP2009082130A (ja) * | 2007-10-02 | 2009-04-23 | Genetai Inc | 促進された遺伝子発現能力を伴う新規発現ベクターおよびそれを使用するための方法 |
JP2012514976A (ja) * | 2009-01-12 | 2012-07-05 | ボーナス,ウラ | モジュラーdna結合ドメインおよび使用方法 |
JP2012157293A (ja) * | 2011-02-01 | 2012-08-23 | Hiroshima Univ | 哺乳動物細胞内で目的遺伝子の増幅構造を制御し、高発現させる方法 |
JP2012034698A (ja) * | 2011-09-16 | 2012-02-23 | Hiroshima Univ | 遺伝子増幅効率の増加方法、および当該方法を行なうためのキット |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
GENOME BIOLOGY,, vol. 9, JPN6019002125, 2008, pages 115, ISSN: 0003963201 * |
JOURNAL OF CELLULAR BIOCHEMISTRY, vol. 102, JPN6019002123, 2007, pages 515 - 529, ISSN: 0003963200 * |
Cited By (4)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN110546257A (zh) * | 2017-03-17 | 2019-12-06 | 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 | 用于增强基因表达的组合物和方法 |
US11773406B2 (en) | 2017-03-17 | 2023-10-03 | Adverum Biotechnologies, Inc. | Compositions and methods for enhanced gene expression |
CN110546257B (zh) * | 2017-03-17 | 2024-03-01 | 阿德夫拉姆生物技术股份有限公司 | 用于增强基因表达的组合物和方法 |
EP3456821B1 (en) | 2017-09-19 | 2020-08-12 | Deutsches Krebsforschungszentrum | Non-integrating dna vectors for the genetic modification of cells |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6544565B2 (ja) | 2019-07-17 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
AU2016316027B2 (en) | Systems and methods for selection of gRNA targeting strands for Cas9 localization | |
US11913014B2 (en) | S. pyogenes Cas9 mutant genes and polypeptides encoded by same | |
JP6745599B2 (ja) | 分子の作製 | |
US7244609B2 (en) | Synthetic genes and bacterial plasmids devoid of CpG | |
EP3234146B1 (en) | Selective optimisation of a ribosome binding site for protein production | |
Van Rhijn et al. | Development of a marker-free mutagenesis system using CRISPR-Cas9 in the pathogenic mould Aspergillus fumigatus | |
CN113234702B (zh) | 一种Lt1Cas13d蛋白及基因编辑系统 | |
JP4575338B2 (ja) | 相同組換えによる目的遺伝子のクローニング及び発現方法 | |
JP6544565B2 (ja) | 哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高める方法およびキット、並びに、その利用 | |
JP5283044B2 (ja) | 目的遺伝子を染色体外で高度に増幅させるためのベクターおよびその利用 | |
JP5688771B2 (ja) | 哺乳動物細胞内で目的遺伝子を増幅し高発現させる方法、および当該方法を実施するために用いられるキット | |
JP4923244B2 (ja) | 遺伝子増幅効率の増加方法 | |
JP5800176B2 (ja) | 哺乳動物細胞内で目的遺伝子の増幅構造を制御し、高発現させる方法 | |
JP5464378B2 (ja) | 遺伝子増幅効率の増加方法、および当該方法を行なうためのキット | |
JP5124737B2 (ja) | 哺乳動物細胞内で目的遺伝子を高度に増幅させるための方法およびベクター | |
Chen et al. | Development of a universal gap repair vector for yeast-based screening of knockout rodents | |
US11155822B2 (en) | Transposon that promotes functional DNA expression in episomal DNAs and method to enhance DNA transcription during functional analysis of metagenomic libraries | |
JP6370226B2 (ja) | 哺乳動物細胞内で増幅された目的遺伝子の発現を高めるポリヌクレオチド | |
Marques et al. | Construction and analysis of full-length and normalized cDNA libraries from citrus | |
WO2019093418A1 (ja) | 哺乳動物細胞内の標的染色体部位で目的遺伝子を含むポリヌクレオチドを増幅させる方法およびベクター、ならびにその利用 | |
EP3960862A1 (en) | Rna-aptamer-sensors | |
JP2022001038A (ja) | 哺乳動物細胞内で増幅された目的遺伝子の発現を高める方法および哺乳動物細胞内で目的遺伝子の発現を高めるためのキット | |
JP4216875B2 (ja) | メタノール応答性プロモーター、プロモーターと外来遺伝子を発現可能な様式で連結した融合遺伝子、ベクター、形質転換体、およびタンパク質の生産方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180309 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20190116 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190129 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20190314 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190528 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190605 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6544565 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |