JP5124737B2 - 哺乳動物細胞内で目的遺伝子を高度に増幅させるための方法およびベクター - Google Patents

Description

本発明は、哺乳類細胞内において目的とする遺伝子を高度に増幅させる方法、および該方法を実施するために用いるベクターに関する。より具体的には、本発明者らが開発した「高度遺伝子増幅系」を用いて所望の遺伝子を増幅する際に、遺伝子導入効率および遺伝子増幅効率を向上させることができる方法、および当該方法を行うためのベクターに関する。

本発明者は、哺乳動物の複製開始領域（ＩＲ；Initiation Region）と核マトリックス結合領域（ＭＡＲ； Matrix Attachment Region）とを持つプラスミド（以下「ＩＲ／ＭＡＲプラスミド」という）をヒト由来がん細胞（COLO 320 大腸がん細胞株、およびHeLa細胞株）にリポフェクション法で導入し、プラスミド上に存在する薬剤耐性遺伝子（ブラスティサイジン（Blasticidine）あるいはネオマイシン（Neomycine））を利用して選択するだけで、
(1)発現させるべきタンパク質をコードする遺伝子（以下、適宜「目的遺伝子」という）の細胞内コピー数を１万コピー程度にまで増幅できること、および、
(2)目的遺伝子はＩＲ／ＭＡＲプラスミドに対して同一の遺伝子構築物（シス）として導入した場合であっても、別の遺伝子構築物（トランス）として導入した場合であっても、高度に増幅することができるということを発見した（特許文献１および非特許文献１参照）。そして、本発明者は当該知見に基づいて、ＩＲ／ＭＡＲプラスミドと目的遺伝子とを、哺乳動物細胞（例えば、ヒト由来がん細胞（COLO 320 大腸がん細胞株、およびHeLa細胞株）、ＣＨＯ細胞等）にリポフェクション法で導入し、プラスミド上に存在する薬剤耐性遺伝子（BlasticidineあるいはNeomycine）を利用して選択するだけで、目的遺伝子を１万コピー程度に増幅できる系（以下、「高度遺伝子増幅系」という）を完成させるに至った。

ここで、ＤＭとＨＳＲがＩＲ／ＭＡＲプラスミド（「ＩＲ／ＭＡＲベクター」ともいう）によって生じるメカニズムを図１に示す。ＩＲ／ＭＡＲプラスミドは宿主細胞内で直列に反復してつながることで多量体化する（Ｓｔｅｐ１）。この多量体は細胞が成長している間は宿主細胞内で安定して存在し、自己複製を行う。上記多量体がそのまま大きくなるか、宿主細胞内に元から存在するＤＭに取り込まれることでＤＭが発生する。また、Ｓｔｅｐ２のように多量体の環状ＤＮＡは宿主細胞内でＤＮＡ２本鎖が切断され（ＤＳＢ;double strand breakage）、直鎖状ＤＮＡになる。すると、当該直鎖状ＤＮＡはクロモソームに組み込まれ、Ｓｔｅｐ３のようなＢＦＢ（Breakage-Fusion-Bridge）サイクルが開始され、ＨＳＲが生じる。
日本国公開特許公報「特開２００３−２４５０８３号公報（公開日：平成１５（２００３）年９月２日） Noriaki Shimizu, et al. (2001) Plasmids with a Mammalian Replication Origin and a Matrix Attachment Region Initiate the Event Similar to Gene Amplification. Cancer Research vol.61, no.19, p6987-6990.

特許文献１に記載されている高度遺伝子増幅系で利用しているＭＡＲは数百ｂｐのポリヌクレオチドであるが、ＩＲは数ｋｂｐにもおよぶ。例えばｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来のＩＲは２．４ ｋｂｐ、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（以下、適宜「ＤＨＦＲ」という）遺伝子座由来のＩＲは４．６ ｋｂｐである。よって、ＩＲ／ＭＡＲプラスミドは比較的大きなサイズの遺伝子構築物となってしまう。

高度遺伝子増幅系を用いて目的遺伝子を増幅する場合、ＩＲ／ＭＡＲプラスミドと目的遺伝子とを哺乳動物細胞へ導入するが、このとき、ＩＲ／ＭＡＲプラスミドのサイズが小さくなれば、以下のメリットを享受できることが考えられた。
(A)哺乳動物細胞への遺伝子導入効率がさらに向上する。
(B)さらにサイズの大きい目的遺伝子を高度遺伝子増幅系へ適用することが可能となる。
(C)タグタンパク質やシグナルペプチド等のその他のエレメントをコードするポリヌクレオチドを、ＩＲ／ＭＡＲプラスミドに容易に組み込むことができるようになり、より複雑なベクターを構築することも可能になる。

そこで本発明は、高度遺伝子増幅系のさらなる改良を目的とした。より具体的には、上記(A)〜(C)のメリットを享受し得るベクターの開発、および上記ベクターを用いた目的遺伝子の増幅方法を提供することを本発明は目的とした。

本発明者らは、上記課題を解決するためにＩＲ／ＭＡＲプラスミドのＩＲに着目して鋭意検討を行ったところ、目的遺伝子を高度に増幅させることができるＩＲの部分断片を発見し本発明を完成するに至った。

驚くべきことに、上記ＩＲの部分断片を高度遺伝子増幅系に適用して目的遺伝子の増幅を行うと、全長のＩＲを用いた場合よりもＨＳＲの発生頻度が著しく向上するという、当業者が予想し得る以上の効果が得られた。また、上記ＩＲの部分断片を高度遺伝子増幅系に適用して目的遺伝子の増幅を行った場合は、全長のＩＲを用いた場合と同程度の遺伝子増幅量であったとしても、タンパク質の生産量が高くなるという、当業者が予想し得る以上の効果が得られた。

本発明は、上記課題を解決するために以下の発明を包含する。

本発明にかかる方法は、目的遺伝子を増幅させるための方法であって、
哺乳動物複製開始領域の部分断片であって遺伝子増幅活性部位を有する増幅活性断片、および哺乳動物核マトリックス結合領域を具備するベクターと、前記目的遺伝子とを哺乳動物細胞に導入する工程と、
を含む方法である。

本発明にかかる方法は、前記哺乳動物複製開始領域が、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、およびβ−グロビン遺伝子座の複製開始領域のいずれか１つに由来するものであってもよい。

また本発明にかかる方法は、前記増幅活性断片が、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座に由来し、Duplex Unwinding ElementとtopoisomeraseII結合領域とを少なくとも含むことを特徴とするものであってもよい。

また本発明にかかる方法は、前記増幅活性断片が、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座に由来し、下記（ａ）のポリヌクレオチドと下記（ｂ）のポリヌクレオチドとを含む、請求項１に記載の方法であってもよい：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号１に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド。

また本発明にかかる方法は、前記増幅活性断片が、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号３に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチドを含むものであってもよい。

また本発明にかかる方法は、前記増幅活性断片が、配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号４に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチドを含むものであってもよい。

また本発明にかかる方法は、前記増幅活性断片が、配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号５に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチドを含むものであってもよい。

また本発明にかかる方法は、前記増幅活性断片が、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座に由来し、配列番号１０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号１０に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチドを含むことを特徴とする方法であってもよい。

また本発明にかかる方法は、前記増幅活性断片が、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座に由来し、配列番号１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号１１に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチドを含むことを特徴とする方法であってもよい。

また本発明にかかる方法は、前記哺乳動物核マトリックス結合領域が、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、およびジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか１つに由来するものであってもよい。

また本発明にかかる方法は、前記目的遺伝子と、前記ベクターとをトランスに配置して、哺乳動物細胞に導入することを特徴とする方法であってもよい。

一方、本発明にかかるベクターは、目的遺伝子を哺乳動物細胞内で増幅させるためのベクターであって、哺乳動物複製開始領域の部分断片であって遺伝子増幅活性部位を有する増幅活性断片、哺乳動物核マトリックス結合領域、および形質転換細胞を選択するための遺伝子を具備するベクターを含むことを特徴としている。

また本発明にかかるベクターは、前記哺乳動物複製開始領域が、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、およびβ−グロビン遺伝子座の複製開始領域のいずれか１つに由来するものであってもよい。

また本発明にかかるベクターは、前記増幅活性断片が、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座に由来し、Duplex Unwinding ElementとtopoisomeraseII結合領域とを少なくとも含むことを特徴とするものであってもよい。

また本発明にかかるベクターは、前記増幅活性断片が、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座に由来し、下記（ａ）のポリヌクレオチドと下記（ｂ）のポリヌクレオチドとを含む、ベクターであってもよい：
（ａ）配列番号１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号１に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド；
（ｂ）配列番号２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド。

また本発明にかかるベクターは、前記増幅活性断片が、配列番号３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号３に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチドを含むものであってもよい。

また本発明にかかるベクターは、前記増幅活性断片が、配列番号４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号４に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチドを含むものであってもよい。

また本発明にかかるベクターは、前記増幅活性断片が、配列番号５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号５に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチドを含むものであってもよい。

また本発明にかかるベクターは、前記増幅活性断片が、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座に由来し、配列番号１０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号１０に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチドを含むものであってもよい。

また本発明にかかるベクターは、前記増幅活性断片が、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座に由来し、配列番号１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号１１に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチドを含むものであってもよい。

また本発明にかかるベクターは、前記哺乳動物核マトリックス結合領域が、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、およびジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか１つに由来するものであってもよい。

なお、上記増幅活性断片は、配列番号１、２、３、４、５、１０、および１１に示された塩基配列にて特定されるポリヌクレオチドに限定されるものではなく、配列番号１、２、３、４、５、１０、および１１に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるものであってもよい。また上記増幅活性断片は、配列番号１、２、３、４、５、１０、および１１に示された塩基配列にて特定されるポリヌクレオチド、並びに配列番号１、２、３、４、５、１０、および１１に示された塩基配列の相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドのいずれかとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするポリヌクレオチドも含まれる。なお、上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも９０％以上の同一性、好ましくは少なくとも９５％以上の同一性、最も好ましくは９７％の同一性が配列間に存在する時にのみハイブリダイゼーションが起こることを意味する。

一方、本発明にかかる形質転換体は、上記本発明にかかるベクター、および目的遺伝子が哺乳動物細胞に導入されてなるものである。

本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分かるであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明によって明白になるであろう。

ＩＲ／ＭＡＲプラスミドによってＤＭおよびＨＳＲが生じるメカニズムを示す模式図である。 ベクターによって形質転換されたＣＯＬＯ ３２０ＤＭに生じたＤＭおよびＨＳＲをＦＩＳＨ法によって検出した蛍光顕微鏡像であり、ＡおよびＢはｐＳＦＶｄｈｆｒが導入された形質転換細胞の結果を示し、ＣはｐΔＨｐＡ×２．ｄｈｆｒが導入された形質転換細胞の結果を示し、ＤはｐＴＨ２．ｄｈｆｒが導入された形質転換細胞の結果を示し、ＥはｐＥＰＩ−Ｉが導入された形質転換細胞の結果を示す。 実施例および参考例において使用されているプラスミドの概略図である。 参考例１においてｐＴＨ．ＩＲ．ＭＡＲプラスミドが遺伝子導入されたＣＯＬＯ ３２０ＤＭに生じたＨＳＲの頻度を示す棒グラフである。 プラスミド（ｐΔＢＮ．ＡＲ１、ｐΔＨｐＡ、ｐΔＨｐＡ．ｄｈｆｒ、ｐΔＨｐＡ×２．ｄｈｆｒ、ｐＴＨ２．ｄｈｆｒ、ｐＴＨ２．ｄｈｆｒ．ｉｎｖ、ｐＥＰＩ−１、またはｐＴＨ３）が導入された、ＨｅＬａ（図５（Ａ））、ＣＯＬＯ ３２０ＨＳＲ（図５（Ｂ））、またはＣＯＬＯ３２０ＤＭ（図５（Ｃ））のＨＳＲ発生頻度を示す棒グラフである。 実施例１の結果を示す図であり、Ａはｃ−ｍｙｃ遺伝子座（GenBank HSMYCC; accession number X00364）の概略図であり、ＢおよびＣはｃ−ｍｙｃ遺伝子座のＩＲ全長とその部分断片Ｃ０〜Ｃ１６との位置関係を示す図、並びに上記部分断片を含むプラスミド（ｐＣ０〜ｐＣ１６）が導入された形質転換細胞のＨＳＲ発生頻度を示す図である。 実施例２の結果を示す図であり、ＡはＤＨＦＲ遺伝子座Ｏｒｉ−β領域（Genbank CFORIDHFR; accession number X94372）の概略図、ＢはＤＨＦＲ遺伝子座Ｏｒｉ−β領域のＩＲ全長とその部分断片Ｃ０〜Ｃ１１との位置関係を示す図、および各部分断片を含むプラスミドが導入された形質転換細胞のＨＳＲ発生頻度を示す図である。 Ａは実施例において使用したｐＣ１２ベクターの模式図であり、Ｂは実施例において使用したｐＣ１２.Ｐｓｖ４０ベクターの模式図である。 各実験区における抗体生産量をそれぞれ示す棒グラフであり、「with No IR/MAR」はＩＲ／ＭＡＲプラスミドをトランスフェクションしなかった場合の結果を示し、「ｐΔＢＮ.ＡＲ１」はｐΔＢＮ.ＡＲ１をコトランスフェクションした場合の結果を示し、「ｐＣ１２.Ｐｓｖ４０」はｐＣ１２.Ｐｓｖ４０をコトランスフェクションした場合の結果を示す。 実施例３において、ｐＣ１２.Ｐｓｖ４０をコトランスフェクションした場合の各クローンの抗体生産量を示す棒グラフである。 実施例３において、ｐΔＢＮ.ＡＲ１をコトランスフェクションした場合の各クローンの抗体生産量を示す棒グラフである。

以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更実施し得る。また、本明細書中に記載された公知文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。

＜１.本発明の遺伝子増幅方法＞
本発明の一実施形態は、目的遺伝子を増幅させるための方法に関する。上記方法のことを「本発明の遺伝子増幅方法」と称する。

ここで本発明の遺伝子増幅方法は、
哺乳動物複製開始領域の部分断片であって遺伝子増幅活性部位を有する増幅活性断片、および哺乳動物核マトリックス結合領域を具備するベクターと、前記目的遺伝子とを哺乳動物細胞に導入する工程（以下、「導入工程」という）を含む方法である。

ここで「目的遺伝子」とは発現させるべきタンパク質をコードする遺伝子のことを意味する。上記目的遺伝子は、特に限定されるものではなく、所望のタンパク質をコードするポリヌクレオチドを適宜選択の上、採用すればよい。目的遺伝子であるポリヌクレオチドは、その塩基配列情報を元にＰＣＲ等の公知の技術を用いて取得すればよい。

本発明の遺伝子増幅方法を実施することによって目的遺伝子が、染色体外のダブルマイニュート染色体（以下、適宜「ＤＭ」という）上、および／または染色体の均一染色領域（Homogeneously staining regeon；以下、適宜「ＨＳＲ」という）で増幅される。つまり形質転換細胞のクローンについて目的遺伝子がＤＭ上および／またはＨＳＲで検出される、すなわち増幅構造が形成されていれば、目的遺伝子が増幅されていると判断できる。形質転換細胞のクローンにおいて上記増幅構造が形成されたか否かを検出する方法については、特に限定されるものではないが、例えば分裂期の染色体について公知のＦＩＳＨ法（fluorescence in situ hybridization）を行ない、哺乳動物細胞へ導入した遺伝子を検出することによって判断し得る。上記判断は、当業者であれば容易に行い得る。なおＦＩＳＨ法を実施する際の具体的な方法については特に限定されるものではなく、従来公知の方法を適宜選択の上、採用すればよい。

また本発明の遺伝子増幅方法によれば、従来の高度遺伝子増幅系に比して目的遺伝子の増幅効率が向上するという、当業者が予想し得る以上の効果をも得られる（実施例を参照のこと）。目的遺伝子の増幅効率が増加したか否かについては、従来の高度遺伝子増幅系を実施した場合の遺伝子増幅構造発生頻度（例えば、ＨＳＲ発生頻度、ＤＭ発生頻度）と、本発明の遺伝子増幅方法を実施した場合の遺伝子増幅構造発生頻度とを比較することによって判断することができる。そして後者における遺伝子増幅構造発生頻度が前者に比して高ければ、後者、すなわち本発明の遺伝子増幅方法によれば、従来の高度遺伝子増幅系に比して目的遺伝子の増幅効率が向上するということが確認できる。

なお本発明にかかる方法には、上記導入工程の他に、
目的遺伝子とベクターとが導入された哺乳動物細胞を分離する工程（以下、「選抜工程」という）や、当該選抜工程によって選抜された哺乳動物細胞（すなわち形質転換細胞）を培養する培養工程（以下、「培養工程」という）が含まれていてもよい。また、上記培養工程によって生産された目的タンパク質を精製する方法（以下、「精製工程」という）が含まれていてもよい。以下、本発明にかかる方法を工程ごとに説明する。

〔１−１．導入工程〕
本発明にかかる方法における導入工程は、
(i)哺乳動物複製開始領域の部分断片であって遺伝子増幅活性部位を有する増幅活性断片、哺乳動物核マトリックス結合領域、および形質転換細胞を選択するための遺伝子を具備するベクターと、前記目的遺伝子とを哺乳動物細胞に導入する工程である。

上記ベクター（以下「ＩＲ／ＭＡＲプラスミド」という）に含まれる哺乳動物複製開始領域および哺乳動物核マトリックス結合領域は、哺乳動物をはじめとする真核生物細胞内で機能する複製開始領域および核マトリックス結合領域であれば特に限定されるものではない。上記哺乳動物複製開始領域としては、例えばｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来、ジヒドロ葉酸リダクターゼ（ＤＨＦＲ）遺伝子座由来、β-グロビン遺伝子座由来等の複製開始領域が挙げられる。なおｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来の複製開始領域（以下、適宜「ｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来の複製開始領域」については、「McWhinney, C. et al., Nucleic Acids Res. vol. 18, p1233-1242 (1990)」を参照のこと。またジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の複製開始領域については、「Dijkwel, P.A. et al., Mol. Cell. Biol. vol.8, p5398-5409 (1988) 」を参照のこと。またβ-グロビン遺伝子座の複製開始領域については、「Aladjem, M. et al., Science vol. 281, p1005-1009 (1998) 」を参照のこと。

また上記哺乳動物核マトリックス結合領域としては、例えば、Igκ遺伝子座、SV40初期領域、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座等の核マトリックス結合領域に由来するポリヌクレオチドが挙げられる。なお、Igκ遺伝子座の核マトリックス結合領域については、「Tsutsui, K. et al., J. Biol. Chem. vol. 268, p12886-12894 (1993) 」を参照のこと。またSV40初期領域の核マトリックス結合領域については、「Pommier, Y. et al., J. Virol., vol 64, p419-423 (1990) 」を参照のこと。またジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域については、「Shimizu N. et al., Cancer Res. vol. 61, p6987-6990 」を参照のこと。

なお本明細書において特に言及しない場合においては、哺乳動物複製開始領域を「ＩＲ」と表記し、哺乳動物核マトリックス結合領域を「ＭＡＲ」と表記する。また全長のＩＲおよびＭＡＲのみならず、これらの部分断片により構成されているベクターも「ＩＲ／ＭＡＲプラスミド」と称する。

本発明の遺伝子増幅方法では、ＩＲ／ＭＡＲプラスミドのサイズを小さくするために、哺乳動物複製開始領域（ＩＲ）の部分断片であって遺伝子増幅活性部位を有する増幅活性断片を用いることを特徴としている。ここで「哺乳動物複製開始領域（ＩＲ）の部分断片」とは全長のＩＲを除くＩＲの一部分であることを意味する。ＩＲの部分断片の長さは特に限定されるものではないが、約２．４ ｋｂｐであるｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来のＩＲの場合は、部分断片の長さは０．５ｋｂｐ以上２．０ｋｂｐ以下であることが好ましく、０．５ｋｂｐ以上１．５ｋｂｐ以下であることがさらに好ましく、０．５ｋｂｐ以上１．３ｋｂｐ以下であることが最も好ましい。また約４．６ ｋｂｐであるＤＨＦＲ遺伝子座由来のＩＲの場合は、部分断片の長さは１．７ｋｂｐ以上３．５ｋｂｐ以下であることが好ましく、１．７ｋｂｐ以上３．１ｋｂｐ以下であることがさらに好ましい。上記好ましい範囲を満たす場合は、上記(A)〜(D)の効果が得られやすい。

ここで「遺伝子増幅活性部位」とは、高度遺伝子増幅系における遺伝子増幅が起こるために必須なエレメントのことを意味する。例えば、あるＩＲの部分断片が、上記遺伝子増幅活性部位を有しているか否かは、例えば、当該部分断片とＭＡＲとを用いてＩＲ／ＭＡＲプラスミドを調製し、当該ＩＲ／ＭＡＲプラスミドと目的遺伝子とを哺乳動物細胞へ導入した際に遺伝子増幅形態（ＨＳＲ、ＤＭ）の発生頻度を検討することによって判断することができる。すなわち上記検討において遺伝子増幅形態（ＨＳＲ、ＤＭ）の発生頻度が全長のＩＲを用いた場合に比して著しく低下する、または遺伝子増幅形態（ＨＳＲ、ＤＭ）が発生しなくなれば、その検討に用いたＩＲの部分断片には遺伝子増幅活性部位が含まれていないと判断できる。

さらに、ＩＲのディレーションミュータントを調製し、上記検討を行なうことで遺伝子増幅活性部位を同定することができる。ディレーションミュータントはＩＲの配列情報からＰＣＲ法や制限酵素消化によって調製することが可能である。

本発明者らの検討によれば、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来ＩＲの場合、配列番号４、５、６、７、８、および９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが遺伝子増幅活性部位を有していることが明らかとなった。

さらに、上記の結果をもとに本発明者らが検討したところ、特に、Duplex Unwinding Element（以下「ＤＵＥ」と表記する）およびtopoisomeraseII結合領域が遺伝子増幅活性部位に相当することがわかった。よってＩＲ／ＭＡＲプラスミドにおける全長ＩＲの代わりに、ＤＵＥおよびtopoisomeraseII結合領域を少なくとも含むＩＲの部分断片を用いることによって、目的遺伝子を高度に増幅することができる。なお上記ＩＲの部分断片はｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来のＤＵＥおよびtopoisomeraseII結合領域のみからなるものであってもよく、またＤＵＥおよびtopoisomeraseII結合領域が複数連結されたものであってもよく、さらにｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来ＩＲのＤＵＥおよびtopoisomeraseII結合領域を含む部分断片であってもよい。

ｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来ＩＲの塩基配列は、例えばGenbank HSMYCC(accession number X00364)の第１〜２３４９位に相当するものが挙げられる。そのうちＤＵＥを含むＩＲの部分断片の好ましい実施形態としては、Genbank HSMYCC(accession number X00364)の第１８９〜４７３位に相当するポリヌクレオチドが挙げられる。上記ポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号１に示した。ただし配列番号１に示されるもののみが、ＤＵＥを含むＩＲの部分断片の好ましい実施形態に該当するものではなく、配列番号１に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、すなわち変異ポリヌクレオチドもＤＵＥを含むＩＲの部分断片の好ましい実施形態に該当するということを、当業者は容易に理解する。なお上記変異ポリヌクレオチドを用いてＩＲ／ＭＡＲプラスミドを構築した場合に目的遺伝子を増幅させる活性を有することはいうまでもない。

また配列番号１に示されている塩基配列を、クエリーとしてＢＬＡＳＴＮ ２．２．１などの相同検索プログラムを用いて、ＧｅｎＢａｎｋやＥＭＢＬ、ＤＤＢＪなどのデータベースに対して相同検索を行うことで得られた塩基配列からなるポリヌクレオチドを、ＤＵＥを含むＩＲの部分断片として利用可能である。上記の変異ポリヌクレオチドまたは相同検索を行うことで得られたポリヌクレオチドと、配列番号１に示されるポリヌクレオチドとの相同性は、８０％以上が好ましく、約９０％以上がさらに好ましく、約９５％以上が最も好ましい。

またGenbank HSMYCC(accession number X00364)の第１〜２３４９位に示されているｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来ＩＲのうち、topoisomeraseII結合領域を含むＩＲの部分断片の好ましい実施形態としては、Genbank HSMYCC(accession number X00364)の第７４５〜９８７位に相当するポリヌクレオチドが挙げられる。上記ポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号２に示した。ただし配列番号２に示されるもののみが、topoisomeraseII結合領域を含むＩＲの部分断片の好ましい実施形態に該当するものではなく、配列番号２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、すなわち変異ポリヌクレオチドもtopoisomeraseII結合領域を含むＩＲの部分断片の好ましい実施形態に該当するということを、当業者は容易に理解する。なお変異ポリヌクレオチドについては上述の通りである。

またＤＵＥおよびtopoisomeraseII結合領域を少なくとも含むＩＲの部分断片の好ましい実施形態としては、Genbank HSMYCC(accession number X00364)の第１８９〜９８７位に相当するポリヌクレオチドが挙げられる。上記ポリヌクレオチドの塩基配列を配列番号３に示した。ただし配列番号３に示されるもののみが、ＤＵＥおよびtopoisomeraseII結合領域を少なくとも含むＩＲの部分断片の好ましい実施形態に該当するものではなく、配列番号３に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、すなわち変異ポリヌクレオチドも部分断片の好ましい実施形態に該当するということを、当業者は容易に理解する。なお変異ポリヌクレオチドについては上述の通りである。

またＤＨＦＲ由来ＩＲの場合、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、および１６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが増幅活性断片に該当することを本発明者らは確認した。そして、これらの結果から配列番号１０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを少なくとも含むポリヌクレオチドをＩＲ／ＭＡＲプラスミドの全長ＩＲの代わりに使用することで、目的遺伝子を増幅することができるということを見出した。ただし配列番号１０の代わりに、配列番号１０に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、すなわち変異ポリヌクレオチドも本発明にかかる遺伝子増幅方法において利用可能であるということを、当業者は容易に理解する。なお変異ポリヌクレオチドについては上述の通りである。

配列番号１０に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号１０に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチドを含む、ＤＨＦＲ由来の増幅活性断片としては、配列番号１１、１２、１３、１４、１５、および１６に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、ならびに当該ポリヌクレオチドの変異ポリヌクレオチドが挙げられる。かかる増幅活性断片には、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座由来ＩＲのものと同様に、ＤＵＥおよびtopoisomeraseII結合領域が含まれている。またＤＨＦＲ由来ＩＲの増幅活性断片には、湾曲ＤＮＡ、ＲＩＰ６０結合領域、およびＡＴ−ｒｉｃｈエレメントがさらに含まれている。

特に配列番号１１に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドをＩＲ／ＭＡＲプラスミドの全長ＩＲの代わりに使用することで、全長ＩＲを使用した場合に比して目的遺伝子の増幅効率が向上するという驚くべき知見が得られた。

なおＤＨＦＲ由来ＩＲの塩基配列としては、Genbank CFORIDHFR(accession number X94372)の第１５３２〜６１６６位に示される塩基配列がその一例として挙げられる。

本発明にかかる遺伝子増幅方法の導入工程において使用するＩＲ／ＭＡＲプラスミドは、既述の増幅活性断片、およびＭＡＲが具備されていればよいが、当該ＩＲ／ＭＡＲには、大腸菌内でクローニングを行うために必要な配列、選択マーカー（マーカータンパク質）としての薬剤耐性遺伝子(ブラスティサイジン抵抗性遺伝子、ネオマイシン抵抗性遺伝子、ヒグロマイシン抵抗性遺伝子等)または緑色蛍光タンパク質遺伝子等が含まれていてもよい。これらの選択マーカーを指標とすることによって、ＩＲ／ＭＡＲプラスミドが導入された哺乳動物細胞を選別できる。

また本発明にかかる遺伝子増幅方法の導入工程において導入される、目的遺伝子はプロモーターに制御可能に連結されていることが好ましい。上記プロモーターは、導入される哺乳動物細胞において機能するものであれば特に限定されるものではなく、転写因子等による所定の操作によって、プロモーターの転写活性が活性化または不活性化されるプロモーター（本明細書においては「転写活性調節型プロモーター」という）であっても、恒常的に転写活性が活性化されている恒常型プロモーターであってもよい。「転写活性調節型プロモーター」は、上記特性を有するものであれば特に限定されるものではなく、例えば、ＴＲＥプロモーター（クロンテック社製）、Ｔ−ＲＥＸプロモーター（インビトロジェン社製）等の市販品が本発明にかかる方法において利用可能である。恒常型プロモーターとしては、ＣＭＶプロモーター、ＳＶ４０初期領域由来プロモーター（ＳＶ４０プロモーター）、SRalphaプロモーター（ＳＲαプロモーター）、ＬＴＲプロモーター、ＭＭＴＶプロモーター等が利用可能である。

本発明にかかる遺伝子増幅方法の導入工程において、ＩＲ／ＭＡＲプラスミドと目的遺伝子とを哺乳動物細胞へ同時に導入する。このようにすることによって、目的遺伝子が法入道物細胞において高度に増幅される。

上記哺乳動物細胞は、特に限定されるものではなく、例えばＣＨＯ−Ｋ１細胞（入手先：例えば、ATCC CCL-61、RIKEN RCB0285、RIKEN RCB0403等）、各種腫瘍細胞等が挙げられる。ただし、上記哺乳動物細胞としては、無限増殖能を有する腫瘍細胞が特に好ましい。上記腫瘍細胞としては、例えば、ＨｅＬａ細胞（入手先：例えば、ATCC CCL-2、ATCC CCL-2.2、RIKEN RCB0007、RIKEN RCB0191等）、ヒト大腸がんCOLO 320DM細胞（入手先：例えば、ATCC CCL-220）、ヒト大腸がんCOLO 320HSR細胞（入手先：例えば、ATCC CCL-220.1）、ＮＳ０細胞（入手先：例えば、RIKEN RCB0213）等が挙げられる。なおヒト大腸がんCOLO 320DM細胞については、「Shimizu, N., Kanda, T., and Wahl, G. M. Selective capture of acentricfragments by micronuclei provides a rapid method for purifying extrachromosomally amplified DNA. Nat. Genet., 12: 65−71, 1996.」を参照のこと。

なお、ＩＲ／ＭＡＲプラスミドおよび目的遺伝子を哺乳動物細胞に導入する際には、両者が同時に哺乳動物細胞へ導入される態様であれば特に限定されるものではなく、両者を連結して同一の遺伝子構築物として導入してもよいし、おのおの別々の遺伝子構築物として導入してもよい。ここで前者をＩＲ／ＭＡＲプラスミドと目的遺伝子とをシスに配置するといい、後者をＩＲ／ＭＡＲプラスミドと目的遺伝子とをトランスに配置するという。前者の場合は一の遺伝子構築物を哺乳動物細胞へ導入すればよく、操作が容易であるというメリットがある。一方、後者の場合はそれぞれの遺伝子構築物のサイズを小さくすることができるために、上記(A)〜(D)のメリットをさらに得られやすくなる。

また遺伝子構築物の形態については、プラスミドであってもコスミドであってもよい。またＩＲ／ＭＡＲプラスミドおよび目的遺伝子の哺乳動物細胞への導入方法は、特に限定されるものではなく、リポフェクション、エレクトロポレーション法、パーティクルガン法等公知の方法を適宜選択の上、採用すればよい。

なおＩＲ／ＭＡＲプラスミドと目的遺伝子とを別の遺伝子構築物として導入する場合には、それぞれの遺伝子構築物に選択マーカーをコードする遺伝子が含まれていることが好ましい。上記ポリヌクレオチドが導入された哺乳動物細胞を選抜することができるからである。この時、ＩＲ／ＭＡＲプラスミドに含まれる選択マーカーと、目的遺伝子を含む遺伝子構築物に含まれる選択マーカーとが異なることが好ましいことはいうまでもない。

〔１−２．選抜工程〕
本発明の遺伝子増幅方法における「選抜工程」は、目的遺伝子とベクターとが導入された哺乳動物細胞を分離する工程である。より詳細には、本工程は、目的遺伝子とベクターとが導入されていない哺乳動物細胞、および目的遺伝子とベクターとが導入された哺乳動物細胞が含まれる細胞の多クローン性集団から後者の細胞を選抜する工程である。なお、薬剤耐性を指標として本工程を行う場合には、哺乳動物細胞を培地で培養する工程が含まれる場合があるが、本工程では目的遺伝子とベクターとが導入されていない哺乳動物細胞、および目的遺伝子とベクターとが導入された哺乳動物細胞が含まれる細胞の混合物を培養するのに対して、後述する目的遺伝子とベクターとが導入された哺乳動物細胞として既に選抜された細胞を培養する点において、両工程は明らかに相違する。かかる選抜工程によって、哺乳動物細胞に導入された目的遺伝子が高度に増幅された哺乳動物細胞を選抜することができる。

上記選抜工程の具体的方法は特に限定されるものではないが、例えば、目的遺伝子とベクターとを哺乳動物細胞へ導入する際に用いた遺伝子構築物に薬剤耐性遺伝子が含まれている場合、その薬剤耐性を利用して目的遺伝子とベクターとが導入された哺乳動物細胞を選抜すればよい。

なお、本発明の遺伝子導入方法における選抜工程は、ＰＣＲ法やサザンブロット法によって、哺乳動物細胞に含まれる目的遺伝子若しくはベクター、またはそのヌクレオチド断片を検出することによっても行い得る。上記薬剤耐性、ＰＣＲ法、サザンブロット法の具体的な方法は、特に限定されるものではなく、公知の方法が適宜利用され得る。

〔１−３．培養工程〕
本発明の遺伝子増幅方法における「培養工程」は、上記選抜工程によって既に選抜された哺乳動物細胞を培養する工程である。かかる培養工程によって、目的遺伝子が導入され且つ高度に増幅された哺乳動物細胞を増殖させることができ、所定の操作（転写誘導操作等）によって、目的タンパク質を生産することができる。

上記培養工程の具体的方法は特に限定されるものではなく、培養する哺乳動物細胞に最適な条件を検討の上、適宜採用すればよい。

〔１−４．精製工程〕
本発明の遺伝子増幅方法における「精製工程」は、上記培養工程によって生産された目的タンパク質を精製する方法である。

本精製工程におけるタンパク質精製の具体的方法としては、例えば、哺乳動物細胞をＰＢＳ（Phosphate Buffered Saline）等の緩衝溶液に懸濁した後、ホモジェナイザーまたは超音波等で細胞を破砕し、遠心分離をして上清を回収する。上記緩衝溶液には、タンパク質の可溶化を促進するための界面活性剤や、タンパク質の立体構造を安定化するための還元剤、タンパク質の分解を防止するためのプロテアーゼインヒビターを適宜添加することもできる。上記界面活性剤としては、CHAPS(3-[(3-cholamidopropyl)-dimethylammonio-1-propanesulfonate]、Triton X-100、Nikkol、ｎ―オクチルグリコシド等を利用することができる。また、上記還元剤としては、ＤＴＴ（dithiothreitol）、ＤＥＴ(dithioerythritol）等を利用することができる。また、上記プロテアーゼインヒビターとしては、アプロチニンや、ロイペプチンを利用することができる。

上記上清から、目的遺伝子がコードするタンパク質（目的タンパク質）をアフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過クロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィーを用いて、精製することができる。また、精製されたタンパク質溶液を適当な緩衝液に透析することで不要な塩を除去することもできる。上記のタンパク質の精製工程は、タンパク質の分解を抑えるために低温条件下で行われることが好ましい。特に４℃下で精製工程が行われることが好ましい。

なお、上記精製工程の具体的方法は、この限りではなく、公知の方法を適宜利用され得る。

＜２.本発明のベクター＞
なお本発明は、上記で説示した本発明の遺伝子増幅方法を行うためのベクター（以下「本発明のベクター」という）、または当該ベクターを含むことを特徴とする遺伝子増幅キット（以下「本発明のキット」という）をも包含する。

本発明のベクターの説明は、上記本発明の遺伝子増幅方法において使用するＩＲ／ＭＡＲプラスミドの説明を援用することができる。

また、本発明のキットは、上記本発明のベクターを含むことを特徴としている。本発明にかかるキットは、本発明にかかる方法を実施し得るものであれば、上記構成に限定されるものではなく、その他の構成を含んでいてもよい。なお、本発明にかかるキットを構成する物品等の説明については、本発明にかかる方法の説明を適宜援用することができる。

以下に、実施例に基づいて、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。本実施例および参考例に記載のＰＣＲは全てＫＯＤポリメラーゼ（東洋紡積株式会社製）を用いて行った。またＰＣＲの諸条件は、ＫＯＤポリメラーゼに添付されている説明書に記載されている標準の条件で行った。また、プライマーの配列については後述する。

〔各種プラスミド〕
５’末端と３’末端とにＡｓｃ Ｉサイトを有する、ＤＨＦＲ遺伝子座Ｏｒｉ−β領域のＩＲ遺伝子、およびｃ−ｍｙｃのＩＲ遺伝子の作製方法は以下の通りである。ＤＨＦＲ遺伝子座Ｏｒｉ−β領域のＩＲ（４．６ｋｂｐ）を、「N. Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 61, p6987-6990」に記載されているｐＳＦＶｄｈｆｒからＮｏｔ Ｉで制限酵素消化することによって切り出した。また、ｃ−ｍｙｃのＩＲ（２．４ｋｂｐ）は「McWhinney, C. et al., Nucleic Acids Res. Vol. 18, p1233-1242 (1990)」に記載されているｐＮｅｏ．Ｍｙｃ−２．４からＮｏｔ ＩとＨｉｎｄ ＩＩＩを用いて制限酵素消化して切り出した。上記２つのＩＲ断片の５’と３’末端を平滑末端化した後、その平滑末端にＡｓｃ Ｉの制限酵素サイトを有するアダプターオリゴヌクレオチドを連結した。

またｐΔＢＮ．ＡＲ１、ｐΔＢＮ．ｐｏｌｙＡ、およびｐＳＦＶ−Ｖとして、「N. Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 61, p6987-6990」に記載のプラスミドをそれぞれ用いた。

またｐΔＨはｐＳＦＶ−Ｖに含まれる完全長のハイグロマイシン抵抗性遺伝子カセットをＮｏｔ ＩとＮｒｕ Ｉの制限酵素を用いて取り除き、代わりにその場所にマルチクローニングサイトを含む合成オリゴヌクレオチドを挿入することで作製された。上記マルチクローニングサイトの制限酵素サイトはブラスティサイジン抵抗性遺伝子（以下、「ＢＳＲ」という）の下流に位置し、５’末端から３’末端にかけてＫｐｎ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉ−Ａｓｃ Ｉ−Ｎｒｕ Ｉの順番である。

また図３Ｄに示されているｐΔＨｐＡは、ＨＳＶ ｐｏｌｙ Ａ配列（１３５７ｂｐ）を含む遺伝子を５’末端および３’末端にＫｐｎ Ｉの制限酵素サイトが付加されるように設計したＨＳＶｐＡＫｐｎＩＲとＨＳＶｐＡＫｐｎＩＬのプライマーセットとを用いてＰＣＲ法によって増幅し、当該Ｋｐｎ Ｉの制限酵素サイトを用いて上記ｐΔＨのＫｐｎ Ｉサイトに挿入することで作製された。ＨＳＶｐＡＫｐｎＩＲおよびＨＳＶｐＡＫｐｎＩＬの各プライマーの塩基配列を配列番号１７と配列番号１８にそれぞれ示した。また、上記、ＨＳＶ ｐｏｌｙ Ａ配列の塩基配列を配列番号１９で示した。

図３Ｅに示されているｐΔＨｐＡｄｈｆｒを、上記で作製したＤＨＦＲ遺伝子座Ｏｒｉ−β領域のＩＲを、そのＩＲ断片の内部に存在するＭＡＲ配列が、ＢＳＲの転写開始点よりも遠くになるようにｐΔＨｐＡのＡｓｃ Ｉサイトに挿入することで作製した。

また図３Ｆに示されているｐΔＨｐＡ×２．ｄｈｆｒは、平滑末端処理を施した上記ＨＳＶ ｐｏｌｙ Ａ配列（図３中「ＨＳＶ ｐＡ」で示す）を含む遺伝子断片をｐΔＨｐＡ．ｄｈｆｒのＮｒｕ Ｉサイトに挿入することで作製された。

また図３ＣのｐＴＨ．ＩＲ．ＭＡＲは下記の通りにして作製された。
（ｉ）ＡＲ１のＭＡＲ（３７５ｂｐ）断片をＨｉｎｄ ＩＩＩとＢａｍＨ Ｉを用いて制限酵素消化することでｐＡＲ１より切り出し、当該断片の両末端を平滑末端処理した。なお、ｐＡＲ１の詳細は「N. Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 61, p6987-6990」に記載されている。
（ｉｉ）ＳＶ４０の初期領域のＭＡＲ遺伝子を、ｐＮｅｏ．Ｍｙｃ−２．４を鋳型としてＳＶ４０ＬとＳＶ４０Ｒのプライマーセットを用いてＰＣＲ法により取得した。ＳＶ４０ＬおよびＳＶ４０Ｒの塩基配列を配列番号２０および２１にそれぞれ示した。また、上記ＳＶ４０の初期領域のＭＡＲ遺伝子の塩基配列を配列番号２２に示した。
（ｉｉｉ）ＲＦＢ（replication fork barrier）配列を含む遺伝子（１１８ｂｐ）は、ｐＳＶ２．ＳＢ２を鋳型として、５’末端と３’末端とにＮｏｔ Ｉの制限酵素サイトが付加されるように設計したＲＦＢ Ｎｏｔ ＩＬとＲＦＢ Ｎｏｔ ＩＲのプライマーセットとを用いてＰＣＲ法により取得された。上記ＲＦＢ配列は複製フォークの発生をブロックするため、当該ＲＦＢ配列が導入されたプラスミドの複製を阻害することができる。ＲＦＢ Ｎｏｔ ＩＬおよびＲＦＢ Ｎｏｔ ＩＲの塩基配列を配列番号２３および２４にそれぞれ示した。また、ＲＦＢ配列の塩基配列を配列番号２５で示した。
（ｖｉ）上記ＲＦＢ配列を含む遺伝子を、ＩＲからの複製フォークをブロックする方向性でｐΔＨｐＡのＮｏｔ Ｉサイトに挿入した。次に、平滑末端処理したＡＲ１とＳＶ４０との両方のＭＡＲ遺伝子を、上記プラスミドのＮｒｕ Ｉサイトに挿入した。
（ｖ）最後に、上記で作製したｃ−ｍｙｃのＩＲ遺伝子またはＤＨＦＲ遺伝子座Ｏｒｉ−β領域のＩＲ遺伝子と、λ―ファージのＨｉｎｄ ＩＩＩで制限酵素消化した４３６１ｂｐの断片の両末端にＡｓｃ Ｉサイトを付加した遺伝子とを、それぞれ（ｖｉ）で作製したプラスミドのＡｓｃ Ｉサイトに挿入した。

また図３Ｇに示されているｐＴＨ２．ｄｈｆｒ、またはｐＴＨ２．ｄｈｆｒ．ｉｎｖは、上記で取得したＤＨＦＲ遺伝子座Ｏｒｉ−β領域のＩＲ遺伝子（４．６ｋｂｐ）を平滑末端処理したものを、ｐΔＨｐＡのＥｃｏＲ Ｉ消化物を平滑末端処理したものに対して、ＢＳＲの転写に関して同じ、または反対の方向になるように挿入してそれぞれ作製された。

また図３Ｈに示されているｐＥＰＩ−Ｉ（「Schaarschmidt, D., Baltin, J., Stehle, I. M., Lipps, H. J., and Knippers, R. (2004) EMBO J. 23(1), 191-201.」、および 「Jenke, A. C., Stehle, I. M., Herrmann, F., Eisenberger, T., Baiker, A., Bode, J., Fackelmayer, F. O., and Lipps, H. J. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 11322-11327.」）はDaniel Schaarchmidt (Department of Biology, Universitat of Konstanz)氏より提供された。

また図３Ｊに記されているｐＴＨＶは、ｐΔＨのＫｐｎ Ｉサイトに平滑末端ライゲーションでＡＲ１のＭＡＲを挿入することで作製された。

また図３Ｉに記されているｐＴＨ３は、上記ｐＴＨＶのＮｏｔ Ｉサイトに平滑末端ライゲーションでＨＳＶ ｐｏｌｙ Ａ配列を挿入することで作製された。

また２．４ｋｂｐのｃ−ｍｙｃのＩＲの部分断片（Ｃ０〜Ｃ１６）または４．６ｋｂｐのＤＨＦＲ遺伝子座Ｏｒｉ−β領域のＩＲの部分断片（Ｄ１〜Ｄ１１）を含むベクターは、ｐＮｅｏ．Ｍｙｃ−２．４とｐＳＦＶｄｈｆｒとを鋳型とするＰＣＲによって増幅された遺伝子を、ｐＴＨＶのＡｓｃ Ｉサイトに挿入することによって作製された。

上記のＰＣＲで用いた、Ｃ０増幅用の５’プライマー（Ｃ０−５’）の塩基配列を配列番号２６に、３’プライマー（Ｃ０−３’）の塩基配列を配列番号２７に示した。また、Ｃ１増幅用の５’プライマー（Ｃ１−５’）の塩基配列を配列番号２８に、３’プライマー（Ｃ１−３’）の塩基配列を配列番号２９に示した。また、Ｃ２増幅用の５’プライマー（Ｃ２−５’）の塩基配列を配列番号３０に、３’プライマー（Ｃ２−３’）の塩基配列を配列番号３１に示した。また、Ｃ３増幅用の５’プライマー（Ｃ３−５’）の塩基配列を配列番号３２に、３’プライマー（Ｃ３−３’）の塩基配列を配列番号３３に示した。また、Ｃ４増幅用の５’プライマー（Ｃ４−５’）の塩基配列を配列番号３４に、３’プライマー（Ｃ４−３’）の塩基配列を配列番号３５に示した。また、Ｃ５増幅用の５’プライマー（Ｃ５−５’）の塩基配列を配列番号３６に、３’プライマー（Ｃ５−３’）の塩基配列を配列番号３７に示した。また、Ｃ６増幅用の５’プライマー（Ｃ６−５’）の塩基配列を配列番号３８に、３’プライマー（Ｃ６−３’）の塩基配列を配列番号３９に示した。また、Ｃ７増幅用の５’プライマー（Ｃ７−５’）の塩基配列を配列番号４０に、３’プライマー（Ｃ７−３’）の塩基配列を配列番号４１に示した。また、Ｃ８増幅用の５’プライマー（Ｃ８−５’）の塩基配列を配列番号４２に、３’プライマー（Ｃ８−３’）の塩基配列を配列番号４３に示した。また、Ｃ９増幅用の５’プライマー（Ｃ９−５’）の塩基配列を配列番号４４に、３’プライマー（Ｃ９−３’）の塩基配列を配列番号４５に示した。また、Ｃ１０増幅用の５’プライマー（Ｃ１０−５’）の塩基配列を配列番号４６に、３’プライマー（Ｃ１０−３’）の塩基配列を配列番号４７に示した。また、Ｃ１１増幅用の５’プライマー（Ｃ１１−５’）の塩基配列を配列番号４８に、３’プライマー（Ｃ１１−３’）の塩基配列を配列番号４９に示した。また、Ｃ１２増幅用の５’プライマー（Ｃ１２−５’）の塩基配列を配列番号５０に、３’プライマー（Ｃ１２−３’）の塩基配列を配列番号５１に示した。また、Ｃ１３増幅用の５’プライマー（Ｃ１３−５’）の塩基配列を配列番号５２に、３’プライマー（Ｃ１３−３’）の塩基配列を配列番号５３に示した。また、Ｃ１４増幅用の５’プライマー（Ｃ１４−５’）の塩基配列を配列番号５４に、３’プライマー（Ｃ１４−３’）の塩基配列を配列番号５５に示した。また、Ｃ１５増幅用の５’プライマー（Ｃ１５−５’）の塩基配列を配列番号５６に、３’プライマー（Ｃ１５−３’）の塩基配列を配列番号５７に示した。また、Ｃ１６増幅用の５’プライマー（Ｃ１６−５’）の塩基配列を配列番号５８に、３’プライマー（Ｃ１６−３’）の塩基配列を配列番号５９に示した。また、Ｄ１増幅用の５’プライマー（Ｄ１−５’）の塩基配列を配列番号６０に、３’プライマー（Ｄ１−３’）の塩基配列を配列番号６１に示した。また、Ｄ２増幅用の５’プライマー（Ｄ２−５’）の塩基配列を配列番号６２に、３’プライマー（Ｄ２−３’）の塩基配列を配列番号６３に示した。また、Ｄ３増幅用の５’プライマー（Ｄ３−５’）の塩基配列を配列番号６４に、３’プライマー（Ｄ３−３’）の塩基配列を配列番号６５に示した。また、Ｄ４増幅用の５’プライマー（Ｄ４−５’）の塩基配列を配列番号６６に、３’プライマー（Ｄ４−３’）の塩基配列を配列番号６７に示した。また、Ｄ５増幅用の５’プライマー（Ｄ５−５’）の塩基配列を配列番号６８に、３’プライマー（Ｄ５−３’）の塩基配列を配列番号６９に示した。また、Ｄ６増幅用の５’プライマー（Ｄ６−５’）の塩基配列を配列番号７０に、３’プライマー（Ｄ６−３’）の塩基配列を配列番号７１に示した。また、Ｄ７増幅用の５’プライマー（Ｄ７−５’）の塩基配列を配列番号７２に、３’プライマー（Ｄ７−３’）の塩基配列を配列番号７３に示した。また、Ｄ８増幅用の５’プライマー（Ｄ８−５’）の塩基配列を配列番号７４に、３’プライマー（Ｄ８−３’）の塩基配列を配列番号７５に示した。また、Ｄ９増幅用の５’プライマー（Ｄ９−５’）の塩基配列を配列番号７６に、３’プライマー（Ｄ９−３’）の塩基配列を配列番号７７に示した。また、Ｄ１０増幅用の５’プライマー（Ｄ１０−５’）の塩基配列を配列番号７８に、３’プライマー（Ｄ１０−３’）の塩基配列を配列番号７９に示した。また、Ｄ１１増幅用の５’プライマー（Ｄ１１−５’）の塩基配列を配列番号８０に、３’プライマー（Ｄ１１−３’）の塩基配列を配列番号８１に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ０の塩基配列を配列番号８２に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ１の塩基配列を配列番号８３に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ２の塩基配列を配列番号８４に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ３の塩基配列を配列番号８５に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ４の塩基配列を配列番号８６に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ５の塩基配列を配列番号８７に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ６の塩基配列を配列番号８８に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ７の塩基配列を配列番号８９に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ８の塩基配列を配列番号９０に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ９の塩基配列を配列番号９１に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ１０の塩基配列を配列番号９２に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ１１の塩基配列を配列番号９３に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ１２の塩基配列を配列番号９４に示した。また、上記ＰＣＲで増幅されたＣ１３の塩基配列を配列番号９５に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＣ１４の塩基配列を配列番号９６に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＣ１５の塩基配列を配列番号９７に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＣ１６の塩基配列を配列番号９８に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ１の塩基配列を配列番号９９に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ２の塩基配列を配列番号１００に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ３の塩基配列を配列番号１０１に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ４の塩基配列を配列番号１０２に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ５の塩基配列を配列番号１０３に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ６の塩基配列を配列番号１０４に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ７の塩基配列を配列番号１０５に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ８の塩基配列を配列番号１０６に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ９の塩基配列を配列番号１０７に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ１０の塩基配列を配列番号１０８に示した。また、上記ＰＣＲに増幅されたＤ１１の塩基配列を配列番号１０９に示した。

〔実験方法〕
上記で作製したプラスミドを用いて以下の実験を行った。

本実施例および参考例（「実施例等」という）では、上記プラスミドを細胞に遺伝子導入し、当該プラスミドで形質転換された形質転換細胞を選択し、ＦＩＳＨ法を用いて当該形質転換細胞内のＨＳＲの形成頻度を調べた。

本実施例等で用いられている遺伝子導入方法については以下の通りである。まず遺伝子導入に用いるプラスミドをキアゲンプラスミド精製キット（Qiagen Inc., Valencia, CA）を用いて大腸菌より精製した。さらに、上記プラスミドを細胞内に導入する際には、ＤＮＡ精製の過程で混入する大腸菌由来の内毒素をMiraCLEAN（登録商標）endotoxin removalキット（Mirus., Madison,WI）を用いて除去した後に、メーカーの推薦する手法に従って、GenePorter（登録商標） 2 lipofectionキット（Gene Therapy Systems, San Diego,CA）を用いて細胞に遺伝子導入した。

上記の遺伝子導入される細胞は、ヒト大腸癌細胞株である、ＣＯＬＯ ３２０ＤＭまたは、ＣＯＬＯ３２０ ＨＳＲ、またはヒト頸癌細胞株であるＨｅｌａである。上記細胞株は「N. Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 61, p6987-6990」に記載の所から取得され、当該記載と同じ条件で培養された。ＣＯＬＯ ３２０ＤＭにはｃ−ｍｙｃ遺伝子の増幅によって多くの内在性のＤＭが生じており、一方、ＣＯＬＯ ３２０ＤＭと同質遺伝子系統のＣＯＬＯ ３２０ＨＳＲにはＤＭよりもＨＳＲが多く生じている。

上記形質転換細胞を、遺伝子導入から２日後に、終濃度５μｇ／ｍｌになるようにブラスティサイジンを加えた選択培地で上記細胞を培養することで選択した。選択培地は３日〜５日ごとに培養中の選択培地の半分を、新しく調製した上記選択培地と交換した。

上記ＦＩＳＨ法と、ＦＩＳＨ法に用いる導入遺伝子を検出するためのプローブの調製と、メタフェーズスプレッディング（metaphase spreading）とは、それぞれ培養４、６、または８週後に、培養中の細胞の一部を回収し、「N. Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 61, p6987-6990」に記載の方法に従って行われた。また、上記プローブはビオチン化されており、緑色蛍光を発するＦＩＴＣ（fluorescein isothiocyanate）が結合したストレプトアビジンによって検出することができる。また、赤色蛍光を発するＰＩ（propidium iodide）でＤＮＡを対比染色した。ＦＩＳＨ法によって蛍光標識したスライドガラス上の細胞を、蛍光色素を検出するのに適切なフィルタセットと１００倍の対物レンズ（Nikon Plan Fluor、NA1.30 oil）を設置している倒立蛍光顕微鏡（ECLIPSE TE2000-U、Nikon）を用いて観察し、上記顕微鏡とつながれているFuji FinePix S1Pro digital camera(Fuji Film Co.Tokyo)を用いて、細胞内での導入遺伝子とＤＮＡの態様の写真をデジタル画像として撮影した。得られた、それぞれの画像は画像解析ソフトAdobe（登録商標）Photpshop（登録商標）version 4.0J(Adobe Systems Inc)を用いて合成した。

〔参考例１〕
プラスミドｐＳＦＶｄｈｆｒ、ｐΔＨｐＡｘ２．ｄｈｆｒ、ｐＴＨ２．ｄｈｆｒ、またはｐＥＰＩ−ＩをＣＯＬＯ３２０ＤＭに遺伝子導入した。ｐＳＦＶｄｈｆｒを導入した場合には培養８週間後に、それ以外のプラスミドを導入した場合には培養６週間後に、形質転換細胞を回収した。回収されたそれぞれの形質転換細胞について、ＦＩＳＨ法によってＤＭとＨＳＲとを検出した。

ＤＭおよびＨＳＲをＦＩＳＨ法により検出した結果を図２に示す。図２における「Ａ」および「Ｂ」はｐＳＦＶｄｈｆｒが導入された形質転換細胞の結果、「Ｃ」はｐΔＨｐＡｘ２．ｄｈｆｒが導入された形質転換細胞の結果、「Ｄ」はｐＴＨ２．ｄｈｆｒが導入された形質転換細胞の結果、「Ｅ」はｐＥＰＩ−Ｉが導入された形質転換細胞の結果をそれぞれ示す。図２において、矢頭はＤＭを示し、矢印はＨＳＲを示す。

種々のＩＲとＭＡＲとの組み合わせを含むｐＴＨ．ＩＲ．ＭＡＲを作製し、ＣＯＬＯ ３２０ＤＭに遺伝子導入し、４、６、または８週間培養後に形質転換細胞を取得した。上記形質転換細胞に生じているＨＳＲをＦＩＳＨ法により調べ、ＨＳＲ発生頻度（Frequency of HSR）をもとめた。その結果を図４に示した。ＨＳＲ発生頻度は、「（ＨＳＲが発生している形質転換細胞数÷形質転換細胞数）×１００」として計算された。図４中のＩＲの欄における「（＋）」および「（−）」は、ＩＲがＢＳＲの転写方向と同じである場合および反対である場合をそれぞれ示す。また、「λ―DNA fragment」はλファージの４３６１ｂｐの遺伝子断片がＩＲの代わりに組み込まれていることを示し、「ｎｏｎｅ」はＩＲを含まないことを示す。

図４によれば、ＩＲとＭＡＲとを有しているプラスミドを遺伝子導入されている形質転換細胞のみにＨＳＲが生じていることが分かる。さらに、ＩＲの代わりにλファージの４３６１ｂｐの遺伝子断片を用いた場合や、ＩＲを用いない場合には、ＨＳＲがほとんど生じていないことから、ＩＲ中にＨＳＲを発生させる活性を有する塩基配列があることが示唆された。

プラスミド（ｐΔＢＮ．ＡＲ１、ｐΔＨｐＡ、ｐΔＨｐＡ．ｄｈｆｒ、ｐΔＨｐＡ×２．ｄｈｆｒ、ｐＴＨ２．ｄｈｆｒ、ｐＴＨ２．ｄｈｆｒ．ｉｎｖ、ｐＥＰＩ−１、またはｐＴＨ３）を、ＨｅＬａまたはＣＯＬＯ ３２０ＨＳＲ、ＣＯＬＯ３２０ＤＭに遺伝子導入を行った。遺伝子導入後、４週間または８週間選択培地で培養することで、形質転換細胞を選抜した。次に、選抜された形質転換細胞ＨＳＲ発生頻度を調べた。その結果を図５に示した。

図５によれば、遺伝子複製と非コード転写との間で衝突が起きるように作製されたｐΔＨｐＡ．ｄｈｆｒを遺伝子導入した場合において、ＨＳＲが生じた。一方、ポリＡ配列を１つ追加して非コード転写と遺伝子複製との間の衝突が起きないように作成したｐΔＨｐＡ×２．ｄｈｆｒを遺伝子導入した場合には、ＨＳＲが生じなかった。このことは、遺伝子複製と非コード転写との間で衝突が起きることでプラスミドが不安定になり、プラスミドは多量体化し、ＨＳＲを生じるということを示唆している。また、非コード転写と遺伝子複製との間の衝突が起きないように作製したｐＴＨ２．ｄｈｆｒが遺伝子導入された場合には、低頻度であるがＨＳＲが生じた。このことは、遺伝子複製と非コード転写との間で衝突が起こっていたことが推察される。上記の結果から、ＩＲの両端にポリＡ配列を付加することで、遺伝子複製と非コード転写との間に起こる衝突をなくすことができるということが分かった。

また、転写領域の間に挿入されたＭＡＲが遺伝子複製と哺乳類エピソームの維持に必須であり、ＩＲは必要ではないという文献「Jenke, A. C., Stehle, I. M., Herrmann, F., Eisenberger, T., Baiker, A., Bode, J., Fackelmayer, F. O., and Lipps, H. J. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 11322-11327.」がある。そこで、上記文献で用いられているプラスミド（ｐＥＰＩ−１）とｐＥＰＩ−１と同様の構成のプラスミド（ｐＴＨ３）を作製した。ｐＴＨ３はＡＲ１由来のＭＡＲがＢＳＲ転写領域の内部に存在するプラスミドである。上記プラスミドをＨｅＬａ、ＣＯＬＯ ３２０ＨＳＲ、またはＣＯＬＯ３２０ＤＭに遺伝子導入し、ＨＳＲの発生を調べたところ、当該形質転換細胞においてＨＳＲおよびＤＭは全く発生していなかった。一方、極微小物体であるエピソームは確認することができた。このことはＩＲがＨＳＲの発生に必須であることを示唆している。またＩＲは遺伝子複製に関与し、ＨＳＲは遺伝子増幅に関与することから、ＩＲの遺伝子複製と遺伝子増幅とが関連すると考えられる。

〔実施例１〕
遺伝子増幅活性を有するｃ−ｍｙｃ遺伝子座のＩＲの部分断片の同定を試みた。すなわち、ＰＣＲを用いてｃ−ｍｙｃ遺伝子座のＩＲの部分断片（Ｃ０〜Ｃ１６）を作製し、当該部分断片（Ｃ０〜Ｃ１６）をそれぞれｐＴＨＶ（図３Ｊ）のＡｓｃ Ｉサイトに挿入し、Ｃ０〜Ｃ１６を含むプラスミド（ｐＣ０〜ｐＣ１６）を作製した（各種プラスミドの項を参照のこと）。

上記各プラスミドを細胞へ導入した場合、組み込まれた部分断片に遺伝子増幅活性があると、ＭＡＲ部位で複製と転写との間で衝突が起こり、当該プラスミドで形質転換された形質転換細胞にＨＳＲが生じる。その反対に、組み込まれた部分断片に遺伝子増幅活性がないと、形質転換細胞にＨＳＲが生じない。このことを利用することによって、遺伝子増幅活性を有するｃ−ｍｙｃ遺伝子座のＩＲの部分断片の同定を試みた。ここで上記の同定方法を便宜上「プラスミド安定化分析法」と称する。

上記ｐＣ０〜ｐＣ１６、陽性対照としてｃ−ｍｙｃのＩＲの全長を含むプラスミド（「ｐＣｆ．ｌ」）、または陰性対照としてｃ−ｍｙｃのＩＲを含まないプラスミド（「ｐＴＨＶ」）をそれぞれＣＯＬＯ３２０ＤＭに遺伝子導入し６週間選択培地で培養することで形質転換細胞を取得した。取得された形質転換細胞のＨＳＲ発生頻度（Frequency of HSR）を既述の方法により調べた。

その結果を図６に示した。図６Ａはｃ−ｍｙｃ遺伝子座（Genbank HSMYCC; accession number X00364）の概略図である。ｃ−ｍｙｃ遺伝子座のＩＲは、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座のHind III-Xho I断片（２３４９ｂｐ）の相当する。図６ＢおよびＣは、ｃ−ｍｙｃ遺伝子座のＩＲ全長と、その部分断片であるＣ０〜Ｃ１６との位置関係、並びに各部分断片が導入された形質転換細胞のＨＳＲ発生頻度を示している。また図６中の「□（白四角）」はｃ−ｍｙｃ遺伝子座のＩＲにおけるtopoisomeraseII結合領域の位置を示し、「◆（黒ひし）」はDuplex Unwinding Element（ＤＵＥ）の位置を示し、「○（白丸）」はプラスミドの自己複製を助けると報告されている、ヒトの３６ｂｐのコンセンサス配列の内のコア２０ｂｐに相当する配列の位置をそれぞれ示している。また、「ｃI」はDuplex Unwinding Element（ＤＵＥ）を含む遺伝子増幅活性を有する塩基配列の位置、「ｃII」はtopoisomeraseII結合領域を含む遺伝子増幅活性を有する塩基配列の位置、「ｃII’」はCIIに類似した配列の位置、「N」はネガティブ領域（ＨＳＲ形成を抑制する領域）の位置をそれぞれ示している。

図６Ｂによれば、ｐＣ３を遺伝子導入して得られた形質転換細胞のＨＳＲの発生頻度が最も高く、また陽性対照のそれよりも多いことが分かった。またｐＣ１を遺伝子導入して得られた形質転換細胞のＨＳＲの発生頻度が最も高く、また陽性対照のそれよりも多いことが分かった。またｐＣ２またはｐＣ７を遺伝子導入して得られた形質転換細胞のＨＳＲの発生頻度は、陽性対照のそれと同等であった。またｐＣ９またはｐＣ６を遺伝子導入して得られた形質転換細胞についてＨＳＲの発生が観察された。

さらに、ｐＣ３に挿入されているｃ−ｍｙｃのＩＲの部分断片について、さらに部分断片を作製しＨＳＲ発生頻度を調べた。その結果、図６Ｃによれば、topoisomeraseII結合領域とDuplex Unwinding Element（ＤＵＥ）とを含む部分断片を有するプラスミド（ｐＣ１２）が導入された形質転換細胞のＨＳＲ発生頻度が最も高かった。さらにそのＨＳＲ発生頻度は陽性対照のそれよりも多いことが分かった。一方、topoisomeraseII結合領域またはDuplex Unwinding Element（ＤＵＥ）のいずれかが含まれていない部分断片が導入された形質転換細胞ではＨＳＲが形成されない、またはＨＳＲ発生頻度が極めて低いということがわかった。よって、topoisomeraseII結合領域とDuplex Unwinding Element（ＤＵＥ）とは、遺伝子増幅において必須のエレメントであるということがわかった。また、topoisomeraseII結合領域とDuplex Unwinding Element（ＤＵＥ）とを含む部分断片を用いることによって、ＩＲ全長を用いた場合に比してＨＳＲ発生頻度がさらに高くなるという、新規知見が得られた。
〔実施例２〕
遺伝子増幅活性を有するＤＨＦＲ遺伝子座Ｏｒｉ−β領域のＩＲの部分断片の同定を行った。ＤＨＦＲ遺伝子座Ｏｒｉ−β領域のＩＲを用いた以外は、実施例１と同様にした。すなわち、ＰＣＲを用いてＤＨＦＲ遺伝子座Ｏｒｉ−β領域のＩＲの部分断片（Ｄ１〜Ｄ１１）を作製し、当該部分断片（Ｄ１〜Ｄ１１）をそれぞれｐＴＨＶ（図３Ｊ）のＡｓｃ Ｉサイトに挿入し、Ｄ１〜Ｄ１１を含むプラスミド（ｐＤ１〜ｐＤ１１）を作製した（各種プラスミドの項を参照のこと）。陽性対照としてＤＨＦＲ遺伝子座Ｏｒｉ−β領域のＩＲの全長を含むプラスミド（「ｐＤｆ．Ｉ」）を採用し、また陰性対照としてＤＨＦＲ遺伝子座Ｏｒｉ−β領域のＩＲを含まないプラスミド（「ｐＴＨＶ」）を採用した。

本実施例の結果を図７に示す。図７にはＤＨＦＲ遺伝子座Ｏｒｉ−β領域（Genbank CFORIDHFR; accession number X94372）の概略図が示されており、ＤＨＦＲ遺伝子座Ｏｒｉ−β領域のBamHI-Hind III断片（４．６ｋｂｐ）がＤＨＦＲ遺伝子座Ｏｒｉ−β領域のＩＲに相当する。また図７には、ＤＨＦＲ遺伝子座Ｏｒｉ−β領域のＩＲ全長とその部分断片であるＤ０〜Ｄ１１との位置関係、並びに各部分断片が導入された形質転換細胞のＨＳＲ発生頻度を示す。

図７によれば、ＤＨＦＲ遺伝子座Ｏｒｉ−β領域（Genbank CFORIDHFR; accession number X94372）の第３１４２の領域を欠く部分断片を有するプラスミド（ｐＤ６およびｐＤ７）が導入された形質転換細胞についてＨＳＲが発生しなかった。またＤＨＦＲ遺伝子座Ｏｒｉ−β領域（Genbank CFORIDHFR; accession number X94372）の第４８８５位の領域を欠く部分断片を有するプラスミド（ｐＤ５およびｐＤ１０）が導入された形質転換細胞についてＨＳＲ発生頻度が著しく低下した。よってＤＨＦＲ遺伝子座Ｏｒｉ−β領域（Genbank CFORIDHFR; accession number X94372）の第３１４２〜４８８５位の領域がＨＳＲの発生に必須であることが分かった。上記領域にはtopoisomeraseII結合領域（図７中□（白四角））とDuplex Unwinding Element（ＤＵＥ、図７中◆（黒ひし形））とが含まれている。したがって、実施例１の結果と合わせて、topoisomeraseII結合領域とDuplex Unwinding Element（ＤＵＥ）とを含むＩＲの部分断片は遺伝子増幅活性を有しているといえる。さらに上記領域には塩基配列として、湾曲ＤＮＡ（ｂｅｎｔ ＤＮＡ、図７中＝（二重線））、ＲＩＰ６０結合領域（図７中△（白三角））、およびＡＴ−ｒｉｃｈエレメント（図７中「ＡＴ」で示す）も含まれている。ｐＤ６またはｐＤ７を遺伝子導入して得られた形質転換細胞のＨＳＲの発生頻度と、ｐＤ１を遺伝子導入して得られた形質転換細胞のＨＳＲの発生頻度とを比べた結果から、ＤＨＦＲ遺伝子座Ｏｒｉ−β領域については、３つのエレメント（湾曲ＤＮＡ、ＲＩＰ６０結合領域、およびＡＴ−ｒｉｃｈエレメント）もＨＳＲ発生に必須であることがわかった。
〔実施例３〕
本実施例では、実施例１において使用したｐＣ１２（図８Ａに示す）におけるＳＲαプロモーター（図８Ａにおいて「ＰＳＲα」で示す）を、ＳＶ４０初期領域由来プロモーター領域（以下、単に「ＳＶ４０プロモーター」という）に置換したｐＣ１２.Ｐｓｖ４０（図８Ｂに示す）を使用した。図８ＢにおいてＳＶ４０プロモーターを「Ｐｓｖ４０」として示す。ｐＣ１２.Ｐｓｖ４０の作製方法は以下の通りである。

まずｐＣ１２をＥｃｏ ＲＩおよびＸｈｏ Ｉで制限酵素消化することによりＳＲαプロモーター領域を切り出した。切り出した部位へ、マルチクローニングサイトを含む合成オリゴヌクレオチド（ＥＳＭＸリンカー）を挿入した。このマルチクローニングサイトの制限酵素サイトはアンピシリン耐性遺伝子（Ａｍｐ^R）の下流(すなわちＳＲαプロモーターがあった部位)に位置しており、制限酵素サイトが５’末端から３’末端にかけてＥｃｏ ＲＩ−Ｓａｌ Ｉ−Ｍｌｕ Ｉ−Ｘｈｏ Ｉの順番で配列している。なおＥＳＭＸリンカーの塩基配列を、表１および配列番号１１０および配列番号１１１に示した。上記のようにして作製したプラスミドをＳａｌ ＩおよびＭｌｕ Ｉで制限酵素消化した。その後、Ｓａｌ ＩおよびＭｌｕ Ｉで制限酵素消化したＳＶ４０プロモーターを、上記プラスミドに挿入し、ｐＣ１２.Ｐｓｖ４０を構築した。ＳＶ４０プロモーターは、ＢＳＲを転写する方向でプラスミドに挿入された。

なお、ＳＶ４０プロモーターは下記のようにして作製された。ｐＭＡＣＳ４．１(Mitenyi Biotech社製)を鋳型として、ＳＶ４０プロモーター増幅用プライマー（MACS4.1 4288LおよびMACS4.1 1454R）を用い、ＰＣＲ法により増幅した。増幅されたＳＶ４０プロモーターは、Ｓａｌ ＩおよびＭｌｕ Ｉで制限酵素消化して使用した。ＳＶ４０プロモーター増幅用プライマーであるMACS4.1 4288L（配列番号１１２）およびMACS4.1 1454R（配列番号１１３）の塩基配列を表１に示す。ＳＶ４０プロモーターの塩基配列を配列番号１１４に示し、ＳＲαプロモーターの塩基配列を配列番号１１５に示した。

抗Pyrococcus kodakaraensis KOD1株由来のDNAポリメラーゼに対する抗体を産生するマウスハイブリドーマ細胞（入手先：生命工学工業技術研究所、寄託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−６０５７）から、RNeasy Plus Mini Kit(QIAGEN社製、74134)を用いてトータルＲＮＡを抽出し、Rever Tra Ace-α-(TOYOBO社製、FSK-101)を使用して１本鎖ｃＤＮＡを合成した。抗KOD ポリメラーゼ抗体のシグナル配列を除く重鎖と軽鎖を特異的に増幅するプライマーを用いてＰＣＲ増幅し、それぞれの増幅産物にイムノグログリン κ鎖由来のシグナル配列を付加した後、ＣＭＶプロモーターを有するプラスミドのＸｂａ Ｉ−Ｎｏｔ Ｉサイトに連結してｐＣＭＶ−ＨとｐＣＭＶ-Ｌとを構築した。

ｐＣＭＶ−ＨおよびｐＣＭＶ-Ｌを、ｐＣ１２.Ｐｓｖ４０とともにチャイニーズハムスター卵巣細胞にコトランスフェクトした。トランスフェクション２日後にブラスティサイジン（Invivogen社製、ant-bl-1）を５μg/mlの濃度で添加して、３〜４日間隔で培地を入れ替えながら２週間培養して、安定な形質転換体を得た。なお、比較対照実験として、ＤＨＦＲ遺伝子座Ｏｒｉ−β領域の全長ＩＲを有するｐΔＢＮ.ＡＲ１をｐＣ１２.Ｐｓｖ４０の替わりに用いた場合、およびＩＲ／ＭＡＲをトランスフェクションしない場合も行った。

次に、細胞培養シャーレ６０ｍｍ（SUMILON社製、MS-11600）まで拡大培養後、段階的にブラスティサイジン濃度を高めていき、最終濃度３２０μg/mlで安定して生育できるまで培養を続けた。上記で生育した１×１０⁶個の細胞からゲノムＤＮＡを取得し、重鎖および軽鎖抗体遺伝子コピー数の増加を、リアルタイム定量ＰＣＲ（ABI社製、7900HT）を用いて確認した。測定試薬にはSYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO社製、QPK-201)を使用した。

遺伝子増幅量を確認後、ブラスティサイジン３２０μg/mlを添加して４日間培養した上清を取得し、ＥＩＡ法で抗体濃度を測定した。詳細には以下のようにした。ヤギ抗マウス抗体を固相化したＥＬＩＳＡプレート(SUMILON社製、MS-8896F)に、１０ｍＭ ＰＢＳ(-)で５倍希釈した培養上清を添加し３５℃で２時間インキュベートした。続いて、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、ＰＢＳ＋１％ ＢＳＡ＋１０％ ヤギ血清で４０００倍希釈したペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウス抗体を５０μl/well添加し、３５℃で２時間インキュベートした。その後、ＥＬＩＳＡプレートをＰＢＳ−Ｔで４回洗浄した後、完全に水分を除き、発色試薬５０μl/well添加して室温で１５分間インキュベートした。１Ｎ硫酸溶液 ５０μl/wellで反応を停止させ、プレートリーダー（主波長４５０ｎｍ、副波長６２０ｎｍ）で吸光度を測定した。標準品から作成した検量線をもとに抗体濃度を算出した。

その結果を図９および表２に示した。図９は各実験区における抗体生産量をそれぞれ示す棒グラフであり、「with No IR/MAR」はＩＲ／ＭＡＲプラスミドをトランスフェクションしなかった場合の結果を示し、「ｐΔＢＮ.ＡＲ１」はｐΔＢＮ.ＡＲ１をコトランスフェクションした場合の結果を示し、「ｐＣ１２.Ｐｓｖ４０」はｐＣ１２.Ｐｓｖ４０をコトランスフェクションした場合の結果を示す。また、表２は、各実験区における抗体生産量、重鎖および軽鎖抗体遺伝子コピー数を示す表である。表２において「with No IR/MAR」はＩＲ／ＭＡＲプラスミドをトランスフェクションしなかった場合の結果を示し、「ｐΔＢＮ.ＡＲ１」はｐΔＢＮ.ＡＲ１をコトランスフェクションした場合の結果を示し、「ｐＣ１２.Ｐｓｖ４０」はｐＣ１２.Ｐｓｖ４０をコトランスフェクションした場合の結果を示す。

図９および表２によれば、ｐΔＢＮ.ＡＲ１およびｐＣ１２.Ｐｓｖ４０をコトランスフェクションした場合においいて、ＩＲ／ＭＡＲプラスミドを用いなかった場合に比して１２倍以上の遺伝子増幅量が確認された。ｐΔＢＮ.ＡＲ１を用いた場合とｐＣ１２.Ｐｓｖ４０を用いた場合とは遺伝子増幅量はほぼ同等であるにも関わらず、抗体生産量はｐＣ１２.Ｐｓｖ４０の方が高いという興味深い結果が得られた。この結果は、ｐΔＢＮ.ＡＲ１（８９１６ｂｐ）に比してｐＣ１２.Ｐｓｖ４０（４９２０ｂｐ）の方が、ベクターサイズが小さいために遺伝子導入効率が高かったことによることが原因であると発明者らは推察している。

限界希釈法を用いてクローニングした結果を、図１０および１１、並びに表３および４に示す。図１０および表３はｐＣ１２.Ｐｓｖ４０をコトランスフェクションした場合の各クローンについて、抗体タンパク質の生産量を示す棒グラフおよび表である。また図１１および表４はｐΔＢＮ.ＡＲ１をコトランスフェクションした場合の各クローンについて、抗体タンパク質の生産量を示す棒グラフおよび表である。

ｐΔＢＮ.ＡＲ１をコトランスフェクションした場合に比して、ｐＣ１２.Ｐｓｖ４０をコトランスフェクションした場合は、高い抗体タンパク質生産能力を有するクローンを高確率で取得することができるということがわかった。

本発明にかかるベクター（ＩＲ／ＭＡＲプラスミド）は、ＩＲの全長の代わりに遺伝子増幅活性を有するＩＲの部分断片を含んでいるものである。よって、従来の高度遺伝子増幅系で用いられていたＩＲ／ＭＡＲプラスミドと比べてサイズが小さい。

それゆえ、本発明にかかるベクター、およびそれを用いる本発明にかかる方法によれば、以下のメリットを享受できる。
(A)哺乳動物細胞への遺伝子導入効率がさらに向上する。
(B)さらにサイズの大きい目的遺伝子を高度遺伝子増幅系へ適用することが可能となる。
(C)タグタンパク質やシグナルペプチド等のその他のエレメントをコードするポリヌクレオチドを、ＩＲ／ＭＡＲプラスミドに容易に組み込むことができるようになり、より複雑なベクターを構築することも可能になる。

さらに、本発明によれば、
(D)全長のＩＲを用いた従来法よりもＨＳＲの発生頻度が著しく向上する、すなわち遺伝子の増幅効率が向上するという、当業者が予想し得る以上の効果をも得られる。

また本発明によれば、
(E)本発明を実施した場合と全長のＩＲを用いた場合とが同程度の遺伝子増幅量であったとしても、本発明を実施した場合はタンパク質の生産量が高くなるという、当業者が予想し得る以上の効果が得られる。

したがって本発明によれば、従来の高度遺伝子増幅系に比して、種々広範な目的遺伝子を効率良く増幅することができ、ひいては当該遺伝子がコードする目的タンパク質を大量に生産することが可能となる。

発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あくまでも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限定して狭義に解釈されるべきものではなく、本発明の精神と次に記載する請求の範囲内において、いろいろと変更して実施することができるものである。

上記説示したように、本発明にかかる方法によれば、ＩＲの部分断片を含む高度遺伝子増幅系を用いて目的遺伝子の増幅を誘導することが可能となる。それゆえ、本発明によれば、所望のタンパク質（例えば、有用タンパク質）を大量に生産することが可能になるという効果を奏する。

したがって、本発明はタンパク質の生産を行う産業、例えば、医薬品、化学、食品、化粧品、繊維等種々広範な産業において利用可能である。

Claims (6)

1. 目的遺伝子を増幅させるための方法であって、
   哺乳動物複製開始領域の全長を除く部分断片であって遺伝子増幅活性部位を有する増幅活性断片、および哺乳動物核マトリックス結合領域を具備するベクターと、前記目的遺伝子とを哺乳動物細胞に導入する工程を含み、
   前記増幅活性断片は下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかのポリヌクレオチドであり、且つ前記増幅活性断片は、哺乳動物複製開始領域の全長および哺乳動物核マトリックス結合領域を具備するベクターと、前記目的遺伝子とを哺乳動物細胞に導入した場合に比してＨＳＲ発生頻度を高くする活性を有することを特徴とする、方法：
   （ａ）配列番号８３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号８３に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド；
   （ｂ）配列番号８５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号８５に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド；
   （ｃ）配列番号９４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号９４に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド；
   （ｄ）配列番号９９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号９９に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド；
   （ｅ）配列番号１０２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号１０２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド。
2. 前記哺乳動物核マトリックス結合領域が、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、およびジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか１つに由来する、請求項１に記載の方法。
3. 前記目的遺伝子と、前記ベクターとをトランスに配置して、哺乳動物細胞に導入することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
4. 目的遺伝子を哺乳動物細胞内で増幅させるためのベクターであって、
   哺乳動物複製開始領域の全長を除く部分断片であって遺伝子増幅活性部位を有する増幅活性断片、および哺乳動物核マトリックス結合領域を具備し、
   前記増幅活性断片は下記（ａ）〜（ｅ）のいずれかのポリヌクレオチドであり、且つ前記増幅活性断片は、哺乳動物複製開始領域の全長および哺乳動物核マトリックス結合領域を具備するベクターと、前記目的遺伝子とを哺乳動物細胞に導入した場合に比してＨＳＲ発生頻度を高くする活性を有することを特徴とする、ベクター：
   （ａ）配列番号８３に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号８３に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド；
   （ｂ）配列番号８５に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号８５に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド；
   （ｃ）配列番号９４に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号９４に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド；
   （ｄ）配列番号９９に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号９９に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド；
   （ｅ）配列番号１０２に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号１０２に示される塩基配列において１若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド。
5. 前記哺乳動物核マトリックス結合領域が、Ｉｇκ遺伝子座、ＳＶ４０初期領域、およびジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれか１つに由来する、請求項４に記載のベクター。
6. 請求項４または５に記載のベクターと、目的遺伝子とが哺乳動物細胞に導入されてなる形質転換細胞。