WO2008023671A1 - Procédé d'amplification poussée d'un gène cible dans une cellule de mammifère et vecteur correspondant - Google Patents

Procédé d'amplification poussée d'un gène cible dans une cellule de mammifère et vecteur correspondant Download PDF

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Noriaki Shimizu
Toshihiko Hashizume
Masashi Shimizu
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Hiroshima University
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    • C12N2830/46—Vector systems having a special element relevant for transcription elements influencing chromatin structure, e.g. scaffold/matrix attachment region, methylation free island

Definitions

  • the present invention relates to a method for highly amplifying a target gene in mammalian cells, and a vector used for carrying out the method. More specifically, when a desired gene is amplified using the “advanced gene amplification system” developed by the present inventors, a method capable of improving gene transfer efficiency and gene amplification efficiency, and the method It relates to the vector for performing.
  • the present inventor has derived a plasmid having a mammalian replication initiation region (IR) and a nuclear matrix attachment region (MAR) (hereinafter referred to as "IR / MAR plasmid") from a human. Introduce into cancer cells (COLO 320 colorectal cancer cell line and HeLa cell line) by lipofusion method and select using drug resistance gene (Blasticidine or Neomycine) present on plasmid just
  • target gene The ability to amplify the number of intracellular copies of a gene encoding a protein to be expressed (hereinafter referred to as “target gene” where appropriate) to about 10,000 copies;
  • the target gene is highly amplified regardless of whether it is introduced as the same gene construct (cis) or introduced as a separate gene construct (trans) into the IR / MAR plasmid. It was discovered that it is possible (see Patent Document 1 and Non-Patent Document 1). Then, based on this finding, the present inventor used an IR / MAR plasmid and a target gene for mammalian cells (for example, human-derived cancer cells (COLO 320 colorectal cancer cell line and HeLa cell line), CHO cells, System that can amplify the target gene to about 10,000 copies simply by using the drug resistance gene (Blasticidine or Neomycine) present on the plasmid. ”)" was completed. [0003] Here, Fig.
  • Step 1 shows the mechanism generated by DM and HSR force SIR / MAR plasmid (also called "IR / MAR vector”! / ⁇ ).
  • the IR / MAR plasmid multimerizes by repeatedly connecting in series in the host cell (Stepl). This multimer is stably present in the host cell during cell growth and self-replicates.
  • DM is generated when the multimer grows as it is or is taken up by the DM that originally exists in the host cell.
  • Step 2 multimeric circular DNA is broken into double strand breakage (DSB) in the host cell to become linear DNA. Then, the linear DNA is incorporated into the chromosome, a BFB (Breakage-Fusion-Bridge) cycle like Step 3 is started, and HSR is generated.
  • DSB double strand breakage
  • Patent Document 1 Japanese Published Patent Publication “Japanese Unexamined Patent Publication No. 2003-245083 (Released date: September 2, 2003)”
  • Patent text l3 ⁇ 4 l Noriaki Shimizu, et al. (2001) Plasmids with a Mammalian Replication Origin and a Matrix Attachment Region Initiate the Event Similar to Gene Amplificat ion. Cancer Research vol.o ⁇ , no.19, p6987_6990.
  • MAR is a polynucleotide of several hundred bp.
  • the force IR is several kbp.
  • IR from the c-myc locus is 2.4 kbp
  • IR from the dihydrofolate reductase (hereinafter referred to as “DHFR”) locus is 4.6 kbp. Therefore, the IR / MAR plasmid is a relatively large size gene construct.
  • the present invention aims to further improve the advanced gene amplification system. More specifically
  • the object of the present invention is to develop a vector capable of enjoying the merits (A) to (C) and to provide a method for amplifying a target gene using the vector.
  • the present invention includes the following inventions in order to solve the above problems.
  • the method according to the present invention is a method for amplifying a target gene
  • the mammalian replication initiation region may be any one of the c myc locus, the dihydrofolate reductase locus, and the replication initiation region of the / 3-globin locus. It may be derived from.
  • the method according to the present invention is characterized in that the amplification active fragment is derived from the cmyc locus and includes at least a Duplex Unwinding Element and a topoisomerasell binding region. Also good.
  • the amplification active fragment is derived from the C myc locus, and comprises the following polynucleotide (a) and the following (b):
  • the method may be: (a) a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, or a polynucleotide in which one or several bases have been deleted, substituted or added in the base sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • a polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a polynucleotide in which one or several bases have been deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the amplification active fragment may be one or several in the polynucleotide comprising the nucleotide sequence IJ represented by SEQ ID NO: 3 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3.
  • the polynucleotide may contain a polynucleotide in which the base is deleted, substituted, or added.
  • the amplification active fragment may be one or several in the polynucleotide consisting of the base sequence IJ shown in SEQ ID NO: 4 or the base sequence shown in SEQ ID NO: 4.
  • the polynucleotide may contain a polynucleotide in which the base is deleted, substituted, or added.
  • the amplification active fragment may be one or several in the polynucleotide comprising the nucleotide sequence IJ represented by SEQ ID NO: 5 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 5.
  • the polynucleotide may contain a polynucleotide in which the base is deleted, substituted, or added.
  • the amplification active fragment is derived from the dihydrofolate reductase gene locus and is a polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 10, or the base sequence shown in SEQ ID NO: 10.
  • a polynucleotide comprising one or several bases deleted, substituted, or added may be used.
  • the amplification active fragment is derived from the dihydrofolate reductase gene locus, and is a polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11 or shown in SEQ ID NO: 11 It may be a method characterized by comprising a polynucleotide in which one or several bases are deleted, substituted, or added in the base sequence.
  • the mammalian nuclear matrix-binding region comprises a nuclear matrix-binding of Ig ⁇ locus, SV40 initial region, and dihydrofolate reductase locus. It may be derived from any force in the region.
  • the method according to the present invention may be a method characterized in that the target gene and the vector are arranged in trans and introduced into a mammalian cell.
  • the vector which is effective in the present invention is a vector for amplifying a target gene in a mammalian cell, and is a partial fragment of a mammalian replication initiation region and has a gene amplification active site. It comprises a vector comprising an amplified active fragment, a mammalian nuclear matrix binding region, and a gene for selecting transformed cells.
  • the vector according to the present invention is characterized in that the mammalian replication initiation region is a replication force of the myc locus, the dihydrofolate reductase locus, and the / 3-globin locus! Even if it comes from one! /
  • the vector according to the present invention may be characterized in that the amplification active fragment is derived from the cmyc locus and contains at least a Duplex Unwinding Element and a topoisomerasell binding region.
  • the vector according to the present invention is a vector in which the amplification active fragment is derived from the cmyc locus and includes the following polynucleotide (a) and the following (b): Also good:
  • a polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 or a polynucleotide in which one or several bases have been deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2.
  • the amplification active fragment is a polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3, or 1 or several nucleotides in the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 3. It may include a polynucleotide having a base deleted, substituted, or added.
  • the amplification active fragment is 1 in the polynucleotide comprising the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4 or the nucleotide sequence represented by SEQ ID NO: 4.
  • it may contain a polynucleotide in which several bases have been deleted, substituted, or added.
  • the amplification active fragment is a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 5, or 1 or several nucleotides in the base sequence represented by SEQ ID NO: 5. It may include a polynucleotide having a base deleted, substituted, or added.
  • the amplification active fragment is derived from the dihydrofolate reductase gene locus, and is a polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 10, or shown in SEQ ID NO: 10.
  • the nucleotide sequence may include a polynucleotide in which one or several bases are deleted, substituted, or added.
  • the amplification active fragment is derived from the dihydrofolate reductase gene locus and is a polynucleotide comprising the base sequence represented by SEQ ID NO: 11, or represented by SEQ ID NO: 11.
  • the nucleotide sequence may include a polynucleotide in which one or several bases are deleted, substituted, or added.
  • the vector according to the present invention includes any one of the above-mentioned mammalian nuclear matrix-binding region force S, Ig ⁇ gene locus, SV40 initial region, and nuclear matrix-binding region of the dihydrofolate reductase locus. It may be derived from one.
  • the amplification active fragment is not limited to the polynucleotide specified by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 10, and 11. It may be composed of a base sequence complementary to the base sequences shown in 1, 2, 3, 4, 5, 10, and 11.
  • the amplification active fragment is a polynucleotide identified by the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 10, and 11, and SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5,
  • polynucleotides that hybridize under stringent conditions with a! / A shift force of a polynucleotide having a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequences shown in 10, and 11.
  • stringent conditions means that a hybrida is present only when at least 90% identity, preferably at least 95% identity, most preferably 97% identity exists between sequences. This means that an occurrence will occur.
  • the transformant according to the present invention is effective for the above-described present invention, and a target.
  • a gene is introduced into a mammalian cell.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the mechanism by which DM and HSR are generated by an IR / MAR plasmid.
  • FIG. 2 Fluorescence microscopic images of DM and HSR detected by FISH method in COLO 320DM transformed with vector, A and B show the results of transformed cells into which pSFVdhfr has been introduced, and C is ⁇ ⁇ ⁇ 2. Shows the result of the transformed cell into which dhfr was introduced, D shows the result of the transformed cell into which pTH2.dhfr was introduced, and E shows the result of the transformed cell into which pEP II was introduced.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of a plasmid used in Examples and Reference Examples.
  • 6 is a bar graph showing the frequency of HSR occurring in DM.
  • ⁇ —1, or ⁇ 3 6 is a bar graph showing the frequency of HSR occurrence of HeLa (FIG. 5 (A)), COLO 320HSR (FIG. 5 (B)), or COLO320DM (FIG. 5 (C)).
  • FIG. 6 shows the results of Example 1,
  • A is a schematic diagram of the c myc locus (GenBank HSMYCC; acession number X00364), and B and C are the IR full length of the c myc locus and parts thereof. It is a figure which shows the positional relationship with the fragment
  • FIG. 7 is a diagram showing the results of Example 2, wherein A is a schematic diagram of the DHFR locus Ori- ⁇ region (Genbank CFORIDHFR; accession number X94372), and B is the full-length IR of the DHFR locus Ori- ⁇ region and its FIG. 4 is a diagram showing the positional relationship with partial fragments C0 to C11, and a diagram showing the frequency of HSR occurrence in transformed cells into which a plasmid containing each partial fragment has been introduced.
  • A is a schematic diagram of the DHFR locus Ori- ⁇ region (Genbank CFORIDHFR; accession number X94372)
  • B is the full-length IR of the DHFR locus Ori- ⁇ region
  • FIG. 4 is a diagram showing the positional relationship with partial fragments C0 to C11, and a diagram showing the frequency of HSR occurrence in transformed cells into which a plasmid containing each partial fragment has been introduced.
  • FIG. 8 A is a schematic diagram of the pC12 vector used in the Examples, and B is in the Examples.
  • FIG. 3 is a schematic diagram of the pC12.Psv40 vector used in the experiment.
  • FIG. 9 is a bar graph showing the amount of antibody produced in each experimental group. “With No IR / MARJ shows the results when the IR / MAR plasmid was not transfected,“ ⁇ ⁇ B N.AR1 "Shows the result when cotransformation of p A BN.ARl, and” pC12.Psv 40 “shows the result when cotransformation of pC12.Psv40.
  • FIG. 10 is a bar graph showing the antibody production amount of each clone when pC12.Psv40 is co-transformed in Example 3.
  • FIG. 11 is a bar graph showing the amount of antibody produced by each clone when pABN.AR1 is co-transformed in Example 3.
  • One embodiment of the present invention relates to a method for amplifying a gene of interest.
  • the above method is referred to as “the gene amplification method of the present invention”.
  • the gene amplification method of the present invention comprises:
  • introduction process a method including “introduction process”.
  • target gene means a gene encoding a protein to be expressed.
  • the target gene is not particularly limited, and a polynucleotide encoding a desired protein may be appropriately selected and employed.
  • the target polynucleotide can be obtained using a known technique such as PCR based on the nucleotide sequence information.
  • the gene of interest Amplification is performed on the lumniute chromosome (hereinafter referred to as “DM” as appropriate) and / or in a homogeneously stained region of the chromosome (hereinafter referred to as “HSR” as appropriate).
  • DM lumniute chromosome
  • HSR homogeneously stained region of the chromosome
  • the well-known FISH method fluorescence in
  • Judgment can be made by performing in situ hybridization and detecting the gene introduced into the mammalian cell.
  • a specific method for carrying out the FISH method is not particularly limited, and a conventionally known method may be appropriately selected and adopted.
  • the effect of improving the amplification efficiency of the target gene can be obtained as compared with the conventional advanced gene amplification system, which is more than expected by those skilled in the art (Examples). checking). Whether the amplification efficiency of the target gene has increased or not is determined by the gene amplification structure occurrence frequency (for example, HSR occurrence frequency, DM occurrence frequency) when the conventional advanced gene amplification system is implemented, and the gene amplification method of the present invention. Can be determined by comparing the frequency of gene amplification with the occurrence of the structure.
  • the gene amplification structure occurrence frequency for example, HSR occurrence frequency, DM occurrence frequency
  • the frequency of gene amplification structure generation in the latter is higher than that in the former, the latter, that is, the gene amplification method of the present invention, improves the amplification efficiency of the target gene as compared with the conventional advanced gene amplification system. Then you can confirm!
  • the method according to the present invention includes
  • selection step A step of separating mammalian cells into which the target gene and vector have been introduced (hereinafter referred to as “selection step”) and a culture step of culturing the mammalian cells selected by the selection step (ie, transformed cells) ( Hereinafter, it may be referred to as “culture step”.
  • culture step a culture step of culturing the mammalian cells selected by the selection step (ie, transformed cells)
  • culture step a method for purifying the target protein produced by the above culture step
  • purification step a method for purifying the target protein produced by the above culture step
  • an amplification active fragment which is a partial fragment of a mammalian replication initiation region and has a gene amplification active site, a vector comprising a mammalian nuclear matrix binding region, and a gene for selecting a transformed cell; and the target gene In a mammalian cell.
  • the mammalian replication initiation region and the mammalian nuclear matrix-binding region contained in the vector are a replication initiation region that functions in eukaryotic cells including mammals. There is no particular limitation as long as it is a nuclear matrix binding region.
  • Examples of the mammalian replication initiation region include replication initiation regions derived from the c myc locus, the dihydrofolate reductase (DHFR) locus, the / 3_globin locus, and the like.
  • the replication initiation region derived from the myc locus refers to “McWhinney, C. et al., Nucleic Acids Res. Vol. 18, pl 233_1242 (1990
  • For the replication initiation region of the dihydrofolate reductase locus see “Dijkwel, PA et al., Mol. Cell. Biol. Vol.8, p5398-5409 (1988)”. See also “Aladjem, M. et al., Science vol. 281, pl005-1009 (1998)” for the replication initiation region of the / 3 -globin locus.
  • Examples of the mammalian nuclear matrix-binding region include polynucleotides derived from nuclear matrix-binding regions such as the Ig ⁇ locus, the SV40 initial region, and the dihydrofolate reductase locus.
  • nuclear matrix-binding region of the Ig ⁇ locus see “Tsutsui,. Et al., J. Biol. Chem. Vol. 268, pl 2886 — 12894 (1993)”. See also “Pommier, Y. et al., J. Virol., Vol 64, p419-423 (1990)” for the nuclear matrix binding region of the SV40 initial region. See also Shimizu N. et al., Cancer Res. Vol. 61, P6987-6990 for the nuclear matrix binding region of the dihydrofolate reductase gene locus.
  • IR The mammalian replication initiation region
  • MAR mammalian nuclear matrix binding region
  • IR / MAR plasmid not only full-length IR and MAR but also a vector composed of these partial fragments is also referred to as “IR / MAR plasmid”.
  • an amplification active fragment that is a partial fragment of a mammalian replication initiation region (IR) and has a gene amplification active site is used. It is characterized by.
  • partial fragment of mammalian replication origin region means a part of IR excluding full-length IR.
  • the length of the IR partial fragment is not particularly limited, but in the case of IR derived from the c-myc locus, which is about 2.4 kbp, the length of the partial fragment is 0.5 kbp or more and 2. Okbp or less. It is preferably 0.5 kbp or more and 1.5 kbp or less, and more preferably 0.5 kbp or more and 1.3 kbp or less.
  • the length of the partial fragment is preferably 1.7 kbp or more and 3.5 kbp or less. 1.7 kbp or more and 3. lkb p or less More preferably. When the preferable range is satisfied, the effects (A) to (D) are easily obtained.
  • gene amplification active site means an element essential for gene amplification in the advanced gene amplification system. For example, whether or not an IR partial fragment has the above gene amplification active site can be determined by, for example, preparing an IR / MAR plasmid using the partial fragment and MAR, It can be judged by examining the frequency of gene amplification (HSR, DM) when genes are introduced into mammalian cells.
  • HSR gene amplification
  • gene amplification active sites can be identified by preparing an IR delay mutant and conducting the above examination.
  • Delay mutants can be prepared from IR sequence information by PCR or restriction enzyme digestion.
  • the Duplex Unwinding Element (hereinafter referred to as "DUE") and the topoisomerasell binding region are gene amplification activities. It was found to correspond to a sex site. Therefore, the target gene can be highly amplified by using a partial fragment of IR containing at least the DUE and topoisomerasell binding regions instead of full-length IR in the IR / MAR plasmid.
  • the above IR partial fragment may consist only of the DUE and topoisomerasell binding regions derived from the c-myc locus, or may be a combination of a plurality of DUE and topoisomerasell binding regions. It may be a partial fragment containing the DUE and topoisomerasell binding regions of IR derived from the myc locus.
  • Examples of the base sequence of IR derived from the c myc locus include those corresponding to positions 1 to 2349 of Genbank HSMYCC (accession num ber X00364).
  • a preferred embodiment of the IR partial fragment containing DUE is a polynucleotide corresponding to positions 189 to 473 of Genbank HSMYCC (accession number X0 0364).
  • the nucleotide sequence of the above polynucleotide is shown in SEQ ID NO: 1. However, only the force shown in SEQ ID NO: 1 does not correspond to the preferred embodiment of the partial fragment of IR containing DUE.
  • the added polynucleotide ie, the mutated polynucleotide
  • the mutated polynucleotide also corresponds to a preferred embodiment of the IR partial fragment containing DUE. It should be noted that when an IR / MAR plasmid is constructed using the above-mentioned mutant polynucleotide, it has the activity of amplifying the target gene.
  • the base sequence shown in SEQ ID NO: 1 can be subjected to homologous search against databases such as GenBank, EMBL, and DDBJ.
  • the obtained polynucleotide comprising the base sequence can be used as a partial fragment of IR containing DUE.
  • the similarity between the above-mentioned mutant polynucleotide or the polynucleotide obtained by performing homologous search and the polynucleotide shown in SEQ ID NO: 1 is about 80% or more, preferably about 90% or more. More than 95% is most preferred.
  • Genbank HSMYCC accession number X00364
  • Genbank HSMYCC accession number X00364
  • 745 A polynucleotide corresponding to position ⁇ 987.
  • the nucleotide sequence of the above polynucleotide is shown in SEQ ID NO: 2.
  • SEQ ID NO: 2 only those shown in SEQ ID NO: 2 have the ability S, and one or several bases are deleted in the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 which does not correspond to the preferred embodiment of the IR partial fragment containing the topoisomerasell binding region Those skilled in the art will readily understand that substituted, added, or mutated polynucleotides also fall within the preferred embodiment of the IR partial fragment containing the topoisomerasell binding region.
  • the mutant polynucleotide is as described above.
  • a preferred embodiment of the IR partial fragment containing at least the DUE and topoisomerasell binding region is a polynucleotide corresponding to positions 189 to 987 of Genbank HSMYCC (accession number X00364).
  • the nucleotide sequence of the above polynucleotide is shown in SEQ ID NO: 3.
  • SEQ ID NO: 3 only the force shown in SEQ ID NO: 3 does not correspond to the preferred embodiment of the partial fragment of IR including at least the DUE and topoisomeras ell binding region, and the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3 lacks one or several bases.
  • mutant polynucleotide is as described above.
  • the present inventors have confirmed that the polynucleotide comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NOs: 11, 12, 13, 14, 15, and 16 corresponds to the amplification active fragment. . From these results, it is possible to amplify the target gene by using a polynucleotide containing at least the polynucleotide consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 10 instead of the full-length IR of the IR / MAR plasmid. I found.
  • a polynucleotide in which one or several bases are deleted, substituted, or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 10, that is, a mutant polynucleotide is also included in the gene amplification method according to the present invention.
  • a mutant polynucleotide is also included in the gene amplification method according to the present invention.
  • DHFR comprising a polynucleotide comprising the base sequence shown in SEQ ID NO: 10, or a polynucleotide in which one or several bases have been deleted, substituted or added in the base sequence shown in SEQ ID NO: 10.
  • an amplification active fragment derived from SEQ ID NOs: 11, 12, 13, Examples include polynucleotides consisting of the base sequences shown in 14, 15, and 16, and mutant polynucleotides of the polynucleotides.
  • the amplified active fragment contains the DUE and topoisomerasell binding regions, similar to those of the c-myc locus-derived IR.
  • the DHFR-derived IR amplification fragment further contains curved DNA, RIP60 binding region, and AT-rich element.
  • One example is the base sequence shown at positions 1532 to 6166 of X94372).
  • the IR / MAR plasmid used in the introduction step of the gene amplification method according to the present invention is not limited as long as it contains the above-mentioned amplification active fragment and MAR.
  • AR is a self-reliable sequence required for cloning in E. coli, drug resistance gene as a selectable marker (marker one protein) (blasticidin resistance gene, neomycin resistance gene, hygromycin resistance gene, etc.) Alternatively, a green fluorescent protein gene or the like may be included. By using these selectable markers as indicators, mammalian cells introduced with IR / MAR plasmid can be selected.
  • the target gene introduced in the introduction step of the gene amplification method according to the present invention is controllably linked to a promoter.
  • the promoter is not particularly limited as long as it functions in a mammalian cell to be introduced.
  • a promoter (this book) whose transcriptional activity is activated or inactivated by a predetermined operation using a transcription factor or the like.
  • it may be “a transcriptional activity-regulated promoter” or a constitutive promoter in which transcriptional activity is constitutively activated.
  • the “transcriptional activity-regulated promoter” is not particularly limited as long as it has the above-mentioned characteristics.
  • TRE promoter Clontech
  • T-REX promoter Invitrogen
  • the constitutive promoters include CMV promoter, SV40 early region-derived promoter (SV40 promoter), SRalpha promoter (SRa promoter 1) LTR promoter, MMTV promoter, etc. can be used.
  • the IR / MAR plasmid and the target gene are simultaneously introduced into a mammalian cell.
  • the target gene is highly amplified in the legal adduct cell.
  • the mammalian cells are not particularly limited, and examples include CHO-K1 cells (source: ATCC CCL-61, RI EN RCB0285, RI EN RCB0403, etc.), various tumor cells, and the like. .
  • CHO-K1 cells source: ATCC CCL-61, RI EN RCB0285, RI EN RCB0403, etc.
  • various tumor cells and the like.
  • tumor cells having infinite proliferation ability are particularly preferable.
  • tumor cells examples include HeLa cells (obtained from, for example, ATCC CCL-2, ATCC CCL-2.2, RIKEN RCB0007, RIKEN RCB0191, etc.), human colon cancer COLO 320DM cells (obtained from, for example, ATCC CCL- 220), human colorectal cancer COLO 320 HSR cells (source: eg ATCC CCL-220.1), NS0 cells (source: eg RI EN RCB0213), and the like.
  • HeLa cells obtained from, for example, ATCC CCL-2, ATCC CCL-2.2, RIKEN RCB0007, RIKEN RCB0191, etc.
  • human colon cancer COLO 320DM cells obtained from, for example, ATCC CCL- 220
  • human colorectal cancer COLO 320 HSR cells source: eg ATCC CCL-220.1
  • NS0 cells source: eg RI EN RCB0213
  • the IR / MAR plasmid and the gene of interest are not particularly limited as long as they are introduced into mammalian cells at the same time when introduced into mammalian cells.
  • the former is called IR / MAR plasmid and target gene in cis
  • the latter is IR / MAR plasmid and target gene in trans.
  • the operation can be easily performed by introducing one gene construct into a mammalian cell.
  • the advantages (A) to (D) are more easily obtained.
  • the form of the gene construct may be a plasmid or a cosmid.
  • the IR / MAR plasmid and the target gene can be introduced into mammalian cells by appropriately selecting a publicly known method such as lipofection, electopore position method, and particle gun method. .
  • each gene construct contains a gene encoding a selection marker! /.
  • the selection marker contained in the IR / MAR plasmid is preferably different from the selection marker contained in the gene construct containing the target gene.
  • the “selection step” in the gene amplification method of the present invention is a step of separating mammalian cells into which a target gene and a vector have been introduced. More specifically, in this step, a clone of a cell containing a mammalian cell into which the target gene and vector have been introduced! /, Na! /, And a mammalian cell into which the target gene and vector have been introduced is included. This is the process of selecting the latter cells from the sex population.
  • this step may include a step of culturing mammalian cells in a medium.In this step, the target gene and vector are introduced! /, N!
  • the specific method of the selection step is not particularly limited! /, But, for example, a drug resistance gene is used in a gene construct used when introducing a target gene and a vector into a mammalian cell. If so, use the drug resistance to select mammalian cells into which the target gene and vector have been introduced! /.
  • the selection step in the gene introduction method of the present invention can also be performed by detecting a target gene or vector or a nucleotide fragment thereof contained in a mammalian cell by PCR or Southern blotting.
  • Specific methods of the drug resistance, PCR method and Southern plot method are not particularly limited, and known methods can be appropriately used.
  • the “culturing step” in the gene amplification method of the present invention is a step of culturing the mammalian cells already selected by the above selection step.
  • mammalian cells into which the target gene has been introduced and highly amplified can be grown, and the target protein can be produced by a predetermined operation (transcription induction operation or the like).
  • the specific method of the culturing step is not particularly limited, and may be appropriately adopted after examining the optimum conditions for the cultured mammalian cells.
  • the “purification step” in the gene amplification method of the present invention is a method for purifying the target protein produced by the culture step.
  • mammalian cells are suspended in a buffer solution such as PBS (Phosphate Buffered Saline), and then the cells are disrupted with a homogenizer or ultrasonic waves. Centrifuge and collect the supernatant.
  • a surfactant for promoting protein solubilization, a reducing agent for stabilizing the three-dimensional structure of the protein, and a protease inhibitor for preventing protein degradation may be appropriately added. it can.
  • CHAPS ((3-choliaopropyi) _mmethylammomo_l_propanesulfonate Triton X_100 Nikkol n-octylglycoside, etc.
  • DTT dithiothreitol ol DET (dithioerythritol)
  • aprotune or leupeptin can be used as the protease inhibitor.
  • the protein (target protein) encoded by the target gene can be purified using column chromatography such as affinity chromatography, ion exchange chromatography, filtration chromatography, or the like.
  • unnecessary salts can be removed by dialyzing the purified protein solution against an appropriate buffer.
  • the protein purification process described above is preferably performed under low temperature conditions to prevent protein degradation! In particular, it is preferred that the purification process be performed at 4 ° C! /.
  • the present invention also relates to a vector for carrying out the gene amplification method of the present invention described above (hereinafter referred to as “the vector of the present invention”) or a gene amplification kit comprising the vector (hereinafter referred to as “the present invention”). Kit "and! /, U).
  • the description of the IR / MAR plasmid used in the gene amplification method of the present invention can be used.
  • the kit of the present invention is characterized by including the vector of the present invention. As long as the present invention is capable of performing the method according to the present invention, the kit may include other configurations that are not limited to the above configurations. It should be noted that the power S of the present invention will be described with reference to the description of the method according to the present invention as appropriate.
  • the IR gene of the DHFR locus Ori- ⁇ region and the c-myc IR gene having Asc I sites at the 5 ′ and 3 ′ ends are as follows.
  • the DHFR locus Ori— / 3 region IR (4.6 kbp) was restricted with Not I from pSFVdhfr described in “Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 61, p6987_6990”. It was cut out by digestion.
  • the IR (2.4 kbp) of c-myc is from pNeo. Myc—2.4 described in “McWhinney, C. et al., Nucleic Acids Res. Vol. 18, pl233-1242 (1990)”.
  • plasmids described in “ ⁇ ⁇ Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 61, p6987_6990” were used as ⁇ ⁇ AR ⁇ AR1, ⁇ ⁇ ⁇ . PolyA, and pSFV—V, respectively.
  • p ⁇ ⁇ was synthesized by removing the full-length hygromycin resistance gene cassette contained in pSFV-V using Not I and Nru I restriction enzymes, and containing a multicloning site instead. It was made by inserting an oligonucleotide.
  • the restriction enzyme site of the above-mentioned multicloning site is located downstream of the blasticidin resistance gene (hereinafter referred to as “BSR”). From the 5 ′ end to the 3 ′ end, the Kpn I—Not I—Asc I—Nru I In order.
  • ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ shown in Fig. 3D was designed so that a gene containing HSV poly A sequence (1357 bp) was added to the 5 'and 3' ends with Kpn I restriction enzyme sites. Amplification was performed by PCR using a primer set of HSVpAKpnIR and HSVpAKpnIL, and inserted into the KpnI site of ⁇ using the KpnI restriction enzyme site.
  • the nucleotide sequences of the HSVpAKpnIR and HSVpAKpnIL primers are shown in SEQ ID NO: 17 and SEQ ID NO: 18, respectively.
  • the base sequence of the above HSV poly A sequence is represented by SEQ ID NO: 19.
  • p ⁇ HpAdhfr is the DHFR locus generated above, and the IR of the Ori- ⁇ region is the MAR sequence force BSR transcription start site present in the IR fragment. It was prepared by inserting into the Asc I site of p ⁇ HpA so that it was farther away.
  • ⁇ ⁇ ⁇ 2. dhfr shown in FIG. 3F is a gene fragment containing the above-mentioned HSV poly A arrangement I] (shown as “HSV pA” in FIG. 3) subjected to blunt end treatment. ⁇ HpA. It was made by inserting into the Nru I site of dhfr.
  • pTH.IR.MAR in Fig. 3C was prepared as follows.
  • the MAR gene in the early region of SV40 was obtained by PCR using the SV40L and SV40R primer sets with pNeo.
  • the nucleotide sequences of SV40L and SV40R are shown in SEQ ID NOs: 20 and 21, respectively.
  • the initial area of SV40 The nucleotide sequence of the MAR gene in the region is shown in SEQ ID NO: 22.
  • the gene (1 18 bp) containing the RFB (replication fork barrier) sequence is designed so that NotI restriction enzyme sites are added to the 5 'and 3' ends of pSV2. It was obtained by PCR using a primer set of RFB Not IL and RFB Not IR. Since the RFB sequence blocks the generation of replication forks, it can inhibit the replication of the plasmid into which the RFB sequence has been introduced.
  • the nucleotide sequences of RFB Not IL and RFB Not IR are shown in SEQ ID NOs: 23 and 24, respectively.
  • the base sequence of the RFB sequence is represented by SEQ ID NO: 25.
  • pTH2.dhfr or ⁇ 2 ⁇ dhfr.inv shown in Fig. 3G is a blunt-end treated IR gene (4.6 kbp) of the DHFR locus Ori-3 region obtained above. Were prepared by inserting the EcoR I digest of ⁇ ⁇ I ⁇ ⁇ into the same or opposite direction with respect to BSR transcription.
  • pEPI—I (“Schaarschmidt, D., Baltin, J., Stehle, I. ⁇ , Li pps, HJ, and nippers, R. (2004) EMBO J. 23 (1), 191-201 ”, and“ Jenke, A. C, Stehle, IM, Herrmann, F., Eisenberger, ⁇ ⁇ , Baiker, A., Bode, J., Fackelmayer, F. 0., and Lipps, HJ (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 11322—11327 ”) was provided by Daniel Schaarchmidt (Department of Biology, Universitat of Konstanz).
  • the pTHV shown in FIG. 3J was prepared by inserting the MAR of AR1 into the Kpn I site of ⁇ ⁇ ⁇ with a blunt end ligation.
  • pTH3 shown in FIG. 31 is blunt-end ligated to the Not I site of pTHV. It was created by inserting HSV poly A sequences with Chillon.
  • [0090] also includes a 2 ⁇ 4kbp c-myc IR partial fragment (C0 to C16) or a 4 ⁇ 6kbp DHFR gene locus Ori— / 3 region IR partial fragment (D;! To D11)
  • a vector was prepared by inserting a gene amplified by PCR using pNeo. Myc-2.4 and pSFVdhfr into a cage in the Asc I site of pTHV.
  • the base sequence of the 5 'primer (CO-5') for CO amplification used in the above PCR is SEQ ID NO: 26, and the base sequence of the 3 'primer (CO-3') is SEQ ID NO: 27. Indicated.
  • the base sequence of the 5 ′ primer (C 1-5 ′) for C1 amplification is shown in SEQ ID NO: 28, and the base sequence of the 3 primer (C 1-3 ′) is shown in SEQ ID NO: 29.
  • the base sequence of the 5 ′ primer (C2-5 ′) for C2 amplification is shown in SEQ ID NO: 30, and the base sequence of the 3 ′ primer (C2-3 ′) is shown in SEQ ID NO: 31.
  • the base sequence of the 5 ′ primer (C3-5 ′) for C3 amplification is shown in SEQ ID NO: 32
  • the base sequence of the 3 ′ primer (C3-3 ′) is shown in SEQ ID NO: 33
  • the base sequence of 5 ′ primer (C4 5 ′) for C4 amplification is shown in SEQ ID NO: 34
  • the base sequence of 3, primer (C4 3 ′) is shown in SEQ ID NO: 35.
  • the base sequence of the 5 ′ primer (C5-5 ′) for C5 amplification is shown in SEQ ID NO: 36
  • the base sequence of the 3 ′ primer (C5-3 ′) is shown in SEQ ID NO: 37.
  • the base sequence of the 5 ′ primer (C6-5 ′) for C6 amplification is shown in SEQ ID NO: 38
  • the base sequence of the 3 ′ primer (C 6-3 ′) is shown in SEQ ID NO: 39
  • the base sequence of the 5 ′ primer (C7-5 ′) for C7 amplification is shown in SEQ ID NO: 40
  • the base sequence of the 3 ′ primer (C7-3 ′) is shown in SEQ ID NO: 41.
  • the base sequence of the 5 ′ primer (C8-5 ′) for C8 amplification is shown in SEQ ID NO: 42
  • the base sequence of the 3 ′ primer (C8-3 ′) is shown in SEQ ID NO: 43.
  • the base sequence of the 5 ′ primer (C9 5 ′) for C9 amplification is shown in SEQ ID NO: 44
  • the base sequence of the 3 ′ primer (C9 3 ′) is shown in SEQ ID NO: 45
  • the base sequence of the 5 ′ primer (C10-5 ′) for C10 amplification is shown in SEQ ID NO: 46
  • the base sequence of the 3 ′ primer (C10-3 ′) is shown in SEQ ID NO: 47.
  • the base sequence of the 5 ′ primer (C11-5 ′) for C11 amplification is shown in SEQ ID NO: 48
  • the base sequence of the 3 ′ primer (C11-3 ′) is shown in SEQ ID NO: 49.
  • nucleotide sequence of the 5 ′ primer (C 12-5 ′) for C12 amplification is shown in SEQ ID NO: 50
  • nucleotide sequence of the 3 ′ primer (C 12-3 ′) is shown in SEQ ID NO: 51
  • base sequence of the 5 ′ primer (C13-5 ′) for C13 amplification is shown in SEQ ID NO: 52
  • base sequence of the 3 ′ primer (C13-3 ′) is shown in SEQ ID NO: 53. did.
  • the base sequence of 5 ′ primer (C14-5 ′) for C14 amplification is shown in SEQ ID NO: 54
  • the base sequence of 3 and primer (C14-3 ′) is shown in SEQ ID NO: 55.
  • nucleotide sequence of the 5 ′ primer (C 15-5 ′) for C15 amplification is shown in SEQ ID NO: 56
  • nucleotide sequence of the 3 ′ primer (C 15-3 ′) is shown in SEQ ID NO: 57.
  • the base sequence of the 5 'primer (C16-5') for C16 amplification is shown in SEQ ID NO: 58
  • the base sequence of the 3 'primer (C16-3') is shown in SEQ ID NO: 59.
  • the base sequence of the 5 ′ primer (D1-5 ′) for D1 amplification is shown in SEQ ID NO: 60
  • the base sequence of the 3 ′ primer (D1-3 ′) is shown in SEQ ID NO: 61
  • the base sequence of the 5 ′ primer (D2-5 ′) for D2 amplification is shown in SEQ ID NO: 62
  • the base sequence of the primer 3 (D2-3 ′) is shown in SEQ ID NO: 63
  • the base sequence of the 5 ′ primer (D3-5 ′) for D3 amplification is shown in SEQ ID NO: 64
  • the base sequence of the 3 ′ primer (D3-3 ′) is shown in SEQ ID NO: 65.
  • the base sequence of the 5 ′ primer (D4-5 ′) for D4 amplification is shown in SEQ ID NO: 66, and the base sequence of the 3 ′ primer (D4-3 ′) is shown in SEQ ID NO: 67.
  • the base sequence of the 5 ′ primer (D5-5 ′) for D5 amplification is shown in SEQ ID NO: 68
  • the base sequence of the 3 ′ primer (D5-3 ′) is shown in SEQ ID NO: 69.
  • the base sequence of the 5 ′ primer (D6-5 ′) for D6 amplification is shown in SEQ ID NO: 70
  • the base sequence of the 3 ′ primer (D6-3 ′) is shown in SEQ ID NO: 71.
  • the base sequence of 5 ′ primer (D7-5 ′) for D7 amplification is shown in SEQ ID NO: 72
  • the base sequence of 3 ′ primer (D7-3 ′) is shown in SEQ ID NO: 73
  • the base sequence of the 5 ′ primer (D8-5 ′) for D8 amplification is shown in SEQ ID NO: 74
  • the base sequence of the 3 ′ primer (D8-3 ′) is shown in SEQ ID NO: 75.
  • the base sequence of the 5 ′ primer (D9-5 ′) for D9 amplification is shown in SEQ ID NO: 76
  • the base sequence of 3 ′ primer (D9-3 ′) is shown in SEQ ID NO: 77.
  • the base sequence of the 5 ′ primer (D10-5 ′) for D10 amplification is shown in SEQ ID NO: 78
  • the base sequence of the 3 ′ primer (D10-3 ′) is shown in SEQ ID NO: 79.
  • the base sequence of the 5 ′ primer (D11-5 ′) for Dl 1 amplification is shown in SEQ ID NO: 80
  • the base sequence of the 3 ′ primer (Dl 1-3 ′) is shown in SEQ ID NO: 81.
  • the base sequence of CO amplified by the PCR is shown in SEQ ID NO: 82.
  • the base sequence of C1 amplified by the above PCR is shown in SEQ ID NO: 83.
  • the base sequence of C2 amplified by the PCR is shown in SEQ ID NO: 84.
  • the base sequence of C3 amplified by the PCR is shown in SEQ ID NO: 85.
  • the base sequence of C4 amplified by the above PCR is shown in SEQ ID NO: 86.
  • the base sequence of C5 amplified by the PCR is shown in SEQ ID NO: 87.
  • the base sequence of C6 amplified by the PCR is shown in SEQ ID NO: 88.
  • the base sequence of C7 amplified by the above-mentioned PCR is shown in SEQ ID NO: 89.
  • the base sequence of C8 amplified by the above PCR is shown in SEQ ID NO: 90.
  • the base sequence of C9 amplified by the PCR is shown in SEQ ID NO: 91.
  • the base sequence of C10 amplified by the PCR is shown in SEQ ID NO: 92.
  • the base sequence of C11 amplified by the PCR is shown in SEQ ID NO: 93.
  • the base sequence of C12 amplified by the PCR is shown in SEQ ID NO: 94.
  • the base sequence of C13 amplified by the PCR is shown in SEQ ID NO: 95.
  • the base sequence of C14 amplified by the PCR is shown in SEQ ID NO: 96.
  • the base sequence of C15 amplified by the PCR is shown in SEQ ID NO: 97.
  • the base sequence of C16 amplified by the above PCR is shown in SEQ ID NO: 98.
  • the base sequence of D1 amplified by the PCR is shown in SEQ ID NO: 99.
  • the base sequence of D2 amplified by the PCR is shown in SEQ ID NO: 100.
  • the base sequence of D3 amplified by the PCR is shown in SEQ ID NO: 101.
  • the base sequence of D4 amplified by the PCR is shown in SEQ ID NO: 102.
  • the base sequence of D5 amplified by the PCR is shown in SEQ ID NO: 103.
  • the base sequence of D6 amplified by the PCR is shown in SEQ ID NO: 104.
  • SEQ ID NO: 105 shows the base sequence IJ of D7 amplified by the PCR.
  • the base sequence of D8 amplified by the PCR is shown in SEQ ID NO: 106.
  • nucleotide sequence of D9 amplified by the PCR is shown in SEQ ID NO: 107.
  • the base sequence of D10 amplified by the PCR is shown in SEQ ID NO: 108.
  • the base sequence of D11 amplified by the PCR is shown in SEQ ID NO: 109.
  • the gene introduction method used in this example and the like is as follows. First, a plasmid used for gene transfer was purified from E. coli using a Qiagen plasmid purification kit (Qiagen Inc., Valencia, Calif.). Furthermore, when introducing the above plasmid into a cell, endotoxin derived from Escherichia coli mixed in the process of DNA purification is protected with MiraCLEAN (registered trademark) en After removal using the dotoxin removal kit (Mirus., Madison, WI), the gene is transferred to the cells using the GenePorter® 2 lipofection kit (Gene Therapy Systems, San Diego, CA) according to the manufacturer's recommended procedure. Introduced.
  • a Qiagen plasmid purification kit Qiagen Inc., Valencia, Calif.
  • MiraCLEAN registered trademark
  • the gene is transferred to the cells using the GenePorter® 2 lipofection kit (Gene Therapy Systems, San Diego, CA) according to the manufacturer's recommended procedure.
  • the gene-introduced cell is a human colon cancer cell line, COLO 320DM or COLO320 HSR, or a human cervical cancer cell line, Hela.
  • the above cell line was obtained from the place described in “Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 61, p6987_6990” and cultured under the same conditions as described above.
  • COLO 320DM has many endogenous DMs due to the amplification of the c myc gene, while COLO 320HSR, an isogenic line of COLO 320DM, has more HSRs than DM! /.
  • the transformed cells were selected by culturing the cells in a selective medium supplemented with blasticidin to a final concentration of 5 11 g / ml 2 days after gene transfer.
  • the selective medium half of the selective medium in culture was replaced with freshly prepared selective medium every 3 to 5 days.
  • the FISH method the preparation of a probe for detecting a transgene used in the FISH method, and metaphase spreading are performed in culture after 4, 6 or 8 weeks of culture, respectively. A part of the cells was collected and carried out according to the method described in “Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 61, p6987_6990”.
  • the probe is biotinized and can be detected by streptavidin bound with FITC (fluorescein isothiocyanate) that emits green fluorescence.
  • FITC fluorescein isothiocyanate
  • DNA was counterstained with PI (propidium iodide) that emits red fluorescence.
  • Inverted fluorescence microscope (M kon Plan Fluor, NA1.30 oil) equipped with an appropriate filter set and 100x objective lens (M kon Plan Fluor, NA1.30 oil) is used to detect fluorescent dyes on slide glass that has been fluorescently labeled by FISH ECLIPSE TE2000_U, Nikon) Using Fuji FinePix SI Pro digital camera (Fuji Film Co. Tokyo) connected to the above microscope, photo of the transgene and DNA in the cell is digital image Taken as.
  • Each obtained image was synthesized using image analysis software Adobe (registered trademark) Photpshop (registered trademark) version 4.0J (Adobe Systems Inc).
  • Plasmid pSFVdhfr, ⁇ ⁇ ⁇ 2 ⁇ dhfr, pTH2.dhfr, or pEPI—I COLO The gene was introduced into 320DM. When pSFVdhfr was introduced, transformed cells were collected after 8 weeks of culture, and when other plasmids were introduced, transformed cells were collected after 6 weeks of culture. DM and HSR were detected by FISH method for each collected transformed cell.
  • FIG. 2 shows the results of detection of DM and HSR by the FISH method.
  • a and “B” are the results of transformed cells into which pSFVdhfr was introduced
  • C is the result of transformed cells into which ⁇ ⁇ ⁇ 2.dhfr was introduced
  • D is the result of pTH2.dhfr.
  • E indicates the result of the transformed cell into which pEPI-I was introduced.
  • the arrowhead indicates DM and the arrow indicates HSR.
  • pTH. IR. MAR containing various combinations of IR and MAR was prepared, introduced into COLO 320 DM, and transformed cells were obtained after culturing for 4, 6 or 8 weeks.
  • the HSR generated in the transformed cells was examined by the FISH method, and the frequency of HSR (Frequency of HSR) was determined. The results are shown in FIG.
  • the frequency of HSR occurrence was calculated as “(number of transformed cells in which HSR occurred ⁇ number of transformed cells) ⁇ 100”.
  • “(10)” and “(1)” in the IR column in FIG. 4 indicate the case where IR is the same as the transfer direction of BSR and the opposite case, respectively.
  • “Eichi DNA fragment” indicates that the 4361 bp gene fragment of the phage is incorporated in place of IR, and nonej indicates that it does not contain IR.
  • HSR occurs only in transformed cells into which a plasmid having IR and MAR has been introduced. Furthermore, when a 43 61 bp gene fragment of ⁇ phage is used instead of IR, or when IR is not used, almost no HSR is generated. Therefore, there is a base sequence having activity to generate HSR in IR. It was suggested that there was.
  • Plasmid ( ⁇ ⁇ ⁇ . AR1, ⁇ ⁇ ⁇ , ⁇ ⁇ ⁇ . Dhfr, ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ 2 ⁇ dhfr, ⁇ 2.dhfr, ⁇ 2.dhfr. Inv, pEPI-1, or ⁇ 3) Genes were introduced into COLO 320 HSR and COLO320DM. After the gene transfer, transformed cells were selected by culturing in a selective medium for 4 weeks or 8 weeks. Next, the frequency of HSR occurrence of the selected transformed cells was examined. The results are shown in FIG. [0103] According to FIG. 5, HSR occurred when p ⁇ ⁇ . Dhfr produced so that a collision occurred between gene replication and non-coding transcription was introduced.
  • ⁇ ⁇ ⁇ pAX created by adding one poly A sequence to prevent collision between non-coding transcription and gene duplication.
  • HSR was not generated. .
  • pTH2 Dhfr prepared so that there was no collision between non-coding transcription and gene replication was introduced, HSR occurred at a low frequency. This suggests that there was a collision between gene replication and non-coding transcription. From the above results, it was found that by adding a poly A sequence at both ends of the IR, the collision that occurs between gene replication and non-coding transcription can be eliminated.
  • HSR occurs in the transformed cells. On the other hand, if the incorporated partial fragment has no gene amplification activity, HSR will not be produced in the transformed cells.
  • the above identification method is referred to as “plasmid stabilization analysis method” for convenience.
  • pCO to pC16 a plasmid containing the full length of c-myc IR as a positive control ("pCf.lj"), or a c-myc IR as a negative control! /
  • Plasmid Plasmid
  • FIG. 6A is a schematic diagram of the c-myc locus (Genbank HSMYCC; accession number X00364).
  • the IR of the c-myc locus corresponds to the Hind ⁇ -Xho I fragment (2349 bp) of the c-myc locus.
  • Figures 6B and C show the positional relationship between the full IR length of the c-myc locus and its partial fragments, C0 to C16, and the frequency of HSR occurrence in transformed cells into which each partial fragment was introduced! / RU The “mouth (white square)” in FIG.
  • HSR occurrence frequency was highest in the transformed cells into which the plasmid (pCl 2) having a partial fragment containing the topoisomerasell binding region and Duplex Unwinding Element (DUE) was introduced.
  • the HSR frequency was higher than that of the positive control.
  • HSR was not formed in transformed cells into which a partial fragment that did not contain either the topoisomerasell binding region or Duplex Unwinding Element (DUE) was introduced, or when the frequency of HSR occurrence was extremely low.
  • topoisomerasell binding region and duplex unwinding element are essential elements for gene amplification!
  • DUE duplex Unwinding element
  • ⁇ Duplex Unwinding Element
  • DHFR locus Ori Shorte as Example 1 except that IR of region 3 was used. That is, using PCR, a partial fragment (D ;! to D11) of the DHFR locus Ori-3 region was prepared, and each partial fragment (D;! To D11) was recombined with the Asc of pTHV (Fig. The plasmid was inserted into the I site and a plasmid (pD;! To pDll) containing D;! To D11 was prepared (see various plasmids).
  • a plasmid containing the full length of IR in the DHFR locus Ori— / 3 region (“pDf. 1”) is adopted, and as a negative control, the IR in the DHFR locus Ori— / 3 region is not included! /, A plasmid (“pTHV”) was employed.
  • FIG. Fig. 7 shows a schematic diagram of the DHFR locus Ori— / 3 region (Genbank CFORIDHFR; accession number X94372).
  • the BamHI-Hind III fragment (4.6 kbp) of the DHFR locus Ori— ⁇ region is the DHFR gene.
  • Fig. 7 also shows the positional relationship between the IR full length of the DHFR locus Ori- / 3 region and its partial fragments D0 to D11, and transformed cells into which each partial fragment has been introduced. The frequency of HSR occurrence is shown.
  • transformed cells into which plasmids (pD6 and pD7) having a partial fragment lacking the region 3142 of the DHFR locus Ori- ⁇ region (Genbank CFORIDHFR; accession umber X94372) were introduced. About the power that HSR did not occur. In addition, the frequency of HSR was significantly reduced for transformed cells into which plasmids (pD5 and pDIO) having a partial fragment lacking the 4885th region of the DHFR locus Ori-3 region (Genbank CFORIDHFR; accession number X94372) were introduced. .
  • the region force S HSR at positions 3142 to 4885 in the DHFR locus Ori-3 region is essential.
  • the above region includes the topoisomerasell binding region (B in Fig. 7 (white square)) and Duplex Unwinding Element (DUE, ⁇ (black diamond) in Fig. 7). Therefore, in combination with the results of Example 1, it can be said that the IR partial fragment containing the topoisomerasell binding region and Duplex Unwinding Element (DUE) has gene amplification activity.
  • curved DNA (bent DNA, in Fig.
  • the SRa promoter motor (indicated as “PSR a” in FIG. 8A) in pC12 (shown in FIG. 8A) used in Example 1 was replaced with the SV40 early region-derived promoter region (hereinafter simply referred to as “SV40 promoter”).
  • SV40 promoter the SV40 early region-derived promoter region
  • PC12.Psv40 shown in FIG. 8B
  • the SV40 promoter is shown as “Psv40”.
  • the production method of pC12.Ps v40 is as follows.
  • ESMX linker oligonucleotide containing a multiple cloning site
  • a synthetic oligonucleotide containing a multiple cloning site was inserted into the excised site. Restriction enzyme of this multicloning site The site is located downstream of the ampicillin resistance gene (Amp R ) (ie, the site with the SRa promoter), and the restriction enzyme site is Eco RI-Sa 1 I-Mlu I -Xho from the 5 'end to the 3' end. Arranged in the order of I.
  • the base sequences of ESMX linkers are shown in Table 1, SEQ ID NO: 110 and SEQ ID NO: 111.
  • the plasmid prepared as described above was digested with restriction enzymes Sal I and Mlu I. Thereafter, the SV40 promoter digested with Sal I and Mlu I was inserted into the above plasmid to construct pC 12.Psv40. The SV40 promoter was inserted into the plasmid in a direction that transcribes BSR.
  • the SV40 promoter was prepared as follows. pMACS4.1 (Mitenyi Biotech Co., Ltd.) was used as a saddle and amplified by PCR using SV40 promoter amplification primers (MACS4.1 4288L and MACS4.1 1454R). The amplified SV40 promoter was used after restriction enzyme digestion with Sal I and Mlu I. Table 1 shows the base sequence of MACS4.1 4288L (SEQ ID NO: 1 12) and 54.1 1454R (SEQ ID NO: 13), which are primers for SV40 promoter amplification. The nucleotide sequence of SV40 promoter is shown in SEQ ID NO: 114, and the nucleotide sequence of SRa promoter is shown in SEQ ID NO: 115.
  • Anti-Pyrococcus kodakaraensis KOD mouse hyperpridoma cells that produce antibodies against vermilion DNA polymerase (obtained from: Biotechnology Industrial Research Institute, deposit number: FER M BP-6057), RNeasy Plus Mini Kit (QIAGEN) , 74134) to extract total RNA, and then use Rever Tra Ace- ⁇ - (manufactured by Sakai, FSK-101) to create single-stranded cD NA was synthesized.
  • PCR amplification using primers that specifically amplify the heavy and light chains excluding the signal sequence of the anti-KOD polymerase antibody, adding a signal sequence derived from the immunoglodarin ⁇ chain to each amplification product, and then a plasmid with a CMV promoter PCMV—H and pCMV-L were constructed by ligation to the Xb a I-Not I site.
  • pCMV—H and pCMV-L were cotransfected into Chinese nomstar ovary cells with pC12.Psv40. 2 days after transfection, Blasticidin (Invivogen, ant-b ⁇ 1) was added at a concentration of 5 g / ml, and cultured for 2 weeks while changing the medium every 3-4 days. A stable transformant was obtained.
  • Blasticidin Invivogen, ant-b ⁇ 1
  • p A BN.ARl having the full length IR of the DHFR locus Ori-3 region was used in place of pC12.Psv40 V, and IR / MAR was not transferred! / , Also went.
  • FIG. 9 is a bar graph showing the amount of antibody produced in each experimental group, and ⁇ with No IR / MAR '' shows the IR / MAR plasmid transfected. ⁇ ⁇ ⁇ BN.AR1 '' shows the result when co-transformation of p ⁇ BN.AR1 and ⁇ pC12.Psv40 '' co-transforms pC12.Psv40 The result of the case is shown.
  • Table 2 shows the amount of antibody production, the number of heavy chain and light chain antibody gene copies in each experimental group.
  • FIGS. 10 and 11 and Tables 3 and 4 The results of cloning using the limiting dilution method are shown in FIGS. 10 and 11 and Tables 3 and 4.
  • FIG. 10 and Table 3 are a bar graph and a table showing the amount of antibody protein produced for each clone when pC12.Psv40 is cotransformed.
  • FIG. 11 and Table 4 are a bar graph and a table showing the amount of antibody protein produced for each clone when pABN.ARl is cotransformed.
  • the vector (IRZMAR plasmid) according to the present invention contains a partial fragment of IR having gene amplification activity instead of the full length of IR. Therefore, it is smaller than the IR / MAR plasmid used in the conventional advanced gene amplification system.
  • the present invention can be used in various industries that produce proteins, such as pharmaceuticals, chemicals, foods, cosmetics, and fibers.

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Description

明 細 書
哺乳動物細胞内で目的遺伝子を高度に増幅させるための方法およびべ クタ一
技術分野
[0001] 本発明は、哺乳類細胞内において目的とする遺伝子を高度に増幅させる方法、お よび該方法を実施するために用いるベクターに関する。より具体的には、本発明者ら が開発した「高度遺伝子増幅系」を用いて所望の遺伝子を増幅する際に、遺伝子導 入効率および遺伝子増幅効率を向上させることができる方法、および当該方法を行 うためのベクターに関する。
背景技術
[0002] 本発明者は、哺乳動物の複製開始領域 (IR; Initiation Region)と核マトリックス結合 領域（MAR; Matrix Attachment Region)とを持つプラスミド（以下「IR/MARプラス ミド」という）をヒト由来がん細胞（COLO 320大腸がん細胞株、および HeLa細胞株） にリポフエクシヨン法で導入し、プラスミド上に存在する薬剤耐性遺伝子（ブラスティサ ィジン（Blasticidine)あるいはネオマイシン（Neomycine) )を利用して選択するだけで
(1)発現させるべきタンパク質をコードする遺伝子（以下、適宜「目的遺伝子」という）の 細胞内コピー数を 1万コピー程度にまで増幅できること、および、
(2)目的遺伝子は IR/MARプラスミドに対して同一の遺伝子構築物（シス）として導 入した場合であっても、別の遺伝子構築物（トランス）として導入した場合であっても、 高度に増幅することができるということを発見した (特許文献 1および非特許文献 1参 照）。そして、本発明者は当該知見に基づいて、 IR/MARプラスミドと目的遺伝子と を、哺乳動物細胞（例えば、ヒト由来がん細胞（COLO 320大腸がん細胞株、および HeLa細胞株）、 CHO細胞等）にリポフエクシヨン法で導入し、プラスミド上に存在する 薬剤耐性遺伝子（Blasticidineあるいは Neomycine)を利用して選択するだけで、 目的 遺伝子を 1万コピー程度に増幅できる系（以下、「高度遺伝子増幅系」という）を完成 させるに至った。 [0003] ここで、 DMと HSR力 SIR/MARプラスミド（「IR/MARベクター」とも!/ヽぅ）によって 生じるメカニズムを図 1に示す。 IR/MARプラスミドは宿主細胞内で直列に反復して つながることで多量体化する（Stepl)。この多量体は細胞が成長している間は宿主 細胞内で安定して存在し、自己複製を行う。上記多量体がそのまま大きくなるか、宿 主細胞内に元から存在する DMに取り込まれることで DMが発生する。また、 Step2 のように多量体の環状 DNAは宿主細胞内で DNA2本鎖が切断され（DSB;double s trand breakage)、直鎖状 DNAになる。すると、当該直鎖状 DNAはクロモソームに組 み込まれ、 Step3のような BFB (Breakage-Fusion-Bridge)サイクルが開始され、 HS Rが生じる。
特許文献 1 :日本国公開特許公報「特開 2003— 245083号公報 (公開日：平成 15 ( 2003)年 9月 2曰）
^特許文 l¾ l： Noriaki Shimizu, et al. (2001) Plasmids with a Mammalian Replication Origin and a Matrix Attachment Region Initiate the Event Similar to Gene Amplificat ion. Cancer Research vol.o丄， no.19， p6987_6990.
発明の開示
[0004] 特許文献 1に記載されて!/、る高度遺伝子増幅系で利用して!/、る MARは数百 bpの ポリヌクレオチドである力 IRは数 kbpにもおよぶ。例えば c— myc遺伝子座由来の I Rは 2. 4 kbp、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（以下、適宜「DHFR」という）遺伝子座由来 の IRは 4. 6 kbpである。よって、 IR/MARプラスミドは比較的大きなサイズの遺伝 子構築物となってしまう。
[0005] 高度遺伝子増幅系を用いて目的遺伝子を増幅する場合、 IR/MARプラスミドと目 的遺伝子とを哺乳動物細胞へ導入するが、このとき、 IR/MARプラスミドのサイズが 小さくなれば、以下のメリットを享受できることが考えられた。
(A)哺乳動物細胞への遺伝子導入効率がさらに向上する。
(B)さらにサイズの大きい目的遺伝子を高度遺伝子増幅系へ適用することが可能とな
(C)タグタンパク質やシグナルペプチド等のその他のエレメントをコードするポリヌクレ ォチドを、 IR/MARプラスミドに容易に組み込むことができるようになり、より複雑な ベクターを構築することも可能になる。
[0006] そこで本発明は、高度遺伝子増幅系のさらなる改良を目的とした。より具体的には
、上記 (A)〜(C)のメリットを享受し得るベクターの開発、および上記ベクターを用いた 目的遺伝子の増幅方法を提供することを本発明は目的とした。
[0007] 本発明者らは、上記課題を解決するために IR/MARプラスミドの IRに着目して鋭 意検討を行ったところ、 目的遺伝子を高度に増幅させることができる IRの部分断片を 発見し本発明を完成するに至った。
[0008] 驚くべきことに、上記 IRの部分断片を高度遺伝子増幅系に適用して目的遺伝子の 増幅を行うと、全長の IRを用いた場合よりも HSRの発生頻度が著しく向上するという
、当業者が予想し得る以上の効果が得られた。また、上記 IRの部分断片を高度遺伝 子増幅系に適用して目的遺伝子の増幅を行った場合は、全長の IRを用いた場合と 同程度の遺伝子増幅量であったとしても、タンパク質の生産量が高くなるという、当業 者が予想し得る以上の効果が得られた。
[0009] 本発明は、上記課題を解決するために以下の発明を包含する。
[0010] 本発明に力、かる方法は、 目的遺伝子を増幅させるための方法であって、
哺乳動物複製開始領域の部分断片であって遺伝子増幅活性部位を有する増幅活 性断片、および哺乳動物核マトリックス結合領域を具備するベクターと、前記目的遺 伝子とを哺乳動物細胞に導入する工程と、
を含む方法である。
[0011] 本発明に力、かる方法は、前記哺乳動物複製開始領域が、 c myc遺伝子座、ジヒ ドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、および /3—グロビン遺伝子座の複製開始領域のい ずれ力、 1つに由来するものであってもよい。
[0012] また本発明に力、かる方法は、前記増幅活性断片が、 c myc遺伝子座に由来し、 D uplex Unwinding Elementと topoisomerasell結合領域とを少なくとも含むことを特 ί教と するものであってもよい。
[0013] また本発明にかかる方法は、前記増幅活性断片が、 C myc遺伝子座に由来し、 下記（a)のポリヌクレオチドと下記 (b)のポリヌクレオチドとを含む、請求項 1に記載の 方法であってもよい： (a)配列番号 1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号 1に 示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された ポリヌクレオチド；
(b)配列番号 2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号 2に 示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された ポリヌクレオチド。
[0014] また本発明に力、かる方法は、前記増幅活性断片が、配列番号 3に示される塩基配 歹 IJからなるポリヌクレオチド、または配列番号 3に示される塩基配列において 1若しく は数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチドを含むものであって あよい。
[0015] また本発明に力、かる方法は、前記増幅活性断片が、配列番号 4に示される塩基配 歹 IJからなるポリヌクレオチド、または配列番号 4に示される塩基配列において 1若しく は数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチドを含むものであって あよい。
[0016] また本発明に力、かる方法は、前記増幅活性断片が、配列番号 5に示される塩基配 歹 IJからなるポリヌクレオチド、または配列番号 5に示される塩基配列において 1若しく は数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチドを含むものであって あよい。
[0017] また本発明にかかる方法は、前記増幅活性断片が、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝 子座に由来し、配列番号 10に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配 列番号 10に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しく は付加されたポリヌクレオチドを含むことを特徴とする方法であってもよい。
[0018] また本発明にかかる方法は、前記増幅活性断片が、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝 子座に由来し、配列番号 1 1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配 列番号 1 1に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しく は付加されたポリヌクレオチドを含むことを特徴とする方法であってもよい。
[0019] また本発明に力、かる方法は、前記哺乳動物核マトリックス結合領域が、 Ig κ遺伝子 座、 SV40初期領域、およびジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合 領域のいずれ力、 1つに由来するものであってもよい。
[0020] また本発明に力、かる方法は、前記目的遺伝子と、前記ベクターとをトランスに配置し て、哺乳動物細胞に導入することを特徴とする方法であってもよい。
[0021] 一方、本発明に力、かるベクターは、 目的遺伝子を哺乳動物細胞内で増幅させるた めのベクターであって、哺乳動物複製開始領域の部分断片であって遺伝子増幅活 性部位を有する増幅活性断片、哺乳動物核マトリックス結合領域、および形質転換 細胞を選択するための遺伝子を具備するベクターを含むことを特徴としている。
[0022] また本発明に力、かるベクターは、前記哺乳動物複製開始領域が、 c myc遺伝子 座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座、および /3—グロビン遺伝子座の複製開始領 域の!/、ずれ力、 1つに由来するものであってもよ!/、。
[0023] また本発明に力、かるベクターは、前記増幅活性断片が、 c myc遺伝子座に由来 し、 Duplex Unwinding Elementと topoisomerasell結合領域とを少なくとも含むことを特 ί毁とするものであってもよレ、。
[0024] また本発明に力、かるベクターは、前記増幅活性断片が、 c myc遺伝子座に由来 し、下記（a)のポリヌクレオチドと下記（b)のポリヌクレオチドとを含む、ベクターであつ てもよい：
(a)配列番号 1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号 1に 示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された ポリヌクレオチド；
(b)配列番号 2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号 2に 示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された ポリヌクレオチド。
[0025] また本発明に力、かるベクターは、前記増幅活性断片が、配列番号 3に示される塩基 配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号 3に示される塩基配列において 1若し くは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチドを含むものであつ てもよい。
[0026] また本発明に力、かるベクターは、前記増幅活性断片が、配列番号 4に示される塩基 配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号 4に示される塩基配列において 1若し くは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチドを含むものであつ てもよい。
[0027] また本発明に力、かるベクターは、前記増幅活性断片が、配列番号 5に示される塩基 配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号 5に示される塩基配列において 1若し くは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチドを含むものであつ てもよい。
[0028] また本発明に力、かるベクターは、前記増幅活性断片が、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺 伝子座に由来し、配列番号 10に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または 配列番号 10に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、若し くは付加されたポリヌクレオチドを含むものであってもよい。
[0029] また本発明に力、かるベクターは、前記増幅活性断片が、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺 伝子座に由来し、配列番号 11に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または 配列番号 11に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、若し くは付加されたポリヌクレオチドを含むものであってもよい。
[0030] また本発明に力、かるベクターは、前記哺乳動物核マトリックス結合領域力 S、 Ig κ遺 伝子座、 SV40初期領域、およびジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス 結合領域のいずれ力、 1つに由来するものであってもよい。
[0031] なお、上記増幅活性断片は、配列番号 1、 2、 3、 4、 5、 10、および 11に示された塩 基配列にて特定されるポリヌクレオチドに限定されるものではなぐ配列番号 1、 2、 3 、 4、 5、 10、および 11に示される塩基配列と相補的な塩基配列からなるものであって もよい。また上記増幅活性断片は、配列番号 1、 2、 3、 4、 5、 10、および 11に示され た塩基配列にて特定されるポリヌクレオチド、並びに配列番号 1、 2、 3、 4、 5、 10、お よび 11に示された塩基配列の相補的な塩基配列を有するポリヌクレオチドの!/、ずれ 力、とストリンジェントな条件下でハイブリダィズするポリヌクレオチドも含まれる。なお、 上記「ストリンジェントな条件」とは、少なくとも 90%以上の同一性、好ましくは少なくと も 95 %以上の同一性、最も好ましくは 97 %の同一性が配列間に存在する時にのみ ハイブリダィゼーシヨンが起こることを意味する。
[0032] 一方、本発明にかかる形質転換体は、上記本発明に力、かるベクター、および目的 遺伝子が哺乳動物細胞に導入されてなるものである。
[0033] 本発明の他の目的、特徴、および優れた点は、以下に示す記載によって十分分か るであろう。また、本発明の利点は、添付図面を参照した次の説明によって明白にな るであろう。
図面の簡単な説明
[0034] [図 1]IR/MARプラスミドによって DMおよび HSRが生じるメカニズムを示す模式図 である。
[図 2]ベクターによって形質転換された COLO 320DMに生じた DMおよび HSRを FISH法によって検出した蛍光顕微鏡像であり、 Aおよび Bは pSFVdhfrが導入され た形質転換細胞の結果を示し、 Cは ρ Δ ΗρΑΧ 2. dhfrが導入された形質転換細胞 の結果を示し、 Dは pTH2. dhfrが導入された形質転換細胞の結果を示し、 Eは pEP I Iが導入された形質転換細胞の結果を示す。
[図 3]実施例および参考例において使用されているプラスミドの概略図である。
[図 4]参考例 1において pTH. IR. MARプラスミドが遺伝子導入された COLO 320
DMに生じた HSRの頻度を示す棒グラフである。
[図 5]プラスミド（ρ Δ ΒΝ· AR1、 ρ Δ ΗρΑ、 ρ Δ ΗρΑ· dhfr、 ρ Δ ΗρΑ Χ 2· dhfr, ρΤ Η2· dhfr, ρΤΗ2. dhfr. inv、 ρΕΡΙ— 1、または ρΤΗ3)が導入された、 HeLa (図 5 (A) )、 COLO 320HSR (図 5 (B) )、または COLO320DM (図 5 (C) )の HSR発生 頻度を示す棒グラフである。
[図 6]実施例 1の結果を示す図であり、 Aは c myc遺伝子座（GenBank HSMYCC; a ccession number X00364)の概略図であり、 Bおよび Cは c myc遺伝子座の IR全長 とその部分断片 C0〜C16との位置関係を示す図、並びに上記部分断片を含むブラ スミド（pC0〜pC16)が導入された形質転換細胞の HSR発生頻度を示す図である。
[図 7]実施例 2の結果を示す図であり、 Aは DHFR遺伝子座 Ori— β領域（Genbank CFORIDHFR; accession number X94372)の概略図、 Bは DHFR遺伝子座 Ori— β 領域の IR全長とその部分断片 C0〜C11との位置関係を示す図、および各部分断片 を含むプラスミドが導入された形質転換細胞の HSR発生頻度を示す図である。
[図 8]Aは実施例において使用した pC12ベクターの模式図であり、 Bは実施例にお いて使用した pC12.Psv40ベクターの模式図である。
[図 9]各実験区における抗体生産量をそれぞれ示す棒グラフであり、「with No IR/MA RJは IR/MARプラスミドをトランスフエクシヨンしなかった場合の結果を示し、「ρ Δ B N.AR1」は p A BN.ARlをコトランスフエクシヨンした場合の結果を示し、「pC12.Psv 40」は pC12.Psv40をコトランスフエクシヨンした場合の結果を示す。
[図 10]実施例 3において、 pC12.Psv40をコトランスフエクシヨンした場合の各クロー ンの抗体生産量を示す棒グラフである。
[図 11]実施例 3において、 p A BN.ARlをコトランスフエクシヨンした場合の各クローン の抗体生産量を示す棒グラフである。
発明を実施するための最良の形態
[0035] 以下、本発明について詳しく説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束さ れることはなぐ以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適 宜変更実施し得る。また、本明細書中に記載された公知文献の全てが、本明細書中 において参考として援用される。
[0036] < 1.本発明の遺伝子増幅方法〉
本発明の一実施形態は、 目的遺伝子を増幅させるための方法に関する。上記方法 のことを「本発明の遺伝子増幅方法」と称する。
[0037] ここで本発明の遺伝子増幅方法は、
哺乳動物複製開始領域の部分断片であって遺伝子増幅活性部位を有する増幅活 性断片、および哺乳動物核マトリックス結合領域を具備するベクターと、前記目的遺 伝子とを哺乳動物細胞に導入する工程 (以下、「導入工程」という）を含む方法である
[0038] ここで「目的遺伝子」とは発現させるべきタンパク質をコードする遺伝子のことを意味 する。上記目的遺伝子は、特に限定されるものではなぐ所望のタンパク質をコード するポリヌクレオチドを適宜選択の上、採用すればよい。 目的遺伝子であるポリヌクレ ォチドは、その塩基配列情報を元に PCR等の公知の技術を用いて取得すればよい
[0039] 本発明の遺伝子増幅方法を実施することによって目的遺伝子が、染色体外のダブ ルマイニユート染色体（以下、適宜「DM」という）上、および/または染色体の均一染 色領域（Homogeneously staining regeon ;以下、適宜「HSR」という）で増幅される。つ まり形質転換細胞のクローンについて目的遺伝子が DM上および/または HSRで 検出される、すなわち増幅構造が形成されていれば、 目的遺伝子が増幅されている と判断できる。形質転換細胞のクローンにお!/、て上記増幅構造が形成されたか否か を検出する方法については、特に限定されるものではないが、例えば分裂期の染色 体について公知の FISH法（fluorescence in situ hybridization)を行ない、哺乳動物 細胞へ導入した遺伝子を検出することによって判断し得る。上記判断は、当業者で あれば容易に行い得る。なお FISH法を実施する際の具体的な方法については特に 限定されるものではなぐ従来公知の方法を適宜選択の上、採用すればよい。
[0040] また本発明の遺伝子増幅方法によれば、従来の高度遺伝子増幅系に比して目的 遺伝子の増幅効率が向上するという、当業者が予想し得る以上の効果をも得られる（ 実施例を参照のこと）。 目的遺伝子の増幅効率が増加したか否かについては、従来 の高度遺伝子増幅系を実施した場合の遺伝子増幅構造発生頻度（例えば、 HSR発 生頻度、 DM発生頻度）と、本発明の遺伝子増幅方法を実施した場合の遺伝子増幅 構造発生頻度とを比較することによって判断することができる。そして後者における遺 伝子増幅構造発生頻度が前者に比して高ければ、後者、すなわち本発明の遺伝子 増幅方法によれば、従来の高度遺伝子増幅系に比して目的遺伝子の増幅効率が向 上すると!/、うことが確認できる。
[0041] なお本発明に力、かる方法には、上記導入工程の他に、
目的遺伝子とベクターとが導入された哺乳動物細胞を分離する工程 (以下、「選抜 工程」という）や、当該選抜工程によって選抜された哺乳動物細胞（すなわち形質転 換細胞）を培養する培養工程 (以下、「培養工程」という）が含まれていてもよい。また 、上記培養工程によって生産された目的タンパク質を精製する方法（以下、「精製ェ 程」という）が含まれていてもよい。以下、本発明に力、かる方法を工程ごとに説明する
[0042] 〔1 1 ·導入工程〕
本発明に力、かる方法における導入工程は、 (i)哺乳動物複製開始領域の部分断片であって遺伝子増幅活性部位を有する増幅 活性断片、哺乳動物核マトリックス結合領域、および形質転換細胞を選択するため の遺伝子を具備するベクターと、前記目的遺伝子とを哺乳動物細胞に導入する工程 である。
[0043] 上記ベクター（以下「IR/MARプラスミド」という）に含まれる哺乳動物複製開始領 域および哺乳動物核マトリックス結合領域は、哺乳動物をはじめとする真核生物細胞 内で機能する複製開始領域および核マトリックス結合領域であれば特に限定される ものではない。上記哺乳動物複製開始領域としては、例えば c myc遺伝子座由来 、ジヒドロ葉酸リダクターゼ (DHFR)遺伝子座由来、 /3 _グロビン遺伝子座由来等の 複製開始領域が挙げられる。なお c myc遺伝子座由来の複製開始領域 (以下、適 宜 myc遺伝子座由来の複製開始領域」については、「McWhinney， C. et al.， N ucleic Acids Res. vol. 18， p l 233_ 1242 (1990)」を参照のこと。またジヒドロ葉酸リダク ターゼ遺伝子座の複製開始領域については、「Dijkwel， P.A. et al.， Mol. Cell. Biol. vol.8, p5398-5409 (1988)」を参照のこと。また /3 -グロビン遺伝子座の複製開始領域 については、「Aladjem， M. et al.， Science vol. 281， p l005- 1009 ( 1998)」を参照のこ と。
[0044] また上記哺乳動物核マトリックス結合領域としては、例えば、 Ig κ遺伝子座、 SV40 初期領域、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座等の核マトリックス結合領域に由来する ポリヌクレオチドが挙げられる。なお、 Ig κ遺伝子座の核マトリックス結合領域につい ては、「Tsutsui， . et al.， J. Biol. Chem. vol. 268， p l 2886_ 12894 (1993)」を参照の こと。また SV40初期領域の核マトリックス結合領域については、「Pommier， Y. et al.， J . Virol. , vol 64, p419-423 (1990)」を参照のこと。またジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝 子座の核マトリックス結合領域については、「Shimizu N. et al.， Cancer Res. vol. 61， P6987-6990」を参照のこと。
[0045] なお本明細書にぉレ、て特に言及しな!/、場合にお!/、ては、哺乳動物複製開始領域 を「IR」と表記し、哺乳動物核マトリックス結合領域を「MAR」と表記する。また全長の IRおよび MARのみならず、これらの部分断片により構成されているベクターも「IR/ MARプラスミド」と称する。 [0046] 本発明の遺伝子増幅方法では、 IR/MARプラスミドのサイズを小さくするために、 哺乳動物複製開始領域 (IR)の部分断片であって遺伝子増幅活性部位を有する増 幅活性断片を用いることを特徴としている。ここで「哺乳動物複製開始領域 (IR)の部 分断片」とは全長の IRを除く IRの一部分であることを意味する。 IRの部分断片の長さ は特に限定されるものではないが、約 2. 4 kbpである c— myc遺伝子座由来の IRの 場合は、部分断片の長さは 0. 5kbp以上 2. Okbp以下であることが好ましぐ 0. 5kb p以上 1. 5kbp以下であることがさらに好ましぐ 0. 5kbp以上 1. 3kbp以下であること が最も好ましい。また約 4. 6 kbpである DHFR遺伝子座由来の IRの場合は、部分 断片の長さは 1. 7kbp以上 3. 5kbp以下であることが好ましぐ 1. 7kbp以上 3. lkb p以下であることがさらに好ましい。上記好ましい範囲を満たす場合は、上記 (A)〜(D) の効果が得られやすい。
[0047] ここで「遺伝子増幅活性部位」とは、高度遺伝子増幅系における遺伝子増幅が起こ るために必須なエレメントのことを意味する。例えば、ある IRの部分断片力 上記遺 伝子増幅活性部位を有しているか否かは、例えば、当該部分断片と MARとを用い て IR/MARプラスミドを調製し、当該 IR/MARプラスミドと目的遺伝子とを哺乳動 物細胞へ導入した際に遺伝子増幅形態（HSR、 DM)の発生頻度を検討することに よって判断すること力できる。すなわち上記検討において遺伝子増幅形態（HSR、 D M)の発生頻度が全長の IRを用いた場合に比して著しく低下する、または遺伝子増 幅形態（HSR、 DM)が発生しなくなれば、その検討に用いた IRの部分断片には遺 伝子増幅活性部位が含まれてレ、な!/、と判断できる。
[0048] さらに、 IRのディレーシヨンミュータントを調製し、上記検討を行なうことで遺伝子増 幅活性部位を同定することができる。ディレーシヨンミュータントは IRの配列情報から PCR法や制限酵素消化によって調製することが可能である。
[0049] 本発明者らの検討によれば、 c myc遺伝子座由来 IRの場合、配列番号 4、 5、 6、
7、 8、および 9に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドが遺伝子増幅活性部位 を有していることが明ら力、となった。
[0050] さらに、上記の結果をもとに本発明者らが検討したところ、特に、 Duplex Unwinding Element (以下「DUE」と表記する）および topoisomerasell結合領域が遺伝子増幅活 性部位に相当することがわかった。よって IR/MARプラスミドにおける全長 IRの代 わりに、 DUEおよび topoisomerasell結合領域を少なくとも含む IRの部分断片を用い ることによって、 目的遺伝子を高度に増幅することができる。なお上記 IRの部分断片 は c— myc遺伝子座由来の DUEおよび topoisomerasell結合領域のみからなるもの であってもよく、また DUEおよび topoisomerasell結合領域が複数連結されたものであ つてもよく、さらに c— myc遺伝子座由来 IRの DUEおよび topoisomerasell結合領域 を含む部分断片であってもよい。
[0051] c myc遺伝子座由来 IRの塩基配列は、例えば Genbank HSMYCC(accession num ber X00364)の第 1〜2349位に相当するものが挙げられる。そのうち DUEを含む IR の部分断片の好ましい実施形態としては、 Genbank HSMYCC(accession number X0 0364)の第 189〜473位に相当するポリヌクレオチドが挙げられる。上記ポリヌクレオ チドの塩基配列を配列番号 1に示した。ただし配列番号 1に示されるもののみ力 D UEを含む IRの部分断片の好ましい実施形態に該当するものではなぐ配列番号 1 に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加され たポリヌクレオチド、すなわち変異ポリヌクレオチドも DUEを含む IRの部分断片の好 ましい実施形態に該当するということを、当業者は容易に理解する。なお上記変異ポ リヌクレオチドを用いて IR/MARプラスミドを構築した場合に目的遺伝子を増幅させ る活性を有することはレ、うまでもなレ、。
[0052] また配列番号 1に示されている塩基配列を、クエリーとして BLASTN 2. 2. 1など の相同検索プログラムを用いて、 GenBankや EMBL、 DDBJなどのデータベースに 対して相同検索を行うことで得られた塩基配列からなるポリヌクレオチドを、 DUEを含 む IRの部分断片として利用可能である。上記の変異ポリヌクレオチドまたは相同検索 を行うことで得られたポリヌクレオチドと、配列番号 1に示されるポリヌクレオチドとの相 同性は、 80%以上が好ましぐ約 90%以上がさらに好ましぐ約 95%以上が最も好 ましい。
[0053] また Genbank HSMYCC(accession number X00364)の第;!〜 2349位に示されてい る c myc遺伝子座由来 IRのうち、 topoisomerasell結合領域を含む IRの部分断片の 好ましい実施形態としては、 Genbank HSMYCC(accession number X00364)の第 745 〜987位に相当するポリヌクレオチドが挙げられる。上記ポリヌクレオチドの塩基配列 を配列番号 2に示した。ただし配列番号 2に示されるもののみ力 S、 topoisomerasell結 合領域を含む IRの部分断片の好ましい実施形態に該当するものではなぐ配列番号 2に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加さ れたポリヌクレオチド、すなわち変異ポリヌクレオチドも topoisomerasell結合領域を含 む IRの部分断片の好ましい実施形態に該当するということを、当業者は容易に理解 する。なお変異ポリヌクレオチドについては上述の通りである。
[0054] また DUEおよび topoisomerasell結合領域を少なくとも含む IRの部分断片の好まし い実施形態としては、 Genbank HSMYCC(accession number X00364)の第 189〜987 位に相当するポリヌクレオチドが挙げられる。上記ポリヌクレオチドの塩基配列を配列 番号 3に示した。ただし配列番号 3に示されるもののみ力 DUEおよび topoisomeras ell結合領域を少なくとも含む IRの部分断片の好ましい実施形態に該当するものでは なぐ配列番号 3に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、 若しくは付加されたポリヌクレオチド、すなわち変異ポリヌクレオチドも部分断片の好 ましい実施形態に該当するということを、当業者は容易に理解する。なお変異ポリヌク レオチドについては上述の通りである。
[0055] また DHFR由来 IRの場合、配列番号 11、 12、 13、 14、 15、および 16に示される 塩基配列からなるポリヌクレオチドが増幅活性断片に該当することを本発明者らは確 認した。そして、これらの結果から配列番号 10に示される塩基配列からなるポリヌクレ ォチドを少なくとも含むポリヌクレオチドを IR/MARプラスミドの全長 IRの代わりに使 用することで、 目的遺伝子を増幅することができるということを見出した。ただし配列 番号 10の代わりに、配列番号 10に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基 が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチド、すなわち変異ポリヌクレオチドも 本発明にかかる遺伝子増幅方法にお!/、て利用可能であると!/、うことを、当業者は容 易に理解する。なお変異ポリヌクレオチドについては上述の通りである。
[0056] 配列番号 10に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号 10に示 される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポ リヌクレオチドを含む、 DHFR由来の増幅活性断片としては、配列番号 11、 12、 13、 14、 15、および 16に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、ならびに当該ポリヌ クレオチドの変異ポリヌクレオチドが挙げられる。力、かる増幅活性断片には、 c— myc 遺伝子座由来 IRのものと同様に、 DUEおよび topoisomerasell結合領域が含まれて いる。また DHFR由来 IRの増幅活性断片には、湾曲 DNA、 RIP60結合領域、およ び AT— richエレメントがさらに含まれている。
[0057] 特に配列番号 1 1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチドを IR/MARプラスミ ドの全長 IRの代わりに使用することで、全長 IRを使用した場合に比して目的遺伝子 の増幅効率が向上するという驚くべき知見が得られた。
[0058] なお DHFR由来 IRの塩基配列としては、 Genbank CFORIDHFR(accession number
X94372)の第 1532〜6166位に示される塩基配列がその一例として挙げられる。
[0059] 本発明にかかる遺伝子増幅方法の導入工程にお!/、て使用する IR/MARプラスミ ドは、既述の増幅活性断片、および MARが具備されていればよいが、当該 IR/M ARには、大腸菌内でクローニングを行うために必要な酉己列、選択マーカー（マーカ 一タンパク質）としての薬剤耐性遺伝子 (ブラスティサイジン抵抗性遺伝子、ネオマイ シン抵抗性遺伝子、ヒグロマイシン抵抗性遺伝子等)または緑色蛍光タンパク質遺伝 子等が含まれていてもよい。これらの選択マーカーを指標とすることによって、 IR/ MARプラスミドが導入された哺乳動物細胞を選別できる。
[0060] また本発明に力、かる遺伝子増幅方法の導入工程において導入される、 目的遺伝 子はプロモーターに制御可能に連結されていることが好ましい。上記プロモーターは 、導入される哺乳動物細胞において機能するものであれば特に限定されるものでは なぐ転写因子等による所定の操作によって、プロモーターの転写活性が活性化また は不活性化されるプロモーター（本明細書においては「転写活性調節型プロモータ 一」という）であっても、恒常的に転写活性が活性化されている恒常型プロモーターで あってもよい。「転写活性調節型プロモーター」は、上記特性を有するものであれば 特に限定されるものではなぐ例えば、 TREプロモーター（クロンテック社製）、 T— R EXプロモーター（インビトロジェン社製）等の市販品が本発明に力、かる方法において 利用可能である。恒常型プロモーターとしては、 CMVプロモーター、 SV40初期領 域由来プロモーター（SV40プロモーター）、 SRalphaプロモーター（SR aプロモータ 一）、 LTRプロモーター、 MMTVプロモーター等が利用可能である。
[0061] 本発明にかかる遺伝子増幅方法の導入工程において、 IR/MARプラスミドと目的 遺伝子とを哺乳動物細胞へ同時に導入する。このようにすることによって、 目的遺伝 子が法入道物細胞において高度に増幅される。
[0062] 上記哺乳動物細胞は、特に限定されるものではなぐ例えば CHO— K1細胞（入手 先：例えば、 ATCC CCL-61、 RI EN RCB0285、 RI EN RCB0403等）、各種腫瘍細 胞等が挙げられる。ただし、上記哺乳動物細胞としては、無限増殖能を有する腫瘍 細胞が特に好ましい。上記腫瘍細胞としては、例えば、 HeLa細胞（入手先：例えば、 ATCC CCL- 2、 ATCC CCL- 2.2、 RIKEN RCB0007、 RIKEN RCB0191等）、ヒト大腸 がん COLO 320DM細胞（入手先：例えば、 ATCC CCL-220)、ヒト大腸がん COLO 32 0HSR細胞（入手先：例えば、 ATCC CCL-220.1)、 NS0細胞（入手先：例えば、 RI E N RCB0213)等が挙げられる。なおヒト大腸がん COLO 320DM細胞については、「Shi mizu, N., anaa, Γ·， and Wahl, G. M. selective capture or acentncfragments by mic ronuclei provides a rapia method for puriiying extrachromosomally amplified DNA. N at. Genet., 12: 65— 71， 1996·」を参照のこと。
[0063] なお、 IR/MARプラスミドおよび目的遺伝子を哺乳動物細胞に導入する際には、 両者が同時に哺乳動物細胞へ導入される態様であれば特に限定されるものではなく
、両者を連結して同一の遺伝子構築物として導入してもよいし、おのおの別々の遺 伝子構築物として導入してもよい。ここで前者を IR/MARプラスミドと目的遺伝子と をシスに配置するといい、後者を IR/MARプラスミドと目的遺伝子とをトランスに配 置するという。前者の場合は一の遺伝子構築物を哺乳動物細胞へ導入すればよぐ 操作が容易であるというメリットがある。一方、後者の場合はそれぞれの遺伝子構築 物のサイズを小さくすることができるために、上記 (A)〜(D)のメリットをさらに得られや すくなる。
[0064] また遺伝子構築物の形態については、プラスミドであってもコスミドであってもよい。
また IR/MARプラスミドおよび目的遺伝子の哺乳動物細胞への導入方法は、特に 限定されるものではなぐリポフエクシヨン、エレクト口ポレーシヨン法、パーテイクルガ ン法等公知の方法を適宜選択の上、採用すればよい。 [0065] なお IR/MARプラスミドと目的遺伝子とを別の遺伝子構築物として導入する場合 には、それぞれの遺伝子構築物に選択マーカーをコードする遺伝子が含まれている ことが好まし!/、。上記ポリヌクレオチドが導入された哺乳動物細胞を選抜することがで きる力、らである。この時、 IR/MARプラスミドに含まれる選択マーカーと、 目的遺伝 子を含む遺伝子構築物に含まれる選択マーカーとが異なることが好ましいことはいう までもない。
[0066] 〔1 2·選抜工程〕
本発明の遺伝子増幅方法における「選抜工程」は、 目的遺伝子とベクターとが導入 された哺乳動物細胞を分離する工程である。より詳細には、本工程は、 目的遺伝子と ベクターとが導入されて!/、な!/、哺乳動物細胞、および目的遺伝子とベクターとが導 入された哺乳動物細胞が含まれる細胞の多クローン性集団から後者の細胞を選抜 する工程である。なお、薬剤耐性を指標として本工程を行う場合には、哺乳動物細胞 を培地で培養する工程が含まれる場合がある力 本工程では目的遺伝子とベクター とが導入されて!/、な!/、哺乳動物細胞、および目的遺伝子とベクターとが導入された 哺乳動物細胞が含まれる細胞の混合物を培養するのに対して、後述する目的遺伝 子とベクターとが導入された哺乳動物細胞として既に選抜された細胞を培養する点 において、両工程は明らかに相違する。かかる選抜工程によって、哺乳動物細胞に 導入された目的遺伝子が高度に増幅された哺乳動物細胞を選抜することができる。
[0067] 上記選抜工程の具体的方法は特に限定されるものではな!/、が、例えば、 目的遺伝 子とベクターとを哺乳動物細胞へ導入する際に用いた遺伝子構築物に薬剤耐性遺 伝子が含まれている場合、その薬剤耐性を利用して目的遺伝子とベクターとが導入 された哺乳動物細胞を選抜すればよ!/、。
[0068] なお、本発明の遺伝子導入方法における選抜工程は、 PCR法ゃサザンブロット法 によって、哺乳動物細胞に含まれる目的遺伝子若しくはベクター、またはそのヌクレ ォチド断片を検出することによつても行い得る。上記薬剤耐性、 PCR法、サザンプロ ット法の具体的な方法は、特に限定されるものではなぐ公知の方法が適宜利用され 得る。
[0069] 〔1 3·培養工程〕 本発明の遺伝子増幅方法における「培養工程」は、上記選抜工程によって既に選 抜された哺乳動物細胞を培養する工程である。力、かる培養工程によって、 目的遺伝 子が導入され且つ高度に増幅された哺乳動物細胞を増殖させることができ、所定の 操作 (転写誘導操作等）によって、 目的タンパク質を生産することができる。
[0070] 上記培養工程の具体的方法は特に限定されるものではなぐ培養する哺乳動物細 胞に最適な条件を検討の上、適宜採用すればよい。
[0071] 〔1 4·精製工程〕
本発明の遺伝子増幅方法における「精製工程」は、上記培養工程によって生産さ れた目的タンパク質を精製する方法である。
[0072] 本精製工程におけるタンパク質精製の具体的方法としては、例えば、哺乳動物細 胞を PBS (Phosphate Buffered Saline)等の緩衝溶液に懸濁した後、ホモジェナイザ 一または超音波等で細胞を破砕し、遠心分離をして上清を回収する。上記緩衝溶液 には、タンパク質の可溶化を促進するための界面活性剤や、タンパク質の立体構造 を安定化するための還元剤、タンパク質の分解を防止するためのプロテアーゼインヒ ビターを適宜添加することもできる。上記界面活性剤としては、 CHAPS(3_[(3-chol i aopropyi)_mmethylammomo_l_propanesulfonate Triton X_100 Nikkol n―ォクテ ルグリコシド等を利用することができる。また、上記還元剤としては、 DTT (dithiothreit ol DET(dithioerythritol)等を利用することができる。また、上記プロテアーゼインヒ ビターとしては、ァプロチュンや、ロイぺプチンを利用することができる。
[0073] 上記上清から、 目的遺伝子がコードするタンパク質（目的タンパク質）をァフィ二ティ 一クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ろ過クロマトグラフィー等のカラム クロマトグラフィーを用いて、精製すること力 Sできる。また、精製されたタンパク質溶液 を適当な緩衝液に透析することで不要な塩を除去することもできる。上記のタンパク 質の精製工程は、タンパク質の分解を抑えるために低温条件下で行われることが好 まし!/、。特に 4°C下で精製工程が行われることが好まし!/、。
[0074] なお、上記精製工程の具体的方法は、この限りではなぐ公知の方法を適宜利用さ れ得る。
[0075] < 2·本発明のベクター〉 なお本発明は、上記で説示した本発明の遺伝子増幅方法を行うためのベクター（ 以下「本発明のベクター」という）、または当該ベクターを含むことを特徴とする遺伝子 増幅キット（以下「本発明のキット」と!/、う）をも包含する。
[0076] 本発明のベクターの説明は、上記本発明の遺伝子増幅方法において使用する IR /MARプラスミドの説明を援用することができる。
[0077] また、本発明のキットは、上記本発明のベクターを含むことを特徴としている。本発 明に力、かるキットは、本発明に力、かる方法を実施し得るものであれば、上記構成に限 定されるものではなぐその他の構成を含んでいてもよい。なお、本発明に力、かるキッ トを構成する物品等の説明につ!/、ては、本発明にかかる方法の説明を適宜援用する こと力 Sでさる。
実施例
[0078] 以下に、実施例に基づいて、本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに 限定されるものではない。本実施例および参考例に記載の PCRは全て KODポリメラ ーゼ（東洋紡積株式会社製）を用いて行った。また PCRの諸条件は、 KODポリメラ ーゼに添付されている説明書に記載されている標準の条件で行った。また、プライマ 一の配列については後述する。
[0079] 〔各種プラスミド〕
5'末端と 3'末端とに Asc Iサイトを有する、 DHFR遺伝子座 Ori— β領域の IR遺 伝子、および c— mycの IR遺伝子の作製方法は以下の通りである。 DHFR遺伝子座 Ori— /3領域の IR(4. 6kbp)を、「Ν· Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 6 1， p6987_6990」に記載されている pSFVdhfrから Not Iで制限酵素消化することに よって切り出した。また、 c— mycの IR(2. 4kbp)は「McWhinney， C. et al., Nucleic Acids Res. Vol. 18， pl233- 1242 (1990)」に記載されている pNeo. Myc— 2. 4から N ot Iと Hind IIIを用いて制限酵素消化して切り出した。上記 2つの IR断片の 5'と 3' 末端を平滑末端化した後、その平滑末端に Asc Iの制限酵素サイトを有するァダプ ターオリゴヌクレオチドを連結した。
[0080] また ρ Δ ΒΝ· AR1、 ρ Δ ΒΝ. polyA、および pSFV— Vとして、「Ν· Shimizu, et al. ( 2001) Cancer Research, vol. 61， p6987_6990」に記載のプラスミドをそれぞれ用いた [0081] また p Δ Ηは pSFV— Vに含まれる完全長のハイグロマイシン抵抗性遺伝子カセット を Not Iと Nru Iの制限酵素を用いて取り除き、代わりにその場所にマルチクロー二 ングサイトを含む合成オリゴヌクレオチドを揷入することで作製された。上記マルチク ローニングサイトの制限酵素サイトはブラスティサイジン抵抗性遺伝子（以下、「BSR」 という）の下流に位置し、 5'末端から 3'末端にかけて Kpn I— Not I—Asc I— Nr u Iの順番である。
[0082] また図 3Dに示されている ρ Δ ΗρΑは、 HSV poly A配列（1357bp)を含む遺伝 子を 5'末端および 3 '末端に Kpn Iの制限酵素サイトが付加されるように設計した H SVpAKpnIRと HSVpAKpnILのプライマーセットとを用いて PCR法によって増幅し 、当該 Kpn Iの制限酵素サイトを用いて上記 ρ Δ Ηの Kpn Iサイトに揷入することで 作製された。 HSVpAKpnIRおよび HSVpAKpnILの各プライマーの塩基配列を配 列番号 17と配列番号 18にそれぞれ示した。また、上記、 HSV poly A配列の塩基 配列を配列番号 19で示した。
[0083] 図 3Eに示されて!/、る p Δ HpAdhfrを、上記で作製した DHFR遺伝子座 Ori— β領 域の IRを、その IR断片の内部に存在する MAR配列力 BSRの転写開始点よりも遠 くになるように p Δ HpAの Asc Iサイトに揷入することで作製した。
[0084] また図 3Fに示されている ρ Δ ΗρΑΧ 2. dhfrは、平滑末端処理を施した上記 HSV poly A配歹 I] (図 3中「HSV pA」で示す）を含む遺伝子断片を ρ Δ HpA. dhfrの Nru Iサイトに揷入することで作製された。
[0085] また図 3Cの pTH. IR. MARは下記の通りにして作製された。
(i) ARlの MAR (375bp)断片を Hind IIIと BamH Iを用いて制限酵素消化するこ とで pARlより切り出し、当該断片の両末端を平滑末端処理した。なお、 pARlの詳 細は「Ν· Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 61， p6987_6990」に記載され ている。
(ii) SV40の初期領域の MAR遺伝子を、 pNeo. Myc— 2. 4を铸型として SV40Lと SV40Rのプライマーセットを用いて PCR法により取得した。 SV40Lおよび SV40R の塩基配列を配列番号 20および 21にそれぞれ示した。また、上記 SV40の初期領 域の MAR遺伝子の塩基配列を配列番号 22に示した。
(iii) RFB (replication fork barrier)配列を含む遺伝子（1 18bp)は、 pSV2. SB2を 铸型として、 5 '末端と 3 '末端とに Not Iの制限酵素サイトが付加されるように設計し た RFB Not ILと RFB Not IRのプライマーセットとを用いて PCR法により取得さ れた。上記 RFB配列は複製フォークの発生をブロックするため、当該 RFB配列が導 入されたプラスミドの複製を阻害することができる。 RFB Not ILおよび RFB Not IRの塩基配列を配列番号 23および 24にそれぞれ示した。また、 RFB配列の塩基 配列を配列番号 25で示した。
(vi)上記 RFB配列を含む遺伝子を、 IRからの複製フォークをブロックする方向性で p Δ ΗρΑの Not Iサイトに揷入した。次に、平滑末端処理した AR1と SV40との両方 の MAR遺伝子を、上記プラスミドの Nru Iサイトに揷入した。
(V)最後に、上記で作製した c mycの IR遺伝子または DHFR遺伝子座 Ori— /3領 域の IR遺伝子と、 λ ファージの Hind IIIで制限酵素消化した 4361bpの断片の 両末端に Asc Iサイトを付加した遺伝子とを、それぞれ (vi)で作製したプラスミドの A sc Iサイトに揷入した。
[0086] また図 3Gに示されている pTH2. dhfr、または ρΤΗ2· dhfr. invは、上記で取得し た DHFR遺伝子座 Ori— /3領域の IR遺伝子（4. 6kbp)を平滑末端処理したものを、 ρ Δ ΗρΑの EcoR I消化物を平滑末端処理したものに対して、 BSRの転写に関して 同じ、または反対の方向になるように揷入してそれぞれ作製された。
[0087] また図 3Hに示されている pEPI— I (「Schaarschmidt， D.， Baltin, J. , Stehle, I. Μ· , Li pps, H. J. , and nippers, R. (2004) EMBO J. 23(1)， 191-201 ·」、および「Jenke， A. C , Stehle, I. M. , Herrmann, F.， Eisenberger, Τ·， Baiker, A. , Bode, J. , Fackelmayer, F. 0·， and Lipps, H. J. (2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101， 11322— 11327·」）は Daniel Schaarchmidt (Department of Biology, Universitat of Konstanz)氏より提供さ れ 。
[0088] また図 3Jに記されている pTHVは、 ρ Δ Ηの Kpn Iサイトに平滑末端ライゲーシヨン で AR1の MARを揷入することで作製された。
[0089] また図 31に記されている pTH3は、上記 pTHVの Not Iサイトに平滑末端ライゲー シヨンで HSV poly A配列を揷入することで作製された。
[0090] また 2· 4kbpの c— mycの IRの部分断片（C0〜C16)または 4· 6kbpの DHFR遺 伝子座 Ori— /3領域の IRの部分断片（D；!〜 D11)を含むベクターは、 pNeo. Myc - 2. 4と pSFVdhfrとを铸型とする PCRによって増幅された遺伝子を、 pTHVの Asc Iサイトに揷入することによつて作製された。
[0091] 上記の PCRで用いた、 CO増幅用の 5'プライマー（CO— 5' )の塩基配列を配列番 号 26に、 3'プライマー（CO— 3' )の塩基配列を配列番号 27に示した。また、 C1増 幅用の 5 'プライマー（C 1— 5 ' )の塩基配列を配列番号 28に、 3，プライマー（C 1— 3 ' )の塩基配列を配列番号 29に示した。また、 C2増幅用の 5'プライマー（C2— 5' ) の塩基配列を配列番号 30に、 3'プライマー（C2— 3' )の塩基配列を配列番号 31に 示した。また、 C3増幅用の 5'プライマー（C3— 5' )の塩基配列を配列番号 32に、 3' プライマー（C3— 3' )の塩基配列を配列番号 33に示した。また、 C4増幅用の 5 'ブラ イマ一（C4 5 ' )の塩基配列を配列番号 34に、 3，プライマー（C4 3 ' )の塩基配列 を配列番号 35に示した。また、 C5増幅用の 5'プライマー（C5— 5' )の塩基配列を 配列番号 36に、 3'プライマー（C5— 3' )の塩基配列を配列番号 37に示した。また、 C6増幅用の 5'プライマー（C6— 5' )の塩基配列を配列番号 38に、 3'プライマー（C 6— 3 ' )の塩基配列を配列番号 39に示した。また、 C7増幅用の 5'プライマー（C7— 5' )の塩基配列を配列番号 40に、 3'プライマー（C7— 3' )の塩基配列を配列番号 4 1に示した。また、 C8増幅用の 5'プライマー（C8— 5' )の塩基配列を配列番号 42に 、 3'プライマー（C8— 3' )の塩基配列を配列番号 43に示した。また、 C9増幅用の 5' プライマー（C9 5' )の塩基配列を配列番号 44に、 3'プライマー（C9 3' )の塩基 配列を配列番号 45に示した。また、 C10増幅用の 5'プライマー（C10— 5' )の塩基 配列を配列番号 46に、 3'プライマー（C10— 3' )の塩基配列を配列番号 47に示し た。また、 C11増幅用の 5'プライマー（C11— 5' )の塩基配列を配列番号 48に、 3' プライマー（C11— 3' )の塩基配列を配列番号 49に示した。また、 C12増幅用の 5' プライマー（C 12— 5 ' )の塩基配列を配列番号 50に、 3 'プライマー（C 12— 3 ' )の塩 基配列を配列番号 51に示した。また、 C13増幅用の 5'プライマー（C13— 5' )の塩 基配列を配列番号 52に、 3'プライマー（C13— 3' )の塩基配列を配列番号 53に示 した。また、 C14増幅用の 5'プライマー（C14— 5' )の塩基配列を配列番号 54に、 3 ，プライマー（C14— 3' )の塩基配列を配列番号 55に示した。また、 C15増幅用の 5' プライマー（C 15— 5 ' )の塩基配列を配列番号 56に、 3 'プライマー（C 15— 3 ' )の塩 基配列を配列番号 57に示した。また、 C16増幅用の 5'プライマー（C16— 5' )の塩 基配列を配列番号 58に、 3'プライマー（C16— 3' )の塩基配列を配列番号 59に示 した。また、 D1増幅用の 5'プライマー（D1— 5' )の塩基配列を配列番号 60に、 3'プ ライマー（D 1— 3' )の塩基配列を配列番号 61に示した。また、 D2増幅用の 5 'プライ マー（D2— 5 ' )の塩基配列を配列番号 62に、 3，プライマー（D2— 3 ' )の塩基配列 を配列番号 63に示した。また、 D3増幅用の 5'プライマー（D3— 5' )の塩基配列を 配列番号 64に、 3'プライマー（D3— 3' )の塩基配列を配列番号 65に示した。また、 D4増幅用の 5 'プライマー（D4— 5 ' )の塩基配列を配列番号 66に、 3 'プライマー（ D4— 3' )の塩基配列を配列番号 67に示した。また、 D5増幅用の 5'プライマー（D5 - 5' )の塩基配列を配列番号 68に、 3'プライマー（D5— 3' )の塩基配列を配列番 号 69に示した。また、 D6増幅用の 5'プライマー（D6— 5' )の塩基配列を配列番号 7 0に、 3'プライマー（D6— 3' )の塩基配列を配列番号 71に示した。また、 D7増幅用 の 5 'プライマー（D7— 5 ' )の塩基配列を配列番号 72に、 3 'プライマー（D7— 3 ' )の 塩基配列を配列番号 73に示した。また、 D8増幅用の 5'プライマー（D8— 5' )の塩 基配列を配列番号 74に、 3'プライマー（D8— 3' )の塩基配列を配列番号 75に示し た。また、 D9増幅用の 5'プライマー（D9— 5' )の塩基配列を配列番号 76に、 3 'ブラ イマ一（D9— 3' )の塩基配列を配列番号 77に示した。また、 D10増幅用の 5'プライ マー（D10— 5' )の塩基配列を配列番号 78に、 3'プライマー（D10— 3' )の塩基配 列を配列番号 79に示した。また、 Dl 1増幅用の 5'プライマー（D11— 5' )の塩基配 列を配列番号 80に、 3'プライマー（Dl 1— 3 ' )の塩基配列を配列番号 81に示した。 また、上記 PCRで増幅された COの塩基配列を配列番号 82に示した。また、上記 PC Rで増幅された C1の塩基配列を配列番号 83に示した。また、上記 PCRで増幅され た C2の塩基配列を配列番号 84に示した。また、上記 PCRで増幅された C3の塩基 配列を配列番号 85に示した。また、上記 PCRで増幅された C4の塩基配列を配列番 号 86に示した。また、上記 PCRで増幅された C5の塩基配列を配列番号 87に示した 。また、上記 PCRで増幅された C6の塩基配列を配列番号 88に示した。また、上記 P CRで増幅された C7の塩基配列を配列番号 89に示した。また、上記 PCRで増幅さ れた C8の塩基配列を配列番号 90に示した。また、上記 PCRで増幅された C9の塩 基配列を配列番号 91に示した。また、上記 PCRで増幅された C10の塩基配列を配 列番号 92に示した。また、上記 PCRで増幅された C 11の塩基配列を配列番号 93に 示した。また、上記 PCRで増幅された C 12の塩基配列を配列番号 94に示した。また 、上記 PCRで増幅された C 13の塩基配列を配列番号 95に示した。また、上記 PCR に増幅された C14の塩基配列を配列番号 96に示した。また、上記 PCRに増幅され た C15の塩基配列を配列番号 97に示した。また、上記 PCRに増幅された C16の塩 基配列を配列番号 98に示した。また、上記 PCRに増幅された D1の塩基配列を配列 番号 99に示した。また、上記 PCRに増幅された D2の塩基配列を配列番号 100に示 した。また、上記 PCRに増幅された D3の塩基配列を配列番号 101に示した。また、 上記 PCRに増幅された D4の塩基配列を配列番号 102に示した。また、上記 PCRに 増幅された D5の塩基配列を配列番号 103に示した。また、上記 PCRに増幅された D6の塩基配列を配列番号 104に示した。また、上記 PCRに増幅された D7の塩基配 歹 IJを配列番号 105に示した。また、上記 PCRに増幅された D8の塩基配列を配列番 号 106に示した。また、上記 PCRに増幅された D9の塩基配列を配列番号 107に示 した。また、上記 PCRに増幅された D10の塩基配列を配列番号 108に示した。また、 上記 PCRに増幅された D 11の塩基配列を配列番号 109に示した。
[0092] 〔実験方法〕
上記で作製したプラスミドを用いて以下の実験を行った。
[0093] 本実施例および参考例（「実施例等」と!/、う）では、上記プラスミドを細胞に遺伝子導 入し、当該プラスミドで形質転換された形質転換細胞を選択し、 FISH法を用いて当 該形質転換細胞内の HSRの形成頻度を調べた。
[0094] 本実施例等で用いられている遺伝子導入方法については以下の通りである。まず 遺伝子導入に用いるプラスミドをキアゲンプラスミド精製キット（Qiagen Inc., Valencia, CA)を用いて大腸菌より精製した。さらに、上記プラスミドを細胞内に導入する際に は、 DNA精製の過程で混入する大腸菌由来の内毒素を MiraCLEAN (登録商標） en dotoxin removalキット（Mirus., Madison，WI)を用いて除去した後に、メーカーの推薦 する手法に従って、 GenePorter (登録商標） 2 lipofectionキット（Gene Therapy Syste ms， San Diego，CA)を用いて細胞に遺伝子導入した。
[0095] 上記の遺伝子導入される細胞は、ヒト大腸癌細胞株である、 COLO 320DMまた は、 COLO320 HSR、またはヒト頸癌細胞株である Helaである。上記細胞株は「Ν· Shimizu, et al. (2001) Cancer Research, vol. 61， p6987_6990」に記載の所から取得 され、当該記載と同じ条件で培養された。 COLO 320DMには c myc遺伝子の増 幅によって多くの内在性の DMが生じており、一方、 COLO 320DMと同質遺伝子 系統の COLO 320HSRには DMよりも HSRが多く生じて!/、る。
[0096] 上記形質転換細胞を、遺伝子導入から 2日後に、終濃度 5 11 g/mlになるようにブ ラスティサイジンを加えた選択培地で上記細胞を培養することで選択した。選択培地 は 3日〜 5日ごとに培養中の選択培地の半分を、新しく調製した上記選択培地と交換 した。
[0097] 上記 FISH法と、 FISH法に用いる導入遺伝子を検出するためのプローブの調製と 、メタフェーズスプレツディング（metaphase spreading)とは、それぞれ培養 4、 6、また は 8週後に、培養中の細胞の一部を回収し、「Ν· Shimizu, et al. (2001) Cancer Resea rch, vol. 61， p6987_6990」に記載の方法に従って行われた。また、上記プローブはビ ォチン化されており、緑色蛍光を発する FITC (fluorescein isothiocyanate)が結合し たストレプトアビジンによって検出することができる。また、赤色蛍光を発する PI (propi dium iodide)で DNAを対比染色した。 FISH法によって蛍光標識したスライドガラス 上の細胞を、蛍光色素を検出するのに適切なフィルタセットと 100倍の対物レンズ (M kon Plan Fluor, NA1.30 oil)を設置している倒立蛍光顕微鏡（ECLIPSE TE2000_U、 Nikon)を用いて観察し、上記顕微鏡とつながれている Fuji FinePix SI Pro digital cam era(Fuji Film Co.Tokyo)を用いて、細胞内での導入遺伝子と DNAの態様の写真を デジタル画像として撮影した。得られた、それぞれの画像は画像解析ソフト Adobe (登 録商標） Photpshop (登録商標） version 4.0J(Adobe Systems Inc)を用いて合成した。
[0098] 〔参考例 1〕
プラスミド pSFVdhfr、 ρ Δ ΗρΑχ2· dhfr、 pTH2. dhfr、または pEPI— Iを COLO 320DMに遺伝子導入した。 pSFVdhfrを導入した場合には培養 8週間後に、それ 以外のプラスミドを導入した場合には培養 6週間後に、形質転換細胞を回収した。回 収されたそれぞれの形質転換細胞について、 FISH法によって DMと HSRとを検出 した。
[0099] DMおよび HSRを FISH法により検出した結果を図 2に示す。図 2における「A」お よび「B」は pSFVdhfrが導入された形質転換細胞の結果、「C」は ρ Δ ΗρΑχ2. dhfr が導入された形質転換細胞の結果、「D」は pTH2. dhfrが導入された形質転換細 胞の結果、「E」は pEPI— Iが導入された形質転換細胞の結果をそれぞれ示す。図 2 において、矢頭は DMを示し、矢印は HSRを示す。
[0100] 種々の IRと MARとの組み合わせを含む pTH. IR. MARを作製し、 COLO 320 DMに遺伝子導入し、 4、 6、または 8週間培養後に形質転換細胞を取得した。上記 形質転換細胞に生じている HSRを FISH法により調べ、 HSR発生頻度（Frequency of HSR)をもとめた。その結果を図 4に示した。 HSR発生頻度は、「（HSRが発生して いる形質転換細胞数 ÷形質転換細胞数） X 100」として計算された。図 4中の IRの欄 における「（十）」および「（一）」は、 IRが BSRの転写方向と同じである場合および反 対である場合をそれぞれ示す。また、「え一 DNA fragment」はえファージの 4361bp の遺伝子断片が IRの代わりに組み込まれていることを示し、 nonejは IRを含まない ことを示す。
[0101] 図 4によれば、 IRと MARとを有しているプラスミドを遺伝子導入されている形質転 換細胞のみに HSRが生じていることが分かる。さらに、 IRの代わりに λファージの 43 61bpの遺伝子断片を用いた場合や、 IRを用いない場合には、 HSRがほとんど生じ ていないことから、 IR中に HSRを発生させる活性を有する塩基配列があることが示唆 された。
[0102] プラスミド（ρ Δ ΒΝ. AR1、 ρ Δ ΗρΑ、 ρ Δ ΗρΑ. dhfr、 ρ Δ ΗρΑ Χ 2· dhfr, ρΤΗ2 . dhfr, ρΤΗ2. dhfr. inv、 pEPI— 1、または ρΤΗ3)を、 HeLaまたは COLO 320 HSR、 COLO320DMに遺伝子導入を行った。遺伝子導入後、 4週間または 8週間 選択培地で培養することで、形質転換細胞を選抜した。次に、選抜された形質転換 細胞 HSR発生頻度を調べた。その結果を図 5に示した。 [0103] 図 5によれば、遺伝子複製と非コード転写との間で衝突が起きるように作製された p Δ ΗρΑ. dhfrを遺伝子導入した場合において、 HSRが生じた。一方、ポリ A配列を 1 つ追加して非コード転写と遺伝子複製との間の衝突が起きないように作成した ρ Δ Η pAX 2. dhfrを遺伝子導入した場合には、 HSRが生じな力 た。このことは、遺伝子 複製と非コード転写との間で衝突が起きることでプラスミドが不安定になり、プラスミド は多量体化し、 HSRを生じるということを示唆している。また、非コード転写と遺伝子 複製との間の衝突が起きないように作製した pTH2. dhfrが遺伝子導入された場合 には、低頻度であるが HSRが生じた。このことは、遺伝子複製と非コード転写との間 で衝突が起こっていたことが推察される。上記の結果から、 IRの両端にポリ A配列を 付加することで、遺伝子複製と非コード転写との間に起こる衝突をなくすことができる ということが分かった。
[0104] また、転写領域の間に挿入された MARが遺伝子複製と哺乳類ェピソームの維持 に必須であり、 IRは必要ではないという文献「Jenke， A. C, Stehle, I. M., Herrmann, F.， senberger, Τ·， Baiker, A., Bode, J., Fackelmayer, F. 0·， and Lipps, H. J. (200 4) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101， 11322-11327.」がある。そこで、上記文献で用い られて!/、るプラスミド（pEPI— 1)と pEPI— 1と同様の構成のプラスミド（pTH3)を作製 した。 pTH3は AR1由来の MARが BSR転写領域の内部に存在するプラスミドである 。上記プラスミドを HeLa、 COLO 320HSR、または COLO320DMに遺伝子導入 し、 HSRの発生を調べたところ、当該形質転換細胞において HSRおよび DMは全く 発生していな力 た。一方、極微小物体であるェピソームは確認することができた。こ のことは IRが HSRの発生に必須であることを示唆して!/、る。また IRは遺伝子複製に 関与し、 HSRは遺伝子増幅に関与することから、 IRの遺伝子複製と遺伝子増幅とが 関連すると考えられる。
[0105] 〔実施例 1〕
遺伝子増幅活性を有する c— myc遺伝子座の IRの部分断片の同定を試みた。す なわち、 PCRを用いて c— myc遺伝子座の IRの部分断片（C0〜C16)を作製し、当 該部分断片（C0〜C16)をそれぞれ pTHV (図 3J)の Asc Iサイトに揷入し、 C0〜C 16を含むプラスミド（pC0〜pC16)を作製した (各種プラスミドの項を参照のこと）。 [0106] 上記各プラスミドを細胞へ導入した場合、組み込まれた部分断片に遺伝子増幅活 性があると、 MAR部位で複製と転写との間で衝突が起こり、当該プラスミドで形質転 換された形質転換細胞に HSRが生じる。その反対に、組み込まれた部分断片に遺 伝子増幅活性がないと、形質転換細胞に HSRが生じない。このことを利用することに よって、遺伝子増幅活性を有する c myc遺伝子座の IRの部分断片の同定を試み た。ここで上記の同定方法を便宜上「プラスミド安定化分析法」と称する。
[0107] 上記 pCO〜pC16、陽性対照として c— mycの IRの全長を含むプラスミド（「pCf. lj )、または陰性対照として c— mycの IRを含まな!/、プラスミド（「pTHV」 )をそれぞれ C OLO320DMに遺伝子導入し 6週間選択培地で培養することで形質転換細胞を取 得した。取得された形質転換細胞の HSR発生頻度（Frequency of HSR)を既述の方 法により調べた。
[0108] その結果を図 6に示した。図 6Aは c— myc遺伝子座（Genbank HSMYCC; accessio n number X00364)の概略図である。 c— myc遺伝子座の IRは、 c— myc遺伝子座の Hind ΙΙΙ-Xho I断片（2349bp)の相当する。図 6Bおよび Cは、 c— myc遺伝子座の I R全長と、その部分断片である C0〜C16との位置関係、並びに各部分断片が導入さ れた形質転換細胞の HSR発生頻度を示して!/、る。また図 6中の「口（白四角）」は c— myc遺伝子座の IRにおける topoisomerasell結合領域の位置を示し、「♦ (黒ひし）」 は Duplex Unwinding Element (DUE)の位置を示し、「〇（白丸）」はプラスミドの自己 複製を助けると報告されている、ヒトの 36bpのコンセンサス配列の内のコア 20bpに 相当する配列の位置をそれぞれ示している。また、「cl」は Duplex Unwinding Element (DUE)を含む遺伝子増幅活性を有する塩基配列の位置、「cll」は topoisomerasell 結合領域を含む遺伝子増幅活性を有する塩基配列の位置、「cll '」は CIIに類似した 配列の位置、「N」はネガティブ領域 (HSR形成を抑制する領域）の位置をそれぞれ 示している。
[0109] 図 6Bによれば、 pC3を遺伝子導入して得られた形質転換細胞の HSRの発生頻度 が最も高ぐまた陽性対照のそれよりも多いことが分かった。また pClを遺伝子導入し て得られた形質転換細胞の HSRの発生頻度が最も高ぐまた陽性対照のそれよりも 多!/、ことが分かった。また pC2または pC7を遺伝子導入して得られた形質転換細胞 の HSRの発生頻度は、陽性対照のそれと同等であった。また pC9または pC6を遺伝 子導入して得られた形質転換細胞について HSRの発生が観察された。
[0110] さらに、 pC3に揷入されている c— mycの IRの部分断片について、さらに部分断片 を作製し HSR発生頻度を調べた。その結果、図 6Cによれば、 topoisomerasell結合 領域と Duplex Unwinding Element (DUE)とを含む部分断片を有するプラスミド（pCl 2)が導入された形質転換細胞の HSR発生頻度が最も高かった。さらにその HSR発 生頻度は陽性対照のそれよりも多いことが分力、つた。一方、 topoisomerasell結合領域 または Duplex Unwinding Element (DUE)のいずれかが含まれていない部分断片が 導入された形質転換細胞では HSRが形成されない、または HSR発生頻度が極めて 低いといつことかわ力、つた。よって、 topoisomerasell結合領域と Duplex Unwinding Ele ment (DUE)とは、遺伝子増幅にぉレ、て必須のエレメントであると!/、うことがわかった 。まに、 topoisomerasell結合領域と Duplex Unwinding Element (DUE)と^含む l^分 断片を用いることによって、 IR全長を用いた場合に比して HSR発生頻度がさらに高 くなるという、新規知見が得られた。
〔実施例 2〕
遺伝子増幅活性を有する DHFR遺伝子座 Ori— β領域の IRの部分断片の同定を 行った。 DHFR遺伝子座 Ori— /3領域の IRを用いた以外は、実施例 1と同様にした 。すなわち、 PCRを用いて DHFR遺伝子座 Ori— /3領域の IRの部分断片（D；!〜 D1 1)を作製し、当該部分断片（D；!〜 D11)をそれぞれ pTHV (図 3J)の Asc Iサイトに 揷入し、 D；!〜 D11を含むプラスミド（pD；!〜 pDl l)を作製した（各種プラスミドの項を 参照のこと）。陽性対照として DHFR遺伝子座 Ori— /3領域の IRの全長を含むプラス ミド（「pDf. 1」）を採用し、また陰性対照として DHFR遺伝子座 Ori— /3領域の IRを 含まな!/、プラスミド（「pTHV」 )を採用した。
[0111] 本実施例の結果を図 7に示す。図 7には DHFR遺伝子座 Ori— /3領域（Genbank CFORIDHFR; accession number X94372)の概略図が示されており、 DHFR遺伝子 座 Ori— β領域の BamHI-Hind III断片（4· 6kbp)が DHFR遺伝子座 Ori— β領域 の IRに相当する。また図 7には、 DHFR遺伝子座 Ori— /3領域の IR全長とその部分 断片である D0〜D11との位置関係、並びに各部分断片が導入された形質転換細胞 の HSR発生頻度を示す。
[0112] 図 7によれば、 DHFR遺伝子座 Ori— β領域（Genbank CFORIDHFR; accession n umber X94372)の第 3142の領域を欠く部分断片を有するプラスミド（pD6および pD 7)が導入された形質転換細胞について HSRが発生しな力 た。また DHFR遺伝子 座 Ori— /3領域（Genbank CFORIDHFR; accession number X94372)の第 4885位の 領域を欠く部分断片を有するプラスミド (pD5および pDIO)が導入された形質転換 細胞について HSR発生頻度が著しく低下した。よって DHFR遺伝子座 Ori— /3領域 (Genbank CFORIDHFR; accession number X94372)の第 3142〜4885位の領域力 S HSRの発生に必須であることが分かった。上記領域には topoisomerasell結合領域（ 図 7中ロ（白四角））と Duplex Unwinding Element (DUE,図 7中♦ (黒ひし形） )とが 含まれている。したがって、実施例 1の結果と合わせて、 topoisomerasell結合領域と D uplex Unwinding Element (DUE)とを含む IRの部分断片は遺伝子増幅活性を有して いるといえる。さらに上記領域には塩基配列として、湾曲 DNA(bent DNA、図 7中 = (二重線））、 RIP60結合領域（図 7中△ (白三角））、および AT— richエレメント（ 図 7中「AT」で示す)も含まれている。 pD6または pD7を遺伝子導入して得られた形 質転換細胞の HSRの発生頻度と、 pDlを遺伝子導入して得られた形質転換細胞の HSRの発生頻度とを比べた結果から、 DHFR遺伝子座 Ori— /3領域については、 3 つのエレメント（湾曲 DNA、 RIP60結合領域、および AT— richエレメント）も HSR発 生に必須であることがわ力、つた。
〔実施例 3〕
本実施例では、実施例 1において使用した pC12 (図 8Aに示す）における SR aプ 口モーター（図 8Aにおいて「PSR a」で示す）を、 SV40初期領域由来プロモーター 領域（以下、単に「SV40プロモーター」という）に置換した pC12.Psv40 (図 8Bに示 す）を使用した。図 8Bにおいて SV40プロモーターを「Psv40」として示す。 pC12.Ps v40の作製方法は以下の通りである。
[0113] まず pC12を Eco RIおよび Xho Iで制限酵素消化することにより SR αプロモータ 一領域を切り出した。切り出した部位へ、マルチクローニングサイトを含む合成オリゴ ヌクレオチド (ESMXリンカ一）を揷入した。このマルチクローニングサイトの制限酵素 サイトはアンピシリン耐性遺伝子（AmpR)の下流 (すなわち SR aプロモーターがあつ た部位)に位置しており、制限酵素サイトが 5 '末端から 3 '末端にかけて Eco RI - Sa 1 I - Mlu I -Xho Iの順番で配列している。なお ESMXリンカ一の塩基配列を、 表 1および配列番号 1 10および配列番号 1 1 1に示した。上記のようにして作製したプ ラスミドを Sal Iおよび Mlu Iで制限酵素消化した。その後、 Sal Iおよび Mlu Iで 制限酵素消化した SV40プロモーターを、上記プラスミドに揷入し、 pC 12.Psv40を 構築した。 SV40プロモーターは、 BSRを転写する方向でプラスミドに揷入された。
[0114] なお、 SV40プロモーターは下記のようにして作製された。 pMACS4. l(Mitenyi Bi otech社製)を铸型として、 SV40プロモーター増幅用プライマー（MACS4.1 4288Lお よび MACS4.1 1454R)を用い、 PCR法により増幅した。増幅された SV40プロモータ 一は、 Sal Iおよび Mlu Iで制限酵素消化して使用した。 SV40プロモーター増幅 用プライマーである MACS4.1 4288L (配列番号 1 12)ぉょび\八じ54.1 1454R (配列番 号 1 13)の塩基配列を表 1に示す。 SV40プロモーターの塩基配列を配列番号 1 14 に示し、 SR aプロモーターの塩基配列を配列番号 1 15に示した。
[0115] [表 1]
Figure imgf000032_0001
抗 Pyrococcus kodakaraensis KOD 朱由来の DNAポリメラーゼに対する抗体を産生 するマウスハイプリドーマ細胞 (入手先：生命工学工業技術研究所、寄託番号： FER M BP— 6057)力、ら、 RNeasy Plus Mini Kit(QIAGEN社製、 74134)を用いてトータル RNAを抽出し、 Rever Tra Ace- α -(ΤΟΥΟΒΟ社製、 FSK-101)を使用して 1本鎖 cD NAを合成した。抗 KODポリメラーゼ抗体のシグナル配列を除く重鎖と軽鎖を特異的 に増幅するプライマーを用いて PCR増幅し、それぞれの増幅産物にィムノグロダリン κ鎖由来のシグナル配列を付加した後、 CMVプロモーターを有するプラスミドの Xb a I -Not Iサイトに連結して pCMV— Hと pCMV-Lとを構築した。
[0117] pCMV— Hおよび pCMV- Lを、 pC12.Psv40とともにチャイニーズノヽムスター卵巣 細胞にコトランスフエタトした。トランスフエクシヨン 2日後にブラスティサイジン（Invivog en社製、 ant-b卜 1)を 5 g/mlの濃度で添加して、 3〜4日間隔で培地を入れ替えな がら 2週間培養して、安定な形質転換体を得た。なお、比較対照実験として、 DHFR 遺伝子座 Ori— /3領域の全長 IRを有する p A BN.ARlを pC12.Psv40の替わりに用 V、た場合、および IR/MARをトランスフエクシヨンしな!/、場合も行った。
[0118] 次に、細胞培養シャーレ 60mm (SUMILON社製、 MS-11600)まで拡大培養後、段 階的にブラスティサイジン濃度を高めていき、最終濃度 320 g/mlで安定して生育 できるまで培養を続けた。上記で生育した 1 X 106個の細胞からゲノム DNAを取得し 、重鎖および軽鎖抗体遺伝子コピー数の増加を、リアルタイム定量 PCR (ABI社製、 7 900HT)を用いて確認した。測定試薬には SYBR Green Realtime PCR Master Mix(T OYOBO社製、 QPK- 201)を使用した。
[0119] 遺伝子増幅量を確認後、ブラスティサイジン 320 g/mlを添加して 4日間培養した 上清を取得し、 EIA法で抗体濃度を測定した。詳細には以下のようにした。ャギ抗マ ウス抗体を固相化した ELISAプレート (SUMILON社製、 MS-8896F)に、 10mM PBS (-)で 5倍希釈した培養上清を添加し 35°Cで 2時間インキュベートした。続いて、 PBS —Tで 3回洗浄した後、 PBS + 1 % BSA+ 10% ャギ血清で 4000倍希釈したぺ ルォキシダーゼ標識ャギ抗マウス抗体を 50 1/well添加し、 35°Cで 2時間インキュべ ートした。その後、 ELISAプレートを PBS—Tで 4回洗浄した後、完全に水分を除き、 発色試薬 50 ,1 1/well添加して室温で 15分間インキュベートした。 1N硫酸溶液 50 1/wellで反応を停止させ、プレートリーダー（主波長 450nm、副波長 620nm)で吸 光度を測定した。標準品から作成した検量線をもとに抗体濃度を算出した。
[0120] その結果を図 9および表 2に示した。図 9は各実験区における抗体生産量をそれぞ れ示す棒グラフであり、「with No IR/MAR」は IR/MARプラスミドをトランスフエクショ ンしなかった場合の結果を示し、「ρ Δ BN.AR1」は p Δ BN.AR1をコトランスフエクシ ヨンした場合の結果を示し、「pC12.Psv40」は pC12.Psv40をコトランスフエクシヨン した場合の結果を示す。また、表 2は、各実験区における抗体生産量、重鎖および軽 鎖抗体遺伝子コピー数を示す表である。表 2において「with No IR/MARJは IR/M ARプラスミドをトランスフエクシヨンしなかった場合の結果を示し、「p ABN.AR1」は p ABN.ARlをコトランスフエクシヨンした場合の結果を示し、「pC12.Psv40」は pC12 • PSV40をコトランスフエクシヨンした場合の結果を示す。
[表 2]
Figure imgf000034_0001
[0122] 図 9および表 2によれば、 pABN.ARlおよび pC12.Psv40をコトランスフエクシヨン した場合にお!/、レ、て、 IR/MARプラスミドを用いな力 た場合に比して 12倍以上の 遺伝子増幅量が確認された。 pABN.ARlを用いた場合と pC12.Psv40を用いた場 合とは遺伝子増幅量はほぼ同等であるにも関わらず、抗体生産量は pC12.Psv40 の方が高いという興味深い結果が得られた。この結果は、 pABN.ARl(8916bp)に 比して pC12.Psv40(4920bp)の方力 ベクターサイズが小さいために遺伝子導入 効率が高力、つたことによることが原因であると発明者らは推察している。
[0123] 限界希釈法を用いてクローユングした結果を、図 10および 11、並びに表 3および 4 に示す。図 10および表 3は pC12.Psv40をコトランスフエクシヨンした場合の各クロー ンについて、抗体タンパク質の生産量を示す棒グラフおよび表である。また図 11およ び表 4は pABN.ARlをコトランスフエクシヨンした場合の各クローンについて、抗体タ ンパク質の生産量を示す棒グラフおよび表である。
[0124] [表 3]
Figure imgf000035_0001
[0125] [表 4]
Figure imgf000036_0001
[0126] p A BN.ARlをコトランスフエクシヨンした場合に比して、 pC12.Psv40をコトランス フエクシヨンした場合は、高い抗体タンパク質生産能力を有するクローンを高確率で 取得すること力 Sできるとレヽうことがわ力 た。
[0127] 本発明にかかるベクター（IRZMARプラスミド）は、 IRの全長の代わりに遺伝子増 幅活性を有する IRの部分断片を含んでいるものである。よって、従来の高度遺伝子 増幅系で用いられていた IR/MARプラスミドと比べてサイズが小さい。
[0128] それゆえ、本発明にかかるベクター、およびそれを用いる本発明に力、かる方法によ れば、以下のメリットを享受できる。
(A)哺乳動物細胞への遺伝子導入効率がさらに向上する。
(B)さらにサイズの大きレ、目的遺伝子を高度遺伝子増幅系へ適用することが可能とな
(C)タグタンパク質やシグナルペプチド等のその他のエレメントをコードするポリヌクレ ォチドを、 IR/MARプラスミドに容易に組み込むことができるようになり、より複雑な ベクターを構築することも可能になる。
[0129] さらに、本発明によれば、
(D)全長の IRを用いた従来法よりも HSRの発生頻度が著しく向上する、すなわち遺 伝子の増幅効率が向上するという、当業者が予想し得る以上の効果をも得られる。
[0130] また本発明によれば、
(E)本発明を実施した場合と全長の IRを用いた場合とが同程度の遺伝子増幅量であ つたとしても、本発明を実施した場合はタンパク質の生産量が高くなるという、当業者 が予想し得る以上の効果が得られる。
[0131] したがって本発明によれば、従来の高度遺伝子増幅系に比して、種々広範な目的 遺伝子を効率良く増幅することができ、ひいては当該遺伝子がコードする目的タンパ ク質を大量に生産することが可能となる。
[0132] 発明の詳細な説明の項においてなされた具体的な実施形態または実施例は、あく までも、本発明の技術内容を明らかにするものであって、そのような具体例にのみ限 定して狭義に解釈されるべきものではなぐ本発明の精神と次に記載する請求の範 囲内にお!/、て、レ、ろ!/、ろと変更して実施することができるものである。
産業上の利用可能性
[0133] 上記説示したように、本発明にかかる方法によれば、 IRの部分断片を含む高度遺 伝子増幅系を用いて目的遺伝子の増幅を誘導することが可能となる。それゆえ、本 発明によれば、所望のタンパク質 (例えば、有用タンパク質）を大量に生産することが 可能になるという効果を奏する。
[0134] したがって、本発明はタンパク質の生産を行う産業、例えば、医薬品、化学、食品、 化粧品、繊維等種々広範な産業において利用可能である。

Claims

請求の範囲
[1] 目的遺伝子を増幅させるための方法であって、
哺乳動物複製開始領域の部分断片であって遺伝子増幅活性部位を有する増幅活 性断片、および哺乳動物核マトリックス結合領域を具備するベクターと、前記目的遺 伝子とを哺乳動物細胞に導入する工程を含む方法。
[2] 前記哺乳動物複製開始領域が、 c myc遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝 子座、および /3—グロビン遺伝子座の複製開始領域のいずれ力、 1つに由来する、請 求の範囲第 1項に記載の方法。
[3] 前記増幅活性断片力 c myc遺伝子座に由来し、 Duplex Unwinding Elementと to poisomerasell結合領域とを少なくとも含むことを特徴とする請求の範囲第 1項に記載 の方法。
[4] 前記増幅活性断片が、 c— myc遺伝子座に由来し、下記（a)のポリヌクレオチドと下 記 (b)のポリヌクレオチドとを含む、請求の範囲第 1項に記載の方法：
(a)配列番号 1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号 1に 示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された ポリヌクレオチド；
(b)配列番号 2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号 2に 示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された ポリヌクレオチド。
[5] 前記増幅活性断片が、配列番号 3に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、ま たは配列番号 3に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、 若しくは付加されたポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求の範囲第 3項に記載 の方法。
[6] 前記増幅活性断片が、配列番号 4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、ま たは配列番号 4に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、 若しくは付加されたポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求の範囲第 3項に記載 の方法。
[7] 前記増幅活性断片が、配列番号 5に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、ま たは配列番号 5に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、 若しくは付加されたポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求の範囲第 3項に記載 の方法。
[8] 前記増幅活性断片が、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座に由来し、配列番号 10に 示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号 10に示される塩基配列 において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチドを 含むことを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の方法。
[9] 前記増幅活性断片が、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座に由来し、配列番号 1 1に 示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号 1 1に示される塩基配列 において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチドを 含むことを特徴とする請求の範囲第 1項に記載の方法。
[10] 前記哺乳動物核マトリックス結合領域が、 Ig κ遺伝子座、 SV40初期領域、および ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれ力、 1つに由来す る、請求の範囲第 1項ないし第 9項のいずれ力、 1項に記載の方法。
[1 1] 前記目的遺伝子と、前記ベクターとをトランスに配置して、哺乳動物細胞に導入す ることを特徴とする請求の範囲第 1項ないし第 10項のいずれか 1項に記載の方法。
[12] 目的遺伝子を哺乳動物細胞内で増幅させるためのベクターであって、
哺乳動物複製開始領域の部分断片であって遺伝子増幅活性部位を有する増幅活 性断片、および哺乳動物核マトリックス結合領域を具備するベクター。
[13] 前記哺乳動物複製開始領域が、 c myc遺伝子座、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝 子座、および /3—グロビン遺伝子座の複製開始領域のいずれ力、 1つに由来する、請 求の範囲第 12項に記載のベクター。
[14] 前記増幅活性断片力 c myc遺伝子座に由来し、 Duplex Unwinding Elementと to poisomerasell結合領域とを少なくとも含むことを特徴とする請求の範囲第 12項に記 載のベクター。
[15] 前記増幅活性断片が、 c— myc遺伝子座に由来し、下記（a)のポリヌクレオチドと下 記 (b)のポリヌクレオチドとを含む、請求の範囲第 12項に記載のベクター：
(a)配列番号 1に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号 1に 示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された ポリヌクレオチド；
(b)配列番号 2に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号 2に 示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加された ポリヌクレオチド。
[16] 前記増幅活性断片が、配列番号 3に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、ま たは配列番号 3に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、 若しくは付加されたポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求の範囲第 12項に記 載のベクター。
[17] 前記増幅活性断片が、配列番号 4に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、ま たは配列番号 4に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、 若しくは付加されたポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求の範囲第 12項に記 載のベクター。
[18] 前記増幅活性断片が、配列番号 5に示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、ま たは配列番号 5に示される塩基配列において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、 若しくは付加されたポリヌクレオチドを含むことを特徴とする請求の範囲第 12項に記 載のベクター。
[19] 前記増幅活性断片が、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座に由来し、配列番号 10に 示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号 10に示される塩基配列 において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチドを 含むことを特徴とする請求の範囲第 12項に記載のベクター。
[20] 前記増幅活性断片が、ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座に由来し、配列番号 11に 示される塩基配列からなるポリヌクレオチド、または配列番号 11に示される塩基配列 において 1若しくは数個の塩基が欠失、置換、若しくは付加されたポリヌクレオチドを 含むことを特徴とする請求の範囲第 12項に記載のベクター。
[21] 前記哺乳動物核マトリックス結合領域が、 Ig κ遺伝子座、 SV40初期領域、および ジヒドロ葉酸リダクターゼ遺伝子座の核マトリックス結合領域のいずれ力、 1つに由来す る、請求の範囲第 12項ないし第 20項のいずれ力、 1項に記載のベクター。 [22] 請求の範囲第 12項ないし第 21項のいずれ力、 1項に記載のベクターと、 目的遺伝 子とが哺乳動物細胞に導入されてなる形質転換細胞。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5688771B2 (ja) * 2009-03-27 2015-03-25 国立大学法人広島大学 哺乳動物細胞内で目的遺伝子を増幅し高発現させる方法、および当該方法を実施するために用いられるキット

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003245083A (ja) 2002-02-25 2003-09-02 Univ Hiroshima 哺乳動物細胞内で目的遺伝子を高度に増幅させるためのベクターおよび方法
JP2006055175A (ja) * 2005-10-27 2006-03-02 Hiroshima Univ 哺乳動物細胞内で目的遺伝子を高度に増幅させるための方法、および該方法を実施するために用いるベクター

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1427850A4 (en) * 2001-08-16 2006-02-08 Phase 1 Molecular Toxicology I TOXICOLOGICAL RELEVANT HUMAN GENES AND ARRAYS
US20110144128A1 (en) * 2005-01-10 2011-06-16 Exelixis, Inc. Heterocyclic Carboxamide Compounds as Steroid Nuclear Receptors Ligands

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2003245083A (ja) 2002-02-25 2003-09-02 Univ Hiroshima 哺乳動物細胞内で目的遺伝子を高度に増幅させるためのベクターおよび方法
JP2006055175A (ja) * 2005-10-27 2006-03-02 Hiroshima Univ 哺乳動物細胞内で目的遺伝子を高度に増幅させるための方法、および該方法を実施するために用いるベクター

Non-Patent Citations (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ALADJEM, M. ET AL., SCIENCE, vol. 281, 1998, pages 1005 - 1009
DIJKWEL, P.A. ET AL., MOL. CELL. BIOL., vol. 8, 1988, pages 5398 - 5409
JENKE, A. C. ET AL., PROC. NATL. ACAD. SCI. USA, vol. 101, 2004, pages 11322 - 11327
MCWHINNEY, C. ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 18, 1990, pages 1233 - 1242
MCWHINNEY, C. ET AL., NUCLEIC ACIDS RES., vol. 18, 1990, pages L233 - 1242
N. SHIMIZU ET AL., CANCER RESEARCH, vol. 61, 2001, pages 6987 - 6990
NORIAKI SHIMIZU ET AL.: "Plasmids with a Mammalian Replication Origin and a Matrix Attachment Region Initiate the Event Similar to Gene Amplification", CANCER RESEARCH, vol. 61, no. 19, 2001, pages 6987 - 6990, XP003021239
POMMIER, Y. ET AL., J. VIROL., vol. 64, 1990, pages 419 - 423
SCHAARSCHMIDT, D. ET AL., EMBO J., vol. 23, no. 1, 2004, pages 191 - 201
See also references of EP2058391A4 *
SHIMIZU N. ET AL., CANCER RES., vol. 61, pages 6987 - 6990
SHIMIZU N. ET AL.: "Plasmids with a mammalian replication origin and a matrix attachment region initiate the event silimar to gene amplification", CANCER RES., vol. 61, 1 October 2001 (2001-10-01), pages 6987 - 6990, XP003021239 *
SHIMIZU, N.; KANDA, T.; WAHL, G. M.: "Selective capture of acentricfragments by micronuclei provides a rapid method for purifying extrachromosomally amplified DNA", NAT. GENET., vol. 12, 1996, pages 65 - 71, XP002917533, DOI: doi:10.1038/ng0196-65
TSUTSUI, K. ET AL., J. BIOL. CHEM., vol. 268, 1993, pages 12886 - 12894

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP5688771B2 (ja) * 2009-03-27 2015-03-25 国立大学法人広島大学 哺乳動物細胞内で目的遺伝子を増幅し高発現させる方法、および当該方法を実施するために用いられるキット

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