KR20090039820A - 포유동물세포 내에서 목적 유전자를 고도로 증폭시키기 위한 방법 및 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명의 벡터는 목적 유전자를 포유동물세포 내에서 증폭시키기 위한 벡터로서, 포유동물 복제개시영역의 부분 단편이면서 유전자 증폭 활성부위를 갖는 증폭활성단편, 및 포유동물 핵 매트릭스 결합영역을 구비한다. 예를 들면, 상기 포유동물 복제개시영역이 c-myc 유전자좌 유래인 경우에는 상기 부분 단편은 적어도 듀플렉스 언와인딩 요소(Duplex Unwinding Element)와 토포아이소머라제Ⅱ 결합영역을 포함한다. 본 발명에 따르면, 종래의 고도 유전자 증폭시스템에 비해 유전자 도입효율 및 유전자 증폭효율을 향상시킬 수 있다. 본 발명은 고도 유전자 증폭시스템을 이용하여 목적 유전자를 증폭할 때에, 유전자 도입효율 및 유전자 증폭효율을 향상시킬 수 있는 방법, 및 그 방법을 실시하기 위한 벡터를 제공한다.

목적 유전자, 벡터, 복제개시영역, c-myc 유전자좌

Description

포유동물세포 내에서 목적 유전자를 고도로 증폭시키기 위한 방법 및 벡터{METHOD FOR HIGHLY AMPLIFYING TARGET GENE IN MAMMALIAN CELL AND VECTOR THEREFOR}

본 발명은 포유동물 세포 내에서 목적 유전자를 고도로 증폭시키는 방법, 및 그 방법을 실시하기 위해 사용하는 벡터에 관한 것이다. 보다 상세하게는 본 발명자들이 개발한 "고도 유전자 증폭시스템"를 이용하여 원하는 유전자를 증폭할 때에, 유전자 도입효율 및 유전자 증폭효율을 향상시킬 수 있는 방법, 및 그 방법을 실시하기 위한 벡터에 관한 것이다.

본 발명자는 포유동물의 복제개시영역(IR; Initiation Region)과 핵 매트릭스 결합영역(MAR; Matrix Attachment Region)을 갖는 플라스미드(이하, 'IR/MAR 플라스미드'라 한다)를 인간 유래 암세포(COLO 320 대장암 세포주, 및 HeLa 세포주)에 리포펙션법으로 도입하고, 플라스미드 상에 존재하는 약제내성유전자(블라스티시딘(Blasticidine) 혹은 네오마이신(Neomycine))를 이용하여 선택하는 것만으로,

(1) 발현시킬 단백질을 코딩하는 유전자(이하, 적당히 '목적 유전자'라 한 다)의 세포 내 카피(copy)수를 1만 카피 정도까지 증폭할 수 있으며, 또한

(2) 목적 유전자는 IR/MAR 플라스미드에 대해 동일한 유전자 구축물(시스)로서 도입한 경우이든, 다른 유전자 구축물(트랜스)로서 도입한 경우이든 고도로 증폭할 수 있다는 사실을 발견하였다(특허문헌 1 및 비특허문헌 1 참조). 그리고, 본 발명자는 이와 같은 발견에 기초하여, IR/MAR 플라스미드와 목적 유전자를 포유동물세포(예를 들면, 인간 유래 암세포(COLO 320, 대장암 세포주, 및 HeLa 세포주), CHO 세포 등)에 리포펙션법으로 도입하고, 플라스미드 상에 존재하는 약제내성유전자(블라스티시딘 혹은 네오마이신)를 이용하여 선택하는 것만으로, 목적 유전자를 1만 카피 정도로 증폭할 수 있는 시스템(이하, '고도 유전자 증폭시스템'이라 한다)을 완성하기에 이르렀다.

여기서, DM과 HSR이 IR/MAR 플라스미드('IR/MAR 벡터' 라고도 한다)에 의해 발생하는 메카니즘을 도 1에 나타내었다. IR/MAR 플라스미드는 숙주세포 내에서 직렬로 반복연결됨으로써 다량체화된다(단계 1). 이 다량체는 세포가 성장하고 있는 동안에는 숙주세포 내에서 안정적으로 존재하며 자기복제를 한다. 상기 다량체가 그대로 커지거나, 혹은 숙주세포 내에 원래부터 존재하는 DM에 도입됨으로써 DM이 발생한다. 또한, 단계 2와 같이 다량체의 환형 DNA는 숙주세포 내에서 DNA 이중쇄가 절단되어(DSB; double strand breakage) 직쇄형 DNA가 된다. 그러면, 이 직쇄형 DNA는 염색체에 삽입되며, 단계 3과 같은 BFB(Breakage-Fusion-Bridge) 사이클이 개시되어 HSR가 발생한다.

[특허문헌 1]

일본공개특허공보 "특허공개 2003-245083호 공보"(공개일: 2003년 9월 2일)

[비특허문헌 1]

Noriaki Shimizu, et al.(2001) Plasmids with a Mammalian Replication Origin and a Matrix Attachment Region Initiate the Event Similar to Gene Amplificantion. Cancer Research vol.61, no.19, p6987-6990.

특허문헌 1에 기재되어 있는 고도 유전자 증폭시스템에서 이용하고 있는 MAR은 수백 bp의 폴리뉴클레오티드이지만, IR은 수kbp에 달한다. 예를 들어 c-myc 유전자좌 유래의 IR은 2.4kbp이며, 디하이드로폴레이트 환원효소(이하, 적당히 'DHFR'이라 한다) 유전자좌 유래의 IR은 4.6kbp이다. 따라서, IR/MAR 플라스미드는 비교적 커다란 크기의 유전자 구축물이라 할 수 있다.

고도 유전자 증폭시스템을 이용하여 목적 유전자를 증폭할 경우, IR/MAR 플라스미드와 목적 유전자를 포유동물세포로 도입하는데, 이 때, IR/MAR 플라스미드의 사이즈가 작아지면, 이하의 이점을 얻을 수 있을 것으로 생각된다.

(A) 포유동물세포로의 유전자 도입효율이 더욱 향상된다.

(B) 사이즈가 큰 목적 유전자를 고도 유전자 증폭시스템으로 적용하는 것이 가능하게 된다.

(C) 태그 단백질이나 시그널 펩티드 등의 기타 요소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 IR/MAR 플라스미드에 용이하게 도입할 수 있게 되어, 보다 복잡한 벡터를 구축하는 것도 가능하게 된다.

따라서, 본 발명은 고도 유전자 증폭시스템의 더 나은 개량을 목적으로 하였다. 보다 구체적으로, 본 발명은 상기 (A)∼(C)의 이점을 얻을 있는 벡터의 개발, 및 상기 벡터를 이용한 목적 유전자의 증폭방법을 제공하는 것을 목적으로 하였다.

본 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위해 IR/MAR 플라스미드의 IR에 주목하여 예의 검토를 한 결과, 목적 유전자를 고도로 증폭시킬 수 있는 IR의 부분 단편을 발견하여, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

놀랍게도, 상기 IR의 부분 단편을 고도 유전자 증폭시스템에 적용하여 목적 유전자를 증폭시키면, 전장(全長)의 IR을 이용한 경우보다도 HSR의 발생 빈도가 현저하게 향상된다는, 당업자가 예상할 수 있는 이상의 효과를 얻을 수 있었다. 또한, 상기 IR의 부분 단편을 고도 유전자 증폭시스템에 적용하여 목적 유전자를 증폭시킨 경우에는 전장의 IR을 이용한 경우와 같은 정도의 유전자 증폭량이었다 할지라도, 단백질의 생산량이 높아진다는, 당업자가 예상할 수 있는 이상의 효과를 얻을 수 있었다.

본 발명은 상기 과제를 해결하기 위해 이하의 발명을 포함한다.

본 발명에 따른 방법은 목적 유전자를 증폭시키기 위한 방법으로서, 포유동물 복제개시영역의 부분 단편이면서 유전자 증폭 활성부위를 갖는 증폭활성단편과 포유동물 핵 매트릭스 결합영역을 구비하는 벡터, 및 상기 목적 유전자를 포유동물세포에 도입하는 공정을 포함하는 방법이다.

본 발명에 따른 방법은 상기 포유동물 복제개시영역이 c-myc 유전자좌, 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자좌, 및 β-글로빈 유전자좌의 복제개시영역 중 어느 하나에서 유래한 것일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 상기 증폭활성단편이 c-myc 유전자좌에서 유래하며 듀플렉스 언와인딩 요소(Duplex Unwinding Element)와 토포아이소머라제Ⅱ 결합영역을 적어도 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 상기 증폭활성단편이 c-myc 유전자좌에서 유래하며 하기 (a)의 폴리뉴클레오티드와 하기 (b)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 청구항 1에 기재된 방법일 수 있다 :

(a) 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드;

(b) 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드.

또한, 본 발명에 따른 방법은 상기 증폭활성단편이, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 상기 증폭활성단편이, 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 상기 증폭활성단편이, 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 5로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 상기 증폭활성단편이, 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자좌에서 유래하며, 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 10으로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 상기 증폭활성단편이, 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자좌에서 유래하며, 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 염기서열 11로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 상기 포유동물 핵 매트릭스 결합영역이 Igκ 유전자좌, SV40 초기영역, 및 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자좌의 핵 매트릭스 결합영역 중 어느 하나에서 유래하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법은 상기 목적 유전자와 상기 벡터를 트랜스에 배치하여 포유동물세포에 도입하는 것을 특징으로 하는 방법일 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 벡터는 목적 유전자를 포유동물세포 내에서 증폭시키기 위한 벡터로서, 포유동물 복제개시영역의 부분 단편이면서 유전자 증폭 활성부위를 갖는 증폭활성단편, 포유동물 핵 매트릭스 결합영역, 및 형질전환세포를 선택하기 위한 유전자를 구비하는 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하고 있다.

또한, 본 발명에 따른 벡터는 상기 포유동물 복제개시영역이 c-myc 유전자좌, 디하이드로폴레이트 환원효소, 및 β-글로빈 유전자좌의 복제개시영역 중 어느 하나에서 유래하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 벡터는 상기 증폭활성단편이 c-myc 유전자좌에서 유래하며 듀플렉스 언와인딩 요소(Duplex Unwinding Element)와 토포아이소머라제 II 결합영역을 적어도 포함하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 벡터는 상기 증폭활성단편이 c-myc 유전자좌에서 유래하며 하기 (a)의 폴리뉴클레오티드와 하기 (b)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터일 수 있다 :

(a) 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드;

(b) 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드.

또한, 본 발명에 따른 벡터는 상기 증폭활성단편이, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 벡터는 상기 증폭활성단편이, 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 벡터는 상기 증폭활성단편이, 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 5로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 벡터는 상기 증폭활성단편이, 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자좌에서 유래하며, 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 10으로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 벡터는 상기 증폭활성단편이, 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자좌에서 유래하며, 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 11로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 벡터는 상기 포유동물 핵 매트릭스 결합영역이 Igκ 유전자좌, SV40 초기영역, 및 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자좌의 핵 매트릭스 결합영역 중 어느 하나에서 유래하는 것일 수 있다.

또한, 상기 증폭활성단편은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 10 및 11로 표시되는 염기서열로 특정되는 폴리뉴클레오티드에 한정되는 것이 아니며, 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 10, 및 11로 표시되는 염기서열과 상보적인 염기서열로 이루어진 것일 수 있다. 또한, 상기 증폭활성단편은 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 10 및 11로 표시되는 염기서열로 특정되는 폴리뉴클레오티드, 및 서열번호 1, 2, 3, 4, 5, 10 및 11로 표시되는 염기서열의 상보적인 염기서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 중 어느 하나와 엄격한(stringent) 조건 하에서 하이브리다이제이션하는 폴리뉴클레오티드도 포함된다. 또한, 상기 '엄격한 조건'이란, 적어도 90%이상의 동일성, 바람직하게는 적어도 95% 이상의 동일성, 가장 바람직하게는 97%의 동일성이 서열 간에 존재할 때에만 하이브리다이제이션이 일어나는 것을 의미한다.

한편, 본 발명에 따른 형질전환체는 상기 본 발명에 따른 벡터, 및 목적 유전자가 포유동물세포에 도입되어 된 것이다.

본 발명의 다른 목적, 특징, 및 우수한 점은 이하에 나타낸 기재에 의해 충분히 알 수 있을 것이다. 또한, 본 발명의 이점은 첨부도면을 참조한 다음 설명에 의해 명백해질 것이다.

이하, 본 발명에 대해 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위는 이들 설명에 구속되지 않으며, 이하의 예시 이외에 대해서도 본 발명의 취지를 손상시키지 않는 범위에서 적절히 변경하여 실시할 수 있다. 또한, 본 명세서 중에 기재된 공지의 문헌 모두가 본 명세서 중에서 참고로서 원용된다.

<1. 본 발명의 유전자 증폭방법>

본 발명의 일 실시형태는 목적 유전자를 증폭시키기 위한 방법에 관한 것이다. 상기 방법을 '본 발명의 유전자 증폭방법'이라 한다.

여기에서, 본 발명의 유전자 증폭방법은,

포유동물 복제개시영역의 부분 단편이면서 유전자 증폭활성부위를 갖는 증폭활성단편과 포유동물 핵 매트릭스 결합영역을 구비하는 벡터, 및 상기 목적 유전자를 포유동물세포에 도입하는 공정(이하, '도입공정'이라 한다)을 포함하는 방법이다.

여기에서, '목적 유전자'란 발현시킬 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 상기 목적 유전자는 특별히 한정되는 것은 아니며, 원하는 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 적절히 선택하여 채용하면 된다. 목적 유전자인 폴리뉴클레오티드는 그 염기서열정보를 기초로 PCR 등의 공지 기술을 이용하여 수득할 수 있다.

본 발명의 유전자 증폭방법을 실시함으로써 목적 유전자가 염색체 외의 이중미소염색체(double minute chromosome, 이하, 'DM'이라 한다) 위 및/또는 염색체의 균일 염색 영역(Homogeneously staining regeon ; 이하, 'HSR'이라 한다)에서 증폭된다. 즉, 형질전환세포의 클론에 대해 목적 유전자가 DM 위 및/또는 HSR에서 검출되는, 즉 증폭구조가 형성되어 있다면, 목적 유전자가 증폭되어 있다고 판단할 수 있다. 형질전환세포의 클론에서 상기 증폭구조가 형성되었는지 여부를 검출하는 방법은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 분열기의 염색체에 대해 공지의 FISH법(fluorescence in situ hybridization)을 실시하여, 포유동물세포로 도입한 유전자를 검출함으로써 판단할 수 있다. 상기 판단은 당업자라면 용이하게 할 수 있다. 또한, FISH법을 실시할 때의 구체적인 방법은 특별히 한정되지 아니하며, 종래의 공지 방법을 적절히 선택하여 채용하면 된다.

또한, 본 발명의 유전자 증폭방법에 따르면, 종래의 고도 유전자 증폭시스템에 비해 목적 유전자의 증폭효율이 향상된다는, 당업자가 예상할 수 있는 이상의 효과도 얻을 수 있다(실시예 참조). 목적 유전자의 증폭효율이 증가했는지 여부에 대해서는 종래의 고도 유전자 증폭시스템을 실시한 경우의 유전자 증폭구조 발생빈도(예를 들면 HSR 발생빈도, DM 발생빈도)와, 본 발명의 유전자 증폭방법을 실시한 경우의 유전자 증폭구조 발생빈도를 비교함으로써 판단할 수 있다. 그리고, 후자의 유전자 증폭구조 발생빈도가 전자에 비해 높으면, 후자, 즉 본 발명의 유전자 증폭방법에 따르면, 종래의 고도 유전자 증폭시스템에 비해 목적 유전자의 증폭효율이 향상됨을 확인할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 방법에는 상기 도입공정 외에,

목적 유전자와 벡터가 도입된 포유동물세포를 분리하는 공정(이하, '선발공정'이라 한다)이나, 상기 선발공정에 의해 선발된 포유동물세포(즉, 형질전환세포)를 배양하는 배양공정(이하, '배양공정'이라 한다)이 포함되어 있을 수 있다. 또한, 상기 배양공정에 의해 생산된 목적 단백질을 정제하는 방법(이하, '정제공정'이라 한다)이 포함되어 있을 수 있다. 이하, 본 발명에 따른 방법을 공정별로 설명한다.

[1-1. 도입공정]

본 발명에 따른 방법에서의 도입공정은

(ⅰ) 포유동물 복제개시영역의 부분 단편이면서 유전자증폭활성부위를 갖는 증폭활성단편, 포유동물 핵 매트릭스 결합영역 및 형질전환세포를 선택하기 위한 유전자를 구비하는 벡터와, 상기 목적 유전자를 포유동물세포에 도입하는 공정이다.

상기 벡터(이하, 'IR/MAR 플라스미드'라 한다)에 포함되는 포유동물 복제개시영역 및 포유동물 핵 매트릭스 결합영역은 포유동물을 비롯한 진핵생물세포 내에서 기능하는 복제개시영역 및 핵 매트릭스 결합영역이면 특별히 한정되는 것은 아니다. 상기 포유동물 복제개시영역으로서는 예를 들면 c-myc 유전자좌 유래, 디하이드로폴레이트 환원효소(DHFR) 유전자좌 유래, β-글로빈 유전자좌 유래 등의 복제개시영역을 들 수 있다. c-myc 유전자좌 유래의 복제개시영역(이하, 'c-myc 유전자좌 유래의 복제개시영역'라 한다)에 대해서는 "McWhinney, C. et al., Nucleic Acids Res. vol. 18, p1233-1242(1990)"을 참조할 것. 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자좌의 복제개시영역에 대해서는 "Dijkwel, P.A. et al., Mol. Cell. Biol. vol.8, p5398-5409(1988)"을 참조. β-글로빈 유전자좌의 복제개시영역에 대해서는 "Aladjem, M. et al., Science vol. 281, p1005-1009(1998)"을 참조.

또한, 상기 포유동물 핵 매트릭스 결합영역으로서는 예를 들어 Igκ 유전자좌, SV40 초기영역, 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자좌 등의 핵 매트릭스 결합영역에서 유래하는 폴리뉴클레오티드를 들 수 있다. Igκ 유전자좌의 핵 매트릭스 결합영역에 대해서는 "Tsutsui, K. et al., J. Biol. Chem. vol. 268, p12886-12894(1993)"을 참조. SV40 초기영역의 핵 매트릭스 결합영역에 대해서는 "Pommier, Y. et al., J. Virol., vol 64, p419-423(1990)"을 참조. 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자좌의 핵 매트릭스 결합영역에 대해서는 "Shimizu N. et al., Cancer Res. vol. 61, p6987-6990"을 참조.

또한, 본 명세서에서 특별히 언급하지 않는 경우에는 포유동물 복제개시영역을 'IR'로 표기하고, 포유동물 핵 매트릭스 결합영역을 'MAR'로 표기한다. 또한, 전장의 IR 및 MAR뿐만 아니라, 이들 부분 단편에 의해 구성되어 있는 벡터도 'IR/MAR 플라스미드'라 칭한다.

본 발명의 유전자증폭방법에서는 IR/MAR 플라스미드의 사이즈를 작게 하기 위해, 포유동물 복제개시영역(IR)의 부분 단편이면서 유전자 증폭활성부위를 갖는 증폭활성단편을 이용하는 것을 특징으로 하고 있다. 여기에서 '포유동물 복제개시영역(IR)의 부분 단편'이란 전장 IR을 제외한 IR의 일부분인 것을 의미한다. IR의 부분 단편의 길이는 특별히 한정되는 것은 아니지만, 약 2.4kbp의 c-myc 유전자좌 유래 IR인 경우에는 부분 단편의 길이는 0.5kbp 이상 2.0kbp 이하인 것이 바람직하고, 0.5kbp 이상 1.5kbp 이하인 것이 더욱 바람직하며, 0.5kbp 이상 1.3kbp 이하인 것이 가장 바람직하다. 또한, 약 4.6kbp의 DHFR 유전자좌 유래 IR인 경우에는 부분 단편의 길이는 1.7kbp 이상 3.5kbp 이하인 것이 바람직하며, 1.7kbp 이상 3.1kbp 이하인 것이 더욱 바람직하다. 상기 바람직한 범위를 만족할 경우에는 상기 (A)∼(D)의 효과를 얻기 쉽다.

여기에서 '유전자 증폭 활성부위'란 고도 유전자 증폭시스템에서 유전자 증폭이 일어나기 위해 필수적인 요소를 의미한다. 예를 들어, 어떤 IR의 부분 단편이 상기 유전자 증폭 활성부위를 가지고 있는지 여부는 예를 들어 해당 부분 단편과 MAR를 이용하여 IR/MAR 플라스미드를 조제하고, 이 IR/MAR 플라스미드와 목적 유전자를 포유동물세포로 도입했을 때에 유전자 증폭형태(HSR, MD)의 발생빈도를 검토함으로써 판단할 수 있다. 즉, 상기 검토에서 유전자 증폭형태(HSR, DM)의 발생빈도가 전장 IR을 이용한 경우에 비해 현저하게 저하되거나, 또는 유전자 증폭형태(HSR, DM)가 발생하지 않게 되면, 그 검토에 이용한 IR의 부분 단편에는 유전자 증폭 활성부위가 포함되어 있지 않다고 판단할 수 있다.

또한, IR의 결실 변이체(deletion mutant)를 조제하여, 상기 검토를 수행함으로써 유전자 증폭 활성부위를 동정할 수 있다. 결실 변이체는 IR의 서열정보로부터 PCR법이나 제한효소소화에 의해 조제하는 것이 가능하다.

본 발명자들의 검토에 따르면, c-myc 유전자좌 유래 IR의 경우, 서열번호 4, 5, 6, 7, 8 및 9로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 유전자 증폭 활성부위를 가지고 있는 것이 밝혀졌다.

또한, 상기의 결과를 기초로 본 발명자들이 검토하였더니, 특히 듀플렉스 언와인딩 요소(Duplex Unwinding Element, 이하 'DUE'로 표기한다) 및 토포아이소머라제Ⅱ 결합영역이 유전자증폭 활성부위에 해당함을 알 수 있었다. 따라서, IR/MAR 플라스미드의 전장 IR 대신에 DUE 및 토포아이소머라제Ⅱ 결합영역을 적어도 포함하는 IR의 부분 단편을 사용함으로써, 목적 유전자를 고도로 증폭할 수 있다. 또한, 상기 IR의 부분 단편은 c-myc 유전자좌 유래의 DUE 및 토포아이소머라제Ⅱ 결합영역만으로 이루어진 것일 수 있고, 또한 DUE 및 토포아이소머라제Ⅱ 결합영역이 복수 연결된 것일 수도 있으며, 또한 c-myc 유전자좌 유래 IR의 DUE 및 토포아이소머라제Ⅱ 결합영역을 포함하는 부분 단편일 수도 있다.

c-myc 유전자좌 유래 IR의 염기서열은 예를 들어 Genbank HSMYCC(accession number X00364)의 제1∼2349위에 해당하는 것을 들 수 있다. 그 중 DUE를 포함하는 IR의 부분 단편의 바람직한 실시형태로서는 Genbank HSMYCC(accession number X00364)의 제189∼473위에 해당하는 폴리뉴클레오티드를 예로 들 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 서열번호 1로 표시하였다. 단, 서열번호 1로 표시되는 것만이, DUE를 포함하는 IR의 부분 단편의 바람직한 실시형태에 해당하는 것은 아니며, 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드, 즉 변이 폴리뉴클레오티드도 DUE을 포함하는 IR의 부분 단편의 바람직한 실시형태에 해당한다는 것을 당업자는 쉽게 이해한다. 또한, 상기 변이 폴리뉴클레오티드를 이용하여 IR/MAR 플라스미드를 구축한 경우에 목적 유전자를 증폭시키는 활성을 갖는 것은 말할 필요도 없다.

또한, 서열번호 1로 표시되어 있는 염기서열은 쿼리(query)로서 BLASTN 2.2.1 등의 상동 검색 프로그램을 이용하여, GenBank나 EMBL, DDBJ 등의 데이터 베이스에 대해 상동 검색을 실시함으로써 얻어진 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를, DUE를 포함하는 IR의 부분 단편으로서 이용가능하다. 상기 변이 폴리뉴클레오티드 또는 상동 검색으로 얻어진 폴리뉴클레오티드와, 염기서열 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드와의 상동성은 80% 이상이 바람직하고, 약 90% 이상이 더욱 바람직하며, 약 95% 이상이 가장 바람직하다.

또한 Genbank HSMYCC(accession number X00364)의 제1∼2349위에 표시되어 있는 c-myc 유전자좌 유래 IR 중, 토포아이소머라제Ⅱ 결합영역을 포함하는 IR의 부분 단편의 바람직한 실시형태로서는 Genbank HSMYCC(accessiion number X00364)의 제745∼987위에 해당하는 폴리뉴클레오티드를 예로 들 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 서열번호 2로 표시하였다. 단, 서열번호 2로 표시되는 것만이 토포아이소머라제Ⅱ 결합영역을 포함하는 IR의 부분 단편의 바람직한 실시형태에 해당하는 것은 아니며, 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드, 즉 변이 폴리뉴클레오티드도 토포아이소머라제Ⅱ 결합영역을 포함하는 IR의 부분 단편의 바람직한 실시형태에 해당한다는 것을 당업자는 용이하게 이해한다. 또한, 변이 폴리뉴클레오티드에 대해서는 상술한 바이다.

또한, DUE 및 토포아이소머라제Ⅱ 결합영역을 적어도 포함하는 IR의 부분 단편의 바람직한 실시형태로서는 Genbank HSMYCC(accessiion number X00364)의 제189∼987위에 해당하는 폴리뉴클레오티드를 예로 들 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 염기서열을 서열번호 3으로 표시하였다. 단, 서열번호 3으로 표시되는 것만이, DUE 및 토포아이소머라제Ⅱ 결합영역을 적어도 포함하는 IR의 부분 단편의 바람직한 실시형태에 해당하는 것은 아니며, 서열번호 3으로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드, 즉 변이 폴리뉴클레오티드도 부분 단편의 바람직한 실시형태에 해당한다는 것을 당업자는 용이하게 이해할 것이다. 또한, 변이 폴리뉴클레오티드는 상술한 바와 같다.

또한, DHFR 유래 IR의 경우, 서열번호 11, 12, 13, 14, 15 및 16으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드가 증폭 활성부위에 해당하는 것을 본 발명자들은 확인하였다. 그리고, 이들 결과로부터 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 적어도 포함하는 폴리뉴클레오티드를 IR/MAR 플라스미드의 전장 IR 대신에 사용함으로써, 목적 유전자를 증폭할 수 있음을 발견하였다. 단, 서열번호 10 대신에, 서열번호 10으로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드, 즉 변이 폴리뉴클레오티드도 본 발명에 따른 유전자 증폭방법에서 이용가능하다는 것을 당업자는 용이하게 이해한다. 또한, 상기 폴리뉴클레오티드는 상술한 바와 같다.

서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 10으로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드를 포함하는, DHFR 유래의 증폭활성단편으로는 서열번호 11, 12, 13, 14, 15 및 16으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 및 상기 폴리뉴클레오티드의 변이 폴리뉴클레오티드를 예로 들 수 있다. 이러한 증폭활성단편에는 c-myc 유전자좌 유래의 것과 마찬가지로, DUE 및 토포아이소머라제Ⅱ 결합영역이 포함된다. 또한, DHFR 유래 IR의 증폭활성단편에는 만곡 DNA, RIP60 결합영역 및 AT-rich 요소가 추가로 포함된다.

특히, 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드를 IR/MAR 플라스미드의 전장 IR 대신에 사용함으로써, 전장 IR을 사용한 경우에 비해 목적 유전자의 증폭효율이 향상되는 놀랄만한 결과가 얻어졌다.

또한, DHFR 유래 IR의 염기서열로서는 Genbank CFORIDHFR(accession number X94372)의 제1532∼6166위로 표시되는 염기서열을 일 예로서 들 수 있다.

본 발명에 따른 유전자 증폭방법의 도입공정에서 사용하는 IR/MAR 플라스미드는 이미 기술한 증폭활성단편 및 MAR이 구비되어 있으면 되는데, 해당 IR/MAR에는 대장균 내에서 클로닝을 수행하기 위해 필요한 서열, 선택 마커(마커 단백질)로서의 약재내성유전자(블라스티사이딘 저항성 유전자, 네오마이신 저항성 유전자, 하이그로마이신 저항성 유전자 등) 또는 녹색 형광 단백질 유전자 등이 포함될 수 있다. 이들 선택 마커를 지표로 함으로써, IR/MAR 플라스미드가 도입된 포유동물세포를 선별할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 유전자 증폭방법의 도입공정에서 도입되는 목적 유전자는 프로모터에 제어가능하게 연결되어 있는 것이 바람직하다. 상기 프로모터는 도입되는 포유동물세포에서 기능하는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니며, 전사인자 등으로 인한 소정의 조작에 의해, 프로모터의 전사 활성이 활성화 또는 불활성화되는 프로모터(본 명세서에서는 '전사활성조절형 프로모터'라 한다)이거나, 항상 전사활성이 활성화되어 있는 항상형 프로모터일 수도 있다. "전사활성조절형 프로모터"는 상기 특성을 갖는 것이면 특별히 한정되는 것은 아니며, 예를 들어 TRE 프로모터(클론텍사제), T-REX 프로모터(인비트로젠사제) 등의 시판품이 본 발명에 따른 방법에서 이용가능하다. 항상형 프로모터로서는 CMV 프로모터, SV40 초기영역 유래 프로모터(SV40 프로모터), SRalpha 프로모터(SRα프로모터), LTR 프로모터, MMTV 프로모터 등이 이용가능하다.

본 발명에 따른 유전자 증폭방법의 도입 공정에 있어서, IR/MAR 플라스미드와 목적 유전자를 포유동물세포로 동시에 도입한다. 이와 같이 함으로써, 목적 유전자가 포유동물세포에서 고도로 증폭된다.

상기 포유동물세포는 특별히 한정되는 것은 아니며, 예를 들어 CHO-K1 세포(입수처: 예를 들어 ATCC CCL-61, RIKEN RCB0285, RIKEN RCB0403 등), 각종 종양세포 등을 들 수 있다. 단, 상기 포유동물세포로서는 무한증식능을 갖는 종양세포가 특히 바람직하다. 상기 종양세포로서는 예를 들면 HeLa 세포(입수처: 예를 들면 ATCC CCL-2, ATCC CCL-2.2, RIKEN RCB0007, RIKEN RCB0191 등), 인간 대장암 COLO 320DM 세포(입수처: 예를 들면 ATCC CCL-220), 인간 대장암 COLO 320HSR세포(입수처: 예를 들면 ATCC CCL-220.1). NSO 세포(입수처: 예를 들면 RIKEN RCB0213) 등을 들 수 있다. 인간 대장암 COLO 320DM 세포에 대해서는 "Shimizu, N., Kanda, Ta., and Wahl, G. M. Selective capture of acentricfragments by micronuclei provides a rapid method for purifying extrachromosomally amplified DNA. Nat. Gent., 12:65-71, 1996"을 참조.

또한, IR/MAR 플라스미드 및 목적 유전자를 포유동물세포에 도입할 때에는 양자가 동시에 포유동물세포로 도입되는 양태이면 특별히 한정되는 것은 아니고, 양자를 연결하여 동일한 유전자 구축물로서 도입할 수도 있고, 각각 별개의 유전자 구축물로서 도입할 수도 있다. 여기서, 전자에서는 IR/MAR 플라스미드와 목적 유전자를 시스에 배치하게 되며, 후자에서는 IR/MAR 플라스미드와 목적 유전자를 트랜스에 배치하게 된다. 전자의 경우는 하나의 유전자 구축물을 포유동물세포에 도입하게 되며, 조작이 용이하다는 이점이 있다. 한편, 후자의 경우는 각각의 유전자 구축물의 사이즈를 작게 할 수 있기 때문에, 상기 (A)∼(D)의 이점을 추가로 ㅇ얻을 수 있다.

또한, 유전자 구축물의 형태는 플라스미드이든 코스미드이든 상관없다. 또한, IR/MAR 플라스미드 및 목적 유전자의 포유동물세포로의 도입방법은 특별히 한정되는 것은 아니며, 리포펙션, 일렉트로포레이션법, 파티클건법(particle gun method) 등 공지의 방법을 적절히 선택하여 이용가능하다.

또한, IR/MAR 플라스미드와 목적 유전자를 별도의 유전자 구축물로서 도입할 경우에는 각각의 유전자 구축물에 선택 마커를 코딩하는 유전자가 포함되어 있는 것이 바람직하다. 상기 폴리뉴클레오티드가 도입된 포유동물세포를 선발할 수 있기 때문이다. 이 때, IR/MAR 플라스미드에 포함되는 선택 마커와, 목적 유전자를 포함하는 유전자 구축물에 포함되는 선택 마커가 서로 다른 것이 바람직하다.

[1-2. 선발공정]

본 발명의 유전자 증폭방법에 있어, '선발공정'은 목적 유전자와 벡터가 도입된 포유동물세포를 분리하는 공정이다. 보다 상세하게는 본 공정은 목적 유전자와 벡터가 도입되어 있지 않은 포유동물세포, 및 목적 유전자와 벡터가 도입된 포유동물세포가 포함되는 세포의 다클론성 집단으로부터 후자의 세포를 선발하는 공정이다. 또한, 약제 내성을 지표로 하여 본 공정을 수행할 경우에는, 포유동물세포를 배지에서 배양하는 공정이 포함되는 경우가 있는데, 본 공정에서는 목적 유전자와 벡터가 도입되어 있지 않은 포유동물세포, 목적 유전자와 벡터가 도입된 포유동물세포가 포함되는 세포의 혼합물을 배양하는 것에 반해, 후술하는 목적 유전자와 벡터가 도입된 포유동물세포로서 이미 선발된 세포를 배양하는 점에 있어서, 양 공정은 분명히 서로 다르다. 이러한 선발공정에 의해, 포유동물세포에 도입된 목적 유전자가 고도로 증폭된 포유동물세포를 선발할 수 있다.

상기 선발공정의 구체적 방법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들어, 목적 유전자와 벡터를 포유동물세포로 도입할 때에 사용한 유전자 구축물에 약제내성유전자가 포함되어 있는 경우, 그 약제내성을 이용하여 목적 유전자와 벡터가 도입된 포유동물세포를 선발하면 된다.

또한, 본 발명의 유전자 도입방법에서의 선발공정은 PCR법이나 서던 블롯팅(Southern blotting)법에 의해, 포유동물세포에 포함되는 목적 유전자 또는 벡터, 또는 그 뉴클레오티드 단편을 검출함으로써도 수행할 수 있다. 상기 약제내성은 PCR법, 서던 블롯팅법의 구체적인 방법은 특별히 한정되는 것은 아니며, 공지의 방법이 적절히 이용될 수 있다.

[1-3. 배양공정]

본 발명의 유전자 증폭방법에서의 '배양공정'은 상기 선발공정에 의해 이미 선발된 포유동물세포를 배양하는 공정이다. 이러한 배양공정에 의해, 목적 유전자가 도입되고 고도로 증폭된 포유동물세포를 증식시킬 수 있으며, 소정의 조작(전사유도조작 등)에 의해 목적 단백질을 생산할 수 있다.

상기 배양공정의 구체적 방법은 특별히 한정되는 것은 아니며, 배양하는 포유동물세포에 최적인 조건을 검토한 후, 적절히 채용하면 된다.

[1-4. 정제공정]

본 발명의 유전자 증폭방법에서의 '정제공정'은 상기 배양공정에 의해 생산된 목적 단백질을 정제하는 방법이다.

본 정제공정에서의 단백질 정제의 구체적 방법으로서는 예를 들면, 포유동물세포를 PBS(Phosphate Buffered Saline) 등의 완충용액에 현탁한 후, 호모게나이저(homogenizer) 또는 초음파 등으로 세포를 파쇄하고, 원심분리를 하여 상청액을 회수한다. 상기 완충용액에는 단백질의 가용화를 촉진하기 위한 계면활성제나, 단백질의 입체구조를 안정화하기 위한 환원제, 단백질의 분해를 방지하기 위한 프로테아제 저해제를 적절히 첨가할 수도 있다. 상기 계면활성제로는 CHAPS(3-[3-cholamidopropyl)-dimethylammonio-1-propanesulfonate], Triton X-100, Nikkol, n-옥틸글리코시드 등을 이용할 수 있다. 또한, 상기 환원제로서는 DTT(dithiothreitol), DET(dithioerythritol) 등을 이용할 수 있다. 또한, 상기 프로테아제 저해제로는 아프로티닌이나 류펩틴을 이용할 수 있다.

상기 상청액으로부터 목적 유전자가 코딩하는 단백질(목적 단백질)을 친화성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 여과 크로마토그래피 등의 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 정제할 수 있다. 또한, 정제된 단백질 용액을 적당한 완충액에 투석함으로써 불필요한 염을 제거할 수도 있다. 상기 단백질의 정제공정은 단백질의 분해를 억제하기 위해 저온조건 하에서 행해지는 것이 바람직하다. 특히 4℃ 하에서 정제공정이 이루어지는 것이 바람직하다.

또한, 상기 정제공정의 구체적 방법은 한정되지 않으며, 공지의 방법을 적절히 이용될 수 있다.

<2. 본 발명의 벡터>

또한, 본 발명은 상기에서 설명한 본 발명의 유전자 증폭방법을 수행하기 위한 벡터(이하, '본 발명의 벡터'라 한다), 또는 해당 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전자증폭키트(이하, '본 발명의 키트'라 한다)도 포함한다.

본 발명의 벡터 설명은 상기 본 발명의 유전자 증폭방법에서 사용하는 IR/MAR 플라스미드의 설명을 원용할 수 있다.

또한, 본 발명의 키트는 상기 본 발명의 벡터를 포함하는 것을 특징으로 하고 있다. 본 발명에 따른 키트는 본 발명에 따른 방법을 실시할 수 있는 것이면, 상기 구성에 한정되는 것은 아니며, 기타의 구성을 포함할 수도 있다. 또한, 본 발명에 따른 키트를 구성하는 물품 등의 설명에 대해서는 본 발명에 따른 방법의 설명을 적절히 원용할 수 있다.

도 1은 IR/MAR 플라스미드에 의해 DM 및 HSR가 발생하는 메카니즘을 나타낸 모식도이다.

도 2는 벡터에 의해 형질전환된 COLO 320DM에 발생한 DM 및 HSR을 FISH법에 의해 검출한 형광현미경이미지이며, A 및 B는 pSFVdhfr이 도입된 형질전환세포의 결과, C는 pΔHpA×2.dhfr이 도입된 형질전환세포의 결과, D는 pTH2.dhfr이 도입된 형질전환세포의 결과를 나타내고, E는 pEPI-1이 도입된 형질전환세포의 결과를 각각 나타낸다.

도 3은 실시예 및 참고예에서 사용되는 플라스미드의 개략도이다.

도 4는 참고예 1에서 pTH.IR.MAR 플라스미드가 유전자 도입된 COLO 320DM에 발생한 HSR의 빈도를 나타내는 막대 그래프이다.

도 5는 플라스미드(pΔBN.AR1, pΔHpA, pΔHpA.dhfr, pΔHpA×2.dhfr, pTH2.dhfr, pTH2.dhfr.inv, pEPI-1 또는 pTH3)가 도입된, HeLa(도 5(A)), COLO 320HSR(도 5(B)) 또는 COLO 320DM(도 5(C))의 HSR 발생빈도를 나타낸 막대 그래프이다.

도 6은 실시예 1의 결과를 나타낸 도면으로, A는 c-myc 유전자좌(GenBank HSMYCC; accession number X00364)의 개략도이며, B 및 C는 c-myc 유전자좌의 IR 전장과 그 부분 단편 C0∼C16과의 위치관계를 나타낸 도면, 및 상기 부분 단편을 포함하는 플라스미드(pC0∼pC16)가 도입된 형질전환세포의 HSR 발생빈도를 나타낸 도면이다.

도 7은 실시예 2의 결과를 나타낸 도면으로, A는 DHFR 유전자좌 Ori-β영역(Genbank CFORIDHFR; accession number X94372)의 개략도, B는 DHFR 유전자좌 Ori-β영역의 IR 전장과 그 부분 단편 C0∼C11과의 위치관계를 나타낸 도면, 및 각 부분 단편을 포함하는 플라스미드가 도입된 형질전환세포의 HSR 발생빈도를 나타낸 도면이다.

도 8의 A는 실시예에서 사용한 pC12 벡터의 모식도이며, B는 실시예에서 사용한 pC12.Psv40벡터의 모식도이다.

도 9는 각 실험구의 항체생산량을 각각 나타낸 막대 그래프이며, 'with No IR/MAR'은 IR/MAR 플라스미드를 트랜스펙션하지 않은 경우의 결과를 나타내며, 'pΔBN.AR1'은 pΔBN.AR1을 코트랜스펙션한 경우의 결과를 나타내며, 'pC12.Psv40'은 pC12.Psv40을 코트랜스펙션한 경우의 결과를 나타낸다.

도 10은 실시예 3에 있어서 pC12.Psv40을 코트랜스펙션한 경우의 각 클론의 항체생산량을 나타낸 막대 그래프이다.

도 11은 실시예 3에 있어서 pΔBN.AR1을 코트랜스펙션한 경우의 각 클론의 항체생산량을 나타낸 막대 그래프이다.

이하, 실시예에 기초하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하는데, 본 발명은 이들에 한정되는 것은 아니다. 본 실시예 및 참고예에 기재된 PCR는 모두 KOD 폴리머라제(TOYOBO사제)를 이용하여 실시하였다. 또한, PCR의 모든 조건은 KOD 폴리머라제에 첨부되어 있는 설명서에 기재되어 있는 표준 조건에서 실시하였다. 또한, 프라이머의 서열에 대해서는 후술한다.

[각종 플라스미드]

5' 말단과 3' 말단에 Asc I 사이트를 갖는, DHFR 유전자좌 Ori-β영역의 IR 유전자 및 c-myc의 IR 유전자의 제작방법은 하기와 같다. DHFR 유전자좌 Ori-β영역의 IR(4.6 kbp)를, "N.Shimizu, et al.(2001) Cancer Research, vol.61, p6987-6990"에 기재되어 있는 pSFVdhfr으로부터 NotⅠ로 제한효소소화함으로써 잘라내었다. 또한, c-myc의 IR(2.4kbp)은 "McWhinney, C. et al., Nucleic Acids Res. Vol.18, p1233-1242(1990)"에 기재되어 있는 pNeo.Myc-2.4로부터 NotⅠ와 HindⅢ를 이용하여 제한효소소화하여 잘라내었다. 상기 2개의 IR 단편의 5'와 3' 말단을 평활말단화한 후, 그 평활말단에 AscⅠ의 제한효소사이트를 갖는 어댑터 올리고뉴클레오티드를 연결하였다.

또한, pΔBN.AR1, pΔBN.polyA, 및 pSFV-V로서, "N.Shimizu, et al.(2001) Cancer Research, vol.61, p6987-6990"에 기재된 플라스미드를 각각 이용하였다.

또한, pΔH는 pSFV-V에 포함되는 전장 하이그로마이신 저항성 유전자 카세트를 NotⅠ와 NruⅠ의 제한효소를 이용하여 제거하고, 대신에 그 장소에 멀티 클로닝 사이트를 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드를 삽입함으로써 제작하였다. 상기 멀티 클로닝 사이트의 제한효소사이트는 블라스티사이딘 저항성 유전자(이하, 'BSR'이라 한다)의 하류에 위치하며, 5' 말단에서 3'말단에 걸쳐 KpnⅠ-NotⅠ-AscⅠ-NruⅠ의 순번이다.

또한, 도 3D에 도시되어 있는 pΔHpA는 HSV polyA 서열(1357bp)을 포함하는 유전자를 5'말단 및 3'말단에 KpnⅠ의 제한효소사이트가 부가되도록 설계한 HSVpAKpnIR과 HSVpAKpnIL의 프라이머 세트를 이용하여 PCR법에 의해 증폭하고, 해당 KpnⅠ의 제한효소사이트를 이용하여 상기 pΔH의 KpnⅠ사이트에 삽입함으로써 제작하였다. HSVpAKpnIR 및 HSVpAKpnIL의 각 프라이머의 염기서열을 서열번호 17과 서열번호 18로 각각 표시하였다. 또한, 상기 HSV polyA 서열의 염기서열을 서열번호 19로 표시하였다.

도 3E에 도시되어 있는 pΔHpAdhfr을 상기에서 제작한 DHFR 유전자좌 Ori-β 영역의 IR을, 상기 IR 단편의 내부에 존재하는 MAR 서열이 BSR의 전사개시점보다도 멀어지도록 pΔHpA의 AscⅠ사이트에 삽입함으로써 제작하였다.

또한, 도 3F에 도시되어 있는 pΔHpA×2.dhfr은 평활말단처리를 실시한 상기 HSV polyA 서열(도 3 중 'HSV pA'로 표시한다)을 포함하는 유전자 단편을 pΔHpA.dhfr의 NruⅠ사이트에 삽입함으로써 제작하였다.

또한, 도 3C의 pTH.IR.MAR은 하기와 같이 제작하였다.

(ⅰ) AR1의 MAR(375b) 단편을 Hind Ⅲ과 BamHⅠ을 이용하여 제한효소소화함으로써 pAR1로부터 잘라내어, 이 단편의 양 말단을 평활말단처리하였다. 또한, pAR1의 상세사항은 "N. Shimizu, et al.(2001) Cancer Research, vol.61, p6987-6990"에 기재되어 있다.

(ⅱ) SV40의 초기영역의 MAR 유전자를, pNeo.Myc-2.4를 주형으로 하여 SV40L과 SV40R의 프라이머 세트를 이용하여 PCR법에 의해 수득하였다. SV40L 및 SV40R의 염기서열을 서열번호 20 및 21로 각각 표시하였다. 또한, 상기 SV40의 초기영역의 MAR 유전자의 염기서열을 서열번호 22로 표시하였다.

(ⅲ) FRB(replication fork barrier) 서열을 포함하는 유전자(118bp)는, pSV2. SB2를 주형으로 하여, 5' 말단과 3' 말단에 NotⅠ의 제한효소사이트가 부가되도록 설계한 RFB NotⅠL과 RFB NotⅠR의 프라이머 세트를 이용하여 PCR법에 의해 수득하였다. 상기 RFB 서열은 복제 포크의 발생을 블로킹하기 위해, 해당 RFB 서열이 도입된 플라스미드의 복제를 저해할 수 있다. RFB NotⅠL 및 RFB NotⅠR의 염기서열을 서열번호 23 및 24로 각각 표시하였다. 또한, RFB 서열의 염기서열을 서열번호 25로 표시하였다.

(ⅵ) 상기 RFB 서열을 포함하는 유전자를, IR로부터의 복제 포크를 블로킹하는 방향성으로 pΔHpA의 NotⅠ사이트에 삽입하였다. 이어, 평활말단처리한 AR1과 SV40과의 양측 MAR 유전자를 상기 플라스미드의 NruⅠ사이트에 삽입하였다.

(ⅴ) 마지막으로, 상기에서 제작한 c-myc의 IR 유전자 또는 DHFR 유전자좌 Ori-β영역의 IR 유전자와, λ-파지의 HindⅢ으로 제한효소소화한 4361bp의 단편의 양측 말단에 AscⅠ사이트를 부가한 유전자를, 각각 (ⅵ)로 제작한 플라스미드의 Asc Ⅰ사이트에 삽입하였다.

또한, 도 3G에 도시되어 있는 pTH2.dhfr, 또는 pTH2.dhfr.inv는 상기에서 수득한 DHFR 유전자좌 Ori-β영역의 IR 유전자(4.6kbp)를 평활말단처리한 것을, pΔHpA의 EcoRⅠ소화물을 평활말단처리한 것에 대해, BSR의 전사와 관련하여 동일 또는 반대 방향이 되도록 삽입하여 각각 제작하였다.

또한, 도 3H에 도시되어 있는 pEPI-1("Schaarschmidt, D., Baltin, J., Stehle, I. M., Lipps, H. J., and Knippers, R.(2004) EMBO J. 23(1), 191-201.", 및 "Jenke, A. C., Stehle I. M., Herrmann, F., Eisenberger, T., Baiker, A., Bode, J., Fackelmayer, F. O., and Lipps, H. J.(2004) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 101, 11322-11327.")은 Daniel Schaarchmidt(Department of Biology, Universitat of Konstanz)으로부터 제공받았다.

또한, 도 3J에 기재되어 있는 pTHV는 pΔH의 KpnⅠ사이트에 평활말단 라이게이션으로 AR1의 MAR을 삽입함으로써 제작하였다.

또한, 도 3I에 기재되어 있는 pTH3은 상기 pTHV의 NotⅠ사이트에 평활말단 라이게이션으로 HSV poly A 서열을 삽입함으로써 제작하였다.

또한, 2.4kbp의 c-myc의 IR 부분 단편(C0∼C16) 또는 4.6kbp의 DHFR 유전자좌 Ori-β영역의 IR의 부분 단편(D1∼D11)을 포함하는 벡터는 pNeo.Myc-2.4와 pSFV dhfr을 주형으로 하는 PCR에 의해 증폭된 유전자를, pTHV의 AscⅠ사이트에 삽입함으로써 제작하였다.

상기의 PCR에서 이용한 C0 증폭용 5' 프라이머(C0-5')의 염기서열을 서열번호 26으로, 3' 프라이머(C0-3')의 염기서열을 서열번호 27로 표시하였다. 또한, C1 증폭용 5' 프라이머(C1-5')의 염기서열을 서열번호 28로 표시하고, 3' 프라이머(C1-3')의 염기서열을 서열번호 29로 표시하였다. 또한, C2 증폭용 5' 프라이머(C2-5')의 염기서열을 서열번호 30으로 표시하고, 3' 프라이머(C2-3')의 염기서열을 서열번호 31로 표시하였다. 또한, C3 증폭용 5'-프라이머(C3-5')의 염기서열을 서열번호 32로 표시하고, 3' 프라이머(C3-3')의 염기서열을 서열번호 33으로 표시하였다. 또한, C4 증폭용 5'-프라이머(C4-5')의 염기서열을 서열번호 34로 표시하고, 3' 프라이머(C4-3')의 염기서열을 서열번호 35로 표시하였다. 또한, C5 증폭용 5'-프라이머(C5-5')의 염기서열을 서열번호 36으로 표시하고, 3' 프라이머(C5-3')의 염기서열을 서열번호 37로 표시하였다. 또한, C6 증폭용 5'-프라이머(C6-5')의 염기서열을 서열번호 38로 표시하고, 3' 프라이머(C6-3')의 염기서열을 서열번호 39로 표시하였다. 또한, C7 증폭용 5'-프라이머(C7-5')의 염기서열을 서열번호 40으로 표시하고, 3' 프라이머(C7-3')의 염기서열을 서열번호 41로 표시하였다. 또한, C8 증폭용 5'-프라이머(C8-5')의 염기서열을 서열번호 42로 표시하고, 3' 프라이머(C8-3')의 염기서열을 서열번호 43으로 표시하였다. 또한, C9 증폭용 5'-프라이머(C9-5')의 염기서열을 서열번호 44로 표시하고, 3' 프라이머(C9-3')의 염기서열을 서열번호 45로 표시하였다. 또한, C10 증폭용 5'-프라이머(C10-5')의 염기서열을 서열번호 46으로 표시하고, 3' 프라이머(C10-3')의 염기서열을 서열번호 47로 표시하였다. 또한, C11 증폭용 5'-프라이머(C11-5')의 염기서열을 서열번호 48로 표시하고, 3' 프라이머(C11-3')의 염기서열을 서열번호 49로 표시하였다. 또한, C12 증폭용 5'-프라이머(C12-5')의 염기서열을 서열번호 50으로 표시 하고, 3' 프라이머(C12-3')의 염기서열을 서열번호 51로 표시하였다. 또한, C13 증폭용 5'-프라이머(C13-5')의 염기서열을 서열번호 52로 표시하고, 3' 프라이머(C13-3')의 염기서열을 서열번호 53으로 표시하였다. 또한, C14 증폭용 5'-프라이머(C14-5')의 염기서열을 서열번호 54로 표시하고, 3' 프라이머(C14-3')의 염기서열을 서열번호 55로 표시하였다. 또한, C15 증폭용 5'-프라이머(C15-5')의 염기서열을 서열번호 56로 표시하고, 3' 프라이머(C15-3')의 염기서열을 서열번호 57로 표시하였다. 또한, C16 증폭용 5'-프라이머(C16-5')의 염기서열을 서열번호 58로 표시하고, 3' 프라이머(C16-3')의 염기서열을 서열번호 59로 표시하였다. 또한, D1 증폭용 5'-프라이머(D1-5')의 염기서열을 서열번호 60으로 표시하고, 3' 프라이머(D1-3')의 염기서열을 서열번호 61로 표시하였다. 또한, D2 증폭용 5'-프라이머(D2-5')의 염기서열을 서열번호 62로 표시하고, 3' 프라이머(D2-3')의 염기서열을 서열번호 63으로 표시하였다. 또한, D3 증폭용 5'-프라이머(D3-5')의 염기서열을 서열번호 64로 표시하고, 3' 프라이머(D3-3')의 염기서열을 서열번호 65로 표시하였다. 또한, D4 증폭용 5'프라이머-(D4-5')의 염기서열을 서열번호 66으로 표시하였으며, 3' 프라이머(D4-3')의 염기서열을 서열번호 67로 표시하였다. 또한, D5 증폭용 5'-프라이머(D5-5')의 염기서열을 서열번호 68로 표시하고, 3' 프라이머(D5-3')의 염기서열을 서열번호 69로 표시하였다. 또한, D6 증폭용 5'프라이머-(D6-5')의 염기서열을 서열번호 70으로 표시하였으며, 3' 프라이머(D6-3')의 염기서열을 서열번호 71로 표시하였다. 또한, D7 증폭용 5'-프라이머(D7-5')의 염기서열을 서열번호 72로 표시하고, 3' 프라이머(D7-3')의 염기서열을 서열번호 73으로 표시하였다. 또한, D8 증폭용 5'프라이머-(D8-5')의 염기서열을 서열번호 74로 표시하며, 3' 프라이머(D8-3')의 염기서열을 서열번호 75로 표시하였다. 또한, D9 증폭용 5'-프라이머(D9-5')의 염기서열을 서열번호 76으로 표시하고, 3' 프라이머(D9-3')의 염기서열을 서열번호 77로 표시하였다. 또한, D10 증폭용 5'프라이머-(D10-5')의 염기서열을 서열번호 78로 표시하였으며, 3' 프라이머(D10-3')의 염기서열을 서열번호 79로 표시하였다. 또한, D11 증폭용 5'-프라이머(D11-5')의 염기서열을 서열번호 80으로 표시하고, 3' 프라이머(D11-3')의 염기서열을 서열번호 81로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 C0의 염기서열을 서열번호 82로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 C1의 염기서열을 서열번호 83으로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 C2의 염기서열을 서열번호 84로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 C3의 염기서열을 서열번호 85로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 C4의 염기서열을 서열번호 86으로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 C5의 염기서열을 서열번호 87로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 C6의 염기서열을 서열번호 88로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 C7의 염기서열을 서열번호 89로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 C8의 염기서열을 서열번호 90으로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 C9의 염기서열을 서열번호 91로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 C10의 염기서열을 서열번호 92로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 C11의 염기서열을 서열번호 93으로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 C12의 염기서열을 서열번호 94로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 C13의 염기서열을 서열번호 95로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 C14의 염 기서열을 서열번호 96으로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 C15의 염기서열을 서열번호 97로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 C16의 염기서열을 서열번호 98로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 D1의 염기서열을 서열번호 99로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 D2의 염기서열을 서열번호 100으로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 D3의 염기서열을 서열번호 101로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 D4의 염기서열을 서열번호 102로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 D5의 염기서열을 서열번호 103으로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 D6의 염기서열을 서열번호 104로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 D7의 염기서열을 서열번호 105로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 D8의 염기서열을 서열번호 106로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 D9의 염기서열을 서열번호 107로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 D10의 염기서열을 서열번호 108로 표시하였다. 또한, 상기 PCR로 증폭된 D11의 염기서열을 서열번호 109로 표시하였다.

[실험 방법]

상기에서 제작한 플라스미드를 이용하여 다음과 같은 실험을 하였다.

본 실시예 및 참고예('실시예 등'이라 한다)에서는 상기 플라스미드를 세포에 유전자 도입하고, 이 플라스미드로 형질전환된 형질전환세포를 선택한 후, FISH법을 이용하여 해당 형질전환세포 내의 HSR의 형성빈도를 조사하였다.

본 실시예에서 사용되고 있는 유전자 도입방법에 대해서는 하기와 같다. 먼 저, 유전자 도입에 사용하는 플라스미드를 Qiagen 플라스미드 정제 키트(Qiagen Inc., Valencia, CA)를 이용하여 대장균으로부터 정제하였다. 게다가, 상기 플라스미드를 세포 내에 도입할 때에는 DNA 정제의 과정에서 혼입되는 대장균 유래의 내독소를 Mira CLEAN(등록 상표) endotoxin removal 키트(Mirus., Madison, WI)를 이용하여 제거한 후에, 메이커가 추천하는 수법에 따라, GenePorter(등록 상표)2 Lipofection 키트(Gene Therapy Systems, San Diego, CA)를 이용하여 세포에 유전자 도입하였다.

상기 유전자 도입되는 세포는 인간 대장암 세포주인 COLO 320DM 또는 COLO 320 HSR, 또는 인간 자궁경부암 세포주인 Hela이다. 상기 세포주는 "N, Shimizu, et al.(2001) Cancer Research, vol. 61, p6987-6990"에 기재된 곳으로부터 수득되어, 해당 기재와 동일한 조건에서 배양되었다. COLO 320DM에는 c-myc 유전자의 증폭으로 인해 대부분의 내재성 DM이 발생하고 있으며, 한편, COLO 320DM과 동질 유전자계통의 COLO 320HSR에는 DM보다도 HSR이 많이 발생하고 있다.

상기 형질전환세포를 유전자 도입 2일 후에, 최종농도가 5μg/mL이 되도록 블라스티사이딘을 첨가한 선택 배지에서 상기 세포를 배양함으로써 선택하였다. 선택 배지는 3일∼5일마다 배양중인 선택 배지의 절반을, 새로 조제한 상기 선택 배지와 교환하였다.

상기 FISH법과, FISH법에 사용하는 도입유전자를 검출하기 위한 프로브의 조제와, 메타페이즈 스프레딩(metaphase spreading)은 각각 배양 4, 6, 또는 8주 후에, 배양중인 세포의 일부를 회수하여, "N. Shimizu, et al.(2001) Cancer Research, vol.61, p6987-6990"에 기재된 방법에 따라 이루어졌다. 또한, 상기 프로브는 바이오틴화되어 있어, 녹색 형광을 발하는 FITC(fluorescein isothiocyanate)가 결합된 스트렙트아비딘에 의해 검출할 수 있다. 또한, 녹색 형광을 발하는 PI(propidium iodide)로 DNA를 대비염색하였다. FISH법에 의해 형광 표식한 슬라이드 글래스 상의 세포를, 형광 색소를 검출하는 데에 적절한 필터 세트와 100배의 대물렌즈(Nikon Plan Fluor, NA1.30 oil)를 설치하고 있는 도립(倒立)형광현미경(ECLIPSE TE2000-U, Nikon)을 이용하여 관찰하고, 상기 현미경과 연결되어 있는 Fuji FinePix S1Pro digital camera(Fuji Film Co. Tokyo)를 이용하여, 세포 내에서의 도입 유전자와 DNA 양태의 사진을 디지털 화상으로서 촬영하였다. 얻어진 각각의 화상은 화상해석소프트 Adobe(등록 상표) Photpshop(등록 상표) version 4.0J(Adobe Systems Inc)를 이용하여 합성하였다.

[참고예 1]

플라스미드 pSFVdhfr, pΔHpAx2.dhfr, pTH2.dhfr, 또는 pEPI-1을 COLO 320DM에 유전자 도입하였다. pSFVdhfr를 도입한 경우에는 배양 8주 후에 형질전환세포를 회수하며, 그것 이외의 플라스미드를 도입한 경우에는 배양 6주 후에, 형질전환세포를 회수하였다. 회수된 각각의 형질전환세포에 대해, FISH법에 의해 DM과 HSR를 검출하였다.

DM 및 HSR을 FISH법에 의해 검출한 결과를 도 2에 나타낸다. 도 2에 있어서의 'A' 및 'B'는 pSFVdhfr가 도입된 형질전환세포의 결과, 'C'는 pΔHpAx2.dhfr가 도입된 형질전환세포의 결과, 'D'는 pTH2.dhfr가 도입된 형질전환세포의 결과, 'E'는 pEPI-1가 도입된 형질전환세포의 결과를 각각 나타낸다. 도 2에 있어서, 화살표 머리는 DM을 나타내며, 화살표는 HSR을 나타낸다.

여러 가지 IR과 MAR의 조합을 포함하는 pTH.IR.MAR을 제작하여, COLO 320DM에 유전자 도입하였으며, 4, 6, 또는 8주 배양 후에 형질전환세포를 수득하였다. 상기 형질전환세포에 발생하고 있는 HSR를 FISH법에 의해 조사하여, HSR 발생빈도(Frequency of HSR)를 구하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다. HSR 발생빈도는 "(HSR이 발생하고 있는 형질전환세포수÷형질전환세포수)×100"로서 계산되었다. 도 4 중의 IR란의 '(+) 및 (-)'는 IR이 BSR의 전사방향과 동일한 경우 및 반대인 경우를 각각 나타낸다. 또한, 'λ-DNA fragment'는 λ파지의 4361bp의 유전자 단편이 IR 대신에 도입되어 있는 것을 나타내며, 'none'는 IR을 포함하지 않는 것을 나타낸다.

도 4에 따르면, IR과 MAR을 가지고 있는 플라스미드가 유전자 도입되어 있는 형질전환세포에만 HSR이 발생하고 있음을 알 수 있다. 또한, IR 대신에 λ파지의 4361bp의 유전자 단편을 이용한 경우나, IR을 이용하지 않는 경우에는 HSR이 대부분 발생하지 않기 때문에, IR중에 HSR을 발생시키는 활성을 갖는 염기서열이 있음이 시사되었다.

플라스미드(pΔBN.AR1, pΔHpA, pΔHpA.dhfr, pΔHpA×2.dhfr, pTH2.dhfr, pTH2.dhfr.inv. pEPI-1, 또는 pTH3)를 HeLa 또는 COLO 320HSR, COLO 320DM에 유전자 도입하였다. 유전자 도입 후, 4주간 또는 8주간 선택 배지에서 배양함으로써, 형질전환세포를 선발하였다. 이어, 선발된 형질전환세포 HSR의 발생빈도를 조사하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 따르면, 유전자복제와 비코딩전사와의 사이에서 충돌이 일어나도록 제작된 pΔHpA.dhfr를 유전자 도입한 경우에 HSR이 발생하였다. 한편, 폴리A서열을 하나 추가하여 비코딩전사와 유전자복제간의 충돌이 일어나지 않도록 작성한 pΔHpA×2.dhfr를 유전자 도입한 경우에는 HRS이 발생하지 않았다. 이는 유전자 복제와 비코딩전사와의 사이에서 충돌이 일어남으로써 플라스미드가 불안정해지며, 플라스미드는 다량체화되어 HSR을 발생하는 것을 시사하고 있다. 또한, 비코딩전사와 유전자복제 간의 충돌이 일어나지 않도록 제작한 pTH2.dhfr가 유전자 도입된 경우에는 저빈도이지만 HSR이 발생하였다. 이는 유전자복제와 비코딩전사와의 사이에서 충돌이 일어났었음이 추측된다. 상기의 결과로부터, IR의 양단에 폴리A서열을 부가함으로써, 유전자 복제와 비코딩전사와의 사이에 발생하는 충돌을 없앨 수 있음을 알 수 있었다.

또한, 전사영역 사이에 삽입된 MAR이 유전자 복제와 포유동물 에피좀의 유지에 필수적이며, IR은 필요하지 않다는 문헌 "Jenke, A.C., Stehle I. M., Herrmann, F., Eisenberger, T., Baiker, A., Bode, J., Fackelmayer, F. O., and Lipps, H.J.(2004) Proc.Natl.Acad.Sci. USA 101, 11322-11327."이 있다. 때문에, 상기 문헌에서 사용되고 있는 플라스미드(pEPI-1)와 pEPI-1과 마찬가지 구성의 플라스미드(pTH3)를 제작하였다. pTH3은 AR1 유래의 MAR이 BSR 전사영역의 내부에 존재하는 플라스미드이다. 상기 플라스미드를 HeLa, COLO 320HSR 또는 COLO 320DM 에 유전자 도입하여 HSR의 발생을 조사한 결과, 해당 형질전환세포에서 HSR 및 DM은 전혀 발생하지 않았다. 한편, 극미세물체인 에피좀을 확인할 수 있었다. 이는 IR이 HSR의 발생에 필수적임을 시사하고 있다. 또한, IR은 유전자 복제에 관여하며, HSR은 유전자 증폭에 관여하기 때문에, IR의 유전자 복제와 유전자 증폭이 서로 관련이 있다고 생각된다.

[실시예 1]

유전자증폭활성을 갖는 c-myc 유전자좌의 IR의 부분 단편을 동정하였다. 즉, PCR을 사용하여 c-myc 유전자좌의 IR의 부분 단편(C0∼C16)을 제작하여, 해당 부분 단편(C0∼C16)을 각각 pTHV(도 3J)의 AscⅠ사이트에 삽입하였으며, C0∼C16을 포함하는 플라스미드(pC0∼pC16)을 제작하였다(여러 플라스미드의 항을 참조).

상기 각 플라스미드를 세포로 도입한 경우, 삽입된 부분 단편에 유전자증폭활성이 있으면, MAR 부위에서 복제와 전사와의 사이에서 충돌이 일어나며, 해당 플라스미드로 형질전환된 형질전환세포에 HSR이 발생한다. 그 반대로, 삽입된 부분 단편에 유전자증폭활성이 없으면, 형질전환세포에 HSR이 발생하지 않는다. 이를 이용함으로써, 유전자증폭활성을 갖는 c-myc 유전자좌의 IR의 부분 단편을 동정하였다. 여기에서 상기의 동정방법을 편의상 '플라스미드 안정화 분석법'이라 칭한다.

상기 pC0∼pC16, 양성 대조로서 c-myc의 IR 전장을 포함하는 플라스미드('pCf.1'), 또는 음성대조로서 c-myc의 IR을 포함하지 않는 플라스미드('pTHV') 를 각각 COLO 320DM에 유전자 도입하여 6주간 선택 배지에서 배양함으로써 형질전환세포를 수득하였다. 수득된 형질전환세포의 HSR 발생빈도(Frequency)를 상술한 방법에 의해 조사하였다.

그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6A는 c-myc 유전자좌(Genbank HSMYCC ; accession number X00364)의 개략도이다. c-myc 유전자좌의 IR은 c-myc 유전자좌의 HindⅢ-XhoⅠ단편(2349bp)에 해당한다. 도 6B 및 C는 c-myc 유전자좌의 IR 전장과 그 부분 단편인 C0∼C16과의 위치관계, 및 각 부분 단편이 도입된 형질전환세포의 HSR 발생빈도를 나타내고 있다. 또한, 도 6 중의 '□(흰 사각)'은 c-myc 유전자좌의 IR에서의 토포아이소머라제Ⅱ 결합영역의 위치를 나타내며, '◆(검정 마름모)'는 듀플렉스 언와인딩 요소(Duplex Unwinding Element, DUE)의 위치를 나타내며, '○(흰 동그라미)'은 플라스미드의 자기복제를 도와준다고 보고되는, 인간의 36bp의 콘센서스 서열 내의 코어 20bp에 해당하는 서열의 위치를 각각 나타내고 있다. 또한 'cⅠ'은 듀플렉스 언와인딩 요소(Duplex Unwinding Element, DUE)를 포함하는 유전자증폭활성을 갖는 염기서열의 위치, 'cⅡ'은 토포아이소머라제Ⅱ 결합영역을 포함하는 유전자증폭활성을 갖는 염기서열의 위치, 'cⅡ''은 cⅡ와 유사한 서열의 위치, 'N'은 네가티브 영역(HSR 형성을 억제하는 영역)의 위치를 각각 나타내고 있다.

도 6B에 따르면, pC3을 유전자 도입하여 얻어진 형질전환세포의 HSR의 발생빈도가 가장 높고, 또한 양성대조군의 그것보다도 많음을 알 수 있었다. 또한, pC1을 유전자 도입하여 얻어진 형질전환세포의 HSR의 발생빈도가 가장 높고, 또한 양성대조군의 그것보다도 많음을 알 수 있었다. 또한, pC2 또는 pC7을 유전자 도입하여 얻어진 형질전환세포의 HSR 발생빈도는 양성대조군의 그것과 동등하였다. 또한, pC9 또는 pC6을 유전자 도입하여 얻어진 형질전환세포에 대해 HSR의 발생이 관찰되었다.

또한, pC3에 삽입되어 있는 c-myc의 IR의 부분 단편에 대해 추가로 부분 단편을 제작하여 HSR 발생빈도를 조사하였다. 그 결과, 도 6C에 따르면, 토포아이소머라제Ⅱ 결합영역과 듀플렉스 언와인딩 요소(Duplex Unwinding Element, DUE)를 포함하는 부분 단편을 갖는 플라스미드(pC12)가 도입된 형질전환세포의 HSR 발생빈도가 가장 높았다. 게다가, 그 HSR 발생빈도는 양성대조군의 그것보다도 많음을 알 수 있었다. 한편, 토포아이소머라제Ⅱ 결합영역 또는 듀플렉스 언와인딩 요소(Duplex Unwinding Element, DUE) 중 어느 하나가 포함되어 있지 않은 부분 단편이 도입된 형질전환세포에서는 HSR이 형성되지 않거나, 또는 HSR 발생빈도가 매우 낮음을 알 수 있었다. 따라서, 토포아이소머라제Ⅱ결합영역과 D듀플렉스 언와인딩 요소(Duplex Unwinding Element, DUE)는 유전자 증폭에서 필수적인 요소임을 알 수 있었다. 또한, 토포아이소머라제Ⅱ결합영역과 듀플렉스 언와인딩 요소(Duplex Unwinding Element, DUE)를 포함하는 부분 단편을 이용함으로써, IR 전장을 이용한 경우에 비해 HSR 발생빈도가 더욱 높아짐을 확인할 수 있었다.

[실시예 2]

유전자 증폭활성을 갖는 DHFR 유전자좌 Ori-β영역의 IR의 부분 단편을 동정 하였다. DHFR 유전자좌 Ori-β영역의 IR을 이용한 것 이외에는 실시예 1과 동일하게 하였다. 즉, PCR을 이용하여 DHFR 유전자좌 Ori-β영역의 IR의 부분 단편(D1∼D11)을 제작한 후, 해당 부분 단편(D1∼D11)을 각각 pTHV(도 3J)의 AscⅠ사이트에 삽입하여, D1∼D11을 포함하는 플라스미드(pD1∼pD11)을 제작하였다(여러 플라스미드의 항 참조). 양성대조군으로서 DHFR 유전자좌 Ori-β영역의 IR의 전장을 포함하는 플라스미드(pDf.Ⅰ)를 채용하였으며, 또한 음성대조군으로서 DHFR 유전자좌 Ori-β영역의 IR을 포함하지 않는 플라스미드('pTHV)')를 채용하였다.

본 실시예의 결과를 도 7에 나타낸다. 도 7에는 DHFR 유전자좌 Ori-β영역(Genbank CFORIDHFR; accession number X94372)의 개략도가 도시되어 있으며, DHFR 유전자좌 Ori-β영역의 BamHⅠ-HindⅢ 단편(4.6kbp)가 DHFR 유전자좌 Ori-β영역의 IR에 해당한다. 또한, 도 7에는 DHFR 유전자좌 Ori-β영역의 IR 전장과 그 부분 단편인 D0∼D11과의 위치관계, 및 각 부분 단편이 도입된 형질전환세포의 HSR 발생빈도를 나타낸다.

도 7에 따르면, DHFR 유전자좌 Ori-β영역(Genbank CFORIDHFR; accession number X94372)의 제3142위의 영역이 결여된 부분 단편을 갖는 플라스미드(pD6 및 pD7)가 도입된 형질전환세포에 대해 HSR이 발생하지 않았다. 또한, DHFR 유전자좌 Ori-β영역(Genbank CFORIDHFR; accession number X94372)의 제4885위의 영역이 결여된 부분 단편을 갖는 플라스미드(pD5 및 pD10)가 도입된 형질전환세포에 대해 HSR 발생빈도가 현저하게 저하되었다. 따라서, DHFR 유전자좌 Ori-β영역(Genbank CFORIDHFR;accession number X94372)의 제3142∼4885위의 영역이 HSR의 발생에 필 수적임을 알 수 있었다. 상기 영역에는 토포아이소머라제Ⅱ 결합영역(도 7 중의 □(흰 사각))과 듀플렉스 언와인딩 요소(Duplex Unwinding Element, DUE, 도 7 중 ◆(검은 마름모꼴))이 포함되어 있다. 따라서, 실시예 1의 결과를 함께 참조할 때, 토포아이소머라제Ⅱ 결합영역과 듀플렉스 언와인딩 요소(Duplex Unwinding Element, DUE)를 포함하는 IR의 부분 단편은 유전자 증폭 활성을 갖고 있다고 할 수 있다. 게다가, 상기 영역에는 염기서열로서, 만곡 DNA(bent DNA, 도 7 중 〓 (이중선), RIP60 결합영역(도 7 중 △(흰 삼각)), 및 AT-rich 요소(도 7 중 'AT'로 표시함)도 포함되어 있다. pD6 또는 pD7을 유전자 도입하여 얻어진 형질전환세포의 HSR의 발생빈도와, pD1을 유전자 도입하여 얻어진 형질전환세포의 HSR의 발생빈도를 비교한 결과를 볼 때, DHFR 유전자좌 Ori-β영역에 대해서는 3개의 요소(만곡 DNA, RIP60 결합영역, 및 AT-rich 요소)도 HSR 발생에 필수적임을 알 수 있었다.

[실시예 3]

본 실시예에서는 실시예 1에서 사용한 pC12(도 8A에 나타냄)에서의 SRα프로모터(도 8A에서는 'PSRα'로 나타냄)를, SV40 초기영역에서 유래된 프로모터영역(이하, 'SV40 프로모터'라 한다)으로 치환한 pC12.Psv40(도 8B에 나타냄)을 사용하였다. 도 8B에 있어서 SV40 프로모터를 'Psv40'으로서 나타낸다. pC12.Psv40의 제작방법은 하기와 같다.

먼저, pC12를 EcoRⅠ 및 XhoⅠ로 제한효소소화함으로써 SRα프로모터 영역을 잘라내었다. 잘라낸 부위로, 멀티 클로닝 사이트를 포함하는 합성 올리고뉴클레오 티드(ESMX 링커)를 삽입하였다. 이 멀티 클로닝 사이트의 제한효소사이트는 암피실린 내성 유전자(Amp^R)의 하류(즉, SRα프로모터가 있었던 부위)에 위치하고 있으며, 제한효소 사이트가 5'말단에서 3'말단에 걸쳐 EcoRⅠ-SalⅠ-MluⅠ-XhoⅠd의 순으로 배열하고 있다. 또한, EXMX 링커의 염기서열을, 표 1 및 서열번호 110 및 서열번호 111로 표시하였다. 상기와 같은 방법으로 제작한 플라스미드를 SalⅠ 및MluⅠ로 제한효소소화하였다. 그 후, SalⅠ 및 MluⅠ로 제한효소소화한 SV40 프로모터를 상기 플라스미드에 삽입하여 pCl12.Psv40을 구축하였다. SV40 프로모터를 BSR을 전사하는 방향에서 플라스미드에 삽입하였다.

또한, SV40 프로모터는 하기와 같은 방법으로 제작하였다. pMACS4.1(Mitenyi Biotech사제)를 주형으로 하여, SV40 프로모터 증폭용 프라이머(MACS4.1 4288L 및MACS4.1 1454R)를 이용하여 PCR법에 의해 증폭하였다. 증폭된 SV40 프로모터는 SalⅠ및 MluⅠ로 제한효소소화하여 사용하였다. SV40 프로모터 증폭용 프라이머인 MACS4.1 4288L(서열번호 112) 및 MACS 4.1 1454R(서열번호 113)의 염기서열을 표 1에 나타낸다. SV40 프로모터의 염기서열을 서열번호 114로 나타내었으며, SRα프로모터의 염기서열을 서열번호 115로 나타내었다.

항 Pyrocuccus kodakaraensis KOD1주에서 유래한 DNA 폴리머라제에 대한 항체를 생산하는 마우스 하이브리도마 세포(입수처: 일본 생명공학공업기술연구소, 기탁번호:FERM BP-6057)로부터 RNeasy Plus Mini Kit(QIAGEN사제, 74134)를 사용하여 토탈 RNA을 추출하고, Rever Tra Ace-α-(TOYOBO사제, FSK-101)을 사용하여 단쇄 cDNA를 합성하였다. 항 KOD 폴리머라제 항체의 시그널 서열을 제외한 중쇄와 경쇄를 특이적으로 증폭하는 프라이머를 이용하여 PCR 증폭하고, 각각의 증폭 산물에 면역 글로글린 κ쇄 유래의 시그널 서열을 부가한 후, CMV 프로모터를 갖는 플라스미드의 XbaⅠ-NotⅠ사이트에 연결하여 pCMV-H와 pCMV-L을 구축하였다.

pCMV-H 및 pCMV-L을 pC12.Psv40과 함께 차이니즈 햄스터의 난소세포에 코트랜스펙션하였다. 트랜스펙션 2일 후에 블라스티사이딘(Invivogen사제, ant-bl-1)을 5μg/mL의 농도로 첨가하여, 3∼4일 간격으로 배지를 교체하면서 2주간 배양하여 안정된 형질전환체를 얻었다. 또한, 비교대조실험으로서, DHFR 유전자좌 Ori-β영역의 전장 IR을 갖는 pΔBN.AR1을 pC12.Psv40 대신에 사용한 경우, 및 IR/MAR을 트랜스펙션하지 않는 경우도 실시하였다.

이어, 세포배양샬레 60mm(SUMILON사제, MS-11600)까지 확대 배양한 후, 단계적으로 블라스티사이딘 농도를 높여가서, 최종농도 320μg/mL에서 안정적으로 생육할 수 있을 때까지 배양을 계속하였다. 상기에서 생육한 1×10⁶개의 세포로부터 게놈 DNA을 수득하여, 중쇄 및 경쇄 항체 유전자 카피수의 증가를 실시간 정량 PCR(ABI사제, 7900HT)을 이용하여 확인하였다. 측정 시약에는 SYBR Green Realtime PCR Master Mix(TOYOBO사제, QPK-201)를 사용하였다.

유전자 증폭량을 확인한 후, 블라스티사이딘 320μg/mL을 첨가하여 4일간 배양한 상청액을 수득하여, EIA법으로 항체 농도를 측정하였다. 상세하게는 하기와 같이 하였다. 염소 항마우스 항체를 고상화한 ELISA 플레이트(SUMILON사제, MS-8896F)에, 10mM PBS(-)로 5배 희석한 배양 상청액을 첨가하여 35℃에서 2시간 인큐베이팅하였다. 이어서, PBS-T로 3회 세척한 후, PBS+1% BSA+10% 염소혈청으로 4000배 희석한 퍼옥시다제 표식 염소 항마우스 항체를 50μl/well 첨가하여, 35℃에서 2시간 인큐베이팅하였다. 그 후, ELISA 플레이트를 PBS-T로 4회 세척한 후, 완전히 수분을 제거하고, 발색시약 50μl/well 첨가하여 실온에서 15분간 인큐베이팅하였다. 1N 황산용액 50μl/well로 반응을 정지시키고, 플레이트 리더(메인파장 450nm, 서브파장 620nm)로 흡광도를 측정하였다. 표준품으로 작성한 검량선을 기초로 항체 농도를 산출하였다.

그 결과를 도 9 및 표 2에 나타내었다. 도 9는 각 실험구의 항체생산량을 각각 나타낸 막대 그래프이며, "with No IR/MAR"은 IR/MAR 플라스미드를 트랜스펙션하지 않은 경우의 결과를 나타내며, 'pΔBN.AR1'은 pΔBN.AR1을 코트랜스펙션한 경우의 결과를 나타내며, 'pC12.Psv40'은 pC12.Psv40을 코트랜스펙션한 경우의 결과를 나타낸다. 또한, 표 2는 각 실험구의 항체생산량, 중쇄 및 경쇄 항체 유전자 카피수를 나타낸 표이다. 표 2에 있어서 'with No IR/MAR'은 IR/MAR 플라스미드를 트랜스펙션하지 않은 경우의 결과를 나타내며, 'pΔBN.AR1'은 pΔBN.AR1을 코트랜스펙션한 경우의 결과를 나타내며, 'pC12.Psv40'은 pC12.Psv40을 코트랜스펙션한 경우의 결과를 나타낸다.

도 9 및 표 2에 따르면, pΔBN.AR1 및 pC12.Psv40을 코트랜스펙션한 경우에 있어서, IR/MAR 플라스미드를 사용하지 않았던 경우에 비해 12배 이상의 유전자 증폭량이 확인되었다. pΔBN.AR1을 사용한 경우와 pC12.Psv40을 사용한 경우는 유전자 증폭량은 거의 동등함에도 불구하고, 항체생산량은 pC12.Psv40 쪽이 높다는 흥미로운 결과가 얻어졌다. 이 결과는 pΔBN.AR1(8916bp)에 비해 pC12.Psv40(4920bp) 쪽이, 벡터 사이즈가 작기 때문에 유전자 도입효율이 높았던 것으로 발명자들에 의해 추정된다.

한계 희석법을 이용하여 클로닝한 결과를, 도 10 및 도 11과 표 3 및 표 4에 나타내었다. 도 10 및 표 3은 pC12.Psv40을 코트랜스펙션한 경우의 각 클론에 대해 항체 단백질의 생산량을 나타내는 막대 그래프 및 표이다. 또한, 도 11 및 표 4는 pΔBN.AR1을 코트랜스펙션한 경우의 각 클론에 대해 항체 단백질의 생산량을 나타내는 막대 그래프 및 표이다.

pΔBN.AR1을 코트랜스펙션한 경우에 비해, pC12.Psv40을 코트랜스펙션한 경우에는 높은 항체 단백질 생산능력을 갖는 클론을 높은 확률로 수득할 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명에 따른 벡터(IR/MAR 플라스미드)는 IR의 전장 대신에 유전자 증폭활성을 갖는 IR의 부분 단편을 포함하고 있는 것이다. 따라서, 종래의 고도 유전자 증폭시스템에서 사용되었었던 IR/MAR 플라스미드에 비해 사이즈가 작다.

그 때문에, 본 발명에 따른 벡터, 및 그것을 이용하는 본 발명에 따른 방법에 의하면, 다음과 같은 이점을 가질 수 있다.

(A) 포유동물세포로의 유전자 도입효율이 더욱 향상된다.

(B) 사이즈가 더 큰 목적 유전자를 고도 유전자 증폭시스템으로 적용하는 것이 가능하게 된다.

(C) 태그 단백질이나 시그널 펩티드 등의 기타 요소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 IR/MAR 플라스미드에 용이하게 도입할 수 있게 되어, 보다 복잡한 벡터를 구축하는 것도 가능하게 된다.

또한, 본 발명에 따르면,

(D) 전장의 IR을 이용한 종래법보다도 HSR의 발생빈도가 현저하게 향상되는, 즉 유전자의 증폭효율이 향상되는, 당업자가 예상할 수 있는 이상의 효과를 얻을 수 있다.

또한, 본 발명에 따르면,

(E) 본 발명을 실시한 경우와 전장의 IR을 이용한 경우가 같은 정도의 유전자 증폭량이었다고 할지라도, 본 발명을 실시한 경우에는 단백질의 생산량이 높아진다는, 당업자가 예상할 수 있는 이상의 효과를 얻을 수 있다.

따라서, 본 발명에 따르면, 종래의 고도 유전자 증폭시스템에 비해, 여러 가지 광범위한 목적 유전자를 효율적으로 증폭할 수 있으며, 나아가 해당 유전자가 코딩하는 목적 단백질을 대량으로 생산하는 것이 가능하게 된다.

발명의 상세한 설명의 항에서 이루어진 구체적인 실시형태 또는 실시예는 어디까지나 본 발명의 기술내용을 분명히 밝히는 것으로서, 그와 같은 구현예에만 한정하여 협의로 해석되어서는 안 되며, 본 발명의 정신과 다음에 기재할 청구범위 내에서 다양하게 변경하여 실시할 수 있는 것이다.

상술한 바와 같이, 본 발명에 의한 방법에 따르면, IR의 부분 단편을 포함하는 고도 유전자 증폭시스템을 이용하여 목적 유전자의 증폭을 유도하는 것이 가능하게 된다. 그 때문에, 본 발명에 따르면, 원하는 단백질(예를 들면, 유용 단백질)을 대량으로 생산할 수 있다.

따라서, 본 발명은 단백질을 생산하는 산업, 예를 들면 의약품, 화학, 식품, 화장품, 섬유 등 여러 광범위한 산업에서 이용가능하다.

<110> Hiroshima University <120> METHOD FOR HIGHLY AMPLIFYING TARGET GENE IN MAMMALIAN CELL AND VECTOR THEREFOR <130> IPA090059 <150> JP2006-228396 <151> 2006-08-24 <160> 115 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 259 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 tctttcttcg gaccttctgc agccaacctg aaagaataac aaggaggtgg ctggaaactt 60 gttttaagga accgcctgtc cttcccccgc tggaaacctt gcacctcgga cgctcctgct 120 cctgccccca cctgaccccc gccctcgttg acatccaggc gcgatgatct ctgctgccag 180 tagagggcac acttacttta ctttcgcaaa cctgaacgcg ggtgctgccc agagaggggg 240 cggagggaaa gacgctttg 259 <210> 2 <211> 243 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 tgttttttgt ttttcatgcc gtggaataac acaaaataaa aaatcccgag ggaatataca 60 ttatatatta aatatagatc atttcaggga gcaaacaaat catgtgtggg gctgggcaac 120 tagctgagtc gaagcgtaaa taaaatgtga atacacgttt gcgggttaca tacagtgcac 180 tttcactagt attcagaaaa aattgtgagt cagtgaacta ggaaattaat gcctggaagg 240 cag 243 <210> 3 <211> 799 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 tctttcttcg gaccttctgc agccaacctg 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cacacagaga 3000 gagagagaga gagagagaga gagagagaga gagagagggg ggggggcaga cagacagaca 3060 gagggagaga ggcagaga 3078 <210> 16 <211> 3087 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 16 gggattaaag gcgtgtacca ccaacgctcg gcctgtctgt gaatatttaa aatgaaaact 60 ttggaaatgt tctgaaacca gctggtgtca gatagtcaga gaactttcgt aaggtaggtg 120 tgggttatag cataatccca cacaagaggc tgaagcagga ggattttgtg tttgagggca 180 gctagagcca catggtgagt ccctgcctca aaacacaaaa gcaagacaaa aacaagctcc 240 aaataagatt cactgggccc tttctttcct tccttctcag tgagtccact tgctttaaaa 300 tcaggtctta aagacgcact agatgctgaa cttaacagta ataataaata tcttctctta 360 cagtacagat tatgctctat aaacactgca ctgataaagt tcagccttaa cctttgttct 420 gtaaatgttt cctagttttt ctactgccgt attataagac aaatgtcagc atgaaggcag 480 gtttttcaga aaacacagca gctccacaga tggcctctaa tccataatca ttaaagacaa 540 gactgcaact ttttcaactg gaaatcattc aagatgtttt tctgaagtcc ctaccaggac 600 acaagccacc ctggttgctg tgtgacatca gttaggtaga ctctgaactg gcttcccaag 660 aaattataca aaagcaaggt gtcacctagt attagcataa cttctgataa 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30 <210> 18 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 18 ggccggtacc ggccgctatc gtccattccg a 31 <210> 19 <211> 1357 <212> DNA <213> Herpes simplex virus <400> 19 ggccggtacc ggccgctatc gtccattccg acagcatcgc cagtcactat ggcgtgctgc 60 tagcgctata tgcgttgatg caatttctat gcgcacccgt tctcggagca ctgtccgacc 120 gctttggccg ccgcccagtc ctgctcgctt cgctacttgg agccactatc gactacgcga 180 tcatggcgac cacacccgtc ctgtggatcc gtttggacaa accacaacta gaatgcagtg 240 aaaaaaatgc tttatttgtg aaatttgtga tgctattgct ttatttgtaa ccattataag 300 ctgcaataaa caagttaaca acaacaattg cattcatttt atgtttcagg ttcaggggga 360 ggtgtgggag gttttttaaa gcaagtaaaa cctctacaaa tgtggtatgg ctgattatga 420 tcctgcctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct gacacatgca gctcccggag 480 acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac aagcccgtca gggcgcgtca 540 gcgggtgttg gcgggtgtcg gggcgcagcc atgacccagt cacgtatcga ctagcttggc 600 acgccagaaa tccgcgcggt ggtttttggg ggtcgggggt gtttggcagc cacagacgcc 660 cggtgttcgt gtcgcgccag tacatgcggt ccatgcccag gccatccaaa aaccatgggt 720 ctgtctgctc agtccagtcg tggaccagac cccacgcaac gcccaaaata ataaccccca 780 cgaaccataa accattcccc atgggggacc ccgtccctaa cccacggggc cagtggctat 840 ggcagggcct gccgccccga cgttggctgc gagccctggg ccttcacccg aacttggggg 900 gtggggtggg gaaaaggaag aaacgcgggc gtattggccc caatggggtc tcggtggggt 960 atcgacagag tgccagccct gggaccgaac cccgcgttta tgaacaaacg acccaacacc 1020 cgtgcgtttt attctgtctt tttattgccg tcatagcgcg ggttccttcc ggtattgtct 1080 ccttccgtgt ttcagttagc ctcccccatc tcccctattc ctttgccctc ggacgagtgc 1140 tggggcgtcg gtttccacta tcggcgagta cttctacaca gccatcggtc cagacggccg 1200 cgcttctgcg ggcgatttgt gtacgcccga cagtcccggc tccggatcgg acgattgcgt 1260 cgcatcgacc ctgcgcccaa gctgcatcat cgaaattgcc gtcaaccaag ctctgataga 1320 gttggtcaag accaatgcgg agcatatggt accggcc 1357 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 20 cacccacgat ctttgtgaag 20 <210> 21 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 21 atcgactacg cgatcatgg 19 <210> 22 <211> 900 <212> DNA <213> Simian Virus 40 <400> 22 cacccacgat ctttgtgaag gaaccttact tctgtggtgt gacataattg gacaaactac 60 ctacagagat ttaaagctct aaggtaaata taaaattttt aagtgtataa tgtgttaaac 120 tactgattct aattgtttgt gtattttaga ttccaaccta tggaactgat gaatgggagc 180 agtggtggaa tgcctttaat gaggaaaacc tgttttgctc agaagaaatg ccatctagtg 240 atgatgaggc tactgctgac tctcaacatt ctactcctcc aaaaaagaag agaaaggtag 300 aagaccccaa ggactttcct tcagaattgc taagtttttt gagtcatgct gtgtttagta 360 atagaactct tgcttgcttt gctatttaca ccacaaagga aaaagctgca ctgctataca 420 agaaaattat ggaaaaatat tctgtaacct ttataagtag gcataacagt tataatcata 480 acatactgtt ttttcttact ccacacaggc atagagtgtc tgctattaat aactatgctc 540 aaaaattgtg tacctttagc tttttaattt gtaaaggggt taataaggaa tatttgatgt 600 atagtgcctt gactagagat cgatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact 660 tgctttaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt 720 tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 780 tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa 840 tgtatcttat catgtctgga tccacaggac gggtgtggtc gccatgatcg cgtagtcgat 900 900 <210> 23 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 23 gggcggccgc gctggaggtc gaccagatgt c 31 <210> 24 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 24 gggcggccgc aatttaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaa 36 <210> 25 <211> 118 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 25 ggccgcgctg gaggtcgacc agatgtccga aagtgtcccc cccccccccc cccccggcgc 60 ggagcggcgg ggccactctg gactcttttt tttttttttt tttttttttt taaattgc 118 <210> 26 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 26 tgcagcaaaa tccagcatag 20 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 27 aaggagctga ctgggttgaa 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 28 tcatacacgg tgcctgactg 20 <210> 29 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 29 ctgccctcca cacagagaac 20 <210> 30 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 30 tcatacacgg tgcctgactg 20 <210> 31 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 31 cagataccgc ccctcctg 18 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 32 tcatacacgg tgcctgactg 20 <210> 33 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 33 gggcaagtgg agagcttgt 19 <210> 34 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 34 ttgcgggtta catacagtgc 20 <210> 35 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 35 aaggagctga ctgggttgaa 20 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 36 ctccacttgc cccttttagg 20 <210> 37 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 37 aaggagctga ctgggttgaa 20 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 38 tctttcttcg gaccttctgc 20 <210> 39 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 39 cagccgagca ctctagctct 20 <210> 40 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 40 tctttcttcg gaccttctgc 20 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 41 ggaggaaaac gatgcctaga 20 <210> 42 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 42 tgcagcaaaa tccagcatag 20 <210> 43 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 43 ctgccctcca cacagagaac 20 <210> 44 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 44 ctttcccccg aattgttttc 20 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 45 cagccgagca ctctagctct 20 <210> 46 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 46 tcatacacgg tgcctgactg 20 <210> 47 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 47 tctcatcctt ggtccctcac 20 <210> 48 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 48 tgcagcaaaa tccagcatag 20 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Synthesized Primer Sequence <400> 54 tctttcttcg gaccttctgc 20 <210> 55 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 55 tctcatcctt ggtccctcac 20 <210> 56 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 56 tgcagcaaaa tccagcatag 20 <210> 57 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 57 tgccttccag gcattaattt 20 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 58 cccccgaatt gttttctctt 20 <210> 59 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 59 gggcaagtgg agagcttgt 19 <210> 60 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 60 cttggttatg ccggtactgc 20 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 61 tgaagagaca ccatgaccac a 21 <210> 62 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 62 tctctgcctc tctccctctg 20 <210> 63 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 63 ttcagcctta acctttgttc tgt 23 <210> 64 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 64 ggcatcaggt agtgagtgac aa 22 <210> 65 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 65 gggattaaag gcgtgtacca 20 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 66 ggctgaggtc ctttttgaca 20 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 67 caggcctttg agctcagact a 21 <210> 68 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 68 gaggcagggc acatacctac 20 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 69 tagtgactgg cgatgctgtc 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 70 cttggttatg ccggtactgc 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 71 gagctccaat gccctctttt 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 72 tctctgcctc tctccctctg 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 73 ccttctccct ctccctcatc 20 <210> 74 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 74 ggcatcaggt agtgagtgac aa 22 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 75 tgaagagaca ccatgaccac a 21 <210> 76 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 76 ttgggactat tctatttttg caagt 25 <210> 77 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ggcctggagg 60 caggagtaat ttgcaatcct taaagctgaa ttgtgcagtg catcggattt ggaagctact 120 atattcactt aacacttgaa cgctgagctg caaactcaac gggtaataac ccatcttgaa 180 cagcgtacat gctatacaca cacccctttc ccccgaattg ttttctcttt tggaggtggt 240 ggagggagag aaaagtttac ttaaaatgcc tttgggtgag ggaccaagga tgagaagaat 300 gttttttgtt tttcatgccg tggaataaca caaaataaaa aatcccgagg gaatatacat 360 tatatattaa atatagatca tttcagggag caaacaaatc atgtgtgggg ctgggcaact 420 agctgagtcg aagcgtaaat aaaatgtgaa tacacgtttg cgggttacat acagtgcact 480 ttcactagta ttcagaaaaa attgtgagtc agtgaactag gaaattaatg cctggaaggc 540 agccaaattt taattagctc aagactcccc ccccccccca aaaaaaggca cggaagtaat 600 actcctctcc tcttctttga tcagaatcga tgcatttttt gtgcatgacc gcatttccaa 660 taataaaagg ggaaagagga cctggaaagg aattaaacgt ccggtttgtc cggggaggaa 720 agagttaacg gtttttttca caagggtctc tgctgactcc cccggctcgg tccacaagct 780 ctccacttgc cccttttagg aagtccggtc ccgcggttcg ggtaccccct gcccctccca 840 tattctcccg tctagcacct ttgatttctc ccaaacccgg cagcccgaga ctgttgcaaa 900 ccggcgccac agggcgcaaa ggggatttgt ctcttctgaa acctggctga gaaattggga 960 actccgtgtg ggaggcgtgg gggtgggacg gtggggtaca gactggcaga gagcaggcaa 1020 cctccctctc gccctagccc agctctggaa caggcagaca catctcaggg ctaaacagac 1080 gcctcccgca cggggcccca cggaagcctg agcaggcggg gcaggagggg cggtatctgc 1140 tgctttggca gcaaattggg ggactcagtc tgggtggaag gtatccaatc cagatagctg 1200 tgcatacata atgcataata catgactccc cccaacaaat gcaatgggag tttattcata 1260 acgcgctctc caagtatacg tggcaatgcg ttgctgggtt attttaatca ttctaggcat 1320 cgttttcctc cttatgcctc tatcattcct ccctatctac actaacatcc cacgctctga 1380 acgcgcgccc attaataccc ttctttcctc cactctccct gggactcttg atcaaagcgc 1440 ggccctttcc ccagccttag cgaggcgccc tgcagcctgg tacgcgcgtg gcgtggcggt 1500 gggcgcgcag tgcgttctct gtgtggaggg cagctgttcc gcctgcgatg atttatactc 1560 acaggacaag gatgcggttt gtcaaacagt actgctacgg aggagcagca gagaaaggga 1620 gagggtttga gagggagcaa aagaaaatgg taggcgcgcg tagttaattc atgcggctct 1680 cttactctgt ttacatccta gagctagagt gctcggctgc ccggctgagt ctcctcccca 1740 ccttccccac cctccccacc ctccccataa gcgcccctcc cgggttccca aagcagaggg 1800 cgtgggggaa aagaaaaaag atcctctctc gctaatctcc gcccaccggc cctttataat 1860 gcgagggtct ggacggctga ggacccccga gctgtgctgc tcgcggccgc caccgccggg 1920 ccccggccgt ccctggctcc cctcctgcct cgaccgatgc ccttgagagc cttcaaccca 1980 gtcagctcct t 1991 <210> 83 <211> 2034 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 tcatacacgg tgcctgactg cgttagcaat ttaactgtga taaactaccg cattaaagct 60 tgtttggccg ttttagggtt tgttggaatt tttttttcgt ctatgtactt gtgaattatt 120 tcacgtttgc cattaccggt tctccatagg gtgatgttca ttagcagtgg tgataggtta 180 attttcacca tctcttatgc ggttgaatag tcacctctga accacttttt cctccagtaa 240 ctcctctttc ttcggacctt ctgcagccaa cctgaaagaa taacaaggag gtggctggaa 300 acttgtttta aggaaccgcc tgtccttccc ccgctggaaa ccttgcacct cggacgctcc 360 tgctcctgcc cccacctgac ccccgccctc gttgacatcc aggcgcgatg atctctgctg 420 ccagtagagg gcacacttac tttactttcg caaacctgaa cgcgggtgct gcccagagag 480 ggggcggagg gaaagacgct ttgcagcaaa atccagcata gcgattggtt gctccccgcg 540 tttgcggcaa 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600 ttctccactc acttcaccgg ttttttaggt ctgtttaaat cagggaaact tagttgtcat 660 gcttataaaa gaaatagcta cagatttctt aaaatactaa gctctcttta acagtttata 720 gttttcttaa aatgttaatt gaagagtaat gcgtgtcaag aaggcgggac atattttgta 780 tttgtgtttc agaggctgag gtcctttttg acattttgat ttttatttcc ttctgagtgc 840 tatgatagta tggacttctc tccagtgaca atgaagattt atcttttgag tctgtttctg 900 ttgtgcttta gtgatagggc cttttataat gaatattctt gttttatcat tctaggaatt 960 gtccttgtat catgttcttg gtgatttatt tattttgttt actttttggg actattctat 1020 ttttgcaagt taatgtttta ggttaatcat atgcacaata tgattttctt attattcatg 1080 tctttgatgt ttatgttttt ctacttttag taagatttca tcagatttgt cattccactt 1140 tataaaggat ttatactagt agcatatttc ttaatttcta agaactcttt cttggcatct 1200 gaatattctt tttgtgtagc acagtctagt cttttataaa atttctttga tttctttaag 1260 attatcaaaa acatcacact gaggcagggc acatacctac aatactaaca ctcagaagct 1320 agaaacagga agctctagag tttcagacaa gcttaggatt cctagcaaga acctatagaa 1380 acttagttga aagttatctc ttgttttcat tatatttgaa ttcatatttt ctgtgccaca 1440 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Cricetulus griseus <400> 101 ggcatcaggt agtgagtgac aagtgagctt gctttctagt ttccaccatg tgagagtgta 60 gtacctagac ttagtgtcct ggactgaggc tccagaactg agagaaatac atttctgttc 120 tttataaatt tcccagagtt caggataaaa tggatgaaga ccttgccttt actgggagca 180 gtcatgtggg atgctgtctt cgtatcccct ttctccactc acttcaccgg ttttttaggt 240 ctgtttaaat cagggaaact tagttgtcat gcttataaaa gaaatagcta cagatttctt 300 aaaatactaa gctctcttta acagtttata gttttcttaa aatgttaatt gaagagtaat 360 gcgtgtcaag aaggcgggac atattttgta tttgtgtttc agaggctgag gtcctttttg 420 acattttgat ttttatttcc ttctgagtgc tatgatagta tggacttctc tccagtgaca 480 atgaagattt atcttttgag tctgtttctg ttgtgcttta gtgatagggc cttttataat 540 gaatattctt gttttatcat tctaggaatt gtccttgtat catgttcttg gtgatttatt 600 tattttgttt actttttggg actattctat ttttgcaagt taatgtttta ggttaatcat 660 atgcacaata tgattttctt attattcatg tctttgatgt ttatgttttt ctacttttag 720 taagatttca tcagatttgt cattccactt tataaaggat ttatactagt agcatatttc 780 ttaatttcta agaactcttt cttggcatct gaatattctt tttgtgtagc 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atcatatgca caatatgatt 60 ttcttattat tcatgtcttt gatgtttatg tttttctact tttagtaaga tttcatcaga 120 tttgtcattc cactttataa aggatttata ctagtagcat atttcttaat ttctaagaac 180 tctttcttgg catctgaata ttctttttgt gtagcacagt ctagtctttt ataaaatttc 240 tttgatttct ttaagattat caaaaacatc acactgaggc agggcacata cctacaatac 300 taacactcag aagctagaaa caggaagctc tagagtttca gacaagctta ggattcctag 360 caagaaccta tagaaactta gttgaaagtt atctcttgtt ttcattatat ttgaattcat 420 attttctgtg ccacattttc aaaacctcaa atctattgga agaaggactc ttccaaaatt 480 caagtgttat gtttggtgtg gtggttcatg cctttaattc cagcacgtgg gaggcaaagg 540 taagtgagtc tctctgagtt caaggccaac ctgaactatg tgatgaattc catgccctgt 600 ctcaaaaaaa tattttagta ataatagagt atttagtttc atgagctgat tggtcatttg 660 ctcattctta aagcaggtgc tgcccaagga aaccagagtt gccatggttt tctgtttggt 720 tttgggaggg gatcattatt gtcccctggc attagctgag gagccagctc cacgaggact 780 gcttgagaag accaaccttt caaaggaagt taagatgcta tcagtaaaat aaatccttta 840 ggatatagga tatcctaaaa ggaacataat actttgacac aggacctggc acaaaggttt 900 tctttggctg gtttcaggcc agtgtttaga tgctggtagt gtccagttac acataagggc 960 agagcagcca caaaaattcc aagacaatgt cacttcttta aaaaaaaaag gaaaaaagat 1020 ttattttatt tttatatgca taaatatttg cctgaatata tatatatata tatatatata 1080 tatatatata tatatatata tagtgttcct ggttcccatg gaagccaaaa gagggcattg 1140 gagctcctag aactggactt aaaactaatt ttggccaggt gttggtggtg catgccttta 1200 atcccagcac tcgggaggca aaggcaggca gatctctgtg agttcgaggc cagcctggtc 1260 tccagagcga gtgccaggat aggctccaaa gctacacaga gaaaccctgt cttgaaaaaa 1320 aacctaaaaa acaaaaaact agttttgatg agggagaggg agaagggatt gacatgtaaa 1380 gcaagcttct tcctaatttg aactaataat aataataaaa aaactagttt tgagtcattt 1440 tatgggcttt taagactatt tactaagtct catcagaaat agcaagctgg ggtataagct 1500 accttgtagc tttggtggtt tgaatgaaaa tggccccata ggctcagagt gagtggaggt 1560 gtggccttgt tggaagaagt gtgtcaatct gatatagaac tctcatctac ttctccagca 1620 ccatgtctgc ctgtgggcca ccatacttcc tgcaatcatg acaatggatt aaacctctga 1680 actgtaagct ggacccaata attgctttcc tttataagag tttctgtggt catggtgtct 1740 cttcacagca atagaaaccc cagctaagac agtagttatc agaagttatg ctaatactag 1800 gtgacacctt gcttttgtat aatttcttgg gaagccagtt cagagtctac ctaactgatg 1860 tcacacagca accagggtgg cttgtgtcct ggtagggact tcagaaaaac atcttgaatg 1920 atttccagtt gaaaaagttg cagtcttgtc tttaatgatt atggattaga ggccatctgt 1980 ggagctgctg tgttttctga aaaacctgcc ttcatgctga catttgtctt ataatacggc 2040 agtagaaaaa ctaggaaaca tttacagaac aaaggttaag gctgaacttt atcagtgcag 2100 tgtttataga gcataatctg tactgtaaga gaagatattt attattactg ttaagttcag 2160 catctagtgc gtctttaaga cctgatttta aagcaagtgg actcactgag aaggaaggaa 2220 agaaagggcc cagtgaatct tatttggagc ttgtttttgt cttgcttttg tgttttgagg 2280 cagggactca ccatgtggct ctagctgccc tcaaacacaa aatcctcctg cttcagcctc 2340 ttgtgtggga ttatgctata acccacacct accttacgaa agttctctga ctatctgaca 2400 ccagctggtt tcagaacatt tccaaagttt tcattttaaa tattcacaga caggccgagc 2460 gttggtggta cacgccttta atccc 2485 <210> 108 <211> 2371 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 108 tgtggtggtt catgccttta attccagcac gtgggaggca aaggtaagtg agtctctctg 60 agttcaaggc caacctgaac tatgtgatga attccatgcc ctgtctcaaa aaaatatttt 120 agtaataata gagtatttag tttcatgagc tgattggtca tttgctcatt cttaaagcag 180 gtgctgccca aggaaaccag agttgccatg gttttctgtt tggttttggg aggggatcat 240 tattgtcccc tggcattagc tgaggagcca gctccacgag gactgcttga gaagaccaac 300 ctttcaaagg aagttaagat gctatcagta aaataaatcc tttaggatat aggatatcct 360 aaaaggaaca taatactttg acacaggacc tggcacaaag gttttctttg gctggtttca 420 ggccagtgtt tagatgctgg tagtgtccag ttacacataa gggcagagca gccacaaaaa 480 ttccaagaca atgtcacttc tttaaaaaaa aaaggaaaaa agatttattt tatttttata 540 tgcataaata tttgcctgaa tatatatata tatatatata tatatatata tatatatata 600 tatatagtgt tcctggttcc catggaagcc aaaagagggc attggagctc ctagaactgg 660 acttaaaact aattttggcc aggtgttggt ggtgcatgcc tttaatccca gcactcggga 720 ggcaaaggca ggcagatctc tgtgagttcg aggccagcct ggtctccaga gcgagtgcca 780 ggataggctc caaagctaca cagagaaacc ctgtcttgaa aaaaaaccta aaaaacaaaa 840 aactagtttt gatgagggag agggagaagg gattgacatg taaagcaagc ttcttcctaa 900 tttgaactaa taataataat aaaaaaacta gttttgagtc attttatggg cttttaagac 960 tatttactaa gtctcatcag aaatagcaag ctggggtata agctaccttg tagctttggt 1020 ggtttgaatg aaaatggccc cataggctca gagtgagtgg aggtgtggcc ttgttggaag 1080 aagtgtgtca atctgatata gaactctcat ctacttctcc agcaccatgt ctgcctgtgg 1140 gccaccatac ttcctgcaat catgacaatg gattaaacct ctgaactgta agctggaccc 1200 aataattgct ttcctttata agagtttctg tggtcatggt gtctcttcac agcaatagaa 1260 accccagcta agacagtagt tatcagaagt tatgctaata ctaggtgaca ccttgctttt 1320 gtataatttc ttgggaagcc agttcagagt ctacctaact gatgtcacac agcaaccagg 1380 gtggcttgtg tcctggtagg gacttcagaa aaacatcttg aatgatttcc agttgaaaaa 1440 gttgcagtct tgtctttaat gattatggat tagaggccat ctgtggagct gctgtgtttt 1500 ctgaaaaacc tgccttcatg ctgacatttg tcttataata cggcagtaga aaaactagga 1560 aacatttaca gaacaaaggt taaggctgaa ctttatcagt gcagtgttta tagagcataa 1620 tctgtactgt aagagaagat atttattatt actgttaagt tcagcatcta gtgcgtcttt 1680 aagacctgat tttaaagcaa gtggactcac tgagaaggaa ggaaagaaag ggcccagtga 1740 atcttatttg gagcttgttt ttgtcttgct tttgtgtttt gaggcaggga ctcaccatgt 1800 ggctctagct gccctcaaac acaaaatcct cctgcttcag cctcttgtgt gggattatgc 1860 tataacccac acctacctta cgaaagttct ctgactatct gacaccagct ggtttcagaa 1920 catttccaaa gttttcattt taaatattca cagacaggcc gagcgttggt ggtacacgcc 1980 tttaatccca gcactcggga ggcagaggca ggcggatctc tgagagttca aggtcagcct 2040 ggtctccaga gcaagtgcca ggataggctc caaagctaca cagagaaaaa caaaaaaaaa 2100 aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaacaagaa aaaaaagaaa aatattcaca gacaggaaga 2160 aaataacgat gtgatggcat tttatgtcct cggtattagt tctccaaagt gacagaatca 2220 aaagaatgac ccgagtgatg gtcagatttg aattggttca tatgatcatt aagtctgtca 2280 ggtgttaagt gtgaagactg ccatggacat tcatcaagct ggaaagctca gagaacctgt 2340 gagttctgtc tagtctgagc tcaaaggcct g 2371 <210> 109 <211> 2495 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 109 tttctttggc tggtttcagg ccagtgttta gatgctggta gtgtccagtt acacataagg 60 gcagagcagc cacaaaaatt ccaagacaat gtcacttctt taaaaaaaaa aggaaaaaag 120 atttatttta tttttatatg cataaatatt tgcctgaata tatatatata tatatatata 180 tatatatata tatatatata tatagtgttc ctggttccca tggaagccaa aagagggcat 240 tggagctcct agaactggac ttaaaactaa ttttggccag gtgttggtgg tgcatgcctt 300 taatcccagc actcgggagg caaaggcagg cagatctctg tgagttcgag gccagcctgg 360 tctccagagc gagtgccagg ataggctcca aagctacaca gagaaaccct gtcttgaaaa 420 aaaacctaaa aaacaaaaaa ctagttttga tgagggagag ggagaaggga ttgacatgta 480 aagcaagctt cttcctaatt tgaactaata ataataataa aaaaactagt tttgagtcat 540 tttatgggct tttaagacta tttactaagt ctcatcagaa atagcaagct ggggtataag 600 ctaccttgta gctttggtgg tttgaatgaa aatggcccca taggctcaga gtgagtggag 660 gtgtggcctt gttggaagaa gtgtgtcaat ctgatataga actctcatct acttctccag 720 caccatgtct gcctgtgggc caccatactt cctgcaatca tgacaatgga ttaaacctct 780 gaactgtaag ctggacccaa taattgcttt cctttataag agtttctgtg gtcatggtgt 840 ctcttcacag caatagaaac cccagctaag acagtagtta tcagaagtta tgctaatact 900 aggtgacacc ttgcttttgt ataatttctt gggaagccag ttcagagtct acctaactga 960 tgtcacacag caaccagggt ggcttgtgtc ctggtaggga cttcagaaaa acatcttgaa 1020 tgatttccag ttgaaaaagt tgcagtcttg tctttaatga ttatggatta gaggccatct 1080 gtggagctgc tgtgttttct gaaaaacctg ccttcatgct gacatttgtc ttataatacg 1140 gcagtagaaa aactaggaaa catttacaga acaaaggtta aggctgaact ttatcagtgc 1200 agtgtttata gagcataatc tgtactgtaa gagaagatat ttattattac tgttaagttc 1260 agcatctagt gcgtctttaa gacctgattt taaagcaagt ggactcactg agaaggaagg 1320 aaagaaaggg cccagtgaat cttatttgga gcttgttttt gtcttgcttt tgtgttttga 1380 ggcagggact caccatgtgg ctctagctgc cctcaaacac aaaatcctcc tgcttcagcc 1440 tcttgtgtgg gattatgcta taacccacac ctaccttacg aaagttctct gactatctga 1500 caccagctgg tttcagaaca tttccaaagt tttcatttta aatattcaca gacaggccga 1560 gcgttggtgg tacacgcctt taatcccagc actcgggagg cagaggcagg cggatctctg 1620 agagttcaag gtcagcctgg tctccagagc aagtgccagg ataggctcca aagctacaca 1680 gagaaaaaca aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aacaagaaaa aaaagaaaaa 1740 tattcacaga caggaagaaa ataacgatgt gatggcattt tatgtcctcg gtattagttc 1800 tccaaagtga cagaatcaaa agaatgaccc gagtgatggt cagatttgaa ttggttcata 1860 tgatcattaa gtctgtcagg tgttaagtgt gaagactgcc atggacattc atcaagctgg 1920 aaagctcaga gaacctgtga gttctgtcta gtctgagctc aaaggcctga gaactatgag 1980 agaggcagac ttttctattc cagctgtcat ctagttggac aaagcccatg cccattggga 2040 tggacaatgt attttaccca gcatactaat ctaaatgttt atgtcatcca aaactatcct 2100 tacgtgcacc cagaatggtt taccaagtgt ctgtacctct gtgccccact caagttgtca 2160 cataatatta accatcacat ctgtattagt tgtgtattac tgcacagtag cataaccaga 2220 aatgcagcag cctagacaca atacatattt actatatcac taaggctttg tgtgttggga 2280 ttctggcatg gcttatctgc atcctattct tgggacctca aaagactgca taaggtgcca 2340 tgcaggtctg tgactcatct gagacttggc tgggaaggag ccacacaatg gattcctttg 2400 tgtctataaa attaagggct tcagttcctt gctgactccg agctaggagg atccgcggcc 2460 gctatcgtcc attccgacag catcgccagt cacta 2495 <210> 110 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 110 gaattcgtcg acggggacgc gtctagag 28 <210> 111 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 111 cttaagcagc tgcccctgcg cagagctc 28 <210> 112 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 112 ggccgtcgac tcgaccaatt ctcatgtttg a 31 <210> 113 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Artificially Synthesized Primer Sequence <400> 113 ggccacgcgt agggctctgg gcttgaat 28 <210> 114 <211> 466 <212> DNA <213> Simian virus 40 <400> 114 aattcgtcga catcgataag ctagcttctg tggaatgtgt gtcagttagg gtgtggaaag 60 tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta gtcagcaacc 120 aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat gcatctcaat 180 tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac tccgcccagt 240 tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga ggccgaggcc 300 gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg cctaggcttt 360 tgcaaaaagc tccctcgagg aactggaaaa ccagaaagtt aactggtaag tttagtcttt 420 ttgtctttta tttcaggtcc cggatcgaat tgcggccgca cgcgtc 466 <210> 115 <211> 663 <212> DNA <213> Simian virus 40 <400> 115 aattcgagaa tgggcggaac tgggcggagt taggggcggg atgggcggag ttaggggcgg 60 gactatggtt gctgactaat tgagatgcat gctttgcata cttctgcctg ctggggagcc 120 tggttgctga ctaattgaga tgcatgcttt gcatacttct gcctgctggg gagcctgggg 180 actttccaca ccctaactga cacacattcc acagctgcct cgcgcgtttc ggtgatgacg 240 gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg agacggtcac agcttgtctg taagcggatg 300 ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt cagcgggtgt tggcgggtgt cggggcgcag 360 ccatgaccca gtcacgtagc gatagcggag tgtatcaggc tcgcatctct ccttcacgcg 420 cccgccgcct tacctgaggc cgccatccac gccggttgag tcgcgttctg ccgcctcccg 480 cctgtggtgc ctcctgaact acgtccgccg tctaggtaag tttagagcta ggtcgagacc 540 gggcctttgt ccggcgctcc cttggagcct acctagactc agccggctct ccacgctttg 600 cctgaccctg cttgctcaac tctacgtctt tgtttcgttt tctgttctgc gccgttacag 660 atc 663

Claims (22)

1. 목적 유전자를 증폭시키기 위한 방법으로서,

   포유동물 복제개시영역의 부분 단편이면서 유전자 증폭 활성부위를 갖는 증폭활성단편과 포유동물 핵 매트릭스 결합영역을 구비하는 벡터, 및 상기 목적 유전자를 포유동물세포에 도입하는 공정을 포함하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 포유동물 복제개시영역은 c-myc 유전자좌, 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자좌, 및 β-글로빈 유전자좌의 복제개시영역 중 어느 하나에서 유래하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 증폭활성단편은 c-myc 유전자좌에서 유래하며, 듀플렉스 언와인딩 요소(Duplex Unwinding Element)와 토포아이소머라제Ⅱ 결합영역을 적어도 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 증폭활성단편은 c-myc 유전자좌에서 유래하며, 하기 (a)의 폴리뉴클레오티드와 하기 (b)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법:

   (a) 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드;

   (b) 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드.
5. 제3항에 있어서, 상기 증폭활성단편은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 제3항에 있어서, 상기 증폭활성단편은 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
7. 제3항에 있어서, 상기 증폭활성단편은 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 5로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 증폭활성단편은 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자좌에서 유래하며, 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 10으로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제1항에 있어서, 상기 증폭활성단편은 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자좌에서 유래하며, 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 염기서열 11로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 핵 매트릭스 결합 영역은 Igκ 유전자좌, SV40 초기영역, 및 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자좌의 핵 매트릭스 결합영역 중 어느 하나에서 유래하는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 목적 유전자와 상기 벡터를 트랜스에 배치하여 포유동물세포에 도입하는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 목적 유전자를 포유동물세포 내에서 증폭시키기 위한 벡터로서,

    포유동물 복제개시영역의 부분 단편이면서 유전자 증폭활성부위를 갖는 증폭활성단편, 및 포유동물 핵 매트릭스 결합영역을 구비하는 벡터.
13. 제12항에 있어서, 상기 포유동물 복제개시영역은 c-myc 유전자좌, 디하이드로폴레이트 환원효소, 및 β-글로빈 유전자좌의 복제개시영역 중 어느 하나에서 유래하는 것을 특징으로 하는 벡터.
14. 제12항에 있어서, 상기 증폭활성단편은 c-myc 유전자좌에서 유래하며, 듀플렉스 언와인딩 요소(Duplex Unwinding Element)와 토포아이소머라제Ⅱ 결합영역을 적어도 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
15. 제12항에 있어서, 상기 증폭활성단편은 c-myc 유전자좌에서 유래하며, 하기 (a)의 폴리뉴클레오티드와 하기 (b)의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터:

    (a) 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 1로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드;

    (b) 서열번호 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 2로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드.
16. 제12항에 있어서, 상기 증폭활성단편은 서열번호 3으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 3으로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
17. 제12항에 있어서, 상기 증폭활성단편은 서열번호 4로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 4로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
18. 제12항에 있어서, 상기 증폭활성단편은 서열번호 5로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 5로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
19. 제12항에 있어서, 상기 증폭활성단편은 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자좌에서 유래하며, 서열번호 10으로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 10으로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
20. 제12항에 있어서, 상기 증폭활성단편은 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자좌에서 유래하며, 서열번호 11로 표시되는 염기서열로 이루어진 폴리뉴클레오티드, 또는 서열번호 11로 표시되는 염기서열에서 하나 또는 수 개의 염기가 결실, 치환, 혹은 부가된 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
21. 제12항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 포유동물 핵 매트릭스 결합영역은 Igκ 유전자좌, SV40 초기영역, 및 디하이드로폴레이트 환원효소 유전자좌의 핵 매트릭스 결합영역 중 어느 하나에서 유래하는 것을 특징으로 하는 벡터.
22. 제12항 내지 제21항 중 어느 한 항의 벡터와, 목적 유전자가 포유동물세포에 도입된 형질전환세포.

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