CN108200885B - 受限制的免疫球蛋白重链基因座 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了具有受限制的免疫球蛋白重链基因座的小鼠，其中所述基因座的特征为具有单一多态性人源VH基因区段、多个人源DH基因区段和多个JH基因区段。本发明提供了制备与抗原(例如病毒抗原)结合的抗体序列的方法，包括使用所关注的抗原免疫小鼠，其中所述小鼠在内源性免疫球蛋白重链基因座包含单一人源VH基因区段、多个人源DH基因区段和多个JH基因区段。
Description
本申请为申请日为2012年10月17日，申请号为201280062449.X的中国申请的分案申请。原申请要求申请日为2011年10月17日的美国临时专利申请号61/547,974、申请日为的2012年2月13日的美国临时专利申请号61/597,969以及申请日为2012年6月12日的美国临时专利申请号61/658,459的优先权，其全部内容通过引用并入本申请。
发明领域
基因修饰免疫球蛋白重链可变(V)区基因座(或在转基因中)以从受限数量的免疫球蛋白重链可变(VH)区段(或单一VH区段)和/或其变体中制备抗体的非人动物。具有来源于单一免疫球蛋白重链可变基因区段例如人源免疫球蛋白VH1-69基因区段或人源VH1-2基因区段的重链可变结构域的非人动物。在非人动物中制备用于与病原体包括人病原体结合的抗体序列的方法。
背景技术
非人动物例如小鼠已经被基因修饰为制备抗体序列方法中的有用工具，其中抗体序列用于抗体依赖的人体治疗。具有人源化可变区基因座(例如VH、DH和JH基因以及VL和JL基因)的小鼠可以用于生成在抗体治疗中使用的同源重链和轻链可变结构域。可以获得其他小鼠用于生成具有同源重链和轻链的全人源抗体。
人体抗体治疗是基于针对某些预定抗原的所需特性设计的。使用预定抗原免疫人源化小鼠，并且使用经免疫的小鼠生成抗体群以便从中鉴定具有所需结合特性的高亲和性同源重链和轻链可变结构域。一些人源化小鼠，例如仅在内源性小鼠基因座的可变区人源化的小鼠，产生在特征和数量上与野生型小鼠B细胞群类似的B细胞群。结果，在这些用于筛选抗体的小鼠中获得了极为大量和多样性的B细胞群。这些B细胞群反映出大量不同免疫球蛋白的重排，并可以从中鉴定具有最为需要特性的重链和轻链可变结构域。
但并不是所有抗原激发的免疫应答均显示出来自各种可变(V)区段的非常大量的重排。也就是说，人体对某些抗原的体液免疫应答明显受到了限制。这种限制反映为对B细胞的克隆选择，即选择那些仅表达某些对特定抗体具有非常高的亲和性和特异性结合的V区段的B细胞。这种抗原中的一些具有临床意义，即大量公知的人类病原体。有一种假设，在人免疫应答中表达的V区段是这样一种V区段，当其与人源D和人源J区段结合，较之在针对该抗原的人源抗体应答中未观察到的随机选择的V区段，更有可能生成有用的高亲和性抗体。
根据一种假说，几千年以来的自然选择已经选择出了最有效的基础，根据其可以设计出用于中和人类病原体最有效的武器——克隆选定的V区段。本领域中需要更多和更优越的用于结合和/或中和抗原(如上文所述的病原体)的抗体。需要更加迅速地由所选定的V区段生成有用的序列，选定的V区段包括多态性和/或体细胞突变选定的V区段，以及更加迅速地生成有用的B细胞群，其具有带多种D和J区段的V区段的重排，包括该重排的体细胞突变版本，并且特别是具有独特的和有用的CDR3的重排。需要一种生物系统例如非人动物(例如小鼠、大鼠、家兔等)，其能够从预定的V区段生成与例如现有经修饰的动物所能达到的相比更大数量和种类的具有治疗用途的抗体可变区序列。需要一种改造过的生物系统，其针对来源于受限制的、预定V区段的克隆选择抗体的可变序列具有定型的体液免疫系统，所述预定的V区段包括但不限于同源的人源重链和轻链可变结构域，所述系统可用于生产针对所选抗原(包括某些人类病原体)的人源抗体依赖的治疗剂。
在本领域中需要一种能够中和病毒抗原例如HIV和HCV的治疗性抗体，包括抗原特异性抗体，其含有来源于单一人源可变区段的重链，以及由所选定的治疗性抗体序列生产多样性来源抗体的系统。还需要用于制备有用抗体的进一步的方法和非人动物，所述抗体包括来源于单一人源VH区段并且具有多样性CDR序列集合的重链库，并且包括表达同源的人源轻链可变结构域的这种重链。还需要用于选择基于免疫球蛋白的结合蛋白的CDR的方法，该结合蛋白提供更多的供选择的结合蛋白的多样性，以及更多的免疫球蛋白可变结构域的多样性，其包括用于生成体细胞突变并克隆选择的免疫球蛋白可变结构域的组合物和方法，这些免疫球蛋白可变结构域可以在例如制备人用治疗剂中使用。
发明概述
本申请提供了一种基因修饰的免疫球蛋白基因座，所述基因座包含具有有限数量的不同重链可变区基因区段(即V基因、VH基因、VH基因区段或V基因区段)，例如不超过一个、两个或三个不同的V基因；或者不超过一个V基因区段家族成员以例如单一拷贝或多个拷贝中和/或包含一种或多种多态性存在。
本申请提供了一种基因座，所述基因座能够重排并且形成编码重链可变结构域的基因，所述基因来源于受限制的(例如是单一VH基因区段或选自多个单一VH基因区段的多态性变体)VH基因库。本申请提供了一种经修饰的免疫球蛋白基因座，其包括了包含人源免疫球蛋白序列的基因座，例如可操作地与人源或者(或人源/非人源嵌合)非人源免疫球蛋白恒定序列(并且与例如D和/或J区段可操作地连接)连接的人源V区段。本申请提供了一种经修饰的基因座，所述基因座包括单一VH基因区段的多个拷贝，其中一个或多个拷贝可以包含多态性的变体。提供了一种经修饰的基因座，所述基因座包括单一VH区段的多个拷贝，其可操作地与一个或多个D区段以及一个或多个J区段连接，其可操作地与非人源免疫球蛋白恒定序列例如小鼠或大鼠序列连接。本申请还提供了一种包含这种人源化基因座的非人动物。
本申请提供了一种非人动物，所述动物具有降低的免疫球蛋白重链可变基因区段复杂性(即具有有限数量的重链可变基因区段，或具有受限制的重链可变基因库)，其中所述降低的免疫球蛋白重链可变基因区段复杂性表征为存在不超过一个或者不超过两个重链可变基因区段，并且其中所存在的重链可变基因可操作地与人源或非人源恒定区序列连接。
本申请提供了一种非人动物，所述动物具有降低的免疫球蛋白重链可变基因区段复杂性(例如单一VH基因区段，或者具有作为单一VH基因区段多态性变体的有限数量的VH基因区段)，其中所述降低的免疫球蛋白重链可变基因区段复杂性表征为存在单一VH基因区段或者多个作为单一VH基因区段多态性形式的VH基因区段(例如在人体内与高拷贝数和/或多态性相关的VH基因区段)，并且其中所存在的重链可变基因可操作地与人源或非人源恒定区序列连接。在多种实施方式中，所述存在的重链可变基因可操作地与非人动物种系中的一个或多个D和/或一个或多个J基因区段连接。
本申请提供了一种非人动物，所述动物包含免疫球蛋白重链可变基因座(例如在内源性非人动物重链可变基因座的转基因上或作为其插入或取代)，其中免疫球蛋白重链可变基因座包括可操作地与D和/或J基因区段连接的单一VH区段。在多种实施方式中，在所述非人动物的内源性免疫球蛋白重链可变基因基因座上，所述单一VH基因区段可操作地与一个或多个D和/或一个或多个J基因区段连接。
本申请提供了一种非人动物，所述动物在其免疫球蛋白重链可变区基因座被修饰以缺失全部或基本上全部(例如全部功能性区段，或几乎全部功能性区段)内源性免疫球蛋白VH区段并且在所述非人动物的内源性免疫球蛋白重链可变区基因座上包含可操作地与D和J区段或者J区段连接的人源VH1-69区段(或者人源VH1-2区段)。
本申请还提供了一种非人动物，所述动物在其免疫球蛋白重链可变区基因座被修饰以使其内源性可变区基因组不能重排形成包含内源性可变区基因区段的功能性重链；其中在所述非人动物的内源性免疫球蛋白重链可变区基因座包含可操作地与D和J区段或者J区段连接的单一人源可变基因区段(人源VH1-2或人源VH1-69基因区段)。
本申请提供了一种非人动物，所述动物包含与人源或非人源恒定区序列可操作地连接的具有有限数量的(例如不超过一个或不超过两个)重链基因区段。在一个实施方式中，所述与恒定区序列连接的不超过一个或不超过两个重链基因区段在转基因上，例如在不同于内源性重链基因座的位置上。
本申请提供了一种在非人动物中制备人源免疫球蛋白序列的方法。在多种实施方式中，所述人源免疫球蛋白序列来源于免疫球蛋白V序列库，其基本上由单一人源V区段例如VH1-69或VH1-2以及一个或多个D和J区段或者一个或多个J区段组成。本申请提供了一种在非人动物、组织和细胞中制备人源免疫球蛋白序列的方法，其中所述人源免疫球蛋白序列与病原体结合。
本申请提供了一种制备特征为具有受限制的免疫球蛋白重链基因座的小鼠的方法，其中所述限制针对免疫球蛋白VH基因区段的数量。在多种方面，所述限制是指一个或不超过两个，或者单一VH基因家族成员(例如一个或多个VH等位基因、其变体或其多态性变体)。在多种方面，所述重链基因座进一步包含一个或多个DH基因区段和一个或多个JH基因区段。在多种方面，所述VH、DH和JH基因区段是人源的。在多种方面，所述VH、DH和JH基因区段可操作地与非人源恒定区(例如IgM和/或IgG)连接。在多种方面，所述恒定区是小鼠或大鼠恒定区。
在一个方面，本申请提供了一种制备具有受限制的免疫球蛋白重链基因座的小鼠的方法，包括将如本申请所述的核酸构建体引入小鼠胚胎干(ES)细胞，并且分离或鉴定包含所述核酸构建体的小鼠ES细胞。
在一个实施方式中，所述核酸构建体包含单一人源VH基因区段、一个或多个人源DH基因区段以及一个或多个人源JH基因区段。在一个实施方式中，所述核酸构建体包含一个或多个位点特异性重组位点(例如loxP或Frt位点)。
在一个方面，本申请提供了一种使用如本申请所述的靶向载体、核酸序列或细胞制备的小鼠。在不同实施方式中，所述靶向载体、核酸序列或细胞包含含有与非人源恒定基因可操作地连接的单一人源VH基因区段(或其多态性变体)、一个或多个人源DH基因区段以及一个或多个人源JH基因区段的DNA序列。
在一个方面，本申请提供了一种制备包含受限制的免疫球蛋白重链基因座的小鼠的方法，包括使用人基因组序列取代小鼠免疫球蛋白重链基因座，所述人基因组序列包含单一人源VH基因区段(或其多态性变体)、一个或多个人源DH基因区段以及一个或多个人源JH基因区段，其中所述人源VH、DH和JH基因区段能够重排形成含有可操作地与非人源恒定区连接的人源可变结构域的嵌合重链。在一个实施方式中，所述非人源恒定区是小鼠或大鼠恒定区。
在多种方面，所述非人动物是啮齿动物。在不同的方面，所述啮齿动物是小鼠和/或大鼠。
在一个方面，本申请提供了一种经修饰的免疫球蛋白重链基因座，所述基因座包含重链V区段库，该库针对V区段的一致性是受限制的，并且所述基因座包含一个或多个D区段和一个或多个J区段，或者一个或多个J区段。在一个实施方式中，所述重链V区段是人源区段。在一个实施方式中，所述一个或多个D区段是人源D区段。在一个实施方式中，所述一个或多个J区段是人源J区段。在一个实施方式中，所述一个或多个D区段和一个或多个J区段是人源D和人源J区段。
在一个实施方式中，所述经修饰的基因座是非人源基因座。在一个实施方式中，所述非人源基因座具有至少一个人源免疫球蛋白序列被修饰的。
在一个实施方式中，所述限制是针对一种V区段家族成员的。在一个实施方式中，所述一种V区段家族成员存在于两个或多个拷贝中。在一个实施方式中，所述一种V区段家族成员以两种或多种变体形式存在(例如V区段家族成员的两种或多种多态性形式)。在一个实施方式中，所述一种V区段是一个人源V区段家族成员。在一个实施方式中，所述一种V区段家族成员存在于在针对该变体的人群中所观察到的多种变体中。在一个实施方式中，所述V区段家族成员选自表1。在一个实施方式中，所述V区段家族成员存在于所示的多种变体中，对于各V区段而言，其存在于在由1个等位基因至表1的右栏所显示的等位基因数量的多个等位基因中。
在一个实施方式中，所述限制是针对人源VH1-69基因区段的。在一个实施方式中，所述人源VH1-69基因区段存在于两个或多个拷贝中。在一个实施方式中，所述人源VH1-69基因区段以两种或多种变体形式存在(例如人源VH1-69基因的两种或多种多态性形式)。在一个实施方式中，所述人源VH1-69基因区段存在于在具有人源VH1-69基因区段的人群中所观察到的多种变体中。在一个实施方式中，所述人源VH1-69基因区段选自表2。在一个实施方式中，所述人源VH1-69基因区段存在于所示的多种变体中，对于各VH1-69基因区段而言，在由一个等位基因至表2所示等位基因数量的多个等位基因中。
在一个实施方式中，所述限制针对人源VH1-2基因区段。在一个实施方式中，所述人源VH1-2基因区段存在于两个或多个拷贝中。在一个实施方式中，所述人源VH1-2基因区段以两种或多种变体形式存在(例如人源VH1-2基因的两种或多种多态性形式)。在一个实施方式中，所述人源VH1-2基因区段存在于在具有人源VH1-2基因区段的人群中所观察到的多种变体中。在一个实施方式中，所述人源VH1-2基因区段选自表3。在一个实施方式中，所述人源VH1-2基因区段存在于所示的多种变体中，对于各VH1-2基因区段而言，在由一个等位基因至表2所示等位基因数量的多个等位基因中。
在一个方面，本申请提供了一种重链免疫球蛋白基因座，其包含单一功能性人源V区段。在一个实施方式中，所述单一功能性人源V区段选自VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1和VH7-81区段。在一个实施方式中，所述单一功能性人源V区段是VH1-69区段；在一个特定实施方式中，在人群中发现的所述单一功能性人源V区段存在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或13中多态性形式。在一个实施方式中，所述单一功能性人源V区段是VH1-2区段；在一个特定实施方式中，在人群中发现的所述单一功能性人源V区段存在1、2、3、4或5种多态性形式。
在一个实施方式中，所述重链免疫球蛋白基因座是非人动物的一个经修饰的基因座。在一个实施方式中，所述经修饰的非人源免疫球蛋白重链基因座在非人动物中存在于野生型非人动物基因组中相应的未经修饰的非人源基因座的位置。在一个实施方式中，所述经修饰的非人源免疫球蛋白重链基因座存在于非人动物的转基因上。
在一个实施方式中，所述单一功能性人源V基因区段是VH1-69基因区段。在一个实施方式中，所述VH1-69基因区段包含SEQ ID NO:34。在一个实施方式中，所述VH1-69基因区段来源于SEQ ID NO:34。在一个实施方式中，所述VH1-69基因区段与SEQ ID NO:34具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的一致性。
在一个实施方式中，所述单一功能性人源V基因区段由SEQ ID NO:34所述的核苷酸序列编码。
在一个实施方式中，所述单一功能性人源V基因区段是VH1-2基因区段。在一个实施方式中，所述VH1-2基因区段包含SEQ ID NO:60。在一个实施方式中，所述VH1-2基因区段来源于SEQ ID NO:60。在一个实施方式中，所述VH1-2基因区段与SEQ ID NO:60具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％的一致性。
在一个实施方式中，所述单一功能性人源V基因区段由SEQ ID NO:60所述的核苷酸序列编码。
在一个实施方式中，所述单一功能性人源V区段可操作地与一个或多个D区段及一个或多个J区段，或者一个或多个J区段连接。在一个实施方式中，所述V区段与一个或多个D和/或J区段可操作地与免疫球蛋白重链恒定区序列连接。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白重链恒定区序列选自CH1、铰链、CH2、CH3序列及其组合。在一个实施方式中，所述CH1、铰链、CH2、CH3或其组合均是非人源内源性恒定序列。在一个实施方式中，所述CH1、铰链、CH2、CH3或其组合中的至少一个是人源序列。在一个特定实施方式中，所述CH1和/或铰链是人源序列。
在一个方面，本申请提供了一种经修饰的内源性非人源免疫球蛋白重链基因座，所述基因座包含用单一人源V基因区段(或者以多种多态性形式或拷贝数存在的单一人源V基因区段)取代全部功能性V基因区段，其中所述非人源免疫球蛋白重链基因座不能重排形成来源于单一人源V基因区段(或者多态性形式或拷贝中的一种)以外的V基因区段的重链可变基因。
在一个实施方式中，所述单一人源V基因区段是VH1-69。在一个实施方式中，所述单一人源V基因区段是VH1-2。
在一个实施方式中，所述基因组包含至少一个人源或非人源DH基因区段，以及一个人源或非人源JH基因区段。在一个特定实施方式中，所述基因座包含人源DH基因区段和人源JH基因区段。在一个特定实施方式中，所述基因座包含人源JH基因区段。在另一个特定实施方式中，所述基因座包含人源VH1-69基因区段(以单一拷贝或不同多态性形式的多重拷贝形式存在)、全部功能性人源DH基因区段以及全部功能性人源JH基因区段。在另一个特定实施方式中，所述基因座包含人源VH1-2基因区段(以单一拷贝或不同多态性形式的多重拷贝形式存在)、全部功能性人源DH基因区段以及全部功能性人源JH基因区段。在一个实施方式中，在内源性小鼠重链基因座位置所述人源V、D和J基因区段(或者V和J基因区段)可操作地与小鼠恒定区基因连接。在一个特定实施方式中，所述小鼠重链基因座包含野生型小鼠免疫球蛋白恒定区序列库。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，其中所述非人动物单一功能性免疫球蛋白重链V基因区段选自人源VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1和VH7-81基因区段。在一个实施方式中，所述重链V基因区段是人源VH1-69基因区段。在一个实施方式中，所述重链V基因区段是人源VH1-2基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，其中所述非人动物包含单一功能性人源VH基因区段(以单一拷贝或不同多态性形式的多重拷贝形式存在)，并且其中所述非人动物基本上不能形成缺乏单一功能性人源VH基因区段(或者多态性形式或拷贝中的一种)的重排的免疫球蛋白重链可变结构域基因。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，其中仅在非人动物中表达的免疫球蛋白重链可变区来源于选自人源VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1和VH7-81基因区段的人源区段之一。在一个实施方式中，所述人源区段是VH1-69区段。在一个实施方式中，所述人源区段是VH1-2区段。在一个实施方式中，由小鼠表达的唯一的免疫球蛋白重链可变区来源于单一V区段家族成员，并且在一个实施方式中，所述唯一的免疫球蛋白重链可变区来源于单一V区段家族成员的多态性变体。
在一个方面，本申请提供了一种包含受限制的免疫球蛋白重链V基因区段库的非人动物，其中所述非人动物进一步包含一个或多个人源免疫球蛋白κ轻链可变区段(Vκ)。在一个实施方式中，所述一个或多个Vκ区段可操作地与一个或多个人源J区段连接。在一个特定实施方式中，所述J区段是人源Jκ区段。在另一个特定实施方式中，所述非人动物不表达免疫球蛋白λ轻链。在另一个特定实施方式中，所述非人动物不包含功能性人源或功能性内源性免疫球蛋白λ轻链可变基因座。
在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物是小鼠。
在一个实施方式中，所述非人动物包含用一个或多个功能性人源Vκ区段取代内源性非人源免疫球蛋白Vκ基因座的全部或基本上全部功能性内源性Vκ区段。在进一步的特定实施方式中，所述取代使用全部或基本上全部功能性人源免疫球蛋白Vκ区段。
在一个实施方式中，所述非人动物包含在内源性非人免疫球蛋白Vκ基因座用选自Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ7-3、Vκ2-4、Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ3-7、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ2-10、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ2-14、Vκ3-15、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ3-20、Vκ6-21、Vκ1-22、Vκ1-23、Vκ2-24、Vκ3-25、Vκ2-26、Vκ1-27、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ3-31、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ3-34、Vκ1-35、Vκ2-36、Vκ1-37、Vκ2-38、Vκ1-39、Vκ2-40及其组合的人源Vκ基因区段取代全部或基本上全部的功能性内源性Vκ基因区段。
在一个实施方式中，所述非人动物包含在内源性非人源免疫球蛋白Jκ基因座用一个或多个功能性人源免疫球蛋白Jκ区段取代全部或基本上全部的功能性内源性非人源免疫球蛋白Jκ区段。在进一步的特定实施方式中，所述取代是使用全部或基本上全部功能性人源免疫球蛋白Jκ区段。
在一个实施方式中，所述非人动物包含在内源性非人源免疫球蛋白Jκ基因座用选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、Jκ5及其组合的人源Jκ基因区段取代全部或基本上全部的功能性内源性非人源免疫球蛋白Jκ基因区段。
在一个特定实施方式中，所述非人动物包含免疫球蛋白重链可变区基因座，其包含基本上由单一V区段和/或其多态性变体组成的V区段库。在一个实施方式中，所述单一免疫球蛋白重链V区段是人源VH1-69区段，并且所述非人动物进一步包含用全部功能性人源DH区段取代全部功能性非人源DH区段，并且进一步包含用全部功能性人源JH区段取代全部功能性非人源JH区段，并且其中所述免疫球蛋白重链可变区基因座可操作地与人源或非人源恒定区基因序列连接。在一个特定实施方式中，所述恒定区基因序列是内源性非人源恒定区基因序列。在一个特定实施方式中，所述非人动物在非人免疫球蛋白重链基因座重排区段以形成编码包含人源VH1-69序列、人源DH序列、人源JH序列和小鼠恒定区序列的重链可变区的基因。
在一个特定实施方式中，所述非人动物包含免疫球蛋白重链可变区基因座，其包含基本上由单一V区段和/或其多态性变体组成的V区段库。在一个实施方式中，所述单一免疫球蛋白重链V区段是人源VH1-2区段，并且所述非人动物进一步包含用全部功能性人源DH区段取代全部功能性非人源DH区段，并且进一步包含用全部功能性人源JH区段取代全部功能性非人源JH区段，并且其中所述免疫球蛋白重链可变区基因座可操作地与人源或非人源恒定区基因序列连接。在一个特定实施方式中，所述恒定区基因序列是内源性非人源恒定区基因序列。在一个特定实施方式中，所述非人动物在非人免疫球蛋白重链基因座重排区段以形成编码包含人源VH1-2序列、人源DH序列、人源JH序列和小鼠恒定区序列的重链可变区的基因。
在一个实施方式中，本申请提供了一种包含所述重排的基因的B细胞。在一个特定实施方式中，所述B细胞来源于用所关注的抗原免疫的所述小鼠，并且所述B细胞编码与所关注的抗原特异性结合的抗体。在一个实施方式中，所关注的抗原是病原体。在一个特定实施方式中，所述病原体选自流感病毒、肝炎病毒(例如乙型肝炎或丙型肝炎病毒)和人免疫缺陷病毒。在一个特定实施方式中，所述B细胞编码体细胞突变的、高亲和性(例如约10-9KD或更低)抗体，所述抗体包含与所关注抗原特异性结合的人源轻链可变区(例如人源κ轻链可变区)。
在一个方面，本申请提供了一种包含受限制的免疫球蛋白重链V区段库的非人动物，其中所述非人动物包含一个或多个人源化λ轻链可变(Vλ)区段。在一个实施方式中，所述一个或多个人源Vλ区段可操作地与一个或多个人源J区段连接。在一个特定实施方式中，所述J区段是人源Jλ区段。在另一个特定实施方式中，所述非人动物不表达κ轻链。在另一个特定实施方式中，所述非人动物不包含功能性人源或非人源κ轻链可变基因座。
在一个实施方式中，所述非人动物包含用一个或多个功能性人源免疫球蛋白Vλ区段取代全部或基本上全部的功能性非人源免疫球蛋白Vλ区段。在进一步的特定实施方式中，所述取代使用全部或基本上全部的功能性人源免疫球蛋白Vλ区段。
在一个实施方式中，所述非人动物包含用人源λ轻链基因座簇A的片段取代全部或基本上全部功能性非人源Vλ区段。在一个特定实施方式中，所述人源λ轻链基因座簇A的片段包含人源Vλ基因区段Vλ3-27至Vλ3-1。
在一个实施方式中，所述非人动物包含用人源λ轻链基因座簇B的片段取代全部或基本上全部功能性非人源Vλ区段。在一个特定实施方式中，所述人源λ轻链基因座簇B的片段包含人源Vλ基因区段Vλ5-52至Vλ1-40。
在一个实施方式中，所述非人动物包含用人源λ轻链基因座簇A的片段和簇B的片段取代全部或基本上全部功能性非人源Vλ区段，其中所述取代所得的产物包含人源Vλ基因区段Vλ5-52至Vλ3-1。
在一个实施方式中，所述非人动物包含用至少12个人源Vλ基因区段、至少28个人源Vλ基因区段或至少40个人源Vλ基因区段取代全部或基本上全部功能性非人源Vλ区段。
在一个实施方式中，所述非人动物包含用一个或多个功能性人源免疫球蛋白Jλ基因区段取代全部或基本上全部功能性非人源免疫球蛋白Jλ基因区段。在进一步的特定实施方式中，所述取代使用全部或基本上全部功能性人源免疫球蛋白Jλ基因区段。在不同实施方式中，所述功能性人源Jλ基因区段包括Jλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7。
在一个特定实施方式中，所述非人动物包含包括单一VH区段的免疫球蛋白重链可变(VH)区的基因座，其中所述单一VH区段是人源VH1-69区段或人源VH1-2区段，并且其进一步包含用全部功能性人源DH区段取代全部功能性非人源DH区段，以及进一步包含用全部功能性人源JH区段取代全部功能性非人源JH区段，并且其中所述VH区基因座可操作地与人源或非人源恒定区基因序列连接。在一个特定实施方式中，所述恒定区基因序列是非人源恒定区基因序列，例如内源性非人源恒定基因序列。在一个特定实施方式中，所述非人动物在非人源免疫球蛋白重链基因座重排区段以形成编码包含VH1-69序列(或人源VH1-2序列)、人源DH序列、人源JH序列和内源性非人源恒定区序列的人源免疫球蛋白重链可变区的基因。
在一个实施方式中，本申请提供了一种包含所述重排基因的B细胞。在一个特定实施方式中，所述B细胞来源于已使用所关注的抗原免疫的所述非人动物，并且所述B细胞编码与所关注的抗原特异性结合的抗体。在一个实施方式中，所述抗原是选自配体、细胞表面受体和胞内蛋白的人源蛋白。在一个实施方式中，所关注的抗原是病原体。在一个特定实施方式中，所述病原体选自流感病毒、肝炎病毒(例如乙型肝炎或丙型肝炎病毒)和人免疫缺陷病毒。在一个特定实施方式中，所述B细胞编码体细胞突变的、高亲和性(例如约10-9KD或更低)抗体，所述抗体包含与所关注抗原特异性结合的人源轻链可变区(例如人源λ轻链可变区)。
在一个方面，本申请提供了一种包含受限制的免疫球蛋白VH区段库的非人动物，其中所述非人动物在转基因上包含人源VH1-69区段(或人源VH1-2区段)，其中所述人源VH1-69区段可操作地在转基因上与人源或非人源DH区段和/或人源或非人源J区段连接，并且所述转基因进一步包含人源或非人源恒定区基因，或者人源/非人源嵌合恒定区(例如CH1、铰链、CH2、CH3或其组合，其中至少一个序列是非人源的，例如选自铰链、CH2和CH3和/或铰链)。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠或大鼠并且所述非人源D、J和/或恒定区基因是小鼠或大鼠基因或者嵌合的人源/小鼠或大鼠基因。
在一个实施方式中，所述非人动物包含转基因，所述转基因包含免疫球蛋白轻链可变区基因座，其包含一个或多个人源免疫球蛋白Vλ基因区段和Jλ基因区段，或者一个或多个人源免疫球蛋白Vκ基因区段和Jκ基因区段，以及人源免疫球蛋白κ或λ轻链恒定区，以使得所述转基因在非人动物中重排形成重排的免疫球蛋白κ或λ轻链基因。在多种实施方式中，所述人源Vκ和Jκ基因区段是此处所描述的那些。在多种实施方式中，所述人源Vλ和Jλ基因区段是此处所描述的那些。
在一个特定实施方式中，所述非人动物包含具有免疫球蛋白重链可变基因座的转基因，所述免疫球蛋白重链可变基因座包含单一V区段，其为人源VH1-69区段(或人源VH1-2区段)、一个或多个人源D区段、一个或多个人源J区段，并且人源恒定基因可操作地与所述重链可变基因座连接，以使得所述小鼠由转基因表达来源于VH1-69区段(或VH1-2区段)的全人源抗体。在一个实施方式中，所述非人动物不包含功能性内源免疫球蛋白重链可变区基因座。在一个特定实施方式中，所述非人动物包含非功能性内源免疫球蛋白重链可变区基因座，所述基因座包含内源性非人源DH和/或内源性非人源JH区段缺失，以使得所述非人动物不能重排内源性免疫球蛋白重链可变区基因座以形成重排的非人源抗体基因。在一个特定实施方式中，所述非人动物包含可操作地与内源性小鼠重链恒定区连接的开关序列的缺失。在一个特定实施方式中，所述开关序列是非人源(例如小鼠)开关序列。在另一个实施方式中，所述非人动物进一步包含功能性内源轻链可变基因座的缺失，所述功能性内源轻链可变基因座选自免疫球蛋白κ基因座和免疫球蛋白λ基因座。在一个特定实施方式中，所述非人动物包含Jκ和/或Jλ序列缺失，以使得所述非人动物不能重排内源性非人源免疫球蛋白κ轻链和/或内源性非人源免疫球蛋白λ轻链可变区以形成重排的内源性非人源免疫球蛋白κ轻链和/或重排的内源性非人源免疫球蛋白λ轻链基因。
在一个实施方式中，所述非人动物包含内源性非人源免疫球蛋白κ轻链序列的缺失，其导致内源性非人源免疫球蛋白κ轻链的功能性敲除。在一个实施方式中，所述非人动物包含内源性非人源免疫球蛋白λ轻链序列的缺失，其导致内源性非人源免疫球蛋白λ轻链的功能性敲除。
在一个方面，所述非人动物包含被功能性沉默的内源免疫球蛋白重链可变基因基因座，并且包含受限制的人源重链可变基因区段库(例如不超过一个或者不超过两个)。在一个实施方式中，所述功能性沉默包含内源性非人源重链可变基因基因座的修饰，所述修饰选自缺失、插入、反转及其组合。
在一个方面，本申请提供了一种啮齿动物，所述啮齿动物包含免疫球蛋白VH库，其来源于不超过一个人源VH区段或其一个或多个多态性变体，和来源于选自一个或多个D区段库的D区段以及来源于来自一个或多个J区段库的J区段。在一个实施方式中，所述啮齿动物重排所述人源VH区段、人源D区段和人源J区段并且形成与人源或啮齿动物恒定区序列可操作地连接的重排的人源重链序列。在一个实施方式中，所述人源和/或啮齿动物恒定区序列选自CH1、铰链、CH2、CH3及其组合。在一个实施方式中，所述啮齿动物表达包含人源可变结构域的免疫球蛋白轻链，其中所述轻链与来源于重排的人源重链序列的人源重链结构域是同源的。在一个实施方式中，所述啮齿动物不表达选自非人源重链可变结构域、非人源轻链可变结构域及其组合的多肽序列。
在一个实施方式中，所述人源VH区段以1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19或者更多种多态性变体形式存在，其中各多态性变体可操作地与D和/或J区段连接以使得各多态性变体能够重排和形成具有任意一个或多个D区段和任意一个或多个J区段的重排的重链可变结构域。在一个实施方式中，所述啮齿动物是小鼠或大鼠。在一个实施方式中，所述D区段库包含两个或多个D区段。在一个实施方式中，所述J区段库包含两个或多个J区段。在一个实施方式中，所述D和/或J区段是人源区段。
在一个方面，本申请提供了一种核酸构建体，所述构建体包含编码单一人源免疫球蛋白VH区段和/或其多态性变体的序列以及一个或多个DH和一个或多个J序列，其中所述构建体包含至少一个与非人源免疫球蛋白重链可变基因座同源的同源臂，或重组酶识别位点(例如lox位点)。在一个实施方式中，所述V区段是VH1-69区段或VH1-2区段。
在一个方面，本申请提供了一种核酸构建体；所述构建体包含编码单一人源免疫球蛋白重链V区段的核酸序列，其中所述单一VH区段是VH1-69(或VH1-2)区段。在一个实施方式中，所述构建体包含位点特异性重组酶识别位点。在一个实施方式中，所述构建体包含VH1-69(或VH1-2)区段上游的第一小鼠同源臂和VH1-69(或VH1-2)区段下游的第二小鼠同源臂，并且其中所述第一小鼠同源臂与小鼠染色体上小鼠免疫球蛋白重链可变区上游紧邻的区域具有同源性但不包括功能性小鼠免疫球蛋白重链可变区段。在一个实施方式中，所述构建体包含SEQ ID NO:3。在一个实施方式中，所述构建体包含SEQ ID NO:70。
在一个方面，所述受限制的单一VH区段在非人动物中，或者所述受限制的VH区段在非人源免疫球蛋白重链基因座(例如在原位或在转基因中)，并且所述非人动物或非人源免疫球蛋白重链基因座选自小鼠、大鼠、家兔、猪、牛(例如母牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、犬、雪貂、灵长类动物(例如绒猴、猕猴)基因座或动物。在一个特定实施方式中，所述非人动物或基因座是小鼠或大鼠基因座。
在一个方面，本申请提供了一种细胞或组织，其中所述细胞或组织来源于如本申请所述的非人动物，并且包含受限制的VH区段库。在一个实施方式中，所述VH区段库被限制为单一VH区段家族成员和/或其多态性变体。在一个特定实施方式中，所述单一VH区段是人源VH1-69区段或人源VH1-2区段。在一个实施方式中，所述细胞或组织来源于非人动物的脾脏、淋巴结或骨髓。
在一个实施方式中，所述细胞是ES细胞。在一个实施方式中，所述细胞是B细胞。在一个实施方式中，所述细胞是生殖细胞。
在一个实施方式中，所述组织选自结缔、肌肉、神经和上皮组织。在一个特定实施方式中，所述组织是生殖组织。
在一个实施方式中，分离来源于如本申请所述小鼠的所述细胞和/或组织用于一项或多项体外检测。在多种实施方式中，所述一项或多项体外检测包括物理、热、电、机械或光学性质检测，外科手术，不同组织类型相互作用检测，影像技术显影或其组合。
在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个方面，本申请提供了一种非人动物胚胎，所述胚胎包括如本申请所述的受限制的重链VH区段。在一个实施方式中，所述胚胎包含包括受限制VH区段的ES供体细胞，以及宿主胚胎细胞。
在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个方面，所述非人细胞包含如本申请所述的非人动物的染色体或其片段。在一个实施方式中，所述非人细胞包含如本申请所述的非人动物的细胞核。在一个实施方式中，所述非人动物细胞包含核转移得到的染色体或其片段。
在一个方面，本申请提供了一种来源于如本申请所述的来源于非人动物的细胞核。在一个实施方式中，所述细胞核来自非B细胞的二倍体细胞。
在一个方面，本申请提供了一种来源于如本申请所述的非人动物的多能性、诱导多能性或全能性细胞。在一个特定实施方式中，所述细胞是小鼠胚胎干(ES)细胞。
在一个方面，本申请提供了一种包含受限制的VH区段库的非人源的诱导多能性细胞。在一个实施方式中，所述诱导多能性细胞来源于如本申请所述的非人动物。
在一个方面，本申请提供了一种来源于如本申请所述的非人动物细胞的杂交瘤或四价体瘤。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠或大鼠。
在一个方面，本申请提供了如本申请所述的非人动物的淋巴细胞。在一个实施方式中，所述淋巴细胞是B细胞。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠细胞和小鼠胚胎，其包括但不限于包含如本申请所述的基因修饰的ES细胞、多能行细胞以及诱导多能性细胞。本申请提供了XX细胞和XY细胞。本申请还提供了包含具有如本申请所述的修饰的细胞核的细胞，例如通过前核显微注射将修饰引入细胞。
在一个方面，本申请提供了在如本申请所述的非人动物中制备的抗体可变结构域序列。
在一个方面，本申请提供了一种人用治疗剂，所述治疗剂包括包含来源于如本申请所述的非人动物序列的抗体可变结构域。
在一个方面，本申请提供了一种从非人动物中获得抗体可变区序列的方法，其中所述抗体可变区序列来源于人源VH1-69区段或VH1-2区段，其中所述方法包括(a)使用所关注的抗原免疫非人动物，其中所述非人动物包含用单一人源可变区段在内源性免疫球蛋白重链基因座取代全部或基本上全部的非人源可变区段，其中所述单一人源可变区段是VH1-69区段或VH1-2区段，并且其中所述非人动物基本上不能形成非来源于人源VH1-69区段或VH1-2区段的免疫球蛋白重链可变区序列；(b)使所述非人动物发生针对所关注抗原的免疫应答；以及(c)鉴定或分离所述非人动物的免疫球蛋白重链可变区序列，其中所述抗体与所关注抗原结合。
在一个实施方式中，所述单一人源可变区段是VH1-69区段。
在一个实施方式中，所述抗体可变区序列来源于SEQ ID NO:34。在一个实施方式中，所述抗体可变区序列有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％与SEQ ID NO:34相同。在一个实施方式中，所述抗体可变区序列包含SEQ ID NO:34。
在一个实施方式中，所述单一人源可变区段是VH1-2区段。
在一个实施方式中，所述抗体可变区序列来源于SEQ ID NO:60。在一个实施方式中，所述抗体可变区序列有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％与SEQ ID NO:60的相同。在一个实施方式中，所述抗体可变区序列包含SEQ ID NO:60。
在一个实施方式中，针对抗原的免疫应答的特征为在ELISA检测中测定的抗体的滴度比本底的两倍高约6x104至约5x105倍。在一个特定实施方式中，根据在ELISA检测中测定的结果抗体的滴度比本底的两倍高约1.5x105倍。在一个实施方式中，所述抗原是人细胞表面受体。
在一个方面，本申请提供了一种在非人动物中生成人源抗体可变区库的方法，其中所述人源重链可变区库来源于同一VH基因家族成员和多个DH区段之一和多个JH区段之一，其中所述库的特征为具有来自单一VH基因家族成员的重链免疫球蛋白FR1(框架1)、CDR1、FR2、CDR2和FR3序列。在一个实施方式中，所述库进一步的特征为具有多个不同的CDR3+FR4序列。
在一个实施方式中，所述单一VH基因家族选自VH家族1、2、3、4、5、6和7。在一个特定实施方式中，所述单一VH基因家族是VH家族1。在一个实施方式中，所述单一VH基因家族成员选自VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70和VH3-23。在一个特定实施方式中，所述单一VH基因家族成员是VH1-69。在一个特定实施方式中，所述单一VH基因家族成员是VH1-2。
在一个实施方式中，所述库包含来源于VH1-69区段的重链FR1、CDR1、FR2、CDR2和FR3序列。在一个特定实施方式中，所述库包含来源于SEQ ID NO:35的重链FR1、CDR1、FR2、CDR2和FR3序列。在一个特定实施方式中，所述库包含SEQ ID NO:35的重链FR1、CDR1、FR2、CDR2和FR3序列。
在一个实施方式中，所述库包含来源于VH1-2区段的重链FR1、CDR1、FR2、CDR2和FR3序列。在一个特定实施方式中，所述库包含来源于SEQ ID NO:61的重链FR1、CDR1、FR2、CDR2和FR3序列。在一个特定实施方式中，所述库包含SEQ ID NO:61的重链FR1、CDR1、FR2、CDR2和FR3序列。
在一个方面，本申请提供了一种用于生成多种不同人源CDR3序列的生物(即体内)系统，所述序列反映了单一人源VH基因区段与多种人源D和J区段的多种重排，其中该系统生成的人源重链可变结构域的特征为具有与人源FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3一致但具有体细胞高突变的序列，其中所述重链可变结构域的特征为具有特异性高突变并且来源于单一人源VH基因区段和多个人源D和J区段；其中所述系统包含如本申请所述的基因修饰的非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)。
在一个实施方式中，所述单一人源VH基因区段选自VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70和VH3-23。在一个实施方式中，所述单一人源VH基因区段是VH1-69。在一个实施方式中，所述单一人源VH基因区段是VH1-2。在一个实施方式中，所述单一人源VH基因区段列于表1中。在一个实施方式中，所述单一人源VH基因区段列于表2中。在一个实施方式中，所述单一人源VH基因区段列于表3中。
在一个方面，本申请提供了一种用于在体内产生多种重链CDR序列的方法，所述序列来源于单一人源VH基因区段与多个人源D和J区段的重排，其中所述方法产生的人源重链可变结构域的特征为具有与人源FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3一致但具有体细胞高突变的序列，其中所述重链可变结构域的特征为具有体细胞突变并且来源于单一人源VH基因区段和多个人源D和J区段；其中所述系统包含如本申请所述的基因修饰的非人动物(例如啮齿动物，例如小鼠或大鼠)。
在一个实施方式中，所述方法包括将如本申请所述的非人动物与所关注的抗原接触，使得所述非人动物产生针对所述抗原的免疫应答，其中所述免疫应答生成多个来源于单一人源VH基因区段与人源D区段之一和人源J区段之一重排的重链CDR序列，以及鉴定一系列与所述抗原结合的重链CDR。在一个实施方式中，所述方法包括从所述动物的核酸序列中分离编码包含重链CDR的人源VH结构域。
在一个实施方式中，所述重链CDR序列来源于人源VH1-69基因区段的重排。在一个实施方式中，所述重链CDR序列来源于人源VH1-2基因区段的重排。
在一个方面，本申请提供了一种在非人动物中产生多个不同的CDR3和FR4序列的方法，所述方法包括将非人动物与所关注的抗原接触，所述非人动物包含具有限定为单一VH区段家族成员的VH区段库的免疫球蛋白重链可变基因基因座，使得所述非人动物产生针对所述抗原的免疫应答，其中所述免疫应答生成重链可变结构域均来源于单一VH区段家族成员且包含多种不同的CDR3和FR4序列的B细胞库。
在一个实施方式中，所述单一VH区段家族成员是人源的。在一个实施方式中，所述非人动物选自小鼠、大鼠和家兔。在一个实施方式中，所述所关注的抗原选自配体、受体、细胞内蛋白和分泌蛋白。在一个实施方式中，所述所关注的抗原是如本申请所述的人病原体。
在一个实施方式中，所述单一人源VH基因家族成员选自VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70和VH3-23。在一个实施方式中，所述单一人源VH基因家族成员是VH1-69。在一个实施方式中，所述单一人源VH基因家族成员是VH1-2。在一个实施方式中，所述单一人源VH基因家族成员列于表1中。在一个实施方式中，所述单一人源VH基因家族成员列于表2中。在一个实施方式中，所述单一人源VH基因家族成员列于表3中。
本申请提供了一种在如本申请所述的非人动物中制备的编码免疫球蛋白可变区的核苷酸序列。
在一个方面，本申请提供了一种在如本申请所述的非人动物中制备的抗体的免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链可变区氨基酸序列。
在一个方面，本申请提供了一种在如本申请所述的非人动物中制备的免疫球蛋白重链或免疫球蛋白轻链可变区核苷酸序列编码的抗体的可变区。
在一个方面，本申请提供了一种在如本申请所述的非人动物中制备的抗体或其抗原结合片段(例如Fab、F(ab)2、scFv)。
在一个方面，本申请提供了一种具有受限制的免疫球蛋白重链基因座的小鼠，其特征为存在单一人源VH基因区段、一个或多个人源DH基因区段以及一个或多个人源JH基因区段，其中所述单一人源VH基因区段在内源性小鼠基因座并且所述VH基因区段可操作地与一个或多个人源DH基因区段、一个或多个人源JH基因区段以及内源性免疫球蛋白重链恒定区连接。
在一个实施方式中，所述小鼠进一步包含人源化的免疫球蛋白轻链基因座，所述基因座包含一个或多个人源VL基因区段以及一个或多个人源JL基因区段，其中所述人源VL基因区段和人源JL基因区段可操作地与非人动物免疫球蛋白轻链恒定区基因连接。在一个特定实施方式中，所述人源VL和JL基因区段在内源性小鼠轻链基因座，并且其中所述非人源免疫球蛋白轻链恒定区基因是小鼠基因。
在一个实施方式中，所述人源化免疫球蛋白轻链基因座在转基因上，并且所述恒定区基因选自小鼠、大鼠和人。
在一个实施方式中，所述人源VL和JL基因区段是Vκ和Jκ基因区段。在一个实施方式中，所述人源VL和JL基因区段是Vλ和Jλ基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种非人动物，其中所述非人动物具有B细胞库，其表达来源于单一V区段家族成员的免疫球蛋白重链可变结构域。在一个实施方式中，在B细胞库中表达的非人动物免疫球蛋白重链可变结构域B细胞库的至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90或至少95％来源于同一V区段家族成员。在一个实施方式中，所述B细胞库基本上由外周(血液)B细胞组成。在一个实施方式中，所述B细胞库基本上由脾脏B细胞组成。在一个实施方式中，所述B细胞库基本上由骨髓B细胞组成。在一个实施方式中，所述B细胞库基本上由外周B细胞、脾脏B细胞和骨髓B细胞组成。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，其中表达重链免疫球蛋白可变结构域的非人动物不超过10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或高于90％的B细胞表达来源于单一VH基因区段家族成员的重链免疫球蛋白可变结构域。在一个实施方式中，表达重链免疫球蛋白可变结构域的非人动物至少75％的B细胞表达来源于单一VH基因区段家族成员的重链免疫球蛋白可变结构域。在一个特定实施方式中，所述百分率为至少90％。在一个实施方式中，全部表达重链结构域的B细胞均来源于单一VH基因家族成员。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，其制备对所关注抗原的免疫产生应答的抗原特异性B细胞群，其中所述抗原特异性B细胞群的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或高于90％表达来源于同一VH基因区段的免疫球蛋白重链。在一个实施方式中，所述至少75％的抗原特异性B细胞群表达来源于同一VH基因区段的免疫球蛋白重链。在一个实施方式中，全部抗原特异性B细胞表达的重链均来源于同一VH基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种包含受限制的VH基因区段库的非人动物，其中所述限制针对人源VH1-69基因区段或与VH1-69*01基因区段具有至少约75.5％、76.5％、86.7％、87.8％、94.9％、96.9％、98％或99％同一性的VH1-69基因区段。在一个特定实施方式中，所述受限制的库选自图15中的一个或多个VH1-69变体。
在一个方面，本申请提供了一种包含受限制的VH基因区段库的非人动物，其中所述限制针对人源VH1-2基因区段或与VH1-2基因区段具有至少约94.9％、95.9％、96.9％、98％或99％同一性的VH1-2基因区段。在一个特定实施方式中，所述受限制的库选自图18中的一个或多个VH1-2变体。
在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个实施方式中，所述小鼠表现出具有与野生型小鼠相比更高的成熟B细胞与未成熟B细胞比率特征的免疫表型。在一个特定实施方式中，所述比率根据从脾脏中收集的B细胞计算。在一个实施方式中，所述小鼠表现出的成熟B细胞群为约1x107。在一个实施方式中，所述小鼠表现出的未成熟B细胞群为约0.5x107。在一个实施方式中，所述小鼠表现出在小鼠脾脏中的成熟B细胞与未成熟B细胞的比率比野生型小鼠显示出的比率高约1.5倍至约2倍。
在一个实施方式中，所述比率根据从骨髓中收集的B细胞计算。在一个特定实施方式中，所述小鼠表现出的成熟B细胞群为约3x105。在一个实施方式中，所述小鼠表现出的未成熟B细胞群为约7x105。在一个实施方式中，所述小鼠表现出在小鼠骨髓中的成熟B细胞与未成熟B细胞的比率比野生型小鼠显示出的比率高约3倍或约3.3倍。
在一个实施方式中，所述小鼠表现出具有与野生型小鼠相比骨髓中更高原B细胞数量的特征的免疫表型。在一个特定实施方式中，所述小鼠表现出的小鼠骨髓中的原B细胞群与野生型小鼠骨髓中表现出的相比高约2.5倍至约3倍。在一个特定实施方式中，所述小鼠表现出的小鼠骨髓中的原B细胞群与野生型小鼠骨髓中表现出的相比高约2.75倍。
在一个实施方式中，所述小鼠表现出具有选自下组特征的免疫表型：约80％野生型B细胞的CD19+脾脏B细胞群、与野生型小鼠大致相同的CD3+脾脏T细胞群及其组合。
在一个实施方式中，所述小鼠包含淋巴细胞群，其脾脏中CD19+B细胞百分比大致与野生型小鼠相同。在一个实施方式中，每只小鼠脾脏中CD19+B细胞的数量为野生型小鼠脾脏中CD19+B细胞数量的至少约50％。
在一个实施方式中，与野生型小鼠相比所述非人动物在骨髓中包含至少约75％至约80％的CD19+B细胞。
在一个实施方式中，所述小鼠股骨中CD19+骨髓细胞的总数不超过野生型小鼠中CD19+骨髓细胞总数的约30％、40％、50％、60％或75％。
在一个实施方式中，所述小鼠表达的IgD和IgM与在野生型小鼠中观察到的具有大致相同的水平。
在一个方面，本申请提供了一种包含受限制的人源VH区段库的小鼠，所述小鼠进一步包含人源化的免疫球蛋白轻链可变区段基因座，其中在所述小鼠中表达的λ与κ轻链的比率与在野生型小鼠中大致相同。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包含受限制的免疫球蛋白重链基因座，其特征为存在单一VH基因区段、一个或多个DH基因区段以及一个或多个JH基因区段，其中所述单一VH基因区段是多态性VH基因区段。
在一个实施方式中，所述多态性VH基因区段是在人群中与较高拷贝数相关的人源VH基因区段。在一个实施方式中，所述人源VH基因区段选自VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70、VH3-23或其多态性变体。在一个特定实施方式中，所述人源VH基因区段是VH1-69基因区段。在另一个特定实施方式中，所述人源VH基因区段是VH1-2基因区段。
在一个实施方式中，所述单一VH基因区段可操作地与人源、小鼠或人源/小鼠嵌合免疫球蛋白恒定区基因连接。在一个特定实施方式中，所述免疫球蛋白恒定区基因是小鼠恒定区基因。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白恒定基因包含选自人源CH1、人源铰链、人源CH2、人源CH3及其组合的人源序列。在一个实施方式中，所述小鼠恒定基因位于内源性免疫球蛋白重链基因座。
在一个实施方式中，所述小鼠进一步包含可操作地与J基因区段和轻链恒定基因连接的人源免疫球蛋白VL基因区段。在一个特定实施方式中，所述VL基因区段和/或J基因区段选自人源κ基因区段和人源λ基因区段。在一个实施方式中，所述VL和/或J基因区段是人源κ基因区段。
在多种实施方式中，所述小鼠包含全部或基本上全部内源性VH基因区段的缺失。
在多种实施方式中，所述非人动物包含灭活的内源性重链可变基因基因座。在多种实施方式中，所述灭活的内源性重链可变基因基因座未可操作地与内源性重链恒定区基因连接。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，其中所述小鼠的特征为表达血清免疫球蛋白，其中80％以上的血清免疫球蛋白包含人源重链可变结构域和同源的人源轻链可变结构域，其中所述人源重链可变结构域来源于基本上由单一人源VH基因区段和/或其多态性变体组成的VH基因区段库。
在一个实施方式中，所述单一人源VH基因区段是人源VH1-69基因区段和/或其多态性变体。在一个实施方式中，所述单一人源VH基因区段是人源VH1-2基因区段和/或其多态性变体。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠在其种系中包含用单一人源VH基因区段和/或其多态性变体区段取代内源性免疫球蛋白重链基因座的全部或基本上全部内源性VH基因区段。在一个实施方式中，所述单一人源VH基因区段是人源VH1-69基因区段和/或其多态性变体。在一个实施方式中，所述单一人源VH基因区段是人源VH1-2基因区段和/或其多态性变体。
在一个实施方式中，所述小鼠进一步包含用一个或多个人源VL基因区段取代内源性免疫球蛋白轻链基因座的全部或基本上全部内源性VL基因区段。在一个特定实施方式中，所述小鼠进一步包含可操作地与人源性VL区段连接的一个或多个人源JL基因区段。
在一个方面，本申请提供了如本申请所述的小鼠用于制备免疫球蛋白可变区核苷酸序列的用途。在一个实施方式中，所述序列包含重排的VH1-69基因区段。在一个实施方式中，所述序列包含重排的VH1-2基因区段。
在一个实施方式中，所述免疫球蛋白可变区核苷酸序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％与人源VH1-69基因区段相同。在一个特定实施方式中，所述免疫球蛋白可变区核苷酸序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％与SEQID NO:34相同。在不同实施方式中，所述人源VH1-69基因区段列于表2中。
在一个实施方式中，所述免疫球蛋白可变区核苷酸序列编码的氨基酸序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％与SEQ ID NO:35相同。
在一个实施方式中，所述免疫球蛋白可变区核苷酸序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％与人源VH1-2基因区段相同。在一个特定实施方式中，所述免疫球蛋白可变区核苷酸序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％与SEQID NO:60相同。在不同实施方式中，所述人源VH1-2基因区段列于表3中。
在一个实施方式中，所述免疫球蛋白可变区核苷酸序列编码的氨基酸序列有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少98％与SEQ ID NO:61相同。
在一个方面，本申请提供了一种如本申请所述的小鼠在制备全人Fab或全人F(ab)2中的用途。在一个实施方式中，所述全人Fab或全人F(ab)2包含包括重排的人源VH1-69基因区段的重链可变区。在一个实施方式中，所述全人Fab或全人F(ab)2包含包括重排的人源VH1-2基因区段的重链可变区。
在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述的小鼠制备永生化细胞系的用途。
在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述的小鼠制备杂交瘤或四价体瘤的用途。
在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述的小鼠制备含有人源重链可变区和人源轻链可变区的噬菌体文库的用途。
在一个实施方式中，所述人源重链可变区来源于人源VH1-69基因区段，其包含选自下述的序列：SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ IDNO:54、SEQ ID NO:56和SEQ ID NO:58。
在一个实施方式中，所述人源重链可变区来源于人源VH1-69基因区段，其包含选自下述的序列：SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ IDNO:55、SEQ ID NO:57和SEQ ID NO:59。
在一个实施方式中，所述人源重链可变区均来源于人源VH1-2基因区段，其包含选自下述的序列：SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:68。
在一个实施方式中，所述人源重链可变区来源于人源VH1-2基因区段，其包含选自下述的序列：SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67和SEQ ID NO:69。
在一个方面，本申请提供了如本申请所述的小鼠生成用于制备人源抗体的可变区序列的用途，包括(a)使用所关注的抗原免疫如本申请所述的小鼠，(b)从经免疫的(a)中的小鼠分离淋巴细胞，(c)将淋巴细胞与一种或多种标记抗体接触，(d)鉴定能够与所关注的抗原结合的淋巴细胞，以及(e)扩增一个或多个来自于淋巴细胞的可变区核酸序列以产生可变区序列。
在一个实施方式中，所述淋巴细胞来源于或分离自小鼠的脾脏。在一个实施方式中，所述淋巴细胞来源于或分离自小鼠的淋巴结。在一个实施方式中，所述淋巴细胞来源于或分离自小鼠的骨髓。在一个实施方式中，所述淋巴细胞来源于或分离自小鼠的血液。
在一个实施方式中，所述标记抗体是荧光团偶联的抗体。在一个实施方式中，所述一种或多种荧光团偶联的抗体选自IgM、IgG和/或其组合。
在一个实施方式中，所述淋巴细胞是B细胞。
在一个实施方式中，所述一个或多个可变区核酸序列包含重链可变区序列。在一个实施方式中，所述一个或多个可变区核酸序列包含轻链可变区序列。在一个特定实施方式中，所述轻链可变区序列是免疫球蛋白κ轻链可变区序列。在一个实施方式中，所述一个或多个可变区核酸序列包含重链和κ轻链可变区序列。
在一个实施方式中，本申请提供了一种如本申请所述的小鼠生成用于制备人源抗体的重链和κ轻链可变区序列的用途，包括(a)使用所关注的抗原免疫如本申请所述的小鼠，(b)从经免疫的(a)中的小鼠分离脾脏，(c)将来自于脾脏的B淋巴细胞与一种或多种标记的抗体接触，(d)鉴定(c)中能够与所关注的抗原结合的B淋巴细胞，以及(e)从B淋巴细胞中扩增重链可变区核酸序列和κ轻链可变区核酸序列以产生重链和κ轻链可变区序列。
在一个实施方式中，本申请提供了一种如本申请所述的小鼠生成用于制备人源抗体的重链和κ轻链可变区序列的用途，包括(a)使用所关注的抗原免疫如本申请所述的小鼠，(b)从经免疫的(a)中的小鼠分离一个或多个淋巴结，将来自于B淋巴细胞的一个或多个淋巴结与一种或多种标记的抗体接触，鉴定(c)中能够与所关注的抗原结合的B淋巴细胞，以及(e)从B淋巴细胞中扩增重链可变区核酸序列和κ轻链可变区核酸序列以产生重链和κ轻链可变区序列。
在一个实施方式中，本申请提供了一种如本申请所述的小鼠生成用于制备人源抗体的重链和κ轻链可变区序列的用途，包括(a)使用所关注的抗原免疫如本申请所述的小鼠，(b)从经免疫的(a)中的小鼠分离骨髓，(c)将来自于骨髓的B淋巴细胞与一种或多种标记的抗体接触，(d)鉴定(c)中能够与所关注的抗原结合的B淋巴细胞，以及(e)从B淋巴细胞中扩增重链可变区核酸序列和κ轻链可变区核酸序列以产生重链和κ轻链可变区序列。在不同实施方式中，所述一种或多种标记的抗体选自IgM、IgG和/或其组合。
在多种实施方式中，所关注的抗原是危害人主体的病原体包括例如病毒抗原。示例性病毒病原体包括例如主要是腺病毒、细菌小核糖核酸病毒、疱疹病毒、肝脱氧核糖核酸病毒、黄病毒、逆转录病毒、正粘病毒、副粘病毒、乳多空病毒、多瘤病毒、弹状病毒和披膜病毒家族的病原体。这些示例性病毒通常的长度范围为20-300纳米。在多种实施方式中，所关注的抗原是选自肝炎病毒(例如HCV、HBV等)、人免疫缺陷病毒(HIV)或流感病毒(例如H1N1)的病毒抗原。
在多种实施方式中，本申请提供了如本申请所述的小鼠生成用于人源抗体的重链和κ轻链可变区序列的用途，其进一步包括将经扩增的重链和轻链可变区序列与人源重链和轻链恒定区序列融合，在细胞中表达融合的重链和轻链序列，并且回收所表达的重链和轻链序列以生成人源抗体。
在多种实施方式中，所述人源重链恒定区选自IgM、IgD、IgA、IgE和IgG。在多种的特定实施方式中，所述IgG选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在多种实施方式中，所述人源重链恒定区包含CH1、铰链、CH2、CH3、CH4或其组合。在多种实施方式中，所述重链恒定区是免疫球蛋白κ恒定区。在多种实施方式中，所述细胞选自HeLa细胞、DU145细胞、Lncap细胞、MCF-7细胞、MDA-MB-438细胞、PC3细胞、T47D细胞、THP-1细胞、U87细胞、SHSY5Y(人神经母细胞瘤)细胞、Saos-2细胞、Vero细胞、CHO细胞、GH3细胞、PC12细胞、人视网膜细胞(例如PER.C6TM细胞)和MC3T3细胞。在一个特定实施方式中，所述细胞是CHO细胞。
在一个方面，本申请提供了一种生成特异性针对所关注抗原的反向嵌合啮齿动物-人源抗体的方法，所述方法包括步骤：使用所述抗原免疫如本申请所述的小鼠，从针对所关注抗原生成特异性反向嵌合小鼠-人源抗体的小鼠中分离至少一个细胞，培养针对所关注抗原生成特异性反向嵌合小鼠-人源抗体的至少一个细胞，以及获得所述抗体。
在一个实施方式中，所述反向-嵌合小鼠-人源抗体包含与小鼠或大鼠重链恒定基因融合的人源重链可变结构域，以及与小鼠或大鼠或人源轻链恒定基因融合的人源轻链可变结构域。在一个特定实施方式中，所述人源重链可变结构域含有重排的人源VH1-69或人源VH1-2基因区段。
在一个实施方式中，对至少一个针对所关注抗原生成特异性反向嵌合啮齿动物-人源抗体的细胞的培养是针对从小鼠分离的至少一个细胞产生的至少一个杂交瘤细胞上进行。
在一个实施方式中，所关注的抗原是如本申请所述的危害人主体的病原体。
在一个方面，本申请提供了一种用于产生特异性针对所关注抗原的全人源抗体的方法，所述方法包括步骤：使用所述抗原免疫如本申请所述的小鼠，从产生特异性针对所述抗原的反向嵌合啮齿动物-人源抗体的小鼠中分离至少一个细胞，产生至少一个生产来源于特异性针对所述抗原的反向-嵌合啮齿动物-人源抗体的全人源抗体的细胞，并且培养至少一个生产所述全人源抗体的细胞，以及获得所述全人源抗体。
在多种实施方式中，分离自针对所述抗原生成特异性反向-嵌合啮齿动物-人源抗体的小鼠的至少一个细胞是脾细胞或B细胞。
在多种实施方式中，所述抗体是单克隆抗体。
在多种实施方式中，所述抗体包含重链可变结构域，其含有重排的人源VH1-69或人源VH1-2基因区段。
在多种实施方式中，针对所关注抗原实施的免疫是使用蛋白、DNA、DNA和蛋白的组合或者表达所述抗原的细胞。在一个实施方式中，所关注的抗原是如本申请所述的危害人主体的病原体。
在一个方面，本申请提供了一种如本申请所述的小鼠用于制备编码免疫球蛋白可变区或其片段的核酸序列的用途。在一个实施方式中，所述核酸序列用于制备人源抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，所述小鼠用于制备选自下述的抗原结合蛋白：抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、scFv、双特异性scFv、二体、三体、四体、V-NAR、VHH、VL、F(ab)、F(ab)2、DVD(即双可变结构域抗原结合蛋白)、SVD(即单可变结构域抗原结合蛋白)或者双特异性T细胞卡合体(BiTE)。
在一个方面，本申请提供了一种制备人源抗原-结合蛋白的方法，所述方法包括将如本申请所述的基因修饰的非人动物与所关注的抗原接触，使得所述基因修饰的非人动物对所述抗原产生免疫应答，从所述基因修饰的非人动物获得编码与所关注的抗原特异性结合的人源重链可变结构域的重链可变结构域核酸序列，将所述重链可变结构域核酸序列克隆至人源恒定区序列，并且在哺乳动物细胞中表达包含人源重链可变结构域序列和人源恒定区序列的抗体。在一个实施方式中，所述哺乳动物细胞是CHO细胞。在一个实施方式中，所述基因修饰的非人动物包含人源VH基因区段库，其基本上由单一人源VH基因区段组成，其任选地以其两种或多种多态性变体形式存在，其可操作地与一个或多个人源D和/或J区段连接。在一个实施方式中，所述人源VH基因区段库在内源性非人源VH区段基因座。在一个实施方式中，所述人源VH基因区段库在不是内源性VH区段基因座的基因座。在一个实施方式中，所述人源VH基因区段与人源D区段和人源J区段重排以形成可操作地与恒定区序列连接的重排的人源VDJ基因，其中所述恒定区序列选自人源序列和啮齿动物序列(例如小鼠或大鼠或仓鼠序列)。在一个实施方式中，所述恒定区序列包含选自CH1、铰链、CH2、CH3及其组合的序列；在一个特定实施方式中，所述恒定区序列包含CH1、铰链、CH2和CH3。在一个实施方式中，所述人源可变结构域和所述恒定序列在具有同源人源轻链可变结构域的来自同一小鼠的哺乳动物细胞中表达(例如来自与人源可变结构域序列相同的B细胞的序列)；在一个实施方式中，然后将从小鼠中获得的编码人源轻链可变结构域的序列与编码人源轻链恒定序列的序列融合，并且在所述哺乳动物细胞中表达所述轻链序列和所述重链序列。
在一个实施方式中，所关注的抗原是如本申请所述的危害人主体的病原体。
在一个方面，本申请提供了一种用于制备与所关注的抗原结合的抗体重链可变结构域的方法，所述方法包括在单一细胞中表达(a)经过免疫的如本申请所述的非人动物的第一VH序列，其中所述第一VH序列与CH基因序列融合；以及(b)经过免疫的如本申请所述的非人动物的VL基因序列，其中所述VL基因序列与人源CL基因序列融合；将所述细胞维持在足以表达抗体的条件下；并且分离所述抗体的重链可变结构域。在一个实施方式中，所述VL基因与所述第一VH序列是同源的。
在一个实施方式中，所述细胞包含经过免疫的如本申请所述的非人动物的第二VH基因序列，其中所述第二VH基因序列与CH基因序列融合，其中所述第一VH基因序列编码特异性结合第一表位的VH结构域，以及所述第二VH基因序列编码特异性结合第二表位的VH结构域，其中所述第一表位和所述第二表位是不同的。
在一个实施方式中，所述恒定区序列均是人源恒定区序列。在一个实施方式中，所关注的抗原是如本申请所述的危害人主体的病原体。
在一个方面，本申请提供了一种制备人源双特异性抗体的方法，包括使用如本申请所述非人动物B细胞的人源可变区基因序列制备所述双特异性抗体。
在一个实施方式中，所述方法包括(a)鉴定所述非人动物克隆选定的淋巴细胞，其中所述非人动物已经与所关注的抗原接触并且已出现针对所关注抗原的免疫应答，并且其中所述淋巴细胞表达与所关注抗原特异性结合的抗体，(b)从所述淋巴细胞或抗体获得编码与所关注抗原特异性结合的人源重链可变区的核苷酸序列，以及(c)在制备双特异性抗体中引入编码与所关注抗原特异性结合的人源重链可变区的核苷酸序列。在一个特定实施方式中，所述人源重链可变区包含重排的VH1-2或VH1-69基因区段。
在一个实施方式中，步骤(a)至(c)在第一时间用于第一所关注抗原以生成第一人源重链可变区序列，和步骤(a)至(c)在第二时间用于第二所关注抗原以生成第二人源重链可变区序列，并且其中所述第一重链可变区序列与第一人源重链恒定区融合表达以形成第一人源重链，所述第二人源重链可变区序列与第二人源重链恒定区融合表达以形成第二人源重链，其中所述第一和第二人源重链在由重排的人源Vκ1-39或人源Vκ3-20基因区段表达的单一人源轻链存在时表达。在一个特定实施方式中，所述单一人源轻链包含种系序列。
在一个实施方式中，所述方法包括(a)从已经与所关注的第一抗原接触的如本申请所述的非人动物，以及从已经与所关注的第二抗原接触的同一非人动物或者基因相同的不同非人动物的B细胞中克隆重链可变区；以及(b)在细胞中表达具有相同重链恒定区的(a)的重链可变区以及相同的轻链以制备双特异性抗体。
在一个方面，本申请提供了如本申请所述的非人动物用于获得编码人源重链可变结构域的核酸序列的用途。在一个实施方式中，所述重链可变结构域包含选自VH1-2和VH1-69的重排的人源VH基因区段。
在一个方面，本申请提供了如本申请所述的非人动物用于获得编码人源重链可变结构域的细胞的用途。在一个实施方式中，所述重链可变结构域包含选自VH1-2和VH1-69的重排的人源VH基因区段。
在一个方面，本申请提供了如本申请所述的非人动物用于制备人源抗体可变结构域的用途。在一个实施方式中，所述可变结构域包含选自VH1-2和VH1-69的重排的人源VH基因区段。
在一个方面，本申请提供了如本申请所述的非人动物用于制备人源抗体的用途，包括使用如本申请所述的非人动物B细胞中的人源可变区基因序列制备所述抗体。在一个实施方式中，所述人源抗体是人源双特异性抗体。在一个特定实施方式中，所述双特异性抗体包含来源于重排的人源VH1-2或VH1-69基因区段的一个重链可变结构域。在一个实施方式中，所述人源可变区基因序列包含重排的人源VH1-2或VH1-69基因区段。
在一个方面，本申请提供了如本申请所述的非人动物用于选择人源免疫球蛋白重链可变结构域的用途。在一个实施方式中，所述重链可变结构域包含选自VH1-2和VH1-69的重排的人源VH基因区段。
在一个方面，本申请提供了如本申请所述的小鼠用于制备治疗人类疾病或病变的药物(例如抗原结合蛋白)或用于制备编码药物(例如抗原结合蛋白)可变序列的序列的用途。在一个实施方式中，所述药物的可变序列包含多态性人源VH基因区段。在一个实施方式中，所述药物的可变序列包含人源VH1-69基因区段。在一个实施方式中，所述药物的可变序列包含人源VH1-2基因区段。
在一个方面，本申请提供了编码在如本申请所述的小鼠中制备的免疫球蛋白可变结构域的核酸构建体。在一个实施方式中，所述可变结构域是重链可变结构域。在一个特定实施方式中，所述重链可变结构域包含选自VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70或VH3-23的重排的人源VH基因区段。在另一个特定实施方式中，所述重链可变结构域包含重排的人源VH1-2基因区段。在另一个特定实施方式中，所述重链可变结构域包含重排的人源VH1-69基因区段。
在一个实施方式中，所述可变结构域是轻链可变结构域。在一个特定实施方式中，所述可变结构域是κ轻链可变结构域，其与包含重排的人源VH1-69基因区段的人源重链可变结构域具有同源性。在一个特定实施方式中，所述可变结构域是κ轻链可变结构域，其与包含重排的人源VH1-2基因区段的人源重链可变结构域具有同源性。
在一个方面，本申请提供了如本申请所述的小鼠用于制备编码人源免疫球蛋白可变结构域的核酸构建体的用途。在一个实施方式中，所述可变结构域是轻链可变结构域。在一个实施方式中，所述可变结构域是κ轻链可变结构域，其包含选自下述的重排的人源Vκ基因区段：Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ7-3、Vκ2-4、Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ3-7、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ2-10、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ2-14、Vκ3-15、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ3-20、Vκ6-21、Vκ1-22、Vκ1-23、Vκ2-24、Vκ3-25、Vκ2-26、Vκ1-27、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ3-31、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ3-34、Vκ1-35、Vκ2-36、Vκ1-37、Vκ2-38、Vκ1-39和Vκ2-40。
在一个实施方式中，所述可变结构域是重链可变结构域。在一个特定实施方式中，所述重链可变结构域包含选自VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70或VH3-23的重排的人源VH基因区段。在一个特定实施方式中，所述重链可变结构域包含重排的人源VH1-69基因区段。在一个特定实施方式中，所述重链可变结构域包含重排的人源VH1-2基因区段。
在一个方面，本申请提供了如本申请所述的小鼠用于制备人源免疫球蛋白可变结构域的用途。在一个实施方式中，所述可变结构域是轻链可变结构域。在一个实施方式中，所述可变结构域是κ轻链可变结构域，其包含选自下述的重排的人源Vκ基因区段：Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ7-3、Vκ2-4、Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ3-7、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ2-10、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ2-14、Vκ3-15、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ3-20、Vκ6-21、Vκ1-22、Vκ1-23、Vκ2-24、Vκ3-25、Vκ2-26、Vκ1-27、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ3-31、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ3-34、Vκ1-35、Vκ2-36、Vκ1-37、Vκ2-38、Vκ1-39和Vκ2-40。
在一个实施方式中，所述可变结构域是重链可变结构域。在一个特定实施方式中，所述重链可变结构域包含选自VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70或VH3-23的重排的人源VH基因区段。在一个特定实施方式中，所述重链可变结构域包含重排的人源VH1-69基因区段。在一个特定实施方式中，所述重链可变结构域包含重排的人源VH1-2基因区段。
在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述的非人动物制备编码人源重链可变结构域的核酸序列。在一个实施方式中，所述人源重链可变结构域的特征为具有来源于多态性人源VH基因区段的人源FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3序列。在一个特定实施方式中，所述人源VH基因区段选自人源VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70或VH3-23基因区段。在一个实施方式中，所述人源VH基因区段是人源VH1-69基因区段。在一个实施方式中，所述人源VH基因区段是VH1-2基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种制备编码人源VH结构域的核酸序列的方法，所述方法包括使用所关注的抗原免疫如本申请所述的非人动物，使所述非人动物对所关注的抗原产生免疫应答，并且从中获得编码与所关注抗原结合的人源VH结构域的核酸序列。在一个实施方式中，所述方法进一步包括制备与人源VH结构域具有同源性的编码人源VL结构域的核酸序列，包括分离编码人源VH结构域和人源VL结构域的B细胞，并且从中获得重链和轻链可变结构域的序列。在不同实施方式中，所述人源VH结构域来源于重排的人源VH1-69或人源VH1-2基因区段。在不同实施方式中，所述人源VL结构域选自人源Vκ或人源Vλ结构域。
在一个方面，本申请提供了如本申请所述的非人动物用于制备人用治疗剂的用途，包括使用所关注的抗原免疫非人动物，使所述非人动物产生免疫应答，从所述动物中获得编码与所关注的抗原结合的免疫球蛋白可变结构域的核酸序列，以及将所述免疫球蛋白可变结构域引入人用治疗剂。在一个实施方式中，所述可变结构域是重链可变结构域。在一个特定实施方式中，所述重链可变结构域来源于重排的人源VH1-69或人源VH1-2基因区段。在一个实施方式中，所述可变结构域是轻链可变结构域。在一个特定实施方式中，所述轻链可变结构域来源于重排的人源Vκ或人源Vλ基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种制备人用治疗剂的方法，包括使用所关注的抗原免疫如本申请所述的非人动物，使所述非人动物产生免疫应答，从所述动物获得编码与所关注抗原结合的免疫球蛋白可变结构域的核酸序列，以及将所述免疫球蛋白可变结构域引入人用治疗剂。在一个实施方式中，所述可变结构域是重链可变结构域。在一个特定实施方式中，所述重链可变结构域来源于重排的人源VH1-69或人源VH1-2基因区段。在一个实施方式中，所述可变结构域是轻链可变结构域。在一个特定实施方式中，所述轻链可变结构域来源于重排的人源Vκ或人源Vλ基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种制备人源抗原结合蛋白的方法，所述方法包括使用所关注的抗原免疫如本申请所述的非人动物，使所述动物产生免疫应答，获得编码与所关注抗原特异性结合的免疫球蛋白可变结构域的小鼠核酸序列，在适于表达所述核酸的载体中克隆所述核酸序列，其中将所述核酸序列克隆至具有编码人源免疫球蛋白恒定区或其功能性片段的核酸序列的框架中，将所述载体引入哺乳动物细胞中，并且将细胞维持在适于表达包含免疫球蛋白可变结构域和免疫球蛋白恒定区或其功能性片段的抗原结合蛋白的条件下。在一个实施方式中，所述抗原结合蛋白是人源抗体。在一个特定实施方式中，所述抗体包含来源于如本申请所述小鼠的重链可变结构域和轻链可变结构域。在一个特定实施方式中，所述抗体包含来源于如本申请所述小鼠的重链可变结构域。在不同实施方式中，所述重链可变结构域来源于重排的人源VH1-69或人源VH1-2基因区段。
在一个方面，本申请提供了在如本申请所述的非人动物中制备的编码人源抗原结合结构域的核酸序列。在一个实施方式中，所述核酸序列编码人源免疫球蛋白VH结构域。在一个实施方式中，所述核酸序列编码人源免疫球蛋白VH结构域以及同源的人源VL结构域。在不同实施方式中，所述人源VH结构域来源于重排的人源VH1-69或人源VH1-2基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种制备人源抗体的方法，所述方法包括使用所关注的抗原免疫如本申请所述的非人动物，使所述非人动物产生免疫应答，从免疫的动物中收集淋巴细胞(例如B细胞)，将所述淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞，从杂交瘤细胞中获得编码人源VH结构域和人源VL结构域的核酸序列，将所述核酸序列克隆至具有人源恒定区序列的框架中(即在可操作的键中)以形成免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，并且在能够表达全人抗体的细胞中表达所述重链和轻链。在一个实施方式中，所述细胞是CHO细胞。在不同实施方式中，所述人源VH结构域来源于重排的人源VH1-69基因区段或人源VH1-2基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种制备人源抗体的方法，所述方法包括使用所关注的抗原免疫如本申请所述的非人动物，使所述非人动物产生免疫应答，从免疫的动物中收集淋巴细胞(例如B细胞)，从淋巴细胞获得编码人源VH结构域和人源VL结构域的核酸序列，将所述核酸序列克隆至具有人源恒定区序列的框架中(即在可操作的键中)以形成免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链，并且在能够表达全人抗体的细胞中表达所述重链和轻链。在一个实施方式中，所述淋巴细胞来源于所述非人动物的脾脏。在一个实施方式中，所述细胞是CHO细胞。在不同实施方式中，所述人源VH结构域来源于重排的人源VH1-69基因区段或人源VH1-2基因区段。
在不同的方面，所关注的抗原是如本申请所述的危害人主体的病原体。在不同的方面，所关注的抗原是能够感染人的病毒。能够在本申请所述的方法和用途中使用的示例性抗原包括微生物如病毒、细菌、朊病毒或真菌或者在人体内导致疾病的任意其他病原体。本领域技术人员在阅读了本公开后将知晓将适用于本申请所述的方法和用途的那些人病原体。除非明确指出或者上下文明确禁止一同使用，否则能够将不同的方面和实施方式一同使用。
附图的简要说明
图1为构建具有经修饰的重链基因座的靶向载体的靶向和分子改造的一系列步骤的未按照比例的通用图示，，所述经修饰的重链基因座在内源性免疫球蛋白重链基因座含有单一人源VH1-69基因区段、27个人源DH和6个人源JH基因区段。
图2为构建具有经修饰的重链基因座的靶向载体的靶向和分子改造步骤的未按照比例的通用图示，所述经修饰的重链基因座在内源性免疫球蛋白重链基因座含有单一人源VH1-2基因区段、27个人源DH和6个人源JH基因区段。
图3显示了对来自野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座的单一人源VH基因区段、27个人源DH和6个人源JH基因区段为纯合子的小鼠(1hVH HO)的脾细胞门控单一淋巴细胞以及CD19(B细胞)和CD3(T细胞)染色的等值线图。
图4A中的左图显示了从野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座的单一人源VH基因区段、27个人源DH和6个人源JH基因区段为纯合子的小鼠(1hVH HO)的脾脏中收集的CD19+B细胞的百分率。右图显示了野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座的单一人源VH基因区段、27个人源DH和6个人源JH基因区段为纯合子的小鼠(1hVH HO)的各脾脏的CD19+B细胞数量。
图4B中的左图显示了从野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座的单一人源VH基因区段、27个人源DH和6个人源JH基因区段为纯合子的小鼠(1hVH HO)的骨髓中收集的CD19+B细胞的百分率。右图显示了野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座的单一人源VH基因区段、27个人源DH和6个人源JH基因区段为纯合子的小鼠(1hVH HO)各股骨的CD19+B细胞数量。
图5显示了对来自野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座的单一人源VH基因区段、27个人源DH和6个人源JH基因区段为纯合子的小鼠(1hVH HO)的脾细胞门控CD19+B细胞以及针对Igλ+和Igκ+表达染色的等值线图。
图6显示了对来自野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座的单一人源VH基因区段、27个人源DH和6个人源JH基因区段为纯合子的小鼠(1hVH HO)的脾细胞门控CD19+B细胞以及针对免疫球蛋白D(IgD)和免疫球蛋白M(IgM)染色的等值线图。
图7显示了从野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座(的单一人源VH基因区段、27个人源DH和6个人源JH基因区段为纯合子的小鼠1hVH HO)的脾脏中收集的过渡性B细胞(CD19+IgMhiIgDint)、成熟B细胞(CD19+IgMintIgDhi)的总数，以及成熟与未成熟B细胞的比率。
图8显示了对来自野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座的单一人源VH基因区段、27个人源DH和6个人源JH基因区段为纯合子的小鼠(1hVH HO)的免疫球蛋白M(IgM)和B220染色的骨髓门控单峰的等值线图。
图9显示了从野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座的单一人源VH基因区段、27个人源DH和6个人源JH基因区段为纯合子的小鼠(1hVH HO)的股骨分离的骨髓中未成熟(B220intIgM+)和成熟(B220hiIgM+)B细胞的总数。
图10显示了对来自野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座的单一人源VH基因区段、27个人源DH和6个人源JH基因区段为纯合子的小鼠(1hVH HO)的骨髓门控CD19+B细胞以及ckit+和CD43+染色的等值线图。
图11A显示了在从野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座的单一人源VH基因区段、27个人源DH和6个人源JH基因区段为纯合子的小鼠(1hVH HO)收集的骨髓中原B(CD19+CD43+ckit+)和前B(CD19+CD43–ckit–)细胞群中CD19+细胞的百分率。
图11B显示了在从野生型小鼠(WT)和针对在内源性免疫球蛋白重链基因座(1hVHHO)的单一人源VH基因区段、27个人源DH和6个人源JH基因区段为纯合子的小鼠收集的骨髓中原B(CD19+CD43+ckit+)和前B(CD19+CD43–ckit–)细胞群中各股骨的绝对细胞数。
图12显示了在使用人源VH、DH、JH、Vκ和Jκ基因区段(Hκ)取代内源性重链VH、DH、JH和区段内源性轻链Vκ和Jκ基因区段为纯合子的小鼠，野生型小鼠(WT)，在内源性免疫球蛋白重链基因座针对单一人源VH基因区段、27个人源DH和6个人源JH基因区段的小鼠杂合子(1hVHHET)以及在内源性免疫球蛋白重链基因座针对单一人源VH基因区段、27个人源DH和6个人源JH基因区段为纯合子的小鼠(1hVHHO)中使用特异性针对人源VH1-69基因区段的探针在定量PCR检测中测定的经纯化的脾脏B细胞的来源于VH1-69的重链相对mRNA的表达情况(y-轴)。将信号归一化至小鼠Cκ的表达情况。
图13显示了人源VH1-69基因中13个已报道的等位基因各第二外显子的核苷酸比对情况。小写碱基表示在等位基因之间的种系核苷酸差异。序列中的框表示互补性决定区(CDR)。虚线表示针对正确序列比对的人工缺口。VH1-69*01(SEQ ID NO:34)；VH1-69*02(SEQID NO:36)；VH1-69*03(SEQ ID NO:38)；VH1-69*04(SEQ ID NO:40)；VH1-69*05(SEQ ID NO:42)；VH1-69*06(SEQ ID NO:44)；VH1-69*07(SEQ ID NO:46)；VH1-69*08(SEQ ID NO:48)；VH1-69*09(SEQ ID NO:50)；VH1-69*10(SEQ ID NO:52)；VH1-69*11(SEQ ID NO:54)；VH1-69*12(SEQ ID NO:56)；VH1-69*13(SEQ ID NO:58)。
图14显示了人源VH1-69基因中13个已报道的等位基因各成熟重链可变基因序列的蛋白比对情况。小写氨基酸表示在等位基因之间的种系差异。序列中的框表示互补性决定区(CDR)。虚线表示针对正确序列比对的人工缺口。VH1-69*01(SEQ ID NO:35)；VH1-69*02(SEQ ID NO:37)；VH1-69*03(SEQ ID NO:39)；VH1-69*04(SEQ ID NO:41)；VH1-69*05(SEQID NO:43)；VH1-69*06(SEQ ID NO:45)；VH1-69*07(SEQ ID NO:47)；VH1-69*08(SEQ ID NO:49)；VH1-69*09(SEQ ID NO:51)；VH1-69*10(SEQ ID NO:53)；VH1-69*11(SEQ ID NO:55)；VH1-69*12(SEQ ID NO:57)；VH1-69*13(SEQ ID NO:59)。
图15显示了人源VH1-69基因中13个已报道的等位基因各成熟可变基因经比对蛋白序列的同一性百分率/相似性百分率矩阵。VH1-69等位基因的同一性百分率以阴影框以上的方框表示和相似性百分率以阴影框以下的方框表示。同一性百分率和相似性百分率评分由使用MacVector软件(MacVector,Inc.,North Carolina)的ClustalW(v1.83)比对工具获得。
图16显示了人源VH1-2基因中5个已报道的等位基因各第二外显子的核苷酸比对情况。小写碱基表示在等位基因之间的种系核苷酸差异。序列中的框表示互补性决定区(CDR)。虚线表示针对正确序列比对的人工缺口。VH1-2*01(SEQ ID NO:60)；VH1-2*02(SEQID NO:62)；VH1-2*03(SEQ ID NO:64)；VH1-2*04(SEQ ID NO:66)；VH1-2*05(SEQ ID NO:68)。
图17显示了人源VH1-2基因中5个已报道的等位基因各成熟重链可变基因序列的蛋白比对情况。小写氨基酸表示在等位基因之间的种系差异。序列中的框表示互补性决定区(CDR)。虚线表示针对正确序列比对的人工缺口。VH1-2*01(SEQ ID NO:61)；VH1-2*02(SEQID NO:63)；VH1-2*03(SEQ ID NO:65)；VH1-2*04(SEQ ID NO:67)；VH1-2*05(SEQ ID NO:69)。
图18显示了人源VH1-2基因中5个已报道的等位基因各成熟可变基因经比对蛋白序列的同一性百分率/相似性百分率矩阵。VH1-2等位基因的同一性百分率以阴影框以上的方框表示和相似性百分率以阴影框以下的方框表示。同一性百分率和相似性百分率评分由使用MacVector软件(MacVector,Inc.,North Carolina)的ClustalW(v1.83)比对工具获得。
图19显示了使用人细胞表面受体(抗原A)免疫的针对人源重链和人源κ轻链可变基因基因座为纯合子的小鼠(Hκ；n＝4)和在内源性免疫球蛋白重链基因座针对单一人源VH1-69基因区段、27个人源DH和6个人源JH基因区段为纯合子的小鼠(1hVHHO；n＝10)的抗体滴度。
图20显示了使用两种不同的流感疫苗免疫的针对人源重链和人源κ轻链可变基因基因座为纯合子的小鼠(Hκ；n＝5)和在内源性免疫球蛋白重链基因座针对单一人源VH1-69基因区段、27个人源DH和6个人源JH基因区段为纯合子的小鼠(1hVHHO；n＝5)的抗体滴度。
图21显示了使用人细胞表面受体(抗原A)免疫的在内源性免疫球蛋白重链基因座针对单一人源VH1-69基因区段、27个人源DH和6个人源JH基因区段为纯合子的小鼠和针对使用人源κ轻链可变基因座取代内源性κ轻链可变基因座的纯合子的VH CDR3区(x-轴)具有特定氨基酸长度的IgM激发的重链百分率(y-轴)。
图22显示了用人细胞表面受体(抗原A)免疫的在内源性免疫球蛋白重链基因座针对单一人源VH1-69基因区段、27个人源DH和6个人源JH基因区段为纯合子的小鼠和针对使用人源κ轻链可变基因座取代内源性κ轻链可变基因座的纯合子的VH CDR3区(x-轴)具有特定氨基酸长度的IgG激发的重链百分率(y-轴)。
发明详述
本发明不限于所描述的特定方法以及实验条件，因为这些方法和条件可以改变。还将理解的是本发明的范围是由权利要求所定义的，因此本申请所使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，其并不旨在限定。
除非另有定义，否则本申请使用的所有术语和短语包括所述术语和短语在本领域中所具有的含义，除非有相反的明确说明或根据使用所述术语或短语的上下文是显而易见的。尽管在实施或检验本发明中可以使用与本申请所描述的那些相似或等效的任意方法和材料，但是在本申请中仅描述了特定的方法和材料。所提及的全部出版物均通过引用并入本申请。
当使用是短语“基本上的”或“基本上地”指基因区段的数量(例如“基本上全部的”V基因区段)包括功能性和非功能性基因区段并且包括，在不同实施方式中，例如全部基因区段的80％或以上、85％或以上、90％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上或者99％或以上；在不同实施方式中，“基本上全部的”基因区段包括例如至少95％、96％、97％、98％或99％的功能性(即非假基因)基因区段。
术语“取代”包括其中DNA序列以这样一种方式放置于细胞的基因组中，即使在基因组用异源性序列(例如在小鼠中的人源序列)取代基因组中的序列。这样放置的DNA序列可以包括一个或多个调控序列，其为所述被放置的序列的来源DNA的一部分(例如启动子、增强子、5’-或3’-非翻译区、适宜的重组信号序列等)。例如，在多种实施方式中，所述取代是异源性序列对内源性序列的取代以生成这样放置的DNA序列(包含异源性序列)的基因产物，但是不表达内源性序列；所述取代是具有编码与编码内源性基因组序列(例如编码免疫球蛋白基因或结构域的内源性基因组序列，以及编码一个或多个人源免疫球蛋白基因或结构域的DNA片段)的蛋白具有相似功能的蛋白的DNA序列的内源性基因组序列。在多种实施方式中，使用相应的人源基因或其片段取代内源性基因或其片段。相应的人源基因或其片段是被取代的内源性基因或其片段的直系同源物、同源物或与其在结构和/或功能上基本相等或相同的人源基因或其片段。
使用受限制的人源免疫球蛋白重链基因座精确地在原位取代小鼠重链免疫球蛋白基因座(VH-DH-JH)可变区的6百万个碱基，但是在杂合基因座中保留翼侧小鼠序列的完整和功能，包括全部小鼠的恒定链基因和基因座转录对照区(图1和图2)。特别地，使用
基因工程技术通过嵌合BAC靶向载体将单一人源VH、27DH和6个JH基因区段引入小鼠ES细胞(参见例如美国专利号6,586,251和Valenzuela等，2003,High-throughputengineering of the mouse genome coupled with high-resolution expressionanalysis,Nat Biotechnol 21:652-659)。
具有受限制的免疫球蛋白VH基因区段的非人动物
本申请提供了一种包含免疫球蛋白基因座的非人动物，所述基因座包含受限制的数量的VH基因以及一个或多个D基因和一个或多个J基因，以及制备和使用其的方法。当使用所关注的抗原免疫时，所述非人动物产生具有仅来源于受限制的预先选定的VH基因或VH基因集合(例如预先选定的VH基因及其变体)的抗体可变区的B细胞群。在不同实施方式中，本申请提供了一种产生表达人源抗体可变结构域的B细胞群的非人动物，所述人源抗体可变结构域是人源重链可变结构域以及同源的人源轻链可变结构域。在不同实施方式中，所述非人动物在经修饰的内源性小鼠免疫球蛋白基因座重排人源重链可变基因区段和人源轻链可变基因区段，所述基因座包含用人源未经重排的可变区序列取代或插入非人源未经重排的可变区序列。
对免疫球蛋白基因的组织、结构和功能的早期工作部分在具有缺陷的内源性基因座并且工程化改造为具有部分人免疫球蛋白基因的转基因基因座(随机设置)的小鼠中进行，例如在存在或不存在人源轻链转基因的情况下，将部分人源重链基因库与人源恒定基因连接，随机插入基因座。尽管这些小鼠用于制备有用的高亲和性抗体不是十分理想，但是其有助于对免疫球蛋白基因座进行某些功能性分析。这些小鼠中的一些具有少至两种或三种，或者甚至单一的重链可变基因。
已报道了表达来源于在随机插入的转基因上的单一人源VH5-51基因以及10个人源DH基因和6个人源JH基因，且具有人源和1恒定基因的全人免疫球蛋白重链(并且具有存在缺陷的内源性免疫球蛋白基因座)的小鼠(Xu和avis,2000,Diversity in the CDR3Region of VH Is Sufficient for Most Antibody Specificities,Immunity 13:37-45)。这些小鼠的全人源免疫球蛋白重链主要仅表达来源于内源性小鼠λ轻链基因座的两种全小鼠λ轻链之一(仅Vλ1-Jλ1或Vλ2-Jλ2)，并且能够不表达κ轻链(所述小鼠是Igκ-/-的)。这些小鼠在B细胞发育和抗体表达方面显示出严重异常的功能障碍。据报道其B细胞数为野生型的5-10％、IgM水平为野生型的5-10％以及IgG1水平仅为野生型的0.1-1％。所观察到的IgM库显示出高度受限制的连接多样性。所述全人源重链针对所有抗原展示出基本相同的CDR3长度，相同的JH(JH2)使用情况以及起始连接Q残基，因此反映了一定程度的CDR3多样性缺失。全小鼠λ轻链在Jλ1几乎均具有W96L取代作为起始连接残基。据报道所述小鼠不能产生针对细菌多糖的任何抗体。由于人源可变结构域与小鼠轻链偶联，因此所述人源可变区的利用受到了极大的限制。
仅具有单一人源VH3-23基因、人源DH和JH基因以及小鼠轻链基因的其他小鼠已被报导，但是部分由于在人源VH与小鼠VL结构域之间存在错配的可能，所述小鼠显示出受限的多样性(因此使用情况受限)(参见例如Mageed等，2001,Rearrangement of the humanheavy chain variable region gene V3-23 in transgenic mice generatesantibodies reactive with a range of antigens on the basis of VHCDR3 andresidues intrinsic to the heavy chain variable region,Clin.Exp.Immunol.123:1-5)。类似地，在含有人源μ恒定基因的转基因中携带两个VH基因(3-23和6-1)以及人源DH和JH基因(Bruggemann等，1991,Human antibody production in transgenic mice:expression from 100kb of the human IgH locus,Eur.J.Immmunol.21:1323-1326)并且在具有小鼠轻链的人IgM链中表达该转基因的小鼠通过错配可以显示出受限制的库(Mackworth-Young等，2003,The role of antigen in the selection of the human V3-23 immunoglobulin heavy chain variable region gene,Clin.Exp.Immunol.134:420-425)。
表达来自随机插入基因组中的人转基因的VH-受限制的全人源重链，具有来自全人源随机插入转基因的受限制的人源λ库的小鼠亦已被报导(参见例如Taylor等，1992,Atransgenic mouse that expresses a diversity of human sequence heavy and lightchain immunoglobulins,Nucleic Acids Res.20(23):6287-6295；Wagner等，1994,Antibodies generated form human immunoglobulin miniloci in transgenic mice,Nucleic Acids Res.22(8):1389-1393)。然而，表达来自随机插入小鼠基因座的转基因的全人源抗体并且包含受损的内源性基因座的小鼠已知与野生型小鼠相比显示出免疫应答上的巨大差异，这些差异影响了从这种小鼠获得的抗体的可变结构域多样性。
能够产生表达来自受限制的VH基因库以及一个或多个D基因和一个或多个J基因的人源抗体可变结构域的多样性B细胞群的有用的非人动物可产生，优选地在一些实施方式中，具有足够多样性的重排的可变区基因库。在不同实施方式中，多样性包括连接多样性、体细胞高突变和在VH基因序列中的多态性多样性(对于VH基因以多态性形成存在的实施方式而言)。组合多样性发生在所述VH基因与多种同源的人源轻链可变结构域之一的配对中(其在不同实施方式中包括结合多样性和/或体细胞高突变)。
包含受限制的人源VH基因库和完全或基本上完全人源的VH基因库的非人动物将在不同实施方式中产生反映多种多样性来源的B细胞群，如连接多样性(例如VDJ、VJ连接、P附加、N附加)、组合多样性(例如同源的VH-受限制的人源重链，人源轻链)和体细胞高突变。在包含将VH库限制为一种人源VH基因的实施方式中，所述的一种人源VH基因能够以两种或多种变体形式存在。在不同实施方式中，VH基因两种或更多多态性形式的存在将丰富B细胞群可变结构域的多样性。
在种系序列基因区段(例如V基因)中的变体有助于在人中抗体应答的多样性。其对多样性的相对贡献是由于V基因序列在V基因之间的差异导致的。在不同基因家族之间多态性的程度不同，并且根据所观察到的在人群中相关和不相关个体之间VH单倍体存在的差异，其反映了多种单倍体(具有共遗传多态性的序列的延伸)产生更多多样性的能力(参见例如Souroujon等，1989,Polymorphisms in Human H Chain V Region Genes from theVHIII Gene Family,J.Immunol.143(2):706-711)。依据从特定多态性人源VH基因家族中得到的数据，一些人提出在种系中单倍体的多样性是VH基因在人群中呈现异质性的主要因素，这反映在人群中不同的种系VH基因具有较大的多样性(参见Sasso等，1990,Prevalenceand Polymorphism of Human VH3 Genes,J.Immunol.145(8):2751-2757)。
尽管由于普遍存在的多态性人群中对于VH基因库显示出了较大的单倍体多样性，但是某些多态性反映在在人群中观察到的普遍(即保守的)的等位基因上(Sasso等，1990)。可将VH的多态性描述为两种主要形式。第一种变体由与相同基因区段的等位基因之间核苷酸序列的差异相关的等位基因变体产生。第二种由发生在免疫球蛋白重链基因座的众多的复制、插入和/或缺失产生。这就造成了独特的情况，其中从相同基因经复制得到的VH基因与其各自的等位基因相比有一个或多个核苷酸取代的差异。这也直接影响了在重链基因座VH基因的拷贝数。
人源免疫球蛋白重链可变基因区段(VH基因)的多态性等位基因基本上是基因区段的插入/缺失以及编码区内单核苷酸的差异导致的，其均对免疫球蛋白分子具有潜在的功能性后果。表1显示了根据人源VH基因家族和在人源免疫球蛋白重链基因座中各VH基因经鉴定的等位基因数列出的功能性VH基因。一些发现提示多态性的VH基因与对某些疾病的易感性相关例如类风湿性关节炎，而在其他情况下VH与疾病之间的联系一直不太清楚。这种不确定性已被归因于在不同人群中不同等位基因的拷贝数和存在情况不同。事实上，已证实若干人源VH基因的拷贝数存在差异(例如VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70和VH3-23)。在不同实施方式中，具有受限制的VH库的如本申请所述的人源化小鼠包含单个VH家族成员的多个多态性变体(例如VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70和VH3-23的两个或多个多态性变体，其在内源性小鼠基因座取代全部或基本上全部的功能性小鼠VH区段)。在一个特定实施方式中，本申请所述小鼠的两个或多个多态性变体的数量可达到和包括表1中对应的VH家族成员所示的数量(例如针对VH1-69，13个变体；针对VH1-2，5个变体等)。
通常所见的特定人源VH基因的变体是本领域所公知的。例如在VH基因座中最复杂的多态性之一是VH1-69基因。所述人源VH1-69基因具有13个已报道的等位基因(Sasso等，1993,A fetally expressed immunoglobulin VH1 gene belongs to a complex set ofalleles,Journal of Clinical Investigation 91:2358-2367；Sasso等，1996,Expression of the immunoglobulin VH gene 51p1 is proportional to its germlinegene copy number,Journal of Clinical Investigation 97(9):2074-2080)并且存在至少三个携带VH1-69基因副本的单倍体，使得在给定基因座存在VH基因的多重拷贝。这些多态性等位基因在互补性决定区(CDR)存在差异，这可能会显著影响抗原的特异性。表2中列出了已报道的人源VH1-69的等位基因以及成熟重链可变区的DNA和蛋白序列的SEQ ID NO。表3中列出了已报道的人源VH1-2的等位基因以及成熟重链可变区的DNA和蛋白序列的SEQ IDNO。
VH1-69基因典型的基因组DNA和全长蛋白序列分别如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示。图13和图14分别显示了13个已报道的VH1-69等位基因的DNA和蛋白比对情况。VH1-2基因典型的DNA和蛋白序列分别如SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:61所示。图16和图17分别显示了5个已报道的VH1-2等位基因的DNA和蛋白比对情况。图15和图18分别显示了与13个已报道的人源VH1-69等位基因和5个已报道的人源VH1-2等位基因对应的经比对的蛋白序列的同一性/相似性百分率矩阵。在不同实施方式中，本发明经修饰的基因座包含选自表1的VH基因，其存在两个或更多的拷贝数，其中所述拷贝数包括高达和包括表1所示的等位基因数。在一个实施方式中，本发明经修饰的基因座包含选自表2的VH1-69基因，其存在两个或更多的拷贝数，其中所述拷贝数包括高达和包括表1所示的等位基因数。在一个实施方式中，本发明经修饰的基因座包含选自表3的VH1-2基因，其存在两个或更多的拷贝数，其中所述拷贝数包括高达和包括表1所示的等位基因数。
尽管对涉及小鼠中受限制的人源VH库的实施方式进行了广泛的讨论，但是本申请还提供了表达受限制的人源VH库的其他非人动物。这种非人动物包括能够被基因修饰以表达如本申请所述的受限制的人源VH库的任意动物，包括例如小鼠、大鼠、家兔、猪、牛(例如母牛、公牛、水牛)、鹿、绵羊、山羊、鸡、猫、狗、雪貂、灵长类动物(例如狨猴、猕猴)等。例如，对于适宜的基因修饰的ES细胞不易于获得的非人动物而言，可以使用其他方法制备包含基因修饰的非人动物。这种方法包括例如修饰非ES细胞基因组(例如成纤维细胞或诱导的多能干细胞)以及引入核转移以便将经修饰的基因组转移至适宜细胞例如卵母细胞，并且在适宜条件下在非人动物中使经修饰的细胞(例如经修饰的卵细胞)妊娠以形成胚胎。修饰非人动物基因组(例如猪、母牛、啮齿动物、鸡等的基因组)的方法包括例如引入锌指核酸酶(ZFN)或转录活化因子样效应物核酸酶(TALEN)以修饰基因组使其包括受限制的人源VH库。因此，在一个实施方式中，本申请提供了一种编辑非人动物基因组使其包括受限制的人源VH库的方法，所述方法包括编辑引入了ZFN或TALEN的基因组以使其包括不超过一个或者不超过两个人源VH基因区段(或其多态性变体)的步骤，其中所述不超过一个或不超过两个人源VH基因区段可操作地与免疫球蛋白恒定基因序列连接。在一个实施方式中，所述恒定基因序列选自人源重链恒定序列和非人源重链恒定序列。在一个实施方式中，所述恒定序列是非人源的并且所述不超过一个或不超过两个人源VH基因区段在内源性非人源免疫球蛋白基因座可操作地与非人源恒定基因序列连接。
在一个方面，所述非人动物是小型哺乳动物，例如跳鼠科或鼠科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠科超家族。在一个实施方式中，所述基因修饰的动物来自选自丽仓鼠科(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(真小鼠和大鼠、沙鼠、刺毛鼠、冠毛大鼠)、马岛鼠科(登山小鼠、岩小鼠、有尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺山鼠科(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(例如摩尔大鼠、竹大鼠和鼢鼠)家族。在一个特定实施方式中，所述基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、刺毛鼠和黄冠鼠。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠是鼠科家族成员。
在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，其是C57BL品系的小鼠。在一个实施方式中，所述C57BL品系选自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr和C57BL/Ola。在另一个实施方式中，所述小鼠是129品系。在一个实施方式中，所述129品系选自下组：129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(参见例如Festing等(1999)Revised nomenclature for strain 129 mice,Mammalian Genome 10:836，亦参见Auerbach等(2000)Establishment and Chimera Analysis of 129/SvEv-and C57BL/6-Derived Mouse Embryonic Stem Cell Lines)。在一个实施方式中，所述基因修饰的小鼠是前述129品系和前述C57BL品系的混合物(例如C57BL/6品系)。在另一个实施方式中，所述小鼠是前述129品系的混合物，或者前述C57BL/6品系的混合物。在一个实施方式中，所述129品系的混合物是129S6(129/SvEvTac)品系。在另一个实施方式中，所述小鼠是129/SvEv-和C57BL/6-来源品系的混合物。在一个特定实施方式中，所述小鼠是Auerbach etal.2000 BioTechniques 29:1024-1032描述的129/SvEv-和C57BL/6-来源品系的混合物。在另一个实施方式中，所述小鼠是BALB品系例如BALB/c品系。在另一个实施方式中，所述小鼠是BALB品系(例如BALB/c品系)和另一种前述品系的混合物。
在一个实施方式中，所述非人动物是大鼠。在一个实施方式中，所述大鼠选自Wistar大鼠、LEA品系、Sprague Dawley品系、Fischer品系、F344、F6和Dark Agouti。在一个实施方式中，所述大鼠品系是两种或多种选自下组的品系的混合物：Wistar、LEA、SpragueDawley、Fischer、F344、F6和Dark Agouti。
表1
表2
表3
抗原依赖性VH基因的使用情况
可以将VH基因的抗原依赖性优选使用情况用于靶向具有临床显著意义的抗原的人用治疗剂的研发上。使用特定VH基因产生抗体可变结构域库的能力在寻找用于人用疗法的高亲和性抗体可变结构域方面提供了显著的益处。针对天然小鼠和在抗体可变结构域中人源VH基因使用情况的研究揭示了大部分重链可变结构域并不是从任意单一或主要使用的VH基因得到。在另一方面，抗体针对某些抗原应答的研究揭示了在一些情况下免疫后特定抗体的应答显示出了对B细胞库中特定VH基因的偏向性使用。
尽管所述人源VH库相当多样，根据某些估计，假定随机选择VH基因，则任意给定VH基因的预计使用频率为约2％(Brezinschek等，1995,Analysis of the Heavy ChainRepertoire of Human Peripheral B Cells Using Single-Cell Polymerase ChainReaction,J.Immunol.155:190-202)。但是在人的外周B细胞中VH的使用是有偏向性的。在一项研究中，功能性V基因的丰度依次为模式VH3>VH4>VH1>VH2>VH5>VH6(Davidkova等，1997,Selective Usage of VH Genes in Adult Human Lymphocyte Repertoires,Scand.J.Immunol.45:62-73)。一项早期研究估计VH3家族的使用频率为约0.65，而VH1家族的使用频率为约0.15；这些和其他观察结果提示人源VH库的种系复杂性并不能精确地反映在具有正常种系VH库的人外周B细胞室中，这种情况与在小鼠中观察到的结果类似——即VH基因的表达是非随机的(Zouali和These,1991,Probing VH Gene-Family Utilization inHuman Peripheral B Cells by In Situ Hybridization,J.Immunol.146(8):2855-2864)。根据一项报道，在人中VH基因的使用情况从高到低为VH3>VH4>VH1>VH5>VH2>VH6；在外周B细胞中的重排揭示了VH3家族的使用情况高于依据种系VH3基因的相对数量所预计的结果(Brezinschek等，1995)。根据另一项报道，依据对美洲商陆丝裂原活化外周小免疫活性B细胞的分析结果,在人中VH的使用情况依次为类型VH3>VH5>VH2>VH1>VH4>VH6，(Davidkova等，1997,Selective Usage of VH Genes in Adult Human B Lymphocyte Repertoires,Scand.J.Immunol.45:62-73)。一项报道称VH3家族中使用频率最高的是3-23、3-30和3-54(Brezinschek等，1995)。在VH4家族中，发现成员4-59和4-4b以及4-39和4-34具有相对较高的使用频率(Id.)(Brezinscheck等，1997,Analysis of the Human VH Gene Repertoire,J.Clin.Invest.99(10):2488-2501)。其他假设显示活化重链库倾向于增加VH5的表达并降低VH3的表达(Van Dijk-Hard和Lundkvist,2002,Long-term kinetics of adult humanantibody repertoires,Immunology 107:136-144)。其他研究显示在成人库中最常用的VH基因是VH4-59，其次是VH3-23和VH3-48(Arnaout等，2001,High-Resolution Descriptionof Antibody Heavy-Chain Repertoires in Humans,PLoS ONE 6(8):108)。尽管使用情况研究基于相对较小的样本数，因此显示出较高的变异性，但是综合考虑上述研究后认为V基因的表达不是纯随机的。事实上，使用特定抗原的研究已确立了在某些情况下，某些VH基因被偏好使用。
随着时间的推移，人们清楚的了解到所观察到的针对某些抗原产生的人源重链可变结构域的库是高度受限制的。一些抗原几乎排他地与仅具有某些特定VH基因的中和抗体结合，从这个意义上说有效的中和抗体基本上仅来源于一个VH基因。多种临床上重要的人病原体就是这种情况。
在多种具有治疗意义的抗原特异性抗体库中观察到来源于VH1-69的重链。例如，通常在患有特应性疾病的幼儿外周血淋巴细胞IgE库的重链转录本中能够观察到VH1-69(Bando等，2004,Characterization of VH gene expressed in PBL from children withatopic diseases:detection of homologous VH1-69 derived transcripts from threeunrelated patients,Immunology Letters 94:99-106)。在B细胞淋巴瘤中也观察到来源于VH1-69的重链具有较高程度的体细胞高突变(Perez等，2009,Primary cutaneous B-cell lymphoma is associated with somatically hypermutated immunoglobulinvariable genes and frequent use of VH1-69 and VH4-59 segments,British Journalof Dermatology 162:611-618)，但在血液疾病患者的自身抗体中观察到的主要是具有种系序列(即几乎不具有体细胞高突变)的一些来源于VH1-69的重链(Pos等，2008,VH1-69germline encoded antibodies directed towards ADAMTS13 in patients withacquired thrombotic thrombocytopenic purpura,Journal of Thrombosis andHaemostasis 7:421-428)。
此外，已发现针对病毒抗原如HIV、流感和丙型肝炎(HCV)的中和抗体利用种系和/或体细胞突变的来源于VH1-69的序列(Miklos等，2000,Salivary gland mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma immunoglobulin VH genes show frequent useof V1-69 with distinctive CDR3 features,Blood 95(12):3878-3884；Kunert等，2004,Characterization of molecular features,antigen-binding,and in vitropropertiesof IgG and IgM variants of 4E10,an anti-HIV type I neutralizing monoclonalantibody,Aids Research and Human Retroviruses 20(7):755-762；Chan等，2001,VH1-69 gene is preferentially used by hepatitis C virus-associated B celllymphomas and by normal B cells responding to the E2 viral antigen,Blood 97(4):1023-1026；Carbonari等，2005,Hepatitis C virus drives the unconstrainedmonoclonal expansion of VH1-69-expressing memory B cells in type IIcryoglobulinemia:A model of infection-driven lymphomagenesis,Journal ofImmunology 174:6532-6539；Wang和Palese,2009,Universal epitopes of influenzavirus hemagglutinins？,Nature Structural&Molecular Biology 16(3):233-234；Sui等，2009,Structural and functional bases for broad-spectrum neutralization ofavian and human influenza A viruses,Nature Structural&Molecular Biology 16(3):265-273；Marasca等，2001,Immunoglobulin Gene Mutations and Frequent Use ofVH1-69 and VH4-34 Segments in Hepatitis C Virus-Positive and Hepatitis CVirus-Negative Nodal Marginal Zone B-Cell Lymphoma,Am.J.Pathol.159(1):253-261)。
在人体内针对乙型流感嗜血杆菌(Hib PS)的体液免疫应答中也观察到了VH的使用偏倚。研究表明VHIII家族(特别是VHIIIb亚家族，VH9.1)使针对Hib PS的人体液应答具有了排他性的特征，其具有多样性的D和J基因(Adderson等，1991,Restricted Ig H Chain VGene Usage in the Human Antibody Response to Haemophilus influenzae Type bCapsular Polysaccharide,J.Immunol.147(5):1667-1674；Adderson等，1993,RestrictedImmunoglobulin VH Usage and VDJ Combinations in the Human Response toHaemophilus influenzae Type b Capsular Polysaccharide,J.Clin.Invest.91:2734-2743)。人源JH基因也显示出使用偏倚；观察结果显示在人外周B细胞中JH4和JH6约为38-41％(Brezinschek等，1995)。
据报道感染了HIV-1的人中VH的使用情况不偏向于VH3，而是偏向于VH1和VH4基因家族(Wisnewski等，1996,Human Antibody Variable Region Gene Usage in HIV-1Infection,J.Acquired Immune Deficiency Syndromes&Human Retroviology 11(1):31-38)。然而，对被感染患者的骨髓进行cDNA分析的结果显示有大量VH3的使用并未表现在功能性B细胞库中，反映VH3使用情况的Fab显示出其在体外有效地中和HIV-1(Id.)。据推测这可能是由于VH受限导致了针对HIV-1感染的体液免疫应答减弱；因此如本申请所述的经修饰的非人动物(不能被HIV-1感染的)可以用于产生来源于存在于本申请所述的基因修饰动物中特定VH基因的中和抗体结构域，但是其与在被感染人员受限制的库中观察到的那些来源于不同的VH基因。
因此，在经过HIV-1免疫的VH-受限制的小鼠中例如(限制为例如VH3家族成员及其多形变体)产生高亲和性人源抗体可变结构域的能力为通过深入挖掘这种经免疫小鼠受限制的(例如限制为VH3家族成员或其变体)库设计有效的HIV-1中和人用疗法提供了丰富的资源。
人源抗体对某种病原体的应答的限制可以减少从被感染人员中获得的抗体可变区的可能性，而这些可能性是设计针对病原体的高亲和性中和抗体的跳板。例如，在HIV-1感染和进入AIDS进展过程中对HIV-1感染的人源免疫应答是克隆受限制的(Muller等，1993,B-cell abnormalities in AIDS:stable and clonally restricted antibodyresponse in HIV-1infection,Scand.J.Immunol.38:327-334；Wisnewski等，1996)。而且，在通常情况下VH基因于任意特定个人中不存在所有多态性形式；在某些群体中的某些个体拥有某一变体，而在其他群体中的个体拥有不同的变体。因此，限制为单一VH基因及其变体的生物系统的可用性将在不同的实施方式中提供迄今为止未被探索的产生多样性来源的基于受限制的VH基因的抗体可变区(例如人源重链和轻链同源结构域)。因此，在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，所述动物包含多个不超过一种或者不超过两种人源VH基因区段家族成员的多态性变体。在一个实施方式中，所述不超过一种或者不超过两种人源VH基因区段可操作地与一个或多个人源DH基因区段、一个或多个人源JH基因区段以及人源或非人源恒定区基因区段连接。在一个实施方式中，所述恒定区在内源性非人源免疫球蛋白恒定基因基因座。在一个实施方式中，所述非人动物进一步包含来源于人源VL序列例如重排的或未经重排的人源VL基因区段或重排的人源VL/JL序列的核酸序列。在一个实施方式中，所述核酸序列来源于在内源性非人源VL基因座的人源VL序列；在一个实施方式中，所述核酸序列来源于转基因上的人源VL序列。在一个特定实施方式中，所述非人动物不能表达本身包含内源性VL或JL基因区段的免疫球蛋白轻链可变结构域(即来自不超过一种或不超过两种重排的人源VL/JL序列)，并且包含编码重排的人源VL结构域的不超过一种或不超过两种轻链基因。
表达具有受限制的VH基因区段的人源重链可变结构域的基因修饰小鼠可用于从一个在其它方面受限制的库中产生一个相对较大的，具有连接多样性、组合多样性、以及体细胞突变的高亲和性人源免疫球蛋白重链可变区的库。受限制的库，在一个实施方式中，指预先限定种系基因的数量和/或特性，以使得小鼠不能由预先选定的V基因以外的任意V基因形成重排重链基因。在使用预先选定的V基因而不是预先选定的D和/或J基因的实施方式中，所述库的限定是针对V基因的特性而非D和/或J基因(例如所述库基本上由不超过一个或不超过两个VH基因区段(和/或其多形变体)以及多个D基因区段和多个J基因区段组成)。预先选定的V基因(以及任意预先选定的D和/或J基因)的特性不限于任何特定的V基因。
设计一种重排单一的VH基因(以单一区段或变体集合的形式存在)和多种人源D和J基因区段(例如DH和JH区段)并且提供体内连接多样性/组合多样性/体细胞高突变排列的小鼠，其能够用于重复突变以产生重排的重链可变区序列(例如V/D/J或V/J，视情况而定)。在这种小鼠中，进行克隆选择过程以选择基于单一预先选定的VH基因(或其变体)与所关注抗原结合的适宜可变区。因为所述小鼠的克隆选择组件是根据单一预先选定的VH基因区段专门选择的，所以在很大程度上消除了背景噪音(例如来源于多个种系基因区段的多种多样的非抗原结合VH结构域)。与具有较大V区段多样性的小鼠相比，具有适宜选择的V区段的小鼠能够在更短的时间内筛选出相对更大量的经克隆选择的抗原特异性抗体。
在不同实施方式中，预先选定有限的库并且将小鼠限定为单一V区段提供了一种系统，该系统的V/D/J连接的重排的速率高于具有多达40个或更多的与D和J区段组合的V区段的小鼠。除去其他V区段使得该基因座可以为预先选定的V区段形成更多的V/D/J组合。由预先选定的V区段与多个D区段之一和多个J区段之一重组形成的转录本的数量增加使得这些转录本被加入到以前B细胞形式的克隆选择系统中，并且该克隆选择系统将用于表达预先选定的V区的循环B细胞中。以这种方式，通过该小鼠可以在给定时间内比其它小鼠选择出更多来源于预先选定的V区段的独特V区重排。
在不同的方面，所述小鼠针对预先选定的V区的V/D/J重组的连接多样性增加，因为免疫球蛋白重链可变基因座全部或基本上全部的重组将是预先选定的V区段与在这种小鼠中的D和J区段之间的。因此，这种小鼠提供了一种使用受限制的VH基因库或基础产生多样性的CDR3区段的方法。
在一个方面，本申请提供了一种非人动物，其中所述非人动物的B细胞群表达来源于不超过一个或者不超过两个人源VH基因区段的免疫球蛋白重链。一个实施方式中，不超过一个或者不超过两个人源VH基因区段均以两种或多种多态性形式存在。在一个实施方式中，所述人源VH基因区段以3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20种多态性形式存在。在一个实施方式中，所述非人动物表达来源于人源VL基因区段的人源轻链可变结构域。
在一个方面，本申请提供了一种在非人动物中产生B细胞群的方法，其中所述B细胞群表达来源于单一种系人源VH基因区段以及两个或多个人源D基因区段和两个或多个人源J基因区段的人源重链；所述方法包括步骤：使用所关注的抗原免疫如本申请所述的非人动物，以及使得所述非人动物针对所关注的抗原产生免疫应答，其中所述免疫应答包括在B细胞群的B细胞表面表达所述人源重链。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物(例如小鼠或大鼠)。在一个实施方式中，所述人源VH基因区段、人源DH区段和人源JH区段可操作地与非人源恒定区基因连接。在一个实施方式中，所述非人动物进一步包含编码人源VL结构域的核酸序列。在一个实施方式中，所述编码人源VL结构域的核酸序列与非人源轻链恒定区基因序列连接。
在一个方面，本申请提供了一种制备表达免疫球蛋白群的非人动物的方法，所述免疫球蛋白群的特征为其免疫球蛋白具有来源于单一人源VH基因区段(或单一人源VH基因家族成员)与多种DH基因区段之一和多种JH基因区段之一的多种重排的重链。在一个实施方式中，所述人源VH基因区段是人源VH1-69基因区段。在一个实施方式中，所述人源VH基因区段是人源VH1-2基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种产生人源免疫球蛋白重链可变结构域群的方法，所述重链可变结构域的CDR1和CDR2来源于同一种系的VH基因区段，并且CDR3来源于该种系基因区段以及两个或多个人源D区段和两个或多个人源J区段；所述方法包括使用所关注的抗原免疫如本申请所述的非人动物，以及使得所述非人动物针对所关注的抗原产生免疫应答，其中所述免疫应答包括在轻链可变结构域背景下表达人源重链可变结构域。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物(例如小鼠或大鼠)。在一个实施方式中，所述人源VH基因区段、人源D区段和人源J区段可操作地与非人源恒定区基因连接。在一个实施方式中，所述非人源动物进一步包含编码人源VL结构域的核酸序列。在一个实施方式中，所述编码人源VL结构域的核酸序列与非人源轻链恒定区基因序列连接。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，其中所述非人动物不能表达非人源VH结构域，其中在所述动物中表达的重链群的各免疫球蛋白重链均包括包含相同的但具有一个或多个体细胞高突变的CDR1和CDR2的人源VH结构域，并且其中所述重链群包含来源于多个D和J基因区段多个重排的多个CDR3序列。
在一个方面，本申请提供了一种在CDR3的特性和长度方面产生变化的生物系统，所述生物细胞包括如本申请所述的基因修饰的非人动物，其中所述非人动物包含不超过一个或不超过两个人源VH基因区段，以及两个或多个D基因区段和一个或多个J基因区段，其中所述非人动物进一步包含人源化的免疫球蛋白轻链基因座。在不同实施方式中，所述非人动物应答所关注抗原的免疫产生包含表达免疫球蛋白重链群的免疫应答，所述免疫球蛋白重链群的特征为各重链均具有仅在体细胞高突变存在差异的CDR1和CDR2以及重排和体细胞高突变不同的CDR3。在一个实施方式中，所述生物系统是如本申请所述的基因修饰的小鼠。在一个实施方式中，所述人源VH基因区段和人源VL基因区段分别在内源性小鼠重链和轻链免疫球蛋白基因座。在一个实施方式中，人源VH基因区段和人源VL基因区段中的一个或多个在转基因上(即在内源性免疫球蛋白基因座以外的基因座)。
本申请还提供以下：
实施方式1.一种具有受限制的免疫球蛋白重链基因座的小鼠，其特征在于，所述受限制的免疫球蛋白重链基因座存在单一人源VH基因区段、一个或多个人源DH基因区段和一个或多个人源JH基因区段，其中所述单一人源VH基因区段是多态性的VH基因区段。
实施方式2.根据实施方式1所述的小鼠，其中所述小鼠包含全部或基本上全部内源性VH、DH和JH基因区段的缺失。
实施方式3.根据实施方式1所述的小鼠，其中所述单一人源VH基因区段选自VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70和VH3-23。
实施方式4.根据实施方式3所述的小鼠，其中所述单一人源VH基因区段是VH1-69。
实施方式5.根据实施方式3所述的小鼠，其中所述单一人源VH基因区段是VH1-2。
实施方式6.根据实施方式1所述的小鼠，其中所述单一人源VH基因区段可操作地与人源或非人源免疫球蛋白恒定区基因连接。
实施方式7.根据实施方式6所述的小鼠，其中所述免疫球蛋白恒定区基因是小鼠、大鼠或人恒定区基因。
实施方式8.根据实施方式1所述的小鼠，其进一步包含与一个或多个人源JH基因片段可操作地连接的一个或多个人源免疫球蛋白VL基因区段。
实施方式9.根据实施方式8所述的小鼠，其中所述一个或多个人源VL基因区段和/或所述一个或多个人源JL基因区段选自人κ和人λ基因区段。
实施方式10.根据实施方式8所述的小鼠，其中所述一个或多个人源免疫球蛋白VL基因区段和一个或多个人源JL基因区段可操作地与非人源轻链恒定基因连接。
实施方式11.根据实施方式10所述的小鼠，其中所述非人源轻链恒定基因选自小鼠或大鼠κ或λ恒定区基因。
实施方式12.一种小鼠，其特征在于，所述小鼠在其种系的内源性免疫球蛋白重链基因座中包含用单一人源VH基因区段和/或其多态性变体、一个或多个人源DH基因区段和一个或多个人源JH基因区段取代全部或基本上全部的内源性VH、DH和JH基因区段。
实施方式13.根据实施方式12所述的小鼠，其进一步包括在内源性免疫球蛋白轻链基因座用一个或多个人源VL和一个或多个人源JL基因区段取代全部或基本上全部的内源性VL和JL基因区段。
实施方式14.根据实施方式12所述的小鼠，其中所述单一人源VH基因区段选自人VH1-69和人VH1-2基因区段。
实施方式15.一种来源于实施方式1或12所述的小鼠的细胞或组织。
实施方式16.一种制备编码人VH结构域的核酸序列的方法，所述方法包括：(a)使用抗原免疫实施方式1或12所述的小鼠；(b)使得所述小鼠产生针对所述抗原的免疫应答；以及，(c)从所述小鼠中获得编码人VH结构域的核酸序列。
实施方式17.根据实施方式16所述的方法，其中所述免疫球蛋白VH区序列与SEQID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56或SEQ ID NO:58具有至少75％的同一性。
实施方式18.根据实施方式16所述的方法，其中所述免疫球蛋白VH区序列包含SEQID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56、SEQID NO:58，或其多态性变体。
实施方式19.根据实施方式16所述的方法，所述免疫球蛋白VH区序列编码的蛋白与SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ IDNO:57或SEQ ID NO:59具有至少75％的同一性。
实施方式20.根据实施方式16所述的方法，其中所述免疫球蛋白VH区序列与SEQID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:68具有至少95％的同一性。
实施方式21.根据实施方式16所述的方法，其中所述免疫球蛋白VH区序列包含SEQID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68，或其多态性变体。
实施方式22.根据实施方式16所述的方法，其中免疫球蛋白VH区序列编码的蛋白与SEQ ID NO:61,、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69具有至少95％的同一性。
实施方式23.根据实施方式1或12所述的小鼠用于制备编码人重链可变结构域的核酸序列的用途。
实施方式24.根据实施方式23所述的用途，其中所述人重链可变结构域的特征为具有来源于多态性人VH基因区段的人FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3序列。
实施方式25.根据实施方式24所述的用途，其中所述人VH基因区段选自人VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70或VH3-23基因区段。
实施方式26.根据实施方式25所述的用途，其中所述人VH基因片区段是VH1-2。
实施方式27.根据实施方式25所述的用途，其中所述人VH基因区段是VH1-69。
实施方式28.根据实施方式1或12所述的小鼠用于制备人源抗体的用途，其中所述人源抗体包含来源于经重排的人VH1-2基因区段、人VH1-69基因区段或其多态性变体的重链可变结构域。
实施方式29.根据实施方式28所述的用途，其中所述重排的人VH1-69基因区段与SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ IDNO:56或SEQ ID NO:58具有至少75％的同一性。
实施方式30.根据实施方式28所述的用途，其中所述经重排的人VH1-2基因区段与SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:68具有至少95％的同一性。
实施例
提供下述实施例以便向本领域技术人员描述如何制备和使用本发明的方法和组合物，而不是旨在限定发明人所认为的发明的范围。除非另有明示，温度以摄氏度表示，并且压力为处于或接近大气压。在前述的实施例中，当指出使用来自不同供应商的试剂盒和/试剂时，所有的程序均依据生产厂商的说明书进行。
实施例1受限制的重链基因座的构建
使用细菌人工染色体(BAC)DNA的细菌细胞(BHR)中通过一系列同源重组反应制备独特的改造的人源重链基因座，所述基因座含有位于全部人源DH和JH基因区段上游的单一人源VH基因区段。使用
基因工程技术构建用于形成含有单一VH的重链基因座的若干靶向构建体(参见例如美国专利号6,586,251和Valenzuela,D.M.等(2003)High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolutionexpression analysis.Nature Biotechnology 21(6):652-659)。
人源VH1-69受限制的重链基因座的构建。简言之，使用人BAC DNA进行四个修饰以形成含有人源VH1-69基因区段以及全部人源DH和JH区段的靶向构建体(图1)。在第一个修饰中，经修饰的人源BAC含有多个远端(5’)人源VH基因区段包括VH1-69、上游潮霉素选择性表达盒和使用第二大观霉素表达盒靶向的5’小鼠同源臂，其还含有经修饰的重组信号序列(RSS；BHR 1，图1左上)。该经修饰的重组信号序列(RSS)在人源VH1-69基因3’RSS区中引入两个点突变(T至A和G至A)以使得RSS九聚体变成最佳共有序列。这样，第一个修饰(BHR 1)形成了含有具有经修饰的3’RSS的人源VH1-69基因区段、在RSS下游约180bp处独特的AsiSI限制性位点和大观霉素表达盒的人基因组片段(图1，中间左侧)。
所述第二个修饰(BHR 2)包括使用两侧具有Frt位点的新霉素(Neo)表达盒去取代潮霉素表达盒以及VH1-69基因区段上游的5’人源VH基因区段。该修饰靶向于人源VH1-69基因区段的5’端以保留完整的约8.2kb的人源VH1-69的启动子区和5’小鼠同源臂(图1，下部左侧)。
所述第三个修饰(BHR 3)包括使用两侧具有独特的工程化5’PI-SceI和3’AsiSI位点的另一个大观霉素表达盒靶向含有前三个功能性人源VH基因区段和全部人源DH和JH基因区段的人基因组片段(图1，中间右侧)。所述人基因组片段此前已经使用新霉素表达盒靶向并且包含含有小鼠基因组序列5’和包括3’内含子增强子和IgM基因的3’内源性重链基因座的5’和3’同源臂。该修饰缺失5’小鼠基因组序列和人源VH基因区段，保留人源DH1-1基因区段上游约3.3kb的VH-DH基因间区、全部的人源DH和JH区段以及含有3’内含子增强子和IgM基因的3’小鼠基因座片段(图1，下部右侧)。
第四个修饰通过引入独特的PI-SceI和AsiSI位点(如上文所述)以实现将来自BHR2和BHR 3的两个经修饰的BAC的连接(图1，下部中间)，以产生最终的靶向构建体。最终的靶向构建体用于在含有其的ES细胞中形成经修饰的重链基因座，所述基因组含有单一人源VH基因区段和全部的人源DH和JH基因区段，所述构建体从5’至3’为：含有内源性重链基因座上游约20kb的小鼠基因组序列的5’同源臂、5’Frt位点、新霉素表达盒、3’Frt位点、约8.2kb的人源VH1-69启动子、具有经修饰的3’RSS的人源VH1-69基因区段、27个人源DH基因区段、6个人源JH区段以及含有包括3’内含子增强子和IgM基因的小鼠JH基因区段下游约8kb小鼠基因组序列的3’同源臂(图1，下部)。将所述人源VH1-69靶向载体(SEQ ID NO:3)线性化并电穿孔至内源性重链基因座缺失的小鼠杂合子ES细胞中。
人源VH1-2受限制的重链基因座的构建。使用上文所述的步骤，在小鼠重链恒定区背景下引入其他多态性VH基因区段以构建具有有限数量(例如1、2、3、4或5)免疫球蛋白重链V区段的一系列小鼠，其中所述V区段是V基因家族成员的多态性变体。示例性的多态性VH基因区段来源于人源VH基因区段，包括例如VH1-2、VH2-26、VH2-70和VH3-23。这种人源VH基因区段使用从公开数据库获得的序列例如通过从头合成法(例如Blue HeronBiotechnology,Bothell,WA)获得。这样，在一些实施方式中，独立地制备用于引入如本申请所述的靶向载体的编码各VH基因的DNA片段。以这种方式，在小鼠重链恒定区背景下制备多个包含限制数量的VH基因区段的经修饰的免疫球蛋白重链基因座。用于制备受限制的人源化重链基因座的一个示例性靶向策略如图2所示，所述基因座包含人源VH1-2基因区段、27个人源DH基因区段和六个人源JH基因区段。
简言之，含有3个人源VH基因区段(VH6-1、VH1-2、VH1-3)、27个人源DH基因区段和6个人源JH基因区段的经修饰的人源BAC克隆(参见USSN 13/404,075；2012年2月24日提交，其通过引用并入本申请)用于制备含有人源VH1-2基因区段的受限制的人源化重链基因座。该经修饰的BAC克隆功能性地连接具有小鼠内含子增强子和IgM恒定区的前述人源重链区段。使用上文所述的经修饰的人源BAC克隆通过两次同源重组获得基于受限制的人源VH1-2的重链基因座。
对于第一次同源重组而言，使用在两侧具有独特的PI-SceI限制性位点的大观霉素(aadA)表达盒通过细菌同源重组缺失经修饰的人BAC克隆中205bp的人源VH6-1基因区段(由在外显子1中的VH6-1起始密码子上游约10bp(5’)至从外显子2开始下游约63bp(3’))(图2，BHR 1)。这使得随后对aadA表达盒的去除不会破坏受限制的重链基因座中的其他人源基因区段。
对于第二次同源重组而言，使用在两侧具有5’AsiSI和3’AscI限制性位点的潮霉素表达盒通过同源重组使包括整个人源VH1-3基因区段和该基因区段下游(3’)约60bp的经修饰的人BAC克隆的5’端(图2，BHR 2)缺失。如上文所述，在对包括人源VH1-2基因区段翼侧的两个人源VH基因区段缺失的最终的靶向载体进行确证后可选地除去大观霉素表达盒(图2，下部)。示例性的人源VH1-2靶向载体如SEQ ID NO:70所示。
在受限制的免疫球蛋白重链基因座引入多态性的VH基因区段代表了一种用于生成抗体、抗体群和表达抗体的B细胞群的新方法，所述抗体具有来源于单一人源VH基因区段的多样性CDR的重链。利用所述动物的体细胞高突变方法以及结合重排的人源免疫球蛋白轻链可变结构域可以产生工程化的独特的重链和独特的VH/VL对，其扩大了基因修饰动物的免疫库并且扩大了其作为用于制备下一代人用治疗剂的平台的用途，特别是作为制备特异性针对人病原体的中和抗体的用途。
因此，使用上文所述用于将附加的和/或其他多态性VH基因区段引入小鼠免疫球蛋白重链基因座的策略能够生成用于中和在其他情况下可能有效地逃避宿主免疫系统的人病原体的新型抗体库。
使用上文所述的靶向ES细胞作为供体ES细胞并通过
法(如上所述)将其引入8-细胞阶段的小鼠胚胎中。使用改良的等位基因检测(Valenzuela等，如上所述)通过基因分型鉴定携带人源化重链基因座的小鼠，所述基因座含有可操作地与小鼠免疫球蛋白恒定区基因连接的单一人源VH基因区段以及全部的人源DH和JH基因区段，所述检测方法检测新霉素表达盒、人源VH基因区段和人源DH和JH基因区段内的区域以及内源性重链序列的存在情况。表4中列出了在这一检测中使用的引物和探针，以确证小鼠具有受限制的重链基因座，其含有单一人源VH1-69基因区段、27个人源DH基因区段和6个人源JH基因区段。
可以将携带含有单一人源VH基因区段的工程化重链基因座的小鼠与FLPe缺失小鼠品系(see,e.g.,Rodriguez,C.I.et al.(2000)High-efficiency deleter mice showthat FLPe is an alternative to Cre-loxP.Nature Genetics 25:139-140交配以除去全部由靶向载体引入例如在ES细胞阶段或在胚胎中且未被除去的Frt’ed新霉素表达盒。可选地，在小鼠中保留新霉素表达盒。
对胎仔进行基因分型并选择含有单一人源VH基因区段且全部人源DH和JH区段可操作地与内源性小鼠免疫球蛋白恒定基因连接的针对人源化重链基因座为杂合子的胎仔用于表征免疫球蛋白重链库。
表4
实施例2表达来源于单一人源VH基因区段的重链的小鼠的鉴定
使用流式细胞术对如实施例1中所描述的在内源性重链基因座单一人源VH基因区段为纯合子的小鼠针对表达和B细胞发育进行评估。
简言之，从野生型(n＝3每组；六周龄，雄性和雌性)和针对可操作地与小鼠重链恒定区连接的单一人源VH基因区段以及全部的人源DH和JH基因区段为纯合子的小鼠中收集脾脏和骨髓。使用ACK裂解缓冲液(Lonza Walkersville)裂解来自脾脏的红细胞，随后使用完全RPMI培养基洗涤。
流式细胞术。抗小鼠CD16/CD32(2.4G2,BD PHARMINGENTM)与细胞(1x106)在冰上共孵育10分钟，随后使用下述抗体组在冰上标记30分钟。骨髓组：抗-小鼠FITC-CD43(1B11,BioLegend)、PE-ckit(2B8,
)、PeCy7-IgM(II/41,
)、PerCP-Cy5.5-IgD(11-26c.2a,
)、APC-eFluor 780-B220(RA3-6B2,
)、APC-CD19(MB19-1,
)。骨髓和脾脏组：抗-小鼠FITC-Igκ(187.1,BD Biosciences)、PE-Igλ(RML-42,
)、PeCy7-IgM(II/41,
)、PerCP-Cy5.5-IgD(11-26c.2a,
)、Pacific Blue-CD3(17A2,
),、APC-B220(RA3-6B2,
)、APC-H7-CD19(ID3,BDBiosciences)。骨髓：未成熟的B细胞(B220intIgM+)、成熟的B细胞(B220hiIgM+)、原B细胞(CD19+ckit+CD43+)、前B细胞(CD19+ckit–CD43–)、未成熟的Igκ+B细胞(B220intIgM+Igκ+Igλ–)、未成熟的Igλ+B细胞(B220intIgM+Igκ–Igλ+)、成熟的Igκ+B细胞(B220hiIgM+Igκ+Igλ–)、成熟的Igλ+B细胞(B220hiIgM+Igκ–Igλ+)。脾脏：B细胞(CD19+)、成熟的B细胞(CD19+IgDhiIgMint)、过渡性/未成熟的B cells(CD19+IgDintIgMhi)。骨髓和脾脏：Igκ+B细胞(CD19+Igκ+Igλ–)、Igλ+B细胞(CD19+Igκ–Igλ+)。
染色后，洗涤细胞并使用2％福尔马林固定。在LSRII流式细胞仪上采集数据并使用FLOWJOTM软件(Tree Star,Inc.)分析。脾脏小室的结果见图3、4A和5-7。骨髓小室的结果见图4B和8-11B。
人源VH表达。通过使用
探针的定量PCR检测确定针对人源VH1-69基因区段以及全部可操作地与小鼠重链恒定区连接的人源DH和JH基因区段的小鼠杂合子和纯合子中人源VH1-69基因区段的表达情况。
简言之，根据生产厂商的说明书使用小鼠CD19微珠(Miltenyi Biotec)从各组小鼠(n＝3每组)的脾脏中纯化CD19+B细胞。使用RNEASYTM微量试剂盒(Qiagen)纯化总RNA并且使用不含RNase的DNase柱上处理(Qiagen)除去基因组RNA。使用First Stand cDNA合成试剂盒(Invitrogen)将约200ng mRNA逆转录成cDNA，随后使用ABI 7900序列检测系统(Applied Biosystems)利用
Universal PCR Master Mix(AppliedBiosystems)扩增。使用独特的引物/探针组合特异性检测人源VH1-69来源重链的表达情况(表5)。将相对表达情况归一化至小鼠κ恒定区(mCκ)。结果如图12所示。
表5
实施例3在表达来源于单一人源VH基因区段的重链的小鼠中的体液免疫应答
通过使用人细胞表面受体(抗原A)进行比较免疫接种确定针对人源重链和轻链可变基因基因座为纯合子的小鼠(Hκ)以及针对可操作地与小鼠重链恒定区连接的单一人源VH基因区段和全部人源DH和JH基因区段为纯合子的小鼠(1hVH HO)的体液免疫应答。
免疫接种。在使用上述抗原免疫前从各组小鼠中收集血清。在初始激发免疫中给予抗原(各2.35μg)，将其与佐剂10μg CpG寡核苷酸(Invivogen)和25μg Adju-phos(Brenntag)混合。通过足跖(f.p.)给予免疫原，每只小鼠的体积为25μl。随后，在第3、6、11、13、17和20天通过f.p.使用2.3μg抗原以及10μg CpG和25μg Adju-Phos作为佐剂对小鼠进行加强免疫，共进行6次加强免疫。分别在第15天和第22天的第四次和第六次加强免疫后对小鼠取血，并且针对抗原A的抗体滴度对抗血清进行检测。
使用ELISA检测确定经免疫小鼠血清中的抗体滴度。使用含抗原A(1μg/ml)的磷酸盐缓冲液(PBS,Irvine Scientific)在4℃下将96孔酶标板(Thermo Scientific)包被过夜。次日，使用洗板机(Molecular Devices)利用含0.05％吐温20的磷酸盐缓冲液(PBS-T,Sigma-Aldrich)洗板4次。然后使用250μl含1％牛血清白蛋白(BSA,Sigma-Aldrich)的PBS将板封闭并在室温下孵育1小时。然后使用PBS-T洗板4次。按照初始1:100的比例在0.1％BSA PBS-T中将经过免疫小鼠的血清和免疫前的血清以10倍的比例倍比稀释，以复孔加入已封闭的板中并在室温下孵育1小时。空出最后两孔作为二抗对照。在洗板机中使用PBS-T再次洗板4次。将1:5000稀释的山羊抗小鼠IgG-Fc-辣根过氧化物酶(HRP,JacksonImmunoresearch)偶联的二抗加入板中并且在室温下孵育1小时。使用PBS-T再次洗板8次并使用TMB/H2O2作为底物显色。将底物孵育20分钟并使用1N H2SO4(VWR)终止反应。使用分光光度计(Victor,Perkin Elmer)在450nm处对板进行检测。使用GRAPHPAD PRISMTM(GraphPadSoftware,Inc)计算抗体滴度。
根据抗原结合信号相当于本底两倍以上的实验滴定范围内的血清稀释度计算血清滴度。针对人细胞表面受体(抗原A)的体液免疫应答的抗体滴度如图19所示。
在一项类似的实验中，通过使用流感病毒疫苗
(Novartis Vaccines)和
(MedImmune LLC)的比较性接种确定了针对人源重链和κ轻链可变基因基因座为纯合子的小鼠(Hκ)和针对可操作地与小鼠重链恒定区连接的单一人源VH基因区段和全部人源DH和JH基因区段为纯合子的小鼠(1hVH HO)的体液免疫应答。
简言之，在使用上述抗原(如上文所述)免疫前从各组小鼠中收集血清。使用
(减毒活流感疫苗)以1/3正常剂量/小鼠对针对可操作地与小鼠重链恒定区连接的单一人源VH基因区段(VH1-69)和全部人源DH和JH基因区段为纯合子的小鼠(1hVH HO)(n＝5)进行鼻内(i.n.)免疫。一个正常剂量的
含有106.5-7.5FFU(荧光病灶单位)的减毒活流感疫苗。因此，在第1天使用70μl
对各只小鼠进行激发，随后在第3、6、11、13、17、20通过i.n.进行加强免疫，共计加强免疫6次。在这项接种中未使用佐剂。分别在第15天和第22天的第四次和第六次加强免疫后对小鼠取血，并且针对
(如上文所述)的抗体滴度对抗血清进行检测。
采用类似的方法，在使用
的接种中，在开始接种前收集小鼠免疫前的血清。以0.75μg各血凝素/小鼠/加强免疫的剂量通过足趾(f.p.)使用
(三价灭活流感疫苗)对针对可操作地与小鼠重链恒定区连接的单一人源VH基因区段(VH1-69)和全部人源DH和JH基因区段为纯合子的小鼠(1hVH HO)(n＝5)进行免疫。在第1天对小鼠进行激发，随后在第3、6、11、13、17、20通过f.p.进行加强免疫，共计加强免疫6次。在这项接种中未使用佐剂。分别在第15天和第22天的第四次和第六次加强免疫后对小鼠取血，并且针对
(如上文所述)的抗体滴度对抗血清进行检测。
根据抗原结合信号相当于本底两倍以上的实验滴定范围内的血清稀释度计算血清滴度。针对
和
的体液免疫应答的抗体滴度如图20所示。
如本实施例所示，对于人细胞表面受体和病毒抗原(例如流感病毒)而言，在1hVHHO小鼠中产生的抗体滴度均与在具有多种人源VH基因区段(Hκ)的小鼠中产生的那些相当。因此，具有限定为单一VH基因区段的免疫球蛋白重链基因座的小鼠能够以与具有含有多种人源VH基因区段(例如80VH)的免疫球蛋白重链基因座的小鼠以相当的方式针对抗原产生较强的免疫应答。
实施例4在具有受限制的免疫球蛋白重链基因座的小鼠中对抗体基因使用情况和CDR3长度的分析
从用人细胞表面受体(抗原A)免疫的针对内源性重链基因座的单一人源VH基因区段为纯合子和针对用人源κ轻链可变基因座取代内源性κ轻链可变基因座为纯合子的小鼠中收集脾细胞，通过对脾脏B细胞的mRNA进行逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCT)分析重链和轻链基因区段的使用情况。
简言之，使用载玻片收集脾脏并在1xPBS(Gibco)中匀浆。在离心机中沉淀细胞(500xg，5分钟)，并在ACK裂解缓冲液(Gibco)中将红细胞裂解3分钟。使用1xPBS洗涤细胞并使用0.7μm的细胞筛过滤。使用针对CD19的MACS磁性阳性分选(Miltenyi Biotec)从脾细胞中分离B细胞。使用RNeasy Plus试剂盒(Qiagen)从沉淀的B细胞中分离总RNA。使用
Direct mRNA微量试剂盒(Qiagen)从总RNA中分离PolyA+mRNA。
使用SMARTerTM Pico cDNA合成试剂盒(Clontech)并使用
II和dNTP(Invitrogen)代替所提供的逆转录酶和dNTP通过5’RACE由脾脏B细胞mRNA制备双链cDNA。使用针对IgM、IgG或Igκ恒定区的特异性引物和SMARTerTM 5’RACE引物由cDNA扩增VH和Vκ抗体库(表6)。使用
PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。使用相同的5’RACE引物和特异性针对IgM、IgG或Igκ恒定区的巢式3’引物进行第二轮PCR(表7)。使用SizeSelectTM 
系统(Invitrogen)纯化第二轮的PCR产物。使用加入了454个适体和条形码的引物进行第三轮PCR。使用
XP小珠(Beckman Coulter)纯化第三轮的PCR产物。使用KAPA文库定量试剂盒(KAPA Biosystems)利用
qPCR对纯化的PCR产物进行定量。使用454 GS Junior Titanium Series Lib-A emPCR试剂盒(Roche Diagnostics)对混合文库进行微乳液PCR(emPCR)并且根据生产厂商的说明书使用Roche 454 GS小型仪器进行双向测序。
生物信息学分析。根据样品条码的完美匹配情况对454条序列进行分类并对质量进行微调。根据使用本地安装的Igblast(NCBI,v2.2.25+)将重排的免疫球蛋白序列与人源种系V(D)J区段数据库进行序列比对的结果对序列进行注释。当检测到多个具有相等得分的最佳命中时，将序列标记为不确定的并将其从分析中剔除。开发一组Perl脚本对结果进行分析并在MYSQL数据库中存储数据。确定在保守的C密码子与针对轻链GFXG基序和针对重链WGXG基序之间的CDR3区。仅使用产生的抗体确定CDR3的长度。从抗体的核酸序列和预计的氨基酸序列，针对IgM激发的(15,650)、IgG激发的(18,967)和Igκ激发的(26,804)序列的基因使用情况进行鉴定。结果如表8、表9、图21和图22所示。
表8中列出了在来源于VH1-69的IgM激发的(15,650条序列)和IgG激发的(18,967条序列)重链可变区序列中所观察到的使用的人源DH和JH基因区段的百分率。将人源DH4-4/DH4-11和人源DH5-5/DH5-18基因区段同时列于表8中因为在各对DH基因区段之间具有相同的序列同一性。表9列出了在与来源于重链可变区的VH1-69具有同源性的轻链(26,804条序列)中所观察到的人源Vκ和Jκ基因区段的百分率。表8和表9中的百分率是四舍五入后的值，在某些情况下将其相加在一起时可能不等于100％。
来源于VH1-69的IgM激发的重链的CDR3区氨基酸长度如图21所示。来源于VH1-69的IgG激发的重链的CDR3区氨基酸长度如图22所示。
如表8和表9所示，根据本发明的小鼠产生含有来源于VH1-69的重链的抗原特异性抗体，其显示出人源VH1-69基因区段与多种人源DH区段和人源JH区段的多种重排。而且，含有包含人源Vκ结构域的同源人轻链的抗原特异性抗体是人源Vκ和Jκ基因区段多种重排的结果。
表6
表7
表8
表9
序列表
<110> L·麦克唐纳
J·麦克沃克
C·古雷尔
K·A·霍西阿瓦
A·J·莫菲
<120> 具有受限制的免疫球蛋白重链的小鼠
<130> 1370A-WO
<150> 61/658,459
<151> 2012-06-12
<150> 61/597,969
<151> 2012-02-13
<150> 61/547,974
<151> 2011-10-17
<160> 81
<170> FastSEQ Windows 4.0版
<210> 1
<211> 872
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 1
gcaggattta gggcttggtc tctcagcatc ccacacttgt acagctgatg tggcatctgt 60
gttttctttc tcatcgtaga tcaggctttg agctgtgaaa taccctgcct catgcatatg 120
caaataacct gaggtcttct gagataaata tagatatatt ggtgccctga gagcatcaca 180
taacaaccac attcctcctc taaagaagcc cctgggagca cagctcatca ccatggactg 240
gacctggagg ttcctctttg tggtggcagc agctacaggt aaggggcttc ctagtcctaa 300
ggctgaggaa gggatcctgg tttagttaaa gaggatttta ttcacccctg tgtcctctcc 360
acaggtgtcc agtcccaggt gcagctggtg cagtctgggg ctgaggtgaa gaagcctggg 420
tcctcggtga aggtctcctg caaggcttct ggaggcacct tcagcagcta tgctatcagc 480
tgggtgcgac aggcccctgg acaagggctt gagtggatgg gagggatcat ccctatcttt 540
ggtacagcaa actacgcaca gaagttccag ggcagagtca cgattaccgc ggacgaatcc 600
acgagcacag cctacatgga gctgagcagc ctgagatctg aggacacggc cgtgtattac 660
tgtgcgagag acacagtgtg aaaacccaca tcctgagagt gtcagaaacc ctgagggaga 720
aggcagctgt gccgggctga ggagatgaca gggtttatta ggtttaaggc tgtttacaaa 780
atgggttata tatttgagaa aaaaagaaca gtagaaacaa gtacatactc ctctaatttt 840
aagataatta ttccattcaa gagtcgtaat at 872
<210> 2
<211> 118
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 2
Met Asp Trp Thr Trp Arg Phe Leu Phe Val Val Ala Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Gly Val Gln Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys
20 25 30
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr
35 40 45
Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
50 55 60
Leu Glu Trp Met Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr
65 70 75 80
Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr
85 90 95
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala
100 105 110
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg
115
<210> 3
<211> 99294
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 3
aagcttatct ctctgttgct cagactcatc taggaatttc agaaatttct gttctagcat 60
ctcttccagc ttttgtctcc aaccctcatt ctcttctttc tttttttttt taaattatat 120
gttctctgtc tttttaaaaa actttttaaa attaggtatt tatgtcattt acatttccaa 180
tgctatccca aaagtcccac ccacgctccc caacccacta tcccacccac ccactcccac 240
ttcttggccc tggcattcac agtgtactga gacatataaa gtttgcacaa ccaatgggcc 300
tctctttcca ctgatggccg actaggccat cttctgatac atatgcagct agagacacga 360
gattctgggg gtactggtta gttcatattg ttgttccacc tatagggttg cagatccttt 420
tagctccttg ggtactttct ctagctcctc cattgggggc cctgtgatcc atccaatagc 480
tgactgtgag catccacttc tgtgtttgct aggccccaga tagtctcaca agagacagct 540
atatctgggt cctttcagca aaatcttgct agtgtatgca acggtgtcag agtttggaag 600
ctgattatgg gatggatccc cggatatggc attctctagt tggttcatcc ttttgtctca 660
gctccaaact ttgtctctgt aactccttcc atgggtgttt tgttcccagt tctaaggagg 720
ggcaaagtat ccacactttg gtcttcattc ttcttgagtt tcatgtgttt tgcaaattgt 780
atcttatatc ttgggtattc taagtttctg ggctaatatc cacttatcag tgagtacaca 840
ttgtgtgagt tcttttgtga ttgggttacc tcactcagta tgatgccctc caggtccatc 900
catttgccta ggaatttcat aaattcattc tttttaatag ctcagtagta ctccattgtg 960
tagatgtacc acattttctg tattcattcc tctgttgagg ggcatctggg ttctttccag 1020
cttctggcta ttataaataa ggctgctatg aacatagtgg agcatgtgac cttcttaccg 1080
gttgggacat cttctggata tatgcccagg agaggtattg ctggatcttc cggtagtact 1140
atgtccaatt ttctgaggaa ctgacaaact gatttccaga gtggttagta ccagcttgca 1200
atcccaccaa caatgagagg agtgttcgtc tttctccaca tcctcaccag catgctgctg 1260
tcacctgaat ttttgatgct tagccattct gactggtgtg aggtggaatc tcagggttgt 1320
tttgatttgt atttccctga tgattaagga tgctgaacat tttctcaggt gcttctcagc 1380
cattcagtat tctttaggtg agaattcttt gtttagctct aagccccatt tttttaatgg 1440
ggttatttga ttttctggag tccaccttct tgagtttttt tttccatttt ttattacata 1500
atttcctcaa ttacatttcc aatgctatcc caaaagtccc ccataccctc ccccccccaa 1560
ttccctaccc accccttccc atttttttgg ccctggcgtt cccctgtact ggggcatata 1620
aagtttgtgt gtccaatggg cttctctttc cagtgatggc tgactaggcc atcttttgat 1680
acatatgcag ctagagtcaa gagctcccgg gtactggtta gttcataatg ttgttccacc 1740
tatagggttg cagatccctt tagcttcttg ggtactttct ctagctcctc cattgggagc 1800
cctgtgatcc atccaatagc tgactgtgag catccacttc tgtgtttgct aggccccggc 1860
atagtctcac aagagacagc tacatctggg tccttttgat aaaatcttgc tagtgtatgc 1920
aagggtgtca gcatttggaa gctgattatg gggtggatcc ctggatatgg cagtctctac 1980
atggtccatc cttttgtctc agctccaaac tttgtctctg taacttcttc catgagtgtt 2040
ttgttcccaa ttctaaggag gggcatagtg tccacacttc attcttcatt cttcttgagt 2100
ttcatgtgtt tagcaaattg tatcttatat cttgggtatc ctaggttttg ggctaatatc 2160
cacttatcag tgagtacata ttgtgtgagt tcctttgtaa atgtgttacc tcactcagga 2220
tgacgccctc caggtccatc catttggcta ggaatttcat aaattcattc tttttaatag 2280
ctgagtagta ctccattgtg taaatgtacc acattttctg tactcattcc tctgttgagg 2340
ggcatctggg ttctttatag gttctggcta ttataaataa ggttgctatg aacatagtgg 2400
agcatgtgtc cttcttaccg gttgagacat cttctggata tatgcccagg cgaggtattg 2460
ctggatcctc cggtagtact atgtccaatt ttctgaggaa ctgccagact gatttccaga 2520
gtggttgtac aagcctgcac tctcaccaac aatggaggag tgttcctctt tctccacatc 2580
cacgccagca tctgctgtca cctgaatttt tgatcttagc cattctgact ggtgtgaggt 2640
ggaatctcag ggttgttttg atttgcattt ccctgatgat taaggatgtt gaacattttt 2700
ttcaggtgct tctctgccat tcggtattcc tcaggtgaga attctttgtt cagttctgag 2760
ccccattttt taatggggtt atttgatttt ctgaagtcca ccttcttgag ttctttatat 2820
atgttggata ttagtcccct atctgattta cgataggtaa agatcctttc ccaatctgtt 2880
ggtggtcttt ttctcttatt gacggtgtct tttgccttgc agaaactttg gagtgagttc 2940
tttatatata ttggatatta gtcccctatc tgatttagga taggtaaaga tcctttccca 3000
atctgttggt gacctttttg tcttattgac ggtgtctttt gccttgcaga atctttgcaa 3060
ttttatgagg tcgcatttgt caattctcga tcttacagca caagtcattg ctgttctgtt 3120
caggaatttt tcctctgtgc ccatatcttc gaggctttta cctgctttct cctctatatg 3180
tttgagtgtc tctggtttaa tgtggagttc cttaatccac ttagatttga ccttagtaca 3240
aggagatagg aatggatcaa ttcgcattct tctacatgat aaccgctagt tgtgccagca 3300
ccatttgttg ataatgctgt cttttttcca ctggatggtt tttgctccct tgtctaagat 3360
caagtgacca taggtgtgtg ggttcatttc tgggtcttca attctatttc attggtctac 3420
ttgtctgttg ttataccagt accatgcaga ttttatcaca attgctctgt agtagagttt 3480
taggtcaggc atggtgatta caccagaggt tttttttatc cttgagcaga gtttttgcta 3540
tcctaggttt tgtgttattt cagatgaatt tgcagattgc cctttccagt tcgttgaaga 3600
attgagttgg aattttgatg gggattgcat tgaatctgta gattgctttg gcaatatagc 3660
catttttact atattgatcc tgccaatcca tgagcatggg agatctttcc atcttctcaa 3720
atcttcttta atttctttct tcagagactt gaagttcttg tcatacagat ctttcacttc 3780
cttagttaga gtcacgctaa ggtattttat attatttgtg actattgaga agggtgttgt 3840
ttccctaatt tctttctcag cctgtttatc ctttgtgtac agaaaagcca ttgacttgtg 3900
ttagttaatc tcatatccag ctacttcact gaagcggttt atcaggttta ggagttctct 3960
ggtgtaattt ttagggtcac tcatatatac tatcatatca tctgcaaaaa gtgacatttt 4020
gacttcttcc tttccaattt gtatcccctt gatctccttt tgttgtcgaa ttgctctggc 4080
aaggacatca agtactatat tgaataggta gggagaaaat cggcaccctt gtctagtccc 4140
tgattttagt aggattgctt caagtttctc accatttact ttgatgttgg ctactggttt 4200
gctgttgaat gctttttatc atgtttaggt atgggccttg aattcctgat ctttccaaga 4260
cttttatcat gaaagggtgt tggattttgt caaatgcttt ctccagcctt tcattctgag 4320
gttgtgtctg tctttttccc tgagatgggt ttcctgtaag cagcaaaatg ttgggtcctg 4380
tttgtgtagc ccgtctgtta ttctatgtct ttttattggg gagttgagtc cattgatatt 4440
aagatatatt aaggaaaagt aattgttgct tcctattatt tttgttttta aagttggcat 4500
tctgttcttg tggctgtctt cttttaggtt tgttgaagga ttcctttctt gctttttcta 4560
ggtcgtggtt tccatccttg tattcatttt ttttctgtta ttatcctttg aaggactgga 4620
ttcatggata gataatgtgt gaatttggtt ttgtcttgga atacttttgt ttctccatct 4680
acggtaattg agagtttggc tgggtatagt agcctgggct ggcaattgtg ttgtcttagt 4740
gtctatataa tgtctgtcca ggatcttctg gctttcatag tctgtggtga aaaatctggt 4800
gtaattctga taggcttgcc tttatatgtt acttgaattt ttcacttact gcttttaata 4860
ttctttcttt atttagtgca tttgttgttc tgattattat gtgtcgggag gaatttcttt 4920
tctggtccag tctatttgga gttctgtagg cttcttgtat gttcacgggc atctctttct 4980
ttaggtttgg gaagttttct tctataattt tgttgaagat atttgctggc ccttcaagtt 5040
gaaaatgttc attctcatct actcctatta ttcgtatggt tggtcttctc attgtgtcct 5100
ggatttcctg gatgttttga gttaggatct ttttgcattt tccattttct ttgattgttg 5160
tgcagatgtt ctctatggaa tcttctgcac ctgatattct ctcttccatc tcttgtagtc 5220
tgttgctgat gctcgcatct atggttccag atttctttcc tagggtttct atctccagtg 5280
ttgccccact ttgggttttc tgtatagtgt ctacttccct ttttagatct agtatggttt 5340
tgttcatttc catcacctgt ttgggtgtgt tttcctgttt ttctttaaag acttgcaact 5400
ctttagcaga gttctcctgt atttaagtga gttattaaag tccttcttga tgtccagtac 5460
cataattgtg agatatgcct ttaaatccaa gtctaggttt ttgggtgtgt tggggtgccc 5520
tggactggct gagttgggag tgctgcattc tgatgatggt gagtggtctt ggtttctgct 5580
agtaagattc ttacatctgc ctttcgccat ctggtaatct ctggagtcag ttgttaaagt 5640
tgtctctggt taaagcttgt tcctctcgtg attctgttat tctcttccag cagacctggg 5700
agactagctc tttcctgagt ttcagtggtc agagcactct ctgcaggcag gatttcctct 5760
ttcagggaag gtgcacagat atctggtgtt cagatttgcc tcctggcaga agatgatggc 5820
ctgaaacagg acctgtccca gaagctgtta gcttctgtag tcaacactgt cacctgtgca 5880
gactagtctc ggtggagtcc gggaaccaag atgtctcctg cagatgctct ggcattccct 5940
tctgggccgg gtgatcacct ctcctctggc agggaaggtg ccctggtgtc tggaacccga 6000
aaagggggct gcctcagaag ctctgtggct actgcctgtc ccagaagctg ttagcttctg 6060
tagtccacac tctcacctgt gcagactagt cttggtggag tctgggaacc aagatgtctc 6120
ccgcagatgc tccagccatt ctcctctttc tgttgcttat tttgacctat gaaatcctgg 6180
acatatagtt ctagtgttgc ttgtaatctc ttttctaagc caaggaattt tttttatcta 6240
gggcacaatc ttttgagaag acatattaaa tcaagagaat aaatattgca agaccaataa 6300
atgataaggt atctattttc tttaaatcca tcgctgtcaa accattcaaa atatcctcac 6360
ataaagccaa aaagatattt attgtgtttc ccatcttagt tgagttcaag tcaatatttt 6420
ggtgccattt tgttgcagta aatctctaac acaaatatgc ctgggcaatg aaaacacaac 6480
tcagttaata tgaatacaga ttgttcagat ctaccactac actaccatct tcttcatcta 6540
agagacccct tagaacttgc agtttctcca ggccttgtgc ttctgcgctg cttttcttct 6600
tcttcctctt ctacattgct tctctcataa acctacttct ttttttccct ccttctgttc 6660
catcttccct tttatctgcc caatcattag ctctccttta ttttacaaat taaggtgtga 6720
agccggtttc taggaaatca cctgagtgct gacttgttcc ttgttcagag ccacgcacag 6780
gagaacagaa ttaacatcaa atataattat ccccagggct atccacaaca cgtgcatcct 6840
ataagatcac cacggactaa tgctggtctt caattacaac ataaacaaca aaaaccccac 6900
atatatgtgg aaacaaatcg aactatacaa agaatcaatg aaaccaggag cttgttcttt 6960
gagaaaaatc aacaagatag ataaaccctt agccagacta accagagggc acagagacag 7020
tatccaaatt aataaagtca gaaatgaaag gaagacataa caatgaaata tatcttaaaa 7080
taattaatct gtttgtagac tattagcagt tgaaaatatt aaaatcatgt tctacaaacg 7140
tggaattatt attgataatt ttctcactgt gcttgaaatt agcattttct taatgtttaa 7200
cttcaaagag tttttgctat tttgaaatat taaacatata cttactgata aaataatttc 7260
cctcctaaca acactgataa tcttttttta agtaaactga ttattagaca atgtacacag 7320
atatataatg tgttttaaat actctcccac tgtcaggtgg tatcatatag ggcctttgaa 7380
tatattttta aatgtattat ttgtaatatt ttatggtctc tcctatgctt atttctgaaa 7440
gaatattttg tatgttttga aacaatttag tatttaacat tagatatagg atcctcagtt 7500
atggatagta ttaaatattc attaatgata tttttaaggt ataaaaggat atgaatataa 7560
aagtttaaca aattttatgt attatttgat tctaaaaata ctcaatatta ttaatatgtt 7620
tgatgtttaa aatgcattta aataataaaa acatttaaaa aaataaaatc aagaaatgag 7680
gttctaagca gaggtcaagg aaaatgagga atagaaaaat agtaaaaatc aatatgtcca 7740
tttattcaag gaaagctcct acatagacat tgcaccagat tagcaaatat tatggtcctc 7800
atattagttt aagttaggag actatgctta tgttatctat ttacattcta aggagcctag 7860
acatttgtga atggattaca ttataagagg aggatgtcta cttaagtagg catgaacgcc 7920
tgtgcattgc accctatgag ttccatcagc attccatgat tggagtatga agaacagcat 7980
tatagacatt acccagaacc ttagtggttc tagaatgcca agataaaaca atctaacctt 8040
ctggatagta gggataaatg ttcctatatc atcagaattc actggtgccc tgaggatgtt 8100
accctgctaa ctgacaattc acaggacatc acatggattc tgataagttg cagaaaagag 8160
gagatgcatt caattggtcc tcctccttct aagctgcaat attaggtgca tccaatttgt 8220
gaacttcaat ttagattaca atagacatga ataatctgaa ttcatgtagt acatattttt 8280
gttttaatat gagttaccat tgttcagaaa attaaataca catgatcaca tattcctaca 8340
tagtgctgtt agtttttcac atctctggga caatattcca aatatctcct tcattagtga 8400
aaatatcaac tactgtaaag cttagctaac atgcctttgc aggaataaga acatcctgga 8460
ttgaaagcta cacagggaga tgtaaaactt tctaagcaca cacattctcc atccattagg 8520
atcatggtcc atgagatttt tctctctctc ttcttcccat taaatgcatg tacatgcagg 8580
ttgggaaaca gattgtgttg cagaatacat ttgcttgatt tccacttcct tctcaatgca 8640
aatatttttg aagtgttaat tttgctgtga gtaccacagt ggttcttgct ctttctgttg 8700
actcctgtct gtgaatgttc caggaattca cacatggaca cacgtggggc tgcatctgag 8760
ctccagactc actgttgtcc ttctgtcctc agctgctctg gcccaggcac agcctcgtga 8820
attcaacaaa gaccctgatc tctcttgttt acacctcatt acaaatggga actgttagag 8880
gtggacccaa ctgcatttcc atgaggaaag cacatgagtt tgagagggtc gttgatgata 8940
aggtagaaac aactttaatt cataggctga gatatcagtc atcacctcca gataaacaag 9000
agccatttct tcctgcatct gagccctgta agcacactag ctttaggaat atgttactgc 9060
tgaagtcaga ttgggcaact tcatagtata caatagaaaa tctacctgca gatgagttca 9120
gaaccagcag ggggcacaat ggggccaaga atccctagca gagagatgtg gtgtgtgtgc 9180
aggggactct gcatcctctg tggtttcctt tcttaactta catgtacctg tagtgattga 9240
catgtaacgt ttccacgctc aaacactgtg aagatacttt gctaaacact tcaaagattt 9300
atgttttctt gatgtgtgca tgtgtgtatt cttttttgtt tttagacaca gggtttctct 9360
gtgtagtcct ggctgccctg gaactcactc tgtagaccag gctggcctcg aactcagaaa 9420
tctgcctgct tctgcctccc aagtgctgaa gttaaagaca tgtgccacca ttgcctggcc 9480
atgtgtgtat tcttgatgca ctcttctgtt gacagataca cagtttattt ccataattta 9540
tttattgtga tggtgctgca ataatcactt atgtacaaat gtttctgaag tatatttagt 9600
tttggtcatt tgggtgatta tttttttctt tctagtatat agcattttgg aaaggtagat 9660
attaattgta tgtatgggaa ggaggctgta aattctaata acttagctgc ttttgaaatt 9720
tgtcctcaat tctatcatcc ttgtaaccac cttaaatcca tctattagcc ttgtcacaag 9780
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ctaaagagag aatcagtgaa atggatttgc agcacagatc tgaataaatt ctccagaatg 37860
tggagccaca cagaagcaag cacaaggaaa gtgcctgatg caagggcaaa gtacagtgtg 37920
taccttcagg ctgggcacag acactctgaa aagccttggc aggaactccc tgcaacaaag 37980
cagagccctg caggcaatgc cagctccaga gccctccctg agagcctcat gggcaaagat 38040
gtgcacaaca ggtgtttctc atagccccaa actgagaatg aagcaaacag ccatctgaag 38100
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ccggcaaaat gaactatctt cttaagggat aaactttcca ctaggaaaac tataaggaaa 38340
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tcccgccctg agaggtgcag gcagcaccac ggagccacgg agtcacagag ccacggagcc 51780
cccattgtgg gcatttgaga gtgctgtgcc cccggcaggc ccagccctga tggggaagcc 51840
tgtcccatcc cacagcccgg gtcccacggg cagcgggcac agaagctgcc aggttgtcct 51900
ctatgatcct catccctcca gcagcatccc ctccacagtg gggaaactga ggcttggagc 51960
accacccggc cccctggaaa tgaggctgtg agcccagaca gtgggcccag agcactgtga 52020
gtaccccggc agtacctggc tgcagggatc agccagagat gccaaaccct gagtgaccag 52080
cctacaggag gatccggccc cacccaggcc actcgattaa tgctcaaccc cctgccctgg 52140
agacctcttc cagtaccacc agcagctcag cttctcaggg cctcatccct gcaaggaagg 52200
tcaagggctg ggcctgccag aaacacagca ccctccctag ccctggctaa gacagggtgg 52260
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tggaatcctg ctgtcctagg aggctgctga cctccaggat ggctccgtcc ccagttccag 52440
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accagagtgc gccccttcct gctctgcacc ctgcaccccc caggccagcc cacgacgtcc 52620
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cagatgtcag ctccatccag gaccacccag cccacaccct gagaggaacg tctgtctcca 52800
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aaggggtgtt gagcccagca agggaaggcc cccaaacaga ccaggaggtt tctgaaggtg 52980
tctgtgtcac agtggggtat agcagcagct ggtaccacag tgacactcac ccagccagaa 53040
accccattcc aagtcagcgg aagcagagag agcagggagg acacgtttag gatctgagac 53100
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agagtcctgg gcccacccca cacaccgggg cggaatgtgt gcaggcctcg gtctctgtgg 53340
gtgttccgct agctggggct cacagtgctc accccacacc taaaatgagc cacagcctcc 53400
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agggcagcag ccactctgat cccatgtcct gccggctccc atgaccccca gcacgcggag 53640
ccccacagtg tccccactgg atgggaggac aagagctggg gattccggcg ggtcggggca 53700
ggggcttgat cgcatccttc tgccgtggct ccagtgcccc tggctggagt tgacccttct 53760
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gggaccccga ccctgatgac ttcccactgg aattcgccgt agagtccacc aggaccaaag 53940
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gacttgggct taggggacac cagtgtgacc ccgaccttga ccaggacgca gacctttcct 54060
tcctttcctg gggcagcaca gactttgggg tctgggccag gaggaacttc tggcaggtcg 54120
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ctgggctctt gccctcactt cccggttaca cgggagcctc ctgtgcacag aagcagggag 55440
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gtccgcccgt gtctctcact gcccgcacct gcagggaggc tccgcactcc ctctaaagac 55560
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gtgcctgcgt gatttggggg caatttatga acccgaaagg acatggccat ggggtgggta 58260
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ctatccacat aagcgaggga cagacccgag tgttcctgca gtagacctga gagcgctggg 58380
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gcaaacgcac ccactcctgg gactgagggg ctgggggagc gtctgggaag tatggcctag 65700
gggtgtccat caatgcccaa aatgcaccag actctcccca agacatcacc ccaccagcca 65760
gtgagcagag taaacagaaa atgagaagca gctgggaagc ttgcacaggc cccaaggaaa 65820
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ttagatccga ggtgagtgtg agaggacagg ggctggggta tggatacgca gaaggaaggc 93480
cacagctgta cagaattgag aaagaataga gacctgcagt tgaggccagc aggtcggctg 93540
gactaactct ccagccacag taatgaccca gacagagaaa gccagactca taaagcttgc 93600
tgagcaaaat taagggaaca aggttgagag ccctagtaag cgaggctcta aaaagcacag 93660
ctgagctgag atgggtgggc ttctctgagt gcttctaaaa tgcgctaaac tgaggtgatt 93720
actctgaggt aagcaaagct gggcttgagc caaaatgaag tagactgtaa tgaactggaa 93780
tgagctgggc cgctaagcta aactaggctg gcttaaccga gatgagccaa actggaatga 93840
acttcattaa tctaggttga atagagctaa actctactgc ctacactgga ctgttctgag 93900
ctgagatgag ctggggtgag ctcagctatg ctacgctgtg ttggggtgag ctgatctgaa 93960
atgagatact ctggagtagc tgagatgggg tgagatgggg tgagctgagc tgggctgagc 94020
tagactgagc tgagctaggg tgagctgagc tgggtgagct gagctaagct ggggtgagct 94080
gagctgagct tggctgagct agggtgagct gggctgagct ggggtgagct gagctgagct 94140
ggggtaagct gggatgagct ggggtgagct gagctgagct ggagtgagct gagctgggct 94200
gagctggggt gagctgggct gagctgggct gagctgggct gagctggggt gagctgagct 94260
ggggtgagct gagctgagct ggggtgagct gagctgagct ggggtgagct ggggtgagct 94320
gagctggggt gagctgagct gagctggggt gagctgagct ggggtgagct gagctgagct 94380
ggggtgagct gagctgagct gagctgagct gagctggggt gagctgagct gagctgagct 94440
ggggtgagct ggggtgagct gagctgagct ggagtgagct gagctgggct gagctggggt 94500
gagctgggct gagctggggt gagctgagct gagctgagct gagctggggt gagctgagct 94560
gagctggggt gagctgagct ggggtgagct gggctgagct gagctgagct gagctgagct 94620
gagctgagct gagctgagct gagctgagct gagctgagct gagctgagct gagctgagct 94680
ggggtgagct gagctgagct gggctgagct ggggtgagct gggctgagct gggctgagct 94740
gggctgagct ggggtgagct gagctggggt gagctgagct gagctgggct gagctgagct 94800
gagctggggt gagctgagct gagctggggt gagctgagct gagctgagct ggggtgagct 94860
gagctgagct gggctgagca gggctgagct ggggtgagct gagctgagct ggggtgagct 94920
gggctgagct gggctgagct gagctgagct gggctgagct gggctgagct gggctgagct 94980
gggctgagct gggctgagct ggggtgagct gagctggggt gagctggggt gagctgagct 95040
ggggtgagct gagctggggt gagctgagct gagctggggt gagctgagct ggggtgagct 95100
gagctgagct ggggtgagct gagctgagct ggggtgagct gagctagggt gaactgggct 95160
gggtgagctg gagtgagctg agctgaggtg aactggggtg agccgggatg ttttgagttg 95220
agctggggta agatgagctg aactggggta aactgggatg agctgtggtg agcggagctg 95280
gattgaactg agctgtgtga gctgagctgg ggtcagctga gcaagagtga gtagagctgg 95340
ctggccagaa ccagaatcaa ttaggctaag tgagccagat tgtgctggga tcagctgtac 95400
tcagatgagc tgggatgagg taggctggga tgagctgggc tagctgacat ggattatgtg 95460
aggctgagct agcatgggct ggcctagctg atgagctaag cttgaatgag cggggctgag 95520
ctggactcag atgtgctaga ctgagctgta ctggatgatc tggtgtaggg tgatctggac 95580
tcaactgggc tggctgatgg gatgcgccag gttgaactag gctcagataa gttaggctga 95640
gtagggcctg gttgagatgg ttcgggatga gctgggaaaa gatggactcg gaccatgaac 95700
tgggctgagc tgggttggga gaccatgaat tgagctgaac tgagtgcagc tgggataaac 95760
tgggttgagc taagaataga ctacctgaat tgtgccaaac tcggctggga tcaattggaa 95820
attatcagga tttagatgag ccggactaaa ctatgctgag ctggactggt tggatgtgtt 95880
gaactggcct gctgctgggc tggcatagct gagttgaact taaatgagga aggctgagca 95940
aggctagcct gcttgcatag agctgaactt tagcctagcc tgagctggac cagcctgagc 96000
tgagtaggtc taaactgagt taaaaatcaa cagggataat ttaacagcta atttaacaag 96060
cctgaggtct gagattgaat gagcagagct gggatgaact gaatgagttt caccaggcct 96120
ggaccagtta ggctaggacc tcgttctata gaggcagact gtgtgctaca gtggagtttc 96180
aagatgattc catgagtcct ccccgccccc aacataaccc accttcctcc taccctacac 96240
gcctgtctgg tgtgtaaatc ccagctttgt gtgctgatac agaagcctga gcccctcccc 96300
cacctccacc tacctattac tttgggatga gaatagttct cccagccagt gtctcagagg 96360
gaagccaagc aggacaggcc caaggctact tgagaagcca ggatctaggc ctctccctga 96420
gaacgggtgt tcatgcccct agagttggct gaagggccag atccacctac tctagaggca 96480
tctctccctg tctgtgaagg cttccaaagt cacgttcctg tggctagaag gcagctccat 96540
agccctgctg cagtttcgtc ctgtatacca ggttcaccta ctaccatatc tagccctgcc 96600
tgccttaaga gtagcaacaa ggaaatagca gggtgtagag ggatctcctg tctgacagga 96660
ggcaagaaga cagattctta cccctccatt tctcttttat ccctctctgg tcctcagaga 96720
gtcagtcctt cccaaatgtc ttccccctcg tctcctgcga gagccccctg tctgataaga 96780
atctggtggc catgggctgc ctggcccggg acttcctgcc cagcaccatt tccttcacct 96840
ggaactacca gaacaacact gaagtcatcc agggtatcag aaccttccca acactgagga 96900
cagggggcaa gtacctagcc acctcgcagg tgttgctgtc tcccaagagc atccttgaag 96960
gttcagatga atacctggta tgcaaaatcc actacggagg caaaaacaaa gatctgcatg 97020
tgcccattcc aggtaagaac caaaccctcc cagcaggggt gcccaggccc aggcatggcc 97080
cagagggagc agcggggtgg ggcttaggcc aagctgagct cacaccttga cctttcattc 97140
cagctgtcgc agagatgaac cccaatgtaa atgtgttcgt cccaccacgg gatggcttct 97200
ctggccctgc accacgcaag tctaaactca tctgcgaggc cacgaacttc actccaaaac 97260
cgatcacagt atcctggcta aaggatggga agctcgtgga atctggcttc accacagatc 97320
cggtgaccat cgagaacaaa ggatccacac cccaaaccta caaggtcata agcacactta 97380
ccatctctga aatcgactgg ctgaacctga atgtgtacac ctgccgtgtg gatcacaggg 97440
gtctcacctt cttgaagaac gtgtcctcca catgtgctgc cagtgagtgg cctgggctaa 97500
gcccaatgcc tagccctccc agattaggga agtcctccta caattatggc caatgccacc 97560
cagacatggt catttgctcc ttgaactttg gctccccaga gtggccaagg acaagaatga 97620
gcaataggca gtagaggggt gagaatcagc tggaaggacc agcatcttcc cttaagtagg 97680
tttgggggat ggagactaag cttttttcca acttcacaac tagatatgtc ataacctgac 97740
acagtgttct cttgactgca ggtccctcca cagacatcct aaccttcacc atccccccct 97800
cctttgccga catcttcctc agcaagtccg ctaacctgac ctgtctggtc tcaaacctgg 97860
caacctatga aaccctgaat atctcctggg cttctcaaag tggtgaacca ctggaaacca 97920
aaattaaaat catggaaagc cctcccaatg gcaccttcag tgctaagggt gtggctagtg 97980
tttgtgtgga agactggaat aacaggaagg aatttgtgcg tactgtgact cacagggatc 98040
tgccttcacc acagaagaaa ttcatctcaa aacccaatgg taggtatccc cccttccctt 98100
cccctccaat tgcaggaccc ttcctgtacc tcatagggag ggcaggtcct cttccaccct 98160
atcctcacta ctgtcttcat ttacagaggt gcacaaacat ccacctgctg tgtacctgct 98220
gccaccagct cgtgagcaac tgaacctgag ggagtcagcc acagtcacct gcctggtgaa 98280
gggcttctct cctgcagaca tcagtgtgca gtggcttcag agagggcaac tcttgcccca 98340
agagaagtat gtgaccagtg ccccgatgcc agagcctggg gccccaggct tctactttac 98400
ccacagcatc ctgactgtga cagaggagga atggaactcc ggagagacct atacctgtgt 98460
tgtaggccac gaggccctgc cacacctggt gaccgagagg accgtggaca agtccactgg 98520
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accatgctag cgctcaacca ggcaggccct gggtgtccag ttgctctgtg tatgcaaact 98640
aaccatgtca gagtgagatg ttgcatttta taaaaattag aaataaaaaa aatccattca 98700
aacgtcactg gttttgatta tacaatgctc atgcctgctg agacagttgt gttttgcttg 98760
ctctgcacac accctgcata cttgcctcca ccctggccct tcctctacct tgccagtttc 98820
ctccttgtgt gtgaactcag tcaggcttac aacagacaga gtatgaacat gcgattcctc 98880
cagctacttc tagatatatg gctgaaagct tgcatgcctg caggtcgact ctagaggatc 98940
cccgggtacc gagctcgaat tcgccctata gtgagtcgta ttacaattca ctggccgtcg 99000
ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac 99060
atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac 99120
agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt 99180
gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt 99240
taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgaa ccccttgcgg ccgc 99294
<210> 4
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 4
tgcggccgat cttagcc 17
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 5
ttgaccgatt ccttgcgg 18
<210> 6
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 6
acgagcgggt tcggcccatt c 21
<210> 7
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 7
ggtggagagg ctattcggc 19
<210> 8
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 8
gaacacggcg gcatcag 17
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 9
tgggcacaac agacaatcgg ctg 23
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 10
tcctccaacg acaggtccc 19
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 11
gatgaactga cgggcacagg 20
<210> 12
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 12
tccctggaac tctgccccga caca 24
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 13
ctctgtggaa aatggtatgg agatt 25
<210> 14
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 14
ggtaagcata gaaggtgggt atcttt 26
<210> 15
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 15
atagaactgt catttggtcc agcaatccca 30
<210> 16
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 16
tggtcacctc caggagcctc 20
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 17
gctgcagggt gtatcaggtg c 21
<210> 18
<211> 30
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 18
agtctctgct tcccccttgt ggctatgagc 30
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 19
gatgggaaga gactggtaac atttgtac 28
<210> 20
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 20
ttcctctatt tcactctttg aggctc 26
<210> 21
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 21
cctccactgt gttaatggct gccacaa 27
<210> 22
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 22
ggtgtgcgat gtaccctctg aac 23
<210> 23
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 23
tgtggcagtt taatccagct ttatc 25
<210> 24
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 24
ctaaaaatgc tacacctggg gcaaaacacc tg 32
<210> 25
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 25
gccatgcaag gccaagc 17
<210> 26
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 26
agttcttgag ccttagggtg ctag 24
<210> 27
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 27
ccaggaaaat gctgccagag cctg 24
<210> 28
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 28
aactacgcac agaagttcca gg 22
<210> 29
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 29
gctcgtggat ttgtccgc 18
<210> 30
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 30
cagagtcacg attacc 16
<210> 31
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 31
tgagcagcac cctcacgtt 19
<210> 32
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 32
gtggcctcac aggtatagct gtt 23
<210> 33
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 33
accaaggacg agtatgaa 18
<210> 34
<211> 296
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 34
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 35
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 35
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 36
<211> 294
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 36
caggtccagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatacta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaga 294
<210> 37
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 37
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 38
<211> 275
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 38
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgatgac acggc 275
<210> 39
<211> 91
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 39
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr
85 90
<210> 40
<211> 296
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 40
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 41
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 41
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 42
<211> 294
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 42
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accacggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaga 294
<210> 43
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 43
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 44
<211> 296
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 44
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 45
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 45
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 46
<211> 233
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 46
agaagcctgg gtcctcggtg aaggtctcct gcaaggcttc tggaggcacc ttcagcagct 60
atgctatcag ctgggtgcga caggcccctg gacaagggct tgagtggatg ggaaggatca 120
tccctatctt tggtacagca aactacgcac agaagttcca gggcagagtc acgattaccg 180
cggacgaatc cacgagcaca gcctacatgg agctgagcag cctgagatct gag 233
<210> 47
<211> 77
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 47
Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr
1 5 10 15
Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly
20 25 30
Leu Glu Trp Met Gly Arg Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr
35 40 45
Ala Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr
50 55 60
Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu
65 70 75
<210> 48
<211> 296
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 48
caggtccagc tggtgcaatc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatacta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 49
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 49
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Thr Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 50
<211> 296
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 50
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 51
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 51
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 52
<211> 296
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 52
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 53
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 53
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 54
<211> 296
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 54
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 55
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 55
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 56
<211> 296
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 56
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 57
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 57
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 58
<211> 296
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 58
caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180
gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240
atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagaga 296
<210> 59
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 59
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 60
<211> 305
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 60
gagcccactc ccaggtgcag ctggtgcagt ctggggctga ggtgaagaag cctggggcct 60
cagtgaaggt ctcctgcaag gcttctggat acaccttcac cggctactat atgcactggg 120
tgcgacaggc ccctggacaa gggcttgagt ggatgggacg gatcaaccct aacagtggtg 180
gcacaaacta tgcacagaag tttcagggca gggtcaccag taccagggac acgtccatca 240
gcacagccta catggagctg agcaggctga gatctgacga cacggtcgtg tattactgtg 300
cgaga 305
<210> 61
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 61
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ser Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 62
<211> 307
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 62
gagcccactc ccaggtgcag ctggtgcagt ctggggctga ggtgaagaag cctggggcct 60
cagtgaaggt ctcctgcaag gcttctggat acaccttcac cggctactat atgcactggg 120
tgcgacaggc ccctggacaa gggcttgagt ggatgggatg gatcaaccct aacagtggtg 180
gcacaaacta tgcacagaag tttcagggca gggtcaccat gaccagggac acgtccatca 240
gcacagccta catggagctg agcaggctga gatctgacga cacggccgtg tattactgtg 300
cgagaga 307
<210> 63
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 63
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 64
<211> 307
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<221> 变异
<222> (124)...(124)
<223> n=a, g, t或c
<400> 64
gagcccactc ccaggtgcag ctggtgcagt ctggggctga ggtgaagaag cttggggcct 60
cagtgaaggt ctcctgcaag gcttctggat acaccttcac cggctactat atgcactggg 120
tgcnacaggc ccctggacaa gggcttgagt ggatgggatg gatcaaccct aacagtggtg 180
gcacaaacta tgcacagaag tttcagggca gggtcaccat gaccagggac acgtccatca 240
gcacagccta catggagctg agcaggctga gatctgacga cacggccgtg tattactgtg 300
cgagaga 307
<210> 65
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> VARIANT
<222> (38)...(38)
<223> Xaa=任意氨基酸
<400> 65
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Leu Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Xaa Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 66
<211> 294
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 66
caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60
tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120
cctggacaag ggcttgagtg gatgggatgg atcaacccta acagtggtgg cacaaactat 180
gcacagaagt ttcagggctg ggtcaccatg accagggaca cgtccatcag cacagcctac 240
atggagctga gcaggctgag atctgacgac acggccgtgt attactgtgc gaga 294
<210> 67
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 67
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Trp Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 68
<211> 346
<212> DNA
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 68
aggatgtggg ttttcacact gtgtctctcg cacagtaata cacgaccgtg tcgtcagatc 60
tcagcctgct cagctccatg taggctgtgc tgatggacgt gtccctggtc atggtgaccc 120
tgccctgaaa cttctgtgca tagtttgtgc caccactgtt agggttgatc cgtcccatcc 180
actcaagccc ttgtccaggg gcctgtcgca cccagtgcat atagtagccg gtgaaggtgt 240
atccagaagc cttgcaggag accttcactg aggccccagg cttcttcacc tcagccccag 300
actgcaccag ctgcacctgg gagtggacac ctgtggagac tcgcga 346
<210> 69
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<223> 合成的
<400> 69
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr
20 25 30
Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 70
<211> 150288
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 70
gcgcgccctg gcatggagga aatgacaaag attattagat tgaagacttt ctcagaaaat 60
gatattaagt cattaaggaa aaggaacaat ataaacgtgt atttgagaaa ttttaattat 120
ttgagagatt tttcatacaa tatttattct gcaagcaaat ttcagggatt gaattaataa 180
aactgataca gaacttcctc tgtaggtatc tgtgtaaaca tcaatttctg aatcagtgtt 240
gtaaatattt tggaacacac acacaaatca cattttatct ctacttttat ctctattttt 300
aaaaatgcca aaaaaactca ttttgtgcat gtagcatttt gaattcccac catcaatgca 360
tgatagttct tggttttcca cattcatatt gccatttatc attatgagaa ttgtgtgttt 420
taaccattct aataggtgag taatggtatc taatttttag ttaaatgcac atttccctaa 480
taaaaattca catttaacaa ttttcatata atttttgcca agatgcctct tctcatattt 540
ggttcatttt taactgcatt gttttctttt gattagttgt aagtttactt gcatattgat 600
tataaaatca tttaacaaat taaaagaatt catttaacaa atatgtgact tggaagtatt 660
ttctccaagt ctgcggctgt cttttactcc cttatcagta tgtattgcag aaaagtgtgt 720
gtgtgtgtgt gtgtgtgtgt ttatacaaat ttagatttaa aaaatgtaaa atgttattca 780
tccacagatc atgtctttgg tattatatct gaaatctcat tataaaatac agtaatagca 840
attacttttt ccacgtctct aatctcaggc tacaatcaac tcatgagtgt ttaagcttca 900
cctacttgat tagaggacta tcaacctaac atatttggaa tacttctgta aaaagatgtg 960
ttcctcttcc tattatttct ttatttgatc acttattaat atgtgtattg gtttatggat 1020
gtctatttca tactctgaag aagatccatg ctacattatt cattttattt ttcaaaccac 1080
cacggcttta ttatgtgctg ggagctcatt gagtttggat cctgcatcct tacagctcac 1140
ctcatgcttt tgtttttgaa cacttccctg tttcctgcta ttataataaa ttctaaactc 1200
attttctata ttatcttttt catacataga atcagccatt tttctaaaga ttgcttgctt 1260
ctgatgttaa agaatagtat ttaaaaaatt gtaatactgg gtatgtgcat tgttaatgtg 1320
gtataagtac ttgcaggacc tctcaaccaa ctggcctagt aaactatgta tctaaccttc 1380
tgtaatgtga ttacattaaa aatgagaaca cactggtctc tctacccaat tatgctacca 1440
catggatctt tctagccttc cttccttgac tgtctataac ctctcactgc aaaatgagga 1500
accccatcca accatatgcc attttattac ttagctgcac aatttcagga cacatgcata 1560
gcagtatcag aaatgtaaag ctgtaccctt gtaggaaaca tgtttatcta ctagaataga 1620
gtgcttatgt tcagtttctt tacactttaa acttacagag tttcctcatt ttcaaagttc 1680
cttaggtcag caacttcatt ttccactttc ttcagtgagg tcatttcaat gacactgtat 1740
aatttgattt atttgaaatt ctataaaagc caaaactgta gtcaagtgaa caacaacata 1800
tagaggatat tcgaggagtt tagagactgg tataaaataa gttaaaaaga cactgtttaa 1860
gaagattaaa attattttta gtgatatgca atggttcaga tatgacacaa ttaatttgtc 1920
taagcacata gttttgtgat ggaaaatata aacctaaata tatacaatta aaaaaaaatt 1980
tagcagttca ttaacccaag gatcaaatgc agattgtata aaattatctc attacttatt 2040
ttgtgagggt ggagatttca tgagatgtat gcaacaaaga atgaggtaat tttcctgatt 2100
tgcatataag atgttgccat tcactaaaga cctttaattt tttaaattgt ttttttttta 2160
aatcaatttt ctatgtgacc caggtttttt tctcttgaca agcaaataac ccacaggatt 2220
attttctttc cttggttgag aaatatttcc ccaaacttca gctcagttca ggcatacact 2280
gtccctgaat gggcatttac cctcagatgg gtacacacac ctgtcaacat gtggactctt 2340
ctgtcagaca aacgcacctt tactcacgtg gattcttctc tcagacaaac acacatgtcc 2400
ccacgtggac tctttcctca gactaccaca tatgttctta catttactct ttcctcagaa 2460
aacagacatt tcctcatgtg gactcttgtc tcagacaagc aaacatgtct ccatgtgaac 2520
tcttcactca cataagtaca catatgtcca cattgactgt ttccttacac aagtacatat 2580
atccaatgtc gaattgttct gtggcaaaat gatctcaaga taatgataat cataaacccc 2640
ctccctgaca aggcatagat ctgtattttt ttcattgcaa cctaactttg ccttattgtc 2700
aagaacagta gtttgcagct ctaaatatac caattagaga caggtgtcca ttttctctgg 2760
aaacgtattt ttatgttctt actggacata tttgttgata atgtttgcta ttatgaagat 2820
accccaacag tgtccacatt agagaataaa aaatagtaat gggcagatta actctgtgca 2880
tccagaccca gaaatccttt gaccttgact tccctgaaat gtagacacag aggatggatg 2940
agcaatgctg agcagtgcac ccatgaccac aaaaagaaag acgtggaaat gtgtcccctc 3000
cacttctcat gaaaggcagc tcatcccctg ttccctcagg ccctggcgag gagccacccc 3060
atgtctgtgc ccttcctcag tgtccacacc gtggggtctg cattgatctg gattctcttc 3120
tcatccccgt caatattagt gtccttcgta aatcaggtcc agctgtggct tctcctcacg 3180
gggctgttct cagtctgttt gctgtgttca cggaagtcct gtgtgaagtt tactgatgga 3240
gtcagagggg gaaaaaattt acagcccagt ggtgagactc tcctgcaaag cctctggttt 3300
cacctttact ggttacagca tgagcttggt ccagcacgct tcacaacagg gataggtgtg 3360
ggtgccaaca gtgagtgatc aagtatgaat tctcagggtt actttccatg agtacaaata 3420
aattaacaat ctcaagcaac acccttttaa gtgcagtctg ccttacaatg accaatctga 3480
aagccaagga caaggtcatg tattactgtg agtgacacag tgagggaaac cctgtgtgag 3540
cccagacaca aagctcaccg cagggagaca ggaggggact atgtggtaga tgctgctcag 3600
aaccaccagg gggcatcagg accatcaggg agggtgcaca gaaccaccag gaggggctca 3660
ggacaccagg gggcgctcag aaccaccagg gggccctcag gacaccagag ggtgctcaga 3720
accaccagga ggcgctcagg acaccagggg gcgctcagaa cactaggagg tgctatgaat 3780
cactaggggg cgctcaggac acaagggagc actcagaacc accagggata gctcaggata 3840
ccagggggca ctcggaaccg ccagggggcg ctcaggacac tagggggcgc tcagaaccac 3900
cagggggcac tcaggaccat cagggagggt gcacagaacc accaggaggg gctcaggaca 3960
ccagggggcg ctcaggacca caagggggcc ctcaggacac cagggggcac tcggaaccac 4020
cagggggcac tcagaaccat cagggagggt gcacagaacc accaggaggg gctcaggacc 4080
accaggaggt gctcaggaca ccagggggcg ctcagaacac taggaggtgc tatgaatcac 4140
tagggggcgc tcaggacaca agggagcact cagaaccacc agggatagct caggacacca 4200
gggggcactc ggaaccgcca gggggcgctc aggacactag ggggcgctca gaaccaccag 4260
gaggcactca ggaccatcag ggagggtgca cagaaccacc aggaggtgct caggacacca 4320
gggggcgctc agaacactag gaggtgctat gaatcactag ggggcgctca ggacacaagg 4380
gagcactcag aaccaccagg gatagctcag gataccaggg ggcactcgga accgccaggg 4440
ggcgctcagg acactagggg gcgctcagaa ccaccagggg gcactcagga ccatcaggga 4500
gggtgcacag aaccaccagg aggggctcag gacaccaggg ggcgctcagg accacaaggg 4560
ggccctcagg acaccagggg gcactcggaa ccaccagggg gcactcagaa ccatcaggga 4620
gggtgcacag aaccaccagg aggggctcag gaccaccagg aggtgctcag gacaccaggg 4680
ggcgctcaga acactaggag gtgctatgaa tcactagggg gcgctcagga cacaagggag 4740
cactcagaac caccagggat agctcaggac accagggggc actcggaacc gccagggggc 4800
actcaggaca ctagggggca ctcagaaccg ccaaggggcg ctcagaagaa gcagggggtg 4860
ctcagaacac cagagggtgc tcagaagcac cagggggcgc tcaggacacc aaagggcact 4920
catgagactg tggcaagggg gtgctgagaa ccacaggatg tgaccaagac accaaggggc 4980
actcagaact gccagggggt gctcaggaca ccagaggatt ctcagaacca ccaggggatg 5040
ctcaggaaac tagcgggtgc tcagaaccac cggaggacac tcagaaaacc aggggatgct 5100
caggaaccac cagggggcgc ccacgacacc agagggcagt cagaaccacc ggggcatgct 5160
cagaaccacc agggggcgct caggacacca ggggatgctc aggacactag gggcgctcag 5220
gaaccaccag gggacgctca ggacactagt agggtctcag aaccaccagg ggatgctcag 5280
gacactaggg ggcgctcagg aaccaccagg ggtcacccag gacaccaggg gtcgctcagg 5340
aaaccagagg gtgcccagga aaccagggga ggttcaggaa ccaccagggg gcactgagga 5400
caccaagggg tgctcagaac caccaggggg cgctcaggaa ccaccagggg gcgctcagga 5460
cactagtagg cactgaggaa ccaccagggg gcgctcagga cactagtagg cactgaggaa 5520
ccaccagggg gggctcagga cactagtagg cactgaggaa ccaccagggg gcgctcagga 5580
cactagtagg cactgaggaa ccaccagggg gggctcagga caccagaggt cgctcagaaa 5640
accagggggt gctcagaacc accagggggc actcaggaac caccagtggg tgttcaggac 5700
agcaagaatg gctcaggaca ccagggagca ctcaggacct ccaaggggct ctttggaggc 5760
agctccatat caggtacctg gggaggatga ggtttccttt tccaccttgg tgattcctga 5820
cctggtcaag caaaagtctt ccccaggatc tcttacgatg tcttccttgt aactcatggt 5880
ttctttcacc tataaaacat taacttagaa caggggttca attcaacttt taactctgcc 5940
tattttcaga gttatactag caatgatata tctcagtata ttttttttaa ttgtgtatat 6000
tcaatccaaa gtctggctct atgcacaatt tttttgtttt ctgtgctgtc agacacacta 6060
ttgtaaatgc ttttctaaca actcagcata tgcatggggt ccagtttctt ttcctttcat 6120
cggctgtttg tgcagatgaa acaccacttt aagggctcct gtcctccact ttggcccctg 6180
gtgttctgct tctcaaactt tctccatctt ctctttttct gtcaaaatat tttatcttcc 6240
tcagtctcca tgcaggaaac aggaagtcct tttacttcct gtcctccatg tctggtaaat 6300
cagttcactt cttttcatga tcactgaagc caaccaagtt taggagagta acagttctcc 6360
ttagaataca ctctacctgc agaccctctg ccctcatcac acttttctag ggtcctgcag 6420
acataacccc cacccattcc tctttttccc taagtaccac agactaggct ctgcaactta 6480
tgctaccctc tgtgtgctca gcccaggggc tcagtagtgc tttcatgaag tccaaatccc 6540
taatgtgttt gcccactctc agaccaccct ccagcaagct gccattgtga ttgaatcctg 6600
caaagcatgg gctgctttca gtttcctatt gctggatgtt ctttattata aaggcatatt 6660
ggcaaataac gactagagtt tgtattgaaa attaacgcca aaaagttttt taaaaagttt 6720
ttcaaataga aaagttctat cctgcctagt ttaaaaaaat acaatgttac tttaatcaat 6780
gatttaataa aaatttaagt gatgtttgtc ttattagtta ttcaatttat taataactga 6840
ctgatattta aaaagtaaat actggctggg cgcagtggct cacgcctgta atctcagcac 6900
tttgggaggg tgaggtgggt ggatcacctg aggtcgggaa ttcgagacca gcctgaccaa 6960
catggagaaa ccccctctct actaaaaata caaaattagc tgggcgtggc ggggaagctg 7020
aggcaggaga atcgcttgaa cctgggaggc ggaggttgcg gtgagccgag aacacgccat 7080
tgcactccag cctgggcgac aagaccaaaa ctctgtctca aaaaaaaaaa aaagtaaata 7140
ccattgtaca cttaagtaat atatttggca agaatggcat ttacattcat tcaaaaatga 7200
aactgcaaat acgagttaca ttcaattaaa taattaaaat aatatagaaa aaaatgggtg 7260
tgttgttttg gtgtttaata tacattcatt tttgcatgga cgggtatatg tgtcattgct 7320
gggctgttgt gtatgtgtgc gtgtgtgtgt gtgtctgtgt gtacaactat gaagtttaaa 7380
atatattatt aaattacgta gttatattaa tccaaattta tcatgttaaa atattaggaa 7440
aaaaacacca gtagagaaat tacagagaac atcagcaatg cctacagcat ttacaagagt 7500
cacattaata acaaacaaac tagttcaaat gtttagatat gacacatgca gtagaaaacg 7560
ttcacatggt attaacacaa aaatggtgca caactgagga aattataata cgttcatgat 7620
attggctaca taaatgctta tgatagtaat gcttttcatc catcaaatgc ttatgataat 7680
gcttttcatc catcatatta tagatgataa aacaactcta taaacacttc catcactagc 7740
gtttaatatg agatgcctca catctttttc tgaaataaat aaacatctgt ccaccacttc 7800
gatgatcatt tcaggattat cctctgaaat aattatccat aataatttta gtaacaatat 7860
tattttcaga agcctatttt ataaggtctt tgaactatta tttttatgat tgttacttta 7920
tattttacac actttttatt tggaataatt ataggttatc agaacaattg taaggaaaat 7980
acagtgtgtt cacatccatc tccaagtttt cactaaagtt aatatgtcaa aaaaaacatg 8040
ggacatggga ctaatatatt tacattgata agtttctgtt tattcagctc tgggatttat 8100
ttgaattttg ccaattttta acagtttcct tttttccttt ttcttttctt tttgagataa 8160
ggtgtcactt tcctattgct ttttgtttgt ttctttgttc aacccacgta accacatcaa 8220
attcagtcac catgttcctc tcatatcttc tggttaatca cagtttgggt tcctgctgtc 8280
ttcccattga atattctata aatgaaacta gtcaaataag ttgattctgg tcacttatat 8340
atttacctat tttatcacgt ttgttttgtc aatcacagta agtgtcgaat tcgctatctg 8400
ttatagatgt tagcctattt tctatcccag atccattggt taaatctttg gtgatgcctt 8460
ttagaaaact gatcccttta ccctatgtaa tatgcccctt gattcctgaa agtcttatgt 8520
ctaccttgtc tgaatttaac atagctaagc acgctttctt ttcgttcata ttttcatggt 8580
ccatgttttc ctgtatttaa cttttctatg tagagcaaat ttctgtacag agctagtagt 8640
tgggtcttgc tttttaaatc aactataata attctatttt aaaactggta ttactatttt 8700
tctgttaatt tctgttttaa tttggcattt tatgatcatg tttatttctc tattaactta 8760
ttgtttagtt catcttttat gaatattgta ttggccctaa gatatacaat aagaattgtg 8820
tataatcaga ttctaattca aataacgtaa aacctcttca taggttgtag agctattata 8880
acttattctt ctaaacactc tttctcatcc gttgtcttag tttattctca gtttgcactt 8940
atatgtgcta taaaatataa tatgtgcatt tttatcatta catagacata tattagaaca 9000
attaaaaata taaaaactac atttcaactt cattttttca ttcttgacca catgttttat 9060
ttggatagat tcatgtttcg gatgtatatc atatggctac tcaccctggc agaaaatttg 9120
ccaaagcacc tactgaagga tgaatgcact agcaataaat tttctcagaa tcgatttgtc 9180
ttacagggta ttcatttgac tttcgcttta aatgaaattt ttaatatata tagaattcca 9240
gtttgacttt aatttgtaat ttattttctt gtactcatgt attcattatt ttcttcctga 9300
agatggtcac acattccatt ctgctgggcc ttcattatag atatttgtgt gtatctattc 9360
agggctatat ttgcaattta tggatgccac aattatcaga gttgaagtca gcttctgctg 9420
tccacagaga tttcaagttc ctcccatgat acttgctttt gtgtccctgt ttgatcctgg 9480
gtctttatat ttagttttcc ccagggaggc tgtctgtttc agctgtggaa agtgcaccct 9540
actgacagtt taaattgatg actgtgtggt gaaggaggtt ggacaaagcg ggacttcctc 9600
caaccttctg actgagtctc cttcttatgc aggagtagta agcatagttc tggggagtgg 9660
ccttccacat tgtcctgtcc ttaactcttt ccccagggct ggaacgtctt ttcccagaca 9720
caactgtttt tcaccagtgt ccccagcttt ttacccacta tccttaccct aaagagtaag 9780
gatttctttc ctgaggaagg agatgggagg tgtttctgga tcaagtttcc ttggtgtcgt 9840
ctgtttcctt ttgtttctgt tgacttcacc acagctcata tgacacatgc tttggtggat 9900
ttcccctgga ggtagtggag gtgcattcag gcattccaca ggagctgctg ttcttttccc 9960
cagtcaacac cacaagacac cagatgagga agttgtccgt ggatttttca agttctctag 10020
gaaaagcttg caagcactag gccaatctaa caccattagt acatgcatac taaaaaaaaa 10080
aaagtcatta agtatttcta ggttagtctg tttctatctc aaatgccatc cagtggcacc 10140
tgccctacgt acactagcag gtaggtcctg gttctctctg caggctccta tcttctcaga 10200
tttcagtttt cttgtttgct tggtgaaatc aactcagata tgttgaatgt tttttctctc 10260
ttttatttgt agctgttcag cttcgttgtt aatgaggtca gaataaaatc acagttttct 10320
catttttttc acattcccac actgaatagc tgctttccgt ataaaagcca gaaactgaga 10380
gaacacattg aatatccatt acaggtgaat gttaaacaat ttgagatatg tttgtgtact 10440
ggaataaaat gctgcattac aatcaagtca tcactcattc acataaaaca tggccacatt 10500
ctcaaataat gtagggacct gagtgcccct ccatctactg gcctctcctg gggccctagc 10560
ctggccacac cttcttgcag ggcagtcttg gacgccctgg gatcccgcac caaaatttct 10620
gccctggcag aacatgcctg actggtggag agctccaatc gggcagccct catgtgcaca 10680
caccagctta cacacttcct ccgaatactg taggttcacc caggcccacg taacttccca 10740
catcactttg cagtcacatg tctgtatagg tgggttttgc ttttcttgtc ccaccattgc 10800
gtggagtgca gtcccctccc cccaccccaa ccaccatggc agaggaagct ttggtgggga 10860
aaaagccagg gccgctcctg tcagcgtccc gcacttgcgc taattctgca cagagaatag 10920
cagatcatct cacacattca gaaatcactc ctgcttgtgg ggcatgaata cggcacccgg 10980
gcctgtgccc acaagtgtcc catccctgag ccaacacctc ctccagtgtg accttgaaca 11040
cagtcaccaa cagggcccca cagacgcaat gcctctgcca ctgtggcgaa cacctgcagg 11100
gaggcaggca cccagacacc cactagcact ctgccacagc tgccacacct ccaacagccc 11160
aggacagtgg attcctaacc ttaaggagcc ggagaaccaa gtcagggact agtataactt 11220
cccccagagt cagagcacac agtctaggtg ttgggagctg agcactggcc acctaaattt 11280
ttccagaaat gaagccagtt ggctgaatcc accttatacc acaatcaaac cctcaaggtc 11340
atccaatagg gtaaaagaaa ataaaaatgt atccaaaggt cagcaacttc aaagattgaa 11400
ggtggataag cccacaaaga tgagaaagaa ccagtgcaaa agtcctgaaa acaaaaaggg 11460
cgccctcttt cctccaaaca accacagcac ctcttcaaca gcagttctga atggggctga 11520
gatggctgaa atgacagaaa cagaactcag aatatggaga gtgaaaatgt agatgaatac 11580
agctatttat ggagaatact ataaatgttc ctcaaaaaat aaagaaacaa aatctactgt 11640
agaatccagc agtctcactg ctggctatgt atccaaagga aatgaaatca acatgtcaaa 11700
gagatatctg cactccatgt tcacgttcat tgcagcatta tttaaaatag taaagatatg 11760
gaaacatcct aaattcccat gaatggatga atgaataaag aaaatgcata cagacacaac 11820
agagtaatgt tcatccttaa ataagaagga aaccctgcct ctgtgacagc atgcatgaat 11880
ctagaggacc ttatgccaag tgaaacaagc caggaacaga ggaagagtca ttcatgattt 11940
cactgtatat attaaagcag tagacttgca gaggtagagt agaatgttgg ttaccagggc 12000
ctagaggggt ggactgggaa agggagatgt gggttaaagt gcacaacgtt ccagttagac 12060
cggaggtata agttatgcct ttctaatgca cagcatgtca actatagctg ataaggtagt 12120
atatatttca aaattactaa aaaaataaac attagaattt ccccactaag aaatgataaa 12180
tttgtgaggt gatgaatata agcggcttga gttacccagt tcataatgta tacatgtatc 12240
ataactaaac aacatatgtc ataaatatat gcaaaaatta tttgtaattt ataataaaat 12300
aagtttcata tttaaataat tacattaaga aaatgaacag aaactttcag atttcaagaa 12360
tattttatat atatatatat atatcttaaa acaaacttgc aacagaatat agaaataagt 12420
tttacgactc aatggaaaag aacagaattc aataaaaact ggctaaaaga aacaacagct 12480
gcatcattat agaaaattct ggaataatca gccatataaa gattctcact ctcttagaac 12540
tagaattccg taggacttgt aattcctcct gacctgggtg ggaggcaaaa ggaagaacag 12600
ctaatggtga ttcagtgagt tttatacctg tgtgtacttc tgtgctcact cagcagaaag 12660
aaaagaagaa aagaaagaaa gagagaaaga aagaaacaga aagaaagaaa gaaagaagaa 12720
agaaagaaag aaagaaagaa agaaagaaag aaagaaagaa agaaagagaa agaaagaaga 12780
aggaagaagg aaggaaagaa aagaaagaaa gaaagagaga gagggagaga gggaaggaag 12840
ggacagcaga agtcattgtg gtgtgtgtga aagcacaatc cttgggctcc cccacatcca 12900
tctctactcc agtcccatca atgtccagca aatacatttt ctaagatgaa gtattttaaa 12960
ctttctaaat cctgctagaa aacccctcag ctctttcagt tttgctctat cacttgaatt 13020
attgaattaa atctagtttt tgtgggccta tcaataccat aagccaaaat aacacatgaa 13080
gaaattgcac tgagacacat gaaaaccttc tgaaagctcc ataatttcag atctgcattc 13140
ttatttcccc gaacctaaat cactgaatag agactcagaa cgagttgatc ttgttcctga 13200
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tcctagagga tataaaatct tgagttaggg aaaaacagcc agggacaccc tgggctttgt 13320
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gctgaggtgt acaacccacg tggcctcgtt ttggtcactt ttgcatggtg agcctgcttt 13440
gcaccatggc ctacaatatg cgtgtgtaac taatctgtct ccatcttcaa aatgacatta 13500
ttccacatca aatctagtgc aggtgcctca cacagaacat tctcaattac ctccatcatt 13560
cataaaattg atgccattaa tttcaagtat acatacatca gactcattta acgtattgtt 13620
attctcattg tttgaaacat aacttttaga tcaaataatt aacaataata aaaatataaa 13680
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ggacatttta acaatattga atctttgaat tcataaacat ggaatattgt tccatcttgt 13920
gtcctcttta tttcctcaat gttttataga tttattgtag ttttttttta ctttgttcat 13980
tacacattgt atgcctgtac caaaacatca catataccca acaaatagaa atatatatac 14040
tattatgtgc ttataacaat taaaaattat gtatgtatat tgaatctatt caaaatcaga 14100
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actcaacaga aagcataata taaacagaat tctaaaatga gtgaaaatct gaacaaacac 14220
ctcaccaaga aaaaatgtta tctgaaaata agaatatata aaattgttca gtatcaattg 14280
tcataaactg atactcatat ttaccaaata caaaagtaaa catgatgtat ttcaacagaa 14340
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gttattaatt cagaagacaa cattttaaca ttttttctaa gtgaaggaag atggacaaaa 14460
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atttatatat atatatatat atatatatat ataataaata tatattatat atcatatata 15900
tattttatat aatatatatg tatattttta tatattatac atacatatca atatatgata 15960
tataatatgt atatataata tataatatgt atattcatat attatataat atgtatattg 16020
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tgtatcactg gagattcctt gtgaaggtca ctgctcagga gaagagggca accaaaccag 16680
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ccgaaatgag aaaagagcca cctccaaccc ccccagagtt ttagcctccc tttgtttcca 17100
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gttctgggca tacaagggga cacacatcat taaacaagga ttgggacagg gacttcagcg 17880
tcccactgtt gcatggccca taaattatgt gtgttctctt tctcatcttg gatcaagtct 17940
agagctatga aatagtatcc ctcatgaata tgcaaataac ctgagattta ctgaagtaaa 18000
tacagatctg tcctgtgccc tgagagcatc acccagcaac cacatctgtc ctctagagaa 18060
tcccctgaga gctccgttcc tcaccatgga ctggacctgg aggatcctct tcttggtggc 18120
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ttgagtggat gggatggatc aaccctaaca gtggtggcac aaactatgca cagaagtttc 18420
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ggctgagatc tgacgacacg gccgtgtatt actgtgcgag agacacagtg tgaaaaccca 18540
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tggttgtttt aaatatacat attcttaata caaagtcttg atgaacactt ttttatacat 19740
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ccaaatggta cttgtggtgg tcaccaccaa cataaaagtg ggccaactgt gccagcagaa 21480
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caccactgtg gaattggggg agcttagaat tggattcaga cacaagggga gagagtggat 21600
cacagggtgg cttctctatg ggataggggg tggagagtat tatactctct ggactcaaga 21660
tgagtaaaat gacacccatc acaaaccatc cagccctatg atggcacctt tatggtaagt 21720
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tctttgaaac cagtgagaac aaagacacaa cataccagaa tctctgggac acattcaaag 45840
cagagtgtag agggaaattt atagcactaa atgcccacaa gagaaagcag gaaaaatcta 45900
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gctacttttc tctgactatt ctaattacat taccgtgttt tcctgtatgt gcccgttcat 73680
gtgaatgtca tttctggcta cttttctctg actattctaa ttacgttacc atggtttctc 73740
ctatatgtgc ccgttcatgt gaatgtcatt tctggctact tttctctgac tattctaatt 73800
acgttaccgt gttttctcct gtatgtgccc gttcatgtga atgtcatttc tggctacttt 73860
tctctgacta ttctaattac attaccgtgt tttcctgtat gtgcccgttc atgtgaatgt 73920
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atttaaaatc tcatctttta gcaattttga aatagtcatt attgttaact atagtcacca 74280
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ctacgccctg gccctgaaga cggaggagga gccgagagct cagggatgga gagactggag 77340
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ggacagctct ccatcatccc cctggacatg accacctccc aaggccgagc tggggcgctt 77760
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gatgatgatg gtggtgatga tgatggcgat ggtttccttt tgcatctgag gcaaggacta 80280
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agcggcctga gatccccagg acgcagcacc gctgtcaata ggggccccaa atgcctggac 101460
cagggcctgc gtgggaaagg cctctggcca cactcgggct ttttgtgaag ggccctcctg 101520
ctgtgtgact acagtaacta ccatagtgat gaacccagtg gcaaaaactg gctggaaacc 101580
caggggctgt gtgcacgcct cagcttggag ctctccagga gcacaagagc cgggcccaag 101640
gatttgtgcc cagaccctca gcctctaggg acacctgggt catctcagcc tgggctggtg 101700
ccctgcacac catcttcctc caaatagggg cttcagaggg ctctgaggtg acctcactca 101760
tgaccacagg tgacctggcc cttccctgcc agctatacca gaccctgtct tgacagatgc 101820
cccgattcca acagccaatt cctgggaccc tgaatagctg tagacaccag cctcattcca 101880
gtacctcctg ccaattgcct ggattcccat cctggctgga atcaagaagg cagcatccgc 101940
caggctccca acaggcagga ctcccgcaca ccctcctctg agaggccgct gtgttccgca 102000
gggccaggcc ctggacagtt cccctcacct gccactagag aaacacctgc cattgtcgtc 102060
cccacctgga aaagaccact cgtggagccc ccagccccag gtacagctgt agagacagtc 102120
ctcgaggccc ctaagaagga gccatgccca gttctgccgg gaccctcggc caggccgaca 102180
ggagtggacg ctggagctgg gcccacactg ggccacatag gagctcacca gtgagggcag 102240
gagagcacat gccggggagc acccagcctc ctgctgacca gaggcccgtc ccagagccca 102300
ggaggctgca gaggcctctc cagggagaca ctgtgcatgt ctggtaccta agcagccccc 102360
cacgtcccca gtcctggggg cccctggctc agctgtctgg gccctccctg ctccctggga 102420
agctcctcct gacagccccg cctccagttc caggtgtggt tattgtcagg cgatgtcaga 102480
ctgtggtgga tatagtggct acgattacca cagtggtgcc gcccatagca gcaaccaggc 102540
caagtagaca ggcccctgct gcgcagcccc aggcatccac ttcacctgct tctcctgggg 102600
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ctgtgctcca gggcagggat gattgagata gaaatcaaag gctggcaggg aaaggcagct 102720
tcccgccctg agaggtgcag gcagcaccac ggagccacgg agtcacagag ccacggagcc 102780
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tgtcccatcc cacagcccgg gtcccacggg cagcgggcac agaagctgcc aggttgtcct 102900
ctatgatcct catccctcca gcagcatccc ctccacagtg gggaaactga ggcttggagc 102960
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gtaccccggc agtacctggc tgcagggatc agccagagat gccaaaccct gagtgaccag 103080
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gcagacggct gtggacggga catattgctg gggcatttct cactgtcact tctgggtggt 103320
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tggaatcctg ctgtcctagg aggctgctga cctccaggat ggctccgtcc ccagttccag 103440
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ccccacagtg tccccactgg atgggaggac aagagctggg gattccggcg ggtcggggca 104700
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tgcctcccct cctgggagaa ggggcctcat gcccagatcc ctgcagcact agacacagct 115020
ggaggcagtg gccccagggc caccctgacc tggcatctaa ggctgctcca gcccagacag 115080
cactgccgtt cctgggaagc ctgggctcca ccagaccaca ggtccagggc acagcccaca 115140
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ctgatggagt aactgagcct ctagactgag cattgcagac taatcttgga tatttgtccc 142020
tgagggagcc ggctgagaga agttgggaaa taaactgtct agggatctca gagcctttag 142080
gacagattat ctccacatct ttgaaaaact aagaatctgt gtgatggtgt tggtggagtc 142140
cctggatgat gggataggga ctttggaggc tcatttgagg gagatgctaa aacaatccta 142200
tggctggagg gatagttggg gctgtagttg gagattttca gtttttagaa taaaagtatt 142260
agctgcggaa tatacttcag gaccacctct gtgacagcat ttatacagta tccgatgcat 142320
agggacaaag agtggagtgg ggcactttct ttagatttgt gaggaatgtt ccacactaga 142380
ttgtttaaaa cttcatttgt tggaaggaga gctgtcttag tgattgagtc aagggagaaa 142440
ggcatctagc ctcggtctca aaagggtagt tgctgtctag agaggtctgg tggagcctgc 142500
aaaagtccag ctttcaaagg aacacagaag tatgtgtatg gaatattaga agatgttgct 142560
tttactctta agttggttcc taggaaaaat agttaaatac tgtgacttta aaatgtgaga 142620
gggttttcaa gtactcattt ttttaaatgt ccaaaattct tgtcaatcag tttgaggtct 142680
tgtttgtgta gaactgatat tacttaaagt ttaaccgagg aatgggagtg aggctctctc 142740
ataacctatt cagaactgac ttttaacaat aataaattaa gtttcaaata tttttaaatg 142800
aattgagcaa tgttgagttg gagtcaagat ggccgatcag aaccagaaca cctgcagcag 142860
ctggcaggaa gcaggtcatg tggcaaggct atttggggaa gggaaaataa aaccactagg 142920
taaacttgta gctgtggttt gaagaagtgg ttttgaaaca ctctgtccag ccccaccaaa 142980
ccgaaagtcc aggctgagca aaacaccacc tgggtaattt gcatttctaa aataagttga 143040
ggattcagcc gaaactggag aggtcctctt ttaacttatt gagttcaacc ttttaatttt 143100
agcttgagta gttctagttt ccccaaactt aagtttatcg acttctaaaa tgtatttaga 143160
attcattttc aaaattaggt tatgtaagaa attgaaggac tttagtgtct ttaatttcta 143220
atatatttag aaaacttctt aaaattactc tattattctt ccctctgatt attggtctcc 143280
attcaattct tttccaatac ccgaagcatt tacagtgact ttgttcatga tcttttttag 143340
ttgtttgttt tgccttacta ttaagacttt gacattctgg tcaaaacggc ttcacaaatc 143400
tttttcaaga ccactttctg agtattcatt ttaggagaaa gacttttttt ttaaatgaat 143460
gcaattatct agacttattt cagttgaaca tgctggttgg tggttgagag gacactcagt 143520
cagtcagtga cgtgaagggc ttctaagcca gtccacatgc tctgtgtgaa ctccctctgg 143580
ccctgcttat tgttgaatgg gccaaaggtc tgagaccagg ctgctgctgg gtaggcctgg 143640
actttgggtc tcccacccag acctgggaat gtatggttgt ggcttctgcc acccatccac 143700
ctggctgctc atggaccagc cagcctcggt ggctttgaag gaacaattcc acacaaagac 143760
tctggacctc tccgaaacca ggcaccgcaa atggtaagcc agaggcagcc acagctgtgg 143820
ctgctgctct taaagcttgt aaactgtttc tgcttaagag ggactgagtc ttcagtcatt 143880
gctttagggg gagaaagaga catttgtgtg tcttttgagt accgttgtct gggtcactca 143940
catttaactt tccttgaaaa actagtaaaa gaaaaatgtt gcctgttaac caataatcat 144000
agagctcatg gtactttgag gaaatcttag aaagcgtgta tacaattgtc tggaattatt 144060
tcagttaagt gtattagttg aggtactgat gctgtctcta cttcagttat acatgtgggt 144120
ttgaattttg aatctattct ggctcttctt aagcagaaaa tttagataaa atggatacct 144180
cagtggtttt taatggtggg tttaatatag aaggaattta aattggaagc taatttagaa 144240
tcagtaagga gggacccagg ctaagaaggc aatcctggga ttctggaaga aaagatgttt 144300
ttagttttta tagaaaacac tactacattc ttgatctaca actcaatgtg gtttaatgaa 144360
tttgaagttg ccagtaaatg tacttcctgg ttgttaaaga atggtatcaa aggacagtgc 144420
ttagatccga ggtgagtgtg agaggacagg ggctggggta tggatacgca gaaggaaggc 144480
cacagctgta cagaattgag aaagaataga gacctgcagt tgaggccagc aggtcggctg 144540
gactaactct ccagccacag taatgaccca gacagagaaa gccagactca taaagcttgc 144600
tgagcaaaat taagggaaca aggttgagag ccctagtaag cgaggctcta aaaagcacag 144660
ctgagctgag atgggtgggc ttctctgagt gcttctaaaa tgcgctaaac tgaggtgatt 144720
actctgaggt aagcaaagct gggcttgagc caaaatgaag tagactgtaa tgaactggaa 144780
tgagctgggc cgctaagcta aactaggctg gcttaaccga gatgagccaa actggaatga 144840
acttcattaa tctaggttga atagagctaa actctactgc ctacactgga ctgttctgag 144900
ctgagatgag ctggggtgag ctcagctatg ctacgctgtg ttggggtgag ctgatctgaa 144960
atgagatact ctggagtagc tgagatgggg tgagatgggg tgagctgagc tgggctgagc 145020
tagactgagc tgagctaggg tgagctgagc tgggtgagct gagctaagct ggggtgagct 145080
gagctgagct tggctgagct agggtgagct gggctgagct ggggtgagct gagctgagct 145140
ggggtaagct gggatgagct ggggtgagct gagctgagct ggagtgagct gagctgggct 145200
gagctggggt gagctgggct gagctgggct gagctgggct gagctggggt gagctgagct 145260
ggggtgagct gagctgagct ggggtgagct gagctgagct ggggtgagct ggggtgagct 145320
gagctggggt gagctgagct gagctggggt gagctgagct ggggtgagct gagctgagct 145380
ggggtgagct gagctgagct gagctgagct gagctggggt gagctgagct gagctgagct 145440
ggggtgagct ggggtgagct gagctgagct ggagtgagct gagctgggct gagctggggt 145500
gagctgggct gagctggggt gagctgagct gagctgagct gagctggggt gagctgagct 145560
gagctggggt gagctgagct ggggtgagct gggctgagct gagctgagct gagctgagct 145620
gagctgagct gagctgagct gagctgagct gagctgagct gagctgagct gagctgagct 145680
ggggtgagct gagctgagct gggctgagct ggggtgagct gggctgagct gggctgagct 145740
gggctgagct ggggtgagct gagctggggt gagctgagct gagctgggct gagctgagct 145800
gagctggggt gagctgagct gagctggggt gagctgagct gagctgagct ggggtgagct 145860
gagctgagct gggctgagca gggctgagct ggggtgagct gagctgagct ggggtgagct 145920
gggctgagct gggctgagct gagctgagct gggctgagct gggctgagct gggctgagct 145980
gggctgagct gggctgagct ggggtgagct gagctggggt gagctggggt gagctgagct 146040
ggggtgagct gagctggggt gagctgagct gagctggggt gagctgagct ggggtgagct 146100
gagctgagct ggggtgagct gagctgagct ggggtgagct gagctagggt gaactgggct 146160
gggtgagctg gagtgagctg agctgaggtg aactggggtg agccgggatg ttttgagttg 146220
agctggggta agatgagctg aactggggta aactgggatg agctgtggtg agcggagctg 146280
gattgaactg agctgtgtga gctgagctgg ggtcagctga gcaagagtga gtagagctgg 146340
ctggccagaa ccagaatcaa ttaggctaag tgagccagat tgtgctggga tcagctgtac 146400
tcagatgagc tgggatgagg taggctggga tgagctgggc tagctgacat ggattatgtg 146460
aggctgagct agcatgggct ggcctagctg atgagctaag cttgaatgag cggggctgag 146520
ctggactcag atgtgctaga ctgagctgta ctggatgatc tggtgtaggg tgatctggac 146580
tcaactgggc tggctgatgg gatgcgccag gttgaactag gctcagataa gttaggctga 146640
gtagggcctg gttgagatgg ttcgggatga gctgggaaaa gatggactcg gaccatgaac 146700
tgggctgagc tgggttggga gaccatgaat tgagctgaac tgagtgcagc tgggataaac 146760
tgggttgagc taagaataga ctacctgaat tgtgccaaac tcggctggga tcaattggaa 146820
attatcagga tttagatgag ccggactaaa ctatgctgag ctggactggt tggatgtgtt 146880
gaactggcct gctgctgggc tggcatagct gagttgaact taaatgagga aggctgagca 146940
aggctagcct gcttgcatag agctgaactt tagcctagcc tgagctggac cagcctgagc 147000
tgagtaggtc taaactgagt taaaaatcaa cagggataat ttaacagcta atttaacaag 147060
cctgaggtct gagattgaat gagcagagct gggatgaact gaatgagttt caccaggcct 147120
ggaccagtta ggctaggacc tcgttctata gaggcagact gtgtgctaca gtggagtttc 147180
aagatgattc catgagtcct ccccgccccc aacataaccc accttcctcc taccctacac 147240
gcctgtctgg tgtgtaaatc ccagctttgt gtgctgatac agaagcctga gcccctcccc 147300
cacctccacc tacctattac tttgggatga gaatagttct cccagccagt gtctcagagg 147360
gaagccaagc aggacaggcc caaggctact tgagaagcca ggatctaggc ctctccctga 147420
gaacgggtgt tcatgcccct agagttggct gaagggccag atccacctac tctagaggca 147480
tctctccctg tctgtgaagg cttccaaagt cacgttcctg tggctagaag gcagctccat 147540
agccctgctg cagtttcgtc ctgtatacca ggttcaccta ctaccatatc tagccctgcc 147600
tgccttaaga gtagcaacaa ggaaatagca gggtgtagag ggatctcctg tctgacagga 147660
ggcaagaaga cagattctta cccctccatt tctcttttat ccctctctgg tcctcagaga 147720
gtcagtcctt cccaaatgtc ttccccctcg tctcctgcga gagccccctg tctgataaga 147780
atctggtggc catgggctgc ctggcccggg acttcctgcc cagcaccatt tccttcacct 147840
ggaactacca gaacaacact gaagtcatcc agggtatcag aaccttccca acactgagga 147900
cagggggcaa gtacctagcc acctcgcagg tgttgctgtc tcccaagagc atccttgaag 147960
gttcagatga atacctggta tgcaaaatcc actacggagg caaaaacaaa gatctgcatg 148020
tgcccattcc aggtaagaac caaaccctcc cagcaggggt gcccaggccc aggcatggcc 148080
cagagggagc agcggggtgg ggcttaggcc aagctgagct cacaccttga cctttcattc 148140
cagctgtcgc agagatgaac cccaatgtaa atgtgttcgt cccaccacgg gatggcttct 148200
ctggccctgc accacgcaag tctaaactca tctgcgaggc cacgaacttc actccaaaac 148260
cgatcacagt atcctggcta aaggatggga agctcgtgga atctggcttc accacagatc 148320
cggtgaccat cgagaacaaa ggatccacac cccaaaccta caaggtcata agcacactta 148380
ccatctctga aatcgactgg ctgaacctga atgtgtacac ctgccgtgtg gatcacaggg 148440
gtctcacctt cttgaagaac gtgtcctcca catgtgctgc cagtgagtgg cctgggctaa 148500
gcccaatgcc tagccctccc agattaggga agtcctccta caattatggc caatgccacc 148560
cagacatggt catttgctcc ttgaactttg gctccccaga gtggccaagg acaagaatga 148620
gcaataggca gtagaggggt gagaatcagc tggaaggacc agcatcttcc cttaagtagg 148680
tttgggggat ggagactaag cttttttcca acttcacaac tagatatgtc ataacctgac 148740
acagtgttct cttgactgca ggtccctcca cagacatcct aaccttcacc atccccccct 148800
cctttgccga catcttcctc agcaagtccg ctaacctgac ctgtctggtc tcaaacctgg 148860
caacctatga aaccctgaat atctcctggg cttctcaaag tggtgaacca ctggaaacca 148920
aaattaaaat catggaaagc cctcccaatg gcaccttcag tgctaagggt gtggctagtg 148980
tttgtgtgga agactggaat aacaggaagg aatttgtgcg tactgtgact cacagggatc 149040
tgccttcacc acagaagaaa ttcatctcaa aacccaatgg taggtatccc cccttccctt 149100
cccctccaat tgcaggaccc ttcctgtacc tcatagggag ggcaggtcct cttccaccct 149160
atcctcacta ctgtcttcat ttacagaggt gcacaaacat ccacctgctg tgtacctgct 149220
gccaccagct cgtgagcaac tgaacctgag ggagtcagcc acagtcacct gcctggtgaa 149280
gggcttctct cctgcagaca tcagtgtgca gtggcttcag agagggcaac tcttgcccca 149340
agagaagtat gtgaccagtg ccccgatgcc agagcctggg gccccaggct tctactttac 149400
ccacagcatc ctgactgtga cagaggagga atggaactcc ggagagacct atacctgtgt 149460
tgtaggccac gaggccctgc cacacctggt gaccgagagg accgtggaca agtccactgg 149520
taaacccaca ctgtacaatg tctccctgat catgtctgac acaggcggca cctgctattg 149580
accatgctag cgctcaacca ggcaggccct gggtgtccag ttgctctgtg tatgcaaact 149640
aaccatgtca gagtgagatg ttgcatttta taaaaattag aaataaaaaa aatccattca 149700
aacgtcactg gttttgatta tacaatgctc atgcctgctg agacagttgt gttttgcttg 149760
ctctgcacac accctgcata cttgcctcca ccctggccct tcctctacct tgccagtttc 149820
ctccttgtgt gtgaactcag tcaggcttac aacagacaga gtatgaacat gcgattcctc 149880
cagctacttc tagatatatg gctgaaagct tgcatgcctg caggtcgact ctagaggatc 149940
cccgggtacc gagctcgaat tcgccctata gtgagtcgta ttacaattca ctggccgtcg 150000
ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac 150060
atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac 150120
agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgcc tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt 150180
gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt 150240
taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg ctgacgcgaa ccccttgc 150288
<210> 71
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 71
ggaaggtgtg cacaccgctg gac 23
<210> 72
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 72
ggaaggtgtg cacaccactg gac 23
<210> 73
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 73
ggaaggtgtg cacactgctg gac 23
<210> 74
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 74
agactgtgcg cacaccgctg gac 23
<210> 75
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 75
tcttatcaga cagggggctc tc 22
<210> 76
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 76
aagaagcaca cgactgaggc ac 22
<210> 77
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<221> 变异
<222> (12)...(12)
<223> w = a或t
<220>
<223> 合成的
<400> 77
agtggataga cwgatggggg tg 22
<210> 78
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 78
agtggataga ccgatggggc tg 22
<210> 79
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 79
aagggataga cagatggggc tg 22
<210> 80
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 80
ggaagacatt tgggaaggac tg 22
<210> 81
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成的
<400> 81
ggaagatgga tacagttggt gc 22
Claims (40)
1.一种小鼠基因组，所述小鼠基因组包含内源性免疫球蛋白重链基因座，其包括单一人源VH基因区段、一个或多个人源DH基因区段和一个或多个人源JH基因区段，
其中所述单一人源VH基因区段、一个或多个人源DH基因区段和一个或多个人源JH基因区段可操作地与内源性免疫球蛋白重链恒定区IgM基因连接，
其中所述单一人源VH基因区段选自由以下组成的组：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1和VH7-81，且以单一拷贝存在，并且
其中所述小鼠基因组进一步包含一个或多个人源免疫球蛋白VL基因区段，其可操作地与一个或多个人源JL基因区段连接。
2.根据权利要求1所述的小鼠基因组，其中所述单一人源VH基因区段选自由以下组成的组：VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70和VH3-23。
3.根据权利要求2所述的小鼠基因组，其中所述单一人源VH基因区段是VH1-2。
4.根据权利要求1所述的小鼠基因组，其中所述小鼠基因组包含全部内源性VH、DH和JH基因区段的缺失。
5.根据权利要求4所述的小鼠基因组，其中
(i)所述单一人源VH基因区段，
(ii)所述一个或多个人源DH基因区段，和
(iii)所述一个或多个人源JH基因区段取代
(I)内源性VH基因区段，
(II)全部内源性DH基因区段，和
(III)全部内源性JH基因区段。
6.根据权利要求5所述的小鼠基因组，其中所述一个或多个人源免疫球蛋白VL基因区段和所述一个或多个人源JL基因区段取代在内源性免疫球蛋白轻链基因座的全部内源性VL和JL基因区段。
7.根据权利要求1所述的小鼠基因组，其中所述一个或多个人源免疫球蛋白VL基因区段和/或所述一个或多个人源JL基因区段选自人κ和人λ基因区段。
8.根据权利要求7所述的小鼠基因组，其中所述一个或多个人源免疫球蛋白VL基因区段和所述一个或多个人源JL基因区段可操作地与内源性轻链恒定基因连接。
9.根据权利要求8所述的小鼠基因组，其中所述一个或多个人源免疫球蛋白VL基因区段和一个或多个人源JL基因区段是一个或多个人源免疫球蛋白Vk基因区段和一个或多个人源Jk基因区段，且可操作地与内源性轻链k恒定基因连接。
10.根据权利要求8所述的小鼠基因组，其中所述一个或多个人源免疫球蛋白VL基因区段和一个或多个人源JL基因区段是一个或多个人源免疫球蛋白Vλ基因区段和一个或多个人源Jλ基因区段，且可操作地与内源性轻链λ恒定基因连接。
11.一种小鼠基因组，所述小鼠基因组包含受限制的内源性免疫球蛋白重链基因座，其特征为存在单一未经重排的人源VH基因区段、多个未经重排的人源DH基因区段和多个未经重排的人源JH基因区段，
其中所述单一未经重排的人源VH基因区段选自由以下组成的组：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1和VH7-81，且以多个拷贝存在，并且
其中所述单一未经重排的人源VH基因区段和所述未经重排的人源DH和JH基因区段能够重组，以形成经重排的人源重链可变区基因序列，其在内源性免疫球蛋白重链基因座，可操作地与包含至少一个内源性IgM基因的内源性免疫球蛋白重链恒定区核酸序列连接。
12.根据权利要求11所述的小鼠基因组，其中所述单一人源VH基因区段选自：VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70和VH3-23。
13.根据权利要求11所述的小鼠基因组，其中
(i)所述单一未经重排的人源VH基因区段，
(ii)所述多个未经重排的人源DH基因区段，和
(iii)所述多个未经重排的人源JH基因区段取代
(I)全部功能性内源性VH基因区段，
(II)全部功能性内源性DH基因区段，和
(III)全部功能性内源性JH基因区段。
14.根据权利要求11所述的小鼠基因组，其中所述小鼠进一步包含在内源性免疫球蛋白轻链基因座，用多个未经重排的人VL基因区段取代内源性VL基因区段，并且用多个未经重排的人JL基因区段取代内源性JL基因区段。
15.根据权利要求11所述的小鼠基因组，其中所述小鼠进一步包含在内源性免疫球蛋白轻链基因座，用多个未经重排的人VL基因区段取代全部功能性内源性VL基因区段，并且用多个人JL基因区段取代全部功能性内源性JL基因区段。
16.一种产生小鼠的方法，所述方法包含基因修饰小鼠基因组，以使得其种系中包含内源性免疫球蛋白重链基因座，所述内源性免疫球蛋白重链基因座包括单一人源VH基因区段、一个或多个人源DH基因区段和一个或多个人源JH基因区段，
其中所述单一人源VH基因区段、一个或多个人源DH基因区段和一个或多个人源JH基因区段可操作地与内源性免疫球蛋白重链恒定区IgM基因连接，
其中所述单一人源VH基因区段选自由以下组成的组：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1和VH7-81，且以单一拷贝存在；以及
其中所述小鼠进一步包含一个或多个人源免疫球蛋白VL基因区段，其可操作地与一个或多个人源JL基因区段连接。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述单一人源VH基因区段选自由以下组成的组：VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70和VH3-23。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述单一人源VH基因区段是VH1-2。
19.根据权利要求16所述的方法，其中所述内源性免疫球蛋白重链基因座包含全部内源性VH、DH和JH基因区段的缺失。
20.根据权利要求19所述的方法，其中
(i)所述单一人源VH基因区段，
(ii)所述一个或多个人源DH基因区段，和
(iii)所述一个或多个人源JH基因区段取代
在所述内源性免疫球蛋白重链基因座的
(I)内源性VH基因区段，
(II)全部内源性DH基因区段，和
(III)全部内源性JH基因区段。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述一个或多个人源免疫球蛋白VL基因区段和所述一个或多个人源JL基因区段取代在内源性免疫球蛋白轻链基因座的全部内源性VL和JL基因区段。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述一个或多个人源免疫球蛋白VL基因区段和/或所述一个或多个人源JL基因区段选自人κ和人λ基因区段。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述一个或多个人源免疫球蛋白VL基因区段和所述一个或多个人源JL基因区段可操作地与内源性轻链恒定基因连接。
24.根据权利要求16-23中任一项所述的方法，其中所述一个或多个人源免疫球蛋白VL基因区段和一个或多个人源JL基因区段是一个或多个人源免疫球蛋白Vκ基因区段和一个或多个人源Jκ基因区段，且可操作地与内源性轻链κ恒定基因连接。
25.根据权利要求16-23中任一项所述的方法，其中所述一个或多个人源免疫球蛋白VL基因区段和一个或多个人源JL基因区段是一个或多个人源免疫球蛋白Vλ基因区段和一个或多个人源Jλ基因区段，且可操作地与内源性轻链λ恒定基因连接。
26.一种产生小鼠的方法，所述方法包含基因修饰小鼠基因组，以使得其种系中包含受限制的内源性免疫球蛋白重链基因座，所述受限制的内源性免疫球蛋白重链基因座特征为存在单一未经重排的人源VH基因区段、多个未经重排的人源DH基因区段和多个未经重排的人源JH基因区段，
其中所述单一未经重排的人源VH基因区段选自由以下组成的组：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1和VH7-81，且以多个拷贝形式存在，
其中所述单一未经重排的人源VH基因区段和所述未经重排的人源DH和JH基因区段能够重组，以形成经重排的人源重链可变区基因序列，所述经重排的人源重链可变区基因序列在所述小鼠的内源性免疫球蛋白重链基因座可操作地与包含至少一个内源性IgM基因的内源性免疫球蛋白重链恒定区核酸序列连接，并且
其中所述小鼠进一步在其脾脏中包含成熟IgMintIgDhiB细胞群，每个B细胞包含不同的经重排的人源重链可变区基因序列，所述经重排的人源重链可变区基因序列来源于所述受限制的内源性免疫球蛋白重链基因座。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述单一人源VH基因区段选自VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70和VH3-23。
28.根据权利要求26所述的方法，其中修饰所述小鼠基因组包含在所述内源性免疫球蛋白重链基因座，用
(i)所述单一未经重排的人源VH基因区段，
(ii)所述多个未经重排的人源DH基因区段，和
(iii)所述多个未经重排的人源JH基因区段
分别取代
(I)内源性VH基因区段，
(II)全部内源性DH基因区段，和
(III)全部内源性JH基因区段，
使得所述单一未经重排的人源VH基因区段、所述多个未经重排的人源DH基因区段和所述多个未经重排的人源JH基因区段可操作地与包含至少一个内源性IgM基因的内源性免疫球蛋白重链恒定区核酸序列连接。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述小鼠进一步在内源性免疫球蛋白轻链基因座包含用多个人VL基因区段取代内源性VL基因区段，并且用多个人JL基因区段取代内源性JL基因区段。
30.根据权利要求26所述的方法，其中所述小鼠进一步在内源性免疫球蛋白轻链基因座包含用多个人VL基因区段取代全部功能性内源性VL基因区段，并且用多个人JL基因区段取代全部功能性内源性JL基因区段。
31.一种细胞或组织，其包含根据权利要求1-15中任一项所述的小鼠基因组，或者分离自根据权利要求16-30中任一项所述的方法制备的小鼠，其中所述细胞是体外的，并且其中所述细胞不是胚胎干(ES)细胞、多能干细胞、诱导型多能干细胞、全能干细胞或生殖细胞。
32.一种制备编码人VH结构域的核酸序列的方法，所述方法包含以下步骤：(a)使用抗原免疫包含根据权利要求1-15中任一项所述的小鼠基因组的，或者根据权利要求16-30中任一项所述的方法制备的小鼠；(b)使得所述小鼠产生针对所述抗原的免疫应答；以及(c)从所述小鼠中获得编码人VH结构域的免疫球蛋白VH区核酸序列。
33.根据权利要求32所述的方法，其中所述免疫球蛋白VH区核酸序列：(a)包含与SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56或SEQID NO:58具有至少75％的同一性的序列；或者(b)编码与SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:37、SEQID NO:39、SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:49、SEQID NO:51、SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:57或SEQ ID NO:59具有至少75％的同一性的蛋白。
34.根据权利要求32所述的方法，其中所述免疫球蛋白VH区核酸序列：(a)包含与SEQ IDNO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:68具有至少95％的同一性的序列；或者(b)编码与SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:69具有至少95％的同一性的蛋白。
35.包含根据权利要求1-15中任一项所述的小鼠基因组的，或者根据权利要求16-30中任一项所述的方法制备的小鼠在产生编码人源重链可变域的核酸序列的方法中的用途。
36.根据权利要求35所述的用途，其中所述人源重链可变域的特征为具有来源于人VH1-2、VH1-69、VH2-26、VH2-70或VH3-23基因区段的人FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3序列。
37.包含根据权利要求1-15中任一项所述的小鼠基因组的，或者根据权利要求16-30中任一项所述的方法制备的小鼠用于制备人源抗体中的用途，其中所述人源抗体包含来源于经重排的人VH1-69基因区段的重链可变域，其中所述经重排的人VH1-69基因区段与SEQ IDNO:34、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:44、SEQ IDNO:46、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:56或SEQID NO:58具有至少75％的同一性。
38.包含根据权利要求1-15中任一项所述的小鼠基因组的，或者根据权利要求16-30中任一项所述的方法制备的小鼠用于制备人源抗体的用途，其中所述人源抗体包含来源于经重排的人VH1-2基因区段的重链可变域，其中所述经重排的人VH1-2基因区段与SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:68具有至少95％的同一性。
39.一种人源免疫球蛋白VH结构域，其由根据权利要求32-34中任一项所述的方法制备的核酸序列编码。
40.一种靶向载体，其包含DNA序列，所述DNA序列含有单一未经重排的人源VH基因区段、一个或多个未经重排的人源DH基因区段和一个或多个未经重排的人源JH基因区段，
其中所述单一未经重排的人源VH基因区段选自由以下组成的组：VH1-2、VH1-3、VH1-8、VH1-18、VH1-24、VH1-45、VH1-46、VH1-58、VH1-69、VH2-5、VH2-26、VH2-70、VH3-7、VH3-9、VH3-11、VH3-13、VH3-15、VH3-16、VH3-20、VH3-21、VH3-23、VH3-30、VH3-30-3、VH3-30-5、VH3-33、VH3-35、VH3-38、VH3-43、VH3-48、VH3-49、VH3-53、VH3-64、VH3-66、VH3-72、VH3-73、VH3-74、VH4-4、VH4-28、VH4-30-1、VH4-30-2、VH4-30-4、VH4-31、VH4-34、VH4-39、VH4-59、VH4-61、VH5-51、VH6-1、VH7-4-1和VH7-81，以及
其中所述单一未经重排的人源VH基因区段以单一拷贝或以多个拷贝存在。
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Non-Patent Citations (4)
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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