JP2022535418A - カッパ遺伝子座から発現される限られたラムダ軽鎖レパートリーを有する非ヒト動物及びその使用 - Google Patents

カッパ遺伝子座から発現される限られたラムダ軽鎖レパートリーを有する非ヒト動物及びその使用 Download PDF

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Abstract

本開示は、とりわけ、遺伝子改変された非ヒト動物であって、その生殖細胞系列ゲノムは、非ヒトＣλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、遺伝子改変された非ヒト動物を提供する。遺伝子改変された非ヒト動物のＢ細胞によって発現されるすべての免疫グロブリンλ軽鎖は、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含む。そのような動物、そのような動物からの組織、及びそのような動物からの細胞は、抗体、例えば、二重特異的抗体を生成するための有効なプラットフォームを表す。【選択図】図１Ａ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１９年６月５日に出願された米国仮出願第６２／８５７，７１２号の利益を主張し、これは参照により本明細書に組み込まれる。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩ形式で電子的に提出された配列表を含み、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。２０２０年５月２０日に作成されたＡＳＣＩＩコピーは、２０１０７９４－２０５０＿ＳＬ．ｔｘｔという名前であり、サイズが４７，５７６バイトである。
ヒト抗体は、最も急速に成長している治療剤のクラスである。それらの生成のために現在使用されている技術のうち、ヒト抗体を全体としてまたは部分的にコードする遺伝物質で修飾された遺伝子修飾された動物（例えば、げっ歯類）の開発は、様々な疾患の処置のためのヒト治療モノクローナル抗体の分野に改革をもたらしてきた。依然として、宿主の遺伝子修飾された動物においてヒト抗体レパートリーを最大化するヒトモノクローナル抗体を生成するための改善されたｉｎ ｖｉｖｏシステムの開発が必要とされている。
本開示は、遺伝子改変されたげっ歯類を提供する。いくつかの実施形態では、提供される遺伝子改変されたげっ歯類は、ラットまたはマウスである。いくつかの実施形態では、すべての内因性配列は、ラットまたはマウス配列である。例えば、いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたげっ歯類は、ラットであり、すべての内因性配列は、ラット配列である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたげっ歯類は、マウスであり、すべての内因性配列は、マウス配列である。
いくつかの実施形態では、本開示は、第１の遺伝子改変されたげっ歯類、第２の遺伝子改変されたげっ歯類、及び第３の遺伝子改変されたげっ歯類を含む本明細書で提供される遺伝子改変されたげっ歯類の繁殖コロニーであって、第１、第２、及び第３の遺伝子改変されたげっ歯類はそれぞれ、本明細書に記載される遺伝子改変されたげっ歯類である、繁殖コロニーを提供する。いくつかの実施形態では、第３の遺伝子改変されたげっ歯類は、第１の遺伝子改変されたげっ歯類及び第２の遺伝子改変されたげっ歯類の子孫である。
提供される遺伝子改変されたげっ歯類は、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む生殖細胞系列ゲノムを有する。いくつかの実施形態では、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーは、１つまたは２つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメント及び１つ以上の非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントを含み得る。いくつかの実施形態では、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーは、２つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメント及び４つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントを含み得る。いくつかの実施形態では、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーは、２つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメント及び５つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントを含み得る。いくつかの実施形態では、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーは、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含み得る。
いくつかの実施形態では、提供される遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞によって発現されるすべての免疫グロブリンλ軽鎖は、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーから発現されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、提供される遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞によって発現されるすべての免疫グロブリンλ軽鎖は、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞によって発現されるすべての免疫グロブリン軽鎖は、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞によって発現されるすべての重鎖は、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及びげっ歯類免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、提供される遺伝子改変されたげっ歯類は、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む修飾された内因性げっ歯類免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、提供される遺伝子改変されたげっ歯類は、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む修飾された内因性げっ歯類免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、提供される遺伝子改変されたげっ歯類は、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む修飾された内因性げっ歯類免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたげっ歯類の生殖細胞系列ゲノムは、修飾された内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座（例えば、修飾された内因性免疫グロブリンλまたはκ軽鎖遺伝子座）についてホモ接合性である。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたげっ歯類の生殖細胞系列ゲノムは、修飾された内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座（例えば、修飾された内因性免疫グロブリンλまたはκ軽鎖遺伝子座）についてヘテロ接合性である。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたげっ歯類の生殖細胞系列ゲノムは、２つのアレルを含む修飾された内因性免疫グロブリンκ遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、第１のアレルは、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含み、第２のアレルは、限られたヒトκ軽鎖可変領域レパートリーを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変されたげっ歯類、ならびにそれによるげっ歯類細胞及びげっ歯類組織の生殖細胞系列ゲノムは、げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む第１の修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座アレルを含み、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変されたげっ歯類、ならびにそれによるげっ歯類細胞またはげっ歯類組織は、げっ歯類Ｃκ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変領域を含む第２の修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座アレルを含み、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変領域は、ヒトＶκ遺伝子セグメント及びヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、そのような非ヒト動物または非ヒト組織は、第１の修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座アレルからλ軽鎖及び第２の修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座アレルからκ軽鎖を発現し得る。いくつかの実施形態では、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変領域は、Ｖκ３－２０またはＶκ１－３９を含み、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、Ｖλ１－５１またはＶλ２－１４を含む。一実施形態では、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変領域は、Ｖκ３－２０／Ｊκ１であり、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、Ｖλ１－５１／Ｊλ２またはＶλ２－１４／Ｊλ２である。
いくつかの実施形態では、提供される遺伝子改変されたげっ歯類は、軽鎖定常領域遺伝子セグメントに機能可能に連結された限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む。いくつかの実施形態では、提供される遺伝子改変されたげっ歯類は、Ｃκ遺伝子セグメントに機能可能に連結された限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む。いくつかの実施形態では、提供される遺伝子改変されたげっ歯類は、Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む。
いくつかの実施形態では、提供される遺伝子改変されたげっ歯類は、げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む。
いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ４－６９、Ｖλ８－６１、Ｖλ４－６０、Ｖλ６－５７、Ｖλ１０－５４、Ｖλ５－５２、Ｖλ１－５１、Ｖλ９－４９、Ｖλ１－４７、Ｖλ７－４６、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ７－４３、Ｖλ１－４０、Ｖλ５－３７、Ｖλ１－３６、Ｖλ３－２７、Ｖλ３－２５、Ｖλ２－２３、Ｖλ３－２２、Ｖλ３－２１、Ｖλ３－１９、Ｖλ２－１８、Ｖλ３－１６、Ｖλ２－１４、Ｖλ３－１２、Ｖλ２－１１、Ｖλ３－１０、Ｖλ３－９、Ｖλ２－８、Ｖλ４－３、及びＶλ３－１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ５－５２、Ｖλ１－５１、Ｖλ９－４９、Ｖλ１－４７、Ｖλ７－４６、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ７－４３、Ｖλ１－４０、Ｖλ５－３７、Ｖλ１－３６、Ｖλ３－２７、Ｖλ３－２５、Ｖλ２－２３、Ｖλ３－２２、Ｖλ３－２１、Ｖλ３－１９、Ｖλ２－１８、Ｖλ３－１６、Ｖλ２－１４、Ｖλ３－１２、Ｖλ２－１１、Ｖλ３－１０、Ｖλ３－９、Ｖλ２－８、Ｖλ４－３、及びＶλ３－１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、及びＶλ２－１４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１またはＶλ２－１４である。いくつかの実施形態では、ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ２である。
いくつかの実施形態では、提供される遺伝子改変されたげっ歯類は、修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座でげっ歯類Ｃκ遺伝子を欠く。
いくつかの実施形態では、提供される遺伝子改変されたげっ歯類は、修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む生殖細胞系列ゲノムを有する。いくつかの実施形態では、修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントは、１つ以上のげっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結されている。
いくつかの実施形態では、提供される遺伝子改変されたげっ歯類は、１つ以上のげっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む生殖細胞系列ゲノムを有する。いくつかの実施形態では、提供される遺伝子改変されたげっ歯類は、修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてホモ接合性である生殖細胞系列ゲノムを有する。
いくつかの実施形態では、提供される遺伝子改変されたげっ歯類は、１つ以上の内因性ＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の内因性ＤＨ遺伝子セグメント、１つ以上の内因性ＪＨ遺伝子セグメント、またはそれらの組み合わせの代わりに１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む生殖細胞系列ゲノムを有する。いくつかの実施形態では、提供される遺伝子改変されたげっ歯類は、１つ以上の内因性ＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の内因性ＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の内因性ＪＨ遺伝子セグメントにそれぞれ置き換わる１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む生殖細胞系列ゲノムを有する。
いくつかの実施形態では、１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ３－７４、ＶＨ３－７３、ＶＨ３－７２、ＶＨ２－７０、ＶＨ１－６９、ＶＨ３－６６、ＶＨ３－６４、ＶＨ４－６１、ＶＨ４－５９、ＶＨ１－５８、ＶＨ３－５３、ＶＨ５－５１、ＶＨ３－４９、ＶＨ３－４８、ＶＨ１－４６、ＶＨ１－４５、ＶＨ３－４３、ＶＨ４－３９、ＶＨ４－３４、ＶＨ３－３３、ＶＨ４－３１、ＶＨ３－３０、ＶＨ４－２８、ＶＨ２－２６、ＶＨ１－２４、ＶＨ３－２３、ＶＨ３－２１、ＶＨ３－２０、ＶＨ１－１８、ＶＨ３－１５、ＶＨ３－１３、ＶＨ３－１１、ＶＨ３－９、ＶＨ１－８、ＶＨ３－７、ＶＨ２－５、ＶＨ７－４－１、ＶＨ４－４、ＶＨ１－３、ＶＨ１－２、ＶＨ６－１、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ＤＨ１－１、ＤＨ２－２、ＤＨ３－３、ＤＨ４－４、ＤＨ５－５、ＤＨ６－６、ＤＨ１－７、ＤＨ２－８、ＤＨ３－９、ＤＨ３－１０、ＤＨ５－１２、ＤＨ６－１３、ＤＨ２－１５、ＤＨ３－１６、ＤＨ４－１７、ＤＨ６－１９、ＤＨ１－２０、ＤＨ２－２１、ＤＨ３－２２、ＤＨ６－２５、ＤＨ１－２６、ＤＨ７－２７、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントは、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、ＪＨ６、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、（ｉ）１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ３－７４、ＶＨ３－７３、ＶＨ３－７２、ＶＨ２－７０、ＶＨ１－６９、ＶＨ３－６６、ＶＨ３－６４、ＶＨ４－６１、ＶＨ４－５９、ＶＨ１－５８、ＶＨ３－５３、ＶＨ５－５１、ＶＨ３－４９、ＶＨ３－４８、ＶＨ１－４６、ＶＨ１－４５、ＶＨ３－４３、ＶＨ４－３９、ＶＨ４－３４、ＶＨ３－３３、ＶＨ４－３１、ＶＨ３－３０、ＶＨ４－２８、ＶＨ２－２６、ＶＨ１－２４、ＶＨ３－２３、ＶＨ３－２１、ＶＨ３－２０、ＶＨ１－１８、ＶＨ３－１５、ＶＨ３－１３、ＶＨ３－１１、ＶＨ３－９、ＶＨ１－８、ＶＨ３－７、ＶＨ２－５、ＶＨ７－４－１、ＶＨ４－４、ＶＨ１－３、ＶＨ１－２、ＶＨ６－１、またはそれらの任意の組み合わせを含み、（ｉｉ）１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ＤＨ１－１、ＤＨ２－２、ＤＨ３－３、ＤＨ４－４、ＤＨ５－５、ＤＨ６－６、ＤＨ１－７、ＤＨ２－８、ＤＨ３－９、ＤＨ３－１０、ＤＨ５－１２、ＤＨ６－１３、ＤＨ２－１５、ＤＨ３－１６、ＤＨ４－１７、ＤＨ６－１９、ＤＨ１－２０、ＤＨ２－２１、ＤＨ３－２２、ＤＨ６－２５、ＤＨ１－２６、ＤＨ７－２７、またはそれらの任意の組み合わせを含み、（ｉｉｉ）１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントは、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、ＪＨ６、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、提供される遺伝子改変されたげっ歯類は、１つ以上のげっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子を含む生殖細胞系列ゲノムを有する。いくつかの実施形態では、１つ以上のげっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子は、１つ以上の内因性げっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子である。
いくつかの実施形態では、提供される遺伝子改変されたげっ歯類は、機能性内因性げっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子を欠く修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む生殖細胞系列ゲノムを有する。いくつかの実施形態では、提供される遺伝子改変されたげっ歯類は、１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む生殖細胞系列ゲノムを有する。いくつかの実施形態では、提供される遺伝子改変されたげっ歯類は、１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片を発現する。いくつかの実施形態では、提供される遺伝子改変されたげっ歯類は、修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座と同じ染色体上に含まれる１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む生殖細胞系列ゲノムを有する。いくつかの実施形態では、提供される遺伝子改変されたげっ歯類は、１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む生殖細胞系列ゲノムを有する。いくつかの実施形態では、提供される遺伝子改変されたげっ歯類は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子の代わりに１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む生殖細胞系列ゲノムを有する。いくつかの実施形態では、提供される遺伝子改変されたげっ歯類は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子に置き換わる１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む生殖細胞系列ゲノムを有する。
いくつかの実施形態では、提供される遺伝子改変されたげっ歯類は、第１及び第２のヒトＶＨ遺伝子セグメントを含む１つ以上のヒトＶＨ遺伝子セグメント、ならびに第１のヒトＶＨ遺伝子セグメントと第２のヒトＶＨ遺伝子セグメントとの間に１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む生殖細胞系列ゲノムを有する。いくつかの実施形態では、第１のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１－２であり、第２のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ６－１である。
いくつかの実施形態では、１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントとヒトＤＨ遺伝子セグメントとの間にある。
いくつかの実施形態では、げっ歯類Ｃλ遺伝子は、マウスＣλ１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一の配列を有する。いくつかの実施形態では、げっ歯類Ｃλ遺伝子は、マウスＣλ２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一の配列を有する。いくつかの実施形態では、げっ歯類Ｃλ遺伝子は、マウスＣλ３遺伝子と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一の配列を有する。
いくつかの実施形態では、げっ歯類Ｃλ遺伝子は、マウスＣλ遺伝子であり、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、げっ歯類Ｃλ遺伝子は、マウスＣλ１遺伝子であり、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、げっ歯類Ｃλ遺伝子は、ラットＣλ１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一の配列を有する。いくつかの実施形態では、げっ歯類Ｃλ遺伝子は、ラットＣλ２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一の配列を有する。いくつかの実施形態では、げっ歯類Ｃλ遺伝子は、ラットＣλ３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一の配列を有する。いくつかの実施形態では、げっ歯類Ｃλ遺伝子は、ラットＣλ４遺伝子と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一の配列を有する。
いくつかの実施形態では、げっ歯類Ｃλ遺伝子は、ラットＣλ遺伝子であり、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、１つ以上のげっ歯類Ｖκ遺伝子セグメント、１つ以上のげっ歯類Ｊκ遺伝子セグメント、またはそれらの任意の組み合わせの代わりである。いくつかの実施形態では、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、１つ以上のげっ歯類Ｖκ遺伝子セグメント、１つ以上のげっ歯類Ｊκ遺伝子セグメント、またはそれらの任意の組み合わせに置き換わる。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変されたマウスは、機能性内因性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変されたマウスは、不活性化内因性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、内因性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座は、内因性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座のすべてまたは一部を欠失または反転させることによって不活性化される。いくつかの実施形態では、内因性Ｖλ遺伝子セグメント、内因性Ｊλ遺伝子セグメント、及び内因性Ｃλ遺伝子は、全体としてまたは部分的に欠失される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される遺伝子改変されたマウスは、内因性免疫グロブリンκ軽鎖可変ドメインを検出可能に発現しない。
本開示は、本明細書に記載される遺伝子改変を含むげっ歯類胚を提供する。いくつかの実施形態では、げっ歯類胚は、げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含むゲノムを有し、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、げっ歯類胚のゲノムは、修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座についてホモ接合性である。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、及びＶλ２－１４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１またはＶλ２－１４である。いくつかの実施形態では、ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ２である。
いくつかの実施形態では、げっ歯類胚であって、そのゲノムは、１つ以上の内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む、げっ歯類胚が提供される。いくつかの実施形態では、げっ歯類胚のゲノムは、修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてホモ接合性である。
本開示は、本明細書に記載の遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞は、修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座の単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンを含む。
いくつかの実施形態では、本開示は、修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座の単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンを含む、本明細書に記載される遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞は、修飾された内因性重鎖遺伝子座において１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメントのヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメントのヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントのヒトＪＨ遺伝子セグメントに由来する再編成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含む。
本開示は、本明細書に記載される遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞から生成されたハイブリドーマを提供する。
本開示は、本明細書に記載される単一の遺伝子改変されたげっ歯類からのＢ細胞の集団を提供する。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞の集団によって発現されるすべての抗体は、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、Ｂ細胞の集団によって発現される抗体は、少なくとも２つの異なる再編成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現される複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む。
本開示は、本明細書に記載される遺伝子改変を含む胚性幹（ＥＳ）細胞などの幹細胞を提供する。いくつかの実施形態では、幹細胞（例えば、ＥＳ細胞）は、げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、幹細胞（例えば、ＥＳ細胞）のゲノムは、修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座についてホモ接合性である。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ４－６９、Ｖλ８－６１、Ｖλ４－６０、Ｖλ６－５７、Ｖλ１０－５４、Ｖλ５－５２、Ｖλ１－５１、Ｖλ９－４９、Ｖλ１－４７、Ｖλ７－４６、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ７－４３、Ｖλ１－４０、Ｖλ５－３７、Ｖλ１－３６、Ｖλ３－２７、Ｖλ３－２５、Ｖλ２－２３、Ｖλ３－２２、Ｖλ３－２１、Ｖλ３－１９、Ｖλ２－１８、Ｖλ３－１６、Ｖλ２－１４、Ｖλ３－１２、Ｖλ２－１１、Ｖλ３－１０、Ｖλ３－９、Ｖλ２－８、Ｖλ４－３、及びＶλ３－１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ５－５２、Ｖλ１－５１、Ｖλ９－４９、Ｖλ１－４７、Ｖλ７－４６、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ７－４３、Ｖλ１－４０、Ｖλ５－３７、Ｖλ１－３６、Ｖλ３－２７、Ｖλ３－２５、Ｖλ２－２３、Ｖλ３－２２、Ｖλ３－２１、Ｖλ３－１９、Ｖλ２－１８、Ｖλ３－１６、Ｖλ２－１４、Ｖλ３－１２、Ｖλ２－１１、Ｖλ３－１０、Ｖλ３－９、Ｖλ２－８、Ｖλ４－３、及びＶλ３－１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、及びＶλ２－１４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１またはＶλ２－１４である。いくつかの実施形態では、ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ２である。
いくつかの実施形態では、幹細胞（例えば、ＥＳ細胞）は、１つ以上の内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含む。
抗体を発現する哺乳動物細胞が本開示によって提供される。いくつかの実施形態では、哺乳動物細胞によって発現される抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む重鎖及びヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含む軽鎖を含み、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメイン、またはその両方は、本明細書に記載の遺伝子改変されたげっ歯類から同定され、それから単離され、またはそれと同一である。
いくつかの実施形態では、（ａ）本明細書に記載の遺伝子改変されたげっ歯類を対象となる抗原に曝露する工程；（ｂ）遺伝子改変されたげっ歯類が対象となる抗原に対する免疫反応を生成するのに十分な条件下で遺伝子改変されたげっ歯類を維持する工程；及び（ｃ）遺伝子改変されたげっ歯類から、（ｉ）対象となる抗原に結合する抗体、（ｉｉ）対象となる抗原に結合する抗体のヒト軽鎖可変ドメイン、ヒト重鎖可変ドメイン、軽鎖、または重鎖をコードするヌクレオチド、または（ｉｉｉ）対象となる抗原に結合する抗体を発現する細胞を回収する工程であって、（ｃ）の抗体は、ヒト重鎖可変及びヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、回収する工程を含む方法によって調製される抗体。いくつかの実施形態では、抗体は、二重特異的抗体である。
いくつかの実施形態では、抗体を作製する方法は、（ａ）本明細書に記載される遺伝子改変されたげっ歯類を抗原に曝露する工程；（ｂ）遺伝子改変されたげっ歯類が抗原に対する免疫反応を起こすことを可能にする工程；及び（ｃ）遺伝子改変されたげっ歯類から抗原に特異的な抗体、抗原に特異的な抗体を発現するＢ細胞、または抗原に特異的な抗体をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を単離する工程を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、二重特異的抗体である。
いくつかの実施形態では、抗体を作製する方法は、（ａ）哺乳動物細胞において、２つのヒト免疫グロブリンλ軽鎖及び２つのヒト免疫グロブリン重鎖を含む前記抗体を発現させる工程であって、各ヒト免疫グロブリンλ軽鎖は、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含み、各ヒト免疫グロブリン重鎖は、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインの少なくとも１つ、λ軽鎖可変ドメインの少なくとも１つ、またはそれらの組み合わせのアミノ酸配列は、本明細書に記載される遺伝子改変されたげっ歯類から同定され、または単離された、発現させる工程；及び（ｂ）抗体を得る工程を含む。いくつかの実施形態では、抗体は、二重特異的抗体である。
いくつかの実施形態では、二重特異的抗体を作製する方法であって、（ａ）本明細書に記載される第１の遺伝子改変されたげっ歯類を第１の抗原の第１のエピトープと接触させること、（ｂ）本明細書に記載される第２の遺伝子改変されたげっ歯類を第２の抗原の第２のエピトープと接触させること、（ｃ）第１の遺伝子改変されたげっ歯類から第１の抗原の第１のエピトープに特異的な第１の抗体を発現するＢ細胞を単離し、第１の抗体の第１のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを決定すること；（ｄ）第２の遺伝子改変されたげっ歯類から第２の抗原の第２のエピトープに特異的な第２の抗体を発現するＢ細胞を単離し、第２の抗体の第２のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを決定すること；（ｅ）第１のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を第１のヒト免疫グロブリン定常ドメインをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結させて第１のヒト重鎖をコードする第１のヌクレオチド配列を生成すること；（ｆ）第２のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を第２のヒト免疫グロブリン定常ドメインをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結させて第２のヒト重鎖をコードする第２のヌクレオチド配列を生成すること；（ｇ）哺乳動物細胞において、（ｉ）第１のヌクレオチド配列；（ｉｉ）第２のヌクレオチド配列；及び（ｉｉｉ）ヒト免疫グロブリンλ軽鎖定常領域に機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンを含む第３のヌクレオチド配列を発現させることを含む、方法が提供される。
いくつかの実施形態では、二重特異的抗体を作製する方法であって、方法は、（ａ）哺乳動物細胞において、（ｉ）第１のヒト免疫グロブリン定常領域に機能可能に連結された第１のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含む第１のヌクレオチド配列；（ｉｉ）第２のヒト免疫グロブリン定常領域に機能可能に連結された第２のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含む第２のヌクレオチド配列；及び（ｉｉｉ）ヒト免疫グロブリンλ軽鎖定常領域に機能可能に連結されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む第３のヌクレオチド配列を発現させることを含む、方法が本明細書で提供される。いくつかの実施形態では、第１のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、第１の抗原の第１のエピトープで免疫された本明細書に記載される第１の遺伝子改変されたげっ歯類における第１の抗体から同定された、単離された、またはそれと同一の第１のヒト重鎖可変ドメインをコードし、第１の抗体は、第１の抗原の第１のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第２のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、第２の抗原の第２のエピトープで免疫された本明細書に記載される第２の遺伝子改変されたげっ歯類における第２の抗体から同定された、単離された、またはそれと同一の第２のヒト重鎖可変ドメインをコードし、第２の抗体は、第２の抗原の第２のエピトープに特異的に結合する。いくつかの実施形態では、第３のヌクレオチドのヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンである。
いくつかの実施形態では、第１の遺伝子改変されたげっ歯類及び第２の遺伝子改変されたげっ歯類は、同一の遺伝子改変されたげっ歯類である。いくつかの実施形態では、第１の遺伝子改変されたげっ歯類及び第２の遺伝子改変されたげっ歯類は、異なる遺伝子改変されたげっ歯類である。
いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、同じ抗原であり、第１のエピトープ及び第２のエピトープは、異なるエピトープである。いくつかの実施形態では、第１の抗原及び第２の抗原は、異なる抗原である。
いくつかの実施形態では、ヒト免疫グロブリン重鎖を作製するための方法は、（ａ）本明細書に記載される遺伝子改変されたげっ歯類を対象となる抗原に曝露する工程；（ｂ）抗原に特異的に結合し、かつ遺伝子改変されたげっ歯類によって生成された抗体のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン配列を得る工程；及び（ｃ）ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン配列をヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列に機能可能に連結させてヒト免疫グロブリン重鎖を形成する工程を含む。いくつかの実施形態では、この段落の方法によって生成されるヒト免疫グロブリン重鎖が提供される。
いくつかの実施形態では、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを作製するための方法は、（ａ）本明細書に記載される遺伝子改変されたげっ歯類を対象となる抗原に曝露する工程；及び（ｂ）抗原に特異的に結合し、かつ遺伝子改変されたげっ歯類によって生成された抗体のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン配列を得る工程を含む。いくつかの実施形態では、この段落のこの方法によって生成されるヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインが提供される。
いくつかの実施形態では、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインのコレクションを作製する方法は、（ａ）本明細書に記載される遺伝子改変されたげっ歯類を対象となる抗原に曝露する工程、及び（ｂ）遺伝子改変されたげっ歯類からヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインのコレクションを単離する工程を含む。いくつかの実施形態では、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインのコレクションはそれぞれ、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインに結合し、コレクションにおけるヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインのいずれか１つと対合したヒトλ軽鎖可変ドメインは、抗原と結合する。
いくつかの実施形態では、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖を作製するための方法は、（ａ）本明細書に記載される遺伝子改変されたげっ歯類を対象となる抗原に曝露する工程；（ｂ）抗原に特異的に結合し、かつ遺伝子改変されたげっ歯類によって生成された抗体のヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメイン配列を得る工程；及び（ｃ）ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメイン配列をヒト免疫グロブリンλ軽鎖定常ドメイン配列に機能可能に連結させてヒト免疫グロブリンλ軽鎖を形成する工程を含む。いくつかの実施形態では、この段落の方法によって生成されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖が提供される。
いくつかの実施形態では、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを生成するための方法は、（ａ）本明細書に記載の遺伝子改変されたげっ歯類を対象となる抗原に曝露する工程；及び（ｂ）抗原に特異的に結合し、かつ遺伝子改変されたげっ歯類によって生成された抗体のヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメイン配列を得る工程を含む。いくつかの実施形態では、この段落の方法によって生成されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインが提供される。
いくつかの実施形態では、ヒト免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を作製するための方法は、（ａ）本明細書に記載される遺伝子改変されたげっ歯類を対象となる抗原に曝露する工程；（ｂ）抗原に特異的に結合し、かつ遺伝子改変されたげっ歯類によって生成された抗体のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン配列をコードするヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を得る工程；及び（ｃ）ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域をヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列に機能可能に連結させてヒト免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を形成する工程を含む。いくつかの実施形態では、この段落の方法によって生成されるヒト免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列が提供される。
いくつかの実施形態では、ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含むヌクレオチド配列を作製するための方法は、（ａ）本明細書に記載される遺伝子改変されたげっ歯類を対象となる抗原に曝露する工程；及び（ｂ）抗原に特異的に結合し、かつ遺伝子改変されたげっ歯類によって生成された抗体のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン配列をコードするヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を得る工程を含む。いくつかの実施形態では、この段落の方法によって生成されるヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含むヌクレオチド配列が提供される。
いくつかの実施形態では、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖をコードするヌクレオチド配列を作製するための方法は、（ａ）本明細書に記載される遺伝子改変されたげっ歯類を対象となる抗原に曝露する工程；（ｂ）抗原に特異的に結合し、かつ遺伝子改変されたげっ歯類によって生成された抗体のヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメイン配列をコードするヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を得る工程；及び（ｃ）ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域をヒト免疫グロブリンλ軽鎖定常領域配列に機能可能に連結させてヒト免疫グロブリンλ軽鎖をコードするヌクレオチド配列を形成する工程を含む。いくつかの実施形態では、この段落の方法によって生成されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖をコードするヌクレオチド配列が提供される。
いくつかの実施形態では、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含むヌクレオチド配列を作製するための方法は、（ａ）本明細書に記載される遺伝子改変されたげっ歯類を対象となる抗原に曝露する工程；及び（ｂ）抗原に特異的に結合し、かつ遺伝子改変されたげっ歯類によって生成された抗体のヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメイン配列をコードするヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を得る工程を含む。いくつかの実施形態では、この段落の方法によって生成されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含むヌクレオチド配列が提供される。
いくつかの実施形態では、ターゲティングベクターが提供される。いくつかの実施形態では、ターゲティングベクターは、（ｉ）内因性げっ歯類κ軽鎖遺伝子座における５’標的配列に対応するヌクレオチド配列を含む５’ホモロジーアーム；（ｉｉ）Ｖλ遺伝子セグメント及びＪλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域；（ｉｉｉ）げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメント；及び（ｉｖ）内因性げっ歯類κ軽鎖遺伝子座における３’標的配列に対応するヌクレオチド配列を含む３’ホモロジーアームを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ４－６９、Ｖλ８－６１、Ｖλ４－６０、Ｖλ６－５７、Ｖλ１０－５４、Ｖλ５－５２、Ｖλ１－５１、Ｖλ９－４９、Ｖλ１－４７、Ｖλ７－４６、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ７－４３、Ｖλ１－４０、Ｖλ５－３７、Ｖλ１－３６、Ｖλ３－２７、Ｖλ３－２５、Ｖλ２－２３、Ｖλ３－２２、Ｖλ３－２１、Ｖλ３－１９、Ｖλ２－１８、Ｖλ３－１６、Ｖλ２－１４、Ｖλ３－１２、Ｖλ２－１１、Ｖλ３－１０、Ｖλ３－９、Ｖλ２－８、Ｖλ４－３、及びＶλ３－１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ５－５２、Ｖλ１－５１、Ｖλ９－４９、Ｖλ１－４７、Ｖλ７－４６、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ７－４３、Ｖλ１－４０、Ｖλ５－３７、Ｖλ１－３６、Ｖλ３－２７、Ｖλ３－２５、Ｖλ２－２３、Ｖλ３－２２、Ｖλ３－２１、Ｖλ３－１９、Ｖλ２－１８、Ｖλ３－１６、Ｖλ２－１４、Ｖλ３－１２、Ｖλ２－１１、Ｖλ３－１０、Ｖλ３－９、Ｖλ２－８、Ｖλ４－３、及びＶλ３－１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、及びＶλ２－１４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１またはＶλ２－１４である。いくつかの実施形態では、ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ２である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変されたげっ歯類を作製する方法は、（ａ）ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を、げっ歯類ＥＳ細胞のゲノムにおける修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に導入する工程；及び（ｂ）工程（ａ）において生成されたげっ歯類ＥＳ細胞を使用してげっ歯類を生成する工程を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変されたげっ歯類を作製する方法は、（ａ）げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を、げっ歯類ＥＳ細胞のゲノムにおける修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に導入する工程であって、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、導入する工程；及び（ｂ）工程（ａ）において生成されたげっ歯類ＥＳ細胞を使用してげっ歯類を生成する工程を含む。いくつかの実施形態では、げっ歯類ＥＳ細胞のゲノムは、修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座で１つ以上の内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、げっ歯類ＥＳ細胞のゲノムは、１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列をさらに含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたげっ歯類ＥＳ細胞を作製する方法は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を、げっ歯類ＥＳ細胞のゲノムにおける修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に導入する工程を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたげっ歯類ＥＳ細胞を作製する方法は、げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を、げっ歯類ＥＳ細胞のゲノムにおける修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に導入する工程であって、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、導入する工程を含む。いくつかの実施形態では、げっ歯類ＥＳ細胞のゲノムは、修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座で１つ以上の内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、げっ歯類ＥＳ細胞のゲノムは、１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列をさらに含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変されたげっ歯類を作製する方法は、（ａ）遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞によって発現されるすべての免疫グロブリンλ軽鎖が、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含むように、げっ歯類の生殖細胞系列ゲノムにおける内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を、げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含むように修飾する工程であって、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、修飾する工程を含む。いくつかの実施形態では、方法は、（ｂ）遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞によって発現されるすべての重鎖が、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及びげっ歯類免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含むように、げっ歯類の生殖細胞系列ゲノムにおける内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を、１つ以上のげっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含むように修飾する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、工程（ｂ）は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を、１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列をさらに含むように修飾することを含む。いくつかの実施形態では、工程（ａ）及び／または工程（ｂ）は、げっ歯類ＥＳ細胞において行われる。
いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ４－６９、Ｖλ８－６１、Ｖλ４－６０、Ｖλ６－５７、Ｖλ１０－５４、Ｖλ５－５２、Ｖλ１－５１、Ｖλ９－４９、Ｖλ１－４７、Ｖλ７－４６、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ７－４３、Ｖλ１－４０、Ｖλ５－３７、Ｖλ１－３６、Ｖλ３－２７、Ｖλ３－２５、Ｖλ２－２３、Ｖλ３－２２、Ｖλ３－２１、Ｖλ３－１９、Ｖλ２－１８、Ｖλ３－１６、Ｖλ２－１４、Ｖλ３－１２、Ｖλ２－１１、Ｖλ３－１０、Ｖλ３－９、Ｖλ２－８、Ｖλ４－３、及びＶλ３－１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ５－５２、Ｖλ１－５１、Ｖλ９－４９、Ｖλ１－４７、Ｖλ７－４６、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ７－４３、Ｖλ１－４０、Ｖλ５－３７、Ｖλ１－３６、Ｖλ３－２７、Ｖλ３－２５、Ｖλ２－２３、Ｖλ３－２２、Ｖλ３－２１、Ｖλ３－１９、Ｖλ２－１８、Ｖλ３－１６、Ｖλ２－１４、Ｖλ３－１２、Ｖλ２－１１、Ｖλ３－１０、Ｖλ３－９、Ｖλ２－８、Ｖλ４－３、及びＶλ３－１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、及びＶλ２－１４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１またはＶλ２－１４である。いくつかの実施形態では、ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ２である。
いくつかの実施形態では、内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座は、げっ歯類Ｃκ遺伝子を欠く。
いくつかの実施形態では、１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントは、１つ以上の内因性ＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の内因性ＤＨ遺伝子セグメント、１つ以上の内因性ＪＨ遺伝子セグメント、またはそれらの組み合わせの代わりである。いくつかの実施形態では、１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントは、１つ以上の内因性ＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の内因性ＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の内因性ＪＨ遺伝子セグメントにそれぞれ置き換わる。
いくつかの実施形態では、１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ３－７４、ＶＨ３－７３、ＶＨ３－７２、ＶＨ２－７０、ＶＨ１－６９、ＶＨ３－６６、ＶＨ３－６４、ＶＨ４－６１、ＶＨ４－５９、ＶＨ１－５８、ＶＨ３－５３、ＶＨ５－５１、ＶＨ３－４９、ＶＨ３－４８、ＶＨ１－４６、ＶＨ１－４５、ＶＨ３－４３、ＶＨ４－３９、ＶＨ４－３４、ＶＨ３－３３、ＶＨ４－３１、ＶＨ３－３０、ＶＨ４－２８、ＶＨ２－２６、ＶＨ１－２４、ＶＨ３－２３、ＶＨ３－２１、ＶＨ３－２０、ＶＨ１－１８、ＶＨ３－１５、ＶＨ３－１３、ＶＨ３－１１、ＶＨ３－９、ＶＨ１－８、ＶＨ３－７、ＶＨ２－５、ＶＨ７－４－１、ＶＨ４－４、ＶＨ１－３、ＶＨ１－２、ＶＨ６－１、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ＤＨ１－１、ＤＨ２－２、ＤＨ３－３、ＤＨ４－４、ＤＨ５－５、ＤＨ６－６、ＤＨ１－７、ＤＨ２－８、ＤＨ３－９、ＤＨ３－１０、ＤＨ５－１２、ＤＨ６－１３、ＤＨ２－１５、ＤＨ３－１６、ＤＨ４－１７、ＤＨ６－１９、ＤＨ１－２０、ＤＨ２－２１、ＤＨ３－２２、ＤＨ６－２５、ＤＨ１－２６、ＤＨ７－２７、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントは、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、ＪＨ６、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上のげっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子は、１つ以上の内因性げっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子である。
いくつかの実施形態では、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、機能性内因性げっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子を欠く。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたげっ歯類の生殖細胞系列ゲノムは、１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片は、遺伝子改変されたげっ歯類によって発現される。いくつかの実施形態では、１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列は、修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座と同じ染色体上に含まれる。いくつかの実施形態では、修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子の代わりである。いくつかの実施形態では、１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子に置き換わる。
いくつかの実施形態では、１つ以上のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、第１及び第２のヒトＶＨ遺伝子セグメントを含み、１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列は、第１のヒトＶＨ遺伝子セグメントと第２のヒトＶＨ遺伝子セグメントとの間にある。いくつかの実施形態では、第１のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１－２であり、第２のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ６－１である。
いくつかの実施形態では、１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントとヒトＤＨ遺伝子セグメントとの間にある。
いくつかの実施形態では、げっ歯類Ｃλ遺伝子は、マウスＣλ１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一の配列を有する。いくつかの実施形態では、げっ歯類Ｃλ遺伝子は、マウスＣλ２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一の配列を有する。いくつかの実施形態では、げっ歯類Ｃλ遺伝子は、マウスＣλ３遺伝子と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一の配列を有する。
いくつかの実施形態では、げっ歯類Ｃλ遺伝子は、マウスＣλ遺伝子であり、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、げっ歯類Ｃλ遺伝子は、マウスＣλ１遺伝子であり、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、げっ歯類Ｃλ遺伝子は、ラットＣλ１と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一の配列を有する。いくつかの実施形態では、げっ歯類Ｃλ遺伝子は、ラットＣλ２と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一の配列を有する。いくつかの実施形態では、げっ歯類Ｃλ遺伝子は、ラットＣλ３と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一の配列を有する。いくつかの実施形態では、げっ歯類Ｃλ遺伝子は、ラットＣλ４遺伝子と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％または少なくとも９９％同一の配列を有する。
いくつかの実施形態では、げっ歯類Ｃλ遺伝子は、ラットＣλ遺伝子であり、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、１つ以上のげっ歯類Ｖκ遺伝子セグメント、１つ以上のげっ歯類Ｊκ遺伝子セグメント、またはそれらの任意の組み合わせの代わりである。いくつかの実施形態では、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、１つ以上のげっ歯類Ｖκ遺伝子セグメント、１つ以上のげっ歯類Ｊκ遺伝子セグメント、またはそれらの任意の組み合わせに置き換わる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の遺伝子改変されたげっ歯類の生殖細胞系列ゲノムは、不活性化内因性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座をさらに含む。いくつかの実施形態では、内因性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座は、内因性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座のすべてまたは一部を欠失または反転させることによって不活性化される。いくつかの実施形態では、内因性Ｖλ遺伝子セグメント、内因性Ｊλ遺伝子セグメント、及び内因性Ｃλ遺伝子は、全体としてまたは部分的に欠失される。
以下の図から構成される、本明細書に含まれる図面は、例示目的のためのものにすぎず、限定のためのものではない。
本開示による非ヒト動物の実施形態の生成において使用されるターゲティングベクター（実施例１及び４に記載されている）を構築するためのストラテジーの縮尺どおりではない例示的な実施形態の図を示している。図中のラベルが別段示唆していない限り（例えば、選択カセット、ｌｏｘＰ部位などについて）、塗りつぶした形状及び一本線は、マウス配列を表し、空の形状及び二重線はヒト配列を表す。「ＦＲＴ」は、Ｆｒｔリコンビナーゼシステム部位を示し；「ＵＢ－ＮＥＯ」は、ＵＢプロモーターを有するネオマイシン耐性遺伝子を示し；「ｅｎｈ」は、エンハンサーを示し；「Ｅｉ」は、イントロンエンハンサーを示し；「３’Ｅ」は、３’エンハンサーを示し；「ＳＰＥＣ」は、スペクチノマイシン耐性遺伝子を示し；「ＳＤ」は、スプライスドナー部位を示し；「ＣＤＳ」は、コーディング配列を示し；「ｌｏｘ」は、ｌｏｘ２３７２部位を示し；「ｌｏｘＰ」は、ｌｏｘ Ｐ部位を示し；「ＵＢ－ＨＹＧ」は、ＵＢプロモーターを有するハイグロマイシン耐性遺伝子を示す。 本開示による非ヒト動物の実施形態の生成において使用されるターゲティングベクター（実施例１及び４に記載されている）を構築するためのストラテジーの縮尺どおりではない例示的な実施形態の図を示している。図中のラベルが別段示唆していない限り（例えば、選択カセット、ｌｏｘＰ部位などについて）、塗りつぶした形状及び一本線は、マウス配列を表し、空の形状及び二重線はヒト配列を表す。「ＦＲＴ」は、Ｆｒｔリコンビナーゼシステム部位を示し；「ＵＢ－ＮＥＯ」は、ＵＢプロモーターを有するネオマイシン耐性遺伝子を示し；「ｅｎｈ」は、エンハンサーを示し；「Ｅｉ」は、イントロンエンハンサーを示し；「３’Ｅ」は、３’エンハンサーを示し；「ＳＰＥＣ」は、スペクチノマイシン耐性遺伝子を示し；「ＳＤ」は、スプライスドナー部位を示し；「ＣＤＳ」は、コーディング配列を示し；「ｌｏｘ」は、ｌｏｘ２３７２部位を示し；「ｌｏｘＰ」は、ｌｏｘ Ｐ部位を示し；「ＵＢ－ＨＹＧ」は、ＵＢプロモーターを有するハイグロマイシン耐性遺伝子を示す。 本開示による非ヒト動物の実施形態の生成において使用されるターゲティングベクター（実施例７及び１０に記載されている）を構築するためのストラテジーの縮尺どおりではない例示的な実施形態の図を示している。図中のラベルが別段示唆していない限り（例えば、選択カセット、ｌｏｘＰ部位などについて）、塗りつぶした形状及び一本線は、マウス配列を表し、空の形状及び二重線はヒト配列を表す。「ＦＲＴ」は、Ｆｒｔリコンビナーゼシステム部位を示し；「ＵＢ－ＮＥＯ」は、ＵＢプロモーターを有するネオマイシン耐性遺伝子を示し；「ｅｎｈ」は、エンハンサーを示し；「Ｅｉ」は、イントロンエンハンサーを示し；「３’Ｅ」は、３’エンハンサーを示し；「ＳＰＥＣ」は、スペクチノマイシン耐性遺伝子を示し；「ＳＤ」は、スプライスドナー部位を示し；「ＣＤＳ」は、コーディング配列を示し；「ｌｏｘ」は、ｌｏｘ２３７２部位を示し；「ｌｏｘＰ」は、ｌｏｘ Ｐ部位を示し；「ＵＢ－ＨＹＧ」は、ＵＢプロモーターを有するハイグロマイシン耐性遺伝子を示す。 本開示による非ヒト動物の実施形態の生成において使用されるターゲティングベクター（実施例７及び１０に記載されている）を構築するためのストラテジーの縮尺どおりではない例示的な実施形態の図を示している。図中のラベルが別段示唆していない限り（例えば、選択カセット、ｌｏｘＰ部位などについて）、塗りつぶした形状及び一本線は、マウス配列を表し、空の形状及び二重線はヒト配列を表す。「ＦＲＴ」は、Ｆｒｔリコンビナーゼシステム部位を示し；「ＵＢ－ＮＥＯ」は、ＵＢプロモーターを有するネオマイシン耐性遺伝子を示し；「ｅｎｈ」は、エンハンサーを示し；「Ｅｉ」は、イントロンエンハンサーを示し；「３’Ｅ」は、３’エンハンサーを示し；「ＳＰＥＣ」は、スペクチノマイシン耐性遺伝子を示し；「ＳＤ」は、スプライスドナー部位を示し；「ＣＤＳ」は、コーディング配列を示し；「ｌｏｘ」は、ｌｏｘ２３７２部位を示し；「ｌｏｘＰ」は、ｌｏｘ Ｐ部位を示し；「ＵＢ－ＨＹＧ」は、ＵＢプロモーターを有するハイグロマイシン耐性遺伝子を示す。 げっ歯類胚性幹（ＥＳ）細胞クローン（実施例２に記載されている）の修飾されたＩｇκ軽鎖遺伝子座へのターゲティングベクターＡ（実施例１に記載されている）の挿入の縮尺どおりではない図を示しており、ＥＳ細胞クローンは、本開示に従うげっ歯類の実施形態の生成において使用された。図には、胚性幹（ＥＳ）細胞クローンが所定の例示的な配列について陽性であることを確認するために使用される様々なプローブのおおよその位置（丸付きダッシュマークによって示される）が含まれている。図中のラベルが別段示唆していない限り（例えば、選択カセット、ｌｏｘＰ部位などについて）、塗りつぶした形状及び一本線は、マウス配列を表し、空の形状及び二重線はヒト配列を表す。「ＦＲＴ」は、Ｆｒｔリコンビナーゼシステム部位を示し；「ＵＢ－ＮＥＯ」は、ＵＢプロモーターを有するネオマイシン耐性遺伝子を示し；「Ｅｉ」は、イントロンエンハンサーを示し；「３’Ｅ」は、３’エンハンサーを示し；「ＳＤ」は、スプライスドナー部位を示す。「Ｈｅｔ」はヘテロ接合性マウスを示し、「ｈｏ」はホモ接合性マウスを示す。 げっ歯類胚性幹（ＥＳ）細胞クローン（実施例５に記載されている）の修飾されたＩｇκ軽鎖遺伝子座へのターゲティングベクターＢ（実施例４に記載されている）の挿入の縮尺どおりではない図を示しており、ＥＳ細胞クローンは、本開示に従うげっ歯類の実施形態の生成において使用された。図には、胚性幹（ＥＳ）細胞クローンが所定の例示的な配列について陽性であることを確認するために使用される様々なプローブのおおよその位置（丸付きダッシュマークによって示される）が含まれている。図中のラベルが別段示唆していない限り（例えば、選択カセット、ｌｏｘＰ部位などについて）、塗りつぶした形状及び一本線は、マウス配列を表し、空の形状及び二重線はヒト配列を表す。「ＦＲＴ」は、Ｆｒｔリコンビナーゼシステム部位を示し；「ＵＢ－ＮＥＯ」は、ＵＢプロモーターを有するネオマイシン耐性遺伝子を示し；「Ｅｉ」は、イントロンエンハンサーを示し；「３’Ｅ」は、３’エンハンサーを示し；「ＳＤ」は、スプライスドナー部位を示し；「ｌｏｘＰ」は、ｌｏｘ Ｐ部位を示し；「ＵＢ－ＨＹＧ」は、ＵＢプロモーターを有するハイグロマイシン耐性遺伝子を示す。「Ｈｅｔ」はヘテロ接合性マウスを示し、「ｈｏ」はホモ接合性マウスを示す。 げっ歯類胚性幹（ＥＳ）細胞クローン（実施例８に記載されている）の修飾されたＩｇκ軽鎖遺伝子座へのターゲティングベクターＣ（実施例７に記載されている）の挿入の縮尺どおりではない図を示しており、ＥＳ細胞クローンは、本開示に従うげっ歯類の実施形態の生成において使用された。図には、胚性幹（ＥＳ）細胞クローンが所定の例示的な配列について陽性であることを確認するために使用される様々なプローブのおおよその位置（丸付きダッシュマークによって示される）が含まれている。図中のラベルが別段示唆していない限り（例えば、選択カセット、ｌｏｘＰ部位などについて）、塗りつぶした形状及び一本線は、マウス配列を表し、空の形状及び二重線はヒト配列を表す。「ＦＲＴ」は、Ｆｒｔリコンビナーゼシステム部位を示し；「ＵＢ－ＮＥＯ」は、ＵＢプロモーターを有するネオマイシン耐性遺伝子を示し；「Ｅｉ」は、イントロンエンハンサーを示し；「３’Ｅ」は、３’エンハンサーを示し；「ＳＤ」は、スプライスドナー部位を示す。「Ｈｅｔ」はヘテロ接合性マウスを示し、「ｈｏ」はホモ接合性マウスを示す。 げっ歯類胚性幹（ＥＳ）細胞クローン（実施例１１に記載されている）の修飾されたＩｇκ軽鎖遺伝子座へのターゲティングベクターＤ（実施例１０に記載されている）の挿入の縮尺どおりではない図を示しており、ＥＳ細胞クローンは、本開示に従うげっ歯類の実施形態の生成において使用された。図には、胚性幹（ＥＳ）細胞クローンが所定の例示的な配列について陽性であることを確認するために使用される様々なプローブのおおよその位置（丸付きダッシュマークによって示される）が含まれている。図中のラベルが別段示唆していない限り（例えば、選択カセット、ｌｏｘＰ部位などについて）、塗りつぶした形状及び一本線は、マウス配列を表し、空の形状及び二重線はヒト配列を表す。「ＦＲＴ」は、Ｆｒｔリコンビナーゼシステム部位を示し；「ＵＢ－ＮＥＯ」は、ＵＢプロモーターを有するネオマイシン耐性遺伝子を示し；「Ｅｉ」は、イントロンエンハンサーを示し；「３’Ｅ」は、３’エンハンサーを示し；「ＳＤ」は、スプライスドナー部位を示し；「ｌｏｘＰ」は、ｌｏｘ Ｐ部位を示し；「ＵＢ－ＨＹＧ」は、ＵＢプロモーターを有するハイグロマイシン耐性遺伝子を示す。「Ｈｅｔ」はヘテロ接合性マウスを示し、「ｈｏ」はホモ接合性マウスを示す。 マウスＣκのヌクレオチド配列（配列番号２５）を示している。コーディング配列は、太文字によって示されており、３’非翻訳領域は非太字である。 ラットＣκのヌクレオチド配列（配列番号２７）を示している。コーディング配列は、太文字によって示されており、３’非翻訳領域は非太字である。 修飾されたＶλ１－５１／Ｊλ２ベクターのヌクレオチド配列（配列番号３１）を示している。制限酵素部位配列－ＡｓｃＩ（配列の５’末端）及びＰＩ－ＳｃｅＩ（配列の３’末端）－は、大文字のイタリック体文字で示されており；Ｖλ１－５１プロモーター配列は、小文字（非太字）によって示されており；Ｖλ１ ５１の５’ＵＴＲ配列は、大文字イタリック体太文字によって示されており；再編成されたＶλ１－５１／Ｊλ２配列は次を含む：Ｖλ１－５１のエクソン１配列は、大文字（非太字）によって示されており、その中でＶλ１－５１のエクソン１開始コドンは、さらにイタリック体で下線が引かれており；Ｖλ１－５１のイントロン１配列は、小文字の太文字によって示されており；Ｖλ１－５１のエクソン２配列は、大文字で太文字で下線（実線の下線）が引かれた文字によって示されており、Ｊλ２配列は、大文字で太文字で下線（破線の下線）が引かれた文字によって示されており；ヒトＪκ５－Ｃκイントロン配列は、小文字イタリック体文字によって示されている。 修飾されたＶλ１－５１／Ｊλ２ベクターのヌクレオチド配列（配列番号３１）を示している。制限酵素部位配列－ＡｓｃＩ（配列の５’末端）及びＰＩ－ＳｃｅＩ（配列の３’末端）－は、大文字のイタリック体文字で示されており；Ｖλ１－５１プロモーター配列は、小文字（非太字）によって示されており；Ｖλ１ ５１の５’ＵＴＲ配列は、大文字イタリック体太文字によって示されており；再編成されたＶλ１－５１／Ｊλ２配列は次を含む：Ｖλ１－５１のエクソン１配列は、大文字（非太字）によって示されており、その中でＶλ１－５１のエクソン１開始コドンは、さらにイタリック体で下線が引かれており；Ｖλ１－５１のイントロン１配列は、小文字の太文字によって示されており；Ｖλ１－５１のエクソン２配列は、大文字で太文字で下線（実線の下線）が引かれた文字によって示されており、Ｊλ２配列は、大文字で太文字で下線（破線の下線）が引かれた文字によって示されており；ヒトＪκ５－Ｃκイントロン配列は、小文字イタリック体文字によって示されている。 修飾されたＶλ１－５１／Ｊλ２ベクターのヌクレオチド配列（配列番号３１）を示している。制限酵素部位配列－ＡｓｃＩ（配列の５’末端）及びＰＩ－ＳｃｅＩ（配列の３’末端）－は、大文字のイタリック体文字で示されており；Ｖλ１－５１プロモーター配列は、小文字（非太字）によって示されており；Ｖλ１ ５１の５’ＵＴＲ配列は、大文字イタリック体太文字によって示されており；再編成されたＶλ１－５１／Ｊλ２配列は次を含む：Ｖλ１－５１のエクソン１配列は、大文字（非太字）によって示されており、その中でＶλ１－５１のエクソン１開始コドンは、さらにイタリック体で下線が引かれており；Ｖλ１－５１のイントロン１配列は、小文字の太文字によって示されており；Ｖλ１－５１のエクソン２配列は、大文字で太文字で下線（実線の下線）が引かれた文字によって示されており、Ｊλ２配列は、大文字で太文字で下線（破線の下線）が引かれた文字によって示されており；ヒトＪκ５－Ｃκイントロン配列は、小文字イタリック体文字によって示されている。 Ｖλ１－５１イントロンを含む再編成されたＶλ１－５１／Ｊλ２可変領域のヌクレオチド配列（配列番号３２）を示している。Ｖλ１－５１のエクソン１配列は、大文字によって示されており、その中でＶλ１－５１のエクソン１開始コドンは、さらにイタリック体で下線が引かれており；Ｖλ１－５１のイントロン１配列は、小文字の太文字によって示されており；Ｖλ１－５１のエクソン２配列は、大文字で太文字で下線（実線の下線）が引かれた文字によって示されており；Ｊλ２配列は、大文字で太文字で下線（破線の下線）が引かれた文字によって示されている。 Ｖλ１－５１イントロンを有さない再編成されたＶλ１－５１／Ｊλ２可変領域のヌクレオチド配列（配列番号３３）を示している。Ｖλ１－５１コーディング配列は、大文字によって示されており、Ｖλ１－５１開始コドンは、さらにイタリック体で下線が引かれており；Ｊλ２配列は、破線の下線を伴って大文字によって示されている。 シグナルペプチドを含む再編成されたＶλ１－５１／Ｊλ２可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号３４）を示している。イタリック体の太字は、シグナルペプチドの配列を示している。 修飾されたＶλ２－１４／Ｊλ２ベクターのヌクレオチド配列（配列番号３６）を示している。制限酵素部位配列－ＡｓｃＩ（配列の５’末端）及びＰＩ－ＳｃｅＩ（配列の３’末端）－は、大文字のイタリック体文字で示されており；Ｖλ１－５１プロモーター配列は、小文字（非太字）によって示されており；Ｖλ１ ５１の５’ＵＴＲ配列は、大文字イタリック体太文字によって示されており；再編成されたＶλ２－１４／Ｊλ２配列は次を含む：Ｖλ２－１４のエクソン１配列は、大文字（非太字）によって示されており、その中でＶλ２－１４のエクソン１開始コドンは、さらにイタリック体で下線が引かれており；Ｖλ２－１４のイントロン１配列は、小文字の太文字によって示されており；Ｖλ２－１４のエクソン２配列は、大文字で太文字で下線（実線の下線）が引かれた文字によって示されており、Ｊλ２配列は、大文字で太文字で下線（破線の下線）が引かれた文字によって示されており；ヒトＪκ５－Ｃκイントロン配列は、小文字イタリック体文字によって示されている。 修飾されたＶλ２－１４／Ｊλ２ベクターのヌクレオチド配列（配列番号３６）を示している。制限酵素部位配列－ＡｓｃＩ（配列の５’末端）及びＰＩ－ＳｃｅＩ（配列の３’末端）－は、大文字のイタリック体文字で示されており；Ｖλ１－５１プロモーター配列は、小文字（非太字）によって示されており；Ｖλ１ ５１の５’ＵＴＲ配列は、大文字イタリック体太文字によって示されており；再編成されたＶλ２－１４／Ｊλ２配列は次を含む：Ｖλ２－１４のエクソン１配列は、大文字（非太字）によって示されており、その中でＶλ２－１４のエクソン１開始コドンは、さらにイタリック体で下線が引かれており；Ｖλ２－１４のイントロン１配列は、小文字の太文字によって示されており；Ｖλ２－１４のエクソン２配列は、大文字で太文字で下線（実線の下線）が引かれた文字によって示されており、Ｊλ２配列は、大文字で太文字で下線（破線の下線）が引かれた文字によって示されており；ヒトＪκ５－Ｃκイントロン配列は、小文字イタリック体文字によって示されている。 修飾されたＶλ２－１４／Ｊλ２ベクターのヌクレオチド配列（配列番号３６）を示している。制限酵素部位配列－ＡｓｃＩ（配列の５’末端）及びＰＩ－ＳｃｅＩ（配列の３’末端）－は、大文字のイタリック体文字で示されており；Ｖλ１－５１プロモーター配列は、小文字（非太字）によって示されており；Ｖλ１ ５１の５’ＵＴＲ配列は、大文字イタリック体太文字によって示されており；再編成されたＶλ２－１４／Ｊλ２配列は次を含む：Ｖλ２－１４のエクソン１配列は、大文字（非太字）によって示されており、その中でＶλ２－１４のエクソン１開始コドンは、さらにイタリック体で下線が引かれており；Ｖλ２－１４のイントロン１配列は、小文字の太文字によって示されており；Ｖλ２－１４のエクソン２配列は、大文字で太文字で下線（実線の下線）が引かれた文字によって示されており、Ｊλ２配列は、大文字で太文字で下線（破線の下線）が引かれた文字によって示されており；ヒトＪκ５－Ｃκイントロン配列は、小文字イタリック体文字によって示されている。 Ｖλ２－１４イントロンを含む再編成されたＶλ２－１４／Ｊλ２可変領域のヌクレオチド配列（配列番号３７）を示している。Ｖλ２－１４のエクソン１配列は、大文字によって示されており、その中でＶλ２－１４のエクソン１開始コドンは、さらにイタリック体で下線が引かれており；Ｖλ２－１４のイントロン１配列は、小文字の太文字によって示されており；Ｖλ１－５１のエクソン２配列は、大文字で太文字で下線（実線の下線）が引かれた文字によって示されており；Ｊλ２配列は、大文字で太文字で下線（破線の下線）が引かれた文字によって示されている。 Ｖλ２－１４イントロンを有さない再編成されたＶλ２－１４／Ｊλ２可変領域のヌクレオチド配列（配列番号３８）を示している。Ｖλ２－１４配列は、大文字によって示されており、Ｖλ２－１４開始コドンは、さらにイタリック体で下線が引かれており；Ｊλ２配列は、破線の下線を伴って大文字によって示されている。 シグナルペプチドを含む再編成されたＶλ２－１４／Ｊλ２可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号３９）を示している。イタリック体の太字は、シグナルペプチドの配列を示している。
配列表における選択された配列の簡単な説明
本明細書に記載される非ヒト動物のいくつかの実施形態において使用され得る様々なヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメントの代表的なヌクレオチド及びアミノ酸配列は、ｔｈｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍのウェブサイトであるｗｗｗ．ｉｍｇｔ．ｏｒｇ、またはＬｅＦｒａｎｃ，Ｍ－Ｐ．，Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ＦａｃｔｓＢｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｍａｙ，２３，２００１（本明細書で「ＬｅＦｒａｎｃ ２００１」と称される）から入手可能である。
以下は、本明細書に記載される非ヒト動物のいくつかの実施形態において利用され得る様々なマウス、ラット、またはヒトラムダ定常領域またはドメインの代表的なヌクレオチド及びアミノ酸配列である。
Figure 2022535418000002
Figure 2022535418000003
Figure 2022535418000004
Figure 2022535418000005
Figure 2022535418000006
Figure 2022535418000007
Figure 2022535418000008
以下は、本明細書に記載される非ヒト動物のいくつかの実施形態において利用され得るマウス、ラット、またはヒトカッパ定常領域またはドメインの代表的なヌクレオチド及びアミノ酸配列である。
マウスＣκのヌクレオチド配列（配列番号２５）（図７で再現されている）：
ＧＧＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＡＴＣＣＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＧＴＧＡＧＣＡＧＴＴＡＡＣＡＴＣＴＧＧＡＧＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＧＴＧＴＧＣＴＴＣＴＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＣＣＣＣＡＡＡＧＡＣＡＴＣＡＡＴＧＴＣＡＡＧＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＡＴＧＧＣＡＧＴＧＡＡＣＧＡＣＡＡＡＡＴＧＧＣＧＴＣＣＴＧＡＡＣＡＧＴＴＧＧＡＣＴＧＡＴＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＡＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＣＡＣＧＴＴＧＡＣＣＡＡＧＧＡＣＧＡＧＴＡＴＧＡＡＣＧＡＣＡＴＡＡＣＡＧＣＴＡＴＡＣＣＴＧＴＧＡＧＧＣＣＡＣＴＣＡＣＡＡＧＡＣＡＴＣＡＡＣＴＴＣＡＣＣＣＡＴＴＧＴＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＡＡＴＧＡＧＴＧＴＴＡＧａｇａｃａａａｇｇｔｃｃｔｇａｇａｃｇｃｃａｃｃａｃｃａｇｃｔｃｃｃｃａｇｃｔｃｃａｔｃｃｔａｔｃｔｔｃｃｃｔｔｃｔａａｇｇｔｃｔｔｇｇａｇｇｃｔｔｃｃｃｃａｃａａｇｃｇａｃｃｔａｃｃａｃｔｇｔｔｇｃｇｇｔｇｃｔｃｃａａａｃｃｔｃｃｔｃｃｃｃａｃｃｔｃｃｔｔｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｔｃｃｃｔｔｔｃｃｔｔｇｇｃｔｔｔｔａｔｃａｔｇｃｔａａｔａｔｔｔｇｃａｇａａａａｔａｔｔｃａａｔａａａｇｔｇａｇｔｃｔｔｔｇｃａｃｔｔｇａ
配列番号２５に関して、以下が適用される：
－コーディング配列は、太文字によって示されており；
－３’非翻訳領域は非太字である。
マウスＣκのアミノ酸配列（配列番号２６）：
ＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＳＥＱＬＴＳＧＧＡＳＶＶＣＦＬＮＮＦＹＰＫＤＩＮＶＫＷＫＩＤＧＳＥＲＱＮＧＶＬＮＳＷＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＴＬＴＫＤＥＹＥＲＨＮＳＹＴＣＥＡＴＨＫＴＳＴＳＰＩＶＫＳＦＮＲＮＥＣ
ラットＣκのヌクレオチド配列（配列番号２７）（図８で再現されている）：
ＧＧＧＣＴＧＡＴＧＣＴＧＣＡＣＣＡＡＣＴＧＴＡＴＣＴＡＴＣＴＴＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＡＣＧＧＡＡＣＡＧＴＴＡＧＣＡＡＣＴＧＧＡＧＧＴＧＣＣＴＣＡＧＴＣＧＴＧＴＧＣＣＴＣＡＴＧＡＡＣＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＣＡＴＣＡＧＴＧＴＣＡＡＧＴＧＧＡＡＧＡＴＴＧＡＴＧＧＣＡＣＴＧＡＡＣＧＡＣＧＡＧＡＴＧＧＴＧＴＣＣＴＧＧＡＣＡＧＴＧＴＴＡＣＴＧＡＴＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＡＧＡＣＡＧＣＡＣＧＴＡＣＡＧＣＡＴＧＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＣＴＣＧＴＴＧＡＣＣＡＡＧＧＣＴＧＡＣＴＡＴＧＡＡＡＧＴＣＡＴＡＡＣＣＴＣＴＡＴＡＣＣＴＧＴＧＡＧＧＴＴＧＴＴＣＡＴＡＡＧＡＣＡＴＣＡＴＣＣＴＣＡＣＣＣＧＴＣＧＴＣＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＡＡＴＧＡＧＴＧＴＴＡＧＡＣＣＣＡＡＡＧＧＴＣＣＴＧＡＧＧＴＧＣＣＡＣＣＴＧＣＴＣＣＣＣＡＧＣＴＣＣＴＴＣＣＡＡＴＣＴＴＣＣＣＴＣＣＴＡＡＧＧＴＣＴＴＧＧＡＧＡＣＴＴＣＣＣＣＡＣＡＡＧＣＧＡＣＣＴＡＣＣＡＣＴＧＴＴＧＣＧＧＴＧＣＴＣＣＡＡＡＣＣＴＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＴＣＡＴＣＣＴＣＣＴＴＣＣＴＴＴＣＣＴＴＧＧＣＴＴＴＧＡＴＣＡＴＧＣＴＡＡＴＡＴＴＴＧＧＧＧＡＡＴＡＴＴＡＡＡＴＡＡＡＧＴＧＡＡＴＣＴＴＴＧＣＡＣＴＴＧＡ
配列番号２７に関して、以下が適用される：
－コーディング配列は、太文字によって示されており；
－３’非翻訳領域は非太字である。
ラットＣκのアミノ酸配列（配列番号２８）：
ＡＤＡＡＰＴＶＳＩＦＰＰＳＴＥＱＬＡＴＧＧＡＳＶＶＣＬＭＮＮＦＹＰＲＤＩＳＶＫＷＫＩＤＧＴＥＲＲＤＧＶＬＤＳＶＴＤＱＤＳＫＤＳＴＹＳＭＳＳＴＬＳＬＴＫＡＤＹＥＳＨＮＬＹＴＣＥＶＶＨＫＴＳＳＳＰＶＶＫＳＦＮＲＮＥＣ
ヒトＣκのヌクレオチド配列（配列番号２９）：
ＧＡＡＣＴＧＴＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＴＣＴＧＴＣＴＴＣＡＴＣＴＴＣＣＣＧＣＣＡＴＣＴＧＡＴＧＡＧＣＡＧＴＴＧＡＡＡＴＣＴＧＧＡＡＣＴＧＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＧＴＧＣＣＴＧＣＴＧＡＡＴＡＡＣＴＴＣＴＡＴＣＣＣＡＧＡＧＡＧＧＣＣＡＡＡＧＴＡＣＡＧＴＧＧＡＡＧＧＴＧＧＡＴＡＡＣＧＣＣＣＴＣＣＡＡＴＣＧＧＧＴＡＡＣＴＣＣＣＡＧＧＡＧＡＧＴＧＴＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＧＡＣＡＧＣＡＡＧＧＡＣＡＧＣＡＣＣＴＡＣＡＧＣＣＴＣＡＧＣＡＧＣＡＣＣＣＴＧＡＣＧＣＴＧＡＧＣＡＡＡＧＣＡＧＡＣＴＡＣＧＡＧＡＡＡＣＡＣＡＡＡＧＴＣＴＡＣＧＣＣＴＧＣＧＡＡＧＴＣＡＣＣＣＡＴＣＡＧＧＧＣＣＴＧＡＧＣＴＣＧＣＣＣＧＴＣＡＣＡＡＡＧＡＧＣＴＴＣＡＡＣＡＧＧＧＧＡＧＡＧＴＧＴ
ヒトＣκのアミノ酸配列（配列番号３０）：
ＴＶＡＡＰＳＶＦＩＦＰＰＳＤＥＱＬＫＳＧＴＡＳＶＶＣＬＬＮＮＦＹＰＲＥＡＫＶＱＷＫＶＤＮＡＬＱＳＧＮＳＱＥＳＶＴＥＱＤＳＫＤＳＴＹＳＬＳＳＴＬＴＬＳＫＡＤＹＥＫＨＫＶＹＡＣＥＶＴＨＱＧＬＳＳＰＶＴＫＳＦＮＲＧＥＣ
修飾されたＶλ１－５１／Ｊλ２ベクターのヌクレオチド配列（配列番号３１）（図１Ａに概略的に示されており、図９Ａ～９Ｃで再現されている）：
Figure 2022535418000009
Figure 2022535418000010
Figure 2022535418000011
配列番号３１に関して、以下が適用される：
－制限酵素部位配列－ＡｓｃＩ（配列の５’末端）及びＰＩ－ＳｃｅＩ（配列の３’末端）－は、大文字のイタリック体文字で示されており；
－Ｖλ１－５１プロモーター配列は、小文字（非太字）文字によって示されており；
－Ｖλ１－５１の５’ＵＴＲ配列は、大文字イタリック体太文字によって示されており；
－再編成されたＶλ１－５１／Ｊλ２配列は次を含む：
ｏ Ｖλ１－５１のエクソン１配列は、大文字（非太字）によって示されており、その中でＶλ１－５１のエクソン１開始コドンは、さらにイタリック体で下線が引かれており；
ｏ Ｖλ１－５１のイントロン１配列は、小文字の太文字によって示されており；
ｏ Ｖλ１－５１のエクソン２配列は、大文字で太文字で下線（実線の下線）が引かれた文字によって示されており、
ｏ Ｊλ２配列は、大文字で太文字で下線（破線の下線）が引かれた文字によって示されており；
－ヒトＪκ５－Ｃκイントロン配列は、小文字イタリック体文字によって示されている。
Ｖλ１－５１イントロンを含む再編成されたＶλ１－５１／Ｊλ２可変領域のヌクレオチド配列（配列番号３２）（図１０で再現されている）：
Figure 2022535418000012
配列番号３２に関して、以下が適用される：
－Ｖλ１－５１のエクソン１配列は、大文字によって示されており、Ｖλ１－５１のエクソン１開始コドンは、さらにイタリック体で下線が引かれており；
－Ｖλ１－５１のイントロン１配列は、小文字の太文字によって示されており；
－Ｖλ１－５１のエクソン２配列は、大文字で太文字で下線（実線の下線）が引かれた文字によって示されており、
－Ｊλ２配列は、大文字で太文字で下線（破線の下線）が引かれた文字によって示されている。
Ｖλ１－５１イントロンを有さない再編成されたＶλ１－５１／Ｊλ２可変領域のヌクレオチド配列（配列番号３３）（図１１で再現されている）：
Figure 2022535418000013
配列番号３３に関して、以下が適用される：
－Ｖλ１－５１コーディング配列は、大文字によって示されており、Ｖλ１－５１開始コドンは、さらにイタリック体で下線が引かれており；
－Ｊλ２配列は、破線の下線を伴って大文字によって示されている。
シグナルペプチドを含む再編成されたＶλ１－５１／Ｊλ２可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号３４）（図１２で再現されている）：
Figure 2022535418000014
配列番号３４に関して、イタリック体の太字は、シグナルペプチドの配列を示している。
シグナルペプチドを有さない再編成されたＶλ１－５１／Ｊλ２可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号３５）：
ＱＳＶＬＴＱＰＰＳＶＳＡＡＰＧＱＫＶＴＩＳＣＳＧＳＳＳＮＩＧＮＮＹＶＳＷＹＱＱＬＰＧＴＡＰＫＬＬＩＹＤＮＮＫＲＰＳＧＩＰＤＲＦＳＧＳＫＳＧＴＳＡＴＬＧＩＴＧＬＱＴＧＤＥＡＤＹＹＣＧＴＷＤＳＳＬＳＡＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
修飾されたＶλ２－１４／Ｊλ２ベクターのヌクレオチド配列（配列番号３６）（図２Ａに概略的に示されており、図１３Ａ～１３Ｃで再現されている）：
Figure 2022535418000015
Figure 2022535418000016
配列番号３６に関して、以下が適用される：
－制限酵素部位配列－ＡｓｃＩ（配列の５’末端）及びＰＩ－ＳｃｅＩ（配列の３’末端）－は、大文字のイタリック体文字で示されており；
－Ｖλ１－５１プロモーター配列は、小文字（非太字）文字によって示されており；
－Ｖλ１－５１の５’ＵＴＲ配列は、大文字イタリック体太文字によって示されており；
－再編成されたＶλ２－１４／Ｊλ２配列は次を含む：
ｏ Ｖλ２－１４のエクソン１配列は、大文字（非太字）によって示されており、その中でＶλ２－１４のエクソン１開始コドンは、さらにイタリック体で下線が引かれており；
ｏ Ｖλ２－１４のイントロン１配列は、小文字の太文字によって示されており；
ｏ Ｖλ２－１４のエクソン２配列は、大文字で太文字で下線（実線の下線）が引かれた文字によって示されており、
ｏ Ｊλ２配列は、大文字で太文字で下線（破線の下線）が引かれた文字によって示されており；
ｏ ヒトＪκ５－Ｃκイントロン配列は、小文字イタリック体文字によって示されている。
Ｖλ２－１４イントロンを含む再編成されたＶλ２－１４／Ｊλ２可変領域のヌクレオチド配列（配列番号３７）（図１４で再現されている）：
Figure 2022535418000017
Figure 2022535418000018
配列番号３７に関して、以下が適用される：
－Ｖλ２－１４のエクソン１配列は、大文字によって示されており、Ｖλ２－１４のエクソン１開始コドンは、さらにイタリック体で下線が引かれており；
－Ｖλ２－１４のイントロン１配列は、小文字の太文字によって示されており；
－Ｖλ１－５１のエクソン２配列は、大文字で太文字で下線（実線の下線）が引かれた文字によって示されており；
－Ｊλ２配列は、大文字で太文字で下線（破線の下線）が引かれた文字によって示されている。
Ｖλ２－１４イントロンを有さない再編成されたＶλ２－１４／Ｊλ２可変領域のヌクレオチド配列（配列番号３８）（図１５で再現されている）：
Figure 2022535418000019
配列番号３８に関して、以下が適用される：
－Ｖλ２－１４配列は、大文字によって示されており、Ｖλ２－１４開始コドンは、さらにイタリック体で下線が引かれており；
－Ｊλ２配列は、破線の下線を伴って大文字によって示されている。
シグナルペプチドを含む再編成されたＶλ２－１４／Ｊλ２可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号３９）（図１６で再現されている）：
Figure 2022535418000020
配列番号３９に関して、イタリック体の太字は、シグナルペプチドの配列を示している。
シグナルペプチドを有さない再編成されたＶλ２－１４／Ｊλ２可変ドメインのアミノ酸配列（配列番号４０）：
ＱＳＡＬＴＱＰＡＳＶＳＧＳＰＧＱＳＩＴＩＳＣＴＧＴＳＳＤＶＧＧＹＮＹＶＳＷＹＱＱＨＰＧＫＡＰＫＬＭＩＹＥＶＳＮＲＰＳＧＶＳＮＲＦＳＧＳＫＳＧＮＴＡＳＬＴＩＳＧＬＱＡＥＤＥＡＤＹＹＣＳＳＹＴＳＳＳＴＬＶＶＦＧＧＧＴＫＬＴＶＬ
定義
本発明の範囲は、本明細書に添付された特許請求の範囲によって定義され、本明細書に記載の所定の実施形態によって限定されない。本明細書を読む当業者は、そのような記載された実施形態と同等であり、またはそうでなければ特許請求の範囲内であり得る様々な改変を認識することになる。通常、本明細書で使用される用語は、別段明確に示されない限り、当該技術分野におけるそれらの理解される意味に従う。所定の用語の明確な定義が以下に提供される；本明細書を通して特定の例におけるこれらの及び他の用語の意味は、文脈から当業者に明らかになる。以下の及び他の用語のための追加の定義が本明細書を通して示されている。本明細書内で引用される特許及び非特許文献の参考文献またはそれらの関連部分は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
特許請求の範囲における請求項の要素を修飾するための「第１」、「第２」、「第３」などの序数詞用語の使用は、それ自体が、ある請求項の要素の別のものに対する任意の優先度、先行度、もしくは順序、または方法の行為が実施される時間的順序を含意するものではないが、所定の名称を有するある請求項の要素を、同じ名称（ただし、序数詞用語を使用する場合）を有する別の要素と区別して請求項の要素を区別するための標識として使用されるにすぎない。
冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、本明細書で使用される場合、明らかに反対に示されない限り、複数の言及を含むものとして理解されるべきである。群の１つ以上のメンバーの間に「または」を含む請求項または記載は、反対に示されない限り、または別段文脈から明らかでない限り、群のメンバーの１つ、複数、またはすべてが、所与の生成物またはプロセスにおいて存在するか、用いられるか、またはそうでなければ関連している場合に満たされると考えられる。いくつかの実施形態では、群の正確に１つのメンバーが所与の生成物またはプロセスに存在する、用いられる、またはそうでなければ関連する。いくつかの実施形態では、複数、またはすべての群メンバーが所与の生成物またはプロセスに存在する、用いられる、またはそうでなければ関連する。本発明は、別段示されない限り、または矛盾もしくは不整合が生じるであろうことが当業者に明らかでない限り、列挙された請求項のうち１つ以上からの１つ以上の限定、要素、条項、記述用語などが、同じ基本請求項に従属する別の請求項（または、関連する場合、任意の他の請求項）に導入されるすべての類型、組み合わせ、並べ替えを包含することを理解されたい。要素が、リストとして（例えば、マーカッシュ群または類似する形式）で提示される場合、要素の各亜群も開示され、任意の要素（複数可）が群から除去され得ることを理解されたい。通常、実施形態または態様が特定の要素、特徴などを「含む」と称される場合、所定の実施形態または態様は、そのような要素、特徴などから「なる」または「本質的になる」ことが理解されるべきである。単純化の目的のため、それらの実施形態は、本明細書において非常に多くの言葉であらゆる場合に具体的に示されているわけではない。任意の実施形態または態様は、特定の除外が本明細書で記述されるかどうかにかかわらず、特許請求の範囲から明白に除外され得ることも理解されるべきである。
投与：本明細書で使用される場合、組成物（例えば、抗原または抗体）の対象またはシステムへの（例えば、細胞、器官、組織、生物、もしくは関連成分またはそれらの一連の成分への）投与を含む。当業者は、投与経路が、例えば、組成物が投与される対象またはシステム、組成物の特質、投与の目的などに応じて変わり得ることを理解する。例えば、所定の実施形態では、動物対象への（例えば、ヒトまたはげっ歯類への）投与は、気管支（気管支注入によるものを含む）、口腔内、腸内、皮間、動脈内、皮内、胃内、髄内、筋肉内、鼻腔内、腹腔内、髄腔内、静脈内、脳室内、粘膜、鼻、経口、直腸、皮下、舌下、局所、気管（気管内注入によるものを含む）、経皮、膣及び／または硝子体であり得る。いくつかの実施形態では、投与は、間欠的投薬を含み得る。いくつかの実施形態では、投与は、少なくとも選択された期間の連続投薬（例えば、かん流）を含み得る。
抗原結合タンパク質：本明細書で使用される場合、少なくとも１つの対象となる抗原に特異的に結合する任意のタンパク質またはポリペプチドを指す。抗原結合タンパク質には、抗体、重鎖、軽鎖（例えば、λまたはκ軽鎖）、重鎖可変ドメイン、軽鎖可変ドメイン（例えば、λまたはκ軽鎖可変ドメイン）、及び一本鎖可変断片（ＳｃＦｖ）が含まれるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、多重特異的であり、２つ以上のエピトープまたは抗原に特異的に結合し得る。
およそ：対象となる１つ以上の値に適用される場合、記述された参照値に類似する値を含む。所定の実施形態では、用語「およそ」または「約」）は、別段記述されない限りまたは文脈から別段明らかでない限り、記述された参照値の（それよりも高いまたは低い）±１０％以内に入る値の範囲を指す（そのような数が、可能性のある値の１００％を超えるであろう場合を除く）。
生物学的に活性：本明細書で使用される場合、生物学的システムにおいて、ｉｎ ｖｉｔｒｏでまたはｉｎ ｖｉｖｏで（例えば、生物において）活性を有する任意の物質の特徴を指す。例えば、生物に存在する場合、その生物内で生物学的効果を有する物質は、生物学的に活性と考えられる。特定の実施形態では、タンパク質またはポリペプチドが生物学的に活性である場合、タンパク質またはポリペプチドの少なくとも１つの生物学的活性を共有するそのタンパク質またはポリペプチドの部分は、典型的には、「生物学的に活性な」部分と称される。
同等の：本明細書で使用される場合、２つ以上の物質、実体、状況、一連の状態などであって、互いに同一ではない場合があるが、観察される相違または類似性に基づいて合理的に結論が出され得るようにそれらの間の比較を可能とするのに十分に類似するものを指す。当業者は、文脈の中で、どの程度の同一性が、任意の所与の状況において２つ以上のそのような物質、実体、状況、一連の状態などが同等と考えられるために必要とされるかを理解する。
保存的：本明細書で使用される場合、保存的アミノ酸置換を表す場合、類似する化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換を含む例を指す。通常、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の対象となる機能的特性、例えば、リガンドに結合する受容体の能力を実質的に変化させない。類似する化学的特性を有する側鎖を有するアミノ酸の基の例には、脂肪族側鎖、例えば、グリシン（Ｇｌｙ、Ｇ）、アラニン（Ａｌａ、Ａ）、バリン（Ｖａｌ、Ｖ）、ロイシン（Ｌｅｕ、Ｌ）、及びイソロイシン（Ｉｌｅ、Ｉ）；脂肪族－ヒドロキシル側鎖、例えば、セリン（Ｓｅｒ、Ｓ）及びトレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）；アミド含有側鎖、例えば、アスパラギン（Ａｓｎ、Ｎ）及びグルタミン（Ｇｌｎ、Ｑ）；芳香族側鎖、例えば、フェニルアラニン（Ｐｈｅ、Ｆ）、チロシン（Ｔｙｒ、Ｙ）、及びトリプトファン（Ｔｒｐ、Ｗ）；塩基性側鎖、例えば、リジン（Ｌｙｓ、Ｋ）、アルギニン（Ａｒｇ、Ｒ）、及びヒスチジン（Ｈｉｓ、Ｈ）；酸性側鎖、例えば、アスパラギン酸（Ａｓｐ、Ｄ）及びグルタミン酸（Ｇｌｕ、Ｅ）；及び硫黄含有側鎖、例えば、システイン（Ｃｙｓ、Ｃ）及びメチオニン（Ｍｅｔ、Ｍ）が含まれる。保存的アミノ酸置換基には、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン（Ｖａｌ／Ｌｅｕ／Ｉｌｅ、Ｖ／Ｌ／Ｉ）、フェニルアラニン／チロシン（Ｐｈｅ／Ｔｙｒ、Ｆ／Ｙ）、リジン／アルギニン（Ｌｙｓ／Ａｒｇ、Ｋ／Ｒ）、アラニン／バリン（Ａｌａ／Ｖａｌ、Ａ／Ｖ）、グルタミン酸／アスパラギン酸（Ｇｌｕ／Ａｓｐ、Ｅ／Ｄ）、及びアスパラギン／グルタミン（Ａｓｎ／Ｇｌｎ、Ｎ／Ｑ）が含まれる。いくつかの実施形態では、保存的アミノ酸置換は、例えば、アラニンスキャニング変異誘発において使用されるように、アラニンを有するタンパク質における任意のネイティブ残基の置換であり得る。いくつかの実施形態では、Ｇｏｎｎｅｔ，Ｇ．Ｈ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５６：１４４３－１４４５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に開示されているＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて正の値を有する保存的置換がなされる。いくつかの実施形態では、置換は適度な保存的置換であり、その場合、置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスにおいて負ではない値を有する。
対照：本明細書で使用される場合、結果が比較される標準である「対照」の当該技術分野で理解される意味を指す。典型的には、対照は、変数についての結論を出すために、そのような変数を分離することによって実験における完全性を増強するために使用される。いくつかの実施形態では、対照は、比較要素を提供するために試験反応またはアッセイと同時に実施される反応またはアッセイである。「対照」にはまた、「対照動物」が含まれる。「対照動物」は、本明細書に記載される改変を有し得、本明細書に記載されるものとは異なる改変を有し得、または改変を有さない場合がある（すなわち、野生型動物）。ある実験では、「試験」パラメータ（例えば、試験される変数）が適用される。もう一つの実験では、試験される変数である「対照」は適用されない。いくつかの実施形態では、対照は、既存対照（すなわち、既に実施された試験もしくはアッセイ、または既に知られている量もしくは結果の）である。いくつかの実施形態において、対照は、印刷されたまたはそうでなければ保存された記録であり、またはそれを含む。対照は、陽性対照または陰性対照であり得る。
破壊：本明細書で使用される場合、ＤＮＡ分子での（例えば、内因性相同配列、例えば、遺伝子または遺伝子座での）相同組換え事象の結果を指す。いくつかの実施形態では、破壊は、挿入、欠失、置換、置き換え、ミスセンス変異、もしくはＤＮＡ配列（複数可）のフレームシフト、またはそれらの任意の組み合わせを達成し、または表し得る。挿入には、遺伝子全体または遺伝子断片、例えば、エクソンの挿入が含まれ得、これは、内因性配列以外の起源のもの（例えば、異種配列）であり得る。いくつかの実施形態では、破壊は、遺伝子または遺伝子産物の（例えば、遺伝子によってコードされるポリペプチドの）発現及び／または活性を増加させ得る。いくつかの実施形態では、破壊は、遺伝子または遺伝子産物の発現及び／または活性を低下させ得る。いくつかの実施形態では、破壊は、遺伝子またはコードされる遺伝子産物（例えば、コードされるポリペプチド）の配列を変化させ得る。いくつかの実施形態では、破壊は、遺伝子またはコードされる遺伝子産物（例えば、コードされるポリペプチド）を切断または断片化し得る。いくつかの実施形態では、破壊は、遺伝子またはコードされる遺伝子産物を伸長させ得る。いくつかのそのような実施形態では、破壊は、融合ポリペプチドの構築を達成し得る。いくつかの実施形態では、破壊は、遺伝子または遺伝子産物の活性ではなくレベルに影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態では、破壊は、遺伝子または遺伝子産物のレベルではなく活性に影響を及ぼし得る。いくつかの実施形態では、破壊は、遺伝子または遺伝子産物のレベルに対する有意な影響を有しない場合がある。いくつかの実施形態では、破壊は、遺伝子または遺伝子産物の活性に対する有意な影響を有しない場合がある。いくつかの実施形態では、破壊は、遺伝子または遺伝子産物のレベルに対しても活性に対しても有意な影響を有しない場合がある。
決定すること、測定すること、評定すること、評価すること、アッセイすること及び分析すること：任意の測定形態を指すために本明細書で互換的に使用され、要素が存在するかしないかを決定することを含む。これらの用語には、定量的及び／または定性的決定の両方が含まれる。アッセイは相対的または絶対的であり得る。「の存在についてのアッセイ」は、存在する何かの量を決定すること及び／または存在するか存在しないかを決定することであり得る。
内因性プロモーター：本明細書で使用される場合、内因性遺伝子と天然に関連する、例えば、野生型生物にあるプロモーターを指す。
修飾された：本明細書で使用される場合、通常、人の手によって操作された態様を指す。例えば、いくつかの実施形態では、ポリヌクレオチドは、天然におけるその順序で互いに連結されていない２つ以上の配列が、修飾されたポリヌクレオチドにおいて互いに直接的に連結されるように人の手によって操作された場合、「修飾された」と考えられ得る。いくつかの実施形態では、修飾されたポリヌクレオチドは、天然では第１のコーディング配列と機能可能に関連して見られるが、第２のコーディング配列と機能可能に関連して見られず、人の手によって第２のコーディング配列と機能可能に関連するように連結された制御配列を含み得る。代替的に、または追加的に、いくつかの実施形態では、天然では互いに連結されていないポリペプチド要素またはドメインをそれぞれコードする第１及び第２の核酸配列は、単一の修飾されたポリヌクレオチドにおいて互いに連結され得る。同様に、いくつかの実施形態では、細胞または生物は、その遺伝情報が変化するように操作された場合（例えば、以前には存在しない新たな遺伝物質が導入された場合、または以前から存在する遺伝物質が変化または除去された場合）、「修飾された」と考えられ得る。一般的な実務であり、当業者によって理解されるように、修飾されたポリヌクレオチドまたは細胞の子孫は、典型的には、実際の操作が先行実体に対して実施された場合であっても、それでもなお「修飾された」と称される。さらに、当業者によって理解されるように、本明細書に記載される「修飾すること」が達成され得る多様な方法論が利用可能である。例えば、いくつかの実施形態では、「修飾すること」は、分析または比較を実施するように、またはそうでなければ配列、変化などを分析、推奨、及び／または選択するようにプログラムされたコンピュータシステムの使用を介する（例えば、核酸配列、ポリペプチド配列、細胞、組織、及び／または生物の）選択または設計を含み得る）。代替的に、または追加的に、いくつかの実施形態では、「修飾すること」は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ化学的合成方法論及び／または組換え核酸技術、例えば、核酸増幅（例えば、ポリメラーゼ連鎖反応を介する）ハイブリダイゼーション、変異、形質転換、トランスフェクションなど、及び／または多様なコントロール交配方法論のいずれかの使用を含み得る。当業者によって理解されるように、多様な確立されたそのような技術（例えば、組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成、ならびに組織培養及び形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクションなど）のためのもの）は、当該技術分野でよく知られており、本明細書を通して引用及び／または論述される様々な一般的及びより具体的な参考文献に記載されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９及びＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，５ｔｈ Ｅｄ．，ｅｄ．Ｂｙ Ｏｌｄ，Ｒ．Ｗ．ａｎｄ Ｓ．Ｂ．Ｐｒｉｍｒｏｓｅ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，１９９４（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照。
機能性：本明細書で使用される場合、特定の特性を示し（例えば、コーディング配列の一部を形成する）及び／または活性を示す実体の形態または断片（例えば、遺伝子または遺伝子セグメント）を指す。例えば、免疫グロブリンの文脈では、可変領域は、機能性コーディング配列を形成するように構築された（または組み換えられた）独自の遺伝子セグメント（すなわち、Ｖ、Ｄ及び／またはＪ）によってコードされる。ゲノムに存在する場合、遺伝子セグメントはクラスターで組織されているが、バリエーションが存在する。「機能性」遺伝子セグメントは、発現される配列（すなわち、可変領域）に現れる遺伝子セグメントであって、対応するゲノムＤＮＡが単離され（すなわち、クローニングされ）、配列によって同定された、遺伝子セグメントである。いくつかの免疫グロブリン遺伝子セグメント配列は、発現されるレパートリーには現れないものの、オープンリーディングフレームを含有し、機能性と考えられるのに対し、他の免疫グロブリン遺伝子セグメント配列は、変異（例えば、点変異、挿入、欠失など）を含有し、その結果、終止コドン及び／または切断された配列をもたらし、これはその後、そのような遺伝子セグメント配列が、非変異配列（複数可）に関連する特性（複数可）及び／または活性（複数可）を発揮することを不可能とする。そのような配列は、発現される配列には現れず、そのため、偽遺伝子として分類される。
遺伝子：本明細書で使用される場合、産物（例えば、ＲＮＡ産物及び／またはポリペプチド産物）をコードする染色体におけるＤＮＡ配列を指す。いくつかの実施形態では、遺伝子は、コーディング配列（すなわち、特定の産物をコードする配列）を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子は、ノンコーディング配列を含む。いくつかの特定の実施形態では、遺伝子は、コーディング（例えば、エクソン）及びノンコーディング（例えば、イントロン）配列の両方を含み得る。いくつかの実施形態では、遺伝子は、例えば、遺伝子発現（例えば、細胞タイプ特異的発現、誘導性発現など）の１つ以上の態様をコントロールし、またはそれに影響を与え得る１つ以上の制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサーなど）及び／またはイントロン配列を含み得る。明確性の目的のため、我々は、本開示において使用される場合、用語「遺伝子」が通常、ポリペプチドまたはその断片をコードする核酸の一部を指すことを認識している；その用語は、任意に、当業者に文脈から明らかになるように、制御配列を包含し得る。この定義は、用語「遺伝子」の適用を非タンパク質コード発現単位へと除外することは意図されておらず、むしろ、ほとんどの場合において、本書類において使用されるその用語がポリペプチドをコードする核酸を指すことを明確化することが意図されている。
遺伝子改変された非ヒト動物または遺伝子修飾された非ヒト動物：本明細書において互換的に使用され、任意の天然に存在しない非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）であって、非ヒト動物の細胞の１つ以上が、対象となるポリペプチドをコードする異種核酸及び／または遺伝子を全体としてまたは部分的に含有するものを指す。例えば、いくつかの実施形態では、「遺伝子改変された非ヒト動物」または「遺伝子修飾された非ヒト動物」は、本明細書に記載される導入遺伝子または導入遺伝子コンストラクトを含有する非ヒト動物を指す。いくつかの実施形態では、異種核酸及び／または遺伝子は、前駆体細胞への導入によって直接的にまたは間接的に、熟考した遺伝子操作を用いて、例えば、マイクロインジェクションによってまたは組換えウイルスでの感染によって細胞に導入される。遺伝子操作という用語は、古典的な交配技術は含まれず、むしろ組換えＤＮＡ分子（複数可）の導入を対象とする。この分子は、染色体内に組み込まれ得る。語句「遺伝子改変された非ヒト動物」または「遺伝子修飾された非ヒト動物」は、異種核酸及び／または遺伝子についてヘテロ接合性またはホモ接合性である動物、及び／または異種核酸及び／または遺伝子の単一または複数のコピーを有する動物を指す。
生殖細胞系列構成：本明細書で使用される場合、野生型動物（例えば、マウス、ラット、またはヒト）の内因性生殖細胞系列ゲノムに見られる配列（例えば、遺伝子セグメント）の配置を指す。免疫グロブリン遺伝子セグメントの生殖細胞系列構成の例は、例えば、ＬｅＦｒａｎｃ，Ｍ－Ｐ．，Ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ＦａｃｔｓＢｏｏｋ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｍａｙ，２３，２００１（本明細書で「ＬｅＦｒａｎｃ ２００１」と称される）で見ることができる：
ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメント及びヒト重鎖定常領域遺伝子の例示的な構成は、ＬｅＦｒａｎｃ ２００１のｐ．４７で見ることができる；
ヒトλ軽鎖可変領域遺伝子セグメント及びヒトλ軽鎖定常領域遺伝子の例示的な構成は、ＬｅＦｒａｎｃ ２００１のｐ．６１で見ることができる；
ヒトκ軽鎖可変領域遺伝子セグメント及びヒトκ軽鎖定常領域遺伝子の例示的な構成は、ＬｅＦｒａｎｃ ２００１のｐ．５３で見ることができる；
マウス重鎖可変領域遺伝子セグメント及びマウス重鎖定常領域遺伝子の例示的な構成は、Ｌｕｃａｓ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ １：Ｔｈｅ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｌｏｃｉ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂ Ｃｅｌｌｓ，２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２０１５（Ｌｕｃａｓ）で見ることができる；
マウスλ軽鎖可変領域遺伝子セグメント及びマウスλ軽鎖定常領域遺伝子の例示的な構成は、ＬｅＦｒａｎｃ，Ｍ－Ｐ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈａｐｔｅｒ ４：Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｌａｍｂｄａ（ＩＧＬ）Ｇｅｎｅｓ ｏｆ Ｈｕｍａｎ ａｎｄ Ｍｏｕｓｅ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ Ｂ Ｃｅｌｌｓ，１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，２００４（ＬｅＦｒａｎｃ ２００４）で見ることができる；
マウスκ軽鎖可変領域遺伝子セグメント及びマウスκ軽鎖定常領域遺伝子の例示的な構成は、Ｃｈｒｉｓｔｅｌｅ，Ｍ－Ｊ，ｅｔ ａｌ．，Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ ａｎｄ Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｏｕｓｅ（Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ａｎｄ Ｍｕｓ ｓｐ．）Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｋａｐｐａ（ＩＧＫ）Ｇｅｎｅｓ，Ｅｘｐ Ｃｌｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔ ２００１，１８：２５５－２７９（Ｃｈｒｉｓｔｅｌｅ）で見ることができる；
ＬｅＦｒａｎｃ ２００１、Ｌｕｃａｓ、ＬｅＦｒａｎｃ ２００４、及びＣｈｒｉｓｔｅｌｅの引用されたセクションの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
生殖細胞系列ゲノム：本明細書で使用される場合、動物の形成において使用される胚細胞（例えば、配偶子、例えば、精子または卵子）に見られるゲノムを指す。生殖細胞系列ゲノムは、動物における細胞のためのゲノムＤＮＡの源である。このように、その生殖細胞系列ゲノムにおいて改変を有する動物（例えば、マウスまたはラット）は、その細胞のすべてのゲノムＤＮＡにおいて改変を有するものと考えられる。
生殖細胞系列配列：本明細書で使用される場合、野生型動物（例えば、マウス、ラット、またはヒト）の内因性生殖細胞系列ゲノムに見られるＤＮＡ配列、または動物（例えば、マウス、ラット、またはヒト）の内因性生殖細胞系列ゲノムに見られるＤＮＡ配列によってコードされるＲＮＡもしくはアミノ酸配列を指す。免疫グロブリン遺伝子セグメントの代表的な生殖細胞系列配列は、例えば、ＬｅＦｒａｎｃ ２００１で見ることができる：
本明細書に記載されるいくつかの実施形態において利用され得るヒトＶＨ遺伝子セグメントの代表的な生殖細胞系列ヌクレオチド配列及びヒトＶＨ遺伝子セグメントの代表的な生殖細胞系列アミノ酸配列は、ＬｅＦｒａｎｃ ２００１の１０７～２３４頁で見ることができる；
本明細書に記載されるいくつかの実施形態において利用され得るヒトＤ遺伝子セグメントの代表的な生殖細胞系列ヌクレオチド配列及びヒトＤ遺伝子セグメントの代表的な生殖細胞系列アミノ酸配列は、ＬｅＦｒａｎｃ ２００１の９８～１００頁で見ることができる；
本明細書に記載されるいくつかの実施形態において利用され得るヒトＪＨ遺伝子セグメントの代表的な生殖細胞系列ヌクレオチド配列及びヒトＪＨ遺伝子セグメントの代表的な生殖細胞系列アミノ酸配列は、ＬｅＦｒａｎｃ ２００１の１０４頁で見ることができる；
本明細書に記載される非ヒト動物のいくつかの実施形態において利用され得るヒトＶλ遺伝子セグメントの代表的な生殖細胞系列ヌクレオチド配列及びヒトＶλ遺伝子セグメントの代表的な生殖細胞系列アミノ酸配列は、ＬｅＦｒａｎｃ ２００１の３５０～４２８頁で見ることができる；及び
本明細書に記載される非ヒト動物のいくつかの実施形態において利用され得るヒトＪλ遺伝子セグメントの代表的な生殖細胞系列ヌクレオチド配列及びヒトＪλ遺伝子セグメントの代表的な生殖細胞系列アミノ酸配列は、ＬｅＦｒａｎｃ ２００１の３４６頁で見ることができる。
ＬｅＦｒａｎｃ ２００１の引用されたセクションの各々は、参照により本明細書に組み込まれる。
異種：本明細書で使用される場合、異なる源からの物質または実体を指す。例えば、特定の細胞または生物に存在するポリペプチド、遺伝子、または遺伝子産物に関して使用される場合、その用語は、関連するポリペプチド、遺伝子、または遺伝子産物が、１）人の手によって修飾されたこと；２）人の手を介して（例えば、遺伝子修飾を介して）細胞または生物（またはその前駆体）に導入されたこと；及び／または３）天然では関連する細胞または生物（例えば、関連する細胞タイプまたは生物タイプ）によって生成されず、その中に存在もしないことを明確化する。「異種」にはまた、通常は特定のネイティブ細胞または生物に存在するが、例えば、天然に関連しない、いくつかの実施形態では、非内因性の制御要素（例えば、プロモーター）のコントロール下で変異または配置によって変化または改変されたポリペプチド、遺伝子または遺伝子産物が含まれる。
宿主細胞：本明細書で使用される場合、核酸またはタンパク質が導入された細胞を指す。本開示を読む当業者は、そのような用語が、特定の対象細胞を指すだけでなく、そのような細胞の子孫を指すために使用されることを理解する。変異または環境的影響のいずれかに起因して、後続の世代において所定の修飾が生じ得るため、そのような子孫は、実際には、親細胞と同一でない場合があるが、語句「宿主細胞」の範囲内に依然として含まれる。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、原核生物または真核細胞であり、またはそれを含む。通常、宿主細胞は、細胞が指定される生物界にかかわらず、異種核酸またはタンパク質を受け取る及び／または生成するのに好適な任意の細胞である。例示的な細胞には、原核生物及び真核生物のもの（単細胞または多細胞）、細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．などの系統）、マイコバクテリウム細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ－９、ＳＦ－２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または例えば、ハイブリドーマもしくはクアドローマなどの細胞融合物が含まれる。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウス細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は真核であり、以下の細胞から選択される：チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ－１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ－７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ－６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ－１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、ＭＭＴ ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、及び前述した細胞に由来する細胞株。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のウイルス遺伝子を含む、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、単離された細胞であり、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、組織の一部である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、生物の一部である。
同一性：配列の比較と組み合わせて本明細書で使用される場合、ヌクレオチド及び／またはアミノ酸配列同一性を測定するために使用され得る当該技術分野で知られている多数の異なるアルゴリズムによって決定される同一性を指す。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される同一性は、ＣｌｕｓｔａｌＷ ｖ．１．８３（ｓｌｏｗ）アライメントを使用して１０．０のオープンギャップペナルティ、０．１のエクステンドギャップペナルティを用いて、及びＧｏｎｎｅｔ類似性マトリックス（ＭＡＣＶＥＣＴＯＲ（商標）１０．０．２，ＭａｃＶｅｃｔｏｒ Ｉｎｃ．，２００８）を使用して決定される。
の代わりに：本明細書で使用される場合、第１の核酸配列が、染色体における第２の核酸配列の位置（例えば、第２の核酸配列が染色体において、例えば、第２の核酸配列の内因性遺伝子座で以前に（例えば、元々）位置していた場所）に位置する位置的置換を指す。語句「の代わりに」は、第２の核酸配列が、例えば、遺伝子座または染色体から除去されることを必要としない。いくつかの実施形態では、第２の核酸配列及び第１の核酸配列は、例えば、第１及び第２の配列が互いに相同であり、対応する要素（例えば、タンパク質コード要素、制御要素など）を含有し、及び／または類似または同一の配列を有するという点で互いに同等である。いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の核酸配列は、プロモーター、エンハンサー、スプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位、イントロン、エクソン、非翻訳領域（ＵＴＲ）のうちの１つ以上を含み；いくつかの実施形態では、第１及び／または第２の核酸配列は、１つ以上のコーディング配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、第２の核酸配列のホモログまたはバリアント（例えば、変異体）である。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、第２の配列のオルソログまたはホモログである。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、ヒト核酸配列であり、またはそれを含む。第１の核酸配列がヒト核酸配列であり、またはそれを含む場合を含むいくつかの実施形態では、第２の核酸配列は、げっ歯類配列（例えば、マウスまたはラット配列）であり、またはそれを含む。第１の核酸配列がヒト核酸配列であり、またはそれを含む場合を含むいくつかの実施形態では、第２の核酸配列は、ヒト配列であり、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、第１の核酸配列は、第２の配列のバリアントまたは変異体（すなわち、第２の配列と比較して、１つ以上の配列の相違、例えば、置換を含有する配列）である。このように配置された核酸配列は、このように配置された配列を得るために使用される核酸配列源の一部である１つ以上の制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、５’または３’非翻訳領域など）を含み得る。例えば、様々な実施形態では、第１の核酸配列は、このように配置された核酸配列（異種配列を含む）からの遺伝子産物の生成をもたらすが、内因性配列の発現をもたらさない異種配列での内因性配列の置換であり；第１の核酸配列は、内因性配列によってコードされるポリペプチドと類似する機能を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有する内因性ゲノム配列のものである（例えば、内因性ゲノム配列は、非ヒト可変領域ポリペプチドを全体としてまたは部分的にコードし、ＤＮＡ断片は、１つ以上のヒト可変領域ポリペプチドを全体としてまたは部分的にコードする）。様々な実施形態では、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントまたはその断片は、内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントまたは断片の代わりである。
ｉｎ ｖｉｔｒｏ：本明細書で使用される場合、多細胞生物内ではなく、人工環境、例えば、試験管または反応容器内、細胞培養などで生じる事象を指す。
ｉｎ ｖｉｖｏ：本明細書で使用される場合、ヒト及び／または非ヒト動物などの多細胞生物内で生じる事象を指す。細胞ベースのシステムの文脈では、その用語は、（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏシステムとは対照的に）生存細胞内で生じる事象を指すために使用され得る。
単離された：本明細書で使用される場合、（１）最初に生成された時にそれが関連していた成分の少なくとも一部から分離された（天然において及び／または実験環境においてのいずれか）、及び／または（２）人の手によって設計、生成、調製、及び／または製造された物質または実体を指す。単離された物質及び／または実体は、それらが最初に関連していた他の成分の約１０％、約２０％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超から分離され得る。いくつかの実施形態では、単離された物質は、それらが最初に関連していた他の成分の１０％～１００％、１５％～１００％、２０％～１００％、２５％～１００％、３０％～１００％、３５％～１００％、４０％～１００％、４５％～１００％、５０％～１００％、５５％～１００％、６０％～１００％、６５％～１００％、７０％～１００％、７５％～１００％、８０％～１００％、８５％～１００％、９０％～１００％、９５％～１００％、９６％～１００％、９７％～１００％、９８％～１００％、または９９％～１００％から分離される。いくつかの実施形態では、単離された物質は、それらが最初に関連していた他の成分の１０％～１００％、１０％～９９％、１０％～９８％、１０％～９７％、１０％～９６％、１０％～９５％、１０％～９０％、１０％～８５％、１０％～８０％、１０％～７５％、１０％～７０％、１０％～６５％、１０％～６０％、１０％～５５％、１０％～５０％、１０％～４５％、１０％～４０％、１０％～３５％、１０％～３０％、１０％～２５％、１０％～２０％、または１０％～１５％から分離される。いくつかの実施形態では、単離された物質は、それらが最初に関連していた他の成分の１１％～９９％、１２％～９８％、１３％～９７％、１４％～９６％、１５％～９５％、２０％～９０％、２５％～８５％、３０％～８０％、３５％～７５％、４０％～７０％、４５％～６５％、５０％～６０％、または５５％～６０％から分離される。いくつかの実施形態では、単離された物質は、約８０％、約８５％、約９０％、約９１％、約９２％、約９３％、約９４％、約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、または約９９％超純粋である。いくつかの実施形態では、単離された物質は、８０％～９９％、８５％～９９％、９０％～９９％、９５％～９９％、９６％～９９％、９７％～９９％、または９８％～９９％純粋である。いくつかの実施形態では、単離された物質は、８０％～９９％、８０％～９８％、８０％～９７％、８０％～９６％、８０％～９５％、８０％～９０％、または８０％～８５％純粋である。いくつかの実施形態では、単離された物質は、８５％～９８％、９０％～９７％、または９５％～９６％純粋である。いくつかの実施形態では、物質は、それが他の成分を実質的に含まない場合、「純粋」である。いくつかの実施形態では、当業者によって理解されるように、物質は、例えば、１つ以上の担体または賦形剤（例えば、緩衝液、溶媒、水など）などの所定の他の成分と組み合わせた後に、依然として「単離された」またはさらに「純粋」と考えられる場合があり；そのような実施形態では、物質の単離率または純度は、そのような担体または賦形剤を含まずに計算される。例を１つだけ挙げると、いくつかの実施形態では、天然に存在するポリペプチドまたはポリヌクレオチドなどの生物学的ポリマーは、ａ）その誘導起源または源の要因によって、天然におけるその天然状態でそれに付随する成分の一部またはすべてと関連しない場合；ｂ）天然においてそれを生成する種と同一の種の他のポリペプチドまたは核酸を実質的に含まない場合；またはｃ）天然においてそれを生成する種のものではない細胞もしくは他の発現系によって発現され、またはそうでなければその細胞もしくは他の発現系からの成分と関連する場合、「単離された」と考えられる。よって、例えば、いくつかの実施形態では、化学的に合成される、または天然で生成するものとは異なる細胞システムで合成されるポリペプチドは、「単離された」ポリペプチドと考えられる。代替的に、または追加的に、いくつかの実施形態では、１つ以上の精製技術に供されたポリペプチドは、ａ）天然で会合している；及び／またはｂ）最初に生成された時に関連していた他の成分から分離された程度まで「単離された」ポリペプチドと考えられ得る。
遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）または遺伝子座（ｌｏｃｉ）：本明細書で使用される場合、遺伝子、ＤＮＡ配列、ポリペプチドをコードする配列の位置（複数可）、または生物のゲノムの染色体上の場所を指す。例えば、「免疫グロブリン遺伝子座」は、免疫グロブリン遺伝子セグメント（例えば、Ｖ、Ｄ、ＪまたはＣ）、免疫グロブリン遺伝子セグメントＤＮＡ配列、免疫グロブリン遺伝子セグメントをコードする配列の位置、またはそのような配列が存在する場所に関して同定された生物のゲノムの染色体上の免疫グロブリン遺伝子セグメントの場所を指し得る。免疫グロブリン遺伝子セグメントの「免疫グロブリン遺伝子座」は、エンハンサー、プロモーター、５’及び／または３’制御配列もしくは領域、またはそれらの組み合わせを含むがこれらに限定されない制御要素を含み得る。「免疫グロブリン遺伝子座」は、遺伝子間ＤＮＡ、例えば、野生型遺伝子座における遺伝子セグメント間に通常存在するまたは現れるＤＮＡを含み得る。当業者は、染色体が、いくつかの実施形態では、何百ものまたはさらに何千もの遺伝子を含有し、異なる種間で比較した場合、類似する遺伝子座の物理的共局在化を実証し得ることを理解する。そのような遺伝子座は、共有されたシンテニーを有するものとして記述され得る。
天然に現れる：生物学的要素（例えば、核酸配列）に関して本明細書で使用される場合、生物学的要素が、細胞または生物（例えば、動物）において、修飾（例えば、遺伝子修飾）の非存在下で特定の状況及び／または場所で見ることができることを意味する。すなわち、特定の状況及び／または位置で天然に現れる配列は、修飾（例えば、遺伝子修飾）の結果として特定の状況及び／または場所に存在しない。例えば、内因性ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖遺伝子座においてヒトＪκ１遺伝子セグメントに隣接して天然に現れる配列は、ヒトにおいて、遺伝子修飾の非存在下で、内因性ヒト免疫グロブリンカッパ軽鎖遺伝子座においてヒトＪκ１遺伝子セグメントに隣接して見ることができる配列である。いくつかの実施形態では、配列は、細胞または生物において天然に現れる場所から得られ、誘導され、及び／または単離され得る。いくつかの実施形態では、細胞または生物は、細胞または生物において天然に現れる配列の直接的源ではない。例えば、細胞または生物における対応する配列は、当該技術分野で知られているメカニズムによって同定され、次いで生成または複製され得る。
非ヒト動物：本明細書で使用される場合、ヒトではない任意の脊椎動物生物を指す。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、円口類、硬骨魚類、軟骨魚類（例えば、サメまたはエイ）、両生類、爬虫類、哺乳動物、及び鳥類である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、非ヒト哺乳動物は、霊長類、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウシ、またはげっ歯類である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウスである。
核酸：本明細書で使用される場合、オリゴヌクレオチド鎖であるか、またはそれに組み込まれ得る任意の化合物及び／または物質を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ホスホジエステル結合を介してオリゴヌクレオチド鎖に組み込まれるか、または組み込まれ得る化合物及び／または物質である。文脈から明らかであるように、いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基（例えば、ヌクレオチド及び／またはヌクレオシド）を指し；いくつかの実施形態では、「核酸」は、個々の核酸残基を含むオリゴヌクレオチド鎖を指す。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＲＮＡであり、またはそれを含み；いくつかの実施形態では、「核酸」は、ＤＮＡであり、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、「核酸」は、１つ以上の天然核酸残基であり、それを含み、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、「核酸」は、１つ以上の核酸アナログであり、それを含み、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、核酸アナログは、ホスホジエステル骨格を利用しない点で「核酸」とは異なる。例えば、いくつかの実施形態では、「核酸」は、当該技術分野で知られており、かつ骨格においてホスホジエステル結合の代わりにペプチド結合を含む１つ以上の「ペプチド核酸」であり、それを含み、またはそれからなる。代替的に、または追加的に、いくつかの実施形態では、「核酸」は、ホスホジエステル結合ではなく、１つ以上のホスホロチオエート及び／または５’－Ｎ－ホスホロアミダイト結合を有する。いくつかの実施形態では、「核酸」は、１つ以上の天然ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン、グアノシン、シチジン、ウリジン、デオキシアデノシン、デオキシチミジン、デオキシグアノシン、及びデオキシシチジン）であり、それを含み、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、「核酸」は、１つ以上のヌクレオシドアナログ（例えば、２－アミノアデノシン、２－チオチミジン、イノシン、ピロロ－ピリミジン、３－メチルアデノシン、５－メチルシチジン、Ｃ－５プロピニル－シチジン、Ｃ－５プロピニル－ウリジン、２－アミノアデノシン、Ｃ５－ブロモウリジン、Ｃ５－フルオロウリジン、Ｃ５－ヨードウリジン、Ｃ５－プロピニル－ウリジン、Ｃ５－プロピニル－シチジン、Ｃ５－メチルシチジン、２－アミノアデノシン、７－デアザアデノシン、７－デアザアデノシン、８－オキソアデノシン、８－オキソグアノシン、Ｏ（６）－メチルグアニン、２－チオシチジン、メチル化塩基、介在塩基、及びそれらの組み合わせ）であり、それを含み、またはそれからなる。いくつかの実施形態では、「核酸」は、天然核酸におけるものと比較して１つ以上の改変糖類（例えば、２’－フルオロリボース、リボース、２’－デオキシリボース、アラビノース、及びヘキソース）を含む。いくつかの実施形態では、「核酸」は、機能性遺伝子産物、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、「核酸」は、１つ以上のイントロンを含む。いくつかの実施形態では、「核酸」は、１つ以上のエクソンを含む。いくつかの実施形態では、「核酸」は、天然源からの単離、相補性テンプレートに基づく重合による酵素合成（ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ）、組換え細胞またはシステムにおける複製、及び化学的合成のうちの１つ以上によって調製される。いくつかの実施形態では、「核酸」は、少なくとも、例えば、限定されないが、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、１５０、１６０、１７０、１８０、１９０、２０、２２５、２５０、２７５、３００、３２５、３５０、３７５、４００、４２５、４５０、４７５、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００またはそれ以上の残基長である。いくつかの実施形態では、「核酸」は一本鎖であり；いくつかの実施形態では、「核酸」は二本鎖である。いくつかの実施形態では、「核酸」は、ポリペプチドをコードする、またはポリペプチドをコードする配列の相補体である少なくとも１つの要素を含むヌクレオチド配列を有する。いくつかの実施形態では、「核酸」は、酵素活性を有する。
機能可能に連結された：本明細書で使用される場合、記載される成分がそれらの意図された様式で機能する（例えば、成分が適正な組織、細胞タイプ、細胞活性などにある場合）ことを可能にする関係にある成分の並置を指す。例えば、１つ以上のＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のＤ遺伝子セグメント、及び１つ以上のＪＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントが、例えば、免疫系外の細胞（例えば、胚細胞）においてスプライシングが生じるかどうかにかかわらず、Ｂ細胞発達における適正な時間に重鎖定常領域にスプライシングされ得る場合、重鎖定常領域に「機能可能に連結されている」。コーディング配列に「機能可能に連結された」コントロール配列は、コーディング配列の発現がコントロール配列と適合性のある条件下で達成されるような方法でライゲーションされている。「機能可能に連結された」配列には、対象となる遺伝子と連続的である発現コントロール配列及びトランスでまたは離れて作用して対象となる遺伝子（または対象となる配列）をコントロールする発現コントロール配列の両方が含まれる。用語「発現コントロール配列」は、ライゲーションされるコーディング配列の発現及びプロセシングに影響を及ぼすのに必要なポリヌクレオチド配列を含む。「発現コントロール配列」には、適切な転写開始、終結、プロモーター及びエンハンサー配列；効率的なＲＮＡプロセシングシグナル、例えば、スプライシング及びポリアデニル化シグナル；細胞質性ｍＲＮＡを安定化する配列；翻訳効率を向上させる配列（すなわち、Ｋｏｚａｋコンセンサス配列）；ポリペプチド安定性を向上させる配列；及び所望の場合は、ポリペプチド分泌を向上させる配列が含まれる。そのようなコントロール配列の特質は、宿主生物によって異なる。例えば、原核生物では、そのようなこのトロール配列には通常、プロモーター、リボソーム結合部位及び転写終結配列が含まれるに対し、真核生物では、典型的には、そのようなコントロール配列には、プロモーター及び転写終結配列が含まれる。用語「コントロール配列」は、存在が発現及びプロセシングに必須である成分を含むことが意図されており、また、存在が有利である追加の成分、例えば、リーダー配列及び融合パートナー配列を含み得る。
ポリペプチド：本明細書で使用される場合、アミノ酸の任意のポリマー鎖を指す。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然に存在するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然に存在しないアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、互いに別々に天然に存在する部分（すなわち、２つ以上の異なる生物からのもの、例えば、ヒト及び非ヒト部分）を含有するアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、人の手の作用を介して設計及び／または生成されたという点で修飾されたアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドは、天然に存在しない配列によってコードされるアミノ酸配列（例えば、前記ポリペプチドをコードするように人の手の作用を介して設計及び／または生成されたという点で修飾された配列）を有する。
再編成された：本明細書で使用される場合、一緒に（直接的にまたは間接的に）接合された２つ以上の免疫グロブリン遺伝子セグメントを含むことにより、接合された遺伝子セグメントが、免疫グロブリンの可変領域をコードするＤＮＡ配列を一緒に有するＤＮＡ配列を表す。再編成されたＤＮＡ配列の２つ以上の免疫グロブリン遺伝子セグメントは、組換えシグナル配列（ＲＳＳ）の機能にはもはや関連せず、このように、さらなる再編成を受けることができない。再編成されたＤＮＡ配列の２つ以上の免疫グロブリン遺伝子セグメントが、さらに再編成することができない場合があるが、これは、同じ遺伝子座内の他の免疫グロブリン遺伝子セグメントが、例えば、二次再編成を受けることができないことを意味するものではないことを当業者は認識する。当業者は、再編成された遺伝子セグメント（例えば、再編成された免疫グロブリン可変領域におけるもの）が、天然ＶＤＪ組換えプロセスを介して一緒に接合され得ることを理解する。当業者はまた、再編成された遺伝子セグメント（例えば、再編成された免疫グロブリン可変領域におけるもの）が、例えば、標準的な組換え技術を使用して遺伝子セグメントを接合することによって、一緒に接合されるように修飾され得ることを理解する。再編成された免疫グロブリン可変領域は、典型的には、２つ以上の接合された免疫グロブリン遺伝子セグメントを含む。例えば、再編成された免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、Ｊλ遺伝子セグメントと接合されたＶλ遺伝子セグメントを含み得る。再編成された免疫グロブリン重鎖可変領域は、接合されたＶＨ遺伝子セグメント、Ｄ遺伝子セグメント、ＪＨ遺伝子セグメントを含み得る。当業者はまた、すべてのまたは実質的にすべての遺伝子間配列が、通常、再編成された免疫グロブリン可変領域免疫グロブリン可変領域において免疫グロブリン遺伝子セグメント間で除去されることを理解する。当業者は、再編成された配列が、遺伝子セグメントにおいて、とりわけ、イントロンを含み得ることをさらに理解する。
組換え：本明細書で使用される場合、複数源（例えば、生物、組織、細胞、ゲノム、またはゲノムの一部）からの遺伝物質を一緒にするために遺伝子組換えの実験室的方法（例えば、クローニング）によって形成される分子（例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはポリペプチド）を指す。いくつかの実施形態では、組換え手段によって設計、修飾、調製、発現、作製または単離される組換えポリペプチドは、例えば、宿主細胞にトランスフェクションされた組換え発現ベクターを使用して発現したポリペプチド、組換えコンビナトリアルヒトポリペプチドライブラリから単離されたポリペプチド（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ，Ｈ．Ｒ．，１９９７，ＴＩＢ Ｔｅｃｈ．１５：６２－７０；Ａｚｚａｚｙ，Ｈ．ａｎｄ Ｗ．Ｅ．Ｈｉｇｈｓｍｉｔｈ，２００２，Ｃｌｉｎ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．３５：４２５－４５；Ｇａｖｉｌｏｎｄｏ，Ｊ．Ｖ．ａｎｄ Ｊ．Ｗ．Ｌａｒｒｉｃｋ，２００２，ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９：１２８－４５；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ Ｈ．，ａｎｄ Ｐ．Ｃｈａｍｅｓ，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：３７１－８（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる））、ヒト免疫グロブリン遺伝子を含むように遺伝子修飾された動物（例えば、マウス）から単離された抗体（例えば、Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－９５；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ，Ｓ－Ａ．ａｎｄ Ｌ．Ｌ．Ｇｒｅｅｎ，２００２，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：５９３－７；Ｌｉｔｔｌｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：３６４－７０；Ｏｓｂｏｒｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９０：１４８１－９０；Ｌｅｅ，Ｅ－Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２（４）：３５６－６３；Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ｌ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１（１４）：５１４７－５２；Ｍｕｒｐｈｙ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１（１４）：５１５３－８（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））または選択された配列要素を互いにスプライシングすることを含む任意の他の手段によって調製、発現、作製または単離されたポリペプチドである。いくつかの実施形態では、そのような選択された配列要素のうちの１つ以上は、天然に見られる。いくつかの実施形態では、そのような選択された配列要素のうちの１つ以上は、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計される。いくつかの実施形態では、そのような選択された配列要素のうちの１つ以上は、例えば、天然または合成（例えば、人工）源からの既知の配列要素の変異誘発（例えば、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏ）に起因する。例えば、いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、対象となる生物源（例えば、ヒト、マウスなど）のゲノムに見られる配列を含む。いくつかの実施形態では、組換えポリペプチドは、変異誘発（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏ、例えば、非ヒト動物における）に起因するアミノ酸配列を有し、これにより組換えポリペプチドのアミノ酸配列は、ポリペプチド配列を起源とし、それに関連するが、ｉｎ ｖｉｖｏで非ヒト動物のゲノム内に天然に存在しない場合がある配列となる。
参照：本明細書で使用される場合、対象となる物質、動物、コホート、個体、集団、サンプル、配列または値が比較される標準または対照物質、動物、コホート、個体、集団、サンプル、配列または値を指す。いくつかの実施形態では、参照物質、動物、コホート、個体、集団、サンプル、配列または値は、対象となる物質、動物、コホート、個体、集団、サンプル、配列または値の試験または決定と実質的に同時に試験及び／または決定される。いくつかの実施形態では、参照物質、動物、コホート、個体、集団、サンプル、配列または値は、任意に有形媒体で具現化された過去の参照である。いくつかの実施形態では、参照は、対照を指し得る。「参照」にはまた、「参照動物」が含まれる。「参照動物」は、本明細書に記載される改変、本明細書に記載されるものとは異なる改変を有する場合があり、または改変を有さない場合がある（すなわち、野生型動物）。典型的には、当業者によって理解されるであろうが、参照物質、動物、コホート、個体、集団、サンプル、配列または値は、対象となる物質、動物（例えば、哺乳動物）、コホート、個体、集団、サンプル、配列または値を決定または特性化するために利用されたものと同等の条件下で決定または特性化される。
置き換え：本明細書で使用される場合、宿主遺伝子座において（例えば、ゲノムにおいて）見られる「置き換えられる」核酸配列（例えば、遺伝子）がその遺伝子座から除去され、異なる「置き換え」核酸がその場所に配置されるプロセスを指す。いくつかの実施形態では、置き換えられる核酸配列及び置き換え核酸配列は、それらが互いに相同であり、対応する要素（例えば、タンパク質コード要素、制御要素など）を含有し、及び／または類似または同一の配列を有するという点で互いに同等である。いくつかの実施形態では、置き換えられる核酸配列は、プロモーター、エンハンサー、スプライスドナー部位、スプライスアクセプター部位、イントロン、エクソン、非翻訳領域（ＵＴＲ）のうちの１つ以上を含み；いくつかの実施形態では、置き換え核酸配列は、１つ以上のコーディング配列を含む。いくつかの実施形態では、置き換え核酸配列は、置き換えられる核酸配列のホモログまたはバリアント（例えば、変異体）である。いくつかの実施形態では、置き換え核酸配列は、置き換えられる配列のオルソログまたはホモログである。いくつかの実施形態では、置き換え核酸配列は、ヒト核酸配列であり、またはそれを含む。置き換え核酸配列がヒト核酸配列であり、またはそれを含むいくつかの実施形態では、置き換えられる核酸配列は、げっ歯類配列（例えば、マウスまたはラット配列）であり、またはそれを含む。置き換え核酸配列がヒト核酸配列であり、またはそれを含むいくつかの実施形態では、置き換えられる核酸配列は、ヒト配列であり、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、置き換え核酸配列は、置き換えられる配列のバリアントまたは変異体（すなわち、置き換えられる配列と比較して、１つ以上の配列相違、例えば、置換を含有する配列）である。このように配置された核酸配列は、このように配置された配列を得るために使用される核酸配列源の一部である１つ以上の制御配列（例えば、プロモーター、エンハンサー、５’または３’非翻訳領域など）を含み得る。例えば、様々な実施形態では、置き換えは、このように配置された核酸配列（異種配列を含む）からの遺伝子産物の生成をもたらすが、内因性配列の発現をもたらさない異種配列での内因性配列の置換であり；置き換えは、内因性配列によってコードされるポリペプチドと類似する機能を有するポリペプチドをコードする核酸配列を有する内因性ゲノム配列のものである（例えば、内因性ゲノム配列は、非ヒト可変領域ポリペプチドを全体としてまたは部分的にコードし、ＤＮＡ断片は、１つ以上のヒト可変領域ポリペプチドを全体としてまたは部分的にコードする）。様々な実施形態では、内因性非ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントまたはその断片は、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントまたはその断片で置き換えられる。
実質的に：本明細書で使用される場合、対象となる特徴または特性の全体またはほぼ全体の範囲または程度を示す量的な状態を指す。生物学分野における当業者は、生物学及び化学の現象が、皆無ではないにせよ、完結すること及び／または完全に進行することまたは絶対的な結果を達成することもしくは回避することがほとんどないことを理解する。用語「実質的に」は、そのため、多くの生物学的及び化学的現象において固有の完全性の潜在的欠如を捕捉するために本明細書で使用される。
実質的類似性：本明細書で使用される場合、アミノ酸または核酸配列の間の比較を指す。当業者によって理解されるように、２つの配列は、通常、それらが、対応する位置で類似する残基（例えば、アミノ酸またはヌクレオチド）を含有する場合、「実質的に類似する」と考えられる。当該技術分野において理解されるように、類似する残基は、同一の残基であり得（以下の実質的同一性参照）、類似する残基はまた、おおよそ同等の構造及び／または機能的特徴を有する非同一残基であり得る。例えば、当業者によってよく知られているように、所定のアミノ酸は、典型的には、「疎水性」または「親水性」アミノ酸として、及び／または「極性」または「非極性」側鎖を有するものとして分類される。あるアミノ酸で同じタイプの別のものを置換することはしばしば、「保存的」置換と考えられ得る。典型的なアミノ酸分類が以下の表にまとめられている。


Figure 2022535418000021
Figure 2022535418000022
当該技術分野でよく知られているように、アミノ酸または核酸配列は、市販のコンピュータプログラムで利用可能なもの、例えば、ヌクレオチド配列の場合はＢＬＡＳＴＮならびにアミノ酸配列の場合はＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ－ＢＬＡＳＴを含む多様なアルゴリズムのいずれかを使用して比較され得る。例示的なそのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３－１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０－８０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－４０２；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，Ａ．Ｄ．ａｎｄ Ｂ．Ｆ．Ｆ．Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ（ｅｄｓ．）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；及びＭｉｓｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９８（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。類似する配列を同定することに加えて、上記のプログラムは、典型的には、類似性の程度の指標を提供する。いくつかの実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基の少なくとも、例えば、限定されないが、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が残基の関連伸長部にわたって類似する（例えば、同一である、または保存的置換を含む）場合、実質的に類似すると考えられる。いくつかの実施形態では、関連伸長部は、完全配列（例えば、遺伝子の配列、遺伝子セグメント、ドメインをコードする配列、ポリペプチド、またはドメイン）である。いくつかの実施形態では、関連伸長部は、少なくとも９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７またはそれ以上の残基である。いくつかの実施形態では、関連伸長部は、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上の残基である。いくつかの実施形態では、関連伸長部は、完全配列に沿って連続残基を含む。いくつかの実施形態では、関連伸長部は、完全配列に沿って非連続残基、例えば、ポリペプチドまたはその一部の折りたたまれたコンフォメーションによって一緒にされた非連続残基を含む。
実質的同一性：本明細書で使用される場合、アミノ酸または核酸配列の間の比較を指す。当業者によって理解されるように、２つの配列は、通常、それらが、対応する位置で同一の残基（例えば、アミノ酸またはヌクレオチド）を含有する場合、「実質的に同一」と考えられる。当該技術分野でよく知られているように、アミノ酸または核酸配列は、市販のコンピュータプログラムで利用可能なもの、例えば、ヌクレオチド配列の場合はＢＬＡＳＴＮならびにアミノ酸配列の場合はＢＬＡＳＴＰ、ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ、及びＰＳＩ－ＢＬＡＳＴを含む多様なアルゴリズムのいずれかを使用して比較され得る。例示的なそのようなプログラムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５（３）：４０３－１０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０－８０；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，２５：３３８９－４０２；Ｂａｘｅｖａｎｉｓ，Ａ．Ｄ．ａｎｄ Ｂ．Ｆ．Ｆ．Ｏｕｅｌｌｅｔｔｅ（ｅｄｓ．） Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ ｔｈｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，Ｗｉｌｅｙ，１９９８；及びＭｉｓｅｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．） Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１３２，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ，１９９８（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。同一の配列を同定することに加えて、上記のプログラムは、典型的には、同一性の程度の指標を提供する。いくつかの実施形態では、２つの配列は、それらの対応する残基の少なくとも８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％またはそれ以上が残基の関連伸長部にわたって同一である場合、実質的に同一と考えられる。いくつかの実施形態では、残基の関連伸長部は、完全配列である。いくつかの実施形態では、残基の関連伸長部は、例えば、限定されないが、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上の残基である。
ターゲティングコンストラクトまたはターゲティングベクター：本明細書で使用される場合、標的化領域を含むポリヌクレオチド分子を指す。標的化領域は、標的細胞、組織または動物における配列と同一または実質的に同一の配列を含み、相同組換えを介して細胞、組織または動物のゲノム内の位置へのターゲティングコンストラクトの組み込みを提供する。部位特異的リコンビナーゼ認識部位（例えば、ｌｏｘＰまたはＦｒｔ部位）を使用して標的化する標的化領域も含まれ、本明細書に記載される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるターゲティングコンストラクトは、特定の対象となる核酸配列または遺伝子、選択可能なマーカー、コントロール及び／または制御配列、ならびにそのような配列を含む組換えを補助し、または容易化するタンパク質の外因性付加を介して媒介される組換えを可能にする他の核酸配列をさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるターゲティングコンストラクトは、対象となる遺伝子を全体としてまたは部分的にさらに含み、対象となる遺伝子は、内因性配列によってコードされるタンパク質と類似する機能を有するポリペプチドを全体としてまたは部分的にコードする異種遺伝子である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるターゲティングコンストラクトは、対象となるヒト化遺伝子を全体としてまたは部分的にさらに含み、対象となるヒト化遺伝子は、内因性配列によってコードされるポリペプチドと類似する機能を有するポリペプチドを全体としてまたは部分的にコードする。いくつかの実施形態では、ターゲティングコンストラクト（またはターゲティングベクター）は、人の手によって操作された核酸配列を含み得る。例えば、いくつかの実施形態では、ターゲティングコンストラクト（またはターゲティングベクター）は、修飾されたまたは組換えポリヌクレオチドであって、その天然の順序で一緒に連結されていないが、修飾されたまたは組換えポリヌクレオチドにおいて互いに直接的に連結されるように人の手によって操作された２つ以上の配列を含有する、修飾されたまたは組換えポリヌクレオチドを含有するように構築され得る。
導入遺伝子または導入遺伝子コンストラクト：本明細書で使用される場合、人の手によって、例えば、本明細書に記載の方法によって細胞に導入された核酸配列（例えば、対象となるポリペプチドを全体としてまたは部分的にコードする）を指す。導入遺伝子は、それが導入される遺伝子修飾された動物または細胞に対して部分的にまたは全体的に異種、すなわち、外来であり得る。導入遺伝子は、選択された核酸配列の発現に必要であり得る１つ以上の転写制御配列及び任意の他の核酸、例えば、イントロンまたはプロモーターを含み得る。
非再編成：本明細書で使用される場合、２つ以上の免疫グロブリン遺伝子セグメントであって、組換え事象を受けておらず、またはそうでなければ接合されておらず、そのため、それらの間に遺伝子間配列（複数可）を含む、２つ以上の免疫グロブリン遺伝子セグメントを含むＤＮＡ配列を表す。当業者は、非再編成Ｖ遺伝子セグメント及びＪ遺伝子セグメントは、インタクトな組換えシグナル配列（ＲＳＳ）に関連し得ることを理解する。非再編成Ｄ遺伝子セグメントは、２つのインタクトな組換えシグナル配列（ＲＳＳ）によって挟まれている場合がある。当業者は、非再編成遺伝子セグメントが、とりわけ、イントロンを含み得ることをさらに理解する。
ベクター：本明細書で使用される場合、それが関連する別の核酸を輸送することが可能な核酸分子を指す。いくつかの実施形態では、ベクターは、真核及び／または原核生物細胞などの宿主細胞においてそれらが連結された核酸の染色体外複製及び／または発現が可能である。機能可能に連結された遺伝子の発現を誘導することが可能なベクターは、本明細書で「発現ベクター」と称される。
野生型：本明細書で使用される場合、「正常な」（変異体、罹患した、変化した、修飾したものなどとは対照的）状態または状況で天然に見られる構造及び／または活性を有する実体を指す。当業者は、野生型遺伝子及びポリペプチドがしばしば、複数の異なる形態（例えば、アレル）で存在することを理解する。
（発明を実施するための形態）
本開示は、免疫グロブリン鎖対合及び親和性成熟を含む、非ヒト動物における内因性抗体発達メカニズムが、外因性ヒト免疫グロブリン配列を含む抗原特異的高親和性抗体を生成するために利用され得るという洞察を提供する。そのような動物は、正常かつ頑丈な免疫反応を生成し得、これは、例えば、ヒト抗体治療剤を作製するために利用され得る。本開示は、遺伝子改変された非ヒト動物が、ヒト重鎖、κ軽鎖、及びλ軽鎖ドメインを含むヒト可変ドメインを含む抗体を生成するための有効かつ効率的なプラットフォームを提供することを認識する。本開示は、遺伝子改変された非ヒト動物が、親和性成熟したヒト重鎖、κ軽鎖、及びλ軽鎖可変ドメインを生成するためにヒト重鎖、κ軽鎖、及びλ軽鎖可変領域遺伝子セグメントを成功裏に利用することができることをさらに認識する。
本開示は、非ヒト動物におけるヒトλ軽鎖可変ドメインを含む抗体の生成が、所定の非ヒト動物におけるλ軽鎖の発現が低い場合に、先行して提示された課題を有することを認識する。例えば、マウスは、λ軽鎖よりも有意に多いκ軽鎖（すなわち、約９５：５のκ：λ比で）を利用する。本開示は、非ヒト動物の軽鎖可変領域レパートリーを限定することによる普遍的軽鎖（例えば、複数の重鎖に結合することが可能な軽鎖）を含む抗体の生成が、高親和性抗体の生成のための最も強力な多様性生成メカニズム、例えば、コンビナトリアル多様性、接合多様性、及び二次再編成の一部を排除するので、チャレンジングであり得ることをさらに認識する。それはまた、「様々に組み合わされる（ｍｉｘ ａｎｄ ｍａｔｃｈ）」重鎖及び軽鎖対合に起因するであろう多様性生成効果を最小化する。これらの認識の観点から、限られたヒトλ軽鎖可変領域から非ヒト動物におけるヒトλ軽鎖可変領域を生成するためのプラットフォーム及び方法が当該技術分野で依然として必要とされている。
本開示は、κ軽鎖遺伝子座で限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）が、高親和性の抗原特異的抗体を有効に生成することができるという洞察を提供する。この結果は、非ヒト動物における限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーが、非ヒト動物にλ軽鎖可変領域配列を利用させるので予期されないことである。λ軽鎖可変領域配列の使用は、所定の非ヒト動物の天然の優先傾向に反する。上記のように、非ヒト動物における限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーの使用はまた、高親和性の抗原特異的抗体を生成するために使用される多くの天然メカニズムを排除する。
本開示は、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを発現する遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）であって、非ヒト動物が、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリー（１つまたは２つのヒトＶλ遺伝子セグメントを含む）を有するものを提供する。いくつかの実施形態では、本開示は、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを発現する遺伝子改変された非ヒト動物であって、非ヒト動物が、限られたヒトλ軽鎖可変レパートリー、及びヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを有するものを提供する。親和性成熟したヒト重鎖可変ドメインの多様なレパートリーと会合する、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーから発現されるヒトλ軽鎖可変ドメインを生成するための生物学的システムも提供される。ヒト免疫グロブリン可変ドメイン（例えば、抗体、重鎖、軽鎖（例えば、λ軽鎖）、重鎖可変ドメイン、軽鎖可変ドメイン（例えば、λ軽鎖可変ドメイン）、一本鎖可変断片（ＳｃＦｖ））を含む抗原結合タンパク質を作製するための方法が提供される。いくつかの実施形態では、方法は、本明細書に記載の非ヒト動物を対象となる抗原で免疫することを含む。いくつかの実施形態では、方法は、抗原結合タンパク質（例えば、対象となる抗原に特異的に結合する結合タンパク質）において本明細書に記載の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）の免疫グロブリン可変領域遺伝子配列を用いることを含む。方法には、多重特異的抗原結合タンパク質の作製において使用するのに好適なヒト免疫グロブリン重鎖及び／またはλ軽鎖可変ドメインを作製するための方法が含まれる。
ヒトλ軽鎖可変領域遺伝子セグメントの限られたレパートリーからヒトλ軽鎖可変ドメインの限られたレパートリーを発現する遺伝子修飾された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域配列（Ｖλ／Ｊλ配列）を含むように遺伝子修飾される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、１つまたは２つのみのヒト非再編成λ軽鎖可変領域遺伝子セグメントを含むように遺伝子修飾される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、１つまたは２つのみの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメント及び１つ以上の非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントを含むように遺伝子修飾される。所定の実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、４つまたは５つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントを含む。本明細書に記載の非ヒト動物によって発現される再編成されたヒトλ軽鎖可変ドメインは、そのような非ヒト動物によって発現される複数の親和性成熟したヒト重鎖の対合が可能であり、複数の重鎖可変領域は、異なるエピトープに特異的に結合することが可能である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、非再編成ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントのレパートリーに由来する好適な親和性成熟したヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを発現及び選択し、親和性成熟したヒト重鎖可変ドメインは、非ヒト動物の限られたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域遺伝子レパートリーに由来するヒトλ軽鎖可変ドメインと会合し、発現する。本開示は、ヒトλ軽鎖可変ドメイン及びヒト重鎖可変ドメイン（コードしているヒトλ軽鎖可変領域及びヒト重鎖可変領域と共に）が、多重特異的抗体、特に二重特異的抗体の生成において利用され得るという洞察を提供する。
非ヒト動物における抗体レパートリー
免疫グロブリン（抗体とも称される）は、病原体（例えば、ウイルス、細菌など）を中和するために宿主免疫系のＢ細胞によって生成される大きな（約１５０ｋＤ）Ｙ形状の糖タンパク質である。各免疫グロブリン（Ｉｇ）は、２つの同一の重鎖及び２つの同一の軽鎖から構成され、その各々は、２つの構造成分：可変ドメイン及び定常ドメインを有する。重鎖及び軽鎖可変領域は、異なるＢ細胞によって生成される抗体で異なるが、単一のＢ細胞またはＢ細胞クローンによって生成されるすべての抗体について同じである。各抗体の重鎖及び軽鎖可変領域は一緒に、抗原結合領域（または抗原結合部位）を含む。免疫グロブリンは、それらが含有する重鎖定常領域（またはドメイン）に基づいてアイソタイプまたはクラスと称される異なる類型で存在し得る。重鎖定常領域は、同じアイソタイプのすべての抗体で同じであるが、異なるアイソタイプの抗体では異なる。以下の表は、マウス及びヒトにおける９種の抗体アイソタイプをまとめている。


Figure 2022535418000023
他の種ではさらなるアイソタイプが同定されている。アイソタイプは、異なるアイソタイプ間の異なる構造的特徴に起因して特徴的な生物学的特性を抗体に付与し、動物身体内の異なる場所（細胞、組織など）に見られる。最初は、Ｂ細胞は、同一の抗原結合領域を有するＩｇＭ及びＩｇＤを生成する。Ｂ細胞は、活性化されると、クラススイッチと称されるプロセスによって異なるアイソタイプにスイッチするが、そのプロセスは、可変領域を同じままとすることにより元の抗体（Ｂ細胞）の抗原特異性を保持しながら、Ｂ細胞によって生成される抗体の定常領域が変化することを含む。
２つの別々の遺伝子座（Ｉｇκ及びＩｇλ）は、再編成されると、抗体の軽鎖をコードする遺伝子セグメントを含有し、アレル及びアイソタイプの両方の排除を示す。κ＋対λ＋Ｂ細胞の発現比は、種間で多様である。例えば、ヒトは、約６０：４０（κ：λ）の比を示す。マウス及びラットでは、９５：５（κ：λ）の比が観察される。興味深いことに、ネコ（５：９５）で観察されるκ：λ比は、マウス及びラットの逆である。これらの観察される比の背景にあり得る理由を解明するためにいくつかの研究が行われており、遺伝子座の複雑性（すなわち、遺伝子セグメント、特に、Ｖ遺伝子セグメントの数）及び遺伝子セグメント再構成の効率の両方が論拠として提案されている。ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座は、１，０００ｋｂを超えて伸長し、３つのクラスターで組織されたおよそ７０個のＶλ遺伝子セグメント（２９～３３個の機能性）及び７個のＪλ－Ｃλ遺伝子セグメント対（４～５個の機能性）を含有する（例えば、米国特許第９，００６，５１１号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の図１参照）。発現される抗体レパートリーにおいて観察されるＶλ領域の大多数は、最も近いクラスター（クラスターＡと称される）内に含有される遺伝子セグメントによってコードされる。マウス免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座は、系統に応じて、ヒト遺伝子座とはとりわけ異なり、２つの区別される遺伝子クラスターで組織された数個のＶλ及びＪλ遺伝子セグメントを含有する（例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第９，００６，５１１号の図２参照）。
様々なヒト疾患の処置のための治療抗体の開発は概ね、修飾された非ヒト動物系統であって、ヒト免疫グロブリン遺伝子に対応するそれらのゲノムにおける様々な量の遺伝物質を保有する、修飾された非ヒト動物系統、特に、修飾されたげっ歯類系統の作製に集中している（例えば、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０１５，Ａｒｃｈ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｈｅｒ．Ｅｘｐ．６３：１０１－８（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）でレビューされている）。そのような遺伝子修飾されたげっ歯類系統の作製における初期の取り組みは、ヒト免疫グロブリン遺伝子座の一部の組み込みに焦点を当てており、これはそれ自体で、遺伝子セグメントの組換え、ならびに不活化した内因性免疫グロブリン遺伝子座を有しながら完全にヒト型の重鎖及び／または軽鎖の生成をサポートし得る（例えば、Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８６：６７－０９－１３；Ｂｒｕｇｇｅｍａｎｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２１：１３２３－６；Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２０：６２８７－６２９５；Ｄａｖｉｅｓ，Ｎ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１１：９１１－４；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．７：１３－２１；Ｌｏｎｂｅｒｇ，Ｎ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３６８：８５６－９；Ｔａｙｌｏｒ，Ｌ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５７９－９１；Ｗａｇｎｅｒ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：２６７２－８１；Ｆｉｓｈｗｉｌｄ，Ｄ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１４：８４５－５１；Ｗａｇｎｅｒ，Ｓ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３５：４０５－１４；Ｍｅｎｄｅｚ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．１５：１４６－５６；Ｇｒｅｅｎ，Ｌ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８８：４８３－９５；Ｘｉａｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｓ ２：３３３－４３；Ｌｉｔｔｌｅ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ２１：３６４－７０；Ｋｅｌｌｅｒｍａｎｎ，Ｓ．Ａ．ａｎｄ Ｌ．Ｌ．Ｇｒｅｅｎ，２００２，Ｃｕｒ．Ｏｐｉｎ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１３：５９３－７（これらの各々は、それらの全体が参照により組み込まれる）参照）。特に、いくつかの取り組みは、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖配列の組み込みを含んでいた（例えば、米国特許出願公開第２００２／００８８０１６Ａ１号、第２００３／０２１７３７３Ａ１号及び第２０１１／０２３６３７８Ａ１号；米国特許第６，９９８，５１４号及び第７，４３５，８７１号；Ｎｉｃｈｏｌｓｏｎ，Ｉ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６３：６８９８－９０６；Ｐｏｐｏｖ，Ａ．Ｖ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９（１０）：１６１１－１９（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照）。そのような取り組みは、ヒトＶλ、Ｊλ及びＣλ配列を含有する酵母人工染色体をランダムに組み込み、それにより完全ヒト免疫グロブリンλ軽鎖（すなわち、ヒトＶλ及びＣλドメイン）を発現するマウス系統を作製することに焦点を当てている。より最近の取り組みは、ヒトＶλ、Ｊλ及びＣλ配列も含有するコンストラクトを使用する類似するストラテジーを用いている（Ｏｓｂｏｒｎ，Ｍ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，２０１３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１９０：１４８１－９０；Ｌｅｅ，Ｅ－Ｃ．ｅｔ ａｌ．，２０１４，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．３２（４）：３５６－６３（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。
さらに他の取り組みは、ヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメントが内因性免疫グロブリン軽鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結されるように、内因性げっ歯類免疫グロブリン軽鎖遺伝子座（κ及びλ）に前記ヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメントを特異的挿入することを含んでいた（例えば、米国特許第９，００６，５１１号、第９，０１２，７１７号、第９，０２９，６２８号、第９，０３５，１２８号、第９，０６６，５０２号、第９，１５０，６６２号及び第９，１６３，０９２号（これらのすべては、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照）。そのような動物のいくつかの実施形態では、クラスターＡ及びＢからのヒトＶλ遺伝子セグメントのすべて及び１つまたは４ついずれかのヒトＪλ遺伝子セグメントが内因性免疫グロブリンκ及び免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座に挿入された。いくつかの異なるヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメントは、げっ歯類抗体レパートリーで発現される機能性軽鎖を形成するための両方の修飾されたげっ歯類免疫グロブリン軽鎖遺伝子座での適正な再編成を実証し、その軽鎖は、内因性Ｃκ及びＣλ領域のいずれかについてヒトＶλドメインを含んでいた（例えば、米国特許第９，００６，５１１号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の表７及び図１１～１３参照）。特に、ヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメントを保有する修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を有するマウスは、脾臓区画において約１：１のヒトラムダ対内因性ラムダ比を実証した（ＩｇＣκ対ＩｇＣλ比によって測定される）（例えば、米国特許第９，００６，５１１号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）の表４参照）。実際、両方の修飾されたマウス系統（すなわち、修飾された免疫グロブリンκまたは修飾された免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座）は、ヒトＶλドメインが、軽鎖発現において通常は大きなバイアスを示すげっ歯類において内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座から発現され得ることを実証した（上記参照）。本開示は、代替の修飾された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座構造が、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーからのヒトλ軽鎖可変ドメインの発現を最大化するために生成され得るという認識を提供する。そのような代替の修飾された免疫グロブリン軽鎖遺伝子座構造は、それらの設計に起因する独自の抗体レパートリーのための能力を提供する。
本開示は、非ヒト動物であって、その生殖細胞系列ゲノムは、げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含有する、非ヒト動物を提供する。単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞によって発現されるすべての免疫グロブリンλ軽鎖は、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座は、非ヒトまたはヒト免疫グロブリンλまたは免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、そのような軽鎖の発現は、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域の内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）への挿入によって達成され得る。いくつかの実施形態では、提供される非ヒト動物は、内因性免疫グロブリンλ軽鎖可変領域の発現が不活性化（例えば、遺伝子欠失による）されるように修飾される。いくつかの実施形態では、提供される非ヒト動物は、内因性免疫グロブリンκ軽鎖可変領域の発現が不活性化（例えば、挿入、置き換えまたは置換による）されるように修飾される。
普遍的軽鎖
有用な多重特異的抗原結合タンパク質、例えば、二重特異的抗体を作製するための過去の取り組みは、共通のパラダイム：ヘテロ二量体二重特異的ヒト免疫グロブリンを対合させるための好適な形式を合理的に修飾する、または試行錯誤を通じて修飾するための配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ選択または操作をたびたび共有する多様な問題によって妨げられてきた。不運なことに、ｉｎ ｖｉｔｒｏ修飾アプローチのすべてではないとしてもほとんどは、概ね、仮にあったとしても、個々の分子のための好適なその場しのぎの解決策を提供する。
ヒト治療剤をもたらすことが可能な適切な対合を選択するために複合生物を用いるためのｉｎ ｖｉｖｏ方法が開発されてきた（例えば、米国特許第１０，１４３，１８６号（その全体が参照により組み込まれる）参照）。しかしながら、十分な力価レベルでヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを有する高親和性普遍的λ軽鎖の生成を含む頑強な免疫反応を生成することが可能な非ヒト動物は過去に生成されていない。通常、ネイティブ非ヒト配列は、多くの場合、ヒト治療用配列のための良好な源ではない。少なくともその理由から、普遍的ヒト軽鎖と対合する非ヒト重鎖免疫グロブリン可変ドメインを生成することは、実用的利用性が限られている。アウトカムは不確かであるが、エピトープ特異性及び親和性ならびに一般的なヒト軽鎖と結合する能力を保持することを期待して、非ヒト重鎖可変配列をヒト化しようとする試行錯誤のプロセスにおいてより多くのｉｎ ｖｉｔｒｏ修飾の取り組みがなされるであろう。そのようなプロセスの最後に、最終産物は、特異性及び親和性の一部を維持し、普遍的軽鎖と会合し得るが、最終的には、ヒトにおける免疫原性が重大なリスクを保持する可能性があるであろう。
そのため、ヒト治療剤を作製するための好適な非ヒト動物は、内因性非ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントの代わりにヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントの適切に広いレパートリーを含むであろう。ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントは、再編成し、内因性非ヒト重鎖定常領域とスプライシングして逆キメラ重鎖（すなわち、ヒト可変ドメイン及び非ヒト定常ドメインを含む重鎖）を形成することが可能であるべきである。重鎖遺伝子座は、クラススイッチ及び体細胞超変異を受けることが可能であるべきであり、これにより重鎖可変ドメインの適切に広いレパートリーは、非ヒト動物が、ヒトλ軽鎖可変領域の限られたレパートリーによってコードされるヒトλ軽鎖可変ドメインと会合し得るものを選択するのに利用可能となる。
複数の重鎖のための普遍的軽鎖を選択する非ヒト動物は、実用的利用性を有する。様々な実施形態では、普遍的軽鎖のみを発現し得る非ヒト動物において発現する抗体は、同一のまたは実質的に同一の軽鎖と会合し、発現し得る重鎖を有する。これは、二重特異的抗体の作製において特に有用である。例えば、そのような非ヒト動物は、第１のエピトープに特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞を生成するために第１の免疫源で免疫され得る。非ヒト動物（またはその重鎖及びλ軽鎖遺伝子座に対する同一の遺伝子改変を含む非ヒト動物）は、第２のエピトープに特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞を生成するために第２の免疫源で免疫され得る。可変重鎖領域は、Ｂ細胞からクローニングされ、同じ重鎖定常領域、及び同じ軽鎖と共に発現され、二重特異的抗体を作製するための細胞において発現され得、その場合、二重特異的抗体の軽鎖成分は、軽鎖成分と会合し、発現するように非ヒト動物によって選択されている。普遍的κ軽鎖を発現する非ヒト動物が開発されている（例えば、米国特許第１０，１４３，１８６号（その全体が参照により組み込まれる）参照）。しかしながら、ヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、普遍的λ軽鎖を発現することができる非ヒト動物の開発が依然として必要とされている。
本開示は、可変領域が生殖細胞系列配列から逸脱する重鎖、例えば、親和性成熟したまたは体細胞超変異した重鎖を含む、相当に多様なファミリーの重鎖と好適に対合する免疫グロブリンλ軽鎖を生成するための修飾された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）を提供する。様々な実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、ヒトλ軽鎖可変ドメインを体細胞変異を含むヒト重鎖可変ドメインと共に発現させ、対合するように修飾され、これによりヒト治療剤として使用するのに好適な高親和性結合タンパク質（例えば、抗体）への経路を可能にする。
本明細書に記載される遺伝子修飾された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、生物内での抗体選択の長く複雑なプロセスを介して、ヒト重鎖可変ドメインの多様なコレクションと限られた数の軽鎖オプションとの対合において生物学的に適切な選択をする。これを達成するために、非ヒト動物は、ヒト重鎖可変ドメインオプションの広い多様性と併せて限られた数のヒトλ軽鎖可変ドメインオプションを提示するように修飾される。本明細書に記載の非ヒト動物は、免疫源を投与されると、そのレパートリーにおけるソリューションの数を最大化して、そのレパートリーにおける数または軽鎖オプションによって概ねまたは専ら制限された、免疫源に対する抗体を発生させ得る。様々な実施形態では、これは、非ヒト動物が、軽鎖可変ドメインの好適で適合性のある体細胞変異を達成することを可能にすることを含み、その軽鎖可変ドメインは、それにもかかわらず、比較的多様なヒト重鎖可変ドメイン（特に、体細胞超変異したヒト重鎖可変ドメインを含む）と適合する。
ヒトλ軽鎖オプションの限られたレパートリーを達成するために、本明細書に記載される非ヒト動物は、ネイティブ非ヒトλ及び／またはκ軽鎖可変ドメインを作製する、または再構成するその能力が非機能性または実質的に非機能性となるように修飾され得る。いくつかの実施形態では、これは、非ヒト動物のλ及び／またはκ軽鎖可変領域遺伝子セグメントを欠失させることによって達成され得る。いくつかの実施形態では、次いで内因性非ヒト遺伝子座は、内因性非ヒト軽鎖定常ドメインに機能可能に連結された好適な外因性ヒトλ軽鎖可変領域配列（複数可）で改変され得る。いくつかの実施形態では、外因性ヒト可変領域遺伝子セグメントは、再編成されておらず（例えば、２つのＶλ遺伝子セグメント及び１つ以上のＪλ遺伝子セグメント）、再編成し、内因性非ヒト軽鎖定常領域遺伝子にスプライシングして再編成された逆キメラ軽鎖遺伝子（ヒト可変、非ヒト定常）を形成し得る。いくつかの実施形態では、外因性ヒト可変遺伝子セグメントは、再編成されており（例えば、１つのＶλ遺伝子セグメント及び１つのＪλ遺伝子セグメント）、内因性非ヒト軽鎖定常領域遺伝子にスプライシングしてヒト可変領域及び非ヒト定常領域を含む逆キメラ軽鎖遺伝子を形成し得る。いくつかの実施形態では、外因性ヒト可変遺伝子セグメントは、再編成されており（例えば、１つのＶλ遺伝子セグメント及び１つのＪλ遺伝子セグメント）、外因性ヒト軽鎖定常領域遺伝子にスプライシングしてヒト可変領域及びヒト定常領域を含むヒト化軽鎖遺伝子を形成し得る。様々な実施形態では、軽鎖可変領域は、体細胞超変異することが可能である。様々な実施形態では、適切なエンハンサー（複数可）は、非ヒト動物において保持される。エンハンサーは、軽鎖可変領域が体細胞変異を獲得する能力を最大化することが報告されている。例えば、内因性非ヒト動物κ可変領域遺伝子セグメントをヒトλ可変領域遺伝子セグメントで置き換えることによって非ヒト動物のκ遺伝子座を改変することにおいて、非ヒトκイントロンエンハンサー及び非ヒトκ３’エンハンサーは、機能的に維持され、または破壊されない。エンハンサーが除去され、または破壊される実施形態が本開示によって企図されるが、そのような実施形態は、体細胞超変異を減少させ、または排除することが予期されるであろう。そのような実施形態では、軽鎖可変領域の体細胞超変異は、例えば、１つ以上の内因性非ヒトエンハンサーを含む軽鎖可変領域と比べて減少する。
多様な逆キメラ（ヒト可変、非ヒト定常）重鎖に関連する逆キメラ（ヒト可変、非ヒト定常）軽鎖の限られたレパートリーを発現する遺伝子修飾された非ヒト動物が提供される。様々な実施形態では、内因性非ヒトκ軽鎖可変領域遺伝子セグメントは、欠失され、または内因性非ヒトκ定常領域遺伝子に機能可能に連結された単一の（または２つの）ヒトλ軽鎖可変領域遺伝子セグメントで置き換えられる。いくつかの実施形態では、非ヒトκイントロンエンハンサー及び非ヒトκ３’エンハンサーが維持される。任意の１つの理論に縛られることなく、エンハンサーは、とりわけ、ヒトλ軽鎖可変領域遺伝子セグメントの体細胞超変異を最大化し得る。様々な実施形態では、非ヒト動物はまた、非機能性λ軽鎖遺伝子座、もしくはその欠失、またはその遺伝子座がλ軽鎖を作製することを不可能とする欠失を含む。
様々な実施形態では、内因性非ヒト軽鎖可変遺伝子セグメントを欠き、かつ非ヒトＣλ遺伝子セグメントに機能可能に連結されたヒト可変遺伝子セグメント、いくつかの実施形態では、再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む軽鎖可変領域遺伝子座を含む遺伝子修飾された非ヒト動物であって、その遺伝子座は、体細胞超変異を受けることが可能であり、その遺伝子座は、非ヒトＣλ遺伝子セグメントに連結されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む軽鎖を発現する、遺伝子修飾された非ヒト動物が提供される。よって、様々な実施形態では、その遺伝子座は、体細胞超変異の正常な、または野生型のレベルと相関関係がある非ヒトκ３’エンハンサーを含む。
様々な実施形態では、遺伝子修飾された非ヒト動物は、対象となる抗原で免疫された場合、１つまたは２つの再編成された軽鎖と共に発現し、機能するヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の多様な再編成を示すＢ細胞を生成する。いくつかの実施形態では、ヒトλ軽鎖可変領域は、体細胞超変異を含む。いくつかの実施形態では、ヒトλ軽鎖可変領域はそれぞれ、１～５個の体細胞超変異を含む。様々な実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物によって発現される軽鎖は、非ヒト動物において発現されるヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含む任意の重鎖と会合し、発現することが可能である。
提供される非ヒト動物、細胞及び組織
（ｉ）１つまたは２つの非再編成Ｖλ遺伝子セグメント及び１つ以上の非再編成Ｊλ遺伝子セグメント、または（ｉｉ）非ヒト動物の生殖細胞系列ゲノムにおける内因性非ヒトλ軽鎖遺伝子座での非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変領域配列の代わりの単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域に由来するヒトλ軽鎖可変ドメインを含む軽鎖を含有する抗体を発現する（例えば、そのＢ細胞が発現する）非ヒト動物が提供される。本明細書に記載の様々な実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物は、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウスであり、本明細書に記載の非ヒト要素（エンハンサー、定常領域など）は、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス要素であることが理解されるであろう。本明細書に記載の非ヒト動物の好適な例には、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス、特に、マウスが含まれるがこれらに限定されない。
本開示は、例えば、ヒトに影響を及ぼす多様な疾患の処置において使用され得る新たな抗原結合タンパク質、抗体、抗体成分（例えば、抗原結合部分及び／または組成物またはそれを含む形式）、及び／または抗体ベースの治療剤を同定及び開発するための改善されたｉｎ ｖｉｖｏシステムを提供する。さらに、本開示は、修飾された免疫グロブリン遺伝子座、例えば、限られたλ軽鎖可変領域レパートリーを含む修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を有する非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）が有用であるという認識を包含する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、ヒトへの投与のための抗体及び／または抗体ベースの治療剤の開発のための改善されたｉｎ ｖｉｖｏシステムを提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、ヒトＶλ領域配列を含有する既存のｉｎ ｖｉｖｏシステムから得られる抗体及び／または抗体ベースの治療剤と比較して、改善された及び／または異なる性能（例えば、抗原特異的抗体レパートリーでの発現及び／または出現）を特徴とするヒトλ軽鎖可変ドメインを含有する抗体及び／または抗体ベースの治療剤の開発のための改善されたｉｎ ｖｉｖｏシステムを提供する。
本開示は、とりわけ、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含むように修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を有する非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織を提供する。いくつかの実施形態では、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーの配列は、非ヒト軽鎖定常領域に機能可能に連結されている。いくつかの実施形態では、非ヒト軽鎖定常領域は、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）軽鎖定常領域である。いくつかの実施形態では、非ヒト軽鎖定常領域は、κまたはλ軽鎖定常領域である。いくつかの実施形態では、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーの配列は、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃκに機能可能に連結されている。いくつかの実施形態では、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーの配列は、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃλ（例えば、Ｃλ１）に機能可能に連結されている。いくつかの実施形態では、非ヒトλ軽鎖定常領域（例えば、マウスＣλ、例えば、マウスＣλ１）は、内因性非ヒトＣκの代わりである。
本開示は、とりわけ、２つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメント及び１つ以上の非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントを含むように修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を有する非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織を提供する。いくつかの実施形態では、２つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ４－６９、Ｖλ８－６１、Ｖλ４－６０、Ｖλ６－５７、Ｖλ１０－５４、Ｖλ５－５２、Ｖλ１－５１、Ｖλ９－４９、Ｖλ１－４７、Ｖλ７－４６、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ７－４３、Ｖλ１－４０、Ｖλ５－３７、Ｖλ１－３６、Ｖλ３－２７、Ｖλ３－２５、Ｖλ２－２３、Ｖλ３－２２、Ｖλ３－２１、Ｖλ３－１９、Ｖλ２－１８、Ｖλ３－１６、Ｖλ２－１４、Ｖλ３－１２、Ｖλ２－１１、Ｖλ３－１０、Ｖλ３－９、Ｖλ２－８、Ｖλ４－３、及びＶλ３－１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、２つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ５－５２、Ｖλ１－５１、Ｖλ９－４９、Ｖλ１－４７、Ｖλ７－４６、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ７－４３、Ｖλ１－４０、Ｖλ５－３７、Ｖλ１－３６、Ｖλ３－２７、Ｖλ３－２５、Ｖλ２－２３、Ｖλ３－２２、Ｖλ３－２１、Ｖλ３－１９、Ｖλ２－１８、Ｖλ３－１６、Ｖλ２－１４、Ｖλ３－１２、Ｖλ２－１１、Ｖλ３－１０、Ｖλ３－９、Ｖλ２－８、Ｖλ４－３、及びＶλ３－１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、２つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、及びＶλ２－１４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７を含む。いくつかの実施形態では、２つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメント及び１つ以上の非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、非ヒト軽鎖定常領域に機能可能に連結されている。いくつかの実施形態では、非ヒト軽鎖定常領域は、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）軽鎖定常領域である。いくつかの実施形態では、非ヒト軽鎖定常領域は、κまたはλ軽鎖定常領域である。いくつかの実施形態では、２つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメント及び１つ以上の非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃκに機能可能に連結されている。いくつかの実施形態では、２つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメント及び１つ以上の非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃλ（例えば、Ｃλ１）に機能可能に連結されている。いくつかの実施形態では、非ヒトλ軽鎖定常領域（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス、例えば、マウスＣλ、例えば、マウスＣλ１）は、内因性非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃκの代わりである。
本開示は、とりわけ、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃκに機能可能に連結された２つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメント及び４つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントを含むように修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を有する非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織を提供する。いくつかの実施形態では、２つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、及びＶλ２－１４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、４つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７である。
本開示は、とりわけ、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃκに機能可能に連結された２つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメント及び５つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントを含むように修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を有する非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織を提供する。いくつかの実施形態では、２つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、及びＶλ２－１４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、５つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７である。
本開示は、とりわけ、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃλ（例えば、Ｃλ１）に機能可能に連結された２つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメント及び４つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントを含むように修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を有する非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織を提供する。いくつかの実施形態では、２つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、及びＶλ２－１４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、４つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７である。
本開示は、とりわけ、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃλ（例えば、Ｃλ１）に機能可能に連結された２つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメント及び５つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントを含むように修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を有する非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織を提供する。いくつかの実施形態では、２つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、及びＶλ２－１４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、５つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７である。
本開示は、とりわけ、１つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメント及び１つ以上の非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントを含むように修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を有する非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織を提供する。いくつかの実施形態では、１つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ４－６９、Ｖλ８－６１、Ｖλ４－６０、Ｖλ６－５７、Ｖλ１０－５４、Ｖλ５－５２、Ｖλ１－５１、Ｖλ９－４９、Ｖλ１－４７、Ｖλ７－４６、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ７－４３、Ｖλ１－４０、Ｖλ５－３７、Ｖλ１－３６、Ｖλ３－２７、Ｖλ３－２５、Ｖλ２－２３、Ｖλ３－２２、Ｖλ３－２１、Ｖλ３－１９、Ｖλ２－１８、Ｖλ３－１６、Ｖλ２－１４、Ｖλ３－１２、Ｖλ２－１１、Ｖλ３－１０、Ｖλ３－９、Ｖλ２－８、Ｖλ４－３、及びＶλ３－１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ５－５２、Ｖλ１－５１、Ｖλ９－４９、Ｖλ１－４７、Ｖλ７－４６、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ７－４３、Ｖλ１－４０、Ｖλ５－３７、Ｖλ１－３６、Ｖλ３－２７、Ｖλ３－２５、Ｖλ２－２３、Ｖλ３－２２、Ｖλ３－２１、Ｖλ３－１９、Ｖλ２－１８、Ｖλ３－１６、Ｖλ２－１４、Ｖλ３－１２、Ｖλ２－１１、Ｖλ３－１０、Ｖλ３－９、Ｖλ２－８、Ｖλ４－３、及びＶλ３－１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、及びＶλ２－１４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、１つ以上の非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７を含む。いくつかの実施形態では、１つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメント及び１つ以上の非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、非ヒト軽鎖定常領域に機能可能に連結されている。いくつかの実施形態では、非ヒト軽鎖定常領域は、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）軽鎖定常領域である。いくつかの実施形態では、非ヒト軽鎖定常領域は、κまたはλ軽鎖定常領域である。いくつかの実施形態では、１つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメント及び１つ以上の非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃκに機能可能に連結されている。いくつかの実施形態では、１つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメント及び１つ以上の非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃλ（例えば、Ｃλ１）に機能可能に連結されている。いくつかの実施形態では、非ヒトλ軽鎖定常領域（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス、例えば、マウスＣλ、例えば、マウスＣλ１）は、内因性非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃκの代わりである。
本開示は、とりわけ、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃκに機能可能に連結された１つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメント及び４つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントを含むように修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を有する非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織を提供する。いくつかの実施形態では、１つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、及びＶλ２－１４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、４つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７である。いくつかの実施形態では、１つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１であり、４つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７である。いくつかの実施形態では、１つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ２－１４であり、４つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７である。
本開示は、とりわけ、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃκに機能可能に連結された１つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメント及び５つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントを含むように修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を有する非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織を提供する。いくつかの実施形態では、１つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、及びＶλ２－１４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、５つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７である。いくつかの実施形態では、１つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１であり、５つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７である。いくつかの実施形態では、１つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ２－１４であり、５つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７である。
本開示は、とりわけ、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃλに機能可能に連結された１つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメント及び４つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントを含むように修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を有する非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織を提供する。いくつかの実施形態では、１つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、及びＶλ２－１４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、４つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７である。いくつかの実施形態では、１つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１であり、４つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７である。いくつかの実施形態では、１つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ２－１４であり、４つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７である。
本開示は、とりわけ、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃλに機能可能に連結された１つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメント及び５つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントを含むように修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を有する非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織を提供する。いくつかの実施形態では、１つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、及びＶλ２－１４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、５つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７である。いくつかの実施形態では、１つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１であり、５つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７である。いくつかの実施形態では、１つの非再編成ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ２－１４であり、５つの非再編成ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７である。
本開示は、とりわけ、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域（Ｖ／Ｊ）を含むように修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を有する非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織を提供する。いくつかの実施形態では、単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域のヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ４－６９、Ｖλ８－６１、Ｖλ４－６０、Ｖλ６－５７、Ｖλ１０－５４、Ｖλ５－５２、Ｖλ１－５１、Ｖλ９－４９、Ｖλ１－４７、Ｖλ７－４６、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ７－４３、Ｖλ１－４０、Ｖλ５－３７、Ｖλ１－３６、Ｖλ３－２７、Ｖλ３－２５、Ｖλ２－２３、Ｖλ３－２２、Ｖλ３－２１、Ｖλ３－１９、Ｖλ２－１８、Ｖλ３－１６、Ｖλ２－１４、Ｖλ３－１２、Ｖλ２－１１、Ｖλ３－１０、Ｖλ３－９、Ｖλ２－８、Ｖλ４－３、及びＶλ３－１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域のヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ５－５２、Ｖλ１－５１、Ｖλ９－４９、Ｖλ１－４７、Ｖλ７－４６、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ７－４３、Ｖλ１－４０、Ｖλ５－３７、Ｖλ１－３６、Ｖλ３－２７、Ｖλ３－２５、Ｖλ２－２３、Ｖλ３－２２、Ｖλ３－２１、Ｖλ３－１９、Ｖλ２－１８、Ｖλ３－１６、Ｖλ２－１４、Ｖλ３－１２、Ｖλ２－１１、Ｖλ３－１０、Ｖλ３－９、Ｖλ２－８、Ｖλ４－３、及びＶλ３－１からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域のヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、及びＶλ２－１４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域のヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１である。いくつかの実施形態では、単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域のヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ２－１４である。いくつかの実施形態では、単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域のヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域のヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１である。いくつかの実施形態では、単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域のヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ２である。いくつかの実施形態では、単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域のヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ３である。いくつかの実施形態では、単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域は、非ヒト軽鎖定常領域に機能可能に連結されている。いくつかの実施形態では、非ヒト軽鎖定常領域は、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）軽鎖定常領域である。いくつかの実施形態では、非ヒト軽鎖定常領域は、κまたはλ軽鎖定常領域である。いくつかの実施形態では、単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域は、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃκに機能可能に連結されている。いくつかの実施形態では、単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域は、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃλ（例えば、Ｃλ１）に機能可能に連結されている。いくつかの実施形態では、非ヒトλ軽鎖定常領域（例えば、マウスＣλ、例えば、マウスＣλ１）は、内因性非ヒト（例えば、げっ歯類、例えばラットまたはマウス）Ｃκの代わりである。
本開示は、とりわけ、マウスＣκに機能可能に連結された単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域を含むように修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を有する非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織を提供し、単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、及びＶλ２－１４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１であり、ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ２である。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ２－１４であり、ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ２である。
本開示は、とりわけ、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃλに機能可能に連結された単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域を含むように修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を有する非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織を提供し、単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、及びＶλ２－１４からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７からなる群から選択される。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１であり、ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ２である。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ２－１４であり、ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ２である。
本開示は、とりわけ、マウスＣλに機能可能に連結された単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域を含むように修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を有するマウス、マウス細胞またはマウス組織を提供し、単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ２－１４を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ２を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１であり、ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ２である。いくつかの実施形態では、ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ２－１４であり、ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ２である。
本開示は、とりわけ、遺伝子改変されたマウス、マウス細胞またはマウス組織であって、その生殖細胞系列ゲノムは、マウスＣλ１遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ１－５１遺伝子セグメント及びヒトＪλ２遺伝子セグメントを含み、遺伝子改変されたマウスのＢ細胞によって発現されるすべての免疫グロブリンλ軽鎖は、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含む、遺伝子改変されたマウス、マウス細胞またはマウス組織を提供する。
本開示は、とりわけ、遺伝子改変されたマウス、マウス細胞またはマウス組織であって、その生殖細胞系列ゲノムは、マウスＣλ１遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ２－１４遺伝子セグメント及びヒトＪλ２遺伝子セグメントを含み、遺伝子改変されたマウスのＢ細胞によって発現されるすべての免疫グロブリンλ軽鎖は、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含む、遺伝子改変されたマウス、マウス細胞またはマウス組織を提供する。
いくつかの実施形態では、提供される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えばラットまたはマウス）は、前記非ヒト動物の生殖細胞系列ゲノムにおける内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座からの抗体の発現を特徴とし、その抗体は、（１）ヒトＶλドメイン及び（２）非ヒトＣλドメインを含有する。いくつかの実施形態では、提供される非ヒト動物は、１つ以上の参照の修飾された非ヒト動物と比較して、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座からのヒトＶλ領域の改善された使用（例えば、限定されないが、約２倍）を特徴とする。
いくつかの実施形態では、非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織であって、その生殖細胞系列ゲノムが、（ａ）単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域、及び（ｂ）Ｃλ遺伝子を含む内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、（ａ）は、（ｂ）に機能可能に連結されており、非ヒト動物は、内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座で非ヒト動物Ｃκ遺伝子を欠くものが提供される。
いくつかの実施形態では、非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織であって、そのゲノムが、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域及びＣλ遺伝子の挿入を含む内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、前記Ｃλ遺伝子に機能可能に連結されており、及びＣλ遺伝子は、内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座で非ヒトＣκ遺伝子の代わりに挿入されているものが提供される。非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織の多くの実施形態では、内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座で非ヒトＣκ遺伝子の代わりに挿入されるＣλ遺伝子は、非ヒトまたはヒトＣλ遺伝子である。いくつかの実施形態では、非ヒトＣλ遺伝子は、霊長類、ヤギ、ヒツジ、ブタ、イヌ、ウシ、またはげっ歯類（例えば、ラットまたはマウス）Ｃλ遺伝子からなる群から選択される哺乳動物Ｃλ遺伝子であり、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、非ヒトＣλ遺伝子は、げっ歯類Ｃλ遺伝子であり、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、げっ歯類Ｃλ遺伝子は、マウスＣλ遺伝子であり、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、マウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ１、マウスＣλ２及びマウスＣλ３からなる群から選択されるマウスＣλ遺伝子と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、マウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ１、マウスＣλ２及びマウスＣλ３からなる群から選択されるマウスＣλ遺伝子と実質的に同一または同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、マウスＣλ１遺伝子は、配列番号１であり、またはそれを含む。いくつかの所定の実施形態では、マウスＣλ２遺伝子は、配列番号２であり、またはそれを含む。いくつかの所定の実施形態では、マウスＣλ３遺伝子は、配列番号３であり、またはそれを含む。いくつかの所定の実施形態では、マウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ１遺伝子と同一の配列を含む。
いくつかの実施形態では、マウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ１、マウスＣλ２及びマウスＣλ３からなる群から選択されるマウスＣλ遺伝子と８０％～１００％、８５％～１００％、９０％～１００％、９５％～１００％、または９８％～１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、マウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ１、マウスＣλ２及びマウスＣλ３からなる群から選択されるマウスＣλ遺伝子と８０％～９８％、８０％～９５％、８０％～９０％、または８０％～８５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、マウスＣλ遺伝子は、マウスＣλ１、マウスＣλ２及びマウスＣλ３からなる群から選択されるマウスＣλ遺伝子と８５％～９８％、９０％～９５％、または８８％～９３％同一の配列を含む。
いくつかの実施形態では、げっ歯類Ｃλ遺伝子は、ラットＣλ遺伝子であり、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、ラットＣλ遺伝子は、ラットＣλ１、ラットＣλ２、ラットＣλ３及びラットＣλ４遺伝子からなる群から選択されるラットＣλ遺伝子と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、ラットＣλ遺伝子は、ラットＣλ１、ラットＣλ２、ラットＣλ３及びラットＣλ４遺伝子からなる群から選択されるラットＣλ遺伝子と実質的に同一または同一の配列を含む。いくつかの所定の実施形態では、ラットＣλ１遺伝子は、配列番号７であり、またはそれを含む。いくつかの所定の実施形態では、ラットＣλ２遺伝子は、配列番号８であり、またはそれを含む。いくつかの所定の実施形態では、ラットＣλ３遺伝子は、配列番号９であり、またはそれを含む。いくつかの所定の実施形態では、ラットＣλ４遺伝子は、配列番号１０であり、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、ラットＣλ遺伝子は、ラットＣλ１、ラットＣλ２、ラットＣλ３及びラットＣλ４遺伝子からなる群から選択されるラットＣλ遺伝子と８０％～１００％、８５％～１００％、９０％～１００％、９５％～１００％、または９８％～１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、ラットＣλ遺伝子は、ラットＣλ１、ラットＣλ２、ラットＣλ３及びラットＣλ４遺伝子からなる群から選択されるラットＣλ遺伝子と８０％～９８％、８０％～９５％、８０％～９０％、または８０％～８５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、ラットＣλ遺伝子は、ラットＣλ１、ラットＣλ２、ラットＣλ３及びラットＣλ４遺伝子からなる群から選択されるラットＣλ遺伝子と８５％～９８％、９０％～９５％、または８８％～９３％同一の配列を含む。
いくつかの実施形態では、ヒトＣλ遺伝子は、ヒトＣλ１、ヒトＣλ２、ヒトＣλ３、ヒトＣλ６及びヒトＣλ７遺伝子からなる群から選択されるヒトＣλ遺伝子と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＣλ遺伝子は、ヒトＣλ、ヒトＣλ２、ヒトＣλ３、ヒトＣλ６及びヒトＣλ７遺伝子からなる群から選択されるヒトＣλ遺伝子と実質的に同一または同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＣλ遺伝子は、ヒトＣλ１、ヒトＣλ２、ヒトＣλ３、ヒトＣλ６及びヒトＣλ７遺伝子からなる群から選択されるヒトＣλ遺伝子と同一の配列を含む。いくつかの所定の実施形態では、ヒトＣλ１遺伝子は、配列番号１５であり、またはそれを含む。いくつかの所定の実施形態では、ヒトＣλ２遺伝子は、配列番号１６であり、またはそれを含む。いくつかの所定の実施形態では、ヒトＣλ３遺伝子は、配列番号１７であり、またはそれを含む。いくつかの所定の実施形態では、ヒトＣλ６遺伝子は、配列番号１８であり、またはそれを含む。いくつかの所定の実施形態では、ヒトＣλ７遺伝子は、配列番号１８であり、またはそれを含む。いくつかの所定の実施形態では、ヒトＣλ遺伝子は、ヒトＣλ２遺伝子であり、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、ヒトＣλ遺伝子は、ヒトＣλ１、ヒトＣλ２、ヒトＣλ３、ヒトＣλ６及びヒトＣλ７遺伝子からなる群から選択されるヒトＣλ遺伝子と８０％～１００％、８５％～１００％、９０％～１００％、９５％～１００％、または９８％～１００％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＣλ遺伝子は、ヒトＣλ１、ヒトＣλ２、ヒトＣλ３、ヒトＣλ６及びヒトＣλ７遺伝子からなる群から選択されるヒトＣλ遺伝子と８０％～９８％、８０％～９５％、８０％～９０％、または８０％～８５％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、ヒトＣλ遺伝子は、ヒトＣλ１、ヒトＣλ２、ヒトＣλ３、ヒトＣλ６及びヒトＣλ７遺伝子からなる群から選択されるヒトＣλ遺伝子と８５％～９８％、９０％～９５％、または８８％～９３％同一の配列を含む。
提供される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織のいくつかの実施形態では、前記非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織の生殖細胞系列ゲノムは、１つ以上のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含むように改変された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座をさらに含み、ヒトＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントは、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座で非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域に機能可能に連結されている（例えば、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ，Ｌ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，“Ｐｒｅｃｉｓｅ ａｎｄ ｉｎ ｓｉｔｕ ｇｅｎｅｔｉｃ ｈｕｍａｎｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ６ Ｍｂ ｏｆ ｍｏｕｓｅ ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ ｇｅｎｅｓ，” Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ，１１１（１４）：５１４７－５１５２（Ａｐｒｉｌ ８，２０１４）、米国特許第６，５９６，５４１号、第８，６４２，８３５号、第８，６９７，９４０号及び第８，７９１，３２３号（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照）。
いくつかの実施形態では、１つ以上のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のヒトＤＨ遺伝子セグメント及び１つ以上のヒトＪＨ遺伝子セグメントの挿入は、全体としてまたは部分的に、非ヒトＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントの代わりであり、またはそれに置き換わる（例えば、非ヒトＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントのコーディング配列をヒトＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントのコーディング配列で位置的に置き換えるまたは置換する）。いくつかの実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域は、内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域であり、またはそれを含む。多くの実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域（例えば、内因性）は、１つ以上の非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子または遺伝子セグメント（例えば、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＡなど）を含む。いくつかの所定の実施形態では、挿入は、ヒトＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメント、及びそれらの組み合わせの間に天然に現れるヒトノンコーディングＤＮＡを含む。いくつかの所定の実施形態では、本明細書に記載される免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントＶＨ３－７４、ＶＨ３－７３、ＶＨ３－７２、ＶＨ２－７０、ＶＨ１－６９、ＶＨ３－６６、ＶＨ３－６４、ＶＨ４－６１、ＶＨ４－５９、ＶＨ１－５８、ＶＨ３－５３、ＶＨ５－５１、ＶＨ３－４９、ＶＨ３－４８、ＶＨ１－４６、ＶＨ１－４５、ＶＨ３－４３、ＶＨ４－３９、ＶＨ４－３４、ＶＨ３－３３、ＶＨ４－３１、ＶＨ３－３０、ＶＨ４－２８、ＶＨ２－２６、ＶＨ１－２４、ＶＨ３－２３、ＶＨ３－２１、ＶＨ３－２０、ＶＨ１－１８、ＶＨ３－１５、ＶＨ３－１３、ＶＨ３－１１、ＶＨ３－９、ＶＨ１－８、ＶＨ３－７、ＶＨ２－５、ＶＨ７－４－１、ＶＨ４－４、ＶＨ１－３、ＶＨ１－２、ＶＨ６－１、またはそれらの任意の組み合わせ、ヒトＤＨ遺伝子セグメントＤＨ１－１、ＤＨ２－２、ＤＨ３－３、ＤＨ４－４、ＤＨ５－５、ＤＨ６－６、ＤＨ１－７、ＤＨ２－８、ＤＨ３－９、ＤＨ３－１０、ＤＨ５－１２、ＤＨ６－１３、ＤＨ２－１５、ＤＨ３－１６、ＤＨ４－１７、ＤＨ６－１９、ＤＨ１－２０、ＤＨ２－２１、ＤＨ３－２２、ＤＨ６－２５、ＤＨ１－２６、ＤＨ７－２７、またはそれらの任意の組み合わせ、及びヒトＪＨ遺伝子セグメントＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、ＪＨ６、またはそれらの任意の組み合わせの挿入を含む。いくつかの所定の実施形態では、挿入は、内因性重鎖遺伝子座においてヒトＶＨ３－７４、ＶＨ３－７３、ＶＨ３－７２、ＶＨ２－７０、ＶＨ１－６９、ＶＨ３－６６、ＶＨ３－６４、ＶＨ４－６１、ＶＨ４－５９、ＶＨ１－５８、ＶＨ３－５３、ＶＨ５－５１、ＶＨ３－４９、ＶＨ３－４８、ＶＨ１－４６、ＶＨ１－４５、ＶＨ３－４３、ＶＨ４－３９、ＶＨ４－３４、ＶＨ３－３３、ＶＨ４－３１、ＶＨ３－３０、ＶＨ４－２８、ＶＨ２－２６、ＶＨ１－２４、ＶＨ３－２３、ＶＨ３－２１、ＶＨ３－２０、ＶＨ１－１８、ＶＨ３－１５、ＶＨ３－１３、ＶＨ３－１１、ＶＨ３－９、ＶＨ１－８、ＶＨ３－７、ＶＨ２－５、ＶＨ７－４－１、ＶＨ４－４、ＶＨ１－３、ＶＨ１－２、またはＶＨ６－１に隣接して天然に現れるヒトノンコーディングＤＮＡ、ヒトＤＨ１－１、ＤＨ２－２、ＤＨ３－３、ＤＨ４－４、ＤＨ５－５、ＤＨ６－６、ＤＨ１－７、ＤＨ２－８、ＤＨ３－９、ＤＨ３－１０、ＤＨ５－１２、ＤＨ６－１３、ＤＨ２－１５、ＤＨ３－１６、ＤＨ４－１７、ＤＨ６－１９、ＤＨ１－２０、ＤＨ２－２１、ＤＨ３－２２、ＤＨ６－２５、ＤＨ１－２６、またはＤＨ７－２７に隣接して天然に現れるヒトノンコーディングＤＮＡ、及び内因性重鎖遺伝子座においてヒトＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、またはＪＨ６に隣接して天然に現れるヒトノンコーディングＤＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織は、そのゲノム（例えば、その生殖細胞系列ゲノム）においてＡｄａｍ６遺伝子を含み、これはＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする（例えば、米国特許第８，６４２，８３５号及び第８，６９７，９４０号（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織は、そのゲノム（例えば、その生殖細胞系列ゲノム）においてげっ歯類（例えば、マウスまたはラット）Ａｄａｍ６遺伝子を含み、これは、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする（例えば、米国特許第８，６４２，８３５号及び第８，６９７，９４０号（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照）。いくつかの実施形態では、ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片は、Ａｄａｍ６遺伝子から発現される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変された非ヒト動物におけるＡｄａｍ６遺伝子は、その特定の非ヒト動物（例えば、ラットＡｄａｍ６遺伝子または別のマウスの系統から得られるマウスＡｄａｍ６遺伝子を含むマウス）を起源としない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、異所性Ａｄａｍ６遺伝子を含む。「異所性」Ａｄａｍ６遺伝子は、本明細書で使用される場合、Ａｄａｍ６遺伝子が野生型非ヒト動物に出現するのとは異なる状況にあるＡｄａｍ６遺伝子を指す。例えば、Ａｄａｍ６遺伝子は、異なる染色体上に位置し得、異なる遺伝子座に位置し得、または異なる配列に隣接して配置され得る。例示的な異所性Ａｄａｍ６遺伝子は、ヒト免疫グロブリン配列（例えば、ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメント）内に位置するマウスＡｄａｍ６遺伝子である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、挿入されたまたは組み込まれたＡｄａｍ６遺伝子を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、そのゲノムにおいて（例えば、その生殖細胞系列ゲノムにおいて）１つ以上の非ヒトＡｄａｍ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列の挿入を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織は、そのゲノムにおいて（例えば、その生殖細胞系列ゲノムにおいて）１つ以上の非ヒトＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織は、そのゲノム（例えば、その生殖細胞系列ゲノム）においてマウスＡｄａｍ６ａ遺伝子及び／またはマウスＡｄａｍ６ｂ遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、マウスＡＤＡＭ６ａ、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片、及び／またはマウスＡＤＡＭ６ｂ、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、１つ以上の非ヒトＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列は、内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座と同じ染色体上に挿入され、及び／または位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の非ヒトＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列は、１つ以上の非ヒトＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列がヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントと連続するような位置に挿入され、及び／または位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の非ヒトＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列は、１つ以上の非ヒトＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列がヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメントに隣接するような位置に挿入され、及び／または位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の非ヒトＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列は、１つ以上の非ヒトＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列がヒト免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子セグメント間に位置するような位置に挿入され、及び／または位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の非ヒトＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列は、第１及び第２のヒトＶＨ遺伝子セグメント間に挿入され、及び／または位置する。いくつかの実施形態では、第１のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ１－２であり、第２のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ６－１である。いくつかの実施形態では、１つ以上の非ヒトＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子の代わりに挿入され、及び／または位置する。いくつかの実施形態では、１つ以上の非ヒトＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントとヒトＤＨ遺伝子セグメントとの間に挿入される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織は、ＡＤＡＭ６活性を回復または向上させるＡｄａｍ６遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、Ａｄａｍ６遺伝子は、機能性内因性Ａｄａｍ６遺伝子を含む同等の非ヒト動物のレベルまでＡＤＡＭ６活性を回復させる。いくつかの実施形態では、Ａｄａｍ６遺伝子は、機能性Ａｄａｍ６遺伝子を含まない同等の非ヒト動物のＡＤＡＭ６活性の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍のレベルまでＡＤＡＭ６活性を向上させる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織は、雄の非ヒト動物で発現した場合、繁殖能力を回復または向上させるＡｄａｍ６遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、Ａｄａｍ６遺伝子は、雄の非ヒト動物における繁殖能力を、機能性内因性Ａｄａｍ６遺伝子を含む同等の非ヒト動物のレベルまで回復させる。いくつかの実施形態では、Ａｄａｍ６遺伝子は、雄の非ヒト動物との交配によって産まれる仔の数が機能性Ａｄａｍ６遺伝子を含まない同等の雄の非ヒト動物との同等の交配から産まれる仔の数の少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％となるように、雄の非ヒト動物における繁殖能力を回復させる。いくつかの実施形態では、Ａｄａｍ６遺伝子は、雄の非ヒト動物との交配によって産まれる仔の数が機能性Ａｄａｍ６遺伝子を含まない同等の雄の非ヒト動物との同様の交配から産まれる仔の数の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍になるように、雄の非ヒト動物の繁殖能力を向上させる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、少なくとも１つの内因性非ヒトＡｄａｍ６遺伝子を欠く。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの内因性非ヒトＡｄａｍ６遺伝子の欠如は、内因性非ヒトＡｄａｍ６遺伝子を欠く雄のげっ歯類（例えば、マウスまたはラット）のＡＤＡＭ６活性及び／または繁殖能力を低下させる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、少なくとも１つの内因性非ヒトＡｄａｍ６遺伝子の破壊を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも１つの内因性非ヒトＡｄａｍ６遺伝子の破壊は、内因性非ヒトＡｄａｍ６遺伝子を欠く雄のげっ歯類（例えば、マウスまたはラット）におけるＡＤＡＭ６活性及び／または繁殖能力を低下させる。
本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織のいくつかの実施形態では、非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、本明細書に記載されるヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントを含む修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてホモ接合性またはヘテロ接合性である。
本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織のいくつかの実施形態では、非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、本明細書に記載されるヒト軽鎖可変遺伝子セグメント（ヒト可変λ軽鎖遺伝子セグメント）を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座についてホモ接合性またはヘテロ接合性である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織は、げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む第１の修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座アレルを含み、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、げっ歯類Ｃκ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変領域を含む第２の修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座アレルを含み、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変領域は、ヒトＶκ遺伝子セグメント及びヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、そのような非ヒト動物または非ヒト組織は、第１の修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座アレルからλ軽鎖及び第２の修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座アレルからκ軽鎖を発現し得る。いくつかの実施形態では、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変領域は、Ｖκ３－２０またはＶκ１－３９を含み、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、Ｖλ１－５１またはＶλ２－１４を含む。一実施形態では、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変領域は、Ｖκ３－２０／Ｊκ１またはＶκ１－３９／Ｊκ５であり、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、Ｖλ１－５１／Ｊλ２またはＶλ２－１４／Ｊλ２である。
提供される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織のいくつかの実施形態では、内因性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座は、全体としてまたは部分的に欠失されている。提供される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織のいくつかの実施形態では、内因性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座は、機能的にサイレンシングされ、またはそうでなければ非機能性である（例えば、遺伝子標的化によって）。提供される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織のいくつかの所定の実施形態では、非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、機能的にサイレンシングされた、またはそうでなければ非機能性の本明細書に記載される内因性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座についてホモ接合性である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織は、内因性免疫グロブリンλ軽鎖を検出可能に発現しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、内因性免疫グロブリンκ軽鎖を検出可能に発現しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、内因性免疫グロブリンλ軽鎖または内因性免疫グロブリンκ軽鎖を検出可能に発現しない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織は、内因性免疫グロブリン重鎖を検出可能に発現しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、内因性免疫グロブリンλ軽鎖、内因性免疫グロブリンκ軽鎖、及び内因性免疫グロブリン重鎖を検出可能に発現しない。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、転写コントロール要素に機能可能に連結された外因性末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）をコードする核酸配列をさらに含むゲノムを有する。（例えば、ＷＯ２０１７／２１０５８６及び米国公開第２０１７／０３４７６３３号（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照）。
いくつかの実施形態では、転写コントロール要素は、ＲＡＧ１転写コントロール要素、ＲＡＧ２転写コントロール要素、免疫グロブリン重鎖転写コントロール要素、免疫グロブリンκ軽鎖転写コントロール要素、免疫グロブリンλ軽鎖転写コントロール要素、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
いくつかの実施形態では、外因性ＴｄＴをコードする核酸配列は、免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座、免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座、免疫グロブリン重鎖遺伝子座、ＲＡＧ１遺伝子座、またはＲＡＧ２遺伝子座に位置する。
いくつかの実施形態では、ＴｄＴは、ヒトＴｄＴである。いくつかの実施形態では、ＴｄＴは、ＴｄＴの短いアイソフォーム（ＴｄＴＳ）である。
いくつかの実施形態では、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、挿入点の近くの非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖エンハンサー領域（またはエンハンサー配列）（例えば、非ヒト免疫グロブリンκイントロンエンハンサー及び／または非ヒト免疫グロブリンκ３’エンハンサー）の全体性を維持する方法で内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に導入される。よって、そのような非ヒト動物は、ヒト及び非ヒト免疫グロブリンλ軽鎖配列（例えば、ヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメント、及び非ヒトＣλまたはＣκ）に機能可能に連結されたまたはヒト免疫グロブリンλ軽鎖配列（例えば、ヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメント、及びヒトＣλまたはＣκ）に機能可能に連結された野生型免疫グロブリンκ軽鎖エンハンサー領域（またはエンハンサー配列）を有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される１つ以上のヒト免疫グロブリンλ軽鎖配列で変化、移動、破壊、欠失、置換または修飾された非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座は、ネズミ科動物免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される１つ以上のヒト免疫グロブリンλ軽鎖配列は、前記非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の２つのコピーのうちの非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の１つのコピー（すなわち、アレル）に挿入され、ヒト免疫グロブリンκ軽鎖配列に関してヘテロ接合性である非ヒト動物がもたらされる。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される１つ以上のヒト免疫グロブリンλ軽鎖配列を含む免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座についてホモ接合性である非ヒト動物が提供される。
いくつかの実施形態では、内因性非ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座の１つ以上の内因性非ヒト免疫グロブリンλ軽鎖配列（またはその一部）は欠失されない。いくつかの実施形態では、内因性非ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座の１つ以上の内因性非ヒト免疫グロブリンλ軽鎖配列（またはその一部）は欠失される。いくつかの実施形態では、内因性非ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座の１つ以上の内因性非ヒト免疫グロブリンλ軽鎖配列（例えば、Ｖ、Ｊ及び／またはＣまたはそれらの任意の組み合わせ）は、前記非ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座が機能的にサイレンシングされるように変化、移動、破壊、欠失、または置換される。いくつかの実施形態では、内因性非ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座の１つ以上の内因性非ヒト免疫グロブリンλ軽鎖配列（例えば、Ｖ、Ｊ及び／またはＣまたはそれらの任意の組み合わせ）は、前記非ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座が機能的に不活性化される（すなわち、本明細書に記載される非ヒト動物の抗体レパートリーで発現される及び／または検出可能である抗体の機能性軽鎖の生成が不可能になる）ようにターゲティングベクターで変化、移動、破壊、欠失、または置換される。内因性非ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座の不活性化のためのガイダンスは、例えば、米国特許第９，００６，５１１号（例えば、図２参照）（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で提供されている。
修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座または導入遺伝子（例えば、本明細書に記載される限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む）またはその発現産物は、例えば、ＰＣＲ、サザンブロット、制限断片長多型（ＲＦＬＰ）、アレルの獲得または喪失アッセイ、ウエスタンブロット、ＦＡＣＳ分析などを含む多様な方法を使用して検出され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に関してヘテロ接合性である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に関して半接合性である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座または導入遺伝子の１つ以上のコピーを含有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織は、図面に示されているように修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含有する。
本開示は、本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織が、その抗体選択及び生成メカニズム（例えば、組換え及び体細胞超変異）においてそのゲノムに含まれるヒト重鎖、及びλ軽鎖可変領域遺伝子セグメントを利用することを認識する。このように、様々な実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織によって生成されるヒト免疫グロブリンヒト重鎖及びλ軽鎖可変ドメインは、それらのゲノムにそれぞれ含まれるヒト重鎖及びλ軽鎖可変領域遺伝子セグメントまたはその体細胞超変異バリアントによってコードされる。
いくつかの実施形態では、非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）であって、そのゲノムは、修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、非ヒト動物は、体細胞超変異したヒト重鎖可変領域配列及び／またはヒトλ軽鎖可変領域配列を含むＢ細胞を含む、非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）が提供される。いくつかの実施形態では、本開示の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）のＢ細胞に存在するヒト重鎖可変領域配列及び／またはヒトλ軽鎖は、１、２、３、４、５、またはそれ以上の体細胞超変異を有する。当業者は、成熟抗体配列における遺伝子セグメント源を同定するための方法を知っている。例えば、例として、ＤＮＡＰＬＯＴ、ＩＭＧＴ／Ｖ－ＱＵＥＳＴ、ＪＯＩＮＳＯＬＶＥＲ、ＳｏＤＡ、及びＡｂ－ｏｒｉｇｉｎなどの様々なツールがこの分析において補助するために利用可能である。
本開示は、とりわけ、本明細書に記載の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラット、マウス）からの細胞及び組織を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物からの脾細胞（及び／または他のリンパ組織）が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物からのＢ細胞が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物からのプロＢ細胞が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物からのプレＢ細胞が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物からの未熟Ｂ細胞が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物からの成熟ナイーブＢ細胞が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物からの活性化Ｂ細胞が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物からのメモリーＢ細胞が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物からのＢ系統リンパ球が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物からの血漿または血漿細胞が提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物からの幹細胞が提供される。いくつかの実施形態では、幹細胞は、胚性幹細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物からの胚細胞が提供される。いくつかの実施形態では、胚細胞は、卵母細胞である。いくつかの実施形態では、胚細胞は、精子細胞である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物からの精子細胞は、１つ以上のＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片を発現する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物からの任意の細胞または組織は、単離され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物からの単離された細胞及び／または単離された組織が提供される。いくつかの実施形態では、ハイブリドーマが提供され、ハイブリドーマは、本明細書に記載される非ヒト動物のＢ細胞を用いて作製される。いくつかの実施形態では、ハイブリドーマは、対象となる抗原で免疫された非ヒト動物のＢ細胞を用いて作製される。いくつかの実施形態では、ハイブリドーマは、対象となる抗原上のエピトープに結合する（例えば、特異的に結合する）抗体を発現する非ヒト動物のＢ細胞を用いて作製される。
本明細書に記載される任意の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、非ヒト動物が１つ以上の対象となる抗原に対する免疫反応を起こすのに十分な条件下及び時間、前記１つ以上の対象となる抗原で免疫され得る。当業者は、非ヒト動物を免疫するための方法を知っている。非ヒト動物を免疫するための例示的で非限定的な方法は、米国特許第７，５８２、２９８号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で見ることができる。
本開示は、とりわけ、本明細書に記載される免疫された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、ならびにそれから単離された細胞及び組織を提供する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物は、１つ以上のエピトープを含む抗原での免疫に反応してＢ細胞の集団を生成する。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、対象となる抗原の１つ以上のエピトープに結合する（例えば、特異的に結合する）抗体を発現するＢ細胞の集団を生成する。いくつかの実施形態では、抗原に反応して生成されたＢ細胞の集団によって発現される抗体は、ヒト重鎖可変領域配列によってコードされるヒト重鎖可変ドメインを有する重鎖及び／または本明細書に記載されるヒトラムダ軽鎖可変領域配列によってコードされるヒトラムダ軽鎖可変ドメインを有するラムダ軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、抗原に反応して生成されたＢ細胞の集団によって発現される抗体は、（ｉ）ヒト重鎖可変領域配列によってコードされるヒト重鎖可変ドメインを有する重鎖、及び（ｉｉ）本明細書に記載されるヒトラムダ軽鎖可変領域配列によってコードされるヒトラムダ軽鎖可変ドメインを有するラムダ軽鎖を含む。
いくつかの実施形態では、非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、対象となる抗原の１つ以上のエピトープに結合する抗体を発現するＢ細胞の集団を生成し、抗原に反応して生成されたＢ細胞の集団によって発現される抗体は、（ｉ）ヒト重鎖可変領域配列によってコードされるヒト重鎖可変ドメインを有する重鎖、及び（ｉｉ）本明細書に記載されるヒトラムダ軽鎖可変領域配列によってコードされるヒトラムダ軽鎖可変ドメインを有するラムダ軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるヒト重鎖可変領域配列及び／またはヒトλ軽鎖可変領域配列は、体細胞超変異している。いくつかの実施形態では、抗原に反応して生成されたＢ細胞の集団におけるＢ細胞の少なくとも約５％、１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％は、体細胞超変異したヒト重鎖可変領域配列及び／またはヒトλ軽鎖可変領域配列を含む。
特定の例示的な実施形態－免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座
いくつかの実施形態では、提供される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、非ヒトまたはヒトＣλ遺伝子セグメントの上流に挿入され、それに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、非ヒトまたはヒトＣλ遺伝子セグメントは、非ヒトＣκ遺伝子の代わりに挿入されている。本明細書に記載されるように、そのような修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座は、非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖エンハンサー領域（またはエンハンサー配列）をさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）は、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座のクラスターＡにおいて現れるヒトＶλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）は、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座のクラスターＢにおいて現れるヒトＶλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）は、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座のクラスターＣにおいて現れるヒトＶλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）は、Ｖλ４－６９、Ｖλ８－６１、Ｖλ４－６０、Ｖλ６－５７、Ｖλ１０－５４、Ｖλ５－５２、Ｖλ１－５１、Ｖλ９－４９、Ｖλ１－４７、Ｖλ７－４６、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ７－４３、Ｖλ１－４０、Ｖλ５－３７、Ｖλ１－３６、Ｖλ３－２７、Ｖλ３－２５、Ｖλ２－２３、Ｖλ３－２２、Ｖλ３－２１、Ｖλ３－１９、Ｖλ２－１８、Ｖλ３－１６、Ｖλ２－１４、Ｖλ３－１２、Ｖλ２－１１、Ｖλ３－１０、Ｖλ３－９、Ｖλ２－８、Ｖλ４－３、及びＶλ３－１からなる群から選択されるヒトＶλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）は、Ｖλ５－５２、Ｖλ１－５１、Ｖλ９－４９、Ｖλ１－４７、Ｖλ７－４６、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ７－４３、Ｖλ１－４０、Ｖλ５－３９、Ｖλ５－３７、Ｖλ１－３６、Ｖλ３－２７、Ｖλ３－２５、Ｖλ２－２３、Ｖλ３－２２、Ｖλ３－２１、Ｖλ３－１９、Ｖλ２－１８、Ｖλ３－１６、Ｖλ２－１４、Ｖλ３－１２、Ｖλ２－１１、Ｖλ３－１０、Ｖλ３－９、Ｖλ２－８、Ｖλ４－３、及びＶλ３－１からなる群から選択されるヒトＶλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）は、Ｖλ５－５２、Ｖλ１－５１、Ｖλ９－４９、Ｖλ１－４７、Ｖλ７－４６、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ７－４３、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２７、Ｖλ３－２５、Ｖλ２－２３、Ｖλ３－２２、Ｖλ３－２１、Ｖλ３－１９、Ｖλ２－１８、Ｖλ３－１６、Ｖλ２－１４、Ｖλ３－１２、Ｖλ２－１１、Ｖλ３－１０、Ｖλ３－９、Ｖλ２－８、Ｖλ４－３、及びＶλ３－１からなる群から選択されるヒトＶλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）は、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、及びＶλ２－１４からなる群から選択されるヒトＶλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）は、Ｖλ１－５１、Ｖλ１－４０、及びＶλ２－１４からなる群から選択されるヒトＶλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、修飾されたκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）は、Ｖλ１－５１またはＶλ２－１４から選択されるヒトＶλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）は、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７からなる群から選択されるヒトＪλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）は、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、及びＪλ７からなる群から選択されるヒトＪλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む。いくつかの実施形態では、修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）は、ヒトＪλ２遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む。
本開示は、本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）が、その抗体選択及び生成メカニズム（例えば、組換え及び体細胞超変異）においてそのゲノムに含まれるヒトλ軽鎖可変領域遺伝子セグメントを利用することを認識する。このように、様々な実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物によって生成されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインは、それらのゲノムに含まれるヒトλ軽鎖可変領域遺伝子セグメントまたはその体細胞超変異バリアントによってコードされる。
いくつかの実施形態では、非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）であって、そのゲノムは、修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、非ヒト動物は、体細胞超変異したヒト重鎖可変領域配列、及び／またはヒトλ軽鎖可変領域配列を含むＢ細胞を含む、非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）が提供される。いくつかの実施形態では、本開示の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）のＢ細胞に存在するヒト重鎖可変領域配列、及び／またはヒトλ軽鎖可変領域配列は、１、２、３、４、５、またはそれ以上の体細胞超変異を有する。当業者は、成熟抗体配列における遺伝子セグメント源を同定するための方法を知っている。例えば、例として、ＤＮＡＰＬＯＴ、ＩＭＧＴ／Ｖ－ＱＵＥＳＴ、ＪＯＩＮＳＯＬＶＥＲ、ＳｏＤＡ、及びＡｂ－ｏｒｉｇｉｎなどの様々なツールがこの分析において補助するために利用可能である。
多くの実施形態では、修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）は、野生型免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）において現れる非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖エンハンサー領域（またはエンハンサー配列）を含有する。いくつかの実施形態では、修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）は、異なる種（例えば、異なるげっ歯類種）の野生型免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）において現れる非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖エンハンサー領域（またはエンハンサー配列）を含有する。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、その生殖細胞系列ゲノムにおいて、１つ以上の非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖エンハンサー（すなわち、エンハンサー配列またはエンハンサー領域）に機能可能に連結された限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリー（例えば、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域）を含む。いくつかの所定の実施形態では、前記限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリー（例えば、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域）は、ネズミ科動物免疫グロブリンκ軽鎖イントロンエンハンサー領域（Ｉｇκ ＥｉまたはＥｉκ）に機能可能に連結されている。いくつかの所定の実施形態では、前記限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリー（例えば、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域）は、ネズミ科動物免疫グロブリンκ軽鎖３’エンハンサー領域（Ｉｇκ ３’Ｅまたは３’Ｅκ）に機能可能に連結されている。いくつかの所定の実施形態では、前記限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリー（例えば、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域）は、ネズミ科動物Ｅｉκに機能可能に連結されており、ネズミ科動物３’Ｅκに機能可能に連結されている。
いくつかの実施形態では、修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）の非ヒトＣλ遺伝子は、例えば、マウスＣλ遺伝子またはラットＣλ遺伝子などのげっ歯類Ｃλ遺伝子である。いくつかの所定の実施形態では、修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）の非ヒトＣλ遺伝子は、１２９系統、ＢＡＬＢ／ｃ系統、Ｃ５７ＢＬ／６系統、掛け合わされた１２９×Ｃ５７ＢＬ／６系統またはそれらの組み合わせを含む遺伝的背景からのマウスＣλ遺伝子であり、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）の非ヒトＣλ遺伝子は、配列番号１（マウスＣλ１）、配列番号２（マウスＣλ２）または配列番号３（マウスＣλ３）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）の非ヒトＣλ遺伝子は、配列番号１（マウスＣλ１）、配列番号２（マウスＣλ２）または配列番号３（マウスＣλ３）と実質的に同一または同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）の非ヒトＣλ遺伝子は、マウスＣλ１遺伝子の配列であり、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）に位置する配列によってコードされる非ヒトＣλドメインは、配列番号４（マウスＣλ１）、配列番号５（マウスＣλ２）または配列番号６（マウスＣλ３）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）に位置する配列によってコードされる非ヒトＣλドメインは、配列番号４（マウスＣλ１）、配列番号５（マウスＣλ２）または配列番号６（マウスＣλ３）と実質的に同一または同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）に位置する配列によってコードされる非ヒトＣλ遺伝子は、マウスＣλ１ドメインポリペプチドであり、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）の非ヒトＣλ遺伝子は、配列番号７（ラットＣλ１）、配列番号８（ラットＣλ２）、配列番号９（ラットＣλ３）または配列番号１０（ラットＣλ４）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一の配列を含む。いくつかの所定の実施形態では、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）の非ヒトＣλ遺伝子は、配列番号７（ラットＣλ１）、配列番号８（ラットＣλ２）、配列番号９（ラットＣλ３）または配列番号１０（ラットＣλ４）と実質的に同一または同一の配列を含む。いくつかの所定の実施形態では、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）の非ヒトＣλ遺伝子は、ラットＣλ１遺伝子の配列であり、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）に位置する配列によってコードされる非ヒトＣλドメインは、配列番号１１（ラットＣλ１）、配列番号１２（ラットＣλ２）、配列番号１３（ラットＣλ３）または配列番号１４（ラットＣλ４）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）に位置する配列によってコードされる非ヒトＣλドメインは、配列番号１１（ラットＣλ１）、配列番号１２（ラットＣλ２）、配列番号１３（ラットＣλ３）または配列番号１４（ラットＣλ４）と実質的に同一または同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）に位置する配列によってコードされる非ヒトＣλドメインは、ラットＣλ１ドメインポリペプチドであり、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）のヒトＣλ遺伝子は、例えば、ヒトＣλ１遺伝子、ヒトＣλ２遺伝子、ヒトＣλ３遺伝子、ヒトＣλ６遺伝子またはヒトＣλ７遺伝子などのヒトＣλ遺伝子を含む。いくつかの所定の実施形態では、修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）のヒトＣλ遺伝子は、ヒトＣλ２遺伝子であり、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）のヒトＣλ遺伝子は、配列番号１５（ヒトＣλ１）、配列番号１６（ヒトＣλ２）、配列番号１７（ヒトＣλ３）、配列番号１８（ヒトＣλ６）または配列番号１９（ヒトＣλ７）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）のヒトＣλ遺伝子は、配列番号１５（ヒトＣλ１）、配列番号１６（ヒトＣλ２）、配列番号１７（ヒトＣλ３）、配列番号１８（ヒトＣλ６）または配列番号１９（ヒトＣλ７）と実質的に同一または同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）のヒトＣλ遺伝子は、ヒトＣλ２遺伝子の配列であり、またはそれを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）に位置する配列によってコードされるヒトＣλドメインは、配列番号２０（ヒトＣλ１）、配列番号２１（ヒトＣλ２）、配列番号２２（ヒトＣλ３）、配列番号２３（ヒトＣλ６）または配列番号２４（ヒトＣλ７）と少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）に位置する配列によってコードされるヒトＣλドメインは、配列番号２０（ヒトＣλ１）、配列番号２１（ヒトＣλ２）、配列番号２２（ヒトＣλ３）、配列番号２３（ヒトＣλ６）または配列番号２４（ヒトＣλ７）と実質的に同一または同一の配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（またはアレル）に位置する配列によってコードされるヒトＣλドメインは、ヒトＣλ２ドメインポリペプチドであり、またはそれを含む。
特定の例示的な実施形態－免疫グロブリン重鎖遺伝子座
いくつかの実施形態では、提供される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、本明細書に記載される限られたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域レパートリー（例えば、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域）を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、生殖細胞系列構成で配列され、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された複数のヒトＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメント、エンハンサー及び制御領域の存在を特徴とする修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座（またはアレル）をさらに含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座（またはアレル）は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域に機能可能に連結された１つ以上のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のヒトＤＨ遺伝子セグメント及び１つ以上のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。いくつかの所定の実施形態では、修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座（またはアレル）は、少なくともヒトＶＨ遺伝子セグメントＶＨ３－７４、ＶＨ３－７３、ＶＨ３－７２、ＶＨ２－７０、ＶＨ１－６９、ＶＨ３－６６、ＶＨ３－６４、ＶＨ４－６１、ＶＨ４－５９、ＶＨ１－５８、ＶＨ３－５３、ＶＨ５－５１、ＶＨ３－４９、ＶＨ３－４８、ＶＨ１－４６、ＶＨ１－４５、ＶＨ３－４３、ＶＨ４－３９、ＶＨ４－３４、ＶＨ３－３３、ＶＨ４－３１、ＶＨ３－３０、ＶＨ４－２８、ＶＨ２－２６、ＶＨ１－２４、ＶＨ３－２３、ＶＨ３－２１、ＶＨ３－２０、ＶＨ１－１８、ＶＨ３－１５、ＶＨ３－１３、ＶＨ３－１１、ＶＨ３－９、ＶＨ１－８、ＶＨ３－７、ＶＨ２－５、ＶＨ７－４－１、ＶＨ４－４、ＶＨ１－３、ＶＨ１－２、ＶＨ６－１、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの所定の実施形態では、修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座（またはアレル）は、少なくともヒトＤＨ遺伝子セグメントＤＨ１－１、ＤＨ２－２、ＤＨ３－３、ＤＨ４－４、ＤＨ５－５、ＤＨ６－６、ＤＨ１－７、ＤＨ２－８、ＤＨ３－９、ＤＨ３－１０、ＤＨ５－１２、ＤＨ６－１３、ＤＨ２－１５、ＤＨ３－１６、ＤＨ４－１７、ＤＨ６－１９、ＤＨ１－２０、ＤＨ２－２１、ＤＨ３－２２、ＤＨ６－２５、ＤＨ１－２６、ＤＨ７－２７、またはそれらの任意の組み合わせを含む。いくつかの所定の実施形態では、修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座（またはアレル）は、少なくともヒトＪＨ遺伝子セグメントＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、ＪＨ６、またはそれらの任意の組み合わせを含む。
本開示は、本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）が、その抗体選択及び生成メカニズム（例えば、組換え及び体細胞超変異）においてそのゲノムに含まれるヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントを利用することを認識する。このように、様々な実施形態では、本明細書に記載の非ヒト動物によって生成されるヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインは、それらのゲノムに含まれるヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントまたはその体細胞超変異バリアントによってコードされる。
いくつかの実施形態では、非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、体細胞超変異したヒト重鎖可変領域配列、及び／またはヒトλ軽鎖可変領域配列を含むＢ細胞を含む。いくつかの実施形態では、本開示の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）のＢ細胞に存在するヒト重鎖可変領域配列、及び／またはヒトλ軽鎖可変領域配列は、１、２、３、４、５、またはそれ以上の体細胞超変異を有する。当業者は、成熟抗体配列における遺伝子セグメント源を同定するための方法を知っている。例えば、例として、ＤＮＡＰＬＯＴ、ＩＭＧＴ／Ｖ－ＱＵＥＳＴ、ＪＯＩＮＳＯＬＶＥＲ、ＳｏＤＡ、及びＡｂ－ｏｒｉｇｉｎなどの様々なツールがこの分析において補助するために利用可能である。
いくつかの実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域は、例えば、免疫グロブリンＭ（ＩｇＭ）、免疫グロブリンＤ（ＩｇＤ）、免疫グロブリンＧ（ＩｇＧ）、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）及び免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）などの１つ以上の非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子を含む。いくつかの所定の実施形態では、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域は、げっ歯類ＩｇＭ、げっ歯類ＩｇＤ、げっ歯類ＩｇＧ３、げっ歯類ＩｇＧ１、げっ歯類ＩｇＧ２ｂ、げっ歯類ＩｇＧ２ａ、げっ歯類ＩｇＥ及びげっ歯類ＩｇＡ定常領域遺伝子を含む。いくつかの実施形態では、前記ヒトＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントは、１つ以上の非ヒト免疫グロブリン重鎖エンハンサー（すなわち、エンハンサー配列またはエンハンサー領域）に機能可能に連結されている。いくつかの実施形態では、前記ヒトＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントは、１つ以上の非ヒト免疫グロブリン重鎖制御領域（または制御配列）に機能可能に連結されている。いくつかの実施形態では、前記ヒトＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントは、１つ以上の非ヒト免疫グロブリン重鎖エンハンサー（またはエンハンサー配列）及び１つ以上の非ヒト免疫グロブリン重鎖制御領域（または制御配列）に機能可能に連結されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、内因性Ａｄａｍ６遺伝子を含有しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、同じ種の野生型非ヒト動物の生殖細胞系列ゲノムに見られるものと同じ生殖細胞系列ゲノム位置において内因性Ａｄａｍ６遺伝子（またはＡｄａｍ６をコードする配列）を含有しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子を含有しない。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、１つ以上の非ヒト（例えば、げっ歯類）Ａｄａｍ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする少なくとも１つのヌクレオチド配列の挿入を含む。いくつかの実施形態では、前記挿入は、本明細書に記載される修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の外（例えば、限定されないが、最も５’側のＶＨ遺伝子セグメントの上流）、修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の中または非ヒト動物（例えば、限定されないが、ランダムに導入された非ヒトＡｄａｍ６コード配列）、細胞または組織の生殖細胞系列ゲノムにおける他の個所に存在し得る。
様々な実施形態では、本明細書に記載される提供される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、抗体分子において内因性非ヒトＶＨ領域を全体としてまたは部分的に検出可能に発現しない。様々な実施形態では、本明細書に記載される提供される非ヒト動物は、抗体分子において内因性非ヒトＶＨ領域（例えば、ＶＨ、ＤＨ及び／またはＪＨ）を全体としてまたは部分的にコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含有しない（または欠く、もしくはその欠失を含有する）。様々な実施形態では、本明細書に記載される提供される非ヒト動物は、内因性非ヒトＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントの欠失を全体としてまたは部分的に含む生殖細胞系列ゲノムを有する。様々な実施形態では、提供される非ヒト動物は、繁殖可能である。
そのような修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座（またはアレル）を保有するターゲティングベクター、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞及び動物の作製のためのガイダンスは、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ（２０１４）、米国特許第６，５９６，５４１号、第８，６４２，８３５号、第８，６９７，９４０号及び第８，７９１，３２３号（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で見ることができる。当業者は、非ヒト（例えば、哺乳動物）ゲノムのそのような遺伝子修飾及び／または操作を達成するための、または非ヒト動物の生殖細胞系列ゲノムに導入するためのそのような配列を調製、提供、または製造するための当該技術分野で知られている多様な技術を知っている。
特定の例示的な実施形態－免疫グロブリン遺伝子座の組み合わせ
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、その生殖細胞系列ゲノムにおいて、本明細書に記載される限られたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域レパートリー（例えば、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域）を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、ヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントまたは他のヒトまたはヒト化遺伝子（例えば、ＴｄＴをコードするヒト遺伝子）を（例えば、交雑または複数遺伝子標的化ストラテジーを介して）含む１つ以上の追加の免疫グロブリン遺伝子座をさらに含む。そのような非ヒト動物は、非ヒト動物の意図された使用に応じて所望の修飾された遺伝子型を達成するために、上述したように、または当該技術分野で知られている方法を使用して調製され得る。他の免疫グロブリン遺伝子座における追加のヒト免疫グロブリン遺伝子セグメントまたは他のヒトまたはヒト化遺伝子（例えば、ＴｄＴをコードするヒト遺伝子）は、上述した遺伝子改変を有する細胞（例えば、胚性幹細胞）のゲノムのさらなる変化を介してまたは所望に応じて他の遺伝子改変された系統との当該技術分野で知られている交配技術を介して導入され得る。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、その生殖細胞系列ゲノムにおいて、本明細書に記載される限られたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域レパートリー（例えば、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域）を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、その生殖細胞系列ゲノムにおいて、１つ以上の非ヒト動物免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された１つ以上のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のヒトＤ遺伝子セグメント、及び１つ以上のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座をさらに含む。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、本明細書に記載される限られたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域レパートリー（例えば、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域）を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座についてヘテロ接合性またはホモ接合性である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、本明細書に記載される修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性またはホモ接合性である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、本明細書に記載される限られたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域レパートリー（例えば、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域）を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座についてホモ接合性であり、本明細書に記載される修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてホモ接合性である。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、その生殖細胞系列ゲノムにおいて、本明細書に記載される限られたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域レパートリー（例えば、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域）を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座、１つ以上の非ヒト動物免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された１つ以上のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のヒトＤ遺伝子セグメント、及び１つ以上のヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、機能的に不活性化した（例えば、全体としてまたは部分的に欠失した、またはそうでなければ非機能性とされた）内因性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座をさらに含む。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、本明細書に記載される限られたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域レパートリー（例えば、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域）を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座についてヘテロ接合性またはホモ接合性である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、本明細書に記載される修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてヘテロ接合性またはホモ接合性である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、機能的に不活性化した（例えば、全体としてまたは部分的に欠失した、またはそうでなければ非機能性とされた）内因性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座についてヘテロ接合性またはホモ接合性である。いくつかの実施形態では、非ヒト動物は、本明細書に記載される限られたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域レパートリー（例えば、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域）を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座についてホモ接合性であり、本明細書に記載される修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてホモ接合性であり、機能的に不活性化した（例えば、全体としてまたは部分的に欠失した、またはそうでなければ非機能性とされた）内因性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座についてホモ接合性である。
いくつかの実施形態では、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）である遺伝子改変された非ヒト動物の生殖細胞系列ゲノムは、２つのアレルを含む修飾された内因性免疫グロブリンκ遺伝子座を含む。いくつかの実施形態では、第１のアレルは、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含み、第２のアレルは、限られたヒトκ軽鎖可変領域レパートリーを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変されたげっ歯類（例えば、マウスまたはラット）、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）細胞またはげっ歯類（例えば、マウスまたはラット）組織の生殖細胞系列ゲノムは、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む第１の修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座アレルを含み、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変されたげっ歯類（例えば、マウスまたはラット）、及びそれによるげっ歯類（例えば、マウスまたはラット）細胞またはげっ歯類（例えば、マウスまたはラット）組織は、げっ歯類（例えば、マウスまたはラット）Ｃκ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変領域を含む第２の修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座アレルを含み、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変領域は、ヒトＶκ遺伝子セグメント及びヒトＪκ遺伝子セグメントを含む。いくつかの実施形態では、そのようなげっ歯類（例えば、マウスまたはラット）組織は、第１の修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座アレルからλ軽鎖及び第２の修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座アレルからκ軽鎖を発現し得る。いくつかの実施形態では、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変領域は、Ｖκ３－２０またはＶκ１－３９を含み、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、Ｖλ１－５１またはＶλ２－１４を含む。一実施形態では、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンκ軽鎖可変領域は、Ｖκ３－２０／Ｊκ１であり、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、Ｖλ１－５１／Ｊλ２またはＶλ２－１４／Ｊλ２である。
いくつかの実施形態では、提供される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、（ａ）非ヒト動物が非ヒトＣＨドメイン配列に融合されたヒトＶＨドメイン配列を含む免疫グロブリン重鎖を発現するように、１つ以上の内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域に機能可能に連結されたヒトＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントを含むホモ接合性またはヘテロ接合性免疫グロブリン重鎖遺伝子座；（ｂ）非ヒト動物が非ヒトＣλドメイン配列に融合されたヒトＶλドメイン配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現するように、非ヒト（例えば、げっ歯類）免疫グロブリンＣλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖を含む免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む生殖細胞系列ゲノムを有する。
いくつかの実施形態では、提供される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、（ａ）非ヒト動物が非ヒトＣＨドメイン配列に融合されたヒトＶＨドメイン配列を含む免疫グロブリン重鎖を発現するように、１つ以上の内因性非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域に機能可能に連結されたヒトＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントを含むホモ接合性またはヘテロ接合性免疫グロブリン重鎖遺伝子座；（ｂ）非ヒト動物が非ヒトＣλドメイン配列に融合されたヒトＶλドメイン配列を含む免疫グロブリン軽鎖を発現するように、非ヒト（例えば、げっ歯類）免疫グロブリンＣλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖を含む免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座；及び（ｃ）全体としてまたは部分的に機能的に不活性化または欠失したホモ接合性またはヘテロ接合性の内因性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座を含む生殖細胞系列ゲノムを有する。
例えば、本明細書に記載されるように、本明細書に記載される修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む非ヒト動物は、（例えば、交雑または複数遺伝子標的化ストラテジーを介して）米国特許第８，６４２，８３５号、第８，６９７，９４０号、第９，００６，５１１号、第９，０３５，１２８号、第９，０６６，５０２号、第９，１５０，６６２号及び第９，１６３，０９２号（これらの各々は、その全体が参照により組み込まれる）に記載される１つ以上の改変をさらに含み得る。
核酸コンストラクト
典型的には、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖配列（例えば、単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域、または１つもしくは２つの非再編成Ｖλ遺伝子セグメントと少なくとも１つの非再編成Ｊλ遺伝子セグメント）、またはその部分（複数可）を含有するポリヌクレオチド分子が、宿主細胞においてポリヌクレオチド分子を複製するために、ベクター、好ましくはＤＮＡベクターと連結される（例えば、それに挿入される）。
ヒト免疫グロブリンλ軽鎖配列は、既知の配列または源（例えば、ライブラリ）から直接的にクローニングされ、ＧｅｎＢａｎｋから利用可能な公開された配列または他の公共に利用可能なデータベース（例えば、ＩＭＧＴ）に基づいてｉｎ ｓｉｌｉｃｏで設計された生殖細胞系列配列から合成され得る。代替的には、細菌人工染色体（ＢＡＣ）ライブラリは、対象となる免疫グロブリンＤＮＡ配列（例えば、ヒトＶλ及びＪλ配列ならびにそれらの組み合わせ）を提供し得る。ＢＡＣライブラリは、１００～１５０ｋｂのインサートサイズを含有し得、３００ｋｂもの大きさのインサートを保有することが可能である（Ｓｈｉｚｕｙａ，ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，ＵＳＡ ８９：８７９４－８７９７；Ｓｗｉａｔｅｋ，ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ７：２０７１－２０８４；Ｋｉｍ，ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ３４ ２１３－２１８（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる））。例えば、１６４～１９６ｋｂの平均インサートサイズを有するヒトＢＡＣライブラリが記載されている（Ｏｓｏｅｇａｗａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．１１（３）：４８３－９６；Ｏｓｏｅｇａｗａ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ５２：１－８，Ａｒｔｉｃｌｅ Ｎｏ．ＧＥ９８５４２３（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる））。ヒト及び非ヒト動物ゲノムＢＡＣライブラリが構築されており、市販されている（例えば、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）。ゲノムＢＡＣライブラリはまた、免疫グロブリンＤＮＡ配列及び転写コントロール領域の源として機能し得る。
代替的には、免疫グロブリンＤＮＡ配列は、酵母人工染色体（ＹＡＣ）から単離され、クローニングされ、及び／または移行され得る。例えば、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座のヌクレオチド配列が決定されている（例えば、Ｄｕｎｈａｍ，Ｉ．ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｎａｔｕｒｅ ４０２：４８９－９５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照）。さらに、ＹＡＣは、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座導入遺伝子を構築するために以前から用いられている（例えば、Ｐｏｐｏｖ，Ａ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｇｅｎｅ １７７：１９５－２０１；Ｐｏｐｏｖ，Ａ．Ｖ．ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８９（１０）：１６１１－１９（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照）。免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座全体（ヒトまたは非ヒト）がクローニングされ、いくつかのＹＡＣ内に含有され得る。含まれる配列にかかわらず、複数のＹＡＣが用いられ、重複する類似領域を含有する場合、それらは酵母宿主系統内で組み換えられて、遺伝子座全体または遺伝子座の所望の部分（例えば、ターゲティングベクターで標的とされる領域）を表す単一のコンストラクトが生成され得る。ＹＡＣアームは、当該技術分野で知られている及び／または本明細書に記載される方法によってコンストラクトを胚性幹細胞または胚に導入する際に補助するために哺乳動物選択カセットでの改良によって追加的に改変され得る。
本明細書に記載される修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の構築において使用するためのヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子セグメントのＤＮＡ及びアミノ酸配列は、公開されているデータベース（例えば、ＧｅｎＢａｎｋ、ＩＭＧＴなど）及び／または公開されている抗体配列から得られ得る。
いくつかの所定の実施形態では、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子セグメント（例えば、単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域、または１つもしくは２つの非再編成Ｖλ遺伝子セグメントと少なくとも１つの非再編成Ｊλ遺伝子セグメント）を含有する核酸コンストラクトは、ヒトまたは非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）免疫グロブリンλまたは免疫グロブリンκ軽鎖定常領域（それぞれＣλまたはＣκ）遺伝子に機能可能に連結されている。いくつかの所定の実施形態では、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子セグメント（例えば、単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域、または１つもしくは２つの非再編成Ｖλ遺伝子セグメントと少なくとも１つの非再編成Ｊλ遺伝子セグメント）を含有する核酸コンストラクトは、１つ以上の非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）免疫グロブリンκまたは免疫グロブリンλ軽鎖エンハンサー領域（またはエンハンサー配列）に機能可能に連結されている。いくつかの実施形態では、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子セグメント（例えば、単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域、または１つもしくは２つの非再編成Ｖλ遺伝子セグメントと少なくとも１つの非再編成Ｊλ遺伝子セグメント）を含有する核酸コンストラクトは、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）またはヒトＣλ領域遺伝子及び非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖エンハンサー領域（またはエンハンサー配列）に機能可能に連結されている。
いくつかの実施形態では、非再編成ヒトＶλ及びＪλ配列を含有する核酸コンストラクトは、ヒト及び／またはネズミ科動物起源の遺伝子間ＤＮＡをさらに含む。いくつかの実施形態では、遺伝子間ＤＮＡは、ノンコーディングネズミ科動物免疫グロブリンκ軽鎖配列、ノンコーディングヒト免疫グロブリンκ軽鎖配列、ノンコーディングネズミ科動物免疫グロブリンλ軽鎖配列、ノンコーディングヒト免疫グロブリンλ軽鎖配列、またはそれらの組み合わせであり、またはそれを含む。
核酸コンストラクトは、当該技術分野で知られている方法を使用して調製され得る。例えば、核酸コンストラクトは、より大きなプラスミドの一部として調製され得る。そのような調製は、当該技術分野で知られているように効率的な方法で正確な構築物のクローニング及び選択を可能にする。本明細書に記載されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖配列を全体としてまたは部分的に含有する核酸コンストラクトは、それらが所望の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）への組み込みのために残存プラスミド配列から単離され得るように、プラスミド上の制限部位間に配置され得る。
核酸コンストラクト（例えば、プラスミド）の調製及び宿主生物の形質転換において用いられる様々な方法が当該技術分野で知られている。原核生物及び真核細胞の両方のための他の好適な発現系、ならびに一般的な組換え手順については、Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ：Ａｎ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ，５ｔｈ Ｅｄ．，ｅｄ．Ｂｙ Ｏｌｄ，Ｒ．Ｗ．ａｎｄ Ｓ．Ｂ．Ｐｒｉｍｒｏｓｅ，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．，１９９４ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，ｅｄ．ｂｙ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ：１９８９（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）を参照されたい。
ターゲティングベクター
ターゲティングベクターは、核酸コンストラクトを標的ゲノム遺伝子座に導入するために用いられ得る。ターゲティングベクターは、核酸コンストラクト及び前記核酸コンストラクトを挟むホモロジーアームを含み得；当業者は、ターゲティングベクターの設計、構造、及び／または使用に一般的に適用可能な多様なオプション及び特徴を知っている。例えば、ターゲティングベクターは、線状形態または環状形態であり得、それらは一本鎖または二本鎖であり得る。ターゲティングベクターは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）またはリボ核酸（ＲＮＡ）であり得る。参照を容易にするため、ホモロジーアームは、本明細書では５’及び３’（すなわち、上流及び下流）ホモロジーアームと称される。この専門用語は、ターゲティングベクター内の核酸コンストラクトに対するホモロジーアームの相対的位置に関する。５’及び３’ホモロジーアームは、標的とされる遺伝子座内の領域にまたは別のターゲティングベクター内の領域に対応し、これは、本明細書では「５’標的配列」及び「３’標的配列」とそれぞれ称される。いくつかの実施形態では、ホモロジーアームはまた、５’または３’標的配列として機能し得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、互いに組み換えることが可能な２つ、３つまたはそれ以上のターゲティングベクターを用いる。様々な実施形態では、ターゲティングベクターは、本明細書の他の箇所に記載されているように、大きなターゲティングベクター（ＬＴＶＥＣ）である。いくつかの実施形態では、第１、第２、及び第３のターゲティングベクターはそれぞれ、５’及び３’ホモロジーアームを含む。第１のターゲティングベクターの３’ホモロジーアームは、第２のターゲティングベクターの５’ホモロジーアームと重複する配列（すなわち、重複配列）を含み、これは、第１及び第２のＬＴＶＥＣ間の相同組換えを可能にする。
二重標的化方法では、第１のターゲティングベクターの５’ホモロジーアーム及び第２のターゲティングベクターの３’ホモロジーアームは、標的ゲノム遺伝子座内の対応するセグメント（すなわち、標的配列）に類似し得、これは、第１及び第２のターゲティングベクターの、対応するゲノムセグメントとの相同組換えを促進し、標的ゲノム遺伝子座を改変し得る。
三重標的化方法では、第２のターゲティングベクターの３’ホモロジーアームは、第３のターゲティングベクターの５’ホモロジーアームと重複する配列（すなわち、重複配列）を含み得、これは、第２及び第３のＬＴＶＥＣの間の相同組換えを可能にし得る。第１のターゲティングベクターの５’ホモロジーアーム及び第３のターゲティングベクターの３’ホモロジーアームは、標的ゲノム遺伝子座内の対応するセグメント（すなわち、標的配列）に類似し、これは、第１及び第３のターゲティングベクターの、対応するゲノムセグメントとの相同組換えを促進し、標的ゲノム遺伝子座を改変し得る。
ホモロジーアーム及び標的配列または２つのホモロジーアームは、２つの領域が互いの配列同一性の十分なレベルを共有し、これによりそれらが相同組換え反応のための基質として作用し得る場合、互いに「対応する」または「対応している」。所与の標的配列とターゲティングベクターに見られる対応するホモロジーアーム（すなわち、重複配列）との間または２つのホモロジーアーム間の配列同一性は、相同組換えが生じることを可能にする任意の程度の配列同一性であり得る。例を１つだけ挙げると、ターゲティングベクター（またはその断片）のホモロジーアーム及び別のターゲティングベクターの標的配列または標的ゲノム遺伝子座の標的配列（またはその断片）によって共有される配列同一性の量は、配列が相同組換えを受けるように、例えば、限定されないが、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％または１００％の配列同一性であり得る。
その上、ホモロジーアームと、対応する標的配列との間の類似性（例えば、同一性）の対応する領域は、標的ゲノム遺伝子座で相同組換えを促進するのに十分な任意の長さのものであり得る。例えば、所与のホモロジーアーム及び／または対応する標的配列は、ホモロジーアームが、細胞の標的ゲノム遺伝子座内のまたは別のターゲティングベクター内の対応する標的配列（複数可）との相同組換えを受けるのに十分な類似性を有するように、例えば、限定されないが、長さが約５～１０ｋｂ、５～１５ｋｂ、５～２０ｋｂ、５～２５ｋｂ、５～３０ｋｂ、５～３５ｋｂ、５～４０ｋｂ、５～４５ｋｂ、５～５０ｋｂ、５～５５ｋｂ、５～６０ｋｂ、５～６５ｋｂ、５～７０ｋｂ、５～７５ｋｂ、５～８０ｋｂ、５～８５ｋｂ、５～９０ｋｂ、５～９５ｋｂ、５～１００ｋｂ、１００～２００ｋｂ、または２００～３００ｋｂ（例えば、本明細書の他の個所で記載されている）である類似性の対応する領域を含み得る。いくつかの実施形態では、所与のホモロジーアーム及び／または対応する標的配列は、ホモロジーアームが、細胞の標的ゲノム遺伝子座内のまたは別のターゲティングベクター内の対応する標的配列（複数可）との相同組換えを受けるのに十分な類似性を有するように、例えば、限定されないが、長さが約１０～１００ｋｂ、１５～１００ｋｂ、２０～１００ｋｂ、２５～１００ｋｂ、３０～１００ｋｂ、３５～１００ｋｂ、４０～１００ｋｂ、４５～１００ｋｂ、５０～１００ｋｂ、５５～１００ｋｂ、６０～１００ｋｂ、６５～１００ｋｂ、７０～１００ｋｂ、７５～１００ｋｂ、８０～１００ｋｂ、８５～１００ｋｂ、９０～１００ｋｂ、または９５～１００ｋｂ（例えば、本明細書の他の個所で記載されている）である類似性の対応する領域を含む。
第１のターゲティングベクターの３’ホモロジーアーム及び第２のターゲティングベクターの５’ホモロジーアームの、または第２のターゲティングベクターの３’ホモロジーアーム及び第３のターゲティングベクターの５’ホモロジーアームの重複配列は、前記ターゲティングベクター間の相同組換えを促進するのに十分な任意の長さのものであり得る。例えば、ホモロジーアームの所与の重複配列は、ホモロジーアームの重複配列が別のターゲティングベクター内の対応する重複配列との相同組換えを受けるのに十分な類似性を有するように、長さが約１～５ｋｂ、５～１０ｋｂ、５～１５ｋｂ、５～２０ｋｂ、５～２５ｋｂ、５～３０ｋｂ、５～３５ｋｂ、５～４０ｋｂ、５～４５ｋｂ、５～５０ｋｂ、５～５５ｋｂ、５～６０ｋｂ、５～６５ｋｂ、５～７０ｋｂ、５～７５ｋｂ、５～８０ｋｂ、５～８５ｋｂ、５～９０ｋｂ、５～９５ｋｂ、５～１００ｋｂ、１００～２００ｋｂ、または２００～３００ｋｂである対応する重複領域を含み得る。いくつかの実施形態では、ホモロジーアームの所与の重複配列は、ホモロジーアームの重複配列が別のターゲティングベクター内の対応する重複配列との相同組換えを受けるのに十分な類似性を有するように、長さが約１～１００ｋｂ、５～１００ｋｂ、１０～１００ｋｂ、１５～１００ｋｂ、２０～１００ｋｂ、２５～１００ｋｂ、３０～１００ｋｂ、３５～１００ｋｂ、４０～１００ｋｂ、４５～１００ｋｂ、５０～１００ｋｂ、５５～１００ｋｂ、６０～１００ｋｂ、６５～１００ｋｂ、７０～１００ｋｂ、７５～１００ｋｂ、８０～１００ｋｂ、８５～１００ｋｂ、９０～１００ｋｂ、または９５～１００ｋｂである重複領域を含む。いくつかの実施形態では、重複配列は、１～５ｋｂ（両端含む）である。いくつかの実施形態では、重複配列は、約１ｋｂ～約７０ｋｂ（両端含む）である。いくつかの実施形態では、重複配列は、約１０ｋｂ～約７０ｋｂ（両端含む）である。いくつかの実施形態では、重複配列は、約１０ｋｂ～約５０ｋｂ（両端含む）である。いくつかの実施形態では、重複配列は、少なくとも１０ｋｂである。いくつかの実施形態では、重複配列は、少なくとも２０ｋｂである。例えば、重複配列は、約１ｋｂ～約５ｋｂ（両端含む）、約５ｋｂ～約１０ｋｂ（両端含む）、約１０ｋｂ～約１５ｋｂ（両端含む）、約１５ｋｂ～約２０ｋｂ（両端含む）、約２０ｋｂ～約２５ｋｂ（両端含む）、約約２５ｋｂ～約３０ｋｂ（両端含む）、約３０ｋｂ～約３５ｋｂ（両端含む）、約３５ｋｂ～約４０ｋｂ（両端含む）、約４０ｋｂ～約４５ｋｂ（両端含む）、約４５ｋｂ～約５０ｋｂ（両端含む）、約５０ｋｂ～約６０ｋｂ（両端含む）、約６０ｋｂ～約７０ｋｂ（両端含む）、約７０ｋｂ～約８０ｋｂ（両端含む）、約８０ｋｂ～約９０ｋｂ（両端含む）、約９０ｋｂ～約１００ｋｂ（両端含む）、約１００ｋｂ～約１２０ｋｂ（両端含む）、約１２０ｋｂ～約１４０ｋｂ（両端含む）、約１４０ｋｂ～約１６０ｋｂ（両端含む）、約１６０ｋｂ～約１８０ｋｂ（両端含む）、約１８０ｋｂ～約２００ｋｂ（両端含む）、約２００ｋｂ～約２２０ｋｂ（両端含む）、約２２０ｋｂ～約２４０ｋｂ（両端含む）、約２４０ｋｂ～約２６０ｋｂ（両端含む）、約２６０ｋｂ～約２８０ｋｂ（両端含む）、または約２８０ｋｂ～約３００ｋｂ（両端含む）であり得る。例を１つだけ挙げると、重複配列は、約２０ｋｂ～約６０ｋｂ（両端含む）であり得る。代替的には、重複配列は、少なくとも１ｋｂ、少なくとも５ｋｂ、少なくとも１０ｋｂ、少なくとも１５ｋｂ、少なくとも２０ｋｂ、少なくとも２５ｋｂ、少なくとも３０ｋｂ、少なくとも３５ｋｂ、少なくとも４０ｋｂ、少なくとも４５ｋｂ、少なくとも５０ｋｂ、少なくとも６０ｋｂ、少なくとも７０ｋｂ、少なくとも８０ｋｂ、少なくとも９０ｋｂ、少なくとも１００ｋｂ、少なくとも１２０ｋｂ、少なくとも１４０ｋｂ、少なくとも１６０ｋｂ、少なくとも１８０ｋｂ、少なくとも２００ｋｂ、少なくとも２２０ｋｂ、少なくとも２４０ｋｂ、少なくとも２６０ｋｂ、少なくとも２８０ｋｂ、または少なくとも３００ｋｂであり得る。いくつかの実施形態では、重複配列は、多くとも４００ｋｂ、多くとも３５０ｋｂ、多くとも３００ｋｂ、多くとも２８０ｋｂ、多くとも２６０ｋｂ、多くとも２４０ｋｂ、多くとも２２０ｋｂ、多くとも２００ｋｂ、多くとも１８０ｋｂ、多くとも１６０ｋｂ、多くとも１４０ｋｂ、多くとも１２０ｋｂ、多くとも１００ｋｂ、多くとも９０ｋｂ、多くとも８０ｋｂ、多くとも７０ｋｂ、多くとも６０ｋｂまたは多くとも５０ｋｂであり得る。
ホモロジーアームは、いくつかの実施形態では、細胞に対してネイティブである遺伝子座（例えば、標的とされる遺伝子座）に対応し、または代替的にそれらは、細胞のゲノムに組み込まれたＤＮＡの異種または外因性セグメントの領域（例えば、導入遺伝子、発現カセット、またはＤＮＡの異種もしくは外因性領域を含む）に対応し得る。いくつかの実施形態では、ホモロジーアームは、いくつかの実施形態では、細胞におけるターゲティングベクター上の領域に対応し得る。いくつかの実施形態では、ターゲティングベクターのホモロジーアームは、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体の領域、または適切な宿主細胞に含有される任意の他の修飾された領域に対応し得る。またさらに、ターゲティングベクターのホモロジーアームは、ＢＡＣライブラリ、コスミドライブラリ、またはＰ１ファージライブラリの領域に対応し、またはそれに由来し得る。いくつかの所定の実施形態では、ターゲティングベクターのホモロジーアームは、原核生物、酵母、トリ（例えば、ニワトリ）、非ヒト哺乳動物、げっ歯類、ヒト、ラット、マウス、ハムスター、ウサギ、ブタ、ウシ、シカ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）、飼い慣らされた哺乳動物、農業用哺乳動物、または対象となる任意の他の生物に対してネイティブ、異種、または外因性である遺伝子座に対応する。いくつかの実施形態では、ホモロジーアームは、ヌクレアーゼ物質（例えば、Ｃａｓタンパク質）によって誘導されるニックまたは二本鎖切断の非存在下で、慣用の方法を使用する標的化に対する限られた感受性を示し、または標的とされる部位での相対的に低いレベルの成功裏の組み込み、及び／または有意なレベルのオフターゲット組み込みを示した細胞の遺伝子座に対応する。いくつかの実施形態では、ホモロジーアームは、修飾されたＤＮＡを含むように設計される。
いくつかの実施形態では、ターゲティングベクター（複数可）の５’及び３’ホモロジーアームは、標的とされるゲノムに対応する。代替的には、ホモロジーアームは、関連するゲノムに対応する。例えば、標的とされるゲノムは、第１の系統のマウスゲノムであり、ターゲティングアームは、第２の系統のマウスゲノムに対応し、第１の系統及び第２の系統は異なる。所定の実施形態では、ホモロジーアームは、同じ動物のゲノムに対応し、または同じ系統のゲノムからのものであり、例えば、標的とされるゲノムは、第１の系統のマウスゲノムであり、ターゲティングアームは、同じマウスからのまたは同じ系統からのマウスゲノムに対応する。
ターゲティングベクターのホモロジーアームは、例えば、長さが１～５ｋｂ（両端含む）、５～１０ｋｂ（両端含む）、５～１５ｋｂ（両端含む）、５～２０ｋｂ（両端含む）、５～２５ｋｂ（両端含む）、５～３０ｋｂ（両端含む）、５～３５ｋｂ（両端含む）、５～４０ｋｂ（両端含む）、５～４５ｋｂ（両端含む）、５～５０ｋｂ（両端含む）、５～５５ｋｂ（両端含む）、５～６０ｋｂ（両端含む）、５～６５ｋｂ（両端含む）、５～７０ｋｂ（両端含む）、５～７５ｋｂ（両端含む）、５～８０ｋｂ（両端含む）、５～８５ｋｂ（両端含む）、５～９０ｋｂ（両端含む）、５～９５ｋｂ（両端含む）、５～１００ｋｂ（両端含む）、１００～２００ｋｂ（両端含む）、または２００～３００ｋｂ（両端含む）を含む、対応する標的配列との相同組換え事象を促進するのに十分な任意の長さのものであり得る。いくつかの実施形態では、ターゲティングベクターのホモロジーアームは、長さが１～１００ｋｂ（両端含む）、５～１００ｋｂ（両端含む）、１０～１００ｋｂ（両端含む）、１５～１００ｋｂ（両端含む）、２０～１００ｋｂ（両端含む）、２５～１００ｋｂ（両端含む）、３０～１００ｋｂ（両端含む）、３５～１００ｋｂ（両端含む）、４０～１００ｋｂ（両端含む）、４５～１００ｋｂ（両端含む）、５０～１００ｋｂ（両端含む）、５５～１００ｋｂ（両端含む）、６０～１００ｋｂ（両端含む）、６５～１００ｋｂ（両端含む）、７０～１００ｋｂ（両端含む）、７５～１００ｋｂ（両端含む）、８０～１００ｋｂ（両端含む）、８５～１００ｋｂ（両端含む）、９０～１００ｋｂ（両端含む）、または９５～１００ｋｂ（両端含む）である、対応する標的配列との相同組換え事象を促進するのに十分な長さを有する。本明細書に記載されるように、大きなターゲティングベクターは、より長いターゲティングアームを用いることができる。
標的遺伝子座の改変（例えば、免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の改変、または既に改変されたもしくは修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の改変）を容易化するために、ヌクレアーゼ物質（例えば、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）がターゲティングベクターと組み合わせて用いられ得る。そのようなヌクレアーゼ物質は、ターゲティングベクターと標的遺伝子座との間の相同組換えを促進し得る。ヌクレアーゼ物質がターゲティングベクターと組み合わせて用いられる場合、ヌクレアーゼ切断部位でのニックまたは二本鎖破断時に標的配列とホモロジーアームとの間の相同組換え事象の発生を促進するように、ターゲティングベクターは、ヌクレアーゼ切断部位に十分に近接して位置する５’及び３’標的配列に対応する５’及び３’ホモロジーアームを含み得る。用語「ヌクレアーゼ切断部位」は、ニックまたは二本鎖破断がヌクレアーゼ物質によってもたらされるＤＮＡ配列（例えば、Ｃａｓ９切断部位）を含む。ターゲティングベクターの５’及び３’ホモロジーアームに対応する標的とされる遺伝子座内の標的配列は、認識部位でのニックまたは二本鎖破断時に５’及び３’標的配列とホモロジーアームとの間の相同組換え事象の発生を促進するような距離である場合、ヌクレアーゼ切断部位に「十分に近接して位置する」。よって、所定の実施形態では、ターゲティングベクターの５’及び／または３’ホモロジーアームに対応する標的配列は、所与の認識部位の少なくとも１ヌクレオチド内にあり、または所与の認識部位の少なくとも１０ヌクレオチドから約１４ｋｂの中にある。いくつかの実施形態では、ヌクレアーゼ切断部位は、標的配列の少なくとも一方または両方に直接隣接する。
ターゲティングベクターのホモロジーアームに対応する標的配列とヌクレアーゼ切断部位との空間的関係は多様であり得る。例えば、標的配列は、ヌクレアーゼ切断部位に対して５’に位置し得、標的配列は、認識部位に対して３’に位置し得、または標的配列は、ヌクレアーゼ切断部位を挟み得る。
ターゲティングベクター（例えば、大きなターゲティングベクターを含む）とヌクレアーゼ物質とを組み合わせた使用は、ターゲティングベクター単独の使用と比較して、向上した標的化効率をもたらし得る。例えば、ターゲティングベクターがヌクレアーゼ物質と併せて使用される場合、ターゲティングベクターの標的化効率は、ターゲティングベクター単独の使用と比較した場合、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、少なくとも１０倍、またはこれらの整数から形成さる範囲内、例えば、２～１０倍向上し得る。
いくつかのターゲティングベクターは、「大型ターゲティングベクター」または「ＬＴＶＥＣ」であり、これは、細胞における相同組換えを実施することが意図された他のアプローチによって典型的に使用されるものよりも大きな核酸配列に対応し、それに由来するホモロジーアームを含むターゲティングベクターを含む。ＬＴＶＥＣは、例えば、長さが少なくとも１０ｋｂであり得、または５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームの総計は、例えば、少なくとも１０ｋｂであり得る。ＬＴＶＥＣにはまた、細胞における相同組換えを実施することが意図された他のアプローチによって典型的に使用されるものよりも大きな核酸コンストラクトを含むターゲティングベクターが含まれる。例えば、ＬＴＶＥＣは、伝統的なプラスミドベースのターゲティングベクターによってそれらのサイズ制限により提供することができない大きな遺伝子座の改変を可能とする。例えば、標的とされる遺伝子座は、ヌクレアーゼ物質（例えば、Ｃａｓタンパク質）によって誘導されるニックまたは二本鎖切断の非存在下で、慣用の方法を使用して標的とすることが不可能であり、または不正確でしかもしくは有意に低い効率を伴ってでしか標的とすることができない細胞の遺伝子座であり得る（すなわち、５’ホモロジーアーム及び３’ホモロジーアームは、その遺伝子座に対応し得る）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法は、３元または４元組換え事象で互いに及び標的ゲノム遺伝子座と組み換えることが可能な２つまたは３つのＬＴＶＥＣを用いてもよい。そのような方法は、単一のＬＴＶＥＣを使用すると達成できない大きな遺伝子座の改変を可能とする。
ＬＴＶＥＣの例には、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、ヒト人工染色体、または酵母人工染色体（ＹＡＣ）に由来するベクターが含まれる。ＬＴＶＥＣは、線状形態または環状形態であり得る。ＬＴＶＥＣ及びそれを作製するための方法の例は、例えば、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ（２０１４）、米国特許第６，５８６，２５１号、第６，５９６，５４１号及び第７，１０５，３４８号；ならびに国際特許出願公開第ＷＯ２００２／０３６７８９号（これらの各々は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
提供される非ヒト動物を作製する方法
非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）を作製するための組成物及び方法であって、その生殖細胞系列ゲノムは、ヒトＶλ及びＪλセグメントの特定の多型形態（例えば、特定のＶ及び／またはＪアレルまたはバリアント）を含む配列をコードするヒト免疫グロブリンλ軽鎖を含む１つ以上のヒト免疫グロブリンλ軽鎖配列（例えば、ヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメント）を非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖配列の代わりに含む修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む、組成物及び方法が提供され、これには、非ヒトまたはヒト免疫グロブリンλ軽鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含有する免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座から構築された、ヒト可変領域及び非ヒトまたはヒト定常領域を含有する免疫グロブリンλ軽鎖を含む抗体を発現する非ヒト動物を作製するための組成物及び方法であって、非ヒトまたはヒト免疫グロブリンλ軽鎖定常領域遺伝子は、野生型非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に通常現れる非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子の代わりに配置されている、組成物及び方法が含まれる。いくつかの実施形態では、内因性免疫グロブリンκエンハンサー（複数可）及び／または内因性免疫グロブリンκ制御配列（複数可）のコントロール下でそのような抗体を発現する非ヒト動物を作製するための組成物及び方法も提供される。いくつかの実施形態では、異種免疫グロブリンκエンハンサー（複数可）及び／または異種免疫グロブリンκ制御配列（複数可）のコントロール下でそのような抗体を発現する非ヒト動物を作製するための組成物及び方法も提供される。
本明細書に記載の方法は、非ヒトまたはヒト免疫グロブリンλ軽鎖定常領域遺伝子（例えば、げっ歯類、例えば、ネズミ科動物、例えば、ラットまたはマウス）またはヒトＣλ領域遺伝子）の上流にヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインをコードする単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を挿入することを含み、非ヒトまたはヒト免疫グロブリンλ軽鎖定常領域遺伝子は、野生型非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に通常現れる非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子の代わりに配置されており、これにより抗体が発現され、その抗体は、ヒトλ軽鎖可変ドメイン及び非ヒトＣλドメイン（例えば、げっ歯類（例えば、ネズミ科動物、例えば、ラットまたはマウス）Ｃλドメイン）を含有する軽鎖の存在またはヒトλ軽鎖可変及びヒトＣλドメインを含有する軽鎖の存在を特徴とし、Ｂ細胞の表面上及び非ヒト動物の血清中の両方で発現される。
いくつかの実施形態では、方法は、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含有する遺伝物質の、免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（例えば、非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えばラットまたはマウス）の野生型、改変または修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座）への挿入を含む。いくつかの実施形態では、方法は、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含有する遺伝物質の、非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）の改変または修飾された系統の免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座への挿入を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、単一のＥＳ細胞クローンにおける複数の挿入を含む。いくつかの実施形態では、方法は、後継ＥＳ細胞クローンにおいて行われる逐次挿入を含む。いくつかの実施形態では、方法は、修飾されたＥＳ細胞クローンにおいて行われる単一の挿入を含む。
いくつかの実施形態では、方法は、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃλ１遺伝子（またはヒトＣλ２遺伝子）の上流へのＤＮＡ挿入（複数可）を含み、これにより前記ＤＮＡ挿入（複数可）は、前記非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃλ１遺伝子（またはヒトＣλ２遺伝子）に機能可能に連結され、ＤＮＡ挿入（複数可）は、Ｖλ４－６９、Ｖλ８－６１、Ｖλ４－６０、Ｖλ６－５７、Ｖλ１０－５４、Ｖλ５－５２、Ｖλ１－５１、Ｖλ９－４９、Ｖλ１－４７、Ｖλ７－４６、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ７－４３、Ｖλ１－４０、Ｖλ５－３９、Ｖλ５－３７、Ｖλ１－３６、Ｖλ３－２７、Ｖλ３－２５、Ｖλ２－２３、Ｖλ３－２２、Ｖλ３－２１、Ｖλ３－１９、Ｖλ２－１８、Ｖλ３－１６、Ｖλ２－１４、Ｖλ３－１２、Ｖλ２－１１、Ｖλ３－１０、Ｖλ３－９、Ｖλ２－８、Ｖλ４－３、及びＶλ３－１からなる群から選択される１つまたは２つのヒトＶλ遺伝子セグメント、ならびにＪλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７からなる群から選択される１つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントを含み、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃλ１遺伝子（またはヒトＣλ２遺伝子）は、内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子の代わりに配置される。いくつかの実施形態では、方法は、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃλ１遺伝子（またはヒトＣλ２遺伝子）の上流へのＤＮＡ挿入（複数可）を含み、これにより前記ＤＮＡ挿入（複数可）は、前記非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃλ１遺伝子（またはヒトＣλ２遺伝子）に機能可能に連結され、ＤＮＡ挿入（複数可）は、Ｖλ４－６９、Ｖλ８－６１、Ｖλ４－６０、Ｖλ６－５７、Ｖλ１０－５４、Ｖλ５－５２、Ｖλ１－５１、Ｖλ９－４９、Ｖλ１－４７、Ｖλ７－４６、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ７－４３、Ｖλ１－４０、Ｖλ５－３９、Ｖλ５－３７、Ｖλ１－３６、Ｖλ３－２７、Ｖλ３－２５、Ｖλ２－２３、Ｖλ３－２２、Ｖλ３－２１、Ｖλ３－１９、Ｖλ２－１８、Ｖλ３－１６、Ｖλ２－１４、Ｖλ３－１２、Ｖλ２－１１、Ｖλ３－１０、Ｖλ３－９、Ｖλ２－８、Ｖλ４－３、及びＶλ３－１からなる群から選択されるヒトＶλ遺伝子セグメント、及びＪλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７からなる群から選択されるヒトＪλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域を含み、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃλ１遺伝子（またはヒトＣλ２遺伝子）は、内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃκ遺伝子の代わりに位置する。
適切な場合、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインをコードするヒト免疫グロブリンλ軽鎖配列（すなわち、ヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメントを含有する配列）は、非ヒト動物における発現に最適化されたコドンを含むように別々に改変され得る（例えば、米国特許第５，６７０，３５６号及び第５，８７４，３０４号（これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）参照）。コドン最適化配列は、修飾された配列であり、好ましくは非コドン最適化親ポリヌクレオチドによってコードされる同一のポリペプチド（または全長ポリペプチドと実質的に同じ活性を有する全長ポリペプチドの生物学的に活性な断片）をコードする。いくつかの実施形態では、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインをコードするヒト免疫グロブリンλ軽鎖配列は、特定の細胞タイプ（例えば、げっ歯類細胞、例えば、ラットまたはマウス細胞）についてコドン使用頻度を最適化するために変化した配列を別々に含み得る。例えば、本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）のゲノムに挿入される各ヌクレオチド配列のコドンは、非ヒト動物の細胞における発現のために最適化され得る。そのような配列は、コドン最適化配列として記載され得る。
ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列の挿入は、本明細書に記載される非ヒト動物の生殖細胞系列ゲノムの最小の改変を用い、ヒトＶλドメインを有する軽鎖を含む抗体の発現をもたらし、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインは、内因性の修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座から発現される。ノックアウト及びノックインを含む、修飾された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）を生成するための方法は、当該技術分野で知られている（例えば、Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｊｏｙｎｅｒ，ｅｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，２０００（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照）。例えば、遺伝子修飾されたげっ歯類の生成は、１つ以上の内因性げっ歯類遺伝子（または遺伝子セグメント）の遺伝子座の破壊及び１つ以上の異種遺伝子（または遺伝子セグメントもしくはヌクレオチド配列）のげっ歯類ゲノムへの、いくつかの実施形態では、内因性げっ歯類遺伝子（または遺伝子セグメント）と同じ場所での導入を任意に含み得る。いくつかの実施形態では、ヒトＶλドメインをコードするヌクレオチド配列は、げっ歯類の生殖細胞系列ゲノムにおけるランダムに挿入された修飾された軽鎖導入遺伝子の非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）またはヒト免疫グロブリンλ軽鎖定常領域遺伝子の上流に導入される。いくつかの実施形態では、ヒトＶλドメインをコードするヌクレオチド配列は、げっ歯類の生殖細胞系列ゲノムにおける内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）またはヒト免疫グロブリンλ軽鎖定常領域遺伝子の上流に導入され；いくつかの所定の実施形態では、内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座は、マウスＣλ１遺伝子に機能可能に連結されたまたはヒトＣλ２遺伝子に機能可能に連結されたヒト免疫グロブリンλ遺伝子セグメント（例えば、ヒトＶ及びＪ）を含有するように変更され、改変され、または修飾される。
本明細書に記載される修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を構築するための例示的な方法の概略図（縮尺どおりではない）が図１～６に提供されている。特に、図１～６は、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含有するヌクレオチド配列の挿入を特徴とする修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の構築のための例示的なストラテジー、及び対応するターゲティングベクターを示している。ターゲティングベクターは、線状化され、げっ歯類胚性幹（ＥＳ）細胞にエレクトロポレーションされて、生殖細胞系列ゲノムが、修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含むげっ歯類が作製され得る。以下の実施例のセクションに記載されているように、ターゲティングベクターのエレクトロポレーションで用いられたげっ歯類ＥＳ細胞は、米国特許第１０，１４３，１８６号（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に先行記載されている修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含有していた。陽性げっ歯類ＥＳ細胞クローンは、当該技術分野で知られているスクリーニング方法を使用して確認される。任意の残存する選択カセットは、所望に応じてリコンビナーゼ媒介欠失を介して欠失され得る。
代替的には、マウスＣλ遺伝子の代わりにヒトＣλ遺伝子がターゲティングベクターにおいて用いられ得る。ターゲティングベクターは、ヒトＣλ遺伝子（例えば、Ｃλ２）をコードする配列がターゲティングベクターに修飾導入される場合を除き、上記と同様の手法で（または以下の実施例で）構築され得る。そのようなアプローチを使用することによりヒト抗体治療剤の開発が可能になるが、その理由は、軽鎖の可変及び定常領域をコードするＤＮＡが一緒に単離され、それにより完全ヒト抗体の調製のためにヒト軽鎖定常領域を連結する任意の後続のクローニング工程を排除できるからである。
本明細書に記載される修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を構築するためのターゲティングベクターは、非ヒト細胞（例えば、げっ歯類（例えば、ラットまたはマウス）胚性幹細胞）の生殖細胞系列ゲノムに組み込まれ得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるターゲティングベクターは、１つ以上の免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子と機能可能に連結されたヒトＶＨ、ＤＨ及びＪＨゲノムＤＮＡ（例えば、複数のヒトＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントを含有する）をさらに含有する非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞の生殖細胞系列ゲノムにおける野生型免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に組み込まれる（例えば、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ（２０１４）、米国特許第６，５９６，５４１号、第８，６４２，８３５号、第８，６９７，９４０号及び第８，７９１，３２３号（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照）。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるターゲティングベクターは、１つ以上の免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子と機能可能に連結されたヒトＶＨ、ＤＨ及びＪＨゲノムＤＮＡ（例えば、複数のヒトＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントを含有する）をさらに含有する非ヒト細胞の生殖細胞系列ゲノムにおける改変または修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に組み込まれる（例えば、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ（２０１４）、米国特許第６，５９６，５４１号、第８，６４２，８３５号、第８，６９７，９４０号、第８，７９１，３２３号、第９，００６，５１１号、第９，０１２，７１７号、第９，０２９，６２８号、第９，０３５，１２８号、第９，０６６，５０２号、第９，１５０，６６２号及び第９，１６３，０９２号（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照）。
ターゲティングベクターは、エレクトロポレーションによって非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、マウスまたはラット）胚性幹細胞に導入され、これによりターゲティングベクターに含有される配列は、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメイン及び非ヒトまたはヒト軽鎖定常（ＣλまたはＣκ）ドメインを含む軽鎖を有する抗体を発現する非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）の能力をもたらし、その軽鎖は、修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座から発現される。本明細書に記載されるように、非ヒト動物の生殖細胞系列ゲノムにおいて、修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座（例えば、内因性げっ歯類Ｃκ遺伝子の代わりにげっ歯類またはヒトＣλ遺伝子に機能可能に連結されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖配列（すなわち、再編成されたヒトλ軽鎖可変領域）を含有する内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座）が生成された遺伝子修飾された非ヒト動物が生成される。ヒトＶλドメイン及び非ヒトまたはヒトＣλドメインを有する軽鎖を特徴とする抗体が、非ヒト動物Ｂ細胞の表面上及び前記非ヒト動物の血清中で発現される。本明細書に記載される非ヒト動物の生殖細胞系列ゲノムにおける内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座が、ターゲティングベクターによって標的とされない場合、修飾された免疫グロブリンκ軽鎖導入遺伝子は、好ましくは、内因性非ヒト動物免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座以外の場所で挿入される（例えば、ランダムに挿入された導入遺伝子）。
上述した非ヒト動物における修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の生成は、ヒトＶλドメイン及び非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）またはヒトＣλドメインを有するそのような修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座から発現される免疫グロブリンλ軽鎖を含む抗体を生成する修飾された非ヒト動物系統を提供する。免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された複数のヒトＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座の存在と共に利用すると、ヒト抗体ベースの治療剤の開発のための抗体及び抗体成分を生成する修飾された非ヒト動物系統が作製される。よって、単一の修飾された非ヒト動物系統は、ヒト疾患を処置するための新たな抗体ベースの薬剤の開発のためにヒトＶλドメインを利用するための代替的なｉｎ ｖｉｖｏシステムを提供するための能力を有することが判明した。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）を作製する方法は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）胚性幹（ＥＳ）細胞のゲノムにおける修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に導入することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物を作製する方法は、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）Ｃλ遺伝子セグメントを、非ヒトＥＳ細胞のゲノムにおける修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に導入することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）を作製する方法は、上述した非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）ＥＳ細胞を使用して非ヒト動物を生成することを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）を作製する方法は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を、非ヒトＥＳ細胞のゲノムにおける修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に導入することを含む。いくつかの実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物を作製する方法は、非ヒトＣλ遺伝子セグメントを、非ヒトＥＳ細胞のゲノムにおける修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に導入することを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）を作製する方法は、（ａ）ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を、非ヒトＥＳ細胞のゲノムにおける修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に導入する工程；及び（ｂ）非ヒトＣλ遺伝子セグメントを、非ヒトＥＳ細胞のゲノムにおける修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に導入する工程を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）を作製する方法は、（ａ）ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を、非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞のゲノムにおける修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に導入する工程；（ｂ）非ヒトＣλ遺伝子セグメントを、非ヒトＥＳ細胞のゲノムにおける修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に導入する工程；及び（ｃ）工程（ａ）及び（ｂ）において生成された非ヒトＥＳ細胞を使用して非ヒト動物を生成する工程を含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）を作製する方法は、１つ以上の内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを、非ヒトＥＳ細胞のゲノムにおける修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に導入することを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）を作製する方法は、（ｄ）１つ以上の内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを、非ヒトＥＳ細胞のゲノムにおける修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座に導入する工程をさらに含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）を作製する方法は、非ヒト動物の生殖細胞系列ゲノムにおける内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を、非ヒトＣλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含むように修飾することを含み、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含み、これにより遺伝子改変された非ヒト動物のＢ細胞によって発現されるすべての免疫グロブリンλ軽鎖は、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含む。
いくつかの実施形態では、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）を作製する方法は、非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）の生殖細胞系列ゲノムにおける内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を、１つ以上の非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含むように修飾することを含み、これにより遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）のＢ細胞によって発現されるすべての重鎖は、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む。
非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）を作製する方法のいくつかの実施形態では、ＤＮＡ断片は、生殖細胞系列ゲノムが１つ以上の修飾された免疫グロブリン遺伝子座（例えば、免疫グロブリン重鎖、免疫グロブリンκ軽鎖、免疫グロブリンλ軽鎖、及びそれらの組み合わせ）を含む非ヒト胚性幹細胞に導入される。いくつかの所定の実施形態では、修飾された免疫グロブリン遺伝子座は、内因性の修飾された免疫グロブリン遺伝子座である。
非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）を作製する方法のいくつかの実施形態では、ＤＮＡ断片は、免疫グロブリンλ軽鎖配列及び／または免疫グロブリンκ軽鎖配列を含む修飾された配列を含む。非ヒト動物を作製する方法のいくつかの実施形態では、ＤＮＡ断片は、免疫グロブリンλ軽鎖配列及び／または免疫グロブリンκ軽鎖配列を非免疫グロブリン配列（例えば、組換えシグナル配列、耐性遺伝子、及びそれらの組み合わせ）と共に含む修飾された配列を含む。
非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）を作製する方法のいくつかの実施形態では、ＤＮＡ断片は、非ヒト胚性幹細胞であって、そのゲノムは、１つ以上のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のヒトＤＨ遺伝子セグメント及び１つ以上のヒトＪＨ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、ヒトＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントは、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域に機能可能に連結されている、非ヒト胚性幹細胞に導入される。いくつかの実施形態では、ＥＳ細胞は、１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードするヌクレオチド配列をさらに含む。
非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）を作製する方法のいくつかの実施形態では、ＤＮＡ断片は、非ヒト胚性幹細胞であって、その生殖細胞系列ゲノムは、単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域の挿入を含む内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、ヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメントは、非ヒト免疫グロブリンκまたはλ軽鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結されている、非ヒト胚性幹細胞に導入される。
非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）を作製する方法のいくつかの実施形態では、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリー（例えば、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域）を含む修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含むように非ヒト動物の生殖細胞系列ゲノムを改変することは、非ヒト胚性幹細胞において行われ、そのゲノムは、１つ以上のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のヒトＤＨ遺伝子セグメント及び１つ以上のヒトＪＨ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、ヒトＶＨ、ＤＨ及びＪＨ遺伝子セグメントは、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域に機能可能に連結されている。
非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）を作製する方法のいくつかの実施形態では、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含むように非ヒト動物の生殖細胞系列ゲノムを改変することは、非ヒト胚性幹細胞において行われ、その生殖細胞系列ゲノムは、１つ以上のヒトＶλ及び１つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントの挿入を含む内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、ヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメントは、非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結されている。非ヒト動物を作製する方法のいくつかの実施形態では、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含むように非ヒト動物の生殖細胞系列ゲノムを改変することは、非ヒト胚性幹細胞において行われ、その生殖細胞系列ゲノムは、１つ以上のヒトＶλ及び１つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメント、ならびに前記１つ以上のヒトＶλ遺伝子セグメントと前記１つ以上のヒトＪλ遺伝子セグメントとの間に位置し、配置されまたは配されたヒト免疫グロブリンκ軽鎖配列の挿入を含む内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、ヒトＶλ及びＪλ遺伝子セグメントは、非ヒト免疫グロブリンκ軽鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結されている。
非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）を作製する方法のいくつかの実施形態では、１つ以上のヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上のヒトＤＨ遺伝子セグメント及び１つ以上のヒトＪＨ遺伝子セグメントの挿入は、内因性ヒト免疫グロブリン遺伝子座においてヒトＶＨ遺伝子セグメントに隣接して天然に現れるヒトノンコーディングＤＮＡ、ヒトＤＨ遺伝子セグメントに隣接して天然に現れるヒトノンコーディングＤＮＡ及びヒトＪＨ遺伝子セグメントに隣接して天然に現れるヒトノンコーディングＤＮＡを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される方法から作製された、生成された、産生された、得られたまたは得ることが可能な非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）のゲノムは、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ（２０１４）、米国特許第６，５９６，５４１号、第８，６４２，８３５号、第８，６９７，９４０号及び第８，７９１，３２３号（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される１つ以上のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域をさらに含む。代替的には、本明細書に記載される限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座は、例えば、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）系統などの異なる改変系統の胚性幹細胞に修飾導入され得る（例えば、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ（２０１４）、米国特許第６，５９６，５４１号及び／または第８，６４２，８３５号（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照）。本明細書に記載される限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座のホモ接合性は、その後、交配によって達成され得る。代替的には、ランダムに挿入された修飾された免疫グロブリンκ軽鎖導入遺伝子（上述している）の場合、非ヒト動物系統は、とりわけ、導入遺伝子からのヒトＶλドメインの発現に基づいて選択され得る。いくつかの実施形態では、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）１（ＶＩ－１）マウスであり得、これは、１８個のヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤＨ遺伝子セグメントのすべて、及びヒトＪＨ遺伝子セグメントのすべてを含む。ＶＩ－１マウスはまた、１６個のヒトＶκ遺伝子セグメント及びヒトＪκ遺伝子セグメントのすべてを含み得る。いくつかの実施形態では、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）２（ＶＩ－２）マウスであり得、これは、３９個のヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤＨ遺伝子セグメントのすべて、及びヒトＪＨ遺伝子セグメントのすべてを含む。ＶＩ－２マウスはまた、３０個のヒトＶκ遺伝子セグメント及びヒトＪκ遺伝子セグメントのすべてを含み得る。いくつかの実施形態では、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）３（ＶＩ－３）マウスであり得、これは、８０個のヒトＶＨ遺伝子セグメント、ヒトＤＨ遺伝子セグメントのすべて、及びヒトＪＨ遺伝子セグメントのすべてを含む。ＶＩ－３マウスはまた、４０個のヒトＶκ遺伝子セグメント及びヒトＪκ遺伝子セグメントのすべてを含み得る。
代替的に、及び／または追加的に、いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）の生殖細胞系列ゲノムは、欠失された、不活性化された、機能的にサイレンシングされたまたはそうでなければ非機能性の内因性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座をさらに含む。遺伝子または遺伝子座を欠失させるまたは非機能性とするのための遺伝子改変は、本明細書に記載の方法及び／または当該技術分野で知られている方法を使用して達成され得る。
遺伝子修飾された創始非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、その生殖細胞系列ゲノムにおける本明細書に記載される限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の存在及び／または非ヒト動物の組織または細胞におけるヒトλ軽鎖可変ドメイン及び非ヒトまたはヒトＣλまたはＣκドメインを有する抗体の発現に基づいて同定され得る。次いで遺伝子修飾された創始非ヒト動物は、本明細書に記載される限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を保有するさらなる非ヒト動物を交配し、それにより限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の１つ以上のコピーをそれぞれ保有する非ヒト動物のコホートを作製するために使用され得る。その上、本明細書に記載される限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を保有する遺伝子修飾された非ヒト動物は、他の導入遺伝子（例えば、ヒト免疫グロブリン遺伝子）または所望に応じて修飾された免疫グロブリン遺伝子座を保有する他の遺伝子修飾された非ヒト動物とさらに交配され得る。
遺伝子修飾された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）はまた、導入遺伝子または組み込まれた配列（複数可）の制御された、仕向けられた、誘導性の及び／または細胞タイプ特異的な発現を可能とする選択されたシステムを含有するように生成され得る。例えば、本明細書に記載される非ヒト動物は、条件付きで発現される抗体のヒトλ軽鎖可変ドメインをコードする１つ以上の配列を含有するように修飾され得る（例えば、Ｒａｊｅｗｓｋｉ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９８（３）：６００－３（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）でレビューされている）。例示的なシステムには、バクテリオファージＰ１のＣｒｅ／ｌｏｘＰリコンビナーゼシステム（例えば、Ｌａｋｓｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：６２３２－６（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照）及びＳ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのＦＬＰ／Ｆｒｔリコンビナーゼシステム（Ｏ’Ｇｏｒｍａｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ，１９９１，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５１：１３５１－５（その全体が参照により本明細書に組み込まれる））が含まれる。そのような動物は、例えば、２つの遺伝子修飾された動物、すなわち、一方は選択された改変を含む導入遺伝子（例えば、本明細書に記載される限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座）を含有するもの及び他方はリコンビナーゼをコードする導入遺伝子（例えば、Ｃｒｅリコンビナーゼ）を含有するものを交配することによって「二重の」遺伝子修飾された動物の構築を介して提供され得る。
本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、しばしば非ヒト動物の意図された使用に応じて、さらなるヒト、ヒト化またはそうでなければ修飾された遺伝子を含むように、上述したように、または当該技術分野で知られている方法を使用して調製され得る。そのようなヒト、ヒト化またはそうでなければ修飾された遺伝子の遺伝物質は、上述した遺伝子改変または変更を有する細胞（例えば、胚性幹細胞）のゲノムのさらなる変更を介してまたは所望に応じて他の遺伝子改変されたまたは修飾された系統を用いた当該技術分野で知られている交配技術を介して導入され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、ヒト重鎖遺伝子セグメントさらに含むように調製される（例えば、Ｍｕｒｐｈｙ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１（１４）：５１５３－５１５８；Ｍａｃｄｏｎａｌｄ（２０１４）、米国特許第６，５９６，５４１号、第８，６４２，８３５号、第８，６９７，９４０号及び第８，７９１，３２３号；米国特許第８，７９１，３２３号；ならびに米国特許出願公開第２０１３／００９６２８７Ａ１号（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照）。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、本明細書に記載のターゲティングベクターを、改変または修飾された系統からの細胞に導入することによって調製され得る。例えば、本明細書に記載されるターゲティングベクターは、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスに導入され得る。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、完全ヒト可変ドメイン及びマウス定常ドメインを有する抗体を発現する。別の例では、本明細書に記載されるターゲティングベクターは、米国特許第９，００６，５１１号、第９，０１２，７１７号、第９，０２９，６２８号、第９，０３５，１２８号、第９，０６６，５０２号、第９，１５０，６６２号及び第９，１６３，０９２号（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）のいずれか１つに記載される修飾されたマウスに導入され得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、ヒト免疫グロブリン遺伝子（可変及び／または定常領域遺伝子）をさらに含むように調製される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、本明細書に記載される限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座及び異種の種（例えば、ヒト）からの遺伝物質を含み、遺伝物質は、１つ以上のヒト重鎖可変領域を全体としてまたは部分的にコードする。
例えば、本明細書に記載されるように、本明細書に記載される限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、（例えば、交雑または複数遺伝子標的化ストラテジーを介して）Ｍｕｒｐｈｙ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（２０１４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．１１１（１４）：５１５３－８；Ｍａｃｄｏｎａｌｄ（２０１４）；米国特許第６，５９６，５４１号、第８，６４２，８３５号、第８，６９７，９４０号及び第８，７９１，３２３号（これらのすべては、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）に記載される１つ以上の改変をさらに含み得る。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む非ヒト動物は、ヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座（例えば、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ（２０１４）、米国特許第６，５９６，５４１号、第８，６４２，８３５号、第８，６９７，９４０号及び／または第８，７９１，３２３号（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照）を含む非ヒト動物と交配される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む非ヒト動物は、ヒト化免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子座（例えば、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ（２０１４）、米国特許第６，５９６，５４１号、第８，６４２，８３５号、第８，６９７，９４０号及び／または第８，７９１，３２３号（参照により本明細書に組み込まれる）参照）及び不活性化内因性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座（例えば、米国特許第９，００６，５１１号、第９，０１２，７１７号、第９，０２９，６２８号、第９，０３５，１２８号、第９，０６６，５０２号、第９，１５０，６６２号及び第９，１６３，０９２号（それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照）を含む非ヒト動物と交配される。
マウス（すなわち、ヒトλ軽鎖可変ドメイン及びマウスまたはヒトＣλまたはＣκドメインを含有する抗体が発現するように、マウスまたはヒトＣλまたはＣκ遺伝子と機能可能に連結された限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーの存在を特徴とする修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を有するマウス）における修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座の構築を記載する実施形態が、本明細書で広範に論述されているが、修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む他の非ヒト動物も提供される。そのような非ヒト動物には、例えば、哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、ウシ（例えば、ウシ、雄牛、スイギュウ）、シカ、ヒツジ、ヤギ、ニワトリ、ネコ、イヌ、フェレット、霊長類（例えば、マーモセット、アカゲザル）などを含む、本明細書に記載される抗体を発現するように遺伝子改変され得るもののいずれかが含まれる。例えば、好適な遺伝子改変可能なＥＳ細胞が容易に利用可能ではない非ヒト動物の場合、遺伝子改変を含む非ヒト動物を作製するために他の方法が用いられる。そのような方法は、例えば、非ＥＳ細胞ゲノム（例えば、線維芽細胞または人工多能性細胞）を改変すること及び体細胞核移植（ＳＣＮＴ）を用いて遺伝子改変されたゲノムを好適な細胞、例えば、除核卵母細胞に移植すること、ならびに胚を形成するための好適な条件下で改変された細胞（例えば、改変された卵母細胞）を非ヒト動物に懐胎させることを含む。
非ヒト動物の生殖細胞系列ゲノム（例えば、ブタ、ウシ、げっ歯類、ニワトリなどのゲノム）を改変するための方法は、例えば、ジンクフィンガーヌクレアーゼ（ＺＦＮ）、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ（ＴＡＬＥＮ）、またはＣａｓタンパク質（すなわち、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓシステム）を用いて、本明細書に記載される限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含めることを含む。非ヒト動物の生殖細胞系列ゲノムを改変するための方法のためのガイダンスは、例えば、米国特許第９，７３８，８９７号、ならびに米国特許出願公開第ＵＳ２０１６／０１４５６４６号（２０１６年５月２６日に公開）及び第ＵＳ２０１６／０１７７３３９号（２０１６年６月２３日に公開）（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で見ることができる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、哺乳動物である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、例えば、ＤｉｐｏｄｏｉｄｅａまたはＭｕｒｏｉｄｅａ上科の小型哺乳動物である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変された動物は、げっ歯類である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるげっ歯類は、マウス、ラット、及びハムスターから選択される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるげっ歯類は、Ｍｕｒｏｉｄｅａ上科から選択される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変された動物は、Ｃａｌｏｍｙｓｃｉｄａｅ（例えば、マウス様ハムスター）、Ｃｒｉｃｅｔｉｄａｅ（例えば、ハムスター、ニューワールドラット及びマウス、ハタネズミ）、Ｍｕｒｉｄａｅ（純種のマウス及びラット、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミラット）、Ｎｅｓｏｍｙｉｄａｅ（キノボリマウス、ロックマウス、オジロラット、マダガスカルラット及びマウス）、Ｐｌａｔａｃａｎｔｈｏｍｙｉｄａｅ（例えば、トゲヤマネ）、及びＳｐａｌａｃｉｄａｅ（例えば、メクラネズミ、タケネズミ、及びモグラネズミ）から選択される科からのものである。いくつかの所定の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変されたげっ歯類は、純種のマウスまたはラット（Ｍｕｒｉｄａｅ科）、アレチネズミ、トゲヤマネ、及びタテガミラットから選択される。いくつかの所定の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変されたマウスは、Ｍｕｒｉｄａｅ科のメンバーからのものである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、げっ歯類である。いくつかの所定の実施形態では、本明細書に記載されるげっ歯類は、マウス及びラットから選択される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、マウスである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、及びＣ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択されるＣ５７ＢＬ系統のマウスであるげっ歯類である。いくつかの所定の実施形態では、本明細書に記載されるマウスは、１２９Ｐ１、１２９Ｐ２、１２９Ｐ３、１２９Ｘ１、１２９Ｓ１（例えば、１２９Ｓ１／ＳＶ、１２９Ｓ１／ＳｖＩｍ）、１２９Ｓ２、１２９Ｓ４、１２９Ｓ５、１２９Ｓ９／ＳｖＥｖＨ、１２９／ＳｖＪａｅ、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）、１２９Ｓ７、１２９Ｓ８、１２９Ｔ１、１２９Ｔ２である系統からなる群から選択される１２９系統である（例えば、Ｆｅｓｔｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｇｅｎｏｍｅ １０：８３６；Ａｕｅｒｂａｃｈ，Ｗ．ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２９（５）：１０２４－１０２８，１０３０，１０３２（これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照）。いくつかの所定の実施形態では、本明細書に記載される遺伝子改変されたマウスは、前述した１２９系統及び前述したＣ５７ＢＬ／６系統のミックスである。いくつかの所定の実施形態では、本明細書に記載されるマウスは、前述した１２９系統のミックス、または前述したＢＬ／６系統のミックスである。いくつかの所定の実施形態では、本明細書に記載されるミックスの１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるマウスは、ＢＡＬＢ系統、例えば、ＢＡＬＢ／ｃ系統である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載されるマウスは、ＢＡＬＢ系統及び別の前述した系統のミックスである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、ラットである。いくつかの所定の実施形態では、本明細書に記載されるラットは、Ｗｉｓｔａｒラット、ＬＥＡ系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ系統、Ｆｉｓｃｈｅｒ系統、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉから選択される。いくつかの所定の実施形態では、本明細書に記載されるラット系統は、Ｗｉｓｔａｒ、ＬＥＡ、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ、Ｆｉｓｃｈｅｒ、Ｆ３４４、Ｆ６、及びＤａｒｋ Ａｇｏｕｔｉからなる群から選択される２つ以上の系統のミックスである。
ラット多能性及び／または分化全能性細胞は、例えば、ＡＣＩラット系統（Ａｕｇｕｓｔ及びＣｏｐｅｎｈａｇｅｎ系統に元々由来する近交系統）、Ｄａｒｋ Ａｇｏｕｔｉ（ＤＡ）ラット系統、Ｗｉｓｔａｒラット系統、ＬＥＡラット系統、Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ（ＳＤ）ラット系統、またはＦｉｓｃｈｅｒラット系統、例えば、Ｆｉｓｈｅｒ Ｆ３４４またはＦｉｓｈｅｒ Ｆ６を含む任意のラット系統からのものであり得る。ラット多能性及び／または分化全能性細胞はまた、上記の２つ以上の系統のミックスに由来する系統から得られ得る。例えば、ラット多能性及び／または分化全能性細胞は、ＤＡ系統またはＡＣＩ系統からのものであり得る。ＡＣＩラット系統は、白色の腹部及び肢ならびにＲＴ１ａｖ１ハロタイプを伴って黒色アグーチを有するものとして特性化される。そのような系統は、Ｈａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む多様な供給源から利用可能である。ＡＣＩラットからのラットＥＳ細胞株の例は、ＡＣＩ．Ｇ１ラットＥＳ細胞である。ＤＡラット系統は、アグーチコート及びＲＴ１ａｖ１ハロタイプを有するものとして特性化される。そのようなラットは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ及びＨａｒｌａｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓを含む多様な供給源から利用可能である。ＤＡラットからのラットＥＳ細胞株の例は、ＤＡ．２ＢラットＥＳ細胞株及びＤＡ．２ＣラットＥＳ細胞株である。いくつかの実施形態では、ラット多能性及び／または分化全能性細胞は、近交系ラット系統からのものである（例えば、２０１４年８月１４日に公開された米国特許出願公開第２０１４－０２３５９３３Ａ１号（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）参照）。本明細書に記載される方法及び／またはコンストラクトを使用してラットゲノムにおいて（例えば、ラットＥＳ細胞において）改変を生成するためのガイダンスは、例えば、米国特許出願公開第２０１４－０３１０８２８号及び第２０１７－０２０４４３０号（これらの両方は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる）で見ることができる。
提供される非ヒト動物、細胞または組織を使用する方法
本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞及び非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織は、抗体の開発のためのプラットフォームとして使用され得る。特に、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞及び非ヒト組織は、限られたヒトλ軽鎖レパートリーから発現されるヒトλ軽鎖可変ドメインと対合するヒト重鎖可変ドメイン、及びそのようなヒト重鎖可変ドメインを含む抗体の生成及び同定のための特に有利なプラットフォームを表す。そのようなヒト重鎖可変ドメインは、例えば、二重特異的抗原結合タンパク質の生成において使用され得る。
したがって、本開示は、本明細書に記載の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞及び非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織が抗体を作製する方法において使用され得ることを提供する。本開示に従って作製される抗体には、例えば、ヒト抗体、キメラ抗体、逆キメラ抗体、これらの抗体のいずれかの断片、またはそれらの組み合わせが含まれ得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞及び非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織は、ヒト抗体（例えば、完全ヒト抗体）を作製するために用いられ得、ヒト抗体は、本明細書に記載される非ヒト動物の細胞の遺伝物質によってコードされる核酸配列に由来する可変ドメインを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、遺伝子改変されたげっ歯類、例えば、遺伝子改変されたラットまたはマウス）は、非ヒト動物が対象となる抗原に対する免疫反応を起こすのに十分な条件下及び時間にて、前記対象となる抗原で免疫される。抗体及び／または抗体配列（すなわち、抗体の一部、例えば、可変領域配列をコードする配列）は、免疫された非ヒト動物（または１つ以上の細胞、例えば、１つ以上のＢ細胞）から単離及び／または同定され、例えば、親和性、特異性、エピトープマッピング、リガンド－受容体相互作用を遮断するための能力、阻害受容体活性化などを測定する様々なアッセイを使用して特性化される。様々な実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞及び非ヒト組織によって生成される抗体は、非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織から単離される１つ以上のヒト可変領域ヌクレオチド配列に由来する１つ以上のヒト可変領域を含む。いくつかの実施形態では、抗薬物抗体（例えば、抗イディオタイプ抗体）が、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞及び非ヒト組織において作られ得る。様々な実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞及び非ヒト組織によって生成される抗体は、ヒト軽鎖可変ドメイン及び非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）軽鎖定常ドメイン及び／またはヒト重鎖可変ドメイン及び非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）重鎖定常ドメインを含む逆キメラ抗体である。
様々な実施形態では、非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞及び非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織によって生成される抗体は、ヒト可変ドメイン及び非ヒト定常ドメインを有する重鎖及び軽鎖を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞及び非ヒト組織によって生成される抗体は、ヒト軽鎖可変ドメイン及び非ヒト（例えば、げっ歯類）軽鎖定常ドメインを含む逆キメラ抗体である。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞及び非ヒト組織によって生成される抗体は、ヒト重鎖可変ドメイン及び非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）重鎖定常ドメインを含む逆キメラ抗体である。
いくつかの実施形態では、提供される方法は、本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）を対象となる抗原で免疫することを含む。いくつかの実施形態では、提供される方法は、前記非ヒト動物からリンパ球（例えば、クローン選択されたリンパ球）を同定することを含み、そのリンパ球は、対象となる抗原に結合する（例えば、特異的に結合する）抗体を発現する。いくつかの実施形態では、リンパ球は、Ｂ細胞である。いくつかの実施形態では、ヒト重鎖可変領域配列及び／またはヒトラムダ軽鎖可変領域配列は、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）から得られ、及び／または同定される（例えば、ジェノタイピングされる、例えば、シーケンシングされる）。いくつかの実施形態では、ヒト重鎖可変ドメイン及び／またはヒトラムダ軽鎖可変ドメインのアミノ酸配列は、リンパ球（例えば、Ｂ細胞）から得られ、及び／または同定される（例えば、シーケンシングされる）。いくつかの実施形態では、非ヒト動物のＢ細胞からのヒト重鎖可変領域配列及び／またはヒトラムダ軽鎖可変領域配列は、宿主細胞において発現される。いくつかの実施形態では、非ヒト動物のＢ細胞からのヒト重鎖可変領域配列及び／またはヒトラムダ軽鎖可変領域配列のバリアントは、宿主細胞において発現される。いくつかの実施形態では、バリアントは、１つ以上の変異を含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、バリアントを含む抗体の薬物動態及び／または薬力学的特性を改善し得る。いくつかの実施形態では、１つ以上の変異は、バリアントを含む抗体の特異性、親和性、及び／または免疫原性を改善し得る。
いくつかの実施形態では、ヒト抗体を作製する方法は、本明細書に記載の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織からのヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及び／またはヒト免疫グロブリン軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を同定すること；ならびに（ｉ）ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメインをコードするヌクレオチド配列と接合またはライゲーションし、それにより完全ヒト免疫グロブリン重鎖をコードするヒト免疫グロブリン重鎖配列を形成すること、及び／または（ｉｉ）ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖定常ドメインをコードするヌクレオチド配列と接合またはライゲーションし、それにより完全ヒト免疫グロブリンλ軽鎖をコードするヒト免疫グロブリンλ軽鎖配列を形成することを含む。所定の実施形態では、ヒト免疫グロブリン重鎖配列、及びヒト免疫グロブリンλ軽鎖配列は、完全ヒト免疫グロブリン重鎖及び完全ヒト免疫グロブリンλ軽鎖が発現され、ヒト抗体を形成するように、細胞（例えば、宿主細胞、哺乳動物細胞）において発現される。いくつかの実施形態では、ヒト抗体は、細胞または細胞を含む培地から単離される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、二重特異的抗体を作製する方法に用いられ得、その方法は、（ａ）非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）定常領域に機能可能に連結された単一の再編成されたヒトＩｇλ軽鎖可変領域を含む本明細書に記載される第１の遺伝子改変された非ヒト動物を第１の抗原の第１のエピトープと接触させること、（ｂ）非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）定常領域（例えば、第１の非ヒト動物に存在するものと同じ単一の再編成されたヒトＩｇλ軽鎖可変領域）に機能可能に連結された単一の再編成されたヒトＩｇλ軽鎖可変領域を含む本明細書に記載される第２の遺伝子改変された非ヒト動物を第２の抗原の第２のエピトープと接触させること、（ｃ）第１の遺伝子改変された非ヒト動物から第１の抗原の第１のエピトープに特異的な第１の抗体を発現するＢ細胞を単離し、第１の抗体の第１のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを決定すること；（ｄ）第２の遺伝子改変された非ヒト動物から第２の抗原の第２のエピトープに特異的な第２の抗体を発現するＢ細胞を単離し、第２の抗体の第２のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを決定すること；（ｅ）第１のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を、第１のヒト免疫グロブリン定常ドメインをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結させて第１のヒト重鎖をコードする第１のヌクレオチド配列を生成すること；（ｆ）第２のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を、第２のヒト免疫グロブリン定常ドメインをコードするヌクレオチド配列に機能可能に連結させて第２のヒト重鎖をコードする第２のヌクレオチド配列を生成すること；（ｇ）哺乳動物細胞において、（ｉ）第１のヌクレオチド配列；（ｉｉ）第２のヌクレオチド配列；及び（ｉｉｉ）ヒト免疫グロブリンλ軽鎖定常領域に機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンを含む第３のヌクレオチド配列を発現させることを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞は、二重特異的抗体を作製する方法のために用いられ得、その方法は、（ａ）非ヒト細胞において、（ｉ）第１のヒト免疫グロブリン定常領域に機能可能に連結された第１のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含む第１のヌクレオチド配列；（ｉｉ）第２のヒト免疫グロブリン定常領域に機能可能に連結された第２のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含む第２のヌクレオチド配列；及び（ｉｉｉ）ヒト免疫グロブリンλ軽鎖定常領域に機能可能に連結されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む第３のヌクレオチド配列を発現させることを含み、第１のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、第１の抗原の第１のエピトープで免疫された第１の遺伝子改変された非ヒト動物において同定された第１のヒト重鎖可変ドメインをコードし、第２のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、第２の抗原の第２のエピトープで免疫された第２の遺伝子改変された非ヒト動物において同定された第２のヒト重鎖可変ドメインをコードし、第１及び第２の遺伝子改変された非ヒト動物はそれぞれ、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）定常領域に機能可能に連結された単一の再編成されたヒトＩｇλ軽鎖可変領域を含む、本明細書に記載される遺伝子改変された非ヒト動物であり、第３のヌクレオチドのヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンである。同定されたアミノ酸または核酸は、本明細書で同定される可変ドメインを含有する抗体または抗原結合タンパク質を作製するために使用される。
本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞及び非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織は、例えば、エピトープまたは抗原に対する抗体の一部としての、本明細書に記載の非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織によって生成されるヒト可変ドメインをコードするヌクレオチドまたは核酸配列を同定するために用いられ得る。
本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞及び非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織は、例えば、エピトープまたは抗原に対する抗体の一部としての、本明細書に記載の非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織によって生成されるヒト可変ドメインのアミノ酸配列を同定するために用いられ得る。
本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞及び非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織は、多様なアッセイに有用なヒト抗体を生成するための改善されたｉｎ ｖｉｖｏシステム及び生物学的物質源（例えば、細胞、ヌクレオチド、ポリペプチド、タンパク質複合体）を提供する。様々な実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞及び非ヒト組織は、対象となるポリペプチド（例えば、膜貫通または分泌ポリペプチド）を標的とし、及び／または前記対象となるポリペプチドに関連する１つ以上の活性を調節し、及び／または前記対象となるポリペプチドと他の結合パートナー（例えば、リガンドまたは受容体ポリペプチド）との相互作用を調節する治療剤を開発するために使用される。例えば、様々な実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞及び非ヒト組織は、１つ以上の受容体ポリペプチドを標的とし、受容体ポリペプチド活性を調節し、及び／または他の結合パートナーとの受容体ポリペプチド相互作用を調節する治療剤を開発するために使用される。様々な実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞及び非ヒト組織は、対象となる１つ以上のポリペプチドに結合する候補治療剤（例えば、抗体、ｓｃＦｖｓなど）を同定、スクリーニング及び／または開発するために使用される。様々な実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞及び非ヒト組織は、対象となる１つ以上のポリペプチドの活性を阻害し、または対象となる１つ以上の受容体ポリペプチドの活性を阻害する候補治療剤（例えば、抗体、ｓｃＦｖｓなど）をスクリーニング及び開発するために使用される。様々な実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞及び非ヒト組織は、対象となる１つ以上のポリペプチドのアンタゴニスト及び／またはアゴニストの結合プロファイルを決定するために使用される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞及び非ヒト組織は、対象となる１つ以上のポリペプチドに結合する１つ以上の候補治療抗体のエピトープ（複数可）を決定するために使用される。
様々な実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞及び非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織は、１つ以上のヒト抗体候補の薬物動態プロファイルを決定するために使用される。様々な実施形態では、本明細書に記載される１つ以上の非ヒト動物、非ヒト細胞及び非ヒト組織ならびに１つ以上の対照または参照非ヒト動物、非ヒト細胞及び非ヒト組織はそれぞれ、１つ以上のヒト抗体候補に様々な用量（例えば、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．２ｍｇ／ｋｇ、０．３ｍｇ／ｋｇ、０．４ｍｇ／ｋｇ、０．５ｍｇ／ｋｇ、１ｍｇ／ｋｇ、２ｍｇ／ｋｇ、３ｍｇ／ｋｇ、４ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｍｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、１５ｍｇ／ｋｇ、２０ｍｇ／ｋｇ、２５ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４０ｍｇ／ｋｇ、または５０ｍｇ／ｋｇまたはそれ以上）で曝露される。候補治療抗体は、非経口及び非経口以外の投与経路を含む任意の所望の投与経路を介して本明細書に記載される非ヒト動物に投薬され得る。非経口経路には、例えば、静脈内、動脈内、門脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、髄腔内、鞘内、側脳室内、頭蓋内、胸腔内または他の注射経路が含まれる。非経口以外の経路には、例えば、経口、経鼻、経皮、経肺、経直腸、口腔粘膜、膣、眼が含まれる。投与はまた、連続注入、局所投与、インプラント（ゲル、膜など）からの持続放出、及び／または静脈内注射によるものであり得る。様々な時点（例えば、０時間、６時間、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日、８日、９日、１０日、１１日、もしくは最大３０日、またはそれ以上）で、非ヒト動物（ヒト化及び対照）から血液が単離される。総ＩｇＧ、抗治療抗体反応、凝集などを含むがこれらに限定されない、投与された候補治療抗体の薬物動態プロファイルを決定するために、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞及び非ヒト組織から得られたサンプルを使用して様々なアッセイが実施され得る。
様々な実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞及び非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織は、対象となるポリペプチドの活性を遮断または調節する治療効果及び細胞性変化の結果としての遺伝子発現に対する効果または、受容体ポリペプチドの観点からは、非ヒト動物、非ヒト細胞または非ヒト組織における細胞の表面上の受容体ポリペプチドの密度を測定するために使用される。様々な実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物（またはそれから単離された細胞）、非ヒト細胞または非ヒト組織は、対象となるポリペプチドに結合する候補治療剤に曝露され、それに続く期間の後、前記対象となるポリペプチドに関連する特定の細胞プロセス、例えば、リガンド－受容体相互作用またはシグナル伝達に対する効果について分析される。
本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト抗体可変領域を発現し、よって、細胞、細胞株、及び細胞培養物は、結合及び機能性アッセイにおいて使用するためのヒト抗体可変領域源として機能するために、例えば、特にアンタゴニストまたはアゴニストが、対象となるヒト抗原に特異的であり、またはリガンド－受容体相互作用（結合）において機能するエピトープに特異的である場合に、アンタゴニストまたはアゴニストの結合または機能についてアッセイするために生成され得る。様々な実施形態では、候補治療抗体または断片によって結合されるエピトープ（例えば、ＶＨ、ＶＬ、ＣＨ１及びＣＬドメインからなる一価断片であるＦａｂ断片；（ｉｉ）ヒンジ領域でジスルフィド架橋によって連結された２つのＦａｂ断片を含む二価断片であるＦ（ａｂ’）２断片；（ｉｉｉ）ＶＨ及びＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片；（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＨ及びＶＬドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）単一可変ドメインを含むｄＡｂ断片（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４１ ：５４４－５４６）；ならびに（ｖｉ）単離された相補性決定領域（ＣＤＲ））が、本明細書に記載される非ヒト動物から単離された細胞を使用して決定され得る。
提供される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）からの細胞は、場当たり的に単離及び使用され得、または多くの世代のために培養下で維持され得る。様々な実施形態では、提供される非ヒト動物からの細胞は、不死化（例えば、ウイルスの使用を介して）され、培養下で無限に（例えば、連続培養で）維持される。
いくつかの実施形態では、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞は、非ヒトリンパ球である。いくつかの実施形態では、非ヒト細胞は、Ｂ細胞、樹状細胞、マクロファージ、単球及びＴ細胞から選択される。いくつかの実施形態では、非ヒト細胞は、未熟Ｂ細胞、成熟ナイーブＢ細胞、活性化Ｂ細胞、メモリーＢ細胞、及び／または血漿細胞である。
いくつかの実施形態では、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞は、非ヒト胚性幹（ＥＳ）細胞である。いくつかの実施形態では、非ヒトＥＳ細胞は、げっ歯類ＥＳ細胞である。いくつかの所定の実施形態では、げっ歯類ＥＳ細胞は、マウスＥＳ細胞であり、１２９系統、Ｃ５７ＢＬ系統、ＢＡＬＢ／ｃまたはそれらの混合系からのものである。いくつかの所定の実施形態では、げっ歯類胚性幹細胞は、マウス胚性幹細胞であり、１２９及びＣ５７ＢＬ系統の混合系である。いくつかの所定の実施形態では、げっ歯類胚性幹細胞は、マウス胚性幹細胞であり、１２９、Ｃ５７ＢＬ及びＢＡＬＢ／ｃ系統の混合系である。
いくつかの実施形態では、非ヒト動物を作製するための本明細書に記載される非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）ＥＳ細胞の使用が提供される。いくつかの所定の実施形態では、非ヒトＥＳ細胞は、マウスＥＳ細胞であり、本明細書に記載される限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含むマウスを作製するために使用される。いくつかの所定の実施形態では、非ヒトＥＳ細胞は、ラットＥＳ細胞であり、本明細書に記載される限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含む修飾された免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含むラットを作製するために使用される。
いくつかの実施形態では、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織は、脂肪、膀胱、脳、乳房、骨髄、眼、心臓、腸、腎臓、肝臓、肺、リンパ節、筋肉、膵臓、血漿、血清、皮膚、脾臓、胃、胸腺、精巣、卵子、及びそれらの組み合わせから選択される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される単離された非ヒト細胞または組織から作製され、生成され、産生され、または得られた不死化細胞が提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒトＥＳ細胞から作製され、生成され、産生され、または得られた非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）胚が提供される。いくつかの所定の実施形態では、非ヒト胚は、げっ歯類胚；いくつかの実施形態では、マウス胚；いくつかの実施形態では、ラット胚である。
本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、対象となるポリペプチドに結合するヒト抗体可変領域のバリアント（例えば、ヒトＶλドメインバリアント）の生成のためのｉｎ ｖｉｖｏシステムを提供する。そのようなバリアントは、対象となるポリペプチドの２つ以上のバリアントによって共有される共通のエピトープに対する所望の機能性、特異性、低い交差反応性を有するヒト抗体可変領域を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、所望のまたは改善された機能性についてスクリーニングされる一連のバリアント可変領域を含有するヒト抗体可変領域のパネルを生成するために用いられる。
本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト抗体可変領域ライブラリ（例えば、ヒトＶλドメインライブラリ）を生成するためのｉｎ ｖｉｖｏシステムを提供する。そのようなライブラリは、当該技術分野で知られている技術（例えば、部位特異的変異誘発、エラープローンＰＣＲなど）を使用して可変領域配列の親和性成熟源として使用される、及び／または例えば、キメラ抗原受容体（すなわち、抗体成分、例えば、ｓｃＦｖを使用して修飾された分子）、多重特異的結合物質（例えば、二重特異的結合物質）及び融合タンパク質（例えば、単一ドメイン抗体、ｓｃＦｖｓなど）などの抗体ベースの治療分子の生成のための抗体成分源として使用される、所望のエフェクター機能に基づいて異なるＦｃ領域にグラフトされ得る重鎖及び／または軽鎖可変領域配列源を提供する。
いくつかの実施形態では、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）動物において抗体を生成する方法であって、方法は、（ａ）本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）を対象となる抗原で免疫する工程；（ｂ）非ヒト動物が対象となる抗原に対する免疫反応を生成する（例えば、抗体を発現する）のに十分な条件下で非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）を維持する工程；及び（ｃ）非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、または非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）の細胞（例えば、Ｂ細胞）から対象となる抗原に結合する抗体を回収する工程を含む、方法が提供される。
非ヒト動物において抗体を生成する方法のいくつかの実施形態では、非ヒト細胞は、Ｂ細胞である。非ヒト動物において抗体を生成する方法のいくつかの実施形態では、非ヒト細胞は、ハイブリドーマである。
いくつかの実施形態では、（ａ）本明細書に記載される非ヒト動物を提供する工程；（ｂ）非ヒト動物を対象となる抗原で免疫する工程；（ｃ）非ヒト動物が対象となる抗原に対する免疫反応を生成するのに十分な条件下で非ヒト動物を維持する工程；及び（ｄ）非ヒト動物、または非ヒト細胞から、対象となる抗原に結合する抗体を回収する工程であって、（ｄ）の抗体は、ヒトＶＨ及びＶλドメインを含む、回収する工程を含む方法によって調製される抗体が提供される。
方法によって調製される抗体のいくつかの実施形態では、ヒト重鎖可変ドメインは、ヒトＶＨ３－７４、ＶＨ３－７３、ＶＨ３－７２、ＶＨ２－７０、ＶＨ１－６９、ＶＨ３－６６、ＶＨ３－６４、ＶＨ４－６１、ＶＨ４－５９、ＶＨ１－５８、ＶＨ３－５３、ＶＨ５－５１、ＶＨ３－４９、ＶＨ３－４８、ＶＨ１－４６、ＶＨ１－４５、ＶＨ３－４３、ＶＨ４－３９、ＶＨ４－３４、ＶＨ３－３３、ＶＨ４－３１、ＶＨ３－３０、ＶＨ４－２８、ＶＨ２－２６、ＶＨ１－２４、ＶＨ３－２３、ＶＨ３－２１、ＶＨ３－２０、ＶＨ１－１８、ＶＨ３－１５、ＶＨ３－１３、ＶＨ３－１１、ＶＨ３－９、ＶＨ１－８、ＶＨ３－７、ＶＨ２－５、ＶＨ７－４－１、ＶＨ４－４、ＶＨ１－３、ＶＨ１－２、ＶＨ６－１を含む再編成されたヒト重鎖可変領域、またはその体細胞超変異バリアントによってコードされる。
方法によって調製される抗体のいくつかの実施形態では、本明細書に記載される限られたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域レパートリーを含む非ヒト動物から得られるヒトλ軽鎖可変ドメインは、ヒトＶλ４－６９、Ｖλ８－６１、Ｖλ４－６０、Ｖλ６－５７、Ｖλ１０－５４、Ｖλ５－５２、Ｖλ１－５１、Ｖλ９－４９、Ｖλ１－４７、Ｖλ７－４６、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ７－４３、Ｖλ１－４０、Ｖλ５－３９、Ｖλ５－３７、Ｖλ１－３６、Ｖλ３－２７、Ｖλ３－２５、Ｖλ２－２３、Ｖλ３－２２、Ｖλ３－２１、Ｖλ３－１９、Ｖλ２－１８、Ｖλ３－１６、Ｖλ２－１４、Ｖλ３－１２、Ｖλ２－１１、Ｖλ３－１０、Ｖλ３－９、Ｖλ２－８、Ｖλ４－３、Ｖλ３－１を含む再編成されたヒトλ軽鎖可変領域、またはその体細胞超変異バリアントによってコードされる。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織は、療法または診断のための薬物（例えば、抗体またはその断片）の製造及び／または開発において使用するために提供される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織は、疾患、障害または病態の処置、予防または好転のための薬品の製造において使用するために提供される。
いくつかの実施形態では、医療において使用するための、例えば、薬剤として使用するための薬物またはワクチンの製造及び／または開発における本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織の使用が提供される。
いくつかの実施形態では、抗体またはその断片の製造及び／または開発における本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）、非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）細胞、または非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）組織の使用が提供される。
本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、薬物またはワクチンの分析及び試験のためのｉｎ ｖｉｖｏシステムを提供する。様々な実施形態では、候補薬物またはワクチンは、本明細書に記載される１つ以上の非ヒト動物に送達され、続いて薬物またはワクチンに対する免疫反応、薬物またはワクチンの安全性プロファイル、または疾患または病態及び／または疾患または病態の１つ以上の症状に対する効果のうちの１つ以上を決定するために非ヒト動物がモニタリングされ得る。安全性プロファイルを決定するために使用される例示的な方法は、毒性、最適な用量濃度、抗体（すなわち、抗薬物）反応、薬物またはワクチンの有効性及び可能性のあるリスク因子の測定を含む。そのような薬物またはワクチンは、そのような非ヒト動物において改善及び／または開発され得る。
ワクチン有効性は、多数の方法で決定され得る。簡潔には、本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、当該技術分野で知られている方法を使用してワクチン接種され、次いでワクチンを投与されるか、またはワクチンは、既に感染した非ヒト動物に投与される。ワクチンに対する非ヒト動物（複数可）の反応は、ワクチンの有効性を決定するために非ヒト動物（複数可）（またはそれから単離された細胞）をモニタリングすることによって、及び／またはそれに対する１つ以上のアッセイを実施することによって測定され得る。次いで、ワクチンに対する非ヒト動物（複数可）の反応は、当該技術分野で知られている及び／または本明細書に記載される１つ以上の指標を使用して、対照動物と比較される。
ワクチン有効性は、ウイルス中和アッセイによってさらに決定され得る。簡潔には、本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は免疫され、免疫後の様々な日に血清が収集される。血清の段階希釈物は、ウイルスに特異的な血清中の抗体がそれに結合する時間、ウイルスと共に事前インキュベートされる。次いで、ウイルス／血清混合物は、プラークアッセイまたはマイクロ中和アッセイによって感染性を決定するために許容細胞に添加される。血清中の抗体がウイルスを中和する場合、対照群と比較して少ないプラークまたは低い相対的ルシフェラーゼ単位が存在する。
本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、ヒト抗体可変領域を生成し、そのため、診断用途（例えば、免疫学、血清学、微生物学、細胞病理学など）において使用するためのヒト抗体の生成のためのｉｎ ｖｉｖｏシステムを提供する。様々な実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物は、例えば、病理学的変化を示す特定の細胞表面マーカーの発現などの細胞性変化の同定のための相対的抗原部位に結合するヒト抗体可変領域を生成するために使用され得る。そのような抗体は、様々な化学的実体（例えば、放射性トレーサー）にコンジュゲートされ得、所望に応じて様々なｉｎ ｖｉｖｏ及び／またはｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて用いられ得る。
本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、腫瘍学及び／または感染性疾患において使用するためのヒト抗体の開発及び選択の改善されたｉｎ ｖｉｖｏシステムを提供する。様々な実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物及び対照非ヒト動物（例えば、本明細書に記載されるものとは異なる遺伝子改変を有する動物、または遺伝子改変のない、すなわち、野生型の動物）は、腫瘍（または腫瘍細胞）が移植され得、またはウイルス（例えば、インフルエンザ、ＨＩＶ、ＨＣＶ、ＨＰＶなど）で感染させられ得る。移植または感染させた後、非ヒト動物に候補治療剤が投与され得る。腫瘍またはウイルスは、候補治療剤の投与前に、非ヒト動物内の１つ以上の場所に定着するのに十分な時間が与えられ得る。代替的に、及び／または追加的に、治療剤として開発され得る潜在的ヒト抗体を特性化し、選択するために、そのような非ヒト動物における免疫反応がモニタリングされ得る。
複数のエピトープに結合する抗原結合タンパク質
本明細書に記載の組成物及び方法は、複数のエピトープに結合する結合タンパク質、例えば、二重特異的抗体を作製するために使用され得る。本発明の利点には、好適に高い結合性の（例えば、親和性成熟した）重鎖免疫グロブリン鎖（その各々が単一の軽鎖に会合する）を選択する能力が含まれる。
二重特異的結合タンパク質の合成及び発現は、２つの異なる重鎖と会合し、発現し得る好適な軽鎖を同定することに関連する問題に部分的に起因して、また、単離の問題に部分的に起因して課題が存在する。本明細書に記載の方法及び組成物により、遺伝子改変された非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、体細胞超変異した（例えば、親和性成熟した）重鎖を含む複数の重鎖と会合し、発現し得るヒトλ軽鎖可変ドメインを含む好適な軽鎖を別途天然プロセスを介して選択することが可能となる。逆キメラ重鎖（すなわち、ヒト可変ドメイン及び非ヒト（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）定常ドメイン）を有する親和性成熟した抗体を発現する本明細書に記載される免疫されたマウスの好適なＢ細胞からのヒトＶλ及びＶＨ配列が同定され、好適なヒト定常領域遺伝子配列（例えば、ヒトＩｇＧ１）と共に発現ベクターにおいてインフレームでクローニングされ得る。２つのそのようなコンストラクトが調製され得、各コンストラクトは、異なるエピトープに結合するヒト重鎖可変ドメインをコードする。生殖細胞系列配列またはその体細胞超変異バージョンを有する遺伝子セグメント（例えば、Ｂ細胞から同定される）を含む再編成されたヒトλ軽鎖可変領域（例えば、ヒトＶλ１－５１／Ｊλ２またはヒトＶλ２－１４／Ｊλ２）は、好適なヒト定常領域遺伝子（例えば、ヒトλ定常遺伝子）とインフレームで融合され得る。これらの３つの完全ヒト重鎖及び軽鎖コンストラクトは、発現のための好適な細胞内に配置され得る。細胞は、２つの主要な種：同一の軽鎖を有するホモ二量体重鎖、及び同一の軽鎖を有するヘテロ二量体重鎖を発現する。これらの主要な種の容易な分離を可能にするため、重鎖の一方は、プロテインＡ結合決定基を除外するように改変され、ヘテロ二量体結合タンパク質とは異なるホモ二量体結合タンパク質の親和性がもたらされる。この問題に対処する組成物及び方法は、米国特許第８，５８６，７１３号；第９，３０９，３２６号；及び第９，９８２，０１３号（これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される抗原結合タンパク質であって、ヒトＶλ及びＶＨ配列が、対象となるエピトープを含む抗原または対象となる抗原で免疫された本明細書に記載のマウスに由来する、抗原結合タンパク質が提供される。
いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質であって、第１及び第２のポリペプチドを含み、第１のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、第１のエピトープに選択的に結合する第１の抗原結合ドメインと、それに続くＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧの第１のＣＨ３ドメインを含む定常ドメインを含み；第２のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端まで、第２のエピトープに選択的に結合する第２の抗原結合ドメインと、それに続くＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧの第２のＣＨ３ドメインを含む定常ドメインを含み、第２のＣＨ３ドメインは、プロテインＡに対する第２のＣＨ３ドメインの結合を減少または排除する改変を含む、抗原結合タンパク質が提供される。
いくつかの実施形態では、第１の重鎖及び第２の重鎖を含む抗原結合タンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、第１の重鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、第１のエピトープに（ヒトλ軽鎖可変ドメインと共に）選択的に結合する第１のヒト重鎖可変ドメインと、それに続くＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧの第１のＣＨ３ドメインを含む定常ドメインを含む。いくつかの実施形態では、第２の重鎖は、Ｎ末端からＣ末端まで、第２のエピトープ（第１のエピトープと同じまたは異なる抗原上にあり得る）に（同じヒトλ軽鎖可変ドメインと共に）選択的に結合する第２のヒト重鎖可変ドメインと、それに続くＩｇＧ１、ＩｇＧ２、及びＩｇＧ４から選択されるヒトＩｇＧの第２のＣＨ３ドメインを含む定常ドメインを含み、第２のＣＨ３ドメインは、プロテインＡに対する第２のＣＨ３ドメインの結合を減少または排除する改変を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは、プロテインＡに対するＣＨ３ドメインの結合を減少または除外する改変を含む。いくつかの実施形態では、プロテインＡに対するＣＨ３ドメインの結合を減少または排除する改変は、Ｈ９５Ｒ改変（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングによるＨ４３５Ｒ）を含む。いくつかの実施形態では、プロテインＡに対するＣＨ３ドメインの結合を減少または排除する改変は、Ｙ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）を含む。いくつかの実施形態では、プロテインＡに対するＣＨ３ドメインの結合を減少または排除する改変は、Ｈ９５Ｒ改変（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングによるＨ４３５Ｒ）及びＹ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）を含む。
いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ改変（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングによるＨ４３５Ｒ）、Ｙ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）、またはその両方を含むＩｇＧ１ドメインであり、Ｄ１６Ｅ改変、Ｌ１８Ｍ改変、Ｎ４４Ｓ改変、Ｋ５２Ｎ改変、Ｖ５７Ｍ改変、Ｖ８２Ｉ改変、またはそれらの組み合わせ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｖ４２２Ｉ、またはそれらの組み合わせ）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ改変（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングによるＨ４３５Ｒ）、Ｙ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）、またはその両方を含むＩｇＧ２ドメインであり、Ｎ４４Ｓ改変、Ｋ５２Ｎ改変、Ｖ８２Ｉ改変、またはそれらの組み合わせ（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ４２２Ｉ、またはそれらの組み合わせ）をさらに含む。
いくつかの実施形態では、ＣＨ３ドメインは、Ｈ９５Ｒ改変（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングによるＨ４３５Ｒ）、Ｙ９６Ｆ改変（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＹ４３６Ｆ）、またはその両方を含むＩｇＧ４ドメインであり、Ｑ１５Ｒ改変、Ｎ４４Ｓ改変、Ｋ５２Ｎ改変、Ｖ５７Ｍ改変、Ｒ６９Ｋ改変、Ｅ７９Ｑ改変、及びＶ８２Ｉ改変（ＩＭＧＴ；ＥＵによるＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９Ｑ、Ｖ４２２Ｉ、またはそれらの組み合わせ）をさらに含む。
複数のエピトープに結合する抗原結合タンパク質を作製するための１つの方法は、本明細書に記載される、限られたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域レパートリーを有する第１の非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）を、対象となる第１のエピトープを含む第１の抗原で免疫することであり、その場合、非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）は、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域に機能可能に連結された１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む。そのような非ヒト動物は、免疫された場合、限られたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域レパートリー（例えば、単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域）から発現されるヒトλ軽鎖可変ドメインを含む逆キメラ抗体を作製する。対象となるエピトープに結合するヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするＢ細胞が同定され得る。いくつかの実施形態では、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列が読み出され（例えば、ＰＣＲによる）、好適なヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメインと共にインフレームで発現コンストラクトにクローニングされ得る。いくつかの実施形態では、このプロセスは、第２の抗原の第２のエピトープに結合する第２のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを同定するために繰り返され得、第２のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインは読み出され、第２の好適な免疫グロブリン定常領域にインフレームで発現ベクターにクローニングされ得る。いくつかの実施形態では、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列が読み出され（例えば、ＰＣＲによる）、好適なヒト免疫グロブリンλ軽鎖定常領域と共にインフレームで発現コンストラクトにクローニングされ得る。いくつかの実施形態では、第１及び第２の免疫グロブリンヒト重鎖定常ドメインは、同じまたは異なるアイソタイプであり得る。いくつかの実施形態では、免疫グロブリンヒト重鎖定常ドメインの一方（他方はそうではない）は、本明細書または米国特許第８，５８６，７１３号；第９，３０９，３２６号；及び第９，９８２，０１３号（これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように改変され得る。いくつかの実施形態では、抗原結合タンパク質は、好適な細胞において発現され、例えば、米国特許第８，５８６，７１３号；第９，３０９，３２６号；及び第９，９８２，０１３号（これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、ホモ二量体抗原結合タンパク質と比較して、プロテインＡに対するその異なる親和性に基づいて単離され得る。いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗原は同じであり得、第１及び第２のエピトープは異なり得る。いくつかの実施形態では、第１及び第２の抗原は異なる。いくつかの実施形態では、二重特異的抗原結合タンパク質は、同じ抗原に結合する単一特異的抗原結合タンパク質よりも高い親和性で抗原に結合する。いくつかの実施形態では、二重特異的抗原結合タンパク質は、異なる親和性で第１のエピトープ及び第２のエピトープに結合する。
いくつかの実施形態では、二重特異的抗原結合タンパク質を作製するための方法であって、内因性κ軽鎖遺伝子座で単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域、ならびに非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域に機能可能に連結された１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）からの第１の親和性成熟した（例えば、１つ以上の体細胞超変異を含む）ヒト重鎖可変ドメインを同定することを含む、方法が提供される。いくつかの実施形態では、二重特異的抗原結合タンパク質を作製するための方法は、内因性κ軽鎖遺伝子座で単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域（例えば、第１の可変ドメインを生成するために使用された非ヒト動物におけるものと同じ単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域）、ならびに非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域に機能可能に連結された１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、本明細書に記載される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）からの第２の親和性成熟した（例えば、１つ以上の体細胞超変異を含む）重鎖可変ドメインを同定することを含む。いくつかの実施形態では、第１の親和性成熟ヒト重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列は、米国特許第８，５８６，７１３号；第９，３０９，３２６号；及び第９，９８２，０１３号（これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているように、プロテインＡ決定基改変を欠くヒト重鎖定常領域と共にインフレームでクローニングされて、完全ヒト重鎖をコードする第１のヌクレオチド配列が形成される。いくつかの実施形態では、第２の親和性成熟ヒト重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列は、米国特許第８，５８６，７１３号；第９，３０９，３２６号；及び第９，９８２，０１３号（これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているようにプロテインＡ決定基を含むヒト重鎖定常領域と共にインフレームでクローニングされて、第２の完全ヒト重鎖が形成される。いくつかの実施形態では、この段落に記載されている第１の完全ヒト重鎖をコードするヌクレオチド、及びこの段落に記載されている第２の完全ヒト重鎖をコードするヌクレオチドは、宿主細胞（例えば、哺乳動物細胞）に導入される。いくつかの実施形態では、この段落に記載されている第１の完全ヒト重鎖をコードするヌクレオチドは、第１の発現ベクターに含まれる。いくつかの実施形態では、この段落に記載されている第２の完全ヒト重鎖をコードするヌクレオチドは、第２の発現ベクターに含まれる。いくつかの例では、第１及び第２の発現ベクターは、同じであり、または異なる。いくつかの実施形態では、二重特異的抗体を作製する方法は、この段落に記載されている第１の完全ヒト重鎖をコードするヌクレオチド、この段落に記載されている第２の完全ヒト重鎖をコードするヌクレオチド、及びヒトλ軽鎖可変ドメインを含むヒトλ軽鎖をコードするヌクレオチドを宿主細胞において発現させることを含み、これによりヒトλ軽鎖可変ドメインが、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリー（例えば、単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域）を有する本明細書に記載される非ヒト動物によって生成された配列を有する二重特異的抗体が形成される。他の実施形態では、ヒトλ軽鎖可変ドメインは、非ヒト動物に存在するものと同じヒトＶ／Ｊ再編成（例えば、非ヒト動物に存在するものと同じ単一の再編成されたヒトλ軽鎖可変領域）に由来する配列を有する。いくつかの実施形態では、二重特異的抗体を作製する方法は、例えば、宿主細胞またはその培地から二重特異的抗体を得ることを含む。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、原核生物及び真核生物の細胞（単細胞または多細胞）、細菌細胞（例えば、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．などの系統）、マイコバクテリウム細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ、Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐｉｃｈｉａ ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ－９、ＳＦ－２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉなど）、非ヒト動物細胞、ヒト細胞、または例えば、ハイブリドーマもしくはクアドローマなどの細胞融合物であり得る。いくつかの実施形態では、細胞は、ヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラット、またはマウス細胞である。いくつかの実施形態では、細胞は、真核であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ－１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ－ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ－７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ－６０、（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮）、ＣＶ－１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ－０、ＭＭＴ ０６０５６２、セルトリ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞、及び前述した細胞に由来する細胞株。いくつかの実施形態では、細胞は、１つ以上のウイルス遺伝子を含む、例えば、ウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６（登録商標）細胞）。
薬学的組成物
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される非ヒト動物によって生成されるまたは本明細書に開示される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）によって生成される抗体、核酸、またはその治療的に関連する部分に由来する抗原結合タンパク質、抗原結合タンパク質をコードする核酸、またはその治療的に関連する部分は、対象（例えば、ヒト対象）に投与され得る。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に開示される非ヒト動物によって生成される抗体を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、緩衝液、希釈剤、賦形剤、またはそれらの任意の組み合わせを含み得る。いくつかの実施形態では、組成物はまた、所望の場合、１つ以上の追加の治療的活性物質を含有し得る。
本明細書で提供される薬学的組成物の説明は、主に、ヒトへの倫理的投与に好適な薬学的組成物に向けられているが、そのような組成物は、通常、すべての種類の動物への投与に好適であることが当業者によって理解される。組成物を様々な動物に対する投与に好適なものとするためのヒトへの投与に好適な薬学的組成物の改変はよく理解されており、通常の熟練された獣医学的薬理学者は、存在する場合でも慣用の実験を伴ってそのような改変を設計及び／または実施し得る。
例えば、本明細書で提供される薬学的組成物は、減菌注射可能な形態（例えば、皮下注射または静脈内注入に好適な形態）であり得る。例えば、いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、注射に好適な液体投薬形態で提供される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、任意に真空下で、注射前に水性希釈剤（例えば、水、緩衝液、塩溶液など）で再構成され得る粉末（例えば、凍結乾燥及び／または滅菌される）として提供される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、水、塩化ナトリウム溶液、酢酸ナトリウム溶液、ベンジルアルコール溶液、リン酸緩衝生理食塩水などで希釈及び／または再構成される。いくつかの実施形態では、粉末は、水性希釈剤と穏やかに混合されるべきである（例えば、振盪しない）。
本明細書に記載の薬学的組成物の製剤は、薬理学の分野で知られているまたは今後開発される任意の方法によって調製され得る。通常、そのような調製方法は、活性成分を希釈剤もしくは別の賦形剤及び／または１つ以上の他の付属成分と関連させ、次いで、必要に応じて及び／または所望により、生成物を所望の単一または複数用量単位に成形及び／または包装する工程を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される非ヒト動物（例えば、げっ歯類、例えば、ラットまたはマウス）によって生成される抗体を含む薬学的組成物は、保存または投与のための容器、例えば、バイアル、シリンジ（例えば、ＩＶシリンジ）、または袋（例えば、ＩＶ袋）に含まれ得る。本開示に従う薬学的組成物は、バルクで、単一単位用量として、及び／または複数の単一単位用量として調製、包装、及び／または販売され得る。本明細書で使用される場合、「単位用量」は、既定量の活性成分を含む薬学的組成物の個別量である。活性成分の量は、通常、対象に投与されるであろう活性成分の投薬量及び／または例えば、そのような投薬量の２分の１または３分の１などのそのような投薬量の好都合な分数と等しい。
本開示による薬学的組成物における活性成分、薬学的に許容可能な賦形剤、及び／または任意の追加の成分の相対量は、処置される対象の同一性、サイズ、及び／または状態に応じて、及びさらに組成物が投与される経路に応じて変わり得る。例として、組成物は、０．１％～１００％（ｗ／ｗ）の間の活性成分を含み得る。
薬学的組成物は、本明細書で使用される場合、所望の特定の投薬形態に好適となるように、任意の及びすべての溶媒、分散媒体、希釈剤、または他の液体ビヒクル、分散または懸濁助剤、表面活性剤、等張剤、増粘または乳化剤、防腐剤、固体結合剤、滑沢剤などを含む薬学的に許容可能な賦形剤を追加的に含み得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ，２１ｓｔ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａ．Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ，Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，ＭＤ，２００６）は、薬学的組成物の製剤化において使用される様々な賦形剤及びそれを調製するための既知の技術を開示している。任意の従来の賦形剤媒体が、任意の望ましくない生物学的作用をもたらす、またはそうでなければ薬学的組成物の任意の他の成分（複数可）と有害な様式で相互作用することなどにより、物質またはその誘導体と不適合である場合を除き、その使用は、本発明の範囲内であることが企図される。
いくつかの実施形態では、薬学的に許容可能な賦形剤は、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、または１００％純粋である。いくつかの実施形態では、賦形剤は、ヒトにおける使用のために及び獣医学的使用のために承認されている。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国食品医薬品局によって承認されている。いくつかの実施形態では、賦形剤は、薬学的グレードである。いくつかの実施形態では、賦形剤は、米国薬局方（ＵＳＰ）、欧州薬局方（ＥＰ）、英国薬局方、及び／または国際薬局方の基準を満たす。
薬学的組成物の製造において使用される薬学的に許容可能な賦形剤には、不活性希釈剤、分散及び／または造粒剤、表面活性剤及び／または乳化剤、崩壊剤、結合剤、防腐剤、緩衝剤、滑沢剤、及び／または油が含まれるがこれらに限定されない。そのような賦形剤は、薬学的製剤に任意に含まれ得る。賦形剤、例えば、ココアバター及び座剤ワックス、着色剤、コーティング剤、甘味、香味、及び／または芳香剤は、製剤製造者の判断に従って、組成物に存在し得る。
いくつかの実施形態では、提供される薬学的組成物は、１つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤（例えば、防腐剤、不活性希釈剤、分散剤、表面活性剤及び／または乳化剤、緩衝剤など）を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、１つ以上の防腐剤を含む。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、防腐剤を含まない。
いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、冷蔵及び／または冷凍され得る形態で提供される。いくつかの実施形態では、薬学的組成物は、冷蔵及び／または冷凍することができない形態で提供される。いくつかの実施形態では、再構成された溶液及び／または液体投薬形態は、再構成後に所定期間（例えば、２時間、１２時間、２４時間、２日、５日、７日、１０日、２週、１ヶ月、２ヶ月、またはそれ以上）保存され得る。いくつかの実施形態では、特定の時間よりも長い間の抗体組成物の保存は、抗体分解をもたらす。
液体投薬形態及び／または再構成された溶液は、投与前に粒子状物質及び／または変色を含み得る。いくつかの実施形態では、溶液は、変色及び／または混濁している場合、及び／または粒子状物質が濾過後に残留する場合、使用されるべきではない。
薬学的薬剤の製剤化及び／または製造における一般的考慮事項は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２１ｓｔ ｅｄ．，Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ＆ Ｗｉｌｋｉｎｓ，２００５で見ることができる。
キット
本開示は、少なくとも本明細書に記載される非ヒト細胞、タンパク質（単一または複合体（例えば、抗体またはその断片））、ＤＮＡ断片、ターゲティングベクター、またはそれらの任意の組み合わせが充填された１つ以上の容器を含むパックまたはキットをさらに提供する。キットは、任意の適用可能な方法（例えば、研究方法）において使用され得る。そのような容器（複数可）には、医薬品または生物製品の製造、使用または販売を規制する政府機関によって規定された形式の文書を任意に添付してもよく、文書は、（ａ）ヒト投与のための製造、使用または販売に関する当局による承認、（ｂ）使用の指示、及び／または（ｃ）材料及び／または生物製品（例えば、本明細書に記載される非ヒト動物または非ヒト細胞）を２つ以上の実体及びこれらの組み合わせの間で移送することを管理する契約を示すものである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト細胞、非ヒト組織、不死化細胞、非ヒトＥＳ細胞、または非ヒト胚を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞、非ヒト組織、不死化細胞、非ヒトＥＳ細胞、または非ヒト胚からのアミノ酸（例えば、抗体またはその断片）を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞、非ヒト組織、不死化細胞、非ヒトＥＳ細胞、または非ヒト胚からの核酸（例えば、抗体またはその断片をコードする核酸）を含むキットが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載される非ヒト動物、非ヒト細胞、非ヒト組織、不死化細胞、非ヒトＥＳ細胞、または非ヒト胚から同定された配列（アミノ酸及び／または核酸配列）を含むキットが提供される。
いくつかの実施形態では、療法または診断のための薬物（例えば、抗体またはその断片）の製造及び／または開発において使用するための本明細書に記載されるキットが提供される。
いくつかの実施形態では、疾患、障害または病態の処置、予防または好転のための薬物（例えば、抗体またはその断片）の製造及び／または開発において使用するための本明細書に記載されるキットが提供される。
所定の実施形態の他の特徴は、以下の例示的な実施形態の説明の過程において明らかになり、これは例示のために提供され、それを限定することは意図されていない。
以下の実施例は、本明細書に記載の方法及び組成物を作製及び使用する仕方を当業者に説明するために提供され；本開示の範囲を限定することは意図されていない。別段示されない限り、温度は摂氏で示され、圧力は大気圧またはその近くで示される。
概して、再編成されたヒトλ軽鎖可変領域を保有するターゲティングベクターをＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術を使用して作製した（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号及びＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（２００３）Ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ－ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１（６）：６５２－６５９（これらはそれぞれ、参照により本明細書に組み込まれる）参照）。マウスゲノム細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローンを、単一の再編成されたヒトラムダ軽鎖可変領域を含有するゲノムコンストラクトを生成するように改変した。そのコンストラクトを、内因性Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントを欠失するように事前に改変された内因性κ軽鎖遺伝子座に挿入した。
実施例１－再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２及びマウスＣκを含むターゲティングベクターの生成
当該技術分野で認識されている標準的な分子生物学技術を使用して再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２を作製した。再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２に含まれるヒトＶλ１－５１遺伝子セグメント及びヒトＪλ２遺伝子セグメントは、ヒトＶλ１－５１生殖細胞系列配列及びヒトＪλ２生殖細胞系列配列をそれぞれ有していた。
ＤＮＡ断片をｄｅ ｎｏｖｏ ＤＮＡ合成（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって作製した。断片は、ＡｓｃＩ部位、２ｋｂのヒトＶλ１－５１プロモーター領域、ヒトＶλ１－５１の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ヒトＶλ１－５１遺伝子セグメントのエクソン１のコーディング配列（リーダーペプチドをコードする配列を含む）、ヒトＶλ１－５１遺伝子セグメントのイントロン１、ヒトＶλ１－５１遺伝子セグメントの第２エクソン及びＪλ２遺伝子セグメントを含む再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２可変配列、ヒトＪκ５－Ｃκイントロンの最初の４１２ｂｐ（Ｊκ５スプライスドナー部位（ＳＤ）を含む）、及びＰＩ－ＳｃｅＩ部位を含有していた（配列番号３１；図１Ａ及び図９Ａ～Ｃも参照）。
上の段落に記載されている断片を先述のターゲティングベクターにライゲーションして図１ＡにおけるターゲティングベクターＡを生成した。先述のターゲティングベクターは、ＢＡＣ ＣＴ７－３０２ｇ１２に由来する約２３ｋｂの５’マウスホモロジーアーム、Ｆｒｔ－Ｕｂ－Ｎｅｏ－Ｆｒｔカセット、ＡｓｃＩ部位、再編成されたヒトＶκ３－２０／Ｊκ１可変領域、ＰＩ－ＳｃｅＩ部位、及びＢＡＣ ＣＴ７－２５４ｍ０４に由来する約７５ｋｂの３’マウスホモロジーアームを含有していた（例えば、米国特許第９，３３４，３３４号の図１４Ｂ、及び米国特許第１０，１４３，１８６号の図２（これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）参照）。マウスホモロジーアームは、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１１１：５１４７－５２（参照により本明細書に組み込まれる）によって先行記載されているものと同一であった。５’アームは、内因性カッパ遺伝子座の上流の約２３ｋｂのゲノム配列を含有し、３’アームは、約２．４ｋｂのマウスＪκ－Ｃκイントロン、マウスＣκエクソン、及びマウスκ遺伝子座の下流の約７２ｋｂのゲノム配列を含有していた。図１Ａ参照。
ターゲティングベクターＡは、５’から３’まで、ＢＡＣ ＣＴ７－３０２ｇ１２に由来する約２３ｋｂの５’マウスホモロジーアーム、Ｆｒｔ－Ｕｂ－Ｎｅｏ－Ｆｒｔカセット、ＡｓｃＩ部位、２ｋｂのヒトＶλ１－５１プロモーター領域、ヒトＶλ１－５１の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ヒトＶλ１－５１遺伝子セグメントのエクソン１のコーディング配列（リーダーペプチドをコードする配列を含む）、ヒトＶλ１－５１遺伝子セグメントのイントロン１、ヒトＶλ１－５１遺伝子セグメントの第２エクソン及びＪλ２遺伝子セグメントを含む再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２可変配列、ヒトＪκ５－Ｃκイントロンの最初の４１２ｂｐ（Ｊκ５スプライスドナー部位（ＳＤ）を含む）、ＰＩ－ＳｃｅＩ部位、ならびに約２．４ｋｂのマウスＪκ－Ｃκイントロン、マウスＣκエクソン、及びマウスκ遺伝子座の下流の約７２ｋｂのゲノム配列を含む、ＢＡＣ ＣＴ７－２５４ｍ０４に由来する約７５ｋｂの３’マウスホモロジーアームを含有していた。
実施例２－再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２及びマウスＣκを含むＥＳ細胞の生成
実施例１に記載されているターゲティングベクターＡを、内因性Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントが再編成されたヒトＶκ３－２０／Ｊκ１で置き換えられ、かつ免疫グロブリン重鎖遺伝子座がマウス重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された非再編成ヒトＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含むマウスＥＳ細胞にエレクトロポレーションする。マウスＥＳ細胞の免疫グロブリン重鎖遺伝子座はまた、機能性マウスＡｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子を含む（米国特許第１０，１３０，０８１号（参照により本明細書に組み込まれる）参照）。相同組換えを受けたクローンの選択は、再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２及びマウスＣκからの抗体を発現するキメラマウスを生成するための改変されたＥＳ細胞をもたらす。
陽性ＥＳ細胞クローンを、内因性κ遺伝子座に挿入された再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２に特異的なプライマー及びプローブを使用してＴＡＱＭＡＮ（商標）スクリーニングによって確認する（上記のＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（参照により本明細書に組み込まれる）参照）。検出に使用され得る様々なプローブのおおよその位置が図３において丸付きダッシュマークによって示されている。アッセイにおいて使用されるプライマー及びプローブは、以下の表Ａにおけるものの中に列挙されている。
Figure 2022535418000024
Figure 2022535418000025
再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２を含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座を保有するＥＳ細胞（図３参照）を、ターゲティングコンストラクトによって導入されたＦＲＴｅｄネオマイシンカセットを除去するために、ＦＬＰを発現するコンストラクトでトランスフェクションする。任意に、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウス（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９（その全体が参照により組み込まれる））と交配することによって除去される。任意に、ネオマイシンカセットは、マウスにおいて保持される。
実施例３－再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２及びマウスＣκに由来する軽鎖を発現するマウスの生成
上記の実施例２に記載の標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞期のマウス胚に導入する（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号及びＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｆ０ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｉｃｅ ｔｈａｔ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｆｕｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｏｎｏｒ ｇｅｎｅ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１－９９（これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）参照）。マウスＣκに連結された再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２を含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座を保有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を、再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２の存在を検出するアレルの改変アッセイ（上記のＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（参照により本明細書に組み込まれる））を使用してジェノタイピングすることによって同定する。１つ目の遺伝子座アレルでマウスＣκに連結された再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２を含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座を保有するマウスは、２つ目の遺伝子座アレルでマウスマウスＣκに連結された再編成されたヒトＶκ３－２０／Ｊκ１を含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座を保有し、マウス重鎖定常領域遺伝子ならびに機能性マウスＡｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子に機能可能に連結された非再編成ヒトＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含有し得る。
マウスを、再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２及びマウスＣκを含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座についてホモ接合性、及びマウス重鎖定常領域遺伝子ならびに機能性マウスＡｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子に機能可能に連結された非再編成ヒトＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてホモ接合性となるように交配する。１つの方法では、これはまず、１つ目の軽鎖遺伝子座アレルでマウスＣκに連結された再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２を含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座、２つ目の軽鎖遺伝子座アレルでマウスＣκに連結された再編成されたヒトＶκ３－２０／Ｊκ１を含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座、及び（両方の重鎖アレルで）マウス重鎖定常領域遺伝子ならびに機能性マウスＡｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子に機能可能に連結された非再編成ヒトＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むマウスを、以下にさらに記載されているように、内因性重鎖及び軽鎖カッパ遺伝子座のノックアウト（ＫＯ）を含み、任意に内因性ラムダ遺伝子座のＫＯも含むマウスと交配することによって達成され得る。代替的には、マウスを、内因性軽鎖カッパ遺伝子座のＫＯを含み、任意に内因性ラムダ遺伝子座のＫＯを含み、マウス重鎖定常領域遺伝子ならびに機能性マウスＡｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子に機能可能に連結された非再編成ヒトＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてホモ接合性のマウスと交配し得る。得られたマウスを、免疫グロブリン遺伝子座、例えば、修飾された及び／または内因性の免疫グロブリン遺伝子座、例えば、ヒト化ラムダ軽鎖及び重鎖遺伝子座でホモ接合性となるように交配する。
仔をジェノタイピングし、再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２及びマウスＣκを含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座についてヘテロ接合性またはホモ接合性の仔を選択し、再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２またはその体細胞超変異バリアントからのヒトλ軽鎖可変ドメインの発現を評価し、特性化する。本明細書に記載の修飾された軽鎖を含むマウスにおけるヒトＶλ１－５１／Ｊλ２のＢ細胞表面発現をＦＡＣＳ分析を使用して検出する。
実施例４－再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２及びマウスＣλ１を含むターゲティングベクターの生成
ターゲティングベクターＡにおけるマウスＣκをマウスＣλ１で置き換えるために、追加のクローニング工程を実施した（図１Ｂ参照）。ターゲティングベクターＡを２つのＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体でｉｎ ｖｉｔｒｏで切断した：イントロンカッパエンハンサー（Ｅｉ）の上流の第１の切断及びＣκの下流の第２の切断。次いでギブソンアセンブリを実施して、欠失した領域を、Ｃａｓ９切断ターゲティングベクターの３’末端との４５ｂｐの重複、Ｅｉ、マウスＣλ１、ｌｏｘＰ－Ｕｂ－Ｈｙｇ－ｌｏｘＰカセット、及びＣａｓ９切断ターゲティングベクターの５’末端との８０ｂｐの重複を含有する４．９ｋｂの合成断片で置き換えた。合成断片は、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６３８４１の図１ＡのプラスミドｐＥの制限断片から得られた。得られたターゲティングベクターであるターゲティングベクターＢが図１Ｂに示されている。
ターゲティングベクターＢは、マウスＣκがマウスＣλ１で置き換えられ、ｌｏｘＰ－Ｕｂ－Ｈｙｇ－ｌｏｘＰカセットがＣκポリＡシグナルの下流に挿入されたことを除き、ターゲティングベクターＡと同一である。
実施例５－再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２及びマウスＣλ１を含むＥＳ細胞の生成
実施例４に記載されているターゲティングベクターＢを、内因性Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントが再編成されたヒトＶκ３－２０／Ｊκ１で置き換えられ、かつ免疫グロブリン重鎖遺伝子座がマウス重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された非再編成ヒトＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含んでいたマウスＥＳ細胞にエレクトロポレーションした。マウスＥＳ細胞の免疫グロブリン重鎖遺伝子座はまた、機能性マウスＡｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子を含んでいた（米国特許第１０，１３０，０８１号（参照により本明細書に組み込まれる）参照）。相同組換えを受けたクローンの選択は、再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２及びマウスＣλ１からの抗体を発現するキメラマウスを生成するための改変されたＥＳ細胞をもたらした。
陽性ＥＳ細胞クローンを、内因性κ遺伝子座に挿入された再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２及びマウスＣλ１に特異的なプライマー及びプローブを使用してＴＡＱＭＡＮ（商標）スクリーニングによって確認した（上記のＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（参照により本明細書に組み込まれる）参照）。検出に使用された様々なプローブのおおよその位置が図４において丸付きダッシュマークによって示されている。アッセイにおいて使用されたプライマー及びプローブは、上記の表Ａにおけるものの中に列挙されている。
再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２及びマウスＣλ１を含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座（図４参照）を保有するＥＳ細胞を、ＦＲＴｅｄネオマイシンまたはＦｌｏｘｅｄハイグロマイシンカセットを除去するために、ＦＬＰ及び／またはＣＲＥを発現するコンストラクトでトランスフェクションした。任意に、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウス（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９（その全体が参照により組み込まれる））と交配することによって除去され得、及び／またはハイグロマイシンカセットは、ＣＲＥリコンビナーゼを発現するマウスと交配することによって除去され得る。任意に、ネオマイシン及び／またはハイグロマイシンカセットは、マウスにおいて保持される。
実施例６－再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２及びマウスＣλ１に由来する軽鎖を発現するマウスの生成
上記の実施例５に記載の標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞期のマウス胚に導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号及びＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｆ０ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｉｃｅ ｔｈａｔ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｆｕｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｏｎｏｒ ｇｅｎｅ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１－９９（これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）参照）。再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２及びマウスＣλ１を含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座を保有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を、再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２またはマウスＣλ１の存在を検出するアレルアッセイ（上記のＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（参照により本明細書に組み込まれる）参照）の改変を使用してジェノタイピングすることによって同定した。１つ目の遺伝子座アレルでマウスＣλ１に連結された再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２を含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座を保有するマウスは、２つ目の遺伝子座アレルでマウスマウスＣκに連結された再編成されたヒトＶκ３－２０／Ｊκ１を含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座を保有し、マウス重鎖定常領域遺伝子ならびに機能性マウスＡｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子に機能可能に連結された非再編成ヒトＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含有し得る。
マウスを、再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２及びマウスＣλ１を含む改変されたκ軽鎖遺伝子座についてホモ接合性、及びマウス重鎖定常領域遺伝子ならびに機能性マウスＡｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子に機能可能に連結された非再編成ヒトＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてホモ接合性となるように交配する。１つの方法では、これはまず、１つ目の軽鎖遺伝子座アレルでマウスＣλ１に連結された再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２を含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座、２つ目の軽鎖遺伝子座アレルでマウスＣκに連結された再編成されたヒトＶκ３－２０／Ｊκ１を含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座、及び（両方の重鎖アレルで）マウス重鎖定常領域遺伝子ならびに機能性マウスＡｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子に機能可能に連結された非再編成ヒトＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むマウスを、以下にさらに記載されているように、内因性重鎖及び軽鎖カッパ遺伝子座のノックアウト（ＫＯ）を含み、任意に内因性ラムダ遺伝子座のＫＯも含むマウスと交配することによって達成され得る。代替的には、マウスを、内因性軽鎖カッパ遺伝子座のＫＯを含み、任意に内因性ラムダ遺伝子座のＫＯを含み、マウス重鎖定常領域遺伝子ならびに機能性マウスＡｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子に機能可能に連結された非再編成ヒトＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてホモ接合性のマウスと交配し得る。得られたマウスを、免疫グロブリン遺伝子座、例えば、修飾された及び／または内因性の免疫グロブリン遺伝子座、例えば、ヒト化ラムダ軽鎖及び重鎖遺伝子座でホモ接合性となるように交配する。
仔をジェノタイピングし、再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２及びマウスＣλ１を含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座についてヘテロ接合性またはホモ接合性の仔を選択し、再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２またはその体細胞超変異バリアントからのヒトλ軽鎖可変ドメインの発現を評価し、特性化する。本明細書に記載の修飾された軽鎖を含むマウスにおけるヒトＶλ１－５１／Ｊλ２のＢ細胞表面発現をＦＡＣＳ分析を使用して検出した。
実施例７－再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２及びマウスＣκを含むターゲティングベクターの生成
当該技術分野で認識されている標準的な分子生物学技術を使用して再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２を作製した。再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２に含まれるヒトＶλ２－１４遺伝子セグメント及びヒトＪλ２遺伝子セグメントは、ヒトＶλ２－１４生殖細胞系列配列及びヒトＪλ２生殖細胞系列配列をそれぞれ有していた。
ＤＮＡ断片をｄｅ ｎｏｖｏ ＤＮＡ合成（Ｂｌｕｅ Ｈｅｒｏｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ）によって作製した。断片は、ＡｓｃＩ部位、２ｋｂのヒトＶλ１－５１プロモーター領域、ヒトＶλ１－５１の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）、ヒトＶλ２－１４遺伝子セグメントのエクソン１のコーディング配列（リーダーペプチドをコードする配列を含む）、ヒトＶλ２－１４遺伝子セグメントのイントロン１、ヒトＶλ２－１４遺伝子セグメントの第２エクソン及びＪλ２遺伝子セグメントを含む再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２可変配列、ヒトＪκ５－Ｃκイントロンの最初の４１２ｂｐ（Ｊκ５スプライスドナー部位（ＳＤ）を含む）、及びＰＩ－ＳｃｅＩ部位を含有していた（配列番号３６；図２Ａ及び図１３Ａ～Ｃも参照）。
上の段落に記載されている断片を先述のターゲティングベクターにライゲーションして図２ＡにおけるターゲティングベクターＣを生成した。先述のターゲティングベクターは、ＢＡＣ ＣＴ７－３０２ｇ１２に由来する約２３ｋｂの５’マウスホモロジーアーム、Ｆｒｔ－Ｕｂ－Ｎｅｏ－Ｆｒｔカセット、ＡｓｃＩ部位、再編成されたヒトＶκ３－２０／Ｊκ１可変領域、ＰＩ－ＳｃｅＩ部位、及びＢＡＣ ＣＴ７－２５４ｍ０４に由来する約７５ｋｂの３’マウスホモロジーアームを含有していた（例えば、米国特許第９，３３４，３３４号の図１４Ｂ、及び米国特許第１０，１４３，１８６号の図２（これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）参照）。マウスホモロジーアームは、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１１１：５１４７－５２（参照により本明細書に組み込まれる）によって先行記載されているものと同一であった。５’アームは、内因性カッパ遺伝子座の上流の約２３ｋｂのゲノム配列を含有し、３’アームは、約２．４ｋｂのマウスＪκ－Ｃκイントロン、マウスＣκエクソン、及びマウスκ遺伝子座の下流の約７２ｋｂのゲノム配列を含有していた。図２Ａ参照。
ターゲティングベクターＣは、５’から３’まで、ＢＡＣ ＣＴ７－３０２ｇ１２に由来する約２３ｋｂの５’マウスホモロジーアーム、Ｆｒｔ－Ｕｂ－Ｎｅｏ－Ｆｒｔカセット、ＡｓｃＩ部位、２ｋｂのヒトＶλ１－５１プロモーター領域、ヒトＶλ１－５１の５’ＵＴＲ、Ｖλ２－１４遺伝子セグメントのエクソン１のコーディング配列（リーダーペプチドをコードする配列を含む）、ヒトＶλ２－１４遺伝子セグメントのイントロン１、ヒトＶλ２－１４遺伝子セグメントの第２エクソン及びＪλ２遺伝子セグメントを含む再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２可変配列、ヒトＪκ５－Ｃκイントロンの最初の４１２ｂｐ（Ｊκ５スプライス部位を含む）、ＰＩ－ＳｃｅＩ部位、ならびに約２．４ｋｂのマウスＪκ－Ｃκイントロン、マウスＣκエクソン、及びマウスκ遺伝子座の下流の約７２ｋｂのゲノム配列を含むＢＡＣ ＣＴ７－２５４ｍ０４に由来する約７５ｋｂの３’マウスホモロジーアームを含有する。
実施例８－再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２及びマウスＣκを含むＥＳ細胞の生成
ターゲティングベクターＣを、内因性Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントが再編成されたヒトＶκ３－２０／Ｊκ１で置き換えられ、かつ免疫グロブリン重鎖遺伝子座がマウス重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された非再編成ヒトＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含むマウスＥＳ細胞にエレクトロポレーションする。マウスＥＳ細胞の免疫グロブリン重鎖遺伝子座はまた、機能性マウスＡｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子を含む（米国特許第１０，１３０，０８１号（参照により本明細書に組み込まれる）参照）。相同組換えを受けたクローンの選択は、再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２及びマウスＣκからの抗体を発現するキメラマウスを生成するための改変されたＥＳ細胞をもたらす。
陽性ＥＳ細胞クローンを、内因性κ遺伝子座に挿入された再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２に特異的なプライマー及びプローブを使用してＴＡＱＭＡＮ（商標）スクリーニングによって確認する（上記のＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（参照により本明細書に組み込まれる）参照）。検出に使用される様々なプローブのおおよその位置が図５において丸付きダッシュマークによって示されている。アッセイにおいて使用されるプライマー及びプローブは、上記の表Ａにおけるものの中に列挙されている。
再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２を含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座（図５参照）を保有するＥＳ細胞を、ターゲティングコンストラクトによって導入されたＦＲＴｅｄネオマイシンカセットを除去するために、ＦＬＰを発現するコンストラクトでトランスフェクションする。任意に、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウス（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９（その全体が参照により組み込まれる））と交配することによって除去される。任意に、ネオマイシンカセットは、マウスにおいて保持される。
実施例９－再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２及びマウスＣκに由来する軽鎖を発現するマウスの生成
上記の実施例８に記載の標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞期のマウス胚に導入する（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号及びＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｆ０ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｉｃｅ ｔｈａｔ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｆｕｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｏｎｏｒ ｇｅｎｅ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１－９９（これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）参照）。再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２及びマウスＣκを含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座を保有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を、再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２の存在を検出するアレルアッセイ（上記のＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（参照により本明細書に組み込まれる））の改変を使用してジェノタイピングすることによって同定する。１つ目の遺伝子座アレルでマウスＣκに連結された再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２を含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座を保有するマウスは、２つ目の遺伝子座アレルでマウスマウスＣκに連結された再編成されたヒトＶκ３－２０／Ｊκ１を含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座を保有し、マウス重鎖定常領域遺伝子ならびに機能性マウスＡｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子に機能可能に連結された非再編成ヒトＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含有し得る。
マウスを、再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２及びマウスＣκを含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座についてホモ接合性、及びマウス重鎖定常領域遺伝子ならびに機能性マウスＡｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子に機能可能に連結された非再編成ヒトＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてホモ接合性となるように交配する。１つの方法では、これはまず、１つ目の軽鎖遺伝子座アレルで再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２及びマウスＣκを含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座、２つ目の軽鎖遺伝子座アレルでマウスＣκに連結された再編成されたヒトＶκ３－２０／Ｊκ１を含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座、及び（両方の重鎖アレルで）マウス重鎖定常領域遺伝子ならびに機能性マウスＡｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子に機能可能に連結された非再編成ヒトＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むマウスを、以下にさらに記載されているように、内因性重鎖及び軽鎖カッパ遺伝子座のノックアウト（ＫＯ）を含み、任意に内因性ラムダ遺伝子座のＫＯも含むマウスと交配することによって達成され得る。代替的には、マウスを、内因性軽鎖カッパ遺伝子座のＫＯを含み、任意に内因性ラムダ遺伝子座のＫＯを含み、マウス重鎖定常領域遺伝子ならびに機能性マウスＡｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子に機能可能に連結された非再編成ヒトＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてホモ接合性のマウスと交配し得る。得られたマウスを、免疫グロブリン遺伝子座、例えば、修飾された及び／または内因性の免疫グロブリン遺伝子座、例えば、ヒト化ラムダ軽鎖及び重鎖遺伝子座でホモ接合性となるように交配する。
仔をジェノタイピングし、再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２及びマウスＣκを含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座についてヘテロ接合性またはホモ接合性の仔を選択し、再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２またはその体細胞超変異バリアントからのヒトλ軽鎖可変ドメインの発現を評価し、特性化する。本明細書に記載の修飾された軽鎖を含むマウスにおけるヒトＶλ２－１４／Ｊλ２のＢ細胞表面発現をＦＡＣＳ分析を使用して検出する。
実施例１０－再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２及びマウスＣλ１を含むターゲティングベクターの生成
ターゲティングベクターＣにおけるマウスＣκをマウスＣλ１で置き換えるために、追加のクローニング工程を実施した（図２Ｂ参照）。ターゲティングベクターＣを２つのＣａｓ９：ｇＲＮＡ複合体でｉｎ ｖｉｔｒｏで切断した：イントロンカッパエンハンサー（Ｅｉ）の上流の第１の切断及びＣκの下流の第２の切断。次いでギブソンアセンブリを実施して、欠失した領域を、Ｃａｓ９切断ターゲティングベクターの３’末端との４５ｂｐの重複、Ｅｉ、マウスＣλ１、ｌｏｘＰ－Ｕｂ－Ｈｙｇ－ｌｏｘＰカセット、及びＣａｓ９切断ターゲティングベクターの５’末端との８０ｂｐの重複を含有する４．９ｋｂの合成断片で置き換えた。合成断片は、参照により本明細書に組み込まれるＰＣＴ／ＵＳ２０１８／０６３８４１の図１ＡのプラスミドｐＥの制限断片から得られた。得られたターゲティングベクターであるターゲティングベクターＤが図２Ｂに示されている。
ターゲティングベクターＤは、マウスＣκがマウスＣλ１で置き換えられ、ｌｏｘＰ－Ｕｂ－Ｈｙｇ－ｌｏｘＰカセットがＣκポリＡシグナルの下流に挿入されたことを除き、ターゲティングベクターＣと同一である。
実施例１１－再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２及びマウスＣλ１を含むＥＳ細胞の生成
ターゲティングベクターＤを、内因性Ｖκ及びＪκ遺伝子セグメントが再編成されたヒトＶκ３－２０／Ｊκ１で置き換えられ、かつ免疫グロブリン重鎖遺伝子座がマウス重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された非再編成ヒトＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含むマウスＥＳ細胞にエレクトロポレーションする。マウスＥＳ細胞の免疫グロブリン重鎖遺伝子座はまた、機能性マウスＡｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子を含む（米国特許第１０，１３０，０８１号（参照により本明細書に組み込まれる）参照）。相同組換えを受けたクローンの選択は、再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２及びマウスＣλ１からの抗体を発現するキメラマウスを生成するための改変されたＥＳ細胞をもたらす。
陽性ＥＳ細胞クローンを、内因性κ遺伝子座に挿入された再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２及びマウスＣλ１に特異的なプライマー及びプローブを使用してＴＡＱＭＡＮ（商標）スクリーニングによって確認する（上記のＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（参照により本明細書に組み込まれる）参照）。検出に使用される様々なプローブのおおよその位置が図６において丸付きダッシュマークによって示されている。アッセイにおいて使用されるプライマー及びプローブは、上記の表Ａにおけるものの中に列挙されている。
再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２及びマウスＣλ１を含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座を保有するＥＳ細胞（図６参照）を、ＦＲＴｅｄネオマイシンまたはＦｌｏｘｅｄハイグロマイシンカセットを除去するために、ＦＬＰ及び／またはＣＲＥを発現するコンストラクトでトランスフェクションする。任意に、ネオマイシンカセットを、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウス（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９（その全体が参照により組み込まれる））と交配することによって除去し、及び／またはハイグロマイシンカセットを、ＣＲＥリコンビナーゼを発現するマウスと交配することによって除去する。任意に、ネオマイシン及び／またはハイグロマイシンカセットは、マウスにおいて保持される。
実施例１２－再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２及びマウスＣλ１に由来する軽鎖を発現するマウスの生成
上記の実施例１１に記載の標的ＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として使用し、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞期のマウス胚に導入する（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号及びＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕ ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｆ０ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｉｃｅ ｔｈａｔ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｆｕｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｏｎｏｒ ｇｅｎｅ－ｔａｒｇｅｔｅｄ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５（１）：９１－９９（これらの各々は、参照により本明細書に組み込まれる）参照）。再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２及びマウスＣλ１を含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座を保有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を、再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２またはマウスＣλ１の存在を検出するアレルアッセイ（上記のＶａｌｅｎｚｕｅｌａ ｅｔ ａｌ．（参照により本明細書に組み込まれる）参照）の改変を使用してジェノタイピングすることによって同定する。１つ目の遺伝子座アレルでマウスＣλ１に連結された再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２を含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座を保有するマウスは、２つ目の遺伝子座アレルでマウスマウスＣκに連結された再編成されたヒトＶκ３－２０／Ｊκ１を含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座を保有し、マウス重鎖定常領域遺伝子ならびに機能性マウスＡｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子に機能可能に連結された非再編成ヒトＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含有し得る。
マウスを、再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２及びマウスＣλ１を含む改変されたκ軽鎖遺伝子座についてホモ接合性、及びマウス重鎖定常領域遺伝子ならびに機能性マウスＡｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子に機能可能に連結された非再編成ヒトＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてホモ接合性となるように交配する。１つの方法では、これはまず、１つ目の軽鎖遺伝子座アレルで再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２及びマウスＣλ１を含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座、２つ目の軽鎖遺伝子座アレルでマウスＣκに連結された再編成されたヒトＶκ３－２０／Ｊκ１を含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座、及び（両方の重鎖アレルで）マウス重鎖定常領域遺伝子ならびに機能性マウスＡｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子に機能可能に連結された非再編成ヒトＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含むマウスを、以下にさらに記載されているように、内因性重鎖及び軽鎖カッパ遺伝子座のノックアウト（ＫＯ）を含み、任意に内因性ラムダ遺伝子座のＫＯも含むマウスと交配することによって達成され得る。代替的には、マウスを、内因性軽鎖カッパ遺伝子座のＫＯを含み、任意に内因性ラムダ遺伝子座のＫＯを含み、マウス重鎖定常領域遺伝子ならびに機能性マウスＡｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子に機能可能に連結された非再編成ヒトＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてホモ接合性のマウスと交配し得る。得られたマウスを、免疫グロブリン遺伝子座、例えば、修飾された及び／または内因性の免疫グロブリン遺伝子座、例えば、ヒト化ラムダ軽鎖及び重鎖遺伝子座でホモ接合性となるように交配する。
仔をジェノタイピングし、再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２及びマウスＣλ１を含む修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座についてヘテロ接合性またはホモ接合性の仔を選択し、再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２またはその体細胞超変異バリアントからのヒトλ軽鎖可変ドメインの発現を評価し、特性化する。本明細書に記載の修飾された軽鎖を含むマウスにおけるヒトＶλ１２－１４／Ｊλ２のＢ細胞表面発現をＦＡＣＳ分析を使用して検出する。
実施例１３－マウスの交配
この実施例は、複数の遺伝子改変された免疫グロブリン遺伝子座を保有する複数の遺伝子改変されたマウス系統を作製するために、本明細書に記載の遺伝子改変されたマウスのいずれか１つと交配され得るいくつかの遺伝子改変されたマウス系統を記載する。
多くの様々な交配スキームは、マウスが再編成されたヒトＩｇλ可変ドメインを有する軽鎖及び再編成されたヒト重鎖可変ドメインを有する重鎖を発現するように、本明細書に記載の修飾された軽鎖及び重鎖遺伝子座でホモ接合性のマウスをもたらすことが想定される。１つのそのようなスキームでは、（内因性カッパ遺伝子座における）１つ目の軽鎖遺伝子座アレルでの再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２または再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２軽鎖及び（内因性カッパ遺伝子座における）２つ目の軽鎖遺伝子座アレルでの再編成されたヒトＶκ３－２０／Ｊκ１についてヘテロ接合性であり、かつ上述した非再編成ヒトＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてホモ接合性である上記の実施例３、６、９、及び１２に記載の遺伝子改変されたマウスを、内因性マウスＩｇκ、Ｉｇλ及びＩｇ重鎖遺伝子座の欠失についてホモ接合性のマウスと交配する。再編成されたλ軽鎖可変ドメインを発現する得られた子孫を互いに交配して、再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２または再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２軽鎖についてホモ接合性及び非再編成ヒトＶＨ、Ｄ、及びＪＨ遺伝子セグメントを含む（及び上述した機能性マウスＡｄａｍ６ａ及びＡｄａｍ６ｂ遺伝子も含む）修飾された免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてホモ接合性のマウスを得る。交配は、当該技術分野で認識されている標準的な技術によって、代替的には、商業的ブリーダー（例えば、Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって実施される。
内因性Ｉｇκノックアウト（Ｉｇκ ＫＯ）。例えば、上述した再編成されたヒトラムダ軽鎖可変領域及びヒト重鎖可変領域を含むマウスを、内因性Ｉｇκ軽鎖遺伝子座が内因性Ｉｇκ軽鎖を発現することを不可能にする内因性Ｉｇκ遺伝子座のすべてまたは一部の欠失を含むマウスと交配し得る。そのような例示的なマウスは、Ｍａｃｄｏｎａｌｄ ｅｔ ａｌ．（２０１４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１１１：５１４７－５２（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されている。
内因性Ｉｇλノックアウト（Ｉｇλ ＫＯ）。限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーの使用を最適化するために、上述した再編成されたヒトラムダ軽鎖可変領域及びヒト重鎖可変領域を含むマウスを、内因性Ｉｇλ軽鎖遺伝子座が内因性λ軽鎖を発現することを不可能にする内因性Ｉｇλ軽鎖遺伝子座のすべてまたは一部の欠失を含有するマウスと交配する（例えば、米国特許第９，０６６，５０２号（参照により本明細書に組み込まれる）の実施例１参照）。この手法では、得られた子孫は、それらのλ軽鎖のみとして、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリー（例えば、実施例３、６、９及び１２に記載されている再編成されたヒトＶλ／Ｊλ）から発現される可変ドメインを有する軽鎖を発現する。限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリー及び内因性λ軽鎖遺伝子座のすべてまたは一部の欠失を保有するマウス系統を、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーの存在及び内因性マウスλ軽鎖の非存在についてスクリーニングする。
内因性Ｉｇ重鎖ノックアウト（ＩｇＨ ＫＯ）。例えば、上述した再編成されたヒトラムダ軽鎖可変領域及び非再編成ヒト重鎖可変領域を含むマウスを、内因性Ｉｇ重鎖遺伝子座が内因性Ｉｇ重鎖を発現することを不可能にする内因性Ｉｇ重鎖遺伝子座のすべてまたは一部の欠失を含むマウスと交配し得る。そのような例示的なマウスは、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第１０，４５７，９６０号の実施例７に記載されている。
よって、上述したように、上述した再編成されたヒトラムダ軽鎖可変領域及びヒト重鎖可変領域を含むマウスを、内因性Ｉｇλ、Ｉｇκ、及び／またはＩｇ重鎖遺伝子座のすべてまたは一部の欠失を含むマウスと交配し得る。後の子孫を、免疫グロブリン遺伝子座、例えば、修飾された及び／または内因性の免疫グロブリン遺伝子座、例えば、ヒト化ラムダ軽鎖及び重鎖遺伝子座でホモ接合性となるように交配する。
実施例１４－重鎖遺伝子使用及びラムダ軽鎖の体細胞超変異頻度
再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２または再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２軽鎖可変領域及び内因性重鎖可変領域の本明細書で上述したヒト重鎖可変領域での置き換えを含むマウスからの重鎖遺伝子使用は、当該技術分野で知られているいくつかの方法を介して決定され得る。１つのそのような方法では、次世代シーケンシング技術が使用される。
普遍的な再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２または再編成されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２軽鎖マウス及び内因性重鎖可変領域の本明細書で上述したヒト重鎖可変領域での置き換えを含むマウスから採取された脾細胞または骨髄を、それらの抗体の重鎖可変領域セグメント使用について分析する。骨髄は、２．５％ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）を含有する１×リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ、Ｇｉｂｃｏ）で大腿骨をフラッシングすることによって大腿骨から収集し、骨髄細胞を必要に応じて異なるＢ細胞サブタイプについてＦＡＣＳ選別する。単一細胞懸濁液をマウス脾臓から調製する。脾臓及び骨髄調製物からの赤血球をＡＣＫ溶解緩衝液（Ｇｉｂｃｏ）で溶解する。抗ＣＤ１９（マウス、Ｂ細胞のためのマーカー）磁性ビーズ及びＭＡＣＳ（登録商標）カラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して磁気セルソーティングによって全脾細胞から脾臓Ｂ細胞を陽性濃縮する。ＲＮｅａｓｙ Ｐｌｕｓ ＲＮＡ単離キット（Ｑｉａｇｅｎ）を使用して製造業者の指示書に従って骨髄及び精製された脾臓Ｂ細胞からトータルＲＮＡを単離する。
ＳＭＡＲＴｅｒ（商標）ＲＡＣＥ ｃＤＮＡ増幅キット（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）及びＩｇＭまたはＩｇＧ特異的プライマーを使用して逆転写を実施してＩｇＭまたはＩｇＧ定常領域配列を含有するヒト重鎖ｃＤＮＡを生成する。逆転写の間、テンプレートスイッチ（ＴＳ）プライマーの逆相補体であるＤＮＡ配列は、新たに合成されたｃＤＮＡの３’末端に結合する。精製されたｃＤＮＡを、２回のセミネスト（ｓｅｍｉ－ｎｅｓｔｅｄ）ＰＣＲによって増幅して、ｍＲＮＡが得られた細胞によって発現した総ＩｇＭまたはＩｇＧ可変ドメイン相補体をコードする複数のｃＤＮＡを生成し、続いて３回のＰＣＲを行ってシーケンシングプライマー及びインデックスを結合させる。ヒト可変ドメインｃＤＮＡをＰｉｐｐｉｎ Ｐｒｅｐ（ＳＡＧＥ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用してサイズ選択し、ＫＡＰＡライブラリ定量キット（ＫＡＰＡ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してｑＰＣＲによって定量してから、サンプルをシーケンシングのためにＭｉＳｅｑシーケンサー（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）にロードする。
バイオインフォマティクス分析のため、Ｒａｗ Ｉｌｌｕｍｉｎａ配列を脱マルチプレックス化し、対応するＩｇＭまたはＩｇＧ定常領域遺伝子プライマーに対する質、長さ及び一致に基づいてフィルター処理する。重複するペアエンドリードをマージし、カスタムインハウスパイプラインを使用して分析する。そのパイプラインは、ＩｇＢＬＡＳＴ（ＮＣＢＩ、ｖ２．２．２５＋）のローカルインストールを使用し、再編成された重鎖配列をヒト生殖細胞系列重鎖Ｖ、Ｄ、及びＪ遺伝子セグメントデータベースにアライメントし、終止コドンの存在と共に生産性及び非生産性接合を表示する。ＣＤＲ３配列及び予測される非テンプレートヌクレオチドを、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（ＩＭＧＴ）において定義されている境界を使用して抽出する。
上記の方法は、様々なヒトＶ、Ｄ、及びＪセグメント使用及び本明細書に記載の普遍的な再編成されたヒト軽鎖マウスにおける特定のヒトＶＤＪ再編成の頻度の決定を可能にする。
普遍的な再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２またはＶλ２－１４／Ｊλ２軽鎖可変領域を含むマウスのラムダ軽鎖における体細胞超変異の存在及び頻度を決定するために、類似する次世代シーケンシング技術を使用し得る。例えば、マウスＣλ（例えば、Ｃλ１）定常領域に連結された普遍的な再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２またはＶλ２－１４／Ｊλ２軽鎖可変領域を含むマウスの場合、免疫グロブリンＣλ（例えば、Ｃλ１）特異的プライマーを使用して上述した逆転写ＰＣＲを実施して、免疫グロブリンλ定常領域（例えば、Ｃλ１）遺伝子配列を含有するｃＤＮＡを生成し、バイオインフォマティクス分析を行って、再編成された軽鎖配列をヒト生殖細胞系列Ｖλ及びＪλ遺伝子セグメントデータベースに対してアライメントする。マウスＣκ定常領域に連結された普遍的な再編成されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２またはＶλ２－１４／Ｊλ２軽鎖可変領域の場合、マウスＣκ特異的プライマーを代わりに使用する。ラムダ軽鎖における体細胞超変異の存在及び頻度を定量する。
実施例１５－マウスからのヒト抗体の生成
限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリー（例えば、実施例３、６、９及び１２に記載されている再編成されたヒトＶλ／Ｊλ）を含むマウスを、他の内因性Ｉｇ遺伝子座の改変及び欠失を含有する様々な所望の系統（例えば、実施例１３に記載されている）と交配した後、選択されたマウスを対象となる抗原で免疫し得る。
通常、限られたヒトλ軽鎖可変領域レパートリーを含むマウス（それらの生殖細胞系列ゲノムにおいてヒト重鎖可変領域遺伝子セグメント及び内因性マウスκ軽鎖遺伝子座の、修飾されたＶλ１－５１／Ｊλ２ヒト軽鎖領域または修飾されたＶλ２－１４／Ｊλ２ヒト軽鎖領域（上述）のいずれかでの置き換えを含み、内因性λ遺伝子座の除去を伴うまたは伴わないマウス）を対象となる抗原で免疫する。血液を収集し、抗体免疫反応を標準的な抗原特異的ＥＬＩＳＡイムノアッセイによってモニタリングする。
所望の免疫反応が達成された場合、１つの方法では、脾細胞（及び／または他のリンパ組織）を採取し、マウス骨髄腫細胞と融合して、それらの生存性を維持し、不死ハイブリドーマ細胞株を形成する。生成されたハイブリドーマ細胞株をスクリーニングし（例えば、ＥＬＩＳＡアッセイによって）、選択して抗原特異的抗体を生成するハイブリドーマ細胞株を同定する。ハイブリドーマを、所望に応じて相対的結合親和性及びアイソタイプについてさらに特性化し得る。この技術、及び上述した免疫原を使用して、いくつかの抗原特異的キメラ抗体（すなわち、ヒト可変ドメイン及びマウス定常ドメインを保有する抗体）を得る。
代替的には、別の方法では、本明細書に記載される及び／または例示される修飾されたマウスのＢ細胞によって生成される抗原特異的キメラ抗体、及び／またはそのλ軽鎖及び／または重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡを、抗原特異的Ｂ細胞から直接的に単離し得る。例えば、ヒト可変領域及びマウス定常領域を有する高親和性キメラ抗体を単離及び特性化し得、対象となる特定の抗体（及び／またはそれを生成するＢ細胞）を定義する。例を数個だけ挙げると、そのような抗体、及び／またはその可変及び／または定常領域の評価された特徴は、エピトープの親和性、選択性、同一性などのうちの１つ以上であり、またはそれを含み得る。抗原特異的抗体を、例えば、米国特許第７，５８２，２９８号（その全体が参照により本明細書に具体的に組み込まれる）に記載されているように、骨髄腫細胞に融合することなく、抗原陽性Ｂ細胞（免疫されたマウスからのもの）から直接的に単離する。
重鎖及びλ軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを、単離し、またはそうでなければ調製し得、完全ヒト抗体の調製のためにヒト重鎖（例えば、所望のアイソタイプのもの）及びヒトλ軽鎖定常領域にそれぞれ連結し得る。単離された重鎖及びλ軽鎖可変領域は、体細胞変異している場合がある。これは、抗原特異的レパートリーに対してさらなる多様性を付与する。完全ヒト抗体（及び／またはその重鎖またはλ軽鎖）を、細胞、典型的にはＣＨＯ細胞などの哺乳動物細胞において生成し得る。次いで完全ヒト抗体を、対象となる抗原の相対的結合親和性及び／または中和活性について特性化し得る。
実施例１６－二重特異的抗体の結合親和性
完全ヒト二重特異的抗体は、当該技術分野で知られている標準的な組換えＤＮＡ技術を使用して上述した対象となる抗原に特異的な選択された単一特異的抗体のクローニングされたヒト重鎖可変領域から構築される。簡潔には、修飾されたヒトＶλ１－５１／Ｊλ２軽鎖または修飾されたヒトＶλ２－１４／Ｊλ２軽鎖領域のいずれかを含むマウスから得られる２つの選択された単一特異的抗体からのヒト重鎖可変領域を含む２つのヒト重鎖を、マウスに存在する同じλ可変領域、またはその体細胞超変異バージョンを含むヒト軽鎖と一緒に好適な細胞株において発現させ；所望の特徴（例えば、２つの抗原について所望の親和性）を含む二重特異的抗体を得る。
対象となる抗原に特異的な二重特異的または親単一特異的抗体の、抗原のすべてまたは一部に対する結合を、ＢＩＡＣＯＲＥ（商標）２０００装置（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）でリアルタイム表面プラズモン共鳴バイオセンサーアッセイを使用して決定する。
所定の実施形態
実施形態１．遺伝子改変されたげっ歯類であって、その生殖細胞系列ゲノムは、
げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含み、
前記遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞によって発現されるすべての免疫グロブリンλ軽鎖は、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含む、前記遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態２．前記遺伝子改変されたげっ歯類の前記生殖細胞系列ゲノムは、前記修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座についてホモ接合性である、実施形態１に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態３．前記遺伝子改変されたげっ歯類の前記生殖細胞系列ゲノムは、前記修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座についてヘテロ接合性である、実施形態１に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態４．前記生殖細胞系列ゲノムは、
１つ以上のげっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座をさらに含み、
前記遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞によって発現されるすべての重鎖は、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及びげっ歯類免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む、実施形態１～３のいずれかに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態５．前記遺伝子改変されたげっ歯類の前記生殖細胞系列ゲノムは、前記修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてホモ接合性である、実施形態４に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態６．前記遺伝子改変されたげっ歯類は、前記修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座でげっ歯類Ｃκ遺伝子を欠く、実施形態１～５のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態７．前記ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、及びＶλ２－１４からなる群から選択される、実施形態１～６のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態８．前記ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７からなる群から選択される、実施形態１～７のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態９．前記１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントは、１つ以上の内因性ＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の内因性ＤＨ遺伝子セグメント、１つ以上の内因性ＪＨ遺伝子セグメント、またはそれらの組み合わせの代わりである、実施形態４～８のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態１０．前記１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントは、１つ以上の内因性ＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の内因性ＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の内因性ＪＨ遺伝子セグメントにそれぞれ置き換わる、実施形態４～９のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態１１．前記１つ以上のげっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子は、１つ以上の内因性げっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子である、実施形態９または１０に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態１２．
（ｉ）前記１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ３－７４、ＶＨ３－７３、ＶＨ３－７２、ＶＨ２－７０、ＶＨ１－６９、ＶＨ３－６６、ＶＨ３－６４、ＶＨ４－６１、ＶＨ４－５９、ＶＨ１－５８、ＶＨ３－５３、ＶＨ５－５１、ＶＨ３－４９、ＶＨ３－４８、ＶＨ１－４６、ＶＨ１－４５、ＶＨ３－４３、ＶＨ４－３９、ＶＨ４－３４、ＶＨ３－３３、ＶＨ４－３１、ＶＨ３－３０、ＶＨ４－２８、ＶＨ２－２６、ＶＨ１－２４、ＶＨ３－２３、ＶＨ３－２１、ＶＨ３－２０、ＶＨ１－１８、ＶＨ３－１５、ＶＨ３－１３、ＶＨ３－１１、ＶＨ３－９、ＶＨ１－８、ＶＨ３－７、ＶＨ２－５、ＶＨ７－４－１、ＶＨ４－４、ＶＨ１－３、ＶＨ１－２、ＶＨ６－１、またはそれらの任意の組み合わせを含み、
（ｉｉ）前記１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ＤＨ１－１、ＤＨ２－２、ＤＨ３－３、ＤＨ４－４、ＤＨ５－５、ＤＨ６－６、ＤＨ１－７、ＤＨ２－８、ＤＨ３－９、ＤＨ３－１０、ＤＨ５－１２、ＤＨ６－１３、ＤＨ２－１５、ＤＨ３－１６、ＤＨ４－１７、ＤＨ６－１９、ＤＨ１－２０、ＤＨ２－２１、ＤＨ３－２２、ＤＨ６－２５、ＤＨ１－２６、ＤＨ７－２７、またはそれらの任意の組み合わせを含み、
（ｉｉｉ）前記１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントは、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、ＪＨ６、またはそれらの任意の組み合わせを含む、
実施形態４～１１のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態１３．前記修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、機能性内因性げっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子を欠く、実施形態４～１２のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態１４．前記遺伝子改変されたげっ歯類の前記生殖細胞系列ゲノムは、１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む、実施形態４～１３のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態１５．前記１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片は、前記遺伝子改変されたげっ歯類によって発現される、実施形態１４に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態１６．前記１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列は、前記修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座と同じ染色体上に含まれる、実施形態１４または１５に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態１７．前記修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、前記１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む、実施形態１４～１６のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態１８．前記１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子の代わりである、実施形態１４～１７のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態１９．前記１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子に置き換わる、実施形態１４～１８のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態２０．前記１つ以上のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、第１及び第２のヒトＶＨ遺伝子セグメントを含み、前記１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列は、前記第１のヒトＶＨ遺伝子セグメントと前記第２のヒトＶＨ遺伝子セグメントとの間にある、実施形態１４～１９のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態２１．前記第１のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１－２であり、前記第２のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ６－１である、実施形態２０に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態２２．前記１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントとヒトＤＨ遺伝子セグメントとの間にある、実施形態１４～１７のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態２３．前記げっ歯類Ｃλ遺伝子は、（ｉ）マウスＣλ１、（ｉｉ）マウスＣλ２、または（ｉｉｉ）マウスＣλ３遺伝子と少なくとも８０％同一の配列を有する、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態２４．前記げっ歯類Ｃλ遺伝子は、マウスＣλ遺伝子を含む、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態２５．前記げっ歯類Ｃλ遺伝子は、マウスＣλ１遺伝子を含む、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態２６．前記げっ歯類Ｃλ遺伝子は、（ｉ）ラットＣλ１、（ｉｉ）ラットＣλ２、（ｉｉｉ）ラットＣλ３または（ｉｖ）ラットＣλ４遺伝子と少なくとも８０％同一の配列を有する、実施形態１～２２に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態２７．前記げっ歯類Ｃλ遺伝子は、ラットＣλ遺伝子を含む、実施形態１～２２のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態２８．前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、１つ以上のげっ歯類Ｖκ遺伝子セグメント、１つ以上のげっ歯類Ｊκ遺伝子セグメント、またはそれらの任意の組み合わせの代わりである、実施形態１～２７のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態２９．前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、１つ以上のげっ歯類Ｖκ遺伝子セグメント、１つ以上のげっ歯類Ｊκ遺伝子セグメント、またはそれらの任意の組み合わせに置き換わる、実施形態１～２８のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態３０．不活性化内因性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座をさらに含む、実施形態１～２９のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態３１．前記内因性Ｖλ遺伝子セグメント、前記内因性Ｊλ遺伝子セグメント、及び前記内因性Ｃλ遺伝子は、全体としてまたは部分的に欠失されている、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態３２．前記げっ歯類は、内因性免疫グロブリンκ軽鎖可変ドメインを検出可能に発現しない、実施形態１～３１のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態３３．前記遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞によって発現されるすべての免疫グロブリン軽鎖は、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含む、実施形態１～３２のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態３４．前記げっ歯類は、ラットまたはマウスである、実施形態１～３３のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
実施形態３５．第１の遺伝子改変されたげっ歯類、第２の遺伝子改変されたげっ歯類、及び第３の遺伝子改変されたげっ歯類を含む遺伝子改変されたげっ歯類の繁殖コロニーであって、前記第３の遺伝子改変されたげっ歯類は、前記第１の遺伝子改変されたげっ歯類及び前記第２の遺伝子改変されたげっ歯類の子孫であり、前記第１、第２、及び第３の遺伝子改変されたげっ歯類はそれぞれ、それらの生殖細胞系列ゲノムにおいて、
げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含み、
前記第１、第２、及び第３の遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞によって発現されるすべての免疫グロブリンλ軽鎖は、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含む、前記繁殖コロニー。
実施形態３６．前記第１、第２、及び第３の遺伝子改変されたげっ歯類の前記生殖細胞系列ゲノムは、前記修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてホモ接合性である、実施形態３５に記載の繁殖コロニー。
実施形態３７．前記第１、第２、及び第３の遺伝子改変されたげっ歯類の各々の前記修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座における前記ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、及びＶλ２－１４からなる群から選択される、実施形態３５または３６に記載の繁殖コロニー。
実施形態３８．前記第１、第２、及び第３の遺伝子改変されたげっ歯類の各々の前記修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座における前記ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７からなる群から選択される、実施形態３５～３７のいずれか１つに記載の繁殖コロニー。
実施形態３９．前記第１、第２、及び第３の遺伝子改変されたげっ歯類はそれぞれ、それらの生殖細胞系列ゲノムにおいて、
１つ以上の内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を含み、
前記遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞によって発現されるすべての重鎖は、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及びげっ歯類免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む、実施形態３５～３８のいずれか１つに記載の繁殖コロニー。
実施形態４０．前記第１、第２、及び第３の遺伝子改変されたげっ歯類の前記生殖細胞系列ゲノムは、前記修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてホモ接合性である、実施形態３９に記載の繁殖コロニー。
実施形態４１．げっ歯類胚であって、そのゲノムは、げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、前記げっ歯類胚。
実施形態４２．前記げっ歯類胚の前記ゲノムは、前記修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座についてホモ接合性である、実施形態４１に記載のげっ歯類胚。
実施形態４３．前記ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、及びＶλ２－１４からなる群から選択される、実施形態４１または４２に記載のげっ歯類胚。
実施形態４４．前記ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７からなる群から選択される、実施形態４１～４３のいずれか１つに記載のげっ歯類胚。
実施形態４５．１つ以上の内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座をさらに含む、実施形態４１～４４のいずれか１つに記載のげっ歯類胚。
実施形態４６．前記げっ歯類胚の前記ゲノムは、前記修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてホモ接合性である、実施形態４５に記載のげっ歯類胚。
実施形態４７．実施形態１～３４のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞であって、
前記修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座の前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンを含む、前記Ｂ細胞。
実施形態４８．実施形態４～３４のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞であって、
前記修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座の前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョン；及び
前記修飾された内因性重鎖遺伝子座において前記１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメントのヒトＶＨ遺伝子セグメント、前記１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメントのヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び前記１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントのヒトＪＨ遺伝子セグメントに由来する再編成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含む、前記遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞。
実施形態４９．実施形態４７または４８に記載のＢ細胞から生成されたハイブリドーマ。
実施形態５０．単一の遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞の集団であって、その生殖細胞系列ゲノムにおいて、
（ａ）げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座であって、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＪλ遺伝子セグメントに機能可能に連結されたヒトＶλ遺伝子セグメントを含む、前記修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座、及び
（ｂ）１つ以上の内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座
を含み、
前記Ｂ細胞の集団によって発現されるすべての抗体は、
（ｉ）前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメイン、及び
（ｉｉ）少なくとも２つの異なる再編成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現される複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン
を含む、前記Ｂ細胞の集団。
実施形態５１．げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む幹細胞であって、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、前記幹細胞。
実施形態５２．前記幹細胞の前記ゲノムは、前記修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座についてホモ接合性である、実施形態５１に記載の幹細胞。
実施形態５３．前記ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、及びＶλ２－１４からなる群から選択される、実施形態５１または５２に記載の幹細胞。
実施形態５４．前記ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７からなる群から選択される、実施形態５１～５３のいずれか１つに記載の幹細胞。
実施形態５５．１つ以上の内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座をさらに含む、実施形態５１～５４のいずれか１つに記載の幹細胞。
実施形態５６．抗体を発現する哺乳動物細胞であって、前記抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む重鎖及びヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含む軽鎖を含み、前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、前記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメイン、またはその両方は、実施形態４～３４のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類から同定された、前記哺乳動物細胞。
実施形態５７．
（ａ）実施形態１～３４のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類を対象となる抗原に曝露する工程；
（ｂ）前記遺伝子改変されたげっ歯類が前記対象となる抗原に対する免疫反応を生成するのに十分な条件下で前記遺伝子改変されたげっ歯類を維持する工程；及び
（ｃ）前記遺伝子改変されたげっ歯類から、
（ｉ）前記対象となる抗原に結合する抗体、
（ｉｉ）前記対象となる抗原に結合する抗体のヒト軽鎖もしくは重鎖可変ドメイン、軽鎖、または重鎖をコードするヌクレオチド、または
（ｉｉｉ）前記対象となる抗原に結合する抗体を発現する細胞
を回収する工程
を含む方法によって調製される抗体であって、
（ｃ）の抗体は、ヒト重鎖可変及びヒトλ軽鎖可変ドメインを含む、前記抗体。
実施形態５８．抗体を作製する方法であって、前記方法は、
（ａ）実施形態１～３４のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類を抗原に曝露すること；
（ｂ）前記遺伝子改変されたげっ歯類が前記抗原に対する免疫反応を起こすことを可能にすること；及び
（ｃ）前記遺伝子改変されたげっ歯類から前記抗原に特異的な抗体、前記抗原に特異的な抗体を発現するＢ細胞、または前記抗原に特異的な抗体をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を単離すること
を含む、前記方法。
実施形態５９．抗体を作製する方法であって、
（ａ）哺乳動物細胞において２つのヒト免疫グロブリンλ軽鎖及び２つのヒト免疫グロブリン重鎖を含む前記抗体を発現させる工程であって、各ヒト免疫グロブリンλ軽鎖は、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含み、各ヒト免疫グロブリン重鎖は、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインの少なくとも１つ、前記λ軽鎖可変ドメインの少なくとも１つ、またはそれらの組み合わせのアミノ酸配列は、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類において同定された、前記発現させる工程；及び
（ｂ）前記抗体を得る工程
を含む、前記方法。
実施形態６０．前記抗体は、二重特異的抗体である、実施形態５８または５９に記載の方法。
実施形態６１．二重特異的抗体を作製する方法であって、前記方法は、
（ａ）実施形態１～３５のいずれか１つに記載の第１の遺伝子改変されたげっ歯類を第１の抗原の第１のエピトープと接触させること、
（ｂ）実施形態１～３５のいずれか１つに記載の第２の遺伝子改変されたげっ歯類を第２の抗原の第２のエピトープと接触させること、
（ｃ）前記第１の遺伝子改変されたげっ歯類から前記第１の抗原の前記第１のエピトープに特異的な第１の抗体を発現するＢ細胞を単離し、前記第１の抗体の第１のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを決定すること；
（ｄ）前記第２の遺伝子改変されたげっ歯類から前記第２の抗原の前記第２のエピトープに特異的な第２の抗体を発現するＢ細胞を単離し、前記第２の抗体の第２のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを決定すること；
（ｅ）前記第１のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を、第１のヒト免疫グロブリン定常ドメインをコードするヌクレオチド配列と機能可能に連結させて第１のヒト重鎖をコードする第１のヌクレオチド配列を生成すること；
（ｆ）前記第２のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を、第２のヒト免疫グロブリン定常ドメインをコードするヌクレオチド配列と機能可能に連結させて第２のヒト重鎖をコードする第２のヌクレオチド配列を生成すること；
（ｇ）哺乳動物細胞において、
（ｉ）第１のヌクレオチド配列；
（ｉｉ）第２のヌクレオチド配列；及び
（ｉｉｉ）ヒト免疫グロブリンλ軽鎖定常領域に機能可能に連結された前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンを含む第３のヌクレオチド配列
を発現させること
を含む、前記方法。
実施形態６２．二重特異的抗体を作製する方法であって、前記方法は、
（ａ）哺乳動物細胞において、
（ｉ）第１のヒト免疫グロブリン定常領域に機能可能に連結された第１のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含む第１のヌクレオチド配列；
（ｉｉ）第２のヒト免疫グロブリン定常領域に機能可能に連結された第２のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含む第２のヌクレオチド配列；及び
（ｉｉｉ）ヒト免疫グロブリンλ軽鎖定常領域に機能可能に連結されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む第３のヌクレオチド配列
を発現させることを含み、
前記第１のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、第１の抗原の第１のエピトープで免疫された第１の遺伝子改変されたげっ歯類における第１の抗体から同定された第１のヒト重鎖可変ドメインをコードし、前記第１の抗体は、前記第１の抗原の前記第１のエピトープに特異的に結合し；
前記第２のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、第２の抗原の第２のエピトープで免疫された第２の遺伝子改変されたげっ歯類における第２の抗体から同定された第２のヒト重鎖可変ドメインをコードし、前記第２の抗体は、前記第２の抗原の前記第２のエピトープに特異的に結合し；
前記第１及び第２の遺伝子改変されたげっ歯類はそれぞれ、実施形態４～３４のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類であり；
前記第３のヌクレオチドの前記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンである、前記方法。
実施形態６３．前記第１及び第２の遺伝子改変されたげっ歯類は、同一の遺伝子改変されたげっ歯類である、実施形態５９または６２に記載の方法。
実施形態６４．前記第１及び第２の遺伝子改変されたげっ歯類は、異なる遺伝子改変されたげっ歯類である、実施形態５９または６２に記載の方法。
実施形態６５．前記第１及び第２の抗原は、同じ抗原であり、前記第１及び第２のエピトープは、異なるエピトープである、実施形態５９～６４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６６．前記第１及び第２の抗原は、異なる抗原である、実施形態５９～６４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態６７．ヒト免疫グロブリン重鎖を作製するための方法であって、前記方法は、
（ａ）実施形態４～３４のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類を対象となる抗原に曝露する工程；
（ｂ）前記抗原に特異的に結合し、かつ前記遺伝子改変されたげっ歯類によって生成された抗体のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン配列を得る工程；及び
（ｃ）ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン配列をヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列に機能可能に連結させてヒト免疫グロブリン重鎖を形成する工程
を含む、前記方法。
実施形態６８．実施形態６７に記載の方法によって生成されたヒト免疫グロブリン重鎖。
実施形態６９．ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを作製するための方法であって、前記方法は、
（ａ）実施形態４～３４のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類を対象となる抗原に曝露する工程；及び
（ｂ）前記抗原に特異的に結合し、かつ前記遺伝子改変されたげっ歯類によって生成された抗体のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン配列を得る工程
を含む、前記方法。
実施形態７０．実施形態６９に記載の方法によって生成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン。
実施形態７１．ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインのコレクションを作製する方法であって、
（ａ）実施形態４～３５のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類を対象となる抗原に曝露すること、及び
（ｂ）前記遺伝子改変されたげっ歯類から前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインのコレクションを単離すること
を含み、
前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインのコレクションはそれぞれ、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインに結合し、
前記コレクションにおける前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインのいずれか１つと対合した前記ヒトλ軽鎖可変ドメインは、前記抗原に結合する、前記方法。
実施形態７２．ヒト免疫グロブリンλ軽鎖を作製するための方法であって、前記方法は、
（ａ）実施形態１～３４のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類を対象となる抗原に曝露する工程；
（ｂ）前記抗原に特異的に結合し、かつ前記遺伝子改変されたげっ歯類によって生成された抗体のヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメイン配列を得る工程；及び
（ｃ）前記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメイン配列をヒト免疫グロブリンλ軽鎖定常ドメイン配列に機能可能に連結させてヒト免疫グロブリンλ軽鎖を形成する工程
を含む、前記方法。
実施形態７３．実施形態７２に記載の方法によって生成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖。
実施形態７４．ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを生成するための方法であって、前記方法は、
（ａ）実施形態１～３５のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類を対象となる抗原に曝露する工程；及び
（ｂ）前記抗原に特異的に結合し、かつ前記遺伝子改変されたげっ歯類によって生成された抗体のヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメイン配列を得る工程
を含む、前記方法。
実施形態７５．実施形態７４に記載の方法によって生成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメイン。
実施形態７６．ヒト免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を作製するための方法であって、前記方法は、
（ａ）実施形態４～３４のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類を対象となる抗原に曝露する工程；
（ｂ）前記抗原に特異的に結合し、かつ前記遺伝子改変されたげっ歯類によって生成された抗体のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン配列をコードするヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を得る工程；及び
（ｃ）前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域をヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列に機能可能に連結させてヒト免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を形成する工程
を含む、前記方法。
実施形態７７．実施形態７６に記載の方法によって生成されたヒト免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列。
実施形態７８．ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含むヌクレオチド配列を作製するための方法であって、前記方法は、
（ａ）実施形態４～３４のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類を対象となる抗原に曝露する工程；及び
（ｂ）前記抗原に特異的に結合し、かつ前記遺伝子改変されたげっ歯類によって生成された抗体のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン配列をコードするヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を得る工程
を含む、前記方法。
実施形態７９．実施形態７８に記載の方法によって生成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含むヌクレオチド配列。
実施形態８０．
ヒト免疫グロブリンλ軽鎖をコードするヌクレオチド配列を作製するための方法であって、前記方法は、
（ａ）実施形態１～３４のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類を対象となる抗原に曝露する工程；
（ｂ）前記抗原に特異的に結合し、かつ前記遺伝子改変されたげっ歯類によって生成された抗体のヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメイン配列をコードするヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を得る工程；及び
（ｃ）前記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域をヒト免疫グロブリンλ軽鎖定常領域配列に機能可能に連結させてヒト免疫グロブリンλ軽鎖をコードするヌクレオチド配列を形成する工程
を含む、前記方法。
実施形態８１．実施形態８０に記載の方法によって生成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖をコードするヌクレオチド配列。
実施形態８２．ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含むヌクレオチド配列を作製するための方法であって、前記方法は、
（ａ）実施形態１～３４のいずれか１つに記載の遺伝子改変されたげっ歯類を対象となる抗原に曝露する工程；及び
（ｂ）前記抗原に特異的に結合し、かつ前記遺伝子改変されたげっ歯類によって生成された抗体のヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメイン配列をコードするヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を得る工程
を含む、前記方法。
実施形態８３．実施形態８２に記載の方法によって生成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含むヌクレオチド配列。
実施形態８４．ターゲティングベクターであって、
（ｉ）内因性げっ歯類κ軽鎖遺伝子座における５’標的配列に対応するヌクレオチド配列を含む５’ホモロジーアーム；
（ｉｉ）Ｖλ遺伝子セグメント及びＪλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域；
（ｉｉｉ）げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメント；及び
（ｉｖ）前記内因性げっ歯類κ軽鎖遺伝子座における３’標的配列に対応するヌクレオチド配列を含む３’ホモロジーアーム
を含む、前記ターゲティングベクター。
実施形態８５．前記ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、及びＶλ２－１４からなる群から選択される、実施形態８４に記載のターゲティングベクター。
実施形態８６．前記ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７からなる群から選択される、実施形態８４または８５に記載のターゲティングベクター。
実施形態８７．遺伝子改変されたげっ歯類を作製する方法であって、
（ａ）ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を、げっ歯類ＥＳ細胞のゲノムにおける修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に導入する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）において生成された前記げっ歯類ＥＳ細胞を使用してげっ歯類を生成する工程
を含む、前記方法。
実施形態８８．遺伝子改変されたげっ歯類を作製する方法であって、
（ａ）げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を、げっ歯類ＥＳ細胞のゲノムにおける修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に導入する工程であって、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、前記導入する工程；及び
（ｂ）工程（ａ）において生成された前記げっ歯類ＥＳ細胞を使用してげっ歯類を生成する工程
を含む、前記方法。
実施形態８９．前記げっ歯類ＥＳ細胞のゲノムは、修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座で１つ以上の内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、実施形態８７または８８に記載の方法。
実施形態９０．遺伝子改変されたげっ歯類ＥＳ細胞を作製する方法であって、
ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を、げっ歯類ＥＳ細胞のゲノムにおける修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に導入する工程
を含む、前記方法。
実施形態９１．遺伝子改変されたげっ歯類ＥＳ細胞を作製する方法であって、
げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を、げっ歯類ＥＳ細胞のゲノムにおける修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に導入する工程であって、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、前記導入する工程
を含む、前記方法。
実施形態９２．前記げっ歯類ＥＳ細胞の前記ゲノムは、
修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座で１つ以上の内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む、実施形態９０または９１に記載の方法。
実施形態９３．遺伝子改変されたげっ歯類を作製する方法であって、
（ａ）前記げっ歯類の前記生殖細胞系列ゲノムにおける内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を、げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含むように修飾する工程であって、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、前記修飾する工程を含み、
これにより前記遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞によって発現されるすべての免疫グロブリンλ軽鎖は、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含む、前記方法。
実施形態９４．前記方法は、
（ｂ）前記げっ歯類の前記生殖細胞系列ゲノムにおける内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座を、１つ以上のげっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含むように修飾する工程をさらに含み、
これにより前記遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞によって発現されるすべての重鎖は、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及びげっ歯類免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む、実施形態９３に記載の方法。
実施形態９５．工程（ａ）及び／または工程（ｂ）は、げっ歯類ＥＳ細胞において行われる、実施形態９３または９４に記載の方法。
実施形態９６．前記内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座は、げっ歯類Ｃκ遺伝子を欠く、実施形態９３～９５のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９７．前記ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、及びＶλ２－１４からなる群から選択される、実施形態９３～９６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９８．前記ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、及びＪλ７からなる群から選択される、実施形態９３～９７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態９９．前記１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントは、１つ以上の内因性ＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の内因性ＤＨ遺伝子セグメント、１つ以上の内因性ＪＨ遺伝子セグメント、またはそれらの組み合わせの代わりである、実施形態９４～９８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１００．前記１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントは、１つ以上の内因性ＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の内因性ＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の内因性ＪＨ遺伝子セグメントにそれぞれ置き換わる、実施形態９４～９９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０１．前記１つ以上のげっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子は、１つ以上の内因性げっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子である、実施形態９４～１００のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０２．
（ｉ）前記１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ３－７４、ＶＨ３－７３、ＶＨ３－７２、ＶＨ２－７０、ＶＨ１－６９、ＶＨ３－６６、ＶＨ３－６４、ＶＨ４－６１、ＶＨ４－５９、ＶＨ１－５８、ＶＨ３－５３、ＶＨ５－５１、ＶＨ３－４９、ＶＨ３－４８、ＶＨ１－４６、ＶＨ１－４５、ＶＨ３－４３、ＶＨ４－３９、ＶＨ４－３４、ＶＨ３－３３、ＶＨ４－３１、ＶＨ３－３０、ＶＨ４－２８、ＶＨ２－２６、ＶＨ１－２４、ＶＨ３－２３、ＶＨ３－２１、ＶＨ３－２０、ＶＨ１－１８、ＶＨ３－１５、ＶＨ３－１３、ＶＨ３－１１、ＶＨ３－９、ＶＨ１－８、ＶＨ３－７、ＶＨ２－５、ＶＨ７－４－１、ＶＨ４－４、ＶＨ１－３、ＶＨ１－２、ＶＨ６－１、またはそれらの任意の組み合わせを含み、
（ｉｉ）前記１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ＤＨ１－１、ＤＨ２－２、ＤＨ３－３、ＤＨ４－４、ＤＨ５－５、ＤＨ６－６、ＤＨ１－７、ＤＨ２－８、ＤＨ３－９、ＤＨ３－１０、ＤＨ５－１２、ＤＨ６－１３、ＤＨ２－１５、ＤＨ３－１６、ＤＨ４－１７、ＤＨ６－１９、ＤＨ１－２０、ＤＨ２－２１、ＤＨ３－２２、ＤＨ６－２５、ＤＨ１－２６、ＤＨ７－２７、またはそれらの任意の組み合わせを含み、
（ｉｉｉ）前記１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントは、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、ＪＨ６、またはそれらの任意の組み合わせを含む、
実施形態９４～１０１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０３．前記内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、機能性内因性げっ歯類Ａｄａｍ６遺伝子を欠く、実施形態９４～１０２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０４．前記遺伝子改変されたげっ歯類の前記生殖細胞系列ゲノムは、１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む、実施形態９４～１０３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０５．前記１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片は、前記遺伝子改変されたげっ歯類によって発現される、実施形態１０４に記載の方法。
実施形態１０６．前記１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列は、前記修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座と同じ染色体上に含まれる、実施形態１０４または１０５に記載の方法。
実施形態１０７．前記修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座は、前記１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む、実施形態１０４～１０６のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０８．前記１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子の代わりである、実施形態１０４～１０７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１０９．前記１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列は、ヒトＡｄａｍ６偽遺伝子に置き換わる、実施形態１０４～１０８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１０．前記１つ以上のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、第１及び第２のヒトＶＨ遺伝子セグメントを含み、前記１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列は、前記第１のヒトＶＨ遺伝子セグメントと前記第２のヒトＶＨ遺伝子セグメントとの間にある、実施形態１０４～１０９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１１．前記第１のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ１－２であり、前記第２のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ６－１である、実施形態１１０に記載の方法。
実施形態１１２．前記１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントとヒトＤＨ遺伝子セグメントとの間にある、実施形態１０４～１１１のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１３．前記げっ歯類Ｃλ遺伝子は、（ｉ）マウスＣλ１、（ｉｉ）マウスＣλ２、または（ｉｉｉ）マウスＣλ３遺伝子と少なくとも８０％同一の配列を有する、実施形態９３～１１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１４．前記げっ歯類Ｃλ遺伝子は、マウスＣλ遺伝子を含む、実施形態９３～１１３のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１５．前記げっ歯類Ｃλ遺伝子は、マウスＣλ１遺伝子を含む、実施形態９３～１１４のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１６．前記げっ歯類Ｃλ遺伝子は、（ｉ）ラットＣλ１、（ｉｉ）ラットＣλ２、（ｉｉｉ）ラットＣλ３、または（ｉｖ）ラットＣλ４遺伝子と少なくとも８０％同一の配列を有する、実施形態９３～１１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１７．前記げっ歯類Ｃλ遺伝子は、ラットＣλ遺伝子を含む、実施形態９３～１１２のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１８．前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、１つ以上のげっ歯類Ｖκ遺伝子セグメント、１つ以上のげっ歯類Ｊκ遺伝子セグメント、またはそれらの任意の組み合わせの代わりである、実施形態９３～１１７のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１１９．前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、１つ以上のげっ歯類Ｖκ遺伝子セグメント、１つ以上のげっ歯類Ｊκ遺伝子セグメント、またはそれらの任意の組み合わせに置き換わる、実施形態９３～１１８のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２０．前記げっ歯類の前記生殖細胞系列ゲノムは、不活性化内因性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座をさらに含む、実施形態９３～１１９のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２１．前記内因性Ｖλ遺伝子セグメント、前記内因性Ｊλ遺伝子セグメント、及び前記内因性Ｃλ遺伝子は、全体としてまたは部分的に欠失されている、実施形態９３～１２０のいずれか１つに記載の方法。
実施形態１２２．前記げっ歯類は、ラットまたはマウスである、実施形態９３～１２１のいずれか１つに記載の方法。
均等物
本開示に対する様々な変更、改変、及び改善が当業者に容易に思いつくことが当業者によって理解されるべきである。そのような変更、改変、及び改善は、本開示の一部であることが意図されており、本発明の趣旨及び範囲内であることが意図されている。したがって、前述の説明及び図面は、例示に過ぎず、以下の特許請求の範囲によってさらに詳細に記載されている場合、本開示に記載の任意の発明である。
当業者は、本明細書に記載されるアッセイまたは他のプロセスで得られた値に起因する逸脱または誤差の典型的な基準を理解する。本発明の背景技術を説明するために及びその実施に関する追加の詳細を提供するために本明細書で参照された刊行物、ウェブサイト及び他の参考文献は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。

Claims (52)

  1. 遺伝子改変されたげっ歯類であって、その生殖細胞系列ゲノムは、
    げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含み、
    前記遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞によって発現されるすべての免疫グロブリンλ軽鎖は、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含む、前記遺伝子改変されたげっ歯類。
  2. 前記遺伝子改変されたげっ歯類の前記生殖細胞系列ゲノムは、前記修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座についてホモ接合性である、請求項１に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
  3. 前記遺伝子改変されたげっ歯類の前記生殖細胞系列ゲノムは、前記修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座についてヘテロ接合性である、請求項１に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
  4. 前記生殖細胞系列ゲノムは、
    １つ以上のげっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座をさらに含み、
    前記遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞によって発現されるすべての重鎖は、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン及びげっ歯類免疫グロブリン重鎖定常ドメインを含む、請求項１～３のいずれかに記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
  5. 前記遺伝子改変されたげっ歯類の前記生殖細胞系列ゲノムは、前記修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座についてホモ接合性である、請求項４に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
  6. 前記遺伝子改変されたげっ歯類は、前記修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座でげっ歯類Ｃκ遺伝子を欠く、請求項１～５のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
  7. 前記ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１、Ｖλ５－４５、Ｖλ１－４４、Ｖλ１－４０、Ｖλ３－２１、またはＶλ２－１４を含む、請求項１～６のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
  8. 前記ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ１－５１を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
  9. 前記ヒトＶλ遺伝子セグメントは、Ｖλ２－１４を含む、請求項１～７のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
  10. 前記ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ１、Ｊλ２、Ｊλ３、Ｊλ６、またはＪλ７を含む、請求項１～９のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
  11. 前記ヒトＪλ遺伝子セグメントは、Ｊλ２を含む、請求項１～１０のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
  12. 前記１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントは、１つ以上の内因性ＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の内因性ＤＨ遺伝子セグメント、１つ以上の内因性ＪＨ遺伝子セグメント、またはそれらの組み合わせの代わりである、請求項４～１１のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
  13. 前記１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントは、１つ以上の内因性ＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の内因性ＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の内因性ＪＨ遺伝子セグメントにそれぞれ置き換わる、請求項４～１２のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
  14. 前記１つ以上のげっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子は、１つ以上の内因性げっ歯類免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子である、請求項１２または１３に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
  15. （ｉ）前記１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメントは、ＶＨ３－７４、ＶＨ３－７３、ＶＨ３－７２、ＶＨ２－７０、ＶＨ１－６９、ＶＨ３－６６、ＶＨ３－６４、ＶＨ４－６１、ＶＨ４－５９、ＶＨ１－５８、ＶＨ３－５３、ＶＨ５－５１、ＶＨ３－４９、ＶＨ３－４８、ＶＨ１－４６、ＶＨ１－４５、ＶＨ３－４３、ＶＨ４－３９、ＶＨ４－３４、ＶＨ３－３３、ＶＨ４－３１、ＶＨ３－３０、ＶＨ４－２８、ＶＨ２－２６、ＶＨ１－２４、ＶＨ３－２３、ＶＨ３－２１、ＶＨ３－２０、ＶＨ１－１８、ＶＨ３－１５、ＶＨ３－１３、ＶＨ３－１１、ＶＨ３－９、ＶＨ１－８、ＶＨ３－７、ＶＨ２－５、ＶＨ７－４－１、ＶＨ４－４、ＶＨ１－３、ＶＨ１－２、ＶＨ６－１、またはそれらの任意の組み合わせを含み、
    （ｉｉ）前記１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメントは、ＤＨ１－１、ＤＨ２－２、ＤＨ３－３、ＤＨ４－４、ＤＨ５－５、ＤＨ６－６、ＤＨ１－７、ＤＨ２－８、ＤＨ３－９、ＤＨ３－１０、ＤＨ５－１２、ＤＨ６－１３、ＤＨ２－１５、ＤＨ３－１６、ＤＨ４－１７、ＤＨ６－１９、ＤＨ１－２０、ＤＨ２－２１、ＤＨ３－２２、ＤＨ６－２５、ＤＨ１－２６、ＤＨ７－２７、またはそれらの任意の組み合わせを含み、
    （ｉｉｉ）前記１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントは、ＪＨ１、ＪＨ２、ＪＨ３、ＪＨ４、ＪＨ５、ＪＨ６、またはそれらの任意の組み合わせを含む、
    請求項４～１４のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
  16. 前記遺伝子改変されたげっ歯類の前記生殖細胞系列ゲノムは、１つ以上のげっ歯類ＡＤＡＭ６ポリペプチド、その機能性オルソログ、機能性ホモログ、または機能性断片をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を含む、請求項４～１５のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
  17. 前記げっ歯類Ｃλ遺伝子は、（ｉ）マウスＣλ１、（ｉｉ）マウスＣλ２、または（ｉｉｉ）マウスＣλ３遺伝子と少なくとも８０％同一の配列を有する、請求項１～１６のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
  18. 前記げっ歯類Ｃλ遺伝子は、マウスＣλ遺伝子を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
  19. 前記げっ歯類Ｃλ遺伝子は、マウスＣλ１遺伝子を含む、請求項１～１７のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
  20. 前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、１つ以上のげっ歯類Ｖκ遺伝子セグメント、１つ以上のげっ歯類Ｊκ遺伝子セグメント、またはそれらの任意の組み合わせの代わりである、請求項１～１９のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
  21. 不活性化内因性免疫グロブリンλ軽鎖遺伝子座をさらに含む、請求項１～２０のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
  22. 前記遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞によって発現されるすべての免疫グロブリン軽鎖は、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含む、請求項１～２１のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
  23. 前記修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座は、前記内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座におけるそれらの内因性位置で１つ以上の内因性エンハンサーをさらに含む、請求項１～２２のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
  24. 前記げっ歯類は、ラットまたはマウスである、請求項１～２３のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類。
  25. 遺伝子改変されたマウスであって、その生殖細胞系列ゲノムは、
    マウスＣλ１遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ１－５１遺伝子セグメント及びヒトＪλ２遺伝子セグメントを含み、
    前記遺伝子改変されたマウスのＢ細胞によって発現されるすべての免疫グロブリンλ軽鎖は、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含む、前記遺伝子改変されたマウス。
  26. 遺伝子改変されたマウスであって、その生殖細胞系列ゲノムは、
    マウスＣλ１遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ２－１４遺伝子セグメント及びヒトＪλ２遺伝子セグメントを含み、
    前記遺伝子改変されたマウスのＢ細胞によって発現されるすべての免疫グロブリンλ軽鎖は、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含む、前記遺伝子改変されたマウス。
  27. げっ歯類胚であって、そのゲノムは、げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含み、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、前記げっ歯類胚。
  28. 請求項１～２６のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類またはマウスのＢ細胞であって、
    前記修飾された内因性κ軽鎖遺伝子座の前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンを含む、前記Ｂ細胞。
  29. 請求項２８に記載のＢ細胞から生成されたハイブリドーマ。
  30. 単一の遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞の集団であって、前記げっ歯類は、その生殖細胞系列ゲノムにおいて、
    （ａ）げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座であって、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＪλ遺伝子セグメントに機能可能に連結されたヒトＶλ遺伝子セグメントを含む、前記修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座、及び
    （ｂ）１つ以上の内因性免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に機能可能に連結された１つ以上の非再編成ヒトＶＨ遺伝子セグメント、１つ以上の非再編成ヒトＤＨ遺伝子セグメント、及び１つ以上の非再編成ヒトＪＨ遺伝子セグメントを含む修飾された内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座
    を含み、
    前記Ｂ細胞の集団によって発現されるすべての抗体は、
    （ｉ）前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメイン、及び
    （ｉｉ）少なくとも２つの異なる再編成されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現される複数のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン
    を含む、前記Ｂ細胞の集団。
  31. げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含む胚性幹細胞であって、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、前記胚性幹細胞。
  32. 抗体を発現する哺乳動物細胞であって、前記抗体は、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含む重鎖及びヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含む軽鎖を含み、前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン、前記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメイン、またはその両方は、請求項４～２６のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類またはマウスから同定された、前記哺乳動物細胞。
  33. 抗体を作製する方法であって、前記方法は、
    （ａ）請求項１～２６のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類またはマウスを抗原に曝露すること；
    （ｂ）前記遺伝子改変されたげっ歯類が前記抗原に対する免疫反応を起こすことを可能にすること；及び
    （ｃ）前記遺伝子改変されたげっ歯類から前記抗原に特異的な抗体、前記抗原に特異的な抗体を発現するＢ細胞、または前記抗原に特異的な抗体をコードする１つ以上のヌクレオチド配列を単離すること
    を含む、前記方法。
  34. 抗体を作製する方法であって、
    （ａ）哺乳動物細胞において２つのヒト免疫グロブリンλ軽鎖及び２つのヒト免疫グロブリン重鎖を含む前記抗体を発現させる工程であって、各ヒト免疫グロブリンλ軽鎖は、ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含み、各ヒト免疫グロブリン重鎖は、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを含み、前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインの少なくとも１つ、前記λ軽鎖可変ドメインの少なくとも１つ、またはそれらの組み合わせのアミノ酸配列は、請求項４～２６のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類またはマウスにおいて同定された、前記発現させる工程；及び
    （ｂ）前記抗体を得る工程
    を含む、前記方法。
  35. 二重特異的抗体を作製する方法であって、前記方法は、
    （ａ）請求項４～２６のいずれか１項に記載の第１の遺伝子改変されたげっ歯類またはマウスを第１の抗原の第１のエピトープと接触させること、
    （ｂ）請求項４～２６のいずれか１項に記載の第２の遺伝子改変されたげっ歯類またはマウスを第２の抗原の第２のエピトープと接触させること、
    （ｃ）前記第１の遺伝子改変されたげっ歯類から前記第１の抗原の前記第１のエピトープに特異的な第１の抗体を発現するＢ細胞を単離し、前記第１の抗体の第１のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを決定すること；
    （ｄ）前記第２の遺伝子改変されたげっ歯類から前記第２の抗原の前記第２のエピトープに特異的な第２の抗体を発現するＢ細胞を単離し、前記第２の抗体の第２のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを決定すること；
    （ｅ）前記第１のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を、第１のヒト免疫グロブリン定常ドメインをコードするヌクレオチド配列と機能可能に連結させて第１のヒト重鎖をコードする第１のヌクレオチド配列を生成すること；
    （ｆ）前記第２のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインをコードするヌクレオチド配列を、第２のヒト免疫グロブリン定常ドメインをコードするヌクレオチド配列と機能可能に連結させて第２のヒト重鎖をコードする第２のヌクレオチド配列を生成すること；
    （ｇ）哺乳動物細胞において、
    （ｉ）第１のヌクレオチド配列；
    （ｉｉ）第２のヌクレオチド配列；及び
    （ｉｉｉ）ヒト免疫グロブリンλ軽鎖定常領域に機能可能に連結された前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンを含む第３のヌクレオチド配列
    を発現させること
    を含む、前記方法。
  36. 二重特異的抗体を作製する方法であって、前記方法は、
    （ａ）哺乳動物細胞において、
    （ｉ）第１のヒト免疫グロブリン定常領域に機能可能に連結された第１のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含む第１のヌクレオチド配列；
    （ｉｉ）第２のヒト免疫グロブリン定常領域に機能可能に連結された第２のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含む第２のヌクレオチド配列；及び
    （ｉｉｉ）ヒト免疫グロブリンλ軽鎖定常領域に機能可能に連結されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む第３のヌクレオチド配列
    を発現させることを含み、
    前記第１のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、第１の抗原の第１のエピトープで免疫された第１の遺伝子改変されたげっ歯類における第１の抗体から同定された第１のヒト重鎖可変ドメインをコードし、前記第１の抗体は、前記第１の抗原の前記第１のエピトープに特異的に結合し；
    前記第２のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域は、第２の抗原の第２のエピトープで免疫された第２の遺伝子改変されたげっ歯類における第２の抗体から同定された第２のヒト重鎖可変ドメインをコードし、前記第２の抗体は、前記第２の抗原の前記第２のエピトープに特異的に結合し；
    前記第１及び第２の遺伝子改変されたげっ歯類はそれぞれ、請求項４～２６のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類またはマウスであり；
    前記第３のヌクレオチドの前記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンである、前記方法。
  37. ヒト免疫グロブリン重鎖を作製するための方法であって、前記方法は、
    （ａ）請求項４～２６のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類またはマウスを対象となる抗原に曝露する工程；
    （ｂ）前記抗原に特異的に結合し、かつ前記遺伝子改変されたげっ歯類によって生成された抗体のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン配列を得る工程；及び
    （ｃ）前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン配列をヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメイン配列に機能可能に連結させてヒト免疫グロブリン重鎖を形成する工程
    を含む、前記方法。
  38. ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを作製するための方法であって、前記方法は、
    （ａ）請求項４～２６のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類またはマウスを対象となる抗原に曝露する工程；及び
    （ｂ）前記抗原に特異的に結合し、かつ前記遺伝子改変されたげっ歯類によって生成された抗体のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン配列を得る工程
    を含む、前記方法。
  39. ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインのコレクションを作製する方法であって、
    （ａ）請求項４～２６のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類またはマウスを対象となる抗原に曝露すること、及び
    （ｂ）前記遺伝子改変されたげっ歯類から前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインのコレクションを単離すること
    を含み、
    前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインのコレクションはそれぞれ、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインに結合し、
    前記コレクションにおける前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインのいずれか１つと対合した前記ヒトλ軽鎖可変ドメインは、前記抗原に結合する、前記方法。
  40. ヒト免疫グロブリンλ軽鎖を作製するための方法であって、前記方法は、
    （ａ）請求項１～２６のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類またはマウスを対象となる抗原に曝露する工程；
    （ｂ）前記抗原に特異的に結合し、かつ前記遺伝子改変されたげっ歯類によって生成された抗体のヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメイン配列を得る工程；及び
    （ｃ）前記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメイン配列をヒト免疫グロブリンλ軽鎖定常ドメイン配列に機能可能に連結させてヒト免疫グロブリンλ軽鎖を形成する工程
    を含む、前記方法。
  41. ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを生成するための方法であって、前記方法は、
    （ａ）請求項１～２６のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類またはマウスを対象となる抗原に曝露する工程；及び
    （ｂ）前記抗原に特異的に結合し、かつ前記遺伝子改変されたげっ歯類によって生成された抗体のヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメイン配列を得る工程
    を含む、前記方法。
  42. ヒト免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を作製するための方法であって、前記方法は、
    （ａ）請求項４～２６のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類またはマウスを対象となる抗原に曝露する工程；
    （ｂ）前記抗原に特異的に結合し、かつ前記遺伝子改変されたげっ歯類によって生成された抗体のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン配列をコードするヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を得る工程；及び
    （ｃ）前記ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域をヒト免疫グロブリン重鎖定常領域配列に機能可能に連結させてヒト免疫グロブリン重鎖をコードするヌクレオチド配列を形成する工程
    を含む、前記方法。
  43. ヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を含むヌクレオチド配列を作製するための方法であって、前記方法は、
    （ａ）請求項４～２６のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類またはマウスを対象となる抗原に曝露する工程；及び
    （ｂ）前記抗原に特異的に結合し、かつ前記遺伝子改変されたげっ歯類によって生成された抗体のヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメイン配列をコードするヒト免疫グロブリン重鎖可変領域を得る工程
    を含む、前記方法。
  44. ヒト免疫グロブリンλ軽鎖をコードするヌクレオチド配列を作製するための方法であって、前記方法は、
    （ａ）請求項１～２６のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類またはマウスを対象となる抗原に曝露する工程；
    （ｂ）前記抗原に特異的に結合し、かつ前記遺伝子改変されたげっ歯類によって生成された抗体のヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメイン配列をコードするヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を得る工程；及び
    （ｃ）前記ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域をヒト免疫グロブリンλ軽鎖定常領域配列に機能可能に連結させてヒト免疫グロブリンλ軽鎖をコードするヌクレオチド配列を形成する工程
    を含む、前記方法。
  45. ヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含むヌクレオチド配列を作製するための方法であって、前記方法は、
    （ａ）請求項１～２６のいずれか１項に記載の遺伝子改変されたげっ歯類またはマウスを対象となる抗原に曝露する工程；及び
    （ｂ）前記抗原に特異的に結合し、かつ前記遺伝子改変されたげっ歯類によって生成された抗体のヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメイン配列をコードするヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を得る工程
    を含む、前記方法。
  46. ターゲティングベクターであって、
    （ｉ）内因性げっ歯類κ軽鎖遺伝子座における５’標的配列に対応するヌクレオチド配列を含む５’ホモロジーアーム；
    （ｉｉ）Ｖλ遺伝子セグメント及びＪλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域；
    （ｉｉｉ）げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメント；及び
    （ｉｖ）前記内因性げっ歯類κ軽鎖遺伝子座における３’標的配列に対応するヌクレオチド配列を含む３’ホモロジーアーム
    を含む、前記ターゲティングベクター。
  47. 遺伝子改変されたげっ歯類を作製する方法であって、
    （ａ）ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を、げっ歯類ＥＳ細胞のゲノムにおける修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に導入する工程；及び
    （ｂ）工程（ａ）において生成された前記げっ歯類ＥＳ細胞を使用してげっ歯類を生成する工程
    を含む、前記方法。
  48. 遺伝子改変されたげっ歯類を作製する方法であって、
    （ａ）げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を、げっ歯類ＥＳ細胞のゲノムにおける修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に導入する工程であって、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、前記導入する工程；及び
    （ｂ）工程（ａ）において生成された前記げっ歯類ＥＳ細胞を使用してげっ歯類を生成する工程
    を含む、前記方法。
  49. 遺伝子改変されたげっ歯類ＥＳ細胞を作製する方法であって、
    ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を、げっ歯類ＥＳ細胞のゲノムにおける修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に導入する工程
    を含む、前記方法。
  50. 遺伝子改変されたげっ歯類ＥＳ細胞を作製する方法であって、
    げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を、げっ歯類ＥＳ細胞のゲノムにおける修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座に導入する工程であって、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、前記導入する工程
    を含む、前記方法。
  51. 遺伝子改変されたげっ歯類を作製する方法であって、
    （ａ）前記げっ歯類の前記生殖細胞系列ゲノムにおける内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を、げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含むように修飾する工程であって、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、前記修飾する工程を含み、
    これにより前記遺伝子改変されたげっ歯類のＢ細胞によって発現されるすべての免疫グロブリンλ軽鎖は、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域またはその体細胞超変異バージョンから発現されるヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変ドメインを含む、前記方法。
  52. 組換えげっ歯類細胞を生成するためのｉｎ ｖｉｔｒｏ方法であって、前記組換えげっ歯類細胞のゲノムを、
    げっ歯類Ｃλ遺伝子セグメントに機能可能に連結された単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域を含む修飾された内因性免疫グロブリンκ軽鎖遺伝子座を含むように改変することを含み、前記単一の再編成されたヒト免疫グロブリンλ軽鎖可変領域は、ヒトＶλ遺伝子セグメント及びヒトＪλ遺伝子セグメントを含む、前記ｉｎ ｖｉｔｒｏ方法。
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