TWI840372B - 可改造dh-dh重排之非人類動物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本發明提供非人類動物，及用於製備及使用該等非人類動物之方法及組成物，該等非人類動物具有基因組，該基因組在免疫球蛋白重鏈可變區內包含經改造或重組多樣性簇，該經改造或重組多樣性簇包含各自可操作地連接至23聚體重組信號序列之一或多個DH區段的插入。亦提供用於由非人類動物產生抗體之方法，該等抗體視情況地含有人類可變區及嚙齒動物例如恆定區。

Description

可改造D H-D H重排之非人類動物及其用途 相關申請案之交叉引用
本申請案依據35 U.S.C.§ 119(3)主張美國臨時申請案第62/685,203號(2018年6月14日申請)、第62/702,206號(2018年7月23日申請)及第62/812,580號(2019年3月1日申請)之權益，申請案之每一者係以全文引用的方式併入本文中。
本發明提供非人類動物，及用於製備及使用該等非人類動物之方法及組成物，該等非人類動物具有基因組，該基因組在免疫球蛋白重鏈可變區內包含經改造或重組多樣性簇，該經改造或重組多樣性簇包含各自可操作地連接至23聚體重組信號序列之一或多個DH區段的插入。亦提供用於由非人類動物產生抗體之方法，該等抗體視情況地含有人類可變區及嚙齒動物例如恆定區。
單株抗體產品已徹底改變生物醫藥行業且在數種疾病治療中取得重大進展。此等單株抗體產品中之許多利用抗體分子之天然特徵(亦即，傳統免疫球蛋白基因區段)，且在一些情況下，併入其他特徵，諸如標記(例如，聚乙二醇化、放射性標記)或與其他藥物接合。在當前批准率下，截至2020年，預期大約70種單株抗體產品上市。儘管取得此等進展及藉由將單株抗體用於治療用途所獲得之知識，但 仍存在與單株抗體難以結合及/或接近之標靶有關的疾病，其突顯了對用於開發有效治療之不同方法的需求。
本發明涵蓋下述認知：期望將非人類動物(例如，嚙齒動物(例如，大鼠，例如，小鼠)進行改造以建立額外活體內系統，該等系統用於鑑別及開發新型基於抗體之治療劑，且在一些具體例中，抗體藥劑(例如，單株抗體及/或其片段)，其可用於治療多種疾病。此外，本發明亦涵蓋以下客觀需要：非人類動物，其在免疫球蛋白重鏈可變區(例如，異源免疫球蛋白重鏈可變區，例如，人類免疫球蛋白重鏈可變區)內具有經改造重鏈多樣性(DH)簇(或經改造DH區)，其包含經改造以可操作地連接至准許DH至DH重排之重組信號序列的一或多個DH區段，該重排會引起含有互補決定區三(CDR3)之抗體表現增加，其特徵在於相比於野生型(或參考)CDR3，胺基酸長度較長，及在一些具體例中，引導與特定抗原結合之多樣性。在一些具體例中，本文所述的非人類動物提供活體內系統，用於開發用於向人類投予之抗體及/或基於抗體之治療劑。
本文描述核苷酸分子，其包含可操作地連接至23聚體重組信號序列(RSS)之至少一個免疫球蛋白重鏈多樣性(DH)基因區段，視情況地其中DH基因區段可位於例如免疫球蛋白重鏈可變區(例如，人類或人類化免疫球蛋白重鏈可變區)之經改造DH區內。如此，在一些具體例中，本文所述的核苷酸分子包含經改造免疫球蛋白重鏈多樣性(DH)區，其包含可操作地連接至23聚體(RSS)之至少一個DH基因區段。在一些具體例中，經改造DH區包含(i)可操作地連接至23聚體RSS之至少一個DH基因區段及(ii)在一側由12聚體RSS側接且在另一側由另一12聚體RSS側接之未經重排DH基因區段，其中(i)可操作地連接至23聚體RSS之至少一個DH基因區段與(ii)在一側由12聚體RSS側接且在另一側由另一12聚體RSS側接之生殖系DH基因區段可操作地連接，使得根據12/23規則，(i)與(ii)能夠在DH-DH重組事件中接合。 亦提供靶向載體、非人類動物(例如，嚙齒動物(例如，大鼠或小鼠))及非人類動物細胞(例如，嚙齒動物細胞(例如，大鼠細胞或小鼠細胞)，其包含本文所述的核苷酸分子，使用本文所述的核苷酸分子之方法等。
在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段包含可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段。在一些具體例中，人類DH基因區段包含至少19個核苷酸且/或編碼二個半胱胺酸。在一些具體例中，人類DH基因區段包含至少20個核苷酸且/或編碼二個半胱胺酸。在一些具體例中，人類DH基因區段包含至少23個核苷酸且/或編碼二個半胱胺酸。在一些具體例中，人類DH基因區段包含至少28個核苷酸且/或編碼二個半胱胺酸。在一些具體例中，人類DH基因區段包含至少31個核苷酸且/或編碼二個半胱胺酸。在一些具體例中，人類DH基因區段包含至少37個核苷酸且/或編碼二個半胱胺酸。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含可操作地連接至23聚體RSS之人類DH2基因區段。在一些具體例中，DH2基因區段包含至少30個核苷酸且/或編碼二個半胱胺酸。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含選自由以下組成之群的DH基因區段：人類DH3-3基因區段、DH3-9基因區段、DH3-10基因區段、DH3-16基因區段、DH3-22基因區段、人類DH2-2基因區段、人類DH2-8基因區段或人類DH2-15基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含選自由以下組成之群的人類DH基因區段：人類DH3-3基因區段、人類DH2-2基因區段、人類DH2-8基因區段及人類DH2-15基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含選自由以下組成之群的人類DH基因區段：人類DH3-3基因區段、人類DH2-2基因區段、人類DH2-8基因區段及人類DH2-15基因區段。在一些具體例中，人類DH基因區段包含人類DH3-3基因區段。在一些具體例中，人類DH基因區段包含人類DH2-2基因區段。在一些具體例中，人類DH基因區段包含人類DH2-8基因區段。在一些具體例中，人類DH基因區段包含人類DH2-15基因區段。
在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段包含：(a)可操作地連接至23聚體RSS之人類DH3-3基因區段，視情況地其中23聚體RSS與人類DH3-3基因區段之5'端相鄰，(b)可操作地連接至23聚體RSS之人類DH2-2基因區段，視情況地其中23聚體RSS與人類DH2-2基因區段之3'端相鄰，(c)可操作地連接至23聚體RSS之人類DH2-8基因區段，視情況地其中23聚體RSS與人類DH2-8基因區段之3'端相鄰，(d)可操作地連接至23聚體RSS之人類2-15基因區段，視情況地其中23聚體RSS與人類DH2-15基因區段之3'端相鄰，或(e)(a)至(d)之任何組合
在一些具體例中，本文所述的核苷酸分子(例如，可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段、經改造DH區、免疫球蛋白重鏈可變區等)包含核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO：52所記載之序列。
在一些具體例中，本文所述的核苷酸分子(例如，可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段、經改造DH區、免疫球蛋白重鏈可變區等)包含核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO：61所記載之序列。
在一些具體例中，本文所述的核苷酸分子(例如，可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段、經改造DH區、免疫球蛋白重鏈可變區等)包含核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO：70所記載之序列。
在一些具體例中，本文所述的核苷酸分子(例如，可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段、經改造DH區、免疫球蛋白重鏈可變區等)包含核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO：71所記載之序列。
在一些具體例中，本文所述的核苷酸分子(例如，可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段、經改造DH區、免疫球蛋白重鏈可變區等)包含核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO：72所記載之序列。
在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段自5'至3'包含23聚體RSS及DH基因區段，例如自5'至3'包含23聚體RSS、(人類)DH基因區段及12聚體RSS，例如23聚體RSS與DH基因區段之5'端相鄰，例如DH基因區段可操作地連接至23聚體RSS之5'端。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之DH基 因區段包含可操作地連接至5'端23聚體RSS之人類DH3-3基因區段，例如核苷酸分子自5'至3'包含23聚體RSS、人類DH3-3基因區段及12聚體RSS。
包含至少一個DH基因區段以及5'端23聚體RSS之經改造DH區可進一步包含未經重排DH基因區段，其在一側由12聚體RSS側接且在另一側由另一12聚體RSS側接(例如，在一側由12聚體RSS側接且在另一側由另一12聚體RSS側接之未經重排DH基因區段包含生殖系DH基因區段，例如呈其生殖系組構之DH基因區段等)，其中未經重排DH基因區段處於可操作地連接至5'端23聚體之至少一個DH基因區段上游且與其可操作地連接。在一些具體例中，在一側由12聚體RSS側接且在另一側由另一12聚體RSS側接之未經重排DH基因區段包含在一側由12聚體RSS側接且在另一側由另一12聚體RSS側接之未經重排人類DH基因區段。
在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段自5'至3'包含DH基因區段及23聚體RSS，例如自5'至3'包含12聚體RSS、(人類)DH基因區段及23聚體RSS，例如23聚體RSS與DH基因區段之3'端相鄰，例如DH基因區段可操作地連接至3'端23聚體RSS等。在一些具體例中，可操作地連接至3'端23聚體RSS之DH基因區段包含可操作地連接至3'端23聚體RSS之人類DH2基因區段，其中DH2基因區段選自由以下組成之群：人類DH2-2基因區段、人類DH2-8基因區段及人類DH2-15基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段自5'至3'包含：可操作地連接至3'端23聚體RSS之人類DH2-2基因區段、可操作地連接至3'端23聚體RSS之人類DH2-8基因區段及可操作地連接至3'端23聚體RSS之人類DH2-15基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至3'端23聚體RSS之DH基因區段自5'至3'包含：第一連續核苷酸序列，其包含12聚體RSS、人類DH2-2基因區段及23聚體RSS；第二連續核苷酸序列，其包含12聚體RSS、人類DH2-8基因區段及23聚體RSS；及第 三連續核苷酸序列，其包含12聚體RSS、人類DH2-15基因區段及23聚體RSS。
包含可操作地連接至3'端23聚體RSS之至少一個DH基因區段的經改造DH區可進一步包含未經重排DH基因區段，其在一側由12聚體RSS側接且在另一側由另一12聚體RSS側接(例如，在一側由12聚體RSS側接且在另一側由另一12聚體RSS側接之未經重排DH基因區段包含生殖系DH基因區段，例如呈其生殖系組構之DH基因區段等)，其中在一側由12聚體RSS側接且在另一側由另一12聚體RSS側接之未經重排DH基因區段處於可操作地連接至3'端23聚體之至少一個DH基因區段下游且與其可操作地連接。在一些具體例中，在一側由12聚體RSS側接且在另一側由另一12聚體RSS側接之未經重排DH基因區段包含在一側由12聚體RSS側接且在另一側由另一12聚體RSS側接之未經重排人類DH基因區段。
在一些具體例中，如本文所述之經改造DH區包含(i)一或多個未經重排人類DH基因區段，其中DH基因區段中之該一或多者中之每一者在5'端及3'端由12聚體RSS側接，及(ii)可操作地連接至23聚體RSS之至少一個DH基因區段，其包含在5'端可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段，例如人類DH3-3基因區段)。在一些具體例中，如本文所述之經改造DH區自5'至3'包含(i)可操作地連接至23聚體RSS之至少一個DH基因區段，例如在3'端可操作地連接至23聚體RSS之人類DH2基因區段，視情況地其中在3'端可操作地連接至23聚體RSS之至少一個人類DH2基因區段包含在3'端可操作地連接至23聚體RSS之人類DH2-2基因區段、在3'端可操作地連接至23聚體RSS之人類DH2-8基因區段、在3'端可操作地連接至23聚體RSS之人類DH2-15基因區段或其任何組合，及(ii)一個或複數個人類DH基因區段，其中該一個或複數個人類DH基因區段中之每一者在5'端及3'端由12聚體RSS側接。
在一些具體例中，如本文所述之經改造DH區僅包含人類DH基因區段。
在一些具體例中，本文所述的核苷酸分子(例如，經改造DH區、免疫球蛋白重鏈可變區等)包含可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段，及在一側由12聚體RSS側接且在另一側由另一12聚體RSS側接之未經重排DH基因區段，其中可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段及在一側由12聚體RSS側接且在另一側由另一12聚體RSS側接之未經重排DH基因區段未經歷與以下重組：(i)另一DH基因區段，(ii)VH基因區段，(iii)JH基因區段，或(iv)其任何組合。在一些具體例中，本文所述的核苷酸分子包括經改造DH區之分子，該等區包含經以下重組之一或多個DH基因區段：(i)另一DH基因區段，(ii)VH基因區段，(iii)JH基因區段或其任何組合，例如，包含編碼免疫球蛋白重鏈可變區之重排VDJ或VDDJ編碼序列之核苷酸分子。
因此，在一些具體例中，包含如本文所述之經改造DH區之本文所述的核苷酸分子進一步以可操作連接形式包含：(a)至少一個未經重排免疫球蛋白重鏈可變(VH)基因區段(例如，未經重排人類VH6-1基因區段)，其處於經改造DH區之上游且與該區可操作地連接，(b)至少一個未經重排免疫球蛋白重鏈接合(JH)基因區段(例如，未經重排人類JH6)基因區段，其處於經改造DH區之下游且與該區可操作地連接，或(a)與(b)之組合。
在一些具體例中，至少一個未經重排VH基因區段包含跨越且包括以下的功能性未經重排人類VH基因區段之全譜系：未經重排人類VH3-74基因區段及未經重排人類VH1-6基因區段。在一些具體例中，至少一個未經重排VH基因區段包含跨越且包括以下的呈生殖系組構之功能性未經重排人類VH基因區段之全譜系：未經重排人類VH3-74基因區段及未經重排人類VH1-6基因區段。在一些具體例中，至少一種未經重排JH基因區段包含未經重排人類JH4基因區段、未經重排人類JH5基因區段及未經重排人類JH6基因區段。在一些具體例中，至少一種未經重排JH基因區段包含未經重排人類JH1基因區段、未經重排人類JH2基因區段、未經重排人類JH3基因區段、未經重排人類JH4基因區段、未經重排人類JH5基因區段及未經重排人類JH6基因 區段。在一些具體例中，至少一種未經重排JH基因區段包含呈生殖系組構(germline configuration)之未經重排人類JH1基因區段、未經重排人類JH2基因區段、未經重排人類JH3基因區段、未經重排人類JH4基因區段、未經重排人類JH5基因區段及未經重排人類JH6基因區段。
在一些具體例中，本文所述的核苷酸分子包含含有如本文所述之經改造DH區之免疫球蛋白重鏈可變(VH)區，例如，自5'至3'以可操作連接形式包含：
(a)至少一個未經重排免疫球蛋白重鏈可變(VH)基因區段，
(b)經改造DH區，其包含可操作地連接至23聚體RSS之至少一個DH基因區段，及
(c)至少一個未經重排免疫球蛋白重鏈接合(JH)基因區段。
在一些具體例中，
(a)至少一個未經重排VH區段包含
(i)未經重排人類VH6-1基因區段，
(ii)未經重排人類VH2-1基因區段及未經重排人類VH6-1基因區段及/或
(iii)跨越且包括以下之所有功能性未經重排人類VH基因區段：未經重排人類VH3-74至未經重排人類VH6-1基因區段，例如呈生殖系組構之所有功能性未經重排人類VH基因區段，視情況地，其中嚙齒動物Adam6基因置換未經重排人類VH2-1基因區段與VH6-1基因區段之間的偽基因；
(b)經改造DH區自5'至3'包含：
(i)一或多個，例如複數個未經重排人類DH基因區段，其中該複數個未經重排人類DH基因區段中之每一者在5'端及3'端由12聚體RSS側接，及在5'端可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段，視情況地其中該複數個未經重排人類DH基因區段包含跨越且包括以下之未經重排人類DH基因區段：呈生殖系組構之未經重排人類DH1-1基因區段及未經重排人類DH1-26基因區段，且/或其中在5'端可操作地連接至23聚體RSS之人類基因區段為人類DH3-3基因區段，例 如其中經改造DH包含呈生殖系組構之未經重排人類DH基因區段之全譜系，除未經重排人類DH7-27基因區段之外，該區段經可操作地連接至5'端23聚體RSS之DH3-3基因區段置換；
(ii)在3'端與23聚體RSS可操作地連接之至少一個人類DH基因區段，及一或多個，例如複數個人類DH基因區段，其中一個或複數個人類DH基因區段中之每一者在5'端及3'端由12聚體RSS側接，視情況地其中在3'端與23聚體RSS可操作地連接之至少一個人類DH基因區段包含在3'端可操作地連接至23聚體RSS之DH2-2基因區段、在3'端可操作地連接至23聚體RSS之人類DH2-8基因區段、在3'端可操作地連接至23聚體RSS之人類DH2-15基因區段，且/或其中一個或複數個人類DH基因區段包含跨越且包括以下之DH基因區段：未經重排人類DH1-1基因區段及未經重排人類DH7-27基因區段，視情況地其中經改造DH包含呈生殖系組構之未經重排人類DH基因區段之全譜系，除未經重排人類DH2-2、DH2-8及DH2-15基因區段之外，該等區段分別經以下置換：在3'端可操作地連接至23聚體RSS之DH2-2基因區段、在3'端可操作地連接至23聚體RSS之人類DH2-8基因區段及在3'端可操作地連接至23聚體RSS之人類DH2-15基因區段；
(iii)或(b)(i)與(b)(ii)之組合；且
(c)至少一個未經重排JH基因區段包含
(i)未經重排人類JH6基因區段，
(ii)未經重排人類JH4基因區段、未經重排人類JH5基因區段及未經重排人類JH6基因區段，及/或
(iii)未經重排人類JH基因區段之全譜系，例如未經重排人類JH1基因區段、未經重排人類JH2基因區段、未經重排人類JH3基因區段、未經重排人類JH4基因區段、未經重排人類JH5基因區段及未經重排人類JH6基因區段，視情況地其中未經重排人類JH1、JH2、JH3、JH4、JH5及JH6基因區段呈生殖系組構。在一些具體例中，免疫球蛋白VH區(包含至少一個功能性VH基因區段、經改造DH區及至少一個功能性JH基因區段)為人類免疫球蛋白VH區，例如各基因區段(例如，其中各 VH、DH及JH基因區段)，包括可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段，為人類(VH、DH或JH)基因區段。
在一些具體例中，包含如本文所述之免疫球蛋白VH區之核苷酸分子自5'至3'以可操作連接形式包含：
(a)至少一未經重排人類VH6-1基因區段，例如跨越且包括以下之所有功能性未經重排人類VH基因區段之全部或一部分：未經重排人類VH3-74至未經重排人類VH6-1基因區段，例如功能性未經重排人類VH基因區段之全譜系，視情況地包括在二個未經重排人類VH基因區段之間的嚙齒動物Adam6基因，例如(例如，其中嚙齒動物Adam6基因位於人類VH1-2基因區段與人類VH6-1基因區段之間)
(b)人類經改造DH區，其自5'至3'包含跨越且包括以下之呈生殖系組構的未經重排人類DH基因區段：未經重排人類DH1-1基因區段及未經重排人類DH1-26基因區段及可操作地連接至5'端23聚體RSS之未經重排人類DH3-3基因區段，例如呈生殖系組構之未經重排人類DH基因區段之全譜系，除未經重排人類DH7-27基因區段之外，該基因區段經可操作地連接至5'端23聚體RSS之未經重排人類DH3-3基因區段置換，及
(c)至少一未經重排人類JH6基因區段。
在一些具體例中，包含如本文所述之免疫球蛋白VH區之核苷酸分子自5'至3'以可操作連接方式包含：
(a)至少一未經重排人類VH6-1基因區段，例如跨越且包括以下之所有功能性未經重排人類VH基因區段之全部或一部分：未經重排人類VH3-74至未經重排人類VH6-1基因區段，例如功能性未經重排人類VH基因區段之全譜系，視情況地包括在二個未經重排人類VH基因區段之間的嚙齒動物Adam6基因，例如(例如，其中嚙齒動物Adam6基因位於人類VH1-2基因區段與人類VH6-1基因區段之間)
(b)人類經改造DH區，其自5'至3'包含跨越且包括以下之呈生殖系組構的未經重排人類DH基因區段：未經重排人類DH1-1基因區段及未經重排人類DH1-26基因區段，及可操作地連接至5'端23聚體RSS之 未經重排人類DH3-3基因區段，例如呈生殖系組構之未經重排人類DH基因區段之全譜系，除未經重排人類DH7-27基因區段之外，該基因區段經可操作地連接至5'端23聚體RSS之未經重排人類DH3-3基因區段置換，及
(c)未經重排人類JH4基因區段、未經重排人類JH5基因區段及未經重排人類JH6基因區段。
在一些具體例中，包含如本文所述之免疫球蛋白VH區之核苷酸分子自5'至3'以可操作的連接形式包含：
(a)至少一未經重排人類VH6-1基因區段，例如跨越且包括以下之所有功能性未經重排人類VH基因區段之全部或一部分：未經重排人類VH3-74至未經重排人類VH6-1基因區段，例如功能性未經重排人類VH基因區段之全譜系，視情況地包括在二個未經重排人類VH基因區段之間的嚙齒動物Adam6基因，例如(例如，其中嚙齒動物Adam6基因位於人類VH1-2基因區段與人類VH6-1基因區段之間)
(b)人類經改造DH區，其自5'至3'包含未經重排人類DH1-1基因區段、在3'端可操作地連接至23聚體RSS之DH2-2基因區段、在3'端可操作地連接至23聚體RSS之人類DH2-8基因區段、在3'端可操作地連接至23聚體RSS之人類DH2-15基因區段，及跨越且包括以下之未經重排人類DH基因區段：未經重排人類DH3-16基因區段及未經重排人類DH7-27基因區段，視情況地其中經改造DH包含呈生殖系組構之未經重排人類DH基因區段的全譜系，除未經重排人類DH2-2、DH2-8及DH2-15基因區段之外，該等基因區段各自經以下置換：在3'端可操作地連接至23聚體RSS之DH2-2基因區段、在3'端可操作地連接至23聚體RSS之人類DH2-8基因區段及在3'端可操作地連接至23聚體RSS之人類DH2-15基因區段，及
(c)未經重排人類JH基因區段之全譜系，例如未經重排人類JH1基因區段、未經重排JH2人類基因區段、未經重排JH3人類基因區段、未經重排JH4人類基因區段、未經重排JH5人類基因區段及未經重排JH6 人類基因區段，視情況地其中未經重排人類JH1、JH2、JH3、JH4、JH5及JH6基因區段呈生殖系組構。
在一些具體例中，如本文所述之核苷酸分子自5'至3'包含(a)(人類)免疫球蛋白重鏈可變(VH)區，該區包含至少一個(人類)VH基因區段、如本文所述之(人類)經改造DH區及至少一個(人類)JH基因區段，其可操作地連接至(b)重鏈免疫球蛋白恆定區(CH)或其部分，視情況地其中CH為嚙齒動物CH，其包含嚙齒動物內含子增強子區、嚙齒動物IgM基因、嚙齒動物IgD基因、嚙齒動物IgG基因、嚙齒動物IgA基因、嚙齒動物IgE基因或其任何組合。在一些具體例中，如本文所述之核苷酸分子自5'至3'包含(a)人類免疫球蛋白重鏈VH區，該區包含至少一個人類VH基因區段、如本文所述之人類經改造DH區及至少一個人類JH基因區段，其可操作地連接至(b)嚙齒動物CH區，其包含至少一嚙齒動物內含子增強子區及視情況地存在之嚙齒動物IgM基因。在一些具體例中，本文所述的核苷酸分子自5'至3'包含(a)人類VH區，該區包含至少一個人類VH基因區段、如本文所述之人類經改造DH區及至少一個人類JH基因區段，其可操作地連接至(b)嚙齒動物CH區，其包含至少一嚙齒動物內含子增強子區及嚙齒動物IgM基因。在一些具體例中，本文所述的核苷酸分子自5'至3'包含(a)人類VH區，該區包含至少一個人類VH基因區段、如本文所述之人類經改造DH區及至少一個人類JH基因區段，其可操作地連接至(b)內源性嚙齒動物CH區，例如在內源性嚙齒動物免疫球蛋白重鏈基因座處。在一些具體例中，嚙齒動物可為大鼠。在一些具體例中，嚙齒動物可為小鼠。
在一些具體例中，如本文所述之核苷酸分子進一步包含嚙齒動物Adam6基因。在一些具體例中，嚙齒動物Adam6基因位於人類VH2-1基因區段與VH6-1基因區段之間，例如，置換位於呈生殖系組構之人類VH2-1基因區段與VH6-1基因區段之間的人類Adam6基因。在一些具體例中，嚙齒動物可為大鼠。在一些具體例中，嚙齒動物可為小鼠。
在一些具體例中，如本文所述之核苷酸分子包含一或多 種藥物選擇卡匣，例如由一或多個位點特異性重組位點側接之抗藥性基因，例如由loxP位點特異性重組識別位點側接之新黴素抗藥性基因，其中該一或多種抗藥性卡匣中之至少一者視情況地緊接可操作地連接至23聚體RSS之至少一個DH基因區段上游。在一些具體例中，核苷酸分子包含圖2中所示出之序列。
本文亦描述靶向載體，例如用於修飾非人類動物(例如，嚙齒動物，諸如大鼠或小鼠)之基因組(例如，生殖系基因組)，以包含如本文所述之經改造DH區。一般而言，如本文所述之靶向載體包含如本文所述之核苷酸分子中之任一者，且視情況地包含5'同源臂及3'同源臂，以便在免疫球蛋白重鏈可變區內進行同源重組，視情況地其中免疫球蛋白重鏈可變區為人類或人類化免疫球蛋白重鏈可變區。在一些具體例中，如本文所述之靶向載體包含5'同源臂，其包含未經重排人類基因區段，例如VH6-1基因區段，及/或3'同源臂，其包含嚙齒動物(例如，小鼠)CH區或其部分，例如嚙齒動物(小鼠)CH內含子增強子區及/或嚙齒動物(小鼠)IgM基因。
在一些具體例中，靶向載體包含如本文所述之核苷酸分子，及5'同源臂及3'同源臂，其經組構以允許與免疫球蛋白重鏈序列進行同源重組，該免疫球蛋白重鏈序列可視情況地位於內源性嚙齒動物免疫球蛋白重鏈基因座處且/或包含人類或人類化免疫球蛋白重鏈可變區。在一些具體例中，如本文所述之靶向載體包含5'同源臂，其包含未經重排人類基因區段(例如，VH6-1基因區段)、人類經改造DH區、至少一個未經重排人類JH基因區段，及3'同源臂，其包含嚙齒動物(小鼠)CH內含子增強子區，且/或嚙齒動物(小鼠)可適用於在嚙齒動物體內改造包含人類化免疫球蛋白重鏈基因座之DH區，例如包含用人類免疫球蛋白可變序列置換小鼠免疫球蛋白可變序列之小鼠，例如VELOCIMMUNE®小鼠，其可視情況地包含恢復其繁殖力之功能性ADAM6基因、包含完整內源性IgM基因及另一內源性經修飾恆定區基因(例如，IgG)以便產生不含功能性CH1域之逆向嵌合非IgM抗體的經修飾內源性重鏈恆定區基因序列、編碼逆向嵌合人類化共同輕鏈之 序列、編碼逆向嵌合人類化κ輕鏈之序列、編碼逆向嵌合人類化λ輕鏈之序列、編碼雜交κ/λ或κ/λ輕鏈之序列、未經重排生殖系人類重基因區段及/或(未)經重排生殖系輕鏈基因區段，該等區段經組胺酸密碼子修飾以便表現具有組胺酸胺基酸且可展現pH敏感抗原結合之可變域，及/或經末端去氧核苷酸轉移酶(TdT)修飾以便提高抗原受體多樣性。參見例如美國專利9,035,128號；第9,066,502號；第9,163,092號；第9,150,662號；第9,334,333號；第9,850,462號；第9,844,212號；第9,029,628號；第9,006,511號；第9,394,373號；第9,206,261號；第9,206,262號；第9,206,263號；第9,226,484號；第9,399,683號；第9,540,452號；第9,012,717號；第9,796,788,8,697,940號；第8,754,287號；第9,334,334號；第9,801,362號；第9,332,742號；第9,969,814號；美國專利公開案2011/0195454、2012/0021409、2012/0192300、2013/0185821、2013/0302836、2013/0045492及2018/0125043；PCT公開案第WO2017210586號及第WO2019/113065號，其中之每一者以全文引用的方式併入本文中。
如此，本文描述改造DH區以便進行DH-DH重組之方法，例如在嚙齒動物體內進行。在一些具體例中，該方法包含對包含一個或複數個未經重排DH基因區段之DH區進行修飾，以包含可操作地連接至23聚體RSS之至少一個DH基因區段。在一些具體例中，對免疫球蛋白重鏈可變區進行修飾以改造DH-DH重組之方法包含獲得免疫球蛋白重鏈可變區，其包含DH區，該區包含一或多個未經重排DH基因區段，該等未經重排DH基因區段中之每一者在一側由12聚體RSS側接且在另一側由另一12聚體RSS側接；及對DH區進行修飾，以進一步包含可操作地連接至23聚體RSS之至少一個DH基因區段。在一些具體例中，DH區為人類DH區，其包含一個或複數個未經重排人類DH基因區段，例如其中該複數個未經重排人類DH基因區段視情況地包含跨越且包括以下之所有功能性未經重排人類DH基因區段：例如呈生殖系組構之DH1-1基因區段及DH7-27基因區段。在一些具體例中，修飾包含將在一側由12聚體RSS側接且在另一側由另一12聚體RSS側接 之一個或複數個未經重排DH基因區段中之一或多者，例如功能性未經重排人類DH基因區段，用可操作地連接至23聚體RSS之至少一個DH基因區段置換。在一些具體例中，DH區之在一側由12聚體RSS側接且在另一側由另一12聚體RSS側接之最接近3'端的未經重排DH基因區段經可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段置換，其中可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段自5'至3'包含23聚體RSS、DH基因區段及12聚體RSS。在一些具體例中，在一側由12聚體RSS側接且在另一側由另一12聚體RSS側接之未經重排DH基因區段經對應DH基因區段置換，該對應基因區段經改造以可操作地連接至23聚體RSS。在一些具體例中，其中DH區包含未經重排人類DH7-27基因區段(例如，生殖系DH7-27基因區段)，該未經重排人類DH7-27基因區段經可操作地連接至5'端23聚體RSS之人類DH基因區段(例如，未經重排人類DH3-3基因區段)置換。在一些具體例中，其中DH區包含未經重排DH2-2基因區段、未經重排DH2-8基因區段及/或未經重排DH2-15基因區段(例如，其中經改造DH包含呈生殖系組構之未經重排人類DH基因區段之全譜系)，未經重排DH2-2基因區段、未經重排DH2-8基因區段及/或未經重排DH2-15基因區段各自經以下置換：在3'端可操作地連接至23聚體RSS之DH2-2基因區段、在3'端可操作地連接至23聚體RSS之人類DH2-8基因區段及/或在3'端可操作地連接至23聚體RSS之人類DH2-15基因區段。在一些具體例中，修飾包含將側接未經重排DH基因區段(例如，人類生殖系DH基因區段)之二個12聚體RSS中之一者用23聚體RSS置換。在一些具體例中，除了DH區以外，待修飾之免疫球蛋白重鏈可變區亦包含JH區(視情況地包含人類生殖系JH基因區段之全譜系，其包含人類生殖系JH1基因區段、人類生殖系JH2基因區段、人類生殖系JH3基因區段、人類生殖系JH4基因區段、人類生殖系JH5基因區段及人類生殖系JH6基因區段，視情況地其中人類生殖系JH1、JH2、JH3、JH4、JH5及JH6基因區段呈生殖系組構)，其可操作地連接至DH區，且置換在一側由12聚體RSS側接且在另一側由另一12聚體RSS側接之未經重排DH基因區段包含刪除JH區中所包含之 至少一個未經重排JH基因區段，例如導致缺失與DH區相鄰之未經重排人類JH1、JH2、JH3、JH4及/或JH5基因區段。在一些具體例中，刪除JH區中所包含之至少一個生殖系JH基因區段包含刪除未經重排人類JH1、JH2及JH3基因區段，及視情況地進一步刪除JH4及JH5基因區段。在一些具體例中，用可操作地連接至5'端23聚體RSS之DH基因區段，例如可操作地連接至5'端23聚體RSS之DH3-3基因區段置換所有功能性DH基因區段中之一或多者，例如置換DH7-27基因區段導致缺失與DH區相鄰之未經重排人類JH1、JH2及JH3基因區段。在一些具體例中，用可操作地連接至5'端23聚體RSS之DH基因區段，例如可操作地連接至5'端23聚體RSS之DH3-3基因區段置換所有功能性DH基因區段中之一或多者，例如置換DH7-27基因區段導致缺失與DH區相鄰之未經重排人類JH1、JH2、JH3、JH4及JH5基因區段。在一些具體例中，DH區經修飾以包含可操作地連接至23聚體RSS之至少一個DH基因區段，其中可操作地連接至23聚體RSS之至少一個DH基因區段包含(a)可操作地連接至23聚體RSS之人類DH3-3基因區段，視情況地其中23聚體RSS與DH3-3基因區段之5'端相鄰，(b)可操作地連接至23聚體RSS之人類DH2-2基因區段，視情況地其中23聚體RSS與DH2-2基因區段之3'端相鄰，(c)可操作地連接至23聚體RSS之人類DH2-8基因區段，視情況地其中23聚體RSS與DH2-8基因區段之3'端相鄰，(d)可操作地連接至23聚體RSS之人類DH2-15基因區段，視情況地其中23聚體RSS與DH2-15基因區段之3'端相鄰，或(e)(a)至(d)之任何組合。
此類方法會產生包含經改造DH區之免疫球蛋白重鏈可變區，例如包含如本文所述之(人類)免疫球蛋白重鏈可變區之核苷酸分子，其中(未)經重排(人類)免疫球蛋白重鏈區可視情況地連接至非人類免疫球蛋白重鏈恆定區或其部分，例如嚙齒動物免疫球蛋白重鏈恆定區，其包含至少一嚙齒動物CH內含子增強子區及/或嚙齒動物IgM基因，例如視情況地處於內源性非人類免疫球蛋白重鏈基因座處。在一些具體例中，在重組後，此類免疫球蛋白重鏈基因座，例如內源性免 疫球蛋白重鏈基因座，包含經重排免疫球蛋白重鏈可變區編碼序列編碼免疫球蛋白重鏈可變域，例如互補決定區3(CDR3)胺基酸長度大於20個胺基酸之免疫球蛋白重鏈可變域，該長度可為以下之結果：VH(DHA-DHB)JH、VHDHJH6或VH(DHA-DHB)JH6重組。因此，本發明提供嚙齒動物、嚙齒動物細胞、基因座及/或核苷酸分子，其包含經重排免疫球蛋白重鏈VH(DHA-DHB)JH、VH(DH)JH6或VH(DHA-DHB)JH6序列，該序列編碼包含CDR3之免疫球蛋白重鏈可變域，其中CDR3之長度為至少20個胺基酸長度。
本文亦描述非人類動物，例如嚙齒動物，其例如在其基因組(例如，生殖系基因組)中包含本發明之經改造DH區，例如如本文所述之核酸、靶向載體及/或免疫球蛋白重鏈基因座。本文亦描述此類非人類動物基因組，例如嚙齒動物基因組。在一些具體例中，本文描述生殖系基因組包含以下之嚙齒動物，或包含以下之嚙齒動物生殖系基因組：如所描述之免疫球蛋白重鏈可變區，其中該免疫球蛋白重鏈可變區包含：(i)至少一個未經重排重鏈可變(VH)基因區段，(ii)經改造重鏈可變區多樣性(DH)區，其中經改造DH區包含一或多個未經重排DH基因區段，其各自在一側由12聚體RSS側接且在另一側由另一12聚體RSS側接，及一或多個DH基因區段，其各自可操作地連接至23聚體重組信號序列(RSS)，及(iii)至少一個未經重排重鏈接合(JH)基因區段，其中(i)至(iii)呈可操作連接形式，使得在重組後，免疫球蛋白重鏈可變區包含經重排重鏈可變區序列，其編碼免疫球蛋白重鏈可變域，視情況地其中經重排重鏈可變區序列在VH(DH-DH)JH重組事件後形成，視情況地其中在VH(DH-DH)重組事件期間，各自可操作地連接至23聚體重組信號序列(RSS)之一或多個DH基因區段中之至少一者接合各自在一側由12聚體RSS側接且在另一側由另一12聚體RSS側接之一或多個未經重排DH基因區段中之一者。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之一或多個DH區段包含可操作地連接至3'23聚體RSS之DH基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之一或多個DH區段包含可操作地連接至5'23聚體RSS之DH基因區 段。在一些具體例中，免疫球蛋白重鏈可變區為人類免疫球蛋白重鏈可變區，其僅包含人類VH、DH及JH基因區段。在一些具體例中，人類免疫球蛋白重鏈可變區可操作地連接至免疫球蛋白重鏈恆定區。在一些具體例中，免疫球蛋白重鏈恆定區為非人類動物或非人類動物基因組之內源性免疫球蛋白重鏈恆定區，例如在內源性免疫球蛋白重鏈基因座處。在一些具體例中，免疫球蛋白重鏈可變區包含人類VH基因區段，其跨越以下：呈生殖系組構之VH3-74至VH6-1。在一些具體例中，免疫球蛋白重鏈可變區包含人類JH6基因區段。在一些具體例中，免疫球蛋白重鏈可變區包含編碼一或多種嚙齒動物Adam6多肽之一或多種核苷酸分子(例如，嚙齒動物Adam6基因)，其可視情況地插入於二個人類VH基因區段之間(例如，插入於人類VH1-2基因區段與人類VH6-1基因區段之間)及/或在人類Adam6偽基因之位置插入。在一些具體例中，非人類動物為嚙齒動物。在一些具體例中，嚙齒動物基因組就經改造DH區而言為異型接合的。在一些具體例中，嚙齒動物基因組就經改造DH區而言為同型接合的。在一些具體例中，嚙齒動物可為大鼠。在一些具體例中，嚙齒動物可為小鼠。在一些具體例中，嚙齒動物、嚙齒動物基因組或嚙齒動物細胞為大鼠、小鼠、大鼠基因組、小鼠基因組、大鼠細胞或小鼠細胞，例如嚙齒動物(大鼠或小鼠)胚胎幹細胞。
在一些具體例中，本文所述的嚙齒動物、嚙齒動物基因組或嚙齒動物細胞進一步包含經重排重鏈VDJ及/或VH(DHA-DHB)JH編碼序列，其編碼免疫球蛋白重鏈可變域。在一些具體例中，本文描述非人類動物，例如嚙齒動物，例如大鼠或小鼠，其(1)在其生殖系基因組中，例如在生殖細胞中，包含免疫球蛋白重鏈基因座，其包含經改造DH區，該區包含可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段，及(2)在其體細胞基因組中，例如在B細胞中，包含經重排重鏈可變區VH(DHA-DHB)JH編碼序列，其中第一或第二DH基因區段(分別DHA或DHB)來源於可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段，或其部分(例如，包含與可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段之至少一部分、 其體細胞超突變變異體及/或其簡併變異體一致的序列)。在一些具體例中，其中B細胞為初始B細胞且/或經重排編碼序列可操作地連接至IgM恆定區序列，DHA及DHB基因區段中之至少一者包含與由可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段編碼之核苷酸分子對齊的至少9個連續核苷酸，且DHA及DHB基因區段中之每一者包含與生殖系DH基因區段之核苷酸分子對齊的至少5個連續核苷酸。在一些具體例中，其中B細胞為血漿或記憶B細胞，且/或經重排重鏈可變區編碼序列經體細胞超突變且/或可操作地連接至非IgM恆定區序列(例如，IgG、IgA、IgE等)，DHA及DHB中之每一者分別展示與第一及第二生殖系DH基因區段具有40%一致性，其中存在最多1個核苷酸突變。在一些具體例中，嚙齒動物中所有經重排重鏈VDJ及/或VH(DHA-DHB)JH編碼序列之至少95%具有至少10個胺基酸之CDR3長度，視情況地其中嚙齒動物中所有經重排重鏈VDJ及/或VH(DHA-DHB)JH編碼序列之至少70%具有至少11個胺基酸之CDR3長度，視情況地嚙齒動物中所有經重排重鏈VDJ及/或VH(DHA-DHB)JH編碼序列之至少15%具有至少14個胺基酸之CDR3長度。在一些具體例中，嚙齒動物中VDJ及/或VH(DHA-DHB)JH編碼序列之群體的CDR3長度為至少15個胺基酸、視情況地至少16個胺基酸、視情況地至少17個胺基酸及視情況地至少18個胺基酸。在一些具體例中，本文描述表現以下之嚙齒動物或嚙齒動物細胞，或包含以下之核酸或免疫球蛋白基因座：經重排重鏈VH(DHA-DHB)JH編碼序列，其中第二生殖系DH基因區段為DH3-3，視情況地其中經重排重鏈VH(DHA-DHB)JH編碼序列編碼超過20個胺基酸之CDR3長度。在一些具體例中，本文描述表現以下之嚙齒動物或嚙齒動物細胞，或包含以下之核酸或免疫球蛋白基因座：經重排重鏈VH(DHA-DHB)JH編碼序列，其中第一生殖系DH基因區段為DH2-2、DH2-8或DH2-15，視情況地其中經重排重鏈VH(DHA-DHB)JH編碼序列編碼超過20個胺基酸之CDR3長度。在一些具體例中，本文描述嚙齒動物或嚙齒動物細胞，其表現經重排重鏈VH(DHA-DHB)JH6編碼序列，該編碼序列編碼超過20個胺基酸之CDR3長度。
在一些具體例中，提供嚙齒動物基因組、核酸或免疫球蛋白基因座，其包含經重排人類免疫球蛋白重鏈VH(DHA-DHB)JH編碼序列，該編碼序列可操作地連接至嚙齒動物免疫球蛋白重鏈恆定區序列。在一些具體例中，DHB基因區段來源於人類生殖系DH3-3基因區段。在一些具體例中，DHA基因區段來源於人類生殖系DH2-2、DH2-8或DH2-15基因區段。在一些具體例中，經重排重鏈經確定為VH(DHA-DHB)JH編碼序列，此係由於DHA及DHB中之每一者分別展示與第一及第二生殖系DH基因區段具有40%一致性，其中存在最多1個核苷酸突變。在一些具體例中，經重排重鏈VH(DHA-DHB)JH編碼序列編碼超過20個胺基酸之CDR3長度。在一些具體例中，JH基因區段來源於人類生殖系JH6基因區段。在一些具體例中，提供嚙齒動物或嚙齒動物細胞，其包含VH(DHA-DHB)JH編碼序列。在一些具體例中，嚙齒動物為大鼠或小鼠，或嚙齒動物細胞為大鼠細胞或小鼠細胞。在一些具體例中，嚙齒動物細胞為嚙齒動物B細胞。在一些具體例中，提供融合瘤，其包含與骨髓瘤細胞融合之嚙齒動物B細胞，該嚙齒動物B細胞表現經重排重鏈VH(DHA-DHB)JH編碼序列。在一些具體例中，當鑑別為DHA及DHB之序列各自分別展示與第一及第二生殖系DH基因區段具有40%一致性，其中存在最多1個核苷酸突變時，VH(DHA-DHB)JH序列證實為DH-DH重組事件之結果。
在一些具體例中，提供非人類動物或細胞，其基因組包含包括經改造DH區之免疫球蛋白重鏈可變區，其中經改造DH區包含可操作地連接至第一及第二重組信號序列(RSS)之至少一個DH區段。在一些具體例中，第一RSS為23聚體RSS且第二RSS為12聚體RSS。在一些具體例中，第一RSS為12聚體RSS且第二RSS為23聚體RSS。
在一些具體例中，提供非人類動物，其基因組包含包括經改造DH區之免疫球蛋白重鏈可變區，該經改造DH區包含各自可操作地連接至23聚體重組信號序列(RSS)之一或多個DH區段。
在一些具體例中，提供非人類細胞或組織，其基因組包含包括經改造DH區之免疫球蛋白重鏈可變區，該經改造DH區包含各 自可操作地連接至23聚體重組信號序列(RSS)之一或多個DH區段。在一些具體例中，細胞來自淋巴或骨髓系。在一些具體例中，細胞為淋巴細胞。在一些具體例中，細胞選自B細胞、樹突細胞、巨噬細胞、單核細胞及T細胞。在一些具體例中，組織選自脂肪、膀胱、腦、骨髓、眼、心臟、腸、腎、肝、肺、淋巴結、肌肉、胰臟、血漿、血清、皮膚、脾、胃、胸腺、睪丸、卵子或其任何組合。
在一些具體例中，提供由如本文所述之非人類細胞製成之永生化細胞，例如由將自如本文所述之非人類動物分離之B細胞與骨髓瘤細胞融合製成之融合瘤細胞。
在一些具體例中，非人類細胞為非人類胚胎幹(ES)細胞。在一些具體例中，非人類胚胎幹細胞為嚙齒動物胚胎幹細胞。在一些具體例中，囓齒動物胚胎幹細胞為小鼠胚胎幹細胞，且來自129品系、C57BL品系或其混合。在一些具體例中，囓齒動物胚胎幹細胞為小鼠胚胎幹細胞，且為129與C57BL品系之混合。
在一些具體例中，提供如本文所述之非人類胚胎幹細胞用於製備非人類動物之用途。在一些具體例中，非人類胚胎幹細胞為小鼠胚胎幹細胞，且用於製備包含包括如本文所述之經改造DH區之免疫球蛋白重鏈可變區的小鼠。在一些具體例中，非人類胚胎幹細胞為大鼠胚胎幹細胞，且用於製備包含包括如本文所述之經改造DH區之免疫球蛋白重鏈可變區的大鼠。在一些具體例中，用於製備包含包括經改造DH區之免疫球蛋白重鏈可變區之大鼠的非限制性例示性方法可包括US20140309487中所揭示之方法，該專利以全文引用的方式併入本文中。
在一些具體例中，提供包含以下、由以下製備、獲自以下或由以下產生之非人類胚胎：如本文所述之非人類胚胎幹細胞。在一些具體例中，非人類胚胎為囓齒動物胚胎；在一些具體例中，為小鼠胚胎；在一些具體例中，為大鼠胚胎。
在一些具體例中，提供本文所述的非人類胚胎用於製備非人類動物之用途。在一些具體例中，非人類胚胎為小鼠胚胎，且用 於製備包含包括如本文所述之經改造DH區之免疫球蛋白重鏈可變區的小鼠。在一些具體例中，非人類胚胎為大鼠胚胎，且用於製備包含包括如本文所述之經改造DH區之免疫球蛋白重鏈可變區的大鼠。
本發明提供製備基因組包含經改造DH區之嚙齒動物之方法，該方法包含(a)對嚙齒動物胚胎幹細胞之基因組進行修飾以包含DNA片段，其包含各自可操作地連接至23聚體RSS之一或多個DH區段，例如其中DNA片段包含本文所述的核苷酸分子、靶向載體及/或經改造DH區，及(b)使用(a)之經修飾嚙齒動物胚胎幹細胞產生嚙齒動物。在一些具體例中，方法包含對免疫球蛋白重鏈可變區之未經重排DH區進行修飾以包含可操作地連接至23聚體RSS之至少一個DH區段，其中未經重排DH區進一步包含一或多個未經重排DH基因區段，其各自在一側由12聚體RSS側接且在另一側由另一12聚體RSS側接，藉此製備該嚙齒動物。在一些具體例中，修飾包含用可操作地連接至23聚體RSS之至少一個DH區段置換一或多個未經重排人類DH基因區段，及視情況地置換或刪除一或多個JH基因區段。在一些具體例中，免疫球蛋白重鏈可變區為人類免疫球蛋白重鏈可變區，例如其中人類免疫球蛋白重鏈可變區包含以下：未經重排人類免疫球蛋白重鏈VH基因簇，其包含至少一個VH基因區段；未經重排人類免疫球蛋白重鏈DH區，其包含一或多個未經重排人類DH基因區段；及未經重排人類免疫球蛋白重鏈JH基因簇，其包含一個未經重排人類JH基因區段，其中未經重排人類免疫球蛋白重鏈DH區經修飾以包含可操作地連接至23聚體RSS之至少一個DH區段。在一些具體例中，修飾步驟產生免疫球蛋白重鏈可變區，其包含(i)功能性人類VH基因區段之全譜系，例如跨越且包括以下之所有功能性VH基因區段：VH3-74至VH6-1，(ii)未經重排人類DH基因區段之全譜系，除DH7-27以外，其經可操作地連接至23聚體RSS之至少一個DH基因區段置換，及(iii)至少一未經重排人類JH6基因區段，且視情況地至少一未經重排JH4基因區段、未經重排JH5基因區段及未經重排JH6基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之至少一個DH基因區段包含可操作地連接 至5'-23聚體RSS之DH3-3基因區段。在一些具體例中，修飾步驟產生免疫球蛋白重鏈可變區，其包含(i)功能性人類VH基因區段之全譜系，例如跨越且包括以下之所有功能性VH基因區段：VH3-74至VH6-1，(ii)未經重排人類DH基因區段之全譜系，除未經重排人類DH2-2、DH2-8及DH2-15基因區段以外，其分別經以下置換：在3'端可操作地連接至23聚體RSS之DH2-2基因區段、在3'端可操作地連接至23聚體RSS之人類DH2-8基因區段及在3'端可操作地連接至23聚體RSS之DH2-15基因區段，及(iii)未經重排人類JH基因區段之全譜系，例如未經重排人類JH1基因區段、未經重排人類JH2基因區段、未經重排人類JH3基因區段、未經重排人類JH4基因區段、未經重排人類JH5基因區段及未經重排人類JH6基因區段。在一些具體例中，免疫球蛋白重鏈可變區(a)進一步包含一或多個嚙齒動物Adam6基因，視情況地其中一或多個嚙齒動物Adam6基因位於二個未經重排VH基因區段之間，例如位於未經重排人類VH1-2基因區段與未經重排人類VH6-1基因區段之間，且/或(b)可操作地連接至免疫球蛋白重鏈恆定區，視情況地其中免疫球蛋白重鏈恆定區為內源性嚙齒動物免疫球蛋白重鏈恆定區，例如在內源性免疫球蛋白重鏈基因座處之內源性嚙齒動物免疫球蛋白重鏈恆定區。在一些具體例中，囓齒動物為大鼠或小鼠。
在一些具體例中，提供套組，其包含如本文所述之非人類動物、如本文所述之非人類細胞或組織、如本文所述之永生化細胞、如本文所述之非人類胚胎幹細胞或如本文所述之非人類胚胎。
在一些具體例中，提供如本文所述之套組，其用於製造及/或開發用於治療或診斷的藥物(例如，抗體抗體或其抗原結合片段)。在一些具體例中，提供如本文所述之套組，其用於製造及/或開發用於治療、預防或改善疾病、病症或症狀的藥物(例如，抗體或其抗原結合片段)。
在一些具體例中，提供如本文所述之轉殖基因、核酸構築體、DNA構築體或靶向載體。在一些具體例中，轉殖基因、核酸構築體、DNA構築體或靶向載體包含如本文所述之經改造DH區。在一 些具體例中，轉殖基因、核酸構築體、DNA構築體或靶向載體包含包括可操作地連接至23聚體RSS之一或多個DH區段之DNA片段。在一些具體例中，轉殖基因、核酸構築體、DNA構築體或靶向載體進一步包含一或多種選擇標記物。在一些具體例中，轉殖基因、核酸構築體、DNA構築體或靶向載體進一步包含一或多個位點特異性重組位點(例如，loxP、Frt或其組合)。在一些具體例中，轉殖基因、核酸構築體、DNA構築體或靶向載體描繪於圖2中。
在一些具體例中，提供如本文所述之轉殖基因、核酸構築體、DNA構築體或靶向載體用於製備非人類動物、非人類細胞、非人類胚胎幹細胞及/或非人類胚胎之用途。
在一些具體例中，一或多個DH區段各自可操作地連接至3' 23聚體RSS。在一些具體例中，一或多個DH區段各自可操作地連接至5' 23聚體RSS。
在一些具體例中，經改造DH區包含可操作地連接至5' 23聚體RSS之一個DH區段。在一些具體例中，經改造DH區包含可操作地連接至3' RSS之一個DH區段。在可操作地連接至5' 23聚體RSS之一個DH區段之一些具體例中，該一個DH區段為合成DH區段；在一些具體例中，合成人類DH區段；在一些具體例中，具有與人類DH3-3區段一致或實質上一致之序列的合成人類DH區段。在可操作地連接至3' 23聚體RSS之一個DH之一些具體例中，該一個DH區段為合成DH區段；在一些具體例中，合成人類DH區段；在一些具體例中，具有與人類DH3-3區段一致或實質上一致之序列的合成人類DH區段。
在一些具體例中，經改造DH區包含各自可操作地連接至5' 23聚體RSS之三個DH區段。在各自可操作地連接至5' 23聚體RSS之三個DH區段之一些具體例中，三個DH區段為合成DH區段。在各自可操作地連接至5' 23聚體RSS之三個DH之一些具體例中，三個DH區段為人類DH2家族區段。在各自可操作地連接至5' 23聚體RSS之三個DH區段之一些具體例中，三個DH區段選自人類DH2-2、人類DH2-8、人類DH2-15、人類DH2-21及其組合。在各自可操作地連接至 5' 23聚體RSS之三個DH之一些具體例中，三個DH區段為人類DH2-2、人類DH2-8及人類DH2-15。
在一些具體例中，經改造DH區包含各自可操作地連接至3' 23聚體RSS之三個DH區段。在各自可操作地連接至3' 23聚體RSS之三個DH區段之一些具體例中，三個DH區段為合成DH區段。在各自可操作地連接至3' 23聚體RSS之三個DH區段之一些具體例中，三個DH區段為人類DH2家族區段。在各自可操作地連接至3' 23聚體RSS之三個DH區段之一些具體例中，三個DH區段選自人類DH2-2、人類DH2-8、人類DH2-15、人類DH2-21及其組合。在各自可操作地連接至3' 23聚體RSS之三個DH區段之一些具體例中，三個DH區段為人類DH2-2、人類DH2-8及人類DH2-15。
在一些具體例中，如本文所述之DH區包括複數個人類DH區段，其中該複數個人類DH基因區段中之至少一者可操作地連接至5'或3' RSS；在一些具體例中，5' 23聚體RSS。在一些具體例中，如本文所述之經改造DH區包括複數個人類DH區段，其中該複數個人類DH基因區段中之至少三個各自可操作地連接至5'或3' RSS；在一些具體例中，3' 23聚體RSS。
在一些具體例中，所提供之非人類動物、非人類細胞或非人類組織之基因組缺少一或多個野生型DH區段。在一些具體例中，所提供之非人類動物、非人類細胞或非人類組織之基因組缺少全部或實質上全部野生型DH區段。在一些具體例中，所提供之非人類動物、非人類細胞或非人類組織之基因組僅含有人類DH區段。
在一些具體例中，免疫球蛋白重鏈可變區為人類免疫球蛋白重鏈可變區。在一些具體例中，人類免疫球蛋白重鏈可變區可操作地連接至免疫球蛋白重鏈恆定區。在一些具體例中，免疫球蛋白重鏈恆定區為內源性(例如，非人類)免疫球蛋白重鏈恆定區。
在一些具體例中，人類免疫球蛋白重鏈可變區包括VH3-74至VH6-1之人類VH基因區段。在一些具體例中，人類免疫球蛋白重鏈可變區包括至少人類JH基因區段JH6。在一些具體例中，人 類免疫球蛋白重鏈可變區包括至少人類JH基因區段JH4、JH5及JH6。在一些具體例中，人類免疫球蛋白重鏈可變區包括人類JH基因區段JH1、JH2、JH3、JH4、JH5及JH6。
在非人類動物、非人類細胞或非人類組織之一些具體例中，基因組缺乏內源性Adam6基因。在非人類動物、非人類細胞或非人類組織之一些具體例中，基因組進一步包含編碼一或多種嚙齒動物Adam6多肽之一或多種核苷酸序列的插入；在一些具體例中，一或多種核苷酸序列插入於第一與第二人類VH基因區段之間；在一些具體例中，一或多種核苷酸序列在人類Adam6偽基因之位置插入；在一些具體例中，一或多種核苷酸序列插入於人類VH基因區段與人類DH基因區段之間。在一些具體例中，第一人類VH基因區段為人類VH1-2，且第二人類VH基因區段為人類VH6-1。
在一些具體例中，提供非人類動物、非人類細胞或非人類組織，其就如本文所述之DH區而言為同型接合、異型接合或半接合(hemizygous)的。在一些具體例中，所提供之非人類動物、非人類細胞或非人類組織經如本文所述之經改造DH區基因轉殖。
在一些具體例中，提供製備非人類動物之方法，該非人類動物之基因組包含包括經改造DH區之免疫球蛋白重鏈可變區，該方法包含(a)將DNA片段插入至非人類胚胎幹細胞中，該DNA片段包含各自可操作地連接至23聚體RSS之一或多個DH區段；(b)獲得(a)中所產生之非人類胚胎幹細胞；及(c)使用(b)之非人類胚胎幹細胞產生非人類動物。
在一些具體例中，DNA片段包含各自可操作地連接至3' 23聚體RSS之一或多個DH區段。在一些具體例中，DNA片段包含可操作地連接至3' 23聚體RSS之一個DH區段。在一些具體例中，DNA片段包含可操作地連接至3' 23聚體RSS之一個合成人類DH區段。在一些具體例中，DNA片段包含可操作地連接至3' 23聚體RSS之一個合成人類DH3-3區段。在一些具體例中，DNA片段包含各自可操作地連接至3' 23聚體RSS之三個DH區段。在一些具體例中，DNA片段包 含各自可操作地連接至3' 23聚體RSS之三個人類DH區段。在一些具體例中，DNA片段包含各自可操作地連接至3' 23聚體RSS之三個人類DH區段，該等人類DH區段為人類DH2-2、人類DH2-8及人類DH2-15。
在一些具體例中，DNA片段包含一或多個DH區段，其各自可操作地連接至5' 23聚體RSS。在一些具體例中，DNA片段包含可操作地連接至5' 23聚體RSS之一個DH區段。在一些具體例中，DNA片段包含可操作地連接至5' 23聚體之一個合成人類DH區段。在一些具體例中，DNA片段包含可操作地連接至5' 23聚體RSS之一個合成人類DH3-3區段。在一些具體例中，DNA片段包含可操作地連接至5' 23聚體RSS之一個合成人類DH3-3區段，該合成人類DH3-3區段定位於人類DH區中人類DH7-27區段之位置。
在一些具體例中，DNA片段包含一或多種選擇標記物。在一些具體例中，DNA片段包含一或多個位點特異性重組位點。
在一些具體例中，提供製備非人類動物之方法，該人類動物之基因組包含包括經改造DH區之免疫球蛋白重鏈可變區，該方法包含以下步驟：對非人類動物或非人類動物細胞之基因組進行修飾，使得其包含包括經改造DH區之免疫球蛋白重鏈可變區，該經改造DH區包含各自可操作地連接至23聚體RSS之一或多個DH區段，藉此製備該非人類動物。
在製備非人類動物之一些具體例中，非人類動物或非人類動物細胞之基因組經修飾以包括各自可操作地連接至5' 23聚體RSS之一或多個DH區段。在製備非人類動物之一些具體例中，非人類動物或非人類動物細胞之基因組經修飾以包括各自可操作地連接至3' 23聚體RSS之一或多個DH區段。
在一些具體例中，提供在非人類動物中產生抗體之方法。在一些具體例中，產生抗體或獲得編碼該抗體之核酸之方法包含用抗原對非人類動物(例如，嚙齒動物(例如，大鼠或小鼠))進行免疫接種，該嚙齒動物具有包含經改造DH區之生殖系基因組，該區包含各自可操作地連接至23聚體RSS之一或多個DH區段，及使嚙齒動物產生 針對抗原之免疫反應，包括結合抗原之抗體，或編碼該抗體之核酸。在一些具體例中，該方法進一步包含自嚙齒動物或嚙齒動物細胞(例如，為B細胞或融合瘤)回收抗體，或編碼該抗體之核酸。在一些具體例中，一或多個DH區段各自可操作地連接至5' 23聚體RSS。在一些具體例中，一或多個DH區段各自可操作地連接至3' 23聚體RSS。
在一些具體例中，該方法包含以下步驟：(a)用抗原對非人類動物進行免疫接種，該非人類動物具有包含包括經改造DH區之免疫球蛋白重鏈可變區的基因組，該經改造DH區包含各自可操作地連接至23聚體RSS之一或多個DH區段；(b)將嚙齒動物保持在足以使非人類動物產生針對抗原之免疫反應之條件下；及(c)自非人類動物，或非人類動物細胞回收結合抗原之抗體。在一些具體例中，非人類動物細胞為B細胞。在一些具體例中，非人類動物細胞為融合瘤。
在一些具體例中，提供非人類動物，其基因組包含人類免疫球蛋白重鏈可變區，其包含一或多個人類VH基因區段、包括可操作地連接至23聚體RSS之至少一個人類DH區段之經改造DH區，及至少一個人類JH基因區段，其中人類免疫球蛋白重鏈可變區可操作地連接至一或多個內源性免疫球蛋白恆定區基因，使得嚙齒動物之特徵在於以下：當其經抗原免疫接種時，其產生抗體，該等抗體包含包括由人類DH-DH重組及/或增強型重組至JH6基因區段產生之CDR3區的人類重鏈可變域，且其中該等抗體展示與抗原之特異性結合。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之至少一個人類DH區段位於人類DH7-27區段之位置。在一些具體例中，人類免疫球蛋白重鏈可變區包含少於全部六個人類JH區段。在一些具體例中，人類免疫球蛋白重鏈可變區僅包含六個人類JH基因區段中之一個。在一些具體例中，人類免疫球蛋白重鏈可變區包含人類JH6基因區段，且缺少功能性JH1基因區段、缺少功能性JH2基因區段，缺少功能性JH3基因區段，缺少功能性JH4基因區段且缺少功能性JH5基因區段。在一些具體例中，人類免疫球蛋白重鏈可變區僅包含六個人類JH基因區段中之三個。在一些具體例中，人類免疫球蛋白重鏈可變區僅包含人類JH4基因區段、 人類JH5基因區段及人類JH6基因區段，且缺少功能性JH1基因區段，缺少功能性JH2基因區段且缺少功能性JH3基因區段。在一些具體例中，其中與對照非人類動物相比，非人類動物展現至JH6基因區段重組之增強，該非人類動物之基因組包含人類免疫球蛋白重鏈可變區，其包含少於全部六個人類JH基因區段，例如僅包含六個人類JH基因區段中之一個的人類免疫球蛋白重鏈可變區(例如，人類免疫球蛋白重鏈可變區，其包含人類JH6基因區段，且缺少功能性JH1基因區段，缺少功能性JH2基因區段，缺少功能性JH3基因區段，缺少功能性JH4基因區段且缺少功能性JH5基因區段)，該對照非人類動物之基因組包含人類免疫球蛋白重鏈可變區，其包含全部六個人類JH基因區段，例如與對照非人類動物相比，非人類動物包含較大百分比之經重排免疫球蛋白重鏈序列，該等序列包含JH6基因區段序列或其部分且/或編碼至少20個胺基酸之CDR3長度。在一些具體例中，其中與對照非人類動物相比，非人類動物展現至JH6基因區段之重組增強，該非人類動物之基因組包含人類免疫球蛋白重鏈可變區，其包含少於全部六個人類JH基因區段，例如僅包含六個人類JH基因區段中之三個的人類免疫球蛋白重鏈可變區(例如，人類免疫球蛋白重鏈可變區，其包含人類免疫球蛋白重鏈可變區，包含人類JH4基因區段、人類JH5基因區段及人類JH6基因區段，且缺少功能性JH1基因區段，缺少功能性JH2基因區段，且缺少功能性JH3基因區段)，該對照非人類動物之基因組包含人類免疫球蛋白重鏈可變區，其包含所有六個人類JH基因區段，例如與對照非人類動物相比，非人類動物包含較大百分比之經重排免疫球蛋白重鏈序列，該等序列包含JH6基因區段序列或其部分且/或編碼至少20個胺基酸之CDR3長度
在一些具體例中，提供非人類動物，該非人類動物之基因組包含人類免疫球蛋白重鏈可變區，其包含一或多個人類VH基因區段、包括3'端由23聚體RSS側接之至少一個人類DH區段之經改造DH區，及至少二個人類JH基因區段，其中人類免疫球蛋白重鏈可變區可操作地連接至一或多個內源性免疫球蛋白恆定區基因，使得嚙齒動物 之特徵在於以下：當其經抗原免疫接種時，其產生抗體，該等抗體包含包括由人類DH-DH重組產生之CDR3區的人類重鏈可變域，且其中該等抗體展示與抗原之特異性結合。在一些具體例中，經改造DH區包括各自在3'端由23聚體RSS側接之至少三個人類DH區段。在一些具體例中，經改造DH區包括各自在3'端由23聚體RSS側接之至少三個人類DH區段，該等三個人類DH區段為人類DH2-2、人類DH2-8及人類DH2-15。在一些具體例中，人類免疫球蛋白重鏈可變區包括VH3-74至VH6-1之人類VH基因區段。
在一些具體例中，抗原為病原體，例如細菌、真菌或病毒病原體。在一些具體例中，本文中非人類動物之免疫接種包含用病原體(例如細菌、真菌或病毒病原體)感染非人類動物。在一些具體例中，本文中非人類動物之免疫接種包含向非人類動物投予自病原體(例如，細菌、真菌或病毒病原體)分離之基因組或蛋白質材料。在一些具體例中，抗原為受體(例如，補體受體、趨化介素受體等)，或其部分。在一些具體例中，抗原為編碼受體或其部分之核酸。在一些具體例中，抗原為表現受體或其部分之細胞。在一些具體例中，抗原為離子通道，或其部分。在一些具體例中，抗原為編碼離子通道或其部分之核酸。在一些具體例中，抗原為表現離子通道之細胞或其部分。
在一些具體例中，所提供之非人類動物、非人類細胞或非人類組織具有基因組，其進一步包含一或多個人類VL基因區段及一或多個人類JL基因區段插入至內源性輕鏈基因座中。在一些具體例中，人類VL及JL區段為Vκ及Jκ基因區段，且插入至內源性κ輕鏈基因座中。在一些具體例中，人類Vκ及Jκ基因區段可操作地連接至嚙齒動物Cκ基因(例如小鼠或大鼠Cκ基因)。在一些具體例中，人類VL及JL區段為Vλ及Jλ基因區段，且插入至內源性λ輕鏈基因座中。在一些具體例中，人類Vλ及Jλ基因區段可操作地連接至嚙齒動物Cλ基因(例如，小鼠或大鼠Cλ基因)。
在一些具體例中，提供如本文所述之非人類動物、非人類細胞或非人類組織之用途，其用於之藥物或疫苗之製造及/或開發， 該藥物或疫苗用於醫藥，諸如用作藥劑。在一些具體例中，提供如本文所述之非人類動物、非人類細胞或非人類組織之用途，其用於製造及/或開發用於向人類投予之抗體。在一些具體例中，提供如本文所述之非人類動物、非人類細胞或非人類組織之用途，其用於製造用於治療、預防或改善疾病、病症或症狀的藥劑。
在一些具體例中，提供如本文所述之非人類動物、非人類細胞或非人類組織之用途，其用於製造及/或開發用於治療或診斷的藥物。在一些具體例中，提供如本文所述之非人類動物、非人類細胞或非人類組織，用於製造用於治療、預防或改善疾病、病症或症狀的藥劑。
在一些具體例中，本文所提供之非人類動物為嚙齒動物；在一些具體例中，為小鼠；在一些具體例中，為大鼠。在許多具體例中，本文所提供之非人類動物細胞為嚙齒動物細胞；在一些具體例中，為小鼠細胞；在一些具體例中，為大鼠細胞。在許多具體例中，本文所提供之非人類動物組織為嚙齒動物組織；在一些具體例中，為小鼠組織；在一些具體例中，為大鼠組織。
在一些具體例中，23聚體RSS包含核苷酸序列，其包含如SEQ ID NO：151所記載之序列。
本文中包括之由以下諸圖構成之圖式僅出於說明之目的而非限制。
圖1展示本發明之具體例之未按比例的一般圖示，其展示對免疫球蛋白重鏈可變區基因區段用未經修飾DH區(上圖)及經改造DH區(下圖)進行DJ重組事件中之基因區段的有序組裝。12聚體重組信號序列(RSS)描繪為未經填充之三角形。23聚體RSS描繪為具有豎直條紋之三角形。說明性未經修飾VH基因區段(未經填充之方塊)及DH基因區段(經填充之方塊)分別描繪為未經填充及經填充之方塊且使用字母表之字母提供命名。可操作地連接至23聚體RSS及未經修飾JH 基因區段之D基因區段(例如，DH3-3)分別描繪為填充有水平條紋之方塊且提供有其恰當命名。亦展示μ0啟動子(μ 0 pro)。未描繪VH基因區段重組為經重組DJ基因區段。
圖2展示根據實施例1製得之靶向載體之例示性具體例之未按比例的圖示。井號線(hash line)表示包括於靶向載體中但未具體描繪之DH基因區段。
圖3展示以下之非限制性例示性具體例之未按比例的圖示：經由電穿孔(EP)將23：DH3-3：12/JH6靶向載體插入至小鼠ES細胞基因組中人類化免疫球蛋白重鏈可變區基因座中。井號線表示包括於重鏈可變區基因座中但未具體描繪之VH基因區段或DH基因區段。
圖4展示以下之非限制性例示性具體例之未按比例的圖示：在電穿孔及整合如實施例1及2中所述之23：DH3-3：12/JH6靶向載體後，在人類化免疫球蛋白重鏈基因座中進行Cre介導之選擇卡匣之刪除。井號線表示包括於重鏈可變區基因座中但未具體描繪之VH基因區段或DH基因區段。
圖5展示以下之非限制性例示性具體例之未按比例的圖示：經由電穿孔(EP)將23：DH3-3：12/JH4-6靶向載體插入至小鼠ES細胞基因組中人類化免疫球蛋白重鏈可變區基因座中。井號線表示包括於重鏈可變區基因座中但未具體描繪之VH基因區段或DH基因區段。
圖6展示以下之非限制性例示性具體例之未按比例的圖示：在電穿孔及整合如實施例1及2中所述之23：DH3-3：12/JH4-6靶向載體後，在人類化免疫球蛋白重鏈基因座中進行Cre介導之選擇卡匣之刪除。井號線表示包括於重鏈可變區基因座中但未具體描繪之VH基因區段或DH基因區段。
圖7展示以下之非限制性例示性具體例之未按比例的圖示：經由電穿孔(EP)將12：DH2-2：23|12：DH2-8：23|12：DH2-15：23/JH1-6靶向載體插入至小鼠ES細胞基因組中人類化免疫球蛋白重鏈可變區基因座中。井號線表示包括於重鏈可變區基因座中但未具體描繪之VH基因區段或DH基因區段。經填充之三角形表示偽基因。
圖8展示以下之例示性非限制性具體例之未按比例的圖示：在電穿孔及整合如實施例1及2中所述之12：DH2-2：23|12：DH2-8：23|12：DH2-15：23靶向載體後，在人類化免疫球蛋白重鏈基因座中進行Cre介導之選擇卡匣之刪除。井號線表示包括於重鏈可變區基因座中但未具體描繪之VH基因區段或DH基因區段
圖9A展示關於本發明之一具體例之結果，對由DH-DH重組事件(下圖)產生，具有特定胺基酸長度(x軸)之自經12：DH2-2：23|12：DH2-8：23|12：DH2-15：23靶向載體修飾之動物分離之CDR3的所有功能性免疫球蛋白(Ig)讀段之百分比(y軸)進行繪圖。「S1」、「S2」及「S3」各自表示不同實驗小鼠。
圖9B展示關於本發明之一具體例之結果，對由DH-DH重組事件(下圖)產生，具有特定胺基酸長度(x軸)之自經12：DH2-2：23|12：DH2-8：23|12：DH2-15：23靶向載體修飾之動物分離之CDR3的所有Ig讀段之百分比(y軸)進行繪圖。「S1」、「S2」及「S3」各自表示不同實驗小鼠。
圖10A展示關於本發明之一具體例之結果，對由DH-DH重組事件產生，具有某一數目個半胱胺酸殘基(x軸)之自經12：DH2-2：23|12：DH2-8：23|12：DH2-15：23靶向載體修飾之動物分離之CDR3的所有功能性免疫球蛋白(Ig)讀段之百分比(y軸)進行繪圖。「S1」、「S2」及「S3」各自表示不同實驗小鼠。
圖10B關於本發明之一具體例之結果，對由DH-DH重組事件產生，具有某一數目個半胱胺酸殘基(x軸)之自經12：DH2-2：23|12：DH2-8：23|12：DH2-15：23靶向載體修飾之動物分離之CDR3的所有免疫球蛋白(Ig)讀段之百分比(y軸)進行繪圖。「S1」、「S2」及「S3」各自表示不同實驗小鼠。
圖11展示關於本發明之一具體例之結果，對具有人類化免疫球蛋白重鏈及κ輕鏈可變區基因座之個別小鼠(VI；參見例如美國專利第8,697,940號及第8,642,835號；其各自以全文引用的方式併入本文中)及經如本文所述之23：DH3-3：12/JH6靶向載體修飾之小鼠 (V(DD)J)中之代表性抗體效價(y軸)進行繪圖，該等小鼠之群組均經編碼G蛋白偶合受體(GPCR)之DNA免疫原免疫接種。抗體效價由結合在經改造以表現GPCR(GPCR；x軸)之293細胞及不表現GPCR之細胞(對照)上之MSD細胞測定。
圖12A展示關於本發明之一具體例之結果，展示自經23：DH3-3：12/JH6靶向載體修飾之小鼠的骨髓(BM)或脾分離，且編碼胺基酸(AA)長度為5至30個胺基酸(x軸)之重鏈CDR3(HCDR3)之經重排免疫球蛋白重鏈VHDHJH基因序列及根據表7中所列舉之嚴格標準假定為VHDHA-DHBJH重排之結果的基因序列的百分比(%；y軸)。BM及脾細胞數目未彼此標準化。n=1。
圖12B展示關於本發明之一具體例之結果，提供板圖12A中所示之圖的放大。BM及脾細胞數目未彼此標準化。n=1。
圖12C展示關於本發明之一具體例之結果，展示經23：DH3-3：12/JH6靶向載體修飾之小鼠之骨髓或脾二者中CDR3長度超過21個胺基酸之讀段的百分比。BM及脾細胞數目未彼此標準化。n=1。
圖13展示關於本發明之一具體例之結果，展示自經23：DH3-3：12/JH6靶向載體修飾之小鼠的骨髓(BM)或脾分離，且編碼胺基酸(AA)長度均超過20個胺基酸長度(x軸)之重鏈CDR3(HCDR3)之假定經重排免疫球蛋白重鏈VHDHA-DHBJH基因序列(根據表7中所列舉之嚴格標準)的百分比(%；y軸)。BM及脾細胞數目未彼此標準化。n=1。
定義
本發明之範疇由附隨申請專利範圍界定且不受本文中所描述之特定具體例限制；熟悉本技藝者閱讀本發明，將知道可等效於此類所描述之具體例，或以其他方式在申請專利範圍之範疇內的各種修改。一般而言，除非另有明確說明，否則本文使用的術語與其在本技藝中理解的含義一致。本文及下文提供某些術語的明確定義；熟 悉本技藝者自上下文中將清楚本說明書通篇中特定例子中之此等及其他術語的含義。在本說明書通篇闡述以下術語及其他術語之額外定義。本說明書中引用之參考文獻或其相關部分，以全文引用的方式併入本文中。
在申請專利範圍中使用如「第一」、「第二」、「第三」等的序數術語來修飾申明要素本身，並不意味著此申明要素優先於另一者，或有時間上的任何優先、前列或方法進行順序，僅用作標示，以將具有特定名稱的申明要素與具有相同名稱的另一要素區分(但用於使用序數術語)，以區分該等申明要素。
除非明確相反地指出，否則說明書及申請專利範圍中的冠詞「一(a)」及「一個(an)」應理解為包括複數指示物。若群組中之一個、多於一個或所有群組成員，在所提及的產品或方法中，存在、使用或以其他方式相關，則認為滿足包括群組中一或多個成員之間的「或」的申明或描述，除非另有說明係相反的或自上下文中顯而易見。本發明包括此類具體例，其中該群組之恰好一個成員在所提及的產品或方法中存在、使用或以其他方式相關。本發明亦包括其中大於一個或全部群組成員，在提及的產品或方法中存在、使用或以其他方式相關。此外，應該理解，本發明涵蓋所有變化、組合及置換，其中來自所列請求項中之一或多個限制、要素、條款、描述性術語等，基於相同的基本請求項(或相關的，任何其他請求項)而被引入另一個請求項，除非另有說明或除非一般熟悉本技藝者明白會出現矛盾或不一致。在將要素以列表(例如，以馬庫西群組(Markush group)或類似格式)呈現的情況下，應當理解，每一子群組亦被揭示，並且可自群組中移除任一要素。應當理解，一般而言，在本發明或本發明態樣稱為包含特定要素、特徵等情況下，本發明或本發明態樣之具體例係由或基本上由此類要素、特徵等組成。出於簡化目的，彼等具體例並未在本文中以如此多的詞語具體闡述。亦應理解，無論是否在說明書中敘述特定排除，本發明之任何具體例或態樣均可明確地自申請專利範圍中排除。
如本申請書中所使用，術語「約」及「近似」等效使用。 本申請書中使用的任何數字，無論是否約為/近似，均意欲涵蓋相關技藝之一般技術者所瞭解的任何正常波動，例如+/- 5%。
投藥：係指向個體或系統(例如，細胞、器官、組織、生物體或其相關成分或其成分群)投予組成物。一般熟悉本技藝者將瞭解，投藥途徑可例如視組成物投予之個體或系統、組成物性質、投藥目的等而變化。
舉例而言，在一些具體例中，對動物個體(例如，對人類或囓齒動物)投藥可為支氣管(包括藉由支氣管滴注)、經頰、腸內、皮內、動脈內、皮內、胃內、髓內、肌肉內、鼻內、腹膜內、鞘內、靜脈內、心室內、經黏膜、經鼻、經口、經直腸、皮下、舌下、局部，氣管(包括藉由氣管內滴注)、經皮、經陰道，及/或玻璃體。在一些具體例中，投藥可包括間歇性給藥。在一些具體例中，投藥可包括連續給藥(例如，灌注)至少選定的一段時間。在一些具體例中，由本文所揭示之非人類動物產生之抗體可向個體(例如，人類個體或嚙齒動物)投予。在一些具體例中，醫藥組成物包括由本文所揭示之非人類動物產生之抗體。在一些具體例中，醫藥組成物可包含緩衝劑、稀釋劑、賦形劑或其任何組合。在一些具體例中，包括由本文所揭示之非人類動物產生的抗體之醫藥組成物，可包括在用於儲存或投藥之容器中，例如小瓶、注射器(例如，IV注射器)或袋(例如，IV袋)中。
具生物活性：係指在生物系統中、活體外或活體內(例如，生物體內)，具有活性之任何試劑的特性。舉例而言，當存在於生物體內時，在該生物體內具有生物學效應之試劑視為具有生物活性。
在特定具體例中，其中蛋白質或多肽具有生物活性，賦予蛋白質或多肽之至少一種生物活性的蛋白質或多肽之一部分典型地被稱為「具生物活性之」部分。
可比較(comparable)：係指二或更多種試劑、實體、情況、條件組等，其可能彼此不一致但足夠相似，以允許在其之間進行比較，使得可根據觀測到的差異或相似性合理地得出結論。在上下文中，一般熟悉本技藝者將理解，在任何給定情況下，認為二種或或更 多種此類試劑、實體、情況、條件組等係可比較的所需要之一致性程度。
保守性：係指描述保守性胺基酸取代，亦即，由具有相似化學性質(例如，電荷或疏水性)之側鏈R基團之另一胺基酸殘基，取代一胺基酸殘基。一般而言，保守性胺基酸取代實質上不會改變蛋白質的所關注功能特性，例如，受體與配位體結合之能力。具有相似化學性質的側鏈之胺基酸群組實例包括：脂族側鏈，諸如甘胺酸、丙胺酸、纈胺酸、白胺酸，以及異白胺酸；脂族羥基側鏈，諸如絲胺酸及蘇胺酸；含醯胺側鏈，諸如天冬醯胺及麩胺醯胺；芳族側鏈，諸如苯丙胺酸、酪胺酸及色胺酸；鹼性側鏈，諸如離胺酸、精胺酸及組胺酸；酸性側鏈，諸如天冬胺酸及麩胺酸；及含硫側鏈，諸如半胱胺酸及甲硫胺酸。保守性胺基酸取代基團包括例如纈胺酸/白胺酸/異白胺酸、苯丙胺酸/酪胺酸、離胺酸/精胺酸、丙胺酸/纈胺酸、麩胺酸/天冬胺酸及天冬醯胺/麩醯胺酸。
在一些具體例中，保守性胺基酸取代可為以丙胺酸取代蛋白質中之任何天然殘基，如用於例如丙胺酸掃描式突變誘發。在一些具體例中，進行保守性取代，其在PAM250對數似然矩陣(PAM250 log-likelihood matrix)中具正值，如Gonnet,G.H.等人，1992,Science 256：1443-1445中所揭示，該文獻以全文引用的方式併入本文中。在一些具體例中，取代為中度保守性取代，其中該取代在PAM250對數似然矩陣中具有非負值。
對照：係指「對照」之本技藝理解含義，其為比較結果的標準。典型地，對照用於藉由分離出變數以便得出關於此類變數之結論來增強實驗中之完整性。在一些具體例中，對照為與測試反應或分析同時進行，以提供比較物之反應或分析。「對照」係可指「對照動物」。「對照動物」可具有如本文所述之修飾、不同於本文所述之修飾，或無修飾(亦即，野生型動物)。在一個實驗中，應用「測試」(亦即，正在測試的變數)。在第二實驗中，不應用「對照」(正在測試的變數)。對照可為陽性對照或陰性對照。
在一些具體例中，對照為歷史性對照(亦即，先前進行之測試或分析之對照，或先前已知的量或結果)。在一些具體例中，對照為或包括列印出或以其他方式保存之記錄。
破壞：係指與DNA分子(例如，與內源性同源序列，諸如基因或基因座)進行同源重組事件之結果。
在一些具體例中，破壞可實現或代表DNA序列之插入、刪去、取代、置換、錯義突變或移框，或其任何組合。插入可包括插入完整基因、基因區段，例如外顯子，其可具有非內源性序列的來源(例如，異源性序列)，或來源於特定所關注基因或自其分離之編碼序列。在一些具體例中，破壞可增加基因或基因產物(例如，由基因編碼之蛋白質)的表現及/或活性。在一些具體例中，破壞可降低基因或基因產物的表現及/或活性。在一些具體例中，破壞可改變基因或所編碼基因產物(例如，所編碼蛋白質)之序列。在一些具體例中，破壞可改變染色體序列或基因組中之染色體位置。在一些具體例中，破壞可截短或片段化基因或所編碼基因產物(例如，所編碼蛋白質)。在一些具體例中，破壞可延伸基因或所編碼基因產物。在一些此類具體例中，破壞可實現融合蛋白之組裝。在一些具體例中，破壞可能影響基因或基因產物之含量，但不影響活性。在一些具體例中，破壞可能影響基因或基因產物之活性，但不影響含量。在一些具體例中，破壞可能對基因或基因產物之含量沒有顯著影響。在一些具體例中，破壞可能對基因或基因產物之活性沒有顯著影響。在一些具體例中，破壞可能對基因或基因產物之含量或活性沒有顯著影響。在一些具體例中，可藉由例如(但不限於)司圖頓t檢驗(Student's T-test)量測顯著影響。
內源性基因座或內源性基因：係指在引入如本文所述之更改、破壞、缺失、插入、修飾、取代或置換之前在親本或參考生物體(或細胞)中發現的基因座。
在一些具體例中，內源性基因座包含在自然界中發現之全部或部分序列。在一些具體例中，內源性基因座為野生型基因座。在一些具體例中，參考生物體為野生型生物體。在一些具體例中，參 考生物體為經改造生物體。在一些具體例中，參考生物體為實驗室培育之生物體(無論為野生型或為經改造的)。
內源性啟動子：係指與內源性基因或基因座天然相關的啟動子，例如在野生型生物體中。
經改造：一般係指經人工操縱之態樣。如一般技術者所理解，經改造多核苷酸或細胞之後代典型地仍被稱為「經改造的」，即使實際操作係對先前實體進行。此外，如熟悉本技藝者將瞭解，可使用多種方法，經由其可實現如本文所述之「改造」。
在一些具體例中，當二或更多個並非以天然順序連接在一起之序列，經人工操縱以在經改造多核苷酸中彼此直接連接時，多核苷酸可視為「經改造」。在一些具體例中，經改造多核苷酸可包含在自然界中發現之調控序列，其與第一編碼序列操作性連接但不與第二編碼序列操作性連接，其藉由人為連接，使其操作性地與第二編碼序列連接。在本文經改造DH基因區段具體例中，DH基因區段經人工操縱以可操作地連接至(例如，側接、相鄰、鄰接、緊鄰)23聚體RSS。在一些具體例中，經改造以可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段來源於另一DH基因區段，例如可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段包含除了歸因於遺傳密碼簡併及/或12聚體RSS經23聚體RSS置換之差異，與另一DH基因區段一致的核苷酸序列。其他DH基因區段及來源於其之經改造DH基因區段(例如，可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段)可視為對應基因區段。舉例而言，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH3-3基因區段可視為對應於在一側由12聚體RSS側接且在另一側由另一12聚體RSS側接之DH3-3基因區段，其中可操作地連接至23聚體RSS之DH3-3基因區段與在一側由12聚體RSS側接且在另一側由另一12聚體RSS側接之DH3-3基因區段共有相同核苷酸序列，除歸因於遺傳密碼簡併及/或二個12聚體RSS中之一者經23聚體RSS置換之差異以外。可替代地或另外，在一些具體例中，各自編碼自然界中彼此不連接之多肽元件或域的第一及第二核酸序列，可在單一經改造多核苷酸中互相連接。相較之下，在一些具 體例中，若細胞或生物體已經操縱，使其遺傳資訊改變(例如，先前未存在之新遺傳物質已經引入，或先前存在之遺傳物質已經改變或移除)，則其可視為「經改造」。
在一些具體例中，「改造」可涉及經由使用經程式化以執行分析或比較之電腦系統來選擇或設計(例如，核酸序列、多肽序列、細胞、組織，及/或生物體)，或以其他方式分析、建議，及/或選擇序列、改變等)。可替代地或另外，在一些具體例中，「改造」可涉及使用活體外化學合成方法，及/或重組核酸技術，例如核酸擴增(例如，經由聚合酶連鎖反應)雜交、突變、轉形、轉染等，及/或多種經控制配對法中之任一者。如熟悉本技藝者將瞭解，多種已建立的此類技術(例如，用於重組DNA、寡核苷酸合成及組織培養及轉形(例如，電穿孔、脂質體轉染等))在此項技藝中熟知，且描述於本說明書通篇引用，及/或討論之各種通用及更特定之參考文獻中。參見例如Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989；其以全文引用的方式併入本文中)。
基因：係指染色體中編碼產物(例如，RNA產物及/或多肽產物)之DNA序列。為了清楚起見，術語「基因」一般係指編碼多肽之核酸的一部分；該術語可視情況地涵蓋調控序列，如一般熟悉本技藝者將由上下文而清楚。此定義並不意欲排除將術語「基因」應用於非蛋白質編碼表現單元，而實際上澄清在大多數情況下，如本文中所使用之術語係指編碼多肽之核酸。
在一些具體例中，基因包括編碼序列(亦即，編碼特定產物之序列)。在一些具體例中，基因包括非編碼序列。在一些具體例中，基因可包括編碼(例如，外顯子)及非編碼(例如，內含子)序列二者。在一些具體例中，基因可包括一或多個調控序列(例如，啟動子、增強子等)，及/或內含子序列，例如，其可控制或影響基因表現之一或多個態樣(例如，細胞類型特異性表現、誘導型表現等)。
異源性：係指來自不同來源之試劑或實體。舉例而言， 當關於存在於特定細胞或生物體中之多肽、基因或基因產物使用時，該術語闡明了相關多肽或其片段、基因或其片段，或基因產物或其片段：(1)藉由人工改造；(2)經由人工(例如，經由遺傳工程)引入至細胞或生物體(或其前驅體)中；及/或(3)並非由相關細胞或生物體(例如，相關細胞類型或生物體類型)天然產生或存在於其中。另一實例包括通常存在於特定天然細胞或生物體中，但已經修飾，例如藉由在非天然相關控制下之突變或置入，且在一些具體例中，非內源性調控元件(例如，啟動子)的多肽或其片段、基因或其片段，或基因產物或其片段。
宿主細胞：係指已引入異源性(例如，外源性)核酸或蛋白質之細胞。技術人員閱讀本揭示內容時將瞭解，此類術語不僅指稱特定個體細胞，亦用於指稱此類細胞之後代。因為由於突變或環境影響可能會在後代中發生某些修飾，所以此類後代實際上可能與親代細胞不一致，但仍包括於術語「宿主細胞」之範疇內。
在一些具體例中，宿主細胞為或包含原核或真核細胞。在一些具體例中，宿主細胞為或包含哺乳動物細胞。一般而言，宿主細胞為適合接受及/或產生異源核酸或蛋白質之任何細胞，不論細胞屬於生命界中的哪一界。例示性細胞包括原核生物及真核生物(單細胞或多細胞)細胞、細菌細胞(例如，大腸桿菌(Escherichia coli)、芽孢桿菌屬(Bacillus spp.)、鏈黴菌屬(Streptomyces spp.)菌株等)、分枝桿菌細胞、真菌細胞、酵母細胞(例如，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、甲醇酵母(Pichia pastoris)、甲醇畢赤酵母(Pichia methanolica)等)、植物細胞、昆蟲細胞(例如，SF-9、SF-21、受桿狀病毒感染之昆蟲細胞、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni)等)、非人類動物細胞、人類細胞或細胞融合物，例如，融合瘤或四倍體。
在一些具體例中，細胞為人類、猴、猿、倉鼠、大鼠或小鼠細胞。在一些具體例中，細胞為真核細胞且選自下列細胞：CHO(如CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS(如COS-7)、視網膜細胞、Vero、CV1、腎細胞(如HEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、海拉(HeLa)、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60、 (e.g.、BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L細胞、C127細胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、塞特利氏細胞(Sertoli cell)、BRL 3A細胞、HT1080細胞、骨髓瘤細胞、腫瘤細胞及衍生自上述細胞之細胞株。在一些具體例中，細胞包含一或多個病毒基因，例如表現病毒基因之視網膜細胞(例如，PER.C6®細胞)。在一些具體例中，宿主細胞為或包含經分離細胞。在一些具體例中，宿主細胞為組織之一部分。在一些具體例中，宿主細胞為生物體之一部分。
人類化：係指來源為非人類且其部分已經對應人類分子之對應部分置換，其方式為使得經修飾(例如，人類化)之分子保留其生物功能及/或保持執行所保留生物功能之結構的分子(例如，核酸、蛋白質等)。相比之下，「人類」及類似者各別地涵蓋僅具有人類來源之分子，例如，人類核苷酸或僅包含人類核苷酸及胺基酸序列之蛋白質。術語「人類(化)」用以反映人類(化)分子可為(a)人類分子或(b)人類化分子。
一致性：與序列比較結合，係指藉由本技藝已知的可用於量測核苷酸及/或胺基酸序列一致性之數種不同演算法而確定的一致性。
在一些具體例中，使用ClustalW v.1.83(慢)比對決定本文所述的一致性，使用10.0之開放空位罰分、0.1之延伸空位罰分，以及使用Gonnet相似度矩陣(MACVECTORTM 10.0.2,MacVector Inc.,2008)。
活體外：係指在人工環境中，例如在試管或反應容器中、在細胞培養物中等，而不是在多細胞生物體內發生之事件。
活體內：係指在多細胞生物體，例如人類及/或非人類動物內發生之事件。在基於細胞之系統的上下文中，該術語可以用於指稱在活細胞內發生之事件(例如，與活體外系統相反)。
經分離的：係指物質及/或實體(1)與最初產生時(無論在自然界中及/或在實驗環境中)，與之結合的至少一些成分分離，及/或(2)藉由人工設計、產生、製備，及/或製造。經分離物質及/或實體可與最 初結合之約10種或更多種其他成分分離。在一些具體例中，經分離試劑至少約80%純或更純。若物質實質上不含其他成分，則該物質為「純的」。在一些具體例中，如熟悉本技藝者將理解，物質在與某些其他成分，例如，一或多種載劑或賦形劑(例如，緩衝液、溶劑、水等)組合後，仍可被視為「經分離的」或甚至「純的」；在此類具體例中，物質的百分比或純度之計算不包括此類載劑或賦形劑。
僅給出一個實例，在一些具體例中，天然存在之生物聚合物(諸如多肽或多核苷酸)在以下情況時視為「經分離的」：(a)藉助於其來源或衍生來源並非與自然狀態下其伴隨成分之一些或全部相關；(b)其實質上不含與自然界中產生其之物種相同的物種之其他多肽或核酸；或(c)由並非天然產生其之物種的細胞或其他表現系統之成分表現，或以其他方式相關。因此，舉例而言，在一些具體例中，經化學合成或於製造其之天然細胞系統不同之系統中合成之多肽視為「經分離」多肽。可替代地或另外，在一些具體例中，進行一或多種純化技術之多肽可視為「經分離」多肽，其某種程度上與其他成分分離：a)天然與之結合者；及/或b)最初製造時與之結合者。
非人類動物：係指非人類之任何脊椎動物生物體。
在一些具體例中，非人動物為圓口類動物(cyclostome)、硬骨魚、軟骨魚(例如鯊魚或鱝(ray))、兩棲動物、爬蟲動物、哺乳動物及鳥。在一些具體例中，非人類哺乳動物為靈長類動物、山羊、綿羊、豬、狗、牛或嚙齒動物。在一些具體例中，非人類動物為嚙齒動物，諸如大鼠或小鼠。
核酸：在其最廣泛的意義上，係指併入或可併入至寡核苷酸鏈中之任何化合物及/或物質，且一般可與核酸分子、核酸序列、核苷酸分子、核苷酸分子互換，該等術語亦可彼此互換。
在一些具體例中，「核酸」為化合物及/或物質，其係或可經由磷酸二酯鍵併入至寡核苷酸鏈中。如自上下文可清楚地看出，在一些具體例中，「核酸」係指個別核酸殘基(例如，核苷酸及/或核苷)；在一些具體例中，「核酸」係指包含個別核酸殘基之寡核苷酸鏈。在一 些具體例中，「核酸」為或包含RNA；在一些具體例中，「核酸」為或包含DNA。在一些具體例中，「核酸」為、包含一或多個天然核酸殘基或由一或多個天然核酸殘基組成。在一些具體例中，「核酸」為、包含一或多個核酸類似物或由一或多個核酸類似物組成。在一些具體例中，核酸類似物與「核酸」之不同之處在於其不利用磷酸二酯骨架。舉例而言，在一些具體例中，「核酸」為、包含一或多個「肽核酸」或由一或多個「肽核酸」組成，其為本技藝已知且在骨架中具有肽鍵，而非磷酸二酯鍵，視為在本發明之範疇內。可替代地或另外，在一些具體例中，「核酸」具有一或多個硫代磷酸酯，及/或5'-N-胺基磷酸酯鍵，而非磷酸二酯鍵。在一些具體例中，「核酸」為、包含一或多個天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、去氧腺苷、去氧胸苷、去氧鳥苷及去氧胞苷)或由一或多個天然核苷組成。在一些具體例中，「核酸」為、包含一或多個核苷類似物(例如，2-胺基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-胺基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-胺基腺苷、7-去氮腺苷、7-去氮鳥苷、8-側氧基腺苷、8-側氧基鳥苷，O(6)-甲基鳥嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化鹼基、嵌入性鹼基，及其組合)或由一或多個核苷類似物組成。在一些具體例中，與天然核酸中者相較，「核酸」包含一或多個經修飾醣類(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-去氧核糖、阿拉伯糖及己醣)。在一些具體例中，「核酸」具有核苷酸序列，其編碼功能性基因產物，諸如RNA或蛋白質。在一些具體例中，「核酸」具有核苷酸序列，其編碼多肽片段(例如，肽)。在一些具體例中，「核酸」包括一或多個內含子。在一些具體例中，「核酸」包括一或多個外顯子。在一些具體例中，「核酸」包括一或多個編碼序列。在一些具體例中，「核酸」係藉由將一或多種自天然來源分離、酶合成之分離物製備，該合成係以互補性模板之聚合反應(活體內或活體外)、重組細胞或系統之複製，以及化學合成為基礎。在一些具體例中，「核酸」長度為至少3或較多個殘基。在一些具體例中，「核酸」為單股；在一些具體例中，「核 酸」為雙股。在一些具體例中，「核酸」具有核苷酸序列，其包含至少一個元件，其編碼多肽或其片段，或為編碼多肽或其片段之序列之互補序列。在一些具體例中，「核酸」具酶活性。
可操作地連接：係指其中所描述之成分處於允許其以其預期方式起作用之關係的併接。
在一些具體例中，可操作地連接之核苷酸序列彼此相鄰，例如包含可操作地連接至RSS之免疫球蛋白基因區段的核酸序列包含與RSS核苷酸序列相鄰之免疫球蛋白基因區段核苷酸序列，例如免疫球蛋白基因區段至少在一側由RSS核苷酸序列以相鄰方式側接(例如，鄰接)，使得免疫球蛋白基因區段緊鄰RSS核苷酸序列。
在其他具體例中，可操作連接不需要相鄰。舉例而言，彼此「可操作地連接」之未經重排可變區基因區段能夠進行重排，以形成經重排可變區基因，該等未經重排可變區基因區段可能未必彼此相鄰。彼此可操作地連接之未經重排可變區基因區段能夠進行重排，以形成與恆定區基因結合，以抗原結合蛋白之多肽鏈形式表現的經重排可變區基因。控制序列「可操作地連接」至編碼序列，係以編碼序列之表現係於可與控制序列相容之條件下達成之方式連接。「可操作地連接」之序列包括表現控制序列(其與所關注基因相鄰)，及表現控制序列(其反式或遠距離起作用，以控制所關注基因)二者。
術語「表現控制序列」係指多核苷酸序列，其為影響與其所連接之編碼序列之表現及加工所必需的。「表現控制序列」包括：適當轉錄起始、終止、啟動子及強化子序列；有效RNA加工信號，諸如剪接及多腺苷酸化信號；使細胞質mRNA穩定之序列；提高轉譯效率之序列(亦即，科紮克共同序列(Kozak consensus sequence))；增強蛋白質穩定性之序列；以及當需要時，增強蛋白質分泌之序列。此類控制序列之性質視宿主生物體而不同。舉例而言，在原核生物中，此類控制序列一般包括啟動子、核糖體結合位點及轉錄終止序列，而在真核生物中，此類控制序列典型地包括啟動子及轉錄終止序列。術語「控 制序列」意欲包括其存在對於表現及加工而言必不可少的成分，且亦可包括其存在有利之額外成分，例如前導序列及融合夥伴序列。
一般而言，各未經重排免疫球蛋白V基因區段、D基因區段或J基因區段可操作地連接至(例如，締合、在一側或二側側接、鄰接等)重組信號序列(RSS)，其可為12聚體RSS或23聚體RSS。在每一側由RSS側接之任何基因區段(包括可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段)尚未經歷重組，且因此，可視為「未經重排」基因區段。在一些具體例中，本文之未經重排基因區段可包含呈其生殖系(例如，野生型)組構之基因區段，例如各自在二側由23聚體RSS側接之生殖系VH基因區段及生殖系JH基因區段。對比而言，生殖系DH基因區段，例如未經重排DH基因區段，在每一側由12聚體RSS側接。可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段，例如經改造DH基因區段，亦尚未經歷重組，且因此，包含(i)23聚體RSS及(ii)12聚體RSS。根據12/23重組規則，經改造DH基因區段(例如，可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段)能夠用與12聚體RSS可操作地連接之另一DH基因區段進行重排。
生理條件：係指在此項技藝中理解之參考細胞或生物體生存及/或再生之條件的含義。在一些具體例中，該術語係指可在自然界中存在之用於生物體或細胞系統之外部或內部環境條件。在一些具體例中，生理條件為存在於人類或非人類動物體內之條件，尤其存在於手術部位處及/或手術部位內之條件。生理條件典型地包括，例如，溫度範圍20-40℃、1大氣壓、pH 6-8、葡萄糖濃度1-20mM、常壓水準下之氧濃度，及如在地球上遇到之重力。在一些具體例中，實驗室中之條件經操縱及/或維持於生理條件下。在一些具體例中，生理條件在生物體(例如，非人類動物)中遇到。
多肽：係指胺基酸之任何聚合鏈。
在一些具體例中，多肽具有自然界中存在之胺基酸序列。在一些具體例中，多肽具有自然界不存在之胺基酸序列。在一些具體例中，多肽具有胺基酸序列，其含有在自然界中彼此分開出現之 部分(亦即，來自兩種或更多種不同生物體，例如人類及非人類部分)。在一些具體例中，多肽具有經改造胺基酸序列，因為其經由人工操作設計及/或產生。在一些具體例中，多肽可包含複數個片段或由複數個片段組成，其各自在同一親本多肽中以相對於所關注多肽中所發現之彼此不同的空間排列形式發現(例如，在親本中直接連接之片段可在所關注多肽中中經空間分離或反過來，且/或片段可以與在親本中之不同順序存在於所關注多肽中)，使得所關注多肽為其親本多肽之衍生物。
重組：係指經由重組方式設計、改造、製備、表現、創造或分離之多肽，諸如使用重組表現載體轉染至宿主細胞中而表現的多肽、分離自重組型組合式人類多肽庫之多肽(Hoogenboom H.R.,1997 TIB Tech.15：62-70；Hoogenboom H.及Chames P.,2000,Immunology Today 21：371-378；Azzazy H.及Highsmith W.E.,2002,Clin.Biochem.35：425-445；Gavilondo J.V.及Larrick J.W.,2002,BioTechniques 29：128-145)、自轉殖人類免疫球蛋白基因之動物(例如，小鼠)分離之抗體(參見例如Taylor,L.D.等人，1992,Nucl.Acids Res.20：6287-6295；Little M.等人，2000,Immunology Today 21：364-370；Kellermann S.A.及Green L.L.,2002,Current Opinion in Biotechnology 13：593-597；Murphy,A.J.等人，2014,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.111(14)：5153-5158；其各自以全文引用的方式併入本文中)，或藉由以涉及將所選序列元件彼此剪接之任何其他方式製備、表現、產生或分離的多肽。
在一些具體例中，在自然界中發現此類所選序列元件中之一或多者。在一些具體例中，此類所選序列元件中之一或多者經電腦設計。在一些具體例中，此類所選序列元件中之一或多者來自已知序列元件之突變誘發(例如，活體內或活體外)的結果，例如來自天然或合成來源。舉例而言，在一些具體例中，重組多肽包含所關注之來源生物體(例如，人類、小鼠等)之基因組(或多肽)中發現的序列。在一些具體例中，重組多肽包含在自然界中在兩種不同生物體(例如，人類及非人類生物體)中彼此分開出現之序列(亦即，來自兩種或更多種不同生 物體，例如人類及非人類部分)。在一些具體例中，重組多肽具有由突變誘發產生之胺基酸序列(例如，活體外或活體內，例如，在非人類動物中)，使得重組多肽之胺基酸序列儘管源自且相關於多肽序列，但可不天然存在於非人類動物活體內之基因組中。
參考：係指標準或對照試劑、動物、群組、個體、群體、樣本、序列或值，所關注之試劑、動物、群組、個體、群體、樣本、序列或值與其進行比較。「參考」係可指「參考動物」。「參考動物」可具有如本文所述之修飾、不同於本文所述之修飾，或無修飾(亦即，野生型動物)。典型地，如熟悉本技藝者將理解，參考試劑、動物、群組、個體、群體、樣本、序列或值，係在測定或表徵所關注試劑、動物(例如，哺乳動物)、群組、個體、群體、樣本、序列或值所利用之可比條件下，測定或表徵。
在一些具體例中，參考試劑、動物、群組、個體、群體、樣本、序列或值，與所關注試劑、動物、群組、個體、群體、樣本、序列或值之測試或測定，實質上同時測試及/或測定。在一些具體例中，參考試劑、動物、群組、個體、群體、樣本、序列或值，為歷史參考，視情況地在有形媒體中體現。在一些具體例中，參考係可指對照。
實質上：係指展現總或接近總範圍或程度之之所關注特徵或特性之定性條件。生物技術中之一般技術者將理解，生物及化學現象很少(若曾有)進行完全及/或繼續進行至完全或很少達成或避免絕對結果。因此，術語「實質上」用於獲得諸多生物及化學現象中固有的完全性之可能缺乏。
實質上同源性：係指胺基酸或核酸序列之間的比較。如一般熟悉本技藝者將瞭解，若兩個序列在相對應位置含有同源殘基，則其大體上視為「實質上同源」。同源殘基可為一致殘基。替代地，同源殘基可為具有適當類似之結構及/或功能特性之不一致殘基。舉例而言，如一般熟悉本技藝者所熟知的，某些胺基酸典型地分類為「疏水性」或「親水性」胺基酸，及/或具有「極性」或「非極性」側鏈。將 一種胺基酸取代為另一種相同類型之胺基酸可通常視為「同源」取代。典型胺基酸分類摘概述於以下。
Figure 108120728-A0202-12-0049-1
如此項技藝中所熟知，胺基酸或核酸序列可使用多種演算法中之任一種進行比較，包括市售電腦程式中可用者，諸如用於核 苷酸序列之BLASTN，及用於胺基酸序列之BLASTP、有間隙BLAST及PSI-BLAST。例示性此類程式描述於Altschul,S.F.等人，1990,J.Mol.Biol.,215(3)：403-410；Altschul,S.F.等人，1996,Methods in Enzymol.266：460-80；Altschul,S.F.等人，1997,Nucleic Acids Res.,25：3389-402；Baxevanis,A.D.及B.F.F.Ouellette(編)Bioinformatics：A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins,Wiley,1998；及Misener等人(編)Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology，第132卷)，Humana Press,1998。除了鑑別同源序列之外，上文所提及之程式典型地提供同源性程度之指示。
在一些具體例中，若二個序列之對應殘基之至少95%或更多在殘基相關延伸(stretch)上同源，則該等序列視為實質上同源。在一些具體例中，相關延伸為完整序列。在一些具體例中，相關延伸為至少9個或更多個殘基。在一些具體例中，相關延伸包括沿完整序列之連續殘基。在一些具體例中，相關延伸包括沿完整序列之不連續殘基，例如，藉由多肽或其一部分之摺疊構形聚集在一起的非連續殘基。在一些具體例中，相關延伸為至少10個或更多個殘基。
實質上一致性：係指胺基酸或核酸序列之間的比較。如一般熟悉本技藝者將瞭解，若兩個序列在相對應位置含有一致殘基，則其大體上視為「實質上一致」。如此項技藝中所熟知，胺基酸或核酸序列可使用多種演算法中之任一種進行比較，包括市售電腦程式中可用者，諸如用於核苷酸序列之BLASTN，及用於胺基酸序列之BLASTP、有間隙BLAST及PSI-BLAST。例示性此類程式描述於Altschul,S.F.等人，1990,J.Mol.Biol.,215(3)：403-410；Altschul,S.F.等人，1996,Methods in Enzymol.266：460-80；Altschul,S.F.等人，1997,Nucleic Acids Res.,25：3389-3402；Baxevanis,A.D.及B.F.F.Ouellette(編)Bioinformatics：A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins,Wiley,1998；及Misener等人(編)Bioinformatics Methods and Protocols(Methods in Molecular Biology，第132卷)，Humana Press, 1998.除了識別一致序列之外，上文所提及之程式通常提供一致性程度之指示。
在一些具體例中，若兩個序列之對應殘基之至少95%或更多在殘基相關延伸上一致，則其視為實質上一致。在一些具體例中，相關延伸為完整序列。在一些具體例中，相關延伸為至少10個或更多個殘基。
靶向載體或靶向構築體：係指包含靶向區之多核苷酸分子。靶向區包含與靶細胞、組織或動物中之序列一致或實質上一致的序列，且經由同源重組將該靶向構築體整合至該細胞、組織或動物基因組內之位置。亦包括使用位點特異性重組酶識別位點(例如，loxP或Frt位點)靶向的靶向區。
在一些具體例中，如本文所述之靶向構築體進一步包含尤其受關注之核酸序列或基因、可選標記物、控制及/或調控序列，及允許經由外源添加蛋白質重組介導之其他核酸序列，該等蛋白質幫助或促進涉及此類序列之重組。在一些具體例中，如本文所述之靶向構築體進一步包含全部或部分所關注基因，其中該所關注基因為編碼全部或部分多肽之異源性基因，該多肽具有與由內源性序列編碼之蛋白質相似的功能。在一些具體例中，如本文所述之靶向構築體進一步包含全部或部分的所關注人類化基因，其中所關注人類化基因編碼全部或部分多肽，該多肽具有與由內源性序列編碼之多肽相似的功能。在一些具體例中，靶向構築體(或靶向載體)可包含經人工操縱之核酸序列。舉例而言，在一些具體例中，靶向構築體(或靶向載體)可經構築以含有經改造或重組多核苷酸，其含有二或更多個序列，該等序列在自然界中不以該順序連接在一起，而經人工操縱，以使在經改造或重組多核苷酸中彼此直接連接。
轉殖基因或轉殖基因構築體：係指藉由人工，諸如藉由本文所述之方法引入至細胞中之核酸序列(其編碼例如全部或部分所關注多肽)。轉殖基因相對於其引入之基因轉殖動物或細胞而言，可為部分或完全異源性，亦即外來的。轉殖基因可包括一或多種轉錄調控 序列及任何其他核酸，諸如內含子或啟動子，其可為表現選定核酸序列所必需的。轉殖基因可包括一或多種可選標記物，其允許對吸收轉殖基因之後代(例如，細胞)進行後續選擇。
基因轉殖動物、基因轉殖非人類動物或Tg + ：在本文中可互換使用，且係指任何非天然存在之非人類動物，其中非人類動物細胞中之一或多者含有編碼全部或部分所關注多肽之異源性核酸及/或基因。
在一些具體例中，異源性核酸序列及/或基因直接或間接地藉由有意的基因操控，諸如藉由顯微注射或藉由用重組病毒感染，引入前驅細胞中而引入細胞中。術語基因操控不包括典型育種技術，而實際上係關於重組DNA分子之引入。該分子可整合在染色體內，或其可為染色體外複製DNA。術語「Tg+」包括就異源核酸及/或基因而言為異型接合或同型接合的動物，及/或具有異源核酸及/或基因之單複本或多複本的動物。
載體：係指能夠輸送另一核酸至與其結合者之核酸分子。
在一些具體例中，載體能夠在宿主細胞(諸如真核及/或原核細胞)中進行與其連接之核酸的染色體外複製及/或表現。能夠引導可操作地連接之基因表現的載體，在本文中稱為「表現載體。」
野生型：係指具有在自然界中在「正常」(相對於突變、患病、改造、改變等)狀態或情況下，所發現的結構及/或活性的實體。一般熟悉本技藝者將瞭解，野生型基因及多肽通常以多種不同形式(例如，對偶基因)存在。
本發明之其他特徵、目標及優點在下文一些具體例之實施方式中顯而易見。然而，應理解，實施方式雖然指示本發明之一些具體例，但僅以說明而非限制之方式給出。對於熟悉本技藝者而言，在本發明之範疇內的各種改變及修改將自實施方式而變得顯而易見。
特定具體例之詳細說明
本發明提供尤其基因轉殖或經改造非人類動物，其具有編碼人類免疫球蛋白之一或多個部分(功能片段、結合部分等)之異源遺傳物質，該異源遺傳物質經插入至免疫球蛋白重鏈可變區基因座中，使得異源遺傳物質與重鏈恆定(CH)基因可操作地連接。預期此類非人類動物展現產生由經重排V(DD)J序列編碼之抗體的能力。亦預期此類非人類動物展現抗體群，其特徵在於相比於具有由野生型免疫球蛋白重鏈可變區基因座(或自然界中出現之免疫球蛋白重鏈可變區基因座)產生之免疫球蛋白重鏈可變CDR3多樣性的抗體群，重鏈可變區之CDR3多樣性增加。因此，所提供之非人類動物尤其適用於開發基於抗體之治療劑，其結合特定抗原，尤其與低及/或不良免疫原性相關之抗原，或特徵在於對由傳統(或野生型)抗體結合不利之一或多種表位的抗原。特定而言，本發明涵蓋引入與免疫球蛋白重鏈可變區中DH區之一或多個DH區段(例如，其5'或3')相鄰之23聚體重組信號序列，產生在VDJ重組期間進行DH至DH區段重排之能力，及表現具有重鏈可變區及尤其CDR3區之抗體，該等區之特徵可為相比於由涉及單一DH區段之VDJ重組產生之抗體，胺基酸長度較長。此類基因轉殖非人類動物提供活體內系統，其用於鑑別及開發結合超出現有藥物發現技術之靶向能力之疾病標靶的抗體及/或基於抗體之治療劑。此外，此類基因轉殖非人類動物提供動物模式系統，其適用於開發以以下為中心或針對以下設計的抗體及/或基於抗體之治療劑：干擾對影響人類之各種疾病及/或疾病病理學至關重要的蛋白質-蛋白質相互作用。
如圖1上圖所示，免疫球蛋白基因區段之間的重組遵循通常被稱作12/23規則的規則，其中由重組信號序列(RSS)側接之基因區段藉由有序過程接合。每一RSS由以下組成：七個核苷酸之保守區塊(block)(七聚體；5'-CACAGTG-3'；SEQ ID NO：144)，其與編碼序列(例如，VH、DH或JH區段)相鄰，之後的長度為12bp或23bp之被稱為間隔區的非保守區，及九個核苷酸之第二保守區塊(九聚體；5'-ACAAAAACC-3'；SEQ ID NO：145)。間隔區之序列可改變，但其保守長度對應於一或二匝(turn)DNA雙螺旋。此將七聚體及九聚體序列 帶至DNA螺旋之同一側，其中該等序列可由催化重組之蛋白質複合物結合。具有23bp間隔區之RSS為23聚體RSS且具有12bp間隔區之RSS為12聚體RSS。儘管已報導例外，但12/23重組規則一般促進12聚體RSS與23聚體RSS之間的重組，且阻止23聚體RSS與另一23聚體RSS之間的重組，或12聚體RSS與另一12聚體RSS之間的重組，例如阻止直接生殖系VH至生殖系JH重組(亦即，23聚體至23聚體接合)，或生殖系DH-生殖系DH重組(亦即，12聚體至12聚體接合)。
在一些具體例中，如本文所述之非人類動物包含免疫球蛋白重鏈可變區，其含有經改造多樣性簇(亦即，經改造DH區)，該多樣性簇之特徵在於存在各自可操作地連接至23聚體，且因此能夠進行DH-DH重組之一或多個DH區段。在一些具體例中，含有由此類重組產生之CDR3之抗體的特徵可為由較長胺基酸長度產生，用於引導與特定抗原(例如，病毒、膜通道等)結合之多樣性增加。在一些具體例中，本文所述之非人類動物包含人類重鏈可變(VH)及接合(JH)基因區段，其與經改造DH區可操作地連接，使得在該VH、JH及多於一個DH區段之間發生VDJ重組，以產生結合所關注抗原之重鏈可變區。在一些具體例中，相比於參考免疫球蛋白重鏈可變區基因座，如本文所述之經改造DH區含有一或多個(例如，1、2、3、4、5、10或更多)經改造以允許(或促進)以提高之頻率進行DH至DH重組的人類DH區段。在一些具體例中，如本文所述之非人類動物包含可操作地連接至一或多個DH區段之複數個VH及JH基因區段，其各自可操作地連接至非人類動物基因組中免疫球蛋白重鏈可變區處之23聚體重組信號序列(RSS)。在許多具體例中，VH及JH區段為人類VH及人類JH基因區段。
在一些具體例中，如本文所述之非人類動物進一步包含人類或人類化免疫球蛋白輕鏈基因座(例如，κ及/或λ)，使得非人類動物產生包含人類可變區(亦即，重及輕)及非人類恆定區之抗體。在一些具體例中，該人類或人類化免疫球蛋白輕鏈基因座包含可操作地連接至嚙齒動物輕鏈恆定區(例如，嚙齒動物Cκ或Cλ)之人類VL及JL基因區段。在一些具體例中，本文所述之非人類動物進一步包含如以下中 所描述之免疫球蛋白輕鏈基因座：美國專利第9,796,788號；第9,969,814號；美國專利申請公開案第2011/0195454 A1號、第2012/0021409 A1號、第2012/0192300 A1號、第2013/0045492 A1號、第2013/0185821 A1號、第2013/0302836 A1號、第2018/0125043號；國際專利申請公開案第WO 2011/097603號、第WO 2012/148873號、第WO 2013/134263號、第WO 2013/184761號、第WO 2014/160179號、第WO 2014/160202號；及第WO2019/113065號該等專利中之每一者以全文引用的方式併入本文中)。
本發明之各種態樣詳細描述於以下章節中。章節之使用不意謂對本文所述之具體例進行限制。每一章節可適用於本文所述之任何態樣或具體例。在本申請案中，除非另有說明，否則使用「或」意謂「及/或」。
VDJ重組
負責免疫球蛋白合成之基因見於動物之所有細胞中且佈置於基因區段中，其沿染色體依序定位。遺傳性人類基因區段之組構，例如人類基因區段之生殖系組構，例如人類生殖系基因組(例如，向下傳遞至下一代之基因組)中之人類基因區段的次序，可見於Lefranc,M.-P.,Exp.Clin.Immunogenet.,18,100-116(2001)，該文獻以全文引用的方式併入本文中，其亦展示見於人類免疫球蛋白重鏈基因座內，呈生殖系組構之功能性基因區段及偽基因。一系列重組事件(涉及數種遺傳成分)用以自基因區段(例如，V、D及J)之有序排列組裝免疫球蛋白。已知基因區段之此組裝不精確，且因此免疫球蛋白多樣性藉由不同基因區段之組合及經由不精確接合形成獨特接合部二者來達成。另外的多樣性經由被稱為體細胞超突變之過程產生，在該過程中，免疫球蛋白之可變區序列經改變以提高對抗原之親和力及特異性。免疫球蛋白分子為Y形多肽，該多肽由兩條相同重鏈及兩條相同輕鏈構成，其各自具有兩個結構性成分：一個可變域及一個恆定域。重鏈及輕鏈之可變域藉由基因區段之組裝形成，而恆定域經由RNA剪接融合 至可變域。儘管對於重鏈及輕鏈而言，組裝(或接合)基因區段之機制類似，但對於輕鏈，僅需要一個接合事件(亦即，V至J)，而對於重鏈，需要二個(亦即，D至J及V至DJ)。
重鏈及輕鏈可變區之基因區段組裝(分別稱為VDJ重組及VJ重組)由側接各基因區段，稱為重組信號序列(RSS)之保守非編碼DNA序列引導，其確保DNA重排處於相對於V、D及J編碼序列之精確位置(參見例如Ramsden,D.A.等人，1994,Nuc.Acids Res.22(10)：1785-96；該文獻以全文引用的方式併入本文中)。如熟悉本技藝者所理解之重鏈基因區段之VDJ重組中所涉及之序列的代表性示意圖記載於圖1中。每一RSS由以下組成：七個核苷酸之保守區塊(七聚體)，其與編碼序列(例如，V、D或J區段)相鄰，之後的間隔區(12bp或23bp)，及九個核苷酸之第二保守區塊(九聚體)。儘管在個體中容許12bp或23Bp間隔區之相當大的序列分異度，但此等序列之長度典型地不改變。免疫球蛋白基因區段之間的重組遵循通常被稱作12/23規則之規則，其中由具有12bp間隔區(或12聚體)之RSS側接的基因區段典型地接合至由23bp間隔區(或23聚體)側接之基因區段(參見例如Hiom,K.及M.Gellert,1998,Mol.Cell.1(7)：1011-9；其以全文引用的方式併入本文中)。已報導RSS之序列影響與特定基因區段重組之效率及/或頻率(參見例如Ramsden,D.A及G.E.Wu,1991,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88：10721-5；Boubnov,N.V.等人，1995,Nuc.Acids Res.23：1060-7；Ezekiel,U.R.等人，1995,Immunity 2：381-9；Sadofsky,M.等人，1995,Genes Dev.9：2193-9；Cuomo,C.A.等人，1996,Mol.Cell Biol.16：5683-90；Ramsden,D.A.等人，1996,EMBO J 15：3197-3206；該等文獻中之每一者以全文引用的方式併入本文中)。實際上，許多報導指出個體中基因區段，尤其DH區段之高度偏向且可變的使用情況。除非另外指示或除非對一般熟悉本技藝者顯而易見將產生矛盾或不一致性，否則未參考RSS之未經重排基因區段假定為包含與該基因區段天然相關，例如側接、可操作地連接等之二個RSS。在一些具體例中，本文之未經重排基因區段可包含呈其生殖系(例如，野生型)組構之基因區 段，例如各自在二側由23聚體RSS側接之生殖系VH基因區段及生殖系JH基因區段。對比而言，生殖系DH基因區段，例如未經重排DH基因區段，在每一側由12聚體RSS側接。
如此，未經重排基因區段亦可指呈其生殖系組構之基因區段，包括與此類生殖系組構相關之任何RSS。此外，呈其生殖系組構之複數個基因區段一般不僅係指呈其生殖系(例如，未經重排)組構之每一個別基因區段，而且係指功能性基因區段之次序及/或位置。參見例如Lefranc,M.-P.,Exp.Clin.Immunogenet.,18,100-116(2001)；其以全文引用的方式併入本文中，用於獲得人類V、D及J基因區段之生殖系組構。
形成重鏈及輕鏈可變區之基因區段之組裝引起免疫球蛋白抗原結合區(或位點)的形成。此類抗原結合區之特徵部分在於存在高變區，其通常被稱作互補決定區(CDR)。對於重鏈及輕鏈二者，均存在三個CDR(亦即，總共六個CDR)，其中CDR1及CDR2二者完全由V基因區段編碼。然而，CDR3由接合輕鏈之V及J區段，及重鏈之V、D及J區段產生的序列編碼。因此，在重組期間採用以形成重鏈可變區編碼序列之額外基因區段顯著增加重鏈抗原結合位點之多樣性。因此，含有如本文所述之經改造DH區之所提供的非人類動物產生CDR3多樣性，其特徵在於DH至DH重組，且相比於由傳統VDJ重組產生之重鏈可變區之CDR3區，胺基酸長度增加。
在不受理論束縛之情況下，認為重鏈CDR3譜系中另外的多樣性經由增加形成經重排重鏈可變區基因序列之接合部之數目及/或增加CDR3區長度可為可能的。增加接合部之數目及/或增加CDR3區長度之一種機制可為經由在DH-DH重組事件中將第一DH區段(其可一般稱為DH「A」)接合至另一DH區段(其可一般稱為DH「B」)，隨後進行後續DH-JH及V-DHJH重組事件，得到VH(DHA-DHB)JH基因序列。長期認為自然界中DH-DH重組事件受12/23規則阻止(Alt,F.W.等人，1984,EMBO J.3(6)：1209-19；其以全文引用的方式併入本文中)。然而，似乎DH-DH重組事件確實違反12/23規則，在人類中以極低頻率發生， (800分之1，或約0.125%初始B細胞；參見例如Ollier,P.J.等人1985,EMBO J.4(13B)：3681-88；Milner,E.C.B.等人1986,Immunol.Today 7：36-40；Liu,Z.等人，1987,Nucleic Acids Res.15(11)：4688；Liu,Z.等人，1987,Nucleic Acids Res.15(15)：6296；Meek,K.D.等人，1989,J.Exp.Med.169(2)：519-33；Meek,K.D.等人，1989,J.Exp.Med.170：39-57；Baskin,B.等人1998,Clin.Exp.Immunol.112：44-7；Briney,B.S.等人，2012 Immunol.137：56-64；該等文獻中之每一者以全文引用的方式併入本文中)，且被認為係產生在一些重鏈中所觀測到之不尋常地長的CDR3之主要機制(Janeway's Immunobiology.第9版.Kenneth Murphy,Casey Weaver.第5章，2017；以全文引用的方式併入)。然而，一些潛在治療性標靶(例如(但不限於)病毒、細胞表面受體、IV型跨膜蛋白(如GPCR、離子通道))具有經掩蔽或凹入之表位，其為普通抗體不可接近的，但可由具有長HCDR3序列之抗體識別。舉例而言，具有極長HCDR3之抗體通常見於患有慢性病毒感染之患者體內，且在一些情況下具有廣譜中和活性(例如針對HIV-1或流感之廣譜中和抗體)。為選擇能夠到達此等隱藏表位之抗體，提高具有極長HCDR3之重鏈的頻率將為適用的。不希望受理論束縛，達成此之一種方式為藉由改造DH區段以包含23聚體RSS來提高重鏈VH(DHA-DHB)JH重排頻率，及/或提高DH基因區段重組至較長JH6基因區段之頻率。在小鼠中，DH-JH接合被認為以二個有序步驟發生：(1)近端DQ52區段(在人類中被稱作DH7-27)一級重排至最接近之JH區段(JH1或JH2)中之一者。DQ52上游之強力μ0啟動子隨後使其餘的JH區段(JH3及JH4)更易於由重組活化基因(RAG)接近；(2)遠端DH區段二級重排至其餘的JH區段(JH3或JH4)中之一者。參見圖1上圖。此與小鼠(JH3-JH4)及人類(JH4-JH6)二者中所觀測到之下游JH區段之較頻繁使用情況一致(Nitschke等人2001 J.Immunol.166：2540-52，以全文引用的方式併入本文中)。不希望受理論束縛，假設將DH7-27及JH1-JH3(或JH1-JH5)用具有5' 23聚體RSS及3' 12聚體RSS之合成DH基因(例如，合成DH3-3區段)置換，將引起高頻率之VH(DH-DH)JH重組，且可藉由三步驟機制發生：(1)23-DH-12重排至 JH4、JH5或JH6，以得到23(DH)JH，(2)遠端DH(DH1-1至DH1-26)重排至23(DH)JH，以得到12(DH-DH)JH(VH重排至23(DH)JH將受12/23規則禁止)，(3)VH至12(DH-DH)JH重排，以得到編碼免疫球蛋白重鏈可變域之VDDJ編碼序列。參見例如圖1下圖。亦假設將DH2-2、DH2-8及DH2-15基因區段(其為長DH基因區段(包含編碼二個半胱胺酸之多於31個核苷酸，半胱胺酸形成可形成被認為使長HCDR3區穩定之雙硫鍵[參見例如Wang等人2013 Cell 153：1379-93，以全文引用的方式併入本文中])分別用可操作地連接至5'端12聚體RSS及3'端23聚體RSS之彼等基因區段置換，亦將引起高頻率之VH(DH-DH)JH重組，其可藉由三步驟機制發生：(1)12：DH-12重排至JH4、JH5或JH6，以得到12(DH)JH，(2)遠端12：DH2-2：23、12：DH2-8：23或12：DH2-15-23重排至12(DH)JH，以得到12(DH-DH)JH，及(3)VH至12(DH-DH)JH重排，以得到編碼免疫球蛋白重鏈可變域之VDDJ編碼序列。如本文所述，經改造DH區藉由將23聚體間隔區置放在與一或多個DH區段之5'或3'側接位置相鄰來構築，藉此使得在人類化免疫球蛋白重鏈可變區基因座中能夠進行DH至DH重組。
在一些具體例中，相比於參考非人類動物，本文所述之非人類動物包含展現不遵循12/23規則之VDJ重組的免疫球蛋白重鏈可變區基因座。在一些具體例中，本文所述之非人類動物包含一或多個RSS，其鄰接或側接相比於野生型DH區段經修飾之一或多個DH區段。在一些具體例中，如本文所述之非人類動物之免疫球蛋白重鏈可變區的一或多個DH基因區段各自可操作地連接至5'或3' 23聚體RSS，使得相比於參考非人類動物，在該非人類動物中DH-DH重組之頻率提高。重組效率及/或頻率可在一些具體例中由抗體序列群中基因區段之使用頻率確定(例如，抗體序列來自個體或個體之群組；參見例如Arnaout,R.等人，2011,PLoS One 6(8)：e22365；Glanville,J.等人，2011,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.108(50)：20066-71；該等文獻中之每一者以全文引用的方式併入本文中)。因此，本文所述之非人類動物可在一些具體例中包含一或多個DH區段，其各自可操作地連接至23聚體RSS 或由其側接，使得相比於參考非人類動物中之DH-DH重組，以提高之頻率發生DH-DH重組。在一些具體例中，相比於參考非人類動物中之DH-DH重組，包含如本文所述之經改造DH區之嚙齒動物展現DH-DH重組之頻率提高至少3倍。在一些具體例中，相比於參考非人類動物中之DH-DH重組，包含如本文所述之經改造DH區之嚙齒動物展現DH-DH重組之頻率提高至少4倍。在一些具體例中，相比於參考非人類動物中之DH-DH重組，包含如本文所述之經改造DH區之嚙齒動物展現DH-DH重組之頻率提高至少5倍。在一些具體例中，相比於參考非人類動物中之DH-DH重組，包含如本文所述之經改造DH區之嚙齒動物展現DH-DH重組之頻率提高至少10倍。在一些具體例中，相比於參考非人類動物中之DH-DH重組，包含如本文所述之經改造DH區之嚙齒動物展現DH-DH重組之頻率提高至少20倍。在一些具體例中，相比於參考非人類動物中之DH-DH重組，包含如本文所述之經改造DH區之嚙齒動物展現DH-DH重組之頻率提高至少30倍。在一些具體例中，相比於參考非人類動物中之DH-DH重組，包含如本文所述之經改造DH區之嚙齒動物展現DH-DH重組之頻率提高至少40倍。在一些具體例中，相比於參考非人類動物中之DH-DH重組，包含如本文所述之經改造DH區之嚙齒動物展現DH-DH重組之頻率提高至少50倍。
所提供之活體內系統
本發明係基於以下認知：特定抗原與低及/或不良免疫原性相關，且因此為基於抗體之治療劑的不良標靶。實際上，許多疾病標靶(例如，病毒、通道蛋白)已經特徵化為難治性或無藥可治的(undruggable)。因此，本發明係基於創建活體內系統，其用於開發克服與現有藥物發現技術及/或方法相關之缺陷的抗體及基於抗體之治療劑。在一些具體例中，本發明提供活體內系統，其特徵在於存在免疫球蛋白基因座，尤其人類化免疫球蛋白重鏈可變區基因座，該等基因座包括經改造DH區，其中一或多個DH RSS自12聚體-DH-12聚體格式改變、修飾或改造成12聚體-DH-23聚體或23聚體-DH-12聚體格式， 藉此使得與參考活體內系統中所觀測到之DH至DH重組相比，DH至DH重組能夠以提高之頻率進行。本發明具體而言展現基因轉殖嚙齒動物之構築，其基因組包含包括經改造DH區之免疫球蛋白重鏈可變區，該經改造DH區包括一或多個DH區段，其各自可操作地連接至相對於一或多個DH區段中之每一者定位之23聚體RSS，以允許DH-DH重組之頻率提高。本文所述之方法可適於獲得任何數目之DH區段(例如，傳統或合成)，其各自可操作地連接至5'或3' 23聚體RSS，以便產生如本文所述之經改造DH區。經改造DH區一旦整合於免疫球蛋白重鏈可變區中(亦即，以與VH及JH基因區段及/或一或多個恆定區以可操作連接形式置放)，則為VH及JH基因區段重組提供多於一個DH區段，例如以產生抗體，其特徵在於重鏈具有所添加之多樣性(亦即，長CDR3，例如其中至少95%之重鏈CDR3序列的長度為至少14個胺基酸)以引導與特定抗原之結合。在一些具體例中，此類重鏈可變區具有接近病毒、通道蛋白、GPCR等中之難以到達之表位的能力。
不希望受任何特定理論束縛，吾人注意到，本文所提供之資料在一些具體例中展現，基因組包含包括經改造DH區之免疫球蛋白重鏈可變基因座的嚙齒動物有效地產生藉由V(DD)J重組產生之抗體，該經改造區之特徵在於包括可操作地連接至5' 23聚體RSS之DH區段。吾人亦注意到，本文所提供之資料在一些具體例中展現，基因組包含包括經改造DH區之免疫球蛋白重鏈可變基因座的嚙齒動物有效地產生藉由V(DD)J重組產生之抗體，該經改造區之特徵在於包括各自可操作地連接至3' 23聚體RSS之三個DH區段。本文中亦注意到JH6基因區段上游之一些或所有五個JH基因區段之缺失引起優先重組至JH6基因區段。值得注意地，JH6基因區段包含63個核苷酸，例如比其他JH1、JH2、JH3、JH4及JH5基因區段多10個核苷酸，該等區段分別包含52、53、50、40及51個核苷酸。因此，本發明在至少一些具體例中涵蓋開發活體內系統，其用於產生針對難治性疾病標靶之抗體及/或基於抗體之治療劑，例如藉由提供嚙齒動物，其產生經重排免疫球蛋白重鏈可變區基因序列，例如VHDHJH及VH(DHA-DHB)JH，例如 VH(DHA-DHB)JH6，該等序列為編碼CDR3長度為至少20個胺基酸(例如，CDR3長度在20至30個胺基酸長度之間)之重鏈可變域的序列。在一些具體例中，至少8-10%之經重排免疫球蛋白重鏈可變區基因序列，例如本文所述之非人類動物之VHDHJH及VH(DHA-DHB)JH基因序列，編碼長度為至少21個胺基酸之CDR3區。
在一些具體例中，本文描述非人類動物，例如嚙齒動物，例如大鼠或小鼠，其(1)在其生殖系基因組中，例如在生殖細胞中，包含免疫球蛋白重鏈基因座，其包含經改造DH區，該區包含可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段，及(2)在其體細胞基因組中，例如在B細胞中，包含經重排重鏈VH(DHA-DHB)JH編碼序列，其中第一或第二DH基因區段(亦即，VH(DHA-DHB)JH編碼序列之分別DHA或DHB)包含可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段，或其部分，例如其中第一或第二DH基因區段具有與可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段對齊的至少9個連續核苷酸，且其中第一及第二DH基因區段中之每一者包含無關於任何重疊與對應生殖系DH基因區段對齊之至少5個連續核苷酸。
在一些具體例中，所提供之非人類動物包含免疫球蛋白重鏈基因座，其特徵在於存在複數個人類VH、DH及JH基因區段，該等基因區段以生殖系組構排列，且可操作地連接至非人類免疫球蛋白重鏈恆定區基因、增強子及調控區。在一些具體例中，所提供之非人類動物包含一或多個人類VH基因區段、一或多個人類DH基因區段及一或多個人類JH基因區段，其可操作地連接至非人類免疫球蛋白重鏈恆定區。
在一些具體例中，所提供之非人類動物包含至少人類VH基因區段VH3-74、VH3-73、VH3-72、VH2-70、VH1-69、VH3-66、VH3-64、VH4-61、VH4-59、VH1-58、VH3-53、VH5-51、VH3-49、VH3-48、VH1-46、VH1-45、VH3-43、VH4-39、VH4-34、VH3-33、VH4-31、VH3-30、VH4-28、VH2-26、VH1-24、VH3-23、VH3-21、VH3-20、VH1-18、VH3-15、 VH3-13、VH3-11、VH3-9、VH1-8、VH3-7、VH2-5、VH7-4-1、VH4-4、VH1-3、VH1-2及VH6-1。
在一些具體例中，所提供之非人類動物包含人類DH基因區段DH1-1、DH2-2、DH3-3、DH4-4、DH5-5、DH6-6、DH1-7、DH2-8、DH3-9、DH3-10、DH5-12、DH6-13、DH2-15、DH3-16、DH4-17、DH5-18、DH6-19、DH1-20、DH2-21、DH3-22、DH6-25及DH1-26。在一些具體例中，所提供之非人類動物進一步包含DH1-14、DH4-11、DH4-23、DH5-24或其組合。在一些具體例中，所提供之非人類動物進一步包含人類DH7-27。
在一些具體例中，本文描述非人類動物，例如嚙齒動物，例如大鼠或小鼠，其(1)在其生殖系基因組中，例如在生殖細胞中，包含免疫球蛋白重鏈基因座，其包含經改造DH區，該區包含可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段，及(2)在其體細胞基因組中，例如在B細胞中，包含經重排重鏈VH(DHA-DHB)JH編碼序列，其中第一或第二DH基因區段(亦即，VH(DHA-DHB)JH編碼序列之分別DHA或DHB)包含可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段，或其部分，例如其中第一或第二DH基因區段具有與可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段對齊的至少9個連續核苷酸，且其中第一及第二DH基因區段中之每一者包含無關於任何重疊，與對應生殖系DH基因區段對齊之至少5個連續核苷酸。在一些具體例中，所提供之非人類動物包含可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含二個半胱胺酸密碼子。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段含有至少37個核苷酸。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段含有至少19個核苷酸。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段含有至少20個核苷酸。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段含有至少23個核苷酸。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段含有至少28個核苷酸。在一些具體例中，可操作 地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段含有至少31個核苷酸。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段含有至少37個核苷酸。
在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH1基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH2基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH3基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH4基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH5基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH6基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH7基因區段。
在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH1-1基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH2-2基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH3-3基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH4-4基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH5-5基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH6-6基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH1-7基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH2-8基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH3-9基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH3-10基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH5-12基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS 之人類DH基因區段包含人類DH6-13基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH2-15基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH3-16基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH4-17基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH5-18基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH6-19基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH1-20基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH2-21基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH3-22基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH6-25基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH1-26基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH1-14基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH4-11基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH4-23基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH5-24基因區段。在一些具體例中，可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段包含人類DH7-27基因區段。
在一些具體例中，所提供之非人類動物包含一般以未經重排人類基因組可變基因座中發現之次序排列之人類DH基因區段的完整或實質上全譜系，其中完整或實質上全譜系之人類DH基因區段中之一者經DH基因區段置換，該基因區段經改造以可操作地連接至23聚體RSS。在一些具體例中，完整或實質上全譜系之人類DH基因區段中之一者經對應DH基因區段置換，該對應基因區段經改造以可操作地連接至23聚體RSS，例如野生型DH2-2基因區段經DH2-2基因區段置 換，該基因區段經改造以可操作地連接至23聚體RSS。在一些具體例中，完整或實質上全譜系之人類DH基因區段中之一者經另一DH基因區段置換，該另一基因區段經改造以可操作地連接至23聚體RSS，例如野生型DH7-27基因區段經DH3-3基因區段置換，該基因區段經改造以可操作地連接至23聚體RSS。在一些具體例中，一般以未經重排人類基因組可變基因座中發現之次序排列之完整或實質上全譜系人類DH基因區段之DH1-1基因區段經對應或另一DH基因區段置換，該對應或另一基因區段經改造以可操作地連接至23聚體RSS(例如，3' 23聚體RSS)。在一些具體例中，一般以未經重排人類基因組可變基因座中發現之次序排列之完整或實質上全譜系人類DH基因區段之DH1-1、DH2-2、DH2-8、DH2-15、DH2-21基因區段或其任何組合經對應或另一DH基因區段置換，該對應或另一基因區段經改造以可操作地連接至23聚體RSS(例如，3' 23聚體RSS)。在一些具體例中，一般以未經重排人類基因組可變基因座中發現之次序排列之完整或實質上全譜系人類DH基因區段之DH2-2、DH2-8及DH2-15基因區段中之每一者經對應或另一DH基因區段置換，該對應或另一基因區段經改造以可操作地連接至23聚體RSS(例如，3' 23聚體RSS)。
在一些具體例中，所提供之非人類動物包含至少人類JH基因區段JH6。在一些具體例中，所提供之非人類動物包含至少人類JH基因區段JH4、JH5及JH6。在一些具體例中，所提供之非人類動物包含人類JH基因區段JH1、JH2、JH3、JH4、JH5及JH6。
在一些具體例中，非人類免疫球蛋白重鏈恆定區包括一或多個非人類免疫球蛋白重鏈恆定區基因，例如免疫球蛋白M(IgM)、免疫球蛋白D(IgD)、免疫球蛋白G(IgG)、免疫球蛋白E(IgE)及免疫球蛋白A(IgA)。在一些具體例中，非人類免疫球蛋白重鏈恆定區包括囓齒動物IgM、囓齒動物IgD、囓齒動物IgG3、囓齒動物IgG1、囓齒動物IgG2b、囓齒動物IgG2a、囓齒動物IgE及囓齒動物IgA恆定區基因。在一些具體例中，該人類VH、DH及JH基因區段可操作地連接至一或多個非人類免疫球蛋白重鏈增強子(亦即，增強子序列或增強子 區)。在一些具體例中，該人類VH、DH及JH基因區段可操作地連接至一或多個非人類免疫球蛋白重鏈調控區(或調控序列)。在一些具體例中，該人類VH、DH及JH基因區段可操作地連接至一或多個非人類免疫球蛋白重鏈增強子(或增強子序列)及一或多個非人類免疫球蛋白重鏈調控區(或調控序列)。
在一些具體例中，所提供之非人類動物不含(或缺少)內源性Adam6基因。在一些具體例中，所提供之非人類動物不含或缺少與同一物種之野生型非人類動物之生殖系基因組中所發現之相同生殖系基因組位置中的內源性Adam6基因(或Adam6編碼序列)。在一些具體例中，所提供之非人類動物不含或缺少人類Adam6偽基因。在一些具體例中，所提供之非人類動物包含插入編碼一或多種非人類(例如，嚙齒動物)Adam6多肽的至少一個核苷酸序列。插入可位於如本文所述之經改造免疫球蛋白重鏈基因座之外(例如，最接近5'端之VH基因區段的上游)，在經改造免疫球蛋白重鏈基因座內，或非人類動物(例如，隨機引入之非人類Adam6編碼序列)、細胞或組織之生殖系基因組中的其他位置。在一些具體例中，所提供之非人類動物不含或缺少功能性內源性Adam6偽基因。
在一些具體例中，如本文所述之所提供的非人類動物、非人類細胞或非人類組織並未可偵測地表現(全部或部分)抗體分子中之內源性非人類VH區。在一些具體例中，如本文所述之所提供的非人類動物、非人類細胞或非人類組織不含(或缺乏或含有缺失)一或多個核苷酸序列，其(全部或部分)編碼抗體分子中之內源性非人類VH區(例如，VH、DH及/或JH)。在一些具體例中，如本文所述之所提供的非人類動物、非人類細胞或非人類組織具有生殖系基因組，其包括內源性非人類VH、DH及JH基因區段之缺失(全部或部分)。在一些具體例中，所提供之非人類動物具生育力。
在一些具體例中，所提供之非人類動物進一步包含經改造免疫球蛋白κ輕鏈基因座，其特徵在於存在複數個人類Vκ及Jκ基因區段，該等區段以生殖系組構排列，且插入非人類Cκ基因上游，且與 其可操作地連接。在一些具體例中，經改造免疫球蛋白κ輕鏈基因座包含至少人類Vκ基因區段，其出現於人類免疫球蛋白κ輕鏈基因座之近端可變簇(或近端臂，或近端複製)。在一些具體例中，經改造免疫球蛋白κ輕鏈基因座包含至少人類Vκ基因區段Vκ2-40、Vκ1-39、Vκ1-33、Vκ2-30、Vκ2-8、Vκ1-27、Vκ2-24、Vκ6-21、Vκ3-20、Vκ1-17、Vκ1-16、Vκ3-15、Vκ1-12、Vκ3-11、Vκ1-9、Vκ1-8、Vκ1-6、Vκ1-5、Vκ5-2及Vκ4-1。在一些具體例中，經改造免疫球蛋白κ輕鏈基因座包含選自以下的至少1、2、3、4、5、10或15個人類Vκ基因區段：Vκ2-40、Vκ1-39、Vκ1-33、Vκ2-30、Vκ2-8、Vκ1-27、Vκ2-24、Vκ6-21、Vκ3-20、Vκ1-17、Vκ1-16、Vκ3-15、Vκ1-12、Vκ3-11、Vκ1-9、Vκ1-8、Vκ1-6、Vκ1-5、Vκ5-2及Vκ4-1。在一些具體例中，經改造免疫球蛋白κ輕鏈基因座包含人類Jκ基因區段Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4及Jκ5。在一些具體例中，經改造免疫球蛋白κ輕鏈基因座包含選自以下的至少1、2、3或4個人類Jκ基因區段：Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4及Jκ5。
在許多具體例中，該人類Vκ及Jκ基因區段可操作地連接至一或多個非人類免疫球蛋白κ輕鏈增強子(亦即，增強子序列或增強子區)。在一些具體例中，該人類Vκ及Jκ基因區段可操作地連接至鼠類Igκ輕鏈內含子增強子區(IgκEi或Eiκ)。在許多具體例中，該人類Vκ及Jκ基因區段可操作地連接至一或多個非人類免疫球蛋白κ輕鏈調控區(或調控序列)。在一些具體例中，該人類Vκ及Jκ基因區段可操作地連接至鼠類Igκ輕鏈3'增強子區(Igκ3'E或3'Eκ)。在一些具體例中，該人類Vκ及Jκ基因區段可操作地連接至鼠類Eiκ且可操作地連接至鼠類3'Eκ。在一些具體例中，該人類Vκ及Jκ基因區段可操作地連接至一或多個非人類免疫球蛋白κ輕鏈增強子(或增強子序列或增強子區)及一或多個非人類免疫球蛋白κ輕鏈調控區(或調控序列)。在一些具體例中，經改造免疫球蛋白κ輕鏈基因座含有與野生型免疫球蛋白κ輕鏈基因座中出現之相同非人類免疫球蛋白κ輕鏈增強子區(或增強子序列)。在一些具體例中，經改造免疫球蛋白κ輕鏈基因座含有出現在不同物種 (例如，不同囓齒動物物種)中之野生型免疫球蛋白κ輕鏈基因座之非人類Igκ輕鏈增強子區(或增強子序列)。
在一些具體例中，如本文所述之經改造免疫球蛋白κ輕鏈基因座不含(亦即，缺少)人類VpreB基因(或人類VpreB基因編碼序列)。
在一些具體例中，經改造免疫球蛋白κ輕鏈基因座之非人類Cκ基因包括囓齒動物Cκ基因，例如小鼠Cκ基因或大鼠Cκ基因。在一些具體例中，經改造免疫球蛋白κ輕鏈基因座之非人類Cκ基因為或包含來自遺傳背景之小鼠Cκ基因，其包括129品系、BALB/c品系、C57BL/6品系、混合129xC57BL/6品系，或其組合。
在一些具體例中，所提供之如本文所述之非人類動物、非人類細胞或非人類組織，全部或部分地無法偵測地表現抗體分子中之內源性非人類Vκ區。在一些具體例中，所提供之如本文所述之非人類動物、非人類細胞或非人類組織，不包含(或缺少或含有缺失)一或多個核苷酸序列，其全部或部分編碼抗體分子中之內源性非人類Vκ區。在一些具體例中，所提供之如本文所述之非人類動物、非人類細胞或非人類組織，具有生殖系基因組，其包括全部或部分內源性非人類Vκ及Jκ基因區段缺失。
在一些具體例中，所提供之非人類動物進一步包含野生型或不活化(例如，藉由基因靶向)免疫球蛋白λ輕鏈基因座。
在一些具體例中，所提供之如本文所述之非人類動物、非人類細胞或非人類組織，全部或部分地無法偵測地表現抗體分子中之內源性非人類Vλ區。在一些具體例中，所提供之如本文所述之非人類動物、非人類細胞或非人類組織，不含(或缺少或含有缺失)一或多個核苷酸序列，其全部或部分編碼抗體分子中之內源性非人類Vλ區。在一些具體例中，所提供之如本文所述之非人類動物、非人類細胞或非人類組織，具有生殖系基因組，其包括全部或部分內源性非人類Vλ及Jλ基因區段缺失。在一些具體例中，所提供之如本文所述之非人類動 物、非人類細胞或非人類組織，呈生殖系基因組形式，其包括全部或部分內源性非人類Vλ、Jλ及Cλ基因區段缺失。
有關創造攜帶此類經改造免疫球蛋白基因座之靶向載體、非人類細胞及動物的指南，可見於美國專利第8,642,835號、第8,697,940號、第9,006,511號、第9,012,717號、第9,029,628號、第9,035,128號、第9,066,502號、第9,150,662號及第9,163,092號，其以全文引用的方式併入本文中。熟悉本技藝者知道本技藝用於實現此類遺傳改造及/或操縱非人類動物(例如，哺乳動物)基因組，或用於以其他方式製備、提供或製造此類序列，以引入至非人類動物之生殖系基因組中的多種技術。
DNA構築體
典型地，含有如本文所述之免疫球蛋白基因區段，尤其各自可操作地連接至5'或3' 23聚體RSS之一或多個DH區段之多核苷酸分子插入至載體(較佳DNA載體)中，以便在適合宿主細胞中複製多核苷酸分子。
歸因於其大小，DH區段可自可購自商業供應商之基因組源直接選殖，或基於可獲自GenBank之公開序列電腦設計。可替代地，細菌人工染色體(BAC)庫可提供免疫球蛋白序列。BAC庫含有100-150kb之平均插入片段大小，且能攜帶大至300kb之插入片段(Shizuya等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 89：8794-8797；Swiatek等人，1993,Genes and Development 7：2071-2084；Kim等人，1996,Genomics 34 213-218；該等文獻以全文引用的方式併入本文中)。舉例而言，人類及小鼠基因組BAC庫已經建構且可商購獲得(例如，Invitrogen,Carlsbad Calif.)。基因組BAC庫亦可充當免疫球蛋白DNA序列以及轉錄控制區的來源。
可替代地，可自酵母人工染色體(YAC)分離、選殖及/或轉移出免疫球蛋白序列。整個免疫球蛋白基因座，或其實質性部分，可經選殖且含於一或數個YAC內。若使用多個YAC且含有重疊同源 性之區，則其可在酵母宿主菌株內重組，以產生代表整個基因座的單一構築體。YAC臂可藉由改造，經哺乳動物選擇卡匣額外修飾，以藉由本技藝已知及/或本文所述之方法，幫助將構築體引入胚胎幹細胞或胚胎中。
可使用本技藝已知的方法製備DNA構築體。舉例而言，DNA構築體可以較大質體之部分形式製備。此類製備允許以本技藝已知的高效方式選殖及選擇正確構築體。含有如本文所述之各自可操作地連接至5'或3' 23聚體RSS之一或多個DH區段的DNA片段可定位於質體上之合宜的限制位點之間，使得其可容易地自其餘質體序列分離，以便併入至所要動物中。
在一些具體例中，質體製備及宿主生物體轉形中所採用之方法在本技藝中已知。對於原核及真核細胞之其他適合表現系統，以及一般重組程序，參見Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第2版，Sambrook,J.等人編，Cold Spring Harbor Laboratory Press：1989；其以全文引用的方式併入本文中。
非人類動物之產生
提供非人類動物，其表現具有重鏈CDR3多樣性之抗體，該多樣性之特徵在於由與一或多個DH區段相鄰之23聚體RSS之整合引起的長胺基酸長度，該等RSS允許在非人類動物之基因組中之免疫球蛋白重鏈可變區內進行DH至DH重組。本文所述之適合實例包括囓齒動物，尤其小鼠。在許多具體例中，一或多個DH區段包括異源DH區段(例如，人類DH區段)。亦提供用於製備含有該等DH區段之非人類動物、非人類胚胎及細胞之非人類動物、胚胎及靶向構築體，相比於野生型或參考非人類動物，其能夠以提高之頻率進行DH-DH重組。
在一些具體例中，在非人類動物之基因組中免疫球蛋白重鏈可變區之多樣性簇(亦即，DH區)內，一或多個DH區段經修飾以鄰接於(或可操作地連接至)5'或3' 23聚體RSS。在一些具體例中，免疫球蛋白重鏈可變區之DH區(或其部分)未缺失(亦即，完整)。在一些具 體例中，免疫球蛋白重鏈可變區之DH區(或其部分)經改變、破壞、缺失、改造或經各自可操作地連接至5'或3' 23聚體RSS之一或多個DH區段置換。在一些具體例中，全部或實質上全部DH區經各自可操作地連接至5'或3' 23聚體RSS之一或多個合成DH區段置換；在一些具體例中，在免疫球蛋白重鏈可變區之DH區中，一或多個傳統DH基因區段未缺失或經置換。在一些具體例中，DH區含有傳統DH區段(亦即，各自可操作地連接至5' 12聚體RSS及3' 12聚體RSS之一或多個DH區段)及經改造DH基因區段(亦即，各自可操作地連接至5'或3' 23聚體RSS之一或多個DH區段。在一些具體例中，如本文所述之DH區為合成DH區。在一些具體例中，DH區為人類DH區。在一些具體例中，DH區為鼠類DH區。在一些具體例中，如本文所述之經改造DH區(或其部分)插入至免疫球蛋白重鏈可變區中，使得該經改造DH區(或其部分)與一或多個VH基因區段及/或一或多個JH基因區段可操作地連接。在一些具體例中，該經改造DH區插入至免疫球蛋白重鏈可變區之二個複本中的一個中，產生就該經改造DH區而言為異型接合的非人類動物。在一些具體例中，提供非人類動物，其就經改造DH區而言為同型接合的。在一些具體例中，提供非人類動物，其就經改造DH區而言為異型接合的。
在一些具體例中，如本文所述之非人類動物含有經隨機整合之人類免疫球蛋白重鏈可變區，其包括DH區，該區含有各自可操作地連接至非人類動物基因組內5'或3' 23聚體RSS之一或多個DH區段。因此，此類非人類動物可描述為具有人類免疫球蛋白重鏈轉殖基因，其含有經改造DH區。可使用多種方法偵測經改造DH區，該等方法包括例如PCR、西方墨點法、南方墨點法、限制性片段長度多態性(RFLP)，或對偶基因獲得(GOA)或對偶基因損失(LOA)分析。在一些此類具體例中，就如本文所述之經改造DH區而言，如本文所述之非人類動物為異型接合的。在一些此類具體例中，就如本文所述之經改造DH區而言，如本文所述之非人類動物為同型接合的。在一些此類具體例中，就如本文所述之經改造DH區而言，如本文所述之非人類動物為半 接合的。在一些此類具體例中，如本文所述之非人類動物含有如本文所述之經改造DH區的一或多個複本。
在一些具體例中，如本文所述之非人類動物之經改造DH區包括與5' 23聚體RSS締合(或可操作地連接)的至少一個DH區段。在一些具體例中，如本文所述之非人類動物之經改造DH區包括與3' 23聚體RSS締合(或可操作地連接)的至少一個DH區段。在一些具體例中，如本文所述之非人類動物之經改造DH區包括與5' 23聚體RSS締合(或可操作地連接)的至少一人類DH3-3區段。在一些具體例中，如本文所述之非人類動物之經改造DH區包括與3' 23聚體RSS締合(或可操作地連接)的至少一人類DH2區段，其中人類DH2區段選自由以下組成之群：人類DH2-2、人類DH2-8、人類DH2-15及人類DH2-21。
在一些具體例中，如本文所述之非人類動物之經改造DH區包括各自與5' 23聚體RSS締合(或可操作地連接)的多於一個DH區段。在一些具體例中，如本文所述之非人類動物之經改造DH區包括各自與3' 23聚體RSS締合(或可操作地連接)的多於一個DH區段。在一些具體例中，如本文所述之非人類動物之經改造DH區包括人類DH2-2、人類DH2-8及人類DH2-15區段，其各自與3' 23聚體RSS締合(或可操作地連接)。
提供用於製備非人類動物之組成物及方法，該等非人類動物之基因組包含包括經改造DH區之免疫球蛋白重鏈可變區，其中該經改造DH區包括各自與5'或3' 23聚體RSS締合(或可操作地連接)的一或多個DH區段，包括用於製備表現抗體之非人類動物的組成物及方法，該等抗體包含重鏈可變區，其包括具有由來自免疫球蛋白重鏈基因座之多於一個DH區段編碼之胺基酸序列的CDR3區，該基因座含有可操作地連接至一或多個非人類重鏈恆定區基因之人類VH及JH基因區段。在一些具體例中，亦提供用於製備非人類動物之組成物及方法，該等動物在內源性增強子及/或內源性調控序列之控制下，表現此類抗體。在一些具體例中，亦提供用於製備非人類動物之組成物及方法，該等動物在異源性增強子及/或異源性調控序列之控制下，表現此類抗 體。方法包括在非人類動物之基因組中插入一或多個DH區段，及相比於野生型DH區段，允許以提高之頻率進行DH-DH重組之其他序列，因此包括由V(DD)J重組產生之免疫球蛋白重鏈的抗體經表現。
在一些具體例中，方法包括插入DNA，其包括具有之5' 23聚體RSS及3' 12聚體RSS之DH基因區段，其可操作地連接至一或多個JH基因區段。如本文所述，DH基因區段定位於μ0啟動子序列之下游。在一些具體例中，方法包括在相對於μ0啟動子序列之位置插入具有5' 23聚體RSS及3' 12聚體RSS之DH區段，使得在重組期間，該等JH基因區段可接近RAG基因(例如，RAG-1及/或RAG-2)。包括上文所述之DH區段及側接RSS之遺傳物質可插入至非人類動物之基因組中，藉此產生具有經改造DH區之非人類動物，該區含有該DH區段及必需RSS，以允許與相鄰DH基因區段及VH及JH基因區段進行重組。
在一些具體例中，方法包括插入DNA，其包括各自與5' 12聚體RSS及3' 23聚體RSS締合之三個DH基因區段，其可操作地連接至六個JH基因區段。如本文所述，DH基因區段定位在各自與5'及3' 12聚體RSS締合之複數個DH基因區段中。在一些具體例中，方法包括在多樣性簇中插入各自與之5' 12聚體RSS及3' 23聚體RSS締合之DH2-2、DH2-8及DH2-15基因區段，以及各自與傳統或野生型RSS締合之複數個其他DH基因區段。包括上文所述之DH區段及側接RSS之遺傳物質可插入至非人類動物之基因組中，藉此產生具有經改造DH區之非人類動物，該區含有該等DH區段及必需RSS，以允許與相鄰DH基因區段及VH及JH基因區段進行重組。
在適當時，對應於(或編碼)DH區段之序列可經修飾以包括密碼子，其針對在非人類動物中表現經最佳化(例如，參見美國專利第5,670,356號及第5,874,304號；其各自以全文引用的方式併入)。密碼子最佳化序列為合成序列，且較佳編碼由未經密碼子最佳化之親本多核苷酸編碼的一致多肽(或具有與全長多肽實質上相同活性之全長多肽的生物活性片段)。在一些具體例中，對應於(或編碼)DH區段之序 列可包括經改變序列，以將密碼子使用針對特定細胞類型(例如，嚙齒動物細胞)最佳化。舉例而言，對應於待插入至非人類動物(例如，囓齒動物)基因組中之DH區段之序列的密碼子可針對在非人類動物之細胞中表現經最佳化。此類序列可描述為經密碼子最佳化序列。
將可操作地連接至5'或3' 23聚體RSS之DH區段插入至DH區，使得該等DH區段可操作地連接至VH及JH基因區段(例如，複數個VH及JH基因區段)，採用基因組之相對極小修飾且引起抗體表現，該等抗體包含特徵在於CDR3具有較長胺基酸長度之重鏈。
用於產生基因轉殖非人類動物的方法，包括剔除及敲入，為本技藝中所熟知(參見例如，Gene Targeting：A Practical Approach,Joyner編，Oxford University Press,Inc.,2000；其以全文引用的方式併入本文中)。舉例而言，基因轉殖囓齒動物之產生可視情況地涉及破壞一或多個內源性囓齒動物基因(或基因區段)的基因座，及將各自可操作地連接至23聚體RSS之一或多個DH區段引入至囓齒動物基因組中，在一些具體例中，在與內源性囓齒動物基因(或基因區段)相同的位置上進行。在一些具體例中，各自可操作地連接至23聚體RSS之一或多個DH區段引入至嚙齒動物基因組中隨機插入之免疫球蛋白重鏈基因座的DH區中。在一些具體例中，各自可操作地連接至23聚體RSS之一或多個DH區段引入至嚙齒動物基因組中內源性免疫球蛋白重鏈基因座之DH區中；在一些具體例中，內源性免疫球蛋白重鏈基因座經改變、修飾或改造，以含有可操作地連接至一或多個恆定區基因(例如，人類或鼠類)之人類基因區段(例如，V及/或J)。
代表性靶向載體之示意性圖解(未按比例)提供於圖2中，該等載體用於構築經改造DH區及整合至嚙齒動物胚胎幹(ES)細胞中以產生嚙齒動物，其基因組包含包括經改造多樣性簇(亦即，DH區)之免疫球蛋白重鏈可變區，該多樣性簇包括各自可操作地連接至5'或3' 23聚體RSS之一或多個DH區段。用於將此類載體插入至嚙齒動物ES細胞之基因組中之免疫球蛋白重鏈可變區中的例示性策略及方法提供於圖3至8中。在圖2至8中之每一者中，NotI限制酶識別位點在 適當時指定，針對所展示之各種對偶基因(未按比例)指定各種引子/探針組(參見表4)之名稱及大致位置(小虛線)，且除非另外指出，否則空心符號及線表示人類序列，而實心符號及深色線表示小鼠序列。以下縮寫用於圖式中之每一者spec：觀黴素(spectinomycin)抗性基因；neo：新黴素(neomycin)抗性基因；hyg：濕黴素(hygromycin)抗性基因；lp：loxP位點特異性重組識別位點；Ei：鼠類重鏈內含子增強子；IgM：鼠類免疫球蛋白M恆定區基因；L：loxP位點序列；Frt：翻轉酶(flippase)識別標靶序列；μ0 pro：μ0啟動子序列。
如圖2中所說明，使用VELOCIGENE®技術(參見例如美國專利第6,586,251號，及Valenzuela等人，2003,Nature Biotech.21(6)：652-659；該等文獻以全文引用的方式併入本文中)及本技藝中已知的分子生物學技術製得含有複數個DH區段之DNA片段，其中一個DH區段可操作地連接至5' 23聚體RSS(圖2，頂部及中間)，或其中三個DH區段各自可操作地連接至3' 23聚體RSS(圖2，底部)。在圖2中，除非另外指出，否則空心符號及線表示人類序列，而實心符號及深色線表示小鼠序列。人類VH6-1、DH2-2、DH2-8、DH2-15、DH3-3，及JH1、JH2、JH3、JH4、JH5及JH6基因區段(若存在)之未按比例的相對位置經描繪，且保持未命名之任何基因區段為DH基因區段。一般而言，如以井號描繪之DH區包含未經重排人類DH基因區段之全譜系(參見例如www.imgt.org/IMGTrepertoire/index.php？section=LocusGenes&repertoire=locus&species=human&group=IGH；其以全文引用的方式併入本文中)，例外之處為以下：頂部二個靶向載體缺少最後一個DH7-27基因，其經包含由5'端23聚體RSS及3'端12聚體RSS側接之DH3-3基因區段的序列(描繪為空心箭頭)置換；底部靶向載體缺少未經重排人類DH2-2基因區段、未經重排人類DH2-8基因區段及DH2-15基因區段，其分別經由5'端12聚體RSS及3'端23聚體RSS側接之DH2-2、由5'端12聚體RSS及3'端23聚體RSS側接之DH2-8基因區段及由5'端12聚體RSS及3'端23聚體RSS側接之DH2-15基因區段置換(經改造DH2-2、DH2-8及DH2-15基因區段中之每一者描繪為空心箭頭)。未填 充之豎直矩形表示與引子及探針同源之獨特人工40聚體的位置，其置於12：DH2-2：23|12：DH2-8：23|12：DH2-15：23靶向載體中以幫助保證靶向載體/ES細胞之正確修飾。表示為「1」、「2」、「10」、「16」、「8」及「18」之獨特人工40聚體的序列分別如SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77及SEQ ID NO：78所記載。
DNA片段與同源臂一起組裝以便精確靶向插入至人類化免疫球蛋白重鏈可變區基因座中(圖3、5、7)。由位點特異性重組識別位點(例如，loxP)側接之選擇卡匣(例如，新黴素)包括於靶向載體中，以便於篩選ES細胞純系中之適當插入，且在陽性ES細胞純系中可藉由短暫表現重組酶(例如，Cre)而移除(圖4、6、8)。DNA片段包括在整合於免疫球蛋白重鏈基因座中後，對適當組裝(亦即，重組)、轉錄及表現重鏈可變區而言必需的序列。靶向載體經設計，使得經改造DH區在5'端由人類VH基因組DNA側接，且在3'端由人類JH基因組DNA及非人類(例如，嚙齒動物)基因組重鏈恆定區DNA(例如，內含子增強子及IgM恆定區基因)側接。用於併入至非人類細胞(例如，嚙齒動物胚胎幹細胞)之基因組中的最終靶向載體含有VH基因組DNA(例如，含有一或多個VH基因區段)、經改造DH區、3' JH基因組DNA及非人類(例如，嚙齒動物)基因組重鏈恆定區DNA，其皆可操作地連接，以允許在整合於非人類動物之基因組後，在VH基因區段、經改造DH區及JH基因區段之間進行重組。一旦經組裝，則靶向載體經線性化及電穿孔至嚙齒動物ES細胞中。
靶向載體引入至嚙齒動物(例如，小鼠)胚胎幹細胞中，使得靶向載體中所含有之序列(亦即，經改造DH區)引起非人類細胞或非人類動物(例如，小鼠)表現抗體之能力，該等抗體含有具有由多於一個DH區段編碼之胺基酸的CDR3。
如本文所述，產生基因轉殖嚙齒動物，其中經改造DH區已引入至嚙齒動物基因組之免疫球蛋白重鏈基因座(例如，經改造以含有人類可變區基因區段之免疫球蛋白重鏈基因座，其可為經如此改造之內源性免疫球蛋白重鏈基因座)中。
包含人類可變區基因區段之免疫球蛋白基因座為本技藝中已知的且可發現於例如美國專利第5,633,425號；第5,770,429號；第5,814,318號；第6,075,181號；第6,114,598號；第6,150,584號；第6,998,514號；第7,795,494號；第7,910,798號；第8,232,449號；第8,502,018號；第8,697,940號；第8,703,485號；第8,754,287號；第8,791,323號；第8,809,051號；第8,907,157號；第9,035,128號；第9,145,588號；第9,206,263號；第9,447,177號；第9,551,124號；第9,580,491號及第9,475,559號中，其中之每一者以全文引用的方式併入本文中，以及美國專利公開案第20100146647號；第20110195454號；第20130167256號；第20130219535號；第20130326647號；第20130096287號；及第2015/0113668號中，其中之每一者以全文引用的方式併入本文中，及PCT公開案第WO2007117410號、第WO2008151081號、第WO2009157771號、第WO2010039900、第WO2011004192號、第WO2011123708號及第WO2014093908號中，其中之每一者以引用之方式併入本文中。
在一些具體例中，如本文所揭示之非人類動物包含外源性完全人類免疫球蛋白轉殖基因，該等轉殖基因包含經改造DH區，其能夠在小鼠之前驅體B細胞中重排(Alt等人，1985，Immunoglobulin genes in transgenic mice，Trends Genet1：231-236；其以全文引用的方式併入本文中)。在此等具體例中，包含經改造DH區之完全人類免疫球蛋白轉殖基因可(隨機地)插入且內源性免疫球蛋白基因亦可經剔除(Green等人，1994，Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs,Nat Genet 7：13-21；Lonberg等人，1994,Antigen-specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications,Nature 368：856-859；Jakobovits等人，2007,From XenoMouse technology to panitumumab,the first fully human antibody product from transgenic mice,Nat Biotechnol 25：1134-1143；該等出版物中之每一者以全文引用的方式併入本文中)，例如其中內源性免疫球蛋白重鏈及κ輕鏈基因座 例如藉由靶向刪除各內源性基因座之較小但關鍵的部分，接著以隨機整合的較大轉殖基因或袖珍染色體形式引入人類免疫球蛋白基因座而失活(Tomizuka等人，2000,Double trans-chromosomic mice：maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies,PNAS USA 97：722-727；其以全文引用的方式併入本文中)。
在一些具體例中，包含經改造DH區之人類或人類化免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因座分別位於內源性免疫球蛋白重鏈及輕鏈基因座處。先前已描述用於小鼠生殖系免疫球蛋白可變基因座經人類生殖系免疫球蛋白可變基因座之大規模原位基因置換同時保持小鼠產生後代之能力的方法。參見，例如，美國專利第6,596,541號及第8,697,940號，其中之每一者以全文引用的方式併入本文中。特定言之，描述小鼠重鏈及κ輕鏈免疫球蛋白可變基因兩者之六兆鹼基經其人類對應物精確置換同時保留完整的小鼠恆定區。因此，已形成其全部生殖系免疫球蛋白可變基因譜經等效人類生殖系免疫球蛋白可變序列精確置換同時保持小鼠恆定區的小鼠。人類可變區連接至小鼠恆定區以形成在生理學地適當層級上重排且表現的嵌合人類-小鼠免疫球蛋白基因座。所表現之抗體為「逆向嵌合體」，亦即，其包含人類可變區序列及小鼠恆定區序列。具有表現具有人類或人類化可變區之抗體的人類化免疫球蛋白可變區及小鼠恆定區的此等小鼠稱為VELOCIMMUNE®小鼠。
VELOCIMMUNE®人類化小鼠展現基本上與野生型小鼠之全功能體液免疫系統不可區分的全功能體液免疫系統。其在B細胞發展之所有階段顯示正常的細胞群。其展現正常的淋巴器官形態學。VELOCIMMUNE®小鼠之抗體序列展現正常的V(D)J重排及正常的體細胞超突變頻率。此等小鼠種之抗體群反映由正常的類別切換(例如，正常的同型順式切換)產生之同型分佈。使VELOCIMMUNE®小鼠免疫產生穩固的體液免疫反應，該免疫反應產生大規模的適用作治療候選物之具有人類免疫球蛋白可變域的不同抗體譜系。此平台提供用 於製造醫藥學上可接受之抗體及其他抗原結合蛋白的自然親和力成熟之人類免疫球蛋白可變區序列的充裕來源。亦展示甚至單一內源性VH基因區段經人類VH基因區段之置換可導致包含人類化免疫球蛋白可變域之免疫反應。參見，例如，Tien等人，(2016)Cell 166：1471-84；其以全文引用的方式併入本文中。小鼠免疫球蛋白可變序列經人類免疫球蛋白可變序列之精確置換使得人類免疫球蛋白可變序列以允許製備VELOCIMMUNE®小鼠之逆向嵌合方式與內源性非人類恆定區基因序列可操作地連接。
以逆向嵌合方式修飾之小鼠包括經修飾以在內源性免疫球蛋白基因座處包含人類(化)可變區(例如，包含(D)、J及一或多個人類V區段)的小鼠，該人類(化)可變區可操作地連接至內源性恆定區，例如
(a)在內源性重鏈基因座處：
(i)未經重排人類(化)免疫球蛋白重鏈可變區可操作連接至內源性重鏈恆定區，其中未經重排人類(化)免疫球蛋白重鏈可變區包含複數個未經重排人類重鏈可變區VH基因區段(例如，所有功能性人類未經重排人類VH基因區段)、一或多個未經重排免疫球蛋白重鏈DH基因區段及一或多個未經重排免疫球蛋白重鏈JH基因區段，
視情況地其中一或多個未經重排免疫球蛋白重鏈DH基因區段及一或多個未經重排免疫球蛋白重鏈JH基因區段為一或多個未經重排人類免疫球蛋白重鏈DH基因區段(例如，所有功能性人類DH基因區段)及/或一或多個未經重排人類免疫球蛋白重鏈JH基因區段(例如，所有功能性人類JH基因區段)；
(ii)受限的未經重排人類(化)重鏈可變區可操作連接至內源性重鏈恆定區，其中受限的未經重排人類(化)重鏈可變區基本上由與一或多個未經重排免疫球蛋白DH重鏈基因區段及一或多個未經重排免疫球蛋白重鏈JH基因區段可操作地連接之單一未經重排人類重鏈可變區VH基因區段組成，視情況地其中一或多個未經重排免 疫球蛋白DH重鏈基因區段及一或多個未經重排免疫球蛋白重鏈JH基因區段分別為一或多個未經重排人類免疫球蛋白重鏈基DH因區段及/或一或多個未經重排人類免疫球蛋白重鏈JH基因區段；
(iii)經組胺酸修飾之未經重排人類(化)重鏈可變區可操作連接至內源性重鏈恆定區，其中經組胺酸修飾之未經重排人類(化)重鏈可變區包含未經重排免疫球蛋白重鏈可變基因序列，該未經重排免疫球蛋白重鏈可變基因序列在互補決定區3(CDR3)編碼序列中包含至少一個非組胺酸密碼子經組胺酸密碼子之取代或至少一個組胺酸密碼子之插入；
(iv)包含未經重排人類(化)重鏈可變區之僅重鏈免疫球蛋白編碼序列可操作連接至內源性重鏈恆定區，其中內源性重鏈恆定區包含(1)編碼與輕鏈締合之IgM同型的完整內源性IgM基因及(2)缺少編碼功能性CH1域之序列的非IgM基因，例如IgG基因，其中非IgM基因編碼缺少CH1域之非IgM同型，該域能夠與輕鏈恆定域共價締合；
及/或
(b)在內源性輕鏈基因座處：
(i)未經重排人類(化)免疫球蛋白輕鏈可變區可操作連接至內源性輕鏈恆定區，其中未經重排人類(化)免疫球蛋白輕鏈可變區包含複數個未經重排人類輕鏈可變區VL基因區段(例如，所有功能性人類未經重排人類VL基因區段)及一或多個未經重排免疫球蛋白輕鏈JL基因區段，
視情況地其中一或多個未經重排免疫球蛋白輕鏈JL基因區段為一或多個未經重排人類免疫球蛋白輕鏈JL基因區段(例如，所有功能性人類JHL基因區段)，
視情況地其中內源性免疫球蛋白輕鏈基因座為內源性免疫球蛋白輕鏈κ(κ)基因座，未經重排人類(化)免疫球蛋白輕鏈可變區包含人類可變κ(Vκ)及接合κ(Jκ)基因區段，且其中內源性輕鏈恆定區為內源性κ鏈恆定區序列及/或其中內源性免疫球蛋白輕鏈基 因座為內源性免疫球蛋白輕鏈λ(λ)，未經重排人類(化)免疫球蛋白輕鏈可變區包含人類可變λ(Vλ)及接合λ(Jλ)基因區段，且內源性輕鏈恆定區為內源性λ鏈恆定區序列，視情況地其中內源性免疫球蛋白輕鏈λ基因座包含(a)一或多個人類Vλ基因區段、(b)一或多個人類Jλ基因區段，及(c)一或多個人類Cλ基因區段，其中(a)及(b)可操作地連接至(c)及嚙齒動物免疫球蛋白輕鏈恆定Cλ)基因區段，且其中內源性免疫球蛋白λ輕鏈基因座進一步包含：一或多個嚙齒動物免疫球蛋白λ輕鏈增強子(Eλ)，及一或多個人類免疫球蛋白λ輕鏈增強子(Eλ)，視情況地包含三個人類Eλ；
(ii)包含經重排人類(化)輕鏈可變區序列之共同輕鏈編碼序列可操作連接至內源性輕鏈恆定區，其中經重排人類(化)輕鏈可變區序列包含與免疫球蛋白輕鏈JL基因區段重排的人類輕鏈可變區VL基因區段；
(iii)受限的未經重排人類(化)輕鏈可變區可操作連接至內源性輕鏈恆定區，其中受限的未經重排人類(化)輕鏈可變區包含可操作地連接至一或多個未經重排人類免疫球蛋白輕鏈接合(JL)基因區段的不超過兩個未經重排人類免疫球蛋白輕鏈可變(VL)基因區段；
(iv)經組胺酸修飾之未經重排人類(化)輕鏈可變區可操作連接至內源性輕鏈恆定區，其中經組胺酸修飾之未經重排人類(化)輕鏈可變區包含未經重排人類(化)免疫球蛋白輕鏈可變基因序列，該未經重排免疫球蛋白輕鏈可變基因序列在互補決定區3(CDR3)編碼序列中包含至少一個非組胺酸密碼子經組胺酸密碼子之取代或至少一個組胺酸密碼子之插入；或
(v)經組胺酸修飾之經重排人類(化)輕鏈可變區可操作連接至內源性輕鏈恆定區，其中經組胺酸修飾之經重排人類(化)輕鏈可變區包含經重排人類(化)免疫球蛋白輕鏈可變基因序列，該經重排人類(化)免疫球蛋白輕鏈可變基因序列在互補決定區3(CDR3)編碼序列中包含至少一個非組胺酸密碼子經組胺酸密碼子之取代或至少一個組胺酸密碼子之插入， 視情況地其中小鼠進一步包含
(i)人類(化)免疫球蛋白重鏈基因座，其包含功能性ADAM6基因以使得小鼠展現非人類動物之野生型生育力；及/或
(ii)用於增加抗原受體多樣性之外源性末端去氧核苷酸轉移酶(TdT)基因，視情況地使得至少10%之經重排可變區基因包含非模板添加物，該等小鼠在前文已描述。參見，例如，美國專利第8,697,940號；第8,754,287號；第9,204,624號；第9,334,334號；第9,801,362號；第9,332,742號；及第9,516,868號；及美國專利公開案20110195454、20120021409、20120192300、20130045492、20150289489、20180125043、20180244804；PCT公開案第WO2019/113065號、第WO2017210586號及第WO2011163314號；Lee等人，(2014)Nature Biotechnology 32：356，其中之每一者以全文引用的方式併入本文中。
在一些具體例中，本發明包括經基因修飾之非人類動物，其基因組，例如生殖系基因組包含：
包含免疫球蛋白重鏈可變區之內源性免疫球蛋白基因座，該免疫球蛋白重鏈可變區包含人類VH基因區段、本發明之人類經改造DH基因區段及人類JH基因區段，其中免疫球蛋白重鏈可變區可操作地連接至恆定區，及/或
包含免疫球蛋白輕鏈可變區之內源性鏈基因座，該免疫球蛋白輕鏈可變區包含人類VL基因區段及人類JL基因區段，其中免疫球蛋白輕鏈可變區可操作地連接至恆定區。
在一些具體例中，非人類動物，例如嚙齒動物，例如大鼠或小鼠，在其基因組中包含：在內源性免疫球蛋白重鏈基因座處一或多個內源性VH、DH及JH區段經一或多個人類VH、DH及JH區段之置換，其中一或多個人類VH、DH及JH區段包含可操作地連接至23聚體RSS之人類DH基因區段，且可操作地連接至內源性免疫球蛋白重鏈基因；且視情況地未經重排或經重排人類VL及人類JL區段可操作地 連接至例如在內源性非人類輕鏈基因座處的非人類(例如嚙齒動物，例如小鼠或大鼠)或人類免疫球蛋白輕鏈恆定(CL)區基因。
在某些具體例中，經基因修飾之非人類動物在其基因組(例如生殖系基因組)中亦包含含有免疫球蛋白可變區(其包含包括經改造DH區之一或多個未經重排人類免疫球蛋白可變區基因區段)及免疫球蛋白恆定區(其包含免疫球蛋白恆定區基因)之免疫球蛋白基因座(外源性或內源性)且其中一或多個未經重排人類免疫球蛋白可變區基因區段可操作地連接至免疫球蛋白恆定區基因。
一般而言，經基因修飾之免疫球蛋白基因座包含可操作地連接至免疫球蛋白恆定區的免疫球蛋白可變區(包含免疫球蛋白可變區基因區段)。在一些具體例中，經基因修飾之免疫球蛋白基因座包含可操作地連接至重鏈恆定區基因的一或多個人類未經重排免疫球蛋白重鏈可變區基因區段，其包括經改造DH區。在一些具體例中，經基因修飾之免疫球蛋白基因座包含可操作地連接至κ鏈恆定區基因的人類未經重排免疫球蛋白可變區κ基因區段。在一些具體例中，經基因修飾之免疫球蛋白基因座包含可操作地連接至κ鏈恆定區基因的人類未經重排免疫球蛋白可變區λ基因區段。在一些具體例中，經基因修飾之免疫球蛋白基因座包含可操作地連接至λ鏈恆定區基因的人類未經重排免疫球蛋白可變區λ基因區段。
在某些具體例中，非人類動物在內源性重鏈基因座處包含可操作連接至內源性重鏈恆定區之包含經改造DH區的未經重排人類(化)免疫球蛋白重鏈可變區，其中免疫球蛋白可變區含有一或多個未經重排人類Ig重鏈可變區基因區段。在一些具體例中，一或多個未經重排人類Ig可變區基因區段包含至少一個人類免疫球蛋白重鏈可變(VH)區段、一或多個免疫球蛋白重鏈多樣性(DH)區段(例如，可操作地連接至23聚體RSS之一或多個未經重排人類DH區段)及一或多個免疫球蛋白重鏈接合(JH)區段(視情況地一或多個未經重排人類JH區段)。在一些具體例中，未經重排人類Ig可變區基因區段包含複數個未經重排人類VH區段、一或多個未經重排(人類)DH區段(例如，可操作地連接 至23聚體RSS之一或多個未經重排(人類)DH區段)及一或多個未經重排(人類)JH區段。在一些具體例中，未經重排人類Ig可變區基因區段包含至少3個VH基因區段、至少18個VH基因區段、至少20個VH基因區段、至少30個VH基因區段、至少40個VH基因區段、至少50個VH基因區段、至少60個VH基因區段、至少70個VH基因區段，或至少80個VH基因區段。在一些具體例中，未經重排人類Ig基因區段包括所有功能性人類DH基因區段，其中功能性人類DH基因區段中之至少一者經修飾以可操作地連接至23聚體RSS。在一些具體例中，未經重排人類Ig基因區段包括所有功能性人類JH基因區段。提供包含Ig重鏈基因區段之例示性可變區，例如Macdonald等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 111：5147-52及補充信息中，其以全文引用的方式併入本文中。
在一些具體例中，本文所提供之非人類動物在內源性重鏈基因座處包含可操作連接至包含至少一個非人類IgM基因之內源性重鏈恆定區的受限的未經重排人類(化)重鏈可變區，其中受限的未經重排人類(化)重鏈可變區之特徵在於單一人類VH基因區段、複數個DH基因區段(例如，人類DH基因區段，包括可操作地連接至23聚體RSS之一或多個未經重排(人類)DH區段)及複數個JH基因區段(例如人類JH基因區段)，其中受限的免疫球蛋白重鏈基因座能夠重排且形成複數個不同的重排，其中各重排來源於單一人類VH基因區段、DH區段中之一者及JH區段中之一者，且其中各重排編碼不同的重鏈可變域(例如，如美國專利公開案第20130096287號中所描述，其以全文引用的方式併入本文中)。在一些具體例中，單一人類VH基因區段為VH1-2或VH1-69。
在一些具體例中，非人類動物在內源性輕鏈基因座處包含可操作連接至內源性輕鏈恆定區的未經重排人類(化)免疫球蛋白輕鏈可變區。在一些具體例中，未經重排人類(化)免疫球蛋白輕鏈可變區含有未經重排人類Ig κ可變區基因區段。在一些具體例中，未經重排人類(化)免疫球蛋白可變區包含複數個未經重排人類Vκ區段及一或多 個未經重排人類Jκ區段。在一些具體例中，未經重排人類免疫球蛋白可變區基因區段包含所有人類Jκ區段。在一些具體例中，免疫球蛋白可變區基因區段包含四個Vκ功能性區段及所有人類Jκ區段。在一些具體例中，免疫球蛋白可變區基因區段包含16個功能性Vκ區段及所有人類Jκ區段(例如，所有功能性人類Vκ區段及Jκ區段)。在一些具體例中，未經重排人類免疫球蛋白可變區基因區段包含所有人類Vκ區段及所有人類Jκ區段。提供包含Ig κ基因區段之例示性可變區，例如Macdonald等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1 11：5147-52及補充信息中，其以全文引用的方式併入本文中。
在一些具體例中，可操作連接至內源性輕鏈恆定區之受限的未經重排人類(化)輕鏈可變區之特徵在於未經重排人類(化)輕鏈可變區包含不超過兩個人類VL基因區段及複數個JL基因區段(例如，雙輕鏈小鼠或DLC，如美國專利案第9,796,788號中所描述，其以全文引用的方式併入本文中)。在一些具體例中，VL基因區段為Vκ基因區段。在一些具體例中，VL基因區段為Vλ基因區段。在一些具體例中，Vκ基因區段為IGKV3-20及IGKV1-39。在一些具體例中，非人類動物包含恰好兩個未經重排人類Vκ基因區段及在小鼠之內源性κ輕鏈基因座處可操作地連接至小鼠輕鏈恆定區的五個未經重排人類Jκ基因區段，視情況地其中恰好兩個未經重排人類Vκ基因區段為人類Vκ1-39基因區段及人類Vκ3-20基因區段，其中五個未經重排人類Jκ基因區段為人類Jκ1基因區段、人類Jκ2基因區段、人類Jκ3基因區段、人類Jκ4基因區段及人類Jκ5基因區段，其中未經重排人類κ輕鏈基因區段能夠重排且編碼抗體之人類可變域，且視情況地另外其中非人類動物不包含能夠重排以形成免疫球蛋白輕鏈可變區的內源性Vκ基因區段。
在某些具體例中，可操作連接至內源性輕鏈恆定區的未經重排人類(化)免疫球蛋白輕鏈可變區含有未經重排人類Igλ可變區基因區段。在一些具體例中，未經重排人類免疫球蛋白可變區基因區段包含複數個人類Vλ區段及一或多個人類Jλ區段。在一些具體例中，未經重排人類免疫球蛋白可變區基因區段包含一或多個人類Vλ區 段、一或多個人類Jλ區段及一或多個人類Cλ恆定區序列。在一些具體例中，未經重排人類免疫球蛋白可變區基因區段包含所有人類Vλ區段。在一些具體例中，未經重排人類免疫球蛋白可變區基因區段包含所有人類Jλ區段。提供包含Igλ基因區段之例示性可變區，例如美國專利第9,035,128號及第6,998,514號，其中之每一者以全文引用的方式併入本文中。在一些具體例中，可操作連接至內源性輕鏈恆定區的未經重排人類(化)免疫球蛋白輕鏈可變區包含(a)一或多個人類Vλ基因區段、(b)一或多個人類Jλ基因區段及(c)一或多個人類Cλ基因區段，其中(a)及(b)可操作地連接至(c)及內源性(例如，嚙齒動物)Cλ基因區段，且其中內源性免疫球蛋白λ輕鏈基因座進一步包含：一或多個嚙齒動物免疫球蛋白λ輕鏈增強子(Eλ)及一或多個人類免疫球蛋白λ輕鏈增強子(Eλ)，視情況地包含三個人類Eλ。
在某些具體例中，可操作連接至內源性輕鏈恆定區的未經重排人類(化)免疫球蛋白輕鏈可變區包含可操作地連接至內源性(例如，嚙齒動物，例如大鼠或小鼠)Cκ基因以使得非人類動物表現免疫球蛋白輕鏈的未經重排人類Igλ可變區基因區段，該免疫球蛋白輕鏈包含衍生自與內源性κ恆定域融合之Vλ及Jλ基因區段的人類λ可變域序列，參見例如美國專利第9,226,484號，其以全文引用的方式併入本文中。
在一些具體例中，包含未經重排人類免疫球蛋白可變區基因區段之免疫球蛋白可變區亦包括人類免疫球蛋白可變區基因間序列。在一些具體例中，免疫球蛋白可變區包括非人類(例如，嚙齒動物、大鼠、小鼠)Ig可變區基因間序列。在一些具體例中，基因間序列具有內源性物種來源。
在一些具體例中，免疫球蛋白可變區為經重排輕鏈可變區(通用輕鏈可變區)。在一些具體例中，經重排Ig輕鏈可變區基因為人類經重排Ig輕鏈可變區基因。例示性經重排Ig輕鏈可變區提供於例如美國專利第9,969,814號；第10,130,181號及第10,143,186號及美國專利公開案第20120021409號、第20120192300號、第20130045492 號、第20130185821號、第20130302836號及第20150313193號中，其中之每一者以全文引用的方式併入本文中。在一些具體例中，包含通用輕鏈可變區之非人類生物體(「通用輕鏈」生物體)用以產生雙特異性抗體。在一些具體例中，共同輕鏈編碼序列包含可操作地連接至內源性輕鏈恆定區的單一經重排人類免疫球蛋白輕鏈Vκ/Jκ序列，其中單一經重排人類免疫球蛋白輕鏈Vκ/Jκ序列為(i)包含融合至人類Jκ5基因區段之人類Vκ1-39基因區段的人類Vκ1-39/Jκ5序列，或(ii)包含融合至人類Jκ1基因區段之人類Vκ3-20基因區段的人類Vκ3-20/Jκ1序列。
在一些具體例中，免疫球蛋白可變區為包括經設計以將pH值依賴性結合特性引入至此類非人類生物體中所產生之抗體中的組胺酸密碼子之插入及/或置換的輕鏈及/或重鏈免疫球蛋白可變區。在此類具體例中之一些中，組胺酸密碼子在編碼CDR3之核酸序列中經插入及/或置換。各種此類輕鏈及/或重鏈免疫球蛋白基因座提供於美國專利第9,301,510號；第9,334,334號；及第9,801,362號及美國專利申請公開案第20140013456號中，其中之每一者以全文引用的方式併入本文中。在一些具體例中，可操作連接至內源性輕鏈恆定區之經組胺酸修飾之經重排人類(化)輕鏈可變區包含包含人類Vκ及Jκ區段序列的單一經重排人類免疫球蛋白輕鏈可變區基因序列，視情況地其中Vκ區段序列衍生自人類Vκ1-39或Vκ3-20基因區段，且其中單一經重排人類免疫球蛋白輕鏈可變區基因序列包含Vκ區段序列之至少一個非組胺酸密碼子經在選自由以下組成之群的位置處表現的組胺酸密碼子之取代：105、106、107、108、109、111及其組合(根據IMGT編號)。在一些具體例中，可操作連接至內源性重鏈恆定區的經組胺酸修飾之未經重排人類(化)重鏈可變區包含未經重排人類(化)免疫球蛋白重鏈可變基因序列，該未經重排人類(化)免疫球蛋白重鏈可變基因序列在互補決定區3(CDR3)編碼序列中(例如，在經修飾以可操作地連接至23聚體RSS之(人類)DH基因區段中)包含至少一個非組胺酸密碼子經組胺酸密碼子之取代或至少一個組胺酸密碼子之插入。在一些具體例 中，未經重排人類(化)免疫球蛋白重鏈可變包含未經重排人類VH、未經重排人類DH或包括可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段的合成DH，及未經重排人類JH基因區段，視情況地其中未經重排人類DH或合成DH基因區段或可操作地連接至23聚體RSS之DH基因區段包含至少一個非組胺酸密碼子經組胺酸密碼子之取代或至少一個組胺酸密碼子之插入。在某些具體例中，可操作連接至內源性重鏈恆定區的經組胺酸修飾之未經重排人類(化)免疫球蛋白輕鏈可變區包含未經重排VL及未經重排JL基因區段。在一些具體例中，經組胺酸修飾之未經重排人類(化)輕鏈可變區包含不超過兩個未經重排人類VL(例如，不超過兩個Vκ基因區段)及一或多個未經重排人類JL(例如，Jκ)基因區段，其中不超過兩個人類VL基因區段中之每一者在CDR3編碼序列中包含至少一個非組胺酸密碼子經組胺酸密碼子之取代或至少一個組胺酸密碼子之插入。在一些具體例中，不超過兩個未經重排人類Vκ基因區段為各自包含非組胺酸密碼子經組胺酸密碼子之一或多個取代的人類Vκ1-39及Vκ3-20基因區段，且其中人類Vκ及Jκ基因區段能夠重排且人類Vκ及Jκ基因區段編碼在選自由以下組成之群的位置處包含一或多個組胺酸的人類輕鏈可變域：105、106、107、108、109、111(根據IGMT編號)及其組合，其中一或多個組胺酸衍生自一或多個取代。
在一些具體例中，免疫球蛋白恆定區包含重鏈恆定區基因。在一些具體例中，重鏈恆定區基因為人類重鏈恆定區基因。在一些具體例中，重鏈恆定區基因具有內源性物種來源。在一些具體例中，重鏈恆定區基因為小鼠恆定區基因或大鼠恆定區基因。在一些具體例中，恆定區基因為人類及非人類序列之混合物。舉例而言，在一些具體例中，恆定區基因編碼人類CH1區及非人類(例如，內源性物種來源，小鼠、大鼠)CH2及/或CH3區。在一些具體例中，重鏈恆定區基因為Cμ、Cδ、Cγ(Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4)、Cα或Cε恆定區基因。在一些具體例中，恆定區基因為內源性恆定區基因。在一些具體例中，恆定區基因編碼突變的CH1區以使得非人類動物表現僅重鏈抗體(參見，例如美國專利第8,754,287號、美國專利申請公開案第2015/0289489 號，其中之每一者以全文引用的方式併入本文中)。在一些具體例中，例如在目標為產生製造雙特異性抗體之重鏈(例如，在通用或雙輕鏈生物體中)時，重鏈之Fc域包含修飾以促進重鏈雜二聚體形成及/或抑制重鏈均二聚體形成。此類修飾提供於例如美國專利第5,731,168號；第5,807,706號；第5,821,333號；第7,642,228號及第8,679,785號及美國專利公開案第2013/0195849號中，其中之每一者以全文引用的方式併入本文中。
在一些具體例中，免疫球蛋白恆定區包含輕鏈恆定區基因。在一些具體例中，輕鏈恆定區基因為κ恆定區基因。在一些具體例中，輕鏈恆定區基因為λ恆定區基因。在一些具體例中，輕鏈恆定區基因具有內源性物種來源。在一些具體例中，輕鏈恆定區基因為小鼠恆定區基因或大鼠恆定區基因。在一些具體例中，輕鏈恆定區基因為人類及非人類序列之混合物。
在一些具體例中，包含人類可變區基因區段及與可變區基因區段可操作地連接之免疫球蛋白恆定區基因的免疫球蛋白可變區位於內源性免疫球蛋白基因座處。在一些具體例中，內源性免疫球蛋白基因座為內源性重鏈基因座。在一些具體例中，內源性免疫球蛋白基因座為內源性κ基因座。在一些具體例中，內源性免疫球蛋白基因座為內源性λ基因座。在一些具體例中，與人類可變區基因區段可操作地連接之恆定區基因為內源性恆定區基因。
在一些具體例中，本文所提供之非人類動物之基因組中的內源性免疫球蛋白基因座中之一或多者或一或多個內源性基因座之部分(例如，可變區及/或恆定區)失活。內源性免疫球蛋白可變區基因座及其部分可使用本技藝中已知的任何方法失活，該方法包括(但不限於)自生物體之基因組中刪除基因座或其部分、基因座或其部分經不同核酸序列之置換、基因座之部分逆轉及/或基因座之部分移位至非人類生物體之基因組中的其他位置。在一些具體例中，基因座之失活僅為部分失活。在一些具體例中，基因座之可變區失活但恆定區仍具有功能性(例如，此係因為其可操作地連接至非內源性可變區基因區段)。
在一些具體例中，經基因修飾之非人類動物包括失活內源性免疫球蛋白重鏈基因座。在一些具體例中，內源性免疫球蛋白重鏈基因座或其部分藉由內源性重鏈基因座之內源性可變區之至少部分的刪除、置換、移位及/或逆轉來失活。在一些具體例中，經刪除、置換、移位及/或逆轉之內源性重鏈基因座之可變區的至少部分包含可變區之J區段。在一些具體例中，內源性免疫球蛋白重鏈基因座或其部分藉由內源性重鏈基因座之內源性恆定區之至少部分的刪除、置換、移位及/或逆轉來失活。在一些具體例中，經刪除、置換、移位及/或逆轉之內源性重鏈基因座之恆定區的至少部分包含內源性恆定區之Oμ基因。
在一些具體例中，經基因修飾之非人類動物包括失活內源性免疫球蛋白κ鏈基因座。在一些具體例中，內源性免疫球蛋白κ鏈基因座或其部分藉由內源性κ鏈基因座之內源性可變區之至少部分的刪除、置換、移位及/或逆轉來失活。在一些具體例中，經刪除、置換、移位及/或逆轉之內源性κ鏈基因座之可變區的至少部分包含可變區之J區段。在一些具體例中，內源性免疫球蛋白κ鏈基因座或其部分藉由內源性κ鏈基因座之內源性恆定區之至少部分的刪除、置換、移位及/或逆轉來失活。在一些具體例中，經刪除、置換、移位及/或逆轉的內源性κ鏈基因座之恆定區之至少部分包含內源性恆定區之Cκ基因。
在一些具體例中，經基因修飾之非人類動物包括失活內源性免疫球蛋白λ鏈基因座。在一些具體例中，內源性免疫球蛋白λ鏈基因座或其部分藉由內源性λ鏈基因座之內源性可變區之至少部分的刪除、置換、移位及/或逆轉來失活。在一些具體例中，內源性λ鏈基因座中之至少一個V-J-C基因簇之至少部分經刪除、置換、移位及/或逆轉。在一些具體例中，內源性免疫球蛋白λ鏈基因座或其部分藉由內源性λ鏈基因座之內源性恆定區之至少部分的刪除、置換、移位及/或逆轉來失活。在一些具體例中，經刪除、置換、移位及/或逆轉的內源性λ鏈基因座之恆定區之至少部分包含內源性恆定區之C基因。
在各種具體例中，免疫球蛋白基因座修飾並不影響非人類動物之生育力。在一些具體例中，重鏈基因座包含功能性，例如內源性ADAM6a基因、ADAM6b基因或兩者，且基因修飾不影響內源性ADAM6a基因、ADAM6b基因或兩者之表現及/或功能。在一些具體例中，經基因修飾之非人類動物之基因組進一步包含異位定位功能性，例如內源性ADAM6a基因、ADAM6b基因或兩者。表現外源性ADAM6a及/或ADAM6b之例示性非人類動物描述於美國專利第8,642,835號及第8,697,940號中，其中之每一者以全文引用的方式併入本文中。
在一些具體例中，經基因修飾之非人類動物進一步包含且表現用於增加抗原受體多樣性的外源性末端去氧核苷酸轉移酶(TdT)。表現外源性TdT之例示性非人類動物描述於PCT公開案WO 2017210586中，其以全文引用的方式併入本文中。
在一些具體例中，所提供之非人類動物的基因組進一步包含一或多個人類免疫球蛋白重鏈及/或輕鏈基因(參見例如美國專利第8,502,018號；美國專利第8,642,835號；美國專利第8,697,940號；美國專利第8,791,323號；及美國專利申請公開案第2013/0096287 A1號及第2018/0125043 A1號；及PCT公開案第WO2019/113065號，其中之每一者以全文引用的方式併入本文中)。可替代地，經改造DH區可引入至不同經修飾品系之胚胎幹細胞中，該品系例如VELOCIMMUNE®品系(參見例如美國專利第8,502,018號或美國專利第8,642,835號；其以全文引用的方式併入本文中)。在一些具體例中，如本文所述之非人類動物可藉由將如本文所述之靶向載體引入至來自經修飾品系的細胞中而製備。僅給出一個實例，如本文所述之靶向載體可引入至如美國專利第8,642,835號及第8,697,940號中所描述之非人類動物中；該等專利以全文引用的方式併入本文中，該非人類動物表現具有完全人類可變區及小鼠恆定區之抗體。在一些具體例中，製備如本文所述之非人類動物，以進一步包含人類免疫球蛋白基因(可變區及/或恆定區基因)。在一些具體例中，如本文所述之非人類動物包含 如本文所述之經改造DH區，及來自異源性物種(例如，人類)的遺傳物質，其中該遺傳物質(全部或部分)編碼一或多個人類重鏈及/或輕鏈可變區。
如本文所述之非人類動物可如上文所述製備，或使用本技藝中已知的方法製備，以包含額外人類或人類化基因，通常取決於非人類動物之預期用途。此類額外人類或人類化基因之遺傳物質，可經由進一步改變具有如上所述之基因修飾的細胞(例如，胚胎幹細胞)基因組，或按需要利用其他經基因修飾品系經由本技藝中已知的育種技術引入。
舉例而言，如本文所述，包含經改造DH區之非人類動物可進一步包含(例如，經由雜交育種法或多基因靶向策略)一或多種修飾，如美國專利申請公開案第2011-0195454 A1號、第2012-0021409 A1號、第2012-0192300 A1號、第2013-0045492 A1號、第2013-0185821 A1號、第2013-0198880 A1號、第2013-0302836 A1號、第2015-0059009 A1號；國際專利申請公開案第WO 2011/097603號、第WO 2012/148873號、第WO 2013/134263號、第WO 2013/184761號、第WO 2014/160179號、第WO 2014/160202號所描述；其皆以全文引用的方式併入本文中。
基因轉殖創始者(founder)非人類動物可根據以下鑑別：在其基因組中存在經改造DH區及/或表現包括含有由非人類動物組織或細胞中DH-DH重組產生之胺基酸之CDR3區的抗體。基因轉殖創始者非人類動物可隨後用於生育攜載經改造DH區之其他非人類動物，藉此產生各自攜載經改造DH區之一或多個複本的一系列非人類動物。此外，攜載經改造DH區之基因轉殖非人類動物可按需要進一步培育成攜載其他轉殖基因(例如，人類免疫球蛋白基因)之其他基因轉殖非人類動物。
亦可產生含有所選系統之基因轉殖非人類動物，該等系統允許轉殖基因之經調控或經導向表現。例示性系統包括噬菌體P1之Cre/loxP重組酶系統(參見，例如，Lakso,M.等人，1992,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89：6232-6236，其以全文引用的方式併入)，及釀酒酵母(S. cerevisiae)之FLP/Frt重組酶系統(O'Gorman,S.等人，1991,Science 251：1351-1355；其中之每一者以全文引用的方式併入)。此類動物可經由建構「雙」基因轉殖動物來提供，例如藉由使兩種基因轉殖動物交配，一種基因轉殖動物含有包含所選修飾(例如，經改造DH區)之轉殖基因，且另一種基因轉殖動物含有編碼重組酶(例如，Cre重組酶)之轉殖基因。
儘管在小鼠中採用經改造DH區(亦即，具有與人類VH及JH基因區段可操作地連接之經改造DH區的小鼠，該等人類基因區段皆與一或多個鼠類重鏈恆定區基因可操作地連接)之具體例在本文中充分論述，但亦提供包含經改造DH區之其他非人類動物。在一些具體例中，此類非人類動物包含可操作地連接至內源性VH及JH基因區段之經改造DH區。在一些具體例中，此類非人類動物包含可操作地連接至人類化VH及JH基因區段之經改造DH區。此類非人類動物包括可經基因修飾以表現抗體之非人類動物中之任一者，該等抗體具有包括由如本文所揭示之相比於野生型免疫球蛋白重鏈基因座，以提高之頻率進行DH-DH重組產生之胺基酸的CDR3，該等非人類動物包括例如哺乳動物，例如，小鼠、大鼠、家兔、豬、牛類動物(例如，乳牛、公牛、水牛)、鹿、綿羊、山羊、雞、貓、犬、雪貂、靈長類動物(例如，狨猴、恆河猴)等。舉例而言，對於不容易獲得適合的可基因修飾之ES細胞的非人類動物，採用其他方法製備包含該基因修飾的非人類動物。此類方法包括，例如，修飾非ES細胞基因組(例如，纖維母細胞或誘導多能細胞)，且採用體細胞核轉移(SCNT)將經基因修飾之基因組轉移至適合細胞中，例如去核卵母細胞，且在適合條件下，於非人類動物中孕育該經修飾細胞(例如，經修飾卵母細胞)，以形成胚胎。
用於修飾非人類動物基因組(例如，豬、乳牛、囓齒動物、雞等)之方法包括例如採用鋅指核酸酶(ZFN)、類轉錄活化因子效應子核酸酶(TALEN)，或Cas蛋白(亦即，CRISPR/Cas系統)，來修飾基因組以包括如本文所述之經改造DH區。用於修飾非人類動物之生殖系基因組的方法指南，可見於例如美國專利申請公開案第2015-0376628 A1 號、第US 2016-0145646 A1號及第US 2016-0177339 A1號中；其以全文引用的方式併入本文中。
在一些具體例中，如本文所述之非人類動物為哺乳動物。在一些具體例中，如本文所述之非人類動物為小型哺乳動物，例如跳鼠(Dipodoidea)或鼠(Muroidea)總科。在一些具體例中，如本文所述之經基因修飾動物為囓齒動物。在一些具體例中，如本文所述之囓齒動物選自小鼠、大鼠及倉鼠。在一些具體例中，如本文所述之囓齒動物選自鼠總科。在一些具體例中，如本文所述之經基因修飾動物選自麗倉鼠(Calomyscidae)(例如，類似小鼠之倉鼠)、倉鼠科(Cricetidae)(例如，倉鼠、新世界大鼠及小鼠、田鼠)、鼠科(Muridae)(真小鼠及大鼠、沙鼠、刺毛鼠(spiny mice)、鬃鼠(crested rat))、非洲攀鼠亞科(Nesomyidae)(攀鼠、岩攀鼠、有尾大鼠、馬達加斯加大鼠及小鼠)、刺睡鼠科(Platacanthomyidae)(例如，刺睡鼠(spiny dormice))及鼴形鼠科(Spalacidae)(例如，鼴鼠、竹鼠及鼢鼠(zokor))。在一些具體例中，如本文所述之經基因修飾囓齒動物選自真小鼠或大鼠(鼠科)、沙鼠、刺毛鼠及鬃鼠。在一些具體例中，如本文所述之經基因修飾小鼠為來自鼠科之成員。在一些具體例中，如本文所述之非人類動物為囓齒動物。在一些具體例中，如本文所述之囓齒動物選自小鼠及大鼠。在一些具體例中，如本文所述之非人類動物為小鼠。
在一些具體例中，如本文所述之非人類動物為囓齒動物，其為C57BL品系小鼠，選自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr及C57BL/Ola。在一些具體例中，本發明之小鼠為選自由為以下品系組成之群的129品系，：129P1、129P2、129P3、129X1、129S1(例如，129S1/SV、129S1/SvIm)、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129/SvJae、129S6(129/SvEvTac)、129S7、129S8、129T1、129T2(參見例如Festing等人，1999,Mammalian Genome 10：836；Auerbach,W.等人，2000,Biotechniques 29(5)：1024-1028,1030,1032；其以全文引用的方式併入本文中)。在一 些具體例中，如本文所述之經基因修飾小鼠為前述129品系與前述C57BL/6品系的混合。在一些具體例中，如本文所述之小鼠為前述129品系之混合，或前述BL/6品系之混合。在一些具體例中，如本文所述之混合中的129品系為129S6(129/SvEvTac)品系。在一些具體例中，如本文所述之小鼠為BALB品系，例如BALB/c品系。在一些具體例中，如本文所述之小鼠為BALB品系與另一前述品系的混合。
在一些具體例中，如本文所述之非人類動物為大鼠。在一些具體例中，如本文所述之大鼠選自韋斯(Wistar)大鼠、LEA品系、史-道二氏(Sprague Dawley)品系、費雪(Fischer)品系、F344、F6及Dark Agouti。在一些具體例中，如本文所述之大鼠品系選自由以下組成之群的二或更多種品系的混合：韋斯、LEA、史-道二氏、費雪、F344、F6及Dark Agouti。
方法
針對產生基於抗體之治療劑，已開發出數種活體外及活體內技術。特定而言，活體內技術之特徵在於產生含有人類免疫球蛋白基因的基因轉殖動物(亦即，嚙齒動物)，該等基因隨機併入至動物基因組中(例如，參見美國專利第5,569,825號，其以全文引用的方式併入)，或精確置放於內源性免疫球蛋白基因座處，與動物之與內源性免疫球蛋白恆定區可操作地連接(例如，參見美國專利第8,502,018號；第8,642,835號；第8,697,940號；及第8,791,323號；其中之每一者以全文引用的方式併入)。二種方法均有成效地產生供在人類中使用之有前景的抗體治療性候選物。此外，二種方法均具有優於活體外方法之優點，此係因為抗體候選物選自活體內產生之抗體譜系，其包括對針對宿主之免疫系統之內部環境內之抗原的親和力及特異性進行選擇。以此方式，抗體結合至天然呈遞抗原(在相關生物表位及表面內)，而非可伴隨活體外技術之人工環境或電腦預測。儘管由活體內技術產生穩健抗體譜系，但產生針對複合物(例如，病毒、通道多肽)或細胞質抗原之抗體仍然困難。此外，歸因於免疫耐受，產生針對在物種(例如，人類及小鼠)之間共有高度序列一致性之多肽的抗體仍然具有挑戰性。
因此，本發明尤其基於以下認識：特徵在於產生在CDR，尤其CDR3中具有由非傳統基因區段重排(亦即，DH至DH重組)產生之所添加多樣性之抗體的活體內系統之構築，可使用各自可操作地連接至5'或3' 23聚體RSS之一或多個DH區段來進行。藉由具有5'或3' 23聚體RSS，DH區段之間的重組相比於缺少此類經改造DH基因區段之免疫球蛋白重鏈基因座得到增加。此類所添加多樣性可引導與特定抗原(例如，病毒、通道多肽)之結合。在VH基因區段、至少二個DH基因區段及JH基因區段重組後，形成重鏈可變區編碼序列，其含有具有由DH至DH重組產生之胺基酸序列的CDR3區。此外，歸因於增加之胺基酸長度，由DH至DH產生之此CDR3含有所添加多樣性。此外，此類CDR3區具有引導與特定抗原(或表位)結合之能力，該尤其抗原原本無法與由傳統VDJ重組產生之抗體結合。
所提供之非人類動物可用於製備人類抗體，其中該人類抗體包含來源於由如本文所述之非人類動物之細胞之遺傳物質編碼的一或多個可變區核酸序列的可變域。舉例而言，在一定條件下所提供之非人類動物經所關注抗原(例如，全部或部分病毒或通道多肽)免疫接種，持續一段時間，該等條件及該時間足以使非人類動物對該所關注抗原產生免疫反應。抗體自非人類動物(或一或多個細胞，例如，一或多個B細胞)分離，且使用各種分析量測，例如親和力、特異性、表位定位、阻斷配位體-受體相互作用之能力、抑制受體活化等表徵。在一些具體例中，由所提供之非人類動物產生的抗體包含一或多個人類可變區，其來源於自非人類動物分離的一或多個人類可變區核苷酸序列。在一些具體例中，在所提供之非人類動物中抗藥物抗體(例如，抗個體基因型抗體)可升高。
如本文所述之非人類動物提供經改良活體內系統及生物材料(例如，細胞)的來源，其用於產生可用於多種分析的人類抗體。在一些具體例中，所提供之非人類動物用於開發治療劑，其靶向一或多種病毒且/或調節病毒活性且/或調節病毒與其他結合配偶體(例如，細胞表面受體)之相互作用。在一些具體例中，所提供之非人類動物用 於開發治療劑，其靶向一或多種通道蛋白且/或調節通道蛋白活性且/或調節通道蛋白與其他結合配偶體之相互作用。在一些具體例中，所提供之非人類動物用於鑑別、篩選及/或開發候選治療劑(例如，抗體、siRNA等)，其結合一或多種病毒、通道或G蛋白偶聯受體(GPCR)多肽。在一些具體例中，所提供之非人類動物用於篩選及開發候選治療劑(例如，抗體、siRNA等)，其阻斷一或多種病毒多肽、一或多種人類通道多肽或一或多種人類GPCR多肽之活性。在一些具體例中，所提供之非人類動物用於確定一或多種人類GPCR多肽或一或多種人類通道多肽之拮抗劑及/或促效劑的結合概況。在一些具體例中，所提供之非人類動物用於確定一或多種候選治療性抗體的表位或表位群，該等抗體結合一或多種人類GPCR多肽或結合一或多種人類通道多肽。
在一些具體例中，所提供之非人類動物用於確定抗體之藥物動力學概況。在一些具體例中，一或多種所提供之非人類動物及一或多種對照或參考非人類動物各自暴露於一或多種候選治療性抗體，該等抗體處於各種劑量(例如，0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.3mg/kg、0.4mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/mg、7.5mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg、25mg/kg、30mg/kg、40mg/kg，或50mg/kg或更高)。候選治療性抗體可經由任何所需的投藥途徑投藥，包括腸胃外及非腸胃外投藥途徑。腸胃外途徑包括例如靜脈內、動脈內、門靜脈內、肌肉內、皮下、腹膜內、脊柱內、鞘內、腦室內、顱內、胸膜內或其他注射途徑。非腸胃外途徑包括例如經口、經鼻、經皮、經肺、經直腸、經頰、經陰道、經眼。投藥亦可經由連續輸注、局部投予、由植入物(凝膠、膜或其類似物)持續釋放，及/或靜脈內注射(例如，使用靜脈內流體袋)。在不同時間點(例如，0小時、6小時、1天、2天、3天、4天、5天、6天、7天、8天、9天、10天、11天，或至多30天或更多天)，自非人類動物(人類化及對照)中分離血液。可使用獲自如本文所述之非人類動物的樣品進行各種分析，以確定所投予之候選治療性抗體的藥物動力學概況，包括(但不限於)，總IgG、抗治療性抗體反應、凝集等。
在一些具體例中，所提供之非人類動物用於量測阻斷或調節靶抗原活性之療效，及由於細胞變化而造成對基因表現的影響，或對如本文所述之非人類動物細胞之靶抗原的細胞表面密度(在細胞表面受體之情況下)的影響。在一些具體例中，所提供之非人類動物或自其分離之細胞暴露於候選治療劑，其結合所關注抗原，且在後續的一段時間後，針對對靶抗原依賴性過程(或相互作用)，例如配位體-受體相互作用或抗原相關信號傳導的影響進行分析。
在一些具體例中，所提供之非人類動物用於量測阻斷或調節通道活性(或通道信號傳導，或通道介導之相互作用，或通道動作電位)之療效，及由於細胞變化而造成對基因表現的影響，或對如本文所述之非人類動物細胞的通道密度的影響。在一些具體例中，所提供之非人類動物或自其分離之細胞暴露於候選治療劑，其結合人類通道多肽(或其部分)，且在後續的一段時間後，針對對通道依賴性過程(或相互作用)，例如配位體-受體相互作用或通道動作電位的影響進行分析。
在一些具體例中，所提供之非人類動物表現抗體，因此可產生細胞、細胞株及細胞培養物，以充當抗體的來源，其用於結合及功能性分析，例如，以分析拮抗劑或促效劑之結合或功能，尤其當該拮抗劑或促效劑對人類多肽序列或表位具特異性，或替代地在配位體-受體相互作用(結合)中起作用之人類多肽序列或表位具特異性時。在一些具體例中，與候選治療性抗體或siRNA結合之表位可使用自所提供之非人類動物分離出的細胞來確定。
在一些具體例中，來自所提供之非人類動物的細胞可經分離，且在特別基底(ad hoc basis)上使用，或可在培養物中維持許多代。在一些具體例中，來自所提供之非人類動物的細胞經永生化(例如，經由使用病毒)，且可無限期地維持在培養物中(例如，在連續培養中)。
在一些具體例中，如本文所述之非人類動物提供活體內系統，其用於產生結合人類靶抗原之抗體變異體。此類變異體包括抗 體，其具有所需功能性、特異性，與由二或更多種人類靶抗原共有之共同表位的低交叉反應性。在一些具體例中，所提供之非人類動物用於產生抗體組，以產生針對所需或改良功能性篩選之一系列抗體變異體。
在一些具體例中，如本文所述之非人類動物提供活體內系統，其用於產生抗體庫。使用本技藝中已知的技術(例如，定點突變誘發、易錯PCR等)，此類庫提供重鏈及輕鏈可變區序列之源，該等序列可基於所需效應功能接枝至不同Fc區上及/或用作可變區序列親和力成熟之源。
在一些具體例中，如本文所述之非人類動物提供活體內系統，其用於分析及測試藥物或疫苗。在一些具體例中，候選藥物或疫苗可遞送至一或多種所提供之非人類動物中，之後監測該等非人類動物，以確定對藥物或疫苗的免疫反應、藥物或疫苗安全性概況中之一或多者，或對疾病或症狀，及/或疾病或病狀的一或多種症狀的效果。用於確定安全性概況之例示性方法包括毒性量測、最佳劑量濃度、抗體(亦即，抗藥物)反應、藥物或疫苗之功效及可能的風險因素。此類藥物或疫苗可在此類非人類動物中改良及/或開發。
疫苗功效可以數種方法量測。簡言之，使用本技藝中已知的方法接種本文所述之非人類動物，且隨後以疫苗刺激，或將疫苗投予至已經感染的非人類動物。非人類動物對疫苗之反應可藉由監測非人類動物(或由其分離出的細胞)及/或對其進行一或多種分析來量測，以確定該疫苗之功效。隨後使用本技藝中已知，及/或本文所述之一或多種措施，將非人類動物對疫苗的反應與對照動物進行比較。
疫苗功效可進一步藉由病毒中和分析來確定。簡言之，如本文所述之非人類動物經免疫接種，且在免疫接種後的不同天收集血清。將血清之連續稀釋液與病毒預培育，在此期間血清中對病毒具特異性的抗體將與其結合。隨後將病毒/血清混合物添加至許可細胞中，以藉由溶菌斑分析或微量中和分析確定感染性。若血清中之抗體中和病毒，則與對照相較，斑塊或相對螢光素酶單位會較少。
如本文所述之非人類動物提供經改良活體內系統，其用於開發及表徵用於癌症及/或發炎性疾病的基於抗體之治療劑。發炎長期以來與癌症相關(評述於例如Grivennikov,S.I.等人，2010,Cell 140：883-99；Rakoff-Nahoum,S.,2006,Yale J.Biol.Med.79：123-30中，其中之每一者以全文引用的方式併入本文中)。實際上，發展中之腫瘤環境之特徵部分在於各種炎性介體之浸潤。此外，持續發炎會導致罹患癌症之機率升高。因此，在一些具體例中，如本文所述之非人類動物提供活體內系統，其用於開發及/或鑑別抗癌及/或抗炎性治療劑。在一些具體例中，所提供之非人類動物或對照非人類動物(例如，具有不同於本文所述之基因修飾，或無基因修飾，亦即，野生型)可植入有腫瘤(或腫瘤細胞)，隨後投予一或多種候選治療劑。在一些具體例中，候選治療劑可包括多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)或抗體混合液(cocktail)。在一些具體例中，候選治療劑包括組合療法，例如投予依序或同時投加的二或更多種單特異性抗體。在投予一或多種候選治療劑之前，可允許腫瘤有足夠的時間，以在非人類動物體內一或多個位置建立。腫瘤細胞增生、生長、存活等可在用(多種)候選治療劑投予之前及之後量測。候選治療劑之細胞毒性亦可按需要在非人類動物中量測。
套組
本發明進一步提供一種包裝或套組，其包含一或多個容器，該等容器填充有至少一種如本文所述之非人類動物、非人類細胞、DNA片段及/或靶向載體。套組可用於任何可應用的方法(例如，研究方法)。視情況地與此類容器相關者可為一注意事項，其呈由管理藥劑或生物產品之製造、使用或銷售之政府機構規定的形式，該注意事項反映(a)該機構核准用於人類投予之製造、使用或銷售，(b)使用說明，或二者，或管理在二或更多個實體之間轉移材料及/或生物產品(例如，如本文所述之非人類動物或非人類細胞)的合約。
本發明之其他特徵將在例示性具體例之以下描述過程中變得顯而易見，例示性具體例為了說明而提供，且並不意欲限制本發明。
實施例
提供以下實施例以便向一般熟悉本技藝者描述如何製備及使用本發明之方法及組成物，且不意欲限制諸位創作人視為其發明的內容之範疇。除非另外指示，否則溫度以攝氏度指示，且壓力為大氣壓或接近大氣壓。
實施例1. 靶向載體設計及構築
此實施例說明構建靶向載體，其用於插入至非人類動物，諸如囓齒動物(例如，小鼠)基因組中。特定而言，此實施例中所描述之方法展現產生靶向載體，其用於插入至嚙齒動物(例如，小鼠)胚胎幹(ES)細胞基因組中，以產生嚙齒動物，該嚙齒動物之基因組包含包括經改造重鏈多樣性(DH)區之免疫球蛋白重鏈可變區，該經改造DH區包括各自可操作地連接至5'或3' 23聚體RSS之一或多個DH區段。在此實施例中，描述三個靶向載體：第一靶向載體，其含有經改造DH區，該區包括可操作地連接至5' 23聚體RSS且可操作地連接至一個人類JH區段之近端(或3')DH區段；第二靶向載體，其含有經改造DH區，該區包括可操作地連接至5' 23聚體RSS且可操作地連接至三個人類JH區段之近端(或3')DH區段；及第三靶向載體，其含有經改造DH區，該區包括各自與3' 23聚體RSS締合且可操作地連接至六個人類JH區段之三個DH區段(圖2)。產生此等靶向載體中之每一者，且將其分別地插入至人類化免疫球蛋白重鏈可變區中(圖3、5、7)。如下文所描述，將經改造DH區置於與重鏈可變(VH)及重鏈接合(JH)區段之可操作連接中，使得在VDJ重組後，表現具有由DH-DH重組產生之CDR3的抗體。
使用VELOCIGENE®技術(參見例如美國專利第6,586,251號及Valenzuela等人，2003,Nature Biotech.21(6)：652-659；其 中之每一者以全文引用的方式併入本文中)及本技藝中已知的分子生物學技術產生靶向載體，其含有各自與5'或3' 23聚體RSS締合，以便插入至免疫球蛋白重鏈可變區中之一或多個人類DH區段。此實施例中所描述之方法可用於按需要利用任何DH區段、DH區段之集合或DH區段之組合。
A. 23：D H 3-3：12/J H 6靶向載體(圖2)
簡言之，第一靶向載體使用基因組DNA片段構築，該DNA片段含有複數個人類DH區段及定位於人類DH7-27之位置的合成人類DH3-3區段。活體外Cas9/GA修飾之供體藉由從頭合成製得(Blue Heron Bio)且自5'至3包含：(a)在DH7-27之5' 12聚體RSS上游350bp起始的100bp同源臂(b)用於插入新黴素抗性卡匣之AgeI及XhoI位點，(c)DH7-27之5'端12 RSS上游之250bp區，(d)經5'端23聚體RSS(來自JH4)及3'端12聚體RSS(來自DH3-3)改造之合成人類DH3-3區段，及(3)JH5下游3bp起始之100bp同源盒。loxp-UbC-Em7-Neo-loxp卡匣，例如由loxP位點特異性重組識別位點側接之新黴素抗性基因，定位於合成DH區段上游約250bp，且在下游連接至AgeI及XhoI位點以允許在大腸桿菌及小鼠ES細胞中選擇。包括新黴素卡匣之此23：DH3-3：12/JH6供體(SEQ ID NO：61)用於使用二個Cas9：gRNA複合物，藉由活體外Cas9/GA來修飾BAC。在修飾之前，BAC在序列上與VELOCIMMUNE®小鼠之嵌合IgH基因座一致(參見例如圖3及4，其展示VELOCIMMUNE®小鼠之例示性非限制性內源性免疫球蛋白重鏈基因座，其就以下而言為異型接合的：6394對偶基因，其包含缺少JH基因區段且可操作地連接至內源性小鼠免疫球蛋白重鏈恆定區序列之人類化可變區；及1460對偶基因，其包含可操作地連接至內源性小鼠免疫球蛋白重鏈恆定區序列之人類化可變區。)。具體而言，BAC與1460對偶基因一致，其始於最近端人類VH基因(VH6-1)且包括全部27個人類DH基因、全部6個人類JH基因、小鼠IgH內含子增強子(Eμ)、小鼠IgM交換區(Sμ)及小鼠IgM基因之前4個外顯子。BAC亦包括在 VH6-1基因上游之觀黴素(spec)抗性卡匣及約29kb之人類基因間序列。人類-小鼠接合部離人類JH6基因3'端222bp且離小鼠Eμ增強子5'端490bp。經由GA將23：D3-3：12/JH6供體插入至BAC產生最終23：D3-3：12/JH6靶向載體，其包含DH7-7基因區段經經改造23：D3-3：12區段之置換及JH1、JH2、JH3、JH4及JH5基因區段之缺失(圖2)。表1提供用於確定23：DH3-3：12/JH6靶向載體準確構築之gRNA、引子及探針的序列。
Figure 108120728-A0202-12-0104-2
23：D3-3：12/JH6靶向載體經NotI線性化且電穿孔至小鼠胚胎幹細胞中，小鼠胚胎幹細胞之基因組就人類化免疫球蛋白重鏈可變區而言為異型接合的(亦即，第一重鏈對偶基因(1460het)，其含有可操作地連接至包括嚙齒動物重鏈增強子及調控區之嚙齒動物免疫球蛋白重鏈恆定區的複數個人類VH、DH及JH區段，且含有編碼一或多個 鼠類Adam6基因之插入核苷酸序列(例如，美國專利第8,642,835號及第8,697,940號，其中之每一者以全文引用的方式併入本文中)；及第二重鏈對偶基因(6394het)，其含有複數個人類VH及DH區段、JH區缺失，及包括嚙齒動物重鏈增強子及調控區之嚙齒動物免疫球蛋白重鏈恆定區，且含有編碼一或多個鼠類Adam6基因之插入核苷酸序列(例如，美國專利第8,642,835號及第8,697,940號，其中之每一者以全文引用的方式併入本文中))，且就人類化內源性κ基因座而言為同型接合的(HO)，該基因座包含可操作地連接至內源性小鼠免疫球蛋白重鏈Cκ區之人類免疫球蛋白輕鏈Vκ及Jκ基因區段的全譜系(1293)(參見圖3)。6799對偶基因在電穿孔及1460對偶基因與包含新黴素卡匣之23：D3-3：12/JH6靶向載體適當同源重組後產生。(圖3)。就6394及679對偶基因而言為異型接合的此等經改造小鼠ES細胞用於促進陽性ES純系之高效篩選(參見以下)，及後續的抗藥性卡匣之cre介導移除，在該刪除後6394及6799對偶基因分別被稱作6643及6800(圖4)。
B. 23：D H 3-3：12/J H 4-6靶向載體(圖2)
以類似方式，另一靶向載體(23：DH3-3：12/JH4-6)使用相同基因組DNA片段構築，該DNA片段含有複數個人類DH區段及定位於人類DH7-27之位置的合成人類DH3-3區段。然而，此第二靶向載體包括六個人類JH區段中之三個(亦即，JH4、JH5、JH6)。為產生最終23：DH3-3：12/JH4-6靶向載體，使用供體以對BAC進行修飾，該BAC在序列上與VELOCIMMUNE®小鼠之嵌合IgH基因座一致(參見例如圖3及4，其展示VELOCIMMUNE®小鼠之例示性非限制性內源性免疫球蛋白重鏈基因座，其就以下而言為異型接合的：6394對偶基因，其包含缺少JH基因區段且可操作地連接至內源性小鼠免疫球蛋白重鏈恆定區序列之人類化可變區；及1460對偶基因，其包含可操作地連接至內源性小鼠免疫球蛋白重鏈恆定區序列之人類化可變區)。供體自5'至3'包含：(a)D7-27之5'端12 RSS上游350bp起始之100bp同源盒，(b)用於插入新黴素抗性卡匣之AgeI及XhoI位點，(c)D7-27之5'端12 RSS上游之250bp區，(d)在5'端由23聚體RSS(來自JH4)側接且在3'端由12聚體RSS(來自DH3-3)側接之合成人類DH3-3區段，及(e)JH3下游3bp起始之100bp同源盒。loxp-UbC-Em7-Neo-loxp卡匣，例如由loxP位點特異性重組識別位點側接之新黴素抗性基因，藉由連接至AgeI及XhoI位點定位於合成DH區段上游約250bp，以允許在大腸桿菌及小鼠ES細胞中選擇。包含如SEQ ID NO：52所記載之核苷酸序列，包括新黴素卡匣的此23：D3-3：12/JH4-6供體用於對在序列上與1460對偶基因一致的BAC進行修飾(圖3及4)。具體而言，BAC與1460對偶基因一致，其始於最近端人類VH基因(VH6-1)且包括全部27個人類DH基因、全部6個人類JH基因、小鼠IgH內含子增強子(Eμ)、小鼠IgM交換區(Sμ)及小鼠IgM基因之前4個外顯子。BAC亦包括在VH6-1基因上游之觀黴素(spec)抗性卡匣及約29kb之人類基因間序列。人類-小鼠接合部離人類JH6基因3'端222bp且離小鼠Eμ增強子5'端490bp。使用二個Cas9：gRNA複合物經由活體外Cas9/GA將23：D3-3：12/JH4-6供體插入至BAC中產生最終23：D3-3：12/JH4-6靶向載體(圖2)，其包含DH7-7基因區段經經改造23：D3-3：12區段之置換及JH1、JH2及JH3基因區段之缺失。表2提供用於確定23：DH3-3：12/JH6靶向載體之準確構築之gRNA、引子及探針的序列。
Figure 108120728-A0202-12-0106-3
Figure 108120728-A0202-12-0107-4
23：D3-3：12/JH4-6靶向載體亦經NotI線性化且電穿孔至小鼠胚胎幹細胞中，小鼠胚胎幹細胞之基因組就人類化免疫球蛋白重鏈可變區而言為異型接合的(亦即，第一重鏈對偶基因(1460het)，其含有可操作地連接至包括嚙齒動物重鏈增強子及調控區之嚙齒動物免疫球蛋白重鏈恆定區的複數個人類VH、DH及JH區段，且含有編碼一或多個鼠類Adam6基因之插入核苷酸序列[例如，美國專利第8,642,835號及第8,697,940號，其中之每一者以全文引用的方式併入本文中]；及第二重鏈對偶基因(6394het)，其含有複數個人類VH及DH區段、JH區缺失，及包括嚙齒動物重鏈增強子及調控區之嚙齒動物免疫球蛋白重鏈恆定區，且含有編碼一或多個鼠類Adam6基因之插入核苷酸序列[例如，美國專利第8,642,835號及第8,697,940號，其中之每一者以全文引用的方式併入本文中])，且就人類化內源性κ基因座而言為同型接合的(HO)，該基因座包含可操作地連接至內源性小鼠免疫球蛋白重鏈Cκ區之人類免疫球蛋白輕鏈Vκ及Jκ基因區段的全譜系(1293)(參見圖5)。6797對偶基因在電穿孔及1460對偶基因與包含新黴素卡匣之23：D3-3：12/JH4-6靶向載體適當同源重組後產生。(圖5)。就6394及6797對偶基因而言為異型接合的此等經改造小鼠ES細胞用於促進陽性ES純系之高效篩選(參見以下)，及後續的抗藥性卡匣之cre介導移除，在該刪除後6394及6797對偶基因分別被稱作6643及6798(圖6)。
C. 12：D H 2-2：23|12：D H 2-8：23|12：D H 2-15：23/J H 1-6靶向載體(圖2)
簡言之，第三靶向載體使用DNA片段構築，該DNA片段含有複數個人類DH區段，其包括各自具有12聚體5' RSS及23聚體 3' RSS之三個DH2家族基因區段(DH2-2、DH2-8及DH2-15)。首先，在序列上與VELOCIMMUNE®小鼠之嵌合IgH基因座一致的BAC(參見例如圖3及4，其展示VELOCIMMUNE®小鼠之例示性非限制性內源性免疫球蛋白重鏈基因座，其就以下而言為異型接合的：6394對偶基因，其包含缺少JH基因區段且可操作地連接至內源性小鼠免疫球蛋白重鏈恆定區序列之人類化可變區；及1460對偶基因，其包含可操作地連接至內源性小鼠免疫球蛋白重鏈恆定區序列之人類化可變區)。具體而言，BAC與1460對偶基因一致，其始於最近端人類VH基因(VH6-1)且包括全部27個人類DH基因、全部6個人類JH基因、小鼠IgH內含子增強子(Eμ)、小鼠IgM交換區(Sμ)及小鼠IgM基因之前4個外顯子，其使用細菌同源重組(BHR)進行修飾以在第一人類DH區段(DH1-1)上游512bp插入loxp-UbC-Em7-Neo-loxp卡匣，例如由loxP位點特異性重組識別位點側接之新黴素抗性基因，以便在大腸桿菌及小鼠ES細胞中選擇。此所得BAC隨後使用活體外Cas9/GA經三個供體修飾。
1.用於修飾DH2-2之第一供體自5'至3'含有在DH2-2之5'端12 RSS上游1419bp起始之50bp同源盒、多個選殖位點(MreI-NsiI-EcoRI-KpnI-MreI)、3'端12聚體RSS經來源於人類VH1-69之最佳化3'端23聚體RSS(CACAGTGTGA AAACCCACAT CCTGAGAGTG ACACAAACC；T->A,G->C；SEQ ID NO：151)置換的經修飾D2-2基因及D2-2之3'端23聚體RSS下游863bp結束之50bp同源盒。用於修飾DH2-2之此第一供體的核苷酸序列如SEQ ID NO：70所記載。由於DH區由四個約10kb之正向重複序列組成，因此設計用於篩選之獨特引子及探針極困難。為解決此問題，插入二個獨特40bp序列：一個在5'同源盒下游74bp且一個在3'同源盒上游40bp。此等獨特40聚體用作PCR/定序引子及塔克曼(Taqman)探針之結合位點，由圖2之未經填充之豎直矩形「1」及「2」表示，且分別包含如SEQ ID NO：73及SEQ ID NO：74所記載之核苷酸序列
2.用於修飾DH2-8之第二供體自5'至3'含有在DH2-8之5'端12 RSS上游552bp起始之50bp同源盒、多個選殖位點(MreI-NsiI-EcoRI-KpnI-MreI)、3'端12聚體RSS經來源於人類VH1-69之最佳化3'端23聚體RSS(CACAGTGTGA AAACCCACAT CCTGAGAGTG ACACAAACC；T->A,G->C SEQ ID NO：151)置換的經修飾D2-8基因及D2-8之3'端23聚體RSS下游867bp結束之50bp同源盒。用於修飾DH2-8之此第二供體的核苷酸序列如SEQ ID NO：71所記載。由於DH區由四個約10kb之正向重複序列組成，因此設計用於篩選之獨特引子及探針極困難。為解決此問題，插入二個獨特40bp序列：一個在5'同源盒下游74bp且一個在3'同源盒上游40bp。此等獨特40聚體用作PCR/定序引子及塔克曼探針之結合位點，由圖2之未經填充之豎直矩形「10」及「16」表示，且分別包含如SEQ ID NO：75及SEQ ID NO：76所記載之核苷酸序列。
3.用於修飾DH2-15之第三供體自5'至3'含有在DH2-15之5'端12 RSS上游391bp起始之50bp同源盒、多個選殖位點(MreI-NsiI-EcoRI-KpnI-MreI)、3'端12聚體RSS經來源於人類VH1-69之最佳化3'端23聚體RSS(CACAGTGTGA AAACCCACAT CCTGAGAGTG ACACAAACC；T->A,G->C SEQ ID NO：151)置換的經修飾D2-15基因及D2-15之3'端23聚體RSS下游867bp結束之50bp同源盒。用於修飾DH2-2之此第三供體的核苷酸序列如SEQ ID NO：72所記載。由於DH區由四個約10kb之正向重複序列組成，因此設計用於篩選之獨特引子及探針極困難。為解決此問題，插入二個獨特40bp序列：一個在5'同源盒下游74bp且一個在3'同源盒上游40bp。此等獨特40聚體用作PCR/定序引子及塔克曼探針之結合位點，由圖2之未經填充之豎直矩形「8」及「18」表示，且分別包含如SEQ ID NO：77及SEQ ID NO：78所記載之核苷酸序列。 在用三個供體進行活體外Cas9/GA修飾，最終靶向載體自5'至3'含有含人類可變區DNA之49kb 5'同源臂、新黴素選擇卡匣、包括各自在5'端由12聚體RSS側接且在3'端由23聚體RSS側接之三個人類DH區段的經改造人類DH區、六個人類JH區段及含有小鼠重鏈內含子增強子(Ei)及小鼠IgM恆定區基因的24kb 3'同源臂。(圖2)。表3提供用於確定12：DH2-2：23|12：DH2-8：23|12：DH2-15：23/JH1-6靶向載體之準確構築之gRNA、引子及探針的序列。
Figure 108120728-A0202-12-0110-5
Figure 108120728-A0202-12-0111-6
Figure 108120728-A0202-12-0112-7
Figure 108120728-A0202-12-0113-8
Figure 108120728-A0202-12-0114-12
Figure 108120728-A0202-12-0114-13
Figure 108120728-A0202-12-0114-14
Figure 108120728-A0202-12-0115-11
12：DH2-2：23：|12：DH2-8：23|12：DH2-15：23x3/JH1-6靶向載體亦經NotI線性化且電穿孔至小鼠胚胎幹細胞中，小鼠胚胎幹細胞之基因組就人類化免疫球蛋白重鏈可變區而言為異型接合的，該區含有功能性人類VH基因區段之全譜系、除DH7-27以外的DH區缺失及功能性人類JH基因區段之全譜系(6011)，且就人類化內源性κ基因座而言為同型接合的(HO)，該基因座包含可操作地連接至內源性小鼠免疫球蛋白重鏈Cκ區之人類免疫球蛋白輕鏈Vκ及Jκ基因區段的全譜系(1293)(參見圖7)。20187對偶基因在電穿孔及6011對偶基因與包含新黴素卡匣之12：DH2-2：23|12：DH2-8：23|12：DH2-15：23/JH1-6靶向載體適當同源重組後產生。(圖7)。此等經改造小鼠ES細胞用於促進陽性ES純系之高效篩選(參見以下)，及後續的新黴素抗藥性卡匣之cre介導移除，在該移除後20187對偶基因作為20188(圖8)。
實施例2. ES細胞篩選
此實施例展現非人類動物(例如，嚙齒動物)之產生，其基因組包含包括經改造重鏈多樣性(DH)區之免疫球蛋白重鏈可變區， 其中該經改造DH區包括各自可操作地連接至23聚體RSS之一或多個DH區段。
描述於實施例1中之靶向載體的正確組裝及DNA片段向BAC DNA純系所含之人類化免疫球蛋白重鏈基因座之多樣性簇中的靶向插入由構築每一靶向載體期間之定序及聚合酶連鎖反應確認。經聚合酶連鎖反應確認的靶向BAC DNA隨後經由電穿孔引入至小鼠胚胎幹(ES)細胞中，之後在選擇培養基中培養。用於每一靶向載體之電穿孔的ES細胞基因組分別描繪於圖3、5及7中。抗藥性集落在電穿孔之後10天選取，且由塔克曼TM篩選且對正確靶向進行核型分析，如先前所描述(Valenzuela等人，前述；Frendewey,D.等人，2010,Methods Enzymol.476：295-307，其以全文引用的方式併入本文中)，其使用偵測經改造DH基因區段之適當整合的引子/探針組進行(表4；F：正向引子，P：探針，R：反向引子)。
VELOCIMOUSE®法(DeChiara,T.M.等人，2010,Methods Enzymol.476：285-294；DeChiara,T.M.,2009,Methods Mol.Biol.530：311-324；Poueymirou等人，2007,Nat.Biotechnol.25：91-99；其以全文引用的方式併入本文中)，其中靶向ES細胞注射至未濃縮8細胞期Swiss Webster胚胎中，以產生健康的完全ES細胞衍生F0代小鼠，其就經改造DH區而言為異型接合的，且表現含有包括由DH-DH重組產生之CDR3區之重鏈可變區的抗體。將F0代異型接合雄性與C57B16/NTac雌性雜交，以產生F1異型接合子，其異種交配，以產生F2代同型接合子及野生型小鼠。
藥物選擇卡匣可視情況地藉由後續添加重組酶(例如，藉由Cre處理)或藉由培育成Cre刪除子(deleter)小鼠品系(參見例如國際專利申請公開案第WO 2009/114400號，其以全文引用的方式併入本文中)來移除，以便移除例如在ES細胞期或在胚胎中未移除之由靶向構築體引入之任何lox選擇的卡匣。視情況地，選擇卡匣保留在小鼠中。經改造至本文所述之靶向載體中的選擇卡匣在陽性ES細胞中藉由短暫表現Cre重組酶而移除(分別參見圖4、6及8)。
Figure 108120728-A0202-12-0117-15
Figure 108120728-A0202-12-0118-16
Figure 108120728-A0202-12-0119-18
實施例3. 經23：D H 3-3：12/J H 6、23：D H 3-3：12/J H 4-6或12：D H 2-2：23|12：D H 2-8：23|12：D H 2-15：23/J H 1-6靶向載體修飾之小鼠的表徵
免疫表型分型
對分別就6800或6795經修飾對偶基因而言為異型接合的小鼠(參見圖4及6)進行對經23：DH3-3：12/JH6或23：DH3-3：12/JH4-6靶向載體修飾之動物的免疫表型分型分析。對培育成就20188經修飾對偶基因而言具有同型接合性之小鼠進行對經12：DH2-2：23|12：DH2-8：2-23| 12：DH2-15：23/JH1-6靶向載體修飾之動物的免疫表型分型分析。在此等動物中，B細胞發育藉由螢光活化細胞分選(FACS)分析。簡言之，自以下收集脾及腿骨(股骨及脛骨)：
VELOCIMMUNE®小鼠(n=3，26% C57BL/6 23% 129S6/SvEvTac 51% Balb/cAnNTac；參見例如美國專利第8,502,018號及第8,642,835號)，
6643het/6800het//1293ho小鼠(25% C57BL/6NTac 25% 129S6/SvEvTac 50% Balb/cAnNTac，經23：DH3-3：12/JH6靶向載體修飾；參見圖4；n=3；
6643het/6798het//1293ho小鼠(25% C57BL/6NTac 25% 129S6/SvEvTac 50% Balb/cAnNTac，經23：DH3-3：12/JH4-6靶向載體修飾；參見圖6；n=3)；或
20188ho/1293ho小鼠(25% C57BL/6NTac 25% 129S6/SvFvTac 50% Balb/cAnNTac，經12：DH2-2：23|12：DH2-8：23|12：DH2.1523/JH1-6靶向載體修飾；n=3)。骨髓藉由離心自股骨收集。以ACK裂解緩衝液(Gibco)裂解來自脾及骨髓製備物之紅細胞，之後以含有2% FBS的1×PBS洗滌。在4℃下，經分離細胞(1×106)與所選抗體混合物一起培育30分鐘：染色1：大鼠 抗小鼠CD43-FITC(Biolegend 121206，純系1B11)、大鼠抗小鼠c-kit-PE(Biolegend 105808，純系2B8)、大鼠抗小鼠IgM-PeCy(eBiosciences 25-5790-82，純系II/41)、大鼠抗小鼠IgD-PerCP-Cy5.5(Biolegend 405710，純系11-26c.2a)、大鼠抗小鼠CD3-PB(Biolegend 100214，純系17-A2)、大鼠抗小鼠B220-APC(eBiosciences 17-0452-82，純系RA3-6B2)及大鼠抗小鼠CD19-APC-H7(BD 560143純系1D3)。染色2：大鼠抗小鼠κ-FITC(BD 550003，純系187.1)、大鼠抗小鼠λ-PE(Biolegend 407308，純系RML-42)、大鼠抗小鼠IgM-PeCy(eBiosciences 25-5790-82，純系II/41)、大鼠抗小鼠IgD-PerCP-Cy5.5(Biolegend 405710，純系11-26c.2a)、大鼠抗小鼠CD3-PB(Biolegend 100214，純系17-A2)、大鼠抗小鼠B220-APC(eBiosciences 17-0452-82，純系RA3-6B2)及大鼠抗小鼠CD19-APC-H7(BD 560143純系1D3)。染色後，細胞經洗滌且隨後在2%甲醛中固定。資料獲取係於BD LSRFORTESSATM流式細胞儀(BD Biosciences)上進行，且用FLOWJOTM軟體(BD Biosciences)進行分析。
在就6800或6798對偶基因而言為異型接合的小鼠中，脾及骨髓二者中總B細胞數目減少，且當與對照VELOCIMMUNE®小鼠相比時，在骨髓中所觀測到之原B細胞增加(資料未展示)。總體而言，B細胞具有類似的κ及λ使用情況(資料未展示)。在就20188對偶基因而言為同型接合的小鼠中，在脾中發現稍微較高量之λ+ B細胞(資料未展示)。與對照VELOLCIMMUNE®小鼠相比，在表現6800、6798或20188對偶基因之小鼠中所觀測到之B細胞群體的差異中之每一者均不被視為影響此等動物之B細胞發育(資料未展示)。
DH-DH重排之頻率及特徵
經23：DH3-3：12/JH6靶向載體、23：DH3-3：12/JH4-6靶向載體或12：DH2-2：23|12：DH2-8：23|12：DH2-15：23靶向載體修飾之未經免疫之初始小鼠中的基因重排藉由IgM譜系定序進行分析。來自脾B細胞之IgM譜系庫使用SMARTerTM RACE(cDNA端之快速擴增)cDNA擴增套組(Clontech)，用對小鼠恆定IgM具特異性之引子(表5，「nnnnnn」 表示使得能夠複用樣品以便定序之6bp索引序列)來製備。所製備之譜系庫隨後在MiSeq定序器(Illumina)上定序。
Illumina MiSeq雙端(paired-end)序列(2×300循環)經合併且基於品質及與重鏈IgM恆定區引子之完全匹配過濾。將經重排重鏈序列與生殖系V、D及J參考資料庫(IMGT)比對。後續分析僅包括產生性重排，其被定義為開放閱讀框架內無終止密碼子且具有框內VDJ接合部之序列。
Figure 108120728-A0202-12-0121-19
在經23：DH3-3：12/JH6靶向載體或23：DH3-3：12/JH4-6靶向載體修飾之未經免疫的動物中，未偵測到DH7-27表現，且JH使用情況分別限於JH6，或JH4、JH5及JH6，如所預期(資料未展示)。在經12：DH2-2：23|12：DH2-8：23|12：DH2-15：23靶向載體修飾之未經免疫的動物中，偵測到與所有JH1-6基因區段重組，儘管發現在經修飾及對照動物二者中與JH4重組處於較高頻率(約50%)(資料未展示)。在所有經修 飾動物中，使用多種VH基因區段(例如(但不限於)VH4-39、VH3-23等)，且多種DH基因區段(例如(但不限於)DH1-7、DH3-10及DH5-12)經經改造DH基因區段重組。引起關注地，與對照動物(2.57%，3.44%；3.58%；n=3)相比，DH2-2、DH2-8及DH2-15基因區段之使用率在經12：DH2-2：23|12：DH2-8：23|12：DH2-15：23靶向載體修飾之動物中傾向於較高(2.41%；6.34%；6.91%；n=3)。(表6)。
具有在接合區內鑑別之最少兩個連續DH區段的功能性序列使用以下標準進一步證實為由DH-DH重組事件產生。在自經23：DH3-3：12/JH6靶向載體或23：DH3-3：12/JH4-6靶向載體修飾之小鼠分離的序列中，在滿足以下時DH-DH重組事件得到證實：(1)所鑑別之「後繼」或3' DH區段與IGHD3-3 DH之生殖系序列的最少9個連續鹼基對對齊及(2)所鑑別之前導5'及後繼3' DH基因區段二者無關於任何重疊與生殖系DH基因區段的最少5個連續鹼基對對齊。在自經12：DH2-2：23|12：DH2-8：23|12：DH2-15：23靶向載體修飾之小鼠分離的序列中，在滿足以下時DH-DH重組事件得到證實：(1)所鑑別之「前導」或5' DH區段與IGHD2-2 DH基因區段、IGHD2-8 DH基因區段或IGHD2-15 DH基因區段之生殖系序列的最少9個連續鹼基對對齊及(2)所鑑別之前導5'及後繼3' DH基因區段二者無關於任何重疊與生殖系DH基因區段的最少5個連續核苷酸對齊。
表6以絕對量及總讀段之百分比形式提供功能性Ig讀段之數目，所有功能性讀段之百分比來源於DH2-2基因區段、DH2-8基因區段或DH2-15基因區段，且所有讀段之百分比來源於DH2-2基因區段、DH2-8基因區段或DH2-15基因區段，該等基因區段滿足待證實為DH-DH重組事件之結果的標準。
Figure 108120728-A0202-12-0123-20
如表6中所示，與對照動物相比，所有未經免疫之經修飾動物展示DH-DH重組事件增加。在經經改造2-2、2-8及2-15基因區段修飾(例如，就20188對偶基因為同型接合)的動物中，所有重排之1.69%至4.16%中之DH-DH重組事件包含三個經改造2-2、2-8、2-15 DH基因區段中之一者。對比而言，在對照動物中，DH-DH重組在來源於2-2、2-8或2-15基因區段之所有重排之小於0.2%中得到證實。在獨立實驗中，在就6800小鼠而言為異型接合之小鼠(圖4)中，涉及經改造DH3-3基因區段之所證實DH-DH重組事件的範圍為來源於DH3-3基因區段之所有功能性讀段的0.6至1.2%。
在所有經修飾動物中，經重排VH(DHA-DHB)JH重排編碼較長CDR3長度(例如(但不限於)約21個胺基酸之CDR3長度)且併入較多半胱胺酸殘基。(例如，圖9及10)。
總體而言，經經改造DH基因區段修飾之小鼠展現相對正常B細胞表型，其中歸因於利用DH基因區段，DH-DH重組事件之頻率提高。另外，DH-DH重組序列編碼長度較長且具有較高半胱胺酸併入比率之CDR3。
實施例4. 抗體之產生
此實施例展現在嚙齒動物中產生抗體，該嚙齒動物之基因組包含包括如本文所述之經改造DH區的免疫球蛋白重鏈可變區。此實施例中所描述之方法，及/或本技藝中熟知的免疫接種方法可用於按需要將含有如本文所述之經改造DH區之嚙齒動物用多肽或其片段(例如，來源於所需表位之肽)，或多肽或其片段之組合進行免疫接種。
簡言之，包括如本文所述之經改造DH區之小鼠的群組使用本技藝中已知的免疫接種方法經所關注抗原免疫接種。抗體免疫反應(亦即，血清效價)藉由ELISA免疫分析監測及/或在經改造細胞上藉由MSD監測。當達到希望的免疫反應時，收集脾細胞(及/或其他淋巴組織)，且與小鼠骨髓瘤細胞融合，以保持其存活率，且形成不朽融合瘤細胞株。融合瘤細胞株經篩選(例如，藉由ELISA分析或MSD)及選擇，以鑑別產生抗原特異性抗體之融合瘤細胞株。可按需要進一步表徵融合瘤之相對結合親和力及同型。使用此技術，獲得數種抗原特異性嵌合抗體(亦即，具有人類可變域及囓齒動物恆定域之抗體)。
編碼重鏈及輕鏈可變區之DNA可分離出，且連接至重鏈及輕鏈之期望同型(恆定區)，以製備完全人類抗體。此類抗體可在諸如CHO細胞之細胞中產生。隨後可對完全人類抗體對於所關注抗原之相對結合親和力及/或中和活性進行表徵。
編碼抗原特異性嵌合抗體，或輕鏈及重鏈之可變域的DNA，可直接自抗原特異性淋巴球中分離出。最初，高親和力嵌合抗體經分離，其具有人類可變區及嚙齒動物恆定區，且針對包括(但不限於)親和力、選擇性、表位等期望特徵經表徵及選擇。嚙齒動物(例如(但不限於)大鼠、小鼠等)恆定區經所需人類恆定區置換以產生完全人類抗體。儘管所選恆定區可根據特定用途而不同，但在可變區中具有高親和性抗原結合及靶特異性特徵。抗原特異性抗體亦直接自抗原陽性但不與骨髓瘤細胞融合之B細胞(來自經免疫接種小鼠)中分離出，如例如美國專利第7,582,298號中所述，該專利以全文引用的方式併入本文中。使用此方法，製得數種完全人類抗原特異性抗體(亦即，具有人類可變域及人類恆定域之抗體)。
在一個實驗中，對照小鼠(例如，具有人類化免疫球蛋白重鏈及κ輕鏈可變區基因座之VELOCIMMUNE®小鼠(n=4-6；參見例如美國專利第8,697,940號及第8,642,835號；其中之每一者以全文引用的方式併入本文中))及測試小鼠(例如，經修飾以包含如本文所述之經改造23：DH3-3：12/JH4-6或23：DH3-3：12/JH6區的小鼠(n=4-6))經不同抗原及/或編碼該等抗原之核酸(G蛋白質偶聯受體(GPCR)、離子通道、趨化介素受體或病原體)免疫接種。
小鼠能夠對測試抗原中之每一者產生反應，其中反應在低效價至高特異性效價範圍內(資料未展示)。具有如本文所述之經改造23：DH3-3：12/JH6區的小鼠展現與具有人類化免疫球蛋白重鏈及κ輕鏈可變區基因座之對照小鼠相當的對表現GPCR之細胞株的效價(圖11；實心圓表示表現GPCR之經改造細胞株；空心圓為不表現GPCR之對照細胞)。
另外，在包含經改造DH區之小鼠中產生的對G蛋白質偶聯受體(GPCR)具特異性之23個測試抗體中的100%具有10或更多個胺基酸之重鏈CDR3長度；20%具有14個胺基酸之CDR3長度且1個抗體具有18個胺基酸之CDR3長度(資料未展示)。對比而言，在具有人類化免疫球蛋白重鏈及κ輕鏈可變區基因座而非經改造DH區之小鼠中產生的對GPCR具特異性之8個測試抗體中僅約60%具有10或更多個胺基酸之CDR3長度，其中無一者具有14或更多個胺基酸的CDR3長度(資料未展示)。
複數個抗病毒抗體自具有經改造23：DH3-3：12/JH4-6區之小鼠分離，其中至少一個展現大於比較物分子之中和活性(資料未展示)。
來自具有經改造23：DH3-3：12/JH6且經離子通道免疫接種之小鼠的抗體包含具有源於VHDHJH及VHDHA-DHBJH重排二者(如藉由針對此實施例描述之嚴格標準所測定)的大於21個胺基酸之HCDR3長度的抗體群，其中相比於脾，在骨髓中發現更多編碼較長HCDR3長度之序列(圖12)。對由根據此實施例之嚴格標準(當使用此實施例之 嚴格標準時，所偵測到之每一DH基因區段必須顯示與生殖系D基因區段最小40%之一致性，3' DH基因區段必須來源於DH3-3基因區段，及在每一DH基因區段中之最多1個核苷酸突變)確定為VHDHA-DHBJH重排之結果的序列編碼之CDR3長度的分析在圖13中展示。以下表7提供使用此實施例中所描述之嚴格標準或此實施例中之非嚴格標準(當使用此實施例之非嚴格標準時，所偵測到之每一DH基因區段必須顯示與生殖系D基因區段之最少5個核苷酸的一致性，3' DH基因區段必須來源於DH3-3基因區段)，對骨髓或脾中之VHDHA-DHBJH重組頻率的比較。
Figure 108120728-A0202-12-0126-21
等效物
由此已描述本發明之至少一個具體例的數種態樣，應瞭解熟悉本技藝者將易於想到各種更改、修改及改良。此類改變、修改及改良意欲為本發明之一部分，且意欲在本發明之精神及範疇內。因此，前述描述及圖式僅作為實例且本發明由以下申請專利範圍詳細地描述。
熟悉本技藝者將瞭解，典型標準差或誤差可歸因於在本文所述之分析或其他過程中獲得的值。本文中提及之用以描述發明背景及提供關於其實務之其他細節的出版物、網站及其他參考材料以全文引用的方式併入本文中。
序列表
序列表之正式複本經由EFS-Web以ASCII格式化序列表形式以名稱為「10347_ST25.txt」之檔案電子提交，該檔案創建於2019年6月13日且大小為約50千位元組，且與本說明書同時申請。此ASCII格式化文件中含有之序列表為本說明書之一部分且以全文引用的方式併入本文中。
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<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hIgHJ2
<400> 1
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<210> 2
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hIgHJ2
<400> 2
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<210> 3
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hIgHJ2
<400> 3
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<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VI741-42h1
<400> 4
Figure 108120728-A0305-02-0131-4
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VI741-42h1
<400> 5
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<210> 6
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VI741-42h1
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VI742h2
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<220>
<223> Neo
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Neo
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<223> Neo
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Figure 108120728-A0202-12-0130-35
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<213> 人工序列
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<212> DNA
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Figure 108120728-A0202-12-0132-42
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Figure 108120728-A0202-12-0132-43
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<212> DNA
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Figure 108120728-A0202-12-0132-44
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<220>
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Figure 108120728-A0202-12-0132-45
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
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<212> DNA
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Figure 108120728-A0202-12-0133-48
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> mIgHp2
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<212> DNA
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<223> mIgHp2
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<212> DNA
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<223> mADAM6-1
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<212> DNA
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<223> hIgk5
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<220>
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<212> DNA
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<220>
<223> mIgKd2
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<213> 人工序列
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<223> hyg
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<223> hyg
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<212> DNA
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<220>
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<223> hIgHD-J.1
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<223> hIgHD-J.1
<400> 48
Figure 108120728-A0202-12-0138-73
<210> 49
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hIgHD-J.2
<400> 49
Figure 108120728-A0202-12-0138-74
<210> 50
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hIgHD-J.2
<400> 50
Figure 108120728-A0202-12-0138-75
<210> 51
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> hIgHD-J.2
<400> 51
Figure 108120728-A0202-12-0139-77
<210> 52
<211> 3263
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> >p46458(23-D3-3-12_delJ1-3供體]
<400> 52
Figure 108120728-A0202-12-0139-78
Figure 108120728-A0202-12-0140-79
Figure 108120728-A0202-12-0141-80
<210> 53
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA識別位點
<400> 53
Figure 108120728-A0202-12-0141-81
<210> 54
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5' D7.27 gRNA
<400> 54
Figure 108120728-A0202-12-0141-82
<210> 55
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA識別位點
<400> 55
Figure 108120728-A0202-12-0141-83
<210> 56
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3' JH1-3 del gRNA
<400> 56
Figure 108120728-A0202-12-0142-84
<210> 57
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'上偵測D7-27
<400> 57
Figure 108120728-A0202-12-0142-85
<210> 58
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3' ub pro-200
<400> 58
Figure 108120728-A0202-12-0142-86
<210> 59
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5' neo偵測
<400> 59
Figure 108120728-A0202-12-0142-87
<210> 60
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'下偵測JH1-3 del
<400> 60
Figure 108120728-A0202-12-0142-88
<210> 61
<211> 3263
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> >p46459(23-D3-3-12_delJ1-5供體)
<400> 61
Figure 108120728-A0202-12-0143-89
Figure 108120728-A0202-12-0144-90
Figure 108120728-A0202-12-0145-91
<210> 62
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA識別位點
<400> 62
Figure 108120728-A0202-12-0145-92
<210> 63
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5' D7.27 crRNA
<400> 63
Figure 108120728-A0202-12-0145-93
<210> 64
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> DNA識別位點
<400> 64
Figure 108120728-A0202-12-0145-94
<210> 65
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3' JH1-5 del crRNA
<400> 65
Figure 108120728-A0202-12-0145-96
<210> 66
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'上偵測D7-27
<400> 66
Figure 108120728-A0202-12-0146-97
<210> 67
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3' ub pro-200
<400> 67
Figure 108120728-A0202-12-0146-98
<210> 68
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5' neo偵測
<400> 68
Figure 108120728-A0202-12-0146-99
<210> 69
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'下偵測JH1-5 del
<400> 69
Figure 108120728-A0202-12-0146-100
<210> 70
<211> 3345
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> >p51816(12-D2-2-23供體)
<400> 70
Figure 108120728-A0202-12-0146-101
Figure 108120728-A0202-12-0147-102
Figure 108120728-A0202-12-0148-103
<210> 71
<211> 2484
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> >p53419(12-D2-8-23供體)
<400> 71
Figure 108120728-A0202-12-0149-104
Figure 108120728-A0202-12-0150-105
<210> 72
<211> 2321
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> >p51818(12-D2-15-23供體)
<400> 72
Figure 108120728-A0202-12-0150-106
Figure 108120728-A0202-12-0151-107
Figure 108120728-A0202-12-0152-108
<210> 73
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 1 P51816(D2-2)
<400> 73
Figure 108120728-A0202-12-0152-109
<210> 74
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 2 P51816(D2-2)
<400> 74
Figure 108120728-A0202-12-0152-110
<210> 75
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 10 P53419(D2-8)
<400> 75
Figure 108120728-A0202-12-0152-111
<210> 76
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 16 P53419(D2-8)
<400> 76
Figure 108120728-A0202-12-0152-112
<210> 77
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 8 P51818(D2-15)
<400> 77
Figure 108120728-A0202-12-0153-113
<210> 78
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 18 P51818(D2-15)
<400> 78
Figure 108120728-A0202-12-0153-114
<210> 79
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5' hIgHD HU2(h268)
<400> 79
Figure 108120728-A0202-12-0153-115
<210> 80
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3' hIgHD HU2 AgeI(h269)
<400> 80
Figure 108120728-A0202-12-0153-116
<210> 81
<211> 31
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5' hIgHD HD2 XhoI(h271)
<400> 81
Figure 108120728-A0202-12-0153-117
<210> 82
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3' hIgHD HD2(h272)
<400> 82
Figure 108120728-A0202-12-0154-118
<210> 83
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5' hIgHD HU2偵測(h270)
<400> 83
Figure 108120728-A0202-12-0154-119
<210> 84
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3' ub pro-200
<400> 84
Figure 108120728-A0202-12-0154-120
<210> 85
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5' neo偵測
<400> 85
Figure 108120728-A0202-12-0154-121
<210> 86
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3' hIgHD HD2偵測(h273)
<400> 86
Figure 108120728-A0202-12-0155-122
<210> 87
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5' D2-2 Cas9 DNA靶
<400> 87
Figure 108120728-A0202-12-0155-123
<210> 88
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5' D2-2 gRNA
<400> 88
Figure 108120728-A0202-12-0155-124
<210> 89
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3' D2-2 Cas9 DNA靶
<400> 89
Figure 108120728-A0202-12-0155-125
<210> 90
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3' D2-2 gRNA
<400> 90
Figure 108120728-A0202-12-0155-126
<210> 91
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'上偵測D2-2(h274)
<400> 91
Figure 108120728-A0202-12-0156-127
<210> 92
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3' cm上偵測
<400> 92
Figure 108120728-A0202-12-0156-128
<210> 93
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D2-2seqF2
<400> 93
Figure 108120728-A0202-12-0156-129
<210> 94
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'下偵測D2-2(h275)
<400> 94
Figure 108120728-A0202-12-0156-130
<210> 95
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> JO-1
<400> 95
Figure 108120728-A0202-12-0156-131
<210> 96
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'上偵測D2-2(h274)
<400> 96
Figure 108120728-A0202-12-0157-132
<210> 97
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D2-2seqR1
<400> 97
Figure 108120728-A0202-12-0157-133
<210> 98
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D2-2seqF1
<400> 98
Figure 108120728-A0202-12-0157-134
<210> 99
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D2-2seqR2
<400> 99
Figure 108120728-A0202-12-0157-135
<210> 100
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5' D2-8 Cas9 DNA靶
<400> 100
Figure 108120728-A0202-12-0157-136
<210> 101
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5' D2-8 crRNA
<400> 101
Figure 108120728-A0202-12-0158-137
<210> 102
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3' D2-8 Cas9 DNA靶
<400> 102
Figure 108120728-A0202-12-0158-138
<210> 103
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3' D2-8 crRNA
<400> 103
Figure 108120728-A0202-12-0158-139
<210> 104
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'上偵測D2-8(h276)
<400> 104
Figure 108120728-A0202-12-0158-140
<210> 105
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3' cm上偵測
<400> 105
Figure 108120728-A0202-12-0159-141
<210> 106
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D2-8seqF2
<400> 106
Figure 108120728-A0202-12-0159-142
<210> 107
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'下偵測D2-8(h277)
<400> 107
Figure 108120728-A0202-12-0159-143
<210> 108
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> JO-2
<400> 108
Figure 108120728-A0202-12-0159-144
<210> 109
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'上偵測D2-8(h276)
<400> 109
Figure 108120728-A0202-12-0159-145
<210> 110
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D2-8seqR1
<400> 110
Figure 108120728-A0202-12-0160-146
<210> 111
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D2-8seqF1
<400> 111
Figure 108120728-A0202-12-0160-147
<210> 112
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D2-8seqR2
<400> 112
Figure 108120728-A0202-12-0160-148
<210> 113
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5' D2-8 Cas9 DNA靶
<400> 113
Figure 108120728-A0202-12-0160-149
<210> 114
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5' D2-8 crRNA
<400> 114
Figure 108120728-A0202-12-0160-150
<210> 115
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3' D2-8 Cas9 DNA靶
<400> 115
Figure 108120728-A0202-12-0161-151
<210> 116
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3' D2-8 crRNA
<400> 116
Figure 108120728-A0202-12-0161-152
<210> 117
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'上偵測D2-15(h278)
<400> 117
Figure 108120728-A0202-12-0161-153
<210> 118
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3' cm上偵測
<400> 118
Figure 108120728-A0202-12-0161-154
<210> 119
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D2-15seqF2
<400> 119
Figure 108120728-A0202-12-0162-155
<210> 120
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 3'下偵測D2-15(h279)
<400> 120
Figure 108120728-A0202-12-0162-156
<210> 121
<211> 80
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> JO-3
<400> 121
Figure 108120728-A0202-12-0162-157
<210> 122
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 5'上偵測D2-15(h278)*
<400> 122
Figure 108120728-A0202-12-0162-158
<210> 123
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D2-15seqR1
<400> 123
Figure 108120728-A0202-12-0162-159
<210> 124
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D2-15seqF1
<400> 124
Figure 108120728-A0202-12-0163-160
<210> 125
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> D2-15seqR2
<400> 125
Figure 108120728-A0202-12-0163-161
<210> 126
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23D3.312-1
<400> 126
Figure 108120728-A0202-12-0163-162
<210> 127
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23D3.312-1
<400> 127
Figure 108120728-A0202-12-0163-163
<210> 128
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23D3.312-1
<400> 128
Figure 108120728-A0202-12-0163-164
<210> 129
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23D3.312-2
<400> 129
Figure 108120728-A0202-12-0164-165
<210> 130
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23D3.312-2
<400> 130
Figure 108120728-A0202-12-0164-166
<210> 131
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23D3.312-2
<400> 131
Figure 108120728-A0202-12-0164-167
<210> 132
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23D3.312-3
<400> 132
Figure 108120728-A0202-12-0164-168
<210> 133
<211> 14
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23D3.312-3
<400> 133
Figure 108120728-A0202-12-0165-169
<210> 134
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 23D3.312-3
<400> 134
Figure 108120728-A0202-12-0165-170
<210> 135
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Jxn DH2-2
<400> 135
Figure 108120728-A0202-12-0165-174
<210> 136
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Jxn DH2-2
<400> 136
Figure 108120728-A0202-12-0165-172
<210> 137
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Jxn DH2-2
<400> 137
Figure 108120728-A0202-12-0165-173
<210> 138
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Jxn DH2-8
<400> 138
Figure 108120728-A0202-12-0166-175
<210> 139
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Jxn DH2-8
<400> 139
Figure 108120728-A0202-12-0166-176
<210> 140
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Jxn DH2-8
<400> 140
Figure 108120728-A0202-12-0166-177
<210> 141
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Jxn DH2-15
<400> 141
Figure 108120728-A0202-12-0166-179
<210> 142
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Jxn DH2-15
<400> 142
Figure 108120728-A0202-12-0166-180
<210> 143
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Jxn DH2-15
<400> 143
Figure 108120728-A0202-12-0167-181
<210> 144
<211> 7
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 144
Figure 108120728-A0202-12-0167-182
<210> 145
<211> 9
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工
<400> 145
Figure 108120728-A0202-12-0167-183
<210> 146
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 模板交換寡核苷酸
<400> 146
Figure 108120728-A0202-12-0167-184
<210> 147
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第1輪PCR引子IgM恆定
<400> 147
Figure 108120728-A0202-12-0167-185
<210> 148
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第1輪PCR引子PE2-PIIA
<400> 148
Figure 108120728-A0202-12-0168-186
<210> 149
<211> 68
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第2輪PCR引子
<220>
<221> misc_feature
<222> (30)..(35)
<223> n為a,c,g,或t
<400> 149
Figure 108120728-A0202-12-0168-187
<210> 150
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 第2輪PCR引子
<220>
<221> misc_feature
<222> (25)..(30)
<223> n為a,c,g,或t
<400> 150
Figure 108120728-A0202-12-0168-188
<210> 151
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 來自VH1-69之23聚體RSS
<400> 151
Figure 108120728-A0202-12-0169-189

Claims (49)

  1. 一種核苷酸分子，其包含經改造免疫球蛋白重鏈多樣性(DH)區(經改造DH區)，其包含：(i)經改造DH基因區段，包括緊鄰23聚體重組信號序列(RSS)之經改造DH基因區段(經改造DH基因區段)；以及(ii)在其5’側由第一12聚體RSS側接且在其3’側由第二12聚體RSS側接之未經重排DH基因區段(未經重排DH基因區段)，且其中(i)該經改造DH基因區段以及(ii)該未經重排DH基因區段係可操作地連接，使得根據12/23規則，(i)該經改造DH基因區段以及(ii)該未經重排DH基因區段能夠在DH-DH重組事件中接合，其中該核苷酸分子適用於取得具有經改造DH區之嚙齒動物。
  2. 如請求項1之核苷酸分子，其中該經改造DH區僅包含人類DH基因區段。
  3. 如請求項1之核苷酸分子，其中，該核苷酸分子進一步包含：(a)至少一個未經重排免疫球蛋白重鏈可變(VH)基因區段(未經重排VH基因區段)，其處於該經改造DH區之上游且與該區可操作地連接；(b)至少一個未經重排免疫球蛋白重鏈接合(JH)基因區段(未經重排JH基因區段)，其處於該經改造DH區之下游且與該區可操作地連接，或(c)(a)與(b)之組合。
  4. 如請求項3之核苷酸分子，其中：(a)該至少一個未經重排VH基因區段包含未經重排人類VH6-1基因區段，和/或該至少一個未經重排JH基因區段包含未經重排人類JH6基因區段；(b)該至少一個未經重排JH基因區段包含未經重排人類JH4基因區段、未經重排人類JH5基因區段及未經重排人類JH6基因區段；(c)該至少一個未經重排JH基因區段包含未經重排人類JH1基因區段、未經重排人類JH2基因區段、未經重排人類JH3基因區段、未經 重排人類JH4基因區段、未經重排人類JH5基因區段及未經重排人類JH6基因區段；和/或(d)至少一個未經重排VH基因區段包含跨越且包括以下的功能性未經重排人類VH基因區段之全譜系：未經重排人類VH3-74基因區段及未經重排人類VH1-6基因區段(功能性未經重排人類VH基因區段之全譜系)。
  5. 如請求項4之核苷酸分子，其中：(a)該等未經重排人類JH1基因區段、未經重排人類JH2基因區段、未經重排人類JH3基因區段、未經重排人類JH4基因區段、未經重排人類JH5基因區段、及未經重排人類JH6基因區段基因區段呈生殖系組構；和/或(b)該等功能性未經重排人類VH基因區段之全譜系呈生殖系組構。
  6. 如請求項1之核苷酸分子，其中：(a)該核苷酸分子進一步包含一或多個功能性嚙齒動物Adam6基因；(b)該經改造DH基因區段包括與該DH基因區段之5'端緊鄰該23聚體RSS；(c)該經改造DH基因區段包括與該DH基因區段之3'端緊鄰該23聚體RSS；(d)該經改造DH基因區段包含：(i)緊鄰該23聚體RSS之人類DH3-3基因區段；(ii)緊鄰該23聚體RSS之人類DH2-2基因區段；(iii)緊鄰該23聚體RSS之人類DH2-8基因區段；(iv)緊鄰該23聚體RSS之人類DH2-15基因區段；或(v)(i)至(iv)之任何組合。(e)該核苷酸分子包含如SEQ ID NO：52所記載之核苷酸序列或包含如SEQ ID NO：61所記載之核苷酸序列；(f)該核苷酸分子包含如SEQ ID NO：70所記載之核苷酸序列； (g)該核苷酸分子包含如SEQ ID NO：71所記載之核苷酸序列；和/或(h)該核苷酸分子包含如SEQ ID NO：72所記載之核苷酸序列。
  7. 如請求項6之核苷酸分子，其中該一或多個功能性嚙齒動物Adam6基因位於人類VH1-2基因區段與人類VH6-1基因區段之間，且/或替換人類Adam6基因。
  8. 如請求項1之核苷酸分子，其中該經改造DH基因區段之23聚體係：(i)緊鄰該DH3-3基因區段之5'端；(ii)緊鄰該DH2-2基因區段之3'端；(iii)緊鄰該DH2-8基因區段之3'端；和/或(iv)緊鄰該DH2-15基因區段之3'端。
  9. 如請求項1之核苷酸分子，其自5'至3'以可操作連接形式包含：(a)至少一個未經重排人類VH基因區段；(b)該經改造DH區，其中該經改造DH基因區段包括緊鄰23聚體RSS之人類DH3-3基因區段，其中該23聚體RSS緊鄰人類DH3-3基因區段之5’端；以及(c)至少一個未經重排人類JH基因區段。
  10. 如請求項1之核苷酸分子，其自5'至3'以可操作連接形式包含：(a)至少一個未經重排人類VH基因區段，(b)該經改造DH區，其中該經改造DH基因區段包含緊鄰23聚體RSS之人類DH2基因區段，其中該23聚體RSS緊鄰人類DH2基因區段之3’端，以及(c)至少一個未經重排人類JH基因區段。
  11. 如請求項1之核苷酸分子，其中：(i)該經改造DH基因區段包含緊鄰該23聚體RSS之人類DH2-2基因區段； (ii)該經改造DH基因區段包含緊鄰該23聚體RSS之人類DH2-8基因區段；(iii)該經改造DH基因區段包含緊鄰該23聚體RSS之人類DH2-15基因區段；或(iv)(i)-(iii)之任意組合。
  12. 如請求項9之核苷酸分子，其中：(a)該至少一個未經重排人類VH基因區段自5'至3'包含未經重排人類VH1-2基因區段及未經重排人類VH6-1基因區段，其中該核苷酸在該未經重排人類VH1-2基因區段與該未經重排人類VH6-1基因區段之間進一步包含一或多個功能性嚙齒動物Adam6基因，且其中該未經重排人類VH1-2基因區段、該一或多個功能性嚙齒動物Adam6基因、及該未經重排人類VH6-1基因區段係相鄰的；(b)該至少一個未經重排人類VH基因區段包含功能性未經重排人類VH基因區段之全譜系；和/或(c)該至少一個未經重排人類JH基因區段包含未經重排人類JH6基因區段。
  13. 如請求項12之核苷酸分子，其中：(a)該功能性未經重排人類VH基因區段之全譜系呈生殖系組構；(b)該至少一個未經重排人類JH基因區段包含未經重排人類JH4基因區段、未經重排人類JH5基因區段、及該未經重排人類JH6基因區段；和/或(c)該至少一個未經重排人類JH基因區段包含未經重排人類JH1基因區段、未經重排人類JH2基因區段、未經重排人類JH3基因區段、未經重排人類JH4基因區段、未經重排人類JH5基因區段及未經重排人類JH6基因區段。
  14. 如請求項13之核苷酸分子，其中該未經重排人類JH1基因區段、該未經重排人類JH2基因區段、該未經重排人類JH3基因區段、該未經重排人類JH4基因區段、該未經重排人類JH5基因區段、及該未經重排人類JH6基因區段呈生殖系組構。
  15. 如請求項1之核苷酸分子，其進一步包含：(a)在其3'端的重鏈免疫球蛋白恆定(CH)區基因或其部分；(b)在其3'端的嚙齒動物CH區基因或其部分；(c)在其3'端的該嚙齒動物CH區其因或其部分，其包含嚙齒動物內含子增強子區及嚙齒動物IgM基因；和/或(d)位於該經改造DH基因區段上游之藥物選擇卡匣。
  16. 如請求項15之核苷酸分子，其中該藥物選擇卡匣由一或多個位點特異性重組位點側接。
  17. 一種靶向載體，其包含請求項1至16中任一項之核苷酸分子，進一步地其中該靶向載體包含經組構以允許於內源性嚙齒動物免疫球蛋白重鏈基因座與免疫球蛋白重鏈序列進行同源重組之5'同源臂及3'同源臂。
  18. 如請求項17之靶向載體，其中該免疫球蛋白重鏈序列包含人類或人類化免疫球蛋白重鏈可變區序列。
  19. 一種修飾免疫球蛋白重鏈可變區序列以改造DH-DH重組之方法，該方法包含：(a)獲得免疫球蛋白重鏈可變鏈序列，其包含DH區，該DH區包含至少一個未經重排DH基因區段，其中各未經重排DH基因區段在其5’側由第一12聚體RSS側接且在其3’側由第二12聚體RSS側接，(b)改造該DH區，以進一步包含至少一個經改造DH基因區段，其中該至少一個經改造DH基因區段包含緊鄰23聚體RSS之DH基因區段，其中，於產生的經改造DH區，該至少一個經改造DH基因區段及該至少一個未經重排DH基因區段係可操作地連結以及可根據12/23規則在DH-DH重組事件中接合。
  20. 如請求項19之方法，其中，該至少一個未經重排DH基因區段包含至少一個未經重排人類DH基因區段。
  21. 如請求項20之方法，其中該至少一個未經重排人類DH基因區段包含跨越且包括以下的所有該未經重排人類DH基因區段：未經重排人類DH1-1基因區段及未經重排人類DH7-27基因區段。
  22. 如請求項21之方法，其中所有該未經重排人類DH基因區段係呈生殖系組構。
  23. 如請求項19之方法，其中產生的該經改造DH區僅包含人類DH基因區段。
  24. 如請求項19之方法，其中請求項19中(a)之DH區包括二或更多之未經重排DH基因區段，其每一者在其5’側由第一12聚體RSS側接且在其3’側由第二12聚體RSS側接，以及其中所述改造包含：(a)將該二或更多個未經重排DH基因區段中之至少一者用如請求項19之(b)中定義之經改造DH基因區段置換，(b)將二或更多個未經重排DH基因區段中至少一者之該第一12聚體RSS或該第二12聚體RSS用23聚體RSS置換，或(c)(a)與(b)之組合。
  25. 如請求項24之方法，其中，該免疫球蛋白重鏈可變鏈序列進一步包含JH區，其包含至少一個未經重排JH基因區段，其中該JH區可操作地連接至該DH區，且其中將該二或更多個未經重排DH基因區段中之至少一者用如請求項19之(b)中定義之該經改造DH基因區段置換包含刪除該至少一個未經重排JH基因區段。
  26. 如請求項25之方法，其中，該JH區包含人類生殖系JH基因區段之全譜系，其包含未經重排人類JH1基因區段、未經重排人類JH2基因區段、未經重排人類JH3基因區段、未經重排人類JH4基因區段、未經重排人類JH5基因區段、及未經重排人類JH6基因區段。
  27. 如請求項26之方法，其中該等未經重排人類JH1基因區段、未經重排JH2基因區段、未經重排JH3基因區段、未經重排JH4基因區段、未經重排JH5基因區段、及未經重排JH6基因區段呈生殖系組構。
  28. 如請求項26之方法，其中刪除至少一個生殖系JH基因區段包含刪除該等未經重排人類JH1基因區段、未經重排人類JH2基因區段、及未經重排人類JH3基因區段。
  29. 如請求項28之方法，其中刪除至少一個生殖系JH基因區段進一步包含刪除該等未經重排人類JH4基因區段及未經重排人類JH5基因區段。
  30. 如請求項19之方法，其中：(a)如請求項19之(b)中定義之該經改造DH基因區段包含：(i)緊鄰該23聚體RSS之人類DH3-3基因區段；(ii)緊鄰該23聚體RSS之人類DH2-2基因區段；(iii)緊鄰該23聚體RSS之人類DH2-8基因區段；(iv)緊鄰該23聚體RSS之人類DH2-15基因區段；或(v)(i)至(iv)之任何組合；(b)所述改造步驟包含以如請求項19之(b)中定義之經改造DH基因區段置換如請求項19之(a)中定義之該DH區之最接近3'端的未經重排DH基因區段；和/或(c)所述改造步驟包含以如請求項19之(b)中定義之經改造DH基因區段置換對應於如請求項19之(b)中定義之該經改造DH基因區段的一或多未經重排DH基因區段中至少一者。
  31. 如請求項19之方法，其中該經改造DH基因區段之23聚體係：(i)緊鄰該DH3-3基因區段之5'端；(ii)緊鄰該DH2-2基因區段之3'端；(iii)緊鄰該DH2-8基因區段之3'端；和/或(iv)緊鄰該DH2-15基因區段之3'端。
  32. 一種免疫球蛋白重鏈基因，其包含如請求項1至16中任一項之核苷酸分子。
  33. 一種嚙齒動物基因組，其包含如請求項1至16中任一項之核苷酸分子、如請求項17或18之靶向載體。
  34. 如請求項33之嚙齒動物基因組，其中該嚙齒動物基因組係嚙齒動物生殖系基因組。
  35. 如請求項33之嚙齒動物基因組，其中該嚙齒動物基因組包含免疫球蛋白重鏈可變區序列，該免疫球蛋白重鏈可變區序列包含：(a)至少一個未經重排VH基因區段，(b)該經改造DH區，及(c)至少一個未經重排JH基因區段，其中，(a)至(c)呈可操作連接形式，使得在重組後，該免疫球蛋白重鏈可變區包含編碼免疫球蛋白重鏈可變域之經重排重鏈可變區序列。
  36. 如請求項35之嚙齒動物基因組，其中該經改造DH區僅包含人類DH基因區段。
  37. 如請求項35之嚙齒動物基因組，其中該經重排重鏈可變區序列在VH(DH-DH)JH重組事件後形成。
  38. 如請求項37之嚙齒動物基因組，其中：(a)該經改造DH基因區段包含緊鄰3' 23聚體RSS之DH基因區段；(b)該經改造DH基因區段包含緊鄰5' 23聚體RSS之DH基因區段；(c)該免疫球蛋白重鏈可變區係人類免疫球蛋白重鏈可變區，其僅包含人類VH基因區段、人類DH基因區段、及人類JH基因區段；(d)該等未經重排VH基因區段包含功能性未經重排人類VH基因區段之全譜系；(e)該等未經重排JH基因區段包含人類JH6基因區段；和/或(f)(i)該嚙齒動物基因組缺少內源性Adam6基因；或(ii)該嚙齒動物基因組進一步包含一或多個嚙齒動物Adam6基因。
  39. 如請求項38之(c)之嚙齒動物基因組，其中該人類免疫球蛋白重鏈可變區可操作地連接至CH區序列。
  40. 如請求項39之嚙齒動物基因組，其中該CH區序列係內源性CH區序列。
  41. 如請求項40之嚙齒動物基因組，其中該內源性CH區序列位於內源性免疫球蛋白重鏈基因座。
  42. 如請求項38之(d)之嚙齒動物基因組，其中該等功能性未經重排人類VH基因區段之全譜系呈生殖系組構。
  43. 如請求項38之(f)(ii)之嚙齒動物基因組，其中(i)該一或多個嚙齒動物Adam6基因包含內源性嚙齒動物Adam6基因；(ii)該一或多個嚙齒動物Adam6基因插入於二個人類VH基因區段之間；(iii)該一或多個嚙齒動物Adam6基因插入於人類Adam6偽基因之位置；和/或(iv)該一或多個嚙齒動物Adam6基因插入於未經重排人類VH基因區段與未經重排人類DH基因區段之間。
  44. 如請求項43之(ii)之嚙齒動物基因組，其中該一或多個嚙齒動物Adam6基因插入於未經重排人類VH1-2基因區段與未經重排人類VH6-1基因區段之間。
  45. 如請求項33之嚙齒動物基因組，其中(a)該嚙齒動物基因組進一步包含末端去氧核苷酸轉移酶基因；(b)該嚙齒動物基因組特徵在於其就該經改造DH區而言係同型接合的，或該嚙齒動物基因組特徵在於其就該經改造DH區而言係異型接合的；和/或(c)該囓齒動物基因組係大鼠基因組或小鼠基因組。
  46. 一種製備嚙齒動物之方法，該嚙齒動物之基因組包含經改造DH區，該方法包含(A)由包含如請求項33-45中任一項的嚙齒動物基因組之胚胎幹細胞產生嚙齒動物；(B)(i)對嚙齒動物胚胎幹細胞之基因組進行修飾以包含DNA片段，該DNA片段包含一或多個經改造DH基因區段，其各自包含緊鄰23聚 體RSS之DH基因區段，其中該DNA片段包含如請求項1至16中任一項之核苷酸分子、如請求項17或18之靶向載體、或如請求項32之免疫球蛋白重鏈基因，及(ii)使用(B)(i)之該經修飾嚙齒動物胚胎幹細胞產生嚙齒動物。
  47. 如請求項46之方法，其中，該囓齒動物係大鼠或小鼠。
  48. 一種產生抗體或獲得編碼該抗體之核酸之方法，該方法包含用抗原對嚙齒動物進行免疫接種，該嚙齒動物包含生殖系基因組，該生殖系基因組包含經改造DH區，該區包含緊鄰23聚體RSS之至少一個經改造DH基因區段，其中該嚙齒動物包含如請求項1至16中任一項之核苷酸分子、如請求項17或18之靶向載體、或如請求項32之免疫球蛋白重鏈基因，及使該嚙齒動物產生針對該抗原之免疫反應，其包括結合該抗原之抗體，或編碼該抗體之核酸。
  49. 如請求項48之方法，其中(a)該方法進一步包含自該嚙齒動物或嚙齒動物細胞回收該抗體，或編碼該抗體之核酸，其中，該囓齒動物細胞係B細胞或融合瘤；(b)緊鄰23聚體RSS之該至少一個經改造DH基因區段包含可操作地連接至5' 23聚體RSS之DH基因區段；(c)緊鄰23聚體RSS之該至少一個經改造DH基因區段包含可操作地連接至3' 23聚體RSS之DH基因區段；和/或(d)該囓齒動物係大鼠或小鼠。
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