BR112020011184A2 - roedor geneticamente modificado, células de roedor isolada, célula imortalizada, embrião de roedor, uso de um roedor, célula b isolada, anticorpo preparado por um método, métodos para produzir um roedor geneticamente modificado, um anticorpo, uma cadeia pesada totalmente humana ou uma cadeia leve totalmente humana, uma sequência nucleotídica, para gerar uma ¿ sequência de domínio variável de cadeia pesada ou leve humana e gerar uma ¿ sequência da região variável de cadeia pesada ou leve humana, célula-tronco embrionária, célula es de roedor, e, célula es isolada de roedor. - Google Patents
roedor geneticamente modificado, células de roedor isolada, célula imortalizada, embrião de roedor, uso de um roedor, célula b isolada, anticorpo preparado por um método, métodos para produzir um roedor geneticamente modificado, um anticorpo, uma cadeia pesada totalmente humana ou uma cadeia leve totalmente humana, uma sequência nucleotídica, para gerar uma ¿ sequência de domínio variável de cadeia pesada ou leve humana e gerar uma ¿ sequência da região variável de cadeia pesada ou leve humana, célula-tronco embrionária, célula es de roedor, e, célula es isolada de roedor. Download PDFInfo
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Abstract
Animais não humanos (e/ou células não humanas) e métodos de uso destes são fornecidos, e animais não humanos (e/ou células não humanas) têm um genoma que compreende sequências codificadoras de anticorpos humanos (genes da imunoglobulina). Os animais não humanos descritos neste documento expressam anticorpos que contêm cadeias leves de imunoglobulina (Ig) caracterizadas pela presença de domínios V¿ humanos. Os animais não humanos fornecidos neste documento são, em algumas modalidades, caracterizados pela expressão de anticorpos que contêm cadeias leves V¿ humanas que são codificadas por sequências não codificadoras de cadeia leve de Ig¿ humana inseridas em um locus de cadeia leve de Ig¿ endógena dos referidos animais não humanos. Também são fornecidos métodos para produzir anticorpos a partir de animais não humanos, cujos anticorpos contêm regiões variáveis humanas e regiões constantes de camundongo.
Description
1 / 308 ROEDOR GENETICAMENTE MODIFICADO, CÉLULAS DE ROEDOR ISOLADA, CÉLULA IMORTALIZADA, EMBRIÃO DE ROEDOR, USO DE UM ROEDOR, CÉLULA B ISOLADA, ANTICORPO PREPARADO POR UM MÉTODO, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM ROEDOR GENETICAMENTE MODIFICADO, UM ANTICORPO, UMA CADEIA
PESADA TOTALMENTE HUMANA OU UMA CADEIA LEVE TOTALMENTE HUMANA, UMA SEQUÊNCIA NUCLEOTÍDICA, PARA GERAR UMA λ SEQUÊNCIA DE DOMÍNIO VARIÁVEL DE CADEIA PESADA OU LEVE HUMANA E GERAR UMA λ SEQUÊNCIA DA REGIÃO VARIÁVEL DE CADEIA PESADA OU LEVE HUMANA, CÉLULA-TRONCO EMBRIONÁRIA, CÉLULA ES DE ROEDOR, E,
[001] Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório dos Estados Unidos nº 62/594.944, depositado em 5 de dezembro de 2017; Pedido Provisório dos Estados Unidos nº 62/594.946, depositado em 5 de dezembro de 2017; Pedido Provisório dos Estados Unidos nº 62/609.241, depositado em 21 de dezembro de 2017; e Pedido Provisório dos Estados Unidos nº 62/609.251, depositado em 21 de dezembro de 2017; cada um dos quais é incorporado neste documento por referência.
[002] O presente pedido contém uma Listagem de Sequência, que foi submetida eletronicamente no formato ASCII e está incorporada neste documento a título de referência em sua totalidade. A cópia ASCII, criada em 3 de dezembro de 2018, é denominada 2010794-1440_SL.txt e tem 30.059 bytes de tamanho.
[003] Os anticorpos humanos são a classe terapêutica que cresce mais rapidamente. Das tecnologias atualmente usadas para sua produção, o
2 / 308 desenvolvimento de animais manipulados geneticamente (por exemplo, roedores) manipulados com material genético que codifica anticorpos humanos, no todo ou em parte, revolucionou o campo dos anticorpos monoclonais terapêuticos humanos para o tratamento de várias doenças. Ainda assim, é necessário o desenvolvimento de sistemas in vivo aprimorados para gerar anticorpos monoclonais humanos que maximizem os repertórios de anticorpos humanos em animais geneticamente manipulados hospedeiros.
[004] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um roedor, cujo genoma da linhagem germinativa inclui: um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada, incluindo: (a) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, (b) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, e (c) um ou mais genes Cλ, em que um ou mais segmentos gênicos Vλ humano e um ou mais segmentos gênicos Jλ humano são operacionalmente ligados a um ou mais genes Cλ e em que o roedor não possui um gene Cκ de roedor no locus de imunoglobulina κ endógena manipulada.
[005] Em algumas modalidades, um ou mais genes Cλ é um gene Cλ. Em algumas modalidades, um gene Cλ é ou inclui um gene Cλ de roedor. Em algumas modalidades, um gene Cλ de roedor tem uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a um gene Cλ1 de camundongo, um gene Cλ2 de camundongo ou um gene Cλ3 de camundongo. Em algumas modalidades, um gene Cλ de roedor é ou inclui um gene Cλ1 de camundongo. Em algumas modalidades, um gene Cλ de roedor é ou inclui um gene Cλ de rato. Em algumas modalidades, um gene Cλ de rato tem uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo
3 / 308 menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a um gene Cλ1 de rato, um gene Cλ2 de rato, um gene Cλ3 de rato ou um gene Cλ4 de rato.
[006] Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos estão no lugar de um ou mais segmentos gênicos Vκ de roedor, um ou mais segmentos gênicos Jκ de roedor ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos substituem um ou mais segmentos gênicos Vκ de roedor, um ou mais segmentos gênicos Jκ de roedor ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos substituem todos os segmentos gênicos Vκ de roedor funcionais e/ou todos os segmentos gênicos Jκ de roedor funcionais.
[007] Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos incluem Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5- 39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos incluem Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3- 16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos incluem Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3- 22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, e Vλ3-1.
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[008] Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos incluem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos incluem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 e Jλ7.
[009] Em algumas modalidades, um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulado inclui uma ou mais sequências não codificantes Vλ humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos de Vλ humanos, em que as uma ou mais sequências não codificantes Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico de Vλ humano em um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena. Por exemplo, referindo-se à Figura 20, uma primeira sequência não codificante Vλ humana endógena exemplar aparece naturalmente adjacente (e 3ꞌ) a um segmento gênico Vλ3-12 em um locus de cadeia leveλ de imunoglobulina humana endógena. Um locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógena manipulada incluindo a primeira sequência não codificante Vλ humana endógena exemplar pode incluir essa sequência não codificante em uma posição que é adjacente (e preferencialmente 3ꞌ) a um segmento gênico Vλ3-12 no locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógena manipulada. Um locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógena manipulada incluindo a primeira sequência não codificante Vλ humana endógena exemplar também pode incluir essa sequência não codificante em uma posição que é adjacente (e preferencialmente 5') a um segmento gênico Vλ2-11 no locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógena manipulada. Em alguns casos, um locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógena manipulada incluindo a primeira sequência não codificante Vλ humana endógena exemplar também pode incluir essa sequência não codificante em uma posição que é adjacente (e preferencialmente 3') a um segmento gênico Vλ3-12 e adjacente (e preferencialmente 5') a um segmento gênico Vλ2-11 no locus de cadeia leveκ
5 / 308 de imunoglobulina endógena manipulada. Em algumas modalidades, cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Vλ humanas é ou inclui um íntron.
[0010] Em algumas modalidades, um locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógena manipulada inclui uma ou mais sequências não codificantes Jλ humana, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos Jλ humanas, em que as uma ou mais sequências não codificantes Jλ humana aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico Jλ humana em um locus de cadeia leveλ de imunoglobulina endógeno. Em algumas modalidades, cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Jλ humanas é ou inclui um íntron. Em algumas modalidades, um locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógena manipulada inclui uma ou mais sequências não codificantes Jκ humano, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos Jλ humanas, em que as uma ou mais sequências não codificantes Jκ humano aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico Jκ humano em um locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógeno. Por exemplo, referindo-se à Figura 21, uma primeira sequência não codificante Jκ humano endógena exemplar aparece naturalmente em um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina humana endógena. Um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada incluindo a primeira sequência não codificante Jκ humano endógena exemplar pode ser uma sequência não codificante em uma posição que é adjacente a um segmento gênico Jλ (por exemplo, Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7) no locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógena manipulada. Em algumas modalidades, cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Jκ humano é ou inclui um íntron.
[0011] Em algumas modalidades, um locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógena manipulada inclui uma ou mais sequências não
6 / 308 codificantes Vλ humana, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Vλ humana é adjacente a Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3- 22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 no locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada, e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Vλ humana aparecem naturalmente adjacentes a Vλ4-69, Vλ8- 61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3- 25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena. Em algumas modalidades, um locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógena manipulada inclui uma ou mais sequências não codificantes Jλ humana, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Jλ humana é adjacente a Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Jλ humana aparecem naturalmente adjacentes a Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena. Em algumas modalidades, um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada inclui uma ou mais sequências não codificantes Jκ humano, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Jκ humano é adjacente a Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Jκ humano aparece naturalmente adjacente a Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 ou Jκ5 de um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena.
[0012] Em algumas modalidades, um locus de cadeia leveκ de
7 / 308 imunoglobulina endógena manipulada inclui uma sequência não codificante cadeia leve κ entre os um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e os um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos. Em algumas modalidades, uma sequência não codificante cadeia leve κ é uma sequência não codificante de cadeia leve κ humana. Em algumas modalidades, uma sequência não codificante cadeia leve κ humana tem uma sequência que aparece naturalmente entre um segmento gênico Vκ4-1 humano e um segmento gênico Jκ1 humano em um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina humana endógena.
[0013] Em algumas modalidades, um roedor descrito neste documento é homozigoto para um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada. Em algumas modalidades, um roedor descrito neste documento é homozigoto para um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada. Em algumas modalidades, o genoma da linhagem germinativa de um roedor inclui um segundo locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada que inclui: (a) um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos, e (b) um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos, em que os um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos e os um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos são operacionalmente ligados a um gene Cκ.
[0014] Em algumas modalidades, o genoma do roedor inclui ainda uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma desoxinucleotidiltransferase (TdT) terminal exógena operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional. Em algumas modalidades, o elemento de controle transcricional inclui um elemento de controle transcricional de RAG1, um elemento de controle transcricional de RAG2, um elemento de controle transcricional de cadeia pesada de imunoglobulina, um elemento de controle transcricional de cadeia leve κ de imunoglobulina,
8 / 308 um elemento de controle transcricional de cadeia leve λ de imunoglobulina ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica uma TdT exógena está localizada em um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina, um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina, um locus de RAG1 ou um locus de RAG2. Em algumas modalidades, uma TdT é uma TdT humana. Em algumas modalidades, uma TdT é uma isoforma curta de TdT (TdTS).
[0015] Em algumas modalidades, um roedor descrito neste documento inclui uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma desoxinucleotidiltransferase (TdT) terminal exógena operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional em seu genoma da linhagem germinativa e exibe cadeias leves (por exemplo, expressa domínios variáveis de cadeia leve incluindo) com pelo menos um aumento de 1,2 vezes, pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 1,75 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes ou pelo menos 5 vezes na diversidade juncional sobre um camundongo comparável (por exemplo, da mesma ninhada) que não inclui uma desoxinucleotidiltransferase (TdT) terminal exógena operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional em seu genoma da linhagem germinativa. Em algumas modalidades, a diversidade juncional é medida pelo número de leituras CDR3/10.000 únicas.
[0016] Em algumas modalidades, um roedor descrito neste documento inclui uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma desoxinucleotidiltransferase (TdT) terminal exógena operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional em seu genoma da linhagem germinativa e pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65% das cadeias leves (por exemplo, cadeias leves lambda e/ou kappa) produzidas pelo roedor exibem adições não modelo.
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[0017] Em algumas modalidades, um genoma da linhagem germinativa de um roedor descrito neste documento inclui: um locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulado, incluindo: (a) um ou mais segmentos gênicos VH humanos, (b) um ou mais segmentos gênicos DH humanos, e (c) um ou mais segmentos gênicos JH humanos, em que os um ou mais segmentos gênicos VH humanos, os um ou mais segmentos gênicos DH humanos e os um ou mais segmentos gênicos JH humanos são operacionalmente ligados a uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
[0018] Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos estão no lugar de um ou mais segmentos gênicos VH de roedores, um ou mais segmentos gênicos DH de roedores, um ou mais segmentos gênicos JH de roedores ou uma combinação destes. Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos substituem um ou mais segmentos gênicos VH de roedores, um ou mais segmentos gênicos DH de roedores, um ou mais segmentos gênicos JH de roedores ou qualquer combinação destes.
[0019] Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos VH humano incluem VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1- 45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1 ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos
10 / 308 VH humano incluem VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1- 46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3- 11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, e VH6-1.
[0020] Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos DH humanos incluem DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27 ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos DH humanos incluem DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2- 21, DH3-22, DH6-25, DH1-26 e DH7-27.
[0021] Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos JH humanos incluem JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos JH humanos incluem JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 e JH6.
[0022] Em algumas modalidades, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada inclui uma ou mais sequências não codificantes VH humano, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos VH humanos, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes VH aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico VH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena. Em algumas modalidades, cada uma das uma ou mais sequências não codificantes VH humano é ou inclui um íntron. Em algumas modalidades, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada inclui uma ou mais sequências não codificantes DH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos DH humanos, em que cada uma ou das uma ou mais
11 / 308 sequências não codificantes DH aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico DH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena. Em algumas modalidades, cada uma das uma ou mais sequências não codificantes DH humano é ou inclui um íntron. Em algumas modalidades, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada inclui uma ou mais sequências não codificantes JH humano, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos JH humanos, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes JH aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico JH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena. Em algumas modalidades, cada uma das uma ou mais sequências não codificantes JH humano é ou inclui um íntron.
[0023] Em algumas modalidades, um roedor descrito neste documento é homozigoto para um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
[0024] Em algumas modalidades, uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor é uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor endógena.
[0025] Em algumas modalidades, segmentos gênicos Vλ endógenos, segmentos gênicos Jλ endógenos e os genes Cλ endógenos são excluídos no todo ou em parte. Em algumas modalidades, um roedor descrito neste documento não expressa domínios variáveis de cadeia leve λ de imunoglobulina endógena de forma detectável. Em algumas modalidades, um roedor descrito neste documento não expressa domínios variáveis de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena de forma detectável.
[0026] Em algumas modalidades, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulado não possui um gene Adam6 de roedor endógeno funcional. Em algumas modalidades, um genoma da linhagem germinativa de um roedor inclui uma ou mais sequências nucleotídicas que
12 / 308 codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais. Em algumas modalidades, um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais são expressos (por exemplo, em uma célula do sistema reprodutor masculino, por exemplo, uma célula de testículos).
[0027] Em algumas modalidades, uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais são incluídas no mesmo cromossomo que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada. Em algumas modalidades, uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais estão incluídas no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada. Em algumas modalidades, uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais estão entre um primeiro segmento gênico VH humano e um segundo segmento gênico VH humano. Em algumas modalidades, um primeiro segmento gênico VH humano é VH1-2 e um segundo segmento gênico VH humano é VH6-1. Em algumas modalidades, uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais estão no lugar de um pseudogene Adam6 humano. Em algumas modalidades, uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais substituem um pseudogene Adam6 humano. Em algumas modalidades, uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais
13 / 308 ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais estão entre um segmento gênico VH humano e um segmento gênico DH humano.
[0028] Em algumas modalidades, um roedor descrito neste documento inclui uma população de células B que expressam anticorpos, incluindo cadeias leves λ de imunoglobulina, cada uma incluindo um domínio variável de cadeia leve λ de imunoglobulina humana. Em algumas modalidades, um domínio variável de cadeia leve λ de imunoglobulina humana é codificado por uma sequência de região variável de cadeia leve λ de imunoglobulina humana rearranjada incluindo (i) um dos um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos ou uma variante somaticamente hipermutada deste e (ii) um dos um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos ou uma variante somaticamente hipermutada deste.
[0029] Em algumas modalidades, um roedor descrito neste documento inclui uma população de células B que expressam anticorpos incluindo cadeias pesadas de imunoglobulina, cada uma incluindo um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana. Em algumas modalidades, um domínio variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana é codificado por uma sequência de região variável de cadeia pesada de imunoglobulina humana reorganizada, incluindo (i) um dos um ou mais segmentos gênicos VΗ humanos ou uma variante somaticamente hipermutada deste, (ii) um dos ou mais segmentos gênicos DΗ humanos ou uma variante somaticamente hipermutada deste e (ii) um dos um ou mais segmentos gênicos JΗ humanos ou uma variante somaticamente hipermutada deste.
[0030] Em algumas modalidades, um roedor descrito neste documento produz uma população de células B em resposta à imunização com um antígeno que inclui um ou mais epítopos. Em algumas modalidades, um roedor produz uma população de células B que expressam anticorpos que se ligam (por exemplo, se ligam especificamente) a um ou mais epítopos do
14 / 308 antígeno de interesse. Em algumas modalidades, os anticorpos expressos por uma população de células B produzidas em resposta a um antígeno incluem uma cadeia pesada com um domínio variável de cadeia pesada humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia pesada humana e/ou uma cadeia leve lambda com um domínio variável de cadeia leve lambda humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia leve lambda humana conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, os anticorpos expressos por uma população de células B produzidas em resposta a um antígeno incluem uma cadeia pesada com um domínio variável de cadeia pesada humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia pesada humana e/ou uma cadeia leve kappa com um domínio variável de cadeia leve kappa humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia leve kappa humana, conforme descrito neste documento.
[0031] Em algumas modalidades, um roedor produz uma população de células B que expressam anticorpos que se ligam a um ou mais epítopos de antígeno de interesse, em que os anticorpos expressos pela população de células B produzidas em resposta a um antígeno incluem: (i) uma cadeia pesada com um domínio variável de cadeia pesada humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia pesada humana, (ii) uma cadeia leve lambda com um domínio variável de cadeia leve lambda humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia leve lambda humana conforme descrito neste documento, (iii) uma cadeia leve kappa com um domínio variável de cadeia leve kappa humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia leve kappa humana conforme descrito neste documento ou (iv) qualquer combinação destas.
[0032] Em algumas modalidades, uma sequência de região variável de cadeia pesada humana, uma sequência de região variável de cadeia leveλ humana e/ou uma sequência de região variável de cadeia leveκ humana,
15 / 308 conforme descrito neste documento, é somaticamente hipermutado. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% das células B em uma população de células B produzidas em resposta a um antígeno incluem uma sequência de região variável de cadeia pesada humana, uma sequência de região variável de cadeia leveλ e/ou uma sequência de região variável de cadeia leveκ que é somaticamente hipermutada.
[0033] Em algumas modalidades, um roedor descrito neste documento é um camundongo ou um rato.
[0034] Em algumas modalidades, as células e/ou tecidos fornecidos (por exemplo, células e/ou tecidos isolados) de um roedor são descritos neste documento. Em algumas modalidades, as células e os tecidos fornecidos incluem, por exemplo, tecido linfoide, esplenócitos, células B, células-tronco e/ou células germinativas. Em algumas modalidades, uma célula fornecida é isolada. Em algumas modalidades, uma célula isolada é ou inclui uma célula pró-B, uma célula pré-B, uma célula B imatura, uma célula B naïve madura, uma célula B ativada, uma célula B de memória, um linfócito da linhagem B e/ou uma célula plasmática. Em algumas modalidades, uma célula isolada inclui uma célula-tronco (por exemplo, uma célula-tronco embrionária) e/ou uma célula germinativa (por exemplo, esperma, oócito).
[0035] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece uma célula de roedor isolada cujo genoma da linhagem germinativa inclui: um locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógena manipulada que inclui: (a) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, (b) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, e (c) um gene Cλ, em que os um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e os um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos são operacionalmente ligados ao
16 / 308 gene Cλ.
[0036] Em algumas modalidades, uma célula de roedor isolada descrita neste documento não possui um gene Cκ de roedor no locus de imunoglobulina endógena manipulada κ.
[0037] Em algumas modalidades, uma célula de roedor isolada descrita neste documento é uma célula-tronco embrionária (ES) de roedor.
[0038] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um embrião de roedor gerado a partir de uma célula ES de roedor descrita neste documento.
[0039] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece uma célula imortalizada gerada a partir de uma célula de roedor isolada descrita neste documento.
[0040] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um método para criar um roedor cujo genoma da linhagem germinativa inclui um locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógena manipulada, o método incluindo as etapas de: (a) introdução de um ou mais fragmentos de DNA no genoma da linhagem germinativa de uma célula ES de roedor, em que os um ou mais fragmentos de DNA compreendem: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, e (iii) um ou mais genes Cλ, em que os um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, os um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos e os um ou mais genes Cλ são introduzidos no genoma da linhagem germinativa da célula ES de roedor no locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógena, e em que os um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos e um ou mais genes Cλ são operacionalmente ligados; e (b) geração de um roedor usando a célula ES de roedor gerada
17 / 308 em (a).
[0041] Em algumas modalidades, um método de criação de um roedor cujo genoma da linhagem germinativa inclui um locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógena manipulada inclui a etapa de introdução de uma sequência não codificante de cadeia leveκ no genoma da linhagem germinativa da célula ES de roedor, de modo que a sequência não codificante de cadeia leveκ está entre os um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e os um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos no genoma da linhagem germinativa da célula ES de roedor.
[0042] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um método para criar um roedor cujo genoma da linhagem germinativa inclui um locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógena manipulada, o método incluindo as etapas de: manipular o locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógena no genoma da linhagem germinativa para incluir: um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, e um ou mais genes Cλ, em que os um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e os um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos são operacionalmente ligados aos um ou mais genes Cλ, e em que os um ou mais genes Cλ são inseridos no lugar de um gene Cκ de roedor no locus de imunoglobulina κ endógena.
[0043] Em algumas modalidades, um gene Cλ substitui um gene Cκ de roedor no locus de imunoglobulina κ endógena.
[0044] Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos incluem Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1- 44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-
18 / 308 10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos incluem Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1- 40, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 e Vλ3-1. Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos incluem Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1- 40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 e Vλ3-1.
[0045] Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos incluem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos incluem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 e Jλ7.
[0046] Em algumas modalidades, um locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógena manipulado inclui uma ou mais sequências não codificantes Vλ humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos de Vλ humanos, em que as uma ou mais sequências não codificantes Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico de Vλ humano em um locus de cadeia leveλ de imunoglobulina humana endógena. Em algumas modalidades, cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Vλ humanas é ou inclui um íntron. Em algumas modalidades, um locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógeno manipulado inclui uma ou mais sequências não codificantes Jλ humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, em que as uma ou mais sequências não codificantes Jλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico Jλ humano em um locus de cadeia leveλ de imunoglobulina endógena. Em algumas modalidades, cada uma das uma ou mais sequências
19 / 308 não codificantes Jλ humanas é ou inclui um íntron. Em algumas modalidades, um locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógeno manipulado inclui uma ou mais sequências não codificantes de Jκ humano, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, em que as uma ou mais sequências não codificantes de Jκ humano aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico Jκ humano em um locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógeno. Em algumas modalidades, cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Jκ humanas é ou inclui um íntron.
[0047] Em algumas modalidades, um gene Cλ é ou inclui um gene Cλ de roedor. Em algumas modalidades, um gene Cλ de roedor tem uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a um gene Cλ1 de camundongo, um gene Cλ2 de camundongo ou um gene Cλ3 de camundongo. Em algumas modalidades, um gene Cλ de roedor é ou inclui um gene Cλ1 de camundongo. Em algumas modalidades, um gene Cλ de roedor é ou inclui um gene Cλ de rato. Em algumas modalidades, um gene Cλ de rato tem uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a um gene Cλ1 de rato, um gene Cλ2 de rato, um gene Cλ3 de rato ou um gene Cλ4 de rato.
[0048] Em algumas modalidades, um ou mais fragmentos de DNA incluem pelo menos um marcador de seleção. Em algumas modalidades, um ou mais fragmentos de DNA incluem pelo menos um sítio de recombinação sítio-específico.
[0049] Em algumas modalidades, o genoma da linhagem germinativa de um roedor inclui: um locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulado, incluindo: um ou mais segmentos gênicos VH humanos,
20 / 308 um ou mais segmentos gênicos DH humanos, e um ou mais segmentos gênicos JH humanos, em que os um ou mais segmentos gênicos VH humanos, os um ou mais segmentos gênicos DH humanos e os um ou mais segmentos gênicos JH humanos são operacionalmente ligados a uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor.
[0050] Em algumas modalidades, a etapa de manipulação do locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógena no genoma da linhagem germinativa é realizada em uma célula ES de roedor cujo genoma da linhagem germinativa inclui um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulado incluindo um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos operacionalmente ligados a uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor.
[0051] Em algumas modalidades, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulado inclui uma ou mais sequências não codificantes VH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos VH humanos, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes VH humanas aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico VH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena. Em algumas modalidades, cada uma das uma ou mais sequências não codificantes VH humanas é ou inclui um íntron. Em algumas modalidades, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulado inclui uma ou mais sequências não codificantes DH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos DH humanos, em que cada uma ou das uma ou mais sequências não codificantes DH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico DH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena. Em algumas modalidades, cada uma das
21 / 308 uma ou mais sequências não codificantes DH humanas é ou inclui um íntron. Em algumas modalidades, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulado inclui uma ou mais sequências não codificantes JH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos JH humanos, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes JH aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico JH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena. Em algumas modalidades, cada uma das uma ou mais sequências não codificantes JH humanas é ou inclui um íntron.
[0052] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um método de produção de um anticorpo em um roedor, o método incluindo as etapas de: (i) imunizar um roedor com um antígeno de interesse, em que o roedor possui um genoma da linhagem germinativa, incluindo: um locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógena manipulado, incluindo: (a) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, (b) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, e (c) um ou mais genes Cλ, em que os um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e os um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos são operacionalmente ligados ao gene Cλ, e em que os um ou mais genes Cλ estão no lugar de um gene Cκ de roedor no locus de imunoglobulina κ endógena; manter o roedor em condições suficientes para o roedor produzir uma resposta imune ao antígeno de interesse; e recuperar um anticorpo que se liga ao antígeno de interesse do roedor, a uma célula do roedor ou uma célula derivada de uma célula do
22 / 308 roedor.
[0053] Em algumas modalidades, em resposta à etapa de imunização, um roedor produz uma célula B que expressa um anticorpo que se liga ao antígeno de interesse. Em algumas modalidades, um anticorpo expresso por uma célula B inclui uma cadeia pesada com um domínio variável de cadeia pesada humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia pesada humana e/ou uma cadeia leve lambda com um domínio variável de cadeia leve lambda humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia leve lambda humana conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, um anticorpo expresso por uma célula B inclui (i) uma cadeia pesada com um domínio variável de cadeia pesada humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia pesada humana, (ii) uma cadeia leve lambda com um domínio variável de cadeia leve lambda humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia leve lambda humana, conforme descrito neste documento, (iii) uma cadeia leve kappa com um domínio variável de cadeia leve kappa humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia leve kappa humana, conforme descrito neste documento ou (iv) qualquer combinação destas.
[0054] Em algumas modalidades, em resposta à etapa de imunização, o roedor produz uma população de células B que expressam anticorpos que se ligam a um antígeno de interesse. Em algumas modalidades, os anticorpos expressos por uma população de células B produzidas em resposta a um antígeno incluem uma cadeia pesada com um domínio variável de cadeia pesada humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia pesada humana e/ou uma cadeia leve lambda com um domínio variável de cadeia leve lambda humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia leve lambda humana conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, anticorpos expressos por uma população de células B produzidas em resposta a um antígeno incluem: (i) uma cadeia pesada com
23 / 308 um domínio variável de cadeia pesada humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia pesada humana, (ii) uma cadeia leve lambda com um domínio variável de cadeia leve lambda humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia leve lambda humana conforme descrito neste documento, (iii) uma cadeia leve kappa com um domínio variável de cadeia leve kappa humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia leve kappa humana conforme descrito neste documento ou (iv) qualquer combinação destas.
[0055] Em algumas modalidades, em resposta à etapa de imunização, um roedor produz uma população de células B que expressam anticorpos que se ligam a um ou mais epítopos de antígeno de interesse, em que os anticorpos expressos pela população de células B produzidas em resposta a um antígeno incluem: (i) uma cadeia pesada com um domínio variável de cadeia pesada humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia pesada humana, (ii) uma cadeia leve lambda com um domínio variável de cadeia leve lambda humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia leve lambda humana conforme descrito neste documento, (iii) uma cadeia leve kappa com um domínio variável de cadeia leve kappa humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia leve kappa humana conforme descrito neste documento ou (iv) qualquer combinação destas.
[0056] Em algumas modalidades, uma sequência de região variável de cadeia pesada humana, uma sequência de região variável de cadeia leveλ humana e/ou uma sequência de região variável de cadeia leveκ humana, conforme descrito neste documento, é somaticamente hipermutado. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% das células B em uma população de células B produzidas em resposta a um antígeno incluem uma sequência de região variável de cadeia pesada humana,
24 / 308 uma sequência de região variável de cadeia leveλ e/ou uma sequência de região variável de cadeia leve κ que é somaticamente hipermutada.
[0057] Em algumas modalidades, um anticorpo que se liga ao antígeno de interesse é isolado, recuperado ou identificado a partir de uma célula B do roedor. Em algumas modalidades, um anticorpo que se liga a um antígeno de interesse é isolado, recuperado ou identificado a partir de um hibridoma produzido com uma célula B do roedor.
[0058] Em algumas modalidades, um antígeno inclui um ou mais epítopos e um anticorpo que se liga a um antígeno de interesse se liga a um epítopo dos um ou mais epítopos.
[0059] Em algumas modalidades, um gene Cλ é ou inclui um gene Cλ de roedor. Em algumas modalidades, um gene Cλ de roedor tem uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a um gene Cλ1 de camundongo, um gene Cλ2 de camundongo ou um gene Cλ3 de camundongo. Em algumas modalidades, um gene Cλ de roedor é ou inclui um gene Cλ1 de camundongo. Em algumas modalidades, um gene Cλ de roedor é ou inclui um gene Cλ de rato. Em algumas modalidades, um gene Cλ de rato tem uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica a um gene Cλ1 de rato, um gene Cλ2 de rato, um gene Cλ3 de rato ou um gene Cλ4 de rato.
[0060] Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos compreendem Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos compreendem Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-
25 / 308 18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 e Vλ3-
1. Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos compreendem Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3- 22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 e Vλ3-1.
[0061] Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos incluem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 e Jλ7.
[0062] Em algumas modalidades, um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulado inclui uma ou mais sequências não codificantes Vλ humanas, em que cada um dos um ou mais sequências Vλ não codificantes adjacentes a Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3- 25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 humanos no locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulado, e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5- 45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2- 11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena. Em algumas modalidades, um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulado inclui uma ou mais sequências não codificantes Jλ humanas, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Jλ humanas é adjacente a Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulado e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Jλ humanas aparecem
26 / 308 naturalmente adjacentes a Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena. Em algumas modalidades, um locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógena manipulada inclui uma ou mais sequências não codificantes Jκ humano, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Jκ humano é adjacente a Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Jκ humano aparecem naturalmente adjacentes a Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 ou Jκ5 de um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina humana endógena.
[0063] Em algumas modalidades, um roedor tem um genoma da linhagem germinativa, incluindo um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulado, incluindo: (a) um ou mais segmentos gênicos VH humanos, (b) um ou mais segmentos gênicos DH humanos, e (c) um ou mais segmentos gênicos JH humanos, em que os um ou mais segmentos gênicos VH humanos, os um ou mais segmentos gênicos DH humanos e os um ou mais segmentos gênicos JH humanos são operacionalmente ligados a uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor.
[0064] Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos VH humanos compreendem VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1- 46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3- 11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1 ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos VH humanos compreendem VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5- 51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33,
27 / 308 VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1- 18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, e VH6-1.
[0065] Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos DH humanos compreendem DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27 ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos DH humanos compreendem DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, e DH7-27.
[0066] Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos JH humanos compreendem JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, um ou mais segmentos de gênicos JH humanos compreendem JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 e JH6.
[0067] Em algumas modalidades, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulado inclui uma ou mais sequências não codificantes VH humanas, em que cada um dos um ou mais sequências VH não codificantes adjacentes a VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1- 46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3- 11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2 ou VH6-1 humanos no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulado e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes VH humanas aparecem naturalmente adjacentes a VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1- 69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3- 30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15,
28 / 308 VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1- 2 ou VH6-1 de um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena. Em algumas modalidades, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulado inclui uma ou mais sequências não codificantes DH humanas, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes DH humanas é adjacente a DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26 ou DH7-27 no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulado, e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de DH humanas aparecem naturalmente adjacentes a DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26 ou DH7-27 de um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena. Em algumas modalidades, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulado inclui uma ou mais sequências não codificantes JH humanas, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes JH humanas é adjacente a JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 ou JH6 no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulado, e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes JH naturalmente aparece adjacente a JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 ou JH6 de um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena. Em algumas modalidades, uma célula do roedor que é recuperada é uma célula B. Em algumas modalidades, uma célula derivada de uma célula do roedor é um hibridoma.
[0068] Em algumas modalidades, uma sequência nucleotídica que codifica uma sequência de região variável de cadeia pesada humana, uma sequência de região variável de cadeia leve lambda humana e/ou uma sequência de região variável de cadeia leve kappa humana é obtida de uma célula B.
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[0069] Em algumas modalidades, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulado não possui um gene Adam6 de roedor endógeno funcional. Em algumas modalidades, um genoma da linhagem germinativa de um roedor inclui uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais. Em algumas modalidades, um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais são expressos (por exemplo, em uma célula do sistema reprodutor masculino, por exemplo, uma célula de testículos).
[0070] Em algumas modalidades, uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais são incluídas no mesmo cromossomo que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada. Em algumas modalidades, uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais estão incluídas no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada. Em algumas modalidades, uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais estão entre um primeiro segmento gênico VH humano e um segundo segmento gênico VH humano. Em algumas modalidades, um primeiro segmento gênico VH humano é VH1-2 e um segundo segmento gênico VH humano é VH6-1. Em algumas modalidades, uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais estão no lugar de um pseudogene Adam6 humano. Em algumas modalidades, uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam
30 / 308 um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais substituem um pseudogene Adam6 humano. Em algumas modalidades, uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais estão entre um segmento gênico VH humano e um segmento gênico DH humano.
[0071] Em algumas modalidades, um roedor é um camundongo ou um rato.
[0072] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um roedor cujo genoma da linhagem germinativa inclui um locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulado por homozigotos κ, incluindo: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, em que os um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos compreendem Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5- 37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 ou qualquer combinação destes, (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, em que os um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes, e (iii) um gene Cλ de roedor; em que os um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, os um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos e o gene Cλ de roedor são operacionalmente ligados um ao outro, em que o gene Cλ de roedor está no lugar de um gene Cκ de roedor do locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena, em que o locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulado inclui:
31 / 308 (a) uma ou mais sequências não codificantes Vλ humanas, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Vλ humanas é adjacente a Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3- 22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 no locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulado e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a Vλ5-52, Vλ1- 51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2- 18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena, e (b) uma ou mais sequências não codificantes Jκ humanas, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Jκ humanas é adjacente a Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, ou Jλ7 no locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulado e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Jκ humanas naturalmente aparece adjacente a Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 ou Jκ5 de um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina humana endógena, e em que o locus de cadeia leve κ de imunoglobulina inclui uma sequência não codificante de cadeia leve κ humana entre os um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e os um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos que possui uma sequência que naturalmente aparece entre um segmento do gênico Vκ4-1 humano e um segmento gênico Jκ1 humano em um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina humana endógena.
[0073] Em algumas modalidades, um gene Cλ de roedor é um gene Cλ1 de camundongo.
[0074] Em algumas modalidades, um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulado inclui potenciadores de cadeia leve κ
32 / 308 de imunoglobulina de roedor Eκi eκ3’.
[0075] Em algumas modalidades, um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulado inclui uma deleção de um ou mais segmentos gênicos Vκ e/ou um ou mais segmentos gênicos Jκ de roedor. Em algumas modalidades, um locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógena manipulado inclui uma deleção de todos os segmentos gênicos Vκ e/ou Jκ de roedor funcionais.
[0076] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um roedor cujo genoma da linhagem germinativa inclui: (a) um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena homozigótica que inclui um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos operacionalmente ligados a um ou mais genes de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina endógena, de modo que o roedor expressa cadeias pesadas de imunoglobulina, cada uma compreendendo uma sequência de domínio variável de cadeia pesada humana e uma sequência de domínio constante de cadeia pesada de roedor, (b) um primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulado incluindo um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jκ operacionalmente ligados a um gene de região Cκ de roedor endógeno de modo que o roedor expressa cadeias leves de imunoglobulina, cada uma incluindo uma sequência de domínio variável de cadeia leve κ humana e uma sequência de domínio constante de cadeia leve κ de roedor, e (c) um segundo locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulado, incluindo: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, em que os um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos compreendem Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-
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37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 ou qualquer combinação destes, (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, em que os um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes, e (iii) um gene Cλ de roedor; em que os um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, os um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos e o gene Cλ de roedor são operacionalmente ligados um ao outro, em que o gene Cλ de roedor está no lugar de um gene Cκ de roedor do locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena, em que o locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulado inclui: (a) uma ou mais sequências não codificantes Vλ humanas, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Vλ humanas é adjacente a Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2- 18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 no locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulado e em que cada uma ou mais sequências não codificantes Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5- 45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena, e (b) uma ou mais sequências não codificantes Jκ humanas, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Jκ humanas é adjacente a Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, ou Jλ7 no locus de cadeia leve κ de
34 / 308 imunoglobulina endógena manipulado e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Jκ humanas naturalmente aparece adjacente a Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 ou Jκ5 de um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina humana endógena, e em que o locus de cadeia leve κ de imunoglobulina inclui uma sequência não codificante de cadeia leve κ humana entre os um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e os um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos que possui uma sequência que naturalmente aparece entre um segmento do gênico Vκ4-1 humano e um segmento gênico Jκ1 humano em um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina humana endógena; de modo que o roedor expressa cadeias leves de imunoglobulina, cada uma compreendendo uma sequência de domínio variável de cadeia leve λ humana e uma sequência de domínio constante de cadeia leve λ de roedor.
[0077] Em algumas modalidades, um roedor descrito neste documento inclui um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina endógena inativado. Em algumas modalidades, um roedor descrito neste documento é homozigoto para o locus de cadeia leve λ de imunoglobulina endógena inativado. Em algumas modalidades, um roedor descrito neste documento é homozigoto para o locus de cadeia leve λ de imunoglobulina endógena inativado.
[0078] Em algumas modalidades, o genoma do roedor inclui ainda uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma desoxinucleotidiltransferase (TdT) terminal exógena operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional. Em algumas modalidades, o elemento de controle transcricional inclui um elemento de controle transcricional de RAG1, um elemento de controle transcricional de RAG2, um elemento de controle transcricional de cadeia pesada de imunoglobulina, um elemento de controle transcricional de cadeia leve κ de imunoglobulina,
35 / 308 um elemento de controle transcricional de cadeia leve λ de imunoglobulina ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica uma TdT exógena está localizada em um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina, um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina, um locus de RAG1 ou um locus de RAG2. Em algumas modalidades, uma TdT é uma TdT humana. Em algumas modalidades, uma TdT é uma isoforma curta de TdT (TdTS).
[0079] Em algumas modalidades, um roedor descrito neste documento inclui uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma desoxinucleotidiltransferase (TdT) terminal exógena operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional em seu genoma da linhagem germinativa e exibe cadeias leves (por exemplo, expressa domínios variáveis de cadeia leve incluindo) com pelo menos um aumento de 1,2 vezes, pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 1,75 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes ou pelo menos 5 vezes na diversidade juncional sobre um camundongo comparável (por exemplo, da mesma ninhada) que não inclui uma desoxinucleotidiltransferase (TdT) terminal exógena operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional em seu genoma da linhagem germinativa. Em algumas modalidades, a diversidade juncional é medida pelo número de leituras CDR3/10.000 únicas. Em algumas modalidades, a diversidade juncional é medida pelo número de leituras CDR3/10.000 únicas.
[0080] Em algumas modalidades, um roedor descrito neste documento inclui uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma desoxinucleotidiltransferase (TdT) terminal exógena operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional em seu genoma da linhagem germinativa e pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos
36 / 308 60%, pelo menos 65% das cadeias leves (por exemplo, cadeias leves lambda e/ou kappa) produzidas pelo roedor exibem adições não modelo.
[0081] Em algumas modalidades, um roedor descrito neste documento é um rato ou um camundongo.
[0082] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um anticorpo preparado por um método que inclui as etapas de: (a) fornecer de um roedor descrito neste documento; (b) imunizar o roedor com um antígeno de interesse; (c) manter o roedor em condições suficientes para o roedor produzir uma resposta imune ao antígeno de interesse; e (d) recuperar um anticorpo que se liga ao antígeno de interesse do roedor ou uma célula do roedor ou uma célula derivada de uma célula do roedor, em que o anticorpo de (d) inclui domínios variáveis de cadeia pesada humanos e variáveis de cadeia leve λ humanos.
[0083] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um anticorpo preparado por um método que inclui as etapas de: (a) imunizar um roedor descrito neste documento com um antígeno de interesse; (b) manter o roedor em condições suficientes para o roedor produzir uma resposta imune ao antígeno de interesse; e (c) recuperar um anticorpo que se liga ao antígeno de interesse do roedor ou uma célula do roedor ou uma célula derivada de uma célula do roedor, em que o anticorpo de (c) inclui domínios variáveis de cadeia pesada humanos e variáveis de cadeia leve λ humanos.
[0084] Em algumas modalidades, um roedor não expressa domínios variáveis de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena de forma detectável. Em algumas modalidades, um roedor não expressa domínios variáveis de
37 / 308 cadeia leve λ de imunoglobulina endógena de forma detectável.
[0085] Em algumas modalidades, um roedor descrito neste documento produz uma população de células B em resposta à imunização com um antígeno que inclui um ou mais epítopos. Em algumas modalidades, um roedor produz uma população de células B que expressam anticorpos que se ligam (por exemplo, se ligam especificamente) a um ou mais epítopos do antígeno de interesse. Em algumas modalidades, os anticorpos expressos por uma população de células B produzidas em resposta a um antígeno incluem uma cadeia pesada com um domínio variável de cadeia pesada humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia pesada humana e/ou uma cadeia leve lambda com um domínio variável de cadeia leve lambda humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia leve lambda humana conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, anticorpos expressos por uma população de células B produzidas em resposta a um antígeno incluem: (i) uma cadeia pesada com um domínio variável de cadeia pesada humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia pesada humana, (ii) uma cadeia leve lambda com um domínio variável de cadeia leve lambda humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia leve lambda humana conforme descrito neste documento, (iii) uma cadeia leve kappa com um domínio variável de cadeia leve kappa humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia leve kappa humana conforme descrito neste documento ou (iv) qualquer combinação destas.
[0086] Em algumas modalidades, um roedor produz uma população de células B que expressam anticorpos que se ligam a um ou mais epítopos de antígeno de interesse, em que os anticorpos expressos pela população de células B produzidas em resposta a um antígeno incluem: (i) uma cadeia pesada com um domínio variável de cadeia pesada humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia pesada humana, (ii) uma cadeia
38 / 308 leve lambda com um domínio variável de cadeia leve lambda humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia leve lambda humana conforme descrito neste documento e/ou (iii) uma cadeia leve kappa com um domínio variável de cadeia leve kappa humana codificado por uma sequência de região variável de cadeia leve kappa humana conforme descrito neste documento.
[0087] Em algumas modalidades, uma sequência de região variável de cadeia pesada humana, uma sequência de região variável de cadeia leveλ humana e/ou uma sequência de região variável de cadeia leveκ humana, conforme descrito neste documento, é somaticamente hipermutado. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% das células B em uma população de células B produzidas em resposta a um antígeno incluem uma sequência de região variável de cadeia pesada humana, uma sequência de região variável de cadeia leveλ e/ou uma sequência de região variável de cadeia leveκ que é somaticamente hipermutada.
[0088] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um método para fabricar um anticorpo que inclui: (i) expressar uma primeira sequência nucleotídica que codifica uma cadeia pesada de imunoglobulina em uma célula hospedeira, em que a primeira sequência nucleotídica inclui uma sequência de região variável de cadeia pesada humana; (ii) expressar uma segunda sequência nucleotídica que codifica uma cadeia leve λ de imunoglobulina em uma célula hospedeira, em que a segunda sequência nucleotídica inclui uma sequência de região variável de cadeia leve λ humana que foi identificada (por exemplo, expressa e/ou isolada) de um roedor cujo genoma da linhagem germinativa inclui: um locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógena manipulada que inclui:
39 / 308 (a) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, (b) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, e (c) um ou mais genes Cλ, em que os um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e os um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos são operacionalmente ligados aos um ou mais genes Cλ, e em que o roedor não possui um gene Cκ do roedor no locus de imunoglobulina κ endógena manipulada; (iii) cultivar a célula hospedeira de modo que as cadeias leves de imunoglobulina e cadeias pesadas de imunoglobulina sejam expressas e formem um anticorpo; e (iv) obter o anticorpo da célula hospedeira e/ou cultura de células hospedeiras.
[0089] Em algumas modalidades, uma primeira sequência nucleotídica inclui uma região constante de cadeia pesada humana. Em algumas modalidades, um anticorpo é um anticorpo inteiramente humano.
[0090] Em algumas modalidades, um segundo nucleotídeo inclui uma sequência de região constante de cadeia leve λ humana.
[0091] Em algumas modalidades, um anticorpo é um anticorpo quimérico reverso. Em algumas modalidades, uma primeira sequência nucleotídica inclui uma região constante de cadeia pesada de roedor. Em algumas modalidades, uma segunda sequência nucleotídica inclui uma sequência de região constante de cadeia leve λ de roedor.
[0092] Em algumas modalidades, a presente divulgação fornece um roedor, cujo genoma da linhagem germinativa inclui: (a) um primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulado, compreendendo: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, e
40 / 308 (iii) um gene Cλ, em que os um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e os um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos são operacionalmente ligados ao gene Cλ, e em que o roedor não possui um gene Cκ do roedor no primeiro locus de imunoglobulina κ endógena manipulado; e (b) um segundo locus de cadeia leveκ de imunoglobulina endógena manipulado inclui ainda: (i) um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos, e (ii) um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos, em que os um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos e os um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos são operacionalmente ligados a um gene Cκ.
[0093] Em algumas modalidades, um gene Cκ é um gene Cκ endógeno de roedor.
[0094] Em algumas modalidades, o genoma do roedor inclui ainda uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma desoxinucleotidiltransferase (TdT) terminal exógena operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional. Em algumas modalidades, o elemento de controle transcricional inclui um elemento de controle transcricional de RAG1, um elemento de controle transcricional de RAG2, um elemento de controle transcricional de cadeia pesada de imunoglobulina, um elemento de controle transcricional de cadeia leve κ de imunoglobulina, um elemento de controle transcricional de cadeia leve λ de imunoglobulina ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica uma TdT exógena está localizada em um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina, um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina, um locus de RAG1 ou um locus de RAG2. Em algumas modalidades, uma TdT é uma
41 / 308 TdT humana. Em algumas modalidades, uma TdT é uma isoforma curta de TdT (TdTS).
[0095] Em algumas modalidades, o genoma do roedor inclui ainda uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma desoxinucleotidiltransferase (TdT) terminal exógena operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional. Em algumas modalidades, o elemento de controle transcricional inclui um elemento de controle transcricional de RAG1, um elemento de controle transcricional de RAG2, um elemento de controle transcricional de cadeia pesada de imunoglobulina, um elemento de controle transcricional de cadeia leve κ de imunoglobulina, um elemento de controle transcricional de cadeia leve λ de imunoglobulina ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos que codifica uma TdT exógena está localizada em um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina, um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina, um locus de RAG1 ou um locus de RAG2. Em algumas modalidades, uma TdT é uma TdT humana. Em algumas modalidades, uma TdT é uma isoforma curta de TdT (TdTS).
[0096] Em algumas modalidades, um roedor descrito neste documento inclui uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma desoxinucleotidiltransferase (TdT) terminal exógena operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional em seu genoma da linhagem germinativa e exibe cadeias leves (por exemplo, expressa domínios variáveis de cadeia leve incluindo) com pelo menos um aumento de 1,2 vezes, pelo menos 1,5 vezes, pelo menos 1,75 vezes, pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes ou pelo menos 5 vezes na diversidade juncional sobre um camundongo comparável (por exemplo, da mesma ninhada) que não inclui uma desoxinucleotidiltransferase (TdT) terminal exógena operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional em seu
42 / 308 genoma da linhagem germinativa. Em algumas modalidades, a diversidade juncional é medida pelo número de leituras CDR3/10.000 únicas. Em algumas modalidades, a diversidade juncional é medida pelo número de leituras CDR3/10.000 únicas.
[0097] Em algumas modalidades, um roedor descrito neste documento inclui uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma desoxinucleotidiltransferase (TdT) terminal exógena operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional em seu genoma da linhagem germinativa e pelo menos 25%, pelo menos 30%, pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65% das cadeias leves (por exemplo, cadeias leves lambda e/ou kappa) produzidas pelo roedor exibem adições não modelo.
[0098] Em várias modalidades, um animal não humano, uma célula não humana ou um tecido não humano, conforme descrito neste documento, é um roedor, uma célula de roedor ou um tecido de roedor; em algumas modalidades, um camundongo, uma célula de camundongo ou um tecido de camundongo; em algumas modalidades, um rato, uma célula de rato ou um tecido de rato. Em algumas modalidades, um camundongo, uma célula de camundongo ou um tecido de camundongo, conforme descrito neste documento, compreende um fundo genético que inclui uma cepa 129, uma cepa BALB/c, uma cepa C57BL/6, uma cepa 129xC57BL/6 mista ou combinações destas.
[0099] As Figuras incluídas neste documento, que são compostas das figuras a seguir, são apenas para fins ilustrativos e não para limitação.
[00100] As Figuras 1A e 1B mostram ilustrações de uma modalidade exemplar, sem escala, de uma estratégia para a construção de um vetor de direcionamento (descrito no Exemplo 1.1) usado na geração de uma modalidade do roedor de acordo com a presente divulgação.
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[00101] A Figura 2A mostra uma ilustração de uma modalidade exemplar, sem escala, da inserção de um vetor de direcionamento (descrito no Exemplo 1.1) em um locus de cadeia leve Ig manipulado de um clone de célula-tronco embrionária (ES) de roedor, sendo tal clone de célula ES usado na geração de uma modalidade de acordo com a presente divulgação.
[00102] A Figura 2B mostra uma ilustração de uma modalidade exemplar, sem escala, de remoção de cassete(s) de seleção mediada por recombinase em um locus de cadeia leve Ig manipulado resultante da inserção de um vetor de direcionamento (descrito no Exemplo 1.1) usado na geração de uma modalidade do roedor de acordo com a presente divulgação.
[00103] A Figuras 3 mostra uma ilustração de uma modalidade exemplar, sem escala, de uma estratégia para a construção de um vetor de direcionamento (descrito no Exemplo 1.2) usado na geração de uma modalidade do roedor de acordo com a presente divulgação.
[00104] A Figura 4A mostra uma ilustração, sem escala, da inserção de um vetor de direcionamento (descrito no Exemplo 1.2) em um locus de cadeia leve Ig manipulado de um clone de células-tronco embrionárias (ES) de roedor, tal clone de células ES sendo usado na geração de uma modalidade do roedor de acordo com a presente divulgação.
[00105] A Figura 4B mostra uma ilustração de uma modalidade exemplar, sem escala, de remoção de cassete(s) de seleção mediada por recombinase em um locus de cadeia leve Ig manipulado resultante da inserção de um vetor de direcionamento (descrito no Exemplo 1.2) usado na geração de uma modalidade do roedor de acordo com a presente divulgação.
[00106] A Figura 5 mostra resultados derivados de uma modalidade representativa de acordo com a presente divulgação mostrando esplenócitos marcados únicos colhidos de camundongos de tipo selvagem (WT) e 6558 HO (LiK, homozigotos), a linha superior ilustrando a expressão de CD19 (eixo y) e CD3 (eixo x), e a linha inferior ilustrando os esplenócitos com
44 / 308 marcação por CD19+ expressando imunoglobulina D (IgD, eixo y) e imunoglobulina M (IgM, eixo x).
[00107] A Figura 6 mostra resultados derivados de uma modalidade representativa de acordo com a presente divulgação, incluindo medula óssea marcada por célula única representativa colhida de camundongos de tipo selvagem (WT) e 6558HO (LiK, homozigotos), a linha superior ilustrando a expressão de CD19 (eixo y) e CD3 (eixo x), e a linha inferior ilustrando a expressão de imunoglobulina M (IgD, eixo y) e B220 (eixo x).
[00108] A Figura 7 mostra resultados derivados de uma modalidade representativa de acordo com a presente divulgação, incluindo esplenócitos marcados por CD19+ representativos colhidos de camundongos de tipo selvagem (WT) e 6558HO (LiK, homozigotos) ilustrando a expressão de cadeias leves de imunoglobulina contendo Igλ de camundongo (eixo y) ou regiões constantes de Ig de camundongo (eixo x).
[00109] A Figura 8 mostra resultados derivados de uma modalidade representativa de acordo com a presente divulgação, incluindo esplenócitos marcados por célula única representativos colhidos de vários camundongos humanizados indicados ilustrando a expressão de CD19 (eixo y) e CD3 (eixo x). Camundongos HOH/LiK/λ-/- – camundongos homozigotos para cadeia pesada de imunoglobulina humanizada (ver, por exemplo, Patentes US Nos.
8.642.835 e 8.697.940), homozigotos para o locus LiK e homozigotos para um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina endógena inativado; Camundongos HOH/KoK/LiK/λ-/- – camundongos homozigotos para cadeia pesada de imunoglobulina humanizada (ver, por exemplo, Patentes US Nos.
8.642.835 e 8.697.940), homozigotos para um locus kappa compreendendo locus LiK e um segundo locus kappa compreendendo locus de cadeia leve kappa de imunoglobulina humanizada e homozigoto para um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina endógena inativado; camundongos HOH/KoK – camundongos de controle homozigotos para cadeia pesada de imunoglobulina
45 / 308 humanizada e homozigotos para cadeia leve kappa de imunoglobulina humanizada.
[00110] A Figura 9 mostra resultados derivados de uma modalidade representativa de acordo com a presente divulgação, incluindo esplenócitos marcados por CD19+ representativos colhidos de vários camundongos indicados humanizados ilustrando a expressão de cadeias leves de imunoglobulina contendo Igλ de camundongo (eixo y) ou regiões constantes de Igκ de camundongo (eixo x).
[00111] A Figura 10 mostra resultados derivados de uma modalidade representativa de acordo com a presente divulgação, incluindo medula óssea marcada por célula única representativa colhidos de vários camundongos humanizados indicados ilustrando a expressão de imunoglobulina M (IgD, eixo y) e B220 (eixo x).
[00112] A Figura 11 mostra resultados derivados de uma modalidade representativa de acordo com a presente divulgação, incluindo medula óssea marcada por célula única representativa colhida de vários camundongos humanizados indicados ilustrando expressão de cadeias leves de imunoglobulina contendo regiões constantes de Igλ de camundongo (eixo y) ou de Igκ de camundongo (eixo x) em células B imaturas (linha superior) e maduras (linha inferior).
[00113] A Figura 12 mostra uma ilustração de um diagrama esquemático de uma modalidade exemplar de acordo com a presente divulgação, sem escala, de um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina manipulado conforme descrito neste documento e do rearranjo do locus para formar uma molécula de mRNA.
[00114] A Figura 13 mostra resultados derivados de uma modalidade representativa de acordo com a presente divulgação incluindo imunoblots (Western blots) de proteína representativos de SDS-PAGE usando soro isolado de camundongos de tipo selvagem (WT) e 6558 homozigotos (LiK
46 / 308 HO) conforme descrito no Exemplo 3.3.
[00115] A Figura 14 mostra os resultados do teste de uma modalidade de acordo com a presente divulgação, mostrando esplenócitos representativos marcados por célula única colhidos de camundongos humanizados ilustrando a expressão de CD19 (eixo y) e CD3 (eixo x). Camundongos HOH/LiK/λ-/- /TdT – camundongos homozigotos para cadeia pesada de imunoglobulina humanizada (ver, por exemplo, Patentes US Nos. 8.642.835 e 8.697.940), homozigotos para locus LiK e homozigotos para um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina endógena inativado que inclui uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma desoxinucleotidiltransferase (TdT) terminal exógena; e Camundongos HOH/KoK/LiK/λ-/-/TdT – camundongos homozigotos para cadeia pesada de imunoglobulina humanizada (ver, por exemplo, Patentes US nº 8.642.835 e 8.697.940), homozigotos para um locus kappa compreendendo um locus LiK e um segundo locus kappa compreendendo locus de cadeia leve kappa de imunoglobulina humanizada e homozigoto para um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina endógena inativado que inclui uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma desoxinucleotidiltransferase (TdT) terminal exógena.
[00116] A Figura 15 mostra resultados do teste de uma modalidade de acordo com a presente divulgação, mostrando esplenócitos marcados por CD19+ representativos colhidos de vários camundongos indicados humanizados ilustrando a expressão de cadeias leves de imunoglobulina contendo Igλ de camundongo (eixo y) ou regiões constantes de Igκ de camundongo (eixo x).
[00117] A Figura 16 mostra resultados do teste de uma modalidade de acordo com a presente divulgação, mostrando medula óssea marcada por célula única representativa colhidos de vários camundongos humanizados indicados ilustrando a expressão de imunoglobulina M (IgM, eixo y) e B220 (eixo x).
47 / 308
[00118] A Figura 17 mostra resultados do teste de uma modalidade de acordo com a presente divulgação, mostrando medula óssea marcada por célula única representativa colhida de vários camundongos humanizados indicados ilustrando expressão de cadeias leves de imunoglobulina contendo regiões constantes de Igλ de camundongo (eixo y) ou de Igκ de camundongo (eixo x) em células B imaturas (linha superior) e maduras (linha inferior).
[00119] A Figura 18 mostra os resultados do teste de uma modalidade de acordo com a presente divulgação, mostrando um gráfico comparando respostas imunes em cepas de camundongos LiK/VI-3, LiK/VI-3/TdT e VI- 3/TdT após imunização com um imunógeno proteico.
[00120] A Figura 19 mostra os resultados do teste de uma modalidade de acordo com a presente divulgação, mostrando um gráfico comparando respostas imunes contra o marcador His em cepas de camundongos LiK/VI-3, LiK/VI-3/TdT e VI-3/TdT após imunização com um antígeno proteico irrelevante fundido a um marcador HIS.
[00121] A Figura 20 mostra uma ilustração, sem escala, de uma porção de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena. A Figura 20 inclui uma primeira seta apontando para uma representação de uma primeira sequência não codificante Vλ humana endógena exemplar no locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena. Conforme ilustrado, a primeira sequência não codificante Vλ humana endógena exemplar (representada por uma linha) no locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena naturalmente aparece adjacente a um segmento gênico Vλ3-12 humano (representado por um quadrado cinza escuro) e um segmento gênico Vλ2-11 humano (representado por um quadrado cinza escuro) no locus de cadeia leve Igλ de imunoglobulina humana endógena. A Figura 20 também inclui uma segunda seta apontando para uma representação de uma segunda sequência não codificante Vλ humana endógena exemplar no locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena. Conforme ilustrado, a
48 / 308 segunda sequência não codificante Vλ humana endógena exemplar (representada por uma linha) no locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena naturalmente aparece adjacente a um segmento gênico Vλ2-11 humano (representado por um quadrado cinza escuro) e um segmento gênico Vλ3-10 humano (representado por um quadrado cinza escuro) no locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena.
[00122] A Figura 21 mostra uma ilustração, sem escala, de uma porção de um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina humana endógena. A Figura 21 inclui uma primeira seta apontando para uma representação de uma primeira sequência não codificante Jκ humana endógena exemplar no locus de cadeia leve κ de imunoglobulina humana endógena. Conforme ilustrado, a primeira sequência não codificante Jκ humana endógena exemplar (representada por uma linha) no locus de cadeia leve κ de imunoglobulina humana endógena naturalmente aparece adjacente a um segmento gênico Jκ1 humano (representado por um quadrado cinza escuro) e um segmento gênico Jκ2 humano (representado por um quadrado cinza escuro) no locus de cadeia leve κ de imunoglobulina humana endógena. A Figura 21 também inclui uma segunda seta apontando para uma representação de uma segunda sequência não codificante Jκ humana endógena exemplar no locus de cadeia leve κ de imunoglobulina humana endógena. Conforme ilustrado, a segunda sequência não codificante Jκ humana endógena exemplar (representada por uma linha) no locus de cadeia leve κ de imunoglobulina humana endógena naturalmente aparece adjacente a um segmento gênico Jκ2 humano (representado por um quadrado cinza escuro) e um segmento gênico Jκ3 humano (representado por um quadrado cinza escuro) no locus de cadeia leve κ de imunoglobulina humana endógena.
[00123] A seguir, são apresentadas as sequências representativas de
49 / 308 ácidos nucleicos e aminoácidos de várias regiões constantes de imunoglobulina dos genes lambda de camundongo, rato ou humano. Sequências de ácidos nucleicos e aminoácidos de genes e polipeptídeos de imunoglobulina estão disponíveis no site do International Immunogenetics Information System, www.imgt.org. DNA Cλ λ1 de camundongo (SEQ ID NO:1):
GACTGTTCC Aminoácido Cλ λ1 de camundongo (SEQ ID NO:2):
RHSSYSCQVT HEGHTVEKSL SRADCS DNA Cλ λ2 de camundongo (SEQ ID NO:3):
GTCTC Aminoácido Cλ λ2 de camundongo (SEQ ID NO:4):
50 / 308
VTHEGDTVEKSLSPAECL DNA Cλ λ3 de camundongo (SEQ ID NO:5):
CTGCAGAATG TCTC Aminoácido Cλ λ3 de camundongo (SEQ ID NO:6):
LHLTSDQWRSHNSFTCQVTH EGDTVEKSLSPAECL DNA Cλ λ1 de rato (SEQ ID NO:7):
TGTGTC Aminoácido Cλ λ1 de rato (SEQ ID NO:8):
VTHEGNTVEKSLSPAECV DNA Cλ λ2 de rato (SEQ ID NO:9):
51 / 308
TTCC Aminoácido Cλ λ2 de rato (SEQ ID NO:10):
SCQVTHEENTVEKSLSRAECS DNA Cλ λ3 de rato (SEQ ID NO:11):
TGTGTC Aminoácido Cλ λ3 de rato (SEQ ID NO:12):
VTHEGNTVEKSLSPAECV DNA Cλ λ4 de rato (SEQ ID NO:13):
52 / 308
TTCC Aminoácido Cλ λ4 de rato (SEQ ID NO:14):
SCQVTHEENTVEKSLSRAECS DNA Cλ λ1 de humano (SEQ ID NO:15):
GTTCATAG Aminoácido Cλ λ1 de humano (SEQ ID NO:16):
QVTHEGSTVEKTVAPTECS DNA Cλ λ2 de humano (SEQ ID NO:17):
53 / 308
AGAATGTTCA Aminoácido Cλ λ2 de humano (SEQ ID NO:18):
QVTHEGSTVEKTVAPTECS DNA Cλ λ3 de humano (SEQ ID NO:19):
TTCATAG Aminoácido Cλ λ3 de humano (SEQ ID NO:20):
VTHEGSTVEKTVAPTECS DNA Cλ λ6 de humano (SEQ ID NO:21):
CAGAATGTTCATAG Aminoácido Cλ λ6 de humano (SEQ ID NO:22):
54 / 308
QVTHEGSTVEKTVAPAECS DNA Cλ λ7 de humano (SEQ ID NO:23):
AGAATGCTCT Aminoácido Cλ λ7 de humano (SEQ ID NO:24):
[00124] O escopo da presente invenção é definido pelas reivindicações anexas a este documento e não é limitado por certas modalidades descritas neste documento. Aqueles versados na técnica, lendo a presente especificação, estarão cientes de várias modificações que podem ser equivalentes a tais modalidades descritas ou de outra forma dentro do escopo das reivindicações. Em geral, os termos utilizados neste documento estão de acordo com o significado entendido na técnica, a menos que claramente indicado de outra forma. Definições explícitas de certos termos são fornecidas abaixo; os significados destes e de outros termos em casos particulares ao longo deste relatório descritivo serão claros para aqueles versados na técnica por meio do contexto. Definições adicionais para os seguintes termos e outros termos são estabelecidas ao longo do relatório descritivo. As referências de
55 / 308 literatura de patentes e de literatura geral citadas nesta especificação, ou partes relevantes destas, são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade.
[00125] O uso de termos ordinais como "primeiro", "segundo", "terceiro," etc., nas reivindicações para modificar um elemento de reivindicação não denota por si só qualquer prioridade, precedência ou ordem de um elemento de reivindicação sobre outro ou a ordem temporal em que os atos de um método são realizados, mas são usados apenas como rótulos para distinguir um elemento de reivindicação com um determinado nome de outro elemento com o mesmo nome (não fosse o uso do termo ordinal) para distinguir os elementos reivindicados.
[00126] Conforme utilizado neste documento, os termos "cerca de" e "aproximadamente" são usados como equivalentes. Quaisquer numerais usados neste pedido com ou sem cerca de ou aproximadamente destinam-se a abranger quaisquer flutuações normais apreciadas por alguém com habilidade ordinária na técnica relevante.
[00127] Os artigos “um" e "uma" no relatório descritivo e nas reivindicações, a menos que claramente indicado o contrário, devem ser entendidos como incluindo os referentes plurais. Reivindicações ou descrições que incluem "ou" entre um ou mais membros de um grupo são consideradas satisfeita se um, mais do que um, ou todos os membros do grupo estiverem presentes em, empregados em, ou de outra forma, forem relevantes para um determinado produto ou processo, salvo indicação em contrário ou de outra maneira evidente a partir do contexto. A invenção inclui modalidades em que exatamente um membro do grupo está presente em, empregado em, ou de outro modo, é relevante para um determinado produto ou processo. A invenção também inclui modalidades em que mais do que um ou os membros de todo o grupo se encontram presentes na, empregados em ou de outra forma são relevantes para um determinado produto ou processo. Além disso, deve
56 / 308 ser entendido que a invenção abrange todas as variações, combinações e permutações nas quais uma ou mais limitações, elementos, cláusulas, termos descritivos etc. de uma ou mais das reivindicações listadas são introduzidos em outra reivindicação dependente da mesma reivindicação base (ou, caso seja relevante, qualquer outra reivindicação) a menos que indicado de outra forma ou a menos que seja evidente para uma pessoa com competência comum na técnica que uma contradição ou inconsistência surgirá. Onde os elementos são apresentados como listas, (por exemplo, no formato do grupo Markush ou similar) deve ser entendido que cada subgrupo dos elementos também é divulgado, e qualquer elemento pode ser removido do grupo. Deve ser entendido que, em geral, onde a invenção ou aspectos da invenção é/são referidos como compreendendo elementos, características, etc. particulares, certas modalidades da invenção ou aspectos da invenção consistem ou consistem essencialmente em tais elementos, características, etc. Por motivos de simplicidade, essas modalidades não foram estabelecidas em todos os casos especificamente em tantas palavras neste documento. Deve ser entendido também que quaisquer modalidades ou aspectos da invenção podem ser explicitamente excluídos das reivindicações, independentemente de a exclusão específica ser relatada no relatório descritivo.
[00128] Administração: conforme utilizado neste documento, inclui a administração de uma composição a um sujeito ou sistema (por exemplo, a uma célula, órgão, tecido, organismo ou componente ou conjunto de componentes relevantes destes). A pessoa versada na técnica apreciará que a via de administração pode variar dependendo, por exemplo, do sujeito ou sistema no qual a composição está sendo administrada, da natureza da composição, da finalidade da administração, etc. Por exemplo, em certas modalidades, a administração a um sujeito animal (por exemplo, a um humano ou um roedor) pode ser brônquica (incluindo por instilação brônquica), bucal, enteral, interdérmica, intra-arterial, intradérmica,
57 / 308 intragástrica, intramedular, intramuscular, intranasal, intraperitoneal, intratecal, intravenosa, intraventricular, mucosa, nasal, oral, retal, subcutânea, sublingual, tópica, traqueal (inclusive por instilação intratraqueal), transdérmica, vaginal e/ou vítrea. Em algumas modalidades, a administração pode envolver dosagem intermitente. Em algumas modalidades, a administração pode envolver dosagem contínua (por exemplo, perfusão) por pelo menos um período de tempo selecionado.
[00129] Melhoria: conforme utilizado neste documento, inclui a prevenção, redução ou paliação de um estado ou melhoria do estado de um sujeito. A melhoria inclui, mas não exige, a recuperação completa ou prevenção completa de uma doença, distúrbio ou condição.
[00130] Aproximadamente: conforme aplicado a um ou mais valores de interesse, inclui um valor semelhante a um valor de referência indicado. Em certas modalidades, o termo "aproximadamente" ou "cerca de" refere-se a uma faixa de valores que caem dentro de ± 10% (maior ou menor que) do valor de referência indicado, a menos que seja indicado de outra forma ou evidente pelo contexto (exceto quando esse número exceder 100% de um valor possível).
[00131] Biologicamente ativo: conforme utilizado neste documento, refere-se a uma característica de qualquer agente que tem atividade em um sistema biológico in vitro ou in vivo (por exemplo, em um organismo). Por exemplo, um agente que, quando presente em um organismo, tem um efeito biológico dentro desse organismo é considerado biologicamente ativo. Em modalidades específicas, onde uma proteína ou polipeptídeo é biologicamente ativo, uma porção dessa proteína ou polipeptídeo que compartilha pelo menos uma atividade biológica da proteína ou do polipeptídeo é normalmente referida como uma porção "biologicamente ativa".
[00132] Comparável: conforme utilizado neste documento, refere-se a dois ou mais agentes, entidades, situações, conjuntos de condições, etc. que
58 / 308 podem não ser idênticos, mas que são suficientemente semelhantes para permitir comparação entre si para que as conclusões possam delineadas razoavelmente com base nas diferenças ou semelhanças observadas. Pessoas com competência comum na técnica entenderão, pelo contexto, que grau de identidade é necessário em qualquer dada circunstância para que dois ou mais desses agentes, entidades, situações, conjuntos de condições, etc. sejam considerados comparáveis.
[00133] Conservativo: conforme utilizado neste documento, refere-se a instâncias ao descrever uma substituição de aminoácidos conservativa, incluindo uma substituição de um resíduo de aminoácido por outro resíduo de aminoácido com um grupo R de cadeia lateral com propriedades químicas semelhantes (por exemplo, carga ou hidrofobicidade). Em geral, uma substituição de aminoácidos conservativa não alterará substancialmente as propriedades funcionais de interesse de uma proteína, por exemplo, a capacidade de um receptor de se ligar a um ligante. Exemplos de grupos de aminoácidos que possuem cadeias laterais com propriedades químicas semelhantes incluem: cadeias laterais alifáticas, como glicina (Gly, G), alanina (Ala, A), valina (Val, V), leucina (Leu, L) e isoleucina (Ile, I); cadeias laterais alifáticas-hidroxila, como serina (Ser, S) e treonina (Thr, T); cadeias laterais contendo amida, como asparagina (Asn, N) e glutamina (Gln, Q); cadeias laterais aromáticas, como fenilalanina (Phe, F), tirosina (Tyr, Y) e triptofano (Trp, W); cadeias laterais básicas, como lisina (Lys, K), arginina (Arg, R) e histidina (His, H); cadeias laterais ácidas, como ácido aspártico (Asp, D) e ácido glutâmico (Glu, E); e cadeias laterais contendo enxofre, como cisteína (Cys, C) e metionina (Met, M). Grupos de substituição de aminoácidos conservativa incluem, por exemplo, valina/leucina/isoleucina (Val/Leu/Ile, V/L/I), fenilalanina/tirosina (Phe/Tyr, F/Y), lisina/arginina (Lys/Arg, K/R), alanina/valina (Ala/Val, A/V), glutamato/aspartato (Glu/Asp, E/D) e asparagina/glutamina (Asn/Gln, N/Q). Em algumas modalidades, uma
59 / 308 substituição de aminoácidos pode ser uma substituição de qualquer resíduo nativo em uma proteína por alanina, como usado, por exemplo, na mutagênese de varredura de alanina. Em algumas modalidades, é feita uma substituição conservadora que possui um valor positivo na matriz de log- probabilidade PAM250 divulgada em Gonnet, GH et al., 1992, Science 256:1443-1445, que é incorporada neste documento por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, uma substituição é uma substituição moderadamente conservativa, em que a substituição tem um valor não negativo na matriz de log-probabilidade PAM250.
[00134] Controle: conforme utilizado neste documento, refere-se ao significado entendido na técnica de um "controle" como um padrão com o qual os resultados são comparados. Normalmente, os controles são usados para aumentar a integridade nos experimentos, isolando variáveis, de forma a se chegar a uma conclusão sobre tais variáveis. Em algumas modalidades, um controle é uma reação ou ensaio que é realizado simultaneamente com uma reação ou ensaio de teste para fornecer um comparador. Um "controle"; também inclui um "animal de controle." Um "animal de controle"; pode ter uma modificação conforme descrita neste documento, uma modificação que é diferente da descrita neste documento ou nenhuma modificação (isto é, um animal de tipo selvagem). Em um experimento, um "teste" (ou seja, uma variável sendo testada) é aplicado. Em um segundo experimento, o "controle," a variável que está sendo testada não é aplicada. Em algumas modalidades, um controle é um controle histórico (isto é, de um teste ou ensaio realizado anteriormente, ou uma quantidade ou resultado que é conhecido anteriormente). Em algumas modalidades, um controle é ou compreende um registro impresso ou salvo de outra forma. Um controle pode ser um controle positivo ou negativo.
[00135] Ruptura: conforme utilizado neste documento, refere-se ao resultado de um evento de recombinação homóloga com uma molécula de
60 / 308 DNA (por exemplo, com uma sequência homóloga endógena, como um gene ou locus gênico). Em algumas modalidades, uma interrupção pode alcançar ou representar uma inserção, deleção, substituição, substituição, mutação missense ou uma mudança da matriz de leitura de uma ou mais sequências de DNA ou qualquer combinação destas. As inserções podem incluir a inserção de genes inteiros ou fragmentos de genes, por exemplo, éxons, que podem ter uma origem diferente da sequência endógena (por exemplo, uma sequência heteróloga). Em algumas modalidades, uma ruptura pode aumentar a expressão e/ou a atividade de um gene ou produto gênico (por exemplo, de um polipeptídeo codificado por um gene). Em algumas modalidades, uma ruptura pode diminuir a expressão e/ou a atividade de um gene ou produto gênico. Em algumas modalidades, uma ruptura pode alterar a sequência de um gene ou produto gênico codificado (por exemplo, um polipeptídeo codificado). Em algumas modalidades, uma ruptura pode truncar ou fragmentar um gene ou produto gênico codificado (por exemplo, um polipeptídeo codificado). Em algumas modalidades, uma ruptura pode estender um gene ou um produto gênico codificado. Em algumas dessas modalidades, uma ruptura pode alcançar a montagem de um polipeptídeo de fusão. Em algumas modalidades, uma ruptura pode afetar o nível, mas não a atividade, de um gene ou produto gênico. Em algumas modalidades, uma ruptura pode afetar a atividade, mas não o nível, de um gene ou produto gênico. Em algumas modalidades, uma ruptura pode não ter nenhum efeito significativo sobre o nível de um gene ou produto gênico. Em algumas modalidades, uma ruptura pode não ter nenhum efeito significativo sobre a atividade de um gene ou produto gênico. Em algumas modalidades, uma ruptura pode não ter nenhum efeito significativo sobre o nível e a atividade de um gene ou produto gênico.
[00136] Determinar, medir, avaliar, examinar, testar e analisar: são usados neste documento de forma intercambiável para se referir a qualquer
61 / 308 forma de medição e incluem a determinar se um elemento está presente ou não. Esses termos incluem determinações quantitativas e/ou qualitativas. O teste pode ser relativo ou absoluto. "Testar para a presença de" pode ser determinar a quantidade de algo presente e/ou determinar se algo está presente ou ausente.
[00137] Promotor endógeno: conforme utilizado neste documento, refere-se a um promotor que está naturalmente associado, por exemplo, em um organismo de tipo selvagem, a um gene endógeno.
[00138] Manipulado: conforme utilizado neste documento refere-se, em geral, ao aspecto de ter sido manipulado pelo ser humano. Por exemplo, em algumas modalidades, um polinucleotídeo pode ser considerado "manipulado" quando duas ou mais sequências que não estão ligadas entre si nessa ordem na natureza são manipuladas pelo ser humano para serem diretamente ligadas umas às outras no polinucleotídeo manipulado. Em algumas modalidades, um polinucleotídeo manipulado pode compreender uma sequência reguladora que é encontrada na natureza em associação operativa com uma primeira sequência de codificação, mas não em associação operativa com uma segunda sequência de codificação, é ligada pelo ser humano para que esteja associada operacionalmente à segunda sequência de codificação. Alternativamente, ou adicionalmente, em algumas modalidades, a primeira e a segunda sequências de ácidos nucleicos que codificam elementos de polipeptídeo ou domínios que na natureza não estão ligados um ao outro podem ser ligadas uma à outra em um único polinucleotídeo manipulado. Comparativamente, em algumas modalidades, uma célula ou organismo podem ser considerados “manipulados” se tiverem sido manipulados para que suas informações genéticas sejam alteradas (por exemplo, um novo material genético não presente anteriormente foi introduzido, ou um material genético previamente presente foi alterado ou removido). Como é prática comum e entendido por pessoas versadas na
62 / 308 técnica, a progenia de um polinucleotídeo manipulado ou de uma célula manipulada é normalmente referida ainda como “manipulada” mesmo que a manipulação real tenha sido realizada em uma entidade anterior. Além disso, como será apreciado por pessoas versadas na técnica, uma variedade de metodologias está disponível através das quais a “manipulação” conforme descrita neste documento pode ser alcançada. Por exemplo, em algumas modalidades, "manipulação" pode envolver seleção ou projeto (por exemplo, de sequências de ácidos nucleicos, sequências de polipeptídeos, células, tecidos e/ou organismos) através do uso de sistemas de computador programados para realizar análise ou comparação ou, de outra forma, analisar, recomendar e/ou selecionar sequências, alterações etc.). Alternativamente, ou adicionalmente, em algumas modalidades, "manipulação" pode envolver o uso de metodologias de síntese química in vitro e/ou tecnologias de ácidos nucleicos recombinantes, tais como, por exemplo, amplificação de ácidos nucleicos (por exemplo, via reação em cadeia de polimerase), hibridação, mutação, transformação, transfecção, etc. e/ou qualquer uma de uma variedade de metodologias de união controladas. Como será apreciado por aqueles versados na técnica, uma variedade de tais técnicas estabelecidas (por exemplo, para DNA recombinante, síntese de oligonucleotídeos e cultura e transformação de tecidos (por exemplo, eletroporação, lipofecção, etc.) são bem conhecidas na técnica e descritas em várias referências gerais e mais específicas que são citadas e/ou discutidas ao longo do presente relatório descritivo. Ver, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2ª ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989 e Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Manipulation, 5ª Ed., ed. Por Old, RW e SB Primrose, Blackwell Science, Inc., 1994, incorporado neste documento por referência em sua totalidade.
[00139] Funcional: conforme utilizado neste documento, refere-se a
63 / 308 uma forma ou fragmento de uma entidade (por exemplo, um gene ou segmento gênico) que exibe uma propriedade específica (por exemplo, faz parte de uma sequência de codificação) e/ou atividade. Por exemplo, no contexto de imunoglobulinas, as regiões variáveis são codificadas por segmentos genéticos únicos (ou seja, V, D e/ou J) que são montados (ou recombinados) para formar sequências de codificação funcionais. Quando presentes no genoma, os segmentos gênicos são organizados em clusters, embora ocorram variações. Um segmento gênico “funcional” é um segmento gênico representado em uma sequência expressa (ou seja, uma região variável) para a qual o DNA genômico correspondente foi isolado (ou seja, clonado) e identificado por sequência. Algumas sequências de segmentos gênicos imunoglobulina contêm quadros de leitura abertos e são consideradas funcionais, embora não representadas em um repertório expresso, enquanto outras sequências de segmentos gênicos imunoglobulina contêm mutações (por exemplo, mutações pontuais, inserções, deleções, etc.) que resultam em um códon terminal e/ou uma sequência truncada que subsequentemente torna(m) essas sequências de segmentos gênicos incapazes de executar a(s) propriedade(s) e/ou atividade(s) associada(s) a uma ou mais sequência(s) não mutada(s). Tais sequências não são representadas em sequências expressas e, portanto, são categorizadas como pseudogenes.
[00140] Gene: conforme utilizado neste documento, refere-se a uma sequência de DNA em um cromossomo que codifica para um produto (por exemplo, um produto de RNA e/ou um produto de polipeptídeo). Em algumas modalidades, um gene inclui sequência de codificação (isto é, sequência que codifica um produto específico). Em algumas modalidades, um gene inclui sequência não codificante. Em algumas modalidades em particular, um gene pode incluir uma sequência de codificação (por exemplo, exônica) e não- codificante (por exemplo, intrônica). Em algumas modalidades, um gene pode incluir uma ou mais sequências reguladoras (por exemplo, promotores,
64 / 308 potenciadores, etc.) e/ou sequências de íntrons que, por exemplo, podem controlar ou impactar um ou mais aspectos da expressão gênica (por exemplo, expressão específica de tipo celular, expressão induzível, etc.). Para fins de clareza, observamos que, conforme usado na presente divulgação, o termo "gene" se refere de forma geral a uma porção de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo ou fragmento deste; o termo pode opcionalmente abranger sequências reguladoras, como será claro pelo contexto para aqueles versados na técnica. Esta definição não se destina a excluir a aplicação do termo “gene” a unidades de expressão que não codificam proteínas, mas sim para esclarecer que, na maioria dos casos, o termo conforme utilizado neste documento refere-se a um ácido nucleico codificador de polipeptídeo.
[00141] Heterólogo: conforme utilizado neste documento, refere-se a um agente ou entidade de uma fonte diferente. Por exemplo, quando usado em referência a um polipeptídeo, gene ou produto gênico presente em uma célula ou organismo específico, o termo esclarece que o polipeptídeo, gene ou produto gênico relevante: 1) foi manipulado pelo ser humano; 2) foi introduzido na célula ou organismo (ou em um precursor destes) pelo ser humano (por exemplo, através de manipulação genética); e/ou 3) não é produzido ou está presente na célula ou organismo relevante (por exemplo, no tipo celular ou tipo de organismo relevante) naturalmente. "Heterólogo"; também inclui um polipeptídeo, gene ou produto gênico que normalmente está presente em uma célula ou organismo nativo específico, mas que foi alterado ou modificado, por exemplo, por mutação ou colocação sob o controle de elementos reguladores não naturalmente associados e, em algumas modalidades, não endógenos (por exemplo, um promotor).
[00142] Célula hospedeira: conforme utilizado neste documento, refere-se a uma célula na qual um ácido nucleico ou proteína foi introduzido. Pessoas versadas na técnica, após lerem esta divulgação, entenderão que esses termos se referem não apenas à célula em questão, mas também são usados
65 / 308 para se referir à descendência de tal célula.
Uma vez que determinadas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas devido à mutação ou a influências ambientais, essa progênie, na verdade, pode não ser idêntica à célula precursora, mas ainda está incluída dentro do escopo do termo “célula hospedeira.” Em algumas modalidades, uma célula hospedeira é ou compreende uma célula procariótica ou eucariótica.
Em geral, uma célula hospedeira é qualquer célula que é adequada para receber e/ou produzir um ácido nucleico heterólogo ou uma proteína heteróloga, independentemente do Reino da vida ao qual a célula é designada.
Células exemplares incluem as de procariontes e eucariotos (unicelulares ou multicelulares), células bacterianas (por exemplo, cepas de Escherichia coli, Bacillus spp., Streptomyces spp., etc.), células de micobactérias, células de fungos, células de levedura (por exemplo Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Pichia pastoris, Pichia methanolica, etc.), células vegetais, células de inseto (por exemplo, SF-9, SF-21, células de inseto infectadas por baculovirus, Trichoplusia ni, etc.), células de animais não humanos, células humanas ou fusões de células, tais como, por exemplo, hibridomas ou quadromas.
Em algumas modalidades, uma célula é uma célula humana, de macaco, de símio, de hamster, de rato ou de camundongo.
Em algumas modalidades, uma célula é eucariótica e é selecionada dentre as seguintes células: CHO (por exemplo, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (por exemplo, COS-7), célula da retina, Vero, CV1, rim (por exemplo, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL- 60, (por exemplo, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (epidérmica), CV-1, U937, 3T3, célula L, célula C127, SP2/0, NS-0, MMT 060562, célula de Sertoli, célula BRL 3A, célula HT1080, célula de mieloma, célula tumoral e uma linhagem celular derivada de uma célula mencionada anteriormente.
Em algumas modalidades, uma célula compreende um ou mais genes virais, por exemplo uma célula da retina que expressa um gene viral (por exemplo, uma
66 / 308 célula PER.C6®). Em algumas modalidades, uma célula hospedeira é ou compreende uma célula isolada. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira é parte de um tecido. Em algumas modalidades, uma célula hospedeira é parte de um organismo.
[00143] Identidade: conforme utilizado neste documento em conexão com uma comparação de sequências, refere-se à identidade conforme determinada por um número de algoritmos diferentes conhecidos na técnica que podem ser usados para medir a identidade de sequência de nucleotídeos e/ou aminoácidos. Em algumas modalidades, as identidades descritas neste documento são determinadas usando um alinhamento ClustalW v. 1.83 (lento) empregando uma penalidade de lacuna aberta de 10,0, uma penalidade de lacuna estendida de 0,1 e usando uma matriz de similaridade Gonnet (MACVECTOR ™ 10.0.2, MacVector Inc 2008).
[00144] No lugar de: conforme utilizado neste documento, refere-se a uma substituição posicional na qual uma primeira sequência de ácidos nucleicos está localizada na posição de uma segunda sequência de ácidos nucleicos em um cromossomo (por exemplo, onde a segunda sequência de ácidos nucleicos estava anteriormente (por exemplo, originalmente) localizada em um cromossomo, por exemplo, no locus endógeno da segunda sequência de ácidos nucleicos). O termo "no lugar de" não requer que a segunda sequência de ácidos nucleicos seja removida de, por exemplo, um locus ou cromossomo. Em algumas modalidades, a segunda sequência de ácidos nucleicos e a primeira sequência de ácidos nucleicos são comparáveis entre si no sentido de que, por exemplo, a primeira e a segunda sequências são homólogas entre si, contêm elementos correspondentes (por exemplo, elementos de codificação de proteínas, elementos reguladores, etc.) e/ou possuem sequências semelhantes ou idênticas. Em algumas modalidades, uma primeira e/ou uma segunda sequência de ácidos nucleicos inclui um ou mais dentre um promotor, um potenciador, um sítio doador de splice, um sítio
67 / 308 aceitador de splice, um íntron, um éxon, uma região não traduzida (UTR); em algumas modalidades, uma primeira e/ou uma segunda sequência de ácidos nucleicos inclui uma ou mais sequências de codificação.
Em algumas modalidades, uma primeira sequência de ácidos nucleicos é um homólogo ou uma variante (por exemplo, mutante) da segunda sequência de ácidos nucleicos.
Em algumas modalidades, uma primeira sequência de ácidos nucleicos é um ortólogo ou homólogo da segunda sequência.
Em algumas modalidades, uma primeira sequência de ácidos nucleicos é ou compreende uma sequência de ácidos nucleicos humana.
Em algumas modalidades, incluindo onde a primeira sequência de ácidos nucleicos é ou compreende uma sequência de ácidos nucleicos humana, a segunda sequência de ácidos nucleicos é ou compreende uma sequência de roedor (por exemplo, uma sequência de camundongo ou rato). Em algumas modalidades, incluindo onde a primeira sequência de ácidos nucleicos é ou compreende uma sequência de ácidos nucleicos humana, a segunda sequência de ácidos nucleicos é ou compreende uma sequência humana.
Em algumas modalidades, uma primeira sequência de ácidos nucleicos é uma variante ou mutante (isto é, uma sequência que contém uma ou mais diferenças de sequência, por exemplo, substituições, em comparação com a segunda sequência) da segunda sequência.
A sequência de ácidos nucleicos assim colocada pode incluir uma ou mais sequências reguladoras que são parte da sequência de ácidos nucleicos fonte usada para obter a sequência assim colocada (por exemplo, promotores, potenciadores, regiões não traduzidas 5' ou 3', etc.). Por exemplo, em várias modalidades, uma primeira sequência de ácidos nucleicos é uma substituição de uma sequência endógena por uma sequência heteróloga que resulta na produção de um produto gênico a partir da sequência de ácidos nucleicos assim colocada (compreendendo a sequência heteróloga), mas não a expressão da sequência endógena; uma primeira sequência de ácidos nucleicos é de uma sequência genômica endógena com uma sequência de
68 / 308 ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo que tem uma função semelhante a um polipeptídeo codificado pela sequência endógena (por exemplo, a sequência genômica endógena codifica um polipeptídeo de região variável não humano, no todo ou em parte, e o fragmento de DNA codifica um ou mais polipeptídeos da região variável humanos, no todo ou em parte). Em várias modalidades, um segmento gênico de imunoglobulina humana ou um fragmento deste está no lugar de um segmento ou fragmento gênico de imunoglobulina não humana endógeno.
[00145] In vitro: conforme utilizado neste documento, refere-se aos eventos que ocorrem em um ambiente artificial, por exemplo, em um tubo de ensaio ou recipiente de reação, na cultura de célula, etc., em vez de dentro de um organismo multicelular.
[00146] In vivo: conforme utilizado neste documento, refere-se aos eventos que ocorrem dentro de um organismo multicelular, como um animal humano e/ou um animal não-humano. No contexto de sistemas baseados em células, o termo pode ser usado para se referir a eventos que ocorrem dentro de uma célula viva (ao contrário de, por exemplo, sistemas in vitro).
[00147] Isolado: conforme usado neste documento, refere-se a uma substância e/ou uma entidade que foi (1) separada de pelo menos alguns dos componentes com os quais estava associada quando inicialmente produzida (se na natureza e/ou em uma configuração experimental) e/ou (2) produzida, preparada e/ou fabricada pelo ser humano. As substâncias e/ou entidades isoladas podem ser separadas de cerca de 10%, cerca de 20%, cerca de 30%, cerca de 40%, cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou mais que cerca de 99% dos outros componentes aos quais estavam inicialmente associadas. Em algumas modalidades, os agentes isolados são separados de 10% a 100%, 15%-100%, 20%-100%, 25%-100%, 30%-100%,
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35%-100%, 40%-100%, 45%-100%, 50%-100%, 55%-100%, 60%-100%, 65%-100%, 70%-100%, 75%-100%, 80%-100%, 85%-100%, 90%-100%, 95%-100%, 96%-100%, 97%-100%, 98%-100% ou 99%-100% dos outros componentes aos quais estavam inicialmente associados.
Em algumas modalidades, os agentes isolados são separados de 10% a 100%, 10%-99%, 10%-98%, 10%-97%, 10%-96%, 10%-95%, 10%-90%, 10%-85%, 10%-80%, 10%-75%, 10%-70%, 10%-65%, 10%-60%, 10%-55%, 10%-50%, 10%-45%, 10%-40%, 10%-35%, 10%-30%, 10%-25%, 10%-20% ou 10%-15% dos outros componentes aos quais estavam inicialmente associados.
Em algumas modalidades, os agentes isolados são separados de 11% a 99%, 12%-98%, 13%-97%, 14%-96%, 15%-95%, 20%-90%, 25%-85%, 30%-80%, 35%-75%, 40%-70%, 45%-65%, 50%-60% ou 55%-60% dos outros componentes aos quais estavam inicialmente associados.
Em algumas modalidades, os agentes isolados são cerca de 80%, cerca de 85%, cerca de 90%, cerca de 91%, cerca de 92%, cerca de 93%, cerca de 94%, cerca de 95%, cerca de 96%, cerca de 97%, cerca de 98%, cerca de 99% ou mais do que cerca de 99% puros.
Em algumas modalidades, os agentes isolados são 80%-99%, 85%-99%, 90%- 99%, 95%-99%, 96%-99%, 97%-99%, ou 98%-99% puros.
Em algumas modalidades, os agentes isolados são 80%-99%, 80%-98%, 80%-97%, 80%- 96%, 80%-95%, 80%-90%, ou 80%-85% puros.
Em algumas modalidades, os agentes isolados são 85%-98%, 90%-97%, ou 95%-96% puros.
Em algumas modalidades, uma substância é "pura" se for substancialmente livre de outros componentes.
Em algumas modalidades, como será entendido por aqueles versados na técnica, uma substância pode ainda ser considerada "isolada" ou até mesmo "pura" após ter sido combinada com determinados outros componentes, tais como, por exemplo, um ou mais carreadores ou excipientes (por exemplo, tampão, solvente, água, etc.); nessas modalidades, o isolamento ou pureza percentual da substância são calculados sem incluir esses carreadores ou excipientes.
Para dar apenas um exemplo, em algumas
70 / 308 modalidades, um polímero biológico, tal como um polipeptídeo ou polinucleotídeo que ocorre na natureza, é considerado como sendo "isolado" quando: a) em virtude de sua origem ou fonte de derivação, não é associado a alguns ou a todos os componentes que o acompanham em seu estado nativo na natureza; b) é substancialmente livre de outros polipeptídeos ou ácidos nucleicos da mesma espécie da espécie que o produz na natureza; ou c) é expresso ou está de outro modo em associação com componentes de uma célula ou outro sistema de expressão que não seja da espécie que o produz na natureza. Assim, por exemplo, em algumas modalidades, um polipeptídeo que é quimicamente sintetizado ou é sintetizado em um sistema celular diferente daquele que o produz na natureza é considerado como sendo um polipeptídeo "isolado". Alternativa ou adicionalmente, em algumas modalidades, um polipeptídeo que foi submetido a uma ou mais técnicas de purificação pode ser considerado como sendo um polipeptídeo "isolado" na medida em que foi separado dos outros componentes: a) com os quais está associado na natureza; e/ou b) com os quais foi associado quando inicialmente produzido.
[00148] Locus ou loci: conforme utilizado neste documento, refere-se a uma ou mais localizações de um gene (ou sequência significativa), sequência de DNA, sequência codificante de polipeptídeo ou posição em um cromossomo do genoma de um organismo. Por exemplo, um "locus de imunoglobulina" pode se referir à localização de um segmento gênico de imunoglobulina (por exemplo, V, D, J ou C), sequência de DNA de segmento gênico de imunoglobulina, sequência de codificação de segmento gênico de imunoglobulina ou posição de segmento gênico de imunoglobulina em uma cromossomo do genoma de um organismo que foi identificado quanto ao local onde essa sequência reside. Um "locus de imunoglobulina" pode compreender um elemento regulador de um segmento gênico de imunoglobulina, incluindo, sem limitação, um potenciador, um promotor, uma sequência ou região reguladora 5' e/ou 3' ou uma combinação destes. Um
71 / 308 "locus de imunoglobulina"; pode compreender DNA intergênico, por exemplo, DNA que normalmente reside ou aparece entre segmentos gênicos deem um locus de tipo selvagem. As pessoas comumente versadas na técnica apreciarão que os cromossomos podem, em algumas modalidades, conter centenas ou mesmo milhares de genes e demonstrar colocalização física de loci genéticos similares ao comparar entre espécies diferentes. Esses loci genéticos podem ser descritos como tendo sintenia compartilhada.
[00149] Aparece naturalmente: conforme utilizado neste documento em referência a um elemento biológico (por exemplo, uma sequência de ácidos nucleicos) significa que o elemento biológico pode ser encontrado em um contexto e/ou local especificado, sem manipulação (por exemplo, manipulação genética), em uma célula ou organismo (por exemplo, um animal). Em outras palavras, uma sequência que aparece naturalmente em um contexto e/ou local especificados não está no contexto e/ou local especificados como resultado de manipulação (por exemplo, manipulação genética). Por exemplo, uma sequência que aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico Jκ1 humano em um locus de cadeia leve kappa de imunoglobulina humana endógeno é uma sequência que pode ser encontrada adjacente a um segmento gênico Jκ1 humano em um locus de cadeia leve kappa de imunoglobulina humana endógeno, sem manipulação genética, em um ser humano. Em algumas modalidades, uma sequência pode ser obtida, derivada e/ou isolada de onde aparece naturalmente em uma célula ou organismo. Em algumas modalidades, uma célula ou organismo não é uma fonte direta de uma sequência que aparece naturalmente na célula ou organismo. Por exemplo, uma sequência correspondente em uma célula ou organismo pode ser identificada e, em seguida, produzida ou replicada por mecanismos conhecidos na técnica.
[00150] Animal não humano: conforme utilizado neste documento, refere-se a qualquer organismo vertebrado que não seja humano. Em algumas
72 / 308 modalidades, um animal não humano é um ciclóstomo, um peixe ósseo, um peixe cartilaginoso (por exemplo, um tubarão ou uma raia), um anfíbio, um réptil, um mamífero e um pássaro. Em algumas modalidades, um animal não humano é um mamífero. Em algumas modalidades, um mamífero não humano é um primata, uma cabra, uma ovelha, um porco, um cão, uma vaca ou um roedor. Em algumas modalidades, um animal não humano é um roedor, tal como um rato ou um camundongo.
[00151] Ácido nucleico: conforme utilizado neste documento, refere-se a qualquer composto e/ou substância que são ou podem ser incorporados em uma cadeia oligonucleotídica. Em algumas modalidades, um “ácido nucleico” é um composto e/ou substância que estão ou podem ser incorporados em uma cadeia oligonucleotídica através de uma ligação fosfodiéster. Como estará claro pelo contexto, em algumas modalidades, "ácido nucleico" refere-se a resíduos de ácidos nucleicos individuais (por exemplo, nucleotídeos e/ou nucleosídeos); em algumas modalidades, "ácido nucleico" refere-se a uma cadeia oligonucleotídica que compreende resíduos de ácidos nucleicos individuais. Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" é ou compreende RNA; em algumas modalidades, um "ácido nucleico"; é ou compreende DNA. Em algumas modalidades, um "ácido nucleico"; é, compreende ou consiste em um ou mais resíduos naturais de ácidos nucleicos. Em algumas modalidades, um "ácido nucleico"; é, compreende ou consiste em um ou mais análogos de ácido nucleico. Em algumas modalidades, um análogo de ácido nucleico difere de um "ácido nucleico" no sentido de que não utiliza uma estrutura principal de fosfodiéster. Por exemplo, em algumas modalidades, um "ácido nucleico" é, compreende ou consiste em um ou mais "ácidos nucleicos peptídicos", que são conhecidos na técnica e possuem ligações peptídicas em vez de ligações fosfodiéster na estrutura principal. Alternativa ou adicionalmente, em algumas modalidades, um "ácido nucleico" possui uma ou mais ligações fosforotioato e/ou ligações 5'-N-fosforamidita em vez
73 / 308 de ligações fosfodiéster.
Em algumas modalidades, um "ácido nucleico"; é, compreende ou consiste em um ou mais nucleosídeos naturais (por exemplo, adenosina, timidina, guanosina, citidina, uridina, desoxiadenosina, desoxitimidina, desoxiganosina e desoxicitididina). Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" é, compreende ou consiste em um ou mais análogos de nucleosídeo (por exemplo, 2-aminoadenosina, 2-tiotimidina, inosina, pirrolo- pirimidina, 3-metil adenosina, 5-metilcitidina, C-5 propinil-citidina, C-5 propinil-uridina, 2-aminoadenosina, C5-bromouridina, C5-fluorouridina, C5- iodouridina, C5-propinil-uridina, C5-propinil-citidina, C5-metilcitidina, 2- aminoadenosina, 7-desaza-adenosina, 7-desazaguanosina, 8-oxoadenosina, 8- oxoguanosina, O(6)-metilguanina, 2-tiocitidina, bases metiladas, bases intercaladas e combinações destas). Em algumas modalidades, um "ácido nucleico"; compreende um ou mais açúcares modificados (por exemplo, 2'- fluororibose, ribose, 2'-desoxirribose, arabinose e hexose) em comparação com os ácidos nucleicos naturais.
Em algumas modalidades, um "ácido nucleico"; tem uma sequência nucleotídica que codifica um produto genético funcional, como um RNA ou polipeptídeo.
Em algumas modalidades, um "ácido nucleico"; inclui um ou mais íntrons.
Em algumas modalidades, um "ácido nucleico"; inclui um ou mais éxons.
Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" é preparado por um ou mais dentre isolamento de uma fonte natural, síntese enzimática por polimerização com base em um modelo complementar (in vivo ou in vitro), reprodução em uma célula ou sistema recombinante e síntese química.
Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" tem pelo menos, por exemplo, mas sem limitação, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 20, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000 ou mais resíduos de comprimento.
Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" é de fita simples; em algumas
74 / 308 modalidades, um "ácido nucleico" é de fita dupla. Em algumas modalidades, um "ácido nucleico" tem uma sequência nucleotídica compreendendo pelo menos um elemento que codifica, ou é o complemento de uma sequência que codifica, um polipeptídeo. Em algumas modalidades, um "ácido nucleico"; tem atividade enzimática.
[00152] Operacionalmente ligado: conforme utilizado neste documento, refere-se a uma justaposição em que os componentes descritos estão em uma relação que lhes permite funcionar da maneira pretendida. Uma sequência de controle "operacionalmente ligada" a uma sequência de codificação é ligada de tal forma que a expressão da sequência de codificação é alcançada em condições compatíveis com as sequências de controle. Sequências "operacionalmente ligadas" incluem tanto sequências de controle de expressão que são contíguas com um gene de interesse quanto sequências de controle de expressão que atuam em trans ou a uma distância para controlar um gene de interesse (ou sequência de interesse). O termo "sequência de controle de expressão" inclui sequências polinucleotídicas, que são necessárias para afetar a expressão e o processamento de sequências de codificação às quais estão ligadas. "Sequências de controle de expressão" incluem: sequências de iniciação, terminação, promotoras e intensificadoras de transcrição apropriadas; sinais de processamento de RNA eficientes, tais como sinais de splicing e de poliadenilação; sequências que estabilizam o mRNA citoplasmático; sequências que aumentam a eficiência da tradução (ou seja, sequência de consenso de Kozak); sequências que aumentam a estabilidade do polipeptídeo; e, quando desejado, sequências que aumentam a secreção de polipeptídeo. A natureza de tais sequências de controle difere dependendo do organismo hospedeiro. Por exemplo, em procariontes, essas sequências de controle geralmente incluem promotor, sítio de ligação ribossômica e sequência de terminação da transcrição, enquanto em eucariotos tipicamente essas sequências de controle incluem promotores e
75 / 308 sequência de terminação da transcrição. O termo "sequências de controle" destina-se a incluir componentes cuja presença é essencial para a expressão e o processamento e também pode incluir componentes adicionais cuja presença é vantajosa, por exemplo, sequências líder e sequências de parceiro de fusão.
[00153] Condições fisiológicas: conforme utilizado neste documento, refere-se ao seu significado entendido na técnica, que faz referência a condições sob as quais células ou organismos vivem e/ou se reproduzem. Em algumas modalidades, o termo inclui condições do meio externo ou interno que podem ocorrer na natureza para um organismo ou sistema celular. Em algumas modalidades, condições fisiológicas são aquelas presentes no corpo de um animal humano ou não humano, especialmente aquelas presentes no e/ou dentro de um local cirúrgico. As condições fisiológicas incluem tipicamente, por exemplo, uma faixa de temperatura de 20-40 °C, pressão atmosférica de 1, pH de 6-8, concentração de glicose de 1-20mM, concentração de oxigênio nos níveis atmosféricos e gravidade da Terra. Em algumas modalidades, as condições em um laboratório são manipuladas e/ou mantidas em condições fisiológicas. Em algumas modalidades, condições fisiológicas são encontradas em um organismo.
[00154] Polipeptídeo: conforme utilizado neste documento, refere-se a qualquer cadeia polimérica de aminoácidos. Em algumas modalidades, um polipeptídeo possui uma sequência de aminoácidos que ocorre na natureza. Em algumas modalidades, um polipeptídeo possui uma sequência de aminoácidos que não ocorre na natureza. Em algumas modalidades, um polipeptídeo possui uma sequência de aminoácidos que contém porções que ocorrem na natureza separadamente umas das outras (isto é, de dois ou mais organismos diferentes, por exemplo, porções humanas e não humanas). Em algumas modalidades, um polipeptídeo possui uma sequência de aminoácidos que é manipulada no sentido de que é projetada e/ou produzida pelo ser
76 / 308 humano. Em algumas modalidades, um polipeptídeo possui uma sequência de aminoácidos codificada por uma sequência que não ocorre na natureza (por exemplo, uma sequência que é manipulada no sentido de que é projetada e/ou produzida pelo ser humano para codificar o referido polipeptídeo).
[00155] Recombinante: conforme utilizado neste documento, refere-se a polipeptídeos que são projetados, manipulados, preparados, expressos, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como polipeptídeos expressos usando um vetor de expressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira, polipeptídeos isolados de um recombinante, biblioteca de polipeptídeo humano combinatório (Hoogenboom, H. R., 1997, TIB Tech. 15:62-70; Azzazy, H. e W.E. Highsmith, 2002, Clin. Biochem. 35:425-45; Gavilondo, J. V. e J.W. Larrick, 2002, BioTechniques 29:128-45; Hoogenboom H., e P. Chames, 2000, Immunol. Today 21:371-8, incorporados neste documento por referência em suas totalidades), anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo que foi geneticamente manipulado para incluir genes de imunoglobulina humana (ver, por exemplo, Taylor, L. D. et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-95; Kellermann, S-A. e L.L. Green, 2002, Curr. Opin. Biotechnol. 13:593-7; Little, M. et al., 2000, Immunol. Today 21:364-70; Osborn, M.J. et al., 2013, J. Immunol. 190:1481- 90; Lee, E-C. et al., 2014, Nat. Biotech. 32(4):356-63; Macdonald, L.E. et al., 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5147-52; Murphy, A.J. et al., 2014, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5153-8, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência na sua totalidade) ou polipeptídeos preparados, expressos, criados ou isolados por qualquer outro meio que envolva o splicing de elementos de sequência selecionados. Em algumas modalidades, um ou mais desses elementos de sequência selecionados são encontrados na natureza. Em algumas modalidades, um ou mais desses elementos de sequência selecionados são projetados in silico. Em algumas modalidades, um ou mais desses elementos de sequência
77 / 308 selecionados resultam de mutagênese (por exemplo, in vivo ou in vitro) de um elemento de sequência conhecido, por exemplo, de uma fonte natural ou sintética (por exemplo, criada pelo ser humano). Por exemplo, em algumas modalidades, um polipeptídeo recombinante é composto por sequências encontradas no genoma de um organismo-fonte de interesse (por exemplo, humano, camundongo, etc.). Em algumas modalidades, um polipeptídeo recombinante possui uma sequência de aminoácidos que resultou de mutagênese (por exemplo, in vitro ou in vivo, por exemplo, em um animal não humano), de forma que as sequências de aminoácidos dos polipeptídeos recombinantes são sequências que, embora se originem de e estejam relacionadas a sequências polipeptídicas, podem não existir naturalmente no genoma de um animal não humano in vivo.
[00156] De referência: conforme utilizado neste documento, refere-se a um agente, animal, coorte, indivíduo, população, amostra, sequência ou valor padrão ou de controle com o qual um agente, animal, coorte, indivíduo, população, amostra, sequência ou valor de interesse é comparado. Em algumas modalidades, um agente, animal, coorte, indivíduo, população, amostra, sequência ou valor de referência é testado e/ou determinado substancialmente em simultâneo com o teste ou a determinação de um agente, animal, coorte, indivíduo, população, amostra, sequência ou valor de interesse. Em algumas modalidades, um agente, animal, coorte, indivíduo, população, amostra, sequência ou valor de referência é uma referência histórica opcionalmente incorporada em um meio tangível. Em algumas modalidades, uma referência pode se referir a um controle. Uma "referência" também inclui um "animal de referência." Um "animal de referência" pode ter uma modificação conforme descrita neste documento, uma modificação que é diferente da descrita neste documento ou nenhuma modificação (isto é, um animal de tipo selvagem). Normalmente, como seria entendido por pessoas versadas na técnica, um agente, animal, coorte, indivíduo, população,
78 / 308 amostra, sequência ou valor de referência é determinado ou caracterizado em condições comparáveis às utilizadas para determinar ou caracterizar um agente, animal (por exemplo, um mamífero), coorte, indivíduo, população, amostra, sequência ou valor de interesse.
[00157] Substituinte: conforme utilizado neste documento, refere-se a um processo através do qual uma sequência de ácidos nucleicos (por exemplo, um gene) "substituída" encontrada em um locus hospedeiro (por exemplo, em um genoma) é removida desse locus, e um ácido nucleico "substituinte" diferente está localizado em seu lugar. Em algumas modalidades, a sequência de ácidos nucleicos substituída e as sequências de ácidos nucleicos substituintes são comparáveis entre si pelo fato de que, por exemplo, são homólogas entre si, contêm elementos correspondentes (por exemplo, elementos codificantes de proteína, elementos reguladores, etc.) e/ou possuem sequências similares ou idênticas. Em algumas modalidades, uma sequência de ácidos nucleicos substituída inclui um ou mais dentre um promotor, um potenciador, um sítio doador de splice, um sítio aceptor de splice, um íntron, um éxon, uma região não traduzida (UTR); em algumas modalidades, uma sequência de ácidos nucleicos substituintes inclui uma ou mais sequências de codificação. Em algumas modalidades, uma sequência de ácidos nucleicos substituinte é um homólogo ou uma variante (por exemplo, mutante) da sequência de ácidos nucleicos substituída. Em algumas modalidades, uma sequência de ácidos nucleicos substituinte é um ortólogo ou homólogo da sequência substituída. Em algumas modalidades, uma sequência de ácidos nucleicos substituinte é ou compreende uma sequência de ácidos nucleicos humana. Em algumas modalidades, incluindo onde a sequência de ácidos nucleicos substituinte é ou compreende uma sequência de ácidos nucleicos humana, a sequência de ácidos nucleicos substituída é ou compreende uma sequência de roedor (por exemplo, uma sequência de camundongo ou rato). Em algumas modalidades, incluindo onde a sequência de ácidos nucleicos
79 / 308 substituinte é ou compreende uma sequência de ácidos nucleicos humana, a sequência de ácidos nucleicos substituída é ou compreende uma sequência humana. Em algumas modalidades, uma sequência de ácidos nucleicos substituinte é uma variante ou mutante (isto é, uma sequência que contém uma ou mais diferenças de sequência, por exemplo, substituições, em comparação com a sequência substituída) da sequência substituída. A sequência de ácidos nucleicos assim colocada pode incluir uma ou mais sequências reguladoras que são parte da sequência de ácidos nucleicos fonte usada para obter a sequência assim colocada (por exemplo, promotores, potenciadores, regiões não traduzidas 5' ou 3', etc.). Por exemplo, em várias modalidades, uma sequência de ácidos nucleicos substituinte é uma substituição de uma sequência endógena por uma sequência heteróloga que resulta na produção de um produto gênico a partir da sequência de ácidos nucleicos assim colocada (compreendendo a sequência heteróloga), mas não a expressão da sequência endógena; uma sequência de ácidos nucleicos substituinte é de uma sequência genômica endógena com uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo que tem uma função semelhante a um polipeptídeo codificado pela sequência endógena (por exemplo, a sequência genômica endógena codifica um polipeptídeo de região variável não humano, no todo ou em parte, e o fragmento de DNA codifica um ou mais polipeptídeos da região variável humanos, no todo ou em parte). Em várias modalidades, um segmento gênico de imunoglobulina não humana endógeno ou um fragmento deste é substituído por um segmento gênico de imunoglobulina humana ou um fragmento deste.
[00158] Substancialmente: conforme utilizado neste documento, refere-se à condição qualitativa de exibir a extensão ou o grau total ou quase total de uma característica ou propriedade de interesse. Uma pessoa versada nas técnicas biológicas compreenderá que fenômenos biológicos e químicos raramente, ou nunca, chegam à conclusão e/ou procedem à completude ou
80 / 308 alcançam ou evitam um resultado absoluto. O termo "substancialmente" é, portanto, usado neste documento para capturar a falta potencial de completude inerente a muitos fenômenos biológicos e químicos.
[00159] Semelhança substancial: conforme utilizado neste documento, refere-se a uma comparação entre sequências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos. Como será apreciado pelas pessoas versadas na técnica, duas sequências são geralmente consideradas "substancialmente semelhantes" se contiverem resíduos semelhantes (por exemplo, aminoácidos ou nucleotídeos) em posições correspondentes. Como é entendido na técnica, embora resíduos semelhantes possam ser resíduos idênticos (ver também Identidade Substancial, abaixo), resíduos semelhantes também podem ser resíduos não idênticos com características estruturais e/ou funcionais adequadamente comparáveis. Por exemplo, como é sabido por aqueles ordinariamente versados na técnica, certos aminoácidos são normalmente classificados como aminoácidos "hidrofóbicos" ou "hidrofílicos" e/ou como possuindo cadeias laterais "polares" ou "não polares". A substituição de um aminoácido por outro do mesmo tipo muitas vezes pode ser considerada uma substituição "conservativa". As categorizações típicas de aminoácidos são resumidas na tabela abaixo. Alanina Ala A Não polar Neutro 1,8 Arginina Arg R Polar Positivo -4,5 Asparagina Asn N Polar Neutro -3,5 Ácido aspártico Asp D Polar Negativo -3,5 Cisteína Cys C Não polar Neutro 2,5 Ácido glutâmico Glu E Polar Negativo -3,5 Glutamina Gln Q Polar Neutro -3,5 Glicina Gly G Não polar Neutro -0,4 Histidina His H Polar Positivo -3,2 Isoleucina Ile I Não polar Neutro 4,5 Leucina Leu L Não polar Neutro 3,8 Lisina Lys K Polar Positivo -3,9 Metionina Met M Não polar Neutro 1,9 Fenilalanina Phe F Não polar Neutro 2,8 Prolina Pro P Não polar Neutro -1,6 Serina Ser S Polar Neutro -0,8
81 / 308 Treonina Thr T Polar Neutro -0,7 Triptofano Trp W Não polar Neutro -0,9 Tirosina Tyr Y Polar Neutro -1,3 Valina Val V Não polar Neutro 4,2 Aminoácidos ambíguos 3 letras 1 letra Asparagina ou ácido aspártico Asx B Glutamina ou ácido glutâmico Glx Z Leucina ou Isoleucina Xle J Aminoácido não especificado ou desconhecido Xaa X
[00160] Como é bem conhecido nesta técnica, as sequências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos podem ser comparadas usando qualquer um de uma variedade de algoritmos, incluindo aqueles disponíveis em programas de computador comerciais, tais como BLASTN para sequências nucleotídicas e BLASTP, BLAST incompleto e PSI-BLAST para sequências de aminoácidos. Exemplos de tais programas são descritos em Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-10; Altschul, S.F. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:460-80; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-402; Baxevanis, A.D. e B.F.F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes e Proteins, Wiley, 1998; e Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods e Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 132, Humana Press, 1998, incorporados neste documento por referência em suas totalidades. Além de identificar sequências idênticas, os programas mencionados acima normalmente fornecem uma indicação do grau de similaridade. Em algumas modalidades, duas sequências são consideradas substancialmente similares se pelo menos, por exemplo, mas sem limitação, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de seus resíduos correspondentes são similares (por exemplo, idênticos ou incluem uma substituição conservativa) em relação a um trecho de resíduos relevante. Em algumas modalidades, o trecho relevante é uma sequência completa (por exemplo, uma sequência de um gene, um segmento gênico, uma sequência que codifica um domínio, um polipeptídeo ou um domínio). Em algumas modalidades, o trecho relevante possui pelo menos 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ou mais resíduos. Em algumas modalidades, o trecho
82 / 308 relevante possui pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais resíduos. Em algumas modalidades, o trecho relevante inclui resíduos contíguos ao longo de uma sequência completa. Em algumas modalidades, o trecho relevante inclui resíduos descontínuos ao longo de uma sequência completa, por exemplo, resíduos não contíguos reunidos pela conformação dobrada de um polipeptídeo ou uma porção deste.
[00161] Identidade substancial: conforme utilizado neste documento, refere-se a uma comparação entre sequências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos. Como será apreciado pelas pessoas ordinariamente versadas na técnica, duas sequências são geralmente consideradas "substancialmente idênticas" se contiverem resíduos idênticos (por exemplo, aminoácidos ou nucleotídeos) em posições correspondentes. Como é bem conhecido nesta técnica, as sequências de aminoácidos ou de ácidos nucleicos podem ser comparadas usando qualquer um de uma variedade de algoritmos, incluindo aqueles disponíveis em programas de computador comerciais, tais como BLASTN para sequências nucleotídicas e BLASTP, BLAST incompleto e PSI-BLAST para sequências de aminoácidos. Exemplos de tais programas são descritos em Altschul, S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol., 215(3): 403-10; Altschul, S.F. et al., 1996, Meth. Enzymol. 266:460-80; Altschul, S.F. et al., 1997, Nucleic Acids Res., 25:3389-402; Baxevanis, A.D. e B.F.F. Ouellette (eds.) Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes e Proteins, Wiley, 1998; e Misener et al. (eds.) Bioinformatics Methods e Protocols, Methods in Molecular Biology, Vol. 132, Humana Press, 1998, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência na sua totalidade. Além de identificar sequências idênticas, os programas mencionados acima normalmente fornecem uma indicação do grau de identidade. Em algumas modalidades, duas sequências são consideradas substancialmente idênticas se pelo menos 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais dos seus resíduos correspondentes são idênticos ao longo de um
83 / 308 trecho de resíduos relevante. Em algumas modalidades, um trecho de resíduos relevante é uma sequência completa. Em algumas modalidades, um trecho de resíduos relevante é, por exemplo, mas sem limitação, pelo menos 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 ou mais resíduos.
[00162] Construto de direcionamento ou vetor de direcionamento: conforme utilizado neste documento, refere-se a uma molécula de polinucleotídeo que compreende uma região de direcionamento. Uma região de direcionamento compreende uma sequência que é idêntica ou substancialmente idêntica a uma sequência em uma célula, tecido ou animal alvo e proporciona a integração do construto de direcionamento em uma posição dentro do genoma da célula, tecido ou animal através da recombinação homóloga. As regiões de direcionamento que se guiam usando sítios de reconhecimento de recombinase sítio-específica (por exemplo, sítios loxP ou Frt) também estão incluídas e descritas neste documento. Em algumas modalidades, um construto de direcionamento conforme descrito neste documento compreende ainda uma sequência de ácidos nucleicos ou gene de interesse específico, um marcador selecionável, sequências controle e/ou reguladoras e outras sequências de ácidos nucleicos que permitem a recombinação mediada através da adição exógena de proteínas que auxiliam ou facilitam a recombinação envolvendo essas sequências. Em algumas modalidades, um construto de direcionamento conforme descrito neste documento compreende ainda um gene de interesse no todo ou em parte, em que o gene de interesse é um gene heterólogo que codifica um polipeptídeo no todo ou em parte, tendo uma função semelhante à de uma proteína codificada por uma sequência endógena. Em algumas modalidades, um construto de direcionamento conforme descrito neste documento compreende ainda um gene humanizado de interesse, no todo ou em parte, em que o gene humanizado de interesse codifica um polipeptídeo, no todo ou em parte, que tem uma função semelhante à de um polipeptídeo codificado por uma
84 / 308 sequência endógena. Em algumas modalidades, um construto de direcionamento (ou vetor de direcionamento) pode compreender uma sequência de ácidos nucleicos manipulada pelo ser humano. Por exemplo, em algumas modalidades, um construto de direcionamento (ou vetor de direcionamento) pode ser construído para conter um polinucleotídeo manipulado ou recombinante que contém duas ou mais sequências que não estão ligadas nessa ordem na natureza, mas manipuladas pelo ser humano para serem diretamente ligadas uma à outra no polinucleotídeo manipulado ou recombinante.
[00163] Transgene ou construto de transgene: conforme utilizado neste documento, refere-se a uma sequência de ácidos nucleicos (que codifica, por exemplo, um polipeptídeo de interesse, no todo ou em parte) que foi introduzida em uma célula pelo ser humano, como pelos métodos descritos neste documento. Um transgene pode ser parcial ou totalmente heterólogo, ou seja, estranho ao animal ou célula geneticamente manipulada na qual é introduzido. Um transgene pode incluir uma ou mais sequências reguladoras transcricionais e qualquer outro ácido nucleico, tais como íntrons ou promotores, que podem ser necessários para a expressão de uma sequência de ácidos nucleicos selecionada.
[00164] Animal não humano geneticamente manipulado ou animal não humano geneticamente manipulado: são usados de forma intercambiável neste documento e se referem a qualquer animal não humano de ocorrência não natural no qual uma ou mais das células do animal não humano contêm ácido nucleico e/ou gene heterólogos que codifica um polipeptídeo de interesse, no todo ou em parte. Por exemplo, em algumas modalidades, um "animal não humano geneticamente modificado" ou "animal não humano geneticamente manipulado" refere-se a animais não humanos que contêm um transgene ou construto de transgene conforme descritos neste documento. Em algumas modalidades, um ácido nucleico e/ou gene
85 / 308 heterólogos são introduzidos na célula direta ou indiretamente pela introdução em uma célula precursora por meio de manipulação genética deliberada, tal como por microinjeção ou infecção por um vírus recombinante. O termo manipulação genética não inclui técnicas de reprodução clássicas, mas é direcionado à introdução de molécula(s) de DNA recombinante. Essa molécula pode ser integrada dentro de um cromossomo ou pode estar replicando o DNA extracromossomicamente. As frases "animal não humano geneticamente modificado" ou "animal não humano geneticamente manipulado" refere-se a animais que são heterozigotos ou homozigotos para um ácido nucleico e/ou gene heterólogos, e/ou animais que possuem cópias únicas ou múltiplas de um ácido nucleico e/ou gene heterólogos.
[00165] Vetor: conforme utilizado neste documento, refere-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de transportar outro ácido nucleico ao qual está associada. Em algumas modalidades, os vetores são capazes de replicação e/ou expressão extracromossômica de ácidos nucleicos aos quais estão ligados em uma célula hospedeira, tal como uma célula eucariota e/ou procariota. Os vetores capazes de direcionar a expressão de genes operacionalmente ligados são referidos neste documento como “vetores de expressão.”
[00166] Tipo selvagem: conforme utilizado neste documento, refere-se a uma entidade que possui uma estrutura e/ou atividade encontrada na natureza em um estado ou contexto "normal" (em contraste com mutantes, doentes, alterados, etc.). As pessoas ordinariamente versadas na técnica apreciarão que os genes e os polipeptídeos de tipo selvagem geralmente existem em várias formas diferentes (por exemplo, alelos).
[00167] A presente divulgação fornece, entre outras coisas, animais não humanos manipulados possuindo material genético heterólogo que codifica domínios Vλ humanos, tal material genético heterólogo
86 / 308 compreendendo sequências gênicas (isto é, segmentos gênicos) Vλ e Jλ humanas e outras sequências humanas que fornecem rearranjo (por exemplo, sequência sinal de recombinação (RSS)) e expressão adequados de anticorpos com cadeias leves de Igλ que incluem uma porção humana e uma porção não humana, ou anticorpos com cadeias leves de Igλ que são totalmente humanos. Por exemplo, em várias modalidades, quando um segmento gênico humano está presente em um genoma de um animal não humano manipulado, a(s) sequência(s) sinal de recombinação correspondente(s) também pode(m) estar presente(s) (por exemplo, RSS Vλ com segmento gênico Vλ, RSS Jλ com segmento gênico Jλ, RSS Vκ com segmento gênico Vκ, RSS Jk com segmento gênico Jκ, etc.). Em várias modalidades, desde que os animais não humanos manipulados contenham material genético heterólogo que está inserido de tal maneira que os anticorpos contendo cadeias leves com um domínio Vλ humano e um domínio Cλ não humano ou humano sejam expressos no repertório de anticorpos do animal não humano. Além disso, desde que os animais não humanos manipulados contenham material genético heterólogo que é inserido de tal maneira que anticorpos contendo cadeias leves com um domínio Vλ humano e um domínio Cλ não humano ou humano sejam expressos a partir de loci de cadeia leve de Igκ manipulados que incluem sequências gênicas de Igλ humanas e não humanas (por exemplo, segmentos gênicos) e, em algumas modalidades, sequências de cadeia leve de Igκ humanas no genoma da linhagem germinativa do animal não humano.
[00168] Sem desejar estar vinculado a qualquer teoria em particular, é contemplado que animais não humanos, conforme descritos neste documento, forneçam um sistema in vivo aprimorado que explora a expressão de anticorpos contendo domínios Vλ humanos para a produção de anticorpos terapêuticos. Também é contemplado que animais não humanos, conforme descrito neste documento, em algumas modalidades, forneçam formas de manipulação alternativas de loci de cadeia leve (por exemplo, loci de cadeia
87 / 308 leve de Igκ) que contêm material genético heterólogo para o desenvolvimento de terapias baseadas em anticorpos humanos (por exemplo, anticorpos monoclonais humanos, agentes de ligação multiespecífica, scFvs, polipeptídeos de fusão, etc.) a alvos de doenças que estão associados a respostas de anticorpos tendenciosas (por exemplo, respostas de anticorpos caracterizadas por uma proporção avassaladora de cadeias leves κ ou λ). Assim, desde que animais não humanos sejam particularmente úteis para o desenvolvimento de anticorpos humanos e moléculas baseadas em anticorpos humanos (por exemplo, agentes de ligação multiespecífica, scFvs, polipeptídeos de fusão, etc.) contra alvos associados a baixa imunogenicidade (por exemplo, vírus) devido, em parte, a repertórios e/ou respostas distorcidos de anticorpos.
[00169] A presente divulgação descreve, entre outras coisas, um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ que inclui um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos e um gene Cλ. Tal locus é referido como um locus "lambda em kappa" ou "LiK".
[00170] Em particular, a presente divulgação descreve a produção de um animal não humano (por exemplo, um roedor) com um genoma da linhagem germinativa que contém um locus de cadeia leve de Igκ manipulado que é, em algumas modalidades, caracterizado pela introdução de uma pluralidade de segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos e pela introdução de um gene Cλ não humano ou humano no lugar de um gene Cκ não humano, de modo que a referida pluralidade de segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos estejam operacionalmente ligados ao referido gene Cλ não humano ou humano. Conforme descrito neste documento, a produção de tal locus de cadeia leve de Igκ manipulado resulta na expressão de anticorpos que contêm cadeias leves que incluem um domínio Vλ humano e um domínio Cλ não humano ou humano do referido locus de cadeia leve de Igκ manipulado no genoma da linhagem germinativa do animal não humano. Em algumas
88 / 308 modalidades, o genoma da linhagem germinativa de animais não humanos fornecidos compreende um locus de cadeia leve de Igκ incluindo sequências de cadeia leve de Igλ humanas. Em algumas modalidades, o genoma da linhagem germinativa de animais não humanos fornecidos compreende (i) um locus de cadeia leve de Ig κ que inclui sequências de cadeia leve de Igλ humanas e (ii)(a) um locus de cadeia leve de Igκ que inclui sequências de cadeia leve de Igλ humanas ou (ii)(b) um locus de cadeia leve de Igκ que inclui sequências de cadeia leve de Igκ humanas. O genoma da linhagem germinativa de animais não humanos fornecidos, em algumas modalidades, compreende um locus de cadeia leve de Igκ conforme descrito neste documento e compreende ainda (i) um locus de IgH humanizado ou (ii) um locus de IgH humanizado e um locus de cadeia leve de Igλ endógeno silenciado funcionalmente ou tornado não funcional de outra forma. Animais não humanos fornecidos, conforme descritos neste documento, expressam repertórios de anticorpos que contêm cadeias leves de Igλ que incluem domínios Vλ humanos.
[00171] Em algumas modalidades, os animais não humanos, conforme descritos neste documento, contêm sequências de cadeia leve de Igλ humanas dentro de um locus de cadeia leve de Igκ. Em algumas modalidades, os animais não humanos, conforme descritos neste documento, contêm sequências de cadeia leve de Igλ humana e não humanas dentro de um locus de cadeia leve de Igκ. Em algumas modalidades, os animais não humanos, conforme descritos neste documento, contêm sequências de cadeia leve de Igλ humana e Igκ humana dentro de um locus de cadeia leve de Igκ. Em algumas modalidades, os animais não humanos, conforme descritos neste documento, contêm sequências de cadeia leve de Igλ humana, Igκ humana e Igκ murina e/ou Igλ murina dentro de um locus de cadeia leve de Igκ. Em algumas modalidades, os animais não humanos, conforme descritos neste documento, contêm sequências de cadeia leve de Igλ humana, sequências de cadeia leve
89 / 308 de Igλ não humana, sequências de cadeia leve de Igκ humana, sequências de cadeia leve de Igκ não humana ou combinações destas dentro de um locus de cadeia leve de Igκ. Em muitas modalidades de animais não humanos, conforme descritos neste documento, as sequências não humanas são ou compreendem sequências murinas (por exemplo, camundongo ou rato).
[00172] Em algumas modalidades, as sequências de cadeia leve de Igκ e/ou Igλ incluem DNA intergênico que é de origem humana e/ou murina. Em algumas modalidades, as sequências de cadeia leve de Igκ e/ou Igλ incluem DNA intergênico que é manipulado e baseado em uma sequência fonte que é de origem humana ou murina. Em algumas modalidades, o referido DNA intergênico é do mesmo locus de imunoglobulina no qual o DNA intergênico é colocado, inserido, posicionado ou manipulado (por exemplo, DNA intergênico de Igκ em um locus de cadeia leve de Igκ). Em algumas modalidades, o referido DNA intergênico é de um locus de imunoglobulina diferente no qual o DNA intergênico é colocado, inserido, posicionado ou manipulado (por exemplo, DNA intergênico de Igλ em um locus de cadeia leve de Igκ). Em algumas certas modalidades, os animais não humanos, conforme descritos neste documento, contêm um locus de cadeia leve de Igκ manipulado que contém DNA intergênico que inclui sequência(s) de cadeia leve de Igκ, sequência(s) de cadeia leve de Igλ e/ou combinações destas.
[00173] Em várias modalidades, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humanizada contém pelo menos um VH humano, pelo menos um DH humano e pelo menos um segmento gênico JH humano operacionalmente ligado a uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina não humana (por exemplo, uma região constante de cadeia pesada de imunoglobulina não humana que inclui um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina, como, por exemplo, IgM, IgD, IgG, IgE, IgA, etc.), por exemplo, uma pluralidade de segmentos gênicos VH, DH e JH humanos operacionalmente ligados a uma região constante de cadeia
90 / 308 pesada de imunoglobulina não humana. Em algumas modalidades, desde que os animais não humanos possuam um genoma da linhagem germinativa que inclui um ou mais loci de imunoglobulina representados nas Figuras. Tais animais não humanos manipulados fornecem uma fonte de anticorpos humanos e fragmentos de anticorpos humanos e fornecem um sistema in vivo melhorado adequado para explorar sequências Vλ humanas para a produção de anticorpos terapêuticos humanos.
[00174] Conforme descrito na seção Exemplos abaixo, são fornecidos animais não humanos que possuem um genoma que contém pelo menos um de cada segmento gênico de região variável de cadeia pesada (por exemplo, VH, DH e JH) e de cadeia leve (por exemplo, Vλ e Jλ no locus kappa endógeno) humano, por exemplo, uma pluralidade de segmentos gênicos região variável de cadeia pesada (por exemplo, VH, DH e JH) e de cadeia leve (por exemplo, Vλ e Jλ no locus kappa endógeno) humanos, no lugar de segmentos gênicos região variável não humanos em loci de imunoglobulina endógenos e incluem DNA intergênico não codificante humano entre os segmentos gênicos região variável humanos. Esse DNA intergênico inclui, por exemplo, promotores, sequências líderes e sequências sinais de recombinação que permitem recombinação e expressão adequadas dos segmentos gênicos de humanos no contexto de domínios variáveis de anticorpos. Pessoas versadas na técnica entendem que os loci de imunoglobulina não humana também contêm esse DNA intergênico não codificante. Ao ler esta divulgação, pessoas versadas na técnica entenderão que outro DNA intergênico humano ou não humano pode ser empregado na construção de tais loci, resultando na mesma expressão de domínios variáveis humanos no contexto de anticorpos no animal não humano. Esses loci semelhantes precisam conter apenas as sequências de codificação humanas (isto é, éxons) dos segmentos gênicos de humanos desejados para alcançar a expressão de anticorpos que contêm domínios variáveis humanos.
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[00175] Vários aspectos de certas modalidades são descritos em detalhes nas seções a seguir, cada um dos quais podendo ser aplicados a qualquer aspecto ou modalidade conforme descrito neste documento. O uso de seções não é para limitação. Repertórios de anticorpos em animais não humanos
[00176] As imunoglobulinas (também chamadas de anticorpos) são glicoproteínas grandes (~150 kD) em forma de Y que são produzidas por células B de um sistema imunológico do hospedeiro para neutralizar patógenos (por exemplo, vírus, bactérias, etc.). Cada imunoglobulina (Ig) é composta por duas cadeias pesadas idênticas e duas cadeias leves idênticas, cada uma das quais com dois componentes estruturais: um domínio variável e um domínio constante. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve diferem em anticorpos produzidos por células B diferentes, mas são as mesmas para todos os anticorpos produzidos por uma única célula B ou por um clone de célula B. As regiões variáveis das cadeias pesada e leve de cada anticorpo juntas compreendem a região de ligação ao antígeno (ou sítio de ligação ao antígeno). As imunoglobulinas podem existir em diferentes variedades que são chamadas de isotipos ou classes com base nas regiões (ou domínios) constantes de cadeia pesada que elas contêm. A região constante de cadeia pesada é idêntica em todos os anticorpos do mesmo isotipo, mas difere em anticorpos de isotipos diferentes. A tabela abaixo resume os nove isotipos de anticorpos em camundongos e humanos. Camundongo Humano IgM IgM IgD IgD IgG1 IgG1 IgG2a IgG2 IgG2b IgG3 IgG2c IgG4 IgG3 IgE IgE IgA1 IgA IgA2
[00177] Isotipos adicionais foram identificados em outras espécies. Os
92 / 308 isotipos conferem propriedades biológicas especializadas ao anticorpo devido às diferentes características estruturais entre os diferentes isotipos e são encontrados em diferentes locais (células, tecidos, etc.) dentro de um corpo de animal. Inicialmente, as células B produzem IgM e IgD com regiões de ligação ao antígeno idênticas. Após a ativação, as células B mudam para diferentes isotipos por um processo chamado de comutação da classe, que envolve uma alteração da região constante do anticorpo produzido pela célula B, enquanto as regiões variáveis permanecem as mesmas, preservando a especificidade de antígeno do anticorpo original (Célula B).
[00178] Dois loci separados (Igκ e Igλ) contêm os segmentos gênicos deque, após rearranjo, codificam as cadeias leves de anticorpos e exibem exclusão alélica e isotípica. As razões de expressão de células B κ+ a λ+ variam entre as espécies. Por exemplo, seres humanos demonstram uma razão de cerca de 60:40 (κ:λ). Em camundongos e ratos, é observada uma razão de 95:5 (κ:λ). Curiosamente, a razão κ:λ observada em gatos (5:95) é o inverso da razão de camundongos e ratos. Vários estudos foram realizados para elucidar as possíveis razões por trás dessas razões observadas, e tanto a complexidade do locus (ou seja, o número de segmentos gênicos, em particular, de segmentos gênicos V) quanto a eficiência do rearranjo de segmentos gênicos foram propostas como justificativas. O locus de cadeia leve de Igλ humana se estende por mais de 1.000 kb e contém aproximadamente 70 segmentos gênicos Vλ (29 a 33 funcionais) e sete pares de segmentos gênicos Jλ-Cλ (quatro a cinco funcionais) organizados em três clusters (ver, por exemplo, Fig. 1 da Patente US 9.006.511, que é incorporada neste documento por referência na sua totalidade). A maioria das regiões Vλ observadas no repertório de anticorpos expresso é codificada por segmentos gênicos contidos no cluster mais proximal (chamado de cluster A). O locus de cadeia leve da Igλ de camundongo é notavelmente diferente do locus humano e, dependendo da cepa, contém apenas alguns segmentos gênicos Vλ e Jλ
93 / 308 organizados em dois clusters gênicos distintos (ver, por exemplo, a Fig. 2 da Patente US No. 9.006.511, que é incorporada neste documento por referência na sua totalidade).
[00179] O desenvolvimento de anticorpos terapêuticos para o tratamento de várias doenças humanas tem sido amplamente focado na criação de linhagens de animais não humanos manipuladas, em particular, linhagens de roedores manipuladas, abrigando quantidades variáveis de material genético em seus genomas correspondente aos genes de imunoglobulina humana (revisado em, por exemplo, Brüggemann, M. et al., 2015, Arch. Immunol. Ther. Exp. 63:101-8, que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade). Os esforços iniciais na criação de tais linhagens de roedores geneticamente manipuladas focaram na integração de porções de loci de imunoglobulina humana que poderiam, por si só, apoiar a recombinação de segmentos gênicos e a produção de cadeias pesadas e/ou leves que eram inteiramente humanas enquanto possuíam loci de imunoglobulina endógenos inativados (ver, por exemplo, Brüggemann, M. et al., 1989, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 86:67-09-13; Brüggemann, M. et al., 1991, Eur. J. Immunol. 21:1323-6; Taylor, L.D. et al., 1992, Nucl. Acids Res. 20:6287-6295; Davies, N.P. et al., 1993, Biotechnol. 11:911-4; Green, L.L. et al., 1994, Nat. Genet. 7:13-21; Lonberg, N. et al., 1994, Nature 368:856-9; Taylor, L.D. et al., 1994, Int. Immunol. 6:579-91; Wagner, S.D. et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24:2672-81; Fishwild, D.M. et al., 1996, Nat. Biotechnol. 14:845-51; Wagner, S.D. et al., 1996, Genomics 35:405-14; Mendez, M.J. et al., 1997, Nat. Genet. 15:146-56; Green, L.L. et al., 1998, J. Exp. Med. 188:483-95; Xian, J. et al., 1998, Transgenics 2:333-43; Little, M. et al., 2000, Immunol. Today 21:364-70; Kellermann, S.A. e L.L. Green, 2002, Cur. Opin. Biotechnol. 13:593-7, cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade). Em particular, alguns esforços incluíram a integração de sequências de cadeias leves de Igλ humanas (ver, por exemplo, as
94 / 308 Publicações de Pedido de Patente US Nos. 2002/0088016 A1, 2003/0217373 A1 e 2011/0236378 A1; Patentes US Nos. 6.998.514 e 7.435.871; Nicholson, I.C. et al., 1999, J. Immunol. 163:6898-906; Popov, A.V et al., 1999, J. Exp. Med. 189(10):1611-19, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência na sua totalidade). Tais esforços concentraram-se na integração aleatória de cromossomos artificiais de levedura contendo sequências Vλ, Jλ e Cλ, criando assim cepas de camundongo que expressam cadeias leves de Igλ totalmente humana (ou seja, domínios Vλ e Cλ humanos). Esforços mais recentes empregaram estratégias semelhantes usando construtos que também contêm sequências Vλ, Jλ e Cλ humanas (Osborn, M.J. et al., 2013, J. Immunol. 190:1481-90; Lee, E-C. et al., 2014, Nat. Biotech. 32(4):356-63, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência na sua totalidade).
[00180] Ainda outros esforços incluíram a inserção específica de segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos em loci de cadeia leve de Ig de roedor endógenos (κ e λ), de modo que os referido segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos sejam operacionalmente ligados a genes de região constante de cadeia leve de Ig endógenos (ver, por exemplo, Patentes US Nos. 9.006.511,
9.012.717, 9.029.628, 9.035.128, 9.066.502, 9.150.662 e 9.163.092; todas as quais são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade). Nesses animais, todos os segmentos gênicos Vλ humanos dos clusters A e B e um ou quatro segmentos gênicos Jλ humanos foram inseridos em loci de cadeia leve de Igκ e Igλ endógenos. Como resultado, vários segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos diferentes demonstraram um rearranjo adequado nos dois loci de cadeia leve de Ig de roedor manipulados para formar cadeias leves funcionais expressas no repertório de anticorpos de roedor, tais cadeias leves incluindo domínios Vλ humanos no contexto de regiões Cκ e Cλ endógenas (ver, por exemplo, Tabela 7 e Figuras 11-13 da Patente US No.
9.006.511, que é incorporada neste documento por referência na sua
95 / 308 totalidade). Em particular, camundongos com loci de cadeia leve de Igκ manipulados que abrigam segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos demonstraram uma razão lambda humana para lambda endógena (conforme medido pela razão IgCκ para IgCλ) de cerca de 1:1 no compartimento esplênico (ver, por exemplo, Tabela 4 da Patente US 9.006.511, que é incorporada neste documento por referência na sua totalidade). De fato, ambas as cepas de camundongos manipuladas (isto é, loci de cadeia leve de Igκ manipulada ou igλ manipulada) demonstraram que os domínios Vλ humanos podem ser expressos de loci de cadeia leve de Ig endógenos em roedores, que normalmente exibem um grande viés na expressão de cadeia leve (ver acima). A presente divulgação fornece o reconhecimento de que estruturas de locus de cadeia leve de Ig manipulado alternativas podem ser produzidas para maximizar o uso de segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos em repertórios de anticorpos para alvos terapêuticos em animais não humanos, em particular, em comparação com animais não humanos que contêm um locus de cadeia leve de Igλ sem a complexidade e qualidade robusta (por exemplo, camundongos e ratos) que normalmente estão associadas a um locus de cadeia leve de Igλ humano (ou seja, um locus que aparece em uma célula humana). Tais estruturas de locus de cadeia leve de Ig manipulado alternativas fornecem a capacidade de repertórios de anticorpos únicos resultantes de seu projeto.
[00181] A presente divulgação exemplifica a produção bem-sucedida de um animal não humano cujo genoma da linhagem germinativa contém um locus de cadeia leve de Igκ endógeno manipulado que compreende uma pluralidade de segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos em ligação operável com um gene de região constante de cadeia leve de Igλ não humana ou humana, tal gene de região constante de cadeia leve de Igλ não humana ou humana sendo inserido no lugar de um gene de região constante de cadeia leve de Igκ não humana do locus de cadeia leve de Igκ endógeno. Em particular, a
96 / 308 presente divulgação demonstra especificamente a produção bem-sucedida de (1) um animal não humano manipulado que expressa anticorpos com regiões variáveis humanas e regiões constantes não humanas, tais anticorpos incluindo cadeias leves que contêm um domínio Vλ humano e um domínio Cλ não humano, e (2) um animal não humano manipulado que expressa anticorpos com regiões variáveis humanas e regiões constantes humanas, tais anticorpos incluindo cadeias leves que contêm domínios Vλ e Cλ humanos. Conforme especificamente exemplificado neste documento, a expressão de tais cadeias leves é alcançada pela inserção da referida pluralidade de segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos em um locus (ou alelo) de cadeia leve de Igκ endógeno. Em algumas modalidades, desde que os animais não humanos sejam manipulados para que a expressão de regiões variáveis de cadeia leve de Igλ endógenas seja inativada (por exemplo, por deleção de genes).
[00182] Em algumas modalidades, desde que animais não humanos sejam manipulados para que a expressão de regiões variáveis de cadeia leve de Igκ endógenas seja inativada (por exemplo, por substituição). Em algumas modalidades, animais não humanos fornecidos são manipulados de modo que os animais não humanos expressem regiões variáveis de cadeia leve de Igλ humana de um locus de cadeia leve de Igκ endógena manipulado e regiões variáveis de cadeia leve de Igκ humana de um locus de cadeia leve de Igκ endógena manipulado. Assim, a presente divulgação, em pelo menos algumas modalidades, abrange o desenvolvimento de um sistema in vivo aprimorado para a produção de anticorpos humanos através do fornecimento de um animal não humano manipulado que contém um locus de cadeia leve de Igκ manipulado alternativamente que resulta em um repertório de anticorpos expresso contendo domínios Vλ humanos e domínios Cλ não humanos ou humanos. Construtos de Ácido Nucleico
[00183] Tipicamente, uma molécula de polinucleotídeo contendo
97 / 308 sequências de cadeia leve de Igλ humana (por exemplo, segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos) ou uma ou mais porções ligadas a (por exemplo, são inseridas em) um vetor, preferencialmente um vetor de DNA, a fim de replicar a molécula de polinucleotídeo em uma célula hospedeira.
[00184] As sequências de cadeia leve de Igλ humana podem ser clonadas diretamente de sequências ou fontes (por exemplo, bibliotecas) conhecidas ou sintetizadas a partir de sequências de linhagem germinativa projetadas in silico com base em sequências publicadas disponíveis no GenBank ou em outros bancos de dados publicamente disponíveis (por exemplo, IMGT). Alternativamente, as bibliotecas de cromossomo artificial bacteriano (BAC) podem fornecer sequências de DNA de imunoglobulina de interesse (por exemplo, sequências Vλ e Jλ humanas e combinações destas). As bibliotecas BAC podem conter um tamanho de inserção de 100-150kb e são capazes de abrigar inserções tão grandes quanto 300kb (Shizuya, et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 89:8794-8797; Swiatek, et al., 1993, Genes e Development 7:2071-2084; Kim, et al., 1996, Genomics 34 213-218; incorporados neste documento por referência em suas totalidades). Por exemplo, uma biblioteca BAC humana que abriga tamanhos de inserção médios de 164-196kb foi descrita (Osoegawa, K. et al., 2001, Genome Res. 11(3):483-96; Osoegawa, K. et al., 1998, Genomics 52:1-8, Article No. GE985423, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência na sua totalidade). Bibliotecas BAC genômicas humanas e de camundongos foram construídas e estão disponíveis comercialmente (por exemplo, ThermoFisher). As bibliotecas BAC genômicas também podem servir como fonte de sequências de DNA de imunoglobulina, bem como regiões de controle transcricional.
[00185] Alternativamente, as sequências de DNA de imunoglobulina podem ser isoladas, clonadas e/ou transferidas de cromossomos artificiais de levedura (YACs). Por exemplo, a sequência nucleotídica do locus de cadeia
98 / 308 leve de Igλ humana foi determinada (ver, por exemplo, Dunham, I. et al., 1999, Nature 402:489-95, que está incorporado neste documento por referência na sua totalidade). Além disso, os YACs foram anteriormente empregados para montar um transgene de locus de cadeia leve de Igλ humana (ver, por exemplo, Popov, A.V. et al., 1996, Gene 177:195-201; Popov, A.V. et al., 1999, J. Exp. Med. 189(10):1611-19, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência na sua totalidade). Um locus inteiro de cadeia leve de Igλ (humano ou roedor) pode ser clonado e contido em vários YACs. Se vários YACs forem empregados e contiverem regiões de similaridade sobreposta, eles podem ser recombinados dentro das cepas hospedeiras de leveduras para produzir um único construto representando o locus inteiro ou as partes desejadas do locus (por exemplo, uma região a ser direcionada com um vetor de direcionamento). Os braços de YAC podem ser adicionalmente modificados com cassetes de seleção de mamíferos por meio de adaptação para auxiliar na introdução dos construtos em células-tronco embrionárias ou embriões por métodos conhecidos na técnica e/ou descritos neste documento.
[00186] DNA e sequências de aminoácidos de segmentos gênicos cadeia leve de Igλ humana para uso na criação de um locus de cadeia leve de Igκ manipulado conforme descrito neste documento podem ser obtidos de bancos de dados publicados (por exemplo, GenBank, IMGT, etc.) e/ou sequências de anticorpos publicadas. Em algumas modalidades, construtos de ácidos nucleicos contendo segmentos gênicos cadeia leve de Igλ humana compreendem uma região J (isto é, uma sequência genômica que inclui uma pluralidade de segmentos gênicos J de cadeia leve), em que a região J compreende sequências de codificação de segmentos gênicos Jλ humanos com seus 12RSS correspondentes, em que os 12RSS foram posicionados em DNA intergênico não codificante tipicamente associado às sequências de codificação dos segmentos gênicos Jκ humanos com o seus 23RSS correspondentes.
99 / 308
[00187] Em algumas modalidades, tal sequência pode ser referida como uma região J de cadeia leve manipulada. Em algumas determinadas modalidades, construtos de ácidos nucleicos contendo segmentos gênicos cadeia leve de Igλ humana compreendem sequências Vλ e Jλ humanas ligadas operacionalmente a um gene (Cλ) da região constante de cadeia leve de Igλ humana ou não humana. Em algumas determinadas modalidades, construtos de ácidos nucleicos contendo segmentos gênicos cadeia leve de Igλ humana compreendem sequências Vλ e Jλ humanas operacionalmente ligadas a uma ou mais regiões potenciadoras (ou sequências potenciadoras) de cadeia leve de Igκ não humana. Em algumas determinadas modalidades, construtos de ácidos nucleicos contendo segmentos gênicos cadeia leve de Igλ humana compreendem sequências Vλ e Jλ humanas ligadas operacionalmente a um gene da região Cλ não humano ou humano e regiões potenciadoras (ou sequências potenciadoras) de cadeia leve de Igκ não humana.
[00188] Em algumas modalidades, construtos de ácidos nucleicos contendo sequências Vλ e Jλ humanas compreendem ainda DNA intergênico que é de origem humana e/ou murina. Em algumas modalidades, o DNA intergênico é ou compreende a sequência de cadeia leve de Igκ murina não codificante, a sequência de cadeia leve de Igκ humana não codificante, a sequência de cadeia leve de Igλ murina não codificante, a sequência de cadeia leve de Igλ humana não codificante ou combinações destas.
[00189] Os construtos de ácidos nucleicos podem ser preparados usando métodos conhecidos na técnica. Por exemplo, um construto de ácidos nucleicos pode ser preparado como parte de um plasmídeo maior. Tal preparação permite a clonagem e a seleção das construções corretas de uma maneira eficiente, como é conhecido na técnica. Construtos de ácidos nucleicos contendo sequências de cadeia leve de Igλ humana, no todo ou em parte, conforme descrito neste documento, podem ser localizados entre sítios de restrição no plasmídeo para que possam ser isolados das sequências de
100 / 308 plasmídeos restantes para incorporação em um animal não humano desejado.
[00190] Vários métodos empregados na preparação de construtos de ácidos nucleicos (por exemplo, plasmídeos) e na transformação de organismos hospedeiros são conhecidos na técnica. Para outros sistemas de expressão adequados para células procarióticas e eucarióticas, bem como procedimentos recombinantes gerais, ver Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Manipulation, 5ª Ed., ed. Por Old, R.W. e S.B. Primrose, Blackwell Science, Inc., 1994 e Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., ed. por Sambrook, J. et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência na sua totalidade. Vetores de Direcionamento
[00191] Os vetores de direcionamento podem ser empregados para introduzir um construto de ácidos nucleicos em um locus alvo genômico e compreender um construto de ácidos nucleicos e braços de homologia que flanqueiam o referido construto de ácidos nucleicos; aqueles versados na técnica estarão cientes de uma variedade de opções e recursos aplicáveis de forma geral ao projeto, à estrutura e/ou à utilização de vetores de direcionamento. Por exemplo, os vetores de direcionamento podem estar na forma linear ou circular e podem ser de fita simples ou fita dupla. Os vetores de direcionamento podem ser ácido desoxirribonucleico (DNA) ou ácido ribonucleico (RNA). Para facilitar a referência, os braços de homologia são referidos neste documento como braços de homologia 5' e 3' (isto é, a montante e a jusante). Esta terminologia refere-se à posição dos braços de homologia em relação a um construto de ácidos nucleicos em um vetor de direcionamento. Os braços de homologia 5' e 3' correspondem a regiões em um locus direcionado ou a uma região em outro vetor de direcionamento, que são chamados neste documento de "sequência alvo 5'" e "sequência alvo 3'" respectivamente. Em algumas modalidades, os braços de homologia também
101 / 308 podem funcionar como uma sequência alvo 5 'ou 3'.
[00192] Em algumas modalidades, os métodos descritos neste documento empregam dois, três ou mais vetores de direcionamento que são capazes de recombinar uns com os outros. Em várias modalidades, os vetores de direcionamento são vetores de direcionamento grandes (LTVEC), conforme descrito em outras partes deste documento. Em tais modalidades, o primeiro, o segundo e o terceiro vetores de direcionamento compreendem, cada um, braços de homologia 5' e 3'. O braço de homologia 3' do primeiro vetor de direcionamento compreende uma sequência que se sobrepõe ao braço de homologia 5' do segundo vetor de direcionamento (isto é, sequências sobrepostas), o que permite a recombinação homóloga entre o primeiro e o segundo LTVECs.
[00193] No caso de métodos de duplo direcionamento, um braço de homologia 5' de um primeiro vetor de direcionamento e um braço de homologia 3' de um segundo vetor de direcionamento podem ser semelhantes aos segmentos correspondentes em um locus genômico alvo (ou seja, uma sequência alvo), que pode promover a recombinação homóloga do primeiro e do segundo vetores de direcionamento com os segmentos genômicos correspondentes e modifica o locus genômico alvo.
[00194] No caso de métodos de direcionamento triplo, um braço de homologia 3' de um segundo vetor de direcionamento pode compreender uma sequência que se sobrepõe a um braço de homologia 5' de um terceiro vetor de direcionamento (ou seja, sequências sobrepostas), o que pode permitir a recombinação homóloga entre os segundo e terceiro LTVEC. O braço de homologia 5' do primeiro vetor de direcionamento e o braço de homologia 3' do terceiro vetor de direcionamento são semelhantes aos segmentos correspondentes no locus genômico alvo (isto é, a sequência alvo), que pode promover a recombinação homóloga do primeiro e do terceiro vetores de direcionamento com os segmentos genômicos correspondentes e modifica o
102 / 308 locus genômico alvo.
[00195] Um braço de homologia e uma sequência alvo ou dois braços de homologia "correspondem" ou são "correspondentes" um ao outro quando as duas regiões compartilham um nível suficiente de identidade de sequência um com o outro para atuar como substratos para uma reação de recombinação homóloga. A identidade de sequência entre uma determinada sequência alvo e o braço de homologia correspondente encontrado em um vetor de direcionamento (isto é, sequência sobreposta) ou entre dois braços de homologia pode ser qualquer grau de identidade de sequência que permita a recombinação homóloga. Para dar apenas um exemplo, uma quantidade de identidade de sequência compartilhada por um braço de homologia de um vetor de direcionamento (ou um fragmento deste) e uma sequência alvo de outro vetor de direcionamento ou uma sequência alvo de um locus genômico alvo (ou um fragmento deste) pode ser, por exemplo, mas sem limitação, pelo menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% de identidade de sequência, de modo que as sequências são submetidas a recombinação homóloga.
[00196] Além disso, uma região correspondente de similaridade (por exemplo, identidade) entre um braço de homologia e uma sequência alvo correspondente pode ter qualquer comprimento que seja suficiente para promover a recombinação homóloga no locus genômico alvo. Por exemplo, um determinado braço de homologia e/ou sequência alvo correspondente pode compreender regiões de similaridade correspondente que têm, por exemplo, mas sem limitação, cerca de 5-10kb, 5-15kb, 5-20kb, 5-25kb, 5- 30kb, 5-35kb, 5-40kb, 5-45kb, 5-50kb, 5-55kb, 5-60kb, 5-65kb, 5-70kb, 5- 75kb, 5-80kb, 5-85kb, 5-90kb, 5-95kb, 5-100kb, 100-200kb ou 200-300kb de comprimento (conforme descrito neste documento em outra parte), de modo que um braço de homologia tem semelhança suficiente para ser submetido a
103 / 308 recombinação homóloga com uma ou mais sequências alvo correspondentes em um locus genômico alvo da célula ou em outro vetor de direcionamento. Em algumas modalidades, um determinado braço de homologia e/ou sequência alvo correspondente compreendem regiões de similaridade correspondentes que têm, por exemplo, mas sem limitação, cerca de 10- 100kb, 15-100kb, 20-100kb, 25-100kb, 30-100kb, 35-100kb, 40-100kb, 45- 100kb, 50-100kb, 55-100kb, 60-100kb, 65-100kb, 70-100kb, 75-100kb, 80- 100kb, 85-100kb, 90-100kb ou 95 -100kb de comprimento (conforme descrito neste documento em outra parte), de modo que um braço de homologia tem similaridade suficiente para ser submetido a recombinação homóloga com uma ou mais sequências alvo correspondentes em um locus genômico alvo da célula ou em outro vetor de direcionamento.
[00197] As sequências sobrepostas de um braço de homologia 3' de um primeiro vetor de direcionamento e um braço de homologia de 5' de um segundo vetor de direcionamento ou de um braço de homologia de 3' de um segundo vetor de direcionamento e um braço de homologia de 5' de um terceiro vetor de direcionamento podem ser de qualquer comprimento que seja suficiente para promover recombinação homóloga entre os referidos vetores de direcionamento. Por exemplo, uma determinada sequência sobreposta de um braço de homologia pode compreender regiões sobrepostas correspondentes que têm cerca de 1-5kb, 5-10kb, 5-15kb, 5-20kb, 5-25kb, 5- 30kb, 5-35kb, 5-40kb, 5-45kb, 5-50kb, 5-55kb, 5-60kb, 5-65kb, 5-70kb, 5- 75kb, 5-80kb, 5-85kb, 5-90kb, 5-95kb, 5-100kb, 100-200kb ou 200-300kb de comprimento, de modo que uma sequência sobreposta de um braço de homologia tem semelhança suficiente para sofrer recombinação homóloga com uma sequência sobreposta correspondente em outro vetor de direcionamento. Em algumas modalidades, uma determinada sequência sobreposta de um braço de homologia compreende uma região sobreposta que tem cerca de 1-100kb, 5-100kb, 10-100kb, 15-100kb, 20-100kb, 25-100kb,
104 / 308
30-100kb, 35-100kb, 40-100kb, 45-100kb, 50-100kb, 55-100kb, 60-100kb, 65-100kb, 70-100kb, 75-100kb, 80-100kb, 85-100kb, 90-100kb ou 95-100kb em comprimento de modo que uma sequência sobreposta de um braço de homologia tem semelhança suficiente para ser submetida a recombinação homóloga com uma sequência sobreposta correspondente em outro vetor de direcionamento.
Em algumas modalidades, uma sequência sobreposta tem 1-5 kb, inclusive.
Em algumas modalidades, uma sequência sobreposta tem de cerca de 1kb a cerca de 70kb, inclusive.
Em algumas modalidades, uma sequência sobreposta tem de cerca de 10kb a cerca de 70kb, inclusive.
Em algumas modalidades, uma sequência sobreposta tem de cerca de 10kb a cerca de 50kb, inclusive.
Em algumas modalidades, uma sequência sobreposta tem pelo menos 10kb.
Em algumas modalidades, uma sequência sobreposta tem pelo menos 20kb.
Por exemplo, uma sequência sobreposta pode ter de cerca de 1kb a cerca de 5kb, inclusive, de cerca de 5kb a cerca de 10kb, inclusive, de cerca de 10kb a cerca de 15kb, inclusive, de cerca de 15kb a cerca de 20kb, inclusive, de cerca de 20kb a cerca de 25kb, inclusive, de cerca de 25kb a cerca de 30kb, inclusive, de cerca de 30kb a cerca de 35kb, inclusive, de cerca de 35kb a cerca de 40kb, inclusive, de cerca de 40kb a cerca de 45kb, inclusive, de 45kb a cerca de 50kb, inclusive, de cerca de 50kb a cerca de 60kb, inclusive, de cerca de 60kb a cerca de 70kb, inclusive, de cerca de 70kb a cerca de 80kb, inclusive, de cerca de 80kb a cerca de 90kb, inclusive, de cerca de 90kb a cerca de 100kb, inclusive, de cerca de 100kb a cerca de 120kb, inclusive, de cerca de 120kb a cerca de 140kb, inclusive, de cerca de 140kb a cerca de 160kb, inclusive, de cerca de 160kb a cerca de 180kb, inclusive, de cerca de 180kb a cerca de 200kb, inclusive, de cerca de 200kb a cerca de 220kb, inclusive, de cerca de 220kb a cerca de 240kb, inclusive, de cerca de 240kb a de cerca de 260 kb, inclusive, de cerca de 260 kb a cerca de 280 kb, inclusive ou de 280 kb a cerca de 300 kb, inclusive.
Para dar apenas um exemplo, uma sequência sobreposta pode ter de cerca de 20kb a cerca de
105 / 308 60kb, inclusive. Alternativamente, uma sequência sobreposta pode ter pelo menos 1kb, pelo menos 5kb, pelo menos 10kb, pelo menos 15kb, pelo menos 20kb, pelo menos 25kb, pelo menos 30kb, pelo menos 35kb, pelo menos 40kb, pelo menos 45kb, pelo menos 50kb, pelo menos 60kb, pelo menos 70kb, pelo menos 80kb, pelo menos 90kb, pelo menos 100kb, pelo menos 120kb, pelo menos 140kb, pelo menos 160kb, pelo menos 180kb, pelo menos 200kb, pelo menos 220kb, pelo menos 240kb, pelo menos pelo menos 260kb, pelo menos 280kb ou pelo menos 300kb. Em algumas modalidades, uma sequência sobreposta pode ter no máximo 400kb, no máximo 350kb, no máximo 300kb, no máximo 280kb, no máximo 260kb, no máximo 240kb, no máximo 220kb, no máximo 200kb, no máximo 180kb, no máximo 160kb, no máximo no máximo 140kb, no máximo 120kb, no máximo 100kb, no máximo 90kb, no máximo 80kb, no máximo 70kb, no máximo 60kb ou no máximo 50kb.
[00198] Os braços de homologia podem, em algumas modalidades, corresponder a um locus nativo de uma célula (por exemplo, um locus direcionado) ou, alternativamente, podem corresponder a uma região de um segmento heterólogo ou exógeno de DNA que foi integrado ao genoma da célula, incluindo, por exemplo, transgenes, cassetes de expressão ou regiões heterólogas ou exógenas de DNA. Em algumas modalidades, os braços de homologia podem, em algumas modalidades, corresponder a uma região em um vetor de direcionamento em uma célula. Em algumas modalidades, os braços de homologia de um vetor de direcionamento podem corresponder a uma região de um cromossomo artificial de levedura (YAC), um cromossomo artificial bacteriano (BAC), um cromossomo artificial humano ou qualquer outra região manipulada contida numa célula hospedeira apropriada. Além disso, os braços de homologia de um vetor de direcionamento podem corresponder ou ser derivados de uma região de uma biblioteca BAC, uma biblioteca de cosmídeos ou uma biblioteca de fagos P1. Em algumas
106 / 308 modalidades, os braços de homologia de um vetor de direcionamento correspondem a um locus que é nativo, heterólogo ou exógeno a um procarionte, uma levedura, um pássaro (por exemplo, galinha), um mamífero não humano, um roedor, um humano, um rato, um camundongo, um hamster, um coelho, um porco, um bovino, um veado, uma ovelha, uma cabra, um gato, um cão, um furão, um primata (por exemplo, sagui, macaco rhesus), um mamífero domesticado, um mamífero agrícola ou qualquer outro organismo de interesse. Em algumas modalidades, os braços de homologia correspondem a um locus da célula que apresenta suscetibilidade ao direcionamento usando um método convencional limitada ou que apresentou níveis relativamente baixos de integração bem-sucedida em um sítio direcionado e/ou níveis significativos de integração off-target na ausência de uma ruptura (nick) ou uma quebra de fita dupla induzida por um agente de nuclease (por exemplo, uma proteína Cas). Em algumas modalidades, os braços de homologia são projetados para incluir DNA manipulado.
[00199] Em algumas modalidades, os braços de homologia 5' e 3' de um ou mais vetores de direcionamento correspondem a um genoma direcionado. Alternativamente, os braços de homologia correspondem a um genoma relacionado. Por exemplo, um genoma direcionado é um genoma de camundongo de uma primeira cepa, e os braços de direcionamento correspondem a um genoma de camundongo de uma segunda cepa, em que a primeira cepa e a segunda cepa são diferentes. Em certas modalidades, os braços de homologia correspondem ao genoma do mesmo animal ou são do genoma da mesma cepa, por exemplo, o genoma direcionado é um genoma de camundongo de uma primeira cepa, e os braços de direcionamento correspondem a um genoma de camundongo do mesmo camundongo ou da mesma cepa.
[00200] Um braço de homologia de um vetor de direcionamento pode ter qualquer comprimento que seja suficiente para promover um evento de
107 / 308 recombinação homóloga com uma sequência alvo correspondente, incluindo, por exemplo, 1-5kb, inclusive, 5-10kb, inclusive, 5-15kb, inclusive, 5-20kb, inclusive, 5-25kb, inclusive, 5-30kb, inclusive, 5-35kb, inclusive, 5-40kb, inclusive, 5-45kb, inclusive, 5-50kb, inclusive, 5-55kb, inclusive, 5- 60kb, inclusive, 5-65kb, inclusive, 5-70kb, inclusive, 5-75kb, inclusive, 5-80kb, inclusive, 5-85kb, inclusive, 5-90kb, inclusive, 5-95kb, inclusive, 5-100kb, inclusive, 100-200kb, inclusive, ou 200-300kb, inclusive, de comprimento. Em algumas modalidades, um braço de homologia de um vetor de direcionamento tem um comprimento que é suficiente para promover um evento de recombinação homóloga com uma sequência alvo correspondente que é de 1-100kb, inclusive, 5-100kb, inclusive, 10-100kb, inclusive, 15- 100kb, inclusive, 20-100kb, inclusive, 25-100kb, inclusive, 30-100kb, inclusive, 35-100kb, inclusive, 40-100kb, inclusive, 45-100kb, inclusive, 50- 100kb, inclusive, 55-100kb, inclusive, 60-100kb, inclusive, 65-100kb, inclusive, 70-100kb, inclusive, 75-100kb, inclusive, 80-100kb, inclusive, 85- 100kb, inclusive, 90-100kb, inclusivo ou 95-100kb, inclusive, de comprimento. Conforme descrito neste documento, vetores de direcionamento grandes podem empregar braços de direcionamento de maior comprimento.
[00201] Agentes de nuclease (por exemplo, sistemas CRISPR/Cas) podem ser empregados em combinação com vetores de direcionamento para facilitar a modificação de um locus alvo (por exemplo, modificação de um locus de cadeia leve de Igκ ou modificação de um locus de cadeia leve de Igκ modificado ou manipulado anteriormente). Tais agentes de nuclease podem promover recombinação homóloga entre um vetor de direcionamento e um locus alvo. Quando agentes de nuclease são empregados em combinação com um vetor de direcionamento, o vetor de direcionamento pode compreender braços de homologia 5' e 3' correspondentes a sequências alvo 5' e 3' localizadas em proximidade suficiente de um sítio de clivagem de nuclease, de modo a promover a ocorrência de um evento de recombinação homóloga
108 / 308 entre sequências alvo e braços de homologia após uma ruptura (nick) ou quebra de fita dupla no sítio de clivagem de nuclease. O termo "sítio de clivagem de nuclease" inclui uma sequência de DNA na qual uma ruptura (nick) ou uma quebra de fita dupla é criada por um agente de nuclease (por exemplo, um sítio de clivagem Cas9). Sequências alvo dentro de um locus direcionado que correspondem aos braços de homologia 5' e 3' de um vetor de direcionamento são "localizadas em proximidade suficiente" a um sítio de clivagem de nuclease se a distância for suficiente para promover a ocorrência de um evento de recombinação homóloga entre as sequências alvo 5' e 3' e os braços de homologia após uma ruptura (nick) ou uma quebra de fita dupla no sítio de reconhecimento. Assim, em certas modalidades, as sequências alvo correspondentes aos braços de homologia 5' e/ou 3' de um vetor de direcionamento estão dentro de pelo menos um nucleotídeo de um determinado sítio de reconhecimento ou estão dentro de pelo menos 10 nucleotídeos a cerca de 14kb de um determinado sítio de reconhecimento. Em algumas modalidades, um sítio de clivagem de nuclease é imediatamente adjacente a pelo menos uma ou ambas as sequências alvo.
[00202] A relação espacial das sequências alvo que correspondem aos braços de homologia de um vetor de direcionamento e um sítio de clivagem de nuclease pode variar. Por exemplo, as sequências alvo podem ser localizadas 5' a um sítio de clivagem de nuclease, as sequências alvo podem ser localizadas 3' a um sítio de reconhecimento ou as sequências alvo podem flanquear um sítio de clivagem de nuclease.
[00203] A utilização combinada de um vetor de direcionamento (incluindo, por exemplo, um vetor de direcionamento grande) com um agente de nuclease pode resultar em uma maior eficiência de direcionamento em comparação com a utilização de um vetor de direcionamento por si só. Por exemplo, quando um vetor de direcionamento é usado em conjunto com um agente de nuclease, a eficiência de direcionamento de um vetor de
109 / 308 direcionamento pode ser aumentada em pelo menos duas vezes, pelo menos três vezes, pelo menos quatro vezes, pelo menos cinco vezes, pelo menos seis vezes, pelo menos sete vezes, pelo menos oito vezes, pelo menos nove vezes, pelo menos dez vezes ou dentro de um intervalo formado a partir desses números inteiros, como 2 a 10 vezes quando comparado ao uso de um vetor de direcionamento por si só.
[00204] Alguns vetores de direcionamento são "vetores de direcionamento grandes" ou "LTVECs", o que inclui vetores de direcionamento que compreendem braços de homologia que correspondem e são derivados de sequências de ácidos nucleicos maiores do que aquelas normalmente usadas por outras abordagens destinadas a realizar recombinação homóloga em células. Um LTVEC pode ter, por exemplo, pelo menos 10kb de comprimento, ou a soma total de um braço de homologia 5' e um braço de homologia 3' pode ter, por exemplo, pelo menos 10kb. LTVECs também incluem vetores de direcionamento compreendendo construtos de ácidos nucleicos maiores do que aqueles tipicamente utilizados por outras abordagens destinadas a realizar recombinação homóloga nas células. Por exemplo, LTVECs tornam possível a modificação de loci grandes que não podem ser acomodados por vetores de direcionamento baseados em plasmídeo tradicionais devido às suas limitações de tamanho. Por exemplo, um locus direcionado pode ser (ou seja, os braços de homologia 5' e 3' podem corresponder a) um locus de uma célula que não é direcionável usando um método convencional ou que pode ser direcionado apenas incorretamente ou apenas com eficiência significativamente baixa na ausência de uma ruptura (nick) ou uma quebra de fita dupla induzidos por um agente de nuclease (por exemplo, uma proteína Cas).
[00205] Em algumas modalidades, os métodos descritos neste documento empregam dois ou três LTVECs que são capazes de recombinar um com o outro e com um locus genômico alvo em um evento de
110 / 308 recombinação de três ou quatro vias. Tais métodos possibilitam a modificação de loci grandes que não pode ser alcançada usando um único LTVEC.
[00206] Exemplos de LTVECs incluem vetores derivados de um cromossomo artificia bacteriano (BAC), um cromossomo artificial humano ou um cromossomo artificial de levedura (YAC). Os LTVECs podem estar em forma linear ou em forma circular. Exemplos de LTVECs e métodos para fabricá-los são descritos, por exemplo, nas Patentes US Nos. 6.586.251,
6.596.541 e No. 7.105.348; e na Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 2002/036789, cada um dos quais é incorporado neste documento por referência na suas totalidades. Animais, células e tecidos não humanos fornecidos
[00207] São fornecidos animais não humanos que expressam (por exemplo, cujas células B expressam) anticorpos que contêm cadeias leves que incluem um domínio Vλ humano resultante da integração de material genético que corresponde a pelo menos uma porção de um locus de cadeia leve de Igλ humana (ou seja, pelo menos uma porção dos segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos) e que codifica um domínio Vλ humano (isto é, uma sequência Vλ-Jλ humana rearranjada) no lugar das sequências correspondentes de região variável de cadeia leve de Igκ não humana no genoma da linhagem germinativa do animal não humano. Exemplos adequados descritos neste documento incluem, mas não estão limitados a, roedores, em particular, camundongos.
[00208] A presente divulgação fornece sistemas in vivo aprimorados para identificar e desenvolver novos anticorpos, componentes de anticorpos (por exemplo, porções de ligação ao antígeno e/ou composições ou formatos que as incluem) e/ou terapias baseadas em anticorpos que podem ser usadas, por exemplo, no tratamento de uma variedade de doenças que afetam seres humanos. Além disso, a presente divulgação também abrange o reconhecimento de que animais não humanos (por exemplo, roedores) que
111 / 308 possuem loci de imunoglobulina manipulados, como loci de cadeia leve de imunoglobulina (Ig) kappa (κ) manipulados e/ou que de outra forma expressam, produzem ou contêm repertórios de anticorpos caracterizados por cadeias leves com regiões V lambda (λ) humanas são úteis. Por exemplo, em algumas modalidades, esses animais não humanos podem ser utilizados para explorar a diversidade de sequências Vλ humanas na identificação e desenvolvimento de novas terapias baseadas em anticorpos. Em algumas modalidades, os animais não humanos descritos neste documento fornecem sistemas in vivo aprimorados para o desenvolvimento de anticorpos e/ou terapias baseadas em anticorpos para administração a seres humanos. Em algumas modalidades, os animais não humanos descritos neste documento fornecem sistemas in vivo aprimorados para o desenvolvimento de anticorpos e/ou terapias baseadas em anticorpos que contêm domínios Vλ humanos caracterizados por desempenho aprimorado (por exemplo, expressão e/ou representação em um repertório de anticorpos específicos para antígenos) em comparação com anticorpos e/ou terapias baseadas em anticorpos obtidos de sistemas in vivo existentes que contêm sequências de região Vλ humanas.
[00209] A presente divulgação fornece, entre outras coisas, um animal não humano que possui um locus de cadeia leve de Igκ que contém uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina manipulada e um gene da região constante de cadeia leve de imunoglobulina manipulada. Conforme descrito neste documento, os animais não humanos fornecidos contêm, em seu genoma da linhagem germinativa, um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ compreendendo uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada caracterizada pela presença de um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, estando os um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e os um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos operacionalmente ligados a um gene (Cλ) da região constante de cadeia leve de imunoglobulina λ, estando o gene
112 / 308 da região constante (Cλ) da cadeia leve de imunoglobulina λ posicionado no lugar de um gene (Cκ) da região constante de cadeia leve de imunoglobulina κ não humana no locus de imunoglobulina κ endógena do animal não humano. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem um locus de cadeia leve de Igκ que contém DNA intergênico que tem origem na cadeia leve de imunoglobulina λ e/ou na cadeia leve de imunoglobulina κ e suas combinações.
[00210] Em muitas modalidades, uma região variável de cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada compreende ainda uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina κ posicionada ou inserida entre os referidos um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos. Em algumas modalidades, a referida sequência de cadeia leve de imunoglobulina κ posicionada ou inserida entre os referidos um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos é ou compreende uma sequência murina (por exemplo, rato ou camundongo). Em algumas modalidades, a referida sequência de cadeia leve de imunoglobulina κ posicionada ou inserida entre os referidos um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos é ou compreende uma sequência humana. Por exemplo, em algumas modalidades, uma sequência de cadeia leve de imunoglobulina κ humana conforme descrita neste documento é ou compreende uma sequência genômica que aparece naturalmente entre um segmento gênico Vκ4-1 humano e um segmento gênico Jκ1 humano de um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ humana.
[00211] Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem pelo menos 5, pelo menos 6, pelo menos 7, pelo menos 8, pelo menos 9, pelo menos 10, pelo menos 11, pelo menos 12, pelo menos 13, pelo menos 14, pelo menos 15, pelo menos 16, pelo menos 17, pelo menos 18, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos
113 / 308 23, pelo menos 24 ou pelo menos 25 segmentos gênicos Vλ humanos funcionais. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem de 5 a 25, 5 a 24, 5 a 23, 5 a 22, 5 a 21, 5 a 20, 5 a 19, 5 a 18, 5 a 17, 5 a 16, 5 a 15, 5 a 14, 5 a 13, 5 a 12, 5 a 11, 5 a 10, 5 a 9, 5 a 8, 5 a 7 ou 5 a 6 segmentos gênicos Vλ humanos funcionais. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem de 6 a 25, 7 a 25, 8 a 25, 9 a 25, 10 a 25, 11 a 25, 12 a 25, 13 a 25, 14 a 25, 15 a 25, 16 a 25, 17 a 25, 18 a 25, 19 a 25, 20 a 25, 21 a 25, 22 a 25, 23 a 25 ou 24 a 25 segmentos gênicos Vλ humanos funcionais. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem de 6 a 24, 7 a 23, 8 a 22, 9 a 21, 10 a 20, 11 a 19, 12 a 18, 13 a 17, 14 a 16 ou 15 a 16 segmentos gênicos Vλ humanos funcionais. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem de 6 a 24, 7 a 23, 8 a 22, 9 a 21, 10 a 20, 11 a 19, 12 a 18, 13 a 17 ou 14 a 16 segmentos gênicos Vλ humanos funcionais.
[00212] Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem de 10 a 70, 10 a 65, 10 a 60, 10 a 55, 10 a 50, 10 a 45, 10 a 40, 10 a 35, 10 a 30, 10 a 25, 10 a 20 ou 10 a 15 segmentos gênicos Vλ humanos funcionais. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem de 15 a 70, 20 a 70, 25 a 70, 30 a 70, 35 a 70, 40 a 70, 45 a 70, 50 a 70, 55 a 70, 60 a 70, ou 65 a 70 segmentos gênicos Vλ humanos funcionais. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem de 15 a 65, 20 a 60, 25 a 55, 20 a 50, 25 a 45, 30 a 40, 30 a 35 ou 35 a 40 segmentos gênicos Vλ humanos funcionais.
[00213] Em algumas modalidades, desde que os animais não humanos fornecidos contenham segmentos gênicos Vλ e/ou Jλ humanos em configuração natural ou de linhagem germinativa (por exemplo, uma sequência de DNA contendo uma pluralidade de sequências codificadoras de segmentos Vλ e/ou Jλ humanos intercaladas com sequência de cadeia leve de imunoglobulina λ não codificante). Em algumas modalidades, desde que os
114 / 308 animais não humanos contenham segmentos gênicos Vλ e/ou Jλ humanos em uma configuração que se afasta ou se desvia de uma configuração natural ou de linhagem germinativa (por exemplo, uma sequência de DNA contendo uma pluralidade de sequências codificadoras de segmentos gênicos Vλ e/ou Jλ humanos intercaladas com a sequência de cadeia leve de imunoglobulina κ não codificante (por exemplo, humana ou murina)). Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos contêm segmentos gênicos Vλ e/ou Jλ humanos em uma configuração que não surge naturalmente em um locus de cadeia leve de imunoglobulina λ humana do genoma da linhagem germinativa de uma célula humana.
[00214] Em algumas modalidades, desde que os animais não humanos contenham uma sequência de DNA em um locus de cadeia leve de Ig κ não humano endógeno que inclua uma pluralidade de sequências codificadoras de Vλ e Jλ humanas intercaladas (ou justapostas, associadas etc.) com a sequência de cadeia leve de imunoglobulina humana não codificante (por exemplo, κ, λ e combinações destas). Em algumas modalidades, desde que os animais não humanos contenham uma sequência de DNA em um locus de cadeia leve de Ig λ não humano endógeno que inclui uma pluralidade de sequências de codificação Vλ e Jλ humanas intercaladas com a sequência de cadeia leve λ de imunoglobulina não humana (por exemplo, murina) não codificante.
[00215] Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos são caracterizados pela expressão de anticorpos de loci de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena no genoma da linhagem germinativa dos referidos animais não humanos, tais anticorpos contendo (1) domínios Vλ e (2) domínios Cλ não humanos ou humanos. Em algumas modalidades, desde que os animais não humanos sejam caracterizados por um uso aprimorado das regiões Vλ humanas de loci de cadeia leve κ de imunoglobulina manipulada (por exemplo, mas não se limitando a, cerca de duas vezes) em comparação
115 / 308 com um ou mais animais não humanos manipulados de referência.
[00216] Em algumas modalidades, é fornecido um animal não humano, uma célula não humana ou um tecido não humano cujo genoma da linhagem germinativa compreende um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena compreendendo: (a) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, (b) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, e (c) um gene Cλ, em que (a) e (b) estão operacionalmente ligados a (c), e em que o roedor não possui um gene Cκ de roedor no locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena.
[00217] Em algumas modalidades, é fornecido um animal não humano, uma célula não humana ou um tecido não humano cujo genoma da linhagem germinativa compreende um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena que compreende a inserção de um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos e um gene Cλ, sendo os segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos operacionalmente ligados ao referido gene Cλ, e sendo o gene Cλ inserido no lugar de um gene Cκ não humano no locus de cadeia leve κ da imunoglobulina endógena. Em muitas modalidades de um animal não humano, uma célula não humana ou um tecido não humano, um gene Cλ inserido no lugar de um gene Cκ não humano em um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena é um gene Cλ não humano ou humano. Em algumas modalidades, um gene Cλ não humano é ou compreende um gene Cλ de mamífero selecionado do grupo que consiste em um gene Cλ de primata, cabra, ovelha, porco, cão, vaca ou roedor.
[00218] Em algumas modalidades, um gene Cλ não humano é ou compreende um gene Cλ de roedor.
[00219] Em algumas modalidades, um gene Cλ de roedor é ou compreende um gene Cλ de camundongo. Em algumas modalidades, um gene Cλ de camundongo compreende uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica a um gene Cλ de camundongo selecionado do grupo que consiste em um Cλ1
116 / 308 de camundongo, um Cλ2 de camundongo e um Cλ3 de camundongo. Em algumas modalidades, um gene Cλ de camundongo compreende uma sequência que é substancialmente idêntica ou idêntica a um gene Cλ de camundongo selecionado do grupo que consiste em um Cλ1 de camundongo, Cλ2 de camundongo e um Cλ3 de camundongo. Em algumas modalidades, um gene Cλ1 de camundongo é ou compreende a SEQ ID NO: 1. Em determinadas modalidades, um gene Cλ2 de camundongo é ou compreende a SEQ ID NO: 3. Em determinadas modalidades, um gene Cλ3 de camundongo é ou compreende a SEQ ID NO: 5. Em determinadas modalidades, um gene Cλ de camundongo compreende uma sequência que é idêntica a um gene Cλ1 de camundongo.
[00220] Em algumas modalidades, um gene Cλ de camundongo compreende uma sequência que é de 80% a 100%, 85% a 100%, 90% a 100%, 95% a 100% ou 98% a 100% idêntica a um gene Cλ de camundongo selecionado do grupo que consiste em um Cλ1 de camundongo, um Cλ2 de camundongo e um Cλ3 de camundongo. Em algumas modalidades, um gene Cλ de camundongo compreende uma sequência que é de 80% a 98%, 80% a 95%, 80% a 90% ou 80% a 85% idêntica a um gene Cλ de camundongo selecionado do grupo que consiste em um Cλ1 de camundongo, Cλ2 de camundongo e um Cλ3 de camundongo. Em algumas modalidades, um gene Cλ de camundongo compreende uma sequência que é de 85% a 98%, 90% a 95% ou 88% a 93% idêntica a um gene Cλ de camundongo selecionado do grupo que consiste em Cλ1 de camundongo, Cλ2 de camundongo e Cλ3 de camundongo.
[00221] Em algumas modalidades, um gene Cλ de roedor é ou compreende um gene Cλ de rato. Em algumas modalidades, um gene Cλ de rato compreende uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica a um gene Cλ de rato selecionado do grupo que consiste em um gene Cλ1 de rato, Cλ2 de
117 / 308 rato, Cλ3 de rato e Cλ4 de rato. Em algumas modalidades, um gene Cλ de rato compreende uma sequência que é substancialmente idêntica ou idêntica a um gene Cλ de rato selecionado do grupo que consiste em um gene Cλ1 de rato, Cλ2 de rato, Cλ3 de rato e Cλ4 de rato. Em determinadas modalidades, um gene Cλ1 de rato é ou compreende a SEQ ID NO: 7. Em determinadas modalidades, um gene Cλ2 de rato é ou compreende a SEQ ID NO: 9. Em determinadas modalidades, um gene Cλ3 de rato é ou compreende a SEQ ID NO: 11. Em determinadas modalidades, um gene Cλ4 de rato é ou compreende a SEQ ID NO: 13.
[00222] Em algumas modalidades, um gene Cλ de rato compreende uma sequência que é de 80% a 100%, 85% a 100%, 90% a 100%, 95% a 100% ou 98% a 100% idêntica a um gene Cλ de rato selecionado do grupo que consiste em um gene Cλ1 de rato, Cλ2 de rato, Cλ3 de rato e Cλ4 de rato. Em algumas modalidades, um gene Cλ de rato compreende uma sequência que é de 80% a 98%, 80% a 95%, 80% a 90% ou 80% a 85% idêntica a um gene Cλ de rato selecionado do grupo que consiste em um gene Cλ1 de rato, Cλ2 de rato, Cλ3 de rato e C λ4 de rato. Em algumas modalidades, um gene Cλ de rato compreende uma sequência que é de 85% a 98%, 90% a 95% ou 88% a 93%, idêntica a um gene Cλ de rato selecionado do grupo que consiste em um gene Cλ1, Cλ2 de rato, Cλ3 de rato e Cλ4 de rato.
[00223] Em algumas modalidades, um gene Cλ humano compreende uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica a um gene Cλ humano selecionado do grupo que consiste em um gene Cλ1 humano, Cλ2 humano, Cλ3, humano, Cλ6 humano e Cλ7 humano. Em algumas modalidades, um gene Cλ humano compreende uma sequência que é substancialmente idêntica ou idêntica a um gene Cλ humano selecionado do grupo que consiste em um gene Cλ humano, Cλ2 humano, Cλ3, humano, Cλ6 humano e Cλ7 humano. Em algumas modalidades, um gene Cλ humano compreende uma sequência
118 / 308 que é idêntica a um gene Cλ humano selecionado do grupo que consiste em um gene Cλ1 humano, Cλ2 humano, Cλ3, humano, Cλ6 humano e Cλ7 humano. Em determinadas modalidades, um gene Cλ1 humano é ou compreende a SEQ ID NO: 15. Em determinadas modalidades, um gene Cλ2 humano é ou compreende a SEQ ID NO: 17. Em determinadas modalidades, um gene Cλ3 humano é ou compreende a SEQ ID NO: 19. Em determinadas modalidades, um gene Cλ6 humano é ou compreende a SEQ ID NO: 21. Em determinadas modalidades, um gene Cλ7 humano é ou compreende a SEQ ID NO: 23. Em determinadas modalidades, um gene Cλ humano é ou compreende um gene Cλ2 humano.
[00224] Em algumas modalidades, um gene Cλ humano compreende uma sequência que é de 80% a 100%, 85% a 100%, 90% a 100%, 95% a 100% ou 98% a 100% idêntica a um gene Cλ humano selecionado do grupo que consiste de um gene Cλ1 humano, Cλ2 humano, Cλ3, humano, Cλ6 humano e Cλ7 humano. Em algumas modalidades, um gene Cλ humano compreende uma sequência que é de 80% a 98%, 80% a 95%, 80% a 90% ou 80% a 85% idêntica a um gene Cλ humano selecionado do grupo que consiste em um gene Cλ1 humano, Cλ2 humano, Cλ3, humano, Cλ6 humano e Cλ7 humano. Em algumas modalidades, um gene Cλ humano compreende uma sequência que é de 85% a 98%, 90% a 95% ou 88% a 93%, idêntica a um gene Cλ humano selecionado do grupo que consiste em um gene Cλ1 humano, Cλ2 humano, Cλ3, humano, Cλ6 humano e Cλ7 humano.
[00225] Em algumas modalidades de um animal não humano fornecido, célula não humana ou tecido não humano, a inserção de um ou mais segmentos gênicos deVλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos substituem segmentos gênicos Vκ e Jκ não humanos no locus da cadeia leve de imunoglobulina κ endógena. Em algumas modalidades, a inserção inclui DNA humano não codificante que aparece naturalmente entre os segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos e suas combinações. Em algumas
119 / 308 modalidades de um animal não humano, célula não humana ou tecido não humano fornecido, a inserção de um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos ficam no lugar ou substituem segmentos gênicos Vκ e Jκ não humanos no locus da cadeia leve de imunoglobulina κ endógena.
Em algumas modalidades de um animal não humano, célula não humana ou tecido não humano fornecido, um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ compreende a inserção de pelo menos 24, pelo menos 34, pelo menos 52, pelo menos 61 ou pelo menos 70 segmentos gênicos Vλ humanos e pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4 ou pelo menos 5 segmentos gênicos Jλ humanos.
Em determinadas modalidades de um animal não humano, célula não humana ou tecido não humano fornecido, um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ compreende a inserção de 39 segmentos gênicos Vλ humanos e pelo menos 5 segmentos gênicos Jλ humanos.
Em algumas modalidades de um animal não humano, célula não humana ou tecido não humano, um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ compreende a inserção de Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6- 57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3- 22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 humanos ou qualquer combinação destes e J Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 humanos ou qualquer combinação destes.
Em algumas modalidades, a inserção inclui DNA não codificante humano que aparece naturalmente adjacente a um Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1- 40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 humano em um locus da cadeia leve λ endógeno e um DNA não codificante humano (completo ou uma parte) que aparece naturalmente adjacente a um Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 humano em um locus da cadeia leve
120 / 308 λ humano endógeno.
Em determinadas modalidades, a inserção inclui DNA humano não codificante que aparece naturalmente adjacente a um Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3- 27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 humano em um locus da cadeia leve λ humano endógeno e DNA não codificante humano que aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 humano em um locus de cadeia leve κ humano.
Em determinadas modalidades, a inserção de Vλ4- 69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3- 27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 humano ou qualquer combinação destes inclui DNA não codificante humano que aparece naturalmente adjacente a um Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1- 40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 humano em um locus da cadeia leve λ humano endógeno e a inserção de Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 humano ou qualquer combinação destes inclui DNA não codificante humano (completo ou parcial) que aparece naturalmente adjacente a um Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 humano em um locus da cadeia leve λ humano endógeno.
Em determinadas modalidades, a inserção de Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1- 36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 humano ou qualquer combinação destes, inclui DNA não codificante humano que aparece naturalmente adjacente a Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-
121 / 308 52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3- 19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 humano em um locus da cadeia leve λ humano endógeno e a inserção de Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 humano ou qualquer combinação destes, inclui DNA humano não codificante (total ou parcial) que aparece naturalmente adjacente a Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4 humano ou Jκ5 em um locus da cadeia leve κ humano endógeno.
[00226] Em algumas modalidades de um animal não humano, célula não humana ou tecido não humano fornecido, um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ, conforme descrito neste documento, compreende ainda uma sequência da cadeia leve de imunoglobulina κ humana entre um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos ou um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos e combinações destes. Em algumas modalidades, uma sequência da cadeia leve de imunoglobulina κ humana, como descrito neste documento, é ou compreende uma sequência genômica que aparece naturalmente entre um segmento gênico Vκ4-1 humano e um segmento gênico Jκ1 humano de um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ humana.
[00227] Em algumas modalidades de um animal não humano fornecido, célula não humana ou tecido não humano, o genoma da linhagem germinativa do referido animal não humano, célula não humana ou tecido não humano compreende ainda um locus da cadeia pesada de imunoglobulina endógena compreendendo inserção de um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos, estes segmentos gênicos VH, DH e JH humanos estão operacionalmente ligados a uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina não humana no locus da cadeia pesada de
122 / 308 imunoglobulina endógena (ver, por exemplo, Patentes US nº 8.502.018,
8.642.835, 8.697.940 e 8.791.323, incorporadas a este documento por referência na sua totalidade).
[00228] Em algumas modalidades, a inserção de um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos estão no lugar de ou substituem, total ou parcialmente, segmentos gênicos VH, DH e JH não humanos (por exemplo, substituir ou substituir posicionalmente sequências de codificação de segmentos gênicos VH, DH e JH não humanos por sequências de codificação de segmentos gênicos VH, DH e JH humanos). Em determinadas modalidades, a inserção inclui DNA humano não codificante que aparece naturalmente entre os segmentos gênicos VH, DH e JH humanos e combinações destes. Em algumas modalidades, uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina não humana é ou compreende uma região constante da cadeia pesada da imunoglobulina não humana endógena. Em muitas modalidades, uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina não humana (por exemplo, endógena) inclui um ou mais genes ou segmentos gênicos de região constante da cadeia pesada de imunoglobulina não humana (por exemplo, IgM, IgD, IgG, IgE, IgA, etc.). Em determinadas modalidades, um locus da cadeia pesada de imunoglobulina como descrito neste documento, compreende a inserção de segmentos gênicos VH humanos VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3- 53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3- 20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1 ou qualquer combinação destes, os segmentos gênicos DH humano DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2- 8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1- 20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27 ou qualquer combinação destes
123 / 308 e os segmentos gênicos JH humano JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 ou qualquer combinação destes. Em determinadas modalidades, a inserção inclui DNA humano não codificante que aparece naturalmente adjacente a um VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1- 58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3- 21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2 ou VH6-1 humano em um locus da cadeia pesada endógeno, DNA humano não codificante que aparece naturalmente adjacente a um DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, ou DH7-27 humano e DNA humano não codificante que aparece naturalmente adjacente a JH1, JH2, JH3, JH4, JH5 ou JH humano em um locus da cadeia pesada endógeno.
[00229] Em algumas modalidades, um animal não humano descrito neste documento inclui um gene Adam6 em seu genoma (por exemplo, seu genoma da linhagem germinativa), que codifica um polipeptídeo ADAM6, um ortólogo funcional, um homólogo funcional ou um fragmento funcional do mesmo (ver, por exemplo, Patentes US nº 8.642.835 e 8.697.940, incorporadas a este documento por referência em sua totalidade). Em algumas modalidades, um polipeptídeo ADAM6, ortólogo funcional, homólogo funcional ou um fragmento funcional do mesmo é expresso a partir de um gene Adam6. Em algumas modalidades, um gene Adam6 não é originário do animal não humano que inclui um gene Adam6 (por exemplo, um camundongo que inclui um gene Adam6 de rato ou um gene Adam6 de camundongo obtido de outra cepa de camundongo). Em algumas modalidades, um animal não humano descrito neste documento inclui um gene ectópico Adam6. Um gene Adam6 "ectópico", como usado neste documento, refere-se a um gene Adam6 que está em um contexto diferente do
124 / 308 que o gene Adam6 aparece em um animal não humano do tipo selvagem. Por exemplo, o gene Adam6 pode estar localizado em um cromossomo diferente, localizado em um locus diferente ou posicionado adjacente a diferentes sequências. Um gene Adam6 ectópico exemplar é um gene Adam6 de camundongo localizado dentro de sequências de imunoglobulina humana (por exemplo, segmentos gênicos de região variável da cadeia pesada humana). Em algumas modalidades, um animal não humano descrito neste documento inclui um gene Adam6 inserido ou integrado.
[00230] Em algumas modalidades, um animal não humano descrito neste documento inclui uma inserção de uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam um ou mais polipeptídeos Adam6 não humanos, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou fragmentos funcionais dos mesmos em seu genoma (por exemplo, seu genoma da linhagem germinativa).
[00231] Em algumas modalidades, um animal não humano descrito neste documento inclui uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6 não humanos, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou fragmentos funcionais destes em seu genoma (por exemplo, seu genoma da linhagem germinativa). Em algumas modalidades, um animal não humano descrito neste documento inclui um gene Adam6a de camundongo e/ou um gene Adam6b de camundongo em seu genoma (por exemplo, em seu genoma da linhagem germinativa). Em algumas modalidades, um animal não humano descrito neste documento inclui uma ou mais sequências nucleotídicas de um ADAM6a de camundongo, ortólogo funcional, homólogo funcional ou fragmento funcional do mesmo e/ou ADAM6b de camundongo, ortólogo funcional, homólogo funcional ou fragmento funcional do mesmo.
[00232] Em algumas modalidades, uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6 não humanos, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou fragmentos funcionais dos
125 / 308 mesmos são inseridos e/ou estão localizados no mesmo cromossomo que o locus da cadeia pesada de imunoglobulina endógena.
Em algumas modalidades, uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6 não humanos, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou fragmentos funcionais destes são inseridas e/ou localizadas em uma posição para que as uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam uma ou mais polipeptídeos ADAM6 não humanos, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais são contíguos aos segmentos gênicos deda região variável da cadeia pesada de imunoglobulina humana.
Em algumas modalidades, uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6 não humanos, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou fragmentos funcionais destes são inseridos e/ou estão localizados em uma posição para que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6 não humanos, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou fragmentos funcionais destes são adjacentes aos segmentos gênicos deda região variável da cadeia pesada de imunoglobulina humana.
Em algumas modalidades, uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6 não humanos, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou fragmentos funcionais destes são inseridas e/ou localizadas em uma posição para que as uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6 não humanos, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais são localizados entre os segmentos gênicos deda região variável da cadeia pesada de imunoglobulina humana.
Em algumas modalidades, uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6 não humanos, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou fragmentos funcionais são inseridos e/ou estão localizados entre um primeiro e um segundo segmento gênicos VH humano.
Em algumas modalidades, um primeiro segmento gênico VH humano
126 / 308 é VH1-2 e um segundo segmento gênico VH humano é VH6-1. Em algumas modalidades, uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6 não humanos, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou fragmentos funcionais são inseridos e/ou estão localizados no lugar de um pseudogene humano Adam6. Em algumas modalidades, uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 não humanos ou seus fragmentos funcionais são inseridos entre um segmento gênico VH humano e um segmento gênico DH humano.
[00233] Em algumas modalidades, um animal não humano descrito neste documento inclui um gene Adam6 que restaura ou potencializa a atividade de ADAM6. Em algumas modalidades, o gene Adam6 restaura a atividade de ADAM6 ao nível de um animal não humano comparável que inclui um gene Adam6 funcional e endógeno. Em algumas modalidades, o gene Adam6 potencializa a atividade de ADAM6 para um nível que seja pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes ou pelo menos 10 vezes a atividade de ADAM6 de um animal não humano comparável que não inclua um gene Adam6 funcional.
[00234] Em algumas modalidades, um animal não humano descrito neste documento inclui um gene Adam6 que restaura ou potencializa a fertilidade em um animal não humano macho. Em algumas modalidades, o gene Adam6 restaura a fertilidade em um animal não humano macho para um nível de um animal não humano comparável que inclui um gene Adam6 funcional e endógeno. Em algumas modalidades, o gene Adam6 restaura a fertilidade em um animal não humano macho, de modo que o número de filhotes produzidos pelo acasalamento do animal não humano macho seja pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 90%, pelo menos 95% o número de filhotes produzidos a partir de um acasalamento comparável de um animal
127 / 308 macho não humano comparável que não inclui um gene Adam6 funcional. Em algumas modalidades, o gene Adam6 potencializa a fertilidade em um animal não humano macho, de modo que o número de filhotes produzidos pelo acasalamento do animal não humano macho inclua pelo menos 2 vezes, pelo menos 3 vezes, pelo menos 4 vezes, pelo menos 5 vezes, pelo menos 6 vezes, pelo menos 7 vezes, pelo menos 8 vezes, pelo menos 9 vezes ou pelo menos 10 vezes o número de filhotes produzidos a partir de um acasalamento comparável de um animal não humano macho comparável que não inclua um gene Adam6 funcional.
[00235] Em algumas modalidades, um locus da cadeia pesada de imunoglobulina não humana, como descrito neste documento, não possui pelo menos um gene Adam6 não humano endógeno. Em algumas modalidades, a falta do pelo menos um gene Adam6 não humano endógeno reduz a atividade de ADAM6 e/ou fertilidade em um camundongo macho que não possui um gene Adam6 não humano endógeno. Em algumas modalidades, um locus da cadeia pesada de imunoglobulina não humana como descrito neste documento inclui uma interrupção de pelo menos um gene Adam6 não humano endógeno. Em algumas modalidades, a interrupção de pelo menos um gene Adam6 não humano endógeno reduz a atividade de ADAM6 e/ou a fertilidade em um camundongo macho que não possui um gene Adam6 não humano endógeno.
[00236] Em algumas modalidades de um animal não humano, célula não humana ou tecido não humano, o animal não humano, célula não humana ou tecido não humano é homozigoto ou heterozigoto para um locus da cadeia pesada de imunoglobulina endógena, como descrito neste documento.
[00237] Em algumas modalidades de um animal não humano, célula não humana ou tecido não humano, o animal não humano, célula não humana ou tecido não humano é homozigoto ou heterozigoto para um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ endógena, como descrito neste documento.
128 / 308
[00238] Em algumas modalidades de um animal não humano, célula não humana ou tecido não humano fornecido, o locus da cadeia leve de imunoglobulina λ endógena é total ou parcialmente deletado. Em algumas modalidades de um animal não humano fornecido, célula não humana ou tecido não humano, o locus da cadeia leve de imunoglobulina λ endógena é funcionalmente silenciado ou não funcional (por exemplo, por direcionamento de genes). Em determinadas modalidades de um animal não humano, célula não humana ou tecido não humano fornecido, o animal não humano, célula não humana ou tecido não humano é homozigoto ou heterozigoto para um locus da cadeia leve de imunoglobulinaλ endógena funcionalmente silenciado ou não funcional, como descrito neste documento.
[00239] Em algumas modalidades, um animal não humano, célula não humana ou tecido não humano, como descrito neste documento, não expressa de forma detectável cadeias leves de imunoglobulina λ endógena, cadeias leves de imunoglobulina κ endógena ou cadeias leves de imunoglobulina λ endógena e cadeias leves de imunoglobulina κ endógena.
[00240] Em algumas modalidades, um animal não humano, célula não humana ou tecido não humano, como descrito neste documento, possui um genoma que compreende ainda uma sequência de ácido nucleico que codifica uma desoxinucleotidiltransferase (TdT) exógena terminal operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional.
[00241] Em algumas modalidades, um elemento de controle transcricional inclui um elemento de controle transcricional de RAG1, um elemento de controle transcricional de RAG2, um elemento de controle transcricional da cadeia pesada de imunoglobulina, um elemento de controle transcricional da cadeia leve de imunoglobulina κ, um elemento de controle transcricional da cadeia leve de imunoglobulina λ ou qualquer combinação destes.
[00242] Em algumas modalidades, uma sequência de ácido nucleico
129 / 308 que codifica uma TdT exógena está localizada em um locus da cadeia leve de imunoglobulinaκ, um locus da cadeia leve de imunoglobulinaλ, um locus da cadeia pesada de imunoglobulina, um locus de RAG1 ou um locus de RAG2.
[00243] Em algumas modalidades, a TdT é uma TdT humana. Em algumas modalidades, a TdT é uma isoforma curta de TdT (TdTS).
[00244] Uma sequência da cadeia leve de Igλ humana, em algumas modalidades, compreende material genético de (por exemplo, isolado ou obtido de) ou idêntico a um locus da cadeia leve de Igλ humana, em que a sequência da cadeia leve de Igλ humana codifica uma cadeia leve de Ig que compreende a porção codificada do material genético do locus da cadeia leve de Igλ humana. Em algumas modalidades, uma sequência da cadeia leve de Igλ humana, como descrito neste documento, compreende pelo menos um segmento gênico Vλ humano e pelo menos um segmento gênico Jλ humano, e uma ou mais sequências necessárias para promover o rearranjo (por exemplo, sequência(s) de sinal de recombinação) de o referido pelo menos um segmento gênico Vλ humano com o referido pelo menos um segmento gênico Jλ humano para formar uma sequência Vλ-Jλ humana rearranjada funcional que codifica um domínio Vλ humano. Em muitas modalidades, uma sequência da cadeia leve de Igλ humana compreende uma pluralidade de segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos e uma ou mais sequências necessárias para promover o rearranjo dos referidos segmentos gênicos Vλ humanos com os referidos segmentos gênicos Jλ humanos. Em muitas modalidades, uma sequência da cadeia leve de Igλ humana compreende pelo menos as sequências de codificação (por exemplo, éxons) de um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e pelo menos as sequências de codificação (por exemplo, éxons) de um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos. Em algumas modalidades, uma sequência da cadeia leve de Igλ humana, como descrita neste documento, é uma sequência genômica de um locus da cadeia leve de Igλ humana (por exemplo, isolado e/ou clonado de um cromossomo artificial
130 / 308 bacteriano) e contém uma pluralidade de segmentos gênicos Vλ humanos na configuração da linhagem germinativa. Em algumas modalidades, uma sequência da cadeia leve de Igλ humana compreende sequências Vλ e Jλ humanas (isto é, segmentos gênicos) na configuração da linhagem germinativa (isto é, uma pluralidade de segmentos gênicos Vλ humanos separados por DNA interveniente que inclui sequências necessárias para e que promovem a recombinação e uma pluralidade de segmentos gênicos de Jλ separados por DNA interveniente que inclui sequências necessárias para e que promovem a recombinação).
[00245] Em algumas modalidades, uma sequência da cadeia leve de Igλ humana, como descrita neste documento, é uma sequência manipulada e contém uma pluralidade de segmentos gênicos Jλ humanos em uma configuração que é diferente daquela que aparece no locus da cadeia leve de Igλ humana em uma célula humana. Em algumas modalidades, uma sequência da cadeia leve de Igλ humana, como descrita neste documento, é uma sequência manipulada e contém uma pluralidade de segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos em uma configuração que se assemelha ou é similar à que aparece em um locus da cadeia leve de Igκ de uma célula de murino do tipo selvagem ou humana. Em algumas modalidades, uma sequência da cadeia leve de Igλ humana compreende sequências Jλ humanas manipuladas (isto é, sequências de codificação de segmentos gênicos Jλ humanos feitas por síntese de DNA de novo que inclui sequências necessárias para e que promovem a recombinação com um ou mais segmentos gênicos Vλ humano). Em algumas modalidades, uma sequência da cadeia leve de Igλ humana compreende sequências de Igκ e Igλ que naturalmente aparecem separadamente nas sequências genômicas de Igκ e Igλ, respectivamente. Em determinadas modalidades, uma sequência da cadeia leve de Igλ humana compreende uma sequência de Igκ, em particular, uma região Jκ (isto é, uma sequência que contém sequências de codificação e não codificação que aparecem em uma
131 / 308 região que contém uma pluralidade de segmentos gênicos Jκ), que aparece naturalmente em um locus da cadeia leve de Igκ, exceto que a referida sequência de Igκ contém sequências de codificação dos segmentos gênicos deJλ e Jλ 12RSS no lugar das sequências de codificação correspondentes dos segmentos gênicos Jκ e Jκ 23RSS, respectivamente. Em determinadas modalidades, uma sequência da cadeia leve de Igλ humana compreende uma pluralidade de segmentos gênicos deJλ e Jλ 12RSS no lugar de segmentos gênicos Jκ e Jκ 23RSS de uma sequência da região Jκ. Em várias modalidades, o DNA interveniente (ou intergênico) que inclui sequências necessárias para e que promovem a recombinação inclui Igκ humana e/ou sequência(s) genômica(s) de Igλ humana. Alternativamente, e em algumas modalidades, o DNA interveniente (ou intergênico) que inclui sequências necessárias para e que promovem a recombinação inclui sequência(s) genômica(s) de Igκ e/ou Igλ de murino.
[00246] Em determinadas modalidades, uma sequência da cadeia leve de Igλ humana é ou compreende uma sequência que aparece no Desenho. Em algumas modalidades, uma sequência da cadeia leve de Igλ humana codifica ou é capaz de codificar (por exemplo, após rearranjo de segmentos gênicos humanos), um polipeptídeo do domínio Vλ, cujo polipeptídeo do domínio Vλ aparece em uma imunoglobulina, em particular uma imunoglobulina que é expressa por uma célula B humana. Animais não humanos, embriões, células e construtos de direcionamento para produzir animais não humanos, embriões não humanos e células que contêm a referida sequência da cadeia leve de Igλ humana no lugar de uma sequência da cadeia leve de Igκ não humana correspondente (por exemplo, um locus da cadeia leve de Igκ endógena de roedor) também são fornecidos.
[00247] Em algumas modalidades, uma sequência da cadeia leve de Igλ humana é inserida no lugar de uma sequência da cadeia leve de Igκ não humana correspondente dentro do genoma da linhagem germinativa de um
132 / 308 animal não humano. Em algumas modalidades, uma sequência da cadeia leve de Igλ humana é inserida a montante de uma sequência da cadeia leve de Igλ não humana (por exemplo, uma sequência de genes da região constante da cadeia leve de Igλ não humana), cuja sequência da cadeia leve de Igλ não humana é posicionada no lugar de uma sequência da cadeia leve de Igκ não humana (por exemplo, uma sequência de gene da região constante da cadeia leve de Igκ não humana). Em algumas modalidades, uma sequência da cadeia leve de Igκ humana é inserida no meio da referida sequência da cadeia leve de Igλ humana (ou seja, entre os segmentos gênicos deVλ e Jλ humanos), de modo que a referida sequência da cadeia leve de Igκ humana seja justaposta por sequências da cadeia leve de Igλ humanas.
[00248] Em algumas modalidades, toda ou substancialmente toda a região variável de um locus da cadeia leve de Igκ não humana é substituída por uma ou mais sequências da cadeia leve de Igλ humana (como descrito neste documento) e as referidas uma ou mais sequências da cadeia leve de Igλ humana estão operacionalmente ligadas a um gene da região constante da cadeia leve de Igλ não humana ou humana. Em algumas modalidades, um gene da região constante da cadeia leve de Igκ não humana é deletado ou substituído em um animal não humano que inclui uma sequência da cadeia leve de Igλ humana, como descrito neste documento. Em um exemplo não limitativo, no caso de uma inserção de uma sequência da cadeia leve de Igλ humana que é inserida em um locus da cadeia leve de Igκ não humano, a referida inserção é feita de maneira a manter a integridade de regiões da cadeia leve potencializadoras de Igκ não humana (ou sequências potencializadoras) próximas ao ponto de inserção (por exemplo, um potencializador intrônico de Igκ não humana e/ou um potencializador de Igκ 3' não humana). Assim, esses animais não humanos têm regiões da cadeia leve potencializadoras de Igκ do tipo selvagem (ou sequências potencializadoras) operacionalmente ligadas a sequências da cadeia leve de
133 / 308 Igλ humana e não humana (por exemplo, segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos e uma região Cλ não humana) ou operacionalmente ligado a sequências da cadeia leve de Igλ humana (por exemplo, segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos e um gene da região Cλ humana). Em algumas modalidades, um locus da cadeia leve de Igκ não humana que é alterado, deslocado, interrompido, deletado, substituído ou manipulado por uma ou mais sequências da cadeia leve de Igλ humana, como descrito neste documento, é um locus da cadeia leve de Igκ de murino. Em algumas modalidades, uma ou mais sequências da cadeias leves de Igλ humana, como descrito neste documento, são inseridas em uma cópia (ou seja, alelo) de um locus da cadeia leve de Igκ não humana das duas cópias do referido locus da cadeia leve de Igκ não humana, dando origem a um animal não humano que é heterozigoto em relação à sequência da cadeia leve de Igκ humana. Em algumas modalidades de um animal não humano que é heterozigoto em relação à sequência da cadeia leve de Igκ humana, o animal não humano inclui uma ou mais sequências da cadeia leve de Igκ humana inseridas na outra cópia (ou seja, alelo) do locus da cadeia leve de Igκ não humana. Em algumas modalidades, é fornecido um animal não humano que é homozigoto para um locus da cadeia leve de Igκ que inclui uma ou mais sequências da cadeia leve de Igλ humana, como descrito neste documento.
[00249] Em algumas modalidades, um locus da cadeia leve de Igκ não humana manipulado, como descrito neste documento, compreende segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos operacionalmente ligados a um gene da região constante da cadeia leve de Igλ não humana ou humana, em que a referida região constante da cadeia leve de Igλ não humana ou humana o gene da região está localizado no lugar de um gene da região constante da cadeia leve de Igκ não humana que aparece em um locus da cadeia leve de Igκ do tipo selvagem de um animal não humano da mesma espécie.
[00250] Em algumas modalidades, uma ou mais sequências da cadeia
134 / 308 leve de Igλ não humana endógena (ou porções das mesmas) de um locus da cadeia leve de Igλ não humana endógena não são deletadas. Em algumas modalidades, uma ou mais sequências da cadeia leve de Igλ não humana endógena (ou porções das mesmas) de um locus da cadeia leve de Igλ não humana endógena são excluídas. Em algumas modalidades, uma ou mais sequências da cadeia leve de Igλ não humana endógena (por exemplo, V, J e/ou C ou qualquer combinação destas) de um locus da cadeia leve de Igλ não humana endógena é alterada, deslocada, interrompida, deletada ou substituída de modo que o referido locus da cadeia leve de Igλ não humana seja funcionalmente silenciado. Em algumas modalidades, uma ou mais sequências endógenas da cadeia leve de Igλ não humana (por exemplo, V, J e/ou C ou qualquer combinação delas) de um locus da cadeia leve de Igλ não humana endógena é alterada, deslocada, interrompida, deletada ou substituída por um vetor de direcionamento de modo que o referido locus da cadeia leve de Igλ não humana seja funcionalmente inativado (isto é, seja incapaz de produzir uma cadeia leve funcional de um anticorpo que é expresso e/ou detectável no repertório de anticorpos do animal não humano). Orientações para a inativação de um locus da cadeia leve de Igλ não humana endógena são fornecidas na, por exemplo, Patente US nº 9.006.511 (ver, por exemplo, a Figura 2), que é incorporada a este documento por referência em sua totalidade.
[00251] Em algumas modalidades, um animal não humano contém um locus da cadeia leve de Igκ manipulada como descrito neste documento que é aleatoriamente integrado ao seu genoma (por exemplo, como parte de uma sequência da cadeia leve de Igλ humana integrada aleatoriamente). Assim, esses animais não humanos podem ser descritos como tendo um transgene da cadeia leve de Igλ humana contendo uma pluralidade de segmentos gênicos de Vλ e Jλ humanos operacionalmente ligados a um gene da região constante da cadeia leve de Igλ não humana ou humana e regiões da cadeia leve
135 / 308 potencializadoras de Igκ não humana (ou sequências potencializadoras), de modo que os referidos segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos sejam capazes de rearranjar e codificar uma cadeia leve de Ig de um anticorpo no repertório expresso do animal não humano, cuja cadeia leve de Ig inclui um domínio Vλ humano e um domínio Cλ não humano ou cuja cadeia leve de Ig inclui domínios Vλ e Cλ humanos. Um locus ou transgene da cadeia leve de Igκ manipulada, como descrito neste documento, pode ser detectado usando uma variedade de métodos, incluindo, por exemplo, PCR, Western blot, Southern blot, polimorfismo no comprimento de fragmentos de restrição (RFLP) ou um ensaio de ganho ou perda de alelo. Em algumas modalidades, um animal não humano, como descrito neste documento, é heterozigoto em relação a um locus da cadeia leve de Igκ manipulada, como descrito neste documento. Em algumas modalidades, um animal não humano, como descrito neste documento, é hemizigótico em relação a um locus da cadeia leve de Igκ manipulada, como descrito neste documento. Em algumas modalidades, um animal não humano, como descrito neste documento, contém uma ou mais cópias de um locus ou transgene da cadeia leve de Igκ manipulada, como descrito neste documento. Em algumas modalidades, um animal não humano, como descrito neste documento, contém um locus da cadeia leve de Igκ, como representado no Desenho.
[00252] A presente divulgação reconhece que um animal não humano, como descrito neste documento, utilizará segmentos gênicos de região variável da cadeia pesada, cadeia leve λ e cadeia leve κ humanos incluídos em seu genoma em seus mecanismos de seleção e geração de anticorpos (por exemplo, recombinação e hipermutação somática). Como tal, em várias modalidades, os domínios variáveis da cadeia pesada, cadeia leve λ e cadeia leve κ de imunoglobulina humana gerados por animais não humanos descritos neste documento são codificados pelos segmentos gênicos de região variável da cadeia leve λ, pesada e cadeia leve κ humanos incluídos em seu
136 / 308 genoma ou variantes somaticamente hipermutadas destes, respectivamente.
[00253] Em algumas modalidades, é fornecido um animal não humano cujo genoma compreende um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada, em que o animal não humano inclui uma célula B que inclui uma sequência de região variável pesada humana, uma sequência de região variável da cadeia leve λ humana e/ou uma sequência de região variável da cadeia leve κ humana que é somaticamente hipermutada. Em algumas modalidades, uma sequência de região variável pesada humana, uma cadeia leve λ humana e/ou uma sequência de região variável da cadeia leve κ humana presente em uma célula B de um camundongo da presente divulgação tem 1, 2, 3, 4, 5 ou mais hipermutações somáticas. Aqueles versados na técnica conhecem os métodos para identificar segmentos gênicos de origem em uma sequência de anticorpos maduros. Por exemplo, várias ferramentas estão disponíveis para auxiliar nessa análise, como, por exemplo, DNAPLOT, IMGT/V-QUEST, JOINSOLVER, SoDA e Ab-origin.
[00254] A presente divulgação fornece, entre outros, células e tecidos de animais não humanos descritos neste documento. Em algumas modalidades, são fornecidos esplenócitos (e/ou outro tecido linfóide) de um animal não humano, como descrito neste documento. Em algumas modalidades, é fornecida uma célula B de um animal não humano, como descrito neste documento. Em algumas modalidades, é fornecida uma célula pro-B de um animal não humano, como descrito neste documento. Em algumas modalidades, é fornecida uma célula pré-B de um animal não humano, como descrito neste documento. Em algumas modalidades, é fornecida uma célula B imatura de um animal não humano, como descrito neste documento. Em algumas modalidades, é fornecida uma célula B madura não exposta de um animal não humano, como descrito neste documento. Em algumas modalidades, é fornecida uma célula B ativada de um animal não humano, como descrito neste documento. Em algumas modalidades, é
137 / 308 fornecida uma célula B de memória de um animal não humano, como descrito neste documento. Em algumas modalidades, é fornecida um linfócito da linhagem B de um animal não humano, como descrito neste documento. Em algumas modalidades, é fornecido plasma ou uma célula de plasma de um animal não humano, como descrito neste documento. Em algumas modalidades, é fornecida uma célula-tronco de um animal não humano, como descrito neste documento. Em algumas modalidades, uma célula-tronco é uma célula-tronco embrionária. Em algumas modalidades, é fornecida uma célula germinativa de um animal não humano, como descrito neste documento. Em algumas modalidades, uma célula germinativa é um oócito. Em algumas modalidades, uma célula germinativa é uma célula espermática. Em algumas modalidades, uma célula espermática de um animal não humano, como descrito neste documento, expressa um ou mais polipeptídeos ADAM6, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou fragmentos funcionais destes. Em algumas modalidades, qualquer célula ou tecido de um animal não humano, como descrito neste documento, pode ser isolado. Em algumas modalidades, é fornecida uma célula isolada e/ou um tecido isolado de um animal não humano, como descrito neste documento. Em algumas modalidades, é fornecido um hibridoma, em que o hibridoma é feito com uma célula B de um animal não humano, como descrito neste documento. Em algumas modalidades, um hibridoma é feito com uma célula B de um animal não humano que foi imunizado com um antígeno de interesse. Em algumas modalidades, um hibridoma é feito com uma célula B de um animal não humano que expressa um anticorpo que se liga (por exemplo, se liga especificamente) a um epítopo em um antígeno de interesse.
[00255] Qualquer um dos animais não humanos, como descrito neste documento, pode ser imunizado com um ou mais antígenos de interesse sob condições e por um tempo suficiente para que o animal não humano desenvolva uma resposta imune aos referidos um ou mais antígenos de
138 / 308 interesse. Aqueles versados na técnica conhecem os métodos para imunizar animais não humanos. Um método exemplificativo e não limitante para imunizar animais não humanos pode ser encontrado em US 2007/0280945A1, incorporada a este documento por referência em sua totalidade.
[00256] A presente divulgação fornece, entre outros, animais não humanos imunizados, como descrito neste documento, e células e tecidos isolados dos mesmos. Em algumas modalidades, um animal não humano descrito neste documento produz uma população de células B em resposta à imunização com um antígeno que inclui um ou mais epítopos. Em algumas modalidades, um animal não humano produz uma população de células B que expressam anticorpos que se ligam (por exemplo, se ligam especificamente) a um ou mais epítopos do antígeno de interesse. Em algumas modalidades, os anticorpos expressos por uma população de células B produzidas em resposta a um antígeno incluem uma cadeia pesada com um domínio variável da cadeia pesada humana codificado por uma sequência de região variável da cadeia pesada humana e/ou uma cadeia leve lambda com um domínio variável da cadeia leve lambda humana codificado por uma sequência de região variável da cadeia leve lambda humana conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, anticorpos expressos por uma população de células B produzidas em resposta a um antígeno incluem: (i) uma cadeia pesada com um domínio variável da cadeia pesada humana codificado por uma sequência de região variável da cadeia pesada humana, (ii) uma cadeia leve lambda com um domínio variável da cadeia leve lambda humana codificado por uma sequência de região variável da cadeia leve lambda humana conforme descrito neste documento, (iii) uma cadeia leve kappa com um domínio variável da cadeia leve kappa humana codificado por uma sequência de região variável da cadeia leve kappa humana conforme descrito neste documento ou (iv) qualquer combinação destas.
[00257] Em algumas modalidades, um animal não humano produz uma
139 / 308 população de células B que expressam anticorpos que se ligam a um ou mais epítopos de antígeno de interesse, em que os anticorpos expressos pela população de células B produzidas em resposta a um antígeno incluem: (i) uma cadeia pesada com um domínio variável da cadeia pesada humana codificado por uma sequência de região variável da cadeia pesada humana, (ii) uma cadeia leve lambda com um domínio variável da cadeia leve lambda humana codificado por uma sequência de região variável da cadeia leve lambda humana conforme descrito neste documento, (iii) uma cadeia leve kappa com um domínio variável da cadeia leve kappa humana codificado por uma sequência de região variável da cadeia leve kappa humana conforme descrito neste documento ou (iv) qualquer combinação destas. Em algumas modalidades, uma sequência de região variável da cadeia pesada humana, uma sequência de região variável da cadeia leve λ humana e/ou uma sequência de região variável da cadeia leve κ humana, conforme descrito neste documento, é somaticamente hipermutado. Em algumas modalidades, pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% das células B em uma população de células B produzidas em resposta a um antígeno incluem uma sequência de região variável da cadeia pesada humana, uma sequência de região variável da cadeia leve λ humana e/ou uma sequência de região variável da cadeia leve κ humana que é somaticamente hipermutada.
[00258] Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos neste documento, em seu genoma de linhagem germinativa, (1) incluem um locus da cadeia leve de imunoglobulinaκ endógena manipulada que compreende (a) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, (b) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, e (c) um gene Cλ, em que um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos estão operacionalmente ligados ao gene Cλ, (2) não possuem um gene Cκ de roedor no locus de imunoglobulina κ endógena manipulada e (3) incluem um
140 / 308 locus da cadeia leve da imunoglobulinaκ endógena manipulada, compreendendo (a) um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos, (b) um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos e (c) um gene Cκ, em que um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos estão operacionalmente ligados ao gene Cκ.
Em algumas modalidades, a porcentagem de cadeias leves em esplenócitos (por exemplo, como detectada ou observada, por exemplo, por citometria de fluxo (ver, por exemplo, o Exemplo 3)) desses animais não humanos que são cadeias leves λ é de pelo menos 35%, pelo menos 40%, pelo menos 45%, pelo menos 50%, pelo menos 55%, pelo menos 60%, pelo menos 65%, pelo menos 70% ou pelo menos 75%. Em algumas modalidades, a porcentagem da cadeias leves em esplenócitos (por exemplo, como detectada ou observada, por exemplo, por citometria de fluxo (ver, por exemplo, o Exemplo 3)) desses animais não humanos que são cadeias leves λ está entre 35-80%, entre 35-75%, entre 40- 80%, entre 40-75%, entre 50-80%, entre 50-75%, entre 55-80%, entre 55- 75%, entre 60-80%, ou entre 60-75%. Em algumas modalidades, a porcentagem da cadeias leves em esplenócitos (por exemplo, como detectada ou observada, por exemplo, por citometria de fluxo (ver, por exemplo, o Exemplo 3)) desses animais não humanos que são cadeias leves κ é de no máximo 65%, no máximo 60%, no máximo 55%, no máximo 50%, no máximo 45%, no máximo 40% ou no máximo 35%. Em algumas modalidades, a porcentagem da cadeias leves em esplenócitos (por exemplo, como detectada ou observada, por exemplo, por citometria de fluxo (ver, por exemplo, o Exemplo 3)) desses animais não humanos que são κ cadeias leves está entre 20-65%, entre 25-65%, entre 20-60%, entre 25-60%, entre 20-55%, entre 25-55%, entre 20-50%, entre 25-50%, entre 20-45%, entre 25 -45%, entre 20-40% ou entre 25-40%. Em algumas modalidades, a razão de κ: cadeias leves λ em esplenócitos (por exemplo, como detectado ou observado, por exemplo, por citometria de fluxo (ver, por exemplo, o Exemplo 3)) de tais
141 / 308 animais não humanos está entre 0,5:1 e 3:1, 0,65:1 e 3:1, entre 0,8:1 e 3:1, entre 1:1 e 3:1, entre 1,2:1 e 3:1, entre 1:1 e 2,3:1, entre 1,1:1 e 1,8:1, entre 1,2:1 e 2,3:1 ou entre 1,2:1 e 1,8:1. Métodos de criação dos animais não humanos fornecidos
[00259] Composições e métodos para criação de animais não humanos cujo genoma de linhagem germinativa compreende um locus da cadeia leve de Igκ manipulada que inclui uma ou mais sequências da cadeia leve de Igλ humanas (por exemplo, segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos) no lugar de sequências da cadeia leve de Igκ não humanas, incluindo sequências de codificação da cadeia leve de Igλ humana que incluem formas polimórficas específicas dos segmentos Vλ e Jλ humanos (por exemplo, alelos ou variantes V e/ou J específicos) são fornecidas, incluindo composições e métodos para criar animais não humanos que expressam anticorpos que compreendem cadeias leves de Igλ que contêm regiões variáveis humanas e regiões constantes não humanas ou humanas, montadas a partir de um locus da cadeia leve de Igκ que contém segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos operacionalmente ligados a um gene de região constante da cadeia leve de Igλ não humana ou humana, cujo gene de região constante da cadeia leve de Igλ humana ou humana está localizado no lugar de um gene de região constante da cadeia leve de Igκ não humana que normalmente aparece em um locus da cadeia leve de Igκ não humana do tipo selvagem. Em algumas modalidades, também são fornecidas composições e métodos para produzir animais não humanos que expressam tais anticorpos sob o controle do(s) intensificador(es) de Igκ endógena e/ou da(s) sequência(s) reguladora(s) de Igκ endógena. Em algumas modalidades, também são fornecidos composições e métodos para criar animais não humanos que expressam tais anticorpos sob o controle do(s) potencializador(es) heterólogo(s) de Igκ e/ou da(s) sequência(s) reguladora(s) heteróloga(s) de Igκ.
[00260] Os métodos descritos neste documento incluem a inserção de
142 / 308 sequências Vλ e Jλ humanas que codificam domínios Vλ humanos a montante de um gene da região constante da cadeia leve de Igλ não humana ou humana (por exemplo, um gene da região Cλ de murino ou humano), cujo gene de região constante da cadeia leve de Igλ não humana ou humana está localizado no lugar de um gene de região constante da cadeia leve de Igκ não humana que normalmente aparece em um locus da cadeia leve de Igκ não humana do tipo selvagem, de modo que um anticorpo seja expresso, anticorpo caracterizado pela presença de uma cadeia leve que contém um domínio Vλ humano e um domínio Cλ não humano (por exemplo, um domínio Cλ de roedor) ou pela presença de uma cadeia leve que contém domínios Vλ humanos e Cλ não humanos (por exemplo, um ou mais domínios Cλ de roedor) e é expresso na superfície das células B e no soro sanguíneo de um animal não humano.
[00261] Em algumas modalidades, os métodos incluem a inserção de material genético que contém segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos em um locus da cadeia leve de Igκ (por exemplo, um locus da cadeia leve de Igκ do tipo selvagem, modificada ou manipulada). Em determinadas modalidades, os métodos incluem a inserção de material genético que contém segmentos gênicos Jλ humanos em um locus da cadeia leve de Igκ de uma cepa modificada ou manipulada. Em algumas modalidades, o material genético que contém sequências da cadeia leve de Igλ humana pode ser manipulado ou genômico (por exemplo, clonado a partir de um cromossomo bacteriano artificial). Em algumas modalidades, o material genético que contém sequências da cadeia leve de Igλ humana pode ser projetado a partir de fontes publicadas e/ou cromossomos bacterianos artificiais, de modo que o referido material genético contenha segmentos Vλ e Jλ humanos em uma orientação diferente da que aparece em um locus da cadeia leve de Igλ humana, porém, o referido material genético ainda contém sequências para apoiar o rearranjo dos referidos segmentos Vλ e Jλ humanos para codificar um domínio Vλ
143 / 308 humano funcional de uma cadeia leve de Ig. Para dar apenas um exemplo, o material genético correspondente a uma pluralidade de segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos pode ser projetado usando a orientação fornecida neste documento para construir uma sequência da cadeia leve de Igλ humana que contém segmentos Vλ e Jλ humanos em uma ordem e/ou arranjo que seja diferente do que aparece no locus da cadeia leve de Igλ humana de uma célula humana (por exemplo, um arranjo que se assemelha ou é semelhante a um locus da cadeia leve de Igκ humana ou de roedor, como, por exemplo, uma série de segmentos gênicos V, seguidos 3' por DNA interveniente, seguidos 3' por uma série de segmentos gênicos J). Nesse exemplo, o conteúdo genético dos segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos seria equivalente aos segmentos correspondentes em uma célula humana; no entanto, a ordem e o arranjo seriam diferentes. Ao construir um locus da cadeia leve de Igκ manipulada para gerar um animal não humano, como descrito neste documento, as sequências de sinal de recombinação necessárias podem ser configuradas de modo que os segmentos gênicos V e J humanos possam reorganizar e formar corretamente um domínio Vλ humano funcional. As orientações para a configuração da linhagem germinativa dos segmentos e sequências dos genes Vλ e Jλ humanos necessários para a recombinação adequada podem ser encontradas em, por exemplo, Molecular Biology of B Cells, Londres: Elsevier Academic Press, 2004, Ed. Honjo, T., Alt, FW, Neuberger, M. Capítulos 4 (pp. 37-59) e 5 (61-82); incorporados a este documento por referência em sua totalidade.
[00262] Em algumas modalidades, os métodos incluem múltiplas inserções em um único clone de célula ES. Em algumas modalidades, os métodos incluem inserções sequenciais feitas em sucessivos clones de células ES. Em algumas modalidades, os métodos incluem uma única inserção feita em um clone de célula ES manipulada.
[00263] Em algumas modalidades, os métodos incluem inserções de
144 / 308 DNA a montante de um gene Cλ1 de murino (ou um gene Cλ2 humano) para que a(s) referida(s) inserção(ões) de DNA estejam operacionalmente ligadas ao gene Cλ1 de murino (ou ao gene Cλ2 humano), cuja(s) inserção(ões) de DNA compreendem segmentos gênicos deVλ, Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 humanos ou qualquer combinação destes e segmentos gênicos Jλ, Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes e cujo gene Cλ1 de murino (ou o gene Cλ2 humano) está localizado no lugar de um gene Cκ de murino de um locus da cadeia leve de Igκ endógena.
[00264] Em algumas modalidades, os métodos incluem inserção(ões) de DNA a jusante de um segmento gênico Vλ3-1 humano e a montante de uma região potencializadora intrônica de Igκ não humana (ou sequência potencializadora) de um locus da cadeia leve de Igκ manipulada, de modo que a(s) referida(s) inserção(ões) de DNA está(ão) operacionalmente ligada(s) a um gene Cλ1 de murino (ou gene Cλ2 humano), cuja(s) inserção(ões) de DNA compreende(m) uma sequência genômica de Igκ humana que aparece naturalmente entre um segmento gênico Vκ4-1 humano e um segmento gênico Jκ1 humano de um locus da cadeia leve de Igκ humana e um ou mais segmentos gênicos Jλ humano (por exemplo, um, dois, três, quatro, cinco, seis ou sete), cujo gene Cλ1 de murino (ou gene Cλ2 humano) está localizado no lugar de um gene Cκ de murino de um locus da cadeia leve de Igκ não humana endógena. Em determinadas modalidades, os métodos incluem inserção(ões) de DNA entre um segmento gênico Vλ3-1 humano e um potencializador intrônico de Igκ não humana, cuja(s) inserção(ões) de DNA inclui(em) uma sequência de VκJκ humano que aparece naturalmente entre os segmentos gênicos Vκ4-1 e Jκ1 humanos de um locus da cadeia leve de Igκ humana e cinco segmentos gênicos Jλ humano (por exemplo, Jλ1, Jλ2, Jλ3,
145 / 308 Jλ6 e Jλ7). Em várias modalidades, a(s) inserção(ões) de DNA, incluindo segmentos gênicos de Jλ humano, compreende DNA genômico Jκ humano com sequências de codificação dos segmentos gênicos Jλ humanos e Jλ 12RSS humanos.
[00265] A inserção de segmentos Vλ e Jλ humanos adicionais pode ser feita usando os métodos descritos neste documento para suplementar adicionalmente a diversidade de um locus da cadeia leve de Igλ manipulada. Por exemplo, em algumas modalidades, os métodos podem incluir a inserção de cerca de 270kb de DNA a montante de um gene Cλ1 de murino (ou gene Cλ2 humano) de um locus da cadeia leve de Igκ manipulada, de modo que o referido DNA esteja operacionalmente ligado ao referido gene Cλ1 de murino (ou ao gene Cλ2 humano), cujo DNA inclui os segmentos gênicos Vλ humano, Vλ10-54, Vλ6-57, Vλ4-60, Vλ8-61e Vλ4-69. Nestas modalidades, o referido DNA é inserido a montante de um segmento gênico Vλ5-52 humano que está operacionalmente ligado a um gene Cλ1 de murino (ou gene Cλ2 humano) de um locus da cadeia leve de Igκ manipulada, cujo DNA inclui os segmentos gênicos Vλ humanos, Vλ10-54, Vλ6-57, Vλ4-60, Vλ8- 61 e Vλ4-69. Em determinadas modalidades, o referido DNA inclui um gene VpreB humano. segmentos gênicos Vλ humanos adicionais descritos acima podem ser clonados diretamente a partir de clones de BAC disponíveis comercialmente e dispostos em fragmentos de DNA menores, utilizando as técnicas recombinantes descritas neste documento ou de outro modo conhecidas na técnica. Alternativamente, segmentos gênicos Vλ humanos adicionais descritos acima podem ser sintetizados como um fragmento de DNA manipulado e adicionados a um locus da cadeia leve de Igκ manipulada, como descrito acima, usando técnicas de biologia molecular conhecidas na técnica. Da mesma forma, segmentos gênicos Jλ humanos adicionais podem ser obtidos a partir de clones de BAC disponíveis no mercado ou sintetizados diretamente a partir de sequências publicadas. Uma ilustração exemplar que
146 / 308 mostra um locus da cadeia leve de Igκ manipulada de animais não humanos, como descrito neste documento, é apresentada na Figura 2B ou 4B.
[00266] Quando apropriado, uma sequência da cadeia leve de Igλ humana (isto é, uma sequência contendo segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos) que codificam um domínio Vλ humano pode ser modificada separadamente para incluir códons que são otimizados para expressão em um animal não humano (por exemplo, ver as Patentes US nº 5.670.356 e
5.874.304). As sequências otimizadas por códon são sequências manipuladas e, de preferência, codificam o polipeptídeo idêntico (ou um fragmento biologicamente ativo de um polipeptídeo completo que possui substancialmente a mesma atividade que o polipeptídeo completo) codificado pelo polinucleotídeo de origem otimizado sem códon. Em algumas modalidades, uma sequência da cadeia leve de Igλ humana que codifica um domínio Vλ humano pode incluir separadamente uma sequência alterada para otimizar o uso de códons para um tipo de célula específico (por exemplo, uma célula de roedor). Por exemplo, os códons de cada sequência nucleotídica a serem inseridos no genoma de um animal não humano (por exemplo, um roedor) podem ser otimizados para expressão em uma célula do animal não humano. Essa sequência pode ser descrita como uma sequência otimizada por códon.
[00267] A inserção de sequências nucleotídicas que codificam domínios Vλ humanos emprega uma modificação mínima do genoma da linhagem germinativa de um animal não humano, conforme descrito neste documento, e resulta na expressão de anticorpos que compreendem cadeias leves com domínios Vλ humanos, cujos domínios Vλ humanos são expressos a partir de loci da cadeia leve de Igκ manipulada endógena. Os métodos para gerar animais não humanos manipulados, incluindo inativação e knock-ins, são conhecidos na técnica (ver, por exemplo, Gene Targeting: A Practical Approach, Joyner, ed., Oxford University Press, Inc., 2000; incorporado a
147 / 308 este documento por referência em sua totalidade). Por exemplo, a geração de roedores geneticamente modificados pode opcionalmente envolver a interrupção dos loci genéticos de um ou mais genes de roedor endógenos (ou segmentos gênicos) e a introdução de um ou mais genes heterólogos (ou segmentos gênicos ou sequências nucleotídicas) no genoma do roedor, em algumas modalidades, no mesmo local que um gene de roedor endógeno (ou segmentos gênicos). Em algumas modalidades, sequências nucleotídicas que codificam domínios Vλ humanos são introduzidas a montante de um gene da região constante da cadeia leve de Igλ humana ou de murino ou de um transgene da cadeia leve manipulado inserido aleatoriamente no genoma da linhagem germinativa de um roedor. Em algumas modalidades, as sequências nucleotídicas que codificam os domínios Vλ humanos são introduzidas a montante de um gene da região constante da cadeia leve de Igλ de murino ou humana de um locus da cadeia leve de Igκ endógena no genoma da linhagem germinativa de um roedor; em determinadas modalidades, um locus da cadeia leve de Igκ endógena é alterado, modificado ou manipulado para conter segmentos gênicos de Igλ humana (por exemplo, V e J humanos) ligados operacionalmente a um gene Cλ1 de camundongo ou operacionalmente ligados a um gene Cλ2 humano.
[00268] Ilustrações esquemáticas (não em escala) de métodos exemplares para a construção de um locus da cadeia leve de Igκ manipulada, como descrito neste documento, são fornecidas nas Figuras 1A, 1B, 2A, 2B, 3, 4A e 4B. Em particular, as Figuras 1A e 1B apresentam uma estratégia exemplar para construção de um locus da cadeia leve de Igκ manipulada, caracterizado pela inserção de sequências nucleotídicas contendo uma pluralidade de segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos. Como ilustrado nas Figuras 1A e 1B, um fragmento de DNA que contém uma região intergênica Vκ-Jκ humana (ver Patente US nº 9.006.511, 9.012.717, 9.029.628,
9.035.128, 9.066.502, 9.150.662 e 9.163.092) e um fragmento manipulado
148 / 308 contendo um conjunto de segmentos gênicos Jλ humanos (por exemplo, Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 e Jλ7 humanos) está operacionalmente ligado a uma região potencializadora intrônica de Igκ de roedor (ou sequência potencializadora) através de uma série de etapas que utilizam várias técnicas de biologia molecular descritas no Exemplo 1. Este fragmento manipulado também é manipulado para conter uma região constante da cadeia leve de Igλ de roedor que está operacionalmente ligada aos segmentos gênicos Jλ humanos. Cassetes de seleção (por exemplo, Neomicina e Higromicina) estão incluídos no vetor de direcionamento para permitir a seleção de clones positivos em células bacterianas e de mamíferos (por exemplo, células-tronco embrionárias). Como ilustrado, um gene de resistência à neomicina é flanqueado por sítios de recombinação específicos do sítio lox2372 (lox) e posicionado entre a região de Vκ-Jκ humano e o conjunto de segmentos gênicos Jλ humanos, enquanto o cassete de seleção de higromicina é flanqueado por sítios de recombinação específicos do sítio loxP e posicionado a 3' do gene da região constante da cadeia leve de Igλ de roedor (mCλ1). O fragmento de DNA é então combinado a um fragmento de DNA contendo um potencializador a 3' da cadeia leve de Igκ de roedor para criar o vetor de direcionamento final (Figura 1B). O vetor de direcionamento resultante (construto G) é linearizado e eletroporado em células-tronco embrionárias de roedor (ES) para criar um roedor cujo genoma de linhagem germinativa compreende o locus da cadeia leve de Igκ manipulada. Como descrito na seção de exemplo abaixo, as células ES de roedor empregadas na eletroporação do vetor de direcionamento continham um locus da cadeia leve de Igκ manipulada como descrito anteriormente nas Patentes US nº
9.006.511, 9.012.717, 9.029.628, 9.035.128, 9.066.502, 9.150.662 e
9.163.092; incorporada a este documento por referência em sua totalidade. A recombinação homóloga com o vetor de direcionamento, como mostrado na Figura 3, resulta em um locus da cadeia leve de Igκ manipulada, caracterizado
149 / 308 por uma pluralidade de segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos operacionalmente ligados a um gene Cλ1 de murino, cujo gene Cλ1 de murino está localizado no lugar de um gene Cκ de murino que aparece naturalmente em um locus da cadeia leve de Igκ do tipo selvagem. Os segmentos gênicos Jλ humanos são manipulados de maneira única em uma sequência que aparece naturalmente em uma região Jκ humana genômica, mas que possui sequências de codificação de Jλ humanao e 12RSS associado no lugar das sequências de codificação de Jκ humano e 23RSS associado. Os clones de células ES de roedores positivos são confirmados usando métodos de triagem descritos neste documento e/ou conhecidos na técnica. Qualquer cassete de seleção restante pode ser excluído conforme desejado por meio de deleção mediada por recombinase (ver o Exemplo 2).
[00269] Alternativamente, um gene Cλ humano pode ser empregado em um vetor de direcionamento em vez de um gene Cλ de camundongo. Para dar apenas um exemplo, a Figura 3 ilustra um vetor de direcionamento que foi construído de maneira semelhante à descrita acima, exceto que uma sequência que codifica um gene Cλ2 humano foi modificada no vetor de direcionamento e em ligação operável com cinco segmentos gênicos Jλ humanos. O uso de tal abordagem fornece um benefício adicional no desenvolvimento de terapêuticas de anticorpos humanos, pois o DNA que codifica as regiões variáveis e constantes das cadeias leves pode ser isolado em conjunto, eliminando assim qualquer etapa de clonagem subsequente para vincular a uma região constante da cadeia leve humana para a preparação de anticorpos totalmente humanos.
[00270] Os vetores de direcionamento para a construção de um locus da cadeia leve de Igκ manipulada, como descrito neste documento, podem ser incorporados no genoma de linhagem germinativa de uma célula não humana (por exemplo, uma célula-tronco embrionária de roedor). Em algumas modalidades, os vetores de direcionamento descritos neste documento são
150 / 308 incorporados a um locus da cadeia leve de Igκ do tipo selvagem no genoma de linhagem germinativa de uma célula não humana que contém ainda o DNA genômico de VH, DH e JH humanos (por exemplo, contendo uma pluralidade de segmentos gênicos VH, DH e JH humanos) operacionalmente ligados a um ou mais genes de região constante da cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, ver as Patentes U.S., Nºs. 8.502.018, 8.642.835, 8.697.940 e
8.791.323, incorporadas a este documento por referência em sua totalidade). Em algumas modalidades, os vetores de direcionamento descritos neste documento são incorporados a um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ modificada ou manipulada no genoma da linhagem germinativa de uma célula não humana que contém ainda DNA genômico humano de VH, DH e JH (por exemplo, contendo uma pluralidade de segmentos gênicos deVH, DH e JH humanos) operacionalmente ligados a um ou mais genes de região constante da cadeia pesada de imunoglobulina (por exemplo, ver as Patentes US nº
8.502.018, 8.642.835, 8.697.940, 8.791.323, 9.006.511, 9.012.717, 9.029.628,
9.035.128, 9.066.502, 9.150.662 e 9.163.092 incorporadas a este documento por referência em sua totalidade).
[00271] Um vetor de direcionamento é introduzido nas células-tronco embrionárias de roedor (por exemplo, camundongo) por eletroporação, de modo que a sequência contida no vetor de direcionamento resulta na capacidade de uma célula não humana ou animal não humano (por exemplo, um camundongo) que expressa anticorpos possuindo cadeias leves que incluem domínios Vλ humanos e domínios Cλ não humanos ou humanos e cujas cadeias leves são expressas a partir de um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada endógena. Como descrito neste documento, um roedor geneticamente modificado é gerado quando um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada foi criado no genoma de linhagem germinativa do roedor (por exemplo, um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ endógena contendo uma sequência da cadeia leve de Igλ humana (isto é, uma
151 / 308 pluralidade de segmentos gênicos Vλ e Jλ) operacionalmente ligados a um gene Cλ de roedor ou humano no lugar de um gene Cκ endógeno de roedor). Os anticorpos são expressos na superfície das células B de roedor e no soro do referido roedor, cujos anticorpos são caracterizados por cadeias leves com domínios Vλ humanos e domínios Cλ não humanos ou humanos. Quando um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ endógena no genoma de linhagem germinativa de roedor não é alvo do vetor de direcionamento, um transgene da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada é preferencialmente inserido em um local diferente do de um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ endógena de roedor (por exemplo, transgene inserido aleatoriamente).
[00272] A criação de um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada em um animal não humano, como descrito acima, fornece uma cepa de roedor manipulada que produz anticorpos que incluem cadeias leves de imunoglobulina λ expressas a partir de um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada com um domínio Vλ humano e um domínio Cλ não humano ou humano. Aproveitando a presença de um locus da cadeia pesada de imunoglobulina manipulada que inclui uma pluralidade de segmentos gênicos deVH, DH e JH humanos operacionalmente ligados a genes de região constante da cadeia pesada de imunoglobulina, é criada uma cepa de roedor manipulada que produz anticorpos e componentes de anticorpos para o desenvolvimento de terapia baseada em anticorpos humanos. Assim, é criada uma cepa de roedor manipulada única que tem a capacidade de fornecer um sistema in vivo alternativo para explorar domínios Vλ humanos para o desenvolvimento de novos medicamentos à base de anticorpos para tratar doenças humanas.
[00273] Em algumas modalidades, é fornecido um método para criar um animal não humano cujo genoma de linhagem germinativa compreende um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ endógena modificado, o método compreendendo (a) a introdução de um fragmento de DNA em uma
152 / 308 célula-tronco embrionária não humana, o referido fragmento de DNA compreendendo uma sequência nucleotídica que inclui (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos e (iii) um gene Cλ (por exemplo, não humano ou humano), em que (i) - (iii) estão operacionalmente ligados e em que a sequência nucleotídica compreende ainda uma sequência da cadeia leve de imunoglobulina k entre (i) e (ii), (b) obtenção da célula-tronco embrionária não humana gerada em (a); e (c) criar um roedor usando a célula-tronco embrionária de roedor de (b).
[00274] Em algumas modalidades, é fornecido um método para criar um animal não humano cujo genoma de linhagem germinativa compreende um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ endógena modificado, o método compreendendo (a) a introdução de um fragmento de DNA em uma célula-tronco embrionária não humana, o referido fragmento de DNA compreendendo uma sequência nucleotídica que inclui um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, um ou mais potencializadores da cadeia leve de imunoglobulina κ não humana e um gene Cλ não humano ou humano, em que segmentos gênicos Jλ humanos estão operacionalmente ligados ao referido um ou mais potencializadores da cadeia leve de imunoglobulina κ não humana e o referido gene Cλ não humano ou humano, (b) obter a célula- tronco embrionária não humana gerada em (a); e (c) criar um roedor usando a célula-tronco embrionária de roedor de (b).
[00275] Em algumas modalidades, um método para criar um animal não humano cujo genoma de linhagem germinativa compreende um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, este locus da cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende a inserção de um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos e um gene Cλ não humano ou humano, estes segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos estão operacionalmente ligados ao referido gene Cλ não humano ou humano fornecido e este gene Cλ não humano ou humano é
153 / 308 inserido no lugar de um gene Cκ não humano no locus de imunoglobulina κ endógena, o método compreendendo a modificação do genoma de linhagem germinativa de um animal não humano, de modo que compreenda um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada que inclui a inserção de um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos e um gene Cλ não humano ou humano, estes segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos estão operacionalmente ligados ao referido gene Cλ não humano ou humano e que o gene Cλ não humano ou humano é inserido no lugar de um gene Cκ não humano no locus de imunoglobulina κ endógena.
[00276] Em algumas modalidades de um método para criar um animal não humano, um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos incluem pelo menos 24, pelo menos 34, pelo menos 52, pelo menos 61 ou pelo menos 70 segmentos gênicos de Vλ humanos. Em algumas modalidades de um método para criar um animal não humano, um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos incluem 39 segmentos gênicos Vλ humanos. Em determinadas modalidades de um método para criar um animal não humano, um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos incluem Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3- 22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 humanos ou qualquer combinação destes. Em determinadas modalidades, um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos incluem DNA humano não codificante que aparece naturalmente adjacente aos segmentos gênicos Vλ humanos relevantes em um locus da cadeia leve λ humano endógeno.
[00277] Em algumas modalidades de um método para criar um animal não humano, um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos incluem pelo menos 1, pelo menos 2, pelo menos 3, pelo menos 4 ou pelo menos 5 segmentos
154 / 308 gênicos Jλ humanos. Em algumas modalidades de um método para criar um animal não humano, um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos incluem 5 segmentos gênicos Jλ humanos. Em algumas modalidades de um método para criar um animal não humano, um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 humano ou qualquer combinação destes. Em determinadas modalidades, um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos incluem DNA humano não codificante, total ou parcial, que aparece naturalmente adjacente aos segmentos gênicos Jλ humanos relevantes em um locus da cadeia leve λ humano endógeno. Em algumas modalidades, um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos incluem DNA humano não codificante que aparece naturalmente adjacente a um Jκ1-Jκ5 em um locus da cadeia leve κ humano endógeno.
[00278] Em algumas modalidades de um método para criar um animal não humano, um fragmento de DNA inclui DNA intergênico que contém DNA de imunoglobulina não codificante (por exemplo, DNA que aparece naturalmente entre a sequência de codificação de dois segmentos gênicos dV, um segmento gênico V e J ou entre dois segmentos gênicos J). Em muitas modalidades, o referido DNA de imunoglobulina não codificante é o DNA da cadeia leve de imunoglobulina não codificante (por exemplo, humano ou de murino). Em algumas modalidades, o DNA da cadeia leve da imunoglobulina não codificante é o DNA da cadeia leve de imunoglobulina κ, DNA da cadeia leve de imunoglobulina λ ou combinações destes.
[00279] Em algumas modalidades de um método para criar um animal não humano, um fragmento de DNA compreende ainda um ou mais marcadores de seleção. Em algumas modalidades de um método para criar um animal não humano, um fragmento de DNA compreende ainda um ou mais sítios de recombinação específicos do sítio. Em determinadas modalidades de um método para criar um animal não humano, um fragmento de DNA compreende ainda um ou mais conjuntos de sítios de recombinação
155 / 308 específicos do sítio que se recombinam com a mesma recombinase. Em determinadas modalidades de um método para criar um animal não humano, um fragmento de DNA compreende ainda um ou mais conjuntos de sítios de recombinação específicos do sítio que se recombinam com diferentes recombinases.
[00280] Em determinadas modalidades de um método para criar um animal não humano, um fragmento de DNA compreende uma sequência manipulada que inclui a sequência da cadeia leve de imunoglobulina κ e a sequência da cadeia leve de imunoglobulina λ juntas em uma sequência contínua. Em algumas modalidades de um método para criar um animal não humano, um fragmento de DNA compreende uma sequência manipulada que inclui a sequência da cadeia leve de imunoglobulina κ e a sequência da cadeia leve de imunoglobulina λ juntas em uma única sequência, porém interrompida por uma sequência não de imunoglobulina (por exemplo, uma sequência de sinal de recombinação, um gene de resistência e combinações destes). Em determinadas modalidades de um método para criar um animal não humano, uma sequência manipulada inclui porções de uma região Jκ e porções de uma região Jλ. Em algumas modalidades, uma sequência manipulada inclui porções de uma região Jκ humana e porções de uma região Jλ humana. Em determinadas modalidades, porções de uma região Jκ humana incluem sequências não codificantes de uma região Jκ humana que aparecem naturalmente em um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ humana de uma célula humana. Em determinadas modalidades, porções de uma região Jλ humana incluem sequências de codificação e sequências de sinal de recombinação (RSS) de um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos. Em determinadas modalidades de um método de produção de um animal não humano, um fragmento de DNA compreende uma sequência manipulada que é caracterizada, em algumas modalidades, pela presença de sequências de codificação e sequências de sinais de recombinação (RSS) de um ou mais
156 / 308 segmentos gênicos Jλ humanos que substituem ou substituem posicionalmente (isto é, são posicionados no lugar de) as sequências de codificação correspondentes e as sequências de sinal de recombinação (RSS) dos segmentos gênicos Jκ humanos, de modo que as referidas sequências de codificação e sequências de sinais de recombinação (RSS) do referido um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos estão dentro de, adjacentes a, contíguos ou justapostos pelas referidas sequências não codificantes dos referidos um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos.
[00281] Em algumas modalidades de um método para criar um animal não humano, um fragmento de DNA é introduzido em uma célula-tronco embrionária não humana cujo genoma de linhagem germinativa compreende um ou mais loci de imunoglobulina manipulada (por exemplo, cadeia pesada de imunoglobulina, cadeia leve de imunoglobulina κ, cadeia leve de imunoglobulina λ e combinações destes). Em determinadas modalidades, os loci de imunoglobulina manipulada são loci endógenos de imunoglobulina manipulada.
[00282] Em algumas modalidades de um método para criar um animal não humano, um fragmento de DNA é introduzido em uma célula-tronco embrionária não humana cujo genoma de linhagem germinativa compreende um locus da cadeia pesada de imunoglobulina endógena que compreende a inserção de um ou mais segmentos gênicos de VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos, cujos segmentos gênicos VH, DH e JH humanos estão operacionalmente ligados a uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina não humana.
[00283] Em algumas modalidades de um método de produção de um animal não humano, um fragmento de DNA é introduzido em uma célula- tronco embrionária não humana cujo genoma de linhagem germinativa compreende um locus da cadeia leve de imunoglobulina κendógena que
157 / 308 compreende a inserção de um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, os segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos são operacionalmente ligados a um gene de região constante da cadeia leve de imunoglobulina κ não humana. Em determinadas modalidades de um método de produção de um animal não humano, um fragmento de DNA é introduzido em uma célula-tronco embrionária não humana cujo genoma da linhagem germinativa compreende um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ endógena que compreende a inserção de um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais Jλ humanos e uma sequência da cadeia leve de imunoglobulina κ humana posicionada, colocada ou localizada entre os referidos um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e os referidos um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, os segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos estão operacionalmente ligados a um gene de região constante da cadeia leve da imunoglobulina κ não humana.
[00284] Em algumas modalidades de um método de produção de um animal não humano, a modificação do genoma da linha germinativa de um animal não humano para que compreenda um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada é realizada em uma célula-tronco embrionária não humana cujo genoma de linhagem germinativa compreende um locus da cadeia pesada de imunoglobulina endógena que compreende a inserção de um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos, os segmentos gênicos VH, DH e JH humanos estão operacionalmente ligados a uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina não humana.
[00285] Em algumas modalidades de um método para criar um animal não humano, a modificação do genoma de linhagem germinativa de um animal não humano para que compreenda um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada é realizada em uma célula-tronco embrionária não humana cujo genoma de linhagem germinativa compreende um locus da
158 / 308 cadeia leve de imunoglobulina κ endógena compreendendo a inserção de um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos Jλ humanos, os segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos estão operacionalmente ligados a um gene de região constante da cadeia leve de imunoglobulina κ não humana. Em algumas modalidades de um método para criar um animal não humano, a modificação do genoma da linhagem germinativa de um animal não humano para que compreenda um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada é realizada em uma célula-tronco embrionária não humana cujo genoma de linhagem germinativa compreende um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ endógena que compreende a inserção de um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos e uma sequência da cadeia leve de imunoglobulina κ humana posicionada, colocada ou localizada entre os referidos um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e o referido um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, os segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos estão operacionalmente ligados a um gene de região constante da cadeia leve de imunoglobulina κ não humana.
[00286] Em algumas modalidades de um método para criar um animal não humano, a inserção de um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos inclui DNA humano não codificante que aparece naturalmente adjacente aos segmentos gênicos VH humanos, DNA humano não codificante que aparece naturalmente adjacente aos segmentos gênicos DH humanos e DNA humano não codificante que aparece naturalmente adjacente aos segmentos gênicos JH humanos em um locus de imunoglobulina humana endógena.
[00287] Em algumas modalidades, é fornecido um animal não humano criado, gerado, produzido, obtido ou que pode ser obtido a partir de um método descrito neste documento.
[00288] Em algumas modalidades, o genoma de um animal não
159 / 308 humano, como descrito neste documento, compreende ainda uma ou mais regiões variáveis pesadas de imunoglobulina humana, como descrito nas Patentes US nº 8.502.018, 8.642.835, 8.697.940 e 8.791.323, incorporadas a este documento por referência em sua totalidade. Alternativamente, um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada, conforme descrito neste documento, pode ser manipulado em uma célula-tronco embrionária de uma cepa modificada diferente, como, por exemplo, uma cepa VELOCIMMUNE (ver, por exemplo, as Patentes US nº 8.502.018 e/ou
8.642.835; incorporadas a este documento por referência em sua totalidade). A homozigosidade do locus da cadeia leve de Igκ manipulada, como descrito neste documento, pode ser alcançada posteriormente por reprodução. Alternativamente, no caso de um transgene da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada inserida aleatoriamente (descrito acima), as cepas de roedores podem ser selecionadas com base em, entre outras coisas, expressão de domínios Vλ humanos do transgene. Em algumas modalidades, um camundongo VELOCIMMUNE pode ser um camundongo VELOCIMMUNE® 1 (VI-1), que inclui dezoito segmentos gênicos VH, todos os segmentos gênicos DH humanos e todos os segmentos gênicos JH. Um camundongo VI-1 também pode incluir dezesseis segmentos gênicos Vκ humanos e todos os segmentos gênicos Jκ humanos. Em algumas modalidades, um camundongo VELOCIMMUNE pode ser um camundongo VELOCIMMUNE® 2 (VI-2), que inclui trinta e nove segmentos gênicos VH humanos, todos os segmentos gênicos DH humanos e todos os segmentos gênicos JH. Um camundongo VI-2 também pode incluir trinta segmentos gênicos Vκ humanos e todos os segmentos gênicos Jκ humanos. Em algumas modalidades, um camundongo VELOCIMMUNE pode ser um camundongo VELOCIMMUNE® 3 (VI-3), que inclui oitenta segmentos gênicos VH humanos, todos os segmentos gênicos DH humanos e todos os segmentos gênicos JH. Um camundongo VI-3 também pode incluir quarenta segmentos
160 / 308 gênicos Vκ humanos e todos os segmentos gênicos Jκ humanos.
[00289] Alternativamente e/ou adicionalmente, em algumas modalidades, o genoma de linhagem germinativa de um animal não humano, como descrito neste documento, compreende ainda um locus da cadeia leve de imunoglobulina λ endógena deletada, inativada, silenciada funcionalmente ou não funcional. Modificações genéticas para deletar ou fazer com que um gene ou locus genético se torne não funcional podem ser feitas usando os métodos descritos neste documento e/ou métodos conhecidos na técnica.
[00290] Um animal não humano fundador geneticamente modificado pode ser identificado com base na presença de um locus da cadeia leve de Igκ manipulada em seu genoma de linhagem germinativa e/ou expressão de anticorpos com um domínio Vλ humano e um domínio Cλ não humano ou humano em tecidos ou células do animal não humano. Um animal não humano fundador geneticamente modificado pode então ser usado para reproduzir animais não humanos adicionais que carregam o locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada, criando assim uma coorte de animais não humanos cada um carregando uma ou mais cópias de um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada. Além disso, animais não humanos geneticamente modificados que transportam um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada, conforme descrito neste documento, podem ainda ser reproduzidos para criar outros animais não humanos geneticamente modificados que transportam outros transgenes (por exemplo, genes de imunoglobulina humana) ou loci de imunoglobulinas manipuladas, conforme desejado.
[00291] Animais não humanos geneticamente modificados também podem ser produzidos para conter sistemas selecionados que permitem a expressão regulada, direcionada, induzível e/ou específica para o tipo de célula do transgene ou sequência(s) integrada(s). Por exemplo, animais não humanos, como descrito neste documento, podem ser manipulados para
161 / 308 conter uma ou mais sequências que codificam um domínio Vλ humano de um anticorpo que é/são expressas condicionalmente (por exemplo, revisado em Rajewski, K. et al., 1996, J. Clin. Invest. 98(3):600-3, incorporado a este documento por referência em sua totalidade). Sistemas exemplares incluem o sistema de recombinase Cre /loxP do bacteriófago P1 (ver, por exemplo, Lakso, M. et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:6232-6, incorporado a este documento por referência na sua totalidade) e o sistema de recombinase FLP/Frt de S. cerevisiae (O'Gorman, S. et al., 1991, Science 251: 1351-5, incorporado a este documento por referência em sua totalidade). Esses animais podem ser fornecidos através da construção de animais geneticamente modificados "duplos", por exemplo, acasalando dois animais geneticamente modificados, um contendo um transgene compreendendo uma modificação selecionada (por exemplo, um locus da cadeia leve de Igκ manipulada como descrito neste documento) e o outro contendo um transgene que codifica uma recombinase (por exemplo, uma recombinase de Cre).
[00292] Animais não humanos, como descrito neste documento, podem ser preparados como descrito acima ou usando métodos conhecidos na técnica, para compreender genes adicionais humanos, humanizados ou modificados de outra forma por engenharia genética, frequentemente dependendo do uso pretendido do animal não humano. O material genético desses genes humanos, humanizados ou manipulados de outra forma pode ser introduzido por meio de alterações adicionais no genoma das células (por exemplo, células-tronco embrionárias) com as modificações ou alterações genéticas descritas acima ou por meio de técnicas de reprodução conhecidas na técnica com outras cepas geneticamente modificadas ou manipuladas, conforme desejado. Em algumas modalidades, os animais não humanos, como descrito neste documento, são preparados para compreender ainda genes ou segmentos gênicos da cadeia leve de IgH e/ou Igκ humana (ver, por exemplo, Murphy, AJ et al., (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5153-5158;
162 / 308 Patente US nº 8.502.018, 8.642.835, 8.697.940 e 8.791.323; Patente US nº
8.791.323; e Publicação de Pedido de Patente US nº 2013/0096287 A1; incorporadas a este documento por referência em sua totalidade).
[00293] Em algumas modalidades, animais não humanos, como descrito neste documento, podem ser preparados através da introdução de um vetor de direcionamento descrito neste documento em uma célula a partir de uma cepa modificada ou manipulada. Por exemplo, um vetor de direcionamento, como descrito neste documento, pode ser introduzido em um camundongo VELOCIMMUNE. Camundongos VELOCIMMUNE expressam anticorpos que possuem regiões variáveis totalmente humanas e regiões constantes de camundongo. Em outro exemplo, um vetor de direcionamento, como descrito neste documento, pode ser introduzido em um camundongo manipulado como descrito em qualquer uma das Patentes US nº
9.006.511, 9.012.717, 9.029.628, 9.035.128, 9.066.502, 9.150.662 e
9.163.092, incorporadas a este documento por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, animais não humanos, como descrito neste documento, são preparados para compreender ainda genes de imunoglobulina humana (genes de região variável e/ou constante). Em algumas modalidades, os animais não humanos, como descrito neste documento, compreendem um locus da cadeia leve de Igκ manipulada como descrito neste documento e material genético de uma espécie heteróloga (por exemplo, humanos), em que o material genético codifica, no todo ou em parte, uma ou mais regiões variáveis da cadeia leve e/ou pesada de Igκ humana.
[00294] Por exemplo, como descrito neste documento, animais não humanos que compreendem um locus da cadeia leve de Igκ manipulada, como descrito neste documento, podem compreender ainda (por exemplo, através de cruzamento ou estratégias de direcionamento de múltiplos genes) uma ou mais modificações, conforme descrito em Murphy, AJ et al., (2014) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5153-8; Macdonald, L.E. et al., 2014,
163 / 308 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 111(14):5147-52; Patente US nº 8.502.018,
8.642.835, 8.697.940 e 8.791.323; incorporados a este documento por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, um roedor compreendendo um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada, como descrito neste documento, é cruzado para um roedor compreendendo um locus de região variável da cadeia pesada de imunoglobulina humanizada e/ou da cadeia leve de imunoglobulina κ (ver, por exemplo, Patentes US nº
8.502.018, 8.642.835, 8.697.940 e/ou 8.791.323; incorporadas a este documento por referência em sua totalidade). Em algumas modalidades, um roedor compreendendo um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada, como descrito neste documento, é cruzado para um roedor compreendendo um locus de região variável da cadeia pesada de imunoglobulina humanizada (ver, por exemplo, Patentes US nº 8.502.018,
8.642.835, 8.697.940 e/ou 8.791.323; incorporadas a este documento por referência) e um locus da cadeia leve de imunoglobulina λ endógena inativado (ver, por exemplo, Patentes US nº 9.006.511, 9.012.717, 9.029.628,
9.035.128, 9.066.502, 9.150.662 e 9.163.092, incorporadas a este documento por referência em sua totalidade).
[00295] Embora modalidades quem descrevem a construção de um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada em um camundongo (isto é, um camundongo com um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada caracterizado pela presença de uma pluralidade de segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos operacionalmente ligados a um gene Cλ de camundongo ou humano, em que o gene Cλ de camundongo ou humano está localizado no lugar de um gene Cκ de camundongo, de modo que os anticorpos contendo domínios Vλ humanos e domínios Cλ de camundongo ou humano sejam expressos) são extensivamente discutidos neste documento, outros animais não humanos que compreendem um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada também são fornecidos. Esses animais não
164 / 308 humanos incluem qualquer um que possa ser geneticamente modificado para expressar anticorpos, como descrito neste documento, incluindo, por exemplo, mamíferos, por exemplo, camundongo, rato, coelho, porco, bovino (por exemplo, vaca, touro, búfalo), veado, ovelha, cabra, galinha, gato, cachorro, furão, primata (por exemplo, sagui, macaco-rhesus), etc. Por exemplo, para os animais não humanos para os quais células ES geneticamente modificáveis adequadas não estão prontamente disponíveis, outros métodos são empregados para criar um animal não humano compreendendo a modificação genética. Tais métodos incluem, por exemplo, modificar um genoma de células não ES (por exemplo, um fibroblasto ou uma célula pluripotente induzida) e empregar transferência nuclear de células somáticas (SCNT) para transferir o genoma geneticamente modificado para uma célula adequada, por exemplo, um oócito enucleado, e gestar a célula modificada (por exemplo, o oócito modificado) em um animal não humano em condições adequadas para formar um embrião.
[00296] Os métodos para modificar o genoma de linhagem germinativa de um animal não humano (por exemplo, genoma de porco, vaca, roedor, galinha etc.) incluem, por exemplo, usar uma nuclease de dedo de zinco (ZFN), uma nuclease efetora do tipo ativador de transcrição (TALEN) ou uma proteína Cas (isto é, um sistema CRISPR/Cas) para incluir um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada, conforme descrito neste documento. As orientações para os métodos de modificação do genoma de linhagem germinativa de um animal não humano podem ser encontradas, por exemplo, nos Pedidos de Patente nº 14/747.461 (depositado em 23 de junho de 2015), 14/948,221 (depositado em 20 de novembro de 2015) e 14/974.623 (depositado em 18 de dezembro de 2015); incorporados a este documento por referência em sua totalidade.
[00297] Em algumas modalidades, um animal não humano, como descrito neste documento, é um mamífero. Em algumas modalidades, um
165 / 308 animal não humano, como descrito neste documento, é um mamífero pequeno, por exemplo, da superfamília Dipodoidea ou Muroidea. Em algumas modalidades, um animal geneticamente modificado, como descrito neste documento, é um roedor. Em algumas modalidades, um roedor, como descrito neste documento, é selecionado a partir de um camundongo, um rato e um hamster. Em algumas modalidades, um roedor, como descrito neste documento, é selecionado da superfamília Muroidea. Em algumas modalidades, um animal geneticamente modificado, como descrito neste documento, é de uma família selecionada de Calomyscidae (por exemplo, hamsters semelhantes a camundongos), Cricetidae (por exemplo, hamster, ratos e camundongos do Novo Mundo, ratazanas), Muridae (camundongos e ratos verdadeiros, gerbilos, Acomys, Lophiomys imhausi), Nesomyidae (ratos-da-árvore, camundongos da rocha, ratos gigantes de cauda branca, hypogeomys antimena), Platacanthomyidae (por exemplo, Platacanthomys lasiurus) e Spalacidae (por exemplo, rato-toupeira-pelado, ratos de bambu e Eospalax fontanierii). Em algumas modalidades, um roedor geneticamente modificado, como descrito neste documento, é selecionado a partir de um camundongo ou rato verdadeiro (família Muridae), um gerbilo, um acomys e um lophiomys imhausi. Em determinadas modalidades, um camundongo geneticamente modificado como descrito neste documento é de um membro da família Muridae. Em algumas modalidades, um animal não humano como descrito neste documento é um roedor. Em determinadas modalidades, um roedor, como descrito neste documento, é selecionado a partir de um camundongo e um rato. Em algumas modalidades, um animal não humano, como descrito neste documento, é um camundongo.
[00298] Em algumas modalidades, um animal não humano, como descrito neste documento, é um roedor que é um camundongo de uma cepa C57BL selecionada dentre C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10,
166 / 308 C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr e C57BL/Ola. Em determinadas modalidades, um camundongo, como descrito neste documento, é uma cepa 129 selecionada do grupo que consiste em uma cepa que é 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (por exemplo, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129/SvJae, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (ver, por exemplo, Festing et al., 1999, Mammalian Genome 10: 836; Auerbach, W. et al., 2000, Biotechniques 29(5):1024-1028, 1030, 1032, cada um dos quais é incorporado a este documento por referência em sua totalidade). Em determinadas modalidades, um camundongo geneticamente modificado, como descrito neste documento, é uma mistura de uma cepa 129 mencionada acima e uma cepa C57BL/6 mencionada acima. Em determinadas modalidades, um camundongo, como descrito neste documento, é uma mistura das cepas 129 mencionadas acima, ou uma mistura das cepas BL/6 mencionadas acima. Em determinadas modalidades, uma cepa 129 da mistura, como descrito neste documento, é uma cepa 129S6 (129/SvEvTac). Em algumas modalidades, um camundongo como descrito neste documento é uma cepa BALB, por exemplo, cepa BALB/c. Em algumas modalidades, um camundongo, como descrito neste documento, é uma mistura de uma cepa BALB e outra cepa mencionada acima.
[00299] Em algumas modalidades, um animal não humano, como descrito neste documento, é um rato. Em determinadas modalidades, um rato como descrito neste documento é selecionado a partir de um rato Wistar, uma cepa LEA, uma cepa Sprague Dawley, uma cepa Fischer, F344, F6 e Dark Agouti. Em determinadas modalidades, uma cepa de rato, como descrito neste documento, é uma mistura de duas ou mais cepas selecionadas do grupo que consiste em Wistar, LEA, Sprague Dawley, Fischer, F344, F6 e Dark Agouti.
[00300] Uma célula pluripotente e/ou totipotente de rato pode ser de qualquer cepa de rato, incluindo, por exemplo, uma cepa de rato ACI (uma cepa endogâmica originalmente derivada das cepas August e Copenhagen),
167 / 308 uma cepa de rato Dark Agouti (DA), uma cepa de rato Wistar, uma cepa de rato LEA, uma cepa de rato Sprague Dawley (SD) ou uma cepa de rato Fischer, como Fisher F344 ou Fisher F6. Células de rato pluripotentes e/ou totipotentes também podem ser obtidos de uma cepa derivada de uma mistura de duas ou mais cepas citadas acima. Por exemplo, a célula pluripotente e/ou totipotente de rato pode ser de uma cepa DA ou de uma cepa ACI. A cepa de rato ACI é caracterizada como aguti preto com barriga e pés brancos e um haplótipo RT1av1. Essas cepas são disponibilizadas por diversas fontes, inclusive Harlan Laboratories. Um exemplo de uma linhagem celular ES de rato de um rato ACI é uma célula ES de rato ACI.G1. A cepa de rato DA é caracterizada como tendo pelagem aguti e um haplótipo RT1av1. Esses ratos são disponibilizados por diversas fontes, inclusive Charles River e Harlan Laboratories. Exemplos de uma linhagem celular ES de rato de um rato DA são o DA.Linhagem celular ES de rato 2B e o DA.Linhagem celular ES de rato 2C. Em algumas modalidades, as células pluripotentes e/ou totipotentes de ratos são de uma cepa endogâmica de rato (ver, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente U.S. Nº. 2014-0235933 A1, publicada em 21 de agosto de 2014, incorporada a este documento por referência em sua totalidade). As orientações para fazer modificações em um genoma de rato (por exemplo, em uma célula ES de rato) usando métodos e/ou construtos, como descrito neste documento, podem ser encontradas, por exemplo, na Publicação de Pedido de Patente U.S. Nºs. 2014-0310828 e 2017-0204430; os quais são incorporados a este documento por referência em sua totalidade. Modalidades Exemplificativas Específicas - Loci da cadeia Pesada de Imunoglobulina
[00301] Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada como descrito neste documento e compreendem ainda loci (ou alelos) de IgH manipulada caracterizados pela presença de uma pluralidade de segmentos
168 / 308 gênicos VH, DH e JH humanos dispostos em configuração de linhagem germinativa e operacionalmente ligados a genes da região constante da cadeia pesada de imunoglobulina não humana, regiões potencializadoras e reguladoras. Em algumas modalidades, um locus (ou alelo) da cadeia pesada de imunoglobulina manipulada, conforme descrito neste documento, compreende um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos operacionalmente ligados a uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina não humana. Em determinadas modalidades, um locus (ou alelo) da cadeia pesada de imunoglobulina manipulada compreende pelo menos os segmentos gênicos VH humanos VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3- 49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3- 15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, ou qualquer combinação destes. Em determinadas modalidades, um locus (ou alelo) de IgH manipulada compreende pelo menos os segmentos gênicos DH humanos DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6- 6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27, ou qualquer combinação destes. Em determinadas modalidades, um locus (ou alelo) da cadeia pesada de imunoglobulina manipulada compreende pelo menos os segmentos gênicos JH humanos JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 ou qualquer combinação destes.
[00302] A presente divulgação reconhece que um animal não humano, como descrito neste documento, utilizará segmentos gênicos de região variável da cadeia pesada humanos compreendidos em seu genoma, em seus mecanismos de seleção e geração de anticorpos (por exemplo, recombinação e hipermutação somática). Consequentemente, em várias modalidades, os
169 / 308 domínios variáveis da cadeia pesada de imunoglobulina humana gerados por animais não humanos descritos neste documento são codificados pelos segmentos gênicos de região variável da cadeia pesada humanos incluídos em seu genoma ou em suas variantes somaticamente hipermutadas.
[00303] Em algumas modalidades, é fornecido um animal não humano cujo genoma compreende um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada, em que o animal não humano inclui uma célula B que inclui uma sequência de região variável pesada humana, uma sequência de região variável da cadeia leve λ humana e/ou uma sequência de região variável da cadeia leve κ humana que é somaticamente hipermutada. Em algumas modalidades, uma sequência de região variável pesada humana, uma sequência de região variável da cadeia leve λ humana e/ou uma sequência de região variável da cadeia leve κ humana presente em uma célula B de um camundongo da presente divulgação tem 1, 2, 3, 4, 5 ou mais hipermutações somáticas. Aqueles versados na técnica conhecem os métodos para identificar segmentos gênicos de origem em uma sequência de anticorpos maduros. Por exemplo, várias ferramentas estão disponíveis para auxiliar nessa análise, como, por exemplo, DNAPLOT, IMGT/V-QUEST, JOINSOLVER, SoDA e Ab-origin.
[00304] Em algumas modalidades, uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina não humana inclui um ou mais genes de região constante da cadeia pesada de imunoglobulina não humana, como, por exemplo, imunoglobulina M (IgM), imunoglobulina D (IgD), imunoglobulina G (IgG), imunoglobulina E (IgE) e imunoglobulina A (IgA). Em determinadas modalidades, uma região constante da cadeia pesada de imunoglobulina não humana inclui genes de região constante de IgM de roedor, IgD de roedor, IgG3 de roedor, IgG1 de roedor, IgG2b de roedor, IgG2a de roedor, IgE de roedor e IgA de roedor. Em algumas modalidades, os referidos segmentos gênicos VH, DH e JH humanos estão operacionalmente
170 / 308 ligados a um ou mais potencializadores da cadeia pesada de imunoglobulina não humana (isto é, sequências potencializadoras ou regiões potencializadoras). Em algumas modalidades, os referidos segmentos gênicos VH, DH e JH humanos estão operacionalmente ligados a uma ou mais regiões reguladoras da cadeia pesada de imunoglobulina não humana (ou sequências reguladoras). Em algumas modalidades, os referidos segmentos gênicos VH, DH e JH humanos estão operacionalmente ligados a um ou mais potencializadores da cadeia pesada de imunoglobulina não humana (ou sequência potencializadora) e uma ou mais regiões reguladoras da cadeia pesada de imunoglobulina não humana (ou sequência reguladora).
[00305] Em algumas modalidades, um locus da cadeia pesada de imunoglobulina manipulada, como descrito neste documento, não contém um gene Adam6 endógeno. Em algumas modalidades, um locus da cadeia pesada de imunoglobulina manipulada, conforme descrito neste documento, não contém um gene Adam6 endógeno (ou sequência codificante de Adam6) na mesma posição genômica de linhagem germinativa que o encontrado no genoma de linhagem germinativa de um animal não humano do tipo selvagem da mesma espécie. Em algumas modalidades, um locus da cadeia pesada de imunoglobulina manipulada, como descrito neste documento, não contém um pseudogene Adam6 humano. Em algumas modalidades, um locus da cadeia pesada de imunoglobulina manipulada, como descrito neste documento, compreende a inserção de pelo menos uma sequência nucleotídica que codifica um ou mais polipeptídeos Adam6 não humanos (por exemplo, de roedores), ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou fragmentos funcionais destes. Em algumas modalidades, a referida inserção pode estar fora de um locus da cadeia pesada de imunoglobulina manipulada, como descrito neste documento, (por exemplo, mas não limitado a, a montante de um segmento gênico VH mais a 5'), dentro de um locus da cadeia pesada de imunoglobulina manipulada ou em outro local do genoma de linhagem
171 / 308 germinativa, célula ou tecido de um animal não humano (por exemplo, mas não limitado a, uma sequência codificante de Adam6 não humano introduzido aleatoriamente).
[00306] Em várias modalidades, um animal não humano fornecido, célula não humana ou tecido não humano, como descrito neste documento, não expressa de maneira detectável, no todo ou em parte, uma região VH não humana endógena em uma molécula de anticorpo. Em várias modalidades, um animal não humano fornecido, célula não humana ou tecido não humano, conforme descrito neste documento, não contém (ou não possui, ou contém uma deleção de) uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam, no todo ou em parte, uma região VH não humana endógena (por exemplo, VH, DH e/ou JH) em uma molécula de anticorpo. Em várias modalidades, um animal não humano, célula não humana ou tecido não humano fornecido, conforme descrito neste documento, possui um genoma de linhagem germinativa que inclui uma deleção de segmentos gênicos VH, DH e JH endógenos não humanos, no todo ou em parte. Em várias modalidades, um animal não humano fornecido é fértil.
[00307] As orientações para a criação de vetores de direcionamento, células não humanas e animais contendo esses loci (ou alelos) da cadeia pesada de imunoglobulina manipulada podem ser encontrados nas Patentes US nº 8.502.018, 8.642.835, 8.697.940 e 8.791.323, incorporadas a este documento por referência em sua totalidade. Os versados na técnica estão cientes de uma variedade de tecnologias, conhecidas na técnica, para realizar essa engenharia genética e/ou manipulação de genomas não humanos (por exemplo, de mamíferos) ou para preparar, fornecer ou fabricar de outra forma estas sequências para introduzir no genoma de linhagem germinativa de animais não humanos. Modalidades Exemplares Específicas - Loci da Cadeia Leve de Imunoglobulina κ
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[00308] Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada caracterizado pela presença de uma pluralidade de segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos dispostos em configuração de linhagem germinativa (isto é, não reorganizados e associados a sequências de sinais de recombinação) e inseridos a montante de e operacionalmente ligados a um gene Cλ não humano ou humano, cujo gene Cλ não humano ou humano é inserido no lugar de um gene Cκ não humano. Como descrito neste documento, esse locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada inclui ainda regiões potencializadoras da cadeia leve de imunoglobulina κ não humana (ou sequências potencializadoras). Em algumas modalidades, um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada compreende um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos operacionalmente ligados a um gene Cλ não humano ou humano. Em determinadas modalidades, um locus (ou alelo) da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada compreende segmentos gênicos Vλ humanos que aparecem pelo menos no cluster A de um locus da cadeia leve de imunoglobulina λ humana; em algumas modalidades, o cluster A e o cluster B de um locus da cadeia leve de imunoglobulina λ humana; em determinadas modalidades, cluster A, cluster B e cluster C de um locus da cadeia leve da imunoglobulina λ humana. Em determinadas modalidades, um locus (ou alelo) da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada compreende pelo menos segmentos gênicos Vλ humanos Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3- 22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 ou qualquer combinação destes. Em determinadas modalidades, um locus (ou alelo) da cadeia leve de Igκ manipulada compreende pelo menos os segmentos gênicos Jλ humanos Jλ1, Jλ2, Jλ3,
173 / 308 Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes.
[00309] A presente divulgação reconhece que um animal não humano, como descrito neste documento, utilizará segmentos gênicos de região variável de cadeia leve λ humanos inclusos em seu genoma, em seus mecanismos de seleção e geração de anticorpos (por exemplo, recombinação e hipermutação somática). Consequentemente, em várias modalidades, os domínios variáveis da cadeia leve λ de imunoglobulina humana gerados por animais não humanos descritos neste documento são codificados pelos segmentos gênicos de região variável de cadeia leve λ humanos incluídos em seu genoma ou em suas variantes somaticamente hipermutadas.
[00310] Em algumas modalidades, é fornecido um animal não humano cujo genoma compreende um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada, em que o animal não humano inclui uma célula B que inclui uma sequência de região variável pesada humana, uma sequência de região variável da cadeia leve λ humana e/ou uma sequência de região variável da cadeia leve κ humana que é somaticamente hipermutada. Em algumas modalidades, uma sequência de região variável pesada humana, uma sequência de região variável da cadeia leve λ humana e/ou uma sequência de região variável da cadeia leve κ humana presente em uma célula B de um camundongo da presente divulgação tem 1, 2, 3, 4, 5 ou mais hipermutações somáticas. Aqueles versados na técnica conhecem os métodos para identificar segmentos gênicos de origem em uma sequência de anticorpos maduros. Por exemplo, várias ferramentas estão disponíveis para auxiliar nessa análise, como, por exemplo, DNAPLOT, IMGT/V-QUEST, JOINSOLVER, SoDA e Ab-origin.
[00311] Em muitas modalidades, um locus (ou alelo) da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada contém as mesmas regiões potencializadoras da cadeia leve de imunoglobulina κ não humana (ou sequências potencializadoras) que aparecem em um locus (ou alelo) da cadeia leve de
174 / 308 imunoglobulina κdo tipo selvagem. Em algumas modalidades, um locus (ou alelo) da cadeia leve da imunoglobulina κ manipulada contém regiões potencializadoras da cadeia leve de imunoglobulina κ não humana (ou sequências potencializadoras) que aparecem em um locus (ou alelo) da cadeia leve de imunoglobulina κ do tipo selvagem de uma espécie diferente (por exemplo, uma espécie diferente de roedor).
[00312] Em algumas modalidades, os referidos segmentos gênicos Vλ e J λ humanos estão operacionalmente ligados a um ou mais potencializadores da cadeia leve de imunoglobulina κ não humana (isto é, sequências potencializadoras ou regiões potencializadoras). Em determinadas modalidades, os referidos segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos estão operacionalmente ligados a uma região potencializadora intrônica da cadeia leve de imunoglobulina κ de murino (Igκ Ei ou Eiκ). Em algumas modalidades, os referidos segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos estão operacionalmente ligados a uma região potenciadora da cadeia leve de imunoglobulina κ de murino 3' (Igκ 3'E ou 3'Eκ). Em determinadas modalidades, os referidos segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos estão operacionalmente ligados a um Eiκ de murino e operacionalmente ligados a um 3'Eκ de murino.
[00313] Em algumas modalidades, um locus (ou alelo) da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada, como descrito neste documento, não contém (isto é, não possui) um gene VpreB humano (ou sequência de codificação do gene VpreB humano).
[00314] Em algumas modalidades, um gene Cλ não humano de um locus (ou alelo) da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada inclui um gene Cλ de roedor, como, por exemplo, um gene Cλ de camundongo ou um gene Cλ de rato. Em algumas modalidades, um gene Cλ não humano de um locus (ou alelo) da cadeia leve de Igκ manipulada é ou compreende um gene Cλ de camundongo de um fundo genético que inclui uma cepa 129, uma cepa
175 / 308 BALB/c, uma cepa C57BL /6, uma cepa 129xC57BL /6 mista ou combinações destas.
[00315] Em algumas modalidades, um gene Cλ não humano de um locus (ou alelo) da cadeia leve de Igκ manipulada, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntico à SEQ ID NO: 1 (Cλ1 de camundongo), SEQ ID NO: 3 (Cλ2 de camundongo) ou SEQ ID NO: 5 (Cλ3 de camundongo). Em algumas modalidades, um gene Cλ não humano de um locus (ou alelo) da cadeia leve de Igκ manipulada, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência que é substancialmente idêntica ou idêntica à SEQ ID NO: 1 (Cλ1 de camundongo), SEQ ID NO: 3 (Cλ2 de camundongo) ou SEQ ID NO: 5 (Cλ3 de camundongo). Em algumas modalidades, um gene Cλ não humano de um locus (ou alelo) da cadeia leve de Igκ manipulada, como descrito neste documento, é ou compreende a sequência de um gene Cλ1 de camundongo.
[00316] Em algumas modalidades, um domínio Cλ não humano codificado por uma sequência posicionada em um locus (ou alelo) da cadeia leve de Igκ manipulada, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 2 (Cλ1 de camundongo), SEQ ID NO: 4 (Cλ2 de camundongo) ou SEQ ID NO: 6 (Cλ3 de camundongo). Em algumas modalidades, um domínio Cλ não humano codificado por uma sequência posicionada em um locus (ou alelo) da cadeia leve de Igκ manipulada, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência que é substancialmente idêntica ou idêntica à SEQ ID NO: 2 (Cλ1 de camundongo), SEQ ID NO: 4 (Cλ2 de camundongo) ou SEQ ID NO: 6 (Cλ3 de camundongo). Em algumas modalidades, um gene Cλ não humano codificado por uma sequência posicionada em um locus (ou alelo) da cadeia leve de Igκ manipulada, como descrito neste documento, é ou compreende
176 / 308 um polipeptídeo de domínio Cλ1 de camundongo.
[00317] Em algumas modalidades, um gene Cλ não humano de um locus (ou alelo) da cadeia leve de Igκ manipulada, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntico à SEQ ID NO: 7 (Cλ1 de camundongo), SEQ ID NO: 9 (Cλ2 de camundongo), SEQ ID NO: 11 (Cλ3 de rato) ou SEQ ID NO: 13 (Cλ4 de camundongo). Em determinadas modalidades, um gene Cλ não humano de um locus (ou alelo) da cadeia leve de Igκ manipulada, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência que é substancialmente idêntica ou idêntica à SEQ ID NO: 7 (rato Cλ1), SEQ ID NO: 9 (Cλ2 de rato), SEQ ID NO: 11 (Cλ3 de rato) ou SEQ ID NO: 13 (Cλ4 de rato). Em determinadas modalidades, um gene Cλ não humano de um locus (ou alelo) da cadeia leve de Igκ manipulada, como descrito neste documento, é ou compreende a sequência de um gene Cλ1 de rato.
[00318] Em algumas modalidades, um domínio Cλ não humano codificado por uma sequência posicionada em um locus (ou alelo) da cadeia leve de Igκ manipulada, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntico à SEQ ID NO: 8 (Cλ1 de rato), SEQ ID NO: 10 (Cλ2 de rato), SEQ ID NO: 12 (Cλ3 de rato) ou SEQ ID NO: 14 (Cλ4 de rato). Em algumas modalidades, um domínio Cλ não humano codificado por uma sequência posicionada em um locus (ou alelo) da cadeia leve de Igκ manipulada, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência que é substancialmente idêntica ou idêntica à SEQ ID NO: 8 (Cλ1 de rato), SEQ ID NO: 10 (Cλ2 de rato), SEQ ID NO: 12 (Cλ3 de rato) ou SEQ ID NO: 14 (Cλ4 de rato). Em algumas modalidades, um domínio Cλ não humano codificado por uma sequência posicionada em um locus (ou alelo) da cadeia leve de Igκ manipulada, como descrito neste documento, é ou
177 / 308 compreende um polipeptídeo de domínio Cλ1 de rato.
[00319] Em algumas modalidades, um gene Cλ humano de um locus (ou alelo) da cadeia leve de Igκ manipulada inclui um gene Cλ humano, como, por exemplo, um gene Cλ1 humano, um gene Cλ2 humano, umgene Cλ3 humano, um gene Cλ6 humano ou um gene Cλ7 humano. Em algumas modalidades, um gene Cλ humano de um locus (ou alelo) da cadeia leve de Igκ manipulada é ou compreende um gene Cλ2 humano.
[00320] Em algumas modalidades, um gene Cλ humano de um locus (ou alelo) da cadeia leve de Igκ manipulada, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 15 (Cλ1 humano), SEQ ID NO: 17 (Cλ2 humano), SEQ ID NO: 19 (Cλ3 humano), SEQ ID NO: 21 (Cλ6 humano) ou SEQ ID NO: 23 (Cλ7 humano). Em algumas modalidades, um gene Cλ humano de um locus (ou alelo) da cadeia leve de Igκ manipulada, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência que é substancialmente idêntica ou idêntica à SEQ ID NO: 15 (Cλ1 humano), SEQ ID NO: 17 (Cλ2 humano), SEQ ID NO: 19 (Cλ3 humano), SEQ ID NO: 21 (Cλ6 humano) ou SEQ ID NO: 23 (Cλ7 humano). Em algumas modalidades, um gene Cλ humano de um locus (ou alelo) da cadeia leve de Igκ manipulada, como descrito neste documento, é ou compreende a sequência de um gene Cλ2 humano.
[00321] Em algumas modalidades, um domínio Cλ humano codificado por uma sequência posicionada em um locus (ou alelo) da cadeia leve de Igκ manipulada, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência que é pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 98% idêntica à SEQ ID NO: 16 (Cλ1 humano), SEQ ID NO: 18 (Cλ2 humano), SEQ ID NO: 20 (Cλ3 humano), SEQ ID NO: 22 (Cλ6 humano) ou SEQ ID NO: 24 (Cλ7 humano). Em algumas modalidades, um domínio Cλ humano codificado por uma sequência posicionada em um locus
178 / 308 (ou alelo) da cadeia leve de Igκ manipulada, conforme descrito neste documento, compreende uma sequência que é substancialmente idêntica ou idêntica à SEQ ID NO: 16 (Cλ1 humano), SEQ ID NO: 18 (Cλ2 humano), SEQ ID NO: 20 (Cλ3 humano), SEQ ID NO: 22 (Cλ6 humano) ou SEQ ID NO: 24 (Cλ7 humano). Em algumas modalidades, um domínio Cλ humano codificado por uma sequência posicionada em um locus (ou alelo) da cadeia leve de Igκ manipulada, como descrito neste documento, é ou compreende um polipeptídeo de domínio Cλ2 humano.
[00322] Entre outras coisas, a presente divulgação demonstra que a presença de segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos nos loci (ou alelos) da cadeia leve de Igκ aumenta a diversidade do repertório da cadeia leve de um animal não humano fornecido, em comparação com a diversidade das cadeias leves no repertório de anticorpos expresso de um animal não humano que não compreende esses loci da cadeia leve de Igκ manipulada. Modalidades Exemplares Específicas - Loci da Cadeia Leve de Imunoglobulina λ
[00323] Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada, como descrito neste documento, e compreendem ainda loci (ou alelos) da cadeia leve de imunoglobulina λ do tipo selvagem ou inativada.
[00324] Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos, as células não humanas e/ou os tecidos não humanos, como descrito neste documento, compreendem uma deleção, total ou parcial, de um locus da cadeia leve de imunoglobulina λ endógena. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos, as células não humanas e/ou os tecidos não humanos, como descrito neste documento, compreendem uma inserção dentro de um locus da cadeia leve de imunoglobulina λ endógena, em que a referida inserção torna o locus da cadeia leve de imunoglobulina λ endógena inoperante. Em algumas modalidades, animais não humanos fornecidos,
179 / 308 células não humanas e/ou tecidos não humanos, como descritos neste documento, compreendem uma deleção de um ou mais segmentos gênicos de um locus da cadeia leve de imunoglobulina λ endógena, de modo que o locus da cadeia leve de imunoglobulina λ endógena é incapaz recombinar e/ou expressar uma cadeia leve funcional de um anticorpo.
[00325] Em algumas modalidades, um animal não humano fornecido, célula não humana ou tecido não humano, como descrito neste documento, não expressa de maneira detectável, no todo ou em parte, uma região Vλ não humana endógena em uma molécula de anticorpo. Em algumas modalidades, um animal não humano fornecido, célula não humana ou tecido não humano, conforme descrito neste documento, não contém (ou não possui, ou contém uma deleção de) uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam, no todo ou em parte, uma região Vλ não humana endógena em uma molécula de anticorpo. Em algumas modalidades, um animal não humano, célula não humana ou tecido não humano fornecido, conforme descrito neste documento, possui um genoma de linhagem germinativa que inclui uma deleção de segmentos gênicos Vλ e Jλ endógenos não humanos, no todo ou em parte. Em algumas modalidades, um animal não humano, célula não humana ou tecido não humano fornecido, como descrito neste documento, como um genoma de linhagem germinativa que inclui uma deleção de segmentos gênicos Vλ, Jλ e Cλ não humanos endógenos, no todo ou em parte.
[00326] As orientações para a criação de vetores de direcionamento, células não humanas e animais que possuem loci (ou alelos) da cadeia leve de Igλ inativados podem ser encontradas, por exemplo, nas Patentes US nº
9.006.511, 9.012.717, 9.029.628, 9.035.128, 9.066.502, 9.150.662 e
9.163.092, incorporadas a este documento por referência em sua totalidade. Os versados na técnica estão cientes de uma variedade de tecnologias, conhecidas na técnica, para realizar inativação genética de loci específicos e/ou manipulação de genomas não humanos (por exemplo, de mamíferos) ou
180 / 308 para preparar, fornecer ou fabricar de outra forma esta inativação genética (por exemplo, deleções de genes) para introdução no genoma de linhagem germinativa de animais não humanos. Modalidades Exemplificativas Específicas - Combinações de loci de Imunoglobulina
[00327] Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada, como descrito neste documento, e compreendem ainda um ou mais genes humanos ou humanizados adicionais (por exemplo, via cruzamento ou estratégias de direcionamento de múltiplos genes). Estes animais não humanos podem ser preparados como descrito acima, ou usando métodos conhecidos na técnica, para obter um genótipo manipulado desejado, dependendo do uso pretendido do animal não humano. O material genético desses genes humanos ou humanizados adicionais pode ser introduzido por meio de alterações adicionais no genoma das células (por exemplo, células- tronco embrionárias) com as modificações genéticas descritas acima ou por meio de técnicas de reprodução conhecidas na técnica com outras cepas geneticamente modificadas ou manipuladas, conforme desejado.
[00328] Em algumas modalidades, animais não humanos sejam preparados para compreender ainda um locus da cadeia pesada de imunoglobulina humana ou humanizada (por exemplo, incluindo, entre outros, uma pluralidade de segmentos gênicos VH, DH e JH humanos operacionalmente ligados a uma ou mais genes de região constante da cadeia pesada de imunoglobulina de roedores em um locus da cadeia pesada de imunoglobulina endógena). Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos são heterozigotos para um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada, como descrito neste documento, e heterozigotos para um locus da cadeia pesada de imunoglobulina humana ou humanizada. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos
181 / 308 são homozigotos para um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada, como descrito neste documento, e homozigotos para um locus da cadeia pesada de imunoglobulina humana ou humanizada.
[00329] Em algumas modalidades, animais não humanos fornecidos são preparados para compreender ainda um locus da cadeia pesada de imunoglobulina humana ou humanizada (por exemplo, incluindo, entre outros, uma pluralidade de segmentos gênicos VH, DH e JH humanos operacionalmente ligados a um ou mais genes de região constante da cadeia pesada de imunoglobulina de roedor em um locus da cadeia pesada de imunoglobulina endógena) e um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ humanizada (por exemplo, incluindo, mas não se limitando a, uma pluralidade de segmentos gênicos Vκ e Jκ humanos operacionalmente ligados a um gene de região constante da cadeia leve de imunoglobulina κ de roedor em um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ endógena. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos são heterozigotos para um locus da cadeia pesada de imunoglobulina humana ou humanizada e compreendem ainda um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ endógena que contém uma pluralidade de segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos ligados operacionalmente a um gene de região constante da cadeia leve de imunoglobulina λ de roedor (isto é, um locus da cadeia leve de Igκ manipulada, como descrito neste documento) e outro locus da cadeia leve de imunoglobulina κ endógena com uma pluralidade de segmentos gênicos Vκ e Jκ humanos operacionalmente ligados a um gene de região constante da cadeia leve de imunoglobulina κ de roedor. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos são homozigotos para um locus da cadeia pesada de imunoglobulina humana ou humanizada e compreendem ainda um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ endógena que contém uma pluralidade de segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos operacionalmente ligados a um gene de região constante da cadeia leve de imunoglobulina λ de roedor
182 / 308 (isto é, um locus da cadeia leve de Igκ manipulada, como descrito neste documento) e outro locus da cadeia leve de imunoglobulina κ endógena com uma pluralidade de segmentos gênicos Vκ e Jκ humanos operacionalmente ligados a um gene de região constante da cadeia leve de imunoglobulina κ de roedor.
[00330] Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos têm um genoma que compreende (a) um locus da cadeia pesada de imunoglobulina humana ou humanizada homozigótico ou heterozigótico compreendendo segmentos gênicos VH, DH e JH humanos operacionalmente ligados a uma ou mais regiões constantes da cadeia pesada de imunoglobulina não humana endógena para que o animal não humano expresse uma cadeia pesada de imunoglobulina que compreende uma sequência de domínio VH humana fundida com uma sequência de domínio CH não humana; (b) um primeiro locus da cadeia leve de imunoglobulina κ compreendendo segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos operacionalmente ligados a um gene Cλ de imunoglobulina não humana, para que o animal não humano expresse uma cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma sequência de domínio Vλ humana fundida a uma sequência do domínio Cλ não humano; e (c) um segundo locus da cadeia leve de imunoglobulina κ compreendendo segmentos gênicos humanos Vκ e Jκ operacionalmente ligados a um gene Cκ não humano endógeno, de modo que o animal não humano expresse uma cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma sequência de domínio Vκ humana fundida a uma sequência do domínio Ck de camundongo.
[00331] Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos têm um genoma que compreende (a) um locus da cadeia pesada de imunoglobulina humana ou humanizada homozigótico ou heterozigótico compreendendo segmentos gênicos VH, DH e JH humanos operacionalmente ligados a uma ou mais regiões constantes da cadeia pesada de imunoglobulina não humana endógena para que o animal não humano expresse uma cadeia
183 / 308 pesada de imunoglobulina que compreende uma sequência de domínio VH humana fundida com uma sequência de domínio CH não humana; (b) um primeiro locus da cadeia leve de imunoglobulina κ compreendendo segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos operacionalmente ligados a um gene Cλ de imunoglobulina não humana, para que o animal não humano expresse uma cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma sequência de domínio Vλ humana fundida a uma sequência do domínio Cλ não humano; e (c) um segundo locus da cadeia leve de imunoglobulina κ compreendendo segmentos gênicos humanos Vκ e Jκ operacionalmente ligados a um gene Cκ não humano endógeno, de modo que o animal não humano expresse uma cadeia leve de imunoglobulina que compreende uma sequência de domínio Vκ humana fundida a uma sequência do domínio Ck de camundongo; e (d) um locus da cadeia leve de imunoglobulina λ endógena homozigoto ou heterozigoto funcionalmente inativado ou deletado, total ou parcialmente.
[00332] Por exemplo, como descrito neste documento, animais não humanos compreendendo um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada, como descrito neste documento, podem compreender ainda (por exemplo, através de cruzamento ou estratégias de direcionamento de múltiplos genes) uma ou mais modificações, conforme descrito nas Patentes US nº 8.642.835, 8.697.940, 9.006.511, 9.035.128, 9.066.502, 9.150.662 e
9.163.092; incorporadas a este documento por referência em sua totalidade. Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem ainda um locus da cadeia pesada de imunoglobulina humanizada (por exemplo, um locus da cadeia pesada de imunoglobulina compreendendo segmentos gênicos VH, DH e JH humanos operacionalmente ligados a um ou mais genes de região constante da cadeia pesada de imunoglobulina não humana). Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem ainda um locus da cadeia pesada de imunoglobulina humanizada e um locus da cadeia leve de imunoglobulina λ endógena não
184 / 308 funcional (por exemplo, deletados, total ou parcialmente, ou tornados não funcionais de outra forma).
[00333] Em algumas modalidades, os animais não humanos fornecidos compreendem um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ com segmentos gênicos Vλ e Jλ humanos operacionalmente ligados a um gene Cλ humano ou não humano posicionado no lugar de um gene Cκ não humano e uma segundo locus da cadeia leve de imunoglobulina κ compreendendo segmentos gênicos Vκ e Jκ humanos operacionalmente ligados a um gene Cκ não humano endógeno. Em tais modalidades, os animais não humanos fornecidos são denominados hemizigotos para um locus da cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada. Em algumas modalidades, os referidos animais não humanos hemizigóticos fornecidos neste documento compreendem ainda um locus da cadeia pesada de imunoglobulina humanizada. Em algumas modalidades, os referidos animais não humanos hemizigotos fornecidos neste documento compreendem ainda um locus da cadeia pesada de imunoglobulina humanizada e um locus da cadeia leve de imunoglobulina λ endógena não funcional. Métodos de utilização de animais, células ou tecidos não humanos fornecidos
[00334] Animais não humanos, como descrito neste documento, podem ser usados como uma plataforma para o desenvolvimento de anticorpos. Em particular, os animais não humanos descritos neste documento representam uma plataforma particularmente vantajosa para a geração e identificação de domínios variáveis da cadeia leve lambda humana e anticorpos que incluem tais domínios variáveis da cadeia leve lambda humana.
[00335] Consequentemente, a presente divulgação fornece que animais não humanos descritos neste documento podem ser utilizados em métodos de produção de anticorpos. Os anticorpos fabricados de acordo com a presente divulgação podem incluir, por exemplo, anticorpos humanos, anticorpos
185 / 308 quiméricos, anticorpos quiméricos reversos, fragmentos de qualquer um desses anticorpos ou combinações destes.
[00336] Em algumas modalidades, animais não humanos, como descrito neste documento, podem ser empregados para produzir um anticorpo humano (por exemplo, um anticorpo totalmente humano), este anticorpo humano compreende regiões variáveis derivadas de sequências de ácidos nucleicos codificadas pelo material genético de uma célula de uma célula não- animal humano como descrito neste documento. Em algumas modalidades, um animal não humano, como descrito neste documento, é imunizado com um antígeno de interesse sob condições e por um tempo suficiente para que o animal não humano desenvolva uma resposta imune ao referido antígeno de interesse. Anticorpos e/ou sequências de anticorpos (ou seja, sequências que codificam parte de um anticorpo, por exemplo, uma sequência de região variável) são isolados e/ou identificados a partir de animais não humanos (ou uma ou mais células, por exemplo, uma ou mais células B) imunizados deste forma e caracterizados usando vários ensaios que medem, por exemplo, afinidade, especificidade, mapeamento de epítopos, capacidade de bloquear a interação ligante-receptor, ativação do receptor de inibição, etc. Em várias modalidades, os anticorpos produzidos por animais não humanos, como descrito neste documento, compreendem uma ou mais regiões variáveis humanas que são derivadas de uma ou mais sequências nucleotídicas da região variável humana isoladas do animal não humano. Em algumas modalidades, os anticorpos antidrogas (por exemplo, anticorpo anti-idiotipo) podem ser criados em animais não humanos, como descrito neste documento. Em várias modalidades, os anticorpos produzidos por animais não humanos, como descrito neste documento, são anticorpos quiméricos reversos que incluem um domínio variável da cadeia leve humana e um domínio constante da cadeia leve não humana (por exemplo, de roedor) e/ou um domínio variável da cadeia pesada humana e um domínio constante da cadeia pesada
186 / 308 não humana (por exemplo, de roedor).
[00337] Em várias modalidades, os anticorpos produzidos por animais não humanos incluem cadeias pesadas e leves com um domínio variável humano e um domínio constante não humano. Em algumas modalidades, os anticorpos produzidos por animais não humanos, como descrito neste documento, são anticorpos quiméricos reversos que incluem um domínio variável da cadeia leve humana e um domínio constante da cadeia leve não humana (por exemplo, de roedor). Em algumas modalidades, os anticorpos produzidos por animais não humanos, como descrito neste documento, são anticorpos quiméricos reversos que incluem um domínio variável da cadeia pesada humana e um domínio constante da cadeia pesada não humana (por exemplo, de roedor).
[00338] Em algumas modalidades, os métodos fornecidos incluem a imunização de um animal não humano, como descrito neste documento, com um antígeno de interesse. Em algumas modalidades, os métodos fornecidos incluem a identificação de um linfócito (por exemplo, um linfócito selecionado clonicamente) do referido animal não humano, em que o linfócito expressa um anticorpo que se liga (por exemplo, se liga especificamente) ao antígeno de interesse. Em algumas modalidades, um linfócito é uma célula B. Em algumas modalidades, uma sequência de região variável da cadeia pesada humana, uma sequência de região variável da cadeia leve lambda humana e/ou uma sequência de região variável da cadeia leve kappa humana é obtida a partir do linfócito (por exemplo, célula B) e/ou identificada (por exemplo, genotipado, por exemplo, sequenciado). Em algumas modalidades, uma sequência de aminoácidos de um domínio variável da cadeia pesada humana, um domínio variável da cadeia leve lambda humana e/ou um domínio variável da cadeia leve kappa humana é obtido a partir do linfócito (por exemplo, célula B) e/ou identificado (por exemplo, sequenciado). Em algumas modalidades, uma sequência de região variável da cadeia pesada
187 / 308 humana, uma sequência de região variável da cadeia leve lambda humana e/ou uma sequência de região variável da cadeia leve kappa humana de uma célula B de um animal não humano é expressa em uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, uma variante de uma sequência de região variável da cadeia pesada humana, uma sequência de região variável da cadeia leve lambda humana e/ou uma sequência de região variável da cadeia leve kappa humana de uma célula B de um animal não humano é expressa em uma célula hospedeira. Em algumas modalidades, uma variante inclui uma ou mais mutações. Em algumas modalidades, uma ou mais mutações podem melhorar uma propriedade farmacocinética e/ou farmacodinâmica de um anticorpo, incluindo uma variante. Em algumas modalidades, uma ou mais mutações podem melhorar a especificidade, a afinidade e/ou a imunogenicidade de um anticorpo incluindo uma variante.
[00339] Em algumas modalidades, os métodos de produção de um anticorpo humano incluem a identificação de uma sequência nucleotídica que codifica um domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina humana e/ou um domínio variável da cadeia leve de imunoglobulina humana de um animal não humano descrito neste documento; e (i) unir ou ligar a sequência nucleotídica que codifica o domínio variável da cadeia pesada de imunoglobulina humana a uma sequência nucleotídica que codifica um domínio constante da cadeia pesada de imunoglobulina humana, formando assim uma sequência da cadeia pesada de imunoglobulina humana que codifica uma cadeia pesada de imunoglobulina totalmente humana, (ii) unir ou ligar a sequência nucleotídica que codifica o domínio variável da cadeia leve de imunoglobulina humana λ a uma sequência nucleotídica que codifica o domínio constante da cadeia leve da imunoglobulina humana λ, formando assim uma sequência da cadeia leve de imunoglobulina humana λ que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina humana λ e/ou (iii) unir ou ligar a sequência nucleotídica que codifica o domínio variável da cadeia leve da
188 / 308 imunoglobulina κ humana a uma sequência nucleotídica que codifica um domínio constante da cadeia leve da imunoglobulina κ humana, formando assim uma sequência da cadeia leve da imunoglobulina κ humana que codifica uma cadeia leve da imunoglobulina κ humana. Em certas modalidades, uma sequência da cadeia pesada de imunoglobulina humana e (i) uma sequência da cadeia leve λ de imunoglobulina humana ou (ii) uma sequência da cadeia leve de imunoglobulina κ humana são expressas em uma célula (por exemplo, uma célula hospedeira, uma célula de mamífero), de modo que cadeias pesadas de imunoglobulina totalmente humana e (i) cadeias leves λ de imunoglobulina totalmente humanas ou (ii) cadeias leves de imunoglobulina κ totalmente humanas são expressas e formam anticorpos humanos. Em algumas modalidades, os anticorpos humanos são isolados de uma célula ou de um meio de cultura que inclui a célula.
[00340] Os animais não humanos, como descrito neste documento, podem ser empregados para identificar uma sequência nucleotídica ou de ácidos nucleicos que codifica um domínio variável humano gerado por um animal não humano descrito neste documento, por exemplo, como parte de um anticorpo contra um epítopo ou antígeno.
[00341] Animais não humanos, como descrito neste documento, podem ser empregados para identificar uma sequência de aminoácidos de um domínio variável humano gerado por um animal não humano descrito neste documento, por exemplo, como parte de um anticorpo contra um epítopo ou antígeno.
[00342] Animais não humanos, como descrito neste documento, fornecem um sistema in vivo aprimorado e uma fonte de materiais biológicos (por exemplo, células, nucleotídeos, polipeptídeos, complexos de proteínas) para a produção de anticorpos humanos que são úteis para uma variedade de ensaios. Em várias modalidades, animais não humanos, conforme descrito neste documento, são utilizados para desenvolver terapias que visam um
189 / 308 polipeptídeo de interesse (por exemplo, um polipeptídeo transmembranar ou secretado) e/ou modular uma ou mais atividades associadas ao referido polipeptídeo de interesse e/ou modular interações do referido polipeptídeo de interesse com outros parceiros de ligação (por exemplo, um ligante ou polipeptídeo receptor). Por exemplo, em várias modalidades, animais não humanos, como descrito neste documento, são utilizados para desenvolver terapias que visam um ou mais polipeptídeos receptores, modulam a atividade do polipeptídeo receptor e/ou modulam interações do polipeptídeo receptor com outros parceiros de ligação. Em várias modalidades, animais não humanos, como descrito neste documento, são usados para identificar, rastrear e/ou desenvolver terapias candidatas (por exemplo, anticorpos, siRNA, etc.) que se ligam a um ou mais polipeptídeos de interesse. Em várias modalidades, animais não humanos, como descrito neste documento, são usados para triagem e desenvolvimento de terapias candidatas (por exemplo, anticorpos, siRNA etc.) que bloqueiam a atividade de um ou mais polipeptídeos de interesse ou que bloqueiam a atividade de um ou mais polipeptídeos receptores de interesse. Em várias modalidades, animais não humanos, como descrito neste documento, são usados para determinar o perfil de ligação de antagonistas e/ou agonistas de um ou mais polipeptídeos de interesse. Em algumas modalidades, animais não humanos, como descrito neste documento, são usados para determinar o epítopo ou epítopos de um ou mais anticorpos terapêuticos candidatos que se ligam a um ou mais polipeptídeos de interesse.
[00343] Em várias modalidades, animais não humanos, como descrito neste documento, são usados para determinar os perfis farmacocinéticos de um ou mais candidatos a anticorpos humanos. Em várias modalidades, um ou mais animais não humanos, conforme descrito neste documento e um ou mais animais não humanos de controle ou referência são expostos a um ou mais candidatos a anticorpos humanos em várias doses (por exemplo, 0,1 mg/kg, 0,2 mg/kg, 0,3 mg/kg, 0,4 mg/kg, 0,5 mg/kg, 1 mg/kg, 2 mg/kg, 3 mg/kg, 4
190 / 308 mg/kg, 5 mg/mg, 7,5 mg/kg, 10 mg/kg, 15 mg/kg, 20 mg/kg, 25 mg/kg, 30 mg/kg, 40 mg/kg, ou 50 mg/kg ou mais). Os anticorpos terapêuticos candidatos podem ser dosados através de qualquer via de administração desejada, incluindo vias de administração parentérica e não parenteral. As vias parentéricas incluem, por exemplo, vias de injeção intravenosa, intra- arterial, intraportal, intramuscular, subcutânea, intraperitoneal, intraespinal, intratecal, intracerebroventricular, intracraniana, intrapleural ou outras. As vias não parentéricas incluem, por exemplo, oral, nasal, transdérmica, pulmonar, retal, bucal, vaginal, ocular. A administração também pode ser por infusão contínua, administração local, liberação sustentada de implantes (géis, membranas ou similares) e/ou injeção intravenosa. O sangue é isolado de animais não humanos (humanizados e controle) em vários momentos (por exemplo, 0 h, 6 h, 1 dia, 2 dias, 3 dias, 4 dias, 5 dias, 6 dias, 7 dias, 8 dias, 9 dias, 10 dias, 11 dias ou até 30 ou mais dias). Vários ensaios podem ser realizados para determinar os perfis farmacocinéticos de anticorpos terapêuticos candidatos administrados usando amostras obtidas de animais não humanos, como descrito neste documento, incluindo, mas não se limitando a IgG total, resposta a anticorpos antiterapêuticos, aglutinação, etc.
[00344] Em várias modalidades, animais não humanos, como descrito neste documento, são usados para medir o efeito terapêutico de bloquear ou modular a atividade de um polipeptídeo de interesse e o efeito na expressão gênica como resultado de alterações celulares ou, no contexto de um polipeptídeo receptor, a densidade de um polipeptídeo receptor na superfície das células nos animais não humanos. Em várias modalidades, um animal não humano como descrito neste documento ou células isoladas a partir dele são expostas a um candidato terapêutico que se liga a um polipeptídeo de interesse e, após um período subsequente de tempo, analisado quanto aos efeitos em processos celulares específicos que estão associados ao referido polipeptídeo de interesse, por exemplo, interações ligante-receptor ou
191 / 308 transdução de sinal.
[00345] Os animais não humanos, conforme descrito neste documento, expressam regiões variáveis de anticorpos humanos, portanto, células, linhagens celulares e culturas de células podem ser geradas para servir como fonte de regiões variáveis de anticorpos humanos para uso em ensaios funcionais e de ligação, por exemplo, para ensaio de ligação ou função de um antagonista ou agonista, particularmente quando o antagonista ou agonista é específico para um antígeno humano de interesse ou específico para um epítopo que funciona na interação ligante-receptor (ligação). Em várias modalidades, os epítopos ligados pelos anticorpos terapêuticos candidatos ou siRNAs podem ser determinados usando células isoladas de animais não humanos, como descrito neste documento.
[00346] As células de animais não humanos fornecidas podem ser isoladas e usadas ad hoc, ou podem ser mantidas em cultura por muitas gerações. Em várias modalidades, as células de um animal não humano fornecido são imortalizadas (por exemplo, através do uso de um vírus) e mantidas em cultura indefinidamente (por exemplo, nas culturas em série).
[00347] Em algumas modalidades, uma célula não humana é um linfócito não humano. Em algumas modalidades, uma célula não humana é selecionada a partir de uma célula B, célula dendrítica, macrófago, monócito e uma célula T. Em algumas modalidades, uma célula não humana é uma célula B imatura, uma célula B ingênua madura, uma célula B ativada, uma célula B de memória e/ou uma célula plasmática.
[00348] Em algumas modalidades, uma célula não humana é uma célula-tronco embrionária (ES) não humana. Em algumas modalidades, uma célula ES não humana é uma célula ES de roedor. Em algumas modalidades, uma célula ES de roedor é uma célula ES de camundongo e é de uma cepa 129, cepa C57BL, BALB/c ou uma mistura destas. Em algumas modalidades, uma célula-tronco embrionária de roedor é uma célula-tronco embrionária de
192 / 308 camundongo e é uma mistura de cepas 129 e C57BL. Em algumas modalidades, uma célula-tronco embrionária de roedor é uma célula-tronco embrionária de camundongo e é uma mistura de cepas 129, C57BL e BALB/c.
[00349] Em algumas modalidades, é fornecida a utilização de uma célula ES não humana, como descrito neste documento, para produzir um animal não humano. Em algumas modalidades, uma célula ES não humana é uma célula ES de camundongo e é usada para fazer um camundongo compreendendo o locus de cadeia leve κ de imunoglobulina manipulada, como descrito neste documento. Em algumas certas modalidades, uma célula ES não humana é uma célula ES de rato e é usada para fazer um rato compreendendo o locus de cadeia leve κ de imunoglobulina manipulada, como descrito neste documento.
[00350] Em algumas modalidades, um tecido não humano é selecionado a partir de adiposo, bexiga, cérebro, mama, medula óssea, olho, coração, intestino, rim, fígado, pulmão, linfonodo, músculo, pâncreas, plasma, soro, pele, baço, estômago, timo, testículo, óvulo e uma combinação destes.
[00351] Em algumas modalidades, é fornecida uma célula imortalizada produzida, gerada, produzida ou obtida a partir de uma célula ou tecido não humano isolado, como descrito neste documento.
[00352] Em algumas modalidades, um embrião não humano produzido, gerado, produzido ou obtido a partir de uma célula ES não humana, conforme descrito neste documento, é fornecido. Em algumas modalidades, um embrião não humano é um embrião de roedor; em algumas modalidades, um embrião de camundongo; em algumas modalidades, um embrião de rato.
[00353] Animais não humanos, como descrito neste documento, fornecem um sistema in vivo para a geração de variantes de regiões variáveis de anticorpos humanos que se ligam a um polipeptídeo de interesse (por exemplo, variantes do domínio Vλ humana). Tais variantes incluem regiões
193 / 308 variáveis de anticorpos humanos com uma funcionalidade, especificidade, baixa reatividade cruzada com um epítopo comum compartilhado por duas ou mais variantes de um polipeptídeo de interesse. Em algumas modalidades, animais não humanos, como descrito neste documento, são empregados para gerar painéis de regiões variáveis de anticorpos humanos que contêm uma série de regiões variáveis variantes que são rastreadas para uma funcionalidade desejada ou aprimorada.
[00354] Animais não humanos, como descrito neste documento, fornecem um sistema in vivo para gerar bibliotecas de regiões variáveis de anticorpos humanos (por exemplo, uma biblioteca de domínio Vλ humana). Essas bibliotecas fornecem uma fonte para sequências de regiões variáveis de cadeia pesada e/ou leve que podem ser enxertadas em diferentes regiões Fc com base em uma função efetora desejada, usada como fonte para maturação por afinidade da sequência de região variável usando técnicas conhecidas na técnica (por exemplo, mutagênese direcionada ao sítio, PCR propensa a erros, etc.) e/ou usada como fonte de componentes de anticorpos para a geração de moléculas terapêuticas baseadas em anticorpos, como, por exemplo, receptores quiméricos de antígeno (ou seja, uma molécula projetada usando anticorpo componentes, por exemplo, um scFv), agentes de ligação multiespecíficos (por exemplo, agentes de ligação biespecíficas) e proteínas de fusão (por exemplo, anticorpos de domínio único, scFvs, etc.).
[00355] Em algumas modalidades, é fornecido um método para produzir um anticorpo em um animal não humano, o método compreendendo as etapas de (a) imunizar um animal não humano como descrito neste documento com um antígeno de interesse; (b) manter o animal não humano em condições suficientes para que o animal não humano produza uma resposta imune ao antígeno de interesse; e (c) recuperar um anticorpo do animal não humano, ou uma célula não humana, que se liga ao antígeno de interesse.
194 / 308
[00356] Em algumas modalidades de um método de produção de um anticorpo em um animal não humano, uma célula não humana é uma célula B. Em algumas modalidades de um método de produção de um anticorpo em um animal não humano, uma célula não humana é um hibridoma.
[00357] Em algumas modalidades, é fornecido um animal não humano cujo genoma da linhagem germinativa compreende um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina homogênea endógena homozigótica compreendendo (i) humano Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9- 49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2- 14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 ou qualquer combinação destes, (ii) humano J Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes, e (iii) um gene Cλ não humano ou humano, em que (i)- (iii) estão operacionalmente ligados um ao outro, o gene Cλ não humano ou humano é inserido no lugar de um gene Cκ não humano do locus de cadeia leve κ da imunoglobulina endógena, o (s) segmento (s) gênicos de Vλ humana (s) incluem DNA não codificante humano que aparece naturalmente adjacente aos segmentos gênicos de Vλ humana correspondente num locus de cadeia leve λ humana endógena e o (s) segmento (s) gênico de Jλ humana incluem DNA não codificante humano que aparece naturalmente adjacente aos segmentos gênicos de Vλ humana correspondentes em um locus de cadeia leve λ endógena humana. Em algumas modalidades de um animal não humano fornecido, um gene Cλ não humano é ou compreende um gene Cλ1 de camundongo. Em algumas certas modalidades de um animal não humano fornecido, um gene Cλ humana é ou compreende um gene Cλ2 humano. Em algumas certas modalidades de um animal não humano fornecido, o locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena compreende ainda potenciadores de cadeia leve κ de imunoglobulina não humana Eκi e 3' Eκ. Em algumas modalidades de um animal não humano fornecido, o locus de cadeia leve κ de
195 / 308 imunoglobulina endógena inclui uma deleção de segmentos gênicos Vκ e Jκ não humanos.
[00358] Em algumas modalidades, é fornecido um anticorpo preparado por um método, compreendendo as etapas de: (a) fornecer um animal não humano como descrito neste documento; (b) imunizar o animal não humano com um antígeno de interesse; (c) manter o animal não humano em condições suficientes para que o animal não humano produza uma resposta imune ao antígeno de interesse; e (d) recuperar um anticorpo do animal não humano, ou uma célula não humana, que se liga ao antígeno de interesse, em que o anticorpo de (d) inclui os domínios VH e Vλ humanas.
[00359] Em algumas modalidades de um anticorpo preparado por um método, um domínio VH humano codificado por uma região variável de cadeia pesada humana rearranjada compreendendo uma VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3- 53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3- 20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2 VH6-1, ou variante humana ou somaticamente hipermutada deste.
[00360] Em algumas modalidades de um anticorpo preparado por um método, um domínio Vλ humana codificado por uma região variável de cadeia leve λ humana reorganizada compreendendo uma Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3- 25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 Vλ3-1, ou variante humana ou somaticamente hipermutada deste.
[00361] Em algumas modalidades, um animal não humano, célula não humana ou tecido não humano, conforme descrito neste documento, é
196 / 308 fornecido para uso na fabricação e/ou desenvolvimento de um fármaco (por exemplo, um anticorpo ou fragmento do mesmo) para terapia ou diagnóstico.
[00362] Em algumas modalidades, um animal não humano, célula não humana ou tecido não humano, como descrito neste documento, é fornecido para uso na fabricação de um medicamento para o tratamento, prevenção ou melhoria de uma doença, distúrbio ou condição.
[00363] Em algumas modalidades, é fornecido o uso de um animal não humano, célula não humana ou tecido não humano, conforme descrito neste documento na fabricação e/ou desenvolvimento de um fármaco ou vacina para uso em medicamentos, como o uso como medicamento.
[00364] Em algumas modalidades, é fornecida a utilização de um animal ou célula não humana, como descrito neste documento na fabricação e/ou desenvolvimento de um anticorpo ou fragmento deste.
[00365] Animais não humanos, como descrito neste documento, fornecem um sistema in vivo para a análise e teste de um fármaco ou vacina. Em várias modalidades, um fármaco ou vacina candidato pode ser entregue a um ou mais animais não humanos, como descrito neste documento, seguido pelo monitoramento dos animais não humanos para determinar uma ou mais da resposta imune ao fármaco ou vacina, a segurança perfil do fármaco ou vacina, ou o efeito sobre uma doença ou condição e/ou um ou mais sintomas de uma doença ou condição. Métodos exemplares usados para determinar o perfil de segurança incluem medições de toxicidade, concentração ideal de dose, resposta de anticorpos (isto é, antifármacos), eficácia do fármaco ou vacina e possíveis fatores de risco. Tais fármacos ou vacinas podem ser aprimorados e/ou desenvolvidos nesses animais não humanos.
[00366] A eficácia da vacina pode ser determinada de várias maneiras. Resumidamente, os animais não humanos como descritos neste documento são vacinados usando métodos conhecidos na técnica e, em seguida, desafiados com uma vacina ou uma vacina é administrada a animais não
197 / 308 humanos já infectados. A resposta de um(ns) animal(is) não humano(s) a uma vacina pode ser medida pela monitoração e/ou realização de um ou mais ensaios no(s) animal(is) não humano(s) (ou células isoladas) para determinar a eficácia da vacina. A resposta de um animal(is) não humano(s) à vacina é então comparada com animais de controle, usando uma ou mais medidas conhecidas na técnica e/ou descritas neste documento.
[00367] A eficácia da vacina pode ainda ser determinada por ensaios de neutralização viral. Resumidamente, animais não humanos como descritos neste documento são imunizados e o soro é coletado em vários dias após a imunização. As diluições em série do soro são pré-incubadas com um vírus, durante o qual os anticorpos no soro específicos para o vírus se ligam a ele. A mistura de vírus/soro é então adicionada às células permissivas para determinar a infectividade por um ensaio de placa ou ensaio de microneutralização. Se os anticorpos no soro neutralizarem o vírus, haverá menos placas ou unidades relativas de luciferase mais baixas em comparação com um grupo de controle.
[00368] Animais não humanos, como descrito neste documento, produzem regiões variáveis de anticorpos humanos e, portanto, fornecem um sistema in vivo para a produção de anticorpos humanos para uso em aplicações de diagnóstico (por exemplo, imunologia, sorologia, microbiologia, patologia celular, etc.). Em várias modalidades, animais não humanos, como descrito neste documento, podem ser utilizados para produzir regiões variáveis de anticorpos humanos que se ligam aos sítios antigênicos relevantes para identificação de alterações celulares, como, por exemplo, expressão de marcadores específicos da superfície celular indicativos de alterações patológicas. Tais anticorpos podem ser conjugados com várias entidades químicas (por exemplo, um marcador radioativo) e ser empregados em vários ensaios in vivo e/ou in vitro, conforme desejado.
[00369] Animais não humanos, como descrito neste documento,
198 / 308 fornecem um sistema in vivo aprimorado para desenvolvimento e seleção de anticorpos humanos para uso em oncologia e/ou doenças infecciosas. Em várias modalidades, animais não humanos como descritos neste documento e controlam animais não humanos (por exemplo, tendo uma modificação genética diferente da descrita neste documento ou nenhuma modificação genética, ou seja, do tipo selvagem) podem ser implantados com um tumor (ou células tumorais) ou infectadas com um vírus (por exemplo, influenza, HIV, HCV, HPV, etc.). Após o implante da infecção, animais não humanos podem receber uma terapêutica candidata. O tumor ou vírus pode ter tempo suficiente para ser estabelecido em um ou mais locais dentro dos animais não humanos antes da administração de um candidato terapêutico. Alternativamente, e/ou adicionalmente, a resposta imune pode ser monitorada em animais não humanos, de modo a caracterizar e selecionar potenciais anticorpos humanos que podem ser desenvolvidos como um terapêutico. Composições Farmacêuticas
[00370] Em algumas modalidades, um anticorpo, um ácido nucleico ou uma porção terapeuticamente relevante produzida por um animal não humano divulgado neste documento ou derivado de um anticorpo, um ácido nucleico ou uma porção terapeuticamente relevante produzida por um animal não humano divulgado neste documento pode ser administrado a um sujeito (por exemplo, um sujeito humano). Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica inclui um anticorpo produzido por um animal não humano divulgado neste documento. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica pode incluir um tampão, um diluente, um excipiente ou qualquer combinação destes. Em algumas modalidades, uma composição, se desejado, também pode conter uma ou mais substâncias terapeuticamente ativas adicionais.
[00371] Embora as descrições das composições farmacêuticas fornecidas neste documento sejam direcionadas principalmente a
199 / 308 composições farmacêuticas que são adequadas para administração ética aos humanos, será entendido por aqueles versados na técnica que essas composições geralmente são adequadas para administração a animais de todos os tipos. Modificação de composições farmacêuticas adequadas para administração a seres humanos a fim de tornar as composições apropriadas para administração a animais diferentes é bem compreendida, e o farmacologista veterinário ordinariamente versado na técnica pode conceber e/ou efetuar essa modificação com experimentação meramente normal, se houver.
[00372] Por exemplo, uma composição farmacêutica fornecida neste documento podem ser fornecidas numa forma injetável esterilizada (por exemplo, uma forma que seja adequada para injeção subcutânea ou para infusão intravenosa). Por exemplo, em algumas modalidades, uma composição farmacêutica é fornecida em uma forma de dosagem líquida que é adequada para injeção. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica é fornecida como pó (por exemplo, liofilizado e/ou esterilizado), opcionalmente sob vácuo, que pode ser reconstituído com um diluente aquoso (por exemplo, água, tampão, solução salina, etc.) antes da injeção. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica é diluída e/ou reconstituída em água, solução de cloreto de sódio, solução de acetato de sódio, solução de álcool benzílico, solução salina tamponada com fosfato, etc. Em algumas modalidades, um pó deve ser misturado suavemente com o diluente aquoso (por exemplo, não agitado).
[00373] As formulações das composições farmacêuticas descritas neste documento podem ser preparadas por qualquer método conhecido ou daqui em diante desenvolvido na técnica da farmacologia. Em geral, tais métodos de preparação incluem a etapa de trazer o ingrediente ativo em associação com um diluente ou outro excipiente e/ou um ou mais de outros ingredientes acessórios, e depois, se necessário e/ou desejável, conformar e/ou embalar o
200 / 308 produto numa unidade desejada única ou multidose.
[00374] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica incluindo um anticorpo produzido por um animal não humano divulgado neste documento pode ser incluída em um recipiente para armazenamento ou administração, por exemplo, um frasco, uma seringa (por exemplo, uma seringa IV) ou uma bolsa (por exemplo, uma bolsa intravenosa). Uma composição farmacêutica de acordo com a presente divulgação pode ser preparada, embalada e/ou vendida a granel, como uma dose unitária única, e/ou como uma pluralidade de doses unitárias. Tal como utilizado neste documento, uma "dose unitária" é uma quantidade discreta da composição farmacêutica compreendendo uma quantidade pré-determinada do ingrediente ativo. A quantidade do ingrediente ativo é geralmente igual à dosagem do ingrediente ativo que seria administrada a um sujeito e/ou uma fracção conveniente de uma dose tal como, por exemplo, metade ou um terço de uma tal dosagem.
[00375] As quantidades relativas do ingrediente ativo, excipiente farmaceuticamente aceitável, e/ou de quaisquer ingredientes adicionais numa composição farmacêutica de acordo com a divulgação vão variar, dependendo da identidade, tamanho, e/ou estado do indivíduo tratado e ainda dependendo da via pela qual a composição é para ser administrada. A título de exemplo, a composição pode compreender entre 0,1% e 100% (em p/p) de ingrediente ativo.
[00376] Uma composição farmacêutica podem compreender adicionalmente um excipiente farmaceuticamente aceitável, o qual, tal como utilizado neste documento, inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, diluentes, ou outros veículos líquidos, de dispersão ou de suspensão auxiliares, agentes ativos de superfície, agentes isotônicos, agentes espessantes ou emulsionantes, conservantes, vinculantes sólidos, lubrificantes e semelhantes, conforme adequado para a forma de dosagem particular
201 / 308 desejada. Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 21ª Edição, AR Gennaro, (Lippincott, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 2006) descreve vários excipientes utilizados na formulação de composições farmacêuticas e técnicas conhecidas para a preparação dos mesmos. Exceto na medida em que qualquer meio excipiente convencional seja incompatível com uma substância ou seus derivados, como por exemplo, produzindo qualquer efeito biológico indesejável ou interagindo de maneira prejudicial com qualquer outro componente da composição farmacêutica, seu uso é contemplado o escopo desta divulgação.
[00377] Em algumas modalidades, um excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% puro. Em algumas modalidades, um excipiente está aprovado para utilização em seres humanos e para utilização veterinária. Em algumas modalidades, um excipiente pode ser aprovado pela United States Food and Drug Administration. Em algumas modalidades, um excipiente é de grau farmacêutico. Em algumas modalidades, um excipiente pode satisfazer os padrões da Farmacopeia dos Estados Unidos (USP), da Farmacopeia Europeia (EP), a Farmacopeia Britânica, e/ou da Farmacopeia Internacional.
[00378] Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis utilizados na fabricação de composições farmacêuticas incluem, mas não estão limitados aos diluentes inertes, agentes dispersantes e/ou granulação, agentes surfactantes e/ou emulsionantes, agentes desintegrantes, agentes aglutinantes, conservantes, agentes de tamponamento, agentes lubrificantes, e/ou óleos. Tais excipientes podem opcionalmente ser incluídos em formulações farmacêuticas. Excipientes tais como manteiga de cacau e ceras para supositórios, agentes corantes, agentes de revestimento, edulcorantes, aromatizantes, e/ou agentes perfumantes podem estar presentes na composição, de acordo com o julgamento do formulador.
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[00379] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica fornecida compreende um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis (por exemplo, conservante, diluente inerte, agente dispersante, agente ativo de superfície e/ou emulsificante, agente tampão etc.). Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica compreende um ou mais conservantes. Em algumas modalidades, as composições farmacêuticas não compreendem conservante.
[00380] Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica é fornecida em uma forma que pode ser refrigerada e/ou congelada. Em algumas modalidades, uma composição farmacêutica é fornecida em uma forma que não pode ser refrigerada e/ou congelada. Em algumas modalidades, soluções reconstituídas e/ou formas de dosagem líquidas podem ser armazenadas por um certo período de tempo após a reconstituição (por exemplo, 2 horas, 12 horas, 24 horas, 2 dias, 5 dias, 7 dias, 10 dias, 2 semanas, um mês, dois meses ou mais). Em algumas modalidades, o armazenamento de composições de anticorpos por mais tempo que o tempo especificado resulta na degradação do anticorpo.
[00381] Formas de dosagem líquidas e/ou soluções reconstituídas podem compreender material particulado e/ou descoloração antes da administração. Em algumas modalidades, uma solução não deve ser usada se descolorida ou turva e/ou se o material particulado permanecer após a filtração.
[00382] Considerações gerais na formulação e/ou fabricação de agentes farmacêuticos podem ser encontradas, por exemplo, em Remington: The Science and Practice of Pharmacy 21ª ed., Lippincott Williams & Wilkins,
2005. Kits
[00383] A presente divulgação fornece ainda uma embalagem ou kit compreendendo um ou mais recipientes preenchido com pelo menos um
203 / 308 animal não humano, célula não humana, fragmento de DNA, vetor de direcionamento ou qualquer combinação dos mesmos, como descrito neste documento. Os kits podem ser usados em qualquer método aplicável (por exemplo, um método de pesquisa). Opcionalmente associado a esse(s) recipiente(s), pode haver um aviso na forma prescrita por uma agência governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos ou biológicos, aviso que reflete (a) a aprovação da agência de fabricação, uso ou venda para administração humana, (b) instruções de uso e/ou (c) um contrato que governe a transferência de materiais e/ou produtos biológicos (por exemplo, um animal não humano ou célula não humana, conforme descrito neste documento) entre dois ou mais entidades e suas combinações.
[00384] Em algumas modalidades, é fornecido um kit que compreende um animal não humano, célula não humana, tecido não humano, célula imortalizada, célula ES não humana ou embrião não humano, conforme descrito neste documento. Em algumas modalidades, um kit compreendendo um aminoácido (por exemplo, um anticorpo ou fragmento deste) de um animal não humano, célula não humana, tecido não humano, célula imortalizada, célula ES não humana ou embrião não humano como descrito neste documento é fornecido. Em algumas modalidades, um kit compreendendo um ácido nucleico (por exemplo, um ácido nucleico que codifica um anticorpo ou fragmento do mesmo) de um animal não humano, célula não humana, tecido não humano, célula imortalizada, célula ES não humana ou é fornecido embrião não humano como descrito neste documento. Em algumas modalidades, um kit compreendendo uma sequência (sequência de aminoácidos e/ou ácido nucleico) identificada a partir de um animal não humano, célula não humana, tecido não humano, tecido não humano, célula imortalizada, célula ES não humana ou não humano embrião como descrito neste documento é fornecido.
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[00385] Em algumas modalidades, é fornecido um kit conforme descrito neste documento para uso na fabricação e/ou desenvolvimento de um fármaco (por exemplo, um anticorpo ou fragmento deste) para terapia ou diagnóstico.
[00386] Em algumas modalidades, é fornecido um kit conforme descrito neste documento para uso na fabricação e/ou desenvolvimento de um fármaco (por exemplo, um anticorpo ou fragmento deste) para o tratamento, prevenção ou melhoria de uma doença, distúrbio ou condição.
[00387] Outras características de certas modalidades tornar-se-ão evidentes no decurso das seguintes descrições de modalidades exemplares, que são fornecidas para ilustração e não se destinam a ser limitativas.
[00388] Os exemplos a seguir são fornecidos para descrever ao versado na técnica como fazer e usar métodos e composições descritos neste documento, e não se destinam a limitar o escopo do que os inventores da presente divulgação consideram sua invenção. Salvo indicação em contrário, a temperatura é indicada em graus Celsius e a pressão é igual ou próxima à atmosférica. Exemplo 1. Construção de vetores de direcionamento para gerar um roedor que expressa pelo menos uma cadeia leve lambda a partir de um locus de cadeia leve kappa Exemplo 1.1: Manipulação de um vetor de direcionamento compreendendo uma região constante de roedor lambda
[00389] Este exemplo ilustra métodos exemplares de construção de um vetor de direcionamento para inserção no genoma de um animal não humano, como um roedor (por exemplo, um camundongo). Além disso, este exemplo demonstra a produção de um animal não humano cujo genoma da linhagem germinativa compreende um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina manipulada. Em particular, este exemplo demonstra a construção de um vetor
205 / 308 de direcionamento para a manipulação de um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena em um roedor, de modo que o roedor expresse e/ou produza anticorpos que incluam cadeias leves λ de imunoglobulina com regiões variáveis humanas e constante de λ imunoglobulina não humana (Cλ) regiões do referido locus de cadeia leve κ da imunoglobulina no genoma da linhagem germinativa do animal não humano.
Como descrito abaixo no Exemplo 2, fragmentos de DNA contendo várias sequências de codificação Jλ humanas (por exemplo, Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 e Jλ7) e uma sequência de codificação de roedor Cλ (por exemplo, um camundongo Cλ1) são inseridas em um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina de roedor endógeno.
Nas modalidades exemplificativas particulares, um gene Cλ1 de camundongo é inserido no lugar de um gene Cκ de camundongo e em ligação operável com potenciadores Ig de roedores (por exemplo, Eκi e 3'Eκ). Uma estratégia exemplar para a criação de um vetor de direcionamento para gerar um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina manipulada em um roedor caracterizado pela presença de uma pluralidade de segmentos gênicos de Vλ e Jλ humanas operacionalmente ligados a um gene Cλ de roedor (por exemplo, camundongo) e operacionalmente ligado aos potenciadores Ig endógenas são apresentados na Figura 1 (Figura 1A: etapas iniciais de construção do vetor alvo; Figura 1B: etapas subsequentes adicionais de construção de um vetor alvo; é indicada uma sequência de cadeia leve κ de imunoglobulina humana entre os segmentos gênicos de humanos Vλ e Jλ por uma barra aberta arquivada com amplas linhas diagonais descendentes (por exemplo, ver as patentes US N°s 9.006.511, 9.035.128, 9.066.502, 9.150.662 e 9.163.092), lox:lox2372; NEO: gene de resistência à neomicina (neoR) sob controle transcricional de um promotor de ubiquitina, HYG: Gene de resistência à higromicina (hygR) sob controle transcricional de um promotor de ubiquitina, Spec: Gene de resistência a espectinomicina (SpecR), origem de replicação R6K: R6K).
206 / 308
[00390] Um vetor de direcionamento contendo sequências codificantes Jλ humana e de roedores Cλ para inserção em um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina de roedores foi criado usando a tecnologia VELOCIGENE® (ver, por exemplo, Patente US N° 6.586.251 e Valenzuela et al., 2003, Nature Biotech. 21(6):652-9; incorporados neste documento por referência em sua totalidade) e técnicas de biologia molecular conhecidas na técnica. Aqueles versados na técnica, lendo o presente exemplo, compreenderão que as tecnologias e a abordagem descritas podem ser empregadas para utilizar qualquer sequência de codificação Jλ humana e Cλ, ou combinação de sequências de codificação (ou fragmentos de sequência), conforme desejado.
[00391] Resumidamente, um fragmento de DNA de 2,7kb contendo os segmentos gênicos de Jλ humana Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 e Jλ7 das regiões de sobreposição únicas 5' e 3' correspondentes a uma sequência genômica Vκ-Jκ humano (não codificante) e uma sequência genômica 5' de um gene Cκ de camundongo, respectivamente, foi produzido por síntese de DNA de novo (pA; Figura 1A, canto superior esquerdo, Blue Heron Biotech, Bothell, WA). Vários sítios de reconhecimento de enzimas de restrição foram incluídos no fragmento de DNA para facilitar a subsequente clonagem de marcadores de seleção e outros fragmentos de DNA (descritos abaixo). O fragmento de DNA foi concebido de forma única para conter sequências Jκ humano não codificantes justapostas com sequências codificantes Jλ humana e sequências de sinais de recombinação Jλ humana (RSS). Como é conhecido na técnica, um RSS consiste em um bloco conservado de sete nucleotídeos (heptâmero) seguido por um espaçador com 12 ou 23 pares de bases de comprimento e seguido por um segundo bloco conservado de nove nucleotídeos (nonâmero). Assim, um RSS possui uma configuração de 7-12-9 (12RSS) ou 7-23-9 (23RSS), dependendo do segmento genético associado (veja, por exemplo, Figura 5.4 em Murphy, Kenneth, et al. “Chapter 5.” Janeway's Immunobiology, 8ª ed., Garland Science/Taylor & Francis Group, LLC, 2012,
207 / 308 que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade). Em particular, os segmentos gênicos de Jλ humana (isto é, sequências de codificação Jλ humana) e seus 12RSS associados foram substituídos no lugar dos segmentos gênicos de Jκ humano (isto é, sequências de codificação Jκ humano) e seus 23RSS associados. Assim, este fragmento continha sequências de DNA Jλ e Jκ humanos. A inclusão de tais sequências nos vetores de direcionamento descritos neste documento pode proporcionar (ou promover) a união eficiente de segmentos gênicos de Vλ e Jλ humanas dentro de um locus de cadeia leve Ig do roedor manipulado.
[00392] O plasmídeo A (pA) foi digerido com AgeI e EcoRI e ligado a um cassete de seleção de Neomicina (isto é, um gene NeoR sob controle de um promotor de ubiquitina ladeado por sítios lox2372) contendo extremidades compatíveis para criar o plasmídeo B (pB) (Figura 1A). Separadamente, fragmentos de DNA únicos contendo um potenciador intrônico Ig de camundongo (Ei), um gene Cλ1 de camundongo (do clone BAC RP23- 60e14), um fragmento de DNA contendo 316 pb de sequência imediatamente a jusante de uma sequência de codificação Cκ de camundongo e 80pb de sequência de sobreposição para facilitar montagem isotérmica e sítios de reconhecimento de enzimas de restrição (NotI, MluI) para facilitar as etapas subsequentes de clonagem, e um R6K-Spec (um gene de Espectinomicina Adenilitransferase e uma origem de replicação R6K) foram amplificados por reação em cadeia da polimerase (PCR) e combinados por isotérmica montagem (ver, por exemplo, Gibson, DG et.al., 2009, Nat. Meth. 6(5):343-5; Gibson, D.G. et al., 2010, Nat. Meth. 7:901-903; incorporado por referência em sua totalidade neste documento) para criar o plasmídeo C (pC), que foi subsequentemente digerido com NotI e MluI e ligado a um cassete de seleção de higromicina (isto é, um gene HygR sob controle de um promotor de ubiquitina flanqueado por sítios loxP) contendo extremidades compatíveis para criar o plasmídeo D (pD; Figura 1A, superior e meio à direita). Este
208 / 308 plasmídeo resultante (pD; Figura 1A, meio) foi então digerido com PI-SceI e AscI e ligado ao plasmídeo B (pB) contendo extremidades compatíveis (Figura 1A, inferior) para gerar o plasmídeo E (pE).
[00393] Em uma próxima etapa, um vetor de direcionamento contendo segmentos gênicos de Vλ e Jλ humanas operacionalmente ligados a um gene Cκ de camundongo e uma sequência de cadeia leve κ de imunoglobulina humana posicionada entre os segmentos gênicos de Vλ e Jλ humanas (ver, por exemplo, Patente US N° 9.006.511, que é incorporado neste documento por referência na sua totalidade) foi digerido separadamente com NotI e religado para remover a região Vλ humana incluindo uma sequência κ de imunoglobulina humana (Figura 1B, parte superior), que resultou em uma deleção de ~137kb. O construto resultante (construto F) foi combinado com o plasmídeo E (pE) usando um método de montagem isotérmica CRISPR/Cas9 (ver, por exemplo, Patente US N° 9.738.897 e Publicação US N° 2016/0145646; incorporado neste documento por referência em sua totalidade), de modo que a região Jκ humana com a sequência de codificação Jλ-12RSS humana (CDS) esteja operacionalmente ligada a uma região intergênica (não codificante) de Vκ-Jκ humanos (ver, por exemplo, Patente US N° 9.006.511, que é incorporada neste documento por referência em sua totalidade) e um potenciador de Igκ 3' de camundongo (Figura 1B). Clones bacterianos positivos foram selecionados em meios contendo canamicina, higromicina e espectinomicina. O vetor de direcionamento resultante (construto G) continha, de 5' a 3', um sítio de reconhecimento de loxP, um sítio NotI, uma sequência intergênica de Vκ-Jκ humanos (ver, por exemplo, Patente US N° 9.006.511, que é incorporada por referência em sua totalidade neste documento), um cassete de seleção de neomicina flanqueada por sítios de reconhecimento lox2372, uma região Jκ humana com cinco segmentos gênicos de Jλ humana e seus respectivos 12RSS, um potenciador intrônico κ de imunoglobulina de camundongo (Eiκ), um gene Cλ1 de camundongo, um
209 / 308 cassete de seleção de higromicina flanqueado pelos sítios de reconhecimento de loxP, um potenciador de imunoglobulina κ 3' de camundongo (3' Eκ) e um cassete de seleção de Espectinomicina (Figura 1B). Exemplo 1.2. Manipulação de um vetor de direcionamento compreendendo uma região constante de humano lambda
[00394] Este exemplo ilustra métodos exemplares de construção de um vetor de direcionamento para inserção no genoma de um animal não humano, como um roedor (por exemplo, um camundongo). Além disso, este exemplo demonstra a produção de um animal não humano cujo genoma da linhagem germinativa compreende um locus de cadeia leve κde imunoglobulina manipulada. Em particular, este exemplo demonstra a construção de um vetor de direcionamento para a manipulação de um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena em um roedor, de modo que o roedor expresse e/ou produza anticorpos que incluam cadeias leves λ de imunoglobulina com regiões variáveis humanas e regiões constantes de λ imunoglobulina humana (Cλ) do referido locus de cadeia leve κ da imunoglobulina no genoma da linhagem germinativa do animal não humano. Como descrito abaixo no Exemplo 2, fragmentos de DNA contendo várias sequências de codificação Jλ humana (por exemplo, Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 e Jλ7) e uma sequência de codificação de Cλ humana (por exemplo, um camundongo Cλ2) são inseridas em um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina humana endógena. Em particular, um gene Cλ2 humano é inserido no lugar de um gene Cκ de camundongo e em ligação operável com potenciadores κ de imunoglobulina de roedores (por exemplo, Eiκ e 3'Eκ). Uma estratégia exemplar para a criação de um vetor de direcionamento é apresentada na Figura 3.
[00395] Um vetor de direcionamento contendo sequências codificantes Jλ humana e Cλ humana para inserção em um locus de cadeia leve κde Ig de roedores foi criado usando a tecnologia VELOCIGENE® (ver, por exemplo, Patente US N° 6.586.251 e Valenzuela et al., 2003, Nature Biotech.
210 / 308 21(6):652-9; incorporados neste documento por referência em sua totalidade) e técnicas de biologia molecular conhecidas na técnica. Aqueles versados na técnica, lendo o presente exemplo, compreenderão que as tecnologias e a abordagem descritas podem ser empregadas para utilizar sequência de codificação Jλ e Cλ humanas, ou combinação de sequências de codificação (ou fragmentos de sequência), conforme desejado.
[00396] Resumidamente, um fragmento de DNA de 871bp contendo uma sequência codificante de Cλ humana e regiões de sobreposição 5' e 3' únicas correspondentes às sequências genômicas 5' e 3' de um gene Cκ de camundongo, respectivamente, foi produzido por síntese de DNA de novo (pH; Figura 3, canto superior esquerdo, Blue Heron Biotech, Bothell, WA). Vários sítios de reconhecimento de enzimas de restrição foram incluídos no fragmento de DNA para permitir a subsequente clonagem de marcadores de seleção e outros fragmentos de DNA (descritos abaixo). O plasmídeo H (pH) foi digerido com AgeI e XhoI e ligado a uma fita de seleção de Higromicina (isto é, um gene HygR sob controle de um promotor de ubiquitina flanqueado pelos sítios loxP) contendo extremidades compatíveis para criar o plasmídeo J (pJ; Figura 3). Um construto intermediário (construto K, gerada a partir do construto F e plasmídeo B usando Cas9 e conjunto isotérmico) contendo uma região Jκ humana manipulada com sequências de codificação Jλ humanas (descritas acima) operacionalmente ligada a um gene Cκ de camundongo e potenciadores Ig de camundongo foi combinada com o plasmídeo J usando um método de montagem isotérmica CRISPR/Cas9 (ver, por exemplo, Patente US N° 9.738.897 e Publicação US N° 2016/0145646; incorporada por referência neste documento em sua totalidade) para que a região Jκ humana com a sequência de codificação Jλ-12RSS humana (CDS) foi operacionalmente ligado à sequência de codificação Cλ2 humana do plasmídeo J (Figura 3). Clones bacterianos positivos foram selecionados em meios contendo canamicina, higromicina e espectinomicina. O vetor de
211 / 308 direcionamento resultante (construto L) continha, de 5' a 3', um sítio de reconhecimento IoxP, um sítio NotI, uma sequência intergênica Vκ-Jκ humanas (ver, por exemplo, Patente US N° 9.006.511, que é incorporada por referência neste documento em sua totalidade), um cassete de seleção de neomicina flanqueada pelos sítios de reconhecimento lox2372, uma região Jκ humana com cinco segmentos gênicos de Jλ humana e seus respectivos 12RSS, um potenciador intrônico Ig de camundongo (Eiκ), um gene Cλ2 humano, um cassete de seleção de higromicina flanqueado pelos sítios de reconhecimento de loxP, um intensificador de imunoglobulinaκ 3' de camundongo (3' Eκ) e um cassete de seleção de Espectinomicina (Figura 3). Exemplo 2. Geração de roedores com um locus de cadeia leve manipulada
[00397] Este exemplo demonstra a produção de animais não humanos (por exemplo, roedores) cujo genoma da linhagem germinativa compreende um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena que compreende a inserção de uma pluralidade de segmentos gênicos de Vλ e Jλ humanas e um gene Cλ de roedor ou humana, segmentos gênicos de Vλ e Jλ humanas estão operacionalmente ligados ao referido gene Cλ de roedor ou humana, e qual gene Cλ de roedor ou humana é inserido no lugar de um gene de roedor Cκ de um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena. Tais animais não humanos são caracterizados, em algumas modalidades, pela expressão de cadeias leves λ de imunoglobulina (domínios variáveis e constantes) a partir de um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena.
[00398] A inserção direcionada dos vetores de direcionamento descritos nos Exemplos 1.1 e 1.2 foi confirmada por reação em cadeia da polimerase. O DNA BAC alvo, confirmado por reação em cadeia da polimerase, foi introduzido em células-tronco embrionárias (ES) de camundongo híbrido F1 (C57BL6NTac/129S6SvEvTac) através da eletroporação seguida por cultura em meio de seleção.
[00399] As células ES usadas para eletroporação do construto G
212 / 308 (camundongo Cλ1) tinham um genoma da linhagem germinativa que incluía um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina heterozigótica contendo uma pluralidade de segmentos gênicos de Vλ e Jλ humanas operacionalmente ligados a um gene da região constante da cadeia leve κ de imunoglobulina de roedor, incluindo potenciadores de cadeia leve κ de imunoglobulina de roedor e uma sequência de cadeia leve κ de imunoglobulina humana posicionada entre os segmentos gênicos de Vλ e Jλ humanas e um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina de roedor de tipo selvagem. As células ES antes e após a eletroporação estão representadas na Figura 2A (1741HET: um clone de célula ES de roedor com um genoma heterozigótico para um locus da cadeia leve k e imunoglobulina manipulada contendo segmentos gênicos Vλ e Jλ humanas operacionalmente ligados a um gene de região constante de cadeia leve k da imunoglobulina do roedor incluindo intensificadores de cadeia leve k imunoglobulina de roedor, e uma sequência de cadeia leve k de imunoglobulina humana posicionada entre os segmentos gênicos Vλ e Jλ humanas indicados por uma barra aberta arquivada com amplas linhas diagonais para baixo e loci de cadeia leve λ e imunoglobulina do tipo selvagem , por exemplo, ver as patentes US N°s 9.006.511, 9.035.128,
9.066.502, 9.150.662 e 9.163.092, que são incorporadas neste documento por referência em sua totalidade; 6557HET: um clone de células ES de camundongo após inserção do construto G, resultando em um genoma heterozigótico para um locus da cadeia leve k de imunoglobulina manipulada, incluindo intensificadores da cadeia leve k de imunoglobulina de roedor, que o locus da cadeia leve k de imunoglobulina manipulada é caracterizado pela presença de uma pluralidade de Vλ humana e segmentos gênicos Jλ, que segmentos gênicos humanos Jλ estão contidos em uma sequência da região Jλ humano com sequências codificadoras de segmento gênico humano Jλ e 12RSS humano no lugar das sequências codificadoras correspondentes do segmento gênico humano Jk e Jk humanos 23RSS, e quais segmentos gênicos
213 / 308 Vλ e Jλ humanos estão operacionalmente ligados a um gene da região constante da cadeia leve λ da imunoglobulina para roedores (por exemplo, mCλ1); lox: lox2372; NEO: gene de resistência à neomicina (neoR) sob controle transcricional de um promotor de ubiquitina; HYG: gene de resistência à higromicina (hygR) sob controle transcricional de um promotor de ubiquitina; as localizações dos conjuntos de primers/sondas selecionados para a triagem de clones de células ES são indicadas próximas às localizações das regiões dentro do locus da cadeia leve Ig manipulada detectada em um ensaio descrito abaixo).
[00400] As células ES usadas para eletroporação do construto L (Cλ2 humano) tinham um genoma da linhagem germinativa que incluía um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina heterozigótica contendo uma pluralidade de segmentos gênicos de Vλ e Jλ humanas operacionalmente ligados a um gene da região constante da cadeia leve κ de imunoglobulina de roedor, incluindo potenciadores de cadeia leve κ de imunoglobulina de roedor e uma sequência de cadeia leve κ de imunoglobulina humana posicionada entre os segmentos gênicos de Vλ e Jλ humanas e um locus de cadeia leve Ig de roedor de tipo selvagem. As células ES antes e após a eletroporação estão representadas na Figura 4A (1741HET: supra; 20029HET: um clone de células ES de camundongo após inserção de um vetor de direcionamento com um genoma heterozigótico para um locus de cadeia leve Ig manipulada, incluindo intensificadores de cadeia leve k de imunoglobulina para roedores, o qual o locus de cadeia leve k de Ig manipulada é caracterizado pela presença de uma pluralidade de segmentos gênicos Vλ e Jλ humanas, cujos segmentos gênicos Jλ humana estão contidos em uma sequência da região Jk humano com sequências codificantes de segmentos gênicos Jλ humana e Jλ 12RSS humana no lugar das sequências codificantes correspondentes do segmento gênicos de Jk humano e Jk 23RSS humano, e quais segmentos gênicos de Vλ e Jλ humanas estão operacionalmente ligados a um gene da região constante
214 / 308 da cadeia leve de Igλ humana (por exemplo, hCλ2) ; lox: lox2372; NEO: gene de resistência à neomicina (neoR) sob controle transcricional de um promotor de ubiquitina; HYG: gene de resistência a higromicina (hygR) sob controle transcricional de um promotor de ubiquitina; locais dos conjuntos de primer/sonda selecionados para triagem de clones de células ES são indicados próximo aos locais das regiões dentro do locus da cadeia leve de k de Ig manipulada detectada em um ensaio descrito abaixo).
[00401] Colônias resistentes aos fármacos foram coletadas 10 dias após a eletroporação e rastreadas por TAQMAN e cariotipagem para direcionamento correto, como descrito anteriormente (Valenzuela et al., Supra; Frendewey, D. et al., 2010, Methods Enzymol. 476:295-307; incorporados neste documento por referência em sua totalidade). A Tabela 1 apresenta conjuntos de primers/sondas exemplares usados para triar clones de células ES positivos (F: frente; R: reverso; P: sonda; GOA: ganho de alelo; LOA: perda de alelo; WT: tipo selvagem).
[00402] O método VELOCIMOUSE® (DeChiara, TM et al., 2010, Methods Enzymol. 476:285-294; DeChiara, TM, 2009, Methods Mol. Biol. 530:311-324; Poueymirou et al., 2007, Nat. Biotechnol. 25:91-99; incorporada por referência em sua totalidade neste documento), na qual células ES direcionadas foram injetadas em embriões Swiss Webster não compactados em estágio de 8 células, foi usada para produzir camundongos saudáveis da geração F0 derivados de células ES totalmente heterozigotos para o locus de cadeia leve Ig manipulada (Figura 2A e 4A). Camundongos heterozigotos de geração F0 foram cruzados com camundongos C57Bl6/NTac para gerar heterozigotos F1 que foram cruzados para produzir animais de geração F2 homozigotos para análises fenotípicas.
[00403] Alternativamente, as células ES murinas portadoras de um locus κ de imunoglobulina manipulada, conforme descrito acima, podem ser modificadas para remover um ou mais cassetes de seleção introduzidos com
215 / 308 um vetor de direcionamento conforme desejado (Figura 2B: 6557HET: supra; 6558HET: um clone de células ES de camundongo após excisão mediada por recombinase de cassetes de seleção de neomicina e higromicina inseridas após recombinação homóloga com um vetor de direcionamento; Figura 4B: 20029HET: supra; 20030HET: um clone de células ES de camundongo após excisão mediada por recombinase de cassetes de seleção de neomicina e higromicina inseridas após recombinação homóloga com um vetor de direcionamento. Cre: recombinase de Cre). Por exemplo, o cassete Neomicina e Higromicina introduzido pelos vetores de direcionamento pode ser removido nas células ES manipuladas (ou embriões) por expressão transitória de recombinase ou reproduzindo uma cepa geneticamente modificada que expressa recombinase (ver, por exemplo, Lakso, M. et al. 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 89: 6232-6; Orban, PC et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89:6861-5; Gu, H. et al., 1993, Cell 73(6):1155-64; Araki, K. et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:160-4; Dymecki, S.M., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(12):6191-6; todos incorporados por referência em sua totalidade neste documento).
[00404] Tomado em conjunto, este exemplo ilustra a geração de um roedor (por exemplo, um camundongo) cujo genoma da linhagem germinativa compreende um locus de cadeia leve Ig manipulada, caracterizado pela presença de uma pluralidade de segmentos gênicos de Vλ e Jλ humanas operacionalmente ligados a um gene Cλ de roedor ou humana, o qual gene Cλ de roedor ou humana é inserido no lugar de um gene Cκ de roedor de um locus de cadeia leve Ig endógena. Um locus de cadeia leve Ig manipulada como descrito inclui a pluralidade de segmentos gênicos de Vλ e Jλ humanas em um arranjo não endógeno. A estratégia descrita neste documento para inserir segmentos gênicos de Vλ e Jλ humanas e um gene Cλ de roedor ou humana no lugar de um gene Cκ de roedor, permite a construção de um roedor que expressa anticorpos que contêm exclusivamente domínios Vλ
216 / 308 humana.
Não ficou claro se um locus de cadeia leve Ig manipulado que inclui exclusivamente segmentos gênicos λ (fora do locus endógeno λ, em uma orientação não endógena) seria capaz de produzir cadeias leves funcionais.
Como descrito neste documento, esses domínios Vλ humanos são expressos a partir de loci de cadeia leve de Ig endógenos no genoma da linhagem germinativa dos roedores fornecidos.
Tabela 1. Conjuntos de primer/sonda representativos para triagem de clones de células ES positivas
Nome Sequência (5’ -3’) Ensaio
217 / 308 Exemplo 3. Caracterização de roedores no locus de cadeia leve de imunoglobulina modificada Exemplo 3.1. Avaliação fenotípica de células imunes em roedores com locus de cadeia leve de imunoglobulina manipulada
[00405] Este exemplo demonstra a caracterização de várias populações de células imunes em roedores (por exemplo, camundongos) manipulados para conter uma pluralidade de segmentos gênicos de Vλ e Jλ humanas ligados operacionalmente a um gene Cλ de roedor e regiões reguladoras e potenciadores de cadeia leve κ de imunoglobulina de roedores, dentro de um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena. Em particular, este exemplo demonstra especificamente que roedores que possuem loci de cadeia leve κ de imunoglobulina manipulada descritos neste documento exibem um perfil de expressão de cadeia leve exclusivo em comparação com roedores de tipo selvagem. Este exemplo também demonstra que os roedores fornecidos expressam um amplo repertório de regiões Vλ humana a partir do locus de cadeia leve κ da imunoglobulina manipulada.
[00406] Resumidamente, os baços e os fêmures foram coletados de camundongos do tipo selvagem (WT, 75% C57BL/6NTac 25% 129SvEvTac) e 6558HO (LiK homozigotos, 75% C57BL/6NTac 25% 129SvEvTac). A medula óssea foi coletada dos fêmures lavando com solução salina tamponada
218 / 308 com fosfato 1x (PBS, Gibco) com soro bovino fetal (FBS) a 2,5%. Os glóbulos vermelhos das preparações de baço e medula óssea foram lisados com tampão de lise ACK (Gibco) seguido de lavagem com 1xPBS com FBS a 2,5%.
[00407] As células isoladas (1x106) foram incubadas com coquetéis de anticorpos selecionados por 30 min a +4°C: anti-mIgκ-FITC (187,1, BD Biosciences), anti-mIgλ-PE (RML-42, BioLegend; 1060-09, Southern Biotech), anti-mIgλ-FITC (106002, Bio-Rad; ABIN303989, anticorpos on- line), IgM-PeCy7 anticamundongo (II/41, eBioscience), IgD-PerCP/Cy5.5 anticamundongo (11-26c.2a, BioLegend), CD3 anticamundongo azul do Pacífico (17A2, BioLegend), B220-APC anticamundongo (RA3-6B2, eBioscience), CD19-APC-H7 anticamundongo (ID3, BD Biosciences). Após a coloração, as células foram lavadas e fixadas em formaldeído a 2%. A aquisição dos dados foi realizada em um citômetro de fluxo BD LSRFORTESSA e analisada com o software FLOWJO. Os resultados representativos são apresentados nas Figuras 5-7.
[00408] Como mostrado nas Figuras 5 e 6, os camundongos LiK demonstram distribuições semelhantes de CD19+ e células B imaturas/maduras em comparação com camundongos do tipo selvagem nos compartimentos do baço e da medula óssea, respectivamente. No entanto, os camundongos LiK demonstram uma expressão única de cadeia leve em comparação com os camundongos do tipo selvagem, em que apenas a expressão de Igλ+ foi observada nesses camundongos (Figura 7). Em particular, >90% das células CD19+B em camundongos LiK expressam a cadeia leve λ da imunoglobulina, confirmando assim a recombinação e expressão adequadas no local κ da imunoglobulina manipulada. Como esperado, dado que esses camundongos não possuem um gene Cκ de camundongo, os camundongos LiK não demonstram expressão κ de imunoglobulina detectável por citometria de fluxo (isto é, o anticorpo anti-
219 / 308 mIgκ detecta a região constante). Níveis semelhantes de expressão de cadeia leve λ de imunoglobulina foram observados a partir de companheiros de ninhada de camundongos LiK adicionais (dados não mostrados). A expressão de regiões Vλ humanas no contexto de uma região Cλ de camundongo a partir do locus LiK foi confirmada por, entre outras coisas, análise de repertório de imunoglobulina usando técnicas de Sequenciamento de Próxima Geração (descritas no Exemplo 3.2 abaixo).
[00409] Exemplo 3.2. Repertório de imunoglobulina em roedores com locus de cadeia leve de imunoglobulina manipulada
[00410] A utilização de genes de anticorpos humanos (isto é, segmentos gênicos de VDJ) na cepa de roedor manipulada descrita acima foi determinada por análise de repertório de anticorpos de sequenciamento de próxima geração. Em particular, a sequenciação de RT-PCR foi conduzida em RNA isolado de esplenócitos de camundongos homozigotos para o locus LiK (6558 HO) para confirmar a transcrição e recombinação corretas do locus LiK. Uma ilustração representativa de um locus LiK reorganizado é apresentada na Figura 12 (locus LiK: locus de cadeia leve κ de imunoglobulina manipulada, conforme descrito neste documento; locus LiK rearranjados: rearranjo representativo do locus de cadeia leve κ da imunoglobulina manipulada (referido neste documento como "locus LiK") resultante na recombinação de Vλ-Jλ humanas; mRNA de LiK rearranjado: transcrição representativa e processamento de mRNA do locus de LiK rearranjado).
[00411] Resumidamente, as células B esplênicas foram positivamente enriquecidas a partir de esplenócitos totais por classificação magnética de células usando esferas magnéticas anti-CD19 de camundongo e colunas MACS® (Miltenyi Biotech). O RNA total foi isolado de células B esplênicas purificadas usando um kit de isolamento de RNA RNeasy Plus (Qiagen) de acordo com as especificações do fabricante. A transcrição reversa foi
220 / 308 realizada para gerar a sequência de genes da região constante λ de imunoglobulina contendo cDNA, usando um Kit de Amplificação de cDNA SMARTer™ RACE (Clontech) e primers específicos λ de imunoglobulina (veja abaixo). Durante este processo, uma sequência de DNA, complemento reverso a 3' de um primer de troca de modelo (TS), foi anexada à extremidade 3' de cDNAs recém-sintetizados. Os cDNAs específicos de Ig purificados foram então amplificados por uma reação de PCR da 1ª volta utilizando o primer específico de TS e primers inversos específicos para sequências de Cλ1 de camundongo. Os produtos de PCR variando de ~450-700 pb foram isolados usando Pippin Prep (SAGE Science) e, em seguida, esses fragmentos foram amplificados ainda mais por uma reação de PCR de 2ª rodada. A Tabela 2 apresenta as sequências de primers selecionados utilizados para a construção da biblioteca de repertórios (para: primer direto; rev: primer reverso). Os produtos de PCR que variam de ~400bp-700bp foram isolados, purificados e quantificados por qPCR usando um Kit de quantificação da biblioteca KAPA (KAPA Biosystems) antes de carregar em um sequenciador Miseq (Illumina) para sequenciação usando o Miseq Reagent Kits v3 (ciclos de 2x300).
[00412] Para análise bioinformática, as sequências Raw Illumina foram desmultiplexadas e filtradas com base na qualidade, comprimento e correspondência com o primer de gene da região constante correspondente. As leituras de extremidade emparelhada sobrepostas foram mescladas e analisadas usando o duto interno personalizado. O duto usou a instalação local de IgBLAST (NCBI, v2.2.25 +) para alinhar sequências de cadeias leves rearranjadas ao banco de dados de segmentos gênicos de Vλ e Jλ da linhagem germinativa humana e denotou junções produtivas e não produtivas junto com a presença de códons de parada. As sequências de CDR3 e os nucleotídeos sem modelo esperados foram extraídos usando limites conforme definido no Sistema Internacional de Informação de Imunogenética (IMGT).
221 / 308 Tabela 2. Primers representativos para construções de bibliotecas de repertório Nome do Primer Sequência (5’ -3’) Primer TS IgʎC (Primer RT) IgʎC (1ª PCR) TS específico (1ª PCR) for (2ª PCR) rev (2ª PCR)
[00413] A maioria dos segmentos funcionais dos genes Vλ e Jλ humanas incluídos no locus LiK em camundongos manipulados representados neste documento foi representada no repertório de anticorpos expresso de camundongos LiK compreendendo uma pluralidade de segmentos gênicos de Vλ e Jλ humanas operacionalmente ligados a um gene Cλ de roedor no locus kappa endógeno (dados não mostrados). No geral, os inventores observaram que as células B de camundongos LiK expressavam anticorpos tendo cadeias leves expressas a partir do locus LiK, conforme o esperado. Não foram observados produtos de emenda alterados, inserções, deleções ou mutações inesperadas nos transcritos analisados. Estes resultados confirmam que a recombinação no locus LiK gera cadeias leves funcionais como parte do repertório de anticorpos desses camundongos. Análises semelhantes foram realizadas em camundongos compreendendo uma pluralidade de segmentos gênicos de Vλ e Jλ humanas operacionalmente ligados a um gene Cλ humana no locus kappa endógeno, onde a expressão de uma pluralidade de segmentos gênicos de Vλ e Jλ humanas foi detectada (dados não mostrados). Exemplo 3.3. Expressão do anticorpo em roedores com locus de cadeia leve modificado
[00414] Este exemplo demonstra a expressão de anticorpos (por exemplo, IgG) de animais não humanos, cujos anticorpos contêm cadeias leves caracterizadas pela presença de regiões Vλ humana e regiões Cλ de
222 / 308 roedores ou humanas, e quais cadeias leves são expressas a partir de um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena de roedor manipulada. Entre outras coisas, este exemplo demonstra especificamente a expressão de anticorpos IgG (em formas diméricas e monoméricas) no soro de animais não humanos (por exemplo, roedores) cujo genoma da linhagem germinativa compreende um locus de cadeia leve κ da imunoglobulina endógena que compreende a inserção de um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana, um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana e um gene Cλ de roedor, cujos segmentos gênicos de Vλ e Jλ humanas estão operacionalmente ligados ao referido gene Cλ de roedor e qual gene Cλ de roedor é inserido no lugar de um gene Cκ de roedor de um locus de cadeia leve Ig endógena de roedor.
[00415] O sangue foi coletado de camundongos do tipo selvagem (WT, 75% C57BL/6NTac 25% 129SvEvTac) e 6558 homozigotos ("LiK", 75% C57BL/6NTac 25% 129SvEvTac). O soro foi separado do sangue usando tubos Eppendorf centrifugados a 9000 rpm por cinco minutos a 4°C. O soro coletado foi utilizado para imunotransferência para identificar a expressão de anticorpos IgG.
[00416] Os soros de camundongo foram diluídos 1:100 ou 1:500 em PBS (sem Ca2+ e Mg2+) e executados com géis Novex Tris-Glycine 4-20% sob condições redutoras e não redutoras. Os géis foram transferidos para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF) de acordo com as especificações do fabricante. As manchas foram bloqueadas durante a noite com leite desnatado a 5% em solução salina tamponada com Tris com Tween- 20 a 0,05% (TBST, Sigma). As membranas de PVDF foram expostas ao anticorpo primário (cabra anti-mIgG1 conjugado com HRP, Southern Biotech) diluído 1:1000 em leite desnatado a 0,1% em TBST por uma hora à temperatura ambiente. As manchas foram lavadas quatro vezes por dez minutos por lavagem e desenvolvidas por cinco minutos com o reagente de detecção Western Blotting ECL da Amersham (GE Healthcare Life Sciences)
223 / 308 de acordo com as especificações do fabricante. As manchas foram então fotografadas usando o Sistema de Documentação em Gel de Câmera de CCD Refrigerado GE Healthcare ImageQuant LAS-4000. As imagens foram capturadas em intervalos de 15 segundos até 20 imagens foram capturadas ou imagens totalmente expostas, o que ocorrer primeiro. Os resultados representativos são apresentados na Figura 13 (os números das faixas são indicados na parte superior de cada imagem de gel e as atribuições das faixas são as mesmas para as duas imagens; canto superior esquerdo: amostras reduzidas; canto inferior esquerdo: amostras não reduzidas; LiK HO: 6558 homozigoto; WT: tipo selvagem; os pesos moleculares são indicados à esquerda de cada imagem de gel).
[00417] Como mostrado na Figura 13, o tamanho dos anticorpos IgG expressos em camundongos LiK é semelhante ao tamanho observado para os anticorpos IgG expressos em camundongos do tipo selvagem, o que demonstra que os camundongos LiK produzem anticorpos funcionais que se ligam ao antígeno e podem ser usados como um sistema in vivo para a produção de anticorpos humanos e componentes de anticorpos humanos para utilização no tratamento de doenças. Exemplo 4. Geração e caracterização de roedores compreendendo vários loci de imunoglobulina manipulada
[00418] Os roedores LiK, conforme descrito neste documento, são criados separadamente com várias linhagens de roedores manipuladas por várias raças usando técnicas conhecidas na técnica para estabelecer linhagens de roedores contendo os seguintes loci de imunoglobulina manipulada: (1) uma cepa de roedor homozigótica para a cadeia pesada de imunoglobulina humanizada (ver, por exemplo, Patentes US N°s 8.642.835 e 8.697.940, cada uma das quais é incorporada neste documento por referência na sua totalidade), homozigoto para um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina compreendendo segmentos gênicos de Vλ e Jλ humanas operacionalmente
224 / 308 ligados a um gene Cλ, como descrito neste documento, e homozigoto para um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina endógena inativada (ver, por exemplo, Patente US N° 9.006.511, que é incorporada por referência neste documento na sua totalidade), em algumas modalidades referidas neste documento como camundongos HoH/LiK/λ-/-, (2) uma cepa de roedor homozigótica para um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humanizada (supra), homozigoto para um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina endógena inativada (supra) e hemizigoto para um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina com um primeiro locus de cadeia leve κ da imunoglobulina compreendendo segmentos gênicos de Vλ e Jλ humanas operacionalmente ligados a um gene Cλ, como descrito neste documento e um segundo locus de cadeia leve κ da imunoglobulina compreendendo segmentos gênicos de Vκ e Jκ humanas operacionalmente ligados a um gene Cκ de camundongo endógeno (ver, por exemplo, as patentes US N°s 8.642.835 e 8.697.940, cada uma das quais é incorporada por referência na sua totalidade neste documento), em algumas modalidades referidas neste documento como camundongos HoH/KoK/LiK/λ-/-. Alternativamente, esses camundongos podem ser gerados pela introdução de vetores de direcionamento compreendendo loci manipulados em células ES, que já compreendem vários loci de imunoglobulina manipulada. Em algumas modalidades, o locus de cadeia pesada de imunoglobulina nos referidos roedores compreende um gene Adam6 de roedor funcional e expresso.
[00419] Especificamente, os camundongos LiK foram criados com várias linhagens de camundongos manipulados em várias criações para estabelecer camundongos HoH/LiK/λ-/- e HoH/KoK/LiK/λ-/-.
[00420] Uma vez estabelecidas, várias populações de células imunes foram caracterizadas nesses camundongos humanizados por citometria de fluxo. Resumidamente, os baços e os fêmures foram coletados de HoH/LiK/λ- /- (n=3), HoH/KoK/LiK/λ-/- (n=4) e VELOCIMMUNE (“HoH/KoK”; n = 3;
225 / 308 ver Patentes N°s US. 8.642.835 e 8.697.940, cada uma das quais é incorporada por referência na sua totalidade neste documento) camundongos e preparada para análise por citometria de fluxo como descrito acima. Os resultados representativos são apresentados nas Figuras 8-11. A expressão média de cadeia leve (κ:λ) observada nos esplenócitos das linhagens de camundongos manipulados testados foi aproximadamente a seguinte: HoH/LiK/λ-/-: 0:100, HoH/KoK/LiK/λ-/-: 40:60, HoH/KoK: 85:15. Exemplo 5. Produção de anticorpos em roedores manipulados
[00421] Este exemplo demonstra a produção de anticorpos em um roedor que compreende um locus de cadeia leve κ da imunoglobulina endógena manipulada, como descrito acima, usando um antígeno de interesse (por exemplo, uma proteína de membrana de passagem única ou múltipla, etc.). Os métodos descritos neste exemplo, ou métodos de imunização bem conhecidos na técnica, podem ser utilizados para imunizar roedores contendo um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada como descrito com vários antígenos (por exemplo, polipeptídeos, etc.). Quaisquer roedores geneticamente modificados descritos acima neste documento, por exemplo, camundongos LiK - camundongos compreendendo um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina compreendendo segmentos gênicos de Vλe Jλ humanas operacionalmente ligados a um gene Cλ (como camundongos homozigotos para o locus LiK); Camundongos HoH/LiK/λ-/- camundongos compreendendo um locus LiK (como camundongos homozigotos para o locus LiK) e também compreendendo locus de cadeia pesada de imunoglobulina humanizada (ver, por exemplo, as patentes US N°s. 8.642.835 e 8.697.940, cada uma das quais é incorporada por referência na sua totalidade nesse documento) e um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina endógena inativada (ver, por exemplo, Patente US N°. 9.006.511, que é incorporada por referência na sua totalidade neste documento); e camundongos HoH/KoK/LiK/λ-/-- camundongos hemizigotos para o locus de cadeia leve κ
226 / 308 de imunoglobulina com um primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina compreendendo LiK e o segundo locus de cadeia leve κ da imunoglobulina compreendendo segmentos gênicos de Vκ e Jκ humanos ligados operacionalmente a um gene Cκ de camundongo endógeno (ver, por exemplo, Patentes US N°s 8.642.835 e 8.697.940), e também compreendendo o locus de cadeia pesada de imunoglobulina humanizada (ver, por exemplo, as Patentes US N°s 8.642.835 e 8.697.940, cada uma das quais é incorporada por referência na sua totalidade neste documento) e um o locus de cadeia leve λ da imunoglobulina endógena inativada (ver, por exemplo, Patente US N°
9.006.511, que é incorporada por referência neste documento), pode ser utilizado para produção de anticorpos após imunização com um antígeno de interesse. Tais camundongos são adequados para imunização e produção de anticorpos humanos e/ou fragmentos de anticorpos humanos.
[00422] Camundongos LiK que incluem ainda os loci de imunoglobulina manipulados descritos acima são desafiados com um antígeno de interesse usando métodos de imunização conhecidos na técnica. A resposta imune do anticorpo é monitorada por um imunoensaio ELISA (ou seja, título sérico). Quando é alcançada uma resposta imune desejada, os esplenócitos (e/ou outro tecido linfático) são coletados e fundidos com células de mieloma de camundongo para preservar sua viabilidade e formar linhagens celulares de hibridoma imortal. As linhagens celulares de hibridoma geradas são rastreadas (por exemplo, por um ensaio ELISA) e selecionadas para identificar linhagens de células de hibridoma que produzem anticorpos específicos para o antígeno. Os hibridomas podem ainda ser caracterizados quanto à afinidade e isotipo de ligação relativa, conforme desejado. Utilizando esta técnica e o imunógeno descrito acima, são obtidos vários anticorpos quiméricos específicos para o antígeno (isto é, anticorpos possuindo domínios variáveis humanos e domínios constantes de roedores).
[00423] O DNA que codifica as regiões variáveis de cadeia pesada e de
227 / 308 cadeia leve pode ser isolado ou preparado de outro modo, e pode ser ligado a regiões constantes de cadeia pesada e de cadeia leve humana (por exemplo, de um isotipo desejado) para a preparação de anticorpos totalmente humanos. Tais anticorpos totalmente humanos (e/ou suas cadeias pesadas ou leves) podem ser produzidos em uma célula, tipicamente uma célula de mamífero, como uma célula CHO. Os anticorpos totalmente humanos podem então ser caracterizados por afinidade de ligação relativa e/ou atividade neutralizante do antígeno de interesse.
[00424] O DNA que codifica anticorpos quiméricos específicos do antígeno produzidos pelas células B dos camundongos manipulados descritos neste documento e/ou exemplificados, e/ou os domínios variáveis das cadeias leve e/ou pesada dos mesmos, podem ser isolados diretamente dos linfócitos específicos do antígeno. Por exemplo, os anticorpos quiméricos de alta afinidade com uma região variável humana e uma região constante de roedor podem ser isolados e caracterizados de modo que sejam definidos anticorpos específicos (e/ou células B que os produzem) de interesse. Para citar apenas alguns exemplos, as características avaliadas de tais anticorpos e/ou regiões variáveis e/ou constantes destes podem ser ou incluir uma ou mais afinidades, seletividade, identidade do epítopo, etc.
[00425] As regiões constantes de roedores são substituídas por uma região constante humana desejada para gerar anticorpos totalmente humanos. Embora a região constante selecionada possa variar de acordo com a utilização específica, a ligação ao antígeno de alta afinidade e características de especificidade alvo residem na região variável. Alternativamente, ao empregar camundongos LiK contendo um gene Cλ2 humano no lugar de um gene Cκ de roedor, como descrito neste documento, é omitida uma etapa de substituição de uma região constante de roedor em um anticorpo isolado de um camundongo imunizado. Os anticorpos específicos de antígeno também são isolados diretamente de células B positivas para antígeno (de
228 / 308 camundongos imunizados) sem fusão com células de mieloma, como descrito em, por exemplo, Patente US N° 7.582.298, especificamente incorporada por referência em sua totalidade neste documento. Utilizando este método, são produzidos vários anticorpos específicos para o antígeno totalmente humanos (isto é, anticorpos que possuem domínios variáveis humanos e domínios constantes humanos). Exemplo 6. Geração de roedores com locus de cadeia leve modificada e expressando o gene da desoxinucleotidil transferase humana terminal (TdT) Exemplo 6.1. Geração de Roedores com Locus de Cadeia Leve Manipulada e Expressando TDT Humano
[00426] Este exemplo ilustra a geração de camundongos cujo genoma da linhagem germinativa compreende um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina manipulada como descrito neste documento e expressando ainda mais a TdT humana. Os camundongos que expressam TdT humano foram feitos como descrito no Exemplo 1.1. do documento WO 2017/210586, incorporado por referência na sua totalidade neste documento. Os camundongos possuindo um genoma compreendendo um locus de cadeia leve deκ imunoglobulina manipulada como descrito neste documento e ainda expressando TdT humano foram gerados por múltiplas criações para estabelecer coortes de linhagens de camundongos contendo ambas as modificações. Exemplo 6.2. Avaliação fenotípica de roedores com locus Kappa manipulado e expressando TDT humano
[00427] Uma vez estabelecidas, populações de células imunes foram caracterizadas nesses camundongos humanizados por citometria de fluxo. Resumidamente, baços e fêmures foram colhidos de camundongos HoH/LiK/λ-/-/TdT (n=4) e HoH/KoK/LiK/λ-/-/TdT (n=6) e preparados para análise por citometria de fluxo, como descrito acima (veja o exemplo 3
229 / 308 acima). Os resultados representativos são apresentados nas Figuras 14-17. A expressão média de cadeia leve (κ:λ) observada nos esplenócitos das linhagens de camundongos manipulados testados foi a seguinte: HoH/LiK/λ-/- /TdT: 0:100, HoH/KoK/LiK/λ-/-/TdT: 45:55. Exemplo 6.3. Diversidade juncional Kappa de imunoglobulina humana e adições não germinativas em camundongos LiK compreendendo TdTS humano
[00428] Conforme demonstrado no documento WO 2017/210586 (incorporado por referência na sua totalidade neste documento), os camundongos compreendendo TdT introduzidos exogenamente exibiram aumentos tanto na diversidade juncional quanto nas adições de nucleotídeos não-germinativos (também "adições de nucleotídeos não-modelo", conforme usado neste documento) na sua cadeia leve. Os camundongos compreendendo HoH/LiK/λ-/-/TdT e HoH/KoK/LiK/λ-/-/TdT foram avaliados para determinar sua diversidade de sequências de repertórios de imunoglobulinas e presença de adições de nucleotídeos não-modelo em sua CDR3 usando a tecnologia de geração de sequenciamento seguinte.
[00429] Resumidamente, os esplenócitos foram coletados de camundongos e as células B foram positivamente enriquecidas do total de esplenócitos por esferas magnéticas CD19 anticamundongo e colunas MACS (Miltenyi Biotech). O RNA total foi isolado das células B esplênicas usando o kit RNeasy Plus (Qiagen).
[00430] A transcrição reversa com um oligo-dT iniciador seguido de PCR específica do gene foi realizada para gerar cDNA contendo a sequência Cλ1 de camundongo, usando o Kit de Amplificação de cDNA SMARTer™ RACE (Clontech). Durante a transcrição reversa, uma sequência de DNA específica (PIIA: 5'-CCCATGTACT CTGCGTTGAT ACCACTGCTT-3', SEQ ID NO: 71) foi anexada à extremidade 3' dos cDNAs recém-sintetizados. Os cDNAs foram purificados pelo NucleoSpin Gel e pelo PCR Clean-Up Kit
230 / 308 (Clontech), e posteriormente amplificados usando um complemento reverso do primer para PIIA (5'- AAGCAGTGGT ATCAACGCAG AGTACAT - 3', SEQ ID NO: 72) emparelhado com o primer Cλ1 específico do camundongo (5'-CACCAGTGTG GCCTTGTTAG TCTC-3', SEQ ID NO: 73).
[00431] Os amplicons purificados foram então amplificados por PCR usando um primer específico de PIIA (5'-GTGACTGGAG TTCAGACGTG TGCTCTTCCG ATCTAAGCAG TGGTATCAAC GCAGAGT-3', SEQ ID NO: 74 e um primer específico Cλ1 de camundongo aninhado (5’-
ACACTCTTTC CCTACACGAC GCTCTTCCGA TCTAAGGTGG AAACAGGGTG ACTGATG-3’, SEQ ID NO: 75. Os produtos de PCR entre 450-690 pb foram isolados e coletados por Pippin Prep (SAGE Science). Esses fragmentos foram amplificados ainda mais por PCR usando os seguintes primers: 5'-AATGATACGG CGACCACCGA GATCTACACX XXXXXACACT CTTTCCCTAC ACGACGCTCT TCCGATC-3', SEQ ID NO: 76 e 5’-CAAGCAGAAG ACGGCATACG AGATXXXXXX GTGACTGGAG TTCAGACGTG TGCTCTTCCG ATCT-3', SEQ ID NO:77 ("XXXXXX" representa uma sequência de índice de 6bp para ativar a multiplexação de amostras para o sequenciamento). Os produtos de PCR entre 490bp-710bp foram isolados e coletados por Pippin Prep, depois quantificados por qPCR usando um Kit de Quantificação de Biblioteca KAPA (KAPA Biosystems) antes de serem carregados no sequenciador Miseq (Illumina) para sequenciamento (v3, 600 ciclos).
[00432] Para análise bioinformática, as sequências resultantes de Illumina foram desmultiplexadas e ajustadas para obter qualidade. As leituras de extremidade pareada sobrepostas foram montadas e anotadas usando a instalação local do igblast (NCBI, v2.2.25+). As leituras foram alinhadas ao banco de dados dos segmentos Vλ e Jλ da linhagem germinativa humana e classificadas para o melhor resultado. Uma sequência foi marcada como ambígua e removida da análise quando vários melhores resultados com
231 / 308 pontuação idêntica foram detectados. Um conjunto de scripts perl internos foi desenvolvido para analisar os resultados.
[00433] As cadeias leves lambda de células B esplênicas de camundongos HoH/LiK/λ-/-/TdT, e as cadeias leves lambda e kappa de células B esplênicas de camundongos HoH/KoK/LiK/λ-/-/TdT, foram testadas para um aumento de adições não-modelo e diversidade juncional nos locais lambda e/ou kappa. As cadeias leves de camundongos HoH/LiK/λ-/-/TdT e HoH/KoK/LiK/λ-/-/TdT exibiram pelo menos um aumento de 2 vezes na diversidade juncional, medida pelo número de leituras únicas de CDR3/10.000 (dados não mostrados). Além disso, cerca de 50% das cadeias leves (lambda e/ou kappa) dos camundongos HoH/LiK/λ-/-/TdT e HoH/KoK/LiK/λ-/-/TdT exibiram adições não-modelo quando comparadas às cadeias leves de camundongos de controle sem TdT, que exibiram apenas cerca de 10% de adições não-modelo (dados não mostrados). Exemplo 7. Imunização de roedores manipulados e análise da resposta imune a imunógenos
[00434] Este exemplo ilustra a imunização de camundongos LiK/VI-3 e LiK/VI-3/TdT, e a análise das respostas de anticorpos séricos aos imunógenos. Resumidamente, (1) VI-3/TdT (por exemplo, um controle positivo para a cadeia leve de kappa humana, que também possui loci de cadeia leve lambda de camundongos endógenos) e camundongos VI-3 com cadeias leves de lambda humanas, (2) LiK/VI- 3 e (3) LiK/VI-3/TdT, respectivamente, foram imunizados com imunógenos de proteínas usando protocolos e adjuvantes padrão. Os camundongos foram sangrados antes do início da imunização e periodicamente sangrados após reforços de imunógenos. Os títulos antissoro foram testados nos respectivos antígenos.
[00435] Os títulos de anticorpos no soro contra imunógenos foram determinados usando ELISA. Noventa placas de microtitulação de seis poços (Pierce) foram revestidas com antígenos a 2 µg/ml em solução salina
232 / 308 tamponada com fosfato (PBS, Irvine Scientific) durante a noite a 4°C. As placas foram lavadas com PBS contendo Tween-20 a 0,05% (PBS-T, Sigma- Aldrich) e bloqueadas com 250 µl de albumina sérica bovina a 0,5% (BSA, Sigma-Aldrich) em PBS por 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas com PBS-T. Os antissoros pré-imunes e imunes foram diluídos em série três vezes em BSA-PBS a 1% e adicionados às placas durante 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas e foram adicionados anticorpos secundários conjugados com IgG-Fc-Peroxidase de rábano silvestre (HRP) (Jackson Immunoresearch), anticamundongo Kappa-HRP (SouthernBiotech) ou anticamundongo Lambda-HRP (SouthernBiotech) na diluição de 1:5000 para as placas e incubadas durante 1 hora à temperatura ambiente. As placas foram lavadas e desenvolvidas usando TMB/H2O2 como substrato por incubação por 15-20 minutos. A reação foi parada com ácido e as placas lidas em um espectrofotômetro (Victor, Perkin Elmer) a 450 nm. Os títulos de anticorpos foram calculados usando o software Graphpad PRISM. O título é definido como o fator de diluição sérica interpolado, cujo sinal de ligação é 2 vezes maior que o fundo.
[00436] As respostas imunes humorais em camundongos LiK/VI-3, LiK/VI-3/TdT e VI-3/TdT foram investigadas após imunização com um imunogênio proteico. Os antissoros de camundongos imunizados com proteína apresentam altos títulos no antígeno nas cepas LiK/VI-3 e LiK/VI- 3/TdT comparáveis às cepas VI-3/TdT (Figura 18). Altos títulos lambda foram obtidos em camundongos LiK/VI-3 e LiK/VI-3/TdT. Nos camundongos da cepa VI-3/TdT, os títulos lambda não foram observados em três camundongos, enquanto os títulos baixos foram observados em dois camundongos, o que corresponde ao baixo uso de variáveis lambda de camundongo nessa cepa. Como esperado, não foram obtidos títulos kappa em camundongos LiK/VI-3 e LiK/VI-3/TdT, pois não possuem a cadeia leve de kappa, enquanto os VI-3/TdT mostraram altos títulos kappa. A Figura 19
233 / 308 mostra títulos de linha de base (menor diluição sérica) no antígeno proteico irrelevante para tag His em todas as três cepas de camundongos com detecção anti-Fc e antikappa, enquanto títulos muito baixos foram observados com detecção antilambda em camundongos LiK/VI-3 e LiK/VI-3/TdT.
[00437] Modalidade 1. Um roedor geneticamente modificado, cujo genoma da linhagem germinativa compreende: um primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (a) um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana, (b) um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana, e (c) um gene Cλ, em que um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana e um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana são operacionalmente ligados ao gene Cλ, e em que o roedor não possui um gene Cκ do roedor no primeiro locus de cadeia leve κ da imunoglobulina endógena manipulada.
[00438] Modalidade 2. O roedor geneticamente modificado da modalidade 1, em que o roedor é homozigoto para o primeiro κ locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada.
[00439] Modalidade 3. O roedor geneticamente modificado da modalidade 1, em que o roedor é heterozigoto para o primeiro κ locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada.
[00440] Modalidade 4. O roedor geneticamente modificado da modalidade 3, em que o genoma da linhagem germinativa do roedor compreende um segundo locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (a) um ou mais segmentos gênicos de Vκ humano, e (b) um ou mais segmentos gênicos de Jκ humano,
234 / 308 em que um ou mais segmentos gênicos de Vκ humano e um ou mais segmentos gênicos de Jκ humano são operacionalmente ligados a um gene Cκ.
[00441] Modalidade 5. O roedor geneticamente modificado da modalidade 4, em que o gene Cκ no segundo locus de cadeia leve κ da imunoglobulina endógena manipulada é um gene Cκ do roedor endógeno.
[00442] Modalidade 6. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 1-5, em que o roedor não possui um gene Cκ do roedor no primeiro locus de cadeia leve κ da imunoglobulina endógena manipulada.
[00443] Modalidade 7. Um roedor geneticamente modificado, cujo genoma da linhagem germinativa compreende: (a) um primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (i) um ou mais segmentos gênicos de Vλ humano, (ii) um ou mais segmentos gênicos de Jλ humano, e (iii) um gene Cλ, em que um ou mais segmentos gênicos de Vλ humano e um ou mais segmentos gênicos de Jλ humano são operacionalmente ligados ao gene Cλ, e em que o roedor não possui um gene Cκ do roedor no primeiro locus de cadeia leve κ da imunoglobulina endógena manipulada; e (b) um segundo κ locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (i) um ou mais segmentos gênicos de Vκ humano, e (ii) um ou mais segmentos gênicos de Jκ humano, em que um ou mais segmentos gênicos de Vκ humano e um ou mais segmentos gênicos de Jκ humano são operacionalmente ligados a um gene Cκ.
235 / 308
[00444] Modalidade 8. O roedor geneticamente modificado da modalidade 7, em que o gene Cκ no segundo locus de cadeia leve κ da imunoglobulina endógena manipulada é um gene Cκ do roedor endógeno.
[00445] Modalidade 9. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 1-8, em que o gene Cλ no primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada compreende um gene Cλ de roedor.
[00446] Modalidade 10. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 1-9, em que o primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada compreende ainda: (i) uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana, em que a uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico de Vλ humana um locus de cadeia leve λ da imunoglobulina endógena humana; (ii) uma ou mais sequências não codificantes Jλ humana, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana, em que a uma ou mais sequências não codificantes Jλ humana aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico de Jλ humana em um locus de cadeia leve λ da imunoglobulina humana endógena; ou (iii) qualquer combinação destes.
[00447] Modalidade 11. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 1-10, em que: (i) um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana compreendem Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3- 22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ou qualquer combinação destes; e
236 / 308 (ii) um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes. Modalidade 12. O roedor geneticamente modificado da modalidade 11, em que o primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana é adjacente a Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 no primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma ou mais sequências não codificantes de Vλ aparecem naturalmente adjacentes a Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5- 37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificantes Jλ humana, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Jλ humana é adjacente às Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Jλ humano aparece naturalmente adjacente a um Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 de um locus de cadeia leve λ da imunoglobulina humana endógena.
[00448] Modalidade 13. O roedor geneticamente modificado da modalidade 11, em que o primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Vλ
237 / 308 humana é adjacente à Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 no primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana aparecem naturalmente adjacentes a Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3- 21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificantes de Jκ humano, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Jκ humano é adjacente às Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Jκ humano aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena humana.
[00449] Modalidade 14. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 1-13, em que: (i) um ou mais segmentos gênicos de Vλ humanos compreendem Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1- 51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3- 16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ou qualquer combinação destes; e (ii) um ou mais segmentos gênicos de Jλ humanos compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes.
[00450] Modalidade 15. O roedor geneticamente modificado da
238 / 308 modalidade 14, em que o primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana é adjacente à Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5- 39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 no primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humano aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3- 22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificantes Jλ humana, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Jλ humana é adjacente às Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Jλ humana aparece naturalmente adjacente a um Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 de um locus de cadeia leve da imunoglobulina humana endógena.
[00451] Modalidade 16. O roedor geneticamente modificado da modalidade 14, em que o primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana é adjacente à Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52,
239 / 308 Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5- 39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 no primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana aparecem naturalmente adjacentes a Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6- 57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3- 22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificantes de Jκ humano, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Jκhumanas é adjacente às Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Jκ humano aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena humana.
[00452] Modalidade 17. Um roedor geneticamente modificado, cujo genoma da linhagem germinativa compreende: um primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulado, compreendendo: (i) um ou mais segmentos gênicos de Vλ humanos, em que um ou mais segmentos gênicos de Vλ humanos compreendem Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5- 37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 ou qualquer combinação destes, (ii) um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana, em que um
240 / 308 ou mais segmentos gênicos de Jλ humana compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes, (iii) um gene Cλ de roedor, (iv) uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana é adjacente a Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 no locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma delas ou mais sequências não codificantes de Vλ humana aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3- 21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena, (v) uma ou mais sequências não codificantes Jκ humano, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Jκ humano é adjacente às Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Jκ humano aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina humana endógena, e (vi) uma sequência não codificante de cadeia leve κ humano entre um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana e um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana que possui uma sequência que aparece naturalmente entre um segmento gênico Vκ4-1 humano e um segmento gênico Jκ1 humano em um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina humana endógena, em que um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana, um ou
241 / 308 mais segmentos gênicos de Jλ humana e o gene Cλ de roedor são operacionalmente ligados um ao outro, e em que o gene Cλ de roedor está no lugar de um gene Cκ de roedor do locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena.
[00453] Modalidade 18. O roedor geneticamente modificado da modalidade 17, em que o genoma da linhagem germinativa do roedor compreende um segundo locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (a) um ou mais segmentos gênicos de Vκ humano, e (b) um ou mais segmentos gênicos de Jκ humano, em que um ou mais segmentos gênicos de Vκ humano e um ou mais segmentos gênicos de Jκ humano são operacionalmente ligados a um gene Cκ.
[00454] Modalidade 19. O roedor geneticamente modificado da modalidade 18, em que o gene Cκ no segundo locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada é um gene Cκ do roedor endógeno.
[00455] Modalidade 20. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 1-19, em que o genoma da linhagem germinativa do roedor compreende ainda: um locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (a) um ou mais segmentos gênicos de VH humanos, (b) um ou mais segmentos gênicos de DH humanos, e (c) um ou mais segmentos gênicos de JH humanos, em que um ou mais segmentos gênicos de VH humanos, um ou mais segmentos gênicos de DH humanos e um ou mais segmentos gênicos de JH humanos são operacionalmente ligados a um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
242 / 308
[00456] Modalidade 21. Um roedor geneticamente modificado, cujo genoma da linhagem germinativa compreende: (a) um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena modificada que compreende um ou mais segmentos gênicos de VH humanos, um ou mais segmentos gênicos de DH humanos e um ou mais segmentos gênicos de JH humanos ligados operacionalmente a um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina endógena, de modo que o roedor expressa cadeias pesadas de imunoglobulina que compreendem uma sequência de domínio variável de cadeia pesada humana e uma sequência de domínio constante de cadeia pesada do roedor, em que o genoma da linhagem germinativa é homozigoto para o locus de cadeia pesada da imunoglobulina endógena modificada; (b) um primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (i) um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana, em que um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana compreendem Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5- 37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ou qualquer combinação destes, (ii) um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana, em que um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes, (iii) um gene Cλ de roedor, (iv) uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana é adjacente à Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3- 19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8,
243 / 308
Vλ4-3 ou Vλ3-1 no segundo locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3- 27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena, (v) uma ou mais sequências não codificantes Jκ humano, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Jκ humano é adjacente às Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Jκ humano aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina humana endógena, e (vi) uma sequência não codificante de cadeia leve κ humana entre um ou mais segmentos gênicos de Vλ humano e um ou mais segmentos gênicos de Jλ humano que possui uma sequência que aparece naturalmente entre um segmento do gene Vκ4-1 humano e um segmento do gene Jκ1 humano em um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina humana endógena, em que um ou mais segmentos gênicos de Vλ humano, um ou mais segmentos gênicos de Jλ humano e o gene Cλ de roedor são operacionalmente ligados um ao outro, em que o gene Cλ de roedor está no lugar de um gene Cκ de roedor do segundo locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena; e (c) um segundo locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada compreendendo um ou mais segmentos gênicos de Vκ humano e um ou mais segmentos gênicos de Jκ operacionalmente ligados a uma região gênica de Cκ de roedor endógeno de modo que o roedor expressa cadeias leves de imunoglobulina, cada uma compreendendo uma sequência de
244 / 308 domínio variável de cadeia leve κ humana e uma sequência de domínio constante de cadeia leve κ de roedor, em que o roedor expressa cadeias leves de imunoglobulina, uma compreendendo uma sequência de domínio variável de cadeia leve λ humana e uma sequência de domínio constante de cadeia leve λ de roedor.
[00457] Modalidade 22. O roedor geneticamente modificado da modalidade 20 ou 21, em que o um ou mais segmentos gênicos de VH humanos, um ou mais segmentos gênicos de DH humanos e um ou mais segmentos gênicos de JH humanos estão no lugar de um ou mais segmentos gênicos de VH de roedores, um ou mais segmentos gênicos de DH roedores, um ou mais segmentos gênicos de JH roedores ou uma combinação destes.
[00458] Modalidade 23. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 20-22, em que o um ou mais segmentos gênicos de VH humanos, um ou mais segmentos gênicos de DH humanos e um ou mais segmentos gênicos de JH humanos substituem um ou mais segmentos gênicos de VH de roedores, um ou mais segmentos gênicos de DH de roedores, um ou mais segmentos gênicos de JH de roedores ou qualquer combinação destes.
[00459] Modalidade 24. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 20-23, em que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada compreende ainda: (i) uma ou mais sequências não codificantes de VH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos de VH humanos, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de VH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico de VH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena; (ii) uma ou mais sequências não codificantes de DH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos
245 / 308 gênicos de DH humanos, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de DH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico de DH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena humana; (iii) uma ou mais sequências não codificantes de JH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos de JH humanos, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de JH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico de JH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena humana; ou (iv) qualquer combinação destes.
[00460] Modalidade 25. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 20-24, em que um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor são um ou mais genes da região constante de cadeia pesada da imunoglobulina de roedor endógenos.
[00461] Modalidade 26. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 20-25, em que: (i) o um ou mais segmentos gênicos VH humano compreendem VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4- 59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3- 23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3- 7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, ou qualquer combinação destes, (ii) um ou mais segmentos gênicos de DH humanos compreendem DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27, ou qualquer combinação destes, e
246 / 308 (iii) um ou mais segmentos gênicos de JH humanos compreendem JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 ou qualquer combinação destes. Modalidade 27. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 20-26, em que o locus de cadeia pesada da imunoglobulina endógena manipulada não possui um gene Adam6 do roedor endógeno funcional.
[00462] Modalidade 28. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 20-27, em que o genoma da linhagem germinativa compreende ainda uma ou mais sequências de nucleotídeos que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou fragmentos funcionais destes.
[00463] Modalidade 29. O roedor geneticamente modificado da modalidade 28, em que o um ou mais polipeptídeos ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais são expressos.
[00464] Modalidade 30. O roedor geneticamente modificado da modalidade 28 ou 29, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais são incluídas no mesmo cromossomo que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
[00465] Modalidade 31. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 28-30, em que as uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6 de roedores, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou fragmentos funcionais destes estão incluídas no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
[00466] Modalidade 32. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 28-31, em que uma ou mais sequências
247 / 308 nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais estão no lugar de um pseudogene Adam6 humano.
[00467] Modalidade 33. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 28-32, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais substituem um pseudogene Adam6 humano.
[00468] Modalidade 34. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 28-33, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais estão entre um primeiro segmento gênico VH humano e um segundo segmento gênico VH humano.
[00469] Modalidade 35. O roedor geneticamente modificado da modalidade 34, em que o primeiro segmento gênico de VH humano é VH1-2 e o segundo segmento gênico de VH humano é VH6-1.
[00470] Modalidade 36. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 28-31, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais estão entre um primeiro segmento gênico VH humano e um segmento gênico de DH humano.
[00471] Modalidade 37. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 20 e 22-36, em que o roedor é homozigoto para o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
[00472] Modalidade 38. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 9-37, em que o gene Cλ do roedor tem uma sequência que é pelo menos 80% idêntica a um gene Cλ1 de camundongo,
248 / 308 Cλ2 de camundongo ou um gene Cλ3 de camundongo.
[00473] Modalidade 39. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 9-38, em que o gene Cλ do roedor compreende um gene Cλ1 do camundongo.
[00474] Modalidade 40. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 9-39, em que o gene Cλ do roedor compreende um gene Cλ do rato.
[00475] Modalidade 41. O roedor geneticamente modificado da modalidade 40, em que o gene Cλ de rato tem uma sequência que é pelo menos 80% idêntica a um gene Cλ1 de rato, Cλ2 de rato, Cλ3 de rato ou Cλ4 de rato.
[00476] Modalidade 42. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 1-41, em que o um ou mais segmentos gênicos de Vλ humanos e o um ou mais segmentos gênicos de Jλ humanos estão no lugar de um ou mais segmentos gênicos de Vκ de roedores, um ou mais segmentos gênicos de Jκ de roedores ou qualquer combinação destes.
[00477] Modalidade 43. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 1-42, em que o um ou mais segmentos gênicos de Vλhumano e o um ou mais segmentos gênicos de Jλ humano substituem um ou mais segmentos gênicos de Vκ do roedor, um ou mais segmentos gênicos de Jκ do roedor ou qualquer combinação destes.
[00478] Modalidade 44. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 1-43, em que o primeiro locus de cadeia leve de κ imunoglobulina endógena manipulada compreende ainda uma sequência não codificante de cadeia leveκ entre um ou mais segmentos gênicos de Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos de Jλ humanos.
[00479] Modalidade 45. O roedor geneticamente modificado da modalidade 44, em que a sequência não codificante da cadeia leve κ é uma sequência não codificante de cadeia leve κ humano.
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[00480] Modalidade 46. O roedor geneticamente modificado da modalidade 45, em que a sequência não codificante de cadeia leve κ humana tem uma sequência que aparece naturalmente entre um segmento gênico Vκ4- 1 humano e um segmento gênico de Jκ1 humano em um locus endógeno de cadeia leve κ da imunoglobulina humana.
[00481] Modalidade 47. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 1-46, compreendendo ainda um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina endógena inativado.
[00482] Modalidade 48. O roedor geneticamente modificado da modalidade 47, em que o roedor é heterozigoto para o locus de cadeia leve λ de imunoglobulina endógena inativada.
[00483] Modalidade 49. O roedor geneticamente modificado da modalidade 47, em que o roedor é homozigoto para o locus de cadeia leve λ de imunoglobulina endógena inativada.
[00484] Modalidade 50. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 1-49, em que os segmentos gênicos de Vλ endógeno, os segmentos gênicos de Jλ endógeno e os genes Cλ endógenos são deletados total ou parcialmente.
[00485] Modalidade 51. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 1-50, em que o roedor não expressa detectável domínios variáveis da cadeia leve λ de imunoglobulina endógena.
[00486] Modalidade 52. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 1-51, em que o roedor não expressa detectável domínios variáveis da cadeia leve κ da imunoglobulina endógena.
[00487] Modalidade 53. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 1-52, em que o roedor compreende uma população de células B que expressam anticorpos, incluindo cadeias leves λ de imunoglobulina que cada uma inclui um domínio variável de cadeia leve λ de imunoglobulina humana.
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[00488] Modalidade 54. O roedor geneticamente modificado da modalidade 53, em que um domínio variável de cadeia leve λ de imunoglobulina humana é codificado por uma sequência de região variável de cadeia leve λ de imunoglobulina humana rearranjada compreendendo (i) um dos um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana ou uma variante somaticamente hipermutada desta e (ii) um dos um ou mais segmentos gênicos Jλ humana ou uma variante somaticamente hipermutada desta.
[00489] Modalidade 55. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 1-54, em que o genoma da linhagem germinativa do roedor compreende ainda uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma desoxinucleotidiltransferase terminal exógena (TdT) operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional.
[00490] Modalidade 56. O roedor geneticamente modificado da modalidade 55, em que o TdT é uma isoforma curta de TdT (TdTS).
[00491] Modalidade 57. O roedor geneticamente modificado da modalidade 55 ou 56, em que o elemento de controle transcricional inclui um elemento de controle transcricional de RAG1, um elemento de controle transcricional de RAG2, um elemento de controle transcricional de cadeia pesada de imunoglobulina, um elemento de controle transcricional de cadeia leve κ de imunoglobulina, um elemento de controle transcricional de cadeia leve λ de imunoglobulina ou qualquer combinação destes.
[00492] Modalidade 58. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 55-57, em que a sequência de ácidos nucleicos que codifica uma TdT exógena está no genoma da linhagem germinativa em um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina, um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina, um locus de RAG1, ou um locus de RAG2.
[00493] Modalidade 59. Um roedor geneticamente modificado, cujo genoma da linhagem germinativa compreende
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(a) uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma desoxinucleotidiltransferase exógena terminal (TdT) operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional; (b) um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena modificada que compreende um ou mais segmentos gênicos de VH humanos, um ou mais segmentos gênicos de DH humanos e um ou mais segmentos gênicos de JH humanos ligados operacionalmente a um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina endógena, de modo que o roedor expressa cadeias pesadas de imunoglobulina que compreendem uma sequência de domínio variável de cadeia pesada humana e uma sequência de domínio constante de cadeia pesada do roedor, em que o genoma da linhagem germinativa é homozigoto para o locus de cadeia pesada da imunoglobulina endógena modificada; e (c) um locus geométrico de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena, compreendendo: (i) um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana, em que o um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana compreendem Vλ5-52, Vλ1- 51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2- 18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3- 1 ou qualquer combinação destes, (ii) um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana, em que os um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana compreendem de Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes, (iii) um gene Cλ de roedor, (iv) uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana é adjacente ao Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-
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19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 no locus da κcadeia leve da imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma ou uma mais sequências não codificantes de Vλ humana aparecem naturalmente adjacentes a Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena, (v) uma ou mais sequências não codificantes Jκ humano, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Jκ humano é adjacente às Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 e Jλ7 no locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Jκ humano aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina humana endógena, e (vi) uma sequência não codificante de cadeia leve κ humano entre um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana e um ou mais segmentos gênicos de Jλ humano que compreende uma sequência que aparece naturalmente entre um segmento gênico de Vκ4-1 humano e um segmento gênico de Jκ1 humano em um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina humana endógena, em que um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana, um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana e o gene Cλ de roedor são operacionalmente ligados um ao outro, em que o gene Cλ de roedor está no lugar de um gene Cκ de roedor do locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena. em que o genoma da linhagem germinativa é homozigoto para o locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada em que o roedor expressa cadeias leves de imunoglobulina que
253 / 308 compreende uma sequência de domínio variável de cadeia leve λ humana e uma sequência de domínio constante de cadeia leve λ do roedor.
[00494] Modalidade 60. O roedor geneticamente modificado de qualquer uma das modalidades 1-59, em que o roedor é um camundongo ou um rato.
[00495] Modalidade 61. Uma célula de roedor isolada obtida a partir de um roedor de qualquer uma das modalidades 1-60.
[00496] Modalidade 62. Uma célula imortalizada gerada a partir da célula de roedor isolada da modalidade 61.
[00497] Modalidade 63. A célula de roedor isolada de 61, em que a célula de roedor é uma célula-tronco embrionária (ES) de roedor.
[00498] Modalidade 64. Um embrião de roedor gerado a partir da célula ES do roedor da modalidade 63.
[00499] Modalidade 65. Uso de um roedor de qualquer uma das modalidades 1-60 para fazer um anticorpo.
[00500] Modalidade 66. Uso de um roedor de qualquer uma das modalidades 1-60 para fazer uma sequência de região variável de cadeia leve.
[00501] Modalidade 67. Uso de um roedor de qualquer uma das modalidades 1-60 para fazer uma sequência de domínio variável de cadeia leve.
[00502] Modalidade 68. Uma célula B isolada obtida a partir de um roedor de qualquer uma das modalidades 1-60, em que o genoma da célula B compreende: (a) uma sequência de região variável de cadeia leve de lambda humana rearranjada operacionalmente ligada a uma sequência de região variável de cadeia leve de lambda, em que a sequência de região variável de cadeia leve de lambda humana rearranjada compreende: (i) um dos um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana ou uma variante somaticamente hipermutado destes, e
254 / 308 (ii) um dos um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana ou uma sua variante somática hipermutada.
[00503] Modalidade 69. A célula B isolada da modalidade 68, compreendendo ainda: (b) uma sequência de região variável de cadeia pesada humana reorganizada operacionalmente ligada a uma sequência de região variável de cadeia pesada de roedor, em que a sequência de região variável de cadeia pesada humana reorganizada compreende: (i) um dos um ou mais segmentos gênicos de VH humanos ou uma variante somaticamente hipermutado destes, (ii) um dos um ou mais segmentos gênicos de DH humano ou uma sua variante somática hipermutada, e (iii) um dos um ou mais segmentos gênicos de JH humano ou uma sua variante somática hipermutada.
[00504] Modalidade 70. Anticorpo preparado por um método compreendendo as etapas de: (a) fornecer um roedor de qualquer uma das modalidades 1-60; (b) imunizar o roedor com um antígeno de interesse; (c) manter o roedor em condições suficientes para o roedor produzir uma resposta imune ao antígeno de interesse; e (d) recuperar do roedor: (i) um anticorpo que se liga ao antígeno de interesse, (ii) um nucleotídeo que codifica um domínio variável de cadeia leve ou pesada humana, uma cadeia leve ou uma cadeia pesada de um anticorpo que se liga ao antígeno de interesse, ou (iii) uma célula que expressa um anticorpo que se liga ao antígeno de interesse, em que um anticorpo de (d) inclui domínios variáveis de cadeia pesada humanos e variáveis de cadeia leve λ humanos.
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[00505] Modalidade 71. Célula de roedor isolada, cujo genoma compreende: um primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulado, compreendendo: (a) um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana, (b) um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana, e (c) um gene Cλ, em que um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana e um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana são operacionalmente ligados ao gene Cλ, e em que o roedor não possui um gene Cκ de roedor no primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada.
[00506] Modalidade 72. A célula isolada de roedor, de acordo com a modalidade 71, em que a célula isolada de roedor é homozigoto para o primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada.
[00507] Modalidade 73. A célula isolada de roedor, de acordo com a modalidade 71, em que a célula isolada de roedor é heterozigoto para o primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada.
[00508] Modalidade 74. A célula de roedor isolada da modalidade 73, em que o genoma da célula de roedor isolado compreende um segundo locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (a) um ou mais segmentos gênicos de Vκ humano, e (b) um ou mais segmentos gênicos de Jκ humano, em que um ou mais segmentos gênicos de Vκ humano e um ou mais segmentos gênicos de Jκ humano são operacionalmente ligados a um gene Cκ.
[00509] Modalidade 75. A célula isolada de roedor, de acordo com a modalidade 74, em que o gene Cκ no segundo locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada é um gene Cκ de roedor endógeno.
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[00510] Modalidade 76. A célula isolada de roedor de qualquer uma das modalidades 71-75, em que a célula isolada de roedor não possui um gene Cκ de roedor no primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada.
[00511] Modalidade 77. A célula isolada de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 71-76, em que o gene Cλ no primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada compreende um gene Cλ de roedor.
[00512] Modalidade 78. A célula isolada de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 71-77, em que o primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada compreende adicionalmente: (i) uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana, em que a uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico de Vλ humana um locus de cadeia leve λ da imunoglobulina endógena humana; (ii) uma ou mais sequências não codificantes Jλ humana, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana, em que a uma ou mais sequências não codificantes Jλ humana aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico de Jλ humana em um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; ou (iii) qualquer combinação destes.
[00513] Modalidade 79. A célula de roedor isolada de qualquer uma das modalidades 71-78, em que:
[00514] (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ compreendem Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5- 39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1,
257 / 308 ou qualquer combinação destes; e (ii) um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes. Modalidade 80. A célula isolada de roedor, de acordo com a modalidade 79, em que o primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana é adjacente à Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1, no primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3- 21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificantes Jλ humana, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Jλ humana é adjacente às Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Jλ humana aparece naturalmente adjacente a um Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 de um locus de cadeia leve da imunoglobulina humana endógena.
[00515] Modalidade 81. A célula isolada de roedor, de acordo com a modalidade 79, em que o primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada compreende:
258 / 308 (i) uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana é adjacente à Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 no primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana aparecem naturalmente adjacentes a Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3- 21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena, (ii) uma ou mais sequências não codificantes de Jκ humano, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Jκ humano é adjacente às Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Jκ humano aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena humana.
[00516] Modalidade 82. A célula de roedor isolada de qualquer uma das modalidades 71-81, em que: (a) os um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana compreendem Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1- 51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3- 16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ou qualquer combinação destes; e (b) um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana
259 / 308 compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes.
[00517] Modalidade 83. A célula isolada de roedor, de acordo com a modalidade 82, em que o primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana é adjacente à Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5- 39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3- 1, no primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana aparecem naturalmente adjacentes a Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificantes Jλ humana, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Jλ humana é adjacente às Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Jλ humana aparece naturalmente adjacente a um Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 de um locus de cadeia leve λ da imunoglobulina humana endógena.
[00518] Modalidade 84. A célula isolada de roedor, de acordo com a modalidade 82, em que o primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana,
260 / 308 em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana é adjacente à Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5- 39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 no primeiro locus da cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, V4-3λ ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificantes de Jκ humano, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Jκ humano é adjacente às Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Jκ humano aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve da de imunoglobulina endógena humana.
[00519] Modalidade 85. A célula isolada de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 71-84, em que o genoma da célula de roedor compreende adicionalmente: um locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (a) um ou mais segmentos gênicos de VH humanos, (b) um ou mais segmentos gênicos de DH humanos, e (c) um ou mais segmentos gênicos de JH humanos, em que um ou mais segmentos gênicos de VH humanos, um ou
261 / 308 mais segmentos gênicos de DH humanos e um ou mais segmentos gênicos de JH humanos são operacionalmente ligados a um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
[00520] Modalidade 86. A célula isolada de roedor, de acordo com a modalidade 85, em que um ou mais segmentos gênicos de VH humanos, um ou mais segmentos gênicos de DH humanos e um ou mais segmentos gênicos de JH humanos estão no lugar de um ou mais segmentos gênicos de VH de roedores, um ou mais segmentos gênicos de DH de roedores, um ou mais segmentos gênicos de JH de roedores ou uma combinação destes.
[00521] Modalidade 87. A célula isolada de roedor, de acordo com a modalidade 85 ou 86, em que um ou mais segmentos gênicos de VH humanos, um ou mais segmentos gênicos de DH humanos e um ou mais segmentos gênicos de JH humanos estão no lugar de um ou mais segmentos gênicos de VH de roedores, um ou mais segmentos gênicos de DH de roedores, um ou mais segmentos gênicos de JH de roedores ou uma combinação destes.
[00522] Modalidade 88. A célula isolada de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 85-87, em que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada compreende adicionalmente: (i) uma ou mais sequências não codificantes de VH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos de VH humanos, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de VH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico de VH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena; (ii) uma ou mais sequências não codificantes de DH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos de DH humanos, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de DH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico de
262 / 308 DH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena humana; (iii) uma ou mais sequências não codificantes de JH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos de JH humanos, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de JH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico de JH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena humana; ou (iv) qualquer combinação destes.
[00523] Modalidade 89. A célula isolada de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 85-88, em que um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor são um ou mais genes da região constante de cadeia pesada da imunoglobulina de roedor endógeno.
[00524] Modalidade 90. A célula de roedor isolada de qualquer uma das modalidades 85-89, em que: (i) o um ou mais segmentos genéticos de VH humano compreendem VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1- 45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, ou qualquer combinação destes, (ii) um ou mais segmentos gênicos de DH humanos compreendem DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-22, DH6-25, DH1-26, DH7-27, ou qualquer combinação destes, e (iii) um ou mais segmentos gênicos de JH humanos compreendem JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 ou qualquer combinação destes.
263 / 308
[00525] Modalidade 91. A célula isolada de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 85-90, em que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada não possui um gene Adam6 de roedor endógeno funcional.
[00526] Modalidade 92. A célula isolada de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 85-91, em que o genoma da célula do roedor compreende adicionalmente uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais.
[00527] Modalidade 93. A célula isolada de roedor, de acordo com a modalidade 92, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais são incluídas no mesmo cromossomo que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
[00528] Modalidade 94. A célula isolada de roedor, de acordo com a modalidade 92 ou 93, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais estão incluídas no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
[00529] Modalidade 95. A célula isolada de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 92-94, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais estão no lugar de um pseudogene Adam6 humano.
[00530] Modalidade 96. A célula isolada de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 92-95, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais
264 / 308 substituem um pseudogene Adam6 humano.
[00531] Modalidade 97. A célula isolada de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 92-96, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais estão entre um primeiro segmento gênico de VH humano e um segundo segmento gênico de VH humano.
[00532] Modalidade 98. A célula isolada de roedor, de acordo com a modalidade 97, em que o primeiro segmento gênico de VH humano é VH1-2 e o segundo segmento gênico de VH humano é VH6-1.
[00533] Modalidade 99. A célula isolada de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 92-94, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais estão entre um segmento gênico de VH humano e um segmento gênico de DH humano.
[00534] Modalidade 100. A célula isolada de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 85-99, em que a célula isolada de roedor é homozigótica para o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
[00535] Modalidade 101. A célula isolada de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 71-100, em que o genoma da célula isolada de roedor compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma desoxinucleotidiltransferase terminal exógena (TdT) operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional.
[00536] Modalidade 102. A célula isolada de roedor, de acordo com a modalidade 101, em que o TdT é uma isoforma curta de TdT (TdTS).
[00537] Modalidade 103. A célula isolada de roedor, de acordo com a modalidade 101 ou 102, em que o elemento de controle transcricional inclui
265 / 308 um elemento de controle transcricional de RAG1, um elemento de controle transcricional de RAG2, um elemento de controle transcricional de cadeia pesada de imunoglobulina, um elemento de controle transcricional de cadeia leve κ de imunoglobulina, um elemento de controle transcricional de cadeia leve λ de imunoglobulina ou qualquer combinação destes.
[00538] Modalidade 104. A célula isolada de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 101-103, em que a sequência de ácido nucleico que codifica um TdT exógeno está no genoma da célula de roedor em um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina, um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina, um locus de RAG1 ou um locus de RAG2.
[00539] Modalidade 105. A célula isolada de roedor de qualquer uma das modalidades 71-104, em que a célula de roedor é uma célula de rato ou uma célula de camundongo.
[00540] Modalidade 106. Uma célula imortalizada gerada a partir da célula isolada de roedor de qualquer uma das modalidades 71-105.
[00541] Modalidade 107. A célula isolada roedor de qualquer uma das modalidades 71-105, em que a célula de roedor é uma célula-tronco embrionária de roedor (ES).
[00542] Modalidade 108. Um embrião de roedor gerado a partir da célula ES do roedor da modalidade 107.
[00543] Modalidade 109. Um método para fabricar um roedor geneticamente modificado, compreendendo as etapas de: (a) introdução de um ou mais fragmentos de DNA no primeiro locus da cadeia leve da imunoglobulina manipulada no genoma de uma célula ES de roedor, em que os um ou mais fragmentos de DNA compreendem: (i) um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana, (ii) um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana, e (iii) um gene Cλ,
266 / 308 em que os um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana, um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana e os genes Cλ são introduzidos no genoma da célula ES de roedor no locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena, e em que um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana, um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana e os genes Cλ são operacionalmente ligados; e (b) geração de um roedor usando a célula ES de roedor gerada em (a).
[00544] Modalidade 110. Um método da modalidade 109, em que o genoma da célula ES de roedor compreende um segundo locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (i) um ou mais segmentos gênicos de Vκ humano, e (ii) um ou mais segmentos gênicos de Jκ humano, em que um ou mais segmentos gênicos de Vκ humano e um ou mais segmentos gênicos de Jκ humano são operacionalmente ligados a um gene Cκ.
[00545] Modalidade 111. O método da modalidade 109 ou 110, em que o genoma da célula ES de roedor compreende um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (i) um ou mais segmentos gênicos de VH humanos, (ii) um ou mais segmentos gênicos de DH humanos, e (iii) um ou mais segmentos gênicos de JH humanos, em que um ou mais segmentos gênicos de VH humanos, um ou mais segmentos gênicos de DH humanos e um ou mais segmentos gênicos de JH humanos são operacionalmente ligados a um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
[00546] Modalidade 112. O método de qualquer uma das modalidades 109-111, em que um ou mais fragmentos de DNA compreendem ainda pelo
267 / 308 menos um marcador de seleção.
[00547] Modalidade 113. O método de qualquer uma das modalidades 109-112, em que um ou mais fragmentos de DNA compreendem ainda pelo menos um sítio de recombinação específico do sítio.
[00548] Modalidade 114. O método de qualquer uma das modalidades 109-113, compreendendo ainda a introdução de uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana e uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana no primeiro locus da cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada, em que cada uma ou mais as sequências não codificantes de Vλ humana são adjacentes a um segmento gênico de Vλ humana, e cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Jλ humana é adjacente a um segmento gênico de Jλ humana.
[00549] Modalidade 115. O método de qualquer uma das modalidades 109-114, compreendendo ainda a introdução de uma sequência não codificante da cadeia leve κ no genoma da célula ES do roedor, de modo que a sequência não codificante da cadeia leve κ esteja entre um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana e o um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana no primeiro locus da cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada.
[00550] Modalidade 116. O método de qualquer uma das modalidades 109-115, em que a célula ES de roedor é uma célula ES de rato ou uma célula ES de camundongo.
[00551] Modalidade 117. Um método para fabricar um roedor geneticamente modificado, compreendendo as etapas de: (a) manipular um primeiro locus da cadeia leve κ de imunoglobulina endógena no genoma da linhagem germinativa do roedor para incluir: (i) um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana, (ii) um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana, e
268 / 308 (iii) um gene Cλ, em que um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana e um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana são operacionalmente ligados ao gene Cλ, e em que o gene C é inserido no primeiro locus da cadeia leve κ da imunoglobulina endógena.
[00552] Modalidade 118. O método da modalidade 117, em que o método compreende ainda a etapa de: (b) manipular um segundo locus da cadeia leve κ de imunoglobulina endógena no genoma da linhagem germinativa do roedor para incluir: (i) um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana, (ii) um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana, e (iii) um gene Cλ, em que um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana e um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana são operacionalmente ligados ao gene Cλ, e em que o gene Cλ é inserido no segundo locus da cadeia leve κ da imunoglobulina endógena.
[00553] Modalidade 119. O método da modalidade 117, em que o método compreende ainda a etapa de: (b) manipular um segundo locus da cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada no genoma da linhagem germinativa do roedor para incluir: (i) um ou mais segmentos gênicos de Vκ humano, e (ii) um ou mais segmentos gênicos de Jκ humano, em que um ou mais segmentos gênicos de Vκ humano e um ou mais segmentos gênicos de Jκ humano são operacionalmente ligados a um gene Cκ.
269 / 308
[00554] Modalidade 120. O método, de acordo com a modalidade 119, em que o gene Cκ no segundo locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada é um gene Cκ de roedor endógeno.
[00555] Modalidade 121. O método de qualquer uma das modalidades 117-120, em que o método compreende ainda a etapa de: (c) manipular um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada no genoma da linhagem germinativa do roedor para incluir: (i) um ou mais segmentos gênicos de VH humanos, (ii) um ou mais segmentos gênicos de DH humanos, e (iii) um ou mais segmentos gênicos de JH humanos, em que um ou mais segmentos gênicos de VH humanos, um ou mais segmentos gênicos de DH humanos e um ou mais segmentos gênicos de JH humanos são operacionalmente ligados a um ou mais genes de região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor.
[00556] Modalidade 122. O método de qualquer uma das modalidades 117-121, em que a etapa de manipulação de um primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena no genoma da linhagem germinativa do roedor é realizada em uma célula ES de roedor cujo genoma compreende um segundo locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada compreendendo um ou mais segmentos gênicos de Vκ humano e um ou mais segmentos gênicos de Jκ humano, em que um ou mais segmentos gênicos de Vκ humano e um ou mais segmentos gênicos de Jκ humano estão operacionalmente ligados a um gene Cκ.
[00557] Modalidade 123. O método, de acordo com a modalidade 122, em que o gene Cκ no segundo locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada é um gene Cκ de roedor endógeno.
[00558] Modalidade 124. O método de qualquer uma das modalidades 117-120, 122 e 123, em que a etapa de manipulação é realizada em uma
270 / 308 célula ES de roedor cujo genoma compreende um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada que compreende um ou mais segmentos gênicos de VH humanos, um ou mais segmentos gênicos de DH humanos e um ou mais segmentos gênicos de JH humanos operacionalmente ligados a um ou mais genes da região constante da cadeia pesada de imunoglobulina de roedores.
[00559] Modalidade 125. O método de qualquer uma das modalidades 121-124, em que o locus da cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada compreende uma ou mais sequências não codificantes de VH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos de VH humanos, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de VH humano aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico de VH humano em um locus endógeno da cadeia pesada de imunoglobulina humana.
[00560] Modalidade 126. O método de qualquer uma das modalidades 121-125, em que o locus da cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada compreende uma ou mais sequências não codificantes de DH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos de DH humanos, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de DH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico de DH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena.
[00561] Modalidade 127. O método de qualquer uma das modalidades 121-126, em que o locus da cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada compreende uma ou mais sequências não codificantes de JH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos de JH humanos, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de JH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico de JH humano em um locus endógeno da cadeia pesada de
271 / 308 imunoglobulina humana.
[00562] Modalidade 128. O método de qualquer uma das modalidades 109-127, em que o primeiro locus da cadeia leve κ de imunoglobulina endógena modificada não possui um gene Cκ de roedor.
[00563] Modalidade 129. O método de qualquer uma das modalidades 110-115 e 119-128, em que o gene Cκ no segundo locus da cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada é um gene Cκ de roedor endógeno.
[00564] Modalidade 130. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 109-129, em que o gene Cλ no primeiro locus de cadeia leve de κ imunoglobulina endógena manipulada compreende um gene Cλ de roedor.
[00565] Modalidade 131. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 109-130, em que o primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada compreende adicionalmente: (i) uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos de Vλ humana, em que a uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico de Vλ humana um locus de cadeia leve λ da imunoglobulina endógena humana; (ii) uma ou mais sequências não codificantes Jλ humana, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana, em que a uma ou mais sequências não codificantes Jλ humana aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico de Jλ humana em um locus de cadeia leve λ da imunoglobulina humana endógena; ou (iii) qualquer combinação destes.
[00566] Modalidade 132. O Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 109-131, em que: (i) o um ou mais segmentos de genes Vλ humana compreendem Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44,
272 / 308 Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3- 22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ou qualquer combinação destes; e (ii) um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes.
[00567] Modalidade 133. O método, de acordo com a modalidade 132, em que o primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana é adjacente à Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 no primeiro locus da cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma delas ou mais sequências não codificantes de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3- 22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 de um locus da cadeia leve λ de imunoglobulina endógena humana; e (ii) uma ou mais sequências não codificantes Jλ humana, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Jλ humana é adjacente às Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Jλ humano aparece naturalmente adjacente a um Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 de um locus de cadeia leve λ da imunoglobulina humana endógena.
[00568] Modalidade 134. O método, de acordo com a modalidade 132,
273 / 308 em que o primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana é adjacente à Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 no primeiro locus da cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana aparecem naturalmente adjacentes a Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3- 21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus da cadeia leve λ de imunoglobulina endógena humana; e (ii) uma ou mais sequências não codificantes de Jκ humano, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Jκ humano é adjacente às Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Jκ humano aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena humana.
[00569] Modalidade 135. O Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 109-134, em que: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos compreendem Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1- 36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ou qualquer
274 / 308 combinação destes; e (ii) um ou mais segmentos gênicos de Jλ humana compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes. Modalidade 136. O método, de acordo com a modalidade 135, em que o primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana é adjacente à Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5- 39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 no primeiro locus da cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana aparecem naturalmente adjacentes a Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3- 22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 de um locus da cadeia leve λ de imunoglobulina endógena humana; e (ii) uma ou mais sequências não codificantes Jλ humana, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes Jλ humana é adjacente às Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Jλ humana aparece naturalmente adjacente a um Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 de um locus de cadeia leve λ da imunoglobulina humana endógena.
[00570] Modalidade 137. O método, de acordo com a modalidade 135, em que o primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena
275 / 308 manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana é adjacente à Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5- 39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 no primeiro locus da cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma ou mais sequências não codificantes de Vλ humana aparecem naturalmente adjacentes a Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6- 57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3- 22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus da cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificantes de Jκ humano, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Jκ humano é adjacente às Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena manipulada e em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de Jκ humano aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve κ de imunoglobulina endógena humana.
[00571] Modalidade 138. O método de qualquer uma das modalidades 111-116 e 121-137, em que um ou mais segmentos gênicos de VH humanos, um ou mais segmentos gênicos de DH humanos e um ou mais segmentos gênicos de JH humanos estão no lugar de um ou mais segmentos gênicos de VH de roedores, um ou mais segmentos gênicos de DH de roedores, um ou mais segmentos gênicos de JH de roedores ou uma combinação destes.
[00572] Modalidade 139. O método de qualquer uma das modalidades
276 / 308 111-116 e 121-138, em que o um ou mais segmentos gênicos de VH humanos, um ou mais segmentos gênicos de DH humanos e um ou mais segmentos gênicos de JH humanos substituem um ou mais segmentos gênicos de VH de roedores, um ou mais segmentos gênicos de DH de roedores, um ou mais segmentos gênicos de JH de roedores ou qualquer combinação destes.
[00573] Modalidade 140. O método de qualquer uma das modalidades 111-116 e 121-139, em que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada compreende adicionalmente: (i) uma ou mais sequências não codificantes de VH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos de VH humanos, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de VH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico de VH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena; (ii) uma ou mais sequências não codificantes de DH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos de DH humanos, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de DH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico de DH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena humana; (iii) uma ou mais sequências não codificantes de JH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um dos um ou mais segmentos gênicos de JH humanos, em que cada uma das uma ou mais sequências não codificantes de JH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico de JH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena humana; ou (iv) qualquer combinação destes.
[00574] Modalidade 141. O método de qualquer uma das modalidades 111-116 e 121-140, em que um ou mais genes da região constante de cadeia
277 / 308 pesada de imunoglobulina de roedor são um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina endógena de roedor.
[00575] Modalidade 142. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 111-116 e 121-141, em que: (i) um ou mais segmentos gênicos VH humano compreendem VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4- 59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3- 23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3- 7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, ou qualquer combinação destes; (ii) um ou mais segmentos gênicos DH humano compreendem DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3- 22, DH6-25, DH1-26, DH7-27, ou qualquer combinação destes; e (iii) um ou mais segmentos gênicos JH humanos compreendem JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 ou qualquer combinação destes.
[00576] Modalidade 143. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 111-116 e 121-142, em que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada não possui um gene Adam6 de roedor endógeno funcional.
[00577] Modalidade 144. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 111-116 e 121-143, em que o gnoma da célula ES de roedor ou o genoma de linhagem germinativa do roedor compreende adicionalmente uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais.
[00578] Modalidade 145. O método, de acordo com a modalidade 144, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais
278 / 308 polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais são incluídas no mesmo cromossomo que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
[00579] Modalidade 146. O método, de acordo com a modalidade 144 ou 145, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais estão incluídas no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
[00580] Modalidade 147. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 144-146, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais estão no lugar de um pseudogene Adam6 humano.
[00581] Modalidade 148. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 144-147, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais substituem um pseudogene Adam6 humano.
[00582] Modalidade 149. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 144-148, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais estão entre um primeiro segmento gênico VH humano e um segundo segmento gênico VH humano.
[00583] Modalidade 150. O método, de acordo com a modalidade 149, em que o primeiro segmento gênico VH humano é VH1-2 e o segundo segmento gênico VH humano é VH6-1.
[00584] Modalidade 151. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 144-146, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que
279 / 308 codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais estão entre um segmento gênico VH humano e um segmento gênico DH humano.
[00585] Modalidade 152. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 111-116 e 121-151, em que o roedor é homozigoto para o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
[00586] Modalidade 153. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 109-152, em que o genoma da célula ES de roedor ou o genoma de linhagem germinativa de roedor compreende adicionalmente uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma desoxinucleotidiltransferase exógena terminal (TdT) operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional.
[00587] Modalidade 154. O método, de acordo com a modalidade 153, em que o TdT é uma isoforma curta de TdT (TdTS).
[00588] Modalidade 155. O método, de acordo com a modalidade 153 ou 154, em que o elemento de controle transcricional inclui um elemento de controle transcricional de RAG1, um elemento de controle transcricional de RAG2, um elemento de controle transcricional de cadeia pesada de imunoglobulina, um elemento de controle transcricional de cadeia leve de imunoglobulina κ, um elemento de controle transcricional de cadeia leve λ de imunoglobulina ou qualquer combinação destes.
[00589] Modalidade 156. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 153-155, em que a sequência de ácidos nucleicos que codifica um TdT exógeno está em um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ, um locus de cadeia leve de imunoglobulina λ, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina, um locus de RAG1 ou um locus de RAG2.
[00590] Modalidade 157. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 109-156, em que o roedor é um rato ou um camundongo.
[00591] Modalidade 158. Um método para produzir um anticorpo em
280 / 308 um roedor geneticamente modificado, o método compreendendo as etapas de: (a) imunizar um roedor com um antígeno de interesse, em que o roedor tem um genoma de linhagem germinativa compreendendo: um primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, compreendendo: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, e (iii) um gene Cλ, em que um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos são operacionalmente ligados ao gene Cλ, e em que o gene Cλ (c) está no lugar de um gene Cκ de roedor no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada; (b) manter o roedor em condições suficientes para o roedor produzir uma resposta imune ao antígeno de interesse; e (c) recuperar do roedor: (i) um anticorpo que se liga ao antígeno de interesse, (ii) um nucleotídeo que codifica um domínio variável de cadeia leve ou pesada humana, uma cadeia leve ou uma cadeia pesada de um anticorpo que se liga ao antígeno de interesse, ou (iii) uma célula que expressa um anticorpo que se liga ao antígeno de interesse.
[00592] Modalidade 159. O método, de acordo com a modalidade 158, em que a célula do roedor é uma célula B.
[00593] Modalidade 160. O método da modalidade 159, compreendendo adicionalmente a produção de um hibridoma a partir da célula B.
[00594] Modalidade 161. Um método para produzir um anticorpo,
281 / 308 compreendendo: (a) expressar uma primeira sequência nucleotídica que codifica uma cadeia pesada de imunoglobulina em uma célula hospedeira, em que a primeira sequência nucleotídica inclui uma sequência da região variável de cadeia pesada humana; (b) expressar uma segunda sequência nucleotídica que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina λ em uma célula hospedeira, em que a segunda sequência nucleotídica inclui uma sequência de região variável de cadeia leve λ humana que foi identificada a partir de um roedor geneticamente modificado cujo genoma de linhagem germinativa compreende: um primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, compreendendo: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, e (iii) um gene Cλ, em que um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos são operacionalmente ligados ao gene Cλ, e em que o roedor não possui um gene Cκ de roedor no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada; e (c) cultivar a célula hospedeira de modo que as cadeias leves de imunoglobulina e cadeias pesadas de imunoglobulina sejam expressas e formem um anticorpo; e (d) obter o anticorpo da célula hospedeira e/ou cultura de células hospedeiras.
[00595] Modalidade 162. O método, de acordo com a modalidade 161, em que o primeiro nucleotídeo inclui adicionalmente um gene da região constante de cadeia pesada humana.
282 / 308
[00596] Modalidade 163. O método, de acordo com a modalidade 161 ou 162, em que o segundo nucleotídeo inclui adicionalmente um gene da região constante de cadeia leve λ humana.
[00597] Modalidade 164. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 158-163, em que o roedor é homozigoto para o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada.
[00598] Modalidade 165. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 158-163, em que o roedor é heterozigoto para o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada.
[00599] Modalidade 166. O roedor geneticamente modificado, de acordo com a modalidade 165, em que o genoma de linhagem germinativa de roedor compreende um segundo κ locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (a) um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos, e (b) um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos, em que um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos são operacionalmente ligados a um gene Cκ.
[00600] Modalidade 167. O método, de acordo com a modalidade 166, em que o gene Cκ no segundo locus de cadeia leve deκ imunoglobulina endógena manipulada é um gene Cκ de roedor endógeno.
[00601] Modalidade 168. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 158-167, em que o roedor não possui um gene Cκ de roedor no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada.
[00602] Modalidade 169. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 158-168, em que o gene Cλ no primeiro locus de cadeia leve de κ imunoglobulina endógena manipulada compreende um gene Cλ de roedor.
[00603] Modalidade 170. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 158-169, em que o primeiro locus de cadeia leve de κ
283 / 308 imunoglobulina endógena manipulada compreende adicionalmente: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, em que a uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico Vλ humano em um λ locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena humana; (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, em que uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico Jλ humano em um λ locus de cadeia leve de imunoglobulina humana endógena; ou (iii) qualquer combinação destes.
[00604] Modalidade 171. O Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 158-170, em que: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ compreendem Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5- 39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ou qualquer combinação destes; e (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes.
[00605] Modalidade 172. O método, de acordo com a modalidade 171, em que o primeiro κ locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10,
284 / 308 Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ouVλ3-1, no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada κ e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1- 44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3- 9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada κ e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 de um locus de cadeia leve de imunoglobulina humana endógena.
[00606] Modalidade 173. O método, de acordo com a modalidade 171, em que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ humana endógena e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacente a um Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3- 22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10,
285 / 308 Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ humana endógena.
[00607] Modalidade 174. O Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 158-173, em que: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos compreendem Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1- 36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ou qualquer combinação destes; e (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes. Modalidade 175. O método, de acordo com a modalidade 174, em que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5- 52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3- 19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena
286 / 308 manipulada κ e em que cada uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada κ e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 de um locus de cadeia leve de imunoglobulina humana endógena.
[00608] Modalidade 176. O método, de acordo com a modalidade 174, em que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5- 52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3- 19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada e em que cada uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ4- 69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3- 27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14,
287 / 308 Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena, (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ humana endógena.
[00609] Modalidade 177. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 158-176, em que o genoma de linhagem germinativa de roedor compreende adicionalmente:
[00610] um locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (a) um ou mais segmentos gênicos VH humanos, (b) um ou mais segmentos gênicos DH humanos, e (c) um ou mais segmentos gênicos JH humanos, em que um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos são operacionalmente ligados a um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
[00611] Modalidade 178. O método, de acordo com a modalidade 177, em que um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos estão no lugar de um ou mais segmentos gênicos VH de roedores, um ou mais segmentos gênicos DH de roedores, um ou mais segmentos gênicos JH de roedores ou uma combinação destes.
[00612] Modalidade 179. O método, de acordo com a modalidade 177
288 / 308 ou 178, em que um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos estão no lugar de um ou mais segmentos gênicos VH de roedores, um ou mais segmentos gênicos DH de roedores, um ou mais segmentos gênicos JH de roedores ou uma combinação destes.
[00613] Modalidade 180. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 177-179, em que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada compreende adicionalmente: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de VH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos VH humanos, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de VH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico VH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena; (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de DH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos DH humanos, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de DH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico DH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena; (iii) uma ou mais sequências não codificadoras de JH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos JH humanos, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de JH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico JH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena; ou (iv) qualquer combinação destes.
[00614] Modalidade 181. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 177-180, em que um ou mais genes da região constante de
289 / 308 cadeia pesada de imunoglobulina de roedor são um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina endógena de roedor.
[00615] Modalidade 182. O Método, de acordo com qualquer uma das modalidades 177-181, em que: (i) um ou mais segmentos gênicos VH compreendem VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1- 58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3- 21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, ou qualquer combinação destes, (ii) um ou mais segmentos gênicos DH humanos compreendem DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3- 22, DH6-25, DH1-26, DH7-27, ou qualquer combinação destes, e (iii) um ou mais segmentos gênicos JH humanos compreendem JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 ou qualquer combinação destes.
[00616] Modalidade 183. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 177-182, em que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada não possui um gene Adam6 de roedor endógeno funcional.
[00617] Modalidade 184. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 177-183, em que o genoma de linhagem germinativa de roedor compreende adicionalmente uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais.
[00618] Modalidade 185. O método, de acordo com a modalidade 184, em que um ou mais polipeptídeos ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais são expressos.
[00619] Modalidade 186. O método, de acordo com a modalidade 184
290 / 308 ou 185, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais são incluídas no mesmo cromossomo que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
[00620] Modalidade 187. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 184-186, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6 de roedores, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais estão incluídas no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
[00621] Modalidade 188. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 184-187, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais estão no lugar de um pseudogene Adam6 humano.
[00622] Modalidade 189. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 184-188, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais substituem um pseudogene Adam6 humano.
[00623] Modalidade 190. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 184-189, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais estão entre um primeiro segmento gênico VH humano e um segundo segmento gênico VH humano.
[00624] Modalidade 191. O método, de acordo com a modalidade 190, em que o primeiro segmento gênico VH humano é VH1-2 e o segundo segmento gênico VH humano é VH6-1.
291 / 308
[00625] Modalidade 192. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 184-187, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais estão entre um segmento gênico VH humano e um segmento gênico DH humano.
[00626] Modalidade 193. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 177-192, em que o roedor é homozigoto para o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
[00627] Modalidade 194. O roedor geneticamente modificado, de acordo com qualquer uma das modalidades 158-193, em que o roedor compreende uma população de células B que expressam anticorpos, incluindo cadeias leves de imunoglobulina λ nas quais cada uma inclui um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina humana λ.
[00628] Modalidade 195. O método, de acordo com a modalidade 194, em que um domínio variável de cadeia leve λ de imunoglobulina humana é codificado por uma sequência de região variável de cadeia leve λ de imunoglobulina humana rearranjada compreendendo (i) um dos um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos ou uma variante somaticamente hipermutada desta e (ii) um de um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos ou uma variante somaticamente hipermutada desta.
[00629] Modalidade 196. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 158-195, em que o genoma de linhagem germinativa do roedor compreende adicionaalmente uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma desoxinucleotidiltransferase terminal exógena (TdT) operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional.
[00630] Modalidade 197. O método, de acordo com a modalidade 196, em que o TdT é uma isoforma curta de TdT (TdTS).
[00631] Modalidade 198. O método, de acordo com a modalidade 196 ou 197, em que o elemento de controle transcricional inclui um elemento de
292 / 308 controle transcricional de RAG1, um elemento de controle transcricional de RAG2, um elemento de controle transcricional de cadeia pesada de imunoglobulina, um elemento de controle transcricional de cadeia leve de imunoglobulina κ, um elemento de controle transcricional de cadeia leve λ de imunoglobulina ou qualquer combinação destes.
[00632] Modalidade 199. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 196-198, em que a sequência de ácidos nucleicos que codifica uma TdT exógena está no genoma da linhagem germinativa em um locus κ de cadeia leve de imunoglobulina, um locus λ de cadeia leve de imunoglobulina, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina, um locus de RAG1, ou um locus de RAG2.
[00633] Modalidade 200. O método, de acordo com qualquer uma das modalidades 158-199, em que o roedor é um rato ou um camundongo.
[00634] Modalidade 201. Célula-tronco embrionária de roedor (ES), cujo genoma compreende: um primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, compreendendo: (a) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, (b) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, e (c) um gene Cλ, em que um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos são operacionalmente ligados ao gene Cλ, e em que a célula ES de roedor não possui um gene Cκ de roedor no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada.
[00635] Modalidade 202. A célula ES de roedor, de acordo com a modalidade 201, em que a célula ES de roedor é homozigoto para o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada.
293 / 308
[00636] Modalidade 203. A célula ES de roedor, de acordo com a modalidade 201, em que a célula ES de roedor é heterozigoto para o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada.
[00637] Modalidade 204. A célula ES de roedor, de acordo com a modalidade 203, em que o genoma da célula ES de roedor compreende um segundo locus κ de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (i) um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos, e (ii) um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos, em que um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos são operacionalmente ligados a um gene Cκ.
[00638] Modalidade 205. A célula ES de roedor, de acordo com a modalidade 204, em que o gene C κno segundo locus de cadeia leve deκ imunoglobulina endógena manipulada é um gene Cκ de roedor endógeno.
[00639] Modalidade 206. A célula ES de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 201-205, em que o genoma de célula ES de roedor compreende um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (i) um ou mais segmentos gênicos VH humanos, (ii) um ou mais segmentos gênicos DH humanos, e (iii) um ou mais segmentos gênicos JH humanos, em que um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos são operacionalmente ligados a um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
[00640] Modalidade 207. A célula ES de roedor, de acordo com as modalidades 201-206, em que o roedor não possui um gene Cκ de roedor no
294 / 308 primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada.
[00641] Modalidade 208. A célula ES de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 201-207, em que o gene Cλ no primeiro locus de cadeia leve de κ imunoglobulina endógena manipulada compreende um gene Cλ de roedor.
[00642] Modalidade 209. A célula ES de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 201-208, em que o primeiro locus de cadeia leve imunoglobulina κ endógena manipulada compreende adicionalmente: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, em que a uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico Vλ humano em um λ locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena humana; (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, em que uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico Jλ humano em um λ locus de cadeia leve de imunoglobulina humana endógena; ou (iii) qualquer combinação destes.
[00643] Modalidade 210. A célula ES de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 201-209, em que: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ compreendem Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5- 39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ou qualquer combinação destes; e (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes.
[00644] Modalidade 211. A célula ES de roedor, de acordo com a
295 / 308 modalidade 210, em que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1, no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada κ e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1- 44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3- 9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada κ e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena.
[00645] Modalidade 212. A célula ES de roedor, de acordo com a modalidade 210, em que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-
296 / 308 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 no primeiro locus de cadeia pesada de imunoglobulina κ endógena manipulada, e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1- 44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3- 10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena, (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ humana endógena.
[00646] Modalidade 213. A célula ES de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 201-212, em que: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos compreendem Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1- 36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ou qualquer combinação destes; e (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes.
[00647] Modalidade 214. A célula ES de roedor, de acordo com a modalidade 213, em que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende:
297 / 308 (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5- 52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3- 19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada κ e em que cada uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada κ e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 de um locus de cadeia leve de imunoglobulina humana endógena.
[00648] Modalidade 215. A célula ES de roedor, de acordo com a modalidade 213, em que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5- 52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-
298 / 308 19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ4- 69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3- 27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ humana endógena.
[00649] Modalidade 216. A célula ES de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 201-215, em que o genoma da célula ES de roedor compreende adicionalmente: um locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (a) um ou mais segmentos gênicos VH humanos, (b) um ou mais segmentos gênicos DH humanos, e (c) um ou mais segmentos gênicos JH humanos, em que um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos são operacionalmente ligados a um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
299 / 308
[00650] Modalidade 217. A célula ES de roedor, de acordo com a modalidade 216, em que um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos estão no lugar de um ou mais segmentos gênicos VH de roedores, um ou mais segmentos gênicos DH de roedores, um ou mais segmentos gênicos JH de roedores ou uma combinação destes.
[00651] Modalidade 218. A célula ES de roedor, de acordo com a modalidade 216 ou 217, em que um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos estão no lugar de um ou mais segmentos gênicos VH de roedores, um ou mais segmentos gênicos DH de roedores, um ou mais segmentos gênicos JH de roedores ou uma combinação destes.
[00652] Modalidade 219. A célula ES de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 216-218, em que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada compreende adicionalmente: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de VH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos VH humanos, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de VH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico VH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena; (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de DH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos DH humanos, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de DH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico DH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena; (iii) uma ou mais sequências não codificadoras de JH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos
300 / 308 gênicos JH humanos, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de JH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico JH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena; ou (iv) qualquer combinação destes.
[00653] Modalidade 220. A célula ES de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 216-219, em que um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor são um ou mais genes da região constante de cadeia pesada da imunoglobulina de roedor endógenos.
[00654] Modalidade 221. A célula ES de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 216-220, em que: (i) um ou mais segmentos gênicos VH humanos compreendem VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4- 59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3- 23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3- 7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, ou qualquer combinação destes, (ii) um ou mais segmentos gênicos DH humanos compreendem DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3- 22, DH6-25, DH1-26, DH7-27, ou qualquer combinação destes, e (iii) um ou mais segmentos gênicos JH humanos compreendem JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 ou qualquer combinação destes.
[00655] Modalidade 222. A célula ES de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 216-221, em que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada não possui um gene Adam6 de roedor endógeno funcional.
301 / 308
[00656] Modalidade 223. A célula ES de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 216-222, em que o genoma do roedor compreende adicionalmente uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais.
[00657] Modalidade 224. A célula ES de roedor, de acordo com a modalidade 223, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais são incluídas no mesmo cromossomo que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
[00658] Modalidade 225. A célula ES de roedor, de acordo com a modalidade 223 ou 224, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais estão incluídas no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
[00659] Modalidade 226. A célula ES de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 223-225, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais estão no lugar de um pseudogene Adam6 humano.
[00660] Modalidade 227. A célula ES de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 223-226, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais substituem um pseudogene Adam6 humano.
[00661] Modalidade 228. A célula ES de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 223-227, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor,
302 / 308 ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais estão entre um primeiro segmento gênico VH humano e um segundo segmento gênico VH humano.
[00662] Modalidade 229. A célula ES de roedor, de acordo com a modalidade 228, em que o primeiro segmento gênico de VH humano é VH1-2 e o segundo segmento gênico de VH humano é VH6-1.
[00663] Modalidade 230. A célula ES de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 223-225, em que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais estão entre um segmento gênico VH humano e um segmento gênico DH humano.
[00664] Modalidade 231. A célula ES de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 216-230, em que a célula de roedor é homozigótica para o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
[00665] Modalidade 232. A célula ES de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 201-231, em que o genoma da célula ES de roedor compreende adicionalmente uma sequência de ácidos nucleicos que codifica uma desoxinucleotidiltransferase terminal exógena (TdT) operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional.
[00666] Modalidade 233. A célula ES de roedor, de acordo com a modalidade 232, em que o TdT é uma isoforma curta de TdT (TdTS).
[00667] Modalidade 234. A célula ES de roedor, de acordo com a modalidade 232 ou 233, em que o elemento de controle transcricional inclui um elemento de controle transcricional de RAG1, um elemento de controle transcricional de RAG2, um elemento de controle transcricional de cadeia pesada de imunoglobulina, um elemento de controle transcricional de cadeia leve de imunoglobulina κ, um elemento de controle transcricional de cadeia
303 / 308 leve λ de imunoglobulina ou qualquer combinação destes.
[00668] Modalidade 235. A célula ES de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 232-234, em que a sequência de ácidos nucleicos que codifica um TdT exógeno está em um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ, um locus de cadeia leve de imunoglobulina λ, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina, um locus de RAG1 ou um locus de RAG2.
[00669] Modalidade 236. A célula ES de roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 201-235, em que a célula ES de roedor é uma célula ES de rato ou uma célula ES de camundongo.
[00670] Modalidade 237. Um método para fabricar um anticorpo totalmente humano específico contra um antígeno, compreendendo as etapas de: (a) imunizar um roedor de acordo com qualquer uma das modalidades 1-60 com o antígeno; (b) determinar uma sequência nucleotídica que codifica um domínio variável de cadeia pesada humana de um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno e que foi gerado pelo camundongo geneticamente modificado e/ou determinar uma sequência nucleotídica que codifica um λ domínio variável de cadeia leve humana de um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno e que foi gerado pelo camundongo geneticamente modificado; e (c) expressar um anticorpo totalmente humano, empregando: (i) a sequência nucleotídica que codifica um domínio variável de cadeia pesada humana de (b) ligada operacionalmente a um gene da região constante de cadeia pesada humana e/ou (ii) a sequência nucleotídica que codifica um λ domínio variável de cadeia leve humana de (b) ligada operacionalmente a um gene da região constante de cadeia leve humana.
[00671] Modalidade 238. Um método para fabricar um anticorpo
304 / 308 totalmente humano específico contra um antígeno, compreendendo as etapas de: (a) expressar em uma célula de mamífero um anticorpo totalmente humano compreendendo duas λ cadeias leves humanas e duas cadeias pesadas humanas, em que cada λ cadeia leve humana inclui um λ domínio variável de cadeia leve humana codificado por uma λ região variável de cadeia leve humana e cada cadeia pesada humana inclui uma domínio variável de cadeia pesada humana codificado por uma região variável de cadeia pesada humana, em que a sequência nucleotídica de pelo menos uma λ região variável de cadeia pesada ou leve humana foi obtida a partir de um roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-60; e (b) obter o anticorpo totalmente humano.
[00672] Modalidade 239. Um método para fabricar um anticorpo totalmente humano específico contra um antígeno, compreendendo as etapas de: (a) imunizar um roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-60; (b) determinar uma sequência de domínio variável de cadeia pesada humana de um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno e que foi gerado pelo camundongo geneticamente modificado e/ou determinar uma sequência de domínio variável de cadeia leve humana λ de um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno e que foi gerado pelo camundongo geneticamente modificado; e (c) expressar um anticorpo totalmente humano, empregando: (i) a sequência de domínio variável de cadeia pesada humana de (b) ligada operacionalmente a uma sequência de domínio constante dee cadeia pesada humana e/ou (ii) a λ sequência de domínio variável da cadeia leve humana de (b) ligada operacionalmente a uma sequência de domínio constante de
305 / 308 cadeia leve humana.
[00673] Modalidade 240. O método, de acordo com a modalidade 239, em que o emprego da sequência de domínio variável de cadeia pesada humana de (b) operacionalmente ligada a uma sequência de domínio constante de cadeia pesada humana compreende expressar uma sequência nucleotídica que codifica a sequência de domínio variável de cadeia pesada humana de (b) e a sequência de domín io constante de cadeia pesada humana.
[00674] Modalidade 241. O método, de acordo com a modalidade 239 ou 240, em que o emprego da λ sequência de domínio variável de cadeia leve humana de (b) operacionalmente ligada a uma sequência de domínio constante de cadeia leve humana compreende expressar uma sequência nucleotídica que codifica a λ sequência do domínio variável de cadeia leve humana de (b) e a sequência de domínio constante de cadeia leve humana.
[00675] Modalidade 242. Um método para fabricar um anticorpo totalmente humano específico contra um antígeno, compreendendo as etapas de: (a) expressar em uma célula de mamífero o referido anticorpo totalmente humano compreendendo duas λ cadeias leves humanas e duas cadeias pesadas humanas, em que cada λ cadeia leve humana inclui um domínio variável de cadeia leve humana e cada cadeia pesada humana inclui um domínio variável de cadeia pesada humana, em que a sequência de aminoácidos de pelo menos um λ domínio variável de cadeia pesada ou leve humana foi obtida a partir de um roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-60; e (b) obter o anticorpo totalmente humano.
[00676] Modalidade 243. Método para gerar uma λ sequência de domínio variável de cadeia pesada ou leve humana, compreendendo as etapas de: (a) imunizar um roedor, de acordo com qualquer uma das
306 / 308 modalidades 1-60; e (b) determinar uma λ sequência de domínio variável de cadeia pesada ou leve humana de um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno e que foi gerado pelo camundongo geneticamente modificado.
[00677] Modalidade 244. O método, de acordo com a modalidade 243, em que determinar uma λ sequência de domínio variável de cadeia pesada ou leve humana compreende determinar uma sequência nucleotídica que codifica a λ sequência de domínio variável de cadeia pesada ou leve humana.
[00678] Modalidade 245. Método para gerar uma cadeia pesada totalmente humana ou uma cadeia leve totalmente humana, compreendendo as etapas de: (a) imunizar um roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-60; (b) determinar uma λ sequência de domínio variável de cadeia pesada ou leve humana de um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno e que foi gerado pelo camundongo geneticamente modificado; e (c) ligar de forma operacional a λ sequência de domínio variável de cadeia pesada ou leve humana a uma sequência de domínio constante de cadeia pesada ou leve humana, respectivamente, para formar uma cadeia pesada totalmente humana ou uma cadeia leve totalmente humana.
[00679] Modalidade 246. O método, de acordo com a modalidade 245, em que a ligação operacional da λ sequência de domínio variável de cadeia pesada ou leve humana a uma sequência de domínio constante de cadeia pesada ou leve humana, respectivamente, compreende a ligação operacional de uma sequência nucleotídica que codifica a λ sequência de domínio variável de cadeia pesada ou leve humana a uma sequência nucleotídica que codifica a sequência de domínio constante de cadeia pesada ou leve humana.
[00680] Modalidade 247. Um método para gerar uma λ sequência da
307 / 308 região variável de cadeia pesada ou leve humana, compreendendo as etapas de: (a) imunizar um roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-60; e (b) determinar uma λ sequência da região variável de cadeia pesada ou leve humana que codifica um λ domínio variável de cadeia pesada ou leve humana, respectivamente, de um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno e que foi gerado pelo camundongo geneticamente modificado.
[00681] Modalidade 248. Um método para gerar uma sequência nucleotídica que codifica uma cadeia pesada totalmente humana ou uma cadeia leve totalmente humana, compreendendo as etapas de: (a) imunizar um roedor, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-60; (b) determinar uma λ sequência da região variável de cadeia pesada ou leve humana que codifica um λ domínio variável de cadeia pesada ou leve humana, respectivamente, de um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno e que foi gerado pelo camundongo geneticamente modificado; e (c) ligar de forma operacional a λ sequência da região variável de cadeia pesada ou leve humana a um gene da região constante de cadeia pesada ou leve humana, respectivamente, para formar uma sequência nucleotídica que codifica uma cadeia pesada totalmente humana ou uma cadeia leve totalmente humana.
[00682] Será apreciado pelos versados na técnica que várias alterações, modificações e aprimoramentos na presente divulgação ocorrerão prontamente para os versados na técnica. Essas alterações, modificações e aprimoramentos se destinam a ser parte desta divulgação, e se destinam a
308 / 308 estar dentro do espírito e escopo da invenção. Em conformidade, a descrição e as figuras anteriores são apenas a título de exemplo e qualquer invenção descrita na presente divulgação é descrita adicionalmente pelas reivindicações a seguir.
[00683] Os versados na técnica apreciarão os padrões de desvio ou erros típicos atribuíveis aos valores obtidos nos ensaios ou nos outros processos conforme descritos neste documento. As publicações, websites e outros materiais de referência referidos neste documento para descrever os fundamentos da invenção e para fornecer detalhes adicionais em relação a sua prática estão incorporados neste documento por referência em suas totalidades.
Claims (248)
1. Roedor geneticamente modificado, cujo genoma de linhagem germinativa é caracterizado pelo fato de que compreende: um primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, compreendendo: (a) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, (b) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, e (c) um gene Cλ, em que um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos são operacionalmente ligados ao gene Cλ; e em que o roedor não possui um gene Cκ de roedor no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada.
2. Roedor geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é homozigótico para o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada.
3. Roedor geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que é heterozigótico para o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada.
4. Roedor geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o genoma de linhagem germinativa de roedor compreende um segundo κ locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (a) um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos, e (b) um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos, em que um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos são operacionalmente ligados a um gene Cκ.
5. Roedor geneticamente modificado de acordo com a
2 / 77 reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o gene Cκ no segundo locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada é um gene Cκ de roedor endógeno.
6. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o roedor não possui um gene Cκ de roedor no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada.
7. Roedor geneticamente modificado, cujo genoma de linhagem germinativa é caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um primeiro locus de cadeia leve de κ imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, e (iii) um gene Cλ, em que um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos são operacionalmente ligados ao gene Cλ, e em que o roedor não possui um gene Cκ de roedor no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada; e (b) um segundo locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, compreendendo: (i) um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos, e (ii) um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos, em que um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos são operacionalmente ligados a um gene Cκ.
8. Roedor geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que o gene Cκ no segundo locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada é um gene Cκ de
3 / 77 roedor endógeno.
9. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 8, caracterizado pelo fato de que o gene Cλ no primeiro locus de cadeia leve de κ imunoglobulina endógena manipulada compreende um gene Cλ de roedor.
10. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o primeiro κ locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada compreende adicionalmente: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, em que a uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico Vλ humano em um λ locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena humana; (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, em que uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico Jλ humano em um λ locus de cadeia leve de imunoglobulina humana endógena; ou (iii) qualquer combinação destes.
11. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 10, caracterizado pelo fato de que: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ compreendem Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5- 39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ou qualquer combinação destes; e (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes.
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12. Roedor geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1, no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada κ e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1- 44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3- 9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada κ e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena.
13. Roedor geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45,
5 / 77 Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada e em que cada uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1- 44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3- 10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 locus de cadeia leve de imunoglobulina humana; e (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ humana endógena.
14. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 13, caracterizado pelo fato de que: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos compreendem Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1- 36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ou qualquer combinação destes; e (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes.
15. Roedor geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o primeiro locus de cadeia
6 / 77 leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5- 52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3- 19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, e em que cada um de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparece naturalmente adjacente a um Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4- 60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada κ e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena.
16. Roedor geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5- 52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40,
7 / 77 Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3- 19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 no primeiro locus da cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada e em que cada uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparece naturalmente adjacentes a um Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3- 27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ humana endógena.
17. Roedor geneticamente modificado, cujo genoma de linhagem germinativa é caracterizado pelo fato de que compreende: um primeiro locus de cadeia leve κde imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, em que um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos compreendem Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9- 49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3- 16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ou qualquer combinação destes, (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, em que os um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7
8 / 77 ou qualquer combinação destes, (iii) um gene Cλ de roedor, (iv) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5- 45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2- 11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 no locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadores de Vλ humanas aparece naturalmente adjacente a um Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3- 21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena, (v) uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ humana endógena, e (vi) uma κ sequência não codificante de cadeia leve humana entre um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos que possui uma sequência que aparece naturalmente entre um segmento gênico Vκ4-1 humano e um segmento gênico Jκ1 humano em um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ humana endógena, em que um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos e o gene Cλ de roedor são
9 / 77 operacionalmente ligados uns aos outros, e em que o gene Cλ de roedor está no lugar de um gene Cκ de roedor do locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena.
18. Roedor geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que o genoma de linhagem germinativa de roedor compreende um segundo κ locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (a) um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos, e (b) um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos, em que um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos são operacionalmente ligados a um gene Cκ.
19. Roedor geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o gene Cκ no segundo locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada é um gene Cκ de roedor endógeno.
20. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 19, caracterizado pelo fato de que o genoma de linhagem germinativa de roedor compreende adicionalmente: um locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (a) um ou mais segmentos gênicos VH humanos, (b) um ou mais segmentos gênicos DH humanos, e (c) um ou mais segmentos gênicos JH humanos, em que um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos são operacionalmente ligados a um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
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21. Roedor geneticamente modificado, cujo genoma de linhagem germinativa é caracterizado pelo fato de que compreende: (a) um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena modificada que compreende um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos ligados operacionalmente a um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina endógena, de modo que o roedor expressa cadeias pesadas de imunoglobulina que compreendem uma sequência de domínio variável da cadeia pesada humana e uma sequência de domínio constante da cadeia pesada do roedor, em que o genoma de linhagem germinativa é homozigoto para o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena modificada; (b) um primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulado, compreendendo: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, em que um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos compreende Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1- 36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ou qualquer combinação destes, (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, em que os um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes, (iii) um gene Cλ de roedor, (iv) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5- 45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8,
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Vλ4-3 ou Vλ3-1 no segundo locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparece naturalmente adjacente a um Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3- 27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena, (v) uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas é adjacente aos Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ humana endógena, e (vi) uma κ sequência não codificante de cadeia leve humana entre um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos que possui uma sequência que aparece naturalmente entre um segmento gênico Vκ4-1 humano e um segmento gênico Jκ1 humano em um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ humana endógena, em que um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, os um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos e o gene Cλ de roedor são operacionalmente ligados uns ao outros, em que o gene Cλ de roedor está no lugar de um gene Cκ de roedor do segundo locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena; e (c) um segundo locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreendendo um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jκ operacionalmente ligados a uma região gênica de Cκ de roedor endógeno de modo que o roedor expressa cadeias leves de imunoglobulina, cada uma compreendendo uma sequência de
12 / 77 domínio variável de cadeia leve κ humana e uma sequência de domínio constante de cadeia leve κ de roedor, em que o roedor expressa cadeias leves de imunoglobulina, uma compreendendo uma sequência de domínio variável de cadeia leve λ humana e uma sequência de domínio constante de cadeia leve λ de roedor.
22. Roedor geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 20 ou 21, caracterizado pelo fato de que um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos estão no lugar de um ou mais segmentos gênicos VH de roedores, um ou mais segmentos gênicos DH de roedores, um ou mais segmentos gênicos JH de roedores ou uma combinação destes.
23. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 22, caracterizado pelo fato de que um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos substituem um ou mais segmentos gênicos VH de roedores, um ou mais segmentos gênicos DH de roedores, um ou mais segmentos gênicos JH de roedores ou qualquer combinação destes.
24. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 23, caracterizado pelo fato de que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada compreende adicionalmente: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de VH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos VH humanos, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de VH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico VH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena; (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de DH humanas,
13 / 77 cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos DH humanos, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de DH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico DH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena; (iii) uma ou mais sequências não codificadoras de JH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos JH humanos, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de JH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico JH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena; ou (iv) qualquer combinação destes.
25. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 24, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor são um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor endógenos.
26. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 25, caracterizado pelo fato de que: (i) um ou mais segmentos gênicos VH humanos compreendem VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4- 59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3- 23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3- 7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, ou qualquer combinação destes, (ii) um ou mais segmentos gênicos DH humanos compreendem DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3-
14 / 77 22, DH6-25, DH1-26, DH7-27, ou qualquer combinação destes, e (iii) um ou mais segmentos gênicos JH humanos compreendem JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 ou qualquer combinação destes.
27. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 26, caracterizado pelo fato de que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada não possui um gene Adam6 de roedor endógeno funcional.
28. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 20 a 27, caracterizado pelo fato de que o genoma de linhagem germinativa compreende adicionalmente uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais.
29. Roedor geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que um ou mais polipeptídeos ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais são expressos.
30. Roedor geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 28 ou 29, caracterizado pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais são incluídas no mesmo cromossomo que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
31. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 28 a 30, caracterizado pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6 de roedores, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais estão incluídas no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
32. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer
15 / 77 uma das reivindicações de 28 a 31, caracterizado pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais estão no lugar de um pseudogene Adam6 humano.
33. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 28 a 32, caracterizado pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais substituem um pseudogene Adam6 humano.
34. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 28 a 33, caracterizado pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais estão entre um primeiro segmento gênico VH humano e um segundo segmento gênico VH humano.
35. Roedor geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 34, caracterizado pelo fato de que o primeiro segmento gênico VH humano é VH1-2 e o segundo segmento gênico VH humano é VH6-1.
36. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 28 a 31, caracterizado pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais estão entre um primeiro segmento gênico VH humano e um segmento gênico DH humano.
37. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 20 e de 22 a 36, caracterizado pelo fato de que o roedor é homozigoto para o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
38. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer
16 / 77 uma das reivindicações de 9 a 37, caracterizado pelo fato de que o gene Cλ de roedor tem uma sequência que é pelo menos 80% idêntica a um gene Cλ1 de camundongo, Cλ2 de camundongo ou um gene Cλ3 de camundongo.
39. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 38, caracterizado pelo fato de que o gene Cλ de roedor compreende um gene Cλ1 de camundongo.
40. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 9 a 39, caracterizado pelo fato de que o gene Cλ de roedor compreende um gene Cλ de rato.
41. Roedor geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que o gene Cλ de rato tem uma sequência que é pelo menos 80% idêntica a um gene Cλ1 de rato, Cλ2 de rato, Cλ3 de rato ou Cλ4 de rato.
42. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 41, caracterizado pelo fato de que um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos estão no lugar de um ou mais segmentos gênicos Vκ de roedores, um ou mais segmentos gênicos Jκ de roedores ou qualquer combinação destes.
43. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 42, caracterizado pelo fato de que um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos substituem um ou mais segmentos gênicos Vκ de roedor, um ou mais segmentos gênicos Jκ de roedor ou qualquer combinação destes.
44. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 43, caracterizado pelo fato de que o primeiro locus de cadeia leve de κ imunoglobulina endógena manipulada compreende adicionalmente uma sequência não codificante de cadeia leve κ entre um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos.
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45. Roedor geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que a sequência não codificante de κ cadeia leve é uma sequência não codificante de cadeia leve κ humana.
46. Roedor geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 45, caracterizado pelo fato de que a sequência não codificante de cadeia leve κ humana tem uma sequência que aparece naturalmente entre um segmento gênico Vκ4-1 humano e um segmento gênico Jκ1 humano em um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ humana endógena.
47. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 46, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina endógena inativada.
48. Roedor geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o roedor é heterozigótico para o locus de cadeia leve de λ imunoglobulina endógena inativada.
49. Roedor geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 47, caracterizado pelo fato de que o roedor é homozigoto para o locus de cadeia leve de λ imunoglobulina endógena inativada.
50. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 49, caracterizado pelo fato de que os segmentos gênicos Vλ endógenos, os segmentos gênicos Jλ endógenos e os genes Cλ endógenos são deletados total ou parcialmente.
51. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 50, caracterizado pelo fato de que o roedor não expressa domínios variáveis de cadeia leve de imunoglobulina λ endógena detectáveis.
52. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 51, caracterizado pelo fato de que o roedor não expressa domínios variáveis de κ cadeia leve de imunoglobulina endógena
18 / 77 detectáveis.
53. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 52, caracterizado pelo fato de que o roedor compreende uma população de células B que expressam anticorpos, incluindo cadeias leves λ de imunoglobulina que cada uma inclui um domínio variável de cadeia leve λ de imunoglobulina humana.
54. Roedor geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 53, caracterizado pelo fato de que um domínio variável de cadeia leve λ de imunoglobulina humana é codificado por uma sequência de região variável de cadeia leve λ de imunoglobulina humana rearranjada compreendendo (i) um dos um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos ou uma variante somaticamente hipermutada desta e (ii) um dos um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos ou uma variante somaticamente hipermutada desta.
55. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 54, caracterizado pelo fato de que o genoma de linhagem germinativa de roedor compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma desoxinucleotidiltransferase terminal exógena (TdT) operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional.
56. Roedor geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o TdT é uma isoforma curta de TdT (TdTS).
57. Roedor geneticamente modificado de acordo com a reivindicação 55 ou 56, caracterizado pelo fato de que o elemento de controle transcricional inclui um elemento de controle transcricional de RAG1, um elemento de controle transcricional de RAG2, um elemento de controle transcricional de cadeia pesada de imunoglobulina, um elemento de controle transcricional de cadeia leve de imunoglobulina κ, um elemento de controle
19 / 77 transcricional de cadeia leve λ de imunoglobulina ou qualquer combinação destes.
58. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 55 a 57, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico que codifica uma TdT exógena está no genoma de linhagem germinativa em um locus κ de cadeia leve de imunoglobulina, um locus λ de cadeia leve de imunoglobulina, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina, um locus de RAG1, ou um locus de RAG2.
59. Roedor geneticamente modificado, cujo genoma de linhagem germinativa é caracterizado pelo fato de que compreende (a) uma sequência de ácido nucleico que codifica uma desoxinucleotidiltransferase exógena terminal (TdT) operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional; (b) um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena modificada que compreende um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos ligados operacionalmente a um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina endógena, de modo que o roedor expressa cadeias pesadas de imunoglobulina que compreendem uma sequência de domínio variável de cadeia pesada humana e uma sequência de domínio constante de cadeia pesada de roedor, em que o genoma de linhagem germinativa é homozigoto para o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena modificada; e (c) um locus geométrico de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena, compreendendo: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, em que um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos compreendem Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9- 49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-
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16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1 ou qualquer combinação destes, (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, em que um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes, (iii) um gene Cλ de roedor, (iv) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5- 45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 no locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, e em que cada uma ou uma mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9- 49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2- 11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena, (v) uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 e Jλ7 no locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ humana endógena, e (vi) uma κ sequência não codificante de cadeia leve humana entre um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos que compreende uma sequência que aparece naturalmente entre um segmento gênico Vκ4-1 humano e um segmento
21 / 77 gênico Jκ1 humano em um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ humana endógena, em que um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, os um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos e o gene Cλ de roedor são operacionalmente ligados uns ao outros, em que o gene Cλ de roedor está no lugar de um gene Cκ de roedor do locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena, em que o genoma da linhagem germinativa é homozigoto para o κ locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada, e em que o roedor expressa cadeias leves de imunoglobulina que compreendem uma sequência de domínio variável de cadeia leve λ humana e uma sequência de domínio constante de cadeia leve λ de roedor.
60. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 59, caracterizado pelo fato de que o roedor é um rato ou um camundongo.
61. Célula de roedor isolada, caracterizada pelo fato de que foi obtida a partir de um roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 60.
62. Célula imortalizada, caracterizada pelo fato de que foi gerada a partir da célula isolada de roedor de acordo com a reivindicação 61.
63. Célula isolada de roedor de acordo com a reivindicação 61, caracterizada pelo fato de que a célula de roedor é uma célula-tronco embrionária (ES) de roedor.
64. Embrião de roedor, caracterizado pelo fato de que foi gerado a partir da célula ES de roedor de acordo com a reivindicação 63.
65. Uso de um roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 60, para a produção de um anticorpo.
66. Uso de um roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 60, caracterizado pelo fato de que consiste em produzir
22 / 77 uma sequência da região variável de cadeia leve.
67. Uso de um roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 60, caracterizado pelo fato de que consiste em produzir uma sequência de domínio variável de cadeia leve.
68. Célula B isolada obtida a partir de um roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 60, caracterizada pelo fato de que o genoma da célula B compreende: (a) uma sequência de região variável de cadeia leve de lambda humana rearranjada operacionalmente ligada a uma sequência de região variável de cadeia leve de lambda, em que a sequência de região variável de cadeia leve de lambda humana rearranjada compreende: (i) um de um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos ou uma variante somaticamente hipermutado destes, e (ii) um de um ou mais segmentos gênicos Jλ humano ou uma sua variante somática hipermutada.
69. Célula B isolada de acordo com a reivindicação 68, caracterizada pelo fato de que compreende adicionalmente: (b) uma sequência de região variável de cadeia pesada humana reorganizada operacionalmente ligada a uma sequência de região variável de cadeia pesada de roedor, em que a sequência de região variável de cadeia pesada humana rearranjada compreende: (i) um dos um ou mais segmentos gênicos VH humanos ou uma variante somaticamente hipermutado destes, (ii) um dos um ou mais segmentos gênicos DH humano ou uma sua variante somática hipermutada, e (iii) um dos um ou mais segmentos gênicos JH humanos ou uma sua variante somática hipermutada.
70. Anticorpo preparado por um método, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
23 / 77 (a) fornecer um roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 60; (b) imunizar o roedor com um antígeno de interesse; (c) manter o roedor em condições suficientes para o roedor produzir uma resposta imune ao antígeno de interesse; e (d) recuperar do roedor: (i) um anticorpo que se liga ao antígeno de interesse, (ii) um nucleotídeo que codifica um domínio variável de cadeia leve ou pesada humana, uma cadeia leve ou uma cadeia pesada de um anticorpo que se liga ao antígeno de interesse, ou (iii) uma célula que expressa um anticorpo que se liga ao antígeno de interesse, em que um anticorpo de (d) inclui domínios variáveis de cadeia pesada humanos e variáveis de cadeia leve λ humanos.
71. Célula de roedor isolada cujo genoma é, caracterizado pelo fato de que compreende: um primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, compreendendo: (a) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, (b) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, e (c) um gene Cλ, em que um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos são operacionalmente ligados ao gene Cλ, e em que o roedor não possui um gene Cκ de roedor no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada.
72. Célula de roedor isolada de acordo com a reivindicação 71, caracterizada pelo fato de que a Célula de roedor isolada é homozigótica para o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada.
24 / 77
73. Célula de roedor isolada de acordo com a reivindicação 71, caracterizada pelo fato de que a Célula de roedor isolada é heterozigótica para o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada.
74. Célula de roedor isolada de acordo com a reivindicação 73, caracterizada pelo fato de que o genoma da célula de roedor isolada compreende um segundo locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, compreendendo: (a) um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos, e (b) um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos, em que um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos são operacionalmente ligados a um gene Cκ.
75. Célula de roedor isolada de acordo com a reivindicação 74, caracterizada pelo fato de que o gene Cκ no segundo locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada é um gene Cκ de roedor endógeno.
76. Célula de roedor isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações de 71 a 75, caracterizada pelo fato de que a Célula de roedor isolada não possui um gene Cκ de roedor no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada.
77. Célula de roedor isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações de 71 a 76, caracterizada pelo fato de que o gene Cλ no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende um gene Cλ de roedor.
78. Célula de roedor isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações de 71 a 77, caracterizada pelo fato de que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende adicionalmente: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos
25 / 77 gênicos Vλ humanos, em que a uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico Vλ humano em um λ locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena humana; (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, em que uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico Jλ humano em um λ locus de cadeia leve de imunoglobulina humana endógena; ou (iii) qualquer combinação destes.
79. Célula de roedor isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações de 71 a 78, caracterizada pelo fato de que: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ compreendem Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5- 39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ou qualquer combinação destes; e (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes.
80. Célula de roedor isolada de acordo com a reivindicação 79, caracterizada pelo fato de que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente
26 / 77 adjacentes a um Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1- 44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3- 9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada κ e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena.
81. Célula de roedor isolada de acordo com a reivindicação 79, caracterizada pelo fato de que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada e em que cada uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1- 44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3- 10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena, (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas,
27 / 77 em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ humana endógena.
82. Célula de roedor isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações de 71 a 81, caracterizada pelo fato de que: (a) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos compreendem Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1- 36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ou qualquer combinação destes; e (b) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes.
83. Célula de roedor isolada de acordo com a reivindicação 82, caracterizada pelo fato de que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5- 52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3- 19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacente a um Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46,
28 / 77 Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3- 25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada κ e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena.
84. Célula de roedor isolada de acordo com a reivindicação 82, caracterizada pelo fato de que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5- 52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3- 19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ4- 69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3- 27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas,
29 / 77 em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ humana endógena.
85. Célula de roedor isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações de 71 a 84, caracterizada pelo fato de que o genoma de célula de roedor compreende adicionalmente: um locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (a) um ou mais segmentos gênicos VH humanos, (b) um ou mais segmentos gênicos DH humanos, e (c) um ou mais segmentos gênicos JH humanos, em que um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos são operacionalmente ligados a um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
86. Célula de roedor isolada de acordo com a reivindicação 85, caracterizada pelo fato de que um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos estão no lugar de um ou mais segmentos gênicos VH de roedores, um ou mais segmentos gênicos DH de roedores, um ou mais segmentos gênicos JH de roedores ou uma combinação destes.
87. Célula de roedor isolada de acordo com a reivindicação 85 ou 86, caracterizada pelo fato de que um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos estão no lugar de um ou mais segmentos
30 / 77 gênicos VH de roedores, um ou mais segmentos gênicos DH de roedores, um ou mais segmentos gênicos JH de roedores ou uma combinação destes.
88. Célula de roedor isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações de 85 a 87, caracterizada pelo fato de que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada compreende adicionalmente: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de VH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos VH humanos, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de VH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico VH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena; (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de DH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos DH humanos, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de DH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico DH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena; (iii) uma ou mais sequências não codificadoras de JH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos JH humanos, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de JH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico JH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena; ou (iv) qualquer combinação destes.
89. Célula de roedor isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações de 85 a 88, caracterizada pelo fato de que um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor são um ou mais genes da região constante de cadeia pesada da imunoglobulina de roedor endógeno.
31 / 77
90. Célula de roedor isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações de 85 a 89, caracterizada pelo fato de que: (i) um ou mais segmentos gênicos VH humanos compreendem VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4- 59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3- 23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3- 7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, ou qualquer combinação destes, (ii) um ou mais segmentos gênicos DH humanos compreendem DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3- 22, DH6-25, DH1-26, DH7-27, ou qualquer combinação destes, e (iii) um ou mais segmentos gênicos JH humanos compreendem JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 ou qualquer combinação destes.
91. Célula de roedor isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações de 85 a 90, caracterizada pelo fato de que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada não possui um gene Adam6 de roedor endógeno funcional.
92. Célula de roedor isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações de 85 a 91, caracterizada pelo fato de que o genoma de célula de roedor compreende adicionalmente uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais.
93. Célula de roedor isolada de acordo com a reivindicação 92, caracterizada pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais são incluídas no mesmo cromossomo que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina
32 / 77 endógena manipulada.
94. Célula de roedor isolada de acordo com a reivindicação 92 ou 93, caracterizada pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais estão incluídas no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
95. Célula de roedor isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações de 92 a 94, caracterizada pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais estão no lugar de um pseudogene Adam6 humano.
96. Célula de roedor isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações de 92 a 95, caracterizada pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais substituem um pseudogene Adam6 humano.
97. Célula de roedor isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações de 92 a 96, caracterizada pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais estão entre um primeiro segmento gênico VH humano e um segundo segmento gênico VH humano.
98. Célula de roedor isolada de acordo com a reivindicação 97, caracterizada pelo fato de que o primeiro segmento gênico VH humano é VH1- 2 e o segundo segmento gênico VH humano é VH6-1.
99. Célula de roedor isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações de 92 a 94, caracterizada pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos
33 / 77 funcionais estão entre um segmento gênico VH humano e um segmento gênico DH humano.
100. Célula de roedor isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações de 85 a 99, caracterizada pelo fato de que a Célula de roedor isolada é homozigótica para o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
101. Célula de roedor isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações de 71 a 100, caracterizada pelo fato de que o genoma da Célula de roedor isolada compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma desoxinucleotidiltransferase terminal exógena (TdT) operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional.
102. Célula de roedor isolada de acordo com a reivindicação 101, caracterizada pelo fato de que o TdT é uma isoforma curta de TdT (TdTS).
103. Célula de roedor isolada de acordo com a reivindicação 101 ou 102, caracterizada pelo fato de que o elemento de controle transcricional inclui um elemento de controle transcricional de RAG1, um elemento de controle transcricional de RAG2, um elemento de controle transcricional de cadeia pesada de imunoglobulina, um elemento de controle transcricional de cadeia leve de imunoglobulina κ, um elemento de controle transcricional de cadeia leve λ de imunoglobulina ou qualquer combinação destes.
104. Célula de roedor isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações de 101 a 103, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácido nucleico que codifica um TdT exógeno está no genoma da célula de roedor em um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ, um locus de cadeia leve de imunoglobulina λ, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina, um locus de RAG1 ou um locus de RAG2.
105. Célula de roedor isolada de acordo com qualquer uma das
34 / 77 reivindicações de 71 a 104, caracterizada pelo fato de que a célula de roedor é uma célula de rato ou uma célula de camundongo.
106. Célula imortalizada caracterizada pelo fato de que foi gerada a partir da célula de roedor isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações de 71 a 105.
107. Célula de roedor isolada de acordo com qualquer uma das reivindicações de 71 a 105, caracterizada pelo fato de que a célula de roedor é uma célula-tronco embrionária de roedor (ES).
108. Embrião de roedor caracterizado pelo fato de que foi gerado a partir da célula ES de roedor de acordo com a reivindicação 107.
109. Método para produzir um roedor geneticamente modificado, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) introduzir um ou mais fragmentos de DNA no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ manipulada no genoma de uma célula ES de roedor, em que um ou mais fragmentos de DNA compreendem: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, e (iii) um gene Cλ, em que um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos e os genes Cλ são introduzidos no genoma da célula ES de roedor no locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena, e em que um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos e os genes Cλ são operacionalmente ligados; e (b) gerar um roedor usando a célula ES de roedor gerada em (a).
110. Método de acordo com a reivindicação 109, caracterizado pelo fato de que o genoma da célula ES de roedor compreende um segundo locus κ de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada,
35 / 77 compreendendo: (i) um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos, e (ii) um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos, em que um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos são operacionalmente ligados a um gene Cκ.
111. Método de acordo com a reivindicação 109 ou 110, caracterizado pelo fato de que o genoma da célula ES de roedor compreende um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (i) um ou mais segmentos gênicos VH humanos, (ii) um ou mais segmentos gênicos DH humanos, e (iii) um ou mais segmentos gênicos JH humanos, em que um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos são operacionalmente ligados a um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
112. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 109 a 111, caracterizado pelo fato de que um ou mais fragmentos de DNA compreendem adicionalmente pelo menos um marcador de seleção.
113. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 109 a 112, caracterizado pelo fato de que um ou mais fragmentos de DNA compreendem adicionalmente pelo menos um sítio de recombinação específico do sítio.
114. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 109 a 113, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a introdução de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas e uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas no primeiro locus
36 / 77 de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, em que cada uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas são adjacentes a um segmento gênico Vλ humano, e cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas é adjacente a um segmento gênico Jλ humano.
115. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 109 a 114, caracterizado pelo fato de que compreende a introdução de uma κ sequência não codificadoras de cadeia leve no genoma da célula ES de roedor, de modo que a κ sequência não codificante de cadeia leve esteja entre um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada.
116. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 109 a 115, caracterizado pelo fato de que a célula ES de roedor é uma célula ES de rato ou uma célula ES de camundongo.
117. Método para produzir um roedor geneticamente modificado, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) manipular um primeiro κ locus da cadeia leve de imunoglobulina endógena no genoma de linhagem germinativa de roedor para incluir: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, e (iii) um gene Cλ, em que um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos são operacionalmente ligados ao gene Cλ, e em que o gene Cλ é inserido no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena.
118. Método de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente a etapa de:
37 / 77 (b) manipular um segundo κ locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena no genoma de linhagem germinativa de roedor para incluir: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, e (iii) um gene Cλ, em que um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos são operacionalmente ligados ao gene Cλ, e em que o gene Cλ é inserido no segundo locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena.
119. Método de acordo com a reivindicação 117, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente a etapa de: (b) manipular um segundo κ locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada no genoma de linhagem germinativa de roedor para incluir: (i) um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos, e (ii) um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos, em que um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos são operacionalmente ligados a um gene Cκ.
120. Método de acordo com a reivindicação 119, caracterizado pelo fato de que o gene Cκ no segundo locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada é um gene Cκ de roedor endógeno.
121. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 117 a 120, caracterizado pelo fato de que o método compreende adicionalmente a etapa de: (c) manipular um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada no genoma de linha germinativa de roedor para incluir:
38 / 77 (i) um ou mais segmentos gênicos VH humanos, (ii) um ou mais segmentos gênicos DH humanos, e (iii) um ou mais segmentos gênicos JH humanos, em que um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos são operacionalmente ligados a um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor.
122. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 117 a 121, caracterizado pelo fato de que a etapa de manipular um primeiro κ locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena no genoma de linhagem germinativa de roedor é realizada em uma célula ES de roedor cujo genoma compreende um segundo locus de κ cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada compreendendo um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos, em que um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos estão operacionalmente ligados a um gene Cκ.
123. Método de acordo com a reivindicação 122, caracterizado pelo fato de que o gene Cκ no segundo locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada é um gene Cκ de roedor endógeno.
124. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 117 a 120, 122 e 123, caracterizado pelo fato de que a etapa de manipulação é realizada em uma célula ES de roedor cujo genoma compreende um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada que compreende um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos operacionalmente ligados a um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedores.
125. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 121 a 124, caracterizado pelo fato de que o locus de cadeia pesada de
39 / 77 imunoglobulina endógena manipulada compreende uma ou mais sequências não codificadoras de VH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos VH humanos, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de VH humanas aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico VH humano em um locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina humana.
126. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 121 a 125, caracterizado pelo fato de que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada compreende uma ou mais sequências não codificadoras de DH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos DH humanos, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de DH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico DH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena.
127. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 121 a 126, caracterizado pelo fato de que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada compreende uma ou mais sequências não codificadoras de JH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos JH humanos, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de JH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico JH humano em um locus endógeno de cadeia pesada de imunoglobulina humana.
128. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 109 a 127, caracterizado pelo fato de que o primeiro locus κ de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada não possui um gene Cκ de roedor.
129. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 110 a 115 e de 119 a 128, caracterizado pelo fato de que o gene Cκ no segundo locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada κ é um gene Cκ de roedor endógeno.
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130. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 109 a 129, caracterizado pelo fato de que o gene Cλ no primeiro locus de cadeia leve de κ imunoglobulina endógena manipulada compreende um gene Cλ de roedor.
131. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 109 a 130, caracterizado pelo fato de que o primeiro locus de cadeia leve de κ imunoglobulina endógena manipulada compreende adicionalmente: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, em que a uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico Vλ humano em um λ locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena humana; (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, em que uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico Jλ humano em um λ locus de cadeia leve de imunoglobulina humana endógena; ou (iii) qualquer combinação destes.
132. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 109 a 131, caracterizado pelo fato de que: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ compreendem Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5- 39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ou qualquer combinação destes; e (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes.
133. Método de acordo com a modalidade 132, caracterizado pelo fato de que o primeiro κ locus de cadeia leve de imunoglobulina
41 / 77 endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1- 44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3- 9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada κ e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena.
134. Método de acordo com a reivindicação 132, caracterizado pelo fato de que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11,
42 / 77 Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1- 44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3- 10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ humana endógena.
135. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 109 a 134, caracterizado pelo fato de que: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos compreendem Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1- 36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ou qualquer combinação destes; e (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes.
136. Método de acordo com a modalidade 135, caracterizado pelo fato de que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas,
43 / 77 em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5- 52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3- 19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, e em que cada de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4- 60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada κ e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena.
137. Método de acordo com a modalidade 135, caracterizado pelo fato de que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5- 52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3- 19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8,
44 / 77 Vλ4-3 ou Vλ3-1 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ4-69, Vλ8- 61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3- 25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ humana endógena.
138. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 111 a 116 e de 121 a 137, caracterizado pelo fato de que um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos estão no lugar de um ou mais segmentos gênicos VH de roedores, um ou mais segmentos gênicos DH de roedores, um ou mais segmentos gênicos JH de roedores ou uma combinação destes.
139. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 111 a 116 e de 121 a 138, caracterizado pelo fato de que o um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos substituem um ou mais segmentos gênicos VH de roedores, um ou mais segmentos gênicos DH de roedores, um ou mais segmentos gênicos JH de roedores ou qualquer combinação destes.
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140. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 111 a 116 e de 121 a 139, caracterizado pelo fato de que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada compreende adicionalmente: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de VH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos VH humanos, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de VH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico VH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena; (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de DH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos DH humanos, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de DH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico DH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena; (iii) uma ou mais sequências não codificadoras de JH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos JH humanos, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de JH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico JH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena; ou (iv) qualquer combinação destes.
141. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 111 a 116 e de 121 a 140, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor são um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina endógena de roedor.
142. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 111 a 116 e de 121 a 141, caracterizado pelo fato de que:
46 / 77 (i) um ou mais segmentos genéticos de VH humano compreendem VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4-59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1- 45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3-23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3-7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, ou qualquer combinação destes; (ii) um ou mais segmentos gênicos DH humano compreendem DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3- 22, DH6-25, DH1-26, DH7-27, ou qualquer combinação destes; e (iii) um ou mais segmentos gênicos JH humanos compreendem JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 ou qualquer combinação destes.
143. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 111 a 116 e de 121 a 142, caracterizado pelo fato de que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada não possui um gene Adam6 de roedor endógeno funcional.
144. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 111 a 116 e de 121 a 143, caracterizado pelo fato de que o gnoma da célula ES de roedor ou o genoma de linhagem germinativa do roedor compreende adicionalmente uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais.
145. Método de acordo com a reivindicação 144, caracterizado pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais são incluídas no mesmo cromossomo que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
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146. Método de acordo com a reivindicação 144 ou 145, caracterizado pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais estão incluídas no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
147. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 144 a 146, caracterizado pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais estão no lugar de um pseudogene Adam6 humano.
148. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 144 a 147, caracterizado pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais substituem um pseudogene Adam6 humano.
149. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 144 a 148, caracterizado pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais estão entre um primeiro segmento gênico VH humano e um segundo segmento gênico VH humano.
150. Método de acordo com a reivindicação 149, caracterizado pelo fato de que o primeiro segmento gênico VH humano é VH1-2 e o segundo segmento gênico VH humano é VH6-1.
151. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 144 a 146, caracterizado pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais estão entre um segmento gênico VH humano e um segmento gênico DH
48 / 77 humano.
152. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 111 a 116 e de 121 a 151, caracterizado pelo fato de que o roedor é homozigoto para o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
153. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 109 a 152, caracterizado pelo fato de que o genoma de célula ES de roedor ou o genoma de linhagem germinativa de roedor compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma desoxinucleotidiltransferase exógena terminal (TdT) operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional.
154. Método de acordo com a reivindicação 153, caracterizado pelo fato de que o TdT é uma isoforma curta de TdT (TdTS).
155. Método de acordo com a reivindicação 153 ou 154, caracterizado pelo fato de que o elemento de controle transcricional inclui um elemento de controle transcricional de RAG1, um elemento de controle transcricional de RAG2, um elemento de controle transcricional de cadeia pesada de imunoglobulina, um elemento de controle transcricional de cadeia leve de imunoglobulina κ, um elemento de controle transcricional de cadeia leve λ de imunoglobulina ou qualquer combinação destes.
156. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 153 a 155, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico que codifica um TdT exógeno está em um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ, um locus de cadeia leve de imunoglobulina λ, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina, um locus de RAG1 ou um locus de RAG2.
157. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 109 a 156, caracterizado pelo fato de que o roedor é um rato ou um camundongo.
158. Método para produzir um anticorpo em um roedor
49 / 77 geneticamente modificado, o método caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) imunizar um roedor com um antígeno de interesse, em que o roedor tem um genoma de linhagem germinativa compreendendo: um primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, compreendendo: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, e (iii) um gene Cλ, em que um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos são operacionalmente ligados ao gene Cλ, e em que o gene Cλ (c) está no lugar de um gene Cκ de roedor no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada; (b) manter o roedor em condições suficientes para o roedor produzir uma resposta imune ao antígeno de interesse; e (c) recuperar do roedor: (i) um anticorpo que se liga ao antígeno de interesse, (ii) um nucleotídeo que codifica um domínio variável de cadeia leve ou pesada humana, uma cadeia leve ou uma cadeia pesada de um anticorpo que se liga ao antígeno de interesse, ou (iii) uma célula que expressa um anticorpo que se liga ao antígeno de interesse.
159. Método de acordo com a reivindicação 158, caracterizado pelo fato de que a célula de roedor é uma célula B.
160. Método de acordo com a reivindicação 159, caracterizado pelo fato de que compreende adicionalmente a produção de um hibridoma a partir da célula B.
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161. Método para produzir um anticorpo, caracterizado pelo fato de que compreende: (a) expressar uma primeira sequência nucleotídica que codifica uma cadeia pesada de imunoglobulina em uma célula hospedeira, em que a primeira sequência nucleotídica inclui uma sequência da região variável de cadeia pesada humana; (b) expressar uma segunda sequência nucleotídica que codifica uma cadeia leve de imunoglobulina λ em uma célula hospedeira, em que a segunda sequência nucleotídica inclui uma sequência de região variável de cadeia leve λ humana que foi identificada a partir de um roedor geneticamente modificado cujo genoma de linhagem germinativa compreende: um primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, compreendendo: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, e (iii) um gene Cλ, em que um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos são operacionalmente ligados ao gene Cλ, e em que o roedor não possui um gene Cκ de roedor no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada; e (c) cultivar a célula hospedeira de modo que as cadeias leves de imunoglobulina e cadeias pesadas de imunoglobulina sejam expressas e formem um anticorpo; e (d) obter o anticorpo da célula hospedeira e/ou cultura de células hospedeiras.
162. Método de acordo com a reivindicação 161, caracterizado pelo fato de que o primeiro nucleotídeo inclui adicionalmente um gene da região constante de cadeia pesada humana.
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163. Método de acordo com a reivindicação 161 ou 162, caracterizado pelo fato de que o segundo nucleotídeo inclui adicionalmente um gene da região constante de cadeia leve λ humana.
164. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 158 a 163, caracterizado pelo fato de que o roedor é homozigoto para o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada.
165. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 158 a 163, caracterizado pelo fato de que o roedor é heterozigoto para o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada.
166. Método de acordo com a reivindicação 165, caracterizado pelo fato de que o genoma de linhagem germinativa de roedor compreende um segundo κ locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (a) um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos, e (b) um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos, em que um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos são operacionalmente ligados a um gene Cκ.
167. Método de acordo com a reivindicação 166, caracterizado pelo fato de que o gene Cκ no segundo locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada é um gene Cκ de roedor endógeno.
168. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 158 a 167, caracterizado pelo fato de que o roedor não possui um gene Cκ de roedor no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada.
169. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 158 a 168, caracterizado pelo fato de que o gene Cλ no primeiro locus de cadeia leve de κ imunoglobulina endógena manipulada compreende um gene Cλ de roedor.
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170. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 158 a 169, caracterizado pelo fato de que o primeiro locus de cadeia leve de κ imunoglobulina endógena manipulada compreende adicionalmente: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, em que a uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico Vλ humano em um λ locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena humana; (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, em que uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico Jλ humano em um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; ou (iii) qualquer combinação destes.
171. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 158 a 170, caracterizado pelo fato de que: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ compreendem Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5- 39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ou qualquer combinação destes; e (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes.
172. Método de acordo com a modalidade 171, caracterizado pelo fato de que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45,
53 / 77 Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ouVλ3-1, no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada κ e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1- 44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3- 9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada κ e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena.
173. Método de acordo com a modalidade 171, caracterizado pelo fato de que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 or Vλ3-1 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-
54 / 77 44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3- 10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ humana endógena.
174. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 158 a 173, caracterizado pelo fato de que: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos compreendem Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1- 36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ou qualquer combinação destes; e (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes.
175. Método de acordo com a modalidade 174, caracterizado pelo fato de que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5- 52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-
55 / 77 19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1, no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3- 25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada κ e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena.
176. Método de acordo com a modalidade 174, caracterizado pelo fato de que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5- 52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3- 19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparece naturalmente adjacente a um Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47,
56 / 77 Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3- 27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve de imunoglobulina humana λ endógena, (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ humana endógena.
177. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 158 a 176, caracterizado pelo fato de que o genoma de linhagem germinativa de roedor compreende adicionalmente: um locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (a) um ou mais segmentos gênicos VH humanos, (b) um ou mais segmentos gênicos DH humanos, e (c) um ou mais segmentos gênicos JH humanos, em que um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos são operacionalmente ligados a um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
178. Método de acordo com a reivindicação 177, caracterizado pelo fato de que um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos estão no lugar de um ou mais segmentos gênicos VH de roedores, um ou mais segmentos gênicos DH de roedores, um ou mais segmentos gênicos JH de
57 / 77 roedores ou uma combinação destes.
179. Método de acordo com a reivindicação 177 ou 178, caracterizado pelo fato de que um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos estão no lugar de um ou mais segmentos gênicos VH de roedores, um ou mais segmentos gênicos DH de roedores, um ou mais segmentos gênicos JH de roedores ou uma combinação destes.
180. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 177 a 179, caracterizado pelo fato de que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada compreende adicionalmente: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de VH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos VH humanos, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de VH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico VH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena; (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de DH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos DH humanos, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de DH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico DH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena; (iii) uma ou mais sequências não codificadoras de JH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos JH humanos, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de JH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico JH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena; ou (iv) qualquer combinação destes.
58 / 77
181. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 177 a 180, caracterizado pelo fato de que um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor são um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina endógena de roedor.
182. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 177 a 181, caracterizado pelo fato de que: (i) um ou mais segmentos gênicos VH humanos compreendem VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4- 59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3- 23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3- 7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, ou qualquer combinação destes, (ii) um ou mais segmentos gênicos DH humanos compreendem DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3- 22, DH6-25, DH1-26, DH7-27, ou qualquer combinação destes, e (iii) um ou mais segmentos gênicos JH humanos compreendem JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 ou qualquer combinação destes.
183. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 177 a 182, caracterizado pelo fato de que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada não possui um gene Adam6 de roedor endógeno funcional.
184. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 177 a 183, caracterizado pelo fato de que o genoma de linhagem germinativa de roedor compreende adicionalmente uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais.
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185. Método de acordo com a reivindicação 184, caracterizado pelo fato de que um ou mais polipeptídeos ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais são expressos.
186. Método de acordo com a reivindicação 184 ou 185, caracterizado pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais são incluídas no mesmo cromossomo que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
187. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 184 a 186, caracterizado pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6 de roedores, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais estão incluídas no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
188. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 184 a 187, caracterizado pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais estão no lugar de um pseudogene Adam6 humano.
189. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 184 a 188, caracterizado pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais substituem um pseudogene Adam6 humano.
190. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 184 a 189, caracterizado pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor,
60 / 77 ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais estão entre um primeiro segmento gênico VH humano e um segundo segmento gênico VH humano.
191. Método de acordo com a reivindicação 190, caracterizado pelo fato de que o primeiro segmento gênico VH humano é VH1-2 e o segundo segmento gênico VH humano é VH6-1.
192. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 184 a 187, caracterizado pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais estão entre um segmento gênico VH humano e um segmento gênico DH humano.
193. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 177 a 192, caracterizado pelo fato de que o roedor é homozigoto para o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
194. Roedor geneticamente modificado de acordo com qualquer uma das reivindicações de 158 a 193, caracterizado pelo fato de que o roedor compreende uma população de células B que expressam anticorpos, incluindo cadeias leves de imunoglobulina λ nas quais cada uma inclui um domínio variável de cadeia leve de imunoglobulina humana λ.
195. Método de acordo com a reivindicação 194, caracterizado pelo fato de que um domínio variável de cadeia leve λ de imunoglobulina humana é codificado por uma sequência de região variável de cadeia leve λ de imunoglobulina humana rearranjada compreendendo (i) um dos um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos ou uma variante somaticamente hipermutada desta e (ii) um de um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos ou uma variante somaticamente hipermutada desta.
196. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 158 a 195, caracterizado pelo fato de que o genoma de linhagem
61 / 77 germinativa do roedor compreende adicionaalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma desoxinucleotidiltransferase terminal exógena (TdT) operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional.
197. Método de acordo com a reivindicação 196, caracterizado pelo fato de que o TdT é uma isoforma curta de TdT (TdTS).
198. Método de acordo com a reivindicação 196 ou 197, caracterizado pelo fato de que o elemento de controle transcricional inclui um elemento de controle transcricional de RAG1, um elemento de controle transcricional de RAG2, um elemento de controle transcricional de cadeia pesada de imunoglobulina, um elemento de controle transcricional de cadeia leve de imunoglobulina κ, um elemento de controle transcricional de cadeia leve λ de imunoglobulina ou qualquer combinação destes.
199. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 196 a 198, caracterizado pelo fato de que a sequência de ácido nucleico que codifica uma TdT exógena está no genoma de linhagem germinativa em um locus κ de cadeia leve de imunoglobulina, um locus λ de cadeia leve de imunoglobulina, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina, um locus de RAG1, ou um locus de RAG2.
200. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações de 158 a 199, caracterizado pelo fato de que o roedor é um rato ou um camundongo.
201. Célula-tronco embrionária de roedor (ES), cujo genoma é caracterizado pelo fato de que compreende: um primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, compreendendo: (a) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, (b) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, e (c) um gene Cλ, em que um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos e um ou
62 / 77 mais segmentos gênicos Jλ humanos são operacionalmente ligados ao gene Cλ, e em que a célula ES do roedor não possui um gene Cκ de roedor no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada.
202. Célula ES de roedor de acordo com a reivindicação 201, caracterizada pelo fato de que a célula ES de roedor é homozigótica para o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada.
203. Célula ES de roedor de acordo com a reivindicação 201, caracterizada pelo fato de que a célula ES de roedor é heterozigótica para o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada.
204. Célula ES de roedor de acordo com a reivindicação 203, caracterizada pelo fato de que o genoma da célula ES de roedor compreende um segundo locus κ de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (i) um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos, e (ii) um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos, em que um ou mais segmentos gênicos Vκ humanos e um ou mais segmentos gênicos Jκ humanos são operacionalmente ligados a um gene Cκ.
205. Célula ES isolada de roedor de acordo com a reivindicação 204, caracterizada pelo fato de que o gene Cκ no segundo locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada é um gene Cκ de roedor endógeno.
206. Célula ES de roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 201 a 205, caracterizada pelo fato de que o genoma de célula ES de roedor compreende um locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (i) um ou mais segmentos gênicos VH humanos,
63 / 77 (ii) um ou mais segmentos gênicos DH humanos, e (iii) um ou mais segmentos gênicos JH humanos, em que um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos são operacionalmente ligados a um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
207. Célula ES de roedor de acordo com as reivindicações de 201 a 206, caracterizada pelo fato de que o roedor não possui um gene Cκ de roedor no primeiro locus de cadeia leve de immunoglobulina κ endógena manipulada.
208. Célula ES de roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 201 a 207, caracterizada pelo fato de que o gene Cλ no primeiro locus de cadeia leve de κ imunoglobulina endógena manipulada compreende um gene Cλ de roedor.
209. Célula ES de roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 201 a 208, caracterizada pelo fato de que o primeiro locus de cadeia leve imunoglobulina κ endógena manipulada compreende adicionalmente: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos, em que a uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico Vλ humano em um λ locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena humana; (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos, em que uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um segmento gênico Jλ humano em um λ locus de cadeia leve de imunoglobulina humana endógena; ou
64 / 77 (iii) qualquer combinação destes.
210. Célula ES de roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 201 a 209, caracterizada pelo fato de que: (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ compreendem Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5- 39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ou qualquer combinação destes; e (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes.
211. Célula ES isolada de roedor de acordo com a reivindicação 210, caracterizada pelo fato de que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1, no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1- 44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3- 9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia
65 / 77 leve de imunoglobulina endógena manipulada κ e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 de um locus de cadeia leve de imunoglobulina humana endógena.
212. Célula ES isolada de roedor de acordo com a reivindicação 210, caracterizada pelo fato de que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2- 23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 no primeiro locus de cadeia pesada de imunoglobulina κ endógena manipulada, e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1- 44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3- 10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena, (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ humana endógena.
213. Célula ES de roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 201 a 212, caracterizada pelo fato de que:
66 / 77 (i) um ou mais segmentos gênicos Vλ humanos compreendem Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1- 36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, Vλ3-1, ou qualquer combinação destes; e (ii) um ou mais segmentos gênicos Jλ humanos compreendem Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6, Jλ7 ou qualquer combinação destes.
214. Célula ES isolada de roedor de acordo com a reivindicação 213, caracterizada pelo fato de que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5- 52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3- 19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparecem naturalmente adjacentes a um Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3- 25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3, ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada κ e em que cada uma de uma
67 / 77 ou mais sequências não codificadoras de Jλ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena.
215. Célula ES isolada de roedor de acordo com a reivindicação 213, caracterizada pelo fato de que o primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada compreende: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas é adjacente ao Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5- 52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3-27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3- 19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada, e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Vλ humanas aparece naturalmente adjacente a um Vλ4-69, Vλ8-61, Vλ4-60, Vλ6-57, Vλ10-54, Vλ5-52, Vλ1-51, Vλ9-49, Vλ1-47, Vλ7-46, Vλ5-45, Vλ1-44, Vλ7-43, Vλ1-40, Vλ5-39, Vλ5-37, Vλ1-36, Vλ3- 27, Vλ3-25, Vλ2-23, Vλ3-22, Vλ3-21, Vλ3-19, Vλ2-18, Vλ3-16, Vλ2-14, Vλ3-12, Vλ2-11, Vλ3-10, Vλ3-9, Vλ2-8, Vλ4-3 ou Vλ3-1 de um locus de cadeia leve λ de imunoglobulina humana endógena; e (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas é adjacente ao Jλ1, Jλ2, Jλ3, Jλ6 ou Jλ7 no primeiro locus de cadeia leve de imunoglobulina κ endógena manipulada e em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de Jκ humanas aparece naturalmente adjacente a um Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, ou Jκ5 de um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ humana endógena.
216. Célula ES de roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 201 a 215, caracterizada pelo fato de que o genoma da
68 / 77 célula ES de roedor compreende adicionalmente: um locus de cadeia leve de imunoglobulina endógena manipulada, compreendendo: (a) um ou mais segmentos gênicos VH humanos, (b) um ou mais segmentos gênicos DH humanos, e (c) um ou mais segmentos gênicos JH humanos, em que um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos são operacionalmente ligados a um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
217. Célula ES de roedor de acordo com a reivindicação 216, caracterizada pelo fato de que um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos estão no lugar de um ou mais segmentos gênicos VH de roedores, um ou mais segmentos gênicos DH de roedores, um ou mais segmentos gênicos JH de roedores ou uma combinação destes.
218. Célula ES de roedor de acordo com a reivindicação 216 ou 217, caracterizada pelo fato de que um ou mais segmentos gênicos VH humanos, um ou mais segmentos gênicos DH humanos e um ou mais segmentos gênicos JH humanos estão no lugar de um ou mais segmentos gênicos VH de roedores, um ou mais segmentos gênicos DH de roedores, um ou mais segmentos gênicos JH de roedores ou uma combinação destes.
219. Célula ES de roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 216 a 218, caracterizado pelo fato de que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada compreende adicionalmente: (i) uma ou mais sequências não codificadoras de VH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos VH humanos, em que cada uma de uma ou mais sequências não
69 / 77 codificadoras de VH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico VH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena; (ii) uma ou mais sequências não codificadoras de DH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos DH humanos, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de DH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico DH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena; (iii) uma ou mais sequências não codificadoras de JH humanas, cada uma das quais é adjacente a pelo menos um de um ou mais segmentos gênicos JH humanos, em que cada uma de uma ou mais sequências não codificadoras de JH aparece naturalmente adjacente a um segmento gênico JH humano em um locus de cadeia pesada de imunoglobulina humana endógena; ou (iv) qualquer combinação destes.
220. Célula ES de roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 216 a 219, caracterizada pelo fato de que um ou mais genes da região constante de cadeia pesada de imunoglobulina de roedor são um ou mais genes da região constante de cadeia pesada da imunoglobulina de roedor endógenos.
221. Célula ES de roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 216 a 220, caracterizada pelo fato de que: (i) um ou mais segmentos gênicos VH humanos compreendem VH3-74, VH3-73, VH3-72, VH2-70, VH1-69, VH3-66, VH3-64, VH4-61, VH4- 59, VH1-58, VH3-53, VH5-51, VH3-49, VH3-48, VH1-46, VH1-45, VH3-43, VH4-39, VH4-34, VH3-33, VH4-31, VH3-30, VH4-28, VH2-26, VH1-24, VH3- 23, VH3-21, VH3-20, VH1-18, VH3-15, VH3-13, VH3-11, VH3-9, VH1-8, VH3- 7, VH2-5, VH7-4-1, VH4-4, VH1-3, VH1-2, VH6-1, ou qualquer combinação
70 / 77 destes, (ii) um ou mais segmentos gênicos DH humanos compreendem DH1-1, DH2-2, DH3-3, DH4-4, DH5-5, DH6-6, DH1-7, DH2-8, DH3-9, DH3-10, DH5-12, DH6-13, DH2-15, DH3-16, DH4-17, DH6-19, DH1-20, DH2-21, DH3- 22, DH6-25, DH1-26, DH7-27, ou qualquer combinação destes, e (iii) um ou mais segmentos gênicos JH humanos compreendem JH1, JH2, JH3, JH4, JH5, JH6 ou qualquer combinação destes.
222. Célula ES de roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 216 a 221, caracterizada pelo fato de que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada não possui um gene Adam6 de roedor endógeno funcional.
223. Célula ES de roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 216 a 222, caracterizada pelo fato de que o genoma do roedor compreende adicionalmente uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos ADAM6, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais.
224. Célula ES de roedor de acordo com a reivindicação 223, caracterizado pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais são incluídas no mesmo cromossomo que o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
225. Célula ES de roedor de acordo com a reivindicação 223 ou 224, caracterizada pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais estão incluídas no locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
226. Célula ES de roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 223 a 225, caracterizada pelo fato de que uma ou mais
71 / 77 sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos, ortólogos funcionais ou homólogos funcionais de ADAM6 de roedor ou seus fragmentos funcionais estão no lugar de um pseudogene Adam6 humano.
227. Célula ES de roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 223 a 226, caracterizada pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais substituem um pseudogene Adam6 humano.
228. Célula ES de roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 223 a 227, caracterizada pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais estão entre um primeiro segmento gênico VH humano e um segundo segmento gênico VH humano.
229. Célula ES de roedor de acordo com a reivindicação 228, caracterizada pelo fato de que o primeiro segmento gênico VH humano é VH1- 2 e o segundo segmento gênico VH humano é VH6-1.
230. Célula ES de roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 223 a 225, caracterizada pelo fato de que uma ou mais sequências nucleotídicas que codificam um ou mais polipeptídeos de ADAM6 de roedor, ortólogos funcionais, homólogos funcionais ou seus fragmentos funcionais estão entre um segmento gênico VH humano e um segmento gênico DH humano.
231. Célula ES de roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 216 a 230, caracterizada pelo fato de que a célula de roedor é homozigótica para o locus de cadeia pesada de imunoglobulina endógena manipulada.
232. Célula ES de roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 201 a 231, caracterizada pelo fato de que o genoma da
72 / 77 célula ES de roedor compreende adicionalmente uma sequência de ácido nucleico que codifica uma desoxinucleotidiltransferase terminal exógena (TdT) operacionalmente ligada a um elemento de controle transcricional.
233. Célula ES de roedor de acordo com a reivindicação 232, caracterizada pelo fato de que o TdT é uma isoforma curta de TdT (TdTS).
234. Célula ES de roedor de acordo com a reivindicação 232 ou 233, caracterizada pelo fato de que o elemento de controle transcricional inclui um elemento de controle transcricional de RAG1, um elemento de controle transcricional de RAG2, um elemento de controle transcricional de cadeia pesada de imunoglobulina, um elemento de controle transcricional de cadeia leve de imunoglobulina κ, um elemento de controle transcricional de cadeia leve λ de imunoglobulina ou qualquer combinação destes.
235. Célula ES de roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 232 a 234, caracterizada pelo fato de que a sequência de ácido nucleico que codifica um TdT exógeno está em um locus de cadeia leve de imunoglobulina κ, um locus de cadeia leve de imunoglobulina λ, um locus de cadeia pesada de imunoglobulina, um locus de RAG1 ou um locus de RAG2.
236. Célula ES de roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 201 a 235, caracterizada pelo fato de que a célula ES de roedor é uma célula ES de rato ou uma célula ES de camundongo.
237. Método para produzir um anticorpo totalmente humano específico contra um antígeno, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) imunizar um roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 60 com o antígeno; (b) determinar uma sequência nucleotídica que codifica um domínio variável de cadeia pesada humana de um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno e que foi gerado pelo camundongo
73 / 77 geneticamente modificado e/ou determinar uma sequência nucleotídica que codifica um λ domínio variável de cadeia leve humana de um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno e que foi gerado pelo camundongo geneticamente modificado; e (c) expressar um anticorpo totalmente humano, empregando: (i) a sequência nucleotídica que codifica um domínio variável de cadeia pesada humana de (b) ligada operacionalmente a um gene da região constante de cadeia pesada humana e/ou (ii) a sequência nucleotídica que codifica um λ domínio variável de cadeia leve humana de (b) ligada operacionalmente a um gene da região constante de cadeia leve humana.
238. Método para produzir um anticorpo totalmente humano específico contra um antígeno, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) expressar em uma célula de mamífero um anticorpo totalmente humano compreendendo duas λ cadeias leves humanas e duas cadeias pesadas humanas, em que cada λ cadeia leve humana inclui um λ domínio variável de cadeia leve humana codificado por uma λ região variável de cadeia leve humana e cada cadeia pesada humana inclui uma domínio variável de cadeia pesada humana codificado por uma região variável de cadeia pesada humana, em que a sequência nucleotídica de pelo menos uma λ região variável de cadeia pesada ou leve humana foi obtida a partir de um roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 60; e (b) obter o anticorpo totalmente humano.
239. Método para produzir um anticorpo totalmente humano específico contra um antígeno, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) imunizar um roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 60;
74 / 77 (b) determinar uma sequência de domínio variável de cadeia pesada humana de um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno e que foi gerado pelo camundongo geneticamente modificado e/ou determinar uma sequência de domínio variável de cadeia leve humana λ de um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno e que foi gerado pelo camundongo geneticamente modificado; e (c) expressar um anticorpo totalmente humano, empregando: (i) a sequência de domínio variável de cadeia pesada humana de (b) ligada operacionalmente a uma sequência de domínio constante dee cadeia pesada humana e/ou (ii) a λ sequência de domínio variável da cadeia leve humana de (b) ligada operacionalmente a uma sequência de domínio constante de cadeia leve humana.
240. Método de acordo com a reivindicação 239, caracterizado pelo fato de que o emprego da sequência de domínio variável de cadeia pesada humana de (b) operacionalmente ligada a uma sequência de domínio constante de cadeia pesada humana compreende expressar uma sequência nucleotídica que codifica a sequência de domínio variável de cadeia pesada humana de (b) e a sequência de domín io constante de cadeia pesada humana.
241. Método de acordo com a reivindicação 239 ou 240, caracterizado pelo fato de que o emprego da λ sequência de domínio variável de cadeia leve humana de (b) operacionalmente ligada a uma sequência de domínio constante de cadeia leve humana compreende expressar uma sequência nucleotídica que codifica a λ sequência do domínio variável de cadeia leve humana de (b) e a sequência de domínio constante de cadeia leve humana.
242. Método para produzir um anticorpo totalmente humano específico contra um antígeno, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
75 / 77 (a) expressar em uma célula de mamífero o referido anticorpo totalmente humano compreendendo duas λ cadeias leves humanas e duas cadeias pesadas humanas, em que cada λ cadeia leve humana inclui um domínio variável de cadeia leve humana e cada cadeia pesada humana inclui um domínio variável de cadeia pesada humana, em que a sequência de aminoácidos de pelo menos um λ domínio variável de cadeia pesada ou leve humana foi obtida a partir de um roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 60; e (b) obter o anticorpo totalmente humano.
243. Método para gerar uma λ sequência de domínio variável de cadeia pesada ou leve humana, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) imunizar um roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 60; e (b) determinar uma λ sequência de domínio variável de cadeia pesada ou leve humana de um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno e que foi gerado pelo camundongo geneticamente modificado.
244. Método de acordo com a reivindicação 243, caracterizado pelo fato de que determinar uma λ sequência de domínio variável de cadeia pesada ou leve humana compreende determinar uma sequência nucleotídica que codifica a λ sequência de domínio variável de cadeia pesada ou leve humana.
245. Método para produzir uma cadeia pesada totalmente humana ou uma cadeia leve totalmente humana, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) imunizar um roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 60; (b) determinar uma λ sequência de domínio variável de cadeia pesada ou leve humana de um anticorpo que se liga especificamente ao
76 / 77 antígeno e que foi gerado pelo camundongo geneticamente modificado; e (c) ligar de forma operacional a λ sequência de domínio variável de cadeia pesada ou leve humana a uma sequência de domínio constante de cadeia pesada ou leve humana, respectivamente, para formar uma cadeia pesada totalmente humana ou uma cadeia leve totalmente humana.
246. Método de acordo com a reivindicação 245, caracterizado pelo fato de que a ligação operacional da λ sequência de domínio variável de cadeia pesada ou leve humana a uma sequência de domínio constante de cadeia pesada ou leve humana, respectivamente, compreende a ligação operacional de uma sequência nucleotídica que codifica a λ sequência de domínio variável de cadeia pesada ou leve humana a uma sequência nucleotídica que codifica a sequência de domínio constante de cadeia pesada ou leve humana.
247. Método para gerar uma λ sequência da região variável de cadeia pesada ou leve humana, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) imunizar um roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 60; e (b) determinar uma λ sequência da região variável de cadeia pesada ou leve humana que codifica um λ domínio variável de cadeia pesada ou leve humana, respectivamente, de um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno e que foi gerado pelo camundongo geneticamente modificado.
248. Método para produzir uma sequência nucleotídica que codifica uma cadeia pesada totalmente humana ou uma cadeia leve totalmente humana, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) imunizar um roedor de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 60;
77 / 77
(b) determinar uma λ sequência da região variável de cadeia pesada ou leve humana que codifica um λ domínio variável de cadeia pesada ou leve humana, respectivamente, de um anticorpo que se liga especificamente ao antígeno e que foi gerado pelo camundongo geneticamente modificado; e (c) ligar de forma operacional a λ sequência da região variável de cadeia pesada ou leve humana a um gene da região constante de cadeia pesada ou leve humana, respectivamente, para formar uma sequência nucleotídica que codifica uma cadeia pesada totalmente humana ou uma cadeia leve totalmente humana.
Região hJκ com sobreposição sobreposição sobreposição de 80 bp de 80 bp de 80 bp
Petição 870200069238, de 03/06/2020, pág. 400/425 Montagem isotérmica quádrupla Ligação AgeI/EcoRI
Região hJκ com sobreposição sobreposição sobreposição de 80 bp de 80 bp de 80 bp
Ligação NotI/MluI 1/24
80bp de sobreposição
Ligação PI-Scel/AscI
Região hJκ com sobreposição sobreposição de 80 bp de 80 bp
Figura 1A
Região Vκ-Jκ humana (22kb)
Petição 870200069238, de 03/06/2020, pág. 401/425 Digestão/religação de NotI construto F
Região hJκ com sobreposição sobreposição 2/24 de 80 bp de 80 bp
Cas9/montagem isotérmica
Região hJκ com construto G
Região Vκ-Jκ humana (22kb)
Figura 1B
Petição 870200069238, de 03/06/2020, pág. 402/425 Região hJκ com construto G linearizado Região Vκ-Jκ humana (22kb)
Eletroporação 3/24
Figura 2A
Figura 2B
Ligação AgeI/XhoI pH (inserção de 87 bp de SnaBI)
de pA de pA
Petição 870200069238, de 03/06/2020, pág. 404/425 Região hJκ com construto K Região Vκ-Jκ humana (22kb) 5/24
Cas9/montagem isotérmica
Região hJκ com construto L Região Vκ-Jκ humana (22kb)
Figura 3
Petição 870200069238, de 03/06/2020, pág. 405/425 Região hJκ com construto G linearizado Região Vκ-Jκ humana (22kb) 6/24
Eletroporação
Figura 4A
Figura 4B madura
Figura 5 Transicional madura madura imatura
Figura 6 madura imatura
Figura 7
Figura 8
Figura 9 madura imatura madura
Figura 10 imatura madura imatura
Figura 11 alelo de LiK
Petição 870200069238, de 03/06/2020, pág. 414/425 alelo de LiK rearranjado 15/24 mRNA de LiK rearranjado
Figura 12
Diluição Genótipo
Vazio Vazio Faixa
Figura 13
Figura 14
Figura 15 madura imatura
Figura 16 madura imatura
Figura 17
Cepas de Camundongo
Figura 18 Detecção:
Títulos de Anticorpos
Cepas de Camundongo
Figura 19 Detecção:
Títulos de Anticorpos
Porção de Locus de Cadeia Leve λ Humana Endógeno
Petição 870200069238, de 03/06/2020, pág. 422/425 Segmentos Gênicos Vλ
Primeira Sequência Segunda Sequência 23/24
Não Codificante Vλ Não Codificante Vλ Humana Endógena Humana Endógena Exemplar Exemplar
Figura 20
Porção de Locus de Cadeia Leve κ Humana Endógeno
Petição 870200069238, de 03/06/2020, pág. 423/425 Segmentos Gênicos Jκ
Primeira Sequência Segunda Sequência Não Codificante Jκ Não Codificante Jκ 24/24
Humana Endógena Humana Endógena Exemplar Exemplar
Figura 21
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