KR20190006029A - Vl 도메인을 함유하는 중쇄를 발현하는 사람화된 설치류 - Google Patents
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Abstract
내인성 비-사람 중쇄 면역글로불린 서열의 변형을 포함하고 설치류 (예를 들어, 마우스)에서 기능적인 ADAM6 활성을 포함하는 비-사람 동물, 조직, 세포, 및 유전 물질이 제공되며, 비-사람 동물은 중쇄 불변 영역의 맥락에서 사람 면역글로불린 경쇄 유전자 세그먼트를 재배열하고 경쇄 불변 도메인에 융합된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 도메인과 인접한 중쇄 불변 도메인에 융합된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린-유사 분자를 발현한다.
Description
면역글로불린 경쇄 가변 도메인과 융합된 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 포함하는 사람 면역글로불린-유사 결합 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 비-사람 생식 가능한 동물, 뿐만 아니라 경쇄 불변 도메인에 융합된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 및 중쇄 불변 도메인에 융합된 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 갖는 결합 단백질이 제공된다. 기능적 ADAM6 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 마우스, 세포, 배아, 및 조직이 설명되며, 마우스, 세포, 배아, 및 조직은 하나 이상의 비-사람 면역글로불린 중쇄 불변 유전자에 작동 가능하게 결합된 사람 면역글로불린 경쇄 유전자 세그먼트를 포함한다. 변형은 사람 및/또는 사람화된 면역글로불린 자리를 포함한다. ADAM6 기능을 포함하는 마우스가 설명되며, ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 핵산 서열을 포함하는 마우스를 포함한다. 내인성 마우스 면역글로불린 VH 영역 자리의 유전적 변형을 포함하고, ADAM6 활성을 더 포함하는, 유전적으로 변형된 수컷 마우스가 설명되며, 수컷 마우스에게 생식능력을 회복시키거나 유지시키는 이소성 핵산 서열을 포함하는 마우스를 포함한다. 예시적 생식능력은 야생형 마우스와 비교 가능한 생식능력이다.
내인성 ADAM6 유전자 또는 이것의 상동체 또는 오솔로그(ortholog)의 결실 또는 변형을 포함하고, ADAM6 (또는 이것의 상동체 또는 오솔로그) 기능을 전체적으로 또는 부분적으로 회복시키는 유전적 변형을 포함하는, 유전적으로 변형된 비-사람 생식 가능한 동물이 제공되며, 비-사람 동물은 중쇄 불변 서열의 맥락에서 사람 면역글로불린 경쇄 가변 서열을 발현한다. 이러한 결합 단백질을 발현하는 세포, 그것들을 만드는 설치류(예를 들어, 마우스), 및 관련된 방법 및 조성물이 또한 제공된다.
중쇄 불변 영역과 융합된 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체를 발현하는 유전적으로 조작된 동물이 설명되며, 비-사람 동물은 기능적 내인성 ADAM6 유전자가 결핍되지만 ADAM6 기능을 유지하고, 마우스가 기능적 ADAM6 단백질을 만들 수 없게 하고 생식능력의 손실을 일으키는 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 (VH) 영역 자리의 변형을 포함하는 설치류 (예를 들어, 마우스)를 포함한다. 유전적으로 변형된 마우스는 복수의 사람 VL, JL 및 선택적으로 DH 유전자 세그먼트 또는 이들의 조합을 특징으로 하는 면역글로불린 VH 자리를 포함하고, ADAM6 기능을 더 포함하는, 유전적으로 변형된 마우스가 설명되며, 수컷 마우스에게 생식능력을 회복시키는 이소성 핵산 서열을 포함하는 마우스를 포함한다. 유전적으로 변형된 마우스는 중쇄 가변 도메인이 결핍되고 대신에 재배열된 경쇄 유전자 세그먼트를 포함하는 가변 도메인을 포함하는 항체를 발현한다.
기능적 ADAM6 자리를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 설치류 (예를 들어, 마우스), 세포, 배아, 및 조직이 설명되며, 마우스, 세포, 배아, 및 조직은 사람 경쇄 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 발현한다. 게다가, 마우스, 세포, 배아, 및 조직은 기능적 내인성 ADAM6 유전자가 결핍되지만 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 핵산 서열의 존재를 특징으로 하는 ADAM6 기능을 유지한다. 항원 결합에 유용한 생식 가능한 비-사람 동물에서 항체 서열을 만드는 방법이 제공된다.
지난 20년 동안, 항체에 대한 약학적 적용은 사람 치료제로서 사용에 적합한 항체를 만드는 것에 대한 많은 연구를 지지하였다. 마우스 항체를 기반으로 하는, 초기 항체 치료제는 마우스 항체를 사람에게 반복적으로 투여하는 것은 장기간 치료 요법이 틀렸음을 입증할 수 있는 면역원성 문제를 일으키기 때문에 사람 치료제로서 이상적이지 않았다. 마우스 항체가 더 사람같고 덜 마우스와 유사하게 보여지게 하기 위한 마우스 항체의 사람화를 기반으로 하는 용액이 개발되었다. 주로 파지, 박테리아, 또는 효모에서 사람 면역글로불린 라이브러리의 시험관 내(in vitro) 발현을 기반으로 하는, 항체에서 사용되는 사람 면역글로불린 서열을 발현시키는 방법이 뒤따랐다. 최종적으로, 시험관 내 사람 림프세포로부터, 사람 조혈성 세포가 이식된 마우스에서, 및 고장난 내인성 면역글로불린 자리로 염색체 이식 또는 유전자 이식된 마우스에서 사람 림프세포로부터 유용한 사람 항체를 만드는 것이 시도되었다.
이들 마우스의 생산을 위해, 무작위로 통합된 완전한 사람 이식 유전자가 마우스에서 면역글로불린의 발현된 레퍼토리로서 기능하는 내인성 마우스 면역글로불린 유전자를 무력화시키는 것이 필요하다. 이러한 마우스는 사람 항체를 사람 치료제로서의 사용에 적합하게 만들 수 있지만, 이 마우스들은 그것들의 면역 시스템에서 실질적인 문제를 나타낸다. 이 문제들은 여러 가지 실험적 장애물로 이어지는데, 예를 들어, 마우스는 충분히 다양한 항체 레퍼토리를 생성하는 것이 실행 불가능하고, 광범위한 재-조작 수정의 사용을 필요로 하고, 사람 및 마우스 요소 사이의 불친화성으로 인한 것일 가능성이 큰, 차선의 클론 선택 공정, 및 사람 치료제를 만드는데 정말로 유용해질 필요가 있는, 사람 가변 서열의 크고 다양한 집단의 신뢰 불가능한 공급원을 제공한다.
완전한 사람 항체 이식 유전자를 함유한 유전자 이식 마우스는 중쇄 불변 서열에 결합된 재배열되지 않은 사람 면역글로불린 중쇄 가변 서열 (V, D, 및 J 서열), 및 사람 경쇄 불변 서열에 결합된 재배열되지 않은 사람 면역글로불린 경쇄 가변 서열 (V 및 J)을 함유하는 무작위로 삽입된 이식 유전자를 함유한다. 그러므로 마우스는, 재배열된 항체 유전자가 완전히 사람인 경우에, 내인성 자리 이외의 자리로부터 재배열된 항체 유전자를 생성한다. 일반적으로, 마우스는 사람 중쇄 서열 및 사람 κ 경쇄 서열을 함유하지만, 적어도 일부의 사람 λ 서열을 갖는 마우스가 또한 보고되었다. 유전자 이식 마우스는 일반적으로 마우스가 내인성 면역글로불린 자리에서 사람 항체 서열을 재배열할 수 없도록 손상된 및 비기능성 내인성 면역글로불린 자리, 또는 내인성 면역글로불린 자리의 넉아웃을 갖고 있다. 이러한 유전자 이식 마우스의 예측불허한 변화(vagary)는 그것들을 마우스에서 충분히 다양한 사람 항체 레퍼토리를 발생시키는데 최적이 아니게 하며, 적어도 부분적으로는, 내인성 선택 시스템 내의 완전한 사람 항체 분자와 이러한 마우스의 내인적 유전적 구성에 대한 변화를 연결시키는 차선의 클론 선택 과정으로 인한 것일 가능성이 크다.
사람 항체 서열을 포함하는, 면역글로불린 서열을 발생시키는데 유용하고, 고전적인 항체 분자 이외의 다양성을 나타내는 다양한 레퍼토리의 면역글로불린-유사 분자를 발생시키는데 유용한, 개선된 유전적으로 변형된 비-사람 동물을 만드는 한편, 동시에 해로운 유전적 변형으로부터 발생할 수도 있는 해로운 변화를 감소시키거나 제거할 필요가 업계에 남아있다. 경쇄 불변 도메인의 맥락에서 사람 면연글로불린 경쇄 가변 도메인과 동족인 중쇄 불변 도메인의 맥락에서 사람 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는, 유용한 재배열된 면역글로불린 유전자를 형성하기 위해 면역글로불린 유전자 세그먼트를 재배열할 수 있고, 사람 경쇄 가변 유전자 세그먼트의 충분히 다양한 콜렉션을 함유하는 자리를 포함하는, 변화된 면역글로불린 자리로부터 단백질을 만들 수 있는 비-사람 동물에 대한 필요가 또한 남아있다. 면역글로불린-유사 결합 단백질을 생성할 수 있는, 비-사람 동물에 대한 필요가 남아있으며, 결합 단백질이 중쇄 불변 도메인에 결합된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함한다.
면역글로불린 자리를 가진 유전적으로 변형된 비-사람 동물이 제공되며, 면역글로불린 자리는 하나 이상의 비-사람 불변 영역, 예를 들어, 사람 Vκ 및 Jκ 또는 사람 Vλ 및 Jλ에 작동 가능하게 결합된 복수의 사람 경쇄 가변 (VL) 유전자 세그먼트를 포함하며, 다양한 구체예에서, 자리는 내인성 기능적 ADAM6 단백질을 암호화하는 서열이 결핍된다. 비-사람 동물은 설치류, 예를 들어, 마우스 및 래트를 포함한다.
재배열하여 사람 경쇄 Vκ 또는 Vλ 유전자 세그먼트 및 사람 Jκ 또는 Jλ 유전자 세그먼트 및 다양한 구체예에서, 추가적으로 DH 유전자 세그먼트를 수반하는 재배열로부터 유래된 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 유전자를 형성할 수 있는 자리가 제공되며, 다양한 구체예에서 자리는 내인성 기능적 ADAM6 유전자 또는 이들의 기능적 단편이 결핍된다.
변형된 면역글로불린 자리는 내인성 기능적 ADAM6 유전자가 결핍되고 사람 면역글로불린 서열을 포함하는 자리, 예를 들어, 사람 또는 (또는 사람/비-사람 키메라) 비-사람 면역글로불린 불변 서열에 작동 가능하게 결합된 (예를 들어, V 및/또는 J 세그먼트와 작동 가능하게 결합됨) 사람 VL 세그먼트를 포함한다. 다수의 VL 유전자 세그먼트 및 ADAM6 단백질 또는 비-사람 동물에서 기능적인 이들의 단편을 암호화하는 이소성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 변형된 자리가 제공된다. 다수의 VL 유전자 세그먼트를 포함하고, 하나 이상의 DH 세그먼트 및/또는 하나 이상의 JL 또는 JH 세그먼트와 작동 가능하게 결합되며, 비-사람 면역글로불린 불변 서열, 예를 들어, 설치류 (예를 들어, 마우스 또는 래트) 또는 사람 서열에 작동 가능하게 결합되는 변형된 자리가 제공된다. 이러한 사람화된 자리를 포함하는 비-사람 동물이 또한 제공되며, 비-사람 동물은 야생형 생식능력을 나타낸다.
사람 D 및/또는 사람 J 유전자 세그먼트에 작동 가능하게 결합된 복수의 사람 VL 유전자 세그먼트를 포함하는 면역글로불린 중쇄 가변 자리 (예를 들어, 이식 유전자에서 또는 내인성 비-사람 동물 중쇄 가변 자리에서의 삽입 또는 대체로서)를 포함하는 비-사람 동물이 제공된다. 다양한 구체예에서, 복수의 사람 VL 유전자 세그먼트는 비-사람 동물의 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 자리에서 하나 이상의 사람 D 및/또는 하나 이상의 사람 J 유전자 세그먼트에 작동 가능하게 결합된다. 다양한 구체예에서, 비-사람 동물은 변형된 중쇄 자리를 포함하는 ADAM6 단백질 또는 수컷 비-사람 동물에서 기능적인 이것의 상동체 또는 오솔로그를 암호화하는 이소성 뉴클레오티드 서열을 더 포함한다. 다양한 구체예에서, 이소성 뉴클레오티드 서열은 적어도 하나의 사람 VL 세그먼트, DH 유전자 세그먼트, 또는 JL 유전자 세그먼트와 인접하다. 다양한 구체예에서, 이소성 뉴클레오티드 서열은 비-사람 동물의 게놈의 비-면역글로불린 서열과 인접하다. 한 구체예에서, 이소성 뉴클레오티드 서열은 변형된 중쇄 자리와 같은 염색체 상에 있다. 한 구체예에서, 이소성 뉴클레오티드 서열은 변형된 중쇄 자리와 다른 염색체 상에 있다.
모든 또는 실질적으로 모든 내인성 면역글로불린 VH 세그먼트 (예를 들어, 모든 기능적 세그먼트, 또는 거의 모든 기능적 세그먼트)를 삭제하기 위해 면역글로불린 중쇄 가변 영역 자리에서 변형되고 비-사람 동물의 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 영역 자리에서 DH 및 J 세그먼트 또는 JL 유전자 세그먼트에 작동 가능하게 결합된 복수의 사람 VL 유전자 세그먼트를 포함하는 비-사람 동물이 제공된다. 이러한 자리를 포함하고 내인성 ADAM6 유전자가 결핍된 비-사람 동물이 또한 제공된다.
비-사람 동물에서 사람 면역글로불린 서열을 만드는 방법이 제공된다. 다양한 구체예에서, 사람 면역글로불린 서열은 면역글로불린 중쇄 불변 영역과 함께 재배열되고 이와 작동 가능하게 결합된 사람 VL 유전자 세그먼트, 예를 들어, VL, 및 하나 이상의 DH 및 J 세그먼트 또는 하나 이상의 Jλ 세그먼트를 포함하는 면역글로불린 중쇄 서열의 레퍼토리로부터 유래된다. 비-사람 동물, 조직, 및 세포에서 사람 면역글로불린 서열을 만드는 방법이 제공되며, 사람 면역글로불린 서열은 원하는 항원에 결합한다.
한 양태에서, 핵산 구조, 세포, 배아, 설치류 (예를 들어, 마우스), 및 비기능적 내인성 설치류 (예를 들어, 마우스) ADAM6 단백질 또는 ADAM6 유전자를 발생시키는 변형 (예를 들어, 내인성 ADAM6 유전자의 넉아웃 또는 결실)을 포함하는 설치류를 만드는 방법이 제공되며, 설치류 (예를 들어, 마우스)는 ADAM6 단백질 또는 같은 종류의 수컷 설치류 (예를 들어, 마우스)에서 기능적인 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 설치류 ADAM6 단백질 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편을 암호화하는 이소성 뉴클레오티드 서열을 포함한다; 특정 구체예에서, 설치류 ADAM6 단백질은 마우스 ADAM6 단백질이다. 한 구체예에서, 마우스는 하나 이상의 설치류 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 하나 이상의 단백질은 SEQ ID NO: 1 또는 SEQ ID NO: 2 또는 마우스에서 기능적인 이들의 단편을 포함한다.
다양한 양태에서, ADAM6 활성을 암호화하는 서열은 사람 면역글로불린 서열과 인접하다. 다양한 양태에서, ADAM6 활성을 암호화하는 서열은 비-사람 면역글로불린 서열과 인접하다. 다양한 양태에서, 서열은 비-사람 동물의 내인성 비-사람 면역글로불린 중쇄 자리와 같은 염색체 상에 존재한다. 다양한 양태에서, 서열은 비-사람 동물의 면역글로불린 중쇄 자리 이외의 다른 염색체 상에 존재한다.
ADAM6 유전자 또는 이것의 상동체 또는 오솔로그의 활성을 유지하는 변형을 포함하는, 유전적으로 변형된 비-사람 동물이 설명되며, 변형은 비-사람 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 업스트림(upstream)에서 하나 이상의 사람 면역글로불린 경쇄 유전자 세그먼트의 삽입을 포함하고, 비-사람 동물은 그것들이 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역과 동족인 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역을 발현 가능하게 하는 변형을 더 포함한다. 다양한 양태에서, 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역은 경쇄 및 중쇄 불변 영역의 맥락에서 발현된다.
다양한 양태에서, 하나 이상의 사람 면역글로불린 경쇄 유전자 세그먼트의 삽입은 비-사람 동물의 ADAM6 유전자의 3' 또는 다운스트림(downstream)에서 수행된다. 다양한 양태에서, 하나 이상의 사람 면역글로불린 경쇄 유전자 세그먼트의 삽입은 비-사람 동물의 ADAM6 활성이 이러한 삽입을 함유하지 않는 비-사람 동물에서와 같거나 비슷한 수준이 되도록 비-사람 동물의 ADAM6 유전자(들)이 분쇄되고, 결실되고 및/또는 기능적으로 침묵하게 되지 않는 방식으로 수행된다. 예시적 분쇄, 결실 및/또는 기능적으로 침묵하는 변형은 비-사람 동물의 ADAM6 유전자(들)에 의해 암호화된 ADAM6 단백질(들)의 활성의 감소, 제거 및/또는 손실을 일으키는 어떤 변형도 포함한다.
한 양태에서, 핵산 구조, 세포, 배아, 마우스, 및 내인성 면역글로불린의 변형을 포함하는 마우스를 만드는 방법이 제공되며, 마우스는 ADAM6 단백질 또는 수컷 마우스에서 기능적인 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 단편을 포함한다. 한 구체예에서, 내인성 면역글로불린 자리는 면역글로불린 중쇄 자리이고, 변형은 수컷 마우스의 세포 또는 조직의 ADAM6 활성을 감소시키거나 제거한다.
한 양태에서, 마우스 ADAM6 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편을 암호화하는 이소성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 마우스가 제공된다. 마우스 ADAM6 또는 오솔로그 또는 상동체 또는 이들의 단편, 및 중쇄 면역글로불린 자리의 적어도 하나의 유전적 변형을 암호화하는 내인성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 마우스가 또한 제공된다. 한 구체예에서, 마우스 ADAM6 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편을 암호화하는 내인성 뉴클레오티드 서열은 야생형 마우스의 내인성 ADAM6 유전자와 비교하여 이소성 위치에 위치한다.
한 양태에서, 내인성 면역글로불린 자리의 변형을 포함하는 마우스를 만드는 방법이 제공되며, 마우스는 ADAM6 단백질 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 수컷 마우스에서 기능적인 단편을 포함한다. 다양한 구체예에서, 변형은 내인성 면역글로불린 자리에서 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트의 삽입을 포함한다.
한 양태에서, 중쇄 면역글로불린 자리의 유전적 변형을 포함하는 마우스를 만드는 방법이 제공되며, 방법의 적용은 변형된 중쇄 면역글로불린 자리 (또는 이들의 결실)을 포함하는 수컷 마우스를 발생시키고, 수컷 마우스는 교배에 의해 자손을 생성할 수 있다. 한 구체예에서, 수컷 마우스는 마우스 자궁에서 마우스 난관을 통해 이동하여 마우스 난자를 수정시킬 수 있는 정자를 생산할 수 있다.
한 양태에서, 면역글로불린 중쇄 자리 및 면역글로불린 경쇄 자리의 유전적 변형을 포함하는 마우스를 만드는 방법이 제공되며, 중쇄 자리를 변형시키기 위한 방법의 적용은 생식능력의 감소를 나타내는 수컷 마우스를 발생시키며, 마우스는 생식능력의 감소를 전체적으로 또는 부분적으로 회복시키는 유전적 변형을 포함한다. 다양한 구체예에서, 생식능력의 감소는 마우스 자궁에서 마우스 난관을 통해 이동하여 마우스 난자를 수정시킬 수 없는 수컷 마우스의 정자의 능력을 특징으로 한다. 다양한 구체예에서, 생식능력의 감소는 생체 내 이동 결점을 나타내는 정자를 특징으로 한다. 다양한 구체예에서, 생식능력의 감소를 전체적으로 또는 부분적으로 회복시키는 유전적 변형은 마우스 ADAM6 유전자 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 수컷 마우스에서 기능적인 단편을 암호화하는 핵산 서열이다.
한 구체예에서, 유전적 변형은 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 자리를 또 다른 종 (예를 들어, 비-마우스 종)의 면역글로불린 경쇄 가변 자리로 대체하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 유전적 변형은 또 다른 종 (예를 들어, 비-마우스 종)의 면역글로불린 경쇄 가변 자리의 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 자리로의 삽입을 포함한다. 특정 구체예에서, 종은 사람이다. 한 구체예에서, 유전적 변형은 전체적으로 또는 부분적으로 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 자리의 결실을 포함하며, 결실은 내인성 ADAM6 기능의 손실을 일으킨다. 특정 구체예에서, 내인성 ADAM6 기능의 손실은 수컷 마우스의 생식능력의 감소와 연관된다.
한 구체예에서, 유전적 변형은 전체적으로 또는 부분적으로 내인성 비-사람 면역글로불린 중쇄 가변 자리의 불활성화를 포함하며, 불활성화는 내인성 ADAM6 기능의 손실을 일으키지 않는다. 불활성화는 내인성 비-사람 유전자 세그먼트를 포함하는 항체의 중쇄를 암호화하도록 실질적으로 재배열될 수 없는 내인성 비-사람 면역글로불린 중쇄 자리를 발생시키는 하나 이상의 내인성 비-사람 유전자 세그먼트의 대체 또는 결실을 포함할 수도 있다. 불활성화는 내인성 면역글로불린 중쇄 자리가 항체의 중쇄를 암호화하도록 재배열될 수 없게 하는 다른 변형을 포함할 수도 있으며, 변형은 내인성 유전자 세그먼트의 대체 또는 결실을 포함하지 않는다. 예시적 변형은 분자적 기술에 의한, 예를 들어, 부위-특이적 재조합 부위의 정확한 배치 (예를 들어, Cre-lox 기술)를 사용하는 염색체 역위(chromosomal inversion) 및/또는 전좌(translocation)를 포함한다. 다른 예시적 변형은 비-사람 면역글로불린 가변 유전자 세그먼트 및 비-사람 면역글로불린 불변 영역 사이의 작동 가능한 결합의 불능화를 포함한다.
한 구체예에서, 유전적 변형은 비-사람 동물의 게놈으로 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트 및 하나 이상의 사람 JL 유전자 세그먼트, 및 하나 이상의 불변 영역 서열 (예를 들어, IgM 및/또는 IgG 유전자)에 작동 가능하게 결합된 또 다른 종 (예를 들어, 비-마우스 종)의 선택적으로 하나 이상의 사람 DH 유전자 세그먼트를 함유하는 DNA 단편을 삽입하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, DNA 단편은 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 결합된 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 서열을 형성하기 위해 비-사람 동물의 게놈에서의 재배열을 겪을 수 있다. 한 구체예에서, 종은 사람이다. 한 구체예에서, 유전적 변형은 ADAM6 활성 (예를 들어, 암호화된 단백질의 발현 및/또는 기능)이 삽입을 포함하지 않는 비-사람 동물과 같거나 비슷하도록 비-사람 동물의 내인성 ADAM6 유전자의 다운스트림 또는 3'에 하나 이상의 사람 면역글로불린 경쇄 유전자 세그먼트의 삽입을 포함한다.
한 양태에서, 면역글로불린 중쇄 자리의 유전적 변형을 포함하는 마우스를 만드는 방법이 제공되며, 방법의 적용은 변형된 면역글로불린 중쇄 자리 (또는 이들의 결실)를 포함하는 수컷 마우스를 발생시키고, 수컷 마우스는 생식능력의 감소를 나타내며, 마우스는 생식능력의 감소를 전체적으로 또는 부분적으로 회복시키는 유전적 변형을 포함한다. 다양한 구체예에서, 생식능력의 감소는 마우스 자궁에서 마우스 난관을 통해 이동하여 마우스 난자를 수정시킬 수 없는 수컷 마우스의 정자의 능력을 특징으로 한다. 다양한 구체예에서, 생식능력의 감소는 생체 내 이동 결점을 나타내는 정자를 특징으로 한다. 다양한 구체예에서, 생식능력의 감소를 전체적으로 또는 부분적으로 회복시키는 유전적 변형은 마우스 ADAM6 유전자 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 수컷 마우스에서 기능적인 단편을 암호화하는 핵산 서열이다.
한 구체예에서, 유전적 변형은 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 자리를 면역글로불린 경쇄 가변 자리, 예를 들어, 하나 이상의 경쇄 가변 (VL) 유전자 세그먼트, 하나 이상의 중쇄 다양성 (DH) 유전자 세그먼트 및 하나 이상의 결합 (J) 유전자 세그먼트, 또는 또 다른 종 (예를 들어, 비-마우스 종)의 하나 이상의 경쇄 결합 (JL) 유전자 세그먼트로 대체하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 유전적 변형은 단일 오솔로그의 면역글로불린 경쇄 가변 자리 VL 유전자 세그먼트, 적어도 하나의 DH 유전자 세그먼트 및 적어도 하나의 J 유전자 세그먼트, 또는 적어도 하나의 JL 유전자 세그먼트의 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 자리로의 삽입을 포함한다. 특정 구체예에서, 종은 사람이다. 한 구체예에서, 유전적 변형은 전체적으로 또는 부분적으로 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 자리의 삭제를 포함하며, 결실은 내인성 ADAM6 기능의 손실을 발생시킨다. 특정 구체예에서, 내인성 ADAM6 기능의 손실은 수컷 마우스의 생식능력의 감소와 연관된다. 한 구체예에서, 유전적 변형은 전체적으로 또는 부분적으로 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 자리의 불활성화를 포함하며, 결실은 내인성 ADAM6 기능의 손실을 발생시키지 않는다. 불활성화는 내인성 유전자 세그먼트를 포함하는 항체의 중쇄를 암호화하도록 실질적으로 재배열될 수 없는 내인성 면역글로불린 중쇄 자리를 발생시키는 하나 이상의 내인성 유전자 세그먼트의 대체 또는 결실을 포함할 수도 있다. 불활성화는 내인성 면역글로불린 중쇄 자리가 항체의 중쇄를 암호화하도록 재배열할 수 없게 하는 다른 변형을 포함할 수도 있으며, 변형은 내인성 유전자 세그먼트의 대체 또는 결실을 포함하지 않는다. 예시적 변형은 염색체 역위 및/또는 하나 이상의 내인성 불변 영역과 작동 가능하게 결합되지 않는 중쇄 자리를 발생시키는 대안을 포함한다.
한 구체예에서, 유전적 변형은 마우스의 게놈으로 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트, 하나 이상의 J 유전자 세그먼트, 및 하나 이상의 불변 영역 서열 (예를 들어, IgM 및/또는 IgG 유전자)에 작동 가능하게 결합된 또 다른 종 (예를 들어, 비-마우스 종) 중 선택적으로 하나 이상의 D 유전자 세그먼트를 함유하는 DNA 단편을 삽입하는 것을 포함한다. 다양한 구체예에서, J 유전자 세그먼트는 JH 또는 Jλ 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, DNA 단편은 항체의 중쇄를 암호화하는 서열을 형성하도록 재배열을 겪을 수 있으며, 중쇄는 중쇄 불변 영역에 융합된 재배열된 사람 경쇄 가변 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 유전적 변형은 적어도 6개, 적어도 16개, 적어도 30개, 또는 적어도 40개 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트, 및 적어도 하나 또는 적어도 5개의 사람 Jλ 유전자 세그먼트의 마우스 게놈으로의 삽입을 포함한다. 특정 구체예에서, 종은 사람이고 유전자 세그먼트는 사람 κ 경쇄 유전자 세그먼트이다. 한 구체예에서, 유전적 변형은 내인성 면역글로불린 중쇄 자리를 비기능적이게 하기 위해 전체적으로 또는 부분적으로 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 자리의 결실을 포함하며, 결실은 내인성 ADAM6 기능의 손실을 더 발생시킨다. 특정 구체예에서, 내인성 ADAM6 기능의 손실은 수컷 마우스의 생식능력의 감소와 연관된다.
한 양태에서, 변형을 갖는 수컷 마우스가 감소된 생식능력 (예를 들어, 교배에 의해 자손을 생성하는 매우 감소된 능력)을 나타내거나, 내인성 ADAM6 기능의 감소 또는 제거로 인해, 근본적으로 생식 불가능한, 내인성 ADAM6 대립유전자로부터 마우스 ADAM6 발현을 감소시키거나 제거하는 변형을 포함하는 마우스가 제공되며, 마우스는 이소성 ADAM6 서열 또는 상동체 또는 오솔로그 또는 이들의 기능적 단편을 더 포함한다. 한 양태에서, 마우스 ADAM6 발현을 감소시키거나 제거하는 변형은 마우스 면역글로불린 자리의 변형 (예를 들어, 삽입, 결실, 대체, 등)이다. 한 구체예에서, 면역글로불린 자리는 면역글로불린 중쇄 자리이다.
한 구체예에서, ADAM6 기능의 감소 또는 손실은 마우스 자궁에서 마우스 난관을 통해 이동하여 마우스 난자를 수정시킬 수 있는 정자를 생산할 수 없는 마우스의 능력 또는 실질적인 능력을 포함한다. 특정 구체예에서, 마우스의 사정액량(ejaculate volume)에서 생산된 정자 세포 중 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%는 교미 후 생체 내에서 난관을 통과할 수 없고 마우스 난자를 수정시킬 수 없다.
한 구체예에서, ADAM6 기능의 감소 또는 손실은 마우스의 정자 세포의 표면상에서 ADAM2 및/또는 ADAM3 및/또는 ADAM6의 복합체를 형성할 수 없는 능력 또는 실질적으로 형성할 수 없는 능력을 포함한다. 한 구체예에서, ADAM6 기능의 손실은 암컷 마우스와의 교미에 의해 마우스 난자를 수정시킬 수 없는 실질적인 능력을 포함한다.
한 양태에서, 기능적 내인성 ADAM6 유전자가 결핍된 마우스가 제공되며, 마우스에서 ADAM6 기능성을 부여하는 단백질 (또는 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오티드 서열)을 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 수컷 마우스이고 기능성은 기능적 내인성 ADAM6 유전자가 결핍된 마우스에 비해 향상된 생식능력을 포함한다.
한 구체예에서, 단백질은 마우스의 생식세포 계열에서 면역글로불린 자리 내에 위치한 게놈 서열에 의해 암호화된다. 특정 구체예에서, 면역글로불린 자리는 중쇄 자리이다. 또 다른 특정 구체예에서, 중쇄 자리는 적어도 하나의 사람 VH, 적어도 하나의 사람 DH 및 적어도 하나의 사람 JH 유전자 세그먼트를 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 중쇄 자리는 적어도 하나의 사람 VL 및 적어도 하나의 사람 JL 유전자 세그먼트를 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 중쇄 자리는 적어도 하나의 사람 VL, 적어도 하나의 사람 DH, 및 적어도 하나의 사람 JL을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 중쇄 자리는 적어도 하나의 사람 VL, 적어도 하나의 사람 DH, 및 적어도 하나의 사람 JH 유전자 세그먼트를 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 중쇄 자리는 적어도 하나의 사람 VL 및 적어도 하나의 사람 JL 유전자 세그먼트를 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 중쇄 자리는 적어도 하나의 사람 VL 및 적어도 하나의 사람 JH 유전자 세그먼트를 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 중쇄 자리는 여섯 개의 사람 Vκ 및 다섯 개의 사람 Jκ 유전자 세그먼트를 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 중쇄 자리는 16개의 사람 Vκ 및 다섯 개의 사람 Jκ 유전자 세그먼트를 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 중쇄 자리는 30개의 사람 Vκ 및 다섯 개의 사람 Jκ 유전자 세그먼트를 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 중쇄 자리는 40개의 사람 Vκ 및 다섯 개의 사람 Jκ 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 구체예에서, 이소성 단백질은 마우스의 생식세포 계열의 비-면역글로불린 자리 내에 위치한 게놈 서열에 의해 암호화된다. 한 구체예에서, 비-면역글로불린 자리는 전사적으로 활성인 자리이다. 특정 구체예에서, 전사적으로 활성인 자리는 ROSA 자리이다. 특정 구체예에서, 전사적으로 활성인 자리는 조직-특이적 발현과 연관된다. 한 구체예에서, 조직-특이적 발현은 생식 조직에 존재한다. 한 구체예에서, 단백질은 마우스의 생식세포 계열에 무작위로 삽입된 게놈 서열에 의해 암호화된다.
한 구체예에서, 마우스는 사람 또는 키메라 사람/마우스 또는 키메라 사람/래트 경쇄 (예를 들어, 사람 가변 마우스 또는 래트 불변) 및 키메라 사람 가변/마우스 또는 래트 불변 중쇄를 포함한다. 특정 구체예에서, 마우스는 전사적으로 활성인 프로모터, 예를 들어, ROSA26 프로모터에 작동 가능하게 결합된 키메라 사람 가변/래트 또는 마우스 불변 경쇄 유전자를 포함하는 이식 유전자를 포함한다. 추가의 특정 구체예에서, 키메라 사람/마우스 또는 래트 경쇄 이식 유전자는 마우스의 생식세포 계열에서 재배열된 사람 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 이소성 뉴클레오티드 서열은 마우스의 생식세포 계열에서 면역글로불린 자리 내에 위치한다. 특정 구체예에서, 면역글로불린 자리는 중쇄 자리이다. 한 구체예에서, 중쇄 자리는 적어도 하나의 사람 VL 및 적어도 하나의 사람 JL 유전자 세그먼트를 포함한다. 특정 구체예에서, 중쇄 자리는 적어도 여섯개 및 최대 40개의 사람 Vκ 유전자 세그먼트, 및 다섯 개의 사람 Jκ 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 이소성 뉴클레오티드 서열은 마우스의 생식세포 계열에서 비-면역글로불린 자리 내에 위치한다. 한 구체예에서, 비-면역글로불린 자리는 전사적으로 활성인 자리이다. 특정 구체예에서, 전사적으로 활성인 자리는 ROSA26 자리이다. 한 구체예에서, 이소성 뉴클레오티드 서열은 마우스의 생식세포 계열로 무작위로 삽입되어 위치한다.
한 양태에서, 기능적 내인성 ADAM6 유전자가 결핍된 마우스가 제공되며, 마우스는 마우스 ADAM6 기능의 손실을 보충하는 이소성 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 이소성 뉴클레오티드 서열은 마우스에게 기능적 내인성 ADAM6 유전자를 함유하는 해당 야생형 마우스와 비슷한 자손을 생산하는 능력을 부여한다. 한 구체예에서, 서열은 마우스에게 마우스의 정자 세포의 표면 상에서 ADAM2 및/또는 ADAM3 및/또는 ADAM6의 복합체를 형성하는 능력을 부여한다. 한 구체예에서, 서열은 마우스에게 마우스 자궁에서 마우스 난관을 통해 이동하여 난자를 수정시킬 수 있는 능력을 부여한다.
한 구체예에서, 기능적 내인성 ADAM6 유전자가 결핍되고 이소성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 마우스는 한 배 새끼 수 중 적어도 약 50%, 60%, 70%, 80%, 또는 90%를 생산하고 같은 나이 및 종족의 야생형 마우스는 6개월 기간에 생산한다.
한 구체예에서, 내인성 ADAM6 유전자가 결핍되고 이소성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 마우스는 6개월 동안 사육될 때 기능적 내인성 ADAM6 유전자가 결핍되고 이소성 뉴클레오티드 서열이 결핍되고 실질적으로 같은 기간 동안 및 실질적으로 같은 조건 하에 사육된 같은 나이 및 같거나 유사한 종족의 마우스보다 적어도 약 1.5배, 약 2배, 약 2.5배, 약 3배, 약 4배, 약 6배, 약 7배, 약 8배, 또는 약 10배 이상의 자손을 생산한다.
한 구체예에서, 내인성 ADAM6 유전자가 결핍되고 이소성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 마우스는 기능적 내인성 ADAM6 유전자가 결핍되고 이소성 뉴클레오티드 서열이 결핍되고, 같은 기간 동안 사육된 마우스보다 4 또는 6개월 사육 기간에 한 배 새끼 당 적어도 평균 약 2배, 3배, 또는 4배 더 많은 수의 새끼들을 생산한다.
한 구체예에서, 내인성 ADAM6 유전자가 결핍되고 이소성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 마우스는 수컷 마우스이고, 수컷 마우스는 기능적 내인성 ADAM6 유전자가 결핍되고 이소성 뉴클레오티드 서열이 결핍된 마우스보다 교미 후 약 5-6 시간에 난관으로부터 회수될 때 적어도 10배, 적어도 20배, 적어도 30배, 적어도 40배, 적어도 50배, 적어도 60배, 적어도 70배, 적어도 80배, 적어도 90배, 100배, 10배, 또는 120배 더 높은 난관 이동을 반영하는 정자를 생한한다.
한 구체예에서, 내인성 ADAM6 유전자가 결핍되고 이소성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 마우스는 암컷 마우스와 교미할 때 6시간 내에 야생형 마우스의 정자와 거의 똑같은 효율로 자궁을 통과하여 난관에 들어가고 통과할 수 있는 정자를 발생시킨다.
한 구체예에서, 내인성 ADAM6 유전자가 결핍되고 이소성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 마우스는 비슷한 기간에 기능적 ADAM6 유전자가 결핍되고 이소성 뉴클레오티드 서열이 결핍된 마우스보다 약 1.5배, 약 2배, 약 3배, 또는 약 4배 이상의 한 배 새끼를 생산한다.
한 양태에서, 생식세포 계열에서 면역글로불린 단백질을 암호화하는 비-마우스 핵산 서열을 포함하는 마우스가 제공되며, 비-마우스 면역글로불린 서열은 마우스 ADAM6 유전자 또는 상동체 또는 오솔로그 또는 이들의 기능적 단편의 삽입을 포함한다. 한 구체예에서, 비-마우스 면역글로불린 서열은 사람 면역글로불린 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 서열은 사람 면역글로불린 중쇄 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 서열은 사람 면역글로불린 경쇄 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 서열은 사람 경쇄 서열과 인접한 사람 중쇄 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 서열은 하나 이상의 V 유전자 세그먼트, 하나 이상의 D 유전자 세그먼트, 및 하나 이상의 J 유전자 세그먼트를 포함한다; 한 구체예에서, 서열은 하나 이상의 V 유전자 세그먼트 및 하나 이상의 J 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 하나 이상의 V, D, 및 J 유전자 세그먼트, 또는 하나 이상의 V 및 J 유전자 세그먼트는 재배열되지 않는다. 한 구체예에서, 하나 이상의 V, D, 및 J 유전자 세그먼트, 또는 하나 이상의 V 및 J 유전자 세그먼트가 재배열된다. 한 구체예에서, 하나 이상의 V, D, 및 J 유전자 세그먼트, 또는 하나 이상의 V 및 J 유전자 세그먼트의 재배열 후, 마우스는 게놈에서 마우스 ADAM6 유전자 또는 상동체 또는 오솔로그 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 재배열 후 마우스는 게놈에서 마우스 ADAM6 유전자 또는 상동체 또는 오솔로그 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하는 적어도 두 개의 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 재배열 후 마우스는 그것의 게놈에서 마우스 ADAM6 유전자 또는 상동체 또는 오솔로그 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하는 적어도 하나의 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 B 세포에서 ADAM6 유전자 또는 상동체 또는 오솔로그 또는 이들의 기능적 단편을 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 비-B 세포에서 ADAM6 유전자 또는 상동체 또는 오솔로그 또는 이들의 기능적 단편을 포함한다.
한 양태에서, 내인성 면역글로불린 중쇄 자리로부터 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 또는 이들의 기능적 단편을 발현하는 마우스가 제공되며, 마우스는 수컷 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성을 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 자리는 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트 및 하나 이상의 JL 유전자 세그먼트, 및 선택적으로 하나 이상의 DH 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 자리는 적어도 여섯 개의 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 다섯 개의 사람 Jκ 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 자리는 적어도 16개의 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 다섯 개의 사람 Jκ 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 자리는 적어도 30개의 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 다섯 개의 사람 Jκ 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 자리는 적어도 40개의 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 다섯 개의 사람 Jκ 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 양태에서, 내인성 면역글로불린 중쇄 자리로부터 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 또는 이들의 기능적 단편을 발현하는 마우스가 제공되며, 마우스는 수컷 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성을 포함한다.
한 구체예에서, 수컷 마우스는 내인성 ADAM6 자리에서 단일 변형되지 않은 내인성 ADAM6 대립유전자 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편을 포함한다.
한 구체예에서, 수컷 마우스는 ADAM6 기능을 부여하는 단백질을 암호화하는 이소성 마우스 ADAM6 서열 또는 상동체 또는 오솔로그 또는 이들의 기능적 단편을 포함한다.
한 구체예에서, 수컷 마우스는 내인성 ADAM6 대립 유전자의 위치에 근접한 마우스 게놈에서 위치, 예를 들어, 최종 V 유전자 세그먼트 서열의 3' 및 처음 J 유전자 세그먼트의 5'에서 ADAM6 서열 또는 상동체 또는 오솔로그 또는 이들의 기능적 단편을 포함한다.
한 구체예에서, 수컷 마우스는 내인성 ADAM6 대립 유전자와 다른 마우스 게놈의 위치, 예를 들어, V 유전자 자리의 가장-5' V 유전자 세그먼트 서열의 5'에서 ADAM6 서열 또는 상동체 또는 오솔로그 또는 이들의 기능적 단편을 포함한다.
한 구체예에서, 수컷 마우스는 면역글로불린 V 유전자 세그먼트 및/또는 면역글로불린 J 유전자 세그먼트를 암호화하는 핵산 서열의, 업스트림, 다운스트림, 또는 업스트림 및 다운스트림 (ADAM6 서열의 전사의 방향에 관하여)에 플랭킹된(flanked) ADAM6 서열 또는 상동체 또는 오솔로그 또는 이들의 기능적 단편을 포함한다. 특정 구체예에서, 면역글로불린 V 및 J 유전자 세그먼트는 사람 유전자 세그먼트이다. 한 구체예에서, 마우스에서 면역글로불린 V 및 J 유전자 세그먼트는 사람 유전자 세그먼트, 및 마우스 ADAM6 또는 오솔로그 또는 상동체 또는 이들의 단편 기능적을 암호화하는 서열은 사람 V 및 J 유전자 세그먼트 사이에 있다; 한 구체예에서, 마우스는 둘 이상의 사람 V 유전자 세그먼트를 포함하고, 서열은 가장-5' 사람 V 유전자 세그먼트의 5'인 위치에 있다; 한 구체예에서, 마우스는 둘 이상의 사람 V 유전자 세그먼트를 포함하고, 서열은 최종 V 유전자 세그먼트 및 끝에서 두 번째의 V 유전자 세그먼트 사이의 위치에 있다; 한 구체예에서, 마우스는 복수의 사람 V 유전자 세그먼트를 포함하고, 서열은 가장-5' 사람 V 유전자 세그먼트의 업스트림인 위치에 있다; 한 구체예에서, 마우스는 D 유전자 세그먼트를 더 포함하고, 서열은 가장-3' V 유전자 세그먼트 및 가장-5' D 유전자 세그먼트 이후의 위치에 있다; 한 구체예에서, 서열은 V 유전자 세그먼트 및 J 유전자 세그먼트 사이의 위치에 있다.
한 구체예에서, 사람 V 유전자 세그먼트는 경쇄 V 유전자 세그먼트이다. 특정 구체예에서, 경쇄 V 유전자 세그먼트는 Vκ 유전자 세그먼트이다. 또 다른 특정 구체예에서, 경쇄 V 유전자 세그먼트는 V 유전자 세그먼트이다. 한 구체예에서, J 유전자 세그먼트는 JH 및 JL 유전자 세그먼트로부터 선택된다. 특정 구체예에서, JL 유전자 세그먼트는 Jκ 유전자 세그먼트이다. 또 다른 특정 구체예에서, JL 유전자 세그먼트는 Jλ 유전자 세그먼트이다.
한 구체예에서, 수컷 마우스는 야생형 수컷 마우스에서와 같은 또는 실질적으로 같은 내인성 면역글로불린 자리에서의 위치에 자리하는 ADAM6 서열 또는 상동체 또는 오솔로그 또는 이들의 기능적 단편을 포함한다. 특정 구체예에서, 내인성 자리는 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화할 수 없으며, 가변 영역은 내인성 비-사람 유전자 세그먼트를 포함하거나 이로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 내인성 자리는 자리의 중쇄 유전자 세그먼트가 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화할 수 없게 하는 수컷 마우스의 게놈에서의 자리에 위치한다. 다양한 구체예에서, 수컷 마우스는 사람 면역글로불린 유전자 세그먼트와 같은 염색체 상에 자리한 ADAM6 서열을 포함하고 ADAM6 서열은 기능적 ADAM6 단백질을 암호화한다.
한 양태에서, 생식세포 계열에서, 비기능적 내인성 ADAM6 유전자, 또는 내인성 ADAM6 유전자의 결실을 포함하는 수컷 마우스가 제공되며; 마우스의 정자 세포는 암컷 마우스의 난관을 통과하고 난자를 수정시킬 수 있다. 한 구체예에서, 마우스는 마우스 ADAM6 유전자 또는 오솔로그 또는 상동체 또는 수컷 마우스에서 기능적인 이들의 기능적 단편의 염색체 외 카피를 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 이소성 마우스 ADAM6 유전자 또는 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 수컷 마우스에서 기능적인 이들의 단편을 포함한다.
한 양태에서, 기능적 내인성 ADAM6 유전자 및 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에 대한 변형을 포함하는 수컷 마우스가 제공된다. 한 구체예에서, 내인성 ADAM6 유전자 또는 자리의 다운스트림, 또는 3'에서 변형이 만들어진다. 한 구체예에서, 변형은 하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자 세그먼트의 하나 이상의 사람 면역글로불린 경쇄 유전자 세그먼트로의 대체이다. 한 구체예에서, 변형은 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자의 업스트림에서 하나 이상의 사람 면역글로불린 경쇄 유전자 세그먼트의 삽입이다.
한 양태에서, 내인성 ADAM6 기능을 감소시키는 유전적 변형을 포함하는 마우스가 제공되며, 마우스는 전체적으로 또는 부분적으로 기능적인 내인성 변형되지 않은 대립 유전자 (예를 들어, 이형 접합체)에 의해, 또는 ADAM6 또는 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 수컷 마우스에서 기능적인 이들의 단편을 암호화하는 이소성 서열의 발현에 의해 제공된 적어도 일부의 ADAM6 기능성을 포함한다. 다양한 구체예에서, ADAM6 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2에서 제시된 ADAM6 단백질, 또는 이들의 조합을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 기능적 ADAM6이 결핍된 수컷 마우스와 비교하여, 수컷 마우스에게 교미에 의해 자손을 생성할 수 있는 능력을 부여하기에 충분한 ADAM6 기능을 포함한다. 한 구체예에서, ADAM6 기능은 마우스 ADAM6 또는 상동체 또는 오솔로그 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하는 이소성 뉴클레오티드 서열의 존재에 의해 부여된다. 한 구체예에서, ADAM6 기능은 내인성 면역글로불린 자리에 존재하는 내인성 ADAM6 유전자에 의해 부여되며, 마우스는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자 세그먼트를 포함하는 항체를 발현할 수 없다. ADAM6 상동체 또는 오솔로그 또는 수컷 마우스에서 기능적인 이들의 단편은 충분한 내인성 ADAM6 활성이 결핍된 수컷 마우스에서 관찰된, 자손을 생성하는 능력의 손실, 예를 들어, ADAM6 넉아웃(knockout) 마우스에서 관찰된 능력의 손실을, 전체적으로 또는 부분적으로, 회복시키는 것들을 포함한다. 이런 의미에서 ADAM6 넉아웃 마우스는 내인성 자리 또는 이들의 단편을 포함하지만, 기능적이지 않은, 즉, ADAM6 (ADAM6a 및/또는 ADAM6b)을 전혀 발현하지 않거나, ADAM6 (ADAM6a 및/또는 ADAM6b)을 야생형 수컷 마우스의 자손을 생성하는 근본적으로 정상적인 능력을 지지하는데 불충분한 수준으로 발현하는 마우스를 포함한다. 기능의 손실은, 예를 들어, 자리의 구조 유전자 (즉, ADAM6a 또는 ADAM6b 암호화 영역) 또는 자리의 조절 영역 (예를 들어, ADAM6a 유전자에 대한 5', 또는 ADAM6a 또는 ADAM6b 암호화 영역의 3'의 서열로서, 여기에서 서열은 ADAM6 유전자의 전사, ADAM6 RNA의 발현, 또는 ADAM6 단백질의 발현을, 전체적으로 또는 부분적으로, 제어함)의 변형으로 인한 것이다. 다양한 구체예에서, 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 수컷 마우스에서 기능적인 단편은 수컷 마우스의 정자 (또는 수컷 마우스의 사정시 대부분의 정자 세포)가 마우스 난관을 통과하며 마우스 난자를 수정시킬 수 있게 하는 것들이다.
한 구체예에서, 사람 면역글로불린 가변 영역 또는 이들의 기능적 단편을 발현하는 수컷 마우스는 수컷 마우스에게 암컷 마우스와의 교미에 의해 자손을 생성할 수 있는 능력을 부여하는데 충분한 ADAM6 활성을 포함하고, 한 구체예에서, 수컷 마우스는 암컷 마우스와 교미할 때, 한 구체예에서 적어도 25%, 한 구체예에서, 적어도 30%, 한 구체예에서 적어도 40%, 한 구체예에서 적어도 50%, 한 구체예에서 적어도 60%, 한 구체예에서 적어도 70%, 한 구체예에서 적어도 80%, 한 구체예에서 적어도 90%, 및 한 구체예에서는 하나 또는 두 개의 내인성 변형되지 않은 ADAM6 대립 유전자를 갖는 마우스의 그것과 거의 같은, 자손을 생산할 수 있는 능력을 나타낸다.
한 구체예에서 수컷 마우스는 수컷 마우스의 정자 세포가 마우스 난관을 통과하고 마우스 난자를 수정시킬 수 있게 하는데 충분한 ADAM6 (또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편)을 발현한다.
한 구체예에서, ADAM6 기능성은 마우스 염색체 서열과 인접한 핵산 서열에 의해 부여된다 (예를 들어, 핵산은, 예를 들어, 부위-특이적 리콤비나제-매개된 (예를 들어, Cre-매개됨) 삽입 또는 상동 재조합에 의해 마우스 염색체로 무작위로 통합되거나; 특정 자리에 배치됨). 한 구체예에서, ADAM6 서열은 마우스의 염색체와는 다른 핵산 상에 존재한다 (예를 들어, ADAM6 서열은 에피솜 위에, 즉, 염색체 외부에, 예를 들어, 발현 구조, 벡터, AYAC, 트랜스염색체, 등에 존재함).
한 양태에서, 내인성 중쇄 면역글로불린 자리의 변형을 포함하는, 유전적으로 변형된 마우스 및 세포가 제공되며, 마우스는 적어도 면역글로불린 경쇄 서열의 일부, 예를 들어, 적어도 사람 서열의 일부를 발현하고, 마우스는 수컷 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성을 포함한다. 한 구체예에서, 변형은 마우스의 ADAM6 활성을 감소시키거나 근절시킨다. 한 구체예에서, 마우스는 ADAM6 활성을 암호화하는 대립 유전자가 없거나 수컷 마우스에서 정상적인 교미를 지지하기 위해 실질적으로 기능하지 않는 ADAM6을 발현하도록 변형된다. 한 구체예에서, 마우스는 마우스 ADAM6 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편을 암호화하는 이소성 핵산 서열을 더 포함한다. 한 구체예에서, 변형은 마우스의 ADAM6 활성을 유지하고 내인성 면역글로불린 중쇄 자리가 항체의 중쇄를 암호화할 수 없게 한다. 특정 구체예에서, 변형은 내인성 면역글로불린 중쇄 자리가 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화하도록 재배열될 수 없게 하는 염색체 역위 및 전좌를 포함한다.
한 양태에서, 내인성 면역글로불린 중쇄 자리의 변형을 포함하는, 유전적으로 변형된 마우스 및 세포가 제공되며, 변형은 자리의 ADAM6 서열로부터 발현된 ADAM6 활성을 감소시키거나 제거하고, 마우스는 ADAM6 단백질 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편을 포함한다. 다양한 구체예에서, ADAM6 단백질 또는 이들의 단편은 이소성 ADAM6 서열에 의해 암호화된다. 다양한 구체예에서, ADAM6 단백질 또는 이들의 단편은 내인성 ADAM6 대립 유전자로부터 발현된다. 다양한 구체예에서, 마우스는 제1 중쇄 대립 유전자의 기능적 ADAM6의 발현을 감소시키거나 제거하는 제1 변형을 포함하는 제1 중쇄 대립 유전자를 포함하고, 마우스는 제2 중쇄 대립 유전자의 기능적 ADAM6의 발현을 실질적으로 감소시키지 않거나 제거하지 않는 제2 변형을 포함하는 제2 중쇄 대립 유전자를 포함한다.
다양한 구체예에서, 변형은 내인성 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자의 업스트림, 또는 5'에서 하나 이상의 사람 면역글로불린 경쇄 유전자 세그먼트의 삽입이다. 다양한 구체예에서, 변형은 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에 자리한 내인성 ADAM6 유전자를 유지한다.
한 구체예에서, 제2 변형은 최종 마우스 V 유전자 세그먼트의 3' (마우스 V 유전자 세그먼트의 전사 방향성에 관하여)에 자리하고 마우스 (또는 키메라 사람/마우스) 면역글로불린 중쇄 불변 유전자 또는 이들의 단편 (예를 들어, 사람 및/또는 마우스: CH1 및/또는 힌지(hinge) 및/또는 CH2 및/또는 CH3을 암호화하는 핵산 서열)의 5' (불변 서열의 방향성에 관하여)에 자리한다.
한 구체예에서, 변형은 제1 ADAM6 대립 유전자를 암호화하는 제1 자리에서 제1 면역글로불린 중쇄 대립 유전자에서 일어나고, ADAM6 기능은 기능적 ADAM6을 암호화하는 제2 자리에서 제2 면역글로불린 중쇄 대립 유전자에서 내인성 ADAM6의 발현으로부터 발생하며, 제2 면역글로불린 중쇄 대립 유전자는 V, D, 및/또는 J 유전자 세그먼트의 적어도 하나의 변형을 포함한다. 특정 구체예에서, V, D, 및/또는 J 유전자 세그먼트의 적어도 하나의 변형은 결실, 사람 V, D, 및/또는 J 유전자 세그먼트로의 대체, 낙타 V, D, 및/또는 J 유전자 세그먼트로의 대체, 사람화된 또는 낙타화된 V, D, 및/또는 J 유전자 세그먼트로의 대체, 중쇄 서열의 경쇄 서열로의 대체 및 이들의 조합이다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 변형은 중쇄 자리에서 하나 이상의 중쇄 V, D, 및/또는 J 유전자 세그먼트의 결실 및 하나 이상의 경쇄 V 및/또는 J 유전자 세그먼트 (예를 들어, 사람 경쇄 V 및/또는 J 유전자 세그먼트)로의 대체이다.
한 구체예에서, 변형은 제1 자리에서 제1 면역글로불린 중쇄 대립 유전자 및 제2 자리에서 제2 면역글로불린 중쇄 대립 유전자에서 일어나고, ADAM6 기능은 마우스의 생식세포 계열의 비-면역글로불린 자리에서 이소성 ADAM6의 발현으로부터 발생한다. 특정 구체예에서, 비-면역글로불린 자리는 ROSA26 자리이다. 특정 구체예에서, 비-면역글로불린 자리는 생식 조직에서 전사적으로 활성이다.
한 구체예에서, 변형은 제1 자리에서 제1 면역글로불린 중쇄 대립 유전자 및 제2 자리에서 제2 면역글로불린 중쇄 대립 유전자에서 일어나고, ADAM6 기능은 마우스의 생식세포 계열의 내인성 ADAM6 유전자로부터 발생한다. 특정 구체예에서, 내인성 ADAM6 유전자는 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자 세그먼트에 의해 병치된다.
한 구체예에서, 변형은 제1 자리에서 제1 면역글로불린 중쇄 대립 유전자 및 제2 자리에서 제2 면역글로불린 중쇄 대립 유전자에서 일어나고, ADAM6 기능은 제1 면역글로불린 중쇄 대립 유전자에서 이소성 ADAM6 서열의 발현으로부터 발생한다. 한 구체예에서, 변형은 제1 자리에서 제1 면역글로불린 중쇄 대립 유전자 및 제2 자리에서 제2 면역글로불린 중쇄 대립 유전자에서 일어나고, ADAM6 기능 또는 활성은 제2 면역글로불린 중쇄 대립 유전자에서 이소성 ADAM6의 발현으로부터 발생한다.
한 양태에서, ADAM6의 이형 접합체 또는 동형 접합체 넉아웃을 포함하는 마우스가 제공된다. 한 구체예에서, 마우스는 사람 또는 사람화된 면역글로불린 서열, 또는 낙타 또는 낙타화된 사람 또는 마우스 면역글로불린 서열인 변형된 면역글로불린 서열을 더 포함한다. 한 구체예에서, 변형된 면역글로불린 서열은 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에 존재한다. 한 구체예에서, 변형된 면역글로불린 서열은 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에서 사람 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 사람 경쇄 가변 영역 서열은 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에서 내인성 중쇄 가변 서열을 대체한다. 한 구체예에서, 변형된 면역글로불린 서열은 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에서 사람 κ 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 변형된 면역글로불린 서열은 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에서 사람 λ 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다.
한 양태에서, 내인성 ADAM6 자리로부터 기능적 내인성 ADAM6을 발현할 수 없는 마우스가 제공된다. 한 구체예에서, 마우스는 ADAM6, 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하고, 마우스에서 기능적인 이소성 핵산 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 이소성 핵산 서열은 ADAM6 넉아웃에 대하여 상동 접합체인 수컷 마우스에 의해 나타난 자손을 생성할 능력의 손실을 구조하는 단백질을 암호화한다. 특정 구체예에서, 이소성 핵산 서열은 마우스 ADAM6 단백질을 암호화한다.
한 양태에서, 기능적 내인성 ADAM6 자리가 결핍되고, 마우스에게 ADAM6 기능을 부여하는 이소성 핵산 서열을 포함하는 마우스가 제공된다. 한 구체예에서, 핵산 서열은 내인성 ADAM6 서열 또는 이들의 기능적 단편을 포함한다. 한 구체예에서, 내인성 ADAM6 서열은 야생형 마우스에서 가장-3' 마우스 면역글로불린 중쇄 V 유전자 세그먼트 (VH) 및 가장-5' 마우스 면역글로불린 중쇄 D 유전자 세그먼트 (DH) 사이에 자리하는 ADAM6a-및 ADAM6b-암호화 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 핵산 서열은 마우스 ADAM6a 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하는 서열 및/또는 마우스 ADAM6b 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하는 서열을 포함하며, ADAM6a 및/또는 ADAM6b 또는 이들의 기능적 단편(들)은 프로모터에 작동 가능하게 결합된다. 한 구체예에서, 프로모터는 사람 프로모터이다. 한 구체예에서, 프로모터는 마우스 ADAM6 프로모터이다. 특정 구체예에서, ADAM6 프로모터는 마우스 가장-5' DH 유전자 세그먼트에 가장 가까운 제1 ADAM6 유전자의 제1 코돈 및 가장-5' DH 유전자 세그먼트의 재조합 신호 서열 사이에 자리한 서열을 포함하며, 5'은 마우스 면역글로불린 유전자의 전사의 방향에 관하여 표시된다. 한 구체예에서, 프로모터는 바이러스 프로모터이다. 특정 구체예에서, 바이러스 프로모터는 시토메갈로바이러스 (cytomegalovirus; CMV) 프로모터. 한 구체예에서, 프로모터는 유비퀴틴 프로모터이다.
한 구체예에서, 프로모터는 유발성 프로모터이다. 한 구체예에서, 유발성 프로모터는 비-생식 조직에서 발현을 조절한다. 한 구체예에서, 유발성 프로모터는 생식 조직에서 발현을 조절한다. 특정 구체예에서, 마우스 ADAM6a 및/또는 ADAM6b 서열 또는 이들의 기능적 단편(들)의 발현은 생식 조직에서 유발성 프로모터에 의해 발전적으로 조절된다.
한 구체예에서, 마우스 ADAM6a 및/또는 ADAM6b는 SEQ ID NO: 1의 ADAM6a 및/또는 서열 SEQ ID NO: 2의 ADAM6b로부터 선택된다.
한 구체예에서, 마우스 ADAM6 프로모터는 SEQ ID NO: 3의 프로모터이다. 특정 구체예에서, 마우스 ADAM6 프로모터는 ADAM6a의 제1 코돈의 바로 업스트림 (ADAM6a의 전사의 방향에 관하여)에서 SEQ ID NO: 3의 핵산 서열 및 ADAM6 암호화 영역의 업스트림에서 SEQ ID NO: 3의 끝으로 연장된 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, ADAM6 프로모터는 ADAM6a의 시작 코돈의 업스트림의 약 5 내지 약 20개 이내의 뉴클레오티드에서 ADAM6a의 시작 코돈의 업스트림의 약 0.5kb, 1kb, 2kb, 또는 3kb 이상으로 연장되는 단편이다.
한 구체예에서, 핵산 서열은 생식이 불가능하거나 ADAM6의 결핍으로 인해 낮은 생식능력을 갖는 마우스에 배치될 때 생식능력을 개선하거나 생식능력을 거의 야생형 생식능력으로 회복시키는 SEQ ID NO: 3 또는 이들의 단편을 포함한다. 한 구체예에서, SEQ ID NO: 3 또는 이들의 단편은 수컷 마우스에게 마우스 난자를 수정시키기 위해 암컷 마우스 난관을 이동할 수 있는 정자 세포를 생산할 수 있는 능력을 부여한다.
한 구체예에서, 마우스 ADAM6 프로모터는 SEQ ID NO: 4의 프로모터이다. 특정 구체예에서, 마우스 ADAM6 프로모터는 마우스 ADAM6 프로모터는 ADAM6a의 제1 코돈의 바로 업스트림 (ADAM6a의 전사의 방향에 관하여)에서 SEQ ID NO: 4의 핵산 서열 및 ADAM6 암호화 영역의 업스트림에서 SEQ ID NO: 4의 끝으로 연장된 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, ADAM6 프로모터는 ADAM6a의 시작 코돈의 업스트림의 약 5 내지 약 20개의 뉴클레오티드에서 ADAM6a의 시작 코돈의 업스트림의 약 0.5kb, 1kb, 2kb, 또는 3kb 이상으로 연장되는 단편이다.
한 구체예에서, 핵산 서열은 생식이 불가능하거나 ADAM6의 결핍으로 인해 낮은 생식능력을 갖는 마우스에 배치될 때 생식능력을 개선하거나 생식능력을 거의 야생형 생식능력으로 회복시키는 SEQ ID NO: 4 또는 이들의 단편을 포함한다. 한 구체예에서, SEQ ID NO: 4 또는 이들의 단편은 수컷 마우스에게 마우스 난자를 수정시키기 위해 암컷 마우스 난관을 이동할 수 있는 정자 세포를 생산할 수 있는 능력을 부여한다.
한 구체예에서, 마우스 ADAM6 프로모터는 SEQ ID NO: 5의 프로모터이다. 특정 구체예에서, 마우스 ADAM6 프로모터는 마우스 ADAM6 프로모터는 ADAM6a의 제1 코돈의 바로 업스트림 (ADAM6a의 전사의 방향에 관하여)에서 SEQ ID NO: 5의 핵산 서열 및 ADAM6 암호화 영역의 업스트림에서 SEQ ID NO: 5의 끝으로 연장된 핵산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, ADAM6 프로모터는 ADAM6a의 시작 코돈의 업스트림의 약 5 내지 약 20개의 뉴클레오티드에서 ADAM6a의 시작 코돈의 업스트림의 약 0.5kb, 1kb, 2kb, 또는 3kb 이상으로 연장되는 단편이다.
한 구체예에서, 핵산 서열은 생식이 불가능하거나 ADAM6의 결핍으로 인해 낮은 생식능력을 갖는 마우스에 배치될 때 생식능력을 개선하거나 생식능력을 거의 야생형 생식능력으로 회복시키는 SEQ ID NO: 5 또는 이들의 단편을 포함한다. 한 구체예에서, SEQ ID NO: 5 또는 이들의 단편은 수컷 마우스에게 마우스 난자를 수정시키기 위해 암컷 마우스 난관을 이동할 수 있는 정자 세포를 생산할 수 있는 능력을 부여한다.
다양한 구체예에서, 마우스에게 ADAM6 기능을 부여하는 이소성 핵산 서열은 하나 이상의 ADAM6 단백질을 암호화하며, 하나 이상의 ADAM6 단백질은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 또는 이들의 조합을 포함한다.
다양한 구체예에서, 이소성 핵산 서열은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 5로부터 선택된 서열을 포함하며, 이소성 핵산 서열은 이소성 핵산 서열에 의해 암호화된 하나 이상의 ADAM6 단백질을 통해 마우스에게 ADAM6 기능을 부여한다.
한 구체예에서, 핵산 서열은 마우스로 배치되거나 마우스에서 유지될 때 야생형 마우스와 같거나 비슷한 생식능력의 수준을 수득하는 ADAM6 유전자 또는 상동체 또는 오솔로그 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하는 어떤 서열도 된다. 생식능력의 예시적 수준은 마우스 난자를 수정시키기 위해 암컷 마우스 난관을 이동할 수 있는 정자 세포를 생산하는 수컷 마우스의 능력에 의해 입증될 수도 있다.
한 양태에서, ADAM6 단백질을 암호화하는 내인성 뉴클레오티드 서열의 결실, 내인성 VH 유전자 세그먼트의 사람 VH 유전자 세그먼트로의 대체, 및 마우스 ADAM6 단백질 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 수컷 마우스에서 기능적인 단편을 암호화하는 이소성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 마우스가 제공된다.
한 양태에서, ADAM6 단백질을 암호화하는 내인성 뉴클레오티드 서열의 결실, 내인성 VH 유전자 세그먼트의 사람 VL 유전자 세그먼트로의 대체, 및 마우스 ADAM6 단백질 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 수컷 마우스에서 기능적인 단편을 암호화하는 이소성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 마우스가 제공된다. 한 구체예에서, 사람 VL 유전자 세그먼트는 Vκ 유전자 세그먼트이다. 한 구체예에서, VL 유전자 세그먼트는 Vλ 유전자 세그먼트이다.
한 구체예에서, 마우스는 사람 JL 유전자 세그먼트를 더 포함하고, 마우스 ADAM6 단백질 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 수컷 마우스에서 기능적인 단편을 암호화하는 이소성 뉴클레오티드 서열은 사람 VL 유전자 세그먼트 및 사람 JL 유전자 세그먼트 사이에 위치한다. 한 구체예에서, 마우스는 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트 및 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트를 포함하고 마우스 ADAM6 단백질 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 수컷 마우스에서 기능적인 단편을 암호화하는 이소성 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트의 업스트림 (또는 5')에 위치한다. 특정 구체예에서, 사람 VL 및 JL 유전자 세그먼트는 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트이다.
한 구체예에서, 마우스는 내인성 ADAM6 유전자를 포함하는 내인성 면역글로불린 자리 뉴클레오티드 서열의 결실을 포함하고, 하나 이상의 사람 면역글로불린 유전자 세그먼트를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 면역글로불린 중쇄 자리를 포함하며, 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오티드 서열이 하나 이상의 사람 면역글로불린 유전자 세그먼트를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 내에 있거나 이에 바로 인접하다.
한 구체예에서, 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 VH 유전자 세그먼트의 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로의 대체를 포함하고, 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 내에 있거나, 이에 바로 인접하다. 한 구체예에서, 마우스는 내인성 DH 유전자 자리에서 하나 이상의 내인성 DL 유전자 세그먼트의 하나 이상의 사람 VL 및/또는 사람 JL 유전자 세그먼트로의 대체를 더 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 내인성 JH 유전자 자리에서 하나 이상의 내인성 JH 유전자 세그먼트의 하나 이상의 사람 JL 유전자 세그먼트로의 대체를 더 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트의 대체 및 내인성 VH, DH, 및 JH 유전자 자리에서 사람 VL 및 JL 유전자 세그먼트와의 대체를 포함하며, 마우스는 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에서 하나 이상의 사람 VL 및 JL 유전자 세그먼트의 삽입을 포함하며, 마우스는 마우스에서 기능적인 ADAM6 유전자를 포함한다. 특정 구체예에서, 사람 VL 및 JL 유전자 세그먼트는 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트이다. 특정 구체예에서, 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 서열은 존재하는 사람 VL 유전자 세그먼트의 끝에서 두 번째의 가장-3' VL 유전자 세그먼트, 및 및 존재하는 사람 JL 유전자 세그먼트의 최후의 가장-5' JL 유전자 세그먼트 사에에 배치된다. 특정 구체예에서, 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 서열은 존재하는 사람 VL 유전자 세그먼트의 가장-5' VL 유전자 세그먼트의 업스트림 (또는 5')에 배치된다. 특정 구체예에서, 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH 유전자 세그먼트의 결실, 및 적어도 40개의 사람 VL 유전자 세그먼트로의 대체를 포함하고, 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오티드 서열은 사람 Vκ4-1 유전자 세그먼트의 다운스트림 및 사람 Jκ1 유전자 세그먼트의 업스트림에 배치된다. 특정 구체예에서, 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH 유전자 세그먼트의 결실, 및 적어도 40개의 사람 VL 유전자 세그먼트로의 대체를 포함하고, 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오티드 서열은 사람 Vκ2-40 유전자 세그먼트의 업스트림에 배치된다.
특정 구체예에서, 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 VH 유전자 세그먼트의 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트를 암호화하는 뉴클레오티드 서열로의 대체를 포함하고, 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 내에 있거나, 이에 바로 인접하다.
한 구체예에서, VL 유전자 세그먼트는 Vκ 유전자 세그먼트이다. 한 구체예에서, VL 유전자 세그먼트는 Vλ 유전자 세그먼트이다.
한 구체예에서, 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오티드 서열은 마우스의 게놈에서 이식 유전자에 존재한다. 한 구체예에서, 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오티드 서열은 마우스에서 염색체 외에 존재한다.
한 양태에서, 내인성 중쇄 면역글로불린 자리의 변형을 포함하는 마우스가 제공되며, 마우스는 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동 가능하게 결합된 재배열된 면역글로불린 서열을 포함하는 B 세포를 발현하고, B 세포는 그것의 게놈에서 (예를 들어, B 세포 염색체 상에서) ADAM6 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 수컷 마우스에서 기능적인 단편을 암호화하는 유전자를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 불변 영역 유전자 서열에 작동 가능하게 결합된 재배열된 면역글로불린 서열은 사람 경쇄 V, J, 및 선택적으로 D 유전자 서열; 마우스 중쇄 V, D, 및/또는 J 서열; 사람 또는 마우스 경쇄 V 및/또는 J 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 불변 영역 유전자 서열은 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 사람 또는 마우스 중쇄 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 사람 경쇄 V 및/또는 J 서열은 사람 Vκ, Vλ, Jκ 및 Jλ 서열로 구성된다.
한 양태에서, 기능적으로 침묵된 내인성 면역글로불린 중쇄 자리를 포함하는 마우스가 제공되며, ADAM6 기능은 마우스에서 유지되고, 하나 이상의 사람 면역글로불린 유전자 세그먼트의 삽입을 더 포함하며, 하나 이상의 사람 면역글로불린 유전자 세그먼트는 사람 VL 및 JL 유전자 세그먼트, 및 선택적으로 사람 DH 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 하나 이상의 사람 면역글로불린 유전자 세그먼트는 사람 Vκ, Vλ, Jκ 및 Jλ 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 양태에서, 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 마우스는 기능적으로 침묵된 면역글로불린 경쇄 유전자를 포함하고, 하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 세그먼트의 하나 이상의 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트로의 대체를 더 포함하며, 마우스는 기능적 내인성 ADAM6 자리가 결핍되고, 마우스는 마우스 ADAM6 단백질 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 수컷 마우스에서 기능적인 단편을 발현하는 이소성 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
한 양태에서, 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 마우스는 기능적으로 침묵된 면역글로불린 경쇄 유전자 자리를 포함하고, 하나 이상의 내인성 면역글로불린 경쇄 가변 유전자 세그먼트의 하나 이상의 사람 면역글로불린 경쇄 가변 유전자 세그먼트로의 대체를 더 포함하며, 마우스는 기능적 내인성 ADAM6 자리가 결핍되고, 마우스는 마우스 ADAM6 단백질 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 수컷 마우스에서 기능적인 단편을 암호화하는 이소성 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 하나 이상의 사람 면역글로불린 경쇄 가변 유전자 세그먼트는 이소성 뉴클레오티드 서열과 인접하다.
한 양태에서, 기능적 내인성 ADAM6 자리 또는 서열이 결핍되고 마우스 ADAM6 자리 또는 서열의 마우스 ADAM6 자리 또는 기능적 단편을 암호화하는 이소성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 마우스가 제공되며, 마우스는 이성의 마우스와 교미하여 이소성 ADAM6 자리 또는 서열을 포함하는 자손을 생산할 수 있다. 한 구체예에서, 마우스는 수컷이다. 한 구체예에서, 마우스는 암컷이다.
한 양태에서, 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 마우스는 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 자리에서 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트를 포함하고, 마우스는 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 자리에서 내인성 기능적 ADAM6 서열이 결핍되며, 마우스는 마우스 ADAM6 단백질 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 수컷 마우스에서 기능적인 단편을 발현하는 이소성 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
한 양태에서, 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 마우스는 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 영역 유전자 자리에서 사람 면역글로불린 경쇄 가변 유전자 세그먼트를 포함하고, 마우스는 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 자리에서 내인성 기능적 ADAM6 서열이 결핍되며, 마우스는 마우스 ADAM6 단백질 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 수컷 마우스에서 기능적인 단편을 발현하는 이소성 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 마우스 ADAM6 단백질을 발현하는 이소성 뉴클레오티드 서열은 염색체 외에 있다. 한 구체예에서, 마우스 ADAM6 단백질을 발현하는 이소성 뉴클레오티드 서열은 마우스의 게놈에서 하나 이상의 자리에서 통합된다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 자리는 면역글로불린 자리를 포함한다.
한 양태에서, 변형된 내인성 면역글로불린 중쇄 자리로부터 면역글로불린 경쇄 서열을 발현하는 마우스가 제공되며, 중쇄는 사람 VL 유전자 세그먼트, J 유전자 세그먼트, 선택적으로 DH 유전자 세그먼트로부터 유래되고, 마우스는 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성을 포함한다. 한 구체예에서, 사람 VL 유전자 세그먼트는 사람 Vκ 및 사람 Vλ 유전자 세그먼트로부터 선택된다. 다양한 구체예에서, J 유전자 세그먼트는 JH, Jκ 또는 Jλ 유전자 세그먼트 또는 이들의 조합이다.
한 구체예에서 마우스는 복수의 사람 VL 유전자 세그먼트및 복수의 J 유전자 세그먼트를 포함한다. 특정 구체예에서, J 유전자 세그먼트는 JL 유전자 세그먼트이다.
한 양태에서, 변형된 내인성 면역글로불린 중쇄 자리로부터 면역글로불린 경쇄 서열을 발현하는 마우스가 제공되며, 중쇄는 사람 VL 유전자 세그먼트 및 JL 유전자 세그먼트로부터 유래되고, 마우스는 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성을 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 복수의 사람 V 유전자 세그먼트, 복수의 J 유전자 세그먼트, 및 선택적으로 복수의 D 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, D 유전자 세그먼트는 사람 D 유전자 세그먼트이고, 한 구체예에서, J 유전자 세그먼트는 사람 J 유전자 세그먼트이다. 한 구체예에서, 마우스는 사람화된 중쇄 불변 영역 서열을 더 포함하며, 사람화는 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택된 서열의 대체를 포함한다. 특정 구체예에서, 중쇄는 사람 V 유전자 세그먼트, 사람 J 유전자 세그먼트, 사람 CH1 서열, 사람 또는 마우스 힌지 서열, 마우스 CH2 서열, 및 마우스 CH3 서열로부터 유래된다. 또 다른 특정 구체예에서, 마우스는 사람 경쇄 불변 서열을 더 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자 세그먼트에 의해 5' 및 3'에 플랭킹된 ADAM6 유전자를 포함한다. 특정 구체예에서, 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 세그먼트는 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화할 수 없다. 특정 구체예에서, 마우스의 ADAM6 유전자는 야생형 마우스에서와 같은 위치에 있고 마우스의 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 자리는 항체의 중쇄를 암호화하도록 재배열될 수 없다.
한 구체예에서, 복수의 사람 V 유전자 세그먼트는 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성을 암호화하는 서열에 의해 5' (V 유전자 세그먼트의 전사 방향에 관하여)에 플랭킹된다. 특정 구체예에서, 복수의 사람 V 유전자 세그먼트는 사람 Vκ 유전자 세그먼트 Vκ4-1, Vκ5-2, Vκ7-3, Vκ2-4, Vκ1-5, Vκ1-6, Vκ3-7, Vκ1-8, Vκ1-9, Vκ2-10, Vκ3-11, Vκ1-12, Vκ1-13, Vκ2-14, Vκ3-15, Vκ1-16, Vκ1-17, Vκ2-18, Vκ2-19, Vκ3-20, Vκ6-21, Vκ1-22, Vκ1-23, Vκ2-24, Vκ3-25, Vκ2-26, Vκ1-27, Vκ2-28, Vκ2-29, Vκ2-30, Vκ3-31, Vκ1-32, Vκ1-33, Vκ3-34, Vκ1-35, Vκ2-36, Vκ1-37, Vκ2-38, Vκ1-39, 및 Vκ2-40을 포함하고 사람 Vκ2-40 유전자 세그먼트는 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성을 암호화하는 서열에 의해 5' (사람 Vκ2-40 유전자 세그먼트의 전사 방향에 관하여)에 플랭킹된다. 특정 구체예에서, 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성을 암호화하는 서열은 사람 Vκ 유전자 세그먼트에 관하여 같은 전사 방향으로 배치된다. 특정 구체예에서, 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성을 암호화하는 서열은 사람 Vκ 유전자 세그먼트에 관하여 반대의 전사 방향으로 배치된다.
한 구체예에서, V 유전자 세그먼트는 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성을 암호화하는 서열에 의해 3' (V 유전자 세그먼트의 전사 방향에 관하여)에 플랭킹된다.
한 구체예에서, D 유전자 세그먼트는 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성을 암호화하는 서열에 의해 5' (D 유전자 세그먼트의 전사 방향에 관하여)에 플랭킹된다.
한 구체예에서, J 유전자 세그먼트는 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성을 암호화하는 서열에 의해 5' (J 유전자 세그먼트의 전사 방향에 관하여)에 플랭킹된다.
한 구체예에서, 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성은 변형된 내인성 중쇄 면역글로불린 자리의 가장-5' D 유전자 세그먼트의 5' 및 가장-3' V 유전자 세그먼트의 3' (V 유전자 세그먼트의 전사의 방향에 관하여)에 자리한 뉴클레오티드 서열의 발현으로부터 발생한다.
한 구체예에서, 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성은 변형된 내인성 면역글로불린 중쇄 자리의 가장-5' J 유전자 세그먼트의 5' 및 가장-3' V 유전자 세그먼트의 3' (V 유전자 세그먼트의 전사의 방향에 관하여)에 자리한 뉴클레오티드 서열의 발현으로부터 발생한다.
한 구체예에서, 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성은 변형된 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에서 두 개의 사람 V 유전자 세그먼트 사이에 자리한 뉴클레오티드 서열의 발현으로부터 발생한다. 한 구체예에서, 두 개의 사람 V 유전자 세그먼트는 사람 Vκ5-2 유전자 세그먼트 및 Vκ4-1 유전자 세그먼트이다.
한 구체예에서, 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성은 변형된 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에서 사람 V 유전자 세그먼트 및 사람 J 유전자 세그먼트 사이에 자리한 뉴클레오티드 서열의 발현으로부터 발생한다. 한 구체예에서, 사람 V 유전자 세그먼트는 사람 Vκ4-1 유전자 세그먼트이고 사람 J 세그먼트는 Jκ1 유전자 세그먼트이다.
한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 마우스 ADAM6b 서열 또는 이들의 기능적 단편, 마우스 ADAM6a 서열 또는 이들의 기능적 단편, 및 이들의 조합으로부터 선택된 서열을 포함한다.
다양한 구체예에서, 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성을 암호화하는 서열은 SEQ ID NO: 2에서 제시된 ADAM6b 단백질을 암호화하고 및/또는 SEQ ID NO: 1에서 제시된 ADAM6a 단백질을 암호화한다.
한 구체예에서, 두 개의 사람 V 유전자 세그먼트 사이에서 뉴클레오티드 서열은 사람 V 유전자 세그먼트에 관하여 반대의 전사 방향으로 배치된다. 특정 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은, ADAM6 유전자의 전사의 방향에 관하여 5'에서 3'으로, ADAM6a 서열에 이어서 ADAM6b 서열을 암호화한다.
한 구체예에서, 사람 V 유전자 세그먼트 및 사람 J 유전자 세그먼트 사이의 뉴클레오티드 서열은 사람 V 및 J 유전자 세그먼트에 관하여 반대의 전사 방향으로 배치된다. 특정 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은, ADAM6 유전자의 전사의 방향에 관하여 5'에서 3'으로, ADAM6a 서열에 이어서 ADAM6b 서열을 암호화한다.
한 구체예에서, 마우스는 히브리드(hybrid) 면역글로불린 서열을 포함하며, 히브리드 면역글로불린 서열은 비-사람 ADAM6 서열과 인접한 사람 면역글로불린 κ 경쇄 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에서 마우스 서열과 인접한 사람 서열을 포함하며, 인접한 서열은 적어도 하나의 사람 VL 유전자 세그먼트, 마우스 ADAM6 서열 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편, 및 사람 JL 유전자 세그먼트를 포함한다. 특정 구체예에서, 마우스 ADAM6 서열 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편은 적어도 하나의 사람 VL 유전자 세그먼트에 바로 인접하게 위치한다. 한 구체예에서, 사람 VL 유전자 세그먼트는 사람 Vκ 유전자 세그먼트이다. 한 구체예에서, 마우스 ADAM6 서열 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편은 적어도 하나의 사람 VL 유전자 세그먼트와 바로 인접하게 및 이에 대하여 3'에 및 사람 JL 유전자 세그먼트와 바로 인접하게 및 이에 대하여 5'에 위치한다. 특정 구체예에서, 사람 VL 유전자 세그먼트는 사람 Vκ 유전자 세그먼트이고 사람 JL 유전자 세그먼트는 사람 Jκ 유전자 세그먼트이다.
한 구체예에서, 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성을 암호화하는 서열은 마우스 ADAM6 서열 또는 이들의 기능적 단편이다.
한 구체예에서, 마우스는 내인성 마우스 DFL16.1 유전자 세그먼트 (예를 들어, 마우스에서 변형된 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 자리에 대하여 이형 접합체), 또는 사람 DH1-1 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 마우스에 의해 발현된 면역글로불린 중쇄의 D 유전자 세그먼트는 내인성 마우스 DFL16.1 유전자 세그먼트 또는 사람 DH1-1 유전자 세그먼트로부터 유래된다.
한 양태에서, 재배열되지 않은 B 세포 계통의 DNA-함유 세포에서 마우스 ADAM6 (또는 상동체 또는 오솔로그 또는 이들의 기능적 단편)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하지만, 재배열된 면역글로불린 자리를 포함하는 B 세포에서 마우스 ADAM6 (또는 상동체 또는 오솔로그 또는 이들의 기능적 단편)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하지 않는 마우스가 제공되며, 마우스 ADAM6 (또는 상동체 또는 오솔로그 또는 이들의 기능적 단편)을 암호화하는 핵산 서열은 야생형 마우스에서 마우스 ADAM6 유전자가 나타나는 위치와 다른 위치의 게놈에서 발생한다. 한 구체예에서, 마우스 ADAM6 (또는 상동체 또는 오솔로그 또는 이들의 기능적 단편)을 암호화하는 핵산 서열은 재배열된 B 세포 계통의 것이 아닌, 모든 또는 실질적으로 모든 DNA-함유 세포에 존재하고; 한 구체예에서, 핵산 서열은 마우스의 생식세포 계열 세포에 존재하지만, 재배열된 B 세포의 염색체에는 존재하지 않는다.
한 양태에서, 재배열된 면역글로불린 자리를 포함하는 B 세포를 포함하는, 모든 또는 실질적으로 모든 DNA-함유 세포에서 마우스 ADAM6 (또는 상동체 또는 오솔로그 또는 이들의 기능적 단편)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 마우스가 제공되며, 마우스 ADAM6 (또는 상동체 또는 오솔로그 또는 이들의 기능적 단편)을 암호화하는 핵산 서열은 야생형 마우스에서 마우스 ADAM6 유전자가 나타나는 위치와 다른 위치의 게놈에서 발생한다. 한 구체예에서, 마우스 ADAM6 (또는 상동체 또는 오솔로그 또는 이들의 기능적 단편)을 암호화하는 핵산 서열은 재배열된 면역글로불린 자리와 인접한 핵산 상에 있다. 한 구체예에서, 재배열된 면역글로불린 자리와 인접한 핵산은 염색체이다. 한 구체예에서, 염색체는 야생형 마우스에서 발견되는 염색체이고 염색체는 마우스 면역글로불린 자리의 변형을 포함한다.
한 양태에서, 유전적으로 변형된 마우스가 제공되며, 마우스는 그것의 게놈에서 ADAM6 서열 또는 이들의 오솔로그 또는 상동체를 포함하는 B 세포를 포함한다. 한 구체예에서, ADAM6 서열 또는 이들의 오솔로그 또는 상동체는 면역글로불린 중쇄 자리에 있다. 특정 구체예에서, 중쇄 자리는 항체의 중쇄를 암호화하도록 재배열될 수 있는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, ADAM6 서열 또는 이들의 오솔로그 또는 상동체는 면역글로불린 자리가 아닌 자리에 있다. 한 구체예에서, ADAM6 서열은 이종 기원 프로모터에 의해 구동되는 이식 유전자 상에 있다. 특정 구체예에서, 이종 기원 프로모터는 비-면역글로불린 프로모터이다. 특정 구체예에서, B 세포는 ADAM6 단백질 또는 이들의 오솔로그 또는 상동체를 발현한다.
한 구체예에서, 마우스의 B 세포 중 90% 이상은 ADAM6 단백질 또는 이들의 오솔로그 또는 이들의 상동체 또는 마우스에서 기능적인 이들의 단편을 암호화하는 유전자를 포함한다. 특정 구체예에서, 마우스는 수컷 마우스이다.
한 구체예에서, B 세포 게놈은 제1 대립 유전자 및 ADAM6 서열 또는 오솔로그 또는 이들의 상동체를 포함하는 제2 대립 유전자를 포함한다. 한 구체예에서, B 세포 게놈은 제1 대립 유전자를 포함하지만 ADAM6 서열 또는 이들의 오솔로그 또는 상동체를 포함하는 제2 대립 유전자를 포함하지 않는다.
한 양태에서, 하나 이상의 내인성 면역글로부린 중쇄 대립 유전자에서 변형을 포함하는 마우스가 제공되며, 변형은 하나 이상의 내인성 ADAM6 대립 유전자를 유지한다.
한 구체예에서, 변형은 마우스가 적어도 하나의 중쇄 대립 유전자의 재배열된 내인성 중쇄 유전자 세그먼트를 포함하고 적어도 하나의 내인성 면역글로불린 중쇄 대립 유전자 내에 자리하는 내인성 ADAM6 대립 유전자를 유지하는 기능적 중쇄를 발현할 수 없게 한다.
한 구체예에서, 마우스는 내인성 면역글로불린 중쇄 대립 유전자 중 적어도 하나의 재배열된 내인성 중쇄 유전자 세그먼트를 포함하는 기능적 중쇄를 발현할 수 없고, 마우스는 내인성 ADAM6 대립 유전자의 ADAM6 단백질을 발현한다. 특정 구체예에서, 마우스는 두 개의 내인성 면역글로불린 중쇄 대립 유전자의 재배열된 내인성 중쇄 유전자 세그먼트를 포함하는 기능적 중쇄를 발현할 수 없고, 마우스는 하나 이상의 내인성 ADAM6 대립 유전자의 ADAM6 단백질을 발현한다.
한 구체예에서, 마우스는 각 내인성 중쇄 대립 유전자의 기능적 중쇄를 발현할 수 없고, 마우스는 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 또는 120 이상의 Mbp 업스트림 (마우스 면역글로불린 중쇄 자리의 전사의 방향에 관하여) 내에 자리한 기능적 ADAM6 대립 유전자를 포함한다. 특정 구체예에서, 기능적 ADAM6 대립 유전자는 내인성 중쇄 자리 (예를 들어, 유전자간 V-D 영역, 두 개의 V 유전자 세그먼트 사이, V 및 D 유전자 세그먼트 사이, D 및 J 유전자 세그먼트 사이, 등)에 있다. 특정 구체예에서, 기능적 ADAM6 대립 유전자는 최종 마우스 V 유전자 세그먼트 및 제1 마우스 D 유전자 세그먼트 사이의 90 내지 100 kb의 유전자간 서열 내에 자리한다. 또 다른 특정 구체예에서, 내인성 90 내지 100 kb 유전자간 V-D 서열이 제거되고, 이소성 ADAM6 서열은 최종 V 및 제1 D 유전자 세그먼트 사이에 위치한다.
한 양태에서, 하나 이상의 내인성 ADAM6 대립 유전자에서 변형을 포함하는 마우스가 제공된다.
한 구체예에서, 변형은 마우스가 하나 이상의 내인성 ADAM6 대립 유전자 중 적어도 하나로부터 기능적 ADAM6 단백질을 발현할 수 없게 한다. 특정 구체예에서, 마우스는 내인성 ADAM6 대립 유전자 각각으로부터 기능적 ADAM6 단백질을 발현할 수 없다.
한 구체예에서, 마우스는 각각의 내인성 ADAM6 대립 유전자로부터 기능적 ADAM6 단백질을 발현할 수 없고, 마우스는 이소성 ADAM6 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 각각의 내인성 ADAM6 대립 유전자로부터 기능적 ADAM6 단백질을 발현할 수 없고, 마우스는 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열의 1, 2, 3, 4, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 또는 120 이상의 kb 업스트림 (마우스 중쇄 자리의 전사의 방향에 관하여) 내에 자리한 이소성 ADAM6 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 이소성 ADAM6 서열은 내인성 면역글로불린 중쇄 자리 (예를 들어, 유전자간 V-D 영역, 두 개의 V 유전자 세그먼트 사이, V 및 J 유전자 세그먼트 등, D 및 J 유전자 세그먼트 사이, 등)에 있다. 특정 구체예에서, 이소성 ADAM6 서열은 최종 마우스 V 유전자 세그먼트 및 제1 마우스 D 유전자 세그먼트 사이의 90 내지 100 kb 유전자간 서열 내에 자리한다. 또 다른 특정 구체예에서, 내인성 90 내지 100 kb 유전자간 V-D 서열이 제거되고, 이소성 ADAM6 서열은 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 제1 사람 Jκ 유전자 세그먼트 사이에 위치한다. 또 다른 특정 구체예에서, 내인성 90 내지 100 kb 유전자간 V-D 서열이 제거되고, 이소성 ADAM6 서열은 사람 Vκ 유전자 세그먼트의 5' 또는 업스트림에 위치하며, 사람 Vκ 유전자 세그먼트는 사람 Vκ4-1 또는 Vκ2-40 유전자 세그먼트로부터 선택된다.
한 구체예에서, 마우스는 하나 이상의 내인성 ADAM6 대립 유전자로부터 기능적 ADAM6 단백질을 발현할 수 있으며, 변형은 면역글로불린 가변 도메인을 암호화하는 사람 서열의 삽입을 포함한다. 한 구체예에서, 사람 서열은 재배열되지 않은 면역글로불린 유전자 세그먼트를 포함한다. 특정 구체예에서, 사람 서열은 V 유전자 세그먼트 및 J 유전자 세그먼트를 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 사람 서열은 V 유전자 세그먼트, J 유전자 세그먼트, 및 D 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 양태에서, 생식 불가능한 수컷 마우스가 제공되며, 마우스는 둘 이상의 내인성 ADAM6 대립 유전자의 결실을 포함한다. 한 양태에서, 수컷 생식불가능 특성의 운반체인 암컷 마우스가 제공되며, 암컷 마우스는 그것의 생식세포 계열에서 비기능적 ADAM6 대립 유전자 또는 내인성 ADAM6 대립 유전자의 넉아웃을 포함한다.
한 양태에서, 항체의 중쇄를 암호화도록 재배열될 수 없는 내인성 면역글로불린 중쇄 V, D, 및 또는 J 유전자 세그먼트를 포함하는 마우스가 제공되며, 마우스의 B 세포의 대부분은 기능적 ADAM6 유전자를 포함한다. 다양한 구체예에서, B 세포의 대부분은 마우스의 하나 이상의 사람 VL 및 JL 유전자 세그먼트의 업스트림에서 면역글로불린 중쇄 불변 영역을 더 포함한다. 한 구체예에서, 사람 VL 및 JL 유전자 세그먼트는 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트이다.
한 구체예에서, 마우스는 항체의 기능적 중쇄를 암호화하도록 재배열될 수 없는 운전한 내인성 면역글로불린 중쇄 V, D, 및 J 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 적어도 하나 및 최대 89개의 V 유전자 세그먼트, 적어도 하나 및 최대 13개의 D 유전자 세그먼트, 적어도 하나 및 최대 네 개의 J 유전자 세그먼트, 및 이들의 조합을 포함하며; 적어도 하나 및 최대 89개의 V 유전자 세그먼트, 적어도 하나 및 최대 13개의 D 유전자 세그먼트, 적어도 하나 및 최대 네 개의 J 유전자 세그먼트는 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화하도록 재배열될 수 없다. 특정 구체예에서, 마우스는 온전한 내인성 면역글로불린 중쇄 V, D, 및 J 유전자 세그먼트 내에 자리한 기능적 ADAM6 유전자를 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 내인성 ADAM6 자리를 포함하는 내인성 중쇄 자리를 포함하며, 내인성 중쇄 자리는 89개의 V 유전자 세그먼트, 13개의 D 유전자 세그먼트, 및 네 개의 J 유전자 세그먼트를 포함하고, 내인성 중쇄 유전자 세그먼트는 항체의 중쇄 가변 영역을 암호화하도록 재배열될 수 없고 ADAM6 자리는 마우스에서 기능적인 ADAM6 단백질을 암호화한다.
한 양태에서, 생식 불가능한 수컷 마우스를 만드는 방법이 제공되며, 기증자 ES 세포의 내인성 ADAM6 대립 유전자를 비기능적이게 하는 단계 (또는 상기 대립 유전자를 넉아웃시키는 단계), 기증자 ES 세포를 숙주 배아로 도입하는 단계, 대리모에서 숙주 배아를 임신시키는 단계, 및 대리모가 전체적으로 또는 부분적으로 기증자 ES 세포로부터 유래된 자손을 출산하게 하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 방법은 생식 불가능한 수컷 마우스를 얻기 위해 자손을 교배시키는 단계를 더 포함한다.
한 양태에서, 원하는 유전적 변형을 갖는 마우스를 만드는 방법이 제공되며, 마우스는 생식 불가능하고, 방법은 (a) 게놈에서 원하는 유전적 변형을 만드는 단계; (b) 내인성 ADAM6 대립 유전자를 넉아웃시키기 위해 게놈을 변형시키는 단계, 또는 내인성 ADAM6 대립 유전자를 비기능적이게 하는 단계; 및, (c) 마우스를 만드는데 있어서 게놈을 이용하는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에서, 게놈은 ES 세포의 것이거나 핵 이식 실험에 사용된다.
한 양태에서, 내인성 면역글로불린 중쇄 V, D, 및 J 유전자 세그먼트가 결핍된 마우스가 제공되며, 마우스의 B 세포의 대부분은 ADAM6 서열 또는 이들의 오솔로그 또는 상동체를 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 둘 이상의 V 유전자 세그먼트, 둘 이상의 D 유전자 세그먼트, 둘 이상의 J 유전자 세그먼트, 및 이들의 조합으로부터 선택된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자 세그먼트가 결핍된다. 한 구체예에서, 마우스는 적어도 하나 및 최대 89개의 V 유전자 세그먼트, 적어도 하나 및 최대 13개의 D 유전자 세그먼트, 적어도 하나 및 최대 네 개의 J 유전자 세그먼트, 및 이들의 조합으로부터 선택된 면역글로불린 중쇄 유전자 세그먼트가 결핍된다. 한 구체예에서, 마우스는 내인성 면역글로불린 중쇄 자리의 약 세 개의 메가베이스(megabase)를 포함하는 염색체 12의 게놈 DNA 단편이 결핍된다. 특정 구체예에서, 마우스는 모든 기능적 내인성 중쇄 V, D, 및 J 유전자 세그먼트가 결핍된다. 특정 구체예에서, 마우스는 89개의 VH 유전자 세그먼트, 13개의 DH 유전자 세그먼트 및 네 개의 JH 유전자 세그먼트가 결핍된다.
한 양태에서, 마우스가 제공되며, 마우스는 면역글로불린 중쇄 자리의 변형을 포함하는 생식세포 계열에서 게놈을 갖고 있고, 면역글로불린 중쇄 자리에 대한 변형은 하나 이상의 마우스 면역글로불린 가변 영역 서열의 하나 이상의 비-마우스 면역글로불린 가변 영역 서열로의 대체를 포함하며, 마우스는 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 내인성 면역글로불린 중쇄 자리의 DH 및 JH 서열 및 적어도 3개, 적어도 10개, 적어도 20개, 적어도 40개, 적어도 60개, 또는 적어도 80개의 VH 서열은 비-마우스 면역글로불린 경쇄 서열에 의해 대체된다. 한 구체예에서, 내인성 면역글로불린 중쇄 자리의 DH, JH, 및 모든 VH 서열은 복수의 비-마우스 면역글로불린 VL 유전자 세그먼트, 하나 이상의 JL 유전자 세그먼트, 및 선택적으로 하나 이상의 D 유전자 세그먼트 서열에 의해 대체된다. 비-마우스 면역글로불린 서열은 재배열될 수 없다. 한 구체예에서, 비-마우스 면역글로불린 서열은 비-마우스 종의 완벽하게 재배열되지 않은 VL 및 JL 영역을 포함한다. 한 구체예에서, 비-마우스 면역글로불린 서열은 하나 이상의 내인성 불변 영역에 작동 가능하게 결합된, 비-마우스 종의 완벽한 가변 영역, 즉, 경쇄 가변 영역을 암호화하는 서열을 형성하도록 함께 결합된 VL 및 JL 유전자 세그먼트를 함유하는 재배열된 가변 영역을 형성할 수 있다. 비-마우스 종은 호모 사피엔스(Homo sapiens)일 수 있고 비-마우스 면역글로불린 서열은 사람 서열일 수 있다.
한 양태에서, 사람 면역글로불린 경쇄 가변 유전자 세그먼트와 인접한 ADAM6 단백질 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 마우스가 제공된다.
한 구체예에서, 마우스는 내인성 변형되지 않은 ADAM6 유전자 서열이 결핍된다. 한 구체예에서, 마우스는 기능적 내인성 ADAM6 유전자 서열이 결핍된다.
한 구체예에서, 사람 면역글로불린 경쇄 가변 유전자 세그먼트는 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 세그먼트이다. 한 구체예에서, 사람 면역글로불린 경쇄 가변 유전자 세그먼트는 면역글로불린 λ 경쇄 가변 유전자 세그먼트이다. 한 구체예에서, 사람 면역글로불린 경쇄 가변 유전자 세그먼트는 면역글로불린 중쇄 불변 유전자 서열에 작동 가능하게 결합된다.
한 구체예에서, 면역글로불린 중쇄 불변 유전자 서열은 마우스 또는 래트 또는 사람 중쇄 유전자 서열이다. 한 구체예에서, 중쇄 불변 유전자 서열은 CH1 및/또는 힌지 영역을 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자 서열의 결실, 또는 이의 대체를 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 사람 또는 마우스 또는 래트 경쇄 불변 영역 서열에 작동 가능하게 결합된 재배열되지 않은 사람 Vκ 또는 재배열되지 않은 사람 Vλ 유전자 세그먼트를 더 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 복수의 재배열되지 않은 사람 Vκ 유전자 세그먼트 (예를 들어, 둘 이상의 사람 Vκ 세그먼트 및 하나 이상의 사람 Jκ 세그먼트) 또는 복수의 재배열되지 않은 사람 Vλ 유전자 세그먼트 (예를 들어, 둘 이상의 사람 Vλ 세그먼트 및 하나 이상의 사람 Jλ 세그먼트)를 포함한다. 한 구체예에서, 재배열되지 않은 사람 Vκ 또는 재배열되지 않은 사람 V 유전자 세그먼트는 내인성 면역글로불린 경쇄 자리에서 불변 영역 서열에 작동 가능하게 결합된다.
한 구체예에서, 마우스는 내인성 κ 경쇄 자리 및/또는 내인성 λ 경쇄 자리를 비기능적이게 하는 변형을 더 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 내인성 마우스 κ 및/또는 내인성 마우스 λ 경쇄 자리의 넉아웃 또는 결실을 포함한다.
한 양태에서, 마우스 종족을 유지하는 방법이 제공되며, 마우스 종족은 마우스 면역글로불린 중쇄 서열의 하나 이상의 사람 면역글로불린 경쇄 서열로의 대체를 포함한다. 한 구체예에서, 하나 이상의 사람 면역글로불린 경쇄 서열은 사람 면역글로불린 Vκ 및/또는 Jκ 유전자 세그먼트이다.
한 구체예에서, 마우스 종족은 하나 이상의 마우스 VH, DH, 및/또는 JH 유전자 세그먼트의 결실을 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트 및 하나 이상의 사람 JL 유전자 세그먼트를 더 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 적어도 6개, 적어도 16개, 적어도 30개, 또는 적어도 40개의 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 적어도 다섯 개의 Jκ 유전자 세그먼트를 포함한다. 특정 구체예에서, 사람 경쇄 유전자 세그먼트는 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 결합된다. 한 구체예에서, 불변 영역 유전자는 마우스 불변 영역 유전자이다. 한 구체예에서, 불변 영역 유전자는 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및/또는 CH4 또는 이들의 조합으로부터 선택된 마우스 불변 영역 유전자 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 방법은 마우스 면역글로불린 중쇄 서열의 대체에 대하여 이형 접합체인 수컷 마우스를 생성하는 단계, 및 이형 접합체인 수컷 마우스를 야생형 암컷 마우스 또는 사람 중쇄 서열에 대하여 상동 접합체 또는 이형 접합체인 암컷 마우스와 교배시키는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 방법은 사람 중쇄 서열에 대하여 이형 접합체인 수컷을 야생형 또는 상동 접합체 또는 이형 접합체인 암컷과 반복적으로 교배시킴으로써 종족을 유지하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 방법은 사람 중쇄 서열에 대하여 상동 접합체 또는 이형 접합체인 수컷 또는 암컷 마우스로부터 세포를 얻는 단계, 및 기증자 세포로서 상기 세포 또는 기증자 핵으로서 핵을 이용하는 단계, 및 숙주 세포를 사용하여 유전적으로 변형된 동물을 만들기 위해 세포 또는 핵을 사용하는 단계, 및/또는 대리모에서 세포 및/또는 핵을 임신시키는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 중쇄 자리에서 대체에 대하여 이형 접합체인 수컷 마우스만이 암컷 마우스와 교배된다. 특정 구체예에서, 암컷 마우스는 대체된 중쇄 자리에 관하여 상동체, 이형 접합체, 또는 야생형이다.
한 구체예에서, 마우스는 내인성 면역글로불린 경쇄 자리에서 λ 및/또는 κ 경쇄 가변 서열의 이종 기원 면역글로불린 경쇄 서열로의 대체를 더 포함한다. 한 구체예에서, 이종 기원 면역글로불린 경쇄 서열은 사람 면역글로불린 λ 및/또는 κ 경쇄 가변 서열이다.
한 구체예에서, 마우스는 내인성 면역글로불린 자리 이외의 자리에서 이식 유전자를 더 포함하며, 이식 유전자는 면역글로불린 경쇄 불변 영역 서열에 작동 가능하게 결합되거나 (재배열되지 않은 것들에 대하여) 또는 이에 융합된 (재배열된 것들에 대하여) 재배열된 또는 재배열되지 않은 이종 기원 λ 또는 κ 경쇄 서열 (예를 들어, 재배열되지 않은 VL 및 재배열되지 않은 JL, 또는 재배열된 VJ)을 암호화하는 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 이종 기원 λ 또는 κ 경쇄 서열은 사람이다. 한 구체예에서, 불변 영역 서열은 설치류, 사람, 및 비-사람 영장류로부터 선택된다. 한 구체예에서, 불변 영역 서열은 마우스, 래트, 및 햄스터로부터 선택된다. 한 구체예에서, 이식 유전자는 경쇄 서열의 발현을 구동하는 비-면역글로불린 프로모터를 포함한다. 특정 구체예에서, 프로모터는 전사적으로 활성인 프로모터이다. 특정 구체예에서, 프로모터는 ROSA26 프로모터이다.
한 양태에서, 내인성 ADAM6 유전자의 변형을 포함하는 생식 가능한 마우스가 제공되며, 마우스는 마우스에게 ADAM6 기능을 부여하는 이소성 서열을 포함하고, 마우스는 그것의 생식세포 계열에서 면역글로불린 중쇄 서열을 암호화하는 핵산 서열에 작동 간으하게 결합된 재배열되지 않은 사람 면역글로불린 경쇄 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 양태에서, 내인성 ADAM6 자리의 변형을 포함하는 생식 가능한 마우스가 제공되며, 변형은 ADAM6 자리를 비기능적이게 하고, 마우스는 중쇄 불변 서열과 인접한 사람 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는 면역글로불린 결합 단백질을 발현한다.
한 구체예에서, 면역글로불린 결합 단백질은 경쇄 불변 서열과 융합된 동족 사람 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 더 포함한다.
한 구체예에서, 중쇄 불변 서열 및 경쇄 불변 서열은 비-사람이다.
한 양태에서, 마우스가 제공되며, 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에서 하나 이상의 면역글로불린 중쇄 가변 영역 (VH) 유전자 세그먼트, 중쇄 다양성 (DH) 유전자 세그먼트, 및 중쇄 결합 (JH) 유전자 세그먼트의 하나 이상의 경쇄 가변 영역 (VL) 유전자 세그먼트 및 하나 이상의 경쇄 결합 영역 (JL) 유전자 세그먼트로의 대체를 포함하는 면역글로불린 중쇄 자리를 포함하며, 마우스는 ADAM6 단백질을 발현할 수 있다.
한 양태에서, 마우스가 제공되며, 내인성 중쇄 자리 (VLH 자리)에서 VL 유전자 세그먼트 서열을 형성하기 위한 모든 또는 실질적으로 모든 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트의 하나 이상의 VL 유전자 세그먼트 및 하나 이상의 JL 유전자 세그먼트로의 대체를 포함하는 면역글로불린 중쇄 자리를 포함하며, VLH 자리는 내인성 CH 유전자와 재조합하여 VL 유전자 세그먼트, JL 유전자 세그먼트, 및 내인성 CH 유전자로부터 유래된 재배열된 유전자를 형성할 수 있다.
한 구체예에서, VL 세그먼트는 사람 VL이다. 한 구체예에서, JL 세그먼트는 사람 JL이다. 특정 구체예에서, VL 및 JL 세그먼트는 사람 VL 및 사람 JL 세그먼트이다.
한 구체예에서, 모든 또는 실질적으로 모든 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트는 적어도 여섯 개의 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 적어도 하나의 Jκ 유전자 세그먼트로 대체된다. 한 구체예에서, 모든 또는 실질적으로 모든 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트는 적어도 16개의 사람 Vκ 유전자 세그먼트 (사람 Vκ) 및 적어도 하나의 Jκ 유전자 세그먼트로 대체된다. 한 구체예에서, 모든 또는 실질적으로 모든 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트는 적어도 30개의 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 적어도 하나의 Jκ 유전자 세그먼트로 대체된다. 한 구체예에서, 모든 또는 실질적으로 모든 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트는 적어도 40개의 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 적어도 하나의 Jκ 유전자 세그먼트로 대체된다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 Jκ 유전자 세그먼트는 둘, 셋, 넷, 또는 다섯 개의 사람 Jκ 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 구체예에서, VL 세그먼트는 사람 Vκ 세그먼트이다. 한 구체예에서, 사람 Vκ 세그먼트는 4-1, 5-2, 7-3, 2-4, 1-5, 및 1-6을 포함한다. 한 구체예에서, 사람 Vκ 세그먼트는 3-7, 1-8, 1-9, 2-10, 3-11, 1-12, 1-13, 2-14, 3-15, 및 1-16을 포함한다. 한 구체예에서, 사람 Vκ 세그먼트는 1-17, 2-18, 2-19, 3-20, 6-21, 1-22, 1-23, 2-24, 3-25, 2-26, 1-27, 2-28, 2-29, 및 2-30을 포함한다. 한 구체예에서, 사람 Vκ 세그먼트는 3-31, 1-32, 1-33, 3-34, 1-35, 2-36, 1-37, 2-38, 1-39, 및 2-40을 포함한다.
한 구체예에서, VL 세그먼트는 사람 Vκ 세그먼트이고 4-1, 5-2, 7-3, 2-4, 1-5, 1-6, 3-7, 1-8, 1-9, 2-10, 3-11, 1-12, 1-13, 2-14, 3-15, 및 1-16을 포함한다. 한 구체예에서, Vκ 세그먼트는 1-17, 2-18, 2-19, 3-20, 6-21, 1-22, 1-23, 2-24, 3-25, 2-26, 1-27, 2-28, 2-29, 및 2-30을 포함한다. 한 구체예에서, Vκ 세그먼트는 3-31, 1-32, 1-33, 3-34, 1-35, 2-36, 1-37, 2-38, 1-39, 및 2-40을 포함한다.
한 구체예에서, VL 세그먼트는 사람 Vλ 세그먼트이고 사람 λ 경쇄 자리의 클러스터(cluster) A의 단편을 포함한다. 특정 구체예에서, 사람 λ 경쇄 자리의 클러스터 A의 단편은 hVλ3-27로부터 hVλ3-1을 통해 연장된다.
한 구체예에서, VL 세그먼트는 사람 λ 경쇄 자리의 클러스터 B의 단편을 포함한다. 특정 구체예에서, 사람 λ 경쇄 자리의 클러스터 B의 단편은 hVλ5-52로부터 hVλ1-40을 통해 연장된다.
한 구체예에서, VL 세그먼트는 클러스터 A의 게놈 단편 및 클러스터 B의 게놈 단편을 포함하는 사람 λ 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 사람 λ 경쇄 가변 영역 서열은 클러스터 A의 적어도 하나의 유전자 세그먼트 및 클러스터 B의 적어도 하나의 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 구체예에서, VL 세그먼트는 클러스터 B의 적어도 하나의 유전자 세그먼트 및 클러스터 C의 적어도 하나의 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 구체예에서, VL 세그먼트는 hVλ3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, 및 3-12를 포함한다. 특정 구체예에서, VL 세그먼트는 Vλ3-12로부터 Vλ3-1로 이어지는 사람 λ 경쇄 자리의 인접한 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 인접한 서열은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12개의 hVλ들을 포함한다. 특정 구체예에서, hVλ들은 3-1, 4-3, 2-8, 3-9, 3-10, 2-11, 및 3-12를 포함한다. 특정 구체예에서, hVλ들은 Vλ3-12로부터 Vλ3-1로 이어지는 사람 λ 자리의 인접한 서열을 포함한다.
한 구체예에서, hVλ들은 13 내지 28개 이상의 hVλ들을 포함한다. 특정 구체예에서, hVλ들은 2-14, 3-16, 2-18, 3-19, 3-21, 3-22, 2-23, 3-25, 및 3-27을 포함한다. 특정 구체예에서, hVλ들은 Vλ3-27로부터 Vλ3-1로 이어지는 사람 λ 자리의 인접한 서열을 포함한다.
한 구체예에서, VL 세그먼트는 29 내지 40개의 hVλ들을 포함한다. 특정 구체예에서, VL 세그먼트는 Vλ3-29로부터 Vλ3-1로 이어지는 사람 λ 자리의 인접한 서열, 및 Vλ5-52로부터 Vλ1-40으로 이어지는 사람 λ 자리의 인접한 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 유전적으로 변형된 마우스에서 hVλ1-40 및 hVλ3-29 사이의 모든 또는 실질적으로 모든 서열은 근본적으로 hVλ1-40 유전자 세그먼트의 다운스트림 (3' 비번역된 부분의 다운스트림)의 자연에서 발견된 대략 959 bp의 사람 λ 서열, 제한 효소 부위 (예를 들어, PI-SceI), 이어서, 자연에서 발견된 hVλ3-29 유전자 세그먼트의 대략 3,431 bp 업스트림의 사람 λ 서열로 구성된다.
한 구체예에서, Jκ는 사람이고 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, Jκ는 Jκ1 내지 Jκ5를 포함한다.
한 구체예에서, VL 세그먼트는 사람 Vλ 세그먼트이고, Jκ 유전자 세그먼트는 12-머 스페이서(spacer)를 갖는 RSS를 포함하며, RSS는 Jκ 유전자 세그먼트의 업스트림 끝에서 병치된다. 한 구체예에서, VL 유전자 세그먼트는 사람 Vλ이고 VLH 자리는 둘 이상의 Jκ 유전자 세그먼트를 포함하고, 각각은 12-머 스페이서를 갖는 RSS를 포함하며 RSS는 각각의 Jκ 유전자 세그먼트의 업스트림 끝에서 병치된다.
특정 구체예에서, VL 세그먼트는 사람 κ 자리가 Vκ4-1로부터 Vκ2-40으로 이어지는 인접한 사람 κ 유전자 세그먼트를 포함하고, JL 세그먼트는 사람 κ 자리가 Jκ1으로부터 Jκ5로 이어지는 인접한 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 구체예에서, VL 세그먼트가 Vλ 세그먼트이고 DH 세그먼트가 VL 세그먼트 및 J 세그먼트 사이에 존재하지 않는 경우, VL 세그먼트는 23-머 RSS와 함께 다운스트림에 플랭킹되고 (즉, 다운스트림 측면에 병치됨), Jκ 세그먼트는 존재하면 또는 Jλ 세그먼트는 존재하면 12-머 RSS와 함께 업스트림에 플랭킹된다 (즉, 업스트림 측면에 병치됨).
한 구체예에서, V 유전자 세그먼트가 Vκ 유전자 세그먼트이고 DH 유전자 세그먼트가 V 유전자 세그먼트 및 J 유전자 세그먼트 사이에 존재하지 않는 경우, Vκ 유전자 세그먼트는 각각 12-머 RSS와 함께 다운스트림 측면에 병치되고, Jκ 세그먼트는 존재하면 또는 Jλ 세그먼트는 존재하면 각각 23-머 RSS와 업스트림 측면에 병치된다.
한 구체예에서, 마우스는 VL 유전자 세그먼트, JL 유전자 세그먼트, 및 내인성 CH 유전자로부터 유래된 재배열된 유전자를 포함한다. 한 구체예에서, 재배열된 유전자는 체세포 돌연변이 된다. 한 구체예에서, 재배열된 유전자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 N 추가를 포함한다. 한 구체예에서, N 추가 및/또는 VL 세그먼트 및 JL 세그먼트로부터 유래된 재배열된 유전자에서 관찰된 체세포 돌연변이는 내인성 경쇄 자리에서 재배열된 재배열된 경쇄 가변 도메인 (같은 VL 유전자 세그먼트 및 같은 JL 유전자 세그먼트로부터 유래됨)에서 관찰된 N 추가 및/또는 체세포 돌연변이의 수보다 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 또는 적어도 5배 더 많다. 한 구체예에서, 재배열된 유전자는 원하는 항원에 특이적으로 결합하는 B 세포에 있으며, B 세포는 낮은 나노몰 범위 이하의 KD (예를 들어, 10 나노몰 이하의 KD)로 원하는 항원에 결합한다. 특정 구체예에서, VL 세그먼트, JL 세그먼트, 또는 둘 다는 사람 유전자 세그먼트이다. 특정 구체예에서, VL 및 JL 세그먼트는 사람 κ 유전자 세그먼트이다. 한 구체예에서, 마우스 CH 유전자는 IgM, IgD, IgG, IgA 및 IgE로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 마우스 IgG는 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG2C 및 IgG3로부터 선택된다. 또 다른 특정 구체예에서, 마우스 IgG는 IgG1이다.
한 구체예에서, 마우스는 B 세포를 포함하며, B 세포는 B 세포의 염색체 상의 자리로부터 발현하고, 결합 단백질은 근본적으로 네 개의 폴리펩티드 사슬로 구성되며, 네 개의 폴리펩티드 사슬은 근본적으로 (a) VL과 융합된 내인성 CH 영역을 포함하는 두 개의 동일한 폴리펩티드; 및, (b) 마우스 CH 영역과 융합된 VL 영역에 관하여 동족인 VL 영역과 융합된 내인성 CL 영역을 포함하는 두 개의 동일한 폴리펩티드로 구성되고, 한 구체예에서, 사람 (예를 들어, 사람 κ) VL 영역이다. 한 구체예에서, 내인성 CH 영역에 융합된 VL 영역은 사람 VL 영역이다. 특정 구체예에서, 마우스 CH 영역과 융합된 사람 VL 영역은 Vκ 영역이다. 특정 구체예에서, 마우스 CH 영역과 융합된 사람 VL 영역은 재배열된 사람 생식세포 계열 경쇄 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 V 영역과 동일하다. 특정 구체예에서, 마우스 CH 영역에 융합된 사람 VL 영역은 둘, 셋, 넷, 다섯, 여섯 개 이상의 체세포 초돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 마우스 CH 영역에 융합된 사람 VL 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 N 추가를 포함하는 재배열된 유전자에 의해 암호화된다.
한 구체예에서, 마우스에 의해 발현된 모든 IgG 분자 중 적어도 50%는 IgG 이소타입(isotype) CH 영역 및 VL 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함하며, 상기 폴리펩티드의 길이는 535, 530, 525, 520, 또는 515개의 아미노산 이내이다. 한 구체예에서, 모든 IgG 분자 중 적어도 75%는 이 단락에서 인용된 폴리펩티드를 포함한다. 한 구체예에서, 모든 IgG 분자 중 적어도 80%, 85%, 90%, 또는 95%는 이 단락에서 인용된 폴리펩티드를 포함한다. 특정 구체예에서, 마우스에 의해 발현된 모든 IgG 분자는 이 단락에서 인용된 폴리펩티드의 길이 이내인 폴리펩티드를 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 재배열된 사람 V 유전자 세그먼트 및 J 유전자 세그먼트에 의해 암호화되지만 DH 유전자 세그먼트에 의해서는 아닌, 가변 도메인과융합되는 내인성 CH 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드, 및 재배열된 사람 V 유전자 세그먼트 및 J 유전자 세그먼트에 의해 암호화되지만 DH 유전자 세그먼트에 의해서는 아닌, V 도메인과 융합된 내인성 CL 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함하는 결합 단백질을 발현하고, 결합 단백질은 마이크로몰, 나노몰, 또는 피코몰 범위의 친화도로 항원에 특이적으로 결합한다. 한 구체예에서, J 세그먼트는 사람 J 세그먼트 (예를 들어, 사람 κ 유전자 세그먼트)이다. 한 구체예에서, 사람 V 세그먼트는 사람 Vκ 세그먼트이다. 한 구체예에서, 내인성 CH 영역과 융합된 가변 도메인은 내인성 CL 영역과 융합된 가변 영역보다 더 많은 수의 체세포 초돌연변이를 포함한다; 특정 구체예에서, 내인성 CH 영역과 융합된 가변 영역은 내인성 CL 영역에 융합된 V 영역보다 약 1.5, 2-, 3-, 4-, 또는 5배 이상의 체세포 초돌연변이를 포함한다; 특정 구체예에서, 마우스 CH 영역과 융합된 V 영역은 마우스 CL 영역과 융합된 V 영역보다 적어도 6, 7, 8, 9, 10, 1 1, 12, 13, 14, 또는 15배 이상의 체세포 초돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 마우스 CH 영역과 융합된 V 영역은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 N 추가를 포함하는 재배열된 유전자에 의해 암호화된다.
한 구체예에서, 마우스는 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열과 융합된 제1 경쇄 가변 도메인 (VL1) 및 면역글로불린 경쇄 불변 영역과 융합된 제2 경쇄 가변 도메인 (VL2)을 포함하는 결합단백질을 발현하며, VL1은 VL2에 존재하는 체세포 초돌연변이의 수보다 약 1.5- 내지 약 5배 더 높거나 더 많은 체세포 초돌연변이의 수를 포함한다. 한 구체예에서, VL1에서 체세포 초돌연변이의 수는 VL2보다 약 2- 내지 약 4배 더 많다. 한 구체예에서, VL1에서 체세포 초돌연변이의 수는 VL2보다 약 2- 내지 약 3배 더 많다. 한 구체예에서, VL1는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 N 추가를 포함하는 서열에 의해 암호화된다.
한 양태에서, 근본적으로 다음 폴리펩티드로 구성된 면역글로불린을 발현하는 유전적으로 변형된 마우스가 제공된다: 근본적으로 VL 유전자 세그먼트 및 JL 유전자 세그먼트로 구성된 유전자 세그먼트로부터 유래된 가변 도메인과 융합된 CH 영역으로 각각 근본적으로 구성된 두 개의 동일한 제1 폴리펩티드, 및 근본적으로 VL 세그먼트 및 JL 세그먼트로 구성된 유전자 세그먼트로부터 유래된 가변 도메인과 융합된 CL 영역으로 각각 근본적으로 구성된 두 개의 동일한 제2 폴리펩티드.
특정 구체예에서, CH 영역을 갖고 있는 두 개의 동일한 폴리펩티드는 마우스 CH 영역을 갖는다.
특정 구체예에서, CL 영역을 갖고 있는 두 개의 동일한 폴리펩티드는 마우스 CL 영역을 갖는다.
한 구체예에서, CL 영역과 융합된 가변 도메인은 CH 영역에 융합된 가변 도메인과 동족인 가변 도메인이다.
한 구체예에서, 내인성 CH 영역과 융합된 가변 도메인은 내인성 CL 영역과 융합된 가변 도메인보다 더 많은 수의 체세포 초돌연변이를 포함한다; 특정 구체예에서, 내인성 CH 영역과 융합된 가변 도메인은 내인성 CL 영역에 융합된 가변 도메인보다 약 1.5배, 2배, 2.5배, 3배, 3.5배, 4배, 4.5배, 또는 5배 이상의 체세포 돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 내인성 CL 영역과 융합된 가변 도메인은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10개 이상의 N 추가를 포함하는 유전자에 의해 암호화된다.
한 구체예에서, V 세그먼트 및 J 세그먼트 중 하나 이상은 사람 유전자 세그먼트이다. 특정 구체예에서, V 세그먼트 및 J 세그먼트 둘 다는 사람 κ 유전자 세그먼트이다. 또 다른 특정 구체예에서, V 세그먼트 및 J 세그먼트 둘 다는 사람 λ 유전자 세그먼트이다. 한 구체예에서, V 세그먼트 및 J 세그먼트는 사람 및 사람 λ 유전자 세그먼트로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구체예에서, V 세그먼트는 Vκ 세그먼트이고 J 세그먼트는 Jλ 세그먼트이다. 또 다른 특정 구체예에서, V 세그먼트는 Vλ 세그먼트이고 J 세그먼트는 Jκ 세그먼트이다.
한 구체예에서, CL 영역과 융합된 가변 도메인 및 CH 영역과 융합된 가변 도메인 중 하나 이상은 사람 가변 도메인이다. 특정 구체예에서, 사람 가변 도메인은 사람 Vκ 도메인이다. 또 다른 특정 구체예에서, 사람 가변 도메인은 Vλ 도메인이다. 한 구체예에서, 사람 도메인은 사람 Vκ 및 사람 Vλ 도메인으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구체예에서, CL 영역과 융합된 사람 가변 도메인은 사람 V 도메인이고 CH 영역과 융합된 사람 가변 도메인은 사람 Vκ 도메인이다. 또 다른 구체예에서, CL 영역과 융합된 사람 가변 도메인은 사람 Vκ 도메인이고 CH와 융합된 사람 가변 도메인은 사람 Vλ 도메인이다.
한 구체예에서, 두 개의 동일한 제1 폴리펩티드의 VL 유전자 세그먼트는 사람 Vλ 세그먼트 및 사람 Vκ 세그먼트로부터 선택된다. 한 구체예에서, 두 개의 동일한 제2 폴리펩티드의 VL 세그먼트는 사람 Vλ 세그먼트 및 사람 Vκ 세그먼트로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 두 개의 동일한 제1 폴리펩티드의 VL 세그먼트는 사람 Vκ 세그먼트이고 두 개의 동일한 제2 폴리펩티드의 VL 세그먼트는 사람 Vκ 세그먼트 및 사람 Vλ 세그먼트로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 두 개의 동일한 제1 폴리펩티드의 VL 세그먼트는 사람 Vλ 세그먼트이고 두 개의 동일한 제2 폴리펩티드의 VL 세그먼트는 사람 Vλ 세그먼트 및 사람 Vκ 세그먼트로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 두 개의 동일한 제1 폴리펩티드의 사람 VL 세그먼트는 사람 Vκ 세그먼트이고, 두 개의 동일한 제2 폴리펩티드의 사람 VL 세그먼트는 사람 Vκ 세그먼트이다.
한 구체예에서, 마우스의 IgG는 항원에 반응하여 만들어진 결합 단백질을 포함하며, 결합 단백질은 근본적으로 가변 도메인 및 CH 영역으로 구성된 폴리펩티드를 포함하고, 가변 도메인은 근본적으로 재배열된 VL 세그먼트 및 재배열된 J 세그먼트로 구성된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되고, 결합 단백질은 마이크로몰, 나노몰, 또는 피코몰 범위의 KD로 항원의 에피토프에 특이적으로 결합한다.
한 양태에서, 마우스가 제공되며, 항원에 반응하여 마우스에 의해 만들어진 IgG 중 모두 또는 실질적으로 모두는 가변 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하고, 가변 도메인은 근본적으로 V 유전자 세그먼트 및 J 유전자 세그먼트로 구성된 유전자 세그먼트로부터 유래된 재배열된 유전자에 의해 암호화된다. 한 구체예에서, 재배열된 유전자는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 N 추가를 포함한다.
한 구체예에서, V 세그먼트는 경쇄의 V 세그먼트이다. 한 구체예에서, 경쇄는 κ 경쇄 및 λ 경쇄로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 경쇄는 κ 경쇄이다. 특정 구체예에서, V 세그먼트는 사람 V 세그먼트이다. 특정 구체예에서, V 세그먼트는 사람 Vκ 세그먼트 이고 J 세그먼트는 사람 Jκ 세그먼트이다.
한 구체예에서, J 세그먼트는 경쇄의 J 세그먼트이다. 한 구체예에서, 경쇄는 κ 경쇄 및 λ 경쇄로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 경쇄는 κ 경쇄이다. 특정 구체예에서, J 세그먼트는 사람 J 세그먼트이다. 또 다른 구체예에서, J 세그먼트는 중쇄 (즉, JH)의 J 세그먼트이다. 특정 구체예에서, 중쇄는 마우스 기원의 것이다. 또 다른 특정 구체예에서, 중쇄는 사람 기원의 것이다.
한 구체예에서, 단 V 세그먼트 및 J 세그먼트로만 만들어진 중쇄의 가변 도메인은 체세포 돌연변이된 가변 도메인이다.
한 구체예에서, 단 V 세그먼트 및 J 세그먼트로만 만들어진 중쇄의 가변 도메인은 마우스 CH 영역에 융합된다.
특정 구체예에서, 항원에 반응하여 마우스에 의해 만들어진 IgG 중 모두 또는 실질적으로 모두는 단 하나의 사람 V 세그먼트 및 단 하나의 사람 J 세그먼트로부터 유래된 가변 도메인을 포함하고, 가변 도메인은 마우스 IgG 불변 영역에 융합되며, IgG는 마우스 CL 영역과 융합된 사람 VL 도메인을 포함하는 경쇄를 더 포함한다. 특정 구체예에서, 마우스 CL 영역과 융합된 VL 도메인은 사람 Vκ 세그먼트 및 사람 Jκ 세그먼트로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 마우스 CL 영역과 융합된 VL 도메인은 사람 Vλ 세그먼트 및 사람 Jλ 세그먼트로부터 유래된다.
한 양태에서, CH 영역을 포함하는 폴리펩티드 상의 제1 CDR3 및 CL 영역을 포함하는 폴리펩티드 상의 제2 CDR3을 포함하는 IgG를 만드는 마우스가 제공되며, 제1 CDR3 및 제2 CDR3 둘 다는 각각 단 두 개의 유전자 세그먼트로부터 독립적으로 유래되며, 두 개의 유전자 세그먼트는 근본적으로 VL 유전자 세그먼트 및 JL 유전자 세그먼트로 구성된다. 한 구체예에서, CH 영역을 포함하는 폴리펩티드 상의 CDR3은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 N 추가를 포함하는 CDR3 뉴클레오티드 서열로부터 유래되는 서열을 포함한다.
한 구체예에서, VL 세그먼트 및 JL 세그먼트는 사람 유전자 세그먼트이다. 한 구체예에서, VL 세그먼트 및 JL 세그먼트는 κ 유전자 세그먼트이다. 한 구체예에서, VL 세그먼트 및 JL 세그먼트는 λ 유전자 세그먼트이다.
한 양태에서, CH 영역을 포함하는 제1 폴리펩티드 상의 제1 CDR3 및 CL 영역을 포함하는 제2 폴리펩티드 상의 제2 CDR3을 포함하는 IgG를 만드는 마우스가 제공되며, 제1 CDR3 및 제2 CDR3 둘 다는 각각 아미노산의 서열을 포함하고 아미노산의 75%는 V 유전자 세그먼트로부터 유래된다. 한 구체예에서, CH 영역을 포함하는 폴리펩티드 상의 CDR3은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 N 추가를 포함하는 CDR3 뉴클레오티드 서열로부터 유래된 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 제1 CDR3의 아미노산 중 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상, 및 제2 CDR3의 아미노산 중 80% 이상, 90% 이상, 또는 95% 이상은 경쇄 V 세그먼트로부터 유래된다.
한 구체예에서, 제1 CDR3의 단 두 개의 아미노산이 경쇄 V 세그먼트 이외의 유전자 세그먼트로부터 유래된다. 한 구체예에서, 제2 CDR3의 단 두 개의 아미노산은 경쇄 V 섹먼트 이외의 유전자 세그먼트로부터 유래된다. 특정 구체예에서, 제1 CDR3의 단 두 개의 아미노산 및 제2 CDR3의 단 두 개의 아미노산은 경쇄 V 세그먼트 이외의 유전자 세그먼트로부터 유래된다. 한 구체예에서, IgG의 CDR3은 D 유전자 세그먼트로부터 유래된 아미노산 서열을 포함하지 않는다. 한 구체예에서, 제1 폴리펩티드의 CDR3은 D 세그먼트로부터 유래된 서열을 포함하지 않는다.
한 구체예에서, V 세그먼트는 사람 V 유전자 세그먼트이다. 특정 구체예에서, V 세그먼트는 사람 Vκ 유전자 세그먼트이다.
한 구체예에서, 제1 및/또는 제2 CDR3은 적어도 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 또는 여섯 개의 체세포 초돌연변이를 갖는다. 한 구체예에서, 제1 CDR3은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 N 추가를 포함하는 핵산 서열에 의해 암호화된다.
한 구체예에서, 제1 CDR3은 근본적으로 사람 경쇄 V 유전자 세그먼트 및 사람 경쇄 J 유전자 세그먼트로부터 유래된 아미노산으로 구성되고, 제2 CDR3은 근본적으로 사람 경쇄 V 유전자 세그먼트 및 사람 경쇄 J 유전자 세그먼트로부터 유래된 아미노산으로 구성된다. 한 구체예에서, 제1 CDR3은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 N 추가를 포함하는 핵산 서열로부터 유래된다. 한 구체예에서, 제1 CDR3은 단 두 개의 유전자 세그먼트로부터 유래되며, 단 두 개의 유전자 세그먼트는 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 사람 Jκ 유전자 세그먼트이고; 제2 CDR3은 단 두 개의 유전자 세그먼트로부터 유래되며, 단 두 개의 유전자 세그먼트는 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 사람 Jκ 세그먼트, 사람 Jλ 세그먼트, 및 사람 JH 세그먼트로부터 선택된 J 유전자 세그먼트이다. 한 구체예에서, 제1 CDR3은 단 두 개의 유전자 세그먼트로부터 유래되며, 단 두 개의 유전자 세그먼트는 선택된 사람 Vλ 세그먼트 및 사람 Jκ 세그먼트, 사람 Jλ 세그먼트, 및 사람 JH 세그먼트로부터 J 세그먼트이다.
한 양태에서, DH 유전자 세그먼트로부터 유래된 아미노산 서열을 함유하지 않는 IgG를 만드는 마우스가 제공되며, IgG는 마우스 CL 영역과 융합된 제1 VL 도메인을 갖는 제1 폴리펩티드 및 마우스 CH 영역과 융합된 제2 VL 도메인을 갖는 제2 폴리펩티드를 포함하고, 제1 VL 도메인 및 제2 VL 도메인은 동일하지 않다. 한 구체예에서, 제1 및 제2 VL 도메인은 다른 V 세그먼트로부터 유래된다. 또 다른 구체예에서, 제1 및 제2 VL 도메인은 다른 J 세그먼트로부터 유래된다. 한 구체예에서, 제1 및 제2 VL 도메인은 동일한 V 및 J 세그먼트로부터 유래되며, 제2 VL 도메인은 제1 VL 도메인과 비교하여 더 많은 수의 체세포 초돌연변이를 포함한다.
한 구체예에서, 제1 및 제2 VL 도메인은 사람 및 마우스 VL 도메인으로부터 독립적으로 선택된다. 한 구체예에서, 제1 및 제2 VL 도메인은 Vκ 및 Vλ 도메인으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 구체예에서, 제1 VL 도메인은 Vκ 도메인 및 Vλ 도메인으로부터 선택되고, 제2 VL 도메인은 Vκ 도메인이다. 또 다른 특정 구체예에서, Vκ 도메인은 사람 Vκ 도메인이다.
한 양태에서, 마우스가 제공되며, 마우스에 의해 만들어진 IgG 중 모두 또는 실질적으로 모두는 근본적으로 마우스 CL 도메인과 융합된 제1 사람 VL 도메인을 갖는 경쇄, 및 마우스 CH 도메인과 융합된 제2 사람 VL 도메인을 갖는 중쇄로 구성된다.
한 구체예에서, 마우스 CH 도메인과 융합된 사람 VL 도메인은 사람 Vκ 도메인이다.
한 구체예에서, 제1 및 제2 사람 VL 도메인은 동일하지 않다.
한 양태에서, 마우스가 제공되며, 마우스에 의해 만들어진 면역글로불린 G 중 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 또는 약 100%는 근본적으로 (a) 근본적으로 면역글로불린 VL 도메인 및 면역글로불린 CL 영역으로 구성된 제1 폴리펩티드; 및 (b) 길이가 단 535 아미노산인 제2 폴리펩티드의 다이머로 구성되며, 제2 폴리펩티드는 근본적으로 CH 영역 및 DH 유전자 세그먼트로부터 유래된 서열이 결핍된 V 도메인으로 구성된다.
한 구체예에서, 제2 폴리펩티드는 길이가 약 435-535 아미노산이다. 특정 구체예에서, 제2 폴리펩티드는 길이가 약 435-530 아미노산이다. 특정 구체예에서, 제2 폴리펩티드는 길이가 약 435-525 아미노산이다. 특정 구체예에서, 제2 폴리펩티드는 길이가 약 435-520 아미노산이다. 특정 구체예에서, 제2 폴리펩티드는 길이가 약 435-515 아미노산이다.
한 구체예에서, 마우스에 의해 만들어진 IgG 중 약 90% 이상에서 제2 폴리펩티드는 길이가 단 약 535 아미노산이다.
한 구체예에서, 마우스에 의해 만들어진 IgG 중 약 50% 이상에서 제2 폴리펩티드는 길이가 단 약 535 아미노산이다. 한 구체예에서, 마우스에 의해 만들어진 면역글로불린 G 중 약 50% 이상에서 제2 폴리펩티드는 길이가 단 약 530, 525, 520, 515, 510, 505, 500, 495, 490, 485, 480, 475, 470, 465, 460, 455, 또는 450 아미노산이다. 한 구체예에서, 마우스에 의해 만들어진 IgG 중 약 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95 % 이상은 인용된 길이의 것이다. 특정 구체예에서, 마우스에 의해 만들어진 IgG 중 모두 또는 실질적으로 모두는 인용된 길이의 것이다.
한 구체예에서, 제2 폴리펩티드의 V 도메인은 VL 도메인이다. 특정 구체예에서, 제2 폴리펩티드의 V 도메인은 Vκ 및 Vλ 도메인으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 제2 폴리펩티드의 V 도메인은 사람 Vκ 또는 Vλ 도메인이다.
한 양태에서, 생식세포 계열의 뉴클레오티드 서열로부터 경쇄 가변 서열 (예를 들어, V 및/또는 J 서열), DH 서열, 및 중쇄 불변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 마우스가 제공된다.
한 구체예에서, 마우스는 내인성 중쇄 자리에서 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 내인성 중쇄 가변 자리 유전자 세그먼트의 복수의 사람 유전자 세그먼트로의 대체를 포함하는 내인성 중쇄 자리로부터 폴리펩티드를 발현한다.
한 구체예에서, 폴리펩티드는 Vλ 또는 Vκ 유전자 세그먼트로부터 유래된 VL 서열을 포함하고, 폴리펩티드는 DH 유전자 세그먼트로부터 유래된 CDR3을 포함하고, 폴리펩티드는 JH 또는 Jλ 또는 Jκ 유전자 세그먼트로부터 유래된 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 모든 기능적 VH 유전자 세그먼트의 하나 이상의 사람 경쇄 Vλ 유전자 세그먼트로의 대체를 포함하는 내인성 중쇄 면역글로불린 자리를 포함하며, 하나 이상의 사람 V 세그먼트 각각은 다운스트림 측면에서 23-머 간격 재조합 신호 서열 (RSS)을 병치하고, Vλ 세그먼트는 업스트림 및 다운스트림에 12-머 간격 RSS를 병치한 사람 또는 마우스 DH 세그먼트에 작동 가능하게 결합되고; DH 유전자 세그먼트는 DH 유전자 세그먼트를 병치하는 12-머 간격 RSS와의 재조합에 적합한 23-머 간격 RSS와 함께 업스트림에 병치된 J 세그먼트와 작동 가능하게 결합되며; V, DH, 및 J 세그먼트는 중쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 결합된다.
한 구체예에서, 마우스는 모든 기능적 VH 유전자 세그먼트의 각각 12-머 간격 재조합 신호 서열 (RSS)과 함께 다운스트림에 병치된 하나 이상의 사람 Vκ 유전자 세그먼트로의 대체를 포함하는 내인성 중쇄 면역글로불린 자리를 포함하며, V 세그먼트는 23-머 간격 RSS와 함께 업스트림 및 다운스트림 둘 다에 병치된 사람 또는 마우스 DH 세그먼트에 작동 가능하게 결합되고; DH 세그먼트는 DH 세그먼트를 병치하는 23-머 간격 RSS와의 재조합에 적합한 12-머 간격 RSS와 함께 업스트림에 병치된 J 세그먼트와 작동 가능하게 결합되며; V, DH, 및 유전자 세그먼트는 중쇄 불변 영역을 암호화하는 핵산 서열에 작동 가능하게 결합된다.
한 구체예에서, 중쇄 불변 영역은 내인성 중쇄 불변 영역이다. 한 구체예에서, 핵산 서열은 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택된 서열을 암호화한다. 한 구체예에서, CH1, 힌지, CH2, 및 CH3 중 하나 이상은 사람이다.
한 구체예에서, 마우스는 모든 기능적 VH 유전자 세그먼트의 23-머 간격 RSS와 함께 다운스트림에 각각 병치된 복수의 사람 Vλ 또는 Vκ 유전자 세그먼트, 12-머 간격 RSS에 의해 업스트림 및 다운스트림 둘 다에 병치된 복수의 사람 DH 세그먼트, 23-머 간격 RSS과 함께 업스트림 및 다운스트림 둘 다에 병치된 복수의 사람 J 세그먼트 (JH 또는 Jλ 또는 Jκ)로의 대체를 포함하는 내인성 중쇄 면역글로불린 자리를 포함하며, 자리는 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택된 내인성 불변 영역 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 사람 Vλ 또는 Vκ 세그먼트, 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 사람 DH 세그먼트, 및 모든 또는 실질적으로 모든 JH 또는 Jλ 또는 Jκ 세그먼트를 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 (a) 마우스 서열을 포함하는 중쇄 불변 서열에 결합된 사람 경쇄 서열을 포함하는 폴리펩티드; 및 (b) 사람 또는 마우스 경쇄 불변 서열에 결합된 사람 경쇄 가변 영역을 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 항원-결합 단백질을 발현한다. 특정 구체예에서, 경쇄 서열은 사람 경쇄 서열이고, 항체를 Fc 및 Fab로 분할할 수 있는 프로테아제에 노출시, 적어도 네 개의 경쇄 CDR을 포함하는 완벽한 사람 Fab가 형성되며, 적어도 네 개의 경쇄 CDR은 λ 서열, κ 서열, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 한 구체예에서, Fab는 적어도 다섯 개의 경쇄 CDR을 포함한다. 한 구체예에서, Fab는 여섯 개의 경쇄 CDR을 포함한다. 한 구체예에서, Fab의 적어도 하나의 CDR은 Vλ 세그먼트 또는 Vκ 세그먼트로부터 유래된 서열을 포함하고, 적어도 하나의 CDR은 D 세그먼트로부터 유래된 서열을 더 포함한다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 CDR은 CDR3이고 CDR은 사람 Vκ 세그먼트, 사람 D 세그먼트, 및 사람 Jκ 세그먼트로부터 유래된다.
한 구체예에서, 폴리펩티드는 사람 V 또는 Vκ 유전자 세그먼트, 사람 DH 유전자 세그먼트, 및 사람 JH 또는 J 또는 Jκ 유전자 세그먼트로부터 유래된 가변 영역을 포함한다. 특정 구체예에서, 중쇄 불변 서열은 사람 CH1 및 마우스 CH2 및 마우스 CH3 서열로부터 유래된다.
한 양태에서, 마우스는 생식세포 계열에서 사람 J 유전자 세그먼트 및 중쇄 불변 영역 서열에 작동 가능하게 결합된 재배열되지 않은 사람 Vκ 또는 Vλ 유전자 세그먼트를 포함하는 마우스가 제공되며, 마우스는 중쇄 불변 영역과 융합된 사람 Vκ 도메인 및 경쇄 불변 도메인와 융합된 사람 VL 도메인을 포함하는 VL 결합 단백질을 발현한다. 한 구체예에서, 사람 VL 도메인은 사람 Vκ 및 사람 Vλ 유전자 세그먼트로부터 선택된 재배열된 사람 VL 유전자 세그먼트를 포함한다. 특정 구체예에서, 사람 VL 도메인은 사람 Jκ 및 사람 Jλ 유전자 세그먼트로부터 선택된 재배열된 사람 JL 유전자 세그먼트를 더 포함한다.
한 양태에서, 생식세포에서 변형된 내인성 중쇄 자리로부터 면역글로불린 단백질을 발현하는 마우스가 제공되며, 변형된 내인성 중쇄 자리는 기능적 마우스 중쇄 V 유전자 세그먼트가 결핍되고 자리는 재배열되지 않은 경쇄 V 유전자 세그먼트 및 재배열되지 않은 J 유전자 세그먼트를 포함하며, 재배열되지 않은 경쇄 V 유전자 세그먼트 및 재배열되지 않은 J 유전자 세그먼트는 중쇄 불변 영역 서열과 작동 가능하게 결합되고; 면역글로불린 단백질은 근본적으로 제1 폴리펩티드 및 제2 폴리펩티드로 구성되며, 제1 폴리펩티드는 면역글로불린 경쇄 서열 및 면역글로불린 중쇄 불변 서열을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 및 경쇄 불변 영역을 포함한다.
한 양태에서, 면역글로불린 단백질을 발현하는 마우스가 제공되며, 면역글로불린 단백질은 중쇄 면역글로불린 가변 도메인이 결핍되고, 면역글로불린 단백질은 경쇄 유전자로부터 유래된 제1 가변 도메인, 및 경쇄 유전자로부터 유래된 제2 가변 도메인을 포함하며, 제1 가변 도메인 및 제2 가변 도메인은 서로에 관하여 동족이고, 제1 및 제2 경쇄 가변 도메인은 동일하지 않고, 제1 및 제2 경쇄 가변 도메인은 결합하고 결합될 때 원하는 항원에 특이적으로 결합한다.
한 양태에서, 생식계열에서 재배열되지 않은 유전자 세그먼트로부터 근본적으로 재배열되지 않은 사람 유전자 세그먼트로 구성된 유전자 세그먼트로부터 전적으로 유래된 가변 영역을 포함하는 면역글로불린 단백질을 발현하는 마우스가 제공되며, 면역글로불린 단백질은 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택된 면역글로불린 경쇄 불변 서열 및 면역글로불린 중쇄 불변 서열을 포함한다.
한 양태에서, 생식계열에서 재배열되지 않은 유전자 세그먼트로부터 가변 영역을 포함하는 면역글로불린 단백질을 발현하는 마우스가 제공되며, 모든 가변 영역의 모든 CDR3은 완전히 경쇄 V 및 J 유전자 세그먼트, 및 선택적으로 하나 이상의 체세포 초돌연변이, 예를 들어, 하나 이상의 N 추가로부터 생성된다.
한 양태에서, 마우스의 생식계열에서 재배열되지 않은 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트로부터 유래된 체세포 돌연변이된 면역글로불린 단백질을 발현하는 마우스가 제공되며, 면역글로불린 단백질은 경쇄 불변 영역과 융합된 경쇄 가변 도메인 상의 제1 CDR3을 포함하고, 중쇄 불변 영역과 융합된 경쇄 가변 도메인 상의 제2 CDR3을 포함하며, 제2 CDR은 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개 이상의 N 추가를 포함하는 재배열된 경쇄 가변 영역 서열로부터 유래된다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같은 마우스가 제공되며, 마우스는 λ 자리, κ 자리, 및 이들의 조합으로부터 선택된 기능적으로 침묵된 경쇄 자리를 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는, 전체적으로 또는 부분적으로, λ 및/또는 κ 자리의 결실을 포함하고 이로 인해 λ 및/또는 κ 자리는 비기능적이다.
한 양태에서, 마우스 배아가 제공되며, 본원에서 설명된 바와 같은 변형된 면역글로불린 자리를 포함하는 세포를 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 키메라이고 배아의 세포 중 적어도 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95%는 본원에서 설명된 바와 같은 변형된 면역글로불린 자리를 포함한다. 한 구체예에서, 배아의 세포 중 적어도 96%. 97%, 98%, 99%, 또는 99.8%는 본원에서 설명된 바와 같은 변형된 면역글로불린 자리를 포함한다. 한 구체예에서, 배아는 숙주 세포 및 기증자 ES 세포로부터 유래된 세포를 포함하며, 기증자 ES 세포로부터 유래된 세포는 본원에서 설명된 바와 같은 변형된 면역글로불린 자리를 포함한다. 한 구체예에서, 배아는 2-, 4-, 8, 16-, 32, 또는 64-세포 단계 숙주 배아, 또는 배반포(blastocyst)이며, 본원에서 설명된 바와 같은 변형된 면역글로불린 자리를 포함하는 기증자 ES 세포를 더 포함한다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같은 핵산 구조를 사용하여 만들어진 마우스 또는 세포가 제공된다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같은 세포를 사용하여 만들어진 마우스가 제공된다. 한 구체예에서, 세포는 마우스 ES 세포이다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같은 유전적 변형을 포함하는 마우스 세포 및 마우스 배아가 제공되며, ES 세포, 만능 세포 (pluripotent cell), 및 유도 만능 세포 (induced pluripotent cell)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. XX인 세포 및 XY인 세포가 제공된다. 본원에 설명된 바와 같은 변형, 예를 들어, 전핵 주입에 의해 세포로 도입된 변형을 함유하는 핵을 포함하는 세포가 또한 제공된다. 바이러스에 의해 도입된 ADAM6 유전자를 포함하는 세포, 배아, 및 마우스, 예를 들어, 마우스에서 기능적인 ADAM6 유전자를 포함하는 형질도입 구조를 포함하는 세포, 배아, 및 마우스가 또한 제공된다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같은 마우스로부터 유도된 세포 또는 조직이 제공된다. 한 구체예에서, 세포 또는 조직은 본원에서 설명된 바와 같은 마우스의 비장, 림프절 또는 골수로부터 유래된다. 한 구체예에서, 세포는 B 세포이다. 한 구체예에서, 세포는 배아 줄기 세포이다. 한 구체예에서, 세포는 생식세포이다.
한 구체예에서, 조직은 연결 조직, 근육 조직, 신경 조직 및 상피 조직으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 조직은 생식 조직이다.
한 구체예에서, 본원에서 설명된 바와 같은 마우스로부터 유래된 세포 및/또는 조직은 하나 이상의 생체 외 (ex vivo) 검정에서의 사용을 위해 분리된다. 다양한 구체예에서, 하나 이상의 생체 외 검정은 물리적, 열적, 전기적, 기계적 또는 광학적 속성의 측정, 수술 절차, 다른 조직 타입의 상호작용의 측정, 이미징(imaging) 기술의 개발, 또는 이들의 조합을 포함한다.
양태에서, 항체를 만들기 위해 본원에서 설명된 바와 같은 마우스로부터 유래된 세포 또는 조직의 사용법이 제공된다. 한 양태에서, 히브리도마(hybridoma) 또는 콰드로마(quadroma)를 만들기 위해 본원에서 설명된 바와 같은 마우스로부터 유래된 세포 또는 조직의 사용법이 제공된다.
한 양태에서, 비-사람 세포는 본원에 설명된 바와 같이 비-사람 동물의 염색체 또는 이들의 단편을 포함한다. 한 구체예에서, 비-사람 세포는 본원에서 설명된 바와 같이 비-사람 동물의 핵을 포함한다. 한 구체예에서, 비-사람 세포는 핵 이식의 결과로서 염색체 또는 이들의 단편을 포함한다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같은 마우스로부터 유래된 핵이 제공된다. 한 구체예에서, 핵은 B 세포가 아닌 2배체 세포로부터 온다.
한 양태에서, 유전적으로 변형된 마우스 세포가 제공되며, 세포는 재배열된 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자 세그먼트를 포함하는 중쇄를 발현할 수 없고, 세포는 마우스 ADAM6 단백질 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하는 기능적 ADAM6 유전자를 포함한다. 한 구체예에서, 세포는 사람 면역글로불린 경쇄 유전자 세그먼트의 삽입을 더 포함한다. 특정 구체예에서, 사람 면역글로불린 경쇄 유전자 세그먼트는 재배열시 마우스 중쇄 불변 도메인에 융합된 기능적 경쇄 가변 도메인을 암호화하는 마우스 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 결합되는 Vκ 및/또는 Jκ 유전자 세그먼트이다.
한 양태에서, 유전적으로 변형된 마우스 세포가 제공되며; 세포는 기능적 내인성 ADAM6 자리가 결핍되고, 세포는 마우스 ADAM6을 암호화하는 이소성 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 세포는 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열의 변형을 더 포함한다. 특정 구체예에서, 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열의 변형은 마우스 VH 유전자 세그먼트의 결실, 마우스 DH 유전자 세그먼트의 결실, 마우스 JH 유전자 세그먼트의 결실, 및 이들의 조합로부터 선택된 결실을 포함한다. 특정 구체예에서, 마우스는 하나 이상의 마우스 면역글로불린 VH, DH, 및/또는 JH 서열의 사람 면역글로불린 서열로의 대체를 포함한다. 특정 구체예에서, 사람 면역글로불린 서열은 사람 VH, 사람 VL, 사람 DH, 사람 JH, 사람 JL, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 세포는 전분화능 세포(totipotent cell), 만능 세포, 또는 유도 만능 세포이다. 특정 구체예에서, 세포는 마우스 ES 세포이다.
한 양태에서, 마우스 B 세포가 제공되며, 마우스 B 세포는 재배열된 면역글로불린 유전자를 포함하며, B 세포는 B 세포의 염색체 상에서 ADAM6 단백질 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 수컷 마우스에서 기능적인 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 마우스 B 세포는 핵산 서열의 두 개의 대립 유전자를 포함한다. 한 구체예에서, 재배열된 면역글로불린 유전자는 중쇄 불변 서열과 인접한 재배열된 면역글로불린 경쇄 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 경쇄 서열은 κ 서열이다; 한 구체예에서, 경쇄 서열은 λ 서열이다.
한 구체예에서, 핵산 서열은 재배열된 마우스 중쇄 면역글로불린 자리와 인접한 핵산 분자 (예를 들어, B 세포 염색체) 상에 있다.
한 구체예에서, 핵산 서열은 재배열된 마우스 중쇄 면역글로불린 자리를 포함하는 핵산 분자와는 다른 핵산 분자 (예를 들어, B 세포 염색체) 상에 있다.
한 구체예에서, 마우스 B 세포는 마우스 또는 사람 중쇄 면역글로불린 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 결합된 재배열된 비-마우스 경쇄 면역글로불린 가변 영역 서열을 포함하며, B 세포는 ADAM6 단백질 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 수컷 마우스에서 기능적인 단편을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다.
한 양태에서, 마우스 체세포가 제공되며, 마우스 ADAM6 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 수컷 마우스에서 기능적인 단편을 암호화하는 변형된 면역글로불린 중쇄 자리, 및 핵산 서열을 포함하는 염색체를 포함한다. 한 구체예에서, 핵산 서열은 변형된 면역글로불린 중쇄 자리와 같은 염색체 상에 있다. 한 구체예에서, 핵산은 변형된 면역글로불린 중쇄 자리와 다른 염색체 상에 있다. 한 구체예에서, 체세포는 핵산 서열의 단일 카피를 포함한다. 한 구체예에서, 체세포는 핵산 서열의 적어도 두 카피를 포함한다. 특정 구체예에서, 체세포는 B 세포이다. 한 구체예에서, 변형된 면역글로불린 중쇄 자리는 중쇄 불변 영역 서열에 작동 가능하게 결합된 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 양태에서, 생식 세포의 염색체 상에서 마우스 ADAM6 (또는 상동체 또는 오솔로그 또는 이들의 기능적 단편)을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 마우스 생식 세포가 제공되며, 마우스 ADAM6 (또는 상동체 또는 오솔로그 또는 이들의 기능적 단편)을 암호화하는 핵산 서열은 야생형 마우스 생식 세포의 염색체의 위치와 다른 염색체의 위치에 있고, 중쇄 불변 영역 서열에 작동 가능하게 결합된 재배열되지 않은 경쇄 면역글로불린 유전자 세그먼트 (Vκ 및/또는 Vλ 및/또는 Vκ 및 Jκ 및/또는 Vλ 및 Jλ)를 포함하는 변형을 더 포함한다. 한 구체예에서, 핵산 서열은 마우스 면역글로불린 자리에 있다. 한 구체예에서, 핵산 서열은 마우스 면역글로불린 자리와, 생식 세포의 같은 염색체 상에 있다. 한 구체예에서, 핵산 서열은 마우스 면역글로불린 자리와, 생식 세포의 다른 염색체 상에 있다. 한 구체예에서, 마우스 면역글로불린 자리는 적어도 하나의 마우스 면역글로불린 서열의 적어도 하나의 비-마우스 면역글로불린 서열로의 대체를 포함한다. 특정 구체예에서, 적어도 하나의 비-마우스 면역글로불린 서열은 사람 면역글로불린 서열이다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같은 마우스로부터 유래된 만능 세포, 유도 만능 세포, 또는 전분화능 세포가 제공된다. 특정 구체예에서, 세포는 마우스 배아 줄기 (ES) 세포이다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같은 변형된 면역글로불린 자리를 포함하는 세포가 제공된다. 한 구체예에서, 세포는 전분화능 세포, 만능 세포, 유도 만능 줄기 세포 (iPS), 및 ES 세포로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 세포는 마우스 세포, 예를 들어, 마우스 ES 세포이다. 한 구체예에서, 세포는 변형된 면역글로불린 자리에 대한 동형 접합체이다.
한 양태에서, 사람 중쇄 불변 영역 서열에 융합된 제1 체세포 돌연변이된 제1 체세포 돌연변이된 사람 Vκ 또는 Vλ 서열을 포함하는 제1 폴리펩티드를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 세포가 제공된다.
한 구체예에서, 세포는 사람 경쇄 불변 영역 서열에 융합된 제2 체세포 돌연변이된 사람 Vκ 또는 Vλ 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드 사슬을 더 포함한다.
한 구체예에서, 제1 폴리펩티드의 사람 Vκ 또는 Vλ 서열은 제2 폴리펩티드의 사람 Vκ 또는 Vλ 서열과 동족이다.
한 구체예에서, 제1 폴리펩티드의 Vκ 또는 Vλ 및 제2 폴리펩티드의 사람 Vκ 또는 Vλ는 결합될 때 원하는 항원에 특이적으로 결합한다. 특정 구체예에서, 제1 폴리펩티드는 근본적으로 사람 Vκ로 구성된 가변 도메인을 포함하고, 제2 폴리펩티드는 제1 폴리펩티드의 사람 Vκ와 동족인 사람 Vκ 로 구성된 가변 도메인을 포함하며, 사람 불변 영역 서열은 IgG 서열이다.
한 구체예에서, 세포는 CHO 세포, COS 세포, 293 세포, HeLa 세포, 및 바이러스 핵산 서열을 발현하는 사람 망막 세포 (예를 들어, PERC.6™ 세포)로부터 선택된다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같은 유전적 변형을 포함하는 염색체를 포함하는 설치류 (예를 들어, 마우스) 체세포가 제공된다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같은 유전적 변형을 포함하는 핵산 서열을 포함하는 설치류 (예를 들어, 마우스) 생식 세포가 제공된다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같이 설치류 (예를 들어, 마우스)로부터 유래된 만능 세포, 유도 만능 세포, 또는 전분화능 세포가 제공된다. 특정 구체예에서, 세포는 마우스 배아 줄기 (ES) 세포이다.
한 양태에서, 설치류 (예를 들어, 마우스), 세포, 또는 치료 단백질 (예를 들어, 항체 또는 다른 항원-결합 단백질)의 제작을 위해 본원에서 설명된 바와 같은 세포의 사용법이 제공된다. 한 구체예에서, 치료 단백질의 제작을 위해 본원에서 설명 된 바와 같은 세포가 제공되며, 치료 단백질은 사람 가변 도메인을 포함한다. 특정 구체예에서, 사람 가변 도메인은 재배열된 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같은 표적화 벡터, 뉴클레오티드 구조, 또는 세포를 사용하여 만들어진 설치류 (예를 들어, 마우스)가 제공된다.
한 양태에서, 설치류 (예를 들어, 마우스) 또는 세포 (예를 들어, 마우스 ES 세포, 마우스 섬유아세포, 등)의 제작을 위해 본원에서 설명된 바와 같은 표적화 벡터의 사용법이 제공된다. 한 구체예에서, 표적화 벡터는 재배열되지 않은 면역글로불린 유전자 세그먼트를 함유하는 사람 게놈 단편을 포함한다. 특정 구체예에서, 재배열되지 않은 면역글로불린 유전자 세그먼트는 V 및 J 유전자 세그먼트를 포함한다. 특정 구체예에서, 재배열되지 않은 면역글로불린 유전자 세그먼트는 V, D 및 J 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 양태에서, 업스트림 상동성 팔 및 다운스트림 상동성 팔을 포함하는 핵산 구조가 제공되며, 업스트림 상동성 팔은 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역 서열과 동일한 또는 실질적으로 동일하고, 업스트림 및 다운스트림 사이에 배치된 서열을 포함하며 상동성 팔은 마우스 ADAM6 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 서열이다. 특정 구체예에서, 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 서열은 마우스 ADAM6이 야생형 마우스에서 결합되는 마우스 프로모터와 작동 가능하게 결합된다.
한 양태에서, (a) 사람 가변 영역 유전자 세그먼트 뉴클레오티드 서열과 동일한 또는 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열; 및, (b) 마우스에서 기능적인 마우스 ADAM6 또는 오솔로그 또는 상동체 또는 이들의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 표적화 벡터가 제공된다.
한 구체예에서, 표적화 벡터는 마우스 ADAM6을 암호화하는 서열에 작동 가능하게 결합된 프로모터를 더 포함한다. 특정 구체예에서, 프로모터는 마우스 ADAM6 프로모터이다.
한 양태에서, 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 자리를 변형시키기 위한 뉴클레오티드 구조가 제공되며, 구조는 적어도 하나의 부위-특이적 리콤비나제 인식 부위 및 ADAM6 단백질 또는 오솔로그 또는 상동체 또는 마우스에서 기능적인 이들의 단편을 암호화하는 서열을 포함한다.
한 양태에서, 23-머 간격 RSS와 함께 업스트림 및 다운스트림에 병치된 사람 오 유전자 세그먼트를 포함하는 핵산 구조가 제공된다. 특정 구체예에서, 핵산 구조는 사람 Vκ 유전자 세그먼트를 포함하는 사람 게놈 서열에 상동성인 상동성 팔을 포함한다. 한 구체예에서, 표적 구조는 23-머 간격 RSS와 함께 업스트림 및 다운스트림에 각각 병치된 모든 또는 실질적으로 모든 사람 DH 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 양태에서, 12-머 간격 RSS와 함RP 업스트림에 배치된 사람 Jκ 유전자 세그먼트를 포함하는 핵산 구조가 제공된다. 특정 구체예에서, 핵산 구조는 23-머 간격 RSS와 함께 업스트림 및 다운스트림에 병치된 사람 게놈 DH 유전자 서열에 대한 상동성을 함유하는 제1 상동성 팔을 포함한다. 한 구체예에서, 핵산 구조는 사람 게놈 J 유전자 서열에 대한 상동성을 함유하거나 마우스 중쇄 불변 영역 서열에 대한 상동성을 함유하거나 마우스 불변 영역 중쇄 서열의 업스트림에서 J-C 유전자간 서열에 대한 상동성을 함유하는 제2 상동성 팔을 포함한다.
한 양태에서, 23-머 간격 RSS와 함께 다운스트림에 병치된 사람 V 세그먼트, 12-머 간격 RSS와 함께 업스트림 및 다운스트림에 병치된 사람 DH 세그먼트, 및 23-머 간격 RSS와 함께 업스트림에 병치된 Jκ 세그먼트, 23-머 간격 RSS와 함께 업스트림에 병치된 사람 Jλ 세그먼트, 및 23-머 간격 RSS와 함께 업스트림에 병치된 사람 JH 세그먼트로부터 선택된 사람 J 세그먼트를 포함하는 핵산 구조가 제공된다. 한 구체예에서, 구조는 마우스 불변 영역 서열, J-C 유전자간 마우스 서열, 및/또는 사람 Vλ 서열에 대한 상동성을 함유하는 상동성 팔을 포함한다.
한 구체예에서, 핵산 구조는 사람 λ 경쇄 자리의 클러스터 A의 단편을 포함하는 사람 λ 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 사람 λ 경쇄 자리의 클러스터 A의 단편은 hVλ3-27로부터 hVλ3-1을 통해 연장된다.
한 구체예에서, 핵산 구조는 사람 λ 경쇄 자리의 클러스터 B의 단편을 포함하는 사람 λ 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 사람 λ 경쇄 자리의 클러스터 B의 단편은 hVλ5-52로부터 hVλ1-40을 통해 연장된다.
한 구체예에서, 핵산 구조는 클러스터 A의 게놈 단편 및 클러스터 B의 게놈 단편을 포함하는 사람 λ 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 사람 λ 경쇄 가변 영역 서열은 클러스터 A의 적어도 하나의 유전자 세그먼트 및 클러스터 B의 적어도 하나의 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 구체예에서, 사람 λ 경쇄 가변 영역 서열은 클러스터 B의 적어도 하나의 유전자 세그먼트 및 클러스터 C의 적어도 하나의 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 양태에서, Jκ, JH, Vλ, 또는 VH 세그먼트를 플랭킹하는, 자연에서 발견된 23-머 간격 RSS와 함께 업스트림 및 다운스트림에 병치된 사람 DH 세그먼트를 포함하는 핵산 구조가 제공된다. 한 구체예에서, 핵산 구조는 사람 V-J 유전자간 영역에 대하여 상동성 또는 사람 V 유전자 세그먼트를 포함하는 사람 게놈 서열에 대하여 상동성인 제1 상동성 팔을 포함한다. 한 구체예에서, 사람 또는 마우스 중쇄 불변 영역 서열에 대하여 상동성인 제2 상동성 팔을 포함한다. 특정 구체예에서, 사람 또는 마우스 중쇄 불변 영역 서열은 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 한 구체예에서, 핵산 구조는 12-머 RSS와 함께 업스트림에 플랭킹된 사람 J 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 핵산 구조는 12-머 RSS와 함께 업스트림에 플랭킹된 J 유전자 세그먼트에 대한 상동성을 함유하는 제2 상동성 팔을 포함한다. 한 구체예에서, J 유전자 세그먼트는 사람 Jκ, 사람 Jλ, 및 사람 JH로부터 선택된다.
한 양태에서, 23-머 간격 RSS와 함께 업스트림 및 다운스트림에 병치된 사람 DH 세그먼트, 및 부위-특이적 리콤비나제 인식 서열, 예를 들어, Cre, Flp, 또는 Dre 단백질과 같은 부위-특이적 리콤비나제에 의해 인식된 서열을 포함하는 핵산 구조가 제공된다.
한 양태에서, 사람 V 또는 사람 Vκ 세그먼트, 12-머 또는 23-머 간격 RSS와 함께 업스트림 및 다운스트림에 병치된 DH 세그먼트, 및 사람 12-머 또는 23-머 간격 RSS를 갖는 J 세그먼트를 포함하는 핵산 구조가 제공되며, 12-머 또는 23-머 간격 RSS는 사람 J 세그먼트에 대하여 바로 5' (즉, 전사의 방향에 관하여)에 위치하고, 한 구체예에서, 구조는 3' 23-머 간격 RSS와 함께 병치된 사람 Vλ, 12-머 간격 RSS와 함께 업스트림 및 다운스트림에 병치된 사람 DH 세그먼트, 및 5' 23-머 간격 RSS와 함께 병치된 사람 Jκ 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 구조는 3' 12-머 간격 RSS와 함께 병치된 사람 Vκ, 23-머 간격 RSS와 함께 업스트림 및 다운스트림에 병치된 사람 DH 세그먼트, 및 5' 12-머 간격 RSS와 함께 병치된 사람 J 세그먼트를 포함한다.
한 양태에서, (a) 제1 및 제2 표적 팔은 사람 및 마우스 표적 팔로부터 독립적으로 선택되고, 표적 팔은 벡터를 내인성 또는 변형된 면역글로불린 V 영역 유전자 자리로 유도하는 제1 표적 팔 및 제2 표적 팔; 및, (b) 인접한 서열이 (i) hVκ4-1부터 hVκ1-6 및 Jκ1까지, (ii) hVκ4-1부터 hVκ1-6까지 및 Jκ1부터 Jκ2까지, (iii) hVκ4-1부터 hVκ1-6까지 및 Jκ1부터 Jκ3까지, (iv) hVκ4-1부터 hVκ1-6까지 및 Jκ1부터 Jκ4까지, (V) hVκ4-1부터 hVκ1-6까지 및 Jκ1부터 Jκ5까지, (vi) hVκ3-7부터 hVκ1-16까지, (vii) hVκ1-17부터 hVκ2-30까지, (viii) hVκ3-31부터 hVκ2-40까지, 및 (ix) 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는, 사람 VL 유전자 세그먼트의 인접한 서열 또는 사람 VL 유전자 세그먼트 및 적어도 하나의 사람 Jκ 유전자 세그먼트의 인접한 서열을 포함하는 표적화 벡터가 제공된다.
한 구체예에서, 벡터를 내인성 또는 변형된 면역글로불린 자리로 유도하는 표적 팔은 내인성 또는 변형된 면역글로불린 자리에서 서열과 동일한 또는 실질적으로 동일하다.
한 양태에서, 유전적으로 변형된 마우스를 만드는 방법이 제공되며, 마우스의 ADAM6 자리의 업스트림 (면역글로불린 중쇄 유전자 세그먼트의 전사에 관하여)에서 하나 이상의 면역글로불린 중쇄 유전자 세그먼트를 하나 이상의 사람 면역글로불린 경쇄 및/또는 중쇄 유전자 세그먼트로 대체하는 단계, 및 마우스의 ADAM6 자리의 다운스트림 (면역글로불린 중쇄 유전자 세그먼트의 전사에 관하여)에서 하나 이상의 면역글로불린 유전자 세그먼트를 하나 이상의 사람 면역글로불린 중쇄 또는 경쇄 유전자 세그먼트로 대체하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 마우스의 내인성 ADAM6 자리의 업스트림에서 하나 이상의 사람 면역글로불린 유전자 세그먼트를 대체하는 하나 이상의 내인성 면역글로불린 유전자 세그먼트는 V 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 마우스의 내인성 ADAM6 자리의 업스트림에서 사람 면역글로불린 유전자 세그먼트를 대체하는 하나 이상의 내인성 면역글로불린 유전자 세그먼트는 V 및 D 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 마우스의 내인성 ADAM6 자리의 다운스트림에서 하나 이상의 사람 면역글로불린 유전자 세그먼트를 대체하는 하나 이상의 내인성 면역글로불린 유전자 세그먼트는 J 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 마우스의 내인성 ADAM6 자리의 다운스트림에서 하나 이상의 사람 면역글로불린 유전자 세그먼트를 대체하는 하나 이상의 내인성 면역글로불린 유전자 세그먼트는 D 및 J 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 마우스의 내인성 ADAM6 자리의 다운스트림에서 하나 이상의 사람 면역글로불린 유전자 세그먼트를 대체하는 하나 이상의 내인성 면역글로불린 유전자 세그먼트는 V, D 및 J 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 양태에서, 유전적으로 변형된 마우스를 만드는 방법이 제공되며, 마우스의 내인성 ADAM6의 업스트림 (면역글로불린 중쇄 유전자 세그먼트의 전사에 관하여)에서 하나 이상의 면역글로불린 중쇄 유전자 세그먼트를 하나 이상의 사람 면역글로불린 경쇄 유전자 세그먼트로 대체하는 단계, 및 마우스의 ADAM6 자리의 다운스트림 (면역글로불린 중쇄 유전자 세그먼트의 전사에 관하여)에서 하나 이상의 면역글로불린 유전자 세그먼트를 하나 이상의 사람 면역글로불린 경쇄 세그먼트로 대체하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 마우스의 내인성 ADAM6의 업스트림에서 하나 이상의 사람 면역글로불린 유전자 세그먼트를 대체하는 하나 이상의 내인성 면역글로불린 유전자 세그먼트는 V 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 마우스의 내인성 ADAM6의 업스트림에서 사람 면역글로불린 유전자 세그먼트를 대체하는 하나 이상의 내인성 면역글로불린 유전자 세그먼트는 V 및 J 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 마우스의 내인성 ADAM6 자리의 다운스트림에서 하나 이상의 사람 면역글로불린 유전자 세그먼트를 대체하는 하나 이상의 내인성 면역글로불린 유전자 세그먼트는 J 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 마우스의 내인성 ADAM6 자리의 다운스트림에서 하나 이상의 사람 면역글로불린 유전자 세그먼트를 대체하는 하나 이상의 내인성 면역글로불린 유전자 세그먼트는 V 및 J 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 마우스의 내인성 ADAM6 자리의 다운스트림에서 하나 이상의 사람 면역글로불린 유전자 세그먼트를 대체하는 하나 이상의 내인성 면역글로불린 유전자 세그먼트는 V 유전자 세그먼트를 포함한다.
특정 구체예에서, V 유전자 세그먼트는 VL 유전자 세그먼트이다. 또 다른 특정 구체예에서, J 유전자 세그먼트는 JL 유전자 세그먼트이다.
한 구체예에서, 만능 세포, 유도 만능 세포, 또는 전분화능 세포에서 하나 이상의 면역글로불린 중쇄 유전자 세그먼트가 ADAM6 유전자의 업스트림 및/또는 다운스트림에서 대체되어 유전적으로 변형된 간세포(progenitor cell)를 형성하고; 유전적으로 변형된 간세포는 숙주로 도입되고; 유전적으로 변형된 간세포를 포함하는 숙주는 임신하여 유전적으로 변형된 간세포로부터 유래된 게놈을 포함하는 마우스를 형성한다. 한 구체예에서, 숙주는 배아이다. 특정 구체예에서, 숙주는 마우스 전-상실배(pre-morula) (예를 들어, 8-또는 4-세포 단계), 4배성 배아, 배아 세포의 응집체, 또는 배반포로부터 선택된다.
한 양태에서, 유전적으로 변형된 마우스를 만드는 방법이 제공되며, 마우스 면역글로불린 유전자 세그먼트 및 마우스 ADAM6 (또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 수컷 마우스에서 기능적인 단편) 뉴클레오티드 서열을 포함하는 마우스 뉴클레오티드 서열을 사람 면역글로불린 유전자 세그먼트를 포함하는 서열로 대체하여 제1 키메라 자리를 형성하는 단계, 이후에 마우스 ADAM6-암호화 서열 (또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편을 암호화하는 서열)을 포함하는 서열을 사람 면역글로불린 유전자 세그먼트를 포함하는 서열로 삽입하여 제2 키메라 자리를 형성하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 제2 키메라 자리는 사람 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 세그먼트 (VH)를 포함한다. 한 구체예에서, 제2 키메라 자리는 사람 면역글로불린 경쇄 가변 유전자 세그먼트 (VL)를 포함한다. 특정 구체예에서, 제2 키메라 자리는 사람 DH 유전자 세그먼트 및 사람 JH 유전자 세그먼트에 작동 가능하게 결합된 사람 VH 유전자 세그먼트 또는 사람 VL 유전자 세그먼트를 포함한다. 특정 구체예에서, 제2 키메라 자리는 사람 JH 또는 사람 JL 유전자 세그먼트에 작동 가능하게 결합된 사람 VL 유전자 세그먼트를 포함한다. 추가의 특정 구체예에서, 제2 키메라 자리는 사람 CH1 서열, 또는 사람 CH1 및 사람 힌지 서열을 포함하는 제3 키메라 자리에 작동 가능하게 결합되고, 마우스 CH2 + CH3 서열과 융합된다.
한 양태에서, 마우스의 중쇄 면역글로불린 자리를 변형시키는 방법이 제공되며, (a) 수컷 마우스에서 내인성 마우스 ADAM6 활성의 감소 또는 제거를 일으키는 마우스 중쇄 면역글로불린 자리의 제1 변형을 만드는 단계; 및, (b) 마우스에게 수컷 마우스에서 기능적인 ADAM6 활성을 부여하는 핵산 서열을 추가하기 위해 제2 변형을 만드는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 제1 변형은 사람 면역글로불린 서열의 추가 또는 마우스 면역글로불린 서열의 사람 면역글로불린 서열로의 대체를 포함한다.
한 구체예에서, 사람 면역글로불린 서열은 중쇄 서열이다. 한 구체예에서, 사람 면역글로불린 서열은 경쇄 서열이다.
한 구체예에서, 제1 및 제2 변형은 단일 ES 세포에서 만들어지고, 단일 ES 세포는 숙주 배아로 도입되어 마우스를 만든다.
한 양태에서, 본원에 설명된 바와 같은 마우스의, 야생형 마우스 또는 유전적으로 변형된 제2 마우스와의 교미의 자손이 제공된다.
한 양태에서, 생식 가능한 수컷 마우스를 만들기 위해 마우스 ADAM6 자리 또는 서열을 포함하는 이소성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 마우스의 사용법이 제공되며, 사용법은 마우스 ADAM6 자리 또는 서열을 포함하는 이소성 뉴클레오티드 서열을 포함하는 마우스를 기능적 내인성 ADAM6 자리 또는 서열이 결핍된 마우스와 교미시키는 단계, 및 이소성 ADAM6 자리 또는 서열을 갖는 자손을 생산할 수 있는 암컷 또는 이소성 ADAM6 자리 또는 서열을 포함하며, 야생형 수컷 마우스에 의해 나타난 생식능력과 거의 같은 생식능력을 나타내는 수컷인 자손을 얻는 단계를 포함한다.
한 양태에서, 이소성 ADAM6 서열을 기능적 내인성 ADAM6 서열이 결핍된 마우스로 도입시키기 위한 본원에서 설명된 바와 같은 마우스의 사용법이 제공되며, 사용법은 본원에 설명된 바와 같은 마우스를 기능적 내인성 ADAM6 서열이 결핍된 마우스와 교미시키는 단계를 포함한다.
한 양태에서, 이소성 ADAM6 서열을 갖는 마우스를 만들기 위한 본원에서 설명된 바와 같은 마우스의 유전 물질의 사용법이 제공된다. 한 구체예에서, 사용법은 본원에서 설명된 바와 같은 마우스의 세포의 핵을 사용하는 핵 이식을 포함한다. 한 구체예에서, 사용법은 본원에서 설명된 바와 같은 마우스의 세포를 클로닝하여 세포로부터 유래된 동물을 생산하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 사용법은 이소성 ADAM6 서열을 포함하는 마우스를 만들기 위한 공정에 있어서 본원에서 설명된 바와 같은 마우스의 정자 또는 난자를 이용하는 단계를 포함한다.
한 양태에서, 변형된 면역글로불린 중쇄 자리를 포함하는 생식 가능한 수컷 마우스를 만드는 방법이 제공되며, 내인성 중쇄 면역글로불린 자리의 변형을 포함하는 제1 마우스 생식 세포를 ADAM6 유전자 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 수컷 마우스에서 기능적인 단편을 포함하는 제2 마우스 생식 세포와 수정시키는 단계; 수정된 세포를 형성하는 단계; 수정된 세포를 배아로 발달시키게 하는 단계; 및, 대리모에서 배아를 임신시켜서 마우스를 얻는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 수정은 수컷 마우스 및 암컷 마우스를 교미시킴으로써 달성된다. 한 구체예에서, 암컷 마우스는 ADAM6 유전자 또는 오솔로그 또는 상동체 또는 이들의 단편을 포함한다. 한 구체예에서, 수컷 마우스는 ADAM6 유전자 또는 오솔로그 또는 상동체 또는 이들의 단편을 포함한다.
한 양태에서, 마우스 ADAM6 단백질 또는 이들의 오솔로그 또는 상동체 또는 면역글로불린 중쇄 자리의 변형을 포함하는 게놈을 갖는 마우스의 생식능력의 회복 또는 향상에 해당하는 ADAM6 단백질의 기능적 단편을 암호화하는 핵산 서열의 사용법이 제공되며, 변형은 내인성 ADAM6 기능을 감소시키거나 제거한다.
한 구체예에서, 핵산 서열은 이소성 위치에서 마우스의 게놈으로 통합된다. 한 구체예에서, 핵산 서열은 내인성 면역글로불린 자리에서 마우스의 게놈으로 통합된다. 특정 구체예에서, 내인성 면역글로불린 자리는 중쇄 자리이다. 한 구체예에서, 핵산 서열은 내인성 면역글로불린 자리 이외의 위치에서 마우스의 게놈으로 통합된다.
한 양태에서, 유전적으로 변형된 마우스를 만드는 방법이 제공되며, 내인성 중쇄 자리에서 마우스의 하나 이상의 면역글로불린 중쇄 유전자 세그먼트를 하나 이상의 사람 면역글로불린 경쇄 유전자 세그먼트로 대체하는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 대체는 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 마우스 면역글로불린 중쇄 세그먼트 (즉, VH, DH, 및 JH 세그먼트)의 하나 이상의 기능적 사람 경쇄 세그먼트 (즉, VL 및 JL 세그먼트)로의 것이다. 한 구체예에서, 대체는 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 마우스 중쇄 VH, DH, 및 JH 세그먼트의 모든 또는 실질적으로 모든 사람 Vλ 또는 Vκ 세그먼트 및 적어도 하나의 Jλ 또는 Jκ 세그먼트의 것이다. 특정 구체예에서, 대체는 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 사람 Jλ 또는 Jκ 세그먼트를 포함한다.
한 양태에서, 마우스 중쇄 불변 영역과 융합된 사람 면역글로불린 Vλ 또는 Vκ 및/또는 Jλ 또는 Jκ 세그먼트로부터 유래된 서열을 포함하는 폴리펩티드를 발현하는 마우스를 만드는 방법이 제공되며, 내인성 중쇄 면역글로불린 가변 세그먼트 (VH, DH, 및 JH)를 적어도 하나의 사람 Vλ 또는 Vκ 세그먼트 및 적어도 하나의 사람 Jλ 또는 Jκ 세그먼트로 대체하는 단계를 포함하고, 대체는 만능 세포, 유도 만능 세포, 또는 마우스 전분화능 세포에서 유전적으로 변형된 마우스 간세포를 형성하기 위한 것이며; 유전적으로 변형된 마우스 간세포는 마우스 숙주로 도입되고; 유전적으로 변형된 간세포를 포함하는 마우스 숙주는 임신하여 유전적으로 변형된 마우스 간세포로부터 유래된 게놈을 포함하는 마우스를 형성한다. 한 구체예에서, 숙주는 배아이다. 특정 구체예에서, 숙주는 마우스 전-상실배 (예를 들어, 8-또는 4-세포 단계), 4배성 배아, 배아 세포의 응집체, 또는 배반포로부터 선택된다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같은 유전적으로 변형된 마우스를 만드는 방법이 제공되며, 핵 이식에 의해 본원에서 설명된 바와 같은 변형을 함유하는 핵산을 세포로 도입하는단계, 및 본원에서 설명된 바와 같은 마우스로 발달시키기 위해 적합한 조건 하에 세포를 유지하는 단계 (예를 들어, 세포를 배양하는 단계 및 대리모에서 세포를 포함하는 배아를 임신시키는 단계 등)를 포함한다.
한 양태에서, 변형된 마우스를 만드는 방법이 제공되며, 면역글로불린 중쇄 불변 서열에 작동 가능하게 결합된, 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 가변 유전자 세그먼트를 포함하도록 본원에서 설명된 바와 같이 마우스 ES 세포 또는 만능 또는 전분화능 또는 유도 만능 마우스 세포를 변형시키는 단계, ES 세포를 배양하는단계, 배양된 ES 세포를 숙주 배아로 도입하여 키메라 배아를 형성하는 단계, 및 변형된 마우스로 발달시키기 위해 키메라 배아를 적합한 숙주 마우스로 도입시키는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트는 사람 λ 또는 사람 κ 유전자 세그먼트이다. 한 구체예에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 가변 영역 유전자 세그먼트는 사람 Vλ 또는 사람 Vκ 세그먼트 및 하나 이상의 Jλ, Jκ, 또는 JH 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 중쇄 불변 유전자 서열은 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택된 사람 서열이다. 한 구체예에서, 하나 이상의 재배열되지 않은 면역글로불린 경쇄 가변 유전자 세그먼트는 내인성 중쇄 자리에서 모든 또는 실질적으로 모든 기능적 내인성 중쇄 가변 영역 유전자 세그먼트를 대체하고, 중쇄 불변 서열은 CH1, 힌지, CH2, 및 CH3을 포함하는 마우스 서열이다.
한 양태에서, 하나 이상의 κ 및/또는 λ 경쇄 가변 영역 면역글로불린 서열 및 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는 단백질을 만들기 위한 핵산 구조, 세포, 배아, 마우스, 및 방법이 제공되며, 사람 λ 또는 κ 경쇄 가변 도메인 및 사람 또는 마우스 중쇄 불변 영역 서열을 포함하는 단백질을 포함한다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같은 마우스에서 만들어진 면역글로불린 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 제공된다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같은 마우스에서 만들어진 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 아미노산 서열이 제공된다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같은 마우스에서 만들어진 항체의 가변 영역을 암호화하는 중쇄 또는 경쇄 가변 영역 뉴클레오티드 서열이 제공된다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같은 마우스에서 만들어진 항체 또는 항원-결합 이들의 단편 (예를 들어, Fab, F(ab)2, scFv)이 제공된다.
한 양태에서, 경쇄 (즉, 카파 (κ) 및/또는 람다 (λ)) 면역글로불린 가변 도메인으로부터 유래되지만, 전체-길이 중쇄 면역글로불린 가변 도메인으로부터는 아닌 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 결합 단백질이 설명된다. 유전적으로 변형된 마우스를 포함하는, 결합 단백질을 만들기 위한 방법 및 조성물이 또한 제공된다.
한 양태에서, 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하지 않는 항원-결합 단백질을 만드는 방법이 제공되며, 본원에서 설명된 바와 같은 마우스를 원하는 항원으로 면역화하는 단계, 및 원하는 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 단백질을 만들게 하는 조건 하에 마우스를 유지하는 단계를 포함한다.
한 양태에서, 중쇄 불변 영역 서열과 인접한 제1 면역글로불린 경쇄 가변 도메인, 및 경쇄 불변 서열과 인접한 제2 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항원-결합 단백질을 만드는 방법이 제공되며, 본원에서 설명된 바와 같은 마우스를 항원으로 면역화하는 단계, 및 원하는 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 단백질을 만들게 하는 조건 하에 마우스를 유지하는 단계를 포함한다.
한 양태에서, 중쇄 불변 영역 서열과 인접한 면역글로불린 경쇄 가변 도메인을 포함하는 항원-결합 단백질을 만드는 방법이 제공되며, 항원-결합 단백질은 면역글로불린 경쇄가 결핍되고, 내인성 κ 및 λ 자리의 넉아웃을 포함하는 (또는 비기능적 내인성 κ 및/또는 λ 자리를 포함하는) 본원에서 설명된 바와 같은 마우스를 원하는 항원으로 면역화하는 단계, 및 원하는 항원에 특이적으로 결합하는 항원-결합 단백질을 만들게 하는 조건 하에 마우스를 유지하는 단계를 포함한다.
한 양태에서, 면역글로불린 가변 영역 뉴클레오티드 서열을 만들기 위한 본원에서 설명된 바와 같은 마우스의 사용법이 제공된다. 한 구체예에서, 가변 영역 뉴클레오티드 서열은 재배열된 VL, DH 및 JL 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 가변 영역 뉴클레오티드 서열은 재배열된 VL, DH 및 JH 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 가변 영역 뉴클레오티드 서열은 재배열된 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 가변 영역 뉴클레오티드 서열은 재배열된 Vλ 및 Jλ 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 양태에서, 완전한 사람 Fab 또는 완전한 사람 F(ab)2를 만들기 위한 본원에서 설명된 바와 같은 마우스가 제공된다. 한 구체예에서, 완전한 사람 Fab 또는 완전한 사람 F(ab)2는 재배열된 VL, DH 및 JL 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 완전한 사람 Fab 또는 완전한 사람 F(ab)2는 재배열된 VL, DH 및 JH 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 완전한 사람 Fab 또는 완전한 사람 F(ab)2는 재배열된 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 완전한 사람 Fab 또는 완전한 사람 F(ab)2는 재배열된 Vλ 및 Jλ 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 양태에서, 완전한 사람 Fab (사람 경쇄 불변 영역과 융합된 제1 사람 VL, 및 사람 중쇄 불변 영역 서열과 융합된 제2 사람 VL 등) 또는 완전한 사람 F(ab)2를 만들기 위한 본원에서 설명된 바와 같은 마우스의 사용법이 제공된다.
한 양태에서, 불멸성 세포주를 만들기 위한 본원에서 설명된 바와 같은 마우스의 사용법이 제공된다. 한 구체예에서, 불멸성 세포주는 마우스 불변 영역 핵산 서열을 포함하는 핵산 서열에 작동 가능하게 결합된 사람 Vλ 또는 Vκ 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 불멸성 세포주는 사람 가변 도메인을 포함하는 항체를 발현한다. 특정 구체예에서, 사람 가변 도메인은 경쇄 가변 도메인이다.
한 양태에서, 히브리도마 또는 콰드로마를 만들기 위한 본원에서 설명된 바와 같은 마우스의 사용법이 제공된다. 한 구체예에서, 히브리도마 또는 콰드로마는 원하는 항원에 결합하는 사람 가변 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 발현한다.
한 양태에서, 사람 경쇄 가변 영역을 함유하는 파지 라이브러리(library)를 만들기 위한 본원에서 설명된 바와 같은 마우스의 사용법이 제공된다. 한 구체예에서, 경쇄 가변 영역은 사람 Vκ 영역이다.
한 양태에서, 사람 항원-결합 단백질을 만드는 가변 영역 서열을 생성하기 위한 본원에서 설명된 바와 같은 마우스의 사용법이 제공되며, (a) 본원에서 설명된 바와 같은 마우스를 원하는 항원으로 면역화하는 단계, (b) (a)의 면역화된 마우스로부터 림프세포를 분리하는 단계, (c) 림프세포를 하나 이상의 표지된 항체에 노출시키는 단계, (d) 원하는 항원에 결합할 수 있는 림프세포를 확인하는 단계, 및 (e) 림프세포의 하나 이상의 사람 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 증폭시키고 이로 인해 가변 영역 서열을 발생시키는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 림프세포는 마우스의 비장으로부터 유래된다. 한 구체예에서, 림프세포는 마우스의 림프절로부터 유래된다. 한 구체예에서, 림프세포는 마우스의 골수로부터 유래된다.
한 구체예에서, 표지된 항체는 형광단-컨쥬게이티드(conjugated) 항체이다. 한 구체예에서, 하나 이상의 형광단-컨쥬게이티드 항체는 IgM, IgG, 및/또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 림프세포는 B 세포이다.
한 구체예에서, 하나 이상의 가변 영역 핵산 서열은 경쇄 가변 영역 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 경쇄 가변 영역 서열은 면역글로불린 κ 경쇄 가변 영역 서열이다. 한 구체예에서, 하나 이상의 가변 영역 핵산 서열은 λ 경쇄 가변 영역 서열이다.
한 구체예에서, 사람 항원-결합 단백질을 만드는 하나 이상의 κ 경쇄 가변 영역 서열을 발생시키기 위한 본원에서 설명된 바와 같은 마우스의 사용법이 제공되며, (a) 본원에서 설명된 바와 같은 마우스를 원하는 항원으로 면역화하는 단계, (b) (a)의 면역화된 마우스로부터 비장을 분리하는 단계, (c) 비장의 B 림프세포를 하나 이상의 표지된 항체에 노출시키는 단계, (d) 원하는 항원에 결합할 수 있는 (c)의 B 림프세포를 확인하는 단계, 및 (e) B 림프세포의 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 증폭시키고 이로 인해 κ 경쇄 가변 영역 서열을 발생시키는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 사람 항원-결합 단백질을 만드는 경쇄 가변 영역 서열을 발생시키기 위한 본원에서 설명된 바와 같은 마우스의 사용법이 제공되며, (a) 본원에서 설명된 바와 같은 마우스를 원하는 항원으로 면역화하는 단계, (b) (a)의 면역화된 마우스로부터 하나 이상의 림프절을 분리하는 단계, (c) 하나 이상의 림프절의 B 림프세포를 하나 이상의 표지된 항체에 노출시키는 단계, (d) 원하는 항원에 결합할 수 있는 (c)의 B 림프세포를 확인하는 단계 및 (e) B 림프세포의 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 증폭시키고 이로 인해 κ 경쇄 가변 영역 서열을 발생시키는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 사람 항원-결합 단백질을 만드는 κ 경쇄 가변 영역 서열을 발생시키기 위한 본원에서 설명된 바와 같은 마우스의 사용법이 제공되며, (a) 본원에서 설명된 바와 같은 마우스를 원하는 항원으로 면역화하는 단계, (b) (a)의 면역화된 마우스로부터 골수를 분리하는 단계, (c) 골수의 B 림프세포를 하나 이상의 표지된 항체에 노출시키는 단계, (d) 원하는 항원에 결합할 수 있는 (c)의 B 림프세포를 확인하는 단계, 및 (e) B 림프세포의 κ 경쇄 가변 영역 핵산 서열을 증폭시키고 이로 인해 κ 경쇄 가변 영역 서열을 발생시키는 단계를 포함한다. 다양한 구체예에서, 하나 이상의 표지된 항체는 IgM, IgG, 및/또는 이들의 조합으로부터 선택된다.
다양한 구체예에서, 사람 항원-결합 단백질을 만드는 κ 경쇄 가변 영역 서열을 발생시키기 위한 본원에서 설명된 바와 같은 마우스의 사용법이 제공되며, 증폭된 κ 경쇄 가변 영역 서열을 사람 중쇄 또는 경쇄 불변 영역 서열 또는 선택적으로 사람 중쇄 가변 영역 서열에 융합시키는 단계, 세포에서 융합된 서열을 발현시키는 단계, 및 발현된 서열을 회수하고 이로 인해 사람 항원-결합 단백질을 생성하는 단계를 더 포함한다.
다양한 구체예에서, 사람 중쇄 불변 영역은 IgM, IgD, IgA, IgE 및 IgG로부터 선택된다. 다양한 특정 구체예에서, IgG는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로부터 선택된다. 다양한 구체예에서, 사람 중쇄 불변 영역는 CH1, 힌지, CH2, CH3, CH4, 또는 이들의 조합을 포함한다. 다양한 구체예에서, 경쇄 불변 영역은 면역글로불린 κ 불변 영역이다. 다양한 구체예에서, 세포는 HeLa 세포, DU145 세포, Lncap 세포, MCF-7 세포, MDA-MB-438 세포, PC3 세포, T47D 세포, THP-1 세포, U87 세포, SHSY5Y (사람 신경아세포) 세포, Saos-2 세포, Vero 세포, CHO 세포, GH3 세포, PC12 세포, 사람 망막 세포 (예를 들어, PERC.6™ 세포), 및 MC3T3 세포로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 세포는 CHO 세포이다
한 양태에서, 원하는 항원에 대하여 특이적인 사람 경쇄 가변 영역을 발생시키는 방법이 제공되며, 본원에서 설명된 바와 같은 마우스를 항원으로 면역화하는 단계, 항원에 대하여 특이적인 사람 경쇄 가변 영역을 생산하는 마우스로부터 적어도 하나의 세포를 분리하는 단계, 항원에 대하여 특이적인 경쇄 가변 영역을 포함하는 사람 항원-결합 단백질을 생산하는 적어도 하나의 세포를 발생시키는 단계, 및 사람 항원-결합 단백질을 생산하는 적어도 하나의 세포를 배양하는 단계, 및 상기 사람 항원-결합 단백질을 얻는 단계를 포함한다. 한 구체예에서, 사람 경쇄 가변 영역은 사람 Vκ 영역이다.
다양한 구체예에서, 항원에 대하여 특이적인 사람 경쇄 가변 영역을 생산하는 마우스로부터 분리된 적어도 하나의 세포는 비장세포 또는 B 세포이다.
다양한 구체예에서, 항원-결합 단백질은 항체이다.
다양한 구체예에서, 원하는 항원으로의 면역화는 단백질, DNA, DNA 및 단백질의 조합, 또는 항원을 발현하는 세포로 수행된다.
한 양태에서, 면역글로불린 가변 영역 또는 이들의 단편을 암호화하는 핵산 서열을 만들기 위한 본원에서 설명된 바와 같은 마우스의 사용법이 제공된다. 한 구체예에서, 핵산 서열은 사람 항체 또는 이들의 항원-결합 단편을 만들기 위해 사용된다. 한 구체예에서, 마우스는 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), scFv, 비스-scFv, 디아바디(diabody), 트라이아바디(triabody), 테트라바디(tetrabody), V-NAR, VHH, VL, F(ab), F(ab)2, DVD (즉, 이중 가변 도메인 항원-결합 단백질), SVD (즉, 단일 가변 도메인 항원-결합 단백질), 또는 이중특이적 T-세포 인게이져(engager) (BiTE)로부터 선택된 항원-결합 단백질을 만들기 위해 사용된다.
한 양태에서, 의약품 (예를 들어, 항원-결합 단백질)의 제조, 또는 의약품 (예를 들어, 항원-결합 단백질)의 가변 서열을 암호화하는 서열의 제조, 사람 질환 또는 장애의 치료를 위한 본원에서 설명된 바와 같은 마우스의 사용법이 제공된다.
한 양태에서, 제2 사람 경쇄 면역글로불린 가변 서열 (VL2)과 인접한 제1 사람 경쇄 면역글로불린 가변 서열 (VL1)을 암호화하는 핵산 서열을 만드는 본원에서 설명된 바와 같은 마우스의 사용법으로서, 사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역 (폴리펩티드 1)과 융합된 VL1은 VL1-VL2 항체를 형성하기 위해, 폴리펩티드 1/폴리펩티드 2의 다이머로서, 사람 면역글로불린 중쇄 불변 영역 (폴리펩티드 2)와 융합된 VL2를 발현한다.
한 양태에서, 사람 면역글로불린 중쇄 서열과 융합된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 서열을 암호화하는 핵산 서열을 만들기 위한 본원에서 설명된 바와 같은 마우스의 사용법으로서, 핵산 서열은 사람 VL-CH 폴리펩티드를 암호화하고, 사람 VL-CH 폴리펩티드는 다이머를 발현하며, 다이머는 면역글로불린 경쇄의 부재시 (예를 들어, 사람 λ 또는 사람 κ 경쇄의 부재시) 발현한다. 한 구체예에서, VL-CH 다이머는 λ 경쇄의 부재시 및 κ 경쇄의 부재시 원하는 항원에 특이적으로 결합한다.
한 양태에서, 면역글로불린 가변 도메인 중 모두 또는 일부를 암호화하는 핵산 서열을 만들기 위한 본원에서 설명된 바와 같은 마우스의 사용법. 한 구체예에서, 면역글로불린 가변 도메인은 사람 Vλ 또는 사람 Vκ 도메인이다.
한 양태에서, 마우스, 세포, 또는 치료 단백질 (예를 들어, 항체 또는 다른 항원-결합 단백질)의 제조를 위한 본 발명에 설명된 바와 같은 핵산 구조의 사용법이 제공된다.
한 양태에서, 사람 치료제의 제조용 세포주를 만들기 위한 본원에서 설명된 바와 같은 마우스의 핵산 서열의 사용법이 제공된다. 한 구체예에서, 사람 치료제는 사람 중쇄 불변 서열과 융합된 사람 경쇄 가변 서열 (예를 들어, 사람 Vλ 또는 사람 Vκ 세그먼트로부터 유래됨)을 포함하는 결합 단백질이다. 한 구체예에서, 사람 치료제는 사람 λ 또는 κ 면역글로불린 경쇄인 제1 폴리펩티드, 및 사람 중쇄 불변 서열과 융합된 사람 Vλ 또는 사람 Vκ 가변 서열을 포함하는 제2 폴리펩티드를 포함한다.
한 양태에서, 사람 CH 도메인과 융합된 체세포 돌연변이된 사람 VL 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 구조로 트랜스펙션된 포유동물 세포를 포함하는 발현 시스템이 제공된다.
한 구체예에서, 발현 시스템은 사람 CL 도메인과 융합된 면역글로불린 VL 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하며, 사람 CL 도메인과 융합된 VL 도메인은 사람 CH 도메인과 융합된 VL 도메인과 동족인 경쇄이다.
한 구체예에서, 포유동물 세포는 CHO 세포, COS 세포, Vero 세포, 293 세포, 및 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포 (예를 들어, PERC.6™ 세포)로부터 선택된다.
한 양태에서, 결합 단백질을 만드는 방법이 제공되며, 본원에서 설명된 바와 같은 마우스 세포의 CH 영역에 융합된 VL 영역을 암호화하는 유전자로부터 VL 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 얻는 단계, 및 VL 영역 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 사람 CH 영역을 암호화하는 유전자와 인 프레임 (in frame) 클로닝하여 사람 결합 단백질 서열을 형성하는 단계, 적합한 세포에서 사람 결합 단백질 서열을 발현시키는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 원하는 항원으로 면역화되었고, CH 영역에 융합된 VL 영역은 원하는 항원의 에피토프에 특이적으로 결합한다 (예를 들어, 마이크로몰, 나노몰, 또는 피코몰 범위의 KD로). 한 구체예에서, CH 영역에 융합된 VL 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 마우스에서 체세포 돌연변이된다.
한 구체예에서, 적합한 세포는 B 세포, 히브리도마, 콰드로마, CHO 세포, COS 세포, 293 세포, HeLa 세포, 및 바이러스 핵산 서열을 발현하는 사람 망막 세포 (예를 들어, PERC.6™ 세포)로부터 선택된다.
한 구체예에서, CH 영역은 사람 IgG 이소타입을 포함한다. 특정 구체예에서, 사람 IgG는 IgG1, IgG2, 및 IgG4로부터 선택된다. 또 다른 특정 구체예에서, 사람 IgG는 IgG1이다. 또 다른 특정 구체예에서, 사람 IgG는 IgG4이다. 또 다른 특정 구체예에서, 사람 IgG4는 변형된 IgG4이다. 한 구체예에서, 변형된 IgG4는 힌지 영역에서 치환을 포함한다. 특정 구체예에서, 변형된 IgG4는 야생형 사람 IgG4에 관하여 아미노산 잔기 228에서의 치환을 포함하며, 카바트(Kabat)의 EU 넘버링(numbering) 지수에 따라 번호가 붙여진다. 특정 구체예에서, 아미노산 잔기 228에서의 치환은 S228P 치환이며, 카바트의 EU 넘버링 지수에 따라 번호가 붙여진다.
한 구체예에서, 세포는 CH 영역에 융합된 VL 도메인에 대하여 동족인 경쇄의 VL 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 더 포함하고, 방법은 사람 Cκ 또는 Cλ 도메인에 융합된 동족 VL 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 발현하는 단계를 더 포함한다.
한 양태에서, 이중특이적 항원-결합 단백질을 만드는 방법이 제공되며, 본원에서 설명된 바와 같은 제1 마우스를 제1 원하는 항원에 노출시키고 제1 원하는 항원에 특이적으로 결합하는 제1 사람 VL 도메인의 서열을 확인하는 단계; 본원에서 설명된 바와 같은 제2 마우스를 제2 원하는 항원에 노출시키고 제2 원하는 항원에 특이적으로 결합하는 제2 사람 VL 도메인의 서열을 확인하는 단계로서, 제1 사람 VL 도메인은 제2 원하는 항원에 결합하지 않고, 제2 사람 VL 도메인은 제1 원하는 항원에 결합하지 않는 단계; 제1 사람 VL 도메인의 서열을 제1 중쇄 불변 서열에 융합시켜서 제1 항원-결합 폴리펩티드를 형성하고, 제2 사람 VL 도메인의 서열을 제2 중쇄 불변 서열에 융합시켜서 제2 항원-결합 폴리펩티드를 형성하는 단계; 및 이중특이적 결합 단백질에서 제1 및 제2 항원-결합 폴리펩티드를 이용하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 항원-결합 단백질은 제1 사람 VL 도메인과 동족인 사람 κ 또는 λ 가변 도메인을 포함하는 제1 면역글로불린 경쇄 및 제2 사람 VL 도메인와 동족인 사람 κ 또는 λ 가변 도메인을 포함하는 제2 면역글로불린 경쇄를 더 포함한다.
한 구체예에서, 제1 중쇄 불변 서열은 제2 중쇄 불변 서열과 동일하다. 한 구체예에서, 제1 중쇄 불변 서열은 제1 중쇄 불변 영역의 단백질 A로의 결합을 감소시키거나 제거하는 변형을 포함하고, 제2 중쇄 불변 서열은 단백질 A에 결합한다.
한 구체예에서, 제1 및 제2 사람 VL 도메인은 사람 Vκ 및 사람 Jκ 유전자 세그먼트로부터 유래된 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 제1 및 제2 사람 VL 도메인은 사람 Vλ 및 사람 Jλ 유전자 세그먼트로부터 유래된 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 제1 및 제2 사람 VL 도메인은 사람 DH 유전자 세그먼트로부터 유래된 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 제1 및 제2 사람 VL 도메인은 사람 JH 유전자 세그먼트로부터 유래된 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 사람 VL 도메인은 사람 DH 및 사람 JH 유전자 세그먼트로부터 유래된 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 제1 및 제2 사람 VL 도메인은 사람 DH 및 사람 Jκ 유전자 세그먼트로부터 유래된 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 제1 사람 VL 도메인은 사람 Vκ 및 사람 Jκ 유전자 세그먼트로부터 유래된 서열을 포함하고 제2 사람 VL 도메인은 사람 Vλ 및 사람 Jλ 유전자 세그먼트로부터 유래된 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 제1 사람 VL 도메인은 사람 V 및 사람 Jλ 유전자 세그먼트로부터 유래된 서열을 포함하고 제2 사람 VL 도메인은 사람 Vκ 및 사람 Jκ 유전자 세그먼트로부터 유래된 서열을 포함한다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같은 마우스에서 만들어진 면역글로불린 가변 영역 (VR) (예를 들어, 사람 JL, 또는 JH, 또는 DH 및 JH, 또는 DH 및 JL과 융합된 사람 VL 서열 포함)이 제공된다. 특정 구체예에서, 면역글로불린 VR은 Vκ 세그먼트 및 Vλ 세그먼트로부터 선택된 생식세포 계열 사람 유전자 세그먼트로부터 유래되며, VR은 마우스의 재배열된 서열에 의해 암호화되고 재배열된 서열은 체세포 초돌연변이된다. 한 구체예에서, 재배열된 서열은 1 내지 5 체세포 초돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 재배열된 서열은 적어도 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 체세포 초돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 재배열된 서열은 10개 이상의 체세포 초돌연변이를 포함한다. 한 구체예에서, 재배열된 서열은 하나 이상의 사람 또는 마우스 중쇄 불변 영역 서열 (예를 들어, 사람 또는 마우스 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택됨)과 융합된다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같은 마우스에서 만들어진 결합 단백질의 면역글로불린 가변 도메인 아미노산 서열이 제공된다. 한 구체예에서, VR은 하나 이상의 사람 또는 마우스 중쇄 불변 영역 서열 (예를 들어, 사람 또는 마우스 CH1, 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택됨)과 융합된다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같은 마우스로부터 유래된 핵산 서열에 의해 암호화된 경쇄 가변 도메인이 제공된다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같은 마우스에서 만들어지거나, 본원에서 설명된 바와 같은 마우스에서 만들어진 서열로부터 유래된 항체 또는 이들의 항원-결합 단편 (예를 들어, Fab, F(ab)2, scFv)이 제공된다.
도 1은 마우스 중쇄 자리 (상단) 및 사람 κ 경쇄 자리 (하단)의 개략도 (스케일 없음)를 도시한다. 마우스 중쇄 자리는 길이가 약 3 Mb이고 대략 200개의 중쇄 가변 (VH) 유전자 세그먼트, 13개의 중쇄 다양성 (DH) 유전자 세그먼트 및 4개의 중쇄 결합 (JH) 유전자 세그먼트, 뿐만 아니라 인핸서(enhancer; Enh) 및 중쇄 불변 (CH) 영역을 함유한다. 사람 κ 경쇄 자리는 각각 약 440 kb 및 600 kb로 이어지는 반대 극성의 원위(distal) 및 근위(proximal)의 콘틱(contig)으로 두배화된다. 두 개의 콘틱 사이는 Vκ 유전자 세그먼트가 없는 것으로 생각되는, 약 800 kb의 DNA이다. 사람 κ 경쇄 자리는 약 76개의 Vκ 유전자 세그먼트, 5개의 Jκ 유전자 세그먼트, 인트론 인핸서 (Enh) 및 단일 불변 영역 (Cκ)을 함유한다.
도 2는 40개의 사람 Vκ 및 다섯 개의 사람 Jκ 유전자 세그먼트의, 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 결합된 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트를 포함하는 변형된 마우스 면역글로불린 중쇄 자리를 발생시키는 마우스 중쇄 자리로의 점진적 삽입에 대한 예시적 표적화 전략을 나타낸다. 히그로마이신 (hyg) 및 네오마이신 (neo) 선택 카세트는 리콤비나제 인식 부위 (R1, R2, 등)과 함께 나타난다.
도 3은 복수의 사람 Vλ 및 단일 사람 Jλ 유전자 세그먼트의 마우스 중쇄 자리로의 점진적 삽입에 대한 예시적 표적화 전략을 나타낸다. 히그로마이신 (hyg) 및 네오마이신 (neo) 선택 카세트는 리콤비나제 인식 부위 (R1, R2, 등)과 함께 나타난다.
도 4는 복수의 사람 Vλ 및 네 개의 사람 Jλ 유전자 세그먼트의 마우스 중쇄 자리로의 점진적 삽입에 대한 예시적 표적화 전략을 나타낸다. 히그로마이신 (hyg) 및 네오마이신 (neo) 선택 카세트는 리콤비나제 인식 부위 (R1, R2, 등)과 함께 나타난다.
도 5는 사람 Vλ, 사람 DH 및 사람 JH 유전자 세그먼트의 마우스 중쇄 자리로의 점진적 삽입에 대한 예시적 표적화 전략을 나타낸다. 히그로마이신 (hyg) 및 네오마이신 (neo) 선택 카세트는 리콤비나제 인식 부위 (R1, R2, 등)과 함께 나타난다.
도 6은 사람 Vλ, 사람 DH 및 사람 Jκ 유전자 세그먼트의 마우스 중쇄 자리로의 점진적 삽입에 대한 예시적 표적화 전략을 나타낸다. 히그로마이신 (hyg) 및 네오마이신 (neo) 선택 카세트는 리콤비나제 인식 부위 (R1, R2, 등)과 함께 나타난다.
도 7은 마우스 면역글로불린 중쇄 V-D 유전자간 영역의 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 게놈 단편을 클로닝하는 단계 및 변형된 면역글로불린 중쇄 자리로의 삽입을 위해 게놈 단편을 변형시키는 조작 단계를 나타낸다.
도 8은 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 게놈 단편의 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 결합된 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트를 함유하는 변형된 마우스 면역글로불린 중쇄 자리의 Vκ-Jκ 유전자간 영역으로의 삽입에 대한 표적화 전략을 나타낸다.
도 9는 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 결합된 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트를 함유하는 변형된 마우스 면역글로불린 중쇄 자리의 사람 Vκ 유전자 세그먼트 (즉, hVκ2-40)의 업스트림 (5')에서 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 게놈 단편의 삽입에 대한 표적화 전략을 나타낸다.
도 2는 40개의 사람 Vκ 및 다섯 개의 사람 Jκ 유전자 세그먼트의, 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 결합된 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트를 포함하는 변형된 마우스 면역글로불린 중쇄 자리를 발생시키는 마우스 중쇄 자리로의 점진적 삽입에 대한 예시적 표적화 전략을 나타낸다. 히그로마이신 (hyg) 및 네오마이신 (neo) 선택 카세트는 리콤비나제 인식 부위 (R1, R2, 등)과 함께 나타난다.
도 3은 복수의 사람 Vλ 및 단일 사람 Jλ 유전자 세그먼트의 마우스 중쇄 자리로의 점진적 삽입에 대한 예시적 표적화 전략을 나타낸다. 히그로마이신 (hyg) 및 네오마이신 (neo) 선택 카세트는 리콤비나제 인식 부위 (R1, R2, 등)과 함께 나타난다.
도 4는 복수의 사람 Vλ 및 네 개의 사람 Jλ 유전자 세그먼트의 마우스 중쇄 자리로의 점진적 삽입에 대한 예시적 표적화 전략을 나타낸다. 히그로마이신 (hyg) 및 네오마이신 (neo) 선택 카세트는 리콤비나제 인식 부위 (R1, R2, 등)과 함께 나타난다.
도 5는 사람 Vλ, 사람 DH 및 사람 JH 유전자 세그먼트의 마우스 중쇄 자리로의 점진적 삽입에 대한 예시적 표적화 전략을 나타낸다. 히그로마이신 (hyg) 및 네오마이신 (neo) 선택 카세트는 리콤비나제 인식 부위 (R1, R2, 등)과 함께 나타난다.
도 6은 사람 Vλ, 사람 DH 및 사람 Jκ 유전자 세그먼트의 마우스 중쇄 자리로의 점진적 삽입에 대한 예시적 표적화 전략을 나타낸다. 히그로마이신 (hyg) 및 네오마이신 (neo) 선택 카세트는 리콤비나제 인식 부위 (R1, R2, 등)과 함께 나타난다.
도 7은 마우스 면역글로불린 중쇄 V-D 유전자간 영역의 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 게놈 단편을 클로닝하는 단계 및 변형된 면역글로불린 중쇄 자리로의 삽입을 위해 게놈 단편을 변형시키는 조작 단계를 나타낸다.
도 8은 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 게놈 단편의 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 결합된 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트를 함유하는 변형된 마우스 면역글로불린 중쇄 자리의 Vκ-Jκ 유전자간 영역으로의 삽입에 대한 표적화 전략을 나타낸다.
도 9는 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 결합된 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트를 함유하는 변형된 마우스 면역글로불린 중쇄 자리의 사람 Vκ 유전자 세그먼트 (즉, hVκ2-40)의 업스트림 (5')에서 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 게놈 단편의 삽입에 대한 표적화 전략을 나타낸다.
본 발명은 특정 방법, 설명된 실험 조건에 제한되지 않는데, 이러한 방법 및 조건이 다를 수도 있기 때문이다. 본 발명의 범위가 청구범위에 의해 한정되기 때문에, 본원에서 사용된 용어는 특정 구체예를 설명할 목적만을 위한 것이며, 제한할 의도는 없는 것으로 또한 이해되어야 한다.
달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용된 모든 용어 및 구절은 그 반대가 분명히 지시되거나 용어 또는 구절이 사용되는 맥락으로부터 분명히 명백하지 않으면, 용어 및 구절은 업계에서 달성되었다는 의미를 포함한다. 본원에서 설명된 것들과 유사하거나 동등한 어떤 방법 및 재료도 본 발명의 실행 또는 테스트에 사용될 수 있지만, 특정 방법 및 재료가 지금 설명된다. 언급된 모든 간행물은 본원에 참고로 포함된다.
구절 "실질적인" 또는 "실질적으로"가 유전자 세그먼트의 양을 나타내기 위해 사용될 때 (예를 들어, "실질적으로 모든" V 유전자 세그먼트) 기능적 및 비기능적 유전자 세그먼트 둘 다를 포함하고, 다양한 구체예에서, 모든 유전자 세그먼트 중 예를 들어, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 또는 99% 이상을 포함한다; 다양한 구체예에서, "실질적으로 모든" 유전자 세그먼트는 기능적 (즉, 비-거짓유전자) 유전자 세그먼트 중, 예를 들어, 적어도 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%를 포함한다.
용어 "대체"는 DNA 서열이, 게놈 서열의 자리에서, 게놈 내의 서열을 이종 기원 서열 (예를 들어, 마우스에서의 사람 서열)을 대체하는 방식으로 세포의 게놈에 배치되는 것을 포함한다. 그렇게 배치된 DNA 서열은 그렇게 배치된 서열 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 5'-또는 3'-비번역된 영역, 적절한 재조합 신호 서열, 등)을 얻기 위해 사용된 공급원 DNA의 일부인 하나 이상의 조절 서열을 포함할 수도 있다. 예를 들어, 다양한 구체예에서, 대체는 그렇게 배치된 DNA 서열 (이종 기원 서열 포함)의 유전자 산물의 생산을 일으키지만, 내인성 서열의 발현은 아닌 이종 기원 서열에 대한 내인성 서열의 치환이다; 대체는 내인성 게놈 서열의 내인성 게놈 서열에 의해 암호화된 단백질과 유사한 기능을 갖는 단백질을 암호화하는 DNA 서열과의 대체이다 (예를 들어, 내인성 게놈 서열은 면역글로불린 유전자 또는 도메인을 암호화하고, DNA 단편은 하나 이상의 사람 면역글로불린 유전자 또는 도메인를 암호화함). 다양한 구체예에서, 내인성 유전자 또는 이들의 단편은 해당 사람 유전자 또는 이들의 단편으로 대체된다. 해당 사람 유전자 또는 이들의 단편은 오솔로그, 상동체인 사람 유전자 또는 단편이거나 구조 및/또는 기능이 대체되는 내인성 유전자 또는 이들의 단편과 실질적으로 동일하거나 같다.
용어 "인접한"은 같은 핵산 분자에서의 발생에 대한 참조를 포함하는데, 예를 들어, 같은 핵산 분자 상에서 발생하지만 또 다른 핵산 서열에 의해 방해되면 두 개의 핵산 서열은 "인접하다". 예를 들어, 재배열된 V(D)J 서열은 불변 영역 유전자 서열과 "인접하지만" V(D)J 서열의 최종 코돈이 불변 영역 서열의 제1 코돈 바로 다음에 있지 않다. 또 다른 예에서, 두 개의 V 유전자 세그먼트 서열은 그것들이 같은 게놈 단편 상에서 발생하지만, V 영역의 코돈을 암호화하지 않는 서열에 의해 분리될 수도 있으며, 예를 들어, 조절 서열, 예를 들어, 프로모터 또는 다른 비 암호화 서열에 의해 분리될 수도 있으면, "인접하다". 한 구체예에서, 인접한 서열은 야생형 게놈에서 발견된 바와 같이 배열된 게놈 서열을 함유하는 게놈 단편을 포함한다.
구절 "로부터 유래된"은 인용된 유전자 또는 유전자 세그먼트로부터 "유래된" 가변 영역에 관해 사용될 때 서열을 특정 재배열되지 않은 유전자 세그먼트 또는 가변 도메인을 발현하는 유전자를 형성하기 위해 재배열된 유전자 세그먼트로 역추적하는 능력을 포함한다 (적용 가능한 경우, 스플라이스(splice) 차이 및 체세포 돌연변이를 설명함).
구절 "기능적"은 가변 영역 유전자 세그먼트 또는 결합 유전자 세그먼트에 관해 사용될 때 발현된 항체 레퍼토리; 예를 들어, 사람 Vλ 유전자 세그먼트 3-1, 4-3, 2-8, 등에서의 용도가 기능적이라는 것을 나타내는 반면에, Vλ 유전자 세그먼트 3-2, 3-4, 2-5, 등은 비기능적이다.
"중쇄 자리"는 염색체, 예를 들어, 마우스 염색체 상의 자리를 포함하며, 야생형 마우스 중쇄 가변 (VH), 중쇄 다양성 (DH), 중쇄 결합 (JH), 및 중쇄 불변 (CH) 영역 DNA 서열이 발견된다.
구절 "이중특이적 결합 단백질"은 둘 이상의 에피토프에 선택적으로 결합할 수 있는 결합 단백질을 포함한다. 이중특이적 결합 단백질은 제1 CH 영역과 융합된 제1 경쇄 가변 도메인 (VL1) 및 제2 CH 영역과 융합된 제2 경쇄 가변 도메인 (VL2)을 포함하는 두 개의 다른 폴리펩티드를 포함한다. 일반적으로, 제1 및 제2 CH 영역은 동일하거나, 하나 이상의 아미노산 치환에 의해 다르다 (예를 들어, 본원에서 설명된 바와 같음). VL1 및 VL2는 다른 에피토프에-두 개의 다른 분자 (예를 들어, 항원) 상에 또는 같은 분자 상에 (예를 들어, 같은 항원 상에) 특이적으로 결합한다. 이중특이적 결합 단백질은 두 개의 다른 에피토프 (제1 에피토프 및 제2 에피토프)에 선택적으로 결합하고, 제1 에피토프에 대한 VL1의 친화도는 일반적으로 제2 에피토프, 및 반대로 VL2에 대한 VL1의 친화도보다 적어도 10배 내지 20 또는 30 또는 40배 더 낮을 것이다. 이중특이적 결합 단백질에 의해 인식된 에피토프는 같은 또는 다른 표적 (예를 들어, 같은 또는 다른 항원) 사에 있을 수 있다. 이중특이적 결합 단백질은 같은 항원의 다른 에피토프를 인식하는 VL1 및 VL2를 결합함으로써 만들어질 수 있다. 같은 항원의 다른 에피토프를 인식하는 VL 서열을 암호화하는 핵산 서열은 다른 CH 영역을 암호화하는 핵산 서열에 융합될 수 있고, 이러한 서열은 면역글로불린 경쇄를 발현하는 세포에서 발현될 수 있거나, 면역글로불린 경쇄를 발현하지 않는 세포에서 발현될 수 있다. 전형적인 이중특이적 결합 단백질은 각각 세 개의 경쇄 CDR, 이어서 (N-말단에서 C-말단으로) CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, 및 CH3 도메인, 및 항원-결합 특이성을 부여하지 않지만 각각의 중쇄와 결합할 수 있거나, VL1 및/또는 VL2에 의해 결합된 에피토프 중 하나 이상에 결합할 수 있거나, 또는 각각의 중쇄와 결합할 수 있고 중쇄 중 하나 또는 두 개의 하나 또는 두 개의 에피토프로의 결합을 가능하게 하거나 이를 돕는 면역글로불린 경쇄를 갖는 두 개의 중쇄를 갖는다.
그러므로, 두 개의 일반적인 타입의 이중특이적 결합 단백질은 (1) VL1-CH (다이머), 및 (2) VL1-CH:경쇄 + VL2-CH:경쇄이며, 경쇄는 같거나 다르다. 어떤 경우에서도, CH (즉, 중쇄 불변 영역)는 본원에서 설명된 바와 같이 별도로 변형될 수 있거나 (예를 들어, 단백질 A에 별도로 결합하거나, 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 등), 또는 같을 수도 있다.
용어 "세포"는, 서열의 발현과 관련하여 사용될 때, 재조합 핵산 서열을 발현하는데 적합한 어떤 세포도 포함한다. 세포는 원핵생물 및 진핵생물 (단일-세포 또는 다중-세포), 박테리아 세포 (예를 들어, 대장균 (E. coli), 바실루스 종 (Bacillus spp.), 스트렙토미세스 종 (Streptomyces spp.), 등의 종족), 미코박테리아(mycobacteria) 세포, 균류 세포, 효모 세포 (예를 들어, S. 세레비시애(S. cerevisiae), S. 폼베(S. pombe), P. 파스토리스(P. pastoris), P. 메타놀리카(P. methanolica), 등), 식물 세포, 곤충 세포 (예를 들어, SF-9, SF-21, 바큘로바이러스(baculovirus)-감염된 곤충 세포, 트리코플루시아 니(Trichoplusia ni), 등), 비-사람 동물 세포, 사람 세포, B 세포, 또는, 예를 들어, 히브리도마 또는 콰드로마와 같은 세포 융합체의 그것들을 포함한다. 일부 구체예에서, 세포는 사람, 원숭이, 유인원, 햄스터, 래트, 또는 마우스 세포이다. 일부 구체예에서, 세포는 진핵생물이고 다음 세포로부터 선택된다: CHO (예를 들어, CHO K1, DXB-11 CHO, Veggie-CHO), COS (예를 들어, COS-7), 망막 세포, Vero, CV1, 신장 (예를 들어, HEK293, 293 EBNA, MSR 293, MDCK, HaK, BHK), HeLa, HepG2, WI38, MRC 5, Colo205, HB 8065, HL-60, (예를 들어, BHK21), Jurkat, Daudi, A431 (상피), CV-1, U937, 3T3, λ 세포, C127 세포, SP2/0, NS-0, MMT 060562, Sertoli 세포, BRL 3A 세포, HT1080 세포, 골수종(myeloma) 세포, 종양 세포, 및 상기 언급된 세포로부터 유래된 세포주. 일부 구체예에서, 세포는 하나 이상의 바이러스 유전자, 예를 들어, 바이러스 유전자를 발현하는 망막 세포 (예를 들어, PERC.6™ 세포)를 포함한다.
용어 "동족"은, 예를 들어, 제2 VL 도메인과 "동족인" 제1 VL 도메인과 동족이라는 의미에서 사용될 때, 본 발명에 따라 마우스에 의해 만들어진 같은 결합 단백질의 두 개의 VL 도메인 사이의 관계에 대한 지시대상를 포함하기 위한 것이다. 예를 들어, 본 발명의 구체예에 따라 유전적으로 변형된 마우스, 예를 들어, VH, DH, 및 JH 영역이 VL 및 JL 영역으로 대체되는 중쇄 자리를 갖는 마우스는 제1 사람 VL 도메인과 융합된 같은 마우스 CH 영역 (예를 들어, IgG 이소타입)으로 만들어진 두 개의 동일한 폴리펩티드 사슬, 및 제2 사람 VL 도메인과 융합된 같은 마우스 CL 영역으로 만들어진 두 개의 동일한 폴리펩티드 사슬을 갖는 항체-유사 결합 단백질을 만든다. 마우스에서 클론의 선택 중에, 제1 및 제2 사람 VL 도메인은 단일 항체-유사 결합 단백질의 맥락에서 함께 나타나는 클론 선택 과정에 의해 선택되었다. 따라서, 클론 선택 과정의 결과로서, 단일 항체-유사 분자에서 함께 나타나는 제1 및 제2 VL 도메인은 "동족"인 것으로 언급된다. 반대로, 제1 및 제2 항체-유사 분자가 동일한 중쇄를 갖지 않으면 (즉, 제1 사람 중쇄 영역에 융합된 VL 도메인 및 제2 사람 중쇄 영역에 융합된 VL 도메인이 동일하지 않으면), 제1 항체-유사 분자에서 나타나는 VL 도메인 및 제2 항체-유사 분자에서 나타나는 VL 도메인은 동족이 아니다.
구절 "상보성 결정 영역", 또는 용어 "CDR"은 보통 (즉, 야생형 동물에서) 면역글로불린 분자 (예를 들어, 항체 또는 T 세포 수용체)의 경쇄 또는 중쇄의 가변 영역의 두 개의 프레임워크 영역 사이에서 나타나는 유기체의 면역글로불린 유전자의 핵산 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한다. CDR은, 예를 들어, 생식세포 계열 서열 또는 재배열된 또는 재배열되지 않은 서열에 의해, 및, 예를 들어, 나이브(naive) 또는 성숙한 B 세포 또는 T 세포에 의해 암호화될 수 있다. 일부 상황에서 (예를 들어, CDR3에 대하여), CDR은 인접하지 않지만 (예를 들어, 재배열되지 않은 핵산 서열에서), 예를 들어, 서열 (예를 들어, 중쇄 CDR3을 형성하기 위한 V-D-J 재조합)의 스플라이싱 또는 연결의 결과로서, B 세포 핵산 서열에서는 인접한 둘 이상의 서열 (예를 들어, 생식세포 계열 서열)에 의해 암호화될 수 있다.
구절 "유전자 세그먼트", 또는 "세그먼트"는 V (경쇄 또는 중쇄) 또는 D 또는 J (경쇄 또는 중쇄) 면역글로불린 유전자 세그먼트에 대한 참조를 포함하며, 재배열 (예를 들어, 내인성 리콤비나제에 의해 매개됨)에 참여하여 재배열된 V/J 또는 V/D/J 서열을 형성할 수 있는 면역글로불린 자리에서 (예를 들어, 사람 및 마우스에서) 재배열되지 않은 서열을 포함한다. 달리 지시되지 않으면, V, D, 및 J 세그먼트는 12/23 법칙에 따라 V/J 재조합 또는 V/D/J 재조합을 허용하는 재조합 신호 서열 (RSS)를 포함한다. 달리 지시되지 않으면, 세그먼트는 그것들이 이들의 천연 등가물 또는 기능적 등가물에서 결합되는 서열을 더 포함한다 (예를 들어, V 세그먼트 프로모터(들) 및 선도 서열(들)에 대하여).
구절 "중쇄", 또는 "면역글로불린 중쇄"는 어떤 유기체의 면역글로불린 중쇄 불변 영역 서열도 포함하고, 달리 명시되지 않으면 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다. 달리 명시되지 않으면, VH 도메인은 세 개의 중쇄 CDR 및 네 개의 프레임워크 (FR) 영역을 포함한다. 중쇄의 단편은 CDRs, CDRs 및 FRs, 및 이들의 조합을 포함한다. 전형적인 중쇄는 근본적으로, 가변 도메인에 따라 (N-말단에서 C-말단으로), CH1 도메인, 힌지, CH2 도메인, CH3 도메인, 및 선택적으로 CH4 도메인 (예를 들어, IgM 또는 IgE의 경우에) 및 막관통 (M) 도메인 (예를 들어, 림프세포 상의 막-결합 면역글로불린의 경우에)으로 구성된다. 중쇄 불변 영역은 외부 FR4에서 중쇄의 C-말단으로 확장되는 (N-말단 측면에서 C-말단 측면으로) 중쇄의 영역이다. 약간의 편차, 예를 들어, C-말단의 하나, 둘, 셋 또는 여러 아미노산의 절단을 가진 중쇄 불변 영역은 구절 "중쇄 불변 영역", 뿐만 아니라 서열 변형, 예를 들어, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 아미노산 치환을 갖는 중쇄 불변 영역에 의해 포함될 것이다. 아미노산 치환은, 예를 들어 (면역글로불린 불변 영역, 예를 들어, 사람 IgG 불변 영역의 EU 넘버링에 관하여), 228, 233, 234, 235, 236, 237, 238, 239, 241, 248, 249, 250, 252, 254, 255, 256, 258, 265, 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 297, 298, 301, 303, 305, 307, 308, 309, 311, 312, 315, 318, 320, 322, 324, 326, 327, 328, 329, 330, 331, 332, 333, 334, 335, 337, 338, 339, 340, 342, 344, 356, 358, 359, 360, 361, 362, 373, 375, 376, 378, 380, 382, 383, 384, 386, 388, 389, 398, 414, 416, 419, 428, 430, 433, 434, 435, 437, 438, 및 439로부터 선택된 하나 이상의 위치에서 만들어질 수 있다.
제한의 방법에 의한 것은 아니지만, 예를 들어, 중쇄 불변 영역은 향상된 혈청 반감기를 나타내도록 변형될 수 있고 (인용된 변형(들)이 없는 같은 중쇄 불변 영역과 비교하여) 위치 250 (예를 들어, E 또는 Q); 250 및 428 (예를 들어, λ 또는 F); 252 (예를 들어, L/Y/F/W 또는 T), 254 (예를 들어, S 또는 T), 및 256 (예를 들어, S/R/Q/E/D 또는 T)에서의 변형; 또는 428 및/또는 433 (예를 들어, L/R/SI/P/Q 또는 K) 및/또는 434 (예를 들어, H/F 또는 Y)에서의 변형; 또는 250 및/또는 428에서의 변형; 또는 307 또는 308 (예를 들어, 308F, V308F), 및 434에서의 변형을 갖는다. 또 다른 예에서, 변형은 428L (예를 들어, M428L) 및 434S (예를 들어, N434S) 변형; 428L, 259I (예를 들어, V259I), 및 308F (예를 들어, V308F) 변형; 433K (예를 들어, H433K) 및 434 (예를 들어, 434Y) 변형; 252, 254, 및 256 (예를 들어, 252Y, 254T, 및 256E) 변형; 250Q 및 428L 변형 (예를 들어, T250Q 및 M428L); 307 및/또는 308 변형 (예를 들어, 308F 또는 308P)을 포함할 수 있다.
구절 "경쇄"는 어떤 유기체의 면역글로불린 경쇄 불변 (CL) 영역 서열을 포함하고, 달리 명시되지 않으면 사람 κ 및 λ 경쇄를 포함한다. 경쇄 가변 (VL) 도메인은, 달리 명시되지 않으면, 전형적으로 세 개의 경쇄 CDR 및 네 개의 프레임워크 (FR) 영역을 포함한다. 일반적으로, 전체-길이 경쇄 (VL + CL)는, 아미노 말단에서 카르복실 말단으로, FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4, 및 CL 영역을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 본 발명과 함께 사용될 수 있는 경쇄 (VL + CL)는, 예를 들어, 결합 단백질에 의해 선택적으로 결합된 제1 또는 제2 (이중특이적 결합 단백질의 경우에) 에피토프 (예를 들어, CH 도메인과 융합된 VL 도메인에 의해 선택적으로 결합된 에피토프(들))에 선택적으로 결합되지 않는 것들을 포함한다.
CH 도메인과 융합된 VL에 의해 결합된 에피토프(들)에 선택적으로 결합되지 않는 VL 도메인은 기존 항체 라이브러리 (습식 라이브러리 또는 인 실리코 (in silico))에서 가장 흔히 이용되는 경쇄에 대하여 스크리닝함으로써 확인될 수 있는 것들을 포함하며, 경쇄는 결합 단백질의 에피토프 결합 도메인의 친화도 및/또는 선택성을 실질적으로 방해하지 않는다. 경쇄는 CH 영역에 융합된 VL에 의해 특이적으로 결합된 에피토프에 결합할 수 있는 것들을 포함한다 (단독으로 또는 CH 영역과 융합된 그것의 동족 VL과 조합하여).
구절 "마이크로몰 범위"는 1-999 마이크로몰을 의미하기 위한 것이다; 구절 "나노몰 범위"는 1-999 나노몰을 의미하기 위한 것이다. 구절 "피코몰 범위"는 1-999 피코몰을 의미하기 위한 것이다.
용어 "비-사람 동물"은 원구류(cyclostome), 경골어류(bony fish), 상어 및 가오리와 같은 연골어류(cartilaginous fish), 양서류, 파충류, 포유류, 및 조류와 같이 어떤 비-사람 동물도 포함하기 위한 것이다. 적합한 포유동물은 비-사람 영장류, 염소, 양, 돼지, 개, 소, 및 설치류를 포함한다. 적합한 포유동물은 래트 및 마우스를 포함하는 설치류로부터 선택된다. 한 구체예에서, 비-사람 동물은 마우스이다.
유전 모델로서 마우스는 유전자 이식 및 넉아웃 기술에 의해 크게 향상되었으며, 이것은 특정 유전자의 지시된 과발현 또는 결실의 효과의 연구를 허용하였다. 그것의 모든 장점에도 불구하고, 마우스는 여전히 사람 질환에 대하여 불완전한 모델 및 사람 치료제를 테스트하고 그것들을 만들기 위한 불완전한 플랫폼으로 만드는 유전적 장애를 제공한다. 먼저, 사람 유전자 중 약 99%는 마우스 상동체를 갖지만 (Waterston et al. (2002), Initial sequencing and comparative analysis of the mouse 게놈, Nature 420, 520-562), 잠재적 치료제는 종종 의도된 사람 표적의 마우스 오솔로그와 교차반응, 또는 불충분하게 교차반응하는데 실패한다. 이 문제를 배제하기 위해, 선택된 표적 유전자는 "사람화될" 수 있는데, 즉, 마우스 유전자는 제거되고 해당 사람 오솔로그의 유전자 서열에 의해 대체될 수 있다 (예를 들어, US 6,586,251, US 6,596,541 및 US 7,105,348, 참고로 본원에 포함됨). 초기에, "넉아웃-플러스-유전자 이식 사람화" 전략에 의해 마우스 유전자를 사람화하려는 노력은 내인성 유전자의 결실을 가지고 있는 마우스의 무작위로 통합된 사람 이식 유전자를 가지고 있는 마우스와의 교배를 수반하였다 (예컨대, Bril et al. (2006), Tolerance to factor VIII in a transgenic mouse expressing human factor VIII cDNA carrying an Arg(593) to Cys substitution, Thromb Haemost 95:341-347; Homanics et al. (2006), Production and characterization of murine models of classic and intermediate maple syrup urine disease, BMC Med Genet 7:33; Jamsai et al. (2006), A humanized BAC transgenic/knockout mouse model for HbE/beta-thalassemia, Genomics 88(3):309-15; Pan et al. (2006), Different role for mouse and human CD3delta/epsilon heterodimer in preT cell receptor (preTCR) function: human CD3delta/epsilon heterodimer restores the defective preTCR function in CD3gamma-and CD3gammadelta-deficient mice, Mol Immunol 43:1741-1750을 참고하며 됨). 하지만 상기 노력들은 크기 제한에 의해 방해되었다; 통상적인 넉아웃 기술은 큰 마우스 유전자를 큰 사람 게놈 대응물로 직접적으로 대체하기 위해 충분하지 않았다. 마우스 유전자의 정확한 유전적 자리에서 (즉, 내인성 마우스 자리에서) 내인성 마우스 유전자가 사람 대응물 유전자에 의해 직접적으로 대체되는, 직접적인 상동성 대체의 간단한 접근법은, 기술적인 어려움 때문에 거의 시도되지 않는다. 지금까지, 직접적인 대체의 노력은 정교하고 부담스러운 과정을 수반하였고, 따라서 핸들링될 수 있는 유전 물질의 길이 및 조작될 수 있는 정확성으로 제한한다.
외부에서 도입된 사람 면역글로불린 이식 유전자는 마우스의 전구체 B-세포에서 재배열된다 (Alt et al. (1985), immunoglobulin genes in transgenic mouse, Trends Gener 1:231-236). 이 발견은 사람 항체를 발현하도록 넉아웃-플러스-유전자 이식 접근법을 사용하여 마우스를 조작함으로써 이용되었다 (Green er al. (1994), Antigen-specific human monoclonal antibodies from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs, Nat Gener 7:13-21; Lonberg, N. (2005), Human antibodies from transgenic animals. Nat Biotechnol 23:1117-1125; Lonberg et al. (1994), Antigen-specific human antibody from mice comprising four distinct genetic modifications, Nature 368:856-859; Jakobovits et al. (2007), From XenoMouse technology to panitumumab, the first fully human antibody product from transgenic mice, Nat Biotechnol 25:1134-1143). 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 및 κ 경쇄 자리는 각각의 내인성 자리의 작지만 결정적인 부분의 표적화된 결실 후, 이어서 상기 설명된 바와 같이, 무작위로 통합된 큰 이식 유전자로서 사람 면역글로불린 유전자 자리, 또는 꼬마염색체의 도입에 의해 이들 마우스에서 불활성화되었다 (Tomizuka et al. (2000), Double trans-chromosomic mice: maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human andibodies, PNAS USA 97:722-727). 이러한 마우스는 유전적 조작에 있어서 중요한 진보를 나타낸다: 그것들로부터 분리된 완전한 사람 단클론성 항체는 다양한 사람 질환을 치료하는데 잠재적인 유망한 치료제를 수득하였다 (Gibson et al. (2006), Randomized phase III trial results of panitumumab, fully human anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody, in metastatic colorectal cancer, Clin Colorectal Cancer 6:29-31; Jakobovits er al., 2007; Kim et al. (2007), Clinical efficacy of zanolimumab (HuMax-CD4): two Phase II studies in refractory cutaneous T-cell lymphoma, Blood 109(11):4655-62; Lonberg, 2005; Maker et al. (2005), Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 blockade and interleukin 2: a phase I/II study, Ann Surg Oncol 12:1005-1016; McClung et al. (2006), Denosumab in postmenopausal women with low bone mineral density, N Engl J Med 354:821-831). 그러나, 상기 논의된 바와 같이, 이들 마우스는 야생형 마우스와 비교할 때 면역 반응이 제대로 작용하지 않는 B 세포 발달 및 면역 결손을 나타낸다. 결손은 (1) 사람 면역글로불린 이식 유전자의 무작위의 도입으로 인한 비효율적 기능성 및 업스트림 및 다운스트림 제어 요소의 결손으로 인한 결과의 부정확한 발현 (Garrett et al. (2005), Chromatin architecture near a potential 3' end of the Igh locus involves modular regulation of histone modifications during B-Cell development and in vivo occupancy at CTCF sites, Mol Cell Biol 25:151 1-1525; Manis et al. (2003), Elucidation of a downstream boundary of the 3' IgH regulatory region, Mol Immunol 39:753-760; Pawlitzky et al. (2006), Identification of a candidate regulatory element within the 5' flanking regioin of the mouse Igh locus defined by pro-B cell-specific hypersensitivity associated with binding of PU.1, Pax5, and E2A, J Immunol 17616839-6851); (2) B 세포의 정상적인 성숙화, 증식, 및 생존에 필요한 신호전달 과정을 손상시킬 수도 있는, 사람 불변 도메인 및 세포 표면 상에서 B-세포 수용체 신호전달 복합체의 마우스 구성요소 사이의 비효율적인 이종간의 상호작용 (Hombach et al. (1990), Molecular components of the B-cell antigen receptor complex of the IgM class, Nature 343:760-762); 및 (3) 가용성 사람 면역글로불린 및 친화도 선택을 감소시킬 수도 있는 마우스 Fc 수용체 사이의 비효율적인 이종간의 상호작용 (Rao et al. (2002). Differential expression of the inhibitory IgG Fc receptor FcgammaRIIB on germinal center cells: implications for selection of high-affinity B 세포, J Immunol 169:1859-1868) 및 면역글로불린 혈청 농도 (Brambell et al. (1964), A Theoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism, Nature 203:1352-1354; Junghans Anderson, (1996), The protection receptor for IgG catabolism is the beta2-microglobulin-containing neonatal intestinal transport receptor, PNAS USA93:5512-5516; Rao et al., 2002; Hjelm et al. (2006), antibody-mediated regulation of the immune response, Scand J Immunol 64:177-184; Nimmerjahn and Ravetch, (2007), Fc-receptors as regulators of immunity, Adv Immunol 96:179-204) 때문일 수도 있다. 이들 결손은 내인성 중쇄 및 경쇄 자리에서 그것들의 천연 위치 내에서 마우스 면역글로불린 자리의 가변 영역만의 인 시튜(in situ) 사람화에 의해 수정될 수 있다. 이것은 고정 마우스 불변 영역에 기초한 마우스 환경으로 정상적인 상호작용 및 선택을 할 수 있는 "역 키메라 (즉, 사람 V: 마우스 C) 항체를 만드는 마우스를 효과적으로 발생시킨다. 게다가 이러한 역 키메라 항체는 치료적 목적을 위해 완전산 사람 항체로 재설정될 수도 있다.
이종 기원 (예를 들어, 또 다른 종) 면역글로불린 서열을 갖는 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에서 삽입 또는 대체를 포함하는, 유전적으로 변형된 동물은 내인성 면역글로불린 경쇄 자리에서 삽입 또는 대체와 함께 또는 면역글로불린 경쇄 이식 유전자 (예를 들어, 키메라 면역글로불린 경쇄 이식 유전자 또는 완벽한 사람 완벽한 마우스, 등)와 함께 만들어질 수 있다. 이종 기원 면역글로불린 서열이 유래되는 종은 다양할 수 있다. 예시적 이종 기원 면역글로불린 서열은 사람 서열을 포함한다.
면역글로불린 가변 영역 핵산 서열, 예를 들어, V, D, 및/또는 J 세그먼트는 다양한 구체예에서 사람 또는 비-사람 동물로부터 얻어진다. V, D, 및/또는 J 세그먼트를 제공하는데 적합한 비-사람 동물은, 예를 들어 경골어류, 상어 및 가오리와 같은 연골어류, 양서류, 파충류, 포유류, 조류 (예를 들어, 닭)를 포함한다. 비-사람 동물은, 예를 들어, 포유류를 포함한다. 포유류는, 예를 들어, 비-사람 영장류, 염소, 양, 돼지, 개, 소 (예를 들어, 암소, 황소, 버팔로), 사슴, 낙타, 페릿 및 설치류 및 비-사람 영장류 (예를 들어, 침팬지, 오랑우탄, 고릴라, 마모셋(marmoset), 붉은털 원숭이(rhesus monkey), 개코원숭이(baboons))를 포함한다.적합한 비-사람 동물은 래트, 마우스, 및 햄스터를 포함하는 설치류로부터 선택된다. 한 구체예에서, 비-사람 동물은 마우스이다. 문맥에서 명백한 바와 같이, 다양한 비-사람 동물은 가변 도메인 또는 가변 영역 유전자 세그먼트의 공급원으로서 사용될 수 있다 (예를 들어, 상어, 가오리, 포유류, 예를 들어, 낙타, 마우스 및 래트와 같은 설치류).
문맥에 따르면, 비-사람 동물은 가변 서열 또는 세그먼트와 관련되어 사용되기 위한 불변 영역 서열의 공급원으로서도 사용되는데, 예를 들어, 설치류 불변 서열은 사람 또는 비-사람 가변 서열 (예를 들어, 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트 또는 햄스터에 작동 가능하게 결합된 사람 또는 비-사람 영장류 가변 서열, 불변 서열)에 작동 가능하게 결합된 이식 유전자에서 사용될 수 있다. 따라서, 다양한 구체예에서, 사람 V, D, 및/또는 J 세그먼트는 설치류 (예를 들어, 마우스 또는 래트 또는 햄스터) 불변 영역 유전자 서열에 작동 가능하게 결합된다. 일부 구체예에서, 사람 V, D, 및/또는 J 세그먼트 (또는 하나 이상의 재배열된 VDJ 또는 VJ 유전자)는, 예를 들어, 내인성 면역글로불린 자리가 아닌 자리에서 통합된 이식 유전자에서 마우스, 래트, 또는 햄스터 불변 영역 유전자 서열에 작동 가능하게 결합되거나 이에 융합된다.
특정 구체예에서, 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에서 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트의 하나 이상의 사람 VL 및 하나 이상의 사람 JL 유전자 세그먼트로의 대체를 포함하는 마우스가 제공되며, 하나 이상의 사람 VL 및 하나 이상의 JL 유전자 세그먼트는 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자에 작동 가능하게 결합되고; 마우스는 내인성 면역글로불린 자리 이외의 자리에서 이식 유전자를 포함하며, 이식 유전자는 마우스 또는 래트 또는 사람 불변 영역에 작동 가능하게 결합된 재배열되지 않은 또는 재배열된 사람 VL 및 사람 JL 유전자 세그먼트를 포함한다. 다양한 구체예에서, 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트는 사람 Vκ 또는 사람 Vλ 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 하나 이상의 사람 JL 유전자 세그먼트는 사람 Jκ 또는 사람 JL 유전자 세그먼트를 포함한다.
자손을 생성하는 마우스의 능력을 유지하는 한편 마우스 생식세포 계열 면역글로불린 중쇄 가변 유전자의 사람 생식세포 계열 면역글로불린 경쇄 가변 유전자로의 큰 인 시튜 유전적 대체 방법이 설명된다. 특이적으로, 마우스 불변 영역을 온전하게 두는 한편 마우스 중쇄 가변 유전자 자리의 사람 경쇄 가변 유전자 자리로의 정확한 대체가 설명된다. 결과로서, 내인성 불변 영역의 맥락에서 면역글로불린-유사 결합 단백질을 발현하는 마우스가 생성되었다. 사람 경쇄 가변 영역은 마우스 중쇄 불변 영역에 결합되어 독특한 면역글로불린-유사 분자를 재배열하고 발현하는 키메라 사람-마우스 면역글로불린 자리를 형성한다. 발현된 면역글로불린-유사 분자는 "역 키메라"이고, 즉, 그것들은 사람 가변 영역 서열 및 마우스 불변 영역 서열을 포함한다.
정확한 자리, 예를 들어, 내인성 마우스 면역글로불린 자리에서, 마우스의 게놈에서 사람 면역글로불린 서열의 조작은 마우스 및 사람 사이의 면역글로불린 자리의 분지 진화(divergent evolution)로 인한 특정 과제를 제시할 수도 있다. 예를 들어, 면역글로불린 자리 내에 배치된 유전자간 서열은 마우스 및 사람 사이에서 동일하지 않고, 일부 상황에서는, 기능적으로 동등하지 않을 수도 있다. 면역글로불린 자리에서 마우스 및 사람 사이의 차이는, 특히 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 자리의 특정 부분을 사람화하거나 조작할 때, 사람화된 마우스의 이상을 일으킬 수 있다. 마우스 면역글로불린 중쇄 자리에서 일부 변형은 유해하다. 유해한 변형은, 예를 들어, 교미하거나 자손을 생산하는 변형된 마우스의 능력의 손실을 포함한다. 다양한 구체예에서, 마우스의 게놈에서 사람 면역글로불린 서열의 조작은 변형된 마우스 종족에서 부재시 해로운 내인성 서열을 유지하는 방법을 포함한다. 예시적 유해한 효과는 변형된 종족을 번식시킬 수 없는 능력, 필수 유전자의 기능의 손실, 폴리펩티드를 발현시킬 수 없는 능력, 등을 포함할 수도 있다. 이러한 유해한 효과는 마우스의 게놈으로 조작된 변형과 직접적으로 또는 간접적으로 관련될 수도 있다.
대체된 면역글로불린 자리를 갖는 마우스에서 관찰된 거의 야생형인 체액 면역 기능에도 불구하고, 무작위로 통합된 이식 유전자를 이용하는 일부 접근법에서는 발생하지 않는 면역글로불린의 직접적인 대체를 이용할 때 발생하는 다른 과제가 있다. 마우스 및 사람 사이에서 면역글로불린 자리의 유전적 조성의 차이는 대체된 면역글로불린 유전자 세그먼트를 갖는 마우스의 번식에 이로운 서열의 발견으로 이어졌다. 특이적으로는, 내인성 면역글로불린 중쇄 자리 내에 자리한 마우스 ADAM6 유전자는, 생식능력에서 그것들의 역할로 인해, 대체된 면역글로불린 자리를 갖는 마우스에서 최적으로 존재한다.
마우스 중쇄 면역글로불린 자리 (VH-DH-JH)의 가변 영역의 6개의 메가베이스의 사람 면역글로불린 경쇄 가변 유전자 자리 (VL-JL)로의 정확한, 인 시튜 대체가 수행되는 한편, 모든 마우스 불변 사슬 유전자 및 자리 전사 조절 영역을 포함하는, 플랭킹된 마우스 서열을 히브리드 자리 내에서 온전하고 기능적으로 둔다 (도 2-도 6). 마우스에게 야생형 마우스와 비슷한 방식으로 교미하고 자손을 생산하는 능력을 부여하는 마우스 서열을 유지하도록 조작하는 단계가 수행되었다 (도 7-도 9). 특이적으로, 근위 팔 (즉, 40개의 기능적 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 다섯 개의 사람 Jκ 유전자 세그먼트) 및 마우스 ADAM6 유전자를 함유하는 절반의 메가베이스의 약 사람 면역글로불린 κ 경쇄 자리는 VELOCIGENE® 유전적 조작 기술을 사용하여 키메라 BAC 표적화 벡터를 통해 마우스 ES 세포로 도입되었다 (예컨대, 미국 특허 번호 제6,586,251호 및 Valenzuela et al., 2003, High-throughput engineering of the mouse 게놈 coupled with high-resolution expression analysis, Nat Biotechnol 21:652-659를 참고하면 됨).
마우스 ADAM6의 게놈 자리 및 기능
어떤 기능적 ADAM6 단백질도 발현할 수 있는 능력이 결핍된 수컷 마우스는 교미하고 자손을 생성하는 마우스의 능력의 심각한 결점을 나타낸다. 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 세그먼트의 사람 경쇄 가변 유전자 세그먼트로의 대체의 장점에 의해 기능적 ADAM6 단백질을 발현하는 능력이 결핍된다. ADAM6 기능의 손실은 DH 유전자 세그먼트의 업스트림에 있는 VH 유전자 세그먼트 자리의 3' 끝에 가까운, 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 자리의 영역 내에 자리하기 때문에 발생한다. 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 중쇄 가변 유전자 세그먼트의 사람 경쇄 가변 유전자 세그먼트로의 대체에 동형 접합체인 마우스를 교배시키기 위해서, 대체에 대하여 각각 동형 접합체인 수컷 및 암컷을 설정하고 생산적인 교미를 기다리는 것은 일반적으로 번거로운 접근법이다. 성공적인 한 배 새끼는 비교적 드물고, 평균 한 배 새끼 크기는 매우 작다. 대신에, 대체에 대하여 이형 접합체인 수컷은 대체에 대하여 이형 접합체인 자손을 생성하기 위해 대체에 대하여 상동 접합체인 암컷과 교미하는데 이용되었고, 그후 그 상동 접합체 마우스를 교배시켰다. 발명자는 수컷 마우스에서 생식능력의 손실의 가능한 원인이 기능적 ADAM6 단백질의 상동 접합체 수컷 마우스에는 없는 것으로 결정하였다.
다양한 양태에서, 손상된 (즉, 비기능적 또는 미미하게 기능적) ADAM6 유전자를 포함하는 수컷 마우스는 생식능력의 감소 또는 제거를 나타낸다. 마우스 (및 다른 설치류)에서 ADAM6 유전자가 면역글로불린 중쇄 자리에 자리하기 때문에, 발명자는 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에 대한 변형을 포함하는 마우스를 번식시키거나, 또는 마우스의 종족을 생성하고 유지하기 위해서, 다양하게 변형된 교배 또는 번식 전략이 이용되는 것으로 결정하였다. 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 자리의 대체에 대하여 상동성인 수컷 마우스의 낮은 생식능력, 또는 생식불가능은 마우스 종족에서 이러한 변형의 유지를 어렵게 한다. 다양한 구체예에서, 종족의 유지는 대체에 대하여 상동 접합체인 수컷 마우스에 의해 나타난 생식불가능 문제의 방지를 포함한다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같은 마우스 종족의 유지 방법이 제공된다. 마우스의 종족은 이소성 ADAM6 서열을 포함할 필요가 없고, 다양한 구체예에서, 마우스의 종족은 ADAM6의 넉아웃 (예를 들어, 기능적 넉아웃)에 대한 상동 접합체 또는 이형 접합체이다. 마우스 종족은 수컷 마우스에서 생식능력의 감소 또는 손실을 일으키는 내인성 면역글로불린 중쇄 자리의 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 변형은 ADAM6 유전자의 조절 영역 및/또는 암호화 영역의 결실을 포함한다. 특정 구체예에서, 변형은 변형을 포함하는 수컷 마우스의 생식능력을 감소시키거나 제거하는 내인성 ADAM6 유전자 (조절 및/또는 암호화 영역)의 변형을 포함한다; 특정 구체예에서, 변형은 변형에 대하여 상동 접합체인 수컷 마우스의 생식능력을 감소시키거나 제거한다.
한 구체예에서, 마우스 종족은 넉아웃 (예를 들어, 기능적 넉아웃) 또는 결실에 대하여 상동 접합체 또는 이형 접합체이다.
한 구체예에서, 마우스 종족은 변형에 대하여 상동 접합체 또는 이형 접합체인 마우스로부터 숙주 배아의 세포를 분리하고, 대리모에서 숙주 배아 및 기증자 세포를 임신시키고, 대리모로부터 유전적 변형을 포함하는 자손을 얻음으로써 유지된다. 한 구체예에서, 기증자 세포는 ES 세포이다. 한 구체예에서, 기증자 세포는 만능 세포, 예를 들어, 유도 만능 세포이다.
한 구체예에서, 마우스 종족은 변형에 대하여 상동 접합체 또는 이형 접합체인 마우스로부터 변형을 포함하는 핵산 서열을 분리하고, 핵산 서열을 숙주 핵으로 도입하고, 적합한 동물에서 핵산 서열 및 숙주 핵을 포함하는 세포를 임신시킴으로써 유지된다. 한 구체예에서, 핵산 서열은 숙주 난모세포 배아로 도입된다.
한 구체예에서, 마우스 종족은 변형에 대하여 상동 접합체 또는 이형 접합체인 마우스로부터 핵을 분리하고, 핵을 숙주 세포로 도입하고, 적합한 동물에서 핵 및 숙주 세포를 임신시켜서 변형에 대하여 상동 접합체 또는 이형 접합체인 자손을 얻음으로써 유지된다.
한 구체예에서, 마우스 종족은 유전적 변형을 포함하는 수컷 마우스의 정자를 이용하는 암컷 마우스 (야생형, 변형에 대한 상동 접합체, 또는 변형에 대한 이형 접합체)의 시험관 내 수정 (IVF)를 이용함으로써 유지된다. 한 구체예에서, 수컷 마우스는 유전적 변형에 대하여 이형 접합체이다. 한 구체예에서, 수컷 마우스는 유전적 변형에 대하여 상동 접합체이다.
한 구체예에서, 마우스 종족은 유전적 변형에 대하여 이형 접합체인 수컷 마우스를 암컷 마우스와 교배시켜서 유전적 변형을 포함하는 자손을 얻고, 유전적 변형을 포함하는 수컷 및 암컷 자손을 확인하며 유전적 변형에 대하여 야생형, 상동 접합체, 또는 이형 접합체인 암컷과 교배시켜서 유전적 변형을 포함하는 자손을 얻는데 있어서 유전적 변형에 대하여 이형 접합체인 수컷을 이용함으로써 유지된다. 한 구체예에서, 유전적 변형에 대하여 이형 접합체인 수컷을 야생형 암컷, 유전적 변형에 대하여 이형 접합체인 암컷, 또는 유전적 변형에 대하여 상동 접합체인 암컷과 교배시키는 단계가 마우스 종족에서 유전적 변형을 유지하기 위해 반복된다.
한 양태에서, 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 자리의 하나 이상의 사람 면역글로불린 경쇄 서열, 및 선택적으로 하나 이상의 사람 DH 유전자 세그먼트로의 대체를 포함하는 마우스 종족을 유지하는 방법이 제공되며, 마우스 종족을 교배시켜서 이형 접합체인 수컷 마우스를 생성하는 단계를 포함하고, 이형 접합체인 수컷 마우스는 종족의 유전적 변형을 유지하기 위해 교배된다. 특정 구체예에서, 종족은 상동 접합체 수컷의 야생형 암컷, 또는 유전적 변형에 대하여 상동 접합체 또는 이형 접합체인 암컷과의 어떤 교배에 의해서도 유지되지 않는다.
ADAM6 단백질은 에이 디스인테그린 앤 메탈로프로테아제 (A Disintegrin And Metalloprotease; ADAM) 과의 멤버이며, 이것은 세포 부착을 포함하는 다양한 기능을 가진 큰 과이다. ADAM6 과의 일부 멤버는 정자 형성(spermatogenesis) 및 수정에 연관된다. 예를 들어, ADAM2는 단백질 퍼틸린의 서브유닛을 암호화하며, 이것은 정자-난자 상호작용에 연관된다. ADAM3, 또는 사이리테스틴(cyritestin)은 투명대(zona pellucida)에 결합하는 정자가 필요한 것으로 나타난다. ADAM2 또는 ADAM3의 부재는 생식불가능을 발생시킨다. ADAM2, ADAM3, 및 ADAM6은 마우스 정자 세포의 표면 상에서 복합체를 형성한다는 것이 가정되었다.
사람에서, ADAM6 유전자, 전하는 바에 의하면 거진유전자는 사람 VH 유전자 세그먼트 VH1-2 및 VH6-1 사이에 자리한다. 마우스에서, 마우스 VH 및 DH 유전자 세그먼트 사이의 유전자간 영역에 자리하는 두 개의 ADAM6 유전자, ADAM6a 및 ADAM6b가 있으며, 주위의 면역글로불린 유전자 세그먼트의 전사 방향과 반대의 전사 방향을 향한다. 마우스에서, 기능적 ADAM6 자리는 정상 수정에 분명히 필요하다. 기능적 ADAM6 자리 또는 서열은 손실 또는 손상된 내인성 ADAM6 자리를 가진 수컷 마우스에서 나타난 대폭 감소된 수정을 보충하거나, 또는 구조할 수 있는 ADAM6 자리 또는 서열을 나타낸다.
ADAM6a 및 ADAM6b를 암호화하는 마우스에서 유전자간 서열의 위치는 내인성 중쇄를 변형시킬 때 유전자간 서열을 변형에 민감하게 한다. VH 유전자 세그먼트가 결실되거나 대체될 때, 또는 DH 유전자 세그먼트가 결실되거나 대체될 때, 결과의 마우스가 생식능력의 극심한 결손을 나타낼 확률이 높다. 결손을 보상하기 위해서, 마우스는 내인성 ADAM6 자리의 변형으로 인한 ADAM6 활성의 손실을 보충하는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하도록 변형된다. 다양한 구체예에서, 보충 뉴클레오티드 서열은 마우스 ADAM6a, 마우스 ADAM6b, 또는 상동체 또는 오솔로그 또는 생식능력 결손을 구조하는 이들의 기능적 단편을 암호화하는 것이다. 다양한 구체예에서, 보충 뉴클레오티드 서열은 SEQ ID NO: 1에서 제시된 마우스 ADAM6a 단백질, 및/또는 SEQ ID NO: 2에서 제시된 마우스 ADAM6b 단백질을 암호화한다. 대안으로, 내인성 ADAM6 자리를 보존하는데 적합한 방법이 이용될 수 있는 한편, 마우스 ADAM6 자리에 플랭킹된 내인성 면역글로불린 중쇄 서열을 기능적 내인성 중쇄 가변 영역을 암호화하기 위해 재배열할 수 없게 한다. 예시적 대안의 방법은 내인성 중쇄 불변 유전자에 작동 가능하게 결합된 기능적 중쇄 가변 영역을 암호화하기 위해 재배열될 수 있는 방법으로 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 영역 자리에 위치한 마우스 염색체 대부분의 조작을 포함한다. 다양한 구체예에서, 방법은 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자 세그먼트를 함유하는 마우스 염색체 단편의 역위 및/또는 전좌를 포함한다.
생식능력을 구조하는 뉴클레오티드 서열은 어떤 적합한 위치에도 배치될 수 있다. 그것은 유전자간 영역 (예를 들어, V 유전자 세그먼트와 J 유전자 세그먼트 또는 V 유전자 세그먼트의 업스트림 사이), 또는 게놈의 어떤 적합한 위치에도 (즉, 이소성으로) 배치될 수 있다. 한 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 마우스 게놈으로 무작위로 통합된 이식 유전자로 도입될 수 있다. 한 구체예에서, 서열은 에피솜에서, 즉, 마우스 염색체 대신에 별도의 핵산에서 유지될 수 있다. 적합한 위치는 전사적으로 허용 가능하거나 활성인 위치, 예를 들어, ROSA26 자리 (Zambrowicz et al., 1997, PNAS USA 94:3789-3794), BT-5 자리 (Michael er al., 1999, Mech. Dev. 85:35-47), 또는 Oct4 자리 (Wallace et al., 2000, Nucleic Acids Res. 28:1455-1464)를 포함한다. 뉴클레오티드 서열의 전사적으로 활성인 자리로의 표적화는, 예를 들어, 제US 7,473,557호에서 설명되며, 본원에 참고로 포함된다.
대안으로, 생식능력을 구조하는 뉴클레오티드 서열은 적절한 세포 및/또는 조직, 예를 들어, 생식 조직에서 최적의 발현을 용이하게 하기 위해 유발성 프로모터와 커플링될 수 있다. 예시적 유발성 프로모터는 물리적 (예를 들어, 열 충격 프로모터) 및/또는 화학적 수단 (예를 들어, IPTG 또는 테트라시클린)에 의해 활성화된 프로모터를 포함한다.
게다가, 뉴클레오티드 서열의 발현은 발달의 특정 단계에서 또는 특정 조직 내에서 발현을 달성하기 위해 다른 유전자에 결합될 수 있다. 이러한 발현은 발달의 특정 단계에서 발현된 유전자의 프로모터와 작동 가능하게 결합된 뉴클레오티드 서열을 배치함으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, 숙주 종의 CD19 유전자 (B 세포 특이적 유전자)의 프로모터 서열과 작동 가능하게 결합된, 숙주 종의 게놈으로 조작된 한 종의 면역글로불린 서열이 배치된다. 정확한 발달 단계에서 B 세포-특이적 발현은 면역글로불린이 발현될 때 달성된다.
삽입된 뉴클레오티드 서열의 강한 발현을 달성하기 위한 또 다른 방법은 구성 프로모터를 이용하는 것이다. 예시적 구성 프로모터는 SV40, CMV, UBC, EF1A, PGK 및 CAGG를 포함한다. 유사한 방식으로, 선택된 구성 프로모터와 작동 가능하게 결합된 원하는 뉴클레오티드 서열이 배치되며, 이것은 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화된 단백질(들)의 높은 수준의 발현을 제공한다.
용어 "이소성"은 자연에서 보통 발생하지 않는 위치에서의 변위, 또는 대체 (예를 들어, 야생형 마우스에서 발견되는 핵산 서열과 같은 위치가 아닌 위치에서 핵산 서열의 대체)를 포함하기 위한 것이다. 용어는 다양한 구체예에서 정상적인, 또는 적절한 위치 외부에 있는 물체의 의미로 사용된다. 예를 들어, 구절 ".를 암호화하는 이소성 뉴클레오티드 서열"은 마우스에서 보통 발생하지 않는 위치에서 나타나는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 예를 들어, 마우스 ADAM6 단백질 (또는 오솔로그 또는 상동체 또는 수컷 마우스에서 같거나 유사한 생식능력 이점을 제공하는 이들의 단편)을 암호화하는 이소성 뉴클레오티드 서열의 경우에, 서열은 야생형 마우스에서 보통 발견되는 마우스의 게놈의 다른 위치에 배치될 수 있다. 이러한 경우에서, 마우스 서열의 새로운 서열 접합은 야생형 마우스 이외에 마우스의 게놈의 다른 위치에 서열을 배치함으로써 생성될 것이다. 마우스 ADAM6의 기능적 상동체 또는 오솔로그는 ADAM6-/- 마우스에서 관찰되는 생식능력 손실 (예를 들어, 교미에 의해 자손을 생성하는 수컷 마우스의 능력의 손실)의 구조를 부여하는 서열이다. 기능적 상동체 또는 오솔로그는 ADAM6a의 아미노산 서열 및/또는 ADAM6b의 아미노산 서열과 적어도 약 89%이상의 동일성, 예를 들어, 최대 99% 동일성을 갖고, 성공적으로 교미하는 능력을 보충하거나, 또는 구조할 수 있는, ADAM6a 및/또는 ADAM6b의 결실 또는 넉아웃을 포함하는 유전자형을 갖는 마우스의, 단백질을 포함한다.
이소성 위치는 어떤 곳 (마우스 ADAM6 서열을 함유하는 이식 유전자의 무작위 삽입과 같음)도 될 수 있거나, 또는, 예를 들어, 야생형 마우스의 위치에 근사한 (하지만 정확히 같지는 않은) 위치 (변형된 내인성 면역글로불린 자리이지만, 그것의 자연의 업스트림 또는 다운스트림, 예를 들어, 변형된 면역글로불린 자리 내에 있지만 다른 유전자 세그먼트 사이, 또는 마우스 V-D 유전자간 서열의 다른 위치)에 있을 수 있다. 이소성 대체의 한 예는 내인성 면역글로불린 중쇄 자리 내에서 야생형 마우스에서 보통 발견되는 위치를 유지하는 한편, 주위의 내인성 중쇄 유전자를 내인성 중쇄 불변 영역을 함유하는 기능적 중쇄를 암호화하기 위해 재배열할 수 있게 하는 것이다. 이 예에서, 이것은 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 자리를 함유하는 염색체 단편의 역위에 의해, 예를 들어, 가변 영역 자리를 플랭킹하는 위치에 배치된 조작된 부위-특이적 재조합 부위를 사용하여 성취될 수도 있다. 따라서, 재조합시 내인성 중쇄 가변 영역 자리는 내인성 중쇄 불변 영역으로부터 먼 거리에 배치되고 이로 인해 내인성 중쇄 불변 영역을 함유하는 기능적 중쇄를 암호화하기 위한 재배열을 방지한다. 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 자리의 기능적 침묵을 성취하는 한편 기능적 ADAM6 자리를 유지하기 위한 다른 예시적 방법은 본 개시의 판독시 당업자에게 명백하고 및/또는 업계에 알려져 있는 방법과 조합될 것이다. 내인성 중쇄 자리의 이러한 대체로, 내인성 ADAM6 유전자가 유지되고 내인성 면역글로불린 중쇄 자리는 기능적으로 침묵된다.
이소성 대체의 또 다른 예는 변형된 면역글로불린 중쇄 자리 내에서의 대체이다. 예를 들어, 하나 이상의 내인성 VH 유전자 세그먼트의 사람 VL 유전자 세그먼트로의 대체를 포함하는 마우스는 사람 VL 유전자 세그먼트를 함유하는 서열 내에 자리한 마우스 ADAM6 서열을 갖도록 조작될 수 있으며, 대체는 내인성 ADAM6 서열을 제거한다. 결과의 변형은 사람 유전자 서열 내에서 (이소성) 마우스 ADAM6 서열을 발생시킬 것이고, 사람 유전자 서열 내에서 마우스 ADAM6 서열의 (이소성) 대체는 사람 ADAM6 거짓 유전자의 위치 (즉, 두 개의 V 세그먼트 사이)에 근접할 수 있거나 마우스 ADAM6 서열의 위치 (즉, V-D 유전자간 영역 내)에 근접할 수 있다. 마우스의 생식세포 계열 내에서 사람 유전자 서열 (예를 들어, 면역글로불린 경쇄 유전자 서열) 내의 또는 이에 인접한 (이소성) 마우스 ADAM6 서열의 결합에 의해 새엉된 결과의 서열 접합은 야생형 마우스의 게놈의 같거나 유사한 위치에 비해 새로울 것이다.
다양한 구체예에서, ADAM6 또는 이들의 오솔로그 또는 상동체가 결핍된 비-사람 동물이 제공되며, 결핍은 비-사람 동물이 생식 불가능하게 하거나, 실질적으로 비-사람 동물의 생식능력을 감소시킨다. 다양한 구체예에서, ADAM6 또는 이들의 오솔로그 또는 상동체의 결핍은 내인성 면역글로불린 중쇄 자리의 변형으로 인한 것이다. 실질적인 생식능력의 감소는, 예를 들어, 약 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 또는 95% 이상의 생식능력 (예를 들어, 교배 빈도, 한 배 새끼 당 마릿수, 1년 당 한 배 새끼 수, 등)의 감소이다. 다양한 구체예에서, 비-사람 동물은 마우스 ADAM6 유전자 또는 오솔로그 또는 상동체 또는 비-사람 동물의 수컷에서 기능적인 이들의 기능적 단편으로 보충되며, 보충된 ADAM6 유전자 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편은 전체적으로 또는 실질적인 부분에서 생식능력의 감소를 구조한다. 실질적인 부분에서 생식능력의 구조는, 예를 들어, 비-사람 동물은 변형되지 않은 (즉, ADAM6 유전자 또는 이들의 오솔로그 또는 상동체에 대한 변형이 없는 동물) 중쇄 자리에 비해 적어도 70%, 80%, 또는 90% 이상인 생식능력을 나타내는, 생식능력의 복구이다.
다양한 구체예에서, 유전적으로 변형된 동물 (즉, 예를 들어, 면역글로불린 중쇄 자리의 변형으로 인해, 기능적 ADAM6 또는 이들의 오솔로그 또는 상동체가 결핍된 동물)에게 부여하는 서열은 ADAM6 유전자 또는 이들의 오솔로그 또는 상동체로부터 선택된다. 한 구체예에서, 예를 들어, 마우스에서, ADAM6 기능의 손실은 마우스 ADAM6 유전자를 추가함으로써 구조된다. 한 구체예에서, 마우스에서 ADAM6 기능의 손실은 마우스, 예를 들어, 설치류, 예를 들어, 다른 종족 또는 종의 마우스, 어떤 종의 래트, 설치류에 관하여 밀접하게 관련된 종의 오솔로그 또는 상동체를 추가함으로써 구조되며; 마우스에 오솔로그 또는 상동체의 추가는 ADAM6 기능의 손실 또는 ADAM6 유전자의 손실로 인한 생식능력의 손실을 구조한다. 다양한 구체예에서, 다른 종의 오솔로그 및 상동체는 계통발생학적으로 관련된 종으로부터 선택되고, 다양한 구체예에서, 약 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 또는 97% 이상이고; 생식능력의 ADAM6-관련된 또는 (비-마우스에서) ADAM6 오솔로그-관련된 손실을 구조하는 내인성 ADAM6 (또는 오솔로그)와의 퍼센트 동일성을 나타낸다. 예를 들어, ADAM6 기능이 결핍된 유전적으로 변형된 수컷 래트 (예를 들어, 내인성 면역글로불린 중쇄 가변 영역이 사람 면역글로불린 중쇄 가변 영역으로 대체되거나, 또는 래트 면역글로불린 중쇄 영역에서 넉아웃된 래트)에서, 래트의 생식능력의 손실은 래트 ADAM6, 또는 일부 구체예에서, 래트 ADAM6의 오솔로그 (예를 들어, 또 다른 래트 종족 또는 종, 또는 한 구체예에서, 마우스의 ADAM6 오솔로그)의 추가에 의해 구조된다.
따라서, 다양한 구체예에서, ADAM6 단백질 (또는 이들의 오솔로그 또는 상동체)를 암호화하는 핵산 서열 또는 핵산 서열과 작동 가능하게 결합된 조절 서열의 변형으로 인한 생식 불가능 또는 생식능력의 감소를 나타내는 유전적으로 변형된 동물은 생식능력의 손실을 보충하거나 회복시키는 핵산 서열이 같은 종의 다른 종족 또는 계통발생학적으로 관련된 종의 것인 경우에 생식능력의 손실을 보충하거나 회복시키는 핵산 서열을 포함한다. 다양한 구체예에서, 보충 핵산 서열은 ADAM6 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편이다. 다양한 구체예에서, 보충 ADAM6 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편은 생식능력 결점을 가진 유전적으로 변형된 동물과 밀접하게 관련된 비-살마 동물의 것이다. 예를 들어, 유전적으로 변형된 동물이 특정 종족의 마우스인 경우에, ADAM6 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편은 또 다른 종족의 마우스, 또는 관련된 종의 마우스로부터 얻어질 수 있다. 한 구체예에서, 생식능력 결점을 포함하는, 유전적으로 변형된 동물이 설치목인 경우에, ADAM6 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편은 설치목의 또 다른 동물의 것이다. 한 구체예에서, 생식능력 결점을 포함하는, 유전적으로 변형된 동물은 쥐아목 (예를 들어, 날쥐, 긴꼬리 생쥐, 마우스-유사 햄스터, 햄스터, 뉴 월드 래트(New World rat) 및 마우스, 들쥐, 트루 마우스 (true mouse) 및 래트, 저빌쥐, 아프리카가시쥐, 벼슬 래트, 클라이밍 마우스(climbing mouse), 락 마우스(rock mouse), 흰 꼬리 래트, 말라가시(malagasy) 래트 및 마우스, 가시겨울잠쥐, 뒤쥐, 밤부(bamboo) 래트, 조코르(zokor))이고, ADAM6 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편은 설치목의 동물로부터 선택되거나, 쥐아목이다.
한 구체예에서, 유전적으로 변형된 동물은 뛰는쥐상과(Dipodoidea)의 것이고, ADAM6 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편은 쥐상과(Muroidea)의 것이다. 한 구체예에서, 유전적으로 변형된 동물은 쥐상과의 것이고, ADAM6 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편는 뛰는쥐상과의 것이다.
한 구체예에서, 유전적으로 변형된 동물은 설치류이다. 한 구체예에서, 설치류는 쥐상과로부터 선택되고, ADAM6 오솔로그 또는 상동체는 쥐상과 내의 다른 종의 것이다. 한 구체예에서, 유전적으로 변형된 동물은 칼로미스쿠스과(Calomyscidae) (예를 들어, 새앙쥐같은 햄스터), 비단털쥐과(Cricetidae) (예를 들어, 햄스터, 뉴 월드 래트 및 마우스, 들쥐), 쥐과 (트루 마우스 및 래트, 저빌, 아프리카가시쥐, 벼슬 래트), 네소미이대(Nesomyidae) (클라이밍 마우스, 락 마우스, 흰 꼬리 래트, 마다가스카르 래트 및 마우스), 가시겨울잠쥐과(Platacanthomyidae) (예를 들어, 가시겨울잠쥐), 및 소경쥐과(Spalacidae) (예를 들어, 뒤쥐, 밤부 래트, 및 조코르)로부터 선택된 과의 것이고; ADAM6 오솔로그 또는 상동체는 같은 과의 다른 종으로부터 선택된다. 특정 구체예에서, 유전적으로 변형된 설치류는 트루 마우스 또는 래트 (쥐과(Muridae))로부터 선택되고, ADAM6 오솔로그 또는 상동체는 저빌, 아프리카가시쥐, 또는 벼슬 래트로부터 선택된 종의 것이다. 한 구체예에서, 유전적으로 변형된 마우스는 쥐과의 멤버의 것이고, ADAM6 오솔로그 또는 상동체는 쥐과의 다른 종의 것이다. 특정 구체예에서, 유전적으로 변형된 설치류는 쥐과의 마우스이고, ADAM6 오솔로그 또는 상동체는 쥐과의 래트, 저빌, 아프리카가시쥐, 또는 벼슬 래트의 것이다.
다양한 구체예에서, 과에서 설치류의 하나 이상의 설치류 ADAM6 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편은 생식능력을 ADAM6 오솔로그 또는 상동체가 결핍된 같은 과의 유전적으로 변형된 설치류 (예를 들어, 비단털쥐과 (예를 들어, 햄스터, 뉴 월드 래트 및 마우스, 들쥐); 쥐과 (예를 들어, 트루 마우스 및 래트, 저빌, 아프리카가시쥐, 벼슬 래트))로 회복시킨다.
다양한 구체예에서, ADAM6 오솔로그, 상동체, 및 이들의 단편은 오솔로그, 상동체, 또는 단편이 생식능력을 ADAM6 활성이 결핍된 유전적으로 변형된 수컷 비-사람 동물 (예를 들어, ADAM6 또는 그것의 오솔로그의 넉아웃을 포함하는 설치류, 예를 들어, 마우스 또는 래트)로 회복시키는지를 확인함으로써 기능성에 대하여 평가된다. 다양한 구체예에서, 기능성은 유전적으로 변형된 동물의 같은 종의 난관을 이동하여 그것의 난자를 수정시키는, 내인성 ADAM6 또는 이들의 오솔로그 또는 상동체가 결핍된 유전적으로 변형된 동물의 정자의 능력으로서 정의된다.
다양한 양태에서, 유사한 생식능력 이점을 마우스 ADAM6 (예를 들어, 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 수컷 마우스에서 기능적인 단편)에게 부여하는 단백질을 암호화하는 이소성 뉴클레오티드 서열을 함유하는, 내인성 중쇄 가변 영역 자리 또는 이들의 일부의 결실 또는 대체를 포함하는 마우스가 만들어질 수 있다. 이소성 뉴클레오티드 서열은 다른 마우스 종족 또는 다른 종, 예를 들어, 다른 설치류 종의 ADAM6 상동체 또는 오솔로그 (또는 이들의 단편)인 단백질을 암호화하고, 생식능력의 이점, 예를 들어, 명시된 기간 동안 증가된 수의 한 배 새끼, 및/또는 한 배 새끼 당 증가된 수의 새끼, 및/또는 마우스 난자를 수정시키기 위해 마우스 난관을 통과하는 수컷 마우스의 정자 세포의 능력을 부여하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다.
한 구체예에서, ADAM6은 마우스 ADAM6 단백질와 적어도 89% 내지 99% 동일한 (예를 들어, 마우스 ADAM6a 또는 마우스 ADAM6b와 적어도 89% 내지 99% 동일함) 상동체 또는 오솔로그이다. 한 구체예에서, 이소성 뉴클레오티드 서열은 마우스 ADAM6a와 적어도 89% 동일한 단백질, 마우스 ADAM6b와 적어도 89% 동일한 단백질, 및 이들의 조합으로부터 독립적으로 선택된 하나 이상의 단백질을 암호화한다. 한 구체예에서, 상동체 또는 오솔로그는 마우스 ADAM6a 및/또는 마우스 ADAM6b이거나 또는 이것들과 약 89% 이상 동일하도록 변형된 래트, 햄스터, 마우스, 또는 기니피그 단백질이다. 한 구체예에서, 상동체 또는 오솔로그는 마우스 ADAM6a 및/또는 마우스 ADAM6b이거나 또는 이것들과 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 특정 구체예에서, 마우스 ADAM6a는 SEQ ID NO: 1 또는 이들의 기능적 단편을 포함하고, 마우스 ADAM6b는 SEQ ID NO: 2 또는 이들의 기능적 단편을 포함한다.
한 양태에서, 비-사람 동물이 제공되며, 비-사람 동물은 (a) 비-사람 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 하나 이상의 사람 VL 및 JL 유전자 세그먼트 업스트림의 삽입, (b) 비-사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역의 업스트림에서 하나 이상의 사람 VL, 및 JL 유전자 세그먼트의 삽입, 및 (c) ADAM6 단백질 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 비-사람 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역은 설치류 불변 영역 (예를 들어, 마우스, 래트 또는 햄스터 불변 영역으로부터 선택됨)이다. 한 구체예에서, 비-사람 경쇄 불변 영역은 설치류 불변 영역이다. 특정 구체예에서, 경쇄 불변 영역은 마우스 Cκ 또는 래트 Cκ 영역이다. 특정 구체예에서, 경쇄 불변 영역은 마우스 Cλ 또는 래트 Cκ 영역이다. 한 구체예에서, 사람 VL 및 JL 유전자 세그먼트는 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트이다. 한 구체예에서, 사람 VL 및 JL 유전자 세그먼트는 Vλ 및 Jλ 유전자 세그먼트이다. 한 구체예에서, 비-사람 동물은 사람 VL 및 JL 유전자 세그먼트 사이에 존재하는 하나 이상의 사람 DH 유전자 세그먼트를 더 포함한다. 적합한 비-사람 동물은 설치류, 예를 들어, 마우스, 래트 및 햄스터를 포함한다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스 또는 래트이다.
한 구체예에서, 비-사람 동물은 적어도 6개 내지 적어도 40개의 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 적어도 하나 내지 적어도 다섯 개의 사람 Jκ 유전자 세그먼트를 포함한다. 특정 구체예에서, 비-사람 동물은 여섯 개의 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 다섯 개의 사람 Jκ 유전자 세그먼트를 포함한다. 특정 구체예에서, 비-사람 동물은 16개의 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 다섯 개의 사람 Jκ 유전자 세그먼트를 포함한다. 특정 구체예에서, 비-사람 동물은 30개의 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 다섯 개의 사람 Jκ 유전자 세그먼트를 포함한다. 특정 구체예에서, 비-사람 동물은 40개의 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 다섯 개의 사람 Jκ 유전자 세그먼트를 포함한다. 다양한 구체예에서, 사람 Jκ 유전자 세그먼트는 Jκ1, Jκ2, Jκ3, Jκ4, Jκ5, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
한 구체예에서, ADAM6 단백질 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 비-사람 동물에서 이소성이다. 한 구체예에서, ADAM6 단백질 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하는 (비-사람 동물에서 기능적인) 뉴클레오티드 서열은 야생형 비-사람 ADAM6 자리와 비교하여 같은 자리에 존재한다. 한 구체예에서, 비-사람 동물은 마우스이고 뉴클레오티드 서열은 마우스 ADAM6 단백질 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하고 비-사람 동물의 게놈의 이소성 자리에 존재한다. 한 구체예에서, 비-사람 동물은 마우스이고 뉴클레오티드 서열은 마우스 ADAM6 단백질 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하고 면역글로불린 유전자 세그먼트 내에 존재한다. 특정 구체예에서, 면역글로불린 유전자 세그먼트는 비-사람 동물의 중쇄 유전자 세그먼트이다. 특정 구체예에서, 면역글로불린 유전자 세그먼트는 또 다른 종의 경쇄 유전자 세그먼트이다. 한 구체예에서, 경쇄 유전자 세그먼트는 사람 κ 경쇄 유전자 세그먼트이다. 한 구체예에서, 마우스는 하나 이상의 내인성 재배열되지 않은 중쇄 유전자 세그먼트를 포함하는 이소성 인접한 서열을 포함하고, ADAM6 서열은 이소성 인접한 서열 내에 있다.
한 구체예에서, 비-사람 동물은 내인성 면역글로불린 경쇄 자리에서 내인성 면역글로불린 VL 및/또는 JL 유전자 세그먼트가 결핍된다. 한 구체예에서, 비-사람 동물은 비-사람 동물에서 면역글로불린 VL 도메인을 형성하기 위해 재배열할 수 없는 내인성 면역글로불린 VL 및/또는 JL 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 면역글로불린 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트는 하나 이상의 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트와 대체된다. 한 구체예에서, 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 면역글로불린 Vλ 및 Jλ 유전자 세그먼트는 전체적으로 또는 부분적으로 결실된다. 한 구체예에서, 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 면역글로불린 VL 및 JL 유전자 세그먼트는 비-사람 동물에서 온전하고 비-사람 동물은 내인성 면역글로불린 VL 및/또는 JL 유전자 세그먼트 및 내인성 면역글로불린 경쇄 불변 영역 사이에 삽입된 하나 이상의 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 하나 이상의 사람 Jκ 유전자 세그먼트를 포함한다. 특정 구체예에서, 온전한 내인성 면역글로불린 VL 및 JL 유전자 세그먼트는 비-사람 동물에서 항체의 VL 도메인을 형성하기 위해 재배열할 수 없게 된다. 한 구체예에서, 비-사람 동물의 내인성 면역글로불린 경쇄 자리는 면역글로불린 κ 경쇄 자리이다. 한 구체예에서, 내인성 면역글로불린 VL 및 JL 유전자 세그먼트는 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트이다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같이 비-사람 동물로부터 유래된 세포 및/또는 조직이 제공되며, 세포 및/또는 조직은 (a) 비-사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역의 업스트림에서 하나 이상의 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트의 삽입, (b) 비-사람 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 업스트림에서 하나 이상의 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트의 삽입, 및 (c) ADAM6 단백질 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 비-사람 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역은 마우스 불변 영역이다. 한 구체예에서, 비-사람 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역은 래트 불변 영역이다. 한 구체예에서, 비-사람 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역은 햄스터 불변 영역이다.
한 구체예에서, ADAM6 단백질 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 세포 및/또는 조직에서 이소성이다. 한 구체예에서, ADAM6 단백질 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 야생형 비-사람 ADAM6 자리와 비교하여 같은 자리에 존재한다. 한 구체예에서, 비-사람 세포 및/또는 조직은 마우스로부터 유래되고 뉴클레오티드 서열은 마우스 ADAM6 단백질 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하며 이소성 자리에 존재한다. 한 구체예에서, 비-사람 세포 및/또는 조직은 마우스로부터 유래되고 뉴클레오티드 서열은 마우스 ADAM6 단백질 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하며 면역글로불린 유전자 세그먼트 내에 존재한다. 특정 구체예에서, 면역글로불린 유전자 세그먼트는 중쇄 유전자 세그먼트이다. 특정 구체예에서, 면역글로불린 유전자 세그먼트는 경쇄 유전자 세그먼트이다. 한 구체예에서, 내인성 중쇄 유전자 세그먼트의 인접한 서열은 비-사람 동물에서 이소성으로 배치되며, 이소성으로 배치된 내인성 중쇄 유전자 세그먼트의 인접한 서열은 마우스 (예를 들어, 수컷 마우스에서)에서 기능적인 ADAM6 유전자를 포함한다.
한 양태에서, 항원-결합 단백질을 만들기 위해 본원에서 설명된 비-사람 동물의 사용법이 제공되며, 비-사람 동물은 (a) (i) 사람 Vκ 도메인 및 비-사람 경쇄 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 경쇄 및 (ii) 사람 Vκ 도메인 및 비-사람 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 중쇄를 포함하는 항체; 및 (b) ADAM6 단백질 또는 이들의 기능적 단편을 발현한다. 한 구체예에서, 항원 결합 단백질은 사람이다. 한 구체예에서, 비-사람 동물은 설치류이고 비-사람 불변 영역은 설치류 불변 영역이다. 특정 구체예에서, 설치류는 마우스이다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같이 비-사람 동물로부터 유래된 비-사람 세포 또는 조직이 제공된다. 한 구체예에서, 비-사람 세포 또는 조직은 비-사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역 유전자와 인접한 하나 이상의 사람 면역글로불린 Vκ 유전자 세그먼트 및 적어도 하나의 사람 면역글로불린 Jκ 유전자 세그먼트 및 비-사람 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자와 인접한 하나 이상의 사람 Vκ 및 하나 이상의 사람 Jκ 유전자 세그먼트를 포함하며, 세포 또는 조직은 ADAM6 단백질 또는 이들의 기능적 단편을 발현한다. 한 구체예에서, 비-사람 경쇄 불변 영역 유전자는 마우스 Cκ이다.
한 구체예에서, ADAM6 단백질 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 이소성이다. 한 구체예에서, ADAM6 단백질 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 야생형 비-사람 세포와 같은 위치에 자리한다. 다양한 구체예에서, 비-사람 세포는 마우스 B 세포이다. 다양한 구체예에서, 비-사람 세포는 배아 줄기 세포이다.
한 구체예에서, 조직은 비-사람 동물의 비장, 골수 또는 림프절로부터 유래된다.
한 양태에서, 히브리도마 또는 콰드로마를 만들기 위해 본원에서 설명된 바와 같은 비-사람 동물로부터 유래된 세포 또는 조직의 사용법이 제공된다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 바와 같이 변형된 게놈을 포함하는 비-사람 세포가 제공되며, 비-사람 세포는 난모세포, 숙주 배아, 또는 본원에서 설명된 바와 같은 비-사람 동물의 세포의 융합체 및 다른 비-사람 동물의 세포이다.
한 양태에서, 사람 항원-결합 단백질을 만들기 위해 본원에서 설명된 바와 같이 비-사람 동물로부터 유래된 세포 또는 조직의 사용법이 제공된다. 한 구체예에서, 사람 항원-결합 단백질은 본원에서 설명된 바와 같이 비-사람 동물로부터 분리된 사람 Vκ 도메인을 포함한다.
한 양태에서, 원하는 항원에 결합하는 항원-결합 단백질을 만드는 방법이 제공되며, 방법은 (a) 본원에서 설명된 바와 같은 비-사람 동물을 원하는 항원에 노출시키는 단계, (b) 비-사람 동물의 하나 이상의 B 림프세포를 분리하는 단계로서, 하나 이상의 B 림프세포는 원하는 항원에 결합하는 VL 결합 단백질을 발현하는 단계, 및 (c) 원하는 항원에 결합하는 VL 결합 단백질의 VL 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 확인하는 단계로서, VL 결합 단백질은 사람 Vκ 도메인 및 비-사람 경쇄 불변 도메인 및 사람 Vκ 도메인 및 비-사람 중쇄 불변 도메인을 포함하는 단계, 및 (d) 원하는 항원에 결합하는 사람 항원-결합 단백질을 만들기 위해 사람 면역글로불린 불변 영역 핵산 서열과 함께 (c)의 핵산 서열을 이용하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, VL 결합 단백질의 비-사람 경쇄 불변 도메인은 마우스 Cκ이다. 한 구체예에서, VL 결합 단백질의 비-사람 중쇄 불변 도메인은 마우스 Cγ이다. 한 구체예에서, 비-사람 동물은 마우스이다.
한 양태에서, 면역글로불린 중쇄 자리에서 변형을 포함하는 생식 가능한 수컷 마우스가 제공되며, 생식 가능한 수컷 마우스는 수컷 마우스에서 기능적인 이소성 ADAM6 서열을 포함한다.
변형된 면역글로불린 중쇄 자리의 이소성 ADAM6
유전자 표적화의 발달, 예를 들어, 박테리아 인공 염색체 (BAC)의 발달은 현재 비교적 큰 게놈 단편의 재조합을 가능하게 한다. BAC 조작은 큰 결실, 및 마우스 ES 세포로의 큰 삽입을 만드는 것을 가능하게 하였다.
사람 항체 (즉, 사람 가변 영역)를 만드는 마우스는 현재 얼마 전부터 이용 가능하였다. 사람 치료적 항체의 발달에 있어서 중요한 진보를 나타내지만, 이들 마우스는 그것들의 유용성을 제한하는 많은 심각한 이상을 나타낸다. 예를 들어, 그것들은 면역 반응이 제대로 작용하지 않는 B 세포 발달을 나타낸다. 면역 반응이 제대로 작용하지 않는 발달은 유전자 이식 마우스 및 야생형 마우스 사이의 다양한 차이로 인한 것일 수도 있다.
사람 항체는 클론 선택 중에 성숙화, 증식, 또는 생존에 대하여 신호전달하는 마우스 세포의 표면 상에서 마우스 pre B 세포 또는 B 세포 수용체와 최적으로 상호작용하지 않을 수도 있다. 완전한 사람 항체는 마우스 Fc 수용체 시스템과 최적으로 상호작용하지 않을 수도 있다; 마우스는 사람 Fc 수용체와의 일대일 대응을 나타내지 않는 Fc 수용체를 발현한다. 최종적으로, 완전한 사람 항체를 만드는 다양한 마우스는 모든 진성 마우스 서열, 예를 들어, 다운스트림 인핸서 요소 및 다른 자리 조절 요소를 포함하지 않으며, 이것은 야생형 B 세포 발달에 필요할 수도 있다.
완전한 사람 항체를 만드는 마우스는 일반적으로 어떤 방법으로도 비활성화된 내인성 면역글로불린 자리를 포함하고, 가변 및 불변 면역글로불린 유전자 세그먼트를 포함하는 사람 이식 유전자는 마우스 게놈에서 무작위의 자리로 도입된다. 내인성 자리가 기능적 면역글로불린 유전자를 형성하도록 유전자 세그먼트를 재배열하지 않기 위해 충분히 비활성화되는 동안, 이러한 마우스에서 완전한 사람 항체를 만드는 목표는 면역 반응이 제대로 작용하지 않는 B 세포 발달에도 불구하고 달성될 수 있다.
사람 이식 유전자 자리로부터 완전한 사람 항체를 만드는 것이 강요되지만, 마우스에서 사람 항체를 발생시키는 것은 분명히 바람직하지 않은 과정이다. 일부 마우스에서, 과정은 트랜스-스위칭(trans-switching)의 메커니즘을 통해 키메라 사람 가변/마우스 불변 중쇄 (경쇄는 아님)의 형성을 일으키기 위해 바람직하다. 이 메커니즘에 의해, 완전한 사람 항체를 암호화하는 전사물은 사람 이소타입에서 마우스 이소타입으로의 인 트랜스(in trans) 이소타입 스위칭을 경험한다. 과정은 인 트랜스인데, 완전한 사람 이식 유전자가 마우스 중쇄 불변 영역 유전자의 손상되지 않은 카피를 유지하는 내인성 자리로부터 떨어져서 자리하기 때문이다. 이러한 마우스에서 트랜스-스위칭은 쉽게 명백하지만 현상은 B 세포 발달을 구조하기에 여전히 불충분하며, 이것은 솔직히 손상된 채로 남아있다. 어떤 이벤트에서도, 이러한 마우스에서 만들어진 트랜스-스위칭된 항체는 완전한 사람 경쇄를 유지하는데, 트랜스-스위칭의 현상은 분명히 경쇄에 관해서는 일어나지 않기 때문이고; 트랜스-스위칭은 인 시스 (in cis) 정상 이소타입 스위칭에서 사용된 (다르게 사용되기는 하지만) 내인성 자리에서의 스위치 서열에 의존한다. 따라서, 완전한 사람 항체를 만들기 위해 조작된 마우스가 마우스 불변 영역을 가진 항체를 만들기 위한 트랜스-스위칭 메커니즘을 선택할 때도, 전략은 정상 B 세포 발달을 구조하기에 여전히 불충분하다.
항체-기반 사람 치료제를 만드는데 있어서 주요 관심사는 특정 에피토프를 특이적으로 인식하고 바람직한 친화도, 보통은-하지만 항상은 아님-높은 친화도로 그것들에 결합하는 유용한 가변 도메인을 확인하기 위해 충분히 다양한 사람 면역글로불린 가변 영역 서열을 만드는 것이다. VELOCIMMUNE® 마우스 (본원에서 설명됨)의 개발 전에, 마우스 불변 영역을 가진 사람 가변 영역을 발현하는 마우스가 이식 유전자로부터 사람 항체를 만드는 마우스와 어떤 유의한 차이를 나타낼 것이라는 표시는 없었다. 하지만, 상기 추정은 부정확하였다.
VELOCIMMUNE® 마우스는, 내인성 자리에서 마우스 면역글로불린 가변 영역의 사람 면역글로불린 가변 영역으로의 정확한 대체를 함유하며, B 세포 발달에 관하여 야생형 마우스와 놀랍고 두드러진 유사성을 나타낸다. 놀랍고 충격적인 개발에서, VELOCIMMUNE® 마우스는 하나의 중요한 측면-면역화에 반응하여 발생한 가변 영역에서만 야생형 마우스와 다른 면역화에 대한, 근본적으로 정상인, 야생형 반응을 나타낸다.
VELOCIMMUNE® 마우스는 내인성 자리에서 마우스 면역글로불린 중쇄 (IgH) 및 면역글로불린 경쇄 (예를 들어, κ 경쇄, Igκ)의 생식세포 계열 가변 영역의 해당 사람 면역글로불린 가변 영역으로의 정확하고, 큰 규모의 대체를 함유한다. 전체로서, 마우스 자리의 약 여섯 개의 메가베이스는 사람 게놈 서열의 약 1.5개의 메가베이스로 대체된다. 이 정확한 대체는 사람 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 갖는 중쇄 및 경쇄를 만드는 히브리드 면역글로불린 자리를 갖는 마우스를 발생시킨다. 마우스 VH-DH-JH 및 Vκ-Jκ 세그먼트의 정확한 대체는 히브리드 면역글로불린 자리에서 플랭킹 마우스 서열을 온전하고 기능적으로 둔다. 마우스의 체액 면역 시스템은 야생형 마우스의 그것과 유사하게 기능한다. B 세포 발달은 어떤 유의한 점에서도 제약이 없으며 사람 가변 영역의 풍부한 다양성은 항원 과제에에서 마우스에서 발생한다.
VELOCIMMUNE® 마우스는 중쇄 및 κ 경쇄에 대한 면역글로불린 유전자 세그먼트가 사람 및 마우스에서 유사하게 재배열하기 때문에 가능하며, 그것들의 자리가 같거나 거의 같다고-명백하게 그것들은 아님-말하기 위한 것은 아니다. 하지만, 자리는 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트을 모두 함유하는 인접한 마우스 서열의 약 삼백만 염기쌍을 사람 면역글로불린 자리로부터 근본적으로 동등한 서열을 커버하는 인접한 사람 게놈 서열의 약 백만 염기로 대체함으로써 중쇄 가변 유전자 자리의 사람화가 달성될 수 있을 정도로 충분히 유사하다.
일부 구체예에서, 특정 마우스 불변 영역 유전자 서열의 사람 유전자 서열로의 추가 대체 (예를 들어, 마우스 CH1 서열의 사람 CH1 서열로의 대체, 마우스 CL 서열의 사람 CL 서열로의 대체)는, 예를 들어, 완전한 살마 항체 단편, 예를 들어, 완전한 사람 Fab's을 만드는데 적합한, 사람 가변 영역 및 부분적으로 사람 불변 영역을 갖는 항체를 만드는 히브리드 면역글로불린 자리를 갖는 마우스를 발생시킨다. 히브리드 면역글로불린 자리를 갖는 마우스는 정상 가변 유전자 세그먼트 재배열, 정상 체세포 초돌연변이, 및 정상 등급 스위칭을 나타낸다. 이들 마우스는 야생형 마우스와 구분이 어려운 체액 면역 시스템을 나타내고, 마우스는 사람 가변 영역 유전자 세그먼트의 전체 레퍼토리가 결핍된 경우에 B 세포 발달의 모든 단계에서 정상 세포 집단 및 정상 림프 기관 구조를 나타낸다. 이들 마우스를 면역화하는 것은 가변 유전자 세그먼트 용도의 다양성을 나타내는 강력한 체액 반응을 일으킨다.
마우스 생식세포 계열 가변 영역 유전자 세그먼트의 정확한 대체는 부분적 사람 면역글로불린 자리를 갖는 마우스를 만드는 것을 허용한다. 부분적 사람 면역글로불린 자리는 정상적으로 재배열되고, 초돌연변이되고, 등급 스위치되기 때문에, 부분적 사람 면역글로불린 자리는 사람 가변 영역을 포함하는 마우스에서 항체를 생성한다. 가변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 확인되고 클로닝되어, 선택된 어떤 서열과도 융합될 수 있으며 (예를 들어, 시험관 내 시스템에서), 완전히 사람 서열로부터 유래된 항체 또는 항원-결합 단백질을 발생시킨다.
리컴바이니어링 (recombineering) 방법에 의한 대규모 사람화는 근본적으로 마우스 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트 모두를 포함하는 마우스 중쇄 면역글로불린 자리의 최대 3 메가베이스를 근본적으로 모든 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트를 암호화하는 두 개의 반복 중 하나를 포함하는 사람 게놈의 최대 이분의 일 메가베이스로 정확하게 대체함으로써 독특한 면역글로불린 중쇄 자리를 생성하도록 마우스 배아 줄기 (ES) 세포를 변형시키기 위해 사용되었다. 추가적으로, 근본적으로 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트 모두를 암호화하는 두 개의 반복 중 하나를 포함하는 사람 게놈의 최대 이분의 일 메가베이스 세그먼트는 근본적으로 마우스 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트 모두를 함유하는 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 자리의 3 메가베이스 세그먼트를 대체하기 위해 사용되었다. 이러한 대체된 면역글로불린 자리를 갖는 마우스는 마우스 ADAM6 자리의 붕괴 또는 결실을 포함할 수 있으며, 이것은 정상적으로는 마우스 면역글로불린 중쇄 자리에서 가장-3' VH 유전자 세그먼트 및 가장-5' DH 유전자 세그먼트 사이에서 발견된다. 이 영역의 붕괴는 마우스 ADAM6 자리의 기능성의 감소 또는 제거로 이어질 수 있다.
상기 설명된 바와 같이 대체된 자리를 포함하고, 또한 마우스가 근본적으로 정상 생식능력을 나타내는 경우 마우스 ADAM6을 암호화하는 이소성 핵산 서열을 포함하는 마우스가 설명된다. 한 구체예에서, 이소성 핵산 서열은 변형된 내인성 중쇄 자리에서 사람 VL 유전자 세그먼트 및 사람 JL 유전자 세그먼트 또는 가장-5' 사람 VL 유전자 세그먼트의 업스트림 사이에 배치된다. ADAM6 유전자의 전사의 방향은 주위 사람 VL 유전자 세그먼트의 전사의 방향에 관하여 반대이거나 (도 7) 같을 수도 있다 (도 8). 본원의 예는 표시된 사람 VL 및 JL 유전자 세그먼트 또는 가장-5' 사람 VL 유전자 세그먼트의 업스트림 사이에 이소성 서열을 배치함으로써 생식능력의 구조를 나타내지만, 당업자는 마우스 게놈 (또는 염색체 외부)에서 어떤 적합한 전사적으로 허용 가능한 자리에서 이소성 서열의 배치가 수컷 마우스의 생식능력을 유사하게 구조하는 것으로 예측된다는 것을 인식한다. 다양한 구체예에서, 이소성 핵산 서열은 SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 및 SEQ ID NO: 5로부터 선택되며, 이소성 서열은 하나 이상의 ADAM6 단백질을 암호화하고, 하나 이상의 ADAM6 단백질은 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2 또는 이들의 조합을 포함한다.
마우스 ADAM6 유전자 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편을 포함하는 이소성 서열을 갖는 기능적 ADAM6 자리가 결핍된 마우스를 보충하는 현상은 비기능적 또는 최소한으로 기능적인 내인성 ADAM6 자리를 갖는 어떤 마우스를 구조하는데 적용되는 일반적인 방법이다. 따라서, 면역글로불린 중쇄 자리의 ADAM6-붕괴 변형을 포함하는 많은 마우스는 본 발명의 조성물 및 방법으로 구조될 수 있다. 따라서, 본 발명은 내인성 ADAM6 기능을 포함하는 면역글로불린 중쇄 자리의 다양한 변형을 갖는 마우스를 포함한다. 일부 (비-제한) 예가 본 설명에서 제공된다. 설명된 마우스 이외에, ADAM6과 관련된 조성물 및 방법은, 예를 들어, 다양한 방법으로 중쇄 자리를 변형시킬 때, 많은 적용에서 사용될 수 있다.
한 양태에서, 기능적 ADAM6 단백질 (또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편)을 암호화하는 이소성 ADAM6 서열, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH 유전자 세그먼트의 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트로의 대체, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 DH 유전자 세그먼트 및 JH 유전자 세그먼트의 사람 JL 유전자 세그먼트로의 대체를 포함하는 마우스가 제공되며, 마우스는 CH1 및/또는 힌지 영역이 결핍된다. 한 구체예에서, 마우스는 (a) 사람 VL-마우스 CH1-마우스 CH2-마우스 CH3; (b) 사람 VL -마우스 힌지-마우스 CH2-마우스 CH3; 및, (c) 사람 VL -마우스 CH2-마우스 CH3으로부터 선택되는 면역글로불린 사슬의 다이머인 단일 가변 도메인 결합 단백질을 만든다.
한 양태에서, 생식능력을 구조하는 뉴클레오티드 서열은 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 세그먼트 (mVH's, mDH's, 및 mJH's)의 하나 이상의 사람 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 세그먼트 (hVκ's 및 hJκ's)로의 대체를 갖는 마우스의 사람 면역글로불린 경쇄 가변 영역 서열 (예를 들어, 사람 Vκ4-1 및 Jκ1 유전자 세그먼트 사이) 내에 배치되고, 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 세그먼트 (mVκ's, mJκ's)의 하나 이상의 사람 면역글로불린 κ 경쇄 가변 유전자 세그먼트 (hVκ's 및 hJκ's)로의 대체를 더 포함한다.
한 양태에서, 기능적 마우스 ADAM6 자리 (또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편)는 사람 VL 유전자 세그먼트의 중간 또는 가장-5' 사람 VL 유전자 세그먼트의 업스트림에 배치될 수 있으며, 사람 VL 유전자 세그먼트는 내인성 VH 유전자 세그먼트를 대체한다. 한 구체예에서, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH 유전자 세그먼트는 제거되고 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트로 대체되며, 마우스 ADAM6 자리는 가장-5' 사람 VL 유전자 세그먼트의 5' 끝에 바로 인접하게, 또는 두 개의 사람 VL 유전자 세그먼트 사이에 배치된다. 특정 구체예에서, 마우스 ADAM6 자리는 삽입된 사람 VL 유전자 세그먼트의 3' 말단 근처의 두 개의 VL 유전자 세그먼트 사이에 배치된다. 특정 구체예에서, 사람 VL 유전자 세그먼트의 배열은 다음과 같다 (사람 VL 유전자 세그먼트의 전사의 방향에 관하여 업스트림에서 다운스트림으로): 사람 Vκ5-2-마우스 ADAM6 자리-사람 Vκ4-1. 특정 구체예에서, 사람 VL 유전자 세그먼트의 배열은 다음과 같으며 (사람 VL 유전자 세그먼트의 전사의 방향에 관하여 업스트림에서 다운스트림으로): 마우스 ADAM6 자리-사람 Vκ2-40, 사람 Vκ2-40는 변형된 면역글로불린 중쇄 자리에서 가장-5' 사람 VL 유전자 세그먼트이다. 한 구체예에서, 마우스 ADAM6 자리의 마우스 ADAM6a 및 마우스 ADAM6b 중 하나 이상의 방향은 사람 VL 유전자 세그먼트의 방향과 비교하여 전사의 방향에 관하여 반대이다. 한 구체예에서, 마우스 ADAM6 자리의 마우스 ADAM6a 및 마우스 ADAM6b 중 하나 이상의 방향은 사람 VL 유전자 세그먼트의 방향과 비교하여 전사의 방향에 관하여 같다.
한 양태에서, 기능적 마우스 ADAM6 자리 (또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편)는 사람 VL 유전자 세그먼트 및 사람 JL 유전자 세그먼트 사이에 (즉, 가장-3' 사람 VL 유전자 세그먼트 및 가장-5' JL 유전자 세그먼트 사이의 유전자간 영역에서) 배치될 수 있으며, 사람 VL 및 JL 유전자 세그먼트는 내인성 VH 유전자 세그먼트를 대체한다. 한 구체예에서, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH 유전자 세그먼트가 제거되고 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트 및 하나 이상의 사람 JL 유전자 세그먼트로 대체되며, 마우스 ADAM6 자리는 가장-3' 사람 VL 유전자 세그먼트의 3' 끝에 바로 인접하고 가장-5' 사람 JL 유전자 세그먼트의 5' 끝에 바로 인접하게 배치된다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트 및 하나 이상의 사람 JL 유전자 세그먼트는 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트. 특정 구체예에서, 사람 VL 유전자 세그먼트의 배열은 다음과 같다 (사람 VL 유전자 세그먼트의 전사의 방향에 관하여 업스트림에서 다운스트림으로): 사람 Vκ4-1-마우스 ADAM6 자리-사람 Jκ1. 한 구체예에서, 마우스 ADAM6 자리의 마우스 ADAM6a 및 마우스 ADAM6b 중 하나 이상의 방향은 사람 VL 유전자 세그먼트의 방향과 비교하여 전사의 방향에 관하여 반대이다. 한 구체예에서, 마우스 ADAM6 자리의 마우스 ADAM6a 및 마우스 ADAM6b 중 하나 이상의 방향은 사람 VL 유전자 세그먼트의 방향과 비교하여 전사의 방향에 관하여 같다.
모든 또는 실질적으로 모든 내인성 VH 유전자 세그먼트를 대체하는 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트 (예를 들어, Vκ 또는 Vλ 세그먼트)로 변형된 마우스는, 상기 설명된 바와 같이, 예를 들어, 마우스 ADAM6 자리 또는 이들의 기능적 단편을 포함하는 다운스트림 상동성 팔을 갖는 표적화 벡터를 이용함으로써 내인성 ADAM6 자리를 유지하기 위해, 또는 손상된 마우스 ADAM6 자리를 두 개의 사람 VL 유전자 세그먼트 사이에 또는 사람 VL 유전자 세그먼트 및 DH 유전자 세그먼트 (사람 또는 마우스, 예를 들어, Vλ + m/hDH), 또는 J 유전자 세그먼트 (사람 또는 마우스, 예를 들어, Vκ + JH) 사이에 배치된 이소성 서열로 대체하기 위해 변형될 수 있다. 한 구체예에서, 대체는 둘 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트를 포함하고, 마우스 ADAM6 자리 또는 이들의 기능적 단편은 두 개의 가장-3' VL 유전자 세그먼트 사이에 배치된다. 특정 구체예에서, 사람 VL 유전자 세그먼트의 배열은 다음과 같다 (사람 유전자 세그먼트의 전사의 방향에 관하여 업스트림에서 다운스트림으로): 사람 VL3'-1-마우스 ADAM6 자리-사람 VL3'. 한 구체예에서, 마우스 ADAM6 자리의 마우스 ADAM6a 및 마우스 ADAM6b 중 하나 이상의 방향은 사람 VL 유전자 세그먼트의 방향과 비교하여 전사의 방향에 관하여 반대이다. 대안으로, 마우스 ADAM6 자리는 가장-3' 사람 VL 유전자 세그먼트 및 가장-5' JL 유전자 세그먼트 사이의 유전자간 영역에 배치될 수 있다.
한 양태에서, 하나 이상의 내인성 VH 유전자 세그먼트가 대체된 마우스가 제공되며, 적어도 하나의 내인성 DH 유전자 세그먼트를 포함한다. 이러한 마우스에서, 내인성 VH 유전자 세그먼트의 변형은, 가장-5' DH 유전자 세그먼트는 아니지만, 가장-3' VH 유전자 세그먼트 중 하나 이상의 변형을 포함하며, 하나 이상의 가장-3' VH 유전자 세그먼트의 변형이 내인성 ADAM6 자리를 방해하지 않거나 이를 비기능적이게 하지 않도록 주의가 요구된다. 예를 들어, 한 구체예에서, 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 VH 유전자 세그먼트의 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트로의 대체를 포함하고, 마우스는 하나 이상의 내인성 DH 유전자 세그먼트 및 기능적 내인성 ADAM6 자리를 포함한다.
또 다른 구체예에서, 마우스는 내인성 가장-3' VH 유전자 세그먼트의 변형, 및 하나 이상의 내인성 DH 유전자 세그먼트의 변형을 포함하고, 변형은 내인성 ADAM6 자리의 온전성을 내인성 ADAM6 자리가 기능성을 유지할 정도로 유지하기 위해 수행된다. 한 예에서, 이러한 변형은 두 단계로 실행된다: (1) 업스트림 상동성 팔 및 다운스트림 상동성 팔을 가진 표적화 벡터를 이용하여 가장-3' 내인성 VH 유전자 세그먼트를 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트로 대체하는 단계로서, 다운스트림 상동성 팔은 기능적 마우스 ADAM6 자리의 모두 또는 일부를 포함하는 단계; (2) 그 후 내인성 DH 유전자 세그먼트를 마우스 ADAM6 자리의 모두 또는 기능적 일부를 포함하는 업스트림 상동성 팔을 가진 표적화 벡터로 대체하는 단계.
다양한 양태에서, 변형이 내인성 마우스 ADAM6의 기능을 붕괴시키는 경우, 마우스 ADAM6 단백질 또는 오솔로그 또는 상동체 또는 이들의 기능적 상동체를 암호화하는 이소성 서열을 함유하는 마우스를 이용하는 것이 유용하다. 내인성 마우스 ADAM6 기능을 붕괴시킬 확률은 마우스 면역글로불린 자리에 대한 변형을 만들 때, 특히 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 영역 및 주위 서열을 변형시킬 때 높다. 그러므로, 이러한 마우스는 전체적으로 또는 부분적으로 결실된, 전체적으로 또는 부분적으로 사람화된, 또는 전체적으로 또는 부분적으로 대체되는 (예를 들어, Vκ 또는 V 서열로) 면역글로불린 중쇄 자리를 갖는 마우스를 만들때 특정 이점을 제공한다. 하기 설명된 마우스에 대하여 설명된 유전적 변형을 만드는 방법은 당업자들에게 알려져 있다.
마우스 ADAM6 단백질, 또는 마우스 ADAM6 단백질의 생식능력 이점을 부여하는 실질적으로 동일하거나 유사한 단백질을 암호화하는 이소성 서열을 함유하는 마우스는 내인성 ADAM6 서열을 붕괴시키거나 결실하는 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 자리에 대한 변형과 함께 특히 유용하다. 주로 사람 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 가진 항체를 발현하는 마우스와 관련되어 설명되지만, 이러한 마우스는 내인성 ADAM6 유전자를 붕괴시키는 어떤 유전적 변형에 관해서도 유용하다. 당업자는 이것이 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 유전자 자리의 변형을 함유하는 여러 가지의 유전적으로 변형된 마우스를 포함한다는 것을 인식할 것이다. 이것들은, 예를 들어, 다른 변형에 상관없이, 마우스 면역글로불린 중쇄 유전자 세그먼트 모두 또는 일부가 결실되거나 대체된 마우스를 포함한다. 비-제한 예는 하기 설명된다.
일부 양태에서, 마우스에서 기능적인 이소성 마우스, 설치류, 또는 다른 ADAM6 유전자 (또는 오솔로그 또는 상동체 또는 단편), 및 하나 이상의 사람 면역글로불린 가변 및/또는 불변 영역 유전자 세그먼트를 포함하는, 유전적으로 변형된 마우스가 제공된다. 다양한 구체예에서, 마우스에서 기능적인 다른 ADAM6 유전자 오솔로그 또는 상동체 또는 단편은 소, 개, 영장류, 토끼의 서열 또는 다른 비-사람 서열을 포함할 수도 있다.
한 양태에서, 기능적 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 ADAM6 서열, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH 유전자 세그먼트의 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트로의 대체; 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 DH 및 JH 유전자 세그먼트의 하나 이상의 사람 JL 유전자 세그먼트로의 대체를 포함하는 마우스가 제공된다.
한 구체예에서, 마우스는 마우스 CH1 뉴클레오티드 서열의 사람 CH1 뉴클레오티드 서열로의 대체를 더 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 마우스 힌지 뉴클레오티드 서열의 사람 힌지 뉴클레오티드 서열로의 대체를 더 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 면역글로불린 경쇄 가변 자리 (VL 및 JL)의 사람 면역글로불린 경쇄 가변 자리로의 대체를 더 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 마우스 면역글로불린 경쇄 불변 영역 뉴클레오티드 서열의 사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역 뉴클레오티드 서열로의 대체를 더 포함한다. 특정 구체예에서, VL, JL, 및 CL은 면역글로불린 κ 경쇄 서열이다. 특정 구체예에서, 마우스는 마우스 면역글로불린 자리는 (a) 사람 가변 영역, 사람 CH1 영역, 사람 힌지 영역, 및 마우스 CH2 및 마우스 CH3 영역을 가진 중쇄; 및 (b) 사람 가변 도메인 및 사람 불변 영역을 포함하는 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 유전자를 포함하는 결합 단백질을 암호화하는 유전자를 형성하기 위해 재배열되도록 사람 힌지 및 사람 CH1 서열에 융합되는 마우스 CH2 및 마우스 CH3 면역글로불린 불변 영역 서열을 포함한다.
한 양태에서, 기능적 ADAM6 단백질을 암호화하는 이소성 ADAM6 서열, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH 유전자 세그먼트의 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트로의 대체, 및 선택적으로 모든 또는 실질적으로 모든 DH 유전자 세그먼트 및/또는 JH 유전자 세그먼트의 하나 이상의 사람 DH 유전자 세그먼트 및/또는 사람 JH 유전자 세그먼트로의 대체, 또는 선택적으로 모든 또는 실질적으로 모든 DH 유전자 세그먼트 및 JH 유전자 세그먼트의 하나 이상의 사람 JL 유전자 세그먼트로의 대체를 포함하는 마우스가 제공된다.
한 구체예에서, 마우스는 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트의 하나 이상의 VL, 하나 이상의 DH, 및 하나 이상의 J 유전자 세그먼트 (예를 들어, Jκ 또는 Jλ)로의 대체를 포함하며, 유전자 세그먼트는 마우스 힌지 영역에 작동 가능하게 결합되고, 마우스는, 전사의 방향에서 5'에서 3'으로, 사람 VL-사람 또는 마우스 DH -사람 또는 마우스 J-마우스 힌지-마우스 CH2-마우스 CH3을 함유하는 재배열된 면역글로불린 사슬 유전자를 형성한다. 한 구체예에서, J 영역은 사람 Jκ 영역이다. 한 구체예에서, J 영역은 사람 JH 영역이다. 한 구체예에서, J 영역은 사람 Jλ 영역이다. 한 구체예에서, 사람 VL 영역은 사람 Vλ 영역 및 사람 Vκ 영역으로부터 선택된다.
특정 구체예에서, 마우스는 사람 Vκ, 사람 DH 및 사람 Jκ; 사람 Vκ, 사람 DH, 및 사람 JH; 사람 Vλ, 사람 DH, 및 사람 Jλ; 사람 Vλ, 사람 DH, 및 사람 JH; 사람 Vκ, 사람 DH, 및 사람 Jλ; 사람 Vλ, 사람 DH, 및 사람 Jκ로부터 유래된 마우스 또는 사람 불변 영역 및 가변 영역을 갖는 단일 가변 도메인 항체를 발현한다. 특정 구체예에서, 재조합 인식 서열은 생산적 재배열이 인용된 V, D, 및 J 유전자 세그먼트 사이 또는 인용된 V 및 J 유전자 세그먼트 사이에서 발생하는 것을 허용하기 위해 변형된다.
한 구체예에서, 기능적 ADAM6 단백질 (또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편)을 암호화하는 이소성 ADAM6 서열, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH 유전자 세그먼트의 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트로의 대체, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 DH 유전자 세그먼트 및 JH 유전자 세그먼트의 사람 JL 유전자 세그먼트로의 대체를 포함하는 마우스가 제공되며; 마우스는 CH1 및/또는 힌지 영역이 결핍된다.
한 구체예에서, 마우스는 CH1 도메인을 암호화하는 서열이 결핍된다. 한 구체예에서, 마우스는 힌지 영역을 암호화하는 서열이 결핍된다. 한 구체예에서, 마우스는 CH1 도메인 및 힌지 영역을 암호화하는 서열이 결핍된다.
특정 구체예에서, 마우스는 마우스 CH3 도메인에 부착된 마우스 CH2 도메인에 융합된 사람 면역글로불린 경쇄 가변 도메인 (λ 또는 κ)을 포함하는 결합 단백질을 발현한다.
한 양태에서, 기능적 ADAM6 단백질 (또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편)을 암호화하는 이소성 ADAM6 서열, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 VH 유전자 세그먼트의 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트로의 대체, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 DH 및 JH 유전자 세그먼트의 사람 JL 유전자 세그먼트로의 대체를 포함하는 마우스가 제공된다.
한 구체예에서, 마우스는 CH1 영역, 힌지 영역, CH1 및 힌지 영역, 또는 CH1 영역 및 힌지 영역 및 CH2 영역을 암호화하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자 서열의 결실을 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 (a) 사람 VL-마우스 CH1-마우스 CH2-마우스 CH3; (b) 사람 VL-마우스 힌지-마우스 CH2-마우스 CH3; (c) 사람 VL-마우스 CH2-마우스 CH3로부터 선택된 호모다이머를 포함하는 단일 가변 도메인 결합 단백질을 만든다.
한 양태에서, 변형된 면역글로불린 중쇄 자리를 포함하는 비-사람 동물이 제공되며, 변형된 면역글로불린 중쇄 자리는 비-사람 ADAM6 서열 또는 이들의 오솔로그 또는 상동체를 포함한다.
한 구체예에서, 비-사람 동물은 마우스, 래트, 및 햄스터로부터 선택된 설치류이다.
한 구체예에서, 비-사람 ADAM6 오솔로그 또는 상동체는 마우스 ADAM6 서열에 대한 오솔로그 및/또는 상동체인 서열이며, 오솔로그 또는 상동체는 비-사람 동물에서 기능적이다.
한 구체예에서, 비-사람 동물은 마우스, 래트, 및 햄스터로부터 선택되고 ADAM6 오솔로그 또는 상동체는 마우스, 래트, 및 햄스터로부터 선택된 비-사람 동물의 것이다. 특정 구체예에서, 비-사람 동물은 마우스이고 ADAM6 오솔로그 또는 상동체는 다른 마우스, 래트, 및 햄스터 종으로부터 선택된 동물의 것이다. 특정 구체예에서, 비-사람 동물은 래트이고, ADAM6 오솔로그 또는 상동체는 다른 래트 종, 마우스, 및 햄스터로부터 선택된 설치류의 것이다. 특정 구체예에서, 비-사람 동물은 햄스터이고, ADAM6 오솔로그 또는 상동체는 다른 햄스터 종, 마우스, 및 래트로부터 선택된 설치류의 것이다.
특정 구체예에서, 비-사람 동물은 쥐아목(Myomorpha)의 것이고, ADAM6 서열은 뛰는쥐상과의 설치류 및 쥐상과의 설치류로부터 선택된 동물의 것이다. 특정 구체예에서, 설치류는 쥐상과의 마우스이고, ADAM6 오솔로그 또는 상동체는 쥐상과의 마우스 또는 래트 또는 햄스터의 것이다.
한 구체예에서, 변형된 면역글로불린 중쇄 자리는 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트 및 하나 이상의 사람 JL 유전자 세그먼트를 포함한다. 특정 구체예에서, 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트 및 하나 이상의 사람 Jλ 유전자 세그먼트는 하나 이상의 사람, 키메라 및/또는 설치류 (예를 들어, 마우스 또는 래트) 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 결합된다. 한 구체예에서, 불변 영역 유전자는 마우스이다. 마우스. 한 구체예에서, 불변 영역 유전자는 래트이다. 한 구체예에서, 불변 영역 유전자는 햄스터이다. 한 구체예에서, 불변 영역 유전자는 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택된 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 불변 영역 유전자는 힌지, CH2, 및 CH3 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 사람 VL 및 JL 유전자 세그먼트는 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트이다.
한 구체예에서, 비-사람 ADAM6 서열은 사람 면역글로불린 경쇄 서열과 인접하다. 한 구체예에서, 비-사람 ADAM6 서열은 사람 면역글로불린 경쇄 서열 내에 위치한다. 특정 구체예에서, 사람 면역글로불린 경쇄 서열은 V 및/또는 J 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 구체예에서, 비-사람 ADAM6 서열은 V 유전자 세그먼트와 함께 병치된다. 한 구체예에서, 비-사람 ADAM6 서열은 두 개의 V 유전자 세그먼트 사이에 배치된다. 한 구체예에서, 비-사람 ADAM6 서열은 V 및 J 유전자 세그먼트 사이에 병치된다. 한 구체예에서, 마우스 ADAM6 서열은 두 개의 J 유전자 세그먼트 사이에 병치된다.
한 양태에서, 면역글로불린 자리의 사람 VL 도메인과 동족인 사람 VL 도메인을 발현하는 B 세포를 포함하는, 유전적으로 변형된 비-사람 동물이 제공되며, 비-사람 동물은 면역글로불린 자리의 비-면역글로불린 비-사람 단백질을 발현한다. 한 구체예에서, 비-면역글로불린 비-사람 단백질은 ADAM 단백질이다. 특정 구체예에서, ADAM 단백질은 ADAM6 단백질 또는 상동체 또는 오솔로그 또는 이들의 기능적 단편이다.
한 구체예에서, 비-사람 동물은 설치류 (예를 들어, 마우스 또는 래트)이다. 한 구체예에서, 설치류는 쥐과이다. 한 구체예에서, 설치류는 마우스 및 래트로부터 선택된 쥐아과의 설치류이다.
한 구체예에서, 비-면역글로불린 비-사람 단백질은 설치류 단백질이다. 한 구체예에서, 설치류는 쥐과이다. 한 구체예에서, 설치류는 쥐아과이다. 특정 구체예에서, 설치류는 마우스, 래트, 및 햄스터로부터 선택된다.
한 구체예에서, 사람 VL 도메인은 면역글로불린 불변 도메인 서열에 직접 또는 결합자를 통해 부착된다. 특정 구체예에서, 불변 도메인 서열은 힌지, CH2, CH3, 및 이들의 조합으로부터 선택된 서열을 포함한다. 특정 구체예에서, 사람 VL 도메인은 Vκ 또는 Vλ 도메인으로부터 선택된다.
다양한 구체예에서, 사람 VL 도메인은 사람 Vκ 도메인이다.
한 양태에서, 생식세포 계열에서 사람 면역글로불린 서열을 포함하는, 유전적으로 변형된 비-사람 동물이 제공되며, 수컷 비-사람 동물의 정자는 생체 내 이동 결점을 특징으로 한다. 한 구체예에서, 생체 내 이동 결점은 같은 종의 암컷 비-사람 동물의 자궁에서 난관을 통해 이동할 수 없는 수컷 비-사람 동물의 정자의 능력을 포함한다. 한 구체예에서, 비-사람 동물은 ADAM6 단백질 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 결핍된다. 특정 구체예에서, ADAM6 단백질 또는 이들의 기능적 단편은 ADAM6a 및/또는 ADAM6b 단백질 또는 이들의 기능적 단편을 포함한다. 한 구체예에서, 비-사람 동물은 설치류이다. 특정 구체예에서, 설치류는 마우스, 래트, 및 햄스터로부터 선택된다.
한 양태에서, ADAM6 단백질 또는 이것의 오솔로그 또는 상동체 또는 기능적 단편을 암호화하는 비-사람 서열과 인접한 사람 면역글로불린 서열을 포함하는 비-사람 동물이 제공된다. 한 구체예에서, 비-사람 동물은 설치류이다. 특정 구체예에서, 설치류는 마우스, 래트, 및 햄스터로부터 선택된다.
한 구체예에서, 사람 면역글로불린 서열은 면역글로불린 경쇄 서열이다. 한 구체예에서, 면역글로불린 서열은 하나 이상의 VL 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 사람 면역글로불린 서열은 하나 이상의 JL 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 사람 면역글로불린 서열은 하나 이상의 VL 유전자 세그먼트 및 하나 이상의 JL 유전자 세그먼트를 포함한다. 다양한 구체예에서, 사람 VL 및 JL 유전자 세그먼트는 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트이다.
한 양태에서, 고장난 또는 결실된 내인성 ADAM6 자리를 포함하는, 내인성 면역글로불린 중쇄 자리가 고장난 마우스가 제공되며, 마우스는 사람 또는 마우스 또는 사람/마우스 또는 다른 키메라 항체를 발현하는 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 핵산 서열은 마우스 게놈으로 무작위로 통합된 통합된 이식 유전자 상에 존재한다. 한 구체예에서, 핵산 서열은 야생형 마우스에서 발견되지 않는 에피솜 (예를 들어, 염색체) 상에 있다.
한 양태에서, 기능적 내인성 ADAM6 자리를 포함하는, 내인성 면역글로불린 중쇄 자리가 고장난 마우스가 제공되며, 마우스는 사람 또는 마우스 또는 사람/마우스 또는 다른 키메라 항체를 발현하는 핵산 서열을 포함한다. 한 구체예에서, 핵산 서열은 하나 이상의 내인성 중쇄 불변 영역 유전자의 업스트림인 위치에서 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에 존재한다. 한 구체예에서, 핵산 서열은 마우스 게놈으로 무작위로 통합된 통합된 이식 유전자에 존재한다. 한 구체예에서, 핵산 서열은 야생형 마우스에서 발견되지 않는 에피솜 (예를 들어, 염색체) 상에 있다.
이중특이적-결합 단백질
본원에서 설명된 결합 단백질, 및 그것들을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 다중특이적 결합 단백질, 예를 들어, 이중특이적 결합 단백질을 만들기 위해 사용될 수 있다. 본 양태에서, CH 영역과 융합된 제1 VL 도메인으로 근본적으로 구성된 제1 폴리펩티드는 CH 영역과 융합된 제2 VL 도메인으로 구성된 제2 폴리펩티드와 결합할 수 있다. 제1 VL 도메인 및 제2 VL 도메인은 다른 에피토프에 특이적으로 결합하고, 이중특이적-결합 분자는 두 개의 VL 도메인을 사용하여 만들어질 수 있다. CH 영역은 같거나 다를 수 있다. 한 구체예에서, 예를 들어, CH 영역들 중 하나는 단백질 A 결합 결정요소를 제거하기 위해 변형될 수 있는 반면에, 다른 중쇄 불변 영역은 그렇게 변형되지 않는다. 이 특정 배열은 이중특이적 결합 단백질의, 예를 들어, 호모다이머 (예를 들어, 제1 또는 제2 폴리펩티드의 호모다이머)의 혼합물로부터의 분리를 단순화한다.
한 양태에서, 본원에서 설명된 방법 및 조성물은 이중특이적-결합 단백질을 만들기 위해 사용된다. 이 양태에서, CH 영역에 융합된 제1 VL 및 CH 영역에 융합된 제2 VL은 각각 같은 이소타입의 사람 IgG 서열 (예를 들어, 사람 IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4)로 독립적으로 인 프레임 (in frame) 클로닝된다. 제1 VL은 제1 에피토프에 특이적으로 결합하고, 제2 VL은 제2 에피토프에 특이적으로 결합한다. 제1 및 제2 에피토프는 다른 항원, 또는 같은 항원 상에 있을 수도 있다.
한 구체예에서, 제1 VL에 융합된 CH 영역의 IgG 이소타입 및 제2 VL에 융합된 CH 영역의 IgG 이소타입은 같은 이소타입이지만, 하나의 IgG 이소타입이 적어도 하나의 아미노산 치환을 포함한다는 점에서 다르다. 한 구체예에서, 적어도 하나의 아미노산 치환은 치환을 함유한 중쇄가 치환이 결핍된 중쇄와 비교하여 단백질 A에 결합할 수 없거나 실질적으로 결합할 수 있게 한다.
한 구체예에서, 제1 CH 영역은 IgG1, IgG2, 및 IgG4로부터 선택된 사람 IgG의 제1 CH3 도메인을 포함하고; 제2 CH 영역은 IgG1, IgG2, 및 IgG4로부터 선택된 사람 IgG의 제2 CH3 도메인을 포함하며, 제2 CH3 도메인은 제2 CH3 도메인의 단백질 A로의 결합을 감소시키거나 제거하는 변형을 포함한다.
한 구체예에서, 제2 CH3 도메인은 카바트(Kabat)의 EU 지수에 따라 번호 붙여진, 435R 변형을 포함한다. 또 다른 구체예에서, 제2 CH3 도메인은 카바트의 EU 지수에 따라 번호 붙여진 436F 변형을 더 포함한다.
한 구체예에서, 제2 CH3 도메인은 카바트의 EU 지수에 따라 번호 붙여진, D356E, L358M, N384S, K392N, V397M, 및 V422I로 구성된 군으로부터 선택된 변형을 포함하는 사람 IgG1의 그것이다.
한 구체예에서, 제2 CH3 도메인은 카바트의 EU 지수에 따라 번호 붙여진, N384S, K392N, 및 V422I로 구성된 군으로부터 선택된 변형을 포함하는 사람 IgG2의 그것이다.
한 구체예에서, 제2 CH3 도메인은 카바트의 EU 지수에 따라 번호 붙여진, Q355R, N384S, K392N, V397M, R409K, E419Q, 및 V422I로 구성된 군으로부터 선택된 변형을 포함하는 사람 IgG4의 그것이다.
한 구체예에서, 결합 단백질은 본원에서 인용된 바와 같이 하나 이상의 변형을 갖는 CH 영역을 포함하며, 결합 단백질의 불변 영역은 사람에서 비면역원성 또는 실질적으로 비면역원성이다. 특정 구체예에서, CH 영역은 사람에서 면역원성 에피토프를 제공하지 않는 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 특정 구체예에서, 결합 단백질은 야생형 사람 중쇄에서 발견되지 안는 CH 영역을 포함하고, CH 영역은 T-세포 에피토프를 발생시키는 서열을 포함하지 않는다.
실시예
다음 실시예는 본 발명의 방법 및 조성물을 만들고 사용하는 방법을 설명하기 위해 제공되고, 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 것들의 범위를 제한하기 위한 것은 아니다. 달리 지시되지 않으면, 온도는 섭씨 온도를 나타내고, 압력은 대기압 정도이다.
실시예 1. 사람 경쇄 유전자 세그먼트의 A 중쇄 자리로의 도입
다양한 표적화 구조를 마우스 게놈의 박테리아 인공 염색체 (BAC) 라이브러리를 변형시키기 위해 VELOIGENE® 유전적 조작 기술을 사용하여 만들었다 (예를 들어, 미국 특허 번호 제6,586,251호 및 Valenzuela et al. (2003), High-throughput engineering of the mouse gemome coupled with high-resolution expression analysis, Nat Biotechnol 21:652-659를 참고하면 됨). 마우스 BAC DNA를 상동성 재조합에 의해 변형시켜서 재배열되지 않은 사람 생식세포 계열 κ 경쇄 유전자 서열의 그 후의 삽입을 위한 VH, DH 및 JH 유전자 세그먼트의 표적화된 결실을 통해 내인성 중쇄 자리를 불활성화시켰다 (예를 들어, 도 2의 상단 참조).
간략히 말하면, 마우스 중쇄 자리를 리콤비나제-매개된 재조합을 사용하는 두 개의 연속적인 표적화 이벤트로 결실시켰다. 제1 표적화 이벤트는 5'에서 3'으로 5' 마우스 상동성 팔, 리콤비나제 인식 부위, 네오마이신 카세트 및 3' 상동성 팔을 포함하는 표적화 벡터를 사용하는 마우스 중쇄 자리의 5' 끝에서의 표적화를 포함하였다. 5' 및 3' 상동성 팔은 마우스 중쇄 자리의 서열 5'을 함유하였다. 제2 표적화 이벤트는 5'에서 3'으로 5' 마우스 상동성 팔, 5' 리콤비나제 인식 부위, 제2 리콤비나제 인식 부위, 히그로마이신 카세트, 제3 리콤비나제 인식 부위, 및 3' 마우스 상동성 팔을 함유한 제2 표적화벡터를 사용하는 JH 유전자 세그먼트의 영역에서 마우스 중쇄 자리의 3' 끝에서의 표적화를 포함하였다. 5' 및 3' 상동성 팔은 마우스 JH 유전자 세그먼트 및 인트론성 인핸서 및 불변 영역의 5'을 플랭킹하는 서열을 함유하였다. 두 개의 표적화 벡터로 표적화된 변형된 중쇄 자리를 함유하는 양성 ES 세포 (상기 설명된 바와 같음)를 핵형분석에 의해 확인하였다. DNA를 이중-표적화된 ES 세포로부터 분리하였고 리콤비나제로의 치료를 받게함으로써 제1 표적화 벡터의 5' 리콤비나제 인식 부위 및 제2 표적화 벡터의 5' 리콤비나제 인식 부위 사이에서 마우스 중쇄 자리의 게놈 DNA의 결실을 매개하며, 단일 리콤비나제 인식 부위 및 히그로마이신 카세트를 두 개의 리콤비나제 인식 부위에 의해 플랭킹되게 두었다 (도 2의 상단). 따라서 온전한 CH 유전자를 함유하는 변형된 마우스 중쇄 자리를 하기 설명된 표적화 벡터를 사용하는 정확한 방식으로 사람 κ 생식세포 계열 유전자 세그먼트를 점진적으로 삽입하기 위해 생성하였다.
업계에 인식된 표준 분자적 기술을 사용하여 네 개의 별도의 표적화 벡터를 조작하여 40개의 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 다섯 개의 사람 Jκ 유전자 세그먼트를 불활성화된 마우스 중쇄 자리 (상기 설명됨)로 점진적으로 삽입하였다 (도 2). 네 개의 표적화 구조를 조작하는데 사용된 사람 κ 유전자 세그먼트는 생식세포 계열 사람 κ 경쇄 자리의 근위 콘틱에서 자연적으로 발견된다 (도 1의 하단 및 표 1).
여섯 개의 제1 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 다섯 개의 사람 Jκ 유전자 세그먼트를 함유하는 ~110,499 bp 사람 게놈 단편을 사람 Jκ5 유전자 세그먼트의 431 bp 다운스트림 (3')에서 PI-SceI 부위를 함유하도록 조작하였다. 또 다른 PI-SceI 부위를 마우스 중쇄 인트론성 인핸서, IgM 스위치 영역 (Sμ) 및 마우스 중쇄 자리의 IgM 유전자를 함유하는 ~7,852 bp 게놈 단편의 5' 끝에서 조작하였다. 이 마우스 단편을 ~110.5 kb 사람 단편에 결찰에 의해 3' 상동성 팔로서 사용하였으며, 이것은, 5'에서 3'으로, 여섯 개의 제1 연이은 Vκ 유전자 세그먼트 및 다섯 개의 Jκ 유전자 세그먼트를 함유하는 사람 κ 경쇄 자리의 게놈 서열의 ~110.5 kb, PI-SceI 부위, 마우스 인트론성 인핸서, Sμ 및 마우스 IgM 불변 유전자를 함유하는 마우스 중쇄 서열의 ~7,852 bp를 함유하는 3' 정션(junction)을 생성하였다. 사람 Vκ1-6 유전자 세그먼트의 업스트림 (5')은 5' 마우스 상동성 팔의 시작 전에 사람 κ 서열의 추가 3,710 bp였으며, 이것은 마우스 중쇄 자리의 5'에 해당하는, 19,752 bp의 마우스 게놈 DNA를 함유하였다. 5' 상동성 팔 및 사람 κ 서열의 초반부 사이에서 세 개의 리콤비나제 인식 부위에 의해 플랭킹된 네오마이신 카세트였다 (표적화 벡터 1, 도 2를 참고하면 됨). 사람 κ 서열의 제1 삽입을 위한 최종 표적화 벡터는 5'에서 3'으로 중쇄 자리의 5'에서 ~20 kb의 마우스 게놈 서열을 함유하는 5' 상동성 팔, 제1 리콤비나제 인식 부위 (R1), 네오마이신 카세트, 제2 리콤비나제 인식 부위 (R2), 제3 리콤비나제 인식 부위 (R3), 여섯 개의 제1 연이은 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 다섯 개의 사람 Jκ 유전자 세그먼트, PI-SceI 부위, 및 인트론성 인핸서, Sμ 및 마우스 IgM 불변 유전자를 포함하는, ~8 kb의 마우스 게놈 서열을 함유하는 3' 상동성 팔을 함유하는, ~110.5 kb의 사람 게놈 κ 서열을 포함하였다 (도 2, 표적화 벡터 1). 표적화 벡터로 상동성 재조합은 내인성 중쇄 불변 유전자에 작동 가능하게 결합된 여섯 개의 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 다섯 개의 사람 Jκ 유전자 세그먼트를 함유하는 변형된 마우스 중쇄 자리를 생성하였으며, 재조합시, 이것은 히브리드 중쇄 (즉, 사람 Vκ 도메인 및 마우스 CH 영역)의 형성으로 이어진다.
| 표 1 | |||
| 표적 벡터 |
사람 κ 서열의 크기 |
추가된 사람 κ 유전자 세그먼트 |
|
| Vκ | Jκ | ||
| 1 | ~110.5 kb | 4-1, 5-2, 7-3, 2-4, 1-5, 1-6 | 1-5 |
| 2 | ~140 kb | 3-7, 1-8, 1-9, 2-10, 3-11, 1-12, 1-13, 2-14, 3-15, 1-16 |
- |
| 3 | ~161kb | 1-17, 2-18, 2-19, 3-20, 6-21, 1-22, 1-23, 2-24, 3-25, 2-26, 1-27, 2-28, 2-29, 2-30 |
- |
| 4 | ~90 kb | 3-31, 1-32, 1-33, 3-34, 1-35, 2-36, 1-37, 2-38, 1-39, 2-40 |
- |
열 개의 추가적인 사람 Vκ 유전자 세그먼트의 히브리드 중쇄 자리로의 도입. 제2 표적화 벡터를 10개의 추가적인 사람 Vκ 유전자 세그먼트의 상기 설명된 변형된 마우스 중쇄 자리로의 도입을 위해 조작하였다 (도 2, 표적화 벡터 2 참조). 사람 κ 경쇄 자리의 12개의 연이은 사람 Vκ 유전자 세그먼트를 함유하는 140,058 bp 사람 게놈 단편을 마우스 중쇄 자리의 5'에서 마우스 게놈 서열을 함유하는 5' 상동성 팔 및 사람 게놈 κ 서열을 함유하는 마우스 3' 상동성 팔로 조작하였다. 사람 Vκ1-16 유전자 세그먼트의 업스트림 (5')은 5' 마우스 상동성 팔의 시작 전에 10,170 bp의 추가적 사람 κ 서열이었으며, 이것은 표적화 벡터 1의 구성에 사용된 같은 5' 상동성 팔이었다 (도 2). 5' 상동성 팔 및 사람 κ 서열의 시작 사이에서 리콤비나제 인식 부위에 의해 플랭킹된 히그로마이신 카세트였다. 3' 상동성 팔은 표적화 벡터 1의 사람 게놈 κ 서열의 ~110.5 kb의 동등한 5' 끝에 해당하는 사람 게놈 κ 서열의 31,165 bp 중첩을 포함하였다 (도 2). 5'에서 3'으로, 10개의 추가 사람 Vκ 유전자 세그먼트의 삽입을 위한 최종 표적화 벡터는 중쇄 자리의 5'에서 마우스 게놈 서열 중 ~20kb, 제1 리콤비나제 인식 부위 (R1), 히그로마이신 카세트, 제2 리콤비나제 인식 부위 (R2) 및 12개의 연이은 사람 VL 유전자 세그먼트를 함유하는 사람 게놈 κ 서열 중 ~140 kb를 함유하는 5' 상동성 팔을 포함하였으며, 이것들 중 ~31kb는 표적화 벡터 1의 사람 κ 서열의 5' 끝과 중첩되고 이 표적화 구조를 위한 3' 상동성 팔의 역할을 한다. 이 표적화 벡터로의 상동 재조합은 마우스 중쇄 불변 유전자에 작동 가능하게 결합된 16개의 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 다섯 개의 사람 Jκ 유전자 세그먼트를 함유하는 변형된 마우스 중쇄 자리를 생성하였으며, 재조합시, 히브리드 중쇄의 형성으로 이어진다.
14개의 추가 사람 Vκ 유전자 세그먼트의 히브리드 중쇄 자리로의 도입. 제3 표적화 벡터를 14개의 추가 사람 Vκ 유전자 세그먼트의 상기 설명된 변형된 마우스 중쇄 자리로의 도입을 위해 조작하였다 (도 2, 표적화 벡터 3). 15개의 연이은 사람 Vκ 유전자 세그먼트를 함유하는 160,579 bp 사람 게놈 단편을 마우스 중쇄 자리의 5;에서 마우스 게놈 서열을 함유하는 5' 상동성 팔 및 사람 게놈 κ 서열을 함유하는 3' 상동성 팔로 조작하였다. 사람 Vκ2-30 유전자 세그먼트의 업스트림 (5')은 5' 마우스 상동성 팔의 시작 전에 사람 κ 서열의 추가 14,687 bp였으며, 이것은 이전 두 개의 표적화 벡터에 사용된 같은 5' 상동체였다 (상기에서 설명됨, 또한 도 2 참조). 5' 상동성 팔 및 사람 κ 서열의 시작점 사이는 리콤비나제 인식 부위에 의해 플랭킹된 네오마이신 카세트였다. 3' 상동성 팔은 표적화 벡터 2의 사람 게놈 κ 서열의 ~140kb 단편의 동등한 5' 끝에 해당하는 사람 게놈 κ 서열의 21,275 bp 중첩을 포함하였다 (도 20). 5'에서 3'으로, 14개의 추가 사람 Vκ 유전자 세그먼트의 삽입을 위한 최종 표적화 벡터는 마우스 중쇄 자리의 5'에서 마우스 게놈의 ~20 kb를 함유하는 5' 상동성 팔, 제1 리콤비나제 인식 부위 (R1), 네오마이신 카세트, 제2 리콤비나제 인식 부위 (R2) 및 15개의 사람 Vκ 유전자 세그먼트를 함유하는 사람 게놈 κ 서열 중 ~161kb를 포함하며, 이것들 중 ~21kb는 표적화 벡터 2의 사람 κ 서열의 5' 끝과 중첩되고 이 표적화 구조를 위한 3' 상동성 팔의 역할을 한다. 이 표적화 벡터로의 상동 재조합은 마우스 중쇄 불변 유전자에 작동 가능하게 결합된 30개의 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 다섯 개의 사람 Jκ 유전자 세그먼트를 함유하는 변형된 마우스 중쇄 자리를 생성하였으며, 재조합시, 키메라 κ 중쇄의 형성으로 이어진다.
10개의 추가 사람 Vκ 유전자 세그먼트의 히브리드 중쇄 자리로의 도입. 14개의 표적화 벡터를 10개의 추가 사람 Vκ 유전자 세그먼트의 상기 설명된 변형된 마우스 중쇄 자리로의 도입을 위해 조작하였다 (도 2, 표적화 벡터 4). 16개의 연이은 사람 Vκ 유전자 세그먼트를 함유하는 90,398 bp 사람 게놈 단편을 마우스 중쇄 자리의 5'에서 마우스 게놈 서열을 함유하는 5' 상동성 팔 및 사람 게놈 κ 서열을 함유하는 3' 상동성 팔로 조작하였다. 사람 Vκ2-40 유전자 세그먼트의 업스트림 (5')은 5' 마우스 상동성 팔의 시작 전에 사람 κ 서열의 추가의 8,484 bp였으며, 이것은 상기 표적화 벡터와 같은 5' 상동체였다 (상기 설명됨, 도 2). 5' 상동성 팔 및 사람 κ 서열의 시작점 사이는 리콤비나제 인식 부위에 의해 플랭킹된 히그로마이신 카세트였다. 3' 상동성 팔은 표적화 벡터 3의 사람 게놈 κ 서열의 ~160 kb 단편의 동등한 5' 끝에 해당하는 사람 게놈 κ 서열의 61,615 bp 중첩을 포함하였다 (도 2). 5'에서 3'으로, 10개의 추가 사람 Vκ 유전자 세그먼트의 삽입을 위한 최종 표적화 벡터는 마우스 중쇄 자리의 5'에서 마우스 게놈 서열의 ~20 kb를 함유하는 5' 상동성 팔, 제1 리콤비나제 인식 부위 (R1), 히그로마이신 카세트, 제2 리콤비나제 인식 부위 (R2) 및 16개의 사람 Vκ 유전자 세그먼트를 함유하는 사람 게놈 κ 서열 중 ~90 kb를 함유하였으며, 이것들 중 ~62 kb는 표적화 벡터 3의 사람 κ 서열의 5' 끝과 중첩되고 이 표적화 구조를 위한 3' 상동성 팔의 역할을 한다. 이 표적화 벡터로의 상동 재조합은 마우스 중쇄 불변 유전자에 작동 가능하게 결합된 40개의 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 다섯 개의 사람 Jκ 유전자 세그먼트를 함유하는 변형된 마우스 중쇄 자리를 생성하였으며, 재조합시, 키메라 κ 중쇄의 형성으로 이어진다 (도 2의 하단).
상기 설명된 바와 같은 유사한 접근법을 사용하여, 마우스 중쇄 불변 영역의 맥락에서 사람 경쇄 가변 도메인의 다른 조합이 구성되었다. 추가의 경쇄 가변 도메인은 사람 Vλ 및 Jλ 유전자 세그먼트로부터 유래될 수도 있다 (도 3 및 도 4).
사람 λ 경쇄 자리는 1,000 kb 이상으로 연장되고 가변 (V) 또는 결합 (J) 세그먼트를 암호화하는 80개 이상의 유전자를 함유한다. 사람 λ 경쇄 자리의 70개의 VL 유전자 세그먼트 중에서, 발표된 보고서에 따라 30-38의 어디라도 기능적 유전자 세그먼트인 것으로 나타난다. 70개의 VL 서열은 세 개의 클러스터에서 배열되며, 이것들 모두는 분명한 V 유전자 과 군 (클러스터 A, B 및 C)의 다른 멤버를 함유한다. 사람 λ 경쇄 자리 내에서, 관찰된 VL 도메인 모든 것의 절반 이상은 유전자 세그먼트 1-40, 1-44, 2-8, 2-14, 및 3-21에 의해 암호화된다. 7개의 Jλ 유전자 세그먼트가 있는데, 이것들 중 네 개만이 일반적으로 기능적 Jλ 유전자 세그먼트-Jλ1, Jλ2, Jλ3, 및 Jλ7인 것으로 간주된다. 일부 대립 유전자에서, 15번째, Jλ-Cλ 유전자 세그먼트 쌍은 보고된 바와 같이 가짜 유전자 (Cλ6)이다. 다수의 사람 Jλ 유전자 세그먼트의 히브리드 중쇄자리로의 통합은, 본원에서 설명된 바와 같이, 데 노보 (de novo) 합성에 의해 구성된다. 이 방법으로, 생식세포 계열 구조에서 다수의 사람 Jλ 유전자 세그먼트를 함유하는 게놈 단편은 다수의 사람 VL 유전자 세그먼트로 조작되고 중쇄 불변 영역의 맥락에서 정상 V-J 재조합을 허용한다.
경쇄 가변 도메인을 중쇄 불변 영역과 커플링하는 것은 비-사람 동물의 사람 VL 영역을 갖는 독특한 VL 결합 단백질에 대한 다양성의 잠재적으로 풍부한 공급원을 나타낸다. 마우스의 사람 λ 경쇄 자리 (또는 상기 설명된 바와 같이 사람 κ 자리)의 이 다양성을 이용하는 것은 독특한 히브리드 중쇄의 조작을 일으키고 유전적으로 변형된 동물의 면역 레퍼토리에 대한 또 다른 규모의 결합 단백질 및 치료제의 발생을 위한 치료제를 생성하기 위해 다음 세대 플랫폼으로서 그것들의 이후 사용을 발생시킨다.
추가적으로, 사람 DH 및 JH (또는 Jκ) 유전자 세그먼트는, 재조합시, 새로운 조작된 가변 도메인을 발생시키는 새로운 히브리드 자리를 구성하기 위해 사람 Vκ 또는 VL 유전자 세그먼트와 통합될 수 있다 (도 5 및 6). 이 후자의 경우에서, 단일 자리에서 정상적으로 함유되지 않은 유전자 세그먼트의 조합을 조작하는 것은 단일 자리로 결합될 때 정상적인 재조합이 성취될 수 있는 각각의 유전자 세그먼트와 관련된 재조합 신호 서열 (RSS)에 대한 특정 주의가 필요할 것이다. 예를 들어, V(D)J 재조합은 보존된 비암호화 DNA 서열에 의해 유도되는 것으로 알려져 있으며, 재조합이 일어나는 정확한 자리에서 각각의 유전자 세그먼트에 인접하게 발견된 헵타머(heptamer) 및 노나머(nonamer) 서열로서 알려져 있다. 비암호화 DNA 서열 사이는 길이가 12 또는 23 염기쌍 (bp)인 비보존된 스페이서(spacer) 영역이다. 일반적으로, 재조합은 같은 염색체 상에 자리한 유전자 세그먼트에서만 발생하고 12-bp 스페이서에 의해 플랭킹된 상기 유전자 세그먼트는 23-bp 스페이서, 즉, 12/23 법칙에 의해 플랭킹된 유전자 세그먼트에 결합될 수 있지만, DH 유전자 세그먼트 (각각 12-bp 스페이서에 의해 플랭킹됨) 중 둘을 결합시키는 것은 항체의 작은 부분에서 관찰되었다. 정상적으로 호환성 스페이서를 갖지 않는 유전자 세그먼트 (예를 들어, Vκ 및 DH 또는 DH 및 Jλ) 사이에서 재조합을 허용하기 위해서, 독특하고, 호환성인 스페이서를 성공적인 재조합이 경쇄 가변 영역을 함유하는 독특한 중쇄를 형성하게 하는 독특한 히브리드 중쇄의 구성에 바람직한 유전자 세그먼트가 있는 인접한 자리에서 합성하였다.
따라서, 사람 κ 경쇄 유전자 세그먼트의 내인성 중쇄 자리로의 통합을 위해 상기 약술된 전략을 사용하는 것은 사람 λ 경쇄 유전자 세그먼트, 뿐만 아니라 특정 사람 중쇄 유전자 세그먼트 (예를 들어, DH 및 JH)의 다른 조합 및 이들의 조합의 사용을 허용한다.
실시예
2.
표적화된
ES
세포의 확인 및 내인성
중쇄
자리에서 사람
경쇄
유전자 세그먼트를 함유하는 유전적으로 변형된 마우스의 발생
상기 언급된 실시예에서 만들어진 표적화된 BAC DNA를 VL 결합 단백질 (즉, 마우스 중쇄 불변 영역에 작동 가능하게 결합된 사람 κ 경쇄 유전자 세그먼트)을 발현하는 키메라 마우스를 발생시키기 위해 마우스 ES 세포를 생성된 변형된 ES 세포로 전기천공하는데 사용한다. 재배열되지 않은 사람 κ 경쇄 유전자 세그먼트의 삽입을 함유하는 표적화된 ES 세포를 정량적 PCR 검정, Taqman® (Lie, Y.S., and Petropoulos, C.J. (1998) Advances in quantitative PCR technology: 5' nuclease assays. Curr Opin Biotechnol 9(1): 43-48)에 의해 확인하였다. 특정 프라이머 세트 및 프로브를 사람 κ 서열 및 관련된 선택 카세트의 삽입, 마우스 중쇄 서열의 손실 및 내인성 중쇄 자리를 플랭킹하는 마우스 서열의 유지를 검출하도록 설계하였다.
사람 κ 경쇄 유전자 세그먼트를 함유하는 ES 세포를 사람 κ 유전자 세그먼트를 함유하는 표적화 구조의 삽입에 의해 도입된 바람직하지 않은 어떤 선택 카세트를 제거하기 위해서 리콤비나제를 발현하는 구조로 트랜스펙션할 수 있다. 선택적으로, 사람 κ 경쇄 유전자 세그먼트를 함유하는 조작된 중쇄 자리를 함유하는 마우스를, 예를 들어, ES 세포 단계에서 또는 배아에서 제거되지 않는 표적화 벡터에 의해 도입된 어떤 Frt'ed 카세트를 제거하기 위해서 FLPe 딜리터 마우스 종족와 교배시킬 수 있다 (예를 들어, Rodriguez, C.I. et al. (2000) High-efficiency deletor mice show that FLPe is an alternative to Cre-loxP. Nature Genetics 25: 139-140; US 6,774,279를 참고하면 됨). 선택적으로, 선택 카세트는 마우스에서 유지된다.
상기 설명된 표적화된 ES 세포를 기증자 ES 세포로서 사용하고 VELOCIMOUSE® 방법 (상기)에 의해 8-세포 단계 마우스 배아로 도입한다. 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 결합된 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트를 함유하는 변형된 중쇄 자리를 함유하는 마우스를 카세트 서열, 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트 및 내인성 중쇄 서열의 존재 및/또는 부재를 검출하는 대립 유전자 검정의 변형을 사용하는 유전자형 분석에 의해 확인한다 (Valenzuela et al., 상기).
새끼들을 유전자형 분석하였고 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 불변 유전자에 작동 가능하게 결합된 사람 κ 경쇄 유전자 세그먼트를 함유하는 변형된 중쇄 자리에 대하여 이형 접합체인 새끼를 면역글로불린 중쇄 레퍼토리를 특성화하기 위해 선택하였다.
실시예 3. V
L
결합 단백질을 발현하는 마우스의 증식
VL 결합 단백질의 새로운 세대를 생성하기 위해, 재배열되지 않은 사람 κ 유전자 세그먼트를 함유하는 마우스를 반대 또는 표적화되지 않은 내인성 중쇄 대립 유전자의 결실을 함유하는 또 다른 마우스 (즉, 변형에 대하여 이형 접합체인 마우스)와 교배시킬 수 있다. 이 방식으로, 얻어진 자손은 실시예 1에서 설명된 바와 같은 히브리드 중쇄만을 발현할 것이다. 교배를 업계에 인식된 표준 기술에 의해, 및 대안으로는 영리 회사, 예를 들어, The Jackson Laboratory에 의해 수행하였다. 변형된 중쇄 자리를 함유하는 마우스 종족을 사람 경쇄 가변 도메인을 함유하는 독특한 중쇄의 존재에 대하여 스크리닝하였다.
대안으로, 마우스 중쇄 자리에서 재배열되지 않은 사람 κ 유전자 세그먼트를 함유하는 마우스를 마우스 경쇄 자리 (κ 및 λ)에서 하나 이상의 결실을 함유하는 다른 마우스에 교배시킴으로써 최적화할 수 있다. 이 방식으로, 얻어진 자손은 실시예 1에서 설명된 바와 같이 독특한 사람 κ 중쇄 항체를 발현할 것이다. 교배를 업계에 인식된 표준 기술에 의해, 및, 대안으로는 영리 회사, 예를 들어, The Jackson Laboratory에 의해 유사하게 수행한다. 변형된 중쇄 자리 및 마우스 경쇄 자리의 하나 이상의 결실을 함유하는 마우스 종족을 스크리닝한다.
변형된 중쇄 자리를 함유하는 마우스 (상기 설명됨)를 또한 내인성 κ 경쇄 가변 유전자 자리의 사람 κ 경쇄 가변 유전자 자리로의 대체를 함유하는 마우스와 교배시켰다 (US 6,596,541, Regeneron Pharmaceuticals, The VELOCIMMUNE® Humanized Mouse Technology를 참고하면 됨). VELOCIMMUNE® Humanized Mouse는, 부분적으로, 마우스가 항원 자극에 반응하여 사람 κ 경쇄 가변 도메인 및 마우스 중쇄 불변 도메인을 포함하는 항체를 생산하는 내인성 κ 경쇄 가변 불변 영역 자리에 작동 가능하게 결합된 사람 κ 경쇄 가변 영역을 포함하는 게놈을 갖는 것을 포함한다. 항체의 경쇄의 가변 영역을 암호화하는 DNA를 분리하고 사람 경쇄 불변 영역을 암호화하는 DNA에 작동 가능하게 결합시킬 수 있다. DNA는 항체의 완전한 사람 경쇄를 발현할 수 있는 세포에서 발현될 수 있다. 적합한 교배 스케쥴 상에서, 내인성 κ 경쇄의 사람 κ 경쇄 자리 및 실시예 1에 따른 변형된 중쇄 자리로의 대체를 함유하는 마우스가 얻어진다. 체세포 돌연변이된 사람 Vκ 도메인을 함유하는 독특한 VL 결합 단백질을 원하는 항원으로 면역화시 분리시킬 수 있다.
실시예 4. ADAM 유전자의 변형된 중쇄 자리로의 재조작
내인성 가변 영역 유전자 세그먼트 (즉, VDJ)가 대체된 및/또는 결실된 변형된 면역글로불린 중쇄 자리를 갖는 마우스는 내인성 ADAM6 유전자의 발현이 결핍된다. 부분적으로, 면역글로불린 중쇄 자리의 이러한 변형을 포함하는 수컷 마우스는 생식능력의 감소를 입증한다. 이 실시예는 실시예 1에 따라 ADAM6을 발현할 수 있는 능력을 변형된 마우스 중쇄 자리를 갖는 마우스로 재조작하는 두 가지 방법을 입증하며, 따라서 정상 교배 방법을 사용하여 변형된 마우스 종족의 유지를 허용한다.
사람 경쇄 유전자 세그먼트 내에서 ADAM6 유전자의 재조작. 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트를 함유하는 변형된 면역글로불린 중쇄 자리를 BAC DNA를 사용하는 상동 재조합에 의해 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b를 암호화하는 게놈 단편을 함유하도록 조작하였다. 이것을 마우스 ADAM6 유전자 및 마우스 중쇄 불변 영역과 인접한 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트를 함유하는 최종 표적화 벡터를 수득하는 마우스 및 사람 서열을 함유하는 BAC DNA의 변형을 포함하는 연속 여섯 단계의 VELOCIGENE® 유전적 조작 기술 (상기)에 의해 달성하였다.
5'에서 3'으로, 독특한 제한 부위 부위 (I-CeuI), 마우스 Adam6a 및 Adam6b6b 유전자, IGCR1 조절 요소 (Guo et al., 2011), 면역글로불린 DH 및 JH 유전자 세그먼트, Eμ 인핸서, 및 IgM 불변 영역 유전자를 함유하는 마우스 BAC 클론 (I149)을 ADAM6 유전자를 VL 및 JL 유전자 세그먼트를 함유하는 변형된 중쇄 자리로 조작하기 위한 시작 물질로서 사용하였다 (도 7). VI149를, 가장 먼 D 세그먼트 (DFL16.1)의 5'의 약 53 bp에서 BAC의 3' 끝으로, DH 및 JH 유전자 세그먼트 및 IgM 유전자 모두를 삭제하도록 박테리아 상동성 재조합 (BHR)에 의해 변형시켰다. 이 영역을 BAC 클론 VI413을 수득하도록 5' 끝에서 독특한 AscI 부위를 함유한 스펙시토마이신-저항 카세트 (pSVi0029)로 대체하였다.
추가적인 BHR 변형을 만들어서 마우스 Adam6a 및 adam6b6b 유전자, 뿐만 아니라 IGCR1 요소를 함유하는 BAC 클론을 생성하였다. 제1 BAC 클론을 Adam6a 및 adam6b 사이의 47199 bp 영역을 독특한 I-CeuI (5') 및 AscI (3') 제한 부위 (pLMa0294)를 갖는 Frt'ed 네오마이신-저항 카세트로 대체함으로써 생성하였다. 이 결실은 Adam6b CDS의 3'에서 4779 bp에서 Adam6b CDS의 5'에서 290 bp까지의 영역에 걸쳐있다. 결과의 BAC 클론을 VI421로 명명하였다. 제2 BAC 클론을 VI422를 수득하기 위해 VI413의 Adam6a CDS의 3'의 위치 4782 bp에서 Adam6a 및 adam6b 사이에서 같은 Frt'ed 카세트를 삽입함으로써 생성하였다.
VI421 BAC 클론은, 5'에서 3'으로, 독특한 I-CeuI 부위, CDS의 751 bp 5' 및 4779 bp 3'을 포함하는 Adam6a, Frt'ed 네오마이신-저항 카세트, CDS의 290 bp 5' 및 7320 bp 3'을 포함하는 Adam6b, IGCR1, 및 독특한 AscI 부위를 함유하였다 (SEQ ID NO: 3).
VI422 BAC 클론은, 5'에서 3'으로, 독특한 I-CeuI 부위, CDS의 751 bp 5' 및 4779 bp 3'을 포함하는 Adam6a, Frt'ed 네오마이신-저항 카세트, CDS의 47490 bp 5' 및 7320 bp 3'을 포함하는 Adam6b, IGCR1, 및 독특한 AscI 부위를 함유하였다 (SEQ ID NO: 4).
ADAM6 유전자의 조작을 실시예 1에서 설명된 바와 같이 VI421 및 VI422의 표적화 벡터의 변형된 버젼의 유전자간 영역으로의 삽입에 의해 달성하였다. 표적화 벡터 1을 VI421 및 VI422의 마우스 ADAM6 단편을 삽입하기 위한 두 번의 BHR 단계에 의해 변형시켰다. 제1 BHR 단계에서, 표적화 벡터 1의 네오마이신 카세트를 히그로마이신 카세트 (pLMa0100)와 함께 삭제하였다. 결과의 BAC 클론을 VI425로 명명하였으며, 이것은 5'에서 3'으로 히그로마이신-저항 카세트, 네 개의 가장 근위의 사람 Vκ 세그먼트, 23,552 bp Vκ-Jκ 유전자간 영역, 및 모두 다섯 개의 사람 Jκ 세그먼트를 함유하며, 이것은 마우스 Eμ 인핸서 및 IgM 불변 영역 유전자를 함유하는 8 kb 3' 마우스 상동성 팔에 기능적으로 결합된다. 제2 BHR을 위해, VI425를 Vκ-Jκ 유전자간 영역 내의 740 bp를 독특한 I-CeuI 및 AscI 제한 부위에 의해 플랭킹된 클로람페니콜-저항 카세트 (pDBa0049; 도 8)로 대체하도록 변형시켰다. 740 bp 결실의 자리는 가장 근위의 사람 Vκ 유전자 세그먼트 (Vκ4-1)의 3'의 16,858에서 17,597 bp였다. 두 개의 BHR의 결과의 BAC 클론을 VI426으로 명명하였다 (도 8).
VI421 및 VI422의 마우스 ADAM6 유전자를 함유하는 DNA 단편을 VI426의 클로람페니콜 카세트를 호환성 끝의 I-CeuI/AscI 분해 및 강등(relegation)에 의해 대체하기 위해 독립적으로 사용하였다. 도 8은 최종 표적화 벡터를 나타내며, 각각 VI429 및 VI428로 명명하였다. 각각을 실시예 1에 따라 변형된 독특한 중쇄 자리와의 재조합 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 DNA 단편의 삽입을 허용하도록 표적화 벡터 4로 이전에 변형된 ES 세포로 전기천공하기 위해 사용하였다 (실시예 1에 설명된 바와 같음, 도 2 참조). 네오마이신에 양성인 콜로니를 선택하였다.
사람 경쇄 유전자 세그먼트를 플랭킹하는 ADAM6 유전자의 재조작.
내인성 중쇄 불변 영역 모두의 업스트림에 자리한 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트를 함유하는 변형된 면역글로불린 중쇄 자리를 BAC DNA를 사용하는 상동 재조합에 의해 마우스 ADAM6a 및 adam6b를 암호화하는 게놈 단편을 함유하도록 재조작하였다. 이것을 마우스 ADAM6 유전자 및 마우스 중쇄 불변 영역과 인접한 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트를 함유하는 최종 표적화 벡터를 수득하는 마우스 및 사람 서열을 함유하는 BAC DNA의 변형을 포함하는 연속의 단계의 VELOIGENE® 유전적 조작 기술 (상기)에 의해 달성하였다.
Frt'ed 히그로마이신 카세트를 독특한 AscI (5')및 I-CeuI (3') 제한 부위를 함유하는 클로람페니콜 카세트 (pLMa0231; 도 9)로 대체하기 위해 실시예1에 따라 만들어진 표적화 벡터 4 (도 2 및 도 9의 상단 참조)를 BHR에 의해 변형시켰다. 표적화 벡터 4는, 5'에서 3'으로, ~20 kb 마우스 원위 IgH 상동성 팔, Frt'ed 히그로마이신-저항 카세트, 및 사람 Vκ2-40 내지 사람 Vκ3-25 유전자 세그먼트를 함유하였다.
그 다음, VI444로 명명된 BAC 클론을 사용하여 호환성 끝의 AscI/I-CeuI 분해 및 강등에 의해 VI477 BAC 클론의 사람 Vκ 유전자 세그먼트의 5'의 위치에서 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 DNA 단편을 삽입하였다. VI444 클론은, 5'에서 3'으로, 독특한 I-CeuI 부위, CDS의 751 bp 5' 및 4779 bp 3'을 포함하는 Adam6a 유전자, Frt'ed 네오마이신-저항 카세트, CDS의 290 bp 5' 및 1633 bp 3'을 포함하는 Adam6b 유전자, 및 독특한 AscI 부위를 함유하였다 (SEQ ID NO: 5). 사람 Vκ 유전자 세그먼트의 업스트림에서 마우스 ADAM6 유전자의 삽입을 위한 표적화 벡터로서 사용된 결과의 BAC 클론을 VI478로 명명하였으며, VI478의 마우스 ADAM6에 배치된 이것은, VI421 및 VI422와 반대로, 역 방향이다 (즉, 사람 Vκ 유전자 세그먼트와 비교하여 같은 전사 방향; 도 9). 사람 Vκ 유전자 세그먼트의 원위 끝에서 마우스 ADAM6 유전자의 사빕을 위한 최종 표적화 벡터는, 5'에서 3'으로, ~20 kb 마우스 원위 IgH 상동성 팔, 독특한 AscI 부위, 마우스 Adam6b, Frt'ed 네오마이신-저항 카세트, 마우스 Adam6a, 독특한 I-CeuI 부위, 및 사람 Vκ2-40 내지 사람 Vκ3-25 유전자 세그먼트를 함유하였다. 이 표적화 벡터를 사용하여 실시예 1에 따라 변형된 독특한 중쇄 자리와의 재조합 및 마우스 ADAM6 유전자를 암호화하는 DNA 단편의 삽입을 허용하도록 이전에 표적화 벡터 4로 변형된 ES 세포 (도 2)로 전기천공하였다. 양성 콜로니를 네오마이신으로 선택하였다.
표적화된 ES 세포의 선택 및 확인. 각각의 최종 표적화 벡터 (상기 설명됨)를 사용하여 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트를 함유하는 변형된 중쇄 자리 내에서 마우스 ADAM6a 및 adam6b6b 서열을 포함하는, 이소성으로 배치된 마우스 게놈 서열을 포함하는 변형된 ES 세포를 생성하기 위해 마우스 ES 세포를 전기천공하였다. 변형된 중쇄 자리 내에서 이소성 마우스 게놈을 함유하는 양성 ES 세포를 TAQMAN™ 프로브를 사용하는 정량적 PCR 검정에 의해 확인하였다 (Lie and Petropoulos (1998), 상기).
상기 설명된 표적화된 ES 세포를 기증자 ES 세포로서 사용하였고 VELOCIMOUSE® 마우스 조작 방법에 의해 세포 단계 마우스 배아로 도입하였다 (예를 들어, 미국 특허 번호 제7,6598,442호; 제7,576,259호; 및 제7,294,754호 참고하면 됨). 마우스 ADAM6a 및 adam6b6b 서열을 포함하는 사람 κ 경쇄 유전자 세그먼트 및 이소성 마우스 게놈 서열을 함유하는 변형된 중쇄 자리를 함유하는 마우스를 변형된 중쇄 자리 내의 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 유전자, 뿐만 아니라 사람 κ 경쇄 서열 내의 존재를 검출하는, 대립 유전자 검정의 변형을 사용하는 유전자형 분석에 의해 확인하였다 (Valenzuela et al., 2003).
새끼를 유전자형 분석하였고 마우스 ADAM6a 및 ADAM6b 서열을 포함하는 이소성 마우스 게놈 단편을 함유하는 변형된 중쇄 자리에 대하여 이형 접합체인 새끼를 마우스 ADAM6 유전자 발현 및 생식능력의 특성화에 대하여 선택한다.
SEQUENCE LISTING
<110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
<120> Humanized Rodents That Express Heavy Chains Containing VL Domains
<130> 7350A-WO
<140> To be assigned
<141> Filed herewith
<150> 61/593,463
<151> 2012-02-01
<150> 61/677,538
<151> 2012-07-31
<160> 5
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 754
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 1
Met Leu Ser Leu Thr Trp Gly Met Arg Leu Val Glu Arg Pro Val Val
1 5 10 15
Pro Arg Val Leu Leu Leu Leu Phe Ala Leu Trp Leu Leu Leu Leu Val
20 25 30
Pro Val Trp Cys Ser Gln Gly His Pro Thr Trp Arg Tyr Ile Ser Ser
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Glu Val Val Ile Pro Arg Lys Glu Ile Tyr His Thr Lys Gly Leu Gln
50 55 60
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65 70 75 80
Ile Ile His Leu Arg Arg Lys Thr Leu Ile Trp Pro Arg His Leu Leu
85 90 95
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130 135 140
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145 150 155 160
Ser Phe Glu His Leu Val Ser Gln Ile Val Ser Glu Ser Asp Asp Thr
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210 215 220
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225 230 235 240
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245 250 255
Leu His Met Arg Tyr Tyr Val Phe Leu Met Thr Val Tyr Thr Glu Ala
260 265 270
Asp Pro Phe Ser Gln Asp Phe Arg Val Pro Gly Gly Gln Ala His Thr
275 280 285
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Ile Ile Asn Lys Asn Ser Pro Gly Asp Asp Ala Val Asn Pro Ala Glu
305 310 315 320
Arg Ser Ile Cys Ser Pro Ser Ala Leu Ile Cys Leu Gly Gln His Gly
325 330 335
Arg Asn Pro Leu Phe Leu Ser Ile Ile Ile Thr Asn Arg Val Gly Arg
340 345 350
Ser Leu Gly Leu Lys His Asp Glu Gly Tyr Cys Ile Cys Gln Arg Arg
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Asn Thr Cys Ile Met Phe Lys Asn Pro Gln Leu Thr Asp Ala Phe Ser
370 375 380
Asn Cys Ser Leu Ala Glu Ile Ser Asn Ile Leu Asn Thr Pro Asp Leu
385 390 395 400
Met Pro Cys Leu Phe Tyr Asp Arg His Val Tyr Tyr Asn Thr Ser Leu
405 410 415
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435 440 445
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450 455 460
Ala Asn Cys Thr Tyr Ser Pro Ser Gly Thr Leu Cys Arg Pro Ile Gln
465 470 475 480
Asn Ile Cys Asp Leu Pro Glu Tyr Cys Ser Gly Ser Lys Phe Ile Cys
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Pro Asp Asp Thr Tyr Leu Gln Asp Gly Thr Pro Cys Ser Glu Glu Gly
500 505 510
Tyr Cys Tyr Lys Gly Asn Cys Thr Asp Arg Asn Ile Gln Cys Met Glu
515 520 525
Ile Phe Gly Val Ser Ala Lys Asn Ala Asn Ile Lys Cys Tyr Asp Ile
530 535 540
Asn Lys Gln Arg Phe Arg Phe Gly His Cys Thr Arg Ala Glu Glu Ser
545 550 555 560
Leu Thr Phe Asn Ala Cys Ala Asp Gln Asp Lys Leu Cys Gly Arg Leu
565 570 575
Gln Cys Thr Asn Val Thr Asn Leu Pro Phe Leu Gln Glu His Val Ser
580 585 590
Phe His Gln Ser Val Ile Ser Gly Val Thr Cys Phe Gly Leu Asp Glu
595 600 605
His Arg Gly Thr Glu Thr Ala Asp Ala Gly Leu Val Arg His Gly Thr
610 615 620
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625 630 635 640
Leu Ser Arg Leu Gly Tyr Asp Cys Thr Pro Glu Lys Cys Asn Phe Arg
645 650 655
Gly Val Cys Asn Asn Arg Arg Asn Cys His Cys His Phe Gly Trp Ser
660 665 670
Pro Pro Lys Cys Lys Glu Glu Gly His Ser Gly Ser Ile Asp Ser Gly
675 680 685
Ser Pro Pro Val Gln Arg Arg Ile Ile Lys Gln Asn Leu Glu Pro Val
690 695 700
Val Tyr Leu Arg Ile Leu Phe Gly Arg Ile Tyr Phe Leu Phe Val Ala
705 710 715 720
Leu Leu Phe Gly Ile Ala Thr Arg Val Gly Val Thr Lys Ile Phe Arg
725 730 735
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Asp Lys
<210> 2
<211> 756
<212> PRT
<213> Mus musculus
<400> 2
Met Leu Ser Leu Thr Trp Gly Met Arg Leu Val Glu Arg Pro Val Val
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Pro Arg Val Leu Leu Leu Leu Phe Ala Leu Trp Leu Leu Leu Leu Val
20 25 30
Pro Val Trp Cys Ser Gln Gly His Pro Thr Trp Arg Tyr Ile Ser Ser
35 40 45
Glu Val Val Ile Pro Arg Lys Glu Ile Tyr His Thr Lys Gly Leu Gln
50 55 60
Ala Gln Arg Leu Leu Ser Tyr Ser Leu His Phe Arg Gly Gln Arg His
65 70 75 80
Ile Ile His Leu Arg Arg Lys Thr Leu Ile Trp Pro Arg His Leu Leu
85 90 95
Leu Thr Thr Gln Asp Asp Gln Gly Ala Leu Gln Met Asp Tyr Pro Phe
100 105 110
Phe Pro Val Asp Cys Tyr Tyr Ile Gly Tyr Leu Glu Gly Ile Pro Gln
115 120 125
Ser Met Val Thr Val Asp Thr Cys Tyr Gly Gly Leu Ser Gly Val Met
130 135 140
Lys Leu Asp Asp Leu Thr Tyr Glu Ile Lys Pro Leu Asn Asp Ser Gln
145 150 155 160
Ser Phe Glu His Leu Val Ser Gln Ile Val Ser Glu Ser Asp Asp Thr
165 170 175
Gly Pro Met Asn Ala Trp Lys His Trp Ser His Asn Thr Gly Ser Pro
180 185 190
Ser Ser Arg Leu Glu Tyr Ala Asp Gly Ala Pro Arg Ile Ser Ser Lys
195 200 205
Asn Tyr Ala Thr His Pro Ala Ala Ile Lys Gly His Phe Gln Ala Thr
210 215 220
Asn Ser Val Tyr Asn Ser Ala Ala Gly Asp Lys Leu Ser Ser Thr Val
225 230 235 240
Gly Tyr Leu Phe Gln Val Ile Ser Leu Met Asp Thr Tyr Leu Thr Asn
245 250 255
Leu His Met Arg Tyr Tyr Val Phe Leu Met Thr Val Tyr Thr Asn Ser
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Asp Pro Phe Arg Leu Glu Phe Ala Val Pro Gly Gly Ser Ala Tyr Asn
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Tyr Tyr Val Ser Val Phe Tyr Asn Lys Phe Lys Pro Asp Ala Gly Val
290 295 300
Leu Leu Asn Lys Tyr Gly Pro Gln Asp Asn Gln Val Asn Pro Ala Glu
305 310 315 320
Arg Ser Ile Cys Ser Ser Leu Ala Leu Ile Cys Ile Gly Lys Tyr Asp
325 330 335
Arg Asn Pro Leu Phe Leu Ser Pro Ile Ile Thr Asn Arg Val Gly Arg
340 345 350
Ser Leu Gly Leu Lys Tyr Asp Glu Gly Tyr Cys Val Cys Gln Arg Arg
355 360 365
Asn Thr Cys Ile Met Phe Arg His Pro Gln Leu Thr Asp Ala Phe Ser
370 375 380
Asn Cys Ser Leu Ala Glu Ile Ser Asn Ile Leu Asn Thr Pro Gly Leu
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Met Pro Cys Leu Phe Tyr Asp Arg His Val Tyr Tyr Asn Thr Ser Leu
405 410 415
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420 425 430
Asp Cys Gly Ser Gln Lys Ala Cys Tyr Ser Asp Pro Cys Cys Gly Asn
435 440 445
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450 455 460
Ala Asn Cys Thr Tyr Ser Pro Ser Gly Thr Leu Cys Arg Pro Ile Gln
465 470 475 480
Asn Ile Cys Asp Leu Pro Glu Tyr Cys Asn Gly Thr Lys Tyr Ile Cys
485 490 495
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Leu Thr Phe Asn Ala Cys Ala Asp Gln Asp Lys Leu Cys Gly Arg Leu
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Pro Pro Glu Cys Lys Glu Glu Gly Leu Ser Gly Ser Ile Asp Ser Gly
675 680 685
Ser Pro Pro Val Gln Arg His Thr Ile Lys Gln Lys Gln Glu Pro Val
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Leu Leu Phe Gly Ile Ala Thr Arg Val Gly Val Thr Lys Ile Phe Arg
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Phe Glu Asp Leu Gln Ala Thr Leu Arg Ser Gly Gln Gly Pro Ala Arg
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Asp Lys Pro Lys
755
<210> 3
<211> 20468
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 3
taactataac ggtcctaagg tagcgaggga tgacagattc tctgttcagt gcactcaggg 60
tctgcctcca cgagaatcac catgtccttt ctcaagactg tgttctgtgc agtgccctgt 120
cagtggaaat ctggagagca tgcttccatg agcttgtgag tagtatatct agtaagccat 180
ggctttgtgt taatggtgat gttctacata tcagttctct ggcttaataa tgaggtgatg 240
attctatgtt cctgtaacgc ttcctcaact gggtcctaag tctttcttca ctccatctat 300
tcctctaagg aatgatcctg aaaatcccat cacaaactat aggagatggg aaccatcaaa 360
aaacacagtg acaaagaggt gggaacgcat cagggttcag gaaccatatt ttaaaaagat 420
atcgtaaata acttcttaaa agagatatag acaaatctcc attaatacgg agaccagagg 480
cctaaggcta agaaccaatg gtggctcaag gtctcctgct acccgaggag caaacgtaga 540
gcagtttcta atgatttatt taaaatatag aatcaaaagt accagtttgc aattttgaaa 600
gatttatttc agcaatgcaa caacatcagg tggtgccgag tccaacacgt cttatgtccc 660
atgatataaa caaaggccat ccagaactgt ggactggagt tctaccttgt cccctaatga 720
cattcagatt ttttttccat tctctttatc ttagaggaga cagggggcta actcatttta 780
cttgtccttt gcttgttctt gccaagaacg taaagcagct tgcaagtctt caaacctaaa 840
tatcttagta actcctacac gagtggcaat gccaaagagc agtgcaacaa agaggaagta 900
aatacgacca aagagtattc ttaaatacac tactggctct aggttctgtt ttattatgcg 960
cctttgaacc ggaggggacc cactgtctat gctcccactg tgtccctctt ctttgcactt 1020
tggagggctc caaccaaaat ggcaatggca attccgacga ttgttacaca ctcctctgaa 1080
attgcatttt tctggggtgc agtcataacc caaacgagat aaacttccat tgcaagctcc 1140
tcgatcacag aacttacccc ttgaacacgg ggtaccatgt ctcaccaatc cagcatctgc 1200
tgtttctgtc ccacgatgtt catcaagccc aaagcaggta accccagaga taaccgattg 1260
atggaatgaa acatgttctt gcaaaaatgg aagattggtg acattggtac actgcaacct 1320
tccacacagc ttgtcctgat cagcacaagc attgaatgtg aggctttctt ctgctctagt 1380
acaatgccca aatcgaaacc gttgtttgtt gatgtcatag cacttaatat tagcattctt 1440
agcacttaca ccaaagattt ccatgcattg tatgttgcga tcagtgcagt tacctttata 1500
gcagtaaccc tcttctgagc atggtgtccc atcttgcaga taagtgtcat ctgggcaaat 1560
gaacttagag ccactacagt actctggaag atcacatatg ttctggatag gtctgcagag 1620
tgtcccagaa ggactgtaag tgcaatttgc acagcataat tctttatcac aaatgctacc 1680
aggtgttaac ctgcaatcat ttccacagca gggatctgaa taacatgcct tttgggagcc 1740
acagtcacac tgctcattgt tatctacttt gaagtttcca caaaacttat aagtcaatga 1800
tgtattataa taaacatgac ggtcatagaa aagacatggc atcagatcag gagtattaag 1860
tatgttgctt atctctgcaa gggaacaatt gctgaaagca tctgttaatt gaggattttt 1920
gaacatgatg caggtgttcc ttctctggca gatacagtac ccctcatcat gttttaggcc 1980
taaactcctt ccaacacgat tggttattat aatagataaa aataaaggat ttcgaccatg 2040
ttgaccaaga caaattaggg ctgagggaga acatatactc ctctcagctg gattaacagc 2100
atcatctcct ggcgaattct tgttaattat agctcctgca tcaggcctaa aatgagcata 2160
aaatactctc tcatagaaag tatgagcctg ccctcctgga actcgaaaat cttgtgaaaa 2220
tggatcagcc tcggtataca cagtcatgag aaagacatag taccgcatat gaagattggt 2280
cagataggtg tccattaaac taatgacttt aaacaaatac tcaacagtag atgaaagttt 2340
gtcacctcca gaagcactat atacagaatg ggttgcttga aagtggcctt ttatagcagc 2400
tggatgtgta gcgtaattct tactagatag tctgggagct ccatctgcat attccaatct 2460
ggaggaggga gaacctgtat tatggctcca gtgcttccat gcattcatag gccctgtgtc 2520
atcagactca gatactatct gagaaacaag gtgttcaaag ctctgtgaat cattgagggg 2580
tttgatttca taggtaaggt tatccaactt tatgacccct gacaggcccc cataacaagt 2640
atccacagtg accatggatt gcaggatccc ctccaggtag ccaatatagt aacaatctac 2700
aggaaaaaag gggtactcca tctgtaaggc tccttggtca tcttgagttg tcagcaacaa 2760
gtgtctgggc caaatgagtg tctttctccg caggtggatg atatgtctct ggccccgaaa 2820
acgcaagcta tacgagagca gtctttgtgc ttgaagtcct ttggtatggt agatctcctt 2880
ccgaggaata accacctccg atgagatgta acgccaagtg ggatggcctt gagaacacca 2940
gactggaacc aggaggagca gccagagtgc aaatagcaag aggaggaccc tggggaccac 3000
aggtctttcc actagcctca tgccccaggt cagagataac atcctgggtg gagctaactc 3060
cctctgctgt ggccactgcc tggtctagaa aatactgaca gaggactaaa aacctcctca 3120
ggctcccaac ctaagtggtt acccagacaa ctggagttag gtaacagtca ctgggtgtgg 3180
caggaattga gtctgaatgt gttagctgag gttgaggtta aatattgtca aaagggatgt 3240
ctataaatgt gcctggacaa gaaaagtcag aagcagcaag gagtgtctct gacaggctca 3300
atcctttctt ttcttttttt gaagttcaaa atatcatttc cacgtgaatg tatttggttc 3360
ccagtgtgac tctgggtctc tttctaggag tcaatatttc tttatatctt ggctcatgtt 3420
tttcacagtt gttctaactt cttgttttgt tttgtttgtt tgtttgtttg aaagttagaa 3480
gtaaatactg tctatattag ccttttagct ataaatgatt gtttttattt cttctaatca 3540
tgttttgttt gagttttggt taaactattt acaaatgagt tttttttttc cttttgggtg 3600
ttgctcgaaa gtttggagct ttctgttaat attgtgttgt tgtttctcca atattattag 3660
acctgagaat tctacctggg tacctgtgaa ctccagaatt tttaaaaatt ccatctcttg 3720
ggaacattat ctctgacccc gtctgaggcc gaagtggctg tccccctcca acctttagta 3780
tctttctttc ctgactattg ggatttcttc aagcaatcag gctgatgggt tctcagcagt 3840
gagaccagta gactgtcggt atgaacgtcg aagagtctgc cacacactcc gggttcatca 3900
acagtgcttt cgcgtctctt acttttgtag aaggaaatgc agcctctgag ttttctccaa 3960
gaaatcattg atgaaagggt gaaaagatgg gtatcacccg gagttcatga caagccctgg 4020
ctcagacacg tgagcaaggt ctacagcccc aaagataggc tgccctgcaa catgtattta 4080
taagatagga gaaaaaaatg ggtagttgga gggttgatca acttacttcc tctcaaacat 4140
atatatctca tctaagtgtg caggggaaaa ctctgtagaa ctactgggat acctgctcac 4200
ccccaggagc ctcatgaata agtctctgct tctgccttgt agccatgagc attactgcac 4260
ctgatacccc tgcagcttcc tagggaagag ggaggaagtg acttggcccc tgtctggtta 4320
aggtaagagg agataaatcc cttctcattg attagggtga gaggggtcat gtgctctatc 4380
attggtgacc cagttgggac atgggtttat accaaagtca tcactctgag gttctgtgta 4440
ccaccaggct gaactcccat atcctacatg gacataggac aacaccaagc agaaggaggt 4500
tttaggacta aactgaagga cagagatgcg gtttctaaac aactagggag tgccagggcc 4560
agcctctcta accactatag gacactgtgg agtctggtta caaagagaga ttactcaagg 4620
tccttagcac tgattacaga gcatatctca gatgccttct gctgaccaga tgtatctttg 4680
cataatctgc ctatccagat tcagaaaatt gatgccacat agccaagtgg actttcagga 4740
acagacgatt taaaaacagg cagagagatg tgagagaaag gagaaggaga gagagaaggg 4800
agagggagag aagagagagg gagacggaga aggaaagagg gagaaggaga aggagagaag 4860
gggcatggac agagggaggg acagaaggag agaggagata gagaggggga taaggaagaa 4920
gggagggagg gagagagaga gaaggctaag tctttccata cctgggtccc aatacctctt 4980
ataacccaag cacatggttt cacatatcac aatgcggttg ggatatagat aactgtaaat 5040
acttgtgaaa ataatggggc tgagatctgg ggttttcatg atagtttcaa agtcaccgta 5100
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cactaagtgt gtttagaaag atctccacct ttttgccctt gtcttccagt gccccaccta 5220
cgttctggtc tcccacatct gatgtcttct cagtgattct ggccctgcct gctccacagc 5280
tacaaacccc ttcctataat gagctctgtg ctgagccatc atcctgaatc aatccacctt 5340
aagcagatgt tttgcttatt tttcctgtgt ccatactaca gaggaaaggt aggcatgtag 5400
aagctgaagc atctcacctc attccaagca ccctcagtct ctaaatgtgc ccccttgttt 5460
ccagaagtgc aacctcaagc atcttttatt cattcatctt agagggccac atgtgctgta 5520
gtgttataag atgaaattta aagcattaat tattcctaac aagccaatta aacaagccaa 5580
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tttccagggc tgctctggga tcacaggagc tgtcctgtct accagccata taaaggcaga 5700
cctatcagaa ttacaccaga cttctcacca tagactataa aagccagaat atcctggaca 5760
gatgttatac agaaactaag agaacacaaa tgccagccca ggctactata cccagcaaaa 5820
ctctcaatta ccatcgatga agaaaccaag atattccatt acaagtccaa atttacacaa 5880
tatctttcca taaatccagc cctacaaagg atagcagatg gaaaactcca acacaggtag 5940
gaaaactaca ccctagaaag agcactaaag taatcatctt tcaacacact caaaagaaga 6000
taaccacaca aacataattc cacctctaac aacaaaaata aagtaggcaa caatcactat 6060
tccttaatat ctcttttaac atcaatggac tcaattctcc aataaaaaga catagactaa 6120
cagactgaat acataaacag gacacagcat tttgctgcat aaagcaaaca cagcgttact 6180
tttttttttc taaatgacat tttttattag atattgtctt tattgacatt tcaaatgtta 6240
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atccacccac tcccacttcc aggccctggc aatcccctat atttgggcat agagccttca 6360
caggaccaag gtactctcct tgcattgatg accaactagt ccattctctg ctacaaatgc 6420
agctagatct atgagtccca ccatgttttc ttttgttggt ggtttcatgc cagggagctc 6480
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gtgagcatcc acttctgtat ttgccaggca ctggcagagc ctctcagaag acagctatat 6660
caagatcctg gcagcaagct cttgttggta tccacaaaag tgtctggtgg ttgtctatgg 6720
gatggatccc caaaggggca gtctctggat ggtcattcct tcagtctctg ttccacactt 6780
tgtctcttta actccttcca tgactatttt attcctccct ctaagaagga ccgaagtatt 6840
catactttgg tcttccttct tgaaattcat gtgttttgtg aattgtatct ttgatattcc 6900
gaacttctgg gctaatatcc acttatcagt gagtgaatat catgtgtgtt cttatgtgat 6960
tgagttacct cactcaggat gatatcctcc agaaccatcc atttgtctaa gaatttaatg 7020
aattcattgt ttttaatagc tgaggagtac tccattgtgt aaatgtacca cattttctgt 7080
acccattgtt ctcttgaggg acatctgggt tctttaaagc ttctggacat taaatataag 7140
gctgctatgg aaatagtgga gaatgtgtcc ttattacatg ttggagcatc ttctgggtat 7200
atgcccagga gtgctattgc tggatcctct gatagtacta tgtccaattt tctgaggaac 7260
tgccaaactg atttacagag tggttgtacc agcttgcaat tccaccagca atggagaaat 7320
gttccccttc ctccacatcc tcaccaacat ctgctgtcac ctcaatttgt tcttagtgat 7380
tcagacaggt gtgaggtgga atatcagggt tgtttggcat ttccctgatg actagtgata 7440
ttgaaaaaaa ttttaagtgt ttctcagcca ttcagtattc ttcagttgag aattcactgt 7500
ttagctctgt actcaggttt ttttaatagg gttatttggt tttctggagt ctaacgtctt 7560
gaattctttc tatatattgg atattagccc tctgtcatat ttaggattgg taaagatctt 7620
tcccaatatg ttggctgcct ttttgtgtcc tttgccttac agaacctttt taattttatg 7680
aggtcccatt tgctaattct tcattttaca gcacaagcca ttggtgttct gttcaaaaat 7740
ctttccccct gaaccctatc ttcgaggatc ttccccactt tctcctctat aagtttcagt 7800
gtctctatta ttgtgctgag ggcgatcgca ccggtgaaac cctaggaagt tcctatactt 7860
tctagagaat aggaacttcg gaataggaac ttctctaggg gctgcaggtc gaggtctgat 7920
ggaattagaa cttggcaaaa caatactgag aatgaagtgt atgtggaaca gaggctgctg 7980
atctcgttct tcaggctatg aaactgacac atttggaaac cacagtactt agaaccacaa 8040
agtgggaatc aagagaaaaa caatgatccc acgagagatc tatagatcta tagatcatga 8100
gtgggaggaa tgagctggcc cttaatttgg ttttgcttgt ttaaattatg atatccaact 8160
atgaaacatt atcataaagc aatagtaaag agccttcagt aaagagcagg catttatcta 8220
atcccacccc acccccaccc ccgtagctcc aatccttcca ttcaaaatgt aggtactctg 8280
ttctcaccct tcttaacaaa gtatgacagg aaaaacttcc attttagtgg acatctttat 8340
tgtttaatag atcatcaatt tctgcagact tacagcggat cttcagaaga actcgtcaag 8400
aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa gcacgaggaa 8460
gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca cgggtagcca acgctatgtc 8520
ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa agcggccatt 8580
ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat cctcgccgtc 8640
gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct gatgctcttc 8700
gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc gctcgatgcg 8760
atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca agcgtatgca gccgccgcat 8820
tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca ggagatcctg 8880
ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa cgtcgagcac 8940
agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct cgtcctgcag 9000
ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc cctgcgctga 9060
cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt catagccgaa 9120
tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt caatcatggt 9180
ggatggttta gttcctcacc ttgtcgtatt atactatgcc gatatactat gccgatgatt 9240
aattgtcaac aattcgagag acccgggttc ccaatctaga gctcgacgtc taacaaaaaa 9300
gccaaaaacg gccagaattt agcggacaat ttactagtct aacactgaaa attacatatt 9360
gacccaaatg attacatttc aaaaggtgcc taaaaaactt cacaaaacac actcgccaac 9420
cccgagcgca tagttcaaaa ccggagcttc agctacttaa gaagataggt acataaaacc 9480
gaccaaagaa actgacgcct cacttatccc tcccctcacc agaggtccgg cgcctgtcga 9540
ttcaggagag cctaccctag gcccgaaccc tgcgtcctgc gacggagaaa agcctaccgc 9600
acacctaccg gcaggtggcc ccaccctgca ttataagcca acagaacggg tgacgtcacg 9660
acacgacgag ggcgcgcgct cccaaaggta cgggtgcact gcccaacggc accgccataa 9720
ctgccgcccc cgcaacagac gacaaaccga gttctccagt cagtgacaaa cttcacgtca 9780
gggtccccag atggtgcccc agcccatctc acccgaataa gagctttccc gcattagcga 9840
aggcctcaag accttgggtt cttgccgccc accatgcccc ccaccttgtt tcaacgacct 9900
cacagcccgc ctcacaagcg tcttccattc aagactcggg aacagccgcc attttgctgc 9960
gctcccccca acccccagtt cagggcaacc ttgctcgcgg acccagacta cagcccttgg 10020
cggtctctcc acacgcttcc gtcccaccga gcggcccggc ggccacgaaa gccccggcca 10080
gcccagcagc ccgctactca ccaagtgacg atcacagcga tccacaaaca agaaccgcga 10140
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tcggcgttca ccgccccacg gagatccctc cgcagaatcg ccgagaaggg actacttttc 10260
ctcgcctgtt ccgctctctg gaaagaaaac cagtgcccta gagtcaccca agtcccgtcc 10320
taaaatgtcc ttctgctgat actggggttc taaggccgag tcttatgagc agcgggccgc 10380
tgtcctgagc gtccgggcgg aaggatcagg acgctcgctg cgcccttcgt ctgacgtggc 10440
agcgctcgcc gtgaggaggg gggcgcccgc gggaggcgcc aaaacccggc gcggaggcct 10500
cggaggccag acgcgcgaga agttcctata ctttctagag aataggaact tcggaatagg 10560
aacttcggta ccgcgatcgc gatgtgggaa cgcttcagtg ttcaggaacc atatgattta 10620
tttaaaatat agaatcaaaa gtaccaattt gcagttttga aagatttatt ccagtgtaag 10680
cattagcaat gcaccaacat caggtgattt ctgaatccaa cacgtcttat gtcctcatga 10740
tattaaaaaa aaaaaaaggc catccagaac tgtgaacttg agttctacct tgttccctac 10800
tgacattcag attttctttt ttgcattctc tttatcttac aggagacagg aggggagggc 10860
taactcattt tactttggct tgtcccttgc tggtccttgc ccagaacgta aagtagcttg 10920
caagtcttca aatctaaaaa tcttagtaac tcctacacga gtggcaatgc caaagagcag 10980
tgcaacaaag aggaagtaaa tacgaccaaa gagtattctt aaatacacca ctggctcttg 11040
tttttgtttt attgtgtgcc tttgaactgg aggggaccca ctgtctatgc tcccacttag 11100
tccctcttct ttgcactctg gaggcttcca accaaaatga caatggcaat tccgatgatt 11160
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caccattcca gcatctgttg tttctgtccc acgatgttca tcaagcccaa agcaggtaaa 11340
cccagagata atcgattgat ggaatgaaac atgttcttgc aaatatggaa gattggtgac 11400
attggtacac tgcaaccttc cacacagctt gtcctgatca gcacaagcat tgaatgtgag 11460
gctttcttct gctctagtac aatgcccaaa tcgaaaccgt tgtttgttga tgtcatagca 11520
cttaatatta gcattcttag cacttacacc aaagatttcc atgcattgta tgttgcgatc 11580
agtgcagtta cctttatagc agtaaccatc ttctgagcat ggtgtcccat cttgcagata 11640
agtgtcatct gggcaaatgt atttagtccc attacagtac tctggaagat cacatatgtt 11700
ctggataggt ctgcagagtg tcccagaagg actgtaagtg caatttgcac agcataattc 11760
tttatcacaa atgctaccag gtgttaacct gcaatcattt ccacagcagg gatctgaata 11820
acatgccttt tgggagccac agtcacactg ctcatcgtta tctactttga agtttccaca 11880
aaacttataa gtcaatgatg tattataata aacatgacgg tcatagaaaa gacatggcat 11940
cagaccagga gtattaagta tgttgcttat ctctgcaagg gaacaattgc tgaaagcatc 12000
tgttaattga ggatgtctga acataatgca ggtgttcctt ctctggcaga cacagtaccc 12060
ctcatcatat tttaagccta aactccttcc aacacgattg gttattatag gagataaaaa 12120
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ctcagctgga ttaacctggt tatcttgtgg cccatactta ttaagtaaaa ctcctgcatc 12240
aggcttaaat ttattataaa agactgacac atagtaatta taagccgacc ctcctggaac 12300
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aacagtagat gaaagtttgt cacctgcagc agaattatat acagaattgg ttgcttgaaa 12480
gtggcctttt atagcagctg gatgtgtagc gtagttctta ctagatattc tgggagctcc 12540
atctgcatat tccaatctgg aggagggaga acctgtatta tggctccagt gcttccatgc 12600
attcataggc cctgtgtcat cagactcaga tactatctga gaaacaaggt gttcaaagct 12660
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caggccccca taacaagtat ccacagtgac catggattgt gggatcccct ccaggtagcc 12780
aatatagtaa caatctacag gaaaaaaggg gtaatccatc tgtaaggctc cttggtcatc 12840
ttgagttgtc agcaacaagt gtctgggcca aatgagtgtc tttctccgca ggtggatgat 12900
atgtctctgg ccccgaaaat gcaagctata tgagagcagt ctttgtgctt gaagtccttt 12960
ggtatggtag atctccttcc gaggaataac cacctccgat gagatgtaac gccaagtagg 13020
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tattgtcaaa agggatgtct ataaatgtgc ctggacaaga aaagtcagaa gcagcaagga 13380
gtgtctctga caggctcaat cctttctttt ctttttttga agttcaaaat atcatttcca 13440
cgtgaatgta tttggttccc agtgtgactc tgggtctctt tctaggagtc aatatttctt 13500
tatatcttgg ctcatgtttc tcacagttgt tctaatttct tgttttgttt tgtttgtttg 13560
tttgaacgtt agtagtaaat actgtctata ttagcctttt agctataaat gattgttttt 13620
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tttttccttt tgggtgttgc tcgaaagttt ggagctttct gttaatattg tgttgttatt 13740
tttccaatat tattagacct gagaattcta tctgggtacc tgtgaactct agaattttta 13800
aaaattccat ctcttgggaa cattacctct gaccccgtct gaggccgaag tggctgtccc 13860
cctccaacct ttagtatctt tctttcctga ctattgggat ttcttcaagc aatcaggctg 13920
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tgggattgtt attatcatta ttattattat tattattatt attattatta ttattattat 14340
taacttaagg cattttatta gatattttct tcatttagtt ttcaaatgtt atccccggaa 14400
cctcctatac tctctccctg ccctgctccc caacccaccc actcctacat cctggccctg 14460
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tgcttagttc atattgtttt tcctcctata gggttgcaga tccctttagc tccttgggta 14640
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cagatgtatc tttgcataat ctgcctatcc agattcagaa aattgatgcc acatagccaa 15300
gtggactttc aggaacagac gatttaaaaa caggcagaga gatgtgagag aaaggagaag 15360
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gagaaggaga gaaggggcat ggacagaggg agggacagaa ggagagagga gatagagagg 15480
gggataagga agaaaggagg gagggagaga gagagaaggc taagtctttc catacctggg 15540
tcccaatacc tcttataacc caagcacatg gtttcagata tcacaatgcg gttgggatat 15600
agataactgt aaatacttgt gaaaataatg gggctgagat ctggggtttt catgatagtt 15660
tcaaagtcac tgtactgact aaaaccttcc actggcccat ctccagcttg ttaatctgag 15720
ggtatcaaat ttcccactaa gtgtgtttag aaagatctcc acctttttgc cctagtcttc 15780
cagtgcccca cctacgttct ggtctcccac atctgatgtc ttctcagtga ttctggccct 15840
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aatcaatcca ccttaagcag atgttttgct tatttttcct gtgtccatac tacagaggaa 15960
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gtgccccttt gtttccagca gttcagcctc aagcatcttt tattcactcg tcttagaggg 16080
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cttcgtttat taggctgagg tgcctggtgt aaagcatgca tcgcggggaa taggaagggg 16440
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caggctccag gcagcggaca ctctgcatct tatctctgga acatagatcc tccttgacag 16560
ccttggggtg tcaggccagg ctcaggtgta actcatgtcc ttggatggca tgggagttca 16620
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ccctccagca ttaatttcta ttagtagata ttttctttac ttacatttca aatgttatcc 17520
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ctttgaaaag ggggaagatg atgaaatcat tactgtgggg gaaatgcaag gaagattcca 17760
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ctttctgtta aggagatgag aagagaatat ctgaaccttg tgttgacagt gccccacccc 19860
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atgcctggct tgggacactg tctgccctgg atcctctcac tccacatgta aggagctcac 20160
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cccccagaga cagaccattc cagtagttct tatcattcct cccaaagcag ccaccatcca 20280
ggcactgaga gaccaaaggc tgttgggagg tcagcctaga ggcaggctca gacctttctt 20340
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ggcgcgcc 20468
<210> 4
<211> 67667
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> synthetic
<400> 4
taactataac ggtcctaagg tagcgaggga tgacagattc tctgttcagt gcactcaggg 60
tctgcctcca cgagaatcac catgtccttt ctcaagactg tgttctgtgc agtgccctgt 120
cagtggaaat ctggagagca tgcttccatg agcttgtgag tagtatatct agtaagccat 180
ggctttgtgt taatggtgat gttctacata tcagttctct ggcttaataa tgaggtgatg 240
attctatgtt cctgtaacgc ttcctcaact gggtcctaag tctttcttca ctccatctat 300
tcctctaagg aatgatcctg aaaatcccat cacaaactat aggagatggg aaccatcaaa 360
aaacacagtg acaaagaggt gggaacgcat cagggttcag gaaccatatt ttaaaaagat 420
atcgtaaata acttcttaaa agagatatag acaaatctcc attaatacgg agaccagagg 480
cctaaggcta agaaccaatg gtggctcaag gtctcctgct acccgaggag caaacgtaga 540
gcagtttcta atgatttatt taaaatatag aatcaaaagt accagtttgc aattttgaaa 600
gatttatttc agcaatgcaa caacatcagg tggtgccgag tccaacacgt cttatgtccc 660
atgatataaa caaaggccat ccagaactgt ggactggagt tctaccttgt cccctaatga 720
cattcagatt ttttttccat tctctttatc ttagaggaga cagggggcta actcatttta 780
cttgtccttt gcttgttctt gccaagaacg taaagcagct tgcaagtctt caaacctaaa 840
tatcttagta actcctacac gagtggcaat gccaaagagc agtgcaacaa agaggaagta 900
aatacgacca aagagtattc ttaaatacac tactggctct aggttctgtt ttattatgcg 960
cctttgaacc ggaggggacc cactgtctat gctcccactg tgtccctctt ctttgcactt 1020
tggagggctc caaccaaaat ggcaatggca attccgacga ttgttacaca ctcctctgaa 1080
attgcatttt tctggggtgc agtcataacc caaacgagat aaacttccat tgcaagctcc 1140
tcgatcacag aacttacccc ttgaacacgg ggtaccatgt ctcaccaatc cagcatctgc 1200
tgtttctgtc ccacgatgtt catcaagccc aaagcaggta accccagaga taaccgattg 1260
atggaatgaa acatgttctt gcaaaaatgg aagattggtg acattggtac actgcaacct 1320
tccacacagc ttgtcctgat cagcacaagc attgaatgtg aggctttctt ctgctctagt 1380
acaatgccca aatcgaaacc gttgtttgtt gatgtcatag cacttaatat tagcattctt 1440
agcacttaca ccaaagattt ccatgcattg tatgttgcga tcagtgcagt tacctttata 1500
gcagtaaccc tcttctgagc atggtgtccc atcttgcaga taagtgtcat ctgggcaaat 1560
gaacttagag ccactacagt actctggaag atcacatatg ttctggatag gtctgcagag 1620
tgtcccagaa ggactgtaag tgcaatttgc acagcataat tctttatcac aaatgctacc 1680
aggtgttaac ctgcaatcat ttccacagca gggatctgaa taacatgcct tttgggagcc 1740
acagtcacac tgctcattgt tatctacttt gaagtttcca caaaacttat aagtcaatga 1800
tgtattataa taaacatgac ggtcatagaa aagacatggc atcagatcag gagtattaag 1860
tatgttgctt atctctgcaa gggaacaatt gctgaaagca tctgttaatt gaggattttt 1920
gaacatgatg caggtgttcc ttctctggca gatacagtac ccctcatcat gttttaggcc 1980
taaactcctt ccaacacgat tggttattat aatagataaa aataaaggat ttcgaccatg 2040
ttgaccaaga caaattaggg ctgagggaga acatatactc ctctcagctg gattaacagc 2100
atcatctcct ggcgaattct tgttaattat agctcctgca tcaggcctaa aatgagcata 2160
aaatactctc tcatagaaag tatgagcctg ccctcctgga actcgaaaat cttgtgaaaa 2220
tggatcagcc tcggtataca cagtcatgag aaagacatag taccgcatat gaagattggt 2280
cagataggtg tccattaaac taatgacttt aaacaaatac tcaacagtag atgaaagttt 2340
gtcacctcca gaagcactat atacagaatg ggttgcttga aagtggcctt ttatagcagc 2400
tggatgtgta gcgtaattct tactagatag tctgggagct ccatctgcat attccaatct 2460
ggaggaggga gaacctgtat tatggctcca gtgcttccat gcattcatag gccctgtgtc 2520
atcagactca gatactatct gagaaacaag gtgttcaaag ctctgtgaat cattgagggg 2580
tttgatttca taggtaaggt tatccaactt tatgacccct gacaggcccc cataacaagt 2640
atccacagtg accatggatt gcaggatccc ctccaggtag ccaatatagt aacaatctac 2700
aggaaaaaag gggtactcca tctgtaaggc tccttggtca tcttgagttg tcagcaacaa 2760
gtgtctgggc caaatgagtg tctttctccg caggtggatg atatgtctct ggccccgaaa 2820
acgcaagcta tacgagagca gtctttgtgc ttgaagtcct ttggtatggt agatctcctt 2880
ccgaggaata accacctccg atgagatgta acgccaagtg ggatggcctt gagaacacca 2940
gactggaacc aggaggagca gccagagtgc aaatagcaag aggaggaccc tggggaccac 3000
aggtctttcc actagcctca tgccccaggt cagagataac atcctgggtg gagctaactc 3060
cctctgctgt ggccactgcc tggtctagaa aatactgaca gaggactaaa aacctcctca 3120
ggctcccaac ctaagtggtt acccagacaa ctggagttag gtaacagtca ctgggtgtgg 3180
caggaattga gtctgaatgt gttagctgag gttgaggtta aatattgtca aaagggatgt 3240
ctataaatgt gcctggacaa gaaaagtcag aagcagcaag gagtgtctct gacaggctca 3300
atcctttctt ttcttttttt gaagttcaaa atatcatttc cacgtgaatg tatttggttc 3360
ccagtgtgac tctgggtctc tttctaggag tcaatatttc tttatatctt ggctcatgtt 3420
tttcacagtt gttctaactt cttgttttgt tttgtttgtt tgtttgtttg aaagttagaa 3480
gtaaatactg tctatattag ccttttagct ataaatgatt gtttttattt cttctaatca 3540
tgttttgttt gagttttggt taaactattt acaaatgagt tttttttttc cttttgggtg 3600
ttgctcgaaa gtttggagct ttctgttaat attgtgttgt tgtttctcca atattattag 3660
acctgagaat tctacctggg tacctgtgaa ctccagaatt tttaaaaatt ccatctcttg 3720
ggaacattat ctctgacccc gtctgaggcc gaagtggctg tccccctcca acctttagta 3780
tctttctttc ctgactattg ggatttcttc aagcaatcag gctgatgggt tctcagcagt 3840
gagaccagta gactgtcggt atgaacgtcg aagagtctgc cacacactcc gggttcatca 3900
acagtgcttt cgcgtctctt acttttgtag aaggaaatgc agcctctgag ttttctccaa 3960
gaaatcattg atgaaagggt gaaaagatgg gtatcacccg gagttcatga caagccctgg 4020
ctcagacacg tgagcaaggt ctacagcccc aaagataggc tgccctgcaa catgtattta 4080
taagatagga gaaaaaaatg ggtagttgga gggttgatca acttacttcc tctcaaacat 4140
atatatctca tctaagtgtg caggggaaaa ctctgtagaa ctactgggat acctgctcac 4200
ccccaggagc ctcatgaata agtctctgct tctgccttgt agccatgagc attactgcac 4260
ctgatacccc tgcagcttcc tagggaagag ggaggaagtg acttggcccc tgtctggtta 4320
aggtaagagg agataaatcc cttctcattg attagggtga gaggggtcat gtgctctatc 4380
attggtgacc cagttgggac atgggtttat accaaagtca tcactctgag gttctgtgta 4440
ccaccaggct gaactcccat atcctacatg gacataggac aacaccaagc agaaggaggt 4500
tttaggacta aactgaagga cagagatgcg gtttctaaac aactagggag tgccagggcc 4560
agcctctcta accactatag gacactgtgg agtctggtta caaagagaga ttactcaagg 4620
tccttagcac tgattacaga gcatatctca gatgccttct gctgaccaga tgtatctttg 4680
cataatctgc ctatccagat tcagaaaatt gatgccacat agccaagtgg actttcagga 4740
acagacgatt taaaaacagg cagagagatg tgagagaaag gagaaggaga gagagaaggg 4800
agagggagag aagagagagg gagacggaga aggaaagagg gagaaggaga aggagagaag 4860
gggcatggac agagggaggg acagaaggag agaggagata gagaggggga taaggaagaa 4920
gggagggagg gagagagaga gaaggctaag tctttccata cctgggtccc aatacctctt 4980
ataacccaag cacatggttt cacatatcac aatgcggttg ggatatagat aactgtaaat 5040
acttgtgaaa ataatggggc tgagatctgg ggttttcatg atagtttcaa agtcaccgta 5100
ctgactaaaa ccttccactg gcccatctcc agcttcctaa tctgagggta tcaaatttcc 5160
cactaagtgt gtttagaaag atctccacct ttttgccctt gtcttccagt gccccaccta 5220
cgttctggtc tcccacatct gatgtcttct cagtgattct ggccctgcct gctccacagc 5280
tacaaacccc ttcctataat gagctctgtg ctgagccatc atcctgaatc aatccacctt 5340
aagcagatgt tttgcttatt tttcctgtgt ccatactaca gaggaaaggt aggcatgtag 5400
aagctgaagc atctcacctc attccaagca ccctcagtct ctaaatgtgc ccccttgttt 5460
ccagaagtgc aacctcaagc atcttttatt cattcatctt agagggccac atgtgctgta 5520
gtgttataag atgaaattta aagcattaat tattcctaac aagccaatta aacaagccaa 5580
aaacattcat cagtcattcc catggaacct ctgaagcatc ttcctgctct aaccttgggt 5640
tttccagggc tgctctggga tcacaggagc tgtcctgtct accagccata taaaggcaga 5700
cctatcagaa ttacaccaga cttctcacca tagactataa aagccagaat atcctggaca 5760
gatgttatac agaaactaag agaacacaaa tgccagccca ggctactata cccagcaaaa 5820
ctctcaatta ccatcgatga agaaaccaag atattccatt acaagtccaa atttacacaa 5880
tatctttcca taaatccagc cctacaaagg atagcagatg gaaaactcca acacaggtag 5940
gaaaactaca ccctagaaag agcactaaag taatcatctt tcaacacact caaaagaaga 6000
taaccacaca aacataattc cacctctaac aacaaaaata aagtaggcaa caatcactat 6060
tccttaatat ctcttttaac atcaatggac tcaattctcc aataaaaaga catagactaa 6120
cagactgaat acataaacag gacacagcat tttgctgcat aaagcaaaca cagcgttact 6180
tttttttttc taaatgacat tttttattag atattgtctt tattgacatt tcaaatgtta 6240
tcccctttcc tggtttaccc tctgaaatcc cctatctcct ccccctcccc ctgctcacca 6300
atccacccac tcccacttcc aggccctggc aatcccctat atttgggcat agagccttca 6360
caggaccaag gtactctcct tgcattgatg accaactagt ccattctctg ctacaaatgc 6420
agctagatct atgagtccca ccatgttttc ttttgttggt ggtttcatgc cagggagctc 6480
ttggagtact gattggttca tattgttgtt ctccctatgg ggttacaaaa cccttcaact 6540
tcttgggtcc tttctctggc tgcctcattg gggaccttgt gcgaagtcca atggatgact 6600
gtgagcatcc acttctgtat ttgccaggca ctggcagagc ctctcagaag acagctatat 6660
caagatcctg gcagcaagct cttgttggta tccacaaaag tgtctggtgg ttgtctatgg 6720
gatggatccc caaaggggca gtctctggat ggtcattcct tcagtctctg ttccacactt 6780
tgtctcttta actccttcca tgactatttt attcctccct ctaagaagga ccgaagtatt 6840
catactttgg tcttccttct tgaaattcat gtgttttgtg aattgtatct ttgatattcc 6900
gaacttctgg gctaatatcc acttatcagt gagtgaatat catgtgtgtt cttatgtgat 6960
tgagttacct cactcaggat gatatcctcc agaaccatcc atttgtctaa gaatttaatg 7020
aattcattgt ttttaatagc tgaggagtac tccattgtgt aaatgtacca cattttctgt 7080
acccattgtt ctcttgaggg acatctgggt tctttaaagc ttctggacat taaatataag 7140
gctgctatgg aaatagtgga gaatgtgtcc ttattacatg ttggagcatc ttctgggtat 7200
atgcccagga gtgctattgc tggatcctct gatagtacta tgtccaattt tctgaggaac 7260
tgccaaactg atttacagag tggttgtacc agcttgcaat tccaccagca atggagaaat 7320
gttccccttc ctccacatcc tcaccaacat ctgctgtcac ctcaatttgt tcttagtgat 7380
tcagacaggt gtgaggtgga atatcagggt tgtttggcat ttccctgatg actagtgata 7440
ttgaaaaaaa ttttaagtgt ttctcagcca ttcagtattc ttcagttgag aattcactgt 7500
ttagctctgt actcaggttt ttttaatagg gttatttggt tttctggagt ctaacgtctt 7560
gaattctttc tatatattgg atattagccc tctgtcatat ttaggattgg taaagatctt 7620
tcccaatatg ttggctgcct ttttgtgtcc tttgccttac agaacctttt taattttatg 7680
aggtcccatt tgctaattct tcattttaca gcacaagcca ttggtgttct gttcaaaaat 7740
ctttccccct gaaccctatc ttcgaggatc ttccccactt tctcctctat aagtttcagt 7800
gtctctatta ttgtgctgag gtcgcgatcg caccggtgaa accctaggaa gttcctatac 7860
tttctagaga ataggaactt cggaatagga acttctctag gggctgcagg tcgaggtctg 7920
atggaattag aacttggcaa aacaatactg agaatgaagt gtatgtggaa cagaggctgc 7980
tgatctcgtt cttcaggcta tgaaactgac acatttggaa accacagtac ttagaaccac 8040
aaagtgggaa tcaagagaaa aacaatgatc ccacgagaga tctatagatc tatagatcat 8100
gagtgggagg aatgagctgg cccttaattt ggttttgctt gtttaaatta tgatatccaa 8160
ctatgaaaca ttatcataaa gcaatagtaa agagccttca gtaaagagca ggcatttatc 8220
taatcccacc ccacccccac ccccgtagct ccaatccttc cattcaaaat gtaggtactc 8280
tgttctcacc cttcttaaca aagtatgaca ggaaaaactt ccattttagt ggacatcttt 8340
attgtttaat agatcatcaa tttctgcaga cttacagcgg atcttcagaa gaactcgtca 8400
agaaggcgat agaaggcgat gcgctgcgaa tcgggagcgg cgataccgta aagcacgagg 8460
aagcggtcag cccattcgcc gccaagctct tcagcaatat cacgggtagc caacgctatg 8520
tcctgatagc ggtccgccac acccagccgg ccacagtcga tgaatccaga aaagcggcca 8580
ttttccacca tgatattcgg caagcaggca tcgccatggg tcacgacgag atcctcgccg 8640
tcgggcatgc gcgccttgag cctggcgaac agttcggctg gcgcgagccc ctgatgctct 8700
tcgtccagat catcctgatc gacaagaccg gcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatg 8760
cgatgtttcg cttggtggtc gaatgggcag gtagccggat caagcgtatg cagccgccgc 8820
attgcatcag ccatgatgga tactttctcg gcaggagcaa ggtgagatga caggagatcc 8880
tgccccggca cttcgcccaa tagcagccag tcccttcccg cttcagtgac aacgtcgagc 8940
acagctgcgc aaggaacgcc cgtcgtggcc agccacgata gccgcgctgc ctcgtcctgc 9000
agttcattca gggcaccgga caggtcggtc ttgacaaaaa gaaccgggcg cccctgcgct 9060
gacagccgga acacggcggc atcagagcag ccgattgtct gttgtgccca gtcatagccg 9120
aatagcctct ccacccaagc ggccggagaa cctgcgtgca atccatcttg ttcaatcatg 9180
gtggatggtt tagttcctca ccttgtcgta ttatactatg ccgatatact atgccgatga 9240
ttaattgtca acaattcgag agacccgggt tcccaatcta gagctcgacg tctaacaaaa 9300
aagccaaaaa cggccagaat ttagcggaca atttactagt ctaacactga aaattacata 9360
ttgacccaaa tgattacatt tcaaaaggtg cctaaaaaac ttcacaaaac acactcgcca 9420
accccgagcg catagttcaa aaccggagct tcagctactt aagaagatag gtacataaaa 9480
ccgaccaaag aaactgacgc ctcacttatc cctcccctca ccagaggtcc ggcgcctgtc 9540
gattcaggag agcctaccct aggcccgaac cctgcgtcct gcgacggaga aaagcctacc 9600
gcacacctac cggcaggtgg ccccaccctg cattataagc caacagaacg ggtgacgtca 9660
cgacacgacg agggcgcgcg ctcccaaagg tacgggtgca ctgcccaacg gcaccgccat 9720
aactgccgcc cccgcaacag acgacaaacc gagttctcca gtcagtgaca aacttcacgt 9780
cagggtcccc agatggtgcc ccagcccatc tcacccgaat aagagctttc ccgcattagc 9840
gaaggcctca agaccttggg ttcttgccgc ccaccatgcc ccccaccttg tttcaacgac 9900
ctcacagccc gcctcacaag cgtcttccat tcaagactcg ggaacagccg ccattttgct 9960
gcgctccccc caacccccag ttcagggcaa ccttgctcgc ggacccagac tacagccctt 10020
ggcggtctct ccacacgctt ccgtcccacc gagcggcccg gcggccacga aagccccggc 10080
cagcccagca gcccgctact caccaagtga cgatcacagc gatccacaaa caagaaccgc 10140
gacccaaatc ccggctgcga cggaactagc tgtgccacac ccggcgcgtc cttatataat 10200
catcggcgtt caccgcccca cggagatccc tccgcagaat cgccgagaag ggactacttt 10260
tcctcgcctg ttccgctctc tggaaagaaa accagtgccc tagagtcacc caagtcccgt 10320
cctaaaatgt ccttctgctg atactggggt tctaaggccg agtcttatga gcagcgggcc 10380
gctgtcctga gcgtccgggc ggaaggatca ggacgctcgc tgcgcccttc gtctgacgtg 10440
gcagcgctcg ccgtgaggag gggggcgccc gcgggaggcg ccaaaacccg gcgcggaggc 10500
ctcggaggcc agacgcgcga gaagttccta tactttctag agaataggaa cttcggaata 10560
ggaacttcgg taccgcgatc gcccttgatc cacttgaact tgagcattgt tcaaggagat 10620
aagaatggat caattcgaat tcttctacat gataacagcc agttgagcca gcaccatttg 10680
ttgaaaattc tcttttttgc actggatggt tttagcactt ttgtcaaaga tcaagtgact 10740
atggctcttc aactatggct cattccattg atcaacttgt ctgtcactgt acaagcacca 10800
tgcaattttt attgcaattg cttagtatta caccttgagg tcaaggatgg tcattccacc 10860
agaggttctt ttatggttga gaagagtttt tgctatccta ggtttttgtt attccagatg 10920
aatttgcaaa tggccctttc taactcagtg aagaattgag gtggaatttt gatgggaatt 10980
ttattgaatc tgtagattgc attcaacaag atagccattt ataatacatt aatcctgcca 11040
gtccatgagc atgggagatc tttccatctt ccgagatctt cttcgatttc tttcttcaga 11100
gacttgaagt ttttatcata cagatctttc acttccttag ttagagtcac accaaggtat 11160
tttatattat ttgtgactac tgtgaaggtt gttgtttccc taatttcttt ctcagcctgt 11220
tcatcctttg tgtagagaaa ggccactgat ttatttgagt taatattgta tccagctaat 11280
tcactgaagt tgtttatcag gtttaggagt tctcttgtgg aatttttgga atcacatgtg 11340
tatactatta tatcatctgc aattagtgat attttgactt cttctttccc aaattgtatc 11400
cctttgatct ccttttgttg tctaattgcc cacactagga ctcgggcagc cttagtgcct 11460
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tgatttgctg tatattgctt ttattatgtt taggtatggg ccttgaattc ctgatctttc 11580
caatactttt atcatgaatg ggtgttgaat tttgtcaaat gctttctcaa catctacaaa 11640
gatgatcatg tagattttgt ctttcagttt gattatatag tgtattatgt tgatggattt 11700
ccatatatta aaccatccct gcatccctgg gatgaagcct acttggtcat gatagacgat 11760
tgttttgatg tgttcttgga ttcagttagt gagaaatata ttgagtattt ttacatcgat 11820
attcataagg gaaattggtc tgaagttctc tttctttgtt gggtctttat gtggtttagt 11880
tatcagagtc attgtagctt catagaacaa attgagtaga gtaccttctg tctctatttt 11940
gtggtatagt ttgaggagat ttggaaatat gtcttcttgg aacgtctgag agaattctgc 12000
actaaaccca tctgatcctg ggcttctttg gggggggggg actattaatg actgcttcta 12060
tttctttagg ggaaatggga ctgtttagat tgttaatatg atcctgaata gaaatctgat 12120
ctgatctaga aaattgtcca ttttattcag gttttccagt tttgttgagt attgcctttt 12180
gtggtaggat ctgatgatgt tttggatttc cttaggttct gttgttatgt cttctttttc 12240
atttctcatt ttgttaatta ggatactgtc cctgtgtcct ctagttactc tggctaagcg 12300
tttatctatc ttattgattt tctcaaagaa ccagctcctg gtttggttga ttctttgtat 12360
agttcttttt gtttccactt gattgatttc tgccctaagt ttgattgttt cctgctgtct 12420
actcctcttg ggtgaatttg cttccttttg ttctagagct tttaggtgtg ctgtcaagct 12480
gatagggtat gctctctcta gtttcttttt ggcggcactc atagctagga gttttcctct 12540
tagcagtgct ttcattacgt cctgtaagtt tgggtatgtt gtggcttcat ttgcattaaa 12600
ttctaataag tctttaatct ctttccttct ttcttccttg accgagttat cattgactag 12660
agtgttcatc agcttccaca tcaatgttgg ctttttatta tttatgtttt tattgaagat 12720
cagcctttgt cggtggtgat cttctaggat gcatgggaaa ttttcaatat ttttgtatct 12780
attgaggcct gttttgtgac caattatacg gtcaattttg gagaaagtac cgtgaggtac 12840
tgagaagatg gtatatcttt ttgttttagg ataaaatgtt ctgtagatat ctgttaaatc 12900
catttgtttc ataacttctg ttagtttcac tgtgtctctg tttagtttct gattccagaa 12960
tctgtccaat gataagagta gggtattaaa ttctcccact actattgtgt gaggtacaat 13020
gtgtggtttg agctttaaaa gagtttcctt aatgaatgtg gatggccttg catttggagc 13080
atagttattc agaattgaga gttcctcttg gaagatttta cctttgatga gtataaaatg 13140
cccctccttg tcttttttga tacctttggg ttagaagtgg attttattcg atattagaat 13200
ggctaatcca tcttgtttct ttgagatgtt tgcttggaaa attattttcc tgccctttac 13260
tcggtggtag tgtctgtctt agtccctgag gtgggtttcc tgtatacagc aaaatgttgg 13320
gtcctggtta tgtagccagt ctgttagtct gtctttttat caggtaattg agtccattga 13380
tattaagagc tattaaggaa aagtaattgg tgcttcctgt tatttttgtt gttagacttg 13440
ggattctgtt cttgtggcta tcttctttta ggtttgttga aggattactt tcttgctttt 13500
tttagggtgt aatttccctc tttgtgttgg agttttctct ttattatcct ttgaagggct 13560
ggattcatgg aaagatgttg ggtgaatttg gttttgtcat ggaattcttt ggtttctcca 13620
tctataattg agagttttgc tgggtatagt agcctaagct ggcatttgtg ctctcttagt 13680
gtctataaca tctgtccagg atcttctggc tttcataatc tctggtgaga agtctggtgt 13740
aattctgata ggcctgcctt tatatgttac ttgacctttt tcccttactg ctttaaatat 13800
tctatcttca tttagtgcat tttttttctg attttttatg tgtcaggagg aatttctttt 13860
ctgctccagt ctatttggat tctgtaggct acttctatgt tcatgggcat ctccttcttt 13920
aggttacgga cgttttcttc tataattttg ttgaagatat ttactggccc tttaagttga 13980
aaatctccat tctcatctat acctattatc tttaggtttg gtcttctcat tgtgtcctgg 14040
atttcctgga tgttttgagt taggatcttt tttgcatttt gcattttttt ttattgttgt 14100
gcccatgttt tctacggaat cttatgcacc tgagactctc tcttctacct cttgtattct 14160
attggctgat gcttccacct atgtttctcg atttctttcc taggatttct atccccagag 14220
ttgtctccct ttgtgatttc tttattgttt ctacttccat ttttagattt tgaatggttc 14280
tgttcgattc catcgcctgt tgggttgtgt ttttctgtat ttctttgagg gatttttgtg 14340
cttcatcttt aaggtcttct acctgtttag gagtgttttc ctataattct ttgagggatt 14400
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gttctgatga tgaaaactgg tcttggtttt tattagtaag attcctactt ttgccttcca 14640
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taaaaacaat taatttataa aattcttagg caaatggatg aatctggagg atatcatcct 42720
gagggaggta acccgctcac aaaagaactc acttgatatg cactaactga taagtggaca 42780
ttagcccaga aatttagaat actcgtattt ttctaacaat agctaacagc cagcaatctc 42840
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tctctaaaac cctgacttag agggatacag ccaaatggca cccaaaacta aagcctgctt 42960
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<223> synthetic
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cctggtagca tttgtgataa agaattatgc tgtgcaaatt gcacttacag tccttctggg 3060
acactctgca gacctatcca gaacatatgt gatcttccag agtactgtaa tgggactaaa 3120
tacatttgcc cagatgacac ttatctgcaa gatgggacac catgctcaga agatggttac 3180
tgctataaag gtaactgcac tgatcgcaac atacaatgca tggaaatctt tggtgtaagt 3240
gctaagaatg ctaatattaa gtgctatgac atcaacaaac aacggtttcg atttgggcat 3300
tgtactagag cagaagaaag cctcacattc aatgcttgtg ctgatcagga caagctgtgt 3360
ggaaggttgc agtgtaccaa tgtcaccaat cttccatatt tgcaagaaca tgtttcattc 3420
catcaatcga ttatctctgg gtttacctgc tttgggcttg atgaacatcg tgggacagaa 3480
acaacagatg ctggaatggt gagacatggt accccctgct ccaaaagtaa gttctgtgat 3540
caaggagctt gcagtggaag tttatctcat ttgggttatg actgcacccc agaaaaatgc 3600
agttttagag gagtgtgtaa caatcatcgg aattgccatt gtcattttgg ttggaagcct 3660
ccagagtgca aagaagaggg actaagtggg agcatagaca gtgggtcccc tccagttcaa 3720
aggcacacaa taaaacaaaa acaagagcca gtggtgtatt taagaatact ctttggtcgt 3780
atttacttcc tctttgttgc actgctcttt ggcattgcca ctcgtgtagg agttactaag 3840
atttttagat ttgaagactt gcaagctact ttacgttctg ggcaaggacc agcaagggac 3900
aagccaaagt aaaatgagtt agccctcccc tcctgtctcc tgtaagataa agagaatgca 3960
aaaaagaaaa tctgaatgtc agtagggaac aaggtagaac tcaagttcac agttctggat 4020
ggcctttttt tttttttaat atcatgagga cataagacgt gttggattca gaaatcacct 4080
gatgttggtg cattgctaat gcttacactg gaataaatct ttcaaaactg caaattggta 4140
cttttgattc tatattttaa ataaatcata tggttcctga acactgaagc gttcccacat 4200
cgcgatcgcg gtaccgaagt tcctattccg aagttcctat tctctagaaa gtataggaac 4260
ttctcgcgcg tctggcctcc gaggcctccg cgccgggttt tggcgcctcc cgcgggcgcc 4320
cccctcctca cggcgagcgc tgccacgtca gacgaagggc gcagcgagcg tcctgatcct 4380
tccgcccgga cgctcaggac agcggcccgc tgctcataag actcggcctt agaaccccag 4440
tatcagcaga aggacatttt aggacgggac ttgggtgact ctagggcact ggttttcttt 4500
ccagagagcg gaacaggcga ggaaaagtag tcccttctcg gcgattctgc ggagggatct 4560
ccgtggggcg gtgaacgccg atgattatat aaggacgcgc cgggtgtggc acagctagtt 4620
ccgtcgcagc cgggatttgg gtcgcggttc ttgtttgtgg atcgctgtga tcgtcacttg 4680
gtgagtagcg ggctgctggg ctggccgggg ctttcgtggc cgccgggccg ctcggtggga 4740
cggaagcgtg tggagagacc gccaagggct gtagtctggg tccgcgagca aggttgccct 4800
gaactggggg ttggggggag cgcagcaaaa tggcggctgt tcccgagtct tgaatggaag 4860
acgcttgtga ggcgggctgt gaggtcgttg aaacaaggtg gggggcatgg tgggcggcaa 4920
gaacccaagg tcttgaggcc ttcgctaatg cgggaaagct cttattcggg tgagatgggc 4980
tggggcacca tctggggacc ctgacgtgaa gtttgtcact gactggagaa ctcggtttgt 5040
cgtctgttgc gggggcggca gttatggcgg tgccgttggg cagtgcaccc gtacctttgg 5100
gagcgcgcgc cctcgtcgtg tcgtgacgtc acccgttctg ttggcttata atgcagggtg 5160
gggccacctg ccggtaggtg tgcggtaggc ttttctccgt cgcaggacgc agggttcggg 5220
cctagggtag gctctcctga atcgacaggc gccggacctc tggtgagggg agggataagt 5280
gaggcgtcag tttctttggt cggttttatg tacctatctt cttaagtagc tgaagctccg 5340
gttttgaact atgcgctcgg ggttggcgag tgtgttttgt gaagtttttt aggcaccttt 5400
tgaaatgtaa tcatttgggt caatatgtaa ttttcagtgt tagactagta aattgtccgc 5460
taaattctgg ccgtttttgg cttttttgtt agacgtcgag ctctagattg ggaacccggg 5520
tctctcgaat tgttgacaat taatcatcgg catagtatat cggcatagta taatacgaca 5580
aggtgaggaa ctaaaccatc caccatgatt gaacaagatg gattgcacgc aggttctccg 5640
gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat cggctgctct 5700
gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt caagaccgac 5760
ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc ggctatcgtg gctggccacg 5820
acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag ggactggctg 5880
ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc tgccgagaaa 5940
gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc tacctgccca 6000
ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga agccggtctt 6060
gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga actgttcgcc 6120
aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg cgatgcctgc 6180
ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg tggccggctg 6240
ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc tgaagagctt 6300
ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc cgattcgcag 6360
cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgaa gatccgctgt aagtctgcag 6420
aaattgatga tctattaaac aataaagatg tccactaaaa tggaagtttt tcctgtcata 6480
ctttgttaag aagggtgaga acagagtacc tacattttga atggaaggat tggagctacg 6540
ggggtggggg tggggtggga ttagataaat gcctgctctt tactgaaggc tctttactat 6600
tgctttatga taatgtttca tagttggata tcataattta aacaagcaaa accaaattaa 6660
gggccagctc attcctccca ctcatgatct atagatctat agatctctcg tgggatcatt 6720
gtttttctct tgattcccac tttgtggttc taagtactgt ggtttccaaa tgtgtcagtt 6780
tcatagcctg aagaacgaga tcagcagcct ctgttccaca tacacttcat tctcagtatt 6840
gttttgccaa gttctaattc catcagacct cgacctgcag cccctagaga agttcctatt 6900
ccgaagttcc tattctctag aaagtatagg aacttcctag ggtttcaccg gtgcgatcgc 6960
cctcagcaca ataatagaga cactgaaact tatagaggag aaagtgggga agatcctcga 7020
agatagggtt cagggggaaa gatttttgaa cagaacacca atggcttgtg ctgtaaaatg 7080
aagaattagc aaatgggacc tcataaaatt aaaaaggttc tgtaaggcaa aggacacaaa 7140
aaggcagcca acatattggg aaagatcttt accaatccta aatatgacag agggctaata 7200
tccaatatat agaaagaatt caagacgtta gactccagaa aaccaaataa ccctattaaa 7260
aaaacctgag tacagagcta aacagtgaat tctcaactga agaatactga atggctgaga 7320
aacacttaaa atttttttca atatcactag tcatcaggga aatgccaaac aaccctgata 7380
ttccacctca cacctgtctg aatcactaag aacaaattga ggtgacagca gatgttggtg 7440
aggatgtgga ggaaggggaa catttctcca ttgctggtgg aattgcaagc tggtacaacc 7500
actctgtaaa tcagtttggc agttcctcag aaaattggac atagtactat cagaggatcc 7560
agcaatagca ctcctgggca tatacccaga agatgctcca acatgtaata aggacacatt 7620
ctccactatt tccatagcag ccttatattt aatgtccaga agctttaaag aacccagatg 7680
tccctcaaga gaacaatggg tacagaaaat gtggtacatt tacacaatgg agtactcctc 7740
agctattaaa aacaatgaat tcattaaatt cttagacaaa tggatggttc tggaggatat 7800
catcctgagt gaggtaactc aatcacataa gaacacacat gatattcact cactgataag 7860
tggatattag cccagaagtt cggaatatca aagatacaat tcacaaaaca catgaatttc 7920
aagaaggaag accaaagtat gaatacttcg gtccttctta gagggaggaa taaaatagtc 7980
atggaaggag ttaaagagac aaagtgtgga acagagactg aaggaatgac catccagaga 8040
ctgccccttt ggggatccat cccatagaca accaccagac acttttgtgg ataccaacaa 8100
gagcttgctg ccaggatctt gatatagctg tcttctgaga ggctctgcca gtgcctggca 8160
aatacagaag tggatgctca cagtcatcca ttggacttcg cacaaggtcc ccaatgaggc 8220
agccagagaa aggacccaag aagttgaagg gttttgtaac cccataggga gaacaacaat 8280
atgaaccaat cagtactcca agagctccct ggcatgaaac caccaacaaa agaaaacatg 8340
gtgggactca tagatctagc tgcatttgta gcagagaatg gactagttgg tcatcaatgc 8400
aaggagagta ccttggtcct gtgaaggctc tatgcccaaa tataggggat tgccagggcc 8460
tggaagtggg agtgggtgga ttggtgagca gggggagggg gaggagatag gggatttcag 8520
agggtaaacc aggaaagggg ataacatttg aaatgtcaat aaagacaata tctaataaaa 8580
aatgtcattt agaaaaaaaa aagtaacgct gtgtttgctt tatgcagcaa aatgctgtgt 8640
cctgtttatg tattcagtct gttagtctat gtctttttat tggagaattg agtccattga 8700
tgttaaaaga gatattaagg aatagtgatt gttgcctact ttatttttgt tgttagaggt 8760
ggaattatgt ttgtgtggtt atcttctttt gagtgtgttg aaagatgatt actttagtgc 8820
tctttctagg gtgtagtttt cctacctgtg ttggagtttt ccatctgcta tcctttgtag 8880
ggctggattt atggaaagat attgtgtaaa tttggacttg taatggaata tcttggtttc 8940
ttcatcgatg gtaattgaga gttttgctgg gtatagtagc ctgggctggc atttgtgttc 9000
tcttagtttc tgtataacat ctgtccagga tattctggct tttatagtct atggtgagaa 9060
gtctggtgta attctgatag gtctgccttt atatggctgg tagacaggac agctcctgtg 9120
atcccagagc agccctggaa aacccaaggt tagagcagga agatgcttca gaggttccat 9180
gggaatgact gatgaatgtt tttggcttgt ttaattggct tgttaggaat aattaatgct 9240
ttaaatttca tcttataaca ctacagcaca tgtggccctc taagatgaat gaataaaaga 9300
tgcttgaggt tgcacttctg gaaacaaggg ggcacattta gagactgagg gtgcttggaa 9360
tgaggtgaga tgcttcagct tctacatgcc tacctttcct ctgtagtatg gacacaggaa 9420
aaataagcaa aacatctgct taaggtggat tgattcagga tgatggctca gcacagagct 9480
cattatagga aggggtttgt agctgtggag caggcagggc cagaatcact gagaagacat 9540
cagatgtggg agaccagaac gtaggtgggg cactggaaga caagggcaaa aaggtggaga 9600
tctttctaaa cacacttagt gggaaatttg ataccctcag attaggaagc tggagatggg 9660
ccagtggaag gttttagtca gtacggtgac tttgaaacta tcatgaaaac cccagatctc 9720
agccccatta ttttcacaag tatttacagt tatctatatc ccaaccgcat tgtgatatgt 9780
gaaaccatgt gcttgggtta taagaggtat tgggacccag gtatggaaag acttagcctt 9840
ctctctctct ccctccctcc cttcttcctt atccccctct ctatctcctc tctccttctg 9900
tccctccctc tgtccatgcc ccttctctcc ttctccttct ccctctttcc ttctccgtct 9960
ccctctctct tctctccctc tcccttctct ctctccttct cctttctctc acatctctct 10020
gcctgttttt aaatcgtctg ttcctgaaag tccacttggc tatgtggcat caattttctg 10080
aatctggata ggcagattat gcaaagatac atctggtcag cagaaggcat ctgagatatg 10140
ctctgtaatc agtgctaagg accttgagta atctctcttt gtaaccagac tccacagtgt 10200
cctatagtgg ttagagaggc tggccctggc actccctagt tgtttagaaa ccgcatctct 10260
gtccttcagt ttagtcctaa aacctccttc tgcttggtgt tgtcctatgt ccatgtagga 10320
tatgggagtt cagcctggtg gtacacagaa cctcagagtg atgactttgg tataaaccca 10380
tgtcccaact gggtcaccaa tgatagagca catgacccct ctcaccctaa tcaatgagaa 10440
gggatttatc tcctcttacc ttaaccagac aggggccaag tcacttcctc cctcttccct 10500
aggaagctgc aggggtatca ggtgcagtaa tgctcatggc tacaaggcag aagcagagac 10560
ttattcatga ggctcctggg ggtgagcagg tatcccagta gttctacaga gttttcccct 10620
gcacacttag atgagatata tatgtttgag aggaagtaag ttgatcaacc ctccaactac 10680
ccattttttt ctcctatctt ataaatacat gttgcagggc agcctatctt tggggctgta 10740
gaccttgctc acgtgtctga gccagggctt gtcatgaact ccgggtgata cccatctttt 10800
caccctttca tcaatgattt cttggagaaa actcagaggc tgcatttcct tctacaaaag 10860
taagagacgc gaaagcactg ttgatgaacc cggagtgtgt ggcagactct tcgacgttca 10920
taccgacagt ctactggtct cactgctgag aacccatcag cctgattgct tgaagaaatc 10980
ccaatagtca ggaaagaaag atactaaagg ttggaggggg acagccactt cggcctcaga 11040
cggggtcaga gataatgttc ccaagagatg gaatttttaa aaattctgga gttcacaggt 11100
acccaggtag aattctcagg tctaataata ttggagaaac aacaacacaa tattaacaga 11160
aagctccaaa ctttcgagca acacccaaaa ggaaaaaaaa aactcatttg taaatagttt 11220
aaccaaaact caaacaaaac atgattagaa gaaataaaaa caatcattta tagctaaaag 11280
gctaatatag acagtattta cttctaactt tcaaacaaac aaacaaacaa aacaaaacaa 11340
gaagttagaa caactgtgaa aaacatgagc caagatataa agaaatattg actcctagaa 11400
agagacccag agtcacactg ggaaccaaat acattcacgt ggaaatgata ttttgaactt 11460
caaaaaaaga aaagaaagga ttgagcctgt cagagacact ccttgctgct tctgactttt 11520
cttgtccagg cacatttata gacatccctt ttgacaatat ttaacctcaa cctcagctaa 11580
cacattcaga ctcaattcct gccacaccca gtgactgtta cctaactcca gttgtctggg 11640
taaccactta ggttgggagc ctgaggaggt ttttagtcct ctgtcagtat tttctagacc 11700
aggcagtggc cacagcagag ggagttagct ccacccagga tgttatctct gacctggggc 11760
atgaggctag tggaaagacc tgtggtcccc agggtcctcc tcttgctatt tgcactctgg 11820
ctgctcctcc tggttccagt ctggtgttct caaggccatc ccacttggcg ttacatctca 11880
tcggaggtgg ttattcctcg gaaggagatc taccatacca aaggacttca agcacaaaga 11940
ctgctctcgt atagcttgcg ttttcggggc cagagacata tcatccacct gcggagaaag 12000
acactcattt ggcccagaca cttgttgctg acaactcaag atgaccaagg agccttacag 12060
atggagtacc ccttttttcc tgtagattgt tactatattg gctacctgga ggggatcctg 12120
caatccatgg tcactgtgga tacttgttat gggggcctgt caggggtcat aaagttggat 12180
aaccttacct atgaaatcaa acccctcaat gattcacaga gctttgaaca ccttgtttct 12240
cagatagtat ctgagtctga tgacacaggg cctatgaatg catggaagca ctggagccat 12300
aatacaggtt ctccctcctc cagattggaa tatgcagatg gagctcccag actatctagt 12360
aagaattacg ctacacatcc agctgctata aaaggccact ttcaagcaac ccattctgta 12420
tatagtgctt ctggaggtga caaactttca tctactgttg agtatttgtt taaagtcatt 12480
agtttaatgg acacctatct gaccaatctt catatgcggt actatgtctt tctcatgact 12540
gtgtataccg aggctgatcc attttcacaa gattttcgag ttccaggagg gcaggctcat 12600
actttctatg agagagtatt ttatgctcat tttaggcctg atgcaggagc tataattaac 12660
aagaattcgc caggagatga tgctgttaat ccagctgaga ggagtatatg ttctccctca 12720
gccctaattt gtcttggtca acatggtcga aatcctttat ttttatctat tataataacc 12780
aatcgtgttg gaaggagttt aggcctaaaa catgatgagg ggtactgtat ctgccagaga 12840
aggaacacct gcatcatgtt caaaaatcct caattaacag atgctttcag caattgttcc 12900
cttgcagaga taagcaacat acttaatact cctgatctga tgccatgtct tttctatgac 12960
cgtcatgttt attataatac atcattgact tataagtttt gtggaaactt caaagtagat 13020
aacaatgagc agtgtgactg tggctcccaa aaggcatgtt attcagatcc ctgctgtgga 13080
aatgattgca ggttaacacc tggtagcatt tgtgataaag aattatgctg tgcaaattgc 13140
acttacagtc cttctgggac actctgcaga cctatccaga acatatgtga tcttccagag 13200
tactgtagtg gctctaagtt catttgccca gatgacactt atctgcaaga tgggacacca 13260
tgctcagaag agggttactg ctataaaggt aactgcactg atcgcaacat acaatgcatg 13320
gaaatctttg gtgtaagtgc taagaatgct aatattaagt gctatgacat caacaaacaa 13380
cggtttcgat ttgggcattg tactagagca gaagaaagcc tcacattcaa tgcttgtgct 13440
gatcaggaca agctgtgtgg aaggttgcag tgtaccaatg tcaccaatct tccatttttg 13500
caagaacatg tttcattcca tcaatcggtt atctctgggg ttacctgctt tgggcttgat 13560
gaacatcgtg ggacagaaac agcagatgct ggattggtga gacatggtac cccgtgttca 13620
aggggtaagt tctgtgatcg aggagcttgc aatggaagtt tatctcgttt gggttatgac 13680
tgcaccccag aaaaatgcaa tttcagagga gtgtgtaaca atcgtcggaa ttgccattgc 13740
cattttggtt ggagccctcc aaagtgcaaa gaagagggac acagtgggag catagacagt 13800
gggtcccctc cggttcaaag gcgcataata aaacagaacc tagagccagt agtgtattta 13860
agaatactct ttggtcgtat ttacttcctc tttgttgcac tgctctttgg cattgccact 13920
cgtgtaggag ttactaagat atttaggttt gaagacttgc aagctgcttt acgttcttgg 13980
caagaacaag caaaggacaa gtaaaatgag ttagccccct gtctcctcta agataaagag 14040
aatggaaaaa aaatctgaat gtcattaggg gacaaggtag aactccagtc cacagttctg 14100
gatggccttt gtttatatca tgggacataa gacgtgttgg actcggcacc acctgatgtt 14160
gttgcattgc tgaaataaat ctttcaaaat tgcaaactgg tacttttgat tctatatttt 14220
aaataaatca ttagaaactg ctctacgttt gctcctcggg tagcaggaga ccttgagcca 14280
ccattggttc ttagccttag gcctctggtc tccgtattaa tggagatttg tctatatctc 14340
ttttaagaag ttatttacga tatcttttta aaatatggtt cctgaaccct gatgcgttcc 14400
cacctctttg tcactgtgtt ttttgatggt tcccatctcc tatagtttgt gatgggattt 14460
tcaggatcat tccttagagg aatagatgga gtgaagaaag acttaggacc cagttgagga 14520
agcgttacag gaacatagaa tcatcacctc attattaagc cagagaactg atatgtagaa 14580
catcaccatt aacacaaagc catggcttac tagatatact actcacaagc tcatggaagc 14640
atgctctcca gatttccact gacagggcac tgcacagaac acagtcttga gaaaggacat 14700
ggtgattctc gtggaggcag accctgagtg cactgaacag agaatctgtc atccctcgct 14760
accttaggac cgttatagtt a 14781
Claims (32)
- (a) 비-사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역의 업스트림에서 하나 이상의 사람 VL 및 하나 이상의 사람 JL 유전자 세그먼트의 삽입,
(b) 비-사람 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 업스트림에서 하나 이상의 사람 VL 및 하나 이상의 사람 JL 유전자 세그먼트의 삽입, 및
(c) ADAM6 단백질 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로서, ADAM6 단백질은 이소성 ADAM6 핵산 서열로부터 발현되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 비-사람 동물. - 제1 항에 있어서, 비-사람 중쇄 및/또는 경쇄 불변 영역은 설치류 불변 영역인 것을 특징으로 하는 비-사람 동물.
- 제1 항 또는 제2 항에 있어서, 경쇄 불변 영역은 마우스 Cκ인 것을 특징으로 하는 비-사람 동물.
- 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 있어서, 비-사람 면역글로불린 경쇄 불변 영역의 사람 VL 및 JL 유전자 세그먼트 업스트림은 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트인 것을 특징으로 하는 비-사람 동물.
- 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 있어서, 비-사람 면역글로불린 중쇄 불변 영역의 사람 VL 및 JL 유전자 세그먼트 업스트림은 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트인 것을 특징으로 하는 비-사람 동물.
- 제1 항 내지 제5 항 중 어느 한 항에 있어서, ADAM6 단백질 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 야생형 비-사람 ADAM6 자리와 비교하여 같은 자리에 존재하는 것을 특징으로 하는 비-사람 동물.
- 제1 항 내지 제6 항 중 어느 한 항에 있어서, ADAM6 단백질 또는 이들의 기능적 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 면역글로불린 유전자 세그먼트 내에 존재하는 것을 특징으로 하는 비-사람 동물.
- 제7 항에 있어서, 면역글로불린 유전자 세그먼트는 사람 κ 경쇄 유전자 세그먼트인 것을 특징으로 하는 비-사람 동물.
- 제7 항 내지 제8 항에 있어서, 면역글로불린 유전자 세그먼트는 비-사람 동물의 내인성 중쇄 유전자 세그먼트인 것을 특징으로 하는 비-사람 동물.
- 제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 있어서, 비-사람 동물은 비-사람 동물에서 면역글로불린 VL 도메인을 형성하기 위해 재배열될 수 없는 내인성 면역글로불린 VL 및/또는 JL 유전자 세그먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 비-사람 동물.
- (a) 비-사람 동물의 내인성 면역글로불린 중쇄 자리에서 하나 이상의 재배열되지 않은 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 하나 이상의 재배열되지 않은 사람 Jκ 유전자 세그먼트,
(b) 비-사람 동물의 내인성 면역글로불린 경쇄 자리에서 하나 이상의 재배열되지 않은 사람 Vκ 유전자 세그먼트 및 하나 이상의 재배열되지 않은 사람 Jκ 유전자 세그먼트로서, 비-사람 동물은 ADAM6 단백질 또는 이들의 기능적 단편을 발혀할 수 있는 사람 Jκ 유전자 세그먼트를 포함하는, 유전적으로 변형된 비-사람 동물. - 제1 항 또는 제11 항의 비-사람 동물로부터 유래된 세포.
- 제12 항에 있어서, 세포는 B 세포인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제13 항의 B 세포로 만들어진 히브리도마(hybridoma).
- 제12 항에 있어서, 비-사람 동물은 설치류인 것을 특징으로 하는 세포.
- 제15 항에 있어서, 설치류는 마우스 및 래트로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포.
- (a) 제1 항 또는 제11 항의 비-사람 동물을 원하는 항원에 노출시키는 단계,
(b) 비-사람 동물의 하나 이상의 B 림프세포를 분리하는 단계로서, 하나 이상의 B 림프세포는 원하는 항원에 결합하는 VL 결합 단백질을 발현하는 단계,
(c) 원하는 항원에 결합하는 VL 결합 단백질의 VL 도메인을 암호화하는 핵산 서열을 확인하는 단계로서, VL 결합 단백질은 사람 Vκ 도메인 및 비-사람 경쇄 불변 도메인 및 사람 Vκ 도메인 및 비-사람 중쇄 불변 도메인을 포함하는 단계, 및
(d) 사람 면역글로불린 불변 영역 핵산 서열과 함께 (c)의 핵산 서열을 이용하여 원하는 항원에 결합하는 사람 항원-결합 단백질을 만드는 단계를 포함하는, 원하는 항원에 결합하는 항원-결합 단백질을 만드는 방법. - 제17 항에 있어서, VL 결합 단백질의 비-사람 경쇄 불변 영역은 마우스 Cκ이고 비-사람 중쇄 불변 영역은 마우스 중쇄 불변 영역인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제17 항 또는 제18 항에 있어서, 비-사람 동물은 마우스인 것을 특징으로 하는 방법.
- 비-사람 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자에 작동 가능하게 결합된 하나 이상의 사람 면역글로불린 경쇄 유전자 세그먼트를 포함하는 설치류로서, 설치류는 하나 이상의 ADAM6 단백질을 발현하는 설치류.
- 제20 항에 있어서, 하나 이상의 사람 면역글로불린 경쇄 유전자 세그먼트는 사람 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트인 것을 특징으로 하는 설치류.
- 제20 항 또는 제21 항에 있어서, 비-사람 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자는 마우스 또는 래트 중쇄 불변 영역 유전자인 것을 특징으로 하는 설치류.
- 제20 항 내지 제22 항 중 어느 한 항에 있어서, 면역글로불린 중쇄 불변 영역 유전자는 CH1 및/또는 힌지 영역을 포함하는 것을 특징으로 하는 설치류.
- 제20 항 내지 제23 항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 하나 이상의 내인성 면역글로불린 중쇄 유전자 서열의 결실, 또는 대체를 포함하는 것을 특징으로 하는 설치류.
- 제20 항 내지 제24 항 중 어느 한 항에 있어서, 내인성 VH, DH, 및 JH 유전자 세그먼트는 재배열된 V/D/J 서열을 형성하기 위해 재배열할 수 없는 설치류.
- 제20 항 내지 제25 항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 내인성 ADAM6 유전자의 결실을 포함하고 이소성 마우스 ADAM6 유전자를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 설치류.
- 제20 항 내지 제26 항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류는 마우스 또는 래트로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 설치류.
- (a) 수컷 설치류에서 내인성 ADAM6 활성의 감소 또는 제거를 일으키는 설치류 중쇄 면역글로불린 자리의 제1 변형을 만드는 단계로서, 제1 변형은 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트, 하나 이상의 사람 JL 유전자 세그먼트, 및 이들의 조합으로부터 선택된 유전자 세그먼트의 삽입을 포함하는 단계; 및
(b) 설치류에게 수컷 설치류에서 기능적인 ADAM6 활성을 부여하는 핵산 서열을 설치류에게 추가하기 위한 제2 변형을 만드는 단계를 포함하는, 설치류의 중쇄 면역글로불린 자리를 변형시키는 방법. - 제28 항에 있어서, 제1 변형은 하나 이상의 VL 및 하나 이상의 JL 유전자 세그먼트로 재배열할 수 있는 하나 이상의 사람 DH 유전자 세그먼트의 삽입을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제28 항에 있어서, 하나 이상의 VL 유전자 세그먼트 및 하나 이상의 사람 JL 유전자 세그먼트는 Vκ 및 Jκ 유전자 세그먼트 또는 Vλ 및 Jλ 유전자 세그먼트인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제28 항 내지 제30 항 중 어느 한 항에 있어서, 설치류에게 수컷 설치류에서 기능적인 ADAM6 활성을 부여하는 핵산 서열은 하나 이상의 사람 VL 유전자 세그먼트 및/또는 하나 이상의 사람 JL 유전자 세그먼트와 인접한 것을 특징으로 하는 방법.
- 제28 항 내지 제31 항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및 제2 변형은 단일 ES 세포에서 만들어지고, 단일 ES 세포는 설치류를 만들기 위해 숙주 배아로 도입되는 것을 특징으로 하는 방법.
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