JP2021137030A - Vlドメインを含む重鎖を発現するヒト化齧歯動物 - Google Patents
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Abstract
Description
免疫グロブリン軽鎖可変ドメインと融合している免疫グロブリン重鎖定常領域を含むヒト免疫グロブリン様結合タンパク質を発現する遺伝子改変された非ヒト妊性動物の他、軽鎖定常ドメインに融合している免疫グロブリン軽鎖可変ドメインおよび重鎖定常ドメインに融合している免疫グロブリン軽鎖可変ドメインを有する結合タンパク質が提供される。機能的ADAM6タンパク質をコードする核酸配列を含む遺伝子改変されたマウス、細胞、胚、および組織が記載され、該マウス、細胞、胚、および組織は、1つまたは複数の非ヒト免疫グロブリン重鎖定常遺伝子に作動可能に連結したヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントを含む。改変は、ヒトおよび/またはヒト化免疫グロブリン遺伝子座を含む。ADAM6機能を含むマウスは、ADAM6タンパク質をコードする異所性核酸配列を含むマウスを含むと記載される。内因性マウス免疫グロブリンVH領域遺伝子座の遺伝子改変を含み、且つさらにADAM6活性を含む遺伝子改変された雄マウスは、該雄マウスに妊性を回復させるかまたは維持させる異所性核酸配列を含むマウスを含むと記載される。例示的な妊性は、野生型マウスに匹敵する妊性である。
過去二十年にわたって、抗体の薬学的適用は、ヒト治療薬としての使用に好適である抗体の作製の多大な研究を喚起した。ヒトへとマウス抗体を反復して投与することは、長期処置レジメンを混乱させ得る免疫原性の問題を生じさせる結果となるので、マウス抗体に基づく初期抗体治療薬は、ヒト治療薬として理想的ではなかった。マウス抗体をよりヒトらしくし、あまりマウス様にしないようなマウス抗体のヒト化に基づく解決策が開発された。その後、抗体に使用するためのヒト免疫グロブリン配列を発現するための方法が続き、これらは、主として、ファージ、細菌または酵母におけるヒト免疫グロブリンライブラリのin vitro発現に基づくものであった。最終的に、ヒト造血細胞を生着させたマウスにおいて、および内因性免疫グロブリン遺伝子座が無能化された染色体導入マウスまたはトランスジェニックマウスにおいて、in vitroでヒトリンパ球から有用なヒト抗体を作製する試みがなされた。
あるヌクレオチド配列の発現の結果として生ずる。
特定の実施形態では、例えば以下が提供される:
(項目1)
非ヒト動物であって、以下:
(a)1つまたは複数のヒトVL遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒトJL遺伝子セグメントの、非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域の上流への挿入、
(b)1つまたは複数のヒトVL遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒトJL遺伝子セグメントの、非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の上流への挿入、および
(c)ADAM6タンパク質またはその機能的断片をコードするヌクレオチド配列であって、該ADAM6タンパク質が異所性ADAM6核酸配列から発現するヌクレオチド配列を含む、
非ヒト動物。
(項目2)
前記非ヒト重鎖および/または軽鎖定常領域が、齧歯動物定常領域である、項目1に記載の非ヒト動物。
(項目3)
前記軽鎖定常領域がマウスCκである、項目1または2に記載の非ヒト動物。
(項目4)
前記非ヒト免疫グロブリン軽鎖定常領域の上流の前記ヒトVL遺伝子セグメントおよびヒトJL遺伝子セグメントがヒトVκ遺伝子セグメントおよびヒトJκ遺伝子セグメントである、先行する項目のいずれか1項に記載の非ヒト動物。
(項目5)
前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域の上流の前記ヒトVL遺伝子セグメントおよびヒトJL遺伝子セグメントがヒトVκ遺伝子セグメントおよびヒトJκ遺伝子セグメントである、先行する項目のいずれか1項に記載の非ヒト動物。
(項目6)
ADAM6タンパク質またはその機能的断片をコードする前記ヌクレオチド配列が、野生型非ヒトADAM6遺伝子座に比較して同じ場所に存在する、先行する項目のいずれか1項に記載の非ヒト動物。
(項目7)
ADAM6タンパク質またはその機能的断片をコードする前記ヌクレオチド配列が、免疫グロブリン遺伝子セグメント内に存在する、先行する項目のいずれか1項に記載の非ヒト動物。
(項目8)
前記免疫グロブリン遺伝子セグメントが、ヒトκ軽鎖遺伝子セグメントである、項目7に記載の非ヒト動物。
(項目9)
前記免疫グロブリン遺伝子セグメントが、前記非ヒト動物の内因性重鎖遺伝子セグメントである、項目7または8に記載の非ヒト動物。
(項目10)
前記非ヒト動物が、該非ヒト動物において免疫グロブリンVLドメインを形成するように再配列することができない、内因性免疫グロブリンVLおよび/またはJL遺伝子セグメントを含む、先行する項目のいずれか1項に記載の非ヒト動物。
(項目11)
(a)前記非ヒト動物の内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子座における1つまたは複数の再配列していないヒトVκ遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の再配列していないヒトJκ遺伝子セグメント、
(b)該非ヒト動物の内因性免疫グロブリン軽鎖遺伝子座における1つまたは複数の再配列していないヒトVκ遺伝子セグメントおよび1つまたは複数の再配列していないヒトJκ遺伝子セグメント
を含む遺伝子改変された非ヒト動物であって、ADAM6タンパク質またはその機能的断片を発現することができる、非ヒト動物。
(項目12)
項目1または11に記載の非ヒト動物由来の細胞。
(項目13)
前記細胞がB細胞である、項目12に記載の細胞。
(項目14)
項目13に記載のB細胞から生成されたハイブリドーマ。
(項目15)
前記非ヒト動物が齧歯動物である、項目12に記載の細胞。
(項目16)
前記齧歯動物がマウスおよびラットから選択される、項目15に記載の細胞。
(項目17)
(a)項目1または11に記載の非ヒト動物を、対象の抗原に曝露させる工程と;
(b)該非ヒト動物の1つまたは複数のBリンパ球を単離する工程であって、該1つまたは複数のBリンパ球が、対象の該抗原を結合するVL結合タンパク質を発現する、工程と;
(c)対象の該抗原を結合する該VL結合タンパク質のVLドメインをコードする核酸配列を同定する工程であって、該VL結合タンパク質が、ヒトVκドメインおよび非ヒト軽鎖定常ドメイン、ならびにヒトVκドメインおよび非ヒト重鎖定常ドメインを含む、工程と;
(d)(c)の該核酸配列を、ヒト免疫グロブリン定常領域核酸配列と共に用いて、対象の該抗原を結合するヒト抗原結合タンパク質を作製する工程とを含む、対象の抗原に結合する抗原結合タンパク質を作製するための方法が提供される。
(項目18)
前記VL結合タンパク質の非ヒト軽鎖定常領域がマウスCκであり、且つ前記非ヒト重鎖定常領域がマウス重鎖定常領域である、項目17に記載の方法。
(項目19)
前記非ヒト動物がマウスである、項目17または18に記載の方法。
(項目20)
非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結した1つまたは複数のヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントを含む齧歯動物であって、1つまたは複数のADAM6タンパク質を発現する、齧歯動物。
(項目21)
前記1つまたは複数のヒト免疫グロブリン軽鎖遺伝子セグメントがヒトVκ遺伝子セグメントおよびヒトJκ遺伝子セグメントである、項目20に記載の齧歯動物。
(項目22)
前記非ヒト免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子がマウスまたはラット重鎖定常領域遺伝子である、項目20または21に記載の齧歯動物。
(項目23)
前記免疫グロブリン重鎖定常領域遺伝子がCH1領域および/またはヒンジ領域を含む、項目20〜22のいずれか1項に記載の齧歯動物。
(項目24)
1つまたは複数の内因性免疫グロブリン重鎖遺伝子配列の欠失または置き換えを含む、項目20〜23のいずれか1項に記載の齧歯動物。
(項目25)
前記内因性VH遺伝子セグメント、DH遺伝子セグメント、およびJH遺伝子セグメントが、再配列したV/D/J配列を形成するように再配列することができない、項目20〜24のいずれか1項に記載の齧歯動物。
(項目26)
内因性ADAM6遺伝子の欠失を含み、且つ異所性マウスADAM6遺伝子をさらに含む、項目20〜25のいずれか1項に記載の齧歯動物。
(項目27)
マウスまたはラットから選択される、項目20〜26のいずれか1項に記載の齧歯動物。(項目28)
(a)雄齧歯動物において内因性ADAM6活性の低減または消失をもたらす齧歯動物重鎖免疫グロブリン遺伝子座の第1の改変を行う工程であって、該第1の改変が、1つまたは複数のヒトVL遺伝子セグメント、1つまたは複数のヒトJL遺伝子セグメント、およびそれらの組み合わせから選択される遺伝子セグメントの挿入を包含する、工程;ならびに
(b)雄齧歯動物において機能的であるADAM6活性を該齧歯動物に付与する核酸配列を該齧歯動物に付加するように第2の改変を行う工程
を含む、齧歯動物の重鎖免疫グロブリン遺伝子座を改変するための方法。
(項目29)
前記第1の改変が、1つまたは複数のVL遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のJL遺伝子セグメントと共に再配列することができる1つまたは複数のヒトDH遺伝子セグメントの挿入をさらに含む、項目28に記載の方法。
(項目30)
前記1つまたは複数のVL遺伝子セグメントおよび1つまたは複数のヒトJL遺伝子セグメントが、Vκ遺伝子セグメントおよびJκ遺伝子セグメント、またはVλ遺伝子セグメントおよびJλ遺伝子セグメントである、項目28に記載の方法。
(項目31)
雄齧歯動物において機能的であるADAM6活性を前記齧歯動物に付与する前記核酸配列が、前記1つまたは複数のヒトVL遺伝子セグメントおよび/または前記1つまたは複数のヒトJL遺伝子セグメントに近接している、項目28〜30のいずれか1項に記載の方法。
(項目32)
前記第1および前記第2の改変が、単一ES細胞において行われ、且つ該単一ES細胞が、前記齧歯動物を作製するために宿主胚へと導入される、項目28〜31のいずれか1項に記載の方法。
本発明は、記載する特定の方法および実験条件に限定されない。かかる方法および条件は変わることがあるからである。本発明の範囲を特許請求の範囲によって定義するので、本明細書において用いる専門用語は、特定の実施形態を説明することのみを目的としたものであり、限定することを意図したものではないことを理解されたい。
イトVLと組み合わせて)軽鎖を包含する。
from mice engineered with human Ig heavy and light chain YACs.Nat Genet 7:13−21;Lonberg,N.(2005)、Human antibodies from transgenic animals. Nat Biotechnol 23:1117−1125;Lonberg,N.ら(1994)Antigen−specific human antibodies from mice comprising four distinct genetic modifications、Nature 368:856−859;Jakobovitsら(2007)From XenoMouse technology to panitumumab,the first fully human antibody product from transgenic mice.Nat Biotechnol 25:1134−1143)。内因性マウス免疫グロブリン重鎖およびκ軽鎖遺伝子座は、これらのマウスにおいて、各内因性遺伝子座の小さいが重大な部分の標的欠失、続いて、上に記載したようなランダムに組み込まれた大きな導入遺伝子としての、またはミニ染色体としてのヒト免疫グロブリン遺伝子遺伝子座の導入により不活性化された(Tomizukaら(2000)、Double trans−chromosomic mice: maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies.PNAS USA 97:722−727)。かかるマウスは、遺伝子工学の重要な前進を象徴した;それらから単離された完全ヒトモノクローナル抗体は、様々なヒト疾患の処置に有望な治療的可能性をもたらした(Gibsonら(2006)、Randomized phase III trial results of panitumumab、a fully human anti−epidermal growth factor receptor monoclonal antibody,in
metastatic colorectal cancer、Clin Colorectal Cancer 6:29−31;Jakobovitsら、2007;Kimら(2007)Clinical efficacy of zanolimumab(HuMax−CD4):two Phase II studies in refractory cutaneous T−cell lymphoma.Blood 109(11):4655−62;Lonberg、2005;Makerら(2005)、Tumor regression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic T lymphocyte−associated antigen 4 blockade and interleukin 2:a phase I/II study、Ann Surg Oncol 12:1005−1016;McClungら(2006)、Denosumab in postmenopausal women with low bone
mineral density、N Engl J Med 354,821−831)。しかし、上で論じたように、これらのマウスは、野生型マウスと比較して、損なわれたB細胞発生および免疫不全を示す。かかる問題は、活発な体液性応答を維持するおよびしたがって一部の抗原に対する完全ヒト抗体を産生するマウスの能力を潜在的に制限する。上記不全は、(1)ヒト免疫グロブリン導入遺伝子のランダムな導入に起因する不十分な機能性、ならびに上流および下流制御要素の欠如に起因する結果としての不正確な発現(Garrettら(2005)、Chromatin architecture near a potential 3’end of the Igh locus involves modular regulation of histone modifications during B−Cell development and in vivo occupancy at CTCF sites.Mol Cell Biol 25:1511−1525;Manisら(2003)、Elucidation of a downstream boundary of the 3’IgH regulatory region、Mol Immunol 39:753−760;Pawlitzkyら(2006)、Identification of
a candidate regulatory element within the 5’flanking region of the mouse igh locus defined by pro−B cell−specific hypersensitivity associated with binding of PU.1, Pax5,and E2A.J Immunol 176I6839−685
1);(2)B細胞の正常な成熟、増殖および生存に要求されるシグナル伝達過程を害し得る、ヒト定常ドメインと細胞表面のB細胞受容体シグナル伝達複合体のマウス要素の間の非効率的種間相互作用(Hombachら(1990)、Molecular components of the B−cell antigen receptor complex of the IgM class、Nature.343,760−762);および(3)親和性選択(Raoら(2002)、Differential expression of the inhibitory IgG Fc receptor FcgammaRIIB on germinal center cells: implications for selection of high−affinity B cells.J Immunol 169,1859−1868)および免疫グロブリン血清濃度(Brambellら(1964)、A Theoretical Model of Gamma−Globulin Catabolism、Nature 203:1352−1354;JunghansおよびAnderson(1996)、The protection receptor for IgG catabolism is the beta2−microglobulin−containing neonatal intestinal transport receptor.PNAS USA 93,5512−5516;Raoら、2002;Hjelmら(2006)、Antibody−mediated regulation of the immune response.Scand J Immunol 64:177−184;Nimmerjahn and Ravetch(2007)、Fc−receptors as regulators of immunity.Adv Immunol 96,179−204)を低減させ得る、可溶性ヒト免疫グロブリンとマウスFc受容体の間の非効率的種間相互作用に起因し得る。これらの不全は、内因性重および軽鎖遺伝子座におけるその天然の場所の中のマウス免疫グロブリン遺伝子座の可変領域のみのin situヒト化によって修正することができる。これは、マウス定常領域の保持に基づきマウス環境で正常な相互作用および選択が可能であろう「逆キメラ」(すなわち、ヒトV:マウスC)抗体を作製するマウスを有効に生じさせる結果となるであろう。さらに、かかる逆キメラ抗体は、治療のために完全ヒト抗体に容易に再配列することができる。
いずれかの機能的ADAM6タンパク質を発現する能力を欠く雄マウスは、交配して子孫を産生する該マウスの能力の重篤な欠陥を示す。これらのマウスには、すべてのまたは実質的にすべてのマウス免疫グロブリン重鎖可変遺伝子セグメントをヒト軽鎖可変遺伝子セグメントで置き換えることによって機能的ADAM6タンパク質を発現する能力を欠く。ADAM6遺伝子座が、DH遺伝子セグメントの上流にあるVH遺伝子セグメント遺伝子座の3’端の近位の、上記内因性免疫グロブリン重鎖可変遺伝子遺伝子座の領域内にあるため、このADAM6機能の喪失が生ずる結果となる。すべてのまたは実質的にすべての内因性重鎖可変遺伝子セグメントの、ヒト軽鎖可変遺伝子セグメントでの置き換えに関してホモ接合性であるマウスを交配させるために、それぞれが該置き換えに関してホモ接合性であり、生産的交配を待つ雄と雌を供給することは、一般に厄介なアプローチである。好結果の同腹子は、比較的稀であり、平均同腹仔のサイズは非常に小さい。その代り、上記置き換えに関してヘテロ接合性の雄を用いて、上記置き換えに関してホモ接合性の雌と交配させて、上記置き換えに対してヘテロ接合性の後代を産生し、その後、それらからホモ接合型マウスを繁殖させた。上記雄マウスの妊性の喪失についての可能性のある原因は、ホモ接合型雄マウスにおける機能的ADAM6タンパク質の不在であると本発明者らは決定した。
mice)、カンガルーハムスター、ハムスター、新世界ラットおよびマウス、ハタネズミ、純種のマウスおよびラット(true mice and rat)、アレチネズミ、トゲマウス、タテガミネズミ、キノボリマウス、イワマウス、オジロキヌゲネズミ、マダガスカルラットおよびマウス、トゲヤマネ、デバネズミ、タケネズミ、モグラネズミ)のものであり、上記ADAM6オルソログもしくはホモログまたはその機能的断片は、齧歯目の動物、またはネズミ亜目の動物から選択される。
遺伝子ターゲティングの進展、例えば、細菌人工染色体(BAC)の開発により、今や、比較的大きいゲノム断片の組換えが可能である。BAC工学は、マウスES細胞に大きな欠失および大きな挿入を施すことをできるようにした。
本明細書で記載される結合タンパク質およびそれらをコードするヌクレオチド配列は、多重特異性結合タンパク質、例えば、二重特異性結合タンパク質を作製するのに用いることができる。この態様では、CH領域と融合している第1のVLドメインから本質的になる第1のポリペプチドが、CH領域と融合している第2のVLドメインから本質的になる第2のポリペプチドと会合することができる。上記第1のVLドメインと上記第2のVLドメインとが異なるエピトープに特異的に結合する場合は、その2つのVLドメインを用いて二重特異性結合分子を作製することができる。上記CH領域は、同じ場合もあり、異なる場合もある。一実施形態では、例えば、上記CH領域のうちの1つが、プロテインAに対する結合決定基を消失させるように改変され得る一方、他の重鎖定常領域は、そのように改変されない。この特定の配列は、例えば、ホモ二量体(例えば、上記第1のポリペプチドのホモ二量体または上記第2のポリペプチドのホモ二量体)の混合物からの二重特異性結合タンパク質の単離を単純化する。
ヒト軽鎖遺伝子セグメントの重鎖遺伝子座への導入
VELOCIGENE(登録商標)遺伝子操作技術(例えば、米国特許第6,586,251号、およびValenzuelaら(2003年)、「High−throughput engineering of the mouse genome coupled with high−resolution expression analysis」、Nat Biotechnol、21巻、652〜659頁を参照されたい)を用いて、マウスゲノムの細菌人工染色体(BAC)ライブラリーを改変するための多様なターゲティング構築物を作製した。再配列していないヒト生殖細胞系のκ軽鎖遺伝子配列の挿入(例えば、図2の上図を参照されたい)を確実にするために、マウスBAC DNAを相同組換えにより改変して、VH遺伝子セグメント、DH遺伝子セグメント、およびJH遺伝子セグメントの標的とした欠失を介してマウス内因性重鎖遺伝子座を不活化した。
標的とされたES細胞の同定および内因性重鎖遺伝子座にヒト軽鎖遺伝子セグメントを保有する遺伝子改変されたマウスの作製
マウスES細胞を電気穿孔して、VL結合タンパク質(すなわち、マウス重鎖定常領域に作動可能に連結したヒトκ軽鎖遺伝子セグメント)を発現するキメラマウスを生成するための、改変されたES細胞を創製するのに、上記の実施例で作製した、標的BAC DNAを用いる。再配列していないヒトκ軽鎖遺伝子セグメントの挿入を含有する、標的とされたES細胞は、定量的PCRアッセイであるTAQMAN(登録商標)により同定される(Lie,Y.S.およびPetropoulos,C.J.(1998年)Advances in quantitative PCR technology: 5’
nuclease assays. Curr Opin Biotechnol 9(1):43〜48頁)。ヒトκ配列および関連する選択カセットの挿入、マウス重鎖配列の喪失、および、内因性重鎖遺伝子座に隣接するマウス配列の保持を検出するために、特異的なプライマーセットおよびプローブをデザインする。
FLPe is an alternative to Cre−loxP.Nature Genetics 25:139−140;米国特許第6,774,279号参照)へ交配させることができる。必要に応じて、上記選択カセットは、上記マウスにおいて保持される。
VL結合タンパク質を発現するマウスの増殖
VL結合タンパク質の新規の生成を創出するために、上記再配列していないヒトκ遺伝子セグメントを保有するマウスを、反対側の(opposite)または標的としていない内因性重鎖対立遺伝子(すなわち、上記改変についてヘテロ接合性のマウス)の欠失を含有する別のマウスに交配させることができる。このようにすれば、得られる後代は、実施例1で記載したハイブリッド重鎖だけを発現する。交配は、当技術分野において認められている標準的な技法により実施するが、代替的には、企業、例えば、Jackson Laboratoryにより実施される。改変された
重鎖遺伝子座を保有するマウス系統を、ヒト軽鎖可変ドメインを含む固有の重鎖の存在についてスクリーニングする。
内因性可変領域遺伝子セグメント(すなわち、VDJ)が置き換えられている、および/または欠失している改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を有するマウスは、内因性ADAM6遺伝子の発現を欠く。特に、上記免疫グロブリン重鎖遺伝子座のそのような改変を含む雄マウスは、妊性の低減を明らかに示す。この実施例は、実施例1による改変重鎖遺伝子座を有するマウスへADAM6を発現する能力を再操作する(reengineer)ための2つの方法を明らかに示し、それにしたがって、通常の育種方法を用いて該改変マウス系統の維持を可能にする。
ヒトVκおよびJκ遺伝子セグメントを含有する改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を、BAC DNAを用いる相同組換えにより、マウスADAM6aおよびADAM6bをコードするゲノム断片を含有するように再操作した。これは、マウスADAM6遺伝子に近接したヒトVκおよびJκ遺伝子セグメントならびにマウス重鎖定常領域を含有する最終ターゲティングベクターを生じる、マウスおよびヒト配列を含有するBAC DNAの改変を含む一連の6工程においてVELOCIGENE(登録商標)遺伝子操作テクノロジー(上掲)によって達成された。
すべての上記内因性重鎖定常領域の上流に位置するヒトVκおよびJκ遺伝子セグメントを含有する改変免疫グロブリン重鎖遺伝子座を、BAC DNAを用いる相同組換えにより、マウスADAM6aおよびADAM6bをコードするゲノム断片を含有するように再操作した。これは、マウスADAM6遺伝子に近接したヒトVκおよびJκ遺伝子セグメントならびにマウス重鎖定常領域を含有する最終ターゲティングベクターを生じる、マウスおよびヒト配列を含有するBAC DNAの改変を含む一連の工程においてVELOCIGENE(登録商標)遺伝子操作テクノロジー(上掲)によって達成された。
BACクローンのヒトVκ遺伝子セグメントの5’側の位置にマウスADAM6遺伝子をコードするDNA断片を挿入した。上記VI444クローンは、5’から3’へ、固有のI−CeuI部位、上記CDSの5’側の751bpおよび3’側の4779bpを含むAdam6a遺伝子、Frtネオマイシン耐性カセット、上記CDSの5’側の290bpおよび3’側の1633bpを含むAdam6b遺伝子、ならびに固有のAscI部位を含有した(配列番号5)。ヒトVκ遺伝子セグメントの上流のマウスADAM6遺伝子の挿入のためのターゲティングベクターとして用いられた、結果として生じたBACクローンを、VI478と名付け、VI421およびVI422とは対照的に、VI478においてマウスADAM6遺伝子は逆配向に置かれている(すなわち、ヒトVκ遺伝子セグメントに対して同じ転写方向;図9)。上記ヒトVκ遺伝子セグメントの遠位末端におけるマウスADAM6遺伝子の挿入のための最終ターゲティングベクターは、5’から3’へ、約20kbのマウス遠位IgHホモロジーアーム、固有のAscI部位、マウスAdam6b、Frtネオマイシン耐性カセット、マウスAdam6a、固有のI−CeuI部位、およびヒトVκ2−40〜ヒトVκ3−25遺伝子セグメントを含有した。実施例1に従って改変された固有の重鎖遺伝子座での組換えおよびマウスADAM6遺伝子をコードするDNA断片の挿入を可能にするようにターゲティングベクター4(図2)で前もって改変されたES細胞へと、このターゲティングベクターを用いて電気穿孔した。陽性コロニーを、ネオマイシンを用いて選択した。
(上記の)最終ターゲティングベクターのそれぞれを用いて、マウスES細胞を電気穿孔し、ヒトVκおよびJκ遺伝子セグメントを含有する改変重鎖遺伝子座内にマウスADAM6aおよびADAM6b配列を含む、異所性に配置されたマウスゲノム配列を含む改変ES細胞を創製した。上記改変重鎖遺伝子座内に異所性マウスゲノム断片を含有する陽性ES細胞を、TAQMAN(商標)プローブを用いる定量的PCRアッセイにより同定した(LieおよびPetropoulos(1998)、上掲)。
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