CN106117364A - 表达包含vl结构域的重链的人源化啮齿动物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供了非人动物、组织、细胞和遗传物质，其包括内源性非人源重链免疫球蛋白序列的修饰并且包括在啮齿动物(例如小鼠)中具有功能的ADAM6活性，其中所述非人动物在重链恒定区背景下重排人源免疫球蛋白轻链基因区段并且表达免疫球蛋白样分子，所述免疫球蛋白样分子包括与重链恒定结构域融合的人源免疫球蛋白轻链可变结构域，其与同轻链恒定结构域融合的人源轻链可变结构域具有同源性。
Description
交叉引用
本申请为申请号为201380017544.2的中国申请的分案申请。
发明领域
本申请提供了基因修饰的具有生育能力的非人动物，所述动物表达人源免疫球蛋白样结合蛋白，所述结合蛋白含有与免疫球蛋白轻链可变结构域融合的免疫球蛋白重链恒定区，以及具有与轻链恒定结构域融合的免疫球蛋白轻链可变结构域和与重链恒定结构域融合的免疫球蛋白轻链可变结构域的结合蛋白。本申请描述了基因修饰的小鼠、细胞、胚胎和组织，其包括编码具有功能的ADAM6蛋白的核酸序列，其中所述小鼠、细胞、胚胎和组织包括与一个或多个非人源免疫球蛋白重链恒定基因可操作地连接的人源免疫球蛋白轻链基因区段。修饰包括人源和/或人源化的免疫球蛋白基因座。本申请描述了包括ADAM6功能的小鼠，包括含有编码ADAM6蛋白的异位核酸序列的小鼠。本申请描述了包括基因修饰的内源性小鼠免疫球蛋白VH区基因座并且还包括ADAM6活性的雄性小鼠，其包括含有恢复或维持雄性小鼠生育能力的异位核酸序列的小鼠。示例性的生育能力是与野生型小鼠相当的生育能力。
本申请提供了基因修饰的具有生育能力的非人动物，所述动物包括内源性ADAM6基因或者其同源物或直系同源物的缺失或修饰，并且所述动物包括全部或部分恢复ADAM6(或其同源物或直系同源物)功能的基因修饰，其中所述非人动物在重链恒定序列背景下表达人源免疫球蛋白轻链可变序列。本申请还提供了表达这种结合蛋白的细胞，制备其的啮齿动物(例如小鼠)以及相关的方法和组合物。
本申请描述了基因工程化的动物，所述动物表达包括与重链恒定区融合的轻链可变区的抗体，其中所述非人动物缺乏具有功能的内源性ADAM6基因但是保留ADAM6的功能，其包括含有内源性免疫球蛋白重链可变(VH)区基因座修饰的啮齿动物(例如小鼠)，所述修饰使得所述小鼠不能产生具有功能的ADAM6蛋白，结果导致生育能力丧失。本申请描述了基因修饰的小鼠，所述小鼠包括免疫球蛋白VH基因座，其特征为具有多个人源VL、JL和任选地DH基因区段或其组合，并且还包括ADAM6功能，其包括含有使雄性小鼠生育能力恢复的异位核酸序列的小鼠。所述基因修饰的小鼠表达缺乏重链可变结构域但是包括含有重排的轻链基因区段的可变结构域的抗体。
本申请提供了基因修饰的啮齿动物(例如小鼠)、细胞、胚胎和组织，其包括编码具有功能的ADAM6基因座的核酸序列，其中所述小鼠、细胞、胚胎和组织表达含有人源轻链可变结构域的免疫球蛋白重链。而且，所述小鼠、细胞、胚胎和组织缺乏具有功能的内源性ADAM6基因但是保留了ADAM6的功能，其特征为存在编码ADAM6蛋白的异位核酸序列。本申请提供了在具有生育能力的非人动物中制备用于结合抗原的抗体序列的方法。
背景
在过去的二十年中，抗体的药学应用为大量制备适用于人用疗法的抗体的研究起到了推波助澜的作用。基于小鼠抗体的早期抗体疗法并不是理想的人用疗法，因为重复给予人小鼠抗体后会导致免疫原性问题，这个问题可能会干扰长期治疗方案。基于将小鼠抗体人源化以使抗体更加像人并且更少像小鼠的解决方案被开发出来。表达供抗体使用的人源免疫球蛋白序列的方法随之产生，这大部分是基于人源免疫球蛋白文库在噬菌体、细菌或酵母中的体外表达。最后，尝试从体外的人源淋巴细胞中，从植入人源造血细胞的小鼠中以及从使内源性免疫球蛋白基因座丧失功能的转染色体或转基因小鼠中来制备有用的人源抗体。
为了制备这些小鼠，使内源性小鼠免疫球蛋白基因丧失功能是必要的，这使得随机整合的全人源转基因作为小鼠中所表达的免疫球蛋白库的来源。这种小鼠能够制备适合在人用疗法中使用的人源抗体，但是这些小鼠的免疫系统均存在严重的问题。这些问题导致一些实验障碍，例如小鼠无法产生足够多样性的抗体库，其需要使用大量再工程化的修复，可能是由于人与小鼠元件之间的不相容性提供了欠佳的克隆选择过程，以及使得这些小鼠无法成为真正用于制备人用疗法所需的大量和多样性群体的人源可变序列的可靠来源。
含有全人源抗体转基因的转基因小鼠包含随机插入的转基因，所述转基因包含与人源重链恒定序列连接的、未经重排的人源免疫球蛋白重链可变序列(V、D和J序列)以及与人源轻链恒定序列连接的、未经重排的人源免疫球蛋白轻链可变序列(V和J)。因此，当所述重排的抗体基因是全人源时，所述小鼠从内源性基因座以外的基因座产生重排的抗体基因。尽管已经报道了具有至少一些人源λ序列的小鼠，但是在通常情况下，所述小鼠含有人源重链序列和人源κ轻链序列。转基因小鼠通常具有损坏的和非功能性的内源性免疫球蛋白基因座，或者内源性免疫球蛋白基因座敲除，以使得所述小鼠不能在内源性免疫球蛋白基因座上重排人源抗体序列。这种转基因小鼠的变化莫测使其不能理想地在小鼠中产生足够多样性的人源抗体库，这可能至少部分是由于在内源性选择系统中连接全人源抗体分子的是欠佳的克隆选择过程以及由于改变这种小鼠的内源性基因组成而导致的有害作用。
在本领域中仍需要制备改进的基因修饰的非人动物，所述动物可用于生产免疫球蛋白序列(包括人源抗体序列)以及用于生产多样性的免疫球蛋白样分子库，所述免疫球蛋白样分子库显示出与常规抗体分子不同的多样性，并且同时降低或消除可能是由基因修饰引起的有害改变。还需要一种非人动物，所述动物能够重排免疫球蛋白基因区段以形成有用的经重排的免疫球蛋白基因，包括与在轻链恒定结构域背景下的人源免疫球蛋白轻链可变结构域同源的在重链恒定结构域背景下的人源免疫球蛋白轻链可变结构域，或者所述小鼠能够由改变的免疫球蛋白基因座来制备蛋白，所述免疫球蛋白基因座包括含有足够多样的人源轻链可变基因区段集合的基因座。仍需要一种非人动物，所述动物能够产生免疫球蛋白样结合蛋白，其中所述结合蛋白包括与重链恒定结构域连接的人源免疫球蛋白轻链可变结构域。
发明概述
本申请提供了一种具有免疫球蛋白基因座的基因修饰的非人动物，其中所述免疫球蛋白基因座包括可操作地与一个或多个非人源恒定区连接的多个人源轻链可变(VL)基因区段，例如人源Vκ和Jκ或人源Vλ和Jλ，并且在各种实施方式中，所述基因座缺乏编码内源性具有功能的ADAM6蛋白的序列。所述非人动物包括啮齿动物，例如小鼠和大鼠。
本申请提供了一种基因座，所述基因座能够重排和形成编码轻链可变结构域的基因，其来源于涉及人源轻链Vκ或Vλ基因区段和人源Jκ或Jλ基因区段的重排，并且在各种实施方式中，还涉及DH基因区段，其中在各种实施方式中，所述基因座缺乏内源性具有功能的ADAM6基因或其具有功能的片段。
本申请提供了一种经修饰的免疫球蛋白基因座，所述基因座包括缺乏内源性具有功能的ADAM6基因并且包括人源免疫球蛋白序列的基因座，例如可操作地与人源或者(或人源/非人源嵌合)非人源免疫球蛋白恒定序列(并且可操作地与例如V和/或J区段连接)连接的人源VL区段。本申请提供了经修饰的基因座，所述基因座包括多个VL基因区段和编码在非人动物中具有功能的ADAM6蛋白或其片段的异位核苷酸序列。本申请提供了经修饰的基因座，所述基因座包括多个VL基因区段，其可操作地与一个或多个DH区段和/或一个或多个JL或JH区段连接，可操作地与非人源免疫球蛋白恒定序列例如啮齿动物(例如小鼠或大鼠)或人源序列连接。本申请还提供了非人动物，所述非人动物包括这种人源化的基因座，其中所述非人动物显示出野生型的生育能力。
本申请提供了一种非人动物，所述非人动物包括免疫球蛋白重链可变基因座(例如在转基因上或者在内源性非人动物重链可变基因座作为插入或取代)，所述基因座包括可操作地与人源D和/或人源J基因区段连接的多个人源VL基因区段。在各种实施方式中，所述多个人源VL基因区段可操作地与在非人动物内源性免疫球蛋白重链可变基因座的一个或多个人源D和/或一个或多个人源J基因区段连接。在各种实施方式中，所述非人动物还包括编码ADAM6蛋白或其同源物或直系同源物的异位核苷酸序列，其在含有经修饰的重链基因座的雄性非人动物中具有功能。在各种实施方式中，所述异位核苷酸序列与至少一个人源VL区段、DH基因区段或JL基因区段相邻。在各种实施方式中，所述异位核苷酸序列与在非人动物基因组中的非免疫球蛋白序列相邻。在一个实施方式中，所述异位核苷酸序列与经修饰的重链基因座在相同的染色体上。在一个实施方式中，所述异位核苷酸序列与经修饰的重链基因座在不同的染色体上。
本申请提供了一种非人动物，所述非人动物在其免疫球蛋白重链可变区基因座被修饰以缺失全部或基本上全部的(例如全部具有功能的区段或几乎全部具有功能的区段)内源性免疫球蛋白VH区段并且其包括在非人动物的内源性免疫球蛋白重链可变区基因座可操作地与DH和J区段或JL基因区段连接的多个人源VL基因区段。本申请还提供了包括这种基因座并且缺乏内源性ADAM6基因的非人动物。
本申请提供了一种在非人动物中制备人源免疫球蛋白序列的方法。在各种实施方式中，所述人源免疫球蛋白序列来源于免疫球蛋白重链序列库，所述库包括重排的人源VL基因区段并且可操作地与免疫球蛋白重链恒定区(例如VL和一个或多个DH和J区段或一个或多个JL区段)连接。本申请提供了在非人动物、组织和细胞中制备人源免疫球蛋白序列的方法，其中所述人源免疫球蛋白序列与目标抗原结合。
在一个方面，本申请提供了用于制备包括修饰的啮齿动物(例如小鼠)的核酸构建体、细胞、胚胎、啮齿动物(例如小鼠)和方法，所述修饰包括使得内源性啮齿动物(例如小鼠)ADAM6蛋白或ADAM6基因不具有功能的修饰(例如敲除或缺失内源性ADAM6基因)，其中所述啮齿动物(例如小鼠)包括编码在同类的雄性啮齿动物(例如小鼠)中具有功能的ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或片段的核酸序列。在一个实施方式中，所述小鼠包括编码啮齿动物ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或具有功能的片段的异位核苷酸序列；在一个特定的实施方式中，所述啮齿动物ADAM6蛋白是小鼠ADAM6蛋白。在一个实施方式中，所述小鼠包括编码一个或多个啮齿动物ADAM6蛋白的异位核苷酸序列，其中所述一个或多个蛋白包括在小鼠中具有功能的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或其片段。
在各种方面，编码ADAM6活性的序列与人源免疫球蛋白序列相邻。在各种方面，编码ADAM6活性的序列与非人源免疫球蛋白序列相邻。在各种方面，所述序列与非人动物的内源性非人源免疫球蛋白重链基因座存在于相同的染色体上。在各种方面，所述序列与非人动物的免疫球蛋白重链基因座存在于不同的染色体上。
本申请描述了一种基因修饰的非人动物，所述动物包括可维持ADAM6基因或者其同源物或直系同源物活性的修饰，其中所述修饰包括在非人源免疫球蛋白重链恒定区上游插入一个或多个人源免疫球蛋白轻链基因区段，并且所述非人动物还包括某种修饰，所述修饰能够使其表达与人源免疫球蛋白轻链可变区具有同源性的人源免疫球蛋白轻链可变区。在各种方面，所述人源免疫球蛋白轻链可变区在轻链和重链恒定区背景下表达。
在各种方面，所述插入一个或多个人源免疫球蛋白轻链基因区段是在非人动物ADAM6基因的3’端或其下游进行。在各种方面，所述插入一个或多个人源免疫球蛋白轻链基因区段是以某种方式进行，使得非人动物的ADAM6基因不被破坏、缺失和/或功能性沉默，这样非人动物ADAM6的活性与不含这种插入的非人动物在相同或相当的水平。示例性的破坏、缺失和/或功能性沉默的修饰包括导致由非人动物DAM6基因编码的ADAM6蛋白的活性降低、消除和/或丧失的任意修饰。
在一个方面，本申请提供了用于制备包括内源性免疫球蛋白基因座的修饰的小鼠的核酸构建体、细胞、胚胎、小鼠和方法，其中所述小鼠包括在雄性小鼠中具有功能的ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或片段。在一个实施方式中，所述内源性免疫球蛋白基因座是免疫球蛋白重链基因座，并且所述修饰降低或消除雄性小鼠细胞或组织的ADAM6活性。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括编码小鼠ADAM6或者其直系同源物或同源物或功能性片段的异位核苷酸序列；本申请还提供了一种小鼠，所述小鼠包括编码小鼠ADAM6或者其直系同源物或同源物或功能性片段的内源性核苷酸序列，以及至少一个基因修饰的重链免疫球蛋白基因座。在一个实施方式中，编码小鼠ADAM6或者其直系同源物或同源物或功能性片段的内源性核苷酸序列与野生型小鼠的内源性ADAM6基因相比位于异位位置。
在一个方面，本申请提供了制备小鼠的方法，所述小鼠包括修饰的内源性免疫球蛋白基因座，其中所述小鼠包括在雄性小鼠中具有功能的ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或片段。在各种实施方式中，所述修饰包括在内源性免疫球蛋白基因座插入一个或多个人源VL基因区段。
在一个方面，本申请提供了制备小鼠的方法，所述小鼠包括基因修饰的重链免疫球蛋白基因座，其中应用所述方法得到包括经修饰的重链免疫球蛋白基因座(或使其缺失)的雄性小鼠，并且所述雄性小鼠能够通过交配产生后代。在一个实施方式中，所述雄性小鼠能够生产精子，所述精子可以从小鼠的子宫进入小鼠的输卵管使小鼠的卵子受精。
在一个方面，本申请提供了一种制备小鼠的方法，所述小鼠包括基因修饰的免疫球蛋白重链基因座和免疫球蛋白轻链基因座，其中应用所述方法修饰重链基因座使得雄性小鼠显示出降低的生育能力，并且所述小鼠包括使降低的生育能力全部或部分恢复的基因修饰。在各种实施方式中，生育能力降低的特征为雄性小鼠的精子不能从小鼠的子宫迁移至小鼠的输卵管使小鼠的卵子受精。在各种实施方式中，生育能力降低的特征为精子显示出体内迁移缺陷。在各种实施方式中，使降低的生育能力全部或部分恢复的基因修饰是编码在雄性小鼠中具有功能的小鼠ADAM6基因或者其直系同源物或同源物或片段的核酸序列。
在一个实施方式中，所述基因修饰包括使用另一物种(例如不是小鼠的物种)的免疫球蛋白轻链可变基因座来取代内源性免疫球蛋白重链可变基因座。在一个实施方式中，所述基因修饰包括将另一物种(例如不是小鼠的物种)的免疫球蛋白轻链可变基因座插入内源性免疫球蛋白重链可变基因座。在一个特定的实施方式中，所述物种是人。在一个实施方式中，所述基因修饰包括内源性免疫球蛋白重链可变基因座的全部或部分缺失，其中所述缺失导致内源性ADAM6功能的丧失。在一个特定的实施方式中，内源性ADAM6功能的丧失与雄性小鼠生育能力的降低相关。
在一个实施方式中，所述基因修饰包括内源性非人源免疫球蛋白重链可变基因座的全部或部分失活，其中所述失活不会导致内源性ADAM6功能的丧失。失活可以包括一个或多个内源性非人源基因区段的取代或缺失，以使得内源性非人源免疫球蛋白重链基因座基本上不能重排以编码包括内源性非人源基因区段的抗体重链。失活可以包括使得内源性免疫球蛋白重链基因座不能重排以编码抗体重链的其他修饰，其中所述修饰不包括内源性基因区段的取代或缺失。示例性的修饰包括通过分子技术介导的染色体翻转和/或转位，例如使用位点特异性重排位点的精确放置(例如Cre-lox技术)。其他的示例性修饰包括使非人源免疫球蛋白可变基因区段与非人源免疫球蛋白恒定区之间不能可操作地连接。
在一个实施方式中，所述基因修饰包括将DNA片段插入非人动物的基因组，所述DNA片段包括可操性地与一个或多个恒定区序列(例如IgM和/或IgG基因)连接的另一物种(例如不是小鼠的物种)的一个或多个人源VL基因区段和一个或多个人源JL基因区段，以及任选地一个或多个人源DH基因区段。在一个实施方式中，所述DNA片段能够在非人动物的基因组中重排以形成编码可操作地与重链恒定区连接的轻链可变结构域的序列。在一个实施方式中，所述物种是人。在一个实施方式中，所述基因修饰包括将一个或多个人源免疫球蛋白轻链基因区段插入到非人动物内源性ADAM6基因的下游或3’端，以使得ADAM6活性(例如编码蛋白的表达和/或功能)与不包括该插入的非人动物相同或相当。
在一个方面，本申请提供了一种制备小鼠的方法，所述小鼠包括基因修饰的免疫球蛋白重链基因座，其中应用所述方法得到包括经修饰的免疫球蛋白重链基因座(或其缺失)的雄性小鼠，并且所述雄性小鼠显示出生育能力降低，并且所述小鼠包括使降低的生育能力全部或部分恢复的基因修饰。在各种实施方式中，所述生育能力降低表征为雄性小鼠的精子不能由小鼠的子宫迁移至小鼠的输卵管以使小鼠的卵子受精。在各种实施方式中，所述生育能力降低表征为精子显示出在体内的迁移缺陷。在各种实施方式中，使降低的生育能力全部或部分恢复的基因修饰是编码在雄性小鼠中具有功能的小鼠ADAM6基因或其直系同源物和或同源物或片段的核酸序列。
在一个实施方式中，所述基因修饰包括使用免疫球蛋白轻链可变基因座，例如一个或多个轻链可变(VL)基因区段、一个或多个重链多样性(DH)基因区段和一个或多个连接(J)基因区段或者另一物种(例如不是小鼠的物种的)的一个或多个轻链连接(JL)基因区段，取代内源性免疫球蛋白重链可变基因座。在一个实施方式中，所述基因修饰包括将单一直系同源的免疫球蛋白轻链可变基因座VL基因区段、至少一个DH基因区段和至少一个J基因区段或至少一个JL基因区段插入内源性免疫球蛋白重链可变基因座。在一个特定的实施方式中，所述物种是人。在一个实施方式中，所述基因修饰包括内源性免疫球蛋白重链可变基因座全部或部分缺失，其中所述缺失使得内源性ADAM6的功能丧失。在一个特定的实施方式中，所述内源性ADAM6的功能丧失与雄性小鼠的生育能力降低相关。在一个实施方式中，所述基因修饰包括内源性免疫球蛋白重链可变基因座全部或部分失活，其中所述缺失不会导致内源性ADAM6的功能丧失。失活可以包括一个或多个内源性基因区段致使内源性免疫球蛋白重链基因座基本上不能重排以编码包括内源性基因区段的抗体的重链的取代或缺失。失活可以包括其他致使内源性免疫球蛋白重链不能重排以编码抗体的重链的修饰，其中所述修饰不包括内源性基因区段的取代或缺失。示例性的修饰包括染色体倒置和/或改变，其使得重链基因座不能可操作地与一个或多个内源性恒定区连接。
在一个实施方式中，所述基因修饰包括将DNA片段插入小鼠的基因组，所述DNA片段含有可操作地与一个或多个恒定区序列(例如IgM和/或IgG基因)连接的一个或多个人源VL基因区段、一个或多个J基因区段和任选地一个或多个另一物种(例如不是小鼠的物种)的D基因区段。在各种实施方式中，所述J基因区段包括JH或JL基因区段。在一个实施方式中，所述DNA片段能够重排以形成编码抗体的重链的序列，其中所述重链包括与重链恒定区融合的重排的人源轻链可变基因区段。在一个实施方式中，所述基因修饰包括向小鼠基因组插入至少6个、至少16个、至少30个或至少40个或更多的人源VL基因区段和至少1个或至少5个人源JL基因区段。在一个特定的实施方式中，所述物种是人源并且所述基因区段是人源κ轻链基因区段。在一个实施方式中，所述基因修饰包括全部或部分缺失内源性免疫球蛋白重链可变基因座以使得内源性免疫球蛋白重链基因座不具有功能，其中所述缺失还使得内源性ADAM6的功能丧失。在一个特定的实施方式中，所述内源性ADAM6功能的丧失与雄性小鼠的生育能力降低相关。
在一个方面，本申请提供了包括修饰的小鼠，所述修饰降低或消除从内源性ADAM6等位基因表达小鼠ADAM6，以使得由于内源性ADAM6功能的降低或消除，具有该修饰的雄性小鼠显示出降低的生育能力(例如通过交配产生后代的能力大大降低)，或者基本上是不育的，其中所述小鼠还包括异位ADAM6序列或者其同源物或直系同源物或功能性片段。在一个方面，所述降低或消除小鼠ADAM6表达的修饰是在小鼠免疫球蛋白基因座的修饰(例如插入、缺失、取代等)。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白基因座是免疫球蛋白重链基因座。
在一个实施方式中，ADAM6功能的降低或丧失包括小鼠不能或基本上不能产生可以从小鼠子宫进入小鼠输卵管使小鼠卵子受精的精子。在一个特定的实施方式中，在小鼠的一次射精体积中至少约95％、96％、97％、98％或99％的精子细胞在交配后在体内不能进入输卵管并使小鼠的卵子受精。
在一个实施方式中，ADAM6功能的降低或丧失包括在小鼠的精子细胞表面不能形成或基本上不能形成ADAM2和/或ADAM3和/或ADAM6的复合物。在一个实施方式中，ADAM6功能的丧失包括基本上不能通过与雌性小鼠交配来使小鼠的卵子受精。
在一个方面，本申请提供了某种小鼠，所述小鼠缺乏功能性内源性ADAM6基因，但是包括使小鼠具有ADAM6功能的蛋白(或者编码蛋白的异位核苷酸序列)。在一个实施方式中，所述小鼠是雄性小鼠，并且所述功能包括与缺乏功能性内源性ADAM6基因的小鼠相比具有增强的生育能力。
在一个实施方式中，所述蛋白由位于小鼠生殖细胞系免疫球蛋白基因座中的基因组序列编码。在一个特定的实施方式中，所述免疫球蛋白基因座是重链基因座。在另一个特定的实施方式中，所述重链基因座包括至少一个人源VH、至少一个人源DH和至少一个人源JH基因区段。在另一个特定的实施方式中，所述重链基因座包括至少一个人源VL和至少一个人源JL基因区段。在另一个特定的实施方式中，所述重链基因座包括至少一个人源VL、至少一个人源DH和至少一个人源JL。在另一个特定的实施方式中，所述重链基因座包括至少一个人源VL、至少一个人源DH和至少一个人源JH基因区段。在另一个特定的实施方式中，所述重链基因座包括至少一个人源VL和至少一个人源JL基因区段。在另一个特定的实施方式中，所述重链基因座包括至少一个人源VL和至少一个人源JH基因区段。在另一个特定的实施方式中，所述重链基因座包括6个人源Vκ和5个人源Jκ基因区段。在另一个特定的实施方式中，所述重链基因座包括16个人源Vκ和5个人源Jκ基因区段。在另一个特定的实施方式中，所述重链基因座包括30个人源Vκ和5个人源Jκ基因区段。在另一个特定的实施方式中，所述重链基因座包括40个人源Vκ和5个人源Jκ基因区段。
在一个实施方式中，所述异位蛋白由小鼠生殖细胞系非免疫球蛋白基因座中的基因组序列编码。在一个实施方式中，所述非免疫球蛋白基因座是具有转录活性的基因座。在一个特定的实施方式中，所述具有转录活性的基因座是ROSA基因座。在一个特定的实施方式中，所述具有转录活性的基因座与组织特异性表达相关。在一个实施方式中，所述组织特异性表达存在于生殖组织中。在一个实施方式中，所述蛋白由随机插入小鼠生殖细胞系中的基因组序列编码。
在一个实施方式中，所述小鼠包括人源或嵌合的人源/小鼠或嵌合的人源/大鼠轻链(例如人源可变、小鼠或大鼠恒定)和嵌合的人源可变/小鼠或大鼠恒定重链。在一个特定的实施方式中，所述小鼠包括转基因，所述转基因包含与具有转录活性的启动子(例如ROSA26启动子)可操作地连接的嵌合的人源可变/大鼠或小鼠恒定轻链基因。在进一步特定的实施方式中，在小鼠生殖细胞系中的所述嵌合的人源/小鼠或大鼠轻链转基因包括重排的人源轻链可变区序列。
在一个实施方式中，所述异位核苷酸序列位于小鼠生殖细胞系的免疫球蛋白基因座中。在一个特定的实施方式中，所述免疫球蛋白基因座是重链基因座。在一个实施方式中，所述重链基因座包括至少一个人源VL和至少一个人源JL基因区段。在一个特定的实施方式中，所述重链基因座包括至少6个和至多40个人源Vκ基因区段，以及5个人源Jκ基因区段。在一个实施方式中，所述异位核苷酸序列位于小鼠生殖细胞系的非免疫球蛋白基因座中。在一个实施方式中，所述非免疫球蛋白基因座是具有转录活性的基因座。在一个特定的实施方式中，所述具有转录活性的基因座是ROSA26基因座。在一个实施方式中，所述异位核苷酸序列在随机位置插入小鼠的生殖细胞系中。
在一个方面，本申请提供了一种缺乏功能性内源性ADAM6基因的小鼠，其中所述小鼠包括对小鼠ADAM6功能的缺失进行补偿的异位核苷酸序列。在一个实施方式中，所述异位核苷酸序列使小鼠生育后代的能力与包含功能性内源ADAM6基因的野生型小鼠相当。在一个实施方式中，所述序列使小鼠具有在小鼠的精子细胞表面形成ADAM2和/或ADAM3和/或ADAM6复合物的能力。在一个实施方式中，所述序列使小鼠能够从小鼠子宫通过小鼠输卵管到小鼠的卵子以使小鼠的卵子受精。
在一个实施方式中，缺乏功能性内源性ADAM6基因并且包括异位核苷酸序列的小鼠产生在六个月时间段内同龄和同品系的野生型小鼠至少约50％、60％、70％、80％或90％的整窝胎仔数。
在一个实施方式中，所述缺乏功能性内源性ADAM6基因并且包括异位核苷酸序列的小鼠当在六个月时间段内交配时，与同龄和相同或类似品系但缺乏功能性内源性ADAM6基因并且缺乏异位核苷酸序列的小鼠在基本上相同的时间段和基本上相同的条件下交配相比，产生至少约1.5倍、约2倍、约2.5倍、约3倍、约4倍、约6倍、约7倍、约8倍或约10倍或者更多的后代。
在一个实施方式中，所述缺乏功能性内源性ADAM6基因并且包括异位核苷酸序列的小鼠在4个月或6个月的交配期内，与缺乏功能性内源性ADAM6基因并且缺乏异位核苷酸序列且交配时间段相同的小鼠相比，产生的平均窝胎仔数高至少约2倍、3倍或4倍。
在一个实施方式中，所述缺乏功能性内源性ADAM6基因并且包括异位核苷酸序列的小鼠是雄性小鼠，并且所述雄性小鼠产生的精子，当在交配后约5-6小时从输卵管中回收时反映的输卵管迁移，与缺乏功能性内源性ADAM6基因并且缺乏异位核苷酸序列的小鼠相比，为其至少10倍、至少20倍、至少30倍、至少40倍、至少50倍、至少60倍、至少70倍、至少80倍、至少90倍、100倍、110倍或120倍或者更高。
在一个实施方式中，所述缺乏功能性内源性ADAM6基因并且包括异位核苷酸序列的小鼠，当与雌性小鼠交配时产生的精子能够在约6小时内以同野生型小鼠的精子大致相同的效率通过子宫并且进入和通过输卵管。
在一个实施方式中，所述缺乏功能性内源性ADAM6基因并且包括异位核苷酸序列的小鼠，与缺乏功能性ADAM6基因并且缺乏异位核苷酸序列的小鼠相比，在相当的时间段内产生约1.5倍、约2倍、约3倍或约4倍或者更多的整窝胎仔。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠在其生殖细胞系中包括编码免疫球蛋白的非小鼠核酸序列，其中所述非小鼠免疫球蛋白序列包括插入小鼠ADAM6基因或者其同源物或直系同源物或功能性片段。在一个实施方式中，所述非小鼠免疫球蛋白序列包括人源免疫球蛋白序列。在一个实施方式中，所述序列包括人源免疫球蛋白重链序列。在一个实施方式中，所述序列包括人源免疫球蛋白轻链序列。在一个实施方式中，所述序列包括与人源轻链序列邻近的人源重链序列。在一个实施方式中，所述序列包括一个或多个V基因区段、一个或多个D基因区段和一个或多个J基因区段；在一个实施方式中，所述序列包括一个或多个V基因区段和一个或多个J基因区段。在一个实施方式中，所述一个或多个V、D和J基因区段或者一个或多个V和J基因区段是未经重排的。在一个实施方式中，所述一个或多个V、D和J基因区段，或者一个或多个V和J基因区段是经过重排的。在一个实施方式中，在一个或多个V、D和J基因区段或者一个或多个V和J基因区段重排后，所述小鼠在其基因组中包括至少一个编码小鼠ADAM6基因或者其同源物或直系同源物或功能性片段的核酸序列。在一个实施方式中，重排后所述小鼠在其基因组中包括至少两个编码小鼠ADAM6基因或者其同源物或直系同源物或功能性片段的核酸序列。在一个实施方式中，重排后所述小鼠在其基因组中包括至少一个编码小鼠ADAM6基因或者其同源物或直系同源物或功能性片段的核酸序列。在一个实施方式中，所述小鼠在B细胞中包括ADAM6基因或者其同源物或直系同源物或功能性片段。在一个实施方式中，所述小鼠在非B细胞中包括ADAM6基因或者其同源物或直系同源物或功能性片段。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠表达来自内源性免疫球蛋白重链基因座的人源免疫球蛋白重链可变区或其功能性片段，其中所述小鼠包括在雄性小鼠中具有功能的ADAM6活性。在一个实施方式中，所述重链基因座包括一个或多个人源VL基因区段和一个或多个JL基因区段以及任选地一个或多个DH基因区段。在一个实施方式中，所述重链基因座包括至少6个人源Vκ基因区段和5个人源Jκ基因区段。在一个实施方式中，所述重链基因座包括至少16个人源Vκ基因区段和5个人源Jκ基因区段。在一个实施方式中，所述重链基因座包括至少30个人源Vκ基因区段和5个人源Jκ基因区段。在一个实施方式中，所述重链基因座包括至少40个人源Vκ基因区段和5个人源Jκ基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠表达来自内源性免疫球蛋白重链基因座的人源免疫球蛋白轻链可变区或其功能性片段，其中所述小鼠包括在雄性小鼠中具有功能的ADAM6活性。
在一个实施方式中，所述雄性小鼠在内源性ADAM6基因座包括单一未经修饰的内源性ADAM6等位基因或者其直系同源物或同源物或功能性片段。
在一个实施方式中，所述雄性小鼠包括编码具有ADAM6功能的蛋白的异位小鼠ADAM6序列或者其同源物或直系同源物或功能性片段。
在一个实施方式中，所述雄性小鼠在小鼠基因组中的一个位置包括ADAM6序列或者其同源物或直系同源物或功能性片段，该位置大致在内源性ADAM6等位基因的位置，例如最后一个V基因区段序列的3’端和初始J基因区段的5’端。
在一个实施方式中，所述雄性小鼠在小鼠基因组中的一个位置包括ADAM6序列或者其同源物或直系同源物或功能性片段，所述位置不同于内源性ADAM6等位基因，例如V基因座最5’-端的V基因区段序列的5’端。
在一个实施方式中，所述雄性小鼠在编码免疫球蛋白V基因区段和/或免疫球蛋白J基因区段的核酸序列的上游、下游或者上游和下游(相对于ADAM6序列的转录方向)的翼侧包括ADAM6序列或者其同源物或直系同源物或功能性片段。在一个特定的实施方式中，所述免疫球蛋白V和J基因区段是人源基因区段。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白V和J基因区段是人源基因区段，并且在小鼠中具有功能的编码小鼠ADAM6或者其直系同源物或同源物或片段的序列位于人源V和J基因区段之间；在一个实施方式中，所述小鼠包括两个或多个人源V基因区段，并且所述序列位于人源V基因区段最5’端的5’位置；在一个实施方式中，所述小鼠包括两个或多个人源V基因区段，并且所述序列位于最后一个V基因区段和倒数第二个V基因区段之间；在一个实施方式中，所述小鼠包括多个人源V基因区段，并且所述序列位于人源V基因区段最5’端的上游位置，所述小鼠还包括D基因区段，并且所述序列位于V基因区段的最3’端和D基因区段的最5’端；在一个实施方式中，所述序列位于V基因区段和J基因区段之间的位置。
在一个实施方式中，所述人源V基因区段是轻链V基因区段。在一个特定的实施方式中，所述轻链V基因区段是Vκ基因区段。在另一个特定的实施方式中，所述轻链V基因区段是Vλ基因区段。在一个实施方式中，所述J基因区段选自JH和JL基因区段。在一个特定的实施方式中，所述JL基因区段是Jκ基因区段。在另一个特定的实施方式中，所述JL基因区段是Jλ基因区段。
在一个实施方式中，所述雄性小鼠在内源性免疫球蛋白基因座的一个位置包括ADAM6序列或者其同源物或直系同源物或功能性片段，所述位置与在野生型雄性小鼠中相同或基本上相同。在一个特定的实施方式中，所述内源性基因座不能编码抗体的重链可变区，其中所述可变区包括或来源于内源性非人源基因区段。在一个特定的实施方式中，所述内源性基因座位于雄性小鼠基因组中的一个位置上，这使所述基因座的重链基因区段不能编码抗体的重链可变区。在各种实施方式中，所述雄性小鼠包括的ADAM6序列与人源免疫球蛋白基因区段位于相同的染色体上，并且所述ADAM6序列编码功能性ADAM6蛋白。
在一个方面，本申请提供了一种雄性小鼠，所述小鼠在其生殖细胞系中包括无功能的内源性ADAM6基因或者内源性ADAM6基因的缺失；其中所述小鼠的精子细胞能够进入雌性小鼠的输卵管并且使卵子受精。在一个实施方式中，所述小鼠包括在雄性小鼠中具有功能的小鼠ADAM6基因或者其直系同源物或同源物或功能性片段的染色体外拷贝。在一个实施方式中，所述小鼠包括在雄性小鼠中具有功能的异位小鼠ADAM6基因或者其直系同源物或同源物或功能性片段。
在一个方面，本申请提供了一种雄性小鼠，所述小鼠包括功能性内源性ADAM6基因以及内源性免疫球蛋白重链基因座的修饰。在一个实施方式中，所述修饰在内源性ADAM6基因或基因座的下游或3’端。在一个实施方式中，所述修饰使用一个或多个人源免疫球蛋白重链基因区段来取代一个或多个内源性免疫球蛋白轻链基因区段。在一个实施方式中，所述修饰是在内源性免疫球蛋白重链恒定区基因的上游插入一个或多个人源免疫球蛋白轻链基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括降低内源性ADAM6功能的基因修饰，其中所述小鼠包括至少一些ADAM6的功能，所述功能由具有全部或部分功能的内源性未经修饰的等位基因(例如杂合子)来提供，或者由编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6或者其直系同源物或同源物或功能性片段的异位序列表达来提供。在各种实施方式中，所述ADAM6或其直系同源物或同源物或功能性片段包括编码SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或其组合所示的ADAM6蛋白的核酸序列。
在一个实施方式中，与缺乏功能性ADAM6的雄性小鼠相比，所述小鼠包括的ADAM6功能足以使雄性小鼠能够通过交配产生后代。在一个实施方式中，所述ADAM6功能由存在编码小鼠ADAM6或者其同源物或直系同源物或功能片段的异位核苷酸序列赋予。在一个实施方式中，所述ADAM6功能由在内源性免疫球蛋白基因座中存在的内源性ADAM6基因赋予，其中所述小鼠不能表达包含内源性免疫球蛋白重链基因区段的抗体。在雄性小鼠中具有功能的ADAM6同源物或其直系同源物或片段包括使在缺乏足够内源性ADAM6活性的雄性小鼠中观察到的产生后代能力的丧失(例如在ADAM6敲除小鼠中观察到的能力的丧失)完全或部分恢复的那些ADAM6同源物或其直系同源物或片段。从这个意义上讲，ADAM6敲除小鼠包括含有内源性基因座或其片段但是其不具有功能的小鼠，即根本不表达ADAM6(ADAM6a和/或ADAM6b)，或者表达ADAM6(ADAM6a和/或ADAM6b)的水平不足以支持野生型雄性小鼠的基本的正常产生后代的能力。功能的丧失可能是由于例如对基因座结构基因(即ADAM6a或ADAM6b编码区)或者基因座调控区(例如在ADAM6a基因的5’端序列，或者ADAM6a或ADAM6b编码区的3’端，其中所述序列完全或部分控制ADAM6基因的转录、ADAM6RNA的表达或者ADAM6蛋白的表达)的修饰导致的。在各种实施方式中，在雄性小鼠中具有功能的其直系同源物或同源物或片段是能够使雄性小鼠的精子(或者雄性小鼠射精中的大部分精子细胞)进入小鼠输卵管并且使小鼠卵子受精的那些直系同源物或同源物或片段。
在一个实施方式中，表达人源免疫球蛋白可变区或其功能性片段的雄性小鼠包括足够的ADAM6活性，所述活性赋予了雄性小鼠通过与雌性小鼠交配产生后代的能力，并且在一个实施方式中，当与在一个实施方式中的雌性小鼠交配时，所述雄性小鼠显示出的产生后代的能力为具有一个或两个内源性未经修饰ADAM6等位基因小鼠的至少25％，在一个实施方式中至少30％，在一个实施方式中至少40％，在一个实施方式中至少50％，在一个实施方式中至少60％，在一个实施方式中至少70％，在一个实施方式中至少80％，在一个实施方式中至少90％以及在一个实施方式中大致是相同的。
在一个实施方式中，雄性小鼠表达足量的ADAM6(或者其直系同源物或同源物或功能性片段)使得雄性小鼠的精子细胞能够进入雌性小鼠的输卵管并且使小鼠的卵子受精。
在一个实施方式中，ADAM6的功能由与小鼠染色体序列邻近的(contiguous)核酸序列(例如核酸随机整合至小鼠染色体；或者位于特定位置，例如通过将核酸靶向至特定位置例如位点特异性重组酶介导的(例如Cre-介导的)插入或同源重组)所赋予。在一个实施方式中，ADAM6序列存在于与小鼠染色体不同的核酸上(例如ADAM6序列存在于游离基因上，即染色体外，例如在表达构建体、载体、YAC、转移染色体等中)。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠和细胞，其包括内源性重链免疫球蛋白基因座的修饰，其中所述小鼠表达至少一部分免疫球蛋白轻链序列，例如至少一部分人源序列，其中所述小鼠包括在雄性小鼠中具有功能的ADAM6活性。在一个实施方式中，所述修饰降低或消除小鼠的ADAM6活性。在一个实施方式中，所述小鼠被修饰，以使得编码ADAM6活性的两个等位基因要么不存在要么表达的ADAM6基本上不具有支持雄性小鼠正常交配的功能。在一个实施方式中，所述小鼠还包括编码小鼠ADAM6或者其直系同源物或同源物或功能性片段的异位核酸序列。在一个实施方式中，所述修饰维持小鼠的ADAM6活性并且使内源性免疫球蛋白重链基因座不能编码抗体的重链。在一个特定的实施方式中，包括染色体翻转和/或转位的修饰，该修饰使内源性免疫球蛋白重链基因座不能重排以编码抗体的重链可变区。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠和细胞，其包括内源性免疫球蛋白重链基因座的修饰，其中所述修饰降低或消除由基因座ADAM6序列所表达的ADAM6的活性，并且其中所述小鼠包括ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或功能性片段。在各种实施方式中，ADAM6蛋白或其片段由异位ADAM6序列编码。在各种实施方式中，ADAM6蛋白或其片段由内源性ADAM6等位基因表达。在各种实施方式中，所述小鼠包括含有第一修饰的第一重链等位基因，所述第一修饰降低或消除来自所述第一重链等位基因的功能性ADAM6的表达，以及所述小鼠包括含有第二修饰的第二重链等位基因，所述第二修饰基本上不降低或不消除来自第二重链等位基因表达的功能性ADAM6的表达。
在各种实施方式中，所述修饰是在内源性免疫球蛋白重链恒定区基因的上游或5’端插入一个或多个人源免疫球蛋白轻链基因区段。在各种实施方式中，所述修饰保持了位于内源性免疫球蛋白重链基因座的内源性ADAM6基因。
在一个实施方式中，所述第二修饰位于最后一个小鼠V基因区段的3’端(相对于小鼠V基因区段的转录方向)和小鼠(或嵌合的人/小鼠)免疫球蛋白重链恒定基因或其片段(例如编码人和/或小鼠：CH1和/或铰链和/或CH2和/或CH3的核酸序列)的5’端(相对于恒定序列的转录方向)。
在一个实施方式中，所述修饰是在编码第一ADAM6等位基因的第一基因座上的第一免疫球蛋白重链等位基因上，并且所述ADAM6功能来自于在编码功能性ADAM6的第二基因座上的第二免疫球蛋白重链等位基因上表达的内源性ADAM6，其中所述第二免疫球蛋白重链等位基因包括至少一个V、D和/或J基因区段的修饰。在一个特定的实施方式中，至少一个V、D和/或J基因区段的修饰是将其缺失，使用人源V、D和/或J基因区段取代，使用骆驼V、D和/或J基因区段取代，使用人源化或骆驼源化V、D和/或J基因区段取代，使用轻链序列取代重链序列，及其组合。在一个实施方式中，所述至少一个修饰是将一个或多个重链V、D和/或J基因区段缺失并且在重链基因座使用一个或多个轻链V和/或J基因区段(例如人源轻链V和/或J基因区段)取代。
在一个实施方式中，所述修饰是在第一基因座的第一免疫球蛋白重链等位基因和第二基因座的第二免疫球蛋白重链等位基因上，并且所述ADAM6功能来自于小鼠生殖细胞系中非免疫球蛋白基因座中异位ADAM6的表达。在一个特定的实施方式中，所述非免疫球蛋白基因座是ROSA26基因座。在一个特定的实施方式中，所述非免疫球蛋白基因座在生殖组织中具有转录活性。
在一个实施方式中，所述修饰是在第一基因座的第一免疫球蛋白重链等位基因和第二基因座的第二免疫球蛋白重链等位基因上，并且所述ADAM6功能来自于小鼠生殖细胞系中的内源性ADAM6基因。在一个特定的实施方式中，所述内源性ADAM6基因与小鼠免疫球蛋白重链基因区段是毗邻(juxtapose)的。
在一个实施方式中，所述修饰是在第一基因座的第一免疫球蛋白重链等位基因和第二基因座的第二免疫球蛋白重链等位基因上，并且所述ADAM6功能来自于在第一免疫球蛋白重链等位基因上异位ADAM6序列的表达。在一个实施方式中，所述修饰是在第一基因座的第一免疫球蛋白重链等位基因和第二基因座的第二免疫球蛋白重链等位基因上，并且所述ADAM6功能或活性来自于在第二免疫球蛋白重链等位基因上异位ADAM6的表达。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括杂合或纯合的ADAM6敲除。在一个实施方式中，所述小鼠还包括修饰的免疫球蛋白序列，所述序列是人源或人源化的免疫球蛋白序列，或者骆驼或骆驼源化的人源或小鼠免疫球蛋白序列。在一个实施方式中，所述经修饰的免疫球蛋白序列存在于内源性免疫球蛋白重链基因座。在一个实施方式中，所述经修饰的免疫球蛋白序列在内源性免疫球蛋白重链基因座上包括人源轻链可变区序列。在一个实施方式中，所述人源轻链可变区序列在内源性免疫球蛋白重链基因座上取代内源性重链可变序列。在一个实施方式中，所述经修饰的免疫球蛋白序列包括在内源性免疫球蛋白重链基因座的人源κ轻链可变区序列。在一个实施方式中，所述经修饰的免疫球蛋白序列包括在内源性免疫球蛋白重链基因座的人源λ轻链可变区序列。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠不能由内源性ADAM6基因座表达功能性内源性ADAM6。在一个实施方式中，所述小鼠包括在小鼠中具有功能的异位核酸序列，所述序列编码ADAM6或其功能性片段。在一个特定的实施方式中，所述异位核酸序列编码的蛋白挽救ADAM6敲除纯合子雄性小鼠显示出的产生后代能力的丧失。在一个特定的实施方式中，所述异位核酸序列编码小鼠ADAM6蛋白。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠缺乏功能性内源性ADAM6基因座，并且包括使其具有小鼠ADAM6功能的异位核酸序列。在一个实施方式中，所述核酸序列包括内源性ADAM6序列或其功能性片段。在一个实施方式中，所述内源性ADAM6序列包括在野生型小鼠最3’-端小鼠免疫球蛋白重链V基因区段(VH)和最5’-端小鼠免疫球蛋白重链D基因区段(DH)之间的ADAM6a-和ADAM6b-编码序列。
在一个实施方式中，核酸序列包括编码小鼠ADAM6a或其功能性片段的序列和/或编码小鼠ADAM6b或其功能性片段的序列，其中ADAM6a和/或ADAM6b或其功能性片段与启动子可操作地连接。在一个实施方式中，所述启动子是人源启动子。在一个实施方式中，所述启动子是小鼠ADAM6启动子。在一个特定的实施方式中，所述ADAM6启动子包括位于与小鼠最5’-端DH基因区段最接近的第一ADAM6基因的第一密码子和最5’-端DH基因区段的重组信号序列之间的序列，其中5’端是相对于小鼠免疫球蛋白基因的转录方向而言。在一个实施方式中，所述启动子是病毒启动子。在一个特定的实施方式中，所述病毒启动子是巨细胞病毒(CMV)启动子。在一个实施方式中，所述启动子是泛素启动子。
在一个实施方式中，所述启动子是可诱导的启动子。在一个实施方式中，所述可诱导的启动子在非生殖组织中调控表达。在一个实施方式中，所述可诱导的启动子在生殖组织中调控表达。在一个特定的实施方式中，在生殖组织中小鼠ADAM6a和/或ADAM6b序列或其功能性片段的表达受到可诱导的启动子的发育调控。
在一个实施方式中，所述小鼠ADAM6a和/或ADAM6b选自SEQ ID NO:1所示的ADAM6a和/或SEQ ID NO:2所示的ADAM6b序列。
在一个实施方式中，所述小鼠ADAM6启动子是SEQ ID NO:3所示的启动子。在一个特定的实施方式中，所述小鼠ADAM6启动子包括ADAM6a的第一密码子直接上游(相对于ADAM6a的转录方向)的SEQ ID NO:3所示的核酸序列并且延伸至ADAM6编码区上游SEQ IDNO:3的末端。在另一个特定实施方式中，所述ADAM6启动子是由ADAM6a起始密码子上游约5至约20个核苷酸以内延伸至ADAM6a起始密码子上游约0.5kb、1kb、2kb或3kb或者更大的片段。
在一个实施方式中，当将包括SEQ ID NO:3或其片段的核酸序列置于由于缺乏ADAM6而不育或生育能力降低的小鼠中时，小鼠的生育能力改善或生育能力大约恢复至野生型生育能力。在一个实施方式中，SEQ ID NO:3或其片段使雄性小鼠具有产生能够进入雌性小鼠的输卵管以使得小鼠卵子受精的精子细胞的能力。
在一个实施方式中，所述小鼠ADAM6启动子是SEQ ID NO:4所示的启动子。在一个特定的实施方式中，所述小鼠ADAM6启动子包括ADAM6a的第一密码子直接上游(相对于ADAM6a的转录方向)的SEQ ID NO:4所示的核酸序列并且延伸至ADAM6编码区上游的SEQ IDNO:4的末端。在另一个特定实施方式中，所述ADAM6启动子是自ADAM6a起始密码子上游约5至约20个核苷酸以内延伸至ADAM6a起始密码子上游约0.5kb、1kb、2kb或3kb或者更上游的片段。
在一个实施方式中，当将包括SEQ ID NO:4或其片段的核酸序列置于由于缺乏ADAM6而不育或生育能力降低的小鼠中时，小鼠的生育能力改善或生育能力大约恢复至野生型生育能力。在一个实施方式中，SEQ ID NO:4或其片段使雄性小鼠具有产生能够进入雌性小鼠的输卵管以使得小鼠卵子受精的精子细胞的能力。
在一个实施方式中，所述小鼠ADAM6启动子是SEQ ID NO:5所示的启动子。在一个特定的实施方式中，所述小鼠ADAM6启动子包括ADAM6a的第一密码子直接上游(相对于ADAM6a的转录方向)的SEQ ID NO:5所示的核酸序列并且延伸至ADAM6编码区上游的SEQ IDNO:5的末端。在另一个特定实施方式中，所述ADAM6启动子是自ADAM6a起始密码子上游约5至约20个核苷酸以内延伸至ADAM6a起始密码子上游约0.5kb、1kb、2kb或3kb或者更上游的片段。
在一个实施方式中，当将包括SEQ ID NO:5或其片段的核酸序列置于由于缺乏ADAM6而不育或生育能力降低的小鼠中时，小鼠的生育能力改善或生育能力大约恢复至野生型生育能力。在一个实施方式中，SEQ ID NO:5或其片段使雄性小鼠具有产生能够进入雌性小鼠的输卵管以使得小鼠卵子受精的精子细胞的能力。
在各种实施方式中，赋予小鼠ADAM6功能的异位核酸序列编码一个或多个ADAM6蛋白，其中所述一个或多个ADAM6蛋白包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或其组合。
在各种实施方式中，所述异位核酸序列包括选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQID NO:5的序列，其中所述异位核酸序列通过利用异位核酸序列编码的一个或多个ADAM6蛋白赋予小鼠ADAM6功能。
在一个实施方式中，所述核酸序列是编码ADAM6基因或其同源物或直系同源物或功能性片段的任意序列，当将其置于或保持在小鼠中时，产生的生育能力水平与野生型小鼠相同或相当。示例性的生育能力水平可以由雄性小鼠产生能够进入雌性小鼠的输卵管以使得小鼠卵子受精的精子细胞的能力所证实。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括编码ADAM6蛋白的内源性核苷酸序列的缺失，使用人源VH基因区段对内源性VH基因区段的取代和编码在雄性小鼠中具有功能的小鼠ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或片段的异位核苷酸序列。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括编码ADAM6蛋白的内源性核苷酸序列的缺失，使用人源VL基因区段对内源性VH基因区段的取代和编码在雄性小鼠中具有功能的小鼠ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物或片段的异位核苷酸序列。在一个实施方式中，所述人源VL基因区段是Vκ基因区段。在一个实施方式中，所述VL基因区段是Vλ基因区段。
在一个实施方式中，所述小鼠还包括人源JL基因区段，和位于人源VL基因区段和人源JL基因区段之间的编码在雄性小鼠中具有功能的小鼠ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物或片段的异位核苷酸序列。在一个实施方式中，所述小鼠包括一个或多个人源VL基因区段和一个或多个人源JL基因区段以及位于一个或多个人源VL基因区段上游(或5’)的编码在雄性小鼠中具有功能的小鼠ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物或片段的异位核苷酸序列。在一个特定的实施方式中，所述人源VL和JL基因区段是Vκ和Jκ基因区段。
在一个实施方式中，所述小鼠包括免疫球蛋白重链基因座，所述基因座包括含有内源性ADAM6基因的内源性免疫球蛋白基因座核苷酸序列的缺失，其包括编码一个或多个人源免疫球蛋白基因区段的核苷酸序列，并且其中编码小鼠ADMA6蛋白的异位核苷酸序列在编码一个或多个人源免疫球蛋白基因区段的核苷酸序列中或与之紧邻。
在一个实施方式中，所述小鼠包括全部或基本上全部的内源性VH基因区段被编码一个或多个人源VL基因区段的核苷酸序列取代，并且编码小鼠ADMA6蛋白的异位核苷酸序列在编码一个或多个人源VL基因区段的核苷酸序列中或与之紧邻。在一个实施方式中，所述小鼠还包括在内源性DH基因座的一个或多个内源性DL基因区段被一个或多个人源VL和/或人源JL基因区段取代。在一个实施方式中，所述小鼠还包括在内源性JH基因座的一个或多个内源性JH基因区段被一个或多个人源JL基因区段取代。在一个实施方式中，所述小鼠包括全部或基本上全部内源性VH、DH和JH基因区段并且在内源性VH、DH和JH基因座上被人源VL和JL基因区段取代，其中所述小鼠包括编码小鼠ADAM6蛋白的异位序列。在一个实施方式中，所述小鼠包括在内源性免疫球蛋白重链基因座插入一个或多个人源VL和JL基因区段，其中所述小鼠包括在小鼠中具有功能的ADAM6基因。在一个特定的实施方式中，所述人源VL和JL基因区段是Vκ和Jκ基因区段。在一个特定的实施方式中，所述编码小鼠ADAM6蛋白的异位序列位于人源VL基因区段最3’-端倒数第二个VL基因区段与人源JL基因区段的最5’端最后一个JL基因区段之间。在一个特定的实施方式中，编码小鼠ADAM6蛋白的所述异位序列位于人源VL基因区段最5’-端的VL基因区段上游(或5’)。在一个特定的实施方式中，所述小鼠包括全部或基本上全部小鼠VH基因区段的缺失，和至少40个人源VL基因区段的取代，并且编码小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列位于人源Vκ4-1基因区段的下游和人源Jκ1基因区段的上游。在一个特定的实施方式中，所述小鼠包括全部或基本上全部小鼠VH基因区段的缺失，和至少40个人源VL基因区段的取代，并且编码小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列位于人源Vκ2-40基因区段的上游。
在一个特定的实施方式中，所述小鼠包括全部或基本上全部的内源性VH基因区段被编码一个或多个人源VL基因区段的核苷酸序列取代，并且编码小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列在编码一个或多个人源VL基因区段的核苷酸序列中或与之紧邻。
在一个实施方式中，所述VL基因区段是Vκ基因区段。在一个实施方式中，所述VL基因区段是Vλ基因区段。
在一个实施方式中，编码小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列存在于小鼠基因组中的转基因上。在一个实施方式中，编码小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列存在于小鼠中的染色体外。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括内源性重链免疫球蛋白基因座的修饰，其中所述小鼠表达一种B细胞，所述B细胞包括与重链恒定区基因序列可操作地连接的经重排的免疫球蛋白序列，并且所述B细胞在其基因组(例如在B细胞的染色体上)中包括编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6或其直系同源物或同源物或片段的基因。在一个实施方式中，与重链恒定区基因序列可操作地连接的经重排的免疫球蛋白序列包括人源轻链V、J和/或任选地D基因序列；小鼠重链V、D和/或J序列；人源或小鼠轻链V和/或J序列。在一个实施方式中，重链恒定区基因序列包括选自CH1、铰链、CH2、CH3及其组合的人源或小鼠重链序列。
在一个实施方式中，所述人源轻链V和/或J序列选自人源Vκ、Vλ、Jκ和Jλ序列。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括功能性沉默的内源性免疫球蛋白重链基因座，其中在小鼠中维持了ADAM6的功能，并且所述小鼠还包括一个或多个人源免疫球蛋白基因区段的插入，其中所述一个或多个人源免疫球蛋白基因区段包括人源VL和JL基因区段和任选地人源DH基因区段。在一个实施方式中，所述一个或多个人源免疫球蛋白基因区段包括人源Vκ、Vλ、Jκ和Jλ基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，其中所述小鼠包括功能沉默的免疫球蛋白轻链基因，并且还包括一个或多个内源性免疫球蛋白轻链可变区基因区段被一个或多个人源免疫球蛋白轻链可变区基因区段取代，其中所述小鼠缺乏功能性内源性ADAM6基因座，并且其中所述小鼠包括表达在雄性小鼠中具有功能的小鼠ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或片段的异位核苷酸序列。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，其中所述小鼠包括功能沉默的免疫球蛋白轻链基因座，并且还包括一个或多个人源免疫球蛋白轻链可变基因区段对一个或多个内源性免疫球蛋白轻链可变基因区段的取代，其中所述小鼠缺乏功能性内源性ADAM6基因座，并且其中所述小鼠包括编码在雄性小鼠中具有功能的小鼠ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物或片段的异位核苷酸序列。
在一个实施方式中，所述一个或多个人源免疫球蛋白轻链可变基因区段与所述异位核苷酸序列邻近。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠缺乏功能性内源性ADAM6基因座或序列，并且包括编码小鼠ADAM6基因座或者小鼠ADAM6基因座或序列的功能性片段的异位核苷酸序列，其中所述小鼠能够与相反性别的小鼠交配以产生包括异位ADAM6基因座或序列的后代。在一个实施方式中，所述小鼠是雄性的。在一个实施方式中，所述小鼠是雌性的。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，其中所述小鼠在内源性免疫球蛋白重链可变区基因座上包括人源免疫球蛋白轻链可变区基因区段，所述小鼠在内源性免疫球蛋白重链可变区基因座上缺乏内源性功能性ADAM6序列，并且其中所述小鼠包括表达在雄性小鼠中具有功能的小鼠ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或片段的异位核苷酸序列。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，其中所述小鼠包括在内源性免疫球蛋白重链可变区基因座的人源免疫球蛋白轻链可变基因区段，所述小鼠在内源性免疫球蛋白重链可变基因座缺乏内源性的具有功能的ADAM6序列，并且其中所述小鼠包括表达在雄性小鼠中具有功能的小鼠ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物或片段的异位核苷酸序列。
在一个实施方式中，表达小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列是染色体外的。在一个实施方式中，表达小鼠ADAM6蛋白的异位核苷酸序列整合至小鼠基因组的一个或多个基因座上。在一个特定的实施方式中，所述一个或多个基因座包括免疫球蛋白基因座。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠表达来自经修饰的内源性免疫球蛋白重链基因座的免疫球蛋白轻链序列，其中所述重链来源于人源VL基因区段、J基因区段和任选地DH基因区段，其中所述小鼠包括在小鼠中具有功能的ADAM6活性。在一个实施方式中，所述人源VL基因区段选自人源Vκ和人源Vλ基因区段。在各种实施方式中，所述J基因区段是JH、Jκ或Jλ基因区段或其组合。
在一个实施方式中，所述小鼠包括多个人源VL基因区段和多个J基因区段。在一个特定的实施方式中，所述J基因区段是JL基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种表达来源于经修饰的内源性免疫球蛋白重链基因座的免疫球蛋白轻链序列的小鼠，其中所述重链来源于人源VL基因区段和JL基因区段，其中所述小鼠包括在小鼠中具有功能的ADAM6活性。
在一个实施方式中，所述小鼠包括多个人源V基因区段、多个J基因区段和任选的多个D基因区段。在一个实施方式中，所述D基因区段是人源D基因区段。在一个实施方式中，所述J基因区段是人源J基因区段。在一个实施方式中，所述小鼠还包括人源化的重链恒定区序列，其中所述人源化包括取代选自CH1、铰链、CH2、CH3及其组合的序列。在一个特定的实施方式中，所述重链来源于人源V基因区段、人源J基因区段、人源CH1序列、人源或小鼠铰链序列、小鼠CH2序列和小鼠CH3序列。在另一个特定实施方式中，所述小鼠还包括人源轻链恒定序列。在一个实施方式中，所述小鼠包括ADAM6基因，所述ADAM6基因的5’和3’翼侧是内源性免疫球蛋白重链基因区段。在一个特定的实施方式中，所述内源性免疫球蛋白重链可变基因区段不能编码抗体的重链可变区。在一个特定的实施方式中，小鼠的ADAM6基因在与野生型小鼠相同的位置上，并且小鼠的内源性免疫球蛋白重链可变基因座不能重排以编码抗体的重链。
在一个实施方式中，所述多个人源V基因区段的5’翼侧(相对于V基因区段的转录方向)是编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6活性的序列。在一个特定的实施方式中，所述多个人源V基因区段包括人源Vκ基因区段Vκ4-1、Vκ5-2、Vκ7-3、Vκ2-4、Vκ1-5、Vκ1-6、Vκ3-7、Vκ1-8、Vκ1-9、Vκ2-10、Vκ3-11、Vκ1-12、Vκ1-13、Vκ2-14、Vκ3-15、Vκ1-16、Vκ1-17、Vκ2-18、Vκ2-19、Vκ3-20、Vκ6-21、Vκ1-22、Vκ1-23、Vκ2-24、Vκ3-25、Vκ2-26、Vκ1-27、Vκ2-28、Vκ2-29、Vκ2-30、Vκ3-31、Vκ1-32、Vκ1-33、Vκ3-34、Vκ1-35、Vκ2-36、Vκ1-37、Vκ2-38、Vκ1-39和Vκ2-40并且所述人源Vκ2-40基因区段的5’翼侧(相对于人源Vκ2-40基因区段的转录方法)是编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6活性的序列。在一个特定的实施方式中，编码在小鼠中具有功能的ADAM6活性的序列与人源Vκ基因区段在相同的转录方向。在一个特定的实施方式中，编码在小鼠中具有功能的ADAM6活性的序列与人源Vκ基因区段在相反的转录方向。
在一个实施方式中，所述V基因区段的3’翼侧(相对于V基因区段的转录方向)是编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6活性的序列。
在一个实施方式中，所述D基因区段的5’翼侧(相对于D基因区段的转录方向)是编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6活性的序列。
在一个实施方式中，所述J基因区段的5’翼侧(相对于J基因区段的转录方向)是编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6活性的序列。
在一个实施方式中，在小鼠中具有功能的ADAM6的活性来自于位于经修饰的内源性重链免疫球蛋白基因座的最5’-端(5’-most)D基因区段5’端和最3’-端(3’-most)V基因区段3’端(相对于V基因区段的转录方向)的核苷酸序列的表达。
在一个实施方式中，在小鼠中具有功能的ADAM6的活性来自于位于经修饰的内源性重链免疫球蛋白基因座的最5’-端(5’-most)J基因区段5’端和最3’-端(3’-most)V基因区段3’端(相对于V基因区段的转录方向)的核苷酸序列的表达。
在一个实施方式中，在小鼠中具有功能的ADAM6的活性来自于位于经修饰的内源性免疫球蛋白重链基因座中两个人源V基因区段之间的核苷酸序列的表达。在一个实施方式中，所述两个人源V基因区段是人源Vκ5-2基因区段和Vκ4-1基因区段。
在一个实施方式中，在小鼠中具有功能的ADAM6的活性来自于位于经修饰的内源性免疫球蛋白重链基因座中人源V基因区段与人源J基因区段之间的核苷酸序列的表达。在一个实施方式中，所述人源V基因区段是人源Vκ4-1基因区段，并且所述人源J区段是Jκ1基因区段。
在一个实施方式中，所述核苷酸序列包括选自下组的序列：小鼠ADAM6b序列或其功能性片段、小鼠ADAM6a序列或其功能性片段及其组合。
在各种实施方式中，编码在小鼠中具有功能的ADAM6活性的序列编码如SEQ IDNO:2所示的ADAM6b蛋白和/或如SEQ ID NO:1所示的ADAM6a蛋白。
在一个实施方式中，在两个人源V基因区段之间的所述核苷酸序列与人源V基因区段位于相反的转录方向。在一个特定的实施方式中，所述核苷酸序列相对于ADAM6基因的转录方向由5’至3’编码，并且ADAM6a序列之后是ADAM6b序列。
在一个实施方式中，人源V基因区段和人源J基因区段之间的核苷酸序列被置于与人源V和J基因区段相反的转录方向。在一个特定的实施方式中，核苷酸序列相对于ADAM6基因的转录方向由5’至3’编码，ADAM6a序列之后是ADAM6b序列。
在一个实施方式中，所述小鼠包括杂交的免疫球蛋白序列，其中所述杂交的免疫球蛋白序列包括与非人源ADAM6序列邻近的人源免疫球蛋白κ轻链序列。
在一个实施方式中，所述小鼠包括在内源性免疫球蛋白重链基因座与小鼠序列邻近的人源序列，其中所述邻近的序列包括至少一个人源VL基因区段、小鼠ADAM6序列或其直系同源物或同源物或功能性片段和人源JL基因区段。在一个特定的实施方式中，所述小鼠ADAM6序列或者其直系同源物或同源物或功能性片段与至少一个人源VL基因区段紧邻。在一个实施方式中，所述人源VL基因区段是人源Vκ基因区段。在一个实施方式中，所述小鼠ADAM6序列或者其直系同源物或同源物或功能性片段与至少一个人源VL基因区段的3’紧邻并且与人源JL基因区段的5’紧邻。在一个特定的实施方式中，所述人源VL基因区段是人源Vκ基因区段，并且所述人源JL基因区段是人源Jκ基因区段。
在一个实施方式中，编码在小鼠中具有功能的ADAM6活性的序列是小鼠ADAM6序列或其功能性片段。
在一个实施方式中，所述小鼠包括内源性小鼠DFL16.1基因区段(例如在针对经修饰的内源性小鼠免疫球蛋白重链基因座的小鼠杂合子中)或人源DH1-1基因区段。在一个实施方式中，由小鼠表达的免疫球蛋白重链的D基因区段来源于内源性小鼠DFL16.1基因区段或人源DH1-1基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括在非重排B细胞谱系的携带DNA的细胞中编码小鼠ADAM6(或者其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列，但是不包括在包含重排的免疫球蛋白基因座的B细胞中编码小鼠ADAM6(或者其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列，其中所述编码小鼠ADAM6(或者其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列出现在基因组中的位置不同于小鼠ADAM6基因出现在野生型小鼠中的位置。在一个实施方式中，所述编码小鼠ADAM6(或者其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列全部或基本上全部存在于非重排B细胞谱系中携带DNA的细胞中；在一个实施方式中，所述核酸序列存在于小鼠的生殖细胞中，但是不在重排B细胞的染色体中。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括在全部或基本上全部的携带DNA的细胞中编码小鼠ADAM6(或者其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列，所述细胞包括含有重排的免疫球蛋白基因座的B细胞，其中所述编码小鼠ADAM6(或者其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列出现在基因组中的位置不同于小鼠ADAM6基因出现在野生型小鼠中的位置。在一个实施方式中，所述编码小鼠ADAM6(或者其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列在与重排的免疫球蛋白基因座邻近的核酸上。在一个实施方式中，与重排的免疫球蛋白基因座邻近的核酸是染色体。在一个实施方式中，所述染色体是在野生型小鼠中发现的染色体，并且所述染色体包括对小鼠免疫球蛋白基因座的修饰。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，其中所述小鼠包括B细胞，所述B细胞在其基因组中包含ADAM6序列或者其直系同源物或同源物。在一个实施方式中，所述ADAM6序列或者其直系同源物或同源物在免疫球蛋白重链基因座上。在一个特定的实施方式中，所述重链基因座包括不能重排以编码抗体的重链的内源性免疫球蛋白重链基因区段。在一个实施方式中，所述ADAM6序列或者其直系同源物或同源物在非免疫球蛋白基因座的基因座上。在一个实施方式中，所述ADAM6序列是由异源启动子驱动的转基因。在一个特定的实施方式中，所述异源启动子是非免疫球蛋白启动子。在一个特定的实施方式中，B细胞表达ADAM6蛋白或其直系同源物或同源物。
在一个实施方式中，90％或更多的小鼠B细胞包括在小鼠中具有功能的编码ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或片段的基因。在一个特定的实施方式中，所述小鼠是雄性小鼠。
在一个实施方式中，B细胞基因组包括含有ADAM6序列或其直系同源物或同源物的第一等位基因和第二等位基因。在一个实施方式中，B细胞基因组包括含有ADAM6序列或其直系同源物或同源物的第一等位基因但不包括第二等位基因。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括在一个或多个内源性免疫球蛋白重链等位基因的修饰，其中所述修饰保留一个或多个内源性ADAM6等位基因。
在一个实施方式中，所述修饰使小鼠不能表达一种功能性重链，所述功能性重链包括来自至少一个重链等位基因的、经重排的内源性重链基因区段，并且保留了位于至少一个内源性免疫球蛋白重链等位基因中的内源性ADAM6等位基因。
在一个实施方式中，所述小鼠不能表达一种功能性重链，所述功能性重链包括来自至少一个内源性免疫球蛋白重链等位基因的、经重排的内源性重链基因区段，并且所述小鼠表达来自内源性ADAM6等位基因的ADAM6蛋白。在一个特定的实施方式中，所述小鼠不能表达一种功能性重链，所述功能性重链包括来自两个内源性免疫球蛋白重链等位基因的、经重排的内源性重链基因区段的功能性重链，并且所述小鼠表达来自一个或多个内源性ADAM6等位基因的ADAM6蛋白。
在一个实施方式中，所述小鼠不能表达来自各内源性重链等位基因的功能性重链，并且所述小鼠包括位于小鼠免疫球蛋白重链恒定区序列上游(相对于小鼠免疫球蛋白重链基因座转录的方向)1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或120或者更多个Mbp内的功能性ADMA6等位基因。在一个特定的实施方式中，所述功能性ADAM6等位基因在内源性重链基因座上(例如在基因间的V-D区、在两个V基因区段之间、在V与D基因区段之间、在D与J基因区段之间等)。在一个特定的实施方式中，所述功能性ADAM6等位基因位于最后一个小鼠V基因区段与第一个小鼠D基因区段之间90至100kb的基因间序列中。在另一个特定的实施方式中，所述内源性90至100kb的基因间V-D序列被除去，并且将所述内源性ADAM6序列置于最后一个V和第一D基因区段之间。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括在一个或多个内源性ADAM6等位基因的修饰。
在一个实施方式中，所述修饰使小鼠不能表达来自一个或多个内源性ADAM6等位基因中至少一个的功能性ADAM6蛋白。在一个特定的实施方式中，所述小鼠不能表达来自各内源性ADAM6等位基因的功能性ADAM6蛋白。
在一个实施方式中，所述小鼠不能表达来自各内源性ADAM6等位基因的功能性ADAM6蛋白，并且所述小鼠包括异位ADAM6序列。
在一个实施方式中，所述小鼠不能表达来自各内源性ADAM6等位基因的功能性ADAM6蛋白，并且所述小鼠包括位于小鼠免疫球蛋白重链恒定区序列上游(相对于小鼠重链基因座转录的方向)1、2、3、4、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110或120或者更多个kb内的异位ADMA6序列。在一个特定的实施方式中，所述异位ADAM6序列在内源性重链基因座上(例如在基因间的V-D区、在两个V基因区段之间、在V与J基因区段之间、在D与J基因区段之间等)。在一个特定的实施方式中，所述异位ADAM6序列位于最后一个小鼠V基因区段与第一个小鼠D基因区段之间的90至100kb的基因间序列中。在另一个特定实施方式中，内源性90至100kb基因间的V-D序列被除去，并且异位ADAM6序列位于人源Vκ基因区段与第一个人源Jκ基因区段之间。在另一个特定的实施方式中，内源性90至100kb基因间的V-D序列被除去，并且异位ADAM6序列位于人源Vκ基因区段的5’或上游，其中所述人源Vκ基因区段选自人源Vκ4-1或Vκ2-40基因区段。
在一个实施方式中，所述小鼠能够表达来源于一个或多个内源性ADAM6等位基因的具有功能的ADAM6蛋白并且所述修饰包括编码免疫球蛋白可变结构域的人源序列的插入。在一个实施方式中，所述人源序列包括未经重排的免疫球蛋白基因区段。在一个特定的实施方式中，所述人源序列包括V基因区段和J基因区段。在另一个特定的实施方式中，所述人源序列包括V基因区段、J基因区段和D基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种不具有生育能力的小鼠，其中所述小鼠包括两个或更多个内源性ADAM6等位基因的缺失。在一个方面，本申请提供了一种携带雄性不育性状的雌性小鼠，其中所述雌性小鼠在其生殖细胞系中包括无功能的ADAM6等位基因或内源性ADAM6等位基因的敲除。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括内源性免疫球蛋白重链V、D和或J基因区段，其不能重排以编码抗体的重链，其中大部分的小鼠B细胞包括功能性ADAM6基因。在各种实施方式中，大部分的B细胞还包括在小鼠免疫球蛋白重链恒定区上游的一个或多个人源VL和JL基因区段。在一个实施方式中，所述人源VL和JL基因区段是Vκ和Jκ基因区段。
在一个实施方式中，所述小鼠包括完好的内源性免疫球蛋白重链V、D和J基因区段，其不能重排以编码抗体的功能性重链。在一个实施方式中，所述小鼠包括至少1个和至多89个V基因区段、至少1个和至多13个D基因区段、至少1个和至多4个J基因区段及其组合；其中所述至少1个和至多89个V基因区段、至少1个和至多13个D基因区段、至少1个和至多4个J基因区段不能重排以编码抗体的重链可变区。在一个特定的实施方式中，所述小鼠包括位于完好的内源性免疫球蛋白重链V、D和J基因区段中的功能性ADAM6基因。在一个实施方式中，所述小鼠包括含有内源性ADAM6基因座的内源性重链基因座，其中所述内源性重链基因座包括89个V基因区段、13个D基因区段和4个J基因区段，其中所述内源性重链基因区段不能重排以编码抗体的重链可变区，并且ADAM6基因座编码在小鼠中具有功能的ADAM6蛋白。
在一个方面，本申请提供了一种制备不育雄性小鼠的方法，所述方法包括使供体ES细胞内源性ADAM6等位基因无功能(或敲除所述等位基因)，将供体ES细胞引入宿主胚胎，将所述宿主胚胎在代孕母体中妊娠，并且使代孕母体生出全部或部分来源于所述供体ES细胞的后代。在一个实施方式中，所述方法还包括繁殖后代以获得不育的雄性小鼠。
在一个方面，本申请提供了一种制备具有目标基因修饰的小鼠的方法，其中所述小鼠是不育的，所述方法包括下述步骤：(a)在基因组中制备目标基因修饰；(b)修饰所述基因组以敲除内源性ADAM6等位基因，或者使内源性ADAM6等位基因不具有功能；以及(c)将所述基因组用于制备小鼠。在各种实施方式中，所述基因组来自ES细胞或在核转移实验中使用。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠缺乏内源性免疫球蛋白重链V、D和J基因区段，其中大部分的小鼠B细胞包括ADAM6序列或其直系同源物或同源物。
在一个实施方式中，所述小鼠缺乏选自下组的内源性免疫球蛋白重链基因区段：两个或多个V基因区段、两个或多个D基因区段、两个或多个J基因区段及其组合。在一个实施方式中，所述小鼠缺乏选自下组的免疫球蛋白重链基因区段：至少1个至至多89个V基因区段、至少1个和至多13个D基因区段、至少1个和至多4个J基因区段及其组合。在一个实施方式中，所述小鼠缺乏来自染色体12的基因组DNA片段，其包含约3百万碱基的内源性免疫球蛋白重链基因座。在一个特定的实施方式中，所述小鼠缺乏全部功能性的内源性重链V、D和J基因区段。在一个特定的实施方式中，所述小鼠缺乏89个VH基因区段、13个DH基因区段和4个JH基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，其中所述小鼠在其生殖细胞系中具有包括免疫球蛋白重链基因座修饰的基因组，其中对免疫球蛋白重链基因座的修饰包括使用一个或多个非小鼠免疫球蛋白可变区序列来取代一个或多个小鼠免疫球蛋白可变区序列，并且其中所述小鼠包括编码小鼠ADAM6蛋白的核酸序列。在一个实施方式中，免疫球蛋白重链基因座的DH和JH序列以及至少3个、至少10个、至少20个、至少40个、至少60个或至少80个VH序列被非小鼠免疫球蛋白轻链序列取代。在一个实施方式中，所述内源性免疫球蛋白重链基因座的DH、JH和全部VH序列被多个非小鼠免疫球蛋白VL基因区段、一个或多个JL基因区段和任选地一个或多个D基因区段所取代。所述非小鼠免疫球蛋白序列可以是未经重排的。在一个实施方式中，所述非小鼠免疫球蛋白序列包括非小鼠物种完整的未经重排的VL和JL区。在一个实施方式中，所述非小鼠免疫球蛋白序列能够形成完整的可变区，即未经重排的可变区，所述可变区含有VL和JL基因区段，其连接在一起以形成编码非小鼠物种的轻链可变区，其任选地与一个或多个内源性恒定区连接。所述非小鼠物种可以是智人(Homo sapiens)并且所述非小鼠免疫球蛋白序列可以是人源序列。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，所述小鼠包括编码ADAM6蛋白或其功能性片段的与人源免疫球蛋白轻链可变基因区段相邻的核苷酸序列。
在一个实施方式中，所述小鼠缺乏内源性未经修饰的ADAM6基因序列。在一个实施方式中，所述小鼠缺乏具有功能的内源性ADAM6基因序列。
在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链可变基因区段是免疫球蛋白κ轻链可变基因区段。在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链可变基因区段是免疫球蛋白λ轻链可变基因区段。在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链可变基因区段可操作地与免疫球蛋白重链恒定基因序列连接。
在一个实施方式中，所述免疫球蛋白重链恒定基因序列是小鼠或大鼠或人源重链基因序列。在一个实施方式中，所述重链恒定基因序列包括CH1和/或铰链区。
在一个实施方式中，所述小鼠包括一个或多个内源性免疫球蛋白重链基因序列的缺失或取代。
在一个实施方式中，所述小鼠还包括可操作地与人源或小鼠或大鼠轻链恒定区序列连接的未经重排的人源Vκ或未经重排的人源Vλ基因区段。在一个实施方式中，所述小鼠包括多个未经重排的人源Vκ基因区段(例如两个或多个人源Vκ区段和一个或多个人源Jκ区段)或多个未经重排的人源Vλ基因区段(例如两个或多个人源Vλ区段和一个或多个人源Jλ区段)。在一个实施方式中，所述未经重排的人源Vκ或未经重排的人源Vλ基因区段可操作地与内源性免疫球蛋白轻链基因座的恒定区序列连接。
在一个实施方式中，所述小鼠还包括使得内源性κ轻链基因座和/或内源性λ轻链基因座不具有功能的修饰。在一个实施方式中，所述小鼠包括内源性小鼠κ和/或内源性小鼠λ轻链基因座的敲除或缺失。
在一个方面，本申请提供了一种用于保持小鼠品系的方法，其中所述小鼠品系包括使用一个或多个人源免疫球蛋白轻链序列取代小鼠免疫球蛋白重链序列。在一个实施方式中，所述一个或多个人源免疫球蛋白轻链序列是人源Vκ和/或Jκ基因区段。
在一个实施方式中，所述小鼠品系包括一个或多个小鼠VH、DH和/或JH基因区段的缺失。在一个实施方式中，所述小鼠还包括一个或多个人源VL基因区段和一个或多个人源JL基因区段。在一个实施方式中，所述小鼠包括至少6个、至少16个、至少30个或至少40个人源Vκ基因区段以及至少5个Jκ基因区段。在一个特定的实施方式中，所述人源轻链基因区段可操作地与恒定区基因连接。在一个实施方式中，所述恒定区基因是小鼠恒定区基因。在一个实施方式中，所述恒定区基因包括选自CH1、铰链、CH2、CH3和/或CH4或其组合的小鼠恒定区基因序列。
在一个实施方式中，所述方法包括产生针对小鼠免疫球蛋白重链序列的取代是杂合的雄性小鼠，并且使用野生型雌性小鼠或针对人源重链序列是纯合或杂合的雌性小鼠与杂合雄性小鼠交配。在一个实施方式中，所述方法包括通过使用野生型或者针对人源重链序列是纯合或杂合的雌性与杂合雄性反复交配以保持所述品系。
在一个实施方式中，所述方法包括从针对人源重链序列是纯合或杂合的雄性或雌性小鼠中获得细胞，利用这些细胞作为供体细胞或利用其核作为供体核，并且使用所述细胞或核通过使用宿主细胞和/或在代孕母体中将所述细胞和/或核妊娠来制备基因修饰的动物。
在一个实施方式中，将仅针对在重链基因座的取代是杂合的雄性小鼠与雌性小鼠交配。在一个特定的实施方式中，所述雌性小鼠相对于取代的重链基因座是纯合子、杂合子或野生型。
在一个实施方式中，所述小鼠还包括使用异源性免疫球蛋白轻链序列取代在内源性免疫球蛋白轻链基因座的λ和/或κ轻链可变序列。在一个实施方式中，所述异源性免疫球蛋白轻链序列是人源免疫球蛋白λ和/或κ轻链可变序列。
在一个实施方式中，所述小鼠还包括在不同于内源性免疫球蛋白基因座的基因座上的转基因，其中所述转基因包括一种序列，所述序列编码与免疫球蛋白轻链恒定区序列可操作地连接(针对未经重排的)或融合(针对重排的)的经重排的或未经重排的异源性λ或κ轻链序列(例如未经重排的VL和未经重排的JL或者重排的VJ)。在一个实施方式中，所述异源性λ或κ轻链序列是人源的。在一个实施方式中，所述恒定区序列选自啮齿动物、人源和非人灵长类。在一个实施方式中，所述恒定区序列选自小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述转基因包括驱动轻链序列表达的非免疫球蛋白启动子。在一个特定的实施方式中，所述启动子是转录活化的启动子。在一个特定的实施方式中，所述启动子是ROSA26启动子。
在一个方面，本申请提供了一种具有生育能力的小鼠，所述小鼠包括内源性ADAM6基因的修饰，其中所述小鼠包括使得小鼠具有ADAM6功能的异位序列，并且其中所述小鼠在其生殖细胞系中包括可操作地与编码免疫球蛋白重链序列的核酸序列连接的未经重排的人源免疫球蛋白轻链基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种具有生育能力的小鼠，所述小鼠包括内源性ADAM6基因座的修饰，其中所述修饰使得ADAM6基因座不具有功能，并且其中所述小鼠表达包括与重链恒定序列邻近的人源免疫球蛋白轻链可变结构域的免疫球蛋白结合蛋白。
在一个实施方式中，所述免疫球蛋白结合蛋白还包括与轻链恒定序列融合的同源人源免疫球蛋白轻链可变结构域。
在一个实施方式中，所述重链恒定序列和轻链恒定序列是非人源的。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括免疫球蛋白重链基因座，所述基因座包括使用一个或多个轻链可变区(VL)基因区段和一个或多个轻链连接区(JL)基因区段取代在内源性免疫球蛋白重链基因座的一个或多个重链可变区(VH)基因区段、重链多样性(DH)基因区段和重链连接(JH)基因区段，其中所述小鼠能够表达ADAM6蛋白。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括免疫球蛋白重链基因座，所述基因座包括使用一个或多个VL基因区段和一个或多个JL基因区段取代全部或基本上全部的VH、DH和JH基因区段以便在内源性重链基因座(VLH基因座)形成VL基因区段序列，其中所述VLH基因座能够与内源性CH基因重组以形成来源于VL基因区段、JL基因区段和内源性CH基因的重排基因。
在一个实施方式中，所述VL区段是人源VL。在一个实施方式中，所述JL区段是人源JL。在一个特定的实施方式中，所述VL和JL区段是人源VL和人源JL区段。
在一个实施方式中，全部或基本上全部的VH、DH和JH基因区段被至少6个人源Vκ基因区段和至少1个Jκ基因区段取代。在一个实施方式中，全部或基本上全部的VH、DH和JH基因区段被至少16个人源Vκ基因区段(人源Vκ)和至少1个Jκ基因区段取代。在一个实施方式中，全部或基本上全部VH、DH和JH基因区段被至少30个人源Vκ基因区段和至少1个Jκ基因区段取代。在一个实施方式中，全部或基本上全部VH、DH和JH基因区段被至少40个人源Vκ基因区段和至少1个Jκ基因区段取代。在一个实施方式中，所述至少1个Jκ基因区段包括2、3、4或5个人源Jκ基因区段。
在一个实施方式中，所述VL区段是人源Vκ区段。在一个实施方式中，所述人源Vκ区段包括4-1、5-2、7-3、2-4、1-5和1-6。在一个实施方式中，所述人源Vκ区段包括3-7、1-8、1-9、2-10、3-11、1-12、1-13、2-14、3-15和1-16。在一个实施方式中，所述人源Vκ区段包括1-17、2-18、2-19、3-20、6-21、1-22、1-23、2-24、3-25、2-26、1-27、2-28、2-29和2-30。在一个实施方式中，所述人源Vκ区段包括3-31、1-32、1-33、3-34、1-35、2-36、1-37、2-38、1-39和2-40。
在一个实施方式中，所述VL区段是人源Vκ区段并且包括4-1、5-2、7-3、2-4、1-5、1-6、3-7、1-8、1-9、2-10、3-11、1-12、1-13、2-14、3-15和1-16。在一个实施方式中，所述Vκ区段还包括1-17、2-18、2-19、3-20、6-21、1-22、1-23、2-24、3-25、2-26、1-27、2-28、2-29和2-30。在一个实施方式中，所述Vκ区段还包括3-31、1-32、1-33、3-34、1-35、2-36、1-37、2-38、1-39和2-40。
在一个实施方式中，所述VL区段是人源Vλ区段并且包括人源λ轻链基因座簇A的片段。在一个特定的实施方式中，所述人源λ轻链基因座簇A的片段由hVλ3-27延伸至hVλ3-1。
在一个实施方式中，所述VL区段包括人源λ轻链基因座簇B的片段。在一个特定的实施方式中，所述人源λ轻链基因座簇B的片段由hVλ5-52延伸至hVλ1-40。
在一个实施方式中，所述VL区段包括人源λ轻链可变区序列，所述轻链可变区序列包括簇A的基因组片段和簇B的基因组片段。在一个实施方式中，所述人源λ轻链可变区序列包括至少一个簇A的基因区段和至少一个簇B的基因区段。
在一个实施方式中，所述VL区段包括至少一个簇B的基因区段和至少一个簇C的基因区段。
在一个实施方式中，所述VL区段包括hVλ3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2-11和3-12。在一个特定的实施方式中，所述VL区段包括跨距为Vλ3-12至Vλ3-1的人源λ轻链基因座的邻近序列。在一个实施方式中，所述邻近序列包括至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个hVλ。在一个特定的实施方式中，所述hVλ包括3-1、4-3、2-8、3-9、3-10、2-11和3-12。在一个特定的实施方式中，所述hVλ包括跨距为Vλ3-12至Vλ3-1的人源λ基因座的邻近序列。
在一个实施方式中，所述hVλ包括13至28个或更多个hVλ。在一个特定的实施方式中，所述hVλ包括2-14、3-16、2-18、3-19、3-21、3-22、2-23、3-25和3-27。在一个特定的实施方式中，所述hVλ包括跨距为Vλ3-27至Vλ3-1的人源λ基因座的邻近序列。
在一个实施方式中，所述VL区段包括29至40个hVλ。在一个特定的实施方式中，所述VL区段包括跨距为Vλ3-29至Vλ3-1的人源λ基因座的邻近序列，以及跨距为Vλ5-52至Vλ1-40的人源λ基因座的邻近序列。在一个特定的实施方式中，在基因修饰小鼠中hVλ1-40和hVλ3-29之间的全部或基本上全部的序列基本上由hVλ1-40基因区段下游(在3’非翻译部分下游)天然存在的(例如在人群中)约959bp人源λ序列、限制性酶位点(例如PI-SceI)、后接的天然存在的hVλ3-29基因区段上游约3,431bp的人源λ序列组成。
在一个实施方式中，所述Jκ是人源的并且选自下组：Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、Jκ5及其组合。在一个特定的实施方式中，所述Jκ包括Jκ1至Jκ5。
在一个实施方式中，所述VL区段是人源Vλ区段，并且所述Jκ基因区段包括具有12-mer间隔区的RSS，其中所述RSS并置于Jκ基因区段的上游末端。在一个实施方式中，所述VL基因区段是人源Vλ，并且所述VLH基因座包括两个或多个Jκ基因区段，其均包括具有12-mer间隔区的RSS，其中所述RSS并置于各Jκ基因区段的上游。
在一个特定的实施方式中，所述VL区段包括跨人源κ基因座Vκ4-1至Vκ2-40的邻近的人源κ基因区段，并且所述JL区段包括跨人源κ基因座Jκ1至Jκ5的邻近的基因区段。
在一个实施方式中，其中所述VL区段是Vλ区段并且在VL区段和J区段之间不存在DH区段，所述VL区段下游翼侧(即并置于下游侧)为23-mer RSS，并且Jκ区段(如果存在)或Jλ区段(如果存在)则其上游翼侧(即并置于上游侧)为12-mer RSS。
在一个实施方式中，其中所述V基因区段是Vκ基因区段并且在V基因区段和J基因区段之间不存在DH基因区段，所述Vκ基因区段下游侧均并置12-mer RSS，并且Jκ区段如果存在或Jλ区段如果存在在上游侧均并置23-mer RSS。
在一个实施方式中，所述小鼠包括重排的基因，所述基因来源于VL基因区段、JL基因区段和内源性CH基因。在一个实施方式中，所述重排的基因是体细胞突变的。在一个实施方式中，所述重排的基因包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多的N插入。在一个实施方式中，在来自VL区段和JL区段的重排基因中观察到的N插入和/或体细胞突变是在内源性轻链基因座位置重排的重排轻链可变结构域(来源于相同的JL基因区段和相同的JL基因区段)中观察到的N插入和/或体细胞突变的数量的1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍或至少5倍。在一个实施方式中，所述重排基因在与目标抗原特异性结合的B细胞中，其中所述B细胞以低纳摩范围或更低的KD(例如KD为10纳摩或更低)结合目标抗原。在一个特定的实施方式中，所述VL区段、JL区段或这两者均为人源基因区段。在一个特定的实施方式中，所述VL和JL区段是人源κ基因区段。在一个实施方式中，所述小鼠CH基因选自IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在一个特定的实施方式中，所述小鼠IgG选自IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG2C和IgG3。在另一个特定的实施方式中，所述小鼠IgG是IgG1。
在一个实施方式中，所述小鼠包括B细胞，其中所述B细胞在B细胞染色体上的基因座表达基本上由四条多肽链组成的结合蛋白，其中所述四条多肽链基本上由下述组成：(a)两条相同的多肽链，其包括与VL融合的内源性CH区和(b)两条相同的多肽链，其包括与VL区融合的内源性CL区，所述VL区与同小鼠CH区融合的VL区具有同源性，并且在一个实施方式中，所述VL区是人源(例如人源κ)VL区。在一个实施方式中，与内源性CH区融合的VL区是人源VL区。在一个特定的实施方式中，与小鼠CH区融合的人源VL区是Vκ区。在一个特定的实施方式中，与小鼠CH区融合的人源VL区与由重排的人源生殖细胞系轻链核苷酸序列编码的V区相同。在一个特定的实施方式中，与小鼠CH区融合的人源VL区包括2、3、4、5、6或更多的体细胞超突变。在一个实施方式中，与小鼠CH区融合的人源VL区由重排基因编码，所述重排基因包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或者更多的N插入。
在一个实施方式中，由小鼠表达的全部IgG分子中的至少50％包括含有IgG同种型CH区和VL区的多肽，其中所述多肽的长度不超过535、530、525、520或515个氨基酸。在一个实施方式中，全部IgG分子中的至少75％包括本段中所述的多肽。在一个实施方式中，全部IgG分子中的至少80％、85％、90％或95％包括本段中所述的多肽。在一个特定的实施方式中，由小鼠表达的全部IgG分子均包括长度不超过本段中所述多肽的多肽。
在一个实施方式中，所述小鼠表达结合蛋白，所述结合蛋白包括第一多肽，所述第一多肽包括与由重排的人源V基因区段和J基因区段而非DH基因区段编码的可变结构域融合的内源性CH区，和第二多肽，所述第二多肽包括与由重排的人源V基因区段和J基因区段而非DH基因区段编码的V结构域融合的内源性CL区，并且所述结合蛋白特异性地与抗原以微摩、纳摩或皮摩范围的亲和性结合。在一个实施方式中，所述J区段是人源J区段(例如人源κ基因区段)。在一个实施方式中，所述人源V区段是人源Vκ区段。在一个实施方式中，同与内源性CL区融合的可变区相比，与内源性CH区融合的可变结构域包括更高数量的体细胞超突变；在一个特定的实施方式中，与内源性CH区融合的可变区包括与同与内源性CL区融合的V区相比约1.5、2、3、4或5倍或更多的体细胞超突变；在一个特定的实施方式中，与同小鼠CL区融合的V区相比，与小鼠CH区融合的V区包括至少6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个或更多的体细胞超突变。在一个实施方式中，与小鼠CH区融合的V区由重排基因编码，所述重排基因包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或者更多的N插入。
在一个实施方式中，所述小鼠表达结合蛋白，所述结合蛋白包括与免疫球蛋白重链恒定区序列融合的第一轻链可变结构域(VL1)，和与免疫球蛋白轻链恒定区融合的第二轻链可变结构域(VL2)，其中VL1包括多个体细胞超突变，其是VL2中存在的体细胞超突变的数量的约1.5至约5倍。在一个实施方式中，在VL1中体细胞超突变的数量是VL2中的约2至约4倍。在一个实施方式中，在VL1中体细胞超突变的数量是VL2中的约2至约3倍。在一个实施方式中，VL1由包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或者更多的N插入的序列编码。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，所述小鼠表达基本上由下述多肽组成的免疫球蛋白：第一个两个相同的多肽，所述多肽均基本上由与来源于基本上由VL基因区段和JL基因区段组成的基因区段的可变结构域融合的CH区组成，和第二个两个相同的多肽，所述多肽均基本上由与来源于基本上由VL区段和JL区段组成的基因区段的可变结构域融合的CL区组成。
在一个特定的实施方式中，所述两个相同的多肽具有包含小鼠CH区的CH区。
在一个特定的实施方式中，所述两个相同的多肽具有包含小鼠CL区的CL区。
在一个实施方式中，与CL区融合的可变结构域与同CH区融合的可变结构域具有同源性。
在一个实施方式中，与内源性CH区融合的可变结构域与同内源性CL区融合的可变结构域相比包括更多数量的体细胞超突变；在一个特定的实施方式中，与内源性CH区融合的可变结构域包括的体细胞超突变是同内源性CL区融合的可变结构域的约1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍或5倍或者更多。在一个实施方式中，与内源性CL区融合的可变结构域由包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个N插入的基因编码。
在一个实施方式中，一个或多个V区段和J区段是人源基因区段。在一个特定的实施方式中，所述V区段和J区段均是人源κ基因区段。在另一个特定的实施方式中，所述V区段和J区段均是人源λ基因区段。在一个实施方式中，所述V区段和J区段独立地选自人源κ和人源λ基因区段。在一个特定的实施方式中，所述V区段是Vκ区段，并且所述J区段是Jλ区段。在另一个特定的实施方式中，所述V区段是Vλ区段，并且所述J区段是Jκ区段。
在一个实施方式中，一个或多个可变结构域与CL区融合，并且与CH区融合的可变结构域是人源可变结构域。在一个特定的实施方式中，所述人源可变结构域是人源Vκ结构域。在另一个特定的实施方式中，所述人源可变结构域是Vλ结构域。在一个实施方式中，所述人源结构域独立地选自人源Vκ和人源Vλ结构域。在一个特定的实施方式中，与CL区融合的人源可变结构域是人源Vλ结构域，并且与CH区融合的人源可变结构域是人源Vκ结构域。在另一个实施方式中，与CL区融合的人源可变结构域是人源Vκ结构域，并且与CH融合的人源可变结构域是人源Vλ结构域。
在一个实施方式中，所述第一个两个相同的多肽的VL基因区段选自人源Vλ区段和人源Vκ区段。在一个实施方式中，所述第二个两个相同的多肽的VL基因区段选自人源Vλ区段和人源Vκ区段。在一个特定的实施方式中，所述第一个两个相同的多肽的VL区段是人源Vκ区段，并且所述第二个两个相同的多肽的VL区段是选自人源Vκ区段和人源Vλ区段。在一个特定的实施方式中，所述第一个两个相同的多肽的VL区段是人源Vλ区段，并且所述第二个两个相同的多肽的VL区段选自人源Vλ区段和人源Vκ区段。在一个特定的实施方式中，所述第一个两个相同的多肽的人源VL区段是人源Vκ区段，并且所述第二个两个相同的多肽的人源VL区段是人源Vκ区段。
在一个实施方式中，所述小鼠的IgG包括对抗原作出应答的结合蛋白，其中所述结合蛋白包括基本上由可变结构域和CH区组成的多肽，其中所述可变结构域由基本上由重排的VL区段和重排的J区段组成的核苷酸序列编码，并且其中所述结合蛋白以微摩、纳摩或皮摩范围的KD特异性地与抗原的表位结合。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，其中由所述小鼠对抗原应答制备的全部或基本上全部的IgG均包括含有可变结构域的重链，其中所述可变结构域由来源于基本上由V基因区段和J基因区段组成的基因区段的重排基因编码。在一个实施方式中，所述重排基因包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或者更多的N插入。
在一个实施方式中，所述V区段是轻链的V区段。在一个实施方式中，所述轻链选自κ轻链和λ轻链。在一个特定的实施方式中，所述轻链是κ轻链。在一个特定的实施方式中，所述V区段是人源V区段。在一个特定的实施方式中，所述V区段是人源Vκ区段和所述J区段是人源Jκ区段。
在一个实施方式中，所述J区段是轻链的J区段。在一个实施方式中，所述轻链选自κ轻链和λ轻链。在一个特定的实施方式中，所述轻链是κ轻链。在一个特定的实施方式中，所述J区段是人源J区段。在另一个实施方式中，所述J区段是重链的J区段(即JH)。在一个特定的实施方式中，所述重链是鼠源的。在另一个特定的实施方式中，所述重链是人源的。
在一个实施方式中，所述重链的可变结构域由不超过一个V区段制备并且J区段是体细胞突变的可变结构域。
在一个实施方式中，所述重链的可变结构域由不超过一个V区段制备并且J区段与小鼠CH区融合。
在一个特定实施方式中，通过小鼠对抗原应答制备的全部或基本上全部的IgG包括来源于不超过一个人源V区段和不超过一个人源J区段的可变结构域，并且所述可变结构域与小鼠IgG恒定区融合，并且所述IgG还包括含有与小鼠CL区融合的人源VL结构域的轻链。在一个特定的实施方式中，与小鼠CL区融合的VL结构域来源于人源Vκ区段和人源Jκ区段。在一个特定的实施方式中，与小鼠CL区融合的VL结构域来源于人源Vλ区段和人源Jλ区段。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠制备含有在包括CH区的多肽上的第一CDR3和在包括CL区的多肽上的第二CDR3的IgG，其中所述第一CDR3和第二CDR3均独立地来源于不超过两个基因区段，其中所述两个基因区段基本上由VL基因区段和JL基因区段组成。在一个实施方式中，在含有CH区的多肽上的CDR3包含来源于CDR3核苷酸序列的序列，所述核苷酸序列包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或者更多的N插入。
在一个实施方式中，所述VL区段和JL区段是人源基因区段。在一个实施方式中，所述VL区段和JL区段是κ基因区段。在一个实施方式中，所述VL区段和JL区段是λ基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠制备含有在包括CH区的第一多肽上的第一CDR3和在包括CL区的第二多肽上的第二CDR3的IgG，其中所述第一CDR3和第二CDR3均包括氨基酸序列，其中75％以上的氨基酸来源于V基因区段。在一个实施方式中，在含有CH区的多肽上的CDR3包含来源于CDR3核苷酸序列的序列，所述核苷酸序列包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或者更多的N插入。
在一个实施方式中，80％以上、90％以上或95％以上所述第一CDR3的氨基酸，以及80％以上、90％以上或95％以上所述第二CDR3的氨基酸来源于轻链V区段。
在一个实施方式中，所述第一CDR3中的不超过两个氨基酸来源于轻链V区段以外的基因区段。在一个实施方式中，所述第二CDR3中的不超过两个氨基酸来源于轻链V区段以外的基因区段。在一个特定的实施方式中，所述第一CDR3中的不超过两个氨基酸和所述第二CDR3中的不超过两个氨基酸来源于轻链V区段以外的基因区段。在一个实施方式中，IgG的CDR3不包括来源于D基因区段的氨基酸序列。在一个实施方式中，所述第一多肽的CDR3不包括来源于D区段的序列。
在一个实施方式中，所述V区段是人源V基因区段。在一个特定的实施方式中，所述V区段是人源Vκ基因区段。
在一个实施方式中，所述第一和/或第二CDR3具有至少1、2、3、4、5或6个体细胞超突变。在一个实施方式中，所述第一CDR3由包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或者更多的N插入的核酸序列编码。
在一个实施方式中，所述第一CDR3基本上由来源于人源轻链V基因区段和人源轻链J基因区段的氨基酸组成，并且所述第二CDR3基本上由来源于人源轻链V基因区段和人源轻链J基因区段的氨基酸组成。在一个实施方式中，所述第一CDR3来源于包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或者更多的N插入的核酸序列。在一个实施方式中，所述第一CDR3来源于不超过两个的基因区段，其中所述不超过两个的基因区段是人源Vκ基因区段和人源Jκ基因区段；并且所述第二CDR3来源于不超过两个的基因区段，其中所述不超过两个的基因区段是人源Vκ基因区段和J基因区段，所述J基因区段选自人源Jκ区段、人源Jλ区段和人源JH区段。在一个实施方式中，所述第一CDR3来源于不超过两个的基因区段，其中所述不超过两个的基因区段是人源Vλ区段和J区段，所述J区段选自人源Jκ区段、人源Jλ区段和人源JH区段。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠制备不含有来源于DH基因区段的氨基酸序列的IgG，其中所述IgG包括具有与小鼠CL区融合的第一VL结构域的第一多肽和具有与小鼠CH区融合的第二VL结构域的第二多肽，其中所述第一VL结构域和第二VL结构域是不同的。在一个实施方式中，所述第一和第二VL结构域来源于不同的V区段。在另一个实施方式中，所述第一和第二VL结构域来源于不同的J区段。在一个实施方式中，所述第一和第二VL结构域来源于相同的V和J区段，其中与第一VL结构域相比第二VL结构域具有更高数量的体细胞超突变。
在一个实施方式中，所述第一和第二VL结构域独立地选自人源和小鼠VL结构域。在一个实施方式中，所述第一和第二VL结构域独立地选自Vκ和Vλ结构域。在一个特定的实施方式中，所述第一VL结构域选自Vκ结构域和Vλ结构域，并且所述第二VL结构域是Vκ结构域。在另一个特定的实施方式中，所述Vκ结构域是人源Vκ结构域。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，其中由所述小鼠制备的全部或基本上全部的IgG基本上由具有与小鼠CL结构域融合的第一人源VL结构域的轻链和具有与小鼠CH结构域融合的第二人源VL结构域的重链组成。
在一个实施方式中，与小鼠CH结构域融合的人源VL结构域是人源Vκ结构域。
在一个实施方式中，所述第一和第二人源VL结构域是不同的。
在一个实施方式中，本申请提供了一种小鼠，由所述小鼠制备的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或约100％的免疫球蛋白G基本上由(a)第一多肽的二聚体和(b)长度不超过535个氨基酸的第二多肽的二聚体组成，其中所述第一多肽基本上由免疫球蛋白VL结构域和免疫球蛋白CL区组成，其中所述第二多肽基本上由CH区和V结构域组成，其缺乏来源于DH基因区段的序列。
在一个实施方式中，所述第二多肽的长度为约435-535个氨基酸。在一个特定的实施方式中，所述第二多肽的长度为约435-530个氨基酸。在一个特定的实施方式中，所述第二多肽的长度为约435-525个氨基酸。在一个特定的实施方式中，所述第二多肽的长度为约435-520个氨基酸。在一个特定的实施方式中，所述第二多肽的长度为约435-515个氨基酸。
在一个实施方式中，在由所述小鼠制备的约90％或更多的IgG中，所述第二多肽的长度不超过约535个氨基酸。
在一个实施方式中，在由所述小鼠制备的约50％或更多的IgG中，所述第二多肽的长度不超过约535个氨基酸。在一个实施方式中，在由所述小鼠制备的约50％或更多的免疫球蛋白G中，所述第二多肽的长度不超过约530、525、520、515、510、505、500、495、490、485、480、475、470、465、460、455或450个氨基酸。在一个实施方式中，由所述小鼠制备的约60％、70％、80％、90％或95％或者更多的IgG是所述长度。在一个特定的实施方式中，由所述小鼠制备的全部或基本上全部的IgG是所述长度。
在一个实施方式中，所述第二多肽的V结构域是VL结构域。在一个特定的实施方式中，所述第二多肽的V结构域选自Vκ和Vλ结构域。在一个特定的实施方式中，所述第二多肽的V结构域是人源Vκ或Vλ结构域。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠由其生殖细胞系中的核苷酸序列表达一种多肽，所述多肽包括轻链可变序列(例如V和/或J序列)、DH序列和重链恒定区。
在一个实施方式中，所述小鼠表达来自内源性重链基因座的多肽，所述基因座包括在内源性重链基因座全部或基本上全部的具有功能的内源性重链可变基因座基因区段被多个人源基因区段的取代。
在一个实施方式中，所述多肽包括来源于Vλ或Vκ基因区段的VL序列，所述多肽包括来源于DH基因区段的CDR3，以及所述多肽包括来源JH或Jλ或Jκ基因区段的多肽。
在一个实施方式中，所述小鼠包括内源性重链免疫球蛋白基因座，所述基因座包含全部具有功能的VH基因区段被一个或多个人源轻链Vλ基因区段的取代，其中所述一个或多个人源Vλ区段下游侧均并置23-mer间隔重组信号序列(RSS)，其中所述Vλ区段可操作地与人源或小鼠DH区段连接，所述DH区段上游和下游并置12-mer间隔RSS；所述DH基因区段可操作地与J区段连接，所述J区段上游并置23-mer间隔RSS，并且其适于与12-mer间隔RSS并置的DH基因区段重组；其中所述V、DH和J区段可操作地与编码重链恒定区的核酸序列连接。
在一个实施方式中，所述小鼠包括内源性重链免疫球蛋白基因座，所述基因座含有全部具有功能的VH基因区段被一个或多个人源Vκ基因区段的取代，所述Vκ基因区段下游侧均并置12-mer间隔重组信号序列(RSS)，其中所述V区段可操作地与人源或小鼠DH区段连接，所述DH区段上游和下游并置23-mer间隔RSS；所述DH区段可操作地与J区段连接，所述J区段上游侧并置12-mer间隔RSS，其适于与23-mer间隔RSS并置的DH区段重组；其中所述V、DH和基因区段可操作地与编码重链恒定区的核酸序列连接。
在一个实施方式中，所述重链恒定区是内源性重链恒定区。在一个实施方式中，所述核酸序列编码选自下述的序列：CH1、铰链、CH2、CH3及其组合。在一个实施方式中，一个或多个所述的CH1、铰链、CH2和CH3是人源的。
在一个实施方式中，所述小鼠包括内源性重链免疫球蛋白基因座，所述基因座包含全部具有功能的VH基因区段被多个下游并置于23-mer间隔RSS的人源Vλ或Vκ基因区段、多个上游和下游并置于23-mer间隔RSS的人源DH区段、多个上游和下游并置于23-mer间隔RSS的人源J区段(JH或Jλ或Jκ)的取代，其中所述基因座包括选自下述的内源性恒定区序列：CH1、铰链、CH2、CH3及其组合。在一个特定的实施方式中，所述小鼠包括全部或基本上全部的具有功能的人源Vλ或Vκ区段、全部或基本上全部的具有功能的人源DH区段和全部或基本上全部的JH或Jλ或Jκ区段。
在一个实施方式中，所述小鼠表达抗原结合蛋白，所述抗原结合蛋白含有(a)包含与含有小鼠序列的重链恒定序列连接的人源轻链序列的多肽；和(b)包含与人源或小鼠轻链恒定序列连接的人源轻链可变区的多肽。在一个特定的实施方式中，所述轻链序列是人源轻链序列，并且暴露于蛋白酶后其能够将抗体裂解为Fc和Fab，形成包括至少4个轻链CDR的全人源Fab，其中所述至少4个轻链CDR选自λ序列、κ序列及其组合。在一个实施方式中，所述Fab包括至少5个轻链CDR。在一个实施方式中，所述Fab包括6个轻链CDR。在一个实施方式中，至少一个Fab的CDR包括来源于Vλ区段或Vκ区段的序列，并且所述至少一个CDR还包括来源于D区段的序列。在一个实施方式中，所述至少一个CDR是CDR3，并且所述CDR来源于人源Vκ区段、人源D区段和人源Jκ区段。
在一个实施方式中，所述多肽包括来源于人源Vλ或Vκ基因区段、人源DH基因区段和人源JH或Jλ或Jκ基因区段的可变区。在一个特定的实施方式中，所述重链恒定序列来源于人源CH1和小鼠CH2和小鼠CH3序列。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠在其生殖细胞系中包括可操作地与人源J基因区段连接的未经重排的人源Vκ或Vλ基因区段和重链恒定区序列，其中所述小鼠表达VL结合蛋白，所述结合蛋白包括与重链恒定区融合的人源Vκ结构域和与轻链恒定结构域融合的人源VL结构域。在一个实施方式中，所述人源VL结构域包括重排的人源VL基因区段，其选自人源Vκ和人源Vλ基因区段。在一个特定的实施方式中，所述人源VL结构域还包括重排的人源JL基因区段，其选自人源Jκ和人源Jλ基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠表达来自其生殖细胞系中经修饰的内源性重链基因座的免疫球蛋白，其中所述经修饰的内源性重链基因座缺乏具有功能的小鼠重链V基因区段并且所述基因座包括未经重排的轻链V基因区段和未经重排的J基因区段，其中所述未经重排的轻链V基因区段和未经重排的J基因区段可操作地与重链恒定区序列连接；其中所述免疫球蛋白基本上由第一多肽和第二多肽组成，其中所述第一多肽包括免疫球蛋白轻链序列和免疫球蛋白重链恒定序列，并且所述第二多肽包括免疫球蛋白轻链可变结构域和轻链恒定区。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠表达免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白缺乏重链免疫球蛋白可变结构域，并且所述免疫球蛋白包括来源于轻链基因的第一可变结构域，和来源于轻链基因的第二可变结构域，其中所述第一可变结构域和第二可变结构域彼此之间具有同源性，其中所述第一和第二轻链可变结构域是不同的，并且其中所述第一和第二轻链可变结构域结合，并且当结合时其特异性与目标抗原结合。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠表达免疫球蛋白，所述免疫球蛋白由其生殖细胞系中的未经重排的基因片段表达，并且含有全部来源于基因区段的可变区，所述基因区段基本上由未经重排的人源基因区段组成，其中所述免疫球蛋白包括免疫球蛋白轻链恒定序列和免疫球蛋白重链恒定序列，其选自下组：CH1、铰链、CH2、CH3及其组合。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠表达免疫球蛋白，所述免疫球蛋白由其生殖细胞系中未经重排的基因区段表达，并且含有可变区，其中全部可变区的全部CDR3完全由轻链V和J基因区段，以及任选地一个或多个体细胞超突变，例如一个或多个N插入，产生。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠表达体细胞突变的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白来源于在小鼠的生殖细胞系中未经重排的人源免疫球蛋白轻链可变区，并且缺乏包括来源于D基因区段的CDR，其中所述免疫球蛋白包括在与轻链恒定区融合的轻链可变结构域上的第一CDR3，包括在与重链恒定区融合的轻链可变结构域上的第二CDR3，并且其中所述第二CDR3来源于重排的轻链可变区序列，所述序列包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个或者更多的N插入。
在一个方面，本申请提供了一种如本申请所述的小鼠，其中所述小鼠包括功能性沉默的轻链基因座，所述基因座选自λ基因座、κ基因座及其组合。在一个实施方式中，所述小鼠包括λ和/或κ基因座全部或部分的缺失，以使得λ和/或κ基因座不具有功能。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠胚胎，所述胚胎包括包含如本申请所述的经修饰的免疫球蛋白基因座的细胞。在一个实施方式中，所述小鼠是嵌合体，并且所述胚胎至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的细胞包括如本申请所述的经修饰的免疫球蛋白基因座。在一个实施方式中，所述胚胎至少96％、97％、98％、99％或99.8％的细胞包括如本申请所述的经修饰的免疫球蛋白基因座。在一个实施方式中，所述胚胎包括宿主细胞和来源于供体ES细胞的细胞，其中所述来源于供体ES细胞的细胞包括如本申请所述的经修饰的免疫球蛋白基因座。在一个实施方式中，所述胚胎是2-、4-、8、16-、32或64-细胞阶段的宿主胚胎或胚泡，并且还包括供体ES细胞，所述ES细胞含有如本申请所述的经修饰的免疫球蛋白基因座。
在一个方面，本申请提供了一种使用如本申请所述的核酸构建体制备的小鼠或细胞。
在一个方面，本申请提供了一种使用如本申请所述的细胞制备的小鼠。在一个实施方式中，所述细胞是小鼠ES细胞。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠细胞和小鼠胚胎，包括但不限于ES细胞、多能干细胞和诱导性多能干细胞，其包括如上文所述的基因修饰。本申请提供了XX细胞和XY细胞。本申请还提供了包括含有如本申请所述修饰的核的细胞，例如通过原核注射引入细胞的修饰。本申请还提供了包括通过病毒引入的ADAM6基因的细胞、胚胎和小鼠，例如包括含有在小鼠中具有功能的ADAM6基因的转导构建体的细胞、胚胎和小鼠。
在一个方面，本申请提供了来源于如本申请所述小鼠的细胞或组织。在一个实施方式中，所述细胞或组织来源于如本申请所述小鼠的脾脏、淋巴结或骨髓。在一个实施方式中，所述细胞是B细胞。在一个实施方式中，所述细胞是胚胎干细胞。在一个实施方式中，所述细胞是生殖细胞。
在一个实施方式中，所述组织选自结缔、肌肉、神经和上皮组织。在一个特定的实施方式中，所述组织是生殖组织。
在一个实施方式中，分离来源于如本申请所述小鼠的细胞和/或组织以用于一项或多项间接体内检测。在各种实施方式中，所述一项或多项间接体内检测包括物理、热、电、机械或光学性质检测，外科手术，不同组织类型相互作用的检测，影像技术显影或其组合。
在一个方面，本申请提供了使用来源于如本申请所述小鼠的细胞或组织来制备抗体的用途。在一个方面，本申请提供了使用来源于如本申请所述小鼠的细胞或组织来制备杂交瘤或四价体杂交瘤的用途。
在一个方面，非人源细胞包括如本申请所述非人动物的染色体或其片段。在一个实施方式中，所述非人源细胞包括如本申请所述非人动物的核。在一个实施方式中，所述非人源细胞包括核转移所得到的染色体或其片段。
在一个方面，本申请提供了一种来源于如本申请所述小鼠的核。在一个实施方式中，所述核来自非B细胞的二倍体细胞。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠细胞，其中所述细胞不能表达包含重排的内源性免疫球蛋白重链基因区段的重链，并且所述细胞包括具有功能的ADAM6基因，所述基因编码小鼠ADAM6蛋白或其功能性片段。在一个实施方式中，所述细胞还包括人源免疫球蛋白轻链基因区段的插入。在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链基因区段是可操作地与小鼠重链恒定区连接的Vκ和/或Jκ基因区段，从而通过重排能够编码与小鼠重链恒定结构域融合的具有功能的轻链可变结构域。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠细胞；其中所述细胞缺乏具有功能的内源性ADAM6基因座，并且所述细胞包括编码小鼠ADAM6的异位核苷酸序列。在一个实施方式中，所述细胞还包括内源性免疫球蛋白重链可变区序列的修饰。在一个特定的实施方式中，所述内源性免疫球蛋白重链可变区序列的修饰包括选自下组的缺失：小鼠VH基因区段的缺失、小鼠DH基因区段的缺失、小鼠JH基因区段的缺失及其组合。在一个特定的实施方式中，所述小鼠包括使用人源免疫球蛋白序列取代一个或多个小鼠免疫球蛋白VH、DH和/或JH序列。在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白序列选自人源VH、人源VL、人源DH、人源JH、人源JL及其组合。
在一个实施方式中，所述细胞是全能干细胞、多能干细胞或诱导性多能干细胞。在一个特定的实施方式中，所述细胞是小鼠ES细胞。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠B细胞，其中所述小鼠B细胞包括重排的免疫球蛋白基因，其中所述B细胞在B细胞染色体上包括编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或片段的核酸序列。在一个实施方式中，所述小鼠B细胞包括核酸序列的两个等位基因。在一个实施方式中，所述重排的免疫球蛋白基因包括与重链恒定序列邻近的重排的免疫球蛋白轻链。在一个实施方式中，所述轻链序列是κ序列；在一个实施方式中，所述轻链序列是λ序列。
在一个实施方式中，所述核酸序列在与重排的小鼠重链免疫球蛋白基因座邻近的核酸分子(例如B细胞染色体)上。
在一个实施方式中，所述核酸序列在与包括重排的小鼠重链免疫球蛋白基因座的核酸分子不同的核酸分子(例如B细胞染色体)上。
在一个实施方式中，所述小鼠B细胞包括与小鼠或人源重链免疫球蛋白恒定区基因可操作地连接的经重排的非小鼠轻链免疫球蛋白可变区序列，其中所述B细胞包括编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或片段的核酸序列。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠体细胞，所述细胞包括含有经修饰的免疫球蛋白重链基因座的染色体，以及编码在雄性小鼠中具有功能的ADAM6或者其直系同源物和或同源物或片段的核酸序列。在一个实施方式中，所述核酸序列与经修饰的免疫球蛋白重链基因座在相同的染色体上。在一个实施方式中，所述核酸序列与经修饰的免疫球蛋白重链基因座在不同的染色体上。在一个实施方式中，所述体细胞包括单拷贝的核酸序列。在一个实施方式中，所述体细胞包括至少两个拷贝的核酸序列。在一个特定的实施方式中，所述体细胞是B细胞。在一个实施方式中，所述经修饰的免疫球蛋白重链基因座包括可操作地与重链恒定区序列连接的未经重排的免疫球蛋白轻链基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠生殖细胞，所述细胞包括在生殖细胞的染色体上的编码小鼠ADAM6(或者其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列，其中编码小鼠ADAM6(或者其同源物或直系同源物或功能性片段)的核酸序列在染色体上的位置与其在野生型小鼠生殖细胞染色体上的位置不同，其中所述小鼠还包括含有可操作地与重链恒定区序列连接的未经重排的轻链免疫球蛋白基因区段(Vκ和/或Vλ和/或Vκ和Jκ和/或Vλ和Jλ)的修饰。在一个实施方式中，所述核酸序列在小鼠免疫球蛋白基因座上。在一个实施方式中，所述核酸序列与小鼠免疫球蛋白基因座在生殖细胞相同的染色体上。在一个实施方式中，所述核酸序列与小鼠免疫球蛋白基因座在生殖细胞不同的染色体上。在一个实施方式中，所述小鼠免疫球蛋白基因座包括使用至少一个非小鼠免疫球蛋白序列来取代至少一个小鼠免疫球蛋白序列。在一个特定的实施方式中，所述至少一个非小鼠免疫球蛋白序列是人源免疫球蛋白序列。
在一个方面，本申请提供了来源于如本申请所述小鼠的多能、诱导多能或全能干细胞。在一个特定的实施方式中，所述细胞是小鼠胚胎干(ES)细胞。
在一个方面，本申请提供了一种细胞，所述细胞包括如本申请所述的经修饰的免疫球蛋白基因座。在一个实施方式中，所述细胞选自全能性细胞、多能性细胞、诱导多能干细胞(iPS)和ES细胞。在一个特定的实施方式中，所述细胞是小鼠细胞，例如小鼠ES细胞。在一个实施方式中，所述细胞针对经过修饰的免疫球蛋白基因座是纯合的。
在一个方面，本申请提供了一种细胞，所述细胞包括编码第一多肽的核酸序列，其包括与人源重链恒定区序列融合的第一体细胞突变的人源Vκ或Vλ序列。
在一个实施方式中，所述细胞还包括第二多肽链，所述多肽链包括与人源轻链恒定区序列融合的第二体细胞突变的人源Vκ或Vλ序列。
在一个实施方式中，所述第一多肽的人源Vκ或Vλ序列与所述第二多肽的人源Vκ或Vλ序列具有同源性。
在一个实施方式中，所述第一多肽的Vκ或Vλ和所述第二多肽的人源Vκ或Vλ当结合时特异性与目标抗原结合。在一个特定的实施方式中，所述第一多肽包括基本上由人源Vκ组成的可变结构域，所述第二多肽包括由人源Vκ组成的可变结构域，所述可变结构域与第一多肽的人源Vκ具有同源性，以及所述人源恒定区序列是IgG序列。
在一个实施方式中，所述细胞选自CHO细胞、COS细胞、293细胞、HeLa细胞和表达病毒核酸序列的人视网膜细胞(例如PERC.6TM细胞)。
在一个方面，本申请提供了一种啮齿动物(例如小鼠)的体细胞，所述细胞含有包括如本申请所述的基因修饰的染色体。
在一个方面，本申请提供了一种啮齿动物(例如小鼠)的生殖细胞，所述细胞含有包括如本申请所述的基因修饰的核酸序列。
在一个方面，本申请提供了一种来源于如本申请所述的啮齿动物(例如小鼠)的多能、诱导多能或全能细胞。在一个特定的实施方式中，所述细胞是小鼠胚胎干(ES)细胞。
在一个方面，本申请提供了如本申请所述的细胞用于制备啮齿动物(例如小鼠)、细胞或治疗性蛋白(例如抗体或其他抗原结合蛋白)的用途。在一个实施方式中，本申请提供了如本申请所述的细胞用于制备治疗性蛋白的用途，其中所述治疗性蛋白包括人源可变结构域。在一个特定的实施方式中，所述人源可变结构域包括重排的Vκ和Jκ基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种使用如本申请所述的靶向载体、核苷酸构建体或细胞制备的啮齿动物(例如小鼠)。
在一个方面，本申请提供了如本申请所述的靶向载体用于制备啮齿动物(例如小鼠)或细胞(例如小鼠ES细胞、小鼠成纤维细胞等)的用途。在一个实施方式中，所述靶向载体包括人源基因组片段，所述基因组片段含有未经重排的免疫球蛋白基因区段。在一个特定的实施方式中，所述重排的免疫球蛋白基因区段包括V和J基因区段。在一个特定的实施方式中，所述未经重排的免疫球蛋白基因区段包括V、D和J基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种核酸构建体，所述核酸构建体包括上游同源臂和下游同源臂，其中所述上游同源臂包括与人源免疫球蛋白重链可变区序列相同或基本上相同的序列，所述下游同源臂包括与人源或小鼠免疫球蛋白可变区序列相同或基本上相同的序列，并且在所述上游和下游同源臂之间排列的是包括编码小鼠ADAM6蛋白的核苷酸序列的序列。在一个特定的实施方式中，所述编码小鼠ADAM6基因的序列与小鼠启动子可操作地连接，在野生型小鼠中通过其与小鼠ADAM6连接。
在一个方面，本申请提供了一种靶向载体，所述靶向载体包括(a)与人源可变区基因区段的核苷酸序列相同或基本上相同的核苷酸序列；以及(b)编码在小鼠中具有功能的小鼠ADAM6或者其直系同源物或同源物或片段的核苷酸序列。
在一个实施方式中，所述靶向载体还包括与编码小鼠ADAM6的序列可操作地连接的启动子。在一个特定的实施方式中，所述启动子是小鼠ADAM6启动子。
在一个方面，本申请提供了一种用于修饰小鼠免疫球蛋白重链可变基因座的核苷酸构建体，其中所述构建体包括至少一个位点特异性重组酶识别位点和编码在小鼠中具有功能的ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或片段的序列。
在一个方面，本申请提供了一种核酸构建体，所述构建体包括上游和下游并置23-mer间隔RSS的人源DH基因区段。在一个特定的实施方式中，所述核酸构建体包括与含有人源Vκ基因区段的人源基因组序列具有同源性的同源臂。在一个实施方式中，所述靶向构建体包括全部或基本上全部人源DH基因区段上游和下游均并置23-mer间隔RSS。
在一个方面，本申请提供了一种核酸构建体，所述构建体包括上游并置12-mer间隔RSS的人源Jκ基因区段。在一个特定的实施方式中，所述核酸构建体包括第一同源臂，所述同源臂与上游和下游并置23-mer间隔RSS的人源基因组DH基因序列具有同源性。在一个实施方式中，所述核酸构建体包括第二同源臂，所述同源臂与人源基因组J基因序列具有同源性或与小鼠重链恒定区序列具有同源性或与小鼠恒定区重链序列上游的J-C基因间序列具有同源性。
在一个方面，本申请提供了一种核酸构建体，所述构建体包括下游并列23-mer间隔RSS的人源Vλ区段，上游和下游并置12-mer间隔RSS的人源DH区段和人源J区段，所述人源J区段选自上游并置23-mer间隔RSS的Jκ区段、上游并置23-mer间隔RSS的人源Jλ区段和上游并置23-mer间隔RSS的人源JH区段。在一个实施方式中，所述构建体包括与小鼠恒定区序列、J-C基因间小鼠序列和/或人源Vλ序列具有同源性的同源臂。
在一个实施方式中，所述核酸构建体包括人源λ轻链可变区序列，所述序列包括人源λ轻链基因座的簇A的片段。在一个特定的实施方式中，所述人源λ轻链基因座的簇A的片段由hVλ3-27延伸至hVλ3-1。
在一个实施方式中，所述核酸构建体包括人源λ轻链可变区序列，所述序列包括人源λ轻链基因座的簇B的片段。在一个特定的实施方式中，所述人源λ轻链基因座的簇B的片段由hVλ5-52延伸至hVλ1-40。
在一个实施方式中，所述核酸构建体包括人源λ轻链可变区序列，所述序列包括簇A的基因组片段和簇B的基因组片段。在一个实施方式中，所述人源λ轻链可变区序列包括至少一个簇A的基因区段和至少一个簇B的基因区段。
在一个实施方式中，所述人源λ轻链可变区序列包括至少一个簇B的基因区段和至少一个簇C的基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种核酸构建体，所述构建体包括上游和下游并置23-mer间隔的RSS的人源DH区段，所述RSS通常见于Jκ、JH、Vλ或VH区段的天然翼侧。在一个实施方式中，所述核酸构建体包括第一同源臂，所述第一同源臂与人源V-J基因间区同源或与含有人源V基因区段的人源基因组序列同源。在一个实施方式中，所述核酸构建体包括第二同源臂，所述第二同源臂与人源或小鼠重链恒定区序列同源。在一个特定的实施方式中，所述人源或小鼠重链恒定区选自CH1、铰链、CH2、CH3及其组合。在一个实施方式中，所述核酸构建体包括上游翼侧为12-mer RSS的人源J基因区段。在一个实施方式中，所述核酸构建体包括第二同源臂，所述同源臂与上游翼侧为12-mer RSS的J基因区段具有同源性。在一个实施方式中，所述J基因区段选自人源Jκ、人源Jλ和人源JH。
在一个方面，本申请提供了一种核酸构建体，所述构建体包括上游和下游与23-mer间隔的RSS并置的人源DH区段和位点特异性重组酶识别序列，例如被位点特异性重组酶如Cre、Flp或Dre蛋白识别的序列。
在一个方面，本申请提供了一种核酸构建体，所述构建体包括人源Vλ或人源Vκ区段、上游和下游与12-mer或23-mer间隔的RSS并置的DH区段，以及具有12-mer或23-mer间隔的RSS的人源J区段，其中所述12-mer或23-mer间隔的RSS与人源J区段的5’紧邻(即相对于转录的方法)。在一个实施方式中，所述构建体包括与3’23-mer间隔的RSS并置的人源Vλ、上游和下游与12-mer间隔的RSS并置的人源DH区段和与5’23-mer间隔的RSS并置的人源Jκ区段。在一个实施方式中，所述构建体包括与3’12-mer间隔的RSS并置的人源Vκ、上游和下游与23-mer间隔的RSS并置的人源DH区段和与5’12-mer间隔的RSS并置的人源Jλ区段。
在一个方面，本申请提供了一种靶向载体，所述靶向载体包括(a)第一靶向臂和第二靶向臂，其中所述第一和第二靶向臂独立地选自人源和小鼠靶向臂，其中所述靶向臂将所述载体导向内源性或经修饰的免疫球蛋白V区基因座；和(b)人源VL基因区段的邻近序列或人源VL基因区段的邻近序列和至少一个人源Jκ基因区段，其中所述邻近序列选自下组：(i)hVκ4-1至hVκ1-6和Jκ1，(ii)hVκ4-1至hVκ1-6和Jκ1至Jκ2，(iii)hVκ4-1至hVκ1-6和Jκ1至Jκ3，(iv)hVκ4-1至hVκ1-6和Jκ1至Jκ4，(v)hVκ4-1至hVκ1-6和Jκ1至Jκ5，(vi)hVκ3-7至hVκ1-16，(vii)hVκ1-17至hVκ2-30，(viii)hVκ3-31至hVκ2-40和(ix)其组合。
在一个实施方式中，将所述载体导向内源性或经修饰的免疫球蛋白基因座的所述靶向臂与在内源性或经修饰的免疫球蛋白基因座的序列相同或基本上相同。
在一个方面，本申请提供了一种制备基因修饰的小鼠的方法，所述方法包括使用一个或多个人源免疫球蛋白轻链和/或重链基因区段来取代小鼠内源性ADAM6基因座上游(相对于免疫球蛋白重链基因区段的转录方向)的一个或多个免疫球蛋白重链基因区段，并且使用一个或多个人源免疫球蛋白重链或轻链基因区段来取代小鼠ADAM6基因座下游(相对于免疫球蛋白重链基因区段的转录方向)的一个或多个免疫球蛋白基因区段。在一个实施方式中，取代小鼠内源性ADAM6基因座上游的一个或多个内源性免疫球蛋白基因区段的所述一个或多个人源免疫球蛋白基因区段包括V基因区段。在一个实施方式中，取代小鼠内源性ADAM6基因座上游的一个或多个内源性免疫球蛋白基因区段的所述人源免疫球蛋白基因区段包括V和D基因区段。在一个实施方式中，取代小鼠内源性ADAM6基因座下游的一个或多个内源性免疫球蛋白基因区段的所述一个或多个人源免疫球蛋白基因区段包括J基因区段。在一个实施方式中，取代小鼠内源性ADAM6基因座下游的一个或多个内源性免疫球蛋白基因区段的所述一个或多个人源免疫球蛋白基因区段包括D和J基因区段。在一个实施方式中，取代小鼠内源性ADAM6基因座下游的一个或多个内源性免疫球蛋白基因区段的所述一个或多个人源免疫球蛋白基因区段包括V、D和J基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种制备基因修饰的小鼠的方法，所述方法包括使用一个或多个人源免疫球蛋白轻链基因区段取代小鼠内源性ADAM6基因座上游(相对于免疫球蛋白重链基因区段的转录)的一个或多个免疫球蛋白重链基因区段，和使用一个或多个人源免疫球蛋白轻链区段取代小鼠ADAM6基因座下游(相对于免疫球蛋白重链基因区段的转录)的一个或多个免疫球蛋白基因区段。在一个实施方式中，取代小鼠内源性ADAM6基因座上游的一个或多个内源性免疫球蛋白基因区段的所述一个或多个人源免疫球蛋白基因区段包含V基因区段。在一个实施方式中，取代小鼠内源性ADAM6基因座上游的一个或多个内源性免疫球蛋白基因区段的所述人源免疫球蛋白基因区段包含V和J基因区段。在一个实施方式中，取代小鼠内源性ADAM6基因座下游的一个或多个内源性免疫球蛋白基因区段的所述一个或多个人源免疫球蛋白基因区段包含J基因区段。在一个实施方式中，取代小鼠内源性ADAM6基因座下游的一个或多个内源性免疫球蛋白基因区段的所述一个或多个人源免疫球蛋白基因区段包含V和J基因区段的。在一个实施方式中，取代小鼠内源性ADAM6基因座下游的一个或多个内源性免疫球蛋白基因区段的所述一个或多个人源免疫球蛋白基因区段含有V基因区段。
在一个特定的实施方式中，所述V基因区段是VL基因区段。在另一个特定的实施方式中，所述J基因区段是JL基因区段。
在一个实施方式中，在多能、诱导多能或全能干细胞中将所述ADAM6基因上游和/或下游的一个或多个免疫球蛋白重链基因区段取代，以形成基因修饰的祖细胞；将所述基因修饰的祖细胞引入宿主；并且将包括所述基因修饰的祖细胞的宿主进行妊娠以形成某种小鼠，所述小鼠包括来源于基因修饰的祖细胞的基因组。在一个实施方式中，所述宿主是胚胎。在一个特定的实施方式中，所述宿主选自小鼠的前-桑葚胚(例如8或4细胞期)、四倍体胚胎、胚胎细胞聚集物或胚泡。
在一个方面，本申请提供了一种制备基因修饰的小鼠的方法，所述方法包括使用包括人免疫球蛋白基因区段的序列来取代包括小鼠免疫球蛋白基因区段和小鼠ADAM6(或者在雄性小鼠中具有功能的其直系同源物或同源物或片段)核苷酸序列的小鼠核苷酸序列以形成第一嵌合基因座，然后将包括小鼠ADAM6编码序列(或者编码其直系同源物或同源物或功能性片段的序列)的序列插入包括所述人源免疫球蛋白基因区段的序列以形成第二嵌合基因座。
在一个实施方式中，所述第二嵌合基因座包括人源免疫球蛋白重链可变基因区段(VH)。在一个实施方式中，所述第二嵌合基因座包括人源免疫球蛋白轻链可变基因区段(VL)。在一个特定的实施方式中，所述第二嵌合基因座包括与人源DH基因区段和人源JH基因区段可操作地连接的人源VH基因区段或人源VL基因区段。在一个特定的实施方式中，所述第二嵌合基因座包括可操作地与人源JH或人源JL基因区段连接的人源VL基因区段。在进一步特定的实施方式中，所述第二嵌合基因座与第三嵌合基因座可操作地连接，所述第三嵌合基因座包括与小鼠CH2+CH3序列融合的人源CH1序列或者人源CH1和人源铰链序列。
在一个方面，本发明提供了一种修饰小鼠的重链免疫球蛋白基因座的方法，所述方法包括：(a)制备小鼠重链免疫球蛋白基因座的第一修饰，所述修饰使得在雄性小鼠中的内源性小鼠ADAM6的活性降低或消除；和(b)制备第二修饰以引入核酸序列，所述核酸序列赋予小鼠在雄性小鼠中具有功能的ADAM6活性。
在一个实施方式中，所述第一修饰包含人源免疫球蛋白序列的插入或者使用人源免疫球蛋白序列取代小鼠免疫球蛋白序列。
在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白序列是重链序列。在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白序列是轻链序列。
在一个实施方式中，所述第一和第二修饰在单一ES细胞中制备，并将所述单一ES细胞引入宿主胚胎以制备所述小鼠。
在一个方面，本申请提供了一种由本申请所述的小鼠与另一种小鼠交配的子代，所述的另一种小鼠是野生型小鼠或基因修饰的。
在一个方面，本申请提供了使用包括含有小鼠ADAM6基因座或序列的异位核苷酸序列的小鼠来制备具有生育能力的雄性小鼠的用途，其中所述用途包括将包括含有小鼠ADAM6基因座或序列的异位核苷酸序列的小鼠与缺乏功能性内源性ADAM6基因座或序列的小鼠进行交配，并且获得能产生具有异位ADAM6基因座或序列的后代的雌性后代或包括异位ADAM6基因座或序列的雄性后代，并且所述雄性显示出的生育能力与野生型雄性小鼠显示出的生育能力大致相同。
在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述的小鼠将异位ADAM6序列引入缺乏具有功能的内源性ADAM6序列的小鼠的用途，其中所述用途包括将如本申请所述的小鼠与缺乏具有功能的内源性ADAM6序列的小鼠进行交配。
在一个方面，本申请提供了使用来自如本申请所述小鼠的遗传物质来制备具有异位ADAM6序列的小鼠的用途。在一个实施方式中，所述用途包括使用如本申请所述小鼠的细胞核进行核转移。在一个实施方式中，所述用途包括将如本申请所述小鼠的细胞克隆以产生来源于所述细胞的动物。在一个实施方式中，所述用途包括在制备包括异位ADMA6序列的小鼠的过程中利用如本申请所述小鼠的精子或卵子。
在一个方面，本申请提供了一种制备包括经修饰的免疫球蛋白重链基因座的、具有生育能力的雄性小鼠的方法，所述方法包括使用包括在雄性小鼠中具有功能的ADAM6基因或者其直系同源物或同源物或片段的第二小鼠生殖细胞将包括经修饰的内源性重链免疫球蛋白基因座的第一小鼠生殖细胞受精；形成已受精的细胞；使已受精的细胞发育成胚胎；并且将所述胚胎在代孕母体中妊娠以获得小鼠。
在一个实施方式中，通过将雄性小鼠与雌性小鼠交配来完成受精。在一个实施方式中，所述雌性小鼠包括ADAM6基因或者其直系同源物或同源物或片段。在一个实施方式中，所述雄性小鼠包括ADAM6基因或者其直系同源物或同源物或片段。
在一个方面，本申请提供了使用编码小鼠ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或相应ADAM6蛋白功能性片段的核酸序列的用途，所述用途是恢复或增强具有包括免疫球蛋白重链基因座修饰的基因组的小鼠的生育能力，其中所述修饰降低或消除内源性ADAM6的功能。
在一个实施方式中，所述核酸序列在异位整合至小鼠基因组。在一个实施方式中，所述核酸序列在内源性免疫球蛋白基因座处整合至小鼠基因组。在一个特定的实施方式中，所述内源性免疫球蛋白基因座是重链基因座。在一个实施方式中，所述核酸序列在不同于内源性免疫球蛋白基因座的位置整合至小鼠基因组。
在一个方面，本申请提供了一种制备基因修饰的小鼠的方法，所述方法包括使用一个或多个人源免疫球蛋白轻链基因区段取代在内源性重链基因座的一个或多个小鼠免疫球蛋白重链基因区段。在一个实施方式中，所述取代是使用一个或多个具有功能的人源轻链区段(即VL和JL区段)取代全部或基本上全部的具有功能的小鼠免疫球蛋白重链区段(即VH、DH和JH区段)。在一个实施方式中，所述取代是使用全部或基本上全部的人源Vλ或Vκ区段和至少一个Jλ或Jκ区段取代全部或基本上全部的具有功能的小鼠重链VH、DH和JH区段。在一个特定的实施方式中，所述取代包含全部或基本上全部的具有功能的人源Jλ或Jκ区段。
在一个方面，本申请提供了一种制备表达多肽的小鼠的方法，所述多肽包含与小鼠重链恒定区融合的人源免疫球蛋白Vλ或Vκ和/或Jλ或Jκ区段，其中含有内源性重链免疫球蛋白可变区(VH、DH和JH)被至少一个人源Vλ或Vκ区段和至少一个人源Jλ或Jκ区段取代，其中所述取代是在多能干细胞、诱导性多能干细胞或全能性小鼠细胞中以形成基因修饰的小鼠祖细胞；将所述基因修饰的小鼠祖细胞引入小鼠宿主；并且将含有所述基因修饰的祖细胞的小鼠宿主妊娠以形成含有来源于所述基因修饰的小鼠祖细胞基因组的小鼠。在一个实施方式中，所述宿主是胚胎。在一个特定的实施方式中，所述宿主选自小鼠的前-桑葚胚(例如8或4细胞期)、四倍体胚胎、胚胎细胞聚集物或胚泡。
在一个方面，本申请提供了一种制备如本申请所述的基因修饰的小鼠的方法，所述方法包括将含有如本申请所述的包含修饰的核酸通过核转移引入细胞中，并且将所述细胞保持在适宜条件下(例如培养所述细胞并将含有所述细胞的胚胎在代孕母体中妊娠)以发育成如本申请所述的小鼠。
在一个方面，本申请提供了一种制备经修饰的小鼠的方法，所述方法包括将如本申请所述地修饰小鼠ES细胞或多能或全能或诱导性多能小鼠细胞，以引入可操作地与免疫球蛋白重链恒定序列连接的一个或多个未经重排的免疫球蛋白轻链可变基因区段，培养所述ES细胞、将所述经培养的ES细胞引入宿主胚胎以形成嵌合的胚胎，并且将所述嵌合的胚胎引入适宜的宿主小鼠以发育成经修饰的小鼠。在一个实施方式中，所述一个或多个未经重排的免疫球蛋白轻链可变区基因区段是人源λ或人源κ基因区段。在一个实施方式中，所述一个或多个未经重排的免疫球蛋白轻链可变区基因区段包含人源Vλ或人源Vκ区段和一个或多个Jλ、Jκ或JH区段。在一个实施方式中，所述重链恒定基因区段是选自CH1、铰链、CH2、CH3及其组合的人源序列。在一个实施方式中，所述一个或多个未经重排的免疫球蛋白轻链可变基因区段取代在内源性重链基因座上的全部或基本上全部的具有功能的内源性重链可变区基因区段，并且所述重链恒定序列是含有CH1、铰链、CH2和CH3的小鼠序列。
在一个方面，本申请提供了用于制备蛋白的核酸构建体、细胞、胚胎、小鼠和方法，所述蛋白含有一个或多个κ和/或λ轻链可变区免疫球蛋白序列和免疫球蛋白重链恒定区序列，包括含有人源λ或κ轻链可变结构域和人源或小鼠重链恒定区序列的蛋白。
在一个方面，本申请提供了编码在如本申请所述的小鼠中制备的免疫球蛋白可变区的核苷酸序列。
在一个方面，本申请提供了在如本申请所述的小鼠中制备的抗体的重链或轻链可变区氨基酸序列。
在一个方面，本申请提供了编码在如本申请所述的小鼠中制备的抗体的可变区的重链或轻链可变区核苷酸序列。
在一个方面，本申请提供了在如本申请所述的小鼠制备的抗体或其抗原结合片段(例如Fab、F(ab)2、scFv)。
在一个方面，所述的含有免疫球蛋白可变区的结合蛋白来源于轻链(即κ和/或λ)免疫球蛋白可变结构域，而不是来源于全长重链免疫球蛋白可变结构域。本申请还提供了用于制备结合蛋白的方法和组合物(包括基因修饰的小鼠)。
在一个方面，本申请提供了一种制备抗原结合蛋白的方法，所述抗原结合蛋白不包含免疫球蛋白重链可变结构域，所述方法包括使用目标抗原免疫如本申请所述的小鼠的步骤，并且将所述小鼠保持在容许其制备特异性与目标抗原结合的抗原结合蛋白的条件下。
在一个方面，本申请提供了一种制备抗原结合蛋白的方法，所述抗原结合蛋白包含与重链恒定区序列相邻的第一免疫球蛋白轻链可变结构域和与轻链恒定序列相邻的第二免疫球蛋白轻链可变结构域，所述方法包括使用目标抗原免疫如本申请所述的小鼠的步骤，并且将所述小鼠保持在容许其制备特异性与目标抗原结合的抗原结合蛋白的条件下。
在一个方面，本申请提供了一种制备抗原结合蛋白的方法，所述抗原结合蛋白包含与重链恒定区序列相邻的免疫球蛋白轻链可变结构域，其中所述抗原结合蛋白缺乏免疫球蛋白轻链，所述方法包括使用目标抗原免疫包含内源性κ和λ基因座敲除(或者包含无功能的内源性κ和/或λ基因座)的如本申请所述的小鼠的步骤，并且将所述小鼠保持在容许其制备特异性与目标抗原结合的抗原结合蛋白的条件下。
在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述的小鼠来制备免疫球蛋白可变区核苷酸序列的用途。在一个实施方式中，所述可变区核苷酸序列包含重排的VL、DH和JL基因区段。在一个实施方式中，所述可变区核苷酸序列包含重排的VL、DH和JH基因区段。在一个实施方式中，所述可变区核苷酸序列包含重排的Vκ和Jκ基因区段。在一个实施方式中，所述可变区核苷酸序列包含重排的Vλ和Jλ基因区段。
在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述的小鼠来制备全人源Fab或全人源F(ab)2的用途。在一个实施方式中，所述全人源Fab或全人源F(ab)2包含重排的VL、DH和JL基因区段。在一个实施方式中，所述全人源Fab或全人源F(ab)2包含重排的Vκ和Jκ基因区段。在一个实施方式中，所述全人源Fab或全人源F(ab)2包含重排的Vλ和Jλ基因区段。
在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述的小鼠来制备全人源Fab(含有与人源轻链恒定区融合的第一人源VL和与人源重链恒定区序列融合的第二人源VL)或全人源F(ab)2的用途。
在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述的小鼠来制备永生化细胞系的用途。在一个实施方式中，所述永生化细胞系包含编码可操作地与含有小鼠恒定区核酸序列的核酸序列连接的人源Vλ或Vκ结构域的核酸序列。在一个实施方式中，所述永生化细胞系表达包含人源可变结构域的抗体。在一个特定的实施方式中，所述人源可变结构域是轻链可变结构域。
在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述小鼠来制备杂交瘤或四价体杂交瘤的用途。在一个实施方式中，所述杂交瘤或四价体杂交瘤表达含有与目标抗原结合的人源可变结构域的多肽。
在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述小鼠来制备包含人源轻链可变区的噬菌体文库的用途。在一个实施方式中，所述轻链可变区是人源Vκ区。
在一个方面，本申请提供了使用如本申请所述小鼠来产生用于制备人源抗原结合蛋白的可变区序列的用途，包括(a)使用目标抗原来免疫如本申请所描述的小鼠，(b)从(a)中经免疫的小鼠中来分离淋巴细胞，(c)将所述淋巴细胞与一种或多种标记抗体接触，(d)鉴定能够与目标抗原结合的淋巴细胞，以及(e)扩增来自所述淋巴细胞的一个或多个人源轻链可变区核酸序列以产生可变区序列。
在一个实施方式中，所述淋巴细胞来源于小鼠的脾脏。在一个实施方式中，所述淋巴细胞来源于小鼠的淋巴结。在一个实施方式中，所述淋巴细胞来源于小鼠的骨髓。
在一个实施方式中，所述标记抗体是荧光团偶联的抗体。一个实施方式中，所述一种或多种荧光团偶联的抗体选自IgM、IgG和/或其组合。
在一个实施方式中，所述淋巴细胞是B细胞。
在一个实施方式中，所述一个或多个可变区核酸序列包含轻链可变区序列。在一个特定实施方式中，所述轻链可变区序列是免疫球蛋白κ轻链可变区序列。在一个实施方式中，所述一个或多个可变区核酸序列是λ轻链可变区序列。
在一个实施方式中，本申请提供了一种使用如本申请所述小鼠来产生用于制备人源抗原结合蛋白的一个或多个κ轻链可变区序列的用途，包括(a)使用目标抗原来免疫如本申请所描述的小鼠，(b)从(a)中经免疫的小鼠中来分离脾脏，(c)将来自于脾脏的B淋巴细胞与一种或多种标记抗体接触，(d)鉴定(c)中能够与目标抗原结合的B淋巴细胞，以及(e)从B淋巴细胞中扩增κ轻链可变区核酸序列以产生κ轻链可变区序列。
在一个实施方式中，本申请提供了一种使用如本申请所述小鼠来产生用于制备人源抗原结合蛋白的κ轻链可变区序列的用途，包括(a)使用目标抗原来免疫如本申请所描述的小鼠，(b)从(a)中经免疫的小鼠中来分离骨髓，(c)将来自于骨髓的B淋巴细胞与一种或多种标记的抗体接触，(d)鉴定(c)中能够与目标抗原结合的B淋巴细胞，以及(e)从B淋巴细胞中扩增κ轻链可变区核酸序列以产生κ轻链可变区序列。在各种实施方式中，所述一种或多种标记抗体选自IgM、IgG和/或其组合。
在各种实施方式中，本申请提供了使用如本申请所述小鼠来产生用于制备人源抗原结合蛋白的κ轻链可变区序列的用途，所述用途还包括将经扩增的κ轻链可变区序列与人源重链或轻链恒定区序列或任选地人源重链可变区序列融合，在细胞中表达融合的序列，并且回收所表达的序列以产生人源抗原结合蛋白。
在各种实施方式中，所述人源重链恒定区选自IgM、IgD、IgA、IgE和IgG。在各种特定实施方式中，所述IgG选自IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在各种实施方式中，所述人源重链恒定区包含CH1、铰链、CH2、CH3、CH4或其组合。在各种实施方式中，所述重链恒定区是免疫球蛋白κ恒定区。在各种实施方式中，所述细胞选自HeLa细胞、DU145细胞、Lncap细胞、MCF-7细胞、MDA-MB-438细胞、PC3细胞、T47D细胞、THP-1细胞、U87细胞、SHSY5Y(人神经母细胞瘤)细胞、Saos-2细胞、Vero细胞、CHO细胞、GH3细胞、PC12细胞、人视网膜细胞(例如PER.C6TM细胞)和MC3T3细胞。在一个特定实施方式中，所述细胞是CHO细胞。
在一个方面，本申请提供了一种产生特异性针对目标抗原的人源轻链可变区的方法，所述方法包括步骤：使用所述抗原来免疫如本申请所描述的小鼠，从产生特异性针对所述抗原的人源轻链可变区的小鼠中分离至少一种细胞，产生生产含有特异性针对所述抗原的轻链可变区的人源抗原结合蛋白的至少一种细胞，培养产生人源抗原结合蛋白的至少一种细胞，并且获得所述人源抗原结合蛋白。在一个实施方式中，所述人源轻链可变区是人源Vκ区。
在各种实施方式中，从产生特异性针对所述抗原的人源轻链可变区的小鼠分离的至少一种细胞是脾细胞或B细胞。
在各种实施方式中，所述抗原结合蛋白是抗体。
在各种实施方式中，使用蛋白、DNA、DNA和蛋白的组合或者表达所述抗原的细胞来实施目标抗原的免疫。
在一个方面，本申请提供了一种使用如本申请所述小鼠来制备编码免疫球蛋白可变区或其片段的核酸序列的用途。在一个实施方式中，所述核酸序列用于制备人源抗体或其抗原结合片段。在一个实施方式中，所述小鼠用于制备选自下组的抗原结合蛋白：抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、scFv、双特异性结合-scFv、二体、三体、四体、V-NAR、VHH、VL、F(ab)、F(ab)2、DVD(即双可变结构域抗原结合蛋白)、SVD(即单可变结构域抗原结合蛋白)或者双特异性T细胞募召剂(Bispecific T cell Engager)(BiTE)。
在一个方面，本申请提供了一种使用如本申请所描述的小鼠用于生产药物(例如抗原结合蛋白)，或者用于生产编码药物(例如抗原结合蛋白)可变序列的序列的用途，所述药物用于治疗人类疾病或病症。
在一个方面，本申请提供了一种使用如本申请所述的小鼠来制备核苷酸序列的用途，所述核苷酸序列编码与第二人源轻链免疫球蛋白可变序列(VL2)具有同源性的第一人源轻链免疫球蛋白可变序列(VL1)，其中所述与人源免疫球蛋白轻链恒定区融合的VL1(多肽1)同与人源免疫球蛋白重链恒定区融合的VL2(多肽2)一起表达，作为多肽1/多肽2的二聚体，以形成VL1-VL2抗体。
在一个方面，本申请提供了一种使用如本申请所述的小鼠来制备核酸序列的用途，所述核酸序列编码与人源免疫球蛋白重链序列融合的人源免疫球蛋白轻链可变序列，其中所述核酸序列编码人源VL-CH多肽，其中所述人源VL-CH多肽以二聚体形式表达，并且其中所述二聚体在缺乏免疫球蛋白轻链的情况下(例如在缺乏人源λ或人源κ轻链的情况下)表达。在一个实施方式中，所述VL-CH二聚体在缺乏λ轻链和在缺乏κ轻链的情况下特异性地与目标抗原结合。
在一个方面，本申请提供了一种使用如本申请所述的小鼠来制备核酸序列的用途，所述核酸序列编码全部或部分免疫球蛋白可变结构域。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白可变结构域是人源Vλ或人源Vκ结构域。
在一个方面，本申请提供了一种使用如本申请所述的核酸构建体来生产小鼠、细胞或治疗性蛋白(例如抗体或其他抗原结合蛋白)的用途。
在一个方面，本申请提供了一种使用来自如本申请所述的小鼠的核酸序列来制备用于生产人用治疗剂的细胞系的用途。在一个实施方式中，所述人用治疗剂是结合蛋白，所述结合蛋白含有与人源重链恒定序列融合的人源轻链可变序列(例如来源于人源Vλ或人源Vκ区段)。在一个实施方式中，所述人用治疗剂包括第一多肽，其为人源λ或κ免疫球蛋白轻链，和第二多肽，其包含与人源重链恒定序列融合的人源Vλ或人源Vκ可变序列。
在一个方面，本申请提供了一种表达系统，所述表达系统包含转染了DNA构建体的哺乳动物细胞，所述DNA构建体编码含有与人源CH结构域融合的体细胞突变的人源VL结构域的多肽。
在一个实施方式中，所述表达系统还包含编码与人源CL结构域融合的免疫球蛋白VL结构域的核苷酸序列，其中所述与人源CL结构域融合的VL结构域是与人源CH结构域融合的VL结构域的同源性轻链。
在一个实施方式中，所述哺乳动物细胞选自CHO细胞、COS细胞、Vero细胞、293细胞和表达病毒基因的视网膜细胞(例如PER.C6TM细胞)。
在一个方面，本申请提供了一种制备结合蛋白的方法，所述方法包括从来源于如本申请所述的小鼠细胞的编码与CH区融合的VL区的基因中获得编码VL结构域的核苷酸序列，并且将编码VL区序列的核苷酸序列克隆至具有编码人源CH区基因的框架中以形成人源结合蛋白序列，在适宜的细胞中表达所述人源结合蛋白序列。
在一个实施方式中，所述小鼠经过目标抗原免疫，并且与CH区融合的VL区特异性地结合(例如具有在微摩、纳摩或皮摩范围内的KD)目标抗原的表位。在一个实施方式中，编码与CH区融合的VL区的核苷酸序列在小鼠中是体细胞突变的。
在一个实施方式中，所述适宜的细胞选自B细胞、杂交瘤、四价体杂交瘤、CHO细胞、COS细胞、293细胞、HeLa细胞和表达病毒核酸序列的人视网膜细胞(例如PERC.6TM细胞)。
在一个实施方式中，所述CH区包含人源IgG同种型。在一个特定的实施方式中，所述人源IgG选自IgG1、IgG2和IgG4。在另一个特定的实施方式中，所述人源IgG是IgG1。在另一个特定的实施方式中，所述人源IgG是IgG4。在另一个特定的实施方式中，所述人源IgG4是经修饰的IgG4。在一个实施方式中，所述经修饰的IgG4含有在铰链区的取代。在一个特定的实施方式中，相对于野生型人源IgG4而言所述经修饰的IgG4包含在氨基酸残基228的取代，其根据Kabat的EU编号索引编号。在一个特定的实施方式中，在氨基酸残基228的所述取代是S228P取代，其根据Kabat的EU编号索引编号。
在一个实施方式中，所述细胞还包括编码来自轻链的VL结构域的核苷酸序列，其与同CH区融合的VL结构域具有同源性，并且所述方法还包括表达编码与人源Cκ或Cλ结构域融合的同源VL结构域的核苷酸序列。
在一个方面，本申请提供了一种制备双特异性抗原结合蛋白的方法，所述方法包括将如本申请所述的第一小鼠与第一目标抗原接触并且鉴定特异性与所述第一目标抗原结合的第一人源VL结构域的序列；将如本申请所述的第二小鼠与第二目标抗原接触并且鉴定特异性与所述第二目标抗原结合的第二人源VL结构域的序列；其中所述第一人源VL结构域不与所述第二目标抗原结合，并且所述第二人源VL结构域不与所述第一目标抗原结合；将所述第一人源VL结构域的序列与第一重链恒定序列融合以形成第一抗原结合多肽，将所述第二人源VL结构域的序列与第二重链恒定序列融合以形成第二抗原结合多肽；以及使用双特异性蛋白中的所述第一和第二抗原结合多肽。
在一个实施方式中，所述抗原结合蛋白还包含第一免疫球蛋白轻链，其包含与所述第一人源VL结构域具有同源性的人源κ或λ可变结构域，和第二免疫球蛋白轻链，其包含与所述第二人源VL结构域具有同源性的人源κ或λ可变结构域。
在一个实施方式中，所述第一重链恒定序列与所述第二重链恒定序列是相同的。在一个实施方式中，所述第一重链恒定序列包含降低或消除所述第一重链恒定区与蛋白A结合的修饰，并且所述第二重链恒定序列与蛋白A结合。
在一个实施方式中，所述第一和第二人源VL结构域包含来源于人源Vκ和人源Jκ基因区段的序列。在一个实施方式中，所述第一和第二人源VL结构域包含来源于人源Vλ和人源Jλ基因区段的序列。在一个实施方式中，所述第一和第二人源VL结构域包含来源于人源DH基因区段的序列。在一个实施方式中，所述第一和第二人源VL结构域包含来源于人源JH基因区段的序列。在一个特定的实施方式中，所述第一和第二人源VL结构域包含来源于人源DH和人源JH基因区段的序列。在一个特定的实施方式中，所述第一和第二人源VL结构域包含来源于人源DH和人源Jκ基因区段的序列。
在一个实施方式中，所述第一人源VL结构域包含来源于人源Vκ和人源Jκ基因区段的序列，并且所述第二人源VL结构域包含来源于人源Vλ和人源Jλ基因区段的序列。在一个实施方式中，所述第一人源VL结构域包含来源于人源Vλ和人源Jλ基因区段的序列，并且所述第二人源VL结构域包含来源于人源Vκ和人源Jκ基因区段的序列。
在一个方面，本申请提供了在如本申请所述的小鼠中制备的免疫球蛋白可变区(VR)(例如含有与人源JL、或JH、或DH和JH、或DH和JL融合的人源VL序列)。在一个特定的实施方式中，所述免疫球蛋白VR来源于选自Vκ区段和Vλ区段的生殖细胞系人源基因区段，其中所述VR由来自小鼠的重排的序列编码，其中所述重排的序列是体细胞突变的。在一个实施方式中，所述重排的序列包含1至5个体细胞超突变。在一个实施方式中，所述重排的序列包含至少6、7、8、9或10个体细胞超突变。在一个实施方式中，所述重排的序列包含10个以上体细胞超突变。在一个实施方式中，所述重排的序列与一个或多个人源或小鼠重链恒定区序列(例如选自人源或小鼠CH1、铰链、CH2、CH3及其组合)融合。
在一个方面，本申请提供了在如本申请所述的小鼠中制备的结合蛋白的免疫球蛋白可变结构域氨基酸序列。在一个实施方式中，所述VR与一个或多个人源或小鼠重链恒定区序列(例如选自人源或小鼠CH1、铰链、CH2、CH3及其组合)融合。
在一个方面，本申请提供了由来源于如本申请所述的小鼠的核酸序列编码的轻链可变结构域。
在一个方面，本申请提供了在如本申请所述的小鼠中制备的或者由来源于在如本申请所述的小鼠中制备的序列的抗体或其抗原结合片段(例如Fab、F(ab)2、scFv)。
附图的简要说明
图1是小鼠重链基因座(上图)和人源κ轻链基因座(下图)的说明性示意图(未按照比例)。所述小鼠重链基因座的长度约3Mb并且含有约200个重链可变(VH)基因区段、13个重链多样性(DH)基因区段和4个重链连接(JH)基因区段以及增强子(Enh)和重链恒定(CH)区。所述人源κ轻链基因座被复制成跨距分别为约440kb和600kb的极性相反的远端和近端邻接片段。在这两个邻接片段之间约800kb的DNA据信不含Vκ基因区段。所述人源κ轻链基因座含有约76个Vκ基因区段、5个Jκ基因区段、内含子增强子(Enh)和单一的恒定区(Cκ)。
图2显示了将40个人源Vκ和5个人源Jκ基因区段逐步插入小鼠重链基因区段以得到经修饰的小鼠免疫球蛋白重链基因座的示例性靶向策略，所述经修饰的小鼠免疫球蛋白重链基因座包含可操作地与小鼠免疫球蛋白重链恒定区连接的人源Vκ和Jκ基因区段。潮霉素(hyg)和新霉素(neo)选择性表达盒与重组酶识别位点(R1、R2等)一起显示。
图3显示了将多个人源Vλ和单一的人源Jλ基因区段逐步插入小鼠重链基因座的示例性靶向策略。潮霉素(hyg)和新霉素(neo)选择性表达盒与重组酶识别位点(R1、R2等)一起显示。
图4显示了将多个人源Vλ和4个人源Jλ基因区段逐步插入小鼠重链基因座的示例性靶向策略。潮霉素(hyg)和新霉素(neo)选择性表达盒与重组酶识别位点(R1、R2等)一起显示。
图5显示了将人源Vλ、人源DH和人源JH基因区段逐步插入小鼠重链基因座的示例性靶向策略。潮霉素(hyg)和新霉素(neo)选择性表达盒与重组酶识别位点(R1、R2等)一起显示。
图6显示了将人源Vλ、人源DH和人源Jκ基因区段逐步插入小鼠重链基因座的示例性靶向策略。潮霉素(hyg)和新霉素(neo)选择性表达盒与重组酶识别位点(R1、R2等)一起显示。
图7显示了克隆编码来自小鼠免疫球蛋白重链V-D基因间区的小鼠ADAM6基因的基因组片段的步骤，和修饰所述基因组区段以插入经修饰的免疫球蛋白重链基因座的工程化步骤。
图8显示了将编码小鼠ADAM6基因的基因组片段插入经修饰的小鼠免疫球蛋白重链基因座的Vκ-Jκ基因间区的靶向策略，所述经修饰的小鼠免疫球蛋白重链基因座含有可操作地与小鼠免疫球蛋白重链恒定区连接的人源Vκ和Jκ基因区段。
图9显示了将编码小鼠ADAM6基因的基因组片段插入经修饰的小鼠免疫球蛋白重链基因座的人源Vκ基因区段(即hVκ2-40)的上游(5’)的靶向策略，所述经修饰的小鼠免疫球蛋白重链基因座含有可操作地与小鼠免疫球蛋白重链恒定区连接的人源Vκ和Jκ基因区段。
详述
本发明不限于所描述的特定方法以及实验条件，因为这些方法和条件可以改变。还应理解本申请所使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，并且其并不旨在限定，因为本发明的范围是由权利要求所定义的。
除非另有定义，否则本申请使用的所有术语和短语包括所述术语和短语在本领域中所具有的含义，除非有相反的明确说明或根据使用所述术语或短语的上下文是显而易见的。尽管在实施或检验本发明中可以使用与本申请所描述的那些相似或等效的任意方法和材料，但是在本申请中仅描述了特定的方法和材料。所提及的全部出版物均通过引用并入本申请。
当使用短语“基本上的”或“基本上地”指基因区段的数量(例如“基本上全部的”V基因区段)包括功能性和非功能性基因区段，并且包括，在各种实施方式中，例如全部基因区段的80％或以上、85％或以上、90％或以上、95％或以上、96％或以上、97％或以上、98％或以上或者99％或以上；在各种实施方式中，“基本上全部的”基因区段包括例如至少95％、96％、97％、98％或99％的功能性(即非假基因)基因区段。
术语“取代”包括其中将DNA序列置于细胞的基因组中，使得在所述基因组序列的基因座上使用异源性序列(例如在小鼠中的人源序列)来取代基因组中的序列。这样放置的DNA序列可以包括一个或多个调控序列，所述调控序列是用于获得这样放置的所述序列的来源DNA的一部分(例如启动子、增强子、5’-或3’-非翻译区、适宜的重组信号序列等)。例如，在各种实施方式中，所述取代是异源性序列对内源性序列的取代，以使得产生这样放置的DNA序列(包含异源性序列)的基因产物，但是不表达内源性序列；所述取代是用DNA序列来取代内源性基因组序列，所述DNA序列编码与内源性基因组序列编码的蛋白(例如内源性基因组序列编码免疫球蛋白基因或结构域，以及DNA片段编码一个或多个人源免疫球蛋白基因或结构域)具有相似功能的蛋白。在各种实施方式中，使用相应的人源基因或其片段取代内源性基因或其片段。相应的人源基因或其片段是被取代的内源性基因或其片段的直系同源物、同源物或与其在结构和/或功能上基本相等或相同的人源基因或其片段。
术语“邻近的(contiguous)”指出现在相同的核酸分子上，例如如果两条核酸出现在相同核酸分子上但是被另一条核酸序列所中断，则两条核酸序列是“邻近的”。例如，重排的V(D)J序列与恒定区基因序列是“邻近的”，尽管V(D)J序列的最后一个密码子之后并不是紧随着恒定区序列的第一个密码子。在另一个例子中，如果两个V基因区段序列出现在相同的基因组片段上，那么所述两个V基因区段序列是“邻近的”，尽管其可能被不编码V区密码子的序列所分隔，例如其可能被调控序列所分隔，所述调控序列例如启动子或其他非编码序列。在一个实施方式中，邻近的序列包括含有以如在野生型基因组中所见的方式排布的基因组序列的基因组片段。
当用“来源于”所引用的基因或基因区段的可变区时，短语“来源于”包括能够将所述序列追溯至经重排以形成表达可变结构域的基因的(考虑如适用的剪接差异和体细胞突变)、特定的未经重排的一段或多段基因区段。
短语“功能性”当用在可变区基因区段或连接基因区段时是指在表达抗体库中的用途；例如在人源Vλ基因区段3-1、4-3、2-8等中是功能性的，而在Vλ基因区段3-2、3-4、2-5等中是无功能的。
“重链基因座”包括在染色体(例如小鼠染色体)上的某个位置，其可见于野生型小鼠重链可变(VH)、重链多样性(DH)、重链连接(JH)和重链恒定(CH)区DNA序列中。
短语“双特异性结合蛋白”包括能够选择性地结合两个或多个表位的结合蛋白。所述双特异性结合蛋白包含两个不同的多肽，其包含与第一CH区融合的第一轻链可变结构域(VL1)和与第二CH区融合的第二轻链可变结构域(VL2)。在通常情况下，所述第一和第二CH区是相同的，或者其有一个或多个氨基酸取代(例如如本申请所述的)的不同。VL1和VL2特异性与不同的表位结合——在两个不同的分子(例如抗原)上或在同一分子上(例如在同一抗原上)。如果双特异性蛋白选择性地与两个不同的表位(第一表位和第二表位)结合，则VL1对第一表位的亲和性将通常比VL1对第二表位的亲和性低至少1至2或3或4个数量级，对于VL2而言反之亦然。双特异性结合蛋白识别的表位可以在相同或不同的靶点上(例如在相同或不同的抗原上)。双特异性蛋白能够通过例如将识别同一抗原上不同表位的VL1和VL2组合制备。例如，可以将编码识别同一抗原上不同表位的VL序列的核酸序列与编码不同CH区的核酸序列融合，并且可以在表达免疫球蛋白轻链的细胞中或者可以在不表达免疫球蛋白轻链的细胞中表达这种序列。典型的双特异性结合蛋白具有两条重链，其均具有3个轻链CDR，随后为(N-末端至C-末端)CH1结构域、铰链、CH2结构域和CH3结构域，以及免疫球蛋白轻链，其不具有抗原结合特异性但能够与各重链结合，或者其能够与各重链结合并且能够通过VL1和/或VL2的结合与一个或多个表位结合，或者能够与各重链结合并且能够结合或辅助一条或全部两条重链与一个或全部两个表位结合。
因此，两种普通类型的双特异性结合蛋白是(1)VL1-CH(二聚体)和(2)VL1-CH:轻链+VL2-CH:轻链，其中所述轻链是相同的或不同的。在这两种情况下，所述CH(即重链恒定区)可以是经过如本申请所述的不同修饰的(例如差异性地与蛋白A结合，或以增加血清半衰期等)，或者可以是相同的。
当与表达某序列相关时，术语“细胞”包括适于表达重组核酸序列的任意细胞。细胞包括那些原核生物和真核生物(单细胞或多细胞)、细菌细胞(例如大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)、链霉菌属(Streptomyces)等的菌株)、分枝杆菌细胞、真菌细胞、酵母细胞(例如酿酒酵母(S.cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)、甲醇毕赤酵母(P.methanolica)等)、植物细胞、昆虫细胞(例如SF-9、SF-21、杆状病毒感染的昆虫细胞、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)等)、非人动物细胞、人细胞、B细胞或细胞融合例如杂交瘤或四价体杂交瘤。在一些实施方式中，所述细胞是人、猴、猿、仓鼠、大鼠或小鼠细胞。在一些实施方式中，所述细胞是真核细胞并且选自下述细胞：CHO(例如CHO K1、DXB-11 CHO、Veggie-CHO)、COS(例如COS-7)、视网膜细胞、Vero、CV1、肾(例如HEK293、293 EBNA、MSR 293、MDCK、HaK、BHK)、HeLa、HepG2、WI38、MRC 5、Colo205、HB 8065、HL-60、(例如BHK21)、Jurkat、Daudi、A431(表皮)、CV-1、U937、3T3、L细胞、C127细胞、SP2/0、NS-0、MMT 060562、Sertoli细胞、BRL3A细胞、HT1080细胞、骨髓瘤细胞、肿瘤细胞和来源于前述细胞的细胞系。在一些实施方式中，所述细胞包括一种或多种病毒基因，例如表达病毒基因的视网膜细胞(例如PER.C6TM细胞)。
术语“同源的”当以“与……是同源的”意义使用时，例如第一VL结构域与第二VL结构域是同源的，旨在包括根据本发明的小鼠制备的同一结合蛋白的两个VL结构域之间关系的参照。例如，根据本发明的实施方式进行基因修饰的小鼠，例如具有其中的VH、DH和JH区被VL和JL区取代的重链基因座的小鼠制备的抗体样结合蛋白，所述抗体样结合蛋白具有由与第一人源VL结构域融合的相同的小鼠CH区(例如IgG同种型)制备的两条相同的多肽链以及由与第二人源VL结构域融合的相同的小鼠CL区制备的两条相同的多肽链。在小鼠中进行克隆选择的过程中，所述第一和第二人源VL结构域通过克隆选择过程被选择在单一抗体样结合蛋白背景下出现在一起。因此，将作为克隆选择过程的结果的在单一抗体样分子中出现在一起的第一和第二VL结构域称为“同源的”。而相反的是，出现在第一抗体样分子中的VL结构域和出现在第二抗体样分子中的VL结构域不是同源的，除非所述第一和第二抗体样分子具有相同的重链(即除非融合于第一人源重链区的所述VL结构域和融合于第二人源重链区的所述VL结构域是相同的)。
短语“互补性决定区”或术语“CDR”包括由生物体免疫球蛋白基因的核酸序列编码的氨基酸序列，所述免疫球蛋白基因通常(即在野生型动物中)出现在免疫球蛋白分子(例如抗体或T细胞受体)的轻链或重链可变区中的两个框架区之间。CDR可以由例如生殖细胞系序列或者重排的或未经重排的序列，以及例如由天然存在的或者成熟的B细胞或T细胞来编码。在一些情况下(例如针对CDR3)，CDR可由两条或更多条序列(例如生殖细胞系序列)编码，所述序列(例如在未经重排的核酸序列中)不是邻近的，但是在B细胞核酸序列中是邻近的，例如作为所述序列剪接或连接的结果(例如V-D-J重组以形成重链CDR3)。
短语“基因区段”或“区段”包括指V(轻链或重链)或D或J(轻链或重链)免疫球蛋白基因区段，这包括在免疫球蛋白基因座(在例如人和小鼠中)中未经重排的序列，其能够参与重排(由例如内源性重组酶所介导)以形成重排的V/J或V/D/J序列。除非另有明示，否则所述V、D和J区段包括重组信号序列(RSS)，所述重组信号序列允许根据12/23规则来进行V/J重组或V/D/J重组。除非另有明示，否则所述区段还包括与其在性质上相关的序列或其功能性等效物的序列(例如V区段的一个或多个启动子和一个或多个先导序列)。
短语“重链”或“免疫球蛋白重链”包括来自任意生物体的免疫球蛋白重链恒定区序列，并且除非另有说明，其包括重链可变结构域(VH)。除非另有说明，VH结构域包括3个重链CDR和4个框架(FR)区。重链的片段包括CDR、CDR和FR及其组合。典型的重链基本上由下述可变结构域组成(从N-末端到C-末端)：CH1结构域、铰链、CH2结构域、CH3结构域和任选地CH4结构域(例如在IgM或IgE中)以及跨膜(M)结构域(例如在淋巴细胞上的膜结合免疫球蛋白中)。重链恒定区(由N末端至C末端)是由FR4外侧延伸至重链C末端的重链区域。具有微小差异例如在C末端的1、2、3或若干个氨基酸截短的重链恒定区将包括在短语“重链恒定区”之中，具有序列修饰例如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸取代的重链恒定区也包括在其中。可以在一个或多个选自下述的位置进行氨基酸取代例如(参照免疫球蛋白恒定区例如人源IgG恒定区的EU编号)228、233、234、235、236、237、238、239、241、248、249、250、252、254、255、256、258、265、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、297、298、301、303、305、307、308、309、311、312、315、318、320、322、324、326、327、328、329、330、331、332、333、334、335、337、338、339、340、342、344、356、358、359、360、361、362、373、375、376、378、380、382、383、384、386、388、389、398、414、416、419、428、430、433、434、435、437、438和439。
举例说明，但不是以限制的方式，可以对重链恒定区进行修饰以使其显示出增强的血清半衰期(与不具有所述修饰的相同的重链恒定区相比)并且具有在位置250(例如E或Q)的修饰；在位置250和428(例如L或F)的修饰；在位置252(例如L/Y/F/W或T)、254(例如S或T)和256(例如S/R/Q/E/D或T)的修饰；或者在位置428和/或433(例如L/R/SI/P/Q或K)和/或434(例如H/F或Y)的修饰；或者在位置250和/或428的修饰；或者在位置307或308(例如308F、V308F)和434的修饰。在另一个例子中，所述修饰可以包括428L(例如M428L)和434S(例如N434S)的修饰；428L、259I(例如V259I)和308F(例如V308F)的修饰；433K(例如H433K)和434(例如434Y)的修饰；252、254和256(例如252Y、254T和256E)的修饰；250Q和428L的修饰(例如T250Q和M428L)；307和/或308的修饰(例如308F或308P)。
短语“轻链”包括来自任意生物体的免疫球蛋白轻链恒定(CL)区序列，并且除非另有说明，其包括人源κ和λ轻链。轻链可变(VL)结构域典型地包括3个轻链CDR和4个框架(FR)区，除非另有说明。通常地，全长轻链(VL+CL)从氨基末端到羧基末端包括VL结构域，其包括FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4，和CL区。能够在本发明中使用的轻链(VL+CL)包括例如不选择性地与第一或第二(在双特异性结合蛋白中)表位结合的那些，所述表位被结合蛋白选择性地结合(例如所述表位被与CH结构域融合的VL结构域选择性地结合)。不选择性地与表位结合的VL结构域(所述表位为被与CH结构域融合的VL结合)包括能够通过筛选在现有的抗体文库(湿文库或在硅片中)中最常使用的轻链就能够鉴定的那些，其中所述轻链基本上不干扰结合蛋白的表位结合结构域的亲和性和/或选择性。适宜的轻链包括能够与表位结合(单独或与同CH区融合的其同源的VL组合)的那些，所述表位被与CH区融合的VL特异性地结合。
短语“微摩范围”旨在表示1-999微摩；短语“纳摩范围”旨在表示1-999纳摩；短语“皮摩范围”旨在表示1-999皮摩。
术语“非人动物”旨在包括任意非人动物例如圆口类、硬骨鱼类、软骨鱼类如鲨鱼和鳐鱼、两栖动物、爬行动物、哺乳动物和鸟类。适宜的非人动物包括哺乳动物。适宜的哺乳动物包括非人灵长类、山羊、绵羊、猪、犬、牛和啮齿类。适宜的非人哺乳动物选自啮齿动物家族(包括大鼠和小鼠)。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
小鼠作为一种遗传模型通过转基因和敲除技术已经被极大地增强，小鼠已能够用于研究定向的过表达或缺失特定基因的作用。尽管所有的均为其优势，但是所述小鼠仍存在遗传障碍，这使小鼠是用于人类疾病的不完善模型并且是检测人用疗法或制备所述疗法的不完善的平台。首先，尽管约99％的人类基因与小鼠具有同源性(Waterston等，(2002),Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome(小鼠基因组的起始测序和比较研究)，Nature 420:520-562)，但是潜在的疗法常常不能与拟采用的人靶点的小鼠直系同源物发生交叉反应或者交叉反应不充分。为了避免这个问题，可以将所选择的靶基因人源化，也就是说，可以将小鼠基因消除并使用相应的人源直系同源基因序列来取代(例如US6,586,251、US 6,596,541和US 7,105,348，其通过引用并入本申请)。最初，努力通过“敲除加转基因人源化”的策略将小鼠基因人源化，使得携带内源性基因缺失(即敲除)的小鼠与携带随机整合的人源转基因的小鼠杂交(参见例如Bril等，(2006),Tolerance to factor VIII in a transgenic mouse expressing human factor VIIIcDNA carrying an Arg(593)to Cys substitution(在表达载有Arg(593)到Cys取代的人源因子VIII cDNA的转基因小鼠中对因子VIII的耐受性)，Thromb Haemost 95:341-347；Homanics等，(2006),Production and characterization of murine models of classicand intermediate maple syrup urine disease(经典型和中间型枫糖尿症的鼠模型的生成和定性)，BMC Med Genet 7:33；Jamsai等，(2006),A humanized BAC transgenic/knockout mouse model for HbE/beta-thalassemia(针对HbE/β-地中海贫血的人源化BAC转基因/敲出小鼠模型)，Genomics 88(3):309-15；Pan等，(2006)Different role formouse and human CD3delta/epsilon heterodimer in preT cell receptor(preTCR)function:human CD3delta/epsilon heterodimer restores the defective preTCRfunction in CD3gamma-and CD3gammadelta-deficient mice(前T细胞受体(preTCR)功能中小鼠和人CD3δ/ε异二聚体的不同作用：人CD3δ/ε异二聚体在CD3γ-和CD3γδ-缺陷小鼠中恢复有缺陷的preTCR的功能)，Mol Immunol 43:1741-1750)。但是那些努力受到尺寸限制的阻碍；常规的敲除技术不足以直接使用其较大的人源基因组对应基因(counterpart)来取代较大的小鼠基因。因为存在技术困难，很少尝试直接同源取代的简单方法，即直接使用人源对应基因在小鼠基因相同的精确基因位置(即在内源性小鼠基因座)上取代内源性小鼠基因。直到现在，直接取代的努力涉及复杂和繁琐的程序，因此限制了能够被处理的遗传物质的长度以及其能够被操作的精确度。
在小鼠的前体B细胞中外源性的引入了人源免疫球蛋白转基因重排(Alt等，(1985),Immunoglobulin genes in transgenic mice(转基因小鼠中的免疫球蛋白基因)，Trends Genet1:231-236)。这一发现是通过使用敲除加转基因方法将小鼠工程改造以表达人源抗体(Green等，(1994),Antigen-specific human monoclonal antibodies frommice engineered with human Ig heavy and light chain YACs(来自使用人源Ig重链和轻链YAC工程改造的小鼠的抗原特异性人源单克隆抗体)，Nat Genet 7:13-21；Lonberg,N.(2005),Human antibodies from transgenic animals(来自转基因动物的人源抗体)，NatBiotechnol 23:1117-1125；Lonberg等，(1994),Antigen-specific human antibodiesfrom mice comprising four distinct genetic modifications(来自包含四个不同的基因修饰的小鼠的抗原特异性人源抗体)，Nature368:856-859；Jakobovits等，(2007),FromXenoMouse technology to panitumumab,the first fully human antibody productfrom transgenic mice(从XenoMouse技术到帕尼单抗，来自转基因小鼠的第一个全人源抗体产物)，Nat Biotechnol 25:1134-1143)。在这些小鼠中通过将各内源性基因座小而关键的部分靶向缺失来使内源性小鼠免疫球蛋白重链和κ轻链基因座失活，随后通过如上文所描述的随机整合大的转基因或者微染色体来引入人源免疫球蛋白基因座(Tomizuka等，(2000),Double trans-chromosomic mice:maintenance of two individual humanchromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression offully human antibodies(双转染色体小鼠：包含Ig重链和κ基因座的两个个人染色体片段的维持和全人源抗体的表达)，PNAS USA 97:722-727)。这种小鼠代表了基因工程的一个重要进展；从其中分离的全人源单克隆抗体对于治疗多种人类疾病具有有希望的治疗潜力(Gibson等，(2006),Randomized phase III trial results of panitumumab,a fullyhuman anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody,in metastaticcolorectal cancer(转移性结直肠癌中，全人源抗表皮生长因子受体单克隆抗体帕尼单抗的随机的III期试验结果)，Clin Colorectal Cancer 6:29-31；Jakobovits等，2007；Kim等，(2007),Clinical efficacy of zanolimumab(HuMax-CD4):two Phase II studies inrefractory cutaneous T-cell lymphoma(zanolimumab的临床效果：难治性皮肤T细胞淋巴瘤的两个II期研究)，Blood109(11):4655-62；Lonberg,2005；Maker等，(2005),Tumorregression and autoimmunity in patients treated with cytotoxic T lymphocyte-associated antigen 4 blockade and interleukin 2:a phase I/II study(用细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4阻断和白介素2治疗的患者中的肿瘤抑制和自身免疫)，Ann SurgOncol 12:1005-1016；McClung等，(2006),Denosumab in postmenopausal women withlow bone mineral density(具有低骨密度的绝经后妇女中的地诺单抗)，N Engl J Med354:821-831)。但是，如上文所讨论的，当与野生型小鼠相比时，这些小鼠显示出受损的B细胞发育和免疫缺陷。这样的问题可能限制了小鼠支持较强体液免疫应答的能力，因此产生针对某些抗原的全人源抗体。所述缺陷可能是由于：(1)由于随机引入人源免疫球蛋白转基因所导致的低效的功能性，以及由于缺乏上游和下游控制元件所导致的不正确的表达(Garrett等，(2005),Chromatin architecture near a potential 3'end of the Ighlocus involves modular regulation of histone modifications during B-Celldevelopment and in vivo occupancy at CTCF sites(在Igh基因座的潜在3'末端附近的染色质结构包括B细胞发育过程中的组蛋白修饰的模块调节和CTCF位点的体内占有)，MolCell Biol25:1511-1525；Manis等，(2003),Elucidation of a downstream boundary ofthe 3'IgH regulatory region(3'IgH调节区的下游边界的说明)，Mol Immunol 39:753-760；Pawlitzky等，(2006),Identification of a candidate regulatory elementwithin the 5'flanking region of the mouse Igh locus defined by pro-B cell-specific hypersensitivity associated with binding of PU.1,Pax5,and E2A(由原B细胞特异性过敏症相关的PU.1、Pax5和E2A结合所定义的小鼠Igh基因座的5'侧翼区中的候选调控元件的鉴定)，J Immunol 176:6839-6851)；(2)人源恒定结构域与小鼠细胞表面B细胞受体信号转导复合物元件之间低效率的种间相互作用，这可能使B细胞的正常的成熟、增殖和存活所需的信号转导过程受损(Hombach等，(1990),Molecular components of theB-cell antigen receptor complex of the IgM class(IgM类的B细胞抗原受体复合物的分子组成),Nature 343:760-762)；以及(3)可溶性人源免疫球蛋白与小鼠Fc受体之间低效率的种间相互作用可能会降低亲和性选择(Rao等，(2002),Differential expression ofthe inhibitory IgG Fc receptor FcgammaRIIB on germinal center cells:implications for selection of high-affinity B cells(生发中心细胞上抑制性IgGFc受体FcγRIIB的差异表达：对高亲和性B细胞选择性的影响)，J Immunol 169:1859-1868)以及免疫球蛋白的血清浓度(Brambell等，(1964),A Theoretical Model of Gamma-Globulin Catabolism(γ球蛋白分解代谢的理论模型)，Nature 203:1352-1354；Junghans等，(1996),The protection receptor for IgG catabolism is the beta2-microglobulin-containing neonatal intestinal transport receptor(IgG分解代谢的保护受体是包含β2微球蛋白的新生儿肠道转运受体)，PNAS USA93:5512-5516；Rao等，2002；Hjelm等，(2006),Antibody-mediated regulation of the immune response(免疫应答的抗体介导的调控)，Scand J Immunol 64:177-184；Nimmerjahn等，(2007),Fc-receptors as regulators of immunity(Fc受体作为免疫调节剂)，Adv Immunol 96:179-204)。能够通过仅仅针对在内源性重链和轻链基因座上其天然位置中的小鼠免疫球蛋白基因座的可变区的原位人源化来纠正这些缺陷。这将有效地产生制备“反向嵌合”(即人源V:小鼠C)抗体的小鼠，所述抗体将能够基于保留小鼠恒定区在小鼠环境中产生正常的相互作用和选择性。此外这种反向嵌合抗体可以容易地重新形成用于治疗目的的全人源抗体。
基因修饰的动物包括在内源性免疫球蛋白重链基因座上使用异源性(例如来自其他物种的)免疫球蛋白序列的插入或取代，所述基因修饰的动物能够从与内源性免疫球蛋白轻链基因座的插入或取代相结合来制备或者与免疫球蛋白轻链转基因相结合来制备(例如嵌合的免疫球蛋白轻链转基因或者全人源全小鼠等)。作为异源性免疫球蛋白序列来源的物种可以有很大的不同。示例性的异源性免疫球蛋白序列包括人源序列。
免疫球蛋白可变区核酸序列例如V、D和/或J区段在各种实施方式中来自人源或非人动物。适于提供V、D和/或J区段的非人动物包括例如硬骨鱼类、软骨鱼类如鲨鱼和鳐鱼、两栖动物、爬行动物、哺乳动物、鸟类(例如鸡)。非人动物包括例如哺乳动物。哺乳动物包括例如非人灵长类、山羊、绵羊、猪、犬、牛(例如奶牛、公牛、水牛)、鹿、骆驼、雪貂和啮齿动物以及非人灵长类(例如黑猩猩、猩猩、大猩猩、狨猴、猕猴、狒狒)。适宜的非人动物选自啮齿动物家族，包括大鼠、小鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。如从上下文中可知，各种非人动物可以作为可变结构域或可变基因区段的来源(例如鲨鱼、鳐鱼、哺乳动物(例如骆驼、啮齿动物如小鼠和大鼠)。
根据上下文，非人动物还作为用于与可变序列或区段连接的恒定区序列的来源，例如啮齿动物的恒定序列可以作为与人源或非人源可变序列可操作地连接的转基因(例如人源或非人源灵长类可变序列与例如啮齿动物如小鼠或大鼠或仓鼠的恒定序列可操作地连接)。这样，在各种实施方式中，人源V、D和/或J区段与啮齿动物(例如小鼠或大鼠或仓鼠)的恒定区基因序列可操作地连接。在一些实施方式中，所述人源V、D和/或J区段(或者一个或多个重排的VDJ或VJ基因)与在例如转基因整合至基因座中的小鼠、大鼠或仓鼠恒定区基因序列可操作地连接或融合，所述基因座不是内源性免疫球蛋白基因座。
在一个特定的实施方式中，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠在内源性免疫球蛋白重链基因座上包括用一个或多个人源VL和一个或多个人源JL基因区段来取代VH、DH和JH基因区段被，其中所述一个或多个人源VL和一个或多个人源JL基因区段与内源性免疫球蛋白重链基因可操作地连接；其中所述小鼠包括在与内源性免疫球蛋白基因座不同的基因座上的转基因，其中所述转基因包括与小鼠或大鼠或人源恒定区可操作地连接的未经重排的或重排的人源VL和人源JL基因区段。在各种实施方式中，所述一个或多个人源JL基因区段包含人源Vκ或人源Vλ基因区段。在一个实施方式中，所述一个或多个人源JL基因区段包含人源Jκ或人源Jλ基因区段。
本申请描述了一种方法，所述方法用于使用人源生殖细胞系免疫球蛋白重链可变基因取代小鼠生殖细胞系免疫球蛋白重链可变基因，但同时保持小鼠产生后代的能力。特别地，本申请描述了使用人源轻链可变基因座精确取代所述小鼠的重链可变基因座，但同时完好保留小鼠的恒定区。其结果是，建立了一种小鼠，所述小鼠在内源性恒定区背景下表达免疫球蛋白样结合蛋白。人源轻链可变区与小鼠重链恒定区连接以形成嵌合人源-小鼠免疫球蛋白基因座，所述基因座重排并表达独特的免疫球蛋白样分子。所表达的免疫球蛋白样分子是“反向嵌合的”，即其包括人源可变区序列和小鼠恒定区序列。
由于小鼠和人之间免疫球蛋白基因座的趋异进化，使得在小鼠基因组中，即使在精确的位置，例如在内源性小鼠免疫球蛋白基因座，工程化人源免疫球蛋白序列，也可能存在某些挑战。例如，在免疫球蛋白基因座中散布的基因间序列在小鼠和人之间不是相同的，并且在一些情况下，可能功能上并不等效。小鼠和人在其免疫球蛋白基因座之间的差异仍会导致人源化小鼠的异常，特别是当人源化或操作内源性小鼠免疫球蛋白重链基因座的某些部分时。在小鼠免疫球蛋白重链基因座上的一些修饰是有害的。有害的修饰可能包括例如经修饰的小鼠交配和产生后代能力的丧失。在各种实施方式中，在小鼠基因组中工程改造人源免疫球蛋白序列包括，当其在经修饰的小鼠品系中缺失是有害的时维持内源性序列的方法。示例性的有害作用可以包括不能繁殖经修饰的品系、必需基因功能的丧失、不能表达多肽等。这种有害作用可能直接或间接地与工程改造进入小鼠基因组的修饰相关。
尽管在具有经取代的免疫球蛋白基因座的小鼠中观察到了接近野生型的体液免疫功能，但是当使用免疫球蛋白的直接取代时还会遇到其他在使用随机整合的一些转基因的方法中未遇到过的挑战。小鼠和人之间免疫球蛋白基因座基因组成的差异导致对具有经取代的免疫球蛋白基因区段的小鼠繁殖有益的序列的发现。特别地，位于内源性免疫球蛋白重链基因座中的小鼠ADAM基因由于其在生育能力方面的作用，更好的存在于具有经取代的免疫球蛋白基因座的小鼠中。
使用人源免疫球蛋白轻链可变基因座(VL-JL)精确地在原位取代6百万个碱基的小鼠重链免疫球蛋白基因座的可变区(VH-DH-JH)，同时在杂交基因座中使小鼠翼侧序列保留完好并具有功能，包括所有的小鼠恒定链基因和基因座转录控制区(图2至图6)。进行工程化步骤以保持小鼠序列，所述序列使得小鼠能够以与野生型小鼠相当的方式交配并产生子代(图7至图9)。特别地，使用基因工程技术通过嵌合BAC靶向载体将含有近端臂(即40个具有功能的人源Vκ基因区段和5个人源Jκ基因区段)和小鼠ADAM6基因的约0.5百万个碱基的人源免疫球蛋白κ轻链基因座引入小鼠ES细胞中(参见例如US专利号6,586,251和Valenzuela等，(2003),High-throughput engineering of the mouse genomecoupled with high-resolution expression analysis(与高分辨率表达分析结合的小鼠基因组的高通量工程改造),Nat Biotechnol 21:652-659)。
小鼠ADAM6在基因组中的位置和功能
缺乏表达任何功能性ADAM6蛋白能力的雄性小鼠显示出所述小鼠严重缺乏交配和产生后代的能力。由于全部或几乎全部小鼠免疫球蛋白重链可变基因区段被人源轻链可变基因区段取代，所述小鼠缺乏表达功能性ADAM6蛋白的能力。产生ADAM6功能丧失的结果是由于ADAM6基因座位于内源性免疫球蛋白重链可变基因座区域内，邻近位于DH基因区段上游的VH基因区段基因座的3’末端。为了繁殖针对全部或基本上全部内源性重链可变基因区段被人源轻链可变基因区段取代的纯合子小鼠，通常比较麻烦的方法是建立针对所述取代各自为纯合子的雄性和雌性并等待产生交配。窝仔成功相对罕见并且平均窝仔大小非常低。取而代之的是，使用针对所述取代是杂合子的雄性与针对所述取代是纯合子的雌性交配，以产生针对所述取代是杂合子的后代，然后从其上繁殖纯合子小鼠。本发明人已确定导致雄性小鼠生育能力的丧失的可能的原因是在纯合雄性小鼠中缺乏功能性ADAM6蛋白。
在各种方面，包括受损的(即无功能或具有轻微功能)ADAM6基因的雄性小鼠显示出生育能力的降低或消失。由于在小鼠(和其他啮齿动物)中ADAM6基因位于免疫球蛋白重链基因座，因此本发明人已确定为了繁殖小鼠或建立和维持包括对内源性免疫球蛋白重链基因座的修饰的小鼠品系，应使用涉及交配和繁殖方案的多种修饰。在针对内源性免疫球蛋白重链可变基因座的取代是纯合子的低生育或无生育能力的雄性小鼠使得在小鼠品系中的维持这种修饰是困难的。在各种实施方式中，维持所述品系包括避免针对取代是纯合的雄性小鼠所显示出不具有生育能力的问题。
在一个方面，本申请提供了一种维持如本申请所描述的小鼠品系的方法。所述小鼠品系不需要包括异位ADAM6序列，并且在各种实施方式中所述小鼠品系是针对ADAM6敲除(例如功能性敲除)的纯合子或杂合子。
所述小鼠品系包括在内源性免疫球蛋白重链基因座的修饰，所述修饰使得在雄性小鼠中生育能力降低或丧失。在一个实施方式中，所述修饰包括ADAM6基因调控区和/或编码区的缺失。在一个特定的实施方式中，所述修饰包括内源性ADAM6基因(调控和/或编码区)的修饰，所述修饰使得包括所述修饰的雄性小鼠的生育能力降低或消除；在一个特定的实施方式中，所述修饰使得针对所述修饰是纯合子的雄性小鼠的生育能力降低或消除。
在一个实施方式中，所述小鼠品系是针对ADAM6基因的敲除(例如功能性敲除)或缺失的纯合子或杂合子。
在一个实施方式中，保持所述小鼠品系是通过从针对所述修饰是纯合子或杂合子的小鼠中分离细胞，和在宿主胚胎中使用供体细胞，并将所述宿主胚胎以及供体细胞在代孕母体中妊娠，并且由所述代孕母体中获得包括所述基因修饰的后代。在一个实施方式中，所述供体细胞是ES细胞。在一个实施方式中，所述供体细胞是多能细胞，例如诱导性多能细胞。
在一个实施方式中，保持所述小鼠品系是通过从针对所述修饰是纯合子或杂合子的小鼠中分离包括所述修饰的核酸序列，和将所述核酸序列引入宿主细胞核，并将包括所述核酸序列和所述宿主细胞核的细胞在适宜的动物中妊娠。在一个实施方式中，将所述核酸序列引入宿主卵母细胞胚胎。
在一个实施方式中，保持所述小鼠品系是通过从针对所述修饰是纯合子或杂合子的小鼠中分离细胞核，和将所述细胞核引入宿主细胞，并且将所述细胞核以及宿主细胞在适宜的动物中妊娠以获得针对所述修饰是纯合子或杂合子的后代。
在一个实施方式中，保持所述小鼠品系是通过使用包括所述基因修饰的雄性小鼠的精子对雌性小鼠(野生型，针对所述修饰是纯合子，或者针对所述修饰是杂合子)进行体外受精(IVF)。在一个实施方式中，所述雄性小鼠针对所述基因修饰是杂合子。在一个实施方式中，所述雄性小鼠针对所述基因修饰是纯合子。
在一个实施方式中，保持所述小鼠品系是通过将针对所述基因修饰是杂合子的雄性小鼠与雌性小鼠繁殖以获得包括所述基因修饰的后代，鉴定包括所述基因修饰的雄性和雌性后代，并且使用针对所述基因修饰是杂合子的雄性与野生型、针对所述基因修饰是纯合子或杂合子的雌性繁殖以获得包括所述基因修饰的后代。在一个实施方式中，将针对所述基因修饰是杂合子的雄性与野生型雌性、针对所述修饰是杂合子的雌性或针对所述修饰是纯合子的雌性繁殖的步骤重复，以维持在小鼠品系中的所述基因修饰。
在一个方面，本申请提供了一种保持小鼠品系的方法，所述小鼠品系包括使用一个或多个人源免疫球蛋白轻链序列和任选地一个或多个人源DH基因区段取代内源性免疫球蛋白重链可变基因座，所述方法包括将所述小鼠品系繁殖以产生杂合子雄性小鼠，其中将所述杂合子雄性小鼠繁殖以维持在该品系中的所述基因修饰。在一个特定的实施方式中，所述品系不通过将纯合子雄性与野生型雌性、或者针对所述基因修饰是纯合子或杂合子的雌性的任意交配来维持。
ADAM6蛋白是蛋白A Disintegrin And Metalloprotease(去整合蛋白和金属蛋白酶)(ADAM)家族的成员。ADAM蛋白家族是较大的家族，具有包括细胞粘附在内的多样性功能。ADAM家族的一些成员参与精子发生和受精。例如，ADAM2编码受精素的亚基，受精素参与精子和卵子的相互作用。ADAM3或cyritestin似乎是精子与透明带结合所必需的。ADAM2或ADAM3的缺乏造成不具有生育能力。已假设ADAM2、ADAM3和ADAM6在小鼠精子细胞表面上形成复合物。
在人类中，ADAM6基因据报道是假基因，其位于人源VH基因区段VH1-2和VH6-1之间。在小鼠中，有两个ADAM6基因——ADAM6a和ADAM6b，是两个ADAM6基因存在于小鼠VH和DH基因区段之间的基因间区，并且其方向与周围的免疫球蛋白基因区段的转录方向相反。在小鼠中，功能性的ADAM6基因座显然是正常生育所需的。然后，功能性ADAM6基因座或序列是指一种ADAM6基因座或序列，所述ADAM6基因座或序列能够补偿或挽救在具有丧失功能或受损的内源性ADAM6基因座的雄性小鼠中显示出的大幅下降的生育能力。
在小鼠中编码ADAM6a和ADAM6b的基因间序列的位置使得当修饰内源性重链时所述基因间序列易于被修饰。当VH基因区段缺失或被取代时，或者当DH基因区段缺失或被取代时，所得到的小鼠在生育能力方面显示出严重缺陷的概率较高。为了补偿该缺陷，对所述小鼠进行修饰以使其包括编码蛋白的核苷酸序列，以补偿由于内源性ADAM6基因座的修饰而导致的ADAM6活性的丧失。在各种实施方式中，所述补偿核苷酸序列是编码挽救生育能力缺陷的小鼠ADAM6a、小鼠ADAM6b或者其同源物或直系同源物或功能性片段的核苷酸序列。在各种实施方式中，所述补偿核苷酸序列编码如SEQ ID NO:1所示的小鼠ADAM6a蛋白，和/或如SEQ ID NO:2所示的小鼠ADAM6b蛋白。或者，可以使用保留内源性ADAM6基因座的适宜方法，同时使小鼠ADAM6基因座翼侧的内源性免疫球蛋白重链序列不能重排以编码功能性内源性重链可变区。示例性的替代方法包括以操纵位于内源性免疫球蛋白重链可变区基因座的大部分小鼠染色体，以使其不能重排以编码与内源性重链恒定基因可操作地连接的功能性重链可变区。在各种实施方式中，所述方法包括将含有内源性免疫球蛋白重链基因区段的小鼠染色体片段倒置和/或转位。
可以将挽救生育能力的核苷酸序列置于任意适宜的位置。可以将其置于基因间区(例如V和J基因区段之间或V基因区段的上游)，或者基因组中任意适宜的位置(即异位的)。在一个实施方式中，可以将所述核苷酸序列引入到随机整合至小鼠基因组中的转基因上。在一个实施方式中，所述序列可以维持在游离基因上，也就是说在小鼠染色体以外的独立核酸上。适宜的位置包括允许转录或具有转录活性的位置，例如ROSA26基因座(Zambrowicz等，1997,PNAS USA 94:3789-3794)、BT-5基因座(Michael等，1999,Mech.Dev.85:35-47)或Oct4基因座(Wallace等，2000,Nucleic Acids Res.28:1455-1464)。对将核苷酸序列靶向至具有转录活性的基因座的描述例如参见US 7,473,557，其通过引用并入本申请。
或者，可以将挽救生育能力的核苷酸序列与诱导性启动子偶联，以促进在适宜的细胞和/或组织例如生殖组织中最佳表达。示例性的诱导性启动子包括以物理(例如热休克启动子)和/或化学方法(例如IPTG或四环素)活化的启动子。
而且，所述核苷酸的表达能够与其他基因相关联，以实现在发育特定阶段或在特定组织中的表达。这种表达能够通过将所述核苷酸序列与在发育特定阶段表达的基因启动子可操作地连接来实现。例如，工程改造至宿主物种基因组中的来自一个物种的免疫球蛋白序列，位于与宿主物种CD19基因(B细胞特异性基因)的启动子序列可操作地连接的位置上。实现了在精确发育阶段的B细胞特异性表达时，免疫球蛋白表达。
实现插入的核苷酸序列强表达的另一种方法是使用组成性启动子。示例性的组成性启动子包括SV40、CMV、UBC、EF1A、PGK和CAGG。按照类似的方式，将所需的核苷酸序列置于与选定的组成性启动子可操作地连接的位置上，所述启动子提供了核苷酸序列编码的一种或多种蛋白的高水平表达。
术语“异位”旨在包括移位，或者在自然界中正常情况下不存在的位置上安置(例如核酸序列所在的位置在不同于野生型小鼠中所发现的该核酸序列的位置上安置)。该术语在各种实施方式中用于对象不在正常的或正确的位置的情况下。例如，短语“编码……的异位核苷酸序列”指核苷酸序列出现在小鼠中的正常情况下不出现的位置上。例如，在编码小鼠ADAM6蛋白(或对雄性小鼠的生育能力提供相同或相近的益处的其直系同源物或同源物或片段)的异位核苷酸序列的情况下，所述序列可以位于小鼠基因组中与在野生型小鼠中在正常情况下所发现的不同位置上。在这种情况下，通过将所述序列置于小鼠基因组中与野生型小鼠不同的位置上，从而形成新的小鼠序列的序列连接。小鼠ADAM6的功能性同源物或直系同源物是能挽救在ADAM6-/-小鼠中观察到的生育能力丧失(例如雄性小鼠通过交配产生后代的能力丧失)的序列。功能性同源物或直系同源物包括与ADAM6a的氨基酸序列和/或ADAM6b的氨基酸序列具有至少约89％一致性或者更高(例如达99％一致性)的蛋白，并且所述蛋白能够补偿或挽救具有包括ADAM6a和/或ADAM6b缺失或敲除基因型的小鼠成功交配的能力。
异位位置可以在任意位置(例如作为含有小鼠ADAM6序列的转基因的随机插入)，或者可以例如在与其在野生型小鼠中的位置接近(但不是精确地相同)的位置(例如在经修饰的内源性免疫球蛋白基因座，但是在其天然位置的上游或下游，例如在经修饰的免疫球蛋白基因座内但是在不同的基因区段之间，或者在小鼠V-D基因间序列的不同位置)。异位安置的一个例子是将在野生型小鼠中正常发现的位置维持在内源性免疫球蛋白重链基因座中，但是使得周围的内源性重链基因区段不能重排以编码含有内源性重链恒定区的功能性重链。在这个例子中，这可以通过使含有所述内源性免疫球蛋白重链可变基因座的染色体片段翻转来实现，例如使用在所述可变区基因座翼侧位置上的工程改造的位点特异性重组位点。这样，重组后，内源性重链可变区基因座置于远离内源性重链恒定区基因的位置上，以阻止重排以编码含有内源性重链恒定区的功能性重链。本领域技术人员在阅读了本公开和/或与本领域公知的方法结合后，对获得内源性免疫球蛋白重链可变基因座功能性沉默并维持功能性ADAM6基因座的其他示例性方法将是显而易见的。内源性重链基因座具有这种安置时，维持了所述内源性ADAM6基因，并且所述内源性免疫球蛋白重链基因座被功能性沉默。
异位安置的另一个例子是在经修饰的免疫球蛋白重链基因座中安置。例如，包括一个或多个内源性VH基因区段被人源VL基因区段取代的小鼠(其中所述取代除去内源性ADAM6序列)能够被工程改造为在位于含有人源VL基因区段的序列中具有小鼠ADAM6序列。所得到的修饰将在人源基因序列中产生(异位)小鼠ADAM6序列，并且在人源基因序列中(异位)安置小鼠ADAM6序列可以接近人源ADAM6假基因的位置(即在两个V区段之间)或者可以接近小鼠ADAM6序列的位置(即在V-D基因间区中)。通过将在小鼠生殖细胞系中的人源基因序列(例如免疫球蛋白轻链基因序列)中或与之邻近的(异位)小鼠ADAM6序列连接以形成所得到的序列连接，与在野生型小鼠基因组中的相同或相近位置相比所述所得到的序列连接是新的。
在各种实施方式中，本申请提供了一种非人动物，所述动物缺乏ADAM6或者其直系同源物或同源物，其中所述缺乏使非人动物不具有生育能力，或者实质性降低所述非人动物的生育能力。在各种实施方式中，ADAM6或者其直系同源物或同源物的缺乏是由于内源性免疫球蛋白重链基因座的修饰导致。实质性降低生育能力是指例如生育能力(例如繁殖频率、窝胎仔数、年窝数等)降低约50％、60％、70％、80％、90％或95％或者更多。在各种实施方式中，所述非人动物补充了在雄性非人动物中具有功能的小鼠ADAM6基因或者其直系同源物或同源物或功能性片段，其中所补充的ADAM6基因或者其直系同源物或同源物或功能性片段全部或大部分挽救了生育能力的降低。大部分挽救了生育能力是指例如使生育能力恢复，以使得所述非人动物显示出的生育能力与未经修饰的(即不具有ADAM6基因或者其直系同源物或同源物修饰的动物)重链基因座相比为至少70％、80％或90％或者更高。
赋予所述经基因修饰的动物(即由于例如免疫球蛋白重链基因座的修饰而缺乏功能性ADAM6或者其直系同源物或同源物的动物)的序列，在各种实施方式中，选自ADAM6基因或者其直系同源物或同源物。例如，在一个实施方式中，在小鼠中，ADAM6功能的丧失通过加入小鼠ADAM6基因来挽救。在一个实施方式中，在小鼠中ADAM6功能的丧失通过加入与小鼠密切相关物种的直系同源物或同源物来挽救，所述物种例如啮齿动物，例如不同品系或物种的小鼠，任意物种的大鼠，啮齿动物；其中加入小鼠的直系同源物或同源物挽救了由于ADAM6功能的丧失或者ADAM6基因的缺失而导致的生育能力的丧失。来自其他物种的直系同源物和同源物，在各种实施方式中，选自在系统发育上有关的物种以及，在各种实施方式中，显示出与所述内源性ADAM6(或者直系同源物)的一致性百分率为约80％或更高、85％或更高、90％或更高、95％或更高、96％或更高或者97％或更高；并且挽救ADAM6有关的或者(在非小鼠中)ADAM6的直系同源物有关的生育能力丧失。例如，在缺乏ADAM6功能的经基因修饰的雄性大鼠中(例如内源性免疫球蛋白重链可变区被人源免疫球蛋白重链可变区取代的大鼠，或者在大鼠的免疫球蛋白重链区中敲除的大鼠)，在大鼠中挽救生育能力丧失是通过加入大鼠ADAM6，或者在一些实施方式中，是通过加入大鼠ADAM6的直系同源物(例如来自其他大鼠品系或物种，或者在一个实施方式中来自小鼠的ADAM6直系同源物)。
因此，在各种实施方式中，经基因修饰的动物显示出由于编码ADAM6蛋白(或者其直系同源物或同源物)的核酸序列的修饰或者与所述核酸序列可操作地连接的调控区的修饰而导致无生育能力或生育能力降低，所述经基因修饰的动物包括补偿或恢复生育能力丧失的核酸序列，其中补偿或恢复生育能力丧失的所述核酸序列来自相同物种的不同品系或者来自系统发育上有关的物种。在各种实施方式中，补偿的核酸序列是ADAM6直系同源物或其同源物或功能性片段。在各种实施方式中，所述补偿的ADAM6直系同源物或其同源物或功能性片段来自与具有生育能力缺陷的所述经基因修饰的动物密切相关的非人动物。例如，当所述经基因修饰的动物是特定品系的小鼠时，ADAM6直系同源物或其同源物或功能性片段可以来自于另一个品系的小鼠，或者相关物种的小鼠。在一个实施方式中，当包括生育能力缺陷的所述经基因修饰的动物是啮齿目时，ADAM6直系同源物或其同源物或功能性片段来自于啮齿目中的另一种动物。在一个实施方式中，包括生育能力缺陷的所述经基因修饰的动物是鼠型亚目(Myomoropha)(例如跳鼠、跳鼠、小鼠样仓鼠、仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠、真小鼠和大鼠、沙鼠、多刺鼠、黄冠鼠、攀鼠、岩鼠、白尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠、多刺睡鼠、鼹鼠、竹鼠、鼢鼠)并且ADAM6直系同源物或其同源物或功能性片段选自啮齿目(Rodentia)或鼠型亚目的动物。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的动物来自跳鼠科(Dipodoidea)总科，并且所述ADAM6直系同源物或其同源物或功能性片段来自鼠科(Muroidea)总科。在一个实施方式中，所述经基因修饰的动物来自鼠科总科，并且所述ADAM6直系同源物或其同源物或功能性片段来自跳鼠科总科。
在一个实施方式中，所述经基因修饰的动物是啮齿动物。在一个实施方式中，所述啮齿动物选自鼠科总科，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自鼠科总科的不同物种。在一个实施方式中，所述经基因修饰的动物来自选自下述的科：丽仓鼠科(Calomyscidae)(例如小鼠样仓鼠)、仓鼠科(Cricetidae)(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)、鼠科(Muridae)(真小鼠和大鼠、沙鼠、多刺鼠、黄冠鼠)、马岛鼠科(Nesomyidae)(攀鼠、岩鼠、白尾大鼠、马达加斯加大鼠和小鼠)、刺山鼠科(Platacanthomyidae)(例如多刺睡鼠)和鼹形鼠科(Spalacidae)(例如鼹鼠、竹鼠和鼢鼠)；以及所述ADAM6直系同源物或同源物选自同一科的不同物种。在一个特定的实施方式中，所述经基因修饰的啮齿动物选自真小鼠或大鼠(鼠科)，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自选自下述的物种：沙鼠、多刺小鼠或黄冠鼠。在一个实施方式中，所述经基因修饰的小鼠来自鼠科成员，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自鼠科的不同物种。在一个特定的实施方式中，所述经基因修饰的啮齿动物是鼠科中的小鼠，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自鼠科中的大鼠、沙鼠、多刺小鼠或黄冠鼠。
在各种实施方式中，使用科中啮齿动物的一种或多种啮齿动物ADAM6直系同源物或其同源物或功能性片段，从而使相同科的缺乏ADAM6直系同源物或同源物的、经基因修饰的啮齿动物的生育能力恢复(例如仓鼠科(例如仓鼠、新世界大鼠和小鼠、田鼠)；鼠科(例如真小鼠和大鼠、沙鼠、多刺鼠、黄冠鼠))。
在各种实施方式中，通过确定所述直系同源物、同源物或片段使缺乏ADAM6活性的经基因修饰的非人动物(例如包括ADAM6或其直系同源物敲除的啮齿动物，例如小鼠或大鼠)是否恢复生育能力来评估ADAM6直系同源物、其同源物及片段的功能性。在各种实施方式中，将功能性定义为缺乏内源性ADAM6或其直系同源物或同源物的经基因修饰的动物的精子迁移至输卵管并且使经基因修饰的相同物种动物的卵子受精的能力。
在各种方面，可以制备包括内源性重链可变区基因座或其部分的缺失或取代的小鼠，所述小鼠含有异位核苷酸序列，所述异位核苷酸序列编码赋予与小鼠ADAM6(例如在雄性小鼠中具有功能的其直系同源物或同源物或片段)具有相似生育能力益处的蛋白。所述异位核苷酸序列可以包括编码蛋白的核苷酸序列，所述蛋白是不同小鼠品系或不同物种(例如不同的啮齿动物物种)的ADAM6同源物或直系同源物(或其片段)，并且在生育能力方面具有益处，例如在特定时间段内增加窝数，和/或增加每窝胎仔数，和/或使雄性小鼠的精子细胞能够穿过小鼠的输卵管使小鼠的卵子受精。
在一个实施方式中，ADAM6是与小鼠ADAM6蛋白具有至少89％至99％一致性的同源物或直系同源物(例如与小鼠ADAM6a或小鼠ADAM6b具有至少89％至99％一致性)。在一个实施方式中，所述异位核苷酸序列编码一种或多种蛋白，所述蛋白独立地选自与小鼠ADAM6a具有至少89％一致性的蛋白、与小鼠ADAM6b具有至少89％一致性的蛋白，及其组合。在一个实施方式中，所述同源物或直系同源物是大鼠、仓鼠、小鼠或豚鼠蛋白，所述蛋白为或被修饰为与小鼠ADAM6a和/或小鼠ADAM6b具有约89％或者更高的一致性。在一个实施方式中，所述同源物或直系同源物为或与小鼠ADAM6a和/或小鼠ADAM6b具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％一致性。在一个特定的实施方式中，所述小鼠ADAM6a包含SEQ ID NO:1或其功能性片段，并且所述小鼠ADAM6b包含SEQ ID NO:2或其功能性片段。
在一个方面，本申请提供了一种非人动物，其中所述非人动物包括(a)在非人源免疫球蛋白重链恒定区上游插入一个或多个人源VL和JL基因区段，(b)在非人源免疫球蛋白轻链恒定区上游插入一个或多个人源VL和JL基因区段，和(c)编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述非人源重链和/或轻链恒定区是啮齿动物恒定区(例如选自小鼠、大鼠或仓鼠恒定区)。在一个实施方式中，所述非人源轻链恒定区是啮齿动物恒定区。在一个特定的实施方式中，所述轻链恒定区是小鼠Cκ或大鼠Cκ区。在一个特定的实施方式中，所述轻链恒定区是小鼠Cλ或大鼠Cκ区。在一个实施方式中，所述人源VL和JL基因区段是Vκ和Jκ基因区段。在一个实施方式中，所述人源VL和JL基因区段是Vλ和Jλ基因区段。在一个实施方式中，所述非人动物还包括一个或多个存在于人源VL和JL基因区段之间的人源DH基因区段。适宜的非人动物包括啮齿动物，例如小鼠、大鼠和仓鼠。在一个实施方式中，所述啮齿动物是小鼠或大鼠。
在一个实施方式中，所述非人动物包括至少6个到至少40个人源Vκ基因区段和至少1个到至少5个人源Jκ基因区段。在一个特定的实施方式中，所述非人动物包括6个人源Vκ基因区段和5个人源Jκ基因区段。在一个特定的实施方式中，所述非人动物包括16个人源Vκ基因区段和5个人源Jκ基因区段。在一个特定的实施方式中，所述非人动物包括30个人源Vκ基因区段和5个人源Jκ基因区段。在一个特定的实施方式中，所述非人动物包括40个人源Vκ基因区段和5个人源Jκ基因区段。在各种实施方式中，所述人源Jκ基因区段选自Jκ1、Jκ2、Jκ3、Jκ4、Jκ5及其组合。
在一个实施方式中，编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列在非人动物中是异位的。在一个实施方式中，编码ADAM6蛋白或其功能性片段(其在非人动物中具有功能)的核苷酸序列存在于与野生型非人ADAM6基因座相同的位置。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠，并且所述核苷酸序列编码小鼠的ADAM6蛋白或其功能性片段且存在于非人动物基因组的异位位置。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠，并且所述核苷酸序列编码小鼠ADAM6蛋白或其功能性片段且存在于免疫球蛋白基因区段中。在一个特定的实施方式中，所述免疫球蛋白基因区段是非人动物的重链基因区段。在一个特定的实施方式中，所述免疫球蛋白基因区段是另一个物种的轻链基因区段。在一个实施方式中，所述轻链基因区段是人源κ轻链基因区段。在一个实施方式中，所述小鼠包括含有一个或多个内源性未经重排的重链基因区段的异位邻近的序列，并且ADAM6序列在所述异位邻近的序列中。
在一个实施方式中，所述非人动物在内源性免疫球蛋白轻链基因座上缺乏内源性免疫球蛋白VL和/或JL基因区段。在一个实施方式中，所述非人动物包括在非人动物中不能重排形成免疫球蛋白VL结构域的内源性免疫球蛋白VL和/或JL基因区段。在一个实施方式中，全部或基本上全部内源性免疫球蛋白Vκ和Jκ基因区段被一个或多个人源Vκ和Jκ基因区段取代。在一个实施方式中，全部或基本上全部内源性免疫球蛋白Vλ和Jλ基因区段全部或部分缺失。在一个实施方式中，全部或基本上全部内源性免疫球蛋白VL和JL基因区段在非人动物中是完好的，并且所述非人动物包括插入内源性免疫球蛋白VL和/或JL基因区段和内源性免疫球蛋白轻链恒定区之间的一个或多个人源Vκ基因区段和一个或多个人源Jκ基因区段。在一个特定的实施方式中，所述完好的内源性免疫球蛋白VL和JL基因区段在非人动物中不能重排形成抗体的VL结构域。在一个实施方式中，所述非人动物的内源性免疫球蛋白轻链基因座是免疫球蛋白κ轻链基因座。在一个实施方式中，所述内源性免疫球蛋白VL和JL基因区段是Vκ和Jκ基因区段。
在一个方面，本申请提供了来源于如本申请所描述的非人动物的细胞和/或组织，其中所述细胞和/或组织包括(a)在非人源免疫球蛋白轻链恒定区上游插入一个或多个人源Vκ和Jκ基因区段，(b)在非人源免疫球蛋白重链恒定区上游插入一个或多个人源Vκ和Jκ基因区段，和(c)编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述非人源重链和/或轻链恒定区是小鼠恒定区。在一个实施方式中，所述非人源重链和/或轻链恒定区是大鼠恒定区。在一个实施方式中，所述非人源重链和/或轻链恒定区是仓鼠恒定区。
在一个实施方式中，编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列在所述细胞和/或组织中是异位的。在一个实施方式中，编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列存在于与野生型非人源ADAM6基因座相同的位置。在一个实施方式中，所述非人源细胞和/或组织来源于小鼠，并且所述核苷酸序列编码小鼠ADAM6蛋白或其功能性片段并存在于异位位置。在一个实施方式中，所述非人源细胞和/或组织来源于小鼠，并且所述核苷酸序列编码小鼠ADAM6蛋白或其功能性片段并存在于免疫球蛋白基因区段中。在一个特定的实施方式中，所述免疫球蛋白基因区段是重链基因区段。在一个特定的实施方式中，所述免疫球蛋白基因区段是轻链基因区段。在一个实施方式中，内源性重链基因区段的连续序列在非人动物中位于异位，其中位于内源性重链基因区段异位的邻近序列包括在小鼠中(例如在雄性小鼠中)具有功能的ADAM6基因。
在一个方面，本申请提供了使用如本申请所描述的非人动物来制备抗原结合蛋白的用途，其中所述非人动物表达(a)抗体，所述抗体包括(i)含有人源Vκ结构域和非人源轻链恒定区的免疫球蛋白轻链，以及(ii)含有人源Vκ结构域和非人源恒定区的免疫球蛋白重链；以及(b)ADAM6蛋白或其功能性片段。在一个实施方式中，所述抗原结合蛋白是人源的。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物，并且所述非人源恒定区是啮齿动物恒定区。在一个特定的实施方式中，所述啮齿动物是小鼠。
在一个方面，本申请提供了一种来源于如本申请所描述的非人动物的非人源细胞或组织。在一个实施方式中，所述非人源细胞或组织包括与非人源免疫球蛋白轻链恒定区基因邻近的一个或多个人源免疫球蛋白Vκ基因区段和至少一个人源免疫球蛋白Jκ基因区段，以及与非人源免疫球蛋白重链恒定区基因邻近的一个或多个人源Vκ和一个或多个人源Jκ基因区段，其中所述细胞或组织表达ADAM6蛋白或其功能性片段。在一个实施方式中，所述非人源轻链恒定区基因是小鼠Cκ。
在一个实施方式中，编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列是异位的。在一个实施方式中，编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列的位置与野生型非人源细胞的位置相同。在各种实施方式中，所述非人源细胞是小鼠B细胞。在各种实施方式中，所述非人源细胞是胚胎干细胞。
在一个实施方式中，所述组织来源于非人动物的脾脏、骨髓或淋巴结。
在一个方面，本申请提供了使用来源于如本申请所描述的非人动物的细胞或组织来制备杂交瘤或四价体杂交瘤的用途。
在一个方面，本申请提供了包括如本申请所述经修饰的基因组的非人细胞，其中所述非人细胞是来自如本申请所描述的非人动物的卵母细胞、宿主胚胎或者来自如本申请所描述的非人动物的细胞与来自不同非人动物的细胞的融合。
在一个方面，本申请提供了使用来源于如本申请所描述的非人动物的细胞或组织来制备人源抗原结合蛋白的用途。在一个实施方式中，所述人源抗原结合蛋白包括分离自如本申请所描述的非人动物的人源Vκ结构域。
在一个方面，本申请提供了一种用于制备与目标抗原结合的抗原结合蛋白的方法，其中所述方法包括(a)将如本申请所描述的非人动物暴露于目标抗原，(b)从非人动物分离一种或多种B淋巴细胞，其中所述一种或多种B淋巴细胞表达与目标抗原结合的VL结合蛋白，以及(c)鉴定编码与目标抗原结合的VL结合蛋白的VL结构域的核酸序列，其中所述VL结合蛋白包括人源Vκ结构域和非人源轻链恒定结构域以及人源Vκ结构域和非人源重链恒定结构域，以及(d)使用(c)的核酸序列和人源免疫球蛋白恒定区核酸序列来制备与目标抗原结合的人源抗原结合蛋白。
在一个实施方式中，所述VL结合蛋白的非人源轻链恒定结构域是小鼠Cκ。在一个实施方式中，所述VL结合蛋白的非人源重链恒定结构域是小鼠Cγ。在一个实施方式中，所述非人动物是小鼠。
在一个方面，本申请提供了一种具有生育能力的雄性小鼠，所述小鼠包括在免疫球蛋白重链基因座的修饰，其中所述具有生育能力的小鼠包括在雄性小鼠中具有功能的异位ADAM6序列。
在经修饰的免疫球蛋白重链基因座中的异位ADAM6
在基因靶向方面的发展，例如在细菌人工染色体(BAC)方面的发展，使得目前能够对相对较大的基因组片段进行重组。BAC工程化使得能够制备较大的缺失以及将较大的插入引入小鼠ES细胞。
制备人源抗体(即人源可变区)的小鼠在过去一段时间内已经能够得到。尽管这代表了在人源治疗性抗体发展中的一个重要的进步，但是这些小鼠显示出多种显著异常，这些异常限制了小鼠的应用性。例如，小鼠显示出B细胞发育受损。所述发育受损可能是由于转基因小鼠与野生型小鼠之间存在的多种差异所致。
人源抗体可能无法与小鼠前B细胞或小鼠细胞表面的B细胞受体发生最佳的相互作用，所述B细胞受体是在克隆选择过程中针对成熟、增殖或存活的信号。全人源抗体可能无法与小鼠Fc受体系统发生最佳的相互作用；小鼠表达的Fc受体与相应的人源Fc受体并不是一一对应的。最后，多种制备全人源抗体的小鼠不包括所有真正的小鼠序列，例如下游增强子元件和其他基因座控制元件，这些可能是野生型B细胞发育所需的。
制备全人源抗体的小鼠通常包括在某种程度上失能的内源性免疫球蛋白基因座，以及将包括可变和恒定免疫球蛋白基因区段的人源转基因引入小鼠基因组中的随机位置。只要内源性基因座充分失能使得无法重排基因区段以形成功能性免疫球蛋白基因，那么在这种小鼠中制备全人源抗体的目标就能够实现——尽管B细胞的发育受损。
尽管不得不从人源转基因的基因座制备全人源抗体，但是在小鼠中产生人源抗体显然是一个困难的过程。在一些小鼠中，该过程非常困难，使得无法通过反式转换的机制来形成嵌合的人源可变/小鼠恒定重链(而非轻链)。通过这种机制，编码全人源抗体的转录经历由人源同种型向小鼠同种型的反式形式同种型转换。该过程是反式的，因为全人源转基因的位置远离保留了未受损的小鼠重链恒定区基因拷贝的内源性基因座。尽管在这种小鼠中反式转换是显而易见的，但是这个现象仍不足以挽救B细胞的发育，B细胞的发育仍然明显受损。在任何情况下，因为反式转换现象显然不针对轻链发生，所以在这种小鼠中制备的反式转换抗体均保留全人源轻链；假定反式转换依靠在正常同种型顺式转换中使用的内源性基因座中(尽管不同)的转换序列。因此，即使当经过工程改造以制备全人源抗体的小鼠选择反式转换机制来制备具有小鼠恒定区的抗体时，该策略仍不足以挽救正常的B细胞发育。
在发展基于抗体的人用疗法时，首要关注的是制备具有足够大量多样性的人源免疫球蛋白可变区序列以鉴定有用的可变结构域，所述可变结构域特异性识别特定表位并以所需的亲和性(通常但并不总是较高的亲和性)与其结合。在开发小鼠(本申请所述)以前，没有迹象表明表达人源可变区和小鼠恒定区的小鼠将与制备来自转基因的人源抗体的小鼠显示出任何显著的差异。然而，这种假设是不正确的。
小鼠在内源性基因座上含有人源免疫球蛋白可变区对小鼠免疫球蛋白可变区的精确取代，所述小鼠在B细胞发育方面显示出与野生型小鼠的令人吃惊的和显著的相似性。在一项令人吃惊和惊叹的研发中，小鼠针对免疫接种显示出基本正常的野生型应答，所述小鼠与野生型小鼠仅有的一个显著差异是其响应免疫接种产生的可变区是全人源的。
小鼠在内源性基因座上含有使用相应的人源免疫球蛋白可变区来精确地、大规模地取代生殖细胞系中小鼠免疫球蛋白重链(IgH)和免疫球蛋白轻链(例如κ轻链，Igκ)的可变区。总的来说，小鼠基因座的约6百万个碱基被人源基因组序列的约1.5百万个碱基取代。这种精确的取代使得在小鼠中具有杂交的免疫球蛋白基因座，所述基因座产生具有人源可变区和小鼠恒定区的重链和轻链。小鼠VH-DH-JH和V-J区段的精确取代保留了在杂交免疫球蛋白基因座翼侧小鼠序列的完好性和功能性。所述小鼠体液免疫系统的功能与野生型小鼠类似。B细胞发育在全部重要方面都没有受到阻碍，并且在受到抗原攻击后，在所述小鼠中产生丰度多样的人源可变区。
小鼠是可能的，因为在人和小鼠中重链和轻链免疫球蛋白基因区段的重排是类似的，但这并不是说它们的基因座是相同的或者甚至是接近的，因为显然不是这样的。然而，所述基因座是足够相似的，能够通过使用基本上覆盖人源免疫球蛋白基因座等价序列的约1百万个碱基的连续的人源基因组序列来取代含有全部VH、DH和JH基因区段的约3百万个碱基对的连续的小鼠序列，从而实现重链可变基因座的人源化。
在一些实施方式中，进一步使用人源基因序列取代某些小鼠的恒定区基因序列(例如使用人源CH1序列取代小鼠CH1序列，和使用人源CL序列取代小鼠CL序列)使得产生具有杂交免疫球蛋白基因座的小鼠，所述基因座制备具有人源可变区和部分人源恒定区的抗体，所述抗体适于例如制备全人源抗体片段例如全人源Fab。具有杂交免疫球蛋白基因座的小鼠显示出正常的可变基因区段重排，正常的体细胞超突变和正常的类别转换。这些小鼠显示出与野生型小鼠无法区分的体液免疫系统，并且显示出在所有B细胞发育阶段都正常的细胞群和正常的淋巴器官结构——即使是缺乏全人源可变区基因区段库的小鼠也是如此。对这些小鼠进行免疫产生强的体液应答，所述体液应答显示出可变基因区段用途的广泛的多样性。
小鼠生殖细胞系可变区基因区段的精确取代使得可以制备出具有部分人源免疫球蛋白基因座的小鼠。由于所述部分人源免疫球蛋白基因座正常地重排、高频突变和类别转换，因而所述部分人源免疫球蛋白基因座在小鼠中产生包括人源可变区的抗体。可以对编码所述可变区的核苷酸序列进行鉴定和克隆，然后与所选择的任意序列(例如适于特定用途的任意免疫球蛋白同种型)融合(例如在体外系统中)，以产生全部来源于人源序列的抗体或抗原结合蛋白。
通过使用重组工程方法来大规模人源化修饰小鼠胚胎干(ES)细胞以形成独特的免疫球蛋白重链基因座，使用含有编码基本上全部人源Vκ和Jκ基因区段的两个副本之一的达0.5百万个碱基的人源基因组区段精确取代包括基本上全部小鼠VH、DH和JH基因区段的达3百万个碱基的小鼠重链免疫球蛋白基因座。此外，使用包含编码基本上全部人源Vκ和Jκ基因区段的两个副本之一的达0.5百万个碱基的人源基因组区段来取代包含基本上全部小鼠Vκ和Jκ基因区段的3百万个碱基的小鼠免疫球蛋白κ轻链基因座的区段。具有这种取代的免疫球蛋白基因座的小鼠可以包括小鼠ADAM6基因座的破坏或缺失，所述基因座正常出现在小鼠免疫球蛋白重链基因座的最3’-端的VH基因区段和最5’-端的DH基因区段之间。该区域的破坏能够导致小鼠ADAM6基因座功能的降低或消除。
本申请描述了一种包括如上文所述经取代的基因座的小鼠，并且所述小鼠还包括编码小鼠ADAM6的异位核酸序列，其中所述小鼠显示出基本正常的生育能力。在一个实施方式中，所述异位核酸序列位于经修饰的内源性重链基因座的人源VL基因区段和人源JL基因区段之间或者人源VL基因区段最5’-端的上游。所述ADAM6基因的转录方向可以与周围人源VL基因区段的转录方向是相反的(图7)或相同的(图8)。尽管本申请中的实施例显示了通过取代所示的人源VL和JL基因区段之间或者人源VL基因区段最5’-端的上游的异位序列来挽救生育能力，但是本领域技术人员将理解在小鼠基因组中(或者甚至染色体外)任意适宜的可转录的基因座的异位序列的取代均可预期在雄性小鼠中相似地挽救生育能力。在各种实施方式中，所述异位核酸序列选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5，其中所述异位序列编码一个或多个ADAM6蛋白，其中所述一个或多个ADAM6蛋白包含SEQ ID NO:1、SEQID NO:2或其组合。
使用包括小鼠ADAM6a基因或者其直系同源物或同源物或功能性片段的异位序列来补偿缺乏功能性ADAM6基因座的小鼠，这一现象是适用于挽救具有无功能或仅有极低功能的内源性ADAM6基因座的任意小鼠的通常方法。因此，能够使用本发明的组合物和方法来挽救包括免疫球蛋白重链基因座的破坏ADAM6的修饰的大量小鼠。因此，本发明包括具有损坏内源性ADAM6功能的多种免疫球蛋白重链基因座修饰的小鼠。在本说明书中提供了一些(非限制性的)例子。除了所描述的小鼠以外，与ADAM6有关的所述组合物和方法可以用于很多种应用，例如以多种方式修饰重链基因座。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括编码功能性ADAM6蛋白(或者其直系同源物或同源物或功能性片段)的异位ADAM6序列，使用一个或多个人源VL基因区段取代全部或基本上全部小鼠VH基因区段，使用人源JL基因区段取代全部或基本上全部小鼠DH基因区段和JH基因区段；其中所述小鼠缺乏CH1和/或铰链区。在一个实施方式中，所述小鼠制备的单一可变结构域结合蛋白是选自下述的免疫球蛋白链的二聚体：(a)人源VL–小鼠CH1–小鼠CH2–小鼠CH3；(b)人源VL–小鼠铰链–小鼠CH2–小鼠CH3；和(c)人源VL–小鼠CH2–小鼠CH3。
在一个方面，挽救生育能力的核苷酸序列位于小鼠中的人源免疫球蛋白轻链可变区序列中(例如在人源Vκ4-1和Jκ1基因区段之间)，所述小鼠具有全部或基本上全部的小鼠免疫球蛋白重链可变基因区段(mVH's、mDH's和mJH's)被一个或多个人源免疫球蛋白κ轻链可变基因区段(hVκ's和hJκ's)取代，并且所述小鼠还包括全部或基本上全部的小鼠免疫球蛋白κ轻链可变基因区段(mVκ's，mJκ's)被一个或多个人源免疫球蛋白κ轻链可变基因区段(hVκ's和hJκ's)的取代。
在一个方面，功能性小鼠ADAM6基因座(或其直系同源物或同源物或功能性片段)可以位于人源VL基因区段中间或者人源VL基因区段最5’-端的上游，其中所述人源VL基因区段取代内源性VH基因区段。在一个实施方式中，全部或基本上全部的小鼠VH基因区段被除去并且被一个或多个人源VL基因区段取代，并且所述小鼠ADAM6基因座位于与人源VL基因区段最5’-端的5’-末端紧邻，或者在两个人源VL基因区段之间。在一个特定的实施方式中，所述小鼠ADAM6基因座位于所插入的人源VL基因区段3’端附近的两个VL基因区段之间。在一个特定的实施方式中，人源VL基因区段的重排如下(相对于人源VL基因区段的转录方向从上游至下游)：人源Vκ5-2–小鼠ADAM6基因座–人源Vκ4-1。在一个特定的实施方式中，人源VL基因区段的重排如下(相对于人源VL基因区段的转录方向从上游至下游)：小鼠ADAM6基因座–人源Vκ2-40，其中人源Vκ2-40是经修饰的免疫球蛋白重链基因座的人源VL基因区段的最5’-端的片段。在一个实施方式中，与人源VL基因区段的方向相比，小鼠ADAM6基因座的一个或多个小鼠ADAM6a和小鼠ADAM6b的转录方向是相反的。在一个实施方式中，与人源VL基因区段的方向相比，小鼠ADAM6基因座的一个或多个小鼠ADAM6a和小鼠ADAM6b的转录方向是相同的。
在一个方面，功能性小鼠ADAM6基因座(或其直系同源物或同源物或功能性片段)可以位于人源VL基因区段和人源JL基因区段之间(即在人源VL基因区段最3’-端和JL基因区段的最5’-端之间的基因间区)，其中所述人源VL和JL基因区段取代内源性VH基因区段。在一个实施方式中，全部或基本上全部的小鼠VH基因区段被除去并且被一个或多个人源VL基因区段和一个或多个人源JL基因区段取代，并且所述小鼠ADAM6基因座位于与人源VL基因区段最3’-端的3’-末端紧邻且与人源JL基因区段最5’-端的5’-末端紧邻。在一个特定的实施方式中，所述一个或多个人源VL基因区段和一个或多个人源JL基因区段是Vκ和Jκ基因区段。在一个特定的实施方式中，人源VL基因区段的重排如下(相对于人源VL基因区段的转录方向从上游至下游)：人源Vκ4-1–小鼠ADAM6基因座–人源Jκ1。在一个实施方式中，与人源VL基因区段的方向相比，小鼠ADAM6基因座的一个或多个小鼠ADAM6a和小鼠ADAM6b的转录方向是相反的。在一个实施方式中，与人源VL基因区段的方向相比，小鼠ADAM6基因座的一个或多个小鼠ADAM6a和小鼠ADAM6b的转录方向是相同的。
可以修饰一种小鼠，所述小鼠具有用一个或多个人源VL基因区段(例如Vκ或Vλ区段)来取代全部或基本上全部内源性VH基因区段的修饰，以使得例如通过使用具有包括小鼠ADAM6基因座或其功能性片段的下游同源臂的靶向载体来维持如上文所描述的内源性ADAM6基因座，或者使用位于两个人源VL基因区段之间或者人源VL基因区段和DH基因区段(人源或小鼠，例如Vλ+m/hDH)或J基因区段(人源或小鼠，例如Vκ+JH)之间的异位序列来取代受损的小鼠ADAM6基因座。在一个实施方式中，所述取代包括两个或多个人源VL基因区段，并且所述小鼠ADAM6基因座或其功能性片段位于两个最3’-端VL基因区段之间。在一个特定的实施方式中，人源VL基因区段的重排如下(相对于人源基因区段的转录方向从上游至下游)：人源VL3’-1–小鼠ADAM6基因座–人源VL3’。在一个实施方式中，与人源VL基因区段的方向相比，小鼠ADAM6基因座的一个或多个小鼠ADAM6a和小鼠ADAM6b的转录方向是相反的。或者，所述小鼠ADAM6基因座可以位于最3’-端人源VL基因区段和最5’-端JL基因区段之间的基因间区。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠具有一个或多个内源性VH基因区段的取代，并且所述小鼠包括至少一个内源性DH基因区段。在这样的小鼠中，内源性VH基因区段的修饰可以包括一个或多个最3’-端VH基因区段而不是最5’-端DH基因区段的修饰，在此处已经多加谨慎以使得一个或多个最3’-端VH基因区段的修饰不会破坏内源性ADAM6基因座或使得内源性ADAM6基因座不具有功能。例如，在一个实施方式中，所述小鼠包括使用一个或多个人源VL基因区段来取代全部或基本上全部的内源性VH基因区段，并且所述小鼠包括一个或多个内源性DH基因区段和功能性内源性ADAM6基因座。
在另一个实施方式中，所述小鼠包括内源性最3’-端VH基因区段的修饰，以及一个或多个内源性DH基因区段的修饰，并且实施所述修饰以维持内源性ADAM6基因座的完整性，使得达到使所述内源性ADAM6基因座维持功能性的程度。在一个例子中，这种修饰是分两步进行的：(1)使用一个或多个人源VL基因区段取代最3’-端内源性VH基因区段，所述人源VH基因区段使用具有上游同源臂和下游同源臂的靶向载体，其中所述下游同源臂包括全部或部分功能性的小鼠ADAM6基因座；(2)然后使用具有上游同源臂的靶向载体来取代内源性DH基因区段，所述上游同源臂包括小鼠ADAM6基因座的全部或功能性部分。
在各种方面，使用含有编码小鼠ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或功能性同源物的异位序列的小鼠是有用的，该修饰破坏内源性小鼠ADAM6的功能。当对小鼠免疫球蛋白基因座进行修饰时，特别是当对小鼠免疫球蛋白重链可变区及其周围序列进行修饰时，破坏内源性小鼠ADAM6功能的概率较高。因此，当制备具有免疫球蛋白重链基因座全部或部分缺失，全部或部分人源化，或者全部或部分被取代(例如使用Vκ或Vλ序列)的小鼠时，这种小鼠提供了特别的益处。制备用于对下文所描述的小鼠进行所述基因修饰的方法是本领域技术人员所公知的。
含有编码小鼠ADAM6蛋白或者与赋予生育能力益处的小鼠ADAM6蛋白基本相同或相似的蛋白的小鼠，在破坏或缺失内源性ADAM6序列的小鼠免疫球蛋白重链可变基因座的修饰方面特别有用。尽管主要描述了表达具有人源可变区和小鼠恒定区的抗体的小鼠，但是这种小鼠在破坏内源性ADAM6基因的任何基因修饰中均是有用的。本领域技术人员将理解这包含了多种多样的基因修饰小鼠，所述小鼠含有小鼠免疫球蛋白重链可变基因座的修饰。这些包括例如不管其他修饰，具有全部或部分小鼠免疫球蛋白重链基因区段缺失或取代的小鼠。非限制性的例子如下文所述。
在一些方面，本申请提供了一种基因修饰的小鼠，所述小鼠包括在小鼠中具有功能的异位的小鼠、啮齿动物或其他ADAM6基因(或者其直系同源物或同源物或片段)，以及一个或多个人源免疫球蛋白可变和/或恒定区基因区段。在各种实施方式中，在小鼠中具有功能的其他ADAM6基因直系同源物或同源物或片段可以包括来自牛、犬、灵长类、家兔或其他非人源序列的序列。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括编码功能性ADAM6蛋白的异位ADAM6序列，使用一个或多个人源VL基因区段取代全部或基本上全部的小鼠VH基因区段；使用一个或多个人源JL基因区段取代全部或基本上全部的小鼠DH和JH基因区段。
在一个实施方式中，所述小鼠还包括使用人源CH1核苷酸序列取代小鼠CH1核苷酸序列。在一个实施方式中，所述小鼠还包括使用人源铰链核苷酸序列取代小鼠铰链核苷酸序列。在一个实施方式中，所述小鼠还包括使用人源免疫球蛋白轻链可变基因座取代免疫球蛋白轻链可变基因座(VL和JL)。在一个实施方式中，所述小鼠还包括使用人源免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列取代小鼠免疫球蛋白轻链恒定区核苷酸序列。在一个特定的实施方式中，所述VL、JL和CL是免疫球蛋白κ轻链序列。在一个特定的实施方式中，所述小鼠包括与人源铰链和人源CH1序列融合的小鼠CH2和小鼠CH3免疫球蛋白恒定区序列，这样所述小鼠的免疫球蛋白基因座重排以形成编码结合蛋白的基因，所述结合蛋白包括(a)具有人源可变区、人源CH1区、人源铰链区以及小鼠CH2和小鼠CH3区的重链；和(b)编码包括人源可变结构域和人源恒定区的免疫球蛋白轻链的基因。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括编码功能性ADAM6蛋白的异位ADAM6序列，使用一个或多个人源VL基因区段取代全部或基本上全部的小鼠VH基因区段，以及任选地使用一个或多个人源DH基因区段和/或人源JH基因区段取代全部或基本上全部的DH基因区段和/或JH基因区段，或者任选地使用一个或多个人源JL基因区段取代全部或基本上全部的DH基因区段和JH基因区段。
在一个实施方式中，所述小鼠包括使用一个或多个VL、一个或多个DH和一个或多个J基因区段(例如Jκ或Jλ)取代全部或基本上全部的小鼠VH、DH和JH基因区段，其中所述基因区段与小鼠铰链区任选地连接，其中所述小鼠形成重排的免疫球蛋白链基因，所述基因从5’至3’的转录方向含有：人源VL–人源或小鼠DH–人源或小鼠J–小鼠铰链–小鼠CH2–小鼠CH3。在一个实施方式中，所述J区是人源Jκ区。在一个实施方式中，所述J区是人源JH区。在一个实施方式中，所述J区是人源Jλ区。在一个实施方式中，所述人源VL区选自人源Vλ区和人源Vκ区。
在特定实施方式中，所述小鼠表达具有小鼠或人源恒定区和可变区的单一可变结构域抗体，所述可变区来源于人源Vκ、人源DH和人源Jκ；人源Vκ、人源DH和人源JH；人源Vλ、人源DH和人源Jλ；人源Vλ、人源DH和人源JH；人源Vκ、人源DH和人源Jλ；人源Vλ、人源DH和人源Jκ。在特定实施方式中，对重组识别序列进行修饰，以使得能够在所述的V、D和J基因区段之间或者在所述的V和J基因区段之间产生多产的重排。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括编码功能性ADAM6蛋白(或者其直系同源物或同源物或功能性片段)的异位ADAM6序列，使用一个或多个人源VL基因区段取代全部或基本上全部小鼠VH基因区段，使用人源JL基因区段取代全部或基本上全部小鼠DH基因区段和JH基因区段；其中所述小鼠缺乏CH1和/或铰链区。
在一个实施方式中，所述小鼠缺乏编码CH1结构域的序列。在一个实施方式中，所述小鼠缺乏编码铰链区的序列。在一个实施方式中，所述小鼠缺乏编码CH1结构域和铰链区的序列。
在一个特定的实施方式中，所述小鼠表达包括人源免疫球蛋白轻链可变结构域(λ或κ)的结合蛋白，所述轻链可变结构域与同小鼠CH3结构域连接的小鼠CH2结构域融合。
在一个方面，本申请提供了一种小鼠，所述小鼠包括编码功能性ADAM6蛋白(或者其直系同源物或同源物或功能性片段)的异位ADAM6序列，使用一个或多个人源VL基因区段取代全部或基本上全部小鼠VH基因区段，使用人源JL基因区段取代全部或基本上全部小鼠DH和JH基因区段。
在一个实施方式中，所述小鼠包括编码CH1区、铰链区、CH1和铰链区、或者CH1区和铰链区和CH2区的免疫球蛋白重链恒定区基因序列的缺失。
在一个实施方式中，所述小鼠制备单一可变结构域结合蛋白，所述结合蛋白包括选自下述的同源二聚体：(a)人源VL–小鼠CH1–小鼠CH2–小鼠CH3；(b)人源VL–小鼠铰链–小鼠CH2–小鼠CH3；(c)人源VL–小鼠CH2–小鼠CH3。
在一个方面，本申请提供了一种非人动物，所述非人动物包括经修饰的免疫球蛋白重链基因座，其中所述经修饰的免疫球蛋白重链基因座包括非人源的ADAM6序列或者其直系同源物或同源物。
在一个实施方式中，所述非人动物是选自小鼠、大鼠和仓鼠的啮齿动物。
在一个实施方式中，所述非人动物ADAM6直系同源物或同源物是与小鼠ADAM6序列直系同源和/或同源的序列，其中所述直系同源物或同源物在非人动物中具有功能。
在一个实施方式中，所述非人动物选自小鼠、大鼠和仓鼠，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自选自小鼠、大鼠和仓鼠的非人动物。在一个特定的实施方式中，所述非人动物是小鼠，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自选自不同小鼠物种、大鼠和仓鼠的动物。在特定的实施方式中，所述非人动物是大鼠，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自选自不同大鼠物种、小鼠和仓鼠的啮齿动物。在一个特定的实施方式中，所述非人动物是仓鼠，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自选自不同仓鼠物种、小鼠和大鼠的啮齿动物。
在一个特定的实施方式中，所述非人动物来自鼠形亚目(Myomorpha)，并且所述ADAM6序列来自选自跳鼠总科(Dipodoidea)的啮齿动物和鼠总科(Muroidea)的啮齿动物的动物。在一个特定的实施方式中，所述啮齿动物是鼠总科中的小鼠，并且所述ADAM6直系同源物或同源物来自鼠总科中的小鼠或大鼠或仓鼠。
在一个实施方式中，所述经修饰的免疫球蛋白重链基因座包括一个或多个人源VL基因区段和一个或多个人源JL基因区段。在一个特定的实施方式中，所述一个或多个人源VL基因区段和一个或多个人源Jλ基因区段与一个或多个人源、嵌合和/或啮齿动物(例如小鼠或大鼠)恒定区基因任选地连接。在一个实施方式中，所述恒定区基因是小鼠的。在一个实施方式中，所述恒定区基因是大鼠的。在一个实施方式中，所述恒定区基因是仓鼠的。在一个实施方式中，所述恒定区基因包括选自铰链、CH2、CH3及其组合的序列。在特定实施方式中，所述恒定区基因包括铰链、CH2和CH3序列。在一个实施方式中，所述人源VL和JL基因区段是人源Vκ和Jκ基因区段。
在一个实施方式中，所述非人源ADAM6序列与人源免疫球蛋白轻链序列邻近。在一个实施方式中，所述非人源ADAM6序列位于人源免疫球蛋白轻链序列中。在一个特定的实施方式中，所述人源免疫球蛋白轻链序列包括V和/或J基因区段。
在一个实施方式中，所述非人源ADAM6序列与V基因区段是毗邻的。在一个实施方式中，所述非人源ADAM6序列位于两个V基因区段之间。在一个实施方式中，所述非人源ADAM6序列在V和J基因区段之间是毗邻的。在一个实施方式中，所述小鼠ADAM6序列在两个J基因区段之间是毗邻的。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，所述动物包括表达与来自免疫球蛋白基因座的人源VL结构域同源的人源VL结构域的B细胞，其中所述非人动物表达来自免疫球蛋白基因座的非免疫球蛋白非人源蛋白。在一个实施方式中，所述非免疫球蛋白非人源蛋白是ADAM蛋白。在一个特定的实施方式中，所述ADAM蛋白是ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或功能性片段。
在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物(例如小鼠或大鼠)。在一个实施方式中，所述啮齿动物是鼠科的。在一个实施方式中，所述啮齿动物是鼠总科的。在一个特定的实施方式中，所述鼠总科的啮齿动物选自小鼠和大鼠。
在一个实施方式中，所述非免疫球蛋白非人源蛋白是啮齿动物蛋白。在一个实施方式中，所述啮齿动物是鼠科的。在一个实施方式中，所述啮齿动物是鼠总科的。在一个特定的实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
在一个实施方式中，所述人源VL结构域直接或通过接头与免疫球蛋白恒定结构域序列连接。在一个特定的实施方式中，所述恒定结构域序列包括选自铰链、CH2、CH3及其组合的序列。在一个特定的实施方式中，所述人源VL结构域选自Vκ或Vλ结构域。
在各种实施方式中，所述人源VL结构域是人源Vκ结构域。
在一个方面，本申请提供了一种基因修饰的非人动物，所述动物在其生殖细胞系中包括人源免疫球蛋白序列，其中所述雄性非人动物的精子的特征是体内迁移缺陷。在一个实施方式中，所述在体迁移缺陷包括雄性非人动物的精子不能由子宫迁移至相同物种雌性非人动物的输卵管。在一个实施方式中，所述非人动物缺乏编码ADAM6蛋白或其功能性片段的核苷酸序列。在一个特定的实施方式中，所述ADAM6蛋白或其功能性片段包括ADAM6a和/或ADAM6b蛋白或其功能性片段。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个特定的实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
在一个方面，本申请提供了一种非人动物，所述动物包括与编码ADAM6蛋白或者其直系同源物或同源物或功能性片段的非人序列邻近的人源免疫球蛋白序列。在一个实施方式中，所述非人动物是啮齿动物。在一个特定的实施方式中，所述啮齿动物选自小鼠、大鼠和仓鼠。
在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白序列是免疫球蛋白轻链序列。在一个实施方式中，所述免疫球蛋白序列包含一个或多个VL基因区段。在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白序列包含一个或多个JL基因区段。在一个实施方式中，所述人源免疫球蛋白序列包含一个或多个VL基因区段和一个或多个JL基因区段。在各种实施方式中，所述人源VL和JL基因区段是人源Vκ和Jκ基因区段。
在一个方面，本申请提供了一种具有功能丧失的内源性免疫球蛋白重链基因座的小鼠，所述小鼠含有功能丧失的或缺失的内源性ADAM6基因座，其中所述小鼠包含表达人源或小鼠或人源/小鼠或其他的嵌合抗体的核酸序列。在一个实施方式中，所述核酸序列存在于随机整合至小鼠的基因组中的整合的转基因上。在一个实施方式中，所述核酸序列在在野生型小鼠中不存在的游离基因体(例如染色体)上。
在一个方面，本申请提供了一种具有功能丧失的内源性免疫球蛋白重链基因座的小鼠，所述小鼠含有具有功能的内源性ADAM6基因座，其中所述小鼠包含表达人源或小鼠或人源/小鼠或其他嵌合抗体的核酸序列。在一个实施方式中，所述核酸序列存在于位于一个或多个内源性重链恒定区基因上游位置的内源性免疫球蛋白重链基因座中。在一个实施方式中，所述核酸序列存在于随机整合至小鼠的基因组中的整合的转基因上。在一个实施方式中，所述核酸序列在在野生型小鼠中不存在的游离基因体(例如染色体)上。
双特异性结合蛋白
本申请所述的结合蛋白以及编码其的核苷酸序列可以用于制备多特异性结合蛋白，例如双特异性结合蛋白。在这个方面，基本上由与CH区融合的第一VL结构域组成的第一多肽可以与基本上由与CH区融合的第二VL结构域组成的第二多肽结合。在其中所述第一VL结构域和所述第二VL结构域特异性地结合不同的表位，可以使用所述的两个VL结构域制备双特异性结合分子。所述CH区可以是相同的或不同的。在一个实施方式中，例如可以对所述CH区中的一个进行修饰以消除蛋白A结合决定簇，但不对其他的重链恒定区进行这样的修饰。这种特定的排布简化了从例如同型二聚体(例如所述第一或第二多肽的同型二聚体)的混合物中对双特异性结合蛋白的分离。
在一个方面，将如本申请所述的方法和组合物用于制备双特异性结合蛋白。在这个方面，与CH区融合的第一VL和与CH区融合的第二VL分别独立地被克隆至具有相同同种型(例如人源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)的人源IgG序列的框架中。所述第一VL特异性地与第一表位结合，所述第二VL特异性地与第二表位结合。所述第一和第二表位可以在不同的抗原上或者在相同的抗原上。
在一个实施方式中，与所述第一VL融合的CH区的IgG同种型和与所述第二VL融合的CH区的IgG同种型是相同的同种型，但是在含有至少一个氨基酸取代的一个IgG同种型中是不同的。在一个实施方式中，所述至少一个氨基酸取代使得携带所述取代的重链与缺乏所述取代的重链相比不能或者基本上不能结合蛋白A。
在一个实施方式中，所述第一CH区含有选自IgG1、IgG2和IgG4的人源IgG的第一CH3结构域；并且所述第二CH区含有选自IgG1、IgG2和IgG4的人源IgG的第二CH3结构域，其中所述第二CH3结构域含有使所述第二CH3结构域与蛋白A的结合降低或消除的修饰。
在一个实施方式中，所述第二CH3结构域含有435R修饰(根据Kabat的EU索引编号)。在另一个实施方式中，所述第二CH3结构域还含有436F修饰(根据Kabat的EU索引编号)。
在一个实施方式中，所述第二CH3结构域是人源IgG1，其含有选自下组D356E、L358M、N384S、K392N、V397M和V422I的修饰(根据Kabat的EU索引编号)。
在一个实施方式中，所述第二CH3结构域是人源IgG2，其含有选自下组N384S、K392N和V422I的修饰(根据Kabat的EU索引编号)。
在一个实施方式中，所述第二CH3结构域是人源IgG4，其含有选自下组Q355R、N384S、K392N、V397M、R409K、E419Q和V422I的修饰(根据Kabat的EU索引编号)。
在一个实施方式中，所述结合蛋白含有具有一个或多个如本申请所述修饰的CH区，其中所述结合蛋白的恒定区在人体内不具有免疫原性或基本上不具有免疫原性。在一个特定的实施方式中，所述CH区含有在人体内不递呈免疫原性表位的氨基酸序列。在另一个特定的实施方式中，所述结合蛋白含有在野生型人源重链中不存在的CH区，并且所述CH区不包含产生T细胞表位的序列。
实施例
本发明提供下述实施例以描述如何制备和使用本发明的方法和组合物，而不是旨在限定发明人所认为的发明的范围。除非另有明示，温度以摄氏度表示，并且压力为处于或接近大气压。
实施例1：将人源轻链基因区段引入重链基因座
使用基因工程技术(参见例如美国专利号6,586,251和Valenzuela等，(2003),High-throughput engineering of the mouse genome coupledwith high-resolution expression analysis(与高分辨率表达分析结合的对小鼠基因组的高通量工程化改造),Nat Biotechnol 21:652-659)制备了各种靶向构建体，以修饰小鼠基因组细菌人工染色体(BAC)文库。通过同源重组对小鼠BAC DNA进行修饰，通过靶向缺失VH、DH和JH基因区段使内源性重链基因座失活，以确保未经重排的人源生殖细胞系κ轻链基因序列的插入(参见图2的上部)。
简言之，在使用重组酶介导重组的两个连续的靶向事件中将小鼠的重链基因座缺失。第一个靶向事件包括使用靶向载体靶向小鼠重链基因座的5’末端，所述靶向载体从5’至3’包含5’小鼠同源臂、重组酶识别位点、新霉素表达盒和3’同源臂。所述5’和3’同源臂含有小鼠重链基因座的5’序列。第二个靶向事件包括使用第二靶向载体靶向在JH基因区段区的小鼠重链基因座的3’末端，所述靶向载体从5’至3’包含5’小鼠同源臂、5’重组酶识别位点、第二重组酶识别位点、潮霉素表达盒、第三重组酶识别位点和3’小鼠同源臂。所述5’和3’同源臂含有在小鼠JH基因区段和5’内含子增强子和恒定区翼侧的序列。通过染色体核型分析对含有使用这两个靶向载体(如上文所述)靶向的经修饰的重链基因座的阳性ES细胞进行确证。然后从双重靶向的ES细胞中分离DNA并使用重组酶进行处理以介导在所述第一个靶向载体中的5’重组酶识别位点和所述第二个靶向载体中的5’重组酶识别位点之间的小鼠重链基因座基因组DNA的缺失，保留单一的重组酶识别位点和由两个重组酶识别位点翼侧包围的潮霉素表达盒(图2的上部)。这样就形成了含有完整的CH基因的经修饰的小鼠重链基因座，所述基因座用于使用下文所述的靶向载体以精确的方式逐步插入人源κ生殖细胞系基因区段。
使用本领域公知的标准分子技术将四个独立的靶向载体工程改造以便将40个人源Vκ基因区段和5个人源Jκ基因区段逐步插入不具有活性的小鼠重链基因座(如上文所述)(图2)。用于工程改造所述四个靶向构建体的人源κ基因区段通常见于生殖细胞系人源κ轻链基因座的近端邻接片段中(图1和表1下部)。
将含有前6个人源Vκ基因区段和5个人源Jκ基因区段的～110,499bp人源基因组片段工程化使得人源Jκ5基因区段下游(3’)431bp处含有PI-SceI位点。将另一个在～7,852bp基因组片段的5’末端的PI-SceI位点工程改造，所述基因组片段含有小鼠重链内含子增强子、IgM转换区(Sμ)和小鼠重链基因座的IgM基因。该小鼠片段与～110.5kb人源片段连接作为3’同源臂，其形成了下述的3’连接接头：从5’至3’含有～110.5kb人源κ轻链基因座的基因组序列(其含有前6个连续的Vκ基因区段和5个Jκ基因区段)、PI-SceI位点、～7,852bp小鼠重链序列(其含有小鼠内含子增强子)、Sμ和小鼠IgM恒定基因。在人源Vκ1-6基因区段的上游(5’)在小鼠5’同源臂开始前是附加的3,710bp人源κ序列，所述小鼠同源臂含有与小鼠重链基因座的5’序列对应的19,752bp小鼠基因组DNA。在所述5’同源臂和人源κ序列的起始之间是新霉素表达盒，所述表达盒的翼侧为三个重组酶识别位点(见靶向载体1，图2)。用于人源κ序列第一插入的最终的靶向载体从5’至3’包含5’同源臂，其含有重链基因座5’的～20kb小鼠基因组序列、第一重组酶识别位点(R1)、新霉素表达盒、第二重组酶识别位点(R2)、第三重组酶识别位点(R3)、～110.5kb人源基因组κ序列，其含有前6个连续的人源Vκ基因区段和5个人源Jκ基因区段、PI-SceI位点和3’同源臂，其含有～8kb小鼠基因组序列包括内含子增强子、Sμ和小鼠IgM恒定基因(图2，靶向载体1)。与该靶向载体同源重组形成了经修饰的小鼠重链基因座，其含有可操作地与内源性重链恒定区连接的6个人源Vκ基因区段和5个人源Jκ基因区段，其在重组后形成了杂交的重链(即人源Vκ结构域和小鼠CH区)。
表1
将10个附加的人源Vκ基因区段引入杂交的重链基因座。对第二靶向载体进行工程改造以便将10个附加的人源Vκ基因区段引入上文所述的经修饰的小鼠重链基因座(见图2，靶向载体2)。使用含有小鼠重链基因座5’端小鼠基因组序列的5’同源臂和含有人源基因组κ序列的3’同源臂对140,058bp人源基因组片段进行工程改造，所述人源基因组片段含有来自人源κ轻链基因座的12个连续的人源Vκ基因区段。在人源Vκ1-16基因区段的上游(5’)在5’小鼠同源臂开始前是附加的10,170bp人源κ序列，所述5’小鼠同源臂是与靶向载体1的构建中使用的相同的5’同源臂(图2)。在所述5’同源臂和人源κ序列的起始之间是潮霉素表达盒，所述表达盒的翼侧为重组酶识别位点。所述3’同源臂包括与靶向载体1的～110.5kb人源基因组κ序列片段的5’末端等价物对应的31,165bp重叠的人源基因组κ序列(图2)。用于插入10个附加的人源Vκ基因片段的最终的靶向载体从5’至3’包括5’同源臂，其含有重链基因座5’的～20kb小鼠基因组序列、第一重组酶识别位点(R1)、潮霉素表达盒、第二重组酶识别位点(R2)和～140kb人源基因组κ序列(其含有12个连续的人源Vλ基因区段，其中～31kb与靶向载体1的人源κ序列5’末端重叠并且作为该靶向构建体的3’同源臂)。与该靶向载体同源重组形成了经修饰的小鼠重链基因座，其含有可操作地与小鼠重链恒定基因连接的16个人源Vκ基因区段和5个人源Jκ基因区段，其在重组后形成了杂交的重链。
将14个附加的人源Vκ基因区段引入杂交的重链基因座。对第三靶向载体进行工程改造以便将14个附加的人源Vκ基因区段引入上文所述的经修饰的小鼠重链基因座(见图2，靶向载体3)。使用含有小鼠重链基因座5’端小鼠基因组序列的5’同源臂和含有人源基因组κ序列的3’同源臂对160,579bp人源基因组片段进行工程改造，所述人源基因组片段含有15个连续的人源Vκ基因区段。在人源Vκ2-30基因区段的上游(5’)在5’小鼠同源臂开始前是附加的14,687bp人源κ序列，所述同源臂是与此前的两个靶向载体使用的相同的5’同源臂(如上文所述，亦见图2)。在所述5’同源臂和人源κ序列的起始之间是新霉素表达盒，所述表达盒的翼侧为重组酶识别位点。所述3’同源臂包括与靶向载体2的～140kb人源基因组κ序列片段的5’末端等价物对应的21,275bp重叠的人源基因组κ序列(图2)。用于插入14个附加的人源Vκ基因片段的最终的靶向载体从5’至3’包括5’同源臂，其含有小鼠重链基因座5’的～20kb小鼠基因组序列、第一重组酶识别位点(R1)、新霉素表达盒、第二重组酶识别位点(R2)和～161kb人源基因组κ序列(其含有15个连续的人源Vκ基因区段，其中～21kb与靶向载体2的人源κ序列5’末端的重叠并且作为该靶向构建体的3’同源臂)。与该靶向载体同源重组形成了经修饰的小鼠重链基因座，其含有可操作地与小鼠重链恒定基因连接的30个人源Vκ基因区段和5个人源Jκ基因区段，其在重组后形成了嵌合的κ重链。
将10个附加的人源Vκ基因区段引入杂交的重链基因座。对第四靶向载体进行工程改造以便将10个附加的人源Vκ基因区段引入上文所述的经修饰的小鼠重链基因座(见图2，靶向载体4)。使用含有小鼠重链基因座5’端小鼠基因组序列的5’同源臂和含有人源基因组κ序列的3’同源臂对90,398bp人源基因组片段进行工程改造，所述人源基因组片段含有16个连续的人源Vκ基因区段。在人源Vκ2-40基因区段的上游(5’)在5’小鼠同源臂开始前是附加的8,484bp人源κ序列，所述同源臂是与此前的靶向载体具有相同的5’同源臂(如上文所述，图2)。在所述5’同源臂和人源κ序列的起始之间是潮霉素表达盒，所述表达盒的翼侧为重组酶识别位点。所述3’同源臂包括与靶向载体3的～160kb人源基因组κ序列片段的5’末端等价物对应的61,615bp重叠的人源基因组κ序列(图2)。用于插入10个附加的人源Vκ基因片段的最终的靶向载体从5’至3’包括5’同源臂，其含有小鼠重链基因座5’的～20kb小鼠基因组序列、第一重组酶识别位点(R1)、潮霉素表达盒、第二重组酶识别位点(R2)和～90kb人源基因组κ序列(其含有16个连续的人源Vκ基因区段，其中～62kb与靶向载体3的人源κ序列5’末端重叠并且作为该靶向构建体的3’同源臂)。与该靶向载体同源重组形成了经修饰的小鼠重链基因座，其含有可操作地与小鼠重链恒定基因连接的40个人源Vκ基因区段和5个人源Jκ基因区段，其在重组后形成了嵌合的κ重链(图2的下部)。
使用与如上文所述的类似方法，在小鼠重链恒定区背景下构建了人源轻链可变结构域的其他组合。附加的轻链可变结构域可以来源于人源Vλ和Jλ基因区段(图3和图4)。
人源λ轻链基因座延续1,000kb并且含有编码可变(V)或连接(J)区段的80个基因。在人源λ轻链基因座的70个Vλ基因区段中，根据已发布的报告30-38区段中的每一个均可能是具有功能的基因区段。所述70个Vλ序列分布于3个簇中，其均含有独特的V基因家族群(簇A、B和C)的不同成员。在所述人源λ轻链基因座中，在全部已观察的Vλ结构域中有超过半数的结构域由基因区段1-40、1-44、2-8、2-14和3-21编码。在7个Jλ基因区段中，仅有4个通常被认为是具有功能的Jλ基因区段-Jλ1、Jλ2、Jλ3和Jλ7。在一些等位基因中，第五个Jλ-Cλ基因区段对据报道是假基因(Cλ6)。如本申请所述的将多个人源Jλ基因区段整合入如本申请所述的杂交的重链基因座中是通过从头合成构建的。在这种方法中，使用多个人源Vλ基因区段对在生殖细胞系结构中的含有多个人源Jλ基因区段的基因组片段进行工程改造并且使得在重链恒定区背景下进行正常的V-J重组。
将轻链可变结构域与重链恒定区偶联是用于在非人动物中产生具有人源VL区的独特的VL结合蛋白多样性的潜在丰富的来源。在小鼠中开发人源λ轻链结构域(或如上文所述的人源κ基因座)的这种多样性能够得到工程改造的独特的杂交重链和针对基因修饰动物的免疫库产生另一个层面的结合蛋白并且随后将其作为下一代疗法的下一代平台。
此外，可以将人源Vκ或Vλ基因区段整合入人源DH和JH(或Jκ)基因区段中以构建新型的杂交基因座，其将在重组后产生新型的经过工程改造的可变结构域(图5和6)。在这后一种情况中，对通常不包含在单一基因座中的基因区段的工程重组将需要对与各个基因区段结合的重组信号序列(RSS)进行特别的关注，以使得当将其组合在单一结构域中时能够实现正常的重组。例如，已知V(D)J重组需要保守的非编码DNA序列的引导，所述序列称为七聚体和九聚体序列，其存在于各基因区段发生重组的精确位置附近。在这些非编码DNA序列之间是长度为12或23个碱基对(bp)的非保守的间隔区。通常地，重组仅发生在位于同一染色体的基因区段上并且这些被翼侧12-bp间隔包围的基因区段能够与被翼侧23-bp间隔包围的基因区段连接，即12/23规则，尽管在较小比例的抗体中也观察到了两个DH基因区段的连接(其翼侧均为12-bp间隔)。为了使得通常不具有相容性间隔(例如Vκ和DH或DH和Jλ)的基因区段之间能够重组，在所需基因区段的邻近位置合成独特的兼容的间隔，以构建能够成功重组以形成含有轻链可变区的独特重链的独特的杂交重链。
因此，使用上文概述的用于将人源κ轻链基因区段整合入内源性重链基因座的策略能够实现人源λ轻链基因区段以及特定的人源重链基因区段(例如DH和JH)及其组合的其他重组的用途。
实施例2：靶向ES细胞的鉴定和在内源性重链基因座携带人源轻链基因区段的基因修饰小鼠的生成
使用前述实施例中制备的靶向BAC DNA电转染小鼠的ES细胞以形成用于产生表达VL结合蛋白的嵌合小鼠的经修饰的ES细胞(即人源κ轻链基因区段可操作地与小鼠重链恒定区连接)。通过定量PCR试验(Lie,Y.S.和Petropoulos,C.J.(1998)Advances inquantitative PCR technology:5’nuclease assays.(定量PCR技术的发展：5’核酸酶试验)Curr Opin Biotechnol 9(1):43-48)鉴定含有未经重排的人源κ轻链基因区段插入的靶向ES细胞。设计特异性引物集合和探针以检测人源κ序列和相关的选择性表达盒的插入情况，小鼠重链序列的丢失情况和小鼠序列翼侧内源性重链基因座的保留情况。
可以使用表达重组酶的构建体转染携带人源κ轻链基因区段的ES细胞以除去通过含有人源κ基因区段的靶向构建体的插入引入的任何不需要的选择性表达盒。任选地，可以将携带含有人源κ轻链基因区段的经工程改造的重链基因座的小鼠与FLPe缺失小鼠品系(参见例如Rodríguez,C.I.等，(2000)High-efficiency deleter mice show that FLPeis an alternative to Cre-loxP(高效率缺失小鼠显示了FLPe可以替代Cre-loxP)NatureGenetics 25:139-140；US 6,774,279)繁殖，从而除去通过靶向载体引入的并且例如在ES细胞阶段或在胚胎中未被除去的任何Frt化的表达盒。任选地，在小鼠中可保留选择性表达盒。
使用上文所述的靶向ES细胞作为供体ES细胞并通过方法(如上文所述)将其引入8-细胞期小鼠胚胎。通过使用检测表达盒序列、人源Vκ和Jκ基因区段以及内源性重链序列存在和/或不存在的改良的等位基因试验(Valenzuela等，如上文所述)进行基因分型来鉴定携带修饰的重链基因座的小鼠，所述重链基因座携带可操作地与小鼠免疫球蛋白重链恒定区基因连接的人源Vκ和Jκ基因区段。
对胎仔进行基因分型，并选择针对含有可操作地与内源性小鼠免疫球蛋白重链恒定基因连接的人源κ轻链基因区段的经修饰的重链基因座为杂合子的胎仔以用于表征免疫球蛋白重链库。
实施例3：表达VL结合蛋白的小鼠的繁殖
为了形成新一代的VL结合蛋白，可以将携带未经重排的人源κ基因区段的小鼠与含有反向或非靶向内源性重链等位基因的缺失的另一种小鼠繁殖(即针对修饰的小鼠杂合子)。以这种方式，所获得的后代将仅表达如实施例1中所述的杂交重链。采用本领域公知的标准技术或者委托商业公司例如杰克逊实验室公司进行繁殖。针对独特的含有人源轻链可变结构域的重链的存在情况，对携带经修饰的重链基因座的小鼠进行筛选。
或者，在小鼠重链基因座携带未经重排的人源κ基因区段的小鼠可以通过与在小鼠轻链基因座(κ和λ)中含有一个或多个缺失的其他小鼠繁殖以得到优化。以这种方式，所获得的后代将仅表达如实施例1中所述的具有独特的人源κ重链的抗体。采用本领域公知的标准技术或者委托商业公司例如杰克逊实验室公司进行类似的繁殖。针对含有人源Vκ结构域和小鼠重链恒定结构域的独特的重链的存在情况和内源性轻链的缺乏情况，对携带经修饰的重链基因座和小鼠轻链基因座的一个或多个缺失的小鼠品系进行筛选。
还将携带经修饰的重链基因座的小鼠(如上文所述)与含有内源性κ轻链可变基因座被人源κ轻链可变基因座取代的小鼠繁殖(参见US 6,596,541，瑞恩泽制药公司(Regeneron Pharmaceuticals)，人源化小鼠技术)。人源化小鼠部分地包括，具有包括与内源性κ轻链可变区基因座可操作地连接的人源κ轻链可变区的基因组，以使得所述小鼠针对抗原刺激而产生包含人源κ轻链可变结构域和小鼠重链恒定结构域的抗体。可以将编码抗体轻链可变区的DNA分离并且与编码人源轻链恒定区的DNA可操作地连接。然后在能够表达抗体的全人源轻链的细胞中表达所述DNA。根据适宜的繁殖方案，获得具有内源性κ轻链被人源κ轻链基因座的取代和根据实施例1的经修饰的重链基因座的小鼠。在使用目标抗原免疫后能够分离含有体细胞突变的人源Vκ结构域的独特的VL结合蛋白。
实施例4：ADAM基因在经修饰的重链基因座中的重建
具有内源性可变区基因区段(即VDJ)被取代和/或缺失的经修饰的免疫球蛋白重链基因座的小鼠缺乏内源性ADAM6基因的表达。特别地，含有这种免疫球蛋白重链基因座修饰的雄性小鼠显示出生育能力的降低。该实施例显示了在具有根据实施例1的经修饰的重链基因座的小鼠中重建ADAM6表达能力的两种方法，从而使得使用正常的繁殖方法能够维持所述经修饰的小鼠的品系。
ADAM6基因在人源轻链基因区段中的重建。通过同源重组使用BAC DNA重建含有人源Vκ和Jκ基因区段的经修饰的免疫球蛋白重链基因座，以含有编码小鼠ADAM6a和ADAM6b的基因组片段。其利用基因工程技术(如上所述)通过连续的6个步骤实现，其包括修饰含有小鼠和人源序列的BAC DNA，以产生含有与小鼠ADAM6基因和小鼠重链恒定区邻近的人源Vκ和Jκ基因区段的最终的靶向载体。
使用从5’至3’含有独特的限制性位点(I-CeuI)、小鼠Adam6a和Adam6b基因、IGCR1调控元件(Guo等，2011)、免疫球蛋白DH和JH基因区段、Eμ增强子和IgM恒定区基因的小鼠BAC克隆(VI149)作为将ADAM6基因在含有VL和JL基因区段的经修饰的重链基因座中重建的初始原料(图7)。通过细菌同源重组(BHR)修饰VI149以便从最远端D区段(DFL16.1)5’端约53bp至BAC 3’端缺失全部的DH和JH基因区段。该区域被在其5’端含有独特AscI位点的大观霉素抗性表达盒(pSVi0029)取代以产生BAC克隆VI413。
制备附加的BHR修饰以形成含有小鼠Adam6a和Adam6b基因以及IGCR1元件的BAC克隆。通过使用具有独特I-CeuI(5’)和AscI(3’)限制性位点(pLMa0294)的Frt化的新霉素抗性表达盒取代Adam6a和adam6b之间47199bp的区域形成第一BAC克隆。该缺失横跨从Adam6bCDS 3’4779bp至Adam6b CDS 5’290bp 5’的区域。将所得到的BAC克隆命名为VI421。通过在VI413中的Adam6a CDS 3’4782bp位置的Adam6a和Adam6b之间插入相同的Frt表达和形成第二BAC克隆以产生VI422。
VI421BAC克隆从5’至3’含有独特的I-CeuI位点、包括CDS 5’751bp和3’4779bp的Adam6a、Frt化的新霉素抗性表达盒、包括CDS 5’290bp和3’7320bp的Adam6b、IGCR1和独特的AscI位点(SEQ ID NO:3)。
VI422BAC克隆从5’至3’含有独特的I-CeuI位点、包括CDS 5’751bp和3’4779bp的Adam6a、Frt化的潮霉素抗性表达盒、包括CDS 5’47490bp和3’7320bp的Adam6b、IGCR1和独特的AscI位点(SEQ ID NO:4)。
通过将VI421和VI422插入如实施例1所述的经修饰版本的靶向载体1(图2)的基因间区中实现ADAM6基因的重建。通过两个BHR步骤修饰靶向载体1以便插入来自VI421和VI422的小鼠ADAM6片段。第一个BHR步骤使用潮霉素表达盒(pLMa0100)从靶向载体1中缺失新霉素表达盒。将所得到的BAC克隆命名为VI425，其从5’至3’含有潮霉素抗性表达盒、四个最近端的人源Vκ区段、23,552bpVκ-Jκ基因间区和全部5个人源Jκ区段，其功能性地连接至含有小鼠Eμ增强子和IgM恒定区基因的8kb 3’小鼠同源臂。在第二个BHR中，使用翼侧为独特的I-CeuI和AscI限制性位点的氯霉素抗性表达盒(pDBa0049；图8)取代Vκ-Jκ基因间区中的740bp，对VI425进行修饰。740bp缺失的位置从最近端人源Vκ基因区段(Vκ4-1)3’16,858至17,597bp。将由两个BHR得到的BAC克隆命名为VI426(图8)。
通过I-CeuI/AscI酶解和相容性末端重连，独立地使用含有来自VI421和VI422的小鼠ADAM6基因的DNA片段取代VI426中的氯霉素表达盒。图8显示了分别被命名为VI429和VI428的最终的靶向载体。将其均电转染至此前已使用靶向载体4修饰的ES细胞中(如实施例1所述，见图2)，以使得其能够与根据实施例1修饰的独特的重链基因座重组并插入编码小鼠ADAM6基因的DNA片段。使用新霉素选择阳性菌落。
在人源轻链基因区段翼侧重建ADAM6基因。通过同源重组使用BAC DNA重建位于全部内源性重链恒定区上游的含有人源Vκand Jκ基因区段的经修饰的免疫球蛋白重链基因座，以含有编码小鼠ADAM6a和ADAM6b的基因组片段。其利用基因工程技术(如上所述)通过一系列步骤实现，包括修饰含有小鼠和人源序列的BAC DNA，以产生含有与小鼠ADAM6基因和小鼠重链恒定区相邻的人源Vκ和Jκ基因区段的最终的靶向载体。
通过BHR修饰根据实施例1制备的靶向载体4(见图2和图9上部)，以使用含有独特的AscI(5’)和I-CeuI(3’)限制性位点的氯霉素表达盒(pLMa0231；图9)取代Frt化的潮霉素表达盒。靶向载体4从5’至3’含有～20kb小鼠远端IgH同源臂、Frt化的潮霉素抗性表达盒和人源Vκ2-40至人源Vκ3-25基因区段。
接下来，通过AscI/I-CeuI酶解和除去相容性末端重连，使用命名为VI444的BAC克隆在VI477BAC克隆的人源Vκ基因区段的5’位置插入编码小鼠ADAM6基因的DNA片段。VI444克隆从5’至3’含有独特的I-CeuI位点、包括CDS 5’751bp和3’4779bp的Adam6a、Frt化的新霉素抗性表达盒、包括CDS 5’290bp和3’1633bp的Adam6b基因和独特的AscI位点(SEQ IDNO:5)。将用作在人源κ基因区段上游插入小鼠ADAM6基因的靶向载体的所得到的BAC克隆命名为VI478，与VI421和VI422不同，在VI478中的小鼠ADAM6基因在相反的方向(即与人源Vκ基因区段具有相同的转录方向；图9)。用于在人源Vκ基因区段的远端插入小鼠ADAM6基因的最终的靶向载体从5’至3’含有～20kb小鼠远端IgH同源臂、独特的AscI位点、小鼠Adam6b、Frt化的新霉素抗性表达盒、小鼠Adam6a、独特的I-CeuI位点和人源Vκ2-40至人源Vκ3-25基因区段。将该靶向载体电转染至此前已使用靶向载体4修饰的ES细胞中(图2)，以使得其能够与根据实施例1修饰的独特的重链基因座重组并插入编码小鼠ADAM6基因的DNA片段。使用新霉素选择阳性菌落。
靶向ES细胞的选择和确证。使用各个最终的靶向载体(上文所述)电转染小鼠ES细胞以形成经修饰的ES细胞，所述ES细胞含有包含小鼠ADAM6a和ADAM6b序列的小鼠基因组异位序列，所述异位序列在含有人源Vκ和Jκ基因区段的经修饰的重链基因座中。通过使用TAQMANTM探针的定量PCR试验(Lie和Petropoulos(1998)，如上文所述)鉴定在经修饰的重链基因座中含有异位小鼠基因组片段的阳性ES细胞。
使用上文所述的靶向ES细胞作为供体ES细胞通过小鼠工程改造方法(参见例如美国专利号7,6598,442；7,576,259和7,294,754)将其引入8-细胞期小鼠胚胎中。通过使用改良的等位基因试验(Valenzuela等，2003)的染色体核型分析检测经修饰的重链基因座和人源κ轻链序列中小鼠ADAM6a和ADAM6b基因的存在情况对携带经修饰的重链基因座的小鼠进行鉴定，所述经修饰的重链基因组含有人源κ轻链基因区段和包含小鼠ADAM6a和ADAM6b序列的异位小鼠基因组序列。
对胎仔进行基因分型并且选择针对含有包含小鼠ADAM6a和ADAM6b序列的异位小鼠基因组片段的经修饰的重链基因座为杂合子的胎仔以用于鉴定小鼠ADAM6基因的表达和生育能力。
Claims (20)
1.制备人源抗原结合蛋白的方法，包括：
(a)从在小鼠细胞中发现的编码与非人源重链恒定区融合的人源轻链可变结构域的核酸序列处，获取编码所述人源轻链可变结构域的核酸序列，其中所述人源轻链可变结构域与目标抗原结合；
(b)将编码所述人源轻链可变结构域的核酸序列克隆进编码人源重链恒定区的基因框架中，以形成编码人源结合蛋白的人源结合蛋白序列；并且
(c)在宿主细胞中表达所述人源结合蛋白；
其中所述小鼠：
(i)已使用目标抗原免疫；并且
(ii)在其基因组中包括：
(1)在非人源轻链恒定区上游的一个或多个人源VL和一个或多个人源JL基因区段的插入；
(2)在非人源重链恒定区上游的一个或多个人源VL和一个或多个人源JL基因区段的插入；以及
(3)编码ADAM6蛋白或其功能性片段的整合的核苷酸序列，其中所述ADAM6蛋白或其功能性片段由整合的ADAM6核酸序列表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述编码与非人源重链恒定区融合的人源轻链可变结构域的核酸序列在小鼠中是体细胞突变的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞选自B细胞、杂交瘤、四价体杂交瘤、CHO细胞、COS细胞、293细胞、HeLa细胞和表达病毒核酸序列的人视网膜细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中(b)中所述人源重链可变区包含人源IgG同种型。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述人源IgG同种型选自IgG1、IgG2和IgG4。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述人源IgG4是经修饰的IgG4。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述经修饰的IgG4含有在铰链区的取代。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述细胞还包括第二人源抗原结合蛋白序列，所述第二人源抗原结合蛋白序列包括编码第二人源轻链可变结构域的核酸序列，所述第二人源轻链可变结构域在编码人源κ轻链恒定区或人源λ轻链恒定区的基因的框架中，其中从在所述小鼠的细胞中发现的编码与非人源轻链恒定区融合的第二人源轻链可变结构域的核酸序列处，获取编码所述第二人源轻链可变结构域的核酸序列，并且所述方法还包括在宿主细胞中表达所述第二人源抗原结合蛋白。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述在非人源轻链恒定区上游的一个或多个人源VL和一个或多个人源JL基因区段是一个或多个人源Vκ基因区段和一个或多个人源Jκ基因区段。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述在非人源重链恒定区上游的一个或多个人源VL和一个或多个人源JL基因区段是一个或多个人源Vκ基因区段和一个或多个人源Jκ基因区段。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述编码ADAM6蛋白或其功能性片段的整合的核苷酸序列存在于与野生型非人源ADAM6基因座相比相同的位置。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述编码ADAM6蛋白或其功能性片段的整合的核苷酸序列存在于免疫球蛋白基因区段中。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述免疫球蛋白基因区段是人源κ轻链基因区段。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述免疫球蛋白基因区段是所述小鼠的内源性重链基因区段。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述小鼠包括在所述小鼠中不能重排以形成轻链可变结构域的内源性免疫球蛋白VL基因区段和/或内源性免疫球蛋白JL基因区段。
16.根据权利要求1所述的方法，其中所述编码ADAM6蛋白或其功能性片段的整合的核苷酸序列是插入的核酸序列。
17.根据权利要求1所述的方法，其中(1)中所述非人源轻链恒定区基因是小鼠轻链恒定区基因。
18.根据权利要求1所述的方法，其中(2)中所述非人源重链恒定区基因是小鼠重链恒定区基因。
19.根据权利要求1所述的方法，其中(b)中所述非人源重链恒定区是小鼠重链恒定区。
20.根据权利要求8所述的方法，其中所述非人源轻链恒定区是小鼠轻链恒定区。
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